ACCESSION NUMBER "3 0663? PRESS MARK II I II 22102057082 Med K5471 2m * AUS DEM KAISER WILHELM* INSTITUT FÜR CHEMIE UNTERSUCHUNGEN ÜBER CHLOROPHYLL METHODEN UND ERGEBNISSE RICHARD WILLSTATTER UND ARTHUR STOLL MIT 16 TEXTFIGUREN UND 11 TAFELN BERLIN VERLAG VON JULIUS SPRINGER 1913 C hi t r>e0ftfyLL \ \p Alle Rechte, insbesondere das der Übersetzung in fremde Sprachen, Vorbehalten. Copyright 1913 by Julius Springer in Berlin. (rH 7^ l o 663*7 Druck der Spamerschen Buchdruckerei in Leipzig Vorwort. Diese Abhandlung umfaßt unveröffentlichte Untersuchungen, die ich in den letzten Jahren gemeinsam mit Herrn Arthur Stoll ausgeführt habe ; sie betreffen die Isolierung des Chlorophylls, die Trennung und quantitative Bestimmung aller Kompo- nenten des Blattfarbstoffes und die Hydrolyse des Chlorophylls. In diesen Arbeiten sind neue Methoden für die Darstellung und den Abbau des Chlorophylls geschaffen worden; mit den neuen Erfahrungen und den leichter zugänglichen Stoffen wurden dann die früheren Versuche über die Umwandlungen des Chloro- phylls wiederholt und die meisten älteren Verfahren verbessert. Um die Arbeit zu einer Darstellung unserer Kenntnis vom Chlorophyll zu vervollständigen, wird sie mit den Ergebnissen der Untersuchungen ergänzt, die ich mit meinen Mitarbeitern in den letzten sieben Jahren in Liebigs Annalen der Chemie veröffentlicht habe. Eine weitere Ergänzung bilden einige noch unveröffentlichte Untersuchungen, die ich mit Herrn H. J.Page über die Pigmente der Braunalgen und mit Herrn M. Fischer über die Beziehungen zwischen Chlorophyll und Hämin ausgeführt habe. Chlorophyll und Hämin werden zu einer gemeinsamen Stammsubstanz abgebaut mit Hilfe von Reaktionen, die einige Aufschlüsse über wesentliche Unterschiede in der Konstitution von Chlorophyll und Hämin geben. IV Vorwort Die folgende Mitteilung macht das Chlorophyll und seine Derivate für künftige Untersuchungen leicht zugänglich. Indem ich gemeinsam mit Herrn A. St oll die gewonnenen Erfahrungen mitteile, hoffe ich, es dem Chemiker und dem Physiologen zu erleichtern, sich an der Erforschung des Blattfarbstoffes zu beteiligen. Berlin - Dahlem, Juli 1913. Richard Willstätter. Inhaltsverzeichnis. Seite Vorwort Inhaltsverzeichnis I. Theoretische Einleitung i Die Methode i Konstitutionsfragen 25 II. Beschreibung des Blattfarbstoffs in einfachen Ver- suchen 46 III. Die Extraktion der Farbstoffe 53 1. Pflanzenmaterial 53 2. Methoden der Extraktion 58 a) Zustand und Verhalten des Chlorophylls in den Blättern 58 b) Unsere älteren Methoden 64 c) Die Grundlagen der neuen Extraktionsmethode ... 70 d) Extraktionsmethode mit wasserhaltigen Lösungs- mitteln 74 IV. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarb- stoffe 78 1. Bestimmung des Chlorophylls 78 a) Relative Bestimmung 79 b) Absolute Bestimmung 80 2. Das Verhältnis der Komponenten a und b des Chlorophylls 84 a) Zur Geschichte der Methode 84 b) Die Fehlerquellen der Bestimmung 87 c) Die Grundzüge der Methode 94 d) Bestimmung von Chlorophyllpräparaten 96 3. Bestimmung der vier Blattfarbstoffe 99 4. Ergebnisse 109 5. Bestimmung der Braunalgen-Farbstoffe 117 V. Gewinnung von Chlorophyll 126 1. Methode von Willstätter und Hug 126 2. Reinchlorophyll nach Willstätter und Stoll 132 3. Rohchlorophyll 135 4. Chlorophyll aus frischen Blättern 138 5. Beschreibung des Chlorophylls 143 6. Vergleichende Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflanzen r ^g VI Inhaltsverzeichnis. Seite VI. Isolierung der beiden Komponenten des Chloro- phylls 153 1. Zur Geschichte der Methode 153 2. Verfahren von Willstätter und Isler 157 3. Die Chlorophyllkomponenten nach Willstätter und Stoll . 161 4. Beschreibung der Chlorophyllkomponenten 166 VII. Die Wirkungen der Chlorophyllase 172 1. Definition 172 2. Nachweis von Chlorophyllase 174 3. Verbreitung des Enzyms 177 4. Anwendung des Enzyms 178 5. Bestimmung der Hydrolyse durch Trennung mit Alkali . 179 6. Bestimmung der Alkoholyse mittels der Phytolzahl und Jodsilberzahl 181 7. Dynamik der Enzymwirkung 183 VIII. Anwendung des Enzyms zur partiellen Chloro- phyllsynthese 188 IX. Die präparativen Verwendungen der Chlorophyl- lase: Die Chlorophyllide 194 1. Äthylchlorophyllid („Krystallisiertes Chlorophyll“). . . . 195 2. Methylchlorophyllid aus trockenen Blättern 201 3. Methylchlorophyllid aus frischen Blättern 203 4. Freies Chlorophyllid aus frischen Blättern 206 X. Isolierung der Komponenten a und b der Chloro- phyllide 210 1. Trennung der Methylchlorophyllide 211 2. Trennung der freien Chlorophyllide 216 XI. Beschreibung der Chlorophyllide 219 x. Krystallisiertes Chlorophyll 219 2. Zur Methode der Analyse hochmolekularer Verbindungen. 221 3. Bestimmung der Methyl- und Äthylgruppe nebeneinander. 225 4. Die Methylchlorophyllide a und b 227 5. Die beiden freien Chlorophyllide 229 XII. Die gelben Pigmente der Chloroplasten 231 1. Vorkommen der Carotinoide 231 2. Isolierung von Carotin und Xanthophyll 237 3. Beschreibung 242 4. Gewinnung und Beschreibung des Fucoxanthins 247 XIII. Phäophytin 251 1. Definition 25r 2. Die älteren Methoden der Säurespaltung des Chlorophylls. 252 3. Gewinnung des Phäophytins 254 4. Beschreibung 259 XIV. Methode der Trennung und Bestimmung von Chlo- rophyllderivaten 262 1. Fraktionierung mit Salzsäure 262 2. Die Salzsäurezahl 268 3. Die Verteilungszahl 27x I Inhaltsverzeichnis . VII Seite XV. Die Phäophorbide a und 274 1 Trennung des Phäophytins in die Komponenten . . . • 2 74 2 Fraktionierung der Methylphäophorbide • • • 278 3 Umesterung des Phäophytins mit Chlorwasserstoff und Alkohol 2Z^ 4. Bildung und Trennung der freien Phäophorbide .... 201 5. Beschreibung der Phäophorbide 283 XVI. Phytochlorine und Phytorhodine 29° 1. Darstellung von Phytochlorin e und Phytorhodin g aus den Phäophorbiden 29° 2. Bildung aus den Chlorophylliden 296 3. Beschreibung ' 297 4. Die schwach basischen Phytochlorine und Phytorhodine . 303 XVII. Phytol 3°8 1. Gewinnung und quantitative Bestimmung 3°8 2. Beschreibung 311 XVIII. Die Chlorophyllinsalze 3*3 1. Verseifung in der Hitze 3*4 2. Verseifung in der Kälte 3*7 XIX. Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls 1. Einführung von Magnesium mit Magnesiumoxyd und Ätz- kali 2. Einführung von Magnesium mit Hilfe Grignardscher Ver- bindungen 328 XX. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien: Phylline und Porphyrine 334 1. Übersicht 334 2. Gewinnung der Endprodukte Pyrro- und Phyllophyllin aus Chlorophyll (a + b) 339 3. Zwischenprodukte des Abbaus 345 4. Gewinnung der Porphyrine 35 1 5. Beschreibung der Phylline 354 6. Beschreibung der Porphyrine 358 XXI. Oxydation der Chlorophyllderivate 369 XXII. Reduktion der Chlorophyllderivate 376 1. Zur Geschichte 37^ 2. Zerlegung von Hämopyrrol durch fraktionierte Salzbildung mit Pikrinsäure 382 3. Isolierung der Hämopyrrole aus Chlorophyll 387 4. Beschreibung der Pyrrole aus Chlorophyll 389 XXIII. Die carboxylfreien Stammsubstanzen: Ätiophyllin und Ätioporphyrin 391 1. Bildung 391 2. Beschreibung 395 VIII Inhaltsverzeichnis. Seite XXIV. Abbau des Hämins 399 1. Gewinnung von Hämin 399 2. Hämatoporphyrin 4°2 3. Abspaltung des Eisens mit flüssigem Bromwasserstoff . . 406 4. Mesohämin und Hämoporphyrin 4°^ 5. Ätioporphyrin 411 XXV. Graphische Darstellung der Absorptionsspektra . 414 Literaturverzeichnis 4*8 Sachregister I. Theoretische Einleitung. Die Methode. Die Geschichte der chemischen Untersuchung des Chloro- phylls beginnt mit Berzelius1), der es zuerst unternahm, das Pigment aus den Blättern zu isolieren. In der Meinung, daß es weder von konzentrierter Salzsäure noch von Alkalien zersetzt weide, hat er den alkoholischen Auszug der Blätter mit so energisch wirkenden Mitteln behandelt und ist daher nur zu Produkten tiefgreifender Zersetzung gelangt. Er urteilt, daß das Blattgrün weder ein Harz noch Wachs oder Fett sei, sondern zu den Farb- stoffen gehöre; seine Farbkraft vergleicht er mit der von Indigo. Die Abhandlung von Berzelius hat auf die Ansichten und die Arbeitsweise der späteren Forscher viel Einfluß gehabt; entweder mit Salzsäure oder mit Alkali wird in der Folge die Isolierung des Farbstoffs angestrebt, so von G. J. Mulder2), dann von F. S. Morot3) und anderen. F. Verdeil4) glaubt Chlorophyll in reinem Zustand zu isolieren, indem er einen siedenden alkoholischen Extrakt mit Kalkwasser fällt und den Niederschlag mit Salzsäure behandelt. Von Verdeil rührt die Hypothese von der Verwandtschaft des Blut- und des Blattfarbstoffs her; nach ihm soll nämlich das Chlorophyll dem Blutfarbstoff sehr ähnlich sein und wie dieser eine bedeutende Menge Eisen enthalten. Der Eisengehalt ist dann *) Ann. d. Chem. 27, 296 (1838]. 2) Journ. f. prakt. Chem. 33, 478 [1844]. s) Ann. des Sc. nat. (Botan.) [3] 13, 160 [1849]. 4) Compt. rend. 33, 689 [1851]. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. I 2 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. lange Zeit, auch noch in den Arbeiten von E. Schunck1), an- genommen worden. E. Fremy s2) Untersuchungen haben das Verhältnis der grünen zu den gelben Pigmenten der Blätter berührt. Bei der Einwirkung von Salzsäure und Äther auf den Abdampfrückstand eines Ex- traktes verteilte sich der Farbstoff zwischen einer gelben ätherischen Schicht, nach Fr6my „Phylloxanthin“ enthaltend, und einer blauen saueren Lösung von „Phyllocyanin“. In den beiden Schichten nahm Fremy zwei Komponenten des Blattfarbstoffs an; sie sollten das Chlorophyll bilden, verbunden zu einer Art von farbigem Fett, worin Phylloxanthin das Glycerin verträte, Phyllocyanin die Fettsäure. Später änderte Fremy seine Ansicht, er betrachtete dann das Chlorophyll als ein Gemisch aus diesen Komponenten, von indifferentem Phylloxanthin mit dem Kaliumsalz der Säure Phyllocyanin. Erst nach einer langen Unterbrechung folgen die Unter- suchungen von F. Hoppe-Seyler3), welche Verdeils Parallele zwischen Blut- und Blattfarbstoff vertieften und F re m ys Vergleich mit dem Fett zur Lecithinhypothese des Chlorophylls weiterent- wickelt haben. Diese Arbeiten bilden mit den fast gleichzeitigen von A. Gautier4 *) und von A. Tschirch6) und dennachfolgen- den von E. Schunck und L. Marchlewski6) und denen von W. N. Hartley7) eine Periode in der Untersuchung des Blatt- grüns, deren Ergebnisse geschichtliches Interesse beanspruchen. Die Methoden der Behandlung des Farbstoffs werden schonender. Die Frage, ob Säuren und Alkalien zersetzend wirken und welche Veränderungen sie herbeiführen, wird gepiüft, allerdings noch U Proc. Roy. Soc. 50, 308 [1891]. . , , ro *) Compt. rend. 50, 405 [1860], 61, 188 [1865]; Ann. de chim. et de phys. Ul 7 78 [1866] ; Compt. rend. 84, 983 [1877]. 3) Zeitschr. f. physiol.Chem. 3, 339 [1879]; 4, 193 [1880]; 5, 75 [1881]. Compt. rend. 89, 861 [1879]. , 6) Untersuchungen über das Chlorophyll, Berlin 1884; Ber. d. deutsch. botan. vollständig referiert in den drei Monographien von L. Marchlewski: Die Chemie des Chiorophyüs, Hamburg r 895; Artikel „Chlorophyll" in Roscoe - Schorlemmer - Bruhl 8, 848 [1901], Die Chemie der Chlorophylle, Braunschweig 1909. i) Journ. Chem. Soc. 59, 106 [1891] und 85, 1607 [1904]- Theoretische Einleitung. 3 nicht richtig beantwortet. Die chemische Untersuchung tritt mehr und mehr in Abhängigkeit von der spektralanalytischen Methode, deren Nutzen weit überschätzt wird; sie hat nicht vor schweren Irrtümem geschützt. Manche bedeutende Veränderung des Chloro- phylls und seiner Derivate ist nämlich ohne Einfluß auf das Ab- sorptionsspektrum, während andererseits gewisse konstitutionell geringfügige Änderungen unverhältnismäßig große Änderungen im Spektrum hervorrufen. Ein einziges Resultat aus den Arbeiten jener Zeit ist bleibend: die Erkenntnis einer gewissen Verwandtschaft zwischen Hämin und Chlorophyll, die freilich weniger nahe ist, als man immer an- nahm, und die in ihrer Bedeutung überschätzt wurde. Hoppe - Seyler hat im J ahre 1879 Chlorophyll zu isolieren ver- sucht und dabei energische Mittel, überhaupt chemische Reagenzien vermieden; unabhängig von ihm hat A. Gautier das Nämliche angestrebt. Das ist, wie wir heute wissen, der richtige Weg, aber die Ausführung des Versuches war nicht erfolgreich. Hoppe - Seyler extrahierte frisches Gras mit siedendem Alkohol; aus dem eingedunsteten Extrakt ist durch eine Folge von Trennungs- und Reinigungsoperationen ein krystallinisches Präparat, das Chloro- phyllan, von olivgrüner Farbe in Lösung, hervorgegangen. Die erhaltenen Präparate waren nicht etwa unreines Chlorophyll, sondern sie waren überhaupt kein Chlorophyll mehr. Der Farbstoff hatte duch die Pflanzensäuren des Extraktes und das Erwärmen in alkoholischer Lösung gelitten, von Beimischungen war er nicht frei. Daher konnte die Analyse einen Phosphorgehalt von 1,4% ergeben und zu der Vermutung führen, Chlorophyll zähle zu den Lecithinen. Die von Hoppe - Seyler vorsichtig geäußerte Hypo- these wird bis zum heutigen Tage von J. Stoklasa1) heftig ver- fochten, der im Chlorophyll Phosphor und Kalium findet und zwar noch mehr Phosphor als im Lecithin. Die Analyse des Chlorophyllans war also ohne Nutzen, aber von bleibender Bedeutung ist eine Reaktion, die Hoppe-Seyler mit der Substanz vornahm. Bei dem Erhitzen mit Alkalien auf 9 Ber. d. deutsch, botan. Ges. 26, 69 [1907] und 27, 10 [1909]; Mitt. d. Kalisyndikates IV, 73 und 85 [1908]. 4 R. Wülstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. hohe Temperatur beobachtete er seine Umwandlung in einen purpurroten Farbstoff, den er Dichromatinsäure nannte. Er fand ihn sehr zersetzlich; so erklärte er die von Salzsäure bewirkte Farbänderung als die Folge einer Zersetzung. Das mit Säure entstehende Derivat erinnerte ihn in seinen optischen Merkmalen auffallend an Hämatoporphin, das er aus Hämin mit konzentrierter Schwefelsäure erhalten hatte; das Chlorophyllderivat nannte er daher Phylloporphyrin. Dies ist die Beobachtung, mit der Hoppe- Seyler einen gewissen Zusammenhang zwischen Chlorophyll und Hämin im molekularen Bau experimentell festgestellt hat; mit Unrecht wird die Entdeckung meistens den späteren Autoren zugeschrieben. Die Beziehung hat in Hoppe-Seylers Nomen- klatur einen bleibenden Ausdruck erhalten. Seinem Verdienste tut es keinen Abbruch, daß er das Mißgeschick hatte, bei der Analyse der Dichromatinsäure den Stickstoffgehalt zu über- sehen. Die Analyse ist von Schunck und Marchlewski richtig- gestellt, indessen die Beobachtungen von Hoppe -Seyler über die Dichromatinsäure sind in der Folge nicht klargelegt worden. Gemäß ihrer Farbe und Fluorescenz enthält wohl die Dichromatin- säure komplexes Metall; der Farbwechsel der in der Tat zersetz- lichen Substanz mit Säure beruht nicht einfach auf Bildung eines Salzes, wie angenommen worden ist, sondern auf der Eliminierung des komplexen Metalls, also auf Porphyrinbildung. Das Ausgangs- material für den Versuch muß also noch Magnesium enthalten haben. Natürlich war das Produkt nicht entfernt einheitlich oder rein; aber es lagen in der Dichromatinsäure schon Phylline vor, in dem Phylloporphyrin die entsprechende magnesiumfreie Sub- stanz. Die Porphyrine aus dem Chlorophyll und dem Hämin waren also einander ähnlich, aber durchaus nicht identisch. Bis in die letzte Zeit hat man noch keine identischen Produkte bei dem Abbau beider Pigmente erhalten, außer bei tiefgreifender Spaltung des Farbstoffs, bei der Reduktion und der Oxydation. Nachdem M. Nencki und J. Zaleski1) durch reduktive Spaltung mit Jodwasserstoff und Jod- i) Ber. d. deutsch, ehern. Ges. 34. 997 [I901]- Theoretische Einleitung. 5 phosphonium aus Hämin Hämopyrrol erhalten hatten, beobachteten M. Nencki und L. Marchlewski1) Hämopyrrol auch bei der Reduktion von sog. Phyllocyaninkupferacetat. Wie daraus hervor- ging, bestehen die Moleküle von Hämatoporphyrin und Phyllo- porphyrin aus denselben oder aus nahe verwandten Bausteinen. Freilich ist die Zusammensetzung des Hämopyrrols viel weniger einfach, als man lange Zeit annahm. Es ist keine einheitliche Base; Willstätter und Asahina2) haben gezeigt, daß es aus einem Gemisch von Pyrrolhomologen besteht, worin ein tetrasub- stituiertes Pyrrol (Phyllopyrrol) enthalten ist und worin tnsub- stituierte Pyrrole überwiegen. Aus den Beziehungen zwischen den Porphyrinen hat Nencki3) biologische Folgerungen zu ziehen versucht. Die Verwandtschaft der für den Lebensprozeß wichtigen Pigmente sollte uns einen Einblick in die entfernteste Vergangenheit der Entwicklung or- ganischer Wesen gestatten und auf die Stammverwandtschaft dei pflanzlichen und tierischen Organismen hinweisen. Die Folgerung ging über die experimentellen Grundlagen weit hinaus und war verfrüht. Das Unterscheidende in der molekularen Struktur von Chlorophyll und Hämin ist erst später zutage getreten, es ist ent- sprechend der ganz verschiedenen Funktion beider Pigmente viel tiefergreifend als die konstitutionelle Verwandtschaft. Nach Hoppe-Seyler hatten die chemischen Arbeiten nicht mehr die Isolierung des Chlorophylls in Substanz und seine Analyse zum Ziele. Die zahlreichen Untersuchungen von E. Schunck allein und von Schunck und L. Marchlewski4) betrafen die bei der Einwirkung von Alkalien und Säuren auf alkoholische Blätterauszüge entstehenden Spaltungsprodukte Phylloxanthin, Phyllocyanin, Phyllotaonin u. a. Der genetische Zusammenhang dieser Verbindungen mit dem Chlorophyll ist nicht ermittelt und über ihre Zusammensetzung sind fast keine Angaben veröffent- licht worden. Das durch Säure gebildete Phylloxanthin gab Asche, x) Ber. d. deutsch, chem. Ges. 34, 1687 [1901]. 2) Abh. XVIII. ®) Ber. d. deutsch, chem. Ges. 29, 2877 [1896]. 4) Siehe die Fußnote 6 auf S. 2. 6 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. die als integrierenden Bestandteil Eisen aufwies; die mit Alkalien erhaltenen Abbauprodukte waren frei von Mineralbestandteilen. Gerade umgekehrt finden wir heute beim Abbau von Chlorophyll mit Säure aschefreie Substanzen, mit Alkalien hingegen die Deri- vate mit einem eigentümlichen und wesentlichen Mineralbestandteil. In allen Untersuchungen jener Zeit ist für das Chlorophyll kein chemisches Merkmal festgestellt worden, mit welchem es möglich gewesen wäre, das Pigment aus verschiedenen Pflanzen zu vergleichen; daher konnten die Ansichten über Identität oder Verschiedenheit des Farbstoffs in verschiedenen Pflanzen weit auseinandergehen. So stellte A. Gautier1) den Satz auf, daß das Chlorophyll verschieden sei in Mono- und in Dicotyledonen, und A. Etard2) publizierte im Jahre 1906 in einem viel beachteten Buche über eine große Reihe von ganz verschiedenen Chlorophyllen aus einer Pflanze und eine unbegrenzte Zahl von Chlorophyllen verschiedener Herkunft. Auf die gar nicht geradlinige Entwicklung unserer Kenntnis vom Chlorophyll haben wertvolle Beobachtungen von Natur- forschern, denen die Anwendung chemischer Methoden ferne lag, keinen Einfluß ausgeübt. Die chemische Literatur nahm die Angaben und Anregungen eines großen Physikers und die von Botanikern nicht auf oder behandelte sie geringschätzig. So sind die wichtigen Andeutungen über die Existenz zweier Komponenten des Chlorophylls, die sich in optischen Abhandlungen von G. G. Stokes3) finden, nicht auf fruchtbaren Boden gefallen und die reizvollen mikroskopischen Beobachtungen von J.Borodin4 *) haben nicht der Analyse den Weg gewiesen. J.Borodin sah unter gewissen Bedingungen, nämlich beim Eintrocknen mit Alkohol befeuchteter Blattschnitte, Kry stalle ent- stehen, die entweder von Chlorophyll oder einem Chlorophyll- derivat herrührten. N. A. Monteverde6) hat diese Untersuchung 1) Compt. rend. 120, 355 tl895l und nochmals Bull. Soc. China. [4] 5. 319 [1909]. 2) La Biochimie et les Chlorophylles, Paris 1906. ») Proc. Roy. Soc. 13, 144 [1864] und Journ. Chem. Soc. 17, 3°4 Ll864J- 4) Bot. Ztg. 40, 608 [1882]. *) Act. Horti Petropol. 13, Nr. 123 [1893]. Theoretische Einleitung. 7 fortgesetzt und solche Krystalle sogar im kleinen schon isoliert und spektroskopisch gekennzeichnet. Diese Entdeckung blieb nutzlos bis sie ein zweites Mal im chemischen Laboratorium ge- macht wurde. Im Jahre 1907 haben Willstätter und Benz»), in großem Maßstab arbeitend, das „krystallisierte Chlorophyll gewonnen, zu einer Zeit, da die Analyse des Chlorophylls schon mit indirekten Methoden vollendet war. Noch vor wenigen Jahren war also das Chlorophyll m Sub- stanz unbekannt und es gab noch keine Methode, um eine für die chemische Untersuchung brauchbare Lösung des Pigments aus den Blättern zu bereiten. Die ersten Fragen der Analyse harrten der Lösung; es war unentschieden, welche Elemente dem Molekül des Chlorophylls angehören. Nicht viel mehr war festgestellt als die Tatsache, daß Abbauprodukte des Chlorophylls zu den Pyrrolderivaten gehören. Die Isolierung des Chlorophylls anzustreben, erschien zunächst aussichtslos wegen seiner Veränderlichkeit, seiner chemischen In- differenz und wegen der Leichtlöslichkeit des mit so vielen farb- losen und gelben Begleitern verdünnten Farbstoffs. Ohne das Chlorophyll selbst zu untersuchen, haben Willstätter und seine Mitarbeiter die Eigentümlichkeiten seiner Konstitution aus der Betrachtung der Derivate abgeleitet, welche bei der Reaktion mit Säure und mit Alkali entstehen. Wenn man Alkalihydroxyd auf Chlorophyll einwirken läßt, so wird es in Salze von chlorophyllgrüner Farbe verwandelt. Aus dem neutralen Chlorophyll ist eine Säure geworden, die wasser- lösliche Salze bildet. Bei der Reaktion mit Alkalien ist also ohne eine bedeutende optische Änderung eine Komponente hydrolytisch abgespalten worden, welche mit einer sauren Gruppe verbunden war. Auf einen andern Teil des Moleküls richtet sich die gelinde Einwir- kung von Säure, wobei die Chlorophyllfarbe in Oliv umschlägt ; eine salzbildende Gruppe entsteht nicht, die Verseifung wird also dabei vermieden. Daher erreicht man es, bei der Spaltung durch Säure diejenige Komponente des Chlorophylls zu verschonen und im h Abh. VI. 8 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Spaltungsprodukt aufzufinden, welche durch Alkalien abgetrennt wird, und umgekehrt müssen die Alkaliderivate des Farbstoffs noch eine charakteristische Atomgruppe aufweisen, welche von Säuren auffallend leicht zerstört wird. Gemäß diesem leitenden Gedanken1) war es möglich, ehe das Chlorophyll selbst bekannt war, seine Merkmale aus der Analyse der von Säure und Alkali gebildeten Abbauprodukte zu kombinieren — und zwar so voll- ständig, daß die Analyse am Ende gar nichts Neues mehr ergab, als es schließlich gelang, den natürlichen Farbstoff rein darzustellen. Die chlorophyllgrünen Carbonsäuren, die Chlorophylline, welche bei alkalischer Hydrolyse in den alkoholischen Blätterauszügen entstehen, sind zwar sehr zersetzlich, sie ließen sich aber aus dem Gemisch mit anderen Produkten der Verseifung [einigermaßen rein abtrennen. Aus ihrer ätherischen Lösung wurden sie von Dina- triumphosphat aufgenommen und mit Mononatriumphosphat wieder daraus entbunden. Sie erwiesen sich bei der Analyse2) als Magnesium- verbindungen, in denen das Magnesium komplex gebunden ist, also nicht in einem elektrolytisch dissoziierbaren Zustand wie in Magnesiumsalzen, sondern in einer eigentümlichen Bindungsweise und einem Beständigkeitsverhältnis, an dem die Ionenreaktionen des Metalls versagen. Die magnesiumhaltige Gruppe ist zwar sehr em- pfindlich gegen Säure, aber ungemein beständig gegen Alkalien, so daß sie bei tiefgreifenden Umwandlungen der Moleküle, durch die sogar Carboxylgruppen, eine nach der anderen, abgespalten werden, unversehrt bleibt. Daher fand der Nachweis des Magnesiums und seiner Bindungsart sichere Bestätigung durch den Abbau3) der Chlorophylline beim Erhitzen mit konzentrierten alkoholischen Alkalien bis auf 240 °; dabei trat eine Reihe gut krystallisierender farbenprächtiger und intensiv fluorescierender Abbauprodukte mit drei, zwei und schließlich einer Carboxylgruppe auf, die sog. Phylline. Alle diese Verbindungen, von denen eine Anzahl nach ihrer schönen blauen und roten Farbe ihre Namen, wie Glauko- und Rhodophyllin erhalten haben und von denen wir ein Dutzend *) Abh. III. *) Abh. II. 3) Abh. V, VIII, XXII. Theoretische Einleitung. 9 verschiedene im folgenden beschreiben, sind magnesiumhaltige Carbonsäuren. In den hier mitgeteilten Untersuchungen wird der Abbau fortgeführt bis zur carboxylfreien Stammsubstanz, dem Ätiophyllin, dessen Zusammensetzung durch die Formel C3iH34N4Mg ausgedrückt wird. Der Aschegehalt ist hier infolge der Verkleinerung des Moleküls auf 8 % Magnesiumoxyd gestiegen. Die sämtlichen Phylline enthalten auf 4 Atome Stickstoff 1 Atom Magnesium. Die Sauerstoffatome, nämlich die Carboxyl- gruppen, haben keinen Anteil an der Bildung des Metallkomplexes; es sind nur die stickstoffhaltigen Gruppen des Moleküls zur Ver- fügung, um das Magnesium mit Haupt- und Nebenvalenzen zu binden. Diese Vorstellung erhält in Übereinstimmung mit den An- schauungen von A. Werner1) über die Konstitution von komplexen Metallverbindungen und in Analogie mit den von H. Ley2) und von L. Tschugaeff3) erforschten Metallderivaten der Säure- imide, des Biurets und des Dicyandiamidins z. B. von der Formel 0=C— NH HN— C=0 NH >Me< NH hn=c-nh2 h2n-c=nh einen Ausdruck , nach welchem sich in den zwei V alenzen , die an den Stickstoff zweier Pyrrolkerne gebunden sind, die Affinität des Magnesiums nicht erschöpft; durch Partialvalenzen verbindet es sich noch mit zwei anderen Pyrrolstickstoffen zum Komplex. Mg NN NN C31H3, (Ätiophyllin) b Neuere Anschauungen auf dem Gebiete der anorganischen Chemie. 2. Aufl., Braunschweig 1909. 2) Ber. d. deutsch, chem. Ges. 40, 705 [1907]. 8) Ber. d. deutsch, chem. Ges. 40, 1973 [1907]. IO R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. oder ausführlicher: _C/^ _c/N Die sämtlichen Phylline verlieren unter der Einwirkung von Säuren das Magnesium und sie gehen dadurch in mehrbasische und einbasische Carbonsäuren über, die außer den sauren auch charak- teristische basische Eigenschaften aufweisen. Da sie mit dem von Hoppe - Seyler, Tschirch, Schunck und March- lew ski untersuchten, wenn auch noch nicht einheitlich erhaltenen Phylloporphyrin eine natürliche Gruppe bilden, so werden sie als Porphyrine bezeichnet und zwar mit demjenigen Präfixum, das dem entsprechenden Phyllin zukommt. Das Verhalten der beim Abbau entstehenden Phylline gegen Säure belehrt uns über die Reaktion der Säuren auf die Chloro- phyllösung. Dabei erfolgt eine augenfällige Veränderung; die Farbe schlägt in oliv um und die Fluorescenz wird schwächer. Das magnesiumfreie Derivat des Chlorophylls, das wir Phäophy- tin genannt haben, ist ein sehr leicht zugängliches Produkt geworden auf Grund der Entdeckung, daß es bei vorsichtiger Be- handlung von alkoholischen Rohchlorophyllösungen mit Oxal- säure geradezu rein und fast vollständig ausfällt. Somit tritt an die Stelle des umständlichen und wenig ergiebigen Verfahrens, nach welchem Hoppe - Seylers Chlorophyllan als Produkt unbeab- sichtigter Zersetzung des Farbstoffs unter Mitwirkung pflanzlicher Säuren erhalten worden, eine Methode, welche das Chlorophyll in Form eines reinen Derivates abzuscheiden erlaubt. Es läßt sich mit den Hilfsmitteln des Laboratoriums kilogrammweise gewinnen, wofür das Mehl getrockneter Brennesselblätter ein geeignetes Ausgangsmaterial bildet. Das Phäophytin enthält keine Asche und es ist frei von farb- losen und gelben Begleitstoffen; es ist eine wachsartige Substanz ohne saure Eigenschaften und von schwachbasischer Natur. In der Farbe seiner Lösungen ist es ganz verschieden von Chloro- phyll; mit einem Schlage aber wird dieses Spaltungsprodukt dem Theoretische Einleitung. II Chlorophyll wieder ähnlich, sobald man in sein Molekül ein Metall einführt, das komplexe Bindung eingeht. Manche Metalle treten sehr leicht ein, z. B. Kupfer und Zink bei der Einwirkung ihrer essigsauren Salze auf die alkoholische Lösung von Phäophytin. Viel schwieriger war es bei der Säureempfindlichkeit des Komplexes, das Magnesium wieder einzuführen. Dies ist schließlich erreicht worden bei der Einwirkung von Grignard scher Lösung, z. B. von Methylmagnesiumjodid, auf Phäophytin oder auf Por- phyrine. Ein zweites Verfahren, die Einwirkung von Magnesium- oxyd und Alkali in der Hitze, ist zwar für die Rückbildung des Chlorophylls wegen dessen Alkaliunbeständigkeit nicht anwendbai , aber sehr geeignet für die Bildung der Phylline aus Porphyrinen. Das Phäophytin verhält sich bei der Verseifung mit Alkalien wie ein Wachs und liefert dabei neben hochmolekularen stick- stoffhaltigen Säuren mit 34 Kohlenstoffatomen einen stickstoff- freien Alkohol mit zwanzig Kohlenstoffatomen, den Willstätter und Hocheder1) aufgefunden und Phytol genannt haben. Dieses entspricht der Formel C20H39OH, es ist ein ungesättigter primärer Alkohol mit offener Kette von Kohlenstoffatomen. Untersuchungen über seinen Abbau haben es wahrscheinlich gemacht, daß sein Kohlenstoffgerüst stark verzweigt ist; von seiner Struktur mag folgende freilich in ihren Einzelheiten hypothetische Konstitutions- formel ein vorläufiges Bild geben: CH3— CH— CH— CH — CH— CH— CH— CH— C = C-CH2OH I I I I I I I I I ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 ch3 . Es ist nicht unwahrscheinlich, daß Beziehungen bestehen zwischen dem Isopren, dem wohlbekannten Baustein der Terpene und des Kautschuks, und dieser alkoholischen Komponente des Chlorophylls. Das durch die Säure gebildete Chlorophyllderivat hat also den gesuchten Aufschluß gegeben über die hauptsächliche Änderung, welche die Alkalien an dem Molekül des Chlorophylls bewirken; sie verseifen die Phytolestergruppe. Ihre Wirkung beschränkt sich aber nicht darauf; das Phäophytin, folglich das Chlorophyll, x) Abh. III. 12 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. enthält nämlich ferner eine Gruppe — COOCH3, die an zweiter Stelle der Hydrolyse anheimfällt. Außer der Änderung der zwei Estergruppen erfolgt bei der Einwirkung der Alkalien noch eine eigentümliche Umwandlung, die sich durch einen merkwürdigen Farbumschlag verrät, durch die sogenannte braune Phase. Die Lösung von Phäophytin wie von Chlorophyll wird beim Versetzen mit methylalkoholischem Kali intensiv braun, dann kehrt in einigen Minuten die uisprün gliche Farbe der Flüssigkeit zurück. Beim Stehen in alkoholischer Lösung unterliegt das Chlorophyll leicht einer Änderung, bei welcher ihm dieses Merkmal der braunen Phase verloren geht. Das Phytol tritt konstant als Komponente des Chlorophylls auf und es macht ein Drittel des Moleküls aus. Diese Erkenntnis hat sich nicht geraden Weges bei der Verarbeitung verschiedener Pflanzen ergeben. Anfangs zeigten die Phäophytinpräparate ver- schiedener Herkunft erhebliche Schwankungen. Der Phytolgehalt überschritt nie 33 Prozent, blieb aber nicht selten darunter und sank in manchen Fällen bis auf Null. Nun erweisen sich gerade die Pflanzen mit scheinbar phytolarmem Chlorophyll als ausgezeichnetes Ma- terial zur Isolierung des Chlorophylls in der Form wunderschöner Krystalle , derselben, die in mikroskopischen Blattschnitten Bor odin schon im Jahre 1881 beobachtet hatte. Monteverde hatte in seiner spektroskopischen Untersuchung dieses krystallisierte Chlorophyll für das natürliche Pigment erklärt und amorphes Chlorophyll als ein Zersetzungsprodukt betrachtet. Diese Ansicht war nicht länger aufrecht zu erhalten. Das krystalli- sierte Chlorophyll ist phytolfrei, es erweist sich als ein Abkömmling des natürlichen phytolhaltigen Pigmentes, das seinem Gehalt an dem hochmolekularen Alkohol die Leichtlöslichkeit und mehr wachsähnliche Beschaffenheit verdankt. Die Gewinnung des krystallisierten Chlorophylls in präparativem Maßstab und seine Untersuchung war von besonderem Wert, bis es gelang, den natürlichen Farbstoff selbst in reinem Zustand ab- zuscheiden. Die Bildung der krystallisierten Verbindung und das damit Hand in Hand gehende Fehlen des Phytols hat in den letzten Theoretische Einleitung. 13 Jahren seine Erklärung gefunden auf Grund unserer Beobachtung, daß bei raschem Extrahieren mancher Blätter der Phytolgehalt normal, aber bei langsamem Extrahieren zu niedrig wird, also bei längerer Berührung des Extraktes mit dem Mehle getrockneter Blätter. Das Chlorophyll wird in den grünen Pflanzenteilen von einem zu den Esterasen zählenden Enzym, der Chlorophyllase, begleitet, die nicht, wie man von den Enzymen im allgemeinen angenommen hatte, in alkoholischen Medien unwirksam ist, die vielmehr die Verdrängung des Phytols durch den als Lösungs- mittel angewandten Alkohol veranlaßt, also eine Alkoholyse des Chlorophylls bewirkt. Das Enzym ist sehr verbreitet, aber seine Menge scheint in weiten Grenzen zu schwanken. Nachdem einmal die Dynamik dieser Enzymreaktion genügend studiert war, ist von den Wirkungen der Chlorophyllase in ausgedehntem Maße zu präparativen Zwecken Anwendung gemacht worden. Die Bildung des „krystallisierten Chlorophylls“ hat nichts Zufälliges mehr. Aus frischen wie aus getrockneten Blättern läßt sich fast das ge- samte Chlorophyll in Form der Äthyl- oder Methylverbindung (Äthyl- oder Methychlorophyllid) abscheiden oder durch Hydrolyse in Form der entsprechenden freien Carbonsäure, des Chlorophyllids. Umgekehrt gelingt uns auch die partielle Synthese des Chloro- phylls aus den zwei Komponenten, nämlich aus Chlorophyllid mit dem Alkohol Phytol durch Esterifizierung unter der kata- lytischen Wirkung der Chlorophyllase. Die üblichen Methoden der Esterbildung würden in diesem Falle wegen der Empfindlich- keit des Chlorophylls versagen. Da das Phäophytin die für die Untersuchung geeignetste Form des Chlorophylls ist, auch für den Vergleich des Blattfarbstoffes aus den verschiedenen Pflanzen, so setzt die Beschreibung des Chlorophylls außer der Bestimmung des Magnesiums und des Phytols vor allem die Kenntnis der stickstoffhaltigen Carbonsäuren voraus, welche neben dem Phytol bei der Verseifung von Phä- ophytin auftreten. Dieses ist zwar reine Chlorophyllsubstanz, aber keine einheitliche Verbindung; seine saure Komponente setzt sich aus verschieden basischen, verschieden farbigen Verbindungen zusammen. 14 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Anfangs hat die Untersuchung zu einer großen Zahl solcher Spaltungsprodukte geführt, welche zwei Gruppen bilden : die einen, Phytochlorine, sind in indifferenter Lösung olivgrün, die anderen, Phytorhodine, prächtig rot. Wegen ihrer großen Zahl sind die ein- zelnen Verbindungen mit den Gruppennamen und zugefügten Buchstaben bezeichnet worden. Es wäre kaum gelungen, in die Gemische von verwirrender Zusammensetzung, denen man bei den ersten Umwandlungen des Chlorophylls begegnete, Klarheit zu bringen, wenn uns nicht die basische Natur der Abbauprodukte in ihrer ungewöhnlichen Diffe- renzierung eine Methode zur Bestimmung und Trennung der Chloro- phyllderivate in die Hand gegeben hätte, die in keinem Falle versagt hat. Die von Willstätter und Mieg geschaffene Methode1) beruht auf der verschiedenen Verteilung dieser Farbstoffe zwischen Äther und verdünnten Salzsäuren. Ein Chlorophyllderivat wird gekenn- zeichnet durch die Konzentration der Säure („Salzsäurezahl ), die erforderlich ist, um die Substanz aus Äther auszuziehen. Das Ver- hältnis, in welchem sich diese Basen zwischen Äther und ver- dünnten Säuren verteilen, verändert sich ungewöhnlich stark mit der Säurekonzentration. Die in Gemischen auf tretenden Verbindungen werden daher durch Fraktionierung ihrer ätheri- schen Lösung mit Salzsäure von verschiedenem Prozentgehalt ge- trennt. Mit diesem Mittel ist es gelungen, aus Phäophytin die Phytochlorine und Phytorhodine in größerer Zahl rein darzustellen. Das Auftreten der komplizierten Gemische war aber nur eine Folge gewisser Umwandlungen, denen das in alkoholischer Lösung sehr veränderliche Chlorophyll unter den Versuchsbedingungen an- heimfiel, z. B. bei zu langsamem Extrahieren und bei zu langsamem Ausfällen mit Säure. Die Vorbehandlung des Pflanzenmaterials und namentlich seine Extraktion und die Behandlung der Extrakte mit Säure war zu verbessern und gleichmäßiger zu gestalten. Dadurch, daß wir die Ursachen der in Lösungen auftretenden Veränderungen auf suchten und sie zu vermeiden lernten, sind die Unterschiede zwischen unseren Präparaten seltener und gering- fügiger geworden und es ist schließlich gelungen, auf dem Wege i) Abh. I. Theoretische Einleitung. 15 über Phäophytin ausschließlich zwei gut krystallisierende und charakteristische Spaltungsprodukte zu erhalten : Phytochlorin e von der Zusammensetzung C34H3405N4 und Phytorhodin g von der Zusammensetzung ^34^-340 7N 4 . Das Phytochlorin e ist eine Tricarbonsäure mit zwei freien Carboxylgruppen und einer als Lactam gebundenen. Das Phyt rhodin g ist eine Tetracarbonsäure, von deren Carboxylen sich nur zwei oder drei in freiem Zustand befinden. Das gemeinsame Auftreten eines grünen und eines roten Spal- tungsproduktes bei der aufeinanderfolgenden Hydrolyse des Chlorophylls durch Säure und Alkali stellte eine wichtige Frage. Ist es bedingt durch den Zerfall eines größeren Moleküls in zwei Bruchstücke? Dem steht entgegen, daß wir für Phäophytin das Molekulargewicht von ähnlicher Größe finden wie für Phytochlorin und Phytorhodin. Dann wäre es denkbar, daß eines der Spaltungs- produkte einen früheren, das andere einen folgenden Zustand des Abbaus darstellt. Allein Phytochlorin und Phytorhodin lassen sich nicht ineinander überführen, auch entstehen sie in ganz bestimmten Gewichtsverhältnissen. Es ist vielmehr aus der Bildung des Phytochlorins e und des Phytorhodins g hervorgegangen, daß das Phäophytin, mithin auch das Chlorophyll, ein Gemisch aus zwei Komponenten ist, von welchen die eine das Phytochlorin e beim Abbau liefert, die andere das Phytorhodin g. Daraufhin haben wir die Auflösung des Komponentengemisches mit physikalischen und mit chemischen Mitteln erzielt. Der eine Weg, der bei Chlorophyllösungen, bei krystallisiertem Chlorophyll und bei Phäophytin Anwendung findet, besteht in der Verschiebung des gegebenen Komponentenverhältnisses durch ungleiche Verteilung des Farbstoffgemisches zwischen mehreren miteinander nicht mischbaren Lösungsmitteln, z. B. wasserhaltigem Holzgeist und Petroläther oder bei den schwerlöslichen phytol- freien Verbindungen Methylalkohol mit Äther-Petroläther. Die Verschiebung des Komponentenverhältnisses durch zahlreiche Wiederholungen der Operation läßt sich steigern und so ausnützen, daß schließlich die beiden Komponenten von magnesiumhaltigen oder magnesiumfreien Farbstoffen in reinem Zustand vorliegen. l6 R. Willstätter und A, Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die andere Methode, die freilich nur bei den magnesiumfreien Verbindungen anwendbar ist, besteht in der Fraktionierung mit Salzsäure nach dem Verfahren von Willstätter und Mieg. Das Phäophytin ist so schwachbasisch und empfindlich in seiner Phytolestergruppe gegen hydrolytische Mittel, daß es nicht nahe lag und besondere Hindernisse bot, diese Trennung auszuführen. Sie hat dennoch zum Ziele geführt und die Ergebnisse der Ent- mischungsmethode bestätigt. Mit diesen Feststellungen wird jene Vermutung bestätigt, die schon im Jahre 1864 der englische Physiker Stokes1) geäußert hat, leider nur mit ein paar kurzen Worten. Stokes hat spektroskopisch das Chlorophyll als ein Gemisch erkannt und er hat es durch Ver- teilung zwischen Alkohol und Schwefelkohlenstoff zu scheiden versucht, also den Grund gelegt zu dem Verfahren der Entmischung, das nachher H. C. Sorby2) und G. Kraus3) weiter ausgebildet haben. Man hat es zumeist angewandt, um zu zeigen, daß gelbe Pigmente den grünen Farbstoff begleiten. In neuerer Zeit hat der Botaniker M. Tswett4) in Warschau die Ansicht von Stokes auf originellem Wege bestätigt, nämlich durch eine Trennung des natürlichen Pigmentes in analytischem Maßstabe mittels fraktionierter Adsorption aus seinen Lösungen. Während es aber bisher schlechterdings unmöglich war, zu prüfen, ob nicht bei der Extraktion und bei den Trennungsoperationen erst Änderungen, vielleicht Spaltungen des Farbstoffes erfolgt sind, ermöglicht jetzt der Abbau zu den typischen Spaltungsprodukten den Nachweis des unveränderten Farbstoffkernes. Zwischen der lange Zeit fast ver- gessenen Angabe von Stokes und vielen entgegenstehenden An- schauungen, wie den Angaben von Etard über die unendliche Variabilität des Chlorophylls, kann jetzt erst die Entscheidung erbracht werden, da die chemischen Merkmale des Blattgrüns genügend festgestellt sind. So ist die chemische Kennzeichnung des Chlorophylls die Voraussetzung gewesen, um das Pigment !) 1. C. *) Proc. Roy. Soc. 21, 442 [1873]. , »j Zur Kenntnis der Chlorophyllfarbstoffe und ihrer Verwandten. Stuttgart 1872. „ r 4) Ber. d. deutsch, botan. Ges. 24, 316, 385 [190b). Theoretische Einleitung. 17 in unversehrtem und reinem Zustand als Gemisch seiner Kompo- nenten (a und b) zu isolieren und durch seine Analyse die Folge- rungen zu bestätigen, welche wir zuvor aus der Untersuchung seiner Derivate gezogen haben. Chlorophyll in Substanz entspricht folgenden Merkmalen, die sich aus dem Abbau mit Alkali und mit Säure ergeben haben : Es gibt 4,5% Asche von reiner Magnesia. Bei der Verseifung durch kurzes Kochen mit methylalkoholischer Kalilauge liefern Chlorophyll und Phäophytin das normale Gemisch von Phytochlorin e und Phytorhodin g ; daneben wird ein Drittel von Gewicht an Phytol frei, einem farblosen öle. Der Farbstoff ent- hält keine gelben Pigmente mehr, man würde sie beim Ausäthern nach dieser Verseifung bemerken. Führt man die Einwirkung von Alkali vorsichtig in der Kälte aus, so muß die braune Phase auf treten, bei der reinen Komponente a ein Farbumschlag in Gelb, bei Chlorophyll b in Rot. Endlich ist der spektroskopische Vergleich des Chlorophylls mit einem frischen Blätterauszug zu erwähnen; bei beginnender Zersetzung des Chlorophylls nimmt die Absorption in der grünen Region auffallend zu. Die Lösung der präparativen Aufgaben wird durch neue Me- thoden des Extrahierens gefördert, die in dieser Abhandlung ver- öffentlicht werden sollen. Das Material für die Arbeiten in größerem Maßstabe sind ge- trocknete und zerkleinerte Blätter. Es hat sich gezeigt, daß ein gewisser Wassergehalt der Lösungsmittel das Ausziehen des ge- samten Blattfarbstoffs wesentlich beschleunigt. Die Pigmente be- finden sich in den Chloroplasten auch nach dem Trocknen in kollo- idalem Zustand und sind in diesem schwer löslich ; sie werden durch ein Lösungsmittel, welches Salze aus der Blattsubstanz auflöst, ausgeflockt und dadurch leichter löslich gemacht. Zur Isolierung wird das Chlorophyll aus den Extrakten in Petroläther über- geführt. Die große Menge von Beimischungen, die dem Chloro- phyll in das wasserhaltige Lösungsmittel folgen und sein Aus- ziehen erleichtern, wirken auf den Reinheitsgrad der petrol- Wlllstät ter-S toll , Chlorophyll. 2 18 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. ätherischen Farbstofflösung weit weniger ungünstig als die Begleitstoffe des Chlorophylls in Alkohol oder Acetonextrakten von geringem Wassergehalt. Die Isolierung des Chlorophylls, die Willstätter und H u g1) vor zwei Jahren gelungen ist, beruht auf der kolorimetrischen Bestim- mung des Reinheitsgrades seiner Lösungen und auf ihrer syste- matischen Steigerung durch Entmischungsmethoden. Die Ver- teilung der in den Extrakten enthaltenen Stoffe zwischen mehreren Lösungsmitteln wird in besonderer Weise hier angewandt, um die gelben und noch mehr um die farblosen Begleiter des Chlorophylls abzutrennen. Aus Extrakten, die infolge der großen Menge von farb- losen Begleitstoffen nur 8 — iöprozentiges Chlorophyll enthalten, gehen Lösungen von etwa 70 prozentigem Chlorophyll durch die Entmischungsoperationen hervor. Dann endlich verhilft eine unerwartete Beobachtung zur Lösung der Aufgabe. Wenn das Chlorophyll einen gewissen Reinheitsgrad erreicht hat, so ist es zwar noch in alkoholhaltigem Petroläther leicht löslich, aber überraschenderweise nicht mehr in reinem Petroläther. Entfernt man durch Waschen den Äthyl- oder Methylalkohol, so scheidet sich das Chlorophyll aus und es kann durch Umfällen aus Äther mit Petroläther gereinigt werden. Anfangs war dieses Verfahren mühsam und die Ausbeute gering. Beim Arbeiten nach unserer neuen Extraktionsmethode mit wasser- haltigem Aceton ließ sich aber das Verfahren so vervollkommnen, daß wir jetzt ohne viel Mühe aus einigen Kilogrammen Brennessel- mehl das reine Chlorophyll in wenigen Stunden isolieren mit einer Ausbeute von gegen 80% der gesamten Menge, nämlich etwa 6,5 g aus einem kg trockener Blätter. Das Verfahren läßt sich auf frische Blätter übertragen und wie im ganzen Verlauf der Arbeiten, so ergibt sich auch bei der Dar- stellung der Chlorophyllpräparate und in ihren Eigenschaften kein Unterschied zwischen frisch gepflückten und getrockneten Blättern. In einer Vorlesungsstunde kann man aus einem Viertel- kilogramm frischer Brennesseln ein Viertelgramm reines Chloro- l) Abh. XV. Theoretische Einleitung. 19 phyll isolieren; mit mehr Zeitaufwand verarbeitet man auf einmal 2i/2 kg frischer Blätter und gewinnt daraus 4 g Chlorophyll, d. 1. etwa 4/s von ihrem Chlorophyllgehalt. Wir unterscheiden zwischen Methoden zur Darstellung von Chlorophyll in reinem Zustand und zur Gewinnung von Roh- produkten, die sich als Ausgangsmaterial eignen. Solche Roh- produkte, 90-95% Chlorophyll enthaltend, werden durch An- wendung der Extraktion mit wasserhaltigem Aceton leicht zugang- lich. Der Blattfarbstoff kann also heute mindestens so leicht isoliert werden wie irgendein anderer Pflanzenbestandteil, wie ein Alkaloid oder ein Zucker. Bei der Reindarstellung des Blattgrüns war die Abtrennung der gelben Begleiter, die in den Pflanzen außerordentlich verbreitet und mit dem Chlorophyll in den Chloroplasten vergesellschaftet sind, eine wichtige Aufgabe. Das gemeinsame Vorkommen der gelben Farbstoffe mit den grünen weist auf eine bedeutsame physiologische Rolle dieser Carotinoide hin und hat uns veranlaßt, auch sie in reiner Form darzustellen und sie zu analysieren. Sie sind Nebenprodukte bei der Gewinnung der Chlorophyllpräparate geworden. In jedem grünen Blatt kommen zwei wohlkrystallisierende stickstofffreie Pigmente vor, denen viele Eigenschaften gemeinsam sind, die aber im Verhalten gegen Lösungsmittel differieren und die hiernach von J. Borodin1) und anderen Botanikern unter- schieden worden sind. Eines von diesen Pigmenten ist, wie schon A. Arnaud2) wahrscheinlich gemacht hat, mit dem lange bekannten Carotin der Möhre identisch. Die Analyse von Willstätter und Mieg3) hat ergeben, daß es ein ungesättigter Kohlenwasserstoff von der Formel C40H66 ist. Sein Begleiter, das Xanthophyll, war in Substanz noch unbekannt, trotzdem er in den Blättern der Menge nach über wiegt. Er ist nach seiner Zusammensetzung C40H66O2 x) M61anges biologiques tir6s du Bull, de l’Acad. Imp6r. de St. P6ters- bourg 11, 512 [1883]. 2) Compt. rend. 102, 1119 [1886]; 104, 1293 [1887]; Bull. soc. chim. 48, 64 [1887]. s) Abh. IV. 20 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. als ein Oxyd des Carotins aufzufassen. Der Kohlenwasserstoff ist in Petroläther erheblich löslich, die Sauerstoffverbindung hin- gegen nur in Alkohol. Den beiden gelben Pigmenten ist eine große Affinität zum Sauerstoff eigen, den sie, namentlich in ihren Lösungen, gierig absorbieren. Ein drittes Carotinoid findet sich in den Braunalgen, das Fucoxanthin, über dessen Isolierung und Eigenschaften im folgenden zu berichten ist; wo es vorkommt, tritt die Menge der beiden andern zurück. Die Formel des Fucoxanthins ist C40H64O6, in chemischer Beziehung ist es dem Carotin und Xanthophyll ähnlich, aber es zeichnet sich vor ihnen aus durch die beträchtlich basischen Eigenschaften seiner Sauerstoffatome, durch die Bildung charakteristischer blauer Chorhydrate. Mit der chemischen Kennzeichnung des Chlorophylls und seiner Begleiter sind die Vorbedingungen erfüllt, um das Mengenver- hältnis aller Komponenten des Blattfarbstoffes zu ermitteln und um das Blattgrün in den verschiedensten Pflanzenarten zu ver- gleichen. Das Material für den Vergleich in bezug auf die chemischen Merkmale des Chlorophylls boten über 200 Pflanzen aus zahlreichen Klassen der Kryptogamen und der Phanerogamen. Unsere Methode war die Prüfung des Phäophytins, welches durch rasches Extrahieren der Blätter und rasches Fällen mit Säure abge- schieden wurde, auf seinen Phytolgehalt sowie auf seine basischen Spaltungsprodukte Phytochlorin e und Phytorhodin g und zur Ergänzung der Abbau der Chlorophyllinalkalisalze zu dem krystallisierenden Rhodophyllin, dessen Asche in 7,02% Mag- nesiumoxyd besteht. Unser Ergebnis ist die Identität des Chlorophylls in allen unter- suchten Pflanzen. Wir finden nur ein einziges Blattgrün, bestehend aus den zwei Komponenten a und b von Chlorophyll. Auch in dem quantitativen Verhältnis zwischen diesen beobachten wir eine große Regelmäßigkeit; a überwiegt, auf fast drei Moleküle Chlorophyll a trifft nur ein Molekül von Chlorophyll b. Für diese quantitative Beziehung aber bilden eine Ausnahme die Phäophyceen, in welchen neben dem Chlorophyll a nur eine verschwindend kleine Menge der Komponente b vorkommt. Theoretische Einleitung. 21 Diese Untersuchung des Komponentenverhältnisses worüber wir im Kapitel IV eine ausführliche Mitteilung veröffentlichen e- trifft die zwei grünen sowie die zwei gelben Pigmente der Chloro- plasten. Die ersteren wurden in der Form ihrer Spaltungsprodukte Phytochlorin e und Phytorhodin g durch Fraktionieren mit Salzsaure getrennt und kolorimetrisch bestimmt. Die Carotinoide, vom grünen Farbstoff nach seiner Verseifung mit Lauge abgetrennt, fraktio- nieren wir hingegen durch ihre verschiedene Verteilung zwischen Petroläther und verdünntem Holzgeist, um sie gleichfalls mit einem kolorimetrischen Verfahren quantitativ zu bestimmen. Die Analysen ergaben bisher keine bedeutende Abhängigkeit des Komponentenverhältnisses von äußeren Faktoren, wie von der Jahreszeit, der Tageszeit, der Belichtung, und keinen erheb- lichen Unterschied zwischen dieser und jener Pflanzenart, unter extremen Lebensbedingungen betrugen die Abweichungen von der durchschnittlichen Verhältniszahl nicht mehr als 30% der- selben. Auch das molekulare Verhältnis der grünen zu den gelben Pigmenten ist annähernd konstant, nämlich 3:1, und das Ver- hältnis des Carotins zum Xanthophyll beträgt mit unbedeutenden Schwankungen in Lichtblättern 0,6 : 1. Die Mengen und die Mengenverhältnisse der Farbstoffe soll ein Beispiel der ausgeführten Analysen veranschaulichen. In 1 kg trockener Hollunderblätter (entsprechend 4 kg frischer Blätter) sind enthalten : 8.48 g Chlorophyll, nämlich: 6,22 g Chlorophyll a, 2,26 g Chlorophyll b; 1.48 g Carotinoide, nämlich: 0,55 g Carotin, 0,93 g Xanthophyll. Diese Mengen entsprechen folgendem molekularem Verhält- nisse : Auf 1 Molekül Chlorophyll (a + b) treffen 0,35 Moleküle der Carotinoide. Auf 1 Molekül Chlorophyll a treffen 0,36 Mol. Chlorophyll b. Auf 1 Molekül Carotin treffen 1,61 Mol. Xanthophyll. 22 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Solange nur das Gemisch der Chlorophyllkomponenten als Ausgangsmaterial für den Abbau gedient hat, hat es keine Reaktion gegeben, die zu einem einheitlichen Produkt geführt hätte. Geht selbst aus einer reinen Komponente nicht leicht bei irgendeiner Umwandlung ein einheitliches Produkt hervor, da das komplizierte Molekül verschiedene Angriffspunkte bietet, so treten um so kompli- ziertere Gemische von Reaktionsprodukten durch gleichzeitige Veränderung der beiden Chlorophyllkomponenten auf; erst in den späteren Stufen des Abbaus gelingt es unter genau einzuhalten- den Bedingungen, die zwei ihrer Struktur nach verwandten Kom- ponenten in die nämlichen Derivate umzuwandeln, in Pyrrophyllin und Phyllophyllin. Die Betrachtung der Reaktionen wird daher vereinfacht, wenn wir ihr die einheitlichen Ausgangsstoffe zugrunde legen. Das Chlorophyll besteht aus der blaugrünen Komponente a, die ein in Lösung olivgrünes Phäophytin bildet, und der gelblich grünen Komponente b, deren magnesiumfreies Derivat in in- differenten Lösungen rotbraun ist. Bei der Verteilung zwischen Methylalkohol und Petroläther geht in das sauerstoffhaltige Lösungsmittel mehr von der Komponente b über; es zeigt sich bei der Analyse, daß sie die sauerstoffreichere ist. Die Beziehungen in der Zusammensetzung zwischen den beiden Komponenten werden dadurch etwas verschleiert, daß zahlreiche Verbindungen dieser Gruppe zu Hydratbildung neigen und bald mit, bald ohne Wasser, häufig verbunden mit einem halben Molekül auftreten. Das Material für die Analysen besteht in den Magnesiumver- bindungen und ihren magnesiumfreien Derivaten. Nützlicher als die Phytolverbindungen sind dafür die einfacheren phytolfreien Verbindungen, die Methylderivate und die freien Chlorophyllide und Phäophorbide ; wir nennen so die Säuren, die durch Hydrolyse der Phytolester entstehen und ein mit tx bezeichnetes Carboxyl enthalten. Außerdem ist für die Kenntnis des Unterschieds zwischen den zwei Reihen die Analyse des Phytochlorins e und Phyto- rhodins g von Bedeutung. Es hat sich daraus ergeben, daß die beiden Chlorophyllkompo- nenten nicht nur im Magnesium- und Phytolgehalt übereinstimmen, Theoretische Einleitung. 23 Haß sie auch in der Zusammensetzung des basischen Kernes einander sehr nahe stehen; diese Beziehung wiederholt sich in allen parallelen Stufen des Abbaus. Wir folgern aus den Analysen, daß der Unterschied zwischen der a- und der b-Reihe wahrschein- lich in einem Molekül Sauerstoff besteht, indem zwei Atome Wasserstoff des Chlorophylls a durch 1 Atom Sauerstoff ,m Chloro- phyll b ersetzt sind, entsprechend den Formeln. Chlorophyll a, C55H7205N4Mg, Chlorophyll b, C65H7oO0N4Mg. Diese Annahme ist allerdings nicht bewiesen; wir versuchen mit ihr in vorläufiger Weise die Beziehungen zwischen den beiden Komponenten verständlich zu machen, ohne zu ver kennen, daß es weiterer Untersuchungen bedarf, um unsere Er- klärung zu erhärten und zu vertiefen; dies ist em Ziel künftiger ArbNoch ist nicht eine Komponente zur anderen oxydiert oder die umgekehrte Verwandlung mit Reduktionsmitteln erzielt worden; dennoch sind schon manche Reaktionen bekannt, die für einen einfachen Unterschied in der Oxydationsstufe der zwei Reihen sprechen, z. B. die Einwirkung von Grignardschen Magnesium- verbindungen auf Phytorhodin, wobei durch Addition von Kohlen- wasserstoffen Körper der a- Reihe entstehen. Die Beziehung zwischen den beiden Komponenten in der Zu- sammensetzung und Konstitution ist für die Erklärung einer chemischen Funktion des Chlorophylls bedeutsam. Für eine Vor- stellung davon gibt die analytische Untersuchung einige Anhalts- punkte unter der Voraussetzung, daß die Komponente b ein Oxy- dationsprodukt von a ist. Die Rolle des Magnesiums läßt sich nämlich ähnlich wie m den von Barbier und Grignard entdeckten Organomagnesium- verbindungen denken, die in der organischen Synthese durch ihre Reaktionsfähigkeit eine so große Wichtigkeit erlangt haben. Schon in unserer ersten Mitteilung1) über die Analyse des Chloro- x) Ann. d. Chem. 350, 65 [1906]. 24 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. phylls ist ein Vergleich zwischen diesen and Grignardschen Verbindungen gezogen worden; die Parallele1) schien ungenau zu sein und begegnete Widerspruch, da sie den Unterschied zwischen der Bindung des Metalls an Kohlenstoff in den gewöhnlichen magnesiumorganischen Verbindungen und der Substitution am Stickstoff im Chlorophyll unbeachtet läßt. Indessen halten wir diesen Unterschied weder für scharf noch charakteristisch. Seit unserer Veröffentlichung hat B. Oddo2) wichtige Unter- suchungen über Pyrrolmagnesiumjodid ausgeführt, das mit Kohlen- säure und mit Säurechloriden unter Bildung von a-substituierten Pyrrolen reagiert, von a-Carbopyrrolsäure und Alkylpyrryl- ketonen. Wahrscheinlich entsteht zuerst das N-Magnesium- derivat, das sich weiterhin entweder in die a-Magnesiumverbindung verwandelt oder als solche reagiert. Z. B. N-MgX /\ U ■ r NH MgX NH /ycooMgx Die Pyrrolmagnesiumderivate haben sich also — vergleichbar mit Natracetessigester — verhalten wie irgendwelche Grignard- schen Körper mit Bindung des Metalls am Kohlenstoff. Das Chlorophyll kann zu der nämlichen Klasse magnesium- organischer Verbindungen gerechnet werden und es erscheint nicht berechtigt, zwischen dem Magnesiumphenyljodid, dem Pyrrol- magnesiumjodid und dem Chlorophyll eine scharfe Grenze zu ziehen ; nur zeichnet sich das Chlorophyll infolge der hinzukommenden komplexen Bindung des Metalls durch eine größere Beständigkeit des Magnesiums gegen Wasser vor den gewöhnlichen Organo- magnesium Verbindungen aus. Dieser Vergleich fordert nicht, daß der Farbstoff im Assimi- lationsprozeß die Kohlensäure seinem Moleküle einverleibt; dies kann durch die Substitution in den magnesiumtragenden Pyrrol- kernen verhindert sein. Vielmehr läßt sich die Funktion des Chlorophylls so denken, daß die Kohlensäure durch die Affinität b Siehe dazu V. Grignard, Bull. soc. chim. [4] 13, Nr. 1 1, Beilage [1913]. 2) Gazz. chim. ital. 39, I, 649 [1909] und Ber. d. deutsch, chem. Ges. 43, 1012 [1910]. Theoretische Einleitung. 25 der Magnesiumverbindungen angezogen und daß ihre Reduktion durch die Chlorophyllkomponente a in dem Prozesse bewir wird der die absorbierte Lichtenergie verbraucht. Das Chlorophyll a oxydiert sich dabei zum Chlorophyll b und dieses wird unter Ab- spaltung von Sauerstoff wieder in die erste Komponente zuruckver- wandelt ; zwischen beiden Komponenten stellt sich ein Gleich- ge wichtszustand ein. Es ist entweder möglich, daß diese Abgabe von Sauerstoff aus der Komponente b unmittelbar erfolgt oder daß sich die gelben Pigmente Carotin und Xanthophyll an der Rückverwandlung in das Chlorophyll a beteiligen. Da die Carotinoide konstant in den Chloroplasten die grünen Farbstoffe begleiten, so ist es wahr- scheinlich, daß sie mit ihnen durch eine Funktion verbunden sind. Vielleicht ist es ihre Aufgabe, das Verhältnis der Chloro- phyllkomponenten zu regulieren, etwa in der Weise, daß Carotin dem Chlorophyll b Sauerstoff entzieht und daß dieser aus dem gebildeten Xanthophyll unter der Wirkung eines Enzyms entbunden wird. Die Methode für die Bestimmung der vier Komponenten des Blattgrüns bietet dafür Hilfe, das bei der Assimilation der Kohlen- säure wirksame System vollständiger zu erforschen. Konstitutionsfragen. Die ersten Umwandlungen des Chlorophylls, die für das Bei- spiel der Komponente a an Hand der Formeln erläutert werden sollen, betreffen das mit Phytol verbundene Carboxyl oc. Zu den älteren Methoden des Abbaus mit Säure und Alkali hat sich als dritte die enzymatische Spaltung mittels der Chlorophyllase ge- sellt, durch welche in alkoholischen Lösungen die einfachen Alphyl- chlorophyllide, in wasserhaltigen Medien die freien Chlorophyllide entstehen. Diese Verbindungen sind auf keinem anderen Wege zugänglich. Beim Eliminieren des Magnesiums mit Säure liefern sie Alphylphäophorbide, die aus Phäophytin durch Alkoholyse mit Chlorwasserstoff und Methyl- oder Äthylalkohol erhalten werden können, und die freien Phäophorbide, welche wir aus Phäophytin durch Hydrolyse mit konzentrierter Salzsäure gewinnen. 26 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Chlorophyll a mit verd. Säure Phäophytin a In der b-Reihe verlaufen diese ersten Umwandlungen analog und ergeben folgende Stufen des Abbaus: Chlorophyllid b Phäophorbid b [MgN4C32H2802] COOCHg • COOH -> [N4C32H30O2] COOCH3 • COOH . Komplizierter ist die Einwirkung der Alkalien. Sie greifen zu- erst an derjenigen Stelle an, die bei den anderen Verfahren unver- sehrt blieb, nämlich am dritten in Form einer Lactamgruppe vor- handenen latenten Carboxyl. Aus jeder Chlorophyllkomponente gehen, je nach den Bedingungen der alkalischen Verseifung, zwei in einheitlichem Zustand erhaltene Alkalisalze hervor, von denen je eines wie Chlorophyll selbst fluoresciert, während dem andern die Fluorescenz fehlt. Die Alkaliverbindungen, die bei gelinder Versei- fung in der Kälte vorzugsweise entstehen, Chlorophyllinkalium a und b, gehen beim Austritt des Magnesiums in schwachbasische Phyto- chlorine und Phytorhodine über, welche für die Kennzeichnung und für den Abbau der Chlorophyllkomponenten von verhältnis- mäßig geringer Wichtigkeit sind. Die andern, erst später erhaltenen und daher als Isoverbindungen bezeichneten Chlorophylline, durch rasche Verseifung in der Hitze gebildet, sind die komplexen Magnesiumverbindungen des Phytochlorins e und Phytorhodins g, sie gehen in diese wichtigsten Spaltungsprodukte des Chlorophylls beim Ansäuern über. So ist es, übrigens ziemlich spät, gelungen, durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Alkali und dann mit Theoretische Einleitung. 27 Säure zu denselben Derivaten zu gelangen, wie in umgekehrter Reihenfolge der Prozesse. Chlorophyll a [MgN4C32H30O] COOCH8COOC2„H39 mit Säure Iso-Chlorophyllin [MgN4C32H30O] COOH • COOH- mit Säure Phäophytin a [N4C32H320] COOCH3COOC20H38 & Phytochlorin e -[N4C32H320] COOH- COOH Die Beziehung zwischen Chlorophyll und Isochlorophyllin ist aber nicht so einfach, wie dieses Schema erwarten läßt; von den Alkalien ist nicht allein die Verseifung zweier Estergruppen, sondern zuförderst eine Umwandlung bewirkt worden, die am Auftreten der „braunen Phase“ kenntlich ist. Man wird nur in einer Theorie für diese braune Phase den Schlüssel finden zur Erklärung der ersten Stufen des Abbaus, der Veränderung von Chlorophyll in seinen Lösungen und der Bildung verschiedener Reihen von Chlorophyllinen. Erinnern wir uns, daß bei der Einwirkung von Alkalien auf Chlorophyll und Chlorophyllide die grüne Farbe zuerst in inten- sives Braun, in Gelbbraun bei der Komponente a, in Rot bei b um- schlägt und daß dann in einigen Minuten in den alkalischen Medien die ursprüngliche Chlorophyllfarbe zurückkehrt. Die Reaktion er- weckt den Anschein einer gänzlichen Zersetzung und einer Neu- bildung des Chlorophylls. Sie ist natürlich so zu verstehen, daß eine an dem Chromophoren Komplex wesentlich beteiligte Gruppe durch Hydrolyse verändert und daß an ihrer Stelle eine neue ähnliche gebildet wird. Wir versuchen dieses Verhalten des Chlorophylls als ein „Um- lactamisieren“ zu erklären, als Öffnung eines vorhandenen Lactam- ringes und als Schließen eines neuen, zwar ähnlichen, jedoch alkalibeständigen Ringes. Die Erscheinung ist nicht auf die Magnesiumverbindungen beschränkt. Eine ähnliche braune Phase geben mit Alkali die Phäo- phytine und die Phäophorbide ; das ist der einzige Fall, in welchem die magnesiumhaltigen und die magnesiumfreien Verbindungen 28 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. gleiches Aussehen annehmen. Daher denken wir uns während der braunen Phase den komplexen Zustand des Magnesiums unter- brochen. Aus den Phäophorbiden gehen dabei Phytoclilorine und Phytorhodine hervor; in diesen Spaltungsprodukten wird daher auch ein Carboxyl lactamartig gebunden sein. Viele Beobachtungen stehen damit im Einklang. Die Lactamgruppe des Chlorophylls kann sich nicht allein öffnen, wir können auch die Zurückbildung der ursprünglichen Gruppe herbeiführen. Das geschieht beim Versetzen einer ätheri- schen Chlorophyllösung mit methylalkoholischer Kalilauge, sodann mit Wasser. Die Substanz geht zuerst mit brauner Farbe quanti- tativ in die alkalische Schicht, darauf gelangt sie durch hydro- lytische Dissoziation der Kaliumverbindung unversehrt in den Äther zurück; sie hat keine sauren Eigenschaften angenommen und gibt von neuem die braune Phase. Der ursprüngliche Lactam- ring ist also wenig beständig, doch bildet er sich am leichtesten. Andere Lactamgruppierungen kommen langsamer zustande, sind aber beständiger; umlactamisiertes Chlorophyll wird nicht mehr aufgespalten von Alkalien. Die Bildung eines neuen Lactamringes erfolgt auf mehrere Arten; gerade dadurch erklären sich die verschiedenen Reihen der Chlorophylline und das so schwer zu vermeidende Auftreten der schwachbasischen Phytochlorine und Phytorhodine. Die anfangs vorhandene Gruppe werde bezeichnet: y y NH-CO I I Sie kann sich so umlactamisieren, daß das Carboxyl y in anderer Art mit demselben Stickstoffatom oder mit einer andern Stick- stoffgruppe, sie heiße <5, in Verbindung tritt, oder das Umlactami- sieren erfolgt derart, daß ein anderes Carboxyl, nämlich i > o> 0) N V 1 ÖD Öd S / l Y cd g w ct o w 33 Ci .3 « 33 Ci o u o u rC Ok o mit Alkali m mit Alkali 'S, o u u — « auf 140 u P* o S auf 170^ o s o 2 ä 5 — erhitzt Ö 03 erhitzt 43 +* z CI r> u o 33 w 33 o s o u a o mit Alkali ->■ auf 1900 erhitzt Q< g o "fe * a K * <* A 4> 1 | CO CO ■*» 0 0 >r r 1 ' mit Alkali mit Alkali auf 160° erhitzt Theoretische Einleitung. x ft ^ 01 •d ° 1* mit Alkali W « o o - ö fl 'S x ö eo ä £ * j ■ I mit Alkali, verdünnt e o cj G £ s 3^- b q - 'S r-l -<- Mo hD mit Alkali mit Alkali, kalt O u O r-H fl U .S 'S fl S fl % o K 3 £ b rft mit MgCHsI "C Z, fl m. Alkali, Z £ 0* Ml o i ao M K d o o fl fl » q mit Säure O «, |U >. o fl ° mit ft o o fl G K 60 O o fl ö fl A. fl “ 9* S "fl •£ g a fft ft d* fl >. mit Alkali luf 1700 erhitzt •§, 8 -<■ o ~ tUO .8 .d m. Alkali, r—j Enzym hO sa z 04 °S S .'S -G Po O u O | rG S a z CO o s a n d mit Alkali, heiß mit Alkali x A 8 P< •H ■§ 05 z 0 ft mit Alkali ■< W> c •3 o fl ui o t fl (ft ft CO o u o mit fl -<- 'ft z 00 o o ft CO (I Alkali & 'd i f 33 mit mit ft ■“ q T3 O 3 x 5 ff 2 o :c0 x 6 £ ^ £5 "S g s ft mit K <3 eo o o >> ft oft q ■ fft o Enzym o tJ Vh iX O °? u I a ft o u o q konz. HCl |S Ö CHs0H — HCl -ft * °o ft «0 d "^ft fl O, o cd fl (ft O o 0 •ft 1 ft co d mit Alkali und PyTidln auf 155° erhitzt Willstättcr-S toll, Chlorophyll. 24 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die Decarboxylierung aller Chlorophyilderivate beim Erhitzen mit Alkalien im Autoklaven führt nur bis zu den Monocarbonsäuren, da bei höherer Temperatur Zersetzung erfolgt. Die Abspaltung des letzten Carboxyls ist schließlich nach der klassischen Natronkalk- methode erzielt worden und zwar bei Phyllinen wie Porphyrinen. Sie gelingt am besten durch kurzes Erhitzen sehr kleiner Mengen eines Porphyrins und noch glatter eines Phyllins mit Natronkalk. Auf diese Weise entsteht aus Phylloporpbyrin und Pyrroporphyrin das gleiche Ätioporphyrin, aus den Magnesiumverbindungen das nämliche Ätiophyllin. Es bestätigt sich, daß der Unterschied zwi- schen den isomeren Monocarbonsäuren nur durch den Ort des Carboxyls bedingt ist. Die Stammsubstanzen, krystallisierende Verbindungen, fügen sich dem Gruppenbilde ein, das mit den zahlreichen zuerst unter- suchten Phyllinen und Porphyrinen gezeichnet worden ist. Sie eröffnen neue Möglichkeiten für künftige Untersuchungen über den Abbau. Auch gewinnen sie dadurch Bedeutung, daß mit ihnen nun zum ersten Male aus Blattfarbstoff und dem Blutfarb- stoff identische Umwandlungsprodukte erhalten werden, deren Molekül noch in nahen Beziehungen zu den Farbstoffen selbst steht. Identisch waren bisher nur die Zerfallprodukte von Hämin und Chlorophyll, einfachere Pyrrolderivate, welche die Oxydation und die Reduktion geliefert hat, während die Porphyrine aus beiden Pigmenten manche Ähnlichkeit und manche Unterschiede aufweisen. In einer Untersuchung von Willstätter und M. Fischer, über die wir im folgenden in Kürze und ausführlicher an anderer Stelle berichten werden, ist der Abbau von dem bekannten Hämato- porphyrin, das sechs Sauerstoffatome enthält, bis zur sauerstoff- freien Verbindung durchgeführt worden. Aus dem Hämin gehen Porphyrine hervor, durch ganz andere Reaktionen als aus Chlorophyll, aber nicht etwa auf einfache Weise durch Austritt des Metalls. Hämatoporphyrin ist nämlich eine Dioxysäure. Es gelang, dasselbe beim Erhitzen mit methylalko- holischer Kalilauge und Pyridin zu einem neuen Porphyrin zu redu- zieren, welches wir Hämoporphyrin nennen. Dieses unterscheidet Theoretische Einleitung. 35 sich in seiner Zusammensetzung vom Hämatoporphyrm durch das Minus von zwei Hydroxylgruppen; es enthält vielleicht zwei Atome Wasserstoff weniger als Mesoporphyrin. Das Hämoporphynn steht zufolge der Analyse und seinen Eigenschaften dem Rhodoporphyrin und Erythroporphyrin nahe, gleich diesen läßt es sich beim Erhitzen mit Natronkalk decarboxylieren. Da die Magnesiumverbindungen leichter Kohlensäure abspalten, führen wir in das Hämoporphyrin zunächst Magnesium ein und spalten das Metall aus der carboxyl- freien Verbindung am Ende wieder ab. Das Reaktionsprodukt ist identisch mit dem Ätioporphyrin aus Chlorophyll nach Zusammen- setzung und Eigenschaften, wie dem Spektrum und seiner ba- sischen Natur, die mittels der Verteilung zwischen Äther und Salz- säure quantitativ geprüft wurde. Aus der Zusammensetzung C31H36N4 des Ätioporphyrins geht hervor, daß Hämoporphyrin der Formel C33H3604N4 entspricht, somit das Hämin nicht der allgemein angenommenen Formel C34H3204N4FeCl, sondern der Formel C33H3204N4FeCl. Diese steht in der Tat, worauf wir vor längerer Zeit aufmerksam gemacht haben1), mit dem bedeutenden analytischen Material für Hämin im Einklang. Unabhängig von dem Abbau zum Ätioporphyrin haben wir es auch bei der Analyse einer größeren Zahl von Por- phyrinen aus Hämin sehr wahrscheinlich gefunden, daß die Formeln des Hämins und Hämatoporphyrins in diesem Sinne abzuändern sind. Um für die Struktur der Stammsubstanz Ätioporphyrin einen Ausdruck zu finden, müssen wir die Ergebnisse der Oxydation und Reduktion der verschiedenen Porphyrine berück- sichtigen, die in zwei späteren Kapiteln eingehender angeführt werden. Phylloporphyrin liefert bei der Oxydation mehr als ein Molekül Methyläthylmaleinimid : x) Ann. d. Chem. 358, 212 [1907]. 36 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. und ein Molekül Hämatinsäure : ch3-c-c=o II >NH H02C-CH2-CH2-C-C=0 Bei der Reduktion ergeben die Porphyrine Gemische von Pyr- rolhomologen, worin namentlich enthalten sind: CH3-C— c-ch2-ch3 ii ii CH3-C\/C-CH3 NH Phyllopyrrol ch3-c— c-ch2-ch3 II II ch3-cx/ch NH Isohämopyrrol ch3-c— c-ch2-ch3 II II hcx/c-ch3 NH Kryptopyrrol Das Ätioporphyrin setzt sich mithin aus vier Pyrrolkernen zu- sammen. Die Zahl seiner Wasserstoffatome ist auffallend niedrig, die Pyrrole müssen daher so verbunden und substituiert sein, daß dabei im Vergleich mit einfachen Bindungen acht Atome Wasser- stoff erspart werden, sei es durch Doppelbindungen oder weitere Ringschlüsse. Einigen Vorstellungen hinsichtlich der Art, in der man die Pyrrolkerne verknüpft denken kann, begegnen wir in der Literatur über Hämin. W. Küster1) hat das Gebiet des Butfarbstoffs mit folgender Konstitutionsformel des Hämins: H,C CH. Hämin C31H3204N4FeCl . J) Zeitschr. f. physiol. Chem. 82, 463 [1912]. Theoretische Einleitung. 37 beleuchtet, welche dem Verlauf der Reduktion und Oxydation Rechnung trägt. Sie fordert indessen den Einwand heraus, daß von den beiden mit dem Eisen verbundenen Iminogruppen, nur die eine als saures Imin eines Pyrrols, die andere aber als basische Iminogruppe eines Dihydropyrrols dargestellt wird. Das Unwahr- scheinliche dieser Formel liegt besonders in der Annahme eines aus vier Stickstoffatomen und zwölf Kohlenstoffatomen bestehenden sechszehngliedrigen Ringes : — C=CH — C= I I N -N II I -C C= I I C-H H-C 4 N -N -C— HC==C- Die ersten Umwandlungen eines derart komplizierten Pig- mentes sind so schwer zu enträtseln, daß die Ansichten verschie- dener Forscher weit auseinandergehen. Von O. Piloty1) wird das Hämin auf zwei miteinander verbundene kondensierte Systeme zurückgeführt, die aus Pyrrolen mit Kohlenstoffsechs- und -fünf- ringen bestehen: =CH • C-C II i II =CH • C C \/' NH CH NH _/\ C C— CH= H • C • COOH || 2 || C-C-CHa-CHs C OH und II OH • CO-CH* I HN CH /\ /\ =CH— C C C-C-CH3 II 3 II II 4 II -CH— C— C C CH \/\/ C NH /\ CHa OH l) O. Piloty und E. Dormann, Ann. d. Chem. 388, 313 [1912]. ^8 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Diese Auffassung ist nur unter der Annahme möglich, daß die Cyclopentan- und Cyclohexanringe bei der Reduktion leicht zer- fallen. Das ist wenig wahrscheinlich1). Noch bedeutsamer ist der Widerspruch zwischen den Ergebnissen der Oxydation und dem wesentlichen Inhalt dieser Konstitutionsannahmen. Aus Hämin und seinen Derivaten kann gemäß den Formeln von Pilot y Hämatin- säure nicht hervorgehen. Die tertiären Kohlenstoffatome der bei- den Formeln, zum Beispiel: f NH \c/\c A C\/u\ I /C NH C machen die Bildung des Propionsäurerestes der Hämatinsäure un- möglich; derselbe Einwand ist gegen die Formel der Bilirubin- säure (Bilinsäure) von O. Piloty und S. J. Thannhauser2) zu erheben. Die eigentümlichen Ringgebilde, welche die angeführten For- meln darstellen, ergaben sich aus der Schwierigkeit, die Verei- nigung der Pyrrole zu einem so wasserstoffarmen Moleküle aus- zudrücken. Es ist eben nicht wohl möglich, wenn man die zur Er- klärung der Oxydationsprodukte erforderlichen Äthylgruppen vorsieht, das Ätioporphyrin ohne Annahme eines Kohlenstoff- ringes zu formulieren. Als eine einfache Verknüpfung von vier Pyrrolkernen, von nur zwei salzbildenden und zwei komplexbildenden, zu einem Farbstoff ist uns folgende Formel wahrscheinlich: HC-CH HC-CH II >N N< II HC-C C-CH )c HC=C C=CH | )nh hn<[ HC=CH HC=CH 1) Vgl. H. Fischer und E. Bartholomäus, Zeitschr. f. physiol. Chem. 83. 50 [1912]. 2) Ann. d. Chem. 390, 191 [1912]. Theoretische Einleitung. 39 Lassen wir in diese Grundsubstanz mit Rücksicht auf die Oxydationsprodukte drei Methyl- und drei Äthylgruppen und wegen der Reduktionsprodukte mindestens noch ein Methyl eintreten, so bleibt schließlich für die letzten drei Kohlenstoffatome des Ätioporphyrins nur so viel Wasserstoff übrig, daß entweder zwei Doppelbindungen oder zwei Kohlenstoffringe oder je eines von bei- den angenommen werden muß. Wenn wir entsprechend dem Ver- lauf der Reduktion es vermeiden, einen Cyclopentan- oder hexan- ring anzunehmen, so gelangen wir mit einiger Wahrscheinlichkeit zu folgenden Formeln für Ätioporphyrin und Ätiophyllin: CH=CH ch3-c-ch II *>N c„h5-c-c( C C N\ II XC — CH cf CÄÄN ’>C^ C2H5-C=C ch3-c=c I ch3 Nxc 4/ CH=CH c — c — CH \ - )( >N-Mg-N< =c-c2H5 =c-ch3 ch3 Ätiophyllin C31H34N4Mg . Mehrere Einzelheiten dieser Formel wie die Stellung von zwei Methylen sind willkürlich, auch könnte der Cyclobutenring in /?-/J-Stellung an das Pyrrol angegliedert sein. Die Carboxyle des Phyllo- und Pyrroporphyrins substituieren Äthylgruppen; die Formel ist unsymmetrisch genug, um den be- obachteten Isomerien der sauren Porphyrine zu genügen. Versuchen wir nun, die Beziehung zwischen dem Ätioporphyrin ^.O R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. und dem Hämin klarzulegen, so treten uns die Fragen entgegen, welche die ersten Umwandlungen des Hämins noch stellen. Willstätter und Fritzsche1) haben vor vier Jahren darauf aufmerksam gemacht, daß im Hämin gemäß den Versuchen von M. Nencki und J. Zaleski2) über die Esterbildung zwei freie Carboxyle existieren; dieser Ansicht hat sich mit gründlichen Beweisen W. Küster3) angeschlossen, während O. Piloty an der Annahme festhält, Hämin enthalte die beiden Carboxyle in der Form von Lactamgruppen und die zwei übrigen Sauerstoffatome als Hydroxyle: CH = CH \ CO-CH2 I I N C /\/\ u«n \/\/ C N /\ ch3 oh Indessen stehen mit dieser Lactamformel schon die Analysen der Dialkylester von Nencki und Zaleski, deren Werte Formeln wie C32H3o(COOCH3)2N4FeCl entsprechen, und dann die Oxydation des Di- methylhämins zum Hämatinsäureester nach Küster imWiderspruch. Beim Austritt des Eisens aus dem Hämin erfolgt nach Piloty zugleich die Lösung der angenommenen Lactamgruppen, Häma- toporphyrin wäre danach die eisenfreie, dem Hämin genau ent- sprechende Verbindung. Dem entgegen betrachtet W. Küster zwei Vinylgruppen im Hämin als Angriffsstelle der Reagenzien, z. B. des Bromwasserstoffeisessigs bei der Eliminierung des Eisens, und H. Fischer4) hält es für wahrscheinlich, daß es Doppelbin- dungen zwischen Methingruppen und Pyrrolkernen sind, die Halogenwasserstoff, also mittelbar Wasser aufnehmen. Willstätter und M. Fischer haben Versuche über den Ver- lauf der Hämatoporphyrinbildung angestellt und eine Reihe von Zwischenprodukten aufgefunden, die erkennen lassen, daß zunächst b Ann. d. Chem. 371, 49 [1909]- 2) Zeitschr. f. physiol. Chem. 30, 384 [1900]. 3) Zeitschr. f. physiol. Chem. 66, 165 [1910].; Ber. d. deutsch, chem. Ges. 45, 1935 und 2503 [1912]; Zeitschr. f. physiol. Chem. 86, 185 [1913]- «) H. Fischer, E. Bartholomäus und H. Röse, Zeitschr. f. physiol- Chem. 84, 262 [1913]. Theoretische Einleitung. 41 zwei Moleküle Bromwasserstoff addiert werden und daß dabei die Bindung des Eisens bedeutend gelockert wird. Die Erklärung von H. Fischer ließe erwarten, daß die Farbe der Verbindungen bei den Additionen in Mitleidenschaft gezogen, nämlich abgeschwächt würde: C-C \/ I l\/ NH OH HNH was nicht zutrifft. Nach der Betrachtung von Küster wären es unwichtige, die komplexe Bindung nicht beeinträchtigende Gruppen, an welchen Additionen stattfinden würden. Zur Erklärung der Reaktionen bei dem Austritt des Eisens er- scheint uns die Annahme begründet, daß die Gruppen, die sich durch ihr Additionsbestreben auszeichnen, mit Stickstoffatomen in Verbindung stehen, etwa nach folgendem Schema, für das manche Alkaloide Analogien bieten: C \ c \ c c Diese Formel für einen Teil des Häminmoleküls stimmt sehr gut zu einer merkwürdigen, aber noch unsicheren Beobachtung von O. Piloty und J. Stock1), die in der Form des Pikrates ein poly- merisiertes, wahrscheinlich am Stickstoff äthyliertes Pyrrol, näm- lich ein bis-a-/S-Dimethyl-N-äthylpyrrol von der Formel: H H CHS— C — C C— C-CH3 II I I II CH3-C C C C— CHa \/H N H\/ N C= N^CH=CH >C= 7 HOX-CH9-CH2-C= >N- CH,-C= -Fe- I CI -N< C= l =CH =C-CH2-CH2-C02H =c-ch3 ch3 ch3 Hämin C33H3204N4FeCl . i) Aus einer unveröffentlichten Arbeit von Willstätter und M. F i s c h e r, Theoretische Einleitung. 43 Bei der Bildung des Hämatoporphyrins werden sich die Brucken von den zwei Pyrrolstickstoffen loslösen, worauf sich die mittlere Gruppe )c=c< in >C-C< um wandeln kann. Bei den Umwandlungen des Hämatoporphyrins soll nach un- serer Annahme die Kondensation eines Vinylrestes mit einem Koh- lenstoffatom des Pyrrolkernes erfolgen, welche das Strukturbild des Äthioporphyrins zum Ausdruck bringt. Das Hämoporphyrin wird daher durch folgende Formel erklärt: Hämoporphyrin C33H3604N4 . und das möglicherweise um zwei Wasserstof fatome reichere Meso- porphyrin vielleicht durch die entsprechende Formel mit Sät- tigung der Gruppe CH=CH. Die Formeln veranschaulichen, daß das Molekül des Hämins sich beim Abbau in unsymmetrischer Weise ändert, worauf meh- rere Reaktionen hindeuten. Während bei der Oxydation kein Methyläthylmaleinimid auftritt, liefert1) Mesoporphyrin dieses Imid, indessen nicht mehr als ein Molekül. Eine Voraussetzung unserer Betrachtungen bildet die Annahme der einfachen Molekulargröße von Hämin und Hämatoporphyrin, welche die Formeln mit dreiunddreißig Atomen Kohlenstoff aus- H. Fischer und F. Meyer - Betz, Zeitschr. f. physiol. Chem. 82, 96 [1912] und W. Küster und P. Deihle, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 45, 1935, ICJ45 [x912] und Zeitschr. f. physiol. Chem. 82, 463 [1912]. 44 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. drücken. Während unsere Molekulargewichtsbestimmungen1) bei zahlreichen Chlorophyllderivaten und J.Zaleskis2) Bestimmungen für Mesoporphyrin damit im Einklang stehen, haben O. Pilot y und E. Dormann3) aus Versuchen über die Siedepunktserhöhung der Pyridinlösung von Hämatoporphyrin den Schluß gezogen: ,,daß für das Hämatoporphyrin das Doppelte des bisher angenommenen Molekulargewichts als feststehend angenommen werden muß“ ; diese Folgerung ist vonO. Piloty undH. Fink4) gestützt und auf Hämin und Hämoglobin ausgedehnt worden. Diese Ergebnisse sind indessen nicht aufrecht zu halten5). Mit schön krystallisierter Tetramethyl- verbindung des Hämatoporphyrins (Dimethylätherdimethylester) finden Willstätter und M. Fischer in Veratrollösung die ein- fache Molekulargröße bestätigt. Obwohl nun Chlorophyll und Hämin auf das gleiche Ätiopor- phyrin zurückgeführt worden sind, das man als eine Stammsub- stanz bezeichnen kann, ziehen wir aus den Untersuchungen über den Abbau nicht den Schluß einer nahen, konstitutionellen Ver- wandtschaft zwischen Chlorophyll und Hämin. Hier Magnesium, dort Eisen, hier Esterbildung mit Phytol, dort Paarung mit Globin; zu solchen der ungleichartigen Funktion entsprechenden Unter- schieden kommen noch in dem eigentlichen Farbstoffkern bedeu- tende Unterschiede, die erst bei tiefgreifendem Abbau verschwunden sind. Auf dem Wege vom Hämin zum Ätioporphyrin gibt es zwei Verwandlungen, die den Bau des Moleküls wesentlich ändern, näm- lich den Übergang vom Hämin zum Hämatoporphyrin und von diesem zum Hämoporphyrin, das mit den Porphyrinen des Chloro- phylls isomer ist. Auch zwischen Chlorophyll und dem Ätiophyllin und sogar zwischen Chlorophyll und den ersten zweibasischen Porphyrinen wie x) Ann. d. Chem. 382, 155 [iqx i]. 2) Zeitschr. f. physiol. Chem. 37, 73 [1902]. s) Ann. d. Chem. 388, 319 [1912]. 4) Ber. d. deutsch, chem. Ges. 45, 2495 [1912] und 46, 2020 [1913]- s) Entweder war das angewandte Präparat nicht gut oder Hämato- porphyrin verträgt das Sieden mit Pyridin nicht, wie es auch beim Trock- nen bei 100 0 verdirbt. Theoretische Einleitung. 45 Cyanoporphyrin oder Erythroporphyrin liegen zwei das Moleku wesentlich umgestaltende Schritte, die sich mit den Reaktionen des Hämins nicht in Parallele bringen lassen. Der eine Schritt ist die Umlactamisierung der Chlorophyll- komponenten, durch die ein Ringsystem aufgespalten, ein neues synthetisiert wird. Die zweite Umformung des Moleküls, die weniger augenfällig stattfindet, geschieht durch die Einwirkung von Alkali bei höherer Temperatur und führt von den Chlorophyllinen zu den einfacher konstituierten zweibasischen Phyllinen oder vom Phyto- chlorin und Phytorhodin zu den entsprechenden Porphyrinen. Die Bildung von Cyanoporphyrin aus Phytochlorin scheint ein- fach durch Abspaltung eines Carboxyls nach der Gleichung: C34H3606N4 = C33H3804N4 + co2 zu verlaufen. Aber da die Porphyrine zwar alle einander ähnlich, doch von den Chlorinen und Rhodinen sehr verschieden sind, so ist die Umwandlung wohl eine tiefergehende. Wäre das Lactam im Phytochlorin aus einem das Pyrrol substituierenden Carboxyl und dem Pyrrolstickstoff zusammengesetzt, so könnte die Abspaltung der Kohlensäure die Eigenschaften kaum stark beeinflussen, etwa so wenig wie der Übergang von den zweibasischen zu den einbasi- schen Porphyrinen. Darum ist es wahrscheinlicher, daß die Lac- tamgruppe pyridonartig ist , ihr Carboxyl also selbst Ringbestand- teil und daß erst durch Austritt eines Kohlenstoffatoms der vierte Pyrrolkern des Cyanoporphyrins entsteht. Künftige Arbeiten über die Konstitution des Chlorophylls finden daher noch große Aufgaben. Die Beziehungen zwischen den beiden Chlorophyllkomponenten und die Umwandlungen, welche vom Chlorophyll zu den Chlorophyllinen, von den Chlorophyllinen zu den zweibasischen Phyllinen führen, sind aufzuklären und die Struktur des Ätioporphyrins ist noch in wichtigen Einzelheiten zu erforschen. II. Beschreibung des Blattfarbstoffs in einfachen Versuchen. Die Extraktion des Chlorophylls, seine Trennung von den be- gleitenden gelben Pigmenten, seine Isolierung und Gewinnung in der Form schön krystallisierter Derivate, nämlich als Methyl- und Äthylchlorophyllid , und seine Umwandlungen werden in den folgenden Kapiteln behandelt. Auf den dort geschilderten Methoden beruhen einige einfache Versuche, die sich für die Arbeit in kleinem Maßstab, z. B. für die pflanzenphysiologische Vorlesung und das botanische Praktikum eignen mögen. Sie sollen die Abscheidung des Blattfarbstoffs und seine Eigenschaften illustrieren. Diesen Versuchen liegen folgende Haupttatsachen zugrunde. Die Chloroplasten enthalten in kolloidalem Zustand gemischt mit farblosen Substanzen vier Pigmente, nämlich zwei einander nahe verwandte Chlorophyllfarbstoffe und zwei gelbe Pigmente: Chlorophyllkomponente a von der Zusammensetzung C65H 7205N4Mg, blauschwarz, in Lösung grünblau; Chlorophyllkomponente b von der Zusammensetzung Cß6H70O6N4Mg, grünschwarz, in Lösung rein grün; Carotin von der Formel C40H66, orangerote Krystalle; Xanthophyll von der Formel C40H66O2, gelbe Krystalle. Diese Pigmente haben wir in allen untersuchten Pflanzen aus den verschiedenen Klassen identisch gefunden und das Chlorophyll bei der vergleichenden Untersuchung durch seine konstante Zu- sammensetzung gekennzeichnet : Es enthält 2,7% Magnesium und gibt eine Asche von reiner Magnesia (ohne Phosphor oder Eisen). Beschreibung des Blattfarbstoffs in einfachen Versuchen. 47 Es liefert bei der Verseifung den stickstofffreien Alkohol Phytol (C20H40O) als ein Drittel des Moleküls. Der stickstoffhaltige Komplex, der vier Pyrrolkerne enthält, wird durch das Spaltungsprodukt Phytochlorin e aus der Kompo- nente a und Phytorhodin g aus der Komponente b identifiziert. Das eine ist in Äther olivgrün, das andere rot. Frische Blätter enthalten ungefähr 2 Promille Chlorophyll a, 3/4 b, Xanthophyll Vs» Carotin Vs Promille. Verhalten gegen Lösungsmittel. Für die Bereitung von Chlorophyllösungen werden in den bota- nischen Büchern ungeeignete Verfahren angeraten. 1. Versuch. 10 g frische Blätter (Brennesseln) werden mit wenig Seesand in der Reibschale fein zerrieben und auf einen Trichter mit Siebplatte und Filtrierpapierscheibe gebracht. Dann übergießt man den Brei mit 20 ccm Aceton, saugt an der Wasser- strahlpumpe ab und wiederholt Aufgießen und Absaugen des Lösungsmittels. Das Filtrat (ca. 40 ccm) enthält 2 cg Chloro- phyll. 2. Versuch. Beim kurzen Eintauchen in siedendes Wasser färbt sich ein Blatt lebhafter grün und der mikroskopische Schnitt zeigt die Chloroplasten zerflossen. Dabei werden die Oxydations- fermente zerstört. Während ein frisches Holunder- oder Roß- kastanienblatt beim Verreiben olivbraun wird und beim Extra- hieren eine braune Masse hinterläßt, bleibt das abgebrühte Blatt beim Zerkleinern grün und die Blattsubstanz ist nach dem Extra- hieren weiß. 3. Versuch. Gepulverte trockene Blätter geben den Farbstoff nicht ab an Benzol und nur sehr träge an absoluten Alkohol, Aceton und Äther, während sie gut extrahiert werden von 80 bis 90 prozentigem Alkohol oder Aceton. Petroläther extrahiert das Chlorophyll gar nicht. 4. Versuch. 2 g getrocknete Brennesselblätter werden fein ge- pulvert und auf einem Nutschentrichter trocken angesaugt. Dann gießen wir 10 — 20 ccm 85 volumprozentiges Aceton (oder 9opro- zentigen Alkohol) in einzelnen kleinen Anteilen langsam unter zeit- 48 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. weisem, schwachem Saugen mit der Pumpe auf und erhalten in einer Minute in dem schön grünen, intensiv rot fluorescierenden Extrakt fast allen Farbstoff. Wirkungen des Chlorophyllase. 5. Versuch. Chlorophyllasereiche frische Blätter (Heracleum, Galeopsis) legen wir zerkleinert in 70 volumprozentiges Aceton ein (1 g in 3 ccm). Aus der Blattsubstanz tritt viel Chlorophyll aus; es wird durch die Wirkung des Enzyms in Phytol und das sauere Chlorophyllid gespalten. Man erkennt dies schon nach einer Viertel- stunde, wenn man die Farbstofflösung mit Wasser verdünnt und ausäthert, beim Schütteln der Ätherlösung mit 0,05 prozentiger Natronlauge. Sie nimmt desto mehr Farbstoff auf, je vollständiger die Enzymreaktion stattgefunden hat. 6. Versuch. Abgebrühte Blätter derselben chlorophyllase- reichen Pflanzen liefern mit wasserhaltigem Aceton unter gleichen Umständen eine Lösung von unversehrtem Chlorophyll, die mit der verdünnten Natronlauge nicht reagiert. Dadurch wird gezeigt, daß die Hydrolyse (und die Alkoholyse) eine Enzym- wirkung ist. 7. Versuch. Eine Anzahl mikroskopischer Schnitte eines Heracleumblattes befeuchten wir auf dem Objektträger mit einem Tropfen 90 prozentigem Alkohol und legen ein Deckgläschen darauf. Man läßt den Objektträger neben einem Schälchen mit Alkohol unter einer kleinen Glasglocke bis zum Eintrocknen stehen (einen halben bis ganzen Tag). Dann zeigen sich nach Borodin in den Zellen und neben dem Blattgewebe die schönen drei- und sechs- eckigen Formen des krystallisierten Chlorophylls (Äthylchloro- phyllid) (Fig. 7 auf S. 176.) 8. Versuch, ig von einem frischen Heracleumblatt über- gießen wir im Reagierglas mit 4 ccm 75 prozentigem Holzgeist. Das Blatt wird zuerst tiefer grün und dann vergilbt es in 1 bis 3 Stunden. Das austretende Chlorophyll hat das Phytol verloren; das entstandene Methylchlorophyllid bildet schwarze Pünktchen im Blattgewebe, die sich unter dem Mikroskop als glänzende Krystalldrusen erweisen (siehe Fig. 6 auf S. 175)- Beschreibung des Blattfarbstoffs in einfachen Versuchen. 49 9. Versuch. 2 g gepulverte trockene Heracleumblätter lassen wir mit 6 ccm 90 prozentigem Alkohol im Reagierglas einen halben oder ganzen Tag lang stehen. Dann wird der Extrakt auf einem kleinen Nutschenfüter abgesaugt und das Mehl mit etwas Aceton nachgewaschen. Das Filtrat vermischen wir mit dem gleichen Volumen Äther und mit Wasser, heben die ätherische Lösung des Äthylchlorophyllids im Reagierglas- tropftrichter (Fig. 1) ab und waschen sie mit Wasser durch. Sie wird im Reagierglas im Wasserbad bis auf x/2 oder 1 ccm konzentriert und warm mit 3 ccm Petroläther versetzt. Das Chlorophyll fällt beim Stehen in Krystall- drusen aus. Es läßt sich durch Anschütteln mit wenig Äther von gelben Pigmenten befreien und dann aus mehr Äther umkr ystallisieren . Fig. 1. Reagier- Merkmale des Chlorophylls. gias- 10. Versuch. Acetonextrakt aus frischen Blättern von tric^er. Versuch 1 verdünnt man mit dem 5 fachen Volumen 85 prozentigen Acetons zur Beobachtung des Absorptionsspektrums und verwendet eine Schicht von 1 cm im Glastrog mit parallelen Wänden. Als Lichtquelle dient eine Auerlampe oder Sonnenlicht. Wir empfehlen für die Beobachtung ein Taschenspektroskop mit Gitter und Wellenlängenskala von Fuess in Steglitz. Das Spektrum zeigt eine Hauptabsorption im Rot bei der Fra unhof er sehen Linie C; dann folgen gegen Violett hin mit abnehmender Intensität 3 Absorptionsbänder und ein zweites Ab- sorptionsmaximum, die vollständige Auslöschung der blauen bis violetten Region (Fig. 1 der Tafel I). Beim Versetzen einer Probe des verdünnten Acetonextraktes mit einem Tropfen Salzsäure schlägt die Farbe des Chlorophylls sofort in Olivbraun um. Der Magnesiumkomplex wird zerstört, das Spektrum des entstandenen Phäophytins weist eine intensive Absorption im Grün vor der Linie E auf (Fig. 2 der Tafel I). 11. Versuch. Eine ätherische Lösung des Blattfarbstoffes be- reiten wir aus dem Acetonextrakt trockener Blätter (Versuch 4) durch Eingießen in 30 ccm Äther und Zusatz von 50 ccm Wasser Willstätter-StoU, Chlorophyll. 