现代 生物 技术 前 洛 UND dt 党 由 at www.sciencep.com Digitized by the Internet Archive In 2011 with funding from Institute of Botany, CAS and Internet Archive http://www.archive.org/details/daixiezuxuefangf00xugu fat Madd a hig ds ne ii} NN we ek tity a ‘at if er ‘ P 7 Ma ie he 7. iy ff } wai (‘hs vie 4 ‘Va Nae a vv f ee): Varn af a) ind eral |e : ?) Ae 2 if aie * 5, 现代 生物 技术 前 沼 许 国 旺 等 # UL / at Gok Mm Ze 北 oUt A # ® 介 本 书 是 国内 第 一 部 集 基 本 理论 和 实际 应 用 于 一 体 的 、 极 有 价值 的 关于 代谢 组 学 的 专著 , 对 学 科 的 发 展现 状 、 面 临 问题 、 应 用 前 景 、 未 来 趋势 和 学 科 本 身 的 价值 都 做 了 客观 、 科 学 的 描述 。 除 简要 回顾 代谢 组 学 的 发 展 历 史 、 特 点 外 , 重 点 介绍 了 代谢 组 学 技术 平台 及 其 在 健康 疾病 、 药 物 毒性 、 植物 、 微 生物 、 营 养 科 学 和 环境 科学 研究 中 的 应 用 , 使 读者 能 在 短 时间 内 对 最 新 的 技术 和 国内 外 进展 有 一 全 面 了 解 。 为 适应 不 同 层次 人 员 对 代谢 组 学 知识 的 需求 , 本 书 在 全 面前 述 色 谱 、 质 谱 、 核 磁 共 振 谱 和 多 变量 数据 分 析 方 法 在 代谢 组 学 中 的 应 用 的 同时 , 图 文 并 茂 地 剖析 了 代谢 组 学 在 不 同 领 域内 的 应 用 , 使 读者 能 很 容易 地 应 用 本 书 解决 相关 领域 中 的 问题 。 本 书 既 可 作为 从 事 代谢 组 学 研究 的 专业 人 员 的 参考 书 , 也 可 作为 相关 领域 研究 生 的 教材 。 对 代谢 组 学 感 兴趣 或 具备 一 定 的 生物 化 学 和 分 析 化 学 背景 的 读者 也 可 根据 自己 所 从 事 的 专业 有 选择 地 阅读 部 分 章节 。 图 书 在 版 编目 (CPP) 数 据 代谢 组 学 : 方法 与 应 用 / 许 国 旺 等 著 , 一 北京 : 科学 出 版 社 ,2008 《现代 生物 技术 前 沿 ) ISBN 978-7-03-021528-4 I. fee) TL. 许 … OL. 代谢 -研究 TV.Q493.1 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2008) 第 043299 号 责任 编辑 : 夏 梁 席 慧 /责任 校对 : 刘 小 梅 责任 印 制 : 钱 玉 芬 /封面 设计 : 陈 H ae ek BM BEM 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 : 100717 http://www.sciencep.com 新 EG P AM OT Epil 科学 出 版 社 发 行 AT A 关 2008 年 8 月 第 "一 版 FRA: 787X1092 1/16 2008 年 8 月 第 一 次 印刷 印张 : 27 TV2 插页 : i 印 数 : 1—2 000 字数 : 624 000 ”定价 : 88. 00 元 (如 有 印 装 质量 问题 , 我 社 负 责 调 换 《 新 蕾 >) FF 随 着 “基因 组 学 ”的 提出 , 目 前 冠 以 “组 学 ”的 名 字 已 有 200 多 种 。 代 谢 组 学 是 研 究 细胞 和 生物 体 的 所 有 代谢 中 间 体 和 终 产物 〈 即 代谢 组 ) 的 一 门 新 兴 科 学 。 相 对 于 DNA 或 蛋白 质 等 生物 高 分 子 而 言 , 代 谢 组 学 的 研究 对 象 一 般 为 分 子 质量 在 1000Da 以 下 的 小 分 子 。 不 同 于 基因 和 蛋白质 具 有 相对 严格 的 种 属 和 细胞 特异 性 , 同 一 代谢 物 在 任 何其 存在 的 物种 中 都 具有 相同 的 理化 性 质 。 即 便 如 此 , 代 谢 物 的 功能 却 并 不 限于 是 代谢 途径 中 某 酶 的 底 物 或 产物 , 它 们 具有 结构 单元 、 能 量 的 载体 和 储存 体 、 信 和 号 分 子 、 神 经 递 质 、 转 录 和 翻译 的 调控 因子 、 蛋 白质 功能 的 调控 因子 、 辅 酶 、 分 子 伴侣 、 肠 道 因 了 于 和 诱 变 剂 等 诸多 功效 , 在 生命 活动 中 以 代谢 网 络 的 形式 相互 作用 , 参 与 生命 活动 的 各 个 过 程 。 由 于 代谢 网 络 处 于 基因 调控 网 络 、 信 号 转 导 网 络 和 蛋白质 互 作 网 络 的 下 游 , 因 此 代 谢 组 学 研究 能 反映 基因 组 、 转 录 组 和 和 蛋白质 组 受 内 外 环境 影响 后 相互 协调 作用 的 最 终结 果 , 更 接近 于 反映 细胞 或 生物 的 表 型 。 代谢 物 的 众多 功能 和 代谢 组 学 的 重要 性 及 其 测试 技术 的 适用 性 使 代谢 组 学 成 为 系统 生物 学 中 继 基因 组 学 、 转 录 组 学 、 蛋 白质 组 学 后 的 一 个 重要 的 组 学 平台 , 被 广泛 地 应 用 于 医学 、 药 学 、 动 植物 学 、 微 生物 学 、 环 境 科 学 和 食品 科学 等 生命 科学 的 各 个 研究 领 域 。 国 际 上 代谢 组 学 的 研究 萌芽 于 20 世纪 80 年 代 , 在 来 自 不 同 领域 的 科学 家 们 的 共同 努力 下 , 于 90 年 代 末 期 得 到 迅猛 发 展 , 形 成 以 核磁 共振 (NMR) 和 色谱 -质谱 为 核心 的 两 大 技术 平台 , 并 逐渐 得 到 广泛 应 用 。 英 国 帝 国 理工 大 学 和 辉瑞 (Pfizer) 等 六 大 制 药 公司 在 COMET 计划 中 率先 采用 代谢 组 学 方法 来 评价 药物 的 毒性 , 并 取得 了 极 大 的 RA; RE FDA 已 尝试 将 代谢 组 学 技术 作为 药物 安全 性 评价 的 一 种 方法 。 以 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 许 国 旺 研究 员 为 首 的 研究 小 组 是 最 早 系统 从 事 代谢 组 学 研究 的 科 研 团体 之 一 , 在 国际 上 也 有 较 高 的 学 术 地 位 。 该 研究 组 以 色谱 质谱 联 用 技术 为 主导 , 从 技术 平台 的 建立 到 代谢 组 学 在 疾病 、 药 物 、 营 养 、 植 物 和 微生物 研究 中 的 应 用 , 形 成 了 一 套 较 为 完整 的 代谢 组 学 研究 体系 。 《代谢 组 学 一 一 方法 与 应 用 》 是 国内 第 一 部 代谢 组 学 基本 理论 和 实践 应 用 的 专著 。 该 书 的 出 版 将 会 极 大 地 推进 代谢 组 学 技术 在 我 国 的 普及 和 应 用 , 同 时 也 将 为 相关 部 门 合 理 规划 代谢 组 学 的 发 展 提供 必要 参考 。 中 国 工 程 院 院士 ” 杨 胜利 2008 年 1 月 Dit 前 1995 年 , 本 人 获 马 普 〈Max-Planck=-Institute) 研究 基金 资助 , 前 往 德 国 图 宾 根 大 学 医学 院 (University of Tuebingen) 作 高 级 访问 学 者 , 开 始 涉足 生命 科学 的 研究 。 作 为 年 轻 的 科学 工作 者 , 本 人 深 知 分 析 化 学 在 生命 科学 中 的 重要 性 。 健 康 与 疾病 是 生命 科 学 研究 中 永恒 的 主题 , 也 是 国家 和 社会 发 展 中 需要 长 期 关注 和 投入 的 领域 , 为 此 , 我 选 择 了 尿 液 中 代谢 组 分 和 恶性 肿瘤 的 关系 作为 切 人 点 , 采 用 亲 和 色 谱 的 方法 提取 尿 液 中 的 修饰 核 苷 , 并 首次 建立 了 分 析 尿 液 中 核 苷 的 毛细 管 电泳 方法 , 使 检测 分 辩 率 提高 的 同 时 , 也 提高 了 分 析 通 量 。 通 过 对 震 患 十 几 种 不 同 癌症 的 患者 尿 液 进行 检测 发 现 , 瘤 症 串 者 的 尿 液 中 修饰 核 苷 总 量 明 显 高 于 正常 人 。 但 是 始终 没有 发 现 某 种 特定 核 苷 与 癌症 的 关 联 。 事 实 上 , 在 不 同 的 癌症 患者 个 体 中 , 并 非 所 有 修饰 核 苷 的 排放 量 均 产 生 有 规律 的 增 高 现象 , 而 是 出 现 了 有 的 显著 增高 、 有 的 略 有 增高 、 有 的 甚至 反而 降低 的 复杂 情况 。 通 过 对 大 量 数 据 的 研究 表明 , 瘤 症 患 者 尿 液 中 没有 一 种 修饰 核 苷 的 排放 量 总 是 高 于 正常 人 , 以 其 中 某 种 修饰 核 苷 的 排放 量 作为 依据 时 , 癌 症 的 检 出 率 仅 为 40%% 左 右 。 由 此 判 定 , 采 用 单一 代谢 物 指标 进行 癌症 诊断 的 思路 是 值得 商 椎 的 。 人 体 是 个 复杂 的 系统 , 存 在 于 这 一 系统 中 的 物质 之 间 必 然 存 在 着 联系 , 那 么 修饰 核 苷 之 间 也 可 能 存在 着 某 种 联系 。 由 此 , 我 们 在 1997 年 开始 将 多 变量 的 模式 识别 方法 用 于 癌症 诊断 , 对 近 千 个 癌症 患者 尿 样 中 核 苷 的 浓度 数据 进行 处 理 , 原 先 无 序 可 循 的 数据 则 奇迹 般 地 变 得 有 规律 起 来 。 最 终 我 们 证 明 , 尿 液 中 修饰 核 苷 的 代谢 模式 变化 可 用 于 癌 证 的 早期 发 现 和 术 后 随访 , 并 具有 广 谱 性 , 尤 其 适用 于 手术 效果 评价 及 预后 评估 。 在 此 基础 上 我 们 意识 到 , 以 小 分 子 的 产生 作为 表象 的 代谢 活动 应 能 够 更 准确 地 反映 生物 系统 的 状态 , 易 于 与 现实 世界 建立 正确 的 联系 。 对 代谢 物 必 须 进 行 综合 分 析 , 也 即 只 有 对 整个 代谢 指纹 按 “ 组 学 ”的 方式 进行 研究 才 有 意义 , 疾 病 早 期 发 现 和 诊断 也 应 从 利用 单一 标志 物 向 组 合 标志 物 转变 。 恩 师 卢 佩 章 院 土 早 年 提出 的 希望 我 们 能 进行 “建立 人 体 体 液化 学 指纹 数据 库 ” 的 构想 就 是 要 用 分 析 化 学 的 方法 , 把 一 个 人 从 婴 幼 儿 到 成 年 的 化 学 指纹 变化 记录 下 来 , 从 中 发 现 个 体 疾 病 易 感性 , 实 际 上 就 是 人 群 的 “代谢 组 学 ” 研究 。 2001 年 , 在 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 骨干 人 员 人 参加 的 科研 规划 研讨 会 上 , 本 人 受 当 时 的 所 长 包 信 和 研究 员 的 邀请 做 了 专题 报告 , 第 一 次 在 所 里 正式 介绍 “代谢 组 学 ”, 并 被 列 为 中 国 科 学 院 知 识 创新 工程 〈 二 期 ) 重点 支持 方向 。 同 年 , 杨 胜利 院士 出 任 我 所 生物 技术 研究 部 主任 , 将 “代谢 组 学 ”研究 作为 部 里 的 重要 发 展 方向 , 并 将 我 们 的 研究 平台 介绍 给 相关 单位 。 本 课题 组 也 在 此 时 拥有 了 新 名 字 一 一 高 分 辩 分 离 分 析 及 代 谢 组 学 , 并 成 为 后 来 成 立 的 大 连 化 学 物理 研究 所 “代谢 组 学 研究 中 心 ”的 核心 。 这 是 学 科 凝 炼 的 结果 , 也 忠实 记录 了 我 们 进行 代谢 组 学 研究 的 发 展 轨 迹 。 与 此 同时 , 科 技 部 做 出 了 及 时 的 支持 ,2003 年 设立 了 国内 第 一 个 针对 代谢 组 学 的 国家 高 技术 研究 发 展 计划 〈“863” 计 划 ) 项 目 一 一 代谢 组 学 技术 平台 的 研究 , 由 本 人 担 | ie 任 项 目 负责 人 。2003 年 底 , 中 国 科 学 院 在 上 海 生 命 科 学 院 召开 了 关于 “植物 、 微 生物 代谢 组 学 和 代谢 工程 ”学 术 研讨 会 。 在 会 上 , 本 人 受 邀 做 了 题 为 “植物 、 微 生物 代谢 组 学 技术 平台 的 研究 ”的 报告 , 会 场 座无虚席 , 与 会 科研 人 员 和 青年 学 生 对 代谢 组 学 所 表 现 出 的 热情 与 2002 年 的 情景 形成 鲜明 对 比 。 那 年 , 同 样 是 我 受 吴 家 睿 副 院 长 邀请 在 上 海 生命 科 学 院 做 类 似 报告 , 吴 院 长 为 避免 “冷场 ”, 不 得 不 亲自 向 逐个 部 门 打 电 话 动员 听众 。 短 短 一 年 半 时 间 , 代 谢 组 学 在 国内 的 “知名 度 ” 有 了 如 此 飞 牙 使 本 人 在 感动 于 国 内 科研 人 员 巨 大 热情 和 科研 敏感 性 的 同时 , 更 加 坚定 了 进行 代谢 组 学 研究 、 推 广 代 谢 组 学 科学 的 信心 。 近年 来 代谢 组 学 鞍 勃 的 发 展 势 头 与 多 学 科 领 域 科学 家 以 及 政府 部 门 的 极 大 重视 密 不 可 分 。 特 别 是 在 “十 一 五 ”期 间 , 科 技 部 先后 在 国家 重大 研究 计划 “蛋白质 科 学 ”、 家 重点 基础 研究 发 展 规划 〈“9732)、“863” 计 划 和 “十 一 五 ”科技 支撑 项 目 、 食 品 安全 等 方面 支持 了 代谢 组 学 的 研究 。 代 谢 组 学 和 系统 生物 学 被 科技 部 和 欧盟 第 7 框架 计划 列 为 促进 中 医药 现代 化 的 主要 途径 之 一 。 国 家 自然 科学 基金 委员 会 化 学 科学 部 连续 多 年 将 “组 学 分 析 中 的 新 原理 、 新 方法 和 新 技术 ” 列 为 重点 项 目 支持 方向 。 同 时 很 多 科学 家 也 都 急于 进入 这 个 新 的 研究 领域 。 为 了 适应 我 国 代谢 组 学 高 速 发 展 的 需要 , 满 足 广 大 科学 工作 者 的 要 求 , 我 们 在 前 期 工作 的 基础 上 , 应 科学 出 版 社 邀 请 , 扎 写 了 本 书 。 本 书 第 1、10 章 由 许 国 旺 撰写 ; 第 2 章 由 路 读 撰 写 ; 第 3 章 由 杨 军 和 王 媛 撰写 ; 第 4 章 由 赵 欣 捷 撰写 ; 第 5 章 由 石 先 哲 撰 写 ; 第 6 章 由 田 唱 撰写 ; 第 7 章 由 和 孔 宏 伟 撰 写 ; .第 8 章 由 王 畅 撰写 ; 第 9 章 由 杨 军 撰写 ; 第 11 RABI. EH. HERS; 第 12 章 由 尹 沛 源 撰 写 ; 第 13 章 由 汪 江 山 撰写 ; 第 14 章 由 马 晨 菲 撰 写 ; 第 15 章 由 高 鹏 撰写 ; 第 16 章 由 赵 春 震 撰 写 。 全 书 由 许 国 旺 统一 汇总 、 定 稿 。 这 些 作 者 都 是 奋战 在 代谢 组 学 科研 一 线 的 青年 , 他 们 具有 丰富 的 代谢 组 学 研究 经 验 , 同 时 一 直 密 切 关注 国际 上 代谢 组 学 研究 的 发 展 , 因 此 , 此 书 中 的 许多 内 容 反映 了 当前 代谢 组 学 的 最 新 进展 , 也 包含 了 本 研究 组 从 1996 年 以 来 在 相关 领域 取得 的 研究 成 果 。 本 书 除 曾 述 代谢 组 学 的 发 展 历史 和 特点 外 , 重 点 介绍 了 代谢 组 学 技术 平台 及 其 在 疾病 、 药 物 、 微 生物 、 营 养 和 环境 研究 中 的 应 用 , 使 读者 对 代谢 组 学 研究 的 最 新 技术 和 国内 外 进展 有 一 较为 系统 的 了 解 。 除 全 面 地 讲解 了 关于 色谱 (GC、LC) 、 质 谱 〈(MS) 、 核 磁 共 振 (NMR) 和 多 变量 统计 方法 在 代谢 组 学 中 应 用 的 基础 知识 外 , 本 书 力求 图 文 并 茂 地 剖析 大 量 研 究 实 例 , 展 示 代 谢 组 学 在 不 同 领域 内 发 挥 的 作用 , 使 读者 能 够 更 好 地 应 用 本 书 解决 生命 科学 面临 的 实际 问题 , 以 适应 不 同 层次 科研 人 员 对 代谢 组 学 知识 的 需求 。 本 书 在 撰写 过 程 中 特别 是 在 相关 项 目的 进行 过 程 中 , 得 到 了 卢 佩 章 院 士 、 杨 胜利 院 +. RA GEL. KEGEL. J. van der Greef HH. J. Nicholson 教授 、 刘 昌 孝 院 士 、 陈 竺 院士 、 王 红 阳 院士 、 欧 阳平 凯 院 士 、 黎 介 寿 院士 、 李 兰 娟 院士 、 包 信和 研究 员 、 张 涛 研究 员 、 吴 家 睿 研 究 员 、 马 延 和 研究 员 、Mei Wang 博士 和 其 他 同仁 的 大 力 支 持 和 帮助 , 也 得 到 了 国家 杰出 青年 基金 “代谢 组 学 技术 平台 ” (No. 20425516)、 国 家 重 点 基础 研究 发 展 规划 〈“973”) 项 目 “生物 系统 催化 的 理论 和 方法 : 生物 催化 和 生物 转 化 中 关键 问题 的 基础 研究 ”(2003CB716003)、“ 生 物 炼 制 细胞 工厂 的 科学 基础 : 细胞 代 谢 网 络 的 结构 与 动态 特征 分 析 ” (2007GCB707802)、“2 型 糖尿 病 发 生发 展 机 制 的 研究 : 2 型 糖尿 病 发 病 机 制 和 营养 干预 的 代谢 组 学 研究 ” (2006CB503902)、 国 家 “863” 目 标 . 1V . 导向 类 课题 “妇科 常见 恶性 肿瘤 的 生物 标志 物 谱 发 现 及 临床 应 用 ” (2006 AA02Z342) , “发 酵 法 生产 富 马 酸 的 技术 研究 ”(2006AA02Z240)、“ 十 一 五 ”国家 科技 支撑 计划 “ 残 留 标 示 物 高 通 量 表征 关键 技术 研究 ” (2006BAK02A12) 和 “中 医药 诊疗 技术 及 特色 产 品 应 用 研究 ”(2006BAI11B07) 、 科 技 部 国际 科技 合作 项 目 “代谢 组 学 用 于 中 药 质量 控 制 的 方法 学 研究 ”(2007DFA31060) 、 中 德 中 心 “中 德 复杂 样品 的 分 离 分 析 ” 联 合 研 究 小 组 〈GZ364,NSFC 和 DFG)、 国 家 自然 科学 基金 “类 脂 分 析 的 方法 学 研究 ” 《20675082) 、 中 国 科学 院 重点 方向 性 项 目 “ 植 物 、 微 生物 的 代谢 组 学 ” (KKSCX2-SW- 329)、“ 基 于 现代 理论 和 技术 的 复方 中 药 系 统 研究 ” (KGCX2-SW-213) 、 中 国 科 学 院 重 。 大 方向 性 项 目 “ 抗 2 型 糖尿 病 候 选 新 药 和 干预 新 方法 的 系统 性 研究 : 糖尿 病 发 生发 展 的 ”营养 干预 和 机 理 研 究 ” (KSCX1-YW-02) 和 中 国 科 学 院 创 新 基金 “代谢 组 学 在 肝脏 疾 病 研 究 中 的 应 用 ”(K2006A12)、“ 代 谢 组 学 指纹 图 谱 平 台 ” (K2006A13)、“ 维 医 、 维 药 的 系统 生物 学 研究 ” 〈K2006Al4) 的 资助 。 本 书 的 内 容 也 是 这 些 基金 和 项 目 支持 下 研究 成 果 的 集中 体现 。 对 此 , 我 们 说 表示 最 衷心 的 感谢 。 最 后 , 我 还 要 感谢 我 的 同事 、 学 生 及 其 相关 家 属 的 支持 和 理解 , 大 家 在 极度 繁忙 的 情况 下 牺牲 很 多 休息 时 间 完 成 了 有 关 章 节 的 写作 。 由 于 时 间 人 仓促、 水 平 有 限 , 书 中 存在 不 妥 之 处 在 所 难免 , 祈 望 广大 读者 不 音 指正 。 许 国 旺 - 2008 年 1 月 于 大 连 oe tani ser: OS) “Cua a ORR ACR LP WX, i; poe Ot a Cpe ea a ae Sh LONAL ROO TOR Bei i BLA: vero Co ue os aR eRe ‘as cen att etree | sae a ait ~aghiy ~~ 8 Ss 4 a é . VA 4 i. : Pp? r 向 i iy + a ; | ey 7 ~~ 人 7 ‘ 上 =, FF 前 言 第 1 章 绪论 1 1.1 代谢 组 学 简介 cccec reece cece ee ee ee cet ee cence ee eeeeeeeneeeeeeeeeeseeeeeeeeeeeneseeeseeseeees | 1.1.1 代谢 组 学 发 展 的 时 代 背 景 pp 1 1.1.2 代谢 组 学 研究 现状 4 1.1.3 代谢 组 学 与 系统 生物 学 pp 8 12.5 代 谢 组 学 的 研究 方法 -ee 8 1.2.1 样品 采集 与 制备 corte e cee eee ec eee eeseeeeneeceeeeeeeeeeeseeeseeeeeeeeeeeseeeseeeees 10 1.2.2 代谢 组 数据 的 采集 pp 10 1.2.3 数据 分 析 平台 ccc ccecee cee eee sence eee eeeeeeeeseeeeeeeeeeeceeeeeseeeeeeaeseeeeneen ens 12 1.2.4 代谢 组 学 数据 库 RN 13 1. 3 -代谢 组 学 的 应 用 .pp 14 3:1 药物 研发 alate aleaiaininle wjntwraietsieeteietelae sipiath bieteva ele wate is olua are’ arels aqua sreteta Siete ae airs ie’ 6 a peteetie » sete a nis 14 1.3.2 疾病 研究 15 1.3.3 植物 代谢 组 学 coo ee rece ec cence neeereneceeeeeeeeseeesesestsnensneneneeeneeeseseseees 16 1.3.4 微生物 代谢 组 学 pp 17 1.3.5 FRIAS EZR Acree ee eee c cece eee eee ee ee ee ec eeeeeenseeeeeseeeeaseeneeerenes 7 Die «+ ER ARNE Re ee Fe Bains sa erin gupta gyn itn Pe a cig a Tt daides viens dun sh ble eee aR onside geepencenes 18 BEER cc ec ec ete ce cece ceeceeecesecececeeeeeceeeesecneeeseensecececesecseenseeeseeeseesesnensesege 22 第 2 章 气相 色谱 -质谱 技术 在 代谢 组 学 中 的 应 用 .3 29 2.1 气相 色谱 = 质谱 联 用 技术 PP 29 2.1.1 _ GCMS 的 工作 原理 pp 30 2.1.2 全 二 维 气 相 色谱 -飞行 时 间 质 谱 联 用 技术 (GCXGC-TOFMS) pp 31 2.1.3 质谱 谱 图 库 pp 34 2.2 #EF GC-MS, GCXGC-TOFMS 的 代谢 组 学 技术 平台 pp 34 2.2.1 样品 的 采集 与 制备 34 2.2.2 数据 采集 站 pp 36 2.2.3 2£F GC-MS, GCXGC-TOFMS 4878 AUTRE EAP BB coerce cece eeeeee eee 38 2.2.4 代谢 物 的 结构 鉴定 pp 41 2.3 代谢 组 学 应 用 .PP 42 2.3.1 GC-MS 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 .pp 42 2.3.2 全 二 维 气相 色谱 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 :pp 42 2.4 发 展 与 展望 .pp 45 人 参考 文献 ea 46 SIE 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 …PPPP 49 3.1 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 ee 49 3.1.1 液 相 色谱 49 3.1.2 液 相 色谱 -质谱 联 用 .pp 50 3.1.3 基于 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 方法 的 优势 和 发 展 趋势 “…” 52 3. 2 ”用 于 极 性 小 分 子 分 析 的 二 维 液 相 色谱 分 离 系统 .PP 55 3.3 液 相 色谱 及 液 相 色 谱 -质谱 联 用 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 实例 ……… 58 3.3.1 液 相 色谱 代谢 轮廓 分 析 方 法 用 于 肝脏 疾病 严重 程度 的 诊断 vere ec cere eer ee eees 59 3. 3.2 ”基于 液 相 色 谱 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 方法 用 于 慢性 乙 型 肝炎 的 急性 发 作 疾 病 研 究 pp wees 63 3. 3. 3 全 二 维 亲 水 作用 色谱 质谱 联 用 技术 用 于 极 性 复杂 样品 中 结构 类 似 组 分 的 分 离 和 鉴定 pe 74 参考 文献 cece cece cece eee e eee erene eee eee nee eeeeeeeeneeneessesenseneesensensenseensensesensees 84 第 4 章 , 超 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 及 在 代谢 组 学 中 的 应 用 ee 87 和 于, 超 高 效 液 相 色 谱 的 理论 基础 87 4.1.1 van Deemter JyPx tt ester rete tte ee tee e eee eee eeeeneeeeeeeeeneeeeeneeeenneeenaans 87 4.1.2 超 高 效 液 相 色 谱 仪 器 pp 88 4.2 超 高 效 液 相 色谱 与 HPLC 分 析 性 能 的 比较 pp 88 4.2.1 超 高 效 液 相 色谱 与 HPLC 色谱 分 离 性 能 的 理论 比较 pp 88 4.2.2 超 高 效 液 相 色谱 、HPLC 与 质谱 联 用 性 能 的 比较 pp 91 4.3 超 高 效 液 相 色谱 在 代谢 组 学 中 的 应 用 和 pp 95 4.3.1 超 高 效 液 相 色谱 -质谱 用 于 代谢 组 学 研究 的 优势 .pp 95 4.3.2 超 高 效 液 相 色谱 与 质谱 联 用 用 于 代谢 组 学 研究 实例 pp 97 参考 文献 pp 人 *- 103 SSS CMSB RMR ARREARS RAIMA cece eeeeeeeeees 105 5.1 毛细 管 电泳 -质谱 联 用 技术 简介 105 5.1.1 同 轴 液 体 戎 流 pp 106 5.1.2 无 鞘 接 口 pp 106 5.1.3 液体 连接 pe 106 5.2 基于 毛细 管 电 泳 -= 质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 平台 .PP 106 5.2.1 阳离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 pp 107 5.2.2 阴离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 pp 107 5.2.3 多 价 阴离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 ppp 109 553 二 到 细 管 电泳 在 代谢 组 学 中 的 应 用 研究 112 5.3.1 微生物 菌株 细胞 提取 物 的 代谢 分 析 .PP riz 5.3.2 植物 细胞 提取 物 的 代谢 分 析 pp 115 5; 323 疾病 诊断 和 生物 标志 物 发 现 ES a7 5.3.4 食品 安全 cece ec eec eee ece eee eeeseeeeececeeeeeeeeeeseeseeeestecseeeeeeeeesaeeeeseeees 118 * vili 。 参考 文献 .ee 119 第 6 章 , 核磁 共振 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 .pp 121 Ge 1 PRESE DRE RESP AT ABEL wcnec eee ceeeeeeeeeeseeeeeeenditedebenetneaddsteceseetenteseeoes 121 Galo 核磁 共振 概论 ooesoeeoooooooooooooooooooooooooooooovoovoooosoooooooooooooooooooo 121 6.1. 2 核磁 共振 波谱 仪 cee ee eee e cee ee ee ece eee eec ec ececeeeeeeneceeenecsenseensseeaneees 123 6.1.3 核磁 共振 毛 谱 cere ee eee rece eee tence eee ecerececeeeeeeeeseeenesereseseeeeeeeeeees 123 6.1.4 核磁 共振 碳 谱 cence eee e rete e ec ee ee eeeeee tec eeeeeceeeeeeeeseeeeesereceseseeneneeees 125 6.1.5 3 P FEN 核磁 共振 126 6.2 代谢 组 学 中 的 核磁 共振 波谱 分 析 方 法 cece ese recee cent eee cece eee eee eeeeeeee eens 127 6.2.1 样品 的 准备 cecec eee e eee ec eect ee sees eee eeeeeeeeeseseeeeeeeeeeaeceserereeeeneeeeees 127 6.2.2 实验 数据 的 获得 pp 128 6.2.3 数据 分 析 ccecec ect c ec eceee eee ee ececececeeeeeeeeceeeeeeereeseeeeseseensesensesereces a2 6.3 核磁 共振 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 PN 133 6. 3. 1 在 药物 毒 理 学 评价 研究 中 的 应 用 ooooooooroooooooooooioooiooooooooooooooooooy 134 6.3.2 在 人 体 代谢 和 动物 代谢 研究 中 的 应 用 pp 135 6.3.3 在 病理 和 生理 研究 中 的 应 用 cece cece eeceeteeeeeeeee ene eeeeeeceeeeeceseeeees 136 6. 3. 4 在 环境 监测 方面 的 应 用 ooooesooooovoooooooooooovoooooooooooooooooooooooooooooooo。 136 6.3.5 在 植物 化 学 研究 中 的 应 用 pp 137 6.3.6 在 微生物 系统 研究 中 的 应 用 pp 137 6.4 展望 .ee 137 参考 文献 .pp 9 oo 二 区 二 全 138 第 7 章 “代谢 组 学 研究 中 常用 的 化 学 计量 学 方法 :ee 142 7.1 数据 预 处 理 方 法 pp 143 Veg ea | 原始 数据 矩阵 的 获得 seoeooooooveoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooiooooooo sy。 143 7.1.2 自 变 量 科 选 pp 144 7.1.3 数据 的 标 度 化 及 滤波 ppp 144 7.2 常用 的 模式 识别 方法 pp 146 7.2.1 无 监督 的 模式 识别 方法 pp 146 7.2.2 有 监督 的 模式 识别 方法 pp 152 7.3 数据 库 及 专家 系统 PP 157 ii 159 第 8 章 类 脂 和 类 脂 组 学 .pp 161 8.1 类 脂 分 子 的 结构 和 功能 PN 162 8.1.1 非 极 性 类 脂 pp 162 8.1.2 极 性 类 脂 pp 163 8.1.3 类 脂 代谢 物 pp 166 8.2 类 脂 的 分 子 生 物 学 D9] .pp 166 8.2.1 表面 化 学 和 界面 催化 pv 167 8.2.2 BSE ARSE SE SAS ADAIR corer ec eet et ete tence eee eeeee een eeeenen ewes 167 8.2.3 类 脂 - 和 蛋白 质 相 互 作 用 ooeooooooosooooooooovoooooooooooooooosoeoooooooooooosooossoees。 167 ie Cait, Vee a: ee eee eT es 168 83:4 类 脂 的 提取 方法 ooesoeeoeoooooosooooooeoooooooosoeooooooooooooooooooooooooooooeoeoeeeo。 168 832 2 类 脂 的 分 析 方 法 sesooeseooosovooooooooooooooooooooooooooioooooooooooooooooosoooseoo。 169 8:4i, 下 SFEMS 在 类 脂 分 析 申 的 定量 方法 -rononcoreiteaaaaeyiasvaa 171 84: 1 内 标 化 合 物 的 选择 sosoeosoooosoooooosoooooooosooooeooooooooooooosoooooooooooooooooowooooes i Fra 8.4.2 MS 在 定量 分 析 类 脂 分 子 中 存在 的 问题 soon 1] 人 2 8.4.3 ESI-MS 在 类 脂 研究 中 的 定量 方法 ppBPpp ee 172 8 天 脂 组 学 及 其 应 用 ,on 交手 汪 2 178 8.5.1 ARAB AE cece eceeeeceecsscssesccscnscnseeerseeseeseesenseeee se ecssercoseneseneesens 178 8.5.2 类 脂 组 学 中 类 脂 分 子 识别 的 策略 pp 179 8.5.3 基于 质谱 技术 的 几 种 类 脂 组 学 方法 :ppp 180 8.5.4 类 脂 组 学 在 微生物 研究 中 的 应 用 RN 181 8.5.5 类 脂 组 学 在 宿主 -病原 体 相 互 作用 研究 中 的 应 用 入 182 8.5. 6 类 脂 组 学 在 六 3 多 不 他 和 脂肪 酸 影 响 细胞 膜 微 区 域 研究 中 的 应 用 ……… 182 8.5.7 类 脂 组 学 在 疾病 和 药物 开发 研究 中 的 应 用 MP 183 8.5.8 类 脂 组 学 在 功能 研究 中 的 应 用 pp 187 8.5.9 ASABSA RPE Za ye FA DEFE BAG IAD cece cece eee ee cece cence eee eee eeeeeeeeeeeeeeeees 188 8.5.10 与 类 脂 组 学 相关 的 数据 库 pp 9 小 结 cet cece eee eeeeeereecenceeeeceseeeneseseeseceeceasesensecsessnsensesseseseesensesenseues 190 参考 文献 站 190 第 9 章 , 代谢 组 学 在 疾病 分 型 和 标志 物 发 现 研究 中 的 应 用 .pp 195 9.1. 弓 | 吝 pe 195 9.2 ”代谢 组 学 用 于 心血 管 疾病 严重 程度 的 诊断 pp nae OT 9.3 ”基于 修饰 核 苷 的 代谢 组 学 用 于 肝脏 疾病 的 研究 .pp 201 9.3.1 代谢 物 的 靶 标 分 析 pp 202 9.3.2 顺 二 醇 类 代谢 物 的 轮 廊 分 析 pp 203 9.3.3 洪 在 标志 物 的 寻找 pp 205 和 代谢 组 学 用 于 恶性 肿瘤 的 研究 nneeeo eee seecnuinasenecdastione dee sieceendnedineteeennes 206 9.5 “代谢 组 学 在 其 他 疾病 分 型 和 标志 物 发 现 研究 中 的 应 用 ee 208 参考 文献 pe 210 第 10 章 , 修饰 核 苷 在 癌症 诊断 和 随访 中 的 应 用 BR 212 10. 1 概论 212 10.1.1 癌症 诊断 的 方法 概况 pp 219 10. 1. 2 肿瘤 标志 物 的 概况 pp 214 10.1.3 修饰 核 苷 的 来 源 及 在 癌症 患者 中 修饰 核 苷 增高 的 根源 woe ceeeee eee ceece rete 218 10.1.4 修饰 核 苷 作 肿瘤 标志 物 的 可 行 性 pp 221 10.2 (BYR AE REF AY ADT FA ALb BB ee eee eee eee eee e ence ee ence ne ene eee ees eee eerees 999 °' 10"2:4 体液 中 修饰 核 苷 的 分 析 ooooesooosooosoooooooeoooeoosoosoeoooosooooooooooooeossseoeooos。 22? 10.2.2 ”多 变量 可 视 化 数据 分 类 的 方法 pp 226 10. 3” 尿 中 核 苷 在 恶性 肿瘤 诊断 、 治 疗 随访 中 的 应 用 .pp 239 10. 3h RPEMBHOARR HEY Seem meee eee e ewe ean scenes seesaseeesseeessesseseens 239 10. 3.2 PEE HE AIR RE LE ZS HIRT AY DEBE 入 246 10.3.3 和 良性、 恶性 肿瘤 尿 中 修饰 核 苷 排放 差异 的 研究 pp 269 10.3.4 修饰 核 苷 用 于 检测 手术 和 治疗 效果 的 评价 :pp ry alt 10.3.5 化疗 对 尿 中 核 苷 排放 水 平 的 影响 pp 273 10. 3.6 尿 中 核 苷 作 肿 瘤 标志 物 实 际 应 用 范例 eveososvooosooosvovoooooovvooeoooooosoeeeso 274 参考 文献 pe 276 第 11 章 代谢 组 学 在 糖尿 病 研究 中 的 应 用 pp 281 11.1 基 于 GC 的 有 机 酸 轮 廓 分 析 对 2 型 糖尿 病 研 究 eee ee eee tttteeeeeee 282 11.1.1 实验 部 分 本 ee 282 11.1.2 2 型 糖尿 病 的 有 机 酸 轮 廊 分析 pp 283 小 绪 cee eececeeeeceenececeeecesseceeseeececeeeeeeseeseceseeeeseeesecseescesesseseseseeees 286 11.2 ” 屎 样 “全 ”指纹 分 析 及 应 用 于 科 素 亚 对 糖尿 病 的 疗效 评价 ………………: 286 11.2.1 实验 部 分 本 pe 286 11.2.2 科 素 亚 对 糖尿 病 的 疗效 RN 287 INGE cece erences ee eneneecececneneneseceeececececececeseegecseeseceseeeeeceseeeeseseseseceres 292 11. 3 2 型 糖尿 病 中 血浆 磷脂 代谢 轮廓 分 析 和 标记 物 的 识别 ove eeeeeeeeeeeeeeee 293 11.3.1 实验 部 分 pe 293 11.3.2 2 型 糖尿 病 中 血浆 磷脂 代谢 轮 廊 和 标志 物 pp 294 小 绪 ve evececececeeeeecececnsnsceeececececnsesesesnssseeseceseceseeeeceeeeesersceseeneeees 303 11.4 血清 中 脂肪 酸 的 靶 标 分 析 方法 用 于 2 型 糖尿 病 患者 与 正常 人 的 区 分 …… 304 11.4.1 实验 部 分 :Ne 304 11.4.2 结果 与 讨论 Ne 307 小 线 cree eee eee eeeeeeeeeeneeeceeneceneceneceseeesececeseeaeaeeeceseceenseeaeaeuesececeseseees STi 参考 文献 pe 311 $12 WE OUI SEE PE SESE TSE ALAR ooooeeeeeeecceccccteeetenseescneccccseacenesesenes 313 12.1 简介 .ee 313 12.2 PRUE EADIE BE FEAST AQMD Fa cceccccecceccetceceeeeeeneeanneneneenennes 314 12.2.1 代谢 组 学 用 于 食物 和 营养 对 机 体 影响 的 评价 和 pp 315 12.2.2 肠 道 菌 群 与 宿主 的 相互 作用 pp 320 12.3 代谢 轮廓 分 析 及 代谢 物 靶 标 分 析 在 营养 学 中 的 应 用 PP 322 12.4 代谢 组 学 在 营养 学 研究 中 的 应 用 展望 soon 323 参考 文献 站 pt 323 第 13 章 , 代 谢 组 学 与 药物 研究 ppp 326 13.1 药物 开发 现状 pp 326 13.2 ”代谢 组 学 在 药物 研究 中 的 应 用 概况 及 特点 站 pp 328 12.3 代谢 组 学 在 动物 模型 评估 方面 的 应 用 人 330 13.4 代谢 组 学 在 药物 安全 性 研究 中 的 应 用 .PP 333 13.4.1 代谢 组 学 在 药物 毒性 研究 中 的 应 用 概况 及 其 特点 coc ccc ete e eee ee eeeeeees 333 13.4.2 COMET 计划 介绍 ceccecececeeceseeeeceeeeeeeeeeseeeeeeeeneesecereceeseceseneeees 336 13.5 代谢 组 学 在 中 药 研 发 中 的 应 用 .RN 339 13.5.1 代谢 组 学 在 中 药 质量 研究 中 的 应 用 ppp 340 13.5.2 ”代谢 组 学 在 中 药 药 效 研究 中 的 应 用 ppp 347 13.5.3 ”代谢 组 学 在 中 药 安全 性 研究 中 的 应 用 pp 350 参考 文献 351 第 44 音 .代谢 组 学 在 植物 研究 中 的 应 用 ee eeeeeeeeeeeeeeeerererer co 354 14.1: 动能 基因 组 时 代 的 植物 代谢 组 学 .osisrnnn 人 354 14.1.1 植物 功能 基因 组 学 ppp 354 14.1.2 植物 代谢 组 学 pp 354 14.1.3 植物 代谢 工程 简介 pp 356 14.2 植物 代谢 组 的 分 析 … 和 RPR 357 14. 2.1 .植物 样品 的 保存 和 预 处 理 方法 pp … 357 14. 2.2 植物 代谢 组 的 分 析 检 测 pp 364 14.2.3 ”代谢 组 学 研究 的 数据 处 理 pp 365 14.3 植物 代谢 组 学 的 应 用 .PP 366 14.3.1 植物 代谢 指纹 图 谱 及 轮廓 分 析 应 用 实例 pp 366 14.3.2 植物 代谢 分 析 应 用 实例 一 一 多 维 色 谱 / 联 用 技术 入 376 14. 3.3 转基因 植物 及 受 环境 影响 植物 代谢 分 析 应 用 实例 coerce eee c ec eee eeeee cece eee eee 379 14.4 植物 代谢 组 学 的 未 来 一 一 主要 问题 与 发 展 前 景 .… 和 pp 384 人 参考 文献 .pp 385 第 1$ 章 代谢 组 学 在 微生物 学 中 的 应 用 PP 387 15.1 :概述 .pe 388 15.2 ”微生物 代谢 组 学 实验 设计 的 基本 原则 .ennnnneneens age 15. 2.1, 代 谢 组 学 的 优势 pp 388 15. 2.2 实验 设计 原则 pp 389 15.2.3 分 析 平 台 crecececereceeeeeecececeenenseeescesesscnsescscnsesassececeseseeensessesens 393 15.3 代谢 组 学 在 工业 微生物 学 中 的 应 用 .PP 398 15.4, 代 谢 组 学 在 医学 微生物 学 中 的 应 用 .PP 402 15.5 代谢 组 学 在 环境 微生物 学 中 的 应 用 .PN 406 15.6 .展望 .pe 407 Be Revo evevonncerncesrennnscsnsscestnatonsinnensnan ess suncnendediewdwauls dhs ei'tiip tlre Janinaltee 408 We eg (iz oe eae 08 de 8 9 => PR 410 16.1 简介 :pp 410 16. 2 RA FE oh Da BD EB BR HE Ea Do 411 16.2.1 SRE BSS BS eT AP HE BPE E FASE pp 411 。 xii 。 16.2.2 SREP ALIS LPM APHE DD BEPEVE DISS, mar > ee v '* 第 1 章 & w 随 着 人 类 基因 组 测序 工作 的 完成 , 基 因 功 能 的 研究 逐渐 成 为 热点 , 随 之 出 现 了 一 系 列 的 “组 学 ”研究 , 包 括 研 究 转录 过 程 的 转录 组 学 〈transcriptomics) 、 研 究 某 个 生物 体系 中 所 有 蛋白 质 及 其 功能 的 蛋白 质 组 学 (proteomics) 及 研究 代谢 产物 的 变化 及 代谢 途径 的 代谢 组 学 (metabolomics 或 metabonomics) (图 1-1). 基因 组 基因 表达 图 1-1 组 学 时 代 4 种 最 重要 的 组 学 对 基因 组 〈genome) 、 转 录 组 〈transcriptome) 、 蛋 白质 组 (proteome) 及 代谢 组 (metabolome) 的 研究 分 别 对 应 基因 组 学 、 转 录 组 学 、 蛋 白质 组 学 及 代谢 组 学 代谢 组 学 是 众多 组 学 中 的 一 种 , 是 随 着 生命 科学 的 发 展 而 发 展 起 来 的 。 与 其 他 组 学 不 同 , 代 谢 组 学 是 通过 考察 生物 体系 〈 细 胞 、 组 织 或 生物 体 ) 受 刺激 或 扰动 后 〈 如 将 某 个 特定 的 基因 变异 或 环境 变化 后 ), 其 代谢 产物 的 变化 或 其 随时 间 的 变化 , 来 研究 生物 体系 的 一 门 科 学 中 。 所 谓 代 谢 组 〈metabolome) 是 基因 组 的 下 游 产 物 也 是 最 终 产 物 , 是 一 些 参 与 生物 体 新 陈 代谢 、 维 持 生物 体 正 常 功能 和 生长 发 育 的 小 分 子 化 合 物 的 集合 , 主要 是 相对 分 子 质量 小 于 1000 的 内 源 性 小 分 子 。 代 谢 组 中 代谢 物 的 数量 因 生 物 物种 不 同 而 差异 较 大 , 据 估计 , 植 物 王 国 中 代谢 物 的 数量 在 200 000 种 以 上 , 单 个 植物 的 代谢 物 数量 在 5000~25 000, 甚 至 简单 的 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana) 也 产生 约 5000 种 代谢 产物 , 远 远 多 于 微生物 中 的 代谢 产物 〈 约 1500 种 ) 和 动物 中 的 代谢 产物 (4 2500 种 ) 呈 。 实 际 上 , 在 人 体 和 动物 中 , 由 于 还 有 共存 的 微生物 代谢 、 食 物 及 其 代谢 物 本 身 的 再 降解 , 到 目前 为 止 , 还 不 能 估计 出 到 底 有 多 少 种 代谢 产物 , 浓 度 分 布 范 围 有 7 一 9 个 数量 级 。 因 此 对 代谢 组 学 的 研究 , 无 论 从 分 析 平 台 、 数 据 处 理 及 其 生物 解释 等 方面 均 面临 诸多 挑战 。 本 章 对 代谢 组 学 发 展 的 历史 、 国 内 外 现状 、 研 究 方 法 、 典 型 应 用 领域 及 研究 热点 等 给 予 了 介绍 。 1.1 代谢 组 学 简介 1.1.1 代谢 组 学 发 展 的 时 代 背 景 生命 科学 是 研究 生命 现象 、 生 命 活动 的 本 质 、 特 征 和 发 生 、 发 展 规律 , 以 及 各 种 生 物 之 间 和 生物 与 环境 之 间 相 互 关系 的 科学 。 自 从 1953 年 Watson 和 Crick 建立 了 DNA ele WAM, EMP SHRN BeRA— eo. 在 此 基础 上 发 展 的 分 子 生 物 学 使 得 生命 的 基本 问题 , 如 遗传 、 发 育 、 疾 病 和 进化 等 , 都 能 从 分 子 机制 上 得 到 诠释 。 生 物 学 研究 进入 了 对 生命 现象 进行 定量 描述 的 阶段 。 分 子 生物 学 的 飞速 发 展 极 大 地 推动 了 人 们 从 分 子 组 成 水 平 对 生物 系统 进行 深入 的 了 解 。 基 因 组 计划 向 人 们 展示 了 包括 大 肠 杆 菌 、 酵 母 、 线 虫 、 果 蝇 、 小 鼠 等 模式 生物 以 及 人 类 的 所 有 遗传 信息 的 组 成 , 生 命 的 奥秘 就 存在 于 这 些 序 列 中 。 技 术 上 的 突破 使 得 基因 组 数据 的 获得 已 经 不 再 是 生命 科学 的 难 点 。 人 类 基因 组 计划 的 基本 完成 标志 着 后 基因 组 时 代 的 到 来 , 在 这 一 时 期 , 基 因 组 功能 分 析 成 为 生命 科学 的 主要 任务 , 核 心思 想 是 以 整体 和 联系 的 观点 来 看 待 生 物体 内 的 物质 群 , 研 究 遗 传 信息 如 何 由 基因 经 转录 向 功能 蛋白 质 传递 , 基 因 功 能 如 何 由 其 表达 产物 蛋 白质 以 及 代谢 产物 来 体现 。 继 基因 组 (genome) 后 、 转 录 组 〈 transcriptome)、 和 蛋白 质 组 (proteome) 等 相继 出 现 , 并 相应 形成 “omics” 学 说 , 如 转录 组 学 〈transcriptom- ics), HARA (proteomics) 等 。 但 是 基因 与 功能 的 关系 是 非常 复杂 的 , 还 不 能 用 转录 组 、 蛋 白质 组 来 表达 生物 体 的 全 部 功能 。 生 物体 内 存在 着 十 分 完备 和 精细 的 调控 系 统 以 及 复杂 的 新 陈 代 谢 网 络 , 它 们 共同 承担 着 生命 活动 所 需 的 物质 与 能 量 的 产生 与 调 节 。 在 这 一 复杂 体系 中 , 既 有 直接 参与 物质 与 能 量 代 谢 的 糖 类 、 脂 肪 及 其 中 间 代 谢 物 , 也 有 对 新 陈 代谢 起 重要 调节 作用 的 物质 。 这 些 物 质 在 体内 形成 相互 关联 的 代谢 网 络 , 基 因 突 变 、 饮 食 、 环 境 因素 等 都 会 引起 这 一 网 络 中 某 个 或 某 些 代谢 途径 的 变化 , 这 类 物质 的 变化 可 以 反映 机 体 的 状态 。 起 调节 作用 的 代谢 物 , 从 生理 功能 上 来 说 包括 神经 递 质 、 激素 和 细胞 信和 号 转 导 分 子 等 , 从 化 学 组 成 上 来 说 包括 多 肽 、 氮 基 酸 及 其 衍生 物 、 胺 类 物 质 、 脂 类 物质 和 金属 离子 等 , 这 些 调节 物质 绝 大 部 分 都 是 小 分 子 物质 , 在 植物 与 微生物 中 还 存在 着 大 量 的 次 生 代 谢 产 物 。 这 些 分 子 广泛 分 布 于 体内 , 对 多 种 生理 活动 都 具有 普 遍 和 多 样 的 调节 作用 , 仅 微量 存在 就 能 够 发 挥 很 强 的 生物 效应 。 不 同 活 性 的 分 子 或 协 同 、 或 持 抗 、 或 修饰 而 相互 影响 , 在 生物 学 效应 以 及 信和 号 转 导 和 基因 表达 调控 上 形成 复 杂 的 网 络 , 承 担 着 维持 机 体 稳 态 的 重要 使 命 , 是 神经 内 分 泌 和 免疫 网 络 调节 的 物质 基础 和 自 稳 态 调节 的 最 重要 成 分 。 转 录 组 、 蛋 白质 组 的 研究 很 难 涵 盖 这 些 非 常 活 路 而 且 非 常 重要 的 生命 活性 物质 , 然 而 对 这 类 物质 的 生理 和 病理 生理 学 意义 如 果 不 能 充分 认识 , 就 不 可 能 真正 阐明 生命 功能 活动 的 本 质 。 传 统 研究 方法 是 以 生理 学 和 药理 学 实验 方法 为 主 , 缺 乏 高 通 量 的 研究 技术 , 难 以 建立 生物 小 分 子 物 质 复杂 体系 的 研究 模式 。 在 这 种 情 况 下 , 代 谢 组 〈metabolome) 和 代谢 组 学 (metabolomics 或 metabonomics) 应 运 而 生 了 , 并 成 为 系统 生物 学 的 一 个 重要 突破 口 6] , 代 谢 处 于 生命 活动 调控 的 末端 , 因 此 代谢 组 学 比 基 因 组 学 、 蛋 白质 组 学 更 接近 表 型 。 从 广义 的 代谢 组 学 的 意义 上 来 说 , 代 谢 组 学 的 历史 是 相当 长 的 , 很 早 以 前 人 们 就 已 经 对 生物 样品 中 的 某 些 靶 标 化 合 物 进 行 分 析 以 了 解 生 命 机 体 的 状态 。 目 前 代谢 组 学 所 和 采 用 的 一 些 技术 平台 , 如 NMR 和 色谱 技术 以 及 质谱 技术 也 有 比较 长 的 应 用 历史 。 严 格 意 义 上 的 代谢 组 学 〈 对 限定 条 件 下 的 特定 生物 样品 中 所 有 代谢 组 分 的 定性 和 定量 ) 从 提出 到 现在 只 有 短 短 数 年 的 时 间 。 现 在 一 般 认 为 代谢 组 学 源 于 代谢 轮廓 (metabolic profi- ling) 分 析 , 在 代谢 轮廓 分 析 中 体现 了 代谢 组 学 的 “ 尽 可 能 多 地 分 析 生 物 样 本 中 的 代谢 产物 ”这 一 理念 的 萌芽 。 在 这 里 , 我 们 对 从 代谢 轮廓 分 析 发 展 到 代谢 组 学 这 一 过 程 史 (图 1-2) 做 一 简单 的 介绍 。 « % J. Nicholson 给 出 了 metabonomics 的 概念 Sadler Buckingham 和 Nicholson 发 表 第 一 个 有 关 全 血 和 血浆 的 M. G. Horning 代谢 轮廓 分 析 Zo 区 ose Steven Oliver 给 出 了 metabolome 的 概念 van der Greef 发 表 尿 的 MS 代 WHE 图 1-2 ”代谢 组 学 的 发 展 历史 早 在 20 世纪 70 年 代 初 ,Baylor 医学 院 就 发 表 了 有 关 代 谢 轮廓 分 析 方 面 的 论文 , 在 他 们 的 工作 中 采用 了 GC-MS 的 方法 对 多 种 类 固 醇 、 有 机 酸 以 及 尿 中 药物 的 代谢 物 进 行 了 分 析 , 并 将 这 种 多 组 分 分 析 的 方法 称 为 代谢 轮廓 分 析 , 开 创 了 对 复杂 样品 进行 代谢 轮 廓 分析 的 先河 。 此 后 代谢 轮廓 分 析 广 泛 应 用 于 血 、 尿 等 生物 样本 中 代谢 物 的 定性 与 定量 分 析 , 以 对 疾病 进行 筛选 和 诊断 。 在 临床 上 使 用 GC-MS 的 方法 来 诊断 疾病 的 方法 一 直 沿用 到 今天 。 紧 接着 , 人 们 把 重点 主要 放 在 分 析 的 自动 化 上 , 并 将 GC 的 方法 用 于 其 他 类 型 化 合 物 的 分 析 。 进 入 20 世纪 80 年 代 , 人 们 开始 使 用 高 效 液 相 色 谱 和 核磁 共振 的 技 术 来 进行 代谢 轮廓 的 分 析 , 如 1982 年 , 荷 兰 应 用 科学 研究 所 (TNO) 的 van der Greef5 在 国际 上 首先 采用 质谱 对 尿 中 代谢 指纹 进行 研究 。1983 年 ,Sadler、Bucking- ham 和 Nicholson 发 表 了 第 一 个 有 关 全 血 和 血浆 的 !H-NMR 73"), 7£ 1986 年 , 色 谱 杂 志 Journal of Chromatography 发 表 了 一 期 有 关 代 谢 轮廓 (metabolic profiling) 分 析 的 专辑 。 进 入 90 年 代 , 代 谢 轮廓 分 析 技 术 一 直 平 稳 发 展 , 每 年 都 有 10 一 15 篇 的 论文 发 表 , 不 过 这 一 时 期 人 们 的 目标 更 多 地 集中 于 某 些 特定 的 标 靶 化 合 物 上 。 在 90 年 代 初 , Sauter 等 人 用 基于 GC-MS 代谢 轮廓 分 析 的 方法 研究 了 不 同 除草 剂 对 大 麦 的 影响 , 这 种 用 代谢 轮廓 分 析 来 研究 各 种 因素 对 生物 功能 的 影响 的 研究 思路 随即 被 人 们 认可 。1997 年 ,Steven Oliver 研究 小 组 提出 了 通过 对 代谢 产物 的 数量 和 定性 来 评估 酵母 基因 的 遗 传 功能 及 其 宛 余 度 , 并 率先 提出 了 代谢 组 的 概念 0] 1999 年 ,J. Nicholson 等 提出 metabonomics 的 概念 轨 , 并 在 疾病 诊断 、 药 物 筛 选 等 方面 做 了 大 量 卓 有 成 效 的 工 fe], pe, AY Max-Planck-Institut 的 科学 家 们 开始 了 植物 代谢 组 学 的 研 究 023 , 使 代谢 组 学 得 到 了 极 大 的 充实 。 代谢 组 学 的 特点 为 : CD) 关注 内 源 化 合 物 。 (2) 对 生物 体系 中 的 小 分 子 化 合 物 进 行 定性 定量 研究 。 (3) 上 述 化 合 物 的 上 调和 下 调 指示 了 与 疾病 、 毒 性 、 基 因 修 饰 或 环境 因子 的 影响 。 (4) 上 述 内 源 性 化 合 物 的 知识 可 以 被 用 于 疾病 诊断 和 药物 筛选 。 与 转录 组 学 和 和 蛋白质 组 学 比较 , 代 谢 组 学 有 以 下 优点 : CL) 基因 和 和 蛋 白 质 表 达 的 微小 变化 会 在 代谢 物 上 得 到 放大 , 从 而 使 检测 更 容易 。 a (2) 代谢 组 学 的 研究 不 需 建 立 全 基因 组 测序 及 大 量 表达 序列 标签 CEST) 的 数 据 库 。 (3) 代谢 物 的 种 类 要 远 小 于 基因 和 和 有 蛋白质 的 数目 〈 每 个 组 织 中 大 约 为 10° 数量 级 , 即使 在 最 小 的 细菌 基因 组 中 也 有 几 千 个 基因 ) 。 (4) 研究 中 采用 的 技术 更 通用 , 这 是 因为 给 定 的 代谢 物 在 每 个 组 织 中 都 是 一 样 的 缘故 。 代谢 组 学 是 近 几 年 才 发 展 的 一 门 新 兴 的 技术 , 如 何 对 这 种 技术 进行 命名 曾经 有 争 议 , 国 际 上 存在 metabolomics 和 metabonomics 两 个 词汇 , 一 般 认 为 ,metabolomics 是 通过 考察 生物 体系 受 刺激 或 扰动 后 〈 如 将 某 个 特定 的 基因 变异 或 环境 变化 后 ) 代谢 产物 的 变化 或 其 随时 间 的 变化 , 来 研究 生物 体系 的 代谢 途径 的 一 种 技术 。 而 metabonomics 是 生物 体 对 病理 生理 刺激 或 基因 修饰 产生 的 代谢 物质 的 质 和 量 的 动态 变化 的 研究 。 前 者 一 般 以 细胞 作 研 究 对 象 , 后 者 则 更 注重 动物 的 体液 和 组 织 。 在 植物 、 微 生物 领域 一 般 用 metabolomics, 在 药物 研究 和 疾病 诊断 中 , 一 般 用 metabonomics。 现 在 这 两 个 定义 已 ARI! , 没 有 特别 的 区 分 。 1.1.2 代谢 组 学 研究 现状 目前 , 代 谢 组 学 正 日 益 成 为 生命 科学 研究 的 重点 之 一 , 在 世界 范围 越 来 越 多 的 科学 工作 者 已 加 入 到 代谢 组 学 的 研究 中 。 这 可 以 从 以 下 几 个 方面 体现 。 1.1.2.1 有 关 代 谢 组 学 的 文献 数量 增长 迅速 , 学 术 活动 活跃 “Web of knowledge” 是 检索 科学 文献 最 好 的 网 站 之 一 , 在 该 网 站 以 metabolomics or metabonomics 和 metabolic profiling 为 主题 词 进行 检索 , 可 得 图 1-3。 以 metabolo- mics or metabonomics 检索 可 得 1950 篇 , 以 metabolic profiling 检索 可 得 4581 篇 (2008 年 1 月 5 日 )。 类 似 地 , 从 “Web of knowledge” 使 用 proteomics 和 metabolome 分 别 检 索 到 总 文献 9361 篇 和 1000 篇 (图 1-4), 发 现 引用 次 数 分 别 为 112 566 和 8355, 平均 每 篇 引用 分 别 为 12. 02 和 8.35, A 指 数 分 别 为 113 和 39。 从 中 可 知 , 尽 管 代 谢 组 学 比较 年 轻 , 汪汪 作 , 文献 的 ieee ihe a biden lekditiio < 1980~1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 «2005 2006 2007 图 1-3 ”以 关键 字 metabolomics or metabonomics 和 metabolic profiling 进行 检索 所 得 的 文献 统计 图 (2008 年 1 月 5 日 统计 , 因 文献 录入 滞后 ,2007 年 数据 不 全 ) 的 发 展 趋势 。 2000 Hd 25000 H 20000 nm 15000 10000 5000 0 ~ oD O&O = NO tT mM Oo ™ 0 oo CN RRFRSSESSSBSSSSB R BR — eh NINN NON ee ON —_ = 年 份 350 4000 300 3500 250 3000 % 2500 4B 200 150 = 2000 示 1500 100 1000 50 500 CN CN =] lo) ro) S fa) > S fon So oS oS oS oS oS CN ee oOo oO oO oS oS Oo fon Oo oS Oo f=) oS a So 一 一 N ON N N N N N 一 N N N N N N N 年 份 年 份 图 1-4 从 “Web of knowledge” 使 用 proteomics (上 图 ) 和 metabolome (FRI) 检索 得 到 的 结果 (Metabolomics 编辑 部 2007 年 1 月 5 日 统计 ) 代谢 组 学 的 学 术 活 动 也 在 药 勃 进行 ,2001 年 12 月 在 美国 举行 了 题 为 “Metabolic Profiling: Pathways in Discovery” 的 专题 会 议 , 一 年 后 (2002 年 11 月 ) 在 加 利 福 尼 亚 州 召开 的 系统 组 学 国际 会 议 也 特别 强调 了 代谢 组 学 。 有 关 植 物 代谢 组 学 方面 的 会 议 更 多 ,2002 年 4 月 、2003 年 4 月 、2004 年 6 月 及 2006 年 7 月 分 别 在 荷兰 、 德 国 、 美 国 和 英国 举行 了 第 一 届 、 第 二 届 、 第 三 届 和 第 四 届 植 物 代谢 组 学 国际 会 议 , 会 议 就 分 析 技 术 的 发 展 、 代 谢 数据 的 生物 信息 和 数据 统计 分 析 、 标 准 化 及 数据 库 、 代 谢 组 学 在 解决 生物 技术 问题 中 的 作用 和 发 展 农作物 等 方面 进行 了 广泛 的 探讨 。2008 年 7 月 , 国 际 植物 代 谢 组 学 会 议 将 在 日 本 的 横滨 召开 。 为 与 代谢 组 学 的 迅猛 发 展 相 适应 , 国 际 代 谢 组 学 学 会 (http: //metabolomicssoci- ety. org/) 应 运 而 生 , 并 创刊 了 专业 杂志 Metabolomics (http://mebo. edmgr. comy ) 。 2005 年 6 月 在 日 本 召开 了 第 一 届 代 谢 组 学 学 会 的 国际 会 议 〈The First International Conference of the Metabolomics Society) 。 在 取得 成 功 的 基础 上 ,2006 年 和 2007 年 分 别 在 美国 和 英国 召开 了 第 二 届 、 第 三 届 代 谢 组 学 学 会 的 国际 会 议 。 这 些 会 议 的 召开 加 速 了 代谢 组 学 的 发 展 。 国内 在 这 一 领域 也 紧 跟 国际 前 沿 , 中 国 科学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 在 2001 年 学 科 规划 时 就 将 代谢 组 学 列 为 中 国 科 学 院 知 识 创新 工程 〈 二 期 ) 重要 方向 予以 支持 。 自 2003 年 较 全 面 地 介绍 代谢 组 学 的 综述 发 表 后 09 , 又 陆续 有 许多 综述 性 的 文章 发 表 , 内 28s 容 涉及 代谢 组 学 的 技术 平台 以 及 在 医药 、 疾 病 、 植 物 学 等 诸多 方面 的 应 用 Ps 28 2003 年 9 月 , 中 国 科 学 院 生 物 局 在 上 海 召 开 了 “植物 、 微 生物 的 代谢 组 学 、 代 谢 工 程 ” 学 术 研讨 会 。2004 年 10 月 10 一 11 日 在 上 海 威 斯 洒 大 饭店 , 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 和 美国 Waters 公 司 合 作 举办 的 代谢 组 学 高 层 研 讨 会 及 技术 报告 会 隆重 举行 , 英 国 伦 敦 帝国 理工 学 院 的 Jeremy Nicholson 教授 受 邀 首次 访问 中 国 。 此 次 研讨 会 的 成 功 召 开 , 进一步 拉 近 了 中 国 代 谢 组 学 与 国际 的 距离 , 也 标志 着 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 和 XH Waters 公司 “代谢 组 学 联合 实验 室 ” 的 正式 运行 。2004 年 11 月 , 中 国 科学 院 启 动 了 知识 创新 方向 性 项 目 “ 植 物 、 微 生物 代谢 组 学 的 初步 研究 ”。2004 年 12 月 18 日, 天 津 药物 研究 院 与 天 津 大 学 共同 主办 的 “代谢 物 组 学 与 药物 研究 高 层 研讨 会 ”在 天 津 大 学 化 工学 院 举 行 , 就 “代谢 物 组 学 与 重大 疾病 药物 治疗 相关 基础 和 应 用 研究 ”进行 了 深 人 探讨 。2005 年 4 月 5 一 6 日 ,Waters 公司 首届 制药 技术 论坛 在 上 海 虹 桥 宾 馆 召 开 , Jeremy Nicholson 教授 和 许 国 旺 研 究 员 等 做 了 关于 代谢 组 学 、 新 药 发 现 和 研究 等 方面 的 告 , 探 寻 代 谢 组 学 脉动 对 制药 业 的 深层 影响 及 其 对 中 草药 开发 方向 的 揭示 9 。 在 这 期 间 , 国 内 众多 科研 机 构 也 纷纷 加 入 代谢 组 学 研究 的 行列 。2005 年 , 许 国 旺 受 Spring- erLink 邀请 , 正 式 成 为 Metabolomics 杂志 编 委 。 在 “大 连 化 学 物理 研究 所 科学 论坛 (DICP SYMPOSIUM) 专项 基金 ”资助 下 , 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 分 别 在 2005 4F 4 AA 2006 年 9 月 组 织 了 “现代 分 离 /分 析 化 学 和 代谢 组 学 ”和 “分 析 生 物化 学 和 中 医药 代谢 组 学 ”科学 论坛 , 邀 请 了 数 十 位 来 自 英国 、 美 国 、 德 国 、 和 荷兰 、 目 本 、 比利时 、 中 国 、 中 国 香港 、 中 国 澳门 等 国家 和 地 区 的 著名 专家 和 学 者 参加 。 在 国家 有 关 部 门 和 单位 的 配合 下 ,2006 年 9 A 13~14 日 在 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 召开 了 为 期 2 天 的 主题 为 “医学 代谢 组 学 ”的 第 284 次 香山 科学 会 议 , 国 内 数 家 相关 研究 机 构 、 大 专 院 校 和 国外 多 个 从 事 代谢 组 学 研究 的 团体 近 50 余 位 专家 学 者 应 邀 出 席 。 由 中 国 工程 院 医药 卫生 学 部 等 主办 的 2007 年 “ 环 潮 海 医药 发 展 前 沿 论 坛 ” 蜂 “代谢 组 学 与 中 药 研 究 ” 调 研 汇报 会 于 2007 年 12 月 21 一 22 日 在 天 津 举 行 , 在 刘 昌 孝 、 张 伯 礼 和 杨 胜利 三 位 院士 的 组 织 下 , 中 药 代谢 组 学 研究 的 部 分 优势 单位 (中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 、 天 津 药物 研究 院 、 上 海 交 通 大 学 、 中 国药 科大 学 、 浙 江 大 学 、 中 国 科学 院 武 汉 物理 与 数学 研究 所 、 天 津 中 医药 大 学 、 沈 阳 药 科大 学 等 ) 的 专家 就 代谢 组 学 的 技术 平 台 、 生 物 信息 学 、 中 药 安全 性 、 中 药 资源 和 质量 、 中 药方 剂 作 用 机 制 和 中 药 作用 物质 基 础 等 报告 最 新 的 研究 进展 。 所 有 这 些 学 术 研讨 会 , 一 方面 提供 了 与 国内 外 一 流 科学 家 交 流 的 机 会 , 另 一 方面 也 使 得 我 国 的 研究 队伍 不 断 扩大 和 加 强 。 1.1.2.2 代谢 组 学 在 各 国 的 科研 战略 上 得 到 了 重视 美国 Global Information Inc. 的 市 场 调查 报告 显示 ,2002 一 2007 年 代谢 组 学 技术 工业 的 市 场 年 增长 率 将 达到 46%Fo 。2003 年 , 美 国 国立 卫生 研究 院 (National Institu- tes of Health, NIH) 在 其 中 长 期 发 展 规划 (NIH Roadmap) PY, wera eS 题 , 提 出 了 要 建立 专门 收集 小 分 子 信 息 并 从 事 高 通 量 筛选 的 研究 中 心 , 发 展 代谢 组 学 技 术 平 台 , 更 快 、 更 多 地 发 现 具 有 生物 活性 的 小 分 子 的 构想 。 其 下 属 的 The National Institute of General Medical Sciences 已 在 2003 年 批 给 加 州 大 学 3500 万 美元 的 一 个 5 年 计划 做 鼠 巨 喉 细 胞 的 类 脂 组 学 Clipidomics) 研究 。 与 此 类 似 , 日 本 政府 也 专门 设立 了 » Ce “Construction of Basic Techniques for Lipidomics and Their Application” 国家 项 目 , 建 立 类 脂 的 代谢 途径 数据 库 。2005 年 1 月 , 加 拿 大 启动 了 “人 类 代谢 组 项 目 ” (http:V// www. metabolomics. ca/) , 和 希望 从 组 织 和 体液 中 识别 、 定 量 和 分 离 出 浓度 大 于 1pmol/L 的 所 有 代谢 物 。 到 2006 年 底 , 已 定性 出 800 个 代谢 产物 。 预 期 有 1400 个 代谢 产物 可 被 定性 、 定 量 , 其 信息 可 放 到 公共 数据 库 中 , 并 可 制备 出 单 体 保 存 到 一 80C 的 冰箱 中 。 至 2008 年 1 月 5 日 , 该 项 目 已 从 数 千 种 书籍 、 杂 志文 献 和 电子 数据 库 中 收集 了 2500 个 内 源 性 代谢 产物 , 建 立 了 人 类 代谢 组 数据 库 〈http://www. hmdb. ca/)522 。 库 中 每 种 代 谢 产物 都 有 其 相应 的 化 学 、 临 床 、 分 子 生物 学 和 生化 数据 , 据 说 是 目前 世界 上 最 全 的 关 于 人 类 代谢 物 和 人 类 代谢 的 数据 库 。 我 国政 府 也 十 分 重视 代谢 组 学 的 研究 , 科 技 部 早 在 2003 年 就 将 代谢 组 学 平台 技术 的 建立 列 人 了 国家 “863” 计 划 , 并 交 给 大 连 化 学 物理 研究 所 所 承担 。 在 “十 一 五 ”期 间 , 科 技 部 先后 在 国家 重大 研究 计划 “蛋白质 科 学 ” 国家 重点 基础 研究 发 展 规划 (“973”) 、 国 家 高 技术 研究 发 展 计 划 〈“863” 计 划 ) 和 “十 一 五 ”科技 支撑 项 目 、 食 品 安全 等 方面 支持 了 代谢 组 学 的 研究 。 国 家 自然 科学 基金 委员 会 化 学 科学 部 连续 多 年 将 “组 学 分 析 中 的 新 原理 、 新 方法 和 新 技术 ” 列 为 重点 项 目 支 持 方向 。 代谢 组 学 有 着 巨大 的 理论 价值 和 应 用 前 景 , 企 业界 对 此 也 非常 关注 , 西 方 国家 先后 成 立 了 多 个 关于 代谢 组 学 研究 的 研究 中 心 或 公司 , 如 德国 MAX-PLANCK-INSTITUT 的 分 子 植 物 生 理 所 、 英 国 的 Metabometrix Ltd、 和 荷兰 的 Platform Plant Metabolomics (PPM) 、 美 国 的 The Metabolomics Group、 加 拿 大 的 Phenomenome Discoveries Inc. 等 。PFIZER 等 六 个 大 制药 公司 与 英国 帝国 理工 学 院 的 科学 家 们 一 起 组 织 了 一 个 为 期 3 年 的 关于 药物 毒性 研究 的 研究 小 组 (COMET 1) , 拟 在 药物 的 发 现 (discovery) 到 开发 (development) 阶段 用 代谢 组 学 的 方法 来 评价 药物 的 毒性 〈 详 见 第 13 章 )。 在 第 一 期 取 得 成 功 的 基础 上 , 第 二 期 项 目 (COMET 2) 也 于 2006 年 3 月 正式 启动 , 目 标 是 研究 标 准 毒 物 的 分 子 机 制 , 进 而 建立 具 预 测 性 的 构 效 关系 专家 系统 。 以 代谢 组 学 为 核心 的 系统 生物 学 技术 建立 的 BG MEDICINE 公司 (http://www. bg-medicine. com/) , 非 常 重视 代谢 标志 物 对 疾病 的 新 诊断 方法 , 在 发 现 肺结核 疾病 的 生物 标志 物 方面 处 于 领先 地 位 。 正 在 与 M. D. Anderson Cancer Center 合作 以 识别 新 的 、 专 一 性 好 的 、 敏 感 的 用 于 监测 乳腺 癌 患 者 治疗 效果 的 血 中 蛋白 质 和 小 分 子 标 志 物 。 并 从 ACS Biomarker B. V 获得 授权 来 开发 和 商品 化 基于 生物 标志 物 的 分 子 诊 断 测试 方 法 以 预兆 充血 性 心力 衰竭 (congestive heart failure) 。 与 Multiple Sclerosis Research Center of New York (MSRCNY) 合作 以 发 现 针对 疾病 和 市 场 上 现 有 药物 疗效 、 安 全 性 的 新 标 志 物 。 ILE FDA 及 ?7 个 制药 公司 合作 以 发 现 肝 毒 的 生物 标志 物 。 Metabolon 与 美国 传染 病 军队 医学 研究 所 〈U. SArmy Medical Research Institute of Infectious Diseases, USAMRIID) 签署 协议 2 , 军 队 将 使 用 Metabolon 的 代谢 组 学 技术 平台 来 研究 接种 AVA RIB BVE A 〈anthrax vaccine) 的 人 的 生化 轮 廊 (biochemi- cal profile), AVA 疫苗 是 FDA 许可 的 唯一 接种 人 的 痰 瘦 热 疫苗 。 这 也 是 第 一 个 对 接种 疫苗 的 人 的 大 规模 代谢 组 学 研究 , 这 种 生化 轮廓 将 帮助 USAMRIID 较 好 地 了 解 疫 苗 的 安全 性 、 有 效 性 及 其 作用 机 制 。 所 有 这 些 说 明 , 代 谢 组 学 得 到 了 学 术 界 、 政 府 和 工业 界 的 极 大 重视 。 11.3 代谢 组 学 与 系统 生物 学 在 几 种 常见 的 组 学 研究 中 , 基 因 组 学 主要 研究 生物 系统 的 基因 结构 组 成 , 即 DNA 的 序列 及 表达 。 和 蛋白 质 组 学 研究 由 生物 系统 表达 的 蛋白 质 及 由 外 部 刺激 引起 的 差异 。 代 谢 组 学 是 研究 生物 体系 〈 细 胞 、 组 织 或 生物 体 ) 受 外 部 刺激 所 产生 的 所 有 代谢 产物 的 变 化 , 可 以 认为 代谢 组 学 是 基因 组 学 和 和 蛋白质 组 学 的 延伸 。 随 着 这 些 组 学 研究 的 深入 , 科 学 家 们 逐渐 认识 到 : 基因 组 的 变化 不 一 定 能 够 得 到 表达 , 从 而 并 不 对 系统 产生 实质 影 响 。 某 些 蛋 白质 的 浓度 会 由 于 外 部 条 件 的 变化 而 升 高 , 但 由 于 这 个 蛋白 质 可 能 不 具备 活 性 , 从 而 也 不 对 系统 产生 影响 。 同 时 , 由 于 基因 或 蛋白 质 的 功能 补偿 作用 , 某 个 基因 或 蛋白 质 的 缺失 会 由 于 其 他 基因 或 蛋白 质 的 存在 而 得 到 补偿 , 最 后 反应 的 净 结 果 为 零 。 而 小 分 子 的 产生 和 代谢 才 是 这 一 系列 事件 的 最 终结 果 , 它 能 够 更 准确 地 反映 生物 体系 的 状 AS? 。 因 此 , 系 统 生物 学 的 研究 应 涵盖 基因 组 学 、 转 录 组 学 、 蛋 白质 组 学 和 代谢 组 学 , 任何 单一 组 学 的 研究 对 生物 问题 的 理解 都 是 不 全 面 的 。 系统 生物 学 是 在 细胞 、 组 织 、 器 官 和 生物 体 整 体 水 平 研 究 结构 和 功能 各 异 的 各 种 分 子 及 其 相互 作用 , 并 通过 计算 生物 学 来 定量 描述 和 预测 生物 功能 、 表 型 和 行为 的 科 ”学 5 中。 系统 生物 学 从 基因 组 序列 开始 , 完 成 从 生命 密码 到 生命 过 程 的 研究 。 如 果 将 生命 体 看 成 一 个 在 基因 调控 下 的 无 数 的 相互 关联 的 生化 反应 所 组 成 的 一 个 新 陈 代 谢 网 络 , 那 么 系统 生物 学 将 要 鉴别 每 一 个 反应 节点 的 各 种 分 子 及 其 相互 作用 , 从 局 部 到 整 体 , 最 终 完成 整个 生命 活动 的 路 线 图 。 系 统 生物 学 的 主要 技术 平台 为 基因 组 学 、 转 录 组 学 、 蛋 白质 组 学 、 代 谢 组 学 、 相 互 作 用 组 学 和 表 型 组 学 等 , 这 些 “ 组 学 ”分 别 在 DNA、mRNA、 和 蛋白 质 和 代谢 产物 水 平 检测 和 鉴别 各 种 分 子 并 研究 其 功能 以 及 各 种 分 子 之 间 的 相互 关系 。 进 而 发 现 生 化 反应 的 途径 和 网 络 , 构 建生 物 学 模块 , 并 在 研究 模 块 相互 作用 的 基础 上 绘制 生物 体 的 相互 作用 图 谱 。 代 谢 组 学 与 其 他 组 学 结合 对 阐明 生 命 的 奥秘 具有 重要 意义 。 1.2 代谢 组 学 的 研究 方法 代谢 组 学 研究 一 般 包括 样品 采集 和 制备 、 代 谢 组 数据 的 采集 、 数 据 预 处 理 、 多 变量 数据 分 析 、 标 志 物 识别 和 途径 分 析 等 步骤 (图 1-5)59 。 生 物 样品 可 以 是 尿 液 、 血 液 、 组 织 、 细 胞 和 培养 液 等 , 采 集 后 首先 进行 生物 反应 灭 活 、 预 处 理 , 然 后 运用 核磁 共振 、 质谱 或 色谱 等 检测 其 中 代谢 物 的 种 类 、 含 量 、 状 态 及 其 变化 , 得 到 代谢 轮廓 或 代谢 指 纹 。 而 后 使 用 多 变量 数据 分 析 方 法 对 获得 的 多 维 复杂 数据 进行 降 维和 信息 挖掘 , 识 别 出 有 显著 变化 的 代谢 标志 物 , 并 研究 所 涉及 的 代谢 途径 和 变化 规律 , 以 半 述 生物 体 对 相应 刺激 的 响应 机 制 , 达 到 分 型 和 发 现 生 物 标志 物 的 目的 2'?0 。 根据 研究 的 对 象 和 目的 不 同 ,Oliver Fiehn 将 对 生物 体系 的 代谢 产物 分 析 分 为 四 个 层次 2 。 (1) 代谢 物 靶 标 分 析 (metabolite target analysis) :对 某 个 或 某 几 个 特定 组 分 的 分 在 这 个 层次 中 , 需 要 采取 一 定 的 预 处 理 技术 , 除 掉 干 扰 物 , 以 提高 检测 的 灵敏 度 。 \ 析 。 8 样品 制备 数据 采集 GC-FID/MS, GCxGC-FID/TOFMS, LC-MS, UPLC Q-TOF, capillary LC-MS, LCxLC-MS,CE-MS, DI-MS, FT-ICR-MS; NMR, FTIR 图 1-5 代谢 组 学 分 析 流 程 (2) 代谢 轮 廊 分析 (metabolic profiling analysis): 对 少数 所 预 设 的 一 些 代 谢 产 物 的 定量 分 析 。 如 某 一 类 结构 、 性 质 相 关 的 化 合 物 〈 如 氨基 酸 、 顺 二 醇 类 )、 某 一 代谢 途 径 的 所 有 中 间 产 物 或 多 条 代谢 途径 的 标志 性 组 分 。 进 行 代 谢 轮廓 分 析 时 , 可 以 充分 利用 这 一 类 化 合 物 的 特有 的 理化 性 质 , 在 样品 的 预 处理 和 检测 过 程 中 , 采 用 特定 的 技术 来 完成 。 (3) 代谢 组 学 (metabonomics, metabolomics): 限定 条 件 下 特定 生物 样品 中 所 有 内 源 性 代谢 组 分 的 定性 和 定量 。 进 行 代谢 组 学 研究 时 , 样 品 的 预 处 理 和 检测 技术 必须 满 足 对 所 有 的 代谢 组 分 具有 高 灵敏 度 、 高 选择 性 、 高 通 量 的 要 求 , 而 且 基 体 干 扰 要 小 。 代 谢 组 学 涉及 的 数据 量 非 常 大 , 因 此 需要 有 能 对 其 数据 进行 解析 的 化 学 计量 学 技术 。 (4) 代谢 指纹 分 析 (metabolic fingerprinting analysis): 不 具体 鉴定 单一 组 分 , 而 是 通过 比较 代谢 物 指纹 图 谱 的 差异 对 样品 进行 快速 分 类 〈 如 表 型 的 快速 鉴定 ) 。 严格 地 说 , 只 有 第 三 层次 才 是 真正 意义 上 的 代谢 组 学 研究 。 目 前 , 代 谢 组 学 的 最 终 目标 还 是 不 可 完成 的 任务 , 因 为 还 没有 发 展 出 一 种 真正 的 代谢 组 学 技术 可 以 涵盖 所 有 的 代谢 物 而 不 管 分 子 的 大 小 和 性 质 。 但 是 , 它 和 代谢 轮廓 “〈 谱 ) 分 析 有 着 显著 的 差别 , 在 具体 的 实验 中 , 代 谢 组 学 研究 会 设法 解析 所 有 的 可 见 峰 , 因 此 代谢 组 学 研究 的 特征 也 可 以 表述 为 它 会 设法 分 析 尽 可 能 多 的 代谢 组 分 。 12.1 样品 采集 与 制备 样品 的 采集 与 制备 是 代谢 组 学 研究 的 初始 步骤 也 是 最 重要 的 步骤 之 一 , 代 谢 组 学 研 究 要 求 严格 的 实验 设计 。 首 先 需要 采集 足够 数量 的 代表 性 样本 , 减 少 生 物 样 品 个 体 差异 对 分 析 结 果 的 影响 。 实 验 设计 中 对 样品 收集 的 时 间 、 部 位 、 种 类 、 样 本 群体 等 应 给 予 充 分 考虑 。 在 研究 人 类 样本 时 , 还 需 考 虑 饮食 、 性 别 、 年 龄 、 昼 夜 和 地 域 等 诸多 因素 的 影 响 。 此 外 , 在 分 析 过 程 中 要 有 严格 的 质量 控制 , 需 要 考察 如 样本 的 重复 性 、 分 析 精 度 、 空白 等 。 这 方面 的 知识 详 见 第 2、14、15 章 。 根据 研究 对 象 、 目 的 和 采用 的 分 析 技 术 不 同 , 所 需 的 样品 提取 和 预 处 理 方法 各 异 。 如 采用 NMR 的 技术 平台 , 只 需 对 样品 做 较 少 的 预 处理 即 可 分 析 。 对 体液 的 分 析 , 大 多 数 情况 下 , 只 要 用 缓冲 液 或 水 控制 pH 和 减少 秋 度 即 可 。 和 采用 MS 进行 “全 ”成 分 分 析 时 , 样 品 处 理 方法 相对 简单 , 但 不 存在 一 种 普 适 性 的 标准 化 方法 , 依 据 的 还 是 “相似 相 溶 原则 ”, 脱 蛋白 后 代谢 产物 通常 用 水 或 有 机 溶剂 如 甲醇 、 已 烷 等 ) 分 别提 取 吕 ] , 获 得 水 提取 物 和 有 机 溶剂 提取 物 , 从 而 把 非 极 性 相 和 极 性 相 分 开 , 以 便 进 行 分 析 。 对 于 代 谢 轮廓 分 析 或 靶 标 分 析 , 还 需要 做 较为 复杂 的 预 处 理 , 如 常用 固 相 微 萃取 、 固 相 萃取 、 亲 和 色 谱 等 预 处 理 方法 。 用 气相 色谱 或 气相 色谱 -质谱 联 用 时 , 常 常 需要 进行 了 衍生 化 , 以 增加 样品 的 挥发 性 。 由 于 特定 的 提取 条 件 往往 仅 适 合 某 些 类 化 合 物 , 目 前 尚 无 一 种 能 够 适合 所 有 代谢 产物 的 提取 方法 。 应 该 根据 不 同 的 化 合 物 选 择 不 同 的 提取 方法 , 并 对 提 取 条 件 进行 优化 。 具 体 方法 可 见 第 11、14、15 章 。 由 于 代谢 组 学 一 次 分 析 很 多 样品 , 样 品 不 可 能 一 天 和 采集 完成 , 因 此 , 样 品 保存 问题 也 应 注意 , 最 好 是 保存 在 一 80C 。COMET 项 目 表 明 " , 屎 样 保存 在 一 40 它 冰箱 中 , 至 少 9 个 月 内 没有 发 现 变化 。 但 在 18 个 月 后 , 发 现 TCA 循环 中 的 中 间 产 物 有 轻微 的 变 化 。 而 血浆 在 一 80C 下 保存 6 个 月 ,在 NMR 谱 上 没有 发 现 明 显 的 变化 。 1.2.2 代谢 组 数据 的 采集 完成 样本 的 采集 和 预 处 理 后 , 样 品 中 的 代谢 产物 需 通过 合适 的 方法 进行 测定 。 代 谢 组 学 分 析 方法 要 求 具有 高 灵敏 度 、 高 通 量 和 无 偏向 性 的 特点 , 与 原 有 的 各 种 组 学 技术 只 分 析 特 定 类 型 的 化 合 物 不 同 , 代 谢 组 学 所 分 析 的 对 象 的 大 小 、 数 量 、 官 能 团 、 挥 发 性 、 带电 性 、 电 迁移 率 、 极 性 以 及 其 他 物理 化 学 参数 的 差异 很 大 。 由 于 代谢 产物 和 生物 体系 的 复杂 性 , 至 今 为 止 , 尚 无 一 个 能 满足 上 述 所 有 要 求 的 代谢 组 学 分 析 技术 , 现 有 的 分 析 技术 都 有 各 自 的 优势 和 适用 范围 c2~ 细 。 最 好 采用 联 用 技术 和 多 个 方法 的 综合 分 析 。 色 谱 55] pa | NMR) 、 毛 细 管 电泳 cs 、 红 外 光谱 [4 、 电 化 学 检测 [ 针 等 分 离 分 析 手 段 及 其 组 合 都 出 现在 代谢 组 学 的 研究 中 。 其 中 色谱 -质谱 联 用 方法 兼备 色谱 的 高 分 离 度 、 高 通 量 及 质谱 的 普 适 性 、 高 灵敏 度 和 特异 性 ,NMR 特别 是 !H-NMR 以 其 对 含 氢 代谢 产物 的 普 适 性 而 成 为 最 主要 的 分 析 工具 。 NMR ( 见 第 6 章 ): NMR 是 当前 代谢 组 学 研究 中 的 主要 技术 ,NMR 的 优势 在 于 能 够 对 样品 实现 无 创 性 、 无 偏向 的 检测 , 具 有 良好 的 客观 性 和 重 现 性 , 样 品 不 需要 繁琐 - 10 « 处 理 , 具 有 较 高 的 通 量 和 较 低 的 单位 样品 检测 成 本 。 此 外 ,:H-NMR 对 含 氧化 合 物 均 有 响应 , 能 完成 样品 中 大 多 数 化 合 物 的 检测 , 满 足 代 谢 组 学 中 的 对 尽 可 能 多 的 化 合 物 进 行 检测 的 目标 。NMER 虽然 可 对 复杂 样品 如 尿 液 、 血 液 等 进行 非 破 坏 性 分 析 , 与 质谱 法 相 比 , 它 的 缺点 是 检测 灵敏 度 相 对 较 低 〈 和 采用 现 有 成 熟 的 超低温 探头 技术 , 其 检测 灵敏 度 在 纳 克 级 水 平 ) 、 动 态 范围 有 限 , 很 难 同时 测定 生物 体系 中 共存 的 浓度 相差 较 大 的 代谢 产物 ; 同时, 购置 仪器 所 需 的 投资 也 较 大 。 为 了 提高 NMR 技术 的 灵敏 度 , 研 究 者 们 采用 了 增加 场 强 、 使 用 低温 探头 和 微 探头 的 方法 。 针 对 分 辩 率 的 问题 , 使 用 了 多 维 核磁 共振 技术 和 液 相 色谱 -核磁 共振 联 用 〈1liq- uid chromatography-nuclear magnetic resonance,LC-NMR) Daykin 等 叱 在 研究 中 采 用 色谱 技术 , 利 用 LC-NMR 联 用 对 心血 管 疾病 患者 血 中 的 脂 蛋 白 代 谢 产 物 进 行 了 检测 。 Nicholson 研究 小 组 纺 '490 采 用 近年 来 新 发 展 的 魔 角 旋 转 (magic angle spinning, MAS) 技术 , 让 样品 与 磁场 方向 成 54. 17 旋转 , 从 而 克服 了 由 于 偶 极 耦合 〈dipolar coupling) 引起 的 线 展 宽 、 化 学 位 移 的 各 向 异性 。 应 用 MAS 技术 , 研 究 者 能 够 获得 高 质量 的 NMR 谱 图 , 样 品 中 仅 加 入 少量 的 DO 而 不 必 进 行 预 处理 , 样 品 量 只 需 约 10mg。 基 于 NMR 技术 的 代谢 组 学 方法 已 广泛 地 应 用 于 药物 毒性 “~ 、 基 因 功 能 品 '5 以 及 疾病 的 i RS 质谱 〈 见 第 2~5 章 ): 相对 于 NMR 灵敏 度 低 、 检 测 动态 范围 罕 等 弱点 ,MS 具有 较 高 的 灵敏 度 和 专属 性 , 可 以 实现 对 多 个 化 合 物 的 同时 快速 分 析 与 鉴定 。 随 着 质谱 及 其 联 用 技术 的 发 展 , 越 来 越 多 的 研究 者 将 色谱 -质谱 联 用 技术 用 于 代谢 组 学 的 研究 [ 双 5?' 5 。 GC-MS 方法 的 主要 优点 包括 较 高 的 分 辩 率 和 检测 灵敏 度 , 并 且 有 可 供 参 考 、 比较 的 标 准 谱 图 库 , 可 以 用 于 代谢 产物 定性 。 但 是 GC 不 能 直接 得 到 体系 中 难 挥发 的 大 多 数 代谢 组 分 的 信息 , 对 于 挥发 性 较 低 的 代谢 产物 需要 衍生 化 处 理 , 预 处 理 过 程 繁 琐 。GC-MS 常用 于 植物 和 微生物 代谢 指纹 分 析 至 -5 , 如 Fiehn 等 5 采用 GC/MS 研究 拟 南 芥 CAr- abidopsis) 的 基因 型 及 其 表 型 的 关系 ,Styczynski $=! 对 大 肠 杆菌 的 代谢 产物 进行 了 详细 的 分 析 。LC-MS 避免 了 GC-MS 中 繁杂 的 样品 前 处 理 , 由 于 其 较 高 的 灵敏 度 和 较 宽 的 动态 范围 , 已 被 越 来 越 多 地 用 于 代谢 组 学 研究 5 -5 中。 它 非 常 适合 于 生物 样本 中 复杂 代谢 产物 的 检测 和 潜在 标志 物 的 鉴定 。LC-MS 的 代谢 组 学 研究 通常 采用 反 相 填料 、 梯 度 洗 脱 程序 。 但 对 于 体液 样品 特别 是 尿 样 , 含 有 大 量 的 亲 水 性 代谢 产物 , 这 些 代谢 产物 在 反 相 色谱 上 不 保留 或 保留 很 弱 。 最 近 研 究 者 们 使 用 亲 水 反应 色谱 〈hydrophilic inter- action chromatography,HILIC)5 解 决 亲 水 性 物质 的 弱 保 留 问 题 。 新 的 分 析 技 术 如 超 高 效 液 相 色谱 /高 分 辨 飞行 时 间 质 谱 技 术 习 '% 、 毛 细 管 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 [s] 、 傅 里 叶 变换 离子 回旋 共振 技术 5 问 等 也 被 用 于 代谢 组 学 研究 以 提高 代谢 产物 的 检测 灵敏 度 和 通 量 。 为 解决 通常 液 相 色谱 只 能 分 离 疏 水 性 代谢 物 〈 反 相 色 谱 ) 或 亲 水 性 代谢 物 〈 亲 水 性 色谱 ,HILIC) 的 问题 , 我 们 专门 发 展 了 一 个 柱 切换 二 维 液 相 系统 [ss ~ , 采 用 2 根 液 相 色谱 柱 〈 反 相 色 谱 柱 和 亲 水 作用 色谱 柱 ), 通 过 阀 切 换 实现 了 一 次 进 样 同时 检 测 亲 水 和 朴 水 代谢 产物 , 解 决 了 复杂 生物 样品 中 亲 水 性 和 朴 水 性 代谢 产物 的 同时 检测 问题 。 12.3 数据 分 析 平 台 代谢 组 学 得 到 的 是 大 量 、 多 维 的 信息 。 为 了 充分 挖掘 所 获得 数据 中 的 潜在 信息 , 对 数据 的 分 析 需 要 应 用 一 系列 的 化 学 计量 学 方法 。 在 代谢 组 学 研究 中 , 大 多 数 是 从 检测 到 的 代谢 产物 信息 中 进行 两 类 〈 如 基因 突变 前 后 的 响应 ) 或 多 类 〈 如 不 同 表 型 间 代 谢 产 物 ) 的 判别 分 类 2 , 以 及 生物 标志 物 的 发 现 喇 "7 。 数 据 分 析 过 程 中 应 用 的 主要 手 段 为 模式 识别 技术 , 包 括 非 监督 (unsupervised) 学 习 方 法 和 有 监督 (supervised) 学 习 方法 〈 见 第 7 章 )。 非 监督 学 习 方 法 用 于 从 原始 谱 图 信息 或 预 处 理 后 的 信息 中 对 样本 进行 归 类 , 并 采 用 相应 的 可 视 化 技术 直观 地 表达 出 来 , 不 需要 有 关 样 品 分 类 的 任何 背景 信息 。 该 方法 将 得 到 的 分 类 信息 和 这 些 样 本 的 原始 信息 〈 如 药物 的 作用 位 点 或 疾病 的 种 类 等 ) 进行 比较 , 建 立 代谢 产物 与 这 些 原始 信息 的 联系 , 筛 选 与 原始 信息 相关 的 标志 物 , 进 而 考 察 其 中 的 代谢 途径 。 用 于 这 个 目的 的 方法 没有 可 供 学 习 利 用 的 训练 样本 , 所 以 称 为 非 监督 Cunsupervised) 学 习 方 法 。 主 要 有 主 成 分 分 析 (principal components analysis, PCA)$97) 、 非 线性 映射 "3 、 复 类 分 析 [ 轨 等 。 有 监督 学 习 方 法 用 于 建立 类 别 间 的 数学 模型 , 使 各 类 样品 间 达 到 最 大 的 分 离 , 并 利用 建立 的 多 参数 模型 对 未 知 的 样本 进行 预 测 。 在 这 类 方法 中 , 由 于 建立 模型 时 有 可 供 学 习 利 用 的 训练 样本 , 所 以 称 为 有 监督 学 习 。 这 种 方法 经 常 需要 建立 用 来 确认 样品 归 类 〈 防 止 过 拟 合 ) WRU validation set) 和 用 来 测试 模型 性 能 的 测试 集 〈test set) 。 应 用 于 该 领域 的 主要 是 基于 PCA、 偏 最 小 二 乘法 (partial least squares,PLS) 、 神 经 网 络 的 改进 方法 , 常 用 的 有 类 模拟 软 独 立 建 模 75 和 偏 最 小 二 乘法 -判别 分 析 (PLS-discriminant analysis,PLS-DA)5579 、 正 交 (O)-PLS79 。 作 为 非 线性 的 模式 识别 方法 , 人 工 神 经 元 网 络 〈neutral network, ANN) 技术 5 也 得 到 广泛 应 用 。PCA 和 PLS-DA 是 代谢 组 学 研究 中 最 常用 的 模式 识别 方法 。 这 两 种 方法 通常 以 得 分 图 (score plot) 获得 对 样品 分 类 的 信息 , 载 荷 图 . (load- ing plot) 获得 对 分 类 有 贡献 变量 及 其 贡献 大 小 , 从 而 用 于 发 现 可 作为 生物 标志 物 的 变 量 。 此 外 , 在 数据 处 理 和 分 析 的 各 阶段 , 对 数据 的 质量 控制 和 模型 的 有 效 性 验证 也 需 引 起 足够 的 重视 [52 。 应 该 强调 , 由 上 述 分 析 仪器 导出 的 元 数据 (metadata) , 不 能 直接 用 于 模式 识别 分 析 5] , 还 需 对 数据 进行 预 处 理 , 将 元 数据 转变 为 适合 于 多 变量 分 析 〈 主 要 是 模式 识别 ) 的 数据 形式 , 使 相同 的 代谢 产物 在 生成 的 数据 和 矩阵 中 由 同一 个 变量 表示 , 所 有 的 样品 具 有 相同 的 变量 数 。 最 后 用 于 模式 识别 的 数据 为 二 维和 矩阵 数据 形式 , 行 代表 样品 或 实验 数 目 , 列 表示 相应 的 单个 测定 指标 〈 通 常 为 代谢 物 的 信号 强度 等 ) 。 仪器 的 微小 波动 及 样品 pH 和 基体 的 变化 会 引起 NMR 中 化 学 位 移 的 改变 , 色 谱 - 质谱 方法 中 流动 相 组 成 、 柱 温 的 微小 变化 、 梯 度 的 重 现 性 及 其 柱 表面 的 状态 变化 常 导致 保留 时 间 的 差异 。 在 模式 识别 前 , 需 对 谱 图 实行 峰 匹 配 〈 或 称 峰 对 齐 ) , 使 各 样本 的 数 据 得 到 正确 的 比较 。 主 要 的 数据 预 处 理 包 括 滤 品 、 重 私 峰 解析 〈deconvolution) 、 峰 对 齐 、 峰 匹配 、 标 准 化 和 归 一 化 等 。 在 实际 操作 中 , 并 不 是 这 些 步骤 都 需要 进行 , 而 是 根 据 实 际 情况 , 只 做 其 中 几 种 预 处 理 〈 表 1-1) 。 相 比 之 下 ,HPLC 的 保留 时 间 重 复 性 比 “ve GC 要 差 一 些 , 峰 匹配 要 相对 困难 。 我 们 发 展 的 “多 区 域 可 变 保留 值 窗 口 ” 的 峰 对 齐 算 ye), AAT ARF HPLC, 也 可 用 于 GC 代谢 组 学 的 峰 匹 配 6] 。 关 于 这 方面 的 详情 , 有 兴趣 的 读者 可 参看 第 2 一 5 章 的 内 容 , 也 可 查看 表 1-1 中 的 文献 。 表 1-1 代谢 组 学 中 常用 的 峰 匹 配方 法 举例 No。 分 析 工具 采用 的 峰 匹 配方 法 参考 文献 1 GC/MS 一 个 用 于 处 理 色谱 数据 的 新 工具 包 (MSFACT) ,该 工具 可 自动 转换 .匹配 色谱 数据 [84] 2 GC-MS _ 用 GC-MS 研究 汗液 ,通过 峰 匹 配 ,5080 个 峰 减 少 成 373 个 [85] 3 GC-MS ”介绍 了 检测 和 匹配 大 量 GC-MS 数据 的 方法 :OD 从 所 有 色谱 图 中 找 出 可 能 的 目标 峰 ;@ 将 [86] 色谱 图 中 峰 与 这 些 目标 峰 进 行 匹配 形成 与 每 个 目标 群 相关 的 峰 群 ; @ 合 并 相关 的 峰 群 4 GL-MS ”报告 了 两 个 峰 检测 和 匹配 新 方法 ,MZmine 和 XCMS。MZmine 可 免费 下 载 http://mzmine [87,88] LC-MS sourceforge. net/ 5 LC-MS 综述 了 LC-MS 做 代谢 组 学 时 数据 处 理 的 关键 步骤 及 最 新 进展 [89] 6 LC-MS 根据 仪器 质 荷 比 (/z) 的 测量 误差 来 匹配 质谱 数据 [58] 7 LC/MS 报道 了 用 LC-MS 做 代谢 组 学 研究 时 数据 的 提取 、 解 析 和 确认 的 方法 及 LC-MS 做 代谢 组 83,90] 学 研究 的 策略 8 MS HR BE AN 28 ia tar LC m/z) BAM BR ER DL Bic PT [91] 9 CE 使 用 相关 最 佳 扭曲 法 (correlation optimized warping,COW) 来 匹配 毛细 管 电泳 数据 [92] 10 NMR 小 波 变换 (undecimated wavelet transform) JE fit NMR 峰 [93] 11 NMR 使 用 Bayesian 统计 方法 ,同时 考虑 波谱 移 位 和 基线 变动 ,匹配 NMR 数据 [94] 12 NMR 使 用 模糊 扭曲 方法 匹配 由 于 仪器 和 尿 基 体 变 动 引 起 的 NMR 移 位 [95] 13 NMR 使 用 二 维 关联 波谱 法 (2D COSY) SFE FH DH REE PERN S| SA IE [96 ] 14 NMR WaT NMR 峰 匹配 的 两 种 方法 [97] 15 NMR 介绍 了 一 个 自动 峰 匹 配方 法 [98] 12.4 代谢 组 学 数据 库 代谢 组 学 分 析 离 不 开 各 种 代谢 途径 和 生物 化 学 数据 库 。 与 基因 组 学 和 蛋白 质 组 学 已 有 较 完 善 的 数据 库 供 搜索 、 使 用 相 比 , 目 前 代谢 组 学 研究 尚未 有 类 似 的 功能 完备 的 数据 FRE) 。 一 些 生 化 数据 库 52-25 可 供 未 知 代谢 物 的 结构 鉴定 或 用 于 已 知 代谢 物 的 生物 功 能 解释 , 如 连接 图 数据 库 〈(Connections Map DB)、 京 都 基因 与 基因 组 百科 全 书 (KEGG), METLIN, HumanCyc, EcoCyc 和 metacyc、BRENDA、LIGAND、Meta- Cyc. UMBBD, WIT2, EMP 项 目 ,IRIS、AraCyc、PathDB、 生 物化 学 途径 (Ex PASy) 、 互 联网 主要 代谢 途径 (main metabolic pathways on Internet, MMP), Duke 博士 植物 化 学 和 民族 植物 学 数据 库 、Arizona 大 学 天 然 产物 数据 库 等, 其 中 IRIS、Ara- Cyc 分 别 为 水 稻 和 拟 南 芥 的 有 关 数 据 库 。 表 1-2 给 出 了 其 中 的 一 些 网址 , 可 供 读者 参考 。 表 1-2 目前 文献 中 一 些 有 用 的 与 代谢 产物 相关 的 数据 库 No. 数据 库 名 网 址 1 KEGG http://www. genome. jp/kegg/ligand. html 2 HumanCyc http: //biocyc. org 3 代谢 的 原子 重 构 (ARMD) 项 目 数据 库 http: //www. metabolome. jp 4 新 药 及 其 代谢 产物 质谱 库 http://www. ualberta. ca/_gjones/mslib. htm 5 METLIN 数据 库 http: //metlin. scripps. edu/ 6 “肿瘤 ”代谢 组 数据 库 http://www. metabolic-database. com 7 Lipidomics: Lipid Maps http://www. lipidmaps. org/data/ index. html 8 Lipidomics; SphinGOMAP http: //sphingomap. org/ 9 Lipidomics; Lipid Bank http: //lipidbank. jp/ index00, shtml 10 人 类 代谢 组 数据 库 http://www. hmdb. ca 11 ChemSpider Beta http: // www. chemspider. com 12 Pubmed 化 合 物 数据 库 http://www. pubmed. gov 13 NIST 质谱 数据 库 http://www. nist. gov/srd/nistl. htm 理想 的 代谢 组 学 数据 库 应 应 包括 各 种 生物 体 的 代谢 组 信息 以 及 代谢 物 的 定量 数据 , 如 人 类 代谢 组 数据 库 (http://www. hmdb. ca)5 中 的 那样 。 但 实际 上 , 这 方面 的 信息 非 常 缺乏 。 一 些 公共 数据 库 对 各 种 生物 样本 中 代谢 物 的 结构 鉴定 也 非常 有 用 , 如 Pubmed 化 合 物 库 、ChemSpider 数据 库 等 〈 表 1-2), 后 者 包含 有 1650 万 个 化 合 物 的 结构 信息 , 可 供 网 上 检索 。 1.3 代谢 组 学 的 应 用 代谢 组 学 目 从 出 现 以 来 , 引 起 了 各 国 科学 家 的 极 大 兴趣 , 广 泛 地 应 用 于 各 个 领 域 "” , 如 疾病 诊断 、 药 物 开 发 、 的 BaF A eR le ae 面 的 研究 中 。 详 细 的 情况 请 见 后 面 各 章 , 这 只 做 简单 与 纳 。 1.3.1 药物 研发 药物 研发 领域 , 尤 其 是 西方 的 药物 研发 主要 沿用 靶 向 研发 策略 ,“ 致 使 90 妈 的 药物 仅 对 30%~50% BBA”, BI 50 站 一 70%% 的 患者 不 但 未 从 所 接受 的 药物 治疗 中 受 益 , 反 而 要 承担 其 所 带 来 的 副作用 。 鉴 定 出 有 效 的 具有 生理 和 临床 意义 的 标志 物 作为 廉 价 、 快 捷 的 筛选 对 特定 人 群 有 效 或 有 毒药 物 的 方法 , 已 成 为 大 家 的 共识 。 事 实 上 , 由 于 药物 开发 成 本 的 提高 , 新 药 发 现 -开发 环节 中 的 消耗 变 成 了 制药 工业 所 面临 的 巨大 挑战 之 一 。 任 何 能 快速 、 经 济 、 有 效 地 预测 药物 对 特定 人 和 群 的 潜在 毒性 的 工具 , 毫 无 疑问 地 都 会 被 重点 关注 。 代谢 组 学 在 疾病 动物 模型 〈 包 括 转基因 动物 ) 的 确证 、 药 物 筛选 、 药 效 及 毒性 评 价 、 作 用 机 制 和 临床 评价 等 方面 有 着 广泛 的 应 用 5 〈 详 见 第 13 BE). Nicholson 研 究 小 组 Bo425 08 209 利用 基于 NMR 的 代谢 组 学 技术 , 在 药物 毒性 评价 方面 开展 了 深入 的 工作 。 他 们 的 研究 表明 采用 代谢 组 学 方法 可 判断 毒性 影响 的 组 织 器 官 及 其 位 点 , 推 测 药 e 14 e 物 相关 作用 机 制 , 确 定 与 毒性 相关 的 潜在 生物 标志 物 ; 并 在 此 基础 上 可 建立 供 毒性 预测 的 专家 系统 以 及 毒物 影响 动物 内 源 性 代谢 物 随 时 间 的 变化 轨迹 。 在 COMET 研究 项 目 中 , 对 147 种 典型 药物 的 肝 肾 毒性 进行 了 研究 。 通 过 检测 正常 和 受 毒 大 鼠 和 小 鼠 的 体 液 、 组 织 中 代谢 物 的 NMR 谱 , 结 合 已 知 毒 性 物质 的 病理 效应 建立 了 第 1 个 大 鼠 肝 及 和 肾脏 毒性 的 专家 系统 。 该 专家 系统 分 为 3 个 独立 的 级 别 可 实现 正常 /异常 的 判别 、 对 未 知 标本 进行 毒性 或 疾病 的 识别 以 及 病理 学 的 生物 标志 物 识 别 。 目 前 COMET 计划 的 目 标 是 研究 标准 有 毒药 物 的 分 子 机制 , 进 而 建立 可 预测 性 的 构 效 关系 5 。 最 近 Mally 等 对:H-NMR 代谢 组 学 方法 用 于 肾 功 能 损伤 标志 物 的 可 行 性 进行 了 研究 。 他 们 采用 FeNTA 或 溴 化 钾 引 起 的 两 种 崩 功 能 损伤 小 鼠 模型 , 研 究 了 4- 羟基-2(E)- 王 醛 基 - 琉 基 尿 酸 作为 肾 功能 损伤 标志 物 的 可 行 性 。 结 果 表明 :H-NMR 代谢 组 学 方法 可 以 用 来 指示 肾 功能 损伤 , 但 对 氧化 应 激 无 特异 性 ,HNE-MA 和 其 他 的 磷脂 过 氧化 标志 物 有 很 好 的 相 关 性 , 标 志 物 的 类 型 与 病理 条 件 有 关 , 尚 未 发 现 普 适 性 的 氧化 应 激 标志 物 。 1.3.2 疾病 研究 由 于 机 体 的 病理 变化 , 代 谢 产物 也 产生 了 某 种 相应 的 变化 。 对 这 些 由 疾病 引起 的 代 谢 产物 的 响应 进行 分 析 , 即 代谢 组 学 分 析 , 能 够 帮助 人 们 更 好 地 理解 病变 过 程 及 机 体内 物质 的 代谢 途径 , 还 有 助 于 疾病 的 生物 标志 物 的 发 现 和 辅助 临床 诊断 的 目的 。 如 Brin- dle 等 应 用 :H-NNIR 技术 以 36 例 严重 心血 管 疾病 患者 和 30 例 心血 管 动脉 硬化 患者 的 血 清和 血浆 为 研究 对 象 进行 了 代谢 组 学 分 析 , 结 合 PCA、SIMCA、PLSDA、OSC-PLS 等 模式 识别 技术 实现 了 对 心血 管 疾病 及 其 严重 程度 的 判别 , 得 到 了 高 于 90 办 的 灵敏 度 REE. 代谢 组 学 在 疾病 研究 中 的 应 用 主要 包括 病变 标志 物 的 发 现 、 疾 病 的 诊断 、 治 疗 和 预 后 的 判断 29 〈 详 见 第 9~11 章 )。 最 广泛 的 应 用 是 发 现 与 疾病 诊断 、 治 疗 相 关 的 代 谢 标 志 物 〈 群 ), 通 过 代谢 物 谱 分 析 得 到 的 相关 标志 物 是 疾病 的 分 型 、 诊 断 、 治 疗 的 基 础 。 目 前 已 有 较 多 文献 报道 代谢 组 学 在 疾病 研究 的 应 用 , 如 新 生 儿 代谢 紊乱 5525 、 冠 心病 、 膀 胱 炎 55 、 高 血压 和 精神 系统 疾病 "2 等 。 作者 课题 组 将 所 建立 的 代谢 组 学 方法 应 用 于 重大 疾病 〈 如 肿瘤 、2 型 糖尿 病 、 重 型 肝炎 等 ) 的 病变 标志 物 研 究 中 , 建 立 了 基于 正 相 液 相 色谱 / 电 喷 雾 线性 离子 阱 质谱 方法 , 用 于 体液 中 磷脂 的 代谢 轮廓 谱 分 析 "2”" 。 将 该 方法 用 于 2 型 糖尿 病 和 健康 人 进行 分 类 研究 , 识 别 出 4 种 可 能 的 磷脂 分 子 生 物 标 志 物 "'” ;研究 了 m-3 型 多 烯 脂肪 酸 二 十 碳 五 烯 酸 CEPA) 和 二 十 二 碳 六 烯 酸 (DHA) 对 人 类 Jurkat E-6-1 工 细 胞 中 膜 脂 答 和 可 溶 膜 区 域 中 几 种 主要 磷脂 组 成 的 影响 。 结 果 表 明 ,EPA 或 DHA 能 够 使 脂 酰 链 为 mn-3 多 不 饱和 脂肪 酸 CPUFA) 的 磷脂 含量 显著 增加 , 揭 示 了 PUFA 免疫 抑制 作用 的 分 子 机 HOPS) 。 作 者 课题 组 还 建立 了 基于 固 相 薪 取 (SPE)-HPLC 的 体液 中 核 苷 代谢 轮廓 分 析 方 法 ”… ” , 并 将 该 方法 应 用 于 肿瘤 的 研究 中 , 建 立 了 正常 人 和 癌症 患者 尿 中 核 苷 的 排放 水 平和 模式 , 比 较 了 不 同 瘤 种 之 间 排 放水 平 的 差异 , 检 测 癌症 的 敏感 性 均 显 著 高 于 目 前 已 临床 应 用 的 肿瘤 标志 物 。 同 时 在 区 分 良 恶 性 肿瘤 、 监 测 手术 和 化 疗效 果 以 及 预测 肿 瘤 复 发 等 方面 都 有 较 好 的 价值 〈 详 见 第 10 章 )。 同 时 将 基于 液 相 色谱 质谱 联 用 e 15 @ (LC-MS) 方法 的 代谢 组 学 平台 应 用 于 肝病 的 研究 中 , 实 现 了 不 同 肝病 患者 与 正常 人 进 行 有 效 区 分 , 有 肝癌 诊 断 中 肝炎 和 肝 硬 化 患者 的 假 阳性 率 仅 为 7.4%B] 。 应 用 于 慢性 乙 型 肝炎 的 急性 发 作 样 本 , 诊 断 正确 率 为 100%; 并 鉴定 出 1 个 传统 标志 物 和 4 个 新 的 标 Ry 。 1.3.3 植物 代谢 组 学 植物 代谢 组 学 62 的 很 多 研究 集中 在 细胞 代谢 组 学 这 个 相对 独立 的 分 支 。 主 要 是 通 过 研究 植物 细胞 中 的 代谢 组 在 基因 变异 或 环境 因素 变化 后 的 相应 变化 , 去 研究 基因 型 和 表 型 的 关系 及 揭示 一 些 沉 默 基因 的 功能 , 进 一 步 了 解 植 物 的 代谢 途径 82230 〈 详 见 第 14 章 ) 。 植 物 代谢 组 学 研究 大 多 集中 在 代谢 轮廓 或 代谢 物 指纹 图 谱 (metabolite finger- printing) 上 。 根 据 对 象 的 不 同 , 植 物 代谢 组 学 的 研究 主要 包括 : 中 某 些 特定 种 类 (specie) 植物 的 代谢 物 组 学 研究 。 这 类 研究 通常 以 某 一 植物 为 对 象 , 选 择 某 个 器 官 或 组 织 , 对 其 中 的 代谢 物 进 行 定性 和 定量 分 析 。G@ 不 同 基因 型 (genotype) 植物 的 代谢 组 学 表 型 研究 。 一 般 需 要 两 个 或 两 个 以 上 的 同 种 植物 〈 包 括 正常 对 照 和 基因 修饰 植物 ), 然后 应 用 代谢 组 学 对 所 研究 的 不 同 基 因 型 的 植物 进行 比较 和 鉴别 232 。@@ 某 些 生态 型 (ecotype) 植物 的 代谢 组 学 。 这 类 研究 通常 选择 不 同 生 态 环境 下 的 同 种 植物 , 研 究 生长 环境 对 植物 代谢 物产 生 的 影响 。 四 受 外 界 刺 激 后 的 植物 自身 免疫 应 答 。 植物 代谢 组 学 研究 最 具 代 表 性 的 是 Fiehn 等 23 :55 的 工作 , 他 们 利用 GC/MS 技术 通过 对 不 同 表 型 葫芦 韧 皮 部 〈cucurbita maxima phloem) 的 433 种 代谢 产物 进行 代谢 组 学 分 析 , 结 合 化 学 计量 学 方法 (PCA, ANN 和 HCA) 对 这 些 植物 的 表 型 进行 了 分 类 , 找到 了 4 种 在 分 类 中 起 着 相当 重要 的 代谢 物质 : 苹果 酸 (malic acid) 和 柠檬 酸 、 和 葡萄 糖 和 果糖 。 与 线粒体 和 叶绿体 中 的 基因 型 结果 一 致 。 随 着 植物 细胞 代谢 组 学 的 迅速 发 展 , 人 们 已 经 开始 利用 这 一 技术 的 成 果 。Meta- nomics 公司 的 成 立 就 是 一 个 典型 的 代表 , 他 们 的 目标 是 寻找 植物 代谢 过 程 中 的 关键 基 因 , 如 能 够 让 植物 耐寒 的 基因 。 其 思想 就 是 遵循 代谢 组 学 的 方法 , 在 改变 植物 的 基因 后 , 进 行 植物 的 代谢 分 析 或 记录 代谢 产物 , 从 而 更 迅速 地 掌握 有 关 植 物 代谢 途径 的 信息 。 目前 所 发 现 的 次 生 代谢 产物 大 约 有 802%% 来 自 植物 。 植 物 次 生 代 谢 产物 包含 很 多 功 AEA, TAA GBA. ARB. HBS). KoA, BA. AAS. 尽管 植物 能 合成 数 十 万 种 低 分 子 质量 的 有 机 化 合 物 〈 次 生 代谢 产物 ), 很 多 具有 利用 价 值 , 但 植物 细胞 的 巨大 合成 能 力 并 没有 被 很 好 地 利用 , 更 重要 的 是 重要 次 生 代 谢 产 物 的 含量 很 低 , 如 我 国 科 学 家 首先 自 青 贰 中 分 离 得 到 的 对 脑 疙 等 恶性 疙 疾 有 突出 疗效 的 青 项 素 , 在 青 项 中 的 含量 低 于 1% , 与 人 们 的 期 望 相差 甚 远 。 到 目前 为 止 , 植 物 的 次 生 代谢 网 络 没有 被 很 好 地 表征 , 与 生物 合成 相关 的 功能 基因 组 图 还 远 未 完成 。 而 这 些 对 突破 植 物 或 植物 细胞 培养 低产 率 的 瓶颈 十 分 重要 。 为 此 , 我 们 与 中 国 科 学 院 北 京 植物 研究 所 合 作 , 开 展 了 青 芒 中 桩 类 物质 的 代谢 途径 的 研究 。 建 立 了 基于 全 二 维 气相 色谱 -飞行 时 间 质谱 联 用 技术 〈GCXGC-TOFMS) 的 青 若 挥发 油分 离 分 析 方 法 , 对 青 功 中 挥发 油 的 成 分 进行 分 析 , 结 果 表 明 挥 发 油 主要 由 烷烃 、 单 菇 、 单 桔 含 氧 衍生 物 、 倍 半 蓝 、 倍 半 芷 含 - 16° 氧 衍生 物 5 MBAR). Ae EA ES KAT AT IB) RR A A Huse 3002 MLA, FHEEKSTHRRRKWRE PHBE Ply. KA GCX GC-TOFMS FEHR ABA SME A SEtE, MAE FRE 100 PPAR 物质 并 找 出 普通 植株 与 转基因 植株 在 代谢 产物 上 的 差异 。 利 用 气相 色谱 火焰 离子 化 检测 # (GC-FID) 和 GC/MS 方 法 为 主要 手段 , 对 不 同 生 长 阶段 的 青 苇 代谢 指纹 谱 进 行 了 a), BAS 个 生长 时 期 〈 幼 苗 期 、 成 苗 期 、 现 蕾 前 期 、 现 蕾 期 和 盛 花期 ) 可 以 得 到 很 好 的 区 分 , 并 证 实 了 青 蒿 素 产 生 途 径 中 瓶颈 的 存在 。 1.3.4 微生物 代谢 组 学 第 一 篇 微生物 代谢 组 学 文献 报道 了 基于 GC-MS 技术 , 通 过 分 析 脂 肪 酸 、 氮 基 酸 和 糖 类 并 结合 化 学 计量 学 方法 监测 肠系膜 明 串 珠 菌 发 酵 生 产 葡 聚 糖 过 程 中 的 微生物 污 yess) 。 目 前 , 代 谢 组 学 技术 已 应 用 于 微生物 表 型 分 类 0 、 突 变 体 筛 选 n5%] 、 代 谢 途 径 及 微生物 代谢 工程 nb 、 发 酵 工 艺 的 监控 和 优化 0324 及 微生物 降解 环境 污染 物 吕 5, 146] 等 方面 Q47] ( 详 见 第 15 B), Buchholz 等 59 将 快速 取样 技术 和 其 他 分 析 技术 结合 , 实 现 了 细胞 内 大 量 代谢 物 的 快速 、 高 频率 定量 , 使 之 能 够 用 于 发 酵 过 程 的 动态 检测 。 该 技术 将 帮助 研究 各 种 因素 对 发 酵 的 影响 , 从 而 提高 生物 工程 的 产量 。Dalluge 等 0 多 采用 液 相 色谱 与 串联 质谱 联 用 对 发 酵 过 程 中 的 氨基 酸 实 现 了 监测 , 通 过 分 析 认 为 其 中 的 一 个 子 集 可 反映 发 酵 的 状态 。 Grivet “Xt NMR 这 一 技术 用 于 微生物 代谢 组 学 研究 做 了 较为 详尽 的 综述 ;Ishii 等 多 对 微生物 细胞 中 的 计算 机 模拟 做 了 很 详细 的 综述 , 这 里 就 不 再 赣 述 了 。 我 们 在 研究 不 同 基因 修饰 下 胞 内 和 胞 外 代谢 物 的 变化 规律 与 特点 , 比 较 不 同 底 物 、 不 同 菌株 胞 内 代谢 物 指纹 谱 的 差异 的 基础 上 , 考 察 了 环境 对 微生物 代谢 的 影响 ns , 得 到 不 同 条 件 下 嗜 碱 乳 酸 菌 胞 内 氨基 酸 变 化 与 发 酵 液 中 乳酸 产量 的 关系 。 研 究 铜 绿 假 单 胞 菌 和 大 肠 埃 硕 菌 在 不 同 抗生素 作用 下 三 羧 酸 〈tricarboxylic acid, TCA) 循环 和 糖 酵 解 途径 中 主要 有 机 酸 类 代谢 产物 代谢 池 的 变化 , 发 现在 铜绿 假 单 胞 菌 中 唆 诺 酮 类 抗生素 对 TCA 代谢 物 的 影响 与 # 内 酰胺 类 表现 为 负 相 关 , 这 种 相关 性 在 抗菌 活性 上 反映 为 具有 正 协 同 作 用 。 对 野生 株 、Aac& Fil Asdh 基因 修饰 株 大 肠 杆 菌 产 琥珀 酸 情 况 进 行 分 析 发 现 , 以 葡萄 糖 和 果糖 为 碳 源 时 ,Aack 株 的 生物 量 明显 低 于 其 他 两 株 , 而 且 同 样 条 件 下 , 果糖 为 唯一 碳 源 的 情况 下 , 生 物 量 高 于 葡萄 糖 为 碳 源 的 情况 。 通 过 对 胞 内 代谢 通 量 的 分 析 发 现 ,Aack 株 的 代谢 通 量 改变 较为 显著 。 13.5 代谢 组 学 与 中 医药 现代 化 中 医药 学 是 我 国医 学 科学 的 特色 , 也 是 中 华 民族 优秀 传统 文化 的 重要 组 成 部 分 。 由 于 受 我 国 科学 技术 整体 水 平 的 限制 , 中 药 研究 水 平 较 低 、 中 药 产业 科技 含量 差 、 作 用 的 物质 基础 研究 有 限 、 作 用 机 制 缺 乏 科学 研究 、 药 材 资 源 数量 和 质量 的 制约 因素 多 、 认 识 中 药 毒 性 和 不 良 反 应 还 存在 误区 。 这 些 因 素 严重 地 影响 了 中 药 在 世界 范围 内 的 广泛 使 用 和 国际 地 位 。 正 是 基于 此 , 国 家 提出 了 使 用 现代 科学 技术 来 研究 中 药 中 的 药物 作用 的 物 a Ws 质 学 基础 、 中 药 的 质量 控制 、 中 药 的 毒性 研究 等 , 即 中 药 现代 化 的 研究 。 代谢 组 学 的 核心 是 研究 外 源 性 物质 对 生物 体 所 产生 的 整体 性 效应 。 用 它 研 究 药物 对 机 体 所 形成 的 内 源 性 代谢 组 的 系统 作用 时 , 其 研究 方法 与 中 医治 疗 疾病 的 整体 观念 相 一 致 0s] , 从 此 意义 来 看 , 立 题 运用 代谢 组 学 研究 中 药 , 对 认识 中 药 的 药 效 作 用 的 物质 基 础 、 产 生 毒 副作用 的 物质 基础 , 认 识 正确 用 药剂 量 和 疗程 、 防 止 毒 性 反应 都 非常 有 意 义 , 也 是 系统 生物 学 时 代 给 我 们 提供 的 一 个 机 遇 。 因 此 , 刘 昌 孝 、 王 永 炎 、 张 伯 礼 、 石 学 敏 、 陈 凯 先 、 胡 之 壁 、 杨 胜利 、 肖 培根 、 李 连 达 、 许 国 旺 、 王 广 基建 议 国家 重大 专项 研究 计划 项 目 设 立 “ 基 于 代谢 组 学 的 中 药 现代 研究 ”的 专项 5sz150 。 在 2005 年 纪念 《传统 药物 学 杂志 》 创 刊 25 年 出 版 100 卷 时 出 版 的 专集 文章 59 中 明确 认为 , 传 统 药物 与 系统 生物 学 的 整体 观 是 完美 的 匹配 , 肯 定 地 认为 代谢 组 学 技术 是 系统 生物 学 研究 的 关 键 技术 。 用 代谢 组 学 研究 中 药 , 可 对 中 药方 剂 配伍 的 科学 性 、 中 药 种 质 资源 、 中 药 作用 PLO] 、 中 药 的 临床 前 安全 性 和 毒性 0s 及 中 医 疾 病 诊断 的 科学 性 进行 研究 。 这 方面 已 有 很 好 的 综述 Ds"~1s9] , 这 里 不 再 展开 。 有 兴趣 的 读者 可 参看 本 书 第 13 章 的 内 容 。 应 该 注意 的 一 点 是 , 中 药 代 谢 与 肠 道 菌 群 密切 相关 Dee 。 由 于 大 部 分 中 药 都 是 口 服 给 药 , 肠 道 细菌 的 基因 组 会 首先 受到 这 些 药 的 “攻击 ”。 所 以 , 要 了 解 肠 道 细菌 的 基 因 组 对 中 药 汤 剂 的 毒性 和 有 效 性 是 如 何 反应 、 调 节 的 。 这 些 机 制 的 阐明 , 有 可 能 会 开发 出 一 种 突破 性 的 治疗 方法 一 一 通过 调节 人 体 的 细菌 就 可 以 治疗 疾病 。 1.4 代谢 组 学 发 展 展望 从 总 体 来 看 , 代 谢 组 学 仍然 处 于 发 展 阶段 , 在 方法 学 和 应 用 两 方面 均 面 临 着 极 大 的 挑战 , 需 要 其 他 学 科 的 配合 和 交叉 。 在 技术 平台 和 方法 学 研究 方面 , 生 物 样本 的 复杂 性 使 得 代谢 组 学 研究 对 分 析 技 术 的 灵敏 度 、 分 辨 率 、 动 态 范围 和 通 量 提 出 了 更 高 的 要 求 。 代 谢 组 学 研究 的 深入 得 益 于 分 析 技术 的 不 断 发 展 , 如 高 分 辩 质 谱 、 超 高 效 液 相 色 谱 / 质 谱 、 毛 细 管 液 相 色谱 /质谱 、 多 维 色谱 质谱 联 用 技术 和 多 维 核磁 共振 技术 等 的 使 用 。 生 物 标志 物 的 结构 鉴定 也 是 目前 代谢 组 学 研究 的 重点 和 难点 问题 之 一 , 由 于 缺乏 标准 的 可 通用 的 质谱 数据 库 , 基 于 LC-MS 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 在 一 定 程度 上 受到 了 制约 。 理 论 上 讲 ,LC-MS-NMR 可 提供 较 好 的 关于 组 分 结构 的 信息 25 , 但 仪器 复杂 、 操 作 繁 瑞 、 灵 敏 度 和 通 量 急 需 改 进 和 提高 。 功 能 完善 的 代谢 产物 数据 库 的 构建 及 代谢 组 学 研究 的 标准 化 〈http://msi- workgroups. sourceforge. net/)L13 等 问题 已 越 来 越 受 到 关注 659 。 与 其 他 组 学 一 样 , 如 何 克 服 瓶颈 从 大 量 的 代谢 产物 中 找 出 特异 性 的 生物 标志 物 〈 特 别 是 低 丰 度 的 标志 物 ) 是 决定 此 技术 能 和 否 在 药物 和 临床 领域 广泛 应 用 的 一 个 重要 因素 。 陈列 毛细 管 电泳 技术 的 出 现 推动 了 基因 组 学 的 发 展 ,2D eB KA 2D 液 相 色 谱 质 谱 技术 促进 了 有 蛋白 质 组 学 的 发 展 。 从 目前 来 看 , 代 谢 组 学 还 没有 类 似 的 可 通用 的 新 技术 出 现 。 现 今 之 下 , 多 种 分 析 技 术 的 集成 是 主要 的 技术 平台 。 例 如 , 我 们 在 进行 “胰岛 素 抵 TAR” 标志 物 的 研究 中 5 , 提 出 了 关于 生物 标志 物 发 现 和 识别 的 一 套 新 方法 (图 1-6), 包 括 LC-MS 指纹 分 析 、 多 变量 数据 分 析 发 现 可 能 的 生物 标志 物 ,FIT/VMS 测 定 精确 质量 , 通 过 微 制备 、MSV/MS 碎片 信息 、 气 相 色 谱 保 留 指数 及 文献 检索 和 合成 同 eis. @ 位 素 化 合 物 等 识别 和 确认 代谢 标志 物 等 。 据 此 不 仅 可 发 现 可 能 的 生物 标志 物 , 而 且 可 确 定 它们 的 结构 , 异 构 体 也 可 区 分 。 这 一 方法 对 基于 液 质 联 用 的 代谢 组 学 发 展 具 有 强大 的 促进 作用 。 代谢 组 学 研究 多 变量 统计 分 析 生物 标记 物候 选 化 合 物 GC-MS/ NMR .或 ates sue 标准 样品 一 确认 定性 ? 是 阐明 的 分 子 结构 图 1-6 标志 物 定性 的 方案 CIDA 为 信息 依赖 的 数据 采集 技术 ) 由 于 一 次 分 析 不 能 获得 所 有 代谢 产物 的 信息 , 生 物 问题 又 要 从 多 个 侧面 进行 理解 , 因此 , 体 液 代 谢 组 学 研究 与 细胞 生物 学 和 动物 模型 数据 和 知识 的 整合 0ss] 、 不 同 代谢 组 学 方法 (yl UPLC-TOF-MS 与 NMR") 的 整合 、 不 同样 品 〈 尿 、 血 、 组 织 等 ) 代谢 组 学 数据 的 整合 rs- 、 代 谢 组 学 数据 与 其 他 组 学 数据 如 与 转录 组 cm 中、 基因 组 Do、 蛋 白质 组 cs 站 及 与 几 种 组 学 数据 的 整合 we- 、 代 谢 组 学 与 计算 生物 学 的 整合 oo] 、 构 建 代谢 网 络 "0299 和 代谢 流动 态 变化 的 数学 模型 等 在 代谢 组 学 研究 领 域内 有 着 广泛 的 发 展 前 景 , 也 是 下 一 步 研 究 的 重点 。 作 为 例子 , 图 1-7 给 出 了 老鼠 服用 肝 毒 药物 后 不 同时 间 点 不 同体 液 和 器 官 中 代谢 产物 的 变化 , 从 中 可 知 与 时 间 相 关 的 毒性 效应 。 图 1-8 〈 见 彩 版 ) 给 出 了 一 个 关于 APOE" 3-Leiden 转基因 老鼠 的 集成 生物 学 研 FERRO , 这 样 的 网 络 图 对 快速 识别 早期 标志 物 及 生理 过 程 的 关键 组 分 非常 有 用 。 在 应 用 方面 , 代 谢 组 学 要 生存 和 发 展 , 必 然 要 有 特色 , 要 从 表 型 着 手 回答 其 他 组 学 不 能 回答 的 生物 问题 。 代 谢 物 组 代表 了 即时 的 体内 外 刺激 物 的 总 和 分 析 , 患 者 体内 药物 的 表 型 〈 药 物 的 体内 分 布 、 功 效 、 治 疗 的 失败 和 毒性 ), 可 以 通过 尿 液 、 药 物 代谢 产物 。 19 。 , i t 磷脂 酸 胆 碱 / 胆 碱 t 乳酸 酯 图 1-7 ”集成 代谢 组 学 举例 Han-Wistar 老鼠 在 时 间 点 0 服用 肝 毒 药物 亚 蔡 基 异 硫 氰 酸 酯 (naphthylisothiocyanate) , 在 不 同时 间 体 液 和 组 织 中 代谢 产物 的 变化 趋势 nes] 。TMAO: 三 甲 胺 氨 氧 化 物 ,LDL: 低 密度 脂 蛋 白 ,VLDL: 极 低 密度 脂 蛋白 或 者 数 以 干 计 的 内 源 小 分 子 化 合 物 的 代谢 轮廓 来 监测 。 特 异性 模式 可 在 临床 效应 出 现 之 前 显示 个 体 对 药物 毒性 反应 的 易 感 性 。 这 样 , 代 谢 组 学 可 能 帮助 医生 实现 患者 的 个 性 化 治疗 , 避 免 中 毒 并 降低 药物 的 不 良 反应 。 医 生 也 可 根据 患者 的 表 型 来 分 析 患 者 的 病程 并 制订 治疗 方案 ”1] 。 因 此 药物 代谢 组 学 "2 在 个 性 化 药物 治疗 和 其 他 医学 方面 有 很 大 BS Ae FRE AS [ia]? 。 Fi— Tal» AA EY SA FH “RE OO, AS BR Ol 人 体 的 代谢 CAI 1-9)05 .82 , 并 可 用 代谢 组 学 进行 研究 。 在 正常 情况 下 , 肠 道 菌 群 之 间 存 在 着 复杂 的 动态 平衡 关系 , 对 生命 体 的 多 种 生理 功能 乃 至 生命 活动 至 关 重 要 , 肠 道 菌 群 实际 上 参与 了 人 体 的 生理 生化 、 病 理 和 药理 过 程 , 形 成 了 人 类 代谢 网 络 中 重要 的 组 ° 20° 脂肪 酸 结合 蛋白 《转录 ) x 载 脂 蛋白 Al 人 ~ “i Dickkopflaz A ek ef) ER 2 脂肪 酸 结合 蛋白 血红 素 加 氧 酶 2 蛋白 激酶 Ch 亚 型 一 > PR 溶血 磷脂 酰 胆 碱 1 / LIS Bai 3 核 内 核糖 核 蛋白 Hl \ Pssst 凋 亡 抑制 因子 6 体 增殖 物 激 活 受 体 o 转录 启 始 因子 2 C) 转录 和 口 蛋白 质 。Pearson 相 (由 代谢 物 关系 数 |C|>0.8 相对 丰 度 转基因 /对 照 图 1-8 基因 、 有 蛋白质 和 类 脂 的 关联 网 络 红色 和 绿色 分 别 表 示 转 基因 老鼠 与 野生 型 相 比 浓度 增高 和 降低 。 连 接线 表示 基因 、 蛋 白质 或 类 脂 之 间 的 关联 (Pearson 相关 系数 之 0. 8)D75] 。 内 因 [身体 成 分 ] we | 组织 周转 | L_ #9 | [Arise CAE) | (ee Em] es ee | “基因 类 型 “| 一 一 <—|_ 体育 活动 | ET ~~ Ene] cae // y 轴 表 示 的 是 第 二 维 柱 的 保留 时 间 ,z 轴 表 示 的 是 色谱 峰 的 强度 。 eee. 图 2-2 ”全 二 维 气相 色谱 谱 图 的 生成 和 可 视 化 1 55 1DGC 和 GC-GC 相 比 , 全 二 维 气相 色谱 的 主要 优点 佐 呈 如 下 : @ 可 以 提供 更 高 的 峰 容 量 。 峰 容量 近似 等 于 二 维 峰 容 量 的 乘积 , 远 高 于 1DGC 的 峰 容 量 以 及 GC-GC 的 二 维 峰 容量 之 和 ; @ 由 于 调制 器 的 再 聚焦 作用 , 组 分 分 离 和 检测 灵敏 度 都 得 到 提高 ; @ 采 用 适当 的 色谱 操作 条 件 , 可 以 得 到 包含 结构 信息 的 二 维 结构 谱 图 。 结 构 谱 图 可 以 用 于 族 组 成 定性 , 或 对 未 知 组 分 提供 辅助 定性 信息 。 GCXGC 的 第 二 维 分 离 速度 非常 快 , 组 分 应 在 调制 周期 内 完成 第 二 维 的 分 离 , 否 则 , 前 一 脉冲 的 迟 流出 组 分 可 能 会 与 后 一 脉冲 的 前 面 组 分 交叉 或 重 玲 。 通 常 典型 的 第 二 维 峰 底 宽度 为 100~600ms\™~*9) 。 峰 宽 主 要 与 使 用 的 调制 器 类 型 、 第 二 维 色 谱 柱 的 长 度 、 线 速 等 有 关 。 由 于 第 二 维 近似 是 恒温 操作 , 对 于 给 定 的 色谱 条 件 来 说 第 二 维 的 峰 宽 取决 于 保留 时 间 。 对 于 峰 宽 很 窗 的 色谱 峰 检测 需要 快速 检测 器 。 人 快速 检测 器 需要 较 小 的 内 部 体积 、 较 短 的 响应 时 间 和 足够 高 的 数据 采集 频率 才能 确保 二 维 谱 图 的 准确 构建 。 现 代 氢 火焰 离子 化 (FID) 检测 器 的 内 部 体积 几乎 可 以 忽略 不 计 , 且 采集 频率 高 达 50 一 200Hz2, 是 被 最 广泛 采用 的 全 二 维 气相 色谱 检测 器 。 有 研究 报道 微 电 子 捕获 检测 器 (uECD) 用 于 全 二 维 气 相 色 谱 。 它 的 采集 频率 可 达 50Hz, ARBAB 30~150ul, AT HES IER! 。 传 统 的 四 极 杆 质谱 采集 速度 慢 , 通 常 采集 速度 为 2 张 全 谱 图 /s。 目 3 前 商品 化 的 四 极 杆 质谱 能 达到 的 最 快 采集 速度 只 有 20 张 全 谱 图 /s, 而 且 使 用 最 大 采集 频率 时 会 牺牲 检测 灵敏 度 。 显 然 与 1DGC 联 用 已 非常 成 熟 的 四 极 杆 质谱 并 不 十 分 适合 GCXGC 的 检测 。 飞 行 时 间 质 谱 (TOFMS) 有 非常 高 的 采集 速度 , 其 最 高 采集 频率 可 达 500 次 全 扫描 /s, 是 目前 唯一 可 以 与 GCXGC 很 好 匹配 的 质谱 技术 "'” 。 2.1.3 质谱 谱 图 库 质谱 谱 库 是 气相 色谱 -质谱 联 用 技术 不 可 缺少 的 一 部 分 , 特 别 是 用 于 分 析 含 有 多 个 色谱 峰 的 复杂 样品 时 。 手 动 方法 对 每 一 个 色谱 峰 的 质谱 图 进行 解析 是 十 分 困难 的 , 需 要 耗费 大 量 的 时 间 和 人 力 , 且 需要 具有 专业 质谱 知识 的 人 员 才 能 胜任 。 只 有 有 用 和 计算 机 检索 , 才 能 顺利 、 快 速 地 完成 谱 图 解析 任务 。 目前 最 常用 的 质谱 谱 库 包括 NIST/EPA/NIH 质谱 数据 库 和 Wiley/NIST 质谱 数据 库 。NIST/EPAVNIH 质谱 数据 库 由 美国 国家 科学 技术 研究 所 〈National Tastitute of Science and Technology,NIST) 、 美 国 环保 局 CEPA) 和 美国 国立 卫生 研究 院 CNIH) 共同 出 版 。 最 新 版 本 收 有 163198 张 谱 图 CNIST 05, http://www. nist. gov/srd/ mslist. htm) 。 最 新 第 八 版 Wiley/NIST 质谱 数据 库 收 有 标准 质谱 图 319 256 HK (Wiley — Registry, 8th Edition / NIST 2005 Mass Spectral Library) 。 在 Wiley/NIST 质谱 数据 库 中 同一 个 化 合 物 可 能 有 不 同 来 源 的 重复 质谱 图 。 除 上 述 介绍 的 两 个 通用 质谱 库 外 , 还 有 一 些 专用 质谱 谱 库 , 如 农药 库 (standard pesticide library) 、 药 物 库 (Pfleger, Mau- er, Weber Drug, Pesticide Spectral Library, PerkinElmer) 和 挥发 油库 (essential oil) 等 。 2.2 ”基于 GC-MS, GCXGC-TOFMS 的 代谢 组 学 技术 平台 代谢 组 学 力求 分 析 生 物体 系 〈 如 体液 、 细 胞 和 组 织 等 ) 中 的 所 有 代谢 物 , 整 个 过 程 中 都 强调 尽 可 能 地 保留 和 反映 总 的 代谢 物 信 息 。 在 metabonomics 研究 中 最 第 见 的 分 析 TA NMR?“ , 特 别 是 !H-NMR , 能 够 实现 对 样品 的 非 破坏 性 、 非 选择 性 分 析 , 满 足 了 代谢 组 学 中 的 对 尽 可 能 多 的 化 合 物 进行 检测 的 目标 。 但 由 于 其 对 每 个 分 子 的 化 学 和 物理 环境 敏感 , 因 此 样品 制备 的 要 求 很 高 。 同 时 ,NMR 的 动态 范围 有 限 , 很 难 同 时 测 定 生 物体 系 中 共存 的 浓度 相差 较 大 的 代谢 物 。GC-MS 的 优势 在 于 能 够 提供 较 高 的 分 辩 率 和 检测 灵敏 度 , 并 且 有 可 供 参考 、 比 较 的 标准 谱 图 库 , 可 以 方便 地 得 到 竺 分析 代谢 物 的 定性 结果 。 2.2.1 样品 的 采集 与 制备 样品 的 采集 与 制备 是 代谢 组 学 研究 的 初始 步骤 也 是 最 重要 的 步骤 之 一 , 代 谢 组 学 研 究 要 求 严格 的 实验 设计 和 合适 的 分 析 精 度 。 首 先 需 要 采集 足够 数量 的 样本 , 从 而 可 有 效 减少 源 于 生物 样品 个 体 差 异 对 分 析 结 果 的 影响 , 得 到 有 统计 学 意义 的 分 析 数 据 。 实 验 设 计 中 对 样品 收集 的 时 间 、 部 位 、 种 类 、 样 本 群体 等 应 给 予 充分 考虑 。 在 研究 人 类 样本 。34 。 时 , 还 需 考虑 饮食 、 性 别 、 年 龄 和 地 域 等 诸多 因素 的 影响 。 此 外 , 在 分 析 过 程 中 要 有 严 格 的 质量 控制 , 需 要 考察 如 样本 的 重复 性 、 分 析 精 度 、 空 白 等 。 代 谢 物 的 变化 对 分 析 结 果 有 较 大 的 影响 , 在 处 理 生物 样本 时 要 特别 注意 避免 由 于 残留 酶 活性 或 氧化 还 原 过 程 降 解 代谢 物 、 产 生 新 的 代谢 物 59 。 通 常 需 对 所 收集 样品 进行 快速 疼 灭 (quenching) K , 如 液 氨 冷 冻 、 酸 处 理 等 。 FEGCMS sy eR MT APT HAA BIO. 不 需要 化 学 衍生 的 挥发 性 代谢 物 和 需要 化 学 衍生 的 非 挥发 性 代谢 物 。 挥 发 性 的 代谢 牺 不 需 往生 化 步骤 即 可 从 气相 色谱 流出 。 