分 于 Se we 学 、 tke FF 4+ Fe Mm 社 19238 2 ~j Rg a CNY tenet ee A ES ee « — ee LS a + Vi — Oe SS ee ——— = 25228 Wu i 内 & & 介 本 书 并 述 免疫 反应 的 分 子 基础 。 内 容 包括 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 , 搞 体 的 结构 和 功能 ,抗原 抗体 的 相互 作用 ， 抗体 的 合成 , 免疫 球 蛋 白 和 有 关 分 子 的 进化 。 本 书 还 从 分 子 细胞 学 水 平 论述 了 淋巴 细胞 在 抗体 合成 中 ,信和 号、 受 体 和 基因 的 相互 作用 ; 各 类 淋巴 球 表面 分 子 构造 与 免疫 识别 和 免疫 反应 调节 的 关系 ;免疫 反应 的 遗传 控制 ;免疫 球 蛋 白 的 基因 结构 及 抗体 多 样 性 的 “ 起 源 等 现代 免疫 生物 学 的 基本 问题 。 全 书 共 分 五 篇 十 七 章 。 读者 对 象 是 免疫 学 .生物 化 学 、 分 子 生物 学 和 医学 工作 者 以 及 有 关 大 专 院 校 师 生 。 分 子 免 疫 学 王 亚 辉 FZ 责任 编辑 RRM eee ka ih 北京 朝阳 门 内 大 街 137 号 OA Ha aly Ell” 新 华 书店 北京 发 行 所 发 行 ” 各 地 新 华 书店 经 售 * =. 19824212 BR 一 MR 开本 2 787%1092 1/16 1982 年 12 月 第 一 次 印刷 印张 34 1/2 插页 :1 印 数 > 0001 一 5,330 字数 ;: 809,000 统一 书号 : 13031。2080 本 和 社 书号 > 2837。13 一 10 定价 : 5.40 元 目 5 ee 1 oe ae ee) cs) Ce See cere eee ee 10 ea OO 70 lee AS 7): a = 0) ee 11 第 二 章 ”多糖 和 含 多 糖 的 抗原 及 类 脂 物 和 pp 71 第 三 章 ”核酸 90 Pa ae) 17 eee 108 第 五 章 影 啊 对 抗原 起 反应 的 因素 bon ccdicle a cecccs sence siden vcnince pic sbesocciece seasesiccscecices 157 ME— BAB: ,结构 和 功能 -ore ee er er eee pee 168 第 六 章 “抗体 的 一 般 性 质 . 分 离 和 纯化 pp 170 第 七 章 “免疫 球 蛋白 G 的 结构 和 功能 ppp 193 第 八 章 多 聚 体 免疫 球 蛋 白 ， IgM 和 IgA pp 224 STF PL RPREGLHK: Ig 盏 .op 249 第 十 章 ”抗原 结合 位 点 的 结构 :pp 267 第 三 篇 eee doe ey ok. See eee eee 285 第 于 一 章 抗原 抗体 的 相互 作用 Ee ee PO DPE ROO ET Se A 286 第 填 二 章 ”补体 及 其 作用 的 分 子 基 础 pp 357 第 四 篇 ”抗体 的 合成 信号 、 受 体 和 基因 398 第 十 三 章 ， 抗 原 和 淋巴 细胞 的 相互 作用 一 一 抗体 反应 的 触发 机 制 … 399 + pos 免疫 球 蛋 和 白 的 合成 aidne a a:disie'gib s Wisin|iste Siac MiNi 站 司机 术语 dos aa cine Cam Ra ane adie wise nee eicieieins 434 Eee eee 免疫 球 蛋白 和 免疫 反应 的 遗传 控制 PR 470 第 五 篇 免疫 球 和 蛋白 及 有 关 分 子 的 进化 sin Rew ER ala caters ee welsh sees cele sels oc sine detisccuceecacesien 511 第 十 六 章 “免疫 球 蛋白 的 进化 :PP 513 第 十 七 章 补体 及 其 它 与 免疫 球 蛋白 有 关 分 子 的 进化 全 全 < 本 535 补 注 一 补 注 二 aay 有 . -< k ae ; ¥ > ae oo Phat | Bh 4 é 9 r 7 + 天 * ee 了 ar a v A 和 4 为 rae t a’ ‘ : Dd at , uty y's t | | “a Bi TF eevee “ARE RERS OD Coe ci . : 各 wy aD: . . ter. \ {4 : a 9 ~ PL. ea ah ee tala ta dean ms Ad 站 phew 《 全 rev } RO Bd aaa ¥ P thy C vale Fi Aye 4 Fi, YE ete vsnaner tanh nae sp tages vee 4c S , re a . \ rs ae a ae fe fc: 四 - , . aah gear cap ow V0 a ae dees b kske kUab ano ei aeene owes yD on 4 oy vg he \ i ere i 9 .) 2 s We Por eoaeenttecssaeheataatee pe ate TIE “a ie “Ws re | er wat thay Pay $8 本 YA 2 : =) SOY spans 2% <* NyiRY Spe st Gales poe A dye ae 0 night es “te a deep ak alee rir ,到 i = athe i i eee os wile baldies 6 Vin div end aite ‘eel i he 1 we Et | Aves a. Cy a4 ; ; i ‘ ay ~ aoa * Prey iiub tt . me Leo. et eae ee ee ee ee ee ee AP EWS CRE SS Mev wed O6 uae wih, ia 严 - ; ' ; 7 4 ‘ ~ ~ ‘ C ¢ oe ea . : ‘ i . ‘ a “eae 于 ORE OG O\ Je atean 6 «oe eres Phen dete enews euugioes cnuwd sous ee wT « wie E : : a , arr We fail 本 名 ghee rs #erees RESO +i sd cee coneed » dw or secs rY, aeHO 3 te ; co erga’, UF oh See dey ven 二 La lk + sie 5 Ce 8 avin | pre rcat eats Sarasin WE QYAGS ites z 人 ¥ " - \ hs » 和 i, > y . t fr ¥ ‘ ' > a “gc 6? ¥. 如 * é a j s ? ‘ . 下 17 ‘ 7 ‘ 4 \ ‘ 7 . 2 ta 结 论 免疫 性 是 动物 在 长 期 进化 过 程 中 逐渐 发 展 起 来 的 防御 感染 和 维护 机 体 完 整 性 的 十 分 有 效 而 灵巧 的 手段 。 免 疫 系统 的 特殊 功能 是 识别 “自我 "和 ” 非 自 我 ?的 物质 。 对 自身 的 物 质 不 起 反应 ， 而 对 外 源 的 及 体内 改变 了 的 物质 则 能 起 专 一 的 免疫 反应 ， 排 除 其 对 机 体 的 危害 。 另 一 方面 ， 免 疫 系统 还 担负 着 维持 机 体 免 疫 状 态 的 自身 稳定 性 ， 以 清除 体内 衰老 和 突变 的 细胞 。 机 体 的 这 种 免疫 功能 又 是 在 神经 体液 系统 的 调节 下 ， 通 过 细胞 和 体 波 因 素 之 间 , 以 及 细胞 彼此 之 间 , 相互 协作 和 相互 制约 而 维持 常态 的 。 免 疫 功能 的 失调 则 是 造 成 自身 免疫 病 和 某 些 肿瘤 发 生 的 重要 条 件 。 因 此 ， 免 疫 学 的 主要 任务 是 认识 和 利用 免疫 系统 的 这 种 对 立 统 一 的 特殊 规律 ,定向 地 控制 免疫 反应 和 调节 免疫 功能 , 以 维护 机 体 的 健 康 和 完整 性 。 一 、 免 疫 学 的 基本 概念 (一 ) 免疫 反应 的 细胞 学 基础 免疫 反应 的 细胞 学 基础 是 淋巴 样 系统 , 主要 是 小 淋巴 细胞 。 小 淋巴 细胞 能 专 一 地 识别 抗原 , 并 起 反应 ,所 以 也 称 为 免疫 活性 细胞 (Immunological competent cells) 或 抗原 敏感 细胞 (Antigen sensitive cells) 。 在 受到 抗原 刺激 后 ,一 类 小 淋巴 细胞 (依赖 胸腺 WT Ai) 便 增 生 、 分 化 , 直接 参与 攻击 靶 细 胞 或 间接 地 释放 一 些 生物 活性 因子 (RM 制 因 子 、 发 炎 因 子 、 转 移 因 子 、. 淋 巴 毒 素 、 促 分 裂 因子 等 )， 所 起 的 免疫 作用 称 为 细胞 免疫 。 表面 标记 : TLtLyl+2+3+ 一 > Lyl+2+3+ Joa Be Lyl*+2-3- Lyl-2+3+ @) as ES mien a » 8 [ED FA! 小 淋巴 球 的 功能 分 化 ( 据 Tachibana, 1977), (Td) DTH 引发 细胞 (表面 标记 Lyl+2-3-) (Ts) 工 抑制 细胞 (Lyl-2+3+) (Tc) 细胞 毒性 工 细胞 CLy1-2+3+) 《Th) 辅 助 工 细胞 〈(Lyl+2-3-) (Ta) 扩大 工 细胞 (Ly1+2-3-)。 另 一 类 小 淋巴 细胞 (来 源 于 骨 骨 的 B 细胞 ) 则 增生 、 分 化 为 浆 细胞 ,合成 抗体 (各 类 免疫 球 蛋白 ， 包 括 IEM，IgG，IgA, Ig 瑟 等 )， 释 放 到 体液 中 起 作用 ， 称 为 体液 免 疫 。 对 于 大 多 数 抗 原 ( 胸 腺 依赖 抗原 ) ，B 细胞 的 抗体 反应 还 需要 了 T 细胞 (“ 辅 助 ? 细 胞 Helper ce- lis) REMAN DAVE. Keb, 免疫 反应 还 受 了 抑制 细胞 (Tsuppressor cells) 的 调节 。 因 此 ,有 人 认为 工 细胞 (各 亚 群 ) 是 调节 细胞 , 在 免疫 反应 的 调节 中 起 关键 作用 (图 1) 。 两 类 小 淋巴 球 及 其 亚 群 ， 在 细胞 形态 上 看 不 出 差异 ， 只 能 从 功能 上 和 细胞 表面 标记 加 以 区 别 。 无 论 细 胞 免疫 或 体液 免疫 ， 其 最 重要 的 特征 是 对 抗原 或 靶 细 胞 有 高 度 的 专 一 性 。 目 前 已 经 明了 这 是 由 于 淋巴 细胞 表面 存在 专 一 的 抗原 受 体 (在 .B 细胞 是 免疫 球 蛋白 ) 能 非 常 精确 地 识别 抗原 的 缘故 。 (二 ) 免疫 系统 的 系统 发 生 和 个 体 发 生 无 论 在 系统 发 生 或 个 体 发 生 中 ， 免 疫 反应 都 是 随 淋巴 样 系统 的 发 育 而 逐步 建立 和 完 善 起 来 的 。 现 已 证 明 现 存 状 椎 动物 的 最 原始 的 代表 (如 圆 口 类 的 一 种 盲 鳗 ) 已 具有 专 二 的 细胞 免疫 能 力 和 初步 的 体液 免疫 能 力 。 细 胞 免疫 性 表现 为 能 加 速 排斥 再 次 移植 的 皮肤 杆 片 。 这 种 表现 为 移植 免疫 的 细胞 免疫 在 进化 上 是 比 体液 免疫 更 为 古老 的 防御 机 制 ， 可 以 追溯 到 无 脊 椎 动物 (如 环节 动物 ) AE COM, BALTES DES RS 体 。 虽 然 所 有 兰 椎 动物 都 能 产生 专 一 的 抗体 ,但 是 免疫 系统 (淋巴 样 系统 ) 和 抗体 度 应 (能 识别 的 抗原 的 种 类 、 抗体 的 种 类 和 免疫 记忆 ) 都 还 经 历 过 一 个 不 断 完善 和 复杂 化 的 过 程 。 随 着 淋巴 样 系统 的 完善 ,体温 的 恒定 ,到 鸟 类 和 哺乳 类 免疫 性 才 得 到 高 度 发 展 。 哺 乳 类 ,万 其 是 灵 长 类 ,中枢 神 经 系统 高 度 发 展 ,高 级 神经 活动 在 维持 有 机 体 和 环境 的 统一 以 及 体内 环境 的 恒定 中 占有 支配 地 位 。 有 机 体 的 免疫 反应 同样 受到 神经 体液 系统 〈 下 丘脑 一 垂体 一 肾上腺 皮质 系统 ) 的 调节 控制 。 在 神经 体液 系统 的 调节 下 , 随 着 免疫 活性 细胞 的 类 别 和 亚 群 在 功能 上 的 分 化 ,细胞 之 间 , 细 胞 因素 和 体液 因素 之 间 的 相互 作用 , 无 其 是 了 细 胸 调 节 作用 的 发 展 ， 机 体 对 抗原 的 识别 和 反应 的 调控 机 制 ， 即 所 谓 免疫 自 稳 机 制 (Immuno- logical homeostasis) 也 愈 唆 完善 。 兰 椎 动物 免疫 系统 的 进化 ， 除 了 适应 防御 外 来 的 不 利 因素 ( 细 菌 、 病 毒 和 寄生 生物 的 感染 ) 的 需要 外 , 也 需要 适应 防御 体内 的 不 利 因素 ， 消 除 由 于 病毒 感染 或 其 它 原因 产生 的 突变 细胞 和 肿瘤 细胞 ， 以 维持 机 体 的 完整 性 。 由 于 防御 体 细胞 突变 而 发 生 的 肿瘤 细胞 的 需要 ， 在 以 组 织 相 容 性 抗原 (移植 抗原 ) 作为 主要 役 抗 原 的 细胞 免疫 的 基础 上 ， 免 疫 “ 监 管 >? 机 制 (Immune survillence mechanism) 也 发 展 起 来 了 。 ”免疫 反应 在 个 体 发 育 中 也 是 逐步 建立 起 来 的 ， 先 出 现 细胞 免疫 ， 然 后 再 出 现 体液 免 疫 。 这 反映 了 免疫 系统 的 发 育 和 分 化 的 进程 。 同时 ， 也 大 体 上 反映 了 系统 发 生 的 进程 。 在 高 等 状 椎 动物 胚胎 发 育 中 ， 一 般 认 为 淋巴 样 系统 的 干细胞 来 源 于 卵黄 圳 。 这 些 细胞 随 血 流 散播 到 初级 淋巴 器 官 ;在 马 类 为 胸腺 和 法 氏 囊 ,哺乳 类 为 胸腺 和 胎儿 肝脏 〈 继 之 为 骨 i). 胸腺 和 法 氏 圳 都 是 淋巴 上 皮 器 官 ， 它 们 各 自 能 诱导 干细胞 广泛 地 增生 并 分 化 为 了 细胞 和 了 B 细胞 (哺乳 类 相当 于 法 氏 襄 的 器 官 曾 有 许多 争论 ， 目 前 已 有 证 据 表 明 可 能 是 胎 儿 肝脏 ) (图 2) 。T 细胞 和 3 细胞 在 外 表 形 态 上 没有 区 别 。 然而 在 细胞 来 源 上 、 功 能 上 A Se eee ee = -wei 和 细胞 表面 特性 上 却 有 非常 明显 的 不 同 。 它 们 来 源 于 不 同 的 初级 淋巴 器 官 ; 分 布 在 次 级 淋巴 器 官 (脾脏 淋巴结、 肠 淋巴 组 织 等 ) 的 不 同 部 位 (T 细胞 位 于 淋巴 结 的 副 皮 质 和 脾脏 之 中 央 小 动脉 周围 区 域 , 即 依赖 胸腺 区 );， 介 导 不 同类 型 的 免疫 反应 ;并且 具有 不 同 的 表 面 受 体 和 标记 。 两 类 淋巴 细胞 及 其 亚 群 的 功能 ， 在 免疫 系统 的 分 化 和 免疫 反应 中 的 相互 作用 以 及 表面 特性 是 目前 细胞 免疫 学 仍 在 热烈 研究 的 问题 。 初级 淋巴 器 官 次 级 淋巴 器 官 ono tacit’ ae ~ 一 一 胎 骨 jl 肝 eT lye Et yo 图 2 淋巴 细胞 的 来 源 和 分 化 。 (三 ) 免疫 反应 的 进程 免疫 反应 是 通过 许多 种 细胞 之 间 的 相互 作用 而 完成 的 ， 其 关键 在 于 淋巴 细胞 表面 抗 原 受 体 对 抗原 的 专 一 的 识别 作用 。T 细胞 和 了 B 细胞 表面 都 有 专 一 的 抗原 受 体能 选择 地 识 别 抗原 ， 但 是 它们 担任 着 不 同 的 免疫 功能 。 了 T 细胞 的 主要 功能 是 识别 组 织 相 容 性 抗原 《移植 抗原 ) 和 对 免疫 反应 的 调节 和 “监管 ”。T 细胞 又 分 为 许多 亚 群 ， 分 担 这 些 不 同 的 功 能 , 其 中 一 个 亚 群 是 介 导 细胞 免疫 反应 的 (如 移植 物 的 排斥 和 授 发 型 超 敏 反应 等 ) , 另 一 些 亚 群 则 起 调节 作用 (如 "辅助 ”T 细胞 、 抑 制 了 细胞 等 )。B 细胞 是 产生 抗体 的 前 身 细 胞 ， 在 受到 抗原 刺激 后 , 就 增生 、 分 化 为 能 合成 和 分 刻 抗 体 的 浆 细 胞 。 对 于 大 多 数 抗原 ， 抗 体 反应 同时 需要 B 细胞 和 了 T 细胞 参与 作用 。 虽 和 然 这 两 种 细胞 都 专 一 地 参与 抗原 的 识别 , 但 只 有 B 细胞 才 分 化 为 抗体 分 泌 细 胞 。 抗体 效 价 | 20 ESR 次 级 反应 AF 初级 和 次 级 抗体 反应 。 动物 在 受到 一 个 抗原 的 初次 刺激 后 ， 要 经 过 一 个 迟滞 期 才能 产生 抗体 ， 并 且 抗 体 的 类 别 是 IE M, 称 为 初级 抗体 反应 。 如 果 再 次 注射 同一 个 抗原 ,抗体 便 立 即 迅速 增高 ， 并 且 主 要 是 IgG， 呈现 次 级 抗体 反应 的 特点 (图 3) 。 这 一 现象 称 为 免疫 记忆 (Immuno- » 8 «6 logical memory), 其 发 生 的 原因 是 由 于 在 初级 反应 时 ,接受 过 抗原 刺激 的 一 部 分 小 淋 巴 细胞 转化 为 记忆 细胞 (Memory cells) 保存 下 来 。 当 这 些 细胞 再 次 受到 同一 抗原 刺 激 时 ， 它 们 便 迅 速 增生 分化， 并 产生 大 量 抗 体 。 免 疫 记 忆 是 淋巴 细胞 的 重要 特性 。 动物 接受 抗原 刺激 后 的 免疫 反应 进程 ,可 以 设想 分 为 三 个 时 期 ,初始 期 、 中 央 期 和 效 应 期 。 各 时 期 的 关系 和 特点 分 述 如 下 (图 4) : 1. 初始 其 主要 是 抗原 和 小 淋巴 球 表面 的 抗原 受 体 专 一 地 结合 ， 从 而 激活 这 些 细胞 。 这 一 时 其 还 包括 巨 咽 细 胞 吞 唆 和 处 理 抗原 , 并 把 处 理 过 的 抗原 提供 给 淋巴 细胞 。 2. 中 央 其 包括 T，B 细胞 (Bai) 间 的 相互 作用 以 及 同体 液 因子 抗体 等 ) 的 相互 作 A, 其 结果 决定 免疫 反应 的 类 型 (抗体 反应 或 免疫 耐 受 性 ) ， 并 引起 淋巴 细胞 的 增生 和 分 化 ， 产生 对 抗原 起 专 一 反应 的 回忆 细胞 和 效应 细胞 (抗体 分 论 细 胞 或 致 敏 的 工 细胞 ) 。 3. 效应 期 这 一 时 期 不 再 依赖 抗原 的 作用 。 在 上 一 时 期 受到 抗原 专 一 的 刺激 而 增生 的 B 细胞 的 抗原 网 状 内 皮 系统 a 始 fs 网 状 内 皮 抗原 刺激 细胞 扩 增 ; T 和 了 B 细 胞 的 协同 作用 ; 工 和 B (| “记忆 细胞 和 效应 细胞 的 产生 中 央 期 图 4 免疫 反应 进程 的 三 个 时 期 。 后 裔 ， 分 化 成 浆 细 胞 ， 合 成 和 分 刻 抗 体 。 这 些 专 一 的 抗体 对 抗原 ( 靶 细胞 ) 的 作用 还 需要 血清 中 一 类 称 为 补体 的 因子 参加 。 补 体能 被 与 细胞 表面 结合 的 抗原 抗体 复合 物 激活 ， 产 生 溶 细胞 作用 。 此 外 , 补体 激活 过 程 中 产生 的 中 间 产 物 , 还 能 吸引 和 激活 白血球 ， 引 起 炎 症 反 应 , 扩大 专 一 抗体 的 效应 。 另 一 方面 , 致 敏 的 T 效 应 细胞 除去 直接 攻击 靶 细 胞 外 , 还 能 产生 多 种 可 溶性 因子 (包括 迁移 抑制 因子 , 促 分 裂 因 子 ， 转 移 因 子 , 淋巴 毒素 , 化 学 吸引 因子 等 ) ， 总 称 为 淋巴 激动 素 (Lymphokines), 作用 于 巨 鸣 细 胞 、 白 血球 等 其 他 细胞 ， 扩大 细胞 介 导 免疫 的 效应 。 分 子 水 平 的 抗原 抗体 反应 ,通过 免疫 效应 系统 (补体 ， 淋 巴 激 动 素 和 白血球 等 ) 的 放大 , 始 呈 现 为 各 种 宏观 的 免疫 现象 。 对 抗原 反应 的 专 一 性 ， 记 忆 和 效应 的 放大 是 兰 椎 动物 的 免疫 反应 的 主要 特点 。 (四 ) 免疫 反应 的 调节 和 遗传 控制 对 于 同一 抗原 , 不 同 物种 或 品系 的 动物 , 甚至 同一 品系 的 不 同 个 体 的 免疫 反应 可 能 是 不 同 的。 动物 对 一 个 抗原 以 何 种 方式 起 反应 ,一 方面 是 受 遗 传 基础 决定 的 , 另 一 方面 还 受 体液 和 细胞 因素 之 间 的 复杂 的 相互 作用 的 制约 。 抗 原本 身 的 质 和 量 在 免疫 反应 的 调节 中 也 起 重要 的 作用 。 1. 免疫 反应 的 调节 由 于 抗原 是 发 动 淋 巴 球 增生 和 分 化 的 专 一 因素 ， 抗 原 的 有 效 浓度 也 就 是 免疫 反应 的 一 个 主要 的 调节 因素 。 当 抗原 在 体内 被 酶 降解 ， 或 被 产生 的 抗体 中 和 ( 封 阻 ) 时 ， 随 着 抗 原 浓度 的 下 降 , 维持 免疫 反应 的 能 力也 就 逐渐 减弱 。 抗原 和 抗体 之 间 存 在 的 这 种 反馈 机 fill, 限制 了 抗体 的 过 量 产生 。 了 细胞 在 免疫 反应 的 调节 中 占据 着 中 心 位 置 。 除 去 T 辅助 细胞 能 加 强 B 细 胞 的 搞 = © Z 5 免疫 反应 的 调节 。 体 反应 外 ， 有 许多 证 据 表 明 还 存在 一 个 起 抑制 作用 的 亚 群 ，T 抑制 细胞 。 例 如 ， 小 鼠 注 射 大 量 羊 红血球 造成 无 免疫 反应 性 。 将 这 种 动物 的 开 细胞 转移 到 正常 小 鼠 时 ， 就 能 抑制 专 一 的 抗体 的 形成 。 将 年 青 的 新 西 兰 小 黑 鼠 (NZB) 的 胸腺 细胞 注射 到 年 老 患 病 的 小 黑 鼠 ， 能 抑制 自身 抗体 的 产生 。 此 外 ，T 细胞 又 可 能 被 其 他 T 细 胞 或 B 细 胞 抑 制 。 | — UAE AREES—ORERTABRED . — PKI K AUR GE RE TT RESELL, HUI RTARO ROAR. DTEEAK AO tk EE 抗 抗体 。 如 此 反复 作用 ,产生 多 重 的 抗体 和 抗 抗 体 , 构成 一 个 复杂 的 网 络 ， 控 制 着 淋巴 球 的 扩 增 和 抗体 的 产生 (Jerne，1973) 。 免疫 反应 调节 中 细胞 因素 和 体液 因素 相互 制约 的 复杂 关系 可 用 简 图 表示 (图 5)'s 2. 免疫 反应 的 遗传 控制 免疫 反应 受到 非 专 一 的 和 专 一 的 遗传 因子 的 控制 。Biozzi (1972) ENR LEG 逃 择 交配 实验 , 选 育 出 对 许多 种 抗原 的 抗体 反应 高 低 不 同 的 两 个 品系 。 这 两 不 品系 的 小 鼠 的 巨 叹 细 胞 “处 理 ” 抗 原 的 能 力 不 同 。 反 应 能 力 高 的 品系 的 巨 叹 细 胞 表面 能 保持 较 多 的 完 整 的 抗原 分 子 , 从 而 保持 较 大 的 免疫 原 性 。 对 专 一 抗原 的 免疫 反应 受到 两 类 基因 的 控制 ,一 类 是 同 免疫 球 蛋白 基因 连锁 的 , 另 一 类 是 同 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 (MHC) 连锁 的 。 ~ 在 一 些 情形 下 ， 如 用 C 型 链球 菌 免 疫 家 免 时 ， 能 产生 均一 的 抗体 ( 单 株 抗体 ) 。 遗 忧 分 析 证 明 产生 单 株 抗体 的 能 力 及 这 种 抗体 的 个 体型 专 一 性 是 同 该 免疫 球 蛋白 C 区 的 遗传 标 记 连 锁 的 。 这 就 是 说 在 带 有 抗体 的 基因 的 同一 条 染色 体 上 也 可 能 存在 编码 抗体 了 区 的 基因 上。 高 等 脊椎 动物 和 异体 组 织 排斥 有 关 的 移植 =Biozzi /INR” CG) MHC 连锁 ”抗原 主要 是 受 染 色 体 上 的 一 个 称 为 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 (MHC) 的 基因 座 控制 的 。 有 人 | 发 现 对 许多 种 胸腺 依赖 抗原 的 免疫 反应 是 受 同 MHC 连锁 的 基因 专 一 地 控制 的 。 这 一 类 专 一 的 免疫 反应 基因 (Ir 基因 ) 不 影响 B 细胞 对 非 胸腺 依赖 抗原 的 反应 ， 但 能 影响 对 胸腺 依赖 搞 原 的 反应 。 它 们 可 能 是 通过 控制 B 细胞 、T 细 胞 和 巨 噬 细 胞 产生 同 细胞 相互 作用 有 关 的 、 带 有 Ia 抗原 专 一 性 的 因子 而 起 作用 的 。 简 言 之 , 和 Ig 连锁 的 免疫 反应 基因 是 控制 B 细胞 的 ， 而 和 MHC 连锁 的 免疫 反 应 基因 骨 图 6 免疫 反应 的 遗传 控制 。 是 控制 了 细胞 、B 细胞 和 巨 叹 细 胞 的 相互 作用 因子 的 (图 6) 。 . 6 . (五 ) 免疫 反应 的 方式 成 体 动物 对 抗原 的 反应 有 多 种 方式 ,诱导 抗体 形成 IgM, IgG, IgA 或 IgE) 、 细 胞 免疫 或 免疫 耐 受 性 。 正 常情 形 下 ， 机 体 对 病源 微生物 或 其 他 不 利 因素 发 生 免 疫 反应 〈 循 环 抗体 或 细胞 免疫 ) ， 对 抗 感染 或 中 和 抗原 ,起 着 有 利 的 保护 作用 。 然 而 ， 在 一 些 特殊 条 件 下 ,机 体 对 抗原 (或 能 与 抗原 结合 的 简单 分 子 ) 的 反应 性 增高 而 造成 有 害 影 响 这 种 由 抗 原 专 一 地 引起 的 免疫 反应 性 的 改变 (通常 表现 为 反应 性 的 增高 ) 称 为 变态 反应 (Aller- Sy) 或 超 敏 反应 (Hypersensitivity), 如 某 些 敏感 的 人 对 花粉 、 含 有 螨 分 刻 物 的 侍 导 ， 引起 的 哮喘 ， 对 盘 尼 西林 等 药物 的 过 敏 等 。 超 敏 反应 按 其 发 病 潜伏 时 间 的 长 得 和 免疫 学 机 制 的 不 同 ， 又 可 分 为 速 发 型 超 敏 反应 (Immediate hypersensitivity) 和 迟 发 型 超 敏 反应 (Delayed hypersensitivity) 两 大 类 。 简 单 说 来 ,前 者 依赖 循环 抗体 , 可 经 血清 被 动 传递 ; 主要 作用 于 平滑 肌 和 血管 分 钟 内 就 能 呈现 反应 。 如 临床 上 常见 的 对 药物 的 过 敏 性 休克 便 属 于 这 一 类 型 。 后 者 主要 是 由 于 致 敏 的 T 细胞 对 靶 细 胞 作用 的 结果 ， 可 通过 淋巴 球 传递 ; ”呈现 反应 的 潜伏 时 间 长 , 约 需 1 一 3 天 或 更 长 时 间 。 如 对 结核 菌 素 的 反应 属于 这 一 类 型 (图 7)。 Be RB 抗原 抗原 5 分 钟 5 过 敏 性 休克 ( 喷 嘲 、 * a 3h LED ae ZZ 喘息 :惊厥 -死亡 ) 血清 Peed Finis CN eit LP 过 敏 性 休克 抗原 十 死 i 一 光一 aes ) SEL) 2 CSD wine Ls i ix 1 ass So CR) RSD) it A7 ， 速 发 型 和 迟 发 型 超 敏 反应 的 区 别 。 S 为 臻 敏 动物 ; N 为 未 臻 敏 动物 。 在 动物 胚胎 期 或 初生 期 引 人 组 织 抗原 或 可 溶性 抗原 ， 将 来 移植 同一 施主 的 组 织 或 注 射 同一 抗原 , 则 不 起 免疫 反应 ， 而 移植 或 注射 其 他 组 织 或 抗原 时 仍 能 起 反应 (图 8) 。 对 事 先 接触 过 的 抗原 能 专 一 地 不 起 免疫 反应 的 现象 ， 称 为 获得 免疫 耐 受 性 (Acquired im- munological tolerance) 。 成 体 动物 在 特定 条 件 下 ， 某 些 可 溶性 抗原 也 可 以 引起 免疫 耐 受 性 。 正常 情形 下 ， 机 体 不 对 “自我 ”的 组 织 抗 原 起 免疫 反应 。 如 果 机 体 的 免疫 自 稳 机 制 失 调 ,或 者 自身 组 织 抗原 发 生 了 某 种 改变 , 当 这 些 抗原 进入 体 流 环境 后 ， 便 可 能 被 免疫 活性 细胞 误 认 为 “ 非 自我 ”的 抗原 ， 这 些 受到 抗原 刺激 的 细胞 或 引起 的 抗体 就 会 对 相应 的 自身 组 织 起 反应 ,造成 免疫 损伤 ， 引 起 自身 免疫 病 (Autoimmune diesease), 过 去 许多 原 因 不明 的 疑难 病症 , 如 类 风 混 性 关节 炎 , 某 些 肾 小 球 肾 炎 、 红 斑 狼 疮 等 在 发 病 机 制 上 都 属 于 自身 免疫 病 。 迟 发 型 超人 敏 反应 对 照 注射 CBA 初生 的 A 品 系 Oss, ARs 同 胎 小 刀 成 年 移植 CBA 皮肤 植 片 Wee se ont 植 片 被 排斥 植 片 存活 8 免疫 耐 受 性 的 诱导 。A 品系 初生 期 小 鼠 注 射 CBA 小 鼠 细胞 后 对 CBA 皮肤 植 片 产 生 耐 受 性 。 由 上 述 可 见 ， 在 进化 过 程 中 形成 的 免疫 防御 机 制 对 动物 体 的 作用 是 “一 分 为 二 的 ”。 免疫 反应 在 对 抗 感染 ,消除 突变 细胞 一 一 肿瘤 免疫 等 方面 ， 对 负 体 是 有 利 的 :而 在 3 SE SRM. ARASH AMAA SN. 二 、 分 子 免 疫 学 的 范围 及 其 发 展 简 史 | 从 五 十 年 代 末 期 Burnet 提出 获得 性 免疫 的 无 性 细胞 繁殖 系 选 择 学 说 以 来 ,免疫 学 无 论 在 研究 的 广度 和 深度 方面 , 都 取得 了 迅速 的 扩大 和 次 和 人 的 进展 。 由 于 医学 实践 的 推 动 及 受到 分 子 生 物 学 和 细胞 生物 学 蓬勃 发 展 的 影响 ， 近 十 多 年 来 免疫 学 研究 远 远 超出 了 过 去 微生物 免疫 的 范围 , 扩大 到 了 移植 免疫 .肿瘤 免疫 、 生 殖 免疫 .寄生 虫 免疫 ， 以 及 细胞 分 化 、 遗 传 和 进化 等 广阔 的 医学 和 生物 学 领域 ,汇集 这 些 在 分 子 和 细胞 水 平 的 研究 形成 了 免疫 生物 学 。 在 细胞 水 平 的 研究 方面 , 胸腺 和 小 淋巴 球 功能 的 发 现 ,两 类 淋巴 球 功能 上 的 分 工 及 它们 在 抗体 形成 中 的 协同 作用 的 阐明 ,开辟 了 细胞 免疫 学 的 “黄金 时 代 ”。 同 时 ， 对 免疫 反应 的 分 子 基 础 的 研究 也 取得 了 重大 的 进展 ,形成 了 分 子 免疫 学 。 分 子 免疫 学 是 从 免疫 化 学 发 展 而 来 的 ， 是 现代 免疫 学 的 一 个 新 分 支 。 免 疫 化 学 主要 研究 抗原 和 抗体 及 其 相互 作用 , BARK RRTRKRKAEA 抗体 是 免疫 反应 的 关键 分 子 , 具有 识别 抗原 和 发 生效 应 (固定 补体 、 结 合 细胞 等 ) 两 类 功能 。 抗 原 抗体 反应 的 最 显著 特点 是 高 度 专 一 性 。 抗 体 分子 如 何 识别 成 和 于 上 万 结构 不 同 的 抗原 , 如 何 完成 对 抗原 或 靶 细 胞 的 效应 功能 ? 抗体 分 子 的 结构 和 功能 的 关系 , 以 及 和 抗 原 结合 专 一 性 的 结构 基础 ,抗原 抗体 反应 的 机 制 等 ,曾经 是 免疫 化 学 研究 的 中 心 课题 。 从 上 世纪 未 Emil von Behring 发 现 抗 体 以 来 ,抗体 的 研究 经 历 了 几 个 主要 的 发 展 阶段 。P. Ehrlich (1906) 采用 “ 锁 和 钼 ?的 假说 来 解释 免疫 反应 ， 设 想 抗 体 和 对 应 的 抗 原 之 间 的 结合 专 一 性 ， 依 赖 于 这 两 种 分 子 表面 构造 的 互补 性 。 抗 原 抗 体 分 子 结构 互补 的 思想 ,对 于 抗体 问题 的 研究 有 深远 的 影响 。 其 次 ，K. Landsteiner (1917) 对 已 知 化 学 构造 的 人 工 半 抗原 的 研究 ， 阐 明了 抗体 能 识别 分 子 构造 的 微小 差异 ， 并 且 证 明 对 于 各 种 . 8 . 各 样 的 抗原 ,机 体 都 能 相应 地 产生 专 一 的 抗体 。 三 十 年 代 末 ， 自 由 电泳 技术 建立 后 不 久 ， 就 证 明 抗 体 是 血清 丙种 球 蛋 白 ( 免 疫 球 蛋白 ) 。 然 而 ,关于 抗体 的 性 质 、 结 构 和 生物 合成 的 知识 , 主要 是 在 最 近 十 多 年 内 积 梨 起 来 的 。 五 十 年 代 未 期 ，N, Jerne 和 M. Burnet 提出 获得 侈 疫 性 的 无 性 细胞 系 选择 学 说 ， 主张 抗原 有 选择 地 和 免疫 活性 细胞 表面 的 抗原 受 体 结合 , 并 刺激 它 增生 、 分 化 成 为 一 群 浆 细胞 , 产生 结合 专 一 性 相同 的 抗体 。 抗原 选择 预先 存在 的 细胞 ， 而 不 是 象 L. Pauling 曾经 假定 的 那样 ， 作 为 一 个 模板 来 塑造 抗体 。 这 一 学 说 推动 了 抗体 研究 和 整个 免疫 学 的 飞跃 发 展 。 六 十 年 代 初 期 起 ， 及 . R. Porter 和 G. M. Edelman 对 抗体 分 子 的 两 条 肽 链 ( 重 链 和 轻 链 ) 及 其 酶 解 片段 的 结构 分 析 ; 阐明 了 抗体 分 子 的 一 般 结 构 原 理 。Bdelman(1969) 首先 完成 了 一 种 人 类 免疫 球 蛋白 eG.) 全 部 一 级 结构 的 测定 ， 并 在 一 级 结构 的 比较 研 究 基 础 上 ， 提 出 功能 区 学 说 来 解释 抗体 分 子 的 功能 分 化 以 及 遗传 和 进化 等 一 般 生物 学 问 题 。 于 是 , 便 开 创 了 免疫 化 学 发 展 的 新 时 期 一 一 分 子 免疫 学 。 此 后 ,分 子 免疫 学 发 展 十 分 迅速 。 已 经 先后 大 体 上 弄 清 楚 了 各 类 免疫 球 蛋 白 (包括 IgG, IgM, IgA, IgE) 的 一 级 结构 和 一 些 免疫 球 蛋白 的 立体 结构 ， 抗 原 结合 位 点 的 构造 ， 以 及 抗体 生物 合成 的 全 过 程 等 问题 。 在 抗原 研究 方面 ， 盖 明了 一 种 球 蛋 白 ( 肌 红 和 蛋白 ) 的 全 部 抗原 结构 ， 对 抗原 的 免 疫 原 性 和 抗原 专 一 性 结构 基础 已 有 深入 的 认识 ;核酸 的 抗原 性 得 到 证 实 ; 细胞 表面 抗原 (血型 抗原 组织 相 容 性 抗原 .肿瘤 相关 抗原 等 ) 的 研究 也 有 很 大 进展 尤其 引 人 注 目的 是 ， 抗原 的 改造 和 人 工 合成 抗原 的 研究 ,为 人 工 合成 高 效 和 广 谱 的 疫苗 开 如 了 广阔 的 前 景 。 另 一 方面 ,细胞 免疫 学 的 蓬勃 发展 ,也 为 分 子 免疫 学 提供 了 许多 新 概念 和 新 间 题 。 从 七 十 年 代 起 , 分子 免 疫 学 加 强 了 和 细胞 免疫 学 的 相互 渗透 ,研究 领域 已 超出 了 体液 免疫 范 国 , 并 深入 到 对 淋巴 细胞 的 研究 。 