4 ^0 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. im Scheidetrichter. Dadurch trennt sich die Ätherschicht ab. Sie wird noch viermal mit je 50 ccm Wasser gewaschen, das man, ohne zu schütteln, der Gefäßwand entlang laufen läßt. Die äthe- rische Lösung (15 ccm) ist leicht etwas emulsioniert, sie läßt sich durch Schütteln mit wasserfreiem Natriumsulfat und Filtration klären. Das Chlorophyll als ein Ester zeigt keine sauren Eigenschaften ; die ätherische Lösung reagiert nicht mit wässerigen Alkalilaugen bei gelindem Schütteln. Beim Unterschichten mit 30 prozentiger methylalkoholischer Kalilauge zeigt sie die charakteristische braune Phase, die Mo- lisch entdeckt hat. An der Grenzschicht tritt sofort eine Zone von schön brauner Farbe auf, die sich beim Durchschüttein ver- breitet. Sie geht in 10 Minuten durch Oliv wieder in rein Grün über. Das Chlorophyll ist zum Kaliumsalz der Säure Chlorophyllin verseift; beim Verdünnen mit Wasser wandert daher die grüne Farbe nicht mehr in den Äther. 12. Versuch. Der Abbau zu Phytochlorin und zu Phytorhodin und die Trennung derselben läßt sich mit 5 ccm der erhaltenen ätherischen Lösung ausführen. Der Äther wird im Reagierglas abgedampft und der Rückstand mit 3 ccm siedender methylalkoholischer Kalilauge übergossen, die man noch V2 Minute über dem Bunsenbrenner gelinde kocht. Die schön rot fluorescierende Kaliumsalzlösung verdünnen wir mit dem doppelten Volumen Wasser und neutralisieren sie mit konzentrierter Salzsäure, bis die Reaktion eben deutlich sauer ist. Die Lösung gibt die gebildeten Spaltungsprodukte beim Ausschütteln im Reagierglasscheidetrichter an Äther mit olivbrauner Farbe ab. Die Ätherlösung schüttelt man zur Trennung zweimal mit je 10 ccm 4 prozentiger Salzsäure durch; die grünblaue Säureschicht liefert beim Neutralisieren mit Ammoniak und Ausäthern die oliv- grüne Lösung des aus der Chlorophyllkomponente a hervor- gegangenen Phytochlorins e. Der nach dem Ausziehen mit 4 prozentiger Säure hinterbliebene Anteil wird nun einmal mit 10 ccm 12 prozentiger Salzsäure extra- hiert; die grüne Säurelösung läßt beim Verdünnen mit Wasser Beschreibung des Blattfarbstoffs in einfachen Versuchen. 51 Phytorhodin g, das Derivat der Komponente b, mit roter Farbe in Äther übergehen. 13. Versuch. Von der ätherischen Rohchlorophyllösung schüt- teln wir 2 ccm mit ein wenig 20 prozentiger Salzsäure und dann mit etwas Wasser durch; die abgegossene Ätherlösung des magnesium- freien Chlorophyllderivats wird im Wasserbad abgedampft und ihr Rückstand mit 5 ccm Alkohol aufgenommen. Die olivfarbige Flüssigkeit nimmt beim Erwärmen mit einem Körnchen Kupfei- acetat eine prächtige Chlorophyllfarbe an infolge der Bildung einer dem Blattfarbstoff ähnlichen, aber beständigeren Kupfer- verbindung. Trennung der Pigmente. 14. Versuch. Von der ätherischen Lösung des Blattfarb- stoffs (Versuch n) schütteln wir 5 ccm kräftig durch mit 2 ccm starker methylalkoholischer Kalilauge. Nach der Wiederkehr der grünen Farbe verdünnt man nach und nach mit 10 ccm Wasser und fügt noch etwas Äther hinzu. Beim Durchschütteln im Reagierglas bilden sich zwei Schichten, von denen die wässerig- alkalische das Chlorophyll und die ätherische die Carotinoide enthält. 15. Versuch. Zur Trennung der beiden gelben Pigmente dient die im vorigen Versuch erhaltene ätherische Schicht. Sie wird ab- gehoben, mit Wasser gewaschen und auf 1 ccm eingedampft. Dann verdünnen wir sie mit 10 ccm Petroläther und entmischen mit je 10 ccm 90 prozentigem Methylalkohol etwa dreimal, bis er sich nicht mehr anfärbt. Im Holzgeist befindet sich Xanthophyll, im Petroläther Carotin. Mit dem Taschengitterspektroskop beob- achtet man die in der Fig. 4 der Tafel I dargestellten Absorptions- spektren der gelben Blattfarbstoffe (5 mg in 1 1 Äther, Schicht- dicke 1 cm). 16. Versuch. Aus einem Viertel des Acetonextraktes von 2 g trockenen Blättern (Versuch 4) führen wir allen Farbstoff in Petroläther über, indem wir ihn im Reagierglastropftrichter mit 10 ccm Petroläther und 20 ccm Wasser entmischen. Wird die mit etwas Wasser gewaschene Petrolätherlösung mit 92 prozentigem Methylalkohol (10 ccm) durchgeschüttelt, so geht in diesen Chloro- ^2 R. WiUstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. phyll b mit Xanthophyll über, während im Petroläther Chloro- phyll a und Carotin Zurückbleiben. Die gelben Begleiter vermindern den Färb unterschied zwischen den Chlorophyllkomponenten, deutlich tritt ihre Verschiedenheit in dem Farbumschlag beim Unterschichten mit methylalkoholischer Kalilauge zutage. Um die Probe (wie bei Versuch n) auszuführen, bringen wir durch Verdünnen und Ausschütteln b wieder in Äther. Die Chlorophyllkomponente a gibt eine gelbe, b eine braunrote Phase. Die charakteristischen Unterschiede (siehe genauer im Kap. VI) in den Spektren der ganz reinen Chlorophyllkomponenten (Lösung von 0,04 g in einem Liter Äther, Schicht 2 cm) bringt die Fig. 3 der Tafel I zum Ausdruck. III. Die Extraktion der Farbstoffe. i. Pflanzenmaterial. Als Ausgangsmaterial dienen frische und getrocknete Blätter. Die früheren Autoren haben fast immer frische Pflanzen ver- arbeitet, nämlich meistens Gras mit Alkohol bei Siedehitze extra- hiert1). Häufig wird empfohlen, z. B. von R. Sachsse2) und von A. Tschirch3), die frischen Blätter zuerst mit Wasser auszu- kochen, sie dann abzupressen und mit warmem Alkohol auszu- ziehen. F. Hoppe - Seyler4) wäscht vor der Extraktion durch kochenden Alkohol das Gras zur Entfernung von Wachs mit Äther. Eine Angabe über die Verwendung getrockneter Pflanzen findet sich bei A. Hansen5), der frisches Gras zuerst in Wasser x/4 bis i/2 Stunde auskocht, dann trocknet und ohne Zerkleinerung mit siedendem Alkohol extrahiert. Wir verwenden für die meisten präparativen Zwecke Blätter in getrocknetem Zustand und gepulverter Form und führen die Extraktion stets bei gewöhnlicher Temperatur aus. Diese Arbeitsmethode bietet folgende Vorteile: Viel geringeres Volumen und Gewicht der Blätter, so daß die Verarbeitung in zehnmal kleineren Gefäßen erfolgt. x) E. Schunck, Proc. Roy. Soc. 39, 348 [1885] und 44, 448 [1888]. 2) Phytochem. Untersuchungen. I. Chem. Untersuchungen über Chlorophyll. Leipzig 1880. *) Untersuchungen über das Chlorophyll. Berlin [1884]; ferner Ber. d. d. botan. Ges. 14, 76 [1896]. 4) Zeitschr. f. physiol. Chem. 3, 339 [1879]. 6) Die Farbstoffe des Chlorophylls. Darmstadt [1889]. Seite 46. 34 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Ersparnis an Lösungsmitteln, da diese nicht durch den Wasser- gehalt der Blätter (70 — 80% des Frischgewichts) verdünnt werden. Die Verarbeitung ist von der Jahreszeit und vom Standort der Pflanzen unabhängig. Die Zerkleinerung ist erleichtert. Die Verarbeitung der Blattmehle ermöglicht es, die Gewinnung des Chlorophylls und seiner Abbauprodukte auf einen technischen Maßstab zu übertragen und sie macht es leicht, im Laboratorium Mengen darzustellen, wie sie für die chemische Untersuchung er- forderlich sind. Da die Mengen der Präparate nicht mehr einen unbekannten kleinen Bruchteil, sondern den größten Teil des in der Pflanze vorhandenen Chlorophylls darstellen, so werden für die Ausbeuten bei allen präparativen Methoden Angaben mitgeteilt, die früher in der Literatur gänzlich gefehlt haben. Bei der Trocknung des Pflanzenmaterials sind zwei Nachteile in Betracht zu ziehen: Chlorophyllverlust und Verände- rung der Farbstoffe. Die Verminderung des Farbstoffs macht sich erheblich be- merkbar bei käuflichen Blättern, deren Farbstoffgehalt schwankt je nach der Sorgfalt beim Trocknen und der Witterung in der Sammelzeit. Während Brennesselblätter (mit Stielen) in frischem Zustand (berechnet auf die Trockensubstanz) 8—10 g Chlorophyll in 1 kg enthalten, pflegt das Chlorophyll des käuflichen Brennesselmehles nur 5 — 6 V2 g zu betragen. Die Blattsubstanz mag darin auch durch wertlose Bestandteile der Pflanze verdünnt sein. Wenn wir die Trocknung selbst ausführen, am besten über dem Dampfkessel oder mit einem Hürdenofen, so wird dabei kein Chlorophyll verloren. Willstätter und Utzinger fanden in alkoholischen Extrakten von getrockneten Brennesseln und Gale- opsis 93—96% vom Chlorophyll der frischen Blätter. Das Trockengewicht der Pflanzen, zumeist (beispielsweise bei Brennesseln) 25% der frischen Blätter, wird beeinflußt von der Jahreszeit und den Wachstumsbedingungen. Die Extraktion der Farbstoffe. 55 Wachstumsbedingung Trockengewicht Pflanze Jahreszeit 0/ Io Brennesseln 22. März — 17.5 Brennesseln Holunder 20. Juli 12. „ 5hN- Lichtblätter 34»° 27,8 Holunder n. 5hN. Schattenblätter 16,3 Roßkastanie 17. 7h v- Lichtblätter 37-5 Roßkastanie 17. „ 7h V. Schattenblätter 25,0 Fichte 21. „ 5°>° Manche trockne Blätter, z. B. Gras, verderben leicht beim Aufbewahren, andere (Holunder, Nadeln der Coniferen) schon leicht beim Trocknen. Auch solche Blätter haben sich unter Er- haltung des Chlorophylls trocknen lassen durch Aufstellen in Mengen von 50—100 g im Vakuumexsiccator über Schwefelsäure. Besonders schwierig waren Braunalgen, z. B. Fucus, unversehrt zu trocknen. Es gelingt auch nach kurzem Abbrühen, Ausschleu- dem und Ausbreiten im warmen Luftstrom nicht, sie zu einem schön grünen Mehl zu zerkleinern und die Pigmente in guter Aus- beute zu extrahieren. Der zweite Nachteil, der bei Verwendung getrockneter Blätter möglich ist und von Botanikern oft befürchtet wird, die Veränderung der Pigmente beim Trocknen, tritt nicht leicht ein und läßt sich bei geeigneter Auswahl der Pflanzen und richtiger Trocknung vermeiden. Wir haben die Merkmale des Chlorophylls bestimmt und bei vergleichenden Versuchen mit frischen und getrockneten Pflanzen übereinstimmend gefunden. Die Verarbeitung frischer Blätter bleibt wichtig in erster Linie für analytische Zwecke, z. B. bei der raschen Isolierung von reinem Chlorophyll aus kleinen Blattmengen, ferner bei der quanti- tativen Bestimmung der beiden grünen und der beiden gelben Pigmente. Eine weitere Bedeutung hat die Verwendung des frischen Ma- terials in dem Falle, wo die Wirkung der Chlorophyllase auf das Chlorophyll ausgenützt wird, also bei der Gewinnung der krystalli- sierten Chlorophylle. Die Darstellung der freien Chlorophyllide ist sogar bis jetzt nur mit frischen Blättern geglückt, lange Zeit auch die Gewinnung der Methylchlorophyllide. Dann ist die Methode dafür 56 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. unter Nachahmung der Arbeitsbedingungen, welche bei frischen Blättern geboten waren, auf die trockenen übertragen worden. Endlich ist es bei den besonders schwierig zu konservierenden Braunalgen von großem Vorteil gewesen, die Algen in frischem Zustand zur Gewinnung von Fucoxanthin und Chlorophyll zu verwenden. Die frischen Blätter sind in mancher Hinsicht schwerer als die getrockneten zu verarbeiten, z. B. zu zerkleinern und mitunter vor Veränderungen des Chlorophylls zu schützen. In solchen Fällen hilft eine Vorbehandlung nach Willstätter und Isler1) mit wasserhaltigem Methyl- oder Äthylalkohol von solcher Konzentra- tion, daß noch kein Chlorophyll extrahiert wird. Die Blätter werden entwässert, gehärtet und leicht pulverisier- bar. Wir behandeln am besten die Blätter mit so viel wasserfreiem Methylalkohol, daß derselbe durch den Wassergehalt der Blätter ungefähr auf 66 Volumprozent verdünnt wird; dann fügen wir noch weiter 66 volumprozentigen Methylalkohol so lange hinzu, bis die mit Steinen mäßig beschwerten Blätter in der Flüssigkeit ganz untergetaucht bleiben. Manchmal ist es zweckmäßig, Mischungen von wasserhaltigem Holzgeist und Äther anzuwenden, wodurch .gewissen Pflanzen viel Harz entzogen wird. Auf diese Weise ge- lingt es vortrefflich, aus den sonst kaum zu verarbeitenden frischen Fichtennadeln schöne Chlorophyll ösungen herzustellen, indem wir z. B. 800 g Fichtennadeln mit 1500 ccm Methylalkohol, 900 ccm Wasser und 600 ccm Äther behandeln. Nach dieser Behandlung läßt sich das Chlorophyll noch leichter als sonst extrahieren, und bei richtig bemessener Dauer wird die Ausbeute durchwegs gut. Pflanze Dauer der Behandlung Chlorophyll in g aus 1 kg frischer Blätter Brennessel 1 — 18 Stunden K> M 1 W Fichtennadeln 2 0,9 Schachtelhalm 18 1.4 Farnkraut 2 1.5 Laubmoos 16 1.4 *) Ann. d. Chem. 380, 171 [191 1] ; vgl. auch Kap. VII, Abschn. 3. Die Extraktion der Farbstoffe. 57 Die Behandlung in wasserhaltigem Holzgeist ist auch für das Mehl trockener Blätter anwendbar, um ebenfalls das Chlorophyll leichter extrahierbar zu machen. Pflanzenarten. Bei der Auswahl der Pflanzen unterscheiden wir zwischen den an Chlorophyll ase reichen, die sich allein für die Gewinnung von krystallisiertem Chlorophyll eignen, nämlich: Heracleum spondylium, Galeopsis tetrahit, Stachys silvatica, und den an Chlorophyllase armen, die für die meisten praparativen Zwecke den Vorzug verdienen: für die Gewinnung von Chlorophyll, Phäophytin, Phytol, Chlorophyllinsalzen und weiteren Abbau- produkten. Wir verwenden meistens Brennesseln, weil sie billig, chlorophyll- reich und enzymarm sind, sich gut trocknen lassen und beim Auf- bewahren grün bleiben. Für die Darstellung von Reinchlorophyll finden wir es vorteilhaft, die Trocknung selbst vorzunehmen, weil chlorophyllreiches Material abgesehen von besserer Ausbeute auch einen günstigeren Reinheitsgrad erzielen läßt. Für die Gewinnung von Phäophytin ist das käufliche Brennesselkraut gut genug, das als mittelfeines Mehl zum Preise von 65— go Mark für 100 kg käuflich ist. Es pflegt nur 7% Feuchtigkeit zu ent- halten. Die Verwendung der Brennessel läßt sich zurückverfolgen bis auf G. G. Stokes1), der in seiner berühmten Abhandlung vom Jahre 1852: „On the Change of Refrangibüity of Light“, aber an keiner späteren Stelle mehr, darüber schrieb: „A good number of the following observations on the internal dispersion of leaf-green were made with a solution obtained from the leaves of the common nettle, by first boiling them in water and then treating them with cold alcohol, the leaves having pre- viously been partially dried by pressing them between sheets of blotting paper. N ettle was chosen partly because it Stands boiling without losing its green colour, and partly for other reasons.“ Die Brennesseln haben allerdings einen Nachteil, daß nämlich das Chlorophyll in ihrem Extrakte so leicht wie kaum in dem von *) Edinburgh Transactions 12, 486 [1852]. 58 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. anderen Pflanzen sich derart verändert, daß beim Abbau schwach basische Spaltungsprodukte statt der normalen auftreten. Diese Veränderung vermeiden wir durch rasches Extrahieren und so- fortiges Verarbeiten. Beispiel. 500 g Brennesselmehl wurde nach dem Nutschen- verfahren mit 95 prozentigem Alkohol kurz extrahiert. Die Hälfte des Filtrats ist 2 — 5 Tage lang im Dunkeln oder am Licht auf- gestellt worden. Die Verarbeitung auf Phäophytin und seine Ver- seifung ergab neben dem Phytochlorin e viel Phytochlorin f; das Phytorhodin g trat zurück. Die zweite Hälfte des Brennesselextraktes blieb mit dem aus- gezogenen Mehl der ganzen Portion vermischt ebenso lange stehen. Dann führte der Abbau zum normalen Gemisch von Chlorin e und Rhodin g ohne schwächer basische Begleiter. 2. Methoden der Extraktion. a) Zustand und Verhalten des Chlorophylls in den Blättern. j ■ Unsere hauptsächliche Änderung gegenüber der üblichen Ar- beitsweise früherer Autoren besteht im Extrahieren in der Kälte, wofür sich das Mehl der trockenen Blätter eignet. Die zur Extraktion anwendbaren Lösungsmittel sind: Alkohol, Methylalkohol, Äther, Aceton. Die Anwendung ist durchaus nicht allein bedingt durch die Löslichkeit des Chlorophylls. Dieses ist, wie wir jetzt wissen, in reinem Zustand leicht löslich in Benzol und in wasserfreiem Aceton, aber nicht damit extrahierbar. Es ist in Petroläther leicht löslich, solange es mit Begleitstoffen vermischt ist, dennoch ist es damit gar nicht zu extrahieren. Das trockene Blattmehl wird von absolutem Alkohol nur lang- sam extrahiert, von Äther und von Chloroform wie von Aceton sehr träge, von Benzol, Petroläther und Schwefelkohlenstoff gar nicht, dagegen sofort von Methylalkohol. Von der Extraktion mit Lösungsmitteln, die kein Chlorophyll aufnehmen, Petroläther, Benzol und Schwefelkohlenstoff, haben Die Extraktion der Farbstoffe. 59 Willstätter und Mieg zum erstenmal zur Isolierung von Carotin Anwendung gemacht1), später hat uns das Verfahren einige Zeit dazu gedient, um durch Beseitigung einer größeren Menge von farblosen und gelben Begleitern reinere Chlorophyllösungen zu bereiten. Den Nutzen dieser Vorbehandlung für den Reinheitsgrad der Chlorophyllextrakte darf man allerdings nicht nach der Menge des Weggelösten bewerten; vielmehr zeigt sich die Wirkung der Vorextraktion erst an petrolätherischen Chlorophyllösungen, welche beim Entmischen der Extrakte mit Petroläther erhalten werden. Die für die Vorbehandlung geeigneten Lösungsmittel entziehen dem Brennesselmehl pro Kilogramm ungefähr 17 g Extraktstoff. Beispiel. 1 kg Brennesseln, bei 40 0 getrocknet, wurden auf der Nutsche rasch mit mehreren Lösungsmitteln extrahiert und jedes vom folgenden vollständig verdrängt. 1. 2 1 wasserfreien Acetons lösten 0,9 1 g Chlorophyll und gaben 15,4 g Rückstand. 2. 6 1 Benzol gaben 3,5 g Rückstand. 3. 1 1 Äther löste 0,05 g Chlorophyll und enthielt 0,8 g Rückstand. 4. Petroläther: fast ohne Wirkung. 5. 1 1 wasserfreien Acetons nahm 0,15 g Chlorophyll auf, viel Gelbes, gab 1,65 g Rückstand. Die Verarbeitung mit wasserhaltigem Aceton lieferte dann 4,7 g Reinchlorophyll. Das eigentümliche Verhalten des Chlorophylls im Blatt gegen- über den Lösungsmitteln haben wir früher durch die Annahme zu erklären versucht, daß das Chlorophyll sich in der Blattsubstanz wahrscheinlich in der Form von Adsorptionsverbindungen mit Kolloiden befinde; ähnlich hat A. Arnaud2) angenommen, daß es durch Capillarkräfte im Blattgewebe zurückgehalten werde, und M. Tswett3), daß der Farbstoff an das Skelett der Chloroplasten durch molekulare Adsorptionskräfte gebunden sei. Unsere Beobachtungen sprechen nicht für die auf das Ver- halten der Blätter gegen Petroläther gegründete Annahme von *) Ann. d. Chem. 355, 12 [1907]. 2) C. r. 100, 751 [1885]. 3) Arbeiten der Naturf. Ges. Kasan 35, 86 [1901]. 6o R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. W. Palladin1), daß das Chlorophyll in chemisch gebundenem Zu- stand, nämlich mit Phosphatiden (Lipoiden) verbunden in den Blättern enthalten sei. Wir können Lösungen von Chlorophyll entfärben durch Tierkohle und auch mit Hilfe extrahierter Pflanzen- mehle und der Farbstoff befindet sich dann in der Form eines Adsorptionsproduktes, das z. B. von Petroläther nicht angegriffen wird. Es ist sogar schwer, aus der Tierkohle wieder Chlorophyll zu extrahieren; mit Pyridin gelingt es. Die Anwendung der Lösungsmittel zur Extraktion von Blatt- grün wäre also zu erklären durch ihre dissoziierende Kraft, mit der sie auf die Adsorptionsprodukte wirken. Neue Versuche lassen uns eine andere Auffassung über den Zustand des Chlorophylls im Blattgewebe vorziehen. Sämtliche Absorptionsstreifen im Spektrum des lebenden Blattes sind nach M. Tswett2) und nach älteren Autoren gegen- über dem Spektrum eines Chlorophyllextraktes nach der schwächer gebrochenen Seite hin verschoben. D. Iwanowski3) hat die Spektren von Blättern und von kolloidalen Chlorophyllösungen verglichen. Er findet die beiden zwar ähnlich, aber nicht identisch, und nimmt das Chlorophyll im Blatte nicht als kolloidal gelöst, sondern als fein suspendiert an. A. Herlitzka4) weist dagegen die Übereinstimmung der Spektren lebender Blätter mit denjenigen kolloidaler Chlorophylllösungen nach und ihren gemeinsamen Unter- schied gegenüber wirklichen Chlorophyllösungen ; er schließt daraus, wenn auch nicht auf die Identität, so doch auf die Ähnlichkeit des Zustandes von Chlorophyll im Blattgewebe und in der kol- loidalen Lösung. Unsere eigenen Versuche bestätigen ungefähr die Ergebnisse von A. Herlitzka; wir haben die Spektren von Blättern ver- schiedener Pflanzen gemessen und finden sie in der Lage der 1) Biochem. Zeitschr. 26, 357 [1910] und Ber. d. d. bot. Ges. 28, 120 [1910]. 2) Die Chromophylle in der Pflanzen- und Tierwelt, S. 173. Warschau [191°]. 8) Ber. d. d. bot. Ges. 25, 416 [1908] und Biochem. Zeitschr. 48, 328 [1913I 4) Biochem. Zeitschr. 38, 321 [1912]. Die Extraktion der Farbstoffe. 6l Absorptionsstreifen mit dem Spektrum einer kolloidalen Losung von reinem Chlorophyll a (Kap. VI, Abschn. 4) identisch, obschon sie in den Intensitätsverhältnissen der Bänder etwas differieren. Diese spektroskopischen Messungen und namentlich Beobach- tungen über das Verhalten der Blätter gegen Lösungsmittel machen es wahrscheinlich, daß das Chlorophyll im Blatte in kolloidaler Verteilung oder einem sehr ähnlichen Zustand vorhanden ist. Dieser Zustand des Chlorophylls wird in eigentümlicher Weise durch Abbrühen der Blätter beeinflußt; das Chlorophyll wird da- nach leichter extrahiert. Während das normale Blattgewebe die Chloroplasten längs der Zellwände schön angeordnet enthält, dichter in den Pallisaden- zellen, zerstreuter im Schwammparenchym und zwar in scharf be- grenzten, meist elliptischen Formen, zeigen die Blätter nach kurzer Einwirkung von siedendem Wasser die Chloroplasten stark defor- miert oder geplatzt, so daß dann ihre etwas körnigen Massen in- einanderfließen und die Zellen diffus erfüllen. Das Zerfließen tritt fast augenblicklich ein. Die Blätter färben sich beim Eintauchen in siedendes Wasser in wenigen Sekunden tief grün, was am schönsten bei Braunalgen zu sehen ist. Spektroskopisch erweist sich diese Farbänderung der Blätter als eine Verschiebung der Absorptionsstreifen gegen das violette Ende des Spektrums hin; ihre Lage nähert sich etwas der beim Spektrum eines Chlorophyllauszuges beobachteten und ist wenig verschieden von der Lage der Streifen, die eine Lösung von Chloro- phyllgemisch in Phytol auf weist. Das Chlorophyll ist aus seinem kolloidalen Zustand in die Form einer wirklichen Lösung übergegangen, nämlich gelöst in seinen infolge der Temperaturerhöhung verflüssigten wachsartigen Begleitstoffen. Es ist leichtlöslich geworden, sogar Benzol extra- hiert aus dem Mehl von abgebrühten Blättern den Farbstoff leicht. Beim Abbrühen der Blätter geht das Chlorophyll in einem stark brechenden Medium in Lösung. Es gelingt innerhalb des Blatt- gewebes auch eine Chlorophyllösung mit denselben Solvenzien, wie sie für die Extraktion verwendet werden, zu erzeugen. Wir legen ein Blatt z. B. von Brennesseln in Aceton, bis es gleichmäßig Ö2 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. tiefgrün erscheint und noch kein Chlorophyll aus den Zellen austritt (siehe Kap. VII, Abschn. 2); die spektroskopische Messung ergibt dann Werte, die nach Lage und Intensität der Bänder mit denen des Extraktspektrums zusammenfallen. Einige unserer spektroskopischen Beobachtungen haben wir in der folgenden Tabelle zusammengestellt; wir durchleuchteten bei den auf geführten Messungen Brennesselblätter mittels Nernstlampe und Sammellinse unmittelbar vor dem 0,1 mm breiten Spalt eines Ze iß sehen Gitterspektroskops. Schicht in mm Lebendes Blatt Abgebrühtes Blatt Lösung von Chlorophyll Mit Aceton behandeltes in Phytol Blatt Band I l 693—663 1 686—657 1 685—654 ^ 680 — 640 J 625... 601 „ II III / ..643 625 | 61 1 / -.645 623 | 608 f ...641 625 . . 603 ,, iv 592.569 59° -569 590. -57° 588. .564 „ v 551-535 55° I 535 548.532 548.526 „ VI I520. . .505— 1 519. . .505— X 512 | 486 \ 5X4 * • -502— Endabsorption / / J ... 48O 1 Diese vergleichende Messung erklärt vollkommen den Zustand und die optischen Verhältnisse des Chlorophylls im lebenden Blatte, sowie in dem mit heißem Wasser oder mit Lösungsmitteln be- handelten und lebhafter grün gewordenen Blatte. Bei dem Lagern der Blätter im Eisschrank tritt keine im mikroskopischen Schnitt sichtbare Veränderung der Chloroplasten ein; aber die Blätter weisen beim Einlegen in wasserhaltigen Methylalkohol ein anderes Verhalten auf als frisch gepflückte, sie entfärben sich rascher, z. B. Brennesselblätter in 5> anstatt in 21 Stunden. Dies ist eine Behandlung der Blätter1), bei der das Chlorophyll aus den Chloroplasten heraustritt und sich an anderer Stelle im Blatte niederschlägt; wahrscheinlich bildet das Lösungsmittel mit den Begleitstoffen des Chlorophylls zunächst eine Mischung, welche auf das Pigment gut lösend einwirkt und es dann bei zunehmender Verdünnung durch das Lösungsmittel wieder ausscheidet. !) Vgl. Kap. VII, Abschn. 2. Die Extraktion der Farbstoffe. 63 Das Mehl der nach dem Lagern im Eisschrank getrockneten Brennesselblätter gibt das Chlorophyll zwar nicht an Petroläther, aber leicht ab an Benzol, so daß es aus der entstehenden Lösung mit Petroläther gefällt werden kann; auch absoluter Alkohol, wasserfreies Aceton und Äther extrahieren daraus den Farbstoff sehr leicht, und Petroläther schon mit einem ungewöhnlich kleinen Zusatz von Alkohol. Die Ursache der Erscheinung ist noch nicht aufgeklärt; viel- leicht beruht sie auf einer Veränderung der Kolloide in den Chloro- plasten infolge von Konzentrationsänderungen durch Austritt von Wasser aus den Zellbestandteilen. Die Schwerlöslichkeit des in der unversehrten Blattsubstanz enthaltenen Chlorophylls und sein Leichtlöslichwerden unter den angegebenen Umständen schienen darauf hinzudeuten, daß das Chlorophyll sich vielleicht im Zustand einer lockern chemischen Bindung im Blatt befinde, aber es ist uns nicht möglich gewesen, für eine solche Vermutung eine Stütze zu finden. Bei dem raschen Extrahieren und Isolieren aus frischen Blättern, andererseits bei der Verarbeitung von abgebrühten und von den in der Kälte gelagerten Blättern erhält man das Chlorophyll nicht mit irgend einem Unterschied in den Löslichkeitsverhältnissen oder optischen Eigenschaften. Eine gute Erklärung bietet uns die Annahme eines kolloidalen Zustandes des Chlorophylls im Blattgewebe für die merkwürdigen Löslichkeitsverhältnisse des Farbstoffes beim Behandeln des Blatt- mehles mit wasserfreien Lösungsmitteln und andererseits bei Gegenwart von Wasser. Trockenes Mehl von Brennesselblättem färbt Aceton während einer halben Stunde nicht an, sofort und intensiv bei Gegenwart von etwas Wasser; absoluter Alkohol verhält sich ähnlich, der Unter- schied ist aber hier kleiner. Methylalkohol zeigt das umgekehrte Verhalten, er löst wasserhaltig schlechter, wasserfrei sofort und gut. Äther und Benzol werden vom Blattmehl nicht angefärbt; sie bleiben in fünf Minuten noch frei von Chlorophyll, befeuchtet man aber das Mehl mit ein paar Tröpfchen Wasser, so färbt sich der Äther sofort stark grün an, das Benzol ähnlich, doch etwas langsamer. 64 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Kolloidale wässerige Chlorophyllösungen geben, sowohl aus Ex- trakten1) wie aus reinen Präparaten bereitet, an Äther oder Bertzol beim Durchschütteln kein Chlorophyll ab, sofort aber die ganze Menge bei Zusatz von wenig Salz, z. B. von Chlorcalcium. Ähnlich denken wir uns das Verhalten des Chlorophylls im Blattmehl. Das zum organischen Lösungsmittel zugesetzte Wasser löst aus der Blattsubstanz Mineralsalze, wie z. B. Kaliumnitrat. Die entstehende Salzlösung verändert den kolloidalen Zustand des Chlorophylls in den Chloropiasten und macht es leichtlöslich. Dieser Umstand ist von großer Bedeutung bei der Extraktion der Farbstoffe aus getrockneten Blättern mittels der wasserhaltigen Lösungsmittel. b) Unsere älteren Methoden. Die Extrakte werden definiert durch ihren Gehalt an Chloro- phyll und durch seinen Reinheitsgrad2). Wir bezeichnen so das in Prozenten ausgedrückte Verhältnis des Chlorophylls zur Gesamt- menge der Substanz, meistens der gelösten Stoffe. Mittels dieses Wertes wird der Einfluß der Darstellungsweise und der Reinigungs- operationen auf die Trennung des Chlorophylls von den farblosen und gelben Begleitern geprüft. Den Reinheitsgrad der Lösungen leiten wir ab aus dem colori- metrisch ermittelten Chlorophyllgehalt und dem Trockenrückstand, den wir durch Abdampfen im Wasserbad und Erwärmen im Va- kuum bis zur Gewichtskonstanz bestimmen ; bei Mengen von 1 bis 2 g wird sie meist in 1/2 — 3/« Stunden erreicht. In den Rohchlorophyllösungen sind außer den grünen die gelben Pigmente der Blätter, sowie Fette, Wachse, Phytosterin, Kohlen- wasserstoffe, Salze (z. B. Kaliumnitrat), und andere farblose Sub- stanzen enthalten. Der trockene Rückstand eines Extraktes aus 1 kg Brennesseln beträgt 30 bis über 40 g; Lösungen von so ge- ringer Konzentration liefern einen jm Vakuum sich aufblähenden, harzigen, mißfarbigen Rückstand, während hochprozentige einen spröden, blauschwarzen Rückstand geben, der sich nach dem Trocknen leicht mit schön grüner Farbe löst. i) Abh. II. *) Ann. d, Chem. 380, 184 [1911]- Die Extraktion der Farbstoffe. 65 F 1 aschenextrakte . i kg Blattmehl wird mit 2 1 Sprit in der Stöpselflasche extra- hiert, was beim Schütteln an der Maschine höchstens einige Stunden beansprucht. Der Extrakt wird an der Pumpe abgesaugt, das Pulver auf der Putsche scharf abgepreßt und so lange nach- gewaschen, bis das Volumen des Filtrates den angewandten zwei Litern gleichkommt. Bei präparativen Arbeiten im größeren Maßstab stellen wir stärkere Extrakte dar, sogenannte Doppelextrakte, indem die alkoholischen oder ätherischen Auszüge aufs neue zum Erschöpfen von Blattpulver dienen. Doppelextrakte1). Je 5° kg mittelfeines Mehl aus trocke- nem Brennesselkraut oder Gras schüttelten wir mit 75 1 Alkohol von 96% in einem Dutzend 12 1-Pulverflaschen zu einem gleichmäßigen Brei an. Die Extraktion war nach 24stündigem Stehen beendigt, namentlich wenn die Füllung durch häufiges Rollen der Flaschen auf einer dicken Filzunterlage und durch wiederholtes kräftiges Durchschütteln recht gründlich vermischt worden war. Die Lö- sung wurde dann in drei Portionen an der Pumpe scharf abgesaugt auf einer großen Nutsche aus Steinzeug, die man mit einer Platte zudeckte. Da das abgepreßte Pulver pro Kilogramm durchschnitt- lich 0,8 1 Extrakt zurückhält, war zur Gewinnung des Extraktes Nach waschen mit 40 1 Alkohol erforderlich; der Waschalkohol ver- drängte den Extrakt aus dem Pulver, ohne ihn zu verdünnen. So wurden 75 1 einfachen Extraktes erhalten. Um das Pulver vollkommen auszulaugen, diente dann ein zweites Nach waschen mit etwa 20 1 Alkohol; dieser Waschalkohol lieferte noch eine sehr verdünnte Chlorophyllösung, die einfach zum Ansetzen von frischem Pulver Verwendung fand. Mit diesem ersten Extrakt wurde eine zweite Charge von 50 kg Brennesselpulver ausgezogen, und zwar in etwa 48 Stunden. Das Absaugen und Nach waschen erfolgte in der nämlichen Weise, nur war es lohnend, für das letzte Nachwaschen des Doppelextraktes die doppelte Menge Alkohol anzuwenden, also etwa 40 1. Wir er- x) Ann. d. Chem. 350, 65 [1906]. Willstätter-Stoll, Chlorophyll . 5 66 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. hielten demnach aus ioo kg Blätter mit 155 i Alkohol 75 1 Doppel- extrakt, und weitere 60 1 Waschalkohol wurden chlorophyllhaltig wiedergewonnen und zur Darstellung des nächsten Extraktes ver- wendet. Perkolate1). Wir verwenden gläserne Perkolatoren2) von 1/2 und 1 1 Inhalt bis zu solchen von 12 und 25 1 Inhalt. Die Fig. 2 zeigt die Per- kolation mit vier Apparaten von je 25 1 Inhalt, und zwar in der Phase des Macerierens. Größere Perkolatoren aus Stein- zeug sind haltbarer und billiger als die gläsernen Apparate, aber sie sind wegen ihres bedeutenden Gewichtes schwer zu handhaben. Vor dem Einfüllen des Pflanzen- pulvers in die Perkolatoren wird das trockene Mehl mit Alkohol (0,3 1 pro Kilogramm) angefeuchtet und gut vermischt in hölzernen Bottichen 3 — 4 Stunden lang zugedeckt stehen gelassen. Nach dieser Zeit läßt man das Pulver durch ein Roßhaarsieb von ca. 1,5 mm Maschenweite fallen und füllt es in die Perkolatoren ein. Der Boden der Gefäße wird zunächst mit einer dünnen Schicht Watte bedeckt, die als Filter wirkt. Das Material muß ziemlich lose, aber möglichst gleichmäßig eingefüllt und leicht gestampft werden. Ist es zu fest gedrückt, so tritt leicht Verstopfung ein; andererseits, wenn die Füllung ungleichmäßig und zu locker hergestellt ist, findet der Alkohol Kanäle, dufch welche er ohne zu extrahieren abläuft. Die untere Grenze des herab- i -'il i) R Willstätter, Chlorophyll in E. Abderhaldens Handbuch der biochem. Arbeitsmethoden 2, 674 [1910]; ferner Ann. d Chem. 3^. 5 [1910]. , - 2) Die Perkolatoren sind zu beziehen von den Glashuttenwerken von Poncet, Aktiengesellschaft, Berlin. Fig. 2. Die Extraktion der Farbstoffe. 67 sickernden Lösungsmittels soll einen fast horizontalen Kreis bilden. Zur Perkolation und zum Nach waschen dienen ca. 2 1 Alkohol pro Kilogramm Brennesselpulver. Bei den Perkolatoren mit 3 kg Füllung (10 — 12 1 Wasserinhalt) wird einfach eine Flasche mit 6 1 Inhalt umgestülpt und auf den oberen Rand des Perkolators ge- setzt; sie entleert sich in dem Maße, als der Alkohol nach unten abfließt. Für die großen Perkolatoren (gefüllt mit ca. 10 kg B rennessein) werden Flaschen mit je 17 1 Alkohol hoch aufgestellt. Sie tragen aufgeschliffene Helme, eine Glasröhre geht duich den Helm fast bis auf den Boden der Flasche, eine zweite Röhre mündet im Helme; beide führen in den Perkolator, bis dicht über die Fül- lung; auf diese Weise wird der Zufluß von Alkohol automatisch reguliert. Den Perkolator verschließt man zur Vermeidung der Feuchtigkeitsanziehung mit einer geschliffenen Glasplatte, die mit einem Schlitz versehen ist. Gewöhnlich dauert es 12 — 15 Stunden, bis die ganze Füllung der großen Perkolatoren von Alkohol durchdrungen ist; wir setzen dann das Macerieren gewöhnlich nicht weiter fort, sondern lassen das Perkolat in eine Flasche übertropfen oder saugen es ab. An- fangs ist der Ablauf höchst konzentriert, er wird immer verdünnter und es ist zweckmäßig, die Vorlage zu wechseln, wenn aus den großen Perkolatoren 0,6 — 0,7 1 Auszug pro Kilogramm Material abgelaufen ist, d. i. ungefähr nach 24 Stunden. In die zweite Vor- lage wird unter Saugen in 8 — 10 Stunden noch ein Nachlauf ge- leitet, welcher pro Kilogramm Pflanzenmehl 0,30 — 0,45 1 beträgt. Dieser Nachlauf dient zum Ansetzen der nächsten Charge. Beispiel. Die Charge von 36 kg Pulver wird maceriert mit 10 1 Alkohol und in den 4 Apparaten perkoliert mit 16 1 Nach- lauf und 47 1 frischem Sprit; in die I. Vorlage fließen 23 1 Perkolat freiwillig ab, in die Vorlage II werden 16 1 Nachlauf abgesaugt. Das Mehl hält 34 1 Alkohol zurück, die man daraus abdestillieren kann. Die Extraktion von Chlorophyll mittels der Perkolatoren be- hält Wert auch gegenüber den verschiedenen Verbesserungen in der Methode, die im Abschnitt d beschrieben werden. 5* 68 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Erstes Nutschenverfahren. Die langsame Extraktion in Flaschen und in Perkolatoren bietet zwei Nachteile: i. Die Alkoholyse unter der Wirkung der Chlorophyllase be- dingt einen Verlust an Phytol, der auch bei Brennesseln, obwohl sie zu den an Enzym armen Pflanzen zählen, nicht unerheblich ist. Die Phytolzahl für Brennessel war bei langsamer Extraktion im Mittel der Bestimmungen von 12 Präparaten 28,2, hingegen bei rascher Extraktion 32,2. 2. Bei längerem Stehen der Lösungen verändert sich das Chloro- phyll, besonders leicht in Brennesselextrakten, derart, daß die Spaltung des Phäophytins an Stelle des normalen Phytochlorins e das schwächer basische Phytochlorin f ergibt. Es ist daher geboten, ein abgekürztes Verfahren der Extrak- tion anzuwenden, nämlich das Ausziehen des Pulvers direkt auf der Nutsche. 1 kg Galeopsismehl wird in einer Porzellanschale während 5 Minuten mit 0,51 Alkohol (96 prozentig) angefeuchtet, gleich- mäßig bearbeitet und dann auf die Nutsche dicht auf geschichtet. Hierauf gießt man 0,5 1 Alkohol auf und beginnt mit dem Ma- schinenvakuum kurz anzusaugen. Endlich wird unter abwechseln- dem Zugießen und Absaugen noch etwa 1 1 Alkohol nachgefüllt. In 20 Minuten, vom Beginn des Anfeuchtens gerechnet, ist 1 1 Extrakt abgeflossen, 5 g Chlorophyll enthaltend. Bei präparativem Arbeiten hat dieses Nutschenverfahren den Nachteil geringerer Ausbeuten, sie wachsen mit der Zeitdauer der Extraktion; wir gewinnen z. B. aus 1 kg Brennesselmehl beim Ausziehen auf der Nutsche folgende Ausbeuten: Extraktionszeit Extrakt in ccm Chlorophyll in g 7,x (Quantität. Extrakt) 15 Min. 700 2,9 19 >• 800 3.3 25 ,, 850 3-7 120 „ 800 4*4 3 Tage 6000 7-1 Daher arbeiten wir am besten auf der Nutsche mit einer Ex- traktionsdauer von 2-3 Stunden für die Charge von 2 kg. Die Menge des Lösungsmittels braucht dabei nicht größer au sein als Die Extraktion der Farbstoffe. 69 bei der Herstellung von Doppelextrakten, wir reichen aus mit 1,5 1 pro Kilogramm Mehl. Beim Arbeiten mit dem Perkolator muß man zwischen Vor- extraktion und Extraktion das Material wieder trocknen; diese umständliche und für das Chlorophyll ungünstige Operation läßt sich nicht umgehen, weil sonst beim Extrahieren der durch die Vorbehandlung kompakter gewordenen Blattsubstanz Verstopfung ein tritt. Auf der Nutsche lassen sich hingegen Vorextraktion und Extraktion einfach verbinden; diese Extraktionsmethode bietet daher, abgesehen von ihrer Einfachheit, besonderen Vorteil bei der Kombination der Vorextraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln und der Extraktion mit Alkohol. Bei der Arbeit in größerem Maßstab füllen wir einfacher das Blattpulver, ohne es zuvor mit Alkohol anzufeuchten, in die Nutsche ein. Unter stetem Saugen mit dem Maschinenvakuum wird das Mehl gleichmäßig auf der Nutsche verteilt. Bei einiger Übung und sorgfältigem Arbeiten gelingt es, auch eine große Steinzeugnutsche mit 20 kg Pulver zu füllen, ohne daß bei der Extraktion Unregelmäßigkeiten Vorkommen. Auf den Reinheitsgrad des Chlorophylls üben, wie die folgenden Beobachtungen zeigen, Extraktionsmethode und Extraktionsdauer nur wenig Einfluß aus, weniger als Verschiedenheiten der Ernten. Extraktion von 1 kg käufl. Brennesselmehl Extraktions- zeit Extrakt in ccm Rück- stand in g Rein- heitsgrad Chloro- phyll in g 1. Perkolate: a) lang 48 Stunden 1000 33,6 16 5,5 b) kurz, 1. Abfluß 1 Stunde 120 4,9 12 0,6 c) kurz, 2. Abfluß 2 Stunden 220 12,3 12 1-5 2. Flaschenextrakte : a) Doppelextrakte. 48 Stunden 1060 34,8 16 5-5 b) einf. Extrakte . 48 Stunden 1600 46,6 13 6,2 c) rasche Extrakte 10 Minuten 1300 22,0 13 2,8 d) rasch. Extrakte 30 Minuten 1600 21,6 16 3,5 3. Nutschenextrakte: a) rasch 15 Minuten 5°° 12,5 17 2,1 b) mäßig rasch . . 2 Stunden 800 31,4 14 4-4 Am günstigsten für den Reinheitsgrad des Chlorophylls wirkt die Vorbehandlung mit Benzol, weniger günstig die mit Petroläther; JQ R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. da aber für die Isolierung des Chlorophylls die petrolätherische Lösung frei von Benzol sein muß, verdrängen wir bei der Vor- extraktion das Benzol aus dem Blattmehl durch Petroläther. Da- für waren pro Kilogramm Brennesseln 3 1 Benzol und 1 — 11/2 1 Petroläther erforderlich und die Behandlung beanspruchte für eine Charge von 2 kg 2 — 3 Stunden. Den Gewinn für den Reinheitsgrad des in Petroläther über- geführten Chlorophylls zeigt die folgende Tabelle. Die Versuche 1 bis 4 beziehen sich auf die petrolätherische Rohchlorophyllösung, Nummer 5 auf diese Lösung nach einmaligem Waschen mit !/2 Volumen 90 prozentigem Holzgeist. Die Zahlen von Nr. 5 sind Mittelwerte aus 4 Versuchen. Nummer Vor- extraktion Extrakt Extrakt Petrolätherische Chlorophyllösung Chloro- phyll in g Rück- stand in g Rein- heits- grad Chloro- phyll in g Rück- stand in g Rein- heits- grad 1 Keine Alkohol 4.9 37-3 13 3.5 11,2 31 2 Keine Holzgeist 3.7 38,8 IO 2,4 8,8 27 3 Petroläther Alkohol 5-3 35>° 15 3-6 9.8 37 4 Petroläther Holzgeist 3.7 41,2 9 2,3 8,2 28 5 Benzol Alkohol 6,1 43-7 14 3-9 8,0 49 c) Die Grundlagen der neuen Extraktionsmethode1). Eine unerwartete Verbesserung von großer Bedeutung gegen- über den beschriebenen Extraktionsverfahren ist die Anwendung von Lösungsmitteln mit erheblichem Wassergehalt. Durch die mit wasserhaltigen Solvenzien entstehende Salzlösung (z. B. KN03) wird der Zustand des in den Chloroplasten kolloidal gelösten Chlorophylls verändert, es wird leicht löslich. Außerdem wird die Menge der in Lösung gehenden Begleit- stoffe vermehrt; nicht mehr das Lösungsmittel selbst, sondern seine Mischung mit den Begleitstoffen wird das eigentliche Ex- traktionsmittel für das Blattgrün, und zwar ein so ausgezeich- netes, daß damit die Farbstoffe rasch und leicht fast quantitativ q Unveröffentlicht. Die Extraktion der Farbstoffe. 71 ausgezogen werden. Es scheint, wie wenn geradezu die ganze Chloroplastensubstanz vom Lösungsmittel mit geeignetem Wasser- gehalt weggeführt würde. Die Begleitstoffe der Pigmente sind zu unterscheiden als solche, die in Petroläther leicht löslich und in wasserhaltigen Solvenzen schwer löslich sind und andere von reziproker Löslichkeit. Wasser- freie Lösungsmittel extrahieren viele Begleitstoffe des Chlorophylls, die diesem in den Löslichkeitsverhältnissen gleichen und ihm da- her hartnäckig folgen. Die wasserhaltigen Extrakte hingegen sind arm an Begleitstoffen, die mit dem Chlorophyll beim Entmischen in den Petroläther übergehen, und an denjenigen, die sich beim Ausfällen des Chlorophylls mit Wasser oder bei der Abscheidung des Phäophytins niederschlagen. Quantitative Bestimmungen. Um die Wirkung der wich- tigsten Lösungsmittel, wasserfrei und mit wechselndem Wasser- gehalt, quantitativ zu vergleichen und die besten Bedingungen für die Extraktion zu finden, haben wir die Arbeitsweise des prä- parativen Maßstabes eingehalten: die Mengen der Pflanzenmehle und Lösungsmittel und die Zeit der Extraktion. Mit jedem Extraktionsmittel, auch dem wasserfreien, wäre es bei genügend langer Versuchsdauer und unbeschränktem Verbrauch an Lösungsmitteln möglich, allen Farbstoff zu extrahieien. Für den Vergleich wird die Menge der Lösungsmittel ziemlich gleich- mäßig so gewählt, daß sie im günstigsten Falle zur vollständigen Extraktion hinreicht und die Zeit, wie sie eben hierfür erforder- lich ist. Daher muß für die gleichmäßige Durchführung der Ver- suche die Filtration bei einigen wasserfreien Lösungsmitteln ver- zögert werden, weil diese an sich zu rasch durchlaufen. Um gleiche Volumina der Extrakte zu bekommen, ist noch zu berücksich- tigen, daß die Lösungsmittel ungleich vom Pflanzenmehl zurück- gehalten werden, die wasserhaltigen reichlicher. Die Unterschiede im Chlorophyllgehalt würden vergrößert, wenn wir von den Extrakten nur die erste Hälfte vergleichen würden; bei wasserhaltigem Aceton enthält sie schon den größeren Teil des Farbstoffes, während bei den wasserfreien Lösungsmitteln die Extraktion gleichmäßig vom Anfang bis zum Ende verläuft. 72 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Aber für die Anlehnung an die präparative Methode ist der Ver- gleich der ganzen Extraktion wichtiger. Für den folgenden Vergleich der Extrakte mit Aceton, Alkohol, Holzgeist und Äther ist ein von uns selbst Anfang Mai gesammeltes Quantum Brennesseln verwendet worden, das nach dem Trocknen und Mahlen (15,5 kg) noch einige Tage bei 30 — 40 0 zur voll- ständigen Trocknung ausgebreitet worden ist. Dabei wurden 900 g Feuchtigkeit abgegeben; das Material der Versuche ent- hielt dann nur noch 1,3% Feuchtigkeit, es färbte daher Benzol nicht an. x/2 kg von diesem Brennesselmehl wurde unter Saugen mit zwei Wasserstrahlpumpen auf eine Nutsche (von 24 cm innerem Durch- messer) über Koliertuch aufgeschichtet und etwas fest gestopft. Wir gossen nun, ohne zu saugen, V2 1 Lösungsmittel auf und ließen es 5 Minuten lang in das Mehl einsickern. Dann wurde X/41 davon nach- gefüllt und bei allen Versuchen ungefähr gleich mit einer Wasser- strahlpumpe gesaugt, nachdem, um ein starkes Verdunsten des Ex- traktionsmittels während des Absaugens zu verhüten, 50 ccm des betreffenden wasserfreien Lösungsmittels in den Absaugekolben ge- geben worden waren. Man säugt nur so schwach, daß das Lösungs- mittel im Kolben nicht zu lebhaftem Sieden kommt. Nach 5 Mi- nuten füllten wir wieder 1/i 1 auf und saugten weitere 10 Minuten ab. Auch zwei folgende Viertelliter ließen wir in je 10 Minuten durchfließen und zum Schlüsse saugten wir mit beiden Wasser- strahlpumpen kräftig ab. Wegen des Aufquellens der Blattsubstanz mit wasserhaltigen Solvenzien ist so viel Zeit erforderlich. Wir arbeiten mit il/2 1 Lösungsmittel immer auf 0,8— 0,9 1 Ex- trakt hin. Mit den wasserfreien Lösungsmitteln bekommt man leicht so viel und bricht dann den Versuch ab; ein etwas kleineres Volumen bei den stark wasserhaltigen Lösungsmitteln macht keinen Fehler aus, weil hier der letzte Teil des Extraktes sehr arm an Chlorophyll wird. Wenn sich bisweilen im Saugkolben etwas Rohchlorophyll aus- schied, so wurde es mit Aceton aufgenommen und mit den Ex- trakten vereinigt. In den meisten Fällen brachten wir das Volumen derselben auf 1 1 und bestimmten das Chlorophyll colorimetrisch Die Extraktion der Farbstoffe. 73 durch Verseifen mit Alkali und Vergleich mit krystallisiertem Chlorophyll nach der Methode von Kap. IV, Abschn. i. Die Ergebnisse des Vergleichs, welche von den Versuchs- bedingungen und dem Pflanzenmaterial wenig beeinflußt werden, enthält die folgende Tabelle, und die graphische Darstellung der Fig. 3 gibt dafür ein anschauliches Bild. Die Zahl der Bestimmungen reicht zwar nicht aus, um die Kurven in ihren Einzelheiten genau zu bestimmen, aber ihr Verlauf ist durch eine wiederholte Ver- suchsreihe bestätigt worden. T abelle. Die angewandten Brennesseln enthalten in 1 kg des trockenen Mehles 10 g Chlorophyll. Volum- prozentigkeit Chlorophyllgehalt der Extrakte in g Aceton Äthylalkohol Methylalkohol Äther 100 3.05 5-4 6,2 1,6 97 7,7° — — — 95 — 6,6 2,9 — 90 9-45 8,5 — ' 85 9.75 7>5 0,4 — 80 9.15 6,8 — — 75 7,80 4.2 — — 70 7,10 — — ' — ‘ ’ 65 5,60 — — — Während die wasserfreien Extraktionsmittel sich in die Reihen- folge ordnen: Äther, Aceton, Äthylalkohol, Methylalkohol, stellt schon ein Wasserzusatz von nur 1% Aceton, Äthyl- und Methyl- alkohol in ihrer Extraktionswirkung gleich (Chlorophyllgehalt 5V4 g)- Ein größerer Wassergehalt kehrt die Reihenfolge um, Äthylalkohol wird übertroffen von Aceton. Auf diesen Ergebnissen beruhen unsere Methoden für die Iso- lierung des Chlorophylls und der begleitenden Pigmente und für die Gewinnung von Phäophytin. Die Extraktion mit Aceton erfordert einen Wassergehalt von 10 — 20% Wasser. Das Optimum liegt bei 15 Volumprozent Wasser. Dennoch wenden wir für die Extraktion 80 prozentiges Aceton an und erzielen dann mit etwas mehr Lösungsmittel eine ebenso 74 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. günstige Chlorophyllausbeute. Mit dem wasserreicheren Aceton sinkt die Menge der petrolätherlöslichen Begleitstoffe, die Isolierung des Chlorophylls wird erleichtert. Für Alkohol finden wir das Optimum bei einem Wassergehalt von io Volumprozent. Dies gilt auch für käufliches Brennessel- mehl, das für die Gewinnung von Phäophytin wichtig ist und für diesen Zweck mit 90 prozentigem Al- kohol ausgezogen wird. Vergleichsweise extrahierten wir je 1 kg von käuflichem Brennesselmehl, das nur 5,1 g Chloro- phyll enthielt, ohne es nachzutrocknen, auf der Nutsche mit ix/2 1 Alkohol von wechselndem Wassergehalt; bei dem feineren, spezi- fisch schweren, aber 0 3 5 10 Voi.jprocent Wasser “ ° farbstoffarmen Ma- Flg- 3- terial genügt dieses Volumen. Der Chlorophyllgehalt der Extrakte (0,9 1) betrug bei 95 prozentigem Alkohol . . . 4,28 g 90 ,, „ • • • 5>°4 g 85 >> >> • • 4>67 §• d) Extraktionsmethode mit wasserhaltigen Lösungs- mitteln1). Verfahren für getrocknete Blätter. Die Extraktion nach der neuen Methode geschieht mittels der Nutsche unter Anlehnung an das oben beschriebene Nutschenverfahren. 10 r Üe' 5' o 3 5 3 3 / ‘"N — / / / / / — \ s ‘Xv > / / / / ( \ p \ \ i 1 \ 1 * 1 \ \ \ V \ \ \ \ ~ t % 1 Aelhs r — % • X \ 1 ) Unveröffentlicht. Die Extraktion der Farbstoffe. 75 Fig. 4. Die Hauptbedingungen für die Ausführung der Methode ist die Anwendung niedriger Schichten von Blattmehl, damit die Extrakte nicht zu konzentriert und sirupös werden. Sie bilden sonst in den tieferen Schichten des Pulvers Ausscheidungen von Chlorophyll und anderen Stoffen, welche die Filtration verzögern und gänzlich zum Stillstand bringen können. Auch bringt eine höhere Schicht den Nachteil mit sich, daß die gebildeten starken Extrakte mehr und mehr von den Fetten und Wachsen mit- nehmen, die den Reinheitsgrad der Chlorophyllösung herabdrücken. Wir ver- wenden daher, gleichgültig ob die Blatt- mehle chlorophyllreich oder -arm, fein oder gröber und daher spezifisch leichter sind, nie höhere Schichten als 4 — 5 cm in festgesaugtem Zustand, und zwar auf sehr breiten wie auf kleinen Nutschen. Da die Steinzeugnutschen der Tech- nik für ein solches Verfahren ungeeignet sind, haben wir von den Ton- und Steinzeugwerken, A.-G., Charlottenburg, nach neben- stehender Zeichnung (Fig. 4) Nutschen von 50 cm Echtem Durch- messer hersteilen lassen, die mit 2 — 4 kg Blattmehl beschickt werden können. Das Verfahren wird in der Handhabung etwas verschieden, je nach dem Chlorophyllgehalt und der Feinheit der Blattmehle. Da die Extraktion scharf schichtenweise nach unten vorrückt und jede Schicht sogleich erschöpft wird, so untersuchen wir durch eine Stichprobe mit dem Spatel, wie tief das Auslaugen gegangen und das Material entfärbt, d. h. gelblich oder grau geworden ist. Die chlorophyllreichen, selbstgesammelten Brennesseln erfordern viel mehr Lösungsmittel als die käuflichen Mehle; von diesen lassen sich größere Chargen bewältigen. Bei kleinen Mengen wird ähnlich gearbeitet wie bei den oben angeführten quantitativen Versuchen; z. B. 1/2 kg von gutem Ma- terial mit 1,5 — 1,6 1 Lösungsmittel war in 1/2 Stunde ausgezogen, wodurch 0,9 1 Extrakt mit 4x/4 — 4x/2 g Chlorophyll erhalten wer- den. Mit dem Mehl chlorophyllreicher Blätter arbeiten wir in 76 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. keiner größeren Charge als 2 kg auf der Steinzeugnutsche. Diese Füllung, die mit dem Maschinenvakuum gut festgesaugt wird, extrahieren wir unter abwechselndem Einsickern und Absaugen mit 6 1 78 — 80 prozentigem Aceton, die in mehreren Portionen auf- gegossen werden. Die Versuchsdauer ist x/2 — 3/4 Stunde. Die Menge des Extrakts beträgt 4 1 mit einer Chlorophyllausbeute von 16 bis 17 g. Das Mehl wird strohgelb, nur wenige Stellen der unteren Schicht sind noch grünlich. Von technischem Brennesselmehl gehen 4 kg auf eine Charge. Sie erfordern z. B. 6 — 8 1 von 90 prozentigem Alkohol, die in 20 — 30 Minuten, also rascher wie wasserhaltiges Aceton, filtrieren, und 3V2 — 5V2 1 Extrakt mit einem Chlorophyllgehalt von 19 bis 24 g geben. 12 solche Chargen kann ein Arbeiter im Laboratorium mit 2 Nutschen täglich herstellen (vgl. die Anwendung für Phäo- phytin im 3. Abschnitt des XIII. Kapitels). Das Chlorophyll ist in der Acetonlösung vor Allomerisation geschützt; die beschriebenen Extrakte liefern daher Präparate, deren Spaltungsprodukte besonders rein sind. Aber auch im alko- holischen Extrakt ist infolge der raschen Herstellung und infolge des Wassergehalts das Chlorophyll wenig gefährdet. Verarbeitung frischer Blätter. Auch frische Blätter wer- den am besten mit 80 prozentigem Aceton extrahiert. Für die Verarbeitung verschiedener Pflanzen in ungetrocknetem Zustand ist oben (Abschn. 1) auf eine Vorbehandlung mit wasserhaltigem Alkohol hingewiesen worden, wodurch die Zerkleinerung erleichtert wird. Das übliche Pflanzenmaterial, nämlich Brennesseln, kann man aber einfacher und rascher ohne weiteres durch eine geeignete Syenitwalzenmühle mit Motorantrieb zerkleinern und dann einer Vorextraktion mit wenig Aceton unterwerfen, um das Material zu entwässern, Pflanzenschleime zu entfernen und Enzymwirkungen zu hemmen. Infolge des größeren Volumens ist der Verbrauch an Lösungsmitteln bedeutend und die Extrakte werden verdünnt ; ihr Reinheitsgrad ist aber dank der Vorbehandlung weit höher, z. B. 21, während er in entsprechenden Extrakten guter trockener Blätter 8 — 10 zu sein pflegt. 2Y2 kg frische Brennesseln werden dreimal bei allmählich enger Die Extraktion der Farb3toffe. 77 gestellten Walzen gemahlen, was Va Stunde erfordert. Dabei ent- steht ein klebriger, tief olivbrauner Brei, ohne daß indessen das Chlorophyll geschädigt wird. Da man die Blattsubstanz in diesem Zustand nur schwierig und mit Verlust von Farbstoff abpressen kann, schütteln wir sie zuerst mit 1V2 1 Aceton in einer Pulver- flasche kurz an und saugen auf der Nutsche ab, die gelbe bis bräunliche Flüssigkeit enthält kein Chlorophyll, sie färbt Äther nicht an. Den Rückstand pressen wir in Koliertuch eingepackt mit einer Buchnerschen Presse bei ungefähr 200 Atmosphären Druck; der Preßkuchen wiegt beispielsweise 0,8 kg, wovon 0,5 kg Trockensubstanz zu rechnen sind. Der Kuchen wird zerbröckelt und passiert wieder zweimal die Syenitwalzenmühle. Dann schüt- teln wir das Pulver 5 Minuten lang in einer Flasche mit 1 /2 1 Aceton an, das sich mit der zurückgehaltenen Feuchtigkeit der Blattsubstanz auf 80 Volumprozent verdünnt und setzen noch einen weiteren Liter 80 prozentiges Aceton hinzu. Die lösende Wirkung der Beimischungen läßt sich hier nicht in demselben Maße ausnützen wie beim trockenen Mehl und die Extraktion kann nicht einfach auf der Nutsche vorgenommen werden, das Lösungsmittel würde zu rasch aus der voluminösen Masse ab- fließen. Wir saugen schließlich den dünnen Brei wieder auf der Nutsche scharf ab und waschen ihn dreimal nach mit je x/2 1 80 prozentigem Aceton unter abwechselndem Macerieren und Saugen. Das Mehl bleibt nahezu frei von grünem Pigment zurück. Der Extrakt, dessen Gewinnung im ganzen ix/2 Stunden dauert, enthält 4,7 g Chlorophyll in 3,7 1; infolge seines Wassergehaltes ist er arm an den störenden Begleitstoffen. Die Methode hat sich besonders bewährt bei der Verarbeitung von Braunalgen (Fucus). Nach dem ersten Zerkleinern wird durch die Vorextraktion mit Aceton eine sehr große Menge lästiger Schleimsubstanzen entfernt, welche die Extraktion und später die Entmischungen stören und die Isolierung der Farbstoffe sehr er- schweren würden. IV. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. Unsere quantitative Analyse der beiden grünen und der zwei gelben Pigmente der Chlorophyllkörner beruht auf ihrem colori- metrischen Vergleich mit Lösungen von bekanntem Gehalt und findet Anwendung zur Bestimmung der Mengen und des Verhält- nisses dieser Farbstoffe im Blatte, in Extrakten oder in Präparaten. Die Bestimmung des Verhältnisses der Komponenten a und b des Chlorophylls haben Willstätter und Isler in einer den Grund legenden Untersuchung behandelt, deren Methodik wir weiter ent- wickeln. Dazu kommt die Behandlung der neuen Aufgabe, das Mengenverhältnis der zwei gelben Pigmente zu einander und zu den grünen zu bestimmen. Wir lassen die Methoden vorangehen, die der quantitativen Be- stimmung des Chlorophyllgemisches dienen und diejenigen folgen, welche das Komponentenverhältnis der grünen und der gelben Farbstoffe betreffen. i. Bestimmung des Chlorophylls (a + b)1). Die Rohchlorophyllösung enthält die vier Pigmente von ver- schiedener Farbe und Farbintensität in Mengenverhältnissen, die vom Lösungsmittel beeinflußt werden und die von der Pflanzenart und sogar von der Ernte einer und derselben Pflanze abhängig sein können. Annähernd gleich ist das Mengenverhältnis der Kom- ponenten bei den Extrakten einer Pflanze; man kann daher durch i) Ältere Angaben darüber siehe Ann. d. Chem. 371, n [I9°9l un£l 380, 177 [1911]- Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 79 den Vergleich derselben die relative Bestimmung ihres Chlorophyll- gehaltes ausführen. Für die Untersuchung von Extrakten un- gleicher Farbnuance, also z. B. aus verschiedenen Pflanzen, ist es erforderlich, die Farbstoffe durch Verseifung mit Alkali in die in- differenten gelben und in die Alkalisalze der grünen Pigmente zu trennen. Die erhaltenen Chlorophyllinlösungen ermöglichen die relative Bestimmung des Farbwertes und ferner erlaubt ihr Vei- gleich mit einer alkoholischen Lösung von bekanntem Chlorophyll- gehalt die absolute Bestimmung des Farbstoffgehalts. Auch das Verhältnis der blaugrünen zur gelbgrünen Kompo- nente des Chlorophylls ist wechselnd in Extrakten oder Präparaten. Deshalb wählen oder mischen wir das Vergleichspräparat von Chlorophyll oder Phäophorbid im Komponentenverhältnis ähnlich der zu untersuchenden Probe. a) Relative Bestimmung. Um zu ermitteln, wieviel Prozent des aus einem Pflanzen- material extrahierbaren Chlorophylls in eine Lösung übergegangen ist, vergleicht man diese mit dem quantitativen Auszug einer ge- wogenen kleinen Menge des nämlichen Materials. Dabei gibt es beim colorimetrischen Vergleich keine oder nur unerhebliche Nuancendifferenzen. Neben der Verarbeitung eines Blättermehles in großem Maß- stabe beschicken wir z. B. einen kleinen Perkolator mit 100 oder 200 g desselben Pulvers und perkolieren mit Alkohol erschöpfend, also bis der Ablauf farblos ist, oder wir extrahieren 10 — 5° S Blatt- mehl auf einer kleinen Nutsche mit 85 prozentigem Aceton quanti- tativ, was auch bei nicht sehr feinem Mehl in 1 Stunde erreicht wird. Für den colorimetrischen Vergleich verdünnt man die Ex- trakte am zweckmäßigsten mit dem Lösungsmittel so, daß 1 kg Blattpulver 200 1 Extrakt gibt. Das Perkolat aus 36 kg Brennesseln (angesetzt mit dem Nach- lauf einer vorangehenden Charge) enthielt 79,3%, der Nachlauf dieses Perkolates 10,9% des Gesamtchlorophylls. Das Perkolat einer Charge von nur 3 kg Brennesseln enthielt 78,8% der mög- lichen Ausbeute. 8o R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Auf dieselbe Weise mit Hilfe quantitativer Auszüge gewogener Blattmengen lassen sich auch verschiedene Lieferungen oder Ernten derselben Pflanze, ferner frische und getrocknete Blätter der nämlichen Pflanze und auch die Blätter verschiedener Pflanzen vergleichen. Je io g Mehl von getrockneten selbstgesammelten und von technischen Brennesseln wurden auf einer kleinen Nutsche im Laufe einer Stunde mit 200 ccm 85 prozentigem Aceton erschöpfend extra- hiert. Man verdünnte den Extrakt auf 200 ccm mit demselben Lösungsmittel und von dieser Lösung 10 ccm mit 95 prozentigem Alkohol auf 100 ccm. Beim colorimetrischen Vergleich dieser Lösungen ergab sich, daß das Mehl aus selbst gesammelten Blättern 1,71 mal so viel Chlorophyll enthielt, wie technisches Brennesselmehl. Die Chlorophyllmengen in den quantitativen Extrakten wurden auch durch Vergleich mit einer Lösung von bekanntem Chlorophyllgehalt absolut bestimmt. Die gefundenen Werte ließen das Verhältnis von Chlorophyll aus selbstgesammel- tem zum Chlorophyll aus technischem Material wie 1,70 : 1 be- rechnen. Die relative Wertbestimmung genügt auch für eine absolute Bestimmung des Chlorophyllgehaltes von Lösungen, nachdem man den Chlorophyllgehalt eines Blattmehles einmal absolut bestimmt hat. b) Absolute Bestimmung. Die quantitative Bestimmung wird durch den Vergleich mit reinem Chlorophyll ausgeführt. Früher stand dafür nur sogenanntes krystallisiertes Chlorophyll (Äthylchlorophyllgemisch) zur Ver- fügung. Der Vergleich mit diesem ermöglichte es, die Steigerung des Reinheitsgrades bei der Isolierung von natürlichem Phytyl- chlorophyllidgemisch zu kontrollieren und schließlich das reine Präparat herzustellen. Heute sind die beiden Chlorophyllgemische in reinem Zustande gleich leicht zugänglich und wir verwenden beide zum Bereiten der colorimetrischen Vergleichslösungen. Eine geeignete Konzentration der Chlorophyllnormallösung er- hält man mit 0,0500 g Phytylchlorophyllid oder 0,0362 g Äthyl- Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 8l chlorophyllid1) in 2 1 Alkohol. Man löst daher 0,0500 g Chlorophyll mit einem Zuschlag von 2,5% für Trockenverlust, also praktisch 0,0513 g oder 0,0362 g mit Zuschlag von 5% Ti ockenverlust (100 , Hochvakuum), also 0,0380 g Äthylchlorophyll in 100 ccm absolutem Alkohol und kann diese Lösung im Dunkeln aufbewahren. Zum colorimetrischen Vergleich verdünnt man davon 10 ccm auf 200 ccm. , Die Versuchslösung wird annähernd auf dieselbe Konzentration gebracht. Die Übereinstimmung in den Farbnuancen bewirkt man durch die Auswahl eines Vergleichspräparates mit ähnlichem Kompo- nentenverhältnis, wie im Versuchsobjekt oder man mischt die iso- lierten Komponenten a und b in solchem Verhältnis. Die Wertbestimmung einer Rohlösung oder eines Rohproduktes erfordert die quantitative Trennung der grünen von den gelben Pigmenten, die Intensität und Farbnuance beeinflussen würden. Eine kleine gemessene Probe (10 ccm) z. B. eines Aceton- oder Alkoholextraktes wird mit Äther auf 100 ccm verdünnt; von der Mischung gibt man 10 ccm in einen Scheidetrichter und verdünnt weiter mit Äther etwa aufs Fünffache. Im Falle eines alkoholischen Extraktes kann man die verdünnte Ätherlösung ohne weiteres mit 4 — 5 ccm methylalkoholischem Kali tüchtig durchschütteln, wobei die braune Phase eintritt; enthält aber die Lösung Aceton, so muß dieses unter Zusatz von etwas Methylalkohol vor der Verseifung mit Wasser vollständig aus dem Äther herausgewaschen werden, weil Chlorophyllinalkali von Aceton verdorben wird. Nach dem Wiederkehren der reingrünen Farbe gießt man unter Umschütteln langsam Wasser in den Scheide trichter und führt das anfangs von der methylalkoholischen Lauge aufgenommene Xanthophyll wieder in Äther über. Man läßt die wässerig alkalische Chlorophyllin- lösung in einen 200 ccm-Meßkolben fließen, schüttelt die ätherische Lösung der gelben Pigmente noch etwas mit Wasser aus und ver- dünnt die rein grüne Lösung mit Alkohol auf 200 ccm. Das Chloro- phyllin vergleichen wir nun mit der oben beschriebenen Lösung von bekanntem Gehalt im Colorimeter nach Duboscq, wobei unter x) Der Berechnung sind die Molekulargewichte der Komponente a zugrunde gelegt. Willstä t ter-S toll , Chlorophyll. 6 82 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Vertauschen der Gefäße mehrere Ablesungen gemacht und die Mittelwerte bestimmt werden. Der Vergleich des verseiften Chlorophylls mit dem unverseiften der Vergleichslösung bringt keinen Fehler mit sich: io ccm einer ätherischen Lösung von reinem Chlorophyll (0,0500 g in 100 ccm) wurden auf 200 ccm mit Alkohol verdünnt, weitere 10 ccm mit 3 ccm methylalkoholischem Kali verseift, mit etwas Wasser auf- genommen und gleichfalls mit Alkohol auf 200 ccm gebracht. Die beiden Lösungen stimmten dann in der Intensität gut überein, nur war die Nuance des Chlorophyllinlcaliums etwas blauer. Beispiele. 2 kg Mehl mit 7% Feuchtigkeitsgehalt aus selbst- gesammelten Brennesseln gaben auf einer Nutsche von 50 cm Durchmesser mit 6 1 90 prozentigem Alkohol rasch ausgezogen 4,35 1 Extrakt. Eine 10 ccm-Probe desselben ist mit Äther auf 100 ccm verdünnt und aus einem Zehntel davon sind 200 ccm Chlorophyllinlösung erhalten und mit der Vergleichslösung be- stimmt worden. Die Mittelwerte der Colorimeterablesungen be- trugen 50 mm für die Versuchs-, 35,5 mm die Vergleichslösung. Demnach enthielt der Extrakt 4,35 ' ‘5- = 15,5 g Chlorophyll d. i. 7,75 g pro Kilogramm Mehl. Ein quantitativer Nutschenextrakt (200 ccm) aus 10,0 g des selben Mehles mit 85 prozentigem Aceton gab aus einer 10 ccm- Probe ohne Teilung 200 ccm Chlorophyllinlösung. Die Colorimeter- schicht der Vergleichslösung betrug diesmal 43 mm. Der Chloro- phyllgehalt der angewandten 10 g beträgt daher 0,086 g, d. i. 8,6 g im kg Blattmehl. Daraus ergibt sich für den in größerem Maß- stab gewonnenen Extrakt eine Chlorophyllausbeute von 9°%- Von frischen Blättern wird für die Bestimmung des Chlorophyll- gehalts eine gewogene Menge mit Quarzsand zerrieben und dann auf der Nutsche mit ca. 90 prozentigem Aceton erschöpfend extra- hiert. Man führt eine Probe in Äther über, wäscht das Aceton tun- lichst heraus und trennt die gelben Begleiter durch Verseifen des Chlorophylls von den grünen ab. Der Reinheitsgrad von Chlorophyllpräparaten, die frei oder an- nähernd frei von gelben Pigmenten sind, ebenso von Darstellungen Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 83 der Chlorophyllinsalze wird durch Vergleich einer gewogenen Substanzmenge in Alkohol mit unserer Lösung von bekanntem Gehalt bestimmt. Für Rohchlorophyllpräparate, die viel gelbe Pigmente als Verunreinigungen enthalten, wenden wir die Ver- seifungsmethode an. Rohchlorophyll erhielten wir aus gutem Biennesselmateiial in einer Ausbeute von 6,5—7 g Pr0 Kilogramm Mehl. In diesem Falle fanden wir das Verhältnis der Colorimeterschichten wie 50 • 45 bis 47,5. Die Präparate waren also 90 — 95prozentig. Präparate aus technischem Brennesselmehl erforderten als Farb- äquivalent 42 — 40 mm Vergleichslösung; sie waren mit 16 20% farblosen Begleitern verunreinigt. Die quantitative Chlorophyllbestimmung hat die ersten Ver- suche der Isolierung von Chlorophyll geleitet und findet auch heute bei der Gewinnung von Chlorophyllpräparaten häufige Anwendung, um den Reinheitsgrad von Lösungen zu ermitteln. Wir bestimmen nach jeder Reinigungsoperation den Trockenrückstand durch Ein- dampfen einer Probe im Vakuum bei 100 0 und den absoluten Chlorophyllgehalt der Lösung. Ein Rohextrakt mit 85 prozentigem Aceton zur Darstellung von Reinchlorophyll enthielt 16,8 g Chlorophyll und 135,2 g bei 100 0 im Vakuum nicht flüchtigen Rückstand; er war also i2prozentig in bezug auf Chlorophyll. Nach den folgenden Reinigungsopera- tionen steigerte sich der Reinheitsgrad auf ca. 45, dann auf 65%. Bei den zwei Komponenten des Phäophytins ist der Farbunter- schied noch größer als beim Chlorophyll; a ist olivgrün, b rot- braun. Es ist daher beim Phäophytin noch wichtiger, die Ver- gleichslösung durch Mischen der einheitlichen Methylphäophorbide oder Phäophytinkomponenten dem zu untersuchenden Phäophytin- präparat anzupassen, dessen Komponentenverhältnis mit einer Spal- tungsprobe geschätzt wird. Die gewöhnliche Vergleichslösung enthält 0,0500 g Phäophytin vom Komponentenverhältnis 2,5 oder 0,0350 g Methylphäophorbid, nämlich 0,0250 ga + 0,0100 g b in 25 ccm Chloroform gelöst und mit Äther auf 200 ccm, davon 10 ccm nochmals aufs Zehnfache verdünnt. 6* 84 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, 2. Das Verhältnis der Komponenten a und b des Chlorophylls. a) Zur Geschichte der Methode.1) Da es gelingt, das Chlorophyll aus beliebigen Pflanzen ohne Bildung von Nebenprodukten in Phytochlorin e und Phytorhodin g überzuführen, so ermitteln wir das Verhältnis der Komponenten durch die quantitative Bestimmung der Ausbeuten an diesen beiden Verbindungen beim Abbau. Sie kann am einfachsten und mit den kleinsten Mengen erfolgen durch colorimetrischen Vergleich der bei der Spaltung erhaltenen Lösungen mit den bekannten reinen Sub- stanzen. Wenn es sich um das Komponentenverhältnis in isolierten Präparaten, im Chlorophyll oder Phäophytin handelt, so hängt die Bestimmung hauptsächlich ab von der quantitativen Ausführung der Hydrolyse in der einzigen Richtung zu den zwei normalen Spaltungsprodukten und von der quantitativen Trennung beider. Um die Methode auf die Untersuchung des Pigmentes der grünen Blätter zu übertragen, kommt als eine weitere Bedingung hinzu, daß die bei der Extraktion möglichen Fehler vermieden werden. Bei den ersten Beobachtungen über das Komponentenverhält- nis haben Willstätter und I sie r viele Phäophytinpräparate über- einstimmend gefunden, einzelne aber stark abweichend, besonders das Phäophytin aus Pinus und Melisse viel reicher an der Kompo- nente b. Eben durch diese scheinbaren Ausnahmen sind haupt- sächliche Fehler der Methode aufgedeckt worden, nämlich: 1. Schon bei der Extraktion des Chlorophylls aus den Blättern kann eine Fraktionierung des Gemisches der beiden Komponenten stattfinden. Es ist daher erforderlich, wenn die Bestimmung für den Farb- stoff im Blatte gelten soll, denselben quantitativ auszuziehen. 2. Je nach der Verdünnung der Extrakte, ihrem Wassergehalt und nach der Menge von Begleitstoffen scheidet sich das Phao- phytin mehr oder weniger unvollständig aus. Es hat sich gezeigt, [1911] und Ann. d. Chem. 390, 290 [1912]. x) Ann. d. Chem. 380, 159 Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 85 daß der abgeschiedene und der gelöste Anteil im Komponenten- verhältnis differieren. Das Gelöste ist nämlich reicher an der Komponente a. Es ist daher nötig, wenn die Bestimmung für den Farbstoff im Extrakte gelten soll, denselben quantitativ als Phäophytin zur Verseifung zu bringen. 3. Auch bei der Umscheidung des Phäophytins, z. B. aus Chloro- form mit Alkohol erfolgt eine Verschiebung im Komponenten- verhältnis im nämlichen Sinne wie bei der Ausscheidung. Wir ver- zichten daher auf die Wägung des Phäophytins, also auf seine Reinigung. Das Komponentenverhältnis des isolierten Phäophytins ist von Interesse für die Beurteilung gegebener Präparate, aber es drückt nicht das Komponentenverhältnis des Chlorophylls aus. Nur wenn die Ausbeute irgend eines Phäophytins einen hohen Bruchteil der Theorie beträgt, muß sich sein Komponentenverhält- nis demjenigen des Chlorophylls nähern. Daher sind die bei un- seren in größerem Maßstab dargestellten Phäophytinpräparaten gefundenen Werte annähernd brauchbar. Zur Bestimmung des Komponentenverhältnisses für das Chloro- phyll der verschiedenen Pflanzen gründen Willstätter und Isler daher ihre Methode auf die vollständige Extraktion des Farbstoffs, seine verlustlose Überführung in Rohphäophytin, dessen möglichst glatte Verseifung und die quantitative Isolierung von Chlorin und Rhodin. Mittels dieser Methode haben Willstätter und Isler einen Anfang gemacht, das Verhältnis der Chlorophyllkomponenten für eine Anzahl von Pflanzen zu bestimmen und es allgemein annähernd konstant gefunden, nämlich im Mittel von 24 Versuchen = 2,5(7). Die größten Abweichungen betrugen ±0,4 — 0,5. Es blieb noch un- entschieden, ob diese innerhalb der Fehlergrenzen der Methode lagen oder nicht. Wir finden heute, daß diese Abweichungen nicht etwa nur auf Fehlern der Bestimmung beruhen, obwohl die Ge- nauigkeit derselben noch zu übertreffen war. In dem Verfahren liegt auch eine neue quantitative Bestim- mung des Chlorophylls der Extrakte und der Pflanzen. 86 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Willstätter und Isler finden so den Chlorophyllgehalt der Blätter zumeist = 0,7 — 1% des Trockengewichtes. Die Ergebnisse hinsichtlich der Zusammensetzung des Chloro- phylls aus seinen beiden Komponenten entfernen sich weit von den früheren Annahmen. H. C. Sorby1) hat das Verhältnis spektrophotometrisch unter der allerdings unrichtigen Voraussetzung gleicher Absorptionswir- kung der beiden Komponenten im Rot geschätzt, indem er die Chlorophyllösung in einer Röhre so weit verdünnte, bis das erste Absorptionsband der Komponente a in derselben Intensität er- schien wie das erste Band der Komponente b in einer zweiten Röhre. Seine Bestimmungen ergaben bei gesunden grünen Blättern auf 1 Teil Chlorophyll b 5,9 — 7,7 Teile Chlorophyll a. Uber die Veränderlichkeit des Verhältnisses urteilt Sorby: „The normal relative amount of yellow Chlorophyll in green leaves certainly varies, and there seems reason to believe that this to some extent, if not mainly, depends on the length of time to which they have been exposed to the sun.“ Zu ähnlichen Werten ist Ts wett2) durch eine spektroskopische Schätzung gelangt und namentlich bei seiner chromatographischen Adsorptionsanalyse durch den Vergleich der Höhen der in ihrer Farbe etwa gleich gesättigt erscheinenden Chlorophyllzonen a und b. Seine Bestimmungen ergeben das Verhältnis a : b = 4 bis 6 : 1. Vor kurzem haben auch C. A. Jacobson und L. March- lewski3) eine Untersuchung: „Über die Dualität des Chlorophylls und das wechselnde Verhältnis seiner Komponenten“ veröffent- licht. Sie finden, daß die klimatischen Bedingungen eine wichtige Rolle in der Produktion der einen oder anderen Komponente des Chlorophylls zu spielen scheinen und sie teilen noch mehrere Be- lege mit für den Satz, daß das Verhältnis der Chlorophyllkompo- nenten mit der Pflanzenart und mit den Wachstumsbedingungen derselben Art variiere. 1) Proc. Roy. Soc. 21, 480 [1873]. 2) Ber. d. d. bot. Ges. 25, 396 [1907]. 3) Bioch. Zeitschr. 39, 174 [1912]. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 87 Die hauptsächlichen Fehler dieser Untersuchung bestehen darin, daß für die Bestimmung dfes Komponentenverhältnisses in einer Pflanze nur ein beliebiger Teil des Chlorophylls extrahiert, ein be- liebiger, unbekannter Teil des extrahierten Farbstoffs als Phäo- phytin gefällt und ein beliebiger Teil des Rohphäophytins durch Umscheiden isoliert wurde. Diese prinzipiellen Fehler der Methodik sind von Willstätter und Isler überwunden worden. Auf der Grundlage ihrer Untersuchung haben wir weiter- gearbeitet und zwar keine wesentlichen Irrtümer oder Unrichtig- keiten gefunden, aber Ungenauigkeiten in der Verseifung des Phäo- phytins und in der Fraktionierung der beiden Spaltungsprodukte zu vermeiden gelernt, die einen erheblichen Einfluß auf den Wert des Komponentenverhältnisses und auf die Beurteilung dei Kon stanz desselben ausüben. b) Die Fehlerquellen der Bestimmung.1) Unvollständige Extraktion. Eine Bedingung für die Ermittlung des wahren Verhältnisses ist die möglichst quantitative Extraktion des Chlorophylls. Bei teilweisem Herauslösen des Chlorophylls aus fiischen odei getrockneten Blättern gehen die Komponenten nicht in ihrem natürlichen Verhältnis in den Extrakt über, sondern es erfolgt da- bei eine Fraktionierung. Beispiel. Wir extrahierten 40 g Brennesselmehl auf der Nutsche an der Pumpe mit Sprit, und zwar so gründlich, als es mit diesem Lösungsmittel möglich ist. Der Extrakt war daher so verdünnt (über 300 ccm), daß er beim Ansäuern nicht ohne wei- teres Phäophytin abschied. Wir setzten allmählich ein wenig Was- ser hinzu, bis eine Ausscheidung von Phäophytin erfolgte. Sie wurde abfiltriert und vom Filter mit Äther quantitativ herunter- gelöst; nach dem Verdampfen bestimmten wir im Rückstand das Verhältnis a zu b. Die weingeistige Mutterlauge schüttelten wir x) Ann. d. Chem. 390, 294 [1912); zum Teil unveröffentlicht. 88 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. quantitativ mit Äther aus und ermittelten auch in dem so isolierten Anteil des Phäophytins den Quotienten. Das auf der Nutsche ausgezogene Blattmehl enthält nach früheren Erfahrungen mindestens 1/6 vom Chlorophyll, das nur schwierig herausgelöst wird. Wir schüttelten das Mehl in der Flasche mit viel Sprit, fil- trierten und wiederholten zur völligen Erschöpfung noch zweimal diese Operation. Die vereinigten Nachextrakte sind angesäuert und dann zur Bestimmung des Verhältnisses ausgeäthert worden. Phyto- chlorin e Phyto - rhodin g Komponen- tenverhältnis Phäophytinausscheidung 0,0123 0,0121 1,04 Phäophytin der Mutterlauge, 1. Probe . . 0,0173 0,0034 5,22 Phäophytin der Mutterlauge, Rest . . . . 0,0215 0,0050 4.38 Phäophytin des Nachextraktes, 1. Probe . 0,0054 0,0039 Mi Phäophytin des Nachextraktes, Rest . . 0,0081 0,0048 I>73 Gesamtes Phäophytin 0,0646 0,0292 2,26 Der Nutschenextrakt mit einem Gehalt von 76% des Gesamt- chlorophylls gab daher den Quotienten 2,55, die Nachextrakte lieferten den Wert 1,57. Der in den Blättern zurückbleibende An- teil des Chlorophylls ist also viel reicher an der Komponente b. Zugleich geht schon aus diesem Versuche hervor, daß das aus angesäuertem Extrakte ausgeschiedene Phäophytin ein total an- deres Komponentenverhältnis zeigt, als der in der Mutterlauge ge- löste Anteil (hier fast 2/3); dieser ist stets arm an Komponente b. Unvollständige Abscheidung. Hierin liegt zufolge einer großen Anzahl von Versuchen, die mit verschiedenem Material ausgeführt worden sind, der wichtigste Fehler bei der Prüfung von isoliertem Phäophytin anstatt ge- samtem extrahierbarem Farbstoff. Beispiel. 100 g käufliches Brennesselmehl ist auf der Nutsche erschöpfend mit Sprit extrahiert und der Extrakt, der verdünnt war, mit Oxalsäure versetzt worden. Das bei zweitägigem Stehen abgeschiedene Phäophytin wurde in aliquoten Pioben durch Ver- seifung und Fraktionierung bestimmt. Andererseits hat man für Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 89 den Vergleich aus der alkoholischen Mutterlauge den Rest des Phäophytins (57—58% der Gesamtmenge) ausgeäthert. Phytochlorin e Phytorhodin g Komponenten- verhältnis Ausgeschiedenes Phäophytin . Phäophytin der Mutterlauge . 1. 0,0049 2. 0,0046 x. 0,0095 2. 0,0082 0,0054 0,0050 0,0038 0,0037 o,93 o,94 2,58 2,27 Im gleichen Sinn wie durch die Verdünnung wird der Quotient zu ungunsten der Komponente a verschoben durch die Anwendung von höherprozentigem Alkohol z. B. gab ein Perkolatorversuch mit 99 prozentigem Alkohol ein Phäophytinpräparat mit dem Verhält- nis 1,38, während ein mit 95 prozentigem Sprit gewonnener Extrakt von gleicher Chlorophyllkonzentration Phäophytin mit einem Quo- tienten von über 2 lieferte. Die Fraktionierung durch das Lösungsmittel hat die Zusammen- setzung unseres in großem Maßstab und mit guter Ausbeute ge- wonnenen Phäophytins wenig beeinflussen können. Denn wenn der freiwillig ausfallende Anteil etwa 4/s beträgt, so wird der Quo- tient des Präparates, obwohl in der Mutterlauge eine an der Kom- ponente a reiche Phäophytinfraktion hinterbleibt, nicht zu stark vom wahren Komponentenverhältnis des Chlorophyllextraktes ab- weichen. Ganz anders bei der Isolierung von Phäophytin aus Blättern, die sehr viel Extraktstoffe enthalten und sich daher für die Phäo- phytingewinnung wenig eignen. Das Phäophytin scheidet sich frei- willig nur in geringer Ausbeute aus den angesäuerten Extrakten gewisser Pflanzen ab, da die farblosen Begleiter es gelöst halten. Diese lösende Wirkung ist selektiv für die Komponenten, wohl viel mehr als die von Alkohol allein. Man kommt daher bei der freiwilligen und unvollständigen Ab- scheidung des Phäophytins in gewissen Fällen, z. B. bei Pinus und Melisse zu Präparaten, deren Spaltung anormal hohe Ausbeuten an Phytorhodin ergibt. Von der Zusammensetzung der in willkür- licher Ausbeute abgeschiedenen Phäophytinpräparate darf also go R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. nicht auf die Zusammensetzung des Chlorophylls in den Extrakten oder in den Blättern geschlossen werden. Beispiele. 800 g frische Fichtennadeln (März) haben Will- stätter und Isler nach ihrer Methode zur Vorbehandlung in die Mischung von 1500 ccm Holzgeist, 600 ccm Äther und 900 ccm Wasser eingelegt und darin 3 Stunden gelassen; hierauf wurden die Nadeln zentrifugiert, mit der Syenitmühle gemahlen und in der Flasche mit Alkohol angeschüttelt. Der Extrakt ist abgesaugt und mit Oxalsäure versetzt, das in kleiner Ausbeute (0,3 g) abgeschie- dene Phäophytin filtriert und umgeschieden worden. Angewandt 0,0616 g Phäophytin. Gefunden 0,0141 g Phytochlorin e, d. i. 22,9% vom Phäophytin. „ 0,0222 g Phytorhodin g, d. i.36,0% ,, ,, Summe 0,0363 g Spaltungsprod., d. i. 58,9% vom Phäophytin. Das Komponentenverhältnis ist hiernach 0,65, das Phäophytin ist also außerordentlich reich an der Komponente b; es enthält davon 3/5. Um in einer gleichzeitigen Probe der Fichtennadeln das Kom- ponentenverhältnis richtig zu bestimmen, werden sie an der Luft getrocknet und ihr quantitativer Extrakt ohne Ausfällung des Phäophytins auf Chlorin und Rhodin verarbeitet. 10 g Mehl lieferten 0,0118 g Phytochlorin e und 0,0038 g Phyto- rhodin g. Komponentenverhältnis 3,19. Melissenmehl (ähnlich Sambucus) lieferten beim Perkolieren und bei freiwilliger Abscheidung des Phäophytins Präparate mit den Komponentenverhältnissen 1,01 und 1,48 bei Phäophytinausbeuten von 1,5 und 2,1 g pro Kilogramm. Hingegen gaben dieselben Mehle nach der auf quantitativer Isolierung des Phäophytins beruhenden Bestimmung das Verhält- nis 2,5. Unvollständige Umscheidung. Zu dem Einfluß des Lösungsmittels bei der ersten Abscheidung des Phäophytins gesellt sich noch ein weiterer, allerdings weniger bedeutender Fehler, nämlich eine abermalige Fraktionierung, wenn man das Phäophytin umscheidet, z. B. aus Chloroform mit Alkohol. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 91 Verseift man das oxalathaltige Rohphäophytin, so fehlt bei der Bestimmung die Kontrolle durch die Summe der Spaltungsprodukte welche nahe an 2/3 des Phäophytingewichtes betragen soll. Scheidet man aber das Phäophytin um, so wird der ausfallende Anteil wieder etwas reicher an der Komponente b. Diese Verschiebung zeigte sich deutlich beim Behandeln mit Alkohol. Zu einer brauchbaren Methode für die Isolierung der einen oder anderen Komponente gelangt man allerdings nicht bei der fraktionierten Abscheidung aus Solvenzien, weil die beträcht- lichen Löslichkeitsunterschiede der reinen Phäophytinkomponenten nicht genügend zur Geltung kommen bei ihren Gemischen. Die beiden Komponenten beeinflussen sich gegenseitig in ihrer Lös- lichkeit. Beispiel. 2,5 g an Komponente b reiches Phäophytin (I) aus Sambucus wurde in 1700 ccm absolutem Alkohol bei Siedehitze gelöst; nach dem Erkalten schieden sich über Nacht 0,8 g (II) körnig-mikrokrystallinisch aus. Die Abscheidung löste man ein zweites Mal in 550 ccm absolutem Alkohol; hieraus schied sich nur sehr wenig (III) ab und das Filtrat lieferte bei mehrtägigem Stehen noch 0,2 g Phäophytin (IV). Komponentenverhältnis von I: 1 V3, II: 2/z, HI: 1/i, IV: V3 bis Vs- Fehler bei der Verseifung und Fraktionierung. Das Chlorophyll kann als solches nicht ohne Verlust in die zwei Komponenten geschieden werden und auch nicht in der Form seines magnesiumfreien Derivates. Die sehr schwach basischen Phäophytine erfordern nämlich für die Trennung Salzsäure von so hoher Konzentration, daß die Phytolestergruppe leicht an- gegriffen wird. Überdies würde die starke Säure mit der Roh- phäophytinlösung störende Emulsionen verursachen. Deshalb wird die Trennung mit den Produkten der alkalischen Hydrolyse des Phäophytins ausgeführt, die viel stärker basisch sind (Salzsäure- zahlen 3 und 9). Die Bildung dieser Verbindungen ist aber kein einfacher Prozeß ; sie erfolgt durch Hydrolyse der leicht verseifbaren Gruppe > 41 >> 25 „ ,, >> J9 » 100 mm Xanthophyllösung entsprechen 72 mm der Bichromatlösung 50 „ „ »> 2 37 » 25 „ ,, .» I4 -> Die substituierte Vergleichslösung ist mit den beschriebenen und zwar mit solchen von verschiedenen Darstellungen von Carotin und Xanthophyll in einer Reihe colorimetrischer Bestimmungen verglichen worden. Bei den Versuchen, deren Ergebnisse wir im folgenden anführen, hat dieser Ersatz für die eigentlichen Vergleichslösungen noch keine Anwendung gefunden. Berechnung. Die colorimetrischen Messungen werden mit mehreren Ab- lesungen ausgeführt, dann die Zylinder vertauscht und die Ab- lesungen wiederholt. Bei allen Bestimmungen ließen wir die als zweckmäßig erprobten Schichthöhen der Vergleichslösungen kon- stant, nämlich: für Phytochlorin 40 mm, allgemein bezeichnet: ha „ Phytorhodin 50 ,, ,, „ hb ,, Carotin 100 ,, ,, ,, h' ,, Xanthophyll 100 ,, ,, ,, h' Die entsprechenden Schichten der Versuchslösungen (0,5 1 bei den grünen, 0,1 1 bei den gelben Farbstoffen) seien bezeichnet mit ha, hb, hc, hx. Das molekulare Komponentenverhältnis der beiden Chlorophylle /Chlorophyll a\ \ Chlorophyll b/ wird, da die Vergleichslösungen im Verhältnis von 3 Molen a : 1 Mol b hergestellt werden, berechnet als : 40 hb _ . hb 3 b 50 h. 2'4 h. I08 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Für das molekulare Verhältnis der zwei gelben Farbstoffe / Carotin \ „ , . , V XanthophylT / erSlbt slch Qc-^ • Endlich ist von Bedeutung das Verhältnis der beiden Chloro- phylle zu den beiden gelben Farbstoffen, alle in Molen ausgedrückt: '3 ha Qa+b — c+x + hb h^ , h£ hc hx Oder für die gewählte Höhe der Vergleichslösungen: Die colorimetrische Bestimmung ergibt zugleich die Gewichts- mengen der vier Farbstoffe in den angewandten 20 g frischen Blät- tern und weiterhin in 1 kg derselben nach folgender Berechnung . c 4° Chlorophyll a = 50 • 0,00902 • o • ^ , Chlorophyll b = 50 • 0,00916 • 2 • , £ 1 100 Carotin = 5° • °>00536 • — • » 1 100 Xanthophyll = 50 • 0,00568 • 2 • ^ • Um den Gehalt von 1 kg trockener Blätter an den vier Farb- stoffen zu ermitteln, haben wir bei fast jedem Versuche den Prozent- gehalt der frischen Blätter an Trockensubstanz bestimmt, welchen wir als „Trockengehalt“ zu bezeichnen vorschlagen. Die für die frischen Blätter gefundenen Werte sind daher zur Be- rechnung des Farbstoffgehaltes der trockenen zu multiplizieren mit 100 Trockengehalt ' Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 109 4. Ergebnisse1). Mit unserer Methode für die quantitative Bestimmung aller vier Blattfarbstoffe haben wir 20 Beispiele untersucht. Die ersten Ergebnisse dienen vielmehr dazu, die Brauchbarkeit der Analyse zu bestätigen und Fragen von physiologischer Bedeutung, die sie zu lösen gestattet, anzuregen, als etwa schon Gesetzmäßigkeiten in der Verteilung der Farbstoffe festzustellen. Dafür ist die Zahl der untersuchten Fälle noch viel zu gering. Nur die Mengenverhält- nisse der grünen und gelben Pigmente und die wichtigsten Er- scheinungen ihrer Verteilung lehren bereits die ersten Versuche kennen. Der Mitteilung unserer neuen Analysen sollen die früheren Beobachtungen von Willstätter und Isler, welche das Kom- ponentenverhältnis Qa bei verschiedenen Pflanzen und ihren "b* Chlorophyllgehalt betreffen, vorangestellt werden. Das Komponentenverhältnis 2,6, das sich aus den Beispielen der Tabelle I im Mittel ergibt, ist infolge der im Abschnitt 2 b erörterten Ungenauigkeiten etwas zu niedrig gefunden worden. Tabelle I. Zusammensetzung des Chlorophylls aus seinen beiden Komponenten nach Willstätter und Isler. Pflanze Ernte 10 g getrocknete Blätter gaben Kompo- nenten- verhältnis Phyto- chlorin e Phyto- rhodin g I. Fichte 21. Juli 1911 0,0124 0,0044 2,9(1) 2. 1) dieselbe 0,0124 0,0045 2,8(4) 3- Gras 8. Juni 1911 0,0305 0,0140 2,2(4) 4- »1 22. Juni 1911 0,0313 0,0x52 2,1(1) 5- Brennessel Ende Mai 1911 0,0357 0,0174 2,0(9) 6. > 1 23. Juni 1911, an d. Sonne, 4hN. 0,0281 0,0x04 2,7(5) 7- 1 > 30. Juni 1911 0,0228 0,0087 2,6(7) 8. 1 1 20. Juli 1911, an d. Sonne, 2hN. 0,0324 0,0110 3,o(o) 9- . > > 24. Juli 1911, Schatten, 7hV. 0,0409 0,0157 2,6(7) l) Unveröffentlicht. HO R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Tabelle I (Fortsetzung). Pflanze Ernte 10 g getrocknete Blätter gaben Kompo- nenten- verhältnis Phyto- chlorin e Phyto- rkodin g IO. Brennessel Mitte September 19 11 0,0307 0,0140 2,3(5) II. > > 22. März 1912, 7hV., frisch extrah. 0,0333 0,0144 2,3(7) 12. l > dieselbe 0,0330 0,0131 2,5(8) 13- Platane 1. Juni 1911, 5hN. 0,0316 0,0123 2,6(2) 14. 6. Juli 1911 0,0350 0,0152 2,3(6) !5- > f 25. Juli 1911, 9UV. 0,0504 0,0182 2,8(4) 16. Roßkastanie 8. Juni 1911 0,0473 0,0184 2,6(3) 1 7 • 4. Juli 1911 0,0421 0,0179 2,4(0 18. > f 22. Juli 1911 0,0482 0,0167 2,9(6) 19. dieselbe 0,0502 0,0171 3.o(0 20. Bärenklau 18. Mai 1911 0,0322 0,0122 2,7(0) 21. » } 17. Juli 1911 0,0299 0,0120 2,5(6) 22. Mehsse 19. Juli 1911 0,0290 0,0118 2,5(0 23. Holunder 1. Juni 1911, 5hN. 0,0396 0,0178 2,2(7) 24. »> 10. Juli 1911, nhV. 0,0405 0,0188 2,2(0) Tabelle II. Chlorophyllgehalt verschiedener Pflanzen nach Willstätter und Isler. Vers. Pflanze Ernte Trockengew. von 100 g frisch. Blätt. Gehalt von 1 kg getrock. Blättern an Chlorophyll- geh. von 1 kg frisch. Blätt. Kom- pon. a Kom- pon. b Chloro- phyll 1 Fichte 21. Juli 1911 50 1,87 0,67 2,54 1,27 3 Gras 8. Juni 1911 28 4,62 2,10 6,71 1,88 11 Brennessel 22. März 1912 17V2 5.04 2,16 7,20 1,26 6 23. Juni 1911 30 4.25 1.56 5,80 1,74 8 20. Juli 1911 34 4.90 1,66 6,56 2,23 10 Mitte Sept. 1911 — 4.65 2,10 6,75 - 13 Platane 1. Juni 1911 23 4.78 1.85 6,63 1-53 15 25. Juli 1911 24 7.63 2,73 io,37 2,49 16 Roßkastanie 8. Juni 1911 29 7>i6 2,77 9,93 2,83 19 22. Juli 1911 34 7.29 2,50 10,18 3,46 20 Bärenklau 18. Mai 1911 20 4.87 1,83 6,70 i,34 23 1 Holunder 1. Juni 1911 21 5.99 2,67 8,66 1,82 Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. III Bei unseren Bestimmungen sind die Fehler auf wenige Prozente der gefundenen Verhältniszahl der Chlorophyllkomponenten herab- gemindert worden; die Parallelversuche haben nämlich folgende Zahlen ergeben: Nr. 1. 2,74 und 2,70; Differenz r>4 % „ 2. 2,83 „ 2,71; 77 4>3 >> >> 3* 2,90 „ 2,80; y t 3.5 >> „ IO. 2,98 „ 2,90; y > 2,7 „ „ ia. 2,07 „ 2,05; > > 1,0 ,, (kleiner Fehler bei der Verseifung). 77 77 77 ?> 77 Für den Quotienten Carotin gilt das nämliche, seine Be- Xanthophyll Stimmung ist sogar noch genauer als die der grünen Farbstoffe. Nr. 1. 0,588 und 0,588; Differenz 0,0 % „ 2. 0,629 yy 0,613; >y 2,5 „ yy 3‘ 0,51° y y 0,5*3; yy 0,6 „ „ 9- 0.653 y y 0,649; yy 0,6 ,, „ ia. o,345 y y 0,347; yy 0,6 „ Wenn also größere Abweichungen zwischen mehreren Analysen Vorkommen, so kann es jetzt als sicher gelten, daß sie nicht mehr durch das Verfahren der Bestimmung verursacht sind, sondern daß sie natürlichen Schwankungen entsprechen. Wir halten es bei Be- rücksichtigung der Fehlerquellen unserer Methode auch für un- wahrscheinlich, daß sie noch erhebliche Fehler mit sich bringt, die nach ein und derselben Richtung wirken und daher nicht in Differenzen bei Doppelversuchen zutage treten. Die wahren Kom- ponentenquotienten können also nicht mehr erheblich von den ge- fundenen Werten ab weichen. Die Gewichtsmengen von Chlorophyll und Carotinoiden, die sich aus unseren colorimetrischen Bestimmungen ergeben haben, werden in der folgenden Tabelle III und die Komponenten Verhält- nisse in der Tabelle IV verzeichnet. Farbstoffgehalt. Der Chlorophyllgehalt der Blätter ver- schiedener Pflanzen bewegt sich zwischen etwa o,6 und 1,2% der Trockensubstanz und beträgt zumeist 0,8%, nämlich 0,6% Chlorophyll a und 0,2% Chlorophyll b. Wir finden viel größere Ausschläge als zwischen den verschiedenen Pflanzen bei ungleich- artigen Blättern einer einzigen Pflanze. Die Schattenblätter sind, wenn man das Chlorophyll auf das Trockengewicht bezieht, viel 112 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Ö in £> u ai Ö a> r— 1 -M ■'S s <1) G V X o o -b bß r* bo fl fl 0) bo S s Ch OO fn H CO lO t + ui IO O CH O O m ro IO SCO |£) «1 ui m O H lO N N 00 lO CH N Hl in it- N m io N CJ N O. 00 co~ cd 00* 00 Oi CO MO iß 00 0» IO lO lö) U0 Ol Oi lO «0 "t- N Ol o H. 9. m' M Hl Hl o u-> Tj- N Tt- UO Oi Oi Oi Ci o d o 6 h >n in N HI Tf CO N N N O H 0~ 0~ 00 00 M Hl hi in oo Hl N lO H H O Carotin MMinit-HiHiNiooicncn in in >n >n >n >n oo n n to t o o o o o o o d o o o~ d cn n n o' o' oo oi m hi in co co co >n co o~ o" o~ o" o~ Chloro- phyll b o CO in CO ^ CS G\M CO CO in M M CS CS M CS t ^ ^ *0 t cs" cs" cs cs cs cs" cs" CS*" CS M H cs cs Tt- ß N o O ß Cs >0 co co co cs" cs bß M U 0) •9 £ "SB PQ .9 S ■ ,0 0 5n &£ fl n ib vo io io «IO Ol -tio Ol io ,'°v2 M H o 1t- lO N «>• Hl^ M_ ' t> io" ui ui if hi n ro in *n OI O d 'T noo' Ch cd d Xantho- phyll (ONO lO lO N MMN o' o“ o~ o CO M w 00 O Ol CO M o o o o o Tt- Tt- O co CO Ol M Tt- Tj- lO co M OI O rf it- ij- M CO M_ CO o~ o' o~ o o M M oi Hl M oi Oi ch m in Hl Hl N_^ co M d o" o~ o” o' Carotin io >n uf co o t»-hi h co o Tj-Tj-cOCOifil'O'OOiO Hl Hl Hl Hl M M M hi O O ' ' M UOO in oo oo o* o' o' o“ o o o o o o o o t^f'cocococoi>- Ol Ol io lO io Ol M o O O O 0_ 0_ H o" o~ o" o o o Chloro- phyll b Ol N N OIUIOO in O CO Ol 00 o cno ui in o moo Oi n oo O m in 'S in>niOOoooooo_iriniO d o o o o o o d o o o o o oo oo o in-^-Oiin r-~oo r-» co iO N O Tj-Tj-cOiOiOOOiOOi o d o o d o o o Chloro- phyll a inioio -e- n 'omchcomioo Hl M CO Hl CO M Hl Ch» M Oi lO lO o io in >n n n ui t h o io o> H“ hT hT h m" N~ N~ N h h M >n in uo oi Oi M CO CO CO CO M ■3- o CO Ol Ol M in hi in CH. o Hl Hl N N Trockengehalt co in in in o o, . *9 | CO o_ co" in co cC cs m iO in cs cs co CO CO co CO O CO rt c3 c3 ri hi iO 00 Oi Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 113 Anmerkungen zur Tabelle III. Nr. 1. 