这 类 对 象 的 采样 方法 主要 包括 直接 收集 和 分 析 顶 空 样品 2 、 用 固体 吸附 齐 富 集 顶 空 或 液体 样品 币 酌 代谢 产物 5 、 固 相 微 伴 取 [ AP FA AE, PPR 谢 物 通常 不 需要 进一步 样品 制备 就 可 直接 用 于 仪器 分 析 。- 采 用 GC-MS 方法 , 以 挥发 性 代谢 牺 太 研 究 对 象 的 应 用 非常 多 , 如 分 析 动 物 或 人 的 呼吸 气 可 以 用 来 研究 某 些 健康 问 题 、 工 作 场所 风险 评估 5 和 疾病 诊断 5 等 。 通 常 呼吸 气 粒 相 物 在 分 析 前 需 冷冻 保存 以 最 大 限度 地 防止 挥发 性 物质 的 损失 。 临 床 诊断 幽门 螺杆 菌 感染 采用 的 即 是 这 种 非 侵袭 性 的 诊断 方法 。 患 者 服用 含有 2# C 标 记 尿 素 的 药丸 , 采 用 气相 色谱 -同位 素质 谱 测定 服药 前 后 呼出 气 中 CO, 的 :CC 同位素 比例 , 通 过 比较 服药 前 后 同位 素 比 例 差异 即 可 诊断 串 者 是 否 被 感染 c5] 。 稳 定 的 同位 素 , 特 别 是 2C 还 可 用 于 代谢 网 络 通 量 和 动力 学 研究 rc , 但 这 类 研究 通常 需 将 代谢 物 衍生 化 处 理 。 采 集 分 析 番 茄 的 挥发 性 组 分 可 观察 到 经 蜘蛛 螨 各 的 番茄 其 戎 烯 类 化 合 物 含量 增加 5 。Patel 等 用 GC-MS 方法 研究 了 20 多 个 不 同 的 酵母 菌株 对 Symphony 葡萄 酒 中 挥发 性 组 分 的 影响 5 。 代谢 物 谱 中 还 包含 大 量 的 非 挥发 性 代谢 物 , 如 血液 、 尿 液 中 的 氨基 酸 、 脂 肪 酸 、 胺 类 、 糖 类 、 省 体 类 物质 。 这 些 物质 的 极 性 强 , 挥 发 性 低 。 气 相 色谱 只 适 于 分 离 分 析 有 足 够 挥发 性 的 物质 , 对 极 性 强 、 挥 发 性 低 、 热 稳定 性 差 的 物质 往往 不 能 直接 进 样 分 析 。 如 果 能 将 这 些 极 性 强 、 挥 发 性 低 的 物质 进行 适当 的 化 学 处 理 转化 成 相应 的 挥发 性 衍生 物 , 可 以 扩大 气相 色谱 的 测定 范围 。 转 化 成 衔 生物 后 , 生 物 样品 中 结构 极其 近似 的 化 合 物 也 更 易 被 区 分 , 还 可 解决 载体 、 柱 壁 对 高 极 性 、 低 挥发 性 样品 的 吸附 问题 , 改 善 组 分 峰 形 。 某 些 物质 转化 成 含 亲 电 基 团 的 衍生 物 如 卤 代 衍生 物 后 , 可 用 电子 捕获 检测 器 (ECD) 或 NICLMS 检测 , 提 高 检测 灵敏 度 。 当 一 次 或 几 次 分 析 测定 多 个 化 合 物 类 别 (如 氨基 酸 和 有 机 酸 、 糖 、 磷 酸化 代谢 物 、 胺 类 、 醇 、 类 脂 和 其 他 物质 等 ) 时 , 所 需 的 样品 制备 更 为 复杂 。 通 常 需 包 括 样品 干燥 步骤, 这 个 过 程 会 损失 挥发 性 的 代谢 物 。 然 后 再 通过 两 步 化 学 衍生 反应 赋予 代谢 物 挥发 性 和 热 稳定 性 cq 。 这 个 方法 可 用 于 几 种 不 同 类 别 代谢 物 (如 羧 酸 、 氨 基 酸 、 醇 、 胺 、 酰 胺 、 硫 醇 、 磺 酸 类 物质 中 的 一 OH、 一 NH 和 一 SH 官能 团 ) 。 通 常 衍 生化 过 程 包括 与 O- 烷 基 羟 基 胺 生成 胀 , 再 与 烷 基 硅烷 化 试剂 和 甲 基 -.N- 三 里 基 硅 烷 三 氟 乙 酰胺 _〈MSTFA) 反应 , 将 极 性 官能 团 的 活泼 氢 用 非 极 性 的 三 甲 基 硅 烷 基 取 代 , 通 过 降低 偶 极 - 偶 极 作用 力 来 增加 挥发 性 。 对 于 某 些 特定 的 目标 -死人 否 物 也 可 采用 特殊 的 衍生 伦 方 活 cT。 若 果 代 调 牺 中 含有 多 个 活泼 氧 , 衍 生化 反应 可 得 到 多 个 衔 征 花 产 师 。 通 常 衔 生化 反应 是 可 以 高 效 、 定 量 和 重复 进行 的 。 衍 生化 反应 还 可 在 低温 下 快速 完成 , 这 可 使 样 蕊 市 那 下 高 漫 下 热 不 稳定 性 的 不 需 衔 生化 处 理 的 代谢 物 得 以 保留 , 不 受 衍生 化 反应 影响 。 常用 的 衍生 化 试剂 主要 有 硅烷 化 试剂 、 烷 基 化 试剂 〈 包 括 酯 化 试剂 ) 、 酰 基 化 试剂 、 。 35 。 SE INTRA ALE ETE CTIA. SS He / eA BK C1~3h), AAEM POR EELRE SEM — TE. ERENT » RESELL SE 因此 所 用 的 样品 需 充分 干燥 处 理 、 加 入 过 量 的 硅烷 化 试剂 , 且 衔 生化 后 的 样品 要 尽快 分 __ 析 。 最 好 采用 在 线 衍生 化 步 了 "9y 它 可 缩短 衍生 化 和 分 析 步 又 之 间 的 时 间 , 保 证 生生 _ 化 后 样品 的 降解 至 最 低 。 图 2-3 给 出 了 一 个 典型 的 人 血清 的 TIC 谱 图 , 经 衍生 全 预 处 , 理 , 看 优化 的 分 析 条 件 下 检测 到 了 900 多 个 峰 r9 。 2.5e+007 2e+007 1.5e+007 | | 5e+006 | vhs Wil, li ikl | HN baie 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 时 间 /s 图 2-3 GC-TOFMS 用 于 人 血清 分 析 的 总 离子 流 图 5 2.2.2 数据 采集 通常 样品 的 GC-MS 分 析 采 用 高 效 毛 细 管 气相 色谱 柱 , 液 体 进 样 体积 约 1x1。 对 手 痕 量 组 分 分 析 最 好 采用 不 分 流 进 样 方式 以 提高 检测 灵敏 度 '“] 。 由 于 代谢 物 的 浓度 差异 很 大 耳 沸 程 很 宽 , 为 避免 不 分 流 进 样 方式 引起 的 歧视 效应 , 代 谢 物 分 析 也 可 采用 分 流 进 样 方式 辐 ] 。 但 是 对 于 非常 复杂 的 生物 样品 而 言 , 一 维 毛 细 管 气相 色谱 还 不 能 提供 足够 的 分 辨 率 。 如 图 2-4 所 示 , 人 尿 液 (lml) BAHL, MSTFA 硅烷 化 后 得 到 的 气相 色谱 图 , 经 AMDIS 重奏 峰 解析 后 共 检 测 出 1582 MAS, FPA BOY IE 。 从 气相 色谱 被 分 离 出 的 组 分 可 由 EI 或 CI 质谱 检测 ,5 。EI 得 到 的 质谱 图 所 包含 的 质谱 碎片 可 用 于 解释 代谢 物 的 结构 , 它 是 最 普遍 采用 的 质谱 电离 方式 。 串 联 质谱 方式 使 用 得 较 少 , 仅 在 某 些 采 用 CI 的 研究 中 ; CI 方式 得 到 的 质谱 碎片 最 少 [50 。 不 同类 型 的 质谱 仪 检测 灵敏 度 也 不 同 。 与 飞行 时 间 质 谱 和 离子 午 质谱 相 比 , 四 极 杆 质谱 SIM 方式 可 增强 检测 灵敏 度 55 , 但 SIM 方式 仅 适合 样品 中 已 知 的 代谢 物 。TOFMS 是 全 扫描 质 谱 , 采 集 到 的 每 一 个 数据 点 都 对 应 一 个 完整 的 质谱 图 。 与 四 极 杆 质谱 相 比 ,GC- TOFMS 方法 可 以 检测 到 的 挥发 性 化 合 物 要 多 得 多 。 由 于 可 以 检测 到 更 多 的 代谢 物 , 即 。36 。 100 相对 强度 (% 基 峰 ) | lit | | 0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 26.0 28.0 30.0 32.0 34.0 36.0 38.0 40.0 42.0 44.0 46.0 48.0 50.0 时 间 /min 12-4 AR (ml) 经 菜 取 ,MSTFA 硅烷 化 后 得 到 的 GC-MS 总 离子 流 图 AMDIS 重 蚕 峰 解析 后 共 检 测 到 1582 个 组 分 552] 使 不 清楚 代谢 物 相 关 信 息 也 可 得 到 较 好 的 检测 灵敏 度 , 常 可 以 检测 到 特殊 的 或 不 常见 Lag 代谢 物 。 ~ GCXGC-TOFMS 用 于 代谢 物 组 成 分 析 常 用 的 柱 系 统 与 分 析 其 他 复杂 混合 物 相似 , 通常 第 一 维 采用 非 极 性 或 弱 极 性 的 色谱 柱 , 第 二 维 采 用 中 等 极 性 的 色谱 柱 。 如 Synovec 课题 组 采用 GC GC-TOFMS 方法 对 酵母 细胞 内 代谢 物 组 成 进行 了 研究 59 。 胞 内 代谢 物 经 衍生 化 处 理 后 , 经 GCXGC-TOFMS 分 析 。 采 用 的 柱 系统 为 第 一 维 色 谱 柱 RTX- 5MS (20mX 250pm i. d. X0. 5pum ), 第 二 维 色谱 柱 RTX-200MS (2mX180um i. d. X 0.2um); 不 分 流 进 样 方式 , 进 样 lpl; TOFMS 的 采集 频率 为 100 张 全 谱 图 / 秒 。 对 于 经 衍生 化 预 处 理 的 代谢 谱 的 数据 分 析 , 一 般 不 采用 TIC 图 , 而 用 特征 性 更 强 的 质量 碎 片 的 二 维 谱 图 。 由 不 同 特征 质量 数 得 到 的 酵母 胞 内 代谢 物 的 GCX GC-TOFMS 谱 图 见 图 2-5。 胞 内 代谢 物 中 含有 活性 官能 团 的 组 分 经 三 甲 基 硅 烷 化 〈TMS) 反应 生成 含有 1 AMA TMS 基 团 的 衍生 化 产物 。 由 于 TMS 基 团 [Si(CHs:): ] 具 有 m/z 73 的 特征 离 子 , 就 使 得 衍生 化 后 含有 TMS 基 团 的 胞 内 代谢 物 也 含有 m/z 73 的 特征 质量 碎片 。 通 过 选择 特征 质量 数 可 以 得 到 与 样品 组 成 相关 的 信息 ,z/z 73 特征 质量 数 得 到 的 二 维 谱 图 见 图 2-5A. {8 m/z 73 这 个 质量 数 的 二 维 图 干扰 比较 大 , 如 从 图 2-5A 可 检测 到 超过 2500 个 化 合 物 , 但 大 多 数 是 衍生 化 试剂 假 峰 和 固定 液 流失 。 为 了 降低 干扰 , 也 可 选择 对 某 类 化 合 物 特异 性 较 高 的 特征 质量 数 , 如 三 甲 基 硅烷 化 碳水 化 合 物 的 特征 质量 碎片 为 m/z 205 〈 图 2-5C), Be AB Ae BE AY = FA SE BE BEAR Ty BY BE IE J ER EH m/z 387 (图 2-5D) 。 » 37 e 5 10 15 20 2 Sie 柱 1 时间 /s 柱 1 时 间 /s 图 2-5 酵母 细胞 内 代谢 物 的 GCCX GC-TOFMS 的 等 高 线 图 A. 选择 特征 质量 数 m/z 73; BA 中 方 框 所 示 区 域 的 局 部 放大 图 C. BERRIES m/z 205 (碳水 化 合 物 的 特征 质量 数 ),D, 选择 特征 质量 数 m/z 387 〈 磷 酸化 糖 的 特征 质量 数 )5s91 2.2.3 基于 GC-MS, GCXGC-TOFMS 技术 的 代谢 组 学 数据 处 理 分 析 仪 器 得 到 的 元 数据 (metadata) , 不 能 直接 用 于 化 学 计量 学 分 析 。 从 最 初 的 原 始 数据 到 得 到 代谢 组 学 的 分 析 结 果 , 数 据 还 需 经 过 存储 、 预 处 理 、 化 学 计量 学 分 析 〈 主 要 是 模式 识别 、 相 关 分 析 和 建 模 ) 、 数 据 库 检 索 和 网 络 的 构建 5) 。 2.2.3.1 数据 预 处 理 方 法 分 析 对 象 的 原始 数据 需 经 预 处理 , 转 变 为 适合 于 多 变量 分 析 〈 主 要 是 模式 识别 ) 的 数据 形式 。 此 数据 必须 满足 以 下 要 求 : 所 有 样本 中 的 变量 数 相同 ;每 个 变量 在 所 有 的 样 本 中 均 出 现 且 变量 代表 的 意义 相同 。 基 于 GC-MS 的 代谢 组 学 数据 预 处理 过 程 通常 包括 以 下 几 个 步骤 喇 ; 。 (1) 滤 品 、 峰 检测 (filtering and peak detection): 分析 数 据 常常 含有 一 定 的 噪声 , 导致 分 析 结 果 的 准确 度 和 精度 下 降 。 特 别 是 对 低 浓 度 样 品 分 析 , 噪 声 的 存在 甚至 会 导致 错误 结果 。 滤 噪 即 是 将 谱 图 中 的 “true” 峰 从 噪声 中 提取 出 来 。 在 色谱 数据 处 理 中 常用 的 数字 滤波 方法 有 ; 移动 平均 法 、 最 小 二 乘 曲线 拟 合法 、 传 里 叶 变换 和 小 波 变换 等 。 已 有 多 种 方法 用 于 色谱 的 峰 检测 , 包 括 统计 门限 法 、 一 阶 导 数 法 、 二 阶 导数 法 和 增加 斜率 站 法 等 。 其 中 一 阶 导 数 法 是 最 常用 的 峰 检 测 方法 , 二 阶 导数 法 可 用 于 忆 峰 的 判别 。 各 种 滤 PAE REM Fr ES RE (2) 重 和 至 峰 解析 (deconvolution): SAM KMEPAKASKEHESA, BA WE A DT EAP HET ZA A SA. RT KP 假定 纯 物 质 的 质谱 在 整个 出 峰 过 程 中 是 不 变 的 , 可 以 用 某 单个 质量 数 谱 图 来 描述 化 合 物 的 峰 形 。 对 于 包含 不 同 质谱 图 的 重 释 峰 , 通 常 峰 顶 点 相差 1s 即 可 分 离 , 隐 藏 在 大 峰 下 面 的 痕 量 组 分 也 可 被 检测 。 对 于 那些 质谱 图 相似 代谢 物 〈 如 结构 异 构 体 ) 要 特别 注意 , 重 三峰 解 析 算 法 不 适 合 这 类 物质 。 重 又 峰 解 析 可 采用 商品 化 的 软件 〈 如 美国 Leco 公司 的 ChromsTof™) 或 NIST 免费 的 AMIDS (automated mass spectral deconvolution and identification sys- tem) -软件 包 ¢ http: / /chemdata. nist. gov/mass-spe/amdis/) j£ #7 3 HE Xb HAO I 。 Halket $A HARSH AR PA PLB RINT FE, Afb BT GC-MS 和 LC- MS aS Wee OT A RE ALI 4G Waters 公司 的 MarkerLynx™, SpectralWorks 公司 的 AnalyzerPro™ #l RIKILT 食品 安全 研究 所 的 MetAign., IKSb, Jat Al AA ee 峰 解 析 处 理 。MSFACTS 软件 〈 代 谢 物 谱 图 生成 、 匹 配 和 转换 工具 ) 即 可 用 于 色谱 数 组 匹配 和 从 原始 谱 图 的 ASCII Sec Ra, , 而 无 需 重 和 至 峰 解 析 过 程 。Jons- son’) #] Katz!55 也 报道 了 无 需 重 到 峰 解析 的 数据 处 理 方 法 。 (3) 峰 对 齐 、 匹 配 (peak alignment): 分 析 过 程 中 , 柱 温 或 载 气流 量 的 微小 变化 及 其 柱 表面 的 状态 变化 常 导 致 保留 时 间 的 漂移 。 此 外 仪器 参数 的 变化 也 使 得 样品 在 数 周 或 数 月 的 分 析 期 间 保留 时 间 发 生 漂移 。 为 了 利用 色谱 图 中 所 有 可 以 识别 的 峰 信 息 , 需 对 谱 图 实行 峰 匹 配 〈 或 称 峰 对 齐 ) , 使 相同 的 代谢 产物 在 生成 的 数据 和 矩阵 中 由 同一 个 变量 表 示 , 使 各 样本 的 数据 得 到 正确 的 比较 。 (4) 归 一 化 (normalization) : 归 一 化 的 目的 是 消除 分 析 过 程 中 的 系统 偏差 同时 保 留 分 析 数 据 中 有 意义 的 生物 学 差异 。 由 于 代谢 物 的 化 学 多 样 性 导致 了 样品 预 处 理 回收 率 及 质谱 离子 化 过 程 的 差异 , 这 使 得 区 分 系统 偏差 和 样本 间 的 生物 学 差异 变 得 比较 困难 。 用 于 代谢 谱 的 归 一 化 方法 通常 包括 : 基于 全 部 数组 , 采 用 统计 方法 获取 用 于 单个 样本 的 最 优 修正 系数 , 如 用 强度 的 中 间 值 、 最 大 值 进行 归 一 化 等 , 也 可 采用 一 个 或 多 个 内 标 《或 外 标 ) 进行 归 一 化 。 由 于 代谢 组 学 数据 处 理 的 需要 , 研 究 者 们 已 经 发 展 了 多 个 算法 , 新 的 数据 处 理 方 法 也 在 不 断 涌 现 。 近 期 在 GC-MS 数据 处 理 方面 的 主要 进展 包括 Sumner 等 发 展 的 MET-I- DEA (metabolomics ion-based data extraction algorithm) 方法 5606 和 Moritz 等 发 展 的 分 类 多 元 分 辨 曲线 〈hierarchical multivariate curve resolution, MCR) 结合 偏 最 小 二 乘 聚 类 分 析 〈Ppartial least-square discriminant analysis, PLS-DA)"! ai IF 4 (ig Be |) — FE BT (O-PLS)62 的 数据 处 理 方 法 。 MET- IDEA 是 一 个 在 Microsoft. Net 框架 下 开发 的 可 免 + _ 费 提供 给 科研 人 员 使 用 的 软件 。 En RELEASE, ph] ADMIS 得 到 的 原始 数 据 表 据 表 《 离 子 / 保 留 时 间 ) 或 手动 录入 数据 开始 , 可 校正 保留 时 间 和 质量 数 的 偏差 。 它 兼 委 几 个 色谱 技术 平 侣 得 到 的 数据 , 最 适合 处 理 GC-MS 数据 。Moritz 等 开发 的 软件 是 将 MCR 方法 用 于 GC-MS 数据 的 第 一 步 处 理 , 包 括 信号 的 平滑 、 背 景 噪声 去 除 、 时 间 国 yk a, 继而 再 将 多 变量 统计 分 析 方 法 用 于 样本 的 分 类 。 表 2-1 汇总 了 文献 报道 用 于 GC-MS 数据 处 理 的 商品 化 和 免费 软件 。 s。 39 « % 2-1 常用 的 GC-MS 数据 处 理 的 商品 化 和 免费 软件 S 名 称 (网 址 ) 所 有 者 用 途 说 明 AMDIS US NIST 质谱 重 秋 峰 解析 (Chemdata. nist. gov/mass-spc/amdis) AnalyzerPro SpectralWorks Ltd 高 通 量 LC-MS 和 GC- (www. spectralworks. com) MS 数据 处 理 CODA ACD labs 质谱 图 预测 ,LC 和 GC (www. acdlabs. com) 谱 图 的 模拟 MassFrontier HighChem, Ltd. 质谱 图 的 管理 .解释 和 (www. highchem. com) 评价 MetAlign RIKILT-Institure of Food Safety GC-MS 或 LC-MS 数 (www. metalign. nl) 据 的 匹配 和 比较 MetaGeneAlyse Max Planck Institute of Plant Physiology ”基因 表达 和 代谢 组 数 (Metagenealyse. mpimp-golm. mpg. de) 据 的 多 变量 分 析 CSBDB Max Planck Institute of Plant Physiology 公开 的 质谱 数据 库 及 (csbdb. mpimp-golm. mpg. de) 代谢 谱 数据 ArMet University of Wales, Aberystwyth,UK ”植物 代谢 组 学 数据 库 (www. armet. org) MeT-RO UK Centre for Plant and Microbial 初生 和 次 生 代 谢 谱 (www. metabolomics. bbsre. ac. uk/Met-RO. htm) Metabolomic Analysis 数据 2.2.3.2 代谢 差异 研究 的 GCXGC-TOFMS 数据 处 理 方 法 采用 GCX GC-TOFMS 方法 进行 代谢 组 学 研究 时 , 可 得 到 比 1DGC-MS 更 丰富 的 信 息 。 为 了 实现 高 通 量 的 信息 挖掘 , 人 们 发 展 了 多 个 方法 来 研究 代谢 差异 [es- 轨 。 化 学 计 量 学 是 分 析 复杂 代谢 数据 最 常用 的 方法 之 一 [6% 7 73] 。 平 行 因子 算法 (parallel factor analysis, PARAFAC) 也 被 用 于 从 复杂 的 衍生 化 植物 代谢 提取 液 或 细胞 发 酵 液 的 GCX GC-TOFMS 数据 中 得 到 代谢 物 的 纯 质 谱 图 5'7"] 。PARAFAC 是 一 个 基于 迭代 拟 合 三 线 性 模型 的 一 类 算法 , 可 用 于 GCXGC-TOFMS 得 到 的 三 维 数据 5C3 。PARAFAC 利用 待 测 样品 气相 色谱 第 一 维 、 第 二 维和 质谱 信号 , 经 去 除 背 景 噪声 和 重 释 峰 解析 后 得 到 纯 物 质 的 谱 峰 〈 包 括 纯色 谱 峰 和 纯 质 谱 图 )。 继 而 将 第 一 维 、 第 二 维 谱 峰 轮廓 进行 外 积 运算 可 重 构 重 玲 峰 解析 后 的 三 维 峰 。 对 该 峰 积分 可 得 到 与 组 分 浓度 呈正 比 的 峰 体 积 。 在 此 过 程 中 , 必 须 对 保留 时 间 的 偏差 进行 校正 。GCXGC-TOFMS 是 由 二 维 分 离 和 一 维 检测 信 号 构成 的 三 线性 三 元 数据 阵列 。 当 多 个 样本 的 3D 分 析 数 据 组 成 一 个 数据 集 时 , 这 个 数 据 集 是 一 个 四 元 数据 阵列 。PARAFAC 不 能 直接 用 于 GCXGC-TOFMS 得 到 的 4D 数据 集 。 需 将 4D 数据 集 有 效 地 转换 成 3D 数据 , 再 用 PARAFAC 分 析 。 通 常数 据 和 矩阵 可 仅 选择 一 个 xz/z 通 道 的 数据 或 总 离子 流 来 从 原始 3D 数据 阵列 得 到 。 主 成 分 分 析 法 (prin- cipal component analysis, PCA) 是 一 种 能 够 处 理 数据 相关 性 的 统计 分 析 技 术 , 常 用 于 代谢 组 学 的 数据 处 理 。 它 的 目标 是 在 低 维 子 空间 表示 高 维 数据 , 使 得 在 误差 平方 和 的 意 义 下 低 维 表示 能 够 最 好 地 描述 原始 数据 , 最 终 实 现 降 维 的 目的 。PCA 忽略 了 具有 较 小 方差 的 线性 组 成 部 分 , 保 留 了 具有 较 大 方差 项 , 从 而 减少 了 有 效 数 据 表 示 的 维 数 。 w 40 « Pierce 等 用 GCXGC-TOFMS m/z 73 和 217 的 单质 量 通道 数据 矩阵, 采用 PARAFAC 进行 重 到 峰 拆 分 和 峰 体积 计算 , 通 过 PCA 分 析 区 分 了 三 类 植物 样本 HEE. A 薄荷 甜菊 )50 。 由 于 PCA 是 无 监督 分 类 方法 , 当 样品 谱 内 的 类 内 方差 区 域 影 响 到 其 他 含有 类 间 方 差 的 区 域 时 , 常 会 导致 分 类 错误 。 Synovec 研究 小 组 在 GCCXGC-TOFMS 数据 的 化 学 计量 学 和 多 变量 技术 分 析 方 面 开 展 了 一 系列 工作 。 该 课题 组 首次 采用 Fisher 比 法 用 于 GCXGC-TOFMS 的 数据 处 理 55 。 Fisher 准则 是 特征 选择 的 有 效 方法 之 一 , 其 主要 思想 是 鉴别 性 能 较 强 的 特征 表现 为 类 内 距离 尽 可 能 小 , 而 类 间距 尽 可 能 大 。 利 用 Fisher 准则 可 以 删除 无 关 的 和 鉴别 性 能 较 差 的 特征 。 他 们 采用 一 种 新 的 索引 结构 用 于 在 已 知 类 别 的 复杂 样本 中 找 出 未 知 的 化 学 组 成 差异 。 为 了 验证 该 方法 , 他 们 将 Fisher 比 法 用 于 评价 对 照 组 尿 样 和 已 知 加 标 尿 样 的 化 学 差异 。 结 果 显 示 , 在 一 个 检 出 化 学 组 分 数 超过 600 个 的 代谢 谱 中 ,6 个 加 标 组 分 和 其 他 2 个 基质 组 分 有 显著 性 差异 。 继 而 ,Fisher 比 法 用 于 寻找 怀孕 妇女 与 未 怀孕 妇女 的 尿 中 代谢 物 的 化 学 差异 , 得 到 了 11 个 有 显著 性 差异 的 组 分 , 而 采用 PCA 方法 不 能 区 分 这 两 类 人 群 。 由 于 Fisher 比 法 可 以 从 含有 较 大 类 内 方差 的 代谢 谱 中 找 出 有 较 大 类 间 方 差 的 区 域 , 更 适合 于 具有 生物 多 样 性 的 样本 分 析 。 该 研究 小 组 还 报道 了 “DotMap” 算 法 用 于 寻找 目标 化 合 物 , 采 用 “DotMap” 算 法 的 前 提 条 件 是 目标 化 合 物 必 须 是 已 知 AY] 。 该 算法 采用 scale 和 权重 的 向 量 内 积 , 从 GCX GC-TOFMS 数据 集中 每 一 采集 点 的 目标 质谱 数据 和 归 一 化 的 谱 图 库 质谱 数据 来 寻找 目标 化 合 物 。 他 们 将 “DotMap” 算法 用 于 新 生 儿 尿 液 的 代谢 物 分 析 , 从 GCX GC-TOFMS 数据 中 快速 识别 了 12 种 重要 有 机 酸 的 TMS 硅烷 化 产物 。 此 外 ,Shellie 和 合作 者 采用 直接 比较 GCX GC-TOFMS 总 离子 图 的 方法 来 寻找 大 鼠 代 谢 产 物 的 差异 [2 。 2.2.4 代谢 物 的 结构 鉴定 基于 GC-MS 和 GCX GC-TOFMS 技术 得 到 的 代谢 物 可 通过 与 标准 品 的 保留 时 间或 保留 指数 对 照 、 质 谱 解释 或 使 用 保留 指数 /质谱 数据 库 59 等 多 种 方法 进行 识别 和 确认 。 其 中 是 否 有 商品 化 的 代谢 物 在 很 大 程度 上 影响 代谢 物 的 确认 。 如 约 有 600 个 代谢 物 参 与 酿酒 酵母 的 生化 网 络 的 生物 学 过 程 , 其 中 可 以 商品 购买 的 代谢 物 仅 约 200 种 。 参 与 人 和 植物 代谢 过 程 的 代谢 物 的 数目 要 大 得 多 , 而 可 通过 商品 化 购买 的 代谢 物 的 比例 很 小 。 商 品 化 的 质谱 数据 库 (如 NIST/EPA/NIH 数据 库 ) 包含 了 大 量 生物 样本 中 没有 的 人 工 合 成 化 合 物 的 质谱 图 。 尽 管 这些 谱 图 信息 有 助 于 未 知 代谢 物 的 结构 鉴定 , 但 从 如 此 众多 的 谱 图 中 检索 上 百 个 未 知 代谢 物 无 疑 是 十 分 耗 时 的 , 且 还 有 数量 很 大 的 与 代谢 网 络 研 究 有 关 的 代谢 物质 谱 图 不 在 其 中 。 如 在 植物 提取 物 GC-MS 色谱 图 中 通常 有 近 70%% 的 峰 仍 然 无 法 得 到 鉴定 。 利 用 GC-MS,lllmitzer 研究 小 组 对 拟 南 芥 叶 片 和 马铃薯 块 苓 极 性 和 亲 脂性 的 提取 物 中 的 326 种 代谢 产物 进行 了 分 析 , 鉴 定 出 了 其 中 约 一 半 化 合 物 的 结 构 纺 "9 。 针 对 上 述 问题 , 代 谢 物 数据 库 应 运 而 生 。 代 谢 物 数据 库 包含 在 各 种 生物 体 中 检测 出 的 代谢 物 , 如 Golm 代谢 组 数据 库 即 包含 植物 代谢 物 的 四 极 杆 和 飞行 时 间 质 谱 图 "") 。 这 个 质谱 数据 库 中 还 包含 保留 指数 数据 , 提 高 了 质谱 图 相似 化 合 物 的 定性 可 靠 性 。 « 4] = 2.3 代谢 组 学 应 用 2.3.1 GC-MS 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 自 1980 年 Tanaka 等 "5 报道 了 将 GC-MS 技术 用 于 患者 尿 液 分 析 来 得 查 有 机 酸 尿 症 VISE, LX GC-MS 技术 为 基础 的 挥发 性 和 热 稳 定性 的 极 性 和 非 极 性 代谢 产物 分 析 已 经 取 得 快速 发 展 。 德 国 科 研 人 员 最 早 将 GC-MS 用 于 植物 代谢 组 学 研究 ' 7 , 近 年 来 GC- MS 作为 植物 代谢 班 学 研究 的 重要 分 析 技术 手段 得 到 了 广 陀 的 应 用 。 丁 物 代谢 组 学 主要 是 通过 研究 植物 细胞 中 的 代谢 组 在 基因 变异 或 环境 因素 变化 后 的 相应 变化 , 研 究 基因 型 和 表 型 的 关系 以 及 揭示 一 些 沉默 基 因 的 功能 , 进 一 步 了 解 植 物 的 代谢 途径 , 最 具 代 表 性 的 是 Oliver Fiehn 研究 组 的 工作 [2 。 他 们 利用 GC-MS 技术 通过 对 不 同 表 型 拟 南 芥 的 433 种 代谢 产物 进行 代谢 组 学 分 析 , 结 合 化 学 计量 学 方法 (PCA, ANN 和 HCA) 对 这 些 植物 的 表 型 进行 了 分 类 , 找 到 了 4 种 对 分 类 有 重要 贡献 的 代谢 物质 : 苹果 酸 、 柠 檬 酸 、 葡 萄 糖 和 果糖 。 这 个 结果 与 线粒体 和 叶绿体 中 的 基因 型 结果 一 致 。Roessner- Tunali 等 采用 GC-MS 分 析 方 法 系统 研究 了 番茄 叶 和 果实 组 织 的 代谢 谱 , 发 现 由 于 果糖 激酶 AtHXK1 的 过 度 表达 , 转 基因 番茄 植物 的 磷酸 果糖 下 降 ” 。 同 样 类 似 的 方法 还 可 用 于 微生物 代谢 组 学 的 研究 , 如 Strelkov 等 考察 了 不 同 生长 条 件 对 谷 氮 酸 棒状 杆菌 的 lm) 。Klapa 和 Stephanopoulos 采用 质谱 同位 素 法 研究 了 和 谷 氨 酸 棒状 杆菌 生化 网 络 中 的 赖 氨 酸 的 生物 合成 5。 。GC-MS 还 被 用 于 临床 代谢 组 学 研究 , 近 期 的 应 用 包括 尿 液 和 血液 中 的 有 机 酸 谱 分 析 用 来 确定 新 生 儿 代谢 异常 , 有 机 酸 尿 、 脂 肪 酸 氧化 、 神 经 代谢 紊乱 和 2 RS. GC-MS 也 被 用 于 毒性 机 制 研 究 , 如 Lee 等 采用 小 鼠 动物 模 型 , 通 过 给 小 鼠 腹 腔 注 射 不 同 剂 量 的 壬 基 酚 , 来 研究 毒性 作用 。 研 究 结果 表明 , 四 氢 皮 质 当 酮 和 5c- 四 氧 皮质 当 酮 是 与 壬 基 酚 致 毒 相关 的 尿 中 潜在 生物 标记 物 [8s] 。 2.3.2 全 二 维 气 相 色 谱 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 近期 , 采 用 GCX GC-TOFMS 技术 的 代谢 组 学 研究 报道 逐渐 增多 6 748 。Wer- ner Welthagen 和 Oliver Fiehn 等 5 最 先 将 全 二 维 气相 色谱 /飞行 时 间 质 谱 方法 应 用 于 代谢 组 学 研究 。 为 了 证 实 该 技术 用 于 代谢 组 学 研究 的 可 行 性 , 他 们 以 哺乳 动物 生物 学 研 究 为 例 , 分 析 了 小 鼠 脾 组 织 提取 物 的 复杂 代谢 产物 轮廓 。 该 研究 选择 脾 组 织 有 两 个 原 Al: 还 没有 关于 脾 组 织 提取 物 的 代谢 轮廓 或 基于 NMR 代谢 指纹 的 相关 报道 ;肥胖 和 过 度 喂 养 已 经 被 证 实 与 人 类 和 员 齿 目 动物 免疫 反应 负 相 关 。 通 过 代谢 组 学 的 研究 有 可 能 帮 助 揭 示 其 潜在 的 机 制 。 全 二 维 气相 色谱 /飞行 时 间 质 谱 方法 与 传统 的 一 维 色谱 方法 相 比 可 以 提供 更 高 的 分 辨 率 和 灵敏 度 , 该 方法 可 以 检测 到 更 多 一 维 方法 无 法 分 离 的 色谱 峰 。 图 2-6 是 GC-TOFMS 和 GCXGC-TOFMS 两 种 方法 用 于 NZO 雌性 小 鼠 和 脾 组 织 提 取 物 的 分 析 对 比 谱 图 。 采 用 GC-TOFMS 方法 经 重 和 至 峰 解释 和 干扰 峰 去 除 后 检测 到 化 合 物 538 个 , 主 要 是 氨基 酸 和 羟基 酸 。 采 用 GCXGC-TOFMS 方法 经 重 和 至 峰 解释 和 干扰 峰 去 o 42 除 后 共 检 测 到 的 化 合 物 有 1220 个 , 而 在 识别 出 的 化 合 物 中 包括 许多 以 前 采用 NMR 或 其 他 研究 方法 从 哺乳 动物 组 织 中 检测 到 的 化 合 物 。 表 2-2 对 比 了 两 种 方法 检测 到 的 峰 的 数目 和 质量 。 从 表 中 可 知 , 由 于 GCX GC-TOFMS 的 高 分 辨 率 , 采 用 GCXGC-TOFMS 方法 不 但 检测 到 的 化 合 物 数目 是 GC-TOFMS 方 法 的 2 倍 , 且 峰 的 纯度 也 得 到 了 很 大 的 改进 。 图 2-7 给 出 了 5 只 未 禁 食 消瘦 型 C57BLV/6 对 照 雌 性 小 鼠 〈1# 一 5#) 和 4 只 未 禁 食 肥 胖 型 的 NZO 峻 性 小 鼠 (64 ~9 4) 的 脾 组 织 提取 物 的 GCX GC-TOFMS 局 部 谱 图 。 研 究 证 实 了 GCX GC-TOFMS 方法 得 到 的 代谢 轮廓 可 以 用 于 生物 标记 物 的 检测 。 该 研究 小 组 继而 又 对 GCX GC-TOFMS 用 于 代谢 组 学 研究 寻找 生物 标记 物 的 数据 统计 方法 做 了 讨论 5 。 他 们 采用 了 多 种 方法 对 肥胖 型 的 NZO J) Ba A BY C57BL/6 对 比 小 鼠 的 代谢 物 轮 廓 图 进行 比较 , 包 括 直 接 谱 图 比较 〈 谱 图 的 差 减 、 平 均 ) 、 生 成 加 权 峰 后 再 比较 , 以 及 传统 的 上 检验 等 方法 。 他 们 的 研究 结果 表明 后 两 种 方法 在 用 于 生物 标记 物 的 识别 中 有 相似 的 效果 。 S 一 50 相对 强度 /% 2.90 维 保留 时 间 /s a 维 保 留 时 间 /s | ae 995 1957 2918 3880 第 一 维 保留 时 间 /s 图 2-6 GC-TOFMS (A) 与 GCXGC-TOFMS (B) 两 种 方法 用 于 NZO 内 性 小 鼠 脾 组 织 提 取 液 的 分 离 比较 泡 状 图 C 为 GCX GC 方法 鉴定 出 的 峰 , 其 中 泡 的 直径 代表 相应 峰 的 TIC 强度 [80] » 48 « 表 2-2. GCXGC-TOFMS 和 GC-TOFMS 两 种 方法 用 于 小 鼠 脾 组织 提 取 液 分 析 得 到 的 峰 的 数量 和 质量 比较 "1 GC-TOFMS GCX GC-TOFMS 化 合 物 数目 538 1227 S/N>>50, 纯 度 一 1 KHADR 79 563 S/N>100 的 化 合 物 数 202 342 纯度 的 中 间 值 1.9 0. 2 纯度 的 平均 值 a2 0.4 信 噪 比 的 中 间 值 63 47 信 噪 比 的 平均 值 411 310 TE: 峰 检测 的 冰 值 为 信 品 比 (S/ND) 之 10 2515 2615 0.9 a 2415 2515 2615 图 2-7 GCXGC-TOFMS 方法 直接 比较 分 析 C57BL/6 MEH) RBA 〈 左 图 , 样 品 1 一 5) 和 NZO 雌性 小 鼠 脾 组 织 〈 右 图 , 样 品 6 一 9) 图 中 圈 内 化 合 物 被 用 于 作为 生物 标记 物 可 行 性 的 统计 学 评价 bo wb, J. L. Hope 等 建立 了 用 于 研究 氨基 酸 和 有 机 酸 三 甲 基 硅烷 化 衍生 物 的 GCXGC-TOFMS 方法 。 为 了 证 实 该 方法 用 于 实际 样品 的 有 用 性 , 他 们 将 所 建立 的 方法 用 于 普通 草坪 草 提 取 物 中 的 代谢 物 研究 , 试 图 揭示 收割 前 后 其 生理 行为 变化 。1## 样品 是 将 草 收 割 后 立即 冷冻 ,2# 样 品 为 收割 后 放置 lh 再 提取 。 图 2-8 给 出 了 两 个 样品 提取 。 44 。 物 谱 图 差异 最 明显 的 部 分 。 从 两 种 草 的 提取 物 中 检测 到 了 与 损伤 反应 有 关 的 多 种 化 学 成 分 的 出 现 或 消失 , 如 苹果 酸 的 三 甲 基 硅烷 化 衔 生物。 尽管 苹果 酸 的 增加 与 收割 时 间 应 答 之 间 的 生物 意义 还 不 清楚 , 但 这 与 在 此 过 程 中 的 柠檬 酸 循环 活性 变化 相符 。 12 16 20 24 28 32 36 柱 1 时 间 /min 柱 1 时 间 /min x10; 24 21 bly ia Imi gis 图 2-8 A. 新 鲜 草 提取 物 的 GCXGC-TOFMS 总 离子 流 谱 图 。a: 苹果 酸 的 三 甲 基 硅烷 化 衍生 物 ; b: 2-O- 甘 油 醇 -eD- 半 乳 吡 喃 糖苷 的 三 甲 基 硅烷 化 衍生 物 。B. 部 分 腐烂 草 的 提取 物 的 GC X GC- TOFMS 总 离子 流 谱 图 。d、e、f 的 质谱 相似 度 较 低 的 未 知 化 合 物 , 这 些 化 合 物 在 第 一 根 柱 上 与 苹 RBES™ 。C. 苹果 酸 的 三 甲 基 硅烷 化 衍生 物 上 述 研 究 结果 表明 GCX GC-TOFMS 可 以 用 于 代谢 组 学 研究 , 尽 管 这 方面 的 工作 还 刚刚 起 步 , 但 随 着 该 技术 的 不 断 成 熟 和 代谢 组 学 研究 的 不 断 深 入 ,GCXGC-TOFMS 技术 将 被 越 来 越 多 地 用 于 代谢 产物 的 全 面 快速 分 析 , 包 括 目 标 化 合 物 研 究 、 特 定 化 合 物 的 寻找 、 代 谢 指纹 等 , 可 以 预计 ,GCXGC-TOFMS 将 在 代谢 组 学 研究 方面 发 挥 更 大 的 作用 。 2.4 发 展 与 展望 与 代谢 组 学 的 其 他 分 析 手 段 如 NMR、LC-MS、CE-MS 相 比 ,GC-MS 较为 成 熟 。 但 由 于 代谢 物 的 性 质 要 复杂 得 多 , 特 别 是 还 包括 具有 特殊 生物 学 意义 的 立体 异 构 和 几何 异 构 体 , 目 前 尚 没有 一 种 分 析 技 术 可 实现 全 部 代谢 产物 的 分 析 , 需 多 个 分 析 技 术 的 联合 e 45 。 使 用 。GC-MS 分 析 技 术 本 身 也 还 需要 不 断 的 完善 。 如 GC-MS 分 析 生 物 样 本 中 代谢 物 普遍 需要 衍生 化 预 处 理 , 发 展 可 与 多 个 官能 团 发 生 衡 生 反应 且 重复 性 好 的 高 通 量 预 处理 方法 , 才 能 满足 组 学 分 析 大 样本 量 对 通 量 和 信息 量 的 要 求 。 就 GC 分 离 分 析 步 又 而 言 , 经 衍生 化 反应 的 代谢 物 仍 有 较 宽 的 沸 程 , 有 些 衔 生化 的 代谢 物 在 较 高 温度 下 才能 从 色谱 , 柱 中 流出 。 发 展 适 合 复杂 代谢 物 分 析 的 且 可 在 较 高 温度 条 件 下 使 用 的 高 效 气 相 色谱 柱 (尤其 是 极 性 柱 ) 无 疑 会 对 改善 分 辨 率 和 提高 分 析 方 法 的 精度 十 分 有 益 。 采 用 GCX GC- TOFMS 技术 , 也 需要 可 在 高 温 条 件 下 使 用 的 低 流 失 高 效 色谱 柱 。 如 何 从 代谢 轮廓 中 检 出 关键 代谢 产物 和 信和 号 物质 也 是 有 待 解决 的 问题 。 代 谢 产物 的 低 浓度 , 化 学 性 质 的 特殊 性 〈 如 化 学 不 稳定 性 ), 繁 瑞 、 耗 时 的 化 学 分 析 过 程 等 都 妨碍 了 对 这 些 组 分 的 系统 研究 。 此 外 , 尽 管 GC-MS 有 商品 化 的 质谱 谱 图 库 , 但 由 于 还 有 相当 数量 的 代谢 物 或 其 衍生 化 产物 的 质谱 图 未 包含 在 其 中 , 对 这 些 代谢 物 的 鉴定 仍 很 困难 。 目 前 的 研究 人 员 多 将 自 建 代谢 物质 谱 库 和 商品 化 谱 图 库 联 合 使 用 , 尽 快 完善 代谢 物质 谱 谱 图 库 并 实现 研究 人 员 的 质谱 数据 交换 将 会 对 代谢 物 鉴定 有 较 大 帮助 。 数 据 处 理 方面 , 用 于 GC-MS, 特 别 是 GCXGC-TOFMS 的 数据 处 理 方法 还 需 进 一 步 开发 。 目 前 还 没有 用 于 GCX GC-TOFMS 数据 处 理 的 商品 化 代谢 组 学 软件 , 文 献 报道 的 二 维 峰 匹配 、 峰 解析 、 多 变量 分 析 等 还 不 成 熟 , 也 未 能 充分 有 效 地 利用 GCX GC-TOFMS 得 到 的 全 部 信息 , 特 别 是 质谱 信息 的 利用 率 较 低 , 影 响 y GCXGC-TOFMS 在 代谢 组 学 研究 中 的 广泛 使 用 。 参考 文献 [1] Lindon J C, Nicholson J K, Holmes E, Everett J R. 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Metabolomics, 2005, 1 (1): 65 « 48 。 第 3 章 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 在 代谢 组 学 研究 所 采用 的 分 析 手 段 中 , 液 相 色 谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 占据 了 较 大 比重 。 这 主要 得 益 于 液 相 色 谱 (liquid chromatography, LC) 的 高 分 辨 能 力 、 质 谱 (mass spectrometry, MS) 的 高 灵敏 度 及 其 联 用 后 所 带 来 的 信息 量 的 提高 。 另 外 , 液 相 色谱 还 能 够 直接 分 析 体 液 及 组 织 提取 物 而 无 需 衡 生化 操作 , 以 上 优点 使 得 液 相 色谱 及 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技术 得 以 在 代谢 组 学 研究 中 大 显 身 手 。 将 LC 及 LC-MS 技术 应 用 于 代谢 组 学 的 研究 过 程 中 也 遇 到 了 一 些 挑战 , 如 分 析 方 法 的 偏向 性 、 方 法 有 限 的 峰 容 量 造 成 的 峰 重 等 、 潜 在 生物 标记 物 的 鉴定 以 及 海量 数据 的 处 理 策略 等 。 这 些 挑战 也 成 了 基于 LC 及 LC-MS 的 代谢 组 学 平台 技术 研究 的 热点 。 本 章 简要 介绍 LC 及 LC-MS 联 用 技术 、 多 维 液 相 色谱 (mnulti-dimensional LC) 技 术 、 基 于 LCR LC-MS 联 用 技术 的 代谢 组 学 平台 的 优势 和 发 展 趋势 、 基 于 LCR LC MS 联 用 技术 的 代谢 组 学 平台 的 基本 组 成 和 要 求 等 , 并 以 三 个 实例 具体 介绍 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 。 3.1 液 相 色谱 及 液 相 色 谱 -质谱 联 用 技术 3.1.1 液 相 色谱 高 效 液 相 色 谱 具 有 分 离 效能 高 、 分 析 速 度 快 、 检 测 灵 人 敏 度 高 和 应 用 范围 广 的 特点 , 与 气相 色谱 相 比 , 更 适合 于 高 沸点 、 大 分 子 和 热 稳定 性 差 的 化 合 物 的 分 离 分 析 。 由 于 气 相 色谱 使 用 气体 作 流 动 相 , 被 分 析 样 品 必须 要 有 一 定 的 蒸汽 压 , 气 化 后 才能 在 柱 上 分 析 , 这 使 分 离 对 象 的 范围 受到 一 定 的 限制 。 对 于 那些 挥发 性 差 的 物质 〈 高 沸点 化 合 物 ), 柱 温 必须 很 高 , 这 不 仅 给 设备 和 仪器 制造 带 来 不 少 困难 , 更 重要 的 是 许多 高 分 子 化 合 物 和 热 稳定 性 差 的 化 合 物 在 气 化 过 程 中 可 能 分 解 而 改变 了 原 有 的 结构 和 性 质 。 尤 其 是 对 于 一 些 具有 生物 活性 的 生化 样品 , 温 度 过 高 会 使 其 变性 失 活 , 这 样 的 样品 分 析 气相 色谱 难 以 胜任 。 此 外 , 对 于 一 些 极 性 化 合 物 , 如 有 机 酸 、 有 机 碱 等 , 有 些 可 通过 衍生 化 实现 样 品 的 气 化 , 有 些 则 根本 无 法 用 气相 色谱 进行 分 析 。 据 估计 , 现 在 已 知 的 化 合 物 中 , 仅 有 20%% 的 样品 可 不 经 过 预先 的 化 学 处 理 而 能 满意 地 用 气相 色谱 分 离 "] 。 与 此 相反 , 液 相 色谱 则 不 受 样品 挥发 度 和 热 稳定 性 的 限制 。 液 相 色谱 一 般 在 室温 下 操作 , 偶 尔 为 了 提高 柱 效 或 改善 分 离 , 在 较 高 的 温度 下 操作 , 但 最 高 也 不 超过 流动 相 溶 剂 的 沸点 , 所 以 只 要 待 测 物质 在 〈 各 式 各 样 的 ) 流动 相 溶剂 中 有 一 定 的 溶解 度 , 便 可 以 上 柱 进行 分 析 。 所 以 液 相 色谱 特别 适合 于 那些 沸点 高 、 极 性 强 、 热 稳定 性 差 的 化 合 物 , 如 生化 物质 和 药物 、 离 子 型 化 合 物 , 以 及 热 稳定 性 差 的 天 然 产物 等 。 事 实 上 , 在 已 知 的 化 合 物 中 大 约 有 70%% 是 不 挥发 的 , 主 要 存在 于 生命 科学 、 环 境 科 学 、 高 分 子 和 无 机 化 e 49 。 BOTRRT, ERAH, MRM AIA A) PAB AE 另 一 方面 , 液 相 色谱 中 的 流动 相 也 参与 分 离 过程 , 这 就 为 分 离 的 控制 和 改善 提供 了 额 , 外 的 因素 。 气 相 色谱 中 的 载 气 一 般 不 影响 分 离 , 主 要 靠 改变 固定 相 来 改变 选择 性 。 而 在 液 相 色谱 中 除了 改变 固定 相 外 , 还 可 以 改变 洗 脱 剂 达到 同一 目的 。 所 以 液 相 色 谱 中 的 固定 相 不 像 气相 色谱 那样 种 类 繁多 , 有 限 的 几 种 或 十 几 种 固定 相 就 可 以 解决 相当 范围 的 问题 。 与 气相 色谱 相 比 , 高 效 液 相 色谱 对 样品 的 回收 比较 容易 , 而 且 这 种 回收 是 定量 的 , 这 对 任何 规模 的 制备 目的 特别 有 利 。 事 实 上 , 在 很 多 时 候 高 效 液 相 色 谱 不 仅 是 作为 一 种 分 析 方法 , 而 更 多 的 是 作为 一 种 分 离 手段 , 用 以 提纯 和 制备 具有 足够 纯度 的 单一 物质 , 如 在 生化 、 制 药 、 天 然 产 物 和 精细 化 工 等 方面 。 应 当 指 出 , 高 效 液 相 色 谱 是 适应 科学 技术 的 发 展 而 发 展 出 来 的 , 它 和 气相 色谱 各 有 所 长 , 相 互补 充 。 在 高 效 液 相 色谱 获得 越 来 越 广泛 应 用 的 同时 , 气 相 色谱 仍 然 发 挥 着 它 的 重要 作用 。 3.1.2 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 近年 来 液 相 色谱 -质谱 的 联 用 技术 随 着 接口 技术 的 发 展 成 为 热门 的 应 用 研究 领域 , 特别 是 液 相 色 谱 与 串联 质谱 (MS/MS) 的 联 用 得 到 了 极 大 的 重视 和 发 展 。LC-MS 的 联 用 需要 解决 经 LC 分 离 出 的 具有 极 性 大 、 挥 发 度 低 、 热 稳定 性 差 等 特点 的 化 合 物 的 电离 问题 , 而 且 样 品 从 溶剂 状态 (LC) 到 高 真空 系统 (MS) , 进 入 质谱 之 前 需 除去 LC 流 动 相 中 的 大 量 溶剂 , 其 体积 也 至 少 要 多 540 倍 〈 以 乙 且 为 例 ) 。 由 此 可 见 其 接口 要 求 比 GC-MS 苛刻 得 多 , 也 一 度 制约 了 LC-MS 的 应 用 发 展 。20 世纪 90 年 代 后 , 由 于 大 气压 电离 接口 技术 的 成 功 应 用 以 及 质谱 本 身 的 发 展 , 液 相 色 谱 与 质谱 的 联 用 , 特 别 是 与 串联 质谱 (MS/MS) 的 联 用 得 到 了 快速 发 展 。 二 ao Mo 入 忆 接口 技术 一 度 是 实现 液 相 色 谱 -质谱 联 用 的 瓶颈 , 前 后 研制 发 展 了 20 多 种 接口 , 其 中 主要 有 直接 导入 接口 、 移 动 带 接口 、 渗 透 薄膜 接口 、 热 喷雾 接口 和 粒子 束 接口 , 但 这 些 技术 都 有 不 同方 面 的 缺陷 和 应 用 限制 。 直 到 大 气压 电离 (atmospheric pressure ioni- zation, APD 技术 成 熟 后 , 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 才 得 到 实质 性 的 发 展 , 而 迅速 成 为 科研 和 常规 分 析 的 有 力 工 具 。 大 气压 电离 技术 包括 电 喷雾 电离 (ESI) 和 大 气压 化 学 电 离 (APCD. 1. BSA (electrospray ionization, ESI) 接口 品 经 LC Ha A 200um 的 金属 毛细 管 , 管 上 加 有 3 一 6kV ASH, ESE 气 (N:) 和 强 电 场 作 用 下 , 溶 液 迅 速 圾 化 并 产生 高 电荷 液 滴 喷 射出 去 , 形 成 扇 状 喷雾 。 电 雾 滴 表 面 所 带电 荷 的 正 负 由 不 锈 钢 管 上 所 加 的 电压 正 负 而 定 。 大 气压 到 真空 的 接口 处 的 溶剂 迅速 蒸发 , 带 电 雾 滴 的 表面 积 随 之 不 断 变 小 , 其 表面 电荷 密度 逐渐 增 大 。 该 密度 达到 “ 雷 利 极限 ”时 , 带 电 雾 滴 中 的 样品 就 会 由 于 雾 滴 发 生 “库仑 爆炸 ”而 分 离 出 来 , 形成 样品 离子 〈 图 3-1) 。 « 50 。 电 喷雾 离子 化 接口 ToQ0 (8x10 3Torn) 离子 源 (大 气 ) 图 3-1 ESI 离子 化 示意 图 四 ESI 可 以 生成 多 电荷 离子 , 这 使 得 它 能 够 分 析 一 些 生物 大 分 子 〈 如 和 蛋白 质 ); 此 外 , , 它 还 适合 测定 分 析 极 性 化 合 物 。 2. 大 气压 化 学 电离 (atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 接口 APCI 是 将 化 学 电离 〈CD 的 原理 延伸 到 大 气压 下 进行 的 电离 技术 , 同 传统 的 低压 接口 相 比 , 这 一 条 件 下 CI 的 效率 更 高 。 图 3-2 为 一 种 APCI 的 示意 图 。 气 帘 挡 板 wa 1.25~2.0 in (lin=2.54cm) MARES A=3mm 图 3-2 ”APCI 示 意图 外 溶液 中 的 样品 流出 毛细 管 后 同样 由 氮气 流 雾 化 到 加 热管 中 挥发 , 在 加 热管 端的 尖 端 , 放 电 电极 使 中 性 分 子 以 及 溶剂 分 子 电离 , 而 后 大 量 的 离子 与 样品 的 气态 分 子 发 生气 相 离子 -分 子 反 应 , 从 而 导致 样品 的 化 学 电离 , 并 进入 质谱 仪 。 APCI 主要 产生 单 电 荷 离子 , 只 响应 单 电荷 峰 , 适 合 测定 分 析 非 极 性 和 弱 极 性 小 分 子 化 合 物 。 另 外 , 它 适应 高 流量 的 梯度 洗 脱 以 及 高 / 低 含量 水 溶液 变换 的 流动 相 。 通 过 调 他 离子 源 电 压 , 可 以 得 到 不 同 断裂 规律 的 质谱 图 。APCI 的 主要 缺陷 是 会 产生 大 量 的 溶剂 离子 , 它 们 与 样品 离子 一 起 进入 质谱 仪 , 容 易 造 成 较 高 的 化 学 噪声 。 以 上 概述 了 目前 最 常见 的 两 种 LC-MS 的 API 接 口 。 与 GC-MS 相 比 ,LC-MS 的 接 口技 术 普 适 性 较 差 , 因 此 , 常 见 的 商品 化 LC-MS 仪器 大 都 带 有 多 个 可 以 互相 切换 的 接 。51 。 口 , 以 便 满 足 待 分 离 化 合 物 多 样 性 的 要 求 。 3.1.2.2 串联 质谱 GC-MS 的 谱 图 中 有 重复 性 很 好 的 碎片 来 提供 样品 的 结构 信息 。 与 GC-MS 相 比 , LC-MS 接口 常 采 用 软 电离 技术 , 如 ESI、APCI 等 , 其 谱 图 中 样品 的 准 分 子 离子 峰 丰 度 很 高 , 碎 片 峰 则 少 而 弱 , 因 此 主要 给 出 与 样品 的 分 子 质 量 相关 的 信息 , 而 很 少 给 出 与 样 品 结构 有 关 的 信息 。 在 LC-MS 中 通常 采用 多 级 质谱 (MS-MS) 来 弥补 这 一 缺陷 , 它 可 以 给 出 丰富 的 样品 结构 信息 。 实 际 上 , 由 于 在 LC-MS 中 有 样品 的 准 分 子 离子 峰 , 由 LC-MS & LC-MS/MS 能 够 得 到 更 为 清晰 而 易于 解析 的 谱 图 。 MS/MS 在 结构 上 主要 包括 三 个 部 分 , 即 用 于 质量 分 离 的 MS1、 碰 撞 活 化 离 解 室 和 用 于 质谱 检测 的 MS2。 其 中 碰撞 活化 离 解 室 是 用 来 使 运动 中 的 离子 和 中 性 惰性 气体 进 行 碰 撞 、 继 而 发 生 碰 撞 活 化 离 解 的 区 域 。MS1 和 MS2 装置 相同 , 两 者 配合 使 用 , 如 前 者 选择 特定 质量 的 离子 , 后 者 可 以 扫描 一 个 谱 图 ;前 者 扫描 一 个 谱 图 , 后 者 则 可 以 固定 一 个 质量 窗口 收集 某 一 特定 离子 等 。 质谱 /质谱 仪器 有 多 种 结构 , 目 前 主要 有 以 下 几 种 系统 使 用 较为 普遍 : OURS 形 磁 质 谱 ; @ 串 联 四 极 杆 质谱 ; @@ 四 极 杆 质谱 与 飞行 时 间 质 谱 串 联 :,@ 磁 质谱 与 四 极 杆 质谱 串联 。 这 些 被 称 为 空间 序列 质谱 /质谱 。 另 外 , 离 子 阱 和 离子 回旋 共振 质谱 可 以 选 择 性 地 储存 某 一 质 荷 比 (m/z) 的 离子 , 再 直接 观察 其 反应 , 它 们 不 需要 与 任何 其 他 质 量 分 析 器 串联 , 自 身 即 可 以 进行 质谱 /质谱 操作 。 由 于 选择 离子 和 观察 其 反应 这 两 个 过 程 先后 发 生 , 因 此 这 两 种 仪器 可 被 称 为 时 间 序 列 质谱 /质谱 。 这 些 串联 质谱 各 有 特点 。 双 聚焦 磁 质 谱 仪 分 辩 率 高 , 但 结构 复杂 、 体 积 庞大 , 目 前 的 应 用 有 下 降 趋 热 。 傅 里 叶 变 换 离 子 回 旋 共 振 质 谱 〈fourier transform ion cyclotron resonance MS, FT-MS) 同样 具有 很 高 的 分 辨 率 , 且 有 多 级 串联 质谱 功能 , 结 构 也 比 双 聚 焦 磁 质谱 仪 简单 , 但 由 于 价格 和 维护 费用 很 高 , 目 前 的 应 用 仍 不 够 广泛 。 三 重 四 极 杆 质谱 的 高 稳定 性 使 之 在 定量 分 析 上 有 广泛 应 用 , 同 时 它 具 有 的 子 离子 扫描 、 母 离子 扫 描 、 中 性 碎片 丢失 扫描 等 强大 功能 使 之 在 快速 得 选 领域 备 受 青睐 , 但 它 的 分 辩 率 低 , 在 结构 分 析 上 尚 显 不 足 。 离 子 阱 〈ion trap) 技术 实现 了 质谱 在 “时 间 ” 上 的 多 级 串联 , 其 级 数 可 以 达到 MS7 以 上 , 且 体积 小 , 价 格 低 , 目 前 在 市 场 上 有 很 高 的 占有 率 , 但 由 于 离子 阱 质谱 的 分 辩 率 低 , 难 以 胜任 未 知 物质 的 结构 分 析 。 混 合 型 串联 质谱 有 助 于 发 挥 不 同 质量 分 析 器 的 优点 和 特长 , 目 前 以 发 展 不 同 质量 分 析 器 和 飞行 时 间 (time of flight, TOF) 质谱 的 联 用 为 主 , 包 括 四 极 杆 -TOF (Q-TOF)、TOF-TOF $, AW TOF 采用 了 离子 延迟 引出 和 离子 反射 镜 等 技术 , 使 得 其 分 辨 率 大 幅度 提高 , 因 此 Q- TOF、TOF-TOF 等 串联 质谱 可 以 在 很 高 的 质量 范围 内 实现 精确 质量 测定 。 3.1.3 基于 液 相 色 谱 及 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 方法 的 优势 和 发 展 趋势 LC-MS 特别 是 LC-MS" 集中 了 分 辨 率 、 灵 敏 度 和 专 一 性 的 优势 , 非 常 适合 于 极端 复杂 基质 中 靶 标 代 谢 产物 的 分 析 和 鉴定 。 采 用 LC-MS, 可 以 使 用 非常 简单 的 样品 预 处 e 52 。 理 步 又 , 在 很 短 的 时 间 内 对 选 定 的 靶 标 化 合 物 进行 检测 。LC-MS 和 LC-MS" 能 够 实现 对 复杂 基质 中 结构 相似 的 化 合 物 的 同时 分 析 , 因 此 非常 适合 于 代谢 产物 的 代谢 轮廓 分 析 。LC-MS 还 能 反映 在 预 处 理 阶 段 较 难 分 离 和 不 稳定 的 化 合 物 的 信息 。 因 此 , 当 对 待 分 析 化 合 物 的 结构 不 具备 先 验 知识 时 ,LC-MS 可 以 同时 对 生物 样品 中 的 已 知 和 未 知 化 合 物 进行 测定 , 即 可 以 进行 代谢 组 学 分 析 。 在 目前 的 基于 液 相 色谱 及 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 研究 中 , 尚 存在 以 下 PER: @ 分 析 方 法 上 对 化 合 物 的 偏向 性 , 如 极 性 化 合 物 在 反 相 液 相 色谱 〈reversed- phase LC,RPLC) 柱 上 保留 较 弱 , 常 常 由 于 离子 抑制 现象 得 不 到 较 好 的 检测 ,@ 与 气 相 色谱 和 气相 色谱 -质谱 联 用 技术 相 比 , 尚 没有 可 供 定 性 参考 的 数据 库 , 在 代谢 产物 特 别 是 结构 信息 较 少 的 化 合 物 的 解析 上 存在 着 较 大 难度 ; @@ 由 LC-MS 的 高 分 辨 率 所 带 来 的 海量 数据 , 需 要 合适 的 数据 挖掘 技术 和 数据 处 理 方法 来 提取 其 中 的 有 用 信息 。 这 些 挑 战 也 正 是 目前 基于 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 方法 中 的 热点 研究 问题 。 分 析 方 法 的 偏向 性 主要 产生 于 两 个 方面 : 样品 的 预 处 理 和 样品 的 分 析 手 段 。 在 样品 的 预 处 理 过 程 中 , 通 常 需要 使 用 某 种 提取 方法 将 代谢 物 从 基质 中 提取 出 来 进行 LC 及 LC-MS 分 析 , 对 于 一 些 丰 度 比 较 低 的 代谢 物 来 讲 , 人 往往 还 需要 对 其 进行 浓缩 才能 进行 后 续 的 分 析 , 在 这 个 步 又 中 不 可 避免 地 会 因 提取 方法 和 样品 性 质 不同 而 产生 偏向 性 。 而 在 其 后 的 分 析 方 法 中 , 目 前 使 用 最 多 的 LC 模式 是 RPLC, 在 这 种 模式 下 , 极 性 化 合 物 往往 在 柱 上 不 能 得 到 保留 , 在 死 时 间 时 就 被 冲 出 柱 外 , 即 反 相 柱 对 这 些 化 合 物 没 有 分 离 . 能力。 这 些 化 合 物 经 常会 导致 离子 抑制 , 从 而 带 来 分 析 方 法 上 的 偏向 性 。 在 当前 的 代谢 组 学 研究 中 , 通 常 使 用 的 样品 预 处 理 方 法 主要 有 液 液 某 取 Cliquid- liquid extraction, LLE) A /HIFA2¢HX (solid phase extraction,SPE) 。 液 液 菜 取 一 般 用 于 从 固体 组 织 中 提取 代谢 物 。 待 分 析 组 织 通常 用 液 所 进行 冷冻 , 在 革 取 前 使 用 研磨 等 方 法 将 组 织 匀 浆 , 然 后 用 某 种 或 某 几 种 溶剂 对 组 织 中 的 代谢 物 进行 鞋 取 。 一 般 使 用 异 丙 醇 、 乙 醇 、 酸 化 的 甲醇 、 乙 有 睛 、 水 , 以 及 甲醇 和 水 的 混合 物 来 提取 极 性 代谢 物 , 使 用 氧 仿 和 乙酸 乙 酯 提取 亲 酯 性 较 强 的 代谢 物 。 研 究 者 们 针对 不 同 的 分 析 对 象 〈 植 物 或 微生物 等 ) 比较 了 不 同 的 薪 取 方法 , 并 给 出 了 不 同 的 优化 组 合 s~5 。 与 液 液 茶 取 相 比 , 固 相 葵 取 可 以 选择 性 地 吸附 某 些 具有 特殊 性 质 的 代谢 物 , 从 而 达到 去 除 杂 质 和 富 集 待 测 组 分 的 目的 。 因 此 ,SPE 具有 更 强 的 偏向 性 , 一 般 用 于 针对 目标 代谢 物 或 代谢 轮廓 分 析 的 方 法 中 。 在 这 些 方法 中 , 由 于 目标 代谢 物 不 同 , 所 采用 的 SPE 方法 也 各 不 相同 , 在 这 里 不 做 详细 介绍 。 在 代谢 组 学 的 研究 实践 中 , 由 于 经 常 采用 的 LC 分 离 方 法 是 RPLC, 为 了 保护 分 析 及 检测 系统 , 需 要 去 除 样品 中 较 “ 脏 ”的 组 分 〈 如 大 分 子 的 蛋白 质 和 在 柱 上 保留 极 强 的 组 分 ) 和 盐 类 化 合 物 等 , 可 以 使 用 SPE 方法 来 对 样品 进行 预 处 理 , 以 提高 系统 的 稳定 性 。Waters 公司 的 HLB 系列 SPE 柱 由 于 对 极 性 化 合 物 也 有 较 好 的 保留 , 在 代谢 组 学 研究 中 得 到 较为 广泛 的 应 用 。 另 外 , 在 针对 某 些 生物 体液 〈 如 屎 样 ) 的 代谢 组 学 研究 5 -5 中 , 相 当 多 的 研究 者 使 用 直接 进 样 的 方式 来 避免 提取 方法 的 偏向 性 问题 , 但 这 种 方式 往往 会 牺牲 色谱 柱 的 寿命 及 整个 系统 的 稳健 性 。 与 正 相 色谱 、 离 子 对 色谱 和 离子 交换 色谱 相 比 , 反 相 液 相 色谱 所 使 用 的 溶剂 与 电 喷 雾 质 谱 能 够 匹配 , 所 以 在 目前 的 代谢 组 学 研究 中 大 都 使 用 C18 RARE), (BE, OR Shs 性 化 合 物 在 反 相 色谱 柱 上 不 能 得 到 保留 , 往 往 在 死 时 间 时 就 被 冲 出 柱 外 , 损 失 了 这 部 分 极 性 样品 的 信息 , 而 这 些 极 性 代谢 物 往往 具有 较为 重要 的 生物 学 功能 。 为 了 避免 这 个 问 题 , 可 以 考虑 采用 其 他 保留 机 制 的 色谱 柱 来 对 代谢 物 进 行 分 析 。 当 前 比较 热点 的 一 个 方 法 是 使 用 亲 水 作用 色谱 〈hydrophilic interaction chromatography, HILIC) 柱 来 代替 反 相 色 谱 柱 作为 样品 分 离 介质 D -2 。HILIC 的 概念 首次 由 Alpert 提出 59 , 它 是 这 样 一 种 液 相 色 谱 分 离 模式 : 它 能 够 提供 和 正 相 色谱 类 似 的 保留 行为 , 为 强 极 性 的 组 分 提供 合 适 的 保留 , 同 时 采用 水 -水 溶性 有 机 相 作为 流动 相 , 又 能 改善 样品 在 流动 相 中 的 溶解 度 ; 另 一 方面 , 它 在 体现 和 RPLC 正 交 的 选择 性 的 同时 , 具 有 与 RPLC 相 媲 美的 柱 效 和 对 称 的 峰 形 , 又 和 多 种 检测 器 尤其 是 质谱 有 良好 的 兼容 性 , 不 仅 可 用 于 定性 , 还 可 用 于 定 量 分 析 , 是 一 种 非常 适合 于 强 极 性 和 强 亲 水 性 样品 分 析 的 液 相 色谱 替代 技术 。 在 HIL- IC 分 离 体系 中 , 常 使 用 硅胶 、 氨 基 、 二 醇 基 等 正 相 色谱 填料 或 者 特殊 设计 的 表面 含有 极 性 基 团 的 HILIC 专用 填料 作 固 定 相 。 流 动 相 中 水 是 强 洗 脱 剂 , 乙 且 或 异 两 醇 被 用 作 SUCRE. FARMER GED BP FAA Ziel. (AHR! OUD, Tisha ee 强 洗 脱 剂 时 , 并 没有 体现 出 独特 的 和 有 用 的 选择 性 , 反 而 有 可 能 增加 分 离 的 不 稳定 性 和 较 差 的 峰 形 。 异 丙 醇 的 黏度 在 常温 时 较 高 , 容 易 产 生 过 高 的 柱 压 降 , 因 此 在 HILIC 分 离 中 , 一 般 采 用 乙 且 - 水 体系 作 流 动 相 , 其 中 水 相 的 比例 在 5% 一 40%% 以 保证 显著 的 亲 水 作用 。 除 了 硅胶 、 氢 两 基 等 常用 于 正 相 色谱 分 离 的 固定 相 填 料 以 外 , 近 年 来 常见 的 HILIC 固定 相 还 包括 二 醇 基 、 酰 氨基、sulfobetaine 和 天 冬 酰 胺 等 。 目 前 已 有 多 种 商品 化 的 HILIC 色谱 柱 出 售 , 如 Waters 公司 生产 的 Atlantis HILIC Si 色谱 柱 、IOSOH 公 司 生 产 的 TSK Amide-80 色谱 柱 、polyLC 公司 生产 的 polySulfoethyl A 和 polyHydro- ethyl A 色谱 柱 等 。 而 研制 新 型 HILIC 色谱 固定 相 填 料 的 工作 也 在 不 断 开 展 。 目 前 已 合 成 出 多 种 具有 末 水 作用 特性 的 填料 , 其 中 多 数 为 硅胶 基质 , 也 有 少数 采用 聚合 物 基 质 , 以 满足 更 大 范围 流动 相 条 件 的 变化 。 另 外 一 种 研究 趋势 则 是 发 展 可 用 于 HILIC 分 离 模 式 的 液 相 色 谱 整体 柱 2] 。 与 常规 的 填充 柱 相 比 , 整 体 柱 有 良好 的 渗透 性 、 极 低 的 柱 压 降 和 更 高 的 柱 效 。 通 过 增加 柱 长 , 可 以 提供 比 常 规 填充 色谱 柱 高 得 多 的 峰 容 量 , 且 易 与 质谱 联 用 , 由 此 进一步 拓宽 了 HILIC 的 应 用 领域 。 近年 来 ,HILIC 已 被 广泛 用 于 代谢 物 的 靶 标 分 析 和 轮廓 分 析 。Tolstikov RA HILIC 进行 了 南瓜 叶片 的 研究 , 检 测 到 了 窒 糖 、 糖 苷 、 氮 基 糖 (amino sugar), ABER 和 核 苷 酸 糖 。Garbis 4°) A HILIC 检测 了 人 血浆 中 的 叶酸 类 化 合 物 , 包 括 叶酸 、 四 和 氢 叶酸 、5- 甲 基 四 氧 叶 酸 、5- 甲 酰 四 氧 叶 酸 , 他 们 测试 了 多 种 RPLC 色谱 柱 和 几 种 HILIC 色谱 柱 , 发 现 目 标 化 合 物 在 反 相 固定 相 上 峰 形 拖 尾 , 并 有 离子 抑制 现象 , 在 氨 丙 基 固 定 相 上 无 法 出 峰 , 仅 在 聚 〈2- 羟 乙 基 ) 天 冬 酰 胺 固定 相 上 得 到 了 满意 的 分 离 。Schlichthe- rle-Cerny 等 5 用 酰胺 柱 分 离 , 并 用 质谱 鉴定 了 麦 堵 水 解 产 物 以 及 奶酪 中 的 一 系列 氢 基 酸 和 谷 氢 酰 肽 等 化 合 物 。 在 最 近 的 研究 中 ,Cubbon 等 5 比较 了 RPLC 和 HILIC 在 代 谢 组 学 研究 中 的 适用 性 , 通 过 60 例 健康 人 屎 样 的 代谢 组 学 分 析 ,HILIC-MS 方法 体现 出 和 RPLC-MS 方法 相 类 似 的 精度 和 灵敏 度 , 被 认为 是 一 种 和 了 RPLC 互补 的 代谢 组 学 数 据 采集 工具 , 将 两 者 结合 起 来 , 可 以 为 代谢 组 学 研究 提供 更 加 全 面 的 样品 信息 。 类 似 的 研究 工作 已 在 本 研究 组 开展 并 取得 一 定 进展 。 代谢 物 的 衍生 化 也 可 以 被 用 来 提高 色谱 分 离 的 分 辨 率 和 检测 灵敏 度 , 如 使 用 季 贸 化 es。 54 。 合 物 来 衍生 小 分 子 质量 的 胺 和 羧 酸 。 在 理论 上 , 当 降低 柱 内 径 和 填充 颗粒 粒 径 时 , 色 谱 的 分 离 度 将 大 为 提高 。 将 其 应 用 于 复杂 的 代谢 组 学 样品 的 高 分 辩 分 离 , 将 能 提供 更 为 详尽 的 数据 。 当 峰 展 宽 降 低 时 , 将 会 提高 信 噪 比 , 从 而 提高 灵敏 度 。 色 谱 分 辩 率 的 提高 减少 了 代谢 产物 的 共 流 出 现象 , 进 而 减少 了 由 此 产生 的 离子 抑制 现象 。 例 如 , 使 用 Waters 公司 提供 的 超 高 效 液 相 色谱 (ultra-performance LC, UPLC) 系统 , 通 常 可 以 从 人 尿 液 和 血清 样品 中 检测 到 超过 10 000 个 质谱 碎片 峰 品 22 。 针对 代谢 产物 的 结构 解析 问题 , 目 前 仍 缺 乏 像 GC-MS 那样 规模 的 数据 库 来 辅助 定 性 。 但 研究 表明 , 不 同 仪器 产生 的 LC-MS 质谱 图 非常 相似 E , 现 在 已 有 液 相 色谱 - 质 谱 数据 库 提 供 , 并 且 已 有 多 个 组 织 及 公司 正在 构建 代谢 产物 的 谱 图库 B"'?51 。 这 方面 的 工作 进展 迅速 。 另 外 两 个 较 受 欢迎 的 解决 办 法 是 采用 高 分 辨 的 质谱 数据 CTOF-MS, ICR-FT-MS) 和 采用 其 他 分 析 方 法 辅助 定性 5 。 通 过 高 分 辨 质谱 , 能 够 获得 代谢 物 的 精确 分 子 质量 , 从 而 缩小 候选 代谢 物 的 范围 , 另 外 , 串 联 质谱 图 中 碎片 离子 及 碎片 部 分 的 精确 分 子 质量 信息 也 给 解 谱 工 作 提 供 了 极 大 的 帮助 。 但 是 , 研 究 者 也 发 现 单纯 依靠 分 辩 率 的 提高 〈 误 差 低 至 1X10“) 还 不 足以 鉴定 出 代谢 物 的 结构 。 通 过 对 各 数据 库 中 已 有 的 化 合 物 的 研究 5 Kind 等 提出 了 7 条 规则 根据 精确 分 子 质 量 来 辅助 对 代谢 物 的 定 性 B3 。 也 可 以 通过 收集 馆 分 的 方法 制备 候选 代谢 物 , 再 使 用 NMR 等 手段 对 其 进行 结 构 鉴 定 。 但 无 论 采用 上 述 哪 种 方法 都 还 不 能 够 实现 简单 快捷 确定 代谢 物 结构 的 目的 , 往 往 需要 综合 各 种 方法 及 研究 者 的 专业 知识 来 甄别 判断 。 到 目前 为 止 , 已 发 展 出 多 种 用 于 液 相 色 谱 和 液 相 色谱 -质谱 联 用 方法 的 数据 处 理 方 法 和 软件 253 。 相 关内 容 在 本 书 第 7 章 有 比较 详细 的 介绍 。 3.2 用 于 极 性 小 分 子 分 析 的 二 维 液 相 色谱 分 离 系统 生命 现象 是 DNA、RNA、 蛋 白质、 代谢 物 、 细 胞 、 组 织 、 器 官 、 个 体 和 群体 等 层 次 有 机 结合 的 整体 。 代 谢 组 学 的 研究 对 象 一 一 生物 体 中 的 代谢 产物 组 成 非常 复杂 , 既 有 无 机 离子 也 有 有 机 化 合 物 , 既 有 亲 水 性 化 合 物 也 有 玻 水 性 化 合 物 , 既 有 解 离 的 化 合 物 也 有 未 解 离 的 化 合 物 , 且 各 组 分 的 含量 差异 极 大 。 此 外 , 还 存在 一 些 结构 类 似 、 质 量 数 相 同 、 色 谱 保留 行为 非常 相似 , 但 生理 功能 不 尽 相同 的 极 性 代谢 物 组 分 , 采 用 一 维 液 相 色 谱 〈 无 论 是 RPLC 还 是 HILIC) 和 质谱 联 用 技术 无 法 提供 足够 的 峰 容 量 对 其 进行 分 离 。 此 前 曾 有 研究 表明 , 用 一 维 方法 分 离 含 有 100 个 随机 分 布 组 分 的 样品 , 完 全 分 离 其 中 的 82 个 组 分 大 约 需 要 400 万 理论 塔 板 数 品 ] 。 虽 然 当 前 色谱 填料 粒 径 不 断 降低 , 固 定 相 表 面 理化 性 质 不 断 改 进 , 使 得 液 相 色谱 分 离 能 力 不 断 提高 , 但 一 维 色 谱 仍 然 无 法 提供 如 此 高 的 柱 效 史 ] 。 另 一 方面 , 也 有 研究 指出 , 只 有 当 样品 的 维 数 和 分 离 工具 提供 的 分 离 维 数 相同 时 , 才 能 最 大 限度 地 利用 其 分 离 能 力 咏 ] 。 所 谓 “样品 维 数 ”>, 是 指 一 个 样品 中 所 有 成 分 都 能 被 鉴别 出 来 所 需 的 独立 变量 的 数目 。 例 如 , 样 品 中 所 有 成 分 都 是 饱和 直 链 脂 肪 酸 时 , 样 品 维 数 为 1 ( 碳 数 或 分 子 质量 ); 如 果 样 品 中 某 些 脂肪 酸 含 有 支 链 或 双 键 , 则 样品 维 数 为 2〈 另 一 维 是 支 链 或 双 键 的 位 置 )。 可 见 , 想 要 对 特定 条 件 下 特定 的 生物 样本 中 的 所 有 有 响应 的 代谢 组 分 进行 分 析 , 从 而 尽 可 能 地 保留 和 反映 代谢 的 总 体 信 息 , 。 55 引入 更 多 的 分 离 维 数 非 常 必要 。 从 广义 上 讲 , 凡 是 能 够 额外 提供 与 一 维 色 谱 具 有 不 同 选 择 性 的 分 离 手段 , 都 可 以 被 理解 为 增加 了 分 离 体 系 的 维 数 。 因 此 , 串 联 色谱 、 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 和 离线 二 维 液 相 色 谱 等 技术 都 可 以 被 称 作 二 维 液 相 色 谱 , 但 在 线 二 维 液 相 色谱 分 离 体系 的 构建 和 应 用 受到 了 更 多 的 关注 。 目前 主要 有 两 种 在 线 二 维 液 相 色谱 构建 方式 。 一 种 采用 “中 心切 制 ” Cheart-cut- ting) 技术 , 将 第 一 维 色谱 柱 所 分 离 出 的 某 个 或 某 些 感 兴趣 的 部 分 切 人 第 二 维 色谱 柱 进 行进 一 步 的 分 离 。 这 种 模式 适合 目标 组 分 分 析 , 已 成 功用 于 多 种 分 离 对 象 “~ 义 。 本 书 第 10 章 中 对 体液 中 修饰 核 苷 的 分 析 即 采用 了 这 种 方法 。 该 技术 流 路 相对 简单 、 易 于 操 作 , 但 第 一 维 分 离 能 力 利用 不 足 , 且 必须 事先 了 解 目标 组 分 的 保留 窗口 等 信息 , 在 分 析 未 知 组 分 样品 时 则 容易 丢失 样品 信息 。 另 一 种 受到 广泛 关注 的 技术 称 为 “全 二 维 液 相 色 谱 ” (comprehensive two-dimen- sional chromatography,LCXLC), 它 采用 分 离 机 制 不同 的 两 维 色谱 柱 构成 分 离 系统 。 通过 特别 设计 的 接口 , 第 一 维 色 谱 柱 分 离 出 的 所 有 组 分 都 被 在 线 引 入 第 二 维 色 谱 柱 中 进 行 再 次 分 离 。 普 遍 认为 1990 年 由 Bushey 和 Jorgenson 等 "5 的 报道 代表 了 全 二 维 液 相 色 谱 研 究 的 开端 。 他 们 用 商品 化 的 高 效 液 相 色谱 仪 搭建 了 LCXLC 分 析 平 台 并 成 功 分 离 了 和 蛋白 质 混合 标 样 。 通 过 两 个 平行 的 样品 环 , 样 品 中 的 所 有 组 分 都 在 两 维 上 依次 分 离 , 分 离 结 果 由 紫外 检测 器 记录 。 得 到 的 原始 谱 图 用 软件 处 理 成 等 高 线 图 和 三 维 高 程 图 , 使 得 样品 在 两 维 的 分 离 结 果 得 以 同时 体现 。 在 以 后 的 研究 工作 中 , 他 们 设计 的 流 路 被 广泛 采用 , 有 时 稍 加 改动 , 如 用 十 通 闪 代 替 八 通 阀 , 用 两 根 平 行 的 色谱 柱 进行 第 二 维 交替 分 析 取 代 定 量 环 等 〈 图 3-3) 。 得 到 的 原始 数据 也 通常 被 处 理 成 直观 的 等 高 线 图 (A 3-4) 。 此 外 , 他 们 还 定义 了 构建 LCXLC 必须 满足 的 三 个 条 件 : 两 维 分 离 机 制 必须 尽 可 能 正 交 , 即 根据 不 同 的 保留 机 制 分 离 样品 ; 第 一 维 的 分 离 结 果 必 须 在 第 二 维 分 离 的 过 程 中 保持 , 不 能 被 破坏 ; 最 后 , 两 维 的 分 离 结 果 应 当 同时 保留 并 体现 。 虽 然 在 实际 应 用 中 很 难 充分 满足 这 三 个 条 件 , 但 它 指 出 了 全 二 维 液 相 色 谱 的 操作 特点 和 构建 原则 , 对 该 技 术 的 发 展 具 有 重要 的 指导 意义 。 经 过 十 几 年 的 探索 和 发 展 ,LCXLC 的 应 用 范围 不 断 扩 展 , 理 论 研 究 也 在 逐渐 深 人 和 人, 其 发 展 呈 现 出 较 明 显 的 阶段 性 。20 世纪 90 年 代 中 后 期 , 应 用 研究 主要 集中 在 蛋白 质 和 多 肽 的 分 离 上 , 多 采用 离子 交换 或 尺寸 排 阻 色谱 作 第 一 维 , 利 用 样品 的 酸 碱 性 或 分 子 大 小 进行 分 离 , 第 二 维 采 用 反 相 色谱 , 利 用 样品 的 疏水 性 进行 再 次 分 离 。 基 于 样品 的 特殊 性 质 , 这 些 研 究 取得 了 令 人 满意 的 分 离 结 果 。 目 前 ,LCXLC 用 于 分 离 蛋 白质 和 多 肽 类 物质 已 经 成 为 蛋白 质 组 学 研究 中 常见 的 分 离 手段 史 ' 4 。 自 2000 年 以 来 , 新 型 色谱 柱 填料 类 型 尤其 是 整体 柱 的 出 现 和 发 展 , 极 大 地 促进 了 全 二 维 液 相 色谱 技术 的 发 展 , 根 据 待 测 样品 性 质 , 构 建 出 更 多 种 类 的 二 维 柱 系统 , 其 应 用 领域 也 不 断 扩 展 。 如 利用 整体 柱 代 替 常 规 的 硅胶 基质 微粒 色谱 柱 , aa 从 而 在 更 短 的 分 析 时 间 里 获得 更 高 的 峰 容 量 。 有 研究 预测 , 如 果 加 上 质谱 的 分 离 能 力 , 这 样 的 分 元 体系 避 以 提供 高 达 几 千 的 峰 容 量 a 又 如 , 利 用 某 些 新 型 的 色谱 填料 , 可 以 通过 改变 两 维 的 流动 相 条 件 , 实 现 酸 、 碱 、 中 性 物质 的 全 二 维 分 离 59 。 此 外 , 利 用 某 些 具有 特殊 分 离 机 制 的 色谱 填料 与 反 相 色谱 联 用 , 可 以 实现 聚合 物 和 同 分 异 构 体 的 全 二 维 分 离 5%5。 自 2004 年 以 来 , 一 个 新 的 应 用 研究 热点 集中 在 分 别 用 正 相 色谱 和 反 相 . 56 . — = = © a, sll 3-3 常见 的 LCXLC 流 路 上 : 两 根 平行 色谱 柱 交替 进行 第 二 维 分 离 ; 下 : 两 个 平行 样品 环 用 于 组 分 在 两 维 间 的 转移 色谱 作 两 维 , 分 离 分 析 脂 类 等 强 疏 水 性 化 合 物 。 通 过 增加 两 维 间 的 流速 比 , 或 降低 第 二 维 的 上 样 量 , 辅 以 在 两 维 分 别 采 用 互 溶性 较 好 的 流动 相 , 规 避 了 正 相 色谱 和 反 相 色谱 流 动 相 不 兼容 的 问题 。 通 过 这 些 方法 , 一 些 典型 的 强 朴 水 性 化 合 物 得 到 了 分 离 忌 -5] 。 因 为 正 相 色 谱 可 以 提供 样品 的 结构 信息 , 因 此 利用 这 类 全 二 维 液 相 色 谱 体 系 分 析 复 杂 样 品 , 可 以 在 谱 图 中 反映 出 样品 组 分 中 含有 的 双 键 或 某 些 特殊 基 团 的 数目 , 提 供 辅助 定 性 。 在 最 近 的 研究 报告 中 [5 , 应 用 高 温 全 二 维 液 相 色谱 对 BSA 酶 解 液 进行 分 析 , 在 20min 内 分 离 出 1350 个 峰 。 这 可 能 代表 了 全 二 维 液 相 色 谱 技 术 在 未 来 发 展 的 新 趋势 , 即 通过 不 断 改进 色谱 硬件 的 性 能 , 引 入 更 多 可 以 影响 分 离 的 参数 , 达 到 控制 分 离 过 程 , 获得 更 好 分 离 结 果 的 目的 。 在 理论 研究 方面 , 增 加 峰 容 量 和 二 维 柱 系统 的 正 交 性 始终 是 人 们 关注 的 热点 。1987 年 ,Giddings 指出 , 全 二 维 色 谱 的 理论 峰 容 量 是 两 维 各 自 峰 容量 的 乘积 5 。 在 20 世纪 90 年 代 中 期 , 又 提出 了 “样品 维 数 ” 的 概念 , 将 样品 的 复杂 性 和 分 离 体系 的 峰 容 量 结 本 57 e 图 3-4 典型 的 LCXLC 色谱 图 A. 等 高 线 图 ; B. 三 维 高 程 图 。z、?、z 轴 分 别 代表 两 维 保留 时 间 和 组 分 响应 强度 5] 合 起 来 ] 。 此 后 , 很 多 针对 不 同样 品 、 采 用 不 同 填 料 类 型 和 流动 相 条 件 的 柱 系统 的 正 交 性 得 到 考察 。Gilar 等 5 系统 研究 了 多 种 色谱 柱 [包括 HILIC Si, C18, #3£, SEC, SCX 和 五 氟 苯 基 (PFP)] 在 不 同 pH 条 件 下 选择 性 的 正 交 性 。 结 果 表明 , 通 过 改变 柱 系统 配置 和 流动 相 条 件 , 某 些 色谱 柱 之 间 可 以 表现 出 很 强 的 正 交 性 , 尤 其 是 SCX/ RPLC 和 HILICV/RPLC, 但 是 , 所 有 的 实验 数据 都 是 在 单 柱 上 完成 的 , 并 没有 考虑 到 在 线 构建 二 维系 统 时 流动 相 的 匹配 问题 。 即 使 如 此 , 其 实验 结果 仍然 对 了 解 柱 系统 的 正 交 性 有 指导 作用 。 此 外 , 还 有 人 利用 计算 机 模拟 来 预测 全 二 维 液 相 色谱 体系 的 峰 容 量 59) 。 值 得 注意 的 是 , 根 据 预 测 结果 , 在 某 些 设 定 的 分 离 条 件 下 , 要 达到 1500 以 上 的 峰 容 量 , 第 一 维 色 谱 柱 的 柱 长 应 大 于 387mm, 考 虑 到 色谱 仪 的 耐 压 和 色谱 柱 的 填 装 等 问题 , 这 些 条 件 在 现 阶段 尚 无 法 满足 , 预 测 的 峰 容 量 自然 也 无 法 实现 。 这 也 从 一 个 侧面 体现 了 全 二 维 液 相 色谱 发 展 的 现状 , 即 现 有 的 硬件 设施 可 能 会 在 很 大 程度 上 制约 其 分 离 能 力 。 到 目前 为 止 , 全 二 维 液 相 色 谱 已 经 用 于 分 离 蛋 白质 、 多 肽 、 聚 合 物 、 同 分 异 构 体 、 药物 和 天 然 产 物 中 的 朴 水 性 物质 , 而 几乎 所 有 的 LCXLC 柱 系统 都 采用 反 相 色谱 作为 其 中 一 维 , 利 用 组 分 间 朴 水 性 的 差异 对 其 进行 分 离 。 这 样 的 柱 系统 显然 不 适合 于 那些 强 亲 水 性 样品 。 根 据 我 们 的 研究 , 基 于 不 同 功能 基 团 的 HILIC 色谱 柱 的 选择 性 也 不 尽 相 同 5] , 通 过 优化 两 维 间 的 流动 相 组 成 ,HILIC 色谱 柱 之 间 也 能 体现 出 适中 的 正 交 性 , 因此 可 以 构建 这 样 的 柱 系统 用 于 强 亲 水 性 复杂 体系 样品 的 分 离 分 析 [6 。 3.3 液 相 色谱 及 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 实例 代谢 组 学 是 通过 考察 生物 体 受到 刺激 或 扰动 后 其 代谢 产物 的 变化 来 研究 生物 体系 代 谢 途 径 的 一 种 技术 。 这 项 技术 要 求 对 限定 条 件 下 特定 生物 样本 中 的 所 有 代谢 组 分 进行 定 性 和 定量 分 析 。 完 整 的 代谢 组 学 分 析 流 程 包括 样 品 的 采集 和 制备 、 样 品 的 分 析 及 数据 分 析 等 步 又。 s。 58 。 根据 分 析 层 次 和 目的 的 不 同 , 对 不 同样 品 的 采集 和 制备 技术 及 样品 的 分 析 方 法 均 有 不 同 的 考虑 。 另 外 , 在 由 液 相 色谱 及 液 相 色谱 质谱 联 用 技术 搭建 的 技术 平台 中 , 除 了 需 要 满足 仪器 本 身 对 样品 分 析 的 要 求 外 , 还 存在 如 何 从 仪器 给 出 的 总 离子 流 图 (total ion current, TIC) 及 其 质谱 图 构建 出 可 使 用 模式 识别 方法 的 数据 结构 的 问题 , 即 如 何 构建 从 商品 化 仪器 的 通用 数据 结果 到 模式 识别 〈 或 多 元 数据 分 析 ) 之 间 的 接口 。 可 用 于 模式 识别 方法 的 数据 需要 满足 以 下 要 求 " 史 : @ 所 有 样本 有 相同 数目 的 变量 描述 ,@ 每 个 变 量 在 所 有 样本 中 都 出 现 ; @ 所 有 样本 中 这 些 变量 所 代表 的 意义 相同 , 即 如 何 实现 色谱 峰 和 LC-MS 数据 中 的 峰 对 齐 〈 或 匹配 ) 问题 。 下 面 分 别针 对 代谢 轮廓 分 析 和 代谢 组 学 分 析 两 个 层次 , 通 过 实例 对 上 述 几 个 问题 进 行 说 明 。 3.3.1 液 相 色谱 代谢 轮廓 分 析 方法 用 于 肝脏 疾病 严重 程度 的 诊断 [ 正如 前 面 章 节 中 提 到 的 , 代 谢 轮廓 分 析 的 对 象 是 某 一 类 化 合 物 或 某 个 代谢 途径 上 的 代谢 产物 , 因 此 要 建立 基于 色谱 及 其 联 用 技术 的 代谢 轮廓 分 析 方法 , 需 要 选择 合适 的 预 处 理 方法 、 样 品 分 析 方 法 及 数据 分 析 方法 , 从 而 实现 对 特定 目标 化 合 物 的 代谢 轮廓 分 析 。 首先 , 样 品 预 处理 方 法 和 分 析 方 法 需要 针对 目标 化 合 物 的 特性 , 在 实现 时 通常 利用 有 针对 性 的 预 处 理 方法 提取 样品 中 的 这 类 化 合 物 , 如 用 液 液 萃 取 、 亲 和 色谱 柱 吸 附 等 特 异性 的 处 理 方法 将 具有 同类 性 质 的 化 合 物 提取 出 来 , 然 后 用 色谱 技术 进行 分 离 分 析 ; 另 外 一 种 方法 是 利用 选择 性 更 强 的 分 析 方 法 对 某 一 类 化 合 物 的 特异 性 响应 进行 分 析 , 如 可 以 利用 空间 串联 质谱 的 中 性 丢失 和 母 离子 扫描 对 含有 某 些 特定 基 团 的 化 合 物 进行 选择 性 的 检测 , 从 而 达到 对 一 类 化 合 物 的 全 分 析 。 在 得 到 各 种 色谱 技术 采集 的 原始 数据 后 , 下 一 步 就 需要 比较 这 些 样品 的 谱 图 , 利 用 各 种 化 学 计量 学 的 方法 去 挖掘 其 中 的 有 用 信息 "” 。 众 所 周知 , 流 动 相 组 成 的 微小 变 化 、 梯 度 的 重 现 性 、 柱 温 的 微小 变化 , 以 及 柱 表面 的 状态 变化 常常 会 导致 样品 保留 时 间 的 偏差 。 为 了 利用 色谱 图 中 所 有 可 以 识别 的 峰 信 息 , 必 须 对 谱 图 进行 峰 匹 配 〈 或 称 为 峰 对 齐 ), 不 同样 本 中 同一 个 代谢 产物 在 生成 的 数据 矩阵 中 必须 由 同一 个 变量 来 表 示 , 这 样 各 样本 间 的 数据 才能 得 到 正确 的 比较 。 在 过 去 的 几 十 年 里 , 研 究 者 们 已 经 发 展 出 了 很 多 算法 用 于 这 个 目的 。 具 有 代表 性 的 工作 如 Nielsen 等 发 展 的 “COW” 算 法 。 最 近 Par Jonsson 等 发 展 了 一 种 基于 GC-MS 的 代谢 组 学 的 策略 [s] , 使 用 了 一 种 基于 时 间 窗 口 的 算法 来 对 齐 GC-MS 中 的 组 分 峰 。 与 GC 谱 图 中 的 峰 匹 配 相 比 ,HPLC 中 的 峰 匹配 要 相对 困难 〈 因 为 样品 保留 时 间 的 重 现 性 更 难保 证 , 特 别 是 没有 柱 温 箱 的 倩 癌 下 )。 这 里 提出 了 一 种 基于 APLC 技术 的 代谢 轮廓 分 析 策 略 , 图 3-5 给 出 了 其 流程 图 。 实 际 上 , 如 果 在 样品 的 预 处 理 过 程 中 能 够 保留 尽 可 能 多 的 代谢 物 组 分 , 这 个 策略 特别 是 数 据 处 理 部 分 也 适 于 建立 代谢 组 学 研究 层次 的 技术 方法 。 首先 , 应 用 液 相 色谱 技术 对 代谢 组 〈 代 谢 组 学 ) 或 其 子 集 〈 代 谢 轮廓 ) 进行 分 析 ; 然后 使 用 峰 对 齐 算 法 将 所 有 样品 所 对 应 的 谱 图 进行 匹配 ; 最 后 对 这 些 数据 进行 模式 识 e 59 。 | 使 用 HPLC 技 术 分 析 某 一 类 代谢 产物 ll 匹配 色谱 图 数据 阵列 得 分 矩阵 图 : 分 类 结果 因子 载荷 图 : 潜在 生物 标记 物 联 用 技术 定性 潜在 标记 物 的 结构 3-5 基于 HPLC 技术 的 代谢 轮廓 〈 代 谢 组 学 ) 研究 的 策略 流程 图 @] 别 。 模 式 识 别 后 〈 以 主 成 分 分 析 为 例 ) , 可 以 得 到 两 方面 的 信息 : 一 方面 , 通过 得 分 矩 阵 图 (score plot) , 可 以 得 到 样品 在 二 /三 维 平 面 的 投影 分 布 图 , 从 这 张 分 布 图 上 可 以 观察 到 样品 的 分 类 情况 ; 另 一 方面 , 通 过 因子 载荷 图 , 可 以 得 到 那些 对 分 类 有 突出 贡献 的 变量 〈 对 应 于 样品 中 的 组 分 ) , 即 潜在 的 生物 标记 物 。 采 用 LC-MS-MS 技术 及 其 他 方 法 可 以 对 这 些 潜在 的 标记 物 进 行 结构 鉴定 。 在 这 个 过 程 中 , 最 关键 的 部 分 就 是 使 用 峰 对 齐 算法 将 所 有 样品 对 应 的 谱 图 进行 匹配 , 以 得 到 可 以 进行 模式 识别 分 析 的 数据 矩阵 。 研究 结果 表明 5%'""7 , 具 有 顺 式 二 羟基 结构 的 化 合 物 〈 主 要 是 核酸 的 代谢 产物 一 一 BA) 是 一 类 与 癌症 诊断 有 密切 关系 的 代谢 物 。 我 们 以 这 一 类 代谢 产物 的 代谢 轮廓 分 析 为 例 , 对 上 述 流程 中 的 各 部 分 进行 介绍 。 3.3.1.1 实验 部 分 1. 仪器 Shimadzu 型 液 相 色谱 系统 , 配 有 两 个 高 压 梯 度 溶剂 输送 泵 〈(LC-10ATvp) 、 紫 外 检 测 器 (SPD-10Avp)、 自 动 进 样 器 〈SIL-10ADvp)、 系 统 控制 器 (SCL-10Avp) 和 色谱 工作 站 (Shimadzu Class-VP) 。 反 相 液 相 色谱 柱 规格 为 4. 6mm i. d. X 250 mm (Spm), 2. 样本 集 及 预 处理 1) 混合 标 样 15 种 核 苷 标 样 均 溶 于 水 , 分 别 配 制 4mmol/L (RE RF «(Pseu), PREF CU) 和 RAF CA). 2mmol/L dt? (C). 、1. Ommol/L 5- 甲 基 尿 喀 啶 (m5U) 8mmol/L KE MRA CI). 0.8mmol/L 1-H Ze ke Se KF (mlI) 和 1- 甲 基 鸟 苷 (mlG)、 1. 3mmol/L Ni- 乙 酰 胞 苷 〈ac4C)、0. 2mmol/L % # (G), 0. 8mmol/L # EK KA (X) 1.03mmol/L 2-FA E547 (m2G), 0. 4mmol/L 6-FA SEAR FF (m6A), 4mmol/L 1-FASEAREF (mlA)、1lmmol/L 2,2-—-FES (m2, 2G) 为 储备 液 。 根 据 实 验 需 要 将 其 稀释 至 所 需 的 浓度 。 « 60 。 2) 实际 尿 样 采集 27 例 肝 硬 化 患者 、30 例 急 性 肝炎 患者 、20 例 慢 性 肝炎 患 和 48 Bil PBA 随机 尿 样 , 肝 病 患者 尿 样 来 自 大 连 医 科大 学 附属 第 一 和 第 二 医院 , 对 照 组 为 50 例 健康 人 随机 尿 样 , 从 我 们 自己 实验 室 采 集 。 收 集 到 样品 后 立刻 放 人 一 20C 的 冰箱 中 冷冻 。 分 析 尿 中 的 顺 式 二 羟基 代谢 产物 之 前 , 尿 样 在 室温 下 解冻 。 在 使 用 葵 项 酸 亲 和 凝 胶 色 谱 法 提取 前 , 加 入 内 标 8- 澳 化 鸟 背 〈Br8G) 。 3. 肌 本 值 的 测定 尿 样 中 的 肌 栈 浓 度 用 毛细 管区 带电 泳 法 测定 。 具 体 方法 为 : 将 尿 样 离心 后 , 取 0. lml 加 入 0. 15ml Milli-Q 超 纯 水 振 功 离 心 , 取 出 0. lml, 加 入 0. lml FS BORE (3-Dzu) 内 标 〈4. 0mmol/L) 振荡 离心 。 在 Beckman MDQ 毛细 管 电 泳 仪 上 上, 以 0. lmol/L pH6. 0 的 磷酸 盐 为 缓冲 液 , 在 50cmX50km i. d, 的 未 涂 层 石英 毛细 管 上 , 于 20kV 恒 压 、25C 下 进行 电泳 分 离 。 检 测 波长 为 245nm, 内 标 法 定量 。 4. 反 相 高 效 液 相 色谱 分 析 尿 样 中 提取 的 顺 式 二 羟基 代谢 产物 在 反 相 液 相 色谱 柱 上 实现 分 离 。 柱 温 23°C, Bit 动 相 A 为 5mmol/L CREAR (pH4. 5); 流动 相 也 为 602% 的 甲醇 水 溶液 进行 二 元 梯 FEVER (42 3-1) , 检 测 波长 为 254nm。 图 3-6 给 出 了 一 张 典 型 的 色谱 图 。 表 3-1 液 相 色谱 梯度 洗 脱 程序 时 间 /min 0 5 20 35 50 55 70 MeOH 浓度 (其 余 是 Smmol/L ZMK, pH4. 5)/% 0 0 15> 60 60 0 0 Vdtg 图 3-6 ” 尿 样 中 的 顺 式 二 羟基 代谢 产物 的 反 相 高 效 液 相 色谱 分 析 的 典型 色谱 图 5. 液 相 色 谱 的 数据 分 析 图 3-7 给 出 了 数据 处 理 的 流程 图 。 首 先 , 使 用 Shimadzu Class-vp 软件 (Version 6.10) 将 这 些 样 本 的 峰 信 息 以 csv 格式 输出 。 为 了 比较 这 些 样本 , 对 所 有 样本 中 的 色谱 峰 0.25 0.20 0.15 Vdtg 0.10 0.05 0.00 8 5 10 15 30 35 40 45 0.25 0.20 0.05 0.00 15 20 时 间 /min 识别 参考 峰 - 根据 参考 峰 计算 保留 因子 。 对 所 有 蜂 进行 匹 本 用 肌 栈 和 内 标 校正 数据 阵列 图 3-7” 峰 匹配 和 数据 妇 一 化 的 流程 示意 图 e。 62 « 进行 峰 对 齐 , 生 成 一 个 二 维 矩阵 , 其 中 “ 行 ” 对 应 样本 ,“ 列 ”对 应 色谱 图 中 的 色谱 峰 峰 面积 。 校 正和 归 一 化 后 的 数据 使 用 自 编 的 MATLAB 6. 5 程序 进行 主 成 分 分 析 (PCA). 6. 峰 匹 配 算法 本 算法 的 基本 思想 是 : 先 易 后 难 , 分 而 治之 , 逐 步 求 精 。 首 先 找 出 一 系列 〈C 个 ) 易于 识别 的 峰 一 一 参考 峰 , 这 C 个 参考 峰 将 整个 谱 图 分 成 C 十 1 PRM. Bix C 个 参考 峰 的 保留 值 赋 予 一 些 固定 的 值 ARW (7=1, 2, -*, C) 〈 如 100,200,300,…) , 然 后 将 其 他 的 峰 的 保留 值 ro, 如 保留 时 间 、 保 留 指数 等 ) 根据 这 些 参考 峰 进 行 校正 , 得 到 它们 的 校正 保留 值 (aruw)。 由 于 这 些 校 正 保留 值 是 相对 于 这 些 参考 峰 计 算得 到 的 , 也 就 是 说 , 参 考 了 样品 的 实时 分 离 条 件 , 因 此 与 原始 保留 值 相 比 , 不 同色 谱 图 中 的 校正 保留 值 更 稳定 , 依 照 这 种 校正 保留 值得 到 的 峰 匹 配 结果 更 准确 。 具 体 校正 保留 值 的 计算 如 方程 3. 1 Arm: oo 一 RARVh —ARV;) + ARV; Reet Gs 式 中 , ¢ e581 个 峰 的 保留 时 间 ;, ARV;, RV; AT; 分 别 代表 第 7 个 参考 峰 的 校正 保留 值 、 保 留 值 和 保留 时 间 ;, ARV 、RV 和 To 等 于 0。 3.3.1.2 结果 与 讨论 混合 标 样 数据 集 一 一 峰 对 齐 算 法 的 验证 为 了 测试 上 节 发 展 的 峰 对 齐 算法 , 以 分 别 在 两 天 运行 的 15 个 混合 标 样 的 色谱 图 作 为 测试 样本 〈 图 3-8A) , 选 择 了 两 种 保留 因子 作为 保留 值 进行 了 研究 ,一 种 是 保留 因子 k; 另 一 种 是 其 对 数值 log&。 为 了 更 清晰 地 观察 研究 对 象 , 对 色谱 图 进行 了 人 简化, 只 保 留 15 个 标 样 的 保留 值 和 峰 高 〈 或 峰 面 积 ) 信息 , 以 棒状 图 的 形式 表示 ; 将 第 二 张 谱 图 的 纵 坐 标 变换 为 对 应 的 负 值 , 并 与 第 一 张 谱 图 画 在 同一 张 图 上 , 这 样 谱 图 看 起 来 像 谱 图 和 谱 图 在 镜 中 呈现 的 倒影 , 我 们 称 之 为 “mirror spectrum”。 图 3-8B 给 出 了 峰 对 齐 前 以 保留 时 间 为 横 坐标 的 “mirror spectrum”。 图 3-8C 和 了 D 分 别 给 出 了 以 & 和 logk 为 保留 值 进 行 峰 对 齐 的 结果 。 从 图 3-8 中 可 以 看 出 , 无 论 采 用 有 还 是 log& 都 能 得 到 很 好 的 峰 对 齐 效 果 , 所 有 标 样 都 得 到 了 正确 匹配 。 本 书 的 第 9 章 第 3 节 给 出 了 采用 上 述 方法 对 实际 样品 进行 峰 对 齐 的 结果 , 表 明 使 用 基于 液 相 色 谱 的 代谢 轮廓 分 析 不 但 能 够 用 于 癌症 的 早期 诊断 , 还 有 效 地 降低 了 炎症 对 诊 断 的 干扰 , 大 大 降低 了 诊断 的 假 阳 性 率 。 3.3.2 基于 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 方法 用 于 慢性 乙 型 肝炎 的 急性 发 作 疾 病 研 究 与 代谢 轮廓 分 析 不 同 , 代 谢 组 学 分 析 试 图 分 析 样 品 中 的 所 有 内 源 性 代谢 产物 , 在 搭 建 样品 分 析 技术 平台 的 各 个 阶段 都 必须 着 重 考虑 提取 和 保留 尽 可 能 多 的 内 源 性 代谢 产物 信息 。 因 此 , 我 们 在 样品 预 处 理 阶 段 只 做 了 去 蛋白 质 处 理 ; 在 检测 器 的 选择 上 , 采 用 了 通用 型 的 质谱 检测 器 。 整 个 方法 和 数据 处 理 流程 如 图 3-9 所 示 。 。 63 。 强度 /mV 10 20 30 40 50 60 时 间 /min Le} So > 强度 /mV see eee | ea =. i) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 g $e TELA 0.4 5) 012 £ 2 0 “9.2 -0.4 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 , 保留 指数 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 保留 指数 | 图 3-8 不 同 批 次 运行 得 到 的 混合 标 样 色谱 图 的 重 释 显示 及 镜像 (mirror spectrum) 表示 上 : 目标 色谱 图 。 下 : 样品 色谱 图 ( 待 对 齐 的 色谱 图 )。A. 峰 对 齐 前 的 重 笃 显 示 图 ; B. 峰 对 齐 前 的 镜 BA 〈 以 保留 时 间 为 保留 值 ); C. 峰 对 齐 后 的 镜像 图 (以 上 为 保留 值 ); D. 峰 对 齐 后 的 镜像 图 (以 logK ARAB). B~D 的 不 轴 的 坐标 值 均 按 公式 〈3. 1) 进行 了 调整 。 图 中 “* ”为 预先 设 定 的 参考 峰 。 “大 ”使 用 公式 三 (retention time-void time) /void time 进行 计算 , 其 中 void time 为 基线 的 第 一 个 波 动 对 应 的 时 间 ° 64 « 融合 峰 表 -一 一 数据 阵列 一 一 | 图 3-9 基于 液 相 色 谱 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 研究 方法 示意 图 LC-MS 数 据 采 集 下 面 以 基于 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 方法 进行 慢性 乙 型 肝炎 的 急性 发 作 研究 为 例 ” , 对 该 方法 进行 简要 介绍 。 3.3.2.1 实验 部 分 1. 仪器 与 试剂 LC 1100 高 效 液 相 色 谱系 统 〈agilent corporation, USA), Q trap 串联 质谱 〈ap- plied biosystems instrument corporation,USA) , 分 析 柱 为 4. 6mm i. d. X 150mm Zorb- ax® Eclipse XDB-C8 5pm 柱 , 保 护 柱 为 内 径 4. 6mm 的 DBS 柱 , 柱 后 流出 液 在 进 质谱 前 通过 三 通 分 流 至 0. 2ml/min。 乙 且 和 甲酸 为 色谱 纯 试 剂 , 购 自 美 国 Tedia 公司 。 实 验 中 所 有 用 水 均 经 MilrQ 纯 水 系统 (Milipore corporation, USA) 处 理 。 氮 基 酸 标 样 购 自 Sigma (St. Louis, MO, USA), LysoPC 标 样 购 自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA), 2. 样品 及 样品 的 提取 以 37 例 慢性 乙 型 肝炎 肝 功 能 急性 恶化 患者 的 血清 为 样本 , 另 行 采集 50 例 健康 对 照 组 血清 样本 , 健 康 对 照 者 肝 功 能 测试 均 为 正常 , 且 没有 其 他 明显 疾病 。 样 品 的 基本 信息 如 表 3-2 所 示 。 表 3-2 对照 组 和 乙 型 肝炎 组 的 统计 学 信息 项 目 对 照 组 (zx 一 50 ) 肝病 组 (z 一 32 ) 性 别 /( 男 / 女 ) 34/16 26/6 年 龄 / 岁 43. 89 士 13.74 45. 88 士 12. 24 ALT/(U/L) 22. 1643. 64 33. 22+4. 68 TB/(yumol/L) 11. 7644. 92 474. 18+165. 68 PT 12. 080. 79 32. 80+17. 10 YE: ALT, 丙 氨 酸 转氨酶 ; TB, 总 胆 红 素 ; PT, 凝 血 原 时 间 血液 样品 于 室温 放置 1 一 2h 后 , 在 4C 下 以 3000g 离心 10min, 血 清 保存 于 一 70C 直至 分 析 前 。 。65 。 分 析 时 , 取 150ml 血清 , 加 入 150ul CAR, HBA 30s, MB Smin; 于 12 000r/min ”转速 下 离心 3min, 取 上 清 液 , 置 冷冻 浓缩 仪 中 冻 干 。 冻 王后 的 固体 复 溶 于 150pl 80% CARA # . 3. LC-MS 分 析 条 件 LC 条 件 : 流动 相 A 为 0.1%% 的 甲酸 水 溶液 , 流动 相 BAA 0.1% RAZA. 方法 运行 前 , 整 个 LC-MS 系统 预 平 衡 2min, 所 有 仪器 工作 在 初始 状态 。 之 后 , 梯 度 条 件 为 : O~18min, 2%B~98% B 的 线性 梯度 ,18 一 20min, 保 持 98%B 2min; 20~ 22min, 98%B 降 到 2%B; 22~25min 保持 2% B 平 衡 3min。 进 样 量 为 10w1, 柱 温 箱 控 温 在 25°C MS 条 件 : 电 喷 雾 源 CESD ARE, FF (CUR) 20psi, 碰 撞 气 (CAD) low, BF 喷雾 电压 CIS) 5000V, 离 子 源 温度 (TEM) 250C , 雾 化 气 (GS1) 30psi, 辅 助 加 热气 (GS2) 40psi; AMEE (DP) 45V, 离 子 通道 人 口 电压 CEP) 10V, 碰 撞 能 量 〈CE) 10eV。 工 作 模式 : 增强 型 质谱 扫描 (EMS), RBAWHA 100~800amu, Fill Time 50ms, QO trapping On。 扫描 速 度 1000amuys。 分 析 得 到 的 典型 谱 图 如 图 3-10 所 示 。 A 7.7e8 199219 83 7.0e8 | 6.0e8 | 1339. 17,32 187! 2 5.0e8 i ae | 5 22.91 4.0e8 8.93 14.79, Il s 5.89 954 1238 | 2 3994 35S) 6 7 8 9 T0 11 12:18 4 1S 16 17 138 19 Zope 23 24 时 间 /min B Rane 0~2.6% m/z 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 时 间 /min 图 3-10 ”样品 的 总 离子 流 图 (A 及 其 二 维 等 高 线 图 (B) 4. LC-MS/MS 条 件 采用 Analyst 软件 提供 的 IDA 模式 进行 LC-MS/MS 数据 采集 。LC 和 EMS 条 件 同 es。 66 。 LC-MS 中 的 条 件 , 但 EMS 的 扫描 速度 改 为 4000amuy/s 以 达到 更 高 的 duty cycle。 在 增 强 型 的 产物 离子 扫描 CEPD 中 ,Ql 的 分 辩 率 为 LOW 以 得 到 较 高 的 灵敏 度 ,CE 分 别 设 为 20eV、30eV 和 60eV 来 得 到 不 同 碎 裂 程度 的 碎片 信息 。 5. 峰 识别 及 峰 匹配 算法 峰 识 别 部 分 采用 Metabolite ID 1.3 (Applied Biosystems Instrument Corporation, USA) 中 的 脚本 “comparing sample and control” XR, ids XIC HABA 信息 , 汇 总 至 峰 表 输出 。 为 了 后 续 的 数据 处 理 , 必 须 对 这 些 峰 进行 匹配 , 形 成 一 个 数据 矩阵 。 首 先 , 对 得 到 的 峰 表 进行 合并 。 然 后 将 合并 后 的 峰 表 进行 排序 , 同 时 落 入 同一 保留 时 间 窗 口 和 质 荷 比 窗口 内 的 峰 被 认为 是 一 个 峰 , 得 到 一 个 总 的 峰 表 。 最 后 按照 总 峰 表 , 将 每 个 样本 的 信号 值 对 应 填 人 , 不 出 峰 的 部 分 定义 为 0, 这 样 就 得 到 了 一 个 87 〈 样 本 数 ) X7347 CREB) 的 和 矩阵。 该 部 分 使 用 MATLAB 编程 实现 。 3.3:2:2 ”结果 与 讨论 1. 模式 识别 结果 将 上 面 得 到 的 矩阵 做 PLS-DA 分 析 , 结 果 如 图 3-11 所 示 。 结 果 表 明 模 型 能 够 较 好 地 区 分 受 试 样品 的 类 别 。 0.10 0.20 0.30 w*c[1] 图 3-11 PLS-DA 的 分 析 结 果 (类 1 为 对 照 组 , 类 2 为 肝炎 组 ) A. 得 分 图 ; B 载荷 图 ° 67 。 从 图 3-11A 中 可 以 看 出 , 通 过 如 上 代谢 组 学 分 析 流 程 , 患 者 组 和 对 照 组 得 到 了 很 好 的 区 分 。 从 图 3-11B 中 提取 对 分 类 有 重要 贡献 的 前 20 个 变量 的 信息 , 比 较 这 些 变量 在 两 类 样品 中 含量 的 均值 。 如 图 3-12 所 示 , 经 上 检验 , 除 变量 6014 和 6461 外 , 其 他 变 量 均 有 显著 性 差异 。 认 为 满足 这 两 个 条 件 的 18 个 变量 是 潜在 的 生物 标记 物 , 列 于 表 3-3。 表 3-3 ”潜在 标记 物 的 质谱 定性 结果 变量 (主要 ) 变量 在 投影 上 的 重要 性 ”时间 /min m/z 化 合 物 VAR 5229 41. 234 4 Laz 524.5 LysoPC C18 : 0 VAR 4177 33. 074 3 1 于 :33 496. 5 LysoPC C16 : 0 VAR 4167 20. 353 4 15525 478. 2 LysoPC C16 : 0 碎片 VAR 5226 18. 784 4 17.21 506. 6 LysoPC C18 : 0 碎片 VAR 3850 18.038 4 14. 75 520. 5 LysoPC C18 : 2 VAR 686 17. 2795 7. 78 235a2 VAR 644 16. 333 3 i900 235. 2 VAR 4422 16. 163 3 15. 85 522. 4 LysoPC C18: 1 VAR 3849 12. 549 2 14. 75 502. 5 Fragment of LysoPC C18 : 2 VAR 2266 12. 204 3 12. 34 414. 2 Fragment of GCDCA? VAR 6169 11. 453 3 19. 81 282.4 VAR 4417 10. 064 3 15. 84 504. 4 Fragment of LysoPC C18 : 1 VAR 4022 9. 759 21 15.05 478. 4 Fragment of LysoPC C16 : 0 VAR 4024 9. 582 38 15. 05 496.1 LysoPC C16 : 0 VAR 4021 8.5195)32 15. 05 184. 2 磷酸 胆 碱 部 分 Fragment of LysoPC C16 : 0 VAR 5104 7. 956 42 16. 89 524.4 LysoPC C18 : 0 VAR 4178 7. 585 02 15. 34 479. 3 478. 4 的 同位 素 峰 VAR 741 7.99 235.3 a. GCDCA: H 36 4 AUR 强度 /amu Q? Dery REPLIES B RAD 图 3-12 pT 20 Aeshna siete 比较 ° 68 ° ae 和 ee ee a eee rere ree eee 2. 潜在 标记 物 的 质谱 定性 按照 实验 部 分 的 操作 条 件 对 其 中 的 一 个 样品 (A202) 进行 LC-MS/MS 分 析 。 值 得 注意 的 是 , 通 常 质谱 中 一 个 化 合 物 对 应 的 峰 并 不 止 一 个 , 经 常 有 碎片 或 加 合 离子 , 在 对 潜在 标记 物 定性 时 需要 找到 标记 物 的 准 分 子 离子 峰 , 和 否则 可 能 得 到 一 些 错 误 的 结果 。 如 在 表 3-3 中 ,VAR 5229 和 VAR 5226 实际 上 就 是 一 个 化 合 物 ,VAR 5226 是 VAR 5229 丢失 一 个 中 性 分 子 一 一 水 而 生成 的 。 在 本 实验 中 , 采 用 的 方案 是 根据 潜在 标记 物 表 中 的 保留 时 间 和 质 荷 比 找到 该 峰 , 然 后 观察 其 对 应 的 准 分 子 离子 , 并 在 LC-MS/MS 数据 中 找到 该 离子 的 EPI 谱 图 进行 解析 和 上 比照。 在 下 面 的 谱 图 解析 中 , 仅 以 其 中 的 两 个 离子 作为 例子 进行 解析 。 一 个 为 VAR 5229, 这 个 离子 是 准 分 子 离子 , 因 此 其 解析 直接 分 析 这 个 谱 图 即 可 ; 另 一 个 为 VAR 2266, 这 个 离子 不 是 准 分 子 离子 , 在 一 级 谱 图 上 能 找到 其 母 离子 , 但 在 LC-MS/MS 的 谱 图 中 , 由 于 准 分 子 离子 峰 的 强度 太 低 , 没 有 相应 的 EPI 图 , 因 此 需要 同时 分 析 一 级 谱 图 和 二 级 谱 图 。 例子 1,VAR 5229 (图 3-13) 184.2 相对 强度 /% 100 150 200 250 300 350 400 450 500 mlz 图 3-13 变量 5229 的 串联 质谱 图 从 图 3-13 中 可 以 看 出 , 母 离子 524. 3 可 以 生成 506. 3 (VAR 5226) 。 在 谱 图 的 解析 过 程 中 , 发 现 其 EPI 谱 图 中 的 碎片 离子 和 Lyso-Phosphatidyl choline (LysoPC) 类 化 合 物 的 碎片 有 着 共同 的 特征 碎片 离子 : xm/zl104、zz/z184 (磷酸 胆 碱 部 分 )、zz/z258 和 ma/z341。 我 们 找到 准 分 子 离子 峰 刚好 为 524 的 LysoPC C18 : 0 标准 品 进行 对 照 。Ly- soPC C18 : 0 标 样 的 二 级 质谱 谱 图 如 图 3-14 所 示 。 184.2 506.4 oo 125.1 166.2 1181.3 258.2 321.0. 341.4 421.3. 447.2 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Iz FAX Gh BE /% 3 图 3-14 LysoPC C18 : 0 标 样 的 二 级 质谱 可 以 看 到 谱 图 中 的 主要 碎片 离子 均 吻 合 无 误 , 因 此 可 以 认为 VAR 5229 (VAR 5226) Bl LysoPC C18 : 0。 使 用 同样 的 方法 , 鉴 定 出 了 VAR 4177 等 其 他 潜在 标记 物 , 结果 列 于 表 3-3 中 。 例子 2: VAR 2266 (I 3-15) MH +EPI(414.23)Charge(+1)CE(30):Exp4,12.404 min from Sample 1(A 202)of Dat... MAX.1.9E8 EPS. 4142 1.8e6 012 1.6e6 1613 215.3 1.4e6 missin 15$.3 175.2 a 1.2e6 339.4 ha 1.0e6 143.3 229.3 - 177.4 aid 8.0e5 243.3 135.4 6.0e5 239.3 “eg 18k 3 252.2 4.0e5 4 “108.2 24.2 2.0e5 [和 | | 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 m/z 图 3-15 变量 2266 的 串联 质谱 图 当 检查 VAR 2266 的 一 级 质谱 图 (图 3-16) 时 , 发 现在 414. 4 的 高 质量 端 有 两 个 合 理 的 中 性 丢失 前 的 峰 : m/z 432. 3 Al m/z 450.3。 因 此 ,我们 认为 VAR 2266 的 准 分 子 离子 峰 应 为 450. 3。 相对 强度 /% 414.4 321.3、 158.2,175.3 243.4、288.3、 758.3- 100 150 .200, 7250 )3=— 300 3S :330 )3=— 4400's 450 1.500%) 550 ~: 600)» 650, 700%) 7505 eGo 图 3-16 VAR 2266 处 的 一 级 质谱 图 但 是 从 这 两 张 谱 图 中 , 只 能 看 出 VAR 2266 这 个 化 合 物 极 易 脱 去 2 分 子 水 , 可 能 含 有 两 个 游离 的 一 OH。 另 外 从 图 3-12 中 , 我 们 发 现 3 个 两 两 间隔 为 14 的 离子 系列 : 103 一 229、105 一 203、112 一 256。 这 通常 是 长 链 脂 肪 链 断 裂 ,RCH: COCH:R 重 排 或 一 APN Wi Diels-Alder 重 排 所 致 。 以 上 是 能 从 谱 图 中 找到 的 结构 信息 和 特征 。 以 分 子 质 量 (MW) 为 449 到 KEGG 数据 库 中 进行 查询 时 , 发 现 有 几 种 代谢 产物 满足 上 面 的 特征 。 它 们 是 甘氨酸 脱氧 胆 酸 盐 、 甘 氨 牲 脱氧 胆 酸 盐 和 磷酸 乙醇 胺 神经 栈 胺 。 其 对 应 的 结构 如 图 3-17 Aras. se。 70 。 H,C OH NY CH, H Oo CH HON OH H C05466 C R HN pe e O—-F — i) Ca | TREE OH C06062 图 3-17 ”潜在 标记 物 VAR 2266 几 种 可 能 的 化 合 物 结构 以 上 化 合 物 中 ,A、B 均 为 结合 型 胆汁 酸 , 是 肝炎 患者 的 常规 诊断 指标 胆汁 酸 的 加 合 物 。C 为 磷脂 酰 乙醇 胺 , 也 是 人 血清 中 的 一 类 重要 磷脂 。 但 C 的 可 能 性 不 大 , 因 为 这 种 化 合 物 并 不 容易 脱 去 2 分 子 的 水 。 文 献 中 5[ 轨 仅 查 到 与 A、B 类 似 的 GCA 〈glyco- cholate acid) 的 谱 图 (图 3-18) , 该 结构 比 A,B 多 一 个 一 OH, 其 脱 去 1 分 子 水 后 的 离 子 为 448, 比 450 少 2。 对 比 图 3-18 和 图 3-16, 图 3-16 中 高 分 子 质 量 端 与 GCA 的 高 质 量 端 都 相差 2, 说 明 这 两 张 谱 图 的 结构 极为 相似 ,VAR 2266 的 结构 很 有 可 能 是 A 或 者 A 1600 100 200 300 400 500 600 m/z 图 3-18 文献 报道 的 甘氨酸 结合 胆汁 酸 的 一 级 和 二 级 质谱 图 ° 71. B。 其 可 能 的 部 分 断裂 途径 〈 以 GCDCA 为 例 ) 如 图 3-19 所 示 。 yt N OH oh Lee 4 O H,O OH 了 mlz 450 m/z432 es a Ot i m/z414 + OH ae O m/z396 H m/z339 | -Ho 3-19 GCDCA 的 可 能 的 部 分 断裂 途径 从 Sigma 公司 购买 的 GCDCA 标 样 的 串联 质谱 图 如 图 3-20 所 示 , 其 断裂 模式 与 图 3-11 吻 合 , 证 实 了 以 上 推断 。 但 是 由 于 GDCA 与 GCDCA 的 结构 类 似 , 由 质谱 的 结 果 并 不 能 排除 该 潜在 标记 物 是 GDCA 的 可 能 性 。 由 于 GDCA 与 GCDCA 的 性 质 类 似 , 生物 学 作用 也 相近 , 以 下 关于 GCDCA 的 讨论 实际 上 也 适合 于 GDCA。 414.3 See 相对 强度 /% > loa) 368.3 396.2 N So 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z 3-20 GCDCA 标 样 碎片 〈zzz 414 部 分 ) 串联 质谱 图 GCDCA 是 结合 型 胆汁 酸 的 一 种 , 其 前 体 为 胆固醇 , 在 体内 主要 与 脂 类 的 代谢 有 关 , 对 油脂 消化 和 脂 溶 维生素 吸收 有 重要 作用 。 而 胆固醇 与 卵 磷 脂 有 如 下 反应 : ° 72 。 胆固醇 十 卵 磷 脂 -> 胆 固 醇 脂 十 溶血 磷脂 据 报 道 , 在 肝 细 胞 严重 损伤 时 , 胆 固 醇 脂 的 合成 降低 , 由 于 缺 氧 或 氧化 磷酸 化 障 碍 , 致 使 ATP 和 CDP- 胆 碱 的 形成 不 足 , 造 成 磷脂 及 VLDL 的 合成 障碍 , 导 致 肝 内 脂 肪 向 体循环 的 释放 不 足 , 促 使 肝 细 胞 中 甘油 三 酯 的 堆积 , 磷 脂 酰 胆 碱 显著 减少 , 结 合 型 胆汁 酸 含量 增高 。 本 实验 的 结果 显示 LysoPC 含量 显著 减少 , 甘 氨 结 合 胆 汁 酸 增高 , 与 文献 结果 相符 。 将 表 3-3 中 的 标记 物 和 病历 信息 中 的 14 个 指标 〈 年 龄 、 白 蛋白 、 球 蛋白 、 谷 两 转 氨 酶 、 总 胆 红 素 、 直 接 胆 红 素 、 胆 碱 酯 酶 、 凝 血 酶 原 时 间 、 胆 汁 酸 、 甘 油 三 酯 、 胆 固 醇 、 高 密度 脂 和 蛋白、 低 密 度 脂 蛋白 、 极 低 密 度 脂 蛋 白 ) 做 相关 性 分 析 。 对 其 中 相关 系数 | Ci |>0. 8 的 变量 做 相关 性 网 络 图 〈 图 3-21) 。 从 图 中 可 以 找到 这 些 变量 的 生物 相关 性 。 如 GCDCA 与 胆汁 酸 的 正 相 关 与 GCDCA 的 前 体 是 胆汁 酸 相 符 ; 各 种 LPC 和 其 碎 片 有 着 强 相 关 , 这 意味 着 这 种 强 相 关 性 还 可 以 反映 出 峰之 间 的 结构 信息 , 这 对 潜在 标记 物 的 定性 是 有 帮助 的 。 GCDCA 图 3-21 代谢 组 学 方法 鉴定 的 生物 标记 物 和 传统 生物 标记 物 之 间 的 相关 性 网 络 e 73 « 3.3.3 全 二 维 亲 水 作用 色谱 质谱 联 用 技术 用 于 极 性 复杂 样品 中 结构 类 似 组 分 的 分 离 和 鉴定 如 3. 2 节 所 指出 的 , 在 体液 和 植物 鞋 取 物 中 往往 存在 大 量 的 结构 类 似 、 质 量 数 相 同 、 色 谱 保留 行为 非常 相似 , 但 生理 功能 不 尽 相 同 的 极 性 代谢 物 组 分 , 采 用 一 维 液 相 色 i (无 论 是 RPLC 还 是 HILIC) 质谱 联 用 技术 无 法 提供 足够 的 峰 容 量 对 其 进行 分 离 鉴 定 。 此 时 , 应 采用 全 二 维 液 相 色谱 技术 , 通 过 引入 不 同 的 色谱 分 离 机 制 , 利 用 这 些 组 分 间 细 微 的 结构 差异 实现 分 离 。 本 节 以 皂 树 皂 耻 提取 物 的 HILIC x HILIC-Q-TOF-MS 分 离 分 析 为 例 , 阐 述 这 种 技术 平台 的 分 离 特 点 和 分 辩 能 力 。 3.3.3.1 实验 部 分 1. 仪器 与 试剂 HILICX HILIC 系统 用 商品 化 高 效 液 相 色谱 模块 构建 而 成 , 流 路 如 图 3-22 所 示 。 第 一 维 采 用 Agilent 1200 高 效 液 相 色 谱 仪 (Agilent Technologies,USA) , 包 括 二 元 高 压 梯 度 泵 、 自 动 进 样 器 和 脱 气 机 。 第 二 维 采用 Shimadzu — 70 i BE ty He YE FA Ha TK FR (LC-20AB,Shimadzu,Japan) , 两 维 间 的 接口 由 二 位 十 通电 磁 阀 〈77251,Rheodyne, USA) 和 两 个 平行 的 定量 环 组 成 。 实 验 采用 质谱 作为 检测 器 (6510 Q- TOF, Agilent Technologies, USA). 图 3-22 HILICX HILIC-Q-TOF-MS 流 路 示意 图 fiSai CG. PR. CRACREIGA Tedia 公司 〈Tedia,OH,USA)。 去 离子 IZ Milli-Q 系统 (Millipore Co., MA, USA) 净化 后 使 用 。 皂 树 皂 苷 提取 物 购 自 Sigma 公司 (Sigma-Aldrich Inc. ,MO,USA), 其 中 含 皂 武 配 基 成 分 约 10%. AR 醇 : 水 (1 : 1,V/V) 混合 溶液 配制 浓度 为 100 mg/ml 的 皂 树 皂苷 溶液 , 过 膜 待 用 。 2. 色谱 质谱 条 件 第 一 维 采 用 Amide-80 色谱 柱 〈2mm i. d. X150mm,3pkm,TOSOH,Japan) R&C or) ae 套 保 护 柱 (2mm i. d. X10mm, 3um, TOSOH, Japan) (#E 1) 。 在 单 柱 分 离 时 , 流 动 AAAS 1% PRANAB M, Tim BACH. RAAB, Ze 20min 内 BAA 90%% 降 至 50% , 并 保持 10min, PEPE 0. 20ml/min, PolyHYDROXYETHYL Am 填料 (5m, 100A, PolyLC Inc. USA) , 经 湿 法 装 填 在 2.1mm i. d. X 35mm 的 不 锈 钢 柱 管 中 , 作 为 第 二 维 分 析 柱 〈 简 称 “pOH-Et A” 柱 ) (HE 2) 。 单 柱 分 离 时 , 流 动 相 A 为 含 1% 乙酸 的 10mmolL 乙酸 铵 水 溶液 , 流 动 相 B 为 乙 有 睛 。 采 用 和 第 一 维 单 柱 分 离 时 相同 的 线性 梯度 , 流 速 为 0. 25ml/min。 在 HILICX HILIC 分 离 时 , 两 维 的 流动 相 组 成 不 变 , 但 第 一 维 流 速 降 为 0.04ml/min。 仍然 采用 线性 梯度 ,B 相 在 100min 内 从 90% 降 到 50% , 并 保持 至 实验 结束 。 第 二 维 改 用 阶梯 梯度 , 具 体 来 说 , 前 50min 保持 90%B, 50~70min 为 85% B, 70~80min 为 80% B, 80~90min 4 75% B, 90~100min 为 70% B,100min 以 后 为 60%B。 流 速 提 高 至 0. 5ml/min。 第 二 维 分 离 时 间 即 阀 切换 时 间 为 2. 5min。 这 样 , 两 维 间 定量 环 CFF 品 环 1, 样 品 环 2) 的 容积 为 100xl。 在 所 有 分 析 过 程 中 , 上 样 量 均 为 1. Onl. 质谱 采用 dual ESI 离子 源 , 应 用 负离子 扫描 模式 , 流 动 相 不 分 流 直接 进入 喷雾 针 。 Vcap 4000V, 加 热 温 度 为 350C 。 氮 气 被 用 作 drying gas 和 nebulizer, Fragmentor 为 220V。 质 量 扫描 范围 为 300 一 2500zmz/z。 3. 二 级 质谱 条 件 为 保证 尽 可 能 多 地 采集 可 能 存在 的 皂 树 气孔 单 体 组 分 的 结构 信息 , 分 别 采 用 target MS/MS 和 auto MS/MS 两 种 模式 , 对 质量 数 1200 一 2400”z 范围 内 的 离子 , 尤 其 是 那 些 已 知 皂 树 皂苷 单 体质 量 数 的 离子 进行 二 级 质谱 分 析 。Fragmentor 提高 至 270 V, 同 时 根据 不 同 的 质量 数 采 用 30 一 80 的 CE, 其 他 条 件 与 3. 3. 1. 2 相同 。 3.3.3.2 BRK 1. HILICX HILIC 柱 系统 的 选择 皂 树 皂苷 是 由 皂 树 提取 出 的 一 类 具有 表面 活性 剂 性 质 的 化 合 物 , 可 以 和 政 水 或 两 亲 性 蛋白 质 或 脂 类 结合 , 形 成 所 谓 的 “免疫 刺激 混合 物 “” , 这 种 混合 物 可 以 刺激 血 中 抗 体 的 滴定 度 大 幅 升 高 〈 比 蛋白 质 胶 束 单独 刺激 高 10 倍 ) 。 有 研究 表明 , 口 服 皂 树 皂 苷 可 以 增强 免疫 , 还 会 影响 动物 的 胆固醇 代谢 和 血脂 分 布 。 此 外 , 气 树 皂 苷 还 被 广泛 用 作 食 品 、 化 妆 品 和 药物 的 辅 剂 以 及 生化 分 析 中 -“” 。 皂 树 皂苷 具有 多 种 不 同 糖苷 配 体 和 糖 环 残 基 , 可 能 形成 多 种 结构 , 目 前 已 有 100 多 种 单 体 得 到 报道 "” 。 图 3-23 给 出 了 常见 皂 树 皂苷 组 分 的 结构 组 成 , 可 以 看 出 , 其 中 存 在 多 对 同 分 异 构 体 , 结 构 极 其 相似 , 仅 在 特定 位 置 结 合 了 不 同 的 单 糖 或 寡 糖 残 基 。 根 据 其 主要 来 源 《〈 气 树 树 皮 ) 产地 的 不 同 以 及 提取 工艺 的 差别 , 众 多 商品 化 皂 树 皂苷 提取 物 中 各 单 体 种 类 及 其 含量 也 不 尽 相 同 。 多 级 质谱 已 经 成 功用 于 多 个 皂 树 皂苷 组 分 的 结构 鉴 定 中 "”, 但 对 于 皂 树 皂苷 提取 物 来 说 , 组 分 进入 质谱 前 的 预 分 离 过 程 是 十 分 必要 的 , 而 HPLC 是 最 常用 的 预 分 离 手段 之 一 。 曾 有 报道 用 HPLC-UYV 方法 对 皂 树 皂苷 混合 物 进行 轮廓 分 析 ” ”和 质量 控制 , 但 一 方面 其 结构 中 缺乏 强 紫外 吸收 基 团 , 另 一 方面 混 ee 75 。 合 物 组 成 复杂 , 该 方法 很 难 提供 足够 的 灵敏 度 和 分 辨 率 。 也 曾 有 人 采用 离线 的 二 维 HPLC 方法 分 离 制备 皂 树 皂苷 单 体 [9 或 SPE-NMR 方法 结合 质谱 和 核磁 共振 等 手段 对 其 中 的 某 些 组 分 进行 结构 鉴定 。 通 过 增加 分 离 维 数 和 改变 分 离 条 件 , 多 种 新 型 皂 树 皂苷 单 体 得 以 发 现 。 在 目前 报道 的 绝 大 多 数 HPLC (包括 SPE) HHP, MERA RPLC 填料 作为 分 离 介质 的 。 考 虑 到 其 结构 中 含有 丰富 的 亲 水 性 基 团 , 以 及 不 同 皂 树 皂 苷 组 分 间 的 区 别 通常 来 自 糖 环 残 基 的 不 同 , 采 用 选择 性 独特 的 HILIC 色谱 柱 应 能 为 这 种 混合 物 提 供 一 种 新 的 分 离 方 法 。 但 实验 表明 , 一 维 HILICMS 方法 不 能 为 这 种 结构 复杂 的 天 然 产物 提取 物 提 供 足 够 的 峰 容 量 (图 3-24) 。 三 知音 元 皇 皮 酸 (Q) 糖 基部 分 A _ {0H R On i RB rz ATG R° 四 fe) 5 = HO OH CHg O 让 R3 HO R terminal groups on R°-R4 | 葡萄 糖 (Glc) ABH (Xyt) 鼠 李 糖 (Rha) OH ER HO O cH oN HO HO HO OH R FER (Api) 脂肪 酸 链 -阿拉 伯 糖 (Fa) R S > O OH fe) OH R O HO H OH 图 3-23 Le aa” 详细 取代 基 见 表 3-4 。 76 。 S1,S2 S3,S4 S5,S6 S7,S8 S9,S10 $11,S12 Bl, B2 B3,B4 BS, B6 B7 23 S13 1436 1582 1714 1714 1598 1628 1730 1760. 1640. 1802. 1744. 1876. 1870. 2002. 2002. 1912. 2045 2045 2033 2165 2165 1656 1788 1978 1392. 1732 1560. MW 26 . 7, 1568. . 7,1700. . 7,1700. . 7,1584. .7,1614. . 7,1716. 8,1746. 7,1626. 8,1788. 8,1730. 8, 1862. 9,1856. 9,1988. 9,1988. 9,1898. - 0, 2030. - 0, 2030. -0,2018. .0,2151. -0,2151. 1886. 2018. 2297. . 7,1642. .8,1774. . 9,1964. 9 9 0 7 .8 ff co Per! > = a = a = TO Yo Se > Te Vc TRS Ro = i [a aia fare Die 0 | R34 常见 皂 树 皂苷 的 详细 结构 ”1 Agly. D 呈 5DtD2== 量 = 量 = 有 D7 古 2 记 ”= 二 > 页” 三 汪 > 页 =Ee esswe 攻 > P-Ac R° H Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl H H Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl Rha/Xyl H Xyl H R2 MeBu R3 Gle Ac MeBu Glc: 葡 萄 糖 , Ac: 乙 酰基 ,MeBu:2- 甲 基 丁 酰基 ,P: 商 陆 酸 ,, P-Ac:O-23- 乙 酰 化 商 陆 酸 ,Fa: 脂 肪 酸 链 -阿拉 伯 糖 ,Q: 42 MR, OHMeHex: 3- 羟 -4- 甲 基 已 酰基 ,Rha: 鼠 李 糖 ,Api: 芹 糖 , 眉 : 刺 赛 酸 ,Ara: 阿 拉 伯 糖 ,Xyl: 木 糖 。 在 图 3-24 所 示 的 负离子 扫 撒 模式 下 萃取 48 个 组 分 , 观 察 其 在 两 种 HILIC 色谱 柱 上 的 保留 行为 , 并 据 此 计算 两 HILIC 柱 选择 性 的 相关 性 。 对 于 那些 具有 相同 质量 数 的 组 分 , 通 过 各 组 分 的 响应 强度 、2D 保留 行为 , 以 及 MS/MS 等 对 其 在 两 HILIC 柱 上 的 保留 时 间 子 以 确认 。 各 组 分 的 保留 时 间 分 布 图 、 两 柱 间 相关 系数 (Cr) 以 及 峰 分 布 夹 角 BUN 3-25 所 示 。 可 以 看 出 , 在 实验 条 件 下 , 两 种 HILIC 色谱 柱 具 有 适中 的 正 交 性 , 可 以 用 来 构建 全 二 维 分 离 柱 系统 。 77 e . Amide-80 ESI pOH-Et A ESI 0 10 20 50° 0 5 10 15 时 间 /min 时 间 /min 图 3-24 皂 树 皂苷 提取 物 在 HILIC 单 柱 上 分 离 的 总 离子 流 图 〈 负 离子 模式 ESI ) 1VpOH-EtA 0 2 4, 6" °8 > 10) 125-14 SG see t,/Amide-80 图 3-25 48 个 皂 树 皂苷 提取 物 组 分 在 HILIC 单 柱 上 的 保留 时 间 分 布 图 2. HILIC XHILIC 分 离 结果 如 图 3-26 所 示 , 样 品 经 HILICX HILIC 分 离 后 的 总 离子 流 数据 经 Transform 软件 (Ver 3.4, Noesys Software Package, Research Systems International, Crowthorne, UK) 处 理 为 等 高 线 图 , 其 中 上 图 为 负离子 模式 下 的 检测 结果 , 下 图 为 正 离子 模式 下 的 检测 结果 。 从 图 3-26 中 可 以 看 出 , 经 过 第 二 维 pOH-Et A 柱 的 再 次 分 离 , 某 些 在 Am- 25 2.0 第 二 维 保留 时 间 /min 第 一 维 保留 时 间 /min 图 3-26 ” 皂 树 皂苷 混合 物 的 HILICX HILIC-QTOF-MS 总 离子 流 等 高 线 图 。 78 。 AGE ee ae ide-80 柱 上 的 共 流 出 组 分 得 到 了 完全 分 离 ;, 而 某 些 在 pOH-Et A 柱 上 难以 分 开 的 组 分 也 因 在 Amide-80 柱 上 表现 出 不 同 的 保留 行为 而 得 到 分 离 。 在 实验 条 件 下 , 二 维 分 离 空间 得 到 了 较为 充分 的 利用 , 尤 其 是 在 50~100min 的 时 段 内 。 在 LCXLC 系统 中 , 从 第 一 维 进入 第 二 维 的 馆 分 体积 较 大 , 如 果 其 洗 脱 强度 相对 第 二 维 固定 相 较 高 , 则 会 造成 严重 的 峰 展 宽 , 甚 至 导致 第 二 维 分 离 失 败 。 解 决 这 一 问题 的 措施 之 一 是 在 第 一 维 采用 洗 脱 强度 较 弱 的 流动 相 , 以 保证 组 分 在 第 二 维 的 “柱头 聚 焦 "”。 但 对 于 本 节 的 分 析 对 象 来 说 , 为 保证 分 离 , 在 两 维 都 用 高 浓度 有 机 相 是 有 必要 的 。 为 保证 第 二 维 的 “柱头 聚焦 ”效应 , 可 以 从 另 一 方面 出 发 , 将 对 组 分 保留 能 力 较 强 的 固 定 相 用 于 第 二 维 。 在 本 节 中 ,pOH-Et A 色谱 柱 对 组 分 有 较 强 的 保留 能 力 , 所 以 用 于 第 二 维 分 离 。 相 应 地 ,Amide-80 色谱 柱 用 于 第 一 维 。 实 验证 明 , 这 种 柱 系统 设置 较为 合 理 , 在 HILICXHILIC 分 离 中 第 二 维 没有 出 现 严重 的 峰 展 宽 现 象 。 本 节 所 研究 的 分 离 对 象 为 一 复杂 体系 , 除 已 知 皂 树 皂 苷 组 分 具有 不 同 的 分 子 骨 架 、 SERRA. EMEA. HE Gi) 水 性 以 及 水 解 性 质 外 , 尚 存在 大 量 分 子 质 量 范 围 较 广 而 性 质 未 知 的 组 分 。 当 采用 多 维 分 离 方法 时 ,HILICX HILIC 允许 组 分 峰 沿 二 维 方向 展 开 , 为 减少 峰 重 至 现象 提供 了 更 大 的 分 离 空 间 , 质 谱 又 能 额外 提供 一 维 分 离 能 力 , 这 样 , 分 离 手 段 的 维 数 可 以 达到 3, 作 为 一 种 在 线 分 析 手 段 , 显 然 比 普通 的 HPLC-MS 77 法 具有 更 强 的 分 离 能 力 。 在 单 柱 分 离 条 件 下 〈 图 3-24) ,Amide-80 的 有 效 分 离 时 间 约 为 25min, 平 均 峰 底 宽 为 0. 6min, 由 此 计算 所 得 的 峰 容 量 为 42, 而 pOH-Et AHF 14min 的 有 效 分 离 时 间 内 峰 容 量 只 有 18。 即 使 加 入 质谱 的 分 离 能 力 , 也 无 法 完全 避免 峰 重 和 到 现象 的 发 生 。 与 此 对 应 , 在 该 全 二 维 分 离 体 系 中 , 第 一 维 分 离 的 峰 通常 被 分 割 成 2 一 3 个 切片 进入 第 二 维 进行 再 次 分 离 , 而 第 二 维 上 各 组 分 的 平均 峰 底 宽 约 为 0. 3min; 这 样 , 根 据 公 式 (3.2), 在 100min 的 有 效 分 离 时 间 内 , 第 一 维 的 峰 容 量 为 13 一 20, 第 二 维 的 峰 容 量 约 为 8, 则 二 维 空间 的 理论 峰 容 量 Nz 为 104 一 160。 根 据 Liu 等 的 研究 [2] , 该 体系 在 实验 条 件 下 的 实际 峰 容 量 N 和 理论 峰 容 量 以 及 两 维 各 自 的 峰 容 量具 有 以 下 关系 : N, = NiN,—1/2LN3tan(y) 十 Nitan(a)] C352) AH, Ni 和 Nz 分 别 是 第 一 维和 第 二 维 的 峰 容 量 ; o Aly 是 二 维 平面 上 峰 分 布 夹 角 B 以 外 两 部 分 的 角度 。 由 公式 (3.2) 计算 出 该 体系 的 实际 峰 容 量 为 64 一 103, 在 实验 条 件 下 , 约 64KH 理论 峰 容 量 得 到 了 实际 应 用 。 