GE ao MEN UNIVERSITÉ DE GENEVE — INSTITUT DE BOTANIQUE Prof. Dr R. CHODAT. — 7me Série. — Ne Fascicule. CONERIEBUMEFONN A LÉTUDE DE LA PEROVYDANE PAR E. DE STŒCKLIN GENÈVE IMPRIMERIE ROMET, 26, BOULEVARD GEORGES FA VON 1907 / à \44148 RTS Her + Es AE GNIVERSITE DE GENÈVE — INSTITUT DE BOTANIQUE Prof. Dr R. CHODAT. — ‘7me Série. — ViIlme Fascicule. CON FRIBUTION D'ÉTUDE DE LA PERONYDASE GENÈVE IMPRIMERIE ROMET, 26, BOULEVARD GEORGES FAVON 1907 er 2:41 a Je désire témoigner à cette place toute ma reconnais- sance aux personnes qui m'ont soutenu et aidé au cours de mes études. Je remercie tout d’abord mes chers maîtres, MM. les professeurs R. Cxopar et L. Duparc, du précieux appui que j'ai trouvé chez eux jusqu’à ce jour. Dans les mêmes sentiments, je tiens à assurer Mademoiselle Marie Bovacne et ma tante, Mademoiselle Georgine CLaraz, de ma par- faite gratitude. Fribourg, juin 1907. CONTRIBUTION L'ÉTUDE DE LA PEROXYDASE PAR EN DE.STŒERETN Le nom de Peroxydase à été pour la première fois pro- posé par Linossier ? pour une action de ferment déjà connue de Schœnbein et même avant lui. Linossier définit les peroxydases comme étant des « corps dont la fonction est de décomposer l’H2 O2 ou d’autres peroxydes ana- logues et de provoquer ainsi des oxydations, » tandis que les oxydases seraient des « corps capables de fixer sur un corps oxydable l’oxygène de l’air >. Ces définitions sont déjà toutes dans les travaux de Schœnbein. Comme ce dernier, Linossier confond encore les deux actions, celle d'activer l'oxygène des peroxydes et celle de les décom- poser en mettant l’oxygène moléculaire en liberté. C’était d’ailleurs une idée généralement répandue que tous les 1 Cette étude à été faite sous la direction de M. le professeur R. Chodat dans le Laboratoire de Chimie végétale de l’Institut botanique de l’Uni- versité de Genève. ? Linossier, Compt. rend. Soc. biolog., V, 373 (1898). Re Et ferments possèdent cette propriété de décomposer l’eau oxygenée en mettant en liberté l’oxygène inerte. Ce n’est que depuis que Lœw eut démontré que le pouvoir de décomposer l’eau oxygénée appartient à un ferment spécial, la catalase, que les enzymologues ont définitive- ment renoncé à ces propriétés générales des ferments. Mais déjà avant lui Jacobson avait remarqué que la dias- tase (amylase - dextrinase) peut perdre son pouvoir de décomposer l’eau oxygenée tout en conservant celui de saccharifier l’amidon. Mais ce n’est qu’à partir du moment où Bach et Cho- dat ? apprirent à préparer une peroxydase purifiée et à en étudier les propriétés qu’on peut considérer ce ferment comme définitivement connu car Lœw, même, admet encore * que les peroxydases possèdent par elles-mêmes une action oxydante. Bourquelot, également, confondait au début catalase et peroxydase (voir Soc. biol. 1898, 392). Avant ces auteurs Aso * et Woods * ont fourni d’ex- cellentes contributions à l’étude de la peroxydase. Ce der- nier à essayéde montrer la relation qui unit la peroxydase LE et la maladie connue sous le nom de mosaïque du tabac. LES Chodat à aussi montré que dans les plantes panachées les “4 régions dépourvues de chlorophylle sont plus riches en "4 peroxydase. 14 Hunger a étudié la peroxydase de la noix de Coco ; il reconnaît que plusieurs peroxydes (alcool vieilli p. ex.) peuvent servir à ces oxydations. ! Ueber Peroxydase, Ber. d. d. chem. Ges., XXX VI, 601-605 (1903). 3 Lœw, Berichte. d. d. chem. Ges. XXV, 2487 (1902). Jacobson, Untersuchungen über lüstiche Fermente, Zeitschr. f. phys. Chem. XVI., 340. 1892. 3 Aso, Bull. Coll. Agric. Tokio, V., 2. 231: # Woods, U. S. Dep. of Agricult. Rep. no 8, 17. re MS Aïnsi la propriété des peroxydases serait d'agir sur les peroxydes pour effectuer par leur intermédiaire des oxyda- tions dont ces derniers sont incapables à eux seuls (fer- ments oxydants indirects). Les oxydases sont au contraire des ferments qui, en activant l'oxygène de l'air, effectuent directement les oxydations (ferments oxydants directs). Chodat et Bach ! ont alors développé une théorie géné- | rale des oxydases : Selon ces auteurs les oxydases seraient des systèmes (mélanges ou combinaisons) de peroxydase et de peroxydes. Le type d’un de ces systèmes serait l’as- sociation active de la peroxydase et de l’eau oxygénée. Lorsque comme dans les oxydases l'oxydation ne nécessite pas l’addition de l’eau oxygénée ou d’un autre peroxyde cela proviendrait selon ces auteurs que le peroxyde est déjà dans l’oxydase. Or comme ce peroxyde est ici de la nature d’un ferment ils l’ont nommé oxygénase c’est-à dire ferment qui active l’oxygène. Se basant sur la théorie des oxydations lentes déjà élucidée par le génial Schœnbein et sur les travaux subséquents de Bach, Engler et ses colla- borateurs ils admettent tout d’abord que les ferments oxydants sont des peroxydes ; en ceci ils suivent Schœn- bein, Engler et Bach. Mais la théorie Chodat et Bach est autre : elle consiste à admettre dans les ferments oxydants deux composants : le peroxyde (parfois peroxyde ferment) et l’activateur de ce peroxyde, la peroxydase. C’est par ce caractère du système double que la théo- rie Chodat et Bach se distingue de celle des peroxydes (Schœnbein, Engler, Bach, Chodat et Bach dans leurs 1 Chodat et Bach, Bull. Herbier Boissier 1903, p. 76. 