12. Juli 1912, 5 Uhr nachm., helles Wetter; tiefgrüne, dicke Blätter ohne Stiel und Mittelrippe. Nr. 2. 15. Juli, 4 Uhr vorm., sofort nach Pflücken verarbeitet; bei der ersten von den zwei Bestimmungen ist die Ver- seifung etwas weniger günstig ausgefallen (1 2% zuviel Schwachbasisches) . Nr. 3. 15. Juli, 5 Uhr nachm., helles Wetter ; Blätter wie bei 1 und 2 ; auch bei der ersten Bestimmung kleiner Verseifungsfehler. Nr. 4. 18. Juli, 4 Uhr vorm., Blätter ohne Mittelrippen. Nr. 5. 18. Juli, 5 Uhr nachm., bewölkt. Nr. 6. 17. Juli, 7 Uhr vorm., hell; frische Blätter vom Gipfel der Baumkrone. Nr. 7. 18. Juli, 4 Uhr vorm. ; die Krone des Versuchsbaumes (auch von Nr. 8 und 8a) war im Frühling stark geschnitten; Blät- ter von im Wachstum begriffenen Sprossen, die obersten Blätter eines Zweiges nicht verwendet; bei der Verseifung etwas zu viel Schwachbasisches (auch bei Nr. 8). Nr. 8. 18. Juli, 5 Uhr nachm., bewölkt; Blätter wie bei Nr. 7. Nr. 9. 10. Juli, 4 Uhr nachm., hell; Blätter sehr reich an Trocken- substanz, schwierig zu zerkleinern. Nr. 10. 8. Juli, 7 Uhr vorm., hell, Blätter vom Rande der Krone; sie sind ledern, schwer zu verarbeiten, sie färben sich ohne Behandlung mit Aceton beim Zerkleinern braun. Nr. 11. 6. Juli, 7 Uhr vorm., hell; Stockausschläge ohne oberste Blätter. Nr. ia, 11. Juli, 5 Uhr nachm., hell; Blätter aus dem Innern des Strauches, sehr dünn, teilweise etwas gelblich wie ab- sterbend. Nr. 6 a, zugleich mit Nr. 6; die Blätter aus dem Tiefinnern der Baumkrone, weich und etwas blaß. Nr. 8 a, wie 8, aber aus dem Innern der Krone, Blätter viel dünner und leichter als Lichtblätter. Nr. 9 a wie 9, Blätter ganz aus dem Innern der Baumkrone, den- noch dunkelgrün wie Lichtblätter im Gegensatz zu den Schattenblättern von Sambucus und Aesculus. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 8 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 114 Tabelle IV. Komponentenverhältnis der grünen und gelben Farbstoffe. Nr. Pflanze Lebens- bedingungen Tages- zeit Q* b Qa X Q»+b c-fx Lichtblätter i 2-74 0,588 3,33 1 Sambucus nigra 5hN. j 2,70 0,588 3,35 4hV.{ 2,83 0,629 2,83 2 ) > > } 2,71 0,613 2,88 5hN.{ 2,90 o,5ID 3>10 3 » ) i l 2,80 °>5I3 3,04 4 Aesculus hippocastanum )> 4UV. 5bN. K) tO 00 'co to vO 0,699 0,699 2,84 2,80 5 6 7h V. 2,47 0,676 2,40 7 Platanus acerifolia > » 4h V. 3.52 0,478 3,98 8 1 > 5hN. 3,34 0,500 2,83 4hN.{ 3A3 0,653 3,45 9 Fagus silvatica ») — 0,649 — IO Populus canadensis > > 7"V.{ 2,98 2,90 — j 11 1 l > » 7hV. 2,82 2.07 o,345 4>63 ia Sambucus nigra Schattenblätter 5 N- \ 2,05 o,347 4,72 6a Aesculus hippocastanum ) > 7h V. 2,30 0,353 4-7° 8a Platanus acerifolia 1 1 5h N. 3>l6 0,433 3-31 ga Fagus silvatica >1 5h N. 2,92 o,553 6,02 reicher an Chlorophyll (nicht ebenso an Carotinoiden) als die Licht- blätter. Der Vergleich fiele allerdings anders aus, wenn man den Farbstoffgehalt auf die Blattfläche beziehen würde, da die Schatten- blätter oft, z. B. bei Sambucus, Aesculus, Platanus, sehr dünn und leicht sind. Tabelle V. Chlorophyll (in g) in ikg trockener Blätter. Nr. Pflanze Lichtblätter Schattenblätter 1 und 1 a Sambucus nigra 7-99 11,89 11,66 XI, 15 6 „ 6a 8 8a Aesculus hippocastanum Platanus acerifolia 7-99 6,21 9 ,, 9a Fagus silvatica <7 10,04 y >> v“ 1 — ° Auch der Gehalt an gelben Farbstoffen, worüber noch gar keine Angabe vorliegt, bewegt sich in engen Grenzen ; er beträgt nämlich bei Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 115 den geprüften Pflanzen zwischen 0,1 und 0,2% vom Trockengewicht, wovon Xanthophyll 0,07 — 0,12, Carotin 0,03 — 0,08% ausmacht. Der Farbstoffgehalt der Blätter unterliegt in den verschie- denen Tageszeiten keiner erheblichen Schwankung; wir finden nämlich fast gleiche Farbstoffmengen, sei es, daß die Blätter zu Beginn oder gegen Ende eines Sommertages gepflückt werden. Tabelle VI. Farbstoff (in g) in ikg trockener Blätter. Nr. Pflanze Chlorophyll Carotinoide 4hmorgens 5h abends 4hmorgens 5h abends 2 und 3 Sambucus nigra 8,49 8,30 1,48 1.57 4 .. 5 Aesculus hippocastanum 9.58 8,75 2,07 i.9i 7 „ 8 Platanus acerifolia 6,82 6,21 1,06 1,35 Verhältnis der Chlorophyllkomponenten. Das Mittel aus unseren Versuchen (Tabelle IV) beträgt, wenn wir die Doppel- versuche mit ihren Durchschnittswerten ansetzen, 2,85 mit den größten Differenzen von d= °»7 — 0,8. Diese Schwankungen, noch bedeutender als in den Bestimmungen von Willstätter und Isler, werden in ihrer Größe bedingt durch die extremen Lebens- bedingungen der Blätter, die zum Vergleich herangezogen worden sind. Es scheint, daß bei einigen für Schattenwachstum schlecht organisierten Pflanzen, wie z. B. Sambucus, die Schattenblätter anormale Verhältnisse aufweisen, während eine richtige Schatten- pflanze, die Buche, in ihren Schattenblättern keine erhebliche Ab- weichung von der gewöhnlichen Erscheinung bietet. Wenn wir die besonders ausgesuchten Proben von Schatten- blättern beiseite lassen, so ergeben die übrigen Bestimmungen des Komponentenverhältnisses, wobei wieder die Doppelversuche mit ihren Durchschnittsergebnissen nur einfach eingesetzt sind, den Mittelwert 2,93 mit den größten Abweichungen von ±°>5 — 0,6. Dieser Durchschnittswert stellt also das Ergebnis der Bestimmungen mit normal lebenden Blättern dar. Die Tageszeit ist wider Erwarten ohne Einfluß auf das Ver- hältnis der Farbstoffe; es ändert sich also nicht während der Assi- milationstätigkeit der Chloroplasten. 8* n6 R- Willstätter und A. Stell, Untersuchungen über Chlorophyll. Tabelle VII. Q a b” Q C X 4h morgens 5h abends 4h morgens 5h abends Sambucus 2,77 2,85 0,621 0,512 Aesculus 2,89 2,82 0,699 0,699 Platanus 3,52 3.34 0,478 0,500 Das durchschnittliche Komponentenverhältnis der Schatten- blätter ist etwas tiefer, es beträgt 2,61 mit den größten Ausschlägen von ±0,55. Es hat sich also gezeigt, daß die Zusammensetzung des Chlorophylls aus seinen beiden Komponenten bei verschiedenen Pflanzen und verschiedenen Wachstums- bedingungen einer und derselben Pflanze annähernd konstant, aber nicht genau konstant ist. Auf 1 Molekül Chlorophyll b treffen ungefähr 3 Mole Chlorophyll a. Das Verhältnis der zwei gelben Pigmente, von X welchen Xanthophyll überwiegt, weist Schwankungen auf, die nicht viel beträchtlicher sind als die von Qa_. b Der Mittelwert aus allen Bestimmungen ist 0,546 mit Ab- weichungen von ±0,15—0,2. In diesem Falle ergibt die Trennung der Bestimmungen von Licht- und Schattenblättem einen größeren Unterschied. Die ersteren, also die Blätter aus normalen Lebensbedingungen, zeigen das durchschnittliche Verhältnis der gelben Komponenten 0,603 mit den größten Abweichungen von ±0,1 ; auf 1 Mol Caro- tin treffen i1/.,— 2 Mole Xanthophyll. Die Schattenblätter ergeben den mittleren Quotienten 0,421 mit Ausschlagen von eben- falls ±0,1. Zwischen dem niedrigsten und dem höchsten von den beobachteten Werten ist eine etwas größere Spannung als beim Verhältnis der Chlorophyllkomponenten. Beziehung zwischen den grünen und gelben Farb- stoffen. Schon die Angaben über die Gewichtsmengen der ein- zelnen Pigmente haben erkennen lassen, daß die grünen Farbstoffe Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 117 gegenüber den gelben überwiegen. Das Verhältnis des Chlorophylls (a + b) zu den gelben Pigmenten (c + x), in Molen ausgedrückt, ist im Mittel aller Bestimmungen 3,56, im Mittel der Bestimmungen bei Lichtblättern 3,07, im Mittel der Bestimmungen bei Schattenblättern 4,68. Bei den Schattenblättern mehrerer Pflanzen (Platane bildete eine Ausnahme) ist also der Quotient erheblich angestiegen bis zum Wert 6 bei einer für Schattenwachstum gut organisierten Pflanze. Von den Chlorophyllkomponenten überwiegt stets die sauer- stoffärmere, von den Carotinoiden stets die Oxydationsstufe. Aber eine einfache Beziehung zwischen und hat sich nicht ge- b x zeigt. Nur in einem Teil der Beispiele geht das relative Ansteigen von Chlorophyll a und Xanthophyll, der reduzierten Chlorophyll- komponente und des oxydierten Carotinoids, parallel. 5. Bestimmung der Braunalgen-Farbstoffe1). Die Definition der Phäophyceenfarbstoffe ist viel umstritten. Es gilt noch als ungewiß, ob Chlorophyll als solches in den Braun- algen und in den Diatomeen vorkommt oder in der Form eines Abkömmlings von brauner Farbe, der leicht in Chlorophyll über- zugehen vermag. Die schon von F. Cohn2) vertretene Ansicht, daß das „Phäophyll“ ein dem Chlorophyll nahe verwandter Körper, vielleicht nur eine Modifikation desselben sei, haben die Unter- suchungen von H. Moli sch3) zu einer interessanten Hypothese weiterentwickelt. In den Phäophyceen und den Diatomeen soll nur ein braunes Chlorophyllderivat Vorkommen, welches bei raschem Abtöten mit heißem Wasser oder in heißer Luft und bei der Ein- wirkung organischer Lösungsmittel in gewöhnliches Chlorophyll x) Aus einer unveröffentlichten Untersuchung von R. Willstätter und H. J. Page. 2) Uber einige Algen von Helgoland. Beiträge zur näheren Kenntnis und Verbreitung der Algen, herausgegeben von L. Rabenhorst, Heft 2, 19. Leipzig 1865. — Beiträge zur Physiologie der Phykochromaceen und Flo- rideen. Archiv f. mikroskop. Anatomie, Bd. 3 [1867]. 3) Botan. Ztg. 63, 131 [1905]. Il8 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. übergeht. Molisch vergleicht das Phäophyll mit dem braunen Farbstoff, der aus Chlorophyll sofort bei der Einwirkung von Kali- lauge entsteht und so leicht weiterhin in grüne Chlorophyllderivate (Chlorophylline) übergeht. Andere Forscher, namentlich in letzter Zeit M. Tswett1), F. Czapek2) und H. Kylin3), der eine kritische Untersuchung über die Farbstoffe der Fucoideen veröffentlicht hat, bestreiten die Existenz des Phäophylls. Tswett nimmt an, daß die Chloro- phyllfarbe nur verdeckt sei durch die gelben Pigmente, namentlich Fucoxanthin, und daß sie in der bekannten Erscheinung des Er- grünens der Braunalgen beim Abbrühen hervorgerufen werde durch die Auflösung der Pigmente in den Fettstoffen, bei der Einwirkung von Lösungsmitteln oder Reagenzien durch Auflösung oder Ver- änderung des Fucoxanthins. Es ist wohl richtiger, daß es immer die Auflösung des Chloro- phylls beim Behandeln mit heißem Wasser wie mit Lösungsmitteln ist, wodurch das Ergrünen der Braunalgen hervorgerufen wird. Willstätter und Page vollenden den Beweis, daß das Chloro- phyll selbst in den Braunalgen enthalten ist. Diese zeigen im all- gemeinen olivgrüne bis grünlichbraune Farbe; die Chlorophyllfarbe wird in ihnen vor allem deshalb so sehr verdeckt, weil die gelben Pigmente quantitativ überwiegen. Das molekulare Verhältnis der grünen zu den gelben Farbstoffen ist hier, anstatt 3 bis 5 : 1 wie bei vielen Landpflanzen, ungefähr 1:1. Enthielten die Algen einen Farbstoff ähnlich der oft erwähnten braunen Phase des Chlorophylls, also vom Chlorophyll wahrschein- lich durch Öffnung eines Lactamringes sich unterscheidend, so würde er unter verschiedenen Einflüssen (Wärme, Lösungsmittel) nicht in das nämliche Chlorophyll, sondern je nach den Bedingungen in die Derivate der Chlorophyllin- oder Isochlorophyllinreihe über- gehen. Das ist aber nicht der Fall. i) Ber. d. deutsch, botan. Ges. 24, 235 [1906]; ferner die Chromophylle in der Pflanzen - und Tierwelt, Seite 300, physiol. Chem. 82, 221 [1912]. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 119 Durch die spektroskopische Untersuchung wird vollends die An- sicht von Molisch widerlegt. Ein brauner Farbstoff wäre ja op- tisch vom Chlorophyll ganz verschieden, wie es in der Tat das Spektrum der braunen Phase ist gegenüber dem Chlorophyll- spektrum. Im ersteren finden wir keine Absorption im Rot, starke im Grün und Violett (siehe Kap. VI, Abschn. 4). Das Spektrum der Braunalgen unterscheidet sich indessen gar nicht erheblich von dem der gewöhnlichen Blätter. Es gibt auch, wie die folgen- den Messungen zeigen, keine bedeutende Differenz zwischen frischen und abgebrühten Braunalgen, nur sind bei den frischen die Ab- sorptionsbänder verschwommen und zwischen ihnen ist das Spek- trum verdunkelt, bei den abgebrühten sind die Absorptionsstreifen etwas gegen Violett verschoben, wahrscheinlich infolge des Über- gangs von Chlorophyll aus dem kolloidalen Zustand in eine Lösung in den Fetten und Wachsen. Der ätherische Extrakt zeigt, wie der aus gewöhnlichen Blättern hergestellte, die Bänder noch be- deutend weiter gegen Violett hin verschoben. Absorptionsspektrum. Fucus, frisch Fucus, abgebrüht Orangebraunes Stück 685— 663. .536— 682 — 665 522— Olivfarbiges Stück 688 — 664.515 (etwas verstärkt um 590) 5I5 683 664 Schatten um 585 5°6 — Olivgrünes Stück I. 695—655.. II. 641. . .616. .610. HI. 595- -578- IV. 561 538 — I. 687— 656. . .653 II. 630.610 III. 591-574 IV. 545 5io — Ätherischer Extrakt aus Fucus Fucus in frischem Zustand Band I 678 — 647 694 — 661. . .655. . „ II 627. . .606 640. . .612. „ III 585- -574 593- -579- iv 545 1 525 | 555 512 Endabsorption 5°9 — 120 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die mikroskopische Untersuchung der Braunalgen steht nach Willstätter und Page mit der spektroskopischen Beobachtung im Einklang. Schnitte der grünsten Teile von frischem Fucus (Fig. 5) zeigen nur dicht unter der farblosen Cuticula eine Reihe von Zellen, worin ein großer Teil des Pigments sich befindet, und zwar in einzelnen Körnchen in der von der Cuticula abgewandten Zellenhälfte, also anders wie bei grünen Blättern. Diese Hälfte ist olivgrün, die andere Zellhälfte ist stark lichtbrechend und höchstens schwach gelb. Nach dem Behandeln mit heißem Wasser ist das Pigment zerflossen und homogen in der ganzen Zelle enthalten, ab- Fig. 5. Mikroskopischer Schnitt von Fucus, links in frischem, rechts in abgebrühtem Zustand. gesehen von einem farblosen Rande, sie ist klarer und deutlicher grün. Hand in Hand mit der Änderung von Farbe und Spektrum beim Abbrühen geht also die Auflösung der Farbstoffe im öligen Inhalt der farbstoffführenden Zellen. Schnitte von orangebraunen Fucusstücken zeigen ein anderes Bild. Hier ist die äußerste Zellreihe ziemlich vollständig von Pig- ment erfüllt und zwar ist in diesem Falle die äußere Hälfte tief braun, die innere öfters heller braun. Unter dieser ersten Reihe ist das Bild weniger regelmäßig; es gibt Zellen mit einzelnen, aber nicht zahlreichen olivgrünen Chlorophyllkörpern. Solche Algen- stücke werden bei der Einwirkung von siedendem Wasser nur ein bißchen mehr grünlich und etwas heller; der Farbstoff ist dann in der ersten Zellenreihe gleichmäßig verteilt. Zwischen den Bildern olivgrüner und rotbrauner Teile stehen Schnitte olivbrauner Stücke. Sie weisen in den ganzen Zellen der äußeren Reihe gelbes Pigment diffus auf, anscheinend gelöst. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 121 während die dunklere innere Zellhälfte mehr von den Farbstoffen und zwar alles Chlorophyll in den Körnchen enthält. Eine zweite Frage betrifft die Zusammensetzung des aus Phäo- phyceen extrahierten Chlorophylls. H. C. Sorby1) sowie M. Ts wett2) haben angenommen, daß darin die eine der beiden Komponenten des gewöhnlichen Chloro- phylls, nämlich a, vorkomme, zusammen mit einer dritten Chloro- phyllkomponente, die von Sorby Chlorofucin, von Tswett Chloro- phyll y genannt wird. Wir können dieser Ansicht zurückfolgen bis zu der grundlegenden Notiz von G. G. Stokes3) (1864), worin er von zwei Chlorophyllkomponenten sprach und fortfuhr: „ . . . but in olive-coloured seaweeds (Melanospermae) the second green substance is replaced by a third green substance, and the first yellow substance by a third yellow substance, to the presence of which the dull colour of those plants is due.“ Für die angenommene dritte Chlorophyllkomponente wird von Tswett ein sehr charakteristisches Spektrum I 638—622, II 588—575, III 465—440 w (in Äther) angegeben, das ein scharfes Band aufweist gerade in der Lücke zwischen den Absorptionen der Chlorophylle a und b im Orange. Dasselbe Band soll sich nach Tswett im Spektrum frischer Braun- algen bei etwa 640—625 pp befinden, während es gemäß der all- gemeinen Verschiebung der Absorptionsbänder in den Blättern er- heblich weiter gegen das rote Ende gerückt sein müßte. Von dieser dritten Chlorophyllkomponente erhalten Will- st ätt er und Page keine Spur bei raschem Verarbeiten frischer Braunalgen mit kalten Lösungsmitteln; obwohl es gelang, den ge- samten Farbstoff in Lösung zu bringen, zeigen die Extrakte das Absorptionsband bei ungefähr 630 nicht. Nur aus nicht mehr frischen oder aus getrockneten Phäophyceen erhielten wir wieder- holt Lösungen, welche dieses Chlorophyllderivat aufweisen, ge- bildet durch eine noch unbekannte Reaktion. Beim Liegen der Braunalgen verdarb das Chlorophyll mehr und mehr; auch im *) Proc. Roy. Soc. 21, 442 [1873]. 2) Ber. d. deutsch, botan. Ges. 24, 235 [1906]. *) Proc. Roy. Soc. 13, 144 [1864]. X22 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Mehl getrockneter Braunalgen waren die Farbstoffe sehr wenig haltbar. Die angenommene dritte Komponente ist kein natürlicher Farbstoff. Trotz des Fehlens einer spezifischen Komponente zeigt das Chlorophyll der Phäophyceen eine sehr merkwürdige Abweichung von den Landpflanzen, sowie von den Grünalgen. Es besteht näm- lich fast ausschließlich aus der Komponente a. Von Chlorophyll b sind nur Spuren zu beobachten, höchstens 5%. Die Chlorophyllkomponente a, aus Fucoideen von Willstätter und Page isoliert, stimmt im Magnesium- und Phytolgehalt und in der Zusammensetzung der stickstoffhaltigen Spaltungsprodukte mit dem Farbstoff aus anderen Pflanzen überein. Hinsichtlich der gelben Pigmente in den Phäophyceen sind die ersten Angaben von Stokes schon von Tswett und von Kylin berichtigt worden. Die Braunalgen enthalten drei stickstofffreie Pigmente: Carotin, Xanthophyll (dieses soll nach Tswett vom gewöhnlichen Xantho- phyll etwas verschieden sein und wird von ihm als Fucoxanthophyll bezeichnet) und Fucoxanthin (auch Phykoxanthin genannt). Die Isolierung und Analyse des Fucoxanthins wird im XII. Kapitel, Abschn. 4, mitgeteilt ; es ist sauerstoffreicher als die anderen Caro- tinoide, seine Formel ist C40H56O6. Dieses den Braunalgen eigen- tümliche Pigment ist wahrscheinlich zuerst von Stokes, dann von A. Millardet1) und von Sorby beobachtet, aber nicht isoliert worden; andere Forscher (Hansen, Gaidukov) haben seine Exi- stenz bestritten. Erst Tswett und Kylin gelang es, Fucoxanthin in seiner Lösung von Xanthophyll zu trennen und die Eigenschaften der Lösung zu beschreiben. Ein von manchen Botanikern angenommenes braunes Pigment, Phykophäin, existiert nicht in der lebenden Braunalge, was Mo- lisch, Tswett und Kylin deutlich gezeigt haben. Bei raschem Extrahieren mit wasserhaltigem Aceton, wodurch Oxydasewirkun- gen ausgeschlossen werden, erhält man keinen wasserlöslichen Farbstoff und die extrahierte Pflanzensubstanz ist so gut wie farblos. l) Compt. rend. 68, 462 [1869]. Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. 123 Die Bestimmung aller Farbstoffe der Phäophyceen nach Will- st ätt er und Page lehnt sich an unsere allgemeine Methode der Analyse an. Xanthophyll und Fucoxanthin lassen sich so gut wie quanti- tativ trennen nach einem etwas komplizierten Verfahren dei Ver teilung zwischen Äther-Petroläther und 70 prozentigem Methyl- alkohol. Durch wiederholte Vornahme der Entmischung wird die Lösung des Fucoxanthins homogen, da dieses noch leichter in den wasserhaltigen Alkohol übergeht als Xanthophyll. Die zuruck- bleibende Mischung von Chlorophyll und gelben Farbstoffen wird wie sonst fraktioniert. Ausführung der Analyse. Die Braunalgen werden zwischen Filtrierpapier abgedrückt und mit der Syenitwalzenmühle fein ge- mahlen. Von den zerkleinerten Algen wird ein Teil für die Be- stimmung des Trockengewichtes verwendet und 40 g für die Ex- traktion. Hierfür zerreibt man das Material mit ungefähr 200 g Sand, mit noch mehr bei besonders zähen Algen, und mit 50 ccm 40 prozentigem, dann mit weiteren 5° ccm 30 prozentigem Aceton. Nach dem Überführen in die Nutsche und Vorextrahieren mit mehl 30 prozentigem Aceton wird der gesamte Farbstoff mit wasser- freiem Aceton ausgezogen; das Filtrat ist anfangs gelb, darauf gelb- grün, blaugrün und am Ende farblos. Aus dem Extrakt ist durch Vermischen mit 300 ccm Äther und Verdünnen mit destilliertem Wasser der Farbstoff in ätherische Lösung zu bringen, die durch sehr vorsichtiges Waschen mit destilliertem Wasser vom Aceton befreit ward. Nun vermischen wir sie mit dem gleichen Volumen niedrig siedenden Petroläthers. Zur Abtrennung des Fucoxanthins schüttelt man den Äther- Petroläther viermal mit dem gleichen Volumen petroläthergesät- tigtem 70 prozentigem Methylalkohol aus und hält immer durch Zusatz von Äther das Volumen der oberen Schicht konstant. Da in den wasserhaltigen Holzgeist Xanthophyll mit übergegangen ist, so werden die vereinigten Extrakte einmal mit dem gleichen Vo- lumen einer Mischung aus B/e Vol. Petroläther und 1/6 Vol. Äther gewaschen. Dabei geht aber etwas Fucoxanthin verloren; deshalb engt man diesen Auszug im Vakuum auf 250 ccm ein, vermischt Nr. 1 124 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. mit ebensoviel Äther und extrahiert noch zweimal mit je x/2 1 petrolätherhaltigem 70 prozentigem Methylalkohol. Die neuen holzgeistigen Auszüge werden zu den früheren gegeben und die ätherisch-petrolätherische Restlösung zur Hauptlösung. Das Fuco- xanthin ist schließlich zur Bestimmung in 250 ccm Äther über- geführt, vom Methylalkohol durch Waschen befreit und mit einer Vergleichslösung von reinem Fucoxanthin in Äther colorimetrisch analysiert worden. Von der petrolätherisch-ätherischen Lösung dient eine Hälfte zur Bestimmung von Chlorophyll, die andere zur Trennung von Carotin und Xanthophyll. Ergebnis. Die Phäophyceen enthalten viel mehr gelbe Pig- mente als die Landpflanzen und die Grünalgen, das molekulare Verhältnis des Chlorophylls zu den Carotinoiden entfernt sich nicht weit von 1. Unter den gelben Pigmenten überwiegt das sauerstoff- reichste, das Fucoxanthin. Gehalt der Braunalgen an Chlorophyll und Carotinoiden. Gattung Zeit Trockengehalt Mengen (in g) in 1 kg frischer Algen Mengen (in g) in 1 kg trockener Algen Chloro- phyll Fuco- xanthin Carotin Xantho- phyll Chloro- phyll Fuco- xanthin Carotin Xantho- phyll Summe der gelbe Pigment — - Fucus Mai 28,5 0,503b 0,169 0,089 0,087 1,765 0,593 0,312 0,305 1,2x0 Dictyota »1 — 0,640 0,250 0,057 0,063 — — — — Laminaria2) Juni 15.4 0,185 0,081 0,006 0,038 1,202 0,528 0,038 0,247 0,813 Molekulares Verhältnis zwischen Chlorophyll und den gelben Farbstoffen. ü Algen- gattung Chlorophyll ^ Carotin + Xanthophyll + Fucoxanthin Carotin : Xanthophyll : Fucoxanthin 1 Fucus o,95 1,08 : 1 : 1,75 2 Dictyota 1,20 o,77 : 1 : 3,6o 3 Laminaria 1,07 0,16 : 1 : i,92 1) Menge von Chlorophyll a, das Gesamtchlorophyll beträgt etwa 5% mehr. 2) Werte aus zwei verschiedenen Bestimmungen. 125 Quantitative Analyse der vier Chloroplastenfarbstoffe. Bei den quantitativen Bestimmungen hat sich das Ergebnis der spektroskopischen Beobachtung und der präparativen Arbeit be- stätigt, daß fast nur Chlorophyll a in den Braunalgen vorkommt. Nach dem Verseifen des Phäophytins und der Isolierung des Phyto- chlorins e im Gang der Analyse wurde stets die nur noch sehr wenig gefärbte ätherische Lösung mit 12 prozentiger Salzsäure extrahiert und dieser Auszug mit der kleinen Menge von schwach basischem Spaltungsprodukt verglichen, die bei der Herstellung der Ver- gleichslösung (in diesem Fall aus Methylphäophorbid a allein) auf- tritt. Die Fraktion in 12 prozentiger Salzsäure war beim Versuche nur sehr wenig stärker als bei der Vergleichslösung, obwohl sie beim Versuche alles vorhandene Rhodin neben etwas schwach basischem Phytochlorin enthalten mußte. Sie enthielt eben von Phytorhodin g nur eine Spur. Zum Vergleiche mit den Braunalgen ist aus der Abteilung der Chlorophyceae als Beispiel Ulva lactuca untersucht worden. Das Verhältnis der Chlorophyllkomponenten entfernt sich hier vom durch- schnittlichen Werte (ca. 3) in entgegengesetztem Sinne wie bei den Phäophyceen, indessen nicht weit. Das Chlorophyll ist nämlich relativ reich an der Komponente b. Die gelben Pigmente treten verhältnismäßig mehr hervor als bei den höheren Pflanzen, doch nicht in dem Maße wie bei den Braunalgen. Ulva lactuca (Rovigno, Mai). Trockengehalt 17,6. Mengen in 1 kg der frischen Alge: 0,1648 g Chlorophyll a, 0,1172 g Chlorophyll b, 0,0243 g Carotin, 0,0643 g Xanthophyll. Mengen in 1 kg der trockenen Alge: 0,9362 g Chlorophyll a, 0,6660 g Chlorophyll b, 0,1381 g Carotin, 0,3653 g Xanthophyll. Qa = i,43 i Q^= 0,40 ; Qa+b = 1,96 . X C + X V. Gewinnung von Chlorophyll. i. Methode von Willstätter und Hug1). Die Grundzüge der Isolierung. Um das Chlorophyll frei von Begleitstoffen in unversehrtem Zustand zu isolieren, war es notwendig, zuerst seine Merkmale kennen zu lernen. Dadurch sind die Anforderungen festgestellt worden, denen der Farbstoff in den einzelnen Phasen der Isolierung und im isolierten Zustand genügen muß. Zunächst sind dem Chlorophyll die gelben Pigmente der Chloroplasten beigemischt; solange sie das Chlorophyll begleiten, erhält man durch Verseifen mit alkoholischem Kali und Ausäthern gelb gefärbte Lösungen. Farblose Begleiter, Fette, Wachse und fettsaure Salze, folgen dem Chlorophyll und verteilen sich zwischen verschiedenen Lösungs- mitteln in ungefähr demselben Verhältnis wie Chlorophyll; sie drücken den Magnesiumgehalt des Farbstoffes herab und geben der Asche eine Beimischung von Kalk. Die Löslichkeits Verhält- nisse boten keine Handhabe für die Trennung des Chlorophylls von den Begleitern. Der Farbstoff schien in allen organischen Solventien spielend löslich zu sein. Der Gang der Isolierung wird nun so geleitet, daß die Wirkung jeder Behandlung auf das Chlorophyll durch die colorimetrische Bestimmung seines Reinheitsgrades geprüft wird, wofür das krystal- lisierte Äthylchlorophyllid die Grundlage bietet. Aber das eine Prinzip hat nicht ausgereicht. Wir sind bei vielen Vor versuchen zu Chlorophyllpräparaten gelangt, die zwar nach der colorimetii- schen Analyse fast iooprozentig sind, die annähernd ein Drittel b Abh. XV. Gewinnung von Chlorophyll. 127 Phytol enthalten und die dennoch nicht aus unverändertem Chloro- phyll bestehen. Sie unterscheiden sich nämlich vom Chlorophyll guter Blätterauszüge in zwei Eigenschaften, die dem Chlorophyll beim Stehen der Lösungen, beim Eindampfen, beim Aufnehmen mit Adsorptionsmitteln, überhaupt bei allen Operationen sehr leicht verloren gehen, ohne daß die Änderung durch einen auffälligen Unterschied im Spektrum verraten wird. Diese Änderungen sind daher auch von anderen Autoren, welche die Isolierung des Chloro- phylls angestrebt haben, noch nicht beachtet worden. Solange das Chlorophyll intakt ist, zeigt es beim Verseifen mit alkoholischem Kali den auffälligen Farbenumschlag in braun; es dauert einige Minuten, bis die Verseifung vollständig wird, und in dieser Zeit kehrt die Chlorophyllfarbe zurück. Die braune Phase fehlt den Lösungen und Präparaten, wenn sich das Chlorophyll durch eine Änderung in seiner Lactamgruppe allomerisiert hat. Diese Veränderung zeigt sich noch in einer weiteren Abweichung. Die Spaltung liefert dann nicht mehr das normale Gemisch von Phytochlorin e und Phytorhodin g, sondern schwächere Basen. In guten alkoholischen Extrakten getrockneter Blätter ist das Chlorophyll durch ungefähr das Sechsfache an Begleitstoffen ver- dünnt. Die Konzentration des Farbstoffs steigt auf das Doppelte, wenn er aus dem Extrakt in Petroläther übergeführt wird. Durch Vorbehandeln der Blätter mit Lösungsmitteln, welche die Begleit- stoffe, aber kein Chlorophyll extrahieren, am besten mit Benzol, gewinnt man Extrakte, die, ohne selbst einen höheren Reinheits- grad zu besitzen, doch ein viel günstigeres Resultat beim Ent- mischen mit Petroläther ergeben, nämlich Chlorophyll, das nur noch weniger als das i1/2 fache Gewicht anderer Stoffe mitführt. Der Reinheitsgrad läßt sich durch Waschen der petrolätherischen Rohlösung mit Holzgeist auf 60 steigern und noch höher, wenn man mit demselben Lösungsmittel, das zum Auswaschen gedient hat, den Farbstoff aus dem Petroläther extrahiert und ihn von neuem in Petroläther überfühi't. So erhalten wir Lösungen von 7oprozentigem Chlorophyll, die durch weitere Behandlung mit Sol- ventien nicht verbessert werden können. 128 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Wenn das Chlorophyll diesen Reinheitsgrad erreicht hat, dann ist seine Löslichkeit von den Beimischungen nicht mehr so wie an- fangs beeinflußt. Es zeigt sich jetzt überraschenderweise in Petrol- äther nur löslich, solange dieser Methyl- oder Äthylalkohol enthält. Wird der Alkohol quantitativ herausgewaschen, so trübt sich die Lösung, der Petroläther wird opalisierend, die Flüssigkeit enthält dann das Chlorophyll in feinstem Zustand ausgefällt. Man könnte glauben, eine verdorbene Chlorophyllösung vor sich zu haben, aber auf Zusatz von Alkohol oder Äther entsteht wieder eine prächtige grüne Lösung. Gleichzeitig mit Willstätter und Hug1) ist der russische Bo- taniker M. Ts wett2) in seinem Werke „Die Chromophylle in der Pflanzen- und Tierwelt“ (russisch) auch zu der wichtigen Beobach- tung gekommen, daß das Chlorophyll nach der Reinigung der petrolätherischen Lösung aus dieser durch Entfernen des Alkohols ausgefällt wird und in Ligroin nicht mehr löslich ist. Diese Abscheidung aus der gereinigten Lösung ist das Wesent- liche der Isolierungsmethode. Einmal abgeschieden, läßt sich das Präparat durch Umfällen aus Alkohol mit Salzlösung und durch wiederholtes Umscheiden aus konzentrierter ätherischer Lösung mit Petroläther weiter ver- bessern. Das isolierte Chlorophyll erweist sich bei rasch ausgeführten, gut gelungenen Versuchen als rein und gemäß der Prüfung mit allen bekannten Merkmalen als unverändert. Die Ausbeute war infolge des großen Chlorophyllverlustes bei der Fraktionierung von den Begleitstoffen nur eine geringe, sie betrug etwa 5 — 7% vom Chlorophyllgehalt der Blätter. Die Ausführung des Verfahrens. Die Extrakte waren nach der Vorextraktion des Blattmehles mit Benzol und zur Verdrängung desselben durch Petroläther nach dem Nutschenverfahren mit 96 prozentigem Sprit hergestellt (siehe 1) Ann. d. Chem. 378, 21 [191°]- 2) Warschau 1910; Seite 206. Gewinnung von Chlorophyll. 129 Kap. III, Abschn. 2a). Das Chlorophyll wurde in Petroläther über- geführt, wobei Extrakte von den Reinheitsgraden 14—17 Roh- lösungen von den Reinheitsgraden 30 — 44 lieferten. Durch Waschen mit wasserhaltigen Alkoholen ließ sich die Chlorophyllkonzentration in der petrolätherischen Schicht steigern und zwar bis zu den Rein- heitsgraden 50 — 60, aber nicht weiter. Während die Entmischungen von Stokes, Sorby und Kraus stets zur Trennung der verschiedenen Pigmente gedient hatten, also für diejenigen Trennungen, die sich dem Auge verraten, er- fährt hier das Entmischungsverfahren eine im Wesen neue An- wendung zur Abtrennung farbloser Beimischungen, also zur Steige- rung des Reinheitsgrades. Für die Fraktionierung der Rohchlorophyllösungen ist Holz- geist dem Äthylalkohol vorzuziehen. Chlorophyll ist schwerer in ihm löslich. Ferner ist, wie nachstehender Versuch zeigt, in wasser- haltigem Holzgeist viel weniger Petroläther löslich als in Weingeist, und man kann daher mit Holzgeist leichter und schärfer fraktio- nieren als mit Äthylalkohol. Je 50 ccm absoluter Alkohol und käuflicher Methylalkohol wer- den mit 50 ccm Petroläther vom Siedepunkt 30 — 50 0 vermischt. Auf Zusatz von Wasser wird Petroläther in folgendem Maße ab- geschieden : Petroläther aus der Petroläther aus der Wasserzusatz Mischung Mischung mit Methylalkohol mit Äthylalkohol 0,7 ccm 10 ccm 0 ccm 1,0 „ 20 „ 0 „ 3-0 » 4° .. 0 „ 5.° » 45 >> 22 „ 10.0 „ 50 „ 43 »> Vor der Anwendung ist der wasserhaltige Holzgeist mit Petrol- äther vom Siedepunkt 30 — 50 0 gesättigt worden. Chlorophyll und Begleitstoffe sind daher zwischen goprozen- tigem Methylalkohol und Petroläther verteilt worden und zwar mit mehreren aufeinanderfolgenden Entmischungen; denn die einmal fraktionierte Petrolätherlösung ließ sich durch ein wiederholtes Waschen noch erheblich verbessern. Wülstätter-Stoll, Chlorophyll. 9 130 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Zum Beispiel gab eine gewaschene Petrolätherlösung, welche 4,8 g 52 prozentigen Chlorophylls in 1/2 1 enthielt, beim zweiten Waschen mit dem halben Volumen von 90 prozentigem Holzgeist an diesen 10% ihres Chlorophylls mit dem Reinheitsgrade 19 ab. Dadurch stieg im Petroläther die Konzentration des Chlorophylls auf 60. Noch weiter fortgesetztes Auswaschen führte aber zu einem Punkt, wo höherprozentiges Chlorophyll als das zurückbleibende in den Methylalkohol, namentlich in 95 prozentigen, überzugehen begann. Beispielsweise wurde eine gereinigte petrolätherische Lösung mit 8 g 55 prozentigem Chlorophyll in 2 1 angewandt und die Ver- teilung des Chlorophylls beim Durchschütteln mit dem gleichen Volumen petroläthergesättigten 95 prozentigen Holzgeistes unter- sucht. 1. Versuch: Angew. petroläther. Lösung Fraktion in 95 prozent. Holzgeist Petrolätherischer Rest 2. Versuch: Angew. petroläther. Lösung Fraktion in 95 prozent. Holzgeist Petrolätherischer Rest Chloro- Rück- Rein- phyll stand heits- in g in g grad 8,o — 55 3,7 5.8 64 4.5 9,2 49 8,5 15.3 55 4-5 6,5 69 4-° 8,7 46 Dieses Resultat wurde verwertet, um das Chlorophyll durch Überführen in 95 prozentigen Methylalkohol und Wiederausziehen aus demselben mit Petroläther unter starkem Zusatz von Wasser endlich so rein zu erhalten, daß es sich beim vollständigen W eg- waschen des Methylalkohols ausschied. Beispiel. 2 kg chlorophyllreiches Brennesselmehl (Chlorophyllgehalt 7 bis 8 g im Kilogramm) werden unter Saugen, aber ohne Anfeuchten, auf eine Nutsche ausgebreitet und mit 7 1 Benzol extrahiert, was mit dem Maschinenvakuum in 2 — 3 Stunden ausgeführt ist; dann verdrängen wir in etwa 1 Stunde das vom Pulver noch zurück- gehaltene Benzol durch Petroläther, wozu 2—2,5 1 genügen. Nach scharfem Absaugen wird weiter auf der Nutsche im Laufe von Gewinnung von Chlorophyll. 131 etwa 2 Stunden das Chlorophyll mit 3 1 96 prozen tigern Alkohol ausgezogen. Der Extrakt, der viel Petroläther enthält, beträgt gegen 3 1. Wir verarbeiten ihn sofort, indem wir ihn mit V2 V3 seines Volumens Petroläther (spez. Gew. 0,64 — 0,66) und dann mit i/8 seines Volumens Wasser versetzen. Bei dieser Entmischung geht der größere Teil des Chlorophylls in die obere Schicht mit schön blaustichig grüner Farbe. Die wässerig alkoholische Frak- tion ist mißfarbig, hell gelbgrün und stark gelb tingierend, sie wird verworfen. Die petrolätherische Rohlösung reinigen wir durch dreimaliges Ausschütteln mit je dem halben Volumen 90 prozentigem, petrol- äthergesättigtem Methylalkohol. Der erste Auszug ist noch gelb- stichig und tingiert gelb, der dritte ist reiner in der Farbe. Bei dieser Reinigungsoperation ist der Verlust an Chlorophyll oft nicht unerheblich. Aus der dreimal gewaschenen Lösung wird der Farbstoff in Holzgeist übergeführt durch zweimaliges Ausziehen mit je dem gleichen Volumen (1— 1,5 1) 95 prozentigem Methylalkohol, der auch zuvor mit Petroläther gesättigt ist. Im Petroläther bleibt mit blaugrüner leuchtender Farbe etwas weniger als die Hälfte des Chlorophylls zurück; diese Restlösung ist wertvoll für die Ge- winnung von Chlorophyllderivaten, aber zur Isolierung des Chloro- phylls selbst soll nur die reinere methylalkoholische Fraktion dienen. Hieraus bringen wir das Chlorophyll mit verdünnter Kochsalz- lösung quantitativ wieder in 1 1 Petroläther. Nach einmaligem Waschen mit 500 ccm 90 prozentigem Holzgeist weist diese Lösung einen Reinheitsgrad von etwa 70 und 2 — 3 g Chlorophyllgehalt auf. Die prächtig blaustichig grüne Lösung wird mit sehr viel Wasser gewaschen, bis die grüne Farbe und die rote Fluorescenz verschwunden und die Opalescenz und Trübung eingetreten ist. Das in äußerst feiner Verteilung ausgeschiedene Pigment wird mit viel Natriumsulfat gesammelt und mit leichtflüchtigem Petrol- äther nachgewaschen. Mindestens bis zu diesem Punkt ist die Arbeit an einem Tage zu führen. Die Reinheit des Chlorophylls wird durch Umfällen aus Alkohol mit Salzlösung und weiterhin aus Äther mit Petroläther erhöht, 9* 132 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. was in der Originalabhandlung genau beschrieben ist. Die Aus- beute beträgt 3/4 g bis 1 g, aber zwei Chargen lassen sich von An- fang an nebeneinander bewältigen und bei den letzten Operationen vereinigen. Nicht alle Darstellungen liefern tadellose Präparate.; es ist unerläßlich, jede einzelne zu prüfen. 2. Reinchlorophyll nach Willstätter und Stoll1). Das Verfahren für die Isolierung des Chlorophylls von Will- stätter und Hug ist schwierig auszuführen und liefert mit sehr großem Aufwand an Lösungsmitteln und an Zeit eine geringe Ausbeute an Chlorophyll. Die Reinheit der Präparate, gefährdet durch die lange Folge der Vornahmen in alkoholischen Lösungen, fällt nicht immer gleichmäßig befriedigend aus. Durch die Anwendung der neuen Extraktionsmethode mit wasserhaltigem Aceton bei niedriger Schicht von Blattmehl ist das Verfahren wesentlich verändert und so verbessert worden, daß nur noch ein Gemeinsames mit der beschriebenen Methode von Willstätter und Hug geblieben ist: das Ausfallen des Chloro- phylls aus der gereinigten Petrolätherlösung. Der wasserhaltige Acetonextrakt enthält von vornherein eine bessere Chlorophyllausbeute und ist daher ein günstigeres Aus- gangsmaterial; zudem ist daraus das Chlorophyll leichter und voll ständiger in Petroläther überzuführen, als aus den alkoholischen Extrakten. Namentlich ist die Art der Beimischungen in den ent- stehenden petrolätherischen Rohlösungen eine ganz andere als bei den Extrakten mit wasserfreien oder wasser ärmeren Lösungsmitteln. Die wasserhaltigen Extrakte, schlechtere Lösungsmittel für Fette und Wachse, führen gerade die störendsten Begleitstoffe nicht mit, welche die Löslichkeit des Chlorophylls in Petroläther erhöhen und die Ausfällung so sehr erschweren, daß sie erst durch die kompli- zierten Entmischungen möglich ist. Daher gelingt es jetzt, einfach durch Überführen aus dem Ex- trakt in Petroläther und Wegwaschen des Acetons, den Farbstoff in noch unreinem Zustand zu fällen. Wir machen davon keine !) Unveröffentlicht. Gewinnung von . Chlorophyll. 133 Anwendung, da es mit wenig mehr Arbeit möglich ist, zu reinen Präparaten zu gelangen. Es genügt eine zweimalige Reinigung der Petrolätherlösung mit 80 prozentigem Aceton und wiederholtes Entmischen mit 80 prozentigem Methylalkohol, wodurch Xantho- phyll entfernt wird, um den Reinigungsgrad ebenso zu steigern, wie früher durch eine große Zahl von Fraktionierungen mit höher- prozentigem, daher mehr Chlorophyll hinwegnehmendem Methyl- alkohol, sowie durch Überführen des Chlorophylls in den Methyl- alkohol hinein. Die Steigerung des Reinheitsgrades bei kleinem Farbstoffverlust ergibt sich aus folgenden Zahlen: a) Acetonextrakt aus 2 kg; b) gereinigte petroläther. Lösung. a) 3,7 1, Chlorophyllgehalt 16,8 g, Trockenrückstand 135 g, Reinheitsgrad 12; b) 3 1, Chlorophyllgehalt 14,3 g, Trockenrückstand 21,9 g, Reinheitsgrad 65. Da die Isolierung ohne Fraktionierung und Zersplitterung (vgl. die „Restlösung“ im Abschn. 1) des Materials erfolgt, behält das Chlorophyll das natürliche Mischungsverhältnis der Komponenten und die Ausbeute wird annähernd quantitativ, nämlich aus 1 kg Blätter so viel als bisher aus 13 kg. Auch bleibt das Chlorophyll in den empfindlichen Gruppen des Phytochromins unverändert, da es mit Alkoholen nur wenig in Berührung kommt. Ausführung des Verfahrens. Die Verarbeitung von 2 kg Brennesseln bis zur Umfällung des isolierten Präparates erfordert einen halben Tag. Wir verwenden die mit Sorgfalt gesammelten und getrockneten Blätter als mittel- feines Mehl. Auf derSteinzeugnutsche werden 2 kg mit der Pumpe festgesaugt und in V2 Stunde mit 6 — 6,4 1 80 volumprozentigem Aceton extra- hiert. Zuerst lassen wir ohne Saugen 2 1 Lösungsmittel in etwa 5 Minuten einsickern, dann füllen wir die Hauptmenge des Acetons literweise nach, indem wir abwechselnd ohne Vakuum macerieren 134 Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. und mit nur mäßigem Saugen abfließen lassen. Am Ende wird das entfärbte Mehl mit kräftig wirkender Pumpe trocken gesaugt. :.;j Aus dem schönen Extrakt wird der Farbstoff in 4 1 Petroläther (0,64 — 0,66 von Kahlbaum) übergeführt, indem wir ihn hälften- weise im 7 1-Scheidetrichter in die ganze Petroläthermenge ein- gießen und unter Umschwenken je 1/2 1 Wasser langsam zufügen. Nach dem Ablassen der nur schwach gelblichgrünen unteren Schicht wird die petrolätherische Lösung zweimal mit je 1 1 8opro- zentigem Aceton entmischt; dieses nimmt Verunreinigungen, aber sehr wenig Chlorophyll weg. Die Petrolätherschicht ist durch Auf- nahme von Aceton auf 6 1 angewachsen. Das Aceton wird daraus vorsichtig durch viermaliges Ausziehen mit je x/2 1 Wasser unter leichtem Umschwenken entfernt. Die erste von diesen Ent- mischungen beseitigt 0,6, die zweite 0,5, die dritte 0,4 und die letzte noch 0,2 1 Aceton. Durch diese Art der Entmischung werden mit dem hochprozentig ausgeschiedenen Aceton noch Begleitstoffe beseitigt. Wir beabsichtigen nicht, das Aceton jetzt quantitativ wegzu- waschen; sonst würde das gesamte Chlorophyll und Xanthophyll ausfallen und die Reinigung wäre schwierig. Es ist zweckmäßig, zuvor das Xanthophyll abzutrennen, was durch Ausziehen mit 80 prozentigem Methylalkohol ohne zu großen Chlorophyllverlust gelingt. Wir schütteln mit je 2 1 80 prozentigem Methylalkohol dreimal aus oder, wenn der letzte Auszug noch beträchtlich Gelbes enthält, ein viertes und fünftes Mal. Diese Auszüge sind leicht nebenher auf Xanthophyll zu verarbeiten; sie liefern davon 0,8 g. Dem Petroläther, dessen Volumen schließlich 3,6 1 beträgt, ent- ziehen wir durch Waschen mit Wasser in ungefähr vier Malen mit je 2 1 die letzten Anteile von Methylalkohol und Aceton. Dabei verliert der Petroläther die Fluorescenz, er trübt sich und das Chlorophyll fällt aus. Die Suspension im Petroläther schüttelt man mit etwas geglühtem Natriumsulfat und mit etwa 150 g Talk und filtriert sie durch eine Schicht von 50 g Talk mit der Pumpe. Da- bei bildet die feine Ausscheidung über dem Talk leicht eine zu- sammenhängende Schicht und stört die Filtration; wir verrühren sie von Zeit zu Zeit mit dem Silberspatel. Gewinnung von Chlorophyll. 135 Der filtrierte Petroläther ist schwach olivgrün bis gelbgrün und enthält neben wenig Chlorophyll und den öligen Stoffen viel Caro- tin, das daraus mit Leichtigkeit isoliert werden kann. Der chlorophyllhaltige Talk wird auf der Nutsche zuerst mit gewöhnlichem Petroläther nachgewaschen, bis dieser nur schwach gelb abläuft und dann zur Verdrängung von schwerer flüchtigen Bestandteilen mit 300 ccm Petrolätherfraktion vom Siedepunkt 20 50 °. Nun saugen wir vollständig ab und lösen sogleich auf der Nutsche das Chlorophyll mit il sorgfältig destilliertem Äther aus dem Talk heraus. Die ätherische Chlor ophyllösung wird durch geglühtes Natriumsulfat filtriert, auf 100 ccm konzentrieit, zur Sicherheit nochmals filtriert und auf 25 ccm eingedampft. Dann fällen wir durch langsamen Zusatz von 0,8 1 leichtflüchtigem Petroläther das Chlorophyll aus. Manchmal bildet der Niederschlag ein filtrierbares blauschwarzes Pulver, mitunter aber eine Suspen- sion von so feinen Partikeln, daß man sie nur gut auf Talk filtrieren kann. Er wird dann mit Äther wieder ausgezogen und die auf 20 ccm eingeengte Lösung in einer Schale im Exsiccator zu stahl- blau glänzenden dünnen Krusten eingetrocknet. Die Mutterlauge der Umfällung hatte nicht mehr viel Bei- mischungen zu entfernen; sie enthielt z. B. 0,15 g Chlorophyll in 0,5 g Trockenrückstand. Die Ausbeute betrug bei wiederholten Versuchen 13 g, also 6,5 g aus 1 kg Blätter, d. i. drei Viertel ihres Chlorophyllgehaltes. Aus der quantitativen Bestimmung in der Form von Phytochlorin und Phytorhodin ergab sich das Komponentenverhältnis 2,4 und der Reinheitsgrad 98, bei anderen Darstellungen mit kleineren Mengen ein noch höherer Reinheitsgrad. 3. Rohchlorophyll1). Die bedeutende Überlegenheit der Extraktionen mit wasser- haltigem Aceton gegenüber den älteren Verfahren zeigt sich auch bei der Abscheidung von Rohchlorophyll durch Verdünnen. Will- st ätt er und Fritzsche hatten schon die Fällung aus alkoholischen *) Unveröffentlicht. 136 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Extrakten als Ausgangsmaterial für Phyllophyllin angewandt, aber solche Produkte enthielten den Farbstoff verdünnt durch viel Be- gleitstoffe. Ganz anders verhält es sich mit den mittels 80 volum- prozentigem Aceton gewonnenen Extrakten. Schon bei sehr ge- ringem Wasserzusatz fällt das Pigment vollständig aus mit einem Reinheitsgrad von ungefähr 50. Es ist rein genug, um vom Petrol- äther ausgefällt zu werden, da gerade diejenigen Begleitstoffe im wässerigen Aceton fehlen, die sonst an der Mischbarkeit des un- reinen Chlorophylls mit Petroläther schuld tragen. Einmalige Um- fällung aus Äther mit Petroläther genügt daher, um mit nur ge- ringem Verlust Rohchlorophyll in einem Reinheitsgrad von etwa 90 zu gewinnen. Das ist also ein sehr einfaches und rasches Verfahren, wodurch Chlorophyll für technische Anwendungen und viele präparative Zwecke, z. B. für die Darstellung des reinen Chlorophylls und seiner Komponenten, sowie der Phylline und Porphyrine ganz leicht zu- gänglich wird. Die Wiedergewinnung der Lösungsmittel ist hier viel leichter als bei der Isolierung von Reinchlorophyll, da keine Mischungen derselben entstehen. Die Steigerung der Chlorophyllkonzentration in den 4 Phasen des Versuches machen die folgenden Zahlen anschaulich: 1 kg Brennesseln enthält 7,5 g Chlorophyll; Konzentration desselben 0,75. 1 1 Extrakt enthält 7, 2 g Chlorophyll; Reinheitsgrad 7,5. 14 g erste Fällung enthält 7,0 g Chlorophyll; Reinheitsgrad 50. 6,2 g Rohchlorophyll enthalten 5,9 g Chlorophyll; Reinheits- grad 95. 2 kg Mehl selbstgesammelter Brennesseln haben wir auf der Steinzeugnutsche von 50 cm Durchmesser mit 6 1 78 prozentigem Aceton in der schon beschriebenen Weise während 30 — 45 Minuten extrahiert. Das Mehl bleibt strohgelb zurück, höchstens in den unteren Schichten noch etwas grün. Der Extrakt (4 1) ist an Chlorophyll, wovon er 16 — 17 g ent- hält, übersättigt und scheidet beim Stehen öfters einen Teil der Pigmente zähflüssig ab. Manchmal, z. B. bei der Verarbeitung Gewinnung von Chlorophyll. 137 größerer Chargen technischer Mehle, ist es zweckmäßig, den fertigen Extrakt noch mit 80 prozentigem Aceton zu verdünnen (etwa mit i/4 — 1/2 Volumen). Wir schütteln den Extrakt mit 300 — 400 g nicht zu fein gemahlenem Talk; er nimmt sogleich viel Farbstoff auf. Die Abscheidung desselben wird vervollständigt durch all- mählichen Zusatz von 1,2 1 Wasser; die Flüssigkeit enthält dann 40 Volumprozent Wasser und bleibt nur noch gelbgrün. Dann fil- trieren wir durch eine dünne Talkschicht und zwar sofort, damit langsamer ausfallende Begleitstoffe nicht mehr zum Farbstoff kommen. Der tief graugrüne Talk wird mit 2—3 1 65 prozentigem Aceton gewaschen, wobei ziemlich viel gelber Farbstoff entfernt und nur wenig grüner verloren wird, sodann mehrere Male mit Wasser (im ganzen etwa 4 1) unter Aufrühren des Talkes. Eine Probe des Filtrats darf nicht mehr nach Aceton riechen, da dieses selbst in Spuren die Umscheidung stören würde. Nun saugen wir den Talk möglichst trocken und bringen daraus den Farbstoff durch An- schütteln in einer Pulverflasche mit Äther unter Zusatz von ge- glühtem Natriumsulfat in Lösung. Sie wird abgesaugt, nochmals durch Natriumsulfat filtriert und bis zur Sirupkonsistenz ein- gedampft. Dann wird die Masse mit wenig Petroläther vermischt und nach und nach unter Umschütteln mit viel Petroläther, im ganzen i1/* — 2 1, zum großen Teil gefällt. Die Suspension setzt sich beim Stehen ab, sie ist gut filtrierbar und wird mit leicht- flüchtigem Petroläther ausgewaschen. Die Ausbeute beträgt 12 — 14 g und der Reinheitsgrad pflegt zwischen 90 und 95 zu liegen. Das Präparat enthält kein Carotin, aber einige Prozente Xanthophyll. Man erhält dieses beim Verarbeiten des Rohchloro- phylls auf Reinchlorophyll oder auf Chlorophyllinsalz (z. B. 1 g aus 40 g). Die petrolätherische Mutterlauge der Umfällung enthält noch 2 — 3 g Chlorophyll; diesen Rest kann man durch zweimaliges Waschen mit 80 prozentigem Methylalkohol, sodann mit Wasser aus- scheiden und dadurch die Isolierung des gesamten Chlorophylls vervollständigen. 138 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Das Rohchlorophyll entspricht, abgesehen von seinem Gehalt an farblosen und gelben Begleitstoffen, ebensogut den Reinheit^, proben (Phasenprobe, Spaltungsprobe) wie die in den Abschnitten i, 2, 4 beschriebenen Präparate. 4. Chlorophyll aus frischen Blättern1). Die Isolierung des Chlorophylls aus frischen Blättern beschreiben wir, um zu zeigen, daß das aus den getrockneten Blättern gewonnene in unverändertem natürlichen Zustand vorliegt und um zu prüfen, ob das Pigment bei gewissen Einwirkungen auf die Blattzelle, z. B. beim Abbrühen oder beim Lagern der frisch gepflückten Blätter Veränderungen erleidet. Das Verfahren für die Verarbeitung frischer Blätter ist notwendig für die Untersuchung des Farbstoffs aus manchen Pflanzen, die sich nicht leicht unverändert trocknen lassen . Die Extrakte mit wasserhaltigem Aceton aus frischen Blättern sind viel verdünnter als die aus trockenen, weil die lösende Wir- kung der Begleitstoffe nicht ausgenützt wird. Der zum Entwässern erforderliche Vorextrakt hat viel Begleitstoffe weggeführt. 1 kg trockene Brennesselblätter geben 2 1 Extrakt, enth. über 100 g Trockenrückstand; 5 kg frische Brennesselblätter geben 8 1 Extrakt, enth. 45 g Trockenrückstand. Schon die aus den konzentrierten wasserhaltigen Acetonextrak- ten der getrockneten Blätter in Petroläther mitgehenden Begleit- stoffe waren ihrer Natur nach nicht störend für die Abscheidung des Farbstoffs. Hier bei der Verarbeitung der verdünnten Extrakte aus frischen Blättern bleibt zwar auch beim Waschen mit Aceton und Holzgeist die Menge der in Petroläther enthaltenen Bei- mischungen nicht gering, aber auch sie sind ohne ungünstigen Ein- fluß auf die Abscheidung des Chlorophylls. Es genügt durch das Ausschütteln mit Aceton und Holzgeist den Reinheitsgrad auf 5° zu bringen, um das Chlorophyll aus dem Petroläther ausf allen zu lassen. x) Unveröffentlicht. Gewinnung von Chlorophyll. 139 Acetonextrakt aus frischen Brennesselblättern enthält 4,7 g Chlorophyll, Trockenrückstand 22,6 g ; Petroläther nach Waschen mit Aceton enthält 4,5 g Chlorophyll, Trockenrückstand 11,6 g; Mit Holzgeist gewaschen enthält er 4,2 g Chlorophyll, Trocken- rückstand 9,3 g; Petroläther nach Ausfällung enthält o g Chlorophyll, Trocken- rückstand 4,4 g. Beispiel. 2x/2 kg frische Brennesseln haben wir rasch, näm- lich in 20 Minuten, mit der Steinwalzenmühle zu dünnem Brei verarbeitet und diesen durch Anschütteln in der Flasche mit iV2 1 wasserfreiem Aceton entwässert und vorextrahiert (vgl. Kap. III, Abschn. 2c). Beim Absaugen und scharfen Abpressen liefen 2,6 1 Vorextrakt ab, die 90 g Trockensubstanz enthielten. Nun extra- hierten wir mit 1,2 1 reinem Aceton den wieder gemahlenen Preß- kuchen, dessen Wassergehalt das Lösungsmittel auf etwa 80 Volum- prozent verdünnt, unter Zusatz eines weiteren Liters 80 prozentigen Acetons. Beim Absaugen und Nachwaschen mit 2 1 desselben Lö- sungsmittels gewannen wir 3,8 1 Extrakt mit nahezu dem ganzen Chlorophyllgehalt der Blätter, während ein beträchtlicher Teil der gelben Pigmente in dem Blattmehl zurückbleibt; durch Nach- extrahieren der Blätter mit Petroläther wurden 0,06 g reines Caro- tin isoliert, weitere 0,02 g lieferte die Petroläthermutterlauge des Chlorophylls. Den Extrakt ließen wir in ix/2 1 Petroläther unter Umschwenken einlaufen, wobei sich die Schichten scharf trennten und die untere sehr wenig gefärbt blieb. Der Petroläther wurde einmal mit x/2 1 80 prozentigem Aceton gewaschen und die auf 3,1 1 angewachsene Schicht der Chlorophyllösung in zwei Malen mit je x/2 1 Wasser von der Hauptmenge des Acetons frei gewaschen. Das Volumen betrug nun 1,7 1. Hauptsächlich zur Entfernung des Xanthophylls diente sodann Waschen mit 80 prozentigem Holzgeist in zwei Malen mit je x/2 1. Wir haben aus dieser methylalkoholischen Schicht 0,15 g reines Xanthophyll isoliert. Der Chlorophyll Verlust bei allen Entmischungen war gering; die Lösung enthielt am Ende noch 4,2 g Chlorophyll und schied 140 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. dasselbe quantitativ ab bei etwa fünfmaligem Waschen mit je 2 1 Wasser. Die flockige Suspension sammelten wir mit 50 g Talk, filtrierten sie auf Talk und befreiten sie von der Mutterlauge durch Waschen mit Petroläther. Nach dem Ausziehen des Chloro- phylls aus dem Talk mit Äther und langsamem Ausfällen aus ein- geengter Lösung mit Petroläther betrug die Ausbeute 4,05 g, d. i. reichlich vier Fünftel des in den Blättern vorhandenen Chloro- phylls; das Präparat ergab bei quantitativer Bestimmung das Komponentenverhältnis 2,8 und den Reinheitsgrad 97. • In derselben Weise haben wir den Farbstoff aus 5 kg frischen Blättern gewonnen, die mit 20 1 siedendem destilliertem Wasser 5 Minuten abgebrüht und aus einer Menge von 2 1/2 kg Brennesseln, die 4 Tage im Eisschrank gelagert worden waren. Wir haben weder im Gang der Isolierung noch in den Eigenschaften der Präparate Abweichendes gefunden. Die geschilderte Verarbeitung hat einen halben Tag in An- spruch genommen; wenn man auf die hier erreichte hohe Ausbeute verzichtet, gelingt es den Farbstoff aus kleineren Mengen frischer Blätter durch Abkürzung aller Operationen viel rascher in reinem Zustand zu isolieren, nämlich in 45 Minuten. Das so gewonnene Chlorophyll stimmte mit den andern Präparaten gut überein; es zeichnet sich durch die Reinheit seiner Lösung und seiner Spal- tungsprodukte aus. Beispiel. 250 g frische Brennesselblätter werden mit den Syenitwalzen in 3 — 4 Minuten gemahlen, wobei immer eine Hand- voll zweimal die Walzen passiert und sofort in 90 prozentiges Aceton fällt. Wir verzichten, um Zeit zu sparen, auf die Vor- extraktion und ziehen mit 1 1 des Lösungsmittels in der Flasche den Brei in 2 Minuten zur Genüge aus. Nach dem Absaugen und Nach waschen mit x/i 1 80 prozentigem Aceton läßt man das Filtrat in 300 ccm Petroläther einlaufen und wäscht die Chlorophyllösung nur zweimal mit 1/i 1 Wasser und zweimal mit x/4 1 80 prozentigem Holzgeist. Dies genügt, um das Chlorophyll bei vollständigem Wegwaschen des Methylalkohols aus dem Petroläther zur Abscheidung zu bringen. Es wird in der üblichen Weise mit Talk aufgenommen, auf der Nutsche mit Gewinnung von' Chlorophyll. 141 Petroläther gewaschen und sofort auf derNutsche mit Äther ausge- zogen. Den Äther trocknen wir mit Natriumsulfat und fällen daraus nach raschem Einengen das Chlorophyll mit leichtflüchtigem Petrol- äther. Bis zu diesem Punkt kann man in 35—4° Minuten gelangen. Die Ausbeute beträgt 0,25 g, während die angewandten Blätter (entsprechend 50 g getrockneten) 0,4 — 0,5 g Chlorophyll enthalten. Das Präparat ist frei von gelben Farbstoffen. Rohchlorophyll aus frischen Braunalgen1). Die Phäophyceen lassen sich nicht so wie Landpflanzen in trockenem Zustand verwenden. Nach vorsichtigem Trocknen der Braunalgen und Mahlen ließen sich nur noch etwa 5 % des ursprünglich darin enthaltenden Chloro- phylls extrahieren und auch nicht mehr Fucoxanthin, und die kleine Menge der Farbstoffe war nicht einmal in unversehrtem Zustand. Es ist daher notwendig, die Braunalgen in frischem Zustand zu verarbeiten, entweder zu extrahieren oder wenigstens sie zur Zer- störung der Enzyme abzubrühen. Die Schwierigkeiten der Zer- kleinerung und Extraktion des zähen Materials wurden durch eine Vorextraktion mit 40 prozentigem Aceton überwunden, also nach unserer allgemeinen Methode der Verarbeitung frischer Blätter, die sich auch bei einem so schwer zu behandelnden Pflanzenmaterial bewährt. Bei diesem Verfahren wird viel schleimige Substanz extrahiert, so daß man nachher die Algen sehr gut zerkleinern und mit wasserärmerem Aceton allen Farbstoff ausziehen kann. Vorzugsweise wurde Fucus virsoides aus dem Adriatischen Meere verarbeitet. Für die freundliche Versorgung mit vielen, großen Mengen der Fucoideen sind wir der Zoologischen Station der Kaiser Wilhelm-Gesellschaft in Rovigno und ihrem Leiter, Herrn Dr. Thilo Krumbach, zu aufrichtigem Danke verpflichtet. Die Algen wurden in Mengen von 10 — 20 kg durch eine Walzen- mühle mit Maschinenantrieb ganz grob gemahlen und sofort x/4 bis höchstens x/2 Stunde lang unter häufigem Umrühren in 4oprozen- tiges Aceton eingelegt (2 1 für je 1 kg Algen). Dann saugt man x) Unveröffentlichte Angaben von R. Willstätter und H. J. Page. 142 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. auf großen Nutschen ab und entfernt noch vollständiger die schlei- mige Flüssigkeit mittels einer hydraulischen Presse unter einem Druck von 300 Atm. Nun läßt sich das Material zwischen den Steinwalzen viel feiner mahlen. Die zerkleinerten Algen extrahieren wir, um zu große Verdün- nung der Extrakte zu vermeiden, in Portionen entsprechend 3 kg Ausgangsmaterial fünfmal mit 85 prozen tigern Aceton in folgender Weise: Man füllt das Material in Filtrierstutzen, rührt es mit 3 1 Lösungsmittel an und saugt auf der Nutsche ab. Das einmal aus- gezogene Mehl kommt in den zweiten Filtrierstutzen, wird mit neuen 3 1 Aceton angesetzt und wieder abgesaugt. Das zweite Filtrat (nicht etwa schon das erste) dient zum ersten Extrahieren der zweiten Portion. Die erste Algencharge wandert in den dritten Stutzen, ihr dritter Extrakt dient zum zweiten Extrahieren der zweiten Portion und so fort, bis jede 3 kg-Menge fünfmal aus- gezogen ist. Der fünfte Extrakt jeder Charge dient zum vierten Extrahieren der folgenden, zum dritten der übernächsten usw. Aus den chlorophyllhaltigen Extrakten fällt, wenn sie in frisches Mehl kommen, Chlorophyll wieder aus, das erst bei einer folgenden Extraktion von neuem in Lösung geht. Daher sind alle ersten Aus- züge gelbbraun, fast frei von Chlorophyll, sie werden nur auf Fuco- xanthin verarbeitet. Alle zweiten bis fünften Extrakte, welche olivgrün, dann rein grün sind, vereinigt man (z. B. 25 1 aus 20 kg) und fällt daraus in Portionen von etwa 4 1 durch Anrühren mit Talk und vorsichtiges Verdünnen mit der eben erforderlichen Menge Wasser das Chlorophyll aus. Der zweckmäßige Grad der Verdün- nung ist bei jedem Versuche so auszuprobieren, daß das Fuco- xanthin zum größten Teile in Lösung bleibt. Etwas Fucoxanthin geht in allen Fällen in den Talk, der des- halb auf der Nutsche zuerst mit 65 prozentigem Aceton, dann ein- mal mit 60 prozentigem Alkohol ausgewaschen wird. Die sämt- lichen Filtrate dienen als Ausgangsmaterial für die Isolierung von Fucoxanthin (Kap. XII, Abschn. 4), der Talk enthält das Roh- chlorophyll in annähernd quantitativer Ausbeute. Aus dem mit Talk verdünnten Chlorophyll ist Chlorophyllin- kalium sowie Phäophytin und Phytol dargestellt worden. Gewinnung von Chlorophyll. 143 Die Chlorophyllderivate bestehen in beinahe einheitlichen Ver- bindungen der a-Reihe. Es ist daher ganz richtig, daß die Braun- algen als ein von der Natur dargebotenes Ausgangsmaterial für die sogenannte blaue Chlorophyllkomponente dienen können, wo- für sie zuerst H. C. Sorby1) empfohlen hat. Die Isolierung der Komponente a ist deshalb so einfach, weil Sorbys dritte Chloro- phyllkomponente, das Chlorofucin, in der Pflanze gar nicht exi- stiert und sich unter den hier beschriebenen Bedingungen auch nicht bildet. Die Ausbeute an Phäophytin betrug 4,5 g aus 10 kg Fucus (nach der quantitativen Bestimmung 5 g Chlorophyll enthaltend) und an Chlorophyllinkalium 4,2 g. 5. Beschreibung des Chlorophylls2). Die Anforderungen, welchen die Präparate von reinem und un- versehrtem Chlorophyll genügen, ergeben sich aus folgenden Merkmalen : 1. Der Aschengehalt muß 4,5% betragen und die Asche aus reinem Magnesiumoxyd bestehen3). 2. Der Phytogehalt beträgt ein Drittel des Moleküls, das Phytol muß frei von festen Beimischungen sein. 3. Das Chlorophyll darf keine gelben Pigmente enthalten. 4. Bei der Verseifung mit Alkalien muß die braune Phase auf- treten. 5. Die Spaltung muß das normale Gemisch von Phytochlorin e und Phytorhodin g liefern. 6. Es muß im Spektrum mit dem Blattauszug übereinstimmen. Die Darstellungen nach der neuen Methode haben diesen Be- dingungen entsprochen und die analytischen Angaben der Arbeit von Willstätter und Hug sind mit den neuen Präparaten er- gänzt und verbessert worden. Da die Zusammensetzung der beiden Komponenten des Chloro- phylls infolge der Hydratbildung von Chlorophyll a keinen deutlichen *) Proc. Roy. Soc. 21, 452 [1873]. *) Ann. d. Chem. 380, 204 [1911]. 8) Die Asche enthält keinen Phosphor, die Angaben von J. Stoklasa über Phosphor- und Kaliumgehalt des Chlorophylls sind unrichtig. 144 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Unterschied zeigen, so weichen bei dem Gemisch von a und b die Werte nur wenig von der Berechnung für die Komponente a ab. Chlorophyll a (Halbhydrat): C55H7205N4Mg + 1/2 H20. Berechnet für C66H7306 N4Mg Gefunden1) C 73A7 73,53 H 8,15 8,09 N 6,21 6,14 Mg 2,70 2,60 OCH3 3.44 3,33 Phytol 32,85 32.x Empfindlicher als die Analyse lassen die folgenden Reaktionen darüber urteilen , ob das Chlorophyll rein ist und ob die leicht ver- änderlichen Gruppen des Moleküls unversehrt sind. Phasenprobe. Die ätherische Lösung wird mit methylalko- holischer Kalilauge geschüttelt; dabei schlägt die Farbe in reines Braun um2); dann kehrt in einigen Minuten in dem alkalischen Medium die ursprüngliche Chlorophyllfarbe zurück. Die Phase tritt nicht auf bei allomerisiertem Chlorophyll und ist trübe braun bei Mischungen. Wird beim Auftreten der braunen Phase sofort viel Wasser zu- gefügt, so geht die Hauptmenge wieder als grüner Farbstoff in den Äther. Dann ist das regenerierte Chlorophyll merkwürdigerweise vollkommen unversehrt, nicht etwa allomerisiert ; es gibt von neuem mit methylalkoholischem Kali die braune Phase und es lassen sich aus ihm die normalen Spaltungsprodukte gewinnen. Setzt man aber zur alkalischen Schicht erst nach der Rückbildung der grünen Farbe Wasser hinzu, so färbt sich der Äther nicht mehr grün an. Prüfung auf gelbe Pigmente. Bei der Phasenprobe muß der Äther farblos werden. Sind aber Carotin und Xanthophyll vorhanden, so gehen sie zum Teil in die alkalische Schicht und werden erst durch langsamen Zusatz von Wasser in den Äther übergeführt, vollständig bei wiederholtem Ausäthern der alkalischen Flüssigkeit. Das Fehlen der am hartnäckigsten folgenden gelben Begleiter in einem Präparat zeigt nach den Erfahrungen bei der Bestimmung Unveröffentlicht. 2) Diese Reaktion ist früher und wohl zuerst beobachtet worden von H. Molisch, Ber. d. d. bot. Ges. 14, 16 [1896]. Gewinnung von Chlorophyll. 145 des Reinheitsgrads auch an, daß es frei von farblosen Bei- mischungen ist. Spaltungsprobe. Wir übergießen einige Milligramme der gepulverten Substanz mit 3—4 ccm siedender, konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge und setzen das Kochen einige Mi- nuten fort mit der Vorsicht, daß die Flüssigkeit nicht zu weit ein- gedampft und dadurch die Isochlorophylline zu einfacheren Phyl- linen abgebaut werden. Nach schwachem Ansäuern extrahiert man die Basen mit 30 ccm Äther und zieht zuerst mit 4 prozentiger Salzsäure das Phytochlorin e, sodann mit 9 prozentiger das Phyto- rhodin g aus. Nun darf im Äther nur noch ein wenig Rhodin g übrig sein; der Äther wird dann mit 12 prozentiger Salzsäure farb- los und man erhält beim Neutralisieren der Lösung und Ausschütteln mit wenig Äther eine konzentriertere schön rote Rhodinlösung. Enthält aber das Präparat allomerisiertes Chlorophyll, so ist schwachbasisches Phytochlorin vorhanden und dieses macht die letzte Phytorhodinfraktion mißfarbig. Prüfung auf vollständigen Phytolgehalt (Basizitäts- probe). Die Phytolestergruppe kann durch Alkoholyse oder Hydro- lyse angegriffen sein. Bei der Verarbeitung von Blättern mit erheb- lichem Chlorophyllasegehalt kommt nämlich die Bildung von etwas freiem Chlorophyllid vor beim Extrahieren mit wasserhaltigem Aceton, die Beimischung von Alphylchlorophyllid beim Extrahieren mit Alkohol. Weit empfindlicher als die quantitative Phytolbestimmung ist die Prüfung der ätherischen Lösung mit 22 prozentiger Salzsäure, welche die einfachen Chlorophyllide extrahiert. Auf freies Chlorophyllid kann man die ätherische Lösung mit n/100-Kalilauge prüfen. Prüf ung auf unversehrten Magnesiumkomplex. Wenn Chlorophyll durch die Wirkung von Säure leidet, so verrät sich die Beimischung von Phäophytin im Spektrum durch das Auftreten der Absorptionsbänder vor der Fra unhof er sehen Linie E und zwischen den Linien E und F. Das Chlorophyll zeigt weder saure noch basische Eigenschaften ; es ist empfindlich gegen Säure und Alkalien. WtUstätter-Stoll, Chloropyhll. IO 146 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Bei der Einwirkung von Säuren erleidet es sofort den Farb- umschlag in olivbraun, indem es das Magnesium verliert. Auf Zusatz von Oxalsäure zur alkoholischen Lösung wird die Farbe kurze Zeit olivgrün, und es fällt eine Verbindung in olivfarbigen Flocken aus, die sich erst beim Stehen in Phäophytin umwandeln. Mit Pikrinsäure entsteht kein Pikrat, sondern das Chlorophyll wird zersetzt und gibt eine braune Lösung. Das Chlorophyll in Substanz ist blaustichig schwarz, mit starkem, fast metallischem Reflex. Es läßt sich im trockenen Zu- stand sehr leicht und fein zerkleinern zu matt grünstichig- oder blaustichig-schwarzem Pulver. Unter dem Mikroskop erweist sich das Chlorophyll als krystalliniscli, mitunter sogar deutlich als Krystall- aggregat, so daß man am Rande von Drusen scharfe Begrenzungen sieht. Einzeln ausgebildet kamen aber die Krystalle nicht vor. Die Substanz besitzt keinen- scharfen Schmelzpunkt, die Tem- peratur des Schmelzens ist von der Art des Erhitzens abhängig. Bei langsamem Erhitzen auf 100 °, z. B. beim Trocknen, sintert die Substanz, sie gibt dann beim Erkalten eine spröde, schwarze Masse mit nicht merklich veränderten Eigenschaften. Beim Er- wärmen im Schmelzpunktsröhrchen zerfließt das Chlorophyll zu zähen Tropfen, bald etwas unter 100 °, bald etwas darüber; bei mehreren Bestimmungen fanden wir die Schmelzpunkte 93 — 96° und 103 — 106 °. Das Chlorophyll ist in absolutem Alkohol leicht löslich mit blau- stichig-grüner Farbe, etwas schwerer in 95 prozentigem Alkohol sowie in Methylalkohol, schwer in 90 prozentigem Holzgeist. In Äther löst es sich im Gegensatz zum Äthyl- und Methylchloro- phyllid spielend leicht und gibt eine prächtige blaugrüne Lösung, die stark fluoresciert ; sie ist blaustichiger als die alkoholische. Überraschend ist das Verhalten gegen Petroläther; das Chlorophyll ist darin in der Kälte außerordentlich schwer löslich, warm ist es ein wenig löslich. Hingegen ist es auf Zusatz von ein wenig Äthyl- oder Methylalkohol darin leicht löslich. Hexan aus Petro- leum (Kahlbaum) löst das Chlorophyll ziemlich leicht, Petrol- äther fällt es aus dieser Lösung aus; in Hexan aus Propyljodid zeigt es sich dagegen ebenso unlöslich wie im Petroläther. Gewinnung von Chlorophyll. 147 Benzol löst sehr leicht, Cy clohexan leicht, auch Chloroform nd Schwefelkohlenstoff, letzterer mit grüner Farbe, weniger blau ls die anderen Solvenzien. In Pyridin ist die Substanz spielend 3slich. Entmischung nach Kraus. Das isolierte Chlorophyll zeigt rotz seiner Unlöslichkeit in reinem Petroläther die Verteilung wischen Petroläther und Alkohol, wie sie seit den grundlegenden Ersuchen von Stokes und Kraus für den Farbstoff des Blätter- xtrakts bekannt ist; das Verhalten ist eine Folge der Löslichkeit 1 alkoholhaltigem Petroläther. Beim Entmischen mit wenig Nasser erfolgt eine ungefähr gleichmäßige Verteilung des Farb- ILoffs zwischen den beiden Schichten. Auf Zusatz von viel Wasser der bei nochmaligem Ausschütteln mit reinem Petroläther ist die rässerig-alkoholische Schicht nur noch ganz schwach gelblichgrün efärbt. Für 0,1 prozentige äthyl- und methylalkoholische Lösungen aben wir durch colorimetrische Bestimmung die Entmischungs- erhältnisse ermittelt. a) 25 ccm alkoholische Lösung werden mit 25 ccm Petroläther •ersetzt und mit 5 ccm Wasser entmischt; die beiden Schichten rscheinen annähernd gleich. Nach der colorimetnschen Bestim- mung enthält der Petroläther 44% vom Farbstoff. b) Bei dem gleichen Versuch unter Anwendung von Methyl- alkohol enthält die petrolätherische Lösung 56% des Chlorophylls. Oie holzgeistige Schicht wird nochmals mit 25 ccm Petroläther -ersetzt; derselbe entzieht der unteren Schicht den Farbstoff fast a mantitativ. Aus dem Petroläther scheiden sich beim Stehen über der ver- flüiünnt alkoholischen Schicht keine Krystalle aus, im Gegensatz zum 'f "ersuch mit Äthylchlorophyllid. ß '"eränderung in alkoholischer Lösung (Allomerisation)1). Chlorophyll unterliegt in alkoholischen Lösungen, namentlich al 1 den wasserfreien Solvenzien einer Umwandlung welche die Iso- Gerung und Reinigung außerordentlich erschwert hat. Auch die *) Ann. d. Chem. 382, 135 [19x1] und 387, 325 und 357 [1912]. 148 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. einfachen Alphylderivate erleiden diese Veränderung, besonders rasch die freien Chlorophyllide. Dabei verlieren die Chlorophyllide ihre Krystallisationsfähigkeit, sie zeigen nicht mehr die braune Phase und liefern nicht die normalen, sondern schwach basische Spaltungsprodukte. Diese Umwandlung bezeichnen wir als Al- lo merisation1) ; wir versuchen sie als Öffnung der Lactam- gruppen und Bildung neuer Lactamgruppen zu erklären. Es war von großer praktischer Wichtigkeit, die Ursache der Allomerisation aufzufinden und ihren Eintritt zu verhüten; wir haben darüber vorzugsweise mit Methylchlorophyllid Versuche an- gestellt. Durch etwas Wasser werden die Chlorophyllide in der alkoholischen Lösung einigermaßen geschützt schon durch 2%, aber die wasserhaltigen Lösungsmittel lösen die Alkylchlorophyllide zu wenig. Die Lösung von Methylchlorophyllid in absolutem Alkohol gab nach 10 Stunden nur noch einen schwachen Farbumschlag mit Ätzkali, nach 24 Stunden keinen mehr; bei Zusatz von 5% Wasser war die braune Phase nach 2 Tagen noch sehr deutlich und erst nach 5 Tagen verschwunden. In Äther, Chloroform und wasserfreiem Pyridin tritt die Ver- änderung nicht ein ; ätherische Lösungen von Phytyl- und Methyl- chlorophyllid a blieben in Glasgefäßen 3 Wochen lang unverändert. Die Allomerisation wird in der alkoholischen Lösung durch Glas katalytisch begünstigt. Sie unterbleibt in Platin- und Silbergefäßen. Eine absolut alkoholische Lösung von Methylchlorophyll b war in einem Probierrohr von Platin nach 5 Tagen ganz unverändert, während sie im Glasgefäß unter Lichtabschluß nach 24 Stunden die braune Phase nicht mehr gab und eine matter grüne Farbe zeigte. Indessen ist diese Erscheinung nicht einfach auf die Alkalinität des Glases zurückzuführen, denn im Reagierrohr aus reinem Berg- krystall trat die Allomerisation gleichfalls ein. (Methylchlorophyl- lid b, V1000 Mo1 in 1 1 Äthylalkohol, ist darin in 24 Stunden fast Der Name ist davon abgeleitet, das sich bei dieser Erscheinung reaktionsfähige Teile anders im Molekül gruppieren. Da die Zusammen- setzung der veränderten (allomeren) Chlorophyllide nicht genau bekan ist, kann man nicht wohl von Isomerie sprechen. Gewinnung von Chlorophyll. 149 quantitativ allomerisiert worden, etwas langsamer als im Glase.) Auch ist das Methylchlorophyllid b durch Vioooooon-KOH ln ab' solutem Alkohol im Platingefäß in 24 Stunden nicht merklich, hin- gegen in einer Bergkrystallflasche größtenteils verändert worden. Wenn also die Allomerisation nicht einfach als eine Katalyse durch kleine Mengen von Alkalien erklärt werden kann, so gelingt es uns dennoch, sie gänzlich hintanzuhalten durch Zusatz der geringsten Menge einer Säure. Die absolut- alkoholische Lösung eines Methylchlorophyllides versetzen wir z. B. mit einer Spur alkoholischer Oxalsäurelösung. Die Farbe und Phase war nach mehreren Tagen, sogar nach 3 Wochen unverändert ; ein Kontroll- versuch in rein alkoholischer Lösung gab die Phase schon nach einem Tage nicht mehr, bei einem zweiten Vergleichsversuch mit Zusatz einer Spur Kaliumhydroxyd ging die Phase schon in einigen Stunden verloren. Die früher rätselhafte Erscheinung, daß Chlorophyll und Chloro- phyllide in reinen Lösungen große Veränderlichkeit zeigen, aber nicht in den Extrakten, ist nun erklärt. Die Extrakte enthalten Wasser und häufig Spuren organischer Säuren. Durch den Schutz mittels sehr kleiner Mengen von Säure, zweckmäßig 0,01 g Oxalsäure in 1 1 Alkohol, wird nunmehr die Verarbeitung der empfindlichen Magnesiumverbindungen, nament- lich die in den Kapiteln VI und X beschriebene Trennung in die Komponenten, sehr erleichtert und die Isolierung der reinen Sub- stanzen gewinnt an Sicherheit. 6. Vergleichende Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflanzen1). Die Kenntnis der Merkmale und der Zusammensetzung des Chlorophylls bot die Grundlage für den Vergleich des Chlorophylls verschiedener Pflanzen. Die älteren Ansichten über die Identität oder Verschiedenheit des Blattfarbstoffs verschiedener Pflanzen gingen weit auseinander und stützten sich nicht auf die chemische Analyse. J) Abh. VII, X, XIV. j^o R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. A. Gautier1) hat in seiner Abhandlung: „Sur la pluralit6 des chlorophylles“ das Chlorophyll in Mono- und Dicotyledonen als verschieden betrachtet, ohne indessen Angaben über die Unter- schiede zu machen, und er hat sogar seine Verschiedenheit „dans le meme embranchement“ betont. A. Etard2) hat noch im Jahre 1906 in seinem Buche: „La bio- chimie et les chlorophylles“ eine endlose Zahl von Chlorophyllen beschrieben und zwar nicht allein Pigmente ungleicher Herkunft; er stellte auch für eine einzige Pflanze, z. B. für Lolium perenne, eine ganze Reihe verschiedener Chlorophylle auf, deren Formeln Loliophyll I: C129H214N014 II: C28H41N05 III: C169H257N021 IV: C86H156N014 V: C62H76N209 VI: C34H50N2O10 beispielslos differieren. Sie sind absurd; jede Fraktion von mehr oder weniger grün gefärbtem Wachs ist für ein individuelles Chloro- phyll gehalten worden. Die Identität des Chlorophylls beliebiger Herkunft ergibt sich: aus der Bestimmung der basischen Spaltungsprodukte Phyto- chlorin und Phytorhodin, aus der Bestimmung des Magnesiumgehaltes, aus der Bestimmung des Phytolgehaltes. Nachdem es gelungen war, Veränderungen des Farbstoffs bei seiner Isolierung aus den Pflanzen zu vermeiden, hat das Chloro- phyll aller Pflanzen dieselben stickstoffhaltigen Derivate geliefert, deren Bestimmung das IV. Kapitel behandelt. Es kommen also keine Variationen in der Zusammensetzung des Phytochromins vor. Nun war es noch denkbar, daß außer dem Magnesium andere Elemente in der Rolle des komplex gebundenen Metalls auftreten i) Compt. rend. 120, 355 [1895] und Bull. soc. chim [4] 5, 319 [1909]- *) Masson et Co., Paris. Gewinnung von Chlorophyll. I51 könnten. Es hat deshalb nicht genügt, die metallfreien Abbau- produkte aus verschiedenen Pflanzen darzustellen und zu ver- gleichen, es war auch erforderlich, entweder Präparate von Chloro- phyll selbst oder einem Chlorophyllide oder ebensogut Darstellungen eines krystallisierten Phyllins von möglichst verschiedenartiger Her- kunft zu analysieren. Diese Untersuchung ist von Willstätter und Pfannenstiel1) ausgeführt worden, die das nämliche Rhodo- phyllin von der Formel C33H3404N4Mg mit einem Aschengehalt von 7% MgO aus Pflanzen der folgenden Gruppen gewonnen haben: Kryptogamen : Chlorophyceae Musci, Filicales, Equisetales; Phanerogamen : Monocotylae; Gramineae; Dicotylae; Urticaceae, Saxifraginae. Später ist diese vergleichende Untersuchung des Magnesium- gehaltes noch weiter ausgedehnt und durch Isolierung von Chloro- phyll oder seinen nächsten magnesiumhaltigen Derivaten aus einer größeren Anzahl von Pflanzen anderer Ordnungen ergänzt worden (z. B. aus Phäophyceen). Der dritte Punkt, auf den sich unser Vergleich erstreckt, be- trifft den stickstof freien Alkohol, dessen Verbreitung in der Natur sich als außerordentlich erweist. Es wäre zu unsicher gewesen, von wenigen Beispielen den Satz abzuleiten, daß das Phytol ein Bestandteil des Chlorophylls aller Pflanzen ist und stets ein Drittel des Moleküls beträgt. Dieser Alkohol schien nicht in demselben Maße unersetzlich zu sein wie das Magnesium. Deshalb haben wir über 200 Pflanzenarten aus den verschiedenen Klassen heran- gezogen, um das Phytol durch Verseifung von Phäophytin zu iso- lieren und die Phytolzahl zu bestimmen2). Überdies ist das Phytol durch die Elementaranalyse von Präparaten aus 24 Pflanzenarten identifiziert worden. Bei den ersten Versuchen wurde infolge der Chlorophyllase- wirkung die Phytolzahl schwankend gefunden. Nachdem diese Fehlerquelle ermittelt war, gelang es, bei möglichst raschem Extra- hieren der Blätter die Konstanz der Phytolzahl festzustellen. q Abh. V. 2) Ann. d. Chem. 378, 1 [1910]. 152 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Keine Ausnahme hinsichtlich des Phytolgehaltes ist beobachtet worden. Die Beispiele waren so gewählt, daß Pflanzen von den ver- schiedensten Lebensbedingungen zur Beobachtung kamen : Meeres- algen, Süßwasserpflanzen und tropische Gewächse außer den ein- heimischen Landpflanzen. Von Kryptogamen waren folgende Klassen (mit 12 Beispielen) vertreten : Chlorophyceae, Charales, Phaeophyceae, Bryophyta, Pterido- phyta (nämlich Filicales, Equisetales, Lycopodiales). Dazu kamen Gymnospermae (2 Beispiele von Coniferae) und Monocotyledoneae (24 Beispiele) aus folgenden Familien: Potamogetonaceae, Gramineae, Palmae, Araceae, Liliaceae, Musaceae. Endlich von Dicotyledonen 164 Beispiele aus den Familien: Salicaceae, Juglandaceae, Betulaceae, Fagaceae, Ulmaceae, Moraceae, Urticaceae, Aristolochiaceae, Polygonaceae, Cheno- podiaceae, Ceratophyllaceae, Ranunculaceae, Magnoliaceae, Laura- ceae, Papaveraceae, Cruciferae, Saxifragaceae, Platanaceae, Rosa- ceae, Leguminosae, Simarubaceae, Polygalaceae, Linaceae, Buxa- ceae, Celastraceae, Aceraceae, Hippocastanaceae, Balsaminaceae, Tiliaceae, Malvaceae, Bombacaceae, Dilleniaceae, Guttiferae, Di- pterocarpaceae, Violaceae, Passifloraceae, Lecythidaceae, Oeno- theraceae, Hallorrhagidaceae, Araliaceae, Umbelliferae, Cornaceae, Primulaceae, Oleaceae, Loganiaceae, Gentianaceae, Apocynaceae, Convolvulaceae, Borraginaceae, Verbenaceae, Labiatae, Solana- ceae, Scrophulariaceae, Bignoniaceae, Acanthaceae, Plantaginaceae, Rubiaceae, Caprif oliaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae, Cucurbita- ceae, Campanulaceae, Compositae. VI. Isolierung der beiden Komponenten des Chlorophylls. i. Zur Geschichte der Methode1)* * Stokes. G. G. Stokes hat entdeckt, daß das Chlorophyll aus zwei Komponenten besteht. Seine Angabe, die im Jahre 1864 in der inhaltsreichen Notiz2) „On the supposed Identity of Biliverdin with Chlorophyll, with remarks on the Constitution of Chlorophyll“ erschienen ist, lautet: „I find the Chlorophyll of land-plants to be a mixture of four substances, two green an two yellow, all possessing highly distinc- tive optical properties. The green substances yield Solutions ex- hibiting a strong red fluorescence; the yellow substances do not. The four stubstances are soluble in the same solvents, and three of them are extremely easily decomposed by acids or even acid salts, such as bisoxalate of potash; but by proper treatment each may be obtained in a state of very approximate isolation, so far at least as coloured substances are concerned.“ Die Untersuchung von Stokes bestand also in der spektro- skopischen Unterscheidung der beiden Komponenten des Chloro- phylls und der gelben Begleiter Carotin und Xanthophyll. Mit *) Ann. d. Chem. 390, 275 [1912]. *) Proc. Roy. Soc. 13, 144 [1864]. Siehe auch Stokes’ nachträgüche Fußnote im Neudruck der berühmten Abhandlung vom Jahre 1852: ,,On the Change of Refrangibility of Light“, Mathematical and physical Papers, Vol, III, S. 300, Cambridge 1901. 154 R- WiUstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. welcher Methode der große Physiker das im Blätterextrakt ent- haltene Gemisch von Pigmenten getrennt hat, verrät nur eine Bemerkung in dem Vortrag1) „On the Application of the optical Properties of Bodies to the Detection and Discrimination of organic Substances“: „For convenience and rapidity of manipulation, especially in the examination of very minute quantities, there is no method of Separation equal to that of partition between solvents which separate after agitation Bisulphide of carbon in conjunction with alcohol enabled the lecturer to disentangle the coloured substances which are mixed together in the green colouring-matter of leaves.“ Stokes hat also zuerst die fruchtbare Methode der Entmischung angewandt, um das Chlorophyll von den gelben Pigmenten zu trennen und um es in seine Komponenten zu zerlegen. Leider ist weder die in Aussicht gestellte Abhandlung von Stokes über Chlorophyll erschienen, noch hat die Herausgabe seines wissen- schaftlichen Nachlasses Aufzeichnungen darüber zutage gefördert. Kraus und Sorby. G. Kraus2) hat die in den Proc. of the Roy. Soc. veröffent- lichten Resultate von Stokes gekannt, aber nicht dessen Methode, und er hat unabhängig von Stokes die Entmischung von alko- holischer RohchlorophyllÖsung mit Benzol aufgefunden. Statt des Benzols hat etwas später R. Sachsse3) Benzin angewandt. Kraus hat mit der Entmischungsmethode nur die Trennung in grünes und gelbes Pigment erzielt, aber er hat die Methode nicht für die Auflösung des sogenannten Cyanophylls und Xanthophylls in je zwei Komponenten ausgebildet. Nur bei der Besprechung der kurz zuvor erschienenen Untersuchung von Sorby hat Kraus die Zu- sammensetzung des gelben und grünen Anteiles aus je zwei Kom- ponenten berührt und er hat sie nicht bestätigen können. *) Journ. chem. Soc. 17, 304, 31 1 [1864]. «) Zur Kenntnis der Chlorophyllfarbstoffe und ihrer Verwandten. Stuttgart 1872. 8) Die Chemie und Physiologie der Farbstoffe, Kohlehydrate und Proteinsubstanzen (Leipzig 1877), S. 23. Isolierung der beiden Komponenten des Chlorophylls. 155 H. C. Sorby1) führt an, daß er durch einen Vortrag von Stokes in der Royal Institution zu seinen ausgedehnten spektro- skopischen Untersuchungen angeregt worden sei2) und daß er durch unabhängige Versuche zu den gleichen Ergebnissen wie früher Stokes gelange; indessen ist es nicht wahrscheinlich, daß Sorby die Entmischungsmethode unbeeinflußt von Stokes Veröffent lichung aufgefunden hat. Sorby hat durch systematische Ver- teilung der Pigmente der Rohchlorophyllösung zwischen wasser- haltigem Alkohol und Schwefelkohlenstoff Entmischungen erzielt und zwar nur zu dem Zweck der spektroskopischen Unterscheidung und Beschreibung von Fraktionen, die übrigens noch nicht optisch einheitlich waren, ganz abgesehen von dem Gehalt der Lösungen an farblosen Begleitstoffen. Sorbys spektroskopische Angaben waren noch nicht genau und haben sich nur als teilweise richtig erwiesen. Sorby unterscheidet neben den gelben Pigmenten drei ver- schiedene Chlorophyllfarbstoffe, die an den beiden Enden des Spektrums Absorption aufweisen und die rot fluorescieren : Blaues Chlorophyll, gelbes Chlorophyll und Chlorofucin. Einen ganz anderen Sinn bekommt die Anwendung der Ent- mischung in der Arbeit von N. A. Monteverde3). Hier handelt es sich um die verschiedene Verteilung des amorphen und des krystallisierten Chlorophylls zwischen Alkohol und Petroläther. Die Beobachtungen Monteverdes sind erklärt durch die genauere Kenntnis des Borodinschen Chlorophylls. Das phytolhaltige Chlorophyll geht bei der Entmischung in die petrolätherische, das alkoholysierte, phytolfreie Chlorophyll in die alkoholische Schicht. Auf einem neuen Wege hat W. H. Hartley4) eine Trennung von blauem und gelbem Chlorophyll zu erreichen geglaubt. Er läßt auf die alkoholische Rohchlorophyllösung eine warm gesättigte *) On Comparative Vegetable Chromatology, Proc. Roy. Soc. 21, 442 [1873]; siehe auch Proc. Roy. Soc. 15, 433 [1867]; Quarterly Journ. of Microscopical Science 11, 215 [1871); Quarterly Journ. of Science 8, 64 [1871]. 2) Proc. Roy. Soc. 15, 433 [1867] und 21, 451 [1873]. *) Das Absorptionsspektrum des Chlorophylls, Acta Horti Petropoli- tani XIII, 123 [1893]. 4) Journ. ehern. Soc. 59, 106 [1891] und 85, 1607 [1904]. 156 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Bariumhydroxydlösung einwirken. Aus der gefällten Barium- verbindung setzt Borsäure in Glycerin Hartleys blaues Chloro- phyll in Freiheit, während das Filtrat von der Bariumverbindung gelbes Chlorophyll enthält. Wie schon früher nachgewiesen worden1), wird aber Chlorophyll von Bariumhydroxyd verseift, im Filtrat von Chlorophyllinbarium bleiben hauptsächlich gelbe Begleiter, vermischt mit etwas grünem Farbstoff, wenn die Verseifung nicht genügend energisch war. Tswett. M. Tswett2) hat die verdienstvollen Beobachtungen von Stokes gewürdigt und mit einer leistungsfähigen neuen Methode bestätigt. Das im Blattextrakt enthaltene Pigmentgemisch zer- legt Tswett mittels der chromatographischen Adsorptionsanalyse in seine sämtlichen Komponenten und untersucht sorgfältig ihre Spektra. Das Prinzip der Methode besteht darin, daß Farbstoffe wie farblose Körper aus ihren Lösungen in organischen Flüssigkeiten durch pulverförmige Körper in verschiedenem Maße adsorbiert werden. Tswett verwendet für diese Zerlegung die Lösung des Rohchlorophylls in bestimmten Solvenzien, Petroläther, Benzol, Schwefelkohlenstoff, und filtriert sie durch eine Säule von Calcium- carbonat, Inulin oder Zucker. Dadurch werden die Farbstoffe niedergeschlagen und sie verdrängen sich dabei gegenseitig aus ihren Adsorptionsverbindungen nach der sinkenden Reihenfolge ihrer Wirkung auf die Oberflächenspannung des Lösungsmittels, so daß sich im entstehenden „Chromatogramm“ eine Schichtung *) Ann. d. Chem. 350, 63 [1906]. *) Physikalisch-chemische Studien über das Chlorophyll. Die Adsorp- tionen. Ber. d. d. bot. Ges. 24, 316 [1906]. Adsorptionsanalyse und chro- matographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls. Ebenda 24, 384 [1906]. Spektral-analytische Untersuchungen über die Chlorophylline und deren nächste Säurederivate (Chlorophyllane). Ebenda 25, 137 [1907]. — Über die Spektrophotometrie der Chlorophylline und die Energetik des Chlorophylls. Ebenda 25, 388 [1907]. — Siehe ferner Ber. d. d. chem. Ges. 41, 1352 [1908]; 43, 3^9 [191°]; 44- II24 und das russische Buch: Die Chromophylle in der Pflanzen- und Tierwelt, Warschau 1910 (bei Karbassnikow). Isolierung der beiden Komponenten des Chlorophylls. 157 in so viele verschiedene farbige Zonen ergibt, als Komponenten im Farbstoffgemisch vorhanden sind. Die fingierte Säule laßt sich mit dem Skalpell methodisch zerlegen und jeder einzelne Farbstof mit passenden Lösungsmitteln (Alkohol, Äther, Chloroform) wieder extrahieren. Nach dieser Methode findet Ts wett in dem Gemische fünf gelbe Farbstoffe, „Carotinoide“, nämlich Carotin und vier Xantho- phylle und zwei eigentliche Chlorophyllfarbstoffe, die er es wird bei 120 — 130 0 zähflüssig und beginnt dann sich aufzublähen. Die Chlorophyllkomponente a ist in Äther und absolutem Al- kohol spielend leicht löslich, in Methylalkohol in der Kälte nur mäßig, warm ziemlich leicht. In 95 prozentigem Äthylalkohol ist sie noch sehr leicht, in 80 prozentigem schwer, in 90 prozentigem Holzgeist auch in der Wärme schwer und in 80 prozentigem beinahe nicht löslich. In Aceton, Chloroform und Schwefelkohlenstoff ist Chlorophyll a spielend, auch in Benzol sehr leicht löslich. Nur in Petroläther löst sich die Substanz sehr schwer, selbst in der Wärme; Ligroin (Kahlbaum) löst etwas mehr, in der Wärme sogar ziem- lich leicht und die Lösung wird durch Petroläther gefällt. Ein sehr geringer Zusatz von Alkoholen zum Petroläther erhöht die Löslichkeit des Chlorophylls außerordentlich. Die äthylalkoholische Lösung ist blaugrün, tiefrot fluores- cierend; in dicker Schicht läßt sie rubinrotes Licht hindurch. Ge- radezu blau kann man die konzentrierte ätherische Lösung nennen, !) Ann. d. Chem. 390, 327 [1912]. Isolierung der beiden Komponenten des Chlorophylls. 