此 外 ,通过 串联 采集 频率 较 高 的 TOF-MS 作为 检测 器 , 可 以 以 1L 帧 /s 的 速度 获得 第 三 维 样品 信息 , 根 据 此 前 的 研究 哇 's , 认 为 在 实验 条 件 下 MS 可 以 提供 约 18 的 峰 容量 , 如 此 , 该 HILICX HILIC-Q-TOF MS 体系 的 实际 峰 容量 至 少 能 达到 1000 以 上 , 远 高 于 HILIC 单 柱 的 分 离 能 力 。 图 3-27 和 图 3-28 给 出 的 例子 证 明了 这 点 。 图 3-27 是 负离子 模式 下 mm/z 为 2001. 9 的 离子 分 别 在 Amide-80 和 pOH-Et A 柱 上 的 萃取 离子 图 。 当 用 短 的 pOH-Et A 柱 进行 分 离 时 , 多 个 组 分 重 和 至 形成 一 个 共 流 出 峰 ; 而 当 用 Amide-80 柱 进行 分 离 时 , 可 以 得 到 2 个 大 峰 和 其 他 3 个 信和 号 较 弱 的 小 峰 , 而 另 外 一 些 则 类 似 于 噪声 信号 。 图 3-28 是 该 离子 在 HILICX HILIC-Q-TOF-MS 上 分 离 的 茶 取 离 子 原始 谱 图 和 其 对 应 的 等 高 线 图 , 图 下 和 图 左 则 分 别 为 该 离子 在 72. 5 一 95min 时 ss 100 Amide-80 S 50 = mm 25 0 12.5 15.0 17.5 20.0 时 间 /min B 100 pOH-EtA 75 & 50 ae = 25 0 9.0 10.5 12.0 时 间 /min 图 3-27 _ 7z/z 为 2001. 9 的 离子 在 Amide-80 单 柱 (A) 和 pOH-Et ASHE (B) 上 的 荣 取 离子 谱 图 Amide-80 x pOH-Et A 5S. A150 77-5 +80:0; 82.5 85.0 87.5 90.0 92.5 .95.0 时 间 /min 图 3-28 m/z 2001.9 的 离子 在 HILIC X HILIC-Q-TOF-MS 上 分 离 的 茶 取 离子 谱 图 及 其 相应 的 等 高 线 图 和 一 维 模拟 谱 图 段 内 的 模拟 一 维 分 离谱 图 。 经 过 HILICXHILIC 分 离 , 至 少 有 7 个 组 分 得 到 了 很 好 的 分 离 , 其 中 有 3 个 响应 很 强 的 主要 组 分 。 从 等 高 线 图 中 可 以 看 出 , 组 分 1~4 以 及 6 和 7 在 第 一 维 的 保留 时 间 相 近 , 但 在 第 二 维 可 以 得 到 良好 的 分 离 , 证 明了 二 维 平面 能 为 结 构 类 似 的 化 合 物 提供 比 一 维 色 谱 更 高 的 峰 容 量 。 此 外 ,, 该 HILICX HILIC 系统 还 可 以 富 集 痕 量 组 分 , 提 高 分 析 灵 敏 度 。 如 图 3-27 所 示 ,7zz/z 为 2001. 9 的 离子 在 Amide-80 柱 上 的 响应 信号 较 低 , 无 法 判断 在 15min 左 右 的 波动 是 基线 噪音 还 是 痕 量 组 分 峰 , 而 在 2D 原始 谱 图 (图 3-28) 中 , 峰 高 增加 , 使 得 组 分 信号 更 加 清晰 。 另 一 方面 , 因 为 自身 固定 相 性 质 的 原因 , 本 章 所 用 pOH-Et A 柱 的 柱 效 较 低 , 谱 带 扩 张 和 峰 前 伸 现 象 比较 明显 ; 在 HILICX HILIC 分 离 时 , 该 柱 被 用 于 第 二 维 , 流 速 增加 也 有 助 于 降低 峰 展 宽 和 改善 峰 形 , 在 一 定 程度 上 提高 柱 性 能 。 s。 80 。 3. 皂 树 皂苷 单 体 结构 的 鉴定 如 图 3-23 所 示 , 目 前 已 有 几 十 种 皂 树 皂苷 组 分 的 结构 得 到 了 确认 , 其 相对 分 子 质 量 范围 为 1392. 7 一 2297. 0。 其 中 绝 大 多 数 是 以 皂 皮 酸 〈quillaic acid,Q) 为 主体 , 在 其 C-3 位 和 C-28 位 分 别 连 接 不 同 结构 的 寡 糖 而 形成 的 。C-3 位 上 的 R° 位 通常 为 木 糖 (Xyl) 或 鼠 李 糖 〈Rha) 。C-28 (ERE REL AME (Fuc) 和 鼠 李 糖 为 主 , 其 上 的 多 个 羟基 可 能 再 连接 葡萄 糖 〈Glc) 、 木 糖 、 木 糖 - 芹 糖 (Api) 、 乙 酰基 或 特定 的 脂肪 酸 结构 〈 图 3-23 中 Fa 部 分 ) 。 此 外 , 还 有 少数 以 228- 羟 基 皂 皮 酸 、 刺 宫 酸 〈echinocys- tic acid, E) 或 商 陆 酸 (phytolaccinic acid, P) 以 及 酰基 商 陆 酸 (O-23 acetylated phy- tolaccinic acid, P-Ac) 为 主体 的 皂 树 皂苷 组 分 。 虽然 在 正 离子 模式 下 皂 树 皂苷 混合 物 中 各 组 分 的 强度 比 在 负离子 模式 下 稍 强 , 且 出 峰 较 多 , 但 其 质谱 行为 比较 复杂 , 准 分 子 离子 峰 通 常 为 LM 十 NH4]j- , 也 观察 到 LM 十 Na]+ 或 LM 十 H:O 十 H]+ 的 存在 , 但 很 难得 到 LM 十 H]j- , 二 级 质谱 也 难以 总 结 断 裂 规 律 。 这 样 的 质谱 信息 不 利于 对 组 分 进行 结构 鉴定 。 但 在 负离子 模式 下 , 各 组 分 的 分 子 离 子 峰 [MH] 清晰 , 断 裂 特 征 也 有 规律 , 因 此 , 应 选择 在 负离子 模式 下 对 样品 进行 二 级 质谱 分 析 , 并 根据 各 组 分 的 断裂 规律 进行 定性 。 在 实验 条 件 下 , 皂 树 皂 苷 组 分 的 二 级 质谱 在 800 ~ 1000m/z 的 范围 内 有 特征 子 离 子 , 该 子 离子 被 称 为 “A 离子 ”, 它 是 皂 树 皂 丰 主体 上 C-28 位 上 连接 的 酰基 断裂 脱落 究 糖 基 团 所 形成 的 。A 离子 的 质量 数 提示 了 该 皂 树 皂苷 组 分 的 骨架 结构 和 R" 位 上 单 糖 的 种 类 。 当 其 质量 数 为 955. 5 时 , 表 明 该 组 分 的 骨架 是 皂 皮 酸 , 且 R'" 位 上 的 单 糖 是 木 糖 ; 而 当 其 质量 数 为 969. 5 时 , 则 该 组 分 的 骨架 也 为 皂 皮 酸 , 但 R' 位 上 是 鼠 李 糖 。 这 样 , 当 两 个 皂 树 皂苷 组 分 的 分 子 离子 和 A 离子 同时 相差 14m/z, HA 离子 分 别 为 955. 5 和 969. 5 时 , 说 明 这 两 种 组 分 除 Ro 位 上 单 糖 以 外 的 结构 完全 相同 , 这 种 情况 在 皂 树 皂 苷 混合 物 分 析 中 很 常 抑 。 另 一 种 较为 常见 的 情况 是 A 离子 分 别 为 971. 5 和 985. 5 , 两 者 同 样 相 差 14m/z, APH 955.5 和 969. 5 多 16m/z, 此 时 , 皂 树 皂苷 组 分 的 骨架 是 羟基 ARB, Ti Ro 位 上 则 同样 分 别 为 木 糖 或 鼠 李 糖 。 有 时 , 会 观察 到 LA-62】 的 离子 〈 脱 去 1 分 子 的 水 和 C-28 位 上 残留 的 羧基 ) 909. 5m/z 和 923. 5mm/z 而 不 是 A 离子 。 或 除 此 以 外 , 还 有 几 种 较为 少见 的 A 离子 , 如 823.4, 提 示 皂 皮 酸 骨架 上 C-3 位 由 二 糖 代替 了 =F, BD Ro 位 上 不 再 有 糖 环 存在 。A 离子 939. 5m/z 提示 组 分 骨架 为 去 羟基 的 皂 皮 酸 (955. 5 一 939. 5 王 16xz/z), 或 骨架 仍 为 皂 皮 酸 但 有 脱氧 糖 环 存在 , 具 体 情 况 要 根据 二 级 质谱 图 进行 判断 。A 离子 853. 4 则 表明 组 分 骨架 是 商 陆 酸 。 而 A 离子 895. 5”/z 提示 组 分 的 骨架 是 23-O- 栈 基 商 陆 酸 而 非 商 陆 酸 〈895. 4 一 853. 4 王 42zz/z) , 此 时 经 常 伴随 C-28 位 上 三 糖 的 断裂 , 产 生 LM-H-102]- 和 LM-H-60] 的 子 离子 。 除 A 离子 外 ,R: 位 连接 的 脂肪 酸 基 团 , 以 及 C-28 位 连接 的 各 单 糖 基 团 都 可 能 断裂 形成 高 质量 端的 子 离子 。 皂 树 皂苷 中 存在 多 对 同 分 异 构 体 , 除 R: 位 上 连接 的 末端 糖 环 是 Xyl 或 Api 外 , 其 他 结构 完全 相同 。 这 些 组 分 在 RPLC 上 的 保留 行为 非常 接近 , 其 二 级 质谱 也 极其 相似 , 用 RPLC-MS 方法 无 法 区 分 它们 。 如 图 3-29 所 示 ,S4 和 S6 即 是 这 样 一 对 同 分 异 构 体 。 在 本 章 介 绍 的 HILICX HILIC-Q-TOF-MS 体系 中 , 一 维 HILIC 同样 无 法 分 离 它们 , 只 有 经 过 第 二 维 的 再 次 分 离 , 这 对 同 分 异 构 体 才能 得 到 良好 的 分 离 。 但 它们 的 二 级 质谱 极 - 81. 其 相似 , 单 纯 通 过 MS/MS 仍然 无 法 对 其 进行 区 分 。 另 一 方面 , 同 分 异 构 体 间 结 构 的 微 小 差异 导致 的 亲 水 性 差异 及 其 2D 保留 行为 可 以 提供 线索 。 本 节 的 分 离 对 象 为 中 性 物 质 , 在 HILIC 固定 相 上 的 保留 能 力主 要 由 其 亲 水 性 决定 。 有 报道 表明 , 单 糖 Api 在 RPLC 上 保留 时 间 要 比 Xyl KO", BEAR Api 的 亲 水 性 比 Xyl 弱 。 相 应 的 , 末 端 糖 环 为 Api 的 皂 武 组 分 亲 水 性 也 应 稍 弱 于 末端 糖 环 为 Xyl 的 组 分 。 这 一 设想 得 到 了 文献 [85J 的 支持 。 作 者 用 RPLC 分 离 纯 化 了 名 为 QS-21 的 皂 树 皂苷 组 分 , 将 其 在 20cm 长 的 聚 羟 乙 基 天 冬 酰胺 柱 , 即 本 节 HILICX HILIC 柱 系统 中 的 pOH-Et A 色谱 柱 上 进行 再 次 分 离 , 得 到 了 两 个 部 分 分 离 的 同 分 异 构 体 组 分 , 其 中 末端 糖 环 为 Api 的 组 分 先 出 峰 , 这 验证 了 我 们 关于 各 同 分 异 构 体 组 分 间 亲 水 性 的 差异 以 及 在 pOH-Et A 柱 上 出 峰 顺 序 的 设想 。 由 此 , 在 第 二 维 上 出 峰 较 晚 的 组 分 被 定性 为 SS, 而 出 峰 较 早 的 组 分 为 S6。 维 保留 时 间 /min 是 三 1500 1800 2100 2400 mlz 300 600 900 1200 62.5 aS 87.5 第 一 维 保留 时 间 ,min 图 3-29 同 分 异 构 体 SS 和 S6 的 HILIC X HILIC-Q-TOF-MS 分 离 等 高 线 图 (A) 和 二 级 质谱 图 (B) 根据 各 组 分 的 2D 色谱 保留 行为 以 及 MS/MS 信息 , 结 合 文献 报道 , 该 提取 物 中 有 46 个 可 能 的 皂 树 皂苷 组 分 得 到 了 鉴定 , 结 果 如 表 3-5 所 示 。 其 中 第 I 和 第 贡 部 分 组 分 已 见 文 献 报道 , 但 第 开 部 分 的 3 对 同 分 异 构 体 无 法 通过 RPLC-MS 方法 进行 区 分 , 有 些 甚 至 用 HILICMS 方法 也 无 法 区 分 。 在 本 章 实验 中 主要 根据 其 2D 色谱 保留 行为 , 即 亲 水 性 的 差异 进行 区 分 , 第 III 部 分 8 个 组 分 则 未 见 文献 报道 。 这 些 皂 树 皂 苷 组 分 全 部 在 50~100min 出 峰 。 © 82-6 R35 一些 皂 树 皂苷 组 分 的 定性 结果 N LM-HJ]- tR,1D tR,2D 定性 R m/z /min /min ABT AB: 取代 基 I 1 1379. 6 78.7 1.2 955.5 11b -Glc,-Ac 2 1433. 6 ileal 本 895. 5 S13 -MeBu,-Ac 3 1475.6 67.0 2.0 895.5 $13 -MeBu 4 1511.7 1602 132 955.5 13b -Glce,-Ac 5 TS 人 61. 4 1. 4 853. 4 $13 -Ac on P-Ac 6 1525. 7 77.9 0. 4 969.5 l3a -Glc,-Ac te 155857 oe 0.7 955. 5 13b -Gle 8 1559. 7 55a 7 0.7 895.5 $13 9 1567.7 81.9 1.9 955.5 6 10 1641.7 81.2 Mags 971.5 20b 11 1673.7 91.6 1.6 955. 5 13b -Ac 12 1687.7 83.5 1.0 969.5 13a -Ac 13 1689. 7 93. 4 0.9 971.5 13b -Ac, +OH on Q 14 1703. 7 95. 8 0. 8 985. 5 13a -Ac, +OH on Q 15 15. 7 91.3 ina 909. 4 8/10 十 OH on Q 16 1715. 8 61.5 5 955.5 13b 17 Val, 7 88. 9 ea 971.5 13b 十 OH on Q 18 T7Se7 78. 8 Ms 955 8/10 +Ac 19 1757.7 81.1 Ld 955. 5 13b +Ac 20 1771.8 81.3 133 969.5 13a +Ac 21 1773. 8 81.3 Jats 97175 21b 22 1787. 8 88. 9 1.4 955.5 16b 23 1861.8 88. 9 1.4 955.5 18b 24 1869. 9 76. 2 Lads 969.5 Sl 25 1891.8 93.4 0.9 985.5 18a 十 OH on Q 26 1917.8 88. 0 0.5 969.5 18a +Ac 27 1947. 8 88.9 164 955.5 18b -Ac, +OHMeHex 28 1961.9 83.1 0.6 969.5 18a -Ac, +OHMeHex 29 2017.9 82.9 0.4 823. 4 B8 30 2033. 9 83. 3 0.8 971.5 B2 十 OH on Q 31 2164 88. 8 igs 955.5 B2 十 Rha on Fa-Ara 32 2164 83.3 0.8 969. 5 B3/B5 II 33 1987.9 1956 0.6 955. 5 S6 34 1987.9 76. 2 12 955.5 S4 35 2001. 9 76. 1 1 LAR 969.5 S3 36 2001. 9 78.0 0.5 969.5 S5 37 2150 78.1 0.6 955.5 B4 38 2150 78. 7 lez 955. 5 B6 Ill 39 1525.7 76. 3 3 969.5 13a -Glc,-Ac, Xyl-Xyl on R! 40 1552. 7 76. 2 | leg 955.5 13b -~Gle, Xyl-Xyl on Ri 41 1687.7 91.5 175 969.5 13a -Ac, Xyl-Xyl on R! 42 75ST 7 81.9 1.9 955. 5 13b + Ac, Xyl-Xyl on R! 43 1771. 8 81.8 1.8 969.5 l3a + Ac, Xyl-Xyl on R! 44 1773. 8 81.9 1.9 969.5 21b -OH on Q,Rha on R®° 45 1787. 8 88. 1 0. 6 955. 5 16b Api on R! 46 1869. 9 75.6 0.6 969.5 Sl Api on R! © 83 e 此 外 , 还 观察 到 64 个 组 分 , 其 LM-HJ] 的 m/z 和 已 知 皂 树 皂苷 组 分 相同 , 且 子 离 子 中 含有 A 离子 , 但 结构 没有 得 到 确认 。 另 有 44 个 组 分 和 已 知 皂 树 皂苷 有 相同 的 母 离 子 , 但 没有 子 离子 信息 或 子 离子 显示 并 非 皂苷 类 成 分 。 加 上 50~100min 时 间 段 以 外 以 BRE m/z HBF, GW HILICX HILIC-Q-TOF-MS 系统 至 少 检测 到 了 数 百 个 样品 组 分 , 如 前 所 述 , 即 使 色谱 柱 性 能 很 高 , 一 维 色 谱 也 很 难 满足 如 此 复杂 样品 的 分 离 分 析 , 而 本 节 提 出 的 HILICX HILIC-MS 方法 则 显示 出 其 增加 分 离 空 间 和 改变 分 离 介 质 的 优 越 性 。 参考 文 献 [LI ERE, Bite, RAR. 北京 : 中 国 石化 出 版 社 ,1992 [2] ABI Co. 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Sci. , 1993, 690: 392 « 86 « 第 4 章 超 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 及 在 代谢 组 学 中 的 应 用 超 高 效 液 相 色谱 , 即 ultra performance liquid chromatography (UPLC) 。 随 着 液 相 色谱 分 析 对 象 的 复杂 化 , 对 高 效 液 相 色谱 提出 了 更 高 的 要 求 。 尤 其 是 代谢 组 学 研究 的 发 展 , 针 对 的 是 更 加 复杂 的 生物 样品 基质 , 如 血浆 、 尿 样 、 组 织 液 等 , 并 且 样 品 数 量 巨 大 , 都 要 求 液 相 色谱 具有 更 加 高 效 、 快 速 、 灵 敏 的 性 能 。 为 了 获得 更 高 的 色谱 柱 效 , 色 谱 填 料 一 直 以 来 都 朝 着 小 颗粒 的 方向 发 展 , 从 早期 20 世纪 60 年 代 的 40pm 薄 壳 型 填 料 , 到 70 年 代 的 10um 无 规则 型 的 填料 , 再 到 80 年 代 的 Sum 球形 填料 , 以 及 90 年 代 更 高 纯度 、 更 好 性 能 的 3. 5 一 5pm 的 色谱 填料 , 都 提高 了 色谱 的 分 离 效能 。 接 下 来 研究 人 员 也 提出 使 用 更 小 颗粒 的 , 即 所 谓 的 超 高 压 液 相 色谱 。 但 是 , 因 为 小 颗粒 填料 带 来 的 高 色谱 背 压 所 引起 的 填料 和 仪器 的 耐 压 性 和 稳定 性 , 限 制 了 其 应 用 。2004 年 ,Waters 公司 推出 了 ACQUITY UPLC, 使 用 1. 7um 的 新 型 色谱 填料 , 实 现 了 真正 的 超 高 效 液 相 色 谱 。 4.1 超 高 效 液 相 色谱 的 理论 基础 4.1.1 van Deemter 方程 溶质 在 柱 内 移动 时 , 谱 带 随 时 间 而 展 宽 , 这 种 柱 内 谱 带 加 宽 效 应 可 以 用 van Deemter 方程 来 描述 。van Deemter 方程 可 以 简写 为 H=A+2+c (4.1) 式 中 ,A 表示 涡流 扩散 项 , 可 由 2Adp 表示 , 即 A 正比 于 填料 的 粒度 , 与 流动 相 的 性 质 无 关 。 二 表示 分 子 扩散 项 ; 组 分 在 柱 内 清 留 时 间 越 长 , 展 宽 越 严重 。 由 于 液 相 的 扩散 系 数 很 小 , 因 此 只 要 流速 不 太 低 , 这 一 项 可 以 忽略 。Cx 表示 传 质 阻 力 项 ; 其 中 , 包 括 流 型 扩散 、 内 扩散 或 粒子 内 和 孔 的 停滞 流动 相 扩 散 和 固 相 传 质 。x 表示 冲洗 剂 线 速度 。 综合 液 相 色 谱 的 实验 结果 , 式 〈4. 1) A Loo sere 2D 4 0 Toy (4. 2) AP, Dn 表示 溶质 在 流动 相 的 扩散 系数 。 对 式 (4.2) 求 导 , 可 得 到 五 -x 曲线 最 低 点 时 的 最 佳 流 速 YE pe Uu 一 一 一 “一 2Dm 一 一 = C 0. 047d? 代 人 式 〈4. 2) , 得 最 小 塔 板 高 Hain & 3d, +0. 3d, +0. 3d, = 3. 6d, 塔 板 高 度 互 和 填料 粒子 直径 d, 呈正 比 , 即 颗粒 度 愈 小 柱 效 愈 高 。 因 此 , 使 用 微粒 填 料 有 利于 减少 涡流 扩散 效应 , 并 且 缩 短 了 溶剂 在 两 相 的 传 质 扩散 过 程 。 而 且 更 小 的 颗粒 度 使 最 高 柱 效 点 向 更 高 流速 〈 线 速度 ) 方向 移动 , 并 且 有 更 宽 的 线 速度 范围 (图 41)。 所 以 , 降低 颗粒 度 可 以 增加 柱 效 , 同 时 也 能 使 用 高 流速 而 不 过 多 降低 柱 效 , 增 加 分 离 速 度 。 3 4 流速 (mmy/s) 图 4-1 塔 板 高 和 流速 的 关系 4.1.2 超 高 效 液 相 色谱 仪器 越 小 粒 径 的 填料 , 最 佳 流速 向 着 越 高 的 方向 发 展 , 可 以 应 用 更 高 的 流速 , 而 如 果 不 用 到 最 佳 流速 , 小 颗粒 度 填 料 的 高 柱 效 就 无 法 充分 体现 。 但 是 , 与 此 同时 , 色 谱 背 压 的 增长 是 十 分 巨大 的 。 这 就 对 色谱 填料 耐 压 及 仪器 耐 压 提出 了 更 高 的 要 求 。 更 快 的 分 析 速 度 也 要 求 检 测 器 对 数据 的 快速 采集 。 而 且 当 柱子 本 身 效 率 越 高 尺寸 越 小 时 , 柱 外 效应 越 显得 突出 。 例 如 , 进 样 器 、 连 接管 、 接 头 和 检测 池 等 都 可 以 导致 色谱 峰 的 加 宽 和 柱 效 的 下 降 , 和 否则 小 颗粒 度 填 料 的 高 柱 效 同样 无 法 充分 体现 。 只 有 解决 了 填料 和 仪器 的 局 限 问 题 , 才 能 使 真正 的 超 高 效 液 相 色谱 成 为 可 能 。 4. 2 , 超 高 效 液 相 色谱 与 HPLC 分 析 性 能 的 比较 4.2.1 超 高 效 液 相 色 谱 与 HPLC 色谱 分 离 性 能 的 理论 比较 1. 提高 分 离 度 面 对 非 常 复杂 的 混合 物 的 挑战 , 为 了 使 分 离 能 完全 优化 就 需要 一 个 超 高 性 能 的 色谱 系统 , 这 样 一 个 理想 系统 应 符合 液 相 色谱 的 基本 原理 。 根据 等 度 液 相 色谱 分 离 的 分 离 度 (R) Ie, R=4(*—1) (AVN, RooVN. a 按 van Deemter 方程 , 理论 塔 板 数 N= Zoot + BESSA UBL BE Se EL of BR » a 所 以 , 随 着 色谱 填料 粒 径 的 降低 , 柱 效 会 增加 ; 而 柱 效 增 加 , 分 离 度 也 增加 。 这 进 一 步 说 明了 颗粒 度 大 小 和 分 离 度 密 不 可 分 的 关系 。 Al 5pm, 3ym 颗粒 填料 的 色谱 柱 比 较 ,1. 7m 填料 的 色谱 柱 提供 了 高 柱 效 。 当 柱 长 相同 时 , 保 持 色谱 选择 性 和 保留 值 不 变 。1. 7wm 填料 的 色谱 柱 理论 塔 板 数 分 别提 高 了 约 3 倍 和 1.7 倍 , 分 离 度 相应 地 提高 了 1.7 倍 和 1. 3 倍 。 UPLC 用 1. 7um 颗粒 填料 提高 了 分 离 能 力 , 可 以 分 离 出 更 多 的 色谱 峰 , 从 而 对 样 品 提供 的 信息 更 多 , 这 种 分 离 能 力 的 提高 在 梯度 分 离 中 也 具有 优越 性 , 此 时 分 离 能 力 用 峰 容 量 衡量 。 2. 提高 分 离 速度 最 佳 流速 wwce 并, 表明 最 佳 流速 与 粒度 呈 反 比 , 颗 粒度 越 小 , 最 佳 流速 也 越 大 。 而 分 析 时 间 与 流速 旺 反比 , 进 而 可 以 通过 提高 流速 来 加 快 分 离 速度 。 当 柱 长 相同 时 , UPLC 系统 用 1. 7wm 颗粒 填料 , 分 离 速 度 可 以 比 Sm, 3pm 颗粒 填料 的 色谱 柱 分 离 时 间 降 低 约 3 倍 和 1.7 倍 。 较 小 的 颗粒 能 提高 分 离 速度 而 不 降低 分 离 度 。 因 为 Noo 了 ,颗粒 度 减 小 后 , 柱 长 可 以 按 比例 缩短 而 保持 柱 效 不 变 , 柱 长 缩短 也 会 加 快 分 离 速 度 。 所 以 UPLC 系统 用 1. 7um 颗粒 填料 , 柱 长 可 以 比 用 5um、3um 颗粒 填料 时 缩短 3 倍 和 1. 7 倍 而 保持 柱 效 不 变 ,1. Tum 和 Spm 颗粒 填料 相 比 可 使 分 离 在 高 3 倍 的 流速 下 进行 , 结 果 使 分 离 过 程 快 了 9 倍 而 分 离 度 保 持 不 变 。 3. 提高 灵敏 度 采用 UPLC 能 获得 灵敏 度 的 显著 提高 。 这 是 因为 UPLC 可 以 得 到 更 高 的 柱 效 、 更 窗 的 色谱 峰 宽 , 因 为 Noo ,Heightce 过 ,使 用 UPLC 系统 可 以 使 峰 高 得 到 增加 , 而 灵 敏 度 与 色谱 峰 高 呈正 比 , 因 此 使 用 UPLC 可 改善 灵敏 度 。 4. 提高 背 压 AP cou 点 ,xmco 寺 ,所 以 APce 点 , 当 1. 7m 颗粒 与 Sym 颗粒 应 用 相同 柱 长 时 , 以 至 于 压力 提高 了 约 27 倍 。 这 也 是 制约 液 相 色谱 填料 向 更 小 粒 径 发 展 的 主要 原因 。 下 面 将 UPLC 与 HPLC 比较 的 结果 总 结 如 下 : 当 使 用 相同 柱 长 时 , 用 1. 7um BURL Sum, 3m 颗粒 的 参数 比较 结果 见 表 4-1。 表 4-1 相同 柱 长 1.7um 与 Sum、3bum 颗粒 参数 比较 分 离 度 分 析 时 间 灵敏 度 压力 1. 7ym 和 Sum 1.7 3 1.7 27 1. 7um 和 3pm 5S ad ike 6 « 89 。 如 果 保 持 理论 塔 板 数 N 不 变 , 应 用 1. 7pm 粒 径 填料 与 Spm 和 3um 其 对 比 数据 见 表 4-2。 表 4-2 ”相同 理论 塔 板 数 1.7bum 5 Spm, 3um 颗粒 参数 比较 柱 长 分 析 时 间 RABE 压力 1.7pm 和 Sum 3 9 3 9 1. 7pm Al 3pm 1.7 3 1.7 3 UPLC 遵循 HPLC 的 基本 原理 和 规则 ,采用 更 小 粒 径 的 色谱 填料 1. 7pm, RAR 的 分 离 速度 .更 高 的 色谱 性 能 ,提高 灵敏 度 和 峰 容 量 , 与 此 同时 ,也 产生 了 更 大 的 压力 。 一 些 研 究 工作 将 UPLC 与 HPLC 的 性 能 进行 了 比较 。Plumb 等 所 应 用 2. 1mm X 100mm, 3. 5um C18 HPLC 系统 和 2. lmmX 100mm, 1. 7um C18 UPLC 系统 对 老鼠 胆汁 样品 进行 分 析 比 较 , 所 得 色谱 图 如 图 4-2 所 示 ,UPLC 色谱 峰 更 加 尖锐 , 分辨 率 更 高 ,可 获 得 更 多 的 色谱 信息 ,从 图 43 可 以 看 出 , 当 用 HPLC 系统 得 到 1 个 色谱 峰 时 ,UPLC 可 以 得 到 2 个 完全 分 开 的 色谱 峰 。Novakova 等 轨 用 标 样 比较 了 UPLC、HPLC 和 使 用 整体 柱 的 分 离 效率 以 及 分 析 期 间 的 系统 维持 费用 ,得 出 结论 ,UPLC 比 HPLC 和 使 用 整体 柱 时 得 到 更 高 的 理论 塔 板 数 、 分 辩 率 ,不 对 称 因子 也 得 到 更 优 的 结果 ,所 使 用 的 溶剂 量 远 远 少 于 HPLC 和 使 用 整体 柱 。Olsovska $"! 比较 了 用 UPLC 和 HPLC 进行 定量 分 析 的 性 能 ,UPLC 在 高 通 量 的 条 件 下 获得 了 与 HPLC 在 系统 适应 性 、 线 性 、 准 确 度 、 精 密度 、 回 收 率 等 方面 没有 差异 的 结果 。 662 14.09 | 4 17.54 set LLY fer ae. 1 各 AT 六 峰 强 度 /% 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 B 时 间 /min 6.58 7.69 峰 强 度 /% 5.00 K 15.00 20.00 25.00 30.00 时 间 /min 图 4-2 老鼠 胆汁 样品 .HPLC 色谱 图 (A) 和 UPLC 色谱 图 (B) 比 较 « 90 。 A 1: TOF MS ES+ 548.121 0.03Da 599 100 = =— xX a ¥ 0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 时 间 /min B 1:TOF MS ES+ 峰 | 548.119 0.03Da 100 236 BS a ba i = t 2 0 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 时 间 /min 图 4-3 HPLC f(A) UPLC 色谱 图 (B) 比 较 口 4.2.2 超 高 效 液 相 色谱 HPLC 与 质谱 联 用 性 能 的 比较 相对 于 常规 HPLC 而 言 ,UPLC 有 更 好 的 分 离 效 率 . 峰 容量 以 及 灵敏 度 。UPLC 这 些 相 对 HPLC 更 高 效 、. 快 速 . 灵 敏 的 特点 ,使 其 在 和 质谱 联 用 时 有 助 于 目标 化 合 物 与 之 竞 争 电离 的 杂质 的 分 离 , 从 而 可 以 使 质谱 检测 器 的 灵敏 度 因 离 子 抑制 现 象 的 减弱 或 克服 而 得 到 进一步 的 提高 。 所 以 使 用 UPLC-MS 联 用 技术 ,可 以 获得 灵敏 度 比 HPLC-MS 联 用 系统 大 有 改善 的 分 离 结果 ,获得 更 多 、 质 量 更 好 的 信息 。UPLC-MS 成 为 代谢 组 学 .复杂 体系 分 离 分 析 以 及 化 合 物 结构 鉴定 的 良好 平台 。 下 面 以 一 应 用 实例 对 UPLC 与 HPLC 和 质谱 联 用 的 性 能 进行 比较 。 Wilson $v A] HPLC 系统 和 UPLC 系统 ,分 别 与 质谱 联 用 对 老鼠 尿 样 样品 进行 分 析 比 较 。UPLC 系统 :仪器 为 美国 Waters 公司 超 高 效 液 相 ACQUITY 色谱 系统 , 色 谱 柱 为 2. 1mmX 100mm, ACQUITY 1.7m C18, HPLC 系统 :仪器 为 美国 Waters 公 司 ALLIANCE 2795HT 色谱 系统 ,色谱 柱 为 2. ImmX100mm,Symmetry 3. 5um C18。 柱 温 40°C ,流动 相 A WA 0.1% 甲酸 溶液 ,B 液 为 0.1% 乙 且 溶 液 ;梯度 洗 脱 条 件 为 线 性 梯度 10min 由 100% A 溶液 到 95% B 溶液 。UPLC 系统 流速 500nl/min, UPLC 系 统 流速 600u1/min, 4 Ft FE) 150p1/min 进 质 谱 检 测 ,质谱 为 Waters 公司 Micromass LCT Premier, 典型 的 常规 HPLC 获得 的 老鼠 尿 样 的 色谱 图 如 图 4-4A, 相 应 地 应 用 相同 洗 脱 梯度 + Of « E031110RP_20 416 Scan ES+ 7.92e7 峰 强 度 / % 3.19 3.72 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 时 间 /min 040704a_RP_007 ' 73 1:TOF MS ES+ B a BPI 3.90e3 x — 世 中 = 600". 7: 11.00 12.00 时 间 /min 图 4-4 老鼠 尿 样 HPLC 色谱 图 (A) 和 UPLC™ (CB) 色 谱 图 比较 UPLC 获得 的 老鼠 屎 样 的 色谱 图 如 图 4-4B。UPLC 色谱 峰 更 加 尖锐 , 分 辨 率 更 高 ,可 获 得 更 多 的 色谱 信息 。 对 尿 样 中 获得 的 m/z=401 的 峰 莹 取 离 子 谱 图 进行 比较 (图 4-5), UPLC 的 色谱 峰 峰 宽 为 1. 8s,10min 分 离 的 峰 容 量 有 250 ,而 3. Spo 色谱 柱 获得 的 色谱 峰 宽 为 8s, 峰 容量 为 60 一 80。 这 种 分 辨 率 的 提高 ,导致 共 流 出 组 分 减少 ,从 而 相应 的 减少 了 本 离子 抑制 作用 。 离 子 抑制 作用 的 减少 使 得 老鼠 尿 样 中 代谢 物 检 出 的 数目 极 大 增加 ,从 HPLC/MS 系统 的 1800~2000 个 ,提高 到 UPLC/MS 系统 的 10 000~13 000 个 。 检 测 离 子 数 目的 提高 在 3D 图 中 可 以 清晰 地 看 到 (图 4-6)。 这 种 提高 对 代谢 组 学 研究 无 疑 是 极 为 有 利 的。 因为 代谢 组 学 研究 希望 可 以 获得 更 为 全 面 的 代谢 产物 信息 ,这 样 检测 到 的 生 ” 物 标 记 物 的 可 能 性 就 更 大 。 A H031024CSa014 1: TOF MS ES+ 401 100 210 上 ce DO o 峰 强 度 /% e713 372.623 1 si vip —_ a 16a_RP_ESI+_010a 1:TOF MS ES+ e | 8, So 峰 强 度 /% a 人 AAA 和 ore) abiccpuapit pcictiton ran ates Saftyeo eh . : 一 一 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 时 间 /min 图 4-5 老鼠 尿 样 萃取 离子 谱 图 m/z=401 A. HPLC;B. UPLC“1 UPLC 提供 的 更 有 效 的 色谱 分 离 系统 不 仅 减 少 了 离子 抑制 作用 ,使 被 检 出 峰 的 数目 增加 ,而 且 提 供 更 高 的 灵敏 度 。 如 图 4-5 所 示 , 对 HPLC-MS 和 UPLC-MS # hw F m/z=401 , 峰 强 度 分 别 为 210(HPLC) 和 756(UPLC) ,灵敏 度 提高 了 3.5 倍 , 这 一 数值 高 于 UPLC 用 于 UV 检测 器 时 灵敏 度 提高 的 理论 数值 1. 7 倍 ,这 一 方面 归结 于 UPLC ia He fey ES Bl OE, ET AY) a, HP AY 2 UE ST RR aD 谱 多 峰 重 到 时 的 离子 抑制 作用 。 灵 敏 度 的 提高 也 使 UPLC-MS 可 以 在 复杂 体系 人 更 多 的 组 分 。 UPLC 的 分 辨 率 和 灵敏 度 的 提高 也 使 得 质谱 数据 质量 有 所 提高 。 同 样 以 m/z=401 的 离子 为 例 。HPLC 和 UPLC 获得 的 单 张 质谱 图 分 别 如 图 4-7A 和 图 4-7B 所 示 ,UPLC 获得 了 更 好 的 信 噪 比 , 质 谱 图 更 清晰 。UPLC 的 质谱 图 中 可 见 的 4 个 离子 ,my/z 一 401、 313、225、113 ,在 HPLC 的 质谱 图 中 几乎 被 淹没 在 噪声 中 。UPLC 获得 的 高 质量 质谱 图 在 代谢 组 学 的 研究 和 解析 时 更 为 有 利 。 类 似 的 结果 在 其 他 文献 中 也 有 报道 。Castro-Perez 等 加 比较 了 HPLC 和 UPLC 用 于 药物 ` 普 鲁 氧 嗪 ”代谢 物 的 研究 ,在 分 辩 率 灵敏度、 信 品 比 和 质谱 质量 方面 UPLC 都 有 ° 93 « 图 4-6 老鼠 尿 样 三 维 谱 图 坐标 轴 分 别 表示 :保留 时 间 、 质 荷 比 和 峰 强 度 轴 。A. HPLC-MS;B. UPLC-MS A HO31024CSa014 212 (4.839) Cm (208:213} 1:TOF MS ES+ 100 174 1140 1497 217 113.9666 Pais ae ae | jf 236 ta14 401 1495 = 255.0669 400, 1287 |b 27498984, 371 1841 431 0956 457 1591 : f : ; . 478.1591 560 3491 0 其 ili B m/z H040116a_RP_ESi+_010a 165 (3.874) Can (105) 1:TOF MS Est 100 225.0843 1 401.4279 ° x ae HX | 113.9554 中 362.1147 = ¥ 92 3 02.14! swore [7 ih 628.1084 sober aoa 428.0911 456.1401 629.1570 0 Vf 3 514.1462 .8168 626.1656 696.1539 756.3110 7 4823 2586 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 #850 m/z 图 4-7 m/z=401 的 单 扫描 质谱 图 A. HPLC;B. UPLC"™! 显著 的 改善 。 应 用 HPLC 在 8min 内 检测 出 3 种 代谢 产物 ,而 应 用 UPLC 在 5min 内 检测 出 了 “ 普 鲁 氯 嗪 ”的 全 部 8 种 代谢 产物 (图 4-8) 。 这 无 疑 使 代谢 组 学 用 于 药物 的 毒性 和 疗 效 的 评价 更 加 准确 有 利 。Churchwell 等 中 比较 了 UPLC-ES/MS/MS 和 HPLC-ES/MS/ MS, 讨 论 了 UPLC 对 质谱 灵敏 度 的 提高 。 5 94 « 1:TOF MS ES+ 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 时 间 /min B 1:TOF MS ES+ 406 439 峰 强 度 /% 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 时 间 /min 4-8 比较 HPLC 和 UPLC 用 于 普 鲁 毛 嗪 代谢 的 研究 A. HPLC;B. UPLC55] UPLC 相对 于 普通 的 液 相 色谱 更 加 适合 于 和 质谱 联 用 ,改善 复杂 混合 物 的 分 离 度 ,使 目标 组 分 和 与 之 竞争 电离 的 共 流 出 物 分离 , 从 而 降低 质谱 的 离子 抑制 ,更 罕 的 色谱 峰 有 效 地 提高 进入 质谱 离子 源 的 被 测 物 浓度 ,提高 信号 强度 ,改善 检测 限 。 改 善 质谱 质量 ,有 利 于 质谱 解析 和 准确 性 "” 。 4.3 超 高 效 液 相 色谱 在 代谢 组 学 中 的 应 用 4.3.1 超 高 效 液 相 色谱 -质谱 用 于 代谢 组 学 研究 的 优势 代谢 组 学 作为 一 门 新 兴 的 学 科 , 近 几 年 发 展 迅 猛 。 由 于 代谢 产物 的 复杂 性 ,对 生物 样 本 中 所 有 的 代谢 物 进 行 定 性 和 定量 分 析 , 对 分 析 化 学 是 一 个 挑战 。 一 个 通用 的 理想 的 代 谢 组 学 分 析 平 台 应 具有 如 下 特征 :能 够 检 出 生物 样本 中 尽 可 能 多 的 代谢 物 ;对 检 出 的 代谢 物 能 够 定量 和 和 定性 ;方法 通 量 高 .费用 低 、 样 品 用 量 少 。 超 高 效 液 相 色 谱 技 术 (UPLC) 对 比 传统 的 高 效 液 相 色谱 (HPLC) 有 更 好 的 分 离 效 率 、 峰 容 量 以 及 灵敏 度 ,提供 更 适合 与 质谱 联 用 的 接口 ,这 无 绛 有 助 于 更 多 代谢 物 的 检 出 , 提 高 方法 通 量 灵敏度, 改善 与 质谱 联 用 的 定性 定量 结果 。UPLC 与 MS 联 用 为 代谢 组 学 研 究 提供 更 加 高 效 、 灵 敏 的 方法 平台 。 Wilson 等 的 用 UPLC-oa-TOF 对 比 了 不 同类 型 老鼠 的 代谢 模型 的 差异 。 以 老鼠 尿 液 作 为 研究 对 象 , 用 UPLC 系统 得 到 了 8000 多 个 代谢 物 离子 ,可 用 PCA 对 雌性 老鼠 和 雄性 老鼠 实现 完全 分 离 (图 4-9A,B) ,这 一 结果 对 比 HPLC, 普 通 的 高 效 液 相 色谱 只 能 得 到 约 1000 个 代谢 物 离子 (图 4-9C,D)。 由 此 可 见 , 在 同一 样品 中 UPLC 可 以 给 出 更 多 的 内 源 性 生物 标记 物 的 信息 ,这 些 内 源 性 的 生物 标记 物 对 肉 雄 老鼠 的 聚 类 起 着 重要 的 作用 。 ° 95 979 4 0.200 43 ie 0.100... Sere a5 0.000 $7543 | . ~0.100 “OAS angngt rye re oe ee oe eS eee 0.200 _0.50 0.00 0.50 主 成 分 2 0.000 0.500 图 4-9 比较 HPLC-MS #1 UPLC-MS 雌雄 白鼠 尿 样 数据 的 PCA 分 析 结 果 A,B. HPLC 得 到 的 结果 ;C、D. UPLC 得 到 的 结果 雄性 黑 鼠 和 白鼠 --4-----J------b----- J------------L-----= ee 1 ' ' ' ' 5 也 攻 让 记 -一 了 = 一 一 一 一 上 q 一 一 一 一 一 一 g------F ' ' ' ' ee ee eee dn---- Jee eee e t----- dae en ee ee ee eh ee ede ene dene 2 07825 —0.050-0,925 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200 ae. 图 4-10 应 用 lmin 分 离 程序 获得 的 老鼠 尿 样 数据 的 PCA SRR -0.125 -0.100 使 用 1. 7um 颗粒 的 UPLC 的 一 个 重要 的 优势 是 较 高 的 最 佳 线 速 度 , 可 以 提高 分 离 速 度 。 文 章 中 采用 0. 8ml/min 的 流速 , Imin 的 分 离 程 序 对 老鼠 的 尿 样 进行 分 析 , 所 得 UP- LC/MS 数据 的 PCA 结果 见 图 410。 在 如 此 短 的 分 析 时 间 内 ,白鼠 . 黑 鼠 和 裸 鼠 可 以 被 清晰 地 分 辨 ,并 且 白 饼 和 黑 鼠 的 肉 雄 可 以 被 有 意义 地 分 辨 。 使 用 这 个 分 析 方 案 , 所 有 的 。96 。 120 个 样品 能 在 150min 内 完成 分 离 ,成 为 可 能 的 高 通 量 的 方法 。 当 然 这 种 快速 的 分 离 方 法 也 有 着 局 限 性 , 它 与 10min 的 洗 脱 程序 相 比 减 小 了 分 离 能 力 。 作 者 对 比 了 lmin 和 10min 的 方法 的 峰 容 量 , 从 10 000 下 降 到 2000。 但 是 ,仍然 大 于 由 普通 液 相 色谱 系统 _ 10min 所 获得 的 数值 。 所 得 的 结果 证 明 ,UPLC 可 以 改良 普通 液 相 色 谱系 统 获得 的 结果 。 使 用 1. 7km 颗粒 的 UPLC 较 大 地 提高 了 分 离 度 、 分 析 时 间 减少 质谱 的 离子 抑制 ,对 代谢 组 学 研究 的 复杂 样品 十 分 有 利 。 Zhao 等 6 使 用 UPLC Q TOF-MS 对 癌症 患者 尿 中 顺 二 醇 结 构 的 代谢 物 进行 分 析 , 用 代谢 组 学 方法 寻找 可 能 的 临床 诊断 标记 物 ,同样 地 ,在 更 短 的 时 间 内 得 到 了 更 多 的 代谢 物 信息 ,癌症 患者 与 正常 人 得 到 了 更 好 的 区 分 ,与 此 同时 ,发 现 了 更 多 的 生物 标记 物 。 在 使 用 UPLC 与 质谱 联 用 时 发 现 的 对 分 类 贡献 最 大 的 15 种 可 能 的 生物 标记 物 中 有 5 个 在 HPLC 与 质谱 联 用 时 并 没有 被 检测 出 来 。UPLC 在 发 现 标记 物 及 标记 物 鉴定 上 的 优势 无 疑 使 UPLC 成 为 代谢 组 学 研究 中 更 有 效 的 分 析 平 台 。 另 一 个 代谢 组 学 数据 识别 研究 表明 92 :在 用 UPLC 与 HPLC 对 人 血清 样品 中 内 源 性 与 外 源 性 组 分 定量 分 析 时 ,由 于 UPLC 检测 得 到 的 高 保留 时 间 重 复 性 及 高 信 噪 比 提供 了 峰 发 现 .识别 乃 至 进一步 统计 学 评价 的 较 好 的 基础 ,UPLC 可 以 检测 得 到 比 HPLC 多 20%% 的 组 分 ,8/10 的 有 显著 性 差异 的 组 分 被 检 出 。UPLC 与 质谱 联 用 更 适合 于 非 靶 同 的 代谢 分 析 。UPLC 与 质谱 联 用 的 优势 也 使 得 更 多 研究 者 把 生物 标记 物 的 发 现 及 鉴定 工作 在 此 分 析 平 台 上 展开 5329 。 4.3.2 超 高 效 液 相 色 谱 与 质谱 联 用 用 于 代谢 组 学 研究 实例 4.3.2.1 用 于 中 药 代 谢 组 学 的 研究 代谢 组 学 与 药物 的 药 效 和 毒性 筛选 以 及 安全 性 评价 、 作 用 机 制 研 究 和 合理 治疗 用 药 密切 相关 。 代 谢 物 组 是 反应 机 体 状 况 的 分 子 集 合 ,所 有 对 机 体 健 康 影 响 的 因素 均 可 反映 在 代谢 物 组 中 ,因此 研究 代谢 物 组 对 药物 治疗 有 直接 意义 。UPLC 技术 的 发 展 为 中 药 代 谢 组 学 的 研究 提供 了 更 加 高 通 量 高 分 辩 率 ,高 灵敏 度 的 分 析 技 术 平台 。 汪 江 山 等 2 将 超 高 效 液 相 色 谱 与 飞行 时 间 质 谱 联 用 ,用 于 人 参 皂苷 Rg3 作用 后 大 鼠 尿 液 代谢 物 指纹 图 谱 分 析 及 标记 物 的 鉴定 。 人 参 是 一 味 常 用 的 名 贵 中 药 , 人 参 皂 苷 Rg3 是 其 有 效 成 分 之 一 。 有 研究 表明 ,人 参 皂 苷 Rg3 及 其 代谢 产物 均 具 有 抗 肿瘤 活性 。 因 此 文章 中 采用 大 鼠 尿 液 以 及 人 参 皂 苷 Rg3 静脉 给 药 大 鼠 尿 液 作 为 测试 样品 ,考察 UPLC/ Q-TOF 这 一 平台 对 复杂 体系 进行 分 离 分 析 的 能 力 , 进 而 探讨 了 如 何 利用 化 合 物 的 精确 质 量 和 MS/MS 数据 对 给 药 大 鼠 尿 液 中 显著 变化 的 未 知 内 源 性 代谢 物 进行 结构 鉴定 。 采用 UPLC-TOF-MS 的 方法 ,在 老鼠 尿 液 中 至 少 可 以 得 到 500 多 个 代谢 物 的 信息 (Al 4-11)。 对 比 给 药 组 以 及 对 照 组 大 鼠 尿 液 的 代谢 物 指纹 图 谱 , 给 药 后 大 鼠 尿 液 中 众多 代谢 物 的 相对 浓度 发 生 了 较 大 的 变化 。 图 4-12 显示 给 药 后 0 一 24h, 大 鼠 生 化 代谢 发 生 了 显著 性 的 扰动 。 给 药 48 一 72h 后 ,大 鼠 的 生化 代谢 显示 回归 平衡 状态 的 趋势 。 对 浓度 改 变 最 显著 的 100 个 尿 中 代谢 物 进行 考察 ,发 现 96%% 的 代谢 物 在 给 药 后 的 0 一 24h 浓度 增加 。 ° 97 » 100%B 100%A 和 284 ea % B43 x eo x A = $8.25 FE 1515.39 1 1386 1 bd he [了 了 Tine 3200 «2750 6 SNL) 32260 600 16 39 1S 20.00 22.50 时 间 /min 图 4-11 给 药 后 大 鼠 尿 液 UPLCTOF MS 质谱 图 0 一 1250 — 100 上 saa san eee eee CEES 200 标记 物 300 500 对 照 大 鼠 给 药 大 鼠 24h 给 药 大 鼠 72h 0 1250 2500 3750 5000 6250 4-12 对照 大 鼠 、 给 药 大 鼠 24h 以 及 72h 尿 中 代谢 物 的 信号 强度 变化 05] 颜色 深度 与 信号 强度 的 关系 见 图 下 标尺 « 98 。 FA PCA 的 方法 对 给 药 大 鼠 以 及 对 照 大 鼠 的 代谢 指纹 数据 进行 分 析 , 根 据 主 成 分 载荷 因子 可 知 何 种 代谢 物 对 分 类 贡献 最 大 ,这 种 代谢 物 可 认为 是 人 参 所 孔 Rg3 对 大 鼠 生 化 代 谢 影 响 的 生物 标记 物 。 在 标记 物 的 确认 方面 非常 重要 的 前 提 是 要 排除 其 他 外 源 性 物质 或 其 代谢 物 的 干扰 。 要 排除 人 参 皂 碾 Rg3 和 其 代谢 物 的 干扰 ,采取 的 方法 是 先 通过 提取 离 子 的 方法 在 尿 液 指纹 图 谱 中 筛选 可 能 代谢 物 的 离子 ,并 将 其 排除 ,这 种 方法 也 适用 于 代谢 组 学 在 其 他 药物 研究 的 应 用 。 尿 液 中 数 以 千 计 的 代谢 产物 ,大 部 分 为 结构 完全 未 知 的 化 合 物 , UPLC-Q-TOF MS 的 分 离 分 析 平 台 可 以 提供 有 关 化 合 物 的 保留 时 间 、 精 确 质 量 数 `MS/VMS 数据 以 及 单 波长 (254nm) 紫 外 吸收 情况 ,可 用 于 生物 标记 物 的 发 现 和 结构 鉴定 。 文 章 中 通过 PCA 发 现 [M+H_]* m/z=190,206 以 及 154 的 代谢 物 对 分 类 贡献 较 大 ,是 可 能 的 生物 标记 物 。 经 结构 鉴定 分 别 为 4-#% BE-2-1E Ok PR (Cio H7 NO, 189. 0426) 和 4, 8-— #8 EO FA OR (Cio H, NO, » 205. 0375). 这 一 研究 表明 UPLC-TOF-MS 适合 于 尿 液 这 一 复杂 生物 样本 的 分 离 分 析 ,并 能 提供 丰富 的 代谢 物 定性 和 定量 信息 ,适合 于 代谢 组 学 的 应 用 。 李 发 美 b9 应 用 UPLC-MS 进行 中 药 试剂 淫 羊 蔓 提 取 物 对 老鼠 模型 的 药 效 研 究 , 淫 羊 蓝 提 取 物 的 几 种 主要 活性 代谢 产物 被 检 出 并 且 被 定性 。 对 内 源 性 代谢 产物 进行 PCA 分 析 , 对 照 组 、 模 型 组 和 给 药 组 得 到 了 显著 的 分 离 。Chan $7) UPLC 与 TOF MS 联 用 , 用 于 中 药 三 七 原 药 与 蒸汽 提取 药 的 代谢 组 学 研究 , PCA 结果 表明 , 原 药 与 蒸汽 提取 药 可 得 到 很 好 的 区 分 ,可 将 此 方法 应 用 于 中 药 的 加 工 质量 控制 。 4.3.2.2 用 于 功能 基因 组 学 中 不 同 代 谢 模 型 的 研究 代谢 组 是 一 个 细胞 或 组 织 的 生物 化 学 表 型 ,通过 对 不 同 生理 状态 的 代谢 组 进行 分 析 , 人 们 就 可 以 全 面 了 解 该 生物 或 细胞 的 生物 化 学 状态 ,获得 众多 信息 。 由 于 代谢 组 学 分 析 所 获得 的 信息 离 生物 的 表 型 或 生理 状态 最 近 , 所 以 从 理论 上 说 ,代谢 组 学 分 析 所 提供 的 信 息 比 转录 组 和 蛋白 质 组 分 析 所 提供 的 信息 更 有 用 ,更 能 够 揭示 基因 和 表 型 之 间 的 关系 , 达 到 监测 和 推断 基因 功能 的 目的 。 所 以 ,除了 从 mRNA 和 蛋白质 水 平 外 ,还 必须 从 代谢 产 物 水 平 上 来 研究 生物 细胞 有 关 基 因 的 功能 。 与 转录 组 学 和 蛋白 质 组 学 研究 一 样 ,代谢 组 学 研究 也 是 功能 基因 组 学 研究 的 重要 组 成 部 分 0 。 Plumb 等 69 将 UPLC-oa-TOF 的 方法 用 于 代谢 组 学 的 研究 ,研究 Zuker 肥胖 老鼠 和 黑 鼠 .白鼠 和 裸 鼠 之 间 的 年 龄 .性 别 和 昼夜 间 的 代谢 差异 。Zuker 肥胖 老鼠 典型 表现 为 肥 胖 和 胰岛 素 抑制 而 导致 2 型 糖尿 病 。 应 用 1. 5min 的 快速 分 析 程 序 ,Zuker 肥胖 老鼠 和 其 他 正常 雄性 老鼠 (AP)6 周 和 20 周 的 尿 样 谱 图 如 图 4-13 所 示 。 应 用 PLS-DA 分 类 所 得 结 果 如 图 4-14 所 示 , 从 图 414A 可 以 看 出 ,4 类 可 以 清楚 地 区 分 ,而 且 20 周 的 Zuker 肥胖 老 鼠 的 变异 比 6 周 时 的 更 大 。 从 图 4-14B 可 以 看 出 对 聚 类 的 结果 贡献 最 大 的 离子 ,对 其 中 的 m/z=255 Al m/z=332 葵 取 离子 (图 4-15) 可 以 清楚 地 看 出 峰 强 度 的 不 同 。 文 章 中 应 用 这 种 快速 分 析 程 序 分 别 对 比 了 采样 时 间 样品 对 象 的 性 别 和 不 同 种 类 所 带 来 的 生物 学 差异 。 图 4-16A、B 显示 雄性 黑 鼠 早晨 与 晚上 尿 样 的 差异 ,图 4-16C.D 则 显示 采样 时 间 、 样品 对 象 的 性 别 和 不 同 种 类 所 带 来 差异 的 大 小 不 同 。 图 4-16E 显示 肉 雄 白鼠 可 以 完全 被 分 辩 。 。99 。 1:TOF MS ES+ BPI 3.64e3 AP : om Wi B 1:TOF MS ES+ BPI 100 3.64e3 Zucker(+/+) % 6 Al c 1: TOF MS ES+ BPI 100 3.64e3 AP 204 7% 0 D 1:TOF MS ES+ BPI 100 3.64e3 Zucker(+/+) 9% 20 周 i 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 图 4-13 UPLC/MS 尿 样 总 离子 流 图 09] A 100 SL 20 一 100 —100 0 : 100 t{1) = Zuckert+/+6 JA e AP 对照 6 周 B @ Zucker+/+20 周 a AP 对 照 20 周 0.150 4 1_ 192.054 4 1_208.034 att teenias 0.100 a 2 180p05193- 068° _ 0.050 x ce, ae = 0.000} ar se 205 08 1,1, 824.3481-1525.3707™ —0.050 —0.100 -0.150 -0.100 -0.050 0.000 0.050 w*c[1] 图 4-14 AP All Zucke 鼠 分 别 6 周 和 20 周 尿 样 UPLC/MS 数据 的 PLS-DA 4"! 100 。 mlz=255 1:TOF MS ES+ m/z=332 1:TOF MS ES+ 1005 A 255.062 0.5Da ‘i 332 0.05Da 2.47 100 1.56e3 2 ~ m% Z xe Zuker 6 周 hs Zuker 6 周 0 ) co ™ 1’ iy 0.50 1.00 1.50 ae 1:TOF MS ES+ 时 间 /min 1:TOF MS ES+ 100 255.066 0.05Da 100 332.333 0.05Da 2.47e3 D 1.56e3 & x % % : Zuker 20 周 Zuker 20 Jal 0 0 0.50 1.00 1.50 0.50 1.00 1.50 时 间 /min 时 间 /min 图 4-15 Zucker 鼠 6 周 和 20 周 尿 样 的 葵 取 离子 图 m/z=255 和 m/z=33219) 研究 结果 表明 ,应 用 UPLC 系统 1. Smin 的 快速 分 析 程 序 在 代谢 组 学 的 研究 中 ,可 以 获得 高 通 量 的 扫描 分 析 ,快速 地 获得 全 面 的 数据 变量 和 生物 学 变化 。 这 种 快速 .全面 的 方 法 可 用 于 代谢 组 学 的 分 析 和 生物 标记 物 的 检测 。 4.3.2.3 用 于 临床 医学 的 研究 在 临床 医学 中 ,许多 尚 无 明确 病因 的 疾病 等 待 探索 其 发 病 机 制 。 代 谢 产 物 是 基因 表 达 的 最 终 产物 ,与 机 体 的 生理 病理 、 发 育 状态 有 关 。 因 此 ,代谢 组 学 提供 了 从 另 一 角度 研 究 疾 病 的 方法 ,进行 疾病 诊断 .阐明 发 病 机 制 、 治 疗 监 测 。 Yin 4?" py] UPLC Q-TOF MS 对 40 个 肠 瘘 患者 及 17 个 健康 人 的 血清 样品 进行 检测 ,ESI 十 和 ESI 一 的 数据 都 用 于 PLS-DA 分 析 , 肠 瘘 患者 与 健康 人 可 得 到 很 好 的 区 分 , 9 种 可 能 的 生物 标记 物 被 发 现 。 结 果 表 明 ,UPLC 与 质谱 联 用 在 发 现 疾病 可 能 的 生物 标 记 物 并 且 揭 示 病 理 的 改变 上 是 强 有 力 的 工具 。 有 兴趣 的 读者 可 从 表 4-3 中 看 到 更 多 的 应 用 实例 。 UPLC 是 2004 年 推出 的 一 项 新 技术 ,与 传统 的 HPLC 相 比 , UPLC 提供 的 高 效 、 高 速 ,高 灵敏 性 能 已 经 在 代谢 组 学 研究 中 的 显示 了 优势 。Agilent\Thermal、Shimadzu 等 公 司 也 随后 推出 了 类 似 的 高 效 、 高 速 . 高 灵敏 仪器 。Agilent 公司 推出 的 RRLC(Rapid Res- olution LC) 使 用 1. 8um 粒 径 的 色谱 填料 ,Thermal 公司 使 用 1. 9um 粒 径 的 色谱 填料 以 达到 快速 高 效 的 目的 。Shimadzu 公司 的 Prominenece UFLC(CUltra Fast LC) 使 用 2. 2xm 粒 径 的 色谱 填料 ,同时 使 用 较 高 的 温度 (可 达 85°C ) 加 速 物 质 的 扩散 , 减 小 色谱 柱 里 流动 阻力 的 增加 。 这 些 新 技术 的 推出 为 代谢 组 学 研究 的 发 展 提 供 了 技术 支持 ,今后 也 必 将 得 到 更 广泛 的 应 用 。 * 101 二 A B Scores Compacent 1 - Component 2 cadings: Sor pores 1 ~ Samponent 3 0 黑 鼠 肉 性 上 午 口 黑 鼠 雄性 上 午 ”人 裸 鼠 内 性 上 午 口 黑 鼠 肉 性 下 午 ORME A 裸 鼠 雌性 下 午 © 白鼠 肉 性 上 午 作 白 鼠 雄 性 上 午 六 裸 鼠 雄性 上 午 白鼠 肉 性 下 午 人 白鼠 雄性 下 午 A 裸 鼠 雄性 下 午 -0.200 0T00 0.000 0.100 0.200 4 白鼠 雌性 上 午 > 白鼠 雄性 上 午 所 白鼠 肉 性 下 午 A 白鼠 雄性 下 午 4-16 EVER BEF CAM) 和 下 午 (PM) 变 化 的 PCA 分 析 得 分 图 (A) 和 载荷 图 (B); 黑 鼠 , 白 鼠 和 裸 鼠 的 PCA 分 析 得 分 图 (C) 和 载荷 图 (D) ;白色 雄 和 肉 老 鼠 (AM & PMD) 数 据 的 PCA 分 析 ( 下 ) 。 数据 由 LC/MS 分 析 而 得 表 4-3 ”文献 中 UPLC 应 用 于 代谢 组 学 研究 的 实例 分 析 目 的 样品 物种 分 析 对 象 文献 药物 代谢 研究 肝 微 粒 体 老鼠 右 美沙 芬 代 谢 物 [5] 尿 样 老鼠 氧化 槟 郴 碱 代谢 物 [21] 血浆 老鼠 曲 格 列 酮 代谢 物 [22] 血清 人 Retinel oA B&H [23] * 102 « 分 析 目 的 药物 代谢 及 疗效 评价 疾病 诊断 生物 标记 物 的 发 现 功能 基因 组 学 研究 代谢 物 定量 分 析 代谢 轮廓 分 析 生物 标记 物 发 现 植物 代谢 组 学 研究 中 药 提取 鉴别 代谢 组 学 数据 识别 样品 储存 时 间 的 影响 [1] Plumb R, Castro-Perez J, Granger J, Beattie I, Joncour K, Wright A. Rapid Commun Mass Spectrom, 2004, 18; 2331 样品 血浆 ABI 2818 IR PREF 尿 样 血清 、 尿 样 微生物 发 酵 液 发 酵 液 尿 样 拟 南 芥 叶 提取 物 中 药 提 取 液 血清 尿 样 分 析 对 象 羟基 军 酮 代谢 物 滨 项 内 酯 代谢 物 全 组 分 分 析 药物 活性 物质 内 源 性 代谢 物 顺 二 醇 类 代谢 物 全 组 分 分 析 全 组 分 分 析 全 组 分 分 析 全 组 分 分 析 全 组 分 分 析 全 组 分 分 析 全 组 分 分 析 lincomycin 有 机 酸 全 组 分 分 析 全 组 分 全 组 分 分 析 内 源 性 、 外 源 性 代谢 物 人 老鼠 “全 组 分 分 析 参考 文献 [2] Novakova L, Solichova D, Solich P. Journal of Separation Science, 2006, 29: 2433 [3] Olsovska J, Jelinkova M, Man P, Koberska M, Janata J, Flieger M. J Chromatogr. A, 2007, 1139: 214 [4] Wilson ID, Nicholson J K, Castro-Perez J, Granger ] H, Johnson K A, SmithBW, PlumbRS. J. Proteome. Res. , 2005, 4: 591 [5] Castro-Perez J, Plumb R, Granger J H, Beattie I, Joncour K, Wright A. Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19; 843 [6] Churchwell MI, Twaddle N C, Meeker L R, Doerge DR. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. , 2005, 825: 134 [7] Leandro C C, Hancock P, Fussell RJ, Keely BJ. J. Chromatogr. 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A, 2007, 10: 66 2 104 « 第 5 章 毛细 管 电泳 -质谱 联 用 技术 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 代谢 组 学 分 析 的 生物 样品 中 包含 许多 离子 性 代谢 物 , 尤 其 是 糖 酵 解 代 谢 产物 、 三 羧 酸 循环 代谢 物 , 如 羧 酸 、 磷 酸化 糖 。 此 外 , 核 苷 酸 、 氢 基 酸 、 辅 酶 等 代谢 物 也 是 离子 性 化 合 物 。 由 于 离子 性 代谢 物 不 容易 在 反 相 色谱 柱 上 保留 , 而 离子 色谱 和 离子 交换 色谱 流 动 相 中 要 添加 离子 对 试剂 , 不 适合 与 质谱 联 用 , 因 此 HPLC-MS 不 适合 离子 性 代谢 物 的 分 析 。 而 毛细 管 电泳 是 通过 离子 化 合 物 的 质 荷 比 〈zz/z) 的 不 同 造成 迁移 速率 不 同 来 实现 分 离 的 , 因 此 毛细 管 电泳 -质谱 联 用 技术 〈CE-MS) 特别 适合 分 析 离 子 性 代谢 物 。 最 近 ,CE-MS 已 成 为 分 析 离 子 性 代谢 物 的 有 力 工 具 。 本 章 主要 介绍 毛细 管 电泳 -质谱 联 用 技术 及 在 代谢 组 学 研究 中 的 应 用 进展 。 5.1 毛细 管 电泳 -质谱 联 用 技术 简介 毛细 管 电泳 〈capillary electrophoresis) 是 20 世纪 80 年 代 问 世 的 一 种 以 毛细 管 为 分 离 通道 、 以 高 压 直 流 电场 为 驱动 力 的 新 型 液 相 分 离 分 析 技 术 , 是 经 典 电泳 技术 和 现代 微 柱 分 离 相 结合 的 产物 。 它 一 出 现 就 引起 分 离 科 学 界 极 大 的 关注 。 目 前 , 它 已 成 为 和 20 世纪 50 年 代 未 、60 年 代 初 出 现 的 气相 色谱 以 及 20 世纪 70 年 代 初 出 现 的 液 相 色谱 相 媲美 的 一 种 分 离 技术 , 并 被 认为 是 当代 分 析 科 学 最 具 活力 的 前 沿 研究 课题 。 与 传统 的 分 离 方法 相 比 , 毛 细 管 电泳 的 显著 特点 是 简单 、 高 效 、 快 速 和 微量 。 所 有 这 些 特点 使 得 毛 细 管 电泳 迅速 成 为 一 种 极为 有 效 的 分 离 技 术 , 广 泛 应 用 于 分 离 多 种 化 合 物 , 如 氮 基 酸 、 糖 类 、 维 生 素 、 有 机 酸 、 无 机 离子 、 药 物 、 多 肽 和 蛋白质 、 神 经 递 质 、 低 聚 核 苷 酸 (RNA) 和 DNA 片段 等 。 近 年 来 , 毛 细 管 电泳 在 手 性 化 合 物 分 离 、 药 物 分 析 、DNA 分 析 、 代 谢 分 析 和 环境 分 析 等 领域 得 到 越 来 越 广泛 的 应 用 。 质谱 (MS) 检测 法 具有 较 强 的 定性 功能 , 在 一 次 分 析 中 可 获得 很 多 结构 信息 , 因 此 将 毛细 管 电泳 分 离 技术 与 质谱 法 相 结合 可 谓 是 分 离 科 学 方法 学 中 的 一 项 突破 性 进展 。 1987 年 ,Olivares 首次 报道 了 毛细 管 电泳 与 质谱 的 联 用 技术 DJ , 随 之 , 该 项 技术 迅速 获 得 了 认可 和 欢迎 , 得 到 了 很 大 的 发 展 , 并 出 现 了 商品 化 仪器 。CE-MS 的 发 展 与 MS 进 样 系统 的 进展 不 无 关系 , 特 别 是 由 Fenn 等 轨 研 制 的 电 喷 雾 技 术 (ESI) 起 了 关键 的 作 FA. Olivares 将 该 项 技术 应 用 到 CE-MS 中 。 连 续 流 快 原子 又 击 (continuous flow FAB, CEF-FAB) 呈 也 被 成 功 地 应 用 到 联机 模式 。CE-MS 接口 中 的 离子 化 技术 还 有 基体 辅助 激 光 解 吸 离 子 化 (matrix assisted laser desorption ionization,MALDI) , 虽 然 它 也 有 被 用 于 CE-MS 联机 模式 中 的 成 功 报道 5 0 , 但 是 最 常用 的 还 是 脱 机 联 用 模式 。 此 外 , 离 子 喷 3% 〈ionspray,ISP)5 、 大 气压 化 学 电离 (APCD! 4$ th pk ny AAZE CE-MS 中 。 CE 末端 与 质谱 的 接口 是 影响 整个 检测 的 关键 因素 之 一 , 所 有 CE-ESI-MS 接口 的 5 目标 都 是 为 了 获得 稳定 的 雾 流 和 高 效 的 离子 化 。 由 于 CE 需要 较 高 离子 强度 、 挥 发 性 低 的 绥 冲 液 , 而 ESI 需要 相对 较 低 的 盐 浓 度 才 能 获得 好 的 雾 化 及 离子 化 。 因 此 接口 技术 必须 优化 , 使 其 尽 可 能 提供 好 的 电子 接触 , 同 时 尽量 减少 对 CE 分 离 效率 的 影响 。 此 外 , 对 于 每 一 种 接口 应 选择 相应 的 缓冲 液 。CE-ESILMS 接口 共有 三 种 类 型 : 同 轴 液 体 #4 it (coaxial liquid sheath flow)、 无 鞘 接口 、 液 体 连接 。 5.1.1 同 轴 液 体 鞘 流 此 种 类 型 接口 是 最 常见 的 连接 CE 4 ESI-MS 的 方法 。 该 接口 是 一 个 同心 的 不 锈 钢 毛细 管 套 在 电泳 毛细 管 未 端 , 畏 内 充 有 鞘 液 。 在 此 不 锈 钢 套 外 再 套 一 个 同心 的 钢 套 , 鞘 内 通 划 气 。 鞘 液 与 毛细 管 电泳 缓冲 液 液体 在 尖端 混合 , 同 时 被 畏 气 筋 化 。 鞘 液 流 量 通常 为 每 分 钟 纳 升 至 数 微 升 , 但 却 显著 高 于 CE 流速 。 由 于 盖 液 的 稀释 作用 , 雾 流 稳定 性 得 到 改善 。 鞘 液 的 流速 和 组 成 需要 优化 , 一 些 研 究 表明 有 机 溶剂 和 挥发 性 酸 〈 如 正 离子 模 式 下 的 乙酸 、 甲 酸 ) 或 挥发 性 碱 〈 如 负离子 模式 下 的 乙酸 胺 、 三 乙 胺 ) 的 种 类 和 构成 影 响 质谱 信号 的 灵敏 度 "' AAS es PE 。 5.1.2 无 鞘 接口 由 于 鞘 液 的 稀释 , 同 轴 液体 畏 流 接口 质谱 检测 灵敏 度 会 降低 , 无 鞘 接口 可 以 避免 该 问题 。 毛 细 管 未 端 做 成 尖 细 状 以 获得 稳定 的 电子 雾 化 。 该 未 端 外 套 一 同心 套 管 , 内 通 鞘 气 。 该 接口 的 难点 是 不 易 同 时 保持 CE 和 ESI 的 电路 循环 。 为 此 , 在 毛细 管 未 端 粘 上 金 丝 或 镀 一 层 金 , 但 因为 金 的 黏着 力 差 , 易 被 机 械 的 或 电子 的 原因 除 掉 , 因 而 接口 性 能 差 且 寿 命 短 。 近 来 Kelly 等 9 改进 了 这 一 接口 。 他 们 首先 在 CE 末端 镀 上 一 层 镍 或 镍 / 铬 Ge, FEELS, HO AH 100h。 另 外 ,Brocke 等 5 用 铂 或 镀金 不 锈 钢丝 插入 CE 末端 作为 毛细 管内 电极 , 并 以 对 葵 二 酚 缓冲 液 为 添加 剂 以 抑制 电化 学 反应 产生 的 气 泡 。 此 种 接口 相对 于 同 轴 液 体 闽 流 接口 , 待 分 析 物 未 被 稀释 , 检 测 灵 敏 度 要 好 一 些 , 尤 其 是 与 nanoESI 相连 时 , 检 测 限 达 皮 摩 D2 。 5.1.3 液体 连接 该 接口 为 CE 末端 与 一 个 直径 10~20um HHH, MARA CE 缓冲 液 。 与 CE 末端 相对 的 槽 的 另 一 端 接 上 ESI。 此 装置 的 优点 在 于 可 通过 任意 调节 槽 内 液体 流速 以 改善 ESI 效 果 , 然 而 这 通常 是 以 谱 带 展 宽 和 分 离 效 能 减低 为 代价 而 取得 的 。 此 外 , 该 装置 技术 难度 较 大 , 现 仅见 于 芯片 CE 与 MS 联 用 的 仪器 。 5.2 基于 毛细 管 电泳 -质谱 联 用 技术 的 代谢 组 学 平台 生物 样品 中 的 离子 性 代谢 物 , 根 据 所 带电 荷 的 不 同 , 可 分 为 阳离子 代谢 物 和 阴离子 代谢 物 。 据 此 , 分 别 建立 了 相应 的 毛细 管 电泳 -质谱 分 析 方法 。 *- 106 。 5.2.1 阳离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 Soga 等 3 建立 了 阳离子 代谢 物 的 CE-MS 分 析 方 法 。 如 图 5-1 Bra, EAR 电 渗 流 EOF 朝向 电极 负极 , 阳 离子 根据 质 荷 比 的 不 同 得 到 分 离 。 为 了 同时 分 析 所 有 的 阳离子 代谢 物 , 使 用 低 pH 的 电解 液 (lmolL 甲酸 pH1. 8) , 使 代谢 物 带 正 电 荷 , 从 而 质谱 可 以 检测 。 他 们 从 B. subtilis 细菌 细胞 提取 物 中 检测 到 了 质 人 荷 比 〈z"xyz) 在 70 一 1027 的 1053 种 阳离子 代谢 物 。 图 5-2 $B. subtilis 细菌 细胞 提取 物 中 mm/z 在 101 一 150 的 阳离子 代谢 物 的 选择 离子 图 。 所 建立 的 方法 灵敏 度 很 高 , 能 检测 到 单个 细胞 中 40zmol fy AiR EMS Al 350amol 的 葡萄 糖 。 而 且 迁 移 时 间 的 相对 标准 偏差 (RSD) 小 于 2.7%。 图 5-1 CE-MS 分 析 阳 离子 模式 的 电 渗 流 CEOP 示意 图 5.2.2 阴离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 毛细 管 电泳 分 析 阴 离子 代谢 物 时 , 通 常 采用 反 相 电压 模式 , 此 时 毛细 管 进 样 端 在 阴 极 , 出 口 端 在 阳极 , 由 于 CE-MS ARMA ORB. MBB EOF 流向 阴极 , 如 图 5-3A 所 示 , 容 易 在 毛细 管 出 口 端 形 成 气泡 , 造 成 电流 中 断 , 从 而 导致 分 析 失 败 。 为 了 克服 该 问题 ,Johnson 等 5 在 缓冲 液 中 添加 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 阳离子 表面 活性 剂 , 使 电 渗流 EOF 方向 改变 , 见 图 5-3B。 然 而 ,Soga 等 发 现 采 用 该 方法 后 , 加 高 压 数 分 钟 后 , 电 流下 降 仍 不 可 避免 。 据 推测 这 可 能 是 因为 吸附 在 毛细 管内 壁 的 阳离子 表面 活 性 剂 会 逐渐 向 阴极 移动 , 原 来 被 覆盖 的 SiO- 又 暴露 出 来 , 正 相 电 渗流 向 阴极 迁移 , 见 图 5-3C。 后 来 ,Katayama 等 5 应 用 阳离子 聚合 物 SMILE (+) 键 合 毛细 管 涂 层 柱 覆 盖 表 面 硅 羟 基 , 产 生 反 相 电 渗流 解决 了 此 问题 。 此 方法 无 需 在 缓冲 液 中 加 入 任何 添加 剂 , 而 且 具 有 很 强 的 化 学 稳定 性 。 Soga 等 9 应 用 该 技术 建立 了 阴离子 代谢 物 的 CE-MS 分 析 方 法 。 细 胞 中 糖 代 谢 和 三 羧 酸 循环 (TCA) 有 许多 阴离子 代谢 物 , 其 中 包括 FOP 和 G6P、2PG 和 3PG SHY 体 。 高 pH9. 0 的 50mmol/L 乙酸 胺 做 电泳 缓冲 液 有 利于 异 构 体 的 分 离 。 质 谱 采 用 负 离 子 模式 , 阴 离子 代谢 物 一 般 产 生 脱 质子 的 分 子 离子 峰 LM-HJ] , 接 口 为 同 轴 液 体 畏 流 , 鞘 流 液 选 择 含 Smmol/L 乙酸 胺 的 50%% 甲 醇 / 水 溶液 。 他 们 同时 分 析 了 羧 酸 、 磷 酸化 羧 酸 、 磷 酸化 糖 、 核 苷 酸 、 和 氨基酸、 辅酶 等 32 种 阴离子 代谢 物 , 迁 移 时 间 的 相对 标准 偏 #% (RSD) 小 于 0.4%, WMA RSD 为 0.9% 一 5.4%。 浓 度 检 测 限 达到 0. 3 一 6. 7pmol/L ( 按 3 倍 信 噪 比 计算 ) 。 从 B. subtilis 细菌 细胞 提取 物 中 直接 检测 到 了 29 种 阴离子 代谢 物 , 见 图 5-4。 与 其 他 方法 相 比 , 建 立 的 阴离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 具 ¢ 107 » 2410 y 0.4799 0.8993 mlz 101 34 200 oo 08813.、 人 人 9067 3 ye sb SEs) ee a Be 5530 PR J 0.4797 0.7188 x 17799 A m/z 103 71 400 0.6137 GABA 0.8119 ”二 甲 基 氨 基 乙 酸 mlz 104 7720 0.46524 人 CE 13 600 —Z2MiRK oy 人 Ser 人 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 nz 107 EL see ek ee Cr PO) UN ee a eee mlz 108 19900 ace a OR) ee TT ED I eee i it 38 100 ,0.4063 胞 喀 啶 0.7607 1.7789 八 wie 442 2770 0.3812 0,6198 mlz 113 EE 313 000 0.4801 0.6450 mlz 115 124 000 0.6196 0.6789 Prof__0.9665 mlz 116 3650 0.4801 kj (5- AE RE) ne 147 1 060 000 nidin Val 0.9441 mlz 118 63 800 高 丝氨酸 、 人 Thr 0.9412 a 4780 0.4653 Ase A 1.7133, mlz 121 77 100 0.3441 0.6279 mlz 123 3570 0.8414 mlz 124 7840 0.3448 mlz 125 1480 0.6516 5- 甲 基 : Taurine mlz 126 28 100 咪唑 -4- 乙 酸 人 0.6815 mlz 127 491 600 a 4a 6549 0.7608) 0.8394 ae (L-RR IB 1, 6-A BER mlz 129 0.8998 0.9071 m/z 130 4486 0.440: mlz 131 141 382 DAR lle LeuOH-Pro mlz 132 6935 0.4797 Om, 0.7269 Asn ehegt 34 222 0.7607 0.8609 Asp mlz 134 3243 0.6193 人 腺 顺 叭 下 1 51 071 0.3437 0.6450 KRM ale 137 CT 29 456 0.3441 0.4597 Urocanatef mlz 139 6412 0.4959 0.6765 0.8419 (N-Monomethyl-2-aminoethylphosphate) (OHnicotinate) nj» 140 0.8477) 0.8818 RPA 0.4799 mlz 143 95 110 0.6899} 4-Methyl-5-thiazol-ethanol mlz 144 7712 0.4415,0.4799 0.7001 人 0.7420 MEE 34 449 亚 精 腕 (Aminooxohexanone) } y-Ilat T mlz 146 mlz 147 1 151 900 mlz 148 1 eee 88 700 Geis 7 © Te, mlz 150 5 10 15 20 25 时 间 /min 图 5-2 ”了 B subtilis168 细菌 细胞 提取 物 中 阳离子 代谢 物 的 CE-MS ee 实验 条 件 : 毛细 管 柱 (50pm i. d. X100cm); 缓冲 液 Imol/L 甲酸 ;分离 电 压 十 30kV; 压力 进 样 50mbar 进 样 3s; 温度 20°C; HR AA Smmol/L 乙酸 匀 的 50% 甲 醇 /水 溶液 (V/V), PtH 10wl/min; 电 喷 雾 离 子 源 质谱 ; 正 离子 模式 , 电 压 4000V, 加 热 温度 300 °C 有 以 下 几 点 优势 : 中 不 需要 衍生 就 可 以 分 析 不 同类 型 阴离子 代谢 物 ,@ 高 灵敏 度 和 高 选 择 性 ;, 久 分析 时 间 短 。 ¢ 108 « 图 5-3 CE-ES-MS 分 析 阴 离子 模式 的 电 渗流 CEOF) 示意 图 A. 正常 电 渗流 ; B 缓冲 液 中 添加 阳离子 表面 活性 剂 使 电 渗流 方向 改变 ; C. 无 液 区 产生 正常 电 渗流 5.2.3 多 价 阴 离子 代谢 物 CE-MS 分 析 方 法 上 述 建立 的 阴离子 代谢 物 CE-MS 方法 在 分 析 多 价 阴 离子 代谢 物 , 如 柠檬 酸 、 核 苷 、 辅 酶 A 等 , 由 于 吸附 的 原因 , 峰 脱 尾 严 重 , 影 响 准确 定量 分 析 ,Soga 等 5 又 建 立 了 分 析 多 价 阴 离子 代谢 物 的 压力 辅助 毛细 管 电泳 -= 电 喷 雾 质 谱 方法 (PACE/EST MS) 。 为 了 防止 这 些 阴 离子 吸附 在 管 壁 上 , 毛 细 管 内 壁 涂 甫 一 层 中 性 聚合 物 〈 聚 二 甲 基 硅 烷 )。 然 而 , 也 经 常 发 生 电 流 中 断 。 他 们 又 在 毛细 管 进 口 端 增加 辅助 压力 系统 , 使 缓冲 液 不 断 地 流向 质谱 端 , 保 证 毛细 管 和 电 喷 雾 针 之 间 充 满 导电 液 , 防 止 电流 中 断 现象 发 生 , 见 图 5-5 。 利 用 该 方法 分 析 了 柠檬 酸 异 构 体 、 核 背 、 烟 酰胺 腺 味 叭 二 核 HR 〈 辅 酶 ) 、 黄 素 腺 味 叭 二 核 苷 酸 、 辅 酶 A 等 18 种 多 价 阴离子 化 合 物 , 迁 移 时 间 的 相对 标准 偏差 CRSD) 小 于 0. 6 只, 峰 面 积 的 RSD W 1.4%~6.2%., WR Rew 达到 0. 4 一 3. 7pmol/L, 质 量 检测 限 12~110fmol ( 按 3 倍 信 噪 比 计 算 ) AB. subtilis 细菌 细胞 提取 物 中 直接 检测 到 了 18 种 多 价 阴离子 代谢 物 , 图 5-6 是 其 中 柠檬 酸 异 构 KR. BAF. RF PR WHE A 的 PACE/ESLMS 选择 离子 图 。 建 立 的 PACE/ESL MS 具有 以 下 优势 : @ 多 价 阴离子 代谢 物 , 如 柠檬 酸 、 核 苷 、 辅 酶 A 等 不 会 吸附 在 毛 细 管 壁 上 ; @ 不 会 出 现 分 析 电 流 中 断 ;@@ 不 需要 衍生 过 程 ; 四 高 灵敏 度 和 高 选择 性 ; @ 分 析 时 间 短 。 。 109 。 16 \ 57 1H |-3 |" 一 29 2 1 时 Sa ina Finke i Rear] Sit he eee mlz 87 Aad vl AMS al LA) hs angel mlz 89 4 和 | WERAwew mlz 115 Bsmt ee mls 117 j Rev fie ope mlz 133 wwe wo se AAA mlz 145 . : e | | POR cob S rat Dnt, retin mlz 167 tte 3 | m/z 171 pene Bd aks miz 173 Weg J miz 185 Nd} 4 mlz 191 的 二 4 mlz 265 hs m/z 301 1 1 ieee m/z 339 late 19 mlz 346 a=: ui mlz 402 > 1 myz426 24 mlz 442 ET Ie. ings. mlz 662 26 miz 663 27 mlz 742 28 m/z 743 mlz 784 4 6 8 10 12 14 . 16 18 20 时 间 /min 图 5-4 B. subtilis 细菌 细胞 提取 物 中 阴离子 代谢 物 的 选择 离子 图 5) 实验 条 件 : 毛细 管 柱 〈50pm id. X100cm); 缓冲 液 50mmol/L 乙酸 胺 pH 9.0; 分 离 电 压 一 30kV; 压力 进 样 50mbar 进 样 30s; 温度 20°C; WAZ Smmol/L 乙酸 胺 的 50%% 甲 醇 /水 溶液 (V/V), HiT 10pl/min; 电 喷 雾 离子 源 质谱 : 负离子 模式 , 电 压 3500V, 加 热 温 度 300°C 峰 标 示 : 1. ZB; 2. 丙酮 酸 ; 3. 乳酸 ; 4. 延 胡 索 酸 ; 5. BAM; 6. 苹果 酸 ; 7. 2- 酮 戊 二 酸 ; 8. PEP; 9.DHAP; 10. 甘油 -3- 磷 酸 ; 11. 3PG; 12. FM; 13.G1P; 14. F6P; 15.G6P; 16. PIPES (is); 17.Fl, 6P; 18. AMP; 19.GMP; 20. CDP; 21. ADP; 22.GDP; 23.CTP; 24. ATP; 25. NAD; 26. NADH; 27. NADP; 28. NADPH; 29. 未 知 ¢ 110 = 电源 图 5-5 PACE/ESLMS 分 析 系 统 示意 图 FT RR 286.000 8000 RR . 风光 190 000 PIPES (is) ae a waa mlz 322 Md = mlz 346 —— San m/z 362 = sal m/z 402 sb ws =. m/z 426 3960 val mlz 442 Sm == mlz 482 20 300 = mlz 506 I PER Aa pi eee ee aes ne NO mlz 663 Sm = ledge m/z 743 ee) lo ee m/z 766 = 2 mlz785 mlz 808 = mlz 866 5 10 15 20 25 时 间 /min 5-6 B. subtilis168 菌株 细胞 提取 物 中 多 价 阴离子 代谢 物 的 PACE/ES-MS 选择 离子 图 7] 实验 条 件 : EAH (DB—150pum id. X100cm); 缓冲 液 50mmol/L 乙酸 胺 pH7. 5; 分 离 电 压 一 30kV; 压力 进 样 50mbar 进 样 30s; 温度 30°C; HAA Smmol/L ZMH) 50%% 甲 醇 /水 溶液 (V/V) We 10ul/min; MS PRR: 负离子 模式 , 电 压 3500V, 加 热 温 度 300°C 1 5.3 毛细 管 电泳 在 代谢 组 学 中 的 应 用 研究 5.3.1 微生物 菌株 细胞 提取 物 的 代谢 分 析 微生物 代谢 , 尤 其 是 能 量 代谢 过 程 , 如 糖 酵 解 、 戊 糖 磷酸 循环 、 三 羧 酸 循环 中 的 代 谢 物 几乎 都 是 离子 性 化 合 物 。Soga 等 "利用 建立 的 3 种 CEMS 方法 分 析 了 B. subtilisl68 菌株 细胞 代谢 物 , 总 共 检 测 到 1692 个 代谢 物 , 包 括 1053 个 阳离子 代谢 物 和 637 个 阴离子 代谢 物 。 其 中 通过 迁移 时 间 匹 配 和 标准 品 对 照 共 鉴定 出 233 个 代谢 物 , 包 括 参 与 能 量 代谢 过 程 的 78 种 代谢 物 。 部 分 代谢 物 的 定量 分 析 结 果 见 表 5-1。 基 于 这 些 数据 , 他 们 研究 了 B.,sxv2z0zs168 菌株 在 孢子 形成 过 程 中 能 量 代 谢 网 络 的 变化 。 营 养 的 缺乏 或 细胞 密度 增加 都 会 导致 B,szxpbtilis ART EA RM SERNA. AFB 成 过 程 中 , 受 代谢 网 络 控制 的 复杂 形态 变化 会 发 生 。 他 们 利用 CE-MS 平台 检测 了 孢子 形成 前 后 不 同时 间 点 的 B.,sxptilis 菌株 代谢 轮廓 。 如 图 5-7 CLAW) Bras, B. subti- lis 菌株 培养 在 葡萄 糖 缺 乏 的 环境 下 , 在 孢子 形成 的 早期 , 糖 酵 解 、 磷 酸 戊 糖 循环 、 三 羧 酸 循环 中 的 许多 代谢 物 显 著 下 调 , 特 别 是 1,6- 二 磷酸 果糖 (F1.6P) 急剧 下 降 100 多 倍 。F1. 6P 是 CcpA 和 CcpC 转录 因子 调控 的 代谢 抑制 的 关键 因子 ,Fl1. 6P 的 下 调 可 能 导致 代谢 控制 的 抑制 , 进 而 造成 雹 子 形成 相关 基因 的 表达 。 表 5-1 CE-MS 方法 定量 分 析 B. subtilisl68 菌株 细胞 代谢 物 D3] RSD(n=5)/% 代谢 物 摩尔 /细胞 */amol 峰 面 积 相对 保留 时 间 Gly 5.8 20 1.5 L#Ala 0.14 28 opp t L-Ala 24 13 al GABA 0. 12 \ 27 FT L-Ser 4.5 23 0. 83 L-Pro 3.8 3.0 0. 48 L-Val 4.1 19 0. 83 L- 高 丝氨酸 2 2.0 0. 84 L-Thr 13 6.3 0. 33 WAR 2.5 30 1.4 L-lle 2.2 24 0. 61 L-Leu 6.3 21 0. 74 Lose AR 0.17 29 0. 13 I- 乌 氢 酸 0. 27 60 2.1 L-Asn 0. 43 57 1.3 L-Asp 11 11 0. 2 ee 0. 04 63 1.8 ¢ 112 » 代谢 物 酷 胺 亚 精 胺 L-Lys L-Gln L-Glu L-Met © L-His L-Phe L-Arg LIAR Balk L- 肌 肽 胞 喧 Ret 丙酮 酸 乳酸 富 马 酸 琥珀 酸 ERR 2- 酮 戊 二 酸 BER Hs RE TS Al 二 羟基 丙酮 磷酸 甘油 -3- 磷 酸 3- 磷 酸 甘油 酸 柠檬 酸 TREE BE 4- 磷 酸 核 酮 糖 5- 磷 酸 核糖 5- 磷 酸 葡萄 糖 -1- 磷 酸 果糖 6- 磷 酸 葡萄 糖 6- 磷 酸 6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 果糖 1,6- 二 磷酸 CMP AMP 摩尔 /细胞 */amol 0. 37 0. 12 0. 12 ar So Cn 23 73 Se 9S bdo . 16 re ~~ Zp 峰 面 积 RSD(n=5)/% 续 表 相对 保留 时 间 1.6 2.9 2.0 呈 > © ses ,N ec oe NY SPY CC -一 o'r SF pp @ Bie & 2 MB o o- © & oO = = 有 = - 二 上 才 co co oo ° 113 « 续 表 RSD(n=5)/% 代谢 物 摩尔 /细胞 */amol 峰 面 积 相对 保留 时 间 GMP 0.14 42 0. 85 CDP 0. 07 52 0. 89 = ADP 0. 72 49 0. 43 GDP 0. 05 55 0. 93 CTP 0. 15 37 0. 89 ATP 0. 83 36 0. 61 GTP 0. 12 49 0. 63 NAD 4.5 8.9 0. 72 NADP 0. 26 23 0. 64 NADPH 0. 06 53 0. 72 乙酰 辅酶 A 0. 67 36 0. 59 a. 细胞 中 每 种 代谢 物 定量 结果 是 根据 每 毫升 培养 液 中 细胞 数目 来 计算 Cap Gene ae <0. 01-05 052 210 10 ND ax sors -— ol a 图 5-7 B. subtilisl68 菌株 在 孢子 形成 过 程 中 能 量 代谢 网 络 的 变化 D3] A. 在 对 数 生长 后 期 代谢 物 水 平 的 变化 〈To/ T-05); B 孢子 形成 早期 代谢 物 水 平 的 变化 (T2/ T-05). REM 红色 方 框 分 别 表示 代谢 物 水 平 增加 2 一 10 倍 和 10 倍 以 上 ;, 浅 蓝 色 和 靛青 色 方 框 分 别 表 示 代 谢 物 水 平 下 降 到 原来 的 0.1 一 0.5 和 0.1 以 下 ; 白色 方 框 表示 代谢 物 水 平 没 有 大 的 变化 ; 黑色 方 框 表 示 代 谢 物 未 检测 到 。 了 suptzlzs 菌株 的 代谢 图 谱 见 ARM database(http://www. metabolome. jp/) e 114 « Itoh 460°) FY CE-MS 同时 检测 大 肠 杆菌 中 不 同 的 代谢 中 间 体 , 以 便于 原 位 研究 新 陈 代谢 规律 。 为 了 更 好 地 理解 连续 酶 反应 规律 , 他 们 从 10 个 纯化 的 大 肠 杆菌 酶 中 重 构 了 糖 酵 解 过 程 。 结 果 表 明 , 通 过 代谢 物 浓 度 变化 的 微小 平衡 来 调控 该 代谢 途径 , 这 与 天 然 生物 震 功 网 络 相似 。 Edwards 4'7°) FY CE-MS 方法 分 离 检 测 了 DH5-a BRAD E. coli RRM PR 酸化 和 酸性 代谢 物 , 如 图 5-8 所 示 , 鉴 定 了 118 种 化 合 物 。Soga 等 5 用 PACE-MS 77 法 检测 于 野生 型 、pfkA 和 pfkB 突变 型 大 肠 杆菌 中 14 种 核 苷 、 二 核 苷 酸 以 及 辅酶 A 等 磷酸 化 位 点 代谢 物 , 可 为 酶 活性 研究 提供 有 用 信息 。 A 1300 站 Wi 了 mlz ss — es ww 1 6 8 1 14 16 15.2 6 8 10 12 14 16 时 间 /min 图 5-8 大 肠 杆菌 提取 物 分 析 谱 图 5 A. 大 肠 杆 菌 代谢 物 的 离子 谱 图 ; BM A 图 中 提取 m/z808 离子 的 谱 图 ,15. 21min Hie 〈 信 噪 比 35) 经 鉴定 是 乙酰 辅酶 A 5.3.2 植物 细胞 提取 物 的 代谢 分 析 Sato 等 采用 CE-MS 和 CE-DAD 方法 分 析 了 水 稻 叶 子 提取 物 中 的 主要 代谢 物 。 他 们 利用 建立 的 3 套 CE-MS 系统 分 别 检测 了 水 稻 叶 子 提 取 物 中 氨基 酸 、 胺 、 咖 啡 碱 等 阳离子 化 合 物 , 有 机 酸 、 磷 酸 糖 类 等 阴离子 化 合 物 , 核 苷 酸 、 辅 酶 等 多 价 阴 离子 化 合 物 。 利 用 CE-DAD 方法 检测 了 糖 类 化 合 物 。 为 了 提高 分 析 通 量 ,4 种 分 析 方 法 同时 进 行 。 检 测 到 88 种 参与 糖 酵 解 、 三 羧 酸 循环 、 磷 酸 戊 糖 代谢 途径 、 光 合作 用 和 氨基酸 生 物 合成 的 关键 代谢 物 。 图 5-9 是 水 稻 叶 子 提 取 物 中 代谢 物 的 选择 离子 谱 图 。 类 似 的 策 略 ,Takahashi 等 ”通过 定量 分 析 过 度 表达 黄 烷 酮 醇 还 原 酶 (DFR) 的 潮 霉 素 抑制 转 基 。 115 。 因 水 稻 和 作为 对 照 的 潮 霉 素 抑制 转基因 水 稻 中 已 知 代谢 物 的 浓度 。 结 果 表 明 , 几 种 代谢 物 的 浓度 , 如 顺 式 乌 头 碱 、 果 糖 、1,6- 二 磷酸 盐 、 自 由 氨基 酸 和 金属 在 根 、 叶 和 种 子 中 存在 差异 , 而 糖 类 在 种 子 中 的 浓度 一 定 。Carrasco-Pancorbo $*! 比较 了 不 同 种 橄榄 油 中 酚 类 代谢 物 的 浓度 。 酚 类 化 合 物 被 认为 在 橄榄 油 抗 氧 化 特性 方面 起 重要 作用 , 对 慢 性 疾病 起 保护 作用 。Wahby 等 C5] 首 次 报道 了 大 麻 含 有 阿托品 , 并 发 现 其 在 不 同 转基因 型 根部 中 的 浓度 不 同 , 这 与 植物 基因 型 、 接 木 时 细菌 感染 和 转型 有 关 。 另 一 方面 , Tanaka 等 C5 检 测 了 在 表达 甲 基 丙 二 酸 半 醛 脱氧 酶 (MMSDH) 的 转基因 大 米 的 叶鞘 和 叶片 中 三 酸 酸 循环 (TCA) 及 其 代谢 物 , 与 对 照 比 较 , 结 果 表 明 在 转基因 大 米 中 作为 TCA 循环 前 体 的 乙酰 辅酶 A 的 浓度 降低 , 从 而 TCA 循环 的 代谢 物 浓 度 改 变 。 Harada 等 2 将 SN 标记 的 无 机 盐 加 入 到 拟 南 芥 Arabidopsis 〈 细 胞 系 T87) 和 黄连 Coptis 培养 细胞 中 。 用 CE-MS 方法 检测 了 在 光照 和 黑暗 条 件 下 不 同 培养 时 间 点 的 氨基 PRN 标记 比率 。 光 照 条 件 下 随 培养 时 间 延 长 , 氨 基 酸 SN 标记 比率 增加 , 而 在 黑暗 条 件 下 多 数 比率 增加 不 明显 , 表 明 与 氨基 酸 的 含 氮 量 合成 途径 长 度 相 关 , 这 与 微 阵列 检测 的 转录 表达 一 致 。 此 外 ,Coztis 培养 细胞 中 氨基 酸 5N 标记 比率 揭示 了 精 氨 酸 和 赖 氨 酸 的 代谢 抑制 , 这 导致 了 多 胺 生物 合成 的 抑制 和 细胞 分 化 。 10% 1522, HMO i! Pan rt nner, pee arenn rma me menconmen Anan) eigenen et ireies) 704 ae sy =a ure 时 间 /min 5 116 > B 峰 高 m/z=73 m/z=75 m/z=87 m/z=89 m/z=115 m/z=117 m/z=133 m/z=145 m/z=167 , m/z=169 m/z=171 总 iti Ae ey foe > poems | 2. ae ae ee 5 ee ee ae 2a it } woe noe pe y - wh rag) las 4 ‘ tins Lienicetetin t ie ivy ote" ite I mn ee i if 区 — t . rd) Toe Jaci 2 A MoH DTT wend od : TV greet io | fie SF eet OS part a laced guoten” 有 Ja iY wig) sida STORY pede) Link <7 adlondt JM on ular pies ‘tiv! . A, Cs ¥ 17 di hy 4 A eum F 上 rn NO TOL) hee LAP agora) YM Vises 0 congas ae ’ te | en ne ee, ie me 人 人 nal't Ed 6) gene dead uci Jo tT phcidel EF in? se he A Ny 2 ome ‘ ct e* , ae % } 5 pi 了 iden cue Mee sr ee ee ; a ; a ww hf ’ ora My eve» ii RN ein vem (A sins omge ,避风 ’ BOLUS wi y ys : a BA SG ten Huw Astin! PA. ira ted MH weir sit y if if i < iat ITED (6.1) 式 中 ,为 普 朗 克 常数 。 自 旋 量 子 数 等 于 零 的 原子 核 有 5“O\.2C.2S\aSi 等 。 这 些 原子 核 没有 自 旋 现象 , 因 而 没有 磁 矩 , 不 是 NMR 研究 的 对 象 。 自 旋 量子 数 等 于 1 或 大 于 1 的 原子 核 有 : 1=3/2 的 有 5B,.sCl\aBraBr 等 ,I 一 5/2 的 有 7O.zI; I=1 的 有 2HJ4N 等 。 它 们 的 共振 吸 收 常会 产生 复杂 情况 , 目 前 在 核磁 共振 的 研究 上 应 用 还 很 少 。 自 旋 量子 数 等 于 1/2 的 原 子 核 有 :HaC.sN、9F\2Si\aP 等 , 它 们 具有 球形 电荷 分 布 , 容 易 得 到 高 分 辩 的 NMR 谱 , 是 目前 研究 得 最 广泛 的 一 类 原子 核 。 6.1.1.2 自 旋 核 的 进 动 和 核磁 共振 具有 了 磁 和 矩 的 原子 核 在 外 加 磁场 中 会 按 一 定 的 方式 排列 。 根 据 量子 力学 原理 , 它 对 于 外 加 磁场 可 以 有 〈2T 十 1) 种 取向 。 对 于 I 一 六 的 原子 核 , 只 能 有 两 种 取向 , 一 种 与 外 磁场 平行 , 这 时 能 量 较 低 , 以 磁 量 子 数 思 = 十 方 表征 ;一 种 与 外 磁场 道 平行 , 这 时 原子 e 121 = 核 的 能 量 稍 高 , 以 m 一 一 亏 表 征 。 在 低能 态 (或 高 能 态 ) 的 核 中 , 如 果 有 些 核 的 磁场 与 外 磁场 不 完全 平行 , 外 磁场 就 要 使 它 取向 于 外 磁场 的 方向 。 也 就 是 说 , 当 具有 磁 矩 的 核 置 于 外 磁场 中 , 它 在 外 磁场 的 作用 下 , 核 自 旋 产生 的 磁场 与 外 磁场 发 生 相 互 作用 , 因 而 原子 核 的 运动 状态 除了 自 旋 外 , 还 要 附加 一 个 以 外 磁场 方向 为 轴线 的 回旋 , 它 一 面 自 旋 , 一 面 围绕 着 磁场 方向 发 生 回旋 , 这 种 回旋 运动 称 进 动 或 拉 摩 尔 进 动 (Larmor pre- cession) 。 进 动 有 一 定 的 频率 , 称 拉 摩 尔 频率 。 自 旋 核 的 角速度 wo , 进 动 频率 〈 拉 摩尔 PRE) vo 与 外 加 磁场 强度 Ho 的 关系 可 用 拉 摩 尔 公 式 表示 : wo = 2nv = YHo (6. 2) YH) ne 2 核 进 动 角速度 是 量子 化 的 。 当 受到 适当 频率 的 射频 场 Hi 照射 时 , 进 动 角速度 并 不 变化 , 而 是 处 于 低能 态 的 自 旋 核 吸收 射频 能 量 , 牙 迁 到 高 能 态 , 从 而 产生 核磁 共振 吸收 。 式 〈6. 3) 是 产生 核磁 共振 的 条 件 , 它 给 出 了 产生 共振 时 射电 频率 wm 与 磁场 强度 A, 之 间 的 关系 。 此 式 还 说 明 下 述 两 点 : (1) 对 于 不 同 的 原子 核 , 由 于 y 不 同 , 发 生 共振 的 条 件 不 同 ; 即 发 生 共 振 时 vo 和 Ay 的 相对 值 不 同 。 即 在 相同 的 磁场 中 , 不 同 原子 核发 生 共振 时 的 频率 各 不 相同 , 根 据 这 一 点 可 以 鉴别 各 种 元 素 及 同位 素 。 (2) 对 于 同一 种 核 ,y 值 一 定 。 当 外 加 磁场 一 定时 , 共 振 频 率 也 一 定 ; 当 磁 场 强 度 改变 时 , 共 振 频 率 也 随 着 改变 。 例 如 , 和 氧 核 在 1. 409T 的 磁场 中 , 共 振 频 率 为 60MHz, 而 在 2. 350T 磁场 时 , 共 振 频 率 为 100MHz。 6.1.1.3 fa Fn Fn hh KR (6. 3) 当 磁 场 不 存在 时 ,T 一 于 的 原子 核对 两 种 可 能 的 磁 量子 数 并 不 优先 选择 任何 一 个 。 在 这 种 情况 下 ,mm 等 于 十 于 及 一 立 的 核 的 数目 完全 相等 。 在 磁场 中 , 核 则 倾向 于 具有 mm 一 十 方 , 此 种 核 的 进 动 是 与 磁场 定向 有 序 排列 的 。 所 以 , 在 有 磁场 存在 下 ,mm 一 十 亏 比 放 一 一 去 的 能 态 更 为 有 利 , 然 而 核 处 于 一 十 二 的 趋向 , 可 被 热 运动 所 破坏 。 根 据 波 尔 效 曼 分 布 定 律 , 可 以 计算 , 在 室温 (300K) 及 1. 409T 强度 的 磁场 中 , 处 于 低能 态 的 核 仅 比 高 能 态 的 核 稍 多 一 些 , 约 多 107%: Net _ ear 一 gB,/20kT — 1 0000099 (6. 4) Nay» PAC AE SY ar SRP CODES RE), JR RK UE it AA RE, AG 果 就 使 处 于 低能 态 氢 核 的 微弱 多 数 趋 于 消失 , 能 量 的 净 吸 收 逐 渐 减 少 , 核 磁 共 振 信号 消 失 , 这 种 现象 叫做 饱和 。 若 要 能 在 一 定时 间 间 隔 内 持续 检测 到 核磁 共振 信号 , 必 须 有 某 种 过 程 存在 , 它 使 高 。 122 + 能 级 的 原子 核能 够 回 到 低能 级 , 以 保持 低能 级 布 居 数 始终 略 大 于 高 能 级 布 居 数 。 这 个 过 程 就 是 弛 豫 过 程 。 弛 豫 过 程 分 为 自 旋 - 唱 格 弛 豫 〈 又 称 纵向 弛 豫 ) 和 自 旋 - 自 旋 弛 豫 COL 称 横 向 弛 驳 ) 两 种 机 制 。 在 自 旋 - 晶 格 弛 豫 过 程 中 , 处 于 高 能 态 的 原子 核 , 把 能 量 转移 给 周围 的 介质 〈 溶 剂 、 添 加 物 或 其 他 种 类 的 核 统称 为 晶 格 ) 变 成 热 运动 而 回 到 低能 态 。 通过 自 旋 晶 格 弛 豫 , 高 能 态 的 自 旋 核 渐渐 减少 , 低 能 态 的 渐渐 增多 , 直 到 符合 波 尔 效 曼 分 布 定 律 〈 平 衡 态 ) 。 自 旋 唱 格 弛 豫 时 间 以 五 Has, WK. WAHT, AW 1s, BA 高 黏度 的 液体 Th 较 大 , 有 的 甚至 可 达 数 小 时 ;在 自 旋 - 自 旋 弛 豫 过 程 中 , 两 个 进 动 频 率 相 同 、 进 动 取向 不 同 的 磁性 核 , 即 两 个 能 态 不 同 的 相同 核 , 在 一 定 距 离 内 时 , 它 们 会 互相 交换 能 量 , 改 变 进 动 方向 , 通 过 自 旋 - 自 旋 弛 驳 , 磁 性 核 的 总 能 量 不 变 。 自 旋 - 自 旋 BRAT BIL Tz 表示 , 一 般 气 体 、 液 体 的 Tz 也 是 ls 左右。 固体 及 高 黏度 试 样 中 由 于 各 个 核 的 相互 位 置 比 较 固 定 , 有 利于 相互 间 能 量 的 转移 , 故 Tz 极 小 。 6.1.2 核磁 共振 波谱 仪 按照 仪器 工作 原理 , 可 分 为 连续 波 〈continuous wave) 核磁 共振 波谱 仪 (CW- NMR) 和 脉冲 傅 里 时 变换 核磁 共振 波谱 仪 〈pulse and Fourier transform NMR, PFT- NMR) 两 类 。20 世纪 60 年 代 发 展 起 来 的 连续 波 核磁 共振 波谱 仪 主要 由 磁铁 、 射 频 振 蔓 器 、 射 频 接 收 器 等 组 成 。 通 常 只 能 测 !H NMR 谱 。5 一 10min 可 记录 一 张 谱 图 。 工 作 效率 低 , 对 于 低 浓 度 或 小 量 试 样 需 采 用 累加 的 方法 以 增强 信号 。 信 和 号 强度 * 与 累加 次 数 n 呈正 比 , 但 噪声 N 也 将 随 之 而 增加 , 信 噪 比 VN 与 驻 呈 正比 , 因 此 若 使 VN 提高 10 倍 就 需要 累加 100 次 , 进 一 步 提 高 还 需 更 长 时 间 , 这 不 仅 耗 时 , 且 谱 仪 (CW-NMR) 也 难于 保证 信号 长 期 不 漂移 。 现 在 已 被 脉冲 傅 里 叶 变换 谱 仪 取代 。PFT 技术 是 采用 强 而 守 的 脉冲 , 同 时 激发 处 于 不 同化 学 环境 的 同一 种 核 , 然 后 用 接收 器 同时 检测 所 有 核 的 激发 信息 , 得 到 自由 感应 衰减 信号 FID (free induction decay) , 在 FID 信和 号 中 包含 了 各 个 激发 核 的 时 间 域 上 的 波谱 信号 , 经 快速 傅 里 叶 变换 后 得 到 常见 的 NMR 谱 图 。PFT- NMR 既 可 为 常规 磁铁 〈80 一 100MHz) 也 可 为 超 导 磁 体 〈200 一 900MHz) , 后 者 常 配 备 有 大 型 计算 机 , 可 测 各 种 二 维 谱 甚至 三 维 谱 。 与 CW-NMR 相 比 ,PFT-NMR 使 检测 灵敏 度 大 为 提高 , 对 氢 谱 而 言 , 试 样 可 由 几 十 毫克 降低 至 lmg, 甚 至 更 低 ; 测量 时 间 大 为 降低 , 试 样 的 累加 测量 大 为 有 利 。 这 对 his OC) 和 多 种 核 的 测量 是 十 分 重要 的 , 使 复杂 化 合 物 的 结构 分 析 更 加 容易 。 6.1.3 核磁 共振 氢 谱 "H NMR 是 目前 研究 得 最 充分 的 波谱 。20 世纪 70 年 代 以 前 , 核 磁 共 振 的 绝 大 部 分 研究 工作 都 集中 于 氧 谱 , 迄 今 为 止 , 由 于 氢 谱 灵敏 度 最 高 且 所 积累 的 数据 最 丰富 , 其 重 要 性 仍 略 强 于 碳 谱 。 核 磁 共 振 氢 谱 能 提供 重要 的 结构 信息 : 化 学 位 移 、 耦 合 常数 及 峰 的 裂 分 情况 、 峰 面积 等 。 6.1.3.1 化 学 位 移 及 其 表示 方法 前 面 的 讨论 中 是 假定 所 研究 的 氧 核 受到 磁场 的 全 部 作用 , 当 频率 vo 和 磁场 强度 Ho .123 + 符合 式 (6.3) 时 , 试 样 中 的 氢 核 发 生 共 振 , 产 生 一 个 单一 的 峰 。 事 实 上 并 非 如 此 , 每 个 原子 核 都 被 不 断 运 动 着 的 电子 云 所 包围 。 当 和 氧 核 处 于 磁场 中 时 , 在 外 加 磁场 的 作用 下 , 电 子 的 运动 产生 感应 磁场 , 其 方向 与 外 加 磁场 相反 , 因 而 外 围 电子 云 起 到 对 抗 磁场 的 作用 , 这 种 对 抗 磁 场 的 作用 称 为 屏蔽 作用 。 由 于 核 外 电子 云 的 屏蔽 作用 , 使 原子 核实 际 受到 的 磁场 作用 减 小 , 为 了 使 氢 核 发 生 共 振 , 必 须 增加 外 加 磁场 的 强度 以 抵消 电子 云 的 屏蔽 作用 。 核 外 电子 对 核 的 屏蔽 作用 以 屏蔽 常数 c 表示 : H = H,(—o) (6.5) AH, H 为 核 的 实 受 磁 场 强度 。 屏蔽 作用 的 大 小 与 核 外 电子 云 密切 相关 , 电 子 云 密度 愈 大 , 屏 蔽 作用 也 愈 大 , 共 振 时 所 需 的 外 加 磁场 强度 也 愈 强 。 而 电子 云 密度 又 和 和 氢 核 所 处 的 化 学 环境 有 关 , 与 相 邻 的 基 团 是 推 电 子 还 是 吸 电子 等 因素 有 关 。 因 此 由 屏蔽 作用 所 引起 的 共振 时 磁场 强度 的 移动 现象 称 为 化 学 位 移 。 根 据 化 学 位 移 的 大 小 可 以 推断 氢 核 所 处 的 化 学 环境 , 进 而 研究 有 机 物 的 分 子 结构 情况 。 化 学 位 移 用 $ 来 表示 。 由 于 完全 裸露 的 氢 核 是 不 存在 的 , 因 此 化 学 位 移 没有 一 个 绝对 标准 。 一 般 用 四 甲 基 硅烷 [Si (CH;),, TMS] 作 参 比 物 质 , 以 TMS 中 氢 核 共振 时 的 磁场 强度 作为 标准 , 人 为 地 把 它 的 OAS. HEA TMS 作 参 比 的 原因 是 : TMS 的 12 个 氢 核 处 于 完全 相同 的 化 学 环境 中 , 它 们 的 共振 条 件 完全 一 样 , 因 此 只 有 一 个 尖峰 且 不 与 其 他 化 合 物 的 峰 重 #; 而 且 ,TMS 在 大 多 数 有 机 溶剂 中 易 溶 , 呈 现 化 学 惰性 ; 沸点 低 〈27C), 因 此 样品 易 回收 。 在 较 高 温度 测定 时 可 使 用 较 不 易 挥 发 的 六 甲 基 二 硅 醚 [THMDS,(CHas):SiOSi (CH3)3, 6= 0.055]; 水 溶液 中 常用 3- 三 甲 基 硅 丙烷 磺 酸 钠 LDSS,(CHsi )3Si (CH:)sSiO;Na,6 王 0.015] 作 参 比 ; 在 极 性 溶剂 中 使 用 3- 三 甲 基 气 代 硅 丙烷 磺 酸 钠 LDSP,(CHs)sSi (CD,);SiO;Na] 作 参 比 物 会 更 好 一 些 , 分 子 中 3 个 亚 甲 基 的 氢 原 子 均 被 所 原子 取代 , 消 除了 参 比 物 的 干扰 。 化 学 位 移 的 表示 方法 为 : oe (6. 6) 式 中 ,wm 为 仪器 的 操作 频率 , 以 MHz 为 单位 , 试 拌和 TMS 频率 则 以 Hz 为 单位 ; 8 所 表示 的 是 该 吸收 峰 距 原点 的 距离 , 其 单位 为 ppm (X10°) 〈 百 万 分 之 一 ), 是 核磁 共 振 波 谱 技术 中 使 用 的 无 量 纲 单位 。 6.1.3.2 自 旋 耦 合 与 自 旋 裂 分 在 核磁 共振 图 谱 中 往往 可 以 看 到 三 重 峰 或 四 重 峰 等 多 重 峰 , 这 种 峰 的 裂 分 是 由 于 质 子 之 间 相 互 作 用 所 引起 的 , 这 种 作用 称 自 旋 - 自 旋 耦 合 , 简 称 自 旋 耦 合 。 由 自 旋 耦 合 所 引起 的 谱 线 增多 的 现象 称 自 旋 - 自 旋 裂 分 , 简 称 自 旋 裂 分 。 耦 合 表示 质子 间 的 相互 作用 , 裂 分 表示 谱 线 增 多 的 现象 。 一 般 来 讲 , 裂 分 数 可 以 应 用 〈z 十 1) 规律 , 即 二 重 峰 表示 相 邻 碳 原 子 上 有 1 个 质 子 ; 三 重 峰 表示 有 2 个 质子 ;四 重 峰 则 表示 有 3 个 质子 等 。 而 裂 分 后 各 组 多 重 峰 的 强度 比 为 : 二 重 峰 1 : 1、 三 重 峰 1 : 2 : 1、 四 重 峰 1:3:3:1 等 , 即 比例 数 为 (Ca 十 0)"” 展 开 后 各 项 的 系数 。 。 124 。 oS 裂 分 后 各 个 多 重 峰 之 间 的 距离 , 叫 做 耦合 常数 J, 用 Hz am. 的 大 小 表示 核 自 旋 相 互 干扰 的 强 弱 , 与 相互 耦合 核 之 间 的 键 数 、 核 之 间 的 相互 取向 以 及 官能 团 之 间 的 类 型 有 关 。 其 大 小 与 外 加 磁场 强度 无 关 。 由 于 耦合 裂 分 现象 的 存在 , 我 们 可 以 从 核磁 共振 谱 上 获得 更 多 的 信息 , 如 根据 耦 合 常数 可 判断 相互 耦合 的 氢 核 的 键 的 连接 关系 等 , 这 对 有 机 物 的 结构 剖析 极为 有 用 。 目前 已 累积 大 量 耦 合 常 数 与 结构 关系 的 实验 数据 , 并 据 此 得 到 一 些 估 算 耦 合 常数 的 经 验 式 。 6.1.3.3 FAR 由 核磁 共振 波谱 图 中 可 以 看 到 由 左 到 右 呈 阶梯 形 的 曲线 , 此 曲线 称 为 积分 线 。 它 是 将 各 组 共振 峰 的 面积 加 以 积分 而 得 的 。 积 分 线 的 高 度 代 表 了 积分 值 的 大 小 。 由 于 图 谱 上 共振 峰 的 面积 是 和 质子 的 数目 呈正 比 的 , 因 此 只 要 将 峰 面积 加 以 比较 , 就 能 确定 各 组 质 子 的 数目 , 积 分 线 的 各 阶梯 高 度 代表 了 各 组 峰 面 积 。 于 是 根据 积分 线 的 高 度 可 计算 出 和 各 组 峰 相对 应 的 质子 峰 。 6.1.4 核磁 共振 碳 谱 自 旋 量 子 数 为 1/2 的 核 , 其 核磁 共振 研究 、 应 用 得 最 多 的 除 !H 外 , 还 有 23C。 碳 原 子 构成 有 机 化 合 物 的 骨架 , 而 碳 谱 (3C-NMR) 提供 的 是 分 子 骨 架 最 直接 的 信息 , 因 而 对 有 机 化 合 物 结构 鉴定 具有 重要 意义 , 但 2C 没有 NMR 信和 号 ;2C 天 然 丰 度 很 低 , 仅 为 2C 的 1.1%, 且 2C 的 磁 旋 比 约 为 HH 的 1/4, 因 此 23C-NMR 的 相对 灵敏 度 仅 是 氢 谱 的 1/5600, 所 以 测定 2C-NMR 是 很 困难 的 。 直 到 20 世纪 70 年 代 PFT-NMR 谱 仪 的 出 现 及 发 展 ,2C 核磁 共振 技术 才 得 到 迅速 发 展 , 成 为 可 进行 常规 测试 的 手段 。 与 1H-NMR 一 样 , 化 学 位 移 、 耦 合 常数 是 2C-NMR 的 重要 参数 。 化 拖 位 移 SC 的 化 学 位 移 5c 也 用 式 〈6. 6) TR. oc HH 的 化 学 位 移 Sa 大 得 多 , 出 现在 较 宽 范 围 内 : 化 学 位 移 为 0 一 250, 而 dn 则 很 少 超过 10。 化 学 位 移 变 化 大 , 意 味 着 它 对 核 所 处 的 化 学 环境 敏感 , 结 构 上 的 微小 变化 , 可 望 在 碳 谱 上 得 到 反映 。 另 一 方面 在 谱 图 中 峰 的 重 琵 要 比 氢 谱 小 得 多 。 氢 谱 和 碳 谱 的 化 学 位 移 有 许多 相似 之 处 , 如 从 高 场 到 低 场 , 碳 谱 共振 位 置 的 顺序 为 饱和 碳 原子 、 烽 碳 原子 、 炳 碳 原子 、 羧 基 碳 原 子 ; AB AWAA, RA, MA. BES 等 。 而 且 , 与 电 负 性 基 团 相连 , 化 学 位 移 都 移 向 低 场 。 这 种 相似 性 对 解析 谱 图 具有 参考 BM. beke. Relist. HOG. Mi. RASH gc 均 有 经 验 计 算 公式 及 相应 的 参 数 1,4) . 6.1.4.2 耦合 常数 SC 的 天 然 丰 度 很 低 , 两 个 相 邻 的 碳 原子 都 是 ”C 的 概率 极 小 , 故 “CC HA AZ 略 。 碳 原子 常 与 氢 原 子 相 连 , 因 此 碳 谱 中 最 主要 的 是 :H-” C 耦合 , 这 种 键 耦合 常数 。 125 。 CJcu) —BURK, 4*100~250Hz.'H-"C 的 耦合 作用 使 ”C 谱 线 裂 分 为 多 重 峰 , 所 以 不 去 耦 的 ”C-NMR , 由 于 多 重 裂 分 而 使 谱 线 相互 交叉 重 琶 , 妨 碍 识别 。 常 规 C 谱 常 采 用 质子 噪声 去 偶 或 称 宽带 去 偶 以 简化 谱 图 , 使 质子 饱和 , 从 而 消除 全 部 质子 与 ”C 的 耦 合 , 在 谱 图 上 得 到 各 个 碳 原 子 的 单 峰 。 去 耦 不 仅 能 简化 谱 图 , 还 由 于 多 重 峰 合 并 为 单 峰 而 提高 了 信 噪 比 。 除 上 述 在 常规 *C 谱 中 最 常用 的 质子 噪声 去 偶 技术 外 , 已 发 展 并 完善 了 多 种 双 共 振 技 术 且 各 有 不 同 的 目的 , 如 质子 偏 共 振 去 偶 用 于 识别 各 种 碳 原子 的 类 型 ; 门 控 去 偶 用 于 测 耦 合 常数 ;选择 去 偶 以 识别 谱 线 归属 等 。 与 :H 谱 类 似 , 谱 线 的 裂 分 数 , 取 决 于 相 邻 耦合 原子 的 自 旋 量 子 数 和 原子 数目 , 谱 线 的 有 裂 分 距离 则 是 ”C 与 邻近 原子 的 耦合 常数 。。C-NMR 中 耦合 常数 的 应 用 虽 远 不 如 - NMR, {HE J 值 仍 有 其 理论 及 实用 价值 , 如 在 谱 图 解析 中 , 利 用 全 耦合 谱 , 根 据 裂 分 情况 及 了 值 可 帮助 标识 谱 线 , 判 断 结构 。 6.1.4.3 WR SC AY Bie dats sh A 2 We A eshR e H 慢 得 多 , 碳 核 的 自 旋 唱 格 弛 驳 时 间 T) Be 长 可 达 数 分 钟 。 弛 豫 时 间 长 , 使 谱 线 强 度 相 对 较 弱 , 而 不 同 种 类 的 碳 原子 的 弛 豫 时 间 相 差 较 大 , 这 就 可 通过 弛 豫 时 间 了 解 更 多 的 结构 信息 和 分 子 运 动情 况 。 如 五 可 提供 分 子 大 小 、 形 状 、 碳 原子 〈 特 别 是 季 碳 原子 ) 的 指认 、 分 子 运动 的 各 向 异性 、 分 子 内 旋转 、 空间 位 阻 、 分 子 RED) 与 溶剂 的 缔 合 等 信息 。 在 常规 的 全 去 耦 碳 谱 中 , 一 种 碳 原 子 只 有 一 条 细 的 谱 线 , 这 使 弛 豫 时 间 的 测定 较 简 单 , 且 所 使 用 的 PFI-NMR 波谱 仪 也 便 于 测定 。 6.1.5 "PRN 核磁 共振 Akay, HEAR. ASR, ee 它们 的 核磁 共振 谱 也 能 得 到 有 用 的 结构 信息 。 这 里 简 述 它们 的 特点 。 3aP 的 同位 素 丰 度 为 100% ,T=1/2,y=10.841 [107。rad/(T。S)]。 它 的 核磁 测试 灵敏 度 约 为 !H KAY 6.7%, 是 2C 核 的 377 倍 。 这 使 2:P NMR 谱 的 观测 比较 容易 , 且 谱 带 尖 锐 , 谱 图 解析 能 得 到 许多 有 用 的 结构 信息 。 许 多 有 机 化 合 物 中 都 含有 磷 , 在 生 命 活性 物质 的 研究 中 , 也 广泛 使 用 2P NMR 技术 , 因 为 测试 灵敏 度 较 高 .2P 吸收 带 化 学 位 移 和 相对 强度 的 变化 常 可 反映 出 生命 活性 物质 的 变化 过 程 ."P 的 化 学 位 移 范 围 为 6250 一 一 460, 通 常 以 85%% 的 磷酸 作为 化 学 位 移 参 比 (60.0). 许多 有 机 化 合 物 中 都 含有 氮 原 子 。 N 的 天 然 丰 度 为 0.36% ,TI 一 1/2,7 一 一 2. 712 [10’ + rad (T.S)],, 在 2.35T 磁场 中 , 共 振 频 率 为 10. 14MHz, 观 测 灵 敏 度 仅 为 2C 核 的 0. 0214。 对 于 天 然 丰 度 的 含 所 样品 , 需 使 用 尽 可 能 高 的 样品 浓度 , 用 10 一 30mm 直径 的 样品 管 , 以 求 在 较 短 的 时 间 里 得 到 良好 信 噪 比 的 谱 图 。 如 果 能 制备 | 表示 两 样本 cA ez; 之 间 的 欧 氏 距离 。 最 大 P, 值 的 类 别 即 是 未 知 样本 的 分 类 判断 结果 。 其 他 类 别 的 已 值 可 以 用 来 显示 分 类 判断 的 准确 性 。 可 以 采用 高 斯 滤波 参数 c 调整 优化 , 以 获取 最 佳 的 分 类 效果 。 相对 于 其 他 分 类 技术 ,CLOUDS 能 直接 对 复杂 高 维 的 数据 建立 分 类 模型 , 而 不 需 要 进行 降 维 。 不 同 于 一 般 的 有 监督 模式 识别 技术 , 该 方法 对 离 群 值 的 存在 不 敏感 , 即 使 某 些 类 别 的 样本 量 非常 少 , 仍 然 可 以 非常 容易 地 进行 分 类 判断 。CLOUDS 还 可 获得 每 一 类 在 贝 叶 斯 网 络 〈Bayesian framework) 结构 下 的 规律 分 布 , 也 可 以 通过 调整 高 斯 滤 波 参 数 , 在 类 别 、 样 本 、 变 量 之 间 获 得 不 同 的 变化 。 每 一 类 的 可 能 性 不 仅 可 以 进行 分 类 , 同 时 还 可 以 对 模型 进行 进一步 的 研究 分 析 。 如 分 类 的 唯一 性 〈uniqueness) uniqueness = ] 一 Pos C710) e 156 = BP, Proll Ps 表示 最 大 和 次 大 的 类 别 可 能 性 。 如 果 uniqueness 趋 近 于 1, 表 明 分 类 结果 非常 可 靠 , 相 反 , 如 果 该 值 趋 近 于 0, 表 明 至 少 还 有 一 类 具有 相当 的 可 能 性 。 对 于 判定 的 某 一 类 , 其 分 类 判断 的 可 信 度 (confidence) 可 通过 下 式 计 算 ; confidence = log Pix) 一 + S) log( Pi (2:)) (7. 18) RiGS, cain 从 式 中 可 以 看 出 , 可 信 度 是 以 对 数 形式 表示 在 训练 集 的 数学 平均 值 中 判定 类 占 最 大 可 能 性 的 比例 。 高 可 信 度 表明 测试 样本 和 训练 集 的 样本 点 接近 , 否 则 则 表明 测试 样本 在 训练 集 的 边界 或 外 面 。 唯 一 性 表示 类 与 类 之 间 的 重大 状态 , 可 信 度 表示 分 类 质量 或 准 确 性 。 | 1.3 数据库 及 专家 系统 代谢 组 学 研究 越 来 越 受 到 人 们 的 关注 , 但 其 信息 的 使 用 和 深入 挖掘 仍 处 于 初级 阶 段 , 导 致 该 技术 对 生命 科学 研究 的 贡献 还 没有 得 到 充分 的 体现 。 生 物 信息 学 在 代谢 组 学 中 应 用 最 大 的 障碍 在 于 缺乏 合适 的 数据 库 以 及 相应 的 数据 交换 格式 , 使 大 量 的 研究 工作 限于 小 范围 交流 , 导 致 研究 结果 难以 共享 并 获得 充分 的 利用 。 这 种 状态 与 多 年 前 基因 组 学 所 遇 到 的 问题 类 似 。 随 着 大 量 国际 合作 的 开展 , 这 些 障 碍 将 逐步 获得 解决 , 就 像 人 类 基因 组 计划 催生 并 促进 了 生物 信息 学 。 2001 4F, 6 大 国际 制药 公司 (Bristol Myers-Squibb, Eli-Lilly, Pharmacia Corpo- ration, Pfizer, Novo-Nordisk 和 Roche) 与 英国 帝国 理工 学 院 合 作 开 展 COMET 计 fj] (Consortium of Metabonomics Technology) 。 该 计划 应 用 代谢 物 组 学 的 方法 评价 药物 毒性 , 进 行 候 选 药物 的 临床 前 毒性 筛选 。 该 项 目的 一 期 已 于 2005 年 完成 。 他 们 采 用 核磁 共振 技术 对 约 150 种 标准 毒素 进行 了 代谢 组 学 研究 , 建 立 了 第 一 个 大 鼠 肝 脏 和 肾 脏 毒性 预测 的 专家 系统 。COMET 计划 的 二 期 工作 已 于 2005 年 底 启 动 , 目 标 是 研究 标 准 毒素 的 分 子 机制 , 进 而 构建 可 预测 性 的 构 效 关系 专家 系统 。 专家 系统 的 构建 包含 三 个 步骤 (1) 研究 对 照 组 的 代谢 指纹 特征 。 将 候选 药物 组 的 代谢 谱 图 与 之 比较 , 如 果 发 生 偏 离 , 表 明代 谢 发 生 了 变化 。 可 能 导致 变化 的 原因 有 毒性 、 疾 病 、 饮 食 差异 、 基 因 改 变 以 及 污染 等 。 采 用 多 变量 分 析 可 快速 区 分 那些 “异常 ”的 样本 。 理 想 的 候选 药物 , 应 该 在 正常 的 范围 内 不 会 引起 较 大 的 代谢 差异 。 然 而 , 对 于 某 些 特殊 情况 , 如 用 于 治疗 肿瘤 的 药物 , 可 接受 的 毒性 程度 应 被 相应 地 放宽 。 (2) 在 第 一 步 检查 样本 是 否 正 常 的 基础 上 , 采 用 代谢 轨迹 法 对 异常 样本 进行 分 析 , 确定 药物 损伤 随时 间 的 变化 规律 。 具 有 相近 代谢 轨迹 的 药物 通常 对 相同 器 官 具 有 毒性 或 有 相近 的 毒性 机 制 。 采 用 更 为 准确 的 方法 〈 如 PLS) 可 用 于 描述 病例 损伤 的 进展 。 (3) 对 于 代谢 异常 的 样本 , 进 一 步 研究 其 与 正常 样本 间 的 差异 。 这 种 类 别 之 间 谱 图 差异 可 以 通过 人 符 载 矩阵 或 变异 系数 来 获得 。 直 接 采 用 核磁 的 信息 , 或 通过 进一步 的 代谢 物 识 别 手 段 (如 HPLC-MS-NMR) 确定 生物 标志 物 (biomarker) 。 上 述 信息 最 终 将 用 于 药物 毒性 的 机 制 研 究 。 相 似 的 专家 系统 也 可 采用 其 他 分 析 手 段 , 如 基于 HPLC 的 细菌 类 别 分 析 的 专家 系统 等 23 。 7 代谢 组 学 得 到 的 信息 是 生物 样本 中 的 小 分 子 组 分 定性 、 定 量 以 及 浓度 变化 的 信息 。 人 类 的 小 分 子 代 谢 产 物 超过 2500 种 , 现 在 已 经 有 了 多 个 有 关 小 分 子 的 生化 信息 数据 库 , 不 过 这 些 数 据 库 都 有 一 些 不 足 之 处 , 还 不 能 满足 代谢 组 学 研究 的 要 求 ,. 还 要 经 过 不 断 的 完善 。 另 一 方面 , 代 谢 组 学 可 以 被 认为 是 整合 系统 生物 学 的 一 个 关键 , 因 为 它 是 预测 表 型 的 一 种 直接 量度 。 代 谢 组 和 和 蛋 白 质 组、 转录 组 的 相互 关系 研究 为 基因 组 和 表 型 组 的 整合 提供 了 基础 , 将 形成 对 生物 体 研 究 的 一 个 完整 的 环 路 。 生 物 信息 学 面临 的 难题 是 如 何 将 新 兴 的 系统 生物 学 领域 组 织 和 整合 这 些 不 同类 型 的 数据 。 代谢 组 学 的 生物 信息 学 研究 不 是 大 量 代 谢 分 析 结 果 和 信息 的 累积 , 其 真正 意义 在 于 要 理解 这 些 信 息 中 所 蕴含 的 意义 , 也 就 是 了 解 各 种 小 分 子 在 生物 体内 的 生物 功能 、 代 谢 途径 与 网 络 〈 包 括 与 之 相关 的 酶 、 蛋 日 质 以 及 基因 ) 。 代 谢 组 学 数据 库 发 展 较 快 , 以 下 列 出 一 些 常 用 代谢 组 学 研究 相关 的 网 站 供 读者 参考 〈 表 7-1)。 表 7-1 部 分 代谢 组 学 .生物 通路 相关 网 站 名 称 地 址 说 明 ArMet http: //www. armet. org 一 个 涵盖 大 部 分 植物 代谢 组 学 研究 工作 的 ”网 站 DOME http://medicago. vbi. vt. edu/dome. html 有 许多 关于 植物 代谢 物 的 原始 数据 和 分 析 结果 ,以 及 分 子 生 物 学 研究 MetaCyc http: //metacyc. org 一 个 关于 代谢 物 的 数据 库 , 阐述 了 超过 150 种 生物 体 中 的 代谢 途径 ,包含 了 从 大 量 文 献 和 网 上 资源 中 得 到 的 代谢 途径 、 反 应 、` 酶 和 底 物 的 资料 Metcore http: //www. genego. com 人 类 信和 号 表达 调控 以 及 代谢 物 的 生物 通路 数据 库 PathArt www. jubilantbiosys. com. pd. htm 蛋白 质 相 互 作用 、 代 谢 通路 以 及 生物 活性 分 子 数 据 库 Pathway Analysis http: //www. ingenuity. com ‘ 蛋白 质 相互 作用 及 生化 网 络 Protein Lounge http: //www. proteinlounge. com 蛋白 质 、 代 谢 物 及 生物 通路 数据 库 PathwayAssist http: //ariadnegenomics. com 生化 网 络 及 代谢 通路 MMP http://www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/en- 对 主要 代谢 途径 及 涉及 的 关键 酶 进行 了 详 zyme 尽 的 描述 EcoCyc http: //biocyc. org/ecocyc/ KiB BA CK12) 基因 组 、 基 因 产 物 和 代谢 EpoDB http://www. cbil. upenn. edu/EpoDB/ 人 红细胞 生成 过 程 中 的 基因 表达 京都 基因 和 基因 组 http://www. genome. ad. jp/kegg/ 关于 代谢 调节 和 通路 的 数据 库 百科 全 书 (KEGG) LIGAND http://www. genome. ad. jp/dbget/lig- 酶 的 配 体 、 底 物 和 反应 and. html RegulonDB http: //kinich. cifn. unam. mx: 大 肠 杆菌 转录 调节 和 操纵 子 结构 8850/db/regulondb_ intro. frameset UM-BBD http: //www. labmed. umn. edu/umbbd/ 微生物 生物 催化 反应 和 生物 降解 通路 « 158 « FE 一 一 续 表 名 称 地 址 说 明 WIT2 http: //wit. mes. anl. gov/WIT2/ 功能 治疗 和 代谢 模型 发 育 的 集成 系统 BioPAX http: //www. biopax. org 生物 通路 交互 语言 平台 BIND http: //www. bind. ca ” ”生物 分 子 相互 作用 数据 库 LipidSearch http://www. lipidsearch. jp 酯 类 代谢 物 数 据 库 http: //www. metabolome. jp HMDB http: //www. hmdb. ca/ 人 体 低 分 子 质量 代谢 物 数据 库 参考 文 献 {1] Johan T, Elaine H,Torbjorn L. 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Sci., 1994, 32: 219 * 160 。 538 it ” 类 脂 和 类 脂 组 学 类 脂 是 细胞 膜 的 重要 组 成 部 分 , 在 细胞 功能 中 具有 很 重要 的 作用 。 首 先 , 类 脂 分 子 通过 形成 脂 双 层 使 细胞 具有 完整 性 和 相对 独立 性 , 这 对 于 生命 过 程 是 很 重要 的 。 第 二 , 类 脂 能 够 为 膜 蛋白 功能 的 实现 和 相互 作用 提供 合适 的 玻 水 环境 。 第 三 , 类 脂 分 子 通过 多 种 酶 的 作用 可 产生 第 二 信使 一 。 许 多 类 脂 分 子 , 如 类 花生 四 烯 酸 、 溶 血 磷脂 分 子 、 甘 WHR (DAG)、 神 经 酰胺 、 磷 脂 酸 等 参与 了 细胞 信号 转 导 所 。 例 如 , 缩 醛 磷脂 (plasmenylethanolamine, PlsEtn) 4 #8 Mt Z. ZR (ethanolamine glycerophospholip- id, PE) 的 一 个 亚 种 类 , 在 电 生理 活动 性 组 织 中 含量 丰富 〈 包 括 心脏 亚 细 胞 膜 和 神经 元 细胞 膜 )。 这 些 磷脂 分 子 是 花生 四 烯 酸 的 前 体 , 在 促进 细胞 膜 融合 和 保护 细胞 抗 氧 化 方面 有 重要 的 作用 5 。 甘 油 三 酯 分 子 严格 地 讲 不 属于 类 脂 , 但 其 代谢 过 程 却 与 类 脂 有 部 分 关联 , 是 心血 管 疾病 的 独立 危险 因子 局 。 细胞 中 存在 数 以 千 计 的 类 脂 分 子 , 它 们 以 不 同形 式 与 周围 分 子 发 生 相互 作 用 。 最 近 人 们 研究 发 现 , 膜 上 脂 类 并 不 是 均匀 分 布 的 , 而 是 存在 一 些 “ 膜 脂 微 区 域 ”, 如 脂 和 (lipid raft) 和 膜 小 止 〈caveolae) 〈 图 8-1) 。 脂 惩 为 细胞 膜 脂 双 层 内 的 功能 性 区 域 , 富 含 糖 脂 、 鞘 磷脂 和 胆固醇 。 这 些 功 能 性 区 域 包 含 许 多 细胞 信和 号 转 导 必需 的 蛋白 质 组 分 巴 。 在 多 数 哺乳 细胞 中 , 磷 脂 分 子 约 占 整 个 脂 类 分 子 的 60% 〈 摩 尔 比 ), 糖 脂 类 / 神 AeA HBA TAY 10%; 非 极 性 脂 〈 包 括 甘 油 三 酯 和 胆固醇 ) 在 不 同 细胞 类 型 和 亚 细 胞 间隔 中 分 布 范 围 为 0.1% 一 40%。 类 脂 代谢 物 〈 如 游离 脂肪 酸 、 溶 血 磷 脂 、 甘 油 二 酯 、 神 经 酰胺 等 ) 占 整个 细胞 类 脂 分 子 的 比例 不 到 5%, 但 它们 在 机 体 病变 条 件 下 能 够 聚集 并 产生 有 害 的 病理 特征 。 图 8-1 细胞 膜 微 区 域 脂 答 和 膜 小 上 四 的 构成 类 脂 组 学 主要 研究 生物 体 受 外 界 刺激 和 疾病 干扰 后 脂 类 、 脂 类 代谢 物 以 及 与 脂 类 分 子 相 互 作 用 的 因子 的 变化 。 尽 管 类 脂 组 学 是 一 个 新 发 展 起 来 的 领域 , 其 在 疾病 研究 中 的 重要 性 可 以 追溯 到 20 年 前 "2 。 由 于 分 析 技 术 的 局 限 性 , 类 脂 分 子 的 研究 受到 了 很 e 161 « 大 的 限制 。 因 此 , 人 类 仍 需 发 展 新 的 技术 和 方法 〈 如 亲 和 探 针 、 生 物 信息 学 等 ) 以 发 现 新 的 类 脂 分 子 和 可 能 的 代谢 通路 。 8.1 类 脂 分 子 的 结构 和 功能 作为 生命 的 基本 单位 , 哺 乳 细 胞 中 包含 着 众多 细胞 器 〈 如 线粒体 、 高 尔 基 体 、 内 质 网 和 过 氧化 物 酶 体 ) , 每 个 细胞 器 都 有 其 特定 的 功能 。 在 每 个 亚 细 胞 膜 上 都 存在 着 微 区 域 (如 质 膜 中 有 细胞 膜 小 上 四 和 脂 答 ), 它 们 同样 也 调控 着 哺乳 细胞 的 结构 。 哺 乳 细胞 膜 是 由 蛋白 质 和 类 脂 分 子 组 成 的 , 其 中 蛋白 质 占 了 膜 质量 的 70% , 其 余 为 类 脂 分 子 。 数 以 千 计 的 类 脂 分 子 组 成 了 生物 膜 脂 双 层 。 这 些 类 脂 分 子 都 具有 一 个 统一 的 特征 一 一 属于 两 性 分 子 , 这 是 因为 它们 都 具有 亲 水 的 极 性 头 部 和 非 极 性 的 疏水 层 , 这 些 疏 水 区 域 使 类 脂 分 子 具 有 不 同 的 生理 特性 , 从 而 调节 着 细胞 功能 。 脂 双 层 的 两 侧 中 , 类 脂 分 子 的 组 分 是 不 同 的 。 其 中 , 磷 脂 酰 胆 碱 〈phosphatidyl- choline, PC), #HABHBEHE (sphingomyelin, SM) 和 胆固醇 主要 位 于 膜 外 侧面 , 而 磷 脂 酰 乙醇 胺 〈phosphatidylethanolamine,PE) 、 磷 脂 酰 肌 醇 (phosphatidylinositol, PD 和 磷脂 酰 丝氨酸 〈phatidylserine,PS) 主要 位 于 膜 胞 浆 侧 。 多 个 亚 细 胞 器 和 膜 微 区 域 的 存在 、 类 脂 分 子 的 不 均匀 分 布 以 及 类 脂 分 子 相互 作用 的 内 在 动力 学 使 得 类 脂 组 学 的 研 究 更 具有 吸引 力 , 也 更 富有 挑战 性 。 因 此 , 类 脂 组 学 成 为 一 个 新 兴 和 鞍 勃 发 展 的 研究 领 域 , 在 人 类 疾病 研究 中 将 基因 组 学 和 蛋白质 组 学 结合 起 来 。 细胞 中 的 类 脂 分 子 可 大 致 分 为 三 大 类 : 非 极 性 类 脂 、 极 性 类 脂 和 类 脂 代谢 物 。 8.1.1 非 极 性 类 脂 非 极 性 类 脂 分 子 主要 包括 胆固醇 和 胆固醇 酯 〈 图 8-2A, 图 8-2B) 以 及 甘油 三 酯 (TAG) (图 8-2C) , 其 含量 高 低 在 很 大 程度 上 取决 于 细胞 类 型 和 亚 细 胞 部 位 。 这 些 类 脂 分 子 含 有 小 的 或 者 弱 极 性 部 分 以 及 很 大 部 分 的 疏水 区 域 。 不 同 细胞 部 位 或 不 同 细 胞 类 型 中 的 胆固醇 含量 占 哺乳 质 膜 类 脂 分 子 的 0 一 40%55 , 这 对 膜 的 生理 功能 有 很 大 影响 。 胆 人 而 非 酯 化 的 胆固醇 主要 存在 于 质 neon, 0 nto 64 ° Bail ae 图 8-2 ”胆固醇 〈(A) 、 胆 固 醇 酯 (CB) 和 甘油 三 酯 (CO) 的 结构 R、Ri 、Rz 和 Rs 为 脂肪 链 , 在 天 然 化 合 物 中 , 脂 肪 链 通常 包含 13 一 23 个 碳 原子 ,0 一 6 个 双 键 D3 2 = e _— boo cee —— eg bom a. eer —s : yell be Ca 8.1.2 极 性 类 脂 8.1.2.1 磷脂 PH IG EE LIE HUBRIS. RANE AVHRR. 甘油 磷脂 主要 存在 于 真 核 细胞 中 , 约 占 类 脂 分 子 的 60%% 。 甘 油 磷 脂 包括 甘油 骨架 、 两 个 脂肪 酸 及 磷酸 化 。 oo 1 的 醇 , 它 的 结构 如 图 8-3 所 示 , 甘 油分 子 的 中 央 碳 原 oo en 子 是 不 对 称 的 。 天 然 的 磷酸 甘油 酯 都 具有 相同 的 立体 a eae 化 学 构 型 , 属 于 世系 。 根 据 IUPAC-IUB 国际 委员 会 Ho 制定 的 脂 质 命 名 原则 , 磷 酸 甘油 酯 中 如 X 为 胆 碱 , 图 8-3 ”甘油 磷脂 的 结构 则 命名 为 : 1,2- 二 酰基 -sz- 甘 油 -3- 磷 酸 胆 碱 , 又 称 I-3- 磷 酸 胆 碱 , 俗 名 卵 磷 脂 。 图 8-3 A Ri, Ro 代表 脂肪 酸 链 ,X 为 连接 在 磷酸 上 的 小 分 子 化 合 物 ;, 名称 中 sz 为 立体 化 学 专 一 编号 。 磷 脂 因 含有 磷酸 基 团 而 具有 一 个 杀 水 头 部 即 极 性 头 基 (polar head) , 因 含有 两 条 长 脂肪 酸 链 而 具有 两 条 玻 水 尾部 (nonpo- lar tail), , 磷 脂 的 这 种 结构 使 细胞 膜 中 的 脂 质 呈 双 分 子 层 排 列 , 进 而 形成 细胞 骨架 结构 的 基础 。 磷 脂 是 含有 磷酸 基 团 的 脂 , 主 要 有 磷脂 酰 胆 碱 〈 卵 磷脂 ,PC) 、 磷 脂 酰 丝氨酸 (PS) 及 磷脂 酰 乙醇 胺 〈 脑 磷脂 ,PE) , 其 中 以 卵 磷 脂 在 细胞 膜 中 的 含量 最 高 。 常 见 的 甘油 磷脂 如 表 8-1 所 示 。 每 种 磷酸 甘油 酯 都 不 是 单纯 的 化 合 物 , 如 极 性 头 基 的 不 同 、 碳 链 长 短 的 不 同和 不 饱和 键 多 少 的 不 同 , 都 使 得 磷酸 甘油 酯 的 组 成 异彩 纷呈 。 绝 大 多 数 磷 酸 甘 油 酯 C-1 位 上 以 饱和 脂肪 酸 为 主 , 而 C-2 位 上 不 饱和 脂肪 酸 居 多 。 图 8-4 是 一 种 PE 磷脂 分 子 的 立体 结构 示意 图 。 表 8-1 几 种 主要 磷酸 甘油 酯 的 极 性 头 结构 类 别 X 名 称 已 已 NT eee 磷脂 酰 胆 碱 ( 卵 磷脂 ) SN phosphatidylcholine (PC) HO 十 EC n= 溶血 磷脂 酰 胆 碱 ( 卵 磷脂 ) HAR=HRR=H lyso-phosphatidylcholine (lyso-PC) 1 2 a eae PENI. BI a phosphatidylethanolamine (PE) BO=-H,c_ NH 磷脂 酰 丝氨酸 phosphatidylserine (PS) 163。 