当 前 发 展 的 新 趋向 是 以 淋巴 细胞 为 中 心 , 从 分 子 水 平 研 究 淋巴 细胞 对 抗原 的 识别 .激活 和 效应 放大 的 机 制 ,而 核心 问题 又 是 淋巴 细胞 的 分 化 和 激 活 过 程 中 ， 信 和 号、 受 体 和 基因 表达 问题 。 最 近 , 应 用 遗传 工程 技术 分 析 免疫 球 蛋 白 基 因 的 结构 取得 了 重要 进展 。 抗 体 多 样 性 起 源 的 遗传 控制 问题 ， 已 从 理论 上 的 探讨 进入 到 实验 验证 阶段 。 总 之 ,分 子 免疫 学 正在 和 细胞 免疫 学 融合 起 来 , 对 淋巴 细胞 的 识别 机 制 、 抗 体 合成 .抗体 多 样 性 起 源 的 遗传 控制 和 分 子 进化 等 基本 生物 学 问题 ,进行 深入 研究 。 目 前 新 的 现象 不 断 发 现 ， 新 的 领域 不 断 开拓 。 这 些 方面 的 研究 必然 会 促进 对 于 细胞 的 一 般 识 别 机 制 , 真 核 细胞 的 基因 表达 ,生物 大 分 子 合成 的 遗传 控制 等 基本 生物 学 问题 的 进步 。 同 时 ， 分 子 免疫 学 这 些 基 本 理论 研究 成 果 也 必然 会 加 深 对 移植 免疫 .肿瘤 免疫 .变态 反应 和 自身 免疫 病 等 重大 医学 问题 的 认识 ， 并 促进 其 解决 。 Burnet, F, M. (1969). Self and not-self、Cellular Immunology, Melbourne and Cambridge University Press. Hobart, M. J. and McConnell, I. (1975). The Immune System: a course on the molecular and cellular basis of immunity, Blackwell Scientific Publications, Oxford. Jerne, N. K. (1973). The Immune System (Network theory), Scientific American, 229, 52. Roitt, I. M. (1977). Essential Immunology, 3rd edition Blackwell Scientific Publications, Oxford. 第 一 篇 ”抗原 : 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 根据 Landsteiner (1945) 的 定义 ,抗原 是 能 在 动物 体内 引起 抗体 的 产生 , 并 能 和 抗 体 起 反应 的 物质 。 对 于 同一 抗原 ,不 同 的 物种 ,甚至 同 种 不 同 的 个 体 ,引起 的 免疫 反应 也 可 能 不 同 。 免 疫 反 应 不 只 是 决定 于 抗原 的 化 学 构造 ,还 决定 于 个 体 的 反应 能 力 ( 遗 传 性 和 生 理 状 态 ) 。 引 入 抗原 途径 、 剂 量 和 佐 剂 的 应 用 也 有 很 大 的 影响 。 因 此 ， 近 来 常用 免疫 原 性 (Immunogenicity) 这 个 概念 来 概括 抗原 对 有 反应 能 力 的 个 体 引起 免疫 反应 的 能 力 ， 而 用 抗原 专 一 性 (Antigenic specificity) 来 表示 抗原 和 抗体 起 反应 的 能 力 。 相 应 地 ， 一 个 抗原 ,就 其 诱发 免疫 反应 的 能 力 来 说 , 又 可 称 为 免疫 原 (Immunogen), 一 个 免疫 原 的 免疫 原 性 实际 上 涉及 所 引起 的 免疫 反应 的 类 型 (体液 抗体 .细胞 免疫 或 免疫 耐 受 性 )、 抗 体 的 种 类 以 及 反应 强度 等 方面 。 免 疫 反应 的 主要 特点 是 抗原 抗体 反应 的 高 度 专 一 性 。 这 种 专 一 性 是 基于 抗原 的 化 学 结构 , 即 整个 抗原 分 子 的 空间 构象 以 及 局 部 某 些 基 团 (抗原 决定 #% Antigenic determinant) 的 特性 。 总 之 ,抗原 的 免疫 学 功能 即 抗原 性 (Antigenicity ) 包括 两 个 方面 : 即 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 。 免 疫 原 性 是 引起 免疫 反应 的 能 力 ,而 与 形成 的 抗体 的 专 一 性 是 不 同 的 概念 。 抗 原 专 一 性 是 抗体 的 结合 位 点 性 质 的 反映 ,是 由 抗原 分 子 ， 或 其 一 小 部 分 和 已 形成 的 抗体 反应 的 能 力 确定 的 。 不 过 ， 有 时 也 用 抗原 性 来 泛 指 抗原 和 抗体 的 反应 能 力 。 免疫 学 早期 研究 中 ,常用 的 大 多 数 抗原 是 颗粒 性 抗原 , 如 病毒 .细菌 、 红 面 球 等 ;也 有 一 些 可 溶性 抗原 , 如 细菌 和 动 植物 的 毒素 。 后 来 发 现 其 中 有 免疫 原 性 的 成 分 主要 是 蛋白 质 或 复合 蛋白 质 ( 糖 蛋白 、 脂 蛋白 、 或 糖 脂 蛋 白 ), 也 有 一 些 为 多 糖 。 近 来 还 证 实 核酸 也 有 免疫 原 性 。 脂 类 本 身 并 无 免疫 原 性 ,但 能 和 相应 的 抗体 起 专 一 的 反应 。 能 和 抗体 起 反应 ， 但 不 能 引起 免疫 反应 的 简单 分 子 称 为 半 抗 原 (Hapten) 。 天 然 抗原 几乎 都 是 大 分 子 \ 含 有 许多 个 抗原 决定 簇 ,构造 复杂 ,难于 分 析 研 究 。 用 已 知 化 学 构造 的 简单 分 子 ( 半 抗原 ) 和 蛋白 质 载 体 〈Carrier) 或 人 工 合成 的 多 聚 氨 基 酸 结合 做 成 的 人 工 抗原 ,对 抗原 专 一 性 和 免疫 原 性 之 分 子 基 础 的 分 析 研 究 ,曾经 起 过 很 大 的 推动 作用 。 本 篇 主要 讨论 对 于 正常 成 体 动物 , 人工 和 天 然 抗原 (蛋白 质 . 多 糖 .核酸 等 ) 的 化 学 结 构 和 物理 性 质 与 其 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 的 关系 , 即 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 的 分 子 基础 。 然后 再 简略 地 谈 一 些 影响 机 体 对 抗原 反应 的 因素 ,如 佐 剂 作用 原理 、 动 物 遗 传 性 和 反应 能 力 等 方面 的 问题 。 细 胞 表面 抗原 涉及 血型 .移植 免疫 和 肿瘤 免疫 等 方面 的 问题 ,近年 来 受 到 很 大 注意 ,也 将 专列 一 章 讨论 。 第 一 章 “” 人 工 抗原 和 天 然 抗 原 ZAMS ran Ae ee OR 抗原 抗体 反应 最 显著 的 特点 是 作用 的 高 度 专 一 性 。 抗原 专 一 性 的 分 子 基础 是 什么 ? 由 于 天 然 蛋白 质 结构 的 复杂 性 , 有 多 个 决定 簇 ,难于 分 析 。 这 方面 的 知识 最 先是 靠 Land- steiner 创始 的 在 抗原 蛋白 质 上 连结 已 知 结构 的 简单 分 子 的 实验 得 到 的 〈Landsteiner， 1945). (一 ) 人 工 结合 蛋白 质 的 专 一 性 Landsteiner (1917) 把 一 个 预备 作为 决定 得 的 简单 分 子 连 接 到 芳香 族 胺 类 , MAR 分 子 上 ， 然 后 重 氮 化 ， 再 通过 栈 氨 酸 残 基 与 蛋白 质 结合 ， 形 成 的 产物 称 为 结合 蛋白 质 (Conjugated protein) ,或 偶 氮 蛋白 质 (Azoprotein), SO;H SO,H ¢ | + HNO, => 2 + 2H,0 Gi) oie of NHtcl- N=Ntcl- AZAR : BRCERE OH SO;H OH VA H8—9 Z\N_NenNe O + Nag) ca Nees pe Gi) | N=Ntcl- CH, Oo CH, "i H Hi | Pome ake oi +--— N—CH—cC—--- BARZMABRE 偶 氮 葵 磺 酸 蛋白 质 〈 红 或 棕色 ) 这 样 用 人 工 方法 结合 到 蛋白 质 上 的 简单 分 子 起 着 半 抗 原 的 作用 , 与 之 结合 的 蛋白 质 OF, 称 为 载体 蛋白 质 (Carrier protein), 为 了 研究 半 抗 原 的 免疫 学 专 一 性 和 其 化 学 结构 的 关系 , 并 避免 载体 蛋白 质 的 干扰 ，Landsteiner 建立 了 一 种 免疫 学 测定 法 ， 将 马 血清 白 蛋 白 的 偶 氮 衍生 物 作 为 抗原 注射 到 家 免得 到 抗 血 清 。 然 后 用 与 同一 偶 氮 衍生 物 结 合 的 鸡 血清 白 蛋 白 作 为 测定 抗原 , 和 家 免 抗 血清 作 沉 淀 反应 。 由 此 避免 了 和 马 血 清白 蛋 白 的 交叉 反应 。 利 用 这 样 的 实验 系统 证 明 抗 半 抗 原 抗体 具有 高 度 的 免疫 学 专 一 性 。 L. 半 抗 原 专 一 性 Landsteiner 在 最 初 的 一 系列 实验 里 用 这 样 的 方法 证 明 ， 所 基 茶 磺 酸 的 三 个 同 分 异 构 物 , 当 重 须 化 后 和 和 蛋白质 结合 时 , 在 血清 学 上 能 够 互相 区 别 : SO;H SO,H San a ee Py a : Hhr- BAAR Alir- (BRA EM 3 it- BRA ERE 利用 类 似 方法 几乎 可 以 把 任何 所 需 基 团 连 结 到 蛋白 质 分 子 上 。 例如 ， 可 把 酒石酸 的 光学 异 构 物 (d-,1-) 分 别 和 对 硝 基 葵 胺 缩合 ,经 重 氮 化 再 连接 到 和 蛋白质 载体 上 ， 以 研究 其 免疫 学 专 一 性 ,结果 证 明 d-, 和 ]- 酒石酸 可 以 在 血清 学 上 区 分 开 来 ( 表 1-1). 表 1-1 RERORXRMHSRSARKRRS—-EHVM 抗原 : 含 下 列 半 抗原 HAR mm- 酒 石 酸 (分子 内 消 旋 )》 COOH 为 含 下 列 物质 的 | HCOH 偶 氮 蛋白 质 的 抗 | HCOH 血清 沉淀 : | COOH [- 酒 石 酸 - 3h -酒石酸 + m- 酒 石 酸 十 十 十 i RASA 3} - SRA RE iT CEERI) 图 1-1 t-PA RAMAN EMRAOTAARAURERREA A. 分 子 外 形 上 相似 的 半 抗原 ( 反 丁 烯 二 酰 茉 胺 酸 ) 和 抗体 有 很 强 的 交 又 反应 , 另 一 半 抗 原 ( 顺 丁 烯 二 酰 苯胺 酸 ) 只 有 很 弱 的 交叉 反应 - 这 清楚 地 表示 了 半 抗 原 基 团 和 结合 位 点 在 空间 互补 上 的 密 合 程度 的 重要 ( 据 Pauling, 1948), es 12 。 同样 地 , 对 顺 式 和 反 式 异 构 物 也 能 区 别 。 如 卵 白 蛋 白 - 对 - 偶 氮 琥 珀 酰 葵 胺 酸 之 抗 半 抗原 抗体 , 和 偶 氮 反 丁 烯 二 酰 葵 胺 酸 半 抗 原 有 很 强 的 交叉 反应 ,而 和 偶 氮 顺 丁 烯 二 酰 葵 胺 酸 半 抗原 只 有 很 弱 的 交叉 反应 (图 1-1) 。 这 清楚 地 表明 交叉 反应 的 程度 是 由 半 抗 原 决定 簇 和 抗体 结合 位 点 之 间 空 间 互 补 的 密 合 程度 决定 的 。 研究 半 抗 原 化 学 结构 和 免疫 学 专 一 性 的 关系 的 另 一 种 方法 是 利用 半 抗 原 和 抗原 竞争 抗体 的 结合 位 点 ， 从 而 抑制 抗原 和 抗体 的 沉淀 反应 。 例 如 各 种 低 分 子 量 的 P- ART 生物 能 竞争 性 抑制 具有 P- 偶 氮 葵 砷 酸 衍生 物 决 定 簇 的 结合 蛋白 质 和 其 抗体 的 反应 (A 1-2) 。 这 请 楚 地 证 明 抗体 分 子 只 和 抗原 表面 的 一 定 化 学 基 团 起 反应 , 而 不 是 和 整个 大 分 子 表面 起 反应 。 抗 原 抗 体 结合 位 点 可 能 不 超过 10—-15A 大 小 。 抗体 半 抗 原 抗体 - 半 抗 原 复 合 物 Y} 凝集 反应 统 体 - 半 搞 抗原 原 复合 物 1-2 示 半 抗原 抑制 抗体 抗原 反应 的 原理 ( 据 Boyd, 1962), 决定 簇 的 形状 和 稳固 性 与 其 免疫 学 专 一 性 有 密切 的 关系 。 如 前 述 ， 光 学 异 构 物 可 以 互相 区 别 , 而 烃 链 长 短 对 专 一 性 影响 就 很 小 , 这 是 因为 烃 链 在 溶液 中 没有 稳固 的 构象 。 含 对 - 偶 氮 茜 甲 酸 的 结合 蛋白 质 也 可 以 和 含 环 已 烷 \ 唆 吟 . 蔡 的 偶 氮 蛋 白质 起 交叉 反应 。 H, oO = | H, H, VD IN pitied Daeg balie ls hulk 一 H; H, SS VV H, 偶 氨 茶 甲 酸 Ko ke ENG} cS 所 有 这 些 实验 表明 ,抗原 ( 偶 氮 结合 蛋白 质 ) 的 免疫 学 专 一 性 主要 依赖 于 分 子 表面 决定 簇 的 形状 和 稳固 性 。 此 外 , 增加 半 抗 原 的 极 性 基 团 可 以 增强 免疫 原 性 。 用 以 上 方法 还 可 以 在 一 个 蛋白 质 载体 分 子 上 结合 两 个 半 抗 原 。 免 疫 时 可 以 引起 两 种 e bs @ 抗体 ,每 一 种 抗体 只 能 与 一 种 半 抗 原 结 合 。 例 如 羊 血 清 球 蛋白 先 与 偶 氮 砷 酸 结合 , 然后 再 碘 化 。 这 种 结合 抗原 可 引起 两 种 不 同 的 抗体 。 其 中 一 种 可 以 被 碘 化 的 卵 白 蛋白 沉淀 ， 另 一 种 可 被 偶 氮 砷 酸 卵 白 蛋白 况 淀 。 这 表明 抗原 大 分 子 当 有 两 个 以 上 决定 得 时 ， 每 一 决定 伐 可 引起 专 一 性 不 同 的 抗体 。 抗 原 有 两 个 以 上 的 决定 簇 时 ,总 的 免疫 原 性 就 增高 。 2. 载体 效应 (Carrier effect) 结合 抗原 诱导 的 免疫 反应 中 , 抗体 的 专 一 性 虽然 依赖 于 半 抗 原 决定 簇 , 但 是 整个 载体 蛋白 质 大 分 子 对 于 抗体 反应 的 性 质 和 量 也 是 有 影响 的 。 如 用 一 个 结合 蛋白 质 《〈 半 抗原 A+ 载 体 A) 免疫 动物 ,所 产生 的 抗 半 抗 原 A WAR SK, GEM SUA) 加 另 一 载 体 (B) 的 结合 蛋白 质 起 反应 。 但 是 ,如果 用 半 抗 原 (A) 加 另 一 载体 (B) 来 第 二 次 免疫 此 动物 时 , 并 不 能 刺激 次 级 免疫 反应 。 此 时 , 半 抗 原 A 的 抗体 反应 仍 呈 现 初 级 免疫 反 应 的 特点 。 也 就 是 说 , 虽然 半 抗 原 A (决定 专 一 性 的 部 分 ) 没 有 改变 , 而 只 是 载体 (B) 不 同 于 初级 反应 中 所 用 的 载体 (A) ,结果 半 抗 原 (A) 的 抗体 产生 也 会 受到 改变 载体 的 影响 。 这 一 现象 称 为 “载体 效应 ”。 此 外 ，DNP 半 抗 原 和 无 免疫 原 性 的 载体 结合 时 ， 不 能 诱导 抗 体形 成 ;如 改变 为 和 另 一 个 有 免疫 原 性 的 载体 结合 进行 免疫 时 , 就 能 产生 半 抗 原 专 一 的 抗 体 。 这 一 实验 进一步 提示 , 免疫 活性 细胞 对 载体 决定 簇 的 识别 是 诱导 体 牙 抗体 的 产生 以 及 对 半 抗 原 决 定 簇 本 身 识别 的 必要 前 提 。 许多 实验 表明 ， 载 体 效应 是 抗体 形成 中 两 类 淋巴 球 协 同 作用 的 结果 。 家 兔 用 对 氮 基 ARR-BSA 初级 免疫 后 ， 再 用 同一 结合 抗原 免疫 时 便 能 产生 很 强 的 对 氮 基 茶 磺 酸 的 次 级 抗体 反应 。 如 果 次 级 免疫 时 载体 改 用 HGG， 就 不 发 生 次 级 抗体 反应 。 在 后 一 情形 下 ， 如 果 家 免 在 次 级 免疫 几 周 以 前 曾经 单独 用 HGG 免疫 ,也 能 产生 很 好 的 对 半 抗 原 的 次 级 抗 体 反 应 (Rajawsky 等 ,1969) 。 这 一 类 实验 表明 诱导 半 抗 原 抗体 形成 , 可 能 需要 不 同 的 淋巴 球 分 别 对 载体 决定 复 和 半 抗 原 决 定 得 起 相互 作用 ,并 且 这 两 种 相互 作用 对 半 抗 原 抗体 的 产生 都 是 必需 的 。 在 用 不 同 的 结合 抗原 或 载体 继承 免疫 过 的 小 鼠 淋巴 球 离 体 实 验 中 , 发 现 被 结合 抗原 (NIP-BSA) 致 敏 过 的 淋巴 球 , 当 用 和 另 一 载体 结合 的 结合 抗原 (NIP-CGG) 刺激 时 ,不 能 产生 显著 的 免疫 反应 。 但 是 ,如 果 同 时 加 和 经 过 另 一 载体 CGG 致 敏 过 的 细 胞 (辅助 细胞 ) 时 ， 就 有 明显 的 半 抗 原 抗 体形 成 。 对 于 这 同一 个 离 体 系统 ,用 对 工 细 胞 专 一 的 抗 6 血清 处 理 经 过 载体 致 敏 的 辅助 细胞 时 , 抗 半 抗 原 抗 体 的 产生 便 显著 地 下 降 , 而 用 抗 6 血清 处 理 NIP-CGG 致 敏 过 的 细胞 (抗体 形成 细胞 ) 则 没有 明显 的 影响 (Raff, 1970). 这 一 实验 和 其 他 类 似 的 实验 〈Roelants 和 Askonas, 1971; Rittenberg 和 Bullock, 1972), 都 发 现 和 载体 决定 簇 起 反应 的 细胞 似乎 对 抗 6 血清 敏感 , 因而 可 能 是 工 细 胞 ,而 产 生 半 抗原 抗体 的 细胞 则 不 敏感 ， 可 能 是 了 细胞。 总 之 ,载体 效应 的 发 现 是 对 抗体 形成 中 两 类 淋巴 球 协同 作用 的 有 力 的 支持 。 可 以 假定 了 工 细 胞 的 抗原 受 体 带 有 载体 专 一 性 ,而 了 细胞 的 抗原 受 体 带 有 半 抗 原 专 一 性 , 因而 整个 抗体 反应 在 总 体 上 也 就 呈现 出 载体 效应 了 。 载体 效应 涉及 免疫 学 的 许多 重要 理论 问题 ， 将 陆续 在 以 后 有 关 的 章节 中 讨论 。 关 于 载体 效应 的 一 般 论 述 可 参考 Benacerraf 等 (1970) 的 综述 。 3. 半 抗 原 和 药物 过 敏 半 抗 原 蛋 白质 结合 物 的 研究 有 助 于 解释 一 些 化 学 品 和 药物 过 敏 现象 。 火 药 厂 工 人 接 。14 。 NN ee ye 触 三 硝 基 葵 甲 硝 胺 , 这 种 炸药 的 苦味 酸 基 团 易 与 皮肤 蛋白 质 结合 而 引起 过 敏 反应 。 葵 胺 类 染料 , 甚至 低 分 子 量 的 醇 都 可 以 对 某 些 敏感 的 人 引起 过 敏 反应 。 药 物 过 敏 是 临床 常见 的 现象 。 如 一 种 镇 静 剂 司 眼屎 (Sedormid) 能 和 血小板 络 合 ,引起 抗 血小板 抗体 而 造成 血 小 板 缺 乏 性 紫 疤 症 。 对 红血球 有 亲 合 力 的 药物 引起 的 咨 血性 贫血 以 及 药物 诱发 的 白血球 减少 症 都 是 属于 这 种 性 质 的 。 和 常用 退 热 药 阿 斯 匹 林 对 一 些 敏 感 病人 也 能 引起 严重 变态 反 应 。 另 一 种 退 热 药 氨基 上 比 林 也 可 在 一 些 人 引起 严重 的 过 敏 性 休克 ,并 且 过 敏 状 态 可 经 血 祖传 递 。 抗 生 素 类 药物 ,如 几 种 四 环 素 都 可 能 引起 速 发 型 变态 反应 。 临 床上 最 常见 并 可 能 造成 死亡 的 是 对 青霉素 的 过 敏 反应 。 这 可 能 是 由 于 青霉素 转变 成 青霉素 酸 和 体内 蛋白 质 结 合 而 引起 的 。 此 外 ， 发 酵 过 程 中 产生 的 青霉素 酰 蛋白 质 杂 质 也 可 能 是 引起 过 敏 的 原 A. 目前 假定 脂 溶 性 药物 引起 过 敏 的 机 制 的 第 一 步 是 先 经 细胞 内 微粒 体 酶 转变 ， 然 后 再 和 体内 蛋白 质 结合 成 抗原 引起 变态 反应 (Smaster，1971) (图 1-3) 。 9 S ie. AREAS ok R 一 C 一 N 一 C 一 C C(CH;,), O 一 去 烷 基 化 | ss a — C——N—CH—COOH 青霉素 N 一 羟基 化 1 O As | HERBAL b 六 侧 链 氧 化 等 eb es Ee C(CH;), | RC C N—CH—COOH #B3## | \o/No Ft H H ee ule aa 一 C 一 N 一 C 一 C C(CH;), “TURRER’ 5AAR 1 | \ 第 二 相 Di OC N 一 C 一 COOH 蛋白 共 价 结合 三 抗原 | H-*“H N—H | | sank 抗体 V v 抗体 免疫 损伤 y 《根据 半 抗 原 和 载体 蛋 SPEAR NEM, 白质 的 性 质 、 免 疫 学 神经 血管 性 水 肿 ， 类 型 .部 位 而 不 同 ) 过 敏 性 休克 以 致死 亡 胞 内 微粒 体 酶 转变 后 和 体内 蛋白 质 结 合 引起 药物 过 敏 反应 的 矶 制 ( 据 Smaster, 1971), 图 1-3 脂 溶 性 药物 经 I (=) 人 工 合成 多 聚 氨 基 酸 的 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 WA PRAT AA EA TU RA HS RAB: pn R—CH | — | R—CH + nCO, = ere SS N 一 C 一 O NH Sela 实验 室 关 于 人 工 合成 多 聚 氮 基 酸 的 系统 性 研究 ,对 于 了 解 蛋 白质 免疫 原 性 和 抗 原 专 一 性 的 构造 基础 有 重要 的 理论 意义 (Sela，1969,，1970，1972，1973), 其 结果 简 述 uF: 1. 免疫 原 性 的 分 子 基 础 各 种 氮 基 酸 聚 合 物 的 系统 研究 证 明 ， 毛 基 酸 的 直线 单一 聚合 物 (Linear homopo- lymer) 没有 免疫 原 性 。 已 知 明 胶 ( 胶 原 的 部 分 水 解 产 物 ) 也 是 弱 的 免疫 原 。 然 而 ， 如 果 把 芳香 族 环 氮 基 酸 ( 酷 氨 酸 、 色 氮 酸 和 茶 丙 氮 酸 ) 或 胱 氨 酸 的 单一 聚合 物 与 明胶 的 s= 赖 氮 酸 结合 作为 免疫 原 时 , 便 能 引起 对 多 聚 栈 氨 酸 、 多 聚 色 氮 酸 和 多 聚 苯 丙 氨 酸 等 的 大 量 抗 体 。 多 聚 甘 氨 酸 、 多 聚 丙 氨 酸 、 多 聚合 氮 酸 、 多 聚 赖 氮 酸 、 多 聚 丝氨酸 等 则 无 此 种 增强 免疫 原 性 的 作用 。 虽然 这 些 芳香 环 氨基 酸 可 加 强 合成 多 聚 氮 基 酸 的 免疫 原 性 ,但 不 是 绝对 不 可 缺少 的 。 谷 所 酸 和 赖 氮 酸 各 自 的 单一 聚合 物 无 免疫 原 性 , 而 谷 氨 酸 和 赖 氨 酸 的 混合 聚合 物 则 有 免 疫 原 性 。 如 果 再 加 入 少量 酷 氮 酸 残 基 时 , 免疫 原 性 还 要 增加 ;加 入 少量 丙 氨 酸 残 基 时 ， 也 有 这 样 的 作用 。 因 此 ,多 聚 氮 基 酸 的 免疫 原 性 随 组 成 氨基 酸 的 多 样 性 和 不 均一 性 的 增 加 而 增加 。 光学 异 构 物 对 免疫 原 性 也 有 很 大 的 影响 。 d- 氮 基 酸 多 聚 物 和 1- 氮 基 酸 多 聚 物 的 免 疫 原 性 有 显著 的 不 同 。 过 去 用 d- 氮 基 酸 多 聚 物 进 行 的 免疫 动物 的 实验 都 没有 得 到 正 结 果 。 后 来 才 发 现 这 并 不 是 由 于 d- 氨 基 酸 多 聚 物 本 身 没 有 免疫 原 性 ， 而 是 由 于 实验 ARE 不 合适 。 d- 氮 基 酸 多 聚 物 5 引 起 抗体 的 能 力 依赖 于 所 用 的 剂量 。 每 只 小 鼠 最 大 有 效 剂量 为 1 微克 ， 超 过 此 剂量 就 引起 免疫 耐 受 性 , 而 不 是 产生 抗体 。 d- 氮 基 酸 多 聚 物 免 疫 原 性 的 这 一 特性 可 能 和 它 不 易 被 代谢 降解 有 关 。 多 聚 氮 基 酸 的 免疫 原 性 不 但 和 抗原 决定 簇 的 化 学 结构 有 关系 ， 而 且 依 赖 于 这 些 决定 簇 在 载体 分 子 上 的 空间 位 置 。 对 各 种 结构 的 氮 基 酸 聚 合 物 的 系统 研究 证 明 ， 抗 原 决 定 簇 在 分 子 表面 的 外 露 ,因而 能 与 免疫 活性 细胞 接近 , 对 于 产生 免疫 反应 是 有 决定 意义 的 。 如 图 1-4 所 示 ， 三 种 合成 的 又 链 多 聚 氮 基 酸 的 结构 不 同 ， 免 疫 原 性 也 不 同 。 图 1-4a, oR -d，1- 丙 氮 酸 连结 到 多 聚 -1- 束 氮 酸 骨架 上 形成 叉 链 构 造 ， 在 又 链 的 末端 再 连结 上 强 抗 原 Rie Tyr, Glu 残 基 。 在 这 样 的 构造 上 ， 抗 原 决 定 簇 外 露 在 分 子 表 面 ， 易 于 接近 ， 因 (b) 图 1-4 三 种 合成 的 又 链 多 聚 氨 基 酸 ( 据 Sela, 1966), e16e HH NERS 而 表现 为 很 强 的 免疫 原 。 图 1-4b, 交换 了 多 聚 -d，1- 丙 氨 酸 和 Tyr, Glu 残 基 的 相互 位 置 , 原来 的 强 抗原 决定 入 Tyr, Glu 移 到 分 子 内 部 和 多 聚 赖 氮 酸 骨架 直接 相连 ， 并 被 外 露 的 多 聚 丙 氨 酸 掩盖 。 结 果 这 种 构造 便 失 去 免疫 原 性 , 不 能 引起 抗体 。 图 1-4c 中 ， 多 聚 -1- 赖 氮 酸 骨架 被 换 成 多 聚 丙 氨 酰 赖 氨 酸 骨架 。 由 于 侧 链 只 能 和 赖 氨 酸 残 基 相 连 , 结果 侧 链 间 的 距离 扩大 了 。 Glu, Tyr 虽 仍 留 在 分 子 内 部 ,但 有 可 能 被 接近 。 这 种 构造 又 能 引 起 抗体 了 。 因 此 , 抗原 决定 簇 在 分 子 表面 上 外 露 ,能 被 免疫 活性 细胞 接近 是 免疫 原 性 的 必 2. RR RE RIA 利用 人 工 合成 的 多 聚 氨 基 酸 可 以 精细 地 测量 抗原 决定 簇 的 大 小 。 例 如 ,用 1- 丙 氨 酸 的 2 肽 、3 肽 等 一 系列 的 短 肽 来 抑制 多 聚 -1- 丙 氨 酸 和 其 抗体 的 沉淀 反应 。 抑 制程 度 随 短 肽 链 长 的 增加 而 增加 , 5 一 6 肽 时 达到 最 大 值 。1- 丙 氮 酸 5 肽 的 大 小 约 为 25 xl11x6.5A。 这 可 能 相当 于 多 聚 -1- 丙 氮 酸 抗原 决定 簇 大 小 的 上 2o0 限 。 尤其 有 兴趣 的 是 ， 有 人 把 多 聚 -d- 赖 氮 酸 和 磷 { 酸化 牛 血清 白 蛋 白 混 合 后 加 佐 剂 和 注射 家 免 。 于 是 抗 体形 成 系统 便 受 到 和 抗体 的 结合 位 点 的 假定 的 大 小 比较 起 来 要 长 几 百 倍 的 抗原 (650 1ys 残 基 ) 的 刺激 。 可 是 产生 的 抗体 仍 受 赖 氮 酸 5 肽 最 大 程度 地 抑制 。 5 肽 以 上 , 链 长 继续 增加 ,抑制 程度 不 再 增加 (图 1- 5) (Kabat, 1966). 经 这 样 测定 得 到 的 几 种 人 工 合成 多 聚 氨 基 酸 抗 BRR ERA KA WLR 1-2。 此 外 ,用 类 似 方法 , 在 多 聚 -d- 丙 氮 酸 系统 还 证 HA, IgG 和 IgM 的 结合 位 点 大 小 相似 , 都 相当 于 4 肽 的 大 小 。 利用 类 似 方法 还 可 以 进一步 探讨 抗原 决定 徐 和 抗体 结合 位 点 细微 的 空间 互补 关系 。 例 如 , 用 (d- Ala)n, (n=2 325); (d-Ala)n Gly, (n=1 到 EPS Ne ae 4); (d-Ala)n-Gly---g#EB (n=1 到 3) 等 链 长 一 系列 长 短 不 同 的 合成 短 肽 半 抗 原来 抑制 Rama 50% Ina Be Ala) nGly (n=1 到 4)- 载 体 蛋 白质 与 其 同型 的 半 。 需 d- 赖 氨 酸 短 肽 的 量 ( 据 Kabat，1966)。 抗原 抗体 间 的 沉淀 反应 。 结 果 发 现 , 丙 氨 酸 的 4 肽 就 能 产生 最 大 抑制 。 在 这 一 系统 中 , 抗 原 决 定 簇 大 小 的 上 限 似 略 小 于 上 表 列 举 的 数据 。 特 别 值得 注意 的 是 d-Ala-G1y-s- 氮 基 己 酸 对 此 抗原 抗体 系统 的 抑制 要 比 ”(〈d-Ala),G1y-s- 氮 基 已 酸 要 有 效 得 多 。: 若 假定 抗 体 的 结合 位 点 可 细 分 为 几 个 亚 区 (S, 到 S,) ， 每 一 亚 区 适合 一 个 特定 的 氨基 酸 残 基 ， 如 Si 亚 区 适合 于 半 抗 原 的 NH, 末端 残 基 ,， 于 是 便 可 以 解释 上 述 观 察 了 。 d-Ala-Gly-e- 氨基 已 酸 能 与 结合 位 点 完全 密 合 地 互补 (图 1-6a); (d-Ala)。G1y-s- 氮 基 已 酸 和 前 者 在 构造 上 唯一 的 区 别 是 多 了 一 个 Ala 和 残 基 , 但 由 于 第 二 个 Ala 残 基 缺 少 游离 的 o- 基 ， 和 Si 亚 基 在 空间 上 不 能 密 合 (图 1-6b) ， 从 而 影响 了 整个 抗原 决定 簇 和 抗体 的 结合 ~ e AZ se 15 f 4 上 50%2 抑 制 所 需 之 mAM 位 点 的 结合 。 因 此 前 者 的 抑制 能 力 要 比 后 者 强 很 多 。 表 1-2 几 种 抗原 决定 徐 估 测 大 小 i OR hE R 大 小 (&A) 分 子 量 beside ott SOLE Mo UBC ein 6 REA 36% 106 792 SRAABR+MIBABA 5S RRAB 2a KT Woey 373 SREMABRGRBABA 5 (或 6) 聚 赖 氨 酸 2T SII 665 659 多 聚 赖 氨 酸 磷酸 牛 血 请 白 蛋 白 «Ss RRR a 2d SA SAO 659 CH,0 O | H | HH H H H f° 人 HNZ H HH 和 NO 和 (a) CH; O CH O (b) 图 1-6 对 d-Ala-Gly- e- 氨基 已 酸 抗原 决定 簇 之 抗体 的 结合 位 点 。 结合 位 点 包括 4 个 亚 基 (《S: 一 S0)， 每 一 亚 基 适合 于 决定 簇 的 特定 部 分 : Si=d—Ala ( 含 游离 <- 氨基 ) 之 NH, 末端 S,=Gly RH; S3S4= 6 -氨基 已 酸 之 羧基 端 。 (a) 代表 d-Ala-Gly- 6 -氨基 已 酸 多 肽 与 结合 位 点 之 空间 互补 关系 。 (Cb) 代表 〈d-Ala):-Gly- e 氨基 已 酸 多 肽 与 结合 位 点 在 空间 上 不 配合 ( 据 Sela, 1969), 3. 抗原 专 一 性 和 空间 构象 的 关系 。 顺 序 决定 答 和 构象 决定 往 利用 具有 不 同 的 空间 构象 的 人 工 合成 多 聚 氨 基 酸 来 研究 抗原 专 一 性 和 空间 构象 的 关 系 , 得 到 很 有 理论 价值 的 结果 。 Sela (1967) 合成 下 列 具有 不 同 构象 的 、 均 含有 Tyr- Ala-Glu 3 肽 的 聚合 物 : 1)Tyr-Ala-Glu 3 肽 连接 到 又 链 多 聚 丙 氨 酸 - 赖 氨 酸 上 ,形成 一 个 缺少 有 规则 螺旋 结构 的 多 聚 物 ( 简 称 为 TAG-L); 2) Tyr-Ala-Glu 的 高 分 子 量 聚 合 物 , 简称 为 (TAG)n， 具 有 o- 螺 旋 构 象 ,并 和 胶 原 的 构象 有 些 相似 (图 1-7) 。 多 聚 物 TAG-L 和 (TAG)Pn 对 家 兔 都 能 引起 大 量 抗体 形成 ,但 TAG-L 和 (TAG)n 之 间 在 免疫 学 上 无 交叉 反应 。 TAG, (TAG), FEAR HHS VHS Ew TAG-L 与 其 同型 抗体 的 免疫 反应 ,而 不 能 抑制 有 w- 螺 旋 构 象 的 多 聚 物 (TAG)n 和 其 同型 抗体 的 ° 18 « Tyr Ala Glu | <_£-d ,二 - 丙 氨 酸 (Tyr Ala Glu)n 一 一- 一 所 多 来 -!- 赖 氨 酸 《分子量 王 100,000，c- 螺 旋 ) Glu Ala Tyr (4-F H=75,000, XH) 1-7 ALS RN XS RAM, Hh Tyr-Ala-Glu SKE RF XE-SR-DI-RAM-S R-I- 赖 氨 酸 之 侧 链 的 末端 ( 左 )*(CTyr-Ala-Glu) 3 kz ASHES RM CGE Sela, 1969), 反应 。 (TAG)。 对 (TAG)。 抗 原 抗 体系 统 也 只 有 弱 的 抑制 作用 ,而 (TAG),, (TAG), 则 为 有 效 的 抑制 物 。 因此 , 假定 只 有 具 cc- 螺旋 构象 的 (TAG), 构造 才 能 和 抗 (TAG), 抗体 起 反应 。 这 要 求 或 者 这 些 多 肽 ，(TAG)， 和 (TAG), 在 生理 条 件 下 具有 c=- 螺 旋 构象 ,或 者 虽然 缺少 这 种 构象 ,但 在 和 抗体 的 结合 位 点 相互 作用 时 ,能 获得 这 种 构象 。 圆 二 AHMAR, (TAG), 4 (人 mn =7， 风 =9,。…… 叱 =13) 时 ,都 只 含有 很 少 的 cc- 螺旋 构 象 。 然而 ， 当 多 肽 (TAG),。 和 抗 (TAG) 抗体 相互 作用 时 ，c- 螺 旋 含 量 就 显著 增加 (Schechter 等 ,1971) 。 也 就 是 说 , 这 些 多肽 在 和 抗体 结合 位 点 相互 作用 时 , 发 生 构 象 转 化 〈Transconformation)， 成 为 适合 于 一 定 空间 构象 的 决定 簇 。 另 一 方面 , 具 ac- 螺旋 构 象 的 多 聚 物 (TAG)。 的 抗 血 清 能 和 几 种 动物 的 胶原 起 交叉 反应 ， 也 说 明 (TAG), Hit 原 专 一 性 对 wx- 螺旋 构象 的 依赖 。 总 之 ， 这 些 实验 清楚 地 证 明 多 聚 物 (TAG), 的 抗原 专 一 性 依赖 于 分 子 特定 的 空间 构象 * 而 不 是 依赖 于 肽 链 的 一 级 结构 顺序 。 这 种 依赖 空间 构象 的 决定 往 , 称 为 构象 决定 徐 (Confonmational determinant), 反之 ,多 聚 物 TAG-=-L 的 抗原 专 一 性 只 依赖 于 其 一 级 结构 顺序 。 因 此 , 又 可 称 为 顺序 决定 簇 (Sequential determinant), Sela 还 进 一 步 认为 ,构象 决定 簇 可 能 是 位 于 伟 展 的 肽 链 上 相距 很 远 的 几 个 残 基 , 或 位 于 不 同 肽 链 上 的 几 个 残 基 , 由 于 抗原 大 分 子 内 肽 链 的 盘 曲 而 在 空间 上 彼此 靠近, 共同 组 成 的 。 