167 beim Verdünnen wird sie mehr grünstichig. Die alkoholische Lö- sung wird beim Vermischen mit Petroläther blaustichiger, aber nicht in gleichem Maße wie mit Äther. Auffallend gelbstichig ist die Farbe in Schwefelkohlenstoff. Bei raschem Verdünnen einer konzentrierten Lösung von Chloro- phyll a in Alkohol oder Aceton mit viel Wasser entsteht eine wochen- lang haltbare kolloidale Lösung; sie ist in der Durchsicht reingrün und fluoresciert nicht, aber sie zeigt eine sehr schöne blaugrüne Opalescenz ; sie gibt den Farbstoff erst bei anhaltendem kräftigen Durchschütteln an Äther ab, wobei die wässerige Schicht zuerst blaugrün wird, sofort bei Zusatz von etwas Chlorcalcium. Die Löslichkeit des Chlorophylls b ist im allgemeinen eine etwas geringere als die von a, aber der Unterschied ist nur in Petroläther sehr deutlich. Die Komponente b ist nämlich darin in der Kälte ganz unlöslich, und das Lösungsmittel wird auch beim Kochen kaum angefärbt; Ligroin (auch mit Salpeterschwefelsäure gereinig- tes) löst die Substanz mäßig. Die Farbe in verschiedenen Lösungs- mitteln differiert lange nicht so sehr wie bei a, die ätherische Lösung ist leuchtend grün, die alkoholische etwas dumpfer grün, nur im Vergleich mit den Lösungen von a erscheinen die von b stark gelbstichig. Allein die Schwefelkohlenstofflösung ist ent- schieden gelbgrün. In der Durchsicht sind die Lösungen in dicker Schicht nicht rein rot, sondern mehr grünlich braunrot; die Fluores- cenz der Komponente b ist braunstichig rot. Die kolloidale Lösung ist in der Durchsicht gelbgrün und opali- siert dunkelolivgrün. In absolutem Alkohol und in Äther ist Chlorophyll b sehr leicht, in Methylalkohol in der Kälte ziemlich schwer, in der Wärme ziem- lich leicht löslich; 90 prozentiger Äthylalkohol löst schon schwerer, 80 prozen tiger sehr schwer, ebenso 90 prozentiger Holzgeist. In Chloroform, Schwefelkohlenstoff und Aceton ist die Substanz sehr leicht, in Benzol leicht löslich, spielend in Pyridin. Im Sonnen- licht wird die benzolische Lösung zuerst prächtig rot, ehe sie all- mählich ausbleicht. Die Chlorophyllkomponente a wird in ätherischer Lösung beim Schütteln mit 6 prozentiger Salzsäure allmählich, mit 20 prozentiger l68 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. augenblicklich zersetzt; bei der Komponente b erfolgt die Spaltung etwas schwieriger. Mit überschüssiger ätherischer Chlorwasserstoff- säure tritt sofort die schön blaue, bei b die grüne Farbe eines Phäophytinchlorhydrates auf. Bei der Phasenprobe schlägt die Farbe der Komponente a in reines Gelb um. Da die Phase bei der Phytylverbindung etwas rascher als bei dem Methylderivat vorübergeht, führen wir hier die Probe meistens so aus, daß die ätherische Lösung des Chloro- phylls mit dem methylalkoholischen Kali vorsichtig unterschichtet wird. Dann tritt an der Trennungsschicht eine Zone in der charak- teristischen Farbe auf, die sich beim Umschütteln einen Augenblick der ganzen Flüssigkeit mitteilt. Wird nach der Rückkehr der Chlorophyhfarbe Wasser hinzugefügt, so bleibt der Äther farblos. Das Chlorophyll b zeigt eine leuchtendrote Phase, dann kehrt in einigen Minuten, also viel langsamer wie bei a, über eine braune Mischfarbe die ursprüngliche Farbe zurück. Dem Spektrum der roten Phase von Chlorophyll b fehlt die sonst für alle bisher untersuchten Chlorophyllderivate charakteristische Hauptabsorption im Rot oder Orange. Bei mäßiger Schichtdicke sind anfangs einzelne Bänder nicht zu erkennen, bis sich dann in wenigen Sekunden die sehr weit gegen das rote Ende, bis zum Gelb, hinreichende Endabsorption des stärker gebrochenen Teiles in 2 starke Bänder im Grün bei X = 530 und 495 ///* auflöst. Ganz allmählich erst tritt im Rot ein Band bei X — 650 auf, das im Laufe einiger Minuten sehr dunkel und breit wird ; die Bänder im Grünen treten immer mehr zurück und es wird im Gelb bei 575 ein neues Band sichtbar. Endlich nach etwa 10 Minuten ist die rein grüne Farbe der alkalischen Lösung mit dem der Komponente b eigentüm- lichen Spektrum wieder zurückgekehrt. Die gelbe Phase von Chlorophyll a zeigt im Spektroskop einen ähnlichen Verlauf, nur sind die einzelnen Stufen infolge der kurzen Dauer von wenigen Sekunden bis zur Rückkehr der grünen Farbe spektroskopisch schwerer zu beobachten. Die Analysen der im Hochvakuum getrockneten Präparate beider Komponenten werden durch Formeln interpretiert, die namentlich von der Zusammensetzung der einfacheren und daher Isolierung der beiden Komponenten des Chlorophylls. 169 analytisch ausschlaggebenden Chlorophyllide und Phäophorbide hergeleitet sind, nämlich: für Chlorophyll a: C66H7206N4Mg + 7» HaO (Halbhydrat), für Chlorophyll b: C86H70O6N4Mg. Die Zusammensetzung nicht allein der Komponente a, sondern einer ganzen Anzahl von Chlorophylliden und Alphylphäophorbiden wird durch Formeln mit 572 und 672 Atomen Sauerstoff ausge- drückt. Diese Formeln sind nicht zu verdoppeln; solche Verbin- dungen sind vielmehr als Halbhydrate zu erklären und ihre Mole- kulargewichte stehen mit den einfachen Formeln im Einklang. Nach der kryoskopischen Methode in Veratrollösung ergibt z. B. Äthylchlorophyllid (mit gebundenem Äther) das Molekulargewicht 738 anstatt 693, nach der ebullioskopischen Methode in Chloroform ergibt Äthylphäophorbid 639 statt 629 und Phäophytin 839 statt 880. Auch zeigt die Analyse der magnesiumfreien Derivate Phäophor- bid a und b, daß x/2 Molekül Wasser keine Funktion hat und daß es sich nicht um äußere Anhydridbildung handelt. Die Absorptionsspektra1). Die Zeichnungen der Tafel VI (Kap. XXV) stellen die Absorp- tionsspektra der Methylverbindungen dar, diejenigen der Chloro- phyllkomponenten sind in den photographischen Aufnahmen der Tafel VIII wiedergegeben. Während die zeichnerische Darstellung vier Abstufungen be- nützt, führen wir die Messung mit folgenden sechs Zeichen für den Grad der Absorption an: — dunkel, ziemlich dunkel, . . . mäßige Absorption, . . schwache Absorption , . sehr wenig geschwächt, | schwacher Schatten. Chlorophyllkomponente a. Das Spektrum zeigt in der sichtbaren Region sieben scharf getrennte Absorptionsbänder und die Endabsorption (VIII) mit der Reihenfolge nach der Intensität: VIII, VII, I, VI, II, III, IV, V. Das IV. Band steht bei brauchbaren Chlorophyllpräparaten an Intensität weit hinter dem dritten zurück, ein kräftigeres *) Abh. XVII. lyo R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Hervortreten von IV deutet auf beginnende Phäophorbid- bildung hin. Am stärksten tritt also je ein Band in der roten, indigblauen und violetten Region hervor; die schwächsten Absorptionsstreifen liegen im Gelb und Grün. Die Methyl- und Äthylchlorophyllide stimmen hinsichtlich des Ortes und der Intensität der Bänder überein mit dem Phytylprä- parat, nur scheinen die Begrenzungen der Bänder bei den einfachen Chlorophylliden etwas schärfer zu sein. Unsere Beobachtungen stimmen mit den Angaben, die M. Ts wett über seine durch chromatographische Adsorptionsanalyse in kleinem Maßstab getrennten Präparate der Chlorophyllkomponenten macht, im Wesentlichen überein, nur fehlt in der Beschreibung von Ts wett das VI. Band oder vielmehr es findet sich nur bei seinen größten Schichten als Schatten vor der Endabsorption. Lösung von 0,0431g in il Äther (V100o Mol. in 20 1.) Schicht in mm 2,5 IO 40 80 Band I „ II 669 655 619 | 605 675 — 648 623. .603 680 — 637.625 625 600 |ö84 — 596.587 „ III — 585-570 586. . .564 587—561 ,, iv — — 539- -523 541. . .521 „ v — — 5°4 1 489 504.488 „ VI „ VII Endabsorption (VIII) 462 | 455 |439— 427 1 ■■■415— 465-453 J444— 471. 468— •473— Chlorophyllkomponente b. Das Spektrum besteht aus neun Bändern zwischen X = 700 und 410 jxjx, dazu kommt die vor X = 400 beginnende Endabsorption (X); in bezug auf ihre Inten- sität stehen die Bänder in der Reihenfolge: VIII, II, IX, X, I, IV, III, VI, V, VII. Das Band des Chlorophylls a im Rot1) ist bei der Komponente b in zwei Bänder geteilt, desgleichen die Absorption im Orange ; dem Absorptionsstreifen von a im Gelb entspricht hier ein schmaler x) Ein schwacher Schatten im äußeren Rot, der früher manchmal beobachtet worden, fehlt bei den besten Präparaten der Komponente b. Isolierung der beiden Komponenten des Chlorophylls. 171 und schwächerer Streifen im Grün, hingegen ist die Absorption im Blau (VI von a, VIII bei b) außerordentlich intensiv geworden und nun das stärkste Band. Bei dicker Schicht zeigt die Lösung zwei sehr charakteristische Transmissionsbänder, das eine im Rot bei B, das andere im Grün von der Linie E an. In Tswetts Beschreibung dieses Spektrums fehlt das erste Band im Rot sowie das Band im Grün. Lösung von 0,0431g in il Äther (Viqoq Mol in 20 1)1). Schicht in mm 2,5 10 40 80 Band I ,, II 666.659 648. . .638 667. . .659.651 651—635 {673—625 | 677 — 582 . . „ III — 615 | 611 615.609 >574- • -559 „ IV — 599-585 600. . .583 — V — — 571-559 — „ VI — — 547- -530 549. . .530 „ VII — — 506 | 500 „VIII „ IX 467—446 433- -424 >474— I483- ■508.489— Endabsorption (X) 407— J ) Die kolloidale Lösung des Chlorophylls weist gegenüber einer wahren Lösung ähnlich wie das lebende Blatt alle Bänder weit gegen Rot hin verschoben auf (siehe auch Kapitel III, Abschnitt 2 a). Bei der Beobachtung mit einer Nernstlampe als Lichtquelle wurden die nachfolgenden Werte für Chlorophyll a gefunden. 0,044 g in Wasser, 1% Aceton enthaltend (V1000M0I in 20 1). Schicht in mm 10 20 40 Band I 692 — 664 712—658 l 732—650.. „ II — 637 1 615 / 640 . . . 609 „ HI — 595 1 581 598.-575 » iv — — 554-534 ,, V — — ) 510.490... „ VI Endabsorption } 466... 455— | 47i— j 477— Aus der 10 mm Schicht berechnet sich für die Achse der Haupt- absorption im Rot A = 678 gegenüber A = 662 für das erste Band des Spektrums der ätherischen Lösung von Chlorophyll a. *) Messung mit dem Präparat unseres neuen Verfahrens. VII. Die Wirkungen der Chlorophyllase1). i. Definition. Während die Isolierung des Chlorophylls und die Trennung in seine beiden Komponenten ohne chemische Reaktion, nämlich nur durch vorsichtige Anwendung von Lösungsmitteln erfolgt, sind die krystallisierenden Alphylchlorophyllide und freien Chlorophyllide sowie ihre magnesiumfreien Verbindungen durch Umwandlung mittels einer Esterase von spezifischer Wirkung gewonnen worden, welche das Chlorophyll in den grünen Blättern begleitet und in- folge ihrer Unlöslichkeit nicht in die Extrakte übergeht. Das Enzym wird als Chlorophyllase bezeichnet. Die Anwendung des Enzyms zu präparativen Zwecken, die in den folgenden Kapiteln behandelt wird, setzt die Methode für seinen Nachweis voraus und die Ergebnisse über seine Verbreitung sowie die quantitative Bestimmung seiner Wirkung. Wir sind auf das Enzym aufmerksam geworden durch die Be- obachtung2), daß der Phytolgehalt des Chlorophylls bei längerer Berührung mancher Blätterextrakte mit der Blattsubstanz all- mählich von der normalen Prozentzahl 33 bis fast auf Null sinkt, während beim Stehen filtrierter Chlorophyllösungen keine Ände- rung des Farbstoffs erfolgt. Galeopsis tetrahit gab bei raschem Extrahieren des Blattmehls die Phytolzahl 31,3. Derselbe Extrakt führte nach iotägigem Stehen zu der Phytolzahl 30,9. Der Extrakt mit dem zugehörigen extrahierten Galeopsismehl 3 Tage unter zeitweisem Schütteln an- gesetzt, liefert Phäophorbid mit 2,7% Phytol. ») Abh. XI, XIII, XIX. 2) Ann. d. Chera. 378, 4 [1910]. Die Wirkungen der Chlorophyllase. 173 Die Reaktionen, welche unter dem Einfluß des Enzyms in alkoholischen Chlorophyllösungen eintreten, bestehen in Umeste- rungen, nämlich im Ersatz des Phytolrestes durch die Methyl- oder Äthylgruppe; dies ist also eine Alkoholyse des Chlorophylls, Ätha- nolyse und Methanolyse, z. B. in der a-Reihe: 1) [C32H30ON4Mg] (C02CH3) (CO2C20H39) + CH3OH = C20H39OH + [C32H30ON4Mg] (C02CH3)2 , 2) [C32H30ON4Mg] (C02CH3) (CO2C20H39) -j- C2H5OH = c20h39oh + [C32H30ON4Mg] (C02CH3) (C02C2H6) . Ferner wird in anderen wasserhaltigen Lösungen, z. B. Äther und namentlich in verdünntem Aceton, die Phytolestergruppe zu freiem Carboxyl hydrolysiert nach der Gleichung: 3) [C32H30ON4Mg] (C02CH3) (CO2C20H39) + H20 = C20H39OH + [C32H30ON4Mg) (C02CH3) (COOH) . . Diese Reaktionen werden quantitativ verfolgt mittels der Phytolzahl von Phäophytin. Bei der Äthanolyse finden wir in jeder Phase der Reaktion den eingetretenen Äthylalkohol dem ab- gespaltenen Phytol äquivalent. Daher kann man auch aus dem Anwachsen des leichtflüchtigen Alphyls den Gang der Reaktion ableiten. Daß die Veränderungen des Chlorophylls wirklich durch das Enzym verursacht werden, zeigt sich beim Vergleich frischer und abgebrühter Blätter. Die Chlorophyllase ist zwar besonders wider- standsfähig, wie ihre Anwendung in hochprozentiger Alkohol- und Acetonlösung zeigt, und sie hält sich sogar einige Zeit beim Kochen mit Alkohol, aber durch kurzes Sieden der Blätter mit Wasser wird sie zerstört. Die Umwandlung des Chlorophylls bei der Berührung seiner Lösungen mit Blattsubstanz bleibt dann aus. 5 g frische Heracleumblätter wurden mit etwas Quarzsand fein zerrieben und mit 8 ccm Aceton eine Stunde lang geschüttelt. 95% des Chlorophylls sind hydrolysiert worden. Der Versuch wurde wiederholt, nachdem wir die Blätter 5 Mi- nuten gekocht hatten. Zwischen Filtrierpapier abgedrückt wogen sie noch 4 g. Wir behandelten sie mit 1 ccm Wasser und 8 ccm 174 Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Aceton wie zuvor und konnten diesmal keine Spur von Hydrolyse nach weisen. 2. Nachweis der Chlorophyllase. Die an Chlorophyllase reichen Pflanzen entfalten ausgezeichnet die Wirkung des Enzyms, wenn man ihre frischen Blätter in wasserhaltigen Methylalkohol einlegt, z. B. 2 g Heracleumblatt in 5 ccm 70 prozentigen Holzgeist. Dann färbt sich das Blatt zuerst tiefer grün an, wird bald heller, zunächst abseits der Blattnerven, und schließlich gelb. Zugleich tritt ein Teil des Chlorophylls aus den Blättern aus, das Lösungsmittel färbt sich hellgrün an. Das herausgelöste Chlorophyll ist nach seinen Löslichkeitsverhältnissen gänzlich methanolysiert ; es ist in alkoholhaltigem Petroläther un- löslich. In einigen Stunden wird der Extrakt schwach grünlich- gelb, er enthält jetzt kein gelöstes Chlorophyll mehr, sondern bildet eine Suspension schöner mikroskopischer Krystalle des Methyl- chlorophyllides. Die Hauptmenge des Chlorophylls ist aber im Blatte gleichfalls in Form mikroskopischer Krystalle ausgeschieden. Die Untersuchung mikroskopischer Schnitte der mit Methylalkohol behandelten ganzen Blätter gibt ein genaueres Bild von der Umwandlung des Chlorophylls1). Nach dem Einlegen der Blätter in Holzgeist nehmen die Chloroplasten ein dunkleres Aus- sehen an, dann tritt aus ihnen das Chlorophyll heraus und färbt zunächst die ganze Zelle intensiv grün an. Am dunkelsten erschei- nen die Pallisadenzellen, heller grün das Schwammparenchym in- folge seines geringen Chlorophyllgehaltes. Die Epidermis bleibt farblos. Am Ende des Vorgangs, nach dem Vergilben, erkennt man mit unbewaffnetem Auge, wenn man ein Blatt gegen das Licht hält, darin eine Schar schwarzer Punkte. Im mikroskopischen Schnitt findet man jetzt das Chlorophyll in einzelnen Zellen zu größeren Krystalldrusen angehäuft, die sich aus vielen gut aus- gebildeten rhombenförmigen Täfelchen zusammensetzen (Fig. 6). Zum größten Teil befindet sich das Chlorophyllid in dieser Form innerhalb des Blattgewebes, nur wenige einzelne Krystalle liegen außerhalb desselben. l) Ann. d. Chem. 387, 336 [i9H]- Die Wirkungen der Chlorophyllase. 175 Wenn man statt der ganzen Blätter die mikroskopischen Schnitte der frischen Blätter mit Alkohol behandelt, wie es zuerst J. Boro- din1) beschrieben hat, so verläßt bei der Alkoholyse viel Chloro- phyll die Zellen und das Chlorophyllid befindet sich am Ende zum großen Teil außerhalb des Blattgewebes. Unter diesen Bedingungen bildet es schöne einzelne Krystalle, und zwar die Methylverbindung wieder rhombenförmige Blättchen, das Äthylderivat sehr charakte- ristische drei- und sechseckige Täfelchen (Fig. 7). In der Figur sind nur die innerhalb der Zellen liegenden Krystalle mit schwarzen Flächen dargestellt. Fig. 6. Schnitt nach der Methanolyse mit ganzem Blatt von Heracleum. Werden die Blätter chlorophyllasearmer Pflanzen mit den Alko- holen behandelt, so verläßt das Chlorophyll die Chloropiasten gleich- falls, aber langsamer, und es scheidet sich in einzelnen unscharf be- grenzten Klumpen im Blattgewebe aus. Die Auflösung des Chlorophylls in den verschiedenen Fällen und seine Wiederabscheidung erklärt sich durch die lösende Wir- kung der mit Alkohol sich vermischenden lipoiden Chloroplasten- bestandteile. Wenn sich die entstandene Lösung mit dem wasser- haltigen Alkohol weiter verdünnt, so wird sie übersättigt an Chloro- *) Botan. Zeitung 40, 608 [1882]. 176 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. phyll oder Chlorophyllid. Rasch erfolgt dann die Ausscheidung, wenn das Chlorophyll durch die Alkoholyse krystalloid geworden ist. Auf einen Gehalt an Chlorophyllase kann man auch kleine Men- gen von Mehl getrockneter Blätter prüfen, indem man durch An- setzen von V2 g mit 2 ccm 85 prozentigem Äthylalkohol die Bil- dung des krystallisierten Chlorophyllids herbeiführt. Fig. 7. Äthanolyse des Chlorophylls mit dem Schnitt eines Heracleumblattes. Ein qualitativer Nachweis und eine Schätzung der Chlorophyll- asewirkungen läßt sich am besten auf die stärker basischen Eigen- schaften der beim Ansäuern entstehenden Methyl-, Äthyl- und freien Phäophorbide gründen, die aus ätherischer Lösung schon in 22 prozentige Salzsäure vollständig übergehen, während Phäophy- tin erst von 29 prozentiger und stärkerer Salzsäure gut extrahiert und spuren weise von 25 prozentiger Säure aufgenommen wird: wir nennen diesen Versuch die „Basizitätsprobe“. Wir filtrieren 1 ccm des zu prüfenden Extraktes ab und waschen das zugehörige Mehl erschöpfend nach, um von den schwer Die Wirkungen der Chlorophyllase. 1 77 löslichen Chlorophylliden nichts zu verlieren. Nachdem Überführen des Farbstoffs in Äther und Herauswacshen von Alkohol oder Aceton, schütteln wir mit 22 prozentiger Salzsäure gelinde durch. Wenn die Säure Farbstoff aufnimmt, war Abspaltung des Phytols erfolgt. Wird der Äther bei wiederholtem Extrahieren mit der Salz- säure rein gelb und verliert er die rote Fluorescenz vollständig, so war die enzymatische Umwandlung quantitativ. Auch die Unlöslichkeit der einfachen Chlorophyllide in Petrol- äther und sogar in alkoholhaltigem Petroläther ermöglichst den Nachweis des Enzyms und die Bestimmung seiner Wirkung. Man braucht nur nach dem Abfiltrieren vom Pflanzenmehl die Über- führung des Farbstoffs aus dem Extrakt in Petroläther durch lang- samen Zusatz von Wasser zu versuchen, um die petrolätherunlös- lichen Derivate auszufällen. Bei unversehrtem Chlorophyll nimmt der Petroläther alles Grüne auf; im Falle einer quantitativen Chlorophyllasewirkung ist er gelb. Die in der wässerigen und der petrolätherischen Schicht unlöslichen Chlorophyllide werden mit Talk gesammelt. Dann lassen sich die im Petroläther hinterbleiben- den Anteile in alkoholisch-alkalischer Lösung mit der Talkportion colorimetrisch vergleichen. 3. Verbreitung des Enzyms. Die Chlorophyllase ist in allen von uns untersuchten Pflanzen- klassen verbreitet. Sie ist namentlich in sehr zahlreichen Dicotyle- donenfamilien nachgewiesen worden, ferner in Monocotyledonen (Avena sativa), in Gymnospermen (Taxus baccata), Equisetales (Equisetum arvense), Filicales (Aspidium), Phäophyceae (Fucus) und Chlorophyceae (Ulva lactuca). Es sind aber nur wenige Pflanzen, die sich wegen ihrer allge- meinen Verbreitung, ihres reichlichen Vorkommens und ihres großen Gehaltes an Chlorophyllase in allen Jahreszeiten als Material für die präparative Anwendung des Enzyms besonders eignen, nämlich : Heracleum spondylium, Bärenklau; Galeopsis tetrahit, Hohlzahn; Stach ys silvatica, Waldziest. Willstättec-Stoll, Chlorophyll. 178 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Auen Lamium maculatum, Datura stramonium und Melittis melissophyllum sind gut anwendbar. Manche Pflanzen, wie Aesculus hippocastanum , enthalten in frischem Zustand reichlich Chlorophyllase, büßen aber die Wirk- samkeit beim Trocknen rasch ein. Eine weitere Schar von Pflanzen finden wir so arm an dem Enzym, daß auch bei langsamem Extrahieren und bei Versuchen, die eine längere Berührung der Extrakte mit den Blättern nötig machen, keine erhebliche Veränderung des Chlorophylls eintritt. Hierzu gehören: Gras, Platane, Brennessel. 4. Anwendung des Enzyms. Da das Enzym neben seinem Substrat in den grünen Pflanzen- teilen vorkommt, so ist für viele Anwendungen der Chlorophyllase zur Alkoholyse und Hydrolyse die möglichst frische, ungetrocknete Blattsubstanz mit dem sich bildenden oder frisch gebildeten Extrakt in Berührung gebracht worden. Hierauf beruht das Verfahren zur Gewinnung von Methyl- chlorophyllid und freiem Chlorophyllid, Kapitel IX, 3 und 4. Die Blätter konnten in frischem Zustand wenige Stunden oder höchstens einen Tag nach dem Sammeln — in dieser Zeit lagen sie in kühlen Räumen ausgebreitet — im Laboratorium verarbeitet werden, zumeist in täglichen Chargen von 20 — 30 kg. Die Verarbeitung der ungetrockneten Blätter erfordert infolge ihres Wassergehaltes einen außerordentlichen Verbrauch an Lö- sungsmitteln und großräumige Apparate. Zudem ist diese Arbeit abhängig von der Nähe des Standortes der geeigneten Pflanzen und von der Jahreszeit. Daher ist oft die Verwendung des Mehles der getrockneten Blätter vorzuziehen. Beispiele hierfür sind die Darstellung von Äthyl- und Methyl- chlorophyllid im Kapitel IX, 1 und 2 und die partielle Synthese des Chlorophylls aus Chlorophyllid mit Phytol, Kapitel VIII. Die Wirkungen der Chlorophyllase. 179 Die Trocknung soll rasch erfolgen, in 1 — 2 Tagen, in dünn aus- gebreiteter Schicht, bei Temperaturen von höchstens 40 0 und unter Vermeidung von Sonnenlicht. Wir haben zumeist die Blätter über dem Dampfkessel des Laboratoriums getrocknet oder von den Kräutersammlem in Trockenspeichern trocknen lassen. Die enzymatische Wirksamkeit der geeignetsten Pflanzen leidet erst bei längerem Aufbewahren des getrockneten Materials, doch ist es auch noch mit monate-, ja mit jahrelang aufbewahrtem Galeopsis oder Heracleum ziemlich gut gelungen, krystallisiertes Chlorophyll zu gewinnen. Drei Jahre alte Blätter von Galeopsis oder Heracleum waren noch wirksam, und zwar betrug die halbe Umsetzungszeit bei der Äthan olyse nur das Vierfache als bei einem neuen Vergleichs- material. Im Extrakt der alten Blätter (80 prozentiger Alkohol) fand beim Behandeln mit Vio des zugehörigen Blattmehles in 10 Stunden bei 25 0 die Äthanolyse von 44% des Chlorophylls statt. Wenn es sich nicht um präparative Verwendung, sondern um kinetische Versuche mit dem Enzym handelt (z. B. in den Ab- schnitten 6, 7, 8 dieses Kapitels), dann ist als Chlorophyllase das Mehl der bei Zimmertemperatur getrockneten Blätter nach zuerst raschem, sodann erschöpfendem Extrahieren des Chlorophylls mit 96 prozentigem Alkohol, und zwar in alkoholfeuchtem Zustand, möglichst bald nach der Extraktion verwendet worden, mitunter auch einfach das Blattmehl ohne Vorbehandlung. Die Menge des Enzyms bezeichnen wir dann mit dem Bruchteil des Pflanzenmehles, welches dem Chlorophyllgehalt des bei dem Versuche angewandten Extraktes entspricht. Z. B. lieferten uns 1 kg Galeopsis einen Extrakt mit 4,14 g Chlorophyll (entsprechend 3 g Äthylchlorophyllid), während der gesamte Chlorophyllgeh alt des Mehles 6,9 g betragen hat; als X/10-Enzym bezeichnen wir dann 60 g, nämlich 1/10 desjenigen Materials, welches 4,14 g Chlorophyll enthält. 5. Bestimmung der Hydrolyse durch Trennung mit Alkali. Der Verlauf der Hydrolyse läßt sich mit einer einfachen colo- rimetrischen Methode bestimmen, die auf der sauren Natur der freien Chlorophyllide beruht. 12* l8o R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Nach der Reaktion führen wir Proben des Farbstoffes, z. B. 0,01 g, oder bei Versuchen in kleinem Maßstab die ganze Menge in Äther über (ioo ccm) und extrahieren mit n/'50-KOH unter Zusatz von ein paar Kubikzentimeter Holzgeist den sauren Anteil, näm- lich etwa dreimal mit 30 — 50 ccm. Ist viel Chlorophyllid gebildet, so scheidet sich sein Kaliumsalz oft in Form einer Emulsion an der Trennungsschicht von Lauge und Äther aus; es wird mit mehr verdünnter Lauge in Lösung gebracht. Die vereinigten alkali- schen Auszüge bringen wir mit Methylalkohol auf 200 ccm; da- durch läßt es sich verhüten, daß die Lösung rasch mißfarbig wird. Dann verseift man das im Äther zurückgebliebene Chlorophyll durch Zusatz von 5 ccm methylalkoholischem Kali und verdünnt nach dem Wiederkehren der grünen Farbe gleichfalls mit 100 ccm Wasser und mit Holzgeist auf 200 ccm. Die beiden Lösungen werden im Colorimeter verglichen, dabei betragen die Fehler ± 2 — 3%- In zwei Beispielen mit Heracleum unter gleichen Bedingungen fanden wir so in guter Übereinstimmung 70 und 71% hydrolysier- tes Chlorophyll. Um nach dieser Methode die Enzymwirkung eines Pflanzen- materials zu untersuchen, sind folgende Bedingungen geeignet. Die Hydrolyse wird in Aceton von 66 Volumprozent ausgeführt. Das Mehl der zur Gewichtskonstanz getrockneten Blätter (1 g) schütteln wir zunächst 5 Minuten lang mit 4 ccm reinem Aceton; diese Zeit genügt zum guten Extrahieren, und der Extrakt enthält nur unverändertes Chlorophyll. Dann werden 2 ccm Wasser unter Umschütteln hinzugefügt, wobei das Mehl aufquillt und sich dunkler färbt. Diese Masse bewegen wir im Thermostaten von 20 0 gewöhn- lich 1 Stunde lang. Dann saugt man auf der Nutsche die Chlorophyll- lösung ab und wäscht mit 66 prozen tigern Aceton gründlich nach. Bei der Untersuchung frischer Blätter bestimmen wir den Wassergehalt und wenden so viel Aceton an, daß die Lösung 66- prozentig wird: z. B. gaben 5 g Blätter von Heracleum 1 g Trocken- substanz ; sie wurden mit Quarzsand zerrieben und mit 8 ccm Aceton versetzt. Die Lösungen werden immer verdünnter als bei der Verarbeitung getrockneter Pflanzen. Die Wirkungen der ChlorophyUase. 181 Erstes Beispiel mit getrockneten Blättern von Heracleum. Die Pflanze ist im Oktober gesammelt und sofort im Exsiccator zwei Tage getrocknet worden. Nach 7V2 Minuten waren 3°%> nach 15 Minuten 56% des Chlorophylls hydrolysiert. Zweites Beispiel mit frischen (ungetrockneten) Blättern von Heracleum. Die Hydrolyse verlief langsamer, entsprechend der geringeren Chlorophyllkonzentration. Die Enzym Wirkung leidet also bei Heracleum nicht durch das kurze Trocknen. Nach 7V2 Mi- nuten waren 20, nach 30 Minuten 5°% hydrolysiert. 6. Bestimmung der Alkoholyse mittels der Phytolzahl und Jodsilberzahl. Der Gang der Alkoholyse kann an dem schwer löslichen Chloro- phyllderivat, das aus der alkoholischen Lösung durch Einwirkung von Oxalsäure abgeschieden wird, ermittelt werden durch quantitative Bestimmung des Phytols nach der im Ka- pitel XVII beschriebenen Methode sowie durch quantitative Abspaltung der Methyl- und Äthylgruppe mit Jodwasserstoff nach dem Verfahren von Zeisel. a) Phytolzahl. Beim Ansäuern der alkoholischen Lösung nach der enzymatischen Reaktion fällt das magnesiumfreie Derivat unvollständig aus. Es hat sich aber gezeigt, daß Phäophytin und Phäophorbid sich ungefähr in dem Verhältnis gemischt abscheiden, wie sie in der Lösung enthalten sind. Eine Chlorophyllösung aus Brennesseln z. B. gab nach der Äthanolyse beim Ansäuern und zweitägigem Stehen 0,6 g Phäo- phytin mit der Phytolzahl 15,3; die Mutterlauge lieferte beim Ein- dampfen auf die Hälfte und zweitägigem Stehen weitere 0,5 g mit 15,1% Phytol. Ein Extrakt aus Galeopsis lieferte nach der Enzym- reaktion 0,75 g beim Stehen abgeschiedenes Phäophytin mit der Phytolzahl 2,4; die Mutterlauge schied nach dem Einengen zum halben Volumen 0,45 g aus mit 3,8% unreinem Phytol. Wir können uns daher oft damit begnügen, den bei zweitägigem Stehen der angesäuerten Chlorophyllösung ausfallenden Anteil des Phäophytins zu analysieren. Aus der Phytolzahl (Zu) des ausfallenden Gemisches von 182 R. Willstätter und A. Stell, Untersuchungen über Chlorophyll. Phäophytin und Äthylphäophorbid und der Phytolzahl (Za) des magnesiumfreien Derivats aus dem angewandten Extrakt oder Chlorophyllpräparat wird der Bruchteil von umgewandeltem Chlorophyll, d. i. die Umwandlungszahl ui nach folgender Gleichung1) abgeleitet, ohne daß übrigens der Umwandlungsgrad mit dem Sinken der Phytolzahl proportional zunimmt. Zu Ul l1 Za(l + 0,01 180) (Za — Zu) j ' 100 ■ (I) Für die Anwendung der Gleichung für monomolekulare Reaktion : i 1 i a k = — • ln t a — u dient a _ Za(i + o,oii8o)(Za — Zu) a — u Zu b) J odsilberzahl. Chlorophyll und Phäophytin enthalten ein Methoxyl und nehmen in alkoholischer Lösung bei der Einwirkung der Chlorophyllase eine Äthoxylgruppe auf. Die teilweise umge- wandelten Präparate enthalten also in wechselndem Verhältnis Methoxyl und Äthoxyl. Es ist daher unzweckmäßig, die Resultate als Methoxyl oder Äthoxyl anzugeben. Wir führen statt dessen den Begriff Jodsilberzahl ein, den Quotienten: gefundenes AgJ . ioq angewandte Substanz Die theoretische Jodsilberzahl des Äthylphäophorbids, und zwar der Komponente a, des Hauptbestandteiles im Gemische von a und b, und ohne erheblichen Fehler diejenige des Gemisches ist: 46g, 6 629,35 Die Zahl des Phäophytins: 234,8 879,6 100 = 74,6 . 100 - 26,7 . Zwischen diesen beiden Werten liegt die Jodsilberzahl eines alkoholysierten Präparates, die als Ju bezeichnet werden soll. Die Umwandlungszahl un ergibt sich aus den Jodsilberzahlen nach folgender Formel2), worin Da die Differenz der Jodsilberzahl !) Ann. d. Chem. 378, 32 [191°]. 2) Ann. d. Chem. 378, 34 [191°]- Die Wirkungen der Chlorophyllase. 183 von Äthylphäophorbid und derjenigen (JJ vom Phäophytm des angewandten Chlorophylls bedeutet. 1 — (II) Uli = 1 + 74,6 - Ju 100 (i + 0,00830 Da) (Ju — 26,7) Anstatt die Umwandlung aus den Jodsilberzahlen vor und nach der Reaktion zu ermitteln, kann man auch das Ausgangsmaterial lediglich durch seine Phytolzahl (Za) kennzeichnen und dann die Umwandlung (u) mit Hilfe der Jodsilberzahl (Ju) in folgender Weise berechnen: 1 Um = 1 + 74.6 - Ju 100 (III) (i + 0,0Il80 • Za) (Ju — 26,8) Die Übereinstimmung der aus den Phytol- und Jodsilberzahlen abgeleiteten Umwandlungsgrade ^ und un, wie sie die nach- folgenden Beispiele zeigen, lehrt, daß das eintretende Äthoxyl genau äquivalent ist dem austretenden Phytol und zugleich wird dadurch die Brauchbarkeit beider Methoden erwiesen. Alkoholyse von Phäophytin. Werte für das angewandte Präparat: Za = 30,9; Ja = 29,9. Werte für das umgewandelte Präparat: Zu = 11,0; Ju = 58,3. ^ = 71,2; un = 72,7 ; uIU = 72,6. Werte für dasselbe noch weiter alkoholysierte Präparat: Zu = 2,7, Ju = 70,2, Ui = 93,4, un = 93,4, uni = 93.4- Diese beiden Arten von quantitativer Bestimmung sind nicht mit kleinen Versuchsproben auszuführen und sie erfordern längere Zeit. Daher sind sie zur Kontrolle von Versuchen in präparativem Maßstab nicht so geeignet wie die in den Abschnitten 2 und 5 an- geführten Prüfungen. 7. Dynamik der Enzymwirkung. Der Ermittlung geeigneter Versuchsbedingungen für Anwen- dungen der Chlorophyllase dienen Geschwindigkeitsmessungen unter verschiedenen Verhältnissen, welche den Einfluß der Lösungsmittel, besonders des Wassers, der Temperatur, des Alters der Enzym- präparate und anderer Umstände kennen lehren. Die Bedingungen 184 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. für die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit liegen hier beson- ders ungünstig wegen der Beschaffenheit des Enzyms, das außer- ordentlich verdünnt mit anderen Stoffen in der Form des aus- gelaugten Pflanzenmehles angewandt wird, andererseits wegen der komplizierten und größtenteils unbekannten Zusammensetzung des Blätterextraktes, welcher das Substrat enthält. Die Reaktion der Chlorophyllase findet nicht in einem homo- genen System statt, aber die Diffusionsverhältnisse könnten der- art sein, daß das heterogene System sich wie ein homogenes ver- hielte. Dann wäre es möglich, daß die Reaktion zwischen dem Chlorophyll und den Alkoholen, deren Konzentrationsänderung außer Betracht bleiben darf, oder dem Wasser wie eine monomole- kulare verliefe. Die Versuche haben jedoch ergeben, daß die Re- aktionskonstante einen starken Gang hat, daß sie nämlich mit zunehmender Reak- tionsdauer erheblich sinkt. Die Erklärung hierfür ist einesteils darin zu suchen, daß das Enzym während der Reaktion zerstört oder geschwächt wird; denn bei wiederholter Anwendung wird seine Wirksamkeit geringer. Ferner erfährt möglicherweise ein Koenzym oder Aktivator, dessen Einfluß zutage getreten ist, im Verlaufe der Reaktion eine Schwä- chung. Endlich ist es wahrscheinlich, daß die Verhältnisse der Diffusion bei der eigentümlichen Beschaffenheit des enzymhaltigen Materials unter unseren Versuchsbedingungen einen störenden Ein- fluß auf die Geschwindigkeit ausüben. Beispiele. Die Extrakte sollen möglichst unversehrtes Chlorophyll ent- halten, sie werden daher nach dem Nutschen verfahren rasch her- gestellt. Die Konzentration der Lösungsmittel wird in Volum- prozenten angegeben. Die im Pflanzenmehl enthaltene Feuchtig- keit ist bei der Bestimmung des Wassergehaltes der Extrakte be- rücksichtigt. Die Versuche wurden unter Schütteln bei konstanter Temperatur ausgeführt. Die Wirkungen der Chlorophyllase. 185 1. Hydrolyse. Heracleum, exsiccatortrocken , mit ganzer Enzymmenge in 66 prozentigem Aceton bei 20 °. Versuchsanordnung und Bestim- mung wie in Abschnitt 5. Zeit in Minuten u k • io1 15 45 7.52 30 75 8,68 60 91 7.55 120 98 6,17 240 99 — 2. Äthanolyse (Fig. 8). Heracleum (Ernte Anfang Mai) in 92 prozentigem Alkohol bei 25 0 mit 710-Enzym; 500 ccm Extrakt, 1,8 g Chlorophyll enthaltend, mit 27,1 g Blattmehl angesetzt. Za = 3i,5- Zeit in Stunden z„ u k • 10* IO 25,6 24,0 27.5 20 23,2 33.1 20,0 40 19,1 47. 1 i5.9 80 12,0 69,0 i4.7 Einfluß des Zusatzes von Wasser (dieselbe Figur) l86 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Heracleum (Ernte Ende Mai) in 8oprozentigem Alkohol bei 25 ° mit Vio-Enzym, wie oben. Za — 30,6. Zeit in Stunden z„ U k • io* 5 12,9 65,1 210,7 IO 7.4 81,0 166,1 20 5.4 86,4 99.8 Die Geschwindigkeit ist also viel größer. Noch sicherer tritt die Verbesserung durch den Zusatz von Wasser bei einem Parallel- versuch mit gleichem Extrakt und zwar in 92- und in 80 prozenti- gem Alkohol hervor. Heracleum mit ViodEnzym; 25°, 10 Stunden. Za — • In 92 prozentigem Alkohol: Zu = 19,5 ; u = 43.7 1 k . io3 = 57,4. In 80 prozentigem Alkohol: Zu = 9,4; u = 75,4;k. io3 = 140,3. Die halben Umsetzungszeiten lassen sich mit Anlehnung an die Kurven der Fig. 8 hinreichend genau schätzen; sie sind 14 und 4 Stunden. Selbst bei so bedeutendem und noch größerem Wassergehalt der alkoholischen Lösung erfolgt neben der Alkoholyse nur spurenweise Hydrolyse. Einfluß der Temperatur: Das Temperaturoptimum für die Äthan olyse liegt niedriger, als es für die Lipasen aus Rizinussamen und Pankreas gefunden wird, nämlich bei ungefähr 20 °. Heracleum in 80 prozentigem Alkohol mit Vio"Enzym; Zeit Stunden. 2a = 3L9 • 20° Z„= 23,4 u = 33.3 25° = 25,6 = 25,3 35° = 26,5 = 21,9 Heracleum in 80 prozentigem Alkohol mit Vio'Enzym; Zeit 5 Stunden. 2a = 31.7- 15° Zn - 21,0 u = 41,2 20° = 19,1 = 47-6 25° = 21,6 = 39.1 Die Wirkungen der Chlorophyllase. 187 Schwächung des Enzyms: Wir ermittelten zunächst die Geschwindigkeit für eine Dar- stellung von Enzym und Extrakt in 3 Versuchen von 2 7» 5 und 10 Stunden. Das Enzym von jedem Versuch ließen wir aufs neue 2 !/a Stunden auf die ursprüngliche Chlorophyllösung ein wirken. Es zeigte sich, daß in den 21/. Stunden des ersten Versuches das Enzym ganz ungeschwächt geblieben ist. Das Enzym, welches 5 und 10 Stunden gearbeitet hatte, erwies sich als weniger wirksam, und zwar in dem Maße, daß der Unterschied zwischen den Kon- stanten dieser 3 Wiederholungsproben das Sinken unserer Re- aktionskonstanten wenigstens teilweise erklärt durch die Schwä- chung des Enzyms während der V ersuchsdauer. Heracleum in 80 prozen tigern Alkohol bei 25 °. 500 ccm Ex- trakt, i,95g Chlorophyll enthaltend, mit 30 g Blattmehl (V10' Enzym) angesetzt. 2a — 3I»9- Zeit in Stunden Zu U k • io8 Versuch I 2x/2 26,0 23,8 108,7 „ II 5 23,0 34-8 85,4 „ III 10 17,° 54-7 79,1 Wiederholte Wirkung in 21/z Stunden ; Zu u k • io3 Enzym von Versuch I 25.9 24,2 110,7 II 27,2 19,2 85,4 „ HI 28,1 15.7 68,3 Chlorophyllase einer Pflanze mit der Chlorophyllösung aus einer anderen. Die an Chlorophyllase armen Pflanzen geben Extrakte, die bei der Alkoholyse und Hydrolyse schlechter reagieren, als die zum Enzym gehörenden Extrakte. Dieselben Pflanzen geben extra- hierte Blattmehle, welche mit den für die Reaktion geeignetsten Lösungen geringeren Umsatz bewirken als gutes Enzymmaterial. Zeit: 60 Minuten. Brennesselmehl mit Brennesselextrakt: Hydrolyse 10%, ,, ,, Heracleumextrakt : Hydrolyse 23%, Heracleummehl mit Brennesselextrakt: Hydrolyse 62%, ,, ,, Heracleumextrakt: Hydrolyse 91%. VIII. Anwendung des Enzyms zur partiellen Chlorophyllsynthese* *). Wie die Ester- und Glyceridsynthese mit Pankreaslipase ge- glückt ist2), so ließ sich auch die Umkehrung der Alkoholyse mit Chlorophyllase, also die Umwandlung des Äthylchlorophyllids in den Phytolester erzielen. Da das Enzym die Gegenwart von Wasser fordert, worin Phytol unlöslich ist, so sind die Bedingungen für die Reaktion nicht günstig; die Ausbeute war gering. In befriedigender Weise hat sich der wichtigere Fall, die Esteri- fizierung der freien Carbonsäure Chlorophyllid, namentlich mit Phytol, entsprechend der Gleichung: [C32H30ON4Mg] (C02CH3) (C02H) + C20H39OH = [C32H30ON4Mg] (C02CH3) (CO2C20H39) + H20 mit einer sehr einfachen Versuchsanordnung verwirklichen lassen, noch ehe es geglückt war, das leicht zersetzliche Chlorophyllid in Substanz zu isolieren. Wir digerieren das Mehl von Galeopsisblättem einige Tage lang mit feuchtem Äther. Der Phytolester wird hydrolytisch gespalten ; die Phytolzahl sinkt vom Anfangswert 32,8 auf wenige Prozente. Nun fügen wir Phytol zu der mit dem Blattmehl angesetzten Äther- lösung. Dann wird in einigen Tagen ein großer Teil des Chloro- phylls, nämlich ein Drittel bei drei Viertel, zurückgebildet, was aus dem Ansteigen der Phytolzahl hervorgeht. *) Abh. XIII. *) J. H. Kastle und A. S. Loewenhardt, Am. Chem. Joum. 24, 491 [1900]; H. Pottevin, compt. rend. 136, 1152 [1903]; 138, 378 tI9°4]; Bull. soc. chim. 35, 693 [1906]; M. Bodenstein und W. Dietz, Zeitschr. f. Elektroch. 12, 605 [1906] und W. Dietz, Zeitschr. f. physiol. Chem. 52, 279 [1907]- Anwendung des Enzyms zur partiellen Chlorophyllsynthese. 189 Hydrolyse. 1 kg Mehl von Galeopsisblättem (Ernte August) wurde unter Zusatz von 20 g gefälltem Calciumcarbonat mit 2,2 1 alkohol- freiem, feuchtem Äther angesetzt und unter zeitweisem Schütteln 3V2 Tage damit maceriert. Bereits nach J/2 Stunde ergab eine ab- filtrierte Probe eine etwas zu niedrige Phytolzahl, nämlich 30,4. Unserer Berechnung der Umwandlung legen wir nicht diese An- fangsphytolzahl, sondern den theoretischen Wert für Phäophytin a 33,7 zugrunde. Nach der mehrtägigen Einwirkung zeigt das Chlorophyll ver- änderte Löslichkeitsverhältnisse; bringt man eine Probe aus dem Äther in alkoholische Lösung und versucht man daraus das Chloro- phyll in Petroläther überzuführen, so wird der Farbstoff fast voll- ständig gefällt. Das gebildete Chlorophyllid haben wir zur Bestimmung der Phytolzahl auf folgende Weise in Form seines magnesiumfreien Derivates isoliert. Wir schüttelten das Mehl mit dem Ätherextrakt gut an und trennten die Hälfte ab, um mit dem Rest die Ein- wirkung des Phytols zu untersuchen. Die abfiltrierte und nach- gewaschene ätherische Lösung wurde auf 1/i 1 konzentriert, mit V2 1 nur 85 prozentigen Alkohols (in höherprozentigem Alkohol wäre Phäophorbid zu beträchtlich löslich) versetzt und im Vakuum bei 25 0 auf 300 — 400 ccm eingeengt. Zur Reinigung schüttelten wir die alkoholische Chlorophyllösung mit 50 g Calciumcarbonat ; dabei fiel eine große Menge gelber und farbloser Stoffe aus, und die I Lösung hellte sich zu reinem Grün auf. Wir verdünnten die alko- holische Lösung auf 80% und wiederholten das Klären mit Cal- ciumcarbonat. Endlich wurde mit Oxalsäure angesäuert und das magnesiumfreie Derivat aus Chloroform mit 85 prozentigem Alkohol umgeschieden. Den Grad der Hydrolyse und später den der Esterifizierung be- rechnen wir aus der Phytolzahl ähnlich wie früher den Verlauf der Alkoholyse. Die Formel vereinfacht sich, da wir hier Za = der theoretischen Phytolzahl Z„ setzen können. w “ I'4629 ■ igO R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Mx und M2 bedeuten die Molekulargewichte von Phäophytin a (879,6) und Phäophorbid a (601,3). Die Jodsilberzahlen der hydrolysierten Präparate fallen durch- weg etwas zu hoch aus. Entweder ist bei der übrigens vorsichtigen und raschen Isolierung ein wenig Äthylalkohol eingetreten oder der Äther hat unter der Wirkung der Chlorophyllase in einem ge- ringen Maße äthylierend gewirkt. Nach der Ausführung der Hydrolyse wurde die übrig gelassene Hälfte von Galeposismehl (V2 kg) und -extrakt mit Phytol ver- setzt, und zwar mit 50 g, d. i. etwa 50 Mol. bezogen auf den Chloro- phyllgehalt der Blätter. Wir ließen die Einwirkung 3 Tage dauern. Dann haben wir die ätherische Lösung vom Pflanzenmehl abfiltriert und ganz ebenso wie nach der Hydrolyse daraus eine konzentrierte alkoholische Lösung bereitet und diese geklärt. Hierauf säuerten wir mit Oxalsäure an und erhielten in einigen Stunden eine erste Fällung von Phäophytin. Die Mutterlauge hielt infolge ihres Ge- haltes an Phytol noch eine erhebliche Menge von Phäophytin ge- löst. Um den Rest abzuscheiden, führten wir die Substanz in Äther über und verdampften diesen nach Herauswaschen des Alkohols im Vakuum vollständig. Die hinterbleibende Lösung von Phäophytin in Phytol verdünnten wir mit 2 1 Petroläther und ließen damit in der Kälte stehen. Das Phäophytin schied sich ziemlich vollständig aus, die petrolätherische Mutterlauge enthielt fast nur noch gelbes Pigment. Die zwei Fraktionen des Phäophytins oder genauer des Gemisches von Phäophorbid und Phäophytin haben wir vereinigt und zuerst aus konzentrierter Chloroformlösung mit 85 prozentigem Alkohol umgefällt, sodann ein zweites Mal aus Chloroform mit Petroläther. So erhielten wir das Produkt rein, in der Chloroform-Petroläther-Mutterlauge blieben farblose Be- gleiter und Carotin. Esterifizierung mit Phytol. Anwendung des Enzyms zur partiellen Chlorophyllsynthese. 191 Beispiel, a) Hydrolyse. Die isolierte Lösung enthielt nach dem Klären 1,8 g Chloro- phyll, berechnet als phytolhaltiges Chlorophyll. Die Ausbeute an Phäophorbid betrug 1,05 g, d. i. 85% der Theorie. Phytolzahl Zu = 3,0, Jodsilberzahl Ju = 43,3- Der theoretische Wert für Phäophorbid a ist 39,0. Die Jodsilberzahl zeigt, daß nicht Alkoholyse, sondern Hydro- lyse erfolgt ist. Umwandlung ux, nur aus der Phytolzahl bestimmt, = 94- b) Esterifizierung. Ausbeute an Chlorophyll in Lösung 2,0 g und 1,45 g zweimal umgeschiedenes Phäophytin, d. i. 85% der Theorie. Zu == 17,2. Ju = 30,3- u2 = 35- Von der gebildeten freien Carbonsäure haben sich also bei diesem Versuch 38%, bei einem anderen 73%, bei einem dritten 29% mit Phytol verbunden. Das Chlorophyll ist bei der Hydrolyse und Synthese im Phyto- chrominkomplex intakt geblieben. Das magnesiumfreie Derivat des Reaktionsproduktes lieferte nämlich bei der Verseifung das normale Gemisch von Phytochlorin e und Phytorhodin g und keine anderen basischen Spaltungsprodukte. Als wir parallel mit der Esterbildung durch Phytol mit Anteilen der ätherischen Lösung von hydrolysiertem Chlorophyll die Ein- wirkung von Äthylalkohol prüften, ergab die Esterifizierung mit 25 Molen ungefähr dasselbe Resultat wie mit der doppelten Zahl von Phytolmolekülen. Es wird hierdurch erklärt, daß bei der Extraktion von Galeopsis- mehl mit gewöhnlichem, nicht ganz alkoholfreiem Äther die Boro- dinschen Krystalle in geringer Ausbeute erhalten werden1). *) Arm. d. Chem. 358, 275 [1907] und 378, 59 [1910], ig2 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Bildung von Chlorophyll a aus Phytol und freiem Chlorophyllid a1). Nachdem wir die unbeständigen und daher schwierig zu iso- lierenden freien Chlorophyllide kennen gelernt, ist es uns auf sehr einfache Weise gelungen, das natürliche Chlorophyll aus den beiden isolierten Bestandteilen, aus seinem Alkohol und der Carbonsäure zu bilden. Wir brachten Chlorophyllid a mit Phytol in Lösung und ver- setzten diese mit etwas Mehl chlorophyllasereicher Blätter. An der Abnahme des sauren Anteils, den wir aus ätherischer Lösung mit n/60-KOH extrahierten, konnte die Synthese des neutralen Esters verfolgt werden. 0,2 g Chlorophyllid a lösten wir in 4 ccm Aceton wegen seiner Schwerlöslichkeit in Phytol; die schön grünblaue Lösung wurde in 16 ccm Phytol eingetragen und mit 10 g lufttrockenem Mehl aus Heracleumblättem (d. i. 1/1 des dem angewandten Chlorophyllid entsprechenden) vermischt. Den trägflüssigen Brei haben wir öfters umgerührt und davon von Zeit zu Zeit Proben von 2 g ab- gewogen und auf einer kleinen Nutsche mit viel Äther (100 ccm) extrahiert und ausgewaschen. Dann schüttelte man unter Zusatz von etwas Alkohol, um Emulsionen zu vermeiden, wiederholt mit 50 — IOo ccm n/60-KOH gelinde durch, bis die wässerige Schicht farblos blieb, verdünnte die vereinigten Auszüge mit Sprit auf 500 ccm und verglich sie colorimetrisch mit der zu Beginn der enzymatischen Reaktion auf gleiche Weise hergestellten Lösung. Da die wässerig-alkalische Chlorophyllidlösung beim Stehen leicht mißfarbig wird, so entnimmt man dem Reaktionsgemisch mehrere solcher Anfangsproben und bewahrt sie in Form ihrer verdünnten ätherischen Lösungen im Dunkeln auf, um gleichzeitig mit der Versuchsprobe eine Vergleichslösung herzustellen. Unter den oben angeführten Versuchsbedingungen mit trocke- nem Blattmehl war nach 1 und nach 2 Stunden noch kein deut- liches Zurückgehen des sauren Anteils wahrzunehmen. Nach 24 Stunden war die Synthese bis zu 20% des angewandten Chloro- phyllides vorgeschritten. *) Unveröffentlicht. <• < - Anwendung des Enzyms zur partiellen Chlorophyllsynthese. 193 Die Chlorophyllase wirkte in dem beinahe wasserfreien Medium nur sehr langsam, hingegen waren nach tüchtigem Umrühren mit 0,5 ccm Wasser in einem weiteren Tage 60% der ursprünglich vor- handenen Carbonsäure esterifiziert. Die Enzymreaktion hat da- mit schon nahezu den Gleichgewichtszustand erreicht , denn während eines weiteren Tages stieg die Ausbeute an Chlorophyll nur auf 65% und ging auch nicht weiter in 2 folgenden Tagen. Die konzentrierte Lösung von Chlorophyllid a in Phytol bildet ohne Enzymzusatz auch bei tagelangem Stehen keinen Estei. Die ätherische Lösung des gebildeten Chlorophylls zeigte die Merkmale des natürlichen Pigmentes : es war indifferent gegen ver- dünnte wässerige Alkalien, wie sein magnesiumfreies Derivat gegen 23 prozen tige Salzsäure (Basizitätsprobe), und es zeigte eine rein- gelbe Phase. Will 5 1 ä t ter-S toll , Chlorophyll. J3 IX. Die präparativen Verwendungen der Chlorophyllase: Die Chlorophyllide. In unseren ersten Untersuchungen ist der Phytolgehalt von Chlorophyll und Phäophytin ohne Gesetzmäßigkeit normal oder zu niedrig gefunden worden1), und für die Darstellung des phytol- f reien , ,krystallisierten ‘ ‘ Chlorophylls haben W i 1 1 s t ä 1 1 e r und B e n z ohne Kenntnis der für die Bildung maßgebenden Umstände ein empirisches Verfahren beschrieben. Mit der Chlorophyllase haben wir den Schlüssel für die Beziehungen zwischen phytolhaltigem und phytolfreiem Chlorophyll gefunden; dann war die Unter- j suchung der Enzymreaktion die Vorarbeit, um sie für präparative Zwecke nutzbar zu machen. Das natürliche Chlorophyll abzuscheiden, war wegen seiner großen Löslichkeit und Zersetzlichkeit und des Fehlens von sauren und basischen Eigenschaften bis in die letzte Zeit so schwierig, daß es für die analytische Untersuchung und für die ersten Stufen des Abbaus vorzuziehen war, den Farbstoff in der Form der schwer löslichen und ausgezeichnet krystallisierenden einfacheren Chloro- phyllide zu isolieren und anzuwenden. Zudem treten die Unter- schiede in der Zusammensetzung zwischen der a- und b-Reihe schärfer zutage an den phytolf reien Verbindungen, mit welchen die Auflösung des natürlichen Gemisches in seine Komponenten zuerst ausgeführt worden ist. Auch nachdem die neue im V. Kapitel beschriebene Methode es ermöglicht hat, das Chlorophyll selbst in beliebigem Maßstab und *) Abh. VII und X. Die präp arat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide. 195 reinem Zustand zu gewinnen , behalten die sogenannten krystalli- sierten Chlorophylle, die schönsten Substanzen der Chlorophyll- gruppe, ihre Bedeutung als Ausgangsstoffe von zuverlässiger Rein- heit, besonders für die ersten Umwandlungen des Pigmentes. I. Äthylchlorophyllid („Krystallisiertes Chlorophyll“). J. Borodin1) hat im Jahre 1881 in mikroskopischen Blatt- schnitten beim Behandeln mit Äthylalkohol und Austrocknen unter Deckgläsern das krystallisierte Chlorophyll entdeckt und die Form der Krystalle schön beschrieben. Er hat die Frage aufgeworfen, ob die merkwürdigen Gebilde den natürlichen Farbstoff oder eine Verbindung desselben mit einem noch unbekannten Stoff darstellen. N. A. Monteverde2), der die Borodinschen Krystalle für natürliches Chlorophyll, das amorphe aber für ein Zersetzungs- produkt hielt, hat (1893) das krystallisierte Präparat für die Be- schreibung des Absorptionsspektrums dargestellt und dafür folgendes Verfahren mitgeteilt: „Frische Blätter wurden ihrer stärkeren Nerven entledigt und mit einer Achatschere klein geschnitten, dann mit Alkohol ge- waschen und mit kaltem 95 prozentigem Alkohol behandelt. Nach 1 Stunde wurde die Alkohollösung filtriert und an der freien Luft verdunstet. Die sich ausscheidenden Krystalle befreite ich von allen fremden Beimischungen und Farbstoffen durch destilliertes Wasser und Benzin.“ Diese anregenden Arbeiten von Borodin und Monteverde haben an keiner Stelle in der Literatur außer nochmals bei einem russischen Botaniker, M. Ts wett, Würdigung gefunden, wohl des- halb, weil es zu keiner chemischen Untersuchung der Chlorophyll- krystalle gekommen und weil es späteren Autoren nicht gelungen ist, das Chlorophyll in der beschriebenen Form zu isolieren. Willst ätt er und Benz haben 1907, den Angaben von Borodin und von Monteverde folgend, das krystallisierte Chlorophyll wie- der aufgefunden und sind zu einem Verfahren gelangt, um dieses in großem Maßstab zu gewinnen. 13* 1) Bot. Zeitung 40, 608 [1882]. 2) Acta Horti Petropolitani 13, Nr. 9, 123 [1893]. ig6 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Sie verwenden an Stelle frischer Blätter getrocknete, führen den Farbstoff aus dem alkoholischen Extrakt in Äther über und er- zielen durch eine Reinigung dieser Lösung das Auskrystallisieren. A. Gautier1) erinnerte später daran, daß er schon vor den Beobachtungen von B o r o d i n und Monteverde das krystallisierte Chlorophyll isoliert2) und daß er auf Grund des Phosphatgehaltes der Asche seiner Präparate die wesentliche Rolle des Phosphors im Chlorophyll erkannt habe. Beim Vergleich der veröffentlichten Zusammensetzung von Gautiers Produkt mit den Alkylchloro- phy lüden : Chlorophyll von Gautier C 73.97 H 9.80 N 4U5 Asche, Phosphate 1,75 Äthylchlorophyllid (kryst. Chlorophyll nach Borodin) 68,57 Asche («= MgO) 5.97 8,80 5.92 zeigt sich indessen, daß das Chlorophyüpräparat von Gautier, das überdies saure Eigenschaften besaß und lösliche Alkalisalze bildete, ein Zersetzungsprodukt war. Das Verfahren. 10 kg Mehl der Blätter von Galeopsis tetrahit werden mit 20 1 96 prozen tigern Alkohol 2—3 Tage lang ausgezogen, dann abgesaugt und nachgewaschen. Aus dem Extrakt wird durch Vermischen mit 20 — 25 1 Äther und Hinzufügen der zur Besei- tigung der Hauptmenge des Alkohols erforderlichen Menge Wasser (60 1 mit x/4 1 gesättigter Kochsalzlösung) eine ätherische Lösung bereitet. Sie enthält noch unangenehme, schwer zu ent- fernende Verunreinigungen, eine indifferente schleimige Substanz, die das weitere Herauswaschen des Alkohols durch die Bildung von Emulsionen verhindert. Zur Beseitigung des Schleimes schüt- telt man die Flüssigkeit wiederholt und stundenlang mit Klär- mitteln, am besten drei- bis viermal mit je einem ganzen Kilo Talk. Ein Rest der Verunreinigung bleibt allerdings auch dann noch im 1) Bull. soc. chim [4] 5, 3r9 [i9°9]- 2) Compt. rend. 89, 861 [1879]. Die präparat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide. 197 Äther zurück, aber er verursacht beim Ausschütteln mit Wasser keine lästigen Emulsionen mehr und wird dabei nahezu entfernt. Die Lösung ist noch fünfmal mit je 20 1 Wasser durchzuschütteln und ihr Volumen dabei durch Nachfüllen von Äther unvermindert : zu erhalten. Schließlich engt man die ätherische Lösung im Wasser- bade auf 3 1 ein. Die Hauptmenge krystallisiert dann beim Stehen in einigen Stunden aus ; sie wird auf dem Filter mit Äther ge- waschen zur Befreiung von Mutterlauge und gelben Begleitern, bis die Waschflüssigkeit rein hellgrün abläuft. Das Filtrat liefert bei stärkerem Einengen weitere Krystallisationen von wenig geringerer Reinheit. Die Ausbeute betrug 17 g, wovon 13 als erste Krystallisation isoliert waren. Beim Verarbeiten kleinerer Mengen ist dieser Be- trag leicht zu übertreffen. Eine Verbesserung dieses Verfahrens von Willstätter und Utzinger1) zieht die Nutzanwendung aus der Erkenntnis des enzymatischen Prozesses und erzielt die Vervollständigung der Alkoholyse, auch wird das umständliche Reinigungsverfahren mit Talk vereinfacht. Zwei Punkte der Vorschrift werden als wesent- I lieh erkannt : 1. Genügend lange Einwirkung des Blattmehls auf den Extrakt, 2. Zusatz von Wasser behufs Begünstigung der Enzymreaktion. 2 kg gemahlene Blätter einer chlorophyllasereichen Pflanze wer- den mit 4 1 Sprit angesetzt. Nach einigen Stunden tropft man unter Umschwenken 400 ccm Wasser zu und läßt dann unter häufigem Umschütteln die Alkoholyse fortdauem. Ihren Gang kontrolliert die Reagensglasprobe durch Überführen des Chlorophylls in Petrol- äther; hieraus scheidet sich der Farbstoff quantitativ aus, wenn die Abspaltung des Phytols vollständig geworden ist. Dies kann noch am gleichen Tage und wird jedenfalls bis zum nächsten Morgen eingetreten sein. Der Farbstoff wird aus der abgesaugten alkoholischen Lösung in Äther übergeführt und der Alkohol in der Hauptmenge heraus- gewaschen. Man darf dabei nicht stark schütteln, weil sonst l) Ann. d. Chem. 382, 142 [1911]. xg8 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Emulsionen eintreten. Dann wird die ätherische Lösung mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, bis sie dickflüssig zu werden beginnt. Ohne Rücksicht auf die etwaige Abscheidung bildet man durch Zusatz von Talk einen dünnen Brei, schüttelt kurze Zeit und läßt ihn einen halben bis ganzen Tag stehen. Dann wird auf der Nutsche scharf abgesaugt und gründlich mit Äther nachgewaschen, bis dieser rein und ganz hellgrün abläuft. Der Talk ist ganz durchsetzt mit schön ausgebildeten mikroskopischen Krystallen, sechs- und dreieckigen, und er enthält nichts von den gelben Pigmenten. Zur Isolierung der Chlorophyllkrystalle wird der Talk in mög- lichst kurzer Zeit, 10—15 Minuten, mit nicht völlig absolutem Alkohol extrahiert. Da der Alkohol zwar nicht im Extrakt, aber in der reinen Lösung auf den Farbstoff einwirkt und ihn durch Allomerisation unkrystallisierbar macht, so wird die erhaltene Lösung schnell mit Äther vermischt und der Alkohol vollständig herausgewaschen. Aus der ätherischen Lösung krystallisiert bei mäßigem Einengen von gelben und farblosen Beimischungen freies Chlorophyllid. Neues Verfahren1). Bei Willstätter und Utzinger war die enzymatische Alko- holyse vollkommen, aber die Isolierung geschah noch umständlich und mit Verlust. Unsere Abänderung erhöht die Ausbeute und ermöglicht es, die beiden gelben Pigmente ohne Mühe und bemahe vollständig als Nebenprodukt zu gewinnen. Während der Enzymreaktion krystallisiert ein Teil des Chloro- phylls im Pflanzenmehl aus. Anstatt mit Alkohol waschen wir nach dem Abfiltrieren des Extraktes mit Aceton nach, das auch etwas wasserhaltig werdend Äthylchlorophyllid noch leicht und schnell löst. Aus dem gesamten Filtrat wird der Farbstoff nun nicht mehr in Äther übergeführt, sondern langsam mit Wasser in Krystallen gefällt, die sich von Farblosem und Gelbem frei waschen lassen. x) Unveröffentlicht. Die präparat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide. 19g Das Mehl von Heracleum-, Galeopsis- oder Stachysblättem wird mit nur 90 prozentigem Alkohol angesetzt, 1 kg mit 2 1, und unter zeitweisem Umschütteln etwa 12 Stunden stehen gelassen. Schon nach wenigen Stunden zeigt die „Basizitätsprobe“ (Kap. V, Abschn. 5) bei gutem Enzymgehalt eine 8oprozentige Alkoholyse an, nach 12 Stunden soll eine Probe, in Äther über- geführt, an 22 prozen tige Salzsäure allen Chlorophyllfarbstoff als Äthylphäophorbid a und b abgeben, so daß die Ätherschicht durch zweimaliges Ausziehen mit dieser Säure rein gelb und frei von Fluorescenz wird. Zugleich ergibt eine Prüfung mit Alkali, daß kein freies Chloro- phyllid entstanden ist. Der Wassergehalt des Alkohols bewirkt nicht in irgend erheblichem Maße neben der Umesterung Hydro- lyse. Eine in Äther übergeführte Extraktprobe färbt nämlich in guten Versuchen n/100-KOH beim Durchschütteln nicht an. Nach Beendigung der Enzymreaktion filtriert man auf der Nutsche und wäscht mit Aceton nach, mit 21/a 1, und zwar halb- literweise unter abwechselndem kurzen Macerieren und Absaugen, wobei das Lösungsmittel Grünes und Gelbes quantitativ aus dem Mehl aufnimmt. Die vereinigte Alkohol- und Acetonlösung wird mit 150 g grobem Talk versetzt und im Laufe einer Stunde unter Umrühren mit 4 V2 1 Wasser verdünnt. Das Chlorophyllid scheidet sich mit vielen Beimischungen in schönen, metallisch glänzenden Kryställchen aus, die der angewandte Talk bei einigem Stehen sammelt. Wir fil- trieren auf der Nutsche durch eine weitere dünne Schicht von grobem Talk. Der gesamte Talk wird mit 1fi 1 55 prozentigem Aceton und dann 1/4 1 55 prozentigem Alkohol gewaschen, an der Pumpe scharf abgesaugt und sogleich auf der Nutsche durch sehr rasche Extraktion mit 1 1/2 1 Petroläther und darauf mit 1/2 1 Äther noch weiter gereinigt. Die beiden Auszüge von schmutzig-gelb- grüner Farbe enthalten neben sehr viel Farblosem alles Xantho- phyll und Carotin; sie werden zusammen nach einer Reinigung mit methylalkoholischer Kalilauge zur Fraktionierung der beiden gelben Pigmente mit Holzgeist verwendet (siehe Kap. XII, Abschn. 2). 200 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Der Äther fließt bei dieser Extraktion zur Reinigung des Talks zuletzt schön hellgrün ab, nimmt aber sehr wenig Chlorophyll fort. Der vor dem Waschen mit Petroläther und Äther olivbraune Talk ist grau geworden und erscheint unter dem Mikroskop ganz er- füllt von den charakteristischen drei- und sechseckigen Kryställchen. Der Talk wird endlich extrahiert mit 1/i 1 absolutem Alkohol, der zur Verhütung der Allomerisation mit 0,005 g Oxalsäure ver- setzt ist, und das tiefgrüne Filtrat mit 3 — 4 1 Äther vermischt. Durch sechsmaliges Waschen mit ]e 2 1 Wasser befreien wir den Äther quantitativ von Alkohol und dampfen ihn nach kurzem Trocknen mit geglühtem Natriumsulfat auf ix/2 1 ein. Man filtriert die Lösung noch einmal möglichst rasch und destilliert den Äther weiter langsam bis auf 20 ccm ab, aber in einem nicht zu heißen Wasserbad, weil sich sonst der Farbstoff in Krusten an der Ge- fäßwand ansetzt. Während des Eindampfens und bei kurzem Stehen krystallisiert das Äthylchlorophyllid schön aus. Das Prä- parat ist rein, die Ausbeute beträgt 4>5 5 g> 3lso ungefähr 1 g bezogen auf 1 kg frischer Blätter, d. i. mehr als 90% ihres Chloro- phyllgehalts. In einer Portion lassen sich mit Laboratoriumshilfsmitteln 2 kg Blattmehl verarbeiten und 3 Chargen im Tag bewältigen, abgesehen von der Gewinnung der wertvollen gelben Nebenprodukte. Äthylchlorophyllid aus isoliertem Chlorophyll haben Willstätter und Hug1) mittels der Chlorophyllase erhalten. Die Lösung von 1 g Reinchlorophyll in 200 ccm 90 prozentigem Alkohol wurde 3 Tage mit 15 g Enzymmaterial geschüttelt. Dieses war aus 100 g trockenen Galeopsisblättem gewonnen, das Mehl mit Alkohol erschöpfend ausgezogen und daraus nach 24stündigem Stehen mit x/2 1 Alkohol durch Schlämmen das feinste Pulver isoliert. Unter diesen Bedingungen war gemäß der Phytolzahl 13,6 des magnesiumfreien Derivates 70% vom Chlorophyll alkoholysiert. Das gebildete krystallisierte Chlorophyll ist rein isoliert, das abgespaltene Phytol analytisch identifiziert worden. i) Ann. d. Chem. 380, 210 [1911]. Die präparat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide. 20 1 2. Methylchlorophyllid aus trockenen Blättern1). Bei der Ausführung der Methanolyse mit getrockneten Blattern waren unerwartete Hindernisse zu überwinden. Im wasserarmen Holzgeist ist das Enzym wenig wirksam, andererseits wird das Chlorophyll von wasserhaltigem Holzgeist nur schlecht extrahiert und in Lösung gehalten. Auch Aceton-Holzgeist ist als Lösungs- mittel ungenügend. Der Erfolg des Verfahrens hängt von der Anwendung eines Ge- misches von Aceton, Wasser und Holzgeist ab, das gut extrahiert und in welchem die Enzymreaktion gut verläuft. Aceton mit be- trächtlichem Wassergehalt extrahiert das Chlorophyll ausgezeich- net; bei Gegenwart von Wasser verläuft auch die Enzymreaktion leicht, indessen darf in diesem Gemische das Wasser gegenüber dem Holzgeist nicht derart überwiegen, daß die Hydrolyse be- trächtlich wird neben der Methanolyse. Bei der Einwirkung eines Gemisches von 60 Volumprozent Aceton, io Methylalkohol und 30 Wasser auf Heracleummehl war in 2 Tagen Phytol quantitativ abgespalten, aber fast nur durch Hydrolyse, also ohne Bildung der Methylverbindung. Das geeignetste Verhältnis der Lösungsmittel ist eine Mischung von: 80 Volumprozent Aceton, 16 Holzgeist und 4 Wasser. Mit dem üblichen Feuchtigkeitsgehalt der Blätter von 7% ergibt sich folgende volumprozentige Zusammensetzung der Flüssigkeit : 78 Aceton, 15 Holzgeist, 7 Wasser. Darin verhält sich der Holzgeist zum Wasser = 2:1 ungefähr wie bei der Methanolyse mit frischen Blättern. Das Aceton dient nun als Lösungsmittel und die Alkoholyse ist nur abhängig vom Verhältnis des Methylalkohols zum Wasser. 2 kg Blattmehl von Heracleum werden mit dem Gemisch von 3,2 1 Aceton und 0,8 1 80 prozen tigern Methylalkohol in einer l) Unveröffentlicht. 202 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Pulverflasche nach und nach angerührt und unter zeitweisem Um- schütteln ungefähr 40 Stunden stehen gelassen, je nach der enzy- matischen Wirksamkeit des Materials etwas kürzer oder länger, indem man die Beendigung der Methanolyse im Reagierglas kon- trolliert. Zu diesem Zweck filtriert man eine Probe ab, führt den Farbstoff in Äther über und prüft mit 22 prozentiger Salzsäure. Wenn diese Basizitätsprobe das Ende anzeigt, dann filtrieren wir den tiefgrünen Brei auf der Steinzeugnutsche über Koliertuch ab. Nun enthält das Mehl neben fast allem Gelben einen großen Teil (rund 1/3) des krystallisierten Chlorophylls; es ist nicht leicht zu extrahieren, zumal die Pflanzensubstanz viel Wasser absorbiert hat. Wir ziehen daher auf der Nutsche weiter mit 4 — 5 1 Aceton aus unter abwechselndem Macerieren und Saugen mit Maschinen- vakuum, und zwar langsam, etwa im Laufe einer Stunde. Schon die ersten 4 1 des Lösungsmittels genügen für den grünen Farb- stoff; um die gelben Pigmente vollständig auszuziehen, braucht man noch etwas mehr Aceton. Das gesamte Filtrat, 6 — 7 1, wird in einem weiten Gefäß mit 300 g grobgemahlenem Talk versetzt und mit einem breiten Glas- streifenrührer in Bewegung gehalten, während wir aus einem Scheide- trichter langsam (in i1/2 Stunden) 7 1 Wasser einfließen lassen. Dabei krystallisiert das Methylchlorophyllid am Rührer, an der Gefäßwand und auf dem Talk aus in glänzenden, mit bloßem Auge erkennbaren Krystalldrusen und einzelnen wohlausgebildeten Blätt- chen, vermischt mit den gelben und orangeroten Krystallen der Carotinoide. Bei zweistündigem Stehen hellt sich die Flüssigkeit zu schwa- chem Gelbgrün auf. Nun filtriert man durch eine dünne 1 alk- schicht und wäscht nach mit 1/2 1 50 prozentigem Aceton, sodann mit ebensoviel 50 prozentigem Alkohol. Der olivbraune Talk wird scharf abgesaugt, mit 2 1 Petroläther (0,64 — 0,66) kurz und kräftig geschüttelt, wieder auf die Nutsche gebracht und mit je 1 1 Petrol- äther und Äther nachgewaschen. Es geht nicht an, diese wichtige Reinigung durch Ausziehen mit Petroläther einfach auf der Nutsche vorzunehmen. Denn dabei mischt sich anfangs die große Menge der farblosen Begleitstoffe mit dem Petroläther zu einer Lösung, Die präparat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide. 203 die beim Passieren der ziemlich hohen Talkschicht viel Chloro- phyllid wegnimmt. Wird aber das Farblose beim Anschütteln in der Flasche mit viel Petroläther verdünnt, so geht nur sehr wenig vom grünen Farbstoff in Lösung. Aus dem so gereinigten Talk extrahieren wir mit 0,8 1 abso- lutem Alkohol, der zum Schutz vor Allomerisation 0,02 g Oxal- säure enthält, das Methylchlorophylhd und isolieren es gleich wie die Äthylverbindung (siehe Abschn. 1). Auch die Ausbeute ist dieselbe wie dort, nämlich fast 5 g aus 1 kg trockener oder 1 g aus dem Kilogramm frischer Blätter. Die Mutterlauge der Krystahisation enthält neben wenig Methylverbindung nur sehr wenig saueres Chlorophyllid (Prüfung mit n/100-KOH), das isolierte Präparat ist davon frei. Die petrolätherisch-ätherische Waschflüssigkeit hat aus dem Talk die Gesamtmenge der in den Blättern enthaltenen gelben Pigmente extrahiert und ist das beste Material für ihre Isolierung. 3. Methylchlorophyllid aus frischen Blättern1). UnserVerfahren geht aus von der „Methode für die Verarbeitung frischer Blätter“, die Willstätter und Isler beschrieben haben2). Während es früher nicht mit Sicherheit gelungen war, beim Zer- kleinern frischer Blätter Veränderungen des Chlorophylls zu ver- meiden, führte eine Vorbehandlung zu gleichmäßigen Resultaten bei den verschiedenen Pflanzen und erleichterte sehr die Verarbei- tung. Sie ermöglichte die Gewinnung von Chlorophyllösungen mit ganz unversehrtem Phytochromin. Die Methode von Willstätter und Isler besteht in der Be- handlung mit wasserhaltigem Holzgeist von einer Konzentration, mit welcher sich noch kein Chlorophyllextrakt bildet. Man ver- wendet dafür den Alkohol in solcher Menge und Stärke, daß er durch den Wassergehalt der Blätter (4/6 ihres Gewichts) hinreichend verdünnt wird, um nicht beträchtlich extrahierend zu wirken. Das Protoplasma wird abgetötet, die Eiweißstoffe werden koagu- liert und manche Ferment Wirkungen gehemmt. Die Blätter werden x) Ann. d. Chem. 387, 33g [1912]. *) Ann. d. Chem. 380, 171 [1911]. 204 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. dadurch gehärtet und lassen sich mit der Syenitwalzenmühle ausgezeichnet mahlen, ohne daß Erhitzung eintritt. Das Material wird derart entwässert, daß es ohne weiteres das Chlorophyll an Alkohol abgibt und in einer Operation genügend extrahiert wird. Verschiedenartige Pflanzen zeigen bei dieser Behandlung einen interessanten Unterschied. Die einen, z. B. Brennessel, Platane, Holunder, verlieren nur langsam einen kleinen Teil des Chlorophylls. Die Blätter werden intensiver grün und liefern nach dem Ab- schleudem sehr gute Ausbeute an Chlorophyllösung. Bei einer anderen Gruppe von Pflanzen, deren typische Ver- treter Galeopsis und Heracleum sind, also gerade bei den chloro- phyllasereichen, werden die Blätter schnell gebleicht. Es erfolgt die enzymatische Alkoholyse; dabei geht das phytolhaltige Chloro- phyll zunächst in Lösung und das phytolfreie krystallisiert rasch aus, zumeist im Blatt (siehe Kap. VII, Anschn. 2). Auf solche Weise erhielten wir bei dem Transport von grünen Algen (Ulva lactuca) aus Neapel in einem Fasse mit wasserhaltigem Holzgeist zwar die Alge entfärbt, aber das Chlorophyll abgeschie- den als Sediment mikroskopischer Krystalle des Methylesters. Unser Ausgangsmaterial für Methylchlorophyllid und freies Chlorophyllid sind die ohne Stiel gepflückten Blätter der durch ihren Chlorophyllasegehalt ausgezeichneten Pflanzen. 20 kg Heracleum legen wir unter abwechselndem Einfüllen von Blättern und Flüssigkeit in 2 Steinzeugtöpfen mit aufgeschliffenem Deckel in 32 1 Holzgeist, der etwa 66 prozentig wird durch den Wassergehalt der Blätter, da diese nur ein wenig mehr als 20% Trockensubstanz enthalten. Die Blätter müssen gründlich benetzt und während der Dauer der Behandlung mit dem Holzgeist durch- gearbeitet werden. Man läßt das Lösungsmittel so lange einwir- ken, bis die Blätter ganz entfärbt sind; die Zeitdauer ist je nach dem Chlorophyllasegehalt der Ernten verschieden, gewöhnlich be- trägt sie 2 — 3 Stunden. Dann nimmt man die Blätter heraus, sie werden abgepreßt und in einer großen Zentrifuge von anhaften- dem Holzgeist befreit. Dann breiten wir sie in dünner Schicht in Trockenräumen aus und mahlen sie nach dem Trocknen; die Aus- beute an dem hellolivfarbigen Mehl beträgt 3,5 3 >6 kg. Die präparat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide. 205 Die methylalkoholischen Flüssigkeiten werden vereinigt und mit etwas Talk (200 g) angerührt , der den schleimhaltigen feinen Nieder- schlag sammelt und gut filtrierbar macht. Den abfiltnerten Talk trocknet man im Vakuumexsiccator. Verarbeitung des Blattmehles. Für die Extraktion ist es notwendig, das Mehl der mit Holzgeist behandelten Blätter in kleineren Chargen (3 Portionen von etwa 1,2 kg) zu verarbeiten, damit das Chlorophyll möglichst kurz in alkoholischer Lösung bleibt; die Allomerisation des Chlorophylls würde sich nämlich hier durch geringes Ansäuern des Alkohols nicht verhüten lassen, da das übrigens amphoter wirkende1) Pflanzenmehl Säure schluckt. Das Mehl wird trocken auf die Kutsche gebracht, festgestampft und mit der Pumpe angesaugt, dann lassen wir so lange Äther (etwa 3 1) durchlaufen, als er gelbe Pigmente herauslöst; zugleich mit diesen werden viele farblose Stoffe beseitigt, so daß man nachher einen reinen Extrakt gewinnt. Der Äther läuft zuerst stark gelb, dann gelbgrün und schließlich rein hellgrün ab, er enthält fast kein phytolhaltiges Chlorophyll, aber eine nicht unbeträchtliche Menge Methylchlorophyllid, die man ihm durch starkes Einengen und Versetzen mit Talk entzieht. Es ist zweckmäßig, diesen Talk separat zu verarbeiten, weil gerade darin ein an der Komponente b reicheres Chlorophyllidgemisch enthalten ist. Es wird mit Äther gewaschen, mit absolutem Alkohol extrahiert und das Chlorophyllid in Äther übergeführt; so lieferte der Vorextrakt aus den 3,6 kg Mehl eine Krystallisation von 1,25 g. Sofort nach dem Vorextrahieren mit Äther gießen wir auf das Mehl absoluten Alkohol auf, und zwar etwa 1/2 1 auf einmal; wir lassen ihn langsam in das Mehl eindringen und nach einer kleinen Pause saugen wir ihn scharf ab. Dann wird das Filtrat sogleich aus der Saugflasche herausgenommen, sofort durch Versetzen mit Äther und Wasser in Äther übergeführt, während zugleich die Extraktion an der Pumpe mit weiteren halben Litern Alkohol ihren Fortgang nimmt. Im ganzen dienen 4 1 Alkohol zur Extraktion der 1,2 kg *) Ann. d. Chem. 378, 50 [1910]. 2o6 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Blattpulver, und der Extrakt wird in 5 1 ätherische Lösung über- geführt. Den Äther haben wir sechs- bis siebenmal mit sehr viel Wasser gründlich gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und auf 2 1 eingeengt. Wir filtrierten nochmals und konzentrierten die Lösung, in der bereits die Krystallisation begann, bis auf 100 ccm. Das Methylchlorophyllid schied sich in schön reinem Zustand als lockeres Krystallmehl rhombischer Blättchen aus. Die Substanz enthielt weder gelbe noch farblose Beimischungen und sie gab bei der Spaltung ausschließlich Phytochlorin e und Phytorhodin g, nichts schwächer Basisches. Die ätherische Mutterlauge ist hell- grün, sie enthält eine geringe Menge phytolhaltigen Chlorophylls und eine Spur freien Chlorophyllids. Die Ausbeute an Methylchlorophyllid aus dem gesamten Mehl betrug 12 V4 g. Die Komponenten a und b sind (bestimmt mittels der Spaltungsprodukte Chlorin und Rhodin) in dem Gemische ungefähr im Verhältnis 2 : 1 enthalten. Aber bei fraktionierter Krystallisation ändert sich das Verhältnis wesentlich. Die ersten Ausscheidungen sind reich an b (z. B. enthalten sie 5°% davon und noch mehr), die späteren sehr reich an a (z. B. 80%). Verarbeitung der Talkportion. Der Talk wird auf einer kleinen Nutsche mit Äther vorextrahiert, der Gelbes und andere Bei- mischungen herauslöst. Dann wird er gleichfalls auf der Nutsche mit absolutem Alkohol ausgezogen und das Chlorophyllid aus dem Filtrat sofort in Äther übergeführt. Die gewaschene und getrock- nete Lösung engt man zur Krystallisation ein: Ausbeute 1,1 1,2 g. Im ganzen hat also bei diesem Versuch 1 kg der frischen Blätter 3/4 g reines Methylchlorophyllid geliefert. Diese Ausbeute blieb ziemlich gleichmäßig bei der Verarbeitung von 5°° kg Heracleum- blättern. 4. Freies Chlorophyllid aus frischen Blättern1). Während die Darstellung von Methylchlorophyllid einfacher und sparsamer aus trockenen Blättern geschieht, ist man für die Ge- winnung des freien Chlorophyllids auf die Verarbeitung der frischen Blätter angewiesen. Die Carbonsäure ließ sich nämlich infolge 1) Ann. d. Chem. 387, 359 [1912]. 4 Die präparat. Verwendungen der Chlorophyllase : Die Chlorophyllide, 20 7 ihrer Zersetzlichkeit aus den konzentrierten, weniger reinen Lö- sungen nicht isolieren, wie sie bei der enzymatischen Hydrolyse mit Blattmehl erhalten werden. In konzentrierter Lösung ver- wandelt sich Chlorophyllid zu leicht in Phäophorbidmagnesium. Schon in feuchten ätherischen Extrakten trockener Blätter wird das Chlorophyll unter der Einwirkung der Chlorophyllase hydro- lytisch gespalten und zwar betrifft die Reaktion gleich der Alko- holyse nur ein einziges Carboxyl. Viel rascher und glatter verläuft die Hydrolyse mit frischen Blättern unter ähnlichen Bedingungen wie die Methanolyse. Die Blätter der an Chlorophyllase reichen Pflanzen werden statt mit wasserhaltigem Holzgeist mit einem wasserhaltigen indifferenten Lösungsmittel, nämlich Aceton, behandelt. Das Chlorophyll wird quantitativ hydrolisiert und zugleich aus den Blättern extrahiert, so daß es beim Verdünnen des Acetons mit Wasser schon in ziem- lich reinem Zustand krystallinisch ausfällt, natürlich als Gemisch der beiden Komponenten a und b. 24 kg frische Heracleumblätter werden in 3 Steinzeugtöpfen in 29 1 reines Aceton eingelegt, das durch die Feuchtigkeit der Blätter etwa auf einen Wassergehalt von 33% gebracht wird. Sogleich werden die Blätter durch den Austritt von Chlorophyll aus den Chloropiasten tiefgrün; schon nach einer halben Stunde färbt sich das Lösungsmittel schön an, und zwar besteht bereits der erste An- teil des austretenden Farbstoffs aus freiem Chlorophyllid. Ver- setzt man eine Probe dieses Extraktes mit Äther und viel Wasser, so entsteht eine ätherische Lösung, die alles Grüne an n/100-KOH abgibt. Nach 1 Stunde haben die Blätter gelbe Flecken, nach 3 — 4 Stunden sind sie hellgrau und fertig extrahiert. Sie werden durch das Aceton nicht gehärtet wie in Alkohol, sondern aufge- weicht. Chlorophyllid läßt sich aus ihnen nicht isolieren, es be- findet sich nur in der tiefgrünen Acetonlösung. Diese wird in der Zentrifuge von den Blättern getrennt, mit viel Talk (500 — 600 g) versetzt, der zum Sammeln der feinen und leichten Chlorophyllid- kryställchen erforderlich ist, und portionenweise mit Wasser ver- dünnt, im ganzen mit dem doppelten Volumen. Währenddessen krystallisicrt das Chlorophyllid in mikroskopischen Krystallen aus, 208 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. in regelmäßigen, sechseckigen Täfelchen. Vom Talk wird die Flüssigkeit so weit wie möglich dekantiert, dann wird er auf der Nutsche abgesaugt und in Vakuumexsiccatoren getrocknet; dies darf nicht zu langsam erfolgen, da das Präparat sonst verdirbt. Der trockne Talk wird in etwa 4 Portionen verarbeitet. Man füllt ihn auf die Nutsche und wäscht ihn langsam mit viel Äther, der hauptsächlich gelbe und farblose Beimischungen entfernt. Wenn er schön hellgrün abläuft, so verdrängen wir ihn mit etwa 300 ccm Aceton, welches das Chlorophyllid äußerst leicht aufnimmt. Aus der Acetonlösung führen wir die Substanz durch Vermischen mit Wasser (bei den freien Chlorophylliden ist stets destilliertes Wasser anzuwenden , da sonst grüne Flocken das Calciumsalzes ausfallen) und Äther in den letzteren (2 1 für jede Portion) über. Der Äther wird durch 8 — 10 maliges Waschen ganz vom Aceton befreit und mit Natriumsulfat annähernd getrocknet. Die Lösungen müssen verdünnt gehalten werden, damit nicht während der Dauer der notwendigen Vornahmen die erwähnte Selbstzersetzung des Chloro- phyllids erfolgt. In geringerer Konzentration ist die komplexe Ver- bindung beständiger, etwas braunen Niederschlag setzt sie indessen zumeist ab. Die ätherische Chlorophyllidlösung wird sehr rasch und sehr weit eingeengt, und zwar unterbrochen von wiederholtem Filtrieren, bis das Papier sich nicht mehr braun anfärbt. Endlich beim Eindampfen bis fast zur Trockne krystallisiert das Chloro- phyllid aus in stets sechseckigen Blättchen, die prächtig glänzen und in der Aufsicht blauschwarze, in der Durchsicht grüne Farbe zeigen. Die Krystallisation tritt in etwas wasserhaltiger ätherischer Lösung leichter ein als in scharf getrockneter. Die Ausbeute betrug 12 g, also 0,5 g für 1 kg frischer Blätter. Das Präparat gibt eine rein grüne ätherische Lösung, die von n/100-KOH ganz entfärbt wird. Es ist also frei von gelben Sub- stanzen sowie von Estern. Bei der Spaltungsprobe entstehen Phyto- chlorin e und Phytorhodin g im Verhältnis 3 : 1 und nichts Schwach- basisches. Es ist leichter, das Chlorophyllid aus nur mäßig eingeengter ätherischer Lösung (200 ccm für jede Portion) durch langsamen Zusatz von leichtflüchtigem Petroläther (300 ccm) auszufällen; es Die präparat. Verwendungen der ChlorophyUase : Die Chlorophylhde. 209 scheidet sich rasch als sehr feines krystallinisches Pulver von blau- bis grünschwarzer Farbe aus, das unter dem Mikroskop nur die Form von kugeligen Aggregaten zeigt. Diese Form des Präparates ist aber weniger haltbar als die krystallisierte, in 4 Monaten war i/3 davon in Phäophorbidmagnesium verwandelt. Hydrolysevon Methylchloro ph yllid. Auch reiner Methyl- ester läßt sich mit Hilfe von ChlorophyUase hydrolysieren, aber viel schwerer als Rohchlorophyll. Für diesen Versuch bereiteten wir das Enzym aus 50 g Mehl von Heracleumblättern durch wieder- holtes gründliches Extrahieren mit 80 prozentigem Aceton. Das entfärbte Mehl wurde mit 50 ccm Wasser verrührt und in die Lö- sung von 0,5 g Methylchlorophyllid b in 200 ccm reinem Aceton eingetragen. Die Lösung blieb nach Zusatz einer kleinen Menge Oxalsäure (0,02 g) und unter häufigem Umschütteln 4 Tage stehen, doch machte die Reaktion schon nach 2 Tagen keine Fortschritte mehr. Aus dem Reaktionsprodukt haben wir nach dem Überführen in Äther und Wegwaschen von Aceton das freie Chlorophyllid mit Hilfe von Ammoniak quantitativ isoliert, indem wir die äthe- rische Lösung mit einem Drittel ihres Volumens Petroläther ver- mischten und daraus durch Einleiten von gasförmigem Ammoniak das Salz auf Talk ausfällten. Durch Ausschütteln mit Äther und Wasser unter Zusatz von ein paar Tropfen Mononatriumphosphat- lösung isolierten wir das freie Chlorophyllid b in einer Ausbeute von nur 0,05 g. Es zeigte die rote Phase und gab reines Phyto- rhodin g. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. X. Isolierung der Komponenten a und b der Chlorophyllide. Die verschiedenen Darstellungen der krystallisierten Chloro- phyllide unterscheiden sich oft bei der Spaltungsprobe im Ver- hältnis von Chlorin zu Rhodin. Bei der Gewinnung von Methyl- chlorophyllid enthielt der Talkanteil vorherrschend Komponente a. Bei Verarbeitung gewisser Pflanzen z. B. Ulva laetuca, Aesculus hippocastanum, ist mehrmals überwiegend b-Methylchlorophyllid isoliert worden. Aber einheitlich trat dabei eine Komponente nicht auf. Deshalb verzichtet man am besten für die Trennung der Kom- ponenten auf die mehr zufällige Fraktionierung durch Krystalli- sation. Wir isolieren die reinen Verbindungen a und b aus den Chlorophyllidgemischen nach dem Prinzip der Entmischung von Stokes und von Kraus, aber wegen der besonderen Löslichkeits- verhältnisse der Chlorophyllide mit einem neuen System von Lösungsmitteln. Da die Verbindungen in Petroläther und Schwefel- kohlenstoff unlöslich sind, nützt die Trennung einen Unterschied der Löslichkeiten in Äther aus; b ist darin schwerer löslich als a. Wir verteilen die Substanzen zwischen Äther und wasserhaltigem Holzgeist, wenden aber statt des noch mit stark wasserhaltigem Methylalkohol mischbaren Äthers ein Gemisch gleicher Volumina von Äther und Petroläther an. Die Komponenten b gehen hieraus leichter in den wasserhaltigen Holzgeist über. Methylchlorophyllid b wird daher mit 50- bis 60-, freies Chlorophyllid b mit 40- bis 50- prozentigem Holzgeist aus der Äther-Petrolätherlösung des Kom- ponentengemisches extrahiert. Isolierung der Komponenten a und b der Chlorophyllide. 211 1. Trennung der Methylchlorophyllide1). Für die Fraktionierung ist 60 prozentiger Holzgeist am geeignet- sten; damit geht aus der Äther-Petrolätherlösung besonders in die ersten Ausschüttelungen fast nur das Methylchlorophyllid b über. Noch verdünnterer Methylalkohol würde dem Äther zu wenig Sub stanz entziehen, konzentrierterer differenziert nicht so gut, er nimmt zuviel von der Komponente a zusammen mit b auf. Die Reinheit der Präparate wird dadurch gefährdet, daß das Chlorophyll bei der Einwirkung von Alkoholen leicht Allomeri- sation erleidet. Um sie zu verhüten, arbeiten wir in allen methyl- und äthylalkoholischen oder wässerig-alkoholischen Lösungen mit einem kleinen Zusatz von Oxalsäure, nämlich 1/iooo%- Eine Zer- setzung der Magnesiumverbindungen wird bei dieser Verdünnung der Säure nicht beobachtet. Die Arbeitsweise bei der Trennung ist etwas verschieden, je nachdem das Gemisch ärmer oder reicher an b ist; wir führen des- halb 2 Beispiele an. a) Trennung eines Gemisches von etwa 3/* a- und 1ji b- Komponente. Man kann mit einem Scheidetrichter von 7 1 Inhalt 2 g des Ausgangsmaterials auf einmal in Arbeit nehmen und höchstens zwei solche Chargen an einem Tag bewältigen. Die anzuwendenden Lösungsmittel müssen rein sein; allen Kahlbaum- schen Äther haben wir, um ihn von seinem Fettgehalt zu befreien, nochmals destilliert. Trotz der größeren Kosten ist es vorteil- haft, eine Petrolätherfraktion vom Siedepunkt 30 — 50 0 zu be- nutzen. 2 g Methylchlorophyllid nehmen wir, da es zu langwierig wäre, es in Äther oder in Holzgeist aufzulösen, in 0,3 1 absolutem Äthyl- alkohol auf und vermischen die Lösung sofort im großen Scheide- trichter mit 2,8 1 Äther. Dann wird der Äthylalkohol durch drei- maliges Ausschütteln mit je 1 1 Wasser herausgewaschen, wobei das Volumen der ätherischen Schicht auf 2 1/2 1 zurückgeht. Um die Ausfällung des Chlorophyllides durch Petroläther zu verhüten, setzt man nun 0,3 1 Methylalkohol und dann erst unter Umschütteln *) Ann. d. Chem. 387, 345 [1912]. 14* 212 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 2 1 /2 1 niedrig siedenden Petroläther hinzu. Zum erstmaligen Aus- schütteln werden i 1 6o prozentiger Methylalkohol, und da die Flüssigkeit schon 300 ccm Holzgeist enthielt, noch 200 ccm Wasser angewandt. Die methylalkoholische Schicht nimmt vom Farbstoff reichlich 5% auf, und zwar zu ungefähr 70% b und 30% a. Sie ist gelbgrün gefärbt, eine Probe gibt beim Überführen in Äther und Verseifen mit methylalkoholischer Kalilauge die braune Phase mit stark roter Nuance. Nach diesem ersten Entmischen wird das Volumen der ätherisch-petrolätherischen Schicht markiert und bei den folgenden elf Ausschüttelungen durch Zusatz von Äther allein konstant erhalten. Die zweite bis zwölfte Entmischung wird mit je 1 1 60 prozentigem Holzgeist ausgeführt. Von da an wird ohne Ei- gänzung des Äthervolumens weiter mit 60 prozentigem Methyl- alkohol ausgeschüttelt, gewöhnlich noch etwa fünfmal. Ob die Ent- fernung von b vollständig geworden ist, ob also schließlich nur Methylchlorophyllid a in die methylalkoholische Schicht übergeht, prüfen wir (,, Phasenprobe41) etwa von der 15* Entmischung an wieder durch Überführen einer Probe aus der (nicht mehr gelb- stichigen, sondern rein grünen) alkoholischen Lösung in Äther und Versetzen mit methylakoholischem Kali. Wenn die Farbe von Grün nicht mehr in Braun, sondern in reines Gelb umschlägt, so ist nur noch a vorhanden. Dann wird durch häufiges Ausschütteln mit sehr viel Wasser (oder Durchströmenlassen von Wasser durch den Scheidetrichter am Brunnen) der Methylaklohol vollständig und der Äther zum größten Teil weggewaschen. Dabei fällt in- folge seiner Unlöslichkeit in Petroläther das Methylchlorophyllid a in stahlblauen, krystallinischen Flocken aus. Die wässerige Schicht wird abgelassen, dann wird die Flüssigkeit mit etwas geglühtem Natriumsulfat und ein wenig Talk (etwa 50 g), der die Flüssigkeit ganz entfärbt, versetzt und abfiltriert. Man wäscht mit Äther nach und extrahiert sofort (beim Aufbewahren in diesem Zustand leidet das Präparat) auf der Nutsche mit absolutem Alkohol, aus dem man das Chlorophyllid in Äther überführt (etwa 1V2 *)• Die durch gründliches Auswaschen von Alkohol befreite ätherische Lösung wird nach dem Trocknen auf etwa 80 ccm eingeengt. Schon während des Abdampfens krystallisiert das Methylchlorophyllid a Isolierung der Komponenten a und b der Chlorophyllide. 213 in prächtigen, blau glänzenden Drusen rhombenförmiger Blätt- chen aus. Die Ausbeute an a beträgt 0,6— 0,7 g ; die Substanz bedarf keiner weiteren Reinigung. Zu gleicher Zeit soll man die methylalkoholischen Lösungen auf die Komponente b verarbeiten, und zwar die ersten 8 Aus- züge. Sie werden paarweise miteinander vereinigt. Der 1. und 2. Auszug werden zusammen mit x/2 1 Methylalkohol versetzt, so daß die Flüssigkeit aus etwa 65 prozentigem Holzgeist besteht; ebenso verfahren wir bei Auszug 3 und 4, hingegen sind 5 und 6 und 7 und 8 in ihrer ursprünglichen Konzentration zu verwenden. Die 4 Paare von Auszügen werden einmal mit je 1 1 und ein zweites Mal mit je Va 1 Petroläther-Äthergemisch (3 Volumen Petrol- äther und 1 Volumen Äther) ausgeschüttelt, um soweit als möglich die Komponente a zu entfernen. Die obere Schicht gibt bei der „Phasenprobe“ eine ausgesprochen gelbe, die untere (nach Überführen der Substanz aus 5 ccm der holzgeistigen Lösung in Äther) eine rotbraune Phase mit methylalkoholischem Kali. Die vollständige Abtrennung von a in einem einzigen Ver- fahren hat sich bei dem an b armen Ausgangsmaterial nicht bewährt; dasselbe hat eine bessere Ausbeute an b geliefert, wenn wir zunächst auf ein go% b enthaltendes Präparat hinar- beiten und dieses durch ein Verfahren der fraktionierten Fällung reinigten. Zur Isolierung des rohen Methylchlorophyllids b werden die so gewaschenen methylalkoholischen Auszüge alle zusammen ausge- äthert; die ätherische Lösung befreien wir durch gründliches Waschen ganz vom Methylalkohol und engen sie auf V, 1 ein. Man läßt die Substanz aber nicht auskrystallisieren, durch Ausfällen kann man besser noch etwas a abtrennen. Die noch warme Äther- lösung wird zu diesem Zweck mit etwas Talk (etwa 30 g) und mit 300 ccm Petroläther versetzt ; in der Mutterlauge bleibt fast nur etwas a-Komponente. Der Talk wird auf der Nutsche abfiltriert und so lange mit Äther nach gewaschen, bis dieser nur noch schwach gelbgrün gefärbt abläuft und beim Versetzen mit methylalkoho- lischem Kali einen schönen Farbumschlag in Braunrot zeigt. 214 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Anfangs hat der Äther etwas Methylchlorophyllid a weggenommen. Aus dem Talk wird sogleich durch Extrahieren mit absolutem Alkohol, Überführen in Äther, Waschen und Einengen auf 50 ccm das Methylchlorophyllid isoliert, das man in einer Ausbeute von 0,25 — 0,3 g erhält. Es bildet eine schöne grünschwarze Krystalli- sation von metallischem Glanz; sie besteht aus etwa 90% der Komponente b und 10% a. Reinigung des Methylchlorophyllids b. Die bei der Isolierung schon einmal angewandte fraktionierte Fällung wieder- holen wir für die Reinigung noch dreimal. Vom 90 prozentigen Methylchlorophyllid lösen wir 1 g in 600 ccm absolutem Alkohol und machen daraus eine ätherische Lösung durch Vermischen mit 4 1 Äther und Herauswaschen des Alkohols, wofür sechsmaliges Ausschütteln mit je 1V2 1 Wasser erforderlich ist. Die ätherische Lösung wird auf 600 ccm eingeengt und warm, noch ehe die Krystallisation beginnt, mit etwa 50 g Talk versetzt und mit 400 ccm Petroläther gefällt. Auf der Nutsche wäscht man den abgesaugten Talk gründlich mit Äther aus ; dabei wird etwas b verloren, aber namentlich a entfernt. Dann extrahieren wir den Talk sofort auf der Nutsche mit absolutem Alkohol (etwa V2 1). um aufs neue den Farbstoff in Äther überzuführen und wieder unter Zusatz von Talk durch Petroläther abzuscheiden. Dieselbe fraktionierte Ausfällung führen wir noch ein drittes Mal aus. Die beiden ersten ätherisch-petrolätherischen Mutterlaugen waren nach dem Abfiltrieien vom Talk blaugrün und enthielten die Kompo- nente a ; die dritte Mutterlauge hingegen war schwach gefärbt, und zwar gelbgrün. Aus der zum viertenmal bereiteten ätherischen Lösung wird durch Einengen das vollkommen reine Methylchloro- phyllid b als wunderschöne dunkelgrüne Krystallisation erhalten , sie ist einheitlich und besteht aus metallglänzenden rhombenförmi- gen Blättchen; die Mutterlauge ist ganz hell. Die Ausbeute betrug 0,5— 0,6 g, also wenig mehr als die Hälfte des angewandten 90- prozentigen Präparates. Auch bei niedriger prozentigen Roh- produkten von Methylchlorophyllid b (70— 80 prozentig) hat die wiederholte (hier fünfmalige) fraktionierte Ausfällung ein ebenso gutes Resultat ergeben. Isolierung der Komponenten a und b der Chlorophyllide. 215 b) Trennung eines Gemisches von etwa 60% Methy-1- chlorophyllid a und 40% b. Wenn das Ausgangsmatenal an b reicher ist, so ist es leicht möglich, in einem Prozesse zu einem nahezu reinen Präparat von b zu kommen (95— 98 prozen tig). Man kann dann eine größere Anzahl der methylalkoholischen Aus- züge verwenden, und sie werden so viel reicher an b, daß sie sich schon durch Ausschütteln mit Äther-Petroläther und einmaliges Ausfällen genügend von a befreien lassen. 2 g Methylchlorophyllid werden auf dem Umweg über die alko- holische Lösung in Äther gebracht. Die erste Entmischung bewirken wir mit 0,6 1 Holzgeist, 2,5 1 Petroläther und 0,4 1 Wasser, alle folgenden Entmischungen mit je 1 1 60 prozentigem Holzgeist; das Volumen der ätherisch-petrolätherischen Schicht wird bis gegen das Ende der Fraktionierung konstant gehalten. Die 12 ersten Auszüge verarbeiten wir paarweise. Man bringt die 2 ersten Paare wieder auf höhere Konzentration (65%) durch Zufügen von x/2 1 Methylalkohol, die Auszüge 5 und 6 vermischen wir nur mit 0,3 1, 7 und 8 mit 100 ccm Methylalkohol, den folgenden lassen wir ihre ursprüngliche Konzentration. Die Auszüge werden dann nur ein einziges Mal mit je 1 1 Petroläther-Äther 3 : 1 gewaschen; das in den Holzgeist mitgegangene a geht, wie man an der Farbe und dem Farbumschlag mit methylalkoholischem Kali sieht, recht voll- ständig wieder heraus. Nach den ersten 12 methylalkoholischen Auszügen ist die weitere Verarbeitung auf b nicht mehr lohnend. Das Methylchlorophyllid b wird aus dem wässerigen Holzgeist in Äther übergeführt und, wie in a) beschrieben, einmal aus konzen- trierter ätherischer Lösung mit Petroläther fraktioniert ausgefällt, dann wieder gelöst und zur Krystallisation gebracht. Für die Reinigung der Komponente a ist es erforderlich, mit dem Auswaschen durch 60 prozen tigen Holzgeist noch weitere 6 bis 10 mal fortzufahren. Schließlich läßt sich in den Auszügen gar kein b mehr nachweisen. Das Methylchlorophyllid a wird, wie oben angegeben, mit Hilfe von Talk isoliert und dann aus ätherischer Lösung krystallisiert erhalten. Die Ausbeute und der Reinheitsgrad von a hängen von der Zahl der Ausschüttelungen ab. Bei der Verarbeitung von 100 g 2i6 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Methylchlorophyllidgemisch erhielten wir aus je 2 g meistens 0,65 g gut 95 prozentiges oder 0,5 g reines Methyl chlorophyllid a und daneben 0,45 — 0,55 g Methylchlorophyllid b. 2. Trennung der freien Chlorophyllide1). Die freien Carbonsäuren werden mit verdünnterem Methyl- alkohol getrennt als die Methylverbindungen. Da sie sich noch viel leichter allomerisieren als ihre Methyl- und Äthylester — es genügt für diese Umwandlung, sie nur in Alkohol aufzulösen — , so ist bei ihrer Isolierung der Zusatz von 0,001% Oxalsäure besonders wichtig. Außerdem erfolgt bei den sauren Chlorophylliden sehr leicht Selbstzersetzung unter Aus- tritt von Magnesium ; deshalb sind alle Operationen in größter Eile auszuführen. 