2 Tue premiers travaux). Il n’y a donc pas lieu de confondre comme l’a fait récemment M. Bach! la théorie des per- oxydes-ferments avec la théorie des peroxydes, Chodat et Bach. D'ailleurs personne d’autre ne s’est mépris sur cette distinction ?. Comme dans tout autre domaine la terminologie adoptée par les auteurs a fourni matière à discussion. Bourquelot et Marchandier critiquent les termes de peroxydases et d’oxygénases utilisés par R. Chodat et Bach. Selon eux, dans la création d’un mot appliqué aux ferments doivent intervenir, à la fois, le nom de la substance sur laquelle agit le ferment et la nature de l’action que détermine ce ferment. » « Mais le mot tréhalase désigne le ferment qui agit sur le tréhalose et qui agit sur ce sucre en l’hydrolysant. — Dans ces conditions, et en supposant qu'on ait appliqué les mêmes principes aux ferments oxydants, le mot peroxydase signifierait un ferment agissant sur les peroxydes et agissant en les oxydant, ce qui est absurde puisqu'il les réduit. Quant au mot oxygénase il désignerait un ferment qui agirait sur l'oxygène en l’oxydant ! * » Ceci est interprétation de M. Bourquelot, mais il est loin d’être suivi. Le mot oxydase (Yoshida-Bertrand) est employé pour désigner des ferments qui agissent en oxy- dant; par conséquent toute désignation de ferments. directs ou indirects doit s'inspirer de la définition donnée au nom générique. Les oxydases oxydent des corps et non des oxydes, ils agissent en utilisant l'oxygène. De même 1 Bach, Ber. d. d. chem. Ges. 1906, 3399 et Chodat, sb1d., 1906, 2506. ? Voir Oppenheimer, Die Fermente II Auflage; See, Oxydases; Bour- quelot. I. c. 8 Bourquelot et Marchandier, Journ. Phys. et Chimie, Juill. 490%. et les peroxydases sont des ferments oxydants mais ils utilisent les peroxydes, les oxygénases effectuent leur oxydation par l’intermède de l'oxygène. La nomenclature: de Chodat et Bach est donc conforme à l'usage et à la tradition. Si l’on voulait supprimer les termes proposés. il faudrait logiquement éliminer pour les mêmes raisons le: vocable oxydase. Comme on le voit l’objection de Bour- quelot ne tient pas. D'ailleurs cet auteur ne fait que répé- ter les théories Bach-Chodat dans son travail sur l’oxyda- tion de la vanilline. C’est la transcription des idées de: Chodat et Bach dans lesquelles il n’a fait que changer le terme de peroxydase par celui anæroxydase : Or il sera. permis de lui demander si ces anæroxydases sont désignées. conformément à sa nomenclature, la désinence « ase » s'appliquant exclusivement à des ferments hydrolysants: selon lui, ou s’il accepte l’idée de nommer ainsi des fer- ments oxydants où est la désignation de la substance qui est oxydée. M. Bourquelot montre par ce travail ! que la nomen- clature de Chodat et Bach non seulement est conforme à la règle qui doit être appliquée dans la désignation des. ferments oxydants mais qu’il n’a pas été possible d’en trou- ver une qui correspondrait aux règles adoptées pour les. _ferments hydrolysants. Ce même auteur reprenant la théorie de Chodat et Bach lui donne l’énoncé suivant : « l’oxydase directe: serait donc un mélange d’ozonide et d’anæroxydase >. Or les ozonides de Schœnbein sont les peroxydes de: Engier, de Bach et de Bach et Chodat, quant aux anaé- ? Bourquelot et Marchandier, Etude de la réaction provoquée par un: ferment oxydant indirect sur la vanilline et la MEANS Ibid. et Soc. biol. Mai 190%, Ac. Sc. Juin 1904. Soie roxydases ce sont les peroxydases de ces derniers auteurs. Ceux-ci n’auraient pu désirer une confirmation plus com- ; plète de leurs idées. Cette théorie des systèmes peroxydases-peroxydes est | actuellement généralement admise * ; même les auteurs qui restent sur la réserve l’admettent comme une hypothèse "à de travail. 3140 Depuis Bertrand, on sait qu'il existe au moins deux oxydases spécifiques et très probablement un grand nom- bre de catégories d’oxydases. La première catégorie est celle dont l’image est le système peroxydase-hydroperoxyde et qui effectue une quantité considérable d’oxydations : phénols et polyphé- nols : phénol (Chodat et Staub) hydroquinone, résorcine, acide gallique, tannin, guiacol, thymol, etc., des corps k amidés, p. phenylène diamine, metatoluidine, etc., acide 4 iodhydrique. — D'une manière générale les corps oxydés | par l’oxydase (laccase) des champignons (Lactarius) sont -:-FL5RS aussi oxydés par le système peroxydase-hydroperoxyde. Ce dernier corps peut être remplacé par des peroxydes substitués. De Comme il est difficile d'admettre que les ferments ‘2 oxydants soient autre chose que des systèmes peroxydes- peroxydase on peut se demander si la spécificité des fer- ments oxydants nommés laccase et tyrosinase dépend de la nature particulière du peroxyde ou de la spécificité de la peroxydase. Une observation faite par Chodat lui à permis d’élucider ce point. Alors qu’on peut par le système peroxydase-hydroper- Ne DA ENT CT ES Ph 2 Te CESSE ps RSS SEE + PGA ES jé f. Mn, 4: M Do Ta Fan A) 1 Voir Oppenheimer, 1. c.; Palladine, Ber. d. d. bot. Ges. 1906, 98; Bourquelot, 1. c. ; See, Oxydases ; Chodat, Les ferments oxydants, Journ. suisse de Chimie et Pharmacie, 1905. ENST oxyde oxyder une foule de corps, ce même système est sans effet sur la tyrosine qui même à la longue n’est point altérée. C’est cette observation qui l’a amené à cette notion que les oxydases spécifiques diffèrent bien moins par la nature de leurs peroxydes (ou oxygénases) que par la spécificité de leurs peroxydases. Dans ces considérations sur les ferments oxydants on part donc de cette notion que pendant les procès d’oxyda- tion lentes qui se passent entre des matières en solution ou très divisées et l'oxygène de l'air il y a une phase inévitable, la production parfois passagère d’un peroxyde. Voici résumé selon Bach et Chodat ! le mécanisme de ce phénomène : « Lorsqu'une substance se combine à l’oxy- gène moléculaire elle commence par rompre, en vertu de sa propre énergie, par rompre une seule des liaisons qui unissent les atomes dans la molécule d'oxygène et fixe les groupes —0—0O—. Il se forme donc toujours comme premiers termes d’oxydation des peroxydes du type du peroxyde d'hydrogène et qui dans la plupart des cas se transforment effectivement en peroxyde d'hydrogène sous l'action de l’eau. J'emprunte maintenant au lumineux exposé qu’en à fait le professeur Chodat* dans le Journal suisse de Chi- mie et de Pharmacie la représentation que voici de la marche du phénomène dans le processus de la formation du peroxyde. Soit À, un corps qui en vertu de sa propre énergie est capable de se combiner à une molécule d'oxygène O—0. 1 Chodat et Bach, Arch. sc. phys. et nat. Genève 1902. 2 R. Chodat. Journ. suisse de Chim. et Pharm. n9 46. p. 2. 