续 表 X 名 称 磷脂 酰 肌 醇 phosphatidylinositol (PI) OH Aon 磷脂 酰 甘油 HO—-H,C phosphatidylglycerol (PG) elias HO’: Ose OCH Pe ie BRAS © HCOCOR diphosphatidylglycerol, cardiolipin (CA) ROCO CH, Bra phosphatidic acid (PA) 图 8-4 PE 磷脂 分 子 的 立体 结构 图 磷酸 甘油 酯 分 子 中 的 碳 氢 链 并 不 是 无 例外 地 以 酯 键 连接 在 甘油 的 羟基 上 的 。 缩 醛 磷 脂 的 甘油 分 子 中 第 一 个 碳 原子 由 顺 式 烽 醚 键 连接 碳 氢 链 , 第 二 个 碳 原子 以 酯 键 连接 长 链 。164 。 脂肪 酸 。 另 外 还 有 一 种 醚 磷脂 是 缩 醛 磷脂 的 还 原 产物 , 甘 油分 子 的 C-1 以 醚 的 结构 连接 碳 氢 链 , 这 种 化 合 物 比 较 罕见 。 基 于 甘油 骨架 so] 位 连接 的 脂 酰 链 的 共 价 键 类 型 , 每 种 磷脂 又 可 以 分 为 三 个 亚 种 类 , 即 二 酰基 式 、 缩 醛 式 和 烷 酰 基 式 磷脂 CAI 8-5)。 这 些 亚 种 类 主要 发 现 于 PE 和 PC 类 磷脂 分 子 中 。 在 多 数 细 胞 膜 类 脂 分 子 中 , 二 酰基 式 亚 种 类 是 主要 的 磷脂 种 类 。 然 而 在 多 数 具 电 生 理 活性 细胞 的 膜 中 , 如 肌纤维 膜 和 神经 原 细胞 膜 中 , 缩 醛 式 亚 种 类 是 主要 的 类 脂 分 子 550 。 磷 脂 失去 一 个 脂肪 酸 后 的 产物 叫 溶血 磷脂 , 溶血 磷脂 是 一 个 表面 活性 物质 , 能 够 使 红细胞 溶解 , 对 进入 肠 道 食物 中 的 脂 质 , 它 又 是 人 vee O i ang R, ll en ee, ec 7 a 9 二 酰基 础 脂 酰 乙 醇 胶 H,C—O—P— OCH,CH,NH, (diacyl-PE ) ae @ H,C+O—CH=CH-4R, ec i we RE ZEB H,C—O—P— OCH,CH.NH, ae 由 CC 本 证 请 不 全 卫 SALAD RZ RY HC_o- p— OCH,CH,NH, 胺 (alkylacyl -PE) | GQ: 图 8-5 BEAR: Z. BP APR AER 其 分 类 基于 甘油 骨架 sre] 位 脂肪 链 的 连接 在 多 数 真 核 细 胞 膜 中 ,PC 和 PE 的 比例 约 为 3 : 2, 二 者 之 和 占 整 个 磷脂 分 子 的 75%%。 在 多 数 原核 细胞 膜 中 ,PC 含量 很 低 , 甚 至 没有 , 而 PE、PG 和 CA 是 主要 的 磷 脂 种 类 509 。 在 膜 上 , 磷 脂 分 子 呈 不 对 称 分 布 。 例 如 , 在 质 膜 中 ,PC 主要 位 于 胞 外 侧 , 而 PE 和 PS 主要 位 于 胞 内 侧 P5 。 磷脂 分 子 的 复杂 性 不 仅仅 与 不 同 的 极 性 头 部 和 sr] 位 脂 酰 链 类 型 的 多 样 性 有 关 , 而 且 与 链 长 得、 不 饱和 双 键 的 数量 和 位 置 有 关 。 从 理论 上 讲 , 可 以 有 数 以 千 计 的 不 同 磷 脂 分 子 存在 , 老 鼠 B 细胞 中 就 存在 500 多 种 磷脂 分 子 。 8.1.2.2 BARR 极 性 类 脂 分 子 的 第 二 大 类 是 鞘 脂 类 , 它 们 包含 一 个 畏 氨 醇 骨架 或 者 其 类 似 物 , 在 多 数 脑 细胞 中 , 它 们 占 整个 类 脂 分 子 的 5% 一 10%。 令 人 惊异 的 是 , 鞘 脂 类 在 人 大 脑 白质 中 占 整个 类 脂 分 子 的 30%"" 。 基 于 连接 到 神经 酰胺 〈 即 N- 酰 基 博 氨 醇 ) 上 的 极 性 头 基 ANA], SHARAS AT oN AR 〈SM) 、 脑 苷 脂 、 葡 糖苷 〈 脂 ) 酰 鞘 氨 醇 、 乳 糖苷 〈 脂 ) 酰 鞘 氨 醇 、 硫 苷 脂 和 其 他 包含 多 糖 环 的 鞘 糖 脂 〈 图 8-6) 。 对 于 含 多 糖 环 的 鞘 糖 脂 , 其 更 为 详细 的 结构 见 文献 L17]。 在 哺乳 动物 中 , 含 18 个 碳 环 骨 架 的 畏 氨 醇 是 主要 的 萌 脂 类 , 。 165 。 但 同时 也 含有 少量 的 链 长 度 为 14 一 22 个 碳 原子 的 鞘 氨 醇 类 似 物 。 A NH—COR bx yr SY (CH) 2CH; x 2 ste ae OH B x— FS RRS AS HH 一 神经 酰胺 I oe PAAR o ee OH O Aer A (EFL RD HO OH aon OH O Pitt a Rt AE AL -0,S0 OH | Gle — Me RRS GalB1-4Gle 一 AR RARE NeuSAca2-3Galf1-4Gle 一 神经 节 苷 脂 GM3 图 8-6 神经 鞘 磷脂 的 基本 结构 Glc、Gal 和 NeuSAc 分 别 代表 葡萄 糖 、 半 乳糖 和 N-Z HAAR) 8.1.2.3 ABA 极 性 类 脂 的 第 三 大 类 是 糖 脂 类 , 包 括 鞘 糖 脂 和 糖 甘油 酯 。 这 两 类 糖 脂 的 主要 区 别 在 于 下 水 中 心 。 前 者 包含 一 个 神经 酰胺 骨架 , 后 者 包含 一 个 二 酯 甘油 骨架 。 在 一 些 细胞 中 , 糖 脂 类 约 占 整个 类 脂 分 子 的 10%% 。 8.1.3 类 脂 代 谢 物 类 脂 代谢 物 是 类 脂 分 子 合成 过 程 中 或 代谢 过 程 中 在 酶 的 作用 下 产生 的 。 在 正常 生理 条 件 下 , 这 些 代谢 物 分 子 在 整个 类 脂 分 子 中 所 占 比 例 不 大 , 但 数量 还 是 不 小 的 。 通 常 的 代谢 物 包 括 长 链 酰 基辅 酶 A、 长 链 酰 基 肉 碱 、 非 酯 化 的 脂肪 酸 、 神 经 酰胺 、 溶 血 磷脂 分 子 、 类 花生 酸 、 甘 油 二 酯 、 鞘 所 醇 -3- 磷 酸 盐 等 。 许 多 代谢 物 是 具有 生理 活性 的 第 二 信 使 , 并 且 在 许多 情况 下 与 疾病 的 发 生 有 关 55 。 8.2 类 脂 的 分 子 生物 学 利用 生物 体 模型 , 人 们 通过 遗传 方法 、 细 胞 学 方法 和 生物 化 学 方法 实验 了 解 了 类 脂 分 子 的 生物 合成 和 功能 。 在 过 去 的 近 二 十 年 里 , 作 用 于 类 脂 分 子 及 其 类 脂 效应 分 子 的 酶 。 166 + Co in nan TEE Sel es ENA apa we ea ma 系统 的 特征 引起 了 人 们 对 类 脂 分 子 研究 的 关注 。 8.2.1 表面 化 学 和 界面 催化 在 生物 体 中 , 许 多 类 脂 分 子 聚 集 形成 大 分 子 集合 体 , 如 人 体 水 环境 中 的 脂 双 层 。 这 些 聚 集体 除了 类 脂 分 子 外 , 当 然 还 包括 蛋白 质 分 子 〈 如 脂 蛋 白 )。 在 这 些 集合 体 中 , 类 脂 分 子 的 极 性 部 分 与 水 接触 , 而 非 极 性 脂 酰 部 分 则 形成 疏水 中 心 〈 图 8-7)。 这 些 独 特 的 生物 性 质 和 表面 化 学 对 类 脂 功能 的 实现 具有 重要 的 意义 。 了 解 脂 酶 、 脂 激酶 和 磷酸 酶 这 些 水 溶性 酶 结构 和 酶 动力 学 及 它们 与 非 水 溶性 底 物 〈 如 类 脂 分 子 ) 的 识别 是 十 分 必要 的 。“ 界 面 催 化 ”需要 选择 靶 标 分 子 , 如 与 类 脂 分 子 表 面 结合 的 酶 以 及 有 效 的 识别 帮 物 。 因 作 用 酶 的 机 制 不 同 , 表 面 化 学 的 研究 需要 特殊 考虑 类 脂 酶 的 药理 学 靶 标 分 子 。 8.2.2 膜 类 脂 分 子 是 信号 转 导 分 子 的 前 体 在 很 长 一 段 时 间 内 , 人 们 对 生物 膜 中 类 脂 分 子 的 认识 仅 限于 其 结构 功能 。 实 际 上 , 通过 测定 几何 特性 , 类 脂 分 子 聚 集 形 成 的 大 分 子 至 少 也 是 类 脂 分 子 的 一 部 分 。 例 如 , PC 类 磷脂 分 子 在 空间 形成 圆 桶 式 的 空间 结构 , 当 排列 形成 大 分 子 集合 体 时 , 将 采取 双 分 子 层 的 结构 形式 。 而 PE 类 磷脂 分 子 通 过 减 小 极 性 头 基 的 尺寸 和 水 合作 用 倾向 形成 六 PATCH?!) 。 这 些 类 脂 分 子 聚 集体 的 特征 对 生物 膜 的 动力 学 , 如 膜 融 合 22) 和 形成 特定 的 pK Sa) 有 着 深远 意义 。 膜 类 脂 分 子 作为 第 二 信使 前 体 的 发 现 极 大 地 改变 了 人 们 对 类 脂 分 子 作 用 的 看 法 。 例 如 , 磷 脂 酶 能 够 将 磷脂 酰 肌 醇 -4,5- 二 磷酸 [PI (4, 5) P2] 水 解 产 生 第 二 信使 分 子 二 酰 甘 油 (DG). 、 肌 醇 -1,4,5- 三 磷酸 CIP (1,4,5) P3] 和 花生 四 烯 酸 , 这 些 分 子 本 身 是 生物 活性 分 子 的 前 体 。DG 通过 磷酸 化 形成 磷脂 酸 (PA), i PA 不 仅 是 磷脂 合 的 一 个 重要 中 间 体 , 还 是 酶 功能 和 膜 脂 双 层 结构 的 调节 器 。IP (1, 4, 5) P3 通过 复杂 的 酶 系 代谢 产生 不 同 聚 磷酸 化 肌 醇 。 花 生 四 烯 酸 是 炎症 过 程 中 有 重要 作用 的 类 花生 酸 的 前 体 。 鞘 脂 类 是 另外 一 种 高 活性 的 膜 类 脂 。 神 经 酰胺 调节 着 细胞 的 生长 和 凋 亡 忆 ] 。 鞘 氨 醇 -1- 磷 酸 通过 结合 特定 的 受 体 调节 着 免疫 细胞 的 迁移 。 8.2.3 类 脂 -蛋白 质 相 互 作 用 除了 是 第 二 信使 分 子 的 前 体 , 许 多 膜 类 脂 分 子 还 具有 信和 号 转 导 作用 。 磷 酸 肌 醇 分 子 〈 肌 醇 磷酸 化 的 衍生 物 ,PI) 是 一 类 重要 的 信号 分 子 , 参 与 了 许多 细胞 过 程 , 包 括 钙 离 子 的 动态 平衡 、 膜 运输 和 细胞 骨架 动力 学 ” 。 实 际 上 , 了 解 类 脂 分 子 的 生物 学 对 了 解 类 脂 分 子 在 生物 体 中 的 调节 作用 有 很 重要 的 指导 意义 。 研 究 发 现 , 一 些 蛋 白质 模块 可 特 定 地 与 磷酸 化 的 肌 醇 头 基 作用 , 如 血小板 -白细胞 C 激酶 底 物 同 源 物 、PX 和 FYVE Bt?) 〈 图 8-7)。 在 过 去 的 5 一 10 年 间 , 尽 管 人 们 对 类 脂 分 子 识别 的 准确 机 制 〈《 有 可 能 涉及 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作用 、 蛋 白质- 类 脂 相互 作用 ) 知之 甚 少 , 但 有 关 这 些 模块 的 研 究 仍 然 取 得 了 一 定 进展 并 成 为 研究 活 细 胞 中 类 脂 分 子 动力 学 的 一 种 有 效 工具 5: 。 利 用 - 167 。 PT a ar ee 这 些 新 工具 , 开 展 包 括 酵 母 、 果 蝇 、 蠕 虫 和 老鼠 在 内 的 一 些 生 物 模型 的 研究 , 大 大 拓宽 了 人 们 对 PI 的 生物 学 认识 , 尤 其 是 亚 细 胞 膜 的 划分 。 界面 结合 〔 如 结 完全 相互 作用 《如 SHA. 通道 、 细 胞 色素 c) CD1la- 脂 肽 膜 相 互 作用 环 +} “my ra \ ~ Zn | % oo fs , ae Pl P Pl Al8-7 ”类 脂 的 分 子 生物 学 A. 类 脂 和 和 蛋白质 在 膜 双 层 内 或 双 层 外 形成 的 单 层 聚集 体 , 如 脂 蛋 白 和 胶 束 。 其 中 界面 结 合 是 类 脂 或 类 脂 效应 物 和 和 蛋白质 HM) 相互 作用 的 重要 形式 。B. 在 分 子 水 平 上 看 类 脂 和 蛋白 质 相 互 作 用 形式 D9] 8.3 类 脂 研 究 中 的 分 析 方 法 8.3.1 类 脂 的 提取 方法 ath’ P3 很 多 提取 方法 , 如 正己 烷 / 异 两 醇 体 系 2] 、 异 两 醇 体系 5 、 甲 醇 /氯仿 体系 2 都 可 以 用 于 类 脂 的 提取 , 然 而 一 般 的 提取 策略 是 根据 目标 类 脂 化 合 物 优选 的 提取 技术 。 到 目 前 为 止 , 类 脂 提取 最 为 常见 的 提取 方法 仍 是 甲醇 /氯仿 体系 , 这 种 提取 方法 是 由 Floch 和 他 的 合作 者 " 国 首 先 使 用 的 , 后 来 Bligh 和 Dyer 对 该 体系 进行 了 修饰 和 优化 。 这 种 提 取 方 法 对 于 全 组 织 、 体 液 以 及 细胞 中 类 脂 的 提取 都 是 很 方便 实用 的 。 对 类 脂 提取 过 程 进 行 更 为 细致 调整 的 一 个 例子 就 是 从 红细胞 中 提取 类 脂 , 由 于 血红 蛋白 在 甲醇 溶剂 中 有 一 定 的 溶解 度 , 因 而 在 提取 过 程 中 为 了 降低 血红 蛋白 , 异 丙 醇 代替 了 甲醇 6 。 另 外 一 个 。 168 。 例子 是 从 亲 水 神经 节 苷 脂 中 分 离 类 脂 类 化 合 物 , 为 了 降低 提取 过 程 中 类 脂 的 氧化 , 用 氢 对 溶剂 进行 脱 气 2] 。 提 取 系 统 的 pH 有 时 也 需要 考虑 , 某 些 类 脂 如 缩 醛 磷脂 在 酸性 环 境 中 很 不 稳定 。 而 有 时 酸性 的 有 机 溶剂 系统 对 提高 一 些 酸性 类 脂 的 提取 效率 是 必要 的 , 如 磷脂 酸 (PA) 和 溶血 磷脂 酸 的 提取 。 8. 3.2 类 脂 的 分 析 方 法 人 LL) 在 类 脂 分 析 中 ,TLC 是 一 种 比较 古老 的 方法 , 最 早 是 由 Arvidson 提出 的 , 它 利 用 相对 非 专 一 性 的 检测 技术 如 通过 喷 显 剂 对 磷 进 行 可 视 化 , 分 离 和 检测 各 种 各 样 的 类 脂 种 类 。 直 到 今天 这 种 方法 仍然 被 广泛 采用 , 但 样品 需要 量 大 , 测 定 的 灵敏 度 和 分 辩 率 都 很 低 ; FFA TLC 板 上 的 斑点 在 切除 过 程 中 极 易 发 生 不 饱和 类 脂 的 氧化 , 破 坏 了 部 分 类 脂 的 结构 。 . 8.3.2.2 高 效 液 相 色谱 法 〈HPLC) HPLC 已 经 广泛 地 用 于 分 离 不 同 的 类 脂 种 类 , 检 测 方法 有 紫外 吸收 CUV) 87, 荧光 5 、 折 光 率 ) 、 火 焰 电 离 5 以 及 蒸发 光 散 射 (ELSD)r 。 由 于 类 脂 较 弱 的 发 色 官能 团 只 在 200 一 210nm 区 域 有 吸收 , 因 而 大 大 限制 了 紫外 检测 的 灵敏 度 。 使 用 氧化 甲 氧 蔡 两 酸 作为 衍生 化 试剂 可 以 提高 类 脂 在 UV 分 析 中 的 灵敏 度 ' , 但 是 这 种 方法 费时 费力 , 不 适 于 类 脂 的 高 通 量 分 析 。ELSD 可 用 于 梯度 洗 脱 和 定量 分 析 , 然 而 它 的 非 线性 响应 需要 很 小 心地 校正 。 最 近 ,E.,Caudron 等 59 利 用 荧光 探 针 辅助 柱 后 检测 脂 类 , 不 需要 衍生 这 一 繁琐 的 步骤 , 然 而 不 同类 脂 的 识别 仍 是 建立 在 保留 行为 与 已 知 标准 物 比 较 的 基础 上 , 从 而 限制 了 其 在 类 脂 脂 酰 取代 基 测 定 方面 的 应 用 。 8. 3.2.3 质谱 法 1. “传统 ”的 电离 技术 质谱 (mass spectrometry, MS) 以 其 较 高 的 灵敏 度 、 专 一 性 、 简 单 性 , 在 类 脂 组 分 测定 方面 发 挥 了 巨大 的 优势 。 在 过 去 的 几 十 年 里 , 不 同 的 MS 电离 方法 在 极 性 类 脂 的 We HRS SHEE. ARR FDO, 、 化 学 电离 (CD ARR TRG 电离 (FAB)5] 。 然 而 , 直 到 近年 来 MS 才 大 量 用 于 类 脂 方面 的 研究 。 其 主要 原因 是 实 验方 法 的 局 限 性 , 如 由 于 程序 的 复杂 导致 较 低 的 重 现 性 (FED) 、 需 要 特定 的 衍生 化 步骤 《CD 、 产 生 过 多 的 脂 类 分 子 片段 、 混 合 样品 中 基质 背景 信号 的 干扰 导致 较 低 的 灵敏 度 CFAB), 再 加 上 生物 样品 本 身 的 复杂 性 , 这 些 都 使 得 MS 在 类 脂 组 分 分 析 上 的 应 用 受到 了 很 大 限制 。 气 相 色 谱 -质谱 联 用 〈GC-MS) 在 类 脂 分 析 中 是 一 种 很 重要 的 分 析 工 具 , 但 样品 在 分 析 之 前 需 水 解 成 游离 脂肪 酸 , 再 将 这 些 游离 脂肪 酸 进 行 三 甲 硅 烷 基 化 或 甲 酯 化 以 提高 它们 的 挥发 性 , 由 于 在 实际 分 析 中 测定 的 是 酯 化 的 脂肪 酸 , 脂 肪 酸 的 有 关 主 要 位 点 信息 在 测定 过 程 中 丢失 了 。 。 169 。 “ 软 ” 离 子 源 的 引入 , 如 电 喷 雾 质 谱 (ESLMS)、 基 质 辅助 激光 解吸 电离 质谱 (MALDIMS) , 大 大 促进 了 MS 在 类 脂 研 究 中 的 应 用 。 2. FAME is (ESI-MS) ESI-MS 是 由 Fenn “7 REREN, CAD EMATFASILA WHA. ESI-MS ROMWAEZEPESARASKHREOHL, USERRREA. BRR. HB 糖 、 药 物 和 药物 代谢 、 环 境 污 染 以 及 其 他 类 型 化 合 物 的 分 析 中 得 到 了 广泛 应 用 。EST MS 的 出 现 克 服 了 FAB 分 析 带 来 的 问题 , 如 样品 基质 离子 的 复杂 性 以 及 样品 分 子 在 电 离 过 程 中 的 分 解 , 并 且 具 有 稳定 的 离子 流 , 更 易 与 液 相 色谱 相 匹 配 。ESLFMS 不 仅 能 用 于 复杂 生物 样品 中 类 脂 分 子 的 结构 定性 分 析 , 最 为 重要 的 是 , 在 定量 分 析 方 面 与 EFAB- MS 相 比 能 够 提高 2 一 3 个 数量 级 [5 。 许多 种 类 的 类 脂 在 中 性 pH 下 带 有 负电 人 荷 , 因 此 这 些 种 类 的 类 脂 在 负离子 模式 ESL MS 下 能 够 有 效 地 得 到 [M-H]- 分 子 离子 峰 (如 PS、PI 和 PA) 。 然 而 ,PE、PC、SM 和 lyso-PC 属于 兼 性 离子 , 它 们 在 正 离 子 和 负离子 ESITMS 下 都 可 以 得 到 相应 的 准 分 子 离子 峰 。 3. 大 气压 化 学 电离 质谱 (APCI-MS) APCEMS 通过 放电 针 产 生 的 自由 电子 首先 又 击 空气 中 0 、Nz 、HzO 产生 如 O27, N: 、NO- 、H: “0O 等 初级 离子 , 再 由 这 些 初级 离子 与 样品 分 子 进行 质子 或 电子 交换 而 使 其 离子 化 并 进入 气相 。 与 ESLMS 相 比 ,APCLMS 更 适合 于 非 极 性 和 中 等 极 性 类 脂 分 子 的 分 析 。 由 于 磷脂 大 多 数 是 极 性 的 , 到 目前 为 止 ,APCLMS 用 于 磷脂 分 析 的 文献 还 很 少 , 因 为 它 的 灵敏 度 比 ESLMS 要 低 得 多 。 4. 基质 辅助 激光 解吸 电离 质谱 (MALDI-MS) MALDI 电 离 源 和 ESI 电 离 源 是 20 世纪 80 年 代 未 发展 起 来 的 两 种 “ 软 ” 电 离 技 术 , 并 在 质谱 领域 中 得 到 了 迅速 应 用 ,MALDI 电离 源 是 继 ESI 之 后 用 于 类 脂 分 析 的 又 一 电离 方法 。 利 用 MALDI 技术 在 类 脂 分 析 方 面 报道 较 少 , 它 的 优势 是 缓冲 液 和 盐 污染 的 问题 大 大 降低 , 当 它 与 飞行 时 间 质 量 分 析 器 联 用 时 灵敏 度 有 很 大 的 提高 。MALDT TOFMS 是 一 种 快速 和 方便 的 方法 , 样 品 可 在 不 到 lmin 的 时 间 内 得 到 分 析 , 并 且 可 进 行 多 个 样品 的 同时 测定 。 在 类 脂 分 析 方 面 利 用 该 技术 的 报道 近年 来 逐渐 上 升 。 利 用 MALDI-FT-ICR-MS 对 类 脂 结构 进行 定性 是 一 种 灵敏 度 很 高 的 方法 。 利用 MALDI-TOFMS 技术 测定 了 PC、PS、PA、TAG、DAG、 胆 固 醇 、SM、 PE。 然 而 , 由 于 MALDI-MS 技术 要 将 化 学 基质 和 样品 混合 起 来 , 脉 冲 激光 影响 待 测 物 的 解吸 和 电离 , 因 而 化 学 基质 和 激光 两 方面 的 综合 影响 限制 了 该 技术 在 类 脂 分 析 方 面 的 应 用 , 尤 其 是 在 微生物 的 特征 鉴定 上 。 例 如 , 由 于 干燥 的 样品 制备 基质 是 不 均一 的 , 需 要 在 靶 (target) 上 选择 可 接受 的 斑点 以 提供 最 好 的 离子 形成 , 基 质 加 合 离子 的 形成 降 低 了 质谱 的 有 效 分 辨 率 , 减 小 了 分 析 低 分 子 质量 (zz/z<1000) 物质 的 可 能 性 。 一 些 研 究 报道 通过 一 些 办 法 59 解 决 了 由 于 样品 制备 步骤 带 来 的 分 析 重 现 性 差 的 问题 , 但 谱 图 的 重 现 性 依然 存在 一 些 问题 。 ¢ 170 « 将 两 者 相 比 ,ESI 用 于 脂 类 分 析 比 MALDI 更 为 常见 , 而 MALDI-TOF 在 蛋白 质 和 肽 类 分 析 中 更 为 常见 。ESI 用 于 脂 类 分 析 最 为 主要 的 优势 是 它 能 很 容易 与 色谱 柱 “在 线 ” 联 用 。 另 外 ,ESI 不 需要 额外 的 基质 , 因 此 , 低 质量 分 子 端 谱 图 很 容易 解释 。 从 男 外 一 个 角度 来 说 ,MALDI tt ESI 更 为 灵敏 , 不 易 受 高 浓度 的 杂质 干扰 , 并 且 多 个 样板 的 发 明和 使 用 使 得 测定 样品 更 为 快速 。 将 MALDI 电离 技术 与 傅 里 叶 离子 回旋 共振 质量 分 析 器 (FT-ICR) 联 用 用 于 多 种 类 脂 结构 分 析 , 包 括 PS、PE、PI 以 及 PC 等 都 见报 道 ”“) 。 由 于 各 种 类 脂 分 子 形成 的 与 结构 有 关 的 产物 离子 能 够 被 高 分 辩 的 质谱 仪 很 容易 地 分 辨 出 来 , 因 而 MALDI-FT-ICR- MS 是 一 种 高 灵敏 度 和 高 分 辨 率 的 分 析 方 法 。 8.3.2.4 NMR NMR 波谱 学 是 阐明 纯化 的 类 脂 分 子 (LIH-NMR 和 23C-NMR) 结构 和 膜 类 脂 动力 学 CH HAP 高 分 辩 和 固 相 NMR) 的 强 有 力 的 工具 。 PNMR 的 线性 响应 和 快速 的 分 析 速 度 能 够 准确 和 选择 性 地 高 通 量 分 析 样 品 。NMR 在 测定 蛋白 质 - 类 脂 相互 作用 的 动 力学 方面 发 挥 了 巨大 的 作用 , 为 揭示 路 膜 重 白 和 离子 通道 的 调节 机 制 黄 定 了 基础 。 NMR 已 经 成 功 地 用 于 代谢 组 学 研究 中 。 在 大 分 子 聚 集体 〈 如 脂 双 层 或 脂 蛋 白 ) 中 类 脂 分 子 的 有 限 运 动 使 NMR 活体 测定 受到 了 一 定 限制 。 除 此 之 外 , 与 质谱 相 比 ,NMR 技 术 测 定 的 灵敏 度 要 低 。 8.3.2.5 类 脂 研 究 中 的 新 技术 随 着 近年 来 合成 的 纯 类 脂 分 子 的 商品 化 , 生 物体 外 酶 活性 的 表征 、 生 化 结合 研究 和 用 于 色谱 和 质谱 的 标准 品 得 到 了 人 快速 发 展 。 菊 光标 记 的 类 脂 分 子 可 以 用 来 研究 特定 的 亚 细胞 部 分 和 膜 微 区 中 类 脂 分 子 的 运输 ”以 及 类 脂 分 子 的 跨 膜 运动 [”"] 。 用 来 研究 蛋白 质 - 类 脂 相互 作用 的 新 技术 发 展 很 迅速 。 尽 管 真 正 意义 上 的 功能 固定 化 面临 着 许多 挑战 , 将 类 脂 固 定 化 仍然 是 研究 蛋白 质 -类 脂 相互 作用 的 一 个 很 有 价值 的 工具 。 基 于 脂 质 体 与 配 体 作 用 时 其 吸收 特征 发 生 改变 的 光学 系统 能 够 用 于 筛选 和 诊断 。 基 于 细胞 分 析 的 探 针 , 尤 其 当 与 荧光 标记 融合 时 , 是 研究 类 脂 代谢 的 一 个 强 有 力 的 工具 5 。 8.4 ESI-MS 在 类 脂 分 析 中 的 定量 方法 由 于 ESTMS 在 类 脂 分 析 中 应 用 最 为 广泛 , 本 节 针 对 其 定量 类 脂 分 子 的 方法 做 一 STH 8.4.1 内 标 化 合 物 的 选择 定量 分 析 生 物 样 品 中 的 磷脂 分 子 或 者 比较 生物 样品 中 磷脂 轮廓 , 都 需要 将 合适 的 内 标 化 合 物 在 提取 磷脂 分 子 前 加 入 到 需 制 备 的 样品 中 混 匀 。 多 数 情 况 下 , 可 将 类 脂 的 含量 对 组 织 或 细胞 蛋白 质 的 含量 进行 归 一 化 。 另 外 , 在 一 些 研 究 中 , 人 们 也 常常 使 用 组 织 重 量 、 细 胞 数目 或 DNA 含量 。 每 种 “ 归 一 化 ”的 优点 和 缺点 取决 于 研究 体系 的 生理 或 病 理 情 况 。 对 于 多 数 生物 样品 来 说 , 可 使 用 14 : 0 一 14 : 0,15 : 0 一 15 : 0 fy PC, PE, . 171° PS Al PG, 17? 0 lyso PC. N16: 0 硫 苷 脂 、N17 : 0 神经 酰胺 、T17 : 1TAG 等 类 脂 分 子 作 为 内 标 化 合 物 。 原 因 是 这 些 化 合 物 在 多 数 类 型 的 细胞 中 的 含量 过 <<1% 。 然 而 , 在 使 用 这 些 内 标 化 合 物 之 前 , 对 细胞 中 内 源 性 脂 类 分 子 进行 总 体 扫 描 是 必要 的 。 而 内 标的 选择 取决 于 竺 分析 类 脂 分 子 的 种 类 以 及 样品 来 源 , 例 如 ,H35-N18 : 0 GalC 和 N16 :0 硫 苷 脂 主要 用 于 分 析 脑 样品 中 的 脑 苷 脂 和 硫 苷 脂 , 而 内 标 15 : 0/15 : 0 PG 主要 用 于 定 量 含有 CA, PA, PG 和 PI 的 阴离子 磷脂 样品 。 8.4.2 MS 在 定量 分 析 类 脂 分 子 中 存在 的 问题 将 质谱 用 于 组 织 、 体 液 和 细胞 中 复杂 磷脂 混合 物 的 分 析 时 , 不 仅 可 以 得 到 类 脂 分 子 的 定性 信息 , 而 且 也 能 得 到 样品 中 类 脂 分 子 的 绝对 和 相对 定量 信息 。 尽 管 利 用 MS 进行 定量 分 析 比 较 成 功 , 然 而 将 MS 应 用 于 复杂 体系 类 脂 化 合 物 的 定量 分 析 , 存 在 许多 问 题 。 其 中 一 个 最 主要 的 原因 是 人 们 有 时 关心 的 不 是 单独 的 某 一 类 脂 分 子 , 而 是 复杂 混合 物 中 每 一 个 类 脂 分 子 的 相对 量变 化 。 在 理想 的 分 析 条 件 下 , 理 论 上 通过 MS 定量 任 一 化 合 物 必 须 准 确 地 比较 它 本 身 的 峰 强 度 和 稳定 的 同位 素 或 化 学 性 质 相 近 的 内 标 化 合 物 的 峰 强度 。 这 样 的 必 备 条 件 仅仅 在 定量 少数 已 知 类 脂 化 合 物 时 具备 。 例 如 ,Murphy 和 他 的 同事 利用 稳定 的 同位 素 做 内 标 化 合 物 测定 了 混合 物 中 的 一 种 类 脂 分 子 。 然 而 , 利 用 数 百 个 甚至 数 千 个 内 标 化 合 物 去 定量 分 析 存 在 着 数 以 千 计 的 类 脂 分 子 混 合 物 〈 如 生物 样 品 的 粗 提 取 液 ) 显然 是 行 不 通 的 。 影 响 类 脂 分 子 在 ESLMS 中 的 灵敏 度 的 因素 很 多 , 包 括 极 性 头 基 、 链 长 得、 不 饱和 度 等 5” , 使 得 利用 MS 定量 分 析 类 脂 分 子 变 得 复杂 起 来 。 利用 ESFMS 定量 分 析 复 杂 混 合 物 中 的 类 脂 , 一 个 最 主要 的 假设 就 是 离子 强度 与 离 子 浓度 呈正 比 。 到 目前 为 止 , 许 多 文献 上 采用 了 不 同 的 方法 来 定量 或 者 半 定 量 类 脂 分 子 。Han 等 55 用 代表 性 的 内 标 化 合 物 定量 了 血小板 中 主要 的 类 脂 分 子 , 同 样 地 ,Leh- mann 等 5 测定 了 老鼠 胆汁 中 的 PC 分 子 ,Liebisch 等 5 定量 了 血浆 中 的 lyso PC 分 子 。 利用 多 种 内 标定 量 类 脂 分 子 也 有 不 少 报道 , 如 Briigger 等 “利用 多 个 内 标 母 离子 扫描 m/z 184 测定 了 PC 磷脂 分 子 ,Welti 等 5 叹 测 定 了 植物 中 多 种 类 脂 分 子 ,Blom 4°" 测 定 了 PC. PE, PS 和 SM。 一 些 研 究 者 "利用 校准 曲线 的 方法 定量 了 一 些 类 脂 分 子 。 利用 某 一 种 类 脂 分 子 的 相对 丰 度 比较 由 于 刺激 产生 的 类 脂 变 化 也 有 报道 。 最 近 , 有 研究 报道 利用 同位 素 标记 的 内 源 脂 类 分 子 的 混合 物 作为 内 标 物 , 测 定 了 主要 类 脂 种 类 的 FART BE AE" 。 在 许多 情况 下 , 利 用 某 一 种 类 脂 分 子 间 的 相对 丰 度 "或 者 不 同 种 类 的 类 脂 分 子 与 其 相应 的 内 标 物 的 相对 丰 度 “来 比较 体系 受 外 界 刺激 后 类 脂 分 子 的 变化 解决 生物 问题 更 为 可 取 。 在 这 些 研究 中 , 研 究 者 关注 的 是 类 脂 分 子 与 内 标 物 的 比值 , 很 少 甚至 不 用 校 正 单个 分 子 的 响应 "5 。 8.4.3 ESI-MS 在 类 脂 研 究 中 的 定量 方法 co 目前 , 利 用 ESI-MS 定量 类 脂 分 子 主要 有 三 种 方法 : 内 源 分 离 ESIVMS FH, ESI 串联 质谱 方法 和 HPLC-ESI/MS 方法 。 每 种 方法 都 有 它 的 优点 和 缺点 , 在 应 用 过 程 中 .172 + 选择 哪 种 方法 很 大 程度 上 取决 于 研究 的 需要 〈 如 样品 量 的 多 少 、 分 析 结 果 要 求 的 准确 性 等 ) 以 及 使 用 的 仪器 。 下 面 将 详细 地 讨论 每 种 方法 。 8.4.3.1 内 源 分 离 ESILMS 方法 内 源 分 离 〈intrasource separation) ESI-MS 方法 最 早 是 由 Han 和 Grosst9 建 立 的 , 其 方法 是 在 将 Li 加 入 到 提取 液 中 , 在 正 离子 模式 下 ,ESITMS 谱 图 用 于 定量 磷脂 酰 胆 a (PC). FASE BENS (SM) 及 半 乳 糖苷 神经 酰胺 ;在 负离子 模式 下 ,ESLMS 谱 图 用 于 定量 磷脂 酰 乙 醇 胺 (PE). BEARREH TH (PG)、 磷 脂 酰 肌 醇 〈PI) 、 磷 脂 酰 丝氨酸 (PS) 、 磷 脂 酸 〈PA) 及 硫 脂 。 分 子 组 成 的 识别 根据 其 质 荷 比 m/z 以 及 串联 质谱 的 产物 离子 来 估计 , 因 为 在 没有 经 过 样品 预 分 离 的 情况 下 , 相 同 质量 数 的 分 子 有 可 能 是 一 种 以 上 的 磷脂 分 子 〈 如 同 质 异 构 分 子 ) Ri, Han 和 Grossts73 建 立 了 一 种 内 源 分 离 和 二 维 (2D) 质谱 〈 一 维 为 mx/z, 二 维 为 自然 界 中 存在 的 脂肪 酸 质量 数 ) 的 方法 测定 类 脂 分 子 。 他 们 通过 极 性 头 基质 量 数 和 脂肪 酸 质量 数 识别 磷脂 分 子 的 结构 , 根 据 sr1l 位 (或 wz2 位 ) 脂肪 链 的 离子 强度 估计 磷脂 分 子 脂 酰 链 可 能 的 组 成 结构 。2D ESI-MS 从 生 物 样 品 中 定量 脂 类 分 子 的 原理 利用 了 分 析 物 -溶剂 离子 相互 作用 〈 这 种 相互 作用 的 结果 ”能 够 在 离子 源 内 有 效 地 将 不 同 种 类 的 脂 类 分 子 区 分 开 来 ) 以 及 通过 中 性 丢失 或 母 离子 扫 描 功 能 完成 不 同 种 类 脂 分 子 的 测定 3 。 如 图 8-8 所 示 ,PE 磷脂 分 子 的 识别 可 通过 Pre ARERR ESO 。 100 790.6 62.6 内 标 662.6 693.6 662.6 & 50 746.6 =774.6 0 693.6 Pre241.2(15:0) 762.6 ‘ Pre255.2(16:0) * 1788.6 744.6 764.6 | Pre281.2(18:1) + 4790.6 766.6 Pre283.2(18:0) 766.6; Mea a 794.6 Pre303.3(20:4) i Sayer « N . 7466 £7746 ere ae ee ee es 650 700 750 800 850 900 图 8-8 负离子 模式 下 ,Pre 扫描 测定 老鼠 心肌 细胞 中 PE 类 脂 分 子 93] 2 173 « 该 方法 的 理论 基础 为 : @ 分 子 离子 强度 与 类 脂 分 子 的 浓度 呈 线 性 关系 ; @ 同 一 种 类 旨 分 子 具 有 近乎 相同 的 电离 效率 , 当 其 浓度 范围 在 pmol 甚至 更 小 时 , 对 酰基 链 的 物理 性 质 影 响 不 大 ; @@ 无 论 在 正 离子 模式 还 是 负离子 模式 , 内 标 化 合 物 的 电荷 能 够 反映 待 测 类 脂 分 子 的 电子 得 失 倾向 。 除 此 之 外 , 在 这 种 方法 中 进行 2C 同位 素 校正 是 很 必要 的 。 Han 等 5 将 这 种 方法 首先 用 于 凝血 酶 刺激 活性 血小板 中 脂 类 分 子 的 变化 。 这 种 方法 有 如 下 优点 : @ 可 通过 选择 合适 的 内 标 , 定 量 电子 得 失 倾向 相近 的 类 脂 分 子 。@ 所 需 样 品 量 小 。 当 脂 的 浓度 小 于 1pmol/ml 时 , 只 用 不 到 100pl 的 样品 即 可 测定 其 中 的 类 脂 分 子 。@@ 能 够 同时 对 多 个 种 类 的 类 脂 分 子 进 行 定量 , 因 而 这 种 方法 迄今 为 目 应 用 得 最 为 广泛 。 图 高 效 性 。 整 个 脂 的 粗 提取 液 中 类 脂 分 子 的 测定 能 够 在 不 到 30min 的 时 间 内 完成 。 这 种 方法 的 缺点 : @ 仪 器 易 受 Li 的 污染 , 每 隔 6 一 8 周 要 清洗 一 次 离子 源 , 并 且 需要 经 常 校正 仪器 : @ 存 在 低 丰 度 离 子 抑 制作 用 。 一 般 来 说 , 当 离子 的 丰 度 低 于 谱 图 中 FEIN 3%% 时 , 这 些 离子 峰 要 么 掩埋 在 基线 中 , 要 么 定量 它们 非常 困难 。 这 种 方法 的 缺 点 可 以 通过 ESI 串联 质谱 和 HPLC-ESI/MS 克服 。 8.4.3.2 ESI 串 联 质谱 法 用 于 类 脂 测定 的 一 个 非常 强 有 力 的 串联 质谱 扫描 模式 包括 母 离子 扫描 〈precursor scanning, Pre) Alb vE AAA (neutral loss scanning,NL)[5 。 这 项 技术 首先 是 Cole 和 Enke 利用 FAB-MS 测定 特定 的 甘油 磷脂 时 建立 起 来 的 " 。 例 如 , 在 正 离子 模 SUF, Pre fi m/z 184 能 够 识别 PC 和 SM 磷脂 分 子 。 利 用 ESI BRR, Smith, Snyder 和 Harden 获得 了 微生物 类 脂 分 子 的 详细 轮廓 "1 。 这 种 方法 5 利用 了 极 性 头 基 在 MS 中 由 于 碰撞 诱导 解 离 形成 的 特征 碎片 离子 , 通 过 扫描 这 些 特 征 离子 就 可 以 获得 这 些 种 类 的 不 同类 脂 分 子 的 谱 图 。 若 形成 的 碎片 离子 带电 荷 , 就 可 以 利用 产生 这 些 碎片 的 母 离子 扫描 (precursor scanning) 得 到 这 一 种 类 的 全 部 类 脂 分 子 , 若 形成 的 碎片 离子 不 带电 荷 , 则 利用 中 性 丢失 扫描 获得 同一 种 类 的 类 脂 分 子 。 一 般 来 说 , 使 用 这 种 方法 时 , 样 品 可 不 经 过 预 分 离 或 采用 样品 连续 注入 的 方式 。 利 用 这 种 方法 , 在 负离子 模式 下 , 母 离子 扫描 m/z 241 可 用 来 测定 PIA BER. BA SAT m/z 196 测定 PE 类 类 脂 分 子 , 母 离子 扫描 m/z 168 测定 SM 类 磷脂 分 子 , 中 性 丢失 87Da 测定 PS 类 磷脂 分 子 ; 在 正 离子 模式 下 , 中 性 丢失 141Da 测定 PE 类 磷脂 分 子 , 中 性 丢失 185Da 测定 PS 类 磷脂 分 子 , 母 离子 扫描 m/z 184 测定 PC 和 SM 类 磷脂 分 子 。 这 种 方法 经 常用 来 测定 特定 种 类 的 磷脂 分 子 。 图 8-9 和 图 8-10 就 是 利用 这 种 方法 获得 的 CHO 细胞 中 不 同 种 类 磷脂 的 质谱 图 。 当 使 用 这 种 方法 时 , 磷 脂 分 子 中 srr] 和 ser 2 位 的 脂 酰基 团 组 成 不 能 确定 , 而 只 能 通过 母 离子 扫描 脂 酰基 阴离子 来 推断 可 能 的 脂 酰 基 基 团 。 在 负离子 模式 下 , 母 离子 扫描 特定 的 脂肪 酸 GRA) 阴离子 能 够 特定 地 测定 脂 酰 取代 基 。 利 用 这 种 方法 ,Hall 和 Murphy 测定 了 花生 四 烯 酸 和 氧化 的 花生 四 类 酸 [5 。 然 而 在 目前 阶段 , 数 以 千 计 的 低 丰 度 的 类 脂 分 子 利用 这 种 方法 还 不 能 被 测定 出 来 。 ESI 串联 质谱 方法 的 优点 是 它 能 够 有 效 地 对 一 些 种 类 的 类 脂 分 子 进行 定性 , 并 且 可 以 消除 基线 噪声 〈 这 对 用 质谱 测定 低 丰 度 的 类 脂 分 子 很 重要 ), 因 此 这 种 方法 能 够 提供 * 174 « > | 4x10" | 241 -prec PI A (M-H) 4) a R Es 600 680 760 m/z—> 840 920 1000 B 788.6 扫描 模式 : -neu 87 (M-H) of PS 4X a ® 村 600 680 760 ml/z 一 = 840 920 1000 Cc 742.6 扫描 模式 : -prec 196 (M-H) of PE tei a R 三 600 680 760 mm/z 一 > 840 920 1000 D 5 扫描 模式 : -SCID &-prec 168 (M-16) of SM 797.7 737.7 is, 715.7 | 600 680 760 m/z—» 840 920 1000 图 8-9 负离子 模式 下 利用 串联 ESFMS 测定 CHO 细胞 萃取 液 中 的 特定 磷脂 种 类 5 某 一 种 类 脂 的 一 系列 容易 解释 的 分 子 图 谱 , 而 不 像 一 级 ESTMS 产生 的 是 更 为 复杂 的 类 脂 图 谱 。 这 种 方法 的 缺点 是 这 项 技术 依赖 于 仪器 , 因 为 只 有 三 重 四 极 杆 质谱 : ”才能 进 行 母 离子 扫描 和 中 性 丢失 扫描 , 而 离子 阱 质谱 不 具有 这 些 扫描 功能 ;其 二 是 这 种 方法 不 能 提供 类 脂 分 子 更 为 详细 的 化 学 结构 如 酰基 取代 基 的 组 成 ; 其 三 是 只 能 对 样品 中 已 知 种 类 的 类 脂 分 子 进行 测定 , 而 不 能 测定 未 知 种 类 的 类 脂 分 子 尤其 是 对 一 些 功能 上 很 重要 但 又 没有 特征 性 的 扫描 能 够 适合 的 类 脂 分 子 〈 如 磷脂 酸 、 溶 血 磷 脂 酸 、 心 磷脂 等 ); 最 后 , 母 离子 扫描 和 中 性 丢失 扫描 中 质谱 信号 的 响应 受 许多 因素 的 影响 , 如 脂 酰 链 的 长 得、 不 饱和 度 以 及 碰撞 能 的 大 小 [3 , 因 此 在 使 用 这 种 方法 准确 定量 类 脂 分 子 时 , 需 要 使 用 多 * 975 * A 760.6 扫描 模式 : +prec 184 SM+PC 的 (M+H)* a R & 600 680 760 mlz -> 840 920 1000 B 744.6 扫描 模式 : +neu 141 (M+H)’ ions of PE 600 680 760 m/z -> 840 920 1000 Cc 790.6 扫描 模式 : +neu 185 (M+H)’ ions of PS 600 680 760 m/z —~» 840 920 1000 图 8-10 ” 正 离子 模式 下 利用 串联 ESI-MS 测定 CHO Ane BBP Ree OE PO 种 内 标 物 以 使 其 结构 特征 能 够 覆盖 样品 中 不 同 结构 的 类 脂 分 子 。 使 用 这 种 方法 , 研 究 人 员 测 定 了 生物 样品 中 的 多 种 类 脂 分 子 。 、 8.4.3.3 液 质 联 用 方法 CHPLC-ESEMS) 尽管 利用 ESI-MS 和 ESI 串联 质谱 能 够 对 一 些 类 脂 分 子 进行 测定 , 但 对 一 些 功能 上 很 重要 但 在 样品 中 丰 度 很 低 的 类 脂 分 子 来 说 , 利 用 上 述 两 种 方法 显得 无 能 为 力 , 并 且 在 分 析 复 杂 样 品 中 的 类 脂 分 子 时 有 必要 在 类 脂 分 析 中 引入 色谱 分 离 系统 一 一 通过 色谱 将 不 同 种 类 的 类 脂 分 子 进 行 预 分 离 可 避免 质量 数 重 又 带 来 的 干扰 , 然 后 同一 种 类 脂 中 不 同 的 分 子 通过 质谱 来 鉴定 区 分 。 目 前 HPLC-MS 已 成 为 类 脂 分 析 的 一 个 强 有 力 的 工具 。 利用 HPLC 对 类 脂 进行 预 分 离 的 一 个 明显 优势 是 能 够 通过 碎片 分 析 测 定 类 脂 分 子 。 并 且 , 通 过 碎片 分 析 能 够 对 酰基 取代 基 的 on 位 置 进行 测定 。 然 而 , 真 正 对 类 脂 分 子 的 位 置 异 构 体 进行 测定 非常 复杂 , 因 为 srl 和 sre 2 取代 基 的 断裂 在 很 大 程度 上 依赖 于 酰 基 链 的 长 短 和 不 饱和 度 。 类 脂 的 分 离 既 可 通过 正 相 HPLC, 也 可 通过 反 相 HPLC。 当 使 用 正 相 色谱 柱 时 , 类 脂 的 流出 是 按照 从 朴 水 性 到 亲 水 性 的 顺序 。 其 中 比较 典型 的 例子 是 Kim 和 他 的 同事 建 立 的 正 相 色谱 甲醇 /正己 烷 体系 分 离 系统 [59 ,Karlsson 等 发 展 的 正己 烷 / 正 丙 醇 分 离 系 .176 , "PJ Lesnefsky 等 "9 的 乙醇 /正己 烷 / 异 丙 醇 分 离 体 系 。 除 此 之 外 , 和 氯仿 /甲醇 / 氮 水 溶剂 系统 "3 、 乙 且 / 甲 醇 溶剂 系统 [7 也 可 有 效 地 正 相 分 离 脂 类 化 合 物 。 常 用 的 HPLC EEA TERRE 、 二 醇 基 柱 [8 ?9] 。 需 要 指出 的 是 , 利 用 硅胶 柱 分 离 脂 类 分 子 会 导致 部 分 脂 类 化 合 物 的 损失 [so 。 考 虑 到 多 种 化 学 物质 能 够 对 硅胶 产生 催化 作用 、 保 留 时 间 的 波动 性 以 及 对 水 的 不 稳定 性 , 利 用 硅胶 柱 对 脂 类 分 子 进行 定量 分 析 需 小 心 谨慎 3 。 利 用 正 相 分 离 系 统 分 离 类 脂 分 子 , 由 于 一 个 峰 中 包含 着 许多 种 类 脂 分 子 〈 即 同一 种 类 的 类 脂 分 子 保留 时 间 很 接近 ), 峰 中 类 脂 分 子 分 布 将 表现 出 不 均匀 性 , 从 而 易 产 生 拖 尾 现 象 [ 思 。 在 正 相 分 离 条 件 下 , 色 谱系 统 能 够 将 不 同 种 类 的 磷脂 大 体 上 分 开 , 脂 酰 链 的 长 短 不 同和 不 饱和 程度 的 差异 使 得 同一 种 类 的 不 同 磷脂 分 子 在 保留 时 间 上 有 一 些 差异 。 但 这 种 差异 比 不 同 种 类 的 磷脂 分 子 保留 时 间 的 差异 要 小 得 多 , 即 磷脂 分 子 保留 时 间 的 长 短 在 很 大 程度 上 决定 于 极 性 头 基 。 在 许多 情况 下 , 利 用 正 相 色谱 分 离 系统 对 类 脂 分 子 按照 不 同 种 类 分 离 出 来 , 然 后 用 MS 识别 同一 种 类 的 不 同类 脂 分 子 。 图 8-11 为 利用 正己 烷 / 正 丙 醇 分 离 体系 在 正 相 HPLC 二 醇 基 分 离 柱 上 分 离 人 血 中 几 种 主要 磷脂 的 总 离子 流 图 [80] PS/PI pS BA 60% 18.35 22.73 50% 158 | Gue 40% bas 20.42 lysoPC rs eee 3.11, } $702 f Wo 12 “7408 } 35.25 2 4 6 8 10: 12.6 VA Ge Se 20) a 22), Ane IG ee ZR 350s. BD pe 34, 36m, 8 时 间 /min 图 8-11 负离子 LCVESFMS 下 , 人 全 血 中 磷脂 分 子 在 正己 烷 / 正 丙 醇 "9] 分 离 体 系 中 的 总 离子 流 图 〈 二 醇 基 分 离 柱 , 柱 温 为 35"C ) 反 相 HPLC 也 可 用 来 分 离 类 脂 混 合 物 57's5 , 脂 类 分 子 按照 从 亲 水 性 到 下 水 性 的 顺 序 流出 。 在 反 相 色谱 分 离 中 , 类 脂 脂 酰 链 的 长 度 和 不 饱和 度 对 其 流出 顺序 起 着 主要 作 FAC), GR 8-12 所 示 , 磷 脂 分 子 脂 酰 链 的 长 短 和 不 饱和 度 影 响 着 其 流出 顺序 , 如 对 于 不 饱和 度 相 同 而 脂 酰 链 不 同 的 PC 磷脂 分 子 按照 32 :0、34 :0 和 36 :0 的 顺序 流出 , 对 于 脂 酰 链 长 短 相同 而 不 饱和 度 不 同 的 PC 磷脂 分 子 按照 34: 3、34 :2 和 34: 1 的 顺 序 流 出 。 由 于 反 相 色谱 通过 亲 脂 性 分 离 化 合 物 , 不 同 种 类 脂 分 子 的 重 到 性 很 严重 , 从 而 导致 “离子 抑制 ”作用 。 并 且 , 同 一 种 类 的 不 同类 脂 分 子 流 出 贯穿 整个 分 析 时 间 , 如 果 不 假定 在 离子 强度 和 浓度 之 间 存 在 着 线性 关系 , 对 脂 类 分 子 进行 定量 将 变 得 不 可 能 3 。 与 正 相 液 相 色谱 -串联 电 喷 雾 质 谱 (NPLC-ESLMS/MS) 联 用 方法 相 比 , 反 相 色 谱 - 串 联 电 喷雾 质谱 联 用 (RPLC- ESI-MS/MS) 能 更 准确 地 鉴定 出 类 脂 分 子 C7 。 o Wiz = 相对 强度 /% 240-4 | 38 后, 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 保留 时 间 /min 图 8-12 在 负离子 模式 下 利用 RPLC-ESLMS 获得 的 猪 肝 中 PC 磷脂 分 子 混合 物 5 总 之 , 利 用 HPLC-ESI/MS/MS 方法 对 于 定量 一 些 种 类 的 类 脂 分 子 具 有 其 他 方法 无 可 比拟 的 优势 , 当 然 对 于 完整 细胞 的 类 脂 组 学 来 说 , 这 种 方法 还 有 待 进一步 完善 。 类 脂 分 子 的 多 样 性 使 得 利用 一 个 测定 平台 很 难 完成 多 种 类 脂 分 子 的 测定 , 以 上 讨论 的 几 种 ESI/MS 分 析 方 法 都 有 各 自 的 优点 和 本 身 内 在 的 缺点 。 需 要 指出 的 是 , 这 些 方法 并 不 是 独立 的 而 是 彼此 相互 联系 的 , 每 种 方法 的 进一步 发 展 仍 需 以 生物 样品 中 完整 的 类 各 分 析 为 目标 。 对 于 特定 的 研究 来 说 , 究 竟 选 择 哪 种 方法 取决 于 研究 的 需要 , 如 样品 量 的 多 少 、 分 析 结 果 要 求 的 准确 性 等 。 8.5 类 脂 组 学 及 其 应 用 8.5.1 类 脂 组 学 类 脂 组 学 〈lipidomics) 主要 研究 生物 体 受 外 界 刺激 和 疾病 干扰 后 脂 类 、 脂 类 代谢 物 以 及 与 脂 类 分 子 相互 作用 的 因子 的 变化 “2 。 随 着 电 喷雾 质谱 CESI-MS) 应 用 的 发 展 , 它 是 继 基 因 组 学 、 蛋 白质 组 学 后 又 一 个 快速 发 展 的 领域 。 尽 管 类 脂 组 学 处 于 新 生 阶 段 , 然 而 在 20 多 年 前 , 它 的 重要 性 , 尤 其 是 在 研究 疾病 方面 的 重要 性 已 经 引起 了 人 们 的 关注 色 ' 听 。 通 过 测定 细胞 内 类 脂 分子 的 变化 〈 如 脂 种 类 、 亚 种 类 和 单个 脂 类 分 子 )、 类 脂 分 子 的 动态 代谢 以 及 类 脂 与 蛋白 质 的 相互 作用 , 人 们 对 许多 疾病 有 了 新 的 认识 。 类 BOS 〈 包 括 磷脂 分 子 ) 不 仅 是 构成 生物 膜 的 重要 组 分 , 而 且 参 与 了 生物 体 的 许多 生物 过 程 , 因 此 类 脂 组 学 的 发 展 为 药物 开发 、 标 记 物 的 发 现 以 及 疾病 的 早期 诊断 提供 了 新 的 - 178 + a =a uM om iin I aS <_< Ph ns 机 遇 Bs] 。 基 于 类 脂 组 学 的 重要 性 , 美 国 NIH 下 属 的 General Medical Sciences 已 在 2003 年 批 给 加 州 大 学 3500 万 美元 , 用 以 一 个 做 鼠 巨 喉 细 胞 的 类 脂 组 学 研究 的 5 年 计 划 ; 同时 ,Lipomics 公司 也 投资 90 万 美元 用 于 研究 与 类 脂 分 子 代 谢 有 关 的 药物 开发 、 营养 调节 、 疾 病 诊断 及 遗传 修饰 。 8.5.2 ”类 脂 组 学 中 类 脂 分 子 识别 的 策略 [ 轨 类 脂 组 学 中 , 正 确 地 识别 类 脂 组 分 , 必 须 做 到 以 下 几 个 方面 。 8.5.2.1 准确 测定 与 分 子 质量 相关 离子 的 质量 数 其 中 最 重要 的 一 个 因素 就 是 通过 高 分 辨 质谱 获得 类 脂 分 子 与 分 子 质量 有 关 的 离子 的 准确 的 质 荷 比 〈zz/z)。 傅 里 叶 变 换 - 离 子 回旋 共振 质谱 (FT-ICR-MS) 是 目前 获得 准确 质量 数 的 最 好 的 仪器 , 其 次 是 飞行 时 间 质 谱 (TOF-MS) 和 四 极 质谱 仪 。 四 极 质谱 仪 的 分 辩 率 能 够 达到 小 于 100X10 “的 质量 准确 度 ,TOF-MS 和 传 里 叶 变 换 质 谱 (FT-MS) 的 分 辨 率 分 别 能 达到 小 于 20X10““ 和 小 于 3X10“ “的 质量 准确 度 。 实 际 上 , 区 分 分 子 质 量 很 接近 的 不 同 种 类 脂 分子 〈 它 们 的 碳 原子 数 、 双 键 个 数 或 者 氧 原子 数 不 同 ) 的 质量 峰 很 困难 。 例 如 , 烷 酰基 或 者 烯 酰基 类 脂 分 子 和 奇数 碳 原 子 的 二 酰基 类 脂 分 子 仅 相 差 0. 03 个 质量 数 , 而 要 区 分 它们 需要 质谱 的 分 辨 率 达到 60 000 以 上 [sl 。 分 辨 质量 数 上 的 ”差异 , 需 要 小 于 20X10“ 的 质量 准确 度 。 因 此 , 为 了 完全 可 靠 地 鉴别 质谱 峰 ,FI-MS 是 必需 的 工具 , 而 TOF-MS 仅仅 在 分 辨 质 荷 比 有 差异 时 才能 发 挥 作用 。 8. 5.2.2 获取 与 分 子 质量 相关 离子 的 碎片 离子 特征 为 了 准确 地 识别 类 脂 分 子 , 其 次 是 要 获得 与 分 子 质量 有 关 离 子 的 特征 碎片 离子 。 在 这 种 情况 下 , 即 使 碎片 离子 只 能 达到 单位 质量 准确 度 , 也 能 够 有 效 地 识别 母 离子 的 结构 特征 。 在 蛋白 质 组 学 研究 中 , 一 个 共同 并 且 有 效 的 鉴定 蛋白 质 的 方法 就 是 识别 胰 蛋 白 酶 水 解 肽 段 中 的 碎片 离子 , 如 b 型 和 y 型 系列 离子 。 同 样 , 负 离子 模式 下 ,srl 和 sr2 位 脂肪 酰基 阴离子 , 以 及 在 负离子 或 正 离子 模式 下 的 中 性 丢失 烯 酮 类 或 脂肪 酸 , 对 于 鉴 别 甘 油 酯 类 分 子 都 是 非常 重要 的 ~” 。 对 于 未 知 或 者 尚未 鉴定 的 脂 类 代谢 分 子 , 通 过 TOF-MS 和 了 FT-MS 获取 较 高 的 质量 准确 度 的 碎片 离子 对 鉴定 非常 有 帮助 。 同 样 , 磷 脂 分 子 和 甘油 酯 类 的 极 性 头 部 基 团 的 碎片 离子 或 者 特定 的 中 性 丢失 碎片 离子 对 鉴定 极 性 脂 类 的 种 类 具有 重要 作用 。 有 些 情 况 下 , 为 了 可 靠 地 鉴定 类 脂 分 子 , 有 必要 获取 其 相应 的 MS 或 MS' 质谱 图 。 8.5.2.3 较 好 的 液 相 色谱 分 离 和 可 重复 的 保留 时 间 无 论 是 为 了 准确 地 鉴定 和 定量 具有 相同 的 分 子 组 成 的 同 量 异 序 类 脂 分 子 , 还 是 为 了 鉴定 分 子 组 成 相差 在 0. 1 质量 单位 的 具有 相近 质 荷 比 的 类 脂 分 子 , 液 相 色谱 的 分 离 都 很 重要 , 尤 其 是 测定 含量 较 低 或 者 其 离子 化 效率 较 低 的 类 脂 分 子 。 通 过 液 相 色谱 对 类 脂 分 子 进 行 较 好 地 分 离 , 很 大 程度 上 改善 了 类 脂 分 子 的 鉴定 “”……”””。 可 重复 的 和 准 « 179 - 确 的 保留 时 间 对 于 鉴定 类 脂 分 子 起 着 至 关 重 要 的 作用 。 最 近 有 报道 使 用 具有 粒 径 不 到 2mm 填料 的 整体 柱 在 一 次 液 相 色 谱 进 样 中 可 获得 100 多 个 峰 。 即 使 没有 MSV/MS 数据 , 质 荷 比 相近 的 不 同类 脂 分 子 或 者 同 量 异 序 类 脂 分 子 在 LC-MS/MS 轮廓 中 的 洗 脱 顺序 也 能 够 用 于 预测 类 脂 分 子 。 8.5.3 基于 质谱 技术 的 几 种 类 脂 组 学 方法 基于 质谱 的 类 脂 分 析 方法 [5 基本 上 可 分 为 三 种 : 非 靶 标 分 析 Cuntargeted), RH Ayr (focused) Al#lpn4t HT (targeted), , 如 图 8-13 所 示 。 非 靶 标 分 析 方 法 对 高 含量 组 分 (HAR 有 可 能 发 现 新 的 物质 , 有 (全 组 分 分 析 方 法 ) 低 的 灵敏 度 ) 必要 进行 结构 鉴定 LC-MS/MS w 聚焦 分 析 方 法 对 中 等 含量 组 分 人 有 可 能 识别 含量 较 低 的 组 (中 性 委 失 扫描 , (具有 中 等 灵敏 度 ) 0 分 (在 桶 焦 分 析 组 分 内 ) 母 离子 扫描 ) | 4, 全 ® 如 ROKK Coe ”对 低 含量 组 分 (具有 有 可 能 发 现 新 的 同 分 异 构 体 , 特定 的 组 分 , 或 者 理论 较 高 的 灵敏 度 ) Paice wi ey. 上 存在 的 组 分 ) MRM * 图 8-13 ”代谢 组 学 中 基于 质谱 技术 的 几 种 分 析 方 法 5 8.5.3.1 BAAD APE BAR| AT 在 与 分 子 质量 有 关 的 离子 或 者 它们 的 碎片 离子 的 相关 信息 未 知 的 前 提 下 , 可 通过 全 组 分 和 非 靶 标 分 析 方 法 测定 类 脂 提取 物 中 所 包含 的 全 部 代谢 物 "…”'” 。 这 种 方法 的 策略 就 是 检测 所 有 的 与 分 子 质量 有 关 的 峰 然 后 做 进一步 分 析 。 这 种 非 靶 标 分 析 方法 曾经 用 于 未 经 过 液 相 色 谱 分 离 的 , 并 且 基 于 高 分 辩 率 的 FT-MS 的 类 脂 组 学 和 ”5。 然 而 , 在 多 数 情 况 下 , 这 种 方法 是 将 四 极 或 TOF-MS 与 LC-MS sk LC-MS/MS 结合 起 来 应 用 的 5 "5 。 将 适当 的 液 相 分 离 与 具有 高 分 辩 率 的 质谱 (如 FT-MS 或 者 TOF-MS) 结合 起 来 是 正确 识别 已 知 代谢 物 和 诠释 新 发 现 的 代谢 物 的 首选 。 利 用 正 相 液 相 色谱 , 可 以 有 效 地 将 不 同 种 类 的 磷脂 分 子 分开 , 正 负 两 种 离子 模式 下 的 与 分 子 质量 有 关 的 离子 可 用 于 鉴 定 555]。 其 中 , 保 留 时 间 对 鉴定 同 量 异 序 类 脂 分子 具 有 重要 的 作用 。 另 外 , 就 是 MS/MS 获得 的 碎片 离子 信息 也 可 以 用 于 鉴定 。 因 此 , 将 LC-MS/MS 和 相应 的 扫描 模式 结合 起 来 是 一 种 具有 实践 应 用 的 类 脂 组 学 方法 。MS/MS 实验 可 作为 一 种 与 分 子 质量 有 关 的 具 有 高 强度 的 离子 峰 的 鸟 枪 策略 [7] 。 与 靶 标 类 脂 分 子 质量 有 关 离 子 的 碎片 离子 信息 经 常 用 于 未 知 分 子 的 结构 确定 和 结构 鉴定 。 。 180 。 8.5.3.2 聚焦 分 析 聚焦 分 析 方 法 用 于 测定 具有 特定 结构 的 某 些 种 类 的 类 脂 分 子 , 可 通过 母 离子 扫描 或 者 中 性 丢失 扫描 模式 实现 "“…” ”) 。 由 于 具有 较 好 的 选择 性 , 当 与 液 相 色谱 联 用 时 , 许 多 低 含 量 组 分 能 够 被 检测 出 来 。 这 种 方法 在 类 脂 组 学 中 应 用 最 多 , 尤 其 是 甘油 磷脂 和 甘 油 酯 类 [5436 一 99] E 8.5.3.3 BARAT 夺标 分 析 方法 将 与 分 子 质量 相 关 离 子 的 信息 和 其 特定 碎片 离子 的 信息 结合 起 来 用 于 靶 标 分 子 的 测定 。 这 种 分 析 方法 可 通过 选择 反应 监测 模式 (SRM) 和 多 反应 监测 模式 (MRM ) 实现 , 经 常 被 药物 公司 用 于 定量 葛 标 药物 及 其 代谢 物 。 同 时 , 这 种 分 析 方法 也 可 用 于 一 些 类 脂 分 子 代谢 物 的 第 选 。 近 年 来 发 展 的 三 重 四 极 质谱 在 一 次 液 相 进 样 中 , 能 同时 测定 近 100 个 离子 对 。 8.5.4 类 脂 组 学 在 微生物 研究 中 的 应 用 , 利 用 微生物 的 质谱 特征 为 研究 各 种 各 样 的 环境 问题 提供 了 一 种 可 能 。 人 快速 区 分 出 致 病 的 和 未 致 病 的 微生物 对 于 职业 病 预防 、 卫 生 保 健 、 抵 御 细菌 战 和 进行 环境 监测 的 意义 BAU, de 20 世纪 60 年 代 , 脂 类 分 子 就 用 来 区 分 微生物 的 种 类 "9 。 在 1987 ”年 , 人 们 利用 FAB-MS 方法 从 菌 体 裂解 物 中 成 功 地 分 离 出 脂 类 分 子 并 进行 了 特征 鉴 ge] 。 随 着 ESI 和 MALDIMS 的 发 展 , 微 生物 的 识别 也 取得 了 很 大 进展 。 在 未 经 过 预 分 离 的 情况 下 , 人 们 利用 负离子 ESI 质谱 研究 了 多 种 微生物 中 的 甘油 酯 5 。 利 用 母 离子 扫描 和 产物 离子 扫描 〈MS/MS) 能 够 显著 地 区 分 微生物 提取 液 中 不 同 种 类 的 微 生物 。 将 CE 和 微 柱 LC 与 ESI-MS 在 线 联 用 能 够 用 于 微生物 类 脂 的 详细 研究 。 相 反 , 利用 MALDI 技术 研究 微生物 中 的 类 脂 分 子 尚未 见报 道 。 这 或 许 是 因为 从 微生物 中 分 离 出 来 的 脂 类 混合 物 的 复杂 性 需要 在 进入 MS 前 进行 脂 类 的 预 分 离 。 因 此 ,CE-ESI/VMS 和 micro-LC-ESI-MS 的 在 线 联 用 使 得 ESI-MS 在 类 脂 分 析 中 比 MALDI 技术 更 具有 优 势 。 最 近 ,HPLC-ESLMS 已 经 用 于 微生物 提取 液 中 类 脂 的 测定 po?9 。 研究 微生物 群体 结构 是 目前 微生物 生态 学 者 又 一 重要 课题 5D"220 。 由 于 微生物 中 的 类 脂 含量 在 宽泛 的 生长 条 件 下 相对 人 恒定, 因此 定量 分 析 类 脂 能 够 估计 活体 生物 量 D2 。 固有 的 生物 恢复 是 指 微生物 在 自然 条 件 下 能 够 在 位 降解 污染 物 , 而 不 需要 通过 人 工 干 预 提高 微生物 的 活性 。 评 价 固 有 的 生物 恢复 效率 的 一 个 很 有 前 途 的 方法 就 是 利用 微生物 的 旨 类 作为 甲 茶 降 解 和 底 物 利用 5 2 的 一 个 指标 。 类 脂 是 微生物 细胞 膜 的 主要 组 成 部 分 , 占 生物 膜 总 体 的 40% 一 70%D5 。 将 类 脂 分 析 和 2 C 标记 追踪 剂 结合 能 够 有 效 地 跟 踪 底 物 的 利用 程度 和 生物 降解 污染 物 过 程 中 的 碳 流 。 类 脂 分 子 的 轮廓 已 经 用 于 测定 污染 著 水 层 中 微生物 群体 结构 的 变化 0 -1222 。 例 如 ,Riittersa $4" Fi] AY HPLC-ESI-MS 分 析 微 生物 中 类 脂 的 变化 , 并 将 其 作为 研究 活性 微生物 的 生物 标记 物 。 实 验 发 现 , 完 整 的 微生物 类 脂 分 子 位 于 沉淀 物 的 表层 , 类 脂 分 子 的 类 型 和 脂肪 酸 模 式 暗含 了 真 核 藻 类 有 较 强 的 分 布 。 从 图 8-14 可 以 看 出 , 在 沉淀 层 的 上 层 〈10cm 以 内 ), 随 着 深度 的 增加 , 整 * 181 。 个 的 磷脂 分 子 和 三 甘油 酯 含量 迅速 降低 , 并 且 微 生物 类 脂 分 子 降解 的 产物 〈 如 二 甘油 酯 和 单 甘油 酯 以 及 游离 脂肪 酸 ) 也 迅速 降低 。 在 沉淀 层 的 50 cm HRA, TRA LAMBS 脂 分 子 , 暗 含 了 在 这 个 深度 存在 着 微生物 。 Pf) rt ae SN 6 oo S B 0~1lcm a6 a @ 15~19cm oe & 过 = " 5 i i 3 ” ge B © S ss = = = eRe i LSS ce) S cn Ae 一 a =) = o SS = CN R 一 oa > co ~ va) xo 38 = QS 6 ea iS 31 So oo xt 一 \o a S 站 一 站 一 一 一 一 一 S e ° == = Go = $n Qo oS ep gS 2 a 24 O20 & ee = Sis oo a eee + OO 本: S = ~n ioe) oo + co ~ 一 Om = rh \D ms = 口 oo : ™~ N 1 = g A = a oo 一 ~ es n.q. n.d. n.d. n.d. n.d. 0 Voc PGM PG CL PE PCM PC Ul U2 PS+U3 PI 图 8-14 不 同 深度 的 沉淀 物 内 不 同 种 类 磷脂 分 子 的 含量 吕 3 PG: 磷脂 酰 甘 油 ,DPG: 二 磷脂 酰 甘 油 ; PE: 磷脂 酰 乙醇 胺 , PCM: 缩 醛 磷 脂 酰 胆 碱 或 烷 基 酰基 础 脂 酰 胆 碱 ; PC: 磷脂 酰 胆 碱 ; PS: 磷脂 酰 丝 氨 酸 ; Pl: 磷脂 酰 肌 醇 ;Ul 一 U3: 未 识别 的 极 性 类 脂 分 子 。 除 此 之 外 , 图 中 还 给 出 了 大 多 数 种 类 的 磷脂 分 子 准 分 子 质 荷 比 和 酰基 链 组 成 。 脂 酰 链 的 识别 通过 MS/MS 实验 确定 〈n. d. : 未 检测 到 ; n. q. : 未 定量 ) 8.5.5 ”类 脂 组 学 在 宿主 -病原 体 相互 作用 研究 中 的 应 用 细胞 内 病原 体 〈 病 毒 、 细 菌 、 支 原 体 ) 的 细胞 生物 学 信息 提供 了 宿主 -病原 体 相互 作用 的 信息 。 有 关 宿 主 -病原 体 相 互 作 用 的 不 同 阶段 , 类 脂 分 子 所 起 的 作用 越 来 越 受到 人 们 的 关注 。 在 病原 体 吸附 、 侵 入 和 胞 内 运输 中 , 类 脂 分 子 具 有 识别 和 宿主 细胞 信号 转 导 的 作用 。 在 病原 体 复制 和 存活 期 间 , 脂 代谢 调节 着 细胞 能 量 的 动态 平衡 和 生物 膜 的 合 成 。 化 学 组 成 复杂 的 类 脂 分 子 具 有 免疫 调节 因子 的 作用 。 因 此 , 将 新 型 的 生化 分 析 方 法 和 细胞 分 子 生 物 学 结合 起 来 为 剖析 类 脂 分 子 在 宿主 -病原 体 相 互 作 用 的 机 制 开 辟 了 新 的 途径 。 基 于 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 的 类 脂 组 学 研究 是 分 析 病 原 体 类 脂 分 子 的 一 种 主要 生化 分 析 技 术 平 台 。 尽 管 目前 还 不 可 能 通过 一 次 试验 就 能 捕捉 到 细胞 或 组 织 中 所 有 的 类 脂 分 子 , 但 这 种 分 析 平 台 可 以 对 多 种 不 同 种 类 的 类 脂 分 子 进 行 定 性 、 和 定量。 大 量 类 脂 分 子 的 生化 信息 目前 正在 用 来 详细 研究 类 脂 分 子 相 关 生 物 合成 酶 及 其 运输 载体 "2 。 8.5.6 ”类 脂 组 学 在 n-3 多 不 饱和 脂肪 酸 影响 细胞 膜 微 区 域 研究 中 的 应 用 多 不 饱和 脂肪 酸 (PUFA), 存 在 于 海产 鱼肝油 中 , 能 够 调节 机 体 的 免疫 反应 , 在 。 182 。 Ih AR_E AS FS BA ESE Hd AIA IT PAR ERO), TCH 3 系列 的 多 不 饱和 脂肪 酸 在 正常 人 和 慢性 病 患者 的 生理 过 程 有 着 不 同 的 作用 , 如 调节 血浆 类 脂 水 平 、 心 血管 功 能 、 胰 岛 素 作用 。 最 近 研 究 表明 ,-3 多 不 饱和 脂肪 酸 在 免疫 反应 尤其 调节 工 细胞 信和 号 转 导 中 起 重要 作用 2~129 。 人 们 以 前 认为 质 膜 的 模型 是 简单 的 流体 灸 内 模 型 , 现 在 被 认为 包含 许多 特定 的 微 区 域 , 如 脂 答 和 膜 小 止 。 脂 管 是 比较 独特 的 膜 亚 区 域 , 它 不 溶 于 非 离子 表面 活性 剂 , 大 量 的 信号 转 导 蛋白 质 都 集中 在 这 些 功能 性 区 域 中 。 这 些 蛋 白质 是 信号 转 导 的 平台 , 在 活 细 胞 中 能 够 有 效 地 和 特定 地 进行 信号 传递 。 研 究 表明 ,3 PUFA 能 够 挫 人 到 质 膜 中 , 从 而 影响 脂 答 和 小 止 的 功能 2-~13] 。Pike 等 利用 MS/MS 技术 研究 了 脂 徐 中 的 类 脂 组 分 603 。 利 用 LC-MS/MS 技术 ,Stulnig 等 0C 呈 用 二 十 碳 五 烯 酸 (一 种 关 3 PUFA) 处 理 工 细胞 , 发 现 脂 管区 域 类 脂 分 子 中 PUFA (20:5, 22:5) BAAR. MPM, Li 等 82220 用 二 十 碳 五 烯 酸 CEPA) 和 二 十 二 碳 六 烯 酸 (DHA) 处 理工 细胞 , 利 用 LC- MS/MS 技术 测定 了 脂 签 区域 中 类 脂 分 子 的 变化 , 实 验 发 现 二 者 都 使 工 细 胞 脂 答 和 可 溶 膜 区 域 中 脂 酰 链 为 3PUFA 的 磷脂 分 子 含量 不 同 程度 地 增加 , 尤 其 是 在 脂 答 区 域 中 。 并 且 在 PC、PE、PS、PI 四 种 磷脂 分 子 中 ,PE 磷脂 分 子 脂 酰 链 组 成 变化 最 为 显著 。 图 8-15 为 负离子 HPLC/ESLMS 模式 下 人 Jurkat T 细胞 中 18 : 0 (对 照 ) 20:5 (EPA), 22:6 (DHA) 处 理 后 脂 第 中 PE 磷脂 分 子 谱 图 。 与 对 照 组 相 比 ,EPA 和 DHA 处 理 后 PE 磷脂 分 子 分 布 在 丰 度 上 发 生 了 很 大 变化 (A 8-15B,C) 。 图 8-15B 给 出 了 EPA 处 理 工 细胞 后 PE 分 子 的 主要 分 布 , 其 中 脂 酰 链 为 n-3 PUFA 的 PE 磷脂 分 子 丰 度 较 高 , 如 m/z 748.7 (p16 : 0/22: 5). 720.6 (p16: 0/20: 5), 764.7 (18: 0/20: 5,16 : 0/ 22:5), 792.8 (18: 0/22: 5). WH, ADHA HT AS. ERR KH, AB Bist 2-3PUFA AY m/z 722.7 (p 16? 0/20: 4), 744.8 (16 : 0/20: 1, 18+ 0/18: 1), 746.7 (p16: 0/22: 6, p 18+ 1/20: 5), 760.7 (18: 1/20: 6, 16+ 1/22: 6), 766.8 (p 18: 0/20: 4, p16: 0/ 22: 4), 790.7 (18: 0/22: 6, 18: 1/22: 5) 的 PE 磷脂 分 子 丰 度 较 大 (A 8-15C). 4 DHA, EPA Abe# T 4A ARE Kk PE 类 磷脂 分 子 分 布 不 同 的 是 , 对 照 组 中 以 脂 酰 链 为 六 6PUFA 4 m/z 750.7 (p18 : 0/20: 4, pl6 : 0/ 22:4), 744.7 (16: 0/20: 1, 18: 0/18: 1), 766.7 (18: 0/20: 4, 16+ 0/22: 4), 742.7 (18: 1/18: 1, 18: 0/18: 2), 722.7 (p16: 0/20: 4) 的 PE 磷脂 分 子 丰 度 BRK. SRim, FAAP AEE AB ES AA, OA AP AE 工 细 胞 中 AY AB AS FE PS PEAS fe] SS A A eK, BETIS A A, AB ERE ASE SA, 取决 于 细胞 生长 的 阶段 959 。 这 些 无 疑 为 脂 管 功能 性 区 域 的 研究 提出 了 许多 挑战 。 8.5.7 类 脂 组 学 在 疾病 和 药物 开发 研究 中 的 应 用 由 于 类 脂 分 子 具 有 多 种 生物 功能 , 包 括 膜 的 形成 、 能 量 储藏 、 信 和 号 转 导 和 载体 等 , 类 脂 代谢 网 络 的 泰 乱 可 引起 多 种 疾病 的 发 生 , 如 动脉 粥 样 硬化 6 、 冠 心病 5 和 阿尔 茨 海 默 病 (Alzheimer’s disease)030 。 测 定 类 脂 分 子 组 成 的 改变 、 含 量 水 平 的 变化 、 空 间 异 质 性 和 代谢 转换 (metabolic turnover) 有 助 于 揭示 疾病 中 类 脂 的 作用 。 。183 。 750.7 100% 对 照 748.8 ze ad Gee 80% 742.8. xe : ia 722.8 27 716.7 778.8 40% P97 700.7 785.4 & 1 26.7 76416 fe - | 20% 674.7 720. | he bh B127-4 ” 703.6) 6、 li 7H lh tg 7 647.4 这 -645.6 | " ill 山 he ANN fh hl, 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 m/z,amu 748.7 相对 强度 /% “640 二 669 , 63070820 ,...760 780 800 820 m/z,amu 80% 790.7 i 744.8 Jf0-7 x 722.7. = 60% 774.8 ® 40% ae it m2.7 ‘i 700.8 7a6 | a hia 20% 4634.5 726 HS , one i. 659.7 %885~ adn s il 山 | 机 8104 0% Ibi. | it Fb li ’ bye 640 660 680 700 720 740 760 78 800 820 ; m/z,amu 图 8-15 对照 组 、EPA #1 DHA Abe 4a HAGE Kieth PE 磷脂 分 子 在 负离子 模式 下 的 EMS 图 谱 8.5.7.1 巴特 式 综合 征 巴特 式 综 合 征 患者 不 能 有 效 地 将 亚 油 酸 并 人 到 心 磷脂 中 98) , 心 磷脂 对 线粒体 的 功 能 很 重要 5 , 从 而 导致 肌肉 组 织 功能 的 衰退, 进一步 诱发 心肌 病 的 产生 。 巴 特 式 综合 征 患者 血小板 中 的 磷脂 分 子 与 正常 人 血小板 中 的 磅 脂 分 子 存在 的 差异 性 可 用 来 诊断 巴特 式 综合 征 。Valianpour 等 "在 负离子 模式 下 , 利 用 正 相 LC-MS 将 心 磷脂 与 其 他 磷脂 分 子 分开 进 而 检测 心 磷脂 。 如 图 8-16 所 示 , 健 康 人 “〈 对 照 组 ) 血小板 中 的 心 磷 脂 中 脂 肪 酸 阴离子 wm/z 279 〈 对 应 亚 油 酸 ) 的 丰 度 很 高 , 而 在 巴特 式 综合 征 患 者 中 却 几 乎 检测 不 到 阴离子 wm/z 279。 利 用 质谱 谱 图 的 这 种 区 别 ,Valianpour 等 "和 建立 了 一 种 简单 和 灵敏 的 HPLC-ESEMS 分 析 方 法 , 用 于 巴特 式 综合 征 的 诊断 。 。 184 。 — eeeeeeeeeeeeeeeaeaeaaeaas 相对 强度 /% S 相对 强度 /% 260 270 280 290 300 310 mlz 8-16 LC/MS/MS 测定 Barth Syndrome 患者 和 对 照 组 血小板 中 的 心 磷脂 D 8.5.7.2 KA 类 脂 分 子 是 一 类 分 布 广泛 的 信使 分 子 , 参 与 了 胞 内 信和 号 转 导 、 胞 间 信 和 号 传递 , 具 有 神经 递 质 的 作用 。 近 年 来 许多 研究 发 现 类 脂 分 子 与 疼痛 、 炎 症 有 关 -……” 。6 种 类 型 的 类 脂 分 子 [类 前 列 腺 素 、 磷 脂 酰 肌 醇 二 磷酸 盐 、 神 经 酰胺 、 花 生 四 烯 酸 脂 〈 肪 ) Aah 代谢 物 、 脂 肪 酰 多 巴 胺 和 酰基 乙醇 胺 」 通过 与 信号 转 导 系统 中 的 受 体 相互 作用 , 在 调 解 疼痛 反应 中 具有 重要 的 作用 。 体 外 和 体内 的 许多 实验 都 证 明了 这 一 点 "” 。 液 相 色谱 -质谱 联 用 技术 的 发 展 为 这 些 类 脂 信号 转 导 分 子 的 鉴定 创造 了 条 件 "”” 。 8.5.7.3 脑 损 伤 及 其 相关 疾病 除 脂肪 组 织 外 , 脂 类 分 子 在 脑 组 织 中 含量 最 高 , 因 而 脂 代谢 对 于 神经 系统 起 着 尤为 重要 的 作用 。 许 多 神经 障碍 , 包 括 双 相 性 精神 障碍 、 精 神 分 裂 症 、 神 经 变性 疾病 〈 如 阿 尔 蒋 海 默 病 、 帕 金森 氏 症 和 尼 曼 -匹克 病 ) 都 与 脂 代谢 失调 有 关 0? 。 局 部 缺 血 或 再 灌注 时 , 线 粒 体 内 的 磷脂 分 解 能 够 影响 细胞 的 能 量 代 谢 "s …“ 。 伴 随 磷脂 酰 胆 碱 和 磷脂 酰 乙 醇 胺 中 脂肪 酸 组 分 的 改变 , 短 暂 的 脑 缺 血 也 会 使 磷脂 酰 胆 碱 、 磷 旨 酰 肌 醇 、 磷 脂 酰 丝氨酸 、 神 经 鞘 磷脂 和 心 磷脂 显著 损失 。 目 前 组 织 纤维 蛋白 酶 原 激活 剂 〈tPA) 是 美国 食品 与 药品 管理 局 批准 的 治疗 急性 脑 缺 血 的 药物 , 要 求 在 发 病 3h 内 服用 。 然 而 , 除 了 作为 血栓 溶解 剂 的 有 益 作 用 外 ,tPA 有 毒害 神经 的 副作用 ” 。 因 此 , 迫 切 需要 寻找 新 的 治疗 靶 标 , 开 发 新 的 脑 缺 血 治疗 药物 。 以 研究 脂 类 代谢 相关 因子 变化 为 主 的 类 脂 组 学 为 脑 缺 血 药物 开发 提供 了 新 的 机 遇 -”' 。 4 肥胖 肥胖 增加 了 心血 管 和 糖尿 病 的 危险 , 尤 其 是 向 心性 肥胖 的 脂肪 堆积 225 。 部 分 肥 胖 导 致 动脉 粥 样 硬 化 、 增 加 了 心血 管事 件 的 危险 性 , 其 特征 包括 高 密度 脂 蛋 白 胆 固 醇 浓 度 降 低 、 血 浆 中 甘油 三 酯 升 高 、 大 量 的 极 低 密度 脂 蛋 白 颗 粒 以 及 少量 密集 的 低 密 度 脂 蛋 白 颗 粒 “" 。 同 时 , 由 于 脂 类 的 过 氧化 反应 , 类 脂 功能 改变 和 脂肪 酸 组 分 失调 加 剧 了 动 脉 粥 样 硬化 和 糖尿 病 的 发 生 。 .185 + 考察 14 SAR WUE. BRAS HEAD RE aE AE HEE et Ys PS A ot FH 显 不 同 (A 8-17A) 。 含 量 丰富 的 磷脂 分 子 , 如 磷脂 酰 胆 碱 , 其 浓度 升 高 或 降低 取决 于 其 脂肪 酸 组 成 , 而 在 肥胖 双胞胎 中 , 具 有 促 炎 症 反应 和 促 动 脉 粥 样 硬化 的 溶血 磷脂 酰 胆 碱 的 浓度 升 高 , 具 有 抗 氧 化 性 质 的 醚 类 磷脂 的 浓度 降低 〈 图 8-17B) 。 类 脂 分 子 的 这 种 变化 与 胰岛 素 抵 抗 性 有 关 。 因 此 , 获 得 性 肥胖 与 遗传 无 关 , 而 与 类 脂 代谢 失调 有 关 , 并 且 这 种 脂 代谢 失调 容易 促 发 动脉 粥 样 硬 化 和 炎症 , 使 胰岛 素 不 敏感 性 升 高。 因此 , 肥 胖 的 正确 治疗 方案 或 许 应 指向 类 脂 代谢 途径 中 的 一 些 半 标 , 而 这 些 异 常 的 矫正 有 利于 防止 糖尿 病 和 心血 管 疾病 的 发 生 王 ” 。 A PLS-DA 得 分 矩阵 m 非 肥 胖 〈 男 性 ) @ 非 肥胖 〈 女 性 ) O 肥胖 〈 男 性 ) O 肥胖 〈 女 性 ) GPCho(38:3) GPCho(O-16:0/20:3) GPCho(38:2) GPEtn(0-36:3) GPEtn(38:1) co GPCho(34:3) c= GPCho(0-38:7) oj GPEtn(42:6) = GPCho(40:6) 4 GPCho(0-34:1) GPCho(36:4) fxm SM(d18:1/16:0) GPCho(38:6) faz GPCho(18:1/0:0) fxm GPCho(16:0/0:0) fxm GPCho(O-20:3/0:0) _ GPCho(38:4) fxm GPCho(O-20:3/0:0) aman GPCho(0:0/1 6:0) 上 szzzzzmzmzaszzmzz GPCho(34:4) == GPCho(20:4/0:0) [xan GPCho(18:2/0:0) fmm GPCho(0:0/20:4) axe GPCho(18:0/0.0) 卡 ear GPCho(16:0/20:4) fmm 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 图 8-17 最 小 二 乘 判别 分 析 法 CPLS/DA) 用 于 双胞胎 非 均匀 性 肥胖 症 类 脂 轮廓 分 析 A. PLS/DA 得 分 矩阵 ; B. PLS/DA 模型 中 VIP 变量 倍数 的 变化 D59 “186 。 ; i rus weet 表 8-2 列 出 了 类 脂 组 学 在 其 他 疾病 研究 中 的 应 用 。 表 8-2 ”类 脂 组 学 在 疾病 研究 中 的 应 用 疾病 文献 阿尔 海 默 氏 病 [159~163] 癌症 (包括 卵巢 癌 ) [164 一 168] 糖尿 病 [65,169,170] PRZE TORE FE AB Ha i 0 RE (NCL) [90] PRUE [171,172] 高 雪 氏 病 [173] 肾病 [174,175] 类 脂 分 子 的 功能 , 包 括 细胞 膜 形成 和 代谢 、 能 量 储藏 、 类 脂 运输 以 及 其 他 的 许多 生 理 功 能 都 使 得 它们 在 药物 开发 中 成 为 重要 的 评价 指标 ”5 。 作 为 信号 转 导 分 子 前 体 的 许 多 膜 类 脂 分 子 正在 成 为 癌症 和 呼吸 疾病 的 药物 靶 标 ns 5 。 例 如 , 神 经 酰胺 升 高 与 细胞 凋 亡 有 关 , 而 鞘 氢 醇 -1- 磷 酸 能 够 促进 细胞 生长 和 迁移 。 在 许多 瘤 证 疾病 中 鞘 脂 类 的 含 量 水 平 都 会 发 生变 化 。 因 此 , 神 经 酰胺 的 合成 和 代谢 成 为 新 的 和 可 能 的 癌症 治疗 pO 。 在 制药 工业 中 , 类 脂 靶 标 并 不 是 新 兴起 来 的 。 实 际 上 , 许 多 很 成 功 的 药物 种 类 , 包 括 降低 胆固醇 的 制剂 和 环 加 氧 酶 抑制 剂 都 是 直接 作用 于 有 关 类 脂 代谢 酶 。 类 脂 功能 的 许 多 新 模式 在 药物 开发 的 不 同 阶段 都 有 贡献 , 如 监测 细胞 膜 和 组 织 中 类 脂 分 子 的 变化 有 助 于 评价 药物 毒性 ”… ”1 。 8.5.8 类 脂 组 学 在 功能 研究 中 的 应 用 除了 上 述 应 用 , 类 脂 组 学 已 经 用 于 识别 与 植物 生理 有 关 的 研究 中 D59 , 包 括 识别 在 应 激 反应 中 的 代谢 途径 、 特 定 基因 和 酶 的 作用 以 及 寻找 与 植物 防御 反应 有 关 的 脂 代谢 的 酶 5 。 磷 脂 酶 D 能 够 将 磷脂 水 解 成 PA, 而 PA 在 植物 中 含量 尤其 丰富 。 例 如 , 利 用 ESI 串联 质谱 的 pre 和 NL 扫描 功能 ,Welti °° Me TAA (—8°C) 环境 中 间 类 分 子 的 变化 (AI 8-18) 。 这 些 变化 包括 PC、PE、PG 和 MGDG 的 损失 和 PA、ly- soPC 和 lysoPE 的 增加 。PA 的 增加 以 及 PC、PE 和 PG 的 损失 表明 这 3 种 磷脂 被 磷脂 酶 D 水 解 了 , 而 lysoPC、1lysoPE 的 生成 表明 磷脂 酶 A 被 激活 了 。 为 了 测定 磷脂 酶 Da (因为 磷脂 酶 Da 在 植物 中 是 一 种 常见 的 磷脂 酶 D) 在 冰冻 环境 中 在 植物 中 的 作用 , 他 们 还 比较 了 磷脂 酶 D 缺乏 的 拟 南 芥 中 脂 类 分 子 的 变化 。 他 们 发 现在 冰冻 环境 中 ,PC BR 站 分 子 在 野生 型 和 磷脂 酶 Da 缺乏 的 植物 中 减少 的 程度 有 显著 不 同 (45% : 22%), 而 PE 和 PG 在 两 者 中 的 变化 比较 接近 。 同 时 , 磷 脂 酶 Da 缺乏 的 植物 在 冰冻 过 程 中 PA 含 量 比 野 生 植物 中 含量 增加 了 50% , 从 而 证 实 了 PC 是 磷脂 酶 Da 的 主要 活体 底 物 , 这 种 酶 在 PA 的 产生 中 具有 关键 的 作用 。 类 脂 代谢 轮廓 也 有 助 于 识别 细胞 生物 工程 中 的 基因 和 酶 。Shan 和 他 的 同事 通过 研 究 缺 乏 不 饱和 脂肪 酸 酶 的 突变 等 位 基因 所 引起 的 植物 叶子 类 脂 代谢 轮廓 变化 , 识 别 出 了 。 187 。 两 种 抑制 基因 , 盖 明了 类 脂 代谢 在 植物 防御 反应 中 的 作用 Dszas9 。 脂 质 / 干 重 (nmol/mg) Ll SrSTAAMNTNOARAAMNTNHMOANTPFHOANANT SDrHORMANTHORANTNOANTHOANAMN TS AATHFHTHTHTHPTTOOSCGCOSCOCHDHHHOHHSSAAA NGNr 寸 寸 寸 十 十 十 十 DDNONDSDooooooooo 忆 已 NGQNQ mnnnnnnnnnnnnnnnnnonoan 寸 寸 寸 寸 寸 mnnnnnnnnnnnnnnmnoamn 寸 寸 寸 寸 寸 脂 质 分 子 种 类 (总 酰基 碳 数 , 双 键 数 ) 图 8-18 利用 ESI 串 联 质谱 测定 植物 拟 南 芥 在 冰冻 环境 中 的 脂 类 分 子 变 化 5 8. 5.9 类 脂 组 学 在 药物 滥用 研究 中 的 应 用 国立 药物 滥用 研究 所 CNIDA) 进行 动物 和 人 的 分 子 神经 科学 和 行为 研究 始 于 20 世纪 70 年 代 , 主 要 是 揭示 脑 在 药物 涩 用 中 的 作用 。 研 究 发 现 , 脑 内 部 的 化 学 物质 〈 脑 啡 肽 ) 和 外 源 性 麻 醇 剂 , 如 海洛因 作用 于 脑 的 同样 部 位 , 调 节 着 情绪 和 疼痛 , 从 此 也 引 发 了 药物 滥用 和 脑 功能 的 研究 。 涂 用 药物 是 一 种 可 预防 的 行为 , 由 于 具有 强迫 性 , 药 瘾 是 一 种 脑 部 疾病 。 中 枢 神经 系统 类 脂 组 学 有 可 能 成 为 保健 学 和 治疗 学 发 展 的 关键 领域 。 类 脂 组 学 在 系统 发 现 新 的 大 脑 信 号 转 导 分 子 和 途径 中 扮演 着 重要 角色 。 因 此 ,NIDA it 划 利 用 新 发 展 起 来 的 类 脂 组 学 来 前 明 滥 用 药物 的 作用 机 制 , 开 发 新 的 药物 5 。 最 近 有 研究 报道 一 些 类 脂 分 子 的 受 体 已 被 克隆 , 其 中 一 些 被 证 明 是 调节 中 枢 神 经 系 统 功能 的 G 蛋白 偶 联 受 体 (GPCR). & NIDA 更 感 兴趣 的 是 , 这 些 受 体 有 可 能 与 调解 .188 。 药物 滥用 的 神经 功能 有 关 。 有 关 类 脂 信和 号 转 导 分 子 一 个 重要 的 研究 领域 就 是 它们 在 调节 免疫 应 答 中 的 作用 , 尤 其 在 药物 诱导 免疫 抑制 中 的 作用 。 脂 答 和 细胞 膜 小 凹 在 细胞 信号 转 导 、 病 毒 人 侵 和 免疫 调节 中 的 作用 日 益 受 到 人 们 的 重视 。 因 此 了 解 脂 筱 的 作用 对 于 药 物 滥 用 研究 人 员 显 得 尤为 重要 。 此 外 , 类 脂 信号 分 子 在 婴儿 神经 细胞 发 展 、 抑 郁 、 应 激 、 人 愉快、 饮食 调节 和 睡眠 调节 中 的 作用 不 仅 是 药物 滥用 研究 人 员 , 也 是 其 他 神经 科学 研究 人 员 感 兴趣 的 领域 ”) 。 8. 5.10 “与 类 脂 组 学 相关 的 数据 库 Dea 类 脂 组 学 分 析 离 不 开 各 种 代谢 途径 和 生物 化 学 数据 库 , 几 个 有 用 的 网 站 提供 了 类 脂 分 子 、 类 脂 分 析 和 类 脂 代 谢 的 信息 Cyberlipid (http://www. cyberlipid. org/) :除了 包含 类 脂 分 子 结构 及 其 相关 文献 目 录 外 , 还 包含 了 有 关 类 脂 分 析 方 法 的 信息 。 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (http://www. genome. jp/ kegg/) :收集 了 基因 、 配 体 、 生 物 系 统 的 功能 体系 、 途 径 , 包 含 了 很 多 与 脂 代谢 相关 的 酶 和 配 体 途 径 。 Lipid Bank(http; //lipidbank. jp/) :不 仅 包 含 了 6000 多 种 类 脂 分 子 相 关 的 化 学 物理 性 质 、 生 物 活性 信息 、 人 代谢、 基因 信息 , 还 包含 了 结构 式 、 色 谱 数 据 、 紫 外 〈UV) 数 据 、 红 外 CIR) 数据 、 核 磁 共 振 (NMR) 数据 和 质谱 数据 的 图 解数 据 。 此 外 , 还 对 类 脂 分 子 进 行 了 分 类 , 并 提供 了 一 些 高 级 搜索 工具 。 Lipid Data Bank (LDB) (http://www. caffreylabs. ul.ie) :包含 了 LIPIDAT (类 脂 分 子 相关 的 热力 学 信息 )、LIPIDAG (类 脂 分 子 的 可 混合 性 及 其 相关 的 约 1600 个 相位 图 ) 和 LMSD (包含 约 13 000 个 分 子 结构 ) 数据 库 。 LIPID MAPSChttp: //www. lipidmaps. org/) :由 美国 国立 卫生 院 CNIH) 授予 的 协 会 建立 。 主 要 集中 在 类 脂 分 子 的 代谢 组 , 通 过 建立 代谢 系统 研究 类 脂 代 谢 物 的 全 面 的 变 化 , 即 类 脂 组 学 研究 。 他 们 用 12 位 数字 代码 对 类 脂 分 子 进 行 了 系统 分 类 , 体 现 了 类 脂 分 子 的 种 类 和 亚 种 类 。 该 网 站 包含 : (1) IPID MAPS 结构 数据 库 Structure Database (LMSD) , 目 前 包含 了 10 000 多 种 类 脂 分 子 的 化 学 结构 。 (2) 有 蛋白质 组 数据 库 (LMPD), 包 含 了 来 自 UniProt、EntrezGene、ENZYME、 GeneOntology GO 和 KEGG 注解 的 与 类 脂 有 关 的 和 蛋白质 序 列 。 (3) 多 种 搜索 性 能 , 绘 制 类 脂 分 子 结构 的 工具 ; 质谱 工具 (质谱 信息 的 运算 法 则 , 同位 素 模式 的 计算 ) 。 Lipid Library (http://www. lipidlibrary. co. uk/) : 由 苏格兰 作物 研究 所 W. W. Christie 创办 , 包 含 类 脂 分 子 分 析 〈 尤 其 是 脂肪 酸 分 析 ) 的 大 量 信息 、 最 新 的 参考 书 目 、 数 以 百 计 的 质谱 数据 、 脂 肪 酸 盐 生 物 的 8C-NMR 化 学 位 移 、 分 析 方 法 的 一 些 建 议 和 类 脂 分 子 的 生物 化 学 和 化 学 知识 , 并 收集 了 一 些 有 价值 的 与 类 脂 分 子 有 关 的 链接 。 “Seed oil fatty acids” (SOFA) 数据 库 (http://www. bagkf. de/sofa/) :德国 营养 和 食品 联合 研究 中 心 创 办 , 主 要 收集 了 有 关 植 物 油 及 其 类 脂 组 成 的 信息 。 。 189 。 vee 类 脂 研究 得 益 于 其 他 学 科 和 领域 的 进展 和 成 果 。 首 先 , 基 因 和 细胞 生物 学 的 发 展 揭 示 了 类 脂 作用 的 分 子 机 制 。 其 次 , 类 脂 和 类 脂 分 子 代谢 物 在 许多 疾病 研究 中 具有 重要 作 用 。 第 三 , 新 的 分 析 技 术 〈 尤 其 是 液 质 联 用 技术 ) 的 发 展 使 得 复杂 生物 样品 中 类 脂 的 分 析 得 到 了 快速 发 展 。 最 后 , 类 脂 标准 品 合成 技术 、 天 然 类 脂 提取 技术 以 及 类 脂 亲 和 探 针 等 新 技术 的 发 展 促进 了 活 细胞 内 的 类 脂 代谢 研究 和 体外 生化 分 析 。 类 脂 组 学 的 发 展 能 够 为 蛋白 质 和 基因 组 学 提供 额外 的 数据 信息 , 而 蛋白 质 组 学 和 基因 组 学 的 发 展 也 进一步 增 强 了 我 们 对 类 脂 功能 的 了 解 , 扩 大 了 类 脂 组 学 在 微生物 、 分 子 生 物 学 、 医 学 , 药 物 开 发 等 其 他 领域 研究 中 的 应 用 。 参考 文献 [1] Alessenko A V, Burlakova E B. Bioelectrochemistry, 2002, 58: 13 [2] Ghosh S, Strum J C, Bell RM. 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类 似 地 , 蜡 常 蛋白 质 不 一 定 会 对 代谢 产物 造成 不 利 的 影响 。 诱因 和 这 些 异 常 的 蛋白 质 或 代谢 产物 的 相关 程度 决定 了 由 诱因 预测 疾病 的 发 生 的 准确 w“ 195 。 率 。 一 般 来 说 , 单 个 基因 标志 物 不 能 反映 产生 一 个 特定 疾病 的 所 有 突变 情况 , 而 且 一 些 随机 发 生 的 基因 突变 往往 检测 不 到 。 因 此 , 目 前 的 分 子 生物 学 诊断 方法 的 假 阴 性 很 高 。 另 一 方面 , 基 因 片 段 的 很 多 突变 〈 良 性 的 多 态 性 )5 如 果 没 有 得 到 表达 , 不 会 产生 不 良 的 医学 后 果 , 这 意味 着 使 用 基于 基因 的 分 子 生 物 学 方法 容易 导致 较 高 的 假 阳 性 。 正常 基因 _ 异常 基因 正常 重 白质 < 异常 蛋白 质 正常 代谢 物 aire 健康 人 患者 图 9-1 遗传 疾病 中 基因 型 与 表 型 之 间 的 关系 示意 图 对 代谢 产物 进行 全 面 的 测定 , 不 仅仅 可 以 用 于 疾病 的 诊断 〈 即 利用 代谢 物 的 标志 物 实现 对 疾病 的 诊断 ), 而 且 可 以 对 疾病 从 发 病 到 疾病 的 加 重 过 程 进行 整个 过 程 的 监测 , 分 辨 出 疾病 的 严重 程度 , 从 而 可 在 疾病 的 发 病 之 前 和 之 初 , 进 行 及 时 的 预防 和 治疗 。 研 究 表明 , 大 多 数 疾病 的 发 病 与 酶 活性 的 降低 或 失效 〈 遗 传 、 毒 物 )、 不 合适 的 底 物 比例 《营养 ) 或 错误 的 代谢 调节 〈 遗 传 、 营 养 、 生 活 方式 等 ) 有 关 。 所 有 这 些 因素 的 影响 都 归结 于 正常 的 代谢 受到 破坏 。 因 此 , 通 过 对 代谢 产物 的 定量 分 析 〈 即 代谢 组 学 的 分 析 ), 不 但 能 观察 到 代谢 的 变化 , 也 能 通过 对 特定 代谢 途径 “〈 生 化 代谢 途径 也 是 一 个 世纪 以 来 生命 科学 研究 的 焦点 ) 的 分 析 , 解 析出 疾病 的 机 制 。 而 一 旦 找到 疾病 的 病因 后 , 就 可 以 针对 不 同 的 原因 进行 干预 和 治疗 : 如 果 代 谢 的 泰 乱 是 由 底 物 的 不 平衡 〈 和 营养 不 均衡 ) 导 致 的 , 理 所 当然 地 将 选择 均衡 营养 进行 治疗 ;如 果 发 现 是 酶 的 活性 发 生 了 变化 , 那 么 就 MF aha GER) 用 药 。 以 胆固醇 为 例 , 胆 固 醇 的 含量 被 认为 是 检测 心血 管 疾病 患 病 风 险 的 一 个 重要 的 指标 , 但 胆固醇 的 浓度 大 小 并 不 能 反映 出 导致 胆固醇 积累 的 原因 , 这 样 也 就 不 能 给 出 合适 的 治疗 方案 。 一 般 来 说 , 血 清 中 胆固醇 升 高 主要 有 以 下 几 个 原因 : 中 肠 对 胆固醇 的 吸收 过 度 ;@O 内 源 性 的 胆固醇 生物 合成 过 于 旺盛 ; OAR AF 向 胆汁 酸 的 转化 过 缓 。 仅 仅 测 量 血 中 的 总 胆固醇 含量 并 不 能 分 辨 出 是 哪 种 原因 , 但 如 果 将 检测 的 对 象 扩大 为 对 固 醇 类 化 合 物 及 其 代谢 产物 的 分 析 , 那 就 可 以 得 到 需要 的 信息 了 。 和 那些 对 胆固醇 过 度 吸收 的 患者 过 度 吸 收 胆固醇 的 同时 , 对 植物 中 当 醇 类 化 合 物 也 过 度 吸 收 , 在 这 些 患者 的 血浆 中 植物 省 醇 类 化 合 物 的 浓度 也 较 高 , 由 此 可 以 认为 这 类 患者 是 由 于 肠 对 胆固醇 的 过 度 吸 收 所 致 的 , 治 疗 时 应 针对 胆固醇 的 肠 吸收 靶 点 用 药 。 而 对 于 那些 肝脏 和 体内 胆固醇 合成 旺盛 的 患者 而 言 , 其 血浆 中 的 甲 羟 成 酸 的 含量 可 以 直接 反映 固 醇 类 化 合 物 的 体内 合成 速率 , 因 此 治疗 时 应 施 与 胆固醇 生物 合成 的 抑制 剂 。 最 后 , 对 于 那些 由 于 胆固醇 向 胆汁 酸 转化 不 充分 的 患者 , 可 以 通过 直接 检测 转化 的 反应 产物 7-e- 羟 -4- 胆 当 烽 -3- 酮 的 含量 而 知 。 .196 , 针对 在 临床 领域 的 这 两 个 目标 〈 诊 断 和 机 制 研究 ), 相 应 的 代谢 组 学 的 研究 方法 略 有 不 同 。 在 进行 诊断 上 , 往 往 采用 对 已 知 标志 物 的 靶 标 分 析 〈target analysis) , 或 是 采用 指 纹 分 析 〈fingerprint analysis) 的 方法 实现 对 疾病 的 诊断 。 在 针对 机 制 的 研究 中 , 往 往 采 用 ” 代谢 轮廓 分 析 (metabolic profiling) 和 代谢 组 学 (metabonomics 或 metabolomics) 的 分 析 来 分 析 尽 可 能 多 的 代谢 产物 , 利 用 数据 挖掘 工具 找 出 有 重要 意义 的 代谢 产物 , 寻 找 新 的 标 志 物 和 更 透彻 地 了 解 疾 病 的 发 生 过 程 , 并 用 于 准确 的 诊断 、 治 疗 及 其 预后 判断 中 。 在 进行 代谢 轮廓 分 析 和 代谢 组 学 的 分 析 时 , 我 们 旨 在 分 析 生 物 样 品 中 的 所 有 代谢 产 物 的 全 部 或 部 分 , 并 得 到 定量 信息 。 正 如 在 前 面 的 章节 中 提 到 的 那样 , 由 于 代谢 组 学 研 究 对 象 的 性 质 复 杂 , 目 前 还 没有 能 够 完全 满足 代谢 组 学 分 析 要 求 的 技术 。 在 当前 的 研究 中 , 主 要 存在 两 种 分 析 的 策略 : 一 种 是 “ 自 上 而 下 ” (top down) 的 策略 , 利 用 代谢 产 物 普遍 具有 的 性 质 实现 代谢 组 学 分 析 , 如 NMR 可 以 对 有 活性 氢 或 碳 元 素 的 代谢 产物 进 行 分 析 ;, 另 一 种 是 “ 自 下 而 上 ”(bottom up) 的 策略 , 将 代谢 产物 分 成 不 同 的 种 类 , 根 据 这 些 不 同 的 种 类 分 别 使 用 合适 的 分 析 方法 进行 测定 , 最 后 整合 成 完整 的 数据 库 , 在 这 种 方法 中 , 广 泛 采 用 质谱 和 色谱 联 用 技术 。 比较 而 言 , 自 上 而 下 的 策略 的 通 量 较 高 , 检 测 时 预 处理 较 少 , 对 样品 的 原始 信息 保 留 较 多 , 而 问题 在 于 , 由 于 缺乏 分 离 手段 , 很 多 低 浓 度 的 代谢 产物 往往 检测 不 到 , 得 到 的 结果 常常 难以 进行 准确 的 定性 定量 , 从 而 在 对 结果 的 解析 上 存在 一 定 的 困难 , 而 且 目 前 NMR 的 谱 图 由 于 缺乏 较 好 的 数据 库 , 也 增加 了 结果 解析 的 难度 。 而 自 下 而 上 的 策 略 , 能 够 检测 较 多 的 化 合 物 , 色 谱 与 质谱 的 联 用 可 以 提供 结构 信息 , 为 结果 的 解析 提供 了 一 定 的 便利 , 由 于 分 析 方 法 有 着 很 强 的 针对 性 , 得 到 的 代谢 产物 的 定性 定量 结果 较为 准确 , 但 问题 主要 在 于 其 分 析 的 通 量 较 低 , 不 适合 于 大 规模 的 筛选 。 9.2 代谢 组 学 用 于 心血 管 疾病 严重 程度 的 诊断 心血 管 疾病 是 发 达 国 家 中 发 病 率 和 和 死亡 率 最 高 的 一 种 疾病 , 随 着 我 国人 民生 活水 平 的 提高 , 该 病 的 发 病 率 也 随 之 提高 了 。 近 三 十 年 的 流行 病 学 研究 表明 , 这 种 疾病 与 很 多 环境 和 生化 因素 有 关 , 例 如 , 吸 烟 者 比 不 吸烟 的 患 心血 管 疾病 的 风险 高 1 倍 ; 血液 中 富 含 甘 油 酯 的 脂 蛋 白 〈 主 要 是 极 低 密 度 脂 蛋白 和 低 密 度 脂 蛋白 ) 中 的 胆固醇 水 平 与 心血 管 疾病 的 发 病 风险 呈正 相关 , 而 高 密度 脂 蛋白 中 的 胆固醇 水 平 与 之 负 相 关 。 这 些 流 行 病 学 的 研究 结果 支持 了 公共 健康 政策 和 指导 人 们 的 生活 方式 , 如 在 公共 场合 禁止 吸烟 、 减 少 高 胆固醇 食物 的 摄 和 等, 提供 了 导致 动脉 硬化 和 其 他 心血 管 疾病 发 病 机 制 的 重要 分 子 生 物 学 线索 。 而 且 , 目 前 已 经 有 综合 致 病 风 险 因素 〈 年 龄 、 性 别 、 脂 蛋白 水 平 、 血 压 等 ) 的 方法 用 于 鉴别 心血 管 疾病 发 病 的 高 危 人 群 。 但 是 , 这 些 方法 还 很 难 有 效 地 用 于 患者 心 血管 疾病 的 诊断 中 。 英国 帝国 理工 学 院 的 Jeremy K. Nicholson 教授 等 使 用 基于 NMR 技术 的 代谢 组 学 方法 对 传统 医学 方法 确诊 的 心血 管 患者 的 血清 〈 或 血浆 ) 进行 了 分 析 , 对 该 方法 和 传统 的 风险 因子 的 诊断 效果 进行 了 比较 6 。 该 研究 比较 了 36 例 严重 的 心血 管 疾病 (triple vessel disease, TVD) 患者 和 30 例 经 血管 造影 确认 冠状 动脉 正常 的 患者 (normal coro- nary artery, NCA) 的 血清 的 NMR 结果 (图 9-2A,B) 。 从 原始 谱 图 中 看 不 到 明显 的 ss 19% « 脂 类 脂 类 丙胺 酸 % C 5M vip 极 低 密度 脂 蛋 白 ETH ae 低 密度 脂 蛋白 , 极 低 密 度 脂 蛋白 JET 遇 OSES Tob). 556 45.3.5 958575 65554535 251505. 0.5 feet: 85. 7.5 .65.45 {35525005 化 学 位 移 /5 化 学 位 移 /8 D E ji 0.40 0.30 0.20 0 0.10 i = 0.00 We -1 “0.10 —0.20 -030 一 -0.40 222893R82Rs32S NS 党 ee ee ne er ae 化 学 位 移 /5 F G 系数 t[2] 0.80 2 0.60 0.40 0.20 I 0.00 0.20 0 ~0.40 ~0.60 ps a S&F B 15 6545 TiS oOo o oO o oO nn] 化 学 位 移 /5 图 9-2 TVD BAR NCA 患者 的 比较 A. NCA 患者 和 B. TVD 患者 血清 的 典型 600MHz 1H-NMR 谱 图 ; C. TVD 患者 血清 典型 谱 图 的 数据 消减 后 谱 图 ,d4. 5 一 d6 部 分 被 消减 来 避免 由 水 的 信号 导致 的 信号 抑制 ; D. PLS-DA 得 分 图 显示 NCA (A) 和 TVD (BD 能 够 得 到 较 好 的 区 分 。 主 要 的 区 分 来 自 于 t2 和 t3; E 图 D 对 应 的 回归 系数 图 。 正 值 意味 着 TVD HAL NCA 样本 高 , 负 值 意味 着 TVD FAL NCA 样本 低 ; F. 使 用 OSC 去 除 噪音 后 的 PLSDA 图 , 主 要 的 区 分 来 自 于 世 Alt2, G. 对 应 于 图 下 的 回归 系数 图 —0.80 —0.60 —0.40 0.80 e 198 = 差别 。 因 此 该 研究 应 用 化 学 计量 学 的 方法 对 两 组 数据 进行 了 比较 。 首 先 , 为 了 减少 NMR 数据 的 复杂 性 和 便于 比较 , 将 谱 图 自动 地 分 成 245 个 小 的 片段 , 分 别 对 应 着 0.0410 ° AY RHA (A 9-2C) , 这 样 数据 就 可 以 表示 为 一 个 66 〈 样 本 , 对 应 着 分 析 对 象 的 数目 ) X245 (变量 , 对 应 样本 在 NMR 谱 图 不 同 片 段 上 的 响应 ) 的 和 矩阵。 然后 , 对 这 些 数 据 进 行 主 成 分 分 析 〈principal components analysis, PCA) 和 偏 最 小 二 乘 判 别 4}#f (partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA) 。PLS-DA 的 第 二 及 第 三 个 主 成 分 的 得 分 图 结果 (图 9-2D) 显示 , 虽 然 两 类 样本 有 少量 的 重 于 , 但 是 可 以 明显 地 看 到 聚 类 。 相 应 的 变量 相关 系数 〈coefficient) (A 9-2E) 给 出 了 两 类 样品 的 NMR 谱 图 的 不 同 轮廓 。 图 中 横 坐 标 对 应 245 个 宽度 为 0.04 的 化 学 位 移 的 区 间 。 其 中 , 正 值 代表 在 该 化 学 位 移 区 间 ,TVD 样本 中 对 应 的 代谢 物 浓度 有 着 较 大 的 值 , 负 值 表示 在 该 区 间 , 与 NCA 样本 相 比 ,TVD 中 的 代谢 物 浓 度 较 低 。 相 关系 数 〈 或 loading plot) 的 结果 表 AA, Xf TVD 样品 起 重要 作用 的 代谢 物 主要 分 布 于 80. 86 〈 主 要 由 脂 类 特别 是 LDL 和 VLDL 中 的 脂肪 酸 链 中 的 CH; 基 团 产生 )、81.3 和 $1.4 [主要 由 脂 类 特别 是 LDL 和 VLDL 中 的 脂肪 酸 链 中 的 〈CH; ), 基 团 产生 ]。 而 对 NCA 样品 影响 较 大 的 变量 则 是 31. 22 [主要 由 脂 类 特别 是 HDL 中 的 脂肪 酸 链 中 的 〈CH: ), 基 团 产 生 ] 和 8$3. 22 [主要 由 胆 碱 -N〈CHs ); 产生 j]。 其 中 胆 碱 为 大 部 分 来 源 于 脂 蛋 白 〈 主 要 是 HDL) 中 的 磷酸 胆 碱 中 的 胆 碱 片 段 。 为 了 提高 分 类 的 效果 , 研 究 者 采用 了 正 交 信号 校正 技术 (orthogonal signal correc- tion, OSC) 来 提高 模式 识别 的 效果 和 模型 的 预测 能 力 。 应 用 OSC fa, TVD 和 NCA 样本 能 在 PLS-DA 的 得 分 图 中 得 到 良好 的 区 分 (AL 9-2F) 。 而 回归 得 到 的 相关 系数 (A 9-2G) 的 结果 则 与 使 用 OSC 前 的 结果 相同 。 之 后 , 随 机 选择 其 中 的 80%% 的 样本 作为 训练 集 用 以 建立 PLS-DA 的 模型 , 剩 下 的 20 儿 的 样本 作为 测试 集 用 该 模型 进行 预测 , 来 评价 模型 的 可 信和 度 和 稳定 性 。 该 模型 的 相 关系 数 结果 与 上 述 结 果 相 一 致 , 脂 类 (EB VLDL, LDL 和 HDL) 及 胆 碱 对 该 模型 有 着 重要 的 作用 。 使 用 该 模型 对 冠状 动脉 性 心脏 病 〈coronary heart disease, CHD) 进 行 了 预测 , 灵 敏 度 为 92% , 特 异性 为 93% (图 9-3) 。 图 9-3 中 的 > 轴 “1” 表 示 TVD, “0” 表示 NCA, 以 0. 5 为 分 界 点 。 为 了 进一步 发 挥 代谢 组 学 的 威力 , 研 究 者 们 进行 了 区 分 疾病 的 严重 程度 的 研究 。 他 们 分 别 收 集 了 一 支 〈 轻 微 患 者 ,28 例 )、 两 支 〈 中 度 患者 ,20 例 )、 三 支 〈 重 度 患者 , 28 例 ) 冠状 动脉 狭窄 的 血清 样本 。 对 这 76 个 样品 按照 上 文中 的 方法 进行 分 析 , 结 果 《图 9-4) 表明 使 用 该 方法 可 以 区 分 该 疾病 的 严重 程度 , 而 影响 分 类 的 主要 因素 仍 为 上 文 提 及 的 代谢 物 。 为 了 更 好 地 说 明 问 题 , 图 9-4 同时 给 出 了 三 种 不 同 严重 程度 的 病历 两 两 比较 的 结果 。 结 果 表 明基 于 患者 血清 的 代谢 组 学 研究 能 够 区 分 冠 心病 的 严重 程度 。 研究 者 同时 也 对 传统 的 风险 因子 的 结果 进行 了 相似 的 处 理 , 包 括 年 龄 、 血 压 、LDL 和 了 HDL 胆固醇 、 总 胆固醇 、 总 甘油 脂 、 纤 维和 蛋白 原 、 血 桨 纤 溶 酶 原 激 活 物 抑制 剂 (plasminogen activation inhibitor, PAI-1), A 4Hi@a. VLAAMS. MARE 度 组 进行 ANOVA 分 析 , 均 无 显著 性 差异 。 对 其 进行 PLS-DA 处 理 , 也 未 能 提取 出 具 有 统计 学 显著 性 的 主 成 分 。 © (190% 0 10 20 30 40 50 60 样品 数 图 9-3 使 用 PLSDA 模型 对 疾病 的 预测 图 Ca) NCA (@) TVD B 95 85 7.5:--65\45 Sa 425 Bios 化 学 位 移 /5 95 85. 75 6545 35 Zeina 化 学 位 移 /5 图 9-4 不 同 严重 程度 的 冠状 动脉 狭窄 患者 的 比较 谱 图 来 自 于 另外 76 个 男性 患者 , 这 些 患者 使 用 血管 造影 确诊 。 分 别 为 28 例 轻 度 患者 、20 例 中 度 患者 和 28 例 重 度 患 者 。 然 后 使 用 与 图 9-2 相同 的 OSC 变换 对 数据 进行 PLS-DA 处 理 。A. 全 部 分 组 的 PLS-DA 的 比较 , 轻 度 (A). PE 〈@) 、 重 度 〈 国 ) 。 在 第 一 维 上 轻 度 患者 能 与 其 他 分 开 ,B. 对 应 于 A 图 的 回归 系数 图 ,C、D. 轻 度 患 者 与 中 度 患者 的 对 比 ; ELF 中 度 患者 与 重度 患者 的 对 比 ; G、H 卫 . 轻 度 患者 与 重度 患者 的 对 比 。 200 。 fe eo io teas 35 25. LS 0s 化 学 位 移 司 -0.60 -0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 AS t(] 化 学 位 移 /5 图 9-4 不 同 严重 程度 的 冠状 动脉 狭窄 患者 的 比较 (BE) 9. 3 基于 修饰 核 苷 的 代谢 组 学 用 于 肝脏 疾病 的 研 完 修饰 核 背 是 细胞 增生 时 RNA 代谢 产物 , 从 尿 液 中 排出 , 恶 性 肿瘤 均 有 细胞 异常 增 生 。 因 此 不 同类 型 恶性 肿瘤 患者 尿 中 均 可 能 出 现 修饰 核 背 含量 的 增高 。 如 能 证 实 这 一 推 测 , 理 论 上 讲 , 屎 中 修饰 核 苷 就 能 成 为 一 种 普 适 性 肿瘤 标志 物 。 这 一 标志 物 如 能 用 于 肿 瘤 临 床 检验 , 恰 可 弥补 蛋白 质 与 基因 肿瘤 标志 物 检 测 谱系 过 罕 、 诊 断 敏 感性 较 低 的 缺 陷 。 研 究 表明 , 癌 症 患 者 尿 中 修饰 核 苷 的 含量 明显 高 于 正常 人 。 另 有 一 些 报道 表明 修饰 核 苷 可 用 于 监控 癌症 的 进展 和 治疗 效果 。 前 期 研究 表明 使 用 化 学 计量 学 的 方法 建立 的 核 苷 靶 标 分 析 方 法 可 以 实现 对 恶性 肿瘤 的 高 灵敏 度 检 测 , 并 可 用 于 监控 癌症 的 进展 和 治疗 效果 中 。 然 而 有 些 良 性 疾病 , 特 别 是 炎症 在 该 方法 中 呈 阳 性 , 阻 碍 了 该 方法 的 应 用 。 许 国 旺 研 究 组 构建 了 尿 样 中 顺 二 醇 类 代谢 产物 的 代谢 轮廓 分 析 方 法 , 并 将 其 应 用 于 肝脏 疾 病 的 诊断 上 , 成 功 地 区 分 了 肝癌 患者 及 其 他 肝脏 疾病 患者 。 将 假 阳 性 结果 降 到 7.4%, 并 给 出 了 潜在 的 生物 标志 物 5 。 该 研究 从 50 例 正常 人 、125 例 肝 脏 疾 病 患者 (27 例 肝 硬 化 患者 、30 例 急性 肝炎 患 者 、20 例 慢 性 肝炎 患者 和 48 BIR BA) 中 收集 随机 屎 样 , 年 龄 为 50. 6 士 16. 2 〈 年 龄 OO 范围 为 20~58 岁 ) 。 样 品 采集 时 没有 进行 饮食 和 其 他 方面 的 限制 。 收 集 到 样品 后 立刻 放 人 一 20C 的 冰箱 中 冷冻 。 分 析 尿 中 的 顺 式 二 羟基 代谢 产物 之 前 , 屎 样 在 室温 下 解冻 。 在 使 用 苯 基 硼酸 亲 和 凝 胶 色谱 法 提取 前 , 加 入 内 标 8- 省 化 鸟 苷 〈Br8G) 。 肌 本 浓度 用 毛细 管区 带电 泳 法 测定 。 屎 样 中 提取 的 顺 式 二 羟基 代谢 产物 在 反 相 液 相 色谱 柱 上 实现 分 离 。 EY Y 23°C, 5mmol/L 乙酸 铵 溶液 (pH 4.5) 和 60%% 的 甲醇 水 溶液 作为 流动 相 进行 二 元 梯度 洗 脱 〈 表 9-1) , 检 测 波长 为 254nm。 表 9-1 液 相 色谱 梯度 洗 脱 程序 时 间 /min 0 5 20 35 50 55 70 甲醇 % (其 余 为 5 mmol/L pH4. 5 MHC RE 0 0 15 60 60 0 0 该 研究 首先 对 15 PRR CPseu. C. U. mlA, I, m5U, G,. X, mill, miG, ac4C, m2G, A, m2,2G, m6A) #77 SMinait. RPBAREAAMEKEH, Are SERRE KE / MLB (creatinine) 含量 (nmol/imol) 。 然 后 对 顺 二 醇 类 代谢 产物 进行 了 轮廓 分 析 , 在 轮廓 分 析 的 数据 里 , 所 有 HPLC 的 峰 信 息 都 被 记录 下 来 。 整 个 数据 分 析 的 流程 如 图 3-5 所 示 。 首 先 , 选 择 一 个 目标 色谱 图 (target chromatogram or refer- ence chromatogram) , 在 这 张 色 谱 图 上 存在 着 大 多 数 色 谱 图 上 出 现 的 峰 , 简 单 来 说 , 就 是 选择 一 张 具有 代表 性 和 峰 较 多 的 色谱 图 来 作为 目标 色谱 图 。 紧 接着 使 用 峰 检测 算法 去 找 出 这 张 目 标 色谱 图 中 的 所 有 的 峰 。 我 们 使 用 了 峰 高 大 于 1000 倍 信 噪 比 、 峰 宽大 于 12s 作为 限制 条 件 , 使 用 Class-VP 进行 了 峰 检 测 。 得 到 的 峰 表 以 CSV 格式 输出 。 之 后 , 使 用 上 节 发 展 的 峰 对 齐 算法 将 其 他 样本 的 色谱 图 与 目标 色谱 图 对 齐 , 在 峰 对 齐 的 过 程 中 , 使 用 了 6 个 参考 峰 , 分 别 试 验 了 & 和 logk 两 种 保留 值 的 表达 方式 。 经 过 峰 对 齐 后 , 得 到 了 125X113 的 矩阵, 对 应 着 125 个 样本 ,113 个 顺 二 醇 类 代谢 物 的 峰 面 积 。 然后 使 用 这 些 样 本 对 应 的 内 标 峰 Br8G 的 峰 面 积 对 其 进行 校正 , 并 除 以 相应 的 肌 酥 浓 度 。 由 于 使 用 了 肌 酝 校正, 随机 尿 中 的 顺 二 醇 类 代谢 物 的 浓度 将 与 24h 屎 样 中 的 浓度 相 - 似 , 减 小 了 样本 由 于 采样 差异 引起 的 系统 偏差 。 许 多 在 目标 色谱 图 中 检测 到 的 峰 在 样品 色谱 图 中 并 未 出 现 。 这 主要 是 由 于 这 些 峰 的 高 度 低 于 所 设 的 冰 值 一 一 1000 倍 的 信 噪 比 , 这 并 不 意味 着 这 些 化 合 物 的 浓度 为 0, 其 真实 的 峰 面积 应 该 是 介 于 0 AVE A) SET 值 。 对 于 这 样 的 峰 面 积 , 赋 值 为 1X10”。 需要 指出 的 是 , 使 用 目标 色谱 图 的 优点 在 于 生成 的 数据 具有 相同 的 变量 数 , 是 一 个 简单 的 二 维 矩 阵 , 适 合 于 很 多 的 统计 分 析 和 模式 识别 方法 。 9.3.1 代谢 物 的 靶 标 分 析 代谢 物 的 靶 标 分 析 主 要 关注 少数 已 知 的 生物 标志 物 。 该 研究 根据 其 生物 学 重要 性 和 标 样 是 否 能 购买 到 选择 了 15 种 核 苷 , 假 尿 苷 〈pseudouridine,Pseu) 、 胞 苷 (cytidine, C)、 尿 苷 (Curidine,U)、1- 甲 基 腺 苷 〈1-methyladenosine,mlA)、 次 黄 苷 〈inosine, I), 、5- 甲 基 屎 苷 (5-methyluridine, m5U), Sf (guanosine, G), Ht 〈xanthosine, X), 1-H C-methylinosine, ml], 1-H dES4F (1-methylguanosine, mlG), ZA 4- 乙 酰基 胞 苷 〈N4-acetylcytidine,ac4C) 2-FAZE4F (2-methylguanosine, m2G), * 202 = ARF (odenine, A), 2, 2-— FASE (dimethylguanosine, m2,2G) 和 6-FA EAR (6-methyladenosine, m6A), 对 健康 对 照 组 和 肝癌 患者 的 上 检验 数据 表明 , 所 有 15 种 核 苷 的 浓度 均 有 显著 性 差 别 〈C,P<0. 05; 其 他 核 苷 ,P<0. 01) 。 之 后 , 对 15 种 核 苷 的 数据 进行 主 成 分 分 析 , 肝癌 患者 的 阳性 检 出 率 为 81. 25% ( 表 9-2) , 同 时 研究 者 也 收集 了 这 些 患 者 的 常规 指标 (如 AFP, 肝 癌 的 常规 标志 物 ),AFP 的 阳性 检 出 率 仅 为 73%, 说 明 使 用 15 种 核 苷 的 代谢 物 靶 标 分 析 的 检 出 率 高 于 常规 指标 。 表 9-2 ”使 用 传统 标志 物 和 1 种 核 苷 的 代谢 物 的 靶 标 分 析 方 法 , 肝 瘤 患者 的 阳性 诊断 率 AFP/(Cng/ml) 基于 15 BAKA PCA 分 析 一 CEA CA199 CA125 >20 >200 39/48 34/46 27/46 2/33 10/26 13/25 81.25% 73.9% 58.7% 6.1% 38.5% 52.0% 但 是 , 作 为 癌症 临床 诊断 指标 的 另外 一 个 要 求 是 , 其 他 良性 疾病 的 假 阳 性 干扰 小 。 为 了 得 到 该 方法 的 假 阳 性 率 , 对 急性 肝炎 患者 、 慢 性 肝炎 患者 、 肝 人 硬化 患者 的 尿 样 中 这 15 种 核 背 进行 了 分 析 。 图 9-5A 给 出 了 各 类 患者 15 种 核 背 的 平均 浓度 ,?7 HAH (Pseu、C、U、X、mlG、ac4C、m2G) 的 平均 浓度 随 着 疾病 的 严重 程度 而 增高 , 急 性 肝炎 患者 的 平均 浓度 最 小 , 慢 性 肝炎 患者 的 平均 浓度 略 高 , 肝 硬化 患者 的 平均 浓度 更 高 , 瘤 症 患 者 的 平均 浓度 最 高 。 这 与 期 望 的 结果 类 似 。 但 作为 诊断 的 生物 标志 物 , 需 要 考虑 总 体 样本 的 分 布 。 类 似 地 , 对 肝 硬 化 和 肝癌 患者 的 15 种 核 并 数据 做 主 成 分 分 析 。 由 于 主 成 分 分 析 是 将 高 维 的 数据 投影 到 低 维 〈 二 维 ) 的 平面 上 , 其 二 维 显示 可 以 反映 样本 在 高 维 空间 的 分 布 。 图 9-5B 给 出 了 肝 硬 化 和 肝 瘤 患者 的 二 维 分 布 。 从 图 9-5 中 可 以 看 出 , 使 用 15 种 核 苷 的 数据 仍 不 足以 提供 足够 的 信息 来 区 分 肝癌 和 肝 硬 化 。 换 言 之 ,15 种 核 苷 的 代谢 物 的 靶 标 分 析 不 能 解决 肝 硬 化 患者 的 假 阳性 。 9.3.2 顺 二 醇 类 代谢 物 的 轮廓 分 析 为 了 减少 假 阳 性 结果 , 使 用 代谢 轮廓 分 析 对 这 些 样本 的 谱 图 进行 了 分 析 , 期 望 能 从 原始 谱 图 中 得 到 尽 可 能 多 的 信息 。 图 9-6A 给 出 了 肝病 患者 进行 顺 二 醇 类 代谢 轮廓 分 析 的 主 成 分 分 析 的 得 分 图 。 从 图 9-6 中 可 以 看 出 , 肝 炎 和 肝 硬 化 患者 聚集 在 一 起 , 而 肝癌 患者 分 布 在 另 一 个 区 域 , 有 一 些 瘤 症 患者 落 在 了 肝炎 和 肝 硬 化 区 域 , 几 个 肝 硬 化 患者 落 在 了 肝癌 的 区 域 。 这 可 能 与 肝 癌 患 者 有 肝炎 和 肝 硬 化 的 部 分 症状 , 而 肝炎 和 肝 硬 化 患者 很 少 有 像 肝癌 患者 那样 高 表达 的 RNA 转录 有 关 。 另 外 , 有 些 肝 硬化 患者 有 转化 为 肝癌 的 趋势 , 也 可 以 部 分 解释 这 个 Kit RAB . 一 般 认 为 , 如 果 AFP 浓度 大 于 20ng/ml 是 肝癌 的 提示 , 也 有 使 用 200ng/ml 的 标 准 。 如 果 以 20ng/ml 为 标准 , 以 上 数据 中 50% (13/26) 的 肝 硬 化 患者 和 52.2% (12/ 23) 的 慢性 肝炎 患者 将 被 诊断 为 肝癌 。 如 果 使 用 200ng/ml 为 诊断 标准 , 有 11.5% (3/ 26) 的 肝 硬 化 患者 和 17.4% (4/23) 的 慢性 肝炎 患者 被 诊断 为 肝癌 。 而 图 9-6A 显示 只 ° 203 » 平均 浓度 1 PCl 图 9-5 肝脏 疾病 患者 的 15 BETA PSY CA) AUP RGA AEF 15 AP RH BES ERATE CB). A: 肝 硬 化 患者 ; * : RBA 有 7. 40%% 的 肝 硬 化 患者 , 没 有 肝炎 患者 被 诊断 为 肝癌 。 结 果 表 明 , 构 建 的 代谢 轮廓 分 析 方 法 可 以 有 效 地 降低 假 阳 性 率 , 将 肝炎 、 肝 硬化 和 肝癌 有 效 地 区 分 开 来 ; 同时 , 尿 中 的 顺 二 醇 类 化 合 物 的 子 集 比 传统 的 单个 标志 物 CAFP) 与 癌症 的 诊断 关联 更 好 。 为 了 进一步 区 分 肝 硬 化 和 肝癌 患者 , 该 研究 做 了 另 一 个 尝试 。 首 先 用 与 上 面 类 似 的 方法 分 析 肝 炎 患 者 和 肝癌 患者 ;然后 将 肝 硬 化 样本 投影 到 主 成 分 分 析 的 得 分 图 上 “图 9-6B) 。 这 个 过 程 类 似 于 在 肝炎 和 肝癌 患者 所 得 的 基 图 上 预测 肝 硬 化 患者 的 位 置 。 可 以 看 到 88.9% (24/27) 的 肝 硬 化 患者 落 在 肝炎 区 。 图 9-7 是 同一 组 数据 使 用 OSC-PLS-DA 的 结果 。 由 于 使 用 OSC 去 除 变量 中 与 分 类 无 关 的 部 分 ,PLS-DA 又 是 一 种 有 师 监 督 (supervised) 的 模式 识别 方法 , 因 此 得 到 了 。 204 。 9-6 人 A 代 谢 轮廓 分 析 数 据 的 主 成 分 分 析 得 分 图 〈A) 〈 以 logk 为 峰 对 齐 算法 中 的 保留 值 ) 和 肝 硬 化 患 者 通过 回归 投影 到 肝炎 和 肝癌 患者 的 主 成 分 分 析 得 分 图 (B) 。* : 肝癌 ; A: APRs MB SPREE 更 好 的 分 类 结果 。 从 图 9-7 中 可 以 更 清晰 地 看 到 由 肝炎 、 肝 硬化 到 肝癌 的 趋势 。 9.3.3 潜在 标志 物 的 寻找 Borek 及 其 合作 者 的 研究 结果 表明 肿瘤 模型 动物 的 修饰 核 苷 排放 的 增加 是 由 tRNA 的 代谢 加 快 所 导致 的 , 而 不 是 由 于 细胞 死亡 或 组 织 破坏 所 致 。 虽 然 这 种 排放 的 分 子 学 机 制 尚 不 清楚 , 但 已 经 开展 了 很 多 项 将 修饰 核 苷 作为 肿瘤 生化 标志 物 的 研究 。 几 种 修饰 核 4 [如 Pseu, —S PRR MERA (dihydrouridine, Dhu), mlIl, m2G, ml1G] 经 常用 来 比较 癌症 患者 和 健康 人 的 排放 水 平 。 e« 205 « t[]] 图 9-7 ”代谢 轮廓 分 析 的 OSC-PLS-DA 的 结果 图 9-8 给 出 了 顺 二 醇 类 化 合 物 代谢 轮廓 分 析 主 成 分 的 载荷 图 Cloading plot), , 外 围 的 变量 (14H. 15H, 234, 254, 324, 484. 594) 对 分 类 的 贡献 较 大 , 即 潜在 的 标志 物 。 根 据 标 样 的 结果 可 以 知道 : 154A Pseu, 324A ml1A, 594 Amll, Hh 的 潜在 标志 物 还 需要 进行 下 一 步 的 定性 实验 对 其 进行 结构 鉴定 。 结 果 表 明 , 由 代谢 轮 廊 分 析 找 到 的 生物 标志 物 与 图 9-5A 和 以 前 研究 中 使 用 的 核 苷 种 类 有 着 较 大 的 不 同 。 这 说 明 以 前 的 研究 忽视 了 一 些 在 代谢 轮廓 分 析 中 有 着 重要 作用 的 核 背 组 分 。 这 些 组 分 可 能 单 个 来 看 对 诊断 没有 太 大 的 影响 , 而 是 以 一 定 的 组 合 对 诊断 起 着 较 大 的 影响 。 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 图 9-8 主 成 分 分 析 的 载荷 图 反映 了 变量 对 分 类 的 重要 性 9.4 代谢 组 学 用 于 恶性 肿瘤 的 研究 恶性 肿瘤 〈 俗 称 癌症 ) 是 由 控制 细胞 分 化 增殖 机 制 的 失常 而 引起 的 。 癌 细胞 除了 生 。 206 。 长 失控 外 , 还 会 局 部 侵入 周围 正常 组 织 〈 浸 润 ,invasion) , 甚 至 经 由 体内 循环 系统 或 淋 巴 系统 转移 到 身体 其 他 部 分 〈 转 移 ,metastasis) 。 美 国 每 年 病死 的 5 个 人 当中 有 1 人 是 由 癌症 致死 的 , 这 一 数字 在 世界 范围 则 是 十 万 分 之 一 百 到 十 万 分 之 三 百 五 十 。 瘤 症 在 发 达 国 家 中 已 成 为 主要 死亡 原因 之 一 5。 伴 随 着 我 国 经 济 的 发 展 , 环 境 在 一 定 程 度 上 章 到 了 破坏 , 加 上 生活 方式 的 改变 , 我 国 癌症 发 生 率 也 有 所 上 升 。 使 用 质谱 CMS) 和 核磁 共振 C(NMR) 技术 来 监测 恶性 肿瘤 中 的 代谢 的 变化 远 远 早 于 代谢 组 学 概念 的 提出 , 并 不 是 最 近 几 年 才 出 现 的 。 使 代谢 组 学 与 之 前 的 研究 区 别 开 来 的 是 代谢 组 学 的 研究 是 针对 细胞 、 组 织 或 器 官 中 代谢 途径 的 整体 网 络 意义 上 的 代谢 物 变 MO) | AAA OO BAN ES BOE EAS 〈 如 培养 的 细胞 、 组 织 标本 及 活体 肿瘤 ) 中 , 代 谢 物 的 轮廓 与 肿瘤 的 类 型 、 分 化 、 代 谢 活 性 和 细胞 死亡 均 显 示 了 较 强 的 联系 , 说 明代 谢 组 学 较 适 于 恶性 肿瘤 的 诊断 、 预 后 及 其 疗效 的 评价 。 Carsten Denkert6 等 对 原 发 性 侵袭 性 卵 梨 癌 〈primary invasive ovarian carcinoma) 进 行 了 代谢 组 学 的 分 析 。 在 该 项 研究 中 , 使 用 气相 色谱 飞行 时 间 质 谱 对 66 BR A ERE 卵巢 癌 患 者 和 9 例 交 界 瘤 (borderline tumor) 患者 进行 了 分 析 ,291 个 代谢 产物 在 80%% 的 样本 中 稳定 出 现 。 通 过 与 标准 样品 的 质谱 图 和 保留 指数 比 对 , 鉴 定 出 其 中 114 个 化 合 物 (少量 化 合 物 的 通过 与 NIST 数据 库 比 对 鉴定 ) 。 使 用 Welch’s 世 检 验 , 找 到 在 交界 瘤 和 原 发 侵袭 性 卵 梨 癌 中 有 显著 差异 的 51 个 代谢 物 〈P< 0. 01) 。 作 者 使 用 KEGG 数据 库 将 这 些 代谢 的 变化 与 相关 的 代谢 途径 和 关键 酶 相 联系 。 如 表 9-3 tN, KAR WEBS RY 代谢 、 喀 啶 代谢 、 甘 油脂 代谢 及 能 量 代 谢 有 关 。 某 些 统计 上 区 别 非 常 显 著 的 生物 标志 物 特 异性 不 高 , 如 反映 遗传 压力 的 代谢 物 一 一 且 所 酸 和 生育 酚 。 但 另 一 方面 , 如 肌 栈 〈creati- nine) 、 乳 酸 〈lactate) 、1- 磷 酸 葡 萄 糖 Cglucose-l-phosphate) 及 三 羧 酸 循环 的 中 间 产 物 延 胡 索 酸 (fumarate) 和 苹果 酸 (malate) 均 发 生 了 较 大 的 变化 , 提 示 能 量 代谢 发 生 了 变化 , 这 与 恶性 肿瘤 代谢 的 周转 速率 加 快 相符 , 需 要 消耗 更 多 的 能 量 。 表 9-3 ”交界 瘤 和 原 发 性 侵 获 性 卵巢 瘤 中 鉴定 的 生物 标志 物 及 其 相关 代谢 途径 和 关键 酶 变化 倍数 代谢 物 名 称 (58 SLI / P 代谢 途径 涉及 的 关键 酶 (部 分 ) CFE) A- 磷 酸 甘 油 5.3 0.0058 ”甘油 脂 代谢 尿酸 4.2 6.20e-§ MRE RAAT 1. 3. 1. 2 二 氢 喀 啶 脱 氢 酶 KERRY 3.8 0. 0033 WR ART 2. 4. 2. 4 胸 苷 磷酸 化 酶 2,5- 二 羟 吡 喧 3.4 0. 0033 肌 醇 -2- 磷 酸 3.3 0.0042 ”甘油 脂 代谢 磷酸 3.2 0.0029 ”甘油 脂 代谢 BAR 3 0.00018 ”氨基酸 代 谢 , 碳 /所 平衡 ¢ 207 = 续 表 变化 倍数 代谢 物 名 称 (5 SLI / P 代谢 途径 涉及 的 关键 酶 (部 分 ) Ze FE) 甘氨酸 3 4.30e 8 甘氨酸/ 丝氨酸/ 苏 氨 酸 代谢 苹果 酸 2.8 0. 0028 “三 羟 酸 循环 1. 1. 1. 37 苹果 酸 脱 氢 酶 1.1.3.3 苹果 酸 氧 化 酶 YET BR 2 0.0042 ”氨基 酸 代谢 , 碳 / 氮 平 衡 1. 2. 1. 3 醛 脱 氢 酶 2.6. 1. 19 GABA 转氨酶 4. 1. 1. 15 FARR a ot 2.5 0. 0083 1 -磷酸 葡萄 糖 2.5 0.0025 ”甘油 脂 代谢 Aa a3 3.80e -7 ”氨基酸 代 谢 富 马 酸 2 0.0011 “三 羧 酸 循环 ALB 2.2 0.00069 ”磷酸 肌 酸 分 解 半 脱 氨 酸 2 0.006 ”和 氮 基 酸 代 谢 TR 2 0. 0051 。 两 酸 代谢 1.1.1. 27 乳酸 脱 氢 酶 甘氨酸 (minor) 2 0.00041 ”甘氨酸 /丝氨酸 / 苏 氨 酸 代 谢 谷 氨 酸 胺 2 0. 0083 氨基 酸 代谢 , 碳 / 氨 平 街 3. 5. 1. 2 谷 氨 酰 胺 酶 PAB 1.9 0.00011 “甘氨酸 /丝氨酸 / 苏 氨 酸 代谢 天 冬 酸 腰 1.6 0.00093 “氨基酸 代 谢 十 九 酸 —1:2 0.0014 ”游离 脂肪 酸 硬 脂 酸 一 1.4 0.0096 ”游离 脂肪 酸 十 七 酸 =i 0.00073 ”游离 脂肪 酸 AR 一 1.6 0. 00011 AEA ARH 乳酸 一 2. 2 0.0017 ” 丙 酸 - 糖 酵 解 Tas ee ae 乳酸 脱 氨 酶 为 了 减少 假 阳性 率 , 研 究 者 进行 了 变换 分 析 〈permnutation analysis), 假 阳性 率 为 7.8%。 使 用 有 师 监督 模式 的 分 类 算法 建立 了 预测 模型 , 可 从 侵袭 性 卵巢 癌 中 区 分 88%% 的 交界 瘤 。 9.5 代谢 组 学 在 其 他 疾病 分 型 和 标志 物 发 现 研究 中 的 应 用 代谢 组 学 自 诞 生 以 来 , 迅 速 地 在 疾病 的 临床 和 机 制 研究 中 充分 展示 了 其 威力 。 表 9-4 选取 了 文献 中 出 现 的 代谢 组 学 用 于 该 领域 有 代表 性 的 研究 。 从 表 9-4 中 我 们 可 以 看 到 , 可 供 代谢 组 学 的 分 析 对 象 很 广 , 既 可 从 易于 获得 的 尿 液 、 血 样 等 生物 体液 中 获得 有 。 208 。 价值 的 信息 , 又 可 分 析 与 疾病 紧密 相关 的 组 织 〈 如 肝脏 、 皮 质 层 等 ) 得 到 对 疾病 更 进 一 步 的 理解 。 代 谢 组 学 研究 贯穿 于 近乎 所 有 的 疾病 研究 领域 , 从 饮食 的 影响 、(〈 早 期 ) 诊 断 、 生 物 标志 物 发 现 、 疾 病 分 型 〈 严 重 程度 的 判断 ) 、 亚 性 疾病 的 预后 、 疗 效 的 评价 到 疾病 分 子 机 制 的 探寻 。 表 9-4 文献 中 代谢 组 学 用 于 疾病 研究 的 实例 样品 物种 疾病 检测 方法 分 析 对 象 目的 文献 血清 人 冠 心病 。 NMR 全 部 代谢 物 疾病 严重 程度 诊断 D] 尿 液 人 线粒体 疾病 有 机 酸 诊断 D7] +R 人 前 列 腺 瘤 NMR CA- 全 部 代谢 物 诊断 (18) IA( 计 算 机 辅助 图 像 分 析 ) 尿 液 人 NMR 全 部 代谢 物 饮食 影响 D9] 尿 液 KR 糖尿病 F-NMR 6- 脱 氧 -6- 氟 抗坏血酸 ”代谢 途径 及 病理 [20] 皮质 层 . 小 脑 及 脑 小 鼠 ”神经 元 螨 样 质 脂 褐 NMR 全 部 代谢 物 病理 k 部 其 他 区 域 质 沉 积 病 (NCL) 尿 液 人 间 质 性 膀胱 炎 及 MS NMR 全 部 代谢 物 诊断 [22] 细菌 性 膀胱 炎 血清 AR HPLC- 库 饮食 影响 [23] 仑 阵列 RMR KR 有 中 风 倾 向 的 自发 NMR 全 部 代谢 物 病理 生理 [24] 性 高 血压 大 鼠 血管 小 鼠 ”动脉 粥 样 硬化 NMR 全 部 代谢 物 疾病 的 分 子 机 制 [25] 血清 人 2 型 糖尿 病 GC-MS 脂肪 酸 诊断 [5 血清 XK 肝脏 疾病 HPLC BE 疾病 严重 程度 诊断 526] 脑脊液 (腰椎 穿刺 》 人 脑膜 炎 及 脑室 炎 ”NMR 全 部 代谢 物 早期 诊断 [27] 脑脊液 (脑室 穿刺 ) 尿 液 人 先天 性 障碍 GC-MS BERRY ene. 诊断 [28] 碳水 化 合 物 及 其 他 尿 液 人 机 糖尿 证 串 级 MS ARM ART RAL PRA RE 2.30) 的 发 现 肝脏 比目鱼 肝癌 FTICR 全 部 代谢 物 病理 [31] 血浆 人 心肌 缺 血 LC-MS 全 部 代谢 物 生物 标志 物 的 发 现 2 大 脑 小 鼠 “3 RAR BE) ESE NMR 全 部 代谢 物 诊断 [33] 济 失调 尿 液 小 鼠 ”血吸虫 病 NMR 全 部 代谢 物 生物 标志 物 的 发 现 GA 脂肪 组 织 小 鼠 2 型 糖尿 病 Bx AR ZS Nea TRS my nie ATI C35) 床 评价 血清 X 卵巢 上 皮 性 瘤 NMR 全 部 代谢 物 诊断 bse] 由 于 代谢 组 学 可 以 从 生物 体液 中 得 到 较 以 往 多 得 多 的 代谢 物 信息 , 使 得 在 不 同 疾病 及 疾病 模型 中 采用 相似 的 研究 策略 成 为 可 能 , 最 终 将 带 来 代谢 组 学 在 疾病 相关 研究 领域 的 桑 荣 。 而 对 其 中 丰富 信息 的 挖掘 , 使 得 “个 性 化 医疗 ”的 实现 更 具 现实 性 , 最 终 代 谢 * 209 = 组 学 的 研究 成 果 将 给 人 类 的 健康 带 来 质 的 提高 和 新 的 希望 。 参考 文献 [1] Scriver C R. 1995, New York, McGraw-Hill Health Professions Division. 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Cancer, 2005, 113; 782 ¢ 211 » 第 10 章 修饰 核 苷 在 癌症 诊断 和 随访 中 的 应 用 从 第 1 章 我 们 知道 , 根 据 研 究 对 象 的 不 同 , 代 谢 组 学 有 四 个 层次 , 即 代谢 物 靶 标 分 析 (metabolite target analysis)、 代 谢 轮廓 分 析 (metabolic profiling)、 代 谢 组 学 (metabolomics) 和 代谢 物 指纹 分 析 (metabolic fingerprinting) 。 在 第 4 BAB 9 BHR 们 采用 了 以 顺 -二 醇 结 构 特 征 的 代谢 产物 的 轮廓 分 析 对 肝病 进行 了 研究 。 严 格 意义 上 , 第 8 章 及 第 11 章 的 第 3 节 都 是 代谢 轮廓 分 析 的 例子 。 本 章 作为 靶 标 分 析 的 典型 例子 , 介绍 修饰 核 苷 在 癌症 诊断 、 随 访 中 的 应 用 。10. 1 节 主 要 介绍 癌症 诊断 方法 、 肿 瘤 标志 物 现状 、 修 饰 核 苷 的 来 源 及 作 肿 瘤 标志 物 的 可 行 性 。10. 2 节 介 绍 体液 中 核 背 的 毛细 管 电泳 和 高 效 液 相 色 谱 分 析 方 法 及 多 变量 可 视 化 数据 处 理 方 法 。10. 3 节 则 介绍 尿 中 修饰 核 苷 在 诊断 、 随 访 急 发 性 、 高 毒性 的 恶性 肿瘤 〈 如 白血病 和 淋巴 瘤 、 乳 腺 癌 、 肺 癌 、 大 fake. PR. BR. RR. AUR. RAS ROA SAP. AE) 中 的 应 用 。 10.1 概论 10.1.1 癌症 诊断 的 方法 概况 恶性 肿瘤 是 对 人 类 危害 最 大 的 一 类 疾病 。 据 世界 卫生 组 织 CWHO) 报道 ,1997 年 全 球 恶 性 肿瘤 死亡 人 数 为 620 余 万 。 居 全 球 人 类 主要 死因 第 三 位 。 就 全 球 而 言 ,20 世 纪 后 期 20 年 间 癌 证 发 病 数 呈 逐 年 上 升 趋势 。1990 年 癌症 新 病例 数 约 为 807 万 , 比 1975 年 的 587 万 增加 了 37.5%, BEAM 1990 年 癌症 新 病例 数 约 为 139 万 , 比 1975 年 的 121 万 上 升 了 15.7%, 占 世界 癌症 发 病 总 数 的 17.22%, 1990 年 我 国 男 性 瘤 症 发 病 率 为 每 10 万 人 中 有 179 人 ,女性 癌症 发 病 率 为 每 10 万 人 中 有 105 人 。 男 性 发 病 率 明 显 高 于 女性 ”。 因 此 可 以 预计 在 21 世纪 上 半 叶 , 恶 性 肿瘤 仍 将 是 对 人 类 生命 健康 危害 最 大 的 疾病 之 一 。 根据 我 国 试点 市 、 县 恶性 肿瘤 的 发 病 与 死亡 报告 ,1990 年 我 国 恶 性 肿瘤 死亡 发 病 比 约 为 0. 8 。 这 表明 目前 尚 无 治疗 恶性 肿瘤 的 有 效 方法 。 当 前 治疗 肿瘤 的 主要 方法 有 手术 、 化 学 药物 治疗 、 放 射 治疗 及 生物 治疗 4 种。 其中, 手术 治疗 是 其 他 3 种 疗法 的 基 础 。 