2 g krystallisiertes Chlorophyllidgemisch werden in Aceton ge- löst und in 3 1 Äther eingegossen ; das Aceton entfernen wir größten- teils durch dreimaliges Ausschütteln mit Wasser. Dann vermischt man die Ätherlösung mit 1/2 1 Methylalkohol und 2 1 Petroläther (Siedepunkt 30 — 50 °) und entmischt sie durch Zusatz eines halben Liters Wasser. Nach kräftigem Durchschütteln lassen wir die gelb- grüne, verdünnt-holzgeistige Schicht, welche überwiegend die Kom- ponente b enthält, aus dem Scheidetrichter in einen zweiten ab- fließen, der mit Äther beschickt ist. Durch Verdünnen mit Wasser wird hier eine ätherische Lösung von rohem Chlorophyllid b ge- wonnen. Jetzt wird das Volumen der zurückgebliebenen Äther-Petrol- ätherschicht markiert und von nun an durch Auffüllen von Äther nach jeder Entmischung konstant erhalten. Noch 2 weitere Aus- züge mit je 1 1 50 prozen tigern Holzgeist enthalten so viel von der Komponente b, daß sie in derselben Weise in Äther übergeführt und mit dem ersten Auszug gemeinsam verarbeitet werden. Die gewaschene ätherische Lösung wird auf 3°° ccm eingeengt und mit 600 ccm Petroläther auf Talk gefällt. Nach Waschen mit Petrol- äther und wenig Äther extrahiert man erschöpfend mit Äther auf x) Ann. d. Chem. 387, 362 [1912]. Isolierung der Komponenten a und b der Chlorophyllide. 217 der Nutsche und fällt aus der eingedampften Lösung mit viel Petroläther 0,25—0,3 g Chlorophyllid mit einem Gehalt von a/3 — 3/4 b aus. Zu gleicher Zeit mit der Verarbeitung der ersten 3 methylalko- holischen Auszüge auf b ist die Reinigung der im Äther-Petroläther angereicherten Komponente a fortzusetzen. Wir schütteln weitere fünf Mal aus mit je 1 1 50 prozentigem Holzgeist unter Ergänzung der oberen Schicht mit Äther und endlich viermal ohne Nachfüllen von Äther. Die ätherisch-petrolätherische Lösung, die anfangs rein grün gewesen, hat jetzt blaugrüne Farbe und sogar fast blaue, wenn man aus einer Probe den Alkohol herauswäscht. Mit der Phasenprobe kann man bei den freien Chlor ophylliden das Ende der Fraktionierung nicht gut erkennen. Schließlich wird aus dei petrolätherischen Schicht noch durch Waschen mit destilliertem Wasser der Methylalkohol und so viel Äther herausgelöst, bis das Chlorophyllid an den Wänden des Scheidetrichters auszukrystalli- sieren beginnt. Die Absch«idung vervollständigt man im gleichen Gefäß durch Zusatz von noch 1 1 Petroläther sowie von etwas Natriumsulfat und etwa 100 g Talk. Auf der Nutsche waschen wir den Talk zuerst mit Petroläther, dann, um ihn zu verdrängen, mit etwas Äther und extrahieren sogleich mit mehr Äther. Die er- haltene Lösung wird auf einige 100 ccm eingeengt und filtriert, dann bis auf 100 ccm abgedampft und durch langsames Einträgen von 400 ccm Petroläther gefällt. Die Abscheidung (0,55 — g) bildet ein matt-blauschwarzes Pulver, das unter dem Mikroskop krystallische Struktur zeigt und öfters aus gerundeten Blättchen besteht. Sie enthielt bei 5 Versuchen die reine Komponente a ohne eine Beimengung von b, bei einem Versuche, wo die Zahl der Ausschüttelungen mit Holzgeist vermindert worden, mit einem Ge- halt einiger Prozente von b. Die Reinigung der Komponente b besteht in einer Wiederholung des Entmischungsverfahrens. 0,45 g eines b-reichen, z. 75 prozentigen Präparates werden mit 100 ccm Methylalkohol in 1 1 Äther aufgelöst und mit 600 ccm Petroläther vermischt. Zur Entmischung schüttelten wir mit 100 ccm Wasser und weiteren 500 ccm 40 prozentigem Holzgeist durch. Die verdünnt alkoholische 2i8 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Schicht war stark gelbgrün gefärbt, sie wurde abgelassen, und zwar direkt in Äther hinein, in den wir die Substanz durch Zu- satz von Wasser vollständig überführten. Dann schüttelten wir den Äther-Petroläther noch ein zweites bis viertes Mal mit je 1/2 1 40 prozentigem Holzgeist durch und ergänzten das Volumen der oberen Schicht immer wieder mit Äther. Diese 3 holzgeistigen Auszüge sind ebenfalls ausgeäthert und alle Ätherlösungen des Chlorophyllids b zusammen verwendet worden. Man wäscht mög- lichst rasch den Methylalkohol heraus, dampft auf 300 ccm ein und fällt die Substanz nochmals mit 600 ccm Petroläther auf Talk. Aus diesem läßt sie sich auf der Nutsche mit 1 1 Äther extrahieren. Durch Einengen auf 50 ccm und langsames Vermischen mit Petrol- äther wurde endlich die reine Carbonsäure in einer Ausbeute von 0,15 g als dunkelgrüne mikrokrystallinische Fällung ausgeschieden. In diesem Präparat ließ sich durch die Spaltungsprobe kein Phyto- chlorin e mehr nachweisen. XI. Beschreibung der Chlorophyllide. i. Krystallisiertes Chlorophyll1). Krystallisiertes Chlorophyll ist das Gemisch der Äthylchloro- phylhde a und b. Sie bilden in wechselndem Verhältnis Misch- krystalle, werden aber zumeist in dem üblichen Komponenten- verhältnis a : b = 2,5 : i erhalten. Je nach dem Gehalt der beiden Komponenten variieren einige Eigenschaften, namentlich die op- tischen. Die Substanz zeigt sämtliche Merkmale und Reaktionen des natürlichen Pigmentes, abgesehen von den Eigentümlichkeiten, welche auf dessen Phytolgehalt beruhen. Der Ersatz der Phytol- gruppe durch den Äthylrest bewirkt das große Krystallisations- vermögen und die erwünschte Verminderung der Löslichkeit in verschiedenen Solvenzien. Das Molekül ist durch die Änderung der Estergruppe um 28% verkleinert, nämlich von 906,6, dem wahrscheinlichen Durch- schnittswert für das normale Gemisch, auf 654»^; für die Unter- suchung des Phytochromins ist das Äthylchlorophyllid daher als unverändertes, gewissermaßen i39prozentiges Chlorophyll zu be- trachten. Es ist nämlich 1 g Chlorophyll farbäquivalent 0,72 g krystallisiertem Chlorophyll. Das krystallisierte Chlorophyll bildet meistens scharf begrenzte, gleichseitig sechseckige und dreieckige Täfelchen (Tafel II, Fig. 1 und 2). Aus den Dreiecken gehen mitunter durch Abstumpfung der Winkel ungleichseitige Sechsecke hervor. Außer diesen typischen Ann. d. Chem. 358, 277 [1907] und Ann. d. Chem. 382, 151 [1911]. 220 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Formen treten auch keilförmige und stumpflanzettförmige Pris- men auf. Manchmal beobachtet man sehr stumpfe Flächen eines vicinalen Rhomboeders, dessen Kanten senkrecht zu 3 Seitenkanten der Sechsecke stehen. Wahrscheinlich liegt das hexagonale System in einer trigonalen Hemiedrie vor. Der Durchmesser der Krystalle beträgt gewöhnlich 0,1 — 0,2 mm. Das Krystallmehl ist blauschwarz und zeichnet sich durch leb- haften metallischen Glanz aus, namentlich im Sonnenlicht zeigt es wunderbare Reflexe. Die Pulverfarbe ist dunkelgrün. In der Durchsicht erscheinen die Täfelchen bald mehr blaugrün, bald gelbgrün. Beim Erhitzen zersetzt sich die Substanz, ohne einen Schmelz- punkt zu zeigen, unter Aufblähen und Entwicklung von Dämpfen, die den salzsäuregetränkten Fichtenspahn etwas röten; sie bildet schwer verbrennliche Kohle und hinterläßt schließlich rein weiße Magnesia. Das übliche Äthylchlorophyllidgemisch ist leicht löslich in ab- solutem Alkohol, Holzgeist und Aceton, unlöslich in Petroläther, ziemlich schwer löslich in Äther, b-reiches Gemisch sogar recht schwer in diesem (1 g in 2,5 1). Die ätherische Lösung ist blaugrün, die alkoholische viel gelbstichiger grün. Chloroform löst nament- lich in der Wärme reichlich, Benzol beim Sieden ziemlich leicht, kalt schwer, Methylal beim Kochen leicht, aber nur wenig schwerer in der Kälte. Für die Bestätigung des Molekulargewichts1) nach der kryoskopischen Methode war Veratrol ein geeignetes Lösungs- mittel. Aus Methylal, ferner aus Äther, namentlich durch Über- führen in diesen mit etwas Oxalsäure enthaltendem Alkohol läßt sich das Chlorophylhd schön umkrystallisieren , besonders schön aus 90 prozentigem Alkohol, worin eine Spur Oxalsäure gelöst ist. Ohne diesen Zusatz erleidet Äthylchlorophyll in Alkohol oder Holzgeist in höchstens einigen Stunden vollständig die Allomeri- sation und wird dadurch unkrystallisierbar und leicht löslich in Äther; dann fehlt ihm die braune Phase. *) Ann. d. Chem. 382, 155 [1911]. 221 Beschreibung der ChlorophyUide. Beim Erhitzen mit konzentrierter Salpetersäure liefert das Chlorophyllid eine hellgelbe Lösung ohne Ausscheidung von öl; dies ist unterscheidend gegenüber der Phytylverbindung. Äthylchlorophyllid ist indifferent, es hat weder saure noch basische Eigenschaften. 20 prozentige Salzsäure löst die feste Sub- stanz nicht, doch geht der Farbstoff aus seiner ätherischen Lösung unter Verlust des Magnesiums in 20 prozentige Salzsäure zum großen Teil, in 22 prozentige quantitativ über. Durch diese Basi- zitätsprobe unterscheidet sich das einfache Chlorophyllid besonders scharf vom Chlorophyll. Bei der Spaltung mit Säure entsteht das Gemisch von a- und b-Äthylphäophorbid, das sich aus Äther in zwei nach Löslichkeit, Farbe und Krystallform recht verschiedenen Fraktionen ausscheidet ; zunächst kommt eine an der Komponente b reiche Krystallisation in schwarz glänzenden rhombenförmigen Täfelchen, dann eine über- wiegend aus der Komponente a bestehende in rötlich-violettgrauen langen Nadeln zur Abscheidung. 2. Zur Methode der Analyse hochmolekularer Verbindungen. Das im Vakuum der Wasserstrahlpumpe im Phosphorpentoxyd- exsiccator getrocknete (Gewichtsverlust i1/4%) Äthylchlorophyllid entsprach der Formel: C38H4407N4Mg, aber das Analysenergebnis war irreführend. Die Substanz erfuhr nämlich unter 0,001 — 0,01 mm Druck bei 105 0 einen weiteren Ge- wichtsverlust von 5% und stimmte danach für die Formel: Ö37H3gOj| N4Mg. ^ Für die Klarlegung der zwischen den Gliedern einer so kom- plizierten Gruppe bestehenden Beziehungen ist eine solche Diffe- renz von einem Atom Kohlenstoff von großer Bedeutung. Die zweite Formel soll ausdrücken, daß das Chlorophyllid sich zusammen- setzt aus: 1. Chlorophyllid a C37H3906i N4Mg, 2. Chlorophyllid b C37H3708i N4Mg. 222 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Da die Menge von a und b sich ungefähr verhält wie 2,5 : i, so beeinflußt die Beimischung von b sehr wenig die Zusammen- setzung des Präparates. Jede der beiden Komponenten betrachten wir als bestehend aus ungefähr gleichen Teilen von Lactam und Lactamhydrat, wahrscheinlich verbunden zu Halbhydrat. Trotz der Größe des Moleküls ist aus der Elementaranalyse mit Wahrscheinlichkeit auf eine Kohlenstoffdifferenz in den beiden Trockenzuständen zu schließen. Auch zeigte sich der Kohlenstoff der heiß getrockneten Substanz nicht in dem Maße erhöht, wie es nach Abgabe von Wasser der Fall sein müßte. Daher ist nicht allein Fig. 9. Wasser, sondern zugleich eine Kohlenstoffverbindung abgegeben worden. Die Prüfung ergab, daß es sich weder um Formaldehyd, woran man hätte denken können, noch Kohlensäure, auch nicht Methyl- oder Äthylalkohol handelt, sondern daß außer Wasser (nur mit einer Spur von Alkohol) Äther entweicht. Das Trocknungskölbchen A (Fig. 9) ist durch eine Entladungs- rohre B mit der Kondensationsvorlage D und einem Gefäß für Tierkohle F und der Hochvakuumpumpe verbunden. Die Verbindungen sind kurz und weit; der Schliff des Trocknungs- kölbchens und die Hähne, welche 5 rnm Bohrung haben, sind durch Einbetten in Paraffin gedichtet. Wenn das Vakuum hergestellt ist, schließen wir die Verbindung mit der Pumpe ab und ver- bessern das Vakuum durch Kühlen der Tierkohle mit flüssiger Luft, so daß die elektrischen Entladungen zum Verschwinden kommen. Dann wird der Hahn E geschlossen und die Konden- Beschreibung der Chlorophyllide 223 sations Vorlage in flüssige Luft gestellt. Für die Trocknung steht das Kölbchen in einem im Luftraum mit Eisenfeile gefüllten V. Meyerschen Toluolbad; sie erfordert 6 — 8 Stunden. Dann wird der Hahn C geschlossen, die Verbindungen zwischen A und C und zwischen E und F aufgeschnitten und die Kondensationsvorlage z. B. in die Verbrennungsröhre eingesetzt. Die Kondensate zeigten das Atomverhältnis 1. 1 C : 7,45 H : 2,65 O, 2. 1 C : 6,51 H : 2,37 O. Wir finden also etwas mehr Wasser und etwas weniger Äther (2% vom Gewicht des Chlorophyllids an Äthyläther), als der Ab- gabe von: 1V4 Mol. H20 und V* Mol. Äther entspricht. Das Kondensat ist nicht Alkohol. Es gibt nämlich mit Benzoyl- chloriden keine Ester; aber beim Erhitzen mit Jodwasserstoffsäure bildet es Jodäthyl. Auch bei vielen anderen Chlorophyllderivaten ist die Vakuum- trocknung von Wichtigkeit für die Analyse, besonders wegen der festen Bindung des Äthers. Die Ätherate namentlich der magne- siumhaltigen Verbindungen, der Phylline, verhalten sich bei der Trocknung den Grignardschen Magnesiumverbindungen1) ähn- lich, nicht so sehr die Rohprodukte, als die aus Äther umkrystalli- sierten Präparate. Glaukophyllin und Rhodophyllin krystallisieren mit einem Gehalt von 14, Pyrrophyllin mit 11% Äther. Er ist darin so fest gebunden, daß man 3 — 5 Monate im Vakuum der Wasserstrahlpumpe auf 140 — 150 0 erhitzen muß, um ihn zu ver- jagen; dabei können die empfindlichen Substanzen Zersetzung er- leiden. In den meisten Fällen wird die Trocknung oder Abgabe von Äther durch Anwendung niedriger Drucke sehr erleichtert und es genügt dabei Erhitzen im Toluolbad; Ausnahmen bilden einige der erwähnten Phylline, bei denen auch das Hochvakuum keine besondere Beschleunigung bewirkte. x) Vgl. z. B. E. E. Blaise, Compt. rend. 132, 839 [1901]. 224 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Für die Vorbereitung zur Analyse hat uns jahrelang die von Rhede nsche Quecksilberpumpe gedient mit einem Vakuum von o,ooi — 0,03 mm. Wir bedienen uns jetzt statt dessen eines in bezug auf Saugwirkung und erreichbares Vakuum überlegenen Pumpenaggregates von Leybold Nachfolger, das sich aus der Gä de sehen Quecksilberpumpe und einer rotierenden Kapsel- pumpe zusammensetzt. Es empfiehlt sich, zwischen Substanz und Quecksilberpumpe eine Röhre mit Goldblatt einzuschalten, wenigstens wenn flüchtige Be- standteile kondensiert werden sollen. Die meisten wasser- und ätherhaltigen Verbin- dungen werden beim Erhitzen an dieser Pumpe in einigen Stunden oder mindestens in einigen Tagen gewichtskonstant. Nach dieser Trocknung sind die Substanzen oft sehr hygroskopisch. Für die Elementar- analyse wägen wir sie daher nie offen ab, son- dern durch Differenzwägung des Trocknungs- kölbchens. Die Bimenform desselben (Fig. 10) ist dafür wichtig, daß sich die Substanz ohne Verlust in das Schiffchen ausschütten läßt. Zu berücksichtigen ist noch die unvermeidliche Anziehung von Feuchtigkeit. In der Zeit bis zum Einführen in das Verbrennungs- rohr werden gewöhnlich 2 — 3 mS Wasser von der Substanz im Schiffchen aufgenommen; dies wird bestimmt und von dem bei der Verbrennung gefundenen Wasser abgezogen. Auch bei der Analyse anderer hochmolekularer Verbindungen sind diese Erfahrungen zu beachten und es empfiehlt sich, ähnlich wie bei dem krystallisierten Chlorophyll und bei den Phyllinen die Zusammensetzung der beim Trocknen verflüchtigten Bestandteile durch Kondensation zu untersuchen. Im Hinblick auf die allge- meine Bedeutung der Methode führen wir noch ein neues Beispiel an, die Analyse einer metallfreien Verbindung der Hämingruppe. Durch Einwirkung flüssigen Chlorwasserstoffs haben Will- stätter und M. Fischer Hämin enteisent (siehe Kap. XXIV, Abschn. 2) ; das gebildete Chlorid liefert in heißer Eisessiglösung beim Behandeln mit Natriumacetat und Ausfällen mit Wasser eine neue Fig. 10. Trockenkölbchen . Beschreibung der Chloropliyllide. 225 Verbindung der Hämatoporphyringruppe1). Die Zusammensetzung der exsiccatortrocknen Substanz war genau gleich der von Hä- matoporphyrin nach den Analysen von Nencki und Sieber2) und nach unseren Bestimmungen; daher schien ihr auch eine Formel mit 6 Sauerstoffatomen zuzukommen, wahrscheinlich C33H3806N4. Gefunden Berechnet für C33H2808N4 C 66,93 67,54 H 6,47 6,53 Hämatoporphyrin nach Nencki und Sieber (im Mittel) 66,89 6.35 Nach der Trocknung im Vakuum der Gädepumpe bei 105 0 ent- hielt nun das Präparat nur 4 Atome Sauerstoff. Gefunden Berechnet für c33h34o4n1 C 71,70 7t>96 H 6,48 6,23 Das Ergebnis der Analyse deutete auf eine Abspaltung von 2 Molen Wasser hin. Der Trockenverlust betrug aber nicht, wie sich hierfür berechnet, 6,1%, sondern das Doppelte. Es ist also eine Kohlenstoffverbindung abgespalten worden. 2,4 g verloren 0,26 g. In einer mit flüssiger Luft gekühlten Vorlage (einem Reagierglas mit eingeführtem Glasrohr und seit- lichem Ansatz) wurden die Dämpfe verdichtet. Das Kondensat enthielt 0,21 g Essigsäure. Das Präparat hat bei der Trocknung 1 Mol. Essigsäure und 1 Mol. Wasser abgegeben; die Zusammensetzung der exsiccator- trocknen Substanz ist also: C36H40O7N4, wofür sich berechnet: C 66,84, H 6,42. 3. Bestimmung der Methyl- und Äthylgruppe nebeneinander. Grundlegend für die Kenntnis der Chlorophyllase und des krystallisierten Chlorophylls war die Auffindung der darin ent- 1) Unveröffentlicht. 2) Nencki, Opera II, 79. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 15 226 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. haltenen Methyl- und Äthylgruppe. Die Untersuchung war an- fangs durch einen Fehler in der Methodik irregeleitet. Bei der Methoxylbestimmung nach Z ei sei gab das krystallisierte Chloro- phyll Werte, die 2 Methylen entsprachen; das Jodmethyl wurde überdies nach der Angabe von F. Feist1) in der Form von Tri- methylphenylammoniumjodid identifiziert mit Hilfe einer alko- holischen Lösung von Dimethylanilin. Um aber das Jodalphyl mit der aromatischen Base zu bestimmen, darf man nicht eine alkoho- lische Lösung derselben an wenden, da Jodäthyl fast gar nicht dar- auf ein wirkt. Für den Nachweis von Äthyl war das Verfahren nicht erprobt. Das Jodmethyl findet man damit, das Jodäthyi übersieht man dabei. Hingegen eignet sich für den Nachweis beider unver- dünntes Dimethylanilin, noch besser eine Trimethylaminlösung, z. B. eine zehnprozentige alkoholische Lösung. Mit diesem Mittel wurde erkannt, daß Äthylchlorophyllid, im Hochvakuum heiß getrocknet, beim Erhitzen mit Jodwasserstoff- säure Jodmethyl und Jodäthyl in molekularem Verhältnis abspaltet. Die Bestimmung eines Gemisches beider Jodalphyle2) beruht auf folgenden Beobachtungen über die Ausbeuten an quater- nären Ammoniumsalzen aus denselben mit Dimethylanilin und Trimethylamin; 0,5 g Jodalkyl wurden mit je 10 ccm Dimethyl- anilin und mit je 10 ccm 10 prozentiger Lösung von Dimethyl- anilin und Trimethylamin bei 20 0 angesetzt. Stunden Mit Jodmethyl Mit Jodäthyl 1 6 24 1 6 24 Dimethylanilin in Alkohol 4 26 64 O 0 4 Dimethylanilin unverdünnt 46 95 100 I 8 3i Trimethylamin in Alkohol 98 99 99 9 77 90 1. Bei Anwendung von Dimethylanilin kann man die Trennung der Jodide ganz gut auf die verschiedene Reaktionsgeschwindigkeit der Alphyljodide gründen oder auf die verschiedene Löslichkeit der quaternären Jodide, namentlich in Chloroform. q Ber. d. d. chem. Ges. 33, 2094 [1900]. 2) Ann. d. Chem. 382, 148 [1911]. Beschreibung der Chlorophyllide. 22 7 Trimethylphenylammoniumjodid (Schmelzpunkt 212 °) ist in Chloroform in der Kälte sehr schwer, beim Kochen schwer löslich, in warmem Aceton und in kaltem Alkohol ziemlich schwer löslich. Dimethyläthylphenylammoniumjodid (Schmelzpunkt 136°), fin- den wir in Chloroform spielend löslich, in warmem Aceton recht leicht, in Alkohol kalt leicht löslich. 2. Mit Trimethylamin ist die Trennung schärfer und leichter auf Grund folgender Löslichkeitsbestimmungen auszuführen. Tetramethyl- Trimethyläthyl- ammoniumjodid ammoniumjodid Wasser Aceton, Chloroform Absol. Alkohol schwer löslich spurenweise löslich sehr schwer löslich, heiß 1 g in 1060 g äußerst leicht löslich beträchtlich löslich kalt leicht löslich, heiß 1 g in 1,23 g Besonders geeignet ist absoluter Alkohol für die quantitative Trennung. Beispiel: 1,18 g krystallisiertes Chlorophyll lieferten 0,60 g Jodidgemisch. Die Trennung ergab: 1. 0,29 g reines Tetramethyl- ammoniumjodid, 2. 0,02 g Gemisch, 3. 0,23 g Trimethyläthyl- ammonium j odid . Die Methode füllt wohl eine Lücke aus ; sie eignet sich allgemein zur Bestimmung von Methyl- und Äthylalkohol nebeneinander. 4. Die Methylchlorophyllide a und b1). Methylchloroph yllid a, [C32H30ON4Mg] (COOCH3)2 + V. H20, krystallisiert (Tafel II, Fig. 3) in scharf begrenzten, rhombenförmigen Blättchen, die sich meist zu Drusen vereinigen, auch häufig in vor- wiegend prismatisch ausgebildeten Krystallen. In der Durchsicht unter dem Mikroskop sind dünne Krystalle grün, dickere blaugrün ; das Pulver ist blauschwarz. Das Präparat ist luftbeständig und in krystallisiertem Zustande beliebig haltbar. *) Ann. d. Chem. 387, 351 und 355 [1912]. 15* 228 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die Komponente a löst sich in Alkohol sehr leicht mit grüner Farbe und blutroter Fluorescenz, in trockenem Äther schwer, näm- lich i g exsiccatortrocken bei 19 ° in 760 ccm, in wasserhaltigem träger als in wasserfreiem. Die Farbe in Äther ist blaugrün, viel blauer als in den Alkoholen. In Aceton ist das Methylchlorophyllid a leicht löslich, in Benzol und Schwefelkohlenstoff nur ganz wenig, in Petroläther unlöslich, spielend löslich in Pyridin. Zum Umkrystallisieren lösen wir Methylchlorophyllid gepulvert in absolutem Alkohol und bringen es daraus in Äther. Schichtet man den alkoholhaltigen Äther über Wasser, so krystallisiert ein Teil der Substanz allmählich aus. Bei größeren Mengen engt man die ätherische Lösung nach dem gründlichen Herauswaschen des Alkohols ein; entsteht dabei etwas Allomerisationsprodukt, so hinterbleibt es vollständig in der ätherischen Mutterlauge. Das Methylchlorophyllid a ist chemisch indifferent, es nimmt kein Ammoniakgas auf. Gegen Säure ist es empfindlich, die ver- dünnte ätherische Lösung schlägt beim Schütteln mit 5 prozenti- ger Salzsäure langsam, mit 10 prozentiger rasch in Braun um. Methylchlorophyllid b, [C32H2802N4Mg] (COOCH3)2 + V* H20) , krystallisiert in scharf begrenzten rhomben förmigen Täfelchen (Tafel II, Fig. 4) von ähnlicher Form, aber anderer Farbe wie a. Die Krystalle sind grünschwarz in der Aufsicht und unter dem Mikro- skop in durchfallendem Licht gelb, olivgrün und olivbraun, je nach der Dicke. Das Pulver ist grünschwarz. Sogar bei Gemischen der beiden Chlorophyllide läßt sich der Gehalt an den Kompo- nenten schätzen; je mehr a sie enthalten, desto mehr tritt die blaue Farbe auf, beim Uberwiegen von b die dunkelgrüne. Die Löslichkeit von Methylchlorophyllid b ist geringer, nament- lich in Äther. Es löst sich darin sehr schwer, nur 1 g in 2,8 1 bei 19 °. Auch in Benzol ist es schwer löslich. In absolutem Alkohol löst sich die Substanz sehr leicht mit gelbgrüner Farbe und bräun- lich roter Fluorescenz, während die Ätherlösung rein grün ist. Bei der Phasenprobe mit der ätherischen Lösung erfolgt im ersten Augenblick Umschlag in schönes Rot ; braunrot ist sie nur, Beschreibung der Chlorophyllide. 229 wenn a beigemischt ist, trübe braun oder rotbraun, wenn die Sub- stanz durch die Wirkung von Alkohol gelitten hat. Die rote Phase geht bald in Braunrot und dann, allerdings viel langsamer als bei a, in Gelbgrün über. Methylchlorophyllid a gibt hingegen bei der Probe einen Farbumschlag in reines Gelb. In alkoholischer Lö- sung, namentlich in wasserhaltiger, gellt die Phase viel rascher vorüber. Gegen Säure ist das b-Chlorophyllid etwas beständiger als a; die ätherische Lösung behält beim Schütteln mit 10 prozentiger Salzsäure einige Zeit ihre Farbe, erst mit 15 prozentiger Säure wird das Magnesium rasch abgespalten. 5. Die beiden freien Chlorophyllide1). Das Chlorophyllid a, [C32H30ON.,Mg] (COOH) (COOCH3) + 1/2 H20, läßt sich aus wasserhaltigem Äther umkrystallisieren oder aus Aceton durch Zusatz von Wasser in krystallisierter Form ausfällen. Man begegnet nur einer Krystallform, sechsseitigen Täfel- chen, die metallglänzend blauschwarz in der Aufsicht, im durch- fallenden Licht grün bis blaugrün sind. In ätherischer Lösung ist die Farbe von freiem Chlorophyllid a noch blauer als die der Methylverbindung, die alkoholische Lösung hingegen ist rein grün, die Fluorescenz ist dunkelrot. In absolutem Alkohol und Aceton löst sich die Säure spielend leicht, langsam, aber doch noch sehr leicht in 96 prozen tigern Alkohol, ziemlich schwer in Äther (die krystallisierte Substanz, leichter die gefällte), dagegen ist sie unlöslich in kaltem Benzol und Petroläther. Ein freies Carboxyl genügt, um das Chlorophyllid derart sauer zu machen, daß es aus ätherischer Lösung (0,02 g in 100 ccm) reichlich in n/1000-KOH übergeht; n/2000-KOH entzieht dem Äther nur wenig von der Säure; n/4000 nimmt nichts auf. Zwischen n/i00-Na2CO3 und Äther verteilt sich die Substanz, n/1000-Soda löst nur ganz wenig. Natriumbicarbonat (5 prozentig) entzieht die Carbonsäure dem Äther nicht. Ammoniak (n/2) extrahiert aus 1 ) Ann. d. Chem. 387, 366 [1912]. 230 R. Wülstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. dem Äther das Chlorophyllid vollständig, n/20 reichlich, n/200 noch deutlich. Mit der Salzbildung durch Ammoniak läßt sich das Chlorophyllid von den Alkylchlorophylliden bequem trennen; beim Einleiten von Ammoniakgas in die trockene ätherische Lösung schlägt die Farbe in Grün um, dann trübt sich die Flüssigkeit und das Ammonium- salz wird niedergeschlagen, am bequemsten auf Talk. Schüttelt man ihn nach dem Abfiltrieren mit Äther und Wasser, so geht infolge der Dissoziation des Salzes das freie Chlorophyllid in Äther; es ist unversehrt und rein. Bei längerem Aufbewahren, besonders bei langdauerndem Er- wärmen im Vakuum sowie beim langen Stehen selbst verdünnter Lösungen zersetzt sich das Chlorophyllid, es bildet ätherunlösliches Phäophorbidmagnesium. Das Chlorophyllidb [C32H2802N4Mg] (COOH) (COOCH3)kry- stallisiert selbst bei großer Konzentration schwierig, es zersetzt sich leicht beim Einengen seiner ätherischen Lösung. Aus Aceton kommt es beim Abdunsten oder langsamen Verdünnen mit Wasser in derselben Form wie a, in glitzernden sechseckigen Blättchen heraus, die unter dem Mikroskop gelb, gelbgrün oder olivgrün er- scheinen. In krystallisiertem Zustande ist die Substanz längere Zeit haltbar, aber in alkoholischer Lösung wird sie weit rascher als ihr Ester allomerisiert. In den Alkoholen, worin das Chlorophyllid b sich recht leicht löst, zeigt es bei dünner Schicht gelbgrüne, bei stärkerer grasgrüne Farbe und bräunlichrote Fluorescenz. In Äther ist es etwas weniger gelbstichig; es ist darin schwer löslich, etwas schwerer als a. In Aceton löst es sich ebenso leicht, in Petroläther ebensowenig wie a. Die Carbonsäure b ist noch stärker sauer als das Chlorophyllid a. Sie wird aus ihrer ätherischen Lösung (0,02 g in 100 ccm) schon von n/2000-KOH fast quantitativ extrahiert. Auch in n/100-Na2CO3 und in n/100-NH3 geht das Chlorophyllid b vollständig über, sogar noch in n/1000-NH3 reichlich; es verteilt sich ferner zwischen Äther und Natriumbicarbonat. Die alkalischen Lösungen sind grünlich- gelb bis gelbgrün, diejenigen von a sind grün. XII. Die gelben Pigmente der Chloropiasten. i. Vorkommen der Carotinoide. Aus herbstlichem Laub hat zuerst Berzelius1) durch Extra- hieren mit Alkohol einen gelben Farbstoff zu isolieren versucht, den er „Blattgelb“ oder „Xanthophyll“ nannte. Auch in den grünen Blättern begleiten bekanntlich große Mengen von gelben Pigmenten das Chlorophyll. Ihre schönen Krystalle sind den Bota- nikern oft unter dem Mikroskop aufgef allen und den Chemikern, die sich mit dem Chlorophyll beschäftigt haben, in den Extrakten begegnet. Einen krystallisierten gelben Chlorophyllbegleiter hat A. Ar- naud2) in den Jahren 1885—1887 eingehend untersucht und er hat entdeckt, daß dieser sehr wahrscheinlich identisch ist mit dem Carotin, dem Farbstoff der Möhre (Daucus Carota). Auch A. Han- sen hat die Übereinstimmung vermutet und N. A. Monteverde hat sie bestätigt. Aber Analysen des Carotins aus Blättern finden wir nur bei H. Immendorf3) mitgeteilt; wären sie richtig, so würde sich daraus ergeben, daß Carotin aus Blättern und aus Carotten verschieden sind. Das Carotin aus der Mohrrübe hat zuerst Wackenroder4) isoliert; Zeise5) hat es genauer beschrieben und die Formel C6H8 dafür aufgestellt. Später hat A. Husemann6) eine ausführliche x) Ann. d. Chem. 21, 257 [1837]. 2) Compt. rend. 100, 751 [1885); 102, 1119 und 1319 [1886]; 104, 1293 [1887]; 109, 91 1 [1889]; Bull. soc. chim. 48, 64 [1887]. а) Landwirtschaftl. Jahrbücher 18. 507 [1889]. 4) Geigers Magazin f. Pharm. 33, 144 [1831]. б) Ann. d. Chem. 62, 380 [1847]. *) Ann. d. Chem. 117, 200 [1861]; Archiv d. Pharm., II. Reihe, 129, 30 [1867]. 232 R.Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Arbeit über Carotin veröffentlicht und ihm die Formel C18H240 zugeschrieben. Erst Arnaud hat festgesteht, daß der Farbstoff der gelben Rübe wirklich ein Kohlenwasserstoff ist. Seine Analysen des Carotins und eines Carotin jodides führten zu der Formel C26H38, die lange Zeit unbestritten blieb. Arnaud hat nur das Carotin als Begleiter des Chlorophylls be- achtet und ist bei seiner colorimetrischen Bestimmung des Blatt- gelbs in grünen Pflanzenteilen von der Voraussetzung ausgegangen, daß nur eine einzige gelbe Substanz zu berücksichtigen sei, die von Petroläther extrahiert wird. Mit dem Carotin ist, nach den An- deutungen über Löslichkeit und Aussehen der Krystalle zu urteilen, sehr wahrscheinlich das Erythrophyll von Ch.Bougarel, das Chry- sophyll von E.Schunckund wohl auch das Etiolin von N . P r i n g s - heim identisch. Schon lange Zeit zuvor hatten indessen G. G. Stokes1) und H. C. Sorby2) erkannt, daß mehrere gelbe Pigmente neben dem Chlorophyll auftreten; Stokes nimmt zwei, Sorby drei Xantho- phylle an. Dann hat namentlich J. Borodin3) darauf aufmerksam gemacht, daß mehrere krystalhsierbare gelbe Stoffe von verschiedener Löslichkeit in den Blättern Vorkommen und er hat diese Begleiter des Chlorophylls in 2 Gruppen eingeordnet. Zur einen Gruppe, der des Carotins, gehören Krystalle, welche in Benzin leicht, in Alkohol schwer löslich sind. Die Vertreter der zweiten Gruppe lösen sich sehr wenig in Benzin und leicht in Alkohol. Diese Beobachtungen sind von N. A. Monteverde4) und A. Tschirch5) und nament- lich von M. Tswett6) bestätigt und vermehrt und durch die spektralanalytischen Untersuchungen von C. A. Schunck7) er- gänzt worden. 4) Proc. Roy. Soc. 13, 144 [1864]. 2) Quarterly. Journ. of Microscopical Science 11, 215 [1871]; Quarterly. Journ. of Science 8, 64 [1871]; Proc. Roy. Soc. 21, 442 [1873]. 3) Mölanges biologiques tir6s du Bull, de l’Acad. Imper. de St. Peters- burg 11, 512 [1883]. 4) Acta Horti Petropolitani XIII, Nr. 9, 148 [1893]. 6) Ber. d. d. bot. Ges. 14, 76 [1896]; 22, 414 [i9°4]* «) Ber. d. d. bot. Ges. 24, 316 u. 384 [1906]; Die Chromophylle in der Pflanzen- und Tierwelt, Warschau 1910, Seite 218. ■>) Proc. Roy. Soc. 63, 389 [1898]; 65, 177 [1899]; 72, 165 [1904]- 233 Die gelben Pigmente der Chloroplasten. Ts Wett1) schlägt vor, die verschiedenen gelben Pigmente mit dem Namen Carotinoide zusammenzufassen. Dennoch ist die Existenz einer Mehrzahl gelber Pigmente in den Blättern auch vielfach bezweifelt worden. Immendorf z. B. spricht den Satz aus: „Das Carotin ist der einzige gelbe Bestand- teil des normalen Chlorophyllkerns.“ H. Molisch2) läßt in seiner Abhandlung: „Die Krystallisation und der Nachweis des Xantho- phylls (Carotins) im Blatte“ die Frage offen und sie wild auch nicht gelöst durch die ausführliche Arbeit von T. Tammes3): „Über die Verbreitung des Carotins im Pflanzenreich.“ Eine Entscheidung ist durch die Isolierung und Analyse je eines krystallisierten Repräsentanten der beiden Borodinschen Gruppen von Willstätter und Mieg4) herbeigeführt worden. Carotin, aus getrockneten Blättern mit Petroläther isoliert, war wirklich identisch mit dem Pigment der Carotten; die Formel von Ar na ud ist auf Grund genauerer Analysen abzuändern. Die neuen Bestimmungen ergeben den Durchschnittswert CH1)408 , also die empirische Zusammensetzung des Cymols oder noch einfacher (C5H7)x- Die Molekulargewichtsbestimmung mit physikalischen Methoden und auf chemischem Wege, nämlich durch Analyse des jodärmsten Jodadditionsproduktes, führt zu der Formel C40H66 für den Kohlenwasserstoff. In alkoholischen Auszügen der Blätter ist ein zweites gelbes Pigment überwiegend, das Willstätter und Mieg in prächtigen Krystallen erhalten und als Xanthophyll bezeichnet haben. Es ist wie Carotin stark ungesättigt und autoxydabel. Seine Analyse ergab mit der Formel C40H56O2, die durch Molekulargewichts- bestimmung und Jodidanalyse Bestätigung fand, eine überraschend einfache Beziehung zum Carotin. Der Sauerstoff befindet sich in der Substanz wahrscheinlich in ätherartiger Bindung. Xanthophyll und Carotin lassen sich quantitativ trennen durch ihre verschiedene Verteilung zwischen Petroläther und goprozen- *) Ber. d. d. bot. Ges. 29, 630 [1911]. 2) Ber. d. d. bot. Ges. 14, 18 [1896]. 3) Flora 87, 205 [1900]. 4) Abh. IV. 234 Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. tigern Holzgeist; der Kohlenwasserstoff Carotin ist in den Petro- leum-Kohlenwasserstoffen löslich, Xanthophyll, die Sauerstoff- verbindung, geht in das sauerstoffhaltige Lösungsmittel über. Die gelben Farbstoffe sind gegen Säure in so hohem Maße empfindlich, daß sie bei der Gewinnung von Phäophytin nicht un- versehrt bleiben und dabei nicht krystallisiert zu erhalten sind. Aber bei der Verseifung des Chlorophylls mit Alkalien bilden die Mutterlaugen ein geeignetes Ausgangsmaterial für ihre Isolierung. Auch bei der Darstellung von Chlorophyll und krystallisierten Chlo- rophylliden läßt sich der größte Teil der Carotinoide als Neben- produkt gewinnen, wofür wir im folgenden neue Verfahren mit- teilen. Es fragt sich nun, ob diese beiden genau charakterisierten Verbindungen die einzigen gelben Pigmente der Chloropiasten sind. Die hohen Ausbeuten an den reinen Krystallisationen von Carotin und Xanthophyll machen es jedenfalls unwahrscheinlich, daß außer ihnen noch andere- Carotinoide das Chlorophyll in den Land- pflanzen begleiten. Indessen gelangt M. Ts wett anscheinend zu einer noch weitergehenden Auflösung des Blattgelbs auf dem Wege der chro- matographischen Adsorptionsanalyse (vgl. Kap. VI, Abschn. i). Beim Filtrieren z. B. einer Schwefelkohlenstofflösung des Blatt- farbstoffs durch eine Säule von Calciumcarbonat geht Carotin hin- durch, ohne adsorbiert zu werden. Neben den zwei grünen Farb- stoffen trennen sich vier Zonen von gelben Pigmenten ab, die Ts wett als Xanthophylle cc, in feuchtem Raum um 41%. Die Krystalle behalten beim Aus- bleichen ihre scharf begrenzte Form bei. x) Abh. IV und Zeitschr. f. physiolog. Chem. 64, 47 [1910] un) Abh. III und VII. 252 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Fortschritt in der Bereitung der Blätterextrakte bedeutete zu- gleich eine Verbesserung der Phäophytingewinnung. Das beim Behandeln des Rohchlorophylls mit Säure entstehende Phäophytin eignet sich für den weiteren Abbau des Chlorophylls und ist das beste Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Phytol. 2. Die älteren Methoden der Säurespaltung des Chlorophylls1). Die Einwirkung von Säure auf Chlorophyll hat E. Fr£my zu untersuchen begonnen und er hat die Namen Phylloxanthin und Phyllocyanin eingeführt, die in der Folge ihre Bedeutung sehr gewechselt haben. Fr6my2) ließ auf die aus alkoholischem Extrakte mit Alu- miniumhydroxyd und Alkalilauge gebildete gelbe Fällung oder direkt auf den Abdampfrückstand des Extraktes starke Salzsäure und Äther ein wirken. Nach der Scheidung war der Äther rein gelb, die Säure blau; Fremy nahm in diesen Schichten zwei Komponenten des Chlorophylls an, von denen er die gelbe Phyllo- xanthin, die blaue Phyllocyanin nannte. Darauf erhitzte Fremy alkoholische Extrakte mit Bariumhydroxyd und setzte aus dem Bariumsalz mit Schwefelsäure die sogenannte Phyllocyaninsäure in Freiheit. Er vermutete im Chlorophyll ein farbiges Fett, in welchem dem indifferenten Phylloxanthin die Rolle des Glycerins, dem Phyllocyanin diejenige der Fettsäure zukam. Später gab Fremy der Hypothese den Vorzug, Chlorophyll sei ein Gemisch von Phylloxanthin und dem Kaliumsalz der Phyllocyaninsäure. Ursprünglich lag also im Phylloxanthin das natürlich ganz unreine und durch Säure veränderte Gemisch gelber Begleiter vor und im Phyllocyanin ein Gemisch von je nach der Darstellung verschiedenen Spaltungsprodukten der beiden Chlorophyllkompo- nenten durch Säure. Mit denselben Namen hat E. Schunck3) zwei Produkte be- zeichnet, die er in seinen Untersuchungen während der J ahre 1885 ») Abh. XX. *) Compt. rend. 50, 405 [1860]; 61, 188 [1865]; 84. 983 [1877]. 8) Proc. Roy. Soc. 38, 336 [1885]; 39, 348 [1885]; 42, 184 [1886]; 44, 4* * 8 [1888]; 50, 302 [1891]; 55, 351 [1894]. Phäophytin. 253 bis 1896 durch energische Einwirkung von Salzsäure auf Chloro- phyll dargestellt hat, ohne übrigens ihre Analyse zu veröffent- lichen. Frisches Gras wurde mit siedendem starkem Alkohol extrahiert und die filtrierte Lösung mit einem Strom von Chlorwasserstoff- gas behandelt. Dabei schied sich eine dunkle Masse aus, welche beim Behandeln mit Äther und konzentrierter Salzsäure zwei Anteile lieferte: der nicht in starke Salzsäure gehende, in viel größerer Ausbeute entstehende Anteil ist Phylloxanthin, der von der Säure aufgenommene, aus Eisessig wiederholt umkrystallisierte, Phyllocyanin. Phyllocyanin : krystallinisch, in Äther dunkelgrün oder olivgrün. Phylloxanthin: äußerst ähnlich dem Phyllocyanin, aber Fett enthaltend; gibt Asche, die stets einen integrierenden Gehalt an Eisen aufweist. In Lösung gelbbraun. Wird die ätherische Lösung mit konzentrierter Salzsäure geschüttelt, so bleibt diese farblos. Hinsichtlich der Beziehung zwischen beiden kamen E. Schunck und L. Marchlewski1) zu dem Ergebnis, daß das Phylloxanthin Zwischenprodukt der Bildung von Phyllocyanin sei. M. Tswett 2) hat die Bildung von Phylloxanthin und Phyllo- cyanin unter den Versuchsbedingungen von E. Schunck nach- geprüft und die beiden Spaltungsprodukte in Übereinstimmung mit einer alten Vermutung von G. G. Stokes3) auf die zwei Komponenten des Chlorophylls zurückgeführt. Mit Hilfe seiner chromatographischen Methode zeigte er, daß Phylloxanthin im wesentlichen das erste Spaltungsprodukt des Chlorophylls b , Phyllocyanin ein sekundäres Spaltungsprodukt der Chlorophyll- komponente a ist. Für die Erklärung der Beobachtungen fehlt nur die Kenntnis der verseifbaren Gruppen im Chlorophyll und die Berücksichtigung der Allomerisation, durch welche alle die Chlorophyllderivate der älteren Literatur verdorben waren. l) Ann. d. Chem. 278, 329 [1894]; 284, 81 [1894]; Proc. Roy. Soc. 57, 314 tl895l; L- Marchlewski, Die Chemie des Chlorophylls [1895], Seite 63; Roscoe - Schorlemmer VIII, 889; Bioch. Zeitschr. 3, 303 [1907]. *> Bioch. Zeitschr. 5, 6 [1907]; 6, 373 [1907]; io, 404 [1908]. *) Proc. Roy. Soc. 13, 145 [1864]; siehe dazu Proc. Roy. Soc. so * *ii [1891]. / 0 J 254 Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Dem Chlorophyll viel näher stehend ist ein Produkt, das F. Hoppe -Seyler x) im Jahre 1879 durch Extraktion von Gras mit siedendem Alkohol gewonnen und aus den eingedunsteten Extrakten durch eine Folge von Trennungs- und Reinigungs- : Operationen isoliert hat, das Chlor ophyllan. Obwohl krys tallisie- rend, war es keine reine Verbindung. Es lieferte viel Asche, die 1,38% Phosphor und 0,34% Magnesium enthielt, auch wies es;j einen Gehalt an Glycerin und Cholin auf. Seine Zusammensetzung ; hat daher Hoppe -Seyler zu der Vermutung geführt, Chloro- i phyll zähle zu den Lecithinen. Ein ähnliches Präparat hat um die gleiche Zeit A. Gautier * 2) erhalten und als krystallisiertes Chlorophyll beschrieben. Die Bildung des Chlorophyllans, dessen Farbe in Lösungen : i olivgrün ist, beruht nach Willstätter und Hug auf der nicht beabsichtigten Zersetzung des bei der Behandlung mit Lösungs- mitteln schon teilweise allomerisierten Chlorophylls durch Pflanzen- • säuren. Das Chlorophyllan läßt sich nach der Methode von Hoppe- • Seyler nur aschehaltig und nur als Gemisch mit farblosen Stoffen 1 (Fett, Lecithin u. a.) erhalten. 3. Gewinnung des Phäophytins. Nach Willstätter und Hocheder3). Das Mehl von getrock- neten Brennesseln oder Gras wurde in Flaschen mit 96 prozen tigern Alkohol (1V2 — 2 1 für 1 kg) in der Kälte extrahiert; nach dem Absaugen und Nach waschen diente der Extrakt zum Ausziehern einer gleichen weiteren Charge. Der erhaltene Doppelextrakt (Kap. III, Abschn. 2a) zeigt bei der Einwirkung von Säure einen schnellen Farbumschlag in Dunkel- braun und zugleich Verschwinden der starken Fluorescenz. Die Reaktion wurde durch Zufügen einer in der Kälte frisch bereiteten konzentrierten Lösung krystallwasserhaltiger Oxalsäure in 96 prozentigem Alkohol bewirkt. In der Regel waren 2,5 — 5 S Oxalsäure für den Liter Doppelextrakt erforderlich. Zunächst J) Zeitschr. f. physiol. Chem. 3, 339 [1879]; 4. x93 [1880]; 5, 75 [1881]. 2) Compt. rend 89, 861 [1879]. s) Ann. d. Chem. 354, 218 [1907]. Pkäophytin. 255 versetzte man die Chlorophyllösung auf einmal mit 2,5 g Oxalsäure pro Kilogramm Pflanzenmaterial und fügte, wenn daraufhin in i/4 — V2 Stunde kein gänzlicher Wechsel der Farbe eingetreten ist, weiter in kleinen Portionen mit Pausen die noch zur Vervoll- ständigung des Farbenumschlags erforderliche Säuremenge hinzu. Schon während des Zufügens der Oxalsäure beginnt das Aus- fallen eines flockigen Niederschlages, der hauptsächlich aus Phäo- phytin und oxalsauren Salzen, namentlich von Magnesium und Calcium, ferner von Kalium und Aluminium besteht. Bei ein- tägigem Stehen wurde die Abscheidung vollständig und der Nieder- schlag setzte sich so dicht zu Boden, daß sich die Hauptmenge der Flüssigkeit dekantieren ließ. Die Mutterlauge enthält noch etwas Phäophytin und sehr viel von den gelben Begleitern des Chlorophylls, aber man bekommt sie daraus nicht in krystalli- siertem Zustand. Das ausgeschiedene Gemisch von Phäophytin und Oxalaten wurde auf der Nutsche abgesaugt, mit Alkohol mehrmals nachge- waschen und im Vakuumexsiccator getrocknet. Zur Beseitigung der Salze und ersten Reinigung diente immer eine Umfällung aus Chloroformlösung durch Alkohol; die Metallverbindungen hinter- blieben beim Auflösen und die Mutterlauge hielt organische Ver- unreinigungen zurück. Nur bei Gewinnung von Phäophytin in sehr großem Maßstab war es lohnend, noch eine Laugenportion aus der Chloroform-Alkoholmischung zu isolieren. Die Filtration der Chloroformlösung ist schwierig und erfordert ziemlich große Verdünnung. Zunächst wurde mit großen Nutschen an der' Pumpe gearbeitet, danach war, da etwas von dem feinen Niederschlag mitgerissen worden, noch drei- bis viermaliges Fil- trieren durch glatte Filter notwendig, um das Phäophytin asche- frei zu erhalten. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei gewöhnlicher Temperatur stark eingeengt und die dicke fast schwarze Lösung mit dem fünf- bis zehnfachen Volumen Alkohol (von 96%) gefällt. Die Ausbeute an Phäophytin betrug bei Verarbeitung vieler Pflanzen gewöhnlich 3 g aus 1 kg trockenen Krautes; bei chloro- phyllreichen Blättern erheblich mehr, z. B. haben 100 kg Brenn- 256 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. nesseln 424 g Phäophytin geliefert (ohne Verwendung der Mutter- laugen). Eine Abänderung dieses Verfahrens bestand in der Bereitung der Rohchlorophyllösungen mit Hilfe von Perkolatoren (Kap. III, Abschn. 2 a); anfangs wurden die Blattmehle in den Perkolatoren 24 — 48 Stunden lang maceriert und dann perkoliert. Der „Fällungs- koeffizient“, d. i. der Quotient als Phäophytin gefälltes Chlorophyll gelöstes Chlorophyll erwies sich aber günstiger bei Schnellperkolaten, die ganz ohne Macerieren hergestellt waren. So gewannen wir aus 44 kg Brenn- nesselmehl, womit vier Perkolatoren beschickt wurden, 208 g reines Phäophytin, d. i. 4,8 g aus 1 kg. Neues Verfahren1). Nach unseren vergleichenden Versuchen über die Extraktions- methoden ist das beste Verfahren die rasche Extraktion der Blatt- mehle auf der Nutsche mit wasserhaltigen Lösungsmitteln: 1. Aceton mit 10 — 20 Volumprozent Wasser. 2. Alkohol mit 10 Volumprozent Wasser. Dabei wird mit niedriger Schicht des Pflanzenmaterials ge- arbeitet, damit das Chlorophyll aus der gebildeten konzentrierten Lösung nicht im Blattmehl an zweiter Stelle sich wieder absetzen kann. Die so gewonnenen Extrakte ermöglichen große Verbesserungen der Phäophytingewinnung. Das Phäophytin von Willstätter und Hocheder war reine Chlorophyllsubstanz, d. h. frei von Fett, Wachs und anderen farblosen oder farbigen Beimischungen. Allein das Chlorophyll der angewandten Extrakte war in vielen Fällen verändert2), namentlich bei Verarbeitung gewisser Pflanzenmehle (Brennesseln) allomerisiert. Daher lieferten manche Phäophytinpräparate bei der Spaltung nicht allein die normalen Derivate Phytochlorin e 1) Unveröffentlicht. 2) Abh. XIV. Phäophytin. 257 und Phytorhodin g, sondern daneben schwach basisches Chlorin und Rhodin. Ferner war die Phytolestergruppe bei der längeren Berührung des Extraktes mit dem Blattmehle der Alkoholyse aus- gesetzt. Die Zusammensetzung des Phäophytins war also nicht konstant. Die nach dem neuen raschen Verfahren mit wasserhaltigen Lösungsmitteln gewonnenen Extrakte enthalten das Chlorophyll in unverändertem Zustand und liefern daher Phäophytin, das aus einem reinen Gemisch der Phytylphäophorbide a und b in ihrem natürlichen Verhältnis besteht und durch Verseifung nur die zwei normalen Spaltungsprodukte gibt. Ein weiterer Fortschritt be- steht darin, daß diese neuen Extrakte beim Ansäuern mit Salz- säure sofort reines Phäophytin liefern, das keiner Umfällung oder Umscheidung bedarf. Es wäre mit den Extrakten der älteren Methoden unmöglich, durch Ansäuren mit Salzsäure (statt Oxal- säure) reines Phäophytin abzuscheiden; die Umfällung war nicht zu vermeiden. Die Aceton- und die Alkoholextrakte nach der neuen Methode können zur Verarbeitung auf Phäophytin dienen. Mit Aceton erhalten wir bei der Extraktion die größten Chloro- phyllausbeuten (95%), aber bei direktem Ansäuern sehr un reines Phäophytin. Die Acetonextrakte sind daher auf Phäophytin zu verarbeiten durch Ausfällen des Rohchlorophylls auf Talk beim Verdünnen mit Wasser (Kap. V, Abschn. 3), Wiederausziehen des Chlorophylls aus dem Talk mit 92- (nicht höher) prozentigem Al- kohol und Ansäuern. Besser geeignet für die Verarbeitung auf Phäophytin durch direktes Ansäuern sind die alkoholischen Extrakte. Den Einfluß, welchen verschieden große Zusätze von Wasser zum angewandten Alkohol auf die Ausbeute und Reinheit des Phäophytins ausüben, zeigt folgendes Beispiel: Je 1 kg techn. Brennesselmehl (Chlorophyllgehalt 5,1 g) wurde nach dem Nutschenverfahren mit 95-, 90- und 85 volumprozentigem Alkohol unter ganz gleichen Bedingungen (nach dem Verfahren von Kap. III, Abschn. 2) extrahiert und die Auszüge (je 0,9 1) mit Salzsäure gefällt. Wills tä t ter-S toi 1 , Chlorophyll. 258 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Alkohol 95 % 90% 85% Gehalt an Chlorophyll 4.28 g 5.04 g 4.67 g Ausbeute an Phäophytin 3A5 .. 3-7°.. 3.20 „ Reinheit des Phäophytins 90% 100% 100% Aus dem Vergleich ergibt sich das folgende Verfahren für die Gewinnung von Phäophytin. Das in größerem Maßstab verfügbare Ausgangsmaterial war das mittelfein gemahlene Brennesselkraut der Drogengroßhand- lungen („techn. Brennesseln“), deren Chlorophyllgehalt x/2 — %% betrug. Auf unsere niedrigen Steinzeugnutschen von 50 cm Durch- messer füllen wir unter Saugen mit Maschinenvakuum trocken je 4 kg Blattmehl, die eine Schicht von nur 4 — 5 cm Höhe bilden, auf. Ohne weiter zu saugen, lassen wir von 90 prozen tigern Alkohol 2 1 in das Mehl einsickem, dann wird der Vakuumhahn geöffnet und weitere 4 1 Lösungsmittel in einigen Portionen aufgefüllt. Das Mehl ist in 20 Minuten fertig extrahiert. Das Filtrat (4 1) saugt man zur Befreiung von mitgerissenen feinen Mehlpartikeln noch auf einer kleinen Nutsche durch eine mehrfache Schicht Filtrierpapier. Zwei nebeneinander fertiggestellte Chargen vereinigen wir und versetzen sie sofort mit 160 ccm 10 prozentiger alkoholischer Salz- säure. Der Farbumschlag erfolgt rasch -und zugleich beginnt die Ausscheidung des Phäophy tins in feinen Körnchen , die in einer Stunde vollständig ist. Nach dieser Zeit dekantieren wir vorsichtig die braungelbe klare Mutterlauge, worin sich bei längerem Stehen nur eine geringe, weniger reine Fällung bildet, von dem dichten Niederschlag, saugen ihn auf der Nutsche scharf ab und waschen, die Bildung von Rissen vermeidend, dreimal mit je 100 ccm 96 prozen tigern Sprit nach. Abgepreßt und noch alkoholfeucht läßt sich das Präparat sehr leicht zerkleinern, trocken nur äußert schwer. Wir schneiden es deshalb noch feucht mit scharfen Silber- spateln in die für die weitere Verarbeitung, namentlich die Ver- seifung mit alkoholischer Lauge, zweckmäßigen kleinen Partikel und trocknen das Präparat in großen Vakuumexsiccatoren aus Steinzeug mit Lochplatten aus demselben Material. Phäophytin. 259 Wir erzielen einen Fällungskoeffizienten von 0.75 bis 0.85 und aus 1 kg Blattmehl eine Ausbeute von 3,6 — 5 g Phäophytin, das keiner weiteren Reinigung bedarf. Ein Arbeiter bewältigt im Laboratorium täglich 40 — 48 kg mit einem Ertrag von 180 — 250 g Phäophytin; die Mutterlauge liefert bei der Rektifikation den Alkohol 93 volumprozentig mit einer Ausbeute von 80% zurück. Erheblich besser als mit dem käuflichen Brennesselkraut war die Phäophytinausbeute bei Verarbeitung selbstgesammelter Brenn- nesselblätter von gutem Chlorophyllgehalt. Es ist zweckmäßig, von dem chlorophyllreicheren Material nur je 2 kg in die große Nutsche zu füllen und zur Extraktion die doppelte Menge von 90 prozentigem Alkohol, also 6 1, anzuwenden. Der Extrakt (4,4 1) wurde entsprechend seinem größeren Volumen mit mehr Salzsäure versetzt, z. B. mit 100 ccm 15 prozentiger alkoholischer Säure und nach nur einer Stunde filtriert. Wir erhielten sehr reines Phäophytin in einer Ausbeute von 12,9 g und, wie die folgenden Zahlen zeigen, in einem günstigen Verhältnis zum Chlorophyllgehalt der Brennesseln. Chlorophyll in 1 kg Brennesseln: 8,6 g; Chlorophyll im Extrakt aus 1 kg Brennesseln : 7,75 g ; Ex- traktionskoeffizientx) = 0,90; Phäophytin aus 1 kg Brennesseln: 6,45 g; Fällungskoeffi- zient = 0,83 ; Ausbeute = 0,90 . 0,83 = 75% der Theorie. Wir haben für andere Zwecke noch bessere Ernten von Brenn- nesselblättem mit einem Chlorophyllgehalt von 10 g im Kilogramm verarbeitet; sie würden eine Ausbeute von 8 g Phäophytin er- möglichen. 4. Beschreibung2). Das Phäophytin wird in aschefreiem Zustand gewonnen; Dar- stellungen in größtem Maßstabe gaben 0,04%, im kleinen noch weniger Asche. x) Man kann so den Quotienten aus extrahiertem und extrahierbarem Farbstoff bezeichnen. 1 ) Abh. III ; zum Teil Unveröffentlichtes. 17* 2Ö0 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die Reinheit der Präparate wird durch colorimetrischen Ver- gleich mit einem ihrem Komponentenverhältnis entsprechenden Ge- misch der Methylphäophorbide a und b geprüft (Kap. IV, Abschn. ib). Ihrem Farbwert nach sollen die im großen hergestellten Präparate ohne Reinigung zwischen 98- und iooprozentig sein. Sie enthalten also keine farblosen Beimischungen. Gelbe Begleiter verraten sich selbst in Spuren beim Behandeln der ätherischen Lösung mit methylalkoholischem Kali; dabei soll sich der Äther nur in sehr geringem Maße oder gar nicht gelb an färben. Auf dieselbe Weise wird die Phasenprobe angestellt; die Phase ist braun und schlägt bald in Olivgrün bis Grün um, je nach der Konzentration der Alkalilauge. Bei der Spaltungsprobe, die durch Einträgen einer kon- zentrierten Pyridinlösung des Phäophytins in siedende methyl- alkoholische Kalilauge und Kochen während einer halben Minute ausgeführt wird, entstehen nur die beiden normalen Derivate Phytochlorin e und Phytorhodin g, deren Verhältnis ungefähr 2,5 : 1 zu sein pflegt. Ein so glattes Resultat war schwer zu erreichen, besonders bei der Verarbeitung des gewöhnlichen Ausgangsmaterials, der ge- trockneten Brennesseln, deren Extrakte außerordentlich zur Bil- dung von schwach basischen Verbindungen neigen. Das voll- kommen reine Gemisch von Chlorophyllderivaten wird erst und nur dann erhalten, wenn man 1. die Pflanze rasch extrahiert; 2. den Extrakt sofort ansäuert; 3. die Spaltung unter genau ermittelten Bedingungen aus- führt (Kap. IV, 2). Die Bestimmung der Phytolzahl ergibt nun auch, daß die leicht angreifbare Estergruppe unversehrt ist. Viel leichter und empfindlicher prüft man mit der Basizitätsprobe auf eine Bei- mischung von phytolfreiem Phäophorbid, nämlich durch Schütteln der Ätherlösung mit 22 prozentiger Salzsäure. Sie nimmt den Phytolester nicht auf und färbt sich daher nur ganz schwach an. Hydrolysiertes und alkoholysiertes Phäophytin, das bei den alten Phäophytin. 261 langsamen Extraktionsmethoden (Doppelextrakte, Perkolate) un- vermeidlich beigemischt war, geht glatt in diese Säure über. Phäophytin hingegen ist so schwach basisch, daß es erst 25 prozen tige Salzsäure ein wenig anfärbt; 28 29 prozentige nimmt die reine Komponente a auf. In der starken Säure, rascher in ganz konzentrierter, wird das Phytol hydrolytisch abgespalten. Sauere Eigenschaften besitzt das Phytylphäophorbid nicht. Phäophytin verbindet sich leicht mit Metallsalzen zu intensiv- farbigen, sehr beständigen Komplexverbindungen, weshalb bei seiner Darstellung die Berührung mit unedlen Metallen ausge- schlossen werden muß. Mit Ferrisalz entsteht sofort in der Kälte eine schön grünstichig blaue Lösung, die sehr schwach fluoresciert. Zinkacetat gibt eine schön blaugrüne, in der Durchsicht rote Flüssigkeit, die sich durch starke Fluorescenz auszeichnet. Kupfer- acetat verwandelt das Braun des Phäophytins auch in großer Ver- dünnung in intensives Grün; die Lösung fluoresciert nicht. Phäophytin ist ein Wachs; es wird nicht in deutlich krystalli- sierter Form erhalten, bildet aber baumähnliche krystallinische Gebilde. Er ist blauschwarz gefärbt, in Lösung olivbraun und bei großer Schichtdicke in der Durchsicht rot. In heißem Alkohol ist es ziemlich schwer, in kaltem sehr schwer löslich und läßt sich nach Art des Umkrystallisierens daraus „umscheiden“1). In Äther löst es sich träge, aber beträchtlich, in Benzol sehr leicht, in Chloroform spielend, in Petroläther ist es fast unlöslich. Konzentrierte Salpetersäure zerstört Phäophytin beim Kochen, auf der hellen Flüssigkeit schwimmt dann als farblose ölschicht ein stickstoffhaltiges Derivat des Phytols. Charakteristisch ist auch die Reaktion der ätherischen Phäo- phytinlösung mit konzentrierter Salpetersäure: beim Schütteln färbt sich der Äther blau, während die Säure nichts Gefärbtes aufnimmt; beim Waschen mit Wasser nimmt die ätherische Lösung wieder die ursprüngliche Olivfarbe an. x) Ann. d. Chem. 354, 221 [1907]. XIV. Methode der Trennung und Bestim- mung von Chlorophyllderivaten1). i. Fraktionierung mit Salzsäure. Da das Chlorophyll aus zwei Komponenten besteht und da jede leicht veränderliche Lactamgruppen enthält, so entstehen beim Abbau im allgemeinen Gemische von Spaltungsprodukten, für deren Trennung und Reinigung keine Methoden existiert haben und deren Erkennung anfangs sehr unsicher gewesen ist. Diese hochmolekularen Substanzen besitzen oft gleiche, oft sehr ähnliche Zusammensetzung und zeigen in ihren Reaktionen, ihren Farberscheinungen, sowie im Verhalten gegen Lösungs- mittel weitgehende Übereinstimmung. Solange solche Reaktions- produkte gemischt vorliegen, ist ihre Krystallisation erschwert. Die übliche Untersuchungsweise derartiger Chlorophyllderivate, in den Händen vieler Forscher sogar die einzige Methode, war die Spektralanalyse, und zwar nicht die viel zu schwierige vollständige Beobachtung der Absorption, sondern nur die Feststellung der Maxima. Die Methode hat auf diesem Gebiete nicht vor den schwersten Irrtümern geschützt. Sie gibt, solange die Konstanten der reinen Stoffe nicht bekannt sind, wenig Aufschluß darüber, ob die Verbindungen einheitlich und rein sind oder ob sie in Ge- mischen vorliegen. Während die spektralanalytische Methode für manche Veränderungen und Zersetzungen reiner Substanzen einen übertriebenen Ausdruck gibt, ist sie gänzlich unanwendbar für kompliziertere Mischungen von Verbindungen, deren Auflösung in Angriff genommen werden soll. x) Zum Teil nach Abh. I. Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophylldenvaten. 263 Sehr viele Abbauprodukte des Chlorophylls ändern beim Ab- dampfen der ätherischen Lösungen oder beim Umkrystallisieren oder beim Trocknen im Exsiccator ihre Farbe, also ihr Absorptions- spektrum wesentlich, und zwar oft nur infolge von sehr gering- fügigen Änderungen in ihrem Molekül, wie z. B. durch Abspaltung von Wasser. So werden die Lösungen von Glaukophyllin, welche frisch wunderschön blau sind, beim Eindampfen und Wieder- aufnehmen mit Äther mehr und mehr rhodophyllinähnlich, also rot. Spektroskopisch ist dieser Effekt viel größer als etwa der einer Verunreinigung durch Rhodop hyllin. Bei der Charakterisie- rung der Chlorophyllderivate durch ihre Absorptionsspektren ist daher der Zustand der Präparate viel sorgfältiger zu berücksich- tigen, als dies nach den Literaturangaben früher geschehen ist. Bei aller Wichtigkeit der Absorptionsspektra für die Beschrei- bung der Chlorophyllderivate war daher die spektroskopische Methode doch nur selten wertvoll für die chemische Untersuchung, auch für die Arbeit, welche die Isolierung der Farbstoffkompo- nenten zum Ziele hatte; diese Einschätzung, die schon in dei ersten Abhandlung ausgesprochen worden war, hat sich inzwischen oft bestätigt. Die Untersuchung des Chlorophylls hat Willstätter gemein- sam mit W. Mieg eingeleitet mit einer von der Spektralanalyse unabhängigen Trennungs- und Untersuchungsmethode, die sich auf die eigentümliche basische Natur aller magnesiumfreien Chloro- phyllderivate gründet. Chlorophyll selbst ist weder Base noch Säure. Die mit Alkalien entstehenden Abbauprodukte, die Phylline, haben nur sauren Charakter; solange das Molekül komplex gebundenes Magnesium enthält, kann man es nicht mit sauren Agenzien berühren, ohne Zersetzung zu bewirken. Durch Austritt des Magnesiums aus diesen Phyllinen werden die Porphyrine gebildet, Verbindungen von roter Farbe, die zu- gleich sauer und basisch reagieren. Sie sind Gegenstand der An- wendung des zu beschreibenden Verfahrens. Die dem Chlorophyll noch näherstehenden Verbindungen, Phäo- phytin und die anderen Phäophorbide, sind bedeutend schwächer 264 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. basisch als die Porphyrine. Daher erfordern sie zur Lösung Salz- säuren von hoher Konzentration und unterliegen in diesen Lösun- gen sehr leicht Veränderungen, so daß die Salzsäuremethode von Willstätter und Mieg für sie anfangs nicht anwendbar war. Erst nachdem in den letzten Jahren diese Verseifungen bestimmter Estergruppen genau definiert worden waren, konnten sie selbst bei dem Arbeiten mit starken Säuren vermieden werden. Daher beruhen die Trennungen von: Phäophytin in Phytylphäophorbid a und b mit Salzsäure von 30% der Methylphäophorbide a und b „ „ ,, 17% der freien Phäophorbide a und b „ ,, „16% auf derselben Methode und zählen zu ihren wichtigsten Anwen- dungen. Es handelt sich hier (wie im folgenden bei Phytochlorin e und Phytorhodin g), vor allem um Trennung analoger Phasen des Abbaus der beiden Chlorophyllkomponenten. Beim Verseifen von Phäophorbiden, nämlich von verschieden- artigen Phäophytinpräparaten mit alkoholischem Kali treten zwei Reihen von Verbindungen auf, die zugleich schwach sauer und schwach basisch sind: die Phytochlorine, welche in indifferenten Solvenzien olivgrüne bis grüne, in saurer Lösung blaugrüne bis blaue Farbe zeigen und die Phytorhodine, die in saurer Lösung blau bis grün, in neutraler Lösung prächtig rot gefärbt sind. Anfangs bildeten chlorophyllhaltige Extrakte das Material der Untersuchung, in denen mannigfache Veränderungen des Chloro- phylls, die heute genau erklärbar sind, namentlich Allomerisationen, eingetreten waren. Daher entstand nicht einfach je ein Chlorin und ein Rhodin aus den zwei Komponenten, sondern eine ganze Schar von Verbindungen beider Gruppen. Auch sind Estersäuren beider Gruppen, nämlich Phytochlorine durch direkte Einwirkung von Alkalien auf chlorophyllhaltige Extrakte, Phytorhodine durch Behandlung von Chlorophyllinen mit alkoholischer Chlorwasser- stoffsäure erhalten worden. Von der Reihe der Phytochlorine sind 7 Repräsentanten, die Chlorine a bis g, von der Reihe der Ph}dorhodine 10 Glieder, nämlich die Rhodine a bis k beschrieben worden. Von allen diesen Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. 265 Verbindungen hat nur je eine besondere Wichtigkeit als das bei dem glattesten Abbau entstehende, daher als normal bezeichnete Spaltungsprodukt jeder Chlorophyllkomponente, nämlich Phyto- chlorin e und Phytorhodin g. Die meisten anderen Chlorine und Rhodine sind von geringem Interesse als Chlorophyllderivate, sie werden nur als diejenigen Beispiele angeführt, mit welchen die Trennungs- und Bestimmungsmethode ausgearbeitet und beschrieben worden ist. Die Phytochlorine und Phytorhodine sind in Wasser unlöslich, in organischen Solvenzien mehr oder weniger löslich. Als schwache Säuren lösen sie sich in Alkalien, auch in Ammoniak und Bi- carbonat und werden von diesen aus ätherischer Lösung quantitativ aufgenommen. Sie enthalten nur esterifizierbare saure Gruppen, ihre Ester sind nämlich alkaliunlöslich. Alle sind schwache Basen, deren Salze durch Wasser vollständig zerlegt werden. Dabei sind ihre basischen Eigenschaften ungleich differenzierter als ihre sauren und zeigen Unterschiede und Abstufungen, wie sie bei schwachen organischen Basen noch nicht beobachtet worden sind. Um aus ätherischer Lösung in Salzsäure, die im Überschüsse angewandt wird, überzugehen, erfordern diese Verbindungen Säure von bestimmter Konzentration. Schwefelsäure und gar Phosphor- säure sind praktisch weniger gut anzuwenden, weil die nötigen Konzentrationen recht hoch sind. Für jede einzelne Substanz sind Grenzen charakteristisch, so zwar, daß Salzsäure bis zu einer gewissen Stärke der ätherischen Lösung nichts oder nur Spuren, eine etwas konzentriertere einen großen Teil, endlich eine noch stärkere so gut wie alles bei einmaligem Durchschütteln entzieht. Die Konzentration der ätherischen Lösung und die Menge der Salzsäure üben selbstverständlich auf das Resultat einen erheb- lichen Einfluß aus, den man bei der praktischen Anwendung wohl berücksichtigen muß. Natürlich rücken die Grenzzahlen, je stärker die Basen sind, desto enger zusammen, wenn man nicht die relative Konzentration der Chlorwasserstoffsäure, sondern den Prozent- gehalt der Salzsäure in Betracht zieht. Über die Grenzen bei den ersten Phytochlorinen orientiert folgende Tabelle: 266 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Phytochlorin Spuren gehen in Salzsäure von Geht sehr reichlich in Salzsäure von Geht fast vollständig in Salzsäure von a 3,5 6.5 7.5 b 1.5 3.5 5-0 c o,5 1.5 2,0 d 0,15 0.5 1,0 Den Beobachtungen liegen folgende normale Arbeitsbedingun- gen zugrunde: i — 2 ccm ätherische Lösung, die 0,1 g Substanz in ioo ccm enthält, werden mit demselben Volumen Salzsäure einmal durchgeschüttelt. Mit solchen Lösungen wurde für die Phytochlorine a und b die Verteilung zwischen Äther und Salz- säure quantitativ untersucht. Drei Portionen von je o,ioo g wurden in je ioo ccm Äther gelöst und mit je ioo ccm Salzsäure 5 Minuten lang durchge- schüttelt. Dann trennte man die Schichten und dunstete die mit wenig Wasser gewaschene ätherische Lösung vorsichtig ein; der Rückstand wurde im Vakuum über Schwefelsäure zur Konstanz getrocknet. Die nachstehende Tabelle verzeichnet die von den verschiedenen Salzsäuren aufgenommenen Anteile. Phytochlorin Prozentgehalt der Salzsäure Aufgenommene Substanz in % a 8 84,1 a 7.0 73.8 a 6,o 60,7 b 5.5 74*4 b 4,0 54.7 b 2.5 26,4 Auf der verschiedenen Basizität beruht die Möglichkeit der Trennung. Das Beispiel der Phytochlorine a und b diene wiederum zur Beschreibung. Man erhält sie gemengt mit schwächer basischen Substanzen. Schüttelt man die ätherische Lösung1) wiederholt mit 4 prozentiger und 7 prozentiger Salzsäure durch und wäscht man die beiden sauren Lösungen gründlich mit Äther, um die in jedem i) Es ist natürlich nicht notwendig, mit der Lösung des Gemisches zu arbeiten, aber die Anwendung in gepulverter Form führt schwerer zum Ziele. Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. 267 Fall mit aufgenommenen schwächeren Basen wieder herauszuholen, so gelingt es, einen ansehnlichen Teil von a und b in ziemlich reinem Zustande zu isolieren. Viel besser ist eine zweite Ausführungsweise der Fraktionierung. Ihr Prinzip besteht darin, die Verbindungen in der Reihenfolge ihrer Basizität mit so schwachen Säuren zu extrahieren, daß von den nächst schwächeren Basen nur minimale Spuren gelöst werden können. Natürlich muß man die stärksten Säuren anwenden, die dieser Bedingung noch genügen. So isoliert man im gegebenen Falle Phytochlorin b mittels 3 prozen tiger Salzsäure. Da diese aber b nicht quantitativ aus dem Äther herausholt, ist es not- wendig, danach durch wiederholtes Ausschütteln mit 4,5 prozen- tiger Säure eine Mittelfraktion abzutrennen, ehe man an die Extraktion von a geht. Hierfür dient nunmehr 6 prozentige Säure. Auch diesmal sind die (3- bzw. 6 prozentigen) salzsauren Lösungen der Phytochlorine mit Äther zu waschen. Dann erhält man schon bei der einmaligen Fraktionierung die Substanzen in reinem Zustande. Etwas abgeändert wird das Verfahren, um die Chlorophyll- derivate vollkommen zu reinigen, wenn sie schon in ziemlich reinem Zustande vorliegen, beispielsweise so, wie sie bei der ersten, hinsichtlich der Ausbeute vorteilhafteren Art des Trennungs- verfahrens erhalten wurden. So löst man Phytochlorin a in Äther auf, wäscht die Lösung wiederholt mit 4,5 prozen tiger Salzsäure durch und extrahiert dann die Base mit 6,5 prozentiger Säure. Auf dieselbe Weise werden dann die schon gereinigten Sub- stanzen wieder in Fraktionen zerlegt und deren Identität bewiesen. Anwendbar ist die Methode gerade bei diesen gefärbten Stoffen. Es ist nur hier ein leichtes, für jeden Fall die zur Isolierung ge- eigneten Säuren auszuprobieren und nach der Farbintensität der Auszüge den extrahierten Anteil zu schätzen. Dabei ist es wichtig, verschiedene Auszüge einer Substanz hinsichtlich der Farbnuance zu vergleichen, um zu beurteilen, ob sie einheitlich ist. Eine ähnliche Trennung der Chlorophyllderivate mit Alkalien ist nicht möglich, da ihre Alkalisalze im allgemeinen weit weniger hydrolytisch gespalten werden, aber man kann, allerdings viel weniger gut, mit Hilfe von Alkalien nach den gemeinhin üblichen 268 R- Willstatter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Methoden fraktionieren. So wurde z. B. bei der Reinigung von Phytorhodin f , dem nach einer rohen Fraktionierung mit Salzsäure noch recht ähnlich basische Verbindungen beigemengt waren, der- art verfahren, daß man den zur Neutralisation erforderlichen Be- trag von Alkali sehr verdünnte, in eine Reihe von Portionen teilte und mit diesen sukzessive die ätherische Lösung ausschüttelte. Dann wurden die wieder in Äther gebrachten Fraktionen nach ihrer Farbe beurteilt. Eine solche Ergänzung der in saurer Lösung ausgeführten Fraktionierung ist nur ausnahmsweise nötig gewesen. Fast stets erhielten wir dabei die Verbindungen in einheitlichem Zustande, so daß sie ohne weitere Reinigung aus ätherischer Lösung gut krystallisierten. Die farblosen Verunreinigungen der Chlorophyll- derivate, wie Fette, Wachse, die sich durch bloßes Umkrystallisieren schwer abtrennen lassen, sind durch das Aufnehmen mit verdünnter Säure beseitigt. Nicht weniger wertvoll als für die Trennung ist die Fraktio- nierungsmethode für die qualitative Analyse, nämlich die Be- stimmung der Abkömmlinge des Chlorophylls. Bei allen möglichen Reaktionen, die zu einigermaßen basischen Stoffen führen, kann man die Reaktionsprodukte schon im Reagensglastropftrichter untersuchen, indem man die ätherischen Lösungen mit Salzsäuren von abgestufter Konzentration durchschüttelt. Man beobachtet, ob die Produkte Gemische oder einheitlich sind und vermag sie nach ihrer Basizität einzuordnen. Die geringsten Veränderungen der beschriebenen Chlorophyllderivate beim Trocknen in der Wärme oder beim Aufbewahren wurden dadurch auffällig. Um die beschriebene Methode zur Untersuchung der Phylline anzuwenden, zersetzt man dieselben mit Säure und prüft die ent- stehenden Porphyrine ; aus der Basizität eines Porphyrins und aus seiner Einheitlichkeit kann man auf das zugrunde liegende Phyllin zurückschließen. 2. Die Salzsäurezahl. Die in den Beispielen für die Salzsäuremethode angeführten Phytochlorine a, b, c, d haben keine Bedeutung für den Abbau Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. 269 des Chlorophylls. Die wichtigeren magnesiumfreien Chlorophyll- derivate sind in den folgenden drei Tabellen angeführt, die über ihre basischen Eigenschaften orientieren. Die Konzentration der Salzsäure, die unter den üblichen Arbeitsbedingungen eine reichliche Menge der Substanz aus Äther extrahiert, ist für die präparativen Zwecke so bedeutsam, daß sie besonders gekennzeichnet werden soll. Wir nennen daher in den Tabellen und im Folgenden „Salzsäurezahl“ den Prozentgehalt derjenigen Säure, die einem ihr gleichen Volumen ätherischer Lösung beim Durchschütteln ungefähr zwei Drittel der gelösten Substanz entzieht. Zweckmäßig wendet man für diese Prüfung 0,02 g in 100 ccm Äther an oder, wenn die Löslichkeit geringer ist, eine gesättigte ätherische Lösung. Die Salzsäurezahl läßt sich im Reagensglas hinlänglich genau ermitteln. Sie gibt einen Ausdruck für die den Chlorophyllderi- vaten eigentümliche, bei anderen Verbindungen noch nicht be- obachtete Erscheinung, daß das Verhältnis, in welchem sich die Base zwischen gleichen Volumen Äther und wässeriger Säure ver- teilt, mit der Säurekonzentration außerordentlich stark veränder- lich ist und daß daher eine Variation des Säuregehaltes von wenigen Prozenten ausreicht, um den Wert des Verhältnisses von an- nähernd Null auf nahezu Unendlich zu treiben. Infolgedessen ist es für die Beschreibung der basischen Eigenschaften unerheblich, daß hier zumeist nicht eine genaue Verteilung zwischen Äther und Salzsäure, sondern nur der reichliche Übergang aus Äther in die Säure angegeben wird. 1. Phäophorbide. Spuren gehen in Salzsäure von Salzsäure- zahl Geht fast vollständig in Salzsäure von Phäophytin a 25 29 32 Phäophytin b 30 35 Methylphäophorbid a 13 16 18 Methylphäophorbid b 17 21 23 Phäophorbid a 12 15 17 Phäophorbid b 16 I91/* 22 2yo R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 2. Phytochlorine und Phy torhodine. Spuren gehen in Salzsäure von Salzsäure- zahl Geht fast vollständig in Salzsäure von Phytochlorin e 7s 3 4—5 Phytochlorin f 7 IO 12 Phytochlorin g 8 IO II 12—13 Phytorhodin g 6 9 11 Phytorhodin i 11 15 — 16 20 Phytorhodin k 9 14— 141/* 18 3. Porphyrine. Spuren gehen in Salzsäure von Salzsäure- zahl Geht fast vollständig in Salzsäure von Glaukoporphyrin 2 4—5 6 Cyanoporphyrin 1 4 5 Rhodoporphyrin 2 3 4 Erythroporphyrin — — — Rubiporphyrin *7. 47s 67s Pyrroporphyrin V, *7. 3 Phylloporphyrin Y10 7* J7s Ätioporphyrin 1 3 4 Eine weitere Anwendung der Bestimmungsmethode von Will- stätter und Mieg war bei den Verbindungen von Erfolg, welche durch die Enteisenung des Hämins entstehen. Es handelt sich nach Willstätter und M. Fischer *) in der Hämatoporphyrin- gruppe um eine Reihe einander sehr nahe stehender Verbindungen, deren Definition und Unterscheidung wichtig ist. Sie gelingt mit Hilfe der Salzsäurezahlen, und zwar schon mit den geringsten Mengen, während sonst kein Mittel für diesen Zweck bekannt ist. 4. Die Porphyrine aus Hämin. Spuren gehen in Salzsäure von Salzsäure- zahl Geht fast vollständig in Salzsäure von Hämatoporphyrin 0,033 0,1—0,15 0,4 Häminoporphyrin 0,033 0,15 °-4 Hämidoporphyrin 0,2 1,0 2,5 Hämoporphyrin 0,15 o,75 2,0 Mesoporphyrin °.5 1— 1.5 3.° Ätioporphyrin 1,0 3-0 4-° *) Unveröffentlicht. Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. 27 1 3. Die Verteilungszahl1). Die Salzsäurezahl kennzeichnet das basische Verhalten nicht vollständig, indessen für die Erkennung vieler Chlorophyllderivate hinreichend; für die Unterscheidung der einander in der Basizität nahestehenden Verbindungen ist eine genauere Zahl erforderlich. Das Verhalten einer solchen basischen Verbindung würde voll- kommener beschrieben mit ihrer Verteilung als Funktion des Volumenverhältnisses von Äther zu Säure, und zwar für verschie- dene Säurekonzentrationen ; namentlich wäre für die Konzentration der Salzsäurezahl die Verteilung der Base zwischen Säure und Äther in ihrer Abhängigkeit vom Volumverhältnis der beiden Schichten zu ermitteln. Aus dieser Verteilung könnte die Salz- säurezahl abgeleitet werden. Für den genaueren Ausdruck des basischen Charakters mittels einer Konstanten hat es genügt, die Verteilung der Basen für ein einziges Volum Verhältnis von Äther zu Salzsäure, für eine Salzsäurekonzentration und eine Konzentration der ätherischen Lösung zu ermitteln. Aus praktischen Gründen wählen wir zwar ungefähr dieselbe Stärke der Säure, aber nicht das Volumver- hältnis 1 : 1 wie bei der Salzsäurezahl, sondern das Volumverhält- nis 1 Salzsäure : 10 Äther und eine sehr geringe Konzentration der Substanz im Äther. Den Bruchteil einer Substanz in Prozenten, der in Salzsäure von bestimmter Konzentration unter gewissen Bedingungen aus ätherischer Lösung übergeht, bezeichnen wir als Verteilungszahl. Diese Bedingungen sind: 3 mg Substanz in 1 1 Äther, 100 ccm Salzsäureschicht. Die Salzsäurekonzentration kann natürlich nicht nur die von der Salzsäurezahl ausgedrückte sein, sondern man wird für Ver- gleiche öfters irgend eine andere, zur Extraktion anwendbare Säure wählen. Wir wenden nämlich für den Vergleich der einander nahestehenden Verbindungen eine und dieselbe Salzsäure an, z. B. Vzprozentige für Phylloporphyrin und Pyrroporphyrin, deren Salz- säurezahlen 3/i und 1V2 sind. x) Unveröffentlicht. 272 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Während die Salzsäurezahl die für die Extraktion einer Ver- bindung zweckmäßige Säurekonzentration angibt, zeigt die Ver- teilungszahl den Unterschied in den basischen Eigenschaften auch einander ähnlicher Verbindungen deutlich und ermöglicht die sichere Identifizierung eines Chlorophyll- ödes Häminderivates. Bestimmung: Von der gewichtskonstanten Substanz werden 3 mg in einigen Kubikzentimeter ätherhaltiger starker Salzsäure gelöst und durch Neutralisieren mit Ammoniak in 1 1 Äther über- geführt, dem zur Erhöhung des Lösungsvermögens 50 ccm Sprit zugesetzt sind. Der Alkohol wird mit 5 1 destillierten Wassers weggewaschen und durch Zusatz von Äther das Volumen der Lösung auf 1 1 gebracht. Mit 100 ccm der geeigneten Salzsäure, deren Prozentgehalt durch Titration oder mit dem Aräometer bestimmt worden, schütteln wir nun die ätherische Lösung eine Minute lang tüchtig durch; die Volumen Vermehrung (ca. 10 ccm) der salzsauren Schicht durch Aufnahme von Äther wird gemessen und berücksichtigt. Für die colorimetrische Bestimmung der extrahierten Substanz kann a) die salzsaure Lösung des im Äther hinterbliebenen Anteüs oder besser b) eine neue Vergleichslösung derselben Substanz dienen. Im ersteren Fall extrahieren wir den im Äther hinterbliebenen Rest mit stärkerer Salzsäure und verdünnen mit ätherhaltigem Wasser bis auf die Säurekonzentration des ersten Auszugs. Im zweiten Fall lösen wir weitere 3 mg der Substanz in so- viel ätherhaltiger, konzentrierter Salzsäure (20 — 35prozentig, je nach der Löslichkeit), daß beim Verdünnen mit äthergesättigtem Wasser bis aufs Volumen des zu bestimmenden Auszugs eine Salz- säure vom Prozentgehalt des letzteren entsteht. Sind die Colorimeterschichten der Versuchslösung hx und der Vergleichslösung (nach b) h2, so ist die Verteilungszahl • 100. Beispiel: Die Verteilungszahl diente zur Prüfung eines durch Abbau von Hämin gewonnenen neuen Porphyrins, des Hämo- porphyrins, auf seine Einheitlichkeit. Es ist durch Ausziehen mit verdünnten Salzsäuren aus Äther in vier Fraktionen zerlegt worden. Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. 273 Diese stimmten in den Verteilungszahlen genau überein, waren also identisch. Eine andere Anwendung der Verteilungszahlen besteht im Ver- gleich verschiedener Darstellungen einer Substanz. Die folgende Tabelle macht dies ersichtlich und gibt zugleich Anhaltspunkte für die Differenzen bei der Bestimmung. Verteilungszahlen einiger Chlorophyll- und Hämin- derivate. Substanz Darstellung Salzsäure- konzen- tration m °/o Ver- teilungs- zahl Phylloporphyrin aus Phytochlorin e °.5 33,4 aus Phytorhodin g Nebenprodukt von Rhodophyllin (Präp. von Willstätter und °.5 37- 1 Fritzsche 1909) 0.5 35-7 Pyrroporphyrin aus Methylchlorophyllid b aus Chlorophyll a über Pyrro- 0-5 34.6 phyllin o,5 4-8 aus Phytorhodin k °,5 3,8 aus Phytorhodin i o,5 4>4 Glaukoporphyrin aus Glaukophyllin 3-5 15,4 Rhodoporphyrin aus Rhodophyllin 3-5 18, X Rubiporphyrin aus Rubiphyllin 3,5 7-4 Phytorhodin k aus allomerem Chlorophyll b 15,0 7-8 Phytorhodin i aus allomerem Chlorophyll b 15-0 4,2 Mesoporphyrin aus Mesohämin o,5 12,9 Mesoporphyrin nach Nencki und Zaleski 0-5 ii,8 Phonoporphyrin aus Hämatoporphyrin o,5 23.5 Ätioporphyrin aus Chlorophyll 3.0 40,2 Ätioporphyrin aus Hämin 3,o 43,i Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 18 XV. Die Phäophorbide a und b. i. Trennung des Phäophytins in die Komponenten. Die isolierten Chlorophyllkomponenten liefern durch Spaltung mit Säure ihre reinen magnesiumfreien Derivate. Für diese Bil- dung ist es nicht nötig, die Chlorophyllpräparate zuerst abzu- scheiden, man kann ebensogut die nach Willstätter und I s 1 e r fraktionierten Chlorophyll lösungen an wenden 1 ) . Zum Bei- spiel wird eine petrolätherische Lösung des Chlorophylls a, wie sie beim Überführen des Chlorophylls in 95 prozentigem Methyl- alkohol hinterbleibt, von beigemischtem b durch Waschen mit 90- und 95 prozentigem Holzgeist gänzlich befreit und dann mit alkoholischer Oxalsäure zersetzt. Beim Einengen und wiederholten Abdampfen mit Alkohol wird das Rohphäophytin a in filtrierbarer Form abgeschieden. Die Darstellung der Phytylphäophorbide aus den Chlorophyll- komponenten ist umständlich und kostspielig; viel wichtiger ist die Fraktionierung des Phäophytins nach der Methode von Will- stätter und Mieg. Diese Methode haben Willstätter und Isler 2) für die Iso- lierung von Phäophytin b angewandt, während sie die Kompo- nente a, welche durch die Extraktion mit der erforderlichen starken Salzsäure leicht verseift wird, nicht als solche isolieren konnten, sondern auf freies Phäophorbid a verarbeiteten. Wir haben das Verfahren so verbessert, daß es die beiden Phytyl- verbindungen unversehrt und sogar in größerem Maßstab zu ge- winnen erlaubt. !) Ann. d. Chem. 390, 321, 323 [1912]. 2) Ann. d. Chem. 390, 324 [1912]. 1 Die Phäophorbide a und b. 275 Neues Verfahren1). Die Fraktionierung des Phäophytins erfordert mindestens 27prozentige Salzsäure. Diese hochprozentige Säure nimmt viel Äther auf und erhitzt sich dabei sehr stark, so daß sich die Hydro- lyse des in die Säure gehenden Anteils nicht vermeiden läßt. Wir verwenden nun eine zuvor mit Äther gesättigte und abgekühlte Salzsäure, und zwar, um die Fraktionierung rasch durchführen zu können, eine stärkere. Infolge der Vorbehandlung der Säure mit Äther kann eine konzentriertere Phäophytinlösung der Trennung unterworfen werden. Die Extraktion der Komponente a geschieht mit 30 prozentiger, die Reinigung von b mit 31 prozentiger Salzsäure, die wir in folgender Weise in äthergesättigtem Zustand bereiten. 7 1 konzentrierte Salzsäure (spez. Gewicht 1,19, d. i. 37,5% bei 15 °) kühlen wir von 15 0 durch Einträgen von Eisstücken und Umrühren auf 0 — 1° ab. Gerade wenn diese Temperatur erreicht ist, zeigt das Aräometer 31,5% Chlorwasserstoff an oder beim Erwärmen einer Probe auf 15 0 genau 30%. Die kalte Säure wird in drei Portionen mit dem gleichen Volumen Äther geschüttelt. Sie nimmt 90 Volumprozente Äther auf und erwärmt sich dabei auf 28 — 29 °. Im Fall der 31 prozentigen Säure wird die 37 prozen tige von 15 0 durch Zusatz von Eisstücken nur auf 2 — 30 gebracht. Dann ist die Aräometerangabe 32,3%, d. i. soviel als 31 beim Erwärmen einer Probe auf 15 °. Diese zweite Säure nimmt beim Sättigen mit Äther 93 Volum- prozent auf. Die Salzsäureäthermischungen werden für die Anwendung wieder auf o° abgekühlt. 12 g Phäophytin, dessen Komponentenverhältnis 2,5 ist, werden zerkleinert mit 2 1 Äther bis zur Auflösung an der Maschine ge- schüttelt. Zuerst empfiehlt es sich, noch in der Schüttelflasche eine Reinigung durch Waschen der Ätherlösung mit 100 ccm 22,5 prozentiger Salzsäure vorzunehmen, sie fällt oft eine Spur b Unveröffentlicht. 276 R- Willstätter und Ä. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Verunreinigung aus, die Emulsionen verursacht, und entfernt zu- gleich etwas beigemischtes alkoholysiertes Phäophytin. Wir fil- trieren die gesamte Flüssigkeit in einen Scheidetrichter, lassen die salzsaure Schicht ab, und ergänzen das Äthervolumen auf 3 1. Dann erfolgt die Trennung durch eine Reihe von Ausschütte- lungen mit der beschriebenen 30 prozentigen Säure. Die einzelnen mit je 2 1 Säure unter vorsichtigem Durchschütteln erhaltenen tiefblauen Auszüge kommen jeder für sich, auch wenn er von Äther getrübt ist, so schnell als möglich in einen zweiten mit 1/2 1 Äther beschickten Scheidetrichter und werden durch kurzes Um- schütteln von ein wenig beigemischter Komponente b befreit. Dann läßt man die saure Schicht sofort in einen dritten Scheide- trichter mit viel Wasser fließen, wobei die Komponente a voll- ständig in den sich reichlich abscheidenden und zur Lösung hin- reichenden Äther geht. Nach jedem Auszug mit der 30 prozentigen Salzsäure wird das Volumen der Ätherlösung mit V2 1 ergänzt, und zwar mit dem etwas b enthaltenden Waschäther des vorigen Auszuges; die an- gewandte Säure hat nämlich noch 25 Volumprozent Äther ge- schluckt, da sie nur bei etwa 30 0 mit Äther gesättigt worden. In derselben Weise haben wir mit raschem Waschen, wobei der Waschäther immer ärmer an a und immer mehr braun wird, und sofortigem Verdünnen achtmal ausgezogen und die Ätherlösung der Komponente a, im ganzen 5 — 6 1, gesammelt. Sie enthält nur sehr wenig freies Phäophorbid, das man durch Waschen mit 1/2 1 25 prozentiger Salzsäure leicht entfernen kann. ; Die hinterbleibende ätherische Lösung der Komponente b, un- gefähr 3 1, ist noch unrein. Sie muß 4 — 5 mal mit je 1 1 der vor- bereiteten 31 prozentigen Säure ausgeschüttelt werden. Die ersten Waschflüssigkeiten sind noch blaugrün, die letzteren sind fast rein grün und geben beim Überführen in Äther schon eine rötlich braune Lösung, deren Phasenprobe braunrot bis rot ausfällt. Das? Volumen der b-Lösung wird nicht ergänzt, es beträgt am Ende etwa 2 1. Die Farbe ist tief rotbraun, die Phase mit methyl- alkoholischem Kali rein rot; freies Phäophorbid b wird von der kalten Säure nicht gebildet. Die Phäophorbide a und b. 2 77 Schließlich waschen wir die ätherischen Lösungen der beiden Komponenten mit Wasser bis zum Verschwinden der saueren Reaktion und dampfen nach kurzem Trocknen mit Natriumsulfat auf je V2 1 ein. Dann filtrieren wir nochmals in einen 3/4 1-Kolben, dampfen zuletzt unter Umschwenken auf etwa ioo — 150 ccm ein und fällen die Produkte mit Alkohol aus, nämlich a mit V2 1 85 prozentigem, b mit 1/2 1 90 prozentigein Alkohol. Die Nieder- schläge fallen gut filtrierbar aus, die Mutterlaugen sind sehr hell. Die Komponente b wird vollkommen homogen erhalten, a hin- gegen mit einer durch die Spaltungsprobe gut nachweisbaren Beimischung von b, jedenfalls weniger als 5%. Ausbeute: a 6,8 g, b 3,2— 3,3 g! die Verluste durch alle Rei- nigungsoperationen betrugen also im ganzen nur etwa 15%. Um das Phäophytin a auch ganz einheitlich zu gewinnen, wiederholen wir die Fraktionierung mit Salzsäure in folgender Weise. 10 g der oben beschriebenen Darstellung werden in 2,5 1 Äther wieder aufgelöst. Wie bei der ersten Trennung ziehen wir achtmal mit je 2 1 der äthergesättigten kalten 30 prozentigen Salzsäure aus und halten das Äthervolumen bis zur sechsten Ausschüttelung konstant, während es am Ende abnehmen darf. Dabei bleiben gegen 10% der Substanz, ein Gemisch von b mit a, mit brauner Farbe im Äther zurück. Jeder einzelne sauere Phäophytinauszug kommt sofort in einen großen Scheidetrichter, durch den wir mit Vorsicht beständig einen Strom Wasser fließen lassen. Die verdünnte Säure fließt grünlich ab und nimmt etwas hydrolysiertes Phäophytin mit. Immerhin ist es zweckmäßig, die ätherische Lösung noch ein- bis zweimal mit je 1/2 1 25prozentiger Salzsäure davon frei zu waschen, dann mit Wasser bis zur neutralen Reaktion. Am Ende wird der Äther auf 1 1 abgedampft, filtriert und weiter auf 150 ccm ein- geengt. Dann fällen wir das reine Phytylphäophorbid a mit V2 1 85 prozentigem Alkohol aus, unter kräftigem Umschütteln, um ein Zusammenbacken der voluminösen Ausscheidung zu ver- hüten. Die Ausbeute beträgt 8,6 g. 278 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 2. Fraktionierung der Methylphäophorbide1). Das Ausgangsmaterial ist das Gemisch der Methylchlorophyllide. Nachdem man es auf Grund verschiedener Verteilung zwischen Äther-Petroläther und Holzgeist in seine beiden Komponenten zerlegt hat, lassen sich aus ihnen die einheitlichen Methylphäo- phorbide sehr leicht und in quantitativer Ausbeute durch Ein- wirkung von Säure darstellen. Die ätherische Lösung des Methyl- phäophorbids a wird mit 10 prozen tiger, die von b mit 15 prozen- tiger Salzsäure ein paar Minuten geschüttelt, etwas länger als für den vollständigen Farbumschlag nötig ist, damit die Prä- parate ganz aschefrei werden. Bei mäßigem Einengen der äthe- rischen Lösungen krystallisieren die schwer löslichen Phäophorbide prachtvoll aus. Viel leichter ausführbar und exakter ist aber die Trennung der magnesiumfreien, daher säurebeständigen Derivate auf Grund ihrer etwas verschiedenen Basizität, also durch Anwendung der Methode von Willstätter und Mieg. Daher ist es rationeller, zuerst aus dem Gemisch der beiden Methylchlorophyllide mit Säure das Magnesium zu entfernen und dann die Fraktionierung des gebildeten Methylphäophorbidgemisches mit 17 prozentiger Salz- säure vorzunehmen. Diese Konzentration entspricht der Salz- säurezahl der Komponente a, während b von 16- bis 17 prozentiger Säure nur spurenweise und erst von 21 prozentiger reichlich auf- genommen wird. 2 g Methylchlorophyllidgemisch (etwa 2 Teile a, 1 Teil b ent- haltend) lösen wir in wenig Pyridin und tragen es in 4 1 Äther ein; wegen der Schwerlöslichkeit des entstehenden Methylphäo- phorbids b ist es nötig, in so verdünnter Lösung zu arbeiten. Bei kräftigem Durchschütteln der ätherischen Lösung mit 17 prozen- tiger Salzsäure erfolgt der Farbumschlag und die Zersetzung der komplexen Verbindung, während zugleich die Extraktion des Methylphäophorbides a beginnt. Die Säure färbt sich tiefblau an; sechsmaliges Ausschütteln mit je 1 1 der Säure ist erforderlich, bis diese nur noch schwach blaue Farbe zeigt. Die Salzsäure wirkt x) Ann. d. Chem. 387, 370 [1912]. Die Phäophorbide a und b. 279 auf die eine leicht verseifbare Estergruppe allmählich hydro- lysierend ein; die saure Lösung bleibt deshalb nicht unnötig stehen, sondern man läßt sie aus dem Scheidetrichter in einen zweiten fließen, wo sie zur Entfernung einer Spur mitgerissenen Methylphäophorbids b und unter Verlust von ein wenig a mit Äther gewaschen wird. Diesen Waschäther von jedem einzelnen salzsauren Auszug geben wir in den ersten Scheidetrichter zurück und halten dadurch das Volumen der ätherischen Schicht kon- stant. Jeder salzsaure Auszug fließt sofort nach dem Waschen in einen dritten Scheidetrichter, wird hier mit dem gleichen Volumen Wasser und mit n/100-KOH gewaschen, die bei schnellem Arbeiten nur ganz wenig freies Phäophorbid zu beseitigen hat. Dann trocknen wir die olivgrüne Ätherlösung und dampfen sie langsam ein, bis auf etwa 100 ccm; das Produkt ist so rein, daß man es nicht in Fraktionen zu isolieren braucht. Während des Abdampfens krystallisiert das Methylphäophorbid a in einzeln aus- gebildeten Krystallen von prächtigem, violettschwarzem Glanz aus. Für die Reinigung der Komponente b wird nach dem Aus- ziehen der Hauptmenge von a die ätherische Lösung noch zwei- mal mit etwas 18 prozentiger Salzsäure und mit Wasser gewaschen und dann abgedampft; schon in der Wärme vom Beginn des Ein- engens an krystallisiert das reine Methylphäophorbid b in metall- glänzenden dunkelgrauen Blättchen. Die Ausbeute ist nur von der Zusammensetzung des ange- wandten Methylchlorophyllidgemisches abhängig; bei dem an- gegebenen Verhältnis beträgt sie 1 g Methylphäophorbid a und 0,5 g von b. Die Äthylphäophorbide lassen sich mit dem Salzsäureverfahren ebenso wie die Methylverbindungen trennen; auch hier ist i7pro- zentige Säure geeignet. 3. Umesterung des Phäophytins mit Chlorwasserstoff und Alkohol1). Für das Chlorophyll bietet allein die Anwendung der Chloro- phyllase die Möglichkeit, Veränderungen an der Phytolestergruppe *) Unveröffentlicht. 