因 此 ， 其 专 一 性 依赖 于 抗原 大 分 子 整体 或 局 部 的 空间 构象 。 抗 原 大 分 子 的 空间 构象 改变 ， 专 一 性 也 随 之 改变 。 顺 序 决 定 簇 只 依赖 于 肽 链 的 一 级 结构 顺序 ,其 专 一 性 不 随 分 子 构象 的 改变 而 改变 。 这 些 概念 对 于 了 解 天 然 蛋白 质 的 抗原 专 一 性 对 其 各 级 空间 构象 的 依赖 关系 是 很 重 要 的 。 4. 细胞 免疫 和 体液 免疫 多 又 氨基 酸 也 可 以 作为 简单 分 子 ( 半 抗原 ) 的 载体 , 而 使 半 抗 原 成 为 真正 的 抗原 。 例 i, 多 聚 -1- 酷 氨 酸 (本 身 无 免疫 原 性 ) , 当 它 和 重 氮 化 氨基 茶 磺 酸 结 合 后 , 就 获得 很 好 的 免 疫 原 性 。 这 样 一 类 低 分 子 量 的 合成 免疫 原 列 于 表 1-3 内 。 免 疫 原 性 的 强度 ， 以 及 所 引起 的 免疫 反应 的 类 型 (细胞 免疫 或 体液 免疫 ) 与 多 聚 氮 基 酸 载体 分 子 的 链 长 有 关系 。 如 把 重 AACR A THRE HE) 3 聚 -1- 酷 氮 酸 或 6 聚 -1- 酷 氨 酸 ， 得 到 的 产物 没有 诱导 体液 抗体 形成 的 能 力 ,但 仍 能 诱导 迟 发 型 超 敏 反应 。 不 过 ， 这 些 低 分 子 量 的 合成 抗原 ,加 Freund 佐 剂 时 , 仍 能 引起 体液 抗体 。 Ben-Efram (1971) 对 a-DNP-(l-lys)n 合成 抗原 系统 的 实验 还 请 楚 地 表明 免疫 原 性 对 链 长 (?) 的 依赖 关系 ， 并 提示 无 论 在 免疫 原 性 或 抗原 专 e D9 e 表 1-3 一 些 低 分 子 量 的 合成 免疫 原 化 合 物 分 +. 量 免疫 的 动物 a-— TRE A-7 聚 -1- 赖 氨 酸 1,080 豚鼠 P- 偶 氨 苯 砷 酸 -6 聚 -1- 酷 氨 酸 1,200 豚鼠 , 免 P- 偶 氮 苯 砷 酸 -3 聚 -1- 酷 氨 酸 750 RR» 免 P- 偶 氮 苯 砷 酸 -N- 乙 酰 -1- 栈 氨 酰 胺 450 PER P- 偶 氮 苯 砷 酸 -N- 乙 酰 -L- 酷 氨 酸 451 豚鼠 一 性 方面 ,细胞 免疫 和 循环 抗体 对 载体 的 要 求 都 是 不 同 的 ,诱导 或 皮 试 时 引起 细胞 免疫 反 应 所 要 求 的 载体 链 长 都 比较 短 。 最 后 , 还 应 提 到 合成 抗原 的 构象 对 细胞 免疫 同样 是 重要 的 。 含 Glu, Lys, Tyr 的 直 链 多 聚 物 和 又 链 多 聚 物 在 迟 发 型 超 敏 反应 上 , 没有 交叉 反应 。 用 多 聚 -(Pro-G1y-Pro) 的 有 规则 的 排列 顺序 的 多 聚 物 致 敏 动物 , 当 用 (Pro, Gly) 的 无 规则 排列 的 多 聚 物 作 皮 TARY, 也 没有 交叉 反应 。 5. 免疫 原 的 总 电荷 对 于 P- 偶 氮 葵 砷 酸 抗体 和 结合 抗原 系统 的 研究 发 现 ,免疫 原 的 总 电荷 和 诱导 的 抗 体 的 总 电荷 呈 反 比 ,并 且 这 是 依赖 整个 免疫 原 分 子 的 总 电荷 ,而 不 是 依赖 半 抗 原 决定 簇 附 近 的 局 部 电荷 ,这 一 现象 称 为 总 电荷 反比 效应 。 在 不 同 物种 ,如 家 免 . 小 鼠 和 山羊 ,以 及 不 同 类 别 的 抗体 ,IEG、IgM 和 Ig 卫 , 均 得 到 证 实 。 如 酸性 的 白喉 类 毒素 的 抗体 和 带 负 电荷 的 合 成 多 聚 氮 基 酸 的 抗体 ,经 Deae-Sephadex 层 析 分 离 时 ,都 主要 在 第 一 个 峰 内 出 现 ;而 碱 性 溶菌 酶 的 抗体 和 带 正 电 和 荷 的 合成 多 聚 氨 基 酸 的 抗体 主要 在 第 二 个 峰 内 出 现 (Sela，1971; 1973) 。 抗 DNP 半 抗 原 抗 体 的 电荷 性 质 (出 现在 第 一 个 峰 或 第 二 个 峰 ) 同样 取决 于 和 半 抗原 相连 的 载体 分 子 的 总 电荷 。 和 电荷 不 同 的 载体 连接 的 结合 抗原 ， 免 疫 产生 的 抗 半 抗 原 抗 体 的 总 电荷 不 同 ,但 对 半 抗 原 的 结合 专 一 性 和 亲 合 力 并 没有 不 同 。 这 说 明 抗 体 总 电 荷 的 差异 应 局 限于 其 结合 位 点 以 外 的 部 分 。 这 些 实验 还 提示 ， 载 体 的 电荷 对 形成 的 抗体 的 总 电荷 有 影响 ,并且 免 疫 原 是 以 完整 的 大 分 子 形式 和 免疫 活性 细胞 相互 作用 的 。 RIL, 进一步 前 明了 抗原 抗体 总 电荷 反比 效应 的 细胞 基础 .已 知 玻璃 珠 表面 是 酸性 的 〈 带 负电 荷 ), 因此 , 当 用 这 种 玻璃 珠 过 滤 脾 脏 细 胞 时 , 表面 偏 碱 性 ( 带 正 电荷 ) 的 细胞 便 被 吸附 ， 而 表面 偏 酸性 ( 带 负 电荷 ) 的 细胞 较 易 通过 。 理 论 上 ， 经 玻璃 珠 过 滤 的 细胞 ， 较 易 于 和 碱 性 的 免疫 原 ( 带 正 电 荷 ) 相互 作用 。 经 过 往 射线 照射 的 小 鼠 ， 接 种 不 同 数量 的 、 经 过 不 同 处 理 的 同 基因 型 的 脾脏 细胞 , 然后 再 用 酸性 免疫 原 DNP-901[ 多 聚 (Tyr, Glu, Lys) ] ,或 碱 性 免疫 原 DNP-912[ 多 聚 (Tyr，Glu，Lys)J 免 疫 。 当 用 经 过 玻璃 珠 过 滤 的 脾脏 细胞 接种 时 ,能 和 DNP-901 (酸性 载体 ) 反应 的 细胞 被 吸附 去 除了 ， 而 能 和 DNP- 912( 碱 性 载体 ) 反应 的 细胞 数目 却 没 有 改变 。 结 果 产 生 的 抗 DNP 抗体 的 总 电荷 是 负电 性 的 。 反之 ， 玻 璃 珠 表 面 镀 一 层 碱 性 的 多 聚 -1- 赖 氮 酸 时 ， 则 能 选择 地 吸附 表面 较 酸性 的 细胞 。 结 果 经 过 这 种 玻璃 珠 过 滤 的 细胞 ,对 碱 性 DNP-912 的 反应 显著 减少 , 而 对 酸性 DNP-901 的 反应 却 没有 变化 。 这 些 实验 清楚 地 证 明 荷 电 的 免疫 原 倾向 于 选择 能 合成 电 . 荷 相 反 的 抗体 的 淋巴 细胞 。 按照 两 类 细胞 协同 作用 的 假说 , 体液 抗体 的 形成 中 ,需要 了 淋巴 细胞 和 也 淋巴 细 胞 « 20. < ea 的 合作 。 于 是 就 可 以 提出 一 个 问题 ,免疫 原 抗体 电荷 反比 效应 是 与 那 一 类 细胞 有 关系 。 用 玻璃 珠 过 滤 的 胸腺 细胞 (IT 细胞), 加 未 分 离 的 骨 散 细胞 (B 细胞 ) ， 这 样 的 细胞 混合 物 对 DNP- 酸 性 载体 的 抗 半 抗 原 抗 体 反 应 降低 ， 而 对 PNP- 碱 性 载体 的 半 抗 原 抗 体 反 应 却 没 有 改变 。 反 之 ,经 过 玻璃 珠 过 滤 的 骨髓 细胞 (B 细胞 ) ， 加 未 分 离 的 胸腺 细胞 CT 细胞 )， 这 样 的 细胞 混合 物 , 无 论 对 DNBP- 酸 性 载体 或 DNP- 碱 性 载体 的 抗 半 抗原 抗体 反应 都 设 有 变化 。 另 一 方面 ,利用 镀 多 聚 -1- 赖 氮 酸 的 玻璃 珠 分 离 T，B 细胞 的 类 似 实验 ， 也 证明 用 分 离 的 胸腺 细胞 和 未 分 离 的 骨髓 细胞 混合 时 , 对 碱 性 免疫 原 的 抗体 反应 降低 , 而 对 酸性 免疫 原 的 反应 不 降低 。 同 样 地 , 分 离 的 骨 骨 细 胞 和 未 分 离 的 胸腺 细胞 混合 时 , 对 于 酸性 或 碱 性 免疫 原 的 抗体 反应 都 没有 改变 (Karniely 等 ,1973) 。 以 上 这 些 实验 结果 证 明 总 电荷 反比 现象 的 细胞 基础 是 和 胸腺 细胞 (T 细胞 ) 有 关 的 。 不 同 的 了 细胞 可 能 选择 总 电荷 不 同 的 免疫 原 。 总 电荷 反比 效应 实质 上 是 一 个 典型 的 载体 效应 , 它 不 涉及 半 抗 原 决定 徐 和 抗体 结合 位 点 本 身 。 附带 提 到 , 新 近 , 用 两 个 只 是 在 N 端 侧 链 的 氨基 酸 顺 序 有 差别 的 合成 多 聚 物 在 缺少 T 细胞 的 动物 上 做 的 实验 发 现 ， (Tyr-Tyr-Glu-Glu)- 多 聚 (D，L-Ala)- 多 聚 - (L- Lys) 要 依赖 工 细胞 才能 引起 抗体 ， 而 (ITyr-Glu-Tyr-Glu)- 多 聚 -(D,L-Ala)- 2% (L-Lys) 则 无 需 依 赖 了 细胞 的 辅助 就 能 引起 抗体 。 因 此 ， 这 两 种 多 聚 物 由 于 端 侧 链 顺序 的 某 种 不 同 , 独 立地 引发 B 细胞 反应 的 能 力也 有 不 同 (Schwartz “, 1976). 总 结 起 来 ,合成 多 聚 氮 基 酸 的 研究 表明 ,抗原 的 免疫 原 性 依赖 于 分 子 表面 外 露 的 某 些 氨基 酸 残 基 ( 主 要 是 酷 氮 酸 、 色 毛 酸 、 共 丙 氨 酸 等 ) 。 氮 基 酸 分 子 组 成 的 不 均一 性 也 可 以 增 加 免疫 原 性 。 光 学 异 构 对 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 有 很 大 影响 。 足 够 大 小 的 分 子 量 是 强 免 疫 原 性 的 重要 条 件 , 但 某 些 分 子 量 很 小 (450 一 1,000) 的 半 抗 原 多 聚 氮 基 酸 也 能 引起 免 疫 反应 。 抗 原 的 专 一 性 不 但 决定 于 分 子 表面 决定 往 的 性 质 和 数目 ,而 且 决定 于 分 子 的 空 间 构象 。 抗 原 决 定 簇 按 其 性 质 , 依赖 多 肽 一 级 结构 顺序 或 抗原 大 分 子 的 空间 构象 ,区 分 为 分 子 顺 序 决 定 往 和 构象 决定 簇 两 大 类 。 细 胞 免疫 和 体液 免疫 所 要 求 的 抗原 结构 可 能 有 不 同 。 这 些 结果 ， 以 及 研究 方法 对 于 探讨 天 然 蛋 白质 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 的 结构 基础 提供 了 很 有 价值 的 借鉴 。 此 外 , 这 些 研究 对 于 免疫 反应 能 力 的 遗传 基础 、. 耐 受 性 、 载 体 效 应 和 抗 原 竞争 现象 等 免疫 学 基本 问题 都 有 开创 性 的 贡献 ,将 在 有 关 章 节 再 作 讨论 。 如 上 所 述 ， Bee ae 但 毕竟 只 是 模拟 性 实验 。 更 为 重要 的 发 展 方向 应 当 是 按照 天 然 蛋 白质 分 子 已 知 的 一 级 结构 和 抗原 构造 ， 合成 含有 天 然 抗 原 的 一 定 的 抗原 决定 簇 的 人 工 合成 抗原 。 oN ea ee 一 新 的 科学 理想 ,只 有 在 对 天 然 蛋白 质 分 子 的 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 的 结构 基础 有 比较 透彻 的 了 解 后 , 才 可 望 实现 。 二 、 蛋 白质 抗原 天 然 蛋 白质 注射 到 各 种 糊 椎 动物 体内 ， 便 能 引起 抗体 的 合成 。 这 些 抗 体能 专 一 地 和 蛋白 质 分 子 表面 构造 的 确定 区 域 , 即 抗原 决定 簇 起 反应 。 同 时 ,一 个 异 源 蛋 白质 除 能 诱导 PBA ABO 抗体 外 , 还 可 能 专 一 地 诱导 细胞 免疫 反应 。 所 有 和 蛋白质 或 许 都 可 能 有 免疫 原 性 , 不 过 个 别 蛋白 质 免 疫 原 性 的 强 弱 可 能 差别 悬殊 。 同 样 地 , 虽然 一 个 异 源 蛋白 质 能 同时 9 21 e B Sh Rink MAAR. 对 于 不 同 的 蛋白 质 ,所 引起 的 这 两 种 免疫 反应 的 相对 强度 也 可 能 差别 很 大 。 大 量 实验 事实 提示 ,蛋白质 的 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 不 仅 决定 于 分 子 表 面 的 局 部 构象 以 及 抗原 决定 簇 的 性 质 和 数目 , 而且 还 依赖 于 它们 的 空间 排 布 , 即 整 个 大 分 子 的 构象 。 免 疫 原 性 和 抗原 专 一 性 在 分 子 构造 上 的 要 求 亦 有 所 不 同 ， 并 且 诱 导体 液 免疫 或 细胞 免疫 部 分 地 也 依赖 于 蛋白 质 分 子 构造 的 区 别 。 例 如 ,一 般 说 来 , 变性 蛋白 质 的 免疫 原 性 要 比 相应 的 天 然 蛋 白质 低 ; 蛋白 质 的 物理 状态 (聚集 ) 对 抗原 专 一 性 几乎 没有 影响 , 然而 对 免疫 原 性 却 有 很 大 的 影响 ;对 于 某 些 多 又 体 抗原 〈 如 细菌 的 鞭毛 素 ) ， 分 子 的 聚合 程度 〈 单 体 或 多 聚 体 ) BY BE VT $e Bz YS EI IE) 。 本 节 将 讨论 天 然 蛋白 质 和 多 肽 的 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 与 分 子 结构 的 关系 。 详 细 的 文献 综述 可 参考 Borek (1972), Parish 和 Ada (1972), Benjamine 等 (1972) Atas- si (1973; 1975), Crumpton (1974) 和 Reichlin (1975), 为 了 和 氢 述 方便 , 先 谈 抗原 专 一 性 ,然后 再 谈 免 疫 原 性 的 分 子 基础 。 (—) 蛋白 质 的 分 子 结构 和 抗原 专 一 性 蛋 白 质 的 抗原 专 一 性 和 其 各 级 结构 都 可 能 有 关系 。 为 便于 了 解 , 先 简略 地 介绍 一 下 蛋白 质 结 构 的 基本 概念 。 ~ 1. 蛋白 质 的 四 级 结构 蛋白 质 是 由 氨基 酸 分 子 首尾 相连 形成 的 多 肽 链 构成 的 , 氨基 酸 残 基 的 数目 和 顺序 决 定 蛋 白质 的 一 级 结构 (图 1-8a) 。 肽 链 按 螺 旋 形 盘 曲 , 圈 与 圈 之 间 主 要 靠 氨 键 维系 固 定 ， 为 蛋白 质 的 二 级 结构 〈 图 1-8b) 。 由 于 氮 基 酸 残 基 侧 链 间 的 相互 作用 ， 螺 旋 又 按 一 定 的 方式 折 登 盘 曲 ,为 三 级 结构 (图 1-8c) 。 天 然 蛋 白质 分 子 可 能 由 几 条 相同 的 或 不 同 的 肽 链 组 成 。 这 几 条 盘 绕 的 肽 链 又 可 按 一 定 的 空间 关系 结合 起 来 ,组 成 复杂 的 分 子 , 为 四 级 结构 (图 1-8d) 。 此 外 ， 蛋 白质 分 子 还 可 以 和 脂 类 、 核 酸 、 多 糖 等 结合 起 来 ,或 者 携带 较 小 的 其 他 基 团 , 如 金属 离子 和 维生素 、 核 背 酸 等 辅 基 , 更 增加 了 结构 的 复杂 性 。 一 个 蛋白 质 分 子 的 天 然 构 象 (Conformation) 是 由 共 价 键 或 非 共 价 键 维系 的 。 这 些 作 用 力 保证 肽 链 按 一 定 的 空间 秩序 排 布 成 稳定 的 形态 , 而 不 致 成 为 一 个 率 乱 的 线 团 。 共 价 键 中 最 重要 的 是 二 硫 键 , 它 能 把 一 条 多 肽 链 的 不 同 部 分 连接 起 来 (如 核糖 核酸 酶 或 盗 菌 酶 ) ,或 者 把 不 同 的 多 肽 链 连 接 起 来 (如 胰岛 素 、 免 疫 球 蛋白 ) 。 胰 岛 素 、 免 疫 球 蛋 自 等 不 仅 有 和 链 间 二 硫 键 , 同 时 还 有 链 内 二 硫 键 。 非 共 价 键 包括 氢 键 、 离 子 键 以 及 臣 水 性 相互 作 用 ， 蛋白 质 分 子 和 溶剂 间 的 相互 作用 。 此 外 , 蛋白 质 分 子 的 天 然 构 象 ,就 四 级 结构 而 论 ， 还 受 - 金属 离子 和 辅 基 的 影响 。 总 之 ,一 个 天 然 蛋 白质 分 子 的 结构 是 由 所 有 这 些 键 共同 来 BF 的 , 维持 二 级 结构 和 三 级 结构 的 键 也 就 是 维持 多 肽 链 之 间 的 结合 (四 级 结构 ) 的 键 。 但 是 ， 归根 结 蒂 蛋 白质 分 子 的 空间 构象 是 由 一 级 结构 决定 的 。 蛋白 质 按 其 分 子 形状 和 结构 可 分 为 两 大 类 : 球 蛋白 和 纤维 蛋白 。 球 蛋白 的 轴 比 较 小 ， 分 子 的 多 肽 链 通过 ac- 螺 旋 、p8- 折 县 和 非 螺 旋 方式 ， 盘 曲 成 球形 或 椭 球 形 。 纤 维 蛋 白 的 轴 比 大 , 只 具有 a- 螺 旋 、p8- 折 有 登 或 三 股 螺旋 等 三 种 构象 中 的 一 种 构象 ,分 子 往往 由 许多 重 履 单位 相连 成 长 棒状 。 球 蛋白 在 物理 的 或 化 学 的 因素 (如 高 温 、 过 酸 和 过 碱 ) 以 及 浓 尿 素 、 wi 22 8 CO G 1 (FQ o 图 1-8 蛋白 质 各 级 结构 模型 图 。 (2) DRAW (6b) 二 级 结构 (<- 螺 旋 )。 (c) 三 级 结构 ( 肌 红 肌 )。 Cd) 四 级 结构 (血红 蛋白 )o。。 和 白色 表示 eH; 灰色 表示 B 链 ; 黑 圆 盘 表 示 正 铁血 红 素 ; CUNARAARe BNC Nia. GE Niederwieser 和 Pataki，1971)。 ° 叫 、 硫 酸 十 二 烷 基 钠 等 解 离 剂 的 影响 下 , 盘 曲 的 多 肽 链 伸展 ,失去 分 子 的 天 然 构 象 , 而 发 生 变性 。 和 蛋 昌 质 分 子 的 固定 构象 对 其 生物 学 功能 是 很 重要 的 。 由 于 多 肽 链 按 一 定 方式 盘 曲 ， 多 肽 链 间 的 连结 和 结合 而 保持 固定 的 空间 形态 , 同一 条 多 肽 链 上 不 同 地 点 的 或 不 同 多 ik 链 上 的 氮 基 酸 残 基 可 能 彼此 靠近 , 并 按 一 定 的 图 式 分 布 在 分 子 表面 ,组 成 特定 的 局 部 构 象 ,担任 特定 的 生物 学 功能 (如 酶 .激素 的 活性 中 心 , 抗体 结合 位 点 等 ) 。 作 为 抗原 来 说 , 这 种 特定 的 局 部 构象 就 是 抗原 决定 簇 或 表 位 (Epitope), 因此 ,蛋白 质变 性 或 改变 个 别 残 基 的 侧 链 时 ,分 子 的 整个 或 局 部 构象 因而 改变 或 破坏 ,其 生物 学 功能 (就 抗原 而 论 即 抗 原 ° 23 a8 性 ) 也 就 随 之 改变 或 破坏 。 这 一 概念 对 于 了 解 蛋白 质 的 抗原 专 一 性 是 很 重要 的 。 2. 蛋白 质 各 级 结构 和 抗原 专 一 性 的 关系 大 多 数 蛋 白质 都 是 具有 复杂 结构 的 大 分 子 。 蛋 白质 的 一 级 结构 (多 肽 链 的 氨基 酸 FE 列 顺序 ) 从 根本 上 决定 了 分 子 的 空间 构象 和 分 子 形状 。 抗 原 之 专 一 的 免疫 学 功能 主要 依 赖 于 分 子 表面 的 某 些 化 学 基 团 一 一 决定 得 的 性 质 ,数目 和 空间 排 布 图 式 。 抗 原 决定 Kw 择 地 和 某 些 免疫 活性 细胞 表面 的 抗原 受 体 结合 , 从 而 决定 将 来 形成 的 抗体 的 专 一 性 。 注 射 提纯 的 (化 学 上 均一 的 ) 蛋白 质 抗原 ,总 产生 不 同 的 (不 均一 的 ) 抗 体 。 造 成 这 一 现象 的 部 分 原因 是 由 于 蛋白 质 分 子 表 面 有 许多 不 同 的 决定 往 , 因而 诱导 出 在 质 和 量 上 都 不 同 的 各 种 抗体 。 能 诱导 出 高 浓度 的 专 一 抗体 的 决定 簇 ， 称 为 "免疫 优势 的 ”( Immunodomi- nant”); 无 效力 的 称 为 “免疫 静止 的 ”( “Immunosilent?) 。 天 然 蛋白 质 的 各 级 结构 都 可 能 和 抗原 专 一 性 有 关系 。 分 述 如 下 ; (1) 一 级 结 许多 纤维 蛋白 (如 丝 蛋 白 、 胶 原 等 ) 和 多 肽 (如 促 肾 上 腺 皮质 激素 、 促 胃 沪 素 和 高 血压 肽 等 ) 以 及 由 于 变性 而 伸展 的 球 蛋白 (如 氧化 核糖 核酸 酶 ,还原 并 羧 甲 基 化 的 溶菌 酶 等 ) 均 存在 依赖 一 级 结构 的 顺序 决定 篮 。 它 们 的 梅 造 和 位 置 可 用 半 抗 原 竞争 抑制 法 《〈 即 利用 搞 原 的 酶 解 断 片 抑制 该 抗原 和 抗体 的 反应 ) 来 测定 。 这 些 研究 的 结果 发 现 这 几 类 抗原 的 搞 原 结 构 具 有 共同 特点 : 和 体液 抗体 反应 的 抗原 决定 簇 的 数目 是 很 有 限 的 (一 条 分 子 晤 10,000 的 多 肽 大 约 只 有 两 个 决定 簇 ) ,它们 在 多 肽 链 上 的 分 布 是 间断 的 ， 其 间 被 免疫 静止 区 域 隔 开 ; 并 且 它 们 往往 还 倾向 于 分 布 在 多 肽 链 的 C 端 或 N 端 。 例 如 ,氧化 核糖 核酸 酶 有 5 6 了 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 NH. rc 2 Ala Ala —~>Lys—~> Phe — Glu 一 ~Arg 一 ~ Glu 一 ~ His —> Met —> Asp —> Ser —> Ser —> Thr 一 ~ Ser—~Ala—~ Ala 所 (V) 75 80 N Thr oy ;NH, Cys —>Tyr —- Glu—> Ser—~ Ty r —+ Ser —> Thr—+ Met —+ Ser 、 S—o~ ¥* 好 A <«- a" “- nwo wo 省 2-8 (v1) S Ee “3 VIS DIG 107, 118» 149% 120. 121 “192 123 igs Q Ee 局 (V1) gE 100 (VI) 94 90 $42 Lys NH, r ‘“\Asp——Ala~G 好 NH, NH, lu=— Thr+Thr~Lys+Tyr+Ala~+Cys— Asp +-— Pro~— Tyr~— Lys~— Ser<—— 36 35 34 33 1-9 FRAKES REN. FARRAH F ERE RN ie G8—61,105—124), «© 24 - 两 个 抗原 决定 往 , 其 一 分 布 在 伸展 的 多 肽 链 上 顺序 (38 一 61) 的 位 置 ， 另 一 位 于 C 端 顺序 (105 一 124) 的 位 置 。 这 两 段 都 富 含 非 极 性 氮 基 酸 (图 1-9) (Brown, 1962; Liu 和 Bro- wn，1972) 。 在 免疫 活性 肽 眉 内 的 各 氮 基 酸 残 基 的 抗原 活性 强 弱 也 有 不 同 。 如 氧化 核糖 核 酶 顺序 (38 一 61) RABE AHR FLA PAIS (74—96) KEEN 端 两 个 氨 基 酸 残 基 被 去 除 后 ， 这 些 肽 段 的 免疫 学 活性 就 分 别 降 低 60% 和 100% 。 这 说 明 一 个 抗原 决定 敌 假定 有 6 一 7 个 残 基 大 小 ,其 中 只 有 一 小 部 分 (1 一 2 RE) 对 抗原 专 一 性 有 关键 意义 ， 可 视 为 “免疫 优势 基 团 "。 除去 上 述 共 同 点 外 ， 比 较 丝 蛋白 和 伸展 的 球 蛋白 的 抗原 构造 时 ， 可 发 现 一 个 显著 的 不 同 点 。 丝 蛋白 的 抗原 活性 可 被 它 的 任 一 个 胰 蛋 白 酶 酶 解 断 片 全 部 抑 fil] (Cebra，1961) 。 这 可 能 是 由 于 其 决定 签 都 具有 相似 的 构造 和 专 一 性 。 分 子 伸 展 的 球 蛋 白 则 不 然 , 它 的 几 个 决定 往 却 具有 各 不 相同 的 专 一 性 。 如 铁 氧 还 蛋白 (BRerredoxin) 的 N 端 7 肽 和 C 端 5 肽 的 混合 物 抑 制 氧化 的 铁 氧 还 蛋白 和 同型 抗 血 清 结合 的 抑制 程度 达到 约 90%， 远 超过 任 一 肽 眉 单 独 的 抑制 作用 (分 别 约 为 40% 和 55%) (Kelly 和 Levy, 1971), 这 种 差别 可 能 归 因 于 丝 蛋 白 这 一 类 纤维 蛋白 的 一 级 结构 存在 重复 顺序 ， 而 球 蛋白 则 几乎 完全 不 存在 重复 顺序 。 (2) 二 级 结构 抗原 专 一 性 也 可 能 依赖 多 肽 链 的 二 级 结构 。 如 付 肌 球 蛋白 〈 具 有 完全 的 螺旋 构象 ) ， 其 抗原 决定 签 正 好 位 于 有 螺旋 构象 的 地 方 (Kunz 和 Gill, 1964) 。 从 一 种 细菌 (Bacil- lus anthracis) 的 莱 膜 分 离 出 的 多 聚 -Y-D- 谷 氮 酸 ， 其 部 分 水 解 产物 的 抗原 性 和 肽 眉 的 长 度 有 关系 。 当 肽 眉 的 长 度 增加 到 6 肽 以 上 时 , 和 抗 多 聚 -Y-D- 谷 氮 酸 抗体 的 结合 FED 就 加 强 了 。 另 一 方面 ,用 旋光 色散 法 证 明 , 这 种 多 肽 要 达到 7 肽 以 上 的 长 度 在 溶液 内 才 会 出 现 螺旋 构象 。 这 提示 多 聚 -Y-D- 合 氨 酸 的 主要 抗原 决定 簇 可 能 是 螺旋 结构 (Go- odman, 1969). (3) 三 级 结构 对 于 球 蛋 白 , 空 间 构象 是 决定 抗原 性 最 重要 的 ,也 是 最 容易 受到 破坏 的 因素 。 球 蛋白 的 抗原 性 对 空间 构象 的 依赖 , 在 蛋白 质变 性 中 最 明显 地 表现 出 来 。 无 论 用 化 学 的 或 物理 的 方法 使 蛋白 质变 性 ， 或 破坏 分 子 内 部 的 二 硫 键 时 ， 其 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 也 随 之 改 变 。 一 般 说 来 ,变性 蛋白 质 的 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 都 降低 和 改变 了 。 如 核糖 核酸 酶 经 过 碱 处 理 后 和 天 然 酶 的 抗体 的 反应 减弱 了 # 当 二 硫 键 破坏 后 ， 就 完全 无 反应 ; 并且 失 去 在 家 免 引 起 循环 抗体 的 能 力 。 羧 甲 基 化 的 变性 牛 血清 白 蛋白 和 天 然 的 牛 血清 白 蛋白 的 抗 血清 也 只 有 极 微弱 的 反应 (图 1-10) 。 变性 蛋白 质 也 可 能 引起 抗体 , 但 这 种 抗体 和 原来 的 天 然 蛋白 质 抗 原 的 专 一 性 不 同 不 过 有 时 候 还 可 能 表现 一 定 程度 的 交叉 反应 ,表明 变性 过 程 中 部 分 较 稳 定 的 抗原 决定 徐 尚 未 完全 改变 。 有 些 变 性 蛋白 质 不 能 诱导 循环 抗体 ， 但 可 以 诱 导 迟 发 型 超 敏 反应 。 变 性 过 程 中 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 的 改变 可 能 是 由 于 蛋白 质 分子 空 间 构 象 的 改变 , 原来 位 于 分 子 表面 的 一 些 决定 簇 ( 构 象 决定 簇 ) 消失 了 , 而 一 些 原 来 埋藏 在 分 子 内 部 的 一 些 决定 得 (主要 是 顺序 决定 簇 ) 暴露 出 来 了 。 用 化 学 方法 改变 某 些 对 于 维持 空间 构象 有 关 的 氨基 酸 残 基 , 可 以 不 同 程度 地 改 变 分 子 的 构象 ,造成 部 分 的 到 完全 的 变性 。 如 肌 红 须 的 肽 链 上 14 位 置 和 ?7 位 置 的 色 氢 酸 改 变 人 300 x Am 起 5 Zz 200 a 1.5 +R a = + 1.0 100 c $ oan 45, 0 0 80 16 240 25 50 75 100 牛 血清 白 蛋白 (微克 N) TUR HERR (%) 图 1-10 “用 天 然 蛋 白 免疫 制备 的 图 1-11 ， 人 血清 白 蛋 白 用 各 种 方法 改 性 (如 乙酰 化 , 酰胺 化 , BRR 抗 血清 测定 时 ,天 然 牛 血清 白 蛋白 酰 化 ,羧基 化 , 酯 化 和 硝 基 化 ) 的 伸展 程度 与 和 天 然 白 蛋白 的 抗体 的 (o ) 和 完全 还 原 、 羧 甲 基 化 的 牛 血 反应 能 力 降 低 之 间 的 关系 。 分 子 的 伸展 程度 用 改 性 的 血清 白 蛋白 清白 蛋白 (@ ) 沉 淀 曲线 的 比较 ( 据 的 Stokes 半径 比 天 然 白 蛋白 的 增加 值 表示 ,Stokes 半径 用 凝 胶 过 Goetzl 和 Peters，1972)。 滤 估 计 。 抗 原 性 降低 用 改 性 蛋白 质 抑制 :2I- 人 血清 白 蛋 白 和 同型 抗体 结合 能 力 (改变 的 Far KE), 结果 用 相对 于 天 然 白 蛋白 的 抑制 程度 表示 ( 据 Crumpton，1974)。 - 后 , 便 失 去 分 子 原 有 的 全 部 抗原 性 。 从 图 1-11 可 看 出 ,用 各 种 化 学 方法 改 性 的 BSA， 其 构象 变化 程度 (用 分 子 Stokes 半径 表示 ) 和 抗原 性 降低 之 间 存 在 定量 的 关系 (Jacobson 等 , 1972) 。 总 之 ， 这 些 实 验 结 果 清 楚 地 表明 抗原 性 的 降低 和 分 子 的 伸展 程度 (用 旋光 散 射 、Stokes 半径 .二 硫 键 被 还 原 能 力 以 及 对 蛋白 酶 酶 解 易 感 性 等 来 量度 ) 之 间 , 即 抗原 性 和 分 子 构象 之 间 存 在 确定 的 依赖 关系 。 球 蛋 白 分 子 变 构 现象 的 研究 ,也 为 这 方面 提供 了 新 的 证 据 。 人 血红 须 分 子 有 四 个 抗 FORE: 两 个 存在 于 c 链 ,一 个 存在 于 8 链 , 另 一 个 为 c 链 和 整个 分 子 所 共有 。 血 红 肛 和 和 氧 结合 后 ,分 子 构象 发 生变 化 ，c 和 (或 ) 68 亚 基 之 间接 触 区 域 的 原子 发 生长 达 5.7A 的 位 移 。 氧 合 血红 胶 和 脱氧 血红 肝 分 子 的 免疫 学 专 一 性 也 表现 出 不 同 (Rheichlin 等 ， 1964) 。 显 然 , 这 种 抗原 性 的 差别 几乎 可 以 肯定 是 和 分 子 的 上 述 变 构 现象 有 关联 的 。 血 红 肝 的 辅 基 正 铁血 红 素 本 身 并 无 抗原 性 。 然 而 把 它 去 除 后 分 子 的 构象 发 生 改变 ， 结 果 其 免 疫 学 专 一 性 也 随 之 改变 。 如 果 用 铜 原子 来 取代 铁 叶 啉 辅 基 内 的 铁 原 子 , 抗 原 性 并 不 改变 ; 而 改 用 其 他 金属 原子 取代 时 则 减弱 (Atassi，1967) 。 这 同样 可 能 是 由 于 肌 红 及 的 蛋白 部 分 的 构象 有 明显 改变 的 结果 。 总 之 ,所 有 这 些 例子 都 证 明 球 蛋 白 抗原 的 空间 构象 (三 级 结构 ) 和 分 子 的 免疫 学 功能 有 特别 密切 的 依赖 关系 。 抗 原 大 分 子 构象 的 完整 性 对 于 其 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 都 是 极 为 重要 的 。 同 时 , 还 有 证 据 提示 球 蛋白 抗原 在 刺激 抗体 的 产生 过 程 中 是 以 完整 大 分 子 形式 和 免疫 活性 细胞 表面 的 抗原 受 体 相 互 作 用 的 。 以 往 认 为 抗原 首先 在 体内 分 解 是 引起 抗体 形成 的 先决 条 件 ; 至 少 对 于 抗原 刺激 免疫 活性 细胞 的 初期 过 程 说 来 ,这 是 不 对 的 。 球 蛋白 抗原 进入 体内 后 很 可 能 最 先是 以 完整 的 分 子 ， 而 不 是 以 酶 解 片段 的 形式 和 免疫 活性 细胞 相互 作用 的 。 否 则 就 无 法 解释 抗原 专 一 性 对 天 然 分 子 构 象 的 依赖 关系 。 Sach 等 (1972) 比较 了 用 链球 菌 核酸 酶 的 两 个 酶 解 片段 ( 顺 序 1 一 126 和 99 一 149,， 参看 第 36 页 ,图 1-23) es。 26 。 免疫 得 到 的 抗体 和 从 用 完整 的 酶 分 子 免疫 后 得 到 抗 血 清 中 ,用 免疫 吸附 法 分 离 出 来 的 两 个 片 朋 的 专 一 抗体 的 抗原 结合 专 一 性 。 结 果 发 现 抗 酶 解 片段 抗体 的 专 一 性 是 识别 " 开 链 ” 蛋白 质 的 决定 签 (依赖 一 级 结构 的 ) ,而 从 完整 酶 分 子 的 抗 血清 中 分 离 出 来 的 抗体 却 是 针 对 天 然 分 子 构象 上 的 一 定 部 位 。 两 类 抗体 各 自 识别 同一 氨基 酸 排 列 顺 序 的 不 同 构象 。 这 种 依赖 分 子 构象 完整 性 的 抗体 的 存在 , 对 上 述 观点 是 一 个 非常 有 力 的 支持 。 (4) 四 级 结 最 后 ， 对 于 某 些 由 多 个 亚 基 组 成 的 复杂 分 子 ， 四 级 结构 还 可 以 提供 特别 的 抗原 决定 fe. 如 免疫 球 蛋白 IgM 所 引起 的 某 些 抗体 是 针对 由 两 个 亚 基 共同 组 成 的 决定 簇 (Mi- haesco 和 Seligmann，1968) 。 抗 烟草 斑纹 病毒 (TMV) 血清 中 也 含有 只 对 抗 许多 亚 基 处 于 高 度 聚 集 状 态 时 共同 形成 的 构造 的 抗体 。 人 类 血红 胶 ， 在 成 人 是 由 两 条 “ 链 和 两 条 8 链 结合 成 的 四 聚 体 (am PP) ， 在 胎儿 则 为 两 条 MBA BAA MR BORA (a 7Y2)o 抗 成 人 血红 肝 抗 血清 内 存在 着 一 些 对 & 和 有 链 的 专 一 抗体 ,不 过 只 有 当 这 两 条 多 肽 链 位 于 天 然 分 子 上 时 , 它们 才能 呈现 出 抗原 性 , 和 这 些 专 一 的 抗体 结合 。 再 者 , 抗 分 离 的 a 链 的 专 一 抗体 能 够 识别 游离 的 “ 链 , 和 位 于 成 人 血红 遥 (me p2) 四 聚 体 内 链 上 抗原 决定 簇 , 但 不 能 识别 胎儿 血红 肝 〈om 7Y2) 四 聚 体 内 汪 链 上 的 抗原 决定 簇 。 显 然 , 这 是 由 于 同一 对 o 链 当 和 有 链 结合 时 ， 与 和 7?Y 链 结合 时 其 抗原 专 一 性 有 所 改变 的 结果 (Reichlin 等 ，1966) 。 以 上 这 些 例子 证 明 存 在 着 依赖 抗原 四 级 结构 的 抗体 , 它们 针对 两 个 或 更 多 亚 基 交 界 区 域 共同 组 成 的 构造 ,或 者 针对 一 个 亚 基 和 其 它 亚 基 相 互 作用 引起 的 构象 变化 。 总 之 ， 蛋 白质 抗原 的 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 是 基于 暴露 在 大 分 子 表面 的 各 种 决定 往 的 空间 排列 图 式 。 