应 该 说 , 治 疗 的 成 功 与 否 取决 于 局 部 肿瘤 是 否 能 够 在 发 生 的 早期 被 完全 切除 , 如 晚 期 胃癌 手术 治疗 后 的 5 年 生存 率 仅 有 30 汶 左右 , 而 早期 胃 瘤 手术 治疗 后 的 5 年 生存 率 在 我 国 达 70 为 , 在 日 本 可 达 90 为 。 乳 腺 瘤 是 女性 最 常见 的 恶性 肿瘤 之 一 , 但 由 于 其 发 生 位 置 表 浅 , 容 易 被 发 现 , 因 此 在 城市 女性 中 虽然 发 病 率 很 高 , 但 死亡 率 排 位 却 远 远 低 于 其 发 病 率 排 位 。 宫 颈 癌 曾 经 是 威胁 我 国 女性 生命 的 最 主要 亚 性 肿瘤 。 近 年 来 由 于 普查 工作 的 有 效 进 行 , 这 一 肿瘤 可 在 早期 被 发 现 , 其 死亡 率 已 明显 下 降 。 肺 瘤 、 肝 瘤 等 恶性 肿瘤 由 于 发 生 部 位 隐匿 , 加 之 这 些 实质 性 脏 器 的 巨大 的 功能 代 偿 能 力 , 故 在 肿瘤 较 小 时 ole * 难以 发 现 。 然 而 这 类 肿瘤 的 发 病 率 近年 来 却 逐 年 上 升 , 死 亡 率 也 随 之 上 升 。 如 能 找到 早 期 诊断 这 类 肿瘤 的 有 效 方法 , 将 对 成 功 治疗 恶性 肿瘤 、 提 高 肿瘤 患者 治疗 后 的 生存 质量 及 提高 肿瘤 总 体 治疗 效果 具有 重大 意义 。 对 易 感 人 群 进行 肿瘤 普查 是 早期 发 现 肿瘤 的 有 效 方式 之 一 。 目 前 用 于 普查 的 方法 主 要 有 以 下 几 种 。 1. 理学 检查 这 种 检查 包括 医生 常规 的 物理 检 体 及 用 X 射线 、 超 声波 等 方法 对 患者 多 脏 器 进行 扫描 。 优 点 是 可 以 准确 的 定位 。 简 单 易 行 的 物理 检查 方法 在 对 女性 乳腺 瘤 体 表 易 见 肿瘤 的 早期 诊断 中 取得 了 巨大 的 成 功 。 但 对 体内 肿瘤 而 言 , 由 于 位 置 深 , 在 肿瘤 体积 较 小 xz “时 , 脏 器 代 偿 功 能 强 , 患 者 症状 和 体征 都 不 明显 , 且 物理 体检 很 难 发 现 , 必 须 应 用 很 多 设备 进行 检查 , 由 于 这 些 设备 对 机 体 常 有 一 些 损伤 , 所 以 没有 症状 和 体征 者 难以 接受 这 些 检查 。 另 外 , 其 费用 昂贵 , 使 之 在 相当 长 的 一 段 时 间 内 仅 能 用 于 一 些 特殊 人 和 群 的 体 检 , 难 以 在 大 样本 人 和 群 中 广泛 应 用 。 2. 细胞 学 检查 利用 脱落 细胞 进行 肿瘤 普查 已 有 近 百 年 的 历史 。 用 巴 氏 染 色 、 显 微 镜 检 查 发 现 子宫 棋 癌 、 肺 癌 等 方法 已 在 世界 各 国 广 泛 应 用 。 我 国 的 食道 拉 网 食道 瘤 普 查 方法 也 在 食道 癌 早期 诊断 中 取得 了 很 大 的 成 功 。 其 优点 为 : 方法 简便 、 对 被 普查 者 损伤 很 小 、 不 需要 晶 贵 的 设备 。 缺 点 是 该 方法 仅 能 检查 与 外 界 相通 器 官 的 细胞 来 诊断 该 部 位 的 肿瘤 , 但 对 于 体内 脏 器 肿瘤 , 该 方法 难以 实施 。 此 外 , 以 上 两 种 方法 均 以 找到 病灶 为 前 提 。 实 际 发 现 的 病灶 一 般 在 1cm*® 以上, 但 此 时 腺 癌 在 体内 已 有 5 年 , 鳞 癌 已 有 8 一 12 年 , 肿 瘤 已 并 非 早 期 。 这 些 普查 方法 虽 可 以 提高 患者 的 5 年 生存 率 , 但 除 胃 癌 、 子 宫颈 瘤 等 少数 恶性 肿瘤 外 , 并 不 能 降低 患者 的 死 亡 率 。 寻 求 早期 发 现 的 方法 势 在 必 行 。 3. 肿瘤 标志 物 从 1846 4F Bence-Jones 发 现 B-J 蛋白 对 多 发 性 骨 散 瘤 的 诊断 作用 以 来 , 肿 瘤 标志 物 的 研究 已 有 100 多 年 历史 史 。 但 直到 1963 年 Abelev 发 现 了 甲 胎 蛋 白 (AFP) 可 作为 原 发 性 肝癌 的 实验 室 诊断 依据 , 尤 其 是 1975 年 ,Kohler 等 用 杂交 瘤 技术 制备 单 克 隆 抗体 以 后 , 肿 瘤 标志 物 才 广泛 应 用 于 临床 。1978 年 Heserman 在 美国 NCI 召开 的 人 类 免疫 及 肿瘤 免疫 诊断 会 上 首次 提出 肿瘤 标志 物 的 概念 , 此 后 人 们 对 肿瘤 标志 物 的 认识 逐渐 完 善 , 具 有 诊断 价值 的 肿瘤 标志 物 不 断 被 发 现 。 它 对 肿瘤 的 早期 诊断 、 预 后 判断 治疗 指导 及 复发 与 转移 的 监测 都 有 着 相当 重要 的 意义 局 。 肿瘤 标志 物 是 肿瘤 组 织 产生 的 可 以 反映 肿瘤 自身 存在 的 化 学 物质 , 具 有 以 下 特征 : C1) 在 体液 和 组 织 提取 液 中 可 以 检测 出 ; (2) 提示 肿瘤 负荷 ; (3) 某 一 肿瘤 标志 物 可 在 绝 大 多 数 恶性 肿瘤 或 某 类 肿瘤 患者 中 被 检 出 , 对 恶性 肿瘤 具有 特异 性 ; 。213 。 (4) 常 具有 肿瘤 类 别 特异 性 ; (5) 可 提示 肿瘤 复发 及 转移 的 出 现 。 可 见 , 理 想 的 肿瘤 标志 物 应 有 灵敏 度 高 、 特 异性 强 、 表 达 与 肿瘤 出 现 相关 等 特点 。 肿瘤 标志 物 的 应 用 开辟 了 肿瘤 诊断 的 新 思路 和 新 方法 , 它 的 简便 、 无 创 的 特点 使 之 成 为 肿瘤 普查 的 工具 , 同 时 对 于 肿瘤 的 早期 诊断 、 治 疗 后 的 监测 、 随 访 都 具有 重要 意义 。 然 而 , 目 前 所 应 用 的 标志 物 尚未 达到 以 上 全 部 要 求 。 此 外 , 应 用 于 肿瘤 普查 的 肿瘤 标志 物 还 需 具 有 反映 肿瘤 谱系 广 的 特点 。 只 有 具备 这 一 特点 的 标志 物 才 能 在 普查 中 指示 不 同类 型 肿瘤 在 体内 的 存在 , 适 用 于 那些 完全 不 知 体 内 肿瘤 是 否 存 在 的 被 检 者 , 从 而 减少 漏诊 。 常用 的 肿瘤 标志 物 有 : 蛋白 质 类 、 糖 类 及 基因 类 等 〈 表 10-1)。 表 10-1 肿瘤 标志 物 的 分 类 类 别 例子 工 肿瘤 特异 的 标志 物 了 B 细 胞 肿瘤 免疫 球 蛋 白 个 体 基因 型 ,SV40“T” 抗原 ; 了 细胞 白血病 的 工 细胞 受 体 开 肿 瘤 相关 的 标志 物 a. (RAR RED Aik; BAMA; 〈 脂 类 相关 的 ) EAR; 香草 扁桃 酸 及 儿 茶 酚 胺 类 b. 大 分 子 标志 物 1. 酶 / 异 酶 胎盘 碱 性 磷酸 酶 ,前列腺 特异 抗原 (PSA), 前 列 腺 酸 磷 酸 酶 ; [ 胸 〈 腺 喀 啶 脱氧 核 ) 苷 激酶 ;神经 元 特异 ] Ja 2. 激素 , 细 胞 质 , 生 长 因子 , 可 溶性 受 体 [一 IHCG;,IL-2;,EGF;] 肉 激素 及 孕 酮 受 体 3. FEA AREA cmyc, src, ras, erb, neu, sis 4. 癌 胎 蛋白 CEA,u- 胎 球 蛋 白 (AFP), Lewis X, Lewis Y 5. 复杂 糖 配 体 i, 糖 蛋白 和 黏 多 糖 CA 125 (CA 125), CA 15.3 (CA 15.3), SLX, RKLAD 抗原 19. 9 (CA 19.9), TAG-72 ii, 糖 类 脂 Lewis X,Lewis Y,GM2,GD2,CA 19. 9 糖 脂 类 6. 细胞 标志 物 Philadelphia 染色 体 ,PSA 涂 片 上 的 癌 前 细胞 10.1.2 肿 疤 标志 物 的 概况 10.1.2.1 有 蛋白质 类 标志 物 蛋白 质 类 肿瘤 标志 物 是 目前 研究 最 深 和 人 、 应 用 最 广泛 的 一 类 肿瘤 标志 物 。 它 是 肿瘤 细胞 特异 分 化 的 产物 , 如 分 泌 和 蛋白 、 结 构 蛋 白 , 或 是 肿瘤 细胞 失 活 在 细胞 分 化 途中 产生 的 一 种 中 间 产 物 , 如 甲 胎 蛋 白 (AFP) 等 。 由 于 这 些 蛋 白质 是 肿瘤 的 特殊 分 化 产物 , 因 此 可 用 来 特异 地 提示 某 一 类 或 几 类 肿瘤 的 存在 。 常 用 肿瘤 标志 物 在 各 类 癌症 患者 血清 中 的 阳性 检 出 率 分 别 为 : 肝癌 CAFP, 65%), 9 (CA72-4, 52%), BF AR (PSA, 84%)], GN SR (CA125, 44%), REAR IR (CA19 9, 75%)0°, fiir Ole RR (CYFRA21-1, 67%)9", jx2e ay FPA A TA AE. TCT PAY AE 有 某 种 标志 物 表 达 的 肿瘤 患者 , 应 用 该 类 标志 物 进行 治疗 后 的 随访 , 除 能 客观 地 评价 疗 效 外 , 更 能 有 效 监测 肿瘤 的 复发 , 特 别 是 转移 。 但 肿瘤 是 一 种 恶性 增生 的 疾病 , 在 增生 。214。 过 程 中 已 部 分 甚至 完全 丧失 了 特定 方向 的 分 化 功能 。 在 恶性 肿瘤 中 往往 难以 找到 相当 数 量 的 分 化 蛋白 ;另外 , 即 使 是 同一 组 织 起 源 的 同一 类 型 肿瘤 , 细 胞 形态 完全 相同 , 和 蛋白 质 表 达 的 种 类 和 效率 亦 常 常 不 同 。 肿 瘤 分 化 的 这 种 不 稳定 性 , 使 得 蛋白 质 标 志 物 用 于 肿 瘤 检 测 时 , 不 仅 在 灵敏 度 上 大 打折 扣 , 在 特异 性 上 也 不 尽 如 人 意 。 据 统计 , 在 APUD 系统 来 源 的 小 细胞 肺癌 中 , 采 用 非特 异 神 经 烯 醇化 酶 (neuron specific enolase, NSE) 作为 特异 蛋白 质 标志 物 52 , 免 疫 组 织 化 学 方法 在 肿瘤 细胞 中 的 检 出 率 不足 40%, 血 清 的 检 出 率 则 更 低 , 而 且 , 非 肿瘤 组 织 分 沁 的 NSE 也 使 得 结果 的 分 析 变 得 更 为 复杂 ; 消 化 道 肿 瘤 的 特异 标志 物 癌 胚 抗原 (CEA) 在 胃 肠 道 腺 癌 中 5 , 用 免疫 组 织 化 学 方法 的 检 出 率 也 只 有 50% , 实 际 血 清 检 出 率 仅 为 10%% 左 右 。 这 类 分 化 型 蛋白 质 类 标志 物 虽 然 特异 性 较 好 , 但 在 不 同 肿瘤 中 的 阳性 表达 率 差别 其 大, 缺乏 广 谱 应 用 的 可 行 性 , 如 代表 细胞 角 和 蛋白 的 标志 物 CYFRA21-1, 是 普遍 存在 于 上 皮 细 胞 中 的 结构 和 蛋白, 理论 上 是 较 为 广 谱 的 肿瘤 标志 物 , 但 实际 上 除 在 肺 鳞 癌 中 阳性 率 可 达 67%% 外 , 在 结肠 癌 和 肺 转移 癌 等 肿瘤 中 尚 不 足 35% , 难 以 作为 一 种 用 于 肿瘤 筛 查 的 广 谱 标 志 物 。 为 解决 这 一 问题 , 1996 年 , 美 国 临 床 肿瘤 学 会 (American Society of Clinical Oncology, ASCO) 选择 在 各 肿瘤 中 出 现 频 率 较 高 的 特异 性 标志 物 , 联 合 应 用 于 肿瘤 的 诊断 和 筛 查 , 以 提高 阳性 eM) 。 这 些 特异 的 标志 物 包 括 : CA19%.9、CA125; AFP、B2M、NSE、CYFRA21-1、 CA72.4、PSA CAE), CA15.3 (女性 )、fB-HCG (女性 ) 。 对 特定 类 型 肿瘤 的 诊断 和 筛 查 也 规定 了 相应 的 标志 物 组 合 , 如 乳腺 癌 的 筛 查 包括 CEA, CA15.3, MUC-I, BCA225、erbB-2、PTHrP 等 。 多 种 标志 物 的 联合 使 用 , 在 一 定 限度 内 提高 了 诊断 的 阳 性 率 , 但 仍 难以 在 根本 上 解决 漏诊 率 较 高 的 问题 。 目前 , 血 清 中 肿瘤 相关 抗原 的 检测 方法 主要 有 : Western 杂交 、 酶 联 免疫 、 放 射 免 疫 、 电 化 学 发 光 等 。 这 些 方法 的 应 用 大 大 提高 了 蛋白质 的 检测 灵敏 度 。 随 着 分 子 生 物 学 、 计 算 机 技术 的 发 展 , 将 多 种 肿瘤 标志 物 的 单 克隆 抗体 集成 制 成 肿瘤 检测 的 蛋白 质 芯 片 , 通 过 特殊 软件 的 分 析 和 处 理 达 到 诊断 和 筛 查 的 目的 。 同 时 筛选 多 种 抗原 , 已 使 人 们 看 到 了 将 肿瘤 标志 物 用 于 大 规模 肿瘤 得 查 的 希望 。 但 我 们 还 应 清醒 地 看 到 : 这 种 芯片 的 出 现 , 只 是 一 种 方法 的 改进 , 并 不 是 理论 上 的 突破 , 即 使 最 完美 的 组 合 也 不 能 解决 肿瘤 诊断 中 的 漏诊 问题 。 总 的 来 说 , 这 些 方法 多 以 发 现 某 一 特定 肿瘤 为 目标 , 这 与 并 无 特定 目标 的 肿瘤 普查 的 初衷 相 违背 。 因 此 , 为 达到 肿瘤 早期 诊断 , 仍 然 期 待 着 人 们 去 继续 寻 找 特 异 、 有 效 的 标志 物 。 10.1.2.2 基因 类 标志 物 恶性 肿瘤 是 一 种 多 基因 蜡 常 疾病 。 近 年 来 , 一 些 肿 瘤 相 关 基 因 〈 包 括 瘤 基因 、 原 瘤 基因 、 病 毒 癌 基 因 、 抑 癌 基 因 、 肿 瘤 转移 相关 基因 和 肿瘤 耐 药 基 因 等 ) 不 断 被 发 现 呈 2 。 一 般 认为 : 瘤 基 因 的 过 表达 、 抑 癌 基 因 的 表达 异常 及 肿瘤 演进 相关 基因 的 表 达 异 常 与 肿瘤 的 发 生 、 演 进 有 着 密切 关系 。 这 些 异 常 表达 的 基础 是 基因 突变 、 基 因 放 大 、 基 因 过 表达 、 基 因 重 排 等 基因 水 平 的 结构 式 功 能 异常 。 所 以 , 这 些 表达 异常 的 基因 在 一 定 程度 上 就 可 能 成 为 肿瘤 诊断 的 标志 物 。 随 着 肿瘤 分 子 生 物 学 技术 的 迅速 发 展 , 可 以 通过 检测 体液 中 肿瘤 相关 基因 的 存在 , 分 析 肿 瘤 相 关 基 因 的 缺陷 和 表达 来 推测 体液 中 是 否 有 肿瘤 细胞 的 存在 及 机 体 是 否 荷 瘤 。 其 基本 方法 是 用 聚合 酶 链 反 应 CPCR) 扩 增 血 .215 + WB HP AY EFF LE BS APIS An HY Be A EA Be, EBC DK. PAR ZR AC SRO 所 扩 增 DNA 片段 的 含量 。 依 据 扩 增 量 的 差异 或 电泳 带 位置 的 改变 发 现 血 液 中 肿瘤 细胞 的 存在 。 事 实 上 , 许 多 研究 人 员 投 入 大 量 精力 开发 肿瘤 分 子 诊断 的 技术 手段 , 希 望 能 够 找到 特异 的 基因 标志 物 。 令 人 遗憾 的 是 , 绝 大 多 数 肿瘤 相关 基因 并 非 肿瘤 细胞 特有 , 正 常 细胞 也 有 这 些 基 因 。 为 了 弥补 单一 基因 标志 物 检 测 特异 性 差 的 缺陷 , 同 蛋白 质 类 标志 物 的 检 出 手段 相似 , 人 们 开始 了 以 “墙报 ”的 方式 联合 检测 多 种 基因 标志 物 的 变化 , 以 推测 肿瘤 的 存在 。 但 总 的 来 讲 , 基 因 标 志 物 对 肿瘤 部 位 的 指示 作用 比 蛋 白质 标志 物 要 差 。 表 10-2 是 目前 文献 上 应 用 基因 标志 物 对 各 种 肿瘤 诊断 的 一 些 结果 。 表 10-2 ”检测 基因 突变 用 于 癌症 的 诊断 癌症 标本 突变 基因 检 出 率 文献 BF CHE AA p53 61% [16] eA ras 47.6% [17] 尿 的 沉积 物 H-ras 44% [18] 55a ih . Bat K-ras 37.5% [19] 癌 组 织 ras # 50% [20] PARTE AA ras 75%~100% faze) EG K-ras 55% ,33%% 慢 性 胰腺 炎 [22] 肺癌 唾液 ras, P53 67%, 80% [23] FART c-erbB-2 95% [24] cerbB-2 67% [25] bFGF 71% [26] 人 类 基因 组 计划 被 认为 是 生物 学 和 医学 科学 中 最 重要 的 项 目 。 该 计划 的 完成 产生 了 大 量 的 人 类 基因 序列 数据 。 人 们 可 以 利用 这 些 数据 对 肿瘤 做 基因 水 平 的 分 析 。 其 中 , cDNA RB BERR RE 〈 基 因 芯 片 技术 ) 被 认为 是 可 用 于 早期 诊断 肿瘤 的 最 重 要 的 技术 创新 。 该 技术 的 基本 原理 如 下 [5 : 将 cDNA 文库 中 查 得 的 可 用 片段 经 PCR 扩 增 后 制 成 控 针 , 用 机 械 手 将 它们 高 密度 、 有 序 地 固定 在 硅 晶 载 片 上 制备 成 DNA 微 阵 列 , 用 于 检测 待 测 样品 中 是 否 有 与 它 互 补 的 DNA 序列 。 提 取 待 测 样品 中 的 mRNA 通 过 反 转 录 反 应 过 程 获得 标记 荧光 的 EDNA。 与 含有 上 千 个 基因 探 针 的 DNA 微 阵列 进行 分 子 杂 交 反 应 。30min 一 20h 后 , 将 载 片 上 未 互补 结合 的 DNA 片段 洗 去 , 用 激光 共聚 焦 扫描 测定 微 阵列 上 各 点 的 荧光 强度 , 发 现 待 测 样品 中 各 种 基因 表达 差异 , 如 已 知 瘤 基 因 、 抑 癌 基 因 及 其 他 肿瘤 相关 基因 的 突变 、 重 排 、 过 度 表 达 等 , 进 而 推测 标本 中 细胞 基 因 表达 的 特点 , 判 定 细胞 的 基因 表达 状态 , 以 血液 或 其 他 体液 作为 待 测 样品 , 利 用 基因 芯片 技术 , 可 以 发 现 体内 肿瘤 的 存在 。 应 该 说 该 项 技术 的 问世 使 人 们 能 够 大 规模 地 获得 肿瘤 细胞 基因 表达 的 特点 , 对 研究 不 同 肿瘤 的 基因 表达 谱系 、 肿 瘤 发 生机 制 及 基因 表达 不 稳定 性 , 特 别 是 对 高 通 量 肿瘤 基因 药物 筛选 等 工作 2 , 具 有 极 大 的 推动 作用 , 也 为 利用 基因 表达 异常 作为 标志 物 、 早 期 发 现 肿 瘤 提供 了 可 能 。 在 此 基础 上 , 产 生 了 肿瘤 功 能 分 析 和 分 子 指纹 印迹 计划 , 以 求 早 期 诊断 肿瘤 , 并 进行 有 效 的 治疗 、 随 访 和 疗效 观 察 。 但 是 , 用 这 一 方法 来 筛选 肿瘤 患者 是 建立 在 瘤 细 胞 人 血 的 基础 上 的 。 为 了 能 尽早 发 现 肿瘤 , 寻 找到 新 的 特异 性 肿瘤 标志 物 , 美 国 国立 研究 院 制定 了 肿瘤 基因 功能 分 析 计 waw ZG, © a ee ne 加 四 ee 划 。 该 计划 的 核心 是 以 人 类 的 5 ACER OM. ARIE. PLR. OBS. BIT 腺 癌 ) AERO, , 建 立 人 类 肿瘤 的 cDNA 文库 , 以 获得 肿瘤 的 生物 学 信息 , 寻 找 有 效 的 肿瘤 检测 探 针 , 制 备 肿瘤 检测 芯片 。 毫 无 疑问 , 这 种 方法 的 应 用 将 大 大 提高 肿瘤 筛选 的 成 功率 , 但 也 存在 着 局 限 性 , 主 要 有 以 下 几 点 : 《1) 肿瘤 基因 与 正常 细胞 基因 多 数 相同 , 尚 未 发 现 肿瘤 特有 基因 。 因 此 , 即 使 出 现 异常 基因 的 表达 , 也 难以 确定 肿瘤 的 存在 。 (2) 肿瘤 的 特点 是 基因 表达 的 不 稳定 性 。 不 同 肿瘤 〈 即 使 是 同一 类 型 肿瘤 ) 基因 表 达 也 存在 很 大 差异 , 难 以 用 同一 模式 对 不 同 肿瘤 进行 有 效 检测 。 《3) 用 目前 的 生物 学 方法 所 检 出 的 基因 改变 尚 有 限 , 难 以 与 高 通 量 的 基因 分 析 技 术 相 匹配 , 即 生物 信息 的 滞后 。 《4) 血 中 的 细胞 是 正常 细胞 与 肿瘤 细胞 的 混合 物 。 所 得 信息 有 时 难以 区 分 是 由 正常 细胞 还 是 肿瘤 细胞 所 产生 。 《5) 利用 这 一 技术 , 需 提取 在 血细胞 中 含量 很 低 的 mRNA, 且 提取 过 程 要 求 条 件 高 , 如 需 低 温 冷 冻 保存 标本 等 , 就 目前 条 件 , 还 不 适合 用 于 大 规模 普查 。 (6) 价格 昂贵 , 难 以 在 正常 体检 中 推广 。 总 的 来 说 , 现 有 的 和 蛋白质 与 基因 类 标志 物 存在 着 肿瘤 分 化 类 别 特异 性 过 强 、 检 出 谱 过 罕 、 肿 瘤 整 体 敏感 性 较 低 、 用 检 标 本 为 血液 难以 反复 采取 、 标 本 保存 要 求 条 件 高 等 缺 陷 。 如 联合 应 用 , 上 述 缺 陷 虽 可 得 到 部 分 弥补 , 但 难以 从 根本 上 解决 。 而 且 , 该 类 方法 价格 昂贵 , 在 我 国 现 有 条 件 下 人 们 难以 广泛 接受 。 这 也 可 能 是 我 国 利用 肿瘤 标志 物 进行 肿瘤 普查 难以 有 效 实施 的 原因 。 因 此 , 有 必要 寻找 能 够 弥补 蛋白 质 及 基因 标志 物 应 用 缺 陷 的 新 型 肿瘤 标志 物 。 10.1.2.3 内 源 性 小 分 子 类 标志 在 肿瘤 标志 物 的 研究 工作 集中 于 蛋白 质 类 和 基因 类 的 同时 , 越 来 越 多 的 应 用 开始 向 临床 医学 领域 中 的 内 源 性 小 分 子 和 离子 方面 渗透 。 离 子 及 某 些 内 源 性 小 分 子 , 是 维持 机 体 生 存 的 重要 物质 , 反 映 人 体 的 正常 新 陈 代谢 情况 , 它 们 的 变化 与 机 体 的 生 、 老 、 病 、 死 密切 相关 。 近 年 来 , 一 些 与 肿瘤 相关 的 内 源 性 小 分 子 〈 如 多 胺 " 、 唾 液 酸 : MEME BR). RNA RT SO) 不 断 被 发 现 , 以 期 对 瘤 症 的 诊断 有 所 帮助 。 其 中 ,RNA 代谢 产物 主要 包括 DNA 加 合 物 、DNA 氧化 损伤 产物 和 RNA 修饰 核 苷 等 。 图 10-1 以 肺癌 可 能 的 发 病 过 程 来 说 明 这 几 种 核酸 代谢 产物 的 形成 过 程 及 相互 关系 。 DNA 加 合 物 环境 致癌 物 、 吸 烟 等 = IA oe -DNA A os 基因 突变 一 > 肺癌 患者 DNA 氧化 损伤 代谢 加 快 (活性 氧 自由 基 的 损伤 等 ) | 人 省 RNA 修饰 核 苷 浓度 升 高 DNA 氧化 损伤 产物 含量 升 高 图 10-1 肺癌 的 一 种 发 病 过 程 ¢ 217 « 10.1.3 修饰 核 彰 的 来 源 及 在 癌症 患者 中 修饰 核 背 增 高 的 根源 核 苷 检测 在 生物 医学 的 研究 中 变 得 越 来 越 重 要 。 它 存在 于 体液 、 组 织 液 和 细胞 中 , 是 核酸 催化 降解 、 组 织 酶 解 、 饮 食 习 惯 和 大 量 的 再 利用 途径 作用 的 结果 。 由 于 涉及 细胞 的 增殖 和 代谢 过 程 , 核 苷 含量 的 改变 可 用 于 指示 疾病 的 状态 。 10.1.3.1 修饰 核 苷 的 来 源 修饰 核 苷 存在 于 RNA 中 , 它 是 在 转录 后 由 多 种 特定 的 甲 基 转 移 酶 和 连接 酶 作用 于 多 聚 核 背 分 子 而 形成 。 在 各 种 RNA 中 ,tRNA 含量 最 多 〈79 种 ) , 其 次 分 别 为 rRNA (28 种 )、mRNA (12 种 )、snRNA (11 FDS, 1. RNA 在 细胞 代谢 中 的 作用 RNA 在 细胞 代谢 过 程 中 起 着 重要 的 作用 。 蛋 白质 的 合成 基于 转运 RNA (tRNA), 核糖 体 RNA (rRNA) 和 信使 RNA (mRNA) 的 协同 作用 。 其 中 ,rRNA 具有 结构 和 催化 的 功能 ,mRNA 为 携带 蛋白 质 信 息 的 分 子 , 而 tRNA 是 联系 DNA 和 蛋白质 的 纽 带 。 基 因 的 激活 依赖 于 特定 mRNA 的 翻译 和 它 的 准确 结合 、 加 帽 和 处 理 产 生 的 功能 mRNA。mRNA 的 结合 过 程 中 , 需 要 大 量 与 蛋白 质 因子 结合 形成 复合 体 的 小 核 RNA (snRNA) 来 完成 。snRNA 合成 上 的 混乱 引起 了 结合 反应 中 速率 的 变化 。 显 而 易 见 , RNA 的 代谢 与 mRNA 的 成 熟 、 蛋 白质 合成 及 随后 细胞 的 生长 与 转变 紧密 相连 。 在 疾病 状态 , 如 快速 生长 的 肿瘤 ,RNA 合成 和 转录 的 错误 将 可 能 发 生 。 2. RNA 中 的 修饰 核 背 RNA 包括 大 量 的 修饰 核 苷 , 修 饰 核 背 在 多 种 修饰 酶 的 作用 下 转录 合成 。 已 有 超过 50 种 的 化 学 修饰 被 报道 , 其 中 任何 一 种 化 学 修饰 都 需要 特定 的 酶 来 完成 x' 珂 。 修 饰 核 背 的 结构 差异 很 大 , 图 10-2 RNA 中 一 些 正常 和 修饰 核 苷 的 结构 示意 图 。 修 饰 核 苷 的 独特 性 决定 了 真 核 细胞 的 修饰 作用 需要 100 多 种 功能 各 异 的 酶 来 完成 。 迄 今 为 止 , 大 多 数 RNA 修饰 的 生物 功能 仍 不 清楚 , 它 们 的 功能 可 能 与 影响 RNA 分 子 构 象 变化 和 促进 蛋白 质 或 核酸 之 间 的 相互 作用 有 关 。 其 中 ,tRNA 分 子 靠近 反 密 码 子 的 区 域 存在 大 量 的 修饰 现象 , 它 们 主要 用 于 调整 蛋白 质 合成 中 密码 子 和 反 密 码 子 的 相互 作用 。 原 核 生物 和 真 核 生 物 中 , 有 机 体 的 复杂 程度 越 高 , 其 RNA 修饰 的 种 类 也 越 多 。RNA 修饰 的 位 置 是 固定 的 , 位 置 不 正确 的 修饰 有 害 于 细胞 功能 的 发 挥 。 因 此 , 为 防止 RNA 降解 后 随机 的 转录 结合 , 修 饰 核 苷 不 能 被 重新 利用 而 从 细胞 中 完整 地 释放 出 来 。 3. RPE IA 人 和 其 他 动物 中 正常 的 RNA 转化 和 降解 产生 了 修饰 核 苷 。 这 些 修 饰 核 背 通过 肾 的 过 滤 和 浓缩 随 尿 排出 。 因 此 , 尿 中 修饰 核 苷 反映 了 有 机 体 中 RNA 的 降解 速率 。Schoch 等 "报道 了 食物 对 尿 中 核 苷 的 排放 影响 很 小 。 通 过 尿 中 核 苷 的 排放 水 平 计算 RNA FE 儿 和 成 年 人 的 转化 率 , 发 现 其 与 蛋白 质 的 翻转 率 存在 着 定量 关系 。 正 常 成 年 人 修饰 核 苷 .218 + EF es FE th SE-S asoqry JHN‘HO Fed x Se oy GH A id tT pgp — AFF eS asoqry Lee 6) 1 N "HN 县 每 弄 由 -8s 个 R H R HO 再 生 SEC OH 。 OH B OH 洗 脱 人 pH<7 R 图 10-4 样品 预 处 理 过 程 的 色谱 特性 HPAC: eA, SEC: 体积 排 阻 色谱 C1) pH 之 8. 0 时 葵 基 硼酸 亲 和 填 料 对 芳香 族 邻 二 醇和 脂肪 族 顺 -二 醇化 合 物 具 有 共 价 亲 和 作用 。 (2) 被 吸附 的 蛋白 质 等 干扰 物 可 用 体积 排 阻 色谱 (SEC) 进一步 分 离 。 (3) 在 酸性 条 件 下 , 顺 -二 醇化 合 物 可 从 亲 和 填 料 上 洗 脱 下 来 。 (4) 改变 pH 至 碱 性 , 填 料 对 顺 - 二 醇化 合 物 的 亲 和 性 得 以 恢复 , 因 此 填料 可 反复 使 用 。 1. 尿 样 的 亲 和 色 谱 预 处 理 方法 FARE AR EI TE RRR PR. BERR (Ea AA 35ml 0. 25mol/L 的 NH, Ac (pH8. 5) 平 衡 。10ml 离心 后 的 尿 样 加 入 内 标 [A ts: 高 效 液 相 色 谱 法 为 异 S&H UsoG); BAS BIKAR SEB BH 〈3-Dzu)] 到 预 处 理 柱 。 然 后 用 20ml 0. 25mol/ 工 的 NHAc 冲 洗 ,3ml CH;OH : HO (1 : 1,V/V) 洗 2 次 柱子 , 核 苷 洗 提 物 用 25ml 含 0. mol/L CH;COOH 的 CH:OH : HO (1 : 1,V/V) 溶液 洗 提 。 洗 提 物 .23 在 真空 旋转 蒸发 器 中 蒸发 至 干 〈 温 度 大 约 40C), 蒸 发 后 的 残留 物 用 lml 25mmol/L 的 KH:PO, (HPLC) 或 水 (CE) 溶解 。 重 复 使 用 前 凝 胶 用 25ml 含 0. lmol/L CH; COOH 的 CHIOH : HIO (1 : 1,V/V) 溶液 和 25ml CH;OH: H;O (1:1, V/V) 进一步 冲 洗 。 在 两 次 提取 间 用 45ml 0. 25mol/L 的 NH,Ac (pH8.5) 平衡 凝 胶 。 预 处 理 柱 填 料 的 使 用 寿命 在 分 析 尿 样 时 可 达 30 次 以 上 而 不 降低 其 效能 。 2. 血样 的 亲 和 色 谱 预 处 理 方法 [”] 血 中核 苷 也 用 葵 基 硼酸 凝 胶 色 谱 法 来 提取 。lml 血清 中 加 入 0. lml 浓度 为 0. 08mmolL 的 异 鸟 味 叭 核 苷 作 内 标 , 用 AMICO 公司 的 微分 配 单元 (MPS) 〈 图 10-5) 用 转子 固定 角度 为 30 的 离心 机 在 5 一 10C、2000g 离心 1. 5h 去 除 相 对 分 子 质量 大 于 30 000 的 和 蛋白质。 在 超 滤液 中 加 入 250pl 2. Smol/L hy NH4Ac 混合 均匀 。 样 品 加 入 到 活 化 后 已 平衡 的 亲 和 色 谱 预 处 理 柱 中 。 其 他 操作 与 尿 样 相 同 。 预 处 理 后 的 核 苷 用 200nl HPLC 缓冲 液 浴 解 得 到 一 个 5 倍 的 浓缩 效果 。 极 化 蛋白 的 径 向 梯度 无 蛋白 质 的 超 滤液 A 矢量 图 10-5 MPS 结构 图 10.2.1.3 上 肌 栈 的 毛细 管区 带电 泳 法 测定 肌 本 浓度 用 改进 的 JAFFE 方法 5 号 或 毛细 管区 带电 泳 法 测定 5 。 毛 细 管 区 带电 泳 法 为 : 将 尿 样 离心 后 , 取 10ml 加 入 15pl Milli-Q 超 纯 水 振 功 离心 , 取 出 oul, mA 101 3-deazauridine 内 标 振 功 离心 ; 在 Beckman Coulter 的 MDQ 毛细 管 电泳 上 , 以 0. lmol/L pH 为 6.0 的 磷酸 盐 为 缓冲 液 , 在 52xmX 50pm i. d. 的 未 涂 层 石英 毛细 管 (Grom, Herrenberg-Kayh, Germany) 上 , 于 20kV 恒 压 、25C 下 进行 电泳 分 离 , 检 测 波长 为 214nm, 内 标 法 定量 。 2 10.2.1.4 Sa 4 oe ak pple 8 以 300mmol/L SDS-25mmol/L Na2,B,O; + 10H,0-50mmol/L NaH,PO, » 2H,0 为 缓冲 液 ,50km i. d. 未 涂 层 石英 毛细 管 为 分 离 通道 , 在 7kV 恒 压 、29C 下 电泳 , 检 测 波 长 为 254nm。 毛 细 管 柱 使 用 前 用 0. Imol/L NaOH, Milli-Q 超 纯 水 分 别 冲 30min 和 20min。 每 次 电泳 后 , 毛 细 管 分 别 用 0. lmol/L NaOH, Milli-Q 超 纯 水 、 缓 冲 液 冲洗 100s、100s、120s。 尿 中 核 苷 浓度 使 用 内 标 法 〈 内 标 : 3- 脱 咱 尿 苷 ,3-Dzu) 用 UV 定 量 , 串 行 检 测 波长 为 250nm 和 210nm。 校 正 曲线 由 包含 不 同 浓 度 的 三 个 标 样 测 得 。 所 得 结果 转化 为 肌 栈 指 数 (nmol/ mol creatinine) 。 10.2.1.5 高 效 液 相 色谱 分 析 [89'% ZEAE SE ER ERAT A RPE 250mm X 4mm, 5ym LiChrospher 100 Cs 的 反 相 液 相 色谱 柱 〈Merck) 在 30°C EFT ATS. BMWA 25mmol/L 的 KH,PO, (pH4. 55) 和 60%% 的 甲醇 水 溶液 , 二 元 梯度 淋 洗 程序 见 表 10-3。 检 测 波长 250nm 和 280nm, 内 标 法 定量 。 所 得 结果 转化 为 肌 酥 指 数 (nmol/pmol creatinine) 。 表 10-3 ”二 元 梯度 淋 洗 程序 表 时 间 /min KH2PO,/% MeOH/H20/% 流速 / (ml/min) 0 100 0 1.35 1 99 1 1.5 5 99 1 1.5 15 90 10 1.5 40 40 60 1.4 42 40 60 ae 45 100 0 1.4 50~75 100 0 15 AT AE PAR ERR PK RE. E16 种 核 苷 的 标准 库存 溶液 制备 如 下 :三 产 基 尿 苷 (CDHU) 0.32mmol/L, RRA (Pseu) 1.28mmol/L, fa # CC) 0.008mmol/L, 5R# (U) 0.016mmol/L, 1-FASEARFF (m1A) 0. 16mmol/L, KEY KFF (1) 0.032mmol/L, 5-FA HERR FF (m5U) 0.032mmol/L, Ff (G) 0. 008mmol/L, REAR CX) 0.032mmol/L, 3-FA SER (m3U) 0.016mmol/L, 1-FKREY RAF 〈mlI) 0.064mmol/L, 1-H 3ERR FF (m1G) 0.032mmol/L, 2-H HS (m2G) 0.032mmol/L, fR#f (A) 0.032mmol/L, 6-FAZEARFF (m6A) 0. 032mmol/L 和 5 - 脱 氧 -5 - 甲 基 硫 腺 苷 (MTA) 0.016mmol/L, 4 个 不 同体 积 (0. 625ml, 1.25mi, 1. 563ml 和 2. 5ml) 的 标准 库存 溶液 与 0.5ml Aire SH (0. 25mmol/L) 混合 , 用 水 稀释 到 10ml, 然 后 与 尿 样 一 样 预 处 理 来 制备 不 同 浓度 的 标准 溶液 以 绘制 校正 曲线 。 血清 中 核 苷 的 测定 , 除 了 标准 溶液 中 核 背 浓度 不 同和 进 样 体积 不 同 之 外 , 其 他 条 件 与 尿 样 分 析 相 同 。, 电泳 或 色谱 峰 的 识别 方法 为 : 四 将 未 知 峰 的 迁移 时 间或 保留 时 间 与 核 苷 组 分 的 迁移 时 间或 保留 时 间 相 对 照 ! @ 在 尿 样 中 加 入 标 样 。 当 标 样 核 苷 与 尿 样 的 预 处 理 方式 相同 。 225 。 时 , 尿 中 核 苷 的 浓度 可 以 通过 建立 核 苷 标 样 的 工作 曲线 推算 而 得 。 作为 最 新 的 工作 , 我 们 利用 柱 切 换 技 术 , 构 建 了 一 个 样品 预 处 理 和 分 离 一 体 化 的 液 相 色谱 在 线 系统 。 该 仪器 分 离 分 析 尿 中 核 苷 实现 了 从 样品 预 处 理 到 分 析 全 程 的 自动 化 。 避免 了 繁琐 、 耗 时 的 样品 预 处理 步 又, 提高 了 分 析 结 果 的 精密 度 。 大 大 缩减 了 分 析 时 间 , 减 少 了 所 需 的 样品 量 "” 。 同 时 , 我 们 还 发 展 了 整体 柱 高 效 液 相 色谱 法 和 超 高 效 液 相 色谱 法 , 使 得 核 背 的 分 析 时 间 大 大 缩短 。 10.2.2 多 变量 可 视 化 数据 分 类 的 方法 如 上 文 对 正常 的 成 年 人 来 说 , 个 体 间 核 苷 的 排放 浓度 差异 较 小 , 分 布 在 一 个 较 罕 的 范围 。 当 人 体 的 某 一 部 分 发 生 癌变 时 , 核 糖 核酸 周转 加 快 , 导 致 尿 液 或 血液 中 修饰 核 苷 的 含量 急剧 增加 5's 。 根 据 以 上 的 机 制 〈 图 10-3) , 人 们 可 以 通过 尿 液 或 血液 中 的 修饰 核 苷 的 增加 程度 , 对 癌症 的 发 病 进 行 诊断 5 9 。 文献 hs~19 报 道 的 以 修饰 核 苷 为 肿瘤 标志 物 的 研究 方法 是 采用 健康 人 尿 中 或 血 中 的 修饰 核 苷 为 基准 , 分 布 范围 表达 为 平均 值 加 上 2 倍 标准 偏差 。 若 修饰 核 苷 的 排放 量 超过 平均 值 加 上 2 倍 标准 偏差 则 视 为 异常 排放 , 以 此 为 基础 来 对 癌症 患者 和 正常 人 进行 区 分 , 并 辅助 癌症 的 诊断 。 数 据 处 理 方法 多 采用 孤立 的 对 每 个 修饰 核 苷 进行 单独 检验 , 找 出 排放 水 平 超出 平均 值 加 2 倍 标准 偏差 的 修饰 核 背 的 个 数 , 以 此 作为 最 后 的 结果 对 正常 人 和 癌症 患者 进行 分 类 。 由 于 肿瘤 机 制 的 复杂 性 , 单 用 一 种 肿瘤 标志 物 很 难 满 足 临 床 诊断 灵敏 性 和 特异 性 的 要 求 。 毛 细 管 电泳 (CE) 和 高 效 液 相 色谱 法 (HPLC) 给 利用 多 个 修饰 核 背 作为 肿瘤 Fa i BEE Tp BEAR APE? 891 90194,98,101~ 108) , 但 目前 的 数据 处 理 方法 仍 停留 在 传统 的 统计 方法 上 上, 常常 遇 到 的 一 个 问题 是 , 对 同样 的 一 种 恶性 肿瘤 , 由 于 患者 的 不 同 , 各 种 修饰 核 苷 的 增加 程度 不 同 , 有 时 还 会 发 生 同 一 个 患者 的 尿 中 修饰 核 背 浓度 与 正常 人 相 比 有 高 有 低 的 现象 , 给 医生 的 判断 增加 了 很 大 的 难度 。 传 统 的 方法 一 方面 没有 科学 地 综合 考虑 多 个 标志 物 的 变化 , 浪 费 了 大 量 的 宝贵 信息 , 另 一 方面 无 法 将 多 个 标志 物 的 综合 判断 结 果 直 观 地 图 形 化 。 模式 识别 5 是 数据 信息 采掘 技术 的 主要 方法 之 一 。 其 中 , 统 计 模 式 识别 是 计算 机 模式 识别 方法 的 重要 组 成 部 分 。 统 计 模式 识别 将 每 个 样本 用 特征 参数 表示 为 多 维 空间 的 一 个 点 , 通 过 “ 物 以 类 聚 ” 的 原理 , 同 类 或 相似 的 样本 间距 离 应 该 接近 , 不 同类 样本 间 的 距离 应 该 较 远 , 这 样 可 以 通过 根据 各 样本 点 的 距离 或 距离 函数 来 判别 和 分 类 。 模 式 识别 即 通过 对 已 知 样本 点 〈 训 练 点 ) 进行 训练 和 计算 , 在 多 维 空间 找到 一 个 超 平面 将 不 同类 别 的 点 分 在 不 同 的 区 域 。 化 学 模式 识别 是 化 学 计量 学 研究 的 重要 组 成 部 分 , 它 是 从 化 学 测量 数据 出 发 , 进 一 步 解释 物质 的 隐 含 性 质 , 为 化 学 家 提供 有 用 的 信息 。 为 辅助 诊断 恶性 肿瘤 , 首 先 要 建立 正常 人 体液 中 核 苷 的 排放 范围 , 然 后 找 出 医生 已 确诊 的 恶性 肿瘤 患者 , 研 究 他 们 与 正常 人 的 区 别 。 为 此 , 要 测量 两 批 典 型 人 群 的 核 背 浓 度 , 获 得 与 肌 酥 的 相对 值 。 以 上 述 相对 值 为 原始 数据 , 运 用 多 元 统计 分 析 技 术 〈 如 因子 Ay Bee) 、 模 式 识别 或 人 工 神经 元 网 络 技术 5 等 ), 将 正常 人 与 已 知 癌症 串 者 进行 分 类 建立 “模式 识别 基 力 >。 在 “模式 识别 基 力 ”基础 上 上, 可疑 患者 可 根据 高 效 。, 226 。 BA EE EAT “VAS” FT, a A BE A EO a, TA BBY 诊断 癌症 的 目的 。 1.2.2.1 方法 原理 1. 因子 分 析 因子 分 析 计 算 程 序 结构 图 见 图 10-6. 计算 因子 载荷 矩阵 方差 VA 正 交 旋 转变 换 输出 正 交 旋转 结果 对 正 交 因子 载荷 进行 Prom ax 斜 旋转 计算 斜 因子 的 相关 阵 工 、 结 构 阵 8, 模 型 阵 怒 计算 斜 旋转 因子 得 分 输出 计算 结果 图 10-6 ”因子 分 析 计 算 程 序 结构 图 因子 分 析 是 研究 相关 和 矩阵 的 内 部 依赖 关系 , 它 将 多 个 变量 综合 为 少数 几 个 “因子 ”, 以 再 现 原 始 变量 与 “因子 ”之 间 的 相关 关系 。 因 子 分 析 的 主要 应 用 有 两 个 方面 : Oak 基本 结构 、 简 化 观测 系统 ; GO 用 于 分 类 , 将 变量 或 者 样本 进行 分 类 , 根 据 因子 得 分 值 , 在 因子 轴 所 构成 的 空间 中 进行 分 类 处 理 。 因 子 分 析 的 结果 不 仅 是 要 给 出 因子 模型 , 而 且 还 要 得 出 变量 和 因子 间 的 相关 系数 , 这 些 相关 系数 构成 “因子 结构 >”。 一 个 完全 的 因子 解 包 括 因子 模型 和 因子 结构 两 个 方面 , 因 子 结构 反映 变量 与 因子 间 的 相关 关系 , 而 因子 模型 则 是 以 回归 方程 的 形式 将 变量 变 为 因子 的 线性 组 合 。 因 子 分 析 的 基本 问题 是 用 变量 之 间 的 相关 系数 来 决定 因子 载荷 。 ° 227 « 因子 模型 的 求解 过 程 如 下 。 设 原始 矩阵 为 : X11 X21 °°* Lin es i (10. 1) TZ pi Xp2°** Xin} pxn AP, pRNEBHM, n 表示 样本 数 。 将 原始 数据 进行 标准 化 变换 , 然 后 利用 标准 化 值 计算 变量 2 5 ey oes ty xp 两 两 之 间 的 相关 系数 , 建 立 丸 阶 相关 和 矩阵 : | ee. GW, (10. 2) 求解 丸和 矩阵 的 特征 方程 | R—AL | =0, TREE Al >A, >A, 0, RIED HE 阵 为 : WV11W12" ”ZI1p Wiehe cd (10. 3) Up Upo ***Upp 这 样 有 关系 : Ai 0 A2 > R=U. (10. 4) 0 Ap 4 F=U'X = ie Ai 0 pees (10. 5) 0 Ap 下 为 主因 子 阵 , if AF. =vU'x, (a=l1, a aie | nh)’; 即 每 一 个 下, 为 第 a 个 样品 主因 子 观测 值 。 在 因子 分 析 中 , 通 常 只 选 其 中 疡 个 (m) (Inpirwy ) — wo (10. 11) 4) 函数 形式 处 理 单元 根据 其 输入 进行 计算 , 得 到 具有 各 自 权 重 的 所 有 输入 信号 的 点 积 , 减 去 国 值 , 将 此 结果 传 给 某 函 数 形 式 户 , 并 将 节点 的 计算 向 下 传递 。 已 发 现 Sigmoid (S 形 ) 函数 具有 特殊 的 优 上 点。 典型 的 Sigmoid RAN: f (x) = 五 二 e Sigmoid pk 40 10-8 所 示 。 其 极限 值 为 0( 当 一 一 c2) A 1 C4 > 十 cco)。Sigmoid (S 形 ) 函数 可 得 到 较 好 的 图 10-8 Sigmoid (S 形 ) 函数 ¢ 230 ¢ 人 工 神 经 网 络 行为 。 当 采用 Sigmoid 函数 时 , 可 直接 表达 权重 因子 及 抑制 和 激活 作用 ( 即 w;<0 WMH, w,;>0 为 激活 ) 。Sigmoid 函数 为 连续 单调 函数 , 即 使 当 z 趋 于 士 ce 时 , 效 果 也 很 好 , 训 练 效 果 很 好 。 将 若干 个 人 工 神 经 元 作为 有 辕 图 的 Sih 节点 , 连 成 人 工 神经 网 络 。 图 10-9 Pa 出 了 一 个 典型 的 基于 误差 反 传 算法 的 三 层 前 传 网 络 , 分 别称 为 输入 层 、 隐 蔽 层 和 输出 层 。 可 以 将 人 工 神经 网 络 看 成 为 ew’ 一 个 通过 输入 层 的 所 有 节点 输入 特定 信 息 的 黑箱 , 人 工 神经 网 络 通过 节点 之 间 的 相互 连接 关系 来 处 理 这 些 信 息 。 最 后 , 人 », 从 输出 层 的 节点 给 出 最 终结 果 。 O Sere 在 神经 网 络 的 计算 中 , 输 入 层 一 般 表示 为 Imp, 它 的 每 一 个 计算 单元 将 代表 | | | | Inp 中 的 一 个 元 素 , 它 们 通过 连接 权重 Inp wr AR PA SRR IS Boy” A 图 10-9 三 层 式 前 传人 工 神经 网 络 示意 图 连结 , ym = f(>) wF" Inp; + ws") (10. 12) ue” 称 为 偏 置 点 , 根 据 不 同情 况 可 取 不 同 的 值 。 隐 蔽 8 层 y* DSK, thay Dat 连接 权重 由 式 与 输出 层 Out 相连 。 所 以 , 整 个 三 层 前 传人 工 神经 网 络 可 以 由 下 式 表 出 : Ouk, = f( >) wr y™ + utr) (10. 13) = f{ > wr? [ f(D) we inp; + wi!) + we} KM (0.13) RAW, =a A CHA AS Pp i TAY RE 性 函数 将 输入 矢量 Inp 与 输出 矢量 Out 连 在 一 起 。 实 际 上 , 这 样 的 前 传神 经 网 络 还 可 以 多 于 三 层 , 其 结构 可 依次 类 推 。 从 公式 可 以 看 出 , 网 络 的 确定 实质 是 连接 权重 的 确定 , AAS ©). Inp, Ou 都 可 以 预先 确定 , 只 要 权重 确定 以 后 , 网 络 也 就 唯一 确定 了 。 人 工 神 经 网 络 的 运行 分 为 两 个 阶段 : 四 训练 或 学 习 阶 段 ; @ 预 测 〈 推 广 ) BE. 在 训练 或 学 习 阶 段 , 反 复 向 人 工 神经 网 络 提供 一 系列 输入 、 输 出 模式 对 , 通 过 不 断 调节 节点 的 相互 连接 权重 , 直 至 特定 的 输出 产生 。 通 过 这 些 活动 , 人 工 神 经 网 络 学 会 正 确 地 输入 -输出 响应 行为 , 从 而 对 未 知 样本 进行 预报 。 为 了 建立 人 工 神经 网 络 模型 , 也 就 是 确定 连接 权重 ,Rumelhart 等 529 提出 多 层 前 传 网 络 误差 反 传 算法 〈(BP) 。 所 谓 误差 反 传 的 基本 思路 就 是 定义 一 个 误差 函数 作为 训练 网 络 的 目标 函数 , 然 后 采用 一 种 方法 根据 误差 反馈 过 来 的 情况 以 调节 网 络 的 连接 权重 , 从 而 达到 优化 的 目的 。 一 般 来 说 , 采 用 最 小 二 乘 函 数 来 作为 目标 果 数 , 即 使 式 极 小 化 : E = 1/2| >) (Out, — Exp,)? | (10. 14) sth, Exp (1, -+, D 为 期 望 做 得 到 的 输出 值 ,! 为 输出 矢量 的 元 素 个 数 。Out 《1,…, 。231 , LD) 为 实际 得 到 的 输出 值 。& 为 布 望 输入 与 实际 输出 的 偏差 。 BP 算法 将 由 以 下 几 步 构成 : (1) 数据 预 处 理 。 因 为 一 般 大 都 采用 S 形 非 线性 函数 为 其 活性 函数 , 即 jx) = (十 e“) 。 因 其 输出 值 为 0 一 1, 所 以 一 般 都 需要 对 网 络 的 数据 进行 预 处 理 , 使 之 同 样 落 在 0 一 1。 这 样 的 预 处 理 不 会 影响 问题 的 一 般 性 。 (2) 随机 选取 网 络 之 间 的 连接 权重 ur’ Awe GH=1, +, n3 i=1, -*, ms k= 1,…,1), 其 中 对 为 输入 矢量 的 节点 数 〈 或 称 输入 矢量 的 维 数 ); m 为 隐藏 节点 数 ; | 为 输出 节点 数 。 一 般 就 用 (—0.5~0.5) 的 均匀 分 布 的 随机 函数 产生 。 (3) Ma=1, ++, A, 重复 迭 代 进 行 以 下 步骤 , 直 至 收敛 。@ 前 传 计算 : 按照 公式 计算 Out, 并 与 所 期 望 得 到 的 数值 比较 , 按 式 计 算出 误差 郴 数 正 。@O) RAD: 计算 出 由 式 表 出 目标 郴 数 对 连接 权重 的 一 阶 导数 , 并 以 此 来 调节 连接 权重 ul? 和 wr, Aw = pdiu; (10. 15) Af, 为 一 步 长 因子 , 可 在 0 和 1 之 间 取 值 ; 为 第 7 节点 上 的 抽象 变量 , 一 般 视 其 EER HEA ERR, ROWS f Ler yr tue) Raf Qwr Inp; +t); 6 为 梯度 因子 , 对 于 不 同 层 , 它 有 不 同 的 表达 式 : 人 (u;) (1—u,) 如 果 u; 为 输出 节点 i= Suma a@d-u) we u; SRR A (10. 16) 在 这 里 x (—u) =u’, ZA, u = f( >) wr Inp, + wi!) = f(z) = 1/1 +e) (10. 17) 所 以 有 : ue = f' (xz) = [1/0 十 2 光大 六 =Ufer) Hex)2 | (10. 18) =(W/d+teJU—-1/d+e)}} a — a) 注意 到 式 中 的 步 长 因子 o, 它 的 取 值 大 小 对 收敛 速度 有 很 大 的 影响 , 如 果 取 值 太 大 , 则 可 能 引起 迭代 过 程 的 振 功 ;反之 , 若 取 值 太 小 则 会 导致 权重 调节 的 迭代 过 程 收敛 太 慢 。 一 般 在 式 中 引入 一 个 惯量 因子 人 , 即 Aw, (ae 十 1) = pdiu; +AAwy (a) (10. 19) 以 保证 迭代 收敛 速度 。 10.2.2.2 应 用 实例 和 讨论 本 方法 是 希望 通过 基于 体液 中 核 苷 含量 的 变化 程度 来 判断 个 体 是 否 是 恶性 肿瘤 串 者 。 图 10-10 给 出 了 患者 是 否 患 有 恶性 肿瘤 的 判断 流程 。 首 先 , 要 研究 正常 人 和 已 知 瘤 症 患者 的 核 苷 浓度 范围 , 采 用 HPLC 或 CE 的 方法 获得 正常 人 和 典型 恶性 肿瘤 患者 的 尿 样 或 血清 中 核 苷 的 含量 。 然 后 进入 训练 和 学 习 阶 段 , 即 根据 选 定 的 模式 识别 方法 对 正常 人 和 已 知 癌症 患者 的 核 苷 数据 进行 分 类 分 析 〈 具 体 过 程 见 方法 原理 ), 建 立 用 于 预测 的 模式 识别 的 基 图 及 各 种 计算 参数 〈 包 括 计算 权重 等 )。 对 于 未 知 患 者 , 分 析 其 尿 样 或 血 ° 232 ° 清 中 核 苷 的 含量 , 根 据 建立 的 模型 对 该 数据 进行 计算 , 获 得 结果 , 并 根据 其 在 基 图 上 的 相对 位 置 和 结果 判断 其 是 否 是 恶性 肿瘤 的 患者 。 正常 人 的 尿 样 或 血样 分 析 其 中 核 苷 含量 (nmolhmol VRE) 典型 恶性 肿瘤 患者 的 尿 样 或 血样 分 析 其 中 核 苷 含量 (nmol/hmol PLR ) 运用 数据 分 析 技术 , 将 正常 人 与 已 知 癌症 患者 进行 分 类 建立 “模式 识别 基 图 ” 待 诊断 的 患者 尿 样 或 血样 分 析 其 中 核 苷 含量 (nmolhmol PRET) 4 根据 核 背 含量 从 “模式 识别 基 图 ”中 找 出 待 诊断 患者 在 其 中 的 位 置 根据 所 处 位 置 判断 患者 是 否 患 有 恶性 肿瘤 图 10-10 BRR AR AEA HAE 以 18 个 正常 人 和 51 个 癌症 患者 作为 样本 , 用 他 们 尿 中 11 BE A EB 浓度 (nmol/pmol LBA) 为 原始 数据 , 按 图 10-6 进行 因子 分 析 。 原 始 数据 经 标准 化 处 理 , 计 算 相 关 和 矩阵 , 求 解 相 关 和 抢 阵 的 特征 方程 , 得 到 特征 向 量 和 矩阵 和 相应 的 特征 值 。 选 择 两 个 主因 子 , 设 它们 反映 的 信息 已 占 总 体 信 息 量 的 90%, 得 到 因子 载荷 矩 阵 。 对 上 述 因子 载荷 矩阵 进行 方差 极 大 正 交 旋转 , 正 交 旋 转 后 的 结果 进一步 进行 ” Promax 斜 旋转 , 用 相关 因子 进行 线性 描述 , 得 到 斜 交 因子 相关 矩阵 和 和 斜 交 因子 得 分 值 。 用 第 一 和 第 二 斜 交 因子 得 分 值 作 斜 交 因 子 得 分 图 〈 图 10-11) 。 这 个 第 一 、 二 斜 交 因子 得 分 图 即 是 基于 18 个 正常 人 和 51 个 已 知 癌症 患者 用 尿 中 11 种 修饰 核 苷 作为 原始 数据 所 得 的 “模式 识别 基 图 >。 由 图 10-11 可 知 , 正 常人 的 位 置 在 图 中 落 到 一 个 RAEN KS, THERA MRR, Pi Kae BED, SA 10-5 PRK E 代谢 机 制 相 吻合 。 图 10-12 是 以 23 个 正常 人 和 19 个 癌症 患者 为 样本 , 以 他 们 血清 中 11 A 量 为 原始 数据 , 经 因子 分 析 根据 所 得 的 第 一 和 第 二 斜 交 因子 得 分 作 斜 交 因子 得 分 图 , 即 得 到 基于 血清 中 核 苷 分 析 的 “模式 识别 基 图 "。 与 图 10-11 非常 类 似 , 只 有 两 个 癌 证 患 者 的 点 落 到 正常 人 的 区 域 。 有 了 上 面 两 个 基 图 后 , 我 们 即 可 对 未 知 患 者 是 否 有 癌症 进行 判断 。 首 先 , 我 们 采集 竺 诊断 的 患者 尿 样 , 测 其 中 的 核 苷 含量 。 患 者 尿 中 5 种 最 重要 修饰 核 苷 的 浓度 与 正常 人 。 233 + * ©9752 Pe t+ xx & + 到 t+ yk e we 区 x ‘hic i Pg 9756 ® 9758 -3.0 ae -16 -0.9 -02 -0.5 12 19 26 33 40 PCI 图 10-11 因子 分 析 法 基于 尿 中 修饰 核 苷 用 于 分 类 正常 人 (+, 184) 和 癌症 患者 (x,51 个 癌症 患者 ,15 ABLE) 11 PE HRA A Dhu, Pseu, mlA, I, m5U, X, m3U, mlI, ml1G, M6A, MA lot Bad Bog. OEP Pon tae 22> FoR PCI 图 10-12 ”因子 分 析 法 基于 血 中 11 种 修饰 核 苷 用 于 分 类 正常 人 (+, 23) 和 癌症 患者 (x, 194) 11 FE HK AW Dhu, Pseu, mlA, I, m5U, X, m3U, mlI, mlG, M6A, MTA 的 浓度 及 其 分 布 范围 进行 比较 。9758 号 和 9756 号 患者 ,5 种 修饰 核 苷 的 浓度 与 正常 人 比 均 显 著 增 高 〈 指 超过 正常 人 平均 值 十 2 倍 标准 偏差 ), 用 常规 方法 也 可 以 判断 他 们 可 能 患 有 癌症 。 但 9752 号 和 9748 号 患者 , 尿 中 Dhu、Pseu 的 含量 比 正 常人 低 , 而 mlA、 mlI 和 mlG 的 含量 又 明显 增高 〈 图 10-13) 。 如 果 仅 用 2 倍 标准 偏差 的 办 法 来 判断 , 根 本 无 法 知道 患者 是 否 有 恶性 肿瘤 。 但 用 了 本 发 明 的 模式 识别 技术 后 , 根 据 样本 尿 中 核 苷 和 修饰 核 苷 的 含量 , 算 出 该 样本 的 因子 得 分 , 根 据 因子 得 分 , 即 可 找到 该 样本 在 基 图 中 的 位 置 , 即 可 对 样本 的 类 别 进行 判断 。 图 10-11 中 用 圆圈 圈 出 了 上 述 四 个 样本 〈 患 者 ) ° 234 ° 在 图 中 对 应 的 位 置 。 肌 酸 肝 /(nmol/umol) Dhu/10 Pseu/10 mlA mlI mlG 图 10-13 ”四 个 典型 的 患者 尿 中 重要 修饰 核 苷 的 浓度 与 正常 人 的 比较 Normal 为 正常 人 尿 中 核 苷 排放 浓度 的 平均 值 ,Normal 十 2SD 为 正常 人 平均 值 十 2 倍 标准 偏 差 。9752、9758、9748 和 9756 为 患者 编号 。 除 9752 为 喉 咽 癌 外 , 其 他 均 为 乳腺 瘤 作为 另 一 应 用 实例 , 我 们 又 采集 了 手术 前 一 天 患者 的 尿 样 。 图 10-14 给 出 了 三 个 典 型 乳腺 肿瘤 患者 和 正常 人 尿 中 重要 核 背 的 测定 结果 。9717a 与 正常 人 相 比 , 尽 管 mlI、 mlG 增高 不 是 太 明 显 , 但 Pseu、Dhu、mlA 显著 增高 。 表 明 此 患者 很 可 能 患 有 恶性 肿瘤 。 aa 肌 酸 肝 /(nmolumol) Dhu/10 Pseu/10 mlA mlI mlG 图 10-14 =P>HOHRAR PRE ECRRAHRE SIERRA LR 图 中 9727a、9731a 和 9717a 为 三 个 典型 的 患者 〈 均 为 乳腺 癌 ) 。 其 他 同 图 10-13 9731a 与 正常 人 相 比 ,Pseu 明显 增高 , 但 Dhu、mlA、mlI、mlG 反而 降低 。5 个 最 重要 的 修饰 核 并 只 有 一 个 增高 。 这 个 患者 的 数据 就 出 现 了 修饰 核 苷 有 高 有 低 的 现象 。 用 传统 的 2 倍 标准 偏差 法 很 难 知 道 患 者 是 否 患 有 恶性 肿瘤 。 从 因子 分 析 模 式 识 别 基 图 可 SL (AA 10-15) , 此 点 离 正 常人 很 近 , 但 又 没有 进入 正常 人 的 区 域 , 此 患者 应 为 癌症 初 期 。 事 实证 明 也 如 此 〈 表 10-4) 。 5 235 3 十 be t +e. . 9727a Hy <8 ef x 全 六 17a | Ve x e220 SO =0'S’ 000; “0.5 10 Pas 20: eZ 3:0 PC1 图 10-15 利用 本 发 明 的 模式 识别 方法 判断 三 个 未 知 患者 〈 乳 腺 瘤 模式 识别 基 图 ) 正常 人 (十 ,18 个 ) , 乳 腺 癌 患 者 (X,23 个 )。11 种 修饰 核 苷 为 Dhu、Pseu、mlA、fI、 m5U、X、m3U、mlI、mlG、M6A、MTA 表 10-4 肿瘤 患者 的 背景 (乳腺 癌 ) 样品 号 性 别 癌症 阶段 CEA/ (ng/L) CA153/ (V/L) 9727a 去 TIN1 (Il, 期 ) 5.6 40 9731a 女 T2N1 (IIe 期 ) 1.1 6 9717a x 原 位 (0 期 ) 0.7 16 患者 9727a 与 正常 人 相 比 ,Dhu、mlA、mlI、mlG 显著 增高 , 但 Pseu 明显 降低 。 从 图 10-15 可 知 ,9727a 偏离 正常 人 很 远 , 很 可 能 为 癌症 患者 。 上 述 三 个 患者 的 尿 样 是 在 手术 前 一 天 取 来 的 。 在 患者 手术 后 发 现 三 个 患者 都 患 有 恶 性 肿瘤 , 且 处 于 早期 阶段 〈 表 10-4) 。 用 传统 的 目前 在 临床 上 应 用 的 肿瘤 标志 物 CEA、 CA153 检验 , 浓 度 增 加 不 明显 。 相 比 之 下 ,9727a 在 CEA、CA153 上 稍 有 异常 的 反映 , 癌症 应 该 更 严重 一 些 。 这 点 与 本 方法 所 取得 的 结果 一 致 〈 图 10-15) 。 在 本 方法 的 模式 识别 基 力 中, 上 述 三 个 患者 可 非常 明显 地 与 正常 人 区 别 开 。 我 们 也 对 良性 肿瘤 与 恶性 肿瘤 的 区 别 做 了 初步 研究 , 发 现 其 体液 中 核 背 浓度 与 正常 人 相 比 , 基 本 类 似 。 上 述 结 果 显 示 , 因 子 分 析 具 有 良好 的 直观 性 , 可 将 多 变量 转化 为 二 维 平 面 上 的 投 影 , 并 形成 对 应 的 区 域 用 于 类 别 的 区 分 , 但 由 于 其 只 考虑 了 两 个 主因 子 , 在 识别 率 上 有 所 损失 。 采 用 人 工 神经 网 络 , 可 进一步 提高 识别 率 。 以 18 各 正常 人 和 51 个 患者 作为 样本 〈 同 因子 分 析 样 本 ) , 用 他 们 尿 中 11 种 核 苷 和 修饰 核 苷 的 浓度 Cnmol/pmol 肌 酸 肝 ) 为 原始 数据 。 首 先 对 原始 数据 进行 标准 化 处 理 , 使 每 一 列 数据 〈 同 一 核 苷 变量 ) 的 均值 为 0, 方差 为 1, 选择 其 中 的 2/3 FAVA, 其 余 1/3 作为 测试 集 。 建 立 三 层 前 传人 工 神经 网 络 模型 , 输 入 节点 为 11 个 对 应 11 个 核 TRE, BSBA 10 个 节点 , 输 出 层 为 1 个 节点 , 并 随机 确定 连接 权重 和 内 部 冰 值 。 采用 训练 集 的 数据 对 网 络 进行 训练 , 根 据 BP 算法 调整 连接 权重 和 内 部 国 值 , 经 过 1356 次 迭代 , 直 至 误差 累加 值 小 于 10, 网 络 训练 结 束 。 利 用 建立 的 网 络 模型 对 测试 集 进 行 预测 计算 。 与 因子 分 析 比 较 结 果 见 表 10-5, 其 灵敏 度 、 专 一 性 、 正 确 率 均 优 于 因子 。236 。 分 析 。 图 10-16 上 给 出 了 训练 集 在 和 迭代 过 程 中 的 误差 累加 值 的 变化 情况 , 表 10-5 给 出 了 测试 集 的 计算 结果 。 对 训练 集 的 1356 次 迭代 10° a 要 2 10? 10-* 0 200 400 600 800 1000 1200 BARK 1.5 1 0.5 = = 0 -0.5 -1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 FM : 10-16 FR PR REHEAT ER 表 10-$ ”基于 人 工 神 经 网 络 和 因子 分 析 的 尿 中 核 苷 数据 分 类 结果 ” 人 工 神经 网 络 方法 CANN method) 训练 集 / 测试 集 总 数量 “识别 为 健康 ”识别 为 癌症 患 总 数量 “识别 为 健康 ”识别 为 癌症 串 人 个 数 者 个 数 人 个 数 者 个 数 健康 人 12 12 0 6 6 0 癌症 患者 34 0 34 17 1 16 | 训练 识别 率 /%% 预测 率 /% 灵敏 度 /% 专 一 性 /%% 正确 率 /5% 100. 0 95.7 98. 0 94.7 98. 6 2 因子 分 析 方法 (PCA method) | 总 数量 识别 为 健康 人 个 数 识别 为 癌症 患者 个 数 健康 人 18 14 4 瘤 症 患者 51 4 47 灵敏 度 /% 专 一 性 /% 正确 率 /% 92.2 77.8 88. 4 * 有 灵敏度 为 癌症 患者 的 识别 率 , 专 一 性 为 正常 人 的 识别 率 。 表 10-6 和 图 10-17 给 出 了 以 23 个 正常 人 和 19 个 瘤 症 患者 为 样本 , 他 们 血清 中 11 种 核 背 的 含量 为 原始 数据 的 人 工 神 经 网 络 的 预测 结果 , 与 前 者 类 似 。 人 3 和 « 表 10-6 EFA LHAMSAATA AH MAP RRREDKER 人 工 神经 网 络 方法 CANN method) 训练 集 测试 集 总 数量 ”识别 为 健康 BARES 。 总 数量 《识别 为 健康 识别 为 癌症 串 人 个 数 HTK 人 个 数 者 个 数 健康 人 15 15 0 8 8 0 癌症 患者 13 0 13 6 1 5 训练 识别 率 /%% 预测 率 /2% PAE / % 专 一 性 / 儿 正确 率 /%% 100.0 92.9 94.8 95.8 97.6 因子 分 析 方法 (PCA method) 总 数量 识别 为 健康 人 个 数 识别 为 癌症 患者 个 数 健康 人 23 19 4 癌症 患者 19 5 14 FABUE / % e—HE/% TEM e/% TB 79. 2 78.6 灵敏 度 为 癌症 患者 的 识别 率 , 专 一 性 为 正常 人 的 识别 率 。 对 训练 集 的 104 ie 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100. TERRE — 1.5 1 a 05 & ak +z 0 a 0.1 02 03 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 09 1 预测 值 图 10-17 血清 中 核 苷 数据 神经 网 络 预测 结果 与 因子 分 析 相 同 , 有 了 上 面 两 个 基本 模型 后 , 我 们 即 可 对 未 知 患 者 是 否 患 有 癌症 进 行 判 断 , 而 结果 的 正确 识别 率 较 因 子 分 析 高 。 有 兴趣 的 读者 可 继续 参看 我 们 发 表 的 研究 论文 [84100,123,124] | ) 5 238 « Sa ese Tel ey ET. a ech 10.3 RR EBERT. Yar BES A AY 0 A 应 用 10. 2. 1 节 介 绍 的 毛细 管 电 泳 〈CE) 、 高 效 液 相 色谱 CHPLC) 方法 测定 体液 中 核 苷 浓度 , 并 用 主 成 分 分 析 技 术 (PCA) 和 人 工 神经 元 网 络 分 析 软 件 CANN) 对 数 据 进行 处 理 , 对 比 健康 成 人 、 和 良性 肿瘤 患者 和 不 同类 型 恶性 肿瘤 患者 尿 中 13 一 15 种 修 饰 核 苷 的 分 布 差异 , 以 考察 修饰 核 苷 作为 广 谱 肿瘤 标志 物 , 用 于 肿瘤 普查 、 早 期 诊断 及 治疗 后 随访 的 可 行 性 。 健康 成 人 的 样品 来 自 志 愿 者 , 根 据 年 龄 构成 比例 选择 采集 对 象 , 恶 性 肿瘤 患者 和 和 良 性 肿瘤 患者 的 样品 主要 来 自 大 连 医 科大 学 附属 第 一 、 第 二 医院 和 大 连 市 肿瘤 医院 。 尿 样 随机 采集 。 收 集 的 尿 样 于 2h 内 放 人 一 207C 的 冰箱 冷冻 , 核 背 测 定 前 , 室 温 下 解冻 。 健 康成 人 尿 样 中 54 例 用 于 CE 分 析 ,208 例 用 于 HPLC 分 析 。 肿 瘤 患者 尿 样 中 68 例 用 于 CE 分 析 ,296 例 尿 样 用 于 HPLC 分 析 。CE 同时 测定 13 BREF, HPLC 同时 测定 15 种 核 苷 。 所 有 肿瘤 均 经 病理 或 不 同 种 影像 学 技术 确诊 。 所 有 健康 志愿 者 尿 样 随 诊 一 年 内 无 肿瘤 发 生 。 本 研究 所 采样 品 的 类 别 给 出 在 表 10-7。 10-7 ” 核 背 作为 肿瘤 标志 物 研 究 所 做 样品 的 分 类 CE HPLC 总 计 正常 人 54 206 260 恶性 肿瘤 患者 68 296 364 恶性 肿瘤 患者 手术 前 、 后 22X2 24X2 46 X2 其 他 非 癌 患 者 38 19 57 儿童 病 患 者 9 〈 手 术 前 后 3) = 9 (FARA 3) 10.3.1 RPC HRA Ew 为 研究 尿 中 核 苷 作 肿瘤 标志 物 的 可 行 性 , 我 们 从 不 同 医院 专门 采集 了 具 不 同 特征 的 | 尿 样 , 用 毛细 管 电泳 或 高 效 液 相 色谱 进行 研究 。 由 于 每 人 尿 中 均 有 核 苷 排放 , 要 知道 肿瘤 患者 发 病 后 尿 中 核 背 是 否 有 异常 , 首 先 要 了 解 正 常人 尿 中 核 苷 的 排放 水 平 。 为 此 , 我 们 采集 了 54 例 正 常人 男女 各 半 ) 尿 , 以 建立 正常 人 尿 中 修饰 核 苷 水 平 基准 。 正常 人 男 、 女 各 27 例 , 尿 中 修饰 核 背 含量 经 统计 学 二 检验 未 见 性 别 间 差 异 (p>0.05, FA 10-18) 54 例 正 常人 被 分 为 三 组 : 30 岁 以 下 组 14 人 ,30 一 50 岁 组 26 人 ,50 岁 以 上 组 14 人 。 分 析 各 年 龄 组 尿 修饰 核 背 含量 是 否 存 在 差异 。 由 图 10-19 可 知 , 3 组 正常 人 尿 中 13 种 核 苷 含量 均值 比较 , 各 组 间 未 见 明 显 差异 , 在 各 组 间 不 同 种 修饰 核 苷 的 两 两 比较 中 发 现 ,1- 甲 基 次 黄 味 叭 核 背 〈mlI) 在 30 一 50 岁 组 和 50 岁 以 上 组 间 均值 差异 最 大 , 但 巡 值 仅 为 0.041。 可 见 尿 修饰 核 背 含量 在 不 同性 别 和 年 龄 成 人 之 间 不 存在 明显 差异 。 因 此 , 我 们 可 以 认为 尿 中 核 苷 浓度 与 年 龄 和 性 别 无 关 。 为 进一步 了 解 肿瘤 患者 尿 中 核 背 排放 水 平 , 我 们 测定 了 68 例 恶性 肿瘤 患者 尿 中 13 。 239 , 肌 酸 本 (nmolumol) Pse/10 U C mU I mllacC G mlG A X m2G m6A 图 10-18 正常 人 尿 中 核 苷 排放 水 平 的 比较 图 中 数据 用 CE 方法 测量 2.00 1.80 MF R70-30 |, 1.60 47 #4 30~S0 1.40 口 年 龄 50~70 肌 酸 本 (nmolumol) Pseuwl0OU C mU I miI ac4C G mIG A X m2G m6A 图 10-19 正常 人 不 同年 龄 段 核 苷 排放 水 平 的 比较 种 核 苷 含量 , 临 床 背 景 信 息 见 表 10-8。 研 究 结果 表明 : 除了 3- 甲 基 屎 苷 、5- 甲 基 尿 苷 (mU) 和 6- 甲 基 腺 苷 (m6A) 以 外 , 亚 性 肿瘤 患者 尿 中 其 他 11 种 核 苷 含量 均 明显 高 于 正常 人 (p<0. 001、 表 10-9) 。 对 正常 人 与 肿瘤 患者 尿 苷 含量 标准 偏差 进行 比较 , 发 现 恶性 肿瘤 患者 组 标准 偏差 明显 大 于 正常 人 组 。 这 不 仅 表明 恶性 肿瘤 患者 尿 中 核 苷 含量 大 大 增高 , 同 时 也 反映 了 不 同 肿瘤 患者 个 体 间 在 修饰 核 苷 的 排放 量 上 存在 着 明显 的 个 体 差 异 , 且 分 布 范围 较 广 〈 图 10-20) 。 站 表 10-8 毛细管 电泳 法 测定 的 68 个 瘤 症 患者 的 临床 背景 资料 性 别 年 龄 肿瘤 大 小 分 期 AFP CEA CA125 CA153 病理 诊断 te de 直肠 中 分 化 腺 癌 , 浸 润 浆 膜 外 2 43 T2N2Mo FL AR ATG 3 #8 71 10X9.8X2+3.2xX.5 T4N2MO 9.65 3.9 FSA. Ba Poe Rae 4 5 25 d6 T3NOMO 9.2 Bi NR Be est 5 VIER UU | T3NOMO Py An Hi Fe di “ae “Mereare T2NOMO FFL Wi rd HE EE 3 53 4x3 T2NOMO 乳腺 单纯 癌 , 腋 窝 淋巴 结 无 转移 8.0. Hg 535J5X6 T3NOMO 胃 中 分 化 腺 瘤 * 240 。 续 表 患者 下 性 别 FER 肿瘤 大 小 分 期 AFP CEA CA125 CA153 病理 诊断 re. 4) TIN3M1 乳癌 术 后 转移 扩散 WO W320 fee T4N2M1 胃 低 分 化 腺 癌 , 广 泛 转移 1 ok 4B 4 axa T2N1Mo FUR PAL, RKESS (3/9) 12 & 64 6X4 T4NOMO 9.94 乳腺 浸润 性 导管 癌 13 & 46 4X5X1L2 T2NOMO 乳腺 浸润 性 导管 癌 〈0/6) 144 攻 “5S3y 92xX2 T2N1Mo 10. 81 乳腺 瘤 15 # 40 T2NOM1 FEAL AR BPE RE 160 & 47 4X3X1.5 T4N1M1 FLARE 17 § 67 6X5X3.5 T4N2Mo 5.51 6.46 FRA BR 18 Bm 58.2xX3 T2NOMOo AREER (AD 19 FB 8 re T4N1M1 胃 低 分 化 腺 瘤 20 8B 38 7.5X5.5X4 T4NOMO 0 ”结肠 年 夜 腺 癌 , 浸 润 浆 膜 外 Bite tt 69 ofr T4NxM1 胃 腺 瘤 22 wit ortho 12% 10:57 T4N1Mo 左 乳 腺 瘤 23 te 54 42.8 T3N1Mo FRAC RR 24 t& 34 6X4.5X2.5 T4NIM1 3.48 11.2 17.3 ”恶性 胸腺 癌 2 男 47 4X4xX5 T4N1Mo 55 PARA eRe 26 & 65 3X3 TINOMO 3.39 2.03 7.52 ZeSLAR BRA 27 ke BB axe TINO Mo 5.26 1.43 8.67 左 浸润 性 导管 癌 无 淋巴 结 转移 28. view 56 2>62.7X2. 1 TIN1MOo 6.77 FLARES Oe 29 3 54 1X1X1 TINO Mo Ze PUR AR BPE 30 & 44 3.5X5 T3N2M0 5. 58 胃 低 分 化 腺 癌 31-63 5X3. 8X1.0 T2NOMOo 乳腺 浸润 性 导管 瘤 32 *& 57 “d=2 TINIMO 3.05 2.81 胃 中 分 化 腺 癌 , 浸 润 黏膜 下 层 ft) OX25 TINIMO0 乳腺 单纯 癌 , 腋 窝 淋 巴结 (0/5) 34 8B 60 广泛 399.44 6.33 ARR. IRB 3 #8 76 T4N2M1 5 胃 印 戒 细 胞 癌 , 姑 息 36 & 58 3.5X2X1.5 TINOMO 4.1 0.59 0.01 7.73 SLARBStES Ce ar i 59 A T3NOMo 食道 中 分 化 鳞 癌 38 & 44 4X5 T4NI1M1 1.96 8.68 17.3 右 乳 腺 浸润 性 导管 瘤 39 & 63 d=3 T1NOMOo 左上 肺癌 40 8 78 d=4 T3N2M1 4.03 2.74 BRS ae BT C2. 5 X2.5 T2N1Mo 6.94 FLARB HES A 42 & 63 2X2x2 T2N2Mo 10. 81 SLARMBS HES 43 & 60 4X4x4 T3N1MOo 9.54 FLARES Se Mit, 25 d=s T3NOM0 3. 19 FEB PAR 45° “kx” 70 甲状 腺 癌 术 后 复发 46 . 男 ” 59 白血病 47 =H 66 4X3.5 T3N1Mo BENT PRS 48 wt 55 3X2 TINOMo APLAR SS ES ° 241 » 患者 编号 性 别 年 龄 49 男 53 50) "A 62 or’ Tao a ° & “6 ao ae 54 男 60 55 男 66 56 男 46 57. 38) AS 58 3B 46 ao. 38 60 5 65 61 5 59 62 BB 74 63 #8 57 64 女 44 65 3B 70 66 x 42 GT Pee WO3 68 #5 56 BRAK Pseu U C mU I mlI ac4C G mlG A X m2G m6A 肿瘤 大 小 6.5X6X3 5X5X5 3X1 2.02. 0 4X2X1.8 2.8X1.2X1 d2 3.4X2. 8X2. 8 5X3 8X4X2 d=5 12 1.5X1 2Xd0. 7 m2 5X5 义 4 4X3X.1.5 5X3. 8X1. 0 ao 分 期 T4N3M0 T2N2M1 T1N1Mo T2N2Mo T4NOMOo T1NOMo T1N1Mo T2NOMO T2N2Mo T4N2Mo T3NOMOo T3N2Mo T1NOMo T1N2Mo T2N1Mo T1N1Mo T2NOMO T3N1MOo AFP 0. 12 10.51 14. 89 0. 92 S735 LS 15.48 3.6 0. 1 0.1 1027) 2. 74 CEA CA125 CA153 26. 54 续 表 病理 诊断 胃 低 分 化 腺 瘤 肺癌 脑 转移 乳腺 浸润 性 导管 冶 FUERTE 肺 中 分 化 腺 瘤 膀胱 移行 细胞 瘤 胃 溃 疡 亚 变 肾 细胞 瘤 白血病 右 肺 下 叶 低 分 化 鳞 癌 乳腺 浸润 性 导管 瘤 肝 细 胞 瘤 直肠 印 戒 细胞 癌 , 浸 润 外 膜 层 外 胃 腺 癌 , 浸 润 黏膜 固有 层 小 细胞 肺癌 Ete le 肺 低 分 化 腺 瘤 乳腺 浸润 性 导管 瘤 乳腺 浸润 性 导管 癌 胃 印 戒 细 胞 癌 , 浸 润 浆 膜 外 表 10-9 正常 人 和 癌症 患者 尿 中 核 背 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 正常 人 meantsd/ (nmol/pmol ALR EF) 17. 7344. 42 0. 0. 0. 310. 0. 3740. 0. 0. 490. 0. 120. . 790. . 41 士 0. . 82 士 0. . 43 士 0. . 060. 34 士 0. 16 310. 9740. 癌症 患者 meant sd/ . (nmol/pmol 肌 酸 栈 ) 44. 40 士 33. 74 <0. 001 0. 770. 58 <0. 001 0. 79 士 0. 89 <0. 001 0. 43-£0. 57 <0. 05 0. 700. 67 <0. 001 2.451. 80 <0. 001 1. 310. 93 <0. 001 0. 300. 36 <0. 001 1.971. 54 <0. 001 1. 020; 77 <0. 001 1. 4120502 <0. 001 1. 34-£0. 97 <0. 001 0. 19-0. 40 <0. 05 TE: 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 242 。 Pseu 140.00 5 全 120.00 S r=) 己 r=) S 4 之 办 Nn 一 一 So (jounl/jouru), 45 i + oe 06¢e sesame + ot ee (jown/jowu)/ 49a 1h 患者 正常 人 正常 人 BA 正常 人 BA mill mU 7.00 2.50 + #6 6.00 Ss S= 3-48 um + cm (jown/jouru), 44a (joumn/jouru), 45 i a 8 — (jour! jour), $i Ba S sel S 0.00 ERA Be ERA BA ERA BA mlG ac4C 6.00 4.00 5.00 3.50 (jowun//jowu)/ i Sl LA 1.40 a 82S 8 = (O'S 3 76 mm (journ/jouu), 44 i YH + WO +HOOe+ CO 1008S =) So i) N 一 一 己 (joumjouru), 49 a Lf 3.00 = =: So 正常 人 ”患者 正常 人 患者 正常 人 BA 图 10-20 正常 人 和 交 症 患者 尿 中 核 背 浓度 分 布 的 散 点 。 243 。 A m2G m6A 3.50 5.00 2.50 3.00 ' i > 4.00 2.00 全 2.50 : ‘ = 3.50 = S , E EE E = 3.00 ’ a 1.50 = 2.00 8 = = 号 E 250 三 上 1.50 4 te 1.00 ia ae te 1.00 ; ; 1.50 1.00 0.50 0.50 0.50 全 0.00 0.0 0.00 0.00 ERA BS ERA BF ERA BF ERA BF 图 10-20 (4%) WDE AR PRE APE SAI 2 倍 标准 差 为 界 , 超 过 此 界 者 认为 显著 增高 , 可 得 各 个 核 苷 在 肿瘤 患者 尿 中 的 增高 率 〈 表 10-10) 。 从 表 10-10 中 可 知 , 单 个 核 苷 增高 率 的 平均 值 为 52%。 其 中 四 种 修饰 核 苷 [ 假 尿 喀 啶 核 背 (Pseu) 、1- 甲 基 次 黄 味 吟 核 苷 (m1l]D). Ni-C BiH (ac4C), 2S H 〈(m2G)] 的 增高 率 要 明显 高 于 其 他 核 苷 (>60%)。 这 表明 肿瘤 患者 尿 中 修饰 核 苷 含量 比 正常 人 明显 增高 。 但 不 同 患者 所 增高 的 核 苷 类 型 有 所 差异 , 有 时 会 随 肿瘤 患者 个 体 的 不 同 , 在 同一 患者 中 出 现 既 有 增高 又 有 降 低 的 现象 , 仅 靠 一 种 核 苷 值 来 评估 患者 是 否 有 肿瘤 存在 , 不 但 困难 , 也 难免 产生 漏诊 , 因此 , 同 时 利用 多 种 核 苷 , 采 用 多 种 标志 物 同时 检测 肿瘤 显得 非常 必要 。 这 也 符合 肿瘤 是 一 个 多 基因 、 多 因素 控制 的 疾病 的 现实 。 表 10-10 ”癌症 患者 尿 中 13 种 核 背 排放 水 平 的 增高 率 BERK 增高 率 /%% Pseu 46/70 (66%) U 28/70 (40%) C 32/70 (46%) mU 12/70 (17%) I 26/70 (37%) mlI 44/70 (63%) ac4C 48/70 (69%) G 27/70 (39%) mlG- 41/70 (59%) A 37/70 (53%) xX 19/70 (27%) m2G 46/70 (66%) m6A 17/70 (24%) 平均 52% TE: 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 。 244 。 ae get? eae, aa Re Ok Ae Se a Se a ae PCI 10-21 主 成 分 分 析 技 术 (PCA) AAT IER A (+) 和 癌症 患者 〈x ) 的 分 类 为 此 , 我 们 引用 了 分 析 化 学 的 主 组 成 分 析 〈PCA) 技术 , 以 尿 中 13 种 核 苷 浓度 为 数据 矢量 , 对 分 别 患 有 10 余 种 恶性 肿瘤 的 68 例 患 者 和 54 例 正常 人 进行 分 类 研究 (A 10-21) , 结 果 显 示 ,72 色 的 肿瘤 患者 的 尿 中 核 苷 含量 与 正常 人 相 比 出 现 差 异 , 即 利用 PCA 多 指标 方法 对 肿瘤 患者 的 识别 率 为 72% , 而 单个 核 苷 作 指 标 , 平 均 识别 率 只 有 52% (# 10-10). 对 尿 中 不 同 种 核 苷 含量 与 肿瘤 临床 分 期 的 关系 进行 研究 发 现 : (RRA (Pseu), 1- 甲 基 腺 苷 (mlA) 、N- 乙 酰 胞 苷 〈ac4C) 与 分 期 呈正 相关 性 , 随 分 期 增加 , 这 三 种 修饰 核 苷 的 排放 水 平 逐 渐 增 高 〈 表 10-11) 。 表 10-11 修饰 核 苷 排放 与 临床 分 期 的 总 体 趋势 BERR I Il ill VV Pseu 30. 10 36. 48 39x5 9 46. 41 mlA 3. 00 3.72 3. 90 4.72 mlI 2.07 2. 46 2. 36 3. 05 mlG 1. 07 1. 41 1. 30 1.99 ac4C 1.01 1. 16 139 1.71 m2G 0. 83 0. 96 0. 98 Let? m2,2G 1. 83 2. 40 2. 32 2. 84 注 : 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 分 析 尿 中 修饰 核 苷 含量 与 肿瘤 体积 关系 , 发 现 Pseu、mlA、mlI、mlG、ac4C、 m2,2G 的 含量 与 肿瘤 大 小 存在 相关 性 〈 表 10-12)。 以 上 结果 表明 , 我 们 可 结合 PCA Al ANN 技术 研究 、 诊 断 不 同类 型 的 肿瘤 。 。 245 « 10-12 修饰 核 彰 排放 与 肿瘤 大 小 的 总 体 趋 势 RFE PE 0 一 2cm 2 一 4cm 二 4cm Pseu 24. 97 36. 12 42.71 mlA 2. 67 3. Bh 4. 42 mllI 2. 02 2.50 2.98 mlG 1. 18 edz 1. 65 ac4C 0. 76 1. 23 1.35 m2G 0. 91 0. 89 1.27 m2,2G 1.78 2. 22 2. 86 TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 10.3.2 核 背 作为 肿瘤 标志 物 在 多 种 肿瘤 中 的 应 用 研究 1. 白血病 和 淋巴 瘤 白血病 是 血液 系统 中 最 常见 的 恶性 肿瘤 , 其 死亡 率 分 别 为 男性 恶性 肿瘤 的 第 6 位 与 女性 恶性 肿瘤 的 第 8 位 , 居 儿童 及 青少年 恶性 肿瘤 的 首位 , 尤 其 是 急性 白血病 。 目 前 , 临床 上 通常 根据 骨 做 像 对 该 病 进行 诊断 及 分 型 、 观 察 治疗 反应 , 判 断 病情 是 否 缓解 。 由 于 瘤 细 胞 广泛 分 布 于 全 身 血液 中 , 瘤 细胞 代谢 产物 直接 进入 血液 , 因 此 血 与 尿 中 修饰 核 苷 含量 应 与 肿瘤 的 增生 状况 直接 相关 。 理 论 上 讲 , 白 血 病 应 是 判断 尿 修饰 核 苷 能 否 用 于 肿瘤 诊断 的 理想 范例 。 早期 研究 证 实 025 ,Pseu 和 m2,2G 水 平 在 白血病 患者 尿 中 升 高, 并 认为 患者 尿 中 的 这 两 项 指标 可 以 作为 白血病 的 肿瘤 标志 物 。 此 项 研究 激发 了 将 核 苷 作为 肿瘤 标志 物 的 探索 。 随 着 HPLC 作为 一 种 分 离 定 性 核 背 的 方法 的 出 现 525 , 可 以 对 正常 人 及 癌症 患者 尿 中 核 苷 水 平 进行 更 为 精确 的 测定 。 将 不 同类 型 白血病 患者 和 正常 人 相 比 较 的 结果 表 明 D2~12] , 所 有 慢性 骨髓 白血病 患者 尿 中 的 修饰 核 背 水 平 都 升 高 。Pseu、mlI 和 m2,2G 在 缓解 期 其 水 平 是 正常 值 的 1 一 2 倍 , 而 在 加 速 期 其 水 平 可 达 正 常 值 的 12 倍 。 在 急性 淋巴 细胞 性 白血病 患者 中 也 得 到 了 相似 的 结果 。 还 有 报道 介绍 应 用 ELISA 法 测 定 ml), Ree CML BAR PRE ATE. Nielsen 等 "5 检测 了 急性 骨 散 性 白血病 (AML) 和 CML 患者 尿 中 Pseu 的 水 平 , 研 究 未 发 现 患 者 尿 中 Pseu 水 平 与 血 中 不 成 熟 细 胞 的 数量 有 关 。 PRAT EASA CHD) 与 非 霍 奇 金 淋巴 瘤 (NHL) 之 间 进 行 了 尿 中 Pseu 水 平 的 比较 。 结 果 表 明 : 在 低 度 恶性 NHL 和 HDF, BRP Pseu 水 平 与 临床 情况 不 存 在 相关 性 。 而 在 高 度 恶 性 NHL ‘+P, RRP Pseu 水 平 与 临床 情况 有 和 良好 的 相关 性 。 尿 中 Pseu 水 平 对 于 判断 患者 预后 也 有 价值 。Itoh 等 Do 史 报 道 了 在 AML. CML, ALL (att 淋巴 细胞 性 白血病 ) RARER Re BA PSHE ARP Pseu 和 mlA 的 水 平 升 高 且 化 疗 后 缓解 时 恢复 至 正常 , 其 改变 反映 了 疾病 的 状况 和 化 疗 的 效果 。 Jurgen 等 5 对 10 只 经 放射 线 照 射 后 诱发 淋巴 瘤 的 小 鼠 其 尿 中 8 种 修饰 核 苷 (mlA、mlI、mlG、m2G、m2,2G、Pseu、m5C、ac4C) 进行 了 监测 , 实 验证 实 小 鼠 在 临床 确诊 原始 淋巴 细胞 性 白血病 很 早 以 前 , 尿 中 修饰 核 苷 的 排放 量 即 出 现 病理 性 升 高 。 。 246 。 核 苷 用 于 白血病 和 淋巴 瘤 诊 断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13, 表 10-13 ” 核 苷 作为 肿瘤 标志 物 的 应 用 样品 疾病 检测 方法 检测 的 核 苷 组 分 文献 ARR 白血病 柱 色谱 Pseu,m2,2G [125] ARM ”白血病 液 相 色谱 分 析 Pseu,m11,m2,2G [127] 人 尿 液 ”成 人 急性 白血病 液 相 色 谱 分 析 Pseu,mlI,m2,2G,mlA,m1G,PCNR [128] ARM ttt AHA ML 液 相 色谱 分 析 Pseu,mlI,m2,2G,mlA,mlG,PCNR,A [129] ARM HE AEA ML BERR OT mll [130] ARR SHARE ARA MA 。 酶 联 免疫 分 析 Pseu [131] ARR 霍 奇 金 病 (HD) SABA ” 液 相 色谱 分 析 Pseu [132] ik BB (NHL) ARM AMBNA AHA MKB Pseu,mlA [134] 小 鼠 尿 液 RE 液 相 色谱 分 析 Pseu. mlA, mlI, mlG, m2G, m2, 2G [133] m5C,ac4C KR 白血病 和 淋巴 瘤 酶 联 免疫 分 析 PseumlA [109] 人 血清 急性 淋巴 细胞 白血病 液 相 色谱 分 析 Pseu [103] ARR ”白血病 液 相 色谱 分 析 Pseu,5-m-2'-dC [135] ARM 急性 白血病 液 相 色谱 分 析 Pseu [136] 人 血清 EERE 液 相 色谱 分 析 Pseu.mlA,m1G.m1I,m2G,m2,2G [137] ARM “乳腺 癌 、 液 相 色谱 分 析 Pseu,ml1,m2,2G [138] 人 尿 液 FLARE 液 相 色 谱 分 析 mlA、mli [139] ARR FLARE 液 相 色谱 分 析 Pseu,mlA,mlI,m1G,m2,2G [140] ARR PLR 液 相 色谱 分 析 Pseu,Dhu,C U,mlA,1,G,.X.m3U,mlI,mlG, [94] m2G,A,m6A,MIA 人 尿 液 FLERE 放射 性 免疫 分 析 。” t6A [141] ARR SLR 酶 联 免疫 分 析 Pseu.mlA、mlI\ac4C、.m7G、m5C [142] KR FLARE 液 相 色谱 分 析 Pseu [143] ARR 小 细胞 肺癌 液 相 色 谱 分 析 Pseu [58] ”人 屎 液 ”小 细胞 肺癌 液 相 色谱 分 析 Pseu,mlA,ml1,m2G,m2,2G [61] 人 尿 液 CAE | 液 相 色谱 分 析 Pseu [144] 人 血清 肺癌 液 相 色谱 分 析 Pseu,U.mlA,. I, X,.G.mlI,m1G, ac4C.m2, [99] 2G, t6A,m6A ARR ”小 细胞 肺癌 液 相 色 谱 分 析 Pseu,mlA,mlI,m2G,m2,2G [145] ARM 肺癌 液 相 色谱 分 析 Pseu [146] ARM 患 间 皮 瘤 的 高 危 人 群 液 相 色谱 分 析 Pseu,mlA,.ml1,m2G,ac4C [147] 人 尿 液 间 皮 瘤 液 相 色谱 分 析 Pseu,mlA,PCNR,ml1I,m2G,m2,2G [148 ] ARR lake 液 相 色谱 分 析 Pseu, mlA, PCNR, mlI, mlG, m2G, m2, [149] 2G, ac4C KRM 间 皮 瘤 液 相 色谱 分 析 mlA.mlI,m1G,m2(2)G [62] ARR 泌尿 系统 及 女性 生殖 系 RAAB [150] Pseu,mlI,mlA,m1G,PCNR, A,ac4C 统 肿瘤 ° 2A7 « BER 样品 疾病 检测 方法 检测 的 核 苷 组 分 文献 ARR FEM 毛细 管 电泳 分 析 “ PreuDhu,U.C,m5U,m3U,IactC,miG, £151] A.X,.m2G+m2,2G,.m6A ARR 5p Sie 液 相 色谱 分 析 Pseu,mlIl,mlA,m1G [152] ARR 脑 癌 液 相 色谱 分 析 Pseu [153] 黏膜 组 织 结 直肠 瘤 液 相 色谱 分 析 hypoxanthine, U,I,G [59] KRM 55 aie 酶 联 免疫 分 析 mlA [154] 人 尿 液 血 Ave 液 相 色谱 分 析 Pseu [155] 清和 组 织 人 尿 液 FF An Hee 液 相 色谱 分 析 Pseu [156] 人 尿 液 肝癌 液 相 色 谱 分 析 Pseu [157] KIRK 肝癌 - 液 相 色谱 分 析 Pseu [158] 或 血清 应 用 HPLC 方法 , 我 们 对 8 例 白 血 病 患者 “〈 临 床 背 景 资 料 见 表 10-14) 尿 中 15 种 核 苷 含量 进行 了 研究 。 白 血 病 患者 尿 中 15 种 核 背 与 正常 人 相 比 较 的 结果 见 表 10-15 和 图 10-22。 白 血 病 患者 尿 中 多 种 核 苷 的 浓度 较 正 常人 增高 , 其 中 Pseu. mlA, G, X, mlI、mlG、ac4C、m2G、m2,2G 9 种 修饰 核 苷 的 浓度 显著 增高 (P<0.001), WK 苷 浓度 大 于 正常 人 的 平均 值 加 2 倍 标准 偏差 为 上 限 标准 时 ,100%% 的 白血病 患者 m1G 和 X 增 高 ,87.5%% 的 白血病 患者 Pseu、mlI、ac4C、m2G、m2,2G 5 种 修饰 核 苷 增高 ( 表 10-16) , 为 表达 方便 , 下 面 将 其 简称 为 增高 率 达 87.5%. | 表 10-14 和 白血病 患者 的 临床 背景 资料 患者 编号 性 别 年 龄 病理 诊断 1 x 44 ”急性 粒 细胞 白血病 2 女 48 慢性 粒 细胞 性 白血病 3 女 36 急性 淋巴 细胞 性 白血病 4 x 76 急性 淋巴 细胞 性 白血病 5 x 46 慢性 粒 细胞 白血病 6 男 42 急性 非 淋 巴 细胞 性 白血病 7 x 45 急性 粒 细胞 性 白血病 8 K 55 急性 淋巴 细胞 性 白血病 TE: 表 中 患者 尿 采用 HPLC 方法 分 析 。 表 10-15 ”正常 人 和 和 白血病 患者 尿 中 核 苷 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 正常 人 均值 士 标准 偏差 白血病 患者 均值 士 标准 偏差 / (nmol/pmol JLB) 22. 445. 09 0. 190. 15 0. 320. 20 / (nmol/pmol 肌 酸 栈 ) 75. 82-29. 71 <0. 001 0. 320. 23 <0. 05 0. 44 士 0. 16 <0. 01 en 正常 人 均值 土 标 准 偏差 / (nmol/pmol 肌 酸 栈 ) mlA 2523 士 0.54 I 0. 260. 12 mU 0. 06 士 0. 05 G 0. O90. 03 Xx 1. 18-E0. 37 mlI 1. 340. 30 mlG 0. 810. 23 ac4C 0. 730. 24 m2G Q: G10, 17 A 0. 580. 18 m2,2G 1. 32+0. 29 m6A 0. 040. 04 TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 10.00 9.00 8.00 _ 7.00 E 6.00 Z 5,00 ee 4.00 & 3.00 Pseu/10 C U mlA I FL Js SS A i HE Ah 2 a / (nmol/pmol 肌 酸 酝 ) 4. 62 士 2. 10 <0. 001 Laldac07 97 <0. 05 0. 08 士 0. 06 <0. 60 0. 44-40. 38 <0. 001 8. 60-6. 50 <0. 001 7.0243. 74 <0. 001 3. 0222.09 <0. 001 2. 04 士 0. 89 <0. 001 SS2JEE3-56 <0. 001 0. 570. 38 <0. 1 4.55+2. 00 <0. 001 0. 090. 08 <0. 05 BERRA 国正 常人 +2 SD 口 白血病 m5U G X mlImlGac4Cm2G A m2,2G m6A 图 10-22 Ay La RATES A ES EEE 采用 PCA 技术 进行 分 析 时 , 其 识别 率 达 100% (A 10-23), —1.0 0.4 1.8 3.2 46 60 7.4 8.8 Wz Or WS PCI 图 10-23) 主 成 分 分 析 技 术 (PCA) FAFIEA A CX) 和 白血病 患者 〈 十 ) 的 分 类 。 249 。 表 10-16 白血病 患者 尿 中 1S 种 核 苷 排放 水 平 的 增高 率 BRERA 增高 率 /2% Pseu 7/8 (87.5%) 人 1/8 (12.5%) U 1/8 (12.5%) mlA ; 5/8 (62.5%) I 6/8 (75%) mU 1/8 (12.5%) G 7/8 (87.5%) xX 8/8 (100%) MII 7/8 (87.5%) m1G 8/8 (100%) ac4C 7/8 (87.5%) m2G 7/8 (87.5%) A 1/8 (12.5%) m2, 2G 7/8 (87.5%) m6A 1/8 (12.5%) TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 对 8 位 恶性 淋巴 瘤 患者 进行 了 尿 中 核 苷 的 分 析 , 得 到 了 与 白血病 相 类 似 的 结果 , 其 识别 率 也 达 100% 。 可 见 , 尿 核 背 含量 能 够 直接 反映 血液 系统 和 淋巴 系统 中 肿瘤 细胞 的 增殖 状态 , 它 们 可 作为 白血病 和 淋巴 瘤 的 标志 物 用 于 临床 。 同 时 , 也 为 核 苷 用 于 其 他 肿 瘤 诊 断 提 供 了 间接 依据 。 2. FARTS 乳腺 癌 是 妇女 最 常见 的 恶性 肿瘤 , 发 病 率 以 欧美 国家 为 最 高 , 在 我 国 一 些 城市 中 , 是 女性 恶性 肿瘤 的 发 病 率 的 第 2 位 , 且 仍 有 逐年 增加 的 趋势 。 基 于 手术 治疗 中 的 人 文 关 怀 , 适 应 采取 小 切口 和 保留 乳房 等 手术 要 求 , 需 要 在 早期 或 肿瘤 较 小 的 阶段 发 现 肿瘤 。 肿瘤 标志 物 的 应 用 有 助 于 早期 发 现 。 此 外 , 由 于 乳腺 位 于 体 表 , 通 过 触 诊 即 可 了 解 瘤 体 大 小 及 腋窝 淋巴 结 转移 情况 , 因 此 , 对 乳腺 瘤 的 研究 有 助 于 瘤 体 大 小 及 转移 情况 与 尿 核 苷 的 相关 性 分 析 。 Tormey!) SRA, STN FL REBAR m2, 2G 水 平 升 高 〈 高 于 平均 值 2 倍 标准 差 ),442%% 的 患者 表现 为 ml KEE, MRP Pseu 水 平 升 高 的 患者 比例 少 于 25% 。 该 研究 认为 m2,2G 是 乳腺 癌 最 佳 标志 物 。 而 Schlimme 等 "5 报道 m1A 和 mli 在 乳腺 癌 患 者 尿 中 的 排放 亦 有 升 高 , 但 m2,2G 的 升 高 并 没有 超过 均值 的 2 倍 标 准 差 。 Vreken 等 研究 表明 040 在 88%% 的 转移 性 乳腺 癌 中 m1A、mlI、mlG、m2,2G 及 Pseu 至 少 有 一 种 水 平 升 高 , 并 发 现 转移 性 乳腺 癌 mlA 升 高 的 可 能 性 最 高 。 我 们 5 史 利 用 高 效 液 相 色 谱 法 检测 了 乳腺 癌 患 者 尿 中 14 种 核 苷 的 含量 , 同 时 利用 了 和 斜 交 因子 分 析 法 对 患 者 进行 识别 , 诊 断 率 高 达 89% 。Vold040 研 究 组 建立 了 放射 性 免疫 分 析 的 方法 定量 了 和 良 性 乳腺 疾病 、 原 发 性 乳腺 癌 和 转移 性 乳腺 癌 患 者 中 尿 中 t6A 的 含量 变化 。 结 果 表 明 : 89% (16/18) 的 转移 性 乳腺 癌 患 者 发 生 t6A 排放 水 平 增 高 的 现象 , 而 良性 疾病 和 原 发 。 250 。 性 肿瘤 组 未 出 现 。 这 将 有 有 助 于 转移 性 乳腺 瘤 的 诊断 。 核 苷 用 于 乳腺 瘤 诊 断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13。 我 们 应 用 CE 方法 检测 了 26 例 乳 腺 瘤 患 者 〈 临 床 背 景 资 料 见 表 10-17) 和 54 例 正 BARBRA HOM, GRUB 10-18。 表 明 , 乳 腺 瘤 患 者 尿 中 13 种 核 苷 均 明 显 高 于 健 康 人 , 且 乳腺 癌 患 者 尿 中 核 苷 水 平 的 变异 系数 亦 明 显 高 于 正常 人 。 其 中 65. 4%% 的 乳腺 瘤 患 者 Pseu、mlG、ac4C 三 种 修饰 核 背 单个 指标 显著 增高 , 显 著 高 于 其 他 修饰 核 背 (# 10-19). 10-17 乳腺 瘤 患 者 临床 背景 资料 患者 编号 年龄 肿瘤 大 /cm 分 其 CA 153/ (kU/L) 病理 诊断 1 50 8X7 T4N1Mo = 浸润 性 导管 痛 2 53 3X2X2 T2N1Mo 10. 81 RRR 3 47 4X3X1.5 T4N1M1 = BRS ES PE 4 34 6X4.5X2.5 T4NI1M1 17.3 浸润 性 导管 瘤 5 58 3.5X2X1.5 TINOMO 7.73 RES 6 66 2.5X2.5 T2N2M0 三 Ra ES 7 46 2X2 T2NOMo = 浸润 性 导管 痛 8 42 2x2 T1NOMO 8. 67 RES 9 65 3X3 T1NOMo 7.52 黏液 腺 瘤 10 77 3X2.5 T1N1Mo = 浸润 性 导管 癌 11 53 4X3 T2NOM0 = 浸润 性 导管 冯 12 44 4X5 T4N1M1 17.3 浸润 性 导管 痛 13 37 2.5X2.5 T2N1Mo 6. 94 浸润 性 导管 痛 14 53 六 22 T2N2M0 10. 81 浸润 性 导管 冶 15 60 4X4X4 T3N1Mo 9.54 REESE 16 55 3X2 T1NOMo 三 浸润 性 导管 癌 17 43 4X3X3 T2N1Mo = RBS Fie 18 44 12X10.5X7 T4N1Mo = RBS oe q 19 58 8X4X2 T4N2Mo 8. 25 RBS Pe 上 20 42 4X3X.1.5 T1N1Mo a RBs Fe ’ 21 63 5X3.8X1.0 T2NOMo 5. 36 浸润 性 导管 冯 22 48 3X3X2 T2NOMO * 浸润 性 导管 癌 23 56 2X2: 7X2. 1 T1N1Mo 6.77 浸润 性 导管 癌 24 56 3X1 T1N1Mo 26. 54 浸润 性 导管 癌 25 64 6X4 T4NOMo 9. 94 浸润 性 导管 癌 26 46 4X5X1.2 T2NOMo = 浸润 性 导管 癌 注 : 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 ° 251 « 表 10-18 正常 人 (1)、 良 性 乳腺 肿瘤 患者 (2) MRSS (3) RRR Ak AeA aS BHAA 组 号 mean+sd/ (nmol/pmol 肌 酸 酝 ) 组 间 比 较 P Pseu 1 19. 25 士 5. 82 1 一 2 >0. 05 2 21. 62 士 9. 44 1-3 <0. 001 3 55. 1234. 63 2 二 3 < 一 0.01 U 1 0. 35 士 0. 14 1 一 2 >0. 05 2 0. 4340. 23 1-3 <0. 001 3 0. 94 士 0. 64 2 一 3 <0. 05 Cc 1 0. 330. 21 1 一 2 >0. 05 2 0. 4040. 25 1-3 <0. 001 3 0. 98-£0. 85 2—3 <0. 05 mU 1 0. 28 士 0. 17 1 一 2 >0. 05 | 2 0. 2640. 15 1-3 <0. 05 3 0.510. 53 2 一 3 <0. 05 I 1 0. 35 士 0. 19 1-2 >0. 05 2 0. 3840. 32 1-3 <0. 001 3 0. 8240. 67 2-3 <0. 05 mll 1 1.02 士 0. 32 1-2 >0. 05 2 1.190. 43 1-3 <0. 001 3 2.95+1. 79 2 一 3 一 0.01 ac4C 1 0. 53 士 0. 18 1 一 2 >0. 05 2 0. 630. 27 1-3 <0. 001 3 1.550. 89 2 一 3 <0. 01 rs 1 0.12 士 0.08 1 一 2 >0. 05 2 0.130. 12 1 一 3 <0. 001 3 0. 50 士 0. 48 2 一 3 一 0.01 mlG 1 0.86 士 0.22 \ 1-2 >0. 05 2 0. 97£0. 33 13 <0. 001 3 2.32+1.41 2 一 3 < 一 0.01 A 1 0. 44 士 0. 17 1 一 2 >0. 05 2 0.510. 23 1-3 <0. 001 3 1. 190. 83 2 一 3 <0. 01 X 1 0. 86 士 0. 38 1-2 >0. 05 2 0. 890. 39 1-3 <0. 001 3 1. 6841.13 2 一 3 一 0.05 m2G 1 0. 49 士 0. 19 i—2 <0. 05 2 0.710. 29 1-3 <0. 001 3 1.4740. 83 2 一 3 <0. 01 m6A 1 0.09 士 0. 11 1-2 >0. 05 2 0.0740. 13 1 一 3 <0. 05 3 0. 22+0. 43 2 一 3 <0. 05 TE: 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 。1252 。 表 10-19 ARBSAR A 13 种 核 苷 排放 水 平 的 增高 率 BHAA i K/% Pseu 17/26 (65.4%) mlG 17/26 (65.4%) ac4C 17/26 (65.4%) mlI 16/26 (61.5%) m2G 15/26 (57.7%) A 15/26 (57.7%) U 14/26 (53. 8%) G 14/26 (53. 8%) I 12/26 (46. 2%) C 12/26 (46.2%) x 11/26 (42.3%) mU 7/26 (26.9%) m6A 6/26 (23.1%) TE: 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 采用 PCA 技术 分 析 , 其 识别 率 达 到 72% (图 10-24) 。 同 一 批 患者 , 用 通常 的 肿瘤 标志 物 CA153 检验 , 识 别 率 为 7% (1/14) ( 表 10-17) 。 10 =0.3 0.4 1.1 1.8 2.5 sy) 3.9 4.6 5.3 6.0 EC 图 10-24 主 成 分 分 析 技 术 (PCA) AF IEMA (+) MPL BA (©) 的 分 类 乳腺 瘤 患 者 肿瘤 大 小 与 尿 中 13 种 核 苷 浓度 关系 〈 表 10-20) 的 研究 表明 , 肿 瘤 大 小 与 核 背 含量 之 间 不 存在 正 相 关 。 可 能 的 原因 为 早期 恶性 肿瘤 虽然 很 小 , 但 是 细胞 增殖 旺 盛 , 修 饰 核 苷 产生 较 多 , 当 体积 增 大 时 细胞 增殖 速度 减 慢 , 进 入 生长 周期 的 瘤 细 胞 比例 减少 ,RNA 代谢 速度 减 慢 , 修 饰 核 苷 产生 相对 减少 。 可 见 乳腺 瘤 肿 瘤 体积 并 不 能 反映 肿瘤 细胞 的 增殖 和 核 苷 代谢 状态 。 因 此 , 尿 中 修饰 核 苷 含量 并 不 随 肿 瘤 体积 增 大 而 增高 。 rm mc RS ¢ 253 ° 10-20 核 背 的 浓度 与 乳腺 肿瘤 大 小 的 关系 图 ” 最 大 的 肿瘤 直径 <30mm 30~50mm >50mm 核 苷 水 平 / (nmol/pmol 肌 酸 酝 ) Pseu 2 20.77 15.45 28. 62 3 70. 52 52. 41 44.76 U 2 0. 34 0. 64 0.52 3 1.27 0.94 0.53 C 2 0. 33 0.51 0. 48 | 3 1.53 0.97 0. 36 mU 2 0. 25 0. 39 0. 20 3 0. 40 0.57 0. 44 I 2 0. 30 0.73 0. 33 3 1.18 0.71 0. 70 mil 2 ead 0. 98 1.59 3 3. 60 2. 83 2. 50 actC 2 0. 55 0. 61 0. 86 3 1. 80 1.51 1. 33 G 2 0.12 0.15 0.16 3 0. 64 0. 47 0. 40 mG 2 0.94 0. 80 1. 16 3 2.84 2. 23 1.96 A 2 0. 48 0.41 0.65 3 1.01 1. 28 1.16 X 2 0.97 0.77 0. 78 3 1. 84 in85 1. 86 m2G 2 0. 68 0. 66 0.81 3 1.67 1. 49 1.16 m6A 2 0. 06 0.12 0. 05 3 0.51 0.14 0.12 a. 2 表示 乳腺 良性 肿瘤 患者 ;3 表示 乳腺 瘤 患 者 。 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 比较 淋巴 结 转移 组 和 非 淋巴 结 转移 组 肿瘤 患者 尿 中 核 苷 含量 , 发 现 前 者 明显 高 于 后 者 〈 表 10-21), 该 结果 表明 检测 尿 中 核 苷 含量 有 助 于 判断 淋巴 结 转移 是 否 存在 及 为 外 科 选 择 手术 方案 提供 参考 。 尽管 淋巴 结 转移 致 尿 中 修饰 核 彰 合 量 增高 的 原因 尚 不 明确 , 但 该 结果 提示 了 修饰 核 苷 作为 肿瘤 标志 物 用 于 随访 治疗 后 患者 的 可 行 性 。 表 10-21 修饰 核 痛 的 浓度 在 乳腺 瘤 患 者 中 有 无 淋巴 结 转移 的 比较 BRERA 非 淋 巴结 转移 (10) 淋巴 结 转移 (16) Pseu 平均 45. 66 61. 03 范围 20. 96~102. 12 20. 04~133. 15 mlI 平均 2. 43 aoa 范围 1. 04 一 5. 57 1. 14 一 6. 57 ac4C 平均 1. 29 1. 70 范围 0. 63~2. 75 0. 58~3. 34 mlG 平均 1. 96 2. 54 范围 0. 80~4. 65 0. 76~5. 31 m2G 平均 yes: 1. 56 : 范围 0. 54 一 3. 13 0. 58~2. 85 : TE: 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 。254 。 3. 肺癌 肺癌 是 最 常见 的 恶性 肿瘤 之 一 。 近 十 几 年 来 , 世 界 许多 国家 和 地 区 肺癌 的 发 病 率 和 死亡 率 呈 上 升 趋势 , 尤 以 人 口 密度 较 高 的 工业 发 达 国 家 更 为 突出 。 据 WHO 统计 , 在 发 达 国 家 16 种 常见 肿瘤 中 肺癌 居 首 位 。 在 我 国 , 肺 癌 发 病 率 和 死亡 率 近 年 也 有 明显 上 升 趋势 。 以 往 报道 男女 发 病 之 比 为 4 : 1, 但 近年 来 女性 肺癌 患者 增多 , 男 女 发 病 之 比 为 2 : 1, 可 能 与 女性 吸烟 者 增多 和 环境 污染 有 关 。 据 国内 外 专家 预测 , 在 未 来 的 10 年 中 , 我 国 肺癌 发 病 率 将 会 有 明显 的 增加 。 小 细胞 肺癌 的 一 个 特征 为 70%% 的 患者 发 生 早期 远 处 转移 。 由 于 这 种 典型 的 生物 学 行为 , 即 使 应 用 了 现代 的 放射 学 手段 , 在 确定 肿瘤 负荷 、 分 级 和 治疗 监测 上 还 是 存在 问 题 。Tamnura 等 5 报道 了 Pseu 的 水 平 与 瘤 负荷 及 患者 病情 存在 相关 性 。Waalkes 等 [5 认为 Pseu、mlA、mlI、m2G 和 m2, 2G 的 排放 水 平 可 作为 预测 患者 生存 期 的 指标 。 核 苷 用 于 肺癌 诊断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13。 我 们 应 用 HPLC 法 比较 检测 了 42 位 肺癌 患者 〈 临 床 背 景 资 料 见 表 10-22) 和 206 位 正常 人 尿 中 核 苷 含量 , 结 果 见 表 10-23、 图 10-25。 被 检 肺 癌 患 者 除 C、mU 外 , 其 他 13 种 核 苷 含量 均 显 著 高 于 正常 人 〈z<0. 001)。 表 10-22 ”肺癌 患者 的 临床 背景 资料 患者 编号 ”性别 年 龄 ”肿瘤 大 小 临床 分 期 ”AFP CEA CAI19-9 CA125 病理 诊断 1 See AB AXA T2N2Mo 周围 型 肺癌 2 B 63 4X3 T3N2M1 周围 型 肺 瘤 3 二 T2NOM1 肺泡 细胞 瘤 4 男 4 5X5 T2N1Mo 小 细胞 肺癌 5 B 49 3.11 1.89 小 细胞 肺癌 6 EX T3N2M1 周围 型 肺癌 7 & 55 5X6 aE RR 8 男 53 CT4N3M0 0. 97 中 央 型 肺癌 9 B 56 10X9 肺 内 转移 CT3N1MO 2.35 1.27 3.86 44.01 SLR A A IRE 10 mo 49 «(4X4 T2N1Mo 周围 型 肺癌 11 3 39 «5x6 T2N3M1 中 央 型 腺 瘤 12 AB 60 3X4 T2NOM0 小 细胞 肺癌 13 A 478) b 5X5 3. 84 0. 18 14 moe 162.5 23X3 T3N2M1 周围 型 肺癌 15 mB 357 5X4 TIN3M0 中 央 型 肺癌 16 HB 58 5X5 TIN3M0 中 央 型 肺癌 17 EX5 CTI3N3M3 2.5 4.675 2.08% $121.12 OE IE 18 x 49 > 3x2 T2N2M1 Jal El RY Aa 19 B 54 CT3NOM0 3.6 肺癌 20 me ae Bk 21 B72 5X4.5 化 疗 CT3N2M0 1.65 4.61 5.28 6. 49 1K 8 HL FR 22 xk 46 5X4 T2N1Mo 周围 型 肺癌 23 x 68 T2NOM1 周围 型 腺 瘤 。 255 。 续 表 患者 编号 ”性别 AER 肿瘤 大 小 临床 分 期 ”AFP CEA CAl19-9 CA125 病理 诊断 24 明确 58 «6X4 4. 92 25 BiW 6h, 5x5 中 央 型 肺癌 26 ter) 42 . 27 drs; 43 ubx400 275.36 35 Ba 3x3 T2N1Mo 小 细胞 肺癌 36 Be. bho e252 T2N2M1 37 ae 70% 26x 7 T2N3M1 92.7 ARI 38 B 49 «2.5K3.5 CTNOM1 39 B 52 边界 不 清 T4N2M0 1.74 «2.35 3.27 ~=-24. 21 40 B 66 8X12 Ras (1,459.29. 1% 41 B 49 T3N2Mo Ad HC EAR An LIES 42 HB 54 5X4 T2N2Mo 中 央 型 肺癌 表 10-23 ”正常 人 和 肺癌 患者 尿 中 核 苷 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 eee RHR ERAS rte 肺癌 患者 均值 土 标 准 偏差 /_(nmol/pmol LRAT) / (nmol/pymol ALBEF) Pseu 22. 445. 09 34. 9820. 18 <0. 001 Cc 0. 190. 15 0. 230. 14 <0. 05 U 0. 320. 20 0. 440. 28 <0. 001 mlA 2. 230. 54 3. 58+2. 01 <0. 001 I 0. 260. 12 0. 520. 56 <0. 001 m5U 0. 060. 05 0. 06+0. 11 <0. 05 G 0. 090. 03 0. 150. 14 <0. 001 x 1. 183-0. 37 1. 99+1. 23 <0. 001 mll 1. 340. 30 2.48+1. 44 <0. 001 mlG 0. 810. 23 1. 2140. 76 <0. 001 , ac4C 0. 730. 24 1. 160. 67 <0. 001 m2G 0. 610. 17 1. 000. 61 <0. 001 A 0. 580. 18 0. 940. 68 <0. 001 m2,2G 1. 3240. 29 2.1741. 14 <0. 001 m6A 0. 040. 04 0. 0640. 05 <0. 001 TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 ° 256 * 回 正常 人 国正 常人 +2SD 肌 酸 本 人 nmolhumol) = = vo 7) 一 图 10-25 ”肺癌 患者 和 正常 人 尿 中 核 苷 浓度 比较 应 用 PCA 分 析 , 结 果 显 示 其 识别 率 达 70% (图 10-26) , 采 用 ANN 对 数据 进行 分 析 时 , 该 识别 率 达 81%. =20 -0.9 0.2 13 2.4 3.5 46 5.7 6.8 ES ESN) PC1 图 10-26 EASTER (PCA) RIERA OO 和 肺癌 患者 〈 十 ) 的 分 类 肺癌 的 组 织 学 分 类 对 治疗 及 预后 非常 重要 , 不 同 组 织 类 型 的 肺癌 的 治疗 方案 有 所 不 同 。 临 床上 通常 简单 分 为 非 小 细胞 肺癌 “〈 鳞 癌 、 腺 瘤 及 大 细胞 肺癌 ) 和 小 细胞 肺癌 。 本 研究 中 4 例 小 细胞 肺癌 患者 ml1I、mlG、m2G 三 种 尿 修 饰 核 苷 含量 明显 高 于 非 小 细胞 肺癌 患者 〈 表 10-24) 。 小 细胞 肺癌 核 苷 含量 及 增高 种 类 与 其 他 类 型 肿瘤 患者 不 同 , 可 能 源 于 其 发 生 于 APUD 细胞 , 且 生长 迅速 。 这 表明 mlI、mlG、m2G 对 肺癌 的 病理 分 类 有 一 定 的 参考 价值 , 同 时 有 助 于 治疗 方案 的 选择 。 表 10-24 小 细胞 肺癌 和 非 小 细胞 肺癌 7 种 修饰 核 苷 排放 水 平 的 比较 核 苷 种 类 非 小 细胞 肺癌 〈28 个 ) 小 细胞 肺癌 (4 个 ) Pseu 38. 26 35. 59 mlA 3. 78 ey mlI 2. 63 2. 82 ° 257 « BER BEAK 非 小 细胞 肺癌 〈28 个 ) 小 细胞 肺癌 〈4 个 ) mlG 1. 25 1. 37 ac4C 1, 24 Lae m2G 1.01 L At m2,2G 2. 24 2. 24 R PRBS BS ii ANA BRE 〈 表 10-25), CRT AE a a 临床 分 期 主要 根据 肿瘤 体积 来 确定 。 比 较 尿 核 苷 与 肺癌 患者 TNM 分 期 的 关系 发 现 , 尿 中 mlA 量 随 分 期 的 增高 呈 逐 步 升 高 的 趋势 ( 表 10-26), 这 说 明 mlA 在 判断 肺癌 患者 肿瘤 发 展 状 态 方面 有 较 好 的 应 用 价值 , 同 时 也 提示 了 尿 核 苷 作为 肿瘤 标志 物 用 于 随访 肿 瘤 患者 复发 转移 的 可 能 性 。 肺 癌 患 者 尿 中 核 背 与 其 他 肿瘤 标志 物 同 时 测定 的 结果 显示 , 核 苷 的 敏感 性 明显 高 于 传统 肿瘤 标志 物 CEA。 表 10-25 ”肺癌 患者 尿 中 核 彰 浓度 和 分 期 的 关系 图 ” 核 苷 种 类 EP) 1.6) —M 〈13 个 ) WV (14 个 ) Pseu 28. 86 46. 41 35. 09 34. 37 区 0.21 0.34 0. 23 0.21 U 0.54 0. 39 0. 49 0. 42 mlA 2. 85 4. 47 3.15 3. 85 I 2. 02 0.35 0. 45 0. 42 m5U 0. 02 0.04 0.06 0.07 G 0. 02 0.19 0.17 0.13 x 2.74 2. 16 2.18 1.74 mll 3.14 2.93 ; 2. 36 2. 45 mlG 1. 06 1. 66 1.15 1. 10 ac4C 0. 97 1. 55 L.17 1.14 m2G 1. 02 1.27 0.99 0. 89 A 0.92 1.53 0. 85 0. 87 m2,2G 1.73 2.77 1. 99 2. 21 m6A 0.05 0. 08 0.05 0. 06- . 单位 : nmol/pmol 肌 酸 本 。 & 10-26 修饰 核 苷 在 肺癌 患者 中 有 无 淋巴 结 转移 时 排放 水 平 的 比较 BRA 非 淋 巴结 转移 淋巴 结 转移 远 处 转移 Pseu 28. 86 38. 24 34. 37 mlA 2. 85 3 3. 85 mlI 3. 14 2 2. 45 mlG 1. 06 1. 29 1.10 ac4C 0. 97 1.27 1. 14 m2G 1. 02 1.07 0. 89 m2,2G 1. 73 PAA 2. 2 ; ( ' & 4. Kini 大 肠 癌 是 发 病 率 较 高 的 恶性 肿瘤 , 在 世界 范围 内 以 经 济 发 达 的 国家 为 高 , 可 达 每 10 万 人 中 30 一 50 人 。 但 近年 来 由 于 饮食 结构 变化 , 大 肠 癌 在 我 国 的 发 病 率 有 增加 的 趋 势 , 在 消化 道 癌 中 仅 次 于 胃癌 。 此 癌 如 能 早期 发 现 并 及 时 治疗 , 其 术 后 5 年 生存 率 可 达 90% 。 肿 瘤 标志 物 的 应 用 在 大 肠 癌 的 早期 诊断 中 起 着 重要 作用 。 应 用 HPLC 法 比较 检测 了 41 例 大 肠 瘤 患者 〈 临 床 背景 资 料 见 表 10-27) 和 206 位 正常 人 尿 中 核 苷 含量 08s"~10 , 检 测 结果 见 表 10-28、 图 10-27。 被 检 大 肠 癌 患 者 尿 中 核 苷 含量 除 C、U、mU 以 外 , 其 他 12 种 尿 中 核 苷 含量 均 显 著 高 于 正常 人 (p<0.001). 10-27 肠 瘤 患者 的 临床 背景 资料 患者 编号 ”性别 年 龄 ”肿瘤 大 小 临床 分 期 AFP CEA CAI19-9_—- CA125 病理 诊断 1 t 38 3X4xX5 T3N2M2 低 分 化 腺 瘤 2 t 59 T2N1Mo fe me 11. 03 17. 12 中 分 化 腺 瘤 3 男 48 8X8 T2NOMo 1.94 40.89 1. 02 8. 04 AE ADAG ARE 4 Ges Mae ee T3N2M1 低 分 化 腺 瘤 5 te «5D 55 RI 6 %& 68 5X5X6 T3N2Mo 3.14 0.52 1.57 8. 49 低 分 化 腺 瘤 7 8 799 KER T2NOMo 1.56 1.64 1. 23 0. 54 PAG ARE 8 男 73 4X5 T2N1Mo on Pe 6. 16 11. 29 结肠 腺 癌 “9 站 62 4X4 T2NOMO PSP AR 10 t 39 4X53) T2NOMO 1. 69 ARIE ll me) 647) 133 T2N2M1 ae RE 12 ga en65 6X6 T4N1Mo 9.12 2.45 22. 03 4. 92 ARIE 13 me 987i 3x2 T2N1Mo 2.84 2.52 9. 13 9. 86 BPE PAM 14 we 42°" 2X3 TINOMo 中 分 化 腺 瘤 15 m 41 »3X4 T2NOM1 Fie A HEL eB 16 a. 7° 3X3 T2N1Mo 中 分 化 腺 瘤 17 mots. SKS 1.04, 227 5. 82 6. 44 黏液 腺 癌 18 ma) 12> 4X3 ART A BRE 19 B 69 3X4 T2N1Mo Ak 20 t& 54 4X4 T2N2M1 1b RE 21 B 50 5X6 T3N2M1 印 戒 细胞 癌 低 分 化 22 B 66 4X3 T2NOMO PA ARE 23 mm. 546 8X4 T2N1Mo 1. 64 AR 24 eect 3X4 T2N1Mo 低 分 化 腺 癌 25 女 44 6.51 之 1054 58.2 13. 28 26 % 63 335xX4 T2NOMO 2.32 6.03 5. 02 0. 25 RA RUESM LAE 27 % 51 5X4X3 PT4N3M0O 3.31 5.56 17 6. 98 ARIE 28 + 75 35 T2NOMo AG ARR 29 B 70 {APC RE 30 mG. ane T2NOMO 1.88 0.53 0. 53 0. 35 中 分 化 腺 瘤 31 . 665 3XK2 T2NOMO 2.58 1.11 10.38 29.97 ARIE 32 Bo 71 EMS T2N1M1 SY AG RE 33 B 56 3. 23 2. 99 3. 23 {AME ARE e 259 。 续 表 患者 编号 ”性别 年 龄 ”肿瘤 大 小 临床 分 期 AFP CEA CAl19-9 “CA125 病理 诊断 Pa BH 45 4X4 T2NoMom 1.5 (3.81 6.03 «| 817.8 rh ADL AR aE 35 B 62 4X5 T2N1MOo 低 分 化 腺 瘤 36 %& 69 4X5 T2N1Mo 低 分 化 腺 瘤 37 & 4 3x3 T2NOMO 2.11 1.24 4. 67 4. 93 中 分 化 腺 瘤 38 1 T2NOMO ”3.45 1.28 0. 96 1.4 HA} 4b ARE 39 B 42 6X5 ST4N2M0 20. 84 POPC RE | 40 ge oi’ BKaS T2NOMO 1.41 0.99 0. 82 5. 52 中 分 化 腺 瘤 41 Fay Tomes 1.03 425.19 腺 癌 表 10-28 正常 人 和 肠 癌 患 者 尿 中 核 苷 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 正常 人 均值 土 标 准 偏 差 肺癌 患者 均值 土 标准 偏 差 核 苷 种 类 P /(nmol/pmol 肌 酸 栈 ) /(nmol/pmol 肌 酸 栈 ) Pseu 22. 44 士 5. 09 35. 25 士 16. 62 <0. 001 从 0. 19 士 0. 15 0. 22 士 0. 16 >0. 05 U 0. 3240. 20 0. 340. 15 >0. 05 mlA 2. 23 士 0. 54 3. 57 士 1. 42 <0. 001 I 0. 260. 12 0. 3940. 23 <0. 01 m5U 0. 06-£0. 05 0. 0940. 13 >0. 05 | G 0. 090. 03 0. 120. 05 <0. 001 x 1. 180. 37 2.02+1. 05 <0. 001 mll 1. 34£0. 30 2. 29+1. 10 <0. 001 mlG 0. 81 士 0. 23 1.11 士 0. 37 <0. 001 ac4C 0. 7340. 24 1. 220. 88 <0. 001 m2G 0. 61£0. 17 0. 850. 25 <0. 001 A 0. 5840. 18 0. 7940. 36 <0. 001 m2,2G 1. 32+0. 29 2. 15+0. 90 <0. 001 m6A 0. 040. 04 0. 0740. 06 <0. 001 TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 圆 正常 人 国正 常人 +2SD = 口 肠 癌 号 250 = E 2.00 三 = 1.50 & = 1.00 0.50 0.00 aes Oe Sey oe 2 E 8 Eueve & a 6 10-27 aT RBA ALI Fs ADR PEFR IE AY BE ¢ 260 « PCA 分 析 识 别 率 达 76% (Al 10-28), ANN 对 数据 进行 分 析 识 别 率 达 83% 。 图 10-28 主 成 分 分 析 技术 〈PCA) 用 于 正常 人 《〈《X) ABBA C+) 的 分 类 大 肠 癌 多 为 腺 癌 , 根 据 分 化 程度 可 分 为 低 、 中 、 高 三 类 , 在 病历 中 可 查 到 29 个 有 明确 病理 诊断 , 其 中 , 低 分 化 腺 癌 13 例 , 中 分 化 腺 癌 15 例 , 高 分 化 腺 癌 1 例 。 比 较 三 组 中 各 种 尿 核 苷 含量 均值 发 现 〈 表 10-29) , 低 分 化 腺 瘤 组 患者 Pseu, mlA, I, m5U, X、mlI、mlG、ac4C、m2,2G 不 同 程度 地 高 于 中 、 高 分 化 腺 癌 组 患者 。 比 较 尿 中 核 FHS Kis TNM 分 期 发 现 , 随 分 期 增高 ,Pseu、mlA、mlI、mlG、ac4C、 m2G、m2,2G 这 7 种 修饰 核 苷 含量 也 随 之 增高 〈 表 10-30) , 特 别 是 Pseu、mlI、m2, 2G 三 种 修饰 核 苷 增高 明显 。 可 见 , 尿 核 背 含量 可 用 于 判断 肿瘤 的 演进 状况 , 为 选择 治 疗 方案 提供 帮助 。 表 10-29 核 音 在 高 、 中 、 低 分 化 腺 癌 中 排放 水 平 的 比较 CED BRK 低 分 化 腺 癌 (13 个 ) 中 分 化 腺 瘤 〈15 +) 高 分 化 腺 癌 〈1 个 ) Pseu 43: 75 34. 15 30. 72 Cc 0. 27 0. 19 0. 33 U 0. 35 0. 30 0.51 mlA 4. 12 af 4. 02 ° I 0. 45 0. 39 0. 22 } m5u 0.13 0. 05 0. 05 G 0. 12 0.13 0, 12 xX 2.51 1. 83 2.03 mll 2.76 2.14 2. 26 mlG 1. 23 1.04 1.17 ac4C 1. 59 1. 10 1. 35 m2G 0. 88 0. 84 1.03 A 0. 88 0.77 0. 82 m2,2G 2.54 2.00 2.17 m6A 0.07 0.07 0.13 TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 ° 261 。 表 10-30 BRA 非 淋 巴结 转移 《14 个) Pseu 30. 10 mlA 2. 98 mlI 1. 82 mlG 0. 97 ac4C 1.07 m2G 0. 79 m2,2G 1.79 5S. 肝癌 淋巴 结 转移 (12) 37. 81 3. 85 2. 31 115, 1. 20 0. 86 2. 30 MAE EDRBA PAM ESRB A HEMIK-E AYR 远 处 转移 (5 个 ) 53. 77 4. 56 3. 92 1.50 2. 05 | 0. 98 3. 10 肝癌 是 由 肝 细 胞 或 肝 内 胆管 上 皮 细 胞 发 生 的 恶性 肿瘤 , 简 称 肝 癌 。 其 发 病 率 地 区 差 异 较 大 , 在 亚 非 国家 较 常 见 , 我 国 发 病 率 较 高 , 尤 以 东南 沿海 多 见 。 每 年 约 有 11 万 人 死 于 肝癌 , 约 占 全 世界 肝癌 死亡 人 数 的 45%% 。 Tamura Xf 23 位 原 发 性 肝癌 和 13 位 肝 硬 化 患者 尿 中 Pseu 的 含量 进行 测定 。 发 现 肝癌 患者 尿 中 Pseu 平均 浓度 明显 高 于 肝 硬 化 患者 和 健康 对 照 。70%% 的 肝癌 患者 尿 中 Pseu 浓度 增高 。 此 项 研究 还 发 现 尿 中 Pseu 浓度 与 血清 甲 胎 蛋 白水 平 之 间 的 相关 性 并 无 统计 学 意义 〈r 一 一 0. 35) 。 联 合 应 用 这 两 种 肿瘤 标志 物 ,19 名 原 发 性 肝癌 患者 可 以 得 到 诊断 。 核 苷 用 于 肝癌 诊断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13。 应 用 HPLC 法 比较 检测 了 42 例 肝 瘤 患 者 〈 临 床 背 景 资 料 见 表 10-31) 和 206 例 正 常人 尿 核 苷 含量 , 见 表 10-32、 图 10-29。 结 果 显 示 肝 癌 患 者 除了 mU 外 , 其 他 14 种 核 苷 含量 均 显 著 高 于 正常 人 (p<0.001). 患者 编号 性 别 年 龄 i) 5 43 2 B 45 3 男 40 4 男 51 5 B 46 6 男 51 7 男 80 8 B 73 9 男 81 10 B 52 11 男 68 12 男 56 13 男 81 14 男 73 15 5. -57 16 RB AT 17 B 667 表 10-31 肿瘤 大 小 12.5 X10 3X2.5 12X11 3X2 3.7X2.9 3.9X3.2 5X6 8X9 5X6 2X2 9X10 TXbe0 10X8 8X3 5. 3X3. IDSA 肝癌 患者 的 临床 背景 资料 分 期 AFP CEA 2620.12 1.46 7.13 3.29 >3000 187.4 w 4.x6 18. 95 T3NOMo 942.39 1.46 >3000 0.96 2111.96 1.75 T2NOM1 22. 35 a072, | 93 >3000 2.57 2539.19 4.66 5.61 3.66 3.58 2.0% 9.59 5.64 CAI9-9 18. 57 109. 4 31.12 10. 84 129. 4 5. 89 63. 7 } CA125 病理 诊断 100. 61 136.1 RE en 续 表 患者 编号 性 别 年 龄 肿瘤 大 小 分 期 AFP CEA ”CA19-9 “CA125 病理 诊断 18 B 62 6X6 T3NOMO 。” 1026. 17 a8 iF An AE 19 B 66 IMB 357. 68 4. 26 FFF A Ae 20 3 70 104. 56 21 BR 55 5X6 AF nS 22 男 62 2X3 T2NOMo AF Sn 23 5B 48 6. 2X6 445. 49 3. 4 13. 28 21. 49 24 B 62 6X7 T3NOMO 425. 13 4. 82 AF 4 Re 25 B 66 >3000 3.97 16.62 4.56 26 男 70 >3000 27 5 70 4X5 AFF 28 男 64 29 B 47 12X13X14 1409.42 0.98 47.8 26 30 5B 70 10X7 1908. 17 7 ae 16. 2 31 xk 69 4X5 T2NOMo 32 男 60 0.5X3 1583. 46 2. 66 0. 85 42.03 ” 肝 细 胞 肝癌 33 男 66 7X6 FF A Be 34 B 72 5X6 T2NOMo FF A Ae 35 & 51 5X3X3 >3000 Le 50.57 469.9 36 t& Al 7X7X9 159. 67 1. 85 3. 46 6. 78 37 x 50 7.0X6.3 >3000 2.11 7. 76 11. 44 38 & 41 644. 58 1.35 30.75 11. 75 39 x 63 14X8X12 40 x 69 4X5 T2NOMo 234. 86 3. 11.4 "56. 32 23.44 “ 肝 细 胞 瘤 41 x 46 7X7.5 10.09 45.35 301 78. 56 42 t& 43 10.5X9 >3000 表 10-32 ”正常 人 和 肝癌 患者 尿 中 核 苷 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 核 音 种 类 正常 人 均值 土 标准 偏差 肝癌 患者 均值 土 标准 偏差 . / (nmol/pmol LREFT) / (nmol/pmol 肌 酸 栈 ) Pseu 22. 44+5. 09 49, 23+37. 10 <0. 001 Cc 0. 190. 15 0. 440. 68 <0. 001 U 0. 320. 20 0.5740. 64 <0. 001 mlA 2. 230. 54 4.5243. 34 <0. 001 I 0. 26+0. 12 0. 820. 73 <0. 001 m5U 0. 06 士 0. 05 0. 110. 12 >0. 05 G 0. 090. 03 0. 2340. 18 <0. 001 x 1. 180. 37 3. 16+2. 43 <0. 001 mll 1. 340. 30 3. 7943. 22 <0. 001 mlG 0. 81 士 0. 23 2. 05+1. 37 <0. 001 ac4C 0. 73£0. 24 1. 48+1. 33 <0. 001 m2G 0. 6140. 17 1. 45+1. 02 <0. 001 A 0. 580. 18 1. 15+1. 16 <0. 001 m2,2G 1. 3240. 29 3. 04+2. 22 <0. 001 m6A 0. 04-0. 04 0.130. 14 <0. 001 TE: 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 图 正常 人 图 正常 人 + 2SD DAS 2 4.00 = r E 3.00 ie . : 2.00} i 1.0077 | | wees <- > Oo’ £0 0 fon 3 三 ‘2 ee = 3 4 a & = i= = —E 8 a = a E 图 10-29 肝癌 患者 和 正常 人 尿 中 核 苷 浓度 比较 PCA 分 析 识别 率 达 80% 〈 图 10-30), 采 用 ANN 对 数据 进行 分 析 时 , 其 识别 率 达 86%, mit 59 办 的 AFP 的 识别 率 。 =1.0 .. -0.1 0.8 1.7 2.6 3.5 4.4 5.3 6.2 7.1 8.0 Pei 图 10-30 ” 主 成 分 分 析 技 术 (PCA) 用 于 正常 人 〈X) 和 肝癌 患者 C+) 的 分 类 肝 瘤 患者 中 尿 核 苷 含量 与 肿瘤 大 小 和 分 期 都 不 存在 显著 的 正 相关 关系 。 : AFP 是 临床 上 诊断 肝癌 的 重要 肿瘤 标志 物 , 其 特异 性 较 高 , 肝 癌 患 者 的 阳性 表达 率 达 59%. (AVA 4 办 的 患者 肿瘤 细胞 无 AFP 表达 。 利 用 核 背 作为 标志 物 进 行 检测 , 将 有 可 能 填补 AFP 检测 所 遗留 的 空白 。 6. Bis 胃癌 是 消化 道 最 常见 的 恶性 肿瘤 之 一 。 在 我 国 不 少 地 区 的 恶性 肿瘤 死亡 统计 中 , 胃 癌 居 第 一 或 第 二 位 。 目 前 临床 应 用 的 胃癌 诊断 技术 主要 包括 影像 学 、 内 镜 检查 、 病 理学 检查 、 肿 瘤 标志 物 检 查 等 。 在 这 些 方法 中 , 内 镜 检查 是 发 现 早 期 胃癌 的 主要 手段 , 但 由 于 此 种 方法 给 受 检 者 带 来 的 痛苦 较 大 , 且 费用 较 高 , 难 以 作为 普查 形式 在 无 症状 时 让 人 接受 。 Nakano 等 59 发 现 结 直肠 癌 患 者 的 黏膜 中 hypoxanthine 和 U 相 比 正常 人 存在 显著 。 264 « 增高 的 现象 , 而 胃癌 患者 黏膜 中 I 与 正常 人 相 比 有 明显 差别 。Itoh 等 25 报道 了 mlA 在 结肠 癌 患 者 尿 中 有 增高 排放 。 核 苷 用 于 胃 肠 道 肿 瘤 诊 断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13。 我 们 应 用 HPLC 法 比较 检测 了 62 HR BA OR Ae Le 10-33) 屎 中 核 苷 的 量 9s5 , 结 果 详 见 表 10-34、 图 10-31. ARAN BARKS BRC. m6A 外 , 其 他 13 种 核 苷 显著 高 于 正常 人 (zp<0. 001) 。 以 大 于 正常 人 的 平均 值 加 2 倍 标准 偏差 为 上 限 值 , 胃 癌 患 者 不 同 种 核 苷 增高 的 阳性 率 为 8% 一 63% ( 表 10-35) 。 屎 中 各 种 核 苷 在 同 类 肿瘤 的 表达 阳性 率 差异 性 很 大 。 表 10-33 ”胃癌 患者 的 临床 背景 资料 性 别 “年龄 ”肿瘤 大 小 ”临床 分 期 AFP CEA “CA19;9jT CA125 病理 诊断 ee 19 eX 3. 43 1.06 4.51 1. 85 a) oe Axa T3N2Mo 3. 49 12). 64 9.56 ”中 分 化 腺 瘤 3 SC4 T4N2M1 2. 14 1. 24 6. 59 2.32 低 分 化 腺 瘤 印 戒 细 胞 癌 AS: 3X8 ST3N3M0 _3.. 