280 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. vorzunehmen und auf diese zu beschränken. Saure Medien sind wegen der Empfindlichkeit des Magnesiumkomplexes ausge- schlossen, alkalische wegen der Veränderlichkeit der Lactam- gruppen und der Verseifbarkeit auch der zweiten Estergruppe. Hingegen gelingt es beim Phäophytin, das sich unter der Wir- kung der Chlorophyllase nur träge umsetzt, lediglich die Phytol- estergruppe mit Hilfe von Säure umzuwandeln, nämlich mit den einfachen Alkoholen bei Gegenwart von etwas Chlorwasserstoff nach der Methode von A. Haller umzuestern oder mit starker wässeriger Salzsäure zu verseifen. Hierauf beruhen wichtige prä- parative Methoden, wovon zunächst die Gewinnung des Methyl- phäophorbids beschrieben wird. Phäophytin löst sich in Holzgeist auch in der Wärme nur schwer, viel leichter aber bei Gegenwart von nur wenig Chlorwasserstoff. Die Flüssigkeit fluoresciert sehr lebhaft dunkeirot and ist tief- blau, merkwürdig übereinstimmend bei den Phäophorbiden der a- und b-Reihe, die sich nur durch das mehr blaue Tingieren von a und mehr grünliche von b unterscheiden und durch die dunklere Nuance der Fluorescenz von a. io g Phäophytin werden möglichst fein zerdrückt, mit 1 1 Methyl- alkohol angeschüttelt und unter Umrühren, damit die Substanz nicht zusammenklebt, mit ioo ccm 22 prozentiger methylalkoholi- scher Chlorwasserstoffsäure versetzt. Beim Kochen unter Rück- fluß wird die Methanolyse in 1 Stunde vollständig. Dann wird eine Probe nach dem Überführen in Äther quantitativ von 22 pro- zentiger Salzsäure extrahiert, während sich diese mit ätherischer Phäophytinlösung gar nicht anfärbt (Basizitätsprobe). Die Flüssigkeit wird etwas abgekühlt, in 4 1 Äther eingegossen und der Methylalkohol mit Wasser herausgewaschen. Nun kry- stallisiert aus der Lösung, noch ehe sie eingeengt worden, ein Teil des Methylphäophorbidgemisches aus, worin die Komponente b sehr angereichert ist. Das Filtrat wird bis auf etwa 300 ccm eingedampft, wobei sich eine schöne Krystallisation der Methyl- verbindung abscheidet, überwiegend Komponente a. Endlich i) Compt. rend. 143, 657 [1906]; 144, 462 [1907]; 146, 259 [1908]. — A. Haller und Youssoufian, Compt. rend. 143, 803 [1906]. Die Phäophorbide a und b. 281 erhalten wir bei stärkerem Konzentrieren eine kleinere dritte Frak- tion, die beinahe nur aus a-Methylphäophorbid besteht. Diese einzelnen Krystallisationen eignen sich infolge der Anreicherung der Komponenten besonders zum Fraktionieren nach der oben beschriebenen Salzsäuremethode. Die gesamte Ausbeute beträgt 6,2 g, d. i. 90% der Theorie. Die ätherische Mutterlauge, die sich mit 22 prozentiger Salz- säure entfärben ließ , enthält das abgespaltene Phytol , aber nicht in unveränderter Form. Das beim Eindampfen in einer Ausbeute von 3,1 g hinterbleibende öl ist zum Unterschied vom Phytol in Holzgeist nur mäßig löslich und erweist sich bei der Metoxylbestimmung in der Hauptsache als Phytol- methyläther. 4. Bildung und Trennung der freien Phäophorbide1). Freies Phäophorbid, ein Gemisch beider Komponenten, bildet sich beim Ansäuern von Chlorophyllid oder durch Hydrolyse von Methylchlorophyllid mit Salzsäure. In diesem Fall reicht die zur Fraktionierung des Gemisches geeignete i6prozentige Säure nicht zur Hydrolyse hin, aber es bedarf auch nicht so konzentrierter Salzsäure wie für die Hydrolyse der Phytylver- bindungen. Wir lösen 2 g Gemisch der beiden Methylchlorophyllide mit Hilfe von Pyridin in 4 1 Äther und extrahieren dreimal mit je 1/2 1 25 prozentiger Salzsäure. Die saure Lösung bleibt bei Zimmer- temperatur 2 Stunden stehen. Dann ist die Hydrolyse, deren Verlauf man durch Ausäthem von Proben und Versetzen mit n/100-KOH verfolgt, so gut wie beendigt. Wir äthem die Sub- stanz aus und fällen sie durch Einleiten von trockenem Ammoniak- gas als braunes, flockiges Ammonsalz, das mit Talk gesammelt und abfiltriert wird; etwas übriggebliebener Ester befindet sich im Filtrat. Die Carbonsäure wird wieder frei gemacht, indem wir den Talk alsbald auf der Nutsche mit ein wenig Chlorwasserstoff *) Ann. d. Chem. 387, 378 [1912]. 282 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. enthaltendem Aceton extrahieren. Das Filtrat trägt man in Äther ein, wäscht das Aceton heraus und führt nun wie beim folgenden Verfahren die Fraktionierung des Gemisches durch. Die Ausbeute betrug 1,0 g Phäophorbid a und 0,55 g von b. Gewinnung durch Hydrolyse von Phäophytin. Prak- tisch wichtiger ist die Hydrolyse des Phäophytins, durch welche die beiden freien Phäophorbide zu den leichtest zugänglichen und schönsten Ausgangsmaterialien für künftige Untersuchungen werden. Das Phäophytin darf nur aus den zwei reinen Kompo- nenten bestehen, also bei der Spaltungsprobe keine schwach basischen Verbindungen liefern, da sonst den beiden Kompo- nenten ihre allomerisierten Derivate beigemischt bleiben. Die ätherische Lösung des Phäophytins wird ohne Kühlung in konzentrierte (34 — 35 prozentige) Salzsäure eingetragen, z. B. 4 g Phäophytin mit etwa 800 ccm Äther in 2 1 Säure. Schon nach 3/4 — 1 Stunde zeigt eine Probe, daß quantitativ Carbonsäure ge- bildet ist. Nun versetzen wir die Salzsäure mit 800 ccm Wasser und beseitigen das Phytol durch Ausäthem. Die saure Lösung wird sodann weiter verdünnt und der Farbstoff mit etwa 7 1 Äther extrahiert; man darf dabei nicht zu wenig Äther an wenden, da sonst Phäophorbid ausfällt. Nach dem Einengen der ätherischen Lösung auf 5 1 ziehen wir aus dem Gemisch der Carbonsäuren das Phäophorbid a fünfmal mit je 1 1 16 prozentiger Salzsäure aus. Die einzelnen salzsauren Auszüge werden mit 200 ccm Äther ge- waschen und der Waschäther jedesmal zur ätherischen Mutter- lauge zurückgegeben. Diese haben wir, um die letzten Spuren von a zu beseitigen, noch zweimal mit 1/i 1 17 prozentiger Salz- säure ausgeschüttelt. Für präparative Zwecke lohnt es sich nicht, diesen Auszug zu verarbeiten. Nach der Reinigung durch die 17 prozentige Säure bleibt einheitliches Phäophorbid b zurück, dessen Lösung nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen eingedampft wird (Ausbeute 0,9 g). Die Komponente a braucht nur aus der salzsauren Lösung unter Verdünnen mit Wasser in Äther übergeführt zu werden und krystallisiert auch vollständig beim Konzentrieren (1,6 g). 283 Die Phäophorbide a und b. 5. Beschreibung der Phäophorbide. Phytylphäophorbide 1). Die Komponente a [C32H32ON4] (COOCH3) (COOC20H39) -f 1/2U20 löst sich in absolutem Alkohol in der Kälte schwer, in der Hitze ziemlich leicht mit sepiabrauner Farbe; ein kleiner Gehalt an Wasser drückt die Löslichkeit stark herunter. Aus der alkoho- lischen Lösung scheidet sich die Substanz bei raschem Abkühlen grobflockig, bei langsamem mehr körnig aus und in Gebilden, die sich unter dem Mikroskop als baumartig verzweigte krystallinische Aggregate ohne scharfe Begrenzungen erweisen. Äther löst das Phäophytin a leicht, wenn auch langsam; in Benzol und Aceton ist es sehr leicht, in Chloroform und Pyridin spielend löslich, in Petroläther schwer löslich. Die starken Lösungen sind olivbraun, die verdünnteren olivgrün, ähnlich denjenigen des Phytochlorins e, aber zum Unterschied von diesem schwach rot fluorescierend. In Eisessig löst es sich in der Kälte ziemlich schwer, warm mäßig mit violettstichig brauner Farbe, in Ameisensäure hingegen schon kalt sehr leicht mit indigblauer Farbe. Getrocknet bildet die Phytylverbindung blauschwarze, zähe, etwas wachsartige Klumpen; im Schmelzpunktsröhrchen tritt bei 110 — 1140 Zusammensintern ein, dann bis 120 0 Übergang in zäh- flüssigen Zustand. Mit konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge gibt das Phäo- phytin a die gelbe Phase, aber sie geht noch rascher vorüber als bei der Magnesiumverbindung. Auch bei dem Phäophytin tritt dann in der alkalischen Lösung chlorophyllgrüne Farbe auf, die durch die Bildung eines Komplexes erklärt wird, in welchem das Kalium dieselbe Funktion hat wie das Magnesium im Chlorophyll2). Diese Komplexbildung tritt nur bei großer Alkalikonzentration ein. Die Salzsäurezahl der Komponente a ist 29, die saure Lösung ist rein blau. Beim Unterschichten einer gekühlten Ätherlösung mit konzentrierter Salpetersäure färbt sich der Äther schön violett- blau; die Komponente b gibt bei dieser Reaktion nur kurz eine l) Ann. d. Chem. 390, 332 [1912]. *) Siehe Kap. XVI, Abschn. 3. 284 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. grüne Farbe, die infolge tiefergreifender Einwirkung in Rotbraun umschlägt. Das Phäophytin b [C32H30O2N4] (COOCH3) (COOC20H39) ist viel schwächer basisch; seine Salzsäurezahl ist 35, die sauren Lösungen sind grün. Die Phase mit alkoholischer Lauge ist schön rot, aber von kurzer Dauer. Die Phytylverbindung b bildet eine grünschwarze Masse, die spröder ist als a und leichter zu einem grauschwarzen Pulver zer- kleinert werden kann; beim Erhitzen sintert die Substanz bei 148 — 152 °, wird zähflüssig und bläht sich bei 160 — 170 0 auf. In absolutem Alkohol ist das Phäophytin b in der Kälte schwer, in der Wärme ziemlich schwer, nämlich viel schwerer als a lös- lich mit grünlichgelb tingierender, rotbrauner Farbe und schwacher, bräunlichroter Fluorescenz. In Äther, worin es sich beträchtlich löst, zeigt es sehr ähnliche Farbe, welche an die der Phytorhodine erinnert. In 95 prozentigem Sprit ist die Substanz selbst in der Hitze nur sehr schwer löslich, in Petroläther kalt äußerst schwer und auch beim Kochen nur sehr wenig. Das Phäophytin b wird daher besser als a aus Alkohol- oder Acetonlösung von Petrol- äther gefällt. Aus der warmen alkoholischen Lösung scheidet es sich schön feinkörnig aus, weniger flockig als a; unter dem Mikroskop waren auch nur dendritische Aggregate oder rundliche Körner zu beob- achten. Methylphäophorbide x). Die Komponente a [C32H32ON4] (COOCH3)2 krystallisiert in scharf begrenzten rhombenförmigen Blättchen, die oft mit bloßem Auge zu erkennen sind, und in Prismen, die schwalbenschwanz- förmige Zwillingsbildungen zeigen (Tafel IV, Fig. 1). Sie besitzen prachtvollen violettschwarzen Glanz und bilden zerrieben ein dunkel- violettes Pulver. Unter dem Mikroskop erscheinen die dünnsten Krystalle bräunlichgrau, dickere bräunlichgelb bis braunrot. r) Ann. d. Chem. 387, 373 [1912]. Die Phäophorbide a und b. 285 In Äther löst sich der Methylester sehr schwer mit olivbranner, in dünner Schicht olivgrüner Farbe und dunkelroter Fluorescenz. In Petroläther ist die Substanz unlöslich, in den Alkoholen in der Kälte fast unlöslich, beim Kochen beträchtlich löslich, in Chloro- form spielend, noch leichter als in Pyridin. Die Salzsäurezahl von Methylphäophorbid a ist 16, von b 21. Das Methylphäophorbid b [C32H30O2N4] (COOCH3)2 ist in Krystallform und Löslichkeit dem entsprechenden a-Derivat sehr ähnlich. Die grauschwarzen Krystallisationen aus Äther bestehen immer aus großen, einzeln ausgebildeten und scharf begrenzten Rhomben (Tafel IV, Fig. 2), während die Blättchen des Methyl- phäophorbids a oft gerundete Formen zeigen und sich zu Drusen gruppieren. In der Durchsicht unter dem Mikroskop sind die Krystalle des Methylphäophorbids b mit zunehmender Dicke olivgrün, hellbraun und braun, während sich die Farbe bei a eher zu Rot vertieft. In den Lösungen erscheint das Verhältnis in den Farben entgegengesetzt : Methylphäophorbid a ist in Äther olivbraun, b hingegen zeigt rotbraune Farbe mit grünlich gelbem Tingieren. Die Komponente b ist in Äther äußerst schwer und auch in den siedenden Alkoholen nur sehr wenig löslich. Freie Phäophorbide 1). Die Komponente a [C32H32ON4] (COOCH3) (COOH) krystalli- siert aus Äther und aus Alkohol prächtig in blauschwarz glänzenden, scharf begrenzten rhombenförmigen Täfelchen, deren spitze Winkel oft gerade abgestumpft sind. Auch das Pulver ist blauschwarz, nicht dunkelviolett wie das des Methylesters. Unter dem Mikroskop sind dünne Krystalle olivgrün, dickere olivbraun bis braun. In absolutem Alkohol ist die Substanz in der Kälte schwer, in der Wärme leicht löslich, in Äther ziemlich schwer, leicht in Aceton, spielend in Pyridin und Chloroform, dagegen ist sie in Petrol- äther unlöslich. In den üblichen Solvenzien hat die Carbonsäure dieselbe olivgrüne bis olivbraune Farbe wie ihr Methylester und auch die deutliche dunkelrote Fluorescenz. *) Ann. d. Chem. 387, 381 [19x2]. 286 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. ln Ameisensäure ist das Phäophorbid äußerst leicht mit präch- tig blauer, in der Durchsicht violettroter und roter Farbe löslich, dieselbe Farbe wird z. B. in der Acetonlösung durch einen kleinen Zusatz von Salzsäure hervorgerufen; bei der Komponente b ist für den entsprechenden Farbwechsel mehr Säure erforderlich. Eisessig löst die Substanz nur violettstichig braun, während sich darin die Phytochlorine, weil sie stärker basisch sind, schon mit blauer Salzfarbe lösen. Die ätherische Lösung (0,02 g in 100 ccm) reagiert quantitativ mit n/100-Ammoniak und -Kalilauge, welche das Phäophorbid mit brauner Farbe extrahieren; stärkere (n/4) Kalilauge fällt zuerst flockiges Kaliumsalz und löst es dann allmählich, sehr ver- dünnte (n/1000) färbt sich nur wenig olivgrün an. Auch 0,1 pro- zentige Sodalösung und iprozentiges Natriumbicarbonat sowie Dinatriumphosphat fällen das Phäophorbid quantitativ als Salz aus; dagegen nimmt o,25prozentiges Dinatriumphosphat nur eine Spur von der Substanz auf und gibt keine Fällung. Bei den Phäophorbiden a und b bleiben zum Unterschied von den Chlorophylliden beim Überführen in verdünnte Alkalien und bei längerem Stehen in alkalischer Lösung die Lactamgruppen unverändert; denn starke Alkalilauge bewirkt noch die braune Phase, auch liefern die wieder in Freiheit gesetzten Phäophorbide noch normales Chlorin und Rhodin. Die Salzsäurezahl des Phäophorbids a ist 15, die von b 19 — 20. Die Komponente b [C32H30O2N4] (COOCH3) (COOH) ist stär- ker sauer als a, etwa in demselben Maße, wie sich die zwei Chloro- phyllide unterscheiden. Phäophorbid b wird z. B. schon durch o,2prozentige Natriumbicarbonatlösung quantitativ aus ätherischer Lösung (0,02 g in 100 ccm) extrahiert, während diese gar nicht auf die Ätherlösung der Carbonsäure a einwirkt. Auf Grund dieser Differenz kann man die Phäophorbide voneinander trennen. Phäophorbid b geht auch zum Unterschied von a in V4 prozentige Lösung von Dinatriumphosphat quantitativ über und färbt schon 0,005 prozentige Sodalösung ziemlich stark an. Auffallend ist der Unterschied in der Farbe zwischen den Lösungen in verdünnten Die Phäophorbide a und b. 287 und sehr verdünnten Alkalien. Die Substanz geht in n/100- Ammoniak und Kaliumhydroxyd mit braunroter, in n/100o-Lösung mit rein brauner und in n/2000-Alkalien mit olivgrüner Farbe; diese nehmen bei einmaligem Durchschütteln etwa die Hälfte des Phäophorbids aus dem Äther. n/4000-Ammoniak extrahiert ein Viertel mit gelbgrüner Farbe. Das Phäophorbid gibt mit methylalkoholischem Kali eine rein rote Phase, die viel rascher vorübergeht als bei den Estern. Phäophorbid b krystallisiert aus Äther beim Abdampfen in sehr kleinen rhomben förmigen Täfelchen, beim Erkalten der alko- holischen Lösung in grauschwarz glänzenden Rhomben. Es ist in Äther zwar ziemlich schwer, aber viel leichter lös- lich als die Methylverbindung ; die Lösung ist rotbraun und tingiert grünlich gelb. In Äthylalkohol ist es in der Wärme ziemlich leicht, kalt schwer löslich, leicht in Aceton, spielend in Chloroform und Pyridin. Die Absorptionsspektra x). Die drei Phäophorbide jeder der beiden Reihen sind einander in den Absorptionsspektren äußerst ähnlich. In den photogra- phischen Aufnahmen der Tafel IX werden die Spektra der zwei Phäophytinkomponenten, die der Methylphäophorbide in der Zeich- nung der Tafel VII wiedergegeben. Die Messungen sollen für einige Konzentrationen der Methylphäophorbide a und b angeführt wer- den, welche schärfere Begrenzungen der Bänder und der End- absorption zeigen als die Phy ty Verbindungen . Komponente a. Zwischen den Fra unhof er sehen Linien B und G besteht das Spektrum aus sieben scharf getrennten Bändern. Die Ab- sorption im Rot ist gegenüber der Chlorophyllkomponente a fast unverändert, aber außerordentlich verstärkt die Absorption im Grün, nämlich die links und rechts von E nebeneinanderliegenden Bänder IV und V des Chlorophylls (beim Phäophytin V und VI) haben sehr an Intensität gewonnen. *) Abh. XVII. 288 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die photographische Aufnahme läßt kaum deutlich erkennen, daß das Band im Rot von einem getrennten schmalen Streifen im Rotorange begleitet wird. Lösung von 0,30 g in il Äther (71000 Mol. in 20 1). Schicht in mm 2,5 10 40 80 Band I 672 . . .661 678—654 685 — 646 1 687 — 641 „ II — — 637 | 632 J • -631 „ III — 614.602 619 599 621—597 IV — — 565-552 566. . .552 .. V 536.530 536. • .530 539—528 l 541—526 .. VI 509-494 509. . .493 512—490 / | 517—488 „ VII — — 478.464 1 480. . .461 Endabs. (VIII) 431.425— 433— 445-439— / -452— Reihenfolge nach der Intensität: VIII, I, VI, V, III, VII, IV, IT. Komponente b. Das Spektrum setzt sich aus acht zumeist scharfen Bändern zusammen, aus je einem Band im Rot und Orange, vier Streifen im Grün und den beiden im Blau, wozu noch die kräftige Endabsorption (IX) hinzukommt. Immerhin ist das Phäophytinspektrum weniger gegliedert als das des Chlorophylls, indem es statt der gegabelten Absorptionen im Rot und Orange die einfachen Bänder aufweist. Die Absorption im Grün ist in dem Doppelband IV und V verstärkt, wenn auch nicht ganz in dem Maße wie bei den analogen Derivaten von a. Die Absorptionsspektra der Komponenten a und b zwischen den Fra unhof ersehen Linien B und F sind gleichartig und einander sehr ähnlich trotz der auffallenden Farbverschiedenheit der beiden Lösungen. Das Band im Rot und das im Orange ist bei b gegen Violett hin verschoben , erheblich gegen Rot hin ver- schoben ist das äußere Band im Grün, so daß es nahe an das erste Band im Grün (IV) gerückt ist und in die Lücke der gegabelten Absorption von a fällt. Der schmale Streifen II in a fehlt der Verbindung b. Unterscheidend gegenüber a ist ferner eine zwei- armige, sehr starke Absorption im Indigblau (Band VII und VIII). Die aus dem Gesamtchlorophyll entstehenden Gemische der Phäophytinkomponenten (z. B. das von Willstätter und Hoch- Die Phäorphorbide a und b. 289 eder1) beschriebene Präparat) zeigen daher alle Absorptions- streifen verbreitert und verschwommen im Vergleich mit der scharfen Begrenzung und charakteristischen Gliederung der Spektra beider Komponenten. Lösung von 0,030g in il Äther (ViooqMoI. in 20 1). Schicht in mm 2,5 IO 40 80 Band I 659. . .652 664 — 646 670 — 640 674—636 „ II 603 | 595 6°5- -593 608 591 612 — 589 „ HI — 563-552 565 -551 \ 566—550. „ iv 537 1 53i 538. .530 \ 539—529- • > 541 5°8 „ v 523 1 5r7 524. .516 1 525— 5r3 J „ VI „ VII ) 453- • -442 ) 494.483 494. .481 „ VIII Endabs. (IX) } —427- J 415— 1 457— | 463— > 465— Reihenfolge der Intensitäten: IX, VIII, VII = I, IV, V, II, III, VI. *) Ann. d. Chem. 354, 227 [1907]. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 19 XVI. Phytochlorine und Phytorhodine1). i. Darstellung von Phytochlorin e und Phytorhodin g aus den Phäophorbiden. Phytochlorin e und Phytorhodin g sind die wichtigsten Pro- dukte der Hydrolyse von Phäophytin und anderen Phäophorbiden. Da diese Spaltungsprodukte nicht einfach durch Verseifung der zwei Estergruppen, sondern zugleich durch eine von mehreren möglichen Umänderungen der Lactamgruppen entstehen, so ist die Reaktion gleich der Verseifung des Chlorophylls in hohem Maße von den Bedingungen abhängig2). Je nach dem Hauptzweck, welchem die Hydrolyse dient, der Gewinnung des Phytols oder der Isolierung der basischen Spaltungsprodukte, kommen verschiedene Verfahren für die Verseifung des Phäophytins in Betracht, die mit alkoholischer Kalilauge kalt und heiß ausgeführt werden kann, aber nie mit Verdünnungsmitteln, also nicht unter Anwendung ätherischer Phäophytinlösungen. In diesem Fall würde statt des beständigen Phytochlorins e das schwächer basische, unbeständige Chlorin g und anstatt des Phytorhodins g das schwach basische Phytorhodin k auftreten. Von den folgenden drei Verfahren eignen sich die beiden ersten für die Gewinnung von Phytol in großem Maßstab. Erstes Verfahren (nach Willstätter und Hocheder). Verseifung durch längeres Erhitzen mit alkoholischer Kalilauge. Phäophytin wird im Wasserbad am Rückflußkühler mit methyl- alkoholischem Kali gekocht, und zwar werden für das Gramm Phäophytin 5 — 7V2» meistens 6 ccm, von der Lauge angewandt. *) Abh. III und XVI. a) Siehe Kap. IV, Abschn. 2. Phytochlorine und Phytorhodine. 291 Diese bereiten wir durch Auflösen von 200 g gewöhnlichem Stangen- kali in 1 1 Holzgeist. In einer Portion lassen sich einige Hundert Gramm hydrolysieren und ungeteilt auf Phytol verarbeiten. Die Dauer des Erhitzens ist nur von der Art der Verteilung des Phäophytins abhängig. Bei feiner Zerkleinerung war xj2 Stunde hinreichend, beim Verarbeiten von Klumpen sind 4 — 6 Stunden erforderlich. Ob die Verseifung beendigt ist, erkennt man daran, daß keine Klümpchen von unverseiftem Phäophytin mehr vor- handen sind und zweitens, daß eine herausgenommene Probe beim Schütteln mit 20 prozen tiger Salzsäure und Äther in diesen keine Chlorophyllsubstanz mehr gehen läßt. Für die Ausbeute und Reinheit des Phytols bietet das lange Erhitzen keinen Nachteil, hingegen für die basischen Verbindungen, da namentlich Phytorhodin g Erhitzen mit alkoholischer Kali- lauge nicht verträgt und je länger, je mehr in amorphe unlös- liche Flocken verwandelt wird1). Willstätter und Hocheder brachten deshalb, um das nicht pulverisierbare Phäophytin für die Verseifung leicht angreifbar zu machen, es dadurch in feine Verteilung, daß sie die Substanz mit viel Seesand und Äther (4 1 für 33 g) bis zur vollständigen Auf- lösung schüttelten und die Flüssigkeit mitsamt dem Sand im Rundkolben zur Trockne abdampften; der Rückstand ist im gleichen Gefäß verkocht worden. Statt dessen ist es auch sehr zweckmäßig, das Phäophytin nach und nach in kleinen Anteilen in die zum Sieden erhitzte Kalilauge einzutragen. Das Zusammenklumpen des wachsartigen Produktes wird dadurch verhütet und die Verseifung beschleunigt. Zur Extraktion des Phytols kann man zur dunkelgrünen Lauge, die eine starke Ausscheidung von rotbraunem Kalisalz enthält, mehr als das gleiche Volumen Äther und so viel Wasser hinzufügen, daß sich eben die Ätherschicht klar abtrennt. Sie wird abgehoben und die Lauge noch mehrmals mit viel Äther ausgeschüttelt. Die vereinigten bräunlichen Ätherlösungen enthalten das Phytol. Oder man schüttelt ohne Zusatz von Wasser im Kolben selbst die *) Ann. d. Chem. 380, 162 [1911] und 382, 189 [1911]. 19* 2Q2 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. alkalische Flüssigkeit mit sehr viel Äther kräftig an, und zwar mit so viel, daß mit den Salzen der Spaltungsprodukte auch das Ätzkali pulvrig ausfällt und der Methylalkohol vom Äther weg- gelöst wird. Dann kann man leicht dekantieren und unter kräf- tigem Anschütteln und Anrühren den zähen Salzbrei noch ein paarmal mit Äther ausziehen. Zweites Verfahren (nach Willstätter undUtzinger). Ver- seifung in der Kälte durch Schütteln mit alkoholischer Lauge. Schonend für das Phytorhodin und in großem Maßstab leicht ausführbar ist die kalte Verseifung unter Schütteln an der Ma- schine. Wir verwenden von einer konzentrierteren, ungefähr 4opro- zentigen Lauge, die wir aus i 1 Methylalkohol mit 600 g Stangen- kali herstellen, für das Gramm Phäophytin bei kleinen Portionen 10, bei großen 6 ccm und schütteln in dickwandigen Flaschen zusammen mit Quarzstücken oder -kugeln zwei bis drei Tage, bis die Basizitätsprobe das Ende der Verseifung erkennen läßt. Für diesen Zweck eignet sich auch ein Apparat von Leu ne in Paris, der Broyeur Borrel; er läßt eine auf seine horizontale Achse montierte flache Flasche rotieren, wobei ihr Inhalt emul- sioniert und mit Glaskugeln bearbeitet wird. In derselben Weise, aber noch leichter, erfolgt die Verseifung der einfachen Alphylphäophorbide, da sich diese Substanzen fein pulverisieren lassen. Für die Hydrolyse genügt hier etwa zwei- stündiges Schütteln mit der zehnfachen Menge an alkoholischem Kali unter Zusatz von 10% Wasser. v Drittes Verfahren *). Rasche Verseifung in der Hitze unter: Anwendung von Pyridin und sehr viel Kalilauge. Wenn es sich nicht um Verarbeitung großer Mengen, sondern um Bildung und Trennung von Chlorin e und Rhodin g mit der besten Annäherung an die quantitative Bestimmung handelt, dann verdient folgende Arbeitsweise den Vorzug, nach welcher diese basischen Spaltungsprodukte mit der geringsten Beimischung der schwach basischen Derivate erhalten werden. x) Unveröffentlicht. Phytochlorine und Phytorhodine. 293 Wir lösen 6 g Phäophytin in 20 ccm Pyridin von 80 0 und tragen die warme Lösung in dünnem Strahl unter Umrühren mit einem Silberstab in die Lauge ein, die aus 250 ccm Holzgeist mit 160 g alkoholgereinigtem Ätzkali hergestellt worden. Sie befindet sich in einem hohen Silberbecher und wird in nur schwachem Sieden gehalten. Schon nach x/2 Minute darf man unterbrechen und mit kaltem Wasser den Becher abkühlen. Die Verseifung ist beendigt, die Prüfung der Spaltungsprodukte ergibt nur Spuren von Schwach- basischem. Fraktionierung der Spaltungsprodukte. Erstes Bei- spiel 1). Es behandelt die Aufarbeitung der zuletzt beschriebenen Ver- seifung von 6 g. Um ihre Produkte ganz einheitlich zu isolieren und Verluste dabei zu vermeiden, übertragen wir das Verfahren der Komponentenbestimmung auf den größeren Maßstab. Die alkalische Lösung wird mit Wasser in einen 7-l-Scheide- trichter gespült und mit 3 1 Äther überschichtet. Durch all- mählichen Zusatz von 20 prozentiger Salzsäure und unter kräf- tigem Durchschütteln führen wir die Hauptmenge der basischen Verbindungen in Äther über. Ein Teil des Rhodins kann sich dabei in Flocken ausscheiden. Dann läßt man sie mit der wässe- rigen Schicht ab, macht mit Ammoniak wieder alkalisch und bringt durch erneutes Ansäuern in einem anderen Scheidetrichter den Rest in weitere 2 1 Äther. Die gesamte ätherische Lösung ziehen wir achtmal aus mit je 1 1 3 prozen tiger Salzsäure; die grünblaue Chlorinlösung wird mit Äther gewaschen, je zwei Auszüge mit 200 ccm, um Spuren von Rhodin zu beseitigen. Dann neutralisiert man mit Ammoniak, bis ihre Farbe in Violettblau umschlägt. An diesem Punkt geht die Substanz leicht in Äther und wird in zwei Malen, nämlich mit 3 und 1 1 Äther, quantitativ extrahiert. Den Äther wäscht man vorsichtig nur mit wenig Wasser. Solange dieses nur eine Spur Säure aufnimmt, bleibt es frei von Chlorin, bei wiederholtem l) Unveröffentlicht; die ältere Arbeitsweise siehe Ann. d. Chem «4 232 [1907]. 2 g4 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Waschen mit größeren Mengen von Wasser geht aber das Phyto- chlorin reichlich mit Olivfarbe in das reine Wasser über und kann durch Äther daraus nur bei Zufügen von etwas Säure wieder ex- trahiert werden ; dieses Verhalten kann man bei ätherischen Lösungen aus schon isoliertem Phytochlorin nicht wahmehmen. Die ätherische Rhodinlösung enthält noch eine geringe Bei- mischung von Chlorin und wird durch zwei Auszüge mit je i 1 5 prozen tiger Salzsäure davon befreit. Aus der sauren Flüssigkeit bringen wir die Substanz in Äther (i 1) und extrahieren diesen aufs neue mit i 1 3 prozentiger Säure. Der sauere Anteil wird noch zum Chlorin, die Ätherschicht nach Waschen mit 5 prozentiger Salzsäure zum Rhodin geschlagen. Das Phytorhodin g läßt sich in sechs bis acht Malen mit je 1 1 9 prozen tiger Salzsäure extrahieren ; alle Auszüge werden nach- einander oder paarweise mit den nämlichen 500 ccm Äther ge- waschen. Die ätherische Mutterlauge, eine sehr verdünnte Rhodin- lösung mit einem kleinen Gehalt von schwach basischem Chlorin, läßt sich am Ende mit drei Auszügen von je 1f2 1 12 prozentiger Salzsäure erschöpfen. Diese werden auf 7% Chlorwasserstoffgehalt verdünnt, mit Äther vorsichtig gewaschen und mit der Haupt- lösung vereinigt. Die Rhodinlösung neutralisieren wir in Dritteln bis zu trübgrüner Farbe und schütteln sie im ganzen mit 6 — 8 1 Äther aus. Ohne abzuheben, neutralisiert man jeden Anteil noch weiter mit Ammoniak und schüttelt wieder kräftig durch. Endlich werden die Chlorin- und Rhodinlösungen mit Natrium- sulfat getrocknet und eingedampft, erstere auf etwa 1 V2, die andere auf 21/a 1. Dann filtrieren wir von den ersten Aus- scheidungen ab und dampfen noch weiter ein, mit der Vorsicht, daß das Wasser des Bades nicht höher stehe als das Äthemiveau im Kolben, da sich sonst Krusten fest an der Kolbenwandung ansetzen. Die Ausbeute an den schönen Krystallisationen beträgt 1,05 g Phytorhodin g, d. i. fast die ganze mögliche Menge und 2,2 g Phytochlorin e, d. i. 82% der Theorie. Zweites Beispiel. Das erste, bei aller Umständlichkeit noch abgekürzt beschrie- bene Beispiel stellt ein analytisches Verfahren dar. Phytochlorine und Phytorhodine. 295 Bei präparativem Arbeiten wird man gewöhnlich nicht ganz denselben Reinheitsgrad der Spaltungsprodukte erzielen und wohl immer verschwenderischer fraktionieren. Die Summe der beiden Produkte geht dann selten über 40% vom Phäophytin. Zur Abkürzung der beschriebenen Fraktionierung ist man ge- nötigt, um Phytochlorin in der reinen Lactamhydratform zu er- halten, die sich bei längerem Verweilen in salzsaurer Lösung anhydridisiert, die aber für die Aufbewahrung den Vorteil der größeren Haltbarkeit bietet. Nach der Entfernung des Phytols wird die alkalische Masse, z. B. aus 20 g Phäophytin, stark verdünnt und die Chlorophyll- derivate werden unter Ansäuern in 12 1 Äther übergeführt. Das Phytochlorin extrahiert man durch dreimaliges Ausschütteln mit im ganzen 4I 4 prozentiger Salzsäure genügend und wäscht die sauren Auszüge mit je 1 — 1V2 1 Äther, um mitgegangenes Rhodin vollständig zu entfernen. Aus der gereinigten sauren Lösung isolieren wir das Phytochlorin durch annäherndes Neutralisieren und Ausäthern und gewinnen es durch Einengen auf 1/2 1 in der violetten Krystallisation des Hydrates; Ausbeute 5,2 g. Nach der Abtrennung der Hauptmenge von Chlorin braucht man nur noch seine letzten Anteile durch mehrmaliges Aus- schütteln mit 6 prozentiger Salzsäure wegzunehmen, um die Rho- dinlösung genügend rein zur Krystallisation übrig zu behalten. Nach dem Konzentrieren der verdünnten Ätherlösung scheidet es sich in schwarz glänzenden Prismen aus und hinterläßt eine braun gefärbte Mutterlauge; die Ausbeute betrug 2,8 g. Schon eine langsame Ausführung der beschriebenen Isolierung von Phytochlorin e , längeres Stehen der salzsauren Lösung, wieder- holtes Überführen in Salzsäure pflegt zur Folge zu haben, daß außer den violetten Krystallen die charakteristischen Blättchen der Anhydroform auftreten. Bei einer solchen Aufarbeitung der Spaltungsprodukte aus 7 g Äthylphäophorbid lieferte die Phyto- chlorinlösung beim Einengen auf 700 ccm zuerst eine voluminöse Abscheidung von 1 g glänzender schwarzer Blättchen der wasser- freien Modifikation, dann erst bei stärkerem Eindampfen die derben violett glänzenden Krystalle des Hydrates (1,8 g). 2g6 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 2. Bildung aus den Chlorophylliden. Durch die Verseifung von Chlorophyll und den anderen Chloro- phylliden in der Hitze entstehen Iso-Chlorophyllinsalz a und b. Diese sind nichts anderes als die Magnesium derivate von Phyto- chlorin e und Phytorhodin g und sie liefern daher einfach beim Ansäuern ohne Nebenprodukt dieselben Verbindungen, die anderer- seits durch Einwirkung von Säure auf Chlorophyllide und danach von Alkalien auf Phäophorbide erhalten worden sind: Iso-Chlorophyllin a «-Chlorophyll a Chlorophyll b->Iso-Chlorophyllin t I . fr I !■ Phytochlorin e<- Phäophytin a Phäophytin b »-Phytorhodin g Dieser Weg zum Chlorin und Rhodin hat erst spät zum Ziel geführt, da mit verdünnten Chlorophyllösungen, mit den Ex- trakten, die Verseifung zu den Iso-Chlorophyllinsalzen nicht leicht ausführbar ist und gerade die Verseifung unter gelinden Be- dingungen über die Chlorophyllinreihe die schwach basischen Ver- bindungen (Chlorin g, Rhodin k und i) ergibt. Zum erstenmal haben Willstätter und Utzinger x) durch Einwirkung von viel heißem Bariumhydroxyd auf eine Rohchloro- phyllösung und Ansäuern des gebildeten Bariumsalzes Phyto- chlorin e und Phytorhodin g erhalten und durch die Analyse identifiziert. Auf der quantitativen Bildung beider beruht unsere Spaltungs- probe, die auch zur Bestimmung des Komponentenverhältnisses in Chlorophyllpräparaten Anwendung findet. Die einheitlichen Chlorophyllkomponenten führen mühelos, nämlich ohne Fraktionierung, bei diesem Abbau zum Chlorin e oder Rhodin g. Die Verarbeitung des gemischten Chlorophylls2) erfordert hin- gegen dieselbe Trennung wie die beschriebene Gewinnung aus Phäophytin: Nur vereinfacht sie sich dadurch, daß die Bildung der schwächeren Basen gänzlich vermieden werden kann. 4 g Methylchlorophyllid oder 6 g Chlorophyll tragen wir ge- pulvert in einigen Portionen in ioo ccm 35 prozen tige reine methyl- x) Ann. d. Chem. 382, 162 [1911]. *) Unveröffentlicht. Phytochlorine und Phytorhodine. 297 alkoholische Kalilauge ein, die im hohen Silberbecher zum Sieden erhitzt ist und gerührt wird. Unter diesen Bedingungen genügt wenige Minuten langes Kochen, so daß keine Estersäuren auftreten. Nach dem Erkalten wird die Flüssigkeit mit Wasser in den Scheide- trichter gespült und nach dem Überschichten mit 4 1 Äther an- gesäuert. Aus der Ätherschicht ziehen wir das Chlorin wie oben mit 3 prozen tiger Salzsäure aus und behalten nach dem Waschen der ätherischen Lösung mit 5 prozentiger Säure reines Phytorhodin in ihr zurück. Dabei bleiben die Ausbeuten nicht weit hinter den theoretischen zurück. 3. Beschreibung. Phytochlorin e. Es tritt in zwei Modifikationen auf, als Lactamhydrat von der Formel C34H3606N4 , d. i. [C31H32N4] (C(OH)2) (COOH)2, derbe, undurchsichtige Krystallblätter mit mattem, violettem Glanz und als Lactam von der Formel C34H3405N4 d. i. [C31H32N 4] (CO) (COOH )2 , schwarzglänzende, ungefähr rechteckige Täfelchen (Tafel IV, Fig.3). Es erscheint naheliegend, die wasserhaltige Form als Tri- carbonsäure zu erklären. Aber das Auftreten und Verschwinden der gelben Phase bei der Bildung von Phytochlorin läßt sich am besten als Folge der Öffnung und Wiederschließung einer Lactam- gruppe verstehen, die wir deshalb in beiden Modifikationen an- nehmen. Diese zeigen auch in der Salzsäurezahl 3 und in anderen Merkmalen weitgehende Übereinstimmung. Beide Formen geben braunschwarzes Pulver; die Krystalle sind in der Durchsicht hellgrün, olivgrün und braun. Die reine Hydratform ist eine beständige Substanz, die heiß getrockneten Präparate blieben wie die nicht getrockneten beim Aufbewahren unverändert. Die wasserfreie Modifikation läßt sich nur in dem Zustand unversehrt halten, wie man die Krystalle aus Äther isoliert. Ge- trocknet verwandelt sie sich teils in amorphes Unlösliches, teils in schwächer basisches Chlorin, endlich auch in ein Rhodin, das 298 R. Willstätter und A Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. ein charakteristisches, mit grüner Farbe in Äther lösliches Ammon- salz bildet. Auch die Löslichkeit ist ungleich. Das Hydrat ist vor allem in Alkohol in der Kälte sehr schwer und heiß nur wenig leichter, in Aceton sehr schwer löslich, in Chloroform fast unlöslich. In siedendem Eisessig löst es sich ziemlich schwer, in kaltem schwer, in Ameisensäure leicht, in beiden mit tiefblauer Farbe, in Pyridin leicht mit Olivfarbe. Die Anhydroform ist in der Kälte in Eis- essig ziemlich leicht, in Aceton ziemlich schwer, in Pyridin sehr leicht löslich. In kaltem Alkohol und in Chloroform löst sie sich ziemlich leicht ; wenn man die gesättigte alkoholische Lösung kurz erwärmt, so fällt eine Krystallisation von kleinen, unscharf recht- eckigen Täfelchen aus, die in der Durchsicht rotbraun erscheinen. In Äther ist das krystallisierte Phytochlorin äußerst schwer löslich, die mit Hilfe von Säure oder Ammoniak gebildeten Äther- lösungen sind olivstichig grün. Die Lösung in konzentrierter Schwefelsäure ist blaugrün, in konzentrierter Salzsäure smaragdgrün, beinahe wie Phytorhodin g sich in verdünnter Salzsäure löst, aber grün tingierend; beim Ver- dünnen wird die Lösung immer mehr blau, bei 2% Chlorwasser- stoffgehalt ist sie rein blau. Die verdünnt salzsaure Lösung wird durch Zusatz von ein wenig Alkohol mehr violett. In konzentrierter Schwefelsäure verwandelt sich das Chlorin in eine ätherunlösliche amorphe Substanz, in Salzsäure erleidet es keine tiefgehende Änderung, aber beim Stehen in der Säure verliert die Hydratmodifikation Wasser. Wir haben sie zur Um- wandlung in Lactam in 20 prozentiger Salzsäure gelöst, auf 4% Chlorwasserstoffgehalt verdünnt und eine Woche lang stehen ge- lassen; die wieder isolierte Substanz krystallisierte aus Äther an- scheinend einheitlich in den typischen schwarz glänzenden Formen des Lactams, doch ist die Abspaltung von Wasser nach der Ana- lyse noch nicht vollständig. Das Phytochlorin zeigt in beiden Modifikationen stark saure Eigenschaften, es geht aus dem Äther schon in 0,001 prozentiges Ammoniak, vollständig in 0,01 prozentiges über, in Dinatrium- phosphat von 0,01 % spuren weise, von 0,02 % ziemlich leicht. Die Phytochlorine und Phytorhodine. 299 Lösungen in diesen verdünntesten Alkalien zeigen charakteristische violette Farbe, während die Substanz mit olivgrüner Farbe in Ammoniak oder andere Alkalien von etwas größeren Konzen- trationen geht. Ein charakteristisches Derivat des Phytochlorins ist sein Tri- methylester [C34H3303N4] (OCH3)3 , der beim Verreiben des Kaliumsalzes mit Methylsulfat entsteht. Er ist in Alkohol und Äther ziemlich leicht löslich und krystallisiert in stahlblauen, ver- filzten Prismen vom Schmelzpunkt 188 — 19°°>‘ seine Salzsäure- zahl ist 7, mit alkoholischer Kalilauge bildet er Phytochlorin zurück. Phytorhodin g. C34H3407N4 d. i. [C30H31N4](CO)(COOH)3 oder [C30H30N4] (CO) (C[OH]2) (COOH)2 . Es krystallisiert aus Äther in großen, derben, sechsseitigen Prismen mit schiefer Endigung (Tafel IV, Fig. 4); sie zeigen dunkel- rote fast schwarze Farbe von metallischem Glanz. Die Lösungen in Äther, Alkohol und Eisessig sind blaustichig tiefrot und be- sitzen sehr schwache dunkelrote Fluorescenz. Im krystallisierten Zustand ist die Substanz in Äther und Chloroform unlöslich, in Alkohol und Eisessig ziemlich leicht lös- lich. In Pyridin löst sich Rhoding sehr leicht, in Ameisensäure leicht mit smaragdgrüner Farbe, wie in konzentrierter Salzsäure. Obwohl die Salzsäurezahl 9 ist, erfordert die feste Substanz 17 — 2oprozentige Salzsäure zum Lösen, wenn sie ohne Äther angewandt wird. Phytorhodin g ist eine stark saure Verbindung, es geht aus ätherischer Lösung leicht schon in 0,001 prozentiges Ammoniak und vollständig in 0,02 prozentiges Dinatriumphosphat mit rot- stichig grünlicher Farbe. Die Salze des Phytorhodins mit Kalium- oder Cäsiumhydroxyd sind tertiär. Sie werden von Methylsulfat in den Trimethylester verwandelt, der in schwarz glänzenden, rechteckigen und trapez- förmigen Täfelchen vom Schmelzpunkt 207 — 210 0 krystallisiert. Seine Salzsäurezahl ist 13. 300 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die Absorptionsspektra (Tafel X, Kap. XXV)1). Die vergleichende Untersuchung der Absorptionsspektra gibt einen überraschenden Ausdruck für die Beziehungen zwischen den zwei Chlorophyllkomponenten und ihren magnesiumfreien Deri- vaten zu ihren Spaltungsprodukten Phytochlorin e und Phyto- rhodin g. Phytochlorin e in Äther zeigt ein aus fünf scharf begrenzten Bändern zusammengesetztes Spektrum, das dem der Phäophytin- komponente a äußerst ähnlich ist. Nur fehlen hier die schwachen Bänder II und VII des Phäophorbidspektrums, oder genauer, sie sind nur als schwache Schatten wahrzunehmen. Die übrigen fünf Bänder zeigen nicht allein dieselbe Reihenfolge hinsichtlich der Intensität: I, V, IV, II, III, sie stimmen auch in ihrer Stärke und Breite und fast genau im Ort überein mit den entsprechenden Bändern von Phäophorbid. Die Übereinstimmung ist auffallend, weil das Phytochlorin e ja nicht die den Estern Phäophytin und Methylphäophorbid zugrunde liegende Carbonsäure ist. Lösung von 0.030g Lactamhydrat in il Äther (etwa V10oo in 20 1). Schicht in mm 2,5 10 20 40 Band I 672 661 678—655 679—652 | 635 683 — 648.632 „ II — 616 | 602 617. .603 617. . .603 „ HI — — 563 1 553 564-553 „ iv 535-527 535- -527 535- • -527 537 527 „ v 508. .492 509. . .491 510— —490 512—488 Endabsorption 411 427— 432— 437— Phyto rhodin g weist ein schönes Spektrum von noch ein- facherer Gliederung auf : der stärkste Absorptionsstreifen der sicht- baren Region liegt wie durchwegs bei den Chlorophyllderivaten im Rot, aber nahe am Übergang in Orange; im Grün liegt ein kräftiges Doppelband, außerdem gibt es nur noch im Orange ein schwächeres, viertes Band. Die Reihenfolge der Bänder nach ihrer Intensität ist demnach: Endabsorption, I, IV, III, II. Mit dem viel komplizierteren Spektrum der Phäophorbide b ist das relativ einfache Phytorhodinspektrum sehr nahe verwandt. *) Abh. XVII. Phytochlorine und Phytorhodine. 301 Die Abweichungen bestehen nämlich nur darin, daß das auf der Fra unhof er sehen Linie F liegende Band VI der Komponente b hier fehlt und die charakteristische dreiarmige Absorption im Grün ohne Änderung des Ortes zu einem Doppelstreifen verschmolzen ist. Viel bedeutender sind natürlich die Unterschiede gegenüber dem Phytochlorin e; beim Rhodin sind die zwei Bänder im Rot und Orange gegen Violett hin verschoben; statt der über das ganze Grün verteilten drei Streifen zeigt das Rhodin nur zwei kräftige Bänder. Lösung von 0,030g Rhodin in 1 1 Äther (etwa Viooo Mol. in 20 1). Schicht in mm 2,5 IO 40 80 Band I 659- .649 662 — 649 667 — 641 673—636 „ II 602 595 603.594 607. . .592 608 590 „ III 568 555 569-554 57°- • -553 576 552 iv 537- 517 536. .518 539 516 541 — 5°9 Endabsorption 446- 45i— 455— 459— Bildung komplexer Kaliumverbindungen x). Die Spaltungsprodukte der Chlorophylle vermögen mit Alkali- hydroxyd Verbindungen einzugehen, die in überraschendem Maße an die natürlichen Magnesiumverbindungen erinnern. Die Alkali- salze von Chlorin und Rhodin zeigen in alkoholischer Lösung recht genau die Absorptionsspektra der magnesiumfreien Chlorophyll- abkömmlinge, aus welchen diese hervorgegangen sind, nämlich das Chlorinalkali stimmt mit der Komponente a des Phäophytins, das Rhodin mit b überein. Löst man hingegen Phytochlorin und Phytorhodin in konzentriertester alkoholischer Kalilauge auf oder besser, dampft man ihre Lösung in 30 prozen tiger methylalkoholi- scher Kalilauge bis auf einen Gehalt von 45% KOH ab, so schlägt die Farbe vollkommen um in intensives Chlorophyllgrün, und zwar in einem Fall in das Blaugrün der Komponente a, im andern Fall in das Gelbgrün der zweiten Komponente. Die so gebildeten Kaliumverbindungen vergleichen wir mit Iso-Chlorophyllinsalz a und b. Diese stimmen in höchst konzen- trierter methylalkoholischer Kalilauge als Lösungsmittel in den *) Arm. d. Chem. 385, 180 [1911]. 302 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Fig. n. Viooo Mol. in 20 1; Schicht 20 mm. a) Phytochlorin e in Äther; b) Phytochlorin e in 5 prozentiger methylalkoholischer Kalilauge ; c ) Phytochlorin e in 45 prozen tiger methylalkoholischer K alilauge ; d) Isochlorophyllin a in 44prozentigerj methylalkoholischer Kalilauge. Viooo Mol. in 20 1; Schicht 20 mm. a) Phytorhodin g in Äther; b) Phytorhodin g in 5 prozentiger methylalkoholischer Kalilauge; c) Phytorhodin g in 48 prozen tiger methylalkoholischer Kalilauge ; d) Isochlorophyllin b in 45 prozentiger methylalkoholischer Kalilauge. Phytochlorine und Phytorhodine. 303 Absorptionserscheinungen überein mit Chlorin und Rhodin in den- selben Medien, und zwar so vollkommen, daß man das einwertige Alkalimetall analog dem Magnesium im Chlorophyll gebunden annehmen muß. Dieser Metallkomplex, der unbeständigste, den die Chlorophyll- derivate bilden, erleidet schon beim Verdünnen der alkalischen Masse mit Alkohol Dissoziation. Die Figuren 11 und 12 veranschaulichen die Absorptions- spektra von Chlorin und Rhodin neben ihren normalen und komplexen Alkaliverbindungen und den entsprechenden Isochloro- phyllinen. 4. Die schwach basischen Phytochlorine und Phytorhodine. Phytochlorin f1). Wenn das Chlorophyll beim Stehen mancher Extrakte einer Veränderung unterliegt, so daß die braune Phase verloren geht, dann liefert öfters die Phäophytinhydrolyse das Phytochlorin f, welches Willstätter und Hocheder2) zuerst bei der Verarbei- tung von Ulva lactuca isoliert haben. Das Auftreten dieses Spal- tungsproduktes ist nicht für den Extrakt der genannten Pflanze spezifisch, vielmehr kommt die gleiche Veränderung des Chloro- phylls auch bei anderen Extrakten vor und sie wird namentlich bei Brennesseln oft beobachtet. Nur aus ungereinigten Extrakten haben wir Phytochlorin f erhalten, hingegen nicht bei einem Ver- such, für welchen die Blätter mit Benzol und Petroläther vorbe- handelt waren. Auch in gereinigten petrolätherischen Lösungen hat sich das Chlorophyll nicht derart geändert, daß der Abbau zum Phytochlorin f führte, sondern statt dessen zu dem in der Basizität ähnlichen, im übrigen ganz verschiedenen Phytochlorin g. Aus Chlorophyllin ist das Phytochlorin f noch nicht erhalten worden. Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung dieses Phytochlorins *) Abh. XVI. *) Ann. d. Chem. 354, 237 [1907]. 304 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. haben uns oft Phäophytinpräparate aus Brennesselextrakten ge- dient, die nach dem Abfiltrieren vom Mehle vor dem Ansäuren einige Zeit gestanden hatten. Nach der Verseifung wurde das Gemisch der Spaltungsprodukte mit Salzsäure fraktioniert, um das Chlorin f von reichlich beigemischtem Phytochlorin e und von Phytorhodin g zu trennen. Das Phytochlorin f ist mit Salzsäure von 11% ausgeschüttelt und dann aus seiner durch Waschen mit Äther von etwas Phytorhodin i und k befreiten und auf 7 — 8% Chlorwasserstoffgehalt verdünnten Lösung wieder ausgeäthert worden. Beim Einengen des Äthers schied sich das Chlorin als violettschwarze Krystallisation von rhombenförmigen, in der Durchsicht olivbraunen Täfelchen aus (Tafel IV, Fig. 5); das ein- mal isolierte Präparat krystallisiert aus Äther in schönen Krystall- drusen strahlenförmig angeordneter Prismen. Phytochlorin f, [C31H32N4] (CO) (COOH)2, ist isomer mit der wasserfreien Form des Phytochlorins e. Sein Verhalten gegen Ammoniakgas, wovon es nur halb so viel aufnimmt wie Chlorin e, scheint darauf hinzudeuten, daß in ihm eine Dilactammonohydrat- monocarbonsäure vorliegt. Chlorin f ist in allen üblichen Solvenzien äußerst schwer lös- lich. Nur in Pyridin, sowie in Ameisensäure finden wir es leicht löslich, natürlich unter Salzbildung, und zwar in der letzteren mit rein blauer Farbe. Die mittels des Ammonsalzes bereitete Äther- lösung ist schön grün, viel weniger olivstichig, als die Lösung von Chlorin e, die Farbe in Salzsäure von 11% (die Salzsäurezahl ist genauer 10) ist rein blau, während Phytochlorin e in der Säure von dieser Konzentration grünlichblaue, Chlorin g blaugrüne Farbe zeigt. Aus der Ätherlösung geht das Phytochlorin f in Ammoniak von derselben großen Verdünnung wie Chlorin e, aber zum Unter- schied von diesem mit rein grüner Farbe. Chlorin f bildet ein schön krystallisiertes Cäsiumsalz, das mit Methylsulfat einen in Tafeln oder in Prismen krystallisierenden Ester liefert. Beim Abbau mit konzentrierten Alkalien in der Hitze geht Phytochlorin f in Rhodoporphyrin und weiterhin in Pyrropor- phyrin über (siehe Kap. XX, Abschn. 4). Phytochlorine und Phytorhodine. 305 Phytochlorin g1). Es ist ein in der Basizität dem Phytochlorin f ähnliches Spal- tungsprodukt, das beim Abbau von Chlorophyll sehr häufig auf- tritt. Seine Zusammensetzung wird der von Phytochlorin e und f sehr nahe stehen. Es kann sich bei der empirischen Formel nur um eine Differenz von H20 handeln. Da die Verbindung leicht veränderlich ist, gelang es noch nicht, sie zu analysieren; es war aber wichtig, ihre Bildungsweisen zu beobachten und ihre Merk- male festzustellen. Aus rm Versehrtem Chlorophyll entsteht Phytochlorin g: 1. Bei der Verseifung von Phäophytin, wenn dasselbe in äthe- rischer Lösung mit alkoholischer Lauge behandelt wird. 2. Bei der Spaltung mit Säure aus dem mit alkoholischer Lauge in der Kälte gewonnenen Chlorophyllinsalz. Die isolierte Chloro- phyllkomponente a liefert durch Auflösen in Alkohol oder Pyridin und Einträgen in kalte alkoholische Lauge auch ein Chlorophyllin, das bei der Zersetzung mit Mineralsäure Phytochlorin g bildet. Ferner entsteht dieses Phytochlorin g aus verändertem Chloro- phyll; in alkoholhaltiger petrolätherischer Lösung verwandelt sich beim Stehen die Komponente a derart, daß ihre Phäophytin- hydrolyse dieses Chlorin liefert. Auf gleiche Weise geht es aus den in alkoholischen Lösungen gebildeten leicht löslichen Derivaten des Äthylchlorophyllids hervor. Zur Gewinnung haben Willstätter und Utzinger die petrol- ätherische Rohlösung der Chlorophyllkomponente a mit alkoholi- schem Kali verseift imd die alkalische Flüssigkeit mit Salzsäure an- gesäuert. Dann ist das Spaltungsprodukt ausgeäthert und von etwas beigemischtem Chlorin e mit 6 prozentiger Salzsäure befreit worden. Die zurückgebliebene ätherische Lösung von Phytochlorin g ist olivgrün, ähnlich wie Chlorin e, während Chlorin f rein grün ist. Beim Stehen wird die Lösung durch Zersetzung braun und braun- rot. Die Salzsäurezahl ist 10 — 11. Beim Eindunsten schlägt die Farbe der Ätherlösung leicht in braunstichiges Rot um. Charakteristisch für das Phytochlorin g ‘) Abh. XVI. Willst ätter-St oll, Chlorophyll . 20 306 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. ist der Farbumschlag beim Abdampfen und kurzem Erhitzen mit Alkohol. Dabei entsteht eine sehr schöne, aber sehr unbeständige, in indifferenten Lösungen rote, den Phytorhodinen ähnliche Ver- bindung. Sie ist stark basisch, so daß sie aus Äther schon in i prozentige Salzsäure und schon in schwach angesäuertes Wasser mit hell meergrüner Farbe übergeht; übrigens wird sie auch von alkoholhaltigem Wasser dem Äther entzogen. In verdünntem Ammoniak löst sie sich mit roter Farbe. Beim Erhitzen mit alkoholischem Kali auf 140 — 150 0 gibt Phytochlorin g ein dem Glaukoporphyrin nahestehendes Porphy- rin, bei 225 — 230 0 reines Pyrroporphyrin. Die Phytorhodine i und k1). Analog wie in der a-Reihe bilden sich aus Chlorophyll b durch Verseifen in der Kälte und Abspaltung des Magnesiums oder durch Allomerisation und darauffolgende Spaltung auf verschiedenen Wegen statt Phytorhodin g zwei schwächer basische Produkte, Phytorhodin k und i. Diese lassen sich nur auf Grund eines kleinen Unterschiedes in ihren basischen Eigenschaften durch eine sorg- fältige Fraktionierung nach der Methode von Willstätter und Mieg trennen, und zwar mit 14 prozentiger Salzsäure: die Salz- säurezahl von Rhodin k ist nämlich 14 — 14 V2, von i 15 — 16. Viele Bildungweisen ergeben Gemische von Rhodin k und i, häufig überwiegend k. Bei der Verseifung von Phäophytin oder Methylphäophorbid b, zweckmäßig einer verdünnten ätherischen Lösung mit methyl- alkoholischem Kali in der Kälte entsteht viel Rhodin k, daneben wenig i. Chlorophyll oder Methylchlorophyllid b lieferten bei der Ver- seifung in kalter Lauge etwa zur Hälfte starkbasisches Rhodin, zur Hälfte die zwei schwächer basischen. Die Allomerisation von Chlorophyll b gibt ein ergiebiges Aus- gangsmaterial für die schwachbasischen Rhodine. Bei der Ver- seifung in alkoholischer Lösung allomerisierter Präparate mit *) Abh. XVI und XXII. Phytochlorine und Phytorhodine. 307 Lauge erhalten wir neben überwiegendem Produkt k wenig i; besonders groß war der Anteil von Rhodin k, wenn das allomeri- sierte Chlorophyll zuerst mit Säure, dann mit Alkali gespalten wurde. Bei der Allomerisation von Chlorophyll b in Petroläther ent- standen hingegen Lösungen, die bei der Einwirkung von methyl- alkoholischer Kalilauge und darauffolgendem Ansäuern zu reich- lichen Mengen der beiden schwachbasischen Derivate führten. Die Fraktionierung der Spaltungsprodukte mit Salzsäure aus ätherischer Lösung ist wegen der Beimischung stärkerer Basen und infolge des kleinen Unterschiedes in der Basizität umständ- lich. Durch sehr oft wiederholtes Ausschütteln mit wenig 13 pro- zentiger Salzsäure werden die stärksten Basen entfernt, 14 — 1472- prozentige Säure extrahiert dann Rhodin k und i7prozentige Phytorhodin i. Die beiden Spaltungsprodukte werden aus den mit Äther gewaschenen salzsauren Auszügen durch Verdünnen wieder in Äther übergeführt und durch Schütteln mit 12 V2- bzw. mit I472 prozentiger Salzsäure von stärkeren Basen vollständig befreit. Aus den mit Wasser gewaschenen und eingeengten äthe- rischen Lösungen krystallisieren die reinen Rhodine in unscharf begrenzten Blättchen. Tn der Zusammensetzung C34H3206N4 stimmen Phytorhodin k und i überein, sie scheinen sich von Phytorhodin g durch das Minus von 1 Mol. Wasser zu unterscheiden. Die Löslichkeit der Phytorhodine in Äther ist sehr gering, in Alkohol sind sie in der Kälte schwer, in der Wärme ziemlich leicht löslich. Ihre ätherischen Lösungen sind weniger rot als die von Phytorhodin g, mehr braunstichig; bei Phytorhodin k ist die Nuance ein wenig mehr rot als bei i. In 20 prozentiger Salzsäure lösen sie sich mit lichtgrüner, in Ammoniak mit brauner Farbe. Mit verdünnter methylalkoholi- scher Kalilauge gibt k eine schön rote, i eine gelbe Lösung. Beim Versetzen mit wenigen Tropfen konzentrierter Salpeter- säure wird die alkoholische Lösung von Rhodin k tiefblau, die- jenige von i braunrot. 20* XVII. Phytol. i. Gewinnung und quantitative Bestimmung. Nach Willstätter und Hocheder1) wird Phäophytin wie irgend ein anderes Wachs von alkoholischer Kalilauge leicht ver- seift; Chlorophyll verhält sich ebenso. Während die Zusammensetzung der sauren Komponente, näm- lich der empfindlichen stickstoffhaltigen Spaltungsprodukte un- gemein abhängig ist von den Bedingungen der Verseifung, beein- flussen diese im allgemeinen gar nicht die Zusammensetzung des abgespaltenen Alkohols und nur wenig die Ausbeute an dem- selben. Nur bei einem Verfahren, der Methanolyse des Phäo- phytins mit Chlorwasserstoff in Holzgeist2), wird das Phytol in veränderter Form gewonnen, nämlich in der Hauptsache als Phytolmethyläther. Die Frage, ob das Phytol als solches dem Molekül des Farb- stoffs angehört, konnte nach der Isolierung des Chlorophylls ge- löst werden; es hat sich gezeigt, daß der ungesättigte Alkohol nicht etwa erst unter den Bedingungen der Verseifung von Phäophytin aus einem gesättigten Glykol hervorgeht. W illstätter und Hug3) haben nämlich das Phytol aus dem Chlorophyll unter den gelinden Bedingungen der Alkoholyse mittels der Chlorophyllase abgespalten und mit besonderer Vorsicht isoliert. Die Jodzahl stimmte, der abgespaltene Alkohol war reines Phytol. Für die Gewinnung des Phytols durch Verseifen von Phäo- phytin mit alkoholischer Lauge haben wir im I. Abschn. des XVI. Kap. zwei Verfahren angegeben, die Ausführung in der Wärme und in der Kälte; an jener Stelle ist die Extraktion des Phytols aus dem Reaktionsprodukte bereits beschrieben worden. *) Ann. d. Chem. 354, 240 [1907]. 2) Kap. XV, 3. Abschn. *) Kap. IX, 1. Abschn. Phytol. 309 Die ätherischen Lösungen sind zunächst braun gefärbt durch eine kleine Beimischung von stickstoffhaltigen Substanzen, die sich am besten durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Alkali, Salzsäure und Tierkohle beseitigen lassen. Zunächst schüttelt man die Ätherlösung mit sehr verdünnter Lauge durch und eine Reihe von Malen anhaltend mit wenig konzentrierter Salzsäure, die sich blaugrün anfärbt. Dann wird der Äther oft mit viel Wasser gewaschen und eingeengt, z. B. beim Verarbeiten von 200 g Phäophytin auf 1,5 1. Schließlich werden die letzten färbenden Verunreinigungen durch stundenlanges Schütteln mit guter reiner Tierkohle an der Maschine entfernt. Die ätherische Lösung trocknet man mit Natriumsulfat, dann wird sie konzentriert und im Vakuum ganz eingedampft. Um die letzten Spuren vom Lösungsmittel zu verjagen, erwärmt man den Eindampfrückstand mit eingetauchter Capillare 3/4 Stunden lang im Vakuum auf 90 °. Die Tierkohle hält etwas Phytol zurück; es lohnt sich, sie zu sammeln und sie besonders mit Äther zu extrahieren, sie gibt aber nur einen Teil des absorbierten Phytols (nämlich 0,1 — 0,5% vom Phäophytin) wieder ab. Für die Absorption des Phytols durch Tierkohle ist folgender Versuch von Interesse: 5,7 g Phytol wurden in 0,5 1 Äther mit 11 g getrockneter Tierkohle 5 Stunden geschüttelt; die Tierkohle hatte 1,38 g Phytol aufgenommen. Bei sechsstündigem Kochen mit 0,5 1 Äther gab sie nur 0,54 g Phytol wieder ab. Die Isolierung des Phytols, von dem einige Kilogramm ge- wonnen wurden, ist beinahe quantitativ; die Ausbeute beträgt fast ein Drittel vom Phäophytin. Die theoretische Phytolzahl, d. h. der berechnete Phytolgehalt in Prozenten, beträgt: für Phäophytin a 33,7, für Phäophytin b 33,2; für das Gemisch mit dem Komponentenverhältnis 2,5 : 33,56; für Chlorophyll mit dem Komponentenverhältnis 2,5: 32,66. Für die quantitative Bestimmung1) des Phytols, die bei der vergleichenden Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflan- *) Ann. d. Chem. 371, 18 [1909] und 378, 31 [19x0]. 310 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. zen eine wichtige Rolle gehabt hat, dient im wesentlichen dasselbe Verfahren wie bei der Gewinnung in großem Maßstab. Wir verwenden dafür 0,3 — 1 g, gewöhnlich etwa 0,5 g Phäo- phytin oder Chlorophyll. Die fein zerriebene Substanz wird mit 24 prozentiger methylalkoholischer Kalilauge (5 — 6 ccm für 1 g) 2 Stunden lang im Wasserbad gekocht, und zwar in einem reagens- glasähnlichen Gefäß (30 — 40 ccm Inhalt) mit verjüngtem Hals und aufgeschliffenem Kühlrohr bei den kleinen Mengen, im Rund- kölbchen mit aufgeschliffenem Kühler bei etwas größeren Mengen von Farbstoff. Dann wird das Phytol fünf- bis sechsmal mit Äther extrahiert, am bequemsten im nämlichen Gefäß ohne Zusatz von Wasser, indem man die Masse, welche zäh wird, jedesmal mit dem Äther gut verrührt und anschüttelt und den Äther einfach dekantiert. Man kann natürlich auch Fig. 13. Heimkoibchen. Flüssigkeit mit Wasser in einen Tropftrichter spülen und hier ausäthern; aber diese Arbeits- weise ist zeitraubender, weil oft Emulsionen auftreten. Die ver- einigten ätherischen Lösungen werden nur mit Wasser mehrmals gewaschen und mit geglühtem Natriumsulfat getrocknet. Dann werden sie mit reiner, aber nicht besonders getrockneter Tierkohle 15 Minuten geschüttelt, und zwar bei einer Konzentration von 200 ccm für 1 g angewandtes Phäophytin mit 0,1 g Tierkohle. Wir wenden immer dieselbe Menge Tierkohle und gleiche Konzen- tration der ätherischen Lösung an, um den Phytolverlust infolge der Absorption durch die Kohle möglichst gleichmäßig zu machen. Die abermals filtrierte Lösung wird im Helmkolben mit haar- feiner Capillare im Wasserbade eingedampft; endlich spült man den Rückstand mit wenig Äther in ein tariertes, leichtes 15 ccm- Wägekölbchen mit langem Halse (um Verspritzen auszuschließen) und gleichfalls mit aufgeschliffenem Helm (siehe die Figur 13). Der Äther wird durch 3/4 Stunden langes Erwärmen im Vakuum auf 90 0 mit eingetauchter Capillare zur Gewichtskonstanz verjagt und das Phytolkölbchen auf der analytischen Wage gewogen. Phytol. 311 Der Fettgehalt des Kahlbaumschen Äthers bewirkte gewöhn- lich einen Fehler von ungefähr -j-0,2% bei Anwendung von 0,5 g Phäophytin und kompensierte wohl den unvermeidlichen Phytol- verlust bei der Isolierung. Je 200 ccm Äther lieferten nämlich 0,0033 und 0,0028 g fettigen Rückstand; bei Ausführung aller Reinigungsmanipulationen wie bei einer Phytolbestimmung betrug aber der Rückstand 0,0012 g. Da aber manche Handelssorten von Äther viel mehr Rückstand enthalten, ist es vorzuziehen, für die Bestimmungen frisch ge- reinigten und destillierten Äther anzu wenden. Bei wiederholten Bestimmungen differierten die Werte sehr wenig, wie die folgenden Beispiele zeigen. Ein Phäophytinpräparat aus Heracleum gab bei zwei Be- stimmungen die Phytolzahl 29,5 und 29,6 (0,5201:0,1537 g; 0,5315: 1573 g); ein weitergehend alkoholysiertes Präparat gab die Phytolzahlen 23,0 und 23,2 (0,5433: 0,1252 g; 0,3731 : 0,0857 g); ein anderes die Werte 25,6 und 25,7 (0,4213 : 0,1080 g; 0,3102 : 0,0798 g). 2. Beschreibung1). Das Phytol ist ein ungesättigter primärer Alkohol der Fett- reihe von der Formel C20H39OH; seine Kohlenstoffkette enthält Verzweigungen. Es ist ein farbloses, ziemlich dickes öl, das sich mit allen üblichen organischen Lösungsmitteln mischt. Es siedet unter ver- mindertem Druck unzersetzt; die Destillation2) im Hochvakuum ist seine beste Reinigung. Siedepunkt unter 0,03 — 0,04 mm Druck 145 °, unter 9 — 10 mm 203 — 204 °. D° = 0,864, df = 0,852; n£° = 1,46380. Phytol ist autoxydabel und verbindet sich leicht mit Ozon; es addiert ein Molekül Brom (gefunden 1,05 statt 1 Mol.) und gibt x) Abh. III u. XII. s) Für die Vakuumdestillation von hoch- siedenden Substanzen verwenden wir vorteil- haft Kolben von einer Entenform (Fig. 14), die nicht viel schädlichen Raum aufweisen und doch kein Überspritzen Vorkommen lassen. 312 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. eine damit genau übereinstimmende Jodzahl (gefunden 90,5 und 91,2 statt ber. 85,5). Das Natriumsalz des Phytols ist leicht löslich in Äther. Mit Phenylcyanat bildet Phytol ein krystallisierendes Urethan vom Schmelzpunkt 26 — 29 °. Mit Phthalsäureanhydrid verbindet es sich zu einer Estersäure, deren charakteristisches Silbersalz in Äther sowie in Benzol leicht löslich ist und in Prismen vom Schmelzpunkt 1190 krystallisiert. Durch Behandeln mit Wasserstoff bei Gegenwart von Platin läßt sich der ungesättigte Alkohol zum gesättigten hydrieren. Di- hydrophytol (C20H42O) ist ein mit den organischen Solvenzien mischbares öl vom Siedepunkt 201,5 — 202° unter 9,5 mm Druck; D4 = 0,849, nD = 1,45213- Durch Erhitzen von Dihydrophytol mit Natronkalk entsteht die Phytansäure (C20H40O2), ein schwer bewegliches öl vom Siede- punkt 221 0 unter 7,5 mm Druck. Der Stammkohlenwasserstoff des Phytols von der Formel C20H42, Phytan, tritt als Nebenprodukt der Hydrierung des un- gesättigten Alkohols auf; er ist eine in Methylalkohol und Eis- essig wenig lösliche, leicht bewegliche Flüssigkeit vom Siede- punkt 169,5° unter 9,5 mm Druck. Bei der Oxydation von Phytol mit Chromsäure oder beim Ver- kochen seines Ozonides wird die Kohlenstoffkette zwischen dem dritten und vierten Kohlenstoffatom gespalten. Dabei entsteht das Keton C17H340, ein mit den üblichen Lösungsmitteln misch- bares öl vom Siedepunkt 175 0 (bei 11 mm) und d4 = 0,844. Die für dieses Keton zuerst angenommene Formel C16H30O ist als un- richtig erkannt worden. Die Nachprüfung1) der veröffentlichten Arbeit hat ergeben, daß aus rohem und aus destilliertem Phytol stets das nämliche Keton C17H340 in mehr oder weniger reinem Zustand entsteht und sie hat die Annahme von Willstätter, Mayer und Hüni2) widerlegt, daß bei der Destillation des Phytols die Doppelbindung wandere. l) O. Schuppli, Beiträge zum Abbau des Phytols; Promotionsarbeit Zürich 1912. *) Abh. XII. XVIII. Die Chlorophyllinsalze. Mit den Chlorophyllinen ist es zuerst gelungen, Aufschlüsse über die Zusammensetzung des Chlorophylls zu gewinnen1). Ihre saure Natur ermöglichte eine Reinigung mit chemischen Mitteln, nämlich die Überführung aus ätherischer Lösung in Dinatrium- phosphat als Alkali und Entbindung aus dieser Lösung mit Mono- natriumphosphat als Säure. Auf diese Weise einigermaßen ge- reinigt, haben die Chlorophylline die Bedeutung des Magnesiums für die Zusammensetzung des Blattfarbstoffs erkennen lassen. Bei der Einwirkung der Alkalien auf die zwei Chlorophyll- komponenten wird die leicht verseifbare Phytyl- und die schwer verseifbare Methylestergruppe hydrolysiert. Die entstehenden Chlorophylline sind als magnesiumhaltige freie Carbonsäuren sehr zersetzlich, sie werden daher in Form der Salze untersucht und für den Abbau angewandt. Bei dieser Reaktion mit den Alkalien erfolgt unvermeidlich noch eine weitere Veränderung, nämlich eine Umwandlung von Lactamgruppen, die in einer Richtung verläuft, wenn die Ver- seifung in der Hitze, in einer anderen Richtung, wenn sie unter den gelindesten Bedingungen in der Kälte ausgeführt wird, und oftmals nach beiden Richtungen zugleich (siehe S. 27 u. ff.). Erst nachdem in einer Untersuchung von Willstätter und Utzinger2) die Abhängigkeit der Verseifungsprodukte von den Bedingungen genau erkannt worden war, gelang es, je zwei ein- heitliche Chlorophylline der a- und b-Reihe zu unterscheiden und zu untersuchen. 1. Die rasche Verseifung in der Hitze führt zu den Isochloro- phyllinen a und b. Sie haben den Namen Isoverbindungen be- l) Abh. II. *) Abh. XVI. 314 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. kommen müssen, weil sie erst viel später dargestellt werden konnten, als die Produkte der kalten Verseifung, nämlich erst zu einer Zeit, da reine Alphylchlorophyllide zugänglich geworden waren. Gerade aus den Isochlorophyllinen gehen einfach beim Austritt des Magnesiums die wichtigsten Derivate der Chlorophyllkomponenten hervor : Isochlorophyhin a hefert nämlich beim Ehminieren des Magnesiums mit Säure Phytochlorin e, Isochlorophyhin b auf gleiche Weise Phytorhodin g. Der Abbau der beiden Isochlorophylhne mit Alkalien bei höherer Temperatur führt zum Phyhophyhin. Die Isochlorophyllinsalze zeichnen sich durch eine ähnliche Fluorescenz aus wie Chlorophyll, während die Salze der anderen Reihe, die Chlorophylhnsalze, nicht fluorescieren. 2. Die Verseifung in der Kälte läßt sich so leiten, daß die reinen Chlorophylline a und b entstehen. Sie liefern bei der Zer- setzung mit Säure schwach basisches, leicht veränderliches Phyto- chlorin g und schwach basische Phytorhodine, Verbindungen, welche für den Abbau des Chlorophylls erst in zweiter Linie Bedeutung erlangt haben. Die Chlorophyllinsalze selbst sind aber wertvoll als Ausgangs- material für Pyrrophyllin. Bei der Verseifung in der Kälte erfolgte stets nebenher in stören- dem Maße die Bildung der Iso Verbindungen. Deshalb ist eine neue Methode von Nutzen, welche gerade die Chlorophylline rein dar- zustellen ermöglicht. Sie besteht darin, daß zuerst das Chloro- phyll durch Stehen in schwach alkalischer alkoholischer Lösung allomerisiert , d. h. umlactamisiert und darauf in der Kälte ge- linde verseift wird. Dann ist nur noch die Schwierigkeit zu be- achten, daß bei dieser vorsichtigen Verseifung das Chlorophyllin leicht methoxylhaltig bleibt. 1. Verseifung in der Hitze1). Die Verseifung in der Hitze, die für die Gewinnung von Abbau- produkten neue Möglichkeiten eröffnet hat, ließ sich nicht mit Unveröffentlicht. Die Chlorophyllinsalze. 315 dem Chlorophyll in der verdünnten Form der Extrakte ausführen; sie konnte daher erst dann zur Anwendung kommen, als isoliertes Chlorophyllid oder Chlorophyll dafür zur Verfügung stand. Im Kap. XVI, Abschn. 2, ist die Bildung der Isochlorophyllin- salze erwähnt worden mit Rücksicht auf die Darstellung von Phytochlorin e und Phytorhodin g aus denselben. Um die Kalium- salze für den Abbau zu Phyllinen (Phyllophyllin) und Porphyrinen zu verwenden, wofür sie ein wichtiges Ausgangsmaterial bilden, gewinnen wir sie auf ähnliche Weise, ohne sie aus der alkalischen Lösung abzuscheiden. 10 g Methylchlorophyllid (a + b) oder ebensogut 15 g reines oder auch rohes Chlorophyll werden gepulvert und in Portionen von 2 g in 250 ccm siedende 35 prozen tige methylalkoholische Kalilauge eingetragen. Die Lauge bereiten wir in einer silbernen Flasche mit eingeschliffenem silbernem Stopfen durch Auflösen von 350 g mit Alkohol gereinigtem Ätzkali in 650 g Methylalkohol. Für die Verseifung bringen wir, um Verunreinigung durch das Zink der Glasgefäße zu vermeiden, die Kalilauge in einen silbernen Tiegel von 600 ccm Inhalt, wie er als Autoklaveneinsatz verwendet wird, und legen um den oberen Rand des Bechers außen eine Kühl- schlange von Blei, um die Holzgeistdämpfe zu kondensieren. Beim Einträgen der Substanz rühren wir mit dem Silberspatel kräftig um und achten darauf, daß nichts an den Wänden klebt. Mit gelindem Sieden fahren wir fünf Minuten fort, ohne Holzgeist abzudampfen. Die gebildete Isochlorophyllinsalzlösung ist grün- schwarz und wird beim Verdünnen tiefgrün mit prachtvoller Fluorescenz. Das Verseifungsprodukt enthält ausschließlich die zwei Iso- kaliumverbindungen; es gibt beim Ansäuren, Ausäthem und Fraktionieren nur die stark basischen Derivate. Nach dem Durch- schütteln mit 9 prozen tiger Salzsäure liefert ein Auszug mit 12 prozentiger Säure, in Äther übergeführt, eine rein rote Lösung. Einheitliches Isochlorophyllinkalium a haben Willstätter und Fors6n in Substanz abgeschieden. Reines Methylchlorophyllid a wurde in Mengen von 1 g mit 25 ccm sieden- 316 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. der konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge übergossen. Die gelbe Phase tritt sofort auf und verschwindet augenblicklich. Es war schwer, das Verseifungsprodukt ganz methoxylfrei zu ge- winnen; um dies zu erreichen, wurde fünf Minuten zu schwachem Sieden erhitzt, dann 2—3 ccm Wasser hinzugefügt und das Kochen noch einige Minuten fortgesetzt. Zwei solche Portionen vereinigte man und verdünnte sie mit Wasser auf 200 ccm. In diese Lösung wurde dann ein mit Chlorkalium gefülltes Leinwandbeutelchen so lang eingetaucht, bis alles Isochlorophyllinsalz in großen hell- grünen Flocken gefällt und die Flüssigkeit fast entfärbt war. Die Mutterlauge dekantierte man und sammelte das Produkt mit etwas Talk. Hieraus ist nach dem Trocknen und Pulverisieren die Kaliumverbindung mit 200 ccm siedendem Holzgeist ausgezogen worden. Die blaue, stark fluorescierende Lösung engten wir rasch im Vakuum auf 10 ccm ein, versetzten sie mit 100 ccm absolutem Äthylalkohol und konzentrierten zur vollständigen Entfernung des Methylalkohols die Flüssigkeit auf das halbe Volumen. Bei zweistündigem Stehen in der Kältemischung scheidet sich die Kaliumverbindung dunkelblau, grobkörnig fast in ihrer ganzen Menge aus (1,8 g). Sie enthält noch etwas anorganische Bei- mischung und wird erst durch nochmaliges Umfällen aus Methyl- mit Äthylalkohol chlorfrei. Man schüttelt die Substanz in der Kälte mit 100 ccm Holzgeist an und läßt dabei einen Anteil von 0,2 g ungelöst. Die Lösung wird wieder unter vermindertem Druck stark eingedampft und mit 100 ccm Äthylalkohol ver- mischt; dann scheidet sich beim Stehen im Kühlraum 0,9 g schönes Isochlorophyllinkalium als dunkelblaues Pulver ab. Das Salz ist frei von Methoxyl und enthält 16% Kalium und 3%Magnesium, entsprechend den Formeln [C31H31N4Mg] (COOK)3 oder [C31H29N4Mg] (COK) (C02K)2. Es ist in Methylalkohol ziemlich leicht löslich mit grünblauer Farbe, in Äthylalkohol und anderen organischen Solvenzien heiß wie kalt schwer, in Wasser leicht löslich. Das reine Isochlorophyllinkalium b haben Willstätter und Fischer in Lösung erhalten, indem sie 0,3 — 0,8 g Methylchloro- phyllid b, gelöst in 1 — 2,5 ccm Pyridin, in 3 — 8 ccm siedende methylalkoholische Lauge eintrugen und zur vollständigen Ver- Die Chlorophyllinsalze. 317 seifung noch fünf Minuten über einer kleinen Flamme, ohne stark einzukochen, erhitzen. 2. Verseifung in der Kälte. Solange kein anderes Ausgangsmaterial als Rohchlorophyll- lösungen für die Gewinnung der Chlorophyllinsalze existierte, ist die Verseifung in der Kälte folgendermaßen geleitet worden.1) Die Perkolate oder Doppelextrakte wurden in bedeutenden Chargen in große, mit gut aufgeschliffenen Deckeln versehene Steinzeugtöpfe eingefüllt, aus welchen man das Kaliumsalz nach dem Ablassen der Mutterlauge mit kräftigen Silberspateln bequem abschaben konnte. Die innere Wand des Zylinders ist glatt ge- arbeitet; 10 ccm über dem Boden besitzt das Gefäß einen Tubus. Die Verseifung wurde mit 20 ccm konzentrierter (28 prozentiger) methylalkoholischer Kalilauge pro Kilogramm Planzenmehl be- wirkt. Man vermischte den Extrakt mit der Lauge unter kräftigem Schütteln. Das Ende der Verseifung war daran zu erkennen, daß sich aus einer Probe beim Durchschütteln mit Wasser und Äther eine rein gelbgefärbte Ätherschicht absetzte. Die Reaktion, die bei kleinen Proben mit Überschuß von Alkali fast momentan ver- läuft, erforderte hier einige Stunden. In dieser Zeit fiel noch gar kein Chlorophyllin aus, sondern es bildete sich in großer Menge ein dunkelgefärbter, harziger, von Chlorophyllsubstanz beinahe freier Niederschlag, von dem man die Lösung in einen anderen Dekantiertopf umfüllen mußte. Sie blieb dann zur Abscheidung des Chlorophyllins gutverschlossen 7 — 10 Tage lang stehen. Der zähe Niederschlag von Chlorophyllinkalium wurde mit absolutem Alkohol angerieben und ausgewaschen und im Ex- siccator getrocknet. Es bildete danach eine blauschwarze, harte, hygroskopische Masse. Die Ausbeute von 100 kg Brennesseln betrug 306 — 321 g Kalium salz, das meistens 47 — 5öprozentig war. Die alkoholische Mutterlauge des Salzes, die noch viel ver- seiftes Chlorophyllin enthielt, ließ sich durch Verarbeitung auf l) Ann. d. Chem. 358, 215 [1907]. 318 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. gewisse ätherlösliche Chlorophyllinsalze1) verwerten. Das Natrium-, Calcium- und Magnesiumsalz sind bei Gegenwart der vielen Be- gleitstoffe der Mutterlauge in Äther leicht löslich. Die Mutterlauge wird in Portionen von 15—20 1 in Glasballons mit dem anderthalbfachen Volumen Wasser verdünnt und das Calciumsalz durch Zufügen der Lösung von 1 kg Chlorcalcium ausgefällt. Dabei schüttelt man recht heftig; die ausgeschiedenen Flocken ballen sich dann meistens vollständig zu einer halbfesten zähen Masse zusammen, die an der Gefäßwand festklebt. Noch leichter wird dies erreicht, indem man beim Verdünnen der Chloro- phyllinlösung lauwarmes Wasser an wendet. Nach dem Abheben der Lauge wird das Calciumsalz mit 2 — 3 1 Äther aus dem Ballon herausgelöst; die Ätherlösung wäscht man einige Male mit Wasser und trocknet sie mit Natriumsulfat. Man kann nun das Salz entweder mit Petroläther ausfällen oder nach starkem Einengen der ätherischen Lösung mit Alkohol abscheiden, der dann beim Eindampfen noch eine sehr unreine Mutterlaugenportion liefert. Die Mutterlauge von (189 g) Chlorophyllinkalium aus 66 kg Brennesseln gab 620 g Chlorophyllincalcium, mit Alkohol aus der ätherischen Lösung gefällt; es war farbäquivalent 97g krystalli- siertem Chlorophyll. Neue Verfahren2). Die Anwendung von gereinigtem Chlorophyll, auch in der leicht zugänglichen Form unseres sogenannten Rohchlorophylls oder der Rohchlorophylltalkmischung anstatt der Extrakte bietet den Vor- teil, daß der Reinheitsgrad des Chlorophyllinsalzes viel höher wird. Noch wichtiger ist eine zweite Abänderung. Die Verseifung geht bei der Behandlung einer alkoholischen Lösung mit Alkali bei gewöhnlicher Temperatur stets nach den beiden möglichen Richtungen, der Bildung von Chlorophyllin- und von Isochloro- phyllinsalz. Deshalb allomerisieren wir zuerst das Chlorophyll. Dann liefert die Komponente a unter keiner Bedingung mehr *) Ann. d. Chem. 358, 218 [1907]. a) Unveröffentlicht. Die Chlorophyllinsalze. 319 Isoverbindung. Für b gilt nicht das gleiche. Auch nach der Allo- merisation gibt die Komponente b noch die verschiedenen mög- lichen Chlorophyllinsalze bei der Hydrolyse in kalter Lösung und sogar noch einen großen Anteil des dem Phytorhodin g ent- sprechenden Isochlorophyllinsalzes bei der Verseifung in der Wärme. Führt man aber das allomerisierte Chlorophyll in ätherische Lösung über und läßt man hierauf methylalkoholisches Kali einwirken, so entstehen die Chlorophyllinsalze frei von Isokaliumverbindungen, also nur die Magnesium veibindungen der schwach basischen Phytorhodine k und i (neben derjenigen von Phytochlorin g). Durch die glatte Bildung dieser Chlorophylline wird auch die Aus- beute an den Kaliumsalzen a und b erhöht, weil dieselben schwerer löslich sind als die entsprechenden Isokaliumsalze. Chlorophyllinkalium, aus allomerisiertem Chloro- phyll durch Verseifung mittels der ätherischen Lösung gewonnen, bildet das geeignetste Ausgangsmaterial für Pyrro- phyllin. 5 kg Brennesselmehl wurden mit Schichtdicke von 3 cm auf 2 Steinzeugnutschen mit 15 1 80 proz. Aceton extrahiert, wie im Kap. III, Abschn. 2, beschrieben. Der Extrakt (9,1 1) enthielt in einem Beispiel 41 g Chlorophyll; er wurde mit 200 g Talk und unter Umschütteln mit 4 1 Wasser versetzt, so daß die Flüssigkeit nur noch aus 55 prozen tigern Aceton bestand und bei kurzem Stehen fast allen grünen und gelben Farbstoff ausschied. Man hat auf einer Nutsche durch etwas Talk von der schwach gelbgrünen Mutterlauge filtriert, mit einem Liter 65 prozentigem Aceton und darnach mit einem Liter 65 prozentigem Alkohol gewaschen und so scharf wie möglich abgesaugt. Der fast trockene grünschwarze Talk wird nun in einer Pulver- flasche durch Schütteln mit 31 95 prozentigem Alkohol extrahiert und mit ebensoviel auf der Nutsche nachgewaschen. Bei Anwendung von absolutem Alkohol sind 3 — 4 1 zum Extrahieren und Nach waschen hinreichend. Im Talk blieb etwas Xanthophyll und Carotin zurück. Die schöne alkoholische Chlorophyllösung versetzen wir, um nur die Allomerisation, aber noch keine Verseifung zu bewirken, 320 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. unter Umschütteln mit 5 ccm konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge und lassen sie stehen. Nach 16 Stunden gibt die Phasen- probe nur noch eine undeutliche, olivgrüne Farbe und nach 2 bis 3 Tagen ist das Chlorophyll quantitativ allomerisiert, viel rascher in absolutem Alkohol. Nun wird der Farbstoff aus dem Alkohol in Äther übergeführt durch portionen weises Eingießen und vorsichtiges Verdünnen mit Wasser. Nach dem Herauswaschen des Alkohols beträgt das Vo- lumen des Äthers 3 — 4I. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat schütteln wir die ätherische Lösung in einer großen Pulverflasche mit 100 ccm konzentrierter methylalkoholischer Lauge kräftig durch. Das Chlorophyllinsalz scheidet sich nach einiger Zeit zäh- flüssig an den Wänden und am Boden aus. Wenn die ätherische Lösung sich ziemlich geklärt hat und eine Probe beim Schütteln mit Wasser rein gelb wird und nicht mehr fluoresciert, dann dekan- tieren wir die Mutterlauge, welche ein gutes Ausgangsmaterial für Carotin und Xanthophyll bildet, waschen unter Umschwenken zweimal mit Äther nach und schütteln die grüne Masse mit 1 1 absolutem Alkohol an. Sie wird dabei feinkörnig krystallinisch ; so daß man sie von dem verhältnismäßig farbstoffarmen Alkohol leicht filtrieren und mit absolutem Alkohol nachwaschen kann. Die Ausbeute an exsiccatortrockenem Chlorophyllinkalium be- trägt 33 — 37 g; d. i. 29,8 — 33,4 g hochvakuumtrocken, also 6,0 bis 6,7 g aus 1 kg trockener Blätter. Der Reinheitsgrad des Salzes ist 88, d. h. es enthält 12% farblose Beimischung. Das prachtvoll stahlblauglänzende Präparat löst sich mit brillantgrüner Farbe in Wasser und zwar ohne Fluorescenz. Es ist frei von gelben Pig- menten ; beim Ansäuern liefert es nur schwach basische Spaltungs- produkte, deren ätherische Lösung 6 prozentige Salzsäure nicht anfärbt. Rohes Chlorophyllinkalium a. Ohne Allomerisation ge- winnen wir aus der alkoholischen Chlorophyllösung, die aus der Rohchlorophylltalkmischung extrahiert wird, direkt Chlorophyllin- kalium durch Verseifung in nicht zu verdünnter Lösung. Unter diesen Bedingungen führt die Hydrolyse der Kompenente b großenteils zur Isoverbindung, welche leichter löslich ist und in Die Chlorophyllinsalze. 321 der Mutterlauge bleibt. So erhält man einfach Präparate von Chlorophyllinkalium, welche etwa 9/10 von der Komponente a ent- halten. Chlorophyllin b läßt sich darin beim Fraktionieren der Spaltungsprodukte mit 17 prozentiger Salzsäure noch nachweisen. Ein solches Chlorophyllinpräparat ist von Wert für die Gewinnung von Rhodophyllin. Das auf Talk ausgefällte Rohchlorophyll bringen wir mit mög- lichst wenig absolutem Alkohol durch Anschütteln in der Flasche in Lösung und verseifen diese mit viel konzentrierter methyl- alkoholischer Lauge, z. B. mit 50 ccm für den Farbstoff aus einem kg Blattmehl. Das Chlorophyllinsalz beginnt schnell auszufallen ; beim Stehen während eines halben Tages bildet es ein blauschwarzes, körnig krystallines Pulver; es wird mit absolutem Alkohol nach- gewaschen. Die Ausbeute beträgt 4 — 5 g (für 1 kg Blattmehl) Chlorophyllin- salz, das 85 — 90% reiner Kahum Verbindung enthält. Reines Chlorophyllinkalium a1). In krystallisiertem Zu- stand gewannen wir das Salz aus petrolätherischen Lösungen von Chlorophyll a, welche die Fraktionierung des Komponentenge- misches geliefert hatten. Die petrolätherische Lösung von 3 g Sub- stanz schüttelten wir mit 10 ccm 7 prozen tiger methylalkoholischer Kalilauge durch. Das Chlorophyll ging mit brauner Farbe in die Lauge, dann kehrte in einigen Minuten die chlorophyllgrüne Farbe zurück und die Kalium Verbindung krystallisierte reichlich in schönen dunkelblau glänzenden Blättchen aus, die in der Durch- sicht unter dem Mikroskop rein grüne Farbe zeigten. Der Petrol- äther wurde abgegossen und das Salz mit möglichst wenig Holz- geist herausgespült und auf dem Filter mit absolutem Alkohol nachgewaschen. Die methylalkoholische Mutterlauge haben wir mit etwas Holz- geist verdünnt und mit Kohlensäure gesättigt. Dabei schied sich zusammen mit methylkohlensaurem Kalium fast der ganze Rest des Kaliumsalzes aus und ließ sich durch fraktionierte Krystalli- sation aus Holzgeist ziemlich rein erhalten. *) Ann. d. Chem. 382, 157 [1911]. YVillstätter-Stoll, Chlorophyll. 21 322 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die erste Krystallisation von Kaliumsalz war frei von Pott- asche. Das schöne Präparat ist umgeschieden worden durch Auf- nehmen bei gewöhnlicher Temperatur mit ioo ccm absolutem Holz- geist, wobei etwas Farbloses zurückblieb, starkes Einengen im Vakuum und Ausfällen mit absolutem Alkohol. Die Ausbeute be- trug dann o,8 g. Das Chlorophyllinsalz ist in Wasser mit prächtig blaugrüner Farbe sehr leicht, in kaltem Holzgeist ziemlich leicht, in warmem leicht löslich, in Äthylalkohol kalt schwer, heiß nur wenig leichter, in Pyridin sehr schwer löslich. Das Präparat wird nicht ganz frei von Methoxyl und entspricht daher nur annähernd der Formel [C31H31N4Mg](COOK)3 oder [C31H29N4Mg] (COK) (C02K)2. Bei vorsichtigem Ansäuern mit primärem Phosphat wird Chloro- phyllin frei, beim Zersetzen mit Salzsäure entsteht das unbeständige olivgrüne Phytochlorin g, das aus Äther erst von n prozentiger Salzsäure reichlich aufgenommen wird, und zwar mit blaustichig grüner Farbe. XIX. Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls1). Die durch Austritt von Magnesium gebildeten Chlorophyll- derivate, z. B. Phäophorbid, Phytochlorin, Phytorhodin und die verschiedenen Porphyrine, lassen sich leicht von Metall substituieren unter Bildung komplexer Verbindungen, die sich durch ihre Be- ständigkeit in sauren und alkalischen Medien auszeichnen. Solche Metallverbindungen entstehen z. B. bei der Einwirkung von Kupfer-, Zink- und Eisensalzen in Eisessig, oft auch in alkoholischer Lösung auf die stickstoffhaltigen Carbonsäuren und ihre Ester. Mit der Bildung der komplexen Verbindungen gehen bedeutende Veränderungen in der Farbe und in den basischen Eigenschaften Hand in Hand. Die Aufnahme der Metalle wird dadurch so augen- fällig, daß man die allergeringsten Spuren gewisser Metalle, wie Zink oder Kupfer, mit Hilfe von Phytochlorin e nachweisen kann. Nur mit besonderer Vorsicht gelingt es, die magnesiumfreien Chloro- phyllderivate ganz aschefrei zu erhalten2). Der Zinkgehalt der Gläser ist störend, der Kupfergehalt von Lösungsmitteln ver- rät sich. Um Kupfer z. B. im reinen Methylalkohol des Handels nach- zuweisen, lösen wir darin Phytochlorin e und lassen einige Zeit stehen. Die Reaktion erfolgt rascher bei Gegenwart von Pyridin. ») Abh. XXI. 2) Spatel von unedlem Metall dürfen beim Arbeiten mit den Chlorophyll- derivaten nicht angewandt werden. Wir verwenden zumeist Spatel von Feinsilber und für gewisse Zwecke dünne Spatel aus einer elastischen federnden Legierung von Gold-Platin (90% Gold) mit Holzgriff, die wir von W. C. Heraeus anfertigen ließen. 324 R- Willstatter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Man führt dann das Chlorophyllderivat wieder in Äther über und entfernt durch Waschen mit 10 prozentiger Salzsäure quantitativ das überschüssige Phytochlorin. In Äther bleibt die gegen Säure be- ständige, intensiv blaugrüne Kupferverbindung des Phytochlorins e. Der Nachweis von Zink in zinkhaltigen Gläsern benützt ihre Eigenschaft, an Alkalien sehr leicht das Metall1) abzugeben, z. B. schon beim Auflösen von reinem Kaliumhydroxyd in Methyl- alkohol (50 g KOH in 100 ccm) in den zu prüfenden Gefäßen. Ver- seift man dann im Reagierrohr aus Silber oder reinem Kaliglas 5 mg Phäophytin mit etwa 5 ccm dieser Lauge in der Hitze oder löst man 3 — 4 mg Phytochlorin e darin auf, so bleibt die Lösung bei Anwesenheit von Zink auch beim Verdünnen mit Wasser grün und der Farbstoff geht beim Ansäuern mit Mononatriumphosphat mit rein blauer Farbe und intensiver dunkelroter Fluorescenz in Äther über. Mit 5 prozen tiger Salzsäure läßt sich daraus überschüssiges Chlorin e entfernen. Die Zink verbin düng wird beim Ausschütteln ihrer ätherischen Lösung von 12 prozentiger Salzsäure langsam, von 20 prozentiger Salzsäure rasch zersetzt. Außer dieser charakteristi- schen Eigenschaft dient zur Identifizierung der komplexen Ver- bindung ihr Spektrum, das dem Chlorophyllspektrum ähnlich und von dem der metallfreien Derivate ganz verschieden ist. Die Haupt- bänder sind bei /u/u 653 — 623, 603. ..58g, 560.542 und 523. .507. Viele Apparate- und Flaschengläser des Laboratoriums erweisen sich bei dieser Prüfung als zinkhaltig. Die komplexen Verbindungen mancher Metalle sind gegen Säure unbeständig und erfordern andere Bedingungen für ihre Bildung. Phytochlorin liefert mit überschüssigem wasserfreiem Bariumhydroxyd in methylalkoholischer Lösung die intensiv blau- grüne Lösung einer Bariumverbindung, und sogar die Alkalien sind zur Bildung analoger Verbindungen fähig. Diese entstehen beim Auflösen von Phytochlorin und Phytorhodin in konzentrier- tester alkoholischer Kalilauge und werden schon beim Verdünnen mit Alkohol wieder gespalten. Bei den komplexen Metallver- bindungen dieser Gruppe ist also jeder Grad von Beständigkeit i) Uber die ersten derartigen Beobachtungen siehe Ann. d. Chem. 358, 249 [1908]. Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls. 325 verwirklicht. Zwischen den Extremen, den höchst unbeständigen Kalium- und den beispiellos beständigen Kupferverbindungen, steht der Magnesiumkomplex des natürlichen Farbstoffs. Es ist nun vor kurzem Willstätter und Forsen gelungen, auch das Magnesium in die metallfreien Chlorophyllderivate ein- zuführen und dadurch einen kleinen Schritt der Chlorophyll- synthese zu verwirklichen. Ein brauchbares Reagens hierfür ist Magnesiumoxyd bei Gegen- wart sehr konzentrierter Alkalien. In geschmolzenem Kalium- hydroxyd löst sich Magnesium unter Wasserstoffentwicklung klar auf (z. B. 0,1 g Metall in 25 g KOH); bei weiterem Auflösen des Metalls trübt sich die Schmelze. Auch Magnesiumoxyd löst sich, zwar nur spurenweise, in methylalkoholischer Kalilauge, aber be- trächtlich in geschmolzenem Ätzkali (z. B. 0,16 g MgO in 25 g KOH). Die Schmelze enthält vielleicht eine Verbindung der Mag- nesia mit dem Ätzkali, die man als Magnesiat bezeichnen kann: Mg(OK)2. Wenn man Phäophytin oder ein anderes metallfreies Chloro- phyllderivat im silbernen Reagierrohr mit methylalkoholischem Kali und Magnesiumoxyd erhitzt, so entsteht eine Reihe der ver- schiedenen Phylline, die bei vorsichtigem Ansäuern mit grüner und mit leuchtend blauer und roter Farbe und intensiver Fluores- cenz in Äther gehen. So sind aus dem Phytochlorin e zuerst das ent- sprechende Chlorophyllin und dann drei verschiedene Phylline in größerem Maßstab gewonnen worden, je nachdem die Reaktions- temperatur 180, 200 oder 2200 betrug, nämlich die Dicarbon- säuren Cyanophyllin und Erythrophyllin und endlich die Mono- carbonsaure Phyllophyllin. In der b-Reihe entstand analog Rubi- phyllin aus Phytorhodin g und aus Phytorhodin k Pyrrophyllin. Es gelingt auch, die Methode zur Einführung von Magnesium auf die Porphyrine aus Hämin zu übertragen und ferner sie für die Bildung anderer komplexer Metallverbindungen zu erweitern, z. B. Eisen in die Porphyrine einzuführen durch Erhitzen mit methylalkoholischem Kali und Eisenoxyd. Die Methode hat einen Ubelstand. Durch die Anwendung starker Alkalien und hoher Temperatur wird die Bildung des 326 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Chlorophylls selbst und die seiner ersten Umwandlungsprodukte aus den magnesiumfreien Derivaten ausgeschlossen. Hier führt eine zweite Methode für die Einführung des Magnesiums zum Ziel, die auf der Reaktion der Chlorophyllderivate mit Grignardscher Lösung beruht. Man kann Amino- und Iminogruppen bekanntlich quantitativ mit Hilfe der Magnesiumalkylhalogenide substituieren. Mit Phäo- phytin, z. B. mit der reinen Komponente a desselben, reagiert Methylmagnesiumjodid unter Bildung unlöslicher Magnesiumjod- verbindungen. Bei der Einwirkung von 1 Mol. MgCH3J entsteht eine Fällung, welche 2 At. Magnesium enthält, bei Anwendung der doppelten Menge Grignardscher Lösung ein Salz mit 4 At. Ma- gnesium. Die beiden so erhaltenen Niederschläge gaben unter allen Umständen bei der Zersetzung mit Wasser, Säuren, Salzlösungen und anderen Reagenzien nur Phäophytin zurück. Ganz anders war das Resultat bei Anwendung einer noch größeren Menge Magnesiummethyljodid (z. B. 8 Mole). Dadurch wird das Phäo- phytin quantitativ in Form einer Verbindung niedergeschlagen, die bei Zersetzung mit Wasser und Äther eine chlorophyllgrüne, also magnesiumhaltige Lösung liefert. Führt man den nämlichen Versuch mit Chlorophyll selbst aus, so entsteht gleichfalls eine magnesium- und jodreiche Fällung, die bei der Zersetzung ein hinsichtlich des Magnesiumgehaltes und der Phytol-, sowie Metho- xylzahl unverändertes Chlorophyllpräparat liefert. Die verschiedenen Estergruppen bleiben also fürs erste intakt bei der Behandlung mit Methylmagnesiumjodid. Dennoch war das Resultat noch nicht brauchbar. Die so ge- bildeten Magnesiumverbindungen waren kein ganz unversehrtes Chlorophyll; sie gaben nämlich die ,, braune Phase“ des Chloro- phylls bei Einwirkung von Kalilauge nicht, sie waren also unter der Wirkung der bei der Hydrolyse auftretenden basischen Mag- nesiumverbindung allomerisiert. Erst als Willstätter und Forsen die Zersetzung der mit Grignardscher Lösung gewonne- nen Fällung mit überschüssigem Mononatriumphosphat in rascher Operation Vornahmen, gelang es, die Phäophytinkomponente a in die reine Chlorophyllkomponente a überzuführen. Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls. 327 Auf gleichem Wege können alle möglichen Porphyrine in die entsprechenden Phylline umgewandelt werden. Eine merkwürdige Umwandlung erfährt das Phäophytin b bei der Einwirkung von Grignardscher Lösung, nämlich vor der Bildung des Magnesiumkomplexes einen Übergang in die Reihe der Komponente a, allerdings nicht durch eine einfache Reduktion zur sauerstoffärmeren Komponente selbst, sondern vermutlich durch Addition des Magnesiumalkylhalogenides an eine Carbonyl- gruppe. 1. Einführung von Magnesium mit Magnesiumoxyd und Ätzkali. Bildung von Cyanophyllin. Einheitliches Cyanophyllin- kalium entstand aus Phytochlorin e bei vierstündigem Erhitzen mit methylalkoholischem Kali und Magnesiumoxyd auf 180 Wir haben die violette Modifikation des Chlorins (Lactamhydrat) ver- arbeitet und in Mengen von 1 g mit dem gleichen Gewicht Ma- gnesia und 10 ccm konzentrierter methylalkoholischer Lauge im Autoklaven mit Silbereinsatz erhitzt. Dann fällten wir das Kalium- salz der gebildeten Magnesiumverbindung durch Zusatz von 50 ccm Wasser und etwas Kochsalzlösung vollständig aus. Das rohe Cyanophyllinkalium, dem noch Magnesia beigemischt war, wurde mit 1 1 Wasser aufgenommen und im Scheidetrichter mit 3 1 Äther ausgeschüttelt, um es vorsichtig mit primärem Natriumphosphat anzusäuem. In Freiheit gesetzt, ging das Phyllin mit rein blauer Farbe und sehr starker, leuchtend roter Fluorescenz in den Äther. Die Lösung haben wir mit viel Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und auf 10 ccm eingeengt. Dann war es notwendig, nochmals zu filtrieren, da das Cyanophyllin sich ähnlich zersetzt wie Phyllophyllin, sogar noch leichter als dieses, indem es sich in Magnesiumsalz, hauptsächlich vom entsprechenden Porphyrin, verwandelt. Schon beim Stehen in der Kälte wird die ätherische Lösung allmählich trübe und grau. Die Ausbeute an dem freien Phyllin leidet dadurch, wir erhielten nur 0,4 g, obwohl das Kaliumsalz so gut wie quanti- tativ gebildet war. 328 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die konzentrierte ätherische Cyanophyllinlösung gab mit Petroläther einen grünblauen flockigen Niederschlag, dessen Ana- lyse das Atomverhältnis N4: 0,95 Mg ergab. Phyllophyllin aus Phytochlorin e. Wird beim Erhitzen mit Magnesiumoxyd und methylalkoholischer Kalilauge die Tem- peratur 6 Stunden lang auf 220 0 gehalten, so entsteht unter Ab- spaltung von Kohlensäure die leicht zersetzliche Monocarbon- säure, die früher nur in Form ihrer Salze analysiert worden war. Nach dem Erhitzen von 1 g Phytochlorin mit 15 ccm der Lauge und 1 g MgO ist das gebildete Kaliumsalz mit 50 ccm Wasser voll- ständig ausgefällt worden. Durch Verreiben mit Wasser und Äther wurde es in Lösung gebracht und mit Phosphat vorsichtig angesäuert. Die ätherische Lösung enthielt eine Beimischung von zweicarboxyligem Phyllin, das sich durch viermaliges Anschütteln mit sehr viel 0,025 prozen tigern Ammoniak beseitigen ließ. Dann wurde der Äther wieder mit primärem Phosphat durchgeschüttelt, gewaschen und getrocknet. Es gelang aus der bis auf etwa 15 ccm eingeengten, nochmals filtrierten Lösung durch Zusatz von Petrol- äther (400 ccm) das reine Phyllophyllin (0,5 g) auszufällen, das durch die Analyse und die eigentümlichen Löslichkeitsverhältnisse des Calciumsalzes identifiziert wurde. 2. Einführung von Magnesium mit Hilfe Grignardscher Verbindungen. Reaktion von Phäophytin mit Methylmagnesium- jodid. Die für die folgenden Versuche dienende Grignardsche Lösung erforderte zur Neutralisation eines Kubikzentimeters 11,94 ccm n/10 — H2S04, entsprechend 0,198 g MgJCH3, d. i. 1 Mol. für 1 g Phäophytin a. Diese Menge der Magnesiumlösung gab mit der Ätherlösung (700 ccm) von 1 g Phäophytinkomponente a eine unvollständige Fällung, dunkle Flocken, die nach der Isolierung unter vollkom- menem Feuchtigkeitsausschuß in dem Apparate von E. Beck- mann und Th. Paul1) und nach dem Trocknen ein in allen Sol- x) Ann. d. Chem. 266, 1 [1891]. Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls. 329 venzien unlösliches blauschwarzes Pulver bildeten (0,6 g). Es blieb also viel Phäophytin in der Mutterlauge. Das exsiccatortrockene Präparat enthielt 4,46% N, 3,85 Mg und 18,0 J, entsprechend dem Atomverhältnis: N4: 2,0 Mg: 1,8 J. Diese Magnesiumverbindung ließ bei der Zersetzung mit allen möglichen Reagenzien kein Chlorophyll entstehen, sondern bildete nur Phäophytin zurück. Auch die doppelte Menge von Methylmagnesiumjodid (2 ccm für 1 g Phäophytin a in joo ccm Äther) reichte nicht hin, um das Phäophytin vollständig auszufällen ; sie gab einen viel magnesium- reicheren Niederschlag, der auch in den üblichen Lösungsmitteln unlöslich war und aus welchem gleichfalls mit Wasser oder ver- dünnter Phosphorsäure hauptsächlich Phäophytin regeneriert wurde. Dieses zweite Präparat enthielt 3,92 bzw. 3.97% N, 6,88 Mg, 31,4 J und ergab das Verhältnis: N4: 4,0 Mg: 3,5 J. Als wir die Menge der Grignardschen Lösung nochmals ver- doppelten, also 4 Mole Methylmagnesiumjodid einwirken ließen, war die Fällung des Phäophytins ziemlich vollständig und der Nieder- schlag zeigte ein ganz anderes Verhalten gegen Wasser und Säure : ein Atom Magnesium blieb bei der Hydrolyse im Molekül. Aus den Vorarbeiten für diese Methode der Einführung des Metalls verdient noch Erwähnung, daß reines Chlorophyll beim Fällen mit überschüssigem Methylmagnesiumjodid (etwa 8 Molen) und Zersetzen des Niederschlages mit Mononatriumphosphat un- versehrt zurückgewonnen werden konnte. Weder im Magnesium noch im Phytolgehalt oder an der Gruppe COOCH3 war eine Ver- änderung erfolgt. Die Analyse von solchem wiedergewonnenem Chlorophyll ergab nämlich das Verhältnis: N4: 1,02 Mg: 0,93 Phytol: 0,98 OCH3 . Umwandlung von Phäophytin a in Chlorophyll a. Das Ausgangsmaterial für diesen Versuch war ein Präparat der Phäophytinkomponente a, das bei der Hydrolyse glatt Phyto- 330 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. chlorin e lieferte. Die ätherische Lösung dieses Phäophytins (i g in i 1) haben wir mit der Grignardschen Lösung tropfenweise ver- setzt, bis eine Probe im Reagierglas beim Durchschütteln mit ver- dünnter Phosphorsäure eine nicht mehr olivstichige, sondern rein blaue Lösung lieferte. Dann war auch die gesamte Menge in hellgrünen Flocken niedergeschlagen. Die Zersetzung des viel Jod und Magnesium enthaltenden Zwischenproduktes gibt ein schönes Resultat, wenn man sie rasch, mit viel überschüssigem primärem Phosphat ausführt, indem man z. B. i 1 io prozentiger Mononatriumphosphatlösung auf einmal hinzufügt und sofort kräftig durchschüttelt. Die ätherische Lösung zeigt nun die prachtvoll blaue Farbe der Chlorophyllkomponente a. Nach gründlichem Waschen mit sehr viel Wasser und Trocknen der Lösung wurde das gebildete Chlorophyll mit Petroläther aus- gefällt (o,8 g). Bei unmittelbarem Vergleich stimmte es genau mit der reinen Chlorophyllkomponente a überein, nämlich in der Zusammen- setzung, den Farberscheinungen der Lösungen, der Phasen- und Spaltungsprobe. Phyllophyllinmethylester aus dem Porphyrinester. Die Bildung dieses Esters sei angeführt als Beispiel für die bei allen Porphyrinen anwendbare Einführung des Mag- nesiums in die komplexe Bindung mit Hilfe der Grignardschen Lösung. Der Phylloporphyrinmethylester wurde in siedendem absolutem Äther gelöst (0,7 g in 1 1) und nach dem Erkalten Tropfen für Tropfen mit Methylmagnesiumjodid gefällt, bis eben eine kleine Probe nach vorsichtiger Zersetzung mit primärem Phosphat keine Spur Phyllophorphyrinester mehr zurückbildete, nämlich nichts mehr aus ätherischer Lösung an 2 prozen tige Salzsäure abgab. Die Sustanz war quantitativ in himbeerroten Flocken gefällt; es war nicht nötig, diese zu isolieren, sondern wir schüttelten ein- fach die Suspension in Äther mit überschüssigem Mononatrium- phosphat durch und engten dann die blaustichig rote, fluores- cierende Lösung nach dem üblichen Waschen und Trocknen sehr Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls. 331 weit ein. Erst als das Lösungsmittel bis auf ein paar Kubikzenti- meter abdestilliert worden war, krystallisierte der Methylester des Phyllophyllins in rhombenförmigen Blättchen, deren stumpfe Winkel oft abgerundet waren. Einmal auskrystalhsiert, war die Substanz nur recht wenig löslich in Äther ; sie ließ sich aus Alkohol schön umkrystallisieren. Einwirkung Grignardscher Lösung auf die Verbin- dungen der b- Reihe1). Phäophytin b wird analog wie die a-Komponente mit 4 Molen Grignardscher Verbindung (MgCH3J) vollständig ausgefällt als Additionsprodukt in braunroten Flok- ken, die aber, anders als bei a, selbst beim Kochen mit der doppelten Menge Magnesiumlösung nicht grün werden, also nicht in die komplexe Magnesiumverbindung übergehen. Beim Schüt- teln der Suspension mit Mononatriumphosphatlösung färbt sich der Äther mit der braunroten Farbe des unveränderten Phäo- phytins b. Bei der Einwirkung eines großen Überschusses von Methyl- magnesiumjodid (0,4 g MgCH3J in 25 ccm Äther) auf eine äthe- rische Lösung von Phäophytin b (0,025 g in 25 ccm) fällt das Reaktionsprodukt augenblicklich in braunen Flocken aus, die sehr rasch gelb werden. Bei sofortigem Ansäuern entsteht eine oliv- braune ätherische Lösung, die sehr an Phäophytin a erinnert, und die heiße Verseifung einer eingedampften Probe mit methyl- alkoholischem Kali liefert zu vier Fünftel ein Spaltungsprodukt, das wie Chlorin e aussieht , in Äther olivgrün und in 3 prozen tiger Salzsäure grünstichig blau. Ein direkter Vergleich mit reinem Phytochlorin e läßt aber deutliche Unterschiede erkennen. Das aus Phäophytin mit Methylmagnesiumjodid gewonnene Spaltungsprodukt ist etwas stärker basisch (Salzsäurezahl 2 — 21/2) ; es ist in Salzsäure blauer und in ätherischer Lösung etwas mehr gelbstichig. Erst bei längerem Stehen, rascher beim Erwärmen des ge- fällten Reaktionsproduktes mit Grignardscher Lösung färben sich die anfangs gelben Flocken oliv und schließlich bläulichgrün ') Unveröffentlicht. 332 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. und gehen bei vorsichtigem Ansäuern mit prachtvoll blaugrüner Farbe in Äther über. Diese Lösung stimmt in Farbe und Phase mit Chlorophyll a überein, aber die Spältungsprobe liefert neben etwas Rhodin g dasselbe, von wahrem Phytochlorin e etwas ab- weichende Spaltungsprodukt wie vor der Einführung des Mag- nesiums. Auch Chorophyll b wird durch Grignardsche Lösung gefällt und bei großem Überschuß von Magnesiumlösung in ein Derivat der a-Reihe verwandelt, das beim Abbau zu demselben Spaltungs- produkt führt wie Phäophytin. Ohne Nebenprodukte, wie sie bei Chlorophyll und Phäophytin durch Verseifung der Estergruppen oder durch Allomerisation entstehen, verläuft die Umwandlung beim Phytorhodin g, das man wegen seiner Schwerlöslichkeit in Äther in trockenem Pyridin löst und mit sehr viel Grignardscher Verbindung behandelt, da Pyridin damit auch reagiert. Wir gaben 0,02 g Rhodin g in i ccm Pyridin zu ioo ccm einer i V2 prozentigen Methylmagnesiumjodidlösung. Das Rhodin wurde in grünen Flocken zusammen mit dem Additionsprodukt des Pyridins ge- fällt und lieferte beim Ansäuern vollständig das Chlorin mit der Basizität 2 — 2 1/2. Die reaktionsfähige sauerstoffhaltige Gruppe ist demnach so- wohl dem Chlorophyll selbst, wie dem durch Umlactamisierung entstandenen Phytorhodin g eigen. Es ist die Gruppe, die den entsprechenden Verbindungen der a-Reihe fehlt; aus diesen geht nämlich auch nach der Einwirkung eines großen Überschusses von Grignardscher Lösung wahres Phytochlorin e hervor. Homologe Grignardsche Verbindungen führen zu verschiede- nen Endprodukten; die Basizität und Farbe des Reaktionspro- duktes wechselt mit dem Alkyl der Grignardschen Verbindung, die sich an ein Carbonyl anlagert. Magnesiumbrombenzol gibt z. B. unter den beschriebenen Be- dingungen mit Phytorhodin g ein ätherlösliches Additionsprodukt und beim Ansäuern einen in Äther gelblich-oliven Farbstoff, der erst in 5 — 6 prozen tige Salzsäure reichlich mit blaugrüner Farbe übergeht. Einführung des Magnesiums in die Derivate des Chlorophylls. 333 Nach P. Jolibois1) dargestelltes Magnesiumhydrür (wahr- scheinlich MgHJ-haltig) liefert mit Phytorhodin g in Pyridin beim Kochen und Ansäuern ein sehr stark basisches Produkt, das aus Äther, worin es sich sehr schwer mit gelblich-oliver Farbe löst, schon von V2 prozentiger Salzsäure zu zwei Dritteln extrahiert wird. C. r. 155, 213 [1912] und 155, 353 [1912]. XX. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien: Phylline und Porphyrine. i. Übersicht. Der Magnesiumkomplex des Chlorophylls bleibt beim Er- hitzen mit Alkalien erhalten. Dabei entsteht eine Reihe mag- nesiumhaltiger Carbonsäuren von prächtig blauer und roter Farbe, die Phylline. In ihnen ist die komplexe Bindung des Magnesiums Säuren gegenüber sehr reaktionsfähig. Unter Austritt des Me- talls, womit eine erhebliche Farbänderung einhergeht, entsteht aus den Phyllinen eine analoge zweite Reihe von sauren Ver- bindungen, die wegen einer gewissen Ähnlichkeit mit den eisen- freien Derivaten des Hämins als Porphyrine bezeichnet wor- den sind. Willstätter und Pfannenstiel1) und Fritzsche2) haben den Abbau des Chlorophylls beim Erhitzen mit methylalkoholi- schem Kali untersucht und als Endprodukte zwei isomere Mono- carbonsäuren von der Formel [MgN4C31H33] (COOH) aufgefunden, Phyllophyllin3) und Pyrrophyllin. Diese lassen sich nicht inein- ander überführen; sie liefern aber, wie im XXIII. Kapitel mit- geteilt wird, durch Abspaltung von Kohlensäure die beiden Stamm- substanzen der Gruppe: Ätiophyllin MgN4C31H34 Ätioporphyrin N4C31H38. *) Abh. V. z) Abh. VIII. 8) Zu dieser eigentümlichen Bezeichnung waren wir dadurch genötigt, daß dieses Phyllin dem zuvor bekannten Phylloporphyrin entsprach. Die Namen Glauko- und Cyanophyllin sind von den griechischen Ausdrücken für blau, die Vorsilben der Namen Rhodo-, Erythro-, Rubi-, Pyrrophyllin von Bezeichnungen für rot abgeleitet. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 335 Nun entsteht nicht etwa Pyrrophyllin aus der einen, Phyllo- phyllin aus der andern Chlorophyllkomponente, sondern aus jeder Chlorophyllkomponente beide, je nach den Bedingungen des Abbaus. Die Erklärung dafür bietet die Lactamtheorie der braunen Phase (siehe Kap. I) mit der Annahme, daß bei der Verseifung beispielsweise der Chlorophyllkomponente a zum COy Chlorophyllin die Lactamgruppe | geschlossen, NH(S die Carboxyle tx und ß frei, zum COcc Isochlorophyllin die Lactamgruppe | geschlossen, NHy die Carboxyle y und ß frei werden. Diese Lactamgruppen verschwinden bei dem Abbau zu den blauen Zwischenprodukten und weiterhin wird das Carboxyl ß verloren. Der Unterschied der eincarboxyligen Phylline liegt also wahr- scheinlich in der Verschiedenheit, d. h. im verschiedenen Ort der Carboxyle ■ Glaukophyllin-^Glaukoporphyrin i ■ i Rhodophyllin Rhodoporphyrm j 4 | > Phylloporphy r in<-Phyllophyllin Py rrophyllin — >Py rr oporphyrin Die Untersuchung von Willstätter und Fritzsche haben wir gemeinsam mit M. Utzinger, L. Forsen und M. Fischer wiederholt nachgeprüft und ihre Angaben bestätigt gefunden; die Lücken in dem obenstehenden Schema sind durch unveröffent- lichte Versuche, die wir im folgenden auszugsweise anführen, ausgefüllt worden. Erst durch Isolierung der reinen Chlorophyllide a und b ist es möglich geworden, die verschiedenen vier Chlorophylline, nämlich Chlorophyllin Isochlorophyllin Chlorophyllin Isochlorophyllin der Reihe der Reihe a, b, von denen nur das dritte nicht einheitlich, sondern gemeinsam mit dem ersten oder vierten dargestellt worden, als Ausgangsstoffe für die Einwirkung der Alkalien zu verwenden und die wichtigeren Stufen des Abbaus auf den verschiedenen Wegen festzustellen. Für die Reihe der Chlorophylls a gibt die folgende Tabelle eine Übersicht über den ohne Lücke durchgeführten Abbau zu Di- und Monocarbonsäuren Chlorophyll a ochlorin g« Chlorophyllin a [MgN4C32H30O] (COOH)2 Isochlorophyllin a->Phytochlorin e i [ coporphyrin«-Glaukophyllin [MgN4C31H32] (COOH)2 Cyanophyllin »Cyanoporphyrin loporphyrin <- Rhodophyllin [MgN4C31H32] (COOH) 2 Ery throphyllin-*Ery throporphyrin fporphy rin-« Py rrophyllin [MgN4C31H33] (COOH) Phyllophyllin — ►Phylloporphyrin Der Abbau der Chlorophyllinkomponente b zu den Phyllinen war viel schwieriger ausführbar, da in den Verbindungen der Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 7 338 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. b-Reihe eine weitere sauerstoffhaltige Gruppe vorhanden ist und ohne Abspaltung von Kohlensäure reduziert werden muß. Dies ist durch Erhitzen mit konzentriertem methylalkoholischem Kali unter Zusatz von Pyridin gelungen; auch das gegen Alkali unbeständige Phytorhodin g läßt sich bei Gegenwart von Pyridin zum Phyllo- porphyrin abbauen. In der Reihe des Isochloropliyllins b ist vor dem Endprodukt Phyllophyllin eine dem Erythrophyllin entsprechende Zwischen- stufe, das Rubiphyllin, rein dargestellt und in seinen Merkmalen mit den Isomeren verglichen worden. Aus Chlorophyllin b ist analog Pyrrophyllin hervorgegangen und zwar, da im Ausgangs- material auch Isochlorophyllinkalium b enthalten war, gemeinsam mit Phyllophyllin. Einige von den Phyllinen hat die Einführung des Magnesiums nach Willstätter und Fors6n aus den Phäophorbiden, Phyto- chlorinen und -rhodinen leichter zugänglich gemacht. Chlorophyll b Phytorhodin (k+i)<-Chlorophyllinb [MgN4C32H2802] (COOH)2 Isochlorophyllin b->-Phytorl j| ! [MgN4C31H32] (COOH) 2 Rubiphyllin - 1 ►Rubipor 1 Pyrroporphyrin« Pyrrophyllin [MgN4C31H33] (COOH) Phyllophyllin — »-Phyllopor i Die sämtlichen Phylline und Porphyrine, welche bei höherer Temperatur aus Chlorophyllinen hervorgehen, sind als Carbon- säuren der Stammsubstanzen Ätiophyllin und -porphyrin definiert. Hinsichtlich ihrer Bildung ist aber noch eine wichtige Frage zu lösen. Chlorophyllin a z. B., bei dem die Verhältnisse etwas ein- facher liegen als bei b, verliert beim Abbau zum Glaukophyllin und Rhodophyllin sehr wahrscheinlich ein Kohlenstoffatom, das mit Sauerstoff verbunden ist. Handelt es sich einfach um eine Kohlensäureabspaltung wie bei den späteren Stufen des Abbaus, der Bildung von Pyrrophyllin aus Rhodophyllin, von Ätiophyllin aus Pyrrophyllin? Das ist unwahrscheinlich, weil die Phyto- chlorine und Phytorhodine erheblich verschieden von allen Por- phyrinen sind, die untereinander große Ähnlichkeit aufweisen. Es Abbau von Chlorophyll durch Alkalien: Phylline und Porphyrine. 33g ist eher eine tiefergreifende Änderung des Moleküls bei dem Über- gang der Chlorophylline in die blauen Verbindungen anzunehmen. Die Lactamgruppe des Phytochlorins e kann entweder von einem Carboxyl gebildet sein, das einen stickstoffhaltigen Ring substituiert oder von einem Carboxyl, das selbst Bestandteil eines solchen Ringes ist. Nur mit der zweiten Annahme läßt sich der bedeutende Unterschied zwischen Phytochlorin und den Por- phyrinen erklären. Bei dem Abbau der Chlorophylline scheint eine Carbonylgruppe ausgeschaltet und ein Pyrrolring neu gebildet zu werden, etwa nach folgendem, nur das Wesentliche des Vorgangs andeutenden Schema: NH NH /\ /\ HC C = 0 HC CH II I — > II II HC CH HC- CH N/ CH Es ist noch ungewiß, ob Glauko- und Rhodophyllin ganz gleich zusammengesetzt sind; das erstere, falls nur durch Kohlenoxyd- austritt entstehend, kann auch um zwei Wasserstof fatome ärmer sein. 2. Gewinnung der Endprodukte1) Pyrro- und Phyllophyllin aus Chlorophyll (a + b). Die Trennung der einbasischen Pylline von den zweibasischen wird durch die folgenden, sehr charakteristischen Unterschiede ermöglicht : Pyrro- und Phyllophyllin geben in Alkohol lösliche Kalium- salze, Rhodo- und Glaukophyllinkalium sind in Alkohol unlöslich. Aus Äther gehen Pyrro- und Phyllophyllin nicht in verdünntes Ammoniak. Die einbasischen Phylline lassen sich durch die ungleiche Lös- lichkeit ihrer Ammonsalze in Äther trennen, namentlich aber auf Grund der Ätherlöslichkeit von Phyllophyllincalcium. Unter den mitgeteilten Versuchsbedingungen entstehen sie übrigens nicht nebeneinander. x) Unveröffentlichte Verfahren. 22* 340 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die Alkalisalze der Verbindungen mit nur einem Carboxyl werden durch Wasser leicht hydrolytisch gespalten. Pyrrophyllin aus Chlorophyllin (a -f b). 20 g rohes Chlorophyllinsalz enthaltend 16 g reine Kaliumver- bindungwerden in 400 ccm 35 prozentiger methylalkoholischer Lauge (aus mit Alkohol gereinigtem Kaliumhydroxyd) unter Umrühren und Kochen im Silberbecher gelöst und im Autokloven langsam auf 130 0 erhitzt. Nun halten wir die Temperatur zwei Stunden zwischen 130 und 135 0 und steigern sie im Laufe einer weiteren Stunde auf 170 °. Dann läßt man sie zwei Stunden innerhalb 170 — 180 °, steigert sie im Laufe von 1V2 Stunden auf 195 0 und bleibt noch eine Stunde unterhalb 200 °. Diese Temperaturen sind in einer silbernen Thermometerhülse bestimmt, welche in die er- hitzte Masse hineinragt; es bedingt einen gewissen Unterschied, ob die Temperatur im Innern der Reaktionsflüssigkeit oder im Ölbad des Autoklaven bestimmt wird. Die Art des Erhitzens ist keineswegs gleichgültig, man muß bei den einzelnen Stufen des Abbaus zur Genüge verweilen; namentlich gelingt der Versuch nur dann, wenn die Masse längere Zeit bei der Temperatur von etwa 130 0 gehalten wird. Das zweicarboxylige Phyllin scheint sich eben durch eine eigentümliche Umformung des Moleküls zu bilden, nicht durch einfache Kohlensäureabspaltung. Nach dem Erkalten zeigt das Reaktionsprodukt nur sehr schwachen Hämopyrrolgeruch. Auf die Beendigung des Abbaus prüft man nach dem Überführen einer Probe in Äther mit 0,03 prozen tigern Ammoniak. Es färbt sich nur schwach an, wenn wenig Dicarbon- säure mehr vorhanden ist. Die ätherische Lösung ist bei guten Ver- suchen prachtvoll violettrot mit leuchtend gelblichroter Fluorescenz , nach der Zersetzung des Phyllins mit Säure gibt der Äther an 2 pro- zen tige Salzsäure 80—85% des entsprechenden Porphyrins ab. Den halb erstarrten Autoklaveninhalt verdünnen wir langsam uuter Umrühren mit dem doppelten Volumen Wasser und fällen dadurch das Kaliumsalz des Farbstoffs in violetten krystallinischen Flocken fast vollständig aus. Es wird auf der Nutsche abfiltriert und mit wenig Wasser nachgewaschen. Das Salz rührt man mit Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 341 100 — 200 ccm Wasser unter Zusatz von etwas Äther zu einem gleichmäßigen dünnen Brei an, verdünnt ihn mit x/2 1 Alkohol und trägt die feine Suspension in 5 1 Äther ein. Sie wird mit 20 g Krystallen von Mononatriumphosphat versetzt und angeschüttelt. Ein großer Teil des Pyrrophyllins geht in den Äther über; die untere Schicht wird mit mehr Wasser verdünnt, in einen zweiten Scheidetrichter abgelassen und mit Äther und noch etwas Phos- phat geschüttelt. Die Bildung flockiger Ausscheidung wird da- durch vermieden. Die ätherische Lösung waschen wir mit mäßig verdünntem Mononatrium phosphat und mit Wasser und extra- hieren nun das Nebenprodukt Rhodophyllin mit 0,03 prozentigem Ammoniak. Die ersten Auszüge sind prächtig kirschrot, dann färbt sich das Ammoniak nicht mehr an. Es lohnt sich die ammonia- kalischen Lösungen auf Rhodophyllin zu verarbeiten; sie werden mit etwas Sprit versetzt, mit Phosphorsäure angesäuert und aus- geäthert. Beim Einengen auf 15 ccm scheidet sich das Rhodo- phyllin in violett glänzenden Krystallen ab. Die gereinigte Pyrrophyllinlösung schüttelt man zur Befreiung von Ammoniak mit Phosphorsäure durch und trocknet nach dem Waschen mit geglühtem Natriumsulfat. Dann konzentrieren wir sie sehr schnell im Wasserbad bis auf 1 1, filtrieren und dampfen die Lösung im Vakuum bei gewöhnlicher Temperatur auf 50 ccm ein, worauf sie mit 1 1 Petroläther langsam und unter Umrühren gefällt wird. Nach eintägigem Stehen im Eisschrank enthält die Mutterlauge nur noch wenig Phyllin; die violettrote pulvrige Fäl- lung wird auf dem Filter mit leichtflüchtigem Petroläther nach- gewaschen. Die Ausbeute beträgt 8,5 g reines Pyrrophyllin (d. i. drei Viertel der Theorie) und 0,6 g Rhodophyllin. Weniger vollständig und nicht ganz so leicht wurde das Phyllin anstatt durch Fällung aus stark eingeengter Ätherlösung krystalli- siert erhalten. Aus der leuchtend roten Flüssigkeit krystallisiert es sehr rein in Drusen von stahlblau glänzenden oder rötlich grau- blauen, spitzwinkligen Tafeln. Gewinnung aus Rhodophyllin. 5 g rohe Krystalli- sation desselben werden mit 200 ccm konzentriertem methyl- 342 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. alkoholischem Kali 3V2 Stunden lang im Silbertiegel mittels des Pfungstautoklaven auf 225 — 230 0 Ölbadtemperatur erhitzt. Die tiefrote alkalische Flüssigkeit liefert beim Verdünnen mit 300 ccm Wasser eine vollständige Fällung von flockigem Pyrrophyllinkalium. Umkrystallisation1). Beim Umkrystallisieren aus abso- lutem Äther erfährt das Pyrrophyllin eine Änderung, die nicht am chemischen Verhalten, aber an der Löslichkeit und Farbe kenntlich ist. Diese wird bei der Behandlung mit Lösungsmitteln immer weniger blaustichig ; die Absorption im roten Teil des Spek- trums geht zurück. Die Rohlösung der Substanz ist blauer als Rhodophyllin, aber schon beim Wiederauflösen des Rohproduktes ist Pyrrophyllin weniger blau; es tingiert dann schön violett. Um- krystallisiertes Pyrrophyllin gibt eine fuchsin ähnliche, rein rote, gelbrot fluorescierende Ätherlösung, welcher der stark blaue Ton fehlt. Mit dieser Änderung geht die Abnahme der Löslichkeit in trockenem Äther Hand in Hand. In diesem löst sich das feinge- pulverte Rohprodukt noch sehr leicht und schnell; es ist auch nötig, die Lösung rasch herzustellen und zu filtrieren, damit die Wieder- abscheidung nicht zu schnell erfolgt. Wir nahmen 3 g Substanz in wenigen Minuten in 150 ccm absolutem Äther auf und engten auf die Hälfte ein. Dann krystallisierte das Pyrrophyllin schnell aus (1,7 g) und bei etwas weiterem Einengen noch 0,35 g in wunder- schönen, rotvioletten, stark glänzenden Prismen, die unter dem Mikroskop sechsseitigen Umriß zeigten und in der Durchsicht rubinrot erschienen. Wendet man hingegen feuchten Äther zum Umkrystallisieren an, so behält das Pyrrophyllin die Leichtlöslich- keit des Rohproduktes und verhält sich auch wie dieses bei der Trocknung. Das aus wasserfreiem Äther umkrystallisierte Präparat ent- hält Krystalläther, welchen es bei 105 0 im Vakuum außerordent- lich schwer verliert. Phyllophyllin aus Isochlorophyllin (a + b). Die alkalische Isochlorophyllinlösung aus 10 g Methylchloro- phyllid (siehe Kap. XVIII, Abschn. 1) wird in den silbernen x) Ann. d. Chem. 371, 74 [1909]. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 343 Einsatz des Pfungstautoklaven, der 300 ccm faßt, eingefüllt und mit einer Asbestplatte zugedeckt. Wir heizen mit Thermometer im Ölbad langsam auf 140 0 und halten 2 — 3 Stunden die Temperatur der Cyanophyllinstufe ein, d. i. 140— 150 °; sodann steigern wir sie langsam auf 170 0 (Rubiphyllinbildung) und nach einer weiteren Stunde auf 180 — 190 0 (Zersetzung des Rubiphyllins, Bildung von Erythrophyllin). Hier halten wir die Temperatur 2 — 3 Stunden konstant und lassen sie endlich zur Umwandlung des Erythrophyl- lins noch 2 — 3 Stunden von 190 — 205 0 ansteigen (18 Atm. Druck entsprechend 195 0 Innentemperatur unseres größeren Autoklaven). Aus dem Reaktionsprodukt ist durch Verdünnen mit dem doppeltem Volumen Wasser das Kaliumsalz quantitativ in körnig krystallinischer Form abgeschieden worden Das abfiltrierte Salz verreiben wir mit 200 ccm Wasser und etwas Äther, verdünnen es mit 1/2 1 Sprit und tragen es in 4 — 5 1 Äther ein. Die sehr feine Suspension von Phyllophyllinkalium, das sich auch teilweise im Äther löst, säuern wir durch Schütteln mit 20 g groben Krystallen von Mononatriumphosphat an, waschen die ätherische Lösung mit mäßig starker Phosphatlösung und entfernen daraus den Alkohol mit viel destilliertem Wasser. Dann wird etwas Dicarbonsäure, näm- lich Erythrophyllin, durch Ausziehen mit 0,03 prozentigem Ammo- niak entfernt. Nach erneutem Waschen mit primärem Phosphat und Wasser schütteln wir das Phyllophyllin wiederholt mit 1 bis 1V2 1 Kalkwasser tüchtig durch. Beim ersten Male bilden sich einige Flocken aus verdorbenem Phyllin. Die Ätherlösung von Phyllophyllincalcium dampft man, ohne sie zu waschen, nach dem Trocknen über Chlorcalcium auf etwa 200 ccm ein, wobei ein Teil des Calciumsalzes als feiner krystallinischer Brei ausfällt. Der Rest krystallisiert fast vollständig aus dem Filtrat beim Versetzen mit dem gleichen Volumen Sprit. Die Mutterlauge enthält ein wenig von einem andern Phyllin, dessen magnesiumfreies Derivat in Äther grün ist und erst in 7prozentige Salzsäure geht. Die ammoniakalischen Erythrophyllinauszüge werden mit pri- märem Phosphat angesäuert und in Äther übergeführt; bei starkem Einengen erhält man daraus das Nebenprodukt in schönen Krystal- len, z. B. 1,1 g. 344 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die Ausbeute an Phyllophyllincalcium beträgt etwa 70% der Theorie, nämlich 6 g. Die Isolierung in der Form des Salzes ist wegen seiner Be- ständigkeit beim Abdampfen der Lösung und beim Aufbewahren zweckmäßig. Das freie Phyllophyllin verliert sein Magnesium leichter als die Pyrroverbindung und die meisten anderen Phylline. Nur in Verdünnung ist die Lösung der freien Säure existenzfähig und die Zersetzung zeigt sich schon in geringem Maße bei kurzem Stehen einer frisch bereiteten ätherischen Lösung, wobei ihr Absorptionsspektrum mehr und mehr den für Phylloporphyrin charakteristischen Doppelstreifen im Orange aufweist. Bei längerem Stehen der ätherischen Lösung und namentlich beim Abdampfen, sogar bei vorsichtigstem Einengen im Vakuum bei niederer Temperatur, unterliegt die gesamte Substanz dieser Spaltung; in der stärkeren Konzentration der Lösung von Phyllo- phyllin wirkt diese Säure auf den Komplex des eigenen Moleküls ansäuemd und infolgedessen rasch zersetzend. Beim Eindampfen der Phyllophyllinlösung erhält man eine Krystallisation von Phylloporphyrin, während das abgespaltene Magnesium einen Teil des Phyllophyllins neutralisiert zu ätherlöslichem Magnesiumsalz; dieses findet man im Filtrat vom Porphyrin. Dem Magnesiumsalz fehlt das Tingieren des freien Phyllins, säuert man seine Äther- lösung an, so wird die alte Farbe wieder hergestellt. Phyllophyllin aus Phäophytin (a + b). In den früheren Arbeiten war beobachtet worden1), daß aus Phäophytin und Phytochlorin e beim Erhitzen mit methylalkoho- lischem Kali schon bei 140 — 150 0 Phylloporphyrin entsteht. Wir machen nun von einer der im vorigen Kapitel beschriebenen Me- thoden von Willstätter und Forsen für die Einführung des Magnesiums Anwendung, um aus den zwei Phäophytinkompo- nenten durch Einwirkung von Magnesia und methylalkoholischem Kaliumhydroxyd Phyllophyllin zu gewinnen, ebenso wie dort schon seine Bildung aus dem Phytochlorin allein angeführt worden x) Ann. d. Chem. 371, 98 [1909] und Ann. d. Chem. 382, 183 [1911]- Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 345 ist. Die Reaktionstemperatur ist für die Magnesiumverbindung höher als für die magnesiumfreie. Um die b-Verbindung zu dem gewünschten Endprodukt abzubauen, ist ein Zusatz von Pyridin erforderlich, das bei der Umformung einer sauerstoffhaltigen Gruppe wirksam ist. 20 g fein zerteiltes Phäophytin trugen wir allmählich in 200 ccm siedende 40 proz. methylalkoholische Kalilauge ein, die mit 25 ccm Pyridin und 5 g MgO versetzt war. Nach beendeter Auflösung enthält die tiefgrüne Masse, die beim Verdünnen olivfarbig wird, nur Phytochlorin e und Rhodin g und nur Spuren von Flocken. Dann fügten wir weitere 25 ccm Pyridin hinzu und erhitzten im Silbertiegel des Pfungstautoklaven auf 140 °. Wir hielten die Temperatur 2 Stunden bei 140 °, 1 Stunde 140 — 160 °, 2 Stunden 160 °, 2 Stunden 175 — 180 °, langsam 180 — 205 °, 3 Stunden 205 °. Bei der Reaktion hat sich Gas gebildet, das Manometer zeigte 22, nach dem Erkalten 7 Atm. Druck an. Die Reaktion ist in der Haupt- sache bis zum Phyllophyllin gegangen, neben welchem aber noch ziemlich viel Erythrophyllin vorhanden war. Um das Pyridin zu beseitigen, wurde das gefällte und ab- filtrierte Phyllinkalium mit Wasser zu einem Brei verrührt und im Scheidetrichter durch 2 1 Äther in dünnem Strahl hindurchge- gossen; diese Behandlung haben wir wiederholt. Die weitere Iso- lierung geschah mit primärem Phosphat und alkoholhaltigem Äther und durch Überführen in Calciumsalz wie im vorigen Ab- schnitt. Die Ausbeute an Phyllophyllincalcium betrug 6,7 g, dazu kamen 2,2 g mit 0,03 prozentigem Ammoniak abgetrenntes Ery- throphyllin. 3. Zwischenprodukte des Abbaus. Reihe des Chlorophyllins a. Glaukophyllin. Die erste Zwischenstufe der Decarboxylierung von Chloro- phyllin ahabenWillstätterundFritzsche1) aus K aliumsalz dar- gestellt, das sie durch Verseifung von Brennesselextrakten in der b Ann. d. Chem. 371, 62 [1909]. 346 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Kälte gewannen. Das rohe Chlorophyllinsalz (45% reine Kalium- verbindung enthaltend) wurde in Chargen von 30 g mit 250 ccm kon- zentrierter holzgeistiger Kalilauge 6 1/2 Stunden lang auf 140 0 erhitzt. Das Reaktionsprodukt ist zum größten Teil in der erkalteten Lauge gelöst; sie ist am Glasstab tief grünlichblau, aber schon in mäßiger Schicht rot gefärbt. Beim Verdünnen mit 350 ccm Was- ser fällt das rohe Kaliumsalz in grünen Flocken aus und läßt sich auf Hartfiltem absaugen. In der Mutterlauge bleibt chlorophyllin- artige Substanz gelöst. Das noch feuchte Salz wird in der Reibschale mit Alkohol zu einem Brei angerieben, mit 1/2 1 Alkohol verdünnt und in 3 1 Äther eingetragen. Die feine Suspension säuert man mit etwa 30 ccm konzentrierter Monophosphatlösung an; das Glaukophyllin geht leicht in den alkoholhaltigen Äther über. Dann wird der Alkohol mit Wasser herausgewaschen; dabei färbt sich die wässerige Schicht grün an und zugleich scheidet der Äther, indem er ärmer an Alkohol wird, eine voluminöse farblose Verunreinigung aus. Gutes Chloro- phyllinmaterial liefert schön blaue Rohlösungen von Glauko- phyllin, die blutrot fluorescieren. Die weitere Behandlung der Glaukophyllinlösung besteht in der Abtrennung zunächst von schwächer sauren, sodann von stärker sauren chlorophyllinartigen Begleitern. Zu diesem Zweck extrahieren wir fürs erste mit sehr verdünntem Ammoniak ; beim Rhodophyllin ist oben 0,03 prozentiges angewendet worden, hier empfiehlt es sich mit noch verdünnterem zu arbeiten. Glauko- und Rhodophyllin gehen aus verdünnter ätherischer Lösung leicht und vollständig in n/500- Ammoniak, dagegen nur spurenweise in n/5000-Ammoniak. Man schüttelt mit je 1V2 — 2 1 ca. 0,004 prozen tigern Ammoniak er- schöpfend aus, d. i. fünf- bis sechsmal; der Äther ist, wenn reines Chlorophyllinsalz verarbeitet worden, nichtmehr grün. Dieammonia- kalische Lösung ist blau und fluoresciert sehr stark rot, beim Stehen wird sie trüb olivfarbig, indem das Salz in äußerst feiner Verteilung ausfällt. Aus dem Ammoniak wird das Glaukophyllin durch An- säuern mit sehr wenig primärem Phosphat wieder unter Zusatz von etwas Alkohol in Äther (2 1) gebracht und diese Lösung wird öfters mit verdünntem Dinatriumphosphat (0,02 — 0,05 pC) durch- Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 347 geschüttelt. Das Reagens beseitigt eine Beimischung, indem es sich drei- bis viermal blaugrün anfärbt; Glaukophyllin aber geht schon in 0,1 prozentiges Dinatriumphosphat nur noch spurenweise. Jetzt ist die ätherische Lösung rein und prächtig blau gefärbt. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat dampft man sie auf 25 bis 30 ccm ein; erst aus der sehr konzentrierten Lösung krystalli- siert beim Erkalten und kurzem Stehen das Glaukophyllin in glänzenden kleinen Prismen von blauer Oberflächenfarbe, ähnlich dem Rhodophyllin. Die Ausbeute beträgt 1,7 g. Umkrystallisation. Glaukophyllin läßt sich am besten aus wasserfreiem Äther umkrystallisieren. Dabei geht es in eine äther- unlösliche Modifikation über und die Farbe seiner Lösung wird ähnlich wie bei Pyrrophyllin mehr violett. Wir haben 2 g in 2 Portionen fein gepulvert mit je 3/4 1 absolutem Äther 5 Minuten lang gekocht. Dabei wurde ein Teil des Pulvers (0,45 g) grob- krystallinisch und blieb ungelöst ; aus dem Äther schied sich schon während des Einengens auf dem Wasserbad das Glaukophyllin aus in einer schönen einheitlichen Krystallisation (1,2 g) regelmäßiger Prismen von der Form länglicher Rhomben. Rhodophyllin1). Während früher der Gehalt an Isochlorophyllin und an Chloro- phyllin b im Ausgangsprodukt die Darstellung von reinem Rhodo- phyllin erschwerte, ist nun in dem Kaliumsalz, das eine gereinigte Chlorophyllösung bei kalter Verseifung liefert, ein sehr geeignetes Ausgangsmaterial gefunden worden; es enthält fast keine andere Chlorophyllsubstanz als Chlorophyllin a. 10 S 65 prozentiges Chlorophyllinsalz a werden mit 200 ccm 35 prozentiger methylalkoholischer Kalilauge im Autoklaven lang- sam auf 130 0 Innentemperatur erhitzt. Nach 2 Stunden steigern wir diese auf 160 0 und lassen sie in 2 weiteren Stunden nicht über 165° gehen. Auch unter diesen gelinden Bedingungen geht schon ein beträchtlicher Teil des Rhodophyllins in Pyrrophyllin über. Aus der alkalischen Flüssigkeit wird alles Phyllinsalz durch Verdünnen mit dem doppeltem Volumen Wasser ausgefällt, um *) Abh. V; das hier mitgeteilte Verfahren ist neu. 348 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. wie bei den andern Phyllinen das Ansäuern der alkalischen Flüssig- keit zu vermeiden. Den abfiltrierten und mit etwas Wasser nach- gewaschenen flockigen Niederschlag rühren wir mit Wasser, dem doppelten Volumen Alkohol und etwas Äther an, tragen ihn in 5 1 Äther ein und führen in diesen das Phyllin durch Ansäuern mit primärem Phosphat über. Es entsteht eine prachtvolle rote Lösung, die noch mit Phosphat und mit destilliertem Wasser ge- waschen wird. Das Rhodophyllin läßt sich vom Pyrrophylhn mit sehr verdünntem Ammoniak trennen, das die eincarboxylige Ver- bindung nicht aufnimmt; bei einer geringen Beimischung von Pyrrophylhn genügt es aber, das Rhodophyllin aus verdünnter ätherischer Lösung krystalhsieren zu lassen. Zum Ausziehen des Phyllins waren io 1 0,03 prozentiges Ammo- niak erforderlich; daraus brachten wir durch Ansäuern mit festem Phosphat das Rhodophyllin wieder in viel alkoholhaltigen Äther (ca. 5 1) und entfernten den Alkohol durch gründliches Auswaschen mit viel Wasser. Nach raschem Einengen auf 1 1 filtrierten wir die Lösung und konzentrierten sie weiter. Schon aus der warmen noch verdünnten Lösung schied sich das Rhodophyllin in glitzernden Krystallen von blauer bis violetter Oberflächenfarbe aus. Nach dem Ausschütteln mit verdünntem Ammoniak enthielt der Äther noch das Pyrrophylhn; die Lösung wurde mit Phosphat und mit Wasser gewaschen und nach dem Einengen mit Petrol- äther gefällt. Die Ausbeute beträgt 2,2 g Rhodophyllin und 1,0 g Pyrro- phyllin. Rhodophyllin läßt sich gut aus feuchtem Äther umkrystahi- sieren, wovon 3 1 zum Lösen von 2 g am Rückflußkühler erforder- lich sind; die Substanz krystallisiert nach dem Einengen in einzeln ausgebildeten Prismen von bläulichroter Oberflächenfarbe. Reihe des Isochlorophyllins a. Cyanophyllin und Erythrophyllin1). In der Isochlorophyllinreihe werden die verschiedenen Stufen des Abbaus glatter und bei niedrigerer Temperatur erreicht, wenn b Abh. XXII. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 34g die Einwirkung der methylalkoholischen Kalilauge bei Gegenwart einer bedeutenden Menge von Pyridin erfolgt. So entsteht aus dem Produkt der heißen Verseifung beim Erhitzen im Autoklaven mit der dreifachen Menge von Pyridin und der zehnfachen von methyl- alkoholischer Lauge bei 150 — 155 0 in 4 — 5 Stunden einheitliches Cyanophyllinsalz. Es ist in alkoholischer Kalilauge und auch in Wasser leicht löslich und läßt sich nur mit Kochsalz als eine zähe Masse ausfällen. Bei vorsichtigem Isolieren durch saures Phosphat bei Gegenwart von Äther entsteht eine wunderbar blaue, intensiv fluorescierende Lösung. Sie ist aber so unbeständig, daß sie schon bald beim Stehen trübe und grau wird infolge des Austritts von Magnesium aus dem Komplex. Man kann daher das Cyanophyllin nicht durch Eindampfen, wohl aber durch Fällen mit Petroläther in Substanz abscheiden. Viel beständiger als die dem Glaukophyllin entsprechende Stufe ist das Analoge des Rhodophyllins. Zur Gewinnung von Erythrophyllin wurde Chlorophyll a in Portionen von 1 g, mit 3 ccm Pyridin verdünnt, der heißen Ver- seifung mit 10 ccm methylalkoholischer Kalilauge unterworfen und im Silbertiegel 5 Stunden lang auf 175 — 180 0 im Einschluß- rohr erhitzt. Bei genauer Einhaltung der Temperatur war das Reaktionsprodukt fast einheitlich. Eine Probe gibt bei der Spal- tung mit Säure ein Porphyrin, das beim Schütteln der ätherischen Lösung mit 2 prozen tiger Salzsäure diese infolge der Unlöslichkeit des Chlorhydrats gamicht anfärbt; die Cyano- und die Phylloverbin- dung würden in die Säure übergehen. Das Kaliumsalz ist schwer löslich und fiel beim Verdünnen gut aus, während ein wenig beigemischtes Cyanophyllin vollständig in der Mutterlauge blieb. Die Ausbeute an Erythrophyllinkalium betrug 0,6 g. Zur Isolierung des Erythrophyllins lösten wir 2,5 g Kaliumsalz feingepulvert in Sprit und brachten die Carbonsäure mit Hilfe von primärem Phosphat in 4 1 reinen Äther, woraus durch häufiges Waschen der Alkohol entfernt wurde. Die schöne kirschrote Äther- lösung erforderte keine weitere Reinigung; nach dem Einengen auf 60 ccm schied sich eine kleine Menge zersetzten Produktes ab, dann 350 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. erfolgte nach dem Abfiltrieren und Konzentrieren bis auf 20 ccm eine reichliche Krystallisation von schönem Erythrophyllin in rhombenförmigen Täfelchen (1,2 g). Es war zweckmäßig, die Mutterlauge auf das Porphyrin zu verarbeiten. Aus der Chlorophyllkomponente b. Rubiphyllin1). Aus dem Isochlorophyllin b entsteht zuerst bei 150 — 155 0 ein sehr zersetzliches Phyllin, das in alkoholischer Lauge blaue Farbe und starke Fluorescenz zeigt und in ätherischer Lösung grün ist. Das entsprechende Porphyrin geht aus seiner roten ätherischen Lösung in 3prozentige Salzsäure mit tief blaugrüner Farbe. Das schönere und beständigere Phyllin der folgenden Abbau- stufe ist rein dargestellt worden. Methylchlorophyllid b (0,7 g) lösten wir in Pyridin (2 ccm) und trugen es in 7 ccm siedende methylalkoholische Kalilauge ein; zur vollständigen Verseifung wurde weitere 5 Minuten über einer kleinen Flamme erhitzt. Wir führten die blutrot fluorescierende Lösung mit weiteren 10 ccm Lauge in ein silbernes Reagierrohr über, um sie im aufrechtstehenden Einschlußrohr 3 Stunden auf 165 — 170 0 im Ölbad zu erhitzen. Beim Verdünnen des Rohrinhaltes mit dem gleichen Volumen Wasser schied sich das Kaliumsalz aus, voll- ständiger beim Aussalzen mit Chlorkalium. Das nach dem Trocknen blauviolett glänzende Rubiphyllin- kalium wird in wenig Alkohol gelöst und durch Eingießen in 200 ccm Äther feinflockig suspendiert. Dann gelingt es beim Ansäuern mit Mononatriumphosphat, das freie Phyllin ohne Abscheidung schwer löslicher Flocken glatt in den Äther zu bringen. Die Lösung ist violettstichig rot und fluoresciert intensiv. Der Alkohol wird daraus durch wiederholtes Waschen mit im ganzen etwa 10 1 Wasser entfernt und das Volumen der Lösung durch Nachfüllen von alkoholfreiem Äther konstant erhalten. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat gibt die Lösung bei raschem Abfiltrieren bis auf 1 oder höchstens 2 ccm einen Brei von Krystallblättchen des reinen Rubiphyllins (0,5 g). Abh. XXII. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien: Phylline und Porphyrine. 351 Dem Rohprodukt von Rubiphyllinsalz ist häufig schon etwas Phyllophyllinkalium beigemischt; in solchen Fällen trennt man die beiden Phylline durch zwei- bis dreimaliges Ausschütteln ihrer ätherischen Lösung mit o,03prozentigem Ammoniak. Das Rubi- phyllin geht ohne Flockenbildung mit tiefroter Farbe in das Am- moniak, das zu verdünnt ist, um mit Phyllophyllin zu reagieren. Auch aus magnesiumfreien Derivaten des Chlorophylls b ist Rubiphyllin nach der Methode von Willstätter und Fors£n dargestellt worden, und es ist dadurch leicht zugänglich. 2 g Methylphäophorbid b werden nach und nach in 20 ccm siedendes methylalkoholisches Ätzkali eingetragen und mit 2 g MgO im Einschlußgefäß 3V2 Stunden lang auf 170 0 erhitzt. Es empfiehlt sich auch hier, das Phyllin mit sehr verdünntem Am- moniak zu reinigen. Seine Ausbeute erreicht die Flälfte der Aus- gangssubstanz. 4, Gewinnung der Porphyrine. Aus den Phyllinen. Die Phylline sind empfindlich gegen Säure, sie verlieren leicht das Magnesium und bilden die Porphyrine, die aber bei zu raschem Ausfällen aschehaltig bleiben können. Beim Schütteln der Äther- lösungen mit Salzsäure von mittlerer Konzentration lassen sich alle Phylline quantitativ in die reinen Porphyrine umwandeln ; diese werden aber beim Verdünnen und Neutralisieren nur schwierig wieder in Äther übergeführt. Handelt es sich nur um die rasche und vollständige Abscheidung in aschefreiem Zustand, z. B. von Phylloporphyrin aus Phyllophyllincalcium, so neutralisiert man einfach die salzsaure Flüssigkeit ziemlich genau, wobei das Porphyrin in mikrokrystallinischen Flocken ausfällt. Einige Bei- spiele sollen zeigen, wie trotz ihrer ungemein geringen Löslichkeit die Porphyrine in schönen einheitlichen Krystallisationen dar- gestellt werden. Rhodoporphyrin1). Rhodophyllin geht bei raschem, kräf- x) Ann. d. Chem. 358, 243 [1907] und 371, 91 [1909]. 352 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. tigern Anschütteln mit viel Eisessig z. B. io — 12 ccm für 5 bis höchstens 10 mg klar in Lösung, und aus der dunkelroten Flüssig- keit fällt das Porphyrin sofort in prächtig flimmernden Krystall- blättchen aus, die sich auf dem Filter zu einem graublauen, seiden- schimmernden Netz verfilzen. Handelt es sich nicht um ganz kleine Mengen, so nimmt man viel besser das Phyllin unter ge- lindem Erwärmen in Pyridin auf und läßt die Lösung langsam in viel Eisessig einfließen; das Porphyrin fällt rasch in glänzenden rotbraunen Stäbchen aus. Pyrroporphyrin1) erhält man aus seinem Phyllin leicht in Eisessig, da es darin zwar in der Wärme leicht, aber zum charakte- ristischen Unterschied von Phylloporphyrin in der Kälte schwer löslich ist. Wir lösen z. B. 1,5 g Pyrrophyllin (15% gebundenen Äther enthaltend) bei gewöhnlicher Temperatur oder gelinder Wärme in 80 ccm Eisessig. Sobald die Lösung filtriert ist, beginnt das Porphyrin in Blättchen von lebhaftem, blaugrauem Ober- flächenglanz zu krystallisieren. Die Ausbeute ist fast quantitativ (1,25 g), aber erst durch nochmaliges Krystallisieren aus Eisessig werden die Präparate gänzlich aschefrei. Erythroporphyrin2). Das fein gepulverte Erythrophyllin (0,5 g) tragen wir in konzentrierte Salzsäure (100 ccm) ein, die zuvor mit etwas Äther versetzt worden ist. Aus der klaren, roten Lösung wird die gebildete magnesiumfreie Säure extrahiert, indem man 10 1 Äther und 1 1 Alkohol hinzufügt und mit Wasser ver- dünnt. Die große Äthermenge und der Alkoholzusatz sind nicht zu vermeiden, weil sonst ein Teil des Porphyrins schon beim Über- führen in den Äther ausfällt. Die hellrote Ätherlösung kann nur bei vorsichtigem Durchfließenlassen von Wasser alkoholfrei ge- macht werden, ohne daß schon die Krystallisation erfolgt. Auch beim Filtrieren fällt leicht schon ein Teil aus. Bei nur mäßigem Einengen krystallisiert aus dem Äther in seidenglänzenden Pris- men das Erythroporphyrin fast quantitativ, so daß das Filtrat nur eine schwach rötliche Farbe zeigt. *) Ann. d. Chem. 371, 95 [1909]. a) Abh. XXII. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 353 Aus den magnesiumfreien Chlorophyllderivaten. Da die Phylline leichter als die Porphyrine gereinigt werden können, wird man bei der Verarbeitung von Phäophytin oder Phytochlorin auch auf Porphyrine den Weg der Einführung von Magnesium (mit MgO), also die Phyllinbildung, vorziehen. Es ge- lingt aber auch direkt zu den Porphyrinen abzubauen und zwar entsteht z. B. aus Phytochlorin e beim Erhitzen mit methyl- alkoholischer Lauge schon bei 140 — 150 0 in einigen Stunden das Phyllophorphyrin 1 ) . Hingegen liefern die schwachbasischen Phytochlorine Pyrropor- phyrin2), nämlich Chlorin g bei 225— 230 °, Chlorin f bei längerem Erhitzen auf 200 °, nachdem es sich zuerst bei 140 — 150 0 glatt in Rhodoporphyrin umgewandelt hat. Das Pyrroporphyrin scheidet sich als schwerlösliches Kalium- salz aus der alkalischen Flüssigkeit ab; seine Salzsäurezahl iy2 und die geringere Löslichkeit in kaltem Eisessig unterscheiden es vom Phylloporphyrin . Schwieriger ist die Umwandlung von Derivaten des Chloro- phylls b in Porphyrine. DasPhytorhodin g ist gegen konzentrierte Alkalien unbeständig. Es wird dadurch schon bei Wasserbadtemperatur, rasch bei 140 0 in eine ätherunlösliche, amorphe braune Substanz verwandelt. Die Por- phyrinbildung, der die Reduktion einer sauerstoffhaltigen Gruppe voranzugehen scheint, gelingt uns bei Gegenwart von viel Pyridin. Phytorhodin g liefert dann schon bei verhältnismäßig niederer Temperatur fast glatt Phylloporphyrin3). 0,4 g Phytorhodin g wurden in 10 ccm Pyridin gelöst und mit 12 ccm methylalkoholi- scher Kalilauge 6 Stunden auf 150— 155 0 erhitzt. Beim Ansäuern des Kaliumsalzes und Ausäthem fielen nur wenige ätherunlösliche Flocken aus. Zur Reinigung von schwächerbasischen Beimischungen ist das Porphyrin aus dem Äther mit 2 prozentiger Salzsäure aus- gezogen und daraus wieder in Äther übergeführt worden. Beim 2! a™1' i 371 ’ 98 [l9°9] und Ann- d- Chem. 382, 183 riQiil 2) Ann. d. Chem. 382, 183 [1911I J 5 L 9IIJ< 8) Abh. XXII. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 23 354 R* Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Einengen krystallisierten 0,25 g Phylloporphyrin in scharfbegrenz- ten rhombischen Täfelchen aus. Phytorhodin k und i gaben auch ohne Zusatz von Pyridin bei dreistündigem Erhitzen auf etwa 200 0 in glatter Reaktion Pyrro- porphyrin1). 5. Beschreibung der Phylline. Die Dicarbonsäuren [MgN4C31H32] (COOH)2. Glaukophyllin2) krystallisiert mit einem Mol Äther in blauglänzenden, schräg ab- geschnittenen Prismen (Fig. 1 der Tafel V), die in der Durchsicht unter dem Mikroskop grün erscheinen. Das aus der Rohlösung auskrystallisierte Präparat löst sich in trockenem Äther beträcht- lich und zwar viel reichlicher als Rhodophyllin, in feuchtem Äther noch leichter, in Aceton leicht, in Alkohol beträchtlich, aber nicht leicht. In Chloroform und Benzol ist es unlöslich. Nach dem Umkrystallisieren oder längerem Schütteln mit wasserfreiem Äther ist Glaukophyllin hingegen in Äther unlöslich. Die frisch bereitete Glaukophyllinlösung ist von wunderbar blauer Farbe und fluoresciert intensiv rot; mit Lösungsmitteln behandeltes, namentlich umkrystallisiertes Glaukophyllin löst sich violett, aber die Farbe ist im Vergleich mit Rhodophyllin doch noch blau. Von 0,01 proz. Natronlauge wird Glaukophyllin aus ätherischer Lösung quantitativ extrahiert mit violetter Farbe, die Lösung verändert sich beim Stehen; auch 0,5 proz. Dinatriumphosphat extrahiert mit anfangs violetter, aber bald trübe roter und bei längerem Stehen brauner Farbe. Cyanophyllin3). Es gleicht dem Glaukophyllin in der Farbe der Lösungen, die auch allmählich rotstichig werden. Das freie Phyllin ist unbe- ständig, es krystallisiert in spindelähnlichen Formen. q Ann. d. Chem. 382, 194 u. Abh. XXII. 2) Ann. d. Chem. 371, 66 [1909]. s) Abh. XXII. V Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 355 Zum Unterschied von Glaukophyllin wird es von 0,003 pro- zentigem Ammoniak nicht aus Äther extrahiert, im Gegensatz zu Erythrophyllin geht es noch in 0,2 — 0,3 prozentiges Dinatriumphos- phat; es steht also in den sauren Eigenschaften zwischen diesen Isomeren. Rhodophyllin1) krystallisiert, gleichfalls fest gebundenen Äther enthaltend, in Prismen mit ungleich geneigten und ausgebildeten Enddomen, die oft in Wetzstein- und spindelähnliche Formen (Fig. 2 der Tafel V) übergehen. Überraschend ist das Verhalten der feingepulverten Substanz gegen wasserfreien Äther: indem ein ganz kleiner Teil vorübergehend gelöst wird, verwandelt sich das Pulver rasch in neue, prächtig glitzernde dunkelrote Krystalle, scharf ausgebildete Rhomben. Die Lösungen sind kirschsaftähnlich blaustichig rot und zeigen intensive blutrote Fluorescenz. Rhodophyllin ist leicht löslich in absolutem Alkohol (1 g heiß in 250 ccm) und Aceton, ziemlich schwer in Holzgeist, noch schwerer in Äther, unlöslich in Chloroform, dagegen spielend in Pyridin löslich. Es wird aus ätherischer Lösung von sehr verdünnten Alkalien z. B. von 0,3 prozentigem Dinatriumphosphat und von 0,01 pro- zen tigern Kaliumhydroxyd vollständig extrahiert; 0,1 prozentige Kalilauge löst Rhodophyllin mit braunroter Farbe, grün tingierend. Rhodophyllinkalium. Fügt man zur heißen alkoholischen Lösung von Rhodophyllin überschüssiges methylalkohohsches Kali, so erfolgt eine Aufhebung der Flüssigkeit, ihr blauer Ton ver- schwindet, während die Fluorescenz sich nicht ändert. Dann fällt das Dikahumsalz schnell in schweren, lebhaft flimmernden Kry- st allen, Prismen und Nädelchen von blauer Oberflächen färbe aus; die Flüssigkeit wird fast farblos. Kalte alkoholische Lösungen zeigen dieselbe Reaktion langsamer, sie tritt noch in großer Ver- dünnung ein. Beim Verreiben des trockenen Salzes mit Methylsul- fat entsteht der Dimethylester, der in violetten Prismen krystallisiert. b Ann. d. Chem. 358, 223 [1907] und Ann. d. Chem. 371, 7i [Igo9]. 23* 356 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Erythrophyllin1) krystallisiert aus Äther in spitzen rhombenförmigen Täfelchen und ist dann in Äther nur noch wenig, aber in absolutem Alkohol leicht löslich. Vor dem Krystallisieren ist die ätherische Lösung kirsch- rot, indessen viel weniger blau als die von Rhodophyllin ; die Ivrystalle geben eine rein rote, fluorescierende Lösung ohne blauen Ton. Erythrophyllin ist deutlich schwächer sauer als Rhodophyllin, indem es von 0,01 prozen tiger Kalilauge nicht extrahiert wird; 0,1 prozentige fällt Erythrophyllinkalium aus. Von Ammoniakgas wird die trockene Ätherlösung des Rhodophyllins gefällt, während Erythrophyllin als Ammonsalz gelöst bleibt. Auch von Kalk- wasser wird Erythrophyllin nicht gefällt. Der Dimethylester bildet rote Prismen, die in Äther schwer löslich sind. Rubiphyllin2) ist bei der Isolierung in Äther sehr leicht löslich, nach dem Um- krystallisieren aber darin unlöslich; in Alkohol löst es sich ziem- lich leicht. Es bildet dreieckige Blättchen, seltener Rhomben. Die ätherische Lösung ist violettstichig rot, weniger blau als die von Rhodophyllin, nicht grünlich tingierend wie Phytorhodin; auch Pyridin löst Rubiphyllin gelblich rot, während Rhodophyllin darin blaurot ist. Rubiphyllin wird von iprozentigem aber nicht von 0,5 pro- zen tigern Dinatriumphosphat extrahiert und von 0,05 prozentigem Ammoniak, indessen nicht von 0,02 prozentigem; es ist schwächer sauer als die andern zweibasischen Phylline, sogar als Erythro- phyllin. Die Monocarbonsäuren [MgN4C31H33] (COOH)3) . Pyrrophyllin. Es krystallisiert in Prismen (Fig. 3 der Tafel V), die an jedem Ende von einem Domenpaar begrenzt sind. Durch das Umkrystalli- i) Abh. XXII. *) Abh. XXII. 8) Abh. VIII. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 357 sieren wird es nur in Äther sehr schwer löslich, es bleibt m Alkohol und Aceton leicht löslich. Auch in Chloroform, Schwefelkohlen- stoff und warmem Benzol löst es sich leicht und es unterscheidet sich dadurch von den zweicarboxyligen Phyllinen. Die ätherische Lösung verliert beim Schütteln mit 2n-Natron- oder Kalilauge ihren blauen Ton, dabei bilden sich ätherlösliche Alkalisalze. Verdünntere Lauge hingegen z. B. 0,1 prozentiges NaOH extrahiert das Pyrrophyllin mit intensiv roter Farbe gänzlich, 0,01 prozentiges färbt sich nur noch sehr wenig an, Di- natriumphosphatlösung reagiert nicht. Beim Schütteln mit n-Ammoniak krystallisiert aus dem Äther das Salz in leuchtend roten Nüdelchen aus (Unterschied von Phyllo- phyllin). Calcium salz. Wenn man auf die ätherische Lösung von Pyrrophyllinkalium Chlorcalcium ein wirken läßt, so krystallisiert das Calciumsalz in hellroten Nüdelchen aus. Es löst sich in Äther viel schwerer als das Phyllophyllinsalz und in Alkohol leichter als dieses, namentlich in der Wärme leicht. Phyllophyllin gibt eine blaustichig rote Ätherlösung mit roter Fluorescenz. Es ist in den physikalischen und in den chemischen Eigenschaften dem Isomeren sehr ähnlich, aber es verliert leichter das Magnesium. Gegen Alkalien verhält es sich wie Pyrrophyllin und reagiert gleichfalls mit Dinatriumphosphat nicht. Bei der Einwirkung von n-Ammoniak verteilt sich das Ammonsalz zwischen wässeriger und ätherischer Schicht und geht beim Aussalzen ganz in den Äther über. Methylester (siehe Kap. XIX). Phyllophyllincaesium. Die ätherische Lösung des Phyllo- phyllins verliert bei der Salzbildung mit Caesiumhydroxyd ihren blauen Ton, nach starkem Einengen, krystallisiert die Caesium- verbindung schön aus. In größerer Menge erhält man sie am besten durch Versetzen einer auf dem Wege über das ätherlösliche Kaliumsalz konzentrierten ätherischen Phyllophyllinlösung mit mehr als dem gleichen Volumen Alkohol, worin Caesiumhydroxyd gelöst ist. Ein großer Teil des Caesiumsalzes scheidet sich prächtig 358 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. ab in blauviolett glänzenden derben, oft vierseitigen Säulen (Fig. 4 der Tafel V). Das Salz ist nicht löslich in Wasser, einmal aus- krystallisiert auch nicht mehr in Äther, ziemlich leicht in sieden- dem Alkohol und Chloroform. Phyllophyllincalcium. Am geeignetsten für die Isolierung des Phyllophyllins ist das Kalksalz, welches durch Schütteln der Ätherlösung mit Kalkwasser oder aus der ätherischen Kalium- salzlösung mit Chlorcalcium dargestellt wird. Aus der mäßig ein- geengten Lösung scheidet sich das Salz beim Vermischen mit einem Viertelvolumen Alkohol in mattvioletten Flocken ab. Das Phyllophyllincalcium löst sich sehr leicht in Chloroform (das Phylloporphyrincalcium nur schwer) und wird durch Alkohol gefällt; 1 g wurde in 30 ccm Chloroform aufgenommen und die Lösung mit 20 ccm Alkohol verdünnt. Das Salz krystallisiert fast quantitativ in hellroten Nadeln aus. In absolutem Alkohol läßt es sich bei raschem Arbeiten in kleinen Portionen auflösen; dann scheidet es sich bald in schönen Nadeln wieder ab, besonders rasch beim Erwärmen und ist in dem neuen Zustand unlöslich in Alkohol. Auch in Äther ist das Salz nicht mehr löslich, wenn es einmal ausgeschieden vorliegt. 6. Beschreibung der Porphyrine. Die für die Erkennung der Porphyrine wichtige Verteilung zwischen Äther und Salzsäure ist in den Abschnitten 2 und 3 des XIV. Kapitels beschrieben worden (Salzsäurezahl, Verteilungs- zahl). Glaukoporphyrin1) bildet rotviolette Nadeln und läßt sich durch Auflösen in Pyridin und Einträgen in viel heißen Eisessig umkrystallisieren. Es ist in Äther blaustichig rot, aber sehr wenig darin löslich, inkrystalli- sierter Form löst es sich nicht mehr, auch nicht in Alkohol und Chloroform. Die Lösung des Porphyrins in Salzsäure ist violett, in verdünnter mehr blauviolett, in konzentrierter dunkelrot- violett und grünlich tingierend. ») Abh. VIII. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 35g Cyanoporphyrin x) entsteht beim Spalten des Phyllins mit starker Salzsäure in Form einer blaugrünen Salzlösung, die beim Verdünnen mit Wasser rein blau wird. Aus seiner ätherischen Lösung, die blaustichig rot ist , krystallisiert das Porphyrin erst beim Einengen in glänzen- den rotbraunen Nadeln; sie lassen sich aus Eisessig umkrystalli- sieren. Rhodoporphyrin 1 2 *) krystallisiert aus Äther in zwei Formen, in glänzenden rotbraunen Nadeln und dunkelstahlblauen vier- und sechsseitigen Blättchen, die im durchfallenden Licht olivbraun sind. Krystallisiert ist es in den üblichen Solvenzien unlöslich. Das Chlorhydrat krystallisiert beim Verdünnen der Lösung in heißer konzentrierter Salzsäure mit Vg-Volumen heißem Wasser in dünnen Nüdelchen vollstän- dig aus. Auf Zusatz von alkoholischem Kali löst sich das Porphyrin in Alkohol mit roter, etwas gelbstichiger Farbe; das Kaliumsalz krystallisiert allmählich in kurzen blauglänzenden Prismen aus. Auch in verdünnten wässerigen Alkalien löst sich Rhodoporphyrin, z. B. in kalter 1 prozentiger Natronlauge, mit gelblichroter Farbe; beim Kochen fällt das Natriumsalz in äußerst feinen flimmernden Kryställchen aus. Beim Erwärmen mit Essigsäureanhydrid verliert das Por- phyrin 1 Molekül Wasser und bildet ein in Nadeln und rhombi- schen Blättchen krystallisierendes Derivat, das in Chloroform und Aceton schon kalt sehr leicht löslich ist. Erythr oporphyrin 8) fällt schon aus verdünnter ätherischer Lösung in seidenglänzenden Prismen aus und ist in den üblichen Lösungsmitteln unlöslich außer in Pyridin und in den Säuren. Ätherhaltige 20 prozen tige Salzsäure löst es leicht mit rein roter Farbe; die Lösung tingiert zwar blau , ist aber viel weniger blaustichig als die des Rhodopor- phyrins. 1) Abh. XXII. 2) Abh. V und VIII. *) Abh. XXII. 360 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die basischen Eigenschaften lassen sich wegen der Unlöslich- keit des Chlorhydrats in verdünnter Salzsäure mit denen der Isomeren nicht genau vergleichen; der Methylester ist aber in Salzsäure leicht löslich, seine Salzsäurezahl liegt zwischen 5 und 7. Rubiporphyrin* *) krystallisiert in glänzenden braunroten, rhombenförmigen, oft gerundeten Blättchen, die in der Durchsicht olivstichig braun sind. Es ist dem Rhodoporphyrin ähnlich in der Löslichkeit , auch des Chlorhydrats, das gerade abgeschnittene Prismen bildet. Die Nuance der salzsauren Lösung geht mehr nach rot als bei Rhodoporphyrin. Der Methylester, der schon aus sehr viel Äther in violett- glänzenden, schief abgeschnittenen Prismen krystallisiert, gibt in Eisessig mit einem Tropfen konzentrierter Salzsäure eine grün- rote Lösung, der Rhodoporphyrinester eine violettrote; die Salz- säurezahl des Rubiporphyrinesters ist 71/ 2. Phyllo- und Pyrroporphyrin2). Beide krystallisieren in dunkelroten Prismen mit violettem, metallischem Glanz; die Krystalle der Phylloverbindung sind zu- gespitzt (Figur. 6 der Tafel V), die des Pyrroporphyrins gerade abgeschnitten (Figur 5 der Tafel V). Die Pulver sind bräunlich bordeauxfarben, und zwar das von Phylloporphyrin mehr blau- stichig, das von Pyrroporphyrin mehr braunstichig. In Äther und kaltem Alkohol lösen sich die Substanzen sehr wenig, etwas mehr in heißem Alkohol, unlöslich sind sie in Benzol und Schwefelkohlenstoff, in Chloroform beim Kochen ziemlich leicht (Pyrro leichter), kalt nicht löslich, ähnlich in Aceton. Sehr leicht löslich sind sie in Pyridin. Unterscheidend ist das Verhalten gegen Eisessig. Phyllopor- phyrin löst sich nämlich sehr leicht mit dunkel violettroter Farbe und stark violettem Tingieren, das sich beim Erwärmen nicht ändert; Pyrroporphyrin löst sich im Eisessig erheblich schwerer und krystallisiert aus der heißen Lösung. !) Abh. XXII. *) Aus der Abh. VIII; siehe auch Ann. d. Chem. 382, 184 [1911]- Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylli ne und Porphyrine. 361 Die Fluorescenz der beiden Porphyrine in Äther ist nur gering im Vergleich zu derjenigen der Phylline, bei Pyrro aber ganz deut- lich, bei Phyllo sehr schwach. Diese Lösungen sind bräunlichrot, mit weniger blauer Nuance als bei Rhodo- und Glaukoporphyrin und zwar ist die von Pyrroporphyrin brauner. Da die Salzsäurezahlen für Phylloporphyrin 3/4, für Pyrro- porphyrin 1V2 sind, so extrahiert 1 prozen tige Säure bei Phyllopor- phyrin fast alles, bei Pyrroporphyrin weniger als die Hälfte aus der ätherischen Lösung. Die Chlorhydrate zeigen einen großen Unterschied in der Lös- lichkeit; das Salz des Phylloporphyrins ist in Salzsäure leicht löslich, das von Pyrroporphyrin in mäßig verdünnter Salzsäure unlöslich. Die Lösung von Phylloporphyrin in 6 prozentiger Salzsäure zeigt mit zunehmendem Substanzgehalt die Farben blauviolett, rotviolett, dann braunstichig rot mit grünlichem Tingieren. Pyrroporphyrin in Salzsäure ist rot mit nur geringem Blaustich, mit mehr Sub- stanz viel blauer rot und blau tingierend. Beide Porphyrine färben die tierische Faser schön und haltbar. Aus sehr verdünnt salzsaurer Lösung ziehen sie auf Seide mit wesentlich verschiedener Farbe, nämlich Pyrroporphyrin mit kupfrig roter Farbe, Phylloporphyrin stark dichroitisch; die Aus- färbung ist beim Darübersehen bronzebraun, in der Aufsicht grün- lich bronzefarben und kupfrigrot. Die einbasischen Porphyrine reagieren noch mit sehr verdünn- ten Alkalien quantitativ. 0,01 prozen tige Natron- und Kalilauge nehmen aus dem Äther sofort den gesamten Farbstoff. Dabei entstehen in der Durchsicht klare, gelbstichig rote Lösungen, in der Aufsicht bemerkt man beim Schütteln, daß die Flüssigkeit von äußerst kleinen Partikeln erfüllt ist. Zusatz von stärkerer Lauge vermehrt die Fällung, unter dem Mikroskop sind dann deut- lich braungelbe Nadeln zu erkennen. Die Methylester der beiden Porphyrine, mit Holzgeist und Chlorwasserstoff gebildet, sind etwas schwächer basisch als die Carbonsäuren; die Salzsäurezahl der Phylloverbindung ist 1 — iV4, die des Pyrroderivats 21/,. Die Ester sind viel leichter löslich als 362 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 363 die freien Porphyrine, nämlich in Chloroform und Eisessig sehr leicht, in Aceton leicht, schwerer in Äther. Der Phylloporphyrin- ester krystallisiert aus Äther in rotviolett glänzenden, rhomben- förmigen Tafeln, der Pyrroester in langen Prismen. Vergleich der sauren Eigenschaften mit der Ammoniakmethode1). Die Porphyrine unterscheiden sich in ihren sauren Eigen- schaften wie die Phylline; Rubi- und Erythroporphyrin sind schwächer sauer als Rhodoporphyrin. Ein Mittel für die Bestimmung der sauren Gruppen und für den Vergleich der saueren Eigenschaften bietet die Einwirkung von Ammoniakgas auf die zur Gewichtskonstanz getrockneten, feingepulverten Säuren. Bei der Dissoziation der gebildeten Ammonsalze unter gewöhnlichem und unter vermindertem Druck zeigen sich öfters charakteristische Unterschiede. Rhodo-, Erythro- und Rubiporphyrin nehmen 2 Mole Am- moniak auf. Rubiporphyrin gibt im Phosphorpentoxydexsiccator unter gewöhnlichem Druck langsam alles Ammoniak wieder ab, im Vakuum der Wasserstrahlpumpe schon in einem Tage. Auch Erythroporphyrin verliert im evakuierten Exsiccator schnell die 2 Mole NH3, hingegen läßt Rhodoporphyrin im gewöhnlichen Vakuum nur 1 NH3 abdissoziieren und das zweite erst im Hoch- vakuum äußerst langsam. Absorptionsspektra2) . Die Beschreibung und Darstellung der Absorptionsspektra ge- schieht ebenso wie beispielsweise im Kap. VI und in den Tafeln VI und VII. Ganz schwache Schatten ( | ) wurden bei den nachfolgen- den Verbindungen nicht berücksichtigt. Die Messungen wurden mit einem Prismenspektroskop ausgeführt, in der Zeichnung (Fig. 15) aber sind die Abstände der einzelnen Wellenlängen gleich gemacht worden, so wie sie im Gitterspektroskop erscheinen. Die graphisch *) Abh. XXII; siehe auch z. B. Ann. d. Chem. 382, 174 u. 179 [1911]; Ann. d. Chem. 387, 366 und f. [191 il. 2) Abh. V und VIII. 364 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. dargestellten Spektren von umkrystallisiertem Glaukophyllin und von Rhodophyllin sind in alkoholischer, alle anderen in ätherischer Lösung gemessen worden. Glaukophyllin (roh) Glaukophyllin umkryst. 100 mm Rhodophyllin 100 mm Pyrrophyllin (roh) 20 mm 200 mm Phyllophyllin 20 mm 200 mm Pyrroporphyrin 20 mm 200 mm Phylloporphyrin 20 mm 200 mm 64 62 600 J 66 66 64 >52 5^„ j 48 46 44 j 42 D E F G Fig. 15. Glaukophyllin. Aus rohem, frisch isoliertem Kaliumsalz wurde eine ätherische Lösung der Carbonsäure von unbekannter Konzentration be- reitet. Das Absorptionsspektrum zeigt einen sehr großen Unterschied im Vergleich zur umkrystallisierten Substanz. Der Streifen I ist viel intensiver, er ist der stärkste; er ist sehr scharf und so breit, Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 365 daß er weit in das Orange hineinreicht. Noch in äußerst ver- dünnter Lösung ist er gut wahrnehmbar. Diese Absorption im Rot ist der Hauptunterschied von Rhodophyllin. Schicht in mm 2,5 10 40 Band I 652 633 655 — 1 630 662,5 — 622,5 II 605. . .594.5 6o7-5— 594.5 6i3—587 582 „ III 559-551 561 549 547—542 536 „ iv — — 521. .516 Endabsorption — 434— 437— Reihenfolge nach der Intensität: I, II, III, IV. Die umkrystallisierte Substanz steht in dem Absorptions- spektrum namentlich bei geringer Schichtdicke dem Rhodophyllin viel näher als rohem Glaukophyllin ; doch unterscheidet sich um- krystallisiertes Glaukophyllin von Rhodophyllin in stärkerer Schicht im Auftreten des neuen Absorptionsstreifens im Rot bei der Linie C. Außerdem ist das Band IV im Grün schwächer als Band III des Rhodophyllins. 0,1 g umkrystallisiertes Glaukophyllin in 5 1 Alkokol. Schicht in mm 5 20 100 Band I — 670. . .655 .. II 605. . .597 610—597. . .594.5 617—587 585 „ III 557- -55i 563 549 570—536 .. IV — — 523,5. .517,5 Endabsorption 430,5— 435— 440— Reihenfolge nach der Intensität: II, III, I, IV. Rhodophyllin. Das Absorptionsspektrum dieses Phyllins ist einfach und er- innert sehr an Hämin; es besteht in der sichtbaren Region des Spektrums aus zwei scharf begrenzten starken Bändern im Orange bis Gelb und im Grün, denen noch ein sehr viel schwächeres Band im Grün und eine starke Endabsorption im Violett folgt. Der Hauptunterschied vom Hämin besteht darin, daß das Band des Hämins im Orange nach rechts gerückt ist und fast das ganze Gelb umfaßt. 366 R- WiUstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 0,1 g Rhodophyllin in 5I Alkohol. Schicht in mm 2.5 20 100 Band I 602. . .596 6o5— 592. .588 610 — 581 ,, II 554-553 562—545 568—532 „ III — — 520. 512 Endabsorption 424— 43i— 438— Reihenfolge nach der Intensität: I, II, III. Pyrrophyllin läßt zum Unterschied von Rhodophyllin sehr viel Licht im. Orange durch. Das charakteristische Orangeband des Rhodophyllins er- scheint bei geringer Schichtdicke gänzlich ins Gelb gerückt als ein sehr scharfer, schmaler Streifen. Breiter und weniger scharf ist das nachfolgende Band in der grünen Region, das dem Band II von Rhodophyllin sehr ähnlich ist. Erst in starker Schicht tritt ein schwacher, schmaler Absorptions- streifen (I) auf und zwar weiter gegen Rot hin als bei Rhodophyllin. Das Orangeband des letzteren ist dann in zwei Streifen gespalten, in den nach links verschobenen schwachen und den intensiven, das Gelb umfassenden Streifen II. Pyrrophyllin erleidet ähnlich wie Glaukophyllin beim Um- krystallisieren eine Veränderung; umkrystallisiertes Phyllin läßt mehr rotes Licht durch als Rohprodukt, der Absorptionsstreifen I im Rot tritt sehr zurück. Pyrrophyllin aus 0,1 g Kaliumsalz frisch isoliert in 5 1 Äther. Schicht in mm 20 100 Band I 622,5. -6i4 624 613 .. II 585—578 574 587—571,5 „ HI 551. . .548—540 534,5 561 556—526,5 IV — 5°9- -498 End absorption 422,5— 425— Reihenfolge nach der Intensität: II, III, I, IV. Abbau von Chlorophyll durch Alkalien : Phylline und Porphyrine. 367 0,1 g umkrystallisiertes Pyrrophyllin in 5 1 Alkohol. Schicht in mm 10 100 200 Band I _ 621 . .618 „ II 584—579 572 587—569,5 1589—567- • • 561 „ HI 545 538 {559 555— I528 526 J 561— 522 „ iv — 508. . .498 509. . .496.490 Endabsorption 421— 424— 427.5— Reihenfolge nach der Intensität: II, III, IV, I. Phyllophyllin. Die ätherische Phyllophyllinlösung wurde aus umkrystalli- siertem, reinem Calciumsalz durch vorsichtiges Ansäuern frisch bereitet. Die Absorption vor der Fraunhofer sehen Linie G besteht aus 5 Bändern: I ist im Orange, II, das intensivste, im Gelb, III und IV im Grün; diesen folgt ein sehr viel schwächeres Band im Blau. Das III. und IV. Band entsprechen dem Band II und III des Rhodophyllins. Das I. Band des Rhodophyllins im Orange ist in zwei scharfe, schmale Streifen gespalten, von denen der zweite (kurz nach der Natriumlinie stehend) sehr dunkel ist. Im Grün, neben der E-Linie, wird noch bei höherer Konzentration Licht durchgelassen als bei Rhodophyllin. Vom frisch isolierten Pyrrophyllin unterscheidet sich Phyllo- phyllin dadurch, daß bei ihm Band I viel mehr gegen Gelb hin ge- rückt und daß der Streifen II schmaler ist. Schon bei kurzem Stehen der Phyllophyllinlösung verrät sich die beginnende Zersetzung an dem Auftreten des charakteristischen Doppelstreifens von Phylloporphyrin bei X — 633 — 627 und 625 bis 618. 0,1 g in 5 1 Äther. Schicht in mm 5 100 500 Band I .. II .. HI iv .. v Endabsorption 595- • -592 584,5 581 561. . .542. .539 425— 596 591,5 586 — 580. .572 563—534-529 514.506 429,5— J 602— 525. . .519 519—497 484.5- -475 435— 368 Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Pyrroporphyrin und Phylloporphyrin. Die Absorptionsspektra der beiden Porphyrine bestehen, ab- gesehen von der Endabsorption, aus 6 Bändern, die im Orange, im Grün und im Blau als Absorptionsmaxima hervortreten. Von der Phylloverbindung unterscheidet sich Pyrroporphyrin dadurch, daß bei ihm Band I gegen das rote Ende verschoben und viel schwächer ist. Ferner sind bei Pyrroporphyrin Band II und III intensiver, ersteres am gleichen Orte, letzteres gegen Violett verschoben. Die getrennten Absorptionsstreifen IV und V des Phylloporphyrins sind zu einem einzigen Band (IV) bei Pyrro- porphyrin vereinigt, derart, daß es auf der linken Seite von einem Schatten begleitet wird. Band V und VI von Pyrroporphyrin sind mehr gegen Violett gerückt als die entsprechenden Bänder des Phylloporphyrins, und das Band VI ist komplizierter gegliedert als das korrespondierende Band VII von Phylloporphyrin. Es ist deutlich gerippt, so daß sich drei dunkle Streifen herausheben. 0,1 g Pyrroporphyrin in 5 1 Äther. Schicht in mm 20 500 Band I 652.648,5 „ II 624 — 621.613 636. .630 — 609. .600,5 „ III 599- -594-5 600,5—594. . .590 „ iv 583- • -574- -570—565 590—556 „ v 53U5 526,5— 523,5. . .520,5 | „ VI /5°5 ■ ■ • 499.5 497 • • • 494 1490.5 • • • 488,5 485-5- • -481 >547- -541— Endabsorption | 428 — J 0,1 g Phylloporphyrin in 5 1 Äther. Schicht in mm 20 200 Band I 633- -630 633,5 629,5 II 624 620,5 624 — 620 „ III — 606 . . 602 „ iv 587- -577 574 1 597-5- • -589,5—572- -569 „ v 568,5. . .565,5 / 569 565 ., VI 538... 528 543.5 536—528. . .523,5 „ VII J 5i3 5°5 \ 505—496. • -489 5X7 484 • • -481,5 Endabsorption 430,5— 443,5— XXI. Oxydation der Chlorophyllderivate1). William Küster2) hat in seinen gründlichen Arbeiten über den Blutfarbstoff die Oxydation des Hämins untersucht. Sie führt zum Imid C8H904N der dreibasischen Hämatinsäure: CH3— C— COOH ho2c— ch2— ch2— C— cooh Über die Oxydation von Chlorophyll enthielt die Literatur nur eine einzige Angabe. L. Marchlewski3) hat Phylloporphyrin mit Chromsäure nach der Methode von Küster oxydiert und daraus die Hämatinsäure in ihrer stickstofffreien Form (C8H806) erhalten. Dieses Ergebnis schien für die Verwandtschaft der basischen Spal- tungsprodukte des Chlorophylls mit dem Hämin zu sprechen. Es hat sich indessen nicht bestätigt, daß sich das Chlorophyll bei der Oxydation gleich dem Hämin verhält. Das Unterscheidende hat eine Untersuchung von Willstätter und Asahina ermittelt, die mit einer Reihe von Chlorophyllderivaten und mit verschie- denen Oxydationsmethoden ausgeführt worden ist. Die Ausgangsmaterialien waren namentlich Phylloporphyrin, Pyrroporphyrin, Rhodoporphyrin und Phytochlorin. In allen Fällen hat die Oxydation das Gleiche ergeben. Wenn man Blei- superoxyd und Schwefelsäure, Chromsäure oder Carosche Säure *) Abh. IX. *) Beiträge zur Kenntnis des Hämatins, Tübingen 1896. Zeitschr. f. p ^oi. Chem. 28 1 [1899]; 29, 185 [1900]; 44, 391 [1905]; 54, 5oi [1908]; 61, 164 [1909]. Ann. d. Chem. 315, i74 [1900]. Siehe auch W. Küster Das Hamatm und seine Abbauprodukte in Abderhaldens Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden, Bd. II, S. 628 [1910]. ) Bull, de 1 Acad. des Sciences de Cracovie 1902, 1. Will* * tat ter-S toll, Chlorophyll. 24 370 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. einwirken läßt, so führt die Oxydation zu einem Gemisch, das, von kleinen Spaltungsstücken des Moleküls wie Essigsäure und Kohlen- säure abgesehen, aus zwei Hauptprodukten besteht, nämlich aus Hämatinsäure, die stets als Imid von der Formel CH3— c— c = o II >NH ho2c— ch2— ch2— C— c = o auftritt, und aus dem Methyläthylmaleinimid : CH3— C— c = o II >NH . CH3— CH2— C— C = 0 Dieses Maleinimid hat Küster zuerst durch Abspaltung von Kohlensäure aus dem Imid der Hämatinsäure erhalten und dann synthetisch dargestellt1); bei der Oxydation von Hämin trat es nie auf. Die Oxydation der Chlorophyllderivate erfolgt am glattesten durch Chromsäure. Küster oxydiert Hämatin in warmer essig- saurer Lösung. Es ist viel zweckmäßiger, die Chromsäure in stark schwefelsaurer Lösung bei tiefer Temperatur ein wirken zu lassen; auch beim Hämin verdient dieses Verfahren den Vorzug. Dabei läßt sich nämlich Hämin selbst anwenden, man spart die Isolierung des Hämatins und das langwierige Verjagen der Essigsäure, das Küster vorschreibt. Das Oxydationsprodukt, dessen Isolierung sich sehr einfach gestaltet, verliert kein Ammoniak und zeichnet sich durch seine Reinheit aus. Für unsere Kenntnis von der Struktur der angeführten Verbin- dungen sind die Ausbeuten an ihren Oxydationsprodukten wichtig. Küster nahm auf Grund seiner zahlreichen Bestimmungen der Ausbeute von Hämatinsäure an, daß drei oder vielleicht sogar vier Moleküle Hämatinsäure aus ebenso vielen Pyrrolkemen des Hämins gebildet werden. Nach Küster liefert nämlich Hämatoporphyrin : Hämatinsäure roh 60,5, rein 58%; ber. f. 2 Mole 61,2%, Hämin: Hämatinsäure roh 70, rein 60%; ber. f. 2 Mole 56,2%. *) Ann. d. Chem. 345, 1 [i9°5l- Oxydation der Chlorophyllderivate. 371 Hingegen hat 0. Pilot y1) aus seiner schönen Arbeit über die Reduktion von Hämin gefolgert, daß nur 2 Moleküle Hämatin- säure entstehen, indem sie aus der von ihm entdeckten Hämo- pyrrolcarbonsäure hervorgehen. Die Versuche von Willstätter und Asahina, die allerdings hinsichtlich des zum Vergleiche betrachteten Hämins nur eine Er- gänzung zu dem umfassenden Versuchsmaterial von Küster bieten, sprachen zugunsten der Auffassung von Pilot y. Die Aus- beute an roher Hämatinsäure ist durch Beimischungen gesteigert; bei der Reinigung gehen die Ausbeuten so zurück, daß sie die Theorie für 2 Moleküle nicht mehr erreichen. Die Porphyrine aus Chlorophyll liefern annähernd 1 Molekül Hämatinsäure. Dagegen beträgt die Ausbeute an Methyläthyl- maleinimid wahrscheinlich mehr als 1 Molekül; bei Einrechnung der Isolierungsverluste sogar gegen 1 V2 Molekül, so daß wir die Bildung des Maleinimides aus 2 Pyrrolkernen anzunehmen haben. Demnach erstreckt sich der Unterschied zwischen den Por- phyrinen aus Chlorophyll und aus Hämin auf mindestens zwei von ihren vier Pyrrolkernen. Oxydation von Phylloporphyrin mit Bleisuperoxyd. Es ist vorteilhaft, die Oxydation mit kleinen Portionen aus- zuführen. Man löst 1 g Phylloporphyrin in 20 ccm 50 proz. Schwefelsäure und verdünnt mit 30 ccm Wasser. Unter Kühlung mit Eis und Rühren mit der Turbine werden 20 g Bleisuperoxyd in kleinen Portionen im Laufe einer halben Stunde eingetragen. Die Flüssig- keit entfärbt sich, noch ehe alles Oxydationsmittel zugefügt ist; wir setzen das Rühren noch eine Stunde lang fort und lassen über Nacht im Eisschrank stehen. Dann wird der Bleischlamm ab- gesaugt und mit Wasser (50 ccm) nachgewaschen. Das gelbliche Filtrat mit dem Waschwasser äthert man erschöpfend aus und trocknet die ätherische Lösung. Sie hinterläßt beim Eindampfen einen bräunlichen Syrup. 24* 1) Ann. d. Chem. 366, 237 [1909]. 372 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. An rohem Oxydationsprodukt erhielten wir 8,4 g aus 20 g Phylloporphyrin, die zum Teil in größeren Portionen verarbeitet waren; bei einer Reihe von Versuchen mit je 1 g betrug die Aus- beute die Hälfte vom Porphyrin. Das Oxydationsprodukt besteht aus einem neutralen und einem sauren Anteil. Zur Trennung vereinigten wir die Ausbeute von 5 Versuchen und nahmen sie mit wenig Wasser auf; dabei hinterblieb eine kleine Menge von unlöslichem, fettigem Produkt. Das Filtrat wurde mit Soda schwach alkalisch gemacht und mit Äther extrahiert. Beim Abdampfen der Ätherlösung blieb ein fast farbloses, drusig-krystallinisches Produkt zurück; infolge seiner Flüchtigkeit bei Wasserbadtemperatur sublimierten mitunter lange Nadeln in den Kolbenhals. Die sodaalkalische Mutterlauge säuerten wir an und sättigten sie mit Ammonsulfat; durch Ausäthern isolierten wir die Säure, die schon im unreinen Zustand charakteristische Rosetten von feinen Nädelchen bildete. Diese Trennung ergab 3,3 g indifferentes und etwas über 2 g saures Oxydationsprodukt. Die neutrale Substanz wird durch zweimaliges Umkrystalli- sieren aus Wasser, worin sie warm ziemlich leicht, kalt schwer löslich ist, vollkommen gereinigt. In den organischen Solvenzien, außer in Petroleumkohlenwasserstoffen, löst sie sich sehr leicht. Sie stimmt mit dem Schmelzpunkt 67 — 68°, mit ihrem schwachen jodoformähnlichen Geruch, dem anfangs süßen, dann bitteren Ge- schmack und in ihren übrigen Merkmalen genau mit der Beschrei- bung des Methyläthylmaleinimids von Küster überein. Das saure Oxydationsprodukt des Phylloporphyrins erweist sich als identisch mit der eigentlichen Hämatinsäure, also dem ,,Imid der dreibasischen Hämatinsäure“ von der Formel C8H904N, das Küster entdeckt und sorgfältig gekennzeichnet hat. Die Säure war im Wasser und in den Alkoholen sehr leicht löslich; einmal aus Essigester, sodann aus Äther-Benzolmischung um- krystallisiert, lag sie hinreichend rein vor in sternförmig grup- pierten harten Nadeln. Den Schmelzpunkt fanden wir, etwas ab- hängig von der Art des Erhitzens, bei 112 — 1130. Oxydation der Chlorophyllderivate. 373 Oxydation von Phylloporphyrin mit Chromsäure- Schwefelsäure in der Kälte. 5 g Phylloporphyrin werden unter Anrühren in der Reib- schale mit 70 — 90 ccm 5oproz. Schwefelsäure in Lösung gebracht und diese mit 30 — 50 ccm Wasser verdünnt. In die tiefrote Lösimg läßt man nach dem Abkühlen auf o° unter Rühren mit der Turbine die Chromsäure (13 g in 50 ccm Wasser) durch den Franken- stein sehen Rührer eintropfen und hält dabei die Temperatur auf höchstens 5 — 70. Das Einträgen erfordert eine Stunde; ohne er- heblich zu schäumen, färbt sich die Flüssigkeit dunkelweinrot und dann olivgrün. Man setzt das Rühren noch eine Stunde fort und filtriert erst am nächsten Tage die inzwischen rein grün gewordene Flüssigkeit von ein wenig ungelöster rotbrauner Substanz (höch- stens 0,2 g) ab, die sich der Oxydation entzogen hat. Dann extra- hieren wir das Filtrat, ohne es zu verdünnen, erschöpfend mit Äther. Die mit Natriumsulfat getrocknete ätherische Lösung hinterläßt beim Abdampfen das Gemisch der beiden Oxydations- produkte als schwach gelblichen Sirup, der im Vakuum über Natron- kalk langsam den Geruch nach Essigsäure verliert. Das Gemisch krystallisiert nicht, aber wenn man es durch Auf- lösen in Wasser, Neutralisieren und Ausäthem zunächst der soda- alkalischen, sodann der angesäuerten und mit Ammonsulfat ge- sättigten Lösung in seine beiden Komponenten zerlegt, so krystalli- sieren beide sogleich. Bei Versuchen mit je 5 g Phylloporphyrin, das durch Fraktio- nierung mit Salzsäure gereinigt und überdies für den Versuch III aus Äther umkrystallisiert war, erzielten wir folgende Ausbeuten: Rohes Gemisch C7H,02N C8H§OtN Gefunden I. 3,55 1,35 1 ,oo *’ 3.30 1,67 1,31 •• 3.o° 1,20 i,io Theor. Ausbeute von je 1 Mol. 3,18 1,37 i,8x Um die Genauigkeit unserer Ausbeutebestimmung und die unvermeidlichen Verluste bei der Trennung kennen zu lernen, haben wir 1. gewogene Mengen von Imid, sowie von Hämatinsäure in 100 ccm 35 proz. Schwefelsäure gelöst und genau nach der Art 374 R> Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. unserer Isolierung des rohen Oxydationsproduktes zurückge- wonnen. Angewandt 0,890 g Imid, gef. 0,842 g (94,7%). Angewandt 1,000 g Hämatinsäure, gef. 0,897 g (89,7 %). 2. Es wurden die beiden reinen Oxydationsprodukte vermischt und nach der beschriebenen Methode getrennt. Angewandt 1,365 g C7H902N + 1,386 g C8H904N, gef. 1,278 d. i. 93,6% Imid und 1,387 d. i. 100,0% Hämatinsäure. Da wir hier reinen Äther (nicht von der Isolierung des Imids wiedergewonnenen und daher imidhaltigen) anwandten, ging etwas Imid durch Verflüchtigung mit Ätherdampf verloren. Wenn man die hier ermittelten Verluste bei der zweimaligen Isolierung zur Ausbeute des Versuches II hinzurechnet, so ergeben sich die folgenden Schätzungen für die beiden Oxydationsprodukte: Imid 38% statt 27% = 1 Mol. Hämatinsäure 28% statt 36% = 1 Mol. Pyrroporphyrin und Rhodoporphyrin gaben bei der Oxydation dasselbe Resultat wie Phylloporphyrin. Oxydation von Hämin. Mit Bleisuperoxyd. Hämin wurde in Portionen von 1 g in 15 g konzentrierter Schwefelsäure unter Anrühren in der Reib- schale gelöst; die Flüssigkeit trugen wir unter Eiskühlung und Rühren in die Suspension von 15 g Bleisuperoxyd in 60 g 5oproz. Schwefelsäure tropfenweise ein. Die Oxydation wurde wie bei Phylloporphyrin zu Ende geführt; sie ergab 2,1 g krystallisiertes Rohprodukt aus 5 g Hämin und nach der Reinigung mit Sodalösung, wobei eine kleine Menge nicht krystallisierbarer, wachsartiger Substanz ungelöst blieb, 1,8 g ziemlich reine Hämatinsäure. Mit Chromsäure - Schwefelsäure erhalten wir die Hämatin- säure reiner als durch Oxydation in warmem Eisessig nach Küster und die Ausbeute an Rohprodukt niedriger, vielleicht eben infolge des Fehlens von Beimischungen. 5 g Hämin werden mit 25 g konzentrierter Schwefelsäure ver- rührt und mit 50 ccm 5oproz. Schwefelsäure verdünnt. Wir kühlen Oxydation der Chlorophyllderivate. 375 die trübe dunkelbraune Flüssigkeit mit Eis und tragen unter Rühren tropfenweise die wäßrige Chromsäure ein (15 g in 50 ccm); die Temperatur wird während der zum Einträgen erforderlichen Stunde auf 5 — 70 gehalten. Die Farbe schlägt in Olivgrün um und wird beim Stehen in einigen Stunden rein grün ; die abzufiltrierende Ausscheidung ist nur etwa 0,25 g. Die Ausbeute an rohem Imid der dreibasischen Hämatinsäure betrug bei wiederholten Versuchen 2,34 g; bei der Reinigung (nach dem Verfahren von Küster) genügte es, x/i5 der zur Salzbildung erforderlichen Menge Calciumcarbonat anzuwenden. Die wieder isolierte reine Hämatinsäure belief sich auf 1,56 g. XXII. Reduktion der Chlorophyllderivate1). I. Zur Geschichte. Bei der Reduktion von Hämin mit Jodwasserstoff und Phos- phoniumjodid haben M. Nencki und J. Zaleski2) das Hämo- pyrrol entdeckt. Sie haben die Formel C8H13N für die Base aus der Analyse des krystallisierten Pikrats und der amorphen Ver- bindung mit Quecksilberchlorid abgeleitet. Wie die Beziehungen zwischen dem Hämatoporphyrin und dem Phylloporphyrin von Hoppe-Seyler und E. Schunck erwarten ließen, ist es auch gelungen, das Hämopyrrol aus einem Chlorophyllderivat abzu- spalten. Nencki hat nämlich gemeinsam mit L. Marchlewski3) bei der Reduktion von sogenanntem Phyllocyaninkupferacetat die Bildung von Hämopyrrol beobachtet und die Base als Queck- silberverbindung analysiert. Wenige Monate nach der Publikation seiner Entdeckung starb Nencki. Und seitdem ist das Hämopyrrol, so leicht zugänglich es ist nach dem V erfahren von Nencki und Z a 1 e s k i , und so wich- tig für die Kenntnis von Blut- und Blattfarbstoff, bis vor kurzem nur unzureichend untersucht worden. Über die Natur der Seitenketten im Hämopyrrol haben aller- dings die Untersuchungen von W. Küster Aufschluß gegeben. Hatten Nencki und Zaleski von einer Butyl- oder Propyl- gruppe gesprochen, so machte es W. Küster4) durch die Oxy- dation zum Methyläthylmaleinimid sehr wahrscheinlich, daß das !) Abh. XVIII. 2) Ber. d. d. chem. Ges. 34, 997 [1901]. 8) Ber. d. d. chem. Ges. 34, 1687 [1901]. 4) Ann. d. Chem. 346, 1 [1906] u. Zeitschr. f.physiol. Chem. 55, 526 [1908]. Reduktion der Chlorophyllderivate. 377 Hämopyrrol ein a-Methyl-ß , /3-methyläthylpyrrol ist. Überdies hat Küster gezeigt, daß das Hämopyrrol aus einem anderen Kern des Hämins hervorgeht als die Hämatinsäure; denn seine Bildung er- folgt ohne Abspaltung von Kohlendioxyd. Das Hämopyrrol ist nach Küster nicht einheitlich. Mit Mine- ralsäuren trennte Küster das Gemisch in eine saure und eine basische Fraktion. Die erstere enthielt das Pyrrol, die letztere wahrscheinlich das entsprechende Pyrrolin. In einer eingehenden Untersuchung ist dann O. Pilot y1) daran gegangen, Hämopyrrol in reinem Zustand darzustellen. Er führte die Reduktion mit Zinn und Salzsäure aus. Das Pyrrol versuchte er von hydrierten Basen durch fraktionierte Destillation im Vakuum zu trennen. Sein Hämopyrrol krystallisiert teilweise, der Schmelzpunkt liegt bei 39 °; das Pikrat hat stets den Schmelz- punkt 108,5 °. Den Konstitutionsbeweis von Küster vervoll- ständigt Pilot y, indem er das Hämopyrrol mit salpetriger Säure zum Oxim des Methyläthylmaleinimids oxydiert (Schmelzpunkt 201°). Um die Produkte der Spaltung von Chlorophyll und Hämin durch Reduktion zu vergleichen, haben Willstätter und Asahina eine Untersuchung ausgeführt, mit dem Ergebnis, daß das Hämo- pyrrol aus Chlorophyll und Hämin übereinstimmt, daß es aber nicht, wie bis dahin allgemein angenommen worden war, ein ein- heitliches Pyrrol ist, sondern ein kompliziertes Gemisch von Py rrolhomologen . Die beigemischten hydrierten Pyrrolbasen, sekundäre Produkte der Reduktion, ließen sich leicht und quantitativ durch Aus- schütteln mit Mononatriumphosphat abtrennen. Es fehlte aber an Mitteln, um das so gereinigte Hämopyrrol in seine Bestandteile aufzulösen. Die fraktionierte Destillation im Vakuum bot dafür keine Aussicht. Es wurde versucht, durch fraktionierte Krystalli- sation der Pikrate eine Trennung zu erzielen, aber ohne guten Er- folg. Hingegen haben Willstätter und Asahina eine gute Methode in der fraktionierten Salzbildung mit Pikrin- x) Ann- d- Chem- 366, 237 [1909]; 377, 3x4 [1910]; O. Piloty u. E. Quitmann, Ber. d. d. chem. Ges. 42, 4693 [1909]. 