进 入 体内 的 抗原 绝 大 部 分 被 酶 解 , 至 少 总 有 一 小 部 分 存留 下 来 , 以 完整 的 天 然 大 分 子 形式 和 免疫 活性 细胞 表面 的 抗原 受 体 起 作用 。 蛋 白质 抗 原 的 专 一 性 可 能 依 赖 分 子 的 各 级 结构 ， 因 而 同一 抗原 分 子 产 生 的 抗体 也 可 能 是 多 种 多 样 的 。 这 就 大 大 增加 了 研究 蛋白 质 分 子 的 抗原 结构 的 复杂 性 。 天 然 蛋 白质 按 其 分 子 形状 和 构造 的 特点 分 为 球 蛋白 和 纤维 蛋白 两 大 类 。 酶 、 蛋 白质 激 素 、 抗 体 以 及 细胞 的 大 多 数 结构 蛋白 均 属 球 蛋白 。 结 缔 组 织 蛋白 ,如 胶原 . 角 肝 以 及 丝 蛋 白 等 属于 纤维 蛋白 。 这 两 类 蛋白 质 的 分 子 构造 和 抗原 结构 各 具 特 点 , 现 分 述 如 后 。 3. 球 蛋 白 的 抗原 构造 。 决 定 签 的 大 小 \ 数 目 和 微细 结构 如 前 所 述 , 球 蛋白 抗原 的 免疫 原 性 依赖 于 分 子 的 完整 性 和 表面 决定 得 的 空间 排 布 图 式 。 至 于 所 产生 的 每 一 种 抗体 的 结合 位 点 , 却 只 能 各 自 和 抗原 大 分 子 表面 的 极 小 部 位 ( 抗 JURE) 专 一 地 结合 。 为 了 研究 天 然 蛋 白质 抗原 决定 簇 的 大 小 和 构造 ， 通 常 采用 类 似 前 述 半 抗 原 竞 争 抑制 抗原 抗体 反应 的 原理 〈 图 1-2，13 页 )， 即 利用 抗原 的 酶 解 片段 来 抑制 该 抗原 和 抗体 的 反 应 。 如 有 果 抗 体 经 某 一 片段 处 理 后 ,失去 或 减 小 和 原来 抗原 的 结合 能 力 , 就 说 明 这 一 片段 和 原来 抗原 的 决定 簇 在 构象 上 相似 。 再 根据 对 这 一 片段 的 排列 顺序 的 分 析 ， 就 可 以 推测 出 决定 簇 的 大 小 和 结构 。 如 果 已 知 抗原 分 子 的 一 级 结构 和 空间 构象 ,还 可 以 进一步 推测 这 些 片 段 在 分 子 上 分 布 的 位 置 。 为 了 使 片段 和 天 然 分子 的 某 一 部 分 相似 ， 片 段 就 应 当 具 有 足够 大 小 才能 呈现 出 有 序 的 空间 构象 ,或 者 和 抗体 相互 作用 时 , 因 构象 转化 而 适合 于 抗体 5 27 e 结合 受 体 的 空间 构象 。 因 此 ,用 这 种 方法 估 测 出 的 决定 徐 大 小 可 能 偏 高 ,只 能 粗略 地 表示 免疫 活性 多 肽 在 分 子 上 的 分 布 的 大 致 范围 。 用 这 种 方法 比较 详细 研究 过 的 蛋白 质 有 以 下 JL: 白 蛋 白 (Habeeb 等 ，1974); 核糖 核酸 酶 ”(Brown，1962); 链球 菌 核酸 酶 (Omenn 等 ，1970); 肌 红 胶 (Crumpton, 1964, 1965; Atassi, 1973, 1975); 溶菌 酶 (Atassi 等 ，1973); TMV (Spitler 等 ，1970) 等 。 其 中 以 肌 红 肝 和 溶菌 酶 两 个 分 子 HABA. MRAM. 作为 天 然 球 蛋 白 分 子 抗原 结 构 的 代表 : (1) M4 fe (Myoglobin) MAnE-PRASZAR. MRUAROT EA 18,400, HAA 153 FREBRE 的 一 条 肽 链 折 爱 盘 曲 而 成 ,无 二 硫 桥 ,分 子 的 立体 构象 的 稳定 性 很 大 程度 上 是 靠 二 级 结构 (ac- 螺 旋 构 象 约 占 75%) 和 相 邻 侧 链 间 的 长 距离 分 子 力 维持 的 。 这 是 立体 结构 最 先 研 究 清楚 的 一 个 蛋白 质 分子 (Kendrew 等 ,1961) (图 1-12) 。 随后 不 久 ， 全 部 一 级 结构 也 弄 清 楚 了 (Edmundson, 1965) (图 1-13)。 这 为 研究 天 然 蛋 白质 分 子 的 抗原 结构 创造 @ 24 (D2) AB ffi( Az, As) 图 1-12 aR ALACRA HEHE SKE D FAK (Kendrew) 上 的 分 布 。 粗 线圈 内 是 能 和 抗 肌 红 肝 抗 血清 结合 的 酶 解 片 仆 在 分 子 上 的 位 置 ( 据 Crumpton 和 Wilkinson,1965; Atassi 和 Salpin，1968)。 数 目 字 系 肽 链 的 氨基 酸 排列 顺序 ( 据 Edmundson, 1965, KH )o ea 238 。 生生 二 让 从 二 和 -Val- Ala-Gly—-His—Gly-—Gln-As p-Ile—Leu ieee Bh rk A Bb oe —Glu -Lys- NEBR base Serpents RE oe SRS Heh a ye ae ESET eon Oi aamme inn? eM pace aie Ss a His- Glu- Ala- EEE Oe ee Te ee eee ee -Ile- Lys— Tyr- Leu-Glu- 人 Gly- Asn-Phe- Gly- Ala- Asp- 130 140 Ala—Gln-Gly—Ala—Mef-Asn-Lys—Ala—Leu—Glu-—Leu—Phe—Arg— Lys—Asp-Ile-Ala—Ala-Lys-T yr—Lys- Glu-Leu-Gly-Tyr-Gln-Gly 图 1-13 ” 精 鲸 肌 红 及 的 一 级 结构 (Edmundson, 1965), 了 有 利 条 件 。 ANY VARA WLAL it FA SUR, Crumpton (1964, 1965) RSE I SRL AL oe 胰 糜 蛋白酶 酶 解 片 段 , LACM MA aR MRAM. BRARG 至 少 A POA ERS Be, A.(15—33), A,(15—29), B,(56—69), C..(77—89), #0 D,(147— 153) ， 表 现 不 同 程度 的 专 一 的 抑制 能 力 ( 表 1-4) 。 这 说 明 它 们 的 构象 不 同 程度 地 符合 天 然 肌 红 须 分 子 上 相应 的 抗原 决定 得 的 构象 ,更 为 可 能 的 是 这 些 片 段 和 抗体 相互 作用 时 发 生 构象 转化 ”, 而 不 同 程度 地 适合 于 抗体 结合 位 点 的 空间 构象 。 另 一 些 片 段 , 如 D3(1—7) 没有 免疫 学 活性 。 其 原因 或 者 可 能 由 于 这 些 酶 解 片段 不 能 保持 在 完整 分 子 上 原 有 的 构 象 ; 或 者 抗 血清 内 不 存在 对 抗 这 一 部 位 的 抗体 。 换 名 话说 , 这 一 部 位 在 免疫 学 上 是 不 活动 的 ,不 能 引起 抗体 。 把 这 些 有 免疫 学 活性 片 侦 和 肌 红 及 分 子 的 立体 模型 (Kendrew) 对 #14 MARSA (Apomyoglobin) 之 胰 廉 蛋白 酶 解 多 肽 片段 的 氨基 酸 排列 顺序 及 免疫 学 活力 抗原 抗体 复合 物 沉 淀 之 最 大 抑止 (92) Sa | ee MaoRBaE scm eA 15 A, |Ala—Lys-Val-Glu-Ala—Asp-Val—Ala—Gly—His—Gly-Gly-Asp} 2051 [2 33 -[leu-Leu-Ileu—Arg—Leu—Phe | SWE ‘ A, |Ala—Lys-Val-Glu-Ala—Asp-Val—Ala-Gly—His—Gly-Gly—Asp| 1522 12 8 9 : 29 -[leu-Leu 56 B, ne cay te tte ly-Vare bi Vat 1523 0 8 0 -Leu 77 89 Cia |Lys-Lys-Lys-Gly-His-His-Glu-Ala-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu| 1513 0 S7 70 76 C, |Thr-Ala—Leu-Gly-Ala-Ile-Leu 657 0 139 146 Dib |Arg-Lys—Asp-Ile-Ala—Ala—Lys-Tyr 963 5 147 153 D, |Lys-Glu-Leu-Gly-Tyr-[Gln, Gly] 793 15 7 >6 1 7 (Val—Leu-Ser-Glu-Gly-Glu-Trp 照 起 来 研究 ,发 现 它们 都 靠近 或 正好 位 于 折 稚 的 多 肽 链 的 转角 处 , 即 分 子 表 面 外 露 最 突出 的 地 方 。 如 A,(15 一 37) ，A,(15 一 29) 位 于 AB fH, B,(56—69) 位 于 DZE fH, C,,(77 一 89) 位 于 EFG 角 , 而 D:(147 一 153) 相当 于 分 子 'C 端 7 肽 ,也 是 位 于 分 子 表面 突出 部 位 的 (图 1-12) 。 胰 蛋 白 酶 酶 解 片段 的 研究 也 得 到 类 似 的 结果 。 除 去 具 免 疫 活性 的 片 BE (17—31) 位 于 分 子 的 AB 角 , 片 段 (79 一 96) 位 于 EFG 角 , 以 及 C 端 6 肽 和 上 述 胰 糜 蛋 白 酶 酶 解 免疫 活性 片段 在 分 子 上 的 位 置 重合 外 ， 还 出 现 一 个 新 的 免疫 活性 片段 (119—133) fir GH 角 ( 图 1-14) 。 总 之 ,根据 这 些 结 果 可 以 粗略 地 描画 出 免疫 活性 片 REMAKES BARI (A 1-12), 并 提示 天 然 球 蛋白 分 子 的 抗原 决定 繁 可 能 位 于 分 子 表 面 的 突出 部 位 ( 肽 链 转角 上 ) 。 不 过 抗原 决定 簇 的 大 小 可 能 要 比 这 些 片段 的 长 度 要 小 一 些 。 为 了 更 精确 地 定位 ,并 了 解 其 大 小 和 微细 结构 ,就 必须 配合 使 用 其 他 方法 。 位 于 片段 17—31(AB 角 )，79-96(EFG 角 )，119-133(GH 角 ) 和 C 端 6 肽 。 ++++++++ 具 抗原 活性 酶 解 片 眉 ( 据 Atassi 和 Salpin, 1968), 147 148) 149" 150-15 ee 对 有 免疫 学 活性 的 C 端 7 肽 片段 (-Lys-Glu-Leu-Gly-Tyr-Glu-Gly) 更 细致 的 酶 解 实验 提示 , 它 所 包含 的 抗原 决定 簇 的 大 小 可 能 不 超过 C 端 6 肽 的 大 小 (Crumpton, 1967) 。 为 了 精确 地 限定 这 一 抗原 决定 簇 的 范围 ， 合 成 了 C 端 一 系列 短 肽 (7 肽 、6 肽 、 5 肽 和 4 肽 ), 并 比较 了 它们 的 免疫 学 活性 。 结果 发 现 Lys (147) 不 参与 抗体 反应 ， 而 148 149 Gly(153) WAKASERERN. HM, 2 ik (-Gly-Leu-) 参与 C 端 抗原 决定 得 的 组 成 , 而 位 于 肽 链 转角 处 的 Leu(149) 尤其 重要 , 可 能 是 免疫 学 活性 最 强 的 优势 基 团 。 这 更 加 有 力 地 指明 抗体 不 仅 针对 肽 链 的 转角 区 域 ,而 且 还 可 能 主要 针对 转角 处 的 特定 的 一 个 氨基 酸 残 基 (Crumpton，1970) 。 除 一 系列 合成 肽 段 的 比较 方法 外 , 还 可 以 系统 地 应 用 在 特定 的 氨基 酸 残 基 处 切断 HK 链 , 并 结合 个 别 氨基 酸 残 基 化 学 改 性 等 方法 ,进一步 研究 抗原 决定 徐 的 大 小 和 微细 结 构 。 当 用 省 化 氰 (CNBr) 处 理 时 , 精 鲸 肌 红 及 分 子 在 Methio(55) 和 Methio(131) 处 断 开 ， 得 到 三 个 片 眉 , 包 含 着 原 分 子 的 4 个 抗原 决定 往 。 片 段 1 一 55 上 存在 其 中 一 个 抗原 决定 ge 这 个 抗原 决定 繁 在 这 一 片段 上 的 精确 范围 如 何 呢 ? 简 图 1-15 表示 精确 地 推定 断 万 1 一 55 上 抗原 决定 簇 范围 的 步骤 ,同时 也 可 作为 一 个 例子 说 明 球 蛋白 的 抗原 决定 簇 精确 “30 。 定位 的 一 般 方法 (Atassi，1975)。 实验 和 推理 的 步骤 按 图 1-15 上 的 顺序 简 述 如 下 : 1) 用 化 学 改 性 方法 ， 改 变 完 整 分 子 上 Methio-55,His-48, Arg-31 和 了 Tyr-7 残 基 , 对 免疫 活性 没有 影响 。 由 此 可 见 , 这 些 残 基 不 位 于 抗原 决定 徐 的 范围 内 ; 2) 已 知 肽 人 段 1 一 7 无 抑制 活性 ， 而 肽 Re 8—153 却 保持 完整 分 子 的 免疫 学 活性 。 因此 , 肽 段 1 一 7 显然 应 位 于 抗原 决定 簇 范 围 之 外 ; 3) 改变 片段 1 一 55 上 的 Arg-31 和 Arg-45 RE, 对 其 免疫 学 活性 没有 影响 ; 4) 已 知 肽 段 35 一 42 无 抑制 活性 。 联 系 〈c) 一 起 考虑 , 提示 顺序 31 一 45 很 可 能 无 免疫 学 活性 ; 5) KKR17—31 有 抑制 活性 ， 表 明 一 个 免疫 学 活性 区 域 存在 的 大 致 范围 ; 6) fK Be 1—55, 1—36 和 1 一 31 具有 31 36 14 18 __7_ 12:16:20 24 31 1-15 RMA AR 1 一 55 FRE 精 确 定位 步骤 示意 图 。 抗 原 决定 簇 以 外 的 肽 有 侦 和 残 基 用 点 表示 ; 已 证 明 为 决定 簇 的 一 部 用 黑色 表示 ; 只 对 一 些 抗 血 清 有 免疫 学 活性 的 残 基 用 斜 线 表示 ( 据 Atassi,1975)。 相同 的 免疫 学 活性 , 提示 肽 段 31 一 55 不 包 SERRE RIAA; 7) 改变 片段 1 一 31 上 的 His-12 和 His-24 或 Tyr-7 或 Tyr-14 都 不 影响 HK 学 活性 ; 8) 另 一 方面 ，Lys-16 琥珀 酰 化 ，Glu-18 (也 可 能 Asp-20) 还 原 , 则 完全 失 活 。 改 性 的 多 肤 测 不 出 构象 变化 ,显然 它们 的 失 活 不 是 由 于 构象 的 改变 。 综 合 以 上 结果 , 抗原 决 定 往 可 能 存在 的 范围 便 进一步 缩小 到 肽 序 12 一 23 之 间 了 。 9) 为 了 最 后 精确 地 确定 抗原 决定 得 的 范围 ,又 合成 了 肌 红 肝 顺 序 1 一 55 内 几 个 长 短 22 15 AD 一 Lys 一 Val — Glu — Ala — Asp — Val — Ala ist > eae (el ih ER ee ne ee ee 4 1-16 MAH 1 一 55 肽 侦 上 抗原 决定 签 的 精确 定位 及 对 抗 血清 的 依赖 。 右 图 : 对 于 不 同 的 抗 血 清 , 搞 原 反应 区 的 位 置 , 大 小 和 排列 顺序 。 肽 段 16 一 21 为 3 个 抗 血清 (G3, G4, 77) 所 共有 的 区 域 。 对 于 G4 和 77, 抗原 决定 簇 向 右 和 向 左 延长 一 氨基 酸 残 基 。 EA: 这 一 抗原 反应 区 在 1 一 5 肽 段 模型 上 的 位 置 。 实 线 和 代表 抗原 反应 区 的 共同 部 分 (16 一 21 顺序 )。 其 两 侧 的 斜 线 相当 于 一 个 氨基 酸 残 基 , 依 抗 血清 而 定 ， 可 能 参与 或 不 参与 决定 签 的 组 成 ( 据 Koketsu 和 Atassi, 1974), w ay © AA ASH Be 15—23, 16—23 和 15 一 21，. 并 比较 研究 了 这 几 个 肽 疏 和 三 种 抗 肌 红 及 抗 血 清 之 间 的 免疫 学 行为 。 结果 发 现 ,对 于 Gs 抗 血清 (山羊 ) ,抗原 决定 簇 包 括 顺 序 16 一 21(6 RIL), MFG, 抗 血 清 人 (山羊 ) 包括 顺序 16 一 22 (7 残 基 ) ,而 77 抗 血 清 (家 免 ) 则 包括 顺 Fe 15 一 21 (7 残 基 ) (图 1-16) 。 因 此 ,对 于 这 三 个 抗 血 清 ， 这 一 抗原 决定 簇 总 是 都 包含 顺 Fr 16 一 21。 依 抗 血 清 的 不 同 , 某 一 侧 还 可 能 多 一 个 氨基 酸 残 基 。 于 是 ,这 一 抗原 决定 簇 便 最 后 缩小 到 6 一 7 氮 基 酸 残 基 的 范围 。 理 论 上 也 正好 相当 于 抗体 结合 位 点 的 大 小 。 从 完整 的 天 然 肌 红 肛 看 来 ,这 正好 是 位 于 分 子 的 AB 角 , 表 面 最 突出 的 地 方 ( 图 1-12) 。 总 之 , 照 此 办 理 , 如 此 法 一 步 步 地 确定 其 他 几 个 片段 的 抗原 决定 簇 范 围 , 综 合 起 来 便 可 以 得 出 整个 肌 红 肝 分 子 的 全 部 抗原 结构 (Atassi, 1973; 1975) 。 这 里 还 要 指出 上 述 最 后 一 个 实验 的 理论 意义 在 于 说 明 , 对 于 天 然 球 蛋白 的 同一 抗原 决定 徐 , 不 同 物种 或 个 体 产 生 的 抗体 的 结合 位 点 都 能 识别 一 个 包括 6 一 7 氨基 酸 残 基 的 共 同 区 域 ,其 范围 相当 恒定 ,只 有 一 个 残 基 的 出 人 。 换 名 话说 , 免疫 活性 细胞 对 抗原 的 识别 机 制 是 很 精确 的 。 不 同 物 种 或 个 体 产生 的 抗体 基本 上 针对 抗原 分 子 表面 同一 恒定 的 区 域 。 正 因为 如 此 ,蛋白 质 大 分 子 抗原 结构 分 析 ， 才 有 规律 可 循 , 不 致 因 抗 血 清 不 同 得 到 的 结果 也 不 同 (Koketsu 和 Atassi，1974) 。 Atassi 实验 室 系统 地 应 用 上 述 几 种 方法 ,经 过 近 十 年 的 努力 ， 基 本 上 弄 清 楚 了 精 鲸 肌 红 蛋白 分 子 的 全 部 抗原 结构 (Atassi，1973; 1975) 〈 图 1-17) 。 主要 结果 可 简单 地 归 AAW FILA: | 1) KAMPMABADTFRASTRRRER. SRERKRN FMM Oe: RE fe 1: (Ala) -Lys-Val-Glu-Ala~Asp-Val-( Ala) 6 (或 7) RE GE HE 2: sara 7 PRS RE HE 3: Ala-TE?_Lys-His-tys-1ie-pro 7 残 基 Rie TK 4: rigs Nits Lidu-Hie-Ser--aine-Ei-Pro 8 FEE 1-17 PRUARANELA HAE KETENE. HRBERRA 黑 带 表示 。 斜 线 , S-RAMRMT-TALBRE, 对 于 某 些 抗 血清 可 能 参加 抗原 活性 区 的 组 成 。 有 点 的 部 分 代表 无 抗原 活性 的 区 域 ( 据 Atassi, 1975), 决定 答 5， (Lys)-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly“tyf 6 (或 7) AE 从 分 子 的 三 维 结构 模型 (图 1-12, 81-17) EW, RER 1 (15 一 21) 位 于 分 子 的 AB 角 上 ;决定 簇 2 (56 一 62) 位 于 DE 角 上 ;决定 得 3 (94 一 100) 位 于 FG ME RER 4 (113 一 120) 位 于 G 螺旋 末端 和 GH 角 处 ;决定 簇 5 (145—151) 位 于 H 螺旋 末端 和 非 螺旋 的 C 端 5 肽 。 2) 由 前 一 段 可 见 , 抗 原 决 定 得 的 大 小 ,不 超过 6 一 8 个 氨基 酸 残 基 , 并 有 明确 的 界限 。 对 于 不 同 的 抗 血清 ， 变 动 范围 只 有 土 1 氨基 酸 残 基 。 这 和 抗体 的 结合 位 点 的 大 小 是 符合 的 。 它 们 分 布 在 分 子 表面 确定 的 位 置 , 即 肽 链 转角 处 或 未 端 等 分 子 表面 外 露 最 突出 的 地 方 。 决 定 簇 的 大 小 和 位 置 使 它们 易于 和 抗体 的 结合 位 点 接近 并 与 之 结合 。 从 图 1-17 可 WL, RER 3 MRR 5 在 空间 地 位 上 彼此 很 靠近 。 可 以 设想 ,它们 可 能 共同 构成 一 个 特 定 的 空间 图 式 而 和 免疫 活性 细胞 表面 受 体 相互 作用 。 这 也 许可 以 部 分 地 解释 ， 何 以 在 初 级 抗体 反应 (至 少 其 早期 的 抗体 ) 中 , 需要 保持 天 然 分 子 完 整 的 三 维 结构 的 原因 。 3) 天 然 肌 红 肪 分 子 之 抗原 决定 簇 的 数目 是 有 限 的 。 虽 然 存 在 5 个 抗原 决定 簇 ,但 由 于 空间 障碍 , 在 平衡 时 能 和 抗原 表面 结合 的 抗体 分 子 数目 平 均 不 超过 4 个 。 4) 构成 抗原 决定 簇 的 氨基 酸 的 类 型 ,主要 是 极 性 氨基 酸 。 4RERA Lys; 1 个 @ Arg; 3/5 决定 簇 含 Asp 或 Glu, 或 同时 兼 有 二 者 ; 2 决定 簇 含 His. 因此 ， 抗 原 决定 徐 和 抗体 的 结合 位 点 之 间 的 相互 作用 , 主要 是 极 性 性 质 的 。 非 极 性 氨基 酸 则 可 能 通 过 氢 键 或 臣 水 性 相互 作用 起 稳定 作用 。 以 上 这 些 结论 (至 少 前 三 点 ) 或 许 对 其 他 球 蛋 白 抗 原 也 有 普遍 的 意义 。 (2) 溶菌 酶 (Lysozyme) ose — -全 = PE 一 idle 图 1-18 鸡蛋 清 溶菌 酶 之 氨基 酸 排列 顺序 。 “环形 多肽 区 用 横 线 表示 ( 据 Sela，1969)。 ° 33 。 LF e ZIINNN C¥ SX 4 = 6. 1-19 鸡蛋 清 溶菌 酶 肽 链 骨架 构象 简 图 。 虚 线圈 内 为 AKG Blake 4,1965), 溶菌 酶 (鸡蛋 清 ) 是 分 子 量 为 14,300 的 碱 性 蛋白 质 。 分 子 由 一 条 包含 129 AE RR 基 的 多 肽 链 , 靠 四 个 二 硫 桥 相连 成 “紧密 的 ”球形 构造 。 它 的 一 级 结构 (Jolly 等 ，1963， 1965) (图 1-18) 和 立体 结构 (Blake 等 , 1965; Phillips, 1967) 都 已 经 弄 清楚 了 (图 1-19) 。 用 CNBr 处 理 溶 菌 酶 时 , 分 子 在 Meth-12 和 Meth-105 两 处 断 开 ， 但 四 个 二 硫 桥 未 受 破坏 , 仍 能 保持 70% 的 免疫 学 活性 (图 1-20) 。 这 表明 分 子 的 天 然 构 象 主要 是 靠 二 硫 桥 维持 的 。 只 要 这 些 二 硫 桥 不 被 破坏 ,多 肽 链 虽 在 两 处 被 切断 , 仍 能 在 相当 程度 上 保持 原来 分 子 的 构象 (Bonavida 等 ，1969) 。 1-20 溶菌 酶 (鸡蛋 请) 分 子 及 经 过 CNBr 处 理 的 产物 [HEL(CB)] 的 结构 简 图 。 HEL 分 子 在 Metl2 和 Met105 位 置 断 开 ，HELCCB) 仍 保持 四 个 二 硫 桥 ( 据 Bonavida 等 ，1969)。 酶 解 片段 的 研究 证 明 盗 菌 酶 分 子 存在 两 个 大 的 具有 免疫 学 活性 的 片段 : 肽 段 〈57 一 107) 被 Cyst-64 和 -80 以 及 Cyst-76 和 -94 之 间 的 两 个 二 硫 桥 连接 起 来 ; 肽 段 (1 一 27 和 122 一 129) 被 Cyst-6 和 -27 之 间 的 二 硫 桥 连接 起 来 。 从 溶菌 酶 经 胃 蛋 白 酶 酶 解 的 片 段 中 ,分 离 出 的 B 多 肽 (62 一 96), 包含 着 分 子 的 一 个 主要 的 抗原 决定 簇 。B 多 肽 实际 上 是 三 个 酶 解 片 段 (62 一 68)，(74 一 83) 和 (84 一 96) 被 64 和 80,76 和 94 之 间 的 两 个 二 硫 桥 连接 起 来 的 , 其 结构 如 图 1-21 所 示 。 后 来 ， 进 一 步 证 明 此 片段 内 ，(64 一 83) 区 域 ( 包 含有 Cyst-64 和 -80 间 的 二 硫 桥 )， se。 34 。 Glu 35 62 64 68 Trp-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Arg 80 76 74 Cys-Pro-Ileu-Asn-Cys-Leu- Asn 84 94 96 Leu-Ser—Asp-Ile-T hr—Ala-Ser-Val-Asn—Cys—Ala-Lys 1-21 溶菌 酶 (鸡蛋 清 ) 分 子 简 图 , 示 有 免疫 学 活性 的 胃 和 蛋白酶 酶 解 片 眉 在 分 子 上 的 位 置 。 (C++tt+) 免 疫 活性 片 腿 ;( 一 >) 酶 作用 点 ; 米 溶菌 酶 之 酶 活力 中 心 〈 据 Shika 1967), 即 所 谓 “ 环 肽 ”(“loop” peptide) ， 是 溶菌 酶 分 子 的 主要 抗原 决定 往 ( 图 1-18) 。 MI 深 菌 酶 分 子 的 三 维 模型 可 见 ( 图 1-19) ,“ 环 肽 ”位 于 分 子 表面 突出 的 角 上 。 这 是 和 前 述 肌 红 肝 上 得 到 的 结论 是 一 致 的 。 sz omz NOOR om 从 溶菌 酶 分 离 的 “ 环 肽 > 和 多 聚 -D,L- 两 GOCOGOOOHOS, ae 氨 酸 又 链 结合 后 引起 的 抗体 ， 能 和 天 然 的 溶 二 EEC) OOO S OS SS 用 免疫 吸附 剂 能 分 离 出 抗 溶菌 酶 < 环 肽 ”的 专 Co | kb arr 一 抗体 。 这 种 抗体 和 天 然 溶菌 酶 之 间 的 反应 ed Me, 可 被 < 环 肽 > 专 二 地 抑制 。 如 果 “ 环 肽 > 的 二 硫 桥 被 氧化 ,再 羧 甲 基 化 , 环 被 打开 成 为 开 链 之 后 ,就 失去 抑制 能 力 了 。 因 此 , 抗 < 环 肽 > 抗体 是 针对 一 个 依赖 构象 的 抗原 决定 篮 的 。 同 时 ， 这 也 清楚 地 说 明了 决定 做 的 构象 和 专 一 性 的 密切 关系 (Arnon，1968; Arnon 和 Sela, 1969; Maron 等 , 1971; Sela，1972) 。 如 上 所 述 ， 鸡 蛋清 溶菌 酶 的 < 环 肽 ”(64 MELABVESR-D,L-ARME, BH an BID SB —/ SIRE RAO TLE ENN SALA RE 1-22). GPA ARR 疫 动物 ,产生 的 抗体 能 和 原来 溶菌 酶 分 子 的 一 定 部 位 专 一 地 结合 ,而 且 同样 地 依赖 于 决定 e 35 。 用 斑 基 乙醇 还 原 并 在 空气 中 重 氧 化 簇 的 构象 。“ 环 ”被 打开 后 , 专 一 性 就 改变 了 。 Sela 实验 室 还 进一步 合成 了 “ 环 肽 > 的 几 种 结构 类 似 物 (Sela, 1972), 发 现 75 位 置 的 Leu 或 78 位 置 的 Ile 被 Ala 置换 时 ， 对 抗原 性 没有 什么 影响 。 然 而 , 当 79 位 置 的 Pro 被 置换 时 ,抗原 性 就 显著 降低 。 如 果 两 个 Arg Rese (68 和 73 位 置 ) 被 Ala 置换 ,就 完全 失去 和 专 一 抗体 结合 的 能 力 。 这 证 明 有 可 能 人 工 合成 一 个 大 分 子 抗原 , 它 能 引起 针对 天 然 蛋 白质 之 特定 的 构象 决定 得 的 抗体 。 这 一 实验 的 重要 意义 在 于 如 果 对 一 种 酶 是 可 能 的 , 理论 上 对 其 他 已 知 排列 顺序 的 病 毒 和 细菌 的 抗原 决定 簇 也 应 有 此 可 能 。 这 就 为 “人 工 合成 疫苗 开辟 了 广阔 的 前 景 。 最 近 ，Atassi 实验 室 采 用 一 个 新 方法 ,用 柠 康 酸 栈 (Citraconic anhydride) Jj 地 保护 氨基 , 使 溶菌 酶 易于 在 精 氮 酸 肽 键 处 切断 ,得 到 有 完整 二 硫 桥 的 免疫 学 活性 非常 高 的 三 个 肽 段 , 几 乎 包含 分 子 的 全 部 抗原 活性 (Atassi 等 , 1973) 。 这 就 为 研究 溶菌 酶 的 全 部 抗原 构造 准备 了 条 件 。 顺 便 要 提 到 , 同一 方法 也 成 功 地 应 用 到 牛 血 清白 蛋白 (Habe- eb 等 , 1974) 。 这 一 方法 也 许 在 分 析 球 蛋白 的 抗原 结构 上 是 有 广泛 应 用 价值 的 。 除 上 述 两 个 例子 以 外 , 对 链球 菌 核酸 酶 的 酶 解 片段 的 研究 发 现 ,抗原 性 分 布 在 两 个 区 域 , 即 顺序 (6 一 48) 和 顺序 (99 一 149) 区 域 。 前 一 区 域 包含 一 个 抗原 决定 簇 , 可 能 限于 顺 序 (18 一 47) 范围 内 。 后 一 区 域 包含 两 个 决定 簇 ， 可 能 限于 顺序 (99 一 126) 和 顺序 《127 一 149) 范围 内 (Omenn 等 , 1970) 。 从 图 1-23 可 见 ， 这 些 抗原 决定 得 也 是 位 于 肽 链 转 折 处 , 球 蛋白 分 子 表面 突出 的 地 方 。 因 此 ,从 以 上 几 个 例子 看 来 , 对 于 球 蛋 白 分 子 , 抗 原 决定 簇 位 于 分 子 表面 突出 的 部 位 ,很 可 能 是 有 普遍 性 的 。 总 之 ， 从 以 上 几 个 典型 例子 的 研究 结果 可 以 得 出 对 于 球 蛋 分 子 的 抗原 构造 有 一 般 理 论 意义 的 看 法 。 球 蛋白 分 子 的 免疫 原 性 和 抗 原 专 一 性 是 基于 暴露 在 大 分 子 表面 的 抗原 决 定 往 的 特定 化 学 构造 ,数目 和 排列 图 式 。 决 定 敌 的 数目 依赖 于 抗原 分 子 的 表面 积 、 表 面 构 造 的 多 样 性 、 决 定 得 的 大 小 以 及 免疫 活性 细 胞 的 识别 能 力 。 有 材料 指示 , 在 抗体 过 量 时 ， 由 于 空间 障碍 一 个 肌 红 须 分 子 可 能 结合 的 抗 体 最 大 数目 为 3 一 4 个 分 子 , 虽然 已 知 它 有 5 个 抗原 决定 簇 。 由 于 同样 的 原因 , 其 他 球 蛋 珀 有 效 决定 得 的 数目 可 能 同样 是 很 有 限 的 。 在 肌 红 肝 、 溶 菌 酶 和 链球 菌 核酸 酶 分 子 , 这 些 决 定 簇 倾 向 于 分 布 在 肽 链 转 角 处 或 未 端 ， 分 子 图 1-23， 链 球菌 核酸 酶 分 子 多 肽 链 构 象 的 平面 图 。 根据 X- 射 线 晶 体 构造 模型 绘制 ,正面 观 表面 外 露 最 突出 的 地 方 。 抗 原 决定 簇 的 专 一 (4 Arnon 51971). 性 不 仅 依 赖 其 氨基 酸 组 成 和 有 顺序 ， MAAK 赖 局 部 的 构象 (如 “ 环 肽 2) ,以 及 分 子 其 余部 分 对 此 局 部 构象 的 影响 (如 变 构 作用 对 分 子 构 象 的 影响 ) 。 因 此 也 可 以 说 ， 免 疫 活性 细胞 所 识别 的 是 球 蛋白 分 子 表面 的 局 部 构象 。 由 于 球 蛋 白 的 极 性 侧 链 主要 分 布 在 分 子 表面 ,而 非 极 性 基 团 多 埋 在 分 子 的 内 部 (Perutz 等 ， 1965) 。 例 如 , 精 鲸 肌 红 及 外 露 在 分 子 表面 的 120 个 氮 基 酸 残 基 , 在 中 性 条 件 下 ， 其 中 76 个 氨基 酸 是 极 性 的 ,而 43 个 是 非 极 性 的 ;并 且 这 43 个 被 当 作 位 于 表面 的 非 极 性 基 团 ， 其 . 36 . 实 也 是 位 于 接近 表面 的 凹陷 处 , 由 于 空间 阻碍 实际 上 难于 和 抗体 结合 。 如 果 球 蛋白 的 抗 原 决定 往 主 要 是 极 性 基 团 组 成 的 ,那么 就 可 以 推测 球 蛋白 抗原 和 同型 抗体 之 间 的 结 合 或 许可 能 主要 是 靠 静 电 相 互 作 用 和 和 氢 键 。 最 后 , 肌 红 须 的 抗原 决定 簇 的 大 小 有 明确 的 界限 ， 不 超过 6 一 8 个 氨基 酸 残 基 的 范围 。 这 对 于 其 他 球 蛋白 可 能 同样 是 适用 的 ,并 且 也 和 其 他 半 抗 原 决 定 簇 的 大 小 是 相近 的 。 由 于 一 个 球 蛋白 大 分 子 上 的 抗原 决定 簇 的 数目 和 大 小 是 有 限 的 ,因此 可 以 把 它们 看 作 是 半 抗 原 决 定 簇 ,而 把 分 子 表面 的 其 余部 分 看 作 是 载体 ， 各 自 和 不 同 种 类 的 淋巴 球 相互 作用 。 这 一 概念 对 于 了 解 球 蛋白 的 免疫 原 性 和 抗原 构造 的 关 系 是 很 重要 的 。 4. 纤维 蛋白 的 抗原 构造 。 胶 原 胶原 是 结缔 组 织 的 一 种 主要 成 分 。 由 于 其 特殊 的 化 学 结构 , 以 及 胶原 病 是 临床 上 常 见 的 自身 免疫 性 疾病 ;胶原 的 抗原 构造 的 研究 颇 受 重视 。 同时 ， 胶 原作 为 纤维 蛋白 的 代 表 , 其 抗原 构造 的 研究 , 在 理论 上 也 有 意义 。 天 然 可 溶性 胶原 分 子 是 由 三 条 多 肽 链 盘 绕 成 的 一 根 三 股 螺旋 。 每 条 多 肽 链 的 长 度 约 为 1,050 氨基 酸 残 基 。 三 条 多 肽 链 中 ， 两 条 (ol) 链 的 排列 顺序 是 相同 的 ， 另 一 条 (a2 链 ) 则 不 相同 。 在 天 然 分 子 内 ,三 条 多 肽 链 都 具有 左旋 螺旋 构象 (二 级 结构 ), 它们 一 起 又 盘 绕 成 一 根 三 股 的 超 螺旋 (三 级 结构 )。 这 种 空间 构象 的 特点 是 由 特殊 的 一 级 结构 决定 的 。 每 条 =“ 链 都 呈现 三 联 体 (-Gly-x-y-) 周期 性 , 即 每 逢 第 三 个 氨基 酸 残 基 的 位 置 都 是 GI1y， 其 余 两 个 位 置 〈(x,y) 可 能 是 其 它 任何 的 氨基 酸 。 由 于 这 种 特殊 结构 ， 两 条 ol 链 和 一 条 a2 链 才 能 紧密 地 嵌 合 成 一 根 三 股 的 超 螺旋 结构 。 同 时 , UREA AR, Bie 肽 链 氨基 酸 残 基 的 侧 链 全 朝向 分 子 外 面 。 胶 原 的 这 种 独特 的 空间 结构 主要 是 靠 气 键 维持 的 因而 易 受 破坏 (如 轻微 加 热 ) ,出 现 蛋白 质 的 变性 。 变 性 的 胶原 , 几 条 <“ 链 各 自 拆 开 , 伸 ， 展 ， 失 去 原 有 的 构象 而 呈 混 乱 的 线 团 状 。 这。 一 变性 过 程 在 一 定 程度 上 是 可 逆 的 。 占 “ 链 ORES 全 长 约 97% 的 部 分 都 参与 三 股 超 螺 旋 排 列 ， 而 “ 链 两 端 约 15 一 20 氨基 酸 残 基 的 小 眉 肽 | 链 却 不 具有 (-Gly-x-y-) 周期 性 结构 ， 因 i 而 不 参与 三 股 超 螺 旋 构 造 。 