06 2 2. 23 23 {ER AY ERE SO weet 22d X3 T3N1MOo 2.75 0.54 elapse 10.2 粘液 细胞 癌 6 男 56 2x1 TAY ORE i & Bees) 5x2 T2N1MOo 1.21. 2 3.8 EAM EAR ® HH 57 Maks ST4N1MO 1. 43 2.23 8.54 4.14 AR oe eget 3xK3 T2NOMo 1. 68 2. 38 1. 42 0.25 ARI I ge OBR EKA Bie AN HT IT 7. x2 T2NOMo 277 Le 0.00 5.89 {RAE ARR 2 ke 6 3X3 T2N1Mo 中 分 化 腺 瘤 13 B50. 3,5X2 Sid CO Ee pe iBBn 3X3 T2N1Mo 低 分 化 腺 瘤 15 B08 X2..5 4.12 296.82 Be 16 & 52 1.5X1.5 ST2MOMo HA} Ab ARE 17 . BH ma6) 7X5 T3NOM0 低 分 化 腺 瘤 1 3 由 后 WAS 六 3 T2NOM0 2. 03 4.51 2. 04 5.38 (RAMEARIE 19 ke GB axa T2N1Mo 2. 55 6.83 S415 5.96 {KAMER a em 867 CUAXS T3N2M1 a | 0.86 3.52 135.33 {R44 ARI a S67 10X10 T3NOMO 2. 97 Loe Bees 6.22 低 分 化 腺 总 a 男 一 :9 BIV 407. 4 44.22 3.41 0. 54 Se i a Be T2N1M1 2. 06 7.01 9.42 14.3 低 分 化 腺 瘤 24- B 56 4X45 T3NOMO 3.12 8.75 W3i 0.95 {KAMER 2 8 60 5X4 26 Bm 48663. 4x4 T2N1Mo 低 分 化 腺 癌 a7 56 3X3 全 62 8X5xX5 ST4N2M0 3.63 3.45 156.55 22.32 , 低 分 化 腺 瘤 ae 61 5X4 T4N1Mo 6. 12 2. 94 2 65.3 ARE sg 44 2X1 2.3 1. 39 aa 70 3X8 4. 87 2.65 4.63 8.52 中 分 化 腺 瘤 32 &k 65 复发 骨 转 移 CT3N2M0O 2.83 4.57 41.88 35.78 ° 265 。 续 表 患者 ee 性 别 “年龄 “肿瘤 大 小 ”临床 分 期 AFP CEA CAI19-9 CA125 病理 诊断 oe | BTL. loss T4N2M1 1.79 4.29 9.42 44.6 {RA ME ARE 34 # 60 4X4 T2N1Mo 3. 85 4. 31 6. 23 5.55 (KRAMER 5 ee 690 8>K2 T2N1Mo 3. 56 2.15 4.86 7.88 Sve An Hae 36S Se 8 26a) EXK:3 2. 35 27.2 4238 5.49 (RSME ARE 37 tae ae T2NOMo 黏液 细胞 瘤 3° 45 x2 ST2NIMO 2. 93 2.6 3. 64 17.59 “黏液 细胞 癌 3° ak 36 KS 3. 45 2. 18 1. 36 4.87 {RAMEE 40 #8 58 5X6 4. 16 195°. S68 4.83 {EMEA 41. “HOGA 7X5 T2N1Mo 6. 35 4.16 3.85 5.73 (EAME ARIE or ee T2N1Mo 黏液 细胞 瘤 48 & GF 4X4 NAY RE a aA 0.76 4.49 8.31 {RSME ARE as te MB ees ST4N2M1 6.44 43.64 14.73 24.22 ”中 分 化 腺 瘤 46 & 76 散在 多 发 低 分 化 腺 瘤 47 男 64 8X5 ST4N2M1 57 “45 2 7.1 Be AN ARTE 48 ee 下 而 3 二 5 又 5 PT2N2M0 3.38 05692 二 346 6.2 低 分 化 腺 癌 49 B 55 4X3.5 低 分 化 腺 瘤 50 # 63 6X6 肝 转移 T4N4M1 1.04 7.74 7.19 ARI | 51 Sy eX NEPA RT 52. er eG Yai 53 ie aa Be T2N1Mo 2. 26 107° SS 3.1 , 低 分 化 腺 癌 54. oe GX T3N2Mo ES 1b BRE 55 8 68 4X5 T2NOMo 中 分 化 腺 瘤 56 te 86 4X4 4. 67 NE AY AL RE Sf ge Or Xs T2N1Mo 2.01 1.15 1.4 4.67 {RSME ARIE 58 tk 56 化 疗 肝 转移 CT3N2M1 7.94 14.59 23.91 6.69 “ 低 分 化 腺 瘤 59 8 55 4X5 T4N2M1 中 分 化 腺 痛 60 x WRK: T3N2M1 低 分 化 腺 瘤 610 kt MA WSKS 8. 19 1.36 >400 124.78 4&4MEARIE 62 “ 男 aio) axs T3N2M1 中 分 化 腺 癌 表 10-34 正常 人 和 胃癌 患者 尿 中 核 背 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 eee ROK TER ASL tte dE 胃癌 患者 均值 土 标准 偏差 /(nmol/ pmol 肌 酸 栈 ) /(nmol/pmol 肌 酸 栈 ) Pseu 22. 44 士 5. 09 34. 57 士 19. 25 <0. 001 c 0. 190. 15 0. 240. 18 <0. 05 U 0. 320. 20 0. 580. 72 <0. 001 mlA 2. 23 士 0. 54 3. 69 士 2.01 <0. 001 I 0. 260. 12 0. 440. 36 <0. 001 m5U 0. 06 士 0. 05 0. 050. 08 <0. 001 G 0. 09 士 0. 03 0. 13 士 0. 09 <0. 001 x 1. 180. 37 1. 9241. 05 <0. 001 ° 266 « m2,2G m6A PC2 7.0 5.7 44 3.1 1.8 0.5 -0.8 2 -3 4.7 -6.0 正常 人 均值 土 标准 偏差 / (nmol/pmol JURE) . 340. J 8ls-0: 273 主 丰 . 610. . 580. “32 二 05 .04 士 0: 注 : 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 一 =20W =0.9 0.2 30 23 24 17 18 29 04 2.4 3.5 PCI 胃癌 患者 均值 土 标准 偏差 / (nmol/pmol URE) 4.6 2.411. 29 1. 380. 78 1. 080. 66 0. 990. 63 0. 940. 67 pA AV sal WRG! 0. 070. 08 5.7 6.8 79 9.0 图 10-31 主 成 分 分 析 技术 (PCA) FAP IER A (X) 和 胃癌 患者 〈 十 ) 的 分 类 表 10-35 ”胃癌 患者 尿 中 核 苷 的 增高 率 注 : 表 中 数据 采用 HPLC 方法 获得 。 增高 率 /%% 28/63 (44. 44%) 8/63 (12. 70%) 11/63 (17. 46%) 32/63 (50.79%) 17/63 (26.98%) 5/63 (7.94%) 16/63 (25. 40%) 25/63 (39. 68%) 40/63 (63. 49%) 28/63 (44.44%) 17/63 (26.98%) 30/63 (47. 62%) 22/63 (34.92%) 33/63 (52.38%) 10/63 (15. 87%) 。 267 。 FA PCA 分 析 , 其 识别 率 达 62% (图 10-31) , 采 用 ANN 对 数据 进行 分 析 时 , 该 识 别 率 达 85% 。 核 苷 和 肿瘤 大 小 的 关系 见 表 10-36, 发 现 随 着 肿瘤 直径 的 增 大 ,7 PE mR 度 逐 渐 增 高 。 临 床上 常用 的 胃癌 的 肿瘤 标志 物 CEA、CA19-9 和 CA125 的 阳性 率 分 别 为 15%、8% 和 14%% (# 10-37), 尿 核 苷 作为 标志 物 的 敏感 性 明显 高 于 现 有 的 肿瘤 标志 物 。 表 10-36 ”胃癌 患者 中 修饰 核 苷 和 肿瘤 大 小 的 关系 BRA <3cm (21) 3 一 5cm (26 4) >5cem (10 个 ) Pseu 26. 74 35. 26 48. 20 mlA 2.81 3.79 5.01 mlI 1. 94 2. 37 3.13 mlG 113 1. 36 1. 94 ac4C 0. 80 ie i 1 S5il m2G 0. 80 at 02 1. 41 m2,2G 1. 75 2. 23 3. 09 以 上 结果 表明 尿 核 苷 含量 在 白血病 、 淋 巴 瘤 、 肺 癌 、 乳 腺 癌 、 大 肠 癌 、 肝 癌 、 胃 瘤 等 多 种 恶性 肿瘤 患者 中 均 有 不 同 程度 的 增高 , 且 变化 范围 明显 大 于 正常 人 , 不 同 肿瘤 串 者 的 尿 核 背 增 高 种 类 亦 存在 差异 , 这 些 都 提示 了 尿 修 饰 核 苷 作为 广 谱 肿瘤 标志 物 的 应 用 可 行 性 。 将 HPLC 测定 的 206 例 正 常人 和 296 例 肿瘤 患者 尿 中 15 种 核 苷 含量, 用 ANN 软 件 对 数据 进行 处 理 ,83 妈 的 肿瘤 患者 尿 中 核 背 含量 与 正常 人 有 差异 , 即 ANN 方法 对 肿 瘤 患者 的 识别 率 为 83%。PCA 和 ANN 的 应 用 , 使 尿 中 修饰 核 苷 作为 肿瘤 标志 物 对 肿 瘤 的 识别 率 大 大 提高 , 并 使 之 成 为 可 能 用 于 普查 的 广 谱 性 肿瘤 标志 物 。 表 10-37 总 结 了 PCA 和 ANN 及 传统 肿瘤 标志 物 对 各 种 肿瘤 的 识别 率 。 表 10-37 各 种 方法 对 各 种 肿瘤 的 识别 率 识别 率 癌症 种 类 患者 个 数 = 传统 肿瘤 标志 物 PCA ANN 白血病 和 淋巴 瘤 7 十 8 100% 100% ~ FLARE 26 CEA: 7% 72% 肺癌 42 CEA: 18% 70% 81% Kia 41 CEA; 27% 76% 83% CA19-9: 6% . 肝癌 42 AFP; 59% 80% 86% Fle 62 CEA; 15% 62% 85% CA 19-9: 8% CA125; 19% 总 数 296 个 患者 83% 206 个 正常 人 。268 。 7. (8) RB Solomon 研究 组 5 测定 了 从 事 石 棉 业 的 男性 工人 《他 们 是 患 间 皮 瘤 高 危 人 群 , 但 采样 期 间 并 未 有 临床 特征 ) 尿 中 Pseu、mlA、mlI、m2G 和 ac4C 的 排放 水 平 。 将 这 些 指标 作为 变量 用 于 识别 正常 人 和 这 些 男 性 工人 ,96 丸 的 正常 人 和 95 为 的 工人 被 正确 辩 认 。 可 见 , 分 析 尿 中 核 苷 的 含量 有 助 于 为 医学 提供 早期 发 现 肿瘤 易 感人 群 及 处 于 瘤 前 病 变 的 个 体 , 从 而 有 可 能 对 之 实施 早期 干预 措施 , 并 能 在 癌症 预防 和 风险 评价 中 及 时 地 发 挥 效力 。 核 苷 用 于 从 事 石 棉 业 而 患 间 皮 瘤 诊断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13。 8. AMR Trewyn 等 [将 尿 中 Pseu, mlA, PCNR, mlI, mlG, A 和 m2G 的 排出 量 作为 提示 鼻 咽 癌 CNPC) 发 生 和 病情 的 标志 物 来 研究 , 结 果 表 明 ml1A 和 Pseu 水 平 在 患者 被 确诊 时 是 正常 值 的 4~6 倍 。 如 果 在 症状 出 现 以 前 对 患者 进行 这 些 核 苷 的 检测 , 也 许可 以 为 早期 诊断 NPC 提供 一 种 手段 。 9. 泌尿 系统 及 女性 生殖 系统 肿瘤 Koshida 4°! Xf 31 名 泌尿 系统 及 女性 生殖 系统 肿瘤 患者 治疗 前 后 尿 中 Pseu、 mlI、mlA 和 mlG 的 水 平 进行 测定 。 结 果 表 明 : 治疗 前 mlI 是 最 普遍 升 高 的 核 苷 , 77 为 的 患者 此 种 核 苷 出 现 升 高 。Psenu 与 女性 生殖 系统 肿瘤 的 临床 及 预后 相关 性 最 佳 , 而 mlI 则 是 泌尿 系统 肿瘤 患者 疾病 状态 的 最 好 指标 。 核 苷 用 于 泌尿 系统 及 女性 生殖 系统 肿瘤 诊断 的 一 些 实例 列 于 表 10-13。 10. 脑 癌 Manjula 等 "5 应 用 HPLC 法 对 93 名 脑 肿瘤 患者 尿 中 Pseu 的 水 平 进 行 检测 。 发 现 Pseu 在 良性 肿瘤 〈z* 王 41) 、 亚 性 肿瘤 (n=52) 和 正常 对 照 组 未 表现 出 明显 差别 。 与 此 同时 ,Pseu 在 术 前 和 术 后 的 变化 不 存在 差别 。 该 研究 认为 Pseu 对 于 脑 癌 没 有 诊断 价值 。 10.3.3 和 良性、 恶性 肿瘤 尿 中 修饰 核 背 排放 差异 的 研究 为 研究 良 、 亚 性 肿瘤 患者 尿 核 苷 排放 水 平 的 差异 , 我 们 又 采集 了 33 个 良性 肿瘤 串 者 , 分 析 其 尿 中 修饰 核 苷 的 变化 。 表 10-38 结果 显示 , 和 良性 肿瘤 患者 尿 中 核 苷 的 含量 虽 略 高 于 正常 人 , 但 无 统计 学 意义 ;与 恶性 肿瘤 患者 相 比 , 除 C、mU、m6A 三 种 核 音 外 , 其 他 修饰 核 苷 的 浓度 明显 低 于 恶性 肿瘤 患者 〈P<0. 05)。 可 能 的 原因 是 良性 肿瘤 作为 肿瘤 性 增生 物 , 其 细胞 亦 处 于 增殖 状态 , 也 不 断 有 修饰 核 苷 的 产生 , 因 此 , 尿 中 修 饰 核 苷 含量 略 高 于 正常 人 ;, 但是, 其 细胞 增殖 速度 远 远 低 于 恶性 肿瘤 , 尿 中 修饰 核 苷 含 量 也 就 明显 低 于 恶性 肿瘤 。 可 见 , 尿 中 修饰 核 苷 可 用 于 鉴别 良 、 亚 性 肿瘤 。 “269 。 10-38 正常 人 (1 、 良 性 肿瘤 患者 (2) 和 恶性 肿瘤 患者 (3) 尿 中 核 背 释放 水 平 的 均值 和 上 检验 BRA 组 号 mean 十 sd/ (nmol/pmol 肌 酸 栈 ) 组 间 比 较 P —_ 1 17.7344. 42 1-2 <0. 01 2 27. 49-+12. 76 1-3 <0. 001 3 44, 43-+33. 74 2-3 <0.01 U 1 0. 34 士 0. 16 1-2 <0.01 2 0. 4840. 20 13 <0. 001 3 0.77+0.58 2-3 <0. 01 Cc 1 0. 31 士 0. 19 1-2 一 0.01 2 0. 54 士 0. 42 1-3 <0. 001 3 0. 7940. 89 2-3 >0. 05 mU 1 0.31 士 0.18 1-2 >0. 05 2 0. 3140.19 1-3 >0. 05 3 0. 4340.57 2-3 >0. 05 I 1 0. 36-40. 19 1-2 >0. 05 2 0. 43-40. 30 1-3 <0. 001 3 0. 7040. 67 2-3 <0.01 mil 1 0.9740. 25 1-2 <0.01 2 1. 53-£0. 65 1-3 <0. 001 3 2. 46+1. 80 2-3 <0. 05 actC 1 0.49+0. 14 1-2 <0.01 2 0. 780. 38 1-3 <0. 001 3 1.3140. 93 2-3 <0. 001 i 1 0.120. 07 1-2 >i GAPE’. 2 0. 15+0. 16 1-3 <0. 001 3 0. 3040. 36 2-3 <0. 05 mlG 1 0.79 土 0. 20 1-2 <0.01 2 1. 220.59 1-3 <0. 001 3 1.9741. 54 2-3 <0.01 A 1 0.4140. 12 1-2 <0.01 2 0. 6440. 34 1-3 <0. 001 3 1.0140. 77 2-3 <0. 05 X 1 0. 82 士 0. 39 1-2 >0. 05 2 0. 9540. 36 1-3 <0. 001 3 1.41+1.12 2-3 <0.05 m2G 1 0.43+0. 17 1-2 <0.01 2 0. 9540. 57 1-3 <0. 001 3 1. 3540. 97 2-3 <0. 01 m6A 1 0. 06-0. 08 1-2 >0. 05 2 0. 07+0. 13 1-3 >0. 05 3 0. 200. 40 2-3 >0. 05 TE: 表 中 数据 采用 CE 方法 获得 。 以 乳腺 疾病 患者 为 例 , 用 CE 检测 了 41 例 正 常人 、18 例 良 性 乳腺 病变 患者 和 26 Bil 乳腺 癌 患 者 尿 中 核 苷 含量 〈 表 10-18)。 结 果 显 示 , 良 性 乳腺 病变 患者 尿 中 各 种 核 苷 含 量 与 正常 人 相 比 , 虽 略 有 增高 , 但 除 m2G 外 , 均 无 显著 性 差异 (p>0. 05). 。270 。 采用 PCA SkRAEBE, NPA KBB, TIERS CA 10-32)。 乳 腺 瘤 患 者 尿 中 核 苷 水 平 与 良性 乳腺 病变 患者 相 比 , 显 著 增 高 (p<0. 05) 。 2.0 —1S 6-0 '-0.5 0.0 0.5 1.0 的 2.0 25 3.0 PCI 图 10-32 主 成 分 分 析 技术 (PCA) FAT IEMA (+) ALREFLRR BA CX) 的 分 类 与 良性 肿瘤 相似 , 炎 症 患 者 尿 中 核 背 含量 也 略 高 于 正常 人 , 但 男 显 低 于 恶性 肿瘤 串 者 。 由 于 所 考察 的 患者 样本 尚 不 充足 , 需 进一步 研究 证 明 。 10.3.4 修饰 核 苷 用 于 检测 手术 和 治疗 效果 的 评价 应 用 CE 法 和 HPLC 法 分 别 检测 了 22 例 和 26 例 手 术 前 、 后 恶性 肿瘤 患者 一 星期 尿 BEE, UWE MRSA RATS BAIA 图 10-33 为 2 位 胃癌 患者 尿 中 5 种 修饰 核 苷 在 手术 前 、 后 10 天 内 尿 修 饰 核 苷 浓度 的 变化 。 图 10-33A 显示 患者 “1” 在 术 后 第 6 天 时 尿 修饰 核 苷 含量 降 至 正常 人 水 平 , 且 在 以 后 的 几 天 维持 相对 稳定 。 随 诊 表 明 , 半 年 内 没有 复发 。 图 18B 显示 患者 “2” 手 术 后 第 6 天 尿 修饰 核 背 含量 仍 未 见 下 降 , 且 在 以 后 的 几 天 缓慢 升 高。 根据 其 临床 病理 信 息 , 该 患者 为 姑息 性 手术 , 肿 瘤 未 被 完全 切除 。 肌 酸 本 /nmolhumol) WLR /(nmol/mol) 0 5 10 上 一 手术 后 天 数 图 10-33 ”两 个 胃 交 患者 10 天 内 5 种 修饰 核 苷 排放 的 变化 示意 图 右边 竖 线 表示 在 正常 人 尿 中 这 5 种 修饰 核 苷 浓度 的 均值 ° 271 = 图 10-33 告诉 我 们 , 如 果 手 术 切除 肿瘤 彻底 , 术 后 一 星期 尿 中 核 苷 浓度 就 可 回 到 正 常 水 平 , 据 此 可 利用 尿 中 修饰 核 苷 来 判断 患者 的 手术 /治疗 是 否 有 效 , 图 10-34 显示 CE 法 测定 的 22 例 亚 性 肿瘤 患者 手术 前 、 后 1 周 , 尿 中 5 种 修饰 核 苷 含量 的 变化 。 从 总 体 平均 来 看 , 手 术 1 周 后 患者 尿 中 修饰 核 苷 含量 即 降 至 正常 人 水 平 。 将 图 10-34 数 据 用 PCA 技术 来 处 理 可 得 图 10-35, 发 现 患 者 术 后 尿 中 核 苷 含量 开始 向 正 常人 分 布 区 域内 集中 , 其 位 置 类 似 于 前 述 图 中 正常 人 的 位 置 。 图 10-35 可 用 于 直观 地 判 断 治疗 效果 。 肌 酸 本 /nmolumol) -20 =15 ~=:0...-055 0:0), 70:5 1.0 us 2.0 ZS 3.0 PCl 图 10-35 主 成 分 分 析 技 术 (PCA) 用 于 区 别 癌症 患者 手术 前 〈 十 ) AAR OX) 核 苷 的 变化 情况 HPLC 法 对 26 例 恶 性 肿瘤 患者 术 前 、 术 后 的 检测 结果 与 以 上 结果 相似 。 尿 中 核 苷 含量 由 体内 肿瘤 负荷 所 决定 , 其 可 能 成 为 有 效 随 访 肿瘤 复发 与 转移 的 标 * 272 10.3.5 化 疗 对 尿 中 核 背 排放 水 平 的 影响 化 疗 疗效 一 般 可 分 为 以 下 几 种 情况 : (1) 完全 缓解 (complete response, CR): 病灶 完全 消失 。 (2) 部 分 缓解 〈partial response,PR) :病灶 缩小 50% 以 上 。 (3) 病灶 稳定 (stable disease, SD): 指 病灶 缩小 <50%% , 或 增加 <<25% 。 (4) 病灶 进展 〈progressive disease, PD): 指 病灶 增加 六 25% , 或 出 现 新 的 病变 。 本 节 我 们 跟踪 测定 了 15 名 肺癌 患者 化 疗 前 后 尿 中 核 苷 含量 的 变化 , 其 中 化 疗 有 效 的 患者 有 9 位 , 化 疗 无 效 的 患者 有 6 位 〈 表 10-39) 。 图 10-36 直观 显示 了 15 名 肺癌 患 者 在 化 疗 前 后 尿 中 Pseu 排放 水 平 的 变化 。 运 用 成 组 设计 的 配对 上 检验 分 析 表 明 ,9 位 化 疗 有 效 的 肺癌 患者 化 疗 后 尿 中 15 种 核 苷 水 平 明 显 高 低 于 化 疗 前 , 具 有 显著 差异 CP<0.001); 而 6 位 化 疗 无 效 的 患者 化 疗 前 后 核 背 的 含量 无 显著 性 差异 〈P>0. 05)。 表 10-39 不 同 病 理 类 型 肺癌 患者 化 疗 疗 效 化 疗 有 效 化 疗 无 效 PD-SD PD-PR PD-CR 无 变化 恶化 0 1 1 2 2 0 1 J 1 1 1 0 0 0 0 1 1 2 0 0 2 3 4 3 3 9 6 采用 FA 处 理 数 据 , 结 果 表 明 15 种 尿 中 修饰 核 苷 的 变化 量 与 化 疗 后 患者 临床 反应 相 平 行 〈 图 10-37 和 图 10-38) 。 这 可 能 是 由 于 化 疗 药物 作用 于 处 于 增殖 阶段 的 肿瘤 细 肌 酸 本 /nmolumol) oopvonrveeroenooeooeeoomooooemoeovereooooom | 60.006 | 4’ 1 2 3 4 5 6 a 9 peta 3’ Pseu 图 10-36 15 名 肺癌 患者 尿 中 Pseu 在 化 疗 前 后 变化 比较 图 编号 1 一 9 是 化 疗 有 效 的 肺癌 患者 ,1 一 6 是 化 疗 无 效 的 肺癌 患者 RU Cu 上 | 6' « 273 ¢ 胞 , 通 过 抑制 核酸 代谢 或 影响 细胞 分 裂 等 机 制 使 存在 于 快速 生长 周期 中 的 肿瘤 细胞 减少 或 消失 , 因 此 , 尿 中 核 背 量 也 随 之 下 降 。 这 一 结果 提示 , 修 饰 核 苷 可 以 作为 一 种 广 谱 的 肿瘤 标志 物 , 用 于 监测 患者 病情 变化 及 对 化 疗 药物 敏 感性 筛选 。 —1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 re PC1 图 10-37 ”基于 尿 中 15 种 核 苷 的 因子 分 析 CFA) 用 于 区 别 6 位 化 疗 无 效 的 肺癌 患者 化 疗 前 后 核 苷 的 变化 情况 编号 位 置 为 患者 化 疗 前 的 状态 =1.0 - -0.5 0.0 0.5 1.0 Ips) 2.0 PCl 10-38 基于 尿 中 15 种 核 苷 的 因子 分 析 (FA) 用 于 区 别 9 位 化 疗 有 效 的 肺癌 患者 化 疗 前 后 核 苷 的 变化 情况 编号 位 置 为 患者 化 疗 前 的 状态 10.3.6 FRR BSE WS Achill 实例 1: 患者 是 否 患 恶性 肿瘤 的 诊断 患者 , 男 ,45 岁 ,1 个 月 以 来 体重 明显 下 降 , 发 热 , 腹 痛 , 皮 肤 黄 染 , 尿 黄 。 大 连 医科 大 学 附属 第 一 医院 初 查 ; 疑 诊 为 甲 型 肝炎 或 直肠 癌 。 化 验 检查 否定 甲 型 肝 炎 。 不 排除 恶性 肿瘤 。 。 274 。 在 未 明确 诊断 前 , 我 们 采集 了 患者 的 尿 样 , 用 我 们 建立 的 方法 测定 了 尿 中 修饰 核 音 含量 。 通 过 与 28 例 正 常人 尿 中 核 苷 的 平均 值 相 比较 〈 图 10-39), 各 类 修饰 核 苷 水 平 无 明显 增高 , 从 而 排除 患 恶 性 肿瘤 的 可 能 。 大 连 医科 大 学 附属 第 一 医院 复 2s0 诊 表明 , 患 者 症状 为 阑尾 炎 术 后 肠 粘连 引起 , 并 非 恶性 肿瘤 。 现 患者 7 Das 国平 均值 已 经 完全 康复 、 健 在 , 随 诊 2 年 无 he Ces fm ie 肿瘤 发 生 。 实例 2, 术 后 随访 研究 〈 肾 母 细 100 胞 瘤 ) ® 患者 , 女 ,2 岁 , 腹 部 肿瘤 待 查 Pai ne cere 87) ASSET ETO vO. nn wie mia mG 手术 。 经 病理 证 实 为 肾 母 细胞 瘤 。 BATH 术 前 收集 尿 样 , 结 果 表 明 7 种 修饰 图 10-39 待 诊断 患者 尿 中 核 苷 浓度 与 正 党 BROS SH Bm. RAB 8 天 , ARP REP IR BE EY LB PREF SD AN PR PK SP ee CA 10-40) 。 术 后 第 20 天 尿 样 显示 , 尿 中 核 苷 含量 明显 回升 , 提 示 体 内 肿瘤 细胞 存在 并 增 殖 。 此 后 检查 发 现 , 肿 瘤 复 发 。 该 例 表 明 , 修 饰 核 苷 可 提示 患者 术 后 体内 肿瘤 的 存在 , 即 修饰 核 苷 可 用 于 术 后 随访 。 肌 酸 本 (nmolhumol) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 之 3 10-40 ”一 个 两 岁 儿 童 肿瘤 GB) 患者 在 接受 治疗 后 尿 中 核 苷 浓度 的 变化 1: 术 前 第 1 天 ,2: 术 后 第 9 天 ,3: 术 后 第 20 天 从 前 面 可 知 , 基 于 体液 中 核 苷 浓度 , 我 们 采用 高 级 数据 分 析 技 术 〈 如 因子 分 析 、 模 式 识别 或 人 工 神经 元 网 络 技术 等 ) 来 同时 考虑 癌症 患者 体液 中 多 个 修饰 核 苷 类 肿瘤 标志 物 的 浓度 变化 , 据 此 来 判断 恶性 肿瘤 。 尿 中 修饰 核 背 量 的 增高 是 宿主 体内 细胞 增殖 与 代 谢 增高 的 结果 。 亚 性 肿瘤 患者 尿 中 修饰 核 苷 含量 的 增高 , 提 示 了 其 作为 恶性 肿瘤 标志 物 用 于 肿瘤 诊断 、 良 恶性 肿瘤 鉴别 及 治疗 后 随访 的 可 能 性 。 其 肿瘤 诊断 阳性 符合 率 超过 70 和 , 且 对 不 同类 型 的 肿瘤 均 有 良好 的 指示 作用 。 这 一 结果 表明 修饰 核 苷 是 一 类 广 谱 性 的 肿瘤 标志 物 。 我 们 建立 的 检测 分 析 系 统 可 有 效 地 用 于 尿 中 修饰 核 苷 检测 , 能 够 有 效 地 指示 宿主 的 荷 癌 状态 。 被 检 者 以 尿 液 为 样本 取材 , 取 材 方 便 、 无 损伤 , 加 之 标记 谱系 广 ¢ 275 » 的 特点 , 均 提示 了 本 方法 用 于 肿瘤 普查 较 现 用 肿瘤 标志 物 具 有 更 大 的 优越 性 和 互补 性 。 在 肿瘤 预防 及 诊断 工作 中 有 着 良好 、 广 泛 的 应 用 前 景 。 与 以 往 的 方法 相 比 此 法 的 优点 如 下 : (1) 科学 地 综合 考虑 了 多 个 变量 的 贡献 , 将 高 级 数据 分 析 技 术 “〈 如 因子 分 析 、 模 式 识别 或 人 工 神经 元 网 络 技术 等 ) 与 高 效 分 离 分 析 技 术 紧 密 地 结合 起 来 。 传 统 的 现在 正在 临床 应 用 的 肿瘤 标志 物 (如 CEA、CA 153、CA 125 等 ) 都 是 单个 地 在 使 用 , 不 但 难以 较 早 地 发 现 肿瘤 , 而 且 一 般 只 能 适合 于 几 种 肿瘤 , 广 谱 性 有 限 。 (2) 与 常规 的 使 用 核 苷 作 肿 瘤 标 志 物 的 候选 研究 相 比 , 本 项 目的 结果 可 清楚 地 以 图 形 的 形式 表示 出 来 , 给 出 可 视 化 的 诊断 结果 。 避 兔 了 用 “平均 值 加 2 倍 标准 偏差 ”方法 时 , 发 生 同 一 患者 与 正常 人 相 比 , 尿 中 修饰 核 苷 浓度 有 高 有 低 的 现象 、 医 生 不 易 判 断 的 现象 。 《3) 由 于 上 述 两 点 , 使 得 本 方法 可 适合 于 各 种 恶性 肿瘤 的 诊断 , 尤 其 适用 于 急 发 性 、 高 毒性 的 恶性 肿瘤 , 如 和 白血病、 小 细胞 肺癌 、 胃 癌 、 食 道 癌 、 子 宫 癌 、 咽 喉 癌 、 膀 胱 癌 、 卵 巢 癌 、 支 气管 癌 、 乳 腺 癌 、 直 肠 癌 、 前 列 腺 瘤 等 。 对 高 危 患者 的 普查 尤其 有 用 , 与 本 方法 的 多 变量 数据 分 析 技 术 相 结合 , 体 液 中 核 苷 可 作为 普 适 性 肿瘤 标志 物 来 使 用 。 参考 文献 [1] Holland J F, Feiv E [], Re Bast Jr. Maryland, USA: Williams & Wilkine, 1998 (2) FER, BRA, KE, BA, DEB, SH/IMS, DA, AM, KTS, Bh, RAS, DE, RE ta, RR. 中 华 肿瘤 杂志 ,1997,19 (1): 3 [3] FER, KB, 鲁 凤 珠 , HA, HEB, SHU. 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MHAE, 2003, 22 (5): 537 。 280 。 第 11 章 , 代 谢 组 学 在 糖尿 病 研究 中 的 应 用 糖尿 病 是 许多 国家 所 面临 的 日 益 严 重 的 健康 问题 , 也 是 全 球 性 医学 难题 。1997 年 世界 卫生 组 织 CWHO) 报道 , 全 球 范围 内 的 糖尿 病 患者 高 达 1. 25 亿 , 预 计 这 一 数字 到 2025 年 将 增加 到 2. 99 亿 ,2 型 糖尿 病 将 是 西方 国家 第 一 生命 杀手 。 全 世界 大 约 有 1. 46 亿 人 患 有 2 型 糖尿 病 , 约 占 所 有 糖尿 病 患者 的 90%% 一 95%D 。 由 诺 和 诺 德 亚太 医 学 中 心 协助 在 中 国 进 行 的 一 项 研究 , 自 1998 年 共 调 查 2669 例 患 者 , 结 果 显 示 , 糖 尿 病 的 患 病 率 : 2 型 糖尿 病 占 93.7% ,1 型 糖尿 病 占 5.6%; 平均 发 病 年 龄 : 1 型 糖尿 病 为 16.6 岁 ,2 型 糖尿 病 为 50. 9 岁 中 。 可 以 预计 , 随 着 我 国 国民 经 济 的 快速 发 展 和 人 民生 活水 平 的 进一步 提高 , 发 病 率 还 将 继续 升 高 。 由 于 人 口 基数 大 , 我 国 的 糖尿 病 患者 总 数 将 会 十 分 惊人 , 目 前 中 国有 4000 万 糖尿 病 患者 。 如 不 加 以 有 效 干 预 , 今 后 30 年 内 , 我 国 糖尿 病 患 病 率 将 达到 5% 一 10% , 届 时 全 国 糖尿 病 患者 总 数 将 逾 5000 万 , 占 世界 各 国 糖尿 病 新 增 人 数 的 首位 。 以 中 国 为 例 , 因 糖尿 病 导 致 的 死亡 逐年 升 高 ,1974 年 中 国 城市 人 121 糖尿 病 的 死亡 率 仅 3. 4/10 万 人 , 至 1999 年 时 已 上 升 到 15. 4/10 FA, WK 了 近 5 倍 。 不 仅 如 此 , 糖 尿 病 所 导致 的 治疗 费用 也 逐年 增高 。 在 中 国 2 型 糖尿 病 导 致 的 直接 医疗 费 约 为 188. 2 亿 元 , 占 中 国医 疗 总 支出 的 3. 95% , 其 中 治疗 并 发 症 的 费用 就 占 81%。 因 此 ,2 型 糖尿 病 及 其 并 发 症 的 治疗 是 中 国 社会 沉重 的 经 济 负 担 。 因 此 , 糖 尿 病 的 防治 是 全 世界 面临 的 巨大 挑战 , 尤 其 在 中 国 更 是 迫在眉睫 。 糖尿 病 的 病因 至 今 尚 未 完全 阐明。 目前 认为 主要 是 胰岛 素 抵 抗 、 胰 岛 B 细胞 功能 衰 竭 和 胰岛 素 分 刻 障 碍 。 其 原因 是 多 方面 的 , 除 遗传 因素 外 , 环 境 因 素 也 有 重要 关系 。 社 会 经 济 发 展 、 生 活水 平 提高 、 饮 食 热量 摄 和 人 过 多 、 体 力 劳 动 减 轻 、 心 理应 激增 加 及 肥胖 增加 均 与 糖尿 病 密 切 相 关 。 目前 认为 , 糖 尿 病 是 一 种 因 胰岛 素 分 沁 绝 对 或 相对 不 足 而 引起 的 以 高 糖 血 症 为 主要 特征 的 代谢 性 疾病 , 长 期 的 高 血糖 可 导致 眼 、 肾 、 神 经 、 心 脏 及 血管 等 多 器 官 损害 。 临 床上 可 将 糖尿 病 分 为 1 型 糖尿 病 、2 型 糖尿 病 、 其 他 特殊 类 型 和 妊娠 期 糖尿 病 (GDM) 等 近年 来 代谢 组 学 取得 了 很 大 发 展 , 广 泛 应 用 于 疾病 诊断 、 药 物 毒 性 机 制 及 生物 标志 物 发 现 等 方面 的 研究 5- 。 运 用 代谢 组 学 研究 糖尿 病 , 包 括 诊断 、 药 物 评 价 和 病理 机 制 等 的 研究 也 引起 科学 家 的 注意 。 杨 军 等 建立 了 针对 血清 中 脂肪 酸 的 毛细 管 气相 色谱 代 谢 划 标 分 析 平 台 , 并 有 效 地 区 分 了 2 型 糖尿 病 患者 和 健康 对 照 组 。 结 果 表 明 , 通 过 使 用 一 元 和 多 元 统计 技术 , 可 以 选择 一 组 脂肪 酸 的 子 集 得 到 较 好 的 分 类 结果 。 该 方法 将 有 助 于 2 型 糖尿 病 患 者 的 标志 物 发 现 和 发 病 机 制 方 面 的 研究 0J。Granger 等 应 用 UPLC/TOF-MS 基 于 尿 样 代谢 谱 来 区 分 肥胖 Zuker |) BAIXAR], Williams 等 也 建立 了 1H NMR 和 HPLC-MS 方法 以 研究 上 述 两 种 小 鼠 的 代谢 差异 3 。Watkins 等 应 用 类 脂 组 学 评价 Y- 受 体 激 动 剂 对 2 型 糖尿 病 的 疗效 , 研 究 显示 了 药物 能 使 体内 特别 是 血液 中 脂 类 化 合 物 浓度 发 生 改 变 , 心 磷脂 变化 显著 00 。Hodavance 等 综述 了 基于 NMR 的 2 ws 281 。 We RAHA, HR PUSARRRH, SANMRORS Sm PaO. Griffin 等 对 代谢 组 学 作为 功能 基因 组 学 的 工具 研究 糖尿 病 肥 胖 症 和 相关 代谢 紊乱 疾病 的 工作 做 了 综述 05] 。van Doorn 等 评价 了 四 氢 噬 唑 对 2 型 糖尿 病 患者 和 健康 志愿 者 的 药 理学 效应 以 发 现 标志 物 , 他 认为 传统 生化 标志 物 不 足以 调查 药物 作用 , 通 过 建立 的 NMR 代谢 组 学 方法 可 快速 检测 血 和 尿 中 代谢 物 的 变化 , 发 现 尿 中 马 尿 酸 盐 和 芳香 族 氢 基 酸 含量 减少 , 血 浆 中 支 链 氨 基 酸 丙 氨 酸 谷 氮 栈 胺 等 上 升 bJ] 。1 型 糖尿 病 中 最 严重 的 形式 是 糖尿 病 肾病 , 传 统 的 方法 〈 如 白 蛋白 排放 率 ) 不 能 很 准确 地 进行 早期 预测 , Makinen 等 运用 建立 的 血清 NMR 方法 区 分 了 182 例 1 型 糖尿 病 患者 和 21 例 对 照 , 得 到 了 87.1%% 的 准确 度 和 87.7%% 的 专 一 度 , 阳 性 和 阴性 的 预测 值 分 别 为 89.0%% 和 83. 6%") 。 本 章 对 糖尿 病 的 代谢 组 学 研究 进行 了 概述 , 分 为 以 下 4 节 , 第 11. 1 节 应 用 代谢 轮 RTF 2 型 糖尿 病 尿 样 中 有 机 酸 的 研究 ,11. 2 节 将 尿 样 “全 ”代谢 指纹 应 用 于 药物 对 糖尿 病 的 疗效 评价 ,11. 3 节 为 2 型 糖尿 病 中 血浆 磷脂 代谢 轮廓 分 析 和 标志 物 的 识别 。 11.4 节 为 血清 中 脂肪 酸 的 靶 标 分 析 方 法 用 于 2 型 糖尿 病 患 者 与 正常 人 的 区 分 。 11.1 基于 GC 的 有 机 酸 轮廓 分 析 对 2 型 糖尿 病 研究 -- 2 型 糖尿 病 是 典型 的 代谢 北 乱 疾病 , 脂 肪 酸 可 以 作为 糖尿 病 患 者 脂 类 化 合 物 代谢 异 常 的 生物 医学 标志 物 , 当 糖尿 病 患 者 在 治疗 时 病情 会 在 血 和 尿 中 反映 出 来 , 可 以 用 GC 分 析 检 测 血 和 尿 的 小 分 子 变 化 以 揭露 糖尿 病 患者 的 生理 生化 变化 。 我 们 应 用 代谢 轮 廓 分 析 研 究 尿 中 有 机 酸 和 糖尿 病 的 关系 。 11.1.1 实验 部 分 11.1.1.1 样品 收集 及 预 处理 尿 样 采集 于 26 例 正 常人 和 28 例 2 型 糖尿 病 患者 〈 大 连 医科 大 学 附属 二 院 )。 糖 尿 病 患 者 年 龄 28~63 岁 (分别 为 43 士 15、46 士 17) 。 血 中 葡萄 糖 浓度 均 大 于 7. Ommol/L, 样品 收集 后 放 到 一 20C 冰 箱 保 存 。 11.1.1.2 样品 前 处 理 取 尿 样 样品 , 室 温 解冻 , 混 合 均匀 。 第 一 步 为 固 相 革 取 小 柱 〈SPE) 的 老化 : 强 阴 离子 柱 (SAX) 依次 过 2ml 甲醇 ,2ml 水 ,2ml pH 7 磷酸 盐 缓 冲 液 (0. 336mol/L 磷酸 二 氧 钾 和 0. 665mol/L 磷酸 氢 二 钠 ), 最 后 2ml pH 7 磷酸 盐 缓冲 液 (0. 013mol/L 磷酸 =A FAA 0. 020molL 磷酸 氧 二 钠 ) 冲洗 。2ml 尿 液 中 加 入 50pg/L 山梨 酸 , 过 SPE 小 柱 , 小 柱 抽空 10min 后 加 1. 5ml HCl /甲醇 混合 液 (lml 浓 HC! 加 入 甲醇 至 25ml) 洗 脱 柱 中 吸附 的 有 机 酸 。 洗 脱 液 氮气 吹 扫 至 干 , 残 留 物 加 140pl 6 : 1 MTBSTFA LN- 叔 丁 基 二 甲 基 硅 -N- 甲 基 三 氟 乙 酰胺 ,N(tertrbutyldimethy-lsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide] /DMF (N, N- 二 甲 基 甲 酰胺 ,N,N-dimethyl formamide), 50°C 7K IAA lh, CHARA ° 282 » GC-FID 分 析 。 11.1.1.3 GC-FID #1 GC-MS 447 所 用 仪器 为 Agilent 6890 GC-FID (Agilent, 36) 和 QP 2010 GC/MS (Shimad- zu, HA), iE 30m X0. 25mm i. dX 0. 25um DB 5ms (J. & W. Scientific, Folsom, CA) 。 色 谱 条 件 : PERE Il, ANELE 30:1; HEY: 100°C—2.5°C/min—285°C (6min), 进 样 口 280C , 检 测 器 300C , 载 气流 速 : He,30cm/s。MS: 进 样 口 290C, 离 子 源 200°C, #20 285°C, m/z: 40~500, ; 11.1.1.4 GC-FID 色谱 数据 的 处 理 和 模式 识别 为 了 定量 分 析 , 所 有 信 噪 比 (S/N) 大 于 10 的 峰 被 选取 , 峰 面积 被 内 标 校 正 后 输 A. SIMCA-P10. 0 软件 (Umea, Sweden) 进行 多 变量 分 析 (PCA 和 了 PLS-DA)521'22] 。 11.1.2 2 型 糖尿 病 的 有 机 酸 轮 廓 分 析 高 通 量 代谢 轮廓 分 析 要 求 发 展 一 个 包含 广泛 范围 代谢 物 的 指纹 图 谱 GC 方法 。 相 对 NMR, 色 谱 分 析 需 要 解决 不 同样 品 或 仪器 可 能 导致 的 色谱 峰 保 留 时 间 迁 移 问 题 。 针 对 这 种 情况 发 展 了 一 个 峰 匹 配 的 方法 , 峰 匹配 运算 法 则 流程 如 图 11-1。 选择 参考 谱 图 将 样品 谱 图 与 参 考 谱 图 进行 匹配 化 学 计量 学 分 析 识别 可 能 的 生物 标志 物 图 11-1 峰 匹配 运算 法 则 流程 首先 , 选 择 一 个 典型 的 参 比 谱 图 〈 图 11-2)。 这 个 色谱 谱 图 必须 符合 以 下 条 件 : 包 含 基本 所 有 峰 信 息 、 包 含 所 有 参 比 峰 、 参 比 峰 处 于 其 他 谱 图 的 对 应 峰 中 间 位 置 “ 。 AK, BEM (S/N) 大 于 10, 在 参 比 谱 图 上 找到 195 个 峰 。 所 有 其 他 谱 图 以 参 比 峰 表 为 准 对 齐 。 算 法 的 关键 是 在 峰 表 中 找 几 个 容易 鉴定 的 参 比 峰 , 谱 图 被 参 比 峰 .283 + 60 70 80 10 20 30 40 50 8 BH AY fa] /min 图 11-2 ”典型 的 参 比 谱 图 4y S| ILE. EBB AAPL 104. 234. 33H, 544, 74H, 1024, 1334 和 158 间 峰 出 现在 所 有 谱 图 上 , 而 且 峰 值 高 , 分 布 比 较 平 均 , 将 其 设 定 为 参 比 峰 。 内 标 17# 峰 也 被 选 为 参 比 峰 。 当 参 比 峰 保 留 值 为 一 系列 预 设 值 时 , 其 他 峰 保 留 值 (Cari) 基于 调整 保留 指数 被 标准 化 , 这 与 Kovats 保留 指数 类 似 , 计 算 公 式 如 式 〈11. 1) EEX (ARI ARG) +ARL try ) 用 于 构建 PLS-DA 模型 , 然 后 用 该 模型 预测 剩余 的 1/3 样品 数据 “测试 组 ”) 类 别 关系 。 表 11-8 列 出 了 分 类 结果 。 从 表 11-8 中 可 以 看 出 , 在 均值 中 心 。 299 。 eal 2 1 S 0 到 2 “it cre 1 0 1 2 3 . t{1] t[2] Sy ono eo -12-1+10-9 -8-7 6-5-4 -3-2-10 12345 67 8910 t[] SEE A -六 re: 2 a BP Bee al a ‘ ~~ V2 ue \ 和 OF . Mot[3] VY, WE —- a we Ss \ pe gt Ras es. as 2 PNG OS 又 rhs FSO Wes MD 和 图 11-10 PLS-DA 模型 对 2 型 糖尿 病 患者 和 正常 人 的 分 类 〈: SHR; +: DM2) A. Ctr 模型 ;B. Uv 模型 ;C. 三 维 Urv 模型 化 模型 预测 能 力 较 低 , 只 有 78. 3 多 的 预测 率 。 尽 管 与 OSC 模型 相 比 , 单 位 标 度 有 着 相 同 的 预测 率 和 专 一 性 , 但 它 的 识别 率 〈89. 2%) 和 正确 率 (87.0%) 都 低 于 相应 的 OSC 模型 (95.6% 的 识别 率 ,91. 3% 的 正确 率 )。 可 见 ,OSC 算法 能 够 明显 改善 多 变 量 模式 识别 分 析 及 模型 预测 能 力 。 。 300 。 t[2] =i -2 47.824 43.742 03.714 47.620 -0.50 -0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 w*c[1] 11-11 BOSC WYER, PLSDA 模型 2 型 糖尿 病 患者 和 正常 人 分 类 的 “得 分 ”(score) 矩阵 〈b 和 “荷载 ”(loading) 和 矩阵 (Cp) (: 对 照 ; +: DM2) 表 11-8 PLS-DA 方 法 对 血浆 磷脂 样品 的 分 类 预 处 理 方法 识别 率 预测 率 灵敏 度 特异 性 修正 率 87.0% 78. 3 90.0% 88.6% 84.1% Ctr (40/46) (18/23) (27/30) (31/35) (58/69) 89.2% 82.6% 93.3% 91.4% 87.0% PLSDA UV (41/46) (19/23) (28/30) (32/35) (60/69) 95.6% 82.6% 93.9% 91.4% 91.3% OSC/Ctr (44/46) (19/23) (31/33) (32/35) (63/69) 11.3.2.4 可 能 的 标记 物 “载荷 矩阵 ”反映 了 输出 变量 〈 不 同 磷脂 分 子 ) 对 样品 类 别 分 离 的 影响 〈 图 过 QU « 11-11B) , 磷 脂 分 子 对 PLS-DA 模型 “得 分 ”矩阵 的 影响 越 大 , 其 距离 主要 离子 复 的 位 置 越 远 。 换 名 话说, 这 些 磷脂 分 子 是 可 能 的 生物 标志 物 。 在 负离子 模式 下 m/z 为 508、 480, 766 和 762 〈 质 荷 比 取 整 数 ) 的 离子 是 可 能 的 标志 物 (A 11-11B) , 这 些 磷脂 分 子 结构 的 识别 可 以 通过 正 离子 或 负离子 模式 下 的 EPI 实验 来 完成 。 作为 一 个 例子 , 在 负离子 模式 下 m/z 为 762..5 的 磷脂 化 合 物 的 正 离子 EPI 和 负 离 子 EPI 谱 图 如 图 11-12 所 示 。 基 于 该 化 合 物 的 保留 时 间 , 推 断 它 有 可 能 是 甘油 磷脂 化 合 物 。 我 们 首先 考察 了 它 在 正 离 子 模 式 下 的 EPI 谱 图 。 在 正 离子 模式 下 , (M 十 H)+ (m/z 764. 5) 的 碰撞 诱导 解 离 (CAD) 图 谱 只 包含 了 一 个 丰 度 显著 的 片段 离子 [LTM 十 H-141]* (oz 为 623.4), 而 [M+H-141]* 是 甘油 磷脂 分 子 的 基本 特征 , 从 而 进 一 步 证 明了 它 是 甘油 磷脂 化 合 物 5] , 但 是 在 该 谱 图 中 用 来 识别 脂肪 酸 取代 基 组 成 的 片段 离子 丰 度 很 低 , 甚 至 观察 不 到 。 然 而 ,LM 十 Na]j” (m/z 786.5) 的 碰撞 诱导 解 离 图 EE m/z 743.4〈([LM 十 Na-43]+) 、645.4([M 十 Na-141]+) 和 623. 4 ((M+H-141]) 处 有 较 强 丰 度 的 碎片 离子 , 它 们 分 别 代 表 了 中 性 丢失 氮 两 啶 、 〈(HO):P《〈O) (OCH:CH:NH:) 和 (NaO) (HO) P (O) (OCH:CH:NH:) (图 11-12A) 。 此 外 , 该 化 合 物 中 的 LM 十 Na-43 上 六 碎片 丰 度 比 LM+Na-141]* 的 碎片 丰 度 要 小 〈 图 11-12B), 这 表明 了 它 属 于 二 酰基 础 脂 酰 乙醇 胺 类 磷脂 分 子 55] 。 可 以 说 , 这 些 碎片 离子 是 甘油 磷 脂 分 子 的 特征 性 离子 。 磷 脂 栈 乙醇胺 (PE) 的 钠 加 合 物 的 子 离子 特征 类 似 于 其 锂 离子 加 合 物 的 子 离子 特征 [5 m/z 487. 2 和 /zx 415.2 的 碎片 离子 分 别 为 同时 丢失 氮 丙 院 和 sn—1 位 脂肪 酸 〈Cs HaCOOH) 取代 基 或 者 sz: 一 2 位 脂肪 酸 (C2a Hs, COOH) RARE 形成 的 , 因 而 这 些 片段 离子 也 就 给 出 了 其 脂 酰 链 的 组 成 。 在 负离子 模式 下 ,7z/z 506. 3 和 m/z 434. 5 的 碎片 离子 则 分 别 对 应 脱水 的 溶血 C22 : 6 lyso-PE 和 C16 : 0 ly- so-PE (PE 失去 其 中 的 1 个 脂肪 酸 基 团 和 1 分 子 水 ) 离子 。 观 察 到 的 低 丰 度 的 m/z 452.4 离子 峰 为 去 质子 化 的 C16 : 0 lyso-PE BF. m/z 327.3 和 255.4 则 分 别 相应 于 C22 :6 和 C16 : 0 的 脂肪 酸 取代 基 〈 羧 酸 阴 离子 片段 ) 。 磷 脂 分 子 甘 油 骨干 的 酰基 链 位 置 对 它们 解 离 的 程度 有 重要 影响 。 这 里 我 们 仍旧 采用 了 动物 体 上 的 磷脂 分 子 大 多 在 sn—2 位 的 脂肪 酸 不 饱和 程度 要 大 于 在 sx" 一 1 位 的 脂肪 酸 不 饱和 程度 [5 轨 这 一 规则 。 因 此 , 我 们 推断 m/z 762.5 (LM 一 H]-) 为 C16 : 0/C22 : 6 二 酰基 PE。 图 11-12C 给 出 了 这 种 磷脂 分 子 的 可 能 结构 。 其 他 磷脂 分 子 的 生物 标记 物 的 识别 同样 是 通过 正 离子 或 负离子 的 EPI 实验 完成 的 , 表 11-9 列 出 了 这 些 可 能 的 磷脂 生物 标记 物 的 组 成 。 表 11-9 2 型 糖尿 病 中 可 能 的 磷脂 生物 标志 物 负离子 正 离子 磷脂 eo a eae Ta SOUT. 521%, |) ra 组 成 准 分 子 离子 m/z 准 分 子 离子 m/z PE [M—H]- 762.5 [M+Na]* 786. 6 C16 * 0/C22 : 6 PE [M—H]- 766.5 [M-+Na]* 790. 5 C18 : 0/C20: 4 Lyso-PC [M—CHs3 ]~ 480. 4 [M+H]+ 496. 4 C16: 0 Lyso-PC [M—CH; ]— 508. 4 [M+H]* 524. 4 C18: 0 e 302 。 786.5. A M+Na-141)* EPI(+) ( i Ne (M+H-141)* (M+Na-43)* \ 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 m/z,amu B FA 255.4 8.004 EPI(-) 6.0e4 : (lysoPE-H)- - 4.0e4 y 762.3 675.1 703.0 mi/z,amu @ 1 0 HC—O—C—C,H,, eae 一 0 je fe) C16:0/C22:6 PE | HC 一 0 一 P 一 0 一 CHCHNH, OH 图 11-12 m/z 763. 5 在 正 负离子 模式 下 的 EPI 图 谱 和 其 结构 组 成 小 结 本 工作 将 LC-MS 和 多 变量 统计 分 析 成 功 地 用 于 磷脂 轮廓 分 析 。 无 监督 的 PCA 和 有 监督 的 PLS-DA 同时 用 于 2 型 糖尿 病 患者 和 健康 人 的 分 类 。 对 于 无 监督 的 数据 分 析 技 术 , 如 PCA, 过 多 的 不 必要 的 变量 会 给 样品 分 类 带 来 错误 ;相反 , 对 变量 进行 特征 抽 取 对 样品 的 分 类 有 很 大 益处 。 有 监督 的 数据 统计 分 析 技 术 PLS-DA 则 有 效 利 用 了 样品 类 别 信息 , 放 大 了 样品 类 别 (2 型 糖尿 病 患 者 和 健康 人 ) 的 差异 。 在 PLS-DA 模型 中 , 比较 了 单位 标 度 和 OSC 两 种 数据 预 处 理 技术 , 结 果 表 明 OSC 能 显著 改善 样品 的 分 类 。 同时 也 说 明了 LC-MS 技术 和 经 过 OSC 过 滤 校 正 的 PLS-DA 多 变量 数据 统计 分 析 结 合 来 , 可 用 于 2 型 糖尿 病 患 者 和 健康 人 的 分 类 , 而 可 能 的 磷脂 分 子 标 记 物 结构 的 识别 通过 MS/MS 实验 来 实现 。 可 以 说 , 将 多 变量 数据 统计 分 析 技 术 和 LC-MS/MS 分 析 技 术 结 合 起 来 在 代谢 组 学 研究 中 是 一 种 强 有 力 的 工具 55] 。 。 303 。 11.4 血清 中 脂肪 酸 的 靶 标 分 析 方 法 用 于 2 型 糖尿 病 患者 与 正常 AR KAO 有 研究 表明 , 脂 肪 酸 可 以 作为 糖尿 病 患 者 脂 类 化 合 物 代谢 异常 的 生物 医学 标志 物 55] 。 研 究 者 们 还 深入 的 研究 了 糖尿 病 患者 的 脂肪 酸 轮廓 的 变化 。 其 中 的 几 项 研究 表 明 血 清 类 脂 55 和 骨骼 肌 磷 脂 5'5 中 的 脂肪 酸 组 成 影响 了 胰岛 素 的 灵敏 度 。 最 近 的 一 项 研究 提 到 , 无 论 分子 机 制 是 什么 , 长 链 脂肪 酸 可 以 被 认为 是 中 枢 神 经 系统 的 信号 分 子 , 脂肪 酸 和 棕榈 酰 肉 碱 -1 转移 酶 〈carnitine palmitoyltransferase-1) 可 以 作为 治疗 肥胖 和 糖尿 病 的 潜在 药 靶 分 子 。 在 本 节 中 , 我 们 选择 2 型 糖尿 病 作 为 研究 对 象 , 考 察 基 于 血清 中 脂肪 酸 的 靶 标 分 析 能 否 正确 的 将 糖尿 病 患者 从 正常 人 中 区 分 出 来 。 结 果 表 明 , 使 用 我 们 建立 的 基于 血清 中 脂 类 代谢 产物 的 代谢 靶 标 分 析 方法 , 使 用 毛细 管 气相 色谱 与 模式 识别 技术 结合 能 够 提供 一 个 从 正常 人 中 区 分 2 型 糖尿 病 患者 的 有 效 方法 。 化 学 计量 学 方法 的 应 用 大 大 提高 了 灵敏 度 和 专 一 性 。 11.4.1 实验 部 分 11.4.1.1, RERE 我 们 共 收 集 101 例 成 年 人 样本 , 其 中 51 例 2 型 糖尿 病 患 者 和 50 例 健康 对 照 。 样 本 采集 选取 在 早餐 前 抽取 。 样 品 由 Zentrallab、Medizinishce Klinik, Germany 提供 。 健 康 对 照样 本 确认 没有 任何 潜在 的 疾病 。 总 脂 使 用 氯仿 -甲醇 〈2 : 1, V/V) 混合 溶液 提 取 , 使 用 薄 层 色谱 将 其 分 成 各 类 脂肪 酸 。 酯 化 后 , 使 用 FFAP 的 毛细 管 气 相 色 谱 柱 分 析 生 成 的 脂肪 酸 甲 酯 。 采 用 内 标 和 外 标定 量 "5) 。 这 些 样 本 中 的 78 例 (34 例 2 型 糖尿 病 患者 ,44 例 健康 对 照 ) 有 完整 的 脂肪 酸 数 据 , 因 此 他 们 被 用 于 模式 识别 中 。 表 11-10 给 出 了 本 项 研究 中 的 数据 集 的 有 关 情 况 。 表 11-10 ”本 研究 中 使 用 的 数据 集 成 分 患者 组 对 照 组 总 计 胆固醇 酯 45 45 90 游离 脂肪 酸 51 50 ion" 磷脂 40 49 89 三 脂 酰 甘油 49 48 97 结合 数据 34 44 78 11.4.1.2 数据 处 理 图 11-13 给 出 了 本 研究 的 数据 处 理 流 程 。 简 单 地 讲 , 所 有 脂肪 酸 的 数据 都 使 用 主 成 分 分 析 (PCA) 进行 预 处理 。 然 后 使 用 一 种 单 变 量 和 多 变量 混合 的 特征 提取 策略 来 选 择 与 分 类 信息 相关 的 脂肪 酸 。 基 于 选择 的 变量 , 使 用 线性 判别 分 析 〈linear discriminant analysis, LDA) 和 人 工 神 经 元 网 络 (CANN) 区 分 2 型 糖尿 病 患 者 和 对 照 。 并 使 用 leave-n-out 和 single splitting 方法 对 建立 的 模型 进行 检验 。 为 了 对 比 的 需要 , 特 征 提 取 。 304 。 前 的 原始 数据 也 使 用 LDA #1 ANN 进行 了 分 析 。 图 11-13 ”数据 处 理 的 流程 图 1. 特征 选择 特征 选择 的 目的 在 于 找到 变量 的 最 佳 组 合 , 以 得 到 最 好 的 分 类 结果 。 消 除 与 分 类 无 关 的 变量 。 在 本 研究 中 , 采 用 了 一 种 单 变量 和 多 变量 混合 的 特征 提取 策略 来 达到 这 个 目标 。 单独 一 个 变量 (脂肪酸 ) 对 分 类 的 贡献 , 我 们 采用 它们 在 训练 集中 的 方差 权重 (variance weight) 来 表示 , 即 训练 集中 该 变量 类 间 方 差 和 类 内 方差 的 比值 。 对 于 两 类 Fem (K BAIL 类 ), 第 7 个 变量 的 权重 可 以 通过 公式 〈11. 2) 计算 得 到 n n tM oe K ° 1 2 Sie SS » (aig 29) SS EE TT ae ee Cig 2) “KS ) (x4 — ay, +23) Gy - 21)” nN. p=) k'=1 n (= V=1 式 中 , nk All ny 分 别 是 天 类 和 工 类 的 样本 数 , (nx +n =n); Ly FEXT LA 个 样本 , Bj 个 变量 的 值 。 结合 LDA 和 方差 权重 的 逐步 向 后 策略 进行 特征 选择 。 在 每 一 步 中 , 依 次 去 掉 其 中 的 一 个 变量 , 对 剩余 的 变量 进行 线性 判别 分 析 计 算 相 应 的 正确 识别 率 。 选 择 具 有 最 高 正 确 识别 率 和 最 大 方差 权重 加 合 的 变量 子 集 进 入 下 一 步 的 处 理 。 之 后 一 直 重 复 这 个 过 程 直 至 发 生 正确 识别 率 开始 下 降 时 终止 。 2. 分 类 1) 线性 判别 分 析 首先 , 我 们 采用 了 一 种 较为 经 典 的 分 类 方法 一 LDA。LDA 是 一 种 根据 自 变 量 将 样本 分 成 互相 独立 而 又 完备 的 不 同类 别 的 统计 学 方法 。 它 首先 假定 判别 函数 g (z) 是 工 的 线性 函数 , 即 g (2) 三 mwZ 十 rz, 对 于 c 类 问题 , 可 以 定义 “ Zcesd ES O00. 26920 K Ile cont * Speeo* geste -We*o? —strz 9 : 220 N ple ‘0 990°0 8S0°0 991°0 ¥20°0 I91°0 % 060 'S p09'I 821°0. 1650 SIO I?¥'0 G+ 220 N IT8 0 LBeO TBST Oo, FAL. SPOT = SSE“ N 60 ‘T SZO‘T 282°0 veS*O0 Sze°0 ~— E9F‘0 ¥ +220 N PLP ‘0 180°0 .. L€0°0 *-"€20 ‘0 . .$70°0 20 ‘0 K /655Z 922°T _-€9890 — 9 05951060 十 90FT 0: #20 N 020 ‘0 OPT°0 S80°0 SZT"0 Std.” SO x 88h 'Z G08 '°l —=PEev0 60 Zlp'0 =. 189.0 SN S +: 020 N Sb0 民 DEE) ScGve"0N) ett IF'0 —- ShO'T N 60S ‘I QPT‘T 206° 16206500 260° E2101 b+ 020 N PEL ‘I 820°0 9€0°0 820°0 610°0 8g10°0 N €6h “T 9T 民 9€2°0 poet Per 96I'T 0+ 220 N T8Z 0 S300 14070 292°0 660°0 £92°0 多 9 媳 'Z 662'T © SO GUTS 8605 .182°2 9N 8 : 0ZO N 6ST ‘T 860°0 901°0 Sh°0 160°0 TEéP‘o N LSL°0 LOG ‘TI: Le 90TFOS=] 260% 条 TO EGz0'0 Z +020 AK OLS °2 Lev‘O = POS 0-~—s TO LE ‘0 6L 0 N 08h 0 26 ‘1 Tee O = Toso. ae ME TZ" €N € + 810 A 010 7 990°0 ¥80°0 8IT0 P00 160°0 K LE “2 964‘T =e507007 SIE. “SOs -到 9520 0+ 020 N 810 ‘I 1820 €82'0 = S6h'0 S820 LEO N 6EL “I 912 "I JE Bet et iGELT’O 9N 8 :8ID N 669 '0 99 水 TCR ELZ RE SF 9 = WEG “PT N 969 ‘0 O74 和 9 99j75Z 9N 2: 81D N 290 ‘T LO = HELO B9NT = ZB 0 ERT AK 60 °€ 9€€ “I egpro., Set‘. Sel 69 人 ET LN 1+ 810 N 962 ‘0 610'b I8h'F /2698 €09°E 29 “LE 4 S09 "€ teal. 266i 1 Ee Gez70r © ES PF” AH90"zT 6N 1: 810 N 086 ‘T LOOT 860° Tt6"h 286°0 96°F N Lvl ‘0 TXT sreat 9 ESOT 0:8I0 N S06 '0 OLEST as “ELF 1 ca viel mer x TZ8 2 Vig'Ts Meese ome BL 0 «S827 'T 1910 N LEE “1 188° SO8b 881'82 s90°S 9T8 62 N 828 ‘0 292 ‘I GS'I 21S°92 666°S €2°SZ 0:919 N camel 62050 ZERO o> -B68°0.. SFL‘O. 896"0 N 661 ‘0 2801: 5 9G00"°= -Z1z70 80°0. “602 °0 0 : 91ID K TFT ‘¥ 690°l S9T'T 8h'E 66°0 189°2 x 120 ‘2 608 T. +e210"0.- BLE"0. REPO 二 27970 0 :fID A 868 'Z QET‘T SOP‘T SIFT #280 6h ‘0 N 6bP ‘0 992 民 18070 €S0°0 96€°0 620°0 0: 210 ($0 ‘0=”) ARG Whe Ra HW (50'0=) ZU4 He BMY Wes 7 ry 7 Ky gene WEE Ha iii {x He Wi We Oo Habit {x Het aA BH 2d Sl Set Hk ll (3 2G (SY tpl get =i le git a gr eh quiere . Cn oO on (eicosapentaenoic acid), JF BARR PA — +h AMM (eicosapentaenoic acid), —+ BRIN IR (DHA) (docosahexaenoic acid), BEAR FR ASTHM (oleic acid) 、 二 十 二 碳 五 K#i¥@ (docosapentaenoic acid) 可 能 与 分 类 有 着 更 密切 的 联系 。 另 外 ,上 检验 的 结果 也 得 到 了 类 似 的 结果 。 与 其 他 几 个 组 分 中 的 脂肪 酸 相 比 , 几 乎 所 有 甘油 三 酸 酯 中 的 脂肪 酸 都 只 得 到 了 很 低 水 平 的 方差 权重 , 这 意味 着 在 本 研究 中 , 它 们 只 有 很 差 的 分 类 能 力 。 这 与 之 前 的 预 分 析 结果 一 致 。 因 此 , 在 之 后 的 分 析 中 不 再 考虑 甘油 三 酸 酯 中 的 脂肪 酸 数据 。 从 表 11-12 还 可 以 看 出 , 与 其 他 组 分 中 的 脂肪 酸 相 比 , 磷 脂 中 的 脂肪 酸 有 着 更 高 的 方差 权重 , 似 乎 意味 着 其 拥有 更 好 的 分 类 能 力 。 然 而 由 于 在 糖尿 病 患者 和 健康 对 照 组 间 两 者 的 标准 偏差 有 较 大 的 不 同 , 导 致 两 类 样本 呈现 明显 不 同 的 分 布 〈 图 11-14C) 。 在 这 样 的 情况 下 , 应 用 线性 统计 判别 方法 (LDA) 将 导致 分 布 更 分 散 的 类 别 〈 糖 尿 病 患者 ) 的 样本 非常 容易 被 认为 是 分 布 相对 集中 的 类 别 〈 健 康 对 照 组 ) 。 按照 前 文 所 述 的 单 变 量 和 多 变量 混合 的 特征 提取 策略 , 表 11-11 给 出 了 选择 的 变量 的 子 集 。 将 这 些 子 集 组 合 在 一 起 , 生 成 了 有 10 个 脂肪 酸 组 成 变量 的 新 的 数据 集 , 这 些 脂肪 酸 对 区 分 糖尿 病 患者 和 正常 对 照 更 有 利 。 11.4.2.3 RAR # 11-13 给 出 了 分 类 的 结果 。LDA 正确 地 区 分 了 样本 中 的 96. 2%, 灵 人 敏 度 和 特异 性 分 别 为 85. 3% 和 90.9%. ANN 得 到 了 略 高 于 LDA 的 结果 , 特 别 是 使 用 单 分 裂 方法 (single splitting) 时 。 表 11-13 ”特征 选择 后 LDA 和 ANN 的 评价 结果 方法 识别 率 预测 率 灵敏 度 特异 性 LDA 96.2% (75/78) 88.5% (69/78) 85. 3% (29/34) 90.9% (40/44) ANN 留 n 法 97.4% (76/78) 89.7% (70/78) 88.2% (30/34) 90.9% (40/44) 单 分 裂 法 96.2% (50/52) 96.2% (25/26) 90.9% (10/11) 93.75% (14/15) 尽管 LDA 和 ANN 得 到 了 稍 有 不 同 的 分 类 结果 , 但 是 它们 在 本 节 的 实例 中 都 显示 出 了 很 强 的 分 类 能 力 。 这 可 能 是 由 于 在 特征 的 提取 步骤 中 采用 了 线性 的 统计 方法 导致 的 。 同 时 , 可 以 得 出 结论 : 血清 的 脂肪 酸 组 成 和 2 型 糖尿 病 可 能 存在 着 某 种 线性 关系 。 11.4.2.4 FRE # 11-13 也 给 出 了 使 用 leave-n-out 和 单 分 裂 方法 (ANN 中 使 用 ) 计算 的 评价 结 果 。 无 论 LDA 还 是 ANN ABBE TSMR, AHA 88.5%, 89.7%, 96.2%. 模型 的 识别 率 和 预测 率 没 有 太 大 的 不 同 , 说 明 没有 发 生 经 常 影响 有 师 监 督学 习 模型 的 过 拟 合 现象 。 11.4.2.5 与 原始 数据 的 比较 为 了 验证 选择 的 特征 〈 变 量 ), 原 始 数据 也 用 LDA 和 ANN 进行 了 处 理 。 表 11-14 给 出 了 处 理 的 结果 。 与 表 11-13 相 比 , 可 以 看 出 经 过 特征 选择 , 尤 其 是 LDA 方 法 , 能 e 310 - la ig, Se SE, EE ee <> 够 得 到 更 好 的 结果 。 这 说 明 对 于 LDA 来 说 , 特 征 选择 是 十 分 必要 的 , 而 对 于 ANN FF 法 来 讲 , 由 于 其 强大 的 分 类 能 力 , 受 特征 选择 的 影响 很 小 。 表 11-14 ”原始 数据 经 LDA 和 ANN 处 理 后 的 评价 结果 方法 预测 率 灵敏 度 特异 性 LDA, 单 分 裂 法 65.4% 36.4% 65.0% ANN, 单 分 裂 法 80. 8% 90.9% 91.67% 小 结 在 本 节 的 研究 中 , 建 立 了 针对 血清 中 脂肪 酸 的 毛细 管 气相 色谱 代谢 靶 标 分 析 平 台 , 并 有 效 的 区 分 了 2 型 糖尿 病 患者 和 健康 对 照 组 。 结 果 表 明 , 通 过 使 用 一 元 和 多 元 统计 技 术 , 可 以 选择 一 组 脂肪 酸 的 子 集 得 到 较 好 的 分 类 结果 。 该 方法 将 有 助 于 2 型 糖尿 病 患 者 的 标志 物 发 现 和 发 病 机 制 方面 的 研究 。 实际 上 , 这 里 只 是 4 个 关于 代谢 组 学 用 于 糖尿 病 研究 的 具体 例子 。 由 于 糖尿 病 的 发 生发 展 必定 与 脂 类 的 代谢 紊乱 相关 , 所 以 类 脂 组 学 〈lipidomics) 的 研究 非常 重要 , 有 兴趣 的 读者 可 参看 第 8 章 。 SM [1] Ruilope L M, Segura J. 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HRC & CC. , 1991, 14: 433 « 312 « 第 12 章 代谢 组 学 在 营养 学 研究 中 的 应 用 营养 学 是 一 门 研究 人 体 的 营养 规律 及 改善 措施 的 科学 。 作 为 一 门 研究 食物 与 健康 之 间 关 系 的 学 科 , 营 养 学 在 医学 体系 中 一 直 占 有 重要 的 地 位 。 合 理 的 饮食 调配 不 仅 有 益 于 身体 健康 , 而 且 可 以 早期 预防 一 些 疾病 的 发 生 , 从 而 提高 人 们 的 生活 质量 "~” 。 随 着 现 代 分 析 技 术 的 不 断 发 展 , 代 谢 组 学 通过 对 体液 中 或 组 织 中 的 代谢 物 的 分 析 , 不 但 提供 了 一 个 了 解 机 体内 物质 代谢 途径 及 其 调控 的 机 制 的 重要 研究 平台 “ ” , 也 为 营养 学 提供 了 新 的 研究 方法 , 即 通过 代谢 组 学 方法 研究 食物 中 各 种 营养 物质 、 生 物 活性 物质 的 摄 人 对 于 机 体内 代谢 途径 的 影响 、 干 预 , 同 时 也 可 以 通过 代谢 组 学 的 方法 来 评估 营养 的 摄 人 过 程 〈 包 括 肠 道 菌 群 的 作用 ) 及 环境 、 行 为 等 因素 所 带 来 的 健康 影响 ” 。 本 章 从 代谢 组 学 的 不 同 研究 层次 出 发 , 简 要 介绍 代谢 组 学 的 技术 方法 在 营养 学 研究 的 不 同 领域 中 的 应 用 。 12.1 fast 传统 的 营养 学 研究 的 内 容 包括 机 体 对 营养 的 需要 、 饮 食 营养 成 分 的 生物 学 功能 及 营 养 与 健康 之 间 的 关系 等 。 其 中 对 于 营养 成 分 功能 及 对 于 健康 的 影响 的 探讨 多 是 利用 营养 物质 的 纯 品 通过 体外 实验 来 研究 进行 的 。 然 而 , 在 我 们 日 常 摄 和 人 的 食物 中 的 营养 物质 不 仅 种 类 繁多 , 而 且 成 分 复杂 , 这 些 物 质 满足 着 机 体 不 同 的 需求 : 能 量 物质 的 摄 和 人 、 各 种 微量 元 素 的 获取 、 各 种 体内 无 法 合成 的 物质 的 吸收 等 , 并 且 同 疾病 的 发 生 、 发 展 有 着 密 不 可 分 的 联系 。 例 如 , 对 细胞 分 化 、 凋 亡 及 细胞 周期 的 影响 , 对 DNA 修复 的 调控 , 对 各 种 激素 分 泌 的 调节 , 对 致癌 物质 代谢 的 作用 及 在 炎症 应 答 中 的 作用 等 〈 图 12-1)。 可 是 , 由 于 机 体内 环境 的 复杂 性 , 我 们 对 所 摄 人 的 营养 物质 的 功能 、 与 机 体 之 间 的 作用 、 相互 之 间 的 影响 等 尚未 有 一 个 完整 的 认识 。 随 着 系统 生物 医学 的 发 展 , 现 代 的 营养 学 更 加 注重 于 如 何 通 过 饮食 的 调节 来 使 机 体内 环境 平衡 , 以 预防 疾病 的 发 生 。 因 此 , 在 对 食 物 中 的 一 些 确切 的 营养 成 分 的 功能 进行 单独 研究 的 同时 , 也 需要 一 种 能 够 从 整体 的 、 系 统 的 角度 了 解 食物 与 机 体 相互 作用 的 研究 方法 。 在 后 基因 组 学 时 代 里 , 转 录 组 学 、 和 蛋白 组 学 及 代谢 组 学 等 研究 平台 都 在 不 同 层次 上 为 营养 学 的 研究 提供 了 新 的 技术 平台 , 以 探 索 食物 中 的 生物 活性 物质 对 于 基因 表 型 的 影响 。 基因 组 学 的 研究 表明 : 个 体 间 基因 的 千差万别 是 导致 不 同 个 体 对 营养 的 不 同 需求 的 决定 性 因素 , 基 因 决 定 了 不 同 的 个 体 对 各 种 营养 物质 的 吸收 、 转 化 及 代谢 的 潜在 能 力 。 基因 组 差异 的 通常 的 表现 为 单 核 苷 酸 多 态 性 " , 即 在 DNA 序列 内 的 单个 碱 基 的 变化 。 可 以 说 , 基 因 多 态 性 是 各 种 生命 形式 之 间 差 异 的 根源 。 基 因 多 态 性 在 营养 相关 的 疾病 中 的 表现 已 有 相关 的 报道 ”… 。 在 营养 性 相关 疾病 的 研究 中 , 基 因 水 平 上 的 变异 可 能 是 其 中 一 些 疾病 发 生 的 根本 原因 。 由 于 基因 对 生命 过 程 的 调控 是 通过 它 所 表达 的 蛋白 质 来 最 终 实现 的 , 蛋 白质 组 学 可 以 通过 对 和 蛋白质 的 表达 状态 的 研究 来 探索 营养 物质 与 机 体 的 相 .313 + 细胞 生长 周期 av. é / ) ; 图 12-1 “食物 中 的 活性 成 分 与 基因 及 疾病 的 发 生 过 程 的 关系 四 互 作用 及 其 调控 机 制 , 是 目前 营养 学 研究 的 重要 平台 。 与 基因 组 学 、 蛋 白质 组 学 相 比 , 代谢 组 学 的 研究 通过 表征 体液 、 组 织 内 的 代谢 物 浓 度 的 变化 清晰 地 反映 出 机 体内 的 代谢 途径 已 经 发 生 的 变化 轨 , 在 反映 疾病 的 发 展 状态 , 尤 其 是 研究 营养 物质 的 代谢 方面 更 加 具有 优势 。 许 多 多 病因 性 疾病 〈 如 糖尿 病 、 肿 瘤 等 ) 发 生 、 发 展 的 过 程 往 往 十 分 漫长 , 基因 及 基因 表达 产物 的 变化 及 它们 与 环境 的 相互 作用 等 因素 , 共 同 导 致 疾病 的 发 生 及 发 展 。 上 述 的 几 种 组 学 可 以 从 不 同 的 水 平 上 对 疾病 的 发 生 过 程 进 行 监控 , 从 而 来 实现 对 疾 病 的 预防 、 早 期 发 现 及 干预 等 目标 〈 图 12-2) 。 对 于 营养 学 研究 而 言 , 食 物 中 的 生物 活 性 物质 的 吸收 、 转 化 及 降解 等 代谢 过 程 是 其 主要 的 研究 目标 , 尤 其 是 一 些小 分 子 的 营养 物质 , 如 氨基 酸 、 类 脂 、 维 生 素 等 。 这 些 都 与 代谢 组 学 的 研究 内 容 相 吻 合 。 可 以 说 , 代 谢 组 学 为 营养 学 的 研究 提供 了 一 个 系统 生物 学 水 平 上 的 视角 及 一 个 全 新 的 研究 的 平台 。 利用 代谢 组 学 的 研究 方法 从 整体 的 角度 评估 个体 的 饮食 习惯 、 营 养 状况 及 不 同 的 食物 成 分 等 与 慢性 疾病 的 发 生 之 间 的 关系 , 研 究 探索 体内 代谢 途径 的 改变 ,已 经 在 营养 学 的 研 究 实 践 中 得 到 了 广泛 的 应 用 。 12.2 代谢 组 学 全 组 分 分 析 在 营养 学 中 的 应 用 在 代谢 组 学 研究 的 4 个 不 同 的 层次 中 , 以 代谢 组 学 “全 组 分 分 析 ” 的 方法 在 营养 学 研究 的 应 用 最 为 广泛 , 而 针对 特定 目标 化 合 物 的 刘 标 分 析 及 针对 某 一 类 物质 的 代谢 轮 廓 分 析 也 有 许多 相关 的 报道 。 在 营养 学 研究 中 , 系 统 的 研究 机 体 代 谢 途 径 中 的 小 分 子 一 直 是 其 主要 的 研究 方向 。 以 前 由 于 技术 的 限制 , 营 养 学 家 只 能 对 少数 的 营养 物质 的 活性 。314。 图 12-2 ”功能 基因 组 学 平台 用 以 研究 食物 中 的 营养 成 分 同 基 因 表 达 过 程 , 以 及 疾病 发 生 的 关系 成 分 进行 分 析 , 判 断 其 对 细胞 功能 的 影响 及 与 疾病 的 发 生 之 间 的 可 能 关系 等 。 随 着 现代 分 析 手 段 的 不 断 进 步 , 同 时 、 大 量 的 分 析 体 液 或 组 织 内 的 小 分 子 化 合 物 成 为 可 能 , 这 个 新 的 研究 领域 也 就 是 我 们 所 说 的 “代谢 组 学 ”。 可 以 说 , 代 谢 组 学 与 营养 学 研究 之 间 的 关系 非常 密切 。 在 过 去 的 10 年 中 , 通 过 连续 地 测量 体液 中 复杂 的 代谢 物 浓 度 , 代 谢 组 学 实现 并 很 好 地 完成 了 对 食物 及 营养 在 复杂 的 机 体内 环境 下 所 发 挥 的 作用 的 评估 5 。 有 许多 科学 家 都 对 人 体 或 者 动物 体内 的 代谢 同 食物 之 间 的 关系 进行 了 深 入 的 探讨 。 这 样 , 科学 家 们 就 可 以 从 代谢 的 角度 去 解释 食物 的 营养 同人 体 健 康之 间 的 关系 。 12.2.1 代谢 组 学 用 于 食物 和 营养 对 机 体 影 响 的 评价 最 早 发 表 的 对 于 食物 作用 的 代谢 评价 起 始 于 1984 年 ,Bales 等 利用 核磁 共振 谱 分 析 了 饥饿 及 剧烈 运动 后 研究 对 象 的 尿 样 "”。 结 果 表 明 , 激 烈 运动 后 人 尿 中 的 乳酸 明显 升 高 , 而 饥 狐 的 时 候 人 尿 中 的 酮 体会 显著 升 高。 在 随后 的 20 年 里 , 代 谢 组 学 的 概念 在 毒 性 及 药物 的 研究 等 领域 得 到 了 迅速 的 发 展 , 在 对 体液 进行 “全 组 分 ”分 析 的 基础 上 , 通 过 化 学 计量 学 的 应 用 , 可 以 在 整体 上 对 药物 作用 的 效果 、 毒 性 等 加 以 评价 , 并 且 可 以 作 为 诊断 疾病 及 判断 预后 的 一 个 工具 。 而 食物 及 其 营养 成 分 与 人 体 的 作用 过 程 与 药物 的 作 用 过 程 十 分 类 似 , 因 而 代谢 组 学 全 分 析 的 方法 也 很 快 应 用 到 食物 及 营养 的 作用 评价 中 。 12.2.1.1 评价 不 同 的 饮食 习惯 所 带 来 的 代谢 组 差异 代谢 组 学 全 组 分 分 析 的 方法 可 以 用 来 判断 由 不 同 的 饮食 习惯 所 对 应 的 不 同 代谢 表 型 , 这 也 是 代谢 组 学 方法 应 用 于 营养 学 研究 的 代表 性 的 研究 之 一 。Stella 等 在 2006 年 发 表 了 利用 核磁 共振 的 代谢 组 学 分 析 来 判断 素食 者 、 少 量 肉 食 者 及 大 量 肉食 者 之 间 的 代 谢 表 型 的 差别 ””] 。 西 方 的 饮食 结构 常常 是 以 红 肉 为 主 , 而 蔬菜 、 水 果 、 腾 食 纤 维 的 摄 . 315 + 入 量 相对 较 少 , 这 往往 也 是 许多 慢性 疾病 的 根源 , 如 高 血压 、 糖 尿 病 、 心 脑 血 管 疾病 及 癌症 等 。 相 比 之 下 , 素 食 者 的 血糖 、 血 脂 等 临床 指标 就 会 相对 好 很 多 。 可 见 饮食 习惯 与 疾病 的 关联 是 显而易见 的 。 但 是 , 某 些 营 养 物质 对 于 健康 的 保护 机 制 尚 有 待 于 深入 研 究 一 一 这 也 是 营养 学 研究 的 重要 领域 。 通 过 代谢 组 学 的 方法 可 以 实现 对 具有 不 同 饮 食 习 惯 的 人 群 的 代谢 表 型 进行 分 类 判断 与 评估 。 所 谓 的 代谢 表 型 , 其 定义 为 :“ 对 生物 体 在 某 一 生理 条 件 下 , 依 据 对 细胞 、 体 液 或 组 织 的 分 析 数 据 所 进行 的 多 参数 系统 描述 ”09 在 Stella 等 的 研究 中 , 选 取 了 12 名 健康 的 、 年 龄 为 25 一 74 岁 的 男性 作为 研究 对 象 , 食 物 摄 和 人 的 质 和 量 都 受到 严格 的 控制 。 所 有 的 受 试 者 分 别 接受 3 PPR, AERA. DS 肉食 及 大 量 肉食 。 每 种 食谱 15 天 , 从 第 10 天 开始 , 收 集 受 试 者 的 24h PREF, BETTE 共振 的 分 析 。 所 得 的 数据 利用 主 成 分 分 析 (PCA) 的 方法 进行 分 析 。 在 PCA 分 析 结 果 中 , 可 以 看 到 , 在 这 项 研究 中 , 个 体 差异 还 是 占 主 要 地 位 的 , 不 同 的 个 体 在 不 同 的 食谱 之 下 所 产生 的 代谢 组 变化 是 不 同 的 。 但 是 , 当 去 除了 个 体 差 异 之 后 , 高 肉食 组 同 素食 组 间 的 代谢 组 差异 就 显现 出 来 了 : 高 肉食 组 尿 液 中 的 肌 苷 、 肉 碱 、 牛 磺 酸 、 氧 化 三 甲 胺 、 甲 基 组 氨 酸 等 物质 呈现 升 高 的 趋势 。 其 中 肉 碱 、 甲 基 组 氨 酸 等 物质 在 更 早 的 报道 中 可 以 作为 食谱 中 肉 类 含量 的 标志 物 。 当 采用 OPLSDA 〈 正 交 偏 最 小 二 乘法 判别 分 析 ) 的 方 法 进行 数据 处 理 的 时 候 , 不 同 食谱 的 人 群 得 到 很 好 的 区 分 , 尤 其 是 素食 组 与 高 肉食 组 之 间 。 通 过 分 析 , 可 以 发 现 肌 酸 / 肌 苷 在 高 肉食 者 的 尿 内 明显 的 升 高 。 可 以 据 此 推断 , 尽 管 肌 酸 的 分 泌 取决 于 体重 , 但 是 每 日 援 人 的 肉食 量 还 是 对 肌 酸 的 排泄 量具 有 明显 的 影 响 。 同 时 该 研究 还 发 现 , 肉 碱 及 甲 基 肉 碱 在 高 肉食 者 的 尿 液 内 也 明显 的 高 于 素食 者 。 因 为 肉 碱 是 长 链 脂肪 酸 转运 的 重要 辅助 因子 , 而 肉食 又 是 外 源 性 的 肉 碱 的 主要 来 源 , 因 此 , 严 格 素食 者 的 肉 碱 可 能 会 有 一 定 的 短缺 , 同 时 , 内 源 性 肉 碱 合 成 的 增加 , 也 可 能 进 一 步 导 致 一 些 营 养 因 于 的 缺乏 。 在 素食 者 组 中 , 该 研究 发 现 了 羟基 葵 乙 酸 这 种 标志 性 的 代谢 物 。 这 种 物质 虽然 是 食物 中 的 酷 氨 酸 的 代谢 产物 , 但 并 非 来 源 于 人 体 自身 的 代谢 途径 , 而 是 由 肠 道 菌 群 代 谢 所 产生 的 。 在 素食 者 的 尿 液 中 有 另 一 种 化 合 物 一 一 N ,N ,N -三 甲 基 赖 氨 酸 (ITML) 出 现 了 明显 的 缺乏 , 这 是 因为 ,TML 是 真 核 生物 内 源 性 肉 碱 合成 的 主要 化 合 物 , 由 于 素食 者 外 源 性 肉 碱 援 人 的 不 足 , 导 致 内 源 性 肉 碱 合 成 的 增加 , 从 而 使 TML 的 消耗 增 加 , 引 起 尿 中 的 TML 减少 。 该 代谢 途径 如 图 12-3 所 示 。 通过 对 于 尿 液 中 代谢 物 的 分 析 , 不 同 的 营养 条 件 对 正常 人 群 代谢 组 的 影响 可 以 通过 代谢 组 学 的 方法 得 到 系统 的 展现 : 代谢 组 学 不 仅 可 以 通过 尿 样 的 代谢 轮廓 分 析 区 分 不 同 食谱 下 人 和 群 的 代谢 表 型 , 而 且 可 以 从 其 中 纷繁 复杂 的 代谢 组 中 找 出 与 不 同 食谱 相关 的 特 征 性 的 代谢 物 , 并 且 可 以 通过 相关 代谢 途径 的 研究 推测 体内 的 相关 生理 学 变化 。 通 过 这 项 研究 , 代 谢 组 学 表现 出 其 在 营养 学 的 研究 中 具有 极 大 的 潜力 与 应 用 前 景 。 12.2.1.2 食物 中 生物 活性 成 分 与 机 体 的 相互 作用 在 机 体 所 必需 的 营养 物质 中 , 许 多 都 是 只 能 由 食物 供给 而 机 体 所 不 能 合成 的 , 如 必 需 氨 基 酸 、 必 需 脂 肪 酸 等 。 这 类 物质 的 代谢 及 与 机 体 的 相互 作用 的 研究 也 是 营养 学 研究 中 的 重要 课题 。Griffin 等 利用 代谢 组 学 的 方法 研究 运动 神经 元 退行 性 变 的 小 鼠 模型 由 FHA RA E 的 摄 人 量 不 同 而 引起 的 系统 代谢 组 变化 。 通 过 对 小 鼠 血 液 的 NMR 代谢 - 316 。 变形 杆菌 梭 菌 WHEAZ ME Rie AR 对 甲 酚 2- 戊 二 酸 RAR B +O +CO2 Ni- 三 甲 基 赖 氨 酸 抗坏血酸 盐 3-KE-N-= PRM 1 2 1. Nc- 三 甲 基 赖 氨 酸 羟 化 酶 2. 3- 羟 基 -N<- 三 甲 基 赖 氨 酸 醛 缩 酶 oe 3. 4-N- 三 甲 基 氨 丁 缩 醛 脱 气 酶 4. 信 丁 内 胺 羟 化 酶 4-N- 三 甲 基 氨 丁 缩 醋 _NAD* 3 NADH+H* RAR 2-H RR +CO: +O2 L- 肉 碱 抗坏血酸 盐 YT ARE 4 图 12-3 BAMRBRE (AD ALAMARRHB (Bo RRA, HRANKRRERE RE BRENS RRA IR, Ba. SLE 等 物质 明显 升 高。 而 在 模型 的 脑 提取 物 中 , 有 羟基 丁 酸 盐 、 牛 磺 酸 、 谷 氨 酸 盐 、 葵 两 所 BSW, MALT. KAR. SAB. RET RSW EK. 食物 中 的 维生素 下 与 机 体内 小 分 子 物 质 代谢 的 关系 可 以 通过 代谢 组 学 的 方法 系统 的 体 现 出 来 。 由 于 运动 神经 元 退行 性 变 是 儿童 时 期 一 种 比较 常见 的 改变 , 代 谢 组 学 的 方法 可 以 通过 对 体液 的 分 析 来 判别 这 种 维生素 缺乏 的 发 生 , 并 可 以 在 疾病 标志 物 的 研究 上 提供 新 的 线索 。 而 对 于 另外 的 一 些 人 体 非 必需 的 食物 活性 成 分 , 如 表 儿 茶 酸 , 一 种 在 绿茶 、 可 可 和 巧克力 中 广泛 存在 的 植物 类 黄酮 物质 ,Solanky 等 利用 老鼠 模型 对 这 一 类 物质 的 作用 进 . 317 , 行 了 研究 ""] 。 通 过 在 鼠 的 饮水 中 添加 表 儿 茶 酸 , 随 即 对 鼠 尿 进行 代谢 组 学 轮廓 分 析 , 结果 发 现 了 柠檬 酸 、 二 甲 胺 等 物质 浓度 的 升 高 , 并 将 结果 解释 为 饮食 中 的 多 酚 对 肾 功能 及 能 量 物质 代谢 的 影响 。 这 一 研究 利用 了 代谢 组 学 的 方法 深入 探讨 了 食物 中 的 多 酚 类 物 质 对 于 机 体 代 谢 的 潜在 影响 。 对 于 食物 中 活性 成 分 与 机 体 间 相互 作用 的 研究 在 营养 代谢 组 学 中 的 应 用 也 见于 许多 FA SCRE 。 12.2.1.3 食物 卡路里 摄 入 的 限制 对 动物 代谢 组 影响 的 评价 为 生物 体 的 活动 提供 能 量 是 食物 的 主要 功能 , 而 且 卡 路 里 摄 和 人 也 是 营养 学 研究 的 领 域 之 一 。Selman 等 通过 对 血浆 代谢 组 学 的 研究 , 评 估 了 和 急性 卡路里 限制 援 和 人 的 过 程 对 C57BL/6 模型 鼠 的 代谢 影响 2 。 在 实验 的 设计 上 , 选 取 20 只 C57BL/6 鼠 为 研究 对 象 。 在 14 周 之 前 这 些小 鼠 的 在 相同 的 条 件 下 喂养 , 包 括 恒定 的 温度 、 固 定 的 日 夜 节律 、 定 量 的 食物 摄 人 等。 在 14 周 之 后 , 将 实验 鼠 分 为 两 组 , 即 限制 卡路里 摄 人 组 (caloric re- striction, CR) 和 对 照 组 (ad-libitum, AD). M14 周 开 始 ,CR 组 的 能 量 摄 人 每 周 减 少 10%, 直 到 CR 组 的 能 量 摄 人 达到 对 照 组 的 30%% 的 时 候 , 将 老鼠 处 死 , 取 得 血液 样 本 进行 检测 。 取 血 前 对 模型 鼠 不 采取 禁 食 , 以 避免 由 于 急性 的 饥饿 状态 带 来 的 干扰 。 血 浆 以 NMR 进行 代谢 组 学 轮廓 分 析 。 通过 转录 组 学 的 研究 发 现 ,CR 组 的 基因 在 脂肪 代谢 、 脂 肪 酸 合 成 、 氧 化 及 糖 异 生 等 方面 的 表达 都 发 生 了 明显 的 变化 〈 图 12-4) 。 而 代谢 组 学 的 研究 则 表明 , 血 液 中 的 乳 酸 、3- 羟 基 丁 酸 、 胆 固 醇 及 低 密度 脂 蛋 白 在 CR 组 都 有 明显 的 升 高 。 另 外 , 包 括 血 清 肌 苷 、 一 些 生 糖 氨基 酸 等 代谢 物 的 浓度 也 有 增加 的 表现 。 上 述 所 有 的 代谢 物 变化 都 表明 , 体内 代谢 的 改变 都 是 朝 着 能 量 转换 及 糖 异 生 的 方向 进行 的 。 同 时 , 对 基因 表达 的 研究 也 同时 表明 , 在 肌肉 组 织 及 肠 组 织 内 , 基 因 表 达 也 朝 着 不 利于 细胞 增殖 的 方向 发 展 , 机 体 通过 对 基因 表达 及 代谢 的 调控 来 维持 机 体能 量 代谢 的 平衡 。 通 过 这 个 研究 , 代 谢 组 学 很 好 地 解释 了 短期 的 卡路里 的 摄 人 限制 对 体内 代谢 物 变化 的 影响 , 并 结合 转录 组 学 的 研 究 , 很 好 地 展现 了 机 体 在 能 量 摄 人 不 足 的 时 候 整 体 代 谢 途 径 的 转变 。 对 于 这 方面 的 研 究 ,Wang 等 还 利用 代谢 组 学 的 方法 评估 了 年 龄 及 卡路里 的 限制 摄 和 人 对 狗 的 代谢 组 学 的 eq) 。 12.2.1.4 全 胃 肠 外 营养 患者 的 代谢 组 学 研究 全 胃 肠 外 营养 是 治疗 某 些 严重 的 疾病 〈 如 肠 瘘 等 ) 的 重要 手段 。 肠 瘘 多 数 是 手术 后 的 并 发 症 〈 大 概 80%) 、 肠 道 疾病 、 外 伤 、 感 染 及 严重 的 胰腺 疾病 等 病因 所 导致 。 在 早 期 曾经 是 一 种 死亡 率 非 常 高 的 疾病 , 随 着 治疗 手段 的 不 断 进 步 , 主 要 是 营养 支持 治疗 的 不 断 发 展 , 死 亡 率 也 逐年 降低 , 但 仍然 是 一 种 危险 的 疾病 。 我 们 研究 组 利用 超 高 速 液 相 色谱 /飞行 时 间 质 谱 (UPLC/QTOF) 联 用 的 代谢 组 学 分 析 系统 分 别 对 肠 瘘 患者 的 血样 进行 代谢 组 学 的 研究 ”3 。 从 数据 的 PLS-DA 的 分 析 结 果 我 们 可 以 看 出 : ERASE 患者 之 间 在 血液 的 代谢 组 上 存在 着 明显 的 差异 。 通 过 SIMCA-P 软件 的 参数 “VIP” (variable importance in the projection) 我 们 分 别 从 正 负离子 数据 中 各 选 了 20 个 潜在 的 标记 物 , 对 于 其 中 经 过 上 检验 证 明 在 患者 与 正常 人 之 间 存 在 显著 差异 的 部 分 标记 物 进 行 » 313 * 急性 卡路里 摄 入 限制 在 体内 多 个 器 官 的 转录 及 代谢 应 答 促进 营养 吸收 改善 渗透 平衡 Co, fF Sma Arig 促进 食物 摄 入 分 解 代谢 促进 糖 异 生 ? 增加 胰岛 素 敏感 性 FER + 激素 介 导 的 信号 转 导 + 蛋白 质 / 脂 类 结合 | 钙 结 合 上 发 育 Te — — am v + 胆固醇 7 血浆 | 脂 类 (VLDL) | 谷 氨 酸 | 蛋氨酸 肌肉 + 脂肪 酸 代谢 NS + 蛋白 激酶 活性 调 a t MAPK 信 和 号 通路 + 节律 /周期 行为 | 运输 大 分 子 /蛋白 质 代谢 1 离子 平衡 | 类 脂 合 成 | 氨基 酸 / 氨 代谢 分 解 代谢 促进 糖 异 生 肝 糖 异 生 B 氧 化 增强 p 氧 化 增强 类 脂 合成 减少 ATP 产 生 增 加 图 12-4 不 同 组 织 对 限制 能 量 摄 和 人 的 转录 及 代谢 应 答 呈 鉴定 。 最 终 找 出 了 9 种 潜在 的 生物 标记 物 , 包 括 4 种 结合 型 胆汁 酸 、1 种 肉 碱 、2 种 氨 FER, WAR 2 种 溶血 磷脂 酰 胆 碱 等 。 我 们 将 全 部 的 31 个 标记 物 进行 PCA 分 析 , 并 将 它 们 的 浓度 变化 信息 及 相关 性 等 信息 加 入 , 如 图 12-5 所 示 。 在 患者 的 血清 内 , 色 氮 酸 及 葵 丙 氨 酸 的 含量 低 于 正常 人 , 因 为 这 两 种 氨基 酸 属于 必 需 氨 基 酸 , 只 能 从 食物 中 获取 , 不 能 体内 合成 , 因 此 我 们 可 以 发 现 患者 体内 的 营养 物质 吸收 的 不 足 还 是 普遍 存在 的 。 而 且 , 由 于 色 氨 酸 还 是 体内 重要 的 活性 物质 一 5- 凑 色 胺 的 前 体 物质 , 而 葵 丙 氨 酸 则 是 合成 酷 氨 酸 的 原料 〈 图 12-6), 后 者 是 体内 很 多 激素 的 合 成 的 原料 , 由 此 可 见 , 这 两 种 氨基 酸 的 缺乏 对 机 体 有 着 重要 的 影响 , 需 要 引起 足够 的 重 视 。 另 外 , 肉 碱 是 体内 脂肪 酸 合成 及 B 氧 化 的 重要 中 间 物 质 。 肉 碱 在 患者 体内 的 缺乏 则 可 能 预示 着 患者 体内 的 营养 物质 及 能 量 代谢 的 障碍 。 而 结合 型 的 胆汁 酸 常常 是 作为 肝脏 损伤 的 标记 物 , 我 们 发 现在 患者 体内 ,4 种 结合 型 的 胆汁 酸 的 异常 升 高 也 可 能 预示 着 串 者 体内 存在 肝 损 伤 。 虽 然 这 种 损伤 并 不 一 定 有 着 明显 地 临床 表现 , 但 是 , 如 果 不 加 以 关 注 , 也 可 能 造成 严重 的 后 果 , 如 器 官 系统 的 衰竭 等 。 通过 代谢 组 学 的 研究 可 以 发 现 , 代 谢 组 学 在 监控 机 体 的 营养 物质 代谢 方面 有 着 很 好 的 应 用 潜力 , 尤 其 对 于 全 胃 肠 外 营养 的 患者 来 说 , 代 谢 组 学 的 方法 对 于 营养 治疗 的 指导 或 者 大 官 功能 衰退 的 早期 发 现 都 具有 一 定 的 应 用 前 景 。 = S19 » A 负离子 模式 标志 物 肉 碱 心 正 离子 模式 标志 物 274 Pearson4 * Fr MAAN AIC, |>0.8 0.30 深 灰 :上 调 RAK: FA 0.20 367 339 So 10h tS RGAE OE Fr 3014 ae 255 A 0.00 HAR 色 氨 酸 碎 片 569 414@ E 8 RT ae 0.10 46253579 ER IER 205 牛 磺 胆 酸 223 of 498 an 12 -0.10 0.00 0.10 0.20 PC[1] 图 12-5 ae he} TNE RRO AO 5- 羟 基 -L- 色 氢 酸 N- 甲 酰 犬 尿酸 3- 羟 基 -L- 犬 尿酸 3- 羟 基 犬 尿 胺 A126 ” 色 氨 酸 及 苯 丙 氨 酸 的 代谢 途径 2] 12.2.2 肠 道 菌 群 与 宿主 的 相互 作用 作为 一 个 复杂 的 生物 体 , 人 类 肠 道内 还 有 许 许 多 多 的 微生物 一 一 通常 被 称 作 肠 道 菌 群 。 这 些 与 人 类 共生 的 细菌 同 机 体 之 间 相 互 依存 , 很 多 研究 表明 , 肠 道 菌 群 的 代谢 与 人 体 的 代谢 有 着 密切 的 联系 。 而 食物 对 于 肠 道 的 微生物 环境 有 着 极 大 的 影响 , 同 时 , 肠 道 微生物 的 状态 也 影响 着 食物 中 活性 成 分 的 吸收 及 人 代谢。 因此, 研究 肠 道 微生物 与 宿 主 之 间 的 关系 就 显得 尤为 重要 。 代 谢 组 学 在 这 个 研究 中 可 以 发 挥 重 要 的 作用 , 尤 其 是 以 尿 液 为 研究 对 象 时 , 肠 道 微生物 与 宿主 间 的 代谢 作用 产物 可 以 通过 代谢 组 学 的 研究 反映 出 来 。 Nicholls 等 “5 以 无 菌 小 鼠 为 对 象 , 在 实验 室 条 件 下 , 模 拟 了 鼠 肠 道内 微生物 环境 。 320 + 的 形成 过 程 , 并 以 基于 NMR 的 代谢 组 学 平台 对 不 同时 间 点 的 尿 样 加 以 分 析 。 代谢 组 学 的 研究 结果 表明 , 在 无 菌 鼠 肠 道 菌 群 形成 过 程 中 ,在 21 周 左右 鼠 尿 内 的 排泄 物 已 经 基本 接近 普通 非 无 菌 鼠 的 水 平 了 〈 图 12-7)。 代 谢 物 的 浓度 也 表现 出 了 开始 阶段 3- 羟 基 葵 丙 酸 的 及 后 期 马 尿酸 的 升 高 , 尤 其 是 TMAO 在 后 期 的 增加 , 可 以 据 此 将 其 推断 为 肠 道 菌 群 的 代谢 产物 。 通 过 代谢 组 学 的 研究 , 可 以 清晰 地 了 解 到 在 肠 道 菌 群 形 成 的 过 程 中 , 机 体 代 谢 及 同 微生物 相互 作用 后 的 共 代 谢 变化 。 微 摩尔 代谢 物 /h TO 上 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 y} 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 NY 4 [TITTTITTTIIT - PPI TILL OLLI LIED ELIZ SEO SA 1 2 AAAAAAAAAAAALAA RN ee TY a wien o-M RR 琥珀 酸 盐 氧化 三 甲 胺 3- 羟 基 丙 酸 马 尿酸 LAT 0~6h 回 6-24h 国 24-48h 四 4 天 BOK B9K BlI2 天 加 15 天 AK OK 图 12-7“ 尿 中 部 分 代谢 物 在 无 菌 小 鼠 肠 道 菌 群 形成 过 程 中 的 浓度 变化 相对 于 0 一 6h 的 显著 性 改变 以 * 标 出 [26] Dumas 等 进行 了 关于 肠 道 菌 群 与 宿主 的 共 代 谢 的 研究 2 1 。 在 老鼠 模型 中 , 低 脂 饮 食 与 高 脂 饮食 之 间 的 代谢 差异 可 以 通过 血浆 及 尿 液 的 代谢 组 学 研究 体现 出 来 , 而 且 饮 食 与 胰岛 素 抵抗 及 非 酒精 性 脂肪 肝 等 代谢 疾病 之 间 的 关系 也 得 以 从 代谢 的 角度 加 以 深入 探 讨 。 通 过 比较 鼠 血 中 的 三 脂 酰 甘油 及 胆 碱 的 水 平 , 及 食物 中 的 胆 碱 的 作用 等 因素 , 不 仅 找 出 了 传统 的 胰岛 素 抵抗 的 标志 物 , 如 高 血脂 、 高 血糖 及 磷脂 等 , 还 发 现 了 与 肠 道 菌 群 共 代 谢 产生 的 新 的 生物 标志 物 , 如 细菌 源 性 的 甲 胺 等 。 食 物 中 的 胆 碱 有 3 条 代谢 通路 , 包括 在 血液 内 转变 为 磷脂 酰 胆 碱 〈PC) 、 代 谢 为 肌 苷 等 经 尿 排 出 , 及 由 肠 道 微生物 代谢 产生 甲 基 胺 等 物质 , 再 经 尿 液 排出 。 肠 道 微 生物 对 胆 碱 的 利用 不 足 可 能 使 体内 的 胆 碱 来 源 不 足 , 从 而 引发 PC 的 合成 减少 , 直 接 导 致 极 低 密度 脂 蛋 白 CVLDL) 的 合成 不 足 , 而 后 者 是 三 脂 酰 甘油 (TG) 运输 到 肝 外 的 主要 载体 , 从 而 使 TG 在 肝 内 堆积 , 导 致 非 酒精 性 脂肪 肝 (NAFLD) 的 发 生 〈 图 12-8, 见 彩 版 )。 这 项 研究 表明 了 饮食 习惯 对 于 肠 道 微生物 的 影响 及 可 能 会 进一步 的 导致 NAFLD、 胰 岛 素 抵抗 等 慢性 疾病 的 发 生 。 3 129S6 HFD 脂肪 酸 TiMAOBALB/C HED i rene FRR EE \ a BALB/c HFD ae “ Mee 阳 肌 酸 栈 阳 肌 酸 激酶 脂肪 变性 , 非 、 酒精 性 脂肪 肝 12-8 甲 基 胺 在 体内 的 代谢 通路 CAD 和 甲 基 胺 可 能 的 肝 损 伤 途径 〈B) BALBlc 和 129S6 为 小 鼠 种 系 名 。LEFD: 低 脂 饮食 ,HFD: 高 脂 饮食 ,DMA: 二 甲 胺 ,TMA: = FRR; TMAO: 氧化 三 甲 胺 ,FMO3: 黄 素 单 胺 氧化 酶 。A 图 中 红色 方块 表示 正 相 关 , 绿 色 方 块 表示 负 相 关 [27] 12.3 代谢 轮廓 分 析 及 代谢 物 刘 标 分 析 在 营养 学 中 的 应 用 在 营养 学 的 研究 中 , 往 往 需要 对 某 几 种 重要 的 营养 物质 或 者 某 一 类 营养 物质 进行 分 析 , 而 代谢 轮廓 分 析 及 代谢 部 标 分 析 的 研究 平台 往往 能 够 在 这 方面 发 挥 重要 的 作用 。 例 如 , 对 于 氨基 酸 、 核 苷 、 脂 肪 酸 等 营养 物质 进行 的 代谢 物 靶 标 分 析 ” 2 , 及 针对 磷脂 等 物质 进行 的 代谢 轮廓 分 析 等 … ”2 , 这 方面 的 研究 对 于 代谢 组 学 及 营养 学 的 研究 来 说 都 是 比较 重要 的 内 容 , 我 们 在 前 几 章 的 内 容 中 已 经 做 了 详尽 的 介绍 , 本 章 就 不 再 缆 述 。 在 这 一 领域 国内 外 的 研究 小 组 已 经 开展 了 大 量 的 工作 , 包 括 发 展 了 代谢 组 学 的 重要 分 多 Val 1 Asn ; Trp Pod Lys F Phe : His i, Met Pro : 个 体 血 奖 Tyr 代谢 组 Arg 4 数据 Ala Ser i Glu 7 Gly : Thr ’ Gln Asp 图 12-9 CAMC 流程 示意 图 最 后 的 系统 树 状 图 来 源 于 对 于 体内 “〈 鼠 ) 18 种 氨基 酸 的 靶 标 分 析 所 得 B3] * 322 « 支 一 一 类 脂 组 学 等 〈 详 细 内 容 见 第 8 章 )。 另 外 , 在 应 用 于 营养 学 研究 的 靶 标 分 析 的 研 究 中 ,Noguchi 等 发 展 了 一 种 多 元 相关 性 聚 类 分 析 (〈cluster analysis of multivariate cor- relation,CAMC) 的 数据 分 析 方 法 5 , 如 图 12-9 所 示 , 通 过 对 各 种 氨基 酸 浓 度 的 分 析 及 它们 之 间 相 关 性 的 研究 , 可 以 对 食物 中 的 蛋白 质 消化 后 的 氨基 酸 的 吸收 、 人 合成、 分解 等 过 程 有 一 个 系统 的 理解 , 从 而 对 氨基 酸 的 合理 摄 和 人 进行 有 效 的 评估 。 划 标 分 析 的 另 一 个 特殊 运用 就 是 基于 示 踪 剂 的 代谢 组 学 研究 , 即 通过 对 示 踪 剂 (如 3C) 的 应 用 来 研究 代谢 通路 及 考察 代谢 流量 59 。 这 种 方法 虽然 由 来 已 久 , 但 是 结 合 代 谢 物 靶 标 分 析 及 代谢 组 学 研究 方法 , 在 营养 学 研究 , 尤 其 是 一 些 重要 营养 物质 的 代 谢 途 径 的 研究 可 以 发 挥 重要 的 作用 。 12.4 代谢 组 学 在 营养 学 研究 中 的 应 用 展望 营养 学 的 研究 一 直 着 眼 于 食物 中 的 活性 成 分 及 其 在 体内 的 代谢 过 程 及 与 机 体 间 的 相 互 作 用 , 其 中 小 分 子 代谢 物 在 营养 学 的 研究 中 占有 非常 重要 的 地 位 。 在 从 前 , 这 方面 的 研究 一 直 受 制 于 分 析 技 术 的 落后 , 随 着 分 析 仪 器 的 高 速 发 展 、 核 磁 共 振 、 质 谱 的 分 析 能 力 日 益 增 强 , 分 析 能 力 的 瓶颈 已 经 有 所 缓解 。 因 此 , 合 理 的 方法 学 平台 在 营养 学 的 研究 中 显得 尤为 重要 。 代 谢 组 学 作为 后 基因 组 时 代 重 要 的 系统 生物 学 研究 平台 , 在 营养 学 研 究 中 已 经 逐渐 显现 出 优势 。 尤 其 以 针对 体液 的 代谢 组 学 全 分 析 技 术 结 合 多 维 统计 分 析 的 方法 , 在 营养 学 研究 的 许多 方面 都 能 发 挥 重要 的 作用 。 对 于 人 体 来 说 , 影 响 机 体内 环境 稳定 的 因素 有 很 多 , 包 括 内 源 性 因素 和 外 源 性 因素 等 。 食 物 、 药 物 、 微 生物 、 运 动 等 都 是 影响 人 体 代 谢 组 稳定 的 重要 外 在 因素 汪 , 而 食物 及 其 相关 的 生活 方式 对 于 机 体内 环境 的 平衡 、 健 康 的 维持 显得 尤为 重要 。 食 物 由 于 含有 极其 复杂 的 成 分 , 并 且 每 种 成 分 有 可 能 在 体内 有 不 同 的 作用 靶 点 , 因 此 对 食物 中 的 营养 成 分 的 作用 评价 也 是 一 个 极其 复杂 的 过 程 。 而 这 方面 正 是 代谢 组 学 的 优势 所 在 , 即 以 系 统 的 角度 , 通 过 对 体液 的 代谢 组 进行 全 分 析 并 辅 以 相应 的 数据 分 析 方法 , 系 统 地 评价 食 物 对 于 机 体 的 影响 作用 。 当 应 用 于 疾病 的 研究 中 时 , 代 谢 组 学 所 选择 的 标志 物 往往 是 一 组 小 分 子 物 质 , 这 一 点 与 传统 的 有 关 标 志 物 的 观点 并 不 相同 。 这 样 , 代 谢 组 学 所 发 现 的 标志 物 组 不 仅 可 以 应 用 于 疾病 的 诊断 及 预后 判断 上 , 而 且 可 以 作为 机 体 代 谢 稳 态 的 一 个 多 参数 的 判断 指标 。 在 未 来 的 研究 中 , 代 谢 组 学 的 方法 可 能 更 多 地 用 于 某 些 疾病 的 营养 干预 治疗 的 疗 效 评价 之 中 。 在 中 欧 合作 的 TULIP 项 目 中 , 研 究 人 员 就 对 肥胖 和 胰岛 素 抵 抗 人 群 进行 饮食 及 生活 方式 的 干预 , 并 通过 代谢 组 学 的 方法 对 其 效果 进行 评价 。 基 于 代谢 组 学 在 药 物 的 毒性 及 疗效 的 评价 中 的 应 用 , 个 性 化 药物 的 概念 已 经 被 提出 ”, 。 同 样 在 营养 学 的 研究 过 程 中 , 个 性 化 的 营养 干预 也 是 未 来 的 一 个 重要 的 研究 方向 。 通 过 代谢 组 学 的 方法 对 具有 不 同 代 谢 表 型 的 个 体 进 行 个 性 化 的 营养 指导 , 将 可 能 会 成 为 今后 营养 代谢 组 学 研 究 的 重要 课题 。 SM [1] Rezzi S, Ramadan Z, Fay L B, Kochhar S. 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Nature, 2006, 440: 1073 e 325 « 第 13 RK ”代谢 组 学 与 约 物 研究 医药 科学 研究 的 是 疾病 的 发 生发 展 及 如 何 治疗 , 一 般 而 言 引 起 机 能 紊乱 的 内 外 因素 可 以 通过 3 个 层面 来 影响 机 体 , 作 用 于 基因 、 作 用 于 蛋白 质 或 直接 参与 机 体 的 生化 代 谢 , 不 论 通 过 何 种 途径 , 最 终 这 一 影响 会 通过 内 源 性 代谢 物 的 相对 比例 、 浓 度 表现 出 来 。 代 谢 组 学 因为 可 以 精确 而 全 面 地 测定 这 些 变化 而 在 医药 科学 领域 内 有 广阔 的 应 用 。 本 章 介 绍 的 是 代谢 组 学 在 药物 研究 开发 中 的 应 用 现状 、 特 点 及 前 景 。 13.1 药物 开发 现状 药学 科学 研究 的 最 终 目 的 是 不 断 开 发 出 用 于 疾病 诊断 、 预 防 及 治疗 的 药物 。 新 的 疾 病 不 断 发 生 , 现 有 的 许多 疾病 也 远 未 能 达到 彻底 治疗 , 人 们 为 了 健康 的 生活 , 迫 切 期 待 更 为 安全 有 效 的 新 药 。 近 20 年 , 生 命 科 学 的 迅速 发 展 也 使 人 们 对 于 预防 和 治疗 严重 疾 病 充 满 了 和 希望 。 然 而 , 药 物 研 发 的 效率 却 未 能 如 人 所 愿 , 药 物 研 发 费用 逐年 递增 , 研 发 周期 不 断 延 长 , 与 此 同时 投放 到 市 场 上 的 新 药 却 呈 现 减少 的 趋势 。 以 美国 为 例 ,1993 一 2003 年 10 年 中 , 制 药 工业 及 美国 国立 卫生 研究 院 (National Institutes of Health, NIH) 投入 研发 的 费用 在 成 倍 的 增长 , 然 而 , 新 药 研发 成 功率 却 是 呈 下 降 的 趋势 〈 图 13-12, 目前 研发 成 功 一 个 新 药 投入 市 场所 需 的 费用 数 以 亿 计 , 成 为 药物 开发 的 巨大 障碍 , 如 此 高 昂 的 费用 也 使 得 制药 行业 期 望 得 到 高 额 的 市 场 回 报 。 制 药 行 业 将 更 多 的 注意 力 集 中 在 开发 治疗 常见 病 和 多 发 病 的 药物 , 许 多 罕见 病 种 用 药 、 个 体 化 医疗 用 药 及 公共 卫生 用 药 未 能 得 到 应 有 的 重视 。 高 昂 的 研发 费用 也 是 导致 医疗 费用 上 涨 的 原因 之 一 。 药物 研发 似乎 走 人 了 一 个 困境 , 投 入 越 来 越 大 , 但 却 越 来 越 不 能 满足 需求 。 客 观 来 说 , 随 着 对 生命 科学 的 认识 不 断 加 深 , 对 药物 的 有 效 性 与 安全 性 的 要 求 越 来 越 高 , 相 应 的 药品 管理 法 规 也 越 来 越 严 格 。 临 床 前 与 临床 试验 项 目 内 容 增加 , 范 围 扩 大 , 监 测 手段 的 提高 , 对 开发 新 药 进行 广泛 的 比较 试验 等 , 使 开发 时 间 明 显 延 长 , 既 推 民 了 新 药 上 市 时 间 , 又 增加 了 开支 。 但 这 并 不 是 造成 药物 研发 困境 的 根本 原因 , 根 本 原因 还 是 在 于 现 有 的 药物 研发 方法 未 能 充分 及 时 地 对 新 药 进行 评估 。 开 发 一 个 新 药 , 自 始 至 终 要 经 过 : 基础 研究 〈 包 括 疾 病 流 行 趋势 、 市 场 需 求 、 技 术 水 平 现状 等 基本 情况 调查 ); 开发 项 目 立 题 论 证 、 确 定 立 项 研究 , 开 展 包 括 筛选 、 合 成 、 提 取 、 发 酵 等 创新 药物 的 研究 ;创新 药物 理化 性 质 及 其 化 学 结构 的 研究 ;临床 前 研究 〈 动 物 筛选 试验 , 发 现 候选 化 合 物 , 开 展 包 括 药 效 药理 、 一 般 药 理 、 一 般 毒 性 、 特 殊 毒 性 、 人 代谢、 工艺 与 制剂 研究 等 ); 临床 研究 ; 申请 承认 许可 , 新 药 上 市 〈 图 13-2) 。 至 此 , 漫 长 而 多 风险 的 过 程 宣告 完成 。 为 了 提高 药物 研发 的 效率 , 制 药 工 业 采 用 了 包括 组 合 化 学 和 高 通 量 筛 选 的 方法 , 但 即使 是 这 样 研发 效率 的 提高 还 是 很 有 限 。 一 旦 新 药 在 临床 试验 阶段 或 进入 市 场 后 才 发 现 有 难以 容忍 的 缺陷 , 造 成 的 损失 将 是 巨大 的 。 目 前 使 用 的 药物 开发 方法 的 主要 缺点 是 不 * 826 。 OO 美国 制药 工业 研发 投资 一 一 NIH 投 入 资金 & = Mw x 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 年 份 ® = & = eK RQ < ra) iy F 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 年 份 图 13-1 1993 一 2003 年 美国 药物 研发 投入 资金 及 申请 上 市 新 药 数量 变化 趋势 图 D 基础 药物 设计 临床 前 药 政 部 图 13-2 ”药物 开发 的 一 般 程序 ° 327 * 能 快速 、 有 效 、 低 成 本 地 对 药物 的 安全 性 和 有 效 性 进行 评估 。 人 类 已 经 进入 后 基因 组 时 代 , 但 是 基础 生命 科学 的 巨大 发 展 还 未 能 使 得 药物 研发 的 效率 提高 、 费 用 降低 。 药 物 研 究 的 方法 滞后 于 基础 生命 科学 的 发 展 , 以 至 于 美国 食品 药品 管理 局 (FEDA) 吕 认为 现 有 的 药物 研究 方法 是 “20 个 世纪 的 方法 ”", 并 提出 应 该 开发 出 新 的 更 有 效 的 药物 评价 工 具 , 包 括 安全 性 评价 工具 和 有 效 性 评价 工具 。 在 这 种 背景 下 , 将 生命 科学 的 最 新 进展 应 用 于 新 药 研 发 以 提高 研发 效率 降低 研发 费 用 引起 了 药学 科学 工作 者 的 注意 。20 世纪 下 半 叶 以 来 生命 科学 和 生物 技术 的 发 展 日 新 月 异 ,1990 年 启动 的 人 类 基因 组 计划 是 生命 科学 史上 第 一 个 大 科学 工程 , 该 计划 是 生 物 学 发 展 的 一 个 重要 转折 点 , 使 研究 工作 由 分 解 转向 了 整合 。 生 物 学 与 数学 、 物 理 、 计 算 机 科学 将 更 紧密 地 交叉 , 使 生物 学 由 描述 性 科学 发 展 为 定量 预测 的 科学 。 在 人 类 基因 组 计划 带动 下 出 现 的 一 系列 以 整体 性 研究 为 特征 的 组 学 〈OMICS), 如 功能 基因 组 学 、 结构 基因 组 学 、 和 蛋 昌 质 组 学 及 代谢 组 学 , 逐 步 把 分 子 生物 学 时 代 推 向 系统 生物 学 时 代 , 这 标志 着 生命 科学 中 整体 主义 时 代 的 开始 , 是 整体 主义 〈holism) 在 生命 科学 研究 中 的 重要 体现 。 这 是 人 类 第 一 次 从 整个 基因 组 的 结构 、 功 能 和 规模 去 研究 人 类 的 全 部 基因 。 生命 科学 的 发 展 极 大 地 影响 了 药物 发 现 与 开发 的 思路 和 策略 , 逐 渐 形 成 了 一 种 轨 新 的 药 物 研究 模式 , 从 基因 到 药物 , 确 证 药物 作用 及 疾病 发 生发 展 的 机 制 , 然 后 有 的 放 矢 地 寻 找 新 药 。 国 际 上 创新 药物 研究 的 发 展 趋势 呈现 出 两 个 显著 的 特点 : 一 是 生命 科学 前 沿 技 术 《〈 如 基因 组 、 和 蛋白 质 组 及 代谢 组 和 生物 信息 学 等 ) 开始 应 用 于 药物 研究 , 紧 密 结合 以 发 现 和 验证 药物 靶 标 、 评 价 药 物 疗 效 与 毒性 ;二 是 一 些 新 兴学 科 越 来 越 多 地 参与 到 新 药 发 现 和 前 期 研究 之 中 , 化 学 、 物 理学 、 理 论 和 结构 生物 学 、 计 算 机 和 信息 科学 等 与 药物 研究 的 交叉 、 渗 透 与 融合 日 益 加 强 , 使 新 药 研 究 的 面貌 发 生 了 巨大 的 变化 , 出 现 了 一 些 新 的 研究 领域 和 具有 和 良好 应 用 价值 的 新 技术 。 与 此 同时 人 们 也 越 来 越 重视 开发 传统 医 药 , 包 括 中 药 在 内 的 传统 医药 在 长 期 的 临床 应 用 中 充分 证 明了 其 有 效 性 与 安全 性 , 在 全 球 范围 内 形成 了 研究 传统 医药 的 热潮 。 13.2 代谢 组 学 在 药物 研究 中 的 应 用 概况 及 特点 代谢 组 学 是 众多 组 学 中 的 一 种 , 它 是 随 着 生命 科学 的 发 展 而 发 展 起 来 的 , 是 通过 考 察 生 物体 系 受 刺激 或 扰动 后 , 其 代谢 产物 的 变化 或 其 随时 间 的 变化 , 来 研究 生物 体系 的 一 门 科学 思 ; 代谢 组 学 的 重要 应 用 领域 之 一 就 是 药物 研究 。 近 年 来 , 这 方面 的 进展 相当 迅速 , 应 用 范围 涵盖 药物 发 现 、 药 物 开 发 及 临床 研究 等 药物 研究 的 各 个 方面 , 并 取得 了 一 系列 的 研究 成 果 , 在 这 种 情况 下 , 代 谢 组 学 开始 得 到 西方 主流 制药 公司 、 药 政 管理 部 门 及 学 术 界 的 重视 ,Pfizer 等 6 家 制药 公司 与 伦敦 的 帝国 理工 学 院 于 2001 4F 1 Aah 了 一 个 为 期 3 年 的 药物 毒性 研究 计划 (CCOMET)@!, FDA 也 开始 对 这 项 技术 在 药物 研 发 方面 的 应 用 进行 评估 ;2003 NIH 在 其 中 长 期 发 展 规划 (NIH Roadmap) 中 , 专 门 设 立 代 谢 组 学 专题 , 提 出 了 要 建立 专门 收集 小 分 子 信息 并 从 事 高 通 量 筛选 的 研究 中 心 , 发 展 代谢 组 学 技术 平台 , 更 快 、 更 多 地 发 现 具有 生物 活性 的 小 分 子 的 构想 。 代谢 组 学 能 在 药物 研究 领域 取得 如 此 重要 的 地 位 是 与 这 门 技术 的 特点 分 不 开 的 。 生 命 是 一 个 完整 的 系统 , 在 这 一 系统 中 , 各 种 生物 分 子 〈 基 因 、 蛋 白质 及 代谢 物 ) 的 相互 + 326° VE. FACIE oes AE Ie. RAPA a, BA teas. —Bix—-K 杂 体 系 中 的 某 一 部 分 的 平衡 偏离 了 自 稳 态 , 就 会 表现 为 疾病 。 安 全 有 效 的 药物 能 将 出 现 的 偏 移 回复 到 自 稳 态 , 同 时 对 生命 体 其 他 部 分 的 功能 影响 最 小 。 基 因 组 学 、 有 蛋白 质 组 学 及 代谢 组 学 在 不 同 的 层面 上 研究 着 生命 现象 , 并 都 在 药物 研究 领域 有 着 广泛 的 应 用 。 与 基因 组 学 和 和 蛋白 质 组 学 相 比 较 , 代 谢 组 学 有 着 一 些 独特 的 优点 。 对 一 个 完整 的 生命 体 来 说 , 外 源 或 内 源 的 刺激 都 会 使 生命 体 产生 相应 的 反应 , 首 先 使 相关 的 功能 基因 产生 表达 , 然 后 是 一 系列 的 细胞 信号 转 导 及 和 蛋白质 合 成 改变 , 最 终生 命 体 的 新 陈 代谢 发 生变 化 。 这 一 系列 的 过 程 在 时 间 和 空间 上 相互 关联 而 又 有 着 显著 的 区 别 。 基 因 、 蛋 白质 及 代谢 物 都 是 随时 间 在 动态 变化 。 对 于 代谢 物 而 言 , 测 定 生命 体 受 扰 动 后 其 代谢 物 水 平 随时 间 变 化 的 模式 是 非常 重要 的 , 因 为 新 陈 代谢 网 络 中 , 代 谢 流量 的 变化 是 非常 迅速 的 , 即 使 在 动态 平衡 时 , 认 为 代谢 物 的 含量 是 一 个 固定 值 也 是 一 种 误 解 。 对 于 转录 组 和 蛋白 质 组 而 言 , 甚 至 于 酵母 5 和 细菌 裤 这 样 的 单 细胞 生物 其 mRNA 的 转录 水 平 与 相应 的 蛋白 质 表 达 水 平 的 相关 性 也 是 欠 佳 的 。 事 实 上 , 由 于 许多 基因 表达 和 蛋白质 合 成 是 非 线性 的 关系 , 在 生命 体 受到 扰动 后 的 某 个 单一 时 间 点 来 考察 转录 组 与 蛋白 质 组 数据 的 相关 性 也 许 是 不 合适 的 。 对 于 多 细胞 的 生物 体 , 情 况 则 更 为 复杂 , 更 难 以 预测 。 因 此 , 和 采用 转录 组 与 蛋白 质 组 来 研究 机 体 对 药物 的 响应 时 , 选 择 合适 的 时 间 窗 口 是 非 常 重要 的 。 代 谢 组 学 的 一 个 重要 的 潜在 用 途 就 是 有 利于 确定 蛋白 质 组 学 和 基因 组 学 研究 的 时 间 窗 口 , 以 便于 观测 到 生物 过 程 的 变化 和 预测 生物 功能 。 以 药物 毒性 的 研究 为 例 〈 图 13-3), 单 剂量 毒性 可 逆 的 药物 引起 的 生物 体 的 扰动 模式 是 随 着 时 间 在 变化 的 , 如 果 以 理想 化 的 曲线 来 表示 这 种 变化 , 可 以 观察 到 首先 是 上 升 然后 是 回复 自 稳 态 的 一 个 趋势 线 , 扰 动 后 基因 的 表达 水 平 、 蛋 白质 及 代谢 物 的 量 取决 于 测定 的 时 间 。 细胞 损伤 及 死亡 动态 变化 -— 2 1 aaa +—— & 8 JR 上 1 ————4_ 末期 (细胞 死亡 ) 标 记 物 代谢 物 \t-— LH ti—H 毒性 损伤 | 早期 标记 物 损伤 修复 标记 EA tt 量 1 取样 点 时 间 图 13-3 药物 毒性 引起 生命 体 基因 、 蛋 白质 及 代谢 物 变 化 示意 图 如 果 给 药 较 长 时 间 后 测定 生物 体 的 变化 , 这 时 得 到 的 显著 变化 的 生物 标志 物 很 可 能 + 329 + 是 细胞 修复 或 机 体 回 复 自 稳 态 时 的 标志 物 。 对 于 多 次 给 药 而 言 , 由 于 毒性 效应 的 累加 , 生命 体 不 能 回复 自 稳 态 , 曲 线 呈 现 不 断 上 升 的 趋势 , 在 这 时 观测 到 的 就 是 有 关 细 胞 死亡 的 生物 标志 物 。 可 见 时 间 窗 口 的 选取 对 于 生命 现象 的 研究 非常 重要 。 然 而 , 对 于 基因 组 和 蛋白质 组 研究 而 言 , 实 验 样本 通常 采用 的 是 组 织 样本 , 取 样 方式 是 侵入 性 的 , 破 坏 性 比较 大 , 难 以 实现 从 同一 个 生物 体 进 行 连续 的 取样 观测 。 而 代谢 组 学 研究 使 用 的 样本 通 常 是 体液 , 如 尿 液 和 血液 , 可 以 实现 无 损 的 连续 取样 , 可 以 观察 诸多 内 源 型 代谢 物 的 动 态 变化 。 当然 , 代 谢 组 学 还 有 许多 特点 , 如 代谢 组 学 更 接近 于 表 型 、 技 术 的 通用 性 及 长 期 积 累 的 有 关 代 谢 通路 的 知识 有 助 于 结果 的 曾 明 , 这 些 在 本 书 相 关 章节 会 有 详细 的 介绍 , 在 这 里 不 再 费 述 。 13.3 代谢 组 学 在 动物 模型 评 佑 方面 的 应 用 在 药物 研究 中 大 量 使 用 各 种 实验 动物 研究 药物 的 毒性 、 药 效 及 疾病 的 机 制 。 对 实验 动物 本 身 的 研究 是 代谢 组 学 研究 的 一 个 重要 领域 。 生理 和 环境 等 诸多 因素 都 会 对 生物 体内 代谢 物 的 含量 及 相对 组 成 产生 影响 , 并 会 在 血液 和 尿 液 等 体液 中 得 到 反映 。 这 些 变化 包括 比较 明显 的 变化 , 如 动物 在 摄食 后 会 有 一 些 食物 成 分 的 代谢 产物 出 现在 体液 中 , 更 多 的 是 体液 中 多 种 内 源 性 代谢 物 含量 相对 细微 的 改变 , 这 种 细微 变化 的 幅度 取决 于 动物 的 生理 状态 。 很 明显 , 在 研究 药物 对 动物 新 陈 代谢 的 影响 时 , 首 先 要 排除 动物 本 身 生理 上 的 变化 和 环境 因素 的 影响 。 同 时 , 不 同 种 系 的 实验 动物 本 身 差 异 也 是 需要 考虑 的 。 这 方面 的 研究 进行 的 比较 多 , 采 用 的 样本 多 为 尿 液 , 技 术 平 台 既 有 核磁 共振 (NMR) 也 有 质谱 (MS), 数 据 处 理 涉 及 主 成 分 分 析 (PCA) 、 偏 最 小 二 乘 判 别 分 析 (CPLS-DA) 及 SIMCA 等 多 种 模式 识别 技术 。 通 过 代谢 组 学 的 方法 , 科 学 工作 者 成 功 的 回答 了 以 下 一 些 问 题 。 (1) 遗传 因素 使 得 生物 在 代谢 物 组 成 上 有 何 差异 , 包 括 不 同 物种 间 的 差异 、 遗 传 背 景 不 同 的 同类 动物 的 差异 、 遗 传 背景 相近 的 同类 动物 的 差异 。 (2) 环境 因素 和 生理 因素 使 得 同 种 动物 在 代谢 物 组 成 上 有 何 差异 , 包 插 性 别 的 差 异 、 生 长 发 育 期 的 差异 、 人 食物、 生理 节律 、 肠 道 微生物 及 疾病 对 动物 代谢 的 影响 。 对 于 遗传 因素 ,Robertson 等 中 采用 基于 NMR 技术 的 代谢 组 学 平台 研究 了 人 类 、 家 兔 、 大 鼠 和 小 鼠 的 尿 液 , 采 用 PCA 的 方法 对 代谢 指纹 数据 进行 模式 识别 处 理 , 研 究 表明 不 同 种 生物 的 尿 液 代谢 物 组 成 具有 明显 的 差异 〈 图 13-4) 。 Holmes 等 "5 进一步 考察 了 实验 动物 种 间 的 差异 , 在 研究 中 他 们 采用 SD AR, F344 鼠 及 非洲 多 乳头 鼠 的 尿 液 为 样本 , 结 果 表 明 与 F344 LES PLA RRA PHA 酸 、 肌 氢 酸 、 下 珀 酸 等 多 种 代谢 物 的 浓度 显著 增高 。 相 比 而 言 ,SD 鼠 与 F344 鼠 的 尿 液 代 谢 指 纹 比较 相似 , 不 过 SD 鼠 尿 液 中 的 葡萄 糖 和 氨基酸 略 高 于 F344 鼠 。 代 谢 组 学 研究 表明 不 同 动物 乃至 同类 动物 的 种 间 都 是 有 差异 的 , 这 种 表 型 上 的 差异 有 可 能 反映 出 遗传 基因 的 差异 , 并 有 助 于 了 解 基因 的 功能 。 更 进一步 的 研究 表明 , 即 使 是 遗传 和 新 陈 代 谢 非常 相似 的 动物 , 其 尿 液 代 谢 指纹 也 还 是 会 有 区 别 的 031 。Han Wistar (HW) 和 SD strains 是 两 种 在 药物 研究 中 经 常用 于 毒 SSO。 2 Owen © | yee aia ee RIN Nae Mee Ag Bch Si te 4 alk PGI 图 13-4 采用 PCA 模式 识别 方法 区 分 人 类 及 不 同 种 类 的 动物 5 性 评估 的 遗传 和 代谢 上 非常 相似 的 动物 , 虽 然 如 此 , 两 者 的 NMR 指纹 经 过 PCA 分 析 , 依然 能 够 得 到 部 分 的 分 离 ; 采用 有 监督 的 〈SIMCA) 方法 , 预 测 准确 率 可 以 达到 86%, 比较 两 者 的 NMR 谱 图 可 以 发 现 ,HW 鼠 尿 液 中 乙酸 、 乳 酸 及 牛 磺 酸 含量 较 高 ,SD 鼠 中 马 尿 酸 含量 较 高 。 进 一 步 采 用 基于 神经 元 网 络 的 模式 识别 方法 对 代谢 指纹 数据 进行 分 析 , 可 以 将 两 组 实验 动物 完全 区 分 。 食物 和 生长 环境 也 会 对 尿 液 中 代谢 物 的 组 成 产生 影响 。 野 生 的 三 种 哺乳 动物 岸 鼠 (bank vole), 、 地 鼠 (shrew) FIZ EX (wood mouse) 的 食物 是 有 区 别 的 , 采 用 NMR 技 术 得 到 三 者 的 尿 液 代 谢 物 指纹 图 谱 , 并 且 与 常用 的 实验 动物 SD 大 鼠 相 比较 , 四 组 动物 之 间 存 在 显著 的 区 别 。 例 如 , 岸 鼠 的 尿 液 相对 于 SD 鼠 含 有 更 高 浓度 的 芳香 族 氨 基 酸 和 相对 低 的 马 尿 酸 。 这 项 研究 还 表明 , 实 验 用 SD 大 鼠 由 于 具有 相同 的 遗传 背景 和 严格 控 制 的 饲养 条 件 , 个 体 差异 比较 小 5 。 类 似 的 研究 也 表明 2 食物 和 肠 道 菌 群 的 改变 会 使 尿 中 马 尿 酸 和 绿 原 酸 发 生 相 应 的 变化 。 更 早 的 研究 表明 , 喂 食 酷 蛋白 和 咀 食 标准 饲料 (chow diets) 的 大 鼠 尿 中 马 尿酸 、 琥 珀 酸 、 柠 檬 酸 、 氧 化 三 甲 胺 、 甜 菜 碱 及 牛 磺 酸 等 代谢 物 都 会 有 相应 的 变化 2 。 雄性 和 肉 性 动物 由 于 激素 种 类 和 激素 水 平 上 的 差异 会 使 得 两 者 在 新 陈 代谢 方面 表现 出 不 同 。Plumb 等 采用 LC-MS 的 技术 研究 了 AlpK: Apf CD fl #1 57BL107 鼠 的 尿 液 , 对 这 两 种 种 系 的 实验 动物 采用 PCA 的 模式 识别 方法 均 能 对 雄性 和 肉 性 样本 得 到 很 好 的 aoe, 不 同 生 长 发 育 时 期 的 动物 会 具有 不 同 的 代谢 模式 。 对 鼠 类 实验 动物 而 言 , 尿 中 芳香 族 类 物质 、 柠 檬 酸 及 牛 磺 酸 等 物质 会 随 着 动物 年 龄 的 改变 而 变化 。 对 于 幼 鼠 〈 雪 1 月 ), 尿 中 排泄 的 甜菜 碱 和 氧化 三 甲 胺 (trimethylamine-N-oxide) 要 显著 高 于 老龄 户 。 对 NMR 数据 采用 PCA 的 模式 识别 方法 也 可 以 将 8 周 龄 鼠 和 13 周 龄 鼠 样本 清楚 地 进行 区 分 [6,10'12] 。,331 。 肉 性 动物 的 生理 周期 的 变化 会 使 新 陈 代谢 产生 扰动 , 这 种 扰动 也 可 以 通过 代谢 组 学 的 方法 体现 出 来 。 峻 性 SD 大 鼠 尿 液 连续 10 天 , 每 天 取样 2 次 , 结 果 表 明 肉 性 大 鼠 每 3 一 4 天 为 一 个 发 情 周 期 , 在 一 个 周期 内 先后 经 历 了 发 情 前 期 、 发 情 起 、 后 情 期 及 间 情 期 。 采 用 NMR 的 方法 对 发 情 周期 的 各 个 阶段 的 尿 液 代谢 物 进行 分 析 , 并 采用 PCA 的 方法 进行 分 类 , 各 阶段 的 样本 能 够 得 到 部 分 的 区 分 , 发 生变 化 的 代谢 物 包 括 柠檬 酸 、 氧 化 三 甲 胺 、 肌 酸 、 肌 酝 、 牛 磺 酸 、 葡 萄 糖 等 0] 。 这 一 结果 与 以 前 的 研究 是 一 致 的 , 更 早 一 些 的 研究 表明 , 柠 檬 酸 的 改变 与 峻 激素 水 平 有 关 o , 氧 化 三 甲 胺 与 三 甲 胺 的 比值 与 月 经 有 关 09] 。 鼠 类 动物 的 习性 是 夜间 活动 , 昼 夜 节律 会 对 鼠 类 的 活动 产生 影响 。 在 使 用 鼠 类 动物 进行 毒性 研究 或 者 其 他 生化 方面 的 研究 时 , 在 取样 时 应 该 要 考虑 到 这 种 影响 。 避 免 导 夜 节律 对 分 析 结果 的 影响 的 最 简单 的 办 法 就 是 收集 动物 24h 尿 液 。 层 夜 节律 对 动物 代谢 物 组 成 究竟 会 产生 何 种 影响 也 是 人 们 关心 的 问题 。 采 用 基于 NMR 技术 的 方法 , 考 察 层 夜 节律 对 SD 大 鼠 尿 液 代 谢 物 组 成 的 影响 。 对 SD 大 鼠 连 续 取样 10 天 , 分 别 收集 日 间 尿 样 (6 点 至 18 点 ) 和 夜间 尿 样 (18 点 至 6 点 ) 。 采 用 PCA 的 模式 识别 方法 可 以 很 容易 地 将 两 类 样本 进行 区 分 。 相 对 夜间 尿 样 , 日 间 尿 样 中 牛 磺 酸 、 马 尿酸 和 肌 栈 的 量 较 低 , 而 葡 萄 糖 、 琥 珀 酸 、 二 甲 基 甘 氨 酸 、 甘 氨 酸 、 肌 酸 和 甜菜 碱 的 量 较 高 27 科 。 对 于 AWK 也 得 到 了 类 似 的 结果 52 。 类 似 的 研究 还 包括 采用 NMR 和 MS 方法 来 研究 AlpK: Apf CD 鼠 和 C57BL107 鼠 尿 液 代谢 物 有 昼夜 节 律 的 变化 De'22 。 肠 道 菌 群 对 药物 的 吸收 、 代 谢 和 转化 有 着 重要 的 影响 , 同 时 肠 道 菌 群 的 失调 也 与 许 多 种 疾病 有 关 。 肠 道 菌 群 对 尿 液 中 代谢 物 的 影响 也 是 代谢 组 学 感 兴趣 的 方面 之 一 。 将 无 菌 动物 从 无 菌 的 环境 中 取出 , 暴 露 于 “正常 ”的 环境 中 , 在 这 一 过 程 中 , 环 境 中 的 微 生 物 会 进入 无 菌 动物 体内 并 繁殖 , 观 察 尿 液 代 谢 物 随 这 一 过 程 的 变化 是 一 项 有 趣 的 工 作 52] 。 在 最 初 的 17 天 可 以 观测 到 尿 中 葡萄 糖 增高 , 与 三 羧 酸 循环 有 关 的 代谢 物 降低 , 同时 氧化 三 甲 胺 、 马 尿酸 、 葵 乙 尿 酸 和 间 羟 葵 基 丙 酸 增加 。 在 第 21 天 , 尿 中 代谢 物 的 指纹 图 谱 与 正常 动物 的 谱 图 相似 。 这 种 尿 液 代谢 物 的 变化 反映 了 肠 道 微生物 的 增殖 及 再 分 布 的 过 程 。 这 项 研究 有 助 于 识别 给 药 后 动物 尿 液 哪些 代谢 物 的 变化 有 可 能 是 由 肠 道 菌 群 引起 的 , 以 便 观 测 到 真正 由 药物 引起 的 变化 。 通过 使 用 NMR 技术 , 并 结合 模式 识别 的 数据 处 理 方法 , 代 谢 组 学 也 可 用 于 疾病 动 物 模型 的 研究 , 通 过 与 正常 动物 的 代谢 指纹 图 谱 比较 可 以 知道 疾病 模型 动物 的 代谢 物 的 变化 。 这 对 于 了 解 疾病 机 制 是 有 益 的 。 杜 氏 营养 不 良 的 疾病 动物 模型 是 mdx A, 这 种 动物 模型 采用 魔 角 旋 转 核磁 共振 〈(MAS NMR) 技术 得 到 的 心脏 和 脑 组 织 的 代谢 物 指纹 图 谱 与 正常 鼠 的 代谢 指纹 图 谱 通过 PCA 的 方法 可 以 得 到 区 分 。 观 察 表 明 两 者 的 差 别 在 于 肌 氨 酸 、 磷 酸 胆 碱 与 牛 磺 酸 之 间 的 相对 浓度 的 变化 。 在 疾病 动物 模型 中 , 牛 磺 酸 的 含量 增高 。 牛 磺 酸 含量 增高 也 曾 报道 为 骨骼 肌 营养 障碍 的 生物 标志 物 , 并 认为 这 种 标 志 物 是 生物 体 对 营养 不 良 的 一 种 适应 性 反应 。 进 一 步 采用 1-D 和 2-D 高 分 辨 MAS NMR 进行 测定 , 表 明 脂 类 物质 有 变化 , 同 时 乳酸 和 苏 氨 酸 也 有 增高 0425 。 ° 332 。 Oi ght i i rea 13.4 代谢 组 学 在 药物 安全 性 研究 中 的 应 用 13.4.1 代谢 组 学 在 药物 毒性 研究 中 的 应 用 概况 及 其 特点 在 药物 研究 中 , 药 物 的 毒性 是 一 个 非常 重要 的 研究 内 容 , 然 而 因为 安全 性 问题 而 被 淘汰 的 候选 药物 占 相 当 大 的 比例 , 使 得 新 药 安全 性 评价 工作 越 来 越 重要 。 传 统 的 药物 安 全 性 评价 方法 是 基于 实验 动物 对 药物 的 反应 , 然 后 评估 药物 对 人 类 的 毒性 。 这 种 评价 手 段 还 存在 着 许多 固有 缺点 , 如 毒性 反应 的 种 属 差异 ; 动物 数量 有 限 , 对 发 生 率 低 的 毒性 反应 灵敏 性 差 等 问题 。 在 药物 毒性 研究 方面 , 基 因 组 学 和 和 蛋白质 组 学 都 有 应 用 , 但 是 都 很 难 与 传统 意义 上 的 毒 理 学 及 疾病 的 终端 效应 联系 起 来 。 当 毒 性 物质 与 细胞 或 组 织 发 生 作 用 时 , 毒 性 效应 会 扰乱 生物 体内 许多 代谢 通路 中 的 一 些 关键 的 生化 反应 , 使 得 内 源 性 代谢 物 的 浓度 、 流 量 及 相互 之 间 的 比例 发 生变 化 。 在 毒性 效应 比较 弱 的 时 候 , 组 织 或 细胞 试图 维持 其 自 稳 态 , 通 过 调节 体液 中 代谢 物 的 组 成 来 对 新 陈 代谢 进行 控制 。 在 毒性 效应 比较 强 的 时 候 , 细 胞 的 死亡 导致 器 官 功能 障碍 , 细 胞 中 代谢 物 的 泄漏 使 得 体液 中 代谢 物 的 变化 更 为 显著 。 因 此 , 无 论 对 强 毒性 还 是 弱毒 性 , 体 液 中 代谢 物 都 会 显示 出 与 特定 器 官 和 特定 机 制 有 关 的 变化 。 代谢 组 学 能 够 灵敏 而 全 面 地 测定 给 药 后 生物 体内 源 性 代谢 物 对 药物 的 反应 , 从 而 给 出 生物 体 对 药物 毒性 的 整体 信息 , 能 够 系统 的 研究 毒性 与 体内 代谢 物 组 成 的 关系 , 有 利 于 全 面 认识 和 评价 药物 的 价值 和 开发 前 景 并 发 现 新 的 生物 标志 物 。 采 用 代谢 组 学 的 方法 进行 药物 毒性 研究 具有 非常 重要 的 实用 价值 。 简单 来 说 , 采 用 代谢 组 学 的 方法 研究 药物 安全 性 就 是 采用 各 种 分 析 平 台 〈 包 括 NMR, GC-MS, LC-MS 等 ) 得 到 内 源 性 代谢 物 指纹 图 谱 , 并 从 谱 图 差异 中 得 到 药物 对 特定 靶 部 位 的 损伤 信息 , 研 究 毒性 机 制 , 进 而 对 毒性 未 知 的 候选 新 药 的 毒性 靶 部 位 和 毒 性 机 制 进行 预测 , 加 快 药物 开发 的 步伐 。 皖 , 早 在 19 世纪 80 年 代 末 科学 工作 者 就 开始 采用 代谢 组 学 的 方法 来 研究 药物 的 安全 性 。 当 然 , 在 当时 代谢 组 学 这 一 概念 还 没有 被 提出 , 但 研究 者 的 理念 和 所 使 用 的 方法 即 是 我 们 现在 所 称 的 代谢 组 学 。Gartland 等 首次 试图 采用 NMR 技术 获取 尿 液 中 代谢 物 的 指纹 图 谱 并 结合 模式 识别 的 方法 来 对 化 合 物 毒 性 进行 研究 4 5 RA NMR 图 谱 中 17 个 预 设 的 内 源 性 代谢 物 的 信号 强度 构建 成 多 维 数据 集 , 并 采用 模式 识别 的 方法 进行 降 维 和 分 类 。 采 用 的 模式 识别 的 方法 是 无 监督 分 级 聚 类 、 非 线性 映射 及 PCA。 采 用 这 种 方 法 成 功 地 对 不 同类 型 的 毒性 物质 〈 肝 毒性 物质 、 肾 皮层 毒性 物质 及 肾 乳 突 毒性 物质 ) 进 行 了 分 类 。 进 而 又 进行 了 更 为 精细 的 研究 , 包 括 给 予 实 验 大 鼠 6 种 不 同 的 肾 毒 性 物质 , 并 在 给 药 后 3 个 不 同 的 时 间 收 集 大 鼠 尿 液 进行 NMR 的 分 析 。 将 这 一 包含 时 间 维 的 数据 进行 分 析 , 能 够 很 好 地 将 6 种 不 同 肾 毒性 物质 进行 分 类 。 同 时 也 对 给 药剂 量 、 动 物 营养 状态 、 性 别 差 异 等 多 种 因素 对 分 类 的 影响 进行 了 考察 。 上 述 的 这 种 方法 经 过 改进 , 用 于 15 种 具有 肾 皮层 或 肾 人 质 毒性 的 化 合 物 所 引起 的 AE Asi), H-NMR 谱 中 16 种 尿 中 代谢 物 的 信号 强度 分 别 代表 几 种 主要 生化 途径 的 重要 中 间 产 物 。 将 NMR 给 出 的 信息 进行 模式 识别 能 够 很 好 地 将 肾 皮 层 毒 性 和 肾 甬 质 毒 300° * 性 进行 区 分 。 近 一 步 将 临床 化 学 的 数据 与 NMR 的 数据 结合 进行 模式 识别 , 发 现 仅仅 基 F NMR 的 数据 就 已 经 能 够 得 到 很 好 的 分 类 , 加 入 临床 化 学 的 数据 并 不 能 提高 分 类 的 效 BR) 。 药 物 的 毒性 是 随 着 时 间 发 生发 展 的 , 是 一 个 动态 的 变化 过 程 。 仅 仅 考 察 给 药 后 某 一 时 间 点 的 生化 改变 是 不 够 的 。 在 这 种 情况 下 , 代 谢 轨 迹 (metabolic trajectory) 这 一 概念 被 提出 来 了 , 代 谢 轨迹 是 指 新 陈 代谢 发 生 扰动 后 内 源 性 代谢 物 组 成 在 多 维 空间 中 随时 间 的 变化 曲线 。 下 面 是 一 个 代谢 轨迹 的 应 用 范例 2 。 HgCl 和 2- 省 乙 胺 (BEA) 都 是 肾 毒性 物质 , 前 者 具有 肾 近 曲 小 管 毒性 , 后 者 具有 肾 人 质 毒性 。 将 两 者 给 药 诱导 肾 毒 性 。 收 集 连 续 9 天 的 尿 液 , 并 用 NMR RORY 代谢 物 以 研究 毒性 化 合 物 对 动物 生化 过 程 的 影响 。 从 代谢 轨迹 可 以 看 到 由 毒性 所 引起 的 损伤 的 发 生 、 发 展 及 恢复 整个 过 程 。 不 同 毒性 化 合 物 引起 的 损伤 具有 不 同 的 轨迹 , 对 HgCl: 来 说 , 毒 性 发 生发 展 的 曲线 与 毒性 消退 后 的 曲线 具有 相似 性 , 而 BEA 产生 的 代 谢 轨 迹 中 毒性 发 生 与 毒性 消退 曲线 差异 比较 大 , 这 表明 两 者 在 毒性 损伤 机 制 上 是 不 同 的 。