1905. PS De Selon la théorie de Bach et de Engler A brisera une des liaisons de la molécule d'oxygène, laquelle viendra se fixer sur À comme suit : —0 (0) on aÇ | Celle des liaisons qui n’a pas été atteinte, maintient liés 2A0 + O2 inactif AO: EC A + O2 inactif AO: + O2 —— AO + Os aclif AO4 ——>- AO + O3 actif Ces schémas expriment clairement les possibilités pré- sentés par des peroxydes en présence de ferments oxy- dants indirects c’est-à-dire de peroxydases ou de cata- lase (dans le cas de la mise en liberté d’oxygène molé- culaire). Dans la théorie de la spécificité défendue par Chodat la peroxydase fonctionnerait comme ambocepteur se com- binant d’une part avec le corps oxydable et d’autre part avec le peroxyde. C'est à cette théorie qu'amènent naturellement les recherches de Bach et Chodat sur le mode d’action de la peroxydase (superoxydase de Chodat). Reprenant une méthode de Bertrand sur l’oxydation du pyrogallol ils ont démontré que dans les conditions de leurs expériences il s'établit entre la peroxydase et l’eau oxygénée un sys- tème défini et proportionnel aux variations de l’un des composants. Ceci amène inévitablement à la théorie de l’union de la peroxydase et de l’eau oxygénée selon des proportions définies et confirme indirectement la théorie Chodat et Bach des oxydases, systèmes peroxydes-per- oxydases. Les peroxydases extraites par Chodat et Bach sont des ferments assez stables. Fraichement préparées elles 42) be résistent à l’ébulition si elle n’est que passagère. I’appa- rence de ces peroxydases est celle d’une poudre blanche demi-cristalline. On pourait se demander si en opérant sur de grandes quantités on arriverait à purifier de plus en plus la peroxydase de manière à élucider les points contestés de sa nature chimique et voir si avec des degrés divers de purification ce ferment présenterait les mêmes propriétés. En effet la nature chimique des ferments est tou- jours un problème non résolu. Pour les uns tous les fer- ments sont des matières albumineuses, pour d’autres 1l y aurait des ferments qui ne seraient point des albumines (pepsine). Enfin la théorie de M. Bertrand, selon laquelle les ferments oxydants du type laccase (c’est-à-dire ceux qui ont dans le système peroxydase-peroxyde leur image) agiraient par l’intermède du manganèse qui, sous forme de combinaisons, agirait comme sensibilisateur, comme com- plément. Comme toutes les actions connues de la laccase sont aussi effectuées par le système peroxydase-peroxyde, il devenait intéressant de voir si ce système agit aussi par l'intermédiaire de sels de manganèse. Enfin au cours de ses recherches M. Chodat avait remarqué l’influence toxique de l’eau oxygénée. Il devenait nécessaire de défimr l’action de la peroxydase purifiée en fonction de la concentration de l’eau oxygénée. On verra plus loin que le manganèse n’est pas néces- saire à la manifestation de l’activité du ferment et que la théorie des oxydases sensibilisées par le manganèse devient très improbable. D'autre part on verra combien la peroxydase est sen- sible a l’action de l’eau oxygénée et quelles réserves il faut faire à une théorie des peroxydases agissant en propor- tions définie. Ce sont là les raisons qui ont engagé mon maître le Prof. Chodat à me proposer d’élucider sous sa direction les points qui vont être décrits. Préparation de la peroxydase. La peroxydase est l’un des ferments les plus répandus ; on pourrait essayer de l’extraire de beaucoup d’orga- nismes. Mais l’expérience a montré (Chodat et Bach) que le raïifort (Cochlearia Armoracia) se prête particuliè- rement bien à cette extraction. Voici la méthode donnée par Chodat et Bach : on broie la pulpe que l’on obtient en faisant passer la racine dans une machine à hacher, qu’on laisse séjourner pendant 20 heures pour permettre au glycoside, le myronate de potassium, d’être dédoublé par la myrosime. On fait ensuite macérer le tout dans de l’alcool à 80° qui extrait les essences et d’autres corps accessoires. Le liquide alcoolique coloré en rouge est décanté. On recommence une seconde fois la même opération et l’on exprime cette fois-c1 l'alcool par la presse. Le résidu est traité dans un percolateur par de l’alcool à 40° pen- dant 40-60 heures. Par cette extraction ou enlève une bonne partie de la peroxydase soluble dans Palcoo!l à 40°. On peut concentrer cette solution à la température ordi- naire dans le vide. On filtre et on précipite par de l’alcool fort (absolu si possible ou à 30°) aussi longtemps que se fait encore un précipité. Ce dernier est recueilli, il est 9 Le eut dissous dans l’eau et reprécipité par l’alcool. On obtient une poudre cristalline blanche et très active. Nous avons répété cette extraction et obtenu les résul- tats suivants : 4 k° de raïfort broyés, laissés à l’air 20 h., 4 h. alcool à 90° 20 h., puis décanté et répété l’extrac- tion. Le résidu traité par 7 Lit. alcool à 40° pendant cinq jours, puis précipitation du liquide par 12 Lit. d’alcool à 96°. Le précipité recueilli sur une assiette poreuse se redissout dans l’eau; on le reprécipite et on le sèche sur terre poreuse à l’étuve à 35°. On obtient ainsi 4 grammes d’une poudre blanche assez active. Le rendement est donc à peu près 10 °/0o, et emploie 5 Lit. d'alcool par k° de raifort. Dans le but d’éviter une dépense exagérée d’alcool nous avons procédé comme suit : On laisse sécher la poudre de raifort broyée à une douce chaleur. Quand le raïifort est bien sec on le moût dans un moulin qui le réduit en poudre fine. La poudre est couverte d’alcool à 90°, et le traitement subséquent reste le même. Dans cette seconde extraction nous obtenions à partir de 7 k° 300 de raifort, et de 17 litres d’alcool à 96», environ 35 gr. de peroxydase. Pour éviter autant que possible une action prolongée de l’alcool nous avons ensuite essayé un procédé d’extrac- tion à l’eau. 10 k° de raïfort traité comme précédemment furent mis en contact avec deux litres d’eau pendant deux jours, puis l’on additionne d'alcool de manière à amener le titre du liquide à 40° d’alcool. Au bout de 9 jours on exprime le liquide et on précipite par l'alcool fort. Nous avons PAL 0 Ses employé pour cette opération 10 I. d’alcool à 96°. Cette opération fournit 130 gr. d’une poudre très active ce