这 些 位 于 “ 链 丙 (2) Pm ADF SR HEB REBAR 被 酶 解 (Traub 和 Piez, 1971), 关于 胶 = ty Ee ee ee 原 的 抗原 结构 的 一 般 知识 可 参看 Benjamini © i AR a AR ay RS a9 的 综述 (1972). (3) (2) 天 然 和 变性 胶原 明显 不 同 的 结构 〈 三 股 图 1-24 ”天 然 和 变性 胶原 的 构造 模型 及 三 种 不 超 螺旋 和 乱 线 团 构象 ) ,以 及 链 中 段 螺旋 部 IAM ED. (a) 天 然 可 溶性 胶原 。 分 和 两 端 无 螺旋 部 分 的 结构 区 别 ， 在 免疫 学 ee ee ete acm, CO don 上 表现 为 三 种 不 同类 型 的 抗原 决定 往 (图 1- (AEE) 一 不 依赖 构象 , 对 蛋白 酶 敏感 ， 交 又 24). AUDA OR AR RRA) BOT eee ee mca oll wire 清 可 帮助 区 分 这 几 类 不 同 的 抗原 结构 。 大 上 忌 抗 胶原 血清 能 够 识别 依赖 完整 分 子 的 三 股 超 螺旋 构象 的 抗原 决定 徐 ， 称 为 螺旋 抗原 决定 e 37 « f (Helical antigenic determinant) 这 种 抗 血 祖 只 能 和 天 然 分子 起 反应 ,变性 时 这 种 抗原 专 一 性 就 消失 了 。 只 有 当 分 离 的 “ 链 恢复 分 子 天 然 构象 , 即 复 性 时 , 抗原 活性 才 又 可 以 明显 恢复 。 鸡 抗 胶 原 血 清 中 ,除去 具 上 述 抗原 专 一 性 的 抗体 外 , 还 存在 另 一 类 能 和 变性 胶原 起 强 的 交叉 反应 的 抗体 。 经 过 免疫 吸附 分 离 的 第 二 类 抗体 和 变性 胶原 的 反应 甚至 比 和 天 然 分 子 的 反应 还 要 强 。 用 变性 胶原 免疫 时 , 主要 产生 第 二 类 抗体 。 第 二 类 抗体 的 专 一 性 是 针对 位 于 胶原 分 子 中 段 的 在 分 子 变 性 时 才 露 出 来 的 中 心 抗 RR ER (Central antigenic determinant), 中 心 和 螺旋 抗原 决定 簇 都 同位 于 胶原 分 子 的 中 段 ， 但 彼此 的 交叉 反应 很 弱 。 这 假定 是 由 于 螺旋 抗原 决定 簇 的 专 一 性 要 求 天 然 分子 的 氮 基 酸 残 基 固 定 的 空间 排列 ,或 者 cl 和 c2 链 的 共同 参与 ,也 就 是 说 依赖 于 完整 分 子 的 天 然 构象 , 即 所 谓 的 构象 决定 簇 ; 而 中 心 抗 原 决定 簇 的 专 一 性 则 要 求 在 天 然 分 子 中 被 掩盖 了 的 多 肽 链 骨 架 , 或 “ 链 的 柔 曲 性 , 换 句 话说 ,不 依赖 于 完整 分 子 的 天 然 构 象 。 抗 中 心 抗 原 决定 得 抗体 表现 很 强 的 种 间 交 叉 反应 * 而 抗 螺旋 抗原 决定 簇 抗 体 则 没有 。 最 后 ,还 存在 抗 末 端 抗原 决 ‘Efe (Terminal antigenic determinant) 的 抗体 。 这 种 抗体 的 专 一 性 是 针对 ax 链 两 端的 非 螺 旋 排 列 顺序 ， 只 有 在 家 免 抗 血清 中 才能 找到 。 它 能 和 天 然 分 子 、 伸 展 的 & 链 和 CNBr 裂解 的 小 断 片 同样 地 起 反应 。 因此 ， 这 些 抗原 构造 是 不 依赖 构象 的 顺序 决定 簇 (Beil. &, 1973). | . 总 之 , 痊 椎 动物 的 胶原 由 于 其 特殊 的 分 子 结构 , 同时 存在 着 构象 决定 徐 和 顺序 决定 往 。 前 者 位 于 分 子 中 段 的 螺旋 区 域 ,后 者 位 于 分 子 两 端的 非 螺 旋 区 域 。 胶原 能 与 具有 (L-Pro-Gly-L-Pro)n 顺序 和 三 股 超 螺旋 构象 的 合成 多 肽 起 交叉 反应 ,也 支持 构象 决定 ERIE (Borek 等 , 1969) 。 进 化 过 程 中 , 螺旋 区 域 氨基 酸 排列 顺序 的 保守 性 比 两 端 非 螺旋 区 域 要 大 ， 不 过 仍然 存在 物种 之 间 的 构造 差异 。 和 痊 椎 动物 的 胶原 不 同 ， 人 曙 虫 (Ascaris lumbricoidis) 的 胶原 似乎 只 存在 顺序 决定 得 ,因为 其 还 原 和 羧 早 基 化 的 衍生 物 的 抗原 性 , 仍然 和 天 然 崎 虫 胶原 一 样 (Michaeli 3, 1972), 5. 和 细胞 免疫 有 关 的 抗原 决定 笠 。 载 体 决定 往 前面 讲述 的 都 是 和 循环 抗体 (体液 免疫 ) 起 反应 的 抗原 决定 得 的 构造 。 如 前 述 , 这 些 决定 簇 的 大 小 和 特性 是 和 半 抗 原 决定 得 相 似 的 。 许 多 证 据 表明 它们 本 身 并 不 一 定 和 细胞 BERAKR. 和 了 细胞 表面 抗原 受 体 反应 的 决定 簇 很 可 能 或 者 只 相当 于 这 些 决 定 簇 的 一 部 分 或 者 是 抗原 分 子 上 的 其 余部 分 (载体 决定 簇 )。 支 持 这 种 看 法 的 主要 有 两 方面 的 证 据 : 1) 天 然 蛋白 质 和 变性 蛋白 质 之 间 , 以 及 某 些 在 构造 上 有 关系 的 蛋白 质 之 间 ， 对 体 沪 抗体 没有 交叉 反应 ,而 对 细胞 免疫 ( 迟 发 型 超人 敏 反应 \ 巨 噬 细 胞 迁移 抑制 和 刺激 淋巴 细胞 转化 等 ) 则 可 能 有 广泛 的 交叉 反应 。 如 胰岛 素 的 羧 甲 基 化 B 链 和 抗 胰岛 素 抗体 无 交叉 反 应 , 而 能 对 用 胰岛 素 致 敏 的 豚鼠 引发 迟 发 型 超 敏 反应 (Clark 和 Menroz，1970)5 天 然 溶菌 酶 和 还 原 . 羧 甲 基 化 溶菌 酶 之 间 也 是 这 样 。 一 些 在 结构 上 有 关联 的 蛋白 质 , 如 天 然 鸡 蛋白 溶菌 酶 和 天 然 牛乳 白 蛋白 ,人 虫 虫 的 胶原 和 哺乳 动物 的 胶原 之 间 没 有 体 流 抗体 交 又 反应 ,而 有 广泛 的 细胞 免疫 交叉 反应 (Maron 等 , 1972; Michaeli 等 , 1972) 。 因 此 , 对 于 体液 抗体 的 反应 专 一 性 ,蛋白质 天 然 构 象 的 完整 性 是 必要 的 , 而 对 于 细胞 免疫 反应 则 似 乎 是 不 必要 的 。 换 名 话说, 和 细胞 免疫 有 关 的 决定 簇 ( 可 能 是 载体 决定 簇 ) 似乎 对 构 象 的 2 38 « 依赖 程度 较 小 。 2) 载体 决定 往 和 半 抗 原 决 定 徐 有 实际 的 分 界 。 | 胰 升 血糖 素 (Glucagon) 是 一 个 包含 29 个 氨基 酸 残 基 的 多 肽 激素 ， 10 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- 20 29 Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr ( 据 Bromer 等 ,1957) 有 证 据 提 示 其 载体 决定 徐 和 半 抗 原 决 定 徐 ， 分 别 位 于 分 子 的 不 同 部 位 。 体 液 抗体 的 决定 镁 位 于 分 子 N 端 一 半 的 肽 眉 (1 一 17); 而 C 端的 肽 人 段 (18 一 29) 主要 和 细胞 免疫 专 一 性 有 关 。 不 过 , 这 种 区 别 并 不 是 绝对 的 ，C 端 仍 可 与 某 些 体液 抗体 反应 (Senyk 等 ， 1971, a, b), 最 后 还 应 提 到 ,无 论 纤 维 蛋白 、 球 蛋白 或 变性 球 蛋白 和 体液 抗体 反应 的 抗原 决定 敌 的 数目 是 很 有 限 的 ,在 抗原 分 子 上 的 分 布 也 是 间隔 的 。 可 是 ,细胞 免疫 反应 有 关 的 决定 往 在 分 子 上 的 分 布 可 能 比 体液 抗体 决定 得 更 密集 ,并 且 可 能 是 连续 分 布 的 。 这 方面 的 知识 主 要 是 用 巨 唉 细胞 迁移 抑制 法 研究 神经 纤维 的 通 鞘 碱 性 蛋白 质 的 抗原 构造 得 到 的 。 一 疙 21 37 44 69 1 + 12 133 154 170 a DECZ2 ED ERHR aD 134 150 1 12 . (+) 13 24 0 33 42 93 116 73 91 c= 114 130 图 1-25 5 1 MaRS TPL SK AH eR AE GEE) 示意 图 。 上 方 空白 线段 示 整 个 蛋白 分 子 (170 残 基 ), 黑 色 实 线段 示 和 致 敏 豚 鼠 的 淋巴 球 温 育 时 能 抑制 巨 史 细 胞 迁移 的 片段。 虚线 假 示 此 区 域内 的 一 个 抗原 决定 灸 的 可 能 的 位 置 ,但 尚未 肯定 。 下 方 空白 线 侦 示 免疫 不 话 动 区 域 ( 据 Bergstrand,1973)。 fa HES A (OF RADA 18,500) 可 能 是 一 条 伸展 的 多 肽 链 ,其 抗原 性 只 依赖 其 一 级 结构 。 用 巨 吻 细 胞 迁移 抑 币 法 测定 其 抗原 构造 ,发现 和 了 T 细胞 表面 抗原 受 体 起 反应 的 决定 繁 的 分 布 ,如 图 1-25 所 示 , 至 少 有 8 个 决定 簇 。 实 际 上 整个 分 子 就 象 由 一 串 专 一 HEARN RARER, 首尾 相连 而 成 , 其间 只 为 少数 免疫 静止 区 分 隔 (Bergstrand, 1973) 这 和 分 子 量 相近 的 球 蛋白 和 伸展 的 分 子 ( 如 肌 红 肝 . 氧 化 核糖 核酸 酶 ) 比较 起 来 ,决定 签 的 密 度 显 然 高 得 多 。 不 过 , 这 种 情况 是 否 有 普遍 性 ,还 有 待 进一步 的 研究 证 实 。 总 之 ， 和 细胞 免疫 有 关 的 决定 往 的 研究 还 刚 开 始 , 对 这 方面 的 了 解 还 是 很 粗浅 的 。 (=) 蛋白 质 免疫 原 性 的 分 子 基础 抗原 的 免疫 原 性 是 诱导 免疫 反应 , 即 产 生 专 一 的 体液 抗体 和 (或 ) 细 胞 免疫 的 能 力 。 对 © 39 。 于 有 反应 能 力 的 动物 ,一 个 蛋白 质 免疫 原 引 起 免疫 反应 的 能 力 决定 于 一 系列 因素 ;如 处 源 性 、 分 子 的 构造 和 大 小 、 物 理 状态 分解 代 谢 速度 以 及 注射 剂量 .途径 和 佐 剂 的 性 质 等 。 这 里 只 着 重 讨论 免疫 原 的 构造 , 即 外 源 性 、 分 子 大 小 .聚集 状态 以 及 构象 .等 因素 和 免疫 原 性 的 关系 , 包括 免疫 反应 的 类 型 (体液 抗体 或 细胞 免疫 ,以 及 产生 的 抗体 的 类 别 ) 和 免疫 原 分 子 构 造 的 关系 。 关于 免疫 原 性 的 现代 概念 ,在 很 大 程度 上 是 受到 免疫 反应 中 两 类 细胞 协同 作用 理论 的 影响 而 发 展 起 来 的 。 对 于 大 多 数 免疫 原 , 为 了 产生 最 适量 的 抗体 ,需要 来 源 于 胸腺 的 了 淋巴 球 ( 简 称 T 细胞) 和 来 源 于 骨骼 的 B 淋巴 球 (简称 B 细胞 ) 的 协同 作用 , 巨 噬 细 胞 也 可 能 参与 这 一 相互 作用 。 了 细胞 本 身 并 不 产生 体液 抗体 , 然而 却 是 激活 B 细胞 ， 使 其 增 生 、 分 化 并 合成 免疫 球 蛋 白 所 必需 的 。 另 一 方面 ， 发 现 一些 具 有 重复 决定 簇 的 多 聚 体 搞 原 , In EE ES, KEE T 细胞 存在 ,就 能 直接 激活 B 细胞 产生 抗体 。 这 表明 下 细胞 的 合作 对 于 激活 也 细胞 并 不 是 必 不 可 缺 的 ,而 只 是 起 一 种 辅助 的 作用 。 并 且 ， 还 提 示 对 于 诱导 B 细胞 的 分 化 ,在 抗原 和 B 细胞 表面 抗原 受 体 之 间 可 能 需要 比较 高 的 亲 合 力 或 交叉 连接 , 也 就 是 要 求 抗原 具有 专 一 性 相同 的 重复 决定 簇 或 多 价 性 。 载 体 效 应 的 发现 使 能 进一步 假定 , T 细胞 表面 抗原 受 体 主 要 和 免疫 原 的 载体 决定 镁 相互 作用 ， 而 B 细胞 表面 抗原 受 体 则 和 半 抗 原 决定 簇 相 互 作用 。T 细 胞 和 B 细胞 如 何 协同 作用 的 机 制 还 不 太 清楚 ,目前 存在 几 种 假说 。 其 中 最 简单 的 是 抗原 集中 假说 ,免疫 原 通过 其 载体 决定 答 和 了 细胞 表面 抗原 受 体 结合 而 被 集中 在 T 细胞 表面 (或 经 过 中 细胞 因子 ，IgT 的 中 介 而 集中 BAe), 再 由 T 细胞 (或 巨 噬 细 胞 ) 把 一 群 专 一 性 相同 的 半 抗 原 决定 笠 提 供给 B 细胞 表面 的 抗原 受 体 ,激发 B 细胞 的 分 化 和 合成 抗体 (参看 第 十 三 章 , 第 424 页 )。 如 果 上 述 了 和 B 细胞 协同 作用 的 理论 是 对 的 ,于 是 就 诱导 体液 抗体 形成 而 论 ， 免 疫 原 性 就 可 以 看 作 是 载体 决定 把 和 半 抗 原 决定 簇 各 自 和 T “辅助 ?细胞 和 B 细胞 相互 作 用 能 力 的 总 和 ,它们 又 可 能 各 自 独 立地 起 作用 。 从 另 一 方面 看 ,也 就 是 说 了 细胞 和 B 细 胞 表面 的 抗原 受 体 各 自 对 免疫 原 的 决定 签 有 不 同 的 结构 上 的 要 求 。 因 此 ,根据 这 种 细胞 协 同 机 制 对 免疫 原 分 子 结构 的 要 求 ,就 应 包括 抗原 决定 笠 的 数目 ,是 否 有 专 一 性 相同 的 重复 结构 .是 否 同时 表现 半 抗 原 和 载体 功能 ,以 及 决定 敌 间 的 排列 和 间距 等 方面 。 同 时 , 免疫 原 分 子 结构 在 上 述 几 方面 的 不 同 , 可 能 影响 免疫 原 和 两 类 淋巴 球 相互 作用 的 关系 , 从 而 改 变 免疫 反应 的 类 型 一 体液 抗体 细胞 免疫 或 免疫 耐 受 性 。 免 疫 原 的 分 子 结构 及 其 改变 与 免疫 反应 类 型 的 关系 是 当前 受到 很 大 注意 的 问题 。 1. 分 子 的 大 小 和 抗原 构造 的 复杂 性 抗原 的 免疫 原 性 和 分 子 大 小 有 密切 的 关系 。 现 在 已 知 能 引起 免疫 反应 的 最 小 的 天 然 多 肽 是 胰 脏 的 一 种 激素 升 血糖 素 (Glucagon) (分 子 量 一 3,480) 。 其 次 是 胰岛 素 〈 分 子 H=5,734). BRR OT BA 14,000) 加 佐 剂 是 相当 好 的 免疫 原 , 不 加 时 就 弱 。 分 子 量 超过 40,000 的 可 溶性 球 蛋白 ， 如 卵 白 蛋白 通常 是 很 好 的 免疫 原 。 iA eo) se OO TMV) ,细菌 鞭毛 和 血 兰 肝 等 大 分 子 的 多 聚 体 〈 分 子 量 之 1,000,000) 有 更 强 的 免疫 原 性 。 然而 , 角 肝 和 其 它 不 溶 的 纤维 蛋白 , 虽 有 很 大 的 分 子 量 却 无 免疫 原 性 。 一 般 说 来 ， 可 溶性 球 蛋 白 都 是 好 的 免疫 原 , 不 溶性 纤维 蛋白 则 无 免疫 原 性 。 足 够 大 小 的 分 子 量 (之 10,000)， 对 于 天 然 蛋白 质 似乎 是 有 明显 免疫 原 性 的 重要 条 件 。 AN, 最 近 对 一 些 人 工 合成 多 肽 衍 。40 。 生物 的 研究 发 现 ,分子 量 低 达 500 一 1?000 (甚至 更 低 ) ,在 一 些 情形 下 也 有 免疫 原 性 。 细菌 鞭毛 (长 几 微 米 , 直径 王 20 一 50 毫 微米 ) 是 由 无 数 个 亚 基 (MEA, DF B >= 30,000 一 40,000)， 靠 非 共 价 键 首尾 相连 而 成 的 高 度 复杂 的 构造 (图 1-26) 。 凌 毛 经 酸 处 理 后 ， 降 解 为 由 相同 亚 基 组 成 的 大 小 不 等 的 片 侦 ， 提 供 了 研究 分 子 量 和 免疫 原 性 关系 的 好 材料 。 Nossal (1964) HME, MASH (4 300 WH) 和 凌 毛 素 Mik 分子量 一 30,000) ,注射 到 大 鼠 足 掌 。 然后 ”用 细菌 制 动 法 测定 IgM 和 IgG 抗体 产生 过 程 。 随 着 免疫 原 分 子 量 的 不 同 ， 产 生 的 抗体 量 和 种 类 都 有 所 不 同 。 前 两 种 免疫 原 ， 均 含有 重复 的 抗原 结构 ， 能 引起 IgM 抗体 形成 ， 继 之 持续 地 产生 IgG 抗体 。 MEA BAM LEAR 引起 IgM 抗 体 ， 并 且 IgG 抗体 的 高 峰 也 比 前 二 者 低 。 在 抗 体 量 的 方面 ， 引 起 IEM 抗体 初级 免疫 反应 的 能 力 ,鞭毛 比 多 聚 体 要 大 100 倍 。5 引 起 IgG 抗体 的 能 力 ,鞭毛 比 多 聚 体 大 100 倍 , 比 单 体 大 1000 倍 。 《图 1-27) 。 在 这 个 抗原 系统 里 , 清楚 地 看 出 分 子 图 1-26“ 简 图 示 凌 毛 素 分 子 排列 成 多 聚 体 鞭毛 素 颗 粒 。 每 一 个 圆 球 代表 一 个 单 体 分 子 ， 鞭毛 素 。 图 上 方 可 见 三 行 相 邻 排列 的 鞭毛 素 分 子 〈 每 一 个 多 聚 体 颗粒 是 这 样 8 行 分 子 构 成 的 ), 以 及 多 聚 体 颗粒 末端 的 上 面 观 。 每 一 圆 球 的 亮 区 代表 凌 毛 素 分 子 外 露 到 溶液 中 的 部 分 ,上 暗 区 代表 与 相 邻 分 子 毗 连 的 部 分 ,或 朝 向 内 面 的 部 分 。 图 下 方 可 见 三 个 游离 的 凌 毛 素 分 子 和 一 个 溴 化 氰 裂解 成 4 个 片 妥 (A, B， C, D) 的 分 子 。 在 多 聚 体内 ， 分 子 朝 外 的 部 分 主要 是 A 片 侦 ， 已 证 明 它 含有 鞭毛 素 分 子 量 的 大 小 和 免疫 原 性 (产生 的 抗体 的 量 和 类 别 ) 有 的 抗原 活性 ( 据 Nossal 和 Ada, 1971), 一 定 的 关系 。 Parish 和 Ada (1969) 进一步 把 一 种 沙门 氏 菌 (S. adelaide) 的 鞭毛 素 ( 分 子 量 盖 40,000) 用 省 化 氰 裂解 为 四 个 片 眉 :“A?” 片 段 最 大 (分 子 量 反 18,000) 仍然 有 免疫 原 性 ， 而 其 它 三 个 较 小 的 片段 对 大 鼠 和 家 免 都 没有 免疫 原 性 。“A” 片 段 诱导 初级 抗体 反应 的 能 力 比 鞭 毛 素 原来 的 分 子 低 很 多 ， 不 过 诱导 次 级 反应 的 能 力 仍 相差 不 多 。 此 外 , 大 鼠 每 天 注射 “A” 片 段 ， 人 连续 数 周 ， 就 会 产生 对 鞭毛 素 单 体 或 多 聚 体 相 4CSNREIN SE, THEARMEA SR 7 N So > Go o 抗 血清 之 制 动 效 价 上- 24681012 2468101214 ，， 体 都 不 能 诱导 免疫 耐 受 性 ( 表 1-5) 。 A, Be - 时间 毛 素 分 子 在 局 部 降解 过 程 中 , 免疫 原 性 不 但 在 图 1-27 大刀 注射 并 毛 、 多 聚 体 及 单 体 10 微量 上 而 且 在 质 上 发 生 改 变 ， 从 强 的 免疫 原 性 转 克 ) 后 之 免疫 反应 ( 据 Ada， 等 ， 和 Sa os te 变 到 诱导 而 受 性 的 性 质 。 FAT bs i EE SUR AY SC EB, 鞭毛 被 阻 留 在 胭 淋 巴结 内 的 量 比 鞭 毛 素 单 体 要 多 。 用 同样 方法 比较 着 毛 素 单 体 和 “A” 片 段 的 分 布 , 发 现 :4I pid “A” HARE 结 内 的 分 布 和 纤毛 素 原 分 子 的 分 布 有 所 不 同 ,前 者 位 于 淋巴 结 通 部 巨 噬 细 胞 内 很 少 , 而 在 淋巴 滤 泡 内 较 高 。 因 此 , RRM TT EES ASA RMA Ric. mice 已 江 泡 的 抗原 可 能 诱导 免疫 耐 受 性 , 或 者 激发 已 经 受过 免疫 刺激 的 细胞 发 生 次 级 反应 。 至 - 41 表 1-5 鞭毛 素 多 聚 体 , MERAKR A 在 成 年 和 新 生 大 鼠 诱 发 抗体 反应 和 耐 受 性 的 能 力 的 比较 诱发 抗体 形成 的 能 力 (成 年 大 鼠 ) 诱发 高 剂量 区 耐 受 性 的 能 力 物 质 分 :也 县 初级 反应 次 级 反应 新 OE 成 F WER SR (40,000), +H Be + we B&B FR 40 ,000 人 二 二 十 + =: KF B&B A 18,000 aE a tt +H (4 Parigh 和 Ada, 1972), 于 片段 BL,C,D 在 淋巴 结 内 很 少 阻 留 , 因而 不 能 引起 任何 免疫 反应 。 KHADALHE 别 而 造成 的 免疫 反应 类 型 上 的 差别 , 显然 可 能 和 它们 的 分 子 大 小 ,以 及 由 分 子 大 小 决定 的 抗原 结构 的 复杂 性 有 关系 (Parish 和 Ada, 1972; Nossal 和 Ada，1971) 。 鞠 毛 抗原 的 一 个 显著 特点 是 不 需要 T 细胞 的 辅助 就 能 直接 刺激 B 淋巴 球 产生 体液 Dik. Ml. WARES. ARS BH (LPS) 以 及 非 天 然 的 聚 乙 烯 吡咯 烷 酮 等 多 聚 体 抗原 也 有 同样 的 能 力 。 因 此 ， 有 人 把 这 一 类 抗原 称 为 不 依赖 胸腺 的 抗原 〈Thy- mus independent antigen), 其 他 大 多 数 抗原 〈 如 球 蛋白 和 其 它 单 体 抗原 ) 诱导 体 流 抗体 都 需要 了 和 了 B 两 类 细胞 的 协作 , 因此, 称 为 依赖 胸腺 的 抗原 (Thymus dependent antigen), 比较 这 两 类 抗原 的 构造 时 , 可 以 看 出 前 一 类 抗原 的 构造 特点 是 存在 专 一 性 相 同 的 重复 决定 徐 ， 而 后 一 类 则 缺乏 这 种 重复 构造 。 由 此 可 以 合理 地 提出 一 个 假定 : 一 个 抗原 分 子 上 重复 排列 的 专 一 性 相同 的 决定 得 和 反应 细胞 表面 相 邻 受 体 结合 ， 可 能 要 比 和 相同 数目 ,但 不 紧密 相 邻 排列 的 决定 簇 ( 如 在 单 体 上 的 情况 ) 结 合 ， 对 发 动 B 淋巴 球 的 反 应 要 有 效 得 多 。 换 名 话说, 不 依赖 胸腺 的 抗原 由 于 存在 重复 决定 复 ,， 通过 抗原 的 多 价 性 ， 增加 了 和 B 淋巴 球 受 体 的 亲 合 性 ,或 交叉 连接 , 因而 能 单独 地 发 动 B 细胞 的 免疫 反应 o 已 知 球 蛋 白 表面 只 存在 数目 有 限 的 和 专 一 性 各 不 相同 的 抗原 决定 簇 。 如 果 激 活 了 淋巴 球 的 分 化 需要 和 受 体 有 较 高 的 亲 合 力 或 交叉 连接 的 话 ， 它们 只 有 预先 通过 载体 决定 簇 和 了 细 胞 表面 结合 (或 间接 地 和 巨 噬 细 胞 表面 结合 ) ,形成 多 价 的 聚集 物 , 才能 达到 同样 的 效果 。 根据 T 和 B 淋巴 球 协同 作用 的 假说 , 理论 上 对 于 引起 产生 体液 抗体 ， 在 免疫 原 分 子 构造 上 的 最 低 要 求 是 应 存在 两 类 不 同 的 抗原 决定 徐 ， 以 满足 载体 和 半 抗 原 的 免疫 学 功能 的 需要 。 并 且 这 些 决定 签 还 必须 在 空间 上 按 一 定 的 方式 排列 , 以 保证 细胞 间 的 相互 作用 ， 才能 满足 这 些 需 要 。 铁 氧 还 蛋白 (分 子 量 一 5,800) 正 接近 天 然 多 肽 能 引起 体液 抗体 所 需 的 最 低 分 子 量 。 最 近 , 有 人 报告 氧化 的 铁 氧 还 蛋白 的 C 端 5 肽 和 IN 端 7 肽 , 可 能 分 别 起 载体 和 半 抗 原 决 定 簇 的 作用 。 这 两 个 不 同 的 决定 簇 只 有 和 BSA 连接 ,或 者 靠 误 聚 甘 所 酸 连 接 时 , 方 呈 现 免疫 原 性 。 而 且 , 寡 聚 甘氨酸 桥 的 长 短 对 诱导 抗体 产生 的 能 力 有 决定 性 意义 。 桥 长 仅 为 5 个 甘氨酸 残 基 时 , 没有 免疫 原 性 , 而 桥 长 达到 10 残 基 以 上 时 ,就 有 免疫 原 性 。 其 次 ,如 果 将 两 个 相同 的 决定 簇 (C 端 5 肽 ), 即使 通过 12 残 基 的 桥 相 连 ， 也 没有 免疫 原 性 。 这 表明 一 个 免疫 原 的 免疫 原 性 在 结构 上 的 要 求 至 少 存在 两 个 专 一 性 不 同 的 搞 RE (Levy 等 , 1972) 。 天 然 多 肽 要 满足 上 述 分 子 构造 上 的 要 求 , 就 必须 达到 一定 的 最 低 分 子 量 。 随 着 分 子 量 的 增加 , 抗原 结构 的 复杂 性 也 增加 。 当 达到 多 聚 体 那 样 高 的 分 子 量 时 ,又 有 可 能 出 现 重复 排列 的 抗原 决定 簇 。 总 之 ,分 子 的 大 小 制约 着 抗原 结构 的 复 杂 性 , 从 而 制约 着 抗原 的 免疫 原 性 。 因 此 , 抗原 分 子 的 大 小 只 有 反映 了 分 子 结构 的 复杂 ° 42 « 性 有效 决定 往 的 数目 、 排 列 方式 .与 免疫 活性 细胞 的 亲 合 力 以 及 被 吞噬 或 阻 留 的 能 力 时 ， 才能 对 免疫 原 性 有 重要 的 意义 。 一 般 说 来 ,对 于 不 同 的 抗原 系统 , 达到 明显 的 免疫 原 性 所 需 的 最 低 分 子 量 可 能 不 同 。 这 可 能 又 和 分 子 的 外 源 性 ,构象 等 有 关系 。 如 果 从 细胞 水 平 来 考虑 , 淋巴 器 官 内 的 网 状 内 皮 系 统 好 象 一 个 带 有 免疫 学 专 一 性 的 "分子筛 ”能 选择 地 阻 留 一 定性 质 和 一 定 分 子 量 以 上 的 抗原 分 子 。 因 而 ,对 于 不 同 的 抗原 系统 , 阻 留 所 需 的 最 低 分 子 量 也 可 能 不 同 。 抗原 的 分 子 构造 的 复杂 性 ,尤其 是 有 效 决定 簇 的 数目 和 排列 方式 , 直接 制约 着 它 的 免 疫 原 性 。 这 一 概念 也 得 到 被 半 抗 原 不 同 程度 地 取代 的 丙烯 酰胺 直线 聚合 物 的 模式 实验 的 XH. 当 每 一 聚合 物 分子 上 按 适 当 间 上 距 排列 的 半 抗 原 数 目 少 于 12 一 16 时 ， 没 有 免疫 原 性 。 当 超过 此 数目 时 ,就 充分 表现 出 免疫 原 性 。 因 此 , 这 一 结果 似乎 说 明 ， 细 胞 对 抗原 的 免疫 反应 似乎 是 量子 化 的 , 即 至 少 要 有 最 低 数 量 的 专 一 抗原 受 体 (12 一 16) 被 多 价 抗原 连 结 成 一 片 空 间 上 连续 的 免疫 受 体 组 (Immunon) 时 ,才能 触发 反应 细胞 产生 有 效 的 信号 而 起 免疫 反应 (Dintzis 等 ,1976) 。 2. 抗 原 的 物理 状态 。 可 溶性 抗原 和 颗粒 抗原 除去 化 学 结构 外 , 抗原 的 物理 状态 对 免疫 原 性 也 有 很 大 影响 。 一 些 免 疫 原 性 弱 的 可 溶性 抗原 , 由 于 分 子 的 聚集 而 增加 质点 的 大 小 ,或 吸附 在 颗粒 表面 时 ,都 可 能 增加 或 使 其 获得 免疫 原 性 。 很 早 以 前 就 已 经 发 现 , 红 血球 膜 上 的 Forssman 异 嗜 性 抗原 的 类 脂 部 分 〈 半 抗原 ), 经 血清 蛋白 质 、 高 岭 土 或 其 它 胶体 颗粒 吸附 后 , 便 能 恢复 原 有 的 免疫 原 性 。 这 一 原理 在 增加 许多 弱 抗 原 的 免疫 原 性 的 实践 中 得 到 成 功 的 应 用 。 如 甲状 腺 球 蛋 白 和 聚 丙烯 酰胺 颗粒 结合 后 ,对 家 免 引 起 IgM 的 效 价 可 提高 20 倍 。 一 种 毒蛇 (Vipera palestinae) 的 蛇毒 是 很 弱 的 抗原 。 过 去 无 法 得 到 能 中 合 其 中 所 含 的 神经 毒素 的 抗 血 清 。 当 这 种 蛇毒 被 CM- 纤 维 素 吸 附 后 ,就 变 成 对 家 免 很 好 的 免疫 原 。 由 此 得 到 能 中 和 这 种 毒素 的 抗 血 清 (Moroz 等 ，1963) 。 这 里 还 要 提 到 一 个 关于 抗原 的 物理 状态 影响 免疫 原 性 的 重要 实验 。 Dresser (1962) 把 牛 丙种 球 蛋白 (BGG) 盐水 深 液 经 高 速 离心 分 为 沉 泻 和 上 清 液 两 部 分 。 他 发 现 沉淀 ( 聚 集 状 态 ) 能 使 CBA 品系 小 鼠 诱导 抗体 形成 ,而 上 清 液 ( 非 聚 集 状 态 ) 不 但 不 能 诱导 免疫 反 应 ,而 且 当 再 次 注射 BGG 育 集 部 分 时 也 不 能 引起 免疫 反应 , 即 出 现 了 对 BGG 的 耐 受 性 。 同 样 地 ,人 丙种 球 蛋 白 (AGG) 在 家 免 上 的 实验 也 得 到 相同 的 结果 , 而且 还 发 现 聚 集 的 HGG 能 在 免 肤 脏 内 阻 留 , 而 非 聚 集 HGG 则 不 能 (Biro 和 Garcia, 1965) 。 iE, 还 有 人 观察 到 聚集 的 HGG HKRRATER A. BEDS MEAD ER DD, MAO ENB, 而 可 溶性 HGG 的 分 布 则 不 同 (Brown 等 , 1970) 。 这 一 效应 也 在 临 床上 得 到 应 用 。 对 需要 做 组 织 移 植 手术 的 病人 ,事先 注射 可 溶性 ( 非 聚 集 的 ) SAH RE 白 使 获得 免疫 耐 受 性 。 将 来 用 含 抗 淋巴 球 抗体 的 马 丙种 球 蛋白 作为 免疫 抑制 剂 使 用 时 ， 就 不 致 出 现 严重 的 不 利 反 应 (Butler 等 ，1969) 。 抗原 分 子 的 聚集 或 吸附 在 胶体 颗粒 表面 能 增加 免疫 原 性 的 原因 可 能 是 抗原 被 局 部 集 中 , 半 抗 原 决定 往 紧 密 地 相 邻 排列 ,造成 激活 B 淋巴 球 增 生 、 分 化 的 条 件 。 最 近 , 发 现 处 于 聚集 状态 的 刀 豆 凝集 素 A (Concanavalin A) 以 及 和 琼脂 糖 珠 共 价 连 接 的 植物 血球 凝集 素 〈PHA) 都 刺激 B 淋巴 球 合成 DNA, 虽然 可 溶性 的 刀 豆 凝集 素 A 和 PHA 并 © 43 6 没有 这 种 作用 (Andersson 等 , 1972; greaves 和 Bauminger, 1972), 这 些 事实 都 支 持 上 述 解 释 。 此 外 , 巨 吻 细 胞 对 颗粒 抗原 吞噬 能 力 的 增加 ,也 是 一 个 可 能 的 原因 。 3. 免疫 反应 类 型 和 分 子 结构 的 关系 。 体 液 免疫 和 细胞 免疫 与 细胞 协同 作用 C1) 天 然 蛋 白质 抗原 的 载体 效应 天 然 球 蛋白 分 子 表面 仅 具 有 数目 有 限 的 , 专 一 性 各 不 相同 的 决定 徐 。 理 论 上 ,一 个 球 蛋白 分 子 的 任何 一 个 有 效 的 决定 得 都 可 以 看 作 一 个 半 抗 原 决定 得, 而 把 分 子 的 其 余部 分 看 作 载 体 , 分 别 和 也 淋巴 球 和 了 淋巴 球 的 抗原 受 体 起 作用 。 如 果 是 由 多 个 不 同 亚 基 组 成 的 分 子 , 同 样 可 以 把 一 个 亚 基 的 决定 簇 看 作 是 半 抗 原 决定 簇 ， 而 把 其 它 亚 基 看 作 载 体 。 Rajewsky 等 (1967) 证 明 家 免 能 产生 对 乳酸 脱 氢 酶 四 聚 体 的 一 种 亚 基 的 抗体 , 而 不 产生 对 另 一 种 亚 基 的 抗体 。 然 而 , 当 用 杂交 的 酶 分 子 LDH-III ( 亚 基 组 成 AABB) 免疫 时 却 能 同时 产生 对 两 种 亚 基 的 抗体 。 显 然 , 一 种 亚 基 可 能 作为 另 一 种 亚 基 的 载体 。 如 果 家 免 对 载体 亚 基 产生 了 免疫 耐 受 性 , 就 不 再 能 对 杂交 分 子 起 免疫 反应 。 所 以 , 这 一 实验 表明 天 然 球 蛋白 同样 可 能 存在 载体 效应 , 以 及 两 种 淋巴 球 协同 作用 的 现象 , 以 诱导 产生 半 抗 原 抗体 。 (2) 体液 免疫 和 细胞 免疫 目前 普遍 认为 T 细胞 是 同 迟 发 型 超 敏 反应 (细胞 免疫 ) 和 载体 专 一 性 有 关 的 ,而 BAA 胞 则 负责 半 抗 原 专 一 性 和 形成 体液 抗体 。 T 细胞 和 B 细胞 的 抗原 受 体 各 自 对 决定 簇 的 结构 有 不 同 的 要 求 。 对 于 大 多 数 抗原 ,诱导 体液 抗体 ,需要 两 类 细胞 的 协同 作用 。 免 疫 反 应 中 , 两 类 细胞 这 种 功能 上 的 分 工 和 协作 对 于 免疫 反应 类 型 的 调节 有 决定 性 意义 免疫 原 在 分 子 结构 上 的 特点 (有 无 重复 决定 簇 ,是 否 同时 存在 半 抗 原 决 定 徐 和 载体 决定 徐 ， 以 及 它们 在 空间 分 布 上 的 关系 等 ) 及 其 改变 ,都 可 能 影响 两 类 细胞 间 的 相互 作用 ， 从 而 也 影响 免疫 反应 的 类 型 。 对 园 毛 抗原 系统 的 研究 ,在 这 方面 提供 了 一 些 有 价值 的 知识 。 如 前 所 述 , 革 毛 素 抗原 分 子 的 大 小 和 免疫 反应 及 产生 的 抗体 的 类 型 有 密切 的 关系 ,如 多 聚 体能 诱导 IgM 和 IgG 抗体 的 形成 , 而 单 体 只 能 诱导 IgG 的 形成 。 进 一 步 的 研究 还 发 现在 鞠 毛 素 抗原 系统 中 , 抗原 诱导 循环 抗体 的 能 力 和 诱导 细胞 免疫 的 能 力 成 反比 。 例 WEA CNBr 有 裂解 的 片段 “A” 和 鞭毛 素 本 身 相 比 ,诱导 抗体 形成 的 能 力 减 弱 , 而 在 成 年 大 鼠 诱 导 细 胞 免疫 和 免疫 耐 受 性 的 能 力 则 显著 加 强 (Parish 和 Ada，1972) 。 此 Sh, 蒜 毛 素 乙 酸 乙 酰 化 程度 逐渐 增加 时 ,诱导 体液 抗体 的 能 力 逐 渐 减 弱 , 而 诱导 细胞 免疫 和 免疫 耐 受 性 的 能 力 却 逐 渐 增 强 。 同 时 其 抗原 性 也 相应 地 发 生变 化 , 和 天 然 纵 毛 素 抗 体 反应 的 能 力也 降低 。 如 果 这 种 与 抗体 反应 能 力 可 以 在 某 种 程度 上 代表 和 B 细胞 抗原 受 体 结 合 能 力 的 话 , 于 是 便 可 以 认为 化 学 改 性 的 鞭毛 素 诱 导体 液 抗 体能 力 的 降低 或 许 是 由 于 和 也 细胞 受 体 亲 合力 的 降低 。 进 一 步 推论 , 和 B 细胞 有 高 亲 合 力 的 抗原 倾向 于 诱导 体 液 抗 体 , 而 低 亲 合力 的 抗原 倾向 于 诱导 细胞 免 关 和 耐 受 性 。 也 就 是 说 ,体液 免 痕 和 细胞 免 疫 都 针对 相同 的 决定 签 , 不 过 细胞 免疫 (和 耐 受 性 ) 所 要 求 的 专 一 性 较 低 (Parish,1971)。 对 上 述 现 象 还 可 以 作 不 同 的 解释 。 