HgCl 是 一 种 损伤 机 制 单一 并 且 损 伤 可 逆 的 毒物 , 而 对 于 BEA, 这 种 毒性 化 合 物 可 以 造成 两 种 不 同类 型 的 损伤 。 开 始 是 对 线粒体 的 毒性 作用 , 然 后 是 破坏 肾 乳 突 改变 肾脏 的 渗透 性 , 因 此 毒性 消退 后 的 回归 曲线 较为 复杂 。 代 谢 轨 迹 也 被 应 用 于 肝 毒 性 化 合 物 ou- 蔡 异 硫 握 酸 酯 (ANIT) 、 半 乳糖 胺 〈GalN) AT HAZ (butylated hydroxytoluene, BHT) 的 研究 中 2 。 屎 液 样 本 的 NMR 图 谱 表 明 , 对 每 一 种 肝 毒 性 化 合 物 引起 的 损伤 , 尿 中 代谢 物 随时 间 的 变化 都 各 具 特 点 。 将 代谢 轨迹 降 维 并 投影 在 二 维 图 上 , 各 种 毒性 化 合 物 都 有 各 自 的 代谢 轨迹 , 毒 性 损伤 开始 发 生 时 代谢 轨迹 是 向 远离 对 照 组 的 方向 变化 , 距离 对 照 组 越 远 表明 损伤 越 严 重 。 到 达 最 远 点 后 , 代 谢 轨迹 开始 向 对 照 组 的 方向 回复 , 表明 毒性 效应 开始 消退 , 细 胞 进入 修复 期 〈 图 13-5) 。 在 每 个 时 间 点 显著 变化 的 尿 液 代 谢 物 可 以 用 来 区 分 不 同类 型 的 肝 损 伤 。 这 种 非 侵 和 人 性 的 方法 不 仅 可 以 用 于 研究 肝 损 伤 的 机 制 还 可 以 用 来 发 现 新 的 肝 损伤 的 标志 物 以 用 于 药物 开发 中 安全 性 的 评价 。 10 A135 三 种 肝 毒 性 化 合 物 引 起 毒性 损伤 的 代谢 轨迹 2) 尿 液 和 血液 样本 易于 得 到 , 并 可 以 取得 损伤 随时 间 变 化 的 趋势 。 如 果 与 毒性 作用 辑 器 官 的 原 位 代谢 物 的 变化 相 联系 更 能 够 深入 阐明 毒性 的 发 生发 展 及 机 制 。 在 这 方面 , 采 用 基于 魔 角 技 术 的 NMR (MAS-NMR) 可 以 对 损伤 的 肝 肾 等 器 官 代 谢 的 变化 进行 研 sa 334 。 F311, PEMA LOA A AR KR A BAAR, PATRAS PALA. STFA RE RAT Un Hh oh es A. OR AR ERR 液 分 别 采 用 MAS NMR 和 H-NMR 获取 代谢 组 学 的 数据 , 并 采用 模式 识别 的 方法 进行 数据 分 析 。 高 剂量 动物 组 肝 组 织 及 肝 组 织 提取 物 中 甘油 三 酯 和 单 不 饱和 脂肪 酸 增 加 , 同 时 多 不 饱和 脂肪 酸 降低 , 这 表明 线粒体 功能 障碍 并 伴随 着 过 氧化 物 酶 活性 的 代 偿 性 增 高 。 另 外 , 肝 组 织 中 磷脂 的 降低 表明 毒性 效应 可 能 会 抑制 相关 磷脂 的 合成 酶 。 同 时 观察 到 的 现象 还 包括 组 织 中 葡萄 糖 、 肝 糖 原 的 降低 及 组 织 提取 液 中 乳酸 、 丙 氨 酸 的 升 高 和 葡 萄 糖 的 降低 。 血 浆 样 本 显示 , 和 葡萄糖、 乙酸、 丙酮 酸 和 乳酸 增高 。 这 些 数据 都 表明 , 糖 酵 解 反应 速率 的 加 快 。 同 时 , 数 据 也 表明 线粒体 由 于 功能 障碍 在 三 羧 酸 循环 中 不 能 利用 丙酮 酸 及 脂肪 酸 B 氧化 过 程 出 现 障 碍 。 对 于 药物 研究 而 言 , 对 已 知 毒 性 化 合 物 通过 代谢 组 学 的 方法 对 其 造成 的 机 体 损伤 机 制 进行 研究 , 并 通过 损伤 造成 的 代谢 改变 对 毒性 药物 进行 分 类 是 很 重要 的 。 但 更 能 促进 新 药 研发 进程 的 是 能 够 对 新 发 现 的 候选 药物 的 毒性 进行 预测 。 代 谢 组 学 在 毒性 预测 方面 已 经 展开 并 取得 了 很 大 的 进展 。 在 药物 肝脏 和 肾脏 毒性 预测 中 , 给 予 雄性 大 鼠 能 够 引起 Reames GFR) 毒性 的 化 合 物 , 收 集 尿 液 并 使 用 NMR 技术 得 到 尿 液 代谢 物 的 指纹 图 谱 。 给 药 后 24h、24 一 32h 和 32~56h 的 数据 采用 PCA 分 析 。 此 外 , 对 于 阿 霉 素 和 嘲 WE 120~144h 的 尿 样 也 被 收集 , 因 为 这 两 种 药物 会 引起 滞后 的 肾 毒 性 。 通 过 前 3 个 主 成 分 可 以 得 到 不 同 毒性 化 合 物 的 聚 类 模式 , 将 一 部 分 数据 用 于 构建 SIMCA 模型 , 并 利用 剩余 的 数据 对 模型 进行 检验 。 在 61 个 样本 中 , 仅 有 3 个 样本 归 类 错误 52.3] 。 有 监 督 模 式 识 别 方法 在 药物 毒性 预测 应 用 的 发 展 也 比较 快 。 对 大 鼠 给 予 不 同 剂 量 的 能 够 引起 肝 、 肾 或 者 曙 丸 毒性 的 化 合 物 , 采 用 NMER 的 方法 得 到 尿 液 代谢 物 的 数据 , 并 用 神经 元 网 络 对 数据 进行 分 析 59 。 化 合 物 毒 性 引起 的 18 种 内 源 性 小 分 子 代谢 物 的 变化 输入 人 工 神经 元 网 络 , 仅 依靠 这 种 非常 有 限 的 数据 集 , 神 经 元 网 络 能 够 预测 化 合 物 的 毒性 靶 器 官 。 神 经 元 网 络 的 使 用 被 进一步 扩展 , 对 大 鼠 给 予 13 种 具有 肝 或 肾 毒性 的 化 合 物 , 采 FA NMR 的 方法 得 到 不 同时 间 尿 液 代谢 物 的 指纹 图 谱 55 。 将 谱 图 数据 进行 简化 后 采用 随机 神经 元 网 络 (probabilistic neural network,PNN) 的 方法 进行 分 析 , 构 建 了 一 个 具有 1310 张 谱 图 的 数据 库 ,583 张 用 作 训 练 集 ,727 张 用 来 检验 数学 模型 。 采 用 PNN 的 方法 , 对 照 组 动物 和 4 种 毒性 组 动物 〈 肝 、 肾 、 肝 肾 混合 及 线粒体 ) 之 间 的 区 分 度 高 于 90%, 采 用 常规 的 多 层 神经 元 网 络 能 够 得 到 类 似 的 结果 , 不 过 分 类 的 准确 度 要 低 — 36, 对 于 大 样本 量 的 研究 还 需要 发 展 新 的 化 学 计量 学 的 方法 以 完成 数据 的 保存 和 比较 的 任务 。CLOUDS (classification of unknown by density superposition) 是 一 种 由 随机 神 经 元 网 络 发 展 的 归 类 方法 :25 。 采 用 19 组 动物 连续 8 RRA NMR 数据 可 以 构建 一 个 含有 2844 个 样本 , 每 个 样本 含有 205 个 光谱 变量 的 数据 集 。 首 先 对 光谱 数据 进行 预 处 理 , 即 归 一 化 排除 尿 液 浓度 的 和 干扰, 将 非 内 源 性 代谢 物 〈 约 占 整 个 谱 图 数据 的 0. 4%) 从 谱 图 中 去 除 并 以 缺 省 值 蔡 代 。 按 照 药物 毒性 的 靶 器 官 对 数据 建立 模型 ,50 色 的 数据 用 作 训 练 集 , 其 余数 据 用 于 检验 模型 。 结 果 显 示 90%% 的 样本 归 类 正确 。 这 表明 CLOUDS 技术 有 利于 复杂 多 维 变量 的 建 模 , 采 用 一 种 概率 而 不 是 一 种 绝对 的 分 类 方法 来 描述 数据 。 “35 。 数学 模型 的 成 功 应 用 使 得 安全 性 评价 的 专家 系统 成 为 关注 的 重点 之 一 。 基 于 有 监督 模式 判别 的 专家 系统 可 以 在 玫 个 层次 上 得 到 应 用 , 第 一 层次 是 专家 系统 能 够 判别 一 个 样 本 是 否 是 “正常 ”的 样本 , 也 就 是 说 由 于 毒性 效应 、 疾 病 、 饮 食 及 基因 改变 造成 代谢 改 变 的 样本 应 该 能 够 与 对 照样 本 得 到 较 好 的 区 分 , 专 家 系统 可 以 自动 识别 异常 样本 并 判别 是 何 种 因素 引起 样本 的 异常 ;第 二 个 层次 是 专家 系统 能 够 对 毒性 进行 判别 归 类 , 对 于 与 对 照 动物 不 同 的 样本 采用 一 系列 的 数学 模型 与 已 知 毒 性 化 合 物 进行 对 比 , 对 新 药 毒性 葛 器 官 、 毒 性 机 制 进 行 预测 , 第 三 个 层次 是 生物 标志 物 的 发 现 , 能 够 筛选 出 与 毒性 或 功能 障碍 相关 的 代谢 物 。 代谢 组 学 数据 与 转录 组 学 数据 的 整合 也 在 发 展 着 = 。 用 扑热息痛 对 大 鼠 给 药 造成 肝 损 伤 的 模型 , 采 用 基因 阵列 芯片 技术 获取 肝 组 织 转录 组 数据 , 并 采用 NMR 技术 获取 肝 组 织 、 肝 提取 物 及 血浆 的 代谢 组 学 数据 。 两 组 数据 经 过 整合 , 从 代谢 通路 的 角度 来 研 究 肝 毒 性 引起 的 能 量 代谢 的 改变 。 代 谢 组 学 数据 表明 , 在 肝 组 织 中 葡萄 糖 和 肝 糖 原 含量 降低 , 脂 类 物质 含量 增高 ;在 血浆 中 葡萄 糖 、 丙 酮 酸 、 乙 酸 及 乳酸 增高 ;在 肝 组 织 提 取 物 中 丙 氨 酸 和 乳酸 增高 。 这 一 研究 结果 表明 糖 酵 解 速率 的 增加 。 代 谢 组 学 的 数据 是 与 转 录 组 学 的 数据 相 一 致 的 , 在 转录 组 数据 中 与 脂 类 和 能 量 代 谢 相 关 基 因 的 表达 也 发 生 了 显 著 的 变化 。 研 究 结果 表明 , 这 两 种 互补 技术 的 结合 可 以 更 全 面 地 认识 细胞 、 组 织 对 于 毒 性 化 合 物 的 应 答 。 13.4.2 COMET 计划 介绍 代谢 组 学 的 不 断 发 展 及 在 药物 安全 性 研究 中 的 不 断 成 熟 , 引 起 西方 主流 的 大 制药 公 司 的 重视 。 在 1999 年 1 月 , 相 关 的 制药 公司 与 英国 帝国 理工 学 院 建 立 了 一 个 筹划 指导 委员 会 对 代谢 组 学 在 药物 安全 性 方面 的 应 用 进行 评估 。 在 2001 年 1 月 ,6 家 制药 公司 (Bristol-Myers-Squibb, Eli Lilly and Co. 、Hoffman-La Roche, NovoNordisk, Pfizer Incorporated 和 Pharmacia Corporation) 与 英国 帝国 理工 学 院 共 同 组 建 了 毒物 代谢 组 学 研究 小 组 (consortium for metabonomic toxicology, COMET) 开始 了 一 个 为 期 3 年 的 详细 的 研究 计划 。 这 也 标志 着 采用 代谢 组 学 研究 药物 安全 性 得 到 制药 工业 界 的 认可 , 并 走出 实验 室 向 着 实用 性 方面 迈进 ]。 以 下 对 这 一 研究 计划 的 目标 、 采 用 的 方法 做 一 介绍 。 13.4.2.1 COMET 计划 的 主要 目标 主要 目标 : OKA HNMR 技术 对 实验 动物 的 尿 液 、 血 清和 组 织 中 代谢 物 在 正常 生理 情况 下 的 变化 进行 详细 的 多 维 描述 ,@ 建 立 毒 性 化 合 物 引 起 肝 肾 损伤 后 , 实 验 动物 体液 和 组 织 代谢 产物 的 NMR 谱 图 数据 库 ;@ 采 用 化 学 计量 学 方法 对 谱 图 数据 进行 处 理 , 建 立 毒 性 预测 的 专家 系统 ;@ 田 找寻 与 毒性 相关 的 各 类 组 合生 物 标志 物 ; 名 通过 对 有 毒 和 无 毒 类 似 物 的 分 类 , 测 试 所 建立 的 专家 系统 。 研究 小 组 首先 采用 雄性 鼠 类 动物 的 尿 液 和 血清 来 构建 NMR 图 谱 数据 库 , 样 本 均 采 用 NMR 进行 分 析 。 组 织 样本 也 被 采集 并 建立 谱 库 , 以 作为 后 续 建 立 更 全 面 数据 库 的 基 础 。 整 个 研究 计划 需要 研究 约 150 种 化 合 物 。 对 体液 和 组 织 的 NMR 分 析 及 数据 的 模式 。 336 + 识别 首先 在 帝国 理工 学 院 进行 , 研 究 方法 和 研究 结果 将 逐步 提交 给 其 他 合作 伙伴 , 并 对 合作 伙伴 进行 必要 的 应 用 培训 。 13.4.2.2 COMET 计划 的 实验 方法 1. 动物 实验 和 样品 采集 所 有 的 动物 实验 均 符合 有 关 法 律 和 法 规 的 要 求 。 组 织 病 理学 检查 数据 和 临床 化 学 数 据 也 被 采集 并 收入 数据 库 。 实 验 动 物 随机 分 为 对 照 组 、 低 剂量 组 及 高 剂量 组 , 每 组 有 10 只 Sprague-Dawley 大 鼠 或 者 8 只 B6C3F 鼠 。 实 验 动物 可 以 自由 进食 和 饮水 。 给 药 48h 后 各 组 中 半数 动物 被 处 死 , 给 药 168h 后 剩余 动物 也 被 处 死 。 尽 可 能 采用 生理 盐水 和 玉米 油 作 为 药物 的 溶剂 。 高 剂量 组 动物 给 予 的 剂量 是 指 单 剂量 给 药 能 够 产生 明显 的 毒性 效应 , 低 剂量 组 是 指 给 予 能 够 产生 毒性 效应 的 浆 值 剂量 。 动物 实验 的 数据 和 尿 液 样 提交 给 帝国 理工 学 院 。 血 液 样本 在 给 药 24h、48h 和 168h 通过 动物 尾 静 脉 抽取 、 离 心得 到 血清 样本 并 测定 有 关 临 床 化 学 参数 。 剩 余 血 清 样本 保存 于 一 70C 以 备 NMR 分 析 , 尿 液 样本 在 一 2 一 2 收集 并 加 入 释 氮 化 钠 防 腐 , 尿 样 采集 后 置 于 一 70C 保 存 。 动 物 组 织 样本 保存 于 10% 的 甲醛 溶液 中 。 用 于 MAS NMR 分 析 的 组 织 样品 采用 液 氮 速冻 并 保存 于 一 70C 。 其 余 样品 经 处 理 后 切片 做 组 织 学 检查 。 2. 样本 制备 和 NMR 分 析 尿 液 分 析 使 用 的 分 析 仪 器 为 600MHz NMR, 组 织 样本 采用 基于 MAS 技术 的 400MHz 或 600MHz NMR。 大 鼠 和 小 鼠 尿 液 样本 采用 自动 化 的 样品 制备 系统 以 确保 样 品 制 备 的 一 致 性 。 屎 液 样 本 与 缓冲 液 混合 均匀 后 , 取 样 约 500nl 用 于 NMR 分 析 , 在 分 析 中 采用 脉冲 序列 抑制 水 峰 , 每 个 样品 的 分 析 时 间 约 为 4min。 对 于 血清 样本 , 测 定 4 种 不 同类 型 的 NMR 谱 , 即 水 峰 抑制 谱 、 自 旋 - 回 波谱 、 二 维 相 关 谱 及 扩散 -编辑 谱 (diffusion-edited spectrum) 。 3. 数据 结果 及 相关 问题 的 讨论 显然 ,COMET 计划 要 取得 成 功 在 计划 实施 前 期 就 应 该 充分 考虑 到 研究 过 程 中 有 可 能 出 现 的 问题 及 其 解决 方案 , 确 保 各 实验 室 实 验 操 作 程 序 的 标准 化 。 首先 是 化 合 物 的 选择 , 需 要 具有 特定 毒性 并 且 毒 性 重 现 性 良好 , 化 合 物 所 造成 的 损 伤 可 以 得 到 毒 理学 和 病理 学 的 解释 。 参 与 研究 的 各 部 门 采用 优化 的 标准 操作 程序 , 并 充 分 考虑 到 实验 动物 种 系 、 食 物 、 环 境 、 昼 夜 节律 等 多 种 因素 的 影响 。 同 时 也 应 考虑 到 药 物 及 其 可 能 代谢 物 出 现在 体液 中 的 可 能 性 。 通 过 这 些 方法 使 不 同 部 门 的 动物 实验 和 采样 具有 较 高 的 一 致 性 。 对 于 这 种 多 方 参与 的 研究 , 样 品 分 析 技 术 的 重复 性 也 是 非常 重要 的 。NMR 技术 是 COMET 计划 中 使 用 的 分 析 平 台 , 这 种 技术 具有 较 高 的 准确 度 、 精 密度 和 重复 性 。 为 取 得 恨 好 的 重复 性 , 样 品 制备 方法 也 经 过 了 精心 的 设计 。 例 如 , 为 降低 由 于 pH 引起 的 化 学 位 移 的 偏差 , 样 品 采用 强 缓冲 溶液 稀释 以 确保 pH 的 稳定 性 。 另 外 , 尿 液 中 需 添加 县 损 化 钠 以 防止 微生物 的 污染 。NMR 谱 图 中 会 出 现 药物 或 药物 代谢 物 的 谱 峰 , 为 避免 这 .337 , 些 峰 对 模式 识别 的 影响 , 药 物 及 其 代谢 物 的 峰 在 进行 模式 识别 前 应 从 谱 图 中 去 除 。 因 此 需要 建立 能 够 自动 从 大 量 谱 图 中 将 药物 及 其 代谢 物 从 谱 图 中 去 除 的 方法 。 如 果 仅 仅 研 究 少数 几 个 药物 并 且 其 相关 的 代谢 物 比较 少时 , 可 以 简单 地 将 相关 的 化 学 位 移 区 域 从 数据 集中 去 除 。 然 而 , 一 旦 需要 研究 的 药物 数量 庞大 并 且 相 关 代 谢 物 比较 多 的 时 候 , 就 会 发 现 几乎 在 所 有 的 化 学 位 移 处 都 有 药物 及 其 代谢 物 的 峰 , 这 时 通过 简单 将 某 些 化 学 位 移 区 域 去 除 是 不 可 行 的 。 这 个 问题 需要 发 展 能 够 尽量 保留 更 多 的 谱 图 信息 , 同 时 也 能 将 药物 及 其 代谢 物 去 除 的 软件 。 具 体 而 言 , 有 以 下 工作 需要 完成 。 1) 对 照 组 动物 尿 液 的 统计 模型 如 果 能 够 得 到 数 以 千 计 的 对 照 动物 的 尿 液 ,COMET 计划 将 建立 一 个 统计 模型 以 深 人 和 了解 正 常生 理 状 态 下 尿 液 代谢 物 的 变化 情况 。 临 床 化 学 检测 值 异 常 的 对 照 组 动物 在 这 一 统计 模型 应 能 与 其 他 动物 相 比 有 较 大 的 偏离 , 这 样 可 以 早期 发 现 不 正常 的 样本 , 并 通 过 专家 系统 将 这 些 样本 去 除 。 2) 体液 样本 差异 性 的 考察 为 使 来 自 不 同 实验 室 的 谱 图 数据 具有 可 比 性 , 关 键 的 一 点 是 各 实验 室 之 间 动 物 实验 的 误差 尽 可 能 的 小 。 为 考察 实验 数据 是 否 一 致 , 各 实验 室 采用 标准 的 操作 程序 用 肝 作 为 模型 药物 进行 两 项 研究 , 一 是 本 实验 室内 的 一 致 性 研究 , 另 一 个 是 实验 室 间 的 一 致 性 研 究 。 采 用 标准 操作 程序 采集 的 尿 样 和 血样 被 送 到 帝国 理工 学 院 , 并 进行 NMR 分 析 和 模 式 识别 。 研 究 结果 表明 , 来 自 不 同 实验 室 的 样本 的 一 致 性 程度 很 高 , 给 药 组 和 对 照 组 能 够 得 到 清楚 的 分 类 。 代 谢 轨迹 表明 , 低 剂量 组 在 给 药 0 一 8h 变化 达到 最 大 ,在 8 一 48h 缓慢 变化 , 在 72h 后 毒性 消退 , 回 到 起 始 状态 。 对 于 高 剂量 组 , 药 物 诱 导 的 毒性 效应 一 直 持 续 达 168h, 并 且 未 能 完全 回复 起 始 状 态 。 在 这 一 模型 中 , 各 实验 室 提 供 的 样品 之 间 的 差异 小 于 对 照 组 和 给 药 组 之 间 的 差异 。 在 研究 中 也 可 以 看 到 一 些 动物 明显 地 区 别 于 其 他 大 多 数 动物 , 造 成 这 一 差别 的 主要 生物 标志 物 是 柠檬 酸 、 牛 磺 酸 及 马 尿酸 等 , 这 些 内 源 性 代谢 物 易 受 激 素 、 压 力 及 食物 等 多 种 因素 的 影响 , 具 有 较 高 的 个 体 差 异 。 不 同 实 验 室 的 给 药 组 动物 间 有 比较 小 但 是 可 以 观察 到 的 差异 , 这 可 能 是 由 于 一 些 外 部 因素 的 影 响 , 如 食物 摄取 、 温 度 、 光 强 等 的 影响 。 即 使 存在 这 些 差 异 , 各 实验 室 样本 的 平均 代谢 轨迹 是 相似 的 。 这 一 研究 结果 表明 , 相 对 于 毒性 效应 引起 的 生化 改变 而 言 , 不 同 实验 室 样本 之 间 的 差异 是 非常 小 的 。 3) NMR 测定 的 一 致 性 同一 样本 分 成 数 份 , 分 别 在 帝国 理工 学 院 、Pfizer 和 Roche 进行 NMR 分 析 , 并 比 较 分 析 结 果 的 一 致 性 。 这 表明 不 同 实验 室 测 得 的 图 谱 一 致 性 非常 好 , 甚 至 在 不 同 品牌 的 仪器 上 采用 不 同 的 场 强 依然 能 够 得 到 一 致 性 很 好 的 图 谱 :s1 。 4. COMET 计划 的 小 结 及 面临 的 问题 现在 ,COMET 项 目 已 经 顺利 完成 , 参 与 该 项 目的 研究 人 员 对 147 个 化 合 物 的 单 剂 量 7 日 毒性 和 多 剂量 28 日 毒性 进行 了 研究 , 总 共 得 到 了 约 140 000 张 体 液 的 指纹 谱 图 。 在 COMET 项 目 顺利 完成 的 基础 上 , 后 续 项 目 COMET2 的 前 期 筹备 工作 正在 开展 。 由 Nicholson 等 建立 的 Metabometrix 公司 与 Waters 公司 于 2002 年 3 月 10 日 签署 了 一 个 为 期 3 年 的 协议 , 由 Waters 提供 LC/MS 仪器 ,Metabometrix 帮助 Waters 开发 代谢 组 * 338 » 学 技术 , 包 括 基于 LC/MS Al NMR 的 数据 处 理 方法 、 信 息 学 和 化 学 计量 学 模型 等 。 双 方 合作 的 重点 放 在 疾病 诊断 和 药物 毒性 的 代谢 组 学 研究 。 由 于 代谢 组 学 在 药物 安全 评价 方面 的 出 色 表现 ,FDA 正在 考虑 接受 代谢 组 学 这 一 新 的 药物 评价 工具 。 从 以 上 所 述 , 可 以 看 到 代谢 组 学 在 毒性 评价 方面 取得 了 有 目 共 睹 的 成 就 。 但 这 并 不 表明 在 安全 性 评价 方面 已 经 是 完美 的 了 。 就 目前 来 看 , 代 谢 组 学 要 在 药物 安全 性 评价 方 面 扮演 更 重要 的 角色 还 需要 在 以 下 方面 取得 进展 。 首先 , 如 何 将 药物 引起 的 毒性 效应 与 药物 本 身 的 治疗 效应 区 分 开 。 例 如 , 乙 酰 唑 胺 是 一 种 利尿 药 , 其 本 身 的 药理 效应 会 使 得 与 柠檬 酸 循环 有 关 代谢 物 排泄 的 减少 , 较 容易 与 某 些 毒性 效应 相 混淆 。 这 一 问题 的 解决 有 赖 于 对 相关 效应 进行 研究 并 且 建 立 模型 。 其 次 , 药 物 引起 的 某 些 损伤 。 例 如 , 肝 脏 的 纤维 化 , 仅 仅 引 起 体液 代谢 物 组 成 的 细微 变 化 , 只 有 在 器 官 产生 严重 损伤 时 才 会 在 体液 代谢 物 组 成 发 生 较 为 显著 的 变化 。 对 于 这 类 药物 , 要 将 药物 诱导 的 器 官 损伤 与 机 体 正 常 的 生理 变化 相 区 分 是 非常 困难 的 。 不 过 即使 如 此 , 研 究 表明 , 基 于 NMR 技术 的 代谢 组 学 方法 对 这 类 药物 引起 的 损伤 的 检测 灵敏 度 还 是 与 常规 方法 相当 的 空当 。 其 三 , 体 液 的 选择 上 的 局 限 性 。 例 如 , 研 究 神经 系统 的 损伤 时 , 尿 液 可 能 就 不 如 脑脊液 合适 。 另 外 , 如 果 药 物 具 有 混合 毒性 时 该 如 何 处 理 。 例 如 , 如 果 一 个 药物 同时 可 以 造成 肝 损伤 和 肾 损伤 , 这 种 多 位 点 多 机 制 的 损伤 会 使 得 生物 标志 物 的 确定 变 得 复杂 。 可 喜 的 是 这 种 混合 毒性 通常 具有 不 同 的 时 间 维 度 , 即 对 同一 生 物体 而 言 , 两 种 或 更 多 的 毒性 效应 并 不 是 同时 发 生 、 发 展 和 消退 的 , 而 是 有 一 个 时 间 差 。 这 对 同一 实验 动物 连续 重复 取样 测定 并 对 数据 进行 去 卷 积 处 理会 获得 有 关 不 同 毒性 的 信息 。 生命 机 体 功 能 障碍 时 , 通 常会 有 代 偿 机 制 。 如 何 将 代 偿 效应 与 毒性 效应 区 分 是 所 有 “组 学 ”技术 都 面临 的 挑战 , 代 谢 组 学 也 不 例外 。 器 官 或 组 织 损伤 时 , 能 够 引起 内 源 性 代谢 物 变化 的 因素 有 很 多 , 包 括 与 药物 毒性 机 制 有 关 的 作用 、 维 持 自 稳 态 的 代 偿 作用 、 细胞 坏死 导致 胞 内 物质 的 流出 。 在 一 个 复杂 的 机 体 中 , 这 些 效应 有 可 能 是 同时 发 生 的 , 使 得 数据 的 解析 变 得 困难 。 虽 然 如 此 , 在 内 源 性 代谢 物 随时 间 变 化 的 过 程 中 , 在 不 同 的 时 间 点 不 同 的 作用 对 代谢 物 变化 的 贡献 是 不 同 的 , 这 使 得 通过 去 卷 积 运算 将 各 种 不 同 的 效应 区 分 开 成 为 可 能 。 13.5 代谢 组 学 在 中 药 研发 中 的 应 用 由 于 研制 开发 化 学 药 的 高 昂 费 用 及 西医 在 疾病 治疗 中 的 一 些 固有 缺陷 〈 如 化 学 药 毒 副作用 强 、 对 某 些 疑难 病 缺 乏 行 之 有 效 的 药物 及 药 源 性 疾病 的 不 断 增多 ), 人 们 健康 观 念 也 在 发 生变 化 , 在 世界 范围 内 , 回 归 自 然 、 重 视 传 统 医 药 已 经 成 为 重要 的 趋势 , 传 统 医药 由 于 其 在 长 期 应 用 中 表现 出 来 的 安全 性 与 有 效 性 , 在 全 球 日 益 受 到 更 多 的 关注 。 针 和 灸 、 植 物 药 在 一 些 国 家 和 地 区 已 逐步 取得 合法 地 位 , 并 纳入 医疗 保险 体系 , 越 来 越 多 的 国家 政府 机 构 对 传统 医药 陆续 通过 立法 途径 加 以 管理 和 规范 , 世 界 草 药 市 场 也 在 逐年 扩 大 。 不 仅 亚 洲 国 家 对 传统 医药 的 接受 程度 较 高 , 欧 美 等 发 达 国家 对 传统 医药 的 接受 程度 也 在 不 断 提 高 ,FDA 发 布 的 《植物 药 研制 指导 原则 》 (Guidance for Industry; Botani- cal Drug Products) 标志 着 西方 发 达 国 家 对 传统 医药 的 认可 。 e 339 « FA FS Ze PREZ AY Bea St PAE BA EAE lt AR SEB A BR A SB, HP BH 材 种 类 达 12 807 种 , 其 中 药 用 植物 11 146 种 , 药 用 动物 1581 种 , 药 用 矿物 80H, 括 可 以 确定 的 中 草药 5000 余 种 。 中 药 产业 是 我 国 的 传统 产业 , 中 医 中 药理 论 无 论 是 在 诊断 、 药 理 或 者 毒 理 方面 都 凝聚 着 历史 的 智慧 。 中 药 是 一 个 复杂 的 系统 , 无 论 是 复方 还 是 单方 其 药 效 都 是 多 种 化 学 成 分 相互 作用 所 产生 的 综合 效果 。 这 些 化 学 成 分 相互 协同 或 “ 相互 持 抗 , 从 而 产生 中 药 的 药理 作用 。 辩 证 论 治 、 君 臣 优 使 等 原则 是 中 医用 药 的 精 佩 , 因而 整体 观 思想 是 中 草药 药理 研究 的 一 大 特点 , 也 使 中 药 区 别 于 一 般 的 植物 药 。 中 药 的 现代 化 一 直 是 医药 界 、 学 术 界 和 国家 有 关 部 门 关注 和 倡导 的 发 展 方向 , 同 时 也 是 一 个 非常 庞大 和 系统 的 创新 工程 , 对 于 如 何 实现 中 药 的 现代 化 , 近 年 来 众多 学 者 从 不 同 的 角度 做 了 不 同 的 阐述 。 归 根 结 底 , 中 药 的 现代 化 就 是 使 传统 的 中 药 与 现代 科技 相 融合 , 实 现 中药 产 品 的 “ 安 人 全、 有效、 稳定 、 可 控 ”。 在 这 一 过 程 中 有 两 大 问题 需要 面 对 , 其 一 是 中 药 本 身 的 复杂 性 , 其 二 是 中 药 与 人 体 作 用 的 复杂 性 。 众 所 周知 , 中 药材 来 源 于 自然 界 的 植物 、 动 物 、 菌 类 、 矿 物 等 , 其 中 90 为 以 上 为 生物 体 或 其 一 部 分 , 这 使 得 不 管 是 单方 还 是 复方 中 药 , 其 化 学 成 分 大 都 是 非常 复杂 的 , 一 味 中 药 都 可 能 会 有 成 百 上 千 种 化 学 成 分 , 并 且 这 些 化 学 成 分 的 含量 处 于 动态 变化 , 并 受 多 种 因素 的 影响 , 包 括 药材 的 基 源 、 产 地 、 环 境 、 采 收 、 加 工 ; 中 药 所 含 成 分 的 复杂 性 使 得 其 治疗 作用 也 是 一 种 多 系统 、 多 靶 点 、 多 层次 的 作用 , 即 这 些 化 合 物 之 间 也 有 个 “君臣 佐 使 ”的 相互 协同 的 作用 关系 , 往 往 不 是 用 一 个 或 几 个 模型 和 指标 所 能 反映 的 。 中 药 的 现代 化 或 待 解决 的 问题 就 是 如 何 使 得 本 身 为 复杂 体系 的 中 药 质量 “稳定 、 可 控 ”, 如 何 前 明 中 药 的 “安全 、 有 效 ”, 特 别 是 如 何 证 明 中 药 的 协同 作用 。 中 药 发 挥 作 用 的 物质 基础 就 是 中 药 在 生长 过 程 中 产生 的 种 类 繁多 的 代谢 物 , 代 谢 组 学 可 以 全 面 考察 各 种 因素 〈 如 光照 、 产 地 ) 对 中 药 本 身 代 谢 物 含量 、 组 成 的 影响 而 有 利 于 中 药 的 质量 控制 。 同 样 , 代 谢 组 学 也 可 用 于 研究 炮制 、 组 方 对 中 药 成 分 的 影响 。 在 中 药 作 用 机 制 研究 中 , 代 谢 组 学 的 核心 思想 是 通过 内 源 性 代谢 物 的 变化 来 观测 中 药 对 机 体 所 产生 的 整体 效应 , 其 思想 具有 与 中 医 理论 整体 观念 相 一 致 的 特点 , 并 可 根据 代谢 物 组 图 谱 的 变化 , 发 现 生 物 标 志 物 , 阐 明 中 药 的 整体 效应 , 包 括 协同 作用 。 13.5.1 代谢 组 学 在 中 药 质量 研究 中 的 应 用 在 本 书 的 其 他 章节 已 经 提 到 , 根 据 研 究 的 对 象 和 目的 的 不 同 , 代 谢 组 学 可 以 分 为 4 个 层次 "2 , 即 代谢 物 靶 标 分 析 (metabolite target analysis), (UHHH GH) 分 析 (metabolic profiling analysis)、 代 谢 组 学 及 代谢 指纹 分 析 (metabolic fingerprinting analysis) 。 从 这 个 意义 上 来 讲 , 代 谢 组 学 早已 应 用 于 中 药 质量 研究 了 。 例 如 , 《中 国药 典 》 中 已 经 广泛 采用 薄 层 色谱 作为 中 药 的 鉴别 方法 , 并 且 对 多 种 中 药 采 用 单 指标 或 多 指 标的 化 学 成 分 的 测定 来 控制 质量 。 虽 然 这 种 把 已 知 的 主要 成 分 或 有 效 成 分 作为 指标 予以 检测 控制 的 方法 比 过 去 有 很 大 突破 和 进步 , 但 从 中 医药 的 观点 看 , 指 标 成 分 的 控制 难以 真正 控制 中 药 的 功效 。 人 们 总 是 力求 把 中 药 这 一 综合 的 复杂 的 “整体 ”分 解 成 为 便于 观 察 和 研究 的 简单 的 “单元 ”或 “分 子 ”, 以 便 清 楚 明 确 的 研究 。 这 种 方法 对 于 化 学 药品 而 言 , 由 于 其 分 子 结构 清楚 , 构 效 关 系 明 确 , 有 效 性 和 安全 性 与 该 药品 的 成 分 直接 相关 。 340 。 CE Ria 一 et i a 也 许 适 用 , 而 对 于 中 医 理 论 指导 下 的 中 药 , 尤 其 是 复方 制剂 , 检 测 任何 一 种 活性 成 分 均 不 能 反映 其 所 体现 的 整体 疗效 , 这 是 中 药 与 化 学 合成 药品 质量 标准 的 根本 区 别 。 也 就 是 说 分 析 的 越 细 , 目 标 越 缩小 , 离 中 药 的 整体 疗效 距离 越 远 。 中 医 辨证 施 治 用 的 是 药 味 而 非 某 个 化 学 成 分 , 麻 黄 素 与 麻黄 、 甘 草酸 与 甘草 、 人 参 皂 苷 与 人 参 对 中 医 来 说 完全 是 两 回 事 。 又 如 黄连 和 黄柏 均 含 小 果 碱 , 但 测定 小 果 碱 的 含量 说 明 不 了 两 味 药 中 医用 药 的 不 同 , 中 医 也 决 不 会 将 两 者 相互 替 用 ; 六 味 地 黄 丸 中 鉴别 能 果 酸 含量 不 能 证 明 里 面 有 山 荣 黄 , 倘 以 山楂 投料 也 可 鉴别 出 能 果 酸 上 且 绝对 合格 。 可 见 中 药 的 功效 是 药材 饮片 , 中 成 药 方剂 内 含 物质 群 的 整体 作用 结果 , 只 针对 某 一 两 个 化 学 成 分 , 显 然 远 远 不 够 " 。 在 这 种 情况 下 , 采 用 代谢 组 学 的 方法 最 大 限度 地 从 中 药 中 获取 有 关 化 学 成 分 的 信息 , 从 整体 上 评价 中 药 的 质量 成 为 趋势 。 中 药 化 学 指纹 图 谱 即 是 这 一 趋势 的 具体 体现 , 中 药 化 学 指 纹 图 谱系 指 采 用 光谱 、 色 谱 和 其 他 分 析 方法 建立 的 用 以 表征 中 药 化 学 成 分 特征 的 指纹 图 谱 : 5 , 与 传统 质量 控制 模式 的 区 别 在 于 : 指纹 图 谱 是 综合 地 看 问题 , 也 就 是 强调 化 学 谱 图 的 “完整 面 狐 ” 即 整体 性 , 反 映 的 质量 信息 是 综合 的 。 由 于 植物 药 的 次 生 代谢 产 物 , 即 各 种 化 学 成 分 天 然 潜 在 的 不 稳定 性 , 如 同日 常 许多 模糊 现象 一 样 , 它 的 化 学 指纹 图 谱 具 有 无 法 精密 度量 的 模糊 性 。“ 整 体 性 ”和 “模糊 性 ”是 指纹 图 谱 的 基本 属性 , 指 纹 图 谱 的 相似 性 是 通过 其 基本 属性 来 体现 。 指 纹 图 谱 分 析 强 调 准确 的 辨认 , 而 不 是 精密 的 计算 , 比 较 图 谱 强调 的 是 相似 , 而 不 是 相同 。 在 不 可 能 将 中 药 复杂 成 分 都 搞 清 楚 的 情 况 下 , 指 纹 图 谱 的 作用 是 反映 复杂 成 分 的 中 药 内 在 质量 的 均一 性 和 稳定 性 , 指 纹 图 谱 应 满足 专属 性 、 重 现 性 和 实用 性 的 技术 要 求 。 从 代谢 组 学 的 角度 来 看 , 中 药 化 学 指纹 图 谱 是 一 种 代谢 指纹 分 析 。 以 下 我 们 将 对 这 一 技术 在 中 药 〈 植 物 药 ) 研究 中 的 研究 概况 、 研 究 方 法 及 如 何 解 决 中 药 质量 问题 做 一 个 介绍 。 13.5.1.1 -国内 外 研究 概况 目前 指纹 图 谱 已 成 为 国内 外 公认 的 鉴别 中 药品 种 和 评价 中 药 质量 的 最 有 效 手段 , FDA 在 1996 年 制定 的 《植物 制品 指南 〈 试 行 )》 中 对 植物 制品 补充 品 和 植物 药 进行 了 规范 化 , 要 求 对 植物 原料 、 植 物 药 中 间 品 和 植物 药 产品 提供 相应 的 指纹 图 谱 。2000 年 , 美国 EDA 允许 草药 保健 品 申报 资料 可 以 提供 色谱 指纹 图 作为 鉴别 资料 , 在 2004 年 定稿 的 《植物 药 研制 指导 原则 》 中 , 指 纹 图 谱 被 作为 质量 控制 的 主要 手段 。 英 国 草药 典 、 印度 草药 典 、 加 拿 大 药 用 及 芳香 植物 学 会 、 德 国药 用 植物 学 会 也 接受 色谱 指纹 图 谱 。 此 Sb, WHO"! 在 1996 年 植物 药 评价 指导 原则 有 关 章 节 中 都 提 到 “如 果 不 可 能 鉴别 有 效 成 分 , 则 鉴别 一 种 或 几 种 特征 成 分 〈 如 色谱 指纹 图 谱 ) 以 保证 制剂 和 产品 质量 的 一 致 ”。 欧洲 国家 ”在 草药 质量 指南 的 注释 中 提 到 “草药 的 质量 稳定 性 单 靠 测定 已 知 的 有 效 成 分 是 不 够 的 , 因 为 草药 及 其 制剂 是 以 其 整体 作为 有 效 物 质 , 因 此 , 应 该 通过 色谱 指纹 图 谱 显示 其 所 含 的 各 种 成 分 在 草药 及 其 制剂 中 是 稳定 的 , 其 含量 比例 能 保持 恒定 >。 日 本 汉 方 药 主 要 生产 企业 在 20 世纪 80 年 代 就 已 经 在 企业 内 部 采用 高 效 液 相 指纹 图 谱 控制 质 量 。 他 们 把 传统 方剂 采用 地 道 药 材 , 按 饮片 配方 苑 者 得 到 的 煎 计 作为 标准 指纹 图 谱 。 对 大 规模 生产 的 原料 、 配 方 和 工艺 严格 控制 , 使 成 品 指纹 图 谱 与 标准 指纹 图 谱 一 致 。 欧 洲 一 直 比 较 重视 草药 的 医疗 作用 , 对 草药 的 质量 控制 也 殊途同归 , 采 用 了 指纹 图 谱 方法 。 德国 、 法 国联 合 开发 的 银杏 叶 提 取 物 是 一 个 典范 。 他 们 在 研究 中 发 现 银杏 叶 提 取 物 的 医 .341 + 疗 作 用 是 提取 物 所 得 物质 群 的 整体 作用 结果 。 德 、 法 联合 集团 的 技术 负责 人 说 , 提 取 物 是 一 个 “整体 ”, 正 是 这 样 一 种 混合 物 保证 了 其 所 具有 的 治疗 作用 。 他 们 进行 了 长 期 的 研究 , 把 混合 物 所 含 内 酯 和 黄酮 相互 分 离 , 则 “都 不 具备 全 部 提取 物 整体 的 功效 ”。 K 国 国家 药品 监督 管理 部 门 也 于 2000 年 发 布 了 《中 药 注 射 剂 的 指纹 图 谱 研 究 的 技术 要 求 (暂行 )》, 明 确 要 求 对 新 申报 的 中 药 注射 剂 和 已 上 市 的 中 药 注射 剂 实行 指纹 图 谱 标准 。 13.5.1.2 指纹 图 谱 的 要 求 与 应 用 中 药 本 身 的 复杂 性 使 得 如 何 构建 满足 特征 性 、 重 现 性 和 可 操作 性 的 指纹 图 谱 本 身 就 是 一 个 需要 深入 研究 的 问题 。 指 纹 图 谱 的 建立 涉及 药材 的 采集 、 样 品 预 处 理 、 样 品 分 析 、 数 据 处 理 等 一 系列 的 步 又。 国家 药品 监督 管理 部 门 发 布 的 《中 药 注射 剂 的 指纹 图 谱 研究 的 技术 要 求 〈 暂 行 ) 交 扫 是 基本 的 框架 。 近 年 随 着 中 药 指纹 图 谱 研究 的 深信, 国内 学 者 也 纷纷 就 研究 中 出 现 的 一 些 问 题 进 行 了 探讨 , 并 对 如 何 构建 指纹 图 谱 提出 了 诸多 建议 。 近年 来 指纹 图 谱 在 中 药 研究 中 的 应 用 越 来 越 广泛 , 不 仅 中 药 注射 液 而 且 原 药材 、 饮 片 及 各 种 类 型 的 中 药 制剂 也 纷纷 采用 指纹 图 谱 的 方法 进行 质量 控制 。 分 析 技 术 的 发 展 也 非常 迅猛 , 从 常用 的 色谱 (I. BO. AS) 及 其 联 用 技术 到 核磁 共振 、 紫 外 、 红 外 等 光谱 技术 都 得 到 了 应 用 。 此 外 ,X 射线 衍射 法 、 热 分 析 法 、 电 化 学 法 、 化 学 振 荔 技术 等 诸多 方法 也 有 文献 报道 。 数 据 处 理 技术 也 相应 地 从 直观 数据 比较 发 展 到 基于 计算 机 软件 的 模式 识别 技术 。 关 于 分 析 技 术 平 台 〈 包 括 采样 、 分 析 仪 器 及 数据 处 理 ) 的 原理 、 特 点 在 本 书 的 其 他 章节 中 会 有 较为 详细 的 前 述 , 在 本 章节 中 不 再 更 述 。 本 章 重 点 讨论 基于 代谢 组 学 的 指纹 图 谱 分 析 是 如 何 解决 中 药 研究 中 遇 到 的 实际 问题 。 图 13-6 是 从 原 药材 到 中 药 制剂 的 一 个 流程 图 , 在 整个 过 程 中 有 诸多 因素 影响 着 中 药 质量 的 稳定 和 可 控 。 以 下 我 们 将 对 指纹 图 谱 在 这 一 流程 中 的 应 用 做 一 介绍 〈 图 13-6). 药材 Ho[ we es 质量 评价 | 一 > | 加 工 炮制 上 > | an | 一 > | aa | TS 药 用 部 位 种 属 其 他 因素 图 13-6 ”中 药 制药 流程 图 1) 中 药 鉴别 中 药 由 于 药材 本 身 质量 良 蓉 不 齐 、 在 长 期 应 用 流通 中 存在 着 大 量 的 代用 品 及 同名 异 物 和 异 名 同 物 的 现象 , 同 时 还 存在 挫 杂 造假 和 伪 品 等 问题 , 严 重地 影响 了 用 药 的 安全 性 。 342 。 与 有 效 性 。 在 我 国 长 期 的 中 药 使 用 历史 中 , 对 于 中 药 的 鉴别 一 直 采 用 , 而 且 大 部 分 靠 主 观 经 验 来 判断 , 如 对 原 药 材 检 验 主 要 是 看 外 形 、 闻 气味 、 尝 口感。 对 于 制剂 则 可 谓 “ 丸 散 总 丹 , 神 仙 难 辨 "。 建 国 后 , 我 国 对 中 药 的 质量 标准 进行 整理 , 然 而 由 于 技术 上 的 限 制 对 于 药物 的 真 伪 主 要 是 以 外 观 性 状 及 理化 、 显 微 特 征 进行 鉴定 。 薄 层 色 谱 法 的 应 用 使 得 这 一 状况 得 到 了 改变 , 薄 层 色 谱 法 便宜 、 快 速 、 灵 活性 强 , 从 薄 层 色谱 提供 的 指纹 信 息 中 不 仅 可 以 对 药材 的 真 伪 进 行 判 别 , 而 且 可 以 在 同 板 上 形象 地 比较 各 个 样品 的 异同 。 这 使 得 基于 薄 层 色谱 的 指纹 图 谱 广 泛 地 应 用 于 中 药 的 鉴别 ,2000 年 版 中 国药 典 中 采用 薄 层 色谱 法 做 鉴别 的 品种 达 602 种 。 近 年 , 王 爱 芹 等 采集 了 29 个 南 莹 世子 及 易 混 药材 样本 , 对 TLC 指纹 色谱 图 像 分 析 , 南 莹 英子 提取 液 色谱 中 , 在 与 对 照 品 色谱 相应 的 位 置 均 显 亮 黄菊 光斑 点 , 在 北 草 荫 子 及 易 混 药材 样本 的 色谱 中 均 未 见 该 荧光 斑点 , 这 显示 了 较 好 的 专属 性 5 。 基 于 其 他 分 析 方 法 的 指纹 图 谱 也 应 用 于 中 药 的 鉴别 , 如 采用 傅 里 叶 变 换 红 外 光谱 技术 快速 准确 地 鉴别 酸 吏 仁 与 其 伪 品 滇 吏 仁 品 ] 。 采 用 NMR 的 方法 对 同 科 同属 不 同 种 植物 中 药 、 同 科 不 同属 植物 中 药 、 同 科 同 属 同 种 不 同 来 源 植物 中 药 进行 鉴别 , 指 纹 图 谱 具 有 明显 的 特征 性 和 很 好 的 重 现 性 5 。 2) 中 药 质量 研究 人 们 在 长 期 使 用 中 药 的 过 程 中 就 早已 发 现 不 同 产地 、 不 同 采 收 时 期 的 中 药 质量 存在 着 差异 。 限 于 当时 的 条 件 , 古 人 无 法 对 这 个 问题 进行 深入 研究 , 为 控制 中 药 的 质量 提出 了 以 “ 道 地 药材 ”为 优质 药材 , 并 相应 地 对 采 收 和 加 工 炮 制 做 了 一 些 经 验 性 的 规定 以 确 保 药物 的 安全 和 有 效 。 长 期 以 来 , 中 药 质量 的 稳定 和 可 控 一 直 未 能 解决 , 由 于 对 药材 的 需求 量 越 来 越 大 , 中 药 的 引种 和 人 工 栽 培 更 为 普遍 , 使 得 这 一 问题 更 加 突出 。 中 药 发 挥 药 效 的 成 分 主要 是 其 中 所 含 的 代谢 物 , 包 括 初 生 代 谢 产 物 和 次 生 代 谢 产物 , 这 些 代谢 产 物 在 植物 体内 的 分 布 、 组 成 及 浓度 是 随 着 各 种 内 外 条 件 的 变化 而 动态 变化 的 。 对 于 次 生 代谢 产物 而 言 , 受 环境 的 影响 更 大 。 指 纹 图 谱 技 术 可 以 完整 地 反映 代谢 物 随 着 产地 、 采 收 时 间 等 条 件 的 不 同 而 发 生 的 变化 , 因 而 可 以 用 于 研究 环境 对 中 药 质量 的 影响 、 评 价 和 控制 中 药 的 质量 。 近 年 来 中 药 指纹 图 谱 在 这 方面 的 应 用 是 一 个 热点 。 “ 道 地 药材 ”一 直 都 被 视 为 优质 药材 , 这 体现 了 古人 对 环境 对 药材 品质 影响 的 认识 , 采用 指纹 图 谱 技 术 了 解 不 同 产 地 药材 之 间 的 异同 是 对 中 药 质量 控 制 的 一 个 环节 。 近 年 来 大 量 的 研究 工作 表明 不 同 产地 的 药材 在 代谢 物 指纹 方面 既 有 着 共性 也 有 着 差异 。 对 于 生 长 范围 较 广 的 中 药 , 在 地 理 上 相隔 较 远 的 地 区 在 自然 环境 上 差别 较 大 , 这 一 点 会 在 中 药 的 质量 上 得 到 反映 。 密 蒙 花 为 常用 中 药 , 采 用 HPLC 色谱 法 建立 中 药 密 蒙 花 指纹 图 谱 , 测定 10 份 来 源 不 同 省 市 密 蒙 花 商 品 药材 的 指纹 图 谱 , 可 以 看 出 不 同 来 源 的 药材 虽然 出 现 了 相应 的 主 成 分 峰 , 但 峰 面积 比值 不 尽 相 同 , 有 的 相对 峰 面积 差别 在 8 LA EO, 不 同 产地 的 野 葛 药 材 指纹 图 谱 有 明显 不 同 ,8 个 共有 峰 相 对 保留 时 间 符 合 程度 较 好 。 但 相对 峰 面 积 相差 较 大 "5 。 采 用 水 蒸气 蒸 馆 法 提取 不 同 产地 羌活 的 挥发 油 , 用 毛细 管 气 相 色 谱 技 术 测 定 指纹 图 谱 , 选 用 聚 类 法 分 析 比 较 12 种 不 同 来 源 的 羌活 的 指纹 信息 ,12 种 羌活 挥发 油 出 峰 数 基本 一 致 , 但 峰 面 积 比值 有 所 不 同 , 个 别 样 本 差异 较 大 5 。 也 有 的 药材 品种 对 于 产地 的 要 求 不 高 , 不 同 产地 药材 的 相似 程度 比较 高 , 红 花 为 菊 科 植物 红 花 的 干燥 花 , 采 用 RP-HPLC 方法 控制 药材 的 指纹 图 谱 , 用 于 红 花 的 质量 评价 , 不 同 产 地 31 批 次 红 花 药材 化 学 组 成 相似 , 其 相对 比例 较 稳 定 , 但 仍 有 少数 产地 的 药材 指纹 图 ° 343 » 谱 中 有 明显 差别 5 。 研 究 人 员 也 对 一 些 分 布 区 域 比较 窗 的 〈 如 一 个 省 内 ) 药物 质量 采 用 指纹 图 谱 的 方法 进行 了 研究 。 黄 花 倒 水 莲 是 远志 科 远 志 属 植物 黄花 倒 水 莲 的 干燥 根 , 为 广西 民间 常用 草药 , 采 用 RP-HPLC-ELSD 法 对 其 总 皂苷 部 位 的 指纹 图 谱 进 行 研究 , 12 个 广西 各 产地 指纹 图 谱 与 其 均值 相 比较 , 采 集 的 12 个 地 区 样品 相关 性 均 在 0.9 以 上 , 都 有 一 定 相关 性 。 相 应 共有 指纹 峰 均 已 在 色谱 图 上 体现 , 但 是 各 峰 面积 有 所 不 同 , 说 明 各 地 药材 其 成 分 含量 有 一 定 差别 5 中] 。 毛 脉 酸 模 CRumex gmelini Turcz) HERB 模 属 多 年 生 宿 根 草本 植物 , 广 泛 分 布 于 黑龙 江 省 大 、 小 兴安 岭 及 张 广 才 岭 等 地 区 , 是 黑 龙 江 省 、 吉 林 长 白山 地 区 的 重要 药 用 植物 资源 。 对 12 个 野生 毛 脉 酸 模 样品 〈 采 自 黑龙 江 省 各 林 区 ) 进行 指纹 图 谱 的 分 析 和 比较 , 研 究 表明 不 同 产地 毛 脉 酸 模 药 材 共 有 指纹 峰 的 峰 面积 之 和 大 于 95% , 共 有 峰 基 本 都 存在 , 但 各 色谱 峰之 间 的 相对 峰 面积 不 同 , 由 此 可 以 看 出 它们 之 间 的 内 在 质量 存在 一 定 的 差异 , 并 初步 推测 其 中 一 个 样品 中 酸 模 素 的 相对 高 度 较 其 他 样品 均 高 , 可 能 与 样品 采 于 水 湿 洼 地 有 关 , 怀 疑 酸 模 素 的 积累 可 能 受 水 分 的 影响 较 大 55 。 也 有 研究 表明 , 在 江苏 四 个 产 区 的 一 年 生 栽 培 品 太子 参 HPLC 指纹 图 谱 具 有 较 高 的 相似 性 5 。 值 得 注意 的 是 , 样 品 预 处理 和 分 析 方 法 的 选择 对 于 指纹 图 谱 所 含 信息 量 的 影响 是 很 大 的 , 任 何 一 种 方法 建立 的 指纹 图 谱 都 不 可 能 反映 药材 的 全 部 代谢 物 的 信息 , 而 仅仅 是 一 部 分 〈 也 可 能 是 非常 有 限 的 一 部 分 ) 信息 , 因 此 单一 方法 的 指纹 图 谱 并 不 一 定 能 够 对 中 药 的 质量 进行 评价 。 例 如 , 析 子 是 苗 草 科 植 物 山 枯 的 成 熟 干 燥 果 实 , 用 作 药 物 , 对 分 别 产 于 江西 、 广 西 、 浙 江 、 湖 南 和 海南 杠 子 果实 建立 药材 杖 子 水 提 部 分 的 HPLC 指纹 图 谱 , 脂 溶性 成 分 和 挥发 油 的 GC-MS 联 用 指纹 图 谱 , 不 同 产地 柏 子 的 挥发 油 和 脂 溶性 部 分 具有 很 好 的 相似 性 , 而 水 提 部 分 的 相似 性 较 前 两 者 为 差 。 通 过 比较 不 同 产地 杖 子 相 似 系数 的 关系 , 以 及 对 主要 药 效 成 分 定量 结果 的 分 析 , 对 不 同 产 地 析 子 的 指纹 图 谱 做 了 整体 性 评价 。 结 果 表 明 , 只 有 全 面 测定 成 分 及 整体 性 评价 后 , 药 材 的 质量 才能 得 到 有 效 评价 [5 。 中 药 的 采 收 期 在 传统 上 都 有 一 些 经 验 性 的 规定 。 采 用 指纹 图 谱 的 方法 也 表明 这 些 规 定 有 着 合理 性 。 采 用 HPLC-DAD 方 法 比较 江苏 道 地 药材 那州 银杏 叶 在 不 同 采 收 期 的 指 纹 图 谱 。 同 一 树龄 不 同 采 收 期 的 银杏 叶 中 ,2 一 4 年 生 银 杏 叶 分 别 在 不 同 采 收 期 指纹 图 谱 相 似 度 较 高 (0.90); 5 年 生 和 6 年 生 银杏 叶 分 别 在 不 同 采 收 期 指纹 图 谱 相 似 度 变 化 范围 较 大 〈0. 86 一 0. 97) 。 同 一 采 收 期 不 同 树龄 的 银杏 叶 中 ,5 一 7 月 不 同 树龄 银杏 叶 指纹 图 谱 相 似 度 较 高 〈 盖 0.90); 8 一 10 月 不 同 树龄 银杏 叶 指 纹 图 谱 相 似 度 变化 范围 较 大 0. 84 一 0. 99) , 研 究 结果 为 银杏 叶 的 合理 采 收 提供 了 科学 依据 5%] 。 对 山 麦 冬 应 用 HPLC/ESE-MS 技术 对 不 同 批 次 和 采集 点 的 药材 建立 指纹 图 谱 , 采 用 聚 类 分 析 对 数据 进 行 处 理 , 结 果 表 明 采 集 时 间 相 同 的 药材 相似 程度 相对 较 高 501 。 区 草 为 密 科 植物 荤 草 的 干燥 果穗 及 带 叶 葵 枝 , 为 贵州 少数 民族 用 药 , 采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 建立 荤 草药 材 的 指纹 图 谱 , 对 贵州 省 内 数 个 采集 地 的 多 批 药 材 进 行 分 析 , 结 果 表 明 不 同 产地 、 同 一 采 收 期 的 指纹 图 谱 差异 不 大 , 而 同一 产地 不 同 采 收 期 的 药材 指纹 图 谱 差异 较 大 , 因 此 需 固定 采 收 季节 !s5 。 青 皮 为 常用 中 药 主要 分 为 四 花 青 皮 和 个 青皮 两 类 ,5 一 6 月 收集 自 落 的 幼 果 , i, SRR “SR”; 7 一 8 ARAMA RE, SH “ERR”, RA GC 法 和 HPLC 法 对 10 个 青皮 样品 进行 测定 , 并 对 获取 的 指纹 图 谱 采 用 加 权 相 似 度 计算 和 进行 基 于 主 成 分 分 析 的 投影 法 研究 。 气 相 色谱 和 液 相 色谱 的 结果 均 表 明 四 花 青皮 和 个 青皮 之 间 存 。 344 。 FEAR HERO 。 不 仅 是 采 收 期 , 甚 至 在 同一 天 内 不 同时 间 采 样 , 药 材 中 含有 的 化 学 成 分 也 是 有 一 定 的 变化 的 , 在 清晨 和 傍晚 分 别 采 集 银杏 叶 , 从 TLC 指纹 上 可 以 发 现 多 种 化 合 物 的 含量 都 发 生 了 变化 , 这 也 表明 中 药 的 质量 控制 的 确 是 个 艰巨 的 任务 5"9 。 中 药 需 求 量 的 不 断 增 加 使 得 人 工 栽培 得 到 了 广泛 的 应 用 , 采 用 药材 生产 质量 管理 规 范 〈good agriculture practice, GAP) 来 得 到 质量 稳定 的 药材 也 是 中 药 现代 化 的 一 个 重 要 的 组 成 部 分 。 人 工种 植 常 以 植株 生长 健壮 、 快 速生 长 作为 优质 药材 栽培 的 田间 管理 标 准 , 以 “高 产 优质 ”为 优质 植物 药材 种 植 的 目标 , 以 追肥 改 土 和 改良 栽培 环境 作为 提高 药材 质量 的 主要 管理 技术 措施 。 然 而 , 对 大 多 数 植 物 而 言 , 次 生 代谢 产物 的 合成 与 积累 往往 受制 于 所 处 环境 的 变化 。 它 们 根据 所 处 环境 的 变化 来 决定 合成 次 生 代谢 产物 的 种 类 和 数量 , 只 有 在 特定 的 环境 下 才 合成 特定 的 次 生 代 谢 产物 , 或 者 显著 地 增加 特定 的 次 生 代谢 产物 在 体内 的 产量 。 目 前 , 各 方面 的 研究 都 认同 , 有 利于 初生 代谢 的 环境 条 件 不 利 于 次 生 代谢 , 不 利于 初生 代谢 的 条 件 反而 增加 次 生 代谢 , 也 就 是 相对 于 生长 的 胁迫 环境 可 提高 次 生 代 谢 。 初 生生 长 与 次 生 代谢 存在 一 定 的 平衡 关系 , 生 物 量 过 高 时 单位 质量 植 物体 中 的 次 生产 物 的 量 下 降 , 单 位 质量 植物 体 中 的 次 生产 物 的 量 升 高 , 生 物 量 下 降 "“5 。 这 使 得 至 少 对 于 许多 以 次 生 代谢 产物 为 药 效 成 分 的 中 药 存 在 着 “高 产 ” 和 “优质 ”之 屿 的 矛盾 。 采 用 核磁 共振 的 方法 得 到 野生 高 山 红 景 天 和 栽培 高 山 红 景 天 指纹 图 谱 , 通 过 比 较 发 现 特征 提取 物 的 回收 率 不 同 , 说 明 野 生 和 栽培 高 山 红 景 天 之 间 存 在 差异 [*)] 。 中 药 在 长 期 的 使 用 过 程 中 , 经 常 存在 种 属相 近 或 形态 相近 的 植物 当 作 同 一 种 药材 使 用 的 情况 。 这 种 药材 之 间 的 混用 是 否 具 用 科学 性 、 同 一 药材 的 不 同 植 物质 量 是 否 有 差 异 、 差 异 又 有 多 大 都 是 需要 研究 的 问题 。 黄 芬 为 常用 中 药 , 除 了 药典 规定 的 黄 苍 , 其 同 属 近 缘 植 物 〈 如 粘 毛 黄 芬 、 滇 黄 芬 、 甘 肃 黄 苍 等 ) 在 临床 上 也 作 黄 人 劳 人 药 。 对 不 同 来 源 的 黄 芬 药 材 进行 HPLC 指纹 图 谱 的 比较 研究 , 以 系统 聚 类 分 析 进 行 分 类 , 系 统 聚 类 分 析 将 样品 分 为 5 类, 正品 黄 芬 、 汗 黄 劳 、 甘 肃 黄 苍 各 分 为 一 类 ; 2 份 粘 毛 黄 芬 各 分 为 一 类 。 汗 黄 芬 与 正品 黄 芬 的 指纹 图 谱 差异 较 明 显 , 而 粘 毛 黄 劳 、 甘 肃 黄 芬 与 正品 黄 芬 指 纹 图 谱 无 明显 差异 , 不 同 产 地 的 正品 黄 芬 间 指 纹 图 谱 无 明显 差异 “) 。 从 近 几 年 的 文献 来 看 , 基 于 代谢 指纹 分 析 的 中 药 指纹 图 谱 已 经 广泛 的 应 用 于 中 药 药 材 的 质量 研究 , 并 取得 了 一 系列 的 研究 成 果 。 药材 的 质量 控制 只 是 中 药 质量 控制 的 一 个 方面 。 从 药材 到 可 供 使 用 的 中 药 制剂 〈 包 括 传 统 汤 剂 和 中 成 药 等 ) 还 需 经 过 药材 的 加 工 炮 制 和 制剂 等 多 道 工 序 , 指 纹 图 谱 技术 在 这 方面 也 有 广泛 的 应 用 。 原 药材 在 使 用 之 前 常 需 经 过 干燥 、 炮 制 等 加 工 过 程 。 中 药 三 七 为 五 加 科 人 参 属 植物 田 七 的 根 , 在 商品 中 存在 了 晾 干 〈 晒 干 ) 或 烘 干 的 产品 。 不 同 的 干燥 方法 对 三 七 化 学 成 分 会 造成 什么 影响 ? 采用 HPLC 指纹 谱 的 方法 来 分 析 不 同 干燥 方 法 得 到 的 三 七 样品 及 不 同 干燥 程度 和 不 同 保存 时 间 的 三 七 样品 , 结 果 显 示 在 不 同 干燥 方法 下 , 有 的 组 分 受到 干燥 温度 和 时 间 的 影响 较 大 , 干 燥 方法 、 药 材 干 燥 程 度 及 保存 时 间 均 可 对 三 七 HPLC 指纹 谱 造成 一 定 的 影响 "9 。 传统 的 汤 剂 经 常 采用 的 工艺 是 多 味 药材 的 混合 煎 煮 , 从 理论 上 说 , 在 混 前 过 程 中 会 有 一 些 复杂 的 物理 和 化 学 的 变化 , 而 在 现代 的 工业 化 的 制剂 工艺 中 由 于 种 种 原因 常常 采 用 各 味 药材 分 煎 后 再 调配 的 方法 , 这 种 工艺 上 的 不 同 会 造成 中 药 制剂 内 在 质量 上 的 差 异 , 如 何 测定 这 种 差异 并 且 对 这 种 差异 进行 评价 是 人 们 所 关心 的 问题 。 首 先是 混 前 过 程 er 345 » 中 是 否 有 新 的 化 合 物 出 现 ; KEIR SAPNA PRA Ig, KW 文献 来 看 , 第 一 个 问题 与 复方 药物 的 配伍 有 关 , 芮 陈 某 汤 由 英 陈 蒜 、 析 子 、 大 黄 三 味 药 组 成 , 利 用 HPLC 法 分 析 英 陈 芒 汤 与 英 陈 蒿 、 杖 子 、 大 黄 的 指纹 图 谱 , 比 较 菌 陈 蒿 汤 合 前 与 分 硬 的 成 分 考察 中 药 复方 中 其 化 学 成 分 的 来 源 。 结 果 显 示 , 英 陈 贰 汤 出 峰 共 47 个 , 其 中 ,19 MERU T RS. 31 个 峰 来 源 于 大 黄 ,6 个 峰 来 源 于 杖 子 , 认 为 英 陈 芒 汤 合 前 与 分 煎 , 两 者 无 明显 成 分 变化 [9 。 而 对 于 另外 一 个 中 药 复 方 当 归 补 血 汤 却 是 另外 一 种 情况 , 利 用 HPLC-DAD 提供 的 色谱 和 光谱 信息 , 对 相同 实验 条 件 下 提取 的 当 归 补 血 汤 及 其 单 味 药 当 归 、 黄 芪 的 色谱 指纹 图 谱 流 出 组 分 进行 对 比分 析 , 结 合 光谱 与 色 谱 方法 , 比 较 了 复方 与 组 成 该 复方 的 单 味 药 中 各 组 分 的 异同 , 当 归 补 血 汤 色谱 指纹 图 谱 中 的 18 个 色谱 峰 ,10 个 组 分 来 源 于 当归 ,11 个 组 分 来 源 于 黄芪 , 其 中 5 个 组 分 为 当归 和 黄芪 的 共有 组 分 ,2 个 组 分 为 新 物质 [0 。 对 第 二 个 问题 , 也 在 采用 指纹 图 谱 技 术 进 行 考察 。 以 常规 方法 制备 补肾 方 分 前 和 合 衣 的 提取 物 , 采 用 HPLC 法 进行 测定 , 比 较 两 者 指纹 图 谱 的 差异 、 分 前 和 合 前 提取 物 中 化 学 成 分 组 成 存在 差异 , 分 前 提取 物 中 主要 化 学 成 分 的 提取 率 大 于 合 前 提取 物 , 且 共有 化 学 成 分 的 组 成 比例 也 不 同 , 这 表明 补肾 方 分 郁 和 合 前 提取 物质 量 上 有 差异 !' 1 。 当 然 , 这 些 差异 是 否 会 使 药物 在 临床 疗效 上 有 变 化 还 需 进 一 步 验证 , 但 在 改变 工艺 时 通过 指纹 技术 与 传统 工艺 相 比 较 还 是 必要 的 。 工 业 化 的 生产 中 同一 种 制剂 通常 并 不 是 只 有 一 种 工艺 。 例 如 , 参 麦 注射 液 由 红 参 、 麦 冬 提 取 而 成 , 在 制剂 上 是 采用 单 味 药材 分 别提 取 然 后 混合 的 生产 路 线 , 然 而 在 具体 的 工艺 上 存 在 提取 溶剂 和 提取 时 间 的 差别 , 用 HPLC 测定 红 参 药材 及 3 种 工艺 制备 的 红 参 中 间 体 和 人参 麦 提取 液 的 指纹 图 谱 , 结 果 显 示 不 同 制 备 工 艺 对 参 麦 注射 液 中 总 皂苷 含量 和 各 皂苷 比例 均 有 影响 [2 。 指 纹 图 谱 技术 不 仅 是 药品 质量 均一 性 保证 , 而 且 还 可 以 反映 从 药材 一 直到 制剂 整个 流程 的 稳定 性 。 目 前 , 许 多 研究 都 采用 指纹 图 谱 的 方法 来 研究 从 原料 、 中 间 体 一 直到 制剂 的 整个 流程 的 变化 , 为 工艺 优化 和 质量 控制 服务 。 例 如 , 对 肿 节 风 注 射 液 从 原料 一 直到 制剂 都 采用 HPLC 得 到 指纹 图 谱 , 对 工艺 进行 了 评价 , 并 且 采 用 聚 类 分 析 的 方法 分 析 制 剂 、 中 间 体 及 原料 之 间 的 相关 性 53 。 类 似 的 研究 还 包括 银杏 叶片 剂 和 银杏 叶 注射 液 等 多 种 中 药 制剂 。 从 以 上 所 述 可 以 看 出 , 基 于 代谢 物 指纹 分 析 的 中 药 指纹 图 谱 已 经 成 为 中 药 质量 研究 和 质量 控制 的 重要 手段 , 并 在 发 挥 着 越 来 越 重 要 的 作用 。 随 着 分 析 科 学 的 发 展 , 越 来 越 多 新 技术 也 不 断 用 于 指纹 信息 的 获取 , 如 在 中 药 挥发 性 组 分 的 分 离 分 析 中 采用 了 全 二 维 气相 色谱 技术 , 过 去 采用 GC-MS 研究 连 夕 挥发 油 , 鉴 定 的 组 分 在 100 种 之 内 。 而 使 用 GC XxGC/TOF-MS, 通 过 优化 色谱 条 件 , 鉴 定 出 匹配 度 大 于 800 的 组 分 有 220 FH, Ft 有 66 种 物质 的 相对 含量 〈 体 积分 数 ) 大 于 0.02%, VRE, PRES 采用 GC-MS 分 析 , 鉴 定 的 组 分 也 在 100 种 之 内 , 而 用 GC XGC/ TOF-MS 方法 , 得 到 匹配 度 大 于 800 的 组 分 有 249 种 , 共 有 70 种 组 分 的 相对 含量 〈 体 积分 数 ) 大 于 0. 02% 。 但 是 在 中 药 研 究 中 指纹 图 谱 技 术 还 面临 着 一 些 需 要 解决 的 问题 。 目 前 指纹 图 谱 采用 的 分 析 平 台 种 类 较 多 , 每 一 种 方法 都 是 从 不 同 的 侧面 体现 中 药 中 所 含 化 合 物 的 信 息 , 如 何 将 各 种 技术 结合 起 来 综合 反映 中 药 的 内 在 质量 是 需要 进一步 研究 的 问题 ;即使 是 同一 类 型 的 分 析 平 台 〈 如 液 相 色 谱 仪 ), 型 号 及 性 能 也 差异 较 大 , 数 据 之 间 的 比较 较 为 困难 , 指 纹 图 谱 中 得 到 的 海量 数据 在 数据 的 标准 及 数据 的 分 析 方 面 还 需 加 强 。 这 些 问 。 346 。 题 都 需要 在 实践 中 不 断 的 完善 , 并 且 确 定 标准 操作 规程 。 国 外 在 植物 代谢 组 学 方面 也 进 行 了 大 量 的 工作 , 值 得 中 药 指纹 研究 参考 和 借鉴 , 植 物 代谢 组 学 详细 的 研究 概况 和 进展 在 本 书 其 他 章节 有 详细 介绍 , 在 此 不 再 费 述 。 13.5.2 代谢 组 学 在 中 药 药 效 研究 中 的 应 用 如 前 所 述 , 中 药 所 含 成 分 的 复杂 性 使 得 其 治疗 作用 也 是 一 种 多 系统 、 多 靶 点 、 多 层 次 的 作用 , 具 有 整体 、 综 合 、 动 态 及 多 样 性 特点 , 即 这 些 化 合 物 之 间 也 有 个 “君臣 估 使 ”的 相互 协同 的 作用 关系 , 如 何 将 中 医 的 独特 疗效 转化 为 有 效 证 据 , 阐 明 这 种 复杂 的 作用 机 制 是 中 药 研究 的 一 个 难点 和 重要 任务 。 对 于 中 医药 来 说 首先 是 证 明 有 效 。 然 而 在 什么 方面 有 效 、 有 效 的 标准 如 何 确定 是 当前 中 医药 走向 世界 最 需 迫 切 解决 的 问题 , 而 中 药 的 “质量 控制 ”技术 也 必须 与 “ 药 效 的 优 劣 ” 相 联 系 才 有 意义 。 许 多 研究 者 长 期 使 用 西药 的 指标 评价 体系 来 衡量 中 药 的 疗效 , 以 此 来 表明 中 药 的 有 效 性 和 科学 性 , 然 而 由 于 中 药 的 特殊 性 使 得 采用 这 一 体系 出 现 的 诸多 问题 , 如 中 药 作 用 的 温和 性 和 多 靶 点 性 使 得 中 药 很 可 能 在 单一 的 关键 药 效 指标 上 无 法 与 西药 相 比 , 如 果 据 此 认为 中 药 无 效 或 疗效 不 好 , 这 就 忽视 了 中 药 的 整体 性 , 对 中 药 很 不 公平 。 认 识 到 这 个 问题 的 严重 性 后 , 医 药 工 作者 试图 建立 符合 中 医 中 药 特色 的 药 效 评价 体系 。 中 医学 通过 症候 对 个 体 功 能 状态 进行 描述 和 划分 , 作 为 中 药 治疗 的 依据 , 药 物 疗 效 评 价 以 证 候 的 改善 为 指标 , 然 而 中 医 症 候 诊断 主要 是 定性 描述 , 缺 乏 定量 指标 。 这 给 临床 诊断 和 疗效 评价 带 来 很 多 困难 , 也 影响 了 新 药 研 究 的 质量 和 水 平 。 近 年 来 , 医 药 工作 者 一 方面 将 症候 标准 化 定量 化 , 另 一 方面 也 积极 借鉴 西医 的 药 效 评价 指标 , 试 图 建立 量化 的 、 综 合 性 的 中 药 疗效 评价 体系 。 在 前 文中 已 经 提 到 , 生 命 科 学 的 发 展 特别 是 系统 生物 学 的 出 现 使 得 生命 科学 进入 整 合 性 研究 的 时 期 。 系 统 生物 学 认为 在 生命 过 程 中 更 重要 的 是 生命 各 个 单元 〈 基 因 、 和 蛋白 质 、 代 谢 物 等 ) 之 间 存 在 的 相互 影响 和 相互 关系 , 将 生命 体 割 裂 成 一 个 个 彼此 孤立 的 单 元 去 考虑 是 片面 的 , 生 命 体 是 有 着 复杂 的 调控 网 络 的 整体 〈 图 13-7)。 中 药 在 用 药 过 程 中 注重 整体 平衡 , 而 不 局 限于 某 一 种 症状 或 整个 网 络 中 的 某 一 单一 靶 点 , 而 是 多 层次 、 图 13-7 ”生命 调控 网 络 47 多 靶 点 , 从 整体 上 调节 人 体 的 平衡 和 内 环境 的 稳定 。 中 药 配方 则 讲究 配伍 , 不 同 种 药物 的 配合 使 用 要 符合 “君臣 佐 使 ”的 指导 思想 体现 了 系统 论 的 思想 , 而 在 治疗 上 也 十 分 注 重 个 体 的 差异 及 人 与 环境 间 的 关系 , 因 人 而 异 用 药 , 达 到 个 性 化 的 治疗 。 系 统 生物 学 正 是 为 了 从 系统 的 角度 去 了 解 生命 体 , 从 而 为 系统 水 平 的 治疗 手段 提供 基础 , 这 与 中 医药 的 治 病 机 制 是 不 谋 而 合 的 。 采 用 系统 生物 学 的 方法 研究 中 药 的 作用 机 制 , 将 有 可 能 从 系 统 的 角度 诠释 中 医药 多 靶 点 、 平 衡 调理 、 标 本 兼治 的 治 病 机 制 和 分 子 机 制 。 代谢 组 学 是 研究 生命 网 络 重要 组 成 部 分 代谢 物 的 一 门 学科 , 代 谢 处 于 生命 活动 调控 的 末端, 因此 代谢 组 学 比 基 因 组 学 、 蛋 白质 组 学 更 接近 表 型 。 基 因 组 学 、 蛋 白质 组 学 研 究 一 般 是 发 现 和 鉴别 潜在 的 可 能 性 , 而 代谢 组 学 研究 则 是 发 现 和 鉴别 真实 的 变化 。 中 药 作用 生命 网 络 的 不 同 层次 、 不 同 葛 点 都 会 引起 与 之 相关 的 一 系列 代谢 物 在 浓度 及 相对 组 成 上 发 生变 化 , 通 过 现代 分 析 手段 测定 这 些 相互 关联 的 变化 可 以 从 整体 上 把 握 中 药 的 作 用 特点 , 并 进而 通过 代谢 物 的 变化 追溯 到 相关 的 蛋白 质 及 基因 表达 的 变化 , 从 更 高 的 层 次 上 盖 明 中 药 的 作用 机 制 。 中 药 进入 体内 发 挥 作用 的 基本 环节 是 药物 分 子 与 细胞 之 间 各 种 组 分 〈 包 括 基因 、 和 蛋 白质 、 代 谢 物 等 ) 的 直接 或 间接 的 相互 作用 。 中 药 所 含 化 学 成 分 非常 复杂 , 单 味 药材 就 是 一 个 化 学 分 子 库 , 复 方 是 单 味 药材 按照 特定 组 织 原则 组 织 起 来 的 多 个 化 学 分 子 库 的 组 合 , 目 前 单 味 药材 的 化 学 研究 尚未 解决 , 中 药 复方 的 化 学 研究 由 于 其 复杂 性 和 整体 性 , 更 加 难以 确定 其 中 的 有 效 成 分 , 多 昧 药 相互 作用 过 程 的 化 学 成 分 研究 更 是 有 待 进 一 步 深 入 , 进 行 多 组 分 同时 分 离 筛选 存在 很 多 困难 , 这 是 从 传统 化 学 成 分 研究 角度 研究 中 药 所 遇 到 的 难题 。 从 机 体 角度 看 , 机 体 本 身 是 一 个 极其 复杂 的 巨 系统 , 每 个 系统 中 都 包含 着 多 因素 的 问题 。 疾 病 的 发 生 大 多 也 是 多 种 病因 通过 多 种 途径 导致 整体 功能 紊乱 的 过 程 。 研究 这 样 两 个 多 因素 系统 的 相互 作用 , 其 复杂 程度 可 想 而 知 。 中 药 有 效 成 分 进入 人 体 进 而 发 挥 多 成 分 、 多 轰 点 、 多 途径 的 作用 , 必 然 会 引起 整个 生命 网 络 从 遗传 信息 到 整体 功 能 实现 中 的 分 子 、 细 胞 、 器 官 、 整 体 多 个 层面 的 结构 与 功能 状态 的 变化 , 这 些 变化 会 体 现在 相关 代谢 物 在 量 上 的 改变 。 因 此 , 可 以 以 内 源 性 代谢 物 表达 为 指标 进行 中 药 复方 有 效 成 分 多 组 分 、 多 环节 、 多 靶 点 治疗 调整 作用 的 研究 。 从 具体 操作 上 来 讲 , 以 代谢 组 学 理论 为 指导 , 可 以 对 中 药 有 效 成 分 作用 模式 进行 大 规模 的 识别 , 这 里 我 们 提 到 的 作用 模 式 已 经 不 是 传统 意义 上 的 靶 点 了 , 而 是 药物 对 众多 作用 靶 点 的 协同 效应 , 中 药 中 的 多 种 成 分 作用 与 生命 机 体 复杂 网 络 的 不 同 层次 的 不 同 靶 点 , 使 得 相关 代谢 通路 中 的 内 源 性 代 谢 物 的 流量 发 生变 化 , 使 得 诸多 代谢 物 的 含量 发 生变 化 , 通 过 对 发 生变 化 的 代谢 物 进行 定性 分 析 可 以 知道 药物 对 何 种 代谢 通路 有 作用 , 通 过 对 代谢 物 的 定量 分 析 可 以 知道 药物 是 如 何 影响 代谢 通路 的 , 是 增强 相关 酶 的 活性 /表达 还 是 抑制 相关 酶 活性 /表达 等 , 从 而 建立 系统 化 的 中 药 与 生命 体 作用 模式 背景 , 进 而 可 以 指导 中 药 有 效 成 分 的 发 现 及 中 药 作 用 机 制 的 阐明 。 采用 代谢 组 学 来 进行 中 药 药 效 研究 还 是 一 个 新 生 事物 , 代 谢 组 学 在 化 学 药物 研究 中 取得 的 成 就 使 得 人 们 越 来 越 希 望 采 用 这 一 方法 研究 植物 药 〈 包 括 中 药 ) 这 种 复杂 的 多 组 分 体系 对 生命 体 的 作用 。 采 用 与 研究 药物 毒性 相似 的 方法 可 以 研究 中 药 提取 单 体 乃 至 于 复杂 中 药 提取 物 对 生命 机 体 的 作用 。 类 黄酮 是 茶叶 中 含有 的 一 类 具有 保健 功能 的 化 合 物 , 包 括 抗 炎 和 预防 癌症 等 功效 。 。 348 。 但 这 类 多 酚 对 生命 机 体 的 生化 效应 目前 还 知之 不 多 。 代 谢 组 学 的 方法 可 以 从 整体 上 研究 这 类 化 合 物 的 生化 效应 。Solanky' 对 10 只 SD 大 鼠 给 予 22mg 剂量 的 表 儿 茶 酸 , 并 收 集 给 药 前 后 大 鼠 的 尿 样 , 采 用 基于 NMR 技术 的 代谢 组 学 技术 平台 , 并 结合 主 成 分 分 析 的 数据 处 理 方法 研究 了 表 儿 茶 酸 〈 一 种 类 黄酮 ) 对 大 鼠 生 化 代谢 的 影响 。 研 究 表明 , 给 药 后 大 鼠 尿 液 中 牛 磺 酸 、 柠 檬 酸 盐 及 二 甲 胺 等 内 源 性 代谢 物 的 浓度 降低 。 对 给 药 后 不 同 时 段 收集 的 尿 液 进行 分 析 表 明 给 药 后 Sh 对 代谢 的 影响 明显 , 而 且 表 儿 茶 酸 对 生化 代谢 的 影响 是 可 逆 的 。 这 一 研究 结果 表明 , 代 谢 组 学 技术 是 可 以 检测 到 天 然 产 物 对 生命 机 体 新 陈 代谢 的 细微 影响 。 然 而 表 儿 茶 酸 虽然 来 源 于 天 然 植物 , 但 毕竟 还 是 一 个 单一 化 合 物 。 中 药 要 复杂 得 多 。 甘 菊 作 为 功能 食品 和 药物 使 用 已 经 有 比较 长 的 历史 了 , 甘 菊 的 花 具有 抗 炎 、 轻 微 镇 静 及 抗 溃疡 的 功效 。 对 于 甘 菊 的 药 用 功能 人 们 一 直 采 用 从 中 提取 某 类 或 某 个 单 体 成 分 测定 生物 活性 的 方法 。 这 种 方法 不 能 从 整体 上 反映 甘 菊 的 药 效 。Wang 等 "5 采用 代谢 组 学 的 方法 研究 了 甘 菊 对 人 体 生 化 代谢 的 影响 , 采 用 高 分 辨 的 NMR 技 术 集合 模式 识别 的 方法 , 进 行 了 为 期 6 周 的 研究 。 对 志愿 者 分 别 收集 给 药 前 、 给 药 期 间 及 给 药 后 各 两 周 的 每 日 尿 样 。 结 果 显 示 , 给 药 前 尿 样 与 给 药 期 间 尿 样 中 内 源 性 代谢 物 的 含量 有 比较 大 的 差别 CA 13-8);, 代谢 轨迹 分 析 表 明 , 甘 菊 对 人 体 生 化 代谢 有 比较 持久 的 影响 , 停 止 给 药 后 , 药 效 依 然 持续 了 较 长 的 时 间 〈 图 13-9)。 这 一 研究 结果 表明 , 虽 然 环 境 因 素 及 志愿 者 个 体 差 异 较 大 , 代 谢 组 学 的 方法 依然 能 够 有 效 的 评估 甘 菊 这 种 含有 多 种 成 分 的 复杂 体系 对 人 体 生 化 代谢 的 影响 。 ALB WLBT va 马 尿酸 盐 | 0 o- 羟 基 异 丁 酸 盐 AAA B =m 二 甲 胺 B- 羟 基 异 丁 酸 盐 乳酸 / HAR | As 组 氨 酸 /1 7.8 V6 O° FF TF nO.” 6:8 4.0 3.5 3.0 2.5 含量 / (hg/g) 含量 / (ug/g) 图 13-8 给 药 前 后 NMR Big” A., 给 药 前 图 谱 ,B, 给 药 后 图 谱 。 349 。 图 13-9 代谢 轨迹 图 谱 [9 do~d10 表示 给 药 前 ;dl1 一 d20 表示 给 药 期 间 ,d21~d30 表示 停止 给 药 后 的 回复 期 13.5.3 代谢 组 学 在 中 药 安 全 性 研究 中 的 应 用 中 医药 应 用 有 着 悠久 的 历史 , 我 国 历代 中 医药 学 家 对 中 医药 的 疗效 和 安全 性 有 着 深 刻 的 认识 , 并 形成 了 独特 的 中 医药 理论 。 随 着 中 草药 及 其 制剂 在 世界 范围 的 广泛 应 用 , 关于 中 药 安全 性 问题 的 报道 也 逐渐 增多 , 如 众所周知 的 关 木 通 和 中 成 药 龙 胆 海 肝 丸 等 引 起 的 骨 毒 性 , 引 起 人 们 的 普遍 重视 , 并 致使 美国 、 加 拿 大 、 英 国 、 日 本 等 不 少 国家 先后 限制 了 含有 马 兜 铃 酸 的 中 药 的 进口 , 严 重 影响 了 我 国 传统 医药 的 声誉 和 国际 地 位 。 目前 已 知 的 可 能 有 毒性 的 中 药 有 防己 、 木 通 、 关 木 通 等 , 而 这 些 中 药 却 在 临床 上 一 直 占 有 重要 地 位 , 被 普遍 使 用 。 因 此 , 进 行 单 味 药 或 它们 组 成 的 方剂 的 代谢 组 学 研究 , 将 为 中 药 复方 的 科学 性 提供 依据 , 有 利于 帮助 人 们 走出 中 药 安全 性 的 认识 误区 。 由 于 中 医 临 床 用 药 多 为 复方 , 药 味 多 、 成 分 复杂 、 可 变 因素 多 , 加 上 辨证 论 治 的 运用 , 还 有 药 味 的 相互 影响 复杂 , 有 的 配方 中 还 使 用 有 毒 中 药 等 , 给 中 药 的 科学 配伍 、 作 用 机 制 、 有 效 物质 基础 研究 带 来 巨大 困难 。 为 此 , 有 待 提供 一 套 客观 、 全 面 的 评价 体系 用 于 中 药 的 科学 组 方 标准 的 制定 。 运 用 机 体 对 药物 作用 的 整体 反映 性 进行 代谢 组 学 研究 , 有 利于 认 识 中 药 的 作用 机 制 、 有 效 物质 基础 、 配 伍 规 律 和 毒性 规律 , 为 安全 用 药 提供 指导 。 为 此 , 天 津 药 物 研 究 院 刘 昌 孝 院士 、 中 国 中 医科 学 院 王 永 炎 院 士 、 天 津 中 医药 大 学 张 伯 礼 院士 、 天 津 中 医药 大 学 石 学 敏 院士 、 上 海中 医药 大 学 陈 凯 先 院士 、 上 海中 医药 大 学 胡 之 壁 院士 、 中 国 科 学 院 上 海 生物 技术 中 心 杨 胜 利 院 士 、 中 国医 学 科学 院 药 用 植物 研 究 所 肖 培 根 院士 、 中 国 中 医科 学 院 西 苑 医院 李 连 达 院 士 , 以 及 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 许 国 旺 研 究 员 和 中 国药 科大 学 王 广 基教 授 共 同 联合 撰写 了 《关于 开展 中 药 代 谢 组 学 研究 的 建议 沪 ) , 认 为 运用 具有 反映 整体 思想 的 、 先 进 的 代谢 组 学 方法 来 研究 中 药 , 对 搞 清 中 药 的 物质 基础 、 作 用 机 制 、 作 用 划 标 、 药 效 作 用 、 组 方 依据 、 配 伍 规律 和 毒 副 . 350 + 作用 及 对 中 药 种 质 资源 等 进行 的 研究 都 是 十 分 必要 的 , 它 有 可 能 使 有 着 几 千 年 历史 的 、 以 经 验 为 基础 的 中 药 治 病 向 以 科学 的 方法 和 标准 为 基础 的 现代 化 的 中 药 治 病 转变 , 从 而 对 中 医药 事业 的 长 远 和 健康 发 展 产 生 十 分 深远 的 积极 作用 。 建 议 国家 尽快 启动 基于 代谢 组 学 的 中 药 现 代 化 研究 。 代谢 组 学 是 后 基因 时 代 出 现 的 一 门 新 兴 “ 组 学 ”学 科 , 它 能 用 反映 整体 的 代谢 物 图 谱 直 接 认 识 生理 和 生化 状态 。 代 谢 组 学 是 新 药 研究 开发 的 重要 组 成 部 分 , 其 应 用 涵盖 了 新 生物 标志 物 的 发 现 、 新 药 筛选 、 安 全 性 实验 等 。 在 现代 中 药 研 究 中 , 代 谢 组 学 在 药物 有 效 性 和 安全 性 、 中 药 资源 和 质量 控制 研究 等 方面 具有 重要 的 理论 意义 和 应 用 价值 。 参考 文 献 [1] U S Food and Drug Administration. 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HR. AL RRS) 包含 了 多 种 细胞 类 型 〈 表 皮 、 保 卫 细 胞 、 软 组 织 、 腺 毛 等 ), 这 些 不 同类 型 的 细胞 有 专 一 的 代谢 机 制 来 精确 实现 它们 特定 的 功能 。 当地 环境 、 温 度 和 季节 的 影响 通过 代谢 变化 得 到 补偿 。 另 外 , 由 于 非 生物 〈 光 、 紫 外 线 、 水 ) 和 生物 〈 虫 害 、 寄 生 虫 病 和 病菌 侵袭 ) 的 胁迫 影响 , 植 物 派 生出 一 个 复杂 的 代 谢 化 合 物 库 。 这 些 代谢 物 有 些 是 常见 的 , 但 相当 一 部 分 有 种 属 特异 性 。 粗 略 估计 , 植 物 中 代谢 产物 大 约 20 万 种 , 既 有 维持 植物 生命 活动 和 生长 发 育 所 必需 的 初生 代谢 物 , 也 有 利用 初生 代谢 物 生成 的 与 植物 抗 病 和 抗 逆 关系 密切 的 次 生 代谢 物 。 在 基因 型 、 显 形 、 组 织 和 细胞 任意 一 个 水 平 上 这 种 复杂 性 可 以 用 来 定义 植物 。 当 我 们 对 植物 组 织 的 代谢 成 分 有 了 更 深入 全 面 的 了 解 , 这 些 知识 可 以 有 效 地 运用 于 植物 的 判断 和 预测 。 因 此 对 植物 代谢 物 进行 分 析 十 分 必要 5 。 14. 1.2.3 植物 代谢 组 学 的 分 析 思 想 与 其 他 代谢 组 学 思想 方法 类 似 , 植 物 代 谢 组 学 的 思想 方法 是 从 整体 角度 考虑 问题 , 设 定 多 层次 、 多 结构 的 分 析 层 面 , 以 全 面 了 解 植 物 中 代谢 产物 的 成 分 、 结 构 、 合 成 途径 与 相关 的 基因 功能 , 判 断 基 因 表 达 水 平 的 变化 , 从 而 推断 基因 的 功能 及 其 对 代谢 流 的 影 响 " 沁 。 植 物 代谢 组 学 还 可 与 转录 组 学 和 蛋白 质 组 学 技术 整合 , 从 整体 研究 植物 系统 对 基因 或 环境 变化 的 响应 。 根据 不 同 的 分 析 目 的 , 代 谢 分 析 主 要 由 以 下 四 个 层次 组 成 : 代谢 靶 标 化 合 物 分 析 、 代谢 轮廓 分 析 、 代 谢 指纹 图 谱 分 析 、 代 谢 组 学 分 析 。 14.1.2.4 植物 代谢 组 学 的 分 析 过 程 简要 地 说 , 植 物 代 谢 组 学 分 析 流 程 包括 样品 制备 、 代 谢 物 成 分 分 析 鉴 定 和 数据 分 析 《图 14-1)。 由 于 植物 中 代谢 物 的 种 类 繁多 , 而 目前 可 用 的 成 分 检测 和 数据 分 析 方 法 又 多 种 多 样 , 所 以 根据 研究 对 象 不 同 , 采 用 的 样品 制备 、 分 离 鉴定 手段 及 数据 分 析 方法 各 不 相同 。 植物 代谢 物 样 品 制备 分 为 组 织 取样 、 匀 浆 、 抽 提 、 保 存 和 样品 预 处 理 等 步 又。 植物 代谢 物 千 差 万 别 , 其 中 很 多 物质 稍 受 干扰 结构 就 会 发 生 改 变 , 因 此 目前 还 没有 适合 所 有 代谢 物 的 抽 提 方法 , 通 常 只 能 根据 所 要 分 析 的 代谢 物 特性 及 使 用 的 鉴定 手段 选择 合适 的 提取 方法 。 而 抽 提 时 间 、 温 度 、 溶 剂 成 分 和 质量 及 实验 者 的 技巧 等 诸多 因素 也 将 影响 样 品 制备 的 水 平 。 对 获得 的 样品 中 所 有 代谢 物 进行 分 析 鉴 定 是 代谢 组 学 研究 的 关键 步 又, 也 是 最 困难 和 多 变 的 步骤 。 与 原 有 的 各 种 组 学 技术 只 分 析 特 定 类 型 的 物质 不 同 , 代 谢 组 学 分 析 对 象 的 物化 性 质 差异 很 大 , 要 对 它们 进行 无 偏向 的 全 面 分 析 , 单 一 的 分 离 分 析 手 段 往往 难以 保证 。 色 谱 、 质 谱 、 核 磁 共 振 、 红 外 光谱 、 紫 外 吸收 、 荧 光 散 射 、 发 射 性 检测 和 光 散 射 等 分 离 分 析 手 段 及 其 组 合 都 被 应 用 于 代谢 组 学 的 研究 5 , 一 般 根 据 样 品 的 特性 和 实验 目的 , 可 选择 最 合适 的 分 析 方法 。 目 前 最 常用 的 是 气相 色谱 和 质谱 联 用 〈GC-MS)、 液 .355 + 图 14-1 AAS OTReEA” 注释 : OMAARm; QRH 〈 提 取 糖 、 酯 、 氨 基 酸 、 有 机 酸 或 次 级 代谢 产物 ); ORAL: OAT: @ 数 据 转 换 ,@@ 数 据 挖掘 ;,(@) 功 能 未 知 基因 的 功能 阑 明 ; @ 对 生物 学 的 反馈 相 色谱 和 质谱 联 用 〈LC-MS) 、 核 磁 共 振 (NMR) 及 傅 里 叶 变 换 红外 光谱 与 质谱 联 用 (FTIR-MS), 样品 成 分 分 析 鉴 定之 后 , 需 要 对 所 获得 的 数据 进行 相应 的 整合 处 理 , 也 是 代谢 组 学 研究 中 十 分 关键 的 步 又。 可 应 用 模式 识别 和 多 维 统计 分 析 等 方法 从 这 些 大 量 的 数据 中 获 得 有 用 的 信息 , 这 些 方法 能 够 为 数据 降 维 , 使 它们 更 易于 可 视 化 和 分 类 。 目 前 常用 的 两 类 算法 是 基于 寻找 模式 的 非 监督 方法 〈unsupervised method) 和 有 监督 方法 〈super- vised method) 。 14.1.2.5 几 次 重要 的 植物 代谢 组 学 国际 会 议 随 着 代谢 组 学 研究 的 开展 , 越 来 越 多 的 人 投身 于 植物 代谢 研究 领域 。 第 1 届 植 物 代 谢 组 学 大 会 于 2002 年 4 月 在 荷兰 举行 , 期 间 成 立 了 国际 植物 代谢 组 学 委员 会 Cnterna- tional Committee Plant Metabolomics, ICPM) 并 建立 了 该 委员 会 的 国际 官方 网 站 Cht- tp://www. metabolomics. nl) , 此 次 会 议 的 召开 大 大 促进 了 全 世界 此 领域 研究 者 的 交 流 。 第 2 届 植 物 代谢 组 学 大 会 于 2003 年 在 德国 柏林 的 戈 尔 姆 举行 。 第 3 届 植 物 代谢 组 PREF 2004 年 6 月 在 美国 的 爱 荷 华 州 举 行 , 会 议 就 分 析 技术 的 发 展 、 代 谢 数据 的 生 物 信 息 和 数据 统计 分 析 、 代 谢 组 学 在 解决 生物 技术 问题 中 的 作用 和 发 展 农作物 等 方面 进 行 了 讨论 。 第 4 届 国 际 植物 代谢 组 学 大 会 于 2006 年 7 月 在 英国 的 雷 丁 举行 , 会 议 在 生 物 信息 学 、 标 准 化 及 数据 库 等 方面 的 新 方法 及 应 用 进行 了 广泛 的 探讨 。2008 年 7 A, 第 5 届 国 际 植物 代谢 组 学 会 议 将 在 日 本 的 横滨 召开 。 这 些 国 际 性 的 会 议 极 大 地 促进 了 植 物 代谢 组 学 的 研究 , 为 未 来 的 发 展 指明 了 方向 。 14.1.3 植物 代谢 工程 简介 20 世纪 70 年 代 以 来 , 基 因 重 组 技术 取得 了 突飞猛进 的 发 展 , 利 用 基因 重组 技术 对 细胞 的 代谢 网 络 进行 修饰 和 改造 , 使 其 按照 人 类 所 期 望 的 方向 运行 , 从 而 获得 所 需 产物 的 大 量 积 累 。 这 不 仅 在 理论 上 可 行 , 在 实践 上 也 有 许多 成 功 的 事例 。 与 此 相应 , 作 为 基 。 356 。 AT AAs Se ye —$§_ fT i a! AE), 1996 年 , 在 美国 正式 召开 了 第 一 届 代谢 工程 大 会 , 美 国 的 Mendes AAI Kell 教授 在 大 会 上 做 了 题 为 “代谢 工程 一 一 让 细 胞 为 人 类 服务 的 报告 ”, 确 立 了 代谢 工程 的 地 位 和 研究 方法 。1998 年 在 德国 召开 了 第 二 届 代 谢 工 程 大 会 , 与 会 者 从 代谢 途径 的 分 析 、 限 速 步骤 相关 酶 的 确定 、 方 法 及 应 用 等 方 面 探讨 了 代谢 工程 几 年 来 所 取得 的 进展 。 代 谢 工程 最 早 的 发 展 始 于 对 微生物 代谢 网 络 的 HF. At 20 多 年 的 发 展 , 代 谢 工程 在 植物 细胞 代谢 网 络 的 修饰 和 改造 上 也 显示 了 巨 大 的 潜力 。 代谢 工程 是 利用 基因 工程 技术 强化 改变 或 重组 细胞 的 代谢 系统 , 设 计 和 构建 新 的 代 谢 系 统 , 以 改变 代谢 流 , 提 高 目的 代谢 物 的 产量 、 产 生 新 的 代谢 产物 和 降解 某 些 污染 物 , 提 高 能 量 代谢 效率 。 目 前 , 植 物 代 谢 工程 的 热点 集中 在 次 生 代谢 途径 的 研究 上 。 植 物 次 生 代谢 基因 工程 是 利用 基因 工程 技术 对 植物 次 生 代 谢 途 径 的 遗传 特性 进行 改造 , 进 而 改变 植物 次 生 代谢 产物 。 植 物 次 生 代谢 基因 工程 的 出 现 是 人 类 对 次 生 代谢 途径 的 深入 了 解 和 分 子 生物 学 向 纵深 发 展 的 结果 , 同 时 它 又 促进 了 次 生 代谢 分 子 生 物 学 的 发 展 。 随 着 植物 基因 工程 的 发 展 , 植 物 代 谢 途 径 基因 的 发 现 、 克 隆 、 转 化 及 表达 工作 进展 的 速度 惊人 , 许 多 代谢 途径 的 基因 解剖 已 经 有 了 重大 突破 。 但 是 , 试 图 使 用 这 些 工具 对 植物 的 代谢 进行 工程 操作 的 成 功 事例 极为 有 限 。 大 多 数 的 工作 主要 集中 在 对 影响 代谢 途 径 的 单个 基因 的 表达 进行 积极 或 消极 的 修饰 。 由 于 细胞 中 代谢 网 络 是 由 数 千 种 酶 、 膜 传 递 系统 、 信 和 号 传递 系统 构成 , 它 们 之 间 受 到 相互 精密 地 调控 , 对 代谢 的 影响 决 非 单一 因 素 所 能 左右 , 因 此 在 较 广 范围 从 分 子 水 平 到 蛋白 质 水 平 对 植物 生理 及 代谢 进行 深入 研 究 , 透 彻 了 解 植 物体 内 的 相互 作用 与 相互 制约 的 因素 , 以 整体 系统 的 观念 来 研究 细胞 的 代谢 变化 显得 尤为 重要 。 植 物 代谢 组 学 正 是 运用 了 系统 思想 , 综 合 了 植物 生理 学 、 分 析 化 学 、 生 物 信息 学 等 多 种 学 科 的 综合 性 的 边缘 学 科 , 植 物 代 谢 组 学 与 植物 代谢 工程 的 结 合 必 将 为 植物 基因 组 学 做 出 更 加 巨大 的 贡献 。 14.2 植物 代谢 组 的 分 析 由 于 植物 代谢 物 尤 其 是 次 生 代谢 物种 类 繁多 、 结 构 凶 异 , 且 产生 和 分 布 通常 有 种 属 、 器 官 、 组 织 及 生长 发 育 时 期 的 特异 性 , 难 于 进行 分 离 分 析 , 因 此 植物 代谢 分 析 的 方 法 、 手 段 也 因 分 析 的 目的 、 对 象 不 同 而 不 同 〈 图 14-2) 。 本 节 对 植物 代谢 分 析 方法 中 常 用 的 样品 保存 、 提 取 、 纯 化 与 衍生 化 预 处 理 方法 、 分 离 分 析 与 检测 方法 、 数 据 处 理 方法 进行 概括 。 14.2.1 植物 样品 的 保存 和 预 处 理 方 法 14.2.1.1 植物 组 织 的 保存 一 一 超低温 保存 样品 的 保存 条 件 通 常 有 室温 、4C 、 一 20C、 一 80C 、 液 氮 温 度 和 冻 千 。 对 于 不 能 在 取样 后 立刻 提取 代谢 产物 的 植物 组 织 样品 , 超 低温 保存 显得 格外 重要 。 冰冻 生物 材料 的 研究 是 从 低温 保护 附加 剂 的 有 效 利 用 开始 的 0594 。1959 年 , 应 用 二 甲 基 亚 硕 〈DMSO) 作为 冷冻 保护 剂 初次 成 功 , 但 直到 1968 年 Ouatrano 才 用 它 作为 冷 352 * 代谢 指纹 定性 定量 分 析 FT-IR/NIR DIESI-MS HPTLC H-NMR RAMAN MALDI-MS C-NMR A BL 样 et er 8, 组 织 | > BRD mc, Villa ls 细 胞 N 选取 适当 方法 样品 预 处 理 目标 化 合 物 定 性 定量 分 析 代谢 轮廓 分 析 / 代 谢 组 学 GC-FID HPLC-UV CE-UV H-& "C-NMR GC-MS HPLC-MS CE-MS LC-(SPE)-NMR 图 14-2 FAFA RRA TOE oh SA BE A TR RO 冻 植 物 组 织 培养 细胞 的 低温 保护 剂 。1973 4F, Nag 和 Street 将 胡 葛 卜 悬 浮 培 养 细胞 保 存在 液 氮 中 一 段 时 间 后 再 培养 时 , 观 察 到 细胞 仍 可 生长 , 这 是 超低温 保存 植物 材料 的 首 次 报道 。 自 此 以 后 , 许 多 国家 的 有 关 实 验 室 相 继 开展 了 植物 组 织 和 细胞 保存 及 种 质 库 建 立 的 研究 , 并 取得 了 一 定 进展 , 超 低温 保存 技术 也 日 趋 完 善 。 超低温 保存 是 指 在 一 80C 以 下 的 极 低温 度 环境 下 保存 种 质 资源 的 一 整套 生物 科学 技 术 。 常 用 冷 源 有 干冰 〈 一 79C)、 深 冷 冰 箱 及 液 所 《一 196C)。 在 超低温 条 件 下 保存 材 料 , 可 以 大 大 减 慢 甚至 终止 代谢 和 衰老 过 程 , 保 持 生 物 材料 的 稳定 性 , 最 大 限度 地 抑制 生理 代谢 强度 , 减 少 遗 传 变异 的 发 生 。 超 低温 保存 的 两 大 理论 基础 是 细胞 冰冻 结 冰 与 伤 害 理 论 和 溶液 的 玻璃 化 理论 , 它 们 为 防止 植物 组 织 在 冰冻 过 程 中 受到 伤害 提供 了 指导 作 用 。 从 理论 上 讲 , 植 物 材料 在 液 氮 中 的 保存 期 可 以 无 限 延 长 , 植 物 的 生长 处 于 完全 停止 的 状态 。 因 此 超低温 冷冻 保存 技术 可 望 成 为 植物 代谢 研究 中 保存 样品 的 最 佳 办 法 。 关 于 组 织 培养 物 的 超低温 保存 方法 , 有 兴趣 的 读者 可 参看 文献 [15]。 14.2.1.2 植物 次 生 代 谢 产 物 的 提取 方法 植物 代谢 物 常见 的 提取 技术 有 溶剂 萃取 技术 co 、 微 波 辅助 提取 5 ok a 法 、 超 临界 萃取 等 。 近 年 来 植物 中 次 生 代 谢 产 物 的 研究 成 为 了 热点 。 现 将 次 生 代 谢 产物 的 分 类 及 部 分 产物 的 提取 方法 进行 简单 介绍 。 1. 植物 次 生 代谢 产物 的 概念 与 分 类 ro] 1891 年 ,Kossel 明确 提出 了 植物 次 生 代 谢 (secondary metabolism) 的 概念 。 与 初 生 代 谢 产物 相 比 , 植 物 次 生 代 谢 产物 (secondary metabolite) 是 指 植物 体 中 一 大 类 并 非 生长 发 育 所 必需 的 小 分 子 有 机 化 合 物 , 其 产生 和 分 布 通常 有 种 属 、 器 官 、 组 织 和 生长 发 育 期 的 特异 性 。 次 生 代谢 是 植物 在 长 期 进化 过 程 中 对 生态 环境 适应 的 结果 , 有 许多 特定 的 功能 。 许 多 植物 在 受到 病原 微生物 浸染 后 , 产 生 并 积累 次 生 代谢 产物 , 用 以 增强 自身 的 抵抗 力 , ”358 。 DREN) AF RPA (Cphytoalexin), (2A HAS, Ae yD A ZK WO) eh A LR 素 。 有 些 次 生 代 谢 产物 与 植物 异种 相克 、 种 子 传播 、 吸 引 昆虫 及 防御 捕食 有 关 。 次 生 代 谢 产 物 在 整个 代谢 活动 中 的 占 重 要 地 位 。 在 植物 的 某 个 发 育 期 或 某 个 器 官 里 , 次 生物 质 甚至 成 为 代谢 库 的 主要 成 分 , 橡 胶 树 大 量 产生 橡胶 就 是 其 中 一 个 典型 例子 。 中 草药 和 香 料 的 有 效 成 分 , 绝 大 多 数 为 植物 次 生 代谢 产物 。 植物 次 生 代 谢 产 物种 类 繁多 , 包 括 酚 类 、 黄 酮 类 、 香 豆 素 、 木 质 素 、 生 物 碱 、 糖 苷 、 莫 类、 省 类 、 皂 背 、 多 烽 类 和 有 机 酸 等 , 一 般 可 分 为 酚 类 化 合 物 、 苦 类 化 合 物 、 含 所 有 机 碱 三 大 类 。 1) BR 广义 的 酚 类 化 合 物 分 为 黄酮 类 、 简 单 酚 类 和 柄 类 。 黄 酮 类 是 一 大 类 以 茶色 酮 环 为 基 fil, HA C6, C3, CH6 结构 的 酚 类 化 合 物 , 可 分 为 2- 葵 基 衍 生物 〈 黄 酮 、 黄 酮 醇 类 )、 SERED (RR) 和 4- 葵 基 衍 生物 〈 新 黄酮 ) 。 简 单 酚 类 是 含有 一 个 被 烃基 取代 葵 环 的 化 合 物 , 某 些 成 分 有 调节 植物 生长 的 作用 , 有 些 是 植保 素 的 重要 成 分 。 醒 类 化 合 物 是 有 葵 式 多 环 烃 碳 氢化 合 物 〈 如 蔡 、 蔬 等 ) 的 芳香 二 氧化 物 。 柄 类 的 存在 是 植物 呈 色 的 主要 原因 之 一 , 有 些 醒 类 是 抗菌 、 抗 癌 的 主要 成 分 , 如 胡桃 本 和 紫 草 宁 。 2) BALMS MAL HR ROMA He) ARNKAW, HR ROMRE (LRP RRR 途径 )。 由 2 个 、3 hE 4 RR co ld 2 PAE. PE A = AK 等 昔 类 。 单 昔 和 倍 半 昔 是 植物 挥发 油 的 主要 成 分 , 也 是 香料 的 主要 成 分 , 许 多 倍 半 荐 和 二 桩 化 合 物 是 植保 素 。 一 些 熙 类 成 分 具有 重要 的 药 用 价值 , 如 倍 半 昔 成 分 青 芒 素 是 目前 治疗 首 疾 的 最 佳 药物 , 抗 癌 药 物 紫杉醇 是 二 蔡 类 生物 碱 , 存 在 于 裸子 植物 红豆 杉 中。 和 类 化 合 物 和 三 茧 的 合成 前 体 都 是 含 30 MRF, ASH. SELAH 1 个 环 成 烷 并 多 氧 菲 母 核 和 3 个 侧 链 基本 骨架 组 成 , 植 物体 内 三 莫 皂 苷 元 和 人 省 体 皂 背 元 分 别 与 糖 类 结合 形成 三 莫 皂 苷 , 如 人 参 皂 苷 和 薯 蒜 皂苷 等 。 3) 含 所 有 机 化 合 物 含 所 有 机 化 合 物 中 最 大 的 一 类 次 生 代 谢 物 质 是 生物 碱 , 是 一 类 含 氮 的 碱 性 天 然 产 物 , 已 知 的 达 5500 种 以 上 。 按 其 生源 途径 可 分 为 真 生 物 碱 、 伪 生物 碱 和 原生 物 碱 。 真 生物 碱 和 原生 物 碱 都 是 氨基 酸 衍 生物 , 但 后 者 不 含 杂 氮 环 。 伪 生物 碱 不 是 来 自 氨基 酸 , 而 是 来 自 莫 类 、 嘲 叭 和 省 类 化 合 物 。 许 多 生物 碱 是 药 用 植物 的 有 效 成 分 , 如 小 辟 碱 、 若 徐 碱 等 , 还 有 些 是 植保 素 。 含 所 有 机 化 合 物 还 有 胺 类 Ge NH; 中 的 氧 的 不 同 取 代 产 物 )、 非 蛋白 氨基 酸 〈 即 蛋白 质 氨 基 酸 类 似 物 )、 生 和 握 苷 “〈 即 植物 生 氰 过程 中 产生 HCN 的 前 体 物质 , 如 苦 杏 仁 苷 和 亚麻 苦 苷 ) 。 除了 上 述 的 主要 三 大 类 外 , 植 物 还 产生 多 烽 类 、 有 机 酸 等 次 生 代谢 物质 , 多 灿 类 是 HAA RMN KARE, ALIBI IZ tha FS TEM. 2. 植物 中 次 生 代谢 产物 的 提取 方法 1) 植物 中 多 酚 的 提取 植物 多 酚 也 称 单 宁 , 是 一 类 广泛 存在 于 植物 体内 的 多 酚 类 物质 , 主 要 存在 于 植物 的 皮 、 根 、 木 、 叶 、 果 中 。 其 结构 复杂 , 化 学 性 质 活泼 , 并 且 常 以 大 量 性 质 相 似 的 同系 物 - 359 。 的 混合 物 形式 存在 。 植 物 多 酚 由 于 其 内 部 成 分 结构 和 性 质 的 差异 在 提取 时 通常 采用 溶剂 法 、 络 合 沉 证 、 层 析 法 等 方法 进行 提取 分 离 。 溶剂 提取 法 ”由 于 多 酚 物 质 在 结构 中 都 含有 产 基 , 具 有 一 定 极 性 , 所 以 水 、 低 碳 醇 、 乙 酸 乙 酯 、 丙 酮 都 是 可 被 选择 的 溶剂 。 通 常 可 按 以 下 原则 提取 : 按 主 体 酚 类 的 含 量 、 调 节 溶 液 的 pH、 根据 酚 类 分 子 质量 。 沉淀 分 级 法 ”分 为 冷却 沉 省 〈 根 据 植物 多 酚 在 热 水 中 溶解 ;大 分 子 质量 多 酚 在 低温 下 产生 沉淀 的 性 质 而 达到 粗 分 离 的 目的 ) 和 金属 离子 沉淀 法 〈 根 据 金 属 离子 如 Al, Zn . Ca’*, Mg”, AEN pH 条 件 下 可 使 水 溶液 中 单 宁 发 生 沉淀 而 得 以 分 级 , 然后 沉淀 物 再 经 酸 处 理 使 多 酌 溶 出 ) 。 其 他 方法 ” 超 临 界 流体 色谱 、 超 滤 技 术 等 。 2) 答 醇 的 提取 方法 [1 (SB (sterol) 因 其 呈 固 态 又 称 固 醇 , 是 以 环 友 烷 多 和 氢 菲 〈 和 省 核 ) 为 骨架 的 一 种 醇 类 化 合 物 。 光 醇 通 常 为 片 状 或 粉末 状 白色 固体 , 经 湾 剂 结晶 处 理 的 省 醇 为 白色 鳞片 状 或 针 状 晶体 , 人 省 醇 熔点 较 高 , 都 在 100C 以 上 , 最 高 达 215C 。 省 醇 的 相对 密度 略 大 于 水 , 不 溶 于 水 , 可 溶 于 多 种 有 机 溶剂 。 天 然 当 醇 广泛 分 布 在 自然 界 中 , 其 种 类 繁多 , 植 物 笠 醇 主要 包括 谷 省 醇 、 豆 省 醇 和 菜油 省 醇 等 , 存 在 于 植物 的 种 子 中 。 去 除非 省 醇 类 物质 提取 人 省 醇 的 方法 很 多 , 其 原理 一 般 基 于 原料 的 物理 化 学 性 质 及 生 化 反应 方面 的 差异 , 如 物质 在 碱 存 在 下 的 可 皂 化 性 、 有 机 溶剂 中 的 溶解 度 差异 ;省 醇 和 其 他 物质 的 可 络 合 性 及 其 络 合 物 的 溶解 度 差 异 ; 表面 活性 剂 存 在 下 的 亲 水 性 差异 ;高 真 空 条 件 下 物质 的 蒸汽 压 及 分 子 自由 程 的 差异 ; 物质 吸附 力 的 差异 等 。 提 取 人 省 醇 通 常 分 两 步 进行 , 先 从 原料 中 提取 省 醇 为 主 的 不 皂 化 物 HE. , 然 后 从 不 皂 化 物 中 精制 省 醇 。 工业 精制 有 溶剂 结晶 法 、 络 合法 或 两 种 方法 结合 , 还 有 采用 湿润 剂 乳化 分 离 法。 实验 室 精制 采用 吸附 法 、 酶 法 、 分 子 蒸 馅 分离 法 等 。 s 3) 多 糖 的 提取 方法 [2 多 糖 (polysaccharides, PS) 又 称 多 聚 糖 。 其 存在 于 动物 、 高 等 植物 、 微 生物 (A 菌 和 真菌 ) 及 海藻 等 机 体 中 。 多 糖 具 有 复杂 、 多 方面 的 生物 活性 和 功能 , 可 作为 广 谱 免 疫 促进 剂 , 具 有 免疫 调节 功能 ; 抗 感染 、 抗 放射 、 抗 凝血 、 降 血糖 、 降 血脂 作用 ; 促进 核酸 与 蛋白 质 的 生物 合成 作用 ; 控制 细胞 分 裂 和 分 化 , 调 节 细 胞 的 生长 与 衰老 , 而 且 多 糖 作为 药物 其 毒性 极 小 , 因 而 多 糖 的 研究 已 引起 人 们 的 极 大 兴趣 。 多 糖 可 存在 于 植物 的 根 、 葵 、 叶 、 花 、 果 及 种 子 中 。 大 部 分 植物 多 糖 不 溶 于 冷水 , 在 热 水 中 呈 黏 液 状 , 遇 乙醇 能 沉淀 。 这 样 从 植物 中 分 离 、 提 取 较 为 单一 的 植物 多 糖 并 鉴 定 其 纯度 则 极为 困难 。 故 提取 时 需 注 意 对 一 些 含 脂 较 高 的 根 、 蔡 、 叶 、 花 、 果 及 种 子 类 , 在 用 水 提取 前 , 应 先 脱脂 。 科 学 家 曾 采 用 经 水 或 甲醇 等 有 机 溶剂 的 水 溶液 浸泡 、 低 温 减 压 浓 缩 、 流 水 透析 、 凝 胶 柱 层 析 、 冷 冻 干 燥 等 途径 得 到 较 单 一 的 多 糖 成 分 。 粗 多 糖 中 往往 混杂 着 和 蛋白质 、 色 素 、 低 聚 糖 等 杂质 , 必 须 分 别 除 去 。 3. 植物 天 然 色素 的 提取 方法 己 ) 天 然 色素 在 植物 体 中 大 量 分 布 , 并 广泛 参与 植物 体 的 生理 活动 。 植 物 的 根 、 叶 、 荃 、 花 、 果 实 、 种 子 中 均 发 现 有 色素 存在 。 从 细胞 水 平 看 , 色 素 主要 存在 于 质 体 、 液 泡 - 360 + 等 细胞 器 及 细胞 壁 内 , 分 别称 质 体 色素 、 胞 液 色 素 和 膜 色 素 。 天 然 色 素 的 提取 技术 主要 经 历 了 直接 破碎 原料 、 溶 剂 浸 提 、 物 理 技术 辅助 浸 提 及 现 代 仪 器 提取 分 离 等 几 个 阶段 。 1) 直接 破碎 原料 某 些 植物 色素 富 含 于 果实 、 种 子 等 外 皮 或 外 过 中 , 粉 碎 原 料 即 可 使 色素 从 破坏 的 表 皮 组 织 中 透 出 , 直 接收 集 利用 。 2) BMA DAYS 7K BRK IL HESF AE. A A Se Ah BAY J RT Fa es 其 成 品 纯度 偏 低 , 原 料 损耗 大 , 直 接 用 于 工业 化 生产 , 经 济 性 较 差 。 浸 提前 后 的 其 他 工 艺 条件 主 要 包括 除 杂 、 干 燥 、 过 滤 、 浓 缩 、 结 晶 等 。 3) 物理 技术 辅助 浸 提 对 于 易 溶 出 的 色素 成 分 , 采 用 溶剂 浸 提 法 即 可 , 但 对 溶解 度 较 低 的 色素 成 分 则 常常 效率 偏 低 , 因 此 现代 浸 提 多 在 溶剂 萃取 的 同时 加 上 各 种 辅助 提取 技术 , 以 改善 和 增强 浸 提 效 果 。 常 用 的 方法 有 微波 辅助 浸 提 、 超 声波 辅助 和 大 孔 树 脂 吸 附 提 取 。 4) 现代 仪器 提取 分 离 溶剂 法 生产 的 色素 常 存 在 纯度 差 、 有 异味 和 溶剂 残留 等 缺点 , 各 种 辅助 浸 提 方式 虽 能 加 速成 分 溶出 、 增 加 产品 得 率 , 但 对 色素 纯度 的 提高 、 颗 粒 的 均匀 微细 化 分 布 等 要 求 仍 难以 实现 。 目 前 , 超 临界 流体 荃 取 等 现代 仪器 提取 分 离 技 术 克 服 了 传统 溶剂 萃取 色素 纯度 低 及 溶剂 残留 等 缺点 , 已 在 辣椒 红色 素 、 番 茄 红 素 、B- 胡 萝卜 素 提取 等 技术 上 成 功 应 用 。 14.2.1.3 植物 代谢 物 的 分 离 纯 化 上 节 涉 及 的 提取 方法 所 得 到 的 天 然 产 物 提 取 液 或 提取 物 仍然 是 混合 物 , 有 时 需 进 一 步 纯 化 、 分 离 并 进行 精制 。 具 体 的 方法 随 各 天 然 产 物化 学 成 分 的 性 质 不 同 而 异 , 现 分 述 如 下 。 1. 溶剂 分 离 法 一 般 是 将 植物 总 提取 物 , 选 用 三 四 种 不 同 极 性 的 溶剂 , 由 低 极 性 到 高 极 性 分 步 进 行 提取 分 离 。 水 浸 襄 或 乙醇 浸 襄 常常 为 胶 状 物 , 难 以 均匀 分 散在 低 极 性 溶剂 中 , 故 不 能 提 取 完 全 , 可 加 入 适量 惰性 填充 剂 , 如 硅 藻 土 或 纤维 粉 等 , 然 后 低温 或 自然 干燥 , 粉 碎 后 , 再 选用 溶剂 依次 提取 , 使 总 提取 物 中 各 组 成 成 分 依 其 在 不 同 极 性 溶剂 中 溶解 度 的 差 异 而 得 到 分 离 。 利 用 天 然 产 物化 学 成 分 , 在 不 同 极 性 溶剂 中 的 溶解 度 进行 分 离 纯 化 是 最 常用 的 方法 。 癌 天 然 产物 提取 溶液 中 加 入 另 一 种 溶剂 , 析 出 其 中 某 种 或 某 些 成 分 , 或 析出 杂质 , 也 是 一 种 溶剂 分 离 的 方法 。 天 然 产 物 水 提 液 中 常 含有 树胶 、 黏 液 质 、 蛋 白质 、 糊 化 演 粉 等 , 可 以 加 入 一 定量 的 乙醇 , 使 这 些 不 溶 于 乙醇 的 成 分 自 溶 液 中 沉淀 析出 , 而 达到 与 其 他 成 分 分 离 的 目的 。 目 前 , 提 取 多 糖 及 多 肽 类 化 合 物 多 采用 水 溶解 、 浓 缩 、 加 乙醇 或 丙 酮 析出 的 办 法 。 此 外 , 也 可 利用 其 某 些 成 分 能 在 酸 或 碱 中 溶解 , 又 在 加 碱 或 加 酸 变更 溶 BAY pH 后 , 成 不 溶 物 而 析出 以 达到 分 离 。 - 361 。 2. 两 相 溶剂 萃取 法 两 相 溶剂 提取 又 简称 桩 取 法 , 是 利用 混合 物 中 各 成 分 在 两 种 互 不 相 洲 的 溶剂 中 分 配 系数 的 不 同 而 达到 分 离 的 方法 。 萃 取 时 如 果 各 成 分 在 两 相 溶剂 中 分 配 系数 相差 越 大 , 则 分 离 效率 越 高 。 3. 沉淀 法 在 提取 液 中 加 入 某 些 试剂 或 物质 使 沉淀 产生 , 以 获得 化 合 物 或 除去 杂质 的 方法 。 4. 盐 析 法 在 水 提 液 中 , 加 入 无 机 盐 至 一 定 浓度 , 使 某 些 成 分 在 水 中 的 溶解 度 降低 沉淀 析出 , 而 与 水 溶性 大 的 杂质 分 离 。 5S. 透析 法 透析 法 是 利用 小 分 子 物质 在 溶液 中 通过 半 透 膜 , 而 大 分 子 物 质 不 能 透 过 半 透 膜 的 性 质 , 达 到 分 离 的 方法 。 此 法 常用 以 分 离 和 纯化 皂苷 、 和 蛋白质、 多 肽 、 多 糖 等 物质 , 可 用 以 除去 无 机 盐 、 单 糖 、 双 糖 等 杂质 。 6. 重 结晶 法 在 常温 下 , 天 然 产物 的 化 合 物 一 般 为 固体 物质 , 都 具有 结晶 化 的 通 性 , 可 以 根据 浴 解 度 的 不 同 , 用 结晶 法 来 达到 分 离 精制 的 目的 。 纯 化 合 物 的 结晶 有 一 定 的 熔点 和 结晶 学 的 特征 , 有 利于 进行 进一步 的 结构 鉴定 。 7. ERM (SPE)! 1) 原理 RAS REA ABER. ERR, Ae 吸附 力 比 溶解 分 离 物 的 溶剂 更 大 。 当 样品 溶液 通过 吸附 剂 床 时 , 分 离 物 浓缩 在 其 表面 , 其 他 样品 成 分 通过 吸附 剂 床 , 通 过 只 吸附 分 离 物 而 不 吸附 其 他 样品 成 分 的 吸附 剂 , 可 以 得 到 高 纯度 和 浓缩 的 分 离 物 。 2) AAR RA fh Rit Ome, @ 一 个 样品 包括 分 离 物 和 干扰 物 通过 吸附 剂 ; @ 吸 附 剂 选择 性 的 保 留 分 离 物 和 一 些 干扰 物 , 其 他 干扰 物 通过 吸附 剂 ;,@@ 用 适当 的 溶剂 淋 洗 吸附 剂 , 使 先前 保留 的 干扰 物 选择 性 的 淋 洗 掉 , 分 离 物 保留 在 吸附 剂 床上 ;名 纯化 、 浓 缩 的 分 离 物 从 吸 附 剂 上 淋 洗 下 来 。 影响 SPE 效果 的 主要 因素 有 吸附 剂 类 型 及 用 量 、 水 样 体积 、 洗 脱 剂 类 型 。 正 相 吸 附 剂 保留 极 性 有 机 物 , 反 相 吸 附 剂 保留 非 极 性 或 弱 极 性 有 机 物 , 而 离子 交换 树脂 则 适用 于 离子 型 的 有 机 物 ; 在 吸附 剂 和 洗 脱 剂 选 定 的 条 件 下 , 回 收 率 随 吸附 剂量 增 大 而 提高 ; 水 样 流速 对 回收 率 的 影响 不 明显 。 。 362 。 3) 固 相 革 取 的 类 型 固 相 葵 取 技术 经 过 二 十 多 年 的 发 展 , 主 要 有 以 下 类 型 : ABR ORM). BAK 树脂 、 金 属 配合 物 吸 附 剂 、 键 合 硅 胶 、 聚 合 物 吸 附 剂 、 免 疫 亲 和 吸附 剂 、 分 子 散 人 聚 合 物 。 SPE 技术 操作 简便 、 快 速 、 溶 剂 用 量 少 , 重 现 性 好 , 易 与 GC、GC-MS、HPLC 等 仪器 联 用 。 14. 2.1.4 植物 样品 的 衍生 化 预 处 理 对 目标 化 合 物 的 衍生 5 、 不 同 的 分 析 仪器 要 求 不 同 。 但 是 选择 性 和 效率 是 重要 的 考虑 因素 , 试 剂 和 反应 条 件 的 选择 等 都 要 仔细 考虑 到 并 要 验证 方法 的 重复 性 。 另 外 , 衍 生 量 的 稳定 性 也 要 被 评价 。 只 有 挥发 性 化 合 物 适 合 气质 联 用 〈GC-MS) 的 分 析 方 法 , 大 部 分 亲 水 化 合 物 需 要 衍生 化 降低 极 性 增加 挥发 性 。 硅 烧 化 是 最 常用 的 气相 色谱 衍生 方法 , 近 年 的 植物 代谢 文 献 中 多 用 N,O- 双 三 甲 基 硅 三 氟 乙 酰胺 (BSTFA), N-FPHR-N-=PRE=AZ BK (MSTFA) 和 N- 甲 基 -N- 叔 丁 基 二 甲 基 硅 三 氟 乙 酰胺 (MTBSTFA) (ERE ATA 剂 。 另 外 , 酯 化 衍生 化 方法 “〈 甲 醇 法 、 重 氮 甲 烷 、 三 氟 乙 酸 酥 法 等 )、 栈 化 衍生 化 方法 (乙酰 化 法 、 多 氟 酰 化 法 ) 等 也 有 一 定 应 用 。 使 用 紫外 或 荧光 检测 器 的 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 也 需要 衍生 化 。 为 了 使 一 些 没有 紫外 吸收 或 紫外 吸收 很 弱 的 化 合 物 能 被 紫外 检测 器 检测 , 要 通过 衍生 化 的 方法 往 这 些 化 合 物 的 分 子 中 引入 有 强 紫外 吸收 的 基 团 。 常 用 的 紫外 衍生 化 反应 有 葵 甲 酰 化 反应 、 葵 基 磺 酰 氯 的 反应 等 。 液 相 色谱 中 荧光 检测 器 的 灵敏 度 要 比 紫外 检测 器 高 出 几 个 数量 级 , 但 是 液 相 色谱 能 分 离 的 对 象 , 多 数 没有 荧光 , 主 要 依靠 荧光 衍生 化 试剂 在 目标 化 合 物 上 接 上 能 发 出 荧光 的 生 色 基 团 , 达 到 荧光 检测 的 目的 。 常 用 的 荧光 检测 试剂 有 丹 磺 酰氯 、 丹 磺 酰 阱 、 荧 光 胺 等 。 对 于 全 定量 分 析 , 利 用 稳定 同位 素 是 很 重要 的 方法 , 因 为 在 代谢 研究 中 质谱 使 用 频 率 很 高 。 质 谱 在 定性 和 定量 中 都 被 使 用 , 但 是 , 如 果 离 子 源 被 污染 , 离 子 化 效率 就 会 大 大 降低 , 这 种 现象 被 称 为 “离子 抑制 ”。 离 子 抑制 的 主要 原因 是 分 离 阶段 的 失败 导致 污 染 物 与 目标 化 合 物 的 共 流 出 , 它 会 发 生 在 任何 类 型 的 质谱 (包括 GC-MS、LC-MS 和 CE-MS) 。 基 于 全 定量 分 析 的 同位 素 稀释 是 最 合适 的 解决 方式 。 这 种 方法 的 原理 是 将 同 位 素 标 记 的 目标 化 合 物 作为 内 标 。 代 谢 物 从 测试 样 中 提取 出 来 。 用 同样 的 方法 , 代 谢 物 都 被 同位 素 标记 并 从 这 种 控制 样本 中 提取 出 来 。 测 试 样 与 控制 样 混合 。 混 合 物 用 联 用 技 术 分 离 检测 。 在 色谱 和 电 色谱 中 , 目 标 化 合 物 和 相应 的 同位 素 标记 物 是 共 流 出 的 。 每 种 目标 代谢 物 的 比率 取决 于 目标 化 合 物 和 同位 素 标记 物 的 峰 的 比率 。 这 种 技术 用 于 蛋白 质 技术 的 研究 。 在 线 同 位 素 仪 常用 稳定 同位 素 稀 释 。 硫 代谢 物 用 S# 作 标记 物 ,C2 和 N® 也 被 用 于 同位 素 标记 技术 。 在 未 来 , 费 时 的 样品 采集 与 全 定量 的 稳定 同位 素 稀释 的 结合 会 成 为 动力 代谢 分 析 中 的 标准 方法 之 一 。 。 363。 14.2.2 植物 代谢 组 的 分 析 检 测 详细 的 检测 技术 请 见 第 2 一 6 章 。 简 单 地 说 , 植 物 代谢 的 分 析 检 测 一 般 采 用 色谱 、 NMR 和 质谱 技术 等 。 气 相 色谱 (GO) 技术 52-~ 细 是 最 先 发 展 起 来 的 色谱 技术 , 也 是 最 成 熟 、 应 用 最 广泛 的 色谱 技术 。 其 现状 和 发 展 趋势 凸现 以 下 几 个 方面 : 快速 分 析 、 新 色 谱 柱 的 研发 、 多 维 气相 色谱 技术 、 统 计 学 对 复杂 多 组 分 重 到 峰 解析 。19 世纪 90 FRR 展 的 全 二 维 气 相 色谱 〈GCXGC) 是 目前 气相 色谱 中 最 具有 高 峰 容 量 和 高 分 辩 率 的 技 术 , 它 将 会 在 复杂 体系 的 样品 分 离 分 析 中 占有 越 来 越 重要 的 地 位 FJ 。 质 谱 将 成 为 气相 色谱 仪 的 一 个 标准 检测 器 , 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技术 " 细 是 目前 在 植物 代谢 分 析 中 应 用 最 广泛 的 分 离 检测 手段 。 液 相 色谱 (HPLC) 技术 "2' 中 具有 分 离 效 率 高 、 分 析 速 度 快 、 检 测 灵 人 敏 度 高 和 应 用 范 围 广泛 的 特点 , 特 别 适 合 于 高 沸点 、 大 分 子 、 强 极 性 和 热 稳 定性 差 的 化 合 物 的 分 离 分 析 。 毛细 管 电泳 (CE) 技术 5 和 高 效 液 相 色 谱 分 离 模 式 类 似 , 是 以 毛细 管 为 分 离 通 道 、 以 高 压 直 流 电场 为 驱动 力 , 根 据 样品 中 各 组 分 之 间 迁 移 速度 的 差异 而 实现 分 离 的 技术 。 质谱 技术 5 是 天 然 产 物 结构 解析 的 重要 技术 之 一 , 可 以 方便 地 获得 化 合 物 的 分 子 质量 、 分 子 式 和 部 分 结构 信息 , 易 于 与 色谱 、 毛 细 管 联 用 5'50 , 和 核磁 共振 技术 一 起 是 天 然 产 物 结构 解析 最 为 主要 的 技术 。 傅 里 叶 变 换 离 子 回旋 共振 质谱 “FT-ICR-MS) 虽然 在 质谱 联 用 技术 中 较为 常见 , 但 在 植物 领域 中 较 广 泛 的 应 用 还 在 2002 年 以 后 。 这 种 技术 的 优势 在 于 通过 高 分 辨 的 能 力 提供 更 精确 的 质量 数 信 息 。 但 是 这 种 技术 不 能 对 同 分 异 构 体 〈 在 植物 中 大 量 存在 的 ) 进行 很 好 的 区 分 。 最 新 推出 的 静电 场 轨 道 阱 傅 里 叶 变 换 质谱 仪 (Orbitrap FTMS) , 不 仅 能 提供 快速 和 灵敏 的 分 析 能 力 , 而 且 价 格 相 对 回旋 傅 里 时 质谱 便宜 了 很 多 , 有 人 预言 这 种 技术 在 代谢 组 学 应 用 上 有 很 广泛 的 市 场 , 它 理应 得 到 更 多 的 关注 。 核磁 共振 与 色谱 联 用 技术 是 近 些 年 发 展 的 热点 , 主 要 涉及 HPLC-NMR 联 用 , 甚 至 出 现 了 色谱 -质谱 -核磁 (HPLC-MS-NMR) 联 用 技术 5 。HPLC-NMR 联 用 使 得 天 然 产 物 的 在 线 分 析 与 其 中 成 分 的 结构 确定 成 为 可 能 。 对 于 植物 粗 提 样品 进行 LC-NMR 联 用 分 析 根 据 分 析 目 的 不 同 可 采用 “流动 ” (on flow mode) 方式 和 “静态 ”方式 . “流动 ” 操作 是 指 在 液 相 洗 脱 不 停顿 的 情况 下 , 对 流出 峰 进行 NMR 测定 。“ 和 静态” 操作 是 指 当 对 流出 峰 进 行 测定 时 , 流 动 相 洗 脱 暂时 停止 。 实 际 上 , 在 “流动 ”操作 过 程 中 , 由 于 样 品 在 流动 相 中 浓度 太 低 , 加 之 NMR 本 身 的 低 检 测 灵 敏 度 , 使 得 这 种 方式 主要 适用 于 粗 提 物 的 主 成 分 分 析 。“ 静 态 ”操作 由 于 液 相 色谱 峰 在 NMR 仪 中 停留 时 间 增 加 , 因 此 可 以 提高 检测 限 。 但 “静态 ”分 析 要 求 预知 样品 中 被 分 析 化 合 物 的 保留 时 间 。HPLC-MS- NMR 联 用 使 得 在 线 获得 天 然 产 物 中 更 多 化 合 物 的 结构 信息 成 为 可 能 。 傅 里 叶 红外 光谱 5 是 一 种 稳定 的 、 持 续 发 展 的 分 析 技 术 , 它 能 够 快速 、 无 损 、 无 溶剂 、 高 通 量 分 析 不 同类 样品 。 傅 里 叶 红 外 光谱 的 原理 是 当 一 个 样品 被 光 CC St) 照射 时 , 化 学 键 就 会 在 特定 波长 吸收 光线 , 并 且 以 某 种 特定 的 方式 振动 , 如 伸缩 振 动 或 者 弯曲 振动 。 这 种 吸收 /振动 可 以 和 单 键 或 者 分 子 的 官能 团 相 关 , 以 鉴定 出 未 知 化 合 物 。 它 也 是 一 种 通用 型 技术 , 只 需要 很 少 的 样品 预 处 理 和 少量 的 背景 知识 训练 。 有 些 。 364 。 代谢 组 学 的 研究 工作 也 用 到 拉 曼 光谱 和 近 红 外 光谱 。 14.2.3 代谢 组 学 研究 的 数据 处 理 14. 2.3.1 数据 处 理 方 法 代谢 物 数据 采集 之 后 , 需 要 对 所 获得 的 数据 进行 分 析 , 这 是 代谢 组 学 研究 中 十 分 关 键 的 步骤 。 目 前 数据 分 析 常 用 的 两 类 算法 是 基于 寻找 模式 的 非 监督 方法 〈unsupervised method) 和 有 监督 方法 (supervised method) 。 植 物 代谢 数据 处 理 中 常见 方法 是 主 成 分 分 析 〈Pprincipal component analysis, PCA), #2E4>#T A K 矩阵 法 〈hierarchical cluster analysis and K-means clustering), #H24A) (self-organizing map, SOM) 和 偏 最 小 二 乘法 (partial least square) “0, 7587 章 有 详细 的 描述 。 14.2.3.2 ste eS 1. 生化 数据 库 生物 化 学 的 内 容 在 清晰 地 盖 述 代谢 数据 方面 是 十 分 有 用 的 。 这 些 内 容 由 存在 于 组 织 内 部 的 反应 网 络 组 成 。 生 化 内 容 也 包括 催化 每 个 反应 的 已 知 酶 的 活性 , 执 行 这 种 活性 的 蛋白 质 和 它们 密码 的 基因 。 简 而 言 之 , 需 要 这 种 描述 已 知 生物 化 学 的 数据 库 。 尽 管 它们 都 不 完善 , 没 有 一 种 可 以 广泛 用 于 代谢 组 学 , 但 这 些 数据 库 已 有 部 分 存在 GE 141), 表 14-1 互联 网 上 的 部 分 生化 数据 库 29 数据 库 / 单 位 名 称 网 址 KEGG http: //www. genome. ad. jp/kegg/kegg2. html BRENDA http: //www. brenda. uni-kocln. de/ The EMP Project http: //www. empproject. com Institute of Biological Science, University of http: //www. aber. ac. uk/biology/research/abml. html Wales, Aberystwyth Douglas Kell’s Group http: //qbab. aber. ac. uk/home. html Virginia Bioinformatics Institute http: //www. vbi. vt. edu/ IUBMB Enzyme Nomendature http: //www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/ The University of Arizona Natural ; http: //www. npd. chem. arizona. edu/about. asp Products Database Iowa State University http: //www. public. iastate. edu/~botany/wurtele. html Platform Plant Metabolomics http://www. metabolomics. nl Etat http://biocye. org: 1555/ECOLI/class-subs-instances? object = Pathways 2. 代谢 途径 数据 库 代谢 途径 是 度量 精确 状态 下 生物 系统 代谢 物 的 方法 之 一 。 实 验 可 以 由 不 同 的 代谢 途 径 组 成 , 而 它 又 是 一 种 实时 的 过 程 , 在 相同 状态 下 的 突变 比较 , 或 者 相同 生化 系统 在 不 。 365 。 PUPAE FAY EERE. ORES OP EE RAE ARE. 14.3 植物 代谢 组 学 的 应 用 早 些 年 对 植物 代谢 产物 的 分 析 多 是 靶 标 物 分 析 , 鉴 定 的 化 合 物 相 对 少 , 方 法 也 比较 简单 。 近 年 来 对 植物 样品 的 指纹 图 谱 和 代谢 轮廓 图 谱 的 分 析 是 研究 的 热点 。 特 别 是 一 些 转基因 和 受 环 境 因子 影响 的 植株 分 析 大 量 报道 , 多 维 色 谱 和 联 用 技术 大 类 扩展 了 植物 代 谢 组 学 的 应 用 领域 。 下 面 就 对 这 些 内 容 做 简要 的 介绍 。 14.3.1 植物 代谢 指纹 图 谱 及 轮廓 分 析 应 用 实例 14.3.1.1 代谢 指纹 图 谱 分 析 实 侈 1. 使 用 HPLC- 电 喷雾 离子 阱 质谱 对 紫花 萌 菏 和 获 芝 昔 蒂 皂 角 苷 的 指纹 图 谱 分 析 Huhman 等 5 采用 负离子 反 相 液 相 色谱 /二 极 管 阵列 检测 器 / 电 喷 雾 离子 /质谱 联 用 (HPLC/PDA/ESI/MS, HPLC/PDA/ESI/MS/MS) 的 分 析 方 法 , 分 离 定性 首 攻 中 三 hie BAH (A 14-3), BAMA. RAT (Medicago sativa) 中 15 RRA 被 鉴定 ; 另外 还 发 现 两 种 新 的 两 二 酸 皂 角 苷 。 上 述 方法 与 HPLC RAMAASERR Bite (Medicago truncatula) 中 发 现 27 HBA, ILA 144. RRA PHBA Mm Ay ie LORE Ae RR 图 14-3 ”常见 豆 科 植物 中 皂 角 苷 糖苷 配 基 的 化 学 结构 5 2. 用 气质 联 用 方法 同时 检测 杏 中 糖 、 糖 醇 / 酸 、 和 氨基 酸化 合 物 Katona 9 RAG GC-MS 方法 , 发 展 了 一 个 在 果汁 存在 下 的 直接 衍生 化 方法 , 同 时 定量 分 析 单 糖 、 二 糖 、 三 糖 、 糖 醇和 糖 酸 的 三 甲 基 硅烷 胞 化 产物 。 检 测 方法 既 可 基于 总 离子 流 , 也 可 基于 选择 性 碎片 离子 (SFI) 扫描 〈 图 14-5), 保 证 了 方法 适合 于 一 个 , 366 。 40 0 30 时 间 /min 图 14-4 负离子 模式 反 相 液 相 色谱 -二 极 管 阵 列 检测 器 - 电 喷 雾 离子 阱 质谱 总 离子 流 图 [3 A. AEB (M. sativa, cultivar Radius); B. #7E HF 〈(M,satiua,cultivar Kleszczewska); C. BRA (M. truncatula, cultivar Jemalong Al17) 。 峰 号 标 出 的 是 已 鉴定 的 化 合 物 较 宽 的 浓度 范围 。 重 现 性 相对 标准 偏差 小 于 3.6% 〈 总 离子 流 ) 和 4.3% 〈 选 择 性 离 子 )。 上 述 方法 被 用 于 检测 不 同 收获 时 间 和 储藏 条 件 的 两 种 杏 中 的 糖 、 糖 醇 / 羧 酸 和 氨基 酸 组 成 。 ¢ 367 ° oer Succinic a. Malic a. citric a. 31) 33 147 3 135 273 144 234 i 233 | nue 496 | Iho Phesphoric a. Glutamic a. [21 27 ua a. 41} 299 156 | lan. 5 3 zo i Tar 255 32 | 211 | 346 eH) | 1 Wb 24 | | 26 28 | 29 30 | 1 17-18 20 25 | | | 3 i Hy 19 400 600 800 1000 1200 1400 6:40 10:00 13:20 16:10 20:00 23:20 3911 Galacturonic a. Caffeic a. 53 Chlorogenic a. 60 333 219 306 。 345 255 54 | 49 Margaric a. Stearic a. 7 1500 1800 2100 2400 2700 25:00 30:00 35:00 40:00 45:00 图 14-5 (ASG Bef EE 质 联 用 图 谱 58] A. 对 照 标 准 样 品 , 上 图 -总 离子 流 , 下 图 -选择 性 离子 扫描 ; B,A-l/1 杏 树 样品 , 上 图 -总 离子 流 , 下 图 = 选择 性 离子 扫描 。 谱 图 中 的 峰 号 为 可 定性 的 化 合 物 , 小 图 是 部 分 化 合 物 的 质谱 图 。 峰 : 1 三 安息 香 酸 ; 2 三 正 磷酸 ; 3 三 琥 珀 酸 ; 4 一 丙胺 酸 ; 5 十 7 三 菊 芋 酸 1,2; 6 一 丝氨酸 ; 8 一 苹果 酸 ; 9 一 水 杨 酸 ; 10—FAR; 11 三 葵 乙 烯 酸 十 羟 甲 基 糖 醛 ; 12 三 3- 羟 基 葵 甲酸 ;13 三 且 胺 酸 ; 14 王 f# 苯 基 乳 酸 ; 15=—4 HREM; 16 三 酒石酸 ; 17=3, MPRA FARR; 18 王 黎 芦 3,4- 双 甲 产 葵 甲酸 ; 19 王 7- 间 二 羟 葵 基 -2,6- 双 羟 葵 甲酸 ; 20= 戊 醛 糖 1; 21 三 戊 醋 糖 2 十 树胶 醛 糖 1,2 十 香草 3- 甲 氧 基 -4- 产 基 葵 乙 烯 酸 ; 26—B BES 2,4- 二 凑 葵 甲酸 ;27 王莽 草酸 十 原 儿 葵 醛 酸 十 4- 甲 基 苯 乙烯 酸 十 3,5- 二 羟基 葵 甲 酸 十 柠檬 酸 十 岩 薄 糖 1,2; 28 王 奎 宁 酸 ;29 王 mr 香 豆 酸 IKBRACLH; 30=—TF 3,5- 二 甲 氧 基 -4- 羟 葵 甲 酸 , 31 王 甘露 醇 ;32 一 4- 羟基 葵 乙 烯 酸 ; 33 王 山梨 醇 ;34,35 王 果糖 1,2; 36=3, 4, 5- 三 羟基 苯 甲 酸 ;,37 王 咖啡 酸 1 十 3,5- 二 羟基 葵 甲 酸 ,38 王 半 乳 糖 1; 39 王 半 乳 糖 2 十 葡萄 糖 1; 40 三 葡萄 糖 2; 41 一 半 乳 糖 酸 ; 42 王 棕榈 酸 ; 43 王 葡萄 糖 醛 酸 ; 44 一 阿 魏 酸 ; 45 一 咖啡 酸 2; 46 一 珍珠 酸 ; 47= THM; 48 三 硬 脂 酸 ; 49 一 蔗糖 ; 50== 海 藻 糖 ,51,52 王 纤维 二 糖 1,2; 53 三 松 二 糖 1,2 十 麦芽 糖 1; 54 =— HH 2; 55 十 57 三 帕 拉 金 糖 ; 58 王 龙 胆 二 糖 2 十 蜜 二 糖 ,59 三 绿 原 酸 ; 59 * 王 咖啡 酰 奎 尼 酸 ; 60= 蜜 三 糖 ; 61 王 松 三 糖 ; 62 王 麦芽 三 糖 3. 核磁 共振 共振 和 多 变量 分 析 用 于 野生 型 和 转基因 型 烟草 的 代谢 指纹 图 谱 分 析 Choi 等 5 应 用 核磁 共振 CH NMR) 和 多 变量 分 析 技 术 , 对 野生 型 烟草 和 过 表达 水 杨 酸 合 酶 (CSA) 的 转基因 烟草 进行 了 代谢 组 学 分 析 〈 图 14-6)。 基 于 核磁 共振 数据 ”368。 ES | Alanine 8 Succinic a. Malic a. 2 Citric a. 33434 B | 89 147 j 5 247 233 422 Phosphoric a. Glutamic a. : 299 已 ah 21 20 4 | A 400 600 800 1000 6:40 10:40 — 13:40 16:40 39 40Galacturonic a. 49 Caffeoy Iquinic a. 60 41 333 396 | 255 s Palmitic a. Margaric a. Stearic a. 117 = 2 | 313 341 38 327 | | | 550 as 44 Lj 3 | 59* | | Jibs | 训 48 ene 让 p \ | 网 让 LIN rat j 1500 1800 2100 2400 2700 25:00 30:00 35:00 40:00 45:00 图 14-5 ERM ea DARA (Be) 的 主 成 分 分 析 (PCA) , 在 PC1 和 PC2 上 上, 这些 样品 可 以 得 到 清楚 的 区 分 (A 14-7). 非 接种 、 接 种 烟草 花 叶 病 病 毒 〈TMV) 、 全 叶 〈 整 体 烟 叶 ) 和 叶脉 〈vein) 也 可 达到 区 分 。 对 分 类 起 主要 贡献 作用 的 化 合 物 被 定性 为 叶 绿 酸 、 苹 果 酸 和 糖 类 。 这 种 方法 不 需要 预 纯 化 步骤 就 可 以 区 分 野生 型 和 转基因 烟草 。 * 369 « 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 - ppm 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm 图 14-6 ”样品 亲 水 部 分 的 :H NMR Big” A., 野 生 型 叶片 , B, 过 表达 水 杨 酸 合 酶 的 转基因 烟草 叶片 ; C, 野 生 型 叶脉 , D, 过 表达 水 杨 酸 合 酶 (CSA) 的 转基因 烟草 叶脉 ¢ 370 « WNL leaf WIL leaf WSL leaf CNL leaf CIL leaf CSL leaf WNL vein WIL vein WSL vein CNL vein CIL vein CSL vein PC2(38.2%) oO D 4 a ® a 8 4 a 四 A ~20 -10 0 10 20 PC1(51.4%) 14-7 ”野生 型 和 转基因 烟草 的 叶片 /叶脉 核磁 共振 数据 PCA 84 WNL leaf: 野生 型 非 接种 烟叶 ; WIL leaf: 野生 型 接种 烟叶 ; WSL leaf: 野生 型 整体 烟叶 ;CNL leaf: CSA 非 接种 烟叶 ; CIL leaf: CSA 接种 烟叶 ; CSL leaf: CSA 整体 烟叶 ; WNL vein: 野生 型 非 接种 叶 fk; WIL vein: 野生 型 接种 叶脉 ;, WSL vein: 野生 型 整体 叶脉 ; CNL vein: CSA 非 接种 叶脉 ; CIL vein: CSA 接种 叶脉 ; CSL vein: CSA 整体 叶脉 14. 3.1.2 代谢 轮廓 分 析 实 例 1. 代谢 轮廓 分 析 用 于 表征 基因 或 环境 改良 的 植物 系统 Roessner 等 名将 GC-MS 代谢 轮廓 分 析 方 法 应 用 于 对 蔗糖 代谢 修饰 的 四 种 不 同 基 因 型 马铃薯 的 表 型 研究 。 使 用 两 种 数据 处 理 方法 : 分 级 聚 类 分 析 (HCA) 和 主 成 分 分 析 (PCA) 可 以 使 它们 分 别 聚 类 〈 图 14-8) , 并 可 测定 类 与 类 间 的 相互 距离 。 聚 类 中 起 重要 作用 的 化 合 物 也 被 鉴定 。 关 联 分 析 可 以 揭示 代谢 物 谱 间 的 密切 联系 (A 14-9 和 图 14-10)。 另 外 , 将 野生 型 马铃薯 组 织 进行 环境 操作 处 理 , 这 些 实验 的 代谢 轮廓 数据 和 上 述 转基因 马 铃 鞋 的 数据 进行 对 比 , 由 此 可 以 说 明代 谢 轮廓 分 析 在 评估 一 个 基因 修饰 如 何 被 环境 条 件 拟 表 型 (phenocopy) 方面 的 潜力 。 这 个 研究 说 明代 谢 轮廓 分 析 与 数据 挖掘 工具 联 用 可 作为 植物 基因 型 的 综合 性 表征 技术 。 2. 应 用 核磁 共振 的 番茄 代谢 轮廓 图 谱 用 于 检测 基因 修饰 后 的 潜在 影响 Le Gall 等 ”着 眼 于 :H NMR 用 于 番茄 代谢 轮廓 图 谱 的 研究 (A 14-11) 。 样 品 是 转 过 表达 玉米 中 LOM C1 基因 的 番茄 。 与 非 转 基因 番茄 比较 , 发 现 转基因 番茄 从 不 成 熟 到 成 熟 阶段 , 谷 氨 酸 、 果 糖 和 一 些 核 苷 和 核酸 显著 增高 , 但 同时 一 些 氨基 酸 《如 上 顷 氨 酸 、Y- 氨 基 丁 酸 ) 在 不 成 熟 阶段 含量 反而 很 高 。 在 两 种 成 熟 的 红 番 茄 中 ,6 种 主要 的 类 黄酮 配 糖 体 有 显著 增加 , 而 且 至 少 还 有 15 种 其 他 代谢 产物 有 差异 , 包 括 柠檬 酸 、 芒 糖 、 葵 基 丙 氨 酸 等 。 虽 然 在 统计 学 上 有 差异 〈 图 14-12), 但 这 种 差异 仍 .371 , GK3-41 GK3-29 GK3-38 INV-30/33 图 14-8 转基因 系统 的 代谢 轮廓 聚 类 分 析 “”, 然 在 田间 种 植 番 茄 的 自然 变化 范围 内 。 这 个 方法 清楚 地 说 明 :H NMR 结合 化 学 计量 学 和 单 变量 分 析 可 以 揭示 代谢 物 的 微小 变化 , 从 而 检测 农作物 基因 修饰 后 的 潜在 影响 。 3. 葫芦 韧 皮 部 的 代谢 网 络 研究 Fiehn55 运 用 气质 联 用 〈GC-MS) 和 液 质 联 用 (LC-MS) xt (Cucurbita maxima Duch. ) 脉 管 分 泌 物 中 的 代谢 物 进行 分 析 ,400 多 种 化 合 物 可 以 被 检测 , 但 只 BA 90 个 化 合 物 被 初步 识别 。 发 现 许多 氮 基 化 合 物 在 叶柄 脉 管 分 沁 物 中 的 含量 比 相 同 叶片 的 组 织 花 盘 〈tissue disk) 中 高 几 个 数量 级 , 而 己 糖 和 蔗糖 的 含量 很 低 。 为 了 找 出 这 种 在 糖 含 量 上 的 差异 原因 , 在 4. 5 天 内 ,4 种 植物 中 8 片 叶子 中 的 总 韧 皮 部 组 成 被 研 究 。 令 人 惊奇 的 是 ,8 片 叶 子 没 有 发 现 韦 皮 部 代谢 物 变 化 的 昼夜 节律 。 相 反 , 每 片 叶子 有 它 自己 的 独特 的 脉 管 分 泌 物 模式 〈 类 似 于 同一 植物 的 不 同 叶片 ), 而 且 明 显 不 同 于 处 于 相同 发 育 阶段 的 植物 的 叶片 。 