qui correspond à un rendement de 13 °/00. On peut aussi précipiter le liquide aqueux par le sulfate d’ammonium en excès, mais ce procédé ne fut pas trouvé pratique. Nous nous sommes arrêtés alors au procédés suivant : La pulpe broyée est exposée à l’air pendant quelques heures en remplaçant l’eau qui s’évapore par de l’eau nouvelle puis on exprime le raifort à la presse. Les gâteaux sont de nouveau mis en contact avec l’eau pen- dant 10-20 heures en remuant de temps à autre. Le liquide doit à peine dépasser la pulpe. Cette opération se répète une seconde fois. Ces trois liquides réunis on commence la précipitation. Il faut que cette dernière se fasse lentement. On s'arrête au premier trouble. Les matières qui se déposent tout d’abord sont peu actives. Après dépôt, on décante, et on précipite par l’alcool fort. Il se forme un précipité flocconeux et blanc qui se dépose lentement au fond du récipient et sur les parois du vase où il forme une couche gommeuse et adhérente qui jaunit peu à peu. On l’enlève à la spatule aussi vite que possible. On dépose cette masse gommeuse sur des assiettes de porcelaine vernie auxquelles ne s’attache pas le fer- ment comme il le fait avec la porcelaine dégourdie. Il faut sécher rapidement si possible dans le vide après avoir fait égoutter l’alcool. Le précipite sec est broyé et con- servé à l’abri de la lumière et de l’humidité. Pour augmenter la valeur enzymatique de ce préci- pité on peut le purifier d’après la méthode Chodat et Bach en le redissolvant et en reprécipitant, à plusieurs reprises. Il faut avoir soin chaque fois d'éliminer par 200 filtration le premier trouble produit par l’addition de l'alcool fort. Nous avons cependant remarqué que les premières fractions précipitées sont moins actives que celles qui sont. séparées plus tard. On séparera donc ces deux fractions. La valeur de chacune des peroxydases obtenues est déterminée en quantité de purpurogalline obtenue. C’est ainsi que nous avons réussi à enrichir la peroxydase jus- qu’à lui faire donner quatre fois l’action des meilleures peroxydases obtenues par Chodat et Bach. Les meilleures peroxydases obtenues par Chodat et Bach étaient des poudres cristallines très blanches et qui entrent facilement en solution dans l’eau. C’est proba- blement à cette poudre cristalline que M. Rosenfeld à donné le nom peroxydase cristalisée !. M. Rosenfeld A. D. à publié un mémoire sur l’oxydase extraite à partir du Raphanus sativus et l’action des Alca- loïdes sur cette oxydase. Cet auteur, qui donne un bon résumé des travaux anté- rieurs et en particulier de ceux de Chodat et Bach, attribue à la peroxydase extraite d’après les procédés de ces auteurs à la fois une action de peroxydase et une action d’oxydase. Il note en effet que pour peu qu’on lui laisse le temps l’oxydase du Raphanus (peroxydase) oxyde sans eau oxygénée plusieurs des réactifs Les plus sensibles. Il cite en particulier le pyrogallol, la benzidine, la paraphénylènediamine, ete. Nous pensons que l’auteur n’a pas tenu compte d’une cause d'erreur qui à plus d’une fois déjà égaré les enzymologues. Nous voulons parler de la 1 Rosenfeld. Die Oxydase von Rud. Räphant sativi L. und über die Warkung von Alcaloïdsalzen auf die Oxydationsthätigkeit (Pharmac. Enstit. Kais milit. med. AK. St-Petersburg, 1906). NT E facilité avec laquelle beaucoup des réactifs utilisés pour déceler les oxydases se peroxydent à l'air. L'alcool même doit être vérifié quand on fait seulement des recherches qualitatives. Il est en effet souvent per- oxydé; la résine de gaïac et les autres réactifs se per- oxydent rapidement par addition d’une molécule d’oxy- gène. Or dès que dans ces réactifs il y à une minime partie qui est peroxydée elle sert de peroxyde pour la constitution d’un système analogue à la laccase : peroxyde-peroxydase. C’est ainsi qu’on peut expliquer cette contradiction que la peroxydase puisse fonctionner aussi comme oxydase. M. Rosenfeld pense que la peroxydase de Raphanus à laquelle il est arrivé est un corps cristallin; il arrive égale- ment à cette conclusion que la nature ferment est liée à cette structure cristalline. À ces conclusions nous ferons les objections suivantes : L'auteur qui n’est parti de 2 k° de Raphanus n’a obtenu que 0,2 gr. de peroxydase brute. Il a purifiée cette dernière en précipitant d’abord les phos- phates calciques par l’ammoniaque et puis par précipita- tions répétées par l’alcool. Enfin de compte il à obtenu un restant de 0,02 sur lequel il à pu instituer quelques expériences. La quantité de cendres qui était de 62-70 °/o dans sa peroxydase brute à sans doute diminuée, mais cette diminution n’est pas indiquée. Examinée au microscope cette peroxydase cristallisée montre un polymorphisme cristallographique assez grand. L’auteur laisse supposer qu’il peut s’agir d’un mélange mais il tient cependant à cette idée que la fonction ferment est liée à la nature cristalline. Nous pen- sons que les minimes quantités obtenues par cet auteur ne permettant pas une purification méthodique on ne saurait inférer de cette coincidence de cristaux et de tonctiom ferment à la nature cristalline du corps ferment. Parti de quantités beaucoup plus grandes, il nous à été impossible de pousser la purification plus loin que celle dont il à été fait mention. Mais alors sels et ferment sont précipités en même temps. Nous tenons la démonstration de M. Rosenfeld comme insuffisante. Notre peroxydase purifiée n’a plus cette apparence cristalline. C’est en majeure partie une substance amorphe, qu’il n’est plus possible de dissocier utilement par une précipitation fractionnée par l'alcool. Ainsi tandis que la poudre blanc grisâtre qui est quatre fois moins active se laisse facilement enrichir, la masse amorphe semble se maintenir également active. Peroxydase cristalline. Avec l'alcool : précipité tout d'abord inactif Avec HNO3 faible précipité, jaunit un peu (xanthoprotéine). Faible réaction du Biuret. Rougit au réactif de Millon. Réaction au chlorure d’or. Faible précipité par le ferro-cya- nure de potassum. Réaction de Fehling. Peroxydase