已 知 几 种 不 同 血 请 型 的 沙门 氏 获 的 葛 毛 素 存在 共 同 的 抗原 决定 簇 (Hc) MAM MTR RAV). 有 证 据 表明 He 决定 簇 的 专 一 性 和 了 。44 。 ———————————— eee 细胞 及 细胞 免 羟 有 关系 , 布 HV 决定 簇 的 专 一 性 和 体液 抗 休 有关。 Ak, READE 分 子 构造 上 同样 可 看 作 一 个 “ 半 抗 原 -载体 ”系统 ，Hec 起 载体 决定 簇 的 作用 ,而 Hv 起 半 瀛 原 决 定 往 的 作用 。 血 清 型 (f, g) 鞭毛 素 单 体 经 化 学 改 性 (乙酸 乙酰 化 ) 前 后 诱导 细胞 免疫 反应 ( 迟 发 型 超 敏 反应 ) 的 能 力 和 血清 型 (1,2) 鞭毛 素 保持 同样 的 强度 , 没有 改变 ;而 诱导 体液 抗体 的 能 力 显 著 降 低 。 因 此 也 可 以 假定 化 学 改 性 主要 选择 地 破坏 Hv RE fz, 结果 诱导 体液 抗体 的 能 力 被 破坏 ,而 He 决定 得 仍 然 保 持 完 整 , 从 而 能 保持 诱导 细胞 免疫 的 能 力 (Langman，1972) 。 同 理 ，CNBr 裂解 的 “A” 片 段 的 免疫 原 性 的 变化 ， 也 可 以 假定 是 由 于 载体 决定 徐 和 半 抗 原 决定 簇 被 分 离 的 结果 。 此 外 ,一 些 蛋白 质 , We ES 白质 的 一 个 酶 解 片段 (15 肽 ) ,能 诱导 对 天 然 碱 性 蛋白 的 迟 发 型 超 敏 反应 ， 而 不 能 和 天 然 和 碱 性 蛋白 的 抗 血清 反应 (Lennon 等 , 1970) 。 同 样 可 以 认为 这 一 酶 解 片 段 中 只 含有 载体 RIE TR o 总 之 ,两 类 淋巴 球 在 功能 上 存在 分 工 , T 淋巴 球 和 细胞 免疫 同 载体 专 一 性 有 关 , 而 也 淋巴 球 则 负责 产生 循环 抗体 和 半 抗 原 专 一 性 。 与 此 相应 地 , 免疫 原 在 分 子 结构 上 也 有 分 化 ,存在 载体 决定 得 和 半 抗 原 决定 簇 。 虽 然 影响 免疫 反应 类 型 的 因素 是 多 方面 的 (抗原 的 性 质 和 剂量 .参与 反应 的 细胞 种 类 及 其 相互 关系 等 ) ,并且 从 根本 上 说 是 依赖 于 两 类 淋巴 球 及 其 亚 群 的 表面 特性 及 其 行为 的 (Cunningham，1974) ， 但 是 对 于 一 定 的 有 反应 能 力 的 动物 , 抗原 (蛋白 质 或 细胞 抗原 ) 结构 的 改变 (特别 是 载体 性 质 的 改变 ) 确实 能 影响 两 类 淋巴 球 的 相互 作用 ,或 专 一 地 刺激 一 类 细胞 , 从 而 改变 免疫 反应 的 性 质 。 许 多 实验 证 明 载 体能 直接 影响 抗 半 抗原 抗体 反应 的 性 质 。 当 半 抗 原 和 果 聚 糖 、 细 菌 脂 多 糖 ,肺炎 球菌 多 糖 (SIII) 和 Ficoll 等 具有 重复 结构 的 载体 结合 时 , 半 抗 原 抗 体 反 应 的 性 质 就 成 为 不 依赖 网 腺 的 了 (Klaus 等 , 1974, 1975; Inman, 1975), 红血球 表面 连接 上 一 层 大 肠 杆 菌 0127 的 脂 多 糖 时 , 同样 也 转变 为 不 依赖 胸腺 的 抗原 (Moller 等 , 1972) 。 载体 的 性 质 似 乎 还 影响 产生 的 免疫 球 蛋白 的 类 别 。 如 DNBP 半 抗 原 和 师 虫 抗原 载体 结合 时 ， 产 生 同 种 细胞 亲 合 抗体 IgE) 比 和 其 它 蛋 白质 载体 结合 时 要 高 得 多 (Strejen 和 Marsh, 1971) 。 半 抗 原 和 载体 蛋白 质 连 接 的 位 置 可 能 影响 产生 的 抗体 的 性 质 。 DNP 半 抗 原 和 BSA 载 体 的 羧基 或 氨基 相连 ， 免 疫 豚鼠 时 产生 很 高 的 抗 DNP 半 抗 原 抗体 和 很 低 的 抗 BSA tt fK. 4 DNP 和 BSA 的 酷 氨 酸 残 基 相 连 , 免疫 时 却 会 得 到 相反 的 结果 。 很 可 能 在 前 一 情 HF, DNP 半 抗 原 外 露 在 载体 分 子 表面 ,易于 和 免疫 活性 细胞 的 受 体 相 互 作 用 (Hama 等 ,1972) 。 每 一 个 载体 分 子 上 连结 的 半 抗 原 的 数目 似乎 对 此 也 有 影响 。 单价 的 NIP,- BSA 倾向 于 诱导 较 高 比例 的 IEG 抗 半 抗 原 抗 体 ， 而 多 价 的 NIPx-BSA 倾向 于 诱导 大 BA IgM 抗 半 抗 原 抗 体 〈Kontiainen，1971) 。 对 于 细胞 抗原 , 羊 红 血球 同时 受过 碘 酸 氧化 和 乙酸 乙酰 化 处 理 ， 便 从 主要 诱导 体液 免疫 的 抗原 转变 成 主要 诱导 细胞 免疫 的 抗原 (Parish, 1972), 同样 地 , 鸡 红血球 经 成 二 醛 或 甲醛 固定 后 ,保持 诱导 细胞 免疫 的 能 力 ， 而 失去 诱导 体液 抗体 的 能 力 (Dennert 和 Tucker，1972) 。 这 些 发 现 或 许可 能 用 来 加 强 囊 瘤 细胞 表面 抗原 诱导 细胞 免疫 的 能 力 。 近 来 ,有 人 发 现 小 鼠 肿瘤 细胞 经 成 二 醛 处 理 后 仍 保留 原来 的 抗原 专 一 性 , 但 诱导 细胞 免疫 的 能 力 加 强 , 体 该 免疫 反应 减弱 了 (Sanderson 和 Frost, 1974). 免疫 机 制 中 ， 两 种 淋巴 球 分 工 协作 和 免疫 原 结构 上 分 化 的 假说 ， 对 自身 抗体 (如 ACTH, 促 胃 沪 素 等 多 肽 激素 的 抗体 ) 产生 的 原因 ,也 可 能 提供 一 个 合理 的 解释 。 可 以 假 外 45 。 定 正常 动物 体内 可 能 存在 相当 数量 的 能 和 自身 抗原 的 半 抗 原 顺 序 起 反应 的 B 细胞 群 。 然 而 ,或 者 由 于 能 对 这 种 自身 抗原 的 载体 部 分 (内 源 载体 ) 起 反应 的 了 细胞 数量 有 限 ， 或 者 产生 了 耐 受 性 , B 细胞 不 能 被 激活 ,结果 便 不 产生 自身 抗体 。 如 果 把 具有 和 自身 抗原 相同 顺序 的 多 肽 和 ”外 源 载 体 ? 连 接 , 这 些 也 细胞 就 可 能 在 具有 “外 源 载体 ” 专 一 性 的 了 细胞 的 辅助 下 而 被 激活 ， 从 而 产生 自身 抗体 (Chiller #,1971; Benjamini &, 1972; 1973), 反之 ,如 果 将 一 个 半 抗 原 和 ”自身 载体 ”( 同 基因 型 的 IEG 最 有 效 ) 共 价 结 合 ， 则 能 诱导 对 该 半 抗 原 的 免疫 耐 受 性 (Borel 等 1971; Golan 和 Borel, 1971; Borel 等 ，1973) 。 另 一 方面 ， 蛋 白质 变性 时 构象 的 改变 也 可 能 造成 免疫 原 性 的 改变 。 有 些 变性 蛋白 RA 能 诱导 循环 抗体 ,但 可 以 诱导 迟 发 型 超 敏 反应 。 这 种 现象 也 可 能 和 某 些 自身 免疫 性 疾 病 的 发 病 机 制 有 关系 。 有 人 设想 人 体内 某 种 天 然 蛋 白质 由 于 某 些 病 理 原 因 发 生变 性 ， 结 果 成 为 对 自身 有 免疫 原 性 的 抗原 (Burnet，1963) 。 例如 , 因 链 球菌 感染 而 继 发 的 .Y=- 球 蛋 白 变性 被 认为 是 引起 类 风 织 性 关节 炎 的 一 系列 变化 中 的 关键 因素 (Hollander 等 ， 1965), 总 之 ， 抗 原 分 子 结构 和 免疫 原 性 关系 的 研究 对 于 了 解 某 些 自身 抗体 和 自身 免疫 病 的 发 病 机 理 都 可 能 是 有 帮助 的 。 蛋 白质 酶 解 片段 的 免疫 原 性 的 研究 在 这 方面 也 提供 了 一 些 有 启发 性 的 资料 。 4. 蛋白 质 酶 解 片段 的 免疫 原 性 和 自身 免疫 Kabat 等 (1949) 用 同 种 或 异种 实验 动物 的 脑 组 织 注射 到 实验 动物 能 引起 类 似 临 床 的 自身 免疫 性 脑 状 髓 炎 , RHR AHMSA HA (Experimental allergic encephalo- myelitis， 简 称 E.A.E.), Ja3%, Eylar 和 Thompson (1969) \4E 4864-51 E.A.E. 抗原 ， 证 明 是 分 子 量 为 18, 400 的 碱 性 蛋白 质 (简称 A.I. BAM, 是 由 170 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 一 条 单 链 线 状 分 子 , 其 全 部 排列 顺序 已 测定 清楚 (Eylar 3,1971), A. I. 蛋白 质 经 胃 和 蛋白酶 分 解 后 可 得 到 11 个 片段 ,其 中 两 个 片段 ，“ 卫 ”(16 肽 ) 和 “ 卫 . 工 ”(26 肽 ) , 比 原来 的 A. I. 蛋白 质 有 更 强 的 引起 EAE. 自身 免疫 病 的 免疫 原 性 。 由 些 可见 ， 引起 这 种 自身 免疫 病 只 需 A. I. 蛋白 质 分 子 上 的 小 段 多 肽 。 已 知人 的 A. I. SAR (172 氨基 酸 残 基 ) 引起 脑 兰 骨 炎 的 主要 抗原 决定 簇 是 包含 色 氮 酸 残 基 的 一 小 段 多 肽 : 114 115 116 117 118 119 120 121 -Ser- |Try|-Gly-Ala-Glu-Gly-Glu-Lys- 当 用 2- 羟 -6- 硝 基 溴 葵 ( 对 色 氨 酸 有 专 一 作用 ) OS, EE ART MEF A 之 失 活 ， 同 样 证 明 多 肽 链 的 一 小 外 对 于 引起 此 种 自身 免疫 病 有 密切 关系 (Eylar,1970). 值得 提 到 的 是 利用 纯化 抗原 对 狼 猴 的 也 . A. 卫 . 自身 免疫 病 进 行 实验 治疗 得 到 的 初 PER, WRN A.I 蛋白 质 的 主要 抗原 决定 簇 位 于 顺序 134 一 170 肽 段 , 并 和 人 的 A- I. 蛋白 质 有 交叉 反应 。 当 用 人 的 A.I. 蛋白 质 加 Freund 完 全 佐 剂 足 掌 注射 时 ， 能 在 猕 猴 引 起 实验 过 敏 性 脑 脊 髓 炎 。 当 实验 动物 出 现 典 型 的 临床 症状 (下 胶 准 痪 ) 后 24 一 48 小 时 ， 再 用 纯化 的 人 A. I. 蛋白 质 加 Breund 不 完全 佐 剂 肌肉 注射 ， 就 能 抑制 病情 的 发 展 , 并 且 大 部 分 猴子 能 恢复 健康 (了 ylar 等 , 1972) ( 表 1-6) 。 这 一 实验 是 在 实验 性 自身 免疫 病 已 经 出 现 确定 的 症状 后 ,经 实验 治疗 得 到 康复 的 第 一 个 例子 。 此 外 , 还 观察 到 若 事 先 注射 低 剂 量 的 A. I. BARC Freund 完全 佐 剂 ) ， 可 以 在 有 限 程度 上 预防 注射 全 se 46 。 -~ -~ me 表 1-6 猕猴 实验 过 敏 性 脑 装 蓝 炎 出 现 临床 症状 后 的 抑制 * | | HNB-A.l. 和 蛋白 质 ## 组 蛋白 10 不 处 理 10 * 足 掌 注射 人 A. I. 抗原 5 毫克 (加 CFA), 12-13 天 后 发 病 。 ** 人 ALL. 抗原 之 2- 羟 -5- 硝 基 茉 省 衍生 物 。 ( 据 Eylar 等 ,1972)。 剂量 抗原 所 引起 的 实验 过 敏 性 脑 脊 髓 炎 。 如 果 在 第 一 次 低 剂 量 注 射 后 , 再 连续 三 次 注射 一 种 合成 的 碱 性 多 肽 (Ala, Glu, Lys, Tyr 的 共聚 物 , 分 子 量 为 23,000)， 就 可 能 大 大 增加 预防 能 力 (Teitelbaum 等 , 1972)。 由 于 用 纯化 抗原 治疗 自身 免疫 病 具 有 高 度 的 专 一 性 , 在 自身 免疫 病 的 实验 治疗 研究 方面 是 值得 加 以 注意 的 。 5.“ 外 源 性 ” 动物 蛋白 质 的 免疫 原 性 , 通常 与 该 动物 和 被 免疫 动物 在 系统 分 类 上 的 亲 疲 程度 RR 比 , 血 源 关系 相距 愈 远 , 即 “外 源 性 ? 愈 大 , 则 该 动物 的 蛋白 质 抗原 的 免疫 原 性 您 强 。 例 如 ， 鸭 的 蛋白 质 对 鸡 是 较 弱 的 免疫 原 , 而 对 家 兔 是 良好 的 免疫 原 。 反 之 ,分 类 上 相近 的 物种 之 同一 类 蛋白 质 抗原 ( 同 源 的 抗原 ) 在 血清 学 上 有 交叉 反应 。 如 鸡 卵 白 蛋白 的 免 抗 血清 能 使 各 种 家 禽 的 卵 白 蛋白 沉淀 。 同 一 物种 的 抗原 与 抗 血清 所 起 的 反应 最 强 ; 分 类 上 相近 的 火 鸡 、 珠 鸡 的 卵 白 蛋 白 , 则 产生 中 等 反应 ;分 类 上 相距 较 远 的 鸣 鹅 的 卵 白 蛋 白 所 产生 的 沉 淀 最 少 ( 表 1-7) 。 一 般 说 来 ,抗原 的 交叉 反应 强度 和 系统 分 类 土 的 亲 蕊 程度 成 正比 。 血 缘 关 R17 卵 白 蛋白 的 来 源 对 于 鸡 卵 白 蛋白 抗 血清 所 起 沉淀 反应 强度 的 影响 ( 录 自 Carpenter, 1956) PARA KRW KH 5519 99 , ae ms 鸡 形 目 Mow 目 man my gas liter pane loreal, mek 物 的 相对 体积 a 100% 35% 26% 9% 9% G 100 67 37 42 31 两 100 61 51 30 18 系 愈 近 , 交叉 反应 愈 强 ; 血缘 关系 傅 远 , 交叉 反应 愈 弱 。 血 清 学 上 的 关系 反映 了 系统 分 类 止 的 关系 。 目 前 已 证 明 , 实际 上 外 源 性 和 交叉 反应 性 是 同一 抗原 分 子 在 进化 上 的 血缘 关 系 在 不 同方 面 的 反映 , 它们 具有 共同 的 分 子 基础 。 (=) 蛋 白质 抗原 的 系统 发 生 关系 与 交叉 反应 性 及 外 源 性 1. 物种 的 血清 学 分 类 免疫 化 学 的 早期 研究 证 明 各 种 动物 的 同一 类 蛋白 质 之 间 可 能 存在 血清 学 上 的 交叉 反 ae 24 SEWN AE (Ursus americanus) 8 ARGH CAiluropoda melanoleuca) 小 熊猫 CAilurus fulgens) 浣熊 (Procyon lotor) 时 间 ( 百 万 年 ) 图 1-28 两 种 熊猫 的 系统 发 生 。 谱 系 线 上 的 数字 表示 白 蛋 白 和 转 铁 蛋 白 的 量 的 变化 ( 按 免疫 学 距离 单位 计量 )。 时 间 表 是 按 250 单位 变化 相当 于 6 千 万 年 计算 ( 据 Sarich，1973 )。 应 , 交叉 反应 的 程度 反映 这 些 物 种 在 系统 发 生 上 的 亲缘 关系 (Landsteiner, 1945), 这 种 血清 学 分 类 方法 ,曾经 成 功 地 应 用 到 动物 .植物 以 及 微生物 的 分 类 上 。 三 十 年 代 K6nigs- berg 学 派 根据 血清 学 反应 所 显示 的 植物 种 、 属 间 的 亲缘 关系 而 绘 出 的 系统 树 ， 与 根据 解剖 学 ,形态 学 .细胞 学 及 古生物 学 材料 得 出 的 系统 发 生 关 系 是 非常 一 致 的 。 同 样 在 动物 学 方面 ,血液 蛋白 质 的 血清 学 比较 研究 , 对 于 解决 分 类 学 和 进化 上 的 难题 , 至 今 仍 然 是 重 要 的 证 据 。 大 熊猫 (Ailuropoda 人 elanolevca) 是 我 国 特产 的 珍贵 动物 , 然而 ， 它 在 系 统 分 类 上 的 地 位 , 却 是 长 期 争论 未 决 的 问题 。 分 类 学 家 一 般 认 为 和 它 最 接近 的 是 能 BR 浣熊 科 。 可 是 ,究竟 更 象 能 , 还 是 更 象 浣 能 ,就 有 意见 分 歧 了 。 最 近 , 有 人 用 血清 学 方法 肯 ， 定 了 大 熊猫 和 能 最 接近 。 因 此 ,我 们 或 许 应 当 说 大 熊猫 是 能 〈Sarich，1973)〈 图 1-28)。 血清 学 方法 在 古生物 学 和 考古 学 上 也 有 重要 应 用 价值 。 最 近 发 现 许 多 化 石 内 仍然 保 存 着 有 机 大 分 子 , 如 蛋白 质 和 多 糖 的 残留 物 。 这 些 大 分 子 被 密封 在 矿物 化 的 组 织 内 ,和 环 © 境 隔 绝 , 虽然 可 能 经 过 几 千 万 年 的 昌 长 岁月 ,往往 还 完好 地 保留 着 抗原 性 。 从 七 千 万 年 前 一 种 头 足 类 箭 石 (Belemitella junior) 的 化 石 壳 内 提取 出 来 的 大 分 子 物质 , 和 现代 头 足 Et EIR (Sepia officinalis), B3R32 (Nautilus pompilius) 的 提取 物 在 免疫 扩散 上 有 交叉 反应 。 用 这 种 方法 就 可 以 直接 捡 定 某 些 已 绝 灭 的 物种 和 现存 物种 之 间 的 杀 缘 关 系 (De Jong 等 ,1974)5 “除了 上 述 理论 研究 上 的 兴趣 外 , 血清 学 分 类 方法 在 经 济 鱼 类 、 病源 原生 动物 的 种 以 下 的 分 类 上 的 应 用 ,近年 来 也 引起 注意 。 这 对 于 鱼 群 预测 .寄生 虫 六 行 病 学 等 方面 ,都 可 能 有 实用 价值 。 关 于 血清 学 分 类 法 在 动物 上 的 应 用 的 较 近 的 资料 , 可 BA Wright (1974) 的 专著 。. 2. 免疫 学 交叉 反应 程度 及 外 源 性 与 蛋白 质 抗 原 分 子 的 一 级 结构 的 种 属 差异 的 关系 动物 的 蛋白 质 抗 原 除 有 种 属 专 一 性 外 , 还 有 器 官 和 组 织 的 专 一 性 。 不 同 物种 的 同一 类 组 织 专 一 抗原 ,如 各 种 Re irc aeene ue 各 种 哺乳 动物 ， 如 猪 `, 免 和 人 的 胰岛 素 之 间 也 有 交叉 反应 。 这 几 种 胰岛 素 分 子 的 一 级 结构 基本 上 相似 , 可 以 看 作 是 进化 上 同 源 的 分 子 , 它们 之 间 唯 一 已 知 的 差别 是 B 和 依次 分 别 为 Ala、Ser 和 Thr。 这 提示 同 源 的 蛋白 质 分 子 间 的 交叉 反应 是 基于 其 氨基 酸 排列 顺序 的 相似 性 。 近来 , 对 种 系 发 生 上 同 源 的 和 突变 的 蛋白 质 , 特 别 是 对 细胞 色素 C、 溶 菌 酶 和 血红 S 白 的 交叉 反应 性 、 氮 基 酸 排列 顺序 和 构象 的 比较 研究 得 出 两 条 有 普遍 意义 的 原理 ， « 48 « 40 60 80 顺序 差别 (92) 图 1-29 各 种 球 蛋白 免疫 学 交叉 反应 程度 和 氨基 酸 顺 序 差 别 程 度 的 关系 (Prager 和 Wilson，1971)。 根 据 下 列 蛋 白质 研究 结果 绘制 : 〈《@) 碱 性 磷 酯 酶 ;(^) 碳 酸 本 酶 ;( 申 ) 生 长 素 - 胎 盘 催 乳 素 ;〈 棕 ) 铁 氧 还 蛋白 ;( 全 ) 盘 尼 西 林 酶 ;(Y) 胰 蛋白 酶 - 胰 凝 乳 蛋 白 酶 ;(@ ) 胰 核糖 核酸 酶 ;\O76- 乳 球 蛋 白 ; ( 勾 ) 枯 草 杆菌 酶 ;(D )RNA 鸣 菌 体外 壳 蛋 白 ;〈《O 7) 血红 蛋白 ;〈《@ 7) 肌 红 和 蛋 白 ;(9?”) 溶 菌 酶 。 斜 线 区 表示 在 这 一 顺序 差别 范围 内 通常 呈现 交叉 反应 。 (1) 同 源 球 蛋 白 之 间 血 清 学 上 的 交叉 反应 程度 与 其 氨基 酸 排 列 顺序 的 相似 程度 大 的 成 正比 对 一 系列 已 知 一 级 结构 的 球 蛋白 的 免疫 学 交叉 反应 程度 和 排列 顺序 差别 程度 之 间 的 关系 的 研究 结果 总 结 于 图 1-29 (Prager 和 Wilson，1971) 。 由 图 可 见 ， 顺 序 差 别 小 ， 交叉 反应 程度 高 ;顺序 差别 增高 ,交叉 反应 程度 减 小 。 当 顺序 差别 超过 30 一 40% 时 ,就 不 再 有 交叉 反应 了 。 如 果 只 考虑 位 于 球 蛋 白 分 子 表 面 的 顺序 差别 , 这 程 相关 性 可 能 还 要 密 切 。 如 美洲 鹊 部 和 鸡 的 溶菌 酶 之 间 的 交叉 反应 程度 ,测定 的 结果 只 相当 于 1.2 个 残 基 的 差别 ,而 比较 两 者 的 一 级 结构 AAG 4 个 残 基 不 同 (Prager 等 ，1972) 。 然而 ,如 果 从 这 些 残 基 在 分 子 表面 的 位 置 看 来 ,其 中 3 个 残 基 位 于 分 子 表面 陷 人 的 地 方 ， 只 有 一 个 残 基 CREO") 位 于 分 子 表面 突出 的 地 方 ， 也 就 是 有 效 的 抗原 决定 簇 的 地 方 (S48 1-19; Arnon，1968) 。 另 一 方面 , 对 人 、 多 猴 、 马 、 骆 驼 、 牛 、 羊 、 山 羊 和 精 鲸 的 肌 红 肝 的 结构 ,构象 和 交叉 反应 性 的 比较 研究 ,表明 球 蛋白 的 抗原 构造 的 相似 性 不 一 定 和 它们 的 排列 顺序 的 相似 性 成 正比 。 这 种 情况 很 可 能 是 受到 这 些 分 子 在 进化 过 程 中 , ARABS 换 而 产生 的 构象 差异 的 影响 (Atassi 等 ，1970a，Pb) 。 因 此 , 同 源 球 蛋 白 之 间 的 交叉 反应 性 更 可 能 是 由 分 子 局 部 构象 的 相似 性 决定 的 。 只 有 当 排 列 顺 序 的 相似 性 能 反映 分 子 局 部 构象 的 相似 性 时 ,才能 用 以 表示 和 交叉 反应 程度 的 关系 。 严 格 说 来 ,用 免疫 化 学 交叉 反应 程度 来 测量 球 蛋 白 之 间 排 列 顺 序 的 差别 , 只 是 一 个 简化 的 和 近似 的 量度 , 因为 这 是 以 假定 进化 过 程 中 出 现 的 氨基 酸 置换 不 影响 ,或 很 少 影 响 整个 分 子 总 的 构象 为 前 提 的 。 其 次 , 它 所 测定 的 实际 上 只 是 和 分 子 表面 局 部 构象 的 差异 有 关 的 顺序 差异 , 而 不 是 全 部 顺序 差异 。 e 49 e (2) 个 别 和 氨基 酸 的 置换 可 能 引起 整个 球 有 蛋白 分 子 抗原 性 和 免疫 原 性 的 改变 分 子 生物 学 上 的 一 个 重要 现象 是 蛋白 质 的 同 种 异型 (Allotypes)， 即 同一 种 蛋白 质 存在 不 同 的 分 子 形式 。 它 们 的 化 学 性 质 很 相似 , 但 可 用 免疫 化 学 方法 把 它们 区 分 开 来 。 人 的 血红 及 ,免疫 球 蛋白 (如 IgG) 都 是 几 种 同 种 异型 分 子 的 混合 物 。 同 种 异型 蛋白 是 由 一 对 或 一 对 以 上 的 等 位 基因 控制 的 ,它们 之 间 的 差别 是 由 于 基因 突变 造成 肽 链 上 一 小 段 氨 基 酸 排列 顺序 (甚至 仅仅 一 个 氨基 酸 单位 ) 的 改变 。 例如 血红 肝 Al 和 SS 只 有 一 个 氨基 酸 残 基 的 差别 (aap2s va) (Reichlin 等 ,1966) 。 根据 对 突变 蛋白 质 , 主要 是 溶菌 酶 ， 细 胞 色素 C(Nisonoff 等 , 1972) 和 血红 及 的 广 ZH, 发 现 位 于 球 蛋 白 表 面 的 个 别 氨基 酸 的 置换 和 抗原 性 的 变化 有 直接 的 关联 。 例 On, AMER AER C 分 子 结构 的 唯一 差别 是 残 基 58 不 同 CRB SBM), 这 一 残 基 位 于 分 子 表面 , 可 能 参与 抗原 决定 簇 的 形成 。 人 的 细胞 色素 C 上 58 位 置 的 Ile 在 erik ER Thr 代替 ， 结 果 当 用 家 免 抗 人 细胞 色素 C 的 抗 血清 检测 时 ， 发 现 抗 原 性 降低 25—40% (Nisonoff 等 ，1970) 。 另 一 方面 ， 若 用 狼 猴 细胞 色素 C HERR, BIN 63 68 80 92 02 a I 1 B aes | ee |, ee 68 73 85 92 96 102 106 122. 141 a B 图 1-30 Amit A,《〈 用 家 免 抗 血清 测定 ) 之 抗原 活性 区 相对 于 人 和 家 免 血 红 及 氨 基 酸 顺序 的 差异 之 位 置 关 系 。 (a) 顺序 差异 的 直线 图 , 差异 用 黑 方块 表示 。x 和 8 链 顺 序 按 最 大 同 源 程 度 排 列 。 由 图 可 见 , 主 要 的 顺序 差异 (9092) 出 现在 四 个 区 域 。 《〈b) 抗原 活性 区 域 的 位 置 。 用 家 免 抗 HbA, 血清 测定 时 可 区 别 的 人 突变 血红 胶 ， 用 黑 方块 表示 ; 不 能 区 别 的 用 斜 线 表示 。 比 较 以 上 两 图 可 见 ， 抗原 活性 区 倾向 于 分 布 在 多 肽 链 含 顺序 差异 的 区 域 , 而 无 差异 的 区 域 主要 是 无 免疫 活性 的 。( 据 Reichlin, 1972), e 50 。 Ho eK C 的 抗 血 清 , 却 不 能 区 分 人 和 猕猴 的 细胞 色素 C。 也 就 是 说 ， 当 残 基 58 的 Ile 被 . Thr 代替 时 ， 就 使 原来 对 家 免 有 免疫 原 性 的 决定 得 变 成 免疫 学 上 不 活动 的 区 域 ,不 能 在 家 免 引 起 针对 该 部 位 的 抗体 。 已 知 家 免 细 胞 色素 CREE 58 和 猕猴 相同 ,同样 Thr, Ak, BRM C 含 残 基 58 的 部 位 对 于 家 免 没 有 免疫 原 性 是 和 这 一 事实 一 致 的 ,也 就 是 说 球 蛋白 分 子 有 免疫 原 性 的 抗原 决定 往 是 分 子 表面 构造 和 被 免疫 动物 的 同 源 蛋白 质 有 差别 的 部 位 ;如果 这 种 差别 不 存在 了 ,该 部 位 也 就 失去 免疫 原 性 了 。 人 血红 肝 突 变 分 子 的 系统 研究 发 现 , 对 于 家 免 抗 人 在 红 肝 Al 的 抗 血 清 测定 系 统 , 某 些 ( 不 是 全 部 ) 个 别 氨基 酸 置 换 和 免疫 原 性 的 改变 有 关系 , 而 另 一 些 位 置 的 置换 则 无 关系 。 在 人 HbA, (免疫 原 ) MRK Hb (被 免疫 动物 的 同 源 蛋白 质 ) 的 氨基 酸 排列 顺序 的 差别 ， 与 残 基 置 换 能 否 引起 免疫 原 性 的 变化 之 间 , 在 分 布 上 存在 有 趣 的 关联 。 如 图 1-30 所 示 ， 抗原 活性 区 域 (用 家 免 抗 人 HbA， 抗 血清 检测 时 ,能 区 别 的 人 突变 血红 肝 ) 分 布 在 免疫 原 | 分 子 和 被 免疫 动物 的 同 源 分 子 的 多 肽 链 存 在 排列 顺序 差别 的 区 域 (图 左 侧 的 四 个 段落 ) ， 而 抗原 性 上 不 能 区 别 的 突变 主要 位 于 分 子 进化 上 保守 的 区 域 (图 右 侧 的 四 个 段落 ) (Rei- chlin，1972) 。 因此 , 这 种 相关 性 有 力 地 支持 球 蛋白 的 抗原 决定 复 是 分 子 表面 构造 和 被 免疫 动物 的 同 源 蛋 白质 分 子 之 有 差别 的 部 位 。 在 分 子 水 平 , 抗 原 的 交叉 反应 性 和 免疫 原 性 (外 源 性 ) 对 分 子 结构 的 依赖 是 同一 现象 的 两 个 侧面 ,它们 都 依赖 于 抗原 分 子 进化 过 程 中 出 现 的 排列 顺序 的 差异 ， 以 及 由 此 决定 的 分 子 表面 局 部 构象 的 差异 。 免 疫 原 和 被 免疫 动物 的 同 源 分 子 之 间 , 分 子 结构 的 相似 性 决定 抗原 之 间 的 交叉 反应 性 ;而 它们 的 分 子 结构 的 差别 性 ( 即 * 外 源 性 ) 又 决定 其 免疫 原 性 。 抗 原 专 一 性 和 免疫 原 性 不 仅 决定 于 蛋白 质 搞 原 的 一 级 结构 , 更 重要 的 还 决定 于 分 子 表面 的 局 部 构象 (抗原 决定 簇 ) 。 总 之 , 从 蛋白 质 搞 原 分 子 进化 中 , 系统 发 生 关 系 和 交叉 反应 性 的 关联 的 研究 结果 ,更 加 充实 了 前 几 节 中 得 出 的 关于 抗原 专 一 性 和 免疫 原 性 的 分 子 基础 的 结论 ,并 从 抗原 分 子 进 化 过 程 中 产生 的 排列 顺序 的 种 属 差异 说 明了 抗原 专 一 性 和 免疫 原 性 产生 的 历史 根源 。 (4) 几 类 重要 的 天 然 蛋白 质 和 多 肽 抗原 1. 细菌 毒素 蛋 自 质 的 免疫 原 性 在 预防 免疫 上 有 重要 的 实际 意义 。 破 伤风 杆菌 ,白喉 杆菌 、 志 贺 氏 痢疾 杆菌 和 肉 毒 杆菌 都 能 产生 外 毒素 (Exotoxin) ， 释 放 到 环境 中 。 毒 素 是 一 种 含 多 糖 - 类 脂 的 复合 蛋白 质 , 可 形成 结晶 。 毒 素 经 甲醛 或 其 它 适 当 处 理 减 毒 以 后 , 仍 保持 免疫 原 性 ， 称 为 类 毒素 (Toxoid), 类 毒素 能 引起 中 和 毒素 的 抗体 , 故 可 用 于 预防 注射 。 显 然 , 抗 原 决定 徐 和 毒性 基 团 是 不 同 的 ,但 在 空间 排 布 上 可 能 是 相 邻 的 基 团 。 因 此 ,过 去 曾经 假定 当 抗 毒素 和 毒素 结合 时 可 能 阻碍 了 毒性 基 团 的 作用 。 近 年 来 对 于 白喉 毒素 的 毒性 、 抗 原 性 和 分 子 构造 关系 的 研究 ,使 我 们 对 毒素 的 中 和 机 制 有 了 更 深入 的 了 解 。 折 喉 毒素 对 敏感 细胞 的 毒性 作用 是 抑制 细胞 的 蛋白 质 合成 。 这 种 抑制 作用 是 由 于 毒 AAA NAD- 转 移 酶 II-ADP 核糖 转移 酶 (NAD-transferase II-ADP-ribose- transferase) 活力 ,能 把 NAD+ 之 ADP 核糖 基 团 转移 到 氨基 酰 转 移 酶 II (Amino- acyl transferase II) ， 并 与 该 酶 发 生 共 价 结合 从 而 抑制 酶 的 活力 : NAD+ + 氮 基 酰 转 移 酶 II = ADP- 核 糖 - 转 移 酶 II + 获 酰 胺 +Ht+ e 51 e 由 于 氨基 酰 转 移 酶 I 在 蛋白 合成 中 起 关键 作用 ,因此 毒素 对 该 酶 的 作用 , 就 导致 细 胞 蛋白 质 合成 的 抑制 。 白喉 毒素 是 分 子 量 约 为 62,000 的 一 条 多 肽 链 ,完整 分 子 不 表现 酶 活性 。 从 细菌 释放 1S 一 一 一 S S S 时 x ee Se es Se eS ea es ——— A B C 一 上 下 “一 一 一 一 图 1-31 白喉 毒素 降解 片 有 假 间 的 关系 。 括号 表示 二 硫 桥 连接 区 域 ; 表示 胰 蛋 白 酶 敏感 点 ; 立 表示 非 还 原 条 件 下 胰 和 蛋白酶 水 解 点 (# Gill 和 Pappenheimer, 1971), 出 来 后 ， 在 还 原 条 件 下 可 被 酶 解 为 两 个 具 有 不 同 功能 的 片段 (图 1-31) (Gill 和 Dinius,1971), FrBe A (分 子 量 =24;000) 在 离 体 条 件 下 表现 酶 活性 , 能 将 ADP- 核糖 从 NAD+ 转移 到 氮 基 酰 转 移 酶 II 上 。 REB (4+ = 38,000) 含有 三 个 半 胱 氨 酸 , 负 责 和 敏感 的 细胞 专 一 地 结合 ,并 能 使 FEA 进 和 人 细胞 (Gill 和 Pappenhei mer, 1971), Akt, 对 活体 细胞 的 毒性 作 用 需要 毒素 分 子 的 这 两 个 片段 协同 作用 ， 片 妇 B 负责 细胞 专 一 性 〈 识 别 作 用 ) ， 片 段 A 则 起 毒性 作用 (杀伤 作用 ) 。 通过 对 马 和 家 免 抗 白喉 毒素 的 抗 血 清 与 纯化 的 片段 A, B， 以 及 无 毒性 而 和 白 RS 素 有 血清 学 关系 的 Crm,; 和 Crmlsr 突变 和 蛋白质 之 间 的 定量 免疫 化 学 研究 ， 确定 了 一 些 抗 原 决 定 簇 在 毒素 分 子 上 的 位 置 (Pappenheimer 等 , 1972; Pappenheimer 和 Gil1， 1973). HARA 抗体 能 抑制 分 离 的 片段 A， 以 及 激活 的 毒素 分 子 在 离 体 条 件 下 的 酶 活 力 , 但 不 能 在 活体 内 中 和 毒素 。 抗 片 眉 B 抗体 对 毒素 分 子 有 高 度 的 亲人 合力， 能 在 整体 内 中 和 毒素 ,阻止 它 和 敏感 细胞 的 细胞 膜 结 合 。 由 于 抗 片 眉 A 抗体 缺乏 在 整体 内 中 和 毒素 的 作用 , 因此 抗 白喉 毒素 的 抗 血清 中 ,只 有 当 抗 片段 A 含量 低 而 抗 片段 马 高 时 , 才 可 能 有 较 大 的 中 和 毒素 的 亲人 合力 。 从 表 1-8 可 见 , 高 亲 合力 的 抗 血清 只 含 很 少 的 或 不 含 抗 片 RA 抗体 , 而 亲 合 力 低 的 抗 血清 则 含 相当 高 比例 的 抗 片段 A 抗体 。 一 般 说 来 , 抗 自 喉 毒 素 的 亲 合 力 和 抗 片段 A 的 含量 成 反比 。 总 之 , 抗 白喉 毒素 中 和 毒素 的 机 制 主 要 依赖 抗体 和 片段 B 之 间 的 相互 作用 (尤其 是 C 末端 分 子 量 17,000 的 肽 段 ) 。 在 整体 内 抗 毒 素 的 作用 主要 在 于 阻止 毒素 分 子 和 敏感 细胞 表 1-8 抗 白喉 毒素 血清 中 抗 片段 A 含 量 和 亲 合 力 的 关系 毒素 可 沉淀 抗体 总 量 中 一 抗 if 清 亲 合 力 (整体 : 离 体 比值 抗 片 眉 A 之 含量 (52) No. 5353 (3) S12 <20°'- SA. No. 10 (3) 1.2 30 S.A. No. 10 (经 CrM45 吸附 ) >1L-2 0 TUrG (家 免 ) 1.0 30 TUrG (经 CrM,, 吸附 ) Tz 0 抗 CrM,, 0.25 70 抗 CrMi%y No. 1 <0 71 >90 No. 2 mai) -) | >9 . No. 3 0.5 30 Ht CrMi% No. 1 1.0 v0 2 《甲醛 处 理 )No, 1.0 15 (42 Pappenheimer 等 ,1972)。 252 « 细胞 膜 的 结合 , 而 不 是 抑制 其 毒性 基 团 的 作用 ( 酶 活力 ) 。 事 实 上 , 马 抗 毒素 (SA10), 4 用 Crm45 吸附 去 除 所 有 其 它 的 沉淀 抗体 ， 只 剩 下 抗 C 端 分 子 量 1,7000 的 肽 段 的 抗体 时 ,表现 出 中 和 毒素 的 最 大 亲 合 力 , 尽 管 它 不 能 影响 激活 的 毒素 的 酶 活力 。 从 这 些 理论 研 究 结果 不 难看 出 毒素 分 子 的 结构 和 功能 关系 的 研究 ,对 于 生产 高 亲人 合力 的 〈 高 防护 力 的 ) 抗 毒素 是 有 重要 应 用 价值 的 。 