各 叶片 30%% 一 50%% 的 代谢 物 水 平 不 同 于 所 有 代谢 轮 廊 的 平均 值 (AI 14-13、 图 14-14) 。 使 用 代谢 共 调 节 分 析 分 记 物 轮廓 间 的 区 别 和 联系 , 尤 其 是 氮 代谢 , 可 通过 网 络 计算 精确 地 表征 (A 14-15) 。 14.3.2 植物 代谢 分 析 应 用 实例 一 一 多 维 色谱 / 联 用 技术 多 维 技术 〈 全 二 维 气相 色谱 、 液 相 色 谱 - 气 相 色谱 、 二 维 液 相 色谱 ) 的 发 展 在 植物 代谢 分 析 领 域 产生 了 深远 的 影响 。 这 些 技术 使 得 整体 地 、 全 面 地 研究 植物 中 小 分 子 代谢 产物 变 成 了 可 能 。 与 质谱 和 核磁 共振 等 检测 技术 的 联 用 , 可 以 进一步 揭示 代谢 产物 之 间 的 内 在 联系 。 - 372 + @@00e8008080 PC1(44.3%) 葡萄 糖 -6- 磷 酸 ee tL LM | itt 图 14-9 Fee ASCH CHE oo A, 得 分 矩阵 图 ; B, 荷 载 矩 阵 图 14.3.2.1 全 二 维 气相 色谱 -飞行 时 间 质 谱 的 应 用 全 二 维 气相 色谱 技术 是 目前 最 为 成 熟 的 多 维 色谱 技术 , 其 应 用 领域 由 最 初 的 石油 馅 分 扩展 到 农药 、 复 杂 环 境 样品 、 烟 气 、 体 液 〈 血 、 尿 ) 等 方面 。 在 植物 的 分 析 中 , 挥 发 。 373 。 图 14-10 ”不同 转 基因 系统 中 代谢 产物 的 相关 性 5 88 个 代谢 物 之 间 的 相关 性 被 评价 。A, 葡 萄 糖 〈G6P)- 果 糖 〈(F6P) ,B, 亮 氨 酸 - 异 亮 氨 酸 ; C, 赖 氨 酸 - 甲 硫 氨 酸 ,D, 氨 基 乙 酸 -蔗糖 ,E., PTo7-PT15; F. 甘露 糖 -PT19。 图 中 标识 代表 不 同 植株 : ©: F 生 型 MM: INV; @: GK3; A: SP 油分 析 是 最 常见 的 应 用 。 1. 全 二 维 气相 色谱 -飞行 时 间 质 谱 分 析 青 蒿 中 挥发 油 rc] 马 晨 菲 等 应 用 全 二 维 气相 色谱 -飞行 时 间 质 谱 分 析 了 青 蔷 挥发油 的 成 分 , 并 和 一 维 气质 联 用 做 了 比较 。 定 性 出 303 个 化 合 物 , 其 中 大 部 分 是 戎 类 化 合 物 。 在 选 定 的 条 件 下 , 青 蒿 挥发 油 成 分 可 达到 族 分 离 的 效果 , 分 为 烷烃 、 单 辣 、 单 若 含 氧 栓 生物 、 倍 半 ti. PERS AEX 5 部 分 , 见 图 14-16。 与 青 蒿 素 合成 密切 相关 的 青 苇 酸 被 初步 鉴定 〈 图 14-17) 。 .374 , 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 ppm 图 14-11 番茄 中 化 合 物 的 : H NMR 谱 图 所 ] > PLS 2(14.7%) PC3(13.4%) 6 = -lay * =20., “0 20 40 #60 =r, =50 0 50 100 150 PLS1(10.5%) PC1(21.8%) 图 14-12 成熟 期 三 个 阶段 的 80 个 转基因 和 对 照 番茄 的 PLS 得 分 矩阵 图 CA) 和 转基因 和 对 照 成 AB HH PLS Be“ (B) O: GUAR, @: SUAXTREG, A: 半 成 熟 转基因 样品 , 全 : 半 成 熟 对 照样 品 , 口 : 未 成 熟 转基因 样品 , 国 : .未 成 熟 对 照样 品 2. 单车 的 全 二 维 气相 色谱 -飞行 时 间 质 谱 方法 一 一 追溯 葡萄 品种 的 有 力 工具 Rocha 等 "5 报 道 了 基于 顶 空 固 相 微 某 取 -全 二 维 气相 色谱 -飞行 时 间 质 谱 的 白 葡萄 单 莫 代 谢 轮廓 谱 , 在 显示 的 图 中 选取 了 m/z 91、121、136 这 三 个 离子 。 研 究 发 现 葡萄 中 含有 56 AAR, FE 20 种 文献 从 未 报道 过 。 这 些 单 若 根 据 化 学 结构 可 分 为 两 类 : 单 共 烯 和 含 氧 衍生 物 , 再 细 分 可 以 发 现 它 们 由 醇 、 醛 、 酯 、 酮 组 成 〈 图 14-18、 图 14-19 ) 。 他 们 还 建立 了 这 些 组 分 的 GCX GC 保留 指数 数据 库 。 同 时 也 发 现 , 化 学 结构 相似 的 化 合 物 在 二 维 图 上 分 布 是 有 规律 的 , 这 一 信息 对 将 来 未 知 样品 的 研究 非常 有 用 。 这 个 方法 不 仅仅 可 以 用 在 葡萄 分 析 上 , 还 可 以 用 于 葡萄 酒 的 分 析 。 由 于 单 咎 的 合成 是 由 物种 相关 基因 决定 的 次 生 代谢 产物 , 因 此 单 莫 轮廓 谱 可 以 被 用 作 追 溯 物 种 起 源 的 方法 。 ¢ 375 « 0 50 min 强度 十 十 图 14-13 ” 韧 皮 和 叶子 部 分 GC-MS A! 十 代表 仅 存在 于 韧 皮 部 分 有 的 代谢 物 。f: 果糖 ,g: 葡萄 糖 ;,s: ROE vr: 棉 子 糖 ;, is: 内 标 图 14-14 根据 韧 皮 部 内 在 的 代谢 物 变 化 , 使 用 向 量 1、3 和 4 的 主 成 分 分 析 [ A. 不 同 颜色 代表 不 同 植株 ; B. 不 同 颜色 代表 不 同 植株 叶片 。P1L1 表示 植物 1 叶片 1, 其 他 类 推 14.3.2.2 液 相 - 气 相 色谱 联 用 技术 的 应 用 液 相 -气相 色谱 联 用 快速 分 析 水 稻 油 脂 中 的 y- ES Miller 等 [55 发 展 了 一 个 液 相 色谱 -气相 色谱 在 线 联 用 技术 〈LC-GC) 用 于 稻米 中 六 谷 维 醇 的 分 析 。 首 先 将 稻米 中 的 总 类 脂 提取 出 来 , 没 有 经 过 任何 预 处 理 , 直 接 进入 液 相 色谱 -气相 色谱 系统 分 离 。Y- 谷 维 醇 在 液 相 色 谱 中 首先 被 预 分 离 , 在 线 转移 到 气相 色谱 ¢ 376 « ea 2x ae 四 ~ Y NAY tw P2L2 wx 本 {i Ww a waa 图 14-15 依据 各 自 叶 片 根据 Pearson it BRS AHR 图 中 节点 为 代谢 物 , 通 过 边 与 其 他 代谢 物 连 接 成 群 上 进一步 分 离 〈 图 14-20) 得 到 其 主要 成 分 : 24- 亚 甲 基 环 木 菠 葛 醇 类 阿 魏 酸 酯 、 环 木 菠 葛 醇 类 阿 魏 酸 酯 、 菜 油 当 醇 阿 魏 酸 酯 、 久 谷 省 醇 阿 魏 酸 酯 和 氢化 菜油 当 醇 阿 魏 酸 酯 。 这 些 化 合 物 的 定性 经 离线 的 GC-MS 确认 , 总 六 谷 维 醇 的 含量 由 液 相 色 谱 - 紫 外 检测 需 测 定 , 其 详细 分 布 可 由 在 线 联 用 的 GC 来 分 析 。 这 种 方法 为 高 通 量 测 定 不 同 种 水 稻 中 y-4 维 醇 含 量 及 其 组 成 变化 铺 平 了 道路 。 14.3.2.3 二 维 液 相 色谱 技术 的 应 用 全 二 维 正 相 - 反 相 色 谱 分 析 柠 檬 油 成 分 Paola Dugo 等 "报道 了 一 个 正 相模 式微 孔 硅胶 柱 为 第 一 维 、 反 相模 式 C18 整体 柱 作 第 二 维 的 全 二 维 液 相 色 谱系 统 。 两 维 间 以 一 个 十 通 闪 和 两 个 定量 环 连接 CAN 14-21) 。 在 分 析 过 程 中 , 每 一 分 钟 由 第 一 维 流 出 的 组 分 , 在 线 转 移 到 第 二 维 进行 分 离 。 在 第 二 维 柱 后 接 光电 二 极 管 阵列 检测 器 。 这 套 系统 被 用 于 分 离 由 豆 香 素 和 补 骨 酯 素 组 成 的 冷 压 柠 样 油 中 的 氧 杂 环 馅 分 〈 图 14-22) 。 这 些 化 合 物 含有 羟基 、 甲 氧 基 、 异 成 烯 基 、 蜡 戊 炳 ¢ 377 » peace 375-4 维 保留 时 间 /(sx100) 5 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 4800 “ 第 一 维 保留 时 间 A 维 保留 时 间 /(sx100) tO 3 了 一 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 4800 ”第 一 维 保留 时 间 /s 14-16, 青 车 挥发油 的 全 二 维 气相 色谱 飞行 时 间 质 谱 图 已 ] 横 坐 标 为 一 维 保留 时 间 , 纵 坐标 是 二 维 保留 时 间 。A., 族 分 离 效果 图 : Abcks, BAB, C1/C2 Rie 氧 衍生 物 ,D 倍 半 昔 , 正 倍 半 苦 含 氧 衍生 物 ;,B., 被 标注 的 色谱 峰 为 其 他 文献 中 报道 过 的 且 化 合 物 , 青 SM (arteannuic acid) 和 切 酮 (artemisia ketone) 也 被 标注 400 | Lae HL 350 300 500 1000 1500 Al 14-17 FRR RkKA A., 青 蒿 酸 第 一 维 色谱 图 ; B, 青 蒿 酸 第 二 维 色谱 图 ,C, 青 蒿 酸 二 维 效果 图 ; D, 青 苇 酸 结构 图 ; E. El: 样品 中 青 蒿 酸 质谱 图 ,E2: NIST 库 中 的 标准 质谱 图 氧 基 、 香 叶 氧 基 和 带 侧 链 的 含 氧 桩 类 。 这 些 化 合 物 在 二 维 平 面 上 的 相对 位 置 随 着 化 学 结 “378。 1932 2432 2932 图 14-18 选择 离子 的 二 维 谱 图 569 Gm/z 91、121、136) 。 横 纵 坐 标 分 别 代 表 了 第 一 、 二 维 保留 时 间 2.644 2.444 2184 2234 2284 图 14-19 图 4-18 中 /zx 93、121 和 136 的 选择 离子 色谱 图 的 局 部 放大 [4 编号 的 化 合 物 是 文献 中 已 定性 的 化 合 物 ; 横 纵 坐标 分 别 代表 了 第 一 、 二 维 保留 时 间 。 峰 : 8 王 LR-c- 菠 烯 ; I= 柠檬 烯 ; 10=B7K FE; 11 一 罗勒 烯 ; 12=1, SHAAN, 13 王 2,6- 二 甲 基 -2,6- 辛 二 烯 ,14 一 二 氢 月 桂 烯 醇 ;, 15 一 六 熙 烯 构 的 不 同 而 不 同 。 光 电 二 极 管 阵列 检测 器 提供 了 用 于 描述 被 研究 样品 的 新 信息 。 14.3.3 转基因 植物 及 受 环境 影响 植物 代谢 分 析 应 用 实例 14. 3. 3. 1 分 级 代谢 质谱 方法 论证 转基因 马铃薯 和 普通 马 铃 昔 成 分 的 实质 相似 性 现在 , 对 转基因 植物 在 总 代谢 组 成 上 是 否 含 非 预期 的 化 合 物 存 在 争论 。 组 成 类 似 性 比较 的 分 析 技 术 和 可 接受 的 总 代谢 组 成 的 衡量 标准 需要 发 展 。Gareth S. Catchpole 等 "建立 了 一 种 全 面 比 较 转基因 和 普通 马铃薯 所 有 化 学 成 分 的 方法 。 首 先是 “无 选择 ” 的 应 用 流动 注射 电 喷 雾 质 谱 的 快速 “代谢 指纹 图 谱 ” 分 析 , 随 后 是 更 详细 的 气相 色谱 - 。 379 + =H sal Ha op Fils 290nm 5 10 15 时 间 /min B 2.8 5 2.4 4 sek 1.8 a 二 1 = 12 3 2 0.6 00 6.6 13.2 19.8 26.4 33 时间 /min 图 14-20“ 正 相 液 相 色 谱 - 紫 外 检测 器 200nm 和 290nm 色谱 图 (A)55 和 转移 到 气相 色谱 上 的 省 醇 阿 魏 酸 酯 的 色谱 图 CB) 1: 菜油 省 醇 阿 魏 酸 酯 ;2: 氢化 菜油 省 醇 阿 魏 酸 酯 ,3: RASA, 1. 环 木 菠 葛 醇 类 阿 魏 酸 酯 ; 5: 24- 亚 甲 基 环 木 菠萝 醇 类 阿 魏 酸 酯 飞行 时 间 质 谱 对 怀疑 有 明显 区 别 的 代谢 物 的 轮廓 分 析 , 最 后 是 应 用 液 相 色谱 -三 重 四 极 杆 质谱 对 可 以 区 分 转基因 基因 型 的 化 合 物 的 靶 标 分 析 〈 配 糖 生物 碱 和 低 聚 果糖 )。 几 种 不 同 的 数据 处 理 方法 [ 主 成 分 分 析 (PCA)、 线 性 判别 分 析 〈LDA)、 决 策 树 状 分 析 (decision tree analysis)] 的 应 用 得 出 这 样 的 结论 : 相似 程度 的 度量 方法 独立 于 特殊 的 统 计 学 方法 之 外 。 研 究 发 现 , 除 了 6 个 靶 向 化 合 物 有 变化 外 , 转 基因 马铃薯 和 普通 马铃薯 是 实质 等 同 的 。 ¢ 380 » 图 14-21 二 维 液 相 系统 示意 图 [9 30 35 40 45 20 25 AY fa] /min Al14-22 ” 含 氧 杂 环 柠檬 油 的 正 相 - 反 相 全 二 维 液 相 色 谱 示 意图 5 1: 未 知 化 合 物 ; 2: 5-He+ LBA SAB RARS A; 3: 5- 欧 前 胡 素 氧化 前 胡 素 ; 4: 5-H 牛 儿 醇 基 -8- 甲 氧 基 补 骨 脂 素 ; 5: 5- 屁 牛 儿 醇 基 -7- 甲 氧 基 香 豆 素 ;, 6: 5,7- 二 甲 氧 基 香 豆 素 珊瑚 菜 素 ; 7: 5- 甲 氧 基 -8- 欧 前 胡 素 ;8: SHA ILIAD AAR; 9: 5- 异 成 氧 基 -8- 环 氧 欧 前 胡 素 ; 10: 5- 环 氧 欧 前 胡 素 氧 前 胡 素 ; 11: 5- 甲 氧 基 -8- (2,3- 环 氧 欧 前 胡 素 ) 补 骨 脂 素 白 当归 脑 14. 3. 3.2 基于 气相 色谱 和 气 - 质 联 用 的 不 同 生长 时 期 〈 转 基因 ) Hie tee 图 谱 研究 马 晨 菲 等 与 植物 所 合作 , 建 立 了 一 种 基于 三 甲 基 硅烷 衍生 化 的 气相 色谱 和 和 气 - 质 联 用 方法 , 它 可 以 考察 青 项 中 整体 代谢 物 的 指纹 图 谱 。 主 成 分 分 析 和 偏 最 小 二 乘法 判别 分 。 381° 析 用 来 区 分 5 个 生长 时 期 青 葛 的 气相 色谱 数据 〈 图 14-23, A 14-24) 。 结 果 显 示 , 转 基 因 〈 转 法 呢 基 焦 磷酸 合 酶 ; 和 对 照样 品 在 幼苗 期 和 成 苗 期 没有 显著 性 差异 , 但 是 在 现 曹 前 期 、 现 蓄 期 和 盛 花期 可 以 明显 地 区 分 。 鉴 定 出 STR RAK AS 酸 、 二 氢 青 蒿 酸 、 青 蒿 素 B), 通 过 研究 它们 在 不 同 生 长 时 期 的 变化 关系 , 发 现在 青 车 BX AR BRA RARE TH REARS RR. So 一 NY WY Ff PC2(23.8%) = 0 1 PC1(69.2%) ”图 14-23 不同 生 长 阶段 青 蒿 的 主 成 分 分 析 图 [ea A. 对照 样品,B, 转 基因 样品 。Stage 1: 幼苗 期 ;Stage 2: 成 苗 期 ; Stage 3: LAHTI; Stage 4: 现 蕾 期 , Stage 5: 盛 花期 14.3.3.3 AWS A Hae ea Helen E. Johnson 等 [5 提供 了 一 种 基于 傅 里 叶 变 换 红 外 光谱 和 化 学 计量 学 的 方法 研究 盐分 对 番茄 果实 的 影响 。 选 取 了 Edkawy 和 Simge Fl 这 两 个 株 系 作 为 研究 对 象 。 盐分 处 理 明显 地 减少 了 Simge Fl 的 相对 生长 , 但 对 Edkawy 没有 影响 。 盐 处 理 也 明显 减少 两 种 番茄 果实 的 鲜 重 和 大 小 , 但 对 果实 总 数 没有 影响 。 由 于 花 梢 腐烂 , 这 两 种 盐分 处 理 番茄 的 市 场 收 益 减 少 。 对 照 组 和 盐分 处 理 的 番茄 果实 提取 物 用 傅 里 叶 变换 红外 光谱 分 析 〈 图 14-25)。 每 个 样品 的 光谱 含有 吸光 值 在 不 同 波长 的 882 个 变量 。 采 用 主 成 分 分 析 方 法 , 对 照 组 和 盐 处 理 的 果实 样品 不 能 明显 区 分 。 用 判别 功能 分 析 (CDFA) 可 以 将 对 照 组 和 盐 处 理 的 样 品 分 组 〈 图 14-26) 。 遗 传 算法 (GA) 模型 也 可 以 将 对 照 组 和 盐 处 理 的 样品 分 类 , 但 有 ° 382 。 t[2] w^c[2] -0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 图 14-24 eb RE ar POS Ph BA i) — FTE Fl TR A, 得 分 图 , B, 载 荷 图 。001 对 照样 品 ,F4 转基因 样品 0.8 0.7 0.6 0.2 WW, 0.1 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 波 数 /cm 图 14-25 ”典型 的 番茄 果实 样品 傅 里 叶 变换 红外 光谱 图 ce 一 定 的 误差 率 。 应 用 遗传 算法 可 以 鉴定 番茄 对 盐 效 胁迫 应 答 的 可 能 的 重要 功能 团 。 。 383 。 样本 数 DF1 图 14-26 ”判别 功能 分 析 模 型 “” 由 图 可 以 看 出 ,Edkawy (EAD) 样本 有 部 分 重 友 在 一 起 , 而 Simge Fl (下 图 ) 样本 则 可 以 完全 分 开 。0 对 照样 品 , 1 盐 处 理 样品 14.4 植物 代谢 组 学 的 未 来 一 一 主要 问题 与 发 展 前 景 随 着 四 届 国 际 植物 代谢 组 学 会 议 的 召开 , 关 于 植物 代谢 组 学 的 研究 也 正在 国内 外 逐 步 展开 。 近 些 年 有 关 植 物 代 谢 组 学 方面 的 文献 稳步 增长 〈 图 14-27). 在 我 国 , 中 国 科学 院 上 海 生命 科 学 研究 院 植物 生理 生态 研究 所 、 中 国 科学 院 植物 研 究 所 、 中 国 科学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 等 单位 也 正 投 入 到 植物 代谢 组 学 的 研究 浪潮 中 , 并 取得 了 一 定 的 进展 5 。 2006 年 4 月 , 第 四 届 国 际 植物 代谢 组 学 会 议 在 英国 的 雷 丁 举办 。 会 议 的 主办 者 宣 称 “ 如 果 说 基因 组 学 关心 系统 中 所 有 基因 的 测量 、 和 蛋白 质 组 学 关心 所 有 蛋白质 的 测定 , 代谢 组 学 就 是 尝试 测定 所 有 给 定 细胞 〈 或 者 说 体系 ) 中 的 代谢 产物 。” 作 为 生化 通路 的 。384。 | 0 -0.015 -0.01 -0.005 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 | DFI1 0 0 0 mee --4---- —_——_—- — seth an | - I ‘ 0 SS L SR Se Re : See 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 14-27 if 10 年 发 表 的 植物 代谢 文献 增长 趋势 图 数据 来 源 : http://www. pubmed. com 终端 表达 和 植物 显 形 的 “结果 ”, 代 谢 组 学 是 极其 重要 的 。 测 量 这 些 代谢 产物 是 极其 复 杂 的 科学 , 需 要 多 种 技术 和 系列 数据 工具 的 综合 应 用 。 与 会 者 讨论 的 内 容 将 涵盖 在 代谢 组 学 中 广泛 应 用 的 技术 和 可 以 解释 生物 学 问题 的 资料 数据 。 妆 外 , 最 新 方法 学 、 现 有 方 法 学 的 最 新 应 用 , 生 物 信息 学 和 数据 统计 分 析 等 领域 也 是 会 议 涉及 的 热点 。 这 次 会 议 是 最 新 的 植物 代谢 组 学 方向 研究 成 果 的 汇总 , 也 是 今后 发 展 方向 的 展望 。 目前 代谢 组 学 面临 的 主要 问题 主要 有 以 下 几 个 方面 2 : 四 分 离 分 析 工 具 的 偏差 和 局 限 性 ; @ 大 量 数据 中 提取 有 用 信息 的 方法 ; @ 数 据 归 一 化 和 数据 库 的 建立 ;和 由 代谢 组 学 技术 和 其 他 组 学 技术 的 联 用 。 植 物 代 谢 组 学 分 析 技 术 不 仅 能 分 析 单 个 代谢 物 , 更 能 帮 助 了 解 生物 体 中 的 代谢 途径 、 生 物体 中 各 种 复杂 的 相互 作用 及 生物 系统 对 环境 和 基因 变 化 的 响应 , 它 最 终 着 眼 于 将 植物 代谢 组 学 和 其 他 组 学 技术 整合 , 阑 述 植物 从 基因 到 表 型 的 复杂 系统 的 运行 方式 。 相 信和 随 着 更 先进 的 分 析 技 术 平台 的 使 用 、 更 多 种 分 离 检 测 手段 的 联合 、 更 强大 的 数据 处 理工 具 的 出 现 、 更 完善 的 代谢 组 数据 库 的 建立 , 植 物 代 谢 组 学 将 在 生物 、 农 业 、 医 药 及 环境 等 研究 领域 产生 深远 的 影响 。 参考 文 献 LI] ERS, WR, RM, POA, HEP. 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THETA, i 过 基因 组 计划 的 实施 , 我 们 对 细胞 功能 的 了 解 还 是 相对 有 限 , 至 少 在 代谢 物 水 平 对 细胞 的 认识 还 是 不 完全 的 。 微 生物 细胞 内 大 约 40%% 的 基因 或 者 是 与 其 他 生物 同 源 的 未 知 功 能 基因 , 或 者 是 孤儿 基因 一 一 尚未 发 现 其 同 源 基 因 。 在 基因 解析 和 代谢 途径 研究 中 , 一 个 被 忽视 了 的 问题 是 酶 具有 广泛 的 底 物 特异 性 , 这 或 许 说 明了 为 什么 从 基因 组 数据 推断 出 的 代谢 物 数量 远 少 于 代谢 组 分 析 中 实际 出 现 的 代谢 物种 类 。 以 枯草 芽孢 杆菌 为 例 , 利 用 基因 组 数据 进行 的 计算 机 模拟 推断 出 的 代谢 物 为 576 种 , 但 以 葡萄 糖 为 碳 源 的 矿物 盐 培养 基 中 的 培养 物 的 代谢 组 学 分 析 发 现 只 有 300 一 350 种 化 合 物 峰 。 其 中 已 知 化 合 物 为 80 种 〈 其 中 的 57%% 可 获得 商品 化 合 物 ), 约 占 25%。 这 一 数值 甚至 低 于 计算 机 模拟 的 代谢 组 学 数据 , 原 因 主 要 出 自 于 检测 、 分 析 手 段 的 局 限 ;, 假设 枯草 芽孢 杆菌 的 代谢 组 学 分 析 中 可 测 的 已 知 和 未 知 化 合 物 各 占 一 半 , 那 么 枯草 芽孢 杆菌 内 的 总 化 合 物种 类 应 该 为 1200 一 1400, 约 是 基因 组 推断 数据 的 3 倍 。 生命 科学 的 研究 过 程 中 , 同 一 问题 从 一 个 生化 角度 转向 另 一 角度 进行 研究 时 , 在 获 得 新 信息 的 同时 也 会 常常 会 发 生 另 一 些 信息 的 丢失 , 例 如 , 通 过 转录 组 和 蛋白 质 组 改变 所 观察 到 的 数据 推断 出 的 结论 与 实际 细胞 的 生理 状态 或 功能 之 间 的 相关 性 通常 不 是 很 好 (7° =0.6~0. 8) (图 15-2) 。 由 于 代谢 组 学 更 接近 于 细胞 功能 的 反映 , 所 以 代谢 组 学 技 术 被 认为 是 研究 细胞 功能 较 好 的 手段 。 这 一 点 从 来 自 代 谢 工 程 领 域 的 例子 很 容易 被 证 实 , 大 量 的 通过 基因 工程 使 某 代 谢 酶 量 增加 的 操作 通常 对 代谢 通 量 的 影响 较 小 , 却 显著 影响 代谢 物 的 水 平 。 代谢 组 学 分 析 技 术 平 台 一 旦 建立 几乎 可 以 应 用 到 所 有 生物 研究 中 , 从 而 成 为 真正 的 功能 基因 组 学 技术 平台 。 这 意味 着 即使 没有 相应 的 全 基因 组 数据 也 可 对 生物 进行 功能 研 究 , 避 免 了 投入 大 量 的 人 力 、 物 力 对 感 兴趣 的 微生物 进行 测序 和 微 阵 列 分 析 。 微 生物 的 代谢 组 学 研究 中 , 第 一 篇 关于 微生物 代谢 组 学 分 析 的 报道 是 利用 3 种 不 同 分 析 模 式 的 GC-MS 监测 明 串 珠 菌 污 染发 酵 过 程 时 的 脂肪 酸 、 氮 基 酸 和 糖 类 化 合 物 的 代谢 , 但 是 随 后 的 研究 已 经 涉及 微生物 学 的 各 个 领域 , 其 中 比较 有 代表 性 的 就 是 工业 微生物 学 、 环 境 微生物 学 和 医学 微生物 学 领域 的 应 用 。 15.2 微生物 代谢 组 学 实验 设计 的 基本 原则 15.2.1 代谢 组 学 的 优势 在 进行 微生物 功能 基因 组 学 研究 的 过 程 中 , 之 所 以 选择 代谢 组 学 作为 研究 工具 除 前 + 388 , mn —— ee ee ee 一 一 一 一 一 一 一 ee 蛋白 质 2 1 2 3 4 ) alae ga peg Ml ee Seine 15-2 ”两 对 假想 的 基因 〈te) SHA Ct) 事件 之 间 的 时 间 差 异性 基因 1 的 开启 到 蛋白 质 1 的 表达 所 需 时 间 明 显 少 于 基因 2 到 有 蛋白质 2 所 需 时 间 。 但 蛋白 质 2 事件 发 生 的 时 程 明 显 长 于 蛋白 质 1。 如 果 在 时 间 点 Ts 处 取样 同时 进行 转录 组 和 和 蛋白质 组 研究 , 很 容易 得 出 基因 2 与 蛋白 质 1 相关 的 错误 结论 〈 假 定 基因 的 开启 或 关闭 是 全 或 无 的 形式 )[2] 面 已 经 提 到 的 原因 以 外 , 还 出 于 以 下 几 方 面 的 考虑 。 首 先 , 微 生物 由 于 形体 微小 、 结 构 简单 、 培 养 条 件 相 对 容易 满足 、 多 数 微生物 可 在 相对 较 短 时 间 内 获得 大 量 培养 物 、 很 容 易 将 代谢 过 程 与 细胞 功能 或 表 型 相 联系 , 所 以 对 功能 的 关注 更 盛 于 真 核 细胞 生物 的 研 究 。 其 次 , 从 代谢 组 学 得 来 的 数据 明显 不 同 于 从 基因 组 学 、 转 录 组 学 和 蛋 白 质 组 学 所 得 到 的 数据 , 因 为 后 三 者 都 关注 于 细胞 功能 的 某 个 侧面 : 基因 组 学 数据 适用 于 反映 细胞 中 可 能 发 生 的 , 转 录 组 学 代表 了 可 以 发 生 的 , 蛋 白质 组 学 反映 了 赖 以 发 生 的, 代谢 组 学 则 反映 了 已 经 发 生 的。 另外 , 相 对 于 真 核 生物 来 说 , 细 菌 的 基因 组 较 小 , 相 关 的 基因 组 学 、 转 录 组 学 、 和 蛋白 质 组 学 等 数据 比较 丰富 , 而 且 代谢 组 学 的 生化 水 平 表 征 最 接近 于 细 胞 功能 状态 的 反映 , 诸 多 代谢 物 的 变化 处 于 基因 和 和 蛋白 质变 化 的 下 游 , 所 以 借助 相关 系 统 生物 学 分 支 , 利 用 代谢 组 学 来 全 面 理解 微生物 生理 功能 是 最 有 效 的 ” 。 15.2.2 ”实验 设计 原则 虽然 分 析 目 的 和 方法 有 所 差异 , 但 进行 微生物 代谢 组 学 分 析 的 总 的 流程 可 归纳 为 图 15-3 所 示 叶 。 15.2.2.1 样品 要 具有 代表 性 代谢 组 学 分 析 的 主旨 是 分 析 代谢 组 中 的 所 有 信息 , 虽 然 目前 还 不 能 达到 全 分 析 的 水 平 , 但 从 生理 学 角度 看 , 收 集 具 有 包含 足够 信息 和 变量 的 代表 性 样品 需要 考虑 诸多 因 素 , 如 基因 背景 、 环 境 条 件 、 样 品 来 源 等 。 总 之 样品 必须 能 够 反映 所 要 研究 问题 的 全 。 389 。 分 步 取样 ( 胞 内 代谢 物 ) ( 胞 内 、 外 代谢 物 ) 液体 培养 物 同步 取样 of oe ‘ Te} 酸 / 碱 ”离心 /过 滤 生物 质 提 取 高 度 稀释 的 样品 -80C 酸 、 碱 、 Fae i 氯仿 iliac II 中 和 /蒸发 / 冻 干 定量 酶 法 、HPLC-UV/RI aeee HPLC-MS/MS NMR an a ta LWH-8OC BRA Al 15-3 ”微生物 代谢 组 学 分 析 流程 中 貌 , 至 少 不 会 干扰 核心 问题 的 解决 , 如 酿酒 酵母 在 供 氧 充 分 条 件 下 全 部 葡萄 糖 几 乎 都 转 化 成 菌 体 , 而 在 厌 氧 条 件 下 却 要 转化 成 乙醇 和 ATP。 由 于 大 多 数 细菌 可 以 在 短 时 间 内 获得 大 量 的 培养 物 , 而 且 通 过 控制 一 定 条件 还 可 以 实现 恒 化 培养 , 所 以 与 其 他 真 核 生 物 细胞 的 取样 相 比 , 获 得 代表 性 的 原核 微生物 样品 通常 不 是 十 分 困难 。 一 般 情 况 下 恒 化 培 养 物 具有 相对 好 的 代表 性 , 因 为 该 条 件 下 的 细菌 个 体 之 间 具 有 较 稳 定 的 特征 。 批 次 培养 和 流 加 培养 细菌 的 外 环境 存在 很 大 变化 ; 不 同 生长 时 期 的 菌 体内 代谢 差异 也 十 分 显著 。 人 实验 设计 是 代谢 组 学 分 析 的 第 一 重要 步骤 。 为 了 改善 信息 的 获取 质量 , 一 定 要 在 系 统统 计 分 析 后 精确 选择 各 研究 参数 。 在 确保 实验 技术 可 靠 的 前 提 下 一 定 要 进行 最 优化 实 验 设计 , 这 源 于 对 实验 要 解决 问题 的 准确 界定 。 与 传统 的 微生物 实验 设计 相 比 , 代 谢 组 学 研究 由 于 需要 考察 的 参数 众多 , 而 且 真 正 有 意义 的 参数 通常 在 进行 具体 实验 前 无 法 准 确 预 知 , 所 以 一 般 要 借助 一 定 的 统计 学 知识 协助 进行 实验 设计 。 数 理 统计 中 的 具体 实验 设计 方法 很 多 , 常 用 的 有 部 分 因子 设计 、 正 交 设 计 、 均 匀 设 计 、 中 心 组 合 设计 等 。 尽 管 各 有 特点 , 但 主要 目的 还 是 通过 少数 有 代表 性 的 组 合 试验 推断 整体 变化 规律 和 筛选 重要 因素 。 目 前 也 有 一 些 商用 软件 可 使 该 问题 简单 化 , 具 体内 容 可 参照 相关 专著 。 为 有 效 利 用 统计 学 工具 , 一 定 要 抛弃 诸如 “在 正常 参考 值 范围 前 提 下 寻找 两 者 量 的 区 别 ” 这 样 的 思维 定式 去 确定 定量 实验 结果 所 反映 的 真正 问题 , 正 如 前 面 章 节 所 提 到 的 , 某 一 变量 在 5 6890, 特定 代谢 组 分 析 中 的 权重 才 是 十 分 重要 的 , 或 者 更 为 重要 的 可 能 是 代谢 物 之 间 变 化 的 协 同性 。 通 常 绝对 量 的 变化 十 分 显著 的 参数 并 不 一 定 代表 了 对 扰动 应 答 具 有 特征 意义 的 指 标 , 细 胞 内 由 不 同 代 谢 物 和 各 种 调控 机 制 组 成 的 复杂 代谢 网 络 具 有 一 定 的 刚性 和 韧性 , 某 个 代谢 物 量 的 微小 波动 可 能 引起 某 关 键 酶 的 激活 或 抑制 , 进 而 影响 到 下 游 代谢 物 的 水 平 , 如 别 构 调 节 , 受 该 种 机 制 调节 的 酶 的 活性 变化 往往 只 需 很 少量 的 调节 因子 存在 。 即 便 如 此 , 该 酶 下 游 代 谢 物 的 水 平 可 能 还 受 多 种 因素 的 影响 , 单 从 其 量 的 波动 来 看 可 能 忽 视 了 具有 调节 作用 的 那个 关键 代谢 物 在 细胞 应 答 中 的 作用 。 代 谢 工程 领域 内 , 在 许多 转 录 组 与 蛋白 质 组 研究 中 , 通 常 要 对 两 种 不 同 条 件 下 的 结果 进行 比较 。 通 常 表现 最 大 幅度 ” 的 成 倍 变化 的 分 子 被 筛选 出 , 其 相关 基因 或 蛋白 质 被 认为 与 特定 的 条 件 相 关 。 在 提高 某 组 分 产量 时 , 随 着 产 率 提高 而 浓度 大 增 的 代谢 物 并 不 一 定 是 问题 的 瓶颈 所 在 。 而 浓度 锐 减 的 组 分 可 能 与 产量 相关 , 因 为 它 可 能 是 生物 合成 过 程 中 某 酶 的 抑制 剂 。 仅 靠 比较 两 个 代谢 组 学 数据 无 法 确定 与 某 条 件 下 最 相关 的 代谢 分 子 。 量 的 变化 很 小 , 但 却 十 分 显著 , 则 可 能 与 提高 产 率 最 相关 , 因 为 它 极 有 可 能 对 关键 酶 施加 正 或 负 调 控 而 与 产量 相关 。 所 以 这 些 组 分 量 上 的 微小 变化 可 能 极 大 地 影响 产 率 。 因 此 浓度 变化 的 量 或 方向 并 不 能 说 明 该 分 子 对 某 一 表 型 的 重要 程度 , 而 是 特定 代谢 物 变 化 与 表 型 的 相关 性 程度 决定 了 该 代谢 物 的 地 位 。 应 通过 多 因素 分 析 找 到 哪 种 代谢 物 的 变化 与 产量 总 是 相关 的 。 所 以 设计 实验 时 , 应 考虑 到 至 少 需要 考察 多 少 代谢 物 的 数据 和 多 少 组 样本 才能 在 统计 学 上 反映 出 实验 数据 的 真实 意义 习 。 依 据 通常 的 统计 学 实践 , 计 量 资料 至 少 需要 20 例 样 本 ;计数 资料 至 少 需要 30 例 样 本 才 有 统计 学 意义 。 除 非 极 有 价值 的 个 案 报 道 , 多 数 情况 下 样本 例 数 DF 5 的 统计 分 析 不 利于 提供 特别 准确 的 推断 结果 。 一 且 确 定 了 要 比较 的 标本 的 数目 , 下 一 步 就 是 如 何 准备 标本 。 正 如 前 文 所 述 , 从 纯 数学 的 角度 出 发 , 多 因素 分 析 最 为 经 济 和 有 效 , 但 往往 可 行 性 受到 限制 。 微 生物 学 家 多 不 愿意 采用 这 种 随机 性 很 大 的 组 全 方式。 例如, 现今 的 微生物 生产 过 程 优化 研究 中 多 一 次 只 改变 一 个 参数 , 但 是 改变 哪个 参数 呢 ? 比较 产生 同一 产物 的 不 同 株 ? 改变 培养 条 件 ? 或 在 培养 过 程 中 间歇 取样 ? 这 是 一 个 以 时 间 为 代价 的 尝试 , 在 没有 可 借鉴 经 验 的 基 础 上 , 借 助 适当 的 数理 统计 分 析 是 十 分 必要 的 , 因 为 毕竟 所 要 研究 的 参数 众多 5 。 15.2.2.3 微生物 生长 的 重复 性 微生物 培养 技术 直接 影响 实验 结果 。 由 于 生理 条 件 的 重复 性 远 不 如 分 析 条 件 的 重复 性 好 〈 植 物 分 析 中 生理 重复 性 比分 析 重 复 性 低 4 倍 左右 ) , 所 以 必须 比较 多 组 数据 才能 真实 反映 所 研究 的 生理 过 程 。 微 生物 代谢 组 学 研究 的 前 提 是 微生物 生长 状态 的 重复 性 , 恒 化 器 培养 是 最 理想 的 , 它 能 使 微生物 在 尽 可 能 恒定 和 精细 控制 的 条 件 下 生长 , 但 工业 发 酵 都 采用 分 批 补 料 培养 。 在 这 样 复杂 的 培养 体系 内 , 底 物 间歇 添加 , 使 实验 变数 增 加 , 特 别 是 比较 不 同 营养 源 的 复杂 培养 基 的 结果 时 , 往 往 容易 使 问题 复杂 化 。 即 使 是 恒 化 培养 , 搅 拌 速率 、 菌 体 老 化 、 质 粒 丢 失 等 问题 也 往往 会 干扰 微生物 生长 的 重复 性 。 对 真 核 微生物 来 说 , 菌 丝 的 形成 也 是 不 容易 实现 重复 性 的 限制 条 件 。 实 际 研究 往往 需要 在 权衡 各 种 利弊 的 基础 上 使 微生物 生长 的 重复 性 保持 相对 恒定 。 15. 2.2.4 快速 取样 与 代谢 深 灭 微生物 生长 多 数 很 快速 , 特 别 是 工业 上 常用 的 微生物 。 在 最 适 条 件 下 , 大 肠 埃 希 菌 - 391 。 增殖 一 代 仅 需要 20min 左右 。 为 获取 具有 代表 性 的 样品 , 分 析 时 的 样品 的 代谢 组 成 分 必须 保证 与 取样 时 一 致 , 才 能 反映 样品 当时 的 代谢 活动 , 因 此 这 一 反映 特定 生理 状态 的 代谢 状态 必须 要 被 “固定 ” 住 , 直 到 分 析 完 成 。 这 要 求 方法 学 上 的 有 效 性 , 以 确保 分 析 的 结果 确实 反映 细菌 刚 被 取样 时 的 状态 , 避 免 发 生生 物 和 非 生 物 学 改变 导致 部 分 代谢 物 外 流 或 污染 外 来 化 合 物 分子 。 理想 的 条 件 是 取样 到 分 析 之 间 为 零 时 差 , 现 有 的 分 析 手 段 通常 很 难 达 到 , 但 至 少 要 保证 取样 迅速 , 特 别 是 在 需要 大 量 菌 体 和 众多 样本 时 , 这 一 点 往往 很 难 实现 。 在 不 得 不 牺牲 零 时 差 的 情况 下 , 可 选择 保证 取样 方法 的 标准 化 的 策略 , 保 证 所 有 取样 过 程 对 标本 的 影响 是 一 致 的 。 ERA RE Ee EK) 是 取样 的 关键 环节 。 这 是 因为 代谢 物 的 转化 比 mRNA 和 蛋白质 还 要 快 。 例 如 ,ATP 的 半衰期 还 不 到 0. 1s, 所 以 要 求 菌 体 在 被 收获 的 同时 就 停止 代谢 活动 。 文 献上 有 许多 可 用 的 方法 , 包 括 细菌 冷冻 后 立即 滤 膜 超 滤 、 高 毛 酸 稀释 细胞 、 用 一 45C 甲 醇 溶液 稀释 、 快 速 离心 。 其 中 甲醇 方法 比较 适合 代谢 组 分 析 , 方法 温和 而 且 可 以 通过 离心 富 集 细 胞 。 但 有 些 细菌 〈 如 乳酸 乳 球 菌 ) 可 能 会 发 生 菌 体 裂 解 。 在 此 基础 上 对 甲醇 淳 灭 方法 有 过 许多 研究 , 但 针对 的 菌株 不 同 往往 效果 也 有 差 异 5 。 综 合 来 看 , 由 于 不 同 细菌 的 细胞 壁 结构 不 同 , 对 渗透 压 的 耐 受 程度 不 同 以 及 膜 的 通 透 性 差异 , 代 谢 淳 灭 所 选择 的 方法 不 可 能 统一 。 革 兰 氏 阳性 菌 由 于 细胞 壁 较 厚 , 因 此 往往 较 耐 受 剧烈 条 件 而 不 至 于 导致 菌 体 裂 解 , 某 些 酵 母 菌 也 比 真 细菌 表现 出 较 好 的 有 机 溶剂 稳定 性 。 实 际 工作 中 应 该 针对 不 同 的 菌株 优化 出 不 同 的 方法 。 由 于 大 多 数 代 谢 组 学 分 析 不 会 兼顾 各 种 酶 的 分 析 , 所 以 某 些 剧烈 一 些 的 化 学 或 物理 条 件 都 可 以 被 采用 , 如 果 确实 受 实 验 条 件 所 限 , 至 少 也 要 保证 样品 处 于 低温 、 代 谢 不 活跃 状态 。 惯 用 的 参照 标准 是 四 淳 灭 步骤 能 够 快速 使 细胞 代谢 活动 停滞 ,@) 不 破坏 细胞 膜 导致 代谢 物 外 漏 呈 。 15.2.2.5 细胞 间 液 和 区 域 化 细菌 经 过 离心 后 , 沉 淀 物 中 不 但 包含 菌 体 和 细胞 内 液 , 还 混 有 细胞 间 液 。 这 些 细胞 间 液 中 不 仅 包含 培养 基 成 分 而 且 还 有 细胞 外 代谢 产物 , 沉 演 物 经 过 提取 后 细胞 内 外 液 将 无 法 区 别 。 据 估计 , 酿 酒 酵母 细胞 湿 重 的 50%% 是 细胞 间 液 。 提 取 前 仔细 洗涤 菌 体 沉 演 将 有 助 于 解决 混 有 细胞 间 液 问题 , 但 是 缺点 是 容易 使 一 些 自由 出 人 细胞 膜 的 组 分 浓度 降 低 〈 如 小 分 子 有 机 酸 ) 并 容易 导致 细胞 破碎 。 而 且 , 由 于 无 形 中 增加 了 操作 时 间 , 会 使 某 些 不 稳定 成 分 发 生 改 变 ; 如 果 引入 了 本 身 不 易 精 确 控制 的 操作 , 甚 至 有 可 能 造成 比 细 胞 间 液 带 来 的 影响 还 大 的 误差 。 由 于 真 核 微生物 细胞 内 存在 区 域 化 , 转 录 、 翻 译 、 酶 活 性 和 生理 过 程 都 受 区 域 化 〈 图 15-4) 影响 , 所 以 代谢 物 浓 度 的 确定 最 好 按 不 同 区 域 分 开 测 量 , 这 要 求 能 够 实现 有 效 的 亚 细 胞 成 分 分 离 , 但 该 分 离 步骤 一 致 性 本 身 就 是 一 个 巨 大 挑战 。 就 目前 而 言 , 由 于 受 分 析 方 法 的 敏感 性 和 分 离 过 程 的 复杂 性 所 限 , 通 常 对 菌 体 量 的 需求 很 高 , 所 以 真正 实现 区 域 化 测量 仍 难 实现 。 虽 然 大 多 数 原核 微生物 细胞 内 几乎 不 存在 细胞 器 成 分 , 即 区 域 化 现象 几乎 没有 , 但 是 某 些 内 化 形式 的 膜 结构 仍然 存在 , 如 中 间 体 , 这 会 对 代谢 物 测 定 带 来 一 定 影响 , 必 要 时 可 通过 控制 培养 条 件 加 以 消除 。 15.2.2.6 代谢 物 提 取 细胞 内 代谢 物 样 品 制备 通常 为 易 出 问题 的 步骤 。 蒸 馅 的 方法 一 般 不 适合 代谢 组 学 分 e 392 « g a 图 15-4 酵母 菌 细胞 内 的 细胞 器 结构 与 细菌 CE) 比较 由 于 细胞 器 的 存在 , 真 核 细 胞 内 普遍 存在 代谢 物 的 区 域 化 分 布 。 原 核 生 物 也 有 类 似 的 情况 , 如 局 部 细胞 膜 内 陷 形 成 的 中 间 体 析 因 为 分 饱 步骤 越 多 , 组 分 丢失 越 严 重 , 代 谢 组 学 分 析 的 重复 性 越 差 。 所 以 标本 预 处 理 通常 要 简化 以 防止 组 分 丢失 , 这 本 身 就 是 一 个 矛盾 的 过 程 。 另 外 标本 处 理 过 程 中 要 保证 代谢 活动 处 于 停滞 状态 以 防 残留 的 酶 活性 使 代谢 物 成 分 发 生 改 变 。 对 微生物 代谢 组 学 样 品 , 可 考虑 如 下 几 种 样品 处 理 方法 : 中 将 细胞 在 乙 醛 溶液 内 煮沸 然后 通过 旋转 蒸发 器 去 处 多 余 水 分 ;四 以 高 氧 酸 稀释 样品 ;,@ 一 45 氧 仿 抽 提 。 特 别 是 氯仿 抽 提 , 该 法 较为 温 和 并 且 具 有 代谢 漆 灭 作 用 , 还 能 防止 挥发 性 成 分 〈 如 丙酮 酸 ) 的 挥发 。 总 的 来 说 代谢 物 提取 要 保证 提取 到 的 代谢 物 足够 多 , 不 导致 代谢 物性 质 发 生变 化 , 适 合 于 下 游 采 用 的 分 析 技 术 。 除 非 是 专业 的 分 析 机 构 , 就 具体 实验 室 而 言 , 由 于 所 研究 的 菌株 相对 固定 , 所 以 不 妨 彻 底 优化 出 一 个 好 的 样品 预 处 理 流 程 , 这 是 个 一 劳 永 逸 的 办 法 。 15.2.3 分析 平 台 关于 代谢 组 学 的 分 析 技 术 在 相关 章节 内 已 有 详细 描述 , 这 里 只 对 微生物 样品 分 析 中 使 用 的 各 种 技术 的 优 缺 点 进行 比较 , 在 进行 实际 样品 分 析 时 可 根据 分 析 目 的 不 同 加 以 选 择 。 但 是 从 未 来 代谢 组 学 技术 发 展 趋势 来 看 , 任 何 的 单一 分 析 技 术 都 不 能 满足 代谢 组 学 分 析 需 要 , 集 成 或 所 谓 的 联 用 技术 将 是 未 来 发 展 的 主流 。 能 够 实现 体内 无 损 区 域 化 检测 是 代谢 组 学 研究 的 首选 方法 , 但 是 现在 所 用 的 NMR 和 IR 方法 灵敏 度 较 低 , 而 且 不 具备 分 离 能 力 , 因 此 需要 峰 的 拆 分 。 所 以 目前 建立 起 来 的 代谢 组 学 分 析 平 台大 多 是 有 创 检测 技术 为 依托 。 虽 然 第 一 个 完成 的 微生物 代谢 组 学 研 究 是 基于 二 维 薄 层 色谱 , 但 是 起 主导 作用 的 还 是 各 种 联 用 技术 , 如 GC-MS、LC-MS 和 93 e LC- 二 极 管 阵列 检测 。 这 些 方法 整合 了 基于 理化 性 质 不同 对 代谢 物 的 色谱 分 离 过 程 和 基 File OR) 谱 模式 不 同 的 化 合 物 鉴 定 技术 。 分 析 化 学 领域 内 的 GC、LC 联 用 技术 已 应 用 数 十 年 。 但 时 至 今日 , 代 谢 组 学 分 析 中 一 次 可 分 析 的 仍然 限于 特定 条 件 下 研究 者 认为 重要 的 几 个 化 合 物 , 即 所 谓 的 代谢 标 竟 分 析 。 代 谢 组 学 的 出 现在 方法 学 上 正 使 分 析 化 学 从 靶 标 分 析 转 向 全 组 分 分 析 。 GC-MS 的 优势 在 于 与 高 敏感 性 和 选择 性 质谱 结合 后 分 离 效 率 高 , 保 留 时 间 重 现 性 好 。 传 统 的 GC-MS 已 应 用 于 项 空 挥发 性 和 中 极 性 化 合 物 分 析 。 但 是 许多 代谢 物 包含 极 性 官能 团 , 在 所 用 分 离 条件 下 热 稳定 性 好 , 甚 至 不 具 挥发 性 。 含 有 极 性 基 团 的 化 合 物 由 于 与 色谱 柱 的 相互 作用 或 吸附 常 导 致 峰 形 不 佳 , 所 以 GC 柱 前 宿 生 化 常 是 必需 的 。 过 去 数 十 年 的 经 验证 实 胀 化 反应 对 醇 、 醛 、 酸 和 氨基 代谢 物 的 衍生 化 效果 较 好 , 峰 容量 可 达 200, 全 二 维 GCX GC-MS 技术 将 在 代谢 组 学 分 析 中 会 有 更 广泛 的 用 途 。 该 技术 利用 两 根 串 联 的 色谱 柱 , 并 在 交接 处 配 以 低温 调制 器 , 这 使 得 第 一 维 的 洗 脱 峰 通过 低温 聚焦 后 在 很 短 时 间 内 由 温度 脉冲 送 和 第 二 维 再 通过 另 一 分 离 机 制 加 以 区 分 。 第 二 维 的 分 离 时 间 通常 为 4 一 7s。 据 悉 , 这 一 技术 甚至 在 分 离 生 理 复杂 体系 中 的 对 映 体 时 也 显示 良好 的 稳 健 性 和 敏感 性 。 GC 具有 高 分 辨 、 稳 定 和 动态 分 析 特 性 。LC 在 分 析 难 挥发 化 合 物 、 热 不 稳定 化 合 物 〈 如 核 苷 和 脂 酰 辅酶 A) 和 分 子 质量 为 500 一 700Da 大 分 子 代谢 物 时 更 有 优势 。 而 且 可 以 配备 多 种 类 型 的 检测 器 , 如 紫外 或 荧光 检测 就 比 LC-MS 使 用 的 电 喷雾 质谱 针对 某 些 化 合 物 的 检测 灵敏 度 高 。LC 的 另 一 优势 是 通常 不 需要 衍生 化 而 且 标本 用 量 可 降低 到 微 升 或 更 低 。LC-MS 的 主要 缺陷 是 离子 抑制 , 影 响 定量 准确 性 。 当 与 被 检 代谢 物 存 在 共 洗 脱 化 合 物 时 , 由 于 共 洗 脱 化 合 物 的 离子 化 程度 高 于 待 测 物 时 , 就 常会 发 生 离 子 抑 制 。 由 于 多 数 代谢 物 在 极端 条 件 下 通常 不 稳定 , 液 体 流动 相应 尽 可 能 接近 中 性 , 而 且 柱 箱 温 度 不 能 太 高 。 目 前 利用 各 种 方法 实现 全 组 分 分 析 的 LC 方法 仍 不 是 很 多 。 最 近 也 有 利用 毛细 管 电泳 技术 进行 代谢 物 全 组 分 分 析 的 。 与 LC-MS 相 比 ,CE-MS 的 敏感 性 和 分 离 效率 都 比 前 者 高 。 只 是 衍生 化 效果 和 重复 性 都 不 及 LCMS, 而 且 CE 与 MS 的 耦合 比较 复杂 , 当 有 肽 类 和 盐 存在 时 , 稳 健 性 也 不 如 LC-MS。 但 CE 技术 却 是 芯片 实验 室 技 术 用 于 代谢 物 分 析 的 重要 手段 , 相 关 技 术 仍 处 在 不 断 发 展 中 咏 。 15.2.3.1 稳健 性 与 稳定 性 建立 全 组 分 分 析 方 法 并 不 是 最 大 的 挑战 , 代 谢 组 学 分 析 的 主要 挑战 来 自 于 分 析 平 台 的 稳定 性 , 能 够 自动 分 析 组 分 量 上 的 差异 , 达 到 代谢 组 学 分 析 的 真正 目的 。 代 谢 组 学 分 析 更 要 求 分 析 技 术 具 有 稳健 性 , 如 保留 时 间 和 响应 因子 等 参数 , 以 保证 对 每 一 代谢 物 的 分 析 精 确 可 靠 , 能 够 正确 区 分 代谢 物 量 上 的 微小 差异 。 为 有 效 控制 所 有 步骤 的 精确 性 与 准确 性 , 在 标本 处 理 和 分 析 过 程 中 引入 定量 内 标 十 分 必要 , 这 样 可 以 确保 实验 误差 控制 在 可 接受 范围 内 。 分 析 过 程 中 还 要 保证 不 因 实验 过 程 引 入 代谢 物 成 分 变化 , 无 论 是 生理 或 非 生理 改变 。 所 以 样品 的 总 分 析 时 间 不 可 能 太 长 所 。 15.2.3.2 敏感 性 由 于 代谢 组 学 要 分 析 全 组 分 代谢 物 , 所 以 敏感 性 要 求 较 高 。 目 前 常用 的 全 组 分 分 析 .394 + 的 GC-MS #RAHWFBH (ED 离子 化 技术 。 在 全 扫描 模式 中 对 洗 脱 组 分 具有 较 高 的 响应 因子 。 利 用 GC-EL 四 极 杆 -MS 技术 的 检测 限 可 达 0. 025 一 2. 0ng/ml。 新 近 出 现 的 GC-TOF-MS 技术 的 检测 限 可 比 前 者 高 5 一 20 倍 。 如 果 应 用 GCX GC-TOF-MS 技术 , 敏感 性 更 高 , 因 为 第 二 维 分 离 峰 的 宽度 很 小 , 通 常 可 使 灵敏 度 提高 5 一 10 倍 。 如 果 是 广泛 地 对 化 合 物 进 行 筛选 , 常 用 离子 阱 LC-MS 系统 。 依 靠 传统 的 LC 系统 , 离子 阱 LC-MS 的 灵敏 度 常 可 与 利用 四 极 杆 的 GC-EILMS 相 媲美 。 现 在 满足 全 组 分 扫描 的 MS 平台 也 不 断 被 开发 出 来 , 如 线性 离子 阱 LC-MS 系统 比 传统 的 离子 阱 LC-MS 系 统 灵敏 10 一 20 倍 。 | 一 个 方法 的 总 体 灵敏 度 并 不 完全 取决 于 所 用 仪器 的 灵敏 度 , 通 过 提高 样品 中 待 测 组 分 的 浓度 , 使 之 达到 仪器 的 检测 限 也 能 实现 痕 量 组 分 的 分 析 , 通 过 冷冻 干燥 或 小 体积 的 衍生 化 浓缩 步骤 也 可 以 提高 分 析 能 力 , 但 样品 的 损失 也 不 可 避免 呈 。 15.2.3.3 <# 利用 多 变量 数据 分 析 理 论 〈(MVDA) 分 析 代谢 组 学 数据 时 , 绝 对 定量 通常 并 不 总 是 必要 的 , 组 分 浓度 比较 可 以 通过 峰 面 积 所 反映 的 相对 含量 进行 比较 。 但 要 求 分 析 方 法 对 待 测 组 分 的 线性 响应 范围 要 宽 , 而 且 分 析 方 法 的 相对 标准 偏差 〈RSD) 要 尽 可 能 小 。 因为 不 同样 品 中 同一 组 分 或 同一 样品 中 的 不 同 组 分 浓度 差异 极 大 〈 生 物 样品 中 , 代 谢 物 浓度 变异 系数 超过 1000 倍 ) , 而 且 为 了 使 分 析 结 果 具 有 可 靠 性 和 可 比 性 , 样 品 中 引入 内 标 十 分 必要 。 有 条 件 的 情况 下 应 对 不 同类 别 化 合 物 选 择 相应 内 标 。 利 用 EI 的 GC-MS 的 线性 范围 为 10' 一 10: , 而 电 喷 雾 离子 化 的 LC-MS 可 达 10 一 10' 。 实 际 分 析 过 程 中 要 根据 实际 情况 选择 分 析 方 法 , 一 般 来 说 , 分 析 方法 的 检测 限 越 低 , 该 方法 对 微量 组 分 的 检测 RSD 可 能 越 高 。 代谢 组 学 的 代谢 物 的 标 靶 分 析 和 全 组 分 分 析 一 次 可 产生 大 量 的 数据 , 对 任何 一 种 分 析 , 都 要 采取 质 控 措 施 以 保证 诸如 提取 、 衍 生化 和 分 析 的 可 靠 性 并 使 检测 响应 信和 号 或 进 样 量 的 误差 在 允许 范围 内 。 为 了 保证 良好 的 定量 准确 性 , 质 控 措 施 的 采用 是 值得 提倡 的 。 如 仪器 的 定期 校正 、 在 待 测 样品 间 随 机 插 和 人 标准 品 等 。 为 保证 结果 的 可 比 性 , 不 同 实验 室 之 间 还 可 以 建立 室 间 质 控 机 制 。 15.2.3.4 代谢 物 鉴 定 通过 LC-MS 检测 的 化 合 物 常 可 借助 NMR 定性 。 但 由 于 待 测 组 分 含量 较 低 , 直 接 检测 通常 较 难 实现 , 所 以 LC 联合 MS/MS 甚至 多 极 MS 和 高 分 辩 MS 常 很 必要 。 新 近 开发 的 线性 离子 阱 联合 FT-MS 效果 较 好 , 虽 然 流 式 注 射 FT-MS 已 有 应 用 , 但 对 异 构 体 效 果 不 佳 。 对 于 GC-MS, 化 学 电离 用 于 MS 定性 比较 可 取 , 配 合 多 极 MS 可 进一步 用 于 结构 鉴定 B] 。 相 关内 容 可 参见 本 书 有 关 章 节 。 15.2.3.5 数据 前 处 理 大 多 分 析 仪 器 提供 的 检测 数据 需要 一 定 的 前 处 理 才能 利用 MVDA 工具 进行 分 析 , 数据 前 处 理 需 要 考虑 诸多 因素 , 如 为 了 除 掉 干 扰 ,GC、LC 数据 应 进行 保留 时 间 、 基 线 漆 移 和 噪音 半 值 校正 ;不 同样 品 的 定量 数据 可 能 还 需要 一 定 的 变量 变换 才能 进行 下 一 步 。 395 + 分 析 ; 在 进行 复杂 体系 分 析 时 常会 遇 到 共 洗 脱 问题 等 , 相 关 问 题 在 各 有 关 章 节 已 经 描述 过 , 此 不 缆 述 。 目 前 由 于 缺少 相应 的 应 用 软件 , 所 以 数据 处 理 的 方法 学 进展 比较 缓慢 。 但 许多 仪器 开发 商 已 经 开始 注意 这 一 点 了 , 随 机 附带 相应 的 适合 于 代谢 组 学 分 析 软 件 的 分 析 平 台 已 经 到 达 用 户 手 中 。 15.2.3.6 生物 信息 学 代谢 组 学 像 其 他 功能 基因 组 学 一 样 会 产生 大 量 数据 , 因 此 需要 一 个 生物 信息 学 平台 储存 、 处 理 和 保存 这 些 数据 。 这 样 一 个 平台 需要 许多 辅助 系统 中 。 1. 实验 室 信息 管理 系统 (LIMS ) LIMS 对 于 解决 如 何 选择 、 提 取 、 分 析 标 本 和 结果 预 处 理 十 分 必要 。 对 于 判断 数据 质量 十 分 有 效 。 每 个 实验 室 应 建立 一 套 适 合 本 实验 室 特 征 和 分 析 能 力 的 标准 化 样品 采集 处 理 等 方法 , 各 种 分 析 数 据 管 理 要 有 相应 规范 , 便 于 实验 室内 使 用 和 查阅 。 这 是 进行 系 统 生物 学 中 任何 一 项 “组 学 ”研究 所 必 备 的 条 件 , 如 建立 实验 室 环境 条 件 下 的 空白 色 - 质 图 , 可 以 帮助 排除 干扰 因素 的 影响 。 2. 数据 集 不 同 分 析 方 法 产生 的 数据 十 分 庞大 , 如 一 个 LC-MS 文件 大 约 为 40Mb, 但 并 非 所 有 文件 都 含有 有 用 数据 。 经 过 数据 前 处 理 , 可 以 获得 一 个 信息 量 不 变 但 格式 缩小 了 的 文 件 。 原 始 数据 和 经 处 理 过 的 数据 需要 妥善 保存 以 备 分 析 , 该 数据 集 最 好 包含 基因 组 、 蛋 白质 组 和 转录 组 等 所 有 数据 以 利于 系统 生物 学 分 析 。 虽 然 许多 商用 软件 提供 了 该 功能 , 但 通常 不 是 服务 于 分 子 生物 学 研究 目的 的 , 根 据 研 究 领 域 和 应 用 范围 的 不 同 实验 室 数据 集 的 建立 也 不 尽 相同 。 3. 参考 数据 库 代谢 组 学 面临 的 比较 迫切 的 挑战 是 如 何 对 代谢 物 进行 鉴定 。 例 如 , 计 算 机 模拟 出 的 576 个 枯草 杆菌 的 代谢 物 中 , 由 于 自身 不 稳定 或 商业 价值 不 足 ,432%% 没 有 商品 参照 品 。 对 细菌 代谢 物 来 说 , 缺 少 标准 参照 化 学 品 现象 尤为 严重 , 所 以 导致 化 合 物 和 代谢 物 鉴 定 工作 十 分 艰难 。 保 留 指数 、 质 谱 峰 、 同 系 物 、 分 子 质量 等 相关 信息 统统 应 予 保存 在 参考 数据 库 中 。 目 前 GC-MS 数据 库 已 初步 建立 (http://www. webbook. nist. gov/chemis- try/), LC-MS 目前 还 没有 可 用 的 标准 数据 库 , 但 一 定 规模 的 数据 库 已 经 被 许多 研究 机 构建 立 起 来 。 理 想 的 数据 库 应 独立 于 所 用 的 分 析 方 法 而 且 在 代谢 组 学 各 种 分 析 方 法 之 间 具有 普 适 性 。 4. 生物 统计 分 析 工 具 数据 经 过 初步 处 理 后 , 应 将 数据 转化 成 有 用 信息 。 许 多 MVDA 商用 软件 可 以 用 来 进行 数理 统计 分 析 , 如 Matlab。 当 确定 下 来 一 组 代谢 物 与 要 研究 的 问题 相关 后 , 下 一 步 就 是 要 解决 这 些 代谢 物 的 生理 作用 问题 , 需 要 有 一 个 强 有 力 的 工具 帮助 微生物 学 家 解 释 经 统计 分 析 发 现 与 研究 问题 相关 的 代谢 物 的 隐 含 意义 。 通 过 查阅 与 相关 代谢 物 有 关 的 ° 396 = gt OPE Sat 代谢 途径 能 帮助 微生物 学 家 找到 某 代 谢 物 的 作用 , 互 联网 上 有 许多 代谢 途径 的 数据 库 可 供 使 用 , 如 KEGG、EcoCyc、UM-BBD 和 WIT 等 。 这 些 数据 库 由 于 都 过 于 追求 全 面 所 以 可 能 并 不 能 简单 地 用 来 解决 代谢 组 学 中 的 标志 物 发 现 等 问题 。 因 此 也 就 不 一 定 能 简便 地 给 出 问题 的 直接 答案 。 理想 的 数据 库 最 好 是 能 直接 表述 出 感 兴趣 的 代谢 物 的 生理 意义 , 如 为 什么 某 物 质 的 升 高 在 某 种 情况 下 是 合理 的 。 代 谢 途 径 最 好 以 生理 学 家 熟悉 的 方式 呈现 , 而 且 在 代谢 的 每 一 步 中 最 好 将 相关 类 似 物 、 能 量 、 附 因子 的 需求 及 消耗 情况 一 起 标 出 , 每 一 途径 的 反 应 步 又 也 不 要 太 多 , 以 便 一 目 了 然 。 只 反映 代谢 物 浓 度 改 变 的 生物 信息 学 工具 并 不 是 最 佳 研究 工具 , 目 前 的 代谢 途径 数据 库 大 多 不 完整 , 如 谢 曼 两 酸 杆菌 的 三 羧 酸 (TCA) 循环 与 经 典 的 TCA 循环 完全 不 同 , 至 少 KEGG 中 就 没有 收录 该 条 特殊 的 途径 。 微 生物 中 大 量 存在 非 经 典 代谢 途径 , 而 且 有 些 途 径 还 具有 宛 余 性 , 有 的 还 存在 副 反 应 和 底 物 协 同 作用 , 因 此 有 的 学 者 建议 引入 “代谢 域 ” (metabolic neighborhoods) 的 概念 , 其 定 义 为 以 一 个 代谢 物 〈 底 物 或 产物 ) 为 中 心 的 所 有 代谢 途径 及 所 有 参与 各 途径 的 反应 集 合 。 该 形式 可 反映 与 某 代 谢 物 有 关 的 所 有 反应 途径 , 比 现 有 数据 库 的 反应 形式 更 全 面 和 直观 , 但 是 要 建成 这 样 一 个 数据 库 的 工作 绝对 不 亚 于 要 完成 人 类 基因 组 计划 。 虽 然 像 Compound KB 和 LIGAND 数据 库 还 提供 化 合 物化 学 特性 信息 , 但 目前 还 没有 一 个 数 据 库 提供 代谢 物 在 细胞 内 功能 的 信息 。 除了 以 图 形 形 式 表现 代谢 途径 外 , 针 对 许多 微生物 还 建立 了 许多 代谢 模型 。 最 近 利 用 大 肠 埃 希 菌 和 酿酒 酵母 的 全 基因 组 数据 已 建成 了 限制 模型 , 包 含 了 基因 组 数据 解析 出 来 的 所 有 基因 组 成 的 400 多 种 代谢 物 和 700 多 个 反应 , 同 样 也 适用 于 代谢 组 学 研究 。 但 由 于 分 析 工 具 的 不 同 所 以 使 建立 起 来 的 代谢 网 络 无 法 偶 联 或 进行 直接 比较 , 而 且 网 络 构 建 耗 时 费力 。 最 近 科 学 家 试图 利用 新 的 手段 解决 不 同 软件 构建 的 网 络 之 间 缺 乏 可 比 性 的 问题 , 以 便 合 作 开发 和 资源 共享 。 由 于 微生物 代谢 组 学 分 析 的 发 展 , 基于 代谢 组 学 数据 重 构 生 化 网 络 和 调节 网 络 的 工 具 也 相继 被 开发 出 来 , 其 开发 基础 是 代谢 组 中 互相 关联 的 代谢 产物 之 间 的 联系 是 建立 在 代谢 过 程 或 调节 过 程 中 的 , 而 相互 之 间 没 有 关联 的 代谢 物 通 常 相互 作 用 较 少 。 该 研究 一 定 程 度 上 有 利于 发 现 未 知 基因 的 功能 , 其 中 受益 最 大 的 领域 就 是 工业 生物 技术 中 的 代谢 途径 优化 设计 。 目前 有 两 种 方法 可 以 用 来 进行 代谢 组 学 信息 与 基因 功能 的 偶 联 。 第 一 种 方法 是 直接 法 , 即 通过 未 知 功能 基因 编码 的 酶 所 催化 的 化 学 反应 判断 基因 功能 。 例 如 , 通 过 构建 表 达 谷 胱 甘 肽 S 转 移 酶 标签 的 蛋白 质 质粒 的 文库 , 酵 母 内 的 未 知 基 因 功 能 得 到 鉴定 , 并 可 发 现 一 些 蛋白 质 的 新 的 活性 [5 。 该 方法 存在 的 问题 是 , 由 于 通过 序列 同 源 性 判断 基因 功能 , 因 此 出 发 点 只 是 借助 机 制 而 不 是 功能 , 有 一 定 的 基因 组 数据 依赖 性 。 另 一 种 方法 是 通过 对 某 已 知 基因 的 敲 除 或 过 表达 后 的 细胞 代谢 组 变化 , 与 某 未 知 基因 癌 除 后 的 代谢 组 变化 相 比较 发 现 未 知 基 因 功 能 。 这 种 方法 也 被 用 来 进行 酿酒 酵母 的 研究 , 并 被 称 为 FANCY (functional analysis by co-responses in yeast) 法 。 该 方法 需要 应 用 MS 或 NMR 并 将 所 得 结果 进行 复杂 的 化 学 计量 学 计算 7。 ¢ 397 = 5. 文献 和 资源 虽然 互联 网 上 可 供 利用 的 各 种 数据 库 越 来 越 多 , 但 是 内 容 的 准确 性 通常 不 能 完全 保 证 。 而 且 本 来 属于 推断 性 的 结论 一 旦 被 广泛 引用 就 会 被 当成 事实 接受 下 来 。 因 此 必须 注 意 对 引用 的 部 分 进行 交叉 验证 。 特 别 是 随 着 电子 计算 机 技术 的 发 展 , 基 于 理论 的 推断 产 生 的 结论 的 数量 会 越 来 越 多 于 实验 结论 。 互 联网 上 越 来 越 多 的 文献 无 疑 为 科学 研究 提供 了 巨大 帮助 , 但 如 何 选择 重要 文献 同样 重要 。Cytoscape 软件 能 够 提供 适合 生物 信息 学 要 求 的 文献 检索 功能 , 在 一 定 程 度 上 可 以 帮助 科学 家 减轻 文献 检索 负担 。 15.3 代谢 组 学 在 工业 微生物 学 中 的 应 用 资源 荐 乏 、 能 源 短 缺 、 环 境 恶 化 决定 了 21 世纪 对 人 类 社会 将 产生 深远 影响 的 主要 有 两 方面 内 容 : 中 社会 发 展 将 转向 以 可 持续 供给 的 资源 为 基础 ;外 建立 在 对 生命 过 程 的 系统 理解 和 能 力 发 掘 基础 上 的 技术 单 命 。 以 生物 友好 过 程 取代 传统 加 工 工艺 、 以 可 再 生 的 生物 质 资源 取代 不 可 再 生 的 化 石 资源 , 是 工业 可 持续 发 展 的 必然 趋势 , 相 应 地 , 工 业 生物 技术 应 运 而 生 并 被 喻 为 未 来 社会 经 济 发 展 中 最 有 前 途 的 技术 产业 之 一 。 微 生物 是 地 球 上 最 丰富 的 物种 资源 之 一 , 是 最 丰富 的 氮 源 和 磷 源 的 储 库 。 微 生物 具有 多 样 性 的 合成 能 力 和 丰富 的 代谢 产物 , 由 于 其 结构 简单 , 体 外 培养 相对 容易 , 进 行 各 种 改造 比较 容 易 , 所 以 是 工业 生物 技术 中 的 主要 利用 和 依靠 对 象 。 随 着 各 种 基因 操作 技术 的 不 断 成 _ 熟 , 微 生物 在 工业 发 酵 和 工业 生物 技术 中 扮演 着 越 来 越 重 要 的 作用 , 也 是 代谢 组 学 技术 应 用 比较 成 功 的 领域 之 一 。 自 然 进化 出 来 的 代谢 过 程 从 大 量 生产 产品 化 合 物 的 角度 来 说 不 是 最 适 的 , 虽 然 转基因 技术 成 熟 的 时 候 , 曾 一 度 被 认为 是 能 够 领导 工业 生物 技术 走向 成 功 的 希望 , 但 随后 的 研究 很 快 证 实 , 仅 仅 限 于 个 别 基 因 的 操作 往往 达 不 到 提高 目标 化 合 物产 量 的 目的 甚至 适得其反 。 工业 生物 技术 发 展 强调 解析 与 组 合 两 个 特定 的 步 又 , 关 注 怎样 辨认 能 反映 细胞 生理 状态 的 主要 参数 , 怎 样 利用 这 些 信 息 组 织 一 个 代谢 网 络 的 设计 和 控制 , 确 定 合理 的 划 点 以 修饰 构建 特定 物种 , 进 一 步 评估 基因 或 酶 的 真实 修饰 效果 , 达 到 最 佳 生产 要 求 。 代 谢 途径 的 组 合成 为 达到 上 述 目的 的 最 佳 手段 已 被 广泛 接受 , 代 谢 组 学 技术 目前 已 成 为 这 一 领域 内 最 活跃 、 最 有 效 的 研究 方法 。 转 录 组 和 蛋白 质 组 数据 可 以 用 来 对 未 知 的 途径 进行 推测 , 但 是 当 基 因 序 列 或 蛋白 质 结构 等 信息 不 全 的 情况 下 进行 途径 分 析 则 通常 比较 困 难 。 代 谢 组 学 分 析 对 基于 蛋白 质 组 和 基因 组 数据 模拟 出 的 代谢 途径 的 可 靠 性 验证 有 着 无 可 比拟 的 优势 ”。 早 期 的 尝试 是 针对 大 肠 埃 希 菌 的 分 析 , 采 用 了 薄 层 色谱 方法 , 虽 然 没 对 代谢 物 进 行 任何 鉴定 , 但 是 发 现 了 在 氧化 压力 下 统 氮 酸 代谢 池 的 升 高 , 而 且 这 是 原 代 谢 过 程 中 不 存在 的 代谢 物 。 经 验 认为 同一 克隆 的 所 有 菌株 具有 完全 一 致 的 遗传 背景 , 因 此 应 该 具有 一 致 的 代谢 特征 , 但 是 最 近 通 过 对 10 个 相关 克隆 而 来 的 大 肠 埃 希 菌 不 同 菌 株 的 代谢 组 学 比较 研究 发 现 , 在 葡萄 糖 限制 培养 基 上 生长 的 这 些 原本 认为 具有 一 致 表现 的 菌株 在 物质 转运 和 代谢 速率 方面 具有 很 大 差异 , 其 中 177 种 被 研究 代谢 物 中 , 仅 68 种 无 明显 差异 , 其 余 均 表 现 出 受到 不 同 程度 影响 〈 图 15- 5)5 1 。 利 用 NMR 对 酿酒 酵母 的 分 析 同 样 发 现 了 新 的 代谢 物 , 并 且 利用 细胞 内 代谢 物 浓度 的 差异 区 别 出 了 许多 基因 前 + 398 , 除 突变 株 。 对 枯草 芽孢 杆菌 和 谷 氨 酸 棒 杆 菌 也 做 过 许多 代谢 组 学 分 析 。 这 两 种 细菌 在 工 业 生 物 技术 中 具有 重要 作用 。 12 Ga BW2952 区 习 BW4001 (a) BW4003 [7] BW4005 BW4029 BW4036 FS BW3767 BW4002 E533 Bw4004 相对 含量 /% NSNNNNNNNNNNNNNNNNNNI NS OOOOOOOOOFT VILLLLLLLLLLLLL VZLLLLLL1 | | be 小 laa wn =| ZB 谷 氨 酰 胺 海藻 糖尿 苷 二 磷酸 -已 糖 EAR 图 15-5 9 PRA IAF RAB ST 22 ey TE 代谢 物 在 微生物 代谢 中 对 基础 代谢 和 次 生 代谢 起 着 重要 的 调节 作用 , 它 们 同时 也 可 作为 指示 和 感受 外 界 环境 变化 的 信号 分 子 , 最 简单 的 代谢 物 参 与 代谢 调节 的 例子 就 是 酶 的 别 构 调 节 。 它 们 可 在 不 同 水 平 作 为 调节 因子 调节 代谢 途径 , 包 括 从 基因 、 转 录 、 翻 译 和 蛋白质 水 平 。 其 中 多 数 研 究 侧 重 于 转录 后 的 调节 , 如 在 酿酒 酵母 中 碳 源 依赖 性 的 代谢 流 调节 主要 就 是 通过 转录 后 调节 实现 的 。 在 对 酸性 条 件 下 乳 杆 菌 的 生理 活动 研究 过 程 中 , 糖 酵 解 的 调节 在 代谢 物 水 平和 转录 水 平 同 样 重要 。 而 且 代 谢 水 平 的 调节 尤为 重要 , 即使 是 翻译 水 平 的 调节 也 比 转录 水 平 重 要 。 通过 多 种 细菌 的 代谢 组 学 分 析 发 现 , 在 菌 体内 的 中 心 碳 代谢 途径 中 , 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 (PEP) 是 个 重要 节点 , 对 细胞 生理 极为 重要 。 大 肠 埃 和 希 菌 在 葡萄 糖 为 碳 源 的 培养 基 中 生长 时 , 通 索 酸 烦 醇 式 丙 酮 酸 羧 激酶 对 代谢 流 的 调节 是 通过 代谢 物 PEP 和 草 酰 乙酸 浓度 的 改变 来 实现 的 。 兼 性 化 能 自 养 菌 富 氧 产 碱 菌 中 PEP 还 作为 负 调节 因子 , 调 节 中 心 碳 代谢 的 转录 过 程 。 核 苷 酸 能 够 作为 许多 酶 的 别 构 效应 剂 对 酶 活性 进行 调节 。 通 过 对 核 甘 酸 代 谢 池 的 改变 也 能 够 发 挥 代谢 调节 作用 。NAD 的 合成 过 程 中 叶 啉 酸 也 作为 别 构 效应 剂 发 挥 作用 。 谷 氨 酰 胺 作为 氮 代 谢 的 抑制 因子 和 氨 、 谷 氮 酸 作为 氮 储 量 的 信和 号 分 子 已 被 前述 , 随 着 研究 的 深入 , 许 多 过 去 认为 只 是 代谢 中 间 物 和 终 产 物 的 分 子 相继 被 发 现 具有 调节 与 自身 代谢 过 程 不 相关 的 代谢 途径 的 作用 。 除了 作为 代谢 过 程 的 调节 因子 发 挥 作用 以 外 , 许 多 代谢 物 在 基因 表达 和 信和 号 传递 过 程 中 也 发 挥 重 要 作用 。 通 过 双 组 分 磷 光 依赖 信号 转 导 系统 , 微 生物 可 对 外 界 刺激 做 出 反 应 并 调节 相应 基因 的 表达 。 大 肠 埃 和 硕 菌 中 许多 转录 调节 因子 都 有 潜在 的 小 分 子 代谢 物 的 结合 位 点 , 某 一 特定 代谢 物 浓 度 的 变化 都 能 通过 全 局 或 局 部 调节 被 激活 或 抑制 。 在 棒 杆 菌 中 转录 因子 NtcA 控制 着 氮 的 稳 态 。cu- 酮 戊 二 酸 作为 调节 因子 将 信号 传递 给 NtcA, 从 而 调节 与 氮 的 同化 有 关 的 基因 的 转录 。ArcA、ArcB 双 信 和 号 系统 是 大 肠 埃 希 菌 和 其 他 + 399 , 兼 性 厌 氧 菌 中 调节 有 和 氧 呼吸 状态 的 双 组 分 系统 , 在 刺激 生长 的 条 件 下 ,D- 乳 酸 可 作为 ArcB 激酶 的 效应 因子 发 挥 生理 作用 。 大 肠 埃 硕 菌 中 硫 同 化 途径 的 早期 代谢 产物 之 腺 苷 -5 磷 酰 硫酸 可 作为 硫 过 量 的 信号 分 子 , 抑 制 相关 同化 基因 的 转录 。 在 枯草 芽孢 杆菌 中 , 果 糖 -1,6- 二 磷酸 是 糖 酵 解 过 程 中 的 重要 信和 号 转 导 体 , 调 节 糖 酵 解 有 关 基 因 的 转录 。 最 近 几 年 , 国 际 上 又 将 由 诸多 代谢 物 通 过 不 同 催化 过 程 联 系 起 来 的 代谢 途径 的 反应 速率 和 流量 构成 的 代谢 通 量 分 析 (metabolic flux analysis, MFA) 列 为 代谢 工程 领域 内 研究 的 重要 内 容 ,MFA 的 目的 是 准确 定量 微生物 体内 所 有 代谢 途径 的 通 量 , 其 结果 是 提供 一 张 全 细胞 水 平 的 合成 和 分 解 代谢 的 流量 分 布 , 是 数量 化 和 精确 化 的 生化 网 络 。 基于 该 网 络 可 以 发 现 需要 进行 遗传 操作 的 间 位 点 , 评 价 代 谢 改 造 的 效果 和 细胞 内 的 能 量 分 布 状态 。 达 到 对 生化 网 络 中 各 途径 的 定量 分 析 , 标 记 检 测 技术 必 不 可 少 , 由 于 放射 性 核 素 在 使 用 和 保存 过 程 中 的 种 种 弊端 , 稳 定 同位 素 标记 的 底 物 的 使 用 具有 特殊 优势 , 国 际 上 , 以 2C 标记 底 物 为 基础 的 MFA 分 析 发 展 十 分 迅速 , 特 别 是 借助 NMR 和 MS 技 术 的 改进 ,3C 标记 检测 已 经 成 为 该 领域 内 的 主要 研究 手段 , 可 根据 不 同 需 要 定量 分 析 出 不 同 代谢 途径 的 绝对 通 量 〈 图 15-6)0°, 图 15-6 ” 谷 氨 酸 棒 杆 菌 在 生长 〈A) ARR 〈B) 条 件 下 同位 素 标记 代谢 通 量 分 析 示意 图 引 自 http://www. uni-siegen. de/fb11/simtec/software/13cflux/ 工业 生物 技术 中 由 于 对 产品 即 目标 代谢 物 极 为 关注 , 所 以 相关 的 技术 也 受 其 影响 发 eR RO), ARR NMR 的 无 损 检测 优势 所 以 在 微生物 代谢 组 学 研究 中 得 到 了 广泛 的 应 用 , 在 代谢 分 析 中 常用 的 核 素 包括 P、C、H 和 Na 等 。 生 物 技术 领域 , 必 C 标记 的 碳 代谢 流 分 析 已 经 广泛 用 于 指导 细胞 操作 。 过 去 几 年 中 , 工 业 微生物 中 心 碳 代 谢 通 量 分 析 已 经 被 深入 研究 , 为 了 使 以 NMR 技术 为 核心 的 碳 代谢 通 量 分 析 成 为 日 常 分 析 工 具 , 分 析 方 法 、 数 据 处 理 和 数学 模拟 都 得 到 了 极 大 发 展 。 结 合 GC. MS 等 技术 的 应 用 , 许 多 关键 酶 缺失 的 大 肠 埃 希 菌 突变 株 都 被 详细 地 分 析 , 为 代谢 网 络 结构 和 功能 的 关系 研究 。 400 。 a ie) Se ay Ce ato, ie PD 提供 了 不 可 多 得 的 资料 。NMR 代谢 组 学 分 析 技 术 已 经 分 析 了 经 过 基因 工程 改造 的 血红 素 和 核 黄 素 生 产 菌 。 对 以 酿酒 酵母 为 代表 的 真 核 生 物 的 研究 也 层出不穷 。 除 了 用 于 定量 代谢 通 量 , 许 多 工业 微生物 的 生理 功能 也 需要 利用 代谢 组 学 技术 进行 详尽 分 析 。 通 过 代 谢 工 程 改 造 和 途径 重组 进行 菌株 改良 和 次 级 代谢 改造 , 可 提供 种 类 繁多 的 化 学 品 。 近 几 年 来 , 以 工业 微生物 为 对 象 的 基因 组 学 、 和 蛋白 质 组 学 和 代谢 组 学 的 研究 非常 活跃 , 目 前 已 经 完成 或 正在 进行 的 全 基因 组 规模 测序 的 微生物 接近 400 多 种 。 随 着 高 通 量 分 离 分 析 技术 的 发 展 , 已 经 开始 具备 对 细胞 内 的 基因 、 转 录 本 、 和 蛋白 质 和 代谢 物 的 大 规模 并 行 测 定 的 能 力 , 加 之 生物 信息 学 和 化 学 生物 学 的 快速 发 展 , 从 系统 和 整体 的 水 平 观察 、 研 究 细胞 的 网 络 结构 组 成 和 动力 学 行为 已 经 成 为 可 能 , 对 生化 网 络 的 研究 已 成 为 学 科 前 沿 热 点 , 并 在 代谢 工程 领域 发 挥 了 巨大 作用 。 根 据 代谢 组 学 数据 可 以 重建 完整 的 生化 网 络 《图 15-7, 见 彩 版 ), 发 现 细胞 内 目标 产物 相关 途径 的 热力 学 可 行 性 、 代 谢 流 量 及 其 调 控 , 进 而 通过 计算 还 能 推测 理论 最 大 产 率 和 最 佳 〈 发 酵 ) 培养 、 最 优化 改造 条 件 。 图 15-7 大肠 埃 和 希 菌 的 代谢 网 络 示意 图 图 中 的 点 代表 不 同 代谢 物 , 代 谢 物 之 间 的 连 线 代表 生化 反应 途径 , 连 线 的 颜色 代表 了 反应 途径 的 通 量 大 小 ( 引 自 http://www. Ice. hut. fi/publications/annual2004/nodel8. html) 微生物 的 代谢 组 学 研究 将 为 我 们 从 多 角度 理解 微生物 的 生理 特性 与 生命 特征 提供 巨 大 帮助 。 目 前 重 构 的 大 肠 埃 希 菌 代谢 网 络 已 包括 了 931 个 生化 反应 , 对 酿酒 酵母 重 构 的 网 络 中 已 包括 1149 个 反应 。 随 着 相关 数据 的 剧 增 许 多 可 供 代 谢 分 析 使 用 的 数据 库 也 纷 纷 建立 起 来 , 其 中 日 本 的 KEGG 包含 了 至 少 5437 个 生化 反应 ;BRENDA 数据 库 中 收 录 的 代谢 物 多 达 47630 个 。 借 助 NMR, GC-MS 和 LC-MS 等 技术 , 许 多 大 肠 埃 希 菌 关 键 酶 突变 株 的 代谢 网 络 结构 与 功能 关系 被 揭示 出 来 。Price 等 25 在 2004 年 11 月 的 Na- * 401 。 ture Reviews/microbiology 上 总 结 了 最 新 的 基因 组 规模 上 重 构 的 生化 网 络 。 上 述 研究 成 果 的 积累 催生 了 利用 代谢 组 学 进行 通 量 组 〈fluxome) 的 研究 。 在 后 基因 组 时 代 , 通 过 高 通 量 技术 可 产生 描述 网 络 组 分 〈 基 因 、 和 有 蛋白质 及 代谢 物 ) 及 其 相互 作用 的 大 量 生物 数据 , 从 而 将 大 大 推动 大 规模 生化 网 络 的 构建 及 其 拓扑 结构 分 析 。 生 化 网 络 的 大 规模 分 析 可 以 揭示 细胞 的 总 体 组 织 结构 , 最 新 的 科学 研究 表明 , 在 安 观 水 平 所 观察 到 的 细胞 表 型 取决 于 构成 网 络 基础 的 共同 特征 。 随 着 系统 生物 学 的 发 展 和 大 量 细胞 内 分 子 反应 动力 学 、 热 力学 等 数据 的 获得 , 催 生 了 一 门 新 的 生物 学 分 支 一 一 计 算 生 物 学 , 它 涉及 生物 数据 的 收集 及 处 理 技术 〈 包 括 分 析 的 及 理论 的 方法 、 数 学 模型 和 计算 机 模拟 技术 ) 的 开发 , 并 将 这 些 数据 用 于 功能 发 现 和 预测 。 由 于 网 络 重 构 的 复杂 性 和 对 数据 量 的 巨大 需求 , 所 以 已 有 的 生化 网 络 研究 主要 限于 模式 生物 , 如 大 肠 埃 希 菌 及 酿酒 酵母 等 , 而 且 , 重 构 生 化 网 络 的 内 容 一 般 只 是 涉及 碳 及 能 量 的 代谢 , 对 微生物 的 蛋 白质 组 数据 利用 不 是 很 完全 , 只 能 算 作 代谢 网 络 而 非 真正 意义 上 的 生化 网 络 , 因 此 研究 工作 存在 一 定 的 片面 性 , 许 多 碳 及 能 量 的 代谢 网 络 的 研究 是 基于 细胞 的 物质 平衡 和 拟 稳 态 假设 进行 的 , 事 实 上 微生物 的 物质 代谢 是 动态 的 和 非 稳 态 的 , 所 以 基因 组 、 转 录 组 、 蛋白 质 组 、 代 谢 组 、 相 互 作用 组 及 表 型 组 等 都 应 被 列 人 生化 网 络 的 研究 对 象 。 已 有 的 生 化 网 络 的 调控 和 优化 技术 主要 侧重 于 对 微生物 代谢 途径 的 研究 和 改造 上 , 研 究 方法 单 一 , 所 得 到 的 信息 不 能 满足 于 人 们 定向 改造 微生物 的 需求 , 国 内 外 对 多 水 平生 化 网 络 的 调控 和 优化 还 处 在 摸索 阶段 。 但 这 些 模式 生物 网 络 的 研究 取得 的 重要 进展 , 为 其 他 生物 网 络 的 研究 芮 定 了 基础 。 由 于 生物 的 多 样 性 及 所 处 环境 〈 特 别 是 生物 基 化 学 品 的 工业 生 产 条 件 ) 的 不 同 , 因 而 需要 对 这 些 化 学 品 生产 菌 的 生化 网 络 的 结构 和 功能 进行 仔细 研 究 , 才 能 为 优化 及 设计 高 产 菌株 黄 定 坚实 的 基础 。 系统 生物 学 的 发 展 对 进行 大 规模 的 细胞 模拟 提出 了 要 求 , 日 本 于 1996 年 提出 了 E- CELL 计划 , 并 专门 组 建 了 由 代谢 组 、 生 物 信息 学 和 基因 工程 3 个 中 心 组 成 的 研究 机 构 , 这 一 国际 性 研究 机 构 的 目标 是 基于 高 通 量 的 代谢 组 学 分 析 数 据 构 建 全 细胞 水 平 的 生 化 模型 , 达 到 利用 计算 机 设计 新 型 细胞 的 目的 。 美 国 推出 了 V-CELL 计划 , 能 源 部 计 划 开 发 出 计算 机 虚拟 微生物 , 供 研究 使 用 。 为 了 准确 描述 基因 和 生化 代谢 网 络 , 许 多 研 究 机 构 相 继 推出 了 一 些 应 用 软件 , 如 Systems Biology Workbench 和 Systems Biology Markup Language, 目 前 的 开发 焦点 已 经 涉及 具体 生化 反应 过 程 的 模拟 。 总 的 来 看 , 为 适应 工业 生物 技术 发 展 的 需要 , 细 胞 代谢 研究 已 经 从 以 往 的 静态 研究 过 渡 到 动态 研究 , 从 活体 实验 研究 发 展 到 计算 机 虚拟 模拟 。 15.4 代谢 组 学 在 医学 微生物 学 中 的 应 用 微生物 与 人 体 之 间 有 着 相互 依赖 的 关系 , 如 肠 道 内 的 大 肠 埃 和 希 菌 既 能 产生 对 人 体 有 益 的 物质 〈 维 生 素 等 ) 又 可 以 通过 易 位 导致 感染 。 肠 道 菌 群 对 宿主 的 代谢 过 程 也 会 产生 重要 影响 并 在 其 栖 生 部 位 发 挥 着 各 种 生理 作用 , 包 括 免疫 防御 、 肠 道 微 生 态 平衡 的 建 立 、 消 化 食物 中 未 被 分 解 的 食物 纤维 及 分 解 各 种 蛋白 质 和 肽 类 。 发 现 微生物 在 宿主 体内 的 定植 能 力 、 微 生物 如 何 逃 避 宿 主 的 免疫 防御 机 制 并 能 在 其 中 增殖 和 导致 功能 损害 对 解 释 微生物 的 致 病 性 十 分 重要 。 以 铜绿 假 单 胞 菌 为 例 的 许多 音 兰 氏 阴 性 菌 的 毒 力 基 因 并 不 。 402 。 是 组 成 型 表达 , 而 是 受 控 于 菌 体 数目 即 群 体感 应 〈quorum sensing, QS) 的 一 种 机 制 。 相关 的 信和 号 机 制 和 调控 机 制 目前 还 未 完全 明了 。 由 于 该 机 制 中 的 主要 作用 分 子 为 小 分 子 代谢 物 所 以 代谢 组 学 研究 无 疑 要 优 于 蛋白 质 组 和 转录 组 研究 。 目 前 许多 革 兰 氏 阳 性 和 阴 性 菌 中 的 QS 作用 分 子 已 经 得 到 鉴定 , 许 多 为 氨基 酸 、 小 肽 及 脂肪 酸 衍生 物 , 特 别 是 乙 酰 同型 丝氨酸 内 酯 (AHL), 目 前 已 经 在 海藻 中 发 现 了 其 抑制 物 , 这 种 贞 代 哮 喃 类 化 合 物 能 够 抑制 细菌 间 的 QS 识别 。 作 为 革 兰 氏 阴 性 菌 的 外 膜 的 主要 成 分 之 一 的 肽 聚 糖 (LPS) 是 抵抗 抗生素 和 去 污 剂 作用 的 主要 成 分 , 它 的 合成 影响 细菌 的 生理 , 而 且 也 是 诸多 抗生素 和 抗 细菌 药物 作用 和 开发 的 靶 位 点 。 代 谢 组 学 同样 能 够 帮助 理解 LPS 的 合 成 和 调节 。 许 多 病原 菌 与 宿主 的 相互 作用 研究 表明 细菌 具有 干扰 宿主 分 泌 途 径 的 复杂 机 制 , 代 谢 组 学 是 一 个 极 有 价值 的 手段 。 晴 样 芽孢 杆菌 是 一 种 机 会 致 病菌 , 通 常 能 够 引起 胃 肠 炎 、 脑 膜 炎 或 败血症 。Bundy 等 人 69 通过 研究 发 现 , 利 用 代谢 组 学 分 析 可 以 实现 致 病 株 与 非 致 病 株 的 区 分 。 他 们 选 FES 3 株 非 致 病 株 和 3 株 致 病 株 , 通 过 对 11 个 致 病 基 因 的 比较 发 现 有 7 种 基因 在 两 组 . 中 都 能 检 出 并 且 经 统计 学 区 分 无 明显 差异 ; 通过 对 生长 速率 的 比较 也 无 法 将 两 组 分 开 。 但 是 当 利 用 400MHz ‘H-NMR 对 细胞 内 的 代谢 物 分 析 , 然 后 经 多 变量 分 析 后 发 现 致 病 株 与 非 致 病 株 能 够 得 到 很 好 区 分 〈 图 15-8) 。 这 种 区 分 效果 的 达到 并 不 需要 解析 多 种 化 合 物 , 事 实 上 作者 仅仅 利用 了 在 NMR 谱 中 30 几 个 代谢 物 峰 。 相 对 于 基因 组 学 、 有 蛋白 质 组 学 和 转录 组 学 的 比 对 而 言 , 代 谢 组 学 在 解决 这 类 问题 时 显然 要 经 济 有 效 许多 , 而 且 不 需要 太 多 的 背景 资料 的 支持 。 利 用 NMR 技术 分 析 微 生物 的 代谢 过 程 对 人 类 健康 也 有 极 大 的 用 处 , 既 可 用 来 进行 基础 研究 也 可 用 来 进行 药物 和 食品 在 人 体内 的 代谢 研究 。 利 FA? P ASC 对 引起 人 类 胃 肠 炎 的 邻 单 胞 菌 的 研究 证 实 , 该 菌 在 甘露 糖 存 在 下 生长 不 利 主 成 分 〈1) 主 成 分 (2) 图 15-8 SESE BUR (CSOtRa) 与 非 致 病 株 〈 空 心 标志 ) 的 区 分 5 。 403 。 并 不 是 因为 能 量 耗 尽 所 致 , 而 是 因为 甘露 糖 的 代谢 产物 甘露 糖 -6- 磷 酸 对 该 菌 的 毒性 作 用 所 致 , 即 该 菌 对 甘露 糖 的 代谢 不 是 十 分 完善 P 。 结核 分 枝 杆菌 的 感染 在 全 球 又 有 草 延 之 势 ,Mougous 等 59 利用 遗传 手段 结合 质谱 技术 成 功 对 结核 分 枝 杆 菌 和 耻 垢 分 枝 杆菌 的 细胞 内 S 代谢 进行 了 分 析 。 他 们 首先 将 结核 分 枝 杆菌 培养 在 含 :SOF 的 培养 基 上 , 然 后 对 细胞 内 的 含 硫化 合 物 进行 MS 分 析 ; 随后 他 们 又 用 了 一 株 S 营养 缺陷 型 的 耻 垢 分 枝 杆菌 培养 在 含 2S 的 蛋氨酸 培养 基 中 , 因 为 该 菌 的 硫 还 原 途 径 的 一 个 基因 被 删除 , 所 以 大 量 的 含 还 原 硫 的 化 合 物 的 硫 来 源 只 能 是 从 培 养 基 中 获得 , 利 用 MS 比较 两 者 的 硫 代谢 物 的 差异 就 能 判断 硫 还 原 代谢 谱 的 全 狐 。 据 此 , 作 者 发 现 了 至 少 7 种 新 的 含 还 原 硫 的 代谢 物 。 由 于 通过 遗传 操作 技术 获取 营养 缺陷 型 比较 容易 , 所 以 作者 认为 这 是 一 种 实用 的 进行 代谢 途径 研究 的 手段 。 在 药物 代谢 研究 领域 , 微 生物 可 以 作为 真 核 细 胞 的 替代 物 用 来 进行 药物 代谢 研究 , 因为 大 多 数 的 解毒 酶 类 在 原核 和 真 核 细胞 中 都 有 着 极为 相似 的 作用 。 虽 然 目前 为 止 只 有 1F-NMR 的 研究 报道 , 但 多 数 人 认为 IH-NMR 在 将 来 的 药 代 动 力学 研究 中 会 发 挥 越 来 越 大 的 作用 。 因 为 人 和 动物 体内 的 联 元 素 含量 是 十 分 丰富 的 。 另 外 利用 NMR 分 析 了 解 人 类 肠 道内 的 正常 菌 群 的 代谢 作用 也 是 代谢 组 学 应 用 较 有 效 的 领域 之 一 。 人 结肠 内 栖 生 有 超过 人 体 细胞 数 倍 的 大 量 微生物 , 据 估计 成 人 每 克 新 鲜 妆 便 中 含有 102 ~10" CFU 的 细菌 , 其 中 主要 为 厌 氧 菌 。 利 用 ?2C-NMR 分 析 ,Wolin57 等 发 现 , 给 予 药物 和 非 药 物 处 理 前 后 , 肠 道 菌 的 代谢 途径 会 发 生 明 显 的 变化 。 通 过 考察 人 、 动 物体 内 的 微 生 物 的 代谢 变化 , 也 可 以 用 来 评价 食品 安全 和 营养 状态 。 守 糖 和 多 糖 常 被 用 来 当 作 益生 素 使 用 , 其 在 体内 的 代谢 过 程 需要 肠 道 微生物 的 参与 , 通 过 对 动物 体内 的 共生 菌 的 糖 代谢 研究 可 以 发 现 糖 类 的 水 解 酶 特点 。 通 过 跟踪 葡萄 糖 的 C4 信号 , 还 能 了 解 结晶 和 无 定形 纤维 素 在 动物 体内 的 代谢 差异 09 。 有 人 利用 !H-NMR 研究 肠 道 内 微生物 对 一 种 芥 类 植 物 的 抗 结肠 癌 组 分 的 代谢 情况 , 并 以 此 来 证 实 该 组 分 的 抗 瘤 功效。 还 有 人 利用 ?”C- NMR 分 析 母 乳 喂 养 的 婴儿 胃 肠 道内 的 双 歧 杆菌 的 代谢 作用 , 评 价 母乳 喂养 效果 D9?'20 。 通过 对 腹泻 患者 便 中 化 合 物 成 分 的 GC-MS 代谢 组 学 定量 分 析 , 不 同 病 原 感 染 也 能 得 到 相对 准确 的 判断 〈 图 15-9) , 呐 喃 类 化 合 物 增 加 伴 叫 吕 类 化 合 物 缺 失 提示 难 辩 梭 菌 感 染 ; 十 二 烷 酸 酯 类 化 合 物 的 出 现 提 示 轮 状 病毒 感染 , 十 二 烷 酸 酯 类 化 合 物 缺 失 伴 胺 类 化 合 物 增加 提示 其 他 肠 道 病毒 感染 ;弯曲 菌 属 感染 则 伴随 着 莫 类 化 合 物 和 烃 类 化 合 物 的 缺 an), LC-MS 分 析 也 能 达到 同样 效果 , 如 感染 性 腹泻 和 非 感染 性 腹泻 及 不 同 病 原 菌 引 起 的 感染 都 能 很 好 地 得 到 区 分 〈 图 15-10) 。 最 近 的 研究 还 表明 肠 道 微 生物 的 代谢 作用 还 会 影响 到 药物 的 毒性 , 这 种 影响 主要 来 自 于 不 同人 群 的 肠 道 微 生 态 结构 和 菌 群 的 组 成 不 同 。 心 血管 系统 疾病 的 常用 药物 地 高 辛 在 36%% 的 北美 人 群 中 被 肠 道 菌 代谢 成 还 原型 产物 , 而 南美 印第安 人 群 中 只 有 14%% 左 右 的 人 群 中 可 发 现 还 原型 的 代谢 产物 CE 。 目 前 的 代谢 组 学 研究 认为 肠 道 菌 群 与 宿主 细胞 之 间 的 共 代谢 作用 在 药理 、 毒 理 、 营 养 和 健康 方面 的 关系 仍然 需要 进行 深入 剖析 。 细菌 的 耐 药 问题 是 一 个 世界 性 的 问题 , 目 前 许多 细菌 在 强大 的 抗生素 压力 作用 下 , 已 经 具备 了 同时 耐 多 种 抗生素 的 能 力 , 称 为 多 耐 药 性 , 其 中 细菌 的 流出 泵 机 制 是 导致 许 多 阳离子 抗生素 被 细菌 排出 体外 而 导致 抗生素 治疗 失败 的 主要 原因 , 通 过 代谢 组 学 研 究 , 曾 述 细 菌 的 与 耐 药 有 关 的 代谢 过 程 对 新 药 的 开发 和 新 的 驾 位 点 的 确定 都 是 十 分 必要 。 404 。 5 500 000 5 000 000 4 500 000 4 000 000 3 500 000 #X% 3 000 000 2 500 000 2.000 000 18.31 Peak D 14.64 Peak B 11.07 Peak A 16.91 Peak C 22.13 Peak E 23.62 Peak F 1 500 000 1 000 000 500 000 P 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 时 间 B jealew Os) ays 4 oa 3 SAA om 400 000 5 | gue eke 7 oo | ae ew 2 bao || aco 300 000 ea ie is x a ++ 200 000 a a a 25 ~ CN 100 000 - | 0 PE ADSF Th JM 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 时 间 图 15-9 TER ASSE CA). AER RR AEE (CB) 的 GC-MS 图 谱 GET AY DT A UE PR BRE BSE PE AL EH I S| RA » 特异 病原 菌 检测 阳性 © 副 溶 血 弧 菌 感 染 。 特 异 病原 菌 检 测 阴性 o MR ER RH 图 15-10 ”针对 不 同感 染 类 型 和 感染 病原 的 北 便 样本 的 UFLC-IT-TOF/MS 检测 结果 的 PCA 分 析 的 , -相关 的 研究 正在 展开 。 新 型 抗生素 的 筛选 和 开发 中 , 抗 生 素 作用 机 制 的 鉴定 十 分 必 要 , 依 据 作 用 于 同一 靶 点 的 抗生素 应 导致 微生物 出 现 类 似 的 代谢 变化 的 原理 , 已 经 有 人 * 405 。 通过 代谢 组 学 分 析 预 测 具 有 抗 细菌 和 抗 真菌 作用 的 化 合 物 的 作用 靶 点 , 甚 至 抗菌 药物 之 间 的 协同 作用 也 可 通过 微生物 中 心 碳 代谢 途径 的 主要 中 间 代 谢 物 的 代谢 组 学 分 析 被 揭示 出 来 所 ' 国 。 代 谢 组 学 技术 很 可 能 在 未 来 抗生素 的 研发 领域 进一步 发 挥 作 用 。 15.5 代谢 组 学 在 环境 微生物 学 中 的 应 用 近 几 十 年 来 , 随 着 化 学 和 材料 合成 工业 的 快速 发 展 , 出 现 了 大 量 的 人 工 合成 化 合 物 , 尤 其 是 各 种 工业 废水 , 含 有 大 量 的 有 毒 有 害 物 质 , 如 各 种 芳香 族 化 合 物 、 氨 、 氮 、 氰 化 物 、 硫 化 物 等 。 其 中 很 多 污染 物 具 有 复杂 芳 环 或 杂 环 结构 , 人 性 质 比 较 稳 定 , 难 于 降 解 , 特 别 是 芳香 环 和 杂 环 类 的 化 合 物 , 其 中 很 多 是 自然 界 本 不 存在 的 异 生 质 〈xenobi- otics), 在 土壤 或 水 体 中 富 集 后 形成 严重 的 环境 问题 。 目 前 已 知 的 有 机 物种 类 约 700 万 种 之 多 , 其 中 人 工 合成 的 有 机 物种 类 达 十 万 种 以 上 , 且 以 每 年 2000 种 的 速度 递增 。 微 生物 法 处 理 具有 处 理 效率 高 、 极 少 产 生 二 次 污染 、 运 行 与 操作 管理 方便 上 且 费 用 较 低 等 优 点 , 因 而 在 各 类 工业 排放 污染 物 的 处 理 中 占 主导 地 位 。 然 而 , 尽 管 微生物 处 理 法 正在 环 境 污染 物 的 处 理 中 发 挥 着 重要 的 作用 , 但 由 于 大 量 种 类 繁多 的 难 降 解 污染 物 , 单 个 微 生 物 缺 乏 现成 完整 的 代谢 途径 来 彻底 分 解 它 们 , 因 而 往往 导致 对 污染 物 的 去 除 效 果 不 理 想 。 长 期 以 来 , 微 生物 降解 作用 的 研究 多 数 是 通过 富 集 培 养 技术 得 到 的 。 但 是 , 大 部 分 环境 中 微生物 的 可 培养 性 都 很 低 , 许 多 研究 表明 , 能 够 在 人 工 培养 条 件 下 生长 的 微生物 种 类 可 能 只 占 自然 界 总 种 类 数量 的 1% 左 右 。 同 时 , 同 一 个 种 内 的 不 同 菌株 之 间 的 基因 组 序列 可 以 有 高 达 20% 以 上 的 序列 差异 , 使 得 不 同 菌株 的 生理 代谢 能 力 可 以 有 很 大 的 不 同 , 即 使 像 大 肠 埃 希 菌 这 样 研究 比较 深入 的 且 易 于 培养 的 微生物 , 也 表现 出 很 高 的 多 样 性 , 另 外 , 在 自然 条 件 下 占 优势 的 降解 菌 在 人 工 培养 筛选 时 也 不 一 定 具 有 竞争 优势 , 因此 仅 研 究 一些 单 个 的 微生物 菌株 难以 全 面 认识 这 些 种 的 代谢 能 力 , 不 利于 全 面 发 挥 微 生物 在 环境 治理 中 的 作用 。 研 究 表明 一 种 污染 物 的 分 解 往往 并 非 由 单一 种 微生物 独立 完 成 , 污 染 物 降解 过 程 所 需 的 基因 由 不 同 的 微生物 提供 或 在 多 种 微生物 内 存在 有 不 同 的 或 有 交叉 的 代谢 途径 。 仅 研究 纯 菌 单独 的 降解 作用 , 实 际 上 既 忽 略 了 其 他 的 可 能 更 重要 的 代谢 途径 , 也 忽略 了 环境 中 微生物 间 的 代谢 协同 作用 。 自然 微生物 群落 是 一 个 有 机 的 统一 体 , 它 的 微生物 种 群 多 样 性 和 物质 代谢 等 都 决定 于 群落 内 所 有 微生物 细胞 DNA 组 成 的 元 基因 组 , 并 受 环境 因素 的 调控 ;群落 内 的 内 部 过 程 和 表 观 功能 是 元 基因 组 控制 下 所 有 微生物 细胞 协同 作用 的 结果 , 它 们 构成 代谢 网 络 , 而 且 该 网 络 是 路 基因 组 的 网 络 。 这 些微 生物 通过 分 解 有 机 污染 物 共 享 碳 源 或 通过 共 代谢 作用 提供 特定 分 解 阶 段 的 基因 , 所 有 的 相关 微生物 及 其 分 解 作 用 构成 了 特定 污染 物 的 代谢 网 络 。 由 于 工业 污染 物 是 异 生 质 , 这 些 新 出 现在 自然 界 的 化 合 物 , 大 多 都 无 相应 具备 完整 代谢 途径 的 单个 微生物 可 以 完全 分 解 它 , 因 此 必须 依靠 群落 内 多 种 微生物 的 相 互 协作 , 共 同 组 成 一 个 完整 的 分 解 代谢 网 络 。 代 谢 组 学 的 另 一 重要 应 用 领域 就 是 环境 微 生物 学 , 目 前 的 研究 热点 是 利用 群落 微生物 即 通过 元 基因 组 模式 进行 生物 降解 和 生物 治 理 。 某 些微 生物 在 漫长 的 进化 过 程 中 可 能 拥有 了 能 够 将 外 源 异 生 质 通过 化 学 转化 过 程 使 之 进入 其 中 心 代谢 途 径 的 能 力 , 这 对 环境 保护 来 说 很 有 应 用 价值 。 例 如 , 红 球菌 属 细菌 就 有 很 强 的 代谢 能 力 , 它 们 拥有 巨大 的 线形 质粒 , 能 够 进行 多 种 脱硫 反应 和 省 类 化 合 物 。406 。 < IPA 转化 反应 , 通 过 进一步 的 代谢 组 学 分 析 有 望 将 来 把 该 菌 改 造成 有 效 的 环境 污染 治理 菌 。 代谢 组 学 研究 不 仅 有 助 于 理解 微生物 体内 的 代谢 网 络 , 而 且 有 助 于 帮助 我 们 了 解 化 合 物 的 转化 过 程 , 这 对 于 构建 系统 的 异 生 质 微生物 降解 网 络 十 分 有 益 [55'20 。 目 前 对 微生物 降解 有 机 污染 物 的 研究 大 部 分 局 限于 水 体 , 仅 少数 研究 是 针对 土壤 微生物 , 但 总 体 上 , 此 类 研究 都 是 针对 实验 样品 而 不 是 实际 样品 。 虽 然 3P 和 ?#F 的 自然 丰 度 为 100%, 但 污 染 物 中 含 上 述 两 种 核 素 的 很 少 , 所 以 仅 有 的 依靠 H-NMR 的 研究 也 不 多 见 。 目 前 常用 的 研究 策略 是 让 微生物 在 含有 异 生 质 的 培养 基 中 生长 , 然 后 对 培养 基 中 的 代谢 物 成 分 变 化 进行 研究 , 当 有 新 化 合 物 出 现 而 需要 鉴定 时 再 辅 以 其 他 技术 。 除 了 生物 降解 上 的 应 用 以 外 , 也 有 利用 代谢 组 学 策略 进行 有 机 污染 物 与 土壤 内 的 其 他 化 合 物 在 微生物 酶 作用 下 WE ROIS. FA N-NMR 的 相对 低 敏 感性 , 所 以 样品 使 用 的 是 5N AS C 浓缩 异 生 质 。 由 于 上 述 限 制 , 目 前 相关 研究 主要 集中 在 < N-TNT、C-CH3Br、C-PAHs、C- AFF EE ALS C- 阿 特 拉 津 的 研究 。 由 于 标记 位 点 只 有 一 个 所 以 峰 谱 解释 比较 困难 , 只 能 给 出 部 分 结构 信息 。Knicker 最 近 采 用 了 一 种 新 的 技术 集合 5 N-TNT 和 2" C 标记 , 以 及 5N-3C 双 交叉 极 化 魔 角 旋 转 〈double cross polarization magic angle spinning) 技术 , 克服 了 上 述 问 题 , 但 灵敏 度 仍 不 是 很 高 , 而 且 有 时 分 析 时 间 长 达 48ht2] 。 不 过 !H-MAS NMR 技术 还 是 有 优势 用 于 含 自然 污染 物 浓 度 的 实际 样品 分 析 , 特 别 是 水 解 样 品 , 因 为 这 些 样品 接近 自然 状态 能 反映 实际 污染 物 情况 2 (A 15-11) 。 24 ET 28h [| Th Be conve ene Sh were | Wwwreevrrewvyurearrrtreerrimrrvetvynjiwrenvwvvnnananrvvsrawyrovrvevvwvrvvorerre 图 15-11 谷 氨 酸 棒 杆 菌 以 果糖 为 碳 源 时 对 杀 虫 剂 1059 的 分 解 作 用 的 2 P-NMR 谱 52] 15.6 展望 虽然 代谢 组 学 的 优势 显而易见 , 但 是 它 仍然 面临 着 许多 问题 。 最 大 的 挑战 是 , 生 命 科学 家 从 没 系 统 地 接受 过 如 何 全 面 系统 地 处 理 如 此 庞大 的 数据 。 从 生理 学 家 角度 看 , 还 有 一 个 问题 需要 解决 , 就 是 数据 解释 的 问题 。 由 于 基因 组 数据 与 代谢 组 数据 不 存在 直接 联系 , 这 就 牵涉 到 如 何 判断 一 个 经 代谢 组 分 析 发 现 能 降解 或 合成 某 代 谢 物 的 基因 就 是 应 被 敲 除 或 过 表达 的 基因 。 就 代谢 组 学 分 析 技 术 而 言 , 挑 战 仍 很 多 , 许 多 代谢 物 〈 如 信和 号 分 子 ) 通常 浓度 很 低 。 现 有 分 析 手 段 的 灵敏 度 和 动态 检测 范围 对 全 组 分 分 析 仍 有 不 足 。 细胞 内 代谢 物 的 绝对 量 十 分 微小 , 肠 杆菌 科 细 菌 中 , 代 谢 物 的 量 仅 占 细胞 干 重 的 3% ~ 5% 大 肠 埃 希 菌 中 85 儿 的 代谢 物 相 对 分 子 质量 小 于 500。 基 因 组 学 由 于 有 PCR 技术 的 辅助 仅 需要 极 少 量 的 标本 《〈 有 时 几 个 细胞 ) 就 能 满足 分 析 需 要 , 由 于 细胞 干 重 的 近 70% 左 右 为 蛋白 质 , 所 以 蛋白 质 组 学 分 析 通 常 也 极 少 受到 样品 量 的 限制 , 代 谢 组 学 尤其 是 微生物 代谢 组 学 分 析 则 面临 着 如 何 有 效 富 集 样 品 而 不 引入 实验 误差 的 巨大 挑战 , 相 应 * 407 。 地 , 其 他 面临 的 问题 还 有 中 现成 的 商品 化 的 自动 处 理 GC-MS 和 LC-MS 的 数据 的 软件 RE; @ 商 品 化 的 LC-MS 谱 参 考 数据 库 没 有 ; G@GC-MS 参考 数据 库 不 够 完善 。 另 外 商 品 化 的 代谢 物 标准 品 不 多 。 由 于 多 数 代谢 物 以 极 低 的 浓度 ORE) 存在 于 复杂 体系 中 , 需要 分 析 方 法 不 断 地 改进 。 代谢 组 学 发 展 仍 处 于 初始 阶段 , 在 微生物 学 领域 , 代谢 组 学 并 不 光 指 指 全 组 分 分 析 (真正 的 全 组 分 微生物 代谢 分 析 报 道 较 少 , 代 谢 轮 廓 或 靶 标 分 析 相 对 较 多 和 和 较 成 熟 '20) , 还 用 于 动态 的 代谢 流 分 析 。 代 谢 组 学 对 细胞 功能 的 理解 力 是 强大 的 , 但 是 对 细胞 瞬时 代谢 状态 的 反映 仍 较 困难 , 由 于 分 析 技 术 的 复杂 性 因此 真正 实现 对 代谢 物 的 非 歧视 性 检测 尚 需 时 日 。 未 来 几 十 年 , 代 谢 组 学 在 工业 生物 技术 中 的 应 用 还 将 扩大 , 并 取 代 原 有 的 经 验 式 的 代谢 工程 改造 指导 思想 。 除 了 使 代谢 工程 改造 更 有 目的 性 和 效率 以 外 还 能 通过 代谢 组 学 研究 发 现 细胞 新 的 功能 。 在 疾病 和 健康 、 环 境 保 护 领 域内 的 研究 也 在 不 断 扩 大 , 这 就 不 仅 要求 微 生物 学 家 要 有 全 面 思想 , 同 时 要 求 他 们 能 广泛 地 与 分 析 化 学 家 、 统 计 学 家 和 信息 学 家 等 其 他 领域 的 专家 密切 合作 , 探 询 最 佳 解决 方案 。 参考 文献 [1] Oldiges M, lutz S, Pflug S, Schroer K, Stein N,Wiendahl C. 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NMR 进行 了 多 组 分 尿 样 分 析 , 发 现在 注射 CdCl, 后 4. 5h 内 大 鼠 尿 液 中 的 柠檬 酸 盐 、u- 酮 成 二 酸 及 琥珀 酸 含量 都 有 了 明显 降低 , 连 续 注射 4 天 后 成 年 雄 鼠 出 现 了 肾 小 管 酸 中 毒 现 象 。 作 者 同时 还 对 上 述 大 鼠 进 行 了 肾 组 织 学 及 尿 中 肌 酝 测定 。 结 果 提 示 代 谢 组 学 方法 在 有 环境 毒素 及 机 体 功 能 紊乱 的 生物 标志 物 发 现 图 16-1 大 鼠 血 浆 的 !H NMR if) A. 食物 未 被 CAC 污染 ; B, 食物 中 含有 CaCl (40 方面 具有 很 大 光 力 。 ppm)。1: VLDL ( 极 低 密度 脂 蛋白 ) 和 LDL( 低 密度 Griffin 等 55 进一步 拓展 了 这 方面 的 研 脂 蛋白 ) 的 CHs 脂 基 团 ;2, 亮 氨 酸 ` 绵 氨 酸 、 蛋 亮 氨 酸 究 , 他 们 对 高 低 两 个 剂量 CdCl: 的 慢性 生化 效 eee ee: 丙肝 0 二 CC 有 应 进行 代谢 组 分 析 , 通 过 分 析 鼠 尿 、 血 浆 脂 共 振 和 糖 蛋 白 ;8: 甲 硫 氨 酸 ;9: [Ca-EDTA]?- ( 乙 (图 16-1、 图 16-2) 和 组 织 的 改变 , 证 明了 TceEDTAYP( 乙 配 其 质子))12 WM ETAT A 急 、 慢 性 作用 的 生理 机 制 不 同 , 并 建立 了 环 [Me EDTA) (乙酸 基质 子 );13: 游离 的 EDTA” ; 境 污染 对 生物 体 影响 的 非 人 侵 检测 方式 和 毒 让 民生 和 生生 于 和 物 安全 评价 方法 。 Lafaye 等 雪 应 用 高 效 液 相 色谱 串联 电 喷 雾 离子 阱 质谱 分 析 重 金属 毒物 对 大 鼠 的 慢 性 毒性 影响 。 由 于 电 喷 雾 电 离 源 给 出 相对 少 的 化 合 物 结构 信息 , 并 且 目 前 尚未 有 大 型 的 电 喷 雾 CID (collision induced dissociation) 数据 库 , 无 法 进行 化 合 物 辨 认 , 所 以 他 们 进行 基于 碰撞 诱导 解 离 的 MS/MS 实验 , 然 后 搜 索 化 学 或 代谢 物 数 据 库 , 结 合 保留 时 间 和 CID 谱 图 (Al 16-3) RAE RAR. RE. TAREE. 葡萄 糖苷 、 配 糖 类 等 几 大 类 化 学 成 分 , 从 而 解决 了 代谢 组 学 中 海量 数据 的 分 析 与 识别 的 问题 , 并 检测 到 了 几 十 种 质 荷 比 的 物质 有 明显 变化 , 为 可 “PC | 能 的 生物 标志 物 。 图 16-2 连续 94 天 CdCl: 暴露 后 的 大 鼠 尽管 代谢 组 学 方法 在 对 野生 动物 环境 毒物 暴 血浆 轮廓 的 中 心 化 分 析 结果 轨 。 。 露 的 代谢 反应 研究 方面 具有 巨大 潜力 , 野 生动 物 对 各 种 农用 肥料 、 杀 虫 剂 及 其 他 环境 污染 物 也 具 rs 4042 M1 068 F: + pd Fullms2 376,98 @ 25,00 [90,00-765,00] 100 243,1 90 377 1 AT; 38,00 - 43,00 $M: 70 100 100 MAI NL: 59254 90 90 80 80 243,1 B 70 4 60 70 #50 60 gg 40 ca 30 Ht 50 20 z 0 40 ; 38° (39: 40 1) AY Yadav eee 30 时 间 /min 20 394,2 = My sa 498,0 10 33 mrad M7, 39 iP 443,7 45,6 at 0 ! : 200 250 300 350 400 450 mlz 图 16-3 BUR PRR RH LC-MS ig”! A, 内 标 化 合 物 〈10pg/mlD);,B, 尿 样 中 核 黄 素 ; 图 中 图 为 EIC 图 有 很 高 的 暴露 风险 外, 但 到 目前 为 止 , 这 个 方面 的 研究 仍然 很 少 。Griffin 等 四 研究 了 在 欧洲 普遍 出 现 的 小 型 野生 哺乳 动物 的 基本 代谢 状况 及 环境 中 重金 属 污染 物 对 其 代谢 的 影响 , 测 定 了 其 尿 、 肾 、 肝 等 组 织 的 代谢 物 谱 , 并 将 野生 鼠 与 实验 室 大 鼠 模型 的 代谢 状 况 进 行 了 对 比 。 结 果 表 明 , 沙 滩 野 鼠 和 大 鼠 模 型 的 代谢 谱 之 间 存 在 显著 性 差异 , 在 沙滩 * 412 » 野 鼠 的 尿 中 发 现 了 更 多 的 芳香 族 氨 基 酸 类 化 合 物 及 酚 类 化 合 物 〈 图 16-4) 。 一 个 可 能 的 解释 是 这 些 酚 类 化 合 物 是 由 沙滩 野 鼠 独特 的 肠 道 微 生物 菌 群 产 生 的 "" , 类 似 于 鼠 尿 中 马 尿酸 盐 的 产生 方式 , 由 沙滩 野 鼠 的 肠 道 菌 群 产 生 的 这 些 酚 类 化 合 物 可 有 助 于 其 特异 性 地 消化 体内 所 摄 人 的 植物 类 食物 。 沙滩 野 鼠 Factor 2 Factor 2 Factor 1 Factor 1 图 16-4 UO ETE. AR RAISC IR SE ARR FEA 600MHz :H NMR 谱 图 (A)5 AYER BL. AK 鼠 和 实验 室 大 鼠 尿 样 的 PCA 图 CB) 沙滩 野 鼠 尿 中 含 多 种 芳香 族 氨基 酸 类 化 合 物 , 大 鼠 尿 样 中 马 尿 酸 盐 含量 较 高 . 左 侧 scores 图 为 实验 室 大 鼠 和 两 种 野 鼠 的 区 分 结果 ( 马 尿酸 盐 含量 有 差异 ); 右 侧 为 沙滩 野 鼠 和 木 鼠 的 区 分 结果 . A: 乳酸 盐 ; B: ABR; C: 乙酸 盐 ; D: 谷 氨 酸 盐 ; E: MAME; F: RRMA; G: MA: 也 : MAR; I: 三 甲 基 胺 氧化 物 (TMAO); J: 含 葡萄 糖 及 其 他 糖 的 区 域 ; K: RA; L: MAR; M: BAB; N: 马 尿 酸 盐 ; O: 尿酸 盐 ; P: 葵 丙 氨 酸 ; by: WHER; wm: AM 另外 , 研 究 还 发 现 , 相 对 于 实验 室 大 鼠 模 型 , 所 有 被 测 野生 鼠 类 的 肾 胜 和 肝脏 组 织 脂 含量 都 呈 显 著 性 增高 , 其 中 木 鼠 的 肝 肾 组 织 脂 含量 尤其 高 〈 图 16-5), 这 提示 上 述 物 种 受 亲 脂性 环境 污染 物 影 响 的 风险 更 高 。Griffin 还 研究 了 环境 中 砷 类 化 合 物 对 中 齿 类 动物 毒性 作用 的 影响 ,As: O: 作 用 14 天 后 解剖 发 现 , 沙 滩 野 鼠 组织 损 伤 , 同 时 MAS NMR 波谱 反映 出 脂 类 物质 异常 。 他 们 首次 在 毒 理 研究 中 应 用 MAS :再 扩散 权重 弥散 加 ° 413 « PURSE KNAUMD BASE AA, FFA As 造成 的 肾 组 织 损伤 存在 种 属 间 差 异 。 上 述 研究 均 是 采用 代谢 组 学 的 方法 来 完成 的 , 若 是 采用 转录 组 学 及 蛋白 质 组 学 的 手段 , 由 于 相关 动物 基因 序列 及 和 蛋 昌 质 结构 差异 的 缺乏 , 将 很 难 进行 。 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm 4.0 3.0 2.0 1.4 ppm 4.0 3.0 2.0 10 ppm 图 16-5 ”实验 动物 肾脏 外 皮 组 织 的 : H MAS NMR if? A. SWEAR; B WHER: C. RR: D. AR. 与 实验 室 大 鼠 相 比 , 野 生 鼠 类 体内 甘油 三 酸 酯 含量 增高 16.2.2 ”环境 中 有 机 污染 物 对 销 椎 动物 的 毒性 作用 研究 除 重 金属 外 , 环 境 污 染 物 还 包括 多 种 有 机 化 合 物 , 如 农药 DDT、 多 和 氯 联 茶 、 多 环 芳烃 、 二 咀 英 、 聚 葵 乙 烯 、 邻 苯 二 甲酸 酥 类 等 。 采 用 代谢 组 学 方法 对 环境 中 有 机 污染 物 的 毒性 作用 研究 已 逐渐 成 为 环境 科学 领域 的 热点 问题 之 一 。 以 多 环 芳烃 化 合 物 〈polycyclic aromatic hydrocarbon, PAH) 为 例 。PAH 是 指 由 两 个 或 两 个 以 上 葵 环 以 线 状 、 角 状 或 复 状 排列 的 中 性 或 非 极 性 碳 氢化 合 物 00 , 主 要 来 自 于 碳 氧 化合物 的 不 充分 燃烧 , 在 大 气 、 水 体 和 土壤 中 广泛 存在 。 由 于 PAH RAG 性 、 致 癌 性 、 致 畸 性 、 致 突变 性 和 生物 难 降解 性 , 因 此 多 环 芳烃 被 看 作 是 持久 性 有 机 污 染 物 的 主要 代表 0223] 。 目 前 , 多 环 芳烃 的 毒 理 学 研究 是 环境 科学 领域 的 热点 问题 之 一 , 研究 主要 集中 在 多 环 芳烃 及 其 在 环境 中 的 降解 和 转化 产物 在 体内 的 吸收 、 分 布 、 排 泄 和 。414 。 代谢 转化 , 及 阐明 多 环 芳 烃 对 人 体 毒 副作用 的 发 生 、 发 展 和 消除 的 各 种 条 件 和 机 制 。 艺 是 非 致癌 性 多 环 芳烃 , 是 常见 PAH 的 一 种 , 含 量 占 PAH 2%~10%™, 1- EE C1-OHP) 是 艺 在 哺乳 动物 体内 主要 的 代谢 产物 。 虽 然 尿 中 排泄 的 1-OHP 只 占 艾 总 量 的 一 小 部 分 ,1-OHP 仍然 是 PAH 暴露 评价 的 一 个 可 靠 的 生物 指示 物 。 尿 样 中 1-OHP (包括 其 他 PAH 的 羟基 代谢 产物 ) 可 用 HPLC-LIF、HPLC-FD、HPLC-MS、 GC-MS 等 方法 检测 。Keimig 和 Morganb5 在 酸性 条 件 下 水 解 尿 中 1-OHP 结合 物 , 并 用 二 氯 甲 烷 提 取 富 集 1-OHP, 然 后 用 HPLC 分 离 检 测 。Withey SU XA MILB 24h Ja, ERR PAR LED SIA ERIN 22%~40%, 21%~52%. SER 产物 主要 有 一 羟基 菲 (5 种 , 即 1-、2-、3-、4- 和 9- 羟 基 菲 )、 二 羟基 菲 (3 HH, 1,2-, 3,4-、9,10- 二 羟基 菲 )。 这 些 代谢 产物 主要 以 硫酸 和 葡萄 糖 醛 酸 结合 物 的 形式 排出 , 在 员 齿 类 动物 的 实验 中 还 检测 到 这 些 代 谢 物 的 硫 醇 尿 酸 、 硫 醇 丙 酮 酸 、 硫 醇 草酸 及 硫 醇 乙 酸 的 结合 物 6] 。 经 酶 水 解 和 衍生 化 后 ,SmithH8l 用 SPME-GC-MS 检测 了 单 羟 基 菲 。 Abdelrazak oj ict 3 种 途径 向 肉 性 老鼠 施加 菲 , 结 果 发 现在 尿 中 对 羟基 菲 、9,10- 二 羟基 菲 是 最 主要 的 代谢 产物 , 但 通常 采用 几 种 单 羟 基 菲 的 浓度 之 和 来 评价 人 体 对 外 源 性 菲 的 暴露 。Rih S° RA SF PAH 暴露 与 代谢 酶 的 遗传 多 态 性 及 尿 中 代谢 物 的 相关 性 , 并 提出 了 艺 及 菲 在 体内 可 能 的 代谢 途径 〈 图 16-6、 图 16-7) 。 研 究 提 示 尿 中 PAH 的 浓度 不 仅 与 从 事 职业 及 吸烟 与 否 有 关 , 还 与 自身 代谢 酶 的 遗传 多 态 性 相关 。Luan 等 刀 ~25 建 立 了 固 相 微 某 取 衍生 化 技术 与 GC-MS 联 用 同时 测定 多 种 PAH 代谢 产物 的 分 析 方 法 , 开 展 了 细菌 和 微 藻 降解 PAH 的 降解 机 制 和 代谢 物 动 力学 变化 等 研究 。 ae comme ; “SO: afjo | a, oe. site 图 16-6 RPL Sb AA ET REAR A 1; HG; 2: 1-FREE; 3: 菲 的 氧化 物 ; 4: RROMBE; 5: GSH 结合 物 ; 6: —~MRE, 7: ST; 8: 二 羟基 花 ; 9; ey 与 环境 污染 物 PAH 的 代谢 研究 方法 类 似 ,Azmi 等 5 利用 NMR 技术 研究 了 环境 中 污染 物 REP RARE (ANIT) 及 其 代谢 物 1- 蔡 基 蜡 和 氰 酸 酯 COND, LAK (NA) 诱导 的 老鼠 肝 中 毒 。 主 成 分 分 析 (principal components analysis, PCA) 结果 表 *。415 。 ioh GSH ot 0 hc we ae | CQ Ley ot a 16-7 MPLZN A ASERT BER RAC” 1: JE; 2、3 和 4: 芳烃 氧化 物 的 同 分 异 构 体 ; 5、8 和 13: 三 种 反 式 的 二 羟基 菲 ; 6、7、10、11 和 12: 五 种 酚 异 构 体 ; 9、14 和 15: GSH 结合 物 明 , 短 期 的 ANIT 扰动 可 引起 迅速 的 糖尿 反应 , 同 样 的 糖尿 反应 也 发 生 在 NI 给 药 的 老 鼠 模型 中 , 但 对 NA 给 药 的 老鼠 模型 无 上 述 糖 尿 反 应 现象 〈 图 16-8, 见 彩 版 )。 研 究 结 果 表 明代 谢 组 学 方法 确实 为 环境 污染 物 的 毒性 评价 及 代谢 机 制 研究 提供 了 一 种 强 有 力 的 工具 。 A PC2 WN OC HN WE =—§ 4-3 —2-1 0 1°2 3) 4°5).6-7 8 9 10 PC1 16-8 ur- 蔡 基 异 硫 氰 酸 酯 (ANIT) 、1- 蔡 基 异 氰 酸 酯 (ND 、1- 蔡 胺 (NA) 毒性 研究 的 PCA score 图 5 A. 二 维 PCA score 图 (PC1, PC2 可 解释 68.9%% 的 差异 ),ANIT (4), NI (4), NA (4), Xt @®; B. 三 维 PCA score 图 (PC1,PC2,PC3 可 解释 77.1% 的 差异 ) 目前 很 多 研究 小 组 也 开展 了 有 关 杀 虫 剂 及 其 他 环境 毒物 对 水 生动 物 〈 如 鱼 类 等 ) 的 ° 416 。 FS 毒性 作用 研究 。Viant 等 "利用 NMR 方法 研究 了 甸 鱼 暴露 环境 毒物 2-(1- 甲 基 - 正 两 基 )-4,6- 二 硝 基 苯酚 、 二 嗪 农 、 和 氰 戊 菌 酯 后 的 代谢 物 指纹 谱 的 变化 。 对 发 眼 卵 及 刚 孵 化 的 小 鲈鱼 的 代谢 指纹 分 析 表 明 上 述 毒物 在 两 者 体内 的 代谢 机 制 不 同 。 类 似 的 方法 也 用 于 日 本 青 鲜 鱼 的 研究 Viant °° 的 研究 表明 ,2-(1- 甲 基 - 正 两 基 )-4,6- 二 硝 基 葵 酚 暴 露 ABBE RIN RWS EAN SHEAR (如 迟缓 或 不 正常 的 生长 率 、 过 度 暴 露 致死 等 ) 具有 相关 性 .H NMR 的 代谢 组 学 测定 结果 与 3P NMR 和 HPLC-UV 的 测定 结果 一 致 , 利用 磷酸 肌 酸 作为 ATP 降低 的 能 量 补偿 可 被 看 作 是 青 钱 鱼 胚 胎 毒性 的 标志 。 另 外 , 为 更 好 地 理解 青 钱 鱼 胚胎 形成 过 程 中 的 代谢 变化 , 其 胚胎 还 被 用 来 构建 生长 过 程 中 的 不 同 代 谢 通路 模型 〈 如 三 氯 乙烯 暴露 模型 ), 这 为 青 钱 鱼 生 长 过 程 中 的 环境 影响 及 代谢 变化 提供 了 更 多 的 fe 8°") (A 16-9) 。Stentiford 4° 采用 组 织 学 、 蛋 白质 组 学 、 代 谢 组 学 等 方法 联合 研究 了 比目鱼 的 肝 内 肿瘤 的 发 生 。 采 用 组 织 病理 学 鉴定 后 , 利 用 SELDI 蛋白 质 芯 片 和 FT-ICR- MS 等 方法 对 蛋白 质 及 小 分 子 代 谢 物 进行 了 轮 8 4 PC2 5 | oo =2 =20 -15 -10 -5 0 PC1 score(75.2%) Al 16-9 FHI HAZ Meee PCA score 图 23] 三 氯 乙烯 暴露 剂量 : 0.0mg/L ( * ), 0. 88mg/L (A) #18. 76mg/L (*) SURO” 15° 20" 25 RO, Ria LRA SRA BT AE Hs ll a8 BY TEI 16.3 {UHRA AFCA HE DAs wR RARE P 生物 体 代 谢 过 程 中 的 生物 标志 物 可 被 用 来 定量 衡量 生物 体 的 被 污染 程度 , 因 此 测定 生物 标志 物 对 一 系列 环境 刺激 的 应 答对 生态 风险 评价 具有 重要 意义 , 特 别 是 对 于 基因 组 序列 未 知 的 无 兰 椎 动物 来 讲 , 生 物 标 志 物 分 析 显 得 尤为 重要 。 是 是 作为 陆地 上 生物 量 最 大 的 一 类 土壤 无 脊 椎 动物 , 是 农田 生态 系统 土壤 物质 小 循环 中 的 重要 一 环 , 它 通过 取 食 、 挖 掘 等 活动 促进 有 机 质 的 分 解 、 土 壤 层 次 的 混合 、 土 壤 团 粒 的 形成 , 提 高 土壤 的 孔 际 度 、 排 水 能 力 和 通气 性 能 , 从 而 改善 土壤 的 物理 、 化 学 、 生 物 属 性 。 为 满足 日 益 增 长 的 污染 土壤 生态 风险 评价 与 生态 功能 诊断 的 需要 , 赋 晤 常 被 作为 评价 土壤 环境 质量 的 重 要 指示 生物 。 Bundy 等 .5 利用 代谢 组 学 方法 研究 了 被 污染 的 土壤 对 是 是 的 影响 。 他 们 利用 !:H NMR 波谱 考察 了 不 同 毒性 物质 暴露 时 是 归 的 代谢 变化 ,PCA 分 析 结果 表明 有 毒化 合 物 的 暴露 确实 可 引起 昕 归 代 谢 物 组 的 变化 , 不 同 毒 物 在 是 归 体 内 的 代谢 模式 不 同 。 高 效 液 相 色谱 - 传 里 叶 变 换 质 谱 与 :H NMR R&C NMR 波谱 的 测定 结果 相同 ,2- 氟 -4- 甲 基 葵 胺 暴露 可 导致 生物 标志 物 2- 己 基 -5- 乙 基 -3- 呐 喃 磺 酸 的 减少 及 肌 苷 磷酸 盐 的 增加 《图 16-10); 4- 氟 葵 胺 暴露 可 导致 老 芽 糖 浓度 的 降低 ; 而 3,5- 二 所 苯胺 暴露 产生 了 与 2- 氟 -4- 甲 基 葵 胺 暴露 类 似 的 程度 更 轻 的 生物 学 反应 。 代 谢 组 学 方法 也 被 用 来 研究 金属 污 染 物 对 无 脊椎 动物 是 归 的 影响 。 将 三 种 不 同 种 类 的 旺 归 CLumbricus rubellus , Lumbri- ¢ 417 « AKG 丙胺 酸 苹果 酸 盐 甘油 vm gig | 3 名 4a 0.4 琥珀 酸 盐 02 TMAO ie 0 * —0.2 ~ = -0.4 ae 06 —F ”乙酸 盐 10 9 8 7 6 5 4 3 iz 1 0 化 学 位 移 变化 图 16-10 Eisenia veneta 是 归 体 腔 液 的 600MHz 1H NMR 谱 分 析 结 果 60 A. 芳香 族 化 合 物 区 ;B., 脂肪 族 化 合 物 区 ; C. 1H NMR 谱 的 PCA 结果 。NMN: 六 - 甲 基 -- 烟 碱 ;》 AKG: fi 成 二 酸 盐 ; TMAO: 三 甲 基 胺 氮 氧 化 物 cus terrestris, Eisenia andrei) 作为 研究 对 象 ,Bundy 等 5 考察 了 不 同 浓度 的 金属 污染 物 对 虹 归 代谢 的 影响 , 结 果 表 明 Lumbricus rubellus 和 Eisenia andrei 对 金属 毒物 的 反应 更 明显 。 对 上 述 有 毒 污染 物 的 生物 标志 物 的 鉴定 结果 提示 代谢 组 学 方法 可 用 于 研究 影响 昕 归 群 体 的 有 毒 污染 物 及 其 污染 程度 , 找 出 与 之 对 应 的 生物 标志 物 , 并 分 析 其 毒性 。 418 。 Me Ye 的 作用 机 制 。 蝶 归 种 群 的 生物 多 样 性 是 伴随 着 赋 归 对 各 种 生态 环境 的 适应 而 产生 的 。 研 究 表明 , 当 赋 晤 生存 的 土壤 环境 受到 农药 污染 后 , 生 态 系统 的 结构 和 功能 遭 到 破坏 , 食 物 来 源 、 栖息 环境 等 不 适合 其 生存 , 蚜 归 的 种 类 和 数量 也 会 随 之 改变 , 甚 至 出 现 某 些 敏感 种 群 消 亡 的 现象 。 因 此 , 通 过 对 污染 土壤 中 的 虹 归 进行 调查 分 类 和 比较 可 以 了 解 虹 归 种 群 的 变 化 情况 , 通 过 对 蝶 归 的 一 些 重要 生化 指标 的 分 析 可 以 确定 土壤 污染 的 状况 。Bundy 等 63 采 用 代谢 组 学 轮廓 分 析 的 方法 , 以 爱 胜 归属 (Eisenia) 虹 归 为 研究 对 象 , 考 察 了 Zw RA — Fa] (Eisenia fetida, Eisenia andrei, Eisenia veneta) 的 基本 代谢 状 fi. FP, Ja PAP a lA AIR AE AS Seti. MIB ASSURE EF, RRB Mee 进行 区 分 。 但 通过 :H NMR 波谱 结合 PCA RHA SOT, ER = PPM BS TRS 的 鉴别 〈 图 16-11), 且 体腔 液 的 代谢 轮廓 分 析 结 果 明 显 优 于 组 织 提取 液 〈 图 16-12) 。 这 充分 说 明 , 对 于 无 脊椎 生物 〈 如 土壤 无 脊椎 动物 ), 特 别 是 那些 具有 有 限 分 散 能 力 〈 指 那些 长 时 间 在 极 小 范围 内 生存 又 具有 较 强 选择 性 压力 的 生物 群体 ) CA HEA DD, 基于 代谢 物 分 析 的 代谢 组 学 技术 可 以 帮助 我 们 理解 生物 进化 过 程 中 各 种 环境 因素 对 生物 体 本 身 所 造成 的 冲击 。 Jett a rohan le nee ae VF fas srs) ioe a bee ML Ieee all etn 8 ppm 图 16-11 = 3 ee J a S| SAK) 600MHz : H NMR 谱 分 析 结果 [3 1 一 3: Eisenia fetida; 7~9; Eisenia andrei; 16~18; Eisenia veneta ° 419 。 PC2 score PC2 score | | | — — an Oo n 一 —" nN i) “a S S S wv Uv ME PC1 score PC1 score 图 16-12 ” 爱 胜 旦 属 上 昭 组织 液 和 体腔 液 1LH NMR 谱 分 析 的 PCA score 图 〈 中 心 化 分 析 法 )E33 A. 组 织 液 ; B. 体腔 液 。@: Eisenia fetida; vy: Eisenia andrei; jm: Eisenia veneta 16.4 环境 代谢 组 学 的 发 展 前 景 代谢 组 学 作为 一 门 新 技术 , 在 过 去 的 几 年 中 在 环境 方面 的 应 用 研究 取得 了 较 大 发 展 , 它 被 认为 是 环境 安全 性 评价 的 有 力 武器 。 从 人 类 健康 和 环境 保护 的 角度 出 发 , 环 境 代谢 组 学 研究 不 仅 可 以 帮助 人 们 更 好 地 理解 各 种 化 学 毒物 对 人 体 及 整个 生态 环境 所 造成 的 危害 , 还 有 助 于 阐释 环境 毒物 作用 于 生物 体 后 所 产生 的 可 能 的 毒性 及 其 作用 机 制 。 从 总 体 上 讲 , 现 在 环境 代谢 组 学 研究 仍然 处 于 发 展 阶段 , 有 许多 方面 吸 待 开发 和 完 善 , 也 面临 着 各 个 方面 的 挑战 。 从 方法 学 的 角度 讲 , 无 论 现 有 的 分 析 仪 器 、 分 析 技 术 还 是 数据 处 理 方法 都 需要 进一步 发 展 以 改进 灵敏 度 、 分 辨 率 及 通 量 。 代 谢 标志 物 定性 及 代 谢 途 径 的 前 释 是 面临 的 另 一 难题 。 从 应 用 方面 , 环 境 代谢 组 学 研究 应 不 断 开 拓 新 的 研究 方向 , 如 利用 代谢 组 学 新 技术 研究 多 种 环境 毒物 同时 暴露 对 生物 个 体 及 群体 的 影响 、 实 验 用 生物 或 模式 生物 体 对 环境 毒物 〈 包 括 不 同 剂量 、 不 同 种 类 的 化 学 毒物 ) 暴露 产生 的 生物 学 效应 、 KASS Oe 露 对 不 同 区 域 生 态 平衡 的 影响 等 。 我 们 相信 , 随 着 代谢 产物 分 析 技术 和 数据 分 析 方 法 的 不 断 改 进 , 复 杂 环境 评价 的 代 谢 组 学 新 方法 将 会 被 不 断 开 发 , 环 境 毒物 的 生理 和 毒 理 相互 作用 机 制 和 环境 疾病 的 致 病 机 制 将 会 得 到 阑 释 , 代 谢 组 学 技术 也 必然 在 后 基因 组 时 代 的 环境 安全 性 评价 及 其 他 相关 方面 拥有 更 为 广阔 的 发 展 前 景 参考 文 献 [1] Griffin J L. 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PAE gy toss ee ae 将 总 or Fr, “hd ful hod ‘- f ey ne ha Aeon fort oy ees ha ry: 7 Wi ye ee oe Tv 64 力 『 WA a 00 TO a EY a Op Oo Oe RD a: chiens — ” ie ES ARR ART; Bho) 6 ay SRT Re EE ms 4 é a at Lm pls LG papel Octet d op | ola) oA 9 jordenii ' Rages, ‘ mety Vu 全 了 nf “Ce 1) Me a 脂肪 酸 结合 蛋白 《转录 ) QEAAL =p” Dickkopfl 蛋 白 一 > Ogee 脂肪 酸 结合 蛋白 TC 、 mm 蛋白 激酶 Ch 亚 型 一 一 一 化 》 一- BERETA 二 酰基 甘油 ere a 了 血红 素 加 氧 酶 2 KARR AHI 过 氧化 物 酶 a 4M Hh 6 体 增殖 物 激 A tho. 2 转录 局 始 因子 。 核 PCA Pearson 相 “关系 数 |C|>0.8 相对 丰 度 转基因 /对 照 图 1-8 基因 、 和 蛋白 质 和 类 脂 的 关联 网 络 红色 和 绿色 分 别 表示 转基因 老鼠 与 野生 型 相 比 浓度 增高 和 降低 。 连 接线 表示 基因 、 蛋 白质 或 类 脂 之 间 的 关联 (Pearson 相 ¥% AB > 0.8) 0) A BER RG [DHAP|-—- GiyaP) -EEEHS -SEE AMR: gy _ gay? 要 ‘Lactate = (Met)+-—=-| #5 #0 J+ «, PEPER 一 -一 一 国 sn eee oe ne iv 3] al 7 — a-— 6 二 ACN 葬 戎 阅 - 一 Ka scr + _ [Succinate iD [人 rn 2 Oxoghearate [Gu Gu tind Pe ee tt _ + J (ATP- ADP = = ANP (Gn). * -RDP Gr) =n os mm 一 st (Adenine -FEED ae Adercune] ' 相对 量 cm 一 co 一 二 加 <01 01.05 05-2 210 10< ND [一 本 ES ee ae oo =o a 图 $5-7 B. subtilis 168 PETES FFE Bt BE BE ae FR 5 1 A. 在 对 数 生长 后 期 代谢 物 水 平 的 变化 (TOT ,;) ,B. 孢子 形成 早期 代谢 物 水 平 的 变化 (T2/T 95) 。 别 表示 代谢 物 水 平 增加 2~10 倍 和 10 倍 以 上 , 浅 蓝 色 和 靛青 色 方 框 分 别 表示 代谢 物 水 平 下 降 到 原来 的 0.1 一 0 5 和 0.1 以 下 , 白色 方 框 表示 代谢 物 水 平 没有 大 的 变化 , 黑 色 方 框 表示 代谢 物 未 检测 到 。B swbziis 菌 株 的 代谢 图 谐 见 ARM database (http://www.metabolome.jp/) 紫色 和 红色 方 框 分 TMA LFD HFD 12986 HFD 游离 nian BALBIC ACBALB/C HFD 脂肪 酸 bee 12986 a Pati, Gy iti Pe at 从 头 合成 群 处 理 O- 磷 酸 胆 碱 = ~<—> 胆 碱 一 一 ~ 甜菜 醛 脱 氢 栈 11 ore rrem i | meer a NS 酰基 转移 酶 +P 友 酸 a 甜菜 碱 游离 戊 二 酸 盐 胞 苷 二 磷酸 脂肪 酸 三 甲 胺 乙 内 柄 同型 上 同型 半 胱 氨 酸 自由 基 | 磷酸 转移 酶 半 胱 氨 酸 转 甲 基 酶 DS 甲 硫 氨 酸 人 甘氨酸 < wham N, N- 二 甲 基 甘 氨 酸 Ae / Waa 二 甲 基 甘 氮 ae x ae 脱 氢 酶 酸 脱 氨 酶 Litt 肌 酸 磷酸 肌 酸 V A keel emai 脂肪 变性 , te 酒精 性 脂肪 肝 图 12-8 甲 基 胺 在 体内 的 代谢 通路 (A) 和 甲 基 胺 可 能 的 肝 损 伤 途径 (B) BALB/C 和 129AS60 为 小 鼠 种 系 名 . LFD: 低 脂 饮食 ,HEFD: 高 脂 饮食 ,TMA: 二 甲 胺 ,TMA: 三 甲 胺 ,TITMAO: 氧化 三 甲 胺 ,FMO3: 黄 素 单 胺 氧化 酶 。A 图 中 红色 方块 表示 正 相 关 , 绿 色 方 块 表 示 负 相关 呈 图 15-7 大肠 埃 希 菌 的 代谢 网 络 示意 图 图 中 的 点 代表 不 同 代谢 物 , 代 谢 物 之 间 的 连 线 代表 生化 反应 途径 , 连 线 的 颜色 代表 了 反应 途径 的 通 量 大 小 〈 引 自 http/ www.lce.hut.fi/publications/annual2004/nodel8.htm! ) PGS BE? I-45 —2 —1 0 } 23 4 5 6 7 & 9 10 PCI 图 16-8 ”or 蔡 基 异 硫 氰 酸 酯 (ANIT) 、1- 蔡 基 异 氰 酸 酯 (NID) 、1- 蔡 腕 (NA) 毒性 研究 的 PCA score 图 ” A. 二 维 PCA score 图 (PCLPC2 可 解释 68.9% 的 差异 ) , ANIT (A) , NI (A) , NA (A) , 对 照 数 据 ( 国 ) ; B. 三 维 PCA score 图 (PCLPC2,PC3 可 解释 77.1% 的 差异 ) 中 科 院 植物 所 图 书馆 AUN $0053087 Sey ET (Q—2077.0101) te 者 简 介 . 许 国 旺 , 男 ,1963 年 生 , 浙 江 嵊 县 人 。 FE 毕业 于 浙江 工业 大 学 化 工 系 , 1991 年 在 中 国 科学 院 大 ? 连 化 学 物理 研究 所 获 博士 学 位 , 师 从 著名 的 色谱 学 卢 佩 章 院士 。 毕 业 后 留 所 , 在 国家 色谱 研究 分 析 中 心 , 王 作 局 到 由 之 oe hee a ' 研究 基金 资助 , 在 德国 Tuebingen 大 学 做 高 级 访问 学 者 。 回 国 后 担任 大 连 化 学 物理 研究 所 研究 员 、 博 十 生 , 导师 。2004 年 获 国家 杰出 青年 基金 资助 。 现 为 天 连 化 ” 学 物理 研究 所 生物 技术 部 生物 分 子 高 分 辩 分 离 分 析 课 题 组 组 长 、 代 谢 组 学 研究 中 心 主任 、 了 中 国 色 谱 学 会 副 理 事 长 兼 秘 书 长 、 中 国 化 学 会 理事 、 国 家 烟草 局 科学 技术 委员 会 成 员 。 Seg 许 国 旺 研究 员 一 直 从 事 色 谱 及 其 联 用 技术 的 基础 理论 及 应 用 研究 。 根 据 样品 对 象 的 复 ”7”, 杂 性 , 在 方法 学 上 , 走 过 了 从 经 典 一 维 色谱 到 中 心切 割 多 维 色谱 , 再 到 全 二 Sesto / 过 程 , 逐 渐 形 成 了 以 “多 维 色谱 + 联 用 技术 + 化 学 信息 学 ”的 科研 特色 ;在 研究 对 象 下 , 从 ” 石化 、 环 保 领域 逐渐 实现 了 向 生命 科学 (药物 、 代 谢 组 学 、 生 物 催 化 ) 领域 的 转化 。 从 1996 年 起 开展 “健康 和 代谢 的 关系 ”研究 , 并 逐步 进入 代谢 组 学 领域 , 将 研究 方向 集中 到 代 组 学 的 技术 平台 和 其 在 重大 疾病 的 生物 标志 物 发 现 、 中 药 疗 效 毒性 和 作用 机 理 研 究 等 , 中 基于 尿 中 核 苷 代谢 诊断 肿瘤 的 项 目 已 通过 中 国 科学 院 组 织 的 鉴定 。 许 国 旺 是 我 国 最 早 过 行 代谢 组 学 研究 的 学 者 之 一 。 ‘4 至 今 , 许 国 旺 已 出 版 专著 4 部 , 在 国内 外 杂志 发 表 论 文 270 多 篇 。 申 请 专利 32 项 已 (其 已 授权 14 项 ), 鉴 定 成 果 7 项 。 在 相关 领域 形成 了 一 定 的 影响 , 并 得 到 国际 同行 的 认可 。 短 是 JCjromalogr-B 主 编 (editor), Metabolomics, J.Pharmaceut.Biomed., Chromatographia, J. Sep. Sci. 等 10 多 种 杂志 编 委 及 国际 高 效 液 相 色 谱 会 议 永 久 性 科学 委员 会 委员 , 第 30 届 国际 毛细 管 色谱 会 议和 第 33 届 国际 高 效 液 相 色谱 会 议 副 主 席 。 ISBN 978-7-03-021528-4 生物 分 社 4 联系 电话 : 010-64012501 iy http://www.lifescience.com.cn | e-mail:lifescience@mail.sciencep.com 9'787030'215284!> * a | 销售 分 类 建议 , 生 物 / 生物 化 学 定 Hh. 88.00 元