amorphe. Id., précipité actif. Id., pas de précipité, jaunit légè- rement. Pas de réaction de Biuret. Vague coloration qui disparaît aus- sitôt. Pas de réaction. Pas de réaction. Aucune action réductrice. On voit ainsi que la peroxydase peut être séparée des gommes qui forment une part importante de la peroxydase brute. Les sucres réducteurs font aussi défaut et aucun des réactifs n’a pu permettre de décéler nettement des corps protéiques dans le ferment purifié et très actif. On peut donc affirmer que la peroxydase n’est pas une albumine. C'est à ce résultat qu’étaient également arrivés Chodat oo es et Bach! en utilisant une peroxydase beaucoup moins active. Rosenfeld ne trouve non plus de réaction de corps pro- téiques dans sa peroxydase purifiée du Raïfort (React. : Millon, Biuret etc. négatives). Il reconnaît cependant la présence de l’azote par la réaction de Lassaigne. Nous avons fait l'analyse qualitative et quantitative des deux catégories de peroxydases. Peroxydase brute. =. NOSEE 57, = SN NOH.. — =. } C2H40z..... Léger précipité. 5 CeHeH2.... Réduction marquée. Cendres. 11 3 AREA Résidu sensible. POLE Précipité volumineux. SO4H2 ..... Léger précipité. 3 CNE Traces. Re ee » CPR PRE I Traces marquées. 1; RE CS Léger précipité. | 1 RER = VAR EEE Traces. D ne Précipité abondant. | RENE » » , € MMA ES DA » » L'ANPE » » Peroxydase purifiée Trouble à peine sensible. Réaction nulle. Précipité abondant. Léger précipité. On voit par ces analyses que les matières minérales qui accompagnent les peroxydases sont surtout des phosphates de calcium, de Mg. de Na et Ka. A. Bach et R. Chodat, Ueber Peroxydase, Ber. d. d. chem. Ger., XXX VI, 1903, 603. de ANALYSE QUANTITATIVE. Peroxydase Peroxydase Peroxydase purifiée. blanche. brute. DENTS RRRAT Enr 11.2! 9.82 8.69 Matières organiques . 65.88 65.95 77.49 Cendressesers ur 22.71 24.23 13.83 100.00 100.00 100.00 ArOle ee TL 3.43 6.70 D.23 Calculé en protéine... 21.46 L6.50 32.09 DosAGE DES CENDRES. EX NS AT 0.96 3.47 3.48 CITES ER 0.42 2,34 5.16 Maths Preis 0.36 1.04 0.76 KDE NDS 76.88 40.80 38.02 Ces analyses montrent que par purification les gommes s’éliminent. On voit aussi que la diminution en teneur d'azote ne correspond pas à une diminution d’activité. Les sels des métaux alcalino-terreux sont également éli- minés en grande partie dès les premières purifications. La proportion notable d’azote est un fait significatif. De plus il faut retenir que la substance organique azotée est soluble dans l’alcool à 40°. Mais l’absence nette des réactions des matières protéiques n’est pas sans causer quelqu’embarras. Conclusion la peroxydase très active, la plus active contient 65 °/o de matières organiques, 3 °/o d’azote et dans ses cendres (22,7 °/0) surtout des sels alcalins. Sr l’on ne peut affirmer que ce ferment est une albumine on ne peut cependant nier qu'il ne soit accompagné de substances organiques azotées. LR 2 gr Parmi les corps organiques qui accompagnent la per- oxydase Bach et Chodat en ont cité qui fournissent de l’ammoniaque, la pyridine, Tschirch, le Pyrrol. M. Rosenfeld à reconnu également que le caractère peroxydase se maintient malgré l'élimination des phos- phates calciques; il reconnaît surtout la présence de métaux alcalins liés au phosphore, et au soufre. Mais comme il n'a pas mesuré la force de son ferment purifié on ne peut extraire de ses données si l’élimination des matières salines a diminué ou augmenté l’activité du ferment. Les réactions qualitatives sont incertaines. Un autre résultat intéressant c’est l’absence absolue de manganèse !. On connaît la séduisante théorie de M. Ber- trand selon laquelle l’activité de la laccase, le ferment oxydant du Aus vernicifera et des Champignons, et que Chodat et Bach considèrent comme un système peroxy- dase-peroxyde où le peroxyde est un corps ferment auquel il donnent le nom de oxygénase. — Cette activité serait fonction des sels organiques complexes de manganèse. La laccase privée de manganèse deviendrait inactive. Les travaux de Chodat et Bach sur la peroxydase ont montré que toutes les oxydations que peut effectuer la laccase, le système peroxydase-peroxyde peut également l’effectuer, 1l y à identité d’action spécifique. Il devient donc excessivement intéressant de constater que ni l’oxydase du Lactarius purifiée étudiée par Chodat, ni notre peroxydase purifiée ne contiennent de manganèse. Il se peut que dans les variétés d’oxydases étudiée par M. Bertrand le manganèse joue un rôle important. ! Bach et Chodat avaient, dans la peroxydase brute trouvé de 0,2-0,6 de Manganèse. Ils constatent cette présence sans y ajouter d'importance au poiut de vue de l’action ferment. DS, Dans nos oxydations ce corps ne joue aucun rôle puisqu'il n’est pas présent’. Il faut donc penser que si dans quelques oxydations le manganèse joue le rôle qui lui est attribué par Bertrand il n’est cependant pas néces- saire, et que le système hydroperoxyde-peroxydase peut effectuer son travail maximum sans son intervention. Son importance dans les phénomènes provoqués par les ferments oxydants devient donc très problématique et en tous cas elle est nulle en ce qui concerne la peroxydase étudiée par nous. Nous avons voulu aussi examiner dans quelle mesure l’adjonction de certains sels ou des acides aurait une in- fluence sur l’activité de notre peroxydase. À cet effet nous avons établi deux séries d'essais sur les bases suivantes : 1° série. Chaque flacon Erlenmeyer contenait 10 cm? H202 à 1 °/o et 10 cm° de solution de peroxydase fraiche et d'activité moyenne + 1 gramme de pyrogallol. Eau ad 85 cm°. 