2. 病毒 抗原 病毒 是 含 RNA 或 DNA 的 复合 蛋白 质 。 通常 由 许多 亚 基 构成 。 烟草 斑纹 病毒 (TMV) 是 植物 病毒 中 研究 得 最 透彻 的 一 种 抗原 , 可 作为 一 个 代表 。 TMV 分 子 呈 棒状 ， 大 小 约 为 180 x3000A。 分 子 量 达 到 40 x 10*， 病 毒 的 外 壳 是 由 2200 个 相 同 的 蛋白 质 亚 基 组 成 ， 每 个 亚 基 含 158 BEM 位 。 亚 基 分 子 量 为 17,500。 外 壳 核 心 有 一 条 盘 绕 成 螺旋 形 的 RNA 链 (图 1-32) 。 TMV 的 抗原 性 和 病毒 分 子 的 空间 构象 有 密 切 关 系 。 由 于 蛋白 质 亚 基 环 绕 RNA 内 核 规 则 . 地 排列 ， 因 而 可 能 出 现 依 赖 四 级 结构 的 新 的 抗原 决定 簇 。 这 一 类 决定 往 可 能 是 由 几 个 相互 作用 的 亚 基 共同 构成 的 ， 也 可 能 是 由 于 亚 基 间 相互 作用 造成 的 一 个 亚 基 的 构象 变化 而 新 出 现 的 (Rappa- port 和 Zaitlin, 1970), 利用 亚 基 酶 解 片段 抑制 抗 病毒 血清 和 病毒 之 ”四 1.32 Hisham ae. Ast 间 的 免疫 反应 的 方法 ， 分 析 TMV 抗原 结构 的 早 螺旋 形 链 为 RNA， 被 蛋白 质 亚 基 所 包围 期 工作 发 现 ; 亚 基 分 子 上 存在 几 个 抗原 活性 区 域 ， es BGK ie Soe ORs #4 ASE _LBS FRI 2 18—23, 62—68, 123—134, 129—131, 142—158 和 153 一 158 (C 未 端 ) 。 这 些 决 定 簇 可 能 分 布 在 病毒 的 外 表面 上 (Anderer, 1963), 进一步 对 亚 基 蛋 白 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 片段 的 免疫 化 学 研究 发 现 , 93 一 112 位 置 的 多 ik 片段 和 抗 亚 基 蛋 白 抗 体 ( 抗 TMVP) 的 亲 合 力 最 高 。 这 一 片段 包含 20- 个 氮 基 酸 残 基 , 其 排列 顺序 如 下 : eee 05 9G! 97...) 98. 98 “STOO Abd. 102-103, |, 104. 05105 107 Ile- Ile- Glu-Val-Glu-Asp-Gly-Ala-Asp-Pro-Thr-Thr-Ala-Glu-Thr- 108 109 110 111 112 Leu-Asp-Ala-Thr-Arg- 如 果 把 此 20 AKAD N 端 12 个 氮 基 酸 残 基 (93-104) 切除 后 ， 不 影响 和 抗体 的 亲 合 1M ghey | 力 , 而 C 端 2 肽 (CThr-Arg-) 切 除 后 就 失去 部 分 亲 合 力 ,进一步 切 去 Ala(110) ,就 丧失 全 部 免疫 学 活力 (Benjamini 等 , 1965) 。 利用 人 工 合成 的 肽 眉 , 证 明 93 一 112 KRW thee HE in FE C 端 10 肽 的 位 置 (Stewart 等 ,1966) 。 进一步 利用 人 工 合 成 的 其 EA FAS HA Be (C tin 2 肽 到 10 FA) 的 实验 , 还 证 明 能 和 抗 TMVP 抗体 专 一 地 结合 的 最 短 的 肽 疏 是 C 端 5 肽 (-Leu-Asp-Ala-Thr-Arg-) (Young 等 , 1966) ;并 且 还 确定 了 CH es 53 。 5 肽 是 93 一 112 肽 人 段 内 的 唯一 的 抗原 决定 往 (Benjamini 等 1968), 利用 合成 的 结构 类 似 物 的 比较 研究 , 还 可 以 究 供 抗原 决定 笠 微 细 结 构 的 知识 。 用 这 种 方法 证 明 上 述 5 肽 中 的 靠 C 端 3 肽 (-Ala-Thr-Arg-) 是 负责 抗原 专 一 性 的 关键 基 团 ， msc Se N 端的 2 肽 (-Leu-Asp-) 只 是 起 加 强 和 抗体 结合 的 作用 。 此 靠 C 端 3 KK (-Ala-Thr-Arg-) 虽然 单独 不 能 和 抗体 结合 ,但 其 上 若 连 接 一 个 臣 水 性 基 团 , 如 “C 一 N 一 辛 酰 -Ala-Thr-Arg- 就 能 很 强 地 和 抗体 结合 。 和 抗 TMVP 抗体 的 结合 能 力 与 连接 基 团 的 疏水 性 存在 一 定 的 相关 性 。 因此 ,此 5 肽 的 抗原 专 一 性 是 其 中 人 靠 C 端 3 肽 负责 的 ,而 和 抗体 的 结合 还 需要 靠 N 端 蕊 水 性 基 团 和 抗体 结合 位 点 间 的 相互 作用 的 帮助 才能 实现 。 换 名 话说 ,一 个 抗原 决定 簇 的 微细 结构 在 功能 上 可 分 为 两 部 分 :一 部 分 是 负责 抗原 专 一 性 的 , 它 和 抗体 结合 位 点 之 间 存 在 严格 的 空间 互补 性 ; 另 一 部 分 是 非 专 一 的 ,不 存在 严格 的 空间 限制 ， 只 是 通过 与 抗体 结合 位 点 间 的 朴 水 性 相互 作用 而 加 强 前 一 部 分 和 抗体 结合 位 点 的 专 一 的 结合 (Benjamini 等 , 1968b) 。 最 后 ,还 要 提 到 TMV 亚 基 蛋 白 之 C 末端 6 肽 (153 一 158) 对 抗原 性 的 重要 性 , 也 在 TMV 某 些 突变 株 的 抗原 性 的 改变 中 反映 出 来 : 正常 TMV: Thr-Ser-Gly-Pro-Ala-Thr 153) Wl54 AST JSC ae sy MISE: 突变 病毒 株 ， Thr-Ser-|Ala|-Pro-Ala-Thr 突变 病毒 株 和 正常 TMV 肽 链 结 构 唯 一 的 差别 是 C 端 155 氮 基 酸 残 基 位 置 Gly 为 Ala 所 取代 ,抗原 专 一 性 也 发 生 改 变 。 动物 病毒 的 构造 极其 复杂 。 这 里 只 举 几 类 抗原 构造 研究 得 多 一 些 的 病毒 为 例 : (1) 腺 病毒 (Adenovirus) 直径 约 为 72 毫 微米 ,分子量 约 达 175 x 10s。 有 一 个 正 20 面体 对 称 结构 的 蛋白 质 外 过 包围 着 DNA, 病毒 的 18% 蛋白 质 和 DNA 连结 , 称 为 P 抗原 。 外 壳 由 252 个 多 角形 壳 微 体 (Capsomers) 组 成 。 其 中 240 个 称 为 六 联 体 抗 原 (Hexon), 排列 成 许多 三 角形 面 ; 余 剩 的 12 个 壳 微 体 ， 称 为 五 联 体 抗 五 联 体 抗原 (抗原 B) j|JR (Penton)， 位 于 20 面体 的 每 一 个 顶点 ， 细 丝 (抗原 C) 丝 。 六 联 体 抗原 (抗原 A) 能 固定 补体 , 是 所 图 1-33” 腺 病毒 构造 简 图 , 示 各 种 抗原 在 病毒 有 腺 病毒 共同 具有 的 族 抗 原 。 五 联 体 抗 原 ( 抗 FFL RGR, Alison APR Pie AB) 对 寄主 细胞 有 毒性 。 细 丝 ( 抗 原 C) 为 类 型 专 一 的 抗原 (图 1-33) 。 (2) 流感 病毒 (Influenza Virus) 流感 病毒 的 大 小 和 形状 均 不 国定 〈 常 为 圆 球 或 槛 球形 ， 直 径 介 于 80 一 120 毫 微米 之 间 ) 。 病 毒 的 基本 构造 为 螺旋 形 盘 绕 的 RNA 蛋白 质 ,被 复杂 的 蛋白 质 外 壳 包 右 。 壳 的 表 面 密集 着 糖 蛋白 分 子 , 具 血球 凝集 素 作用 , 称 为 Y 抗原 。 它 的 功用 可 能 是 使 病毒 附 着 在 © 54 。 其 上 伸 出 12 根 像 天 线 样 的 .末端 带 小 球 的 细 i. A 外 帝 成 份 了 me ‘eth aaa ata, Lp 5 人 ela 血球 和 集 素 人) aa fs @ O ve) 全 > > Re ° ° ee edge MF rt 7 BH ity OC NU >» o> po” o Sr oe > 图 1-34 流感 病毒 构造 简 图 。 易 感 细胞 表面 的 受 体 上 。 它 们 的 下 面 有 神经 氮 酸 酶 (Neuamidase) 分 布 ,其 功能 可 能 和 病毒 从 细胞 释放 出 来 有 关系 。 寄 主 细 胞 抗原 (血型 抗原 、Forssman 抗原 等 ) 在 病毒 形成 WEA, 也 可 能 参 人 病毒 的 外 壳 ( 图 1-34) 。 宿主 感染 流感 病毒 后 ， 能 产生 对 抗 这 几 种 抗 原 的 抗体 。 不 过 只 有 位 于 病毒 表面 的 两 种 抗原 所 引起 的 抗体 对 机 体 才 有 保护 意义 。 流感 病毒 的 血球 凝集 素 亚 基 是 棒状 分 子 , 大 小 约 为 140 x40 人 ,分 子 量 为 150,000, 由 WA BH ( OF B=60,000) 和 两 条 轻 链 (分 子 量 反 20,000) 构成 。 轻 链 和 重 链 通过 二 硫 键 连接 成 二 聚 体 , 每 一 个 血球 凝集 素 亚 基 包 含 两 个 这 样 的 二 聚 体 。 血球 凝集 素 位 于 病毒 表面 ,决定 病毒 的 类 型 特性 。 决 定 血球 凝集 素 抗原 性 的 基 因 能 独立 地 发 生变 异 , 同时 经 常 受到 寄主 体内 免疫 学 环境 的 选择 ,从 而 产生 流感 病毒 变异 株 。 这 种 变异 现象 很 可 能 和 回复 性 流感 大 流行 的 发 生 有 关系 。 BATHE RE (A 型 ) 的 大 流行 常 间隔 几 年 时 间 , 反 复 地 发 生 。 在 两 次 大 流行 之 间 , 病毒 的 表面 抗原 逐渐 变化 。 当 一 个 新 的 病毒 株 之 表面 抗原 和 当前 流行 的 病毒 株 有 很 大 差异 时 , 就 又 会 引起 一 次 大 流行 。 对 于 在 1968 年 香港 流感 大 流行 发 生 之 前 收集 的 A2 /亚洲 流感 病 毒 株 和 在 1968 一 1971 年 在 世界 各 地 收集 的 香港 流感 病毒 株 的 表面 抗原 , 进行 比较 研究 的 结果 , 发 现 从 两 种 病毒 分 离 出 来 的 血球 凝集 素 亚 基 在 免疫 学 性 质 上 截然 不 同 , 而 神经 氮 酸 酶 亚 基 却 是 相 Uh. 香港 病毒 血球 凝集 素 亚 基 之 重 链 和 轻 链 的 酶 解 肽 段 电泳 层 析 图 谱 和 A2 /亚洲 流 感 病毒 有 很 大 的 不 同 。 这 些 结果 提示 香港 流感 病毒 的 血球 凝集 素 亚 基 可 能 不 是 从 预先 存 在 的 人 A2 病毒 株 通过 突变 起 源 的 ,更 有 可 能 是 通过 和 鸟 类 或 其 它 动物 的 流感 病毒 的 遗 传 重组 而 起 源 的 (Laver，1972) 。 ARS SABER AS, 从 消化 液 中 可 分 离 出 结晶 的 血球 凝集 素 。 这 样 得 到 的 血球 凝集 素 的 结构 改变 (失去 分 子 量 约 3000 的 一 段 多 肽 ) ,并 失去 血球 凝集 能 力 ， 不 过 其 抗原 怪 不 受 影响 。 这 样 的 抗原 可 能 对 于 制造 流感 病毒 亚 基 疫苗 是 有 价值 的 〈Brand 和 Skehel, 1972), 另 一 方面 , 神经 氢 酸 酶 尽管 研究 还 不 多 , 由 于 它 的 抗原 性 较 少 变异 ， 在 研制 可 能 对 多 种 变异 的 病毒 株 都 有 保护 作用 的 亚 基 疫 苗 时 , 是 特别 值得 注意 的 。 (3) AK AR 人 病毒 性 肝炎 是 由 至 少 两 种 传染 途径 不 同 的 病毒 引起 的 。 乙 型 肝炎 抗原 (HBAg), e 55 8 原名 澳大利亚 抗原 (Au antigen)， 或 肝炎 相关 抗原 (简称 了 AA) ， 与 血清 型 肝炎 (主要 通过 输血 传染 ) 的 相关 性 是 肯定 无 疑 的 。 但 是 HBAg 在 病理 发 生 中 的 作用 , 以 及 和 传染 原 的 关系 还 没有 完全 解决 。 HBAg 是 含 酷 、 脂 类 和 核酸 的 蛋白 质 大 分 子 。 其 沉降 常数 为 40.2S 一 110S， 分 子 量 上 限 约 为 24x10'。 抗 原 对 热 很 稳定 ,不 易 被 蛋白 酶 分 解 , 这 些 特 性 都 可 能 和 高 的 酪 含量 有 关系 (Burrell, 1973), HBAg 抗原 在 血清 学 上 是 一 个 复合 物 , 包含 四 种 抗原 成 分 。 电子 显微镜 下 抗原 的 形态 分 为 三 类 : 大 球形 颗粒 (或 称 Dane 颗粒 ) (直径 42 BRK), 小 球形 颗粒 (直径 20 毫 微米 ) 和 管 型 (或 称 丝 状 构造 ) 。 含 HBAg 的 血清 在 中 性 条 件 下 ， 加 入 聚 乙 二 醇 6000， 可 使 大 球形 颗粒 和 管 型 抗原 沉淀 , 而 小 球形 颗粒 大 多 数 仍 留 在 溶液 中 。 由 此 可 将 不 同形 态 的 颗粒 初步 分 离 (Neurath 等 , 1973) 。 HBAg 阳性 血清 经 连续 两 次 等 密度 离心 初步 纯化 后 ,再 经 过 一 次 速度 沉降 离心 纯化 , 便 可 将 三 种 形态 的 抗原 颗粒 请 楚 地 分 离 ( 图 1-35) 。 将 这 样 分 离 的 三 部 分 作 电 子 显微镜 检查 ,可见 A 峰 完 全 是 小 颗 OD. 280 mu SN 1-35 HAA 阳性 血清 连续 两 次 等 密度 离心 (B-29 型 区 域 转 头 ) 得 到 的 半 纯 制品 的 最 后 纯化 。 第 三 次 用 CsCl: 梯度 速度 沉降 法 (B-14 型 区 域 转 头 ) 将 三 种 形态 的 抗原 分 为 三 个 峰 ( 据 Vyas 等 ,1972)。 粒 (20 毫 微米 )，B 峰 主 要 是 管 型 〈 丝 状 构造 ) ，C 峰 以 大 颗粒 (40 毫 微米 ) 居多 (图 1-= 36) 。 各 蛋白 峰 的 化 学 特性 列 于 表 1-8。 由 表 1-8 A, A.B 峰 含 有 HBAg 抗原 专 一 性 , 而 不 含 人 正常 血清 蛋白 抗原 。 C 峰 没 有 HBAg 抗原 专 一 性 ,而 含 人 血清 蛋白 抗原 5 由 于 A 峰 完 全 由 形态 均一 的 小 颗粒 (20 SRK) 组 成 ,有 人 假定 可 代表 纯化 的 HBAg it 原 , 可 作为 进一步 研究 其 抗原 结构 的 材料 (Vyas 等 ,1972) 。 HBAg 表面 还 发 现 有 三 种 糖 蛋 白 、 一 种 糖 脂 和 三 种 磷脂 成 分 存在 。 从 其 抗原 专 一 性 判断 , 它们 很 可 能 来 源 于 寄主 细胞 的 细胞 膜 , 即 在 病毒 成 熟 和 释放 过 程 中 参 人 其 外 壳 组 成 的 。 有 证 据 表明 这 些 寄主 细胞 膜 抗原 的 存在 可 能 引起 自身 免疫 ,而 和 肝 细 胞 损伤 的 发 病 机 制 有 密切 关系 。 因 此 , 制备 肝炎 疫苗 时 , 如 采用 含有 肝 细 胞 膜 成 分 的 HBAg 表面 抗原 将 是 很 不 利 的 ， 最 好 采用 从 .HBAg 分 离 的 亚 基 ， 可 能 更 安全 妥当 些 (Zuckerman, 1975) 。 HBAg 小 颗粒 抗原 (20 毫 微米 ) 的 蛋白 部 分 不 易 酶 解 ， 用 通常 的 生化 方法 不 能 得 到 有 免疫 学 活性 的 亚 基 。 最 近 有 人 在 存在 尿素 和 入 基 乙醇 的 条 件 下 , 用 超声 波 处 理 HBAg。 e 56 。 (A) t& 20 nmHAA (B) 峰 HAA 丝 状 构造 (C) 峰 HAA 40nm 六 NE Cc S SQ YM NSS 2 ¢ 14, NG 22 de a A1-36 IRE EA A, B,C 峰 蛋 白 样品 的 电子 显微镜 反 染 照片 C(X150,0007) ( 据 Vyas 等 ,1972)。 e 57 e 然后 再 经 Sephadex-G75 凝 胶 过 泪 ， 可 分 离 出 有 免疫 活性 的 三 个 亚 基 ， 分 子 量 各 为 80,000, 12,000 #1 6,000 (A 1-37; 表 1-9) (Vyas 等 , 1972; Rao 和 Vyas，1973) 。 最 近 , 同一 实验 室 从 HBAg 表面 抗原 分 离 出 一 个 分 子 量 为 22,000 的 多 肽 成 分 和 一 个 分 子 量 为 28,000 的 糖 多 肽 。 它们 具有 相同 的 末端 9 WR (-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Ser (Cys)-Gly-Phe-Leu) (Peterson 等 , 1977) 。 此 外 ，Zuckerman (1975) XBSAR 丙烯 酰胺 凝 胶 制备 电泳 ,将 HBAg 表面 抗原 分 离 成 5 一 9 多 肽 成 分 , 分子量 介 于 15,000 到 120,000 之 间 。 总 之 ,以 上 这 些 工作 为 HBAg 抗原 结构 分 析 准 备 了 条 件 。 可 以 期 型 不 和 久 的 将 来 就 能 把 HBAg 的 抗原 结构 弄 清 楚 , 并 为 乙 型 肝炎 亚 基 疫 苗 的 研制 商定 基础 。 表 1-9 半 纯 化 HBAg 经 速度 沉降 分 离 的 三 个 蛋白 峰 的 特性 A 峰 B 峰 C 峰 电镜 形态 球形 (20 毫 微米 ) 不 同 长 度 的 管 形 球形 (40 毫 微米 ) OD:so 0.47 0.49 ‘10,23 HBAg 血清 学 测定 琼脂 扩散 0 对 流 电 泳 0 血 凝 抑制 ( 效 价 ) 0 抗 人 正常 血清 的 抗 血 清 十 ( 据 Vyas 等 ，1972)。 表 1-10 HBAg 亚 基 之 免疫 学 活性 的 分 布 * * 血 凝 抑制 法 《HAIU) 测定 。 效 价 用 表现 抑制 的 最 大 稀释 度 的 倒数 表示 。 令 E 0.8 品 0.4 5 - III 40 81 120 160 洗 脱 液体 积 (毫升 ) 图 ]-37 ”超声 处 理 HBAg 在 有 尿素 和 和 琉 基 乙醇 存在 时 之 Sephadex-G75 凝 胶 过 滤 分 离 。 峰 1, II, III 的 分 子 量 估计 各 为 80,000.12,000 和 6,000 ( 据 Rao 和 Vyas, 1973), 至 于 HBAg 和 传染 原 的 关系 ,还 没有 最 后 的 结论 。 一 般 认 为 ,健康 带 HBAg Am 清 中 以 小 球形 颗粒 和 管 型 为 主 , 很 少见 到 大 球形 颗粒 〈Dane 颗粒 ) 。 急 性 肝炎 病人 早期 血 请 中 的 抗原 颗粒 类 型 与 健康 带 HBAg 者 相似 ,不 过 小 球形 颗粒 数量 较 多 。 慢性 肝炎 病 人 人 血 祖 中 管 型 较 多 ,而 Dane 颗粒 仅 在 少数 病人 (尤其 是 细胞 免疫 功能 受到 抑制 的 病人 ) 。 58 。 中 有 较 大 量 存在 。 近 来 有 人 根据 大 球形 颗粒 (Dane 颗粒 ) 的 形态 ,有 类 似 病 毒 的 双 层 结 构 , 以 及 和 DNA 聚合 酶 有 关联 , 认为 Dane 颗粒 很 可 能 就 是 成 误 的 病毒 本 身 , 而 小 球形 、 管 型 颗粒 则 是 非 传染 性 的 病毒 外 壳 。 同 时 ,还 有 人 认为 Dane 颗粒 上 的 核心 抗原 和 病毒 感染 有 密切 关系 ,并 能 产生 核心 抗体 (Core antibody) ， 可 以 作为 乙 型 肝炎 感染 的 标志 (Zuckerman, 1976), 总 之 , 乙 型 肝炎 抗原 在 血清 学 上 是 复杂 的 , 亚 显 微 形 态 也 是 多 型 的 。 这 几 种 形态 的 抗原 颗粒 和 传染 原 及 发 病 机 制 的 关系 , 还 是 没有 完全 弄 清楚 的 问题 。 甲 型 肝炎 (传染 型 肝炎 ) 抗原 的 研究 目前 更 不 清楚 。 Feinstein 等 (1973) 从 和 急性 期 甲 型 肝炎 病人 粪便 提取 物 中 , 用 免疫 电子 显微镜 术 找 到 一 种 血清 学 专 一 性 和 甲 型 肝 炎 相 关 的 病毒 样 抗原 , 其 颗粒 大 小 为 27 毫 微米 。 这 一 观察 后 来 还 得 到 另 一 些 工 作者 的 证 实 (Zuckerman 等 ,1974) 。 3. 激素 垂体 前 叶 激 素 (LH, FSH, TSH, GH 等 ) .胎盘 绒毛 膜 促 性 腺 激素 (HCG) 和 胰岛 素 等 蛋白 质 激素 都 能 引起 抗体 。 多 肽 激素 ,如 胰 升 血糖 素 (分 子 量 =3,485) 、 甲 状 腺 降 钙 素 (Calcitonin) (4-—-H=3,604), (BRA (Gastrin) (分子 量 =2,114) LAE Fil 时 ,也 有 一 定 程 度 的 免疫 原 性 ; 而 垂体 后 叶 激素 ， 如 加 压 素 、 催 产 素 等 ， 由 于 分 子 量 过 小 (+1,000), 没有 免疫 原 性 。 蛋 白质 激素 能 引起 抗体 , 称 为 抗 激素 。 在 临床 和 畜牧 业 上 多 次 使 用 这 些 蛋 白质 激素 时 , 有 时 会 带 来 麻烦 。 如 用 猪 或 牛 胰岛 素 治疗 糖尿 病 时 , 有 时 会 出 现 免疫 反应 。 有 人 认为 这 可 能 是 由 于 胰岛 素 和 血清 蛋白 质 结合 , 免疫 原 性 增强 的 结果 。 现 将 几 种 有 代表 性 的 多 肽 和 和 蛋白质 激 素 的 分 子 结 构 和 抗原 性 的 关系 分 述 如 下 : (1) 组 激 肽 (Bradykinin) 组 织 损伤 或 过 敏 反应 时 ,血清 内 出 现 的 一 种 有 很 强 的 舒张 血管 和 增加 微血管 通 透 性 作用 的 多 肽 , 称 为 缓 激 肽 。 它 可 能 和 免疫 反应 引起 的 局 部 炎症 有 关系 , 可 视 为 一 种 局 部 激 Fo 组 激 肽 来 源 于 血清 中 一 种 o- REE 〈 缓 激 肽 原 ) 分 子 末端 的 酶 解 片段 。 它 是 包含 9 个 氨基 酸 残 基 的 短 肽 (图 1-38) 。 4EMSR-L-MARERN, 能够 在 家 免 引 起 专 一 的 抗体 。 绥 激 肽 的 抗原 性 和 肽 链 的 全 长 度 有 密切 的 关系 。 C 末端 增加 或 减少 一 个 Arg RH 组 激 肽 原 ott ee mee el adh ee ae 〈《c:- 球 蛋白 ) Met-Lys-Arg-Pro-Pro-GIy-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg [—— ite FE, 1-lysyl-#2 3% ik (Kallidin) 1-methionyl-lysyl-42 3% fk COOH ——— FRAG B ™™ REHAB 六 : 胰 蛋 ZEKE 酸 激 Kall ar B. jararacate = 1-38 BmKRAKSRKMABERR 〈c:- 球 BA) 分 子 示 端的 关系 ( 据 M. R. E. Silra 和 J. G. Leme, 1972), 基 , 对 此 多 肽 和 抗体 的 结合 有 相当 大 的 影响 。 ”可 是 ， 当 C 末端 的 Arg RHR Ala 或 D-Arg 置换 时 ,影响 却 很 小 。 由 此 推测 ,其 抗原 性 和 整 条 肽 链 的 全 长 度 有 关系 , 而 和 末端 残 基 侧 链 的 性 质 关 系 不 大 。: 北 外 ,分 子 的 总 电荷 ，C 端 或 区 端 电荷 的 局 部 变化 ,以 及 Phe (8) 或 Ser(6) 被 Ala 代替 时 , 对 分 子 的 抗原 性 的 影响 都 很 小 。 可 是 ; 若 改变 多 肽 链 的 骨 架 , 却 会 引起 分 子 抗原 性 的 剧烈 变化 。 如 Gly(4) 被 Ala 代替 后 ,由 于 8- 碳 原子 的 旋转 受 限 制 ,分 子 构象 便 发 生 改 变 ; 2 3 或 7 位 的 Pro 个 别 地 或 全 部 被 Ala 或 D-Pro 代替 时 ,对 抗原 性 同样 也 有 剧烈 的 影响 。 总 之 , 可 以 设想 缓 激 肽 分 子 可 能 是 以 环形 的 形式 和 抗体 结合 位 点 起 相互 作用 的 , 因而 改变 肽 链 长 度 或 骨架 ,都 会 影响 分 子 环形 构象 的 稳定 性 。 换言之 ,组 激 肽 分 子 的 抗原 决定 簇 可 能 包括 多 肽 链 的 全 长 度 , 并 依赖 整个 分 子 的 形状 (Haber 等 , 1967; Spragg 等 ,1968) 。 (2) 促 明 上 腺 皮质 激素 (ACTH) 为 脑 生 体 前 叶 分 启 的 包含 39 个 氨基 酸 残 基 的 多 肽 激素 。 分 子 为 一 条 直 链 。 人 ACTH 的 一 级 结构 如 下 (Lee 等 ; 1961) : 20 10 Ser—Tyr—Ser—Met-Glu—His—Phe—Arg-Trp-Gly-Lys—Pro-Val-Gly-Lys—Lys—Arg—Arg—Pro-Val- CAIN tn 24 个 氨基 酸 残 基 在 所 有 研究 过 的 物种 都 是 相同 的 ， 并 且 这 一 区 域 和 分 子 的 激素 活性 有 关系 ;而 25 一 33 区 域 则 存在 物种 间 的 差异 。 ACTH 分 子 或 其 片段 和 载体 蛋白 质 结 合 时 , 能 够 引起 抗体 。 激 素 的 C 端 部 分 25 一 39) 具有 抗原 性 , 这 一 片段 能 强烈 地 抑制 ACTH 和 其 抗体 的 结合 (Gelzer, 1968). 用 片段 (1 一 24) 和 免 血 清白 蛋白 载体 结合 的 结合 蛋白 质 来 免疫 家 免 时 ,能 得 到 抗 片段 (1 一 24) 的 抗 血清 。 这 种 抗 血 清 能 够 中 和 ACTH 的 激素 活性 ,证 明 这 一 区 域 是 激素 的 生物 活 性 区 : (了 elber 等 ,1966; Felber 和 Micheli，1967) 。 (3) 促 性 腺 激素 - 脑 垂 体 前 叶 分 刻 的 两 种 主要 的 促 性 腺 激素 , 促 滤 泡 激素 (FSH) 和 黄体 化 激素 (ELH) 都 是 分 子 量 约 30,000 的 糖 蛋白 。 已 经 知道 FSH 和 LH 分 子 都 是 由 w、p 两 个 亚 基 组 成 的 。 其 中 一 个 亚 基 , o 亚 基 ,为 FSH, LH, HCG 和 TSH 所 共有 (或 彼此 相似 ) 。 这 种 分 子 构造 上 的 共同 性 是 这 几 种 激素 在 免疫 学 上 交叉 反应 的 结构 基础 。 这 几 种 促 性 腺 激素 之 抗原 结构 的 异同 是 建立 它们 的 放射 免疫 测 定 的 前 提 。 对 人 促 庆 泡 激 素 (hFSH) 抗原 结构 的 研究 发 现 ， 这 种 激素 分 子 至 少 含 有 四 个 能 和 抗体 反应 的 区 MK: KIKI (位 于 亚 基 ) 和 区 域 II (位 于 8 亚 基 ) 在 抗原 性 上 彼此 相似 ,并 且 又 和 HCG, hLH，hTSH 之 & 亚 基 上 相应 的 区 域 在 抗原 性 上 相似 ;区 域 II 位 于 8 亚 基 上 ， 区 域 IV 只 存在 于 完整 的 hFSH OFL. KM /M Il Hie hFSH 分 子 能 和 HCGo WH 系统 (HCG, LH, TSH) 起 交叉 反应 。 区 域 III 仅 位 于 hFSHP 亚 基 上 , 抗 hFSH 标准 抗 血 清 的 选择 专 一 性 就 是 针对 这 一 特异 的 抗原 决定 往 的 。 此 抗原 决定 簇 区 域 单独 不 表现 明显 的 激素 活性 。 如 在 大 鼠 罕 丸 激 素 受 体 离 体 测 定 系统 中 ，hFSHAP 单独 表现 的 生物 活 性 很 差 。 区 域 IV 是 依赖 整个 分 子 的 抗原 决定 簇 , 在 分 离 的 hFSHea 或 hFSHP 亚 基 上 *。 60 。 都 几乎 不 存在 。 它 可 能 是 与 激素 活性 有 关系 的 区 域 (Rabinowitz 等 ，1973)。 蛋白 质 激素 的 生理 功能 基 团 和 抗原 决定 簇 可 能 处 于 分 子 的 不 同 部 位 。 如 入 绒毛 膜 促 性 腺 激素 分 子 的 多 糖 部 分 对 于 激素 的 生理 活性 是 必要 的 ， 但 不 参与 抗原 决定 簇 的 构成 。 FSH 分 子 的 多 糖 部 分 的 神经 氢 酸 对 于 激素 的 生理 活性 是 不 可 缺少 的 ,但 与 抗原 性 无 关 。 其 抗原 决定 往 含 有 半 乳 糖 吡 喃 双 糖 单位 。 至 于 LH 却 是 蛋白 质 部 分 , 而 不 是 多 糖 部 分 ,对 于 激素 的 生理 功能 和 免疫 学 功能 都 是 必要 的 (Mori，1969a, bj 1970) 。 4. 酶 所 有 已 知 的 酶 都 是 蛋白 质 。 注 射 酶 可 引起 抗体 , MA. KEM TRE WH hi 血清 部 分 地 或 全 部 地 抑制 。 然 而 ,也 有 一 些 酶 虽 能 和 专 一 的 抗 血 清 结合 , 但 不 被 抑制 ， 甚 而 被 激活 (如 牛 胰 核 糖 核酸 酶 、 盘 尼 西 林 酶 等 ) (Cinader，1967) 。 实际 上 ， 在 同一 个 抗 酶 血清 内 可 能 同时 含有 抑制 抗体 、. 激 活 抗体 和 非 抑 制 抗体 (能 和 酶 结合 ， 但 无 抑制 作用 ) 。 如 从 和 牛 胰 核 糖 核酸 酶 抗 血清 中 可 分 离 出 主要 起 抑制 作用 或 激活 作用 的 部 分 (Suzuki 等 ， 1969; Pelichova 等 , 1970) 。 同样 地 , 用 免疫 吸附 剂 也 可 以 从 抗 木瓜 酶 的 专 一 抗体 中 分 离 出 抑制 和 激活 两 类 抗体 (Arnon 和 Shapiro，1967)。 专 一 抗体 不 只 是 起 抑制 或 激 活 作 用 ,而 且 能 增加 酶 对 pH、 热 或 尿素 变性 的 稳定 性 。 因 此 ,有 时 酶 的 激活 或 稳定 的 界 限 易 于 混淆 不 请。 如 一 种 突变 品系 小 鼠 的 触 酶 对 pH、 温 度 变 化 都 很 灵感 。 这 种 突变 触 酶 和 抗 正 常 触 酶 抗体 结合 时 观察 到 的 “激活 ?现象 ,其 实 是 这 种 酶 被 稳定 化 的 结果 (Fein- stein 等 ,1971) 。 专 一 抗体 可 能 影响 酶 的 催化 中 心 , 抑制 或 提高 酶 活力 。 抗 体 对 酶 的 作用 机 制 很 复杂 ， 一 种 可 能 是 直接 的 , 即 专 一 抗体 与 酶 催化 中 心 或 邻近 的 基 团 结合 ,结果 阻碍 了 底 物 和 酶 的 催化 中 心 的 接近 ; 另 一 种 可 能 性 是 更 为 间接 的 , 即 抗体 和 酶 的 结合 可 能 引起 酶 催化 中 心 构 象 转化 ,或 者 阻止 了 底 物 引起 的 酶 分 子 构象 改变 所 致 。 抗体 对 酶 活力 的 抑制 程度 和 底 物 分 子 量 的 大 小 之 间 存 在 一 定 的 关系 。 在 同一 个 酶 和 抗 酶 系统 中 , 抑制 程度 随 底 物 分 子 量 不 同 而 不 同 ( 表 1-11) 。 从 表 上 可 见 ， 在 四 种 酶 和 抗 BAR, 底 物 分 子 量 和 抑制 程度 之 间 存 在 明确 的 相关 性 , 底 物 分 子 量 增 加 ， 抑 制程 度 随 之 增加 。 早 期 的 工作 中 ,有 人 根据 抗体 对 酶 活性 的 影响 依赖 底 物 分 子 量 的 大 小 的 事实 , 提 表 ]1-11 抗体 对 酶 活力 抑制 程度 和 底 物 分 子 量 的 关系 BEA KA F Bs 底 物 | 抑制 程度 名 称 xX 源 名 称 分 1 一 温 %o 核糖 核酸 酶 牛 胰 Tf Hel a ae KF 338 80 核酸 ADT 98 神经 氨 酸 酶 流感 病毒 ee SFL BE 633 0 Orosomucoid fetuin 10* 16 唾 酸 糖 蛋 白 10° 100 C’l- 酯 酶 人 N-Z, B-L-#4 BH ZAR 237 28 C’4 (补体 第 4 成 分 ) 大 分 子 100 Re EAs 苯 甲 酰 - 精 氨 酸 -P- 硝 基 苯 胺 398 23 ( 据 Cinader, 1967), 出 抗体 对 酶 的 抑制 可 能 是 由 于 抗体 和 酶 的 结合 造成 了 空间 阻碍 所 致 〈Cinader，1967)。 不 过 , 较 近 的 研究 结果 提示 还 有 可 能 是 通过 空间 构象 改变 所 致 。 后 一 种 可 能 性 的 例子 是 乙酰 胆 碱 酯 酶 。 有 证 据 提 示 专 一 抗体 对 乙酰 胆 碱 酯 酶 活力 的 抑制 可 能 是 由 于 抗体 和 酶 结合 时 , 酶 分 子 发 生 的 构象 变化 , 而 不 是 由 于 空间 阻碍 。 这 些 证 fz: 1) 酶 和 抑制 抗体 复合 物 的 米 氏 常数 (区 m) 和 游离 酶 的 Km 是 相似 的 ,表明 并 不 存在 底 物 和 酶 催化 中 心 接近 或 反应 产物 离开 的 空间 障碍 ;2) 专 一 抑制 抗体 存在 时 ， 只 有 乙酰 硫 代 胆 碱 碘 盐 (ATch) 的 水 解 被 抑制 ， 而 分 子 量 较 大 的 底 物 丙 酰 硫 代 胆 碱 碘 盐 (PTch) 却 不 受 抑制 。 假 如 抗体 的 抑制 效应 是 由 于 空间 障碍 ,分子量 较 大 的 底 物 (PTchb) 至 少 也 应 受到 部 分 抑制 。 事 实 上 并 非 如 此 。 因 此 , 这 种 抑制 效应 显然 不 是 由 于 空间 障碍 ， 而 是 由 于 其 它 原 因 ， 很 可 能 是 由 于 抗体 和 酶 结合 引起 的 构象 Bt HM (Holmes 等 ， 1973) 。 然而 , 要 证 明 这 种 可 能 性 却 是 颇 为 困难 的 。 因 为 抗体 抗原 相互 作用 时 , 双方 都 可 能 发 生 构 象 变化 ,很 难 用 通常 的 理化 方法 测定 各 自 的 变化 程度 。 为 了 解决 这 一 难题 , 有 人 设计 特殊 的 实验 来 验证 激活 抗体 对 酶 催化 中 心 结 构 完 整 性 的 恢复 的 影响 。 已 知 牛 胰 核 糖 核酸 BA 的 催化 中 心 是 由 末端 多 肽 [尤其 是 His(12)] 和 41 位 ,，115 一 121 顺序 的 氨基 酸 残 基 共 同 组 成 的 (图 1-39) 。 当 用 枯草 杆菌 酶 处 理 牛 胰 核 糖 核酸 酶 人 时 ， 酶 分 子 被 分 解 成 两 个 片段 , 即 N 端的 S- 多 肽 (包括 残 基 1 一 20 或 21) 和 S- 蛋 白质 〈 包 括 残 基 21 或 22—124) (图 1-40)， 催 化 中 心 因而 被 拆散 ,结果 每 一 片段 单独 都 不 能 表现 出 酶 活力 。 然 图 1-39 和牛 胰 核 糖 核酸 酶 立体 结构 简 图 。 黑 线 示 二 硫 桥 位 置 ( 据 Harker 等 ,1967)。 而 , 当 把 两 个 片段 混合 时 , 酶 活力 又 可 恢复 。 假 若 激活 抗体 能 改变 酶 的 构象 ， 那 么 有 设 有 可 能 由 此 影响 S- 蛋 白 和 S- 多 肽 的 结合 , 使 酶 催化 中 心 的 结构 和 功能 得 到 恢复 呢 ? 实 验 的 结果 证 明确 系 如 此 。 当 S- 蛋 白 和 从 抗 RNaseA 抗 血清 中 分 离 得 到 的 激活 抗体 结合 时 ， 酶 活力 最 大 恢复 所 需 的 〈S- 多 肽 /S- 蛋 白 ) 克 分 子 比值 有 所 降低 。 