378 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. säure gefunden und durch mehrmalige Anwendung des Ver- fahrens drei Komponenten des Hämopyrrols isoliert. Zwei von den- selben waren rein (Isohämopyrrol und Phyllopyrrol), eine dritte (Hämopyrrol) hat sich weiterhin als noch nicht einheitlich er- wiesen. Ein Bestandteil des Hämopyrrolgemisches entsprach annähernd und am ehesten den bekannten Angaben: Schmelzpunkt des Pikrates 108 — 109 °, des durch Einwirkung von salpetriger Säure entstehenden Methyläthylmaleinimidoxims 201 °; für diese Kompo- nente wurde deshalb der Name Hämopyrrol beibehalten. Eine zweite Base, deren Pikrat bei 1190 schmolz, wurde in reinem, krystallisiertem Zustand (bei 16 — 17 0 schmelzend) er- halten ; gegen salpetrige Säure verhielt sie sich wie Hämopyrrol, sie gab das zweite Oxim des Methyläthylmaleinimi.ds (Schmelz- punkt 219 °). Für diese neue Komponente haben Willstätter und Asahina den Namen Isohämopyrrol eingeführt, während H. Fischer und E. Bartholomäus1) sie um dieselbe Zeit isolierten und Hämopyrrol nannten. Am wichtigsten war die Auffindung einer anders zusammen- gesetzten dritten Komponente, des Phyllopyrrols von Willstätter und Asahina, dem alle besonderen Kennzeichen des Hämopyrrols fehlten. Es enthielt ein Kohlenstoffatom mehr und wurde als Trimethyläthylpyrrol eiklärt, entsprechend der Formel: ch3— c— c— ch2— ch3 II II CH3— C C— ch3 \ / NH Auch diese Komponente haben zu gleicher Zeit H. Fischer und E. Bartholomäus beobachtet. Das Salz des Phyllopyrrols mit Pikrinsäure wird schwerer er- halten, es ist von den Pikraten das leichtest lösliche. Die Oxy- dation mit Chromsäure, die Reaktion mit salpetriger Säure ver- läuft nicht glatt, das Imid der Methyläthylmaleinsäure ist nicht erhalten worden. Von den Pyrrolbasen mit 8 Kohlenstoffatomen x) Ber. d. d. chem. Ges. 44, 3313 [191 x )- Reduktion der Chlorophyllderivate. 379 unterscheidet sich das Phyllopyrrol vor allem durch das Aus- bleiben der Fichtenspanreaktion und der von P. Ehrlich1) auf- gefundenen und von O. Neubauer2) aufgeklärten Farbreaktion mit Dimethylaminobenzaldehyd. Auch wird es in saurer Lösung durch Diazoniumsalz nicht gefällt. Dennoch kann die Base nichts anderes sein, als ein Pyrrol. Denn sie nahm bei der Reduktion vier Atome Wasserstoff auf und lieferte ein gesättigtes Hydroderivat. Dasselbe war — ungeachtet aller Verschiedenheit der zugrundeliegenden Pyrrole — äußerst ähnlich den zum Vergleich dargestellten Hämopyrrolidinen. Wäre die krystallisierte Base ein Hexahydromethylindol, so könnte sie nur zwei Atome Wasserstoff addieren. Die Unterschiede zwischen Hämo- und Phyllopyrrol erklären sich dadurch, daß im letzteren alle vier Kohlenstoffatome Seiten- ketten tragen. Die Fichtenspanreaktion ist analog der Dimethylaminobenz- aldehydreaktion als eine Kondensation von Aldehyden des Holzes mit den Pyrrolkernen zu verstehen. F. Feist3) hat gezeigt, daß die am Kohlenstoff tetrasubstituierten Pyrrole sich nicht mit Aldehyden zu kondensieren vermögen, und H. Fischer4) hat bemerkt, daß die an den vier Kohlenstoffatomen substituierten Pyrrole die Ehrlichsche Reaktion nicht erfüllen. Noch einen besonders interessanten Unterschied weist Pyllo- pyrrol gegenüber dem Hämopyrrol und gegenüber den Angaben der Literatur auf. Es wird von wässeriger Quecksilberchloridlösung nicht gefällt, es ist also bei der Abscheidung des Hämopyrrols nach Nencki und Zaleski5) stets in der Mutterlauge geblieben. Die trisubstituierten Pyrrole werden von Quecksilberchlorid gefällt, das tetrasubstituierte nicht. Demnach ist die Reaktion der Pyrrole mit dem Quecksilberchlorid nicht, wie man angenommen hat, eine Salzbildung am Stickstoff (mit Kalium gibt Phyllopyrrol natürlich ein Salz), sondern wahrscheinlich eine Mercurierung am *) Die medizinische Woche 1901, 151. 2) Verhandlg. d. Ges. d. Naturf. u. Ärzte 1903, II. Teil, 2. Hälfte, 68. 3) Ber. d. d. chem. Ges. 35, 1647 [1902]. 4) Zeitschr. f. physiol. Chem. 73, 204 [1911]. 6) Ber. d. d. chem. Ges. 34, 1003 [1901], 380 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Kohlenstoff, wie sie zuerst beim Tiophen von J. Volhard* 1), bei vielen aromatischen Verbindungen von O. Dimroth2) und anderen Forschem beobachtet worden ist. Das Gemisch der verschiedenen Pyrrole entsteht immer bei der Reduktion von Derivaten des Chlorophylls mit Jodwasserstoff und Phosphoniumjodid oder mit Zinn und Salzsäure, sowie bei der Reduktion des Hämins nach Nencki und Zaleski oder von Hämatoporphyrin nach Pilot y, also auch da, wo nur auf zwei Kerne des Farbstoffmoleküls oder vielleicht sogar nur auf einen einzigen die Bildung flüchtiger Basen zurückzuführen ist. Von den untersuchten Chlorophyllderivaten hat Phyllopor- phyrin die größte Ausbeute an flüchtigem Reduktionsprodukt ge- liefert, weil es nur eine Carboxylgruppe enthält. Von der Rolle der vier stickstoffhaltigen Kerne des Phylloporphyrins bei der Oxydation und der Reduktion mag man sich folgende Vorstellung bilden: Zwei Kerne liefern bei der Reduktion die trisubstituierten Pyrrole. Es sind die nämlichen, aus denen bei der Oxydation das Methyläthylmaleinimid hervorgeht. Ein Kern tritt nach der Reduktion als Phyllopyrrol auf; es ist wahrscheinlich derselbe, der bei der Oxydation verloren geht. Der vierte Kern behält bei der Reduktion wie bei der Oxydation sein Carboxyl; er bildet also kein flüssiges Pyrrolderivat ; sein Oxydationsprodukt ist das Imid der Hämatinsäure. Mit diesen Ergebnissen war die Aufklärung des Hämopyrrols nicht vollendet; die Fortsetzung der Untersuchung von Will- stätter und Asahina ist aber durch rasche Veröffentlichungen anderer Forscher überholt worden. Schon um die gleiche Zeit haben L. Knorr und K. Hess3) die Synthese des 2,4-Dimethyl-3-äthyl-pyrrols ausgeführt und seine Verschiedenheit von den bei der Reduktion des Hämins er- haltenen Pyrrolen festgestellt. Dieses Pyrrolhomologe ist kurz x) Ann. d. Chem. 267, 172 [1891]. l) Ber. d. d. chem. Ges. 31, 2154 [1898]; 32, 758 [1899]; 35, 2032, 2853 [1902]. *) Ber. d. d. chem. Ges. 44, 2758 [1911]; 45, 2526; vgl. R. Willstätter und Y. Asahina, Ber. d. d. chem. Ges. 44, 3707 [1911]. Reduktion der Chlorophyllderivate. 381 nachher von H. Fischer und E. Bartholomäus1) als Bestand- teil des Hämopyrrols aufgefunden und Kryptopyrrol genannt worden. Die drei Basen Phyllopyrrol, Isohämopyrrol (nach der Bezeich- nung von Fischer Hämopyrrol) und Kryptopyrrol, CH3— C— C— CtH6 CH3— t CH \ / NH Iso-Hämopyrrol ch3-c-c-c2h6 nl £-ch3 \ / NH Kryptopyrrol unter denen Isohämopyrrol quantitativ überwiegt, sind die haupt- sächlichen, aber nicht die einzigen Bestandteile des Gemisches. 0. Pilot y und J. Stock2) haben bedeutende Mengen von Hämo- pyrrolgemisch nach der Methode von Willstätter und Asahina fraktioniert und daraus noch folgende Bestandteile isoliert: CH, — C — C — CoHK HC CH \ / NH Hämopyrrol a d. i. 3,4-Methyläthylpyrrol CH3— C— CH II II CH3— C CH \ / n-c2h6 . Hämopyrrol e d. i. i-Äthyl-2-3-dimethylpyrrol, nur in Form eines bimeren Derivates erhalten3). Das Hämopyrrol von Willstätter und Asahina (Pikrat- schmelzpunkt 108— 109 °) betrachten Pilot y und Stock als Ge- misch von Isohämopyrrol, Kryptopyrrol und anderen Pyrrolen; freilich ist diese Erklärung sehr unsicher, da es in der Untersuchung von Willstätter und Asahina durchaus nicht gelungen ist, die Base durch fraktionierte Salzbildung mit Pikrinsäure zu zerlegen. x) Ber. d. d. chem. Ges. 45, 197g [1912]. *) Ann. d. Chem. 392. 215 [1912]; Ber. d. d. chem. Ges. 46, 1008 [1913]. ») Nach O. Piloty und K. Wilke (Ber. d. d. chem. Ges. 46, 1597 [1913] sind die Angaben über Hämopyrrol e zweifelhaft. 382 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Die oben aufgestellte Formel des Phyllopyrrols ist durch ele- gante Synthesen von H. Fischer und E. Bartholomäus1) be- wiesen worden. Fischer und Bartholomäus haben nämlich die Entdeckung gemacht, daß Pyrrole durch Erhitzen mit Natrium- methylat und Natriumäthylat alkyliert werden. Mit dieser schönen Methode haben sie aus Trimethylpyrrol und aus Dimethyläthyl- pyrrol das Phyllopyrrol erhalten. Auch U. Colacicchi2) hat auf synthetischen Wegen Phyllopyrrol dargestellt. 2. Zerlegung von Hämopyrrol durch fraktionierte Salzbildung mit Pikrinsäure. Das Beispiel einer Fraktionierung von Hämopyrrol, dargestellt aus Hämin, führen wir wegen des praktischen Wertes der Methode ungefähr mit den Worten von Willstätter und Asahina an, wenn auch die Einheitlichkeit der einen von den drei Kompo- nenten etwas zweifelhaft geworden ist. Die Spaltung des Hämins durch die Einwirkung von Jod- wasserstoffsäure mit J odphosphonium haben wir im wesentlichen nach den Angaben von Nencki und Zaleski3) und zwar mit Portionen von 25 — 50 g Hämin ausgeführt. Wir erhitzten je 25 g Hämin mit dem Gemisch von 450 ccm Eisessig und 500 g Jodwasserstoffsäure vom spezifischen Gewicht 1,96 zunächst 1V2 Stunden lang auf dem Dampfbad; das Hämin ging rasch in Lösung; die Flüssigkeit wurde rotbraun und dann durch das Freiwerden von Jod allmählich tiefbraun. Dann trugen wir unter weiterem Erwärmen nur 20 g Phosphoniumjodid (anstatt 40 — 50 nach Nencki und Zaleski) in kleinen Portionen während einer halben Stunde ein. Diese Menge reichte zur Aufhellung der Lösung hin, so daß am Ende eine Probe beim Versetzen mit Wasser klar und hellgelb war. Wir verdünnten mit dem iV2 fachen Volumen Wasser und trugen calcinierte Soda ein bis zu stark alkalischer Reaktion. Man kann die Pyrrole ausäthem, aber reiner erhält x) Ber. d. d. chem. Ges. 45, 466 [1912]; Zeitschr. f. physiol. Chem. 77, 185 [1912]. J) Atti R. Accad. dei Lincei 21, I, 489 und 653 [1912]. a) Ber. d. d. chem. Ges. 34, 1002 [1901]. Reduktion der Chlorophyllderivate. 383 man sie (wenngleich mit einem kleinen Verlust durch Harzbildung) bei der Destillation mit Wasserdampf. Die übergehenden Basen fingen wir in Vorlagen auf, die mit Äther und verdünnter Natron- lauge beschickt waren; die Extraktion mit Äther wurde durch Aussalzen vervollständigt. Für die weitere Aufarbeitung sind die Ätherextrakte aus 300 g Hämin vereinigt worden. Zur Abtrennung der hydrierten Pyrrolbasen schütteln wir die gesamte Ätherlösung der Basen dreimal mit 30 proz. Mono- natriumphosphatlösung aus. Die starken Basen werden quanti- tativ weggenommen, ohne daß etwas von den Pyrrolen mitgeht. Dann wird die ätherische Lösung mit ein wenig Lauge und mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Fraktionierte Salzbildung. Zunächst zerlegen wir das Gemisch durch fraktionierte Pikratbildung in drei noch unreine Hauptfraktionen . Die Lösung (800 ccm) enthielt 70 g Basen, gegen 80% davon konnten wir in der Form der Pikrate isolieren (155 g). Mit der berechneten Menge Pikrinsäure (etwa 135 g) reicht man nicht aus, da sich namentlich das Pikrat des Phyllopyrrols nur aus über- schüssiger ätherischer Pikrinsäure gut ausscheidet. Wir wenden daher 150 — 160 g Pikrinsäure an und isolieren 10 Fraktionen der Pikrate, die sich zu 3 Hauptfraktionen zusammenfassen lassen. 1. Auf Zusatz von 30 g Pikrinsäure, gelöst in 600 ccm wasser- haltigem Äther, schieden sich rasch 35,0 g Pikrat aus. Prismen vom Schmelzpunkt 1160 (unscharf), Schmelzpunkt einer aus Alkohol umkrystallisierten Probe 1190. 2. Das Filtrat von 1. gab mit 10 g Pikrinsäure in 200 ccm feuchtem Äther in einer Stunde 7,0 g von gleichem Pikrat. 3. Das Filtrat wurde wieder mit 10 g gelöster Pikrinsäure ver- mischt und einige Stunden im Eis-chrank aufgestellt. Es gab 19,0 g Pikrat vom Schmelzpunkt 1160, lange und kurze Prismen. Eine umkrystallisierte Probe schmolz bei 1190. Die drei Abscheidungen (zusammen mit 7 a) vereinigten wir zur I. Hauptfraktion (etwa 62 g); sie enthielt hauptsächlich Iso- hämopyrrol. 384 WiUstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 4. Das Filtrat liefert mit 10 g gelöster Pikrinsäure wieder 6,5 g Pikrat, Nadeln und Täfelchen vom Schmelzpunkt 108 — 109 der sich beim Umkrystallisieren nicht änderte. 5. Nochmals mit der gleichen Menge Pikrinsäure entstand eine weitere Ausscheidung von 12,5 g Pikrat bei 109 0 schmelzend. 6. Das Filtrat versetzten wir mit der doppelten Menge Pikrin- säure; in 1V2 Stunden schieden sich 11,0 g Pikrat vom Schmelz- punkt 108 — 109 0 aus. 7. Das Filtrat ließen wir mit 15 g Pikrinsäure in 300 ccm Äther im Kälteraum über Nacht stehen; die neue Ausscheidung betrug 9,0 g, sie schmolz bei 108 0 und bestand aus feinen Nadeln und derben Tafeln. Aus dem Gemisch mechanisch isolierte Tafeln zeigten den Schmelzpunkt 1180. Man sieht, daß die Trennung nicht in einem einmaligen Prozesse gelingt. Nachdem der größte Teil der zweiten Base ausgefällt worden, setzt die Lösung von neuem etwas Isohämopyrrolsalz ab. Die 7. Fraktion erforderte eine Vorbehandlung, ehe sie rein genug war, mit den anderen Krystallisationen vereinigt zu werden. Wir schüttelten sie mit einem Gemisch von 1 Volum Äther und 2 Volumen Essigester an, bis der ungelöste Teil aus ziemlich ein- heitlichen derben Prismen bestand. Dann krystallisicrten wir die letzteren aus Alkohol um und erhielten so 1,4 g lange Säulen vom Schmelzpunkt H5°:7a. Die alkoholische Mutterlauge sowie die ätherisch-essigätherische Lösung gaben 6,0 g Pikrat vom Schmelz- punkt 108 — 109 0 :7b. Die Krystallisationen 4 — 6 und 7b (36 g) vereinigten wir zur II. Hauptfraktion und verarbeiteten sie durch eine weitere Fraktio- nierung auf unsere zweite Komponente. 8. Zum Filtrat von 7 fügten wir 20 g Pikrinsäure in 400 ccm Äther. Beim Stehen bei o° entstand keine Krystallisation mehr. Die Lösung wurde deshalb im Vakuum auf zwei Drittel ihres Vo- lumens eingeengt und dann i1/2 Stunden mit Eis gekühlt. Nun bildete sich eine Ausscheidung von nur 4 g Pikrat (Schmelzpunkt gegen 94 °). Bei der Prüfung erwies sich dieses Präparat als Gemisch. Wir schüttelten es mit 100 ccm Äther längere Zeit und filtrierten das Reduktion der Chlorophyllderivate. 385 Ungelöste ab. Die Lösung lieferte, im Vakuum auf ein kleines Volumen gebracht und mit Pikrinsäure gesättigt, 1 g reines Phyllo- pyrrolsalz. Den ungelösten Teil krystallisierten wir aus Alkohol um. Zuerst schied sich 1,1g Pikrat vom Schmelzpunkt 118— 1190 ab, dann wenig vom Schmelzpunkt 105 °, endlich aus der kon- zentrierten Mutterlauge beim Sättigen mit Pikrinsäure 2,2 g Phyllopyrrolpikrat, mit Pikrinsäure vermischt. Von Fraktion 8 kamen also etwa 3 g zur III. Hauptfraktion. 9. Das Filtrat dampften wir abermals im Vakuum auf sein halbes Volumen ein, diesmal schieden sich 40,0 g Pikrat aus vom Schmelzpunkt gegen 90 0 als Mehl von mikroskopischen Prismen. Eine Probe gab mit N atronlauge rasch krystallinisch erstarrende Base . 10. Die Mutterlauge sättigten wir mit 30 g fein gepulverter Pikrinsäure. Beim Stehen über Nacht im Eisschrank schieden sich noch 5 g Pikrat von den Eigenschaften der Fraktion 9 aus. Die Krystallisationen 8, 9 und 10, die hauptsächlich aus Phyllo- pyrrolsalz bestanden, gaben die III. Hauptfraktion (etwa 48 g) und wurden einer wiederholten Fraktionierung unterworfen. 11. Das Filtrat der 10. Krystallisation lieferte bei weiterem Konzentrieren im Vakuum nur noch eine kleine Menge von krystalli- siertem Prikat. Daher machten wir die Basen daraus frei, extra- hierten sie mit Äther und destillierten den Abdampfrückstand derselben von neuem mit Wasserdampf. Dabei ging etwas öl über, dessen ätherische Lösung mit Pikrinsäure noch eine geringe Ab- scheidung vom Schmelzpunkt 1180 gab und eine weitere Krystalli- sation (0,5 g), die gegen 90 0 schmolz. Bei der Dampfdestillation bleiben aber im Kolben 15 g eines braunen Harzes zurück. Aus diesem ließen sich durch Erwärmen mit Jodwasserstoff und Jod- phosphonium und weitere Verarbeitung genau wie bei der Re- duktion des Hämins wieder Pyrrole gewinnen, wenigstens ein Teil der durch die Verharzung verlorenen Basen. Isohämopyrrol. Aus 60 g der I. Hauptfraktion wurde das Pyrrol mit Natron- lauge isoliert und im Vakuum destilliert; darauf haben wir es der erneuten Fraktionierung mit Hilfe von Pikrinsäure unterworfen, Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 386 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. die, allerdings mit Verlusten, eine nach allem Anschein völlig homogene Base lieferte. Die Rohbase ist mit nur 2/3 der theoretisch erforderlichen Menge der Säure als Pikrat gefällt und dieses aus Alkohol um- krystallisiert worden. Aus der alkoholischen Mutterlauge und der Restlösung von der Pikratbildung gewannen wir Base zurück und schieden mit der Hälfte der berechneten Säure nochmals Pikrat ab, das gleichfalls umkrystallisiert worden ist. Das der Rohbase beigemischte Isomere blieb in der Mutterlauge. Aus dem so gewonnenen reinsten Pikrat ist endlich das Iso- hämopyrrol frei gemacht und abermals im Vakuum destilliert worden. Hämopyrrol. Aus der II. Hauptfraktion der Pikrate haben wir durch weitere drei systematische Anwendungen der fraktionierten Salzbildung ein vollkommen homogenes Präparat isoliert. Zweite Fraktionierung. Die aus 34,5g Pikrat frei gemachte Base ist mit einzelnen Zehnteln der zur Sättigung erforderlichen Menge Pikrinsäure vermischt worden. Die ersten vier Zehntel gaben Fällungen (9,8 g), die einen zu hohen Schmelzpunkt besaßen und sich als Gemische der bei 108 und 1190 schmelzenden Pikrate erwiesen. Darauf erhielten wir mit dem fünften Zehntel und dann in einem Male mit der zweiten Hälfte der Pikrinsäure Krystallisationen vom richtigen Schmelzpunkt (20 g). Hieraus ist aufs neue die Base frei gemacht worden. Dritte Fraktionierung. Diesmal wurde die Pikrinsäure in noch kleineren Anteilen eingetragen, nämlich in Portionen von 20 ccm feuchter ätherischer Lösung = 1 g Säure. Die zwei ersten Niederschläge schmolzen zu hoch, auch der dritte war noch unsicher. Hingegen gab das vierte Gramm Pikrinsäure 1,1 g reines Hämopyrrolpikrat. Darauf wurden 150 ccm Pikrinsäure- lösung auf einmal zugefügt und nach dem Abfiltrieren von 7 g Pikrat vom Schmelzpunkt 108 0 noch eine ebenso reine Krystallisa- tion (3,8 g) durch Einengen im Vakuum gewonnen. Durch besondere Reduktion der Chlorophyllderivate. 387 Fraktionierung ist aus den drei ersten Fällungen noch 1,2 g gutes Pikrat dargestellt worden. Vierte Fraktionierung. Aus den 13,1 g ist nochmals das Pyrrol frei gemacht worden. Zur Sicherheit haben wir endlich die mit dem ersten Zehntel der erforderlichen Pikrinsäure entstandene Fällung (0,4 g vom Schmelzpunkt 107 — 108 °) verworfen. Die folgenden Ausscheidungen, im ganzen 11,2 g Pikrat vom Schmelz- punkt 108 0 bildeten unser Ausgangsmaterial für die Bereitung des freien Hämopyrrols. Die destillierte Base hat in der Tat wieder das Pikrat vom Schmelzpunkt 108 0 geliefert und bei wiederholtem Umkrystalli- sieren konnten wir keine Fraktion von anderem Schmelzpunkt beobachten. Phyllopyrrol. Aus 48 g leichtest löslicher Pikrate (Hauptfraktion III) machten wir die Base frei und versuchten beigemischtes Hämopyrrol durch Zusatz von Pikrinsäure in kleinen Anteilen zur ätherischen Lösung (300 ccm) abzutrennen. Durch 66 ccm und 50 ccm Pikrinsäure- lösung (5 g in 100 ccm enthaltend) und beim Einengen auf ein Drittel des Volumens wurde nur ein wenig Harz gefällt, beim Ver- setzen mit weiteren 50 ccm Pikrinsäure nur 0,5 g Krystalle vom Schmelzpunkt 92 °, die wir verwarfen. Das Filtrat lieferte beim Sättigen mit 25 g feingepulverter Pikrinsäure eine Krystallisation von 30 g und bei mäßigem Konzentrieren noch 3 g Pikrat vom unscharfen Schmelzpunkt 92 °. Aus dieser Fraktion von 33 g ist das Phyllopyrrol in Freiheit gesetzt worden. 3. Isolierung der Hämopyrrole aus Chlorophyll. Das Gemisch von Phytochlorin und Phytorhodin, wie es bei der Hydrolyse von guten Phäophytinpräparaten entsteht, ist der Reduktion in Eisessig-Salzsäurelösung mit Zinngranalien bei 100 0 unterworfen worden. Die ätherische Lösung der flüchtigen Basen gab nach der Reinigung mit Phosphorsäure bei zwei Versuchen mit je 50 g Substanz sofort eine Fällung mit Pikrinsäure (Versuch I 4,7 g, Versuch II 5,5 g) vom Schmelzpunkt etwa no°, der beim 25* 388 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Umkrystallisieren aus Alkohol auf n6° stieg. Aus dem Filtrat konnten wir nach starkem Einengen mit pulverförmiger Pikrin- säure auch das Salz vom Schmelzpunkt 92 — 93 0 der krystalli- sierenden Base (Versuch I 4,1 g, Versuch II 2,5 g) ausscheiden. Nach derselben Methode lieferten einmal 10 g ganz reines Phytochlorin e eine bei 1170 und eine zweite bei 108 0 schmelzende Pikratfraktion (zusammen 2,95 g); Phyllopyrrol blieb in der Mutterlauge. Ähnlich war die Ausbeute bei der reduzierenden Spaltung nach dem Verfahren von Nencki und Zaleski. Die Arbeitsweise war dieselbe wie beim Hämin. 50 g Chlorin-Rhodingemisch sind in 1 1 Eisessig und 1 kg Jodwasserstoffsäure vom spezifischen Ge- wicht 1,96 gelöst, 1 Stunde auf 100 0 erhitzt und dann bis zur Aufhellung zu Braun mit Jodphosphonium versetzt worden. Die Ätherlösung der wasserdampfflüchtigen Basen lieferte 1. 7,7 g Pikrat vom Schmelzpunkt 1160, 2- i,7g » „ „ 113°, 3- 6,8 g „ „ „ 94°. Die zwei ersten Abscheidungen waren Gemische der beiden Hämopyrrolpikrate, die letzte Krystallisation bestand aus ziem- lich reinem Phyllopyrrol. Diese aus zwei gleichartigen Pikrat- darstellungen in Freiheit gesetzte Base destillierte unter 10 mm Druck bei 89° und schmolz nach dem Abpressen auf Ton bei 55— 57 Einen ebensolchen Reduktionsversuch haben wir mit 25 g reinem Phytochlorin e ausgeführt. Die erste Abscheidung von Pikrat (3,8 g) erreichte nach dem Umkrystallisieren aus Alkohol den Schmelzpunkt 118 — 1190, die zweite (1,5 g) den Schmelzpunkt 108 °. Das Phyllopyrrol ist diesmal nicht isoliert worden. Bei diesen Versuchen mit Phytochlorin erreichte die Ausbeute an den zwei Hämopyrrolen zusammen 10%, und die Ausbeute an Phyllopyrrol 5Vb% vom Gewicht des Phytochlorins. Von den Basen zusammen wurden bisher nur rund drei Viertel der Theorie für 1 Mol Base aus 1 Mol Phytochlorin isoliert. Mit anderen Chlorophyllderivaten haben wir bei vorläufigen Bestimmungen folgende Ausbeuten an Hämopyrrolen erzielt, die Reduktion der Chlorophyllderivate. 389 wir nach Nencki und Zaleski einfach in Form der Quecksilber- chloridverbindung bestimmt, nämlich im Goochtiegel gewogen haben. 1 g Äthylchlorophyllid (a mit b) lieferte 0,923 g Hg-Verbindung, das ist 0,15 g Hämopyrrole. 1 g Phylloporphyrin lieferte 2,04 g Hg-Verbindung, das ist 0,33 g Hämopyrrole. 2,5 g Phylloporphyrin lieferten 5,12 g Hg-Verbindung, das ist 0,82 g Hämopyrrole. Also hat 1 Mol Phylloporphyrin fast 1,4 Mole der durch Queck- silberchlorid fällbaren Hämopyrrole geliefert. 4. Beschreibung der Pyrrole aus Chlorophyll. Phyllopyrrol, C9H16N, destilliert unter 10 mm Druck konstant zwischen 88 — 90 0 und siedet bei 725 mm Barometerstand bei 2130 (nach Schleier- macher bestimmt). Aus Äther oder Petroläther krystallisiert das Phyllopyrrol in schneeweißen, unscharf vierseitigen, glimmer- ähnlich glänzenden Blättchen vom Schmelzpunkt 66 — 67°. An der Luft ist es sehr unbeständig. Kalium reagiert unter stürmischer Wasserstoffentwicklung und gibt ein krystallinisches Kaliumsalz. In 1 prozentiger Salzsäure löst sich die Base sehr träge, schneller in konzentrierteren Mineralsäuren. Die bekannten Farbreaktionen der Pyrrole zeigt das Phyllo- pyrrol nicht (zum Unterschied von den anderen Hämopyrrol- komponenten) und seine wässerige (Essigsäure und etwas Alkohol enthaltende) Lösung wird von Quecksilberchlorid nicht ausgefällt. Das Pikrat krystallisiert in dunkelgelben kleinen Prismen vom Schmelzpunkt 95 °. Die Tetrahydroverbindung entsteht nur vermischt mit dem Pyrrolin beim Erhitzen mit Jodwasserstoff und Phosphor auf 250 °; aber die Hydrierung läßt sich mit Wasserstoff und Platin nach dem von Willstätter und Waser1) für ungesättigte Basen erprobten Verfahren zu Ende führen. Das Pyrrolidin destilliert *) Ber. d. d. chem. Ges. 43, 1176 [1910]. 390 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. zwischen 160 — 164°, eine piperidinähnlich riechende, leicht be- wegliche Flüssigkeit von d4 = 0,843. Isohämopyrrol, C8H13N siedet unter 725 mm Druck bei 198°, unter n — 12 mm bei 88° als farbloses (im Gegensatz zu älteren Angaben über Hämopyrrol) nicht fluorescierendes öl von anhaftendem Geruch; d4° = 0,915. Es erstarrt leicht zu einer blättrigen Krystallmasse vom Schmelz- punkt 16 — 17 0 Zur Kennzeichnung der Pyrrole finden wir die styphninsauren Salze besonders geeignet, da sie sich durch Krystallisations- vermögen, Schwerlöslichkeit und Haltbarkeit auszeichnen. Das ,,Styphnat“ des Isohämopyrrols bildet gelbe, viereckige Prismen vom Schmelzpunkt 136 °, die in kaltem Alkohol schwer löslich sind. Das Tetrahydroderivat siedet um 43 0 niedriger als das Pyrrol und ist viel leichter als dieses; d4 = 0,845. Hämopyrrol. Das Pyrrol aus der II. Hauptfraktion der Pikrate entsprach auch der Zusammensetzung C8H13N ; es destillierte unter 12 mm Druck bei 86 — 87° und krystallisierte nicht. Der Schmelzpunkt des Styphnates lag bei 120 — 1210. Mit salpetriger Säure nach Pilot y oxydiert, lieferte es ein scharf bei 201 0 schmelzendes Methyläthylmaleinimidoxim, während aus Isohämopyrrol unter gleichen Umständen ein Isomeres vom Schmelzpunkt 219 0 ent- stand. XXIII. Die carboxylfreien Stammsubstanzen: Ätiophyllin und Ätioporphyrin1). i. Bildung. Die Decarboxylierung durch Erhitzen mit methylalkoholischer Kalilauge im geschlossenen Gefäß hat glatt zu den Monocarbon- säuren geführt, aber nicht über diese hinaus. Bei gegen 250 ° trat Zersetzung ein unter Bildung von amorphen braunen Produkten und von Hämopyrrolen, und es gelang nicht, das carboxylfreie Phyllin oder Porphyrin so zu bilden. Wahrscheinlich dauerte bei diesem Versuch das Erhitzen zu lang. Beim Kochen mit Chinolin und Acridin blieb Phylloporphyrin unverändert; decarboxylierende Bakterien (wir verdanken der Fabrik von F. Hoffmann-La Roche in Grenzach eine Reinkultur von Bakterien, die Histidin elegant decarboxylierten) griffen Rhodophyllin nicht an. Am besten gelingt die Decarboxylierung bei kurzem Erhitzen von Phyllinen und Porphyrinen mit Natronkalk im Reagierrohr in kleinen Mengen, nur muß man dabei die geeignete Temperatur treffen, bei der Kohlensäure schon abgespalten, aber die empfind- liche Substanz noch nicht zerstört wird. Die Zerfallstemperatur der angewandten Alkalisalze liegt jedenfalls höher als die Tem- peratur, bei der sich während der Dauer des Versuches das Reaktionsprodukt bereits zersetzt. Die Phylline spalten Kohlensäure merklich leichter ab als die Porphyrine; es entsteht weniger Nebenprodukt und noch fast kein Hämopyrrol. Daher ist es leichter, Ätiophyllin darzustellen als h Aus einer unveröffentlichten Arbeit von R. Willstätter und M. Fischer. 392 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Ätioporphyrin, und das beste Verfahren für das carboxylfreie Porphyrin führt über das Phyllin, welches mit ziemlich starker Säure von Magnesium befreit wird. Umgekehrt gelingt es nach der Methode von Willstätter und Forsen, das Magnesium wieder in Ätioporphyrin einzuführen, nämlich durch Einwirkung von Grignardschem Reagens. Bei der Darstellung des Phyllins ist mit besonderer Vorsicht darauf zu achten, daß kein Fremdmetall, z. B. kein Eisen an die Stelle von Magnesium tritt; das Porphyrin läßt sich wohl voll- ständig von fremden Metallen befreien, aber nicht das Phyllin. Die carboxylfreien Verbindungen sind überhaupt schwierig zu reinigen. Infolge ihrer Indifferenz gegen Alkalien kann man wohl die sauren Beimischungen entfernen. Auch läßt sich das Ätiophyllin in ätherischer Lösung mit verdünnter Salzsäure, gegen welche es große Beständigkeit zeigt, waschen und das Porphyrin damit nach der all- gemeinen Methode für die Trennung der Chlorophyllderivate frak- tionieren. Aber diese Verfahren waren nicht ausreichend. Dem Ätio- phyllin blieb hartnäckig eine magnesiumhaltige unbeständige Sub- stanz beigemischt, die erst durch Ausfällen mit Petroläther aus der ätherischen Lösung entfernt werden konnte. Das Ätioporphyrin wurde am reinsten aus seinem krystallisierten Styphnat isoliert. Eine hohe Ausbeute ist bei der Kohlensäureabspaltung mit Natronkalk natürlich nicht zu erwarten, weil immer ein Teil un- verändert bleibt und ein anderer Teil zerstört wird. Immerhin er- reichen wir eine Ausbeute von 14% der Theorie an Ätiophyllin aus Rhodophyllin und eine Ausbeute von gegen 10% Ätioporphyrin aus Phylloporphyrin. Aus Phyllo- und aus Pyrroporphyrin wurde das nämliche Ätioporphyrin erhalten, und es ist identisch mit dem aus Rhodo- phyllin über Ätiophyllin gewonnenen. Ätiophyllin. Rhodophyllinkalium wird sorgfältig mit der vier- bis fünffachen Menge von reinem (eisenfreiem) Natronkalk verrieben und im Reagierrohr in Portionen aus je 0,05 — 0,1 g Kaliumsalz über einer kleinen Flamme vorsichtig aber rasch er- hitzt, wobei durch ständiges Bewegen das Anhaften der Substanz an der Glaswand verhütet wird. Bei dem gleichmäßigen Erhitzen Die carboxylfreien Stammsubstanzen : Ätiophyllin und Ätioporphyrin. 393 beobachten wir einen plötzlichen Farbwechsel von Hellgrau in Braun; zugleich wird etwas Hämopyrrolgeruch bemerkbar. Bei diesem Punkt ist das Erhitzen sofort zu unterbrechen und durch Abkühlen in einer Schale mit Kupferpulver die Temperatur schnell herabzudrücken. Das erkaltete Reaktionsprodukt wird mit etwas Wasser angefeuchtet und unter kurzem Erwärmen und Schütteln mit reinem (fettfreiem) Äther ausgezogen. Die aus iog Rhodophyllinkalium erhaltenen Lösungen sind vereinigt und durch aufeinanderfolgende Einwirkung von Alkali und Säure gereinigt worden. Da das Ätiophyllin keine ausgesprochen sauren Eigen- schaften aufweist, wird die ätherische Lösung zunächst mit reiner (zink- und kupferfreier) konzentrierter methylalkoholischer Kali- lauge durchgeschüttelt. Die Lauge nimmt mit brauner Farbe saure Nebenprodukte und einen Teil des Ätiophyllins auf. Ohne vom Äther abzutrennen, verdünnen wir die alkalische Schicht mit Wasser, wobei amorphe Flocken ausfallen und das Phyllin wieder vollständig in Äther übergeht. Ob die Lösung Ätioporphyrin enthält, prüft man durch Schütteln mit 4 prozentiger Salzsäure. Das Phyllin ist beständig gegen sie, beigemischtes Porphyrin geht mit rötlicher Farbe in die Säure über. Nach dem ausgearbeiteten Verfahren entsteht indessen kein Porphyrin. Dennoch empfiehlt es sich, die ätherische Lösung mit einigen Hundert Kubikzenti- meter 5 prozentiger Salzsäure etwa zehnmal tüchtig auszuschütteln, wodurch wieder braune Flocken ausgefällt werden. Zuletzt wird mit verdünntem Ammoniak alle Säure entfernt. Die bis auf 2 ccm eingedampfte Lösung erstarrte in einem Versuch zu einem krystal- linischen Brei; das Präparat ließ sich aus Äther umkrystallisieren, worin es sich spielend löst. Die Lösung wurde ohne Trocknung filtriert und auf 1 ccm eingeengt. Dann schied sich das Ätiophyllin in schönen, blauvioletten Krystalldrusen aus, die unter dem Mikro- skop taflige und prismatische Formen zeigten und je nach der Dicke rosarot bis violett in der Durchsicht waren. Die Ausbeute an Rohprodukt betrug 0,5 — 0,6, an umkrystallisierter Substanz 0,4g. In anderen Versuchen krystallisierte das Ätiophyllin nicht aus, wahrscheinlich, weil es weniger rem war. Auch wurde bei längerem Stehen seine anfangs blaustichig rote Lösung in Äther oder in 3 94 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Benzol mißfarbig. Nach dem Konzentrieren ließ sich mit Petrol- äther eine Beimischung ausf allen, die zwar gleich den Phyllinen fluorescierte, aber von unschöner brauner Farbe war. Sie gab mit Säure unter reichlicher Bildung amorpher Flocken ein in Äther gelbbraunes Porphyrin. Das Nebenprodukt, selbst unbeständig, scheint die Haltbarkeit des Ätiophyllins zu beeinträchtigen. Es hat keine saueren Eigenschaften, ist aber sauerstoffhaltig; viel- leicht hat es den Sauerstoff erst während der Operationen auf- genommen. Nach seiner Entfernung ist das Ätiophyllin rein und auch in verdünnter ätherischer Lösung gut haltbar mit sehr schöner, fuchsienroter Farbe. Bildung aus Ätioporphyrin : Die konzentrierte Lösung in trocke- nem Äther wird durch Magnesiummethyljodid vollständig als hellroter Niederschlag gefällt; beim Schütteln der Suspension mit primärem Phosphat entsteht die stark fluorescierende Phyllin- lösung. Ätioporphyrin. Die gereinigte Lösung des Ätiophyllins (aus 6 g Rhodophyllinkalium) wird mit 20 prozen tiger Salzsäure durch- geschüttelt; die Zersetzung erfolgt augenblicklich und das Por- phyrin geht mit violettroter Farbe in die Säure über. Daraus wird es durch Neutralisieren mit Ammoniak in frischen Äther über- geführt und von neuem mit 4 prozentiger Salzsäure extrahiert, wofür mehrmaliges Ausziehen erforderlich ist. Der Äther behält nur schwach bräunliche Farbe. Unter annäherndem Neutralisieren bringen wir das Porphyrin wieder in Äther und dampfen bis auf 10 — 20 ccm ein; das Porphyrin beginnt nun sich abzuscheiden und bildet eine schöne violettglänzende krystallinische Kruste (0,6 g). Zur Darstellung aus Pliyllo- (und Pyrro- oder Rhodo-)porphyrin wird die innig verriebene Mischung mit dem Natronkalk ebenso kurz aber höher erhitzt als bei dem Phyllin, bis plötzlich heftige Entwicklung von Dämpfen eintritt. Nach dem Anfeuchten und Aus- ziehen mit Äther haben wir die vereinigten Lösungen aus zahlreichen kleinen Portionen mit 1 prozentiger Salzsäure viermal gewaschen. Dabei wird ein in geringer Menge auftretendes Nebenprodukt ent- fernt, das mit leuchtend roter Farbe in die Säure geht; es ist stark Die carboxylfreien Stammsubstanzen: Ätiophyllin und Ätioporphyrin. 395 basisch und krystallisiert schön. Sodann wurde der Äther mit ioproz. Ammoniak öfters ausgeschüttelt und dadurch das Am- moniumsalz einer Säure in Flocken niedergeschlagen, die schwächer basisch ist als Phyllo- und Pyrroporphyrin. Wird das Ätioporphyrin nun isoliert, so ist es noch nicht frei von Mineralbestandteilen; deshalb führen wir es mindestens einmal aus dem Äther in 10 proz. Salzsäure über, wobei ein wenig metallhaltiges Produkt im Äther hinterbleibt. Dann äthern wir lediglich unter Verdünnen wieder aus und lassen die Substanz, die in reinem Zustand schwer löslich ist, aus der mäßig konzentrierten Ätherlösung krystallisieren ; sie bildet krystallinische Aggregate. Die Ausbeute beträgt 6 — 10% vom Ausgangsmaterial. 2. Beschreibung. Das Ätiophyllin ist entsprechend der Formel C3iH34N4Mg zusammengesetzt; es gibt fast 8% Asche von reinem MgO. Seine ätherische Lösung ist gegen 4 — 7 prozen tige Salzsäure beim Durchschütteln und mehrstündigem Stehen beständig, also viel widerstandsfähiger als die Carbonsäuren der Phyllinreihe. Erst an i5prozentige Salzsäure wird sofort ein kleiner Teil abgegeben, während die ätherische Lösung noch in Farbe und Fluorescenz unverändert bleibt. Auch beim Vermischen der äthe- rischen Lösung mit Eisessig verliert das Ätiophyllin nicht leicht das Magnesium. Erst nach einigem Stehen verschwindet die Fluorescenz. Ganz anders und sehr auffallend ist das Verhalten einer petrol- ätherischen Ätiophyllinlösung gegen verdünnte Säure. Schon mit 0,05 proz. Salzsäure schlägt die Farbe sofort in den Bronzeton des Ätioporphyrins um, mit noch verdünnterer Säure allerdings nicht mehr. Gegen 1- bis 3 prozentige Salzsäure verhält sich Ätiophyllin in Petroläther nicht anderswie fertiges Ätioporphyrin. Ein Teil des Porphyrins geht in Lösung, ein anderer Teil krystallisiert als Chlor- hydrat in glitzernden langen Nadeln aus. Beim Erwärmen mit methylalkoholischer Kalilauge geht die Substanz mit roter Farbe in Lösung; kocht man den Alkohol weg, so fällt sie aus und geht beim Verdünnen unverändert in Äther. 396 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Das Ätiophyllin ist in Äther und Alkohol äußerst leicht und auch in den anderen organischen Lösungsmitteln sehr leicht lös- lich, mit Ausnahme von Petroläther, worin es schwerlöslich ist. Die alkoholische Lösung ist blaurot und besitzt starke Fluorescenz wie die Lösung in Äther, verdünnt zeigt sie prächtige violettrote Farbe. Beim Verdunsten der Lösung in Petroläther krystallisiert das Phyllin in rhombenförmigen Täfelchen aus, ähnlich dem Carotin aber noch tiefer rot. Diese Rhomben sind oft spindelförmig ge- rundet und neigen zur Bildung von Zwillingen und Durchwachsungs- drillingen. Beim Trocknen im Hochvakuum änderte sich die Löslichkeit nicht. Im Schmelzpunktsrohr sintert die Sustanz über i6o°, schmilzt unscharf bei etwa 205 0 und erweist sich noch bei 250 0 als unverändert. Ätioporphyrin, C31H36N4. Die Salzsäurezahl des Porphy- rins ist 3, seine Verteilungszahl für 3 prozentige Salzsäure 40. Sein Schmelzpunkt liegt bei ungefähr 280°; das Pulver hat ähnliche Farbe wie Alizarin auf Chrombeize. Das Porphyrin ist in Alkohol in der Kälte wenig, viel mehr, aber doch noch ziemlich schwer, beim Kochen löslich. Die alkoholische Lösung ist braunrot, von etwas mehr roter Nuance als die ätherische und fluoresciert viel schwächer als die Phylline, stärker als Pyrroporphyrin. I11 Eisessig ist es in der Wärme beträchtlich, in Aceton leicht löslich. In Ameisen- säure löst es sich spielend mit prächtig blaustichig roter Farbe. Beim Kochen mit methylalkoholischer Kalilauge bleibt die Sub- stanz unverändert. Mit Schwermetallsalzen bildet das Ätioporphyrin charakte- ristische Komplexverbindungen. Die Eisessiglösung wird beim Er- wärmen mit Zinkacetat rein rot, mit Kupferacetat rotviolett, beim Überführen in Äther gleichfalls rot. Das Kupferderivat widersteht der Einwirkung von konzentrierter Salzsäure, die Zinkverbindung wird von verdünnter Mineralsäure wie Ätiophyllin gespalten. Mit Pikrinsäure, Platinchlorwasserstoffsäure und anderen Säuren bildet das Ätioporphyrin schöne Salze. Das Pikrat wird aus Äther in roten Flocken gefällt, bei langsamer Abscheidung bildet es Die carboxylfreien Stammsubstanzen : Ätiophyllin und Ätioporphyrin, 397 schöne rote Prismen mit domatischer Begrenzung. Das Styphnat (Schmelzpunkt 170 °) krystallisiert in rosafarbigen Prismen mit häufigen Zwillingsbildungen. Mit ätherischem Goldchlorid ent- steht eine rotviolette krystallinische Fällung. Das Chlorhydrat krystallisiert in langen olivbraunen Nadeln, wenn man die ätherische Porphyrinlösung langsam mit chlor- wasserstoffhaltigem Äther versetzt. Mit Dimethylaminobenzaldehyd reagiert die salzsaure Lö- sung nicht. Ab sorptions spektra. Ätiophyllin. Das Absorptionsspektrum (Fig. 16) ist sehr ähnlich dem von Pyrrophyllin, namentlich von umkrystallisiertem. Zu den charakteristischen Absorptionsbändem in der gelben und grünen Region tritt noch ein weniger intensives, eigentümlich ge- ripptes Band im Blau. Das Spektrum weist in der sichtbaren Region außer drei schwachen Streifen im Rot die zwei Haupt- bänder im Gelb und Grün, ein schwächeres Band beim Übergang von Grün in Blau und das im Blau und Indigoblau liegende ge- gliederte Band auf. 0,0488 g in il Äther (Vi0oo Mol in 10 1). Schicht in mm 10 20 40 Band I II „ III „ IV „ V „ VI .. VII Endabsorption 583—572 550 | 548—538 | 532 5°4 | 49i 422 — 646 640 622 619 614 610 585—572 559-55°— 53I-527 507.487 471 I 458-454 I 447 • -445 I 430— 646.640 | 636 622 | 619 614 | 610 586—570 | 560.555—526. 523 508. . .486 472.467 | 460. 455 445 434— 449- Reihenfolge nach der Intensität: Endabsorption, V, IV, VI VII, I, II, III. Ätioporphyrin. Beim Austritt von Magnesium wird das Spektrum in der gelben und grünen Region aufgehellt, während 398 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. die Absorption im Blau verstärkt wird. Ätioporphyrin zeigt ein kompliziertes Spektrum (Fig. 16), ähnlich dem Pyrroporphyrin, mit hauptsächlich vier starken Bändern, wovon eines im Orange, ein eigentümlich gegliedertes in der gelbgrünen Region, das nächste im Grün, das vierte, stärkste und besonders scharfe (VIII) im Blau liegt; dazu kommt noch die bedeutende Absorption im Violett. 0,0464 g in 1 1 Äther (Viooo Mol in 10 1). Schicht in mm IO 20 80 Band I 649.643 „ II 624 620 624 — 619 | I633 | 626— 618. . . „ III 612 | 609 613.609 j 609 „ iv 598 | 593 598 | 593 598.-593 | „ V 580.572 581. . .572. 1 588. 582— 563. . „ VI 568. . .565 | 556 569 564 | 556 J 556 „ VII 533 | 53° • -525- • • 523 -5*8 536 | 531— —522 ..518 545-538—5I9 „ VIII 5°5— 479 507—479 5T4 — 475 • • -463- Endabsorption 427— 435— 452— Reihenfolge nach der Intensität: Endabsorption, VIII, VII, II, VI, V, III, IV, I. XXIV. Abbau des Hämins. i. Gewinnung von Hämin. Verbesserung des Verfahrens von Schalfejeff. Nach dem Verfahren von Schalfejeff sowie von Nencki und Zaleski wird frisches, defibriniertes Blut mit heißem, chlor- natriumhaltigem Eisessig behandelt. Dafür ist nach W. Küster (in Abderhaldens Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden Bd. II, S. 619) mindestens das Vierfache des Blutes an Eisessig erforderlich. Es gelingt aber, diese Menge auf das Dreifache vom Blut herab- zusetzen und nach einer abgeänderten Arbeitsweise bedeutende Mengen von Hämin mit den einfachsten Hilfsmitteln zu gewinnen1). Wir erhitzen auf dem Dampfbade oder auf Gasöfen 5 Rund- kolben von 4 1 Inhalt, die mit je 3 1 Eisessig unter Zusatz von etwas festem Kochsalz oder von 1 ccm gesättigter Kochsalzlösung auf den Liter Eisessig beschickt werden. In jeden Kolben, dessen Inhalt wir durch häufiges Umschwenken oder durch einen gutwirkenden Rührer in Bewegung halten, lassen wir aus einem Tropf trichter defibriniertes und durch Koliertuch filtriertes Blut in dünnem Strahl unter fortdauerndem Erwärmen einfließen, so daß die Temperatur des Kolbeninhalts nicht unter 950 sinkt. Das Abflußrohr des Tropf tri chters endet in der Mitte zwischen Rührer und Wandung des Kolbenhalses so hoch, daß die Eisessigdämpfe es nicht bespülen und es nicht mit Eiweißgerinnsel verstopfen; die Berührung des einfließenden Blutes mit der Kolben- *) Ann. d. Chem. 373, 232 [1910] und 385, 197 [1911], neu bearbeitet. 400 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. wand ist zu vermeiden. Nach dem Einlaufen des Blutes wird die Flüssigkeit noch eine Viertelstunde in schwachem Sieden ge- halten, wobei sich schon ein großer Teil des Hämins in glitzernden Krystallen ausscheidet. Nach 2—3 Tagen dekantiert man die etwas zähflüssige Mutter- lauge, aus der bei längerem Stehen noch ein wenig Hämin aus- krystallisiert, vorsichtig vom Krystallbrei ab und filtriert diesen auf der Nutsche unter Saugen an der Pumpe durch eine mehr- fache Lage von Koliertuch ; die Krystalle werden mit verdünnter Essigsäure, Wasser, Alkohol und Äther gewaschen. Die Ausbeute beträgt, wahrscheinlich mit der Zusammen- setzung des Blutes wechselnd, 41/* — 5x/2 g an reinem Hämin aus i 1 Blut. Gewinnung aus zentrifugiertem Blut1). Wir zentrifugieren defibriniertes Blut unverdünnt, während es sonst üblich ist, es zuvor mit Kochsalzlösung stark zu verdünnen. Mit einer Laboratoriumszentrifuge von Gebrüder Heine in Viersen, deren Kranzdurchmesser 66 cm beträgt, die 3000 Touren in der Minute macht und in 6 Gläsern 1,9 1 faßt, wird die Hälfte des Rinderblutes als Blutkörperchenbrei abgesetzt. Es ist aber schwierig, das Serum vollständig abzuheben, so daß aus 1900 ccm Blut doch praktisch 1100 ccm Blutkörperchen erhalten werden. Beim Vermischen mit 0,9 prozentiger Kochsalzlösung und erneutem Zentrifugieren bleibt das Volumen des konzentrierten Blutes un- verändert. Viel günstiger wirkt eine Jouan-Zentrifuge mit hoher Touren- zahl von Leu ne in Paris (Modell C mit elektrischem Antrieb, 9000 Touren mit den Gläsern von 120 ccm Gesamtinhalt, äußerer Kranzdurchmesser 24 cm) und zwar besonders bei Anwendung ihres sogenannten Bol metallique (innerer Durchmesser 18 cm, Volumen 1V2 1 und 5000 — 5500 Touren), der das Füllen und Ent- leeren bei laufender Zentrifuge gestattet. Trotz des kleineren Weges pro Sekunde wird die Leistung der großen Zentrifuge über- troffen. x) Unveröffentlicht. Abbau des Hämins. 401 Von einem Liter Rinderblut werden nämlich nach 10 Minuten 635 — 640 ccm, bei einer andern Probe 660 ccm klares Serum, d. i. annähernd die größte mögliche Menge, abgelassen. Stellt man dann die Zentrifuge ab, so enthält der Bol die Suspension der unver- änderten Blutkörperchen (340 — 365 ccm). Entleert man aber bei laufender Zentrifuge durch die Messingröhre des Apparates, so werden die Blutkörperchen durch den Anprall an die Wand der Abflußrohre zerschlagen und es läuft aus dem Bol eine lackfarbene, prächtig tiefrote Oxyhämoglobinlösung ab; das ist das gesamte Oxyhämoglobin des Blutes, klar vermischt mit der kleinsten Wasser- menge. Unter dem Mikroskop sind in der roten Lösung nur die Schatten der Blutkörperchen zu erkennen. Beim Waschen des unversehrten Blutkörperchenbreis, wie er durch langsames Arretieren der Zentrifuge erhalten wird, mit Kochsalzlösung und Ausschleudem im Bol nimmt das Volumen nicht ab, auch nicht bei 9000 Touren in den Gläschen der Zentri- fuge; das Waschen ist für die Hämingewinnung ohne Nutzen. Nach dem Zerschlagen kann man natürlich nicht mehr waschen, da die Oxyhämoglobinlösung mit der Kochsalzlösung mischbar ist. Die Anwendung der Oxyhämoglobinlösung hat für die Hämin- bereitung gegenüber der Verarbeitung von Blutkörperchenbrei den Vorzug, daß die Entleerung des Apparates leichter erfolgt und daß man kontinuierlich größere Mengen nachfüllen und entleeren kann, ohne die Zentrifuge dabei abzustellen. Das Zentrifugieren des Blutes und die Behandlung der ge- wonnenen Hämoglobinlösung mit Eisessig lassen sich bequem nebeneinander ausführen. Die Arbeitsweise ist nicht weniger ein- fach, das Hämin ebenso rein, wie nach den älteren Verfahren. Anstatt des Vierfachen oder des Dreifachen vom Blute an Eis- essig genügt es, gleichviel Eisessig wie Blut anzuwenden. Ausführung des Verfahrens. Man läßt frisches, defibri- niertes Rinderblut in Portionen von 1 1 in den mit 3000 Touren in der Minute rotierenden Bol durch ein 2 mm weites Röhrchen einlaufen, steigert alsdann die Tourenzahl innerhalb einer Minute auf etwa 5500 und läßt die Zentrifuge 10 Minuten mit dieser Ge- schwindigkeit gehen. Nun wird das nahezu farblose Serum durch Wills tä tter-Stoll , Chlorophyll. 26 402 R. .Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. langsames Senken des Entleerungsröhrchens abgehoben, bis die Flüssigkeit plötzlich tiefrot abfließt, und dann in ein anderes Ge- fäß die lackfarbige Oxyhämoglobinlösung, bis ein leises Zischen in der Zentrifuge die Berührung des Röhrchens mit der Boiwand verrät. Der Bol ist dann bis auf einige ccm entleert, und das Ab- flußröhrchen wird zurückgeschraubt. Wir schalten nun vor den Elektrometor wieder so viel Widerstand ein, daß der Bol nur mit 3000 Touren pro Minute rotiert und beschicken ihn von neuem. In Fünfliterrundkolben mit weitem Hals erwärmen wir je 2 1 Eisessig, denen wir 10 g Kochsalz zufügen auf Gaskochern zum Sieden und lassen die Oxyhämoglobinlösung aus 2 1 Blut (0,7 1) während einer halben Stunde in die durch einen Rührer lebhaft bewegte, schwach siedende Flüssigkeit eintropfen, wobei die Be- rührung der Oxyhämoglobinlösung mit der Kolbenwand und mit dem Rührer vermieden werden muß. Dann halten wir die tief- braune Flüssigkeit noch 10 Minuten in schwachem Sieden und lassen hierauf während einer Viertelstunde 1 1 destilliertes Wasser zufließen. Das Hämin scheidet sich dabei in glänzenden, groben Krystallen größtenteils aus ; bei rascherem Arbeiten krystalhsierte es so fein, daß die zur Isolierung erforderliche Filtration sehr er- schwert wurde. Bei eintägigem Stehen wird die Krystallisation vollständig. Wir filtrieren dann durch doppeltes Koliertuch die Krystalle von der nur noch wenig gefärbten Mutterlauge ab und waschen mit Essigsäure, Wasser, Alkohol und Äther etwas nach. Das Präparat ist so rein, daß es keine Umkrystallisation erfordert. Die Ausbeute an Hämin betrug 4,6 — 5,2 g aus dem Liter eines Rinderblutes, welches bei Verarbeitung nach dem oben beschriebe- nen älteren Verfahren 4,2 g Hämin ergab. 2. Hämatoporphyrin1). Hämin läßt sich nicht einfach von Eisen befreien wie Chloro- phyll von Magnesium; die Bildung des Hämatoporphyrins ist eine kompliziertere Reaktion. Um diese zu erklären, ist es oft, aber bis i) Aus einer unveröffentlichten Untersuchung von R. Willstätter und M. Fischer. Abbau des Hämins. 403 jetzt vergeblich, versucht worden, Zwischenprodukte der Bildung von Hämatoporphyrin durch Bromwasserstoffsäure zu isolieren. Willstätter und Fischer haben nun bei dieser Reaktion, und zwar bei der Abspaltung des Eisens mit Bromwasserstoff in wässe- riger oder Eisessiglösung oder ohne Lösungsmittel eine Reihe bromhaltiger Zwischenprodukte aufgefunden. Beim Behandeln mit konzentrierter wäßriger Bromwasserstoff- säure (spezifisches Gewicht 1,78) beobachten wir in einem Tage die Umwandlung des in der Hauptmenge ungelöst bleibenden Häminpulvers in neue, glänzende Krystalle, schief abgeschnittene Prismen, die dem Hämin sehr ähnlich sind, aber zwei Moleküle Bromwasserstoff addiert enthalten entsprechend der Formel: C33H3404N4FeBr3 Zum Unterschied von Hämin ist dieses Bromid in Alkohol mit intensiv rotbrauner Farbe leicht, auch in feuchtem Äther beträcht- lich löslich. In konzentrierter Schwefelsäure löst es sich leicht mit blaustichig roter Farbe, während Hämin langsam eine grünlichrote Lösung gibt. Die neue Verbindung enthält das Eisen noch fest gebunden, aber den Bromwasserstoff spaltet sie leicht ab, z. B. beim Erhitzen im Hochvakuum; dabei wird Hämin zurückgebildet. Ein zweites, ebenfalls noch eisenhaltiges, aber bromreicheres Zwischenprodukt von der Formel: C33H3504N4FeBr4 erhalten wir mit Eisessig-Bromwasserstoff, am besten mit Säure von einer für die Lösung nicht geeigneten Konzentration. Bei- spielsweise verwandelt sich Hämin bei der Einwirkung von etwas zu schwachem Eisessig-Bromwasserstoff (spezifisches Gewicht 1,40) in dieses Bromid. Es ist gleichfalls in Alkohol leicht, aber nicht in Äther löslich. Ein drittes Zwischenprodukt läßt sich aus der Auflösung von Hämin in Eisessig-Bromwasserstoff durch trockenen Äther als hellrotes Pulver fällen. Es ist bereits frei von Eisen und entspricht der Formel: C33H3804N4Br4 . 26* 404 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Endlich tritt eine Carbonsäure mit einem Atom Brom von der Zusammensetzung : C33H3705N4Br in der Form ihres Acetylderivates auf, wenn wir die Eisessig-Brom- wasserstof flösung zuerst mit festem Natriumacetat abstumpfen und dann verdünnen, anstatt sie zur Darstellung des Porphyrins mit Wasser versetzt stehen zu lassen und dann zu neutralisieren. Diese bromhaltige Säure krystallisiert aus ihrer ätherischen Lösung in schönen Pyramiden ; sie wird leicht zu Hämatoporphyrin hydrolisiert. Das wichtigste eisenfreie Zwischenprodukt der Hämato- porphyrinbildung entsteht bei der Abspaltung des Eisens durch flüssigen Bromwasserstoff, ein Bromid von der Formel C33H3904N4Br6 . Es lieferte bei vorsichtigem Abstumpfen mit trockenem Natrium- carbonat eine ätherlösliche, zwei Atome Brom enthaltende Säure. Von Salzsäure wird es leicht zu reinem Hämatoporphyrin hydroli- siert und beim Stehen mit Methylalkohol bildet es einen prächtig krystallisierenden Dimethyläther-dimethylester des Hämatopor- phyrins. Aus den beobachteten Zwischenprodukten ist der Schluß zu ziehen, daß zuerst zwei Moleküle Bromwasserstoff an Hämin addiert werden und daß die komplexe Bindung des Eisens dadurch gelockert wird; bei der Porphyrinbildung werden dann die Brom- atome durch hydroxyle ersetzt. Das Hämatoporphyrin ist bisher ausschließlich in amorphem Zustand bekannt; nur das Chlorhydrat ist von Nencki und Zaleski1) und von späteren Forschem2) krystallisiert erhalten wor- den. Nach dem folgenden Verfahren entsteht das Hämatoporphy- rin selbst in einheitlichem, krystallisiertem Zustand. Für die Darstellung von Hämatoporphyrin ist es wichtig, Eisessig-Bromwasserstoff von einer ganz bestimmten, geeigneten Konzentration anzuwenden, nämlich vom spezifischen Gewicht 1,41 (bei o° bestimmt). Damit läßt sich die von Nencki und *) Gesammelte Arbeiten von Nencki, II, Seite 77 u. 754. a) W. Küster in Abderhaldens Handbuch der biochem. Arbeits- methoden II, 623 [1910]; H. Fischer, E. Bartholomäus u. H. Röse, Zeitschr. f. physiol. Chem. 84, 262 u. 282 [i9I3]> Abbau des Hämins. 405 Zaleski angegebene Versuchsdauer erheblich abkürzen und voll- ständige Auflösung des Hämins erzielen. Weder eine stärkere, noch eine schwächere Säure finden wir geeignet, um Hämin zu lösen und das Eisen zu eliminieren; z. B. ist die von Kahlbaum käufliche Säure vom spezifischen Gewicht 1,38 nicht gut brauch- bar, sogar eine Säure vom spezifischen Gewicht 1,40 ist noch un- zweckmäßig. Das Hämin tragen wir, ohne es zu pulvern, auf einmal in die mit Eis gekühlte Bromwasserstoffsäure ein, die sich in einer gut schließenden Stöpselflasche befindet, z. B. Portionen von 10 g in 250 g der Säure vom spezifischen Gewicht 1,41 und schütteln bei gewöhnlicher Temperatur während eines Tages. Das Hämin geht in dieser Zeit klar in Lösung. Die Flüssigkeit wird in 3 1 Wasser gegossen und durch Filtrieren von ganz wenigen ungelösten Par- tikeln befreit. Die Lösung lassen wir nun zur Hydrolyse der ge- büdeten Bromverbindung drei Stunden lang stehen und fällen dann mit konzentrierter Natriumacetatlösung das Hämatopor- phyrin aus. Im Rohprodukt ist Eisen enthalten, im übrigen ist es eine einheitliche Substanz. Am besten wird Hämatoporphyrin gekennzeichnet durch seine Salzsäurezahl; zerlegen wir ein gutes Rohprodukt in Fraktionen, so stimmen diese in der Verteilung zwischen Salzsäure und Äther überein. Man kann das Porphyrin, um es frei von Eisen zu erhalten, nach Nencki in verdünnter Natronlauge lösen und mit Essig- säure wieder fällen. Auch bei der Überführung in den krystalli- sierten Zustand wird die Substanz frei von mineralischen Bestand- teilen. Die flockige Fällung von Hämatoporphyrin saugen wir auf Koliertuch ab und waschen sie mit Wasser aus. Nun lösen wir das noch feuchte Präparat, zweckmäßig das aus Natronlauge umgefällte, in 1 1 Alkohol und tragen die Lösung in 25 1 Äther ein, die auf fünf 7 1-Scheidetrichter verteilt sind. Dann waschen wir den Alkohol weg, indem wir durch jeden Scheidetrichter etwa 20 Minuten lang am Brunnen Wasser durchfließen lassen. Allerdings fällt dabei etwas flockiges Calciumsalz aus, das wir sammeln, um es mit Säure zu zer- 406 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. setzen und das entbundene Porphyrin zur Hauptmenge zurückzu- bringen. Die ätherische Lösung haben wir mit Natriumsulfat ge- trocknet und auf 1 1 eingeengt. Bei diesem Volumen beginnt schon in der Wärme das Hämatoporphyrin auszufallen ; wir lassen nun die Ätherlösung bei gewöhnlicher Temperatur stehen und erhalten das Porphyrin als glänzende violette Krystallisation, die aus schön ge- rundet rechteckigen, in der Durchsicht rotbraunen Blättchen be- steht. Der Betrag des auskrystallisierten Anteils war 4,5 g. Das krystallisierte Hämatoporphyrin ist exsiccatortrocken ge- mäß der Formel C33H3806N4 zusammengesetzt. Es verliert bei 105 0 unter 0,03 mm ein Molekül Wasser, dann ein zweites Molekül unter den gleichen Bedingungen beim Einschalten einer mit flüs- siger Luft gekühlten Vorlage. Aus ätherischer Lösung geht Hämatoporphyrin spurenweise in Salzsäure von 0,03 Prozent, reichlich (ungefähr zwei Drittel) in Säure von 0,1 — 0,15 Prozent, fast vollständig in o,4prozentige Säure. 3. Abspaltung des Eisens aus Hämin durch flüssigen Bromwasserstoff1). Durch Einwirkung von Bromwasserstoff auf Hämin im ge- schlossenen Rohre entsteht bei gewöhnlicher Temperatur das Bromid C33H3904N4Br6, d. i. das bromwasserstoffsaure Salz einer bromhaltigen Carbonsäure, das sich von Eisenbromid trennen läßt. Aus diesem Salz wird die Carbonsäure in Freiheit gesetzt, die zwei Bromatome enthält. Wir füllen 5 g Häminkrystalle in ein Einschlußrohr und kon- densieren darin durch Kühlen mit flüssiger Luft mit Calcium- bromid getrocknetes Bromwasserstoffgas (ca. 10 g), wobei wir das Einleitungsrohr etwa 1 cm über dem Dewargefäß enden lassen, um Verstopfen durch den krystallisierenden Bromwasserstoff zu vermeiden. Nach dem Zuschmelzen bleibt die Röhre einige Tage x) Aus einer unveröffentlichten Untersuchung von R. Willstätter und M. Fischer. Abbau des Hämins. 407 stehen; vor dem öffnen wird sie zuerst mit Kohlensäure-Äther, dann mit flüssiger Luft gekühlt. Der Bromwasserstoff wird ver- dampft und das violette, metallisch glänzende Rohprodukt (10,3 g), das zerfließlich ist, mit trockenem Äther oftmals verrieben und da- durch vom Ferribromid befreit. Leichter erhalten wir die Brom- verbindung eisenfrei durch mehrmaliges Lösen in Aceton und Fällen mit Äther. Das Pentabromid bildet glänzende, in der Durchsicht violette bis rubinrote Blättchen, die keine Krystall- formen zeigen. Um die ätherlösliche Carbonsäure von der Formel C33Hg604N4Br2 darzustellen, ist es erforderlich, den Bromwasserstoff dieses Salzes sehr vorsichtig abzustumpfen. Wir lösen das eisenfreie Pentabromid in Aceton (1 g in 20 ccm) und fällen es mit 100 ccm Äther in feiner Verteilung aus; dann wird die Suspension mit überschüssigem wasserfreiem Natriumcarbonat geschüttelt, bis eine klare, rot- braune Lösung entsteht. Sie wird sofort filtriert und mit Petrol- äther gefällt, da die bromhaltige Säure das Abdampfen der äthe- rischen Lösung nicht verträgt, sondern dabei in ein bromwasser- stoffsaures Salz umgewandelt wird. Nach dem Trocknen ist das dunkle Pulver (0,6 g) in Alkohol und Aceton mit braunroter Farbe leicht löslich, aber nicht mehr in Äther. Die Hydrolyse des Pentabromids liefert in glatter Weise reines krystallisierendes Hämatoporphyrin ; man braucht es nur in mäßig verdünnter Salzsäure aufzulösen, um sofort die Substitution zweier Bromatome durch Hydroxyl zu erzielen. Wir lösen z. B. unter gelin- dem Erwärmen 5 g Pentabromid in il 20 prozentiger Salzsäure und führen aus der filtrierten Lösung unter sorgfältigem Abstumpfen der Säure mit Ammoniak das gebildete Porphyrin in viel (ca. 15 1) Äther über. Nach dem Abdampfen auf 1 1 scheidet sich Hämato- porphyrin als schönes Krystallmehl (1,2 g) aus, worin man sehr oft eine typische Form beobachtet: an beiden Enden abgerundete längliche Blättchen. Auch bei der Einwirkung von Methylalkohol in der Kälte tritt alles Brom aus. Die entstehende Tetramethylverbindung bildet große rubinrote Pyramiden. Sie ist in Äther auch in getrocknetem Zustand leicht löslich, ihre Salzsäurezahl liegt zwischen 3 und 4. 408 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. Sie enthält nur zwei verseifbare Methylgruppen. Bei der Hydrolyse liefert sie den Dimethyläther des Hämatoporphyrins, eine in Äther schwerlösliche Säure , die in braunroten häminähnlichen Blättchen krystallisiert und durch die Salzsäurezahl i gekennzeichnet ist. 4. Mesohämin und Hämoporphyrin1). Auf das Hämin und das Hämatoporphyrin haben wir die Me- thode des Abbaus durch Erhitzen mit Alkalien übertragen, die vom Chlorophyll durch die Reihe der Phylline und Porphyrine bis zu den carboxylfreien Stammsubstanzen geführt hat. Beim Hämin selbst war es nicht möglich, nach dem Verfahren der Ätiophyllin- bildung die Carboxyle abzuspalten, ebensowenig beim Hämato- porphyrin; hingegen gelingt die Abspaltung von Kohlensäure bei den Porphyrinen, welche aus Hämin und Hämatoporphyrin beim Erhitzen mit methylalkoholischem Kali hervorgehen. Bei der Umwandlung des Blutfarbstoffs durch Alkalien bei höherer Temperatur trat dieselbe Schwierigkeit auf wie bei der Chlorophyllkomponente b. Mit methylalkoholischem Kaliumhydro- xyd allein war die Reaktion nicht glatt ausführbar, die Substanz ging teilweise zu Grund. Dagegen entstehen bei Gegenwart von viel Pyridin schöne Porphyrine und zwar verschiedene aus Hämin und Hämatoporphyrin; ihre Bildung erfolgt durch einen Reduktionsvorgang. Beim Hämin bleibt noch bei 200 0 die komplexe Bindung des Eisens erhalten. Die entstehende Verbindung läßt sich mit kon- zentrierter Schwefelsäure oder mit Eisessig-Bromwasserstoff vom Eisen befreien und liefert reines Mesoporphyrin, das den Angaben von M. Nencki und J. Zaleski2) für das mit Jodwasserstoff und Jodphosphonium dargestellte Reduktionsprodukt entspricht. Die Eisen verbin düngen des Mesoporphyrins mit der Gruppe Cl-Fe = und = Fe(OH), von denen die erstere bereits von Zaleski3) durch Einwirkung einer Eisenlösung (eigentümlich ist es, daß Zaleski x) Nach unveröffentlichten Versuchen von R. Willstätter und L. Forsfen. z) Ber. d. d. chem. Ges. 34, 997 [1901]. 3) Zeitschr. f. physiol. Chem. 43, 11 [1904]. Abbau des Hämins. 409 ein Ferrosalz angewandt hat) auf Mesoporphyrin gewonnen wor- den ist, bezeichnen wir als Mesohämin und Mesohämatin. Durch dieselbe Behandlung mit methylalkoholischem Kali und Pyridin bei 200 0 geht aus dem Hämatoporphyrin eine dem Meso- porphyrin ähnliche Verbindung hervor, die Hämoporphyrin ge- nannt werden soll. Zahlreiche Analysen haben für sie die Formel ^33^3604^4 ergeben, während wir für das Mesoporphyrin anstatt der Formel C34H3804N4 von Zaleski1) dieselbe Formel oder die Zusammen- setzung c33h38o4n. annehmen, also vielleicht einen Mehrgehalt von zwei Atomen Wasserstoff gegenüber dem Hämoporphyrin. Die beiden zweibasischen Porphyrine aus Hämin zeigen bei großer Ähnlichkeit auch einige feinere Unterschiede, welche die folgende Tabelle verzeichnet. Mesoporphyrin Hämoporphyrin Salzsäurezahl 1V4 74 Verteilungszahl für o,5proz. Salzsäure 12 23.5 Verhalten gegen verd. löst sich zuerst und sehr leicht löslich; erst Salzsäure (5 — 20%) scheidet sich sofort in groben Flocken ab nach langem Stehen krystallisiert das Chlor- hydrat in Nadeln aus Verhalten gegen Alkohl krystallisiert aus der heißen Lösung sehr gut aus weniger vollständig aus- krystallisierend Mesohämin. Die Lösung von 3 g Hämin in 100 ccm Pyridin verrühren wir im Silbertiegel sorgfältig mit 50 ccm methylalkoholischer Kalilauge und erhitzen im Autoklaven vier Stunden auf 200 °. Die Reaktion ist beendigt, wenn eine Probe sich nach dem Erkalten in konzen- trierter Schwefelsäure mit klarer, roter Farbe löst und ein Por- phyrin liefert, dessen ätherische Lösung an 0,1 prozen tige Säure 1 ) Zeitschr. f. physiol. Chem. 37, 54 [1902]. 410 R- Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. nichts abgibt. Ist die Farbe in der Schwefelsäure noch grünstichig, so enthält die alkalische Masse noch eine Form des Hämins; bei zu weitgehender Einwirkung von Alkali wird die schwefelsaure Lö- sung mißfarbig braun. Die alkalische Masse ist erfüllt von glitzernden braunroten Krystallen des Mesohämatinkaliums, langen, gerade abgeschnitte- nen Prismen, die man durch Verdünnen mit etwas Methylalkohol und Waschen mit Äthylalkohol isolieren kann. In letzterem sind sie unlöslich, in Holzgeist leicht löslich. Ihre Zusammensetzung entspricht der Formel: (C3iH34N4) (FeOK) (COOK)2. Mesohämin wird durch Ansäuern mit verdünnter Salzsäure er- halten und durch mehrmaliges Umfällen des Rohproduktes aus siedendem Holzgeist mit Wasser gereinigt. Dann verwandeln wir die Verbindung in ihr Chlorid durch Auflösen in siedendem Eisessig (2 g in 50 ccm) und Versetzen mit etwas konzentrierter Salzsäure (2 ccm). Die ausgeschiedenen dunklen Körner (1 g) lassen sich wie Hämin umkrystallisieren ; ihre Lösung in Pyridin trugen wir in warmen, kochsalzhaltigen Eisessig ein. Das Mesohämin schied sich aus Eisessig in den bekannten Formen der Häminkry stalle ab, aus Pyridin-Eisessig in dünnen, in der Durchsicht gelbbraunen Tafeln. Es ist in den üblichen Lösungsmitteln beträchtlicher lös- lich als Hämin, namentlich in Aceton mäßig löslich, während Hä- min darin unlöslich ist. Seine Zusammensetzung ist C33H3604N4FeCl, d. i. C31H34N4 (FeCl) (COOH)a (mit einer Unsicherheit in der Zahl der H-atome). Durch konzentrierte Schwefelsäure oder besser durch Eisessig- Bromwasserstoff wird dem Mesohämin das Eisen entzogen unter Bildung des Mesoporphyrins, das wir beim Vergleiche überein- stimmend fanden mit einem nach Nenckis und Zaleskis Ver- fahren bereiteten Präparat. Hämo porphyrin. Beim Behandeln des Hämatoporphyrins mit methylalkoholi- scher Kalilauge verfuhren wir fast ebenso wie beim Hämin. Abbau des Hämins. 411 2 g Hämatoporphyrin wurden mit 100 ccm Pyridin und 50 ccm alkoholischem Kali im Autoklaven 4 — 5 Stunden auf 200 0 erhitzt. Die vollständige Umwandlung zeigt sich in der Veränderung der basischen Eigenschaften; die ätherische Lösung des Reaktions- produktes färbt o,i prozentige Salzsäure nicht mehr an. Der Silbertiegel des Autoklaven enthielt das Kaliumsalz am Boden krystallinisch ausgeschieden, das Pyridin ließ sich davon dekantieren. Beim Ansäuern entstand das freie Hämoporphyrin in fast quantitativer Ausbeute, aber rein wurde es erst durch Fraktionierung mit Salzsäure nach der Methode von Willstätter und Mi eg. Wir nahmen das Rohprodukt in konzentrierter Salz- säure auf und führten es unter Verdünnen und Neutralisieren in Äther über. Nach mehrmaligem Waschen der ätherischen Lösung extrahierten wir daraus mit 2 — 3 prozentiger Salzsäure das Hämo- porphyrin und beseitigten eine gelb gefärbte Beimischung aus der sauren Lösung durch wiederholtes Ausäthern. Dann ging aus der schön roten, fluorescierenden Chlorhydratlösung das reine Porphyrin beim Abstumpfen der Säure in Äther über. Es krystallisierte beim Einengen in haarfeinen rotbraunen Nadeln, aus einer getrockneten ätherischen Lösung in dicken, in der Durchsicht roten Tafeln, die oft rhombischen Umriß zeigten. Das Hämoporphyrin ist in den meisten Lösungsmitteln un- löslich, aus viel siedendem Äther läßt es sich aber umkrystalli- sieren. Im Eisessig löst es sich heiß leicht und kalt beträchtlich. Durch Zerlegung von 2 g Substanz mit verdünnter Salzsäure in mehrere Fraktionen und durch den Vergleich derselben mittels der Verteilungzahl wurde die Einheitlichkeit des Hämoporphyrins bewiesen. Es ist etwas stärker basisch als Mesoporphyrin, und sein Chlor- hydrat ist beträchtlich leichter löslich. 5. Ätioporphyrin C81H86N4 . Das Hämoporphyrin verhält sich beim Erhitzen mit Natronkalk ähnlich dem isomeren Rhodoporphyrin, die Abspaltung von Kohlensäure nimmt aber einen noch weniger glatten Verlauf, so daß viel sauerstoffhaltiges Nebenprodukt auf tritt. Es ist vor- 412 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. zuziehen, da die Phylline ihr Carboxyl leichter verlieren als die Porphyrine, die Magnesiumverbindung des Hämoporphyrins für die Decarboxylierung anzuwenden. Das Phyllin des Hämoporphyrins entsteht unmittelbar aus Hämatoporphyrin beim Erhitzen auf 190 ° in Mengen von 6 g mit Pyridin (160 ccm), methylalkoholischer Kahlauge (90 ccm) und Magnesiumoxyd (2 g) im Autoklaven. In ätherischer Lösung ist es fuchsienrot und fluoresciert stark, durch Säure wird es leicht in Hämoporphyrin mit der Salzsäurezahl s/4 übergeführt. Das Kaliumsalz dieses Phyllins erhitzten wir wie Rhodo- phyllinsalz in kleinen Portionen mit Natronkalk; aus der alkalischen Masse ging Ätiophyllin in Äther, unrein und daher braunrot. Es war wichtig, das Rohprodukt mit Petroläther zu reinigen. Versetzt man die sehr konzentrierte ätherische Lösung mit viel Petroläther, so fallen sofort und noch mehr beim Stehen Flocken von amorphem Nebenprodukt aus. Nach dieser Behandlung ist die Ätiophyllin- lösung prächtig violett und fluoresciert schön rot. Das daraus mit Säure und zwar aus petrolätherischer Phyllinlösung schon mit sehr verdünnter Säure gebildete Ätioporphyrin ist über sein Styphnat gereinigt worden ; die Ausbeute betrug dann 0,3 g aus 10 g Hämo- porphyrin. Das Ätioporphyrin aus Hämin ist in Alkohol und Äther schwer, in Eisessig leicht löslich mit prächtig blauroter Farbe, während es in Äther bronzerot ist. Die ätherische Lösung gibt an 3 prozentige Salzsäure etwa zwei Drittel der Substanz ab, die Verteilungszahl für diese Salzsäure ist 43. Mit Alkali reagiert die Substanz nicht. Beim Erhitzen sintert sie und schmilzt allmählich bei 265 etwas tiefer als das Präparat aus Phylloporphyrin ; der Schmelz- punkt des Styphnates liegt bei 170 °. In seinen Merkmalen, wie im Absorptionsspektrum, stimmt das Ätioporphyrin dieser Darstellung mit dem im XXIII. Kapitel beschriebenen genau überein. Dennoch war die Substanz aus Hämoporphyrin wahrscheinlich etwas weniger rein, die Analyse ergab nämlich etwas zu tiefe Werte für Kohlen- stoff (79,4 — 79,6 anstatt 80,1 % C). In das Ätioporphyrin läßt sich Eisen einführen, wenn man es in Eisessig mit Eisenchlorid und etwas Natriumacetat erwärmt; ohne Abbau des Hämins. 413 den Zusatz von Natriumacetat erfolgt die Substitution nicht. Die Ferriverbindung, braunrot in Ätherlösung, ist zum Unterschied von Ätioporphyrin noch gegen 2oprozentige Salzsäure indifferent, stärkere Salzsäure nimmt ohne Abspaltung des Eisens die kom- plexe Verbindung auf. Mit Alkali reagiert ihre ätherische Lösung sofort, sie wird braun und nimmt intensives gelbes Tingieren an. Dabei erfolgt die Umwandlung des Chlorides in die Base nach der Gleichung: C81H34N4FeCl + NaOH = C81H34N4FeOH + NaCl. Dieselbe Reaktion ist mit Mesohäminester und Häminester ausführbar und liefert krystallisierbare Hämatinester. XXV. Graphische Darstellung der Absorptionsspektra !). Für die Messung der Absorptionsspektren und ihre Darstellung in den Tafeln VI und VII haben wir uns eines von CarlZeißin Jena gelieferten Gitterspektroskops nach F. Löwe* 2) mit Wellenlängen- schraube bedient, welches ein Gitter von nur geringer Dispersion, nämlich 3610 Linien auf den Zoll, enthält. Wir arbeiteten bei einer Spaltbreite von 0,1 mm mit einer Gasinvertlampe als Licht- quelle. Zu der zeichnerischen Darstellung sind vier verschiedene Ab- stufungen verwendet worden: schwarz für — , die schräge Schraf- fierung für zwei Grade der Absorption, nämlich und . . . , die punktierte Schattierung für die Grade . . und . , die gestrichelte Schattierung für die schwächsten Schatten ( | ). Die photographischen Aufnahmen (Tafel VIII — XI) haben wir mit einem von Carl Zeiß konstruierten Spektographen mit einem Ives-Gitter von großer Dispersion, nämlich mit 20000 Strichen pro inch ausgeführt. Die Ausdehnung des Spektrums zwischen den Wellenlängen 400 — 700 /uju beträgt in dem Apparat mit Objektiven von 21 mm Durchmesser und 420 mm Brennweite auf der Platte 110 mm, die Höhe 10 mm, so daß auf der Platte (9 X 12 cm) acht Spektren untereinander aufgenommen werden können. Wir haben die wertvollen Erfahrungen benutzt, die E. Rost, F. Franz und R. Heise3) hinsichtlich der Photographie des Blut- q Vgl. Abh. XVII. 2) Verhandl. d. Deutsch. Physikal. Ges. X, 671 [1908]. 3) Arbeiten aus dem Kaiserl. Gesundheitsamte 32, 223 [1909]. Graphische Darstellung der Absorptionsspektra. 415 Spektrums mitgeteilt haben und uns im Wesentlichen der Ver- suchsanordnung dieser Autoren bedient. Rost, Franz und Heise erzeugen mit einem Gitter von 15000 Linien ein Spek- trum von 46 mm Längenausdehnung ; ihre Lichtquelle ist eine Auerlampe. Statt dieser mußten wir eine Nernstlampe verwenden. Auf einer optischen Bank war dieselbe (Modell für Projektionszwecke, 80HK, 220 Volt, 0,5 Amp.), ferner eine Kondensorlinse (mit ca. 8 cm Brennweite und 6 cm Öffnung) und die Blende mit dem Ab- sorptionstrog verschiebbar befestigt. Das Bild der stabförmigen Lichtquelle wurde bei 11 cm Abstand der Lampe von der Linse und bei einer Entfernung von 15 cm von der Linse zum Spalt scharf auf die Ebene des Spaltes geworfen. Für alle Aufnahmen betrug die Spaltbreite 0,1 mm. Für die Ortsbestimmung wurde als erstes und letztes Spektrum auf jeder Platte das Funkenspektrum des Heliums aufgenommen. Die auf den Tafeln aufgedruckte Wellenlängenskala mit den Fraunhof ersehen Linien und mit vier Heliumlinien haben wir in drei Abschnitten konstruiert, indem wir die Strecken zwischen den Heliumlinien: 667,8— 587,6— 501,6— 447,2 ausgemessen und jede einzeln proportional geteilt haben. Die ganze Skala ist nämlich nicht genau gleicht eilig, weil den Wellenlängen- differenzen zwar gleiche Ablenkungswinkel, aber nicht gleiche Ab- stände in der Plattenebene entsprechen. Wir haben die Prozeß-Panchromaticplatten von Wratten und Wainwright in Croydon benutzt. Während die im Kaiserlichen Gesundheitsamt photographierten relativ einfachen Spektra der Derivate des Blutfarbstoffs keine Absorption im Rot, sondern nur Bänder beginnend bei X = 645 juju aufweisen, handelt es sich bei vielen Chlorophyllderivaten um eine Hauptabsorption im Rot, die bei X = 690^ beginnt. Da hier die Empfindlichkeit der Platten im Rot nicht ausreicht, schlugen wir ein neues Verfahren ein, um die Begrenzung der ersten Bänder herauszubringen. Wir ließen das ganze Spektrum 50 Sekunden lang auf die Platte einwirken, dann schalteten wir eine 10 mm dicke Schicht einer 416 R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll. 0,05 prozen tigen wäßrigen Lösung von Croceinscharlach als Rotfilter ein und exponierten weiter. Das Filter absorbiert vollständig bis ungefähr A = 590 [xfi. Diese Methode hat sich bewährt, um das Bild in der roten Region zu vervollständigen, wenn auch die Objektivi- tät in der Darstellung dadurch vermindert wird. Bei den in der XVII. Abhandlung reproduzierten Aufnahmen ist die Nachbelichtung noch nicht mit genügender Anpassung an die variablen Verhältnisse der einzelnen Aufnahmen gehandhabt worden. Bei allen Farbstoffen und bei jeder Schichtdicke wurde damals gleich lang nachexponiert. Die Bänder sind daher nament- lich bei den b-Derivaten im Rot bei dünnen Schichten infolge der Uberexposition sehr geschwächt auf der Platte, während sie im Spektroskop noch als dunkle Streifen wahrzunehmen sind. Neuerdings haben wir diesen Fehler vermieden durch kürzere Nachexposition bei den dünnen Schichten, so daß jetzt die spektro- graphische Darstellung mit dem im Spektroskop beobachteten Bild in allen wesentlichen Punkten übereinstimmt. Der Unterschied in der Intensität der Hauptabsorption im Rot zwischen den ent- sprechenden Gliedern der a- und der b-Reihe gibt nun annähernd die natürlichen Verhältnisse wieder; b absorbiert im Rot weniger stark als a, im Violett a weniger intensiv als b. In den angehefteten Tafeln VIII — XI sind unsere neuen spektro- graphischen Aufnahmen reproduziert worden. In allen Fällen haben wir Lösungen von 0,043 g Chlorophyll in 1 1 Äther oder äquimolekulare Lösungen der Derivate (0,042 g Phäophytin und 0,030 g Chlorin e oder Rhodin g) angewandt und zwar in Schichtdicken von 2xh, 5, 10, 20 und 40 mm. Die Exposition ohne Rotfilter dauerte 50 Sekunden ; dann wurde bei der 2x/a mm-Schicht der a-Chlorophyllreihe noch 6 Minuten nachexponiert, bei 5 mm-Schichtdicke noch 7, bei 10 mm 8, bei 20 mm 9 und bei 40 mm noch 10 Minuten. Die Hauptabsorption im Rot der b-Derivate liegt gegenüber a etwas mehr gegen Violett hin, also in einer auf die Platte kräftiger wirkenden Spektral- region; sie fordern daher nur eine kürzere Nachexposition, nämlich die Schicht von 2V2 mm 3 Minuten, die von 5 mm 4, 10 mm 6, 20 mm 8 und 40 mm 10 Minuten. Graphische Darstellung der Absorptionsspektra. 417 Die Spektren der gelben Pigmente wurden in Schichten von 10 mm Dicke mit Lösungen von 0,005 g Substanz in 1 1 Alkohol bzw. Schwefelkohlenstoff bei einer Belichtungszeit von 75 Sekunden aufgenommen. Die Platten haben wir mit Metol-Hydrochinon* 1) bei völliger Dunkelheit in 3 Minuten entwickelt und in saurem Bad fixiert. Der Vergleich zwischen Photographie und Zeichnung überzeugt uns davon, daß die photographische Aufnahme und Darstellung der Spektra nicht, wie zumeist angenommen wird, eine Methode von größerer Objektivität ist als die Beobachtung mit dem Auge und zeichnerische Wiedergabe der Messungen. Wir stimmen daher nicht ganz überein mit der Ansicht von Rost, Franz und Heise, die als einen unleugbaren Vorteil der Photographie ,,die völlig objektive Fixierung der Bilder“ hervorheben. Der photographi- schen Methode ist auch viel Subjektivität eigen, die durch die Plattenempfindlichkeit, durch die Belichtung, die Arbeitsweise und die Reproduktion bedingt wird. Wenn unsere Photogramme auch alle beobachteten Absorptionsstreifen nach ihrer Lage richtig wiedergeben, so erhalten die Begrenzungen und Intensitätsverhält- nisse doch einen etwas weniger genauen Ausdruck als bei der un- mittelbaren Beobachtung mit dem Auge, dessen Empfindlichkeit die der photographischen Platte übertrifft. x) Lösung I: 500 ccm dest. Wasser, 50 g kryst. Na2S03, 5 g Hydrochinon, 1 g Metol ; Lösung II: 500 ccm dest. Wasser, 50 g K2COg. Zum Gebrauch: 30 ccm I, 30 ccm II und 60 ccm Wasser; Temperatur 18 — 20°. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. 27 Verzeichnis der abgekürzt zitierten Untersuchungen über Chlorophyll. Abh. I. Willstätter und Walter Mieg, Über eine Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. Ann. d. Chem. 350, 1 [1906]. Abh. II. Willstätter, Zur Kenntnis der Zusammensetzung des Chlorophylls. Ann. d. Chem. 350, 48 [1906]. Abh. III. Willstätter und Ferd. Hocheder, Über die Einwirkung von Säuren und Alkalien auf Chlorophyll. Ann. d. Chem. 354, 205 [1907]. Abh. IV. Willstätter und Walter Mieg, Über die gelben Begleiter des Chlorophylls. Ann. d. Chem. 355, 1 [1907]. Abh. V. Willstätter und Adolf Pfannenstiel, Über Rhodo- phyllin. Ann. d. Chem. 358, 205 [1907]. Abh. VI. Willstätter und Max Benz, Über krystallisiertes Chloro- phyll. Ann. d. Chem. 358, 267 [1907]. Abh. VII. Willstätter, Ferd. Hocheder und Ernst Hug, Verglei- chende Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflanzen. Ann. d. Chem. 371, 1 [1909]. Abh.VIII. Willstätter und Hermann Fritzsche, Über den Abbau von Chlorophyll durch Alkalien. Ann. d. Chem. 371, 33 [1909]. Abh. IX. Willstätter und Yasuhiko Asahina, Oxydation der Chlorophyllderivate. Ann. d. Chem. 373, 227 [1910]. Abh. X. Willstätter und Alfred Oppe, Vergleichende Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflanzen II. Ann. d. Chem. 378, 1 [1910]. Abh. XI. Willstätter und Arthur Stoll, Über Chlorophyllase. Ann. d. Chem. 378, 18 [1910]. Abh. XII. Willstätter, Erwin W. Mayer und Ernst Hüni, Über Phytol I. Ann. d. Chem. 378, 73 [1910]. Abh.XIII. Willstätter und Arthur Stoll, Spaltung und Bildung von Chlorophyll. Ann. d. Chem. 380, 148 [1911]. Abh.XIV. Willstätter und Max Isler, Vergleichende Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflanzen III. Ann. d. Chem. 380, 154 [1911]. Abh. XV. Willstätter und Ernst Hug, Isolierung des Chlorophylls. Ann. d. Chem. 380, 177 [1911]. Verzeichnis der abgekürzt zitierten Untersuchungen über Chlorophyll, 419 Abh. XVI. Willstätter und Max Utzinger, Uber die ersten Umwand lungen des Chlorophylls. Ann. d. Chem. 382, 129 [1911]. Abh. XVII. Willstätter, Arthur Stoll und Max Utzinger, Ab- sorptionsspektra der Komponenten und ersten Derivate des Chlorophylls. Ann. d. Chem. 385, 156 [1911]. Abh. XVIII. Willstätter und Yasuhiko Asahina, Über die Reduktion des Chlorophylls I. Ann. d. Chem. 385, 188 [1911]. Abh. XIX. Willstätter und Arthur Stoll, Über die Chlorophyllide. Ann. d. Chem. 387, 317 [1911]. Abh. XX. Willstätter und Max Isler, Über die zwei Komponenten des Chlorophylls. Ann. d. Chem. 390, 269 [1912]. Abh. XXI. Willstätter und Lennart Forsen, Einführung des Magne- siums in die Derivate des Chlorophylls. Ahn. d. Chem. 396, 180 [1913]- Abh. XXII. Willstätter, Max Fischer und Lennart Forsen, Über den Abbau der beiden Chlorophyllkomponenten durch Alkalien. Ann. d. Chem., im Druck [1913]. 27* Sachregister. Abbau des Chlorophylls durch Alka- lien 26, 30, 334. — magnesiumfreier Chlorophyllderi- vate 353. — von Chlorophyll, tabellarische Übersicht 32. — von Hämin 399. Abgebrühte Blätter 61, 120, 140, 173. Absolute Chlorophyllbestimmung 80. Absorptionsspektra Ätiophyllin und -porphyrin 397. Chlorin und Rhodin 300. Chlorophyll a und b 169. Gelbe Pigmente 245, 250. Phäophytin a und b 287. Phylline und Porphyrine 363, 397. Tafeln I und VI bis XI. Abspaltung des Eisens aus Hämin 402, 406. Abtrennung hydrierter Pyrrolbasen 383- Äthylchlorophyllid, Beschreibung 219. — Gewinnung 195. Äthylalkohol, Bestimmung 225. Ätiophyllin, Beschreibung 395. — Bildung 392. — Konstitution 39. Ätioporphyrin, Beschreibung 396, 412. — Bildung 394, 41 1. — Konstitution 39. Alkoholyse 13, 173. — Bestimmung 181. Allomerisation 29, 147, 314, 319. Altern der Blätter 179. Ammonakmethode 363. Analyse der Chloroplastenfarbstoffe 78. — hochmolekularer Verbindungen 220. Apparate : Autoklaveneinsatz aus Silber 340, 342- Centrifuge von Leune 400. Entenkolben 311. Gitterspektrograph 414. Gitterspektroskop nach Löwe 414. Helmkolben 310. Perkolatoren 66. Reagensglastropftrichter 49. Reagierrohr aus Silber 324, 349. Silberbecher 293, 297, 315. Silberflasche 315. Spatel aus Edelmetall 323. Steinzeugexsikkatoren 258. Steinzeugnutschen 75. Syenitwalzenmühle 76. Taschengitterspektroskop 49. Trocknungskolben 224. Vakuumdestillationskolben 310, 3ii- Basizität derChlorophyllderivate 269. Häminderivate 270. Basizitätsprobe 145, 176, 260. Bestimmung des Chlorophylls 78. — von Chlorophyllpräparaten 96. — von Chlorophyllderivaten 262. Bildung von Chlorophyll 188. Blattfarbstoff, Beschreibung in ein- fachen Versuchen 46. Sachregister. 421 Blattfarbstoffbestimmung 99. Blattschnitte 120, 174. Blattspektrum 60. Blutcentrifuge 400. Braunalgenfarbstoff, Bestimmung 117. Braune Phase 27, 144. Brennesselmehl, käufliches 57. Carboxylfreie Stammsubstanzen 391. Carotin, Beschreibung 242. — Isolierung 237. — aus Carotten 240. Corpus luteum 241. Carotinoide 103, 116, 124, 144, 157. — Funktion 236. — Vorkommen 231. Centrif ugieren von Blut 400. Chlorin e, Beschreibung 297. — Darstellung 290, 296. Chlorin f 303. Chlorin g 305. Chlorophyll, Abbau 25, 30, 32. — Beschreibung 143. — Dritte Komponente 12 1. — Eisengehalt i, 2. — Funktion 24. — Gewinnung 126, 132, 135, 138. — Grignardsche Verbindung 23. — Kaliumgehalt 3. — Konstitutionsfragen 25. — Lecithinhypothese 2, 3. — Magnesiumgehalt 8. — Merkmale 17, 143. — Phosphorgehalt 3. — Phytolgehalt ix. — Reinheitsproben 144. — Spektrum 169. Chlorophyll aus Braunalgen 117, 141. frischen Blättern 138. Chlorophyllan 3, 254. Chlorophyllase 172. — präparative Verwendung 178, 194. — Verbreitung 177. Chlorophyllasearme Pflanzen 178. Chlorophyllasereiche Pflanzen 177. Chlorophyllasewirkung 48, 172. Chlorophyllbestimmung 78. Chlorophyllgehalt der Blätter 112. Chlorophyllide, Beschreibung 2x9, 229. — Gewinnung 194, 206. Chlorophyllide, Trennung 210, 216. Chlorophyllin 313. Chlorophyllincalcium 318. Chlorophyllinkalium 319. Chlorophyllinkalium a 321. Chlorophyllkomponenten, Beschrei- bung 166. — Isolierung 153, 161. — Spektrum 169. Chlorophyllpräparate, Bestimmung 96. Chloroplasten 58, 175. Chlorophyllsynthese 188, 325. Chromatographische Adsorptions- analyse 16, 156, 234. Chrysophyll 232. Cyanophyllin, Beschreibung 354. — Bildung 327. — Gewinnung 348. Cyanoporphyrin 359. Dichromatinsäure 4. Dihydrophytol 312. Doppelextrakte 65. Dynamik der Enzymwirkung 183. Einführung von Magnesium 11, 323. Enteisenung 402, 406. Entmischung nach Stokes und Kraus 129, 147, 154, 210. Enzyme 99, 141, 172. Enzymmenge 179. Enzymwirkung, Dynamik 183. Erythrophyll 232. Erythrophyllin, Beschreibung 356. — Gewinnung 348. Erythroporphyrin 352, 359. Esterase 172. Etiolin 232. Extraktionskoeffizient 259. Extraktionsmethoden 58, 64, 99. — neue 70, 74. Extraktion frischer Blätter 76, 99, 138. Fällungskoeffizient 256. Fehlerquellen bei der Komponenten- bestimmung 87. Fichtenspahnreaktion 379. Flaschenextrakte 65. Fraktionierung der Spaltungspro- dukte 102, 145, 264, 293. — mit Salzsäure 262. 422 Sachregister. Fraktionierte Salzbildung mit Pikrin- säure 377, 382. Freie Clilorophyllide 206, 229. Freie Phaeophorbide 285. Frische Blätter, Verarbeitung 76, 99, 138. Fukoxanthin, Beschreibung 236,247. — Bestimmung 123. — Geschichte 117. — Isolierung 247. Galeopsis tetrahit 177. Gelbe Pigmente 103, 123. Prüfung auf 144, 260. Trennung 103, 237. Gelbe Phase 168, 283. Geschichte der Chlorophyllforschung I» 153, 252. Geschwindigkeit der Chlorophyllase- reaktion 183. Glaukophyllin, Beschreibung 354. — Gewinnung 345. — Umkrystallisation 347. Glaukoporphyrin 358. Graphische Darstellung der Spektra 414. Grignardsche Lösungen, Einwirkung auf Chlorophyllderivate 328, 331. Hämatinsäure 370. Hämatoporphyrin 402, 406. — Molekulargewicht 44. Hämatoporphyrindimethylätherdi- methylester 404. Hämidoporphyrin 270. Hämin, Formel 35. — Gewinnung 399. — Konstitution 42. Häminoporphyrin 270. Hämoporphyrin 34, 43, 408, 4x0. — Konstitution 43. Hämopyrrole 376. Hämopyrrol a und e 381. — Beschreibung 389. — Fraktionierung 386. Heiße Verseifung 29, 296, 314. Heracleum 177. Hochmolekulare Verbindungen, Ana- lyse 221. Hydrolyse des Chlorophylls 173. Bestimmung 179. Jodalphyle, Bestimmung 226. Jodsilberzahl 182. Isochlorophyllin 313, 315. — a 315. Isohämopyrrol 381. — Beschreibung 390. — Isolierung 385. Kalte Verseifung 28, 317. Kolloidale Chlorophyllösung 60, 167. Spektrum 171. Komplexe Bindung des Magnesiums 9, 24. Komplexe Kaliumverbindungen 301. Komponentenbestimmung, Fehler- quellen 87. Komponentenverhältnis 84, 109. Komponenten von Chlorophyll 15, 121, 153, 166. Konstitutionsfragen 25. Kraussche Entmischung 147, 154, 210. Kryptopyrrol 381. Krystallisiertes Chlorophyll , Be- schreibung 219. Gewinnung 195. nach Borodin 6, 176. Kupferchlorophyllverbindungen 323. Lactamtheorie der braunen Phase 27, 335- Lactamtheorie des Hämins 40. Lagern der Blätter im Eisschrank 62. Lipochrome des Tierreichs 235. Lutein 242, 247. Lycopin 241, 246. Magnesiat 325. Magnesiumgehalt des Chlorophylls 143- Prüfung auf 145. Magnesiumkomplexbildung 9,11,323. Merkmale des Chlorophylls 17, 49, 143. Mesohämatin 409. Mesohämin 408. Mesoporphyrin 43, 408. Methanolyse 173. Methyläthylmaleinimid 35, 370. Methylchlorophyllid, Gewinnung 201, 203. — Hydrolyse 209. Sachregister. 423 Methylchlorophyllid, Trennung 21 1. — a, Beschreibung 227. — b, Beschreibung 228. Methylakohol, Bestimmung 225. Methylphäophorbid a 284. — b 285. Methylphäophorbide, Trennung 278. Mikroskopische Blattschnitte 120, 174. Molekulargewichtsbestimmungen 44, 169, 233. Normale Spaltungsprodukte 143, 265. Nutschenverfahren 68, 74. Oxydation der Chlorophyllderivate 369- — von PhyUoporphyrin 371. Hämin 374. Oxyhämoglobinlösung 401. Perkolate 66. Pentabromid des Hämatoporphyrins 404. Pflanzenarten 57, 152. Pflanzenmaterial 53. Phäophorbid a, Beschreibung 285. — b, Beschreibung 286. Phäophorbide, Bildung 281. — Trennung 281. Phäophyceenfarbstoffe, Bestimmung 117. — Darstellung 141. Phäophytin 251. — Beschreibung 259. — Definition 251. — Gewinnung 254. — Trennung 274. — a 283. — b 284. Phase, braune 27, 144. — gelbe 168. — rote 168. Phasenprobe 144, 212, 260. Phasenspektrum 168. Phasentheorie 27. Phylline, Tabellen 337, 338, 362. Phyllophyllin, Beschreibung 357. — Bezeichnung 334. — Gewinnung 342. — aus Phäophytin 344. Phyllophyllincäsium 357. Phyllophyllincalcium 358. Phyllophyllinmethylester 330. Phylloporphyrin, Beschreibung 360. — Geschichte, 4, 336. — Gewinnung 351. Phyllopyrrol 378. — Beschreibung 389. — Isolierung 387. — Synthese 382. Phytansäure 312. Phytochlorin a bis d 262. — e, Beschreibung 297. — e, Bildung aus Chlorophylliden 296. — e, Darstellung 290. — f 3°3- — g 3°5- Phytorhodin a bis f 262. — g, Beschreibung 299. — g, Bildung aus Chlorophylliden 296. — g, Darstellung 290. — i und k 306. Phytol, Beschreibung 31 1. — Bestimmung 309. — Gewinnung 291, 308. — Konstitution n. — Vorkommen 15 1. Phytolgehalt des Chlorophylls 12, 143. I5I- Prüfung auf 145. Phytolzahl 15 1, 181, 309. Phytylphäophorbid a 283. — b 284. Porphyrine, Tabellen 335, 362. Pyrrole aus Chlorophyll 389. Pyrrolhomologe 377. Pyrrophyllin, Beschreibung 356. — Gewinnung 340. — U mkrystallisation 342. Pyrrophyllincalcium 357. Pyrroporphyrin, Beschreibung 360. — Gewinnung 352. Reduktion der b-Komponente 331. Chlorophyllderivate 376. Reinchlorophyll, Gewinnung 132, 138. Reinheitsgrad der Chlorophyllpräpa- rate 82, 96. Chlorophyllösungen 64, 83. Relative Chlorophyllbestimmung 79. 424 Sachregister. Rhodin g, Beschreibung 29g. — g, Darstellung 290, 296. — i und k 306. Rhodophyllin 355. — Gewinnung 347. Rhodophyllinkalium 355. Rhodoporphyrin 351, 359. Rohchlorophyll 135. — aus Braunalgen 141. Rote Phase 168, 284. Rubiphyllin, Beschreibung 356. — Gewinnung 350. Rubiporphyrin 360. Salzsäurezahl 14, 268. Säurespaltung, ältere Methoden 252. Spaltungsprobe 145, 260. Spektrophotogramme, Tafel VIII bis XI. Stammsubstanzen, carboxylfreie 39i, 411- Styphnate 390, 397, 412. Synthese, partielle, von Chlorophyll 188, 323. Trennung der Chlorophyllkomponen- ten 15, 101, 153, 161. gelben Pigmente 103. von Chlorophyllderivaten 14, 262. Trockengehalt 108. Trockengewicht der Blätter 54. Trocknung der Blätter 54. Trocknung im Hochvakuum 221. Umesterung von Chlorophyll 13, 173. Phäophytin 279. Umlactamisieren 27. 335. Umscheiden 90, 261. Umwandlungszahl 182. Verarbeitung frischer Blätter 55, 75. Verbreitung der Chlorophyllase 177. Vergleichende Untersuchung des Chlorophylls verschiedener Pflan- zen 149. Vergleichslösungen 97, 104. Verhalten des Chlorophylls gegen Lö- sungsmittel 147. Verhältnis a : b 84, 109. — Carotin: Xanthophyll 109. — Grün : Gelb 109. Verschiedenheit der Chlorophylle 6, I5°- Verseifung von Chlorophyll 296, 314. Phäophytin 290. Verteilungszahl 271. Vorbehandlung frischer Blätter 56, 62, 203. Vorextraktion 59, 128. Wasserhaltige Lösungsmittel 63, 70, 74- Wasserzusatz bei der Enzymwirkung 185. Xanthophyll «, ß 234. — Beschreibung 243. — Isolierung 237. Zeichnerische Darstellung der Spek- tren, Tafeln VI und VII, 4x4. Zinkchlorophyll Verbindungen 323. Zinkgehalt der Gläser 324. Zustand des Chlorophylls in den Blät- tern 58, 60. Willstätter - Stoll, Chlorophyll. Tafel I Chlorophyll a Fig. 3. Spektrum der beiden Chlorophyll- koinponenten. Chlorophyll b Carotin Fig. 1. Spektrum der gelben Pigmente. Xanthophyll Verlag von Julius Springer in Berlin. *#v*e Willstätter-Stoll, Chlorophyll. Tafel II. Fig. I. Krystallisiertes Chlorophyll (Äthylchlorophyllid). A 4 * ▲ Fig. 2. Äthylchlorophyllid aus Methylal. Fig. 3. Methylchlorophyllid a. Fig. 4. Methylchlorophyllid b. Verlag von Julius Springer in Berlin. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. Tafel III. Fig. i. Carotin aus Schwefelkohlenstoff- Fig. 2. Carotin aus Petroläther. Alkohol. Fig. 4. Xanthophyll aus Methylalkohol. Fig. 3. Xanthophyll aus Äthylalkohol. Fig. 5. Fucoxanthin aus Methylalkohol. Fig. 6. Fucoxanthin aus verd. Alkohol. Verlag von Julius Springer in Berlin. > * Willstätter-Stoll, Chlorophyll. Tafel IV. Fig. 3. Phytochlorin e. Fig. 4. Phytorhodin g. Fig. 5. Phytochlorin f. Verlag von Julius Springer in Berlin. ' Willstätter-Stoll, Chlorophyll. Tafel V. Fig- 3. Pyrrophyllin. Fig. 4. Phyllophyllincäsium. Fig. 5. Pyrroporphyrin. Fig. 6. Phylloporphyrin. Vertag von Julius Springer in Berlin. Willstätter-Stoll, Chlorophyll Tafel VI 2,5 mm 5 mm 0,5 mm 10mm 20 mm 40 mm 60 mm 80 mm 120 mm 160 mm 2,5 mm 0,5 mm 400 5 mm 10 mm 20 mm 40 mm 60 mm 80 mm 120 mm 100 mm E,b, F 1 500 700 B C D, Die MethylöMorophyllide : a 400 E,bi F G h (oben) und b (unten). Verlag von Julius Springer in Berlin. ■r mi • , fc Willstätter-Stoll, Chlorophyll. D, Tafel VII. E,bj V ! 500 | G h 400 G h400 ; oa 6öj 64 62 1 ! 68 1 50 1 54 Tlj ' 52! 1 ‘ ! 48 40 44 ' 42 ; ! 600 | i i 500 ! 1 1 B C D, E. b, F Die Mcthylphäophorbide: a (oben) und b (unten). Verlag von Julius Springer in Berlin. 400 G Willstätter-Stoll, Chlorophyll Tafel VIII Chlorophyll a Chlorophyll b Verlag von Julius Springer in Berlin. Willstätter-Stoll, Chlorophyll. Tafel IX Phaeophytin a Phaeophytin b Verlag von Julius Springer in Berlin. I MllstäUer^töTT, Chlorophyll. Tafel X. Phytochlorin e Phytorhodin g Verlag von Julius Springer in Berlin. 000 Willstätter-Stoil, Chlorophyll Tafel XI. 1. Carotin in Alkohol. 2. Xanthophyll in Alkohol. 3. Carotin in Schwefelkohlenstoff. 4. Xanthophyll in Schwefelkohlenstoff. Verlag von Julius Springer in Berlin. li’y