20 série. Chaque flacon contenait 10 cm° H202 à 1 °/o, 10 cm° d’une solution de peroxydase un peu vieillie et moins active que la précédente, et 0,5 gr. de pyrogallol. Eau ad 85 cm°. Nous avons alors préparé des solutions à 5 °/o de difté- rents sels. Dans chaque essai de la première série nous avons introduit 5 cm° d’une des solutions, variant la nature du sel à chaque essai ; nous avons agi de même dans la deuxième série en n’ajoutant alors que 1 cm° de la solution, ce qui fait que les sels se trouvaient dans les essais de la première série à une concentration de 0,3 °/o et dans la seconde à celle de 0,06 °/0. ? Rosenfeld ne trouve, non plus que nous ni Fer n1 Manganèse. LS QE I IT Purpurogalline Purpurogalline Nature des sels. formée. formée. OMR S E J.a re 0.110 0 080 SON AU ITR 0.110 0.080 SOS Re RER 0.107 0.084 SOMME ru 0.106 0.083 Sd ar 0.109 0.086 SUIS RAT PRES Le 0.107 0.080 SOA ER ae 0 0.033 jh LI LU ERP IEEE CAT 0.115 0.089 NÉE RSR erreur 0.105 0.081 INDE ASS. ne. 0.105 0.084 PORN EN LE 0.066 0.080 BR A ve ue) 0.106 0.088 PURES RE. de 0.110 0.083 ÉURHCT ES Rene 0.108 0.08% Nous avons ensuite établi deux séries d'expériences analogues aux précédentes mais en utilisant une peroxy- dase peu active et en remplaçant les sels par les acides en solution !/10 normale. Nature des acides. Sert oicn RO IL MSÉL ACC Son | FERRER REP PTE 0.027 0.030 CR ee DE 0.023 0.026 1» 1 TRS ERA ASE 0.023 0.030 PA ne Pure 0.024 0.026 LAS CORRE 0.023 0.026 GIBPOONH,::52.72 LE 0.023 0.025 COMTE. 0.024 0.030 Ces expériences montrent que ni les sels ni les acides employés n’ont d’action sur le phénomène d’oxydation, exception soit faite pour le sulfate ferreux ! et le phosphate acide de potassium. | On ne peut donc conclure que les sels ou les acides 1 Le sulfale ferreux étant lui même un réducteur énergique empêche la réaction. an Ur auraient une action accélératrice sur le phénomène d’oxy- dation. Cependant il ne serait pas permis de dire que la peroxydase ne nécessite pas de la présence des sels pour effectuer les phénomènes d’oxydation, car il faudrait pour cela pouvoir les éliminer complètement et examiner leur seuil d’action qui est peut être situé très bas, des traces de sels ou d’acide suffisant à ces réactions. Nous faisons remarquer que notre peroxydase purifié est très sensible à l’action de la température; une faible ébullition la détruit et son action ne réapparaît pas comme cela arrive selon Woods avec une peroxydase impure (v. Mosaïc disease U. $S. Dep. of. Agr. Rep. N° 8, 17). Il semble donc qu’à tous les points de vue la purification à augmenté la sensibilité. Pour mesurer la valeur des peroxydases aux divers degrés de purification, nous nous sommes servis de la méthode de Chodat et Bach. En d’autres termes nous avons préparé une solution de pyrogallol à laquelle on ajoute une quantité constante d’eau oxygénée puis des. quantités variables de ferment. On cherche à connaître la quantité maximum de purpurogalline ! que peut fournir le système peroxydase hydroperoxyde. La purpurogalline dont la formule définitive est encore à vérifier à sans doute une composition voisine d’une pyrogalloquinone. 0—0. CsHs (OH): OH. Ces NO—O. Ces (OH)2 C’est un corps insoluble dans l’eau, soluble dans l’alcool 1 Nous n'avons pas fait assez d'expériences sur l’activité du système per- oxydase-hydroperoxyde sur la catalyse de l’acide iodhydrique pour pouvoir les indiquer ici (voir Bach et Chod. Berichte 1904, et Bach I. c. 23%). froid et plus encore à chaud ; elle cristallise magnifique- ment dans ce liquide. Elle est insoluble dans léther. La purpurogalline en aiguilles pourpres fond en se décom- posant vers 220-230°. Avec l'acide sulfurique concentrée elle donne une belle solution rouge écarlate et avec l’am- moniaque un liquide bleu qui passe peu à peu au vert et au jaune brun ombre. Perkins à obtenu un dérivé tétra- bromé de la formule C2oH12 Br4 O7 (v. Perkins et Steven. P. Chem. Soc. 249, 1904). Dans les expériences de Chodat et Bach on avait les chiffres suivants : l Nos Pyrogallol H202 à 7 0/0 Peroxydase Purpurogalline 1 1 gr. 10 cm$ 0.01 0.021 2 » » 0.02 0.042 < » » 0.03 0.066 4 » » 0.04% 0.083 5) » » 0.05 0.102 6 ») » (1) . 06 0 a 123 7 » » 0.07 0.145 8 » » 0.08 0.166 9 » » 0.09 0.161 19 » » 0.10 0.162 Ici le pyrogallol et l’eau oxygénée restent constants, la peroxydase varie : IT Nos Pyrogallol H202 à 1 °/o Peroxydase Purpurogalline i A gr. 1 cm$ 0.10 0.0205 7 » 2.9 » 0.042 3 » 3 » » 0.061 a » & » » 0.078 5 » L'eL" » 0.099 6 » 6 » » 0.121 7 » Tex D » 0.141 8 » 8 » » 0.158 9 » 9 » » 0.168 19 » 10 » » 0.163 MS OA Dans ces expériences on voit que la quantité de peroxy- dase et la quantité d’eau oxygenée variant la purpurogal- line formée est proportionnelle au système peroxydase- peroxyde employé. Ici accidentellement le rapport de la peroxydase est le suivant : 1 em° d’eau oxygénée à 1 °/o est exactement activé par 0,01 gr. de peroxydase. Mais on remarque que dans cette série le maximum d’action est atteint lorsque 0,08 gr. de peroxydase activent 8 cm° d’eau oxygenée à 1 °/o. Toute nouvelle addition d’eau oxygenée est sans effet, de même un excès de peroxy- dase n’augmente pas la quantité de purpurogalline. Dans ces conditions 1 gr. de pyrogallol semblait ne pouvoir fournir que 0,166 de purpurogalline, quelle que soit la quantité du système peroxydase-hydroperoxyde em- ployé. Mais ces auteurs ont aussi fait varier la masse du pyrogallol : Série III Nos Pyrogallol H20: à 1 °o Peroxydase Purpurogalline 1 » 10 cm3 0.10 gr. 0.166 2 » » » 0.202 5 » » » 0.203 l » » » 0.205 De ces observations Chodat et Bach en ont tiré la con- clusion que les oxydations sont dues à l’établissement d’un système chimique dans lequel l’eau oxygénée et la peroxydase s’uniraient passagèrement à la façon d’une combinaison chimique. Ce système serait analogue à l’oxydase des plantes dont on avait soupçonné précédem- ment la nature peroxyde (Schœænbein, Bach, Engler, Kastle et Lœwenhart). Pour Chodat et Bach, et c’est là la notion nouvelle importante introduite par leurs travaux, les oxydases L'ART re seraient des systèmes peroxydases-peroxydes analogues à celui qu'ils ont réussi à établir dans leurs expériences citées plus haut. Il ya entre cette théorie et celle des autres auteurs cette différence essentielle que pour Schœnbein, pour Engler et Wild, Bach, Kastle et Lœwenhart, les oxy- dases sont des peroxydes. Or cette notion était tout à fait insuffisante car s’il est vrai que le peroxyde d'hydrogène puisse à lui seul catalyser l’acide iodhydrique en mettant l’iode en liberté et en brûlant l'hydrogène : 21H — H20: = LE + H:20 + H:0 il est incapable d'effectuer à lui seul les actions des oxydases : ainsi il ne bleuit pas le gaiac, il ne donne pas la réaction du gaiacol, il n’oxyde pas le pyrogallol en purpurogalline. Il ne suffit donc pas de dire que les oxy- dases sont des peroxydes comme l’ont fait Engler et Wild, Bach et Kastle et Lœwenhart. Dès lors il est difficile de comprendre que dans un article de polémique’ M. Bach réclame pour ses travaux antérieurs à la collaboration avec Chodat le mérite d’avoir établi la théorie actuelle des oxydases, systèmes peroxydases-peroxydes. Cette notion ne date que des recherches de Chodat et Bach qui l’ont établie et défendue dans une série de tra- vaux. C’est là la théorie Chodat et Bach qui diffère comme on le voit essentiellement de celle de Bach qui ne faisait pas intervenir une peroxydase. C’est donc conforme aux faits que de parler d’une théorie des peroxydes Chodat et Bach différente de celle de Engler, Bach, etc. Les recherches qui vont suivre s’inspirent donc de 1 A, Bach, Ber. d. d. chem. Ges. 1906, 3330. de cette théorie Chodat et Bach et sont destinées à les com- pléter en élucidant des points restés douteux et à les amender en faisant connaître des résultats nouveaux. On voit que dans le troisième tableau pour donner toute sa mesure, la peroxydase de ces auteurs, dans le rapport de 0,10 gr. à 10 cm° Hz Oz à 1 °/o doit agir sur une quantité de pyrogallol dépassant 1 gr. Cette action maxi- mum est mesurée par 0,201 de purpurogalline. Ces auteurs ne paraissent pas s'être explicitement exprimés au sujet de ce pouvoir d’oxydation en ce qui concerne le pyrogallol. Il ressort seulement de leur travail qu'en variant la concentration du pyrogallol on peut pousser l’action plus loin. Ayant préparé une peroxydase purifiée (v. p. 19) nous avons vérifié les recherches de ces auteurs et nos résultats nous ont montré que l’incapacité de produire une plus grande quantité de purpurogalline ne peut être attribuée qu'à la nature du système peroxydase hydroperoxyde utilisé par ces auteurs. Lorsqu'on effectue l’oxydation du pyrogallol par le système peroxydase-peroxyde il se fait à côté de la pur- purogalline des produits d’oxydations secondaires, solubles dans l’eau qu'ils colorent en rouge brun. La purpurogal- line ne peut donc à elle seule donner toute la mesure de l’activité du ferment ; elle n’exprime qu'une partie de sou action. Lorsqu'on utilise des peroxydases très affaiblies, on voit se faire la coloration sans dépôt de purpurogalline. Or comme dans nos expériences à partir d'un gramme | 4 de pyrogallol nous pouvions obtenir jusqu’à 0,406 de | parpurogalline et à partir de quantités moindres de ss ferment 0,95, il faut admettre que les peroxydases 2 n- employées ne sont pas comparables. L’explication la plus plausible est qu'il s’agit de sensibilité différentes vis-à-vis des produits d’oxydation qui ralentissent l’action du fer- ment. Certaines peroxydases sont plus sensibles, d’autres le sont moins. Cette différence de sensibilité doit provenir de substances accessoires qui dans le premier cas aug- mentent la toxicité des produits de la réaction sur le fer- ment et qui manquant dans la peroxydase purifiée lui per- mettent de pousser plus loin son action. Mais si la peroxydase dont se sont servis ces auteurs dans leurs expériences paraît sensible à l’action imhibi- toire des produits intermédiaires notre peroxydase puri- fiée qui active une plus grande quantité d’eau oxygénée est par contre très sensible vis-à-vis de cette dernière substance. Il faut, lorsqu'on expérimente avec ces mélanges, avoir som de mettre les trois agents, ferment, pyrogallol et eau oxygénée en présence simultanément ayant dissout au préalable isolément les corps dans l’eau de manière à obtenir du coup la concentration cherchée. À peine les trois corps sont ils en présence que la réaction se produit ; elle se manifeste d’abord par un bru- missement du liquide, puis la liqueur s’éclaircit, rougit et l’on voit distinctement apparaître des cristaux colorés, suivant les cas, de teintes variant du Jaune rouge au brun sombre et qui se déposent lentement. Après dépôt (10 h.) on recueille le précipité sur des filtres pesés; on lave après avoir filtré tout le premier liquide avec 100 cm° d’eau distillée. On porte finalement le filtre à 105°, en ayant soin de n’atteindre cette température que lentement de façon à éviter un entrainement de la purpurogalline par les vapeur d’eau et l’on pèse. MS Co Nous avons fait un très grand nombre d’expériences qui toutes confirment cette sensibilité de la peroxydase vis-à-vis de l’eau oxygénée (plusieurs centaines). Il en résulte que la loi d'action ne donne pas nécessairement l’image simplifiée que fournissait la première série d’ex- périences instituée par les auteurs de la théorie du système peroxydase-hydroperoxyde. Les expériences de ces auteurs montraient déjà le peu de toxicité du pyrogallol vis-à-vis de la peroxydase (v. Ber. d. d. chem. Ges. XXX VI, 607 et seq.). Nous avons voulu vérifier ce point en ce qui concerne la peroxydase purifiée. Concentration Pyrogallol H202 à 0.85 /o de l’H202 Peroxydase Purpurogalline 0.5 à) 0.084 0. 0.112 1.0 10 0.085 0.1 0.132 1.5 1B] 0.088 0.1 0.121 2.0 20 0.085 0.1 0.121 2.9 29 0.088 0.1 0.11 On voit que dans ces expériences si l’on a soin de maiïn- tenir constante la concentration le résultat reste sensi- blement le même. Dès qu’on fait varier au contraire la concentration de l’eau oxygénée, on voit qu'à mesure qu’elle augmente, l’activité qui tout d’abord progressait se ralentit puis tend vers un minimum. Pyrogallol H202 1 °/o Concentration Peroxydase Purpurogalline 1 10 0.068 °/0 0.1 0.232 1 10 0.080 » 0.1 0.169 1 10 0.096 » 0.1 0.138 1 10 0.120 » 0.1 0.127 1 10 0.160 » 0.1 0.104 1 10 0.240 » 0.1 0.054 action nocive ne se montrait pas ou du moins si le plateau qui se manifeste lorsque, dans leurs expériences, on à atteint 0,8 d’eau oxygénée semble indiquer un équilibre atteint, il est difficile de l’attribuer à l’action nocive de l’eau oxygénée. Bach et Chodat à la suite de Schæœnhein ont déjà insisté sur la toxicité de l’eau oxygénée lorsque cette dernière est concentrée, mais il se sont bornés à mentionner cette propriété. (Ueber Peroxydase I. c.). En effet dans l’expérience que relatent ces auteurs où l’eau oxygénée est maintenue constante (10 cm°) la quantité de purpurogalline obtenue à partir de 0,02 de peroxy- dase est la même que celle qu’on obtenait à partir de 0,10 de peroxydase associée à 10 cm° d’eau oxygénée à 1 °/0. Cependant depuis lors Chodat a préparé une peroxydase d’action moyenne qui est également sensible vis-à-vis d’un excès d’eau oxygénée. Il nous autorisé à publier cette expérience : Nos Peroxydase Eau oxygénée Purpurogalline Calc. Il 0.05 1 cm* 0.0178 0.016 2 0.05 2 » 0.0321 0.032 3 0.05 ss) 0.0466 0.048 L 0.05 & » 0.0601 0.06% b) 0.05 D » 0.0802 0.080 6 0.05 6 » 0.095% 0.096 7 0.05 759 0.1181 0.112 8 0.05 8 » 0.0956 0.112 9 0.05 9 » 0.0877 0.112 10 0.05 10 » 0.072 0.112 11 0.05 IL » 0.0467 0.112 12 0.05 12 » 0.0453 0.112 3 0.05 13 » 0.042 0.112 14 0.05 1% » 0.0396 0.112 15 0.05 16 » 0.0358 0.112 16 0.05 15 » 0.0339 0.112 17 0.05 17 » 0.0341 0.112 Re FR Ce qui, ramené à 0,10 gr. de peroxydase, fournirait 0,24 de purpurogalline. Nous avons vu plus haut que lorsqu'on maintient le titre de l’eau oxygénée et du pyrogallol la quantité de purpurogalline se maintient constante. Voici encore une expérience dans laquelle la concen- tration du pyrogallol va diminuant tandis qu’on maintient celle de l’eau oxygénée : | Nos H202 Concentration Peroxydase Purpurogalline 1 10 cm? 0.160 °/0 0.1 0.100 1 15 » 0.160 » 0.1 0.104 1 20 » 0.160 » Dsl 0.096 1 29 » 0.160 » 0.1 0.102 | 30 » 0.160 » (LA 0.103 En diminuant la concentration on obtient des résultats meilleurs en ce qui concerne la quantité de purpurogalline : Nos H202 1 °/o Concentration Peroxydase Purpurogalline 1 15 cm? 0.082 °/ 0.1 0.249 il 15: » 0.063 » 0.1 0.238 1 15 » 0.055 » 0.1 0.222 1 15 » 0.050 » 0.1 0.220 1 15 » 0.042 » 0.1 0.187 Il semblerait donc qu’il y à une relation entre la con- centration de l’eau oxygénée et la quantité de purpuro- galline qui peut être fourni par le système peroxydase- peroxyde. Comme l’indiquent les valeurs obtenues dans l'expérience citée plus haut, cela ne peut provenir que d’une action inhibitoire produite par l’eau oxygénée à un certain moment. L'ensemble de nos études nous à montré que la concen- tration favorable est voisine de 0,07 °/o; elle est en tous cas située entre 0,068-0,082 °/o. on — Voici maintenant une série de tableaux desquels on peut déduire les principes que nous venons d'exposer. I. Tableau donnant la puissance d'oxydation en fonction de l’eau oxygénée. Pyrogallol H:02 à 1.35 /o Peroxydase Purpurogalline Calculé p. 10 cm* 0.5 Licm 0.01 0.032 0.239 0.5 1 cm$ 0.005 0.034 0.240 1.0 > CM 0.05 0.167 0.248 TI. Tableau donnant la puissance d'oxydation en fonction de la peroxydase. Calc. p. 0.1 de Pyrogallol H:0: Concentrat. Peroxydase Purpurogalline peroxydase 0.5 10 0.077 0/0 0.017 0.152 0.880 2.0 60 0.065 » 0.100 0.830 0.830 1.0 2 0.076 » 0.005 0.04% 0.880 L.0 39 0.079 » 0.050 0.455 0.910 0.5 k 0.079 » 0.010 0.092 0.920 0.5 10.8 0.073 » 0.017 0.154 0.930 Il resulte de ces tableaux que l’action de la peroxydase peut s'exprimer par les rapports suivants. ÎTI. Tableau Pyrogallol H202 à 1 °/o Peroxydase Purpurogalline 2.04 37.6 0.2 0.930 hit z ÿ chiffres 2.00 L0 0.2 0.9 | arrondis. 1.00 20 0.1 0.5 En resumé notre peroxydase activait le double de son poids d’eau oxygénée et oxydait environ 10 fois son poids de pyrogallol pour fournir cinq fois son poids de purpuro- galline. Aïnsi qu'il a été dit précédemment notre peroxydase est très sensible à un excès d’eau oxygénée c’est-à-dire à une forte concentration. is us - Voici le relevé de quelques expériences : on “ 4 IV. Tableau 5e Fa ; Pyrogallol © H:O:à1%e Liq.total Peroxydase Purpurogalline ; 1 gr. 1 35 cm$ 0.005 7 = 000 1 » 2 35 » 0.008 4. © bite 1 » 3 85.» 0008, O0 425 LE 350» +20.005: 272, -2002022 k V. Tableau RSA 1 0.5 10 60 cms 0.01 0039. 0.5 10 60 » 0.02 12 : 0.5 10 60 » 0.03 0.116 Rs. VI. l'ableau Le 1 1.8 30 cm. 0.017 003 Le 1 3.6 30 » 0.017 0-066: 140% 4 1 5.4 30 » 0.047 0.076 oe 1 7.2 30 » 0.017 0.048 é, Fa VII. Tableau LA ES : 1 1.8 90 0.017 0.030 Ar fl 3.6 90 0.047 0.060 Re” 1 3.4 90 0.017 0.090 si - I 7.9 90 0.017 0120, 008 1 9 90 0.017 01407, 0470 1 10.8 90 0.017 0.129. +22 1 | VILI. Tableau | : Lu CE Pyrogallol H20: Æ Dee 1 5 30 0.05 0.1058 me. 1 10 30 0.05 0.1535 ; 1 15 30 0.05 0.1340 ; IX. Tableau | ARTS 5 40 0.05 0.1000 1 10 50 0.05 5: M0 TES i 15 L0 0.05 . IV SS X. Tableau 5) | ET PRET UE 1 10-77 "100 0.657 "0.200 15 bah. Li d Ces expériences nous montrent la toxicité du peroxyde de l'hydrogène vis-à-vis du ferment. XI. Tableau Pyrogallol H:0: Liquide Peroxydase Purpurogalline 1 15 200 0.05 0.250 1 20 250 0.05 0.180 1 25 300 0.05 0.170 On voit ici qu'en maintenant la quantité de ferment constante et en augmentant la quantité d’eau oxygénée, il y a même, avec une dilution correspondante, regression. Il y a dans un optimum de concentration à définir pour chaque peroxydase. Pyrogallol H:02 Concentr. Vol Peroxydase Purpurogalline 1 29 0 071 377 0.05 0.353 1 30 0.075 128 0.05 0.405 1 39 0.079 474 0.05 0.455 1 39 0.071 928 0.05 0.396 Pyrogallol H:02 Concentr. Liq. total Peroxydase Purpurogalline 1 ù 0.055 97 0.05 0.097 1 10 0.059 190 0.05 0.164 1 15 0.063 299 0.05 0.226 1 20 0.067 320 0.05 0.289 1 26 0.071 377 0.05 0.353 L'augmentation est ici proportionnelle à l’augmentation de la concentration soit 0.067-0.063. Pyrogallol H202 Concentr. Liq. total Peroxydase Purpurogalline 1 1.8 0 0618 30 0.017 0.033 1 3.6 0.0618 60 0.017 0.066 1 ».4 0.0618 99 0.017 0.091 1 7.2 0.0618 120 0.017 0.121 1 9 0.0618 150 0.017 0.147 1 10.8 0.0618 180 0.017 0.180 Dans notre expérience nous retrouvons la proportio- nalité découverte par Bach et Chodat, mais avec notre peroxydase purifiée nous n’obtenons ces résultats qu’à la condition de diluer proportionellement l’eau oxygénée. 2" 00e D— — — PACA LS LYAT QUE SZ à ERES EEE ETS Sr mi « PURE PR ET MT GE he | PO Pine TT A. NSTITUTION LIBRARIES > TL ee a UE 7