这 一 事实 可 能 反映 两 片段 之 间 的 结合 常数 的 改变 , 而 这 种 改变 又 可 能 是 由 于 S- 和 蛋白 和 激活 抗体 结合 时 ， 人 恢复 了 S- 和 蛋白 在 天 然 酶 分 子 中 的 构象 所 致 。 同 样 地 , 在 和 抗体 结合 后 恢复 的 酶 对 底 物 的 催化 性 能 和 天 然 RNaseA 相似 也 可 能 是 由 于 同样 的 构象 变化 的 结果 。 总 之 , 这些 事实 有 力 / * 62 « 党 s Cys Ser 65 Asn 58 | TYyr25 图 1-40 核糖 核酸 酶 s 与 S- 多 肽 、S- 和 蛋白 系统 ( 据 Gutte 和 Merri-field. 1970), 地 支持 抗体 和 酶 的 结合 ,不 仅 是 掩盖 了 酶 分 子 的 一 部 分 表面 ,而 且 可 能 引起 酶 分 子 构象 变 化 的 假定 (Cinader 等 ,1971) 。 简短 的 结论 1) 天 然 蛋白 质 是 具有 复杂 结构 的 大 分 子 , 其 专 一 的 免疫 学 功能 依赖 大 分 子 的 各 级 结 构 。 抗 原 专 一 性 主要 依赖 分 子 表 面 的 某 些 基 团 一 一 决定 得 的 特殊 化 学 结构 。 抗 原 决 定 簇 按 其 对 构象 的 依赖 与 否 , 又 可 分 为 构象 决定 簇 和 顺序 决定 簇 两 类 。 对 于 球 蛋白 ,抗原 决定 禾 位 于 分 子 表面 的 突出 部 位 , 并 依赖 该 处 的 局 部 构象 。 纤 维 蛋白 则 存在 中 心 决定 簇 (构象 TRIE Be) 和 末端 决定 簇 (顺序 决定 簇 ) 。 2) 天 然 蛋白 质 的 免疫 学 功能 不 但 决定 于 暴露 在 大 分 子 表面 的 决定 得 的 特性 和 数目 ， 而 且 还 决定 于 这 些 决定 簇 在 分 子 表面 的 空间 排 布 图 式 。 因 为 通常 蛋白 质 抗原 是 以 天 然 的 完整 的 大 分 子 形式 和 免疫 活性 细胞 表面 的 抗原 受 体 起 作用 的 。 蛋 白质 变性 ,空间 构 象 改 变 , 免疫 学 功能 (免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 ) 也 随 之 改变 。 3) 一 般 说 来 ,抗原 的 免疫 原 性 在 分 子 结构 上 的 要 求 是 : 1) “外 源 性 ”， 即 抗原 分 子 表面 具有 免疫 活性 细胞 从 未 接触 过 的 决定 簇 ， (2) 足够 大 小 的 分 子 量 。 足够 大 小 的 分 子 量 (>10,000) 是 大 多 数 蛋白 质 有 明显 的 免疫 原 性 的 重要 条 件 。 然 而 , 在 某 些 条 件 下 , 低 分 子 量 的 多 肽 或 蛋白 质 片 段 也 有 引起 免疫 反应 的 能 力 。 对 于 不 同 的 抗原 系统 , 免疫 原 性 所 要 求 的 最 低 分 子 量 可 能 不 同 。 抗 原 分 子 的 大 小 和 形状 只 有 当 它 反 上 映 了 分 子 结构 的 复杂 性 ,有效 决 定 簇 的 数目 和 排列 时 ,对 免疫 原 性 才 是 重要 的 (图 1-41)。 此 外 , 抗原 的 物理 状态 对 免疫 原 性 也 有 很 大 影响 。 低 分 子 量 的 可 溶性 抗原 被 胶体 颖 粒 吸附 或 处 于 聚集 状态 时 , 就 加 强 或 获得 免疫 原 性 。 这 可 能 和 它们 在 淋巴 器 官 内 阻 留 和 分 布 的 变化 , 以 及 巨 噬 细 胞 的 吞噬 活动 的 加 强 有 关系 。 4) 免疫 反应 中 两 类 细胞 协同 作用 的 假说 及 载体 效应 的 发 现 对 了 解 免 疫 原 性 的 分 子 基础 有 重要 意义 。 天 然 球 蛋白 分 子 表面 仅 具 有 有 限 数目 的 , 专 一 性 各 不 相同 的 决定 笠 , A 而 只 有 形成 多 价 聚 集 物 (通过 了 细胞 的 辅助 作用 ) 时 ,才能 和 B 细胞 表面 的 抗原 受 体 有 效 © 63 ~p 10° 1 100 毫 微米 细胞 抗原 (1 一 20 微 米 ) (6X10: 一 7.5X109) MASA D- (SEE BYME-N-Z,=1- BY BBC451) 高 血压 素 (1.031) 图 1-41 各 类 抗原 的 大 小 和 结构 的 复杂 性 的 关系 。 地 相互 作用 ,诱导 体液 抗体 的 形成 。 具 有 重复 抗原 结构 的 抗原 则 能 直接 激活 B 细胞 产 生 体 波 抗体 。 免 疫 原 在 分 子 结构 上 的 特点 (有 无 重复 决定 簇 . 是 否 同时 存在 半 抗 原 决定 簇 和 载体 决定 簇 以 及 载体 的 性 质 等 )， 可 能 影响 两 类 细胞 间 的 相互 作用 ， 从 而 影响 免疫 反应 的 类 型 (细胞 免疫 或 体液 免疫 ) ， 以 及 抗体 的 类 别 。 一 般 说 来 ， 蛋 白质 抗原 诱导 细胞 免疫 的 能 力 和 诱导 体 波 免疫 的 能 力 成 反比 ,并 且 变 性 蛋白 倾向 于 诱导 细胞 免疫 。 这 很 可 能 是 由 于 和 了 细胞 表面 抗原 受 体 相互 作用 在 结构 上 的 要 求 比较 不 严格 的 缘故 。 5) 蛋白 质 抗原 之 间 的 交叉 反应 性 和 免疫 原 性 依赖 于 抗原 分 子 在 进化 过 程 中 出 现 的 氨基 酸 排列 顺序 的 种 属 差 异 , 以 及 由 此 决定 的 分 子 表面 局 部 构象 的 差异 。 分 子 结构 的 相 似 性 决定 抗原 之 间 的 交叉 反应 性 , 而 免疫 原 分 子 和 被 免疫 的 动物 同 源 分 子 之 间 , 分 子 结构 的 差别 性 ( 即 “ 外 源 性 ?) 又 决定 其 免疫 原 性 。 这 说 明 抗 原 性 和 免疫 原 性 对 抗原 分 子 结构 的 依赖 , 有 共同 的 历史 根源 。 S$ 4+ FF #F 人 工 抗 原 和 有 喜 和 白质 抗原 专著 Atassi, M. 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Nature 263, 374. ee。 70 。 第 二 章 ” 多糖 和 含 多 糖 的 抗原 及 类 脂 物 多 糖 和 含 多 糖 的 物质 是 微生物 、 动 植物 细胞 及 其 产物 的 另 一 种 重要 的 抗原 成 分 细菌 的 荧 膜 ,内 毒素 和 血型 物质 以 及 葡 聚 糖 和 果 聚 糖 等 都 是 重要 的 多 糖 或 含 多 糖 的 抗原 。 多 糖 抗原 的 免疫 原 性 和 所 免疫 的 动物 种 类 有 密切 关系 。 纯 化 的 多 糖 抗原 能 对 人 和 小 鼠 引 起 很 好 的 抗体 ， 但 不 能 在 家 兔 和 豚鼠 引起 抗体 。 因 此 ， 多 糖 抗原 的 免疫 化 学 研究 多 采用 人 抗 体 。 类 脂 物 的 分 子 量 小 ,无 固定 构 型 ,只 起 半 抗 原作 用 。 某 些 类 脂 半 抗 原 具 有 临床 检验 意 义 , 也 简略 地 论 及 。 一 、 多 糖 和 含 多糖 的 抗原 (—) 多 糖 抗原 的 一 般 性 质 1 多糖 抗 原 决定 签 的 大 小 天 然 的 葡 聚 糖 是 某 些 细菌 利用 蔗糖 合成 的 只 含 葡 萄 糖 的 高 聚 物 ， 分 子 量 可 高 达 一 于 万 。 葡 聚 糖分 子 虽 很 大 ， 但 构造 却 很 简单 。 如 NRRL 3 512- 葡 聚 糖 的 96 % 葡萄 糖 残 基 是 通过 “ 1-6) 配 糖 键 连接 的 ,其 余 4% 葡萄 糖 残 基 是 通过 (1-~3) 配 糖 键 连接 的 ， O~ u-(1 一 6) 键 42) U O 人 le O : ae 0 a-(1 — 3 ##) 5 O O O O}, a oO}, oe Rehohohotohohotciommmcas 5 O}, R 2-1 NRRL 8B512- 葡 聚 糖分 子 一 部 分 的 构造 。 ee Il e。 5100 3400 4300 1300 us D © GI GIGl GIGIGI GIGIGIGI GIGIGIGIGI GIGIGIGIGIG] n=1 n=2 ise n=4 no n= 6 图 2-2 (RAR A BET A FS PD RK HM AEC Boyd, 1962), 结果 形成 一 个 有 许多 分 枝 的 构造 (图 2-1) 。 AFA M—e, ORR ER 的 性 质 提供 了 许多 方便 。 多糖 抗原 分 子 要 达到 足够 大 小 ,才能 引起 免疫 反应 。 如 葡 聚 糖 的 分 子 量 小 于 100,000 时 ,无 免疫 原 性 ;大 于 600,000 才能 引起 抗体 的 形成 。Kabat (1957) 曾 系统 地 研究 了 低 葡 聚 糖 [(Glu) jasc] 对 葡 聚 糖 与 同型 抗 血清 的 沉淀 反应 的 相对 抑制 能 力 。 随 葡萄 糖 单位 的 数目 (”) 的 增加 ， 对 抗体 结合 位 点 的 相对 抑制 能 力也 增加 ,， non AAS 大 值 ， 此 后 就 不 再 增加 了 (图 2-2) 。 因此 ，6 聚 葡 糖 为 能 进入 葡 聚 糖 抗体 结合 位 点 的 最 大 基 团 , 它 可 与 抗体 结合 位 点 完全 结合 。 已 知 6 聚 葡 糖 分 子 在 最 大 伸展 状态 时 ,分子 大 小 约 为 34x12 x7A ， 这 可 能 大 致 反映 了 决定 签 的 大 小 。 不 过 ， 对 应 的 抗体 结合 位 点 不 一 定 就 具有 相当 于 容纳 这 种 伸展 分 子 的 形态 , 因为 6 聚 葡 糖 可 能 卷曲 为 更 密集 的 构象 《Ka- bat，1976) 。 根 据 这 一 系列 实验 ， 还 可 以 计算 出 从 6 聚 葡 糖 末端 起 每 一 个 葡萄 糖 单位 和 抗体 的 结合 自由 能 在 整个 抗原 抗体 结合 自由 能 中 所 占 的 比例 ， 列 于 表 2-1。 由 表 2-1 可 见 ,最 未 一 个 葡萄 糖 单位 占 全 部 结合 能 的 39% 。 前 5 个 单位 共 占 98%， 第 6 不 单位 只 占 2% 。 这 一 事实 对 于 下 述 细菌 多 糖 抗原 未 端 几 个 单位 对 抗原 专 一 性 的 重要 性 给 予 了 合理 的 解释 。 表 2-1 和 葡 聚 糖 决定 徐 中 各 葡萄 糖 单位 在 全 部 结合 自由 能 中 所 占 的 比例 葡萄 糖 单位 数目 2 1 (42 Boyd, 1962), 2. 多 糖 抗原 的 空间 构象 和 抗原 专 一 性 如 前 一 章 所 述 ， 大 量 事实 证 明 蛋 白质 的 抗原 专 一 性 和 分 子 的 空间 构象 有 极其 密切 的 关系 。 但 是 , 对 于 多 糖 抗原 ， 这 方面 的 知识 还 很 缺乏 。 MMAR ASR SA 究 , 认为 由 于 分 子 沿 " (1~>6) 配 糖 键 能 作 相当 程度 的 自由 转动 ， 因 此 一 个 6 聚 葡 糖 在 溶 液 中 可 能 存在 各 种 各 样 的 构象 ,并 产生 相对 应 的 各 种 抗体 。 后 来 , 有 人 用 含 氨基 糖 的 低 缀 糖 作 旋光 散射 光谱 研究 ， 发 现 这 种 低 聚 糖 在 溶液 中 可 能 保持 比较 固定 的 构象 。 免 疫 化 学 研究 也 有 证 据 表明 多 糖 的 空间 构象 可 能 与 抗原 专 一 性 有 关系 。 链球 菌 含 有 一 类 特殊 的 多 糖 ， 称 为 甘油 - 磷 壁 质 (Glycerine-Teichoic acid) 。 其 a @ ae 结构 是 甘油 和 磷酸 相间 连接 而 成 的 高 聚 物 ; H oO peg ee beeen meio 一 C —CH,+++ o bx b 其 中 甘油 残 基 第 二 碳 原子 上 的 羟基 可 能 被 丙 氢 酸 酯 化 。 McCarty (1964) 在 兔 抗 链球 菌 抗 血 清 中 ， 发 现 专 一 性 不 同 的 三 类 抗体 。 第 一 类 抗 ， 体 只 能 与 被 两 氨 酸 酯 化 的 础 壁 质 起 沉 泻 反应 ， 其 免疫 学 专 一 性 可 能 是 和 含 丙 氨 酸 的 决定 伐 互 补 的 ， 第 二 类 抗体 和 不 含 丙 氨 酸 的 磷 壁 质 有 很 强 的 沉淀 反应 ， 而 和 含 丙 氨 酸 者 只 有 轻 度 反应 ， 这 表明 抗体 的 专 一 性 是 针对 包含 游离 状 基 的 决定 起 的 ， 第 三 类 抗体 对 含有 和 不 含有 丙 氨 酸 的 两 种 高 聚 物 都 能 同样 地 反应 。 这 提示 这 种 抗体 的 结合 专 一 性 是 针对 甘油 茂 基 第 一 矶 原子 的 一 C_ 基 团 ， 而 与 亲 水 性 基 团 无 关 。 所 有 这 些 例 子 说 明 ， 这 三 种 不 同 的 抗体 的 结合 位 点 各 自 针 对 抗原 分 子 的 一 个 特定 部 位 。 也 就 是 说 ， 多 糖 的 抗原 专 一 性 可 能 依赖 分 子 的 空间 构象 。 此 外 ， 血 型 物质 抗原 决定 秘 的 专 一 性 同样 可 能 和 空间 构象 有 关系 。 这 将 在 下 文 再 谈 到 。 (=) 沙门 氏 菌 的 抗原 沙门 氏 菌 属 (Salmonella) 的 抗原 结构 及 其 生物 合成 的 遗传 控制 在 分 子 水平 有 相当 深入 的 研究 ， 可 作为 细菌 多 糖 抗原 的 代表 。 这 方面 的 研究 是 从 沙门 氏 菌 的 血清 学 分 类 工作 起 始 的 。 Kaufmann 和 White 根据 这 一 类 细菌 含有 两 类 主要 抗原 ， 即 “90” 抗 原 ( 胞 体 抗 原 ) 和 “H?” 抗 原 ( 鞠 毛 抗原 ) ,鉴别 各 种 细菌 品系 的 血清 学 类 型 ， 运 今 已 记录 了 近 1,000 个 血清 型 (Serotype) (ath). mis 学 分 类 原理 是 用 不 同 品系 的 沙门 氏 菌 ， 按 照 标准 手续 免疫 家 免 , 制备 抗 血清 , 并 系统 地 测 定 这 些 抗 血清 和 大 量 的 不 同 品系 之 间 的 血清 学 反应 。 根 据 “0” 抗 原 专 一 性 的 不 同 ， 能 区 分 出 四 十 多 个 血清 学 族 -(Sero-group)。 同一 族 的 各 物种 (血清 型 ) 具有 共同 的 “0” 抗原 决定 往 ( 9” 因子 ) ,彼此 之 间 有 交叉 反应 。 如 了 D 族 的 所 有 物种 都 具有 决定 入 9,B 族 都 具 有 决定 簇 4。 除去 这 种 族 专 一 的 决定 簇 (“0” AF) 以 外 ,同一 族 的 各 种 还 具有 一 些 各 不 相同 的 其 它 决定 得 ， 因 而 在 血清 学 上 又 可 以 彼此 区 别 开 来 ( 表 2-2) 。 如 属于 D 族 的 伤 ke (S. 怒 phi) 具有 (9,12) RR; S. sendai 具有 (1,9,12) 决定 簇 ; 而 属于 B 族 的 Bl PE (CS. paratyphi B) 具有 (1,4,5,12) RR; S. abortus equi 具有 (4,12) RE MSS. 由 于 每 一 个 种 都 可 能 存在 许多 决定 往 ， 也 就 可 能 呈现 大 量 的 交叉 反 应 。 因 此 , 在 进行 血清 学 分 类 时 , 需要 使 用 吸附 方法 ， 从 一 个 抗 血清 制备 对 一 个 或 少数 几 个 决定 簇 专 一 的 抗体 , 作为 鉴别 的 手段 。 通 常 这 是 通过 加 一 系列 的 .小 量 浓 的 细菌 悬 液 到 一 个 抗 血清 中 ， 每 次 加 细菌 后 ， 离 心 去 除 凝 集 的 细菌 ， 直 到 所 有 的 交叉 反应 抗体 被 去 除 FL 抗 血 清 已 成 为 对 所 要 求 的 抗原 决定 簇 有 选择 专 一 性 时 为 止 。 例 如 ， 把 属于 “A” 族 的 S. paratyphi A (1,2, 12) 加 入 到 抗 8. typhi (RDM, ERI, 12) 的 抗 血清 中 ( 含 抗 -9， 抗 -12 抗体 ) 。 经 过 这 样 的 吸附 以 后 ， 就 可 以 去 除 抗 -12 抗体 ， 而 得 到 对 决 eI 专 一 的 抗 血 清 ,也 就 可 以 当 作 “D” 族 的 专 一 的 鉴别 血清 。 73 @ R22 一 些 沙门 氏 菌 “9? 抗 原 之 血清 学 因子 和 糖 组 成 血清 型 (种 ) GO2? ¥ 基本 糖 * 之 外 的 糖 成 分 化 学 型 S. ParatyphiA PS Ptr Ws man Rha XV S. Paratyphi A var. durazzo 2,12 Rha S. abortus equt 4,12 Rha XIV- S.. paratyphi B 1,455 42 Rha S. typhimurium 1 5 Rha S. typhimurium(mutant) Rha III S. paratyphi C S. cholerae suis S. newport XIV S. typhi XVI S. senda S. enteritidis S. anatum XIII S. newington S. illinois (3),(15), 34 S. senftenberg 1,3319 . S. adelaide 35 5 xX * 基本 糖 成 分 : KDO, GRRE. ka BUS. EPL A i Man = 甘露 糖 ，Rha = f 242 ¥8, Par. = Paratose, Abe. = Abequose, Tyv = Tyvelose Col = colitose ** 族 特 有 的 “O” 因 子 , 在 序号 数字 下 加 一 横 线 。( 据 Kaufmann 4, 1960), WIT 三 氧 酷 酸 酚 - 水 碱 (5 43H, 68°C) Ba peers |e = | |e = a | eee | 四 碱 本 fa 图 2-3 ”从 沙门 氏 菌 制备 的 各 种 具有 “O?” 抗 原 专 一 性 的 提取 物 。 “0” 抗 原 具 有 很 强 的 毒性 , 极 微量 (0.001 微克 /公斤 体重 ) MIRAE, Amb 少 等 临床 症状 。 由 于 这 些 物 质 是 细菌 细胞 壁 的 组 成 成 份 ， 只 有 在 细胞 解体 时 才 释 放出 来 ,因此 又 称 为 “内 毒素 ”。“ 内 毒素 ”与 0? 抗原 有 密切 关连 ， 但 “0” 抗 原 专 一 性 和 毒素 活力 是 可 以 分 开 的 。 当 用 酚 : 水 溶液 (45:55) 在 68"C 提 取 时 ， 从 水 相 可 以 分 离 出 高 分 子 量 的 脂 多 糖 (Lipopolysaccharide， 简 称 LPS) ， 仍 有 毒性 。 若 再 经 0.1 V BR XK FF (100"C，2 小 时 ) ， 就 可 以 得 到 无 毒性 的 多 糖 ， 并 保持 “0” 抗 原 专 一 性 (图 2-3)。 由 此 可 见 , “0?” 抗 原 专 一 性 存在 于 此 多 糖 部 分 ， 而 毒性 可 能 存在 于 类 脂 物 部 分 。 这 种 多 糖 经 纯化 后 广泛 地 用 于 结构 和 免疫 化 学 的 研究 。 1.“O” 抗 原 专 一 性 的 结构 基础 C1) 特异 的 糖 组 成 和 “化 学 型 ? 如 上 所 述 ， 沙 门 氏 菌 的 分 类 主要 根据 “0” 抗 原 专 一 性 。 对 不 同 血 清 型 沙门 氏 菌 的 近 。74 。 二， es aint ee 7 Al2-4 四 种 脱氧 已 糖 的 分 子 模型 ( 据 Kabat 和 mayer, 1961), 一 百 种 “9” 抗原 进行 的 化 学 分 析 ， 发 现 “9” 抗原 是 由 五 到 八 种 单 糖 成 分 组 成 的 结构 复 杂 的 多 糖 。 然 而 毫 无 例外 地 ， 所 有 沙门 氏 菌 的 “90” 抗 原 都 含有 五 种 共同 的 糖 成 分 : 磷酸 庚 糖 ，Ketodeoxyoctonic acid (KKDO) ，D- 和 葡萄糖，D- 半 乳糖 和 了 D- 毛 基 半 乳糖 。 除 去 上 述 五 种 基本 糖 成 分 以 外 , 每 一 个 血清 型 (种 ) 又 可 能 含有 一 到 三 种 为 各 物种 特异 的 糖 成 分 。 最 特别 的 ， 许 多 沙门 氏 菌 发 现存 在 一 类 新 的 糖 ，3,6- 双 脱氧 已 糖 ， 可 分 为 四 种 : 3,6- 双 脱氧 -D- 甘 露 糖 〈 泰 威 糖 Tyvelose); 3，6- 双 脱氧 -D- 半 乳糖 〈( 阿 比 可 糖 Abe- quose) ;3,6- 双 脱氧 -L- 半 乳糖 (可 立 糖 Colitose) 和 3,6- 双 脱氧 -D- 葡 萄 糖 GHEE Paratose) 。 一 个 特定 的 血清 型 (种 ) 具有 其 中 一 种 特异 的 双 脱 氧 糖 , 位 于 脂 多 糖 链 的 非 还 Dik (9,12): ER La 19) A25 用 血清 学 抑制 实验 测定 的 和 沙门 氏 莫 的 一 些 “O?” 因子 专 一 性 有 关 的 糖 ( 据 Lideritz 44,1966), 人 > ed 原 末端 ， 并 且 是 免疫 优势 基 团 。 图 2-4 为 这 四 种 双 脱 氧 已 糖 的 分 子 模型 ， 彼 此 的 形状 有 明显 的 差异 。 这 或 许可 以 解释 为 什么 它们 可 能 起 免疫 优势 基 团 的 作用 。 由 于 各 种 沙门 氏 菌 除 基本 糖 成 分 外 , 还 含有 特异 的 糖 组 成 (尤其 是 特异 的 双 脱 氧 糖 ) 。 这 种 特异 的 糖 组 成 ， 称 为 化 学 型 (Chemotype) 〈 图 2-5; 表 2-2) 。 从 表 列 举 的 材料 可 见 ， 化 学 型 和 血清 型 的 区 别 在 分 类 上 是 平行 的 ,因而 也 可 作为 分 类 的 参考 。 然 而 ,血清 型 的 专 一 性 不 只 是 在 于 其 糖 的 特异 组 成 ， 更 为 重要 的 是 这 些 糖 单位 在 多 糖 链 上 的 一 定 排 列 顺序 。 (2) “O” 抗原 的 基 核 和 侧 链 的 一 般 构 造 天 然 沙门 氏 菌 在 琼脂 培养 基 上 的 菌落 是 光滑 的 ， 有 时 也 可 能 产生 菌落 “粗糙 ?的 变异 型 (R"-mutant)。 虽然 各 种 沙门 氏 菌 除 基 本 糖 成 分 以 外 ， 还 含有 各 种 特异 的 糖 组 成 ， 但 是 所 有 这 些 “ 化 学 型 不同 的 种 产生 的 突变 型 (“ 粗 糙 型 2) 都 只 含有 这 五 种 基本 糖 成 分 ， 而 失去 原 物 种 特异 的 “化 学 型 ”。 因 此 , 有 人 根据 这 一 现象 提出 一 个 关于 “9” 抗 原 构造 的 ii: 所 有 沙门 氏 菌 的 “9?” 抗原 多 糖 都 具有 一 个 由 五 种 基本 糖 成 分 构成 的 共同 基 核 (Common core) ， 同 时 还 有 由 物种 特异 的 糖 成 分 组 成 的 侧 链 和 它 相 连 。 侧 链 的 构造 又 是 由 一 连 串 含 二 到 四 种 单 糖 组 成 的 低 聚 糖 重复 单位 相连 而 成 的 多 糖 链 。 侧 链 的 特异 的 排 列 顺序 决定 抗原 专 一 性 。 图 2-6 表示 “97? 抗 原 的 基 核 和 侧 链 的 一 般 构造 。 Rha—Gal—|-> Man>Rha~>Gal—|> Man—Rha>Gal—|> R,, Abe Ry BK 类 脂 A “KR” BE Shirl 侧 链 图 2-6 沙门氏菌 co 抗原 (LPS 复合 物 ) 构 造 示意 图 及 5. ryphimurium LIT12 之 专 一 的 多 糖 侧 链 的 构造 ( 据 Lideritz 等 ，1966)。 Abe “天 然 ? 重 覆 单 位 ~ (3)“O” 抗 原 专 一 性 的 微细 构造 LPS 多 糖 侧 链 特异 的 排列 顺序 是 “0? 抗 原 专 一 性 的 结构 基础 。 对 “0” HREM 微细 结构 的 进一步 分 析 发 现 虽然 在 许多 情形 下 ， 非 还 原 未 端 (尤其 是 位 于 未 端的 3，6- 双 脱氧 已 糖 ) 是 免疫 优势 基 团 ， 但 是 构成 “0” 抗原 专 一 性 “0” 因子 ) 的 糖 残 基 , 并 不 一 定 要 位 于 侧 链 的 末端 ， 有 时 也 可 能 是 侧 链 内 的 某 一 个 重复 单位 或 其 一 部 分 (图 2-7) 。 不 论 其 在 侧 链 上 的 位 置 如 何 ， 所 有 这 些 决 定 抗原 专 一 性 的 糖 残 基 都 有 可 能 是 免疫 优势 基 团 。 沙门 氏 菌 的 血清 学 分 类 上 ( 表 2-2) ， 可 见 到 不 同 的 族 可 能 有 共同 的 抗原 决定 簇 (“0” 因子 )， 并 且 常 和 另 一 族 专 有 的 “O” 因子 相伴 出 现 。 例 如 ，B 族 中 存在 的 决定 簇 1, 在 也 族 总 是 和 决定 径 19 一 起 同时 出 现 。 对 这 一 现象 的 解释 是 这 两 种 “0” 因 子 的 专 一 性 是 由 侧 链 的 同一 段落 决定 的 ， 不 过 它们 所 包括 的 长 度 ( 糖 残 基 的 数目 ) 不 同 ， 因 而 这 些 专 一 性 ° 76 °« eg Gal a Gal-Gle —Gal-Glle | | | | | Rha Rha Rha | td! 34 Gal- Glc Gal-Glc Gal-Glc | Man | oe 1 2°) Man 1 fe tee eiop yt | 二 Gal-Gle Gal-Gle Gal-Gle [Seo | ne WE Man ing ia 1 R ae R Rha Rha a h 7 | | | | i] | 1 | 1 | | ——————_—_—_—_—S 0 E HK 基 核 有 A B 末端 位 置 内 部 位 置 2-7 MIKE E, KG15,3) SMe LRERCO” 因子 ) 的 可 能 位 置 。 链 周围 的 黑 线 示 决 定 签 和 抗体 结合 部 位 间 之 亲和力 的 强度 , 线 越 粗 表 示 亲 合力 越 强 ( 据 Lideritz 等 ，1960)。 BR 1 4; —= Ac. Gal —= Man —> Rha-™ Ac. Gal M an 一 se 5 19 E. 族 TON 下 —— Gal 一 Man —s Rha —= Gal —= Man 一 一 一 一 3 图 2-8 B 族 多 糖 重 覆 单位 上 的 1， lias 5， 4, 和 4, 因子 。 E, 族 多 糖 重 覆 单位 上 的 1， 3， 19 因子 ( 据 Lideritz 等 ，1966)。 总 是 相伴 出 现 , 而 又 可 以 互相 区 别 ( 图 2-8) 。 2. 抗原 专 一 性 的 溶菌 转化 史 菌 体感 染 沙门 氏 菌 后 ， 能 引起 “ 0” 抗原 专 一 性 (血清 型 ) 的 转变 ， 原 有 的 抗原 决 定做 减弱 ， 同 时 出 现 新 的 决定 簇 。 这 种 溶菌 转化 现象 对 于 了 解 “9” 抗 原 的 化 学 结构 和 生物 合成 的 遗传 控制 是 很 有 启发 的 。 对 卫 族 沙门 氏 菌 的 一 系列 溶菌 转化 曾 作 过 详尽 的 研究 。 从 图 2-957, ER (3， 10) 被 噬菌体 s15 感染 后 ， 原 有 的 决定 簇 10 改变 为 15, 决定 簇 3 没有 改变 。 结 果 血 清 型 AERA, ME, RAKE. 族 。E。 族 又 可 被 另 一 种 鸣 菌 体 s34 转变 成 Es 族 ， 新 产生 一 个 决定 得 34, MRANRER 3, UREA. 另 一 方面 ,也 族 (3,10) 被 s34 侵袭 后 ， 卫 , 的 抗原 特性 最 初 保 持 不 变 。 但 是 ， 当 再 受到 另 一 个 噬菌体 s 15 作用 时 ， 就 被 转化 e We E, 3,15(€15) 8-D-Gal (16 )-a-D-Man(1—>4)-L-Rha= 3,(10),15(€-15a) '8-Q-Ac-D=Gal-(1—6 )-e-D1-Man-(1—>4 )-L-Rha= 3,(10),15(e15b) €34 a-D-Gal-(1—>6 )-a-D-Man(1—>4)-L-Rha E; E; (3),(15),34(€15,€34) a-O-Ac-D-Gal-(1—>6 )-a-D-Man-(1—>4)-L-Rha a-D-Glu( 1-4 )-8-D-Gal-(1—>6 )-a-D-Man-1—3 )-L-Rha- Ei 3,10 (€34) a-O-Ac-D-Gal-( 1-6 )-a-D-Man-( 1—4)-L-Rha- 2-9 “沙门氏菌 抗原 决定 签 的 溶菌 转变 ( 据 Uchida 等 ，1963)。 39°F, (3515534). 2-9 RRR RARE PEL RRERAWELZADKA. A 体 €15 能 引起 出 现 一 个 新 的 酶 系 ， 使 和 “0” 因 子 10 的 专 一 性 相关 的 O- 乙 酰 -c-D- 4 乳糖 基 团 转变 成 -个 失去 乙酰 基 的 6-D- 半 乳糖 基 团 ,后 者 是 和 “0” 因 子 15 的 专 一 性 相 关 的 。 还 可 以 假定 噬菌体 s15 的 遗传 信息 表现 就 是 形成 68-D- 半 乳糖 键 ， 从 而 提供 进 一 步 在 吻 菌 体 s34 的 作用 下 和 ac- 葡萄 糖 残 基 连 接 的 受 体 。 于 是 便 可 以 解释 E, (3,10) 最 先 被 噬菌体 s34 侵袭 时 ， 不 表现 出 溶菌 转化 ， 因 为 “0” 因 子 10 缺乏 c- 葡 萄 糖 残 基 的 受 体 ， 而 当 再 被 s15 RAN, ZARA AND ATER PRAMAS. RICE 人 WEEK s15 还 分 离 出 两 个 突变 品系 (sl5a 和 sl5b) ， 能 将 sl5 的 作用 再 分 解 为 两 步 。 s15a 的 溶菌 转化 作用 是 把 c-O- 乙 酰 -D- 半 乳糖 转变 为 6-O- 乙 酰 -D- 半 乳糖 ; 而 s 15b 则 能 使 (3,i0) RERAA O- 乙 酰基 团 。 在 两 种 情形 下 , “0” 因 子 10 的 专 一 性 都 被 部 分 地 抑制 ， 而 表现 出 “9 因子 15 的 专 一 性 。 总 之 ， 鸣 菌 体 引 起 的 血清 型 转化 是 由 于 抗原 决定 得 微细 构造 改变 的 结果 ， 如 增加 一 个 新 的 c- 葡 萄 糖 残 基 ，c- 连 接 改 变 为 5- 连接 ，(1-~>4) 连接 改变 为 (1->6) ERS. KH 改变 是 由 于 鸣 菌 体 可 能 引起 出 现 新 的 酶 系 。 至 于 这 种 遗传 控制 的 变化 是 由 于 叹 菌 体 基 因 组 的 作用 , 还 是 细菌 本 身 基 因 去 抑制 的 结果 ， 则 不 得 而 知 了 。 3. “O” 抗原 决定 徐 生 物 合 成 的 遗传 控制 及 基 核 的 构造 对 许多 “粗糙 型 ?突变 品系 的 LPS 构造 的 比较 研究 ， 发 现 所 有 的 突变 品系 都 含有 类 脂 A， 而 其 多 糖 所 含 的 基本 糖 成 分 则 呈现 从 Ra 到 Rd 一 系列 的 变化 (图 2-10)。 另 一 个 突变 品系 Re, RBA KDO, RIF A 和 乙醇 胺 ， 而 不 含 任何 糖 。 据 此 可 以 推论 ， 从 Re 到 Ra 多 糖 链 构造 的 这 一 系列 变化 反映 了 基 核 多 糖 链 的 构造 及 其 逐步 合成 的 阶段 ， 每 一 © 7T8 。 Gall KDO hock | | PE Glc-m Gal =] Glc == HepP ! | | | | GlcNAc, ee -- [Pate mt Gleam ten? Uf Gal) HepP | | I GlcNAc | ] O- 专 一 侧 链 的 重复 单位 Ra 一 Ril 一 基 核 4H Be A S(O fi) 图 2-10 WPI RRC DA RE SSS NY EGE Lideritz , 1966), 步 增加 一 个 糖 单位 (图 2-11) 。 其 中 每 一 步 都 受 一 个 基因 控制 。 因 此 ， 当 由 于 某 一 个 基因 突变 而 失去 生物 合成 途径 中 某 一 中 间 环 Gal KDO 节 的 一 个 酶 时 ， 结果 在 此 环节 之 后 的 合 化 学 型 Ra' GovacvekrenrGkerasre 成 作用 就 中 断 ， 多 糖 链 的 延长 也 就 被 阻 RE od 人 对 各 种 突变 品系 的 LPS 抗原 决定 Gal 签 之 低 聚 糖 的 分 离 和 构造 测定 ， 也 证 实 Sal ee TLRS 法 。 如 从 S.. minnesota 的 Rb: SER TA ae Rb 突变 品系 分 离 出 的 一 个 4 糖 具 有 下 各 从 ae 述 构 造 Glc Hot ih x a-D-Gal Gal Fep-P 6 Re: KDO a-D-Gle->Gal>Glc ; 3 Glc— Hep-P 而 从 Ra 突变 品系 得 到 的 一 个 5 粮 as NAA: et Hep-P “1 ; Hep-P et ds oe KDO Rd: ‘Anas 的 构造 ， 和 前 者 的 唯一 区 别 是 在 末端 多 Sid IT —* o-N-ZGi- BE WE iid 在 缺乏 半 乳 糖 的 培养 条 件 下 产生 的 ep- “粗糙 型 ” Re 突变 品系 ， 其 多 糖 组 成 只 ae 图 2-11 沙门 氏 菌 粗糙 型 ? 突变 品系 之 “R?” 多 糖 的 构造 。 含有 葡萄 糖 和 庚 糖 。 当 培 养 基 中 加 入 半 KDO = 让 Hep—P = 磷酸 庚 糖 乳糖 时 , 它 就 能 合成 完全 的 “0" 抗 原 ， 并 7 恢复 形成 光滑 的 菌落 。 这 是 由 于 这 种 突变 品系 缺少 UDP- 半 乳糖 -4- 差 向 异 构 酶 (将 779 = -区 和 入 转生 转移 酶 I __Ixpp N-Z.Bb36, PP WR LE == WES ——-F eptose i 糖 1PO, (A) UDP-Gal “fk” o Gal-P- “ik” So Rha penile peti ae A re TDP-Rha Man > Paes “pen (4 (Man > Rha > Gal), Man as Rhare Gal- -1]-P-“ 脂 > (B) (5) “ 基 核 ? 脂 多 糖 (6) 完全 的 脂 多 粮 图 2-12 沙门氏菌 O- 专 一 多 糖 的 酶 促 合成 。 (A) 基 核 多 糖 的 酶 促 合成 。 (B) S. typhimurium O- 专 一 链 的 酶 促 合 成 ( 据 Wiener 等 ,1965) UDP- 葡 萄 糖 转变 成 UDP- 半 乳糖 ) ， 因 此 它们 自己 不 能 合成 半 乳 糖 而 依赖 从 环境 中 摄 取 。 根据 类 似 的 一 系列 的 突变 品系 的 研究 ， 阐 明了 “0” 抗 原 侧 链 可 能 的 合成 途径 ， 以 及 和 了 Ra 基 核 的 连接 方式 (图 2-12) 。 图 2-12 说 明 “0” 抗 原 多 糖 的 合成 途径 主要 分 两 个 步骤 : 1) 基 核 类 脂 多 糖 的 合成 ; 2)“0?” 专 一 的 侧 链 的 合成 。 以 S. typhimurium 为 例 Man-Rha-Gal 重复 单位 的 合成 是 在 一 个 类 脂 受 体 上 进 行 的 。 最 先 一 个 UDP-Gal 和 类 脂 受 体 起 作用 ， 连接 成 Gal-1-P- 类 脂 受 体 。 然 后， Rha-，Man- 依 次 通过 配 糖 键 与 其 连接 ， 再 加 上 Abe 侧 链 。 WS RPE SA AE A 合 ， 再 连接 到 基 核 上 面 ， 形 成 完整 的 “0?” 抗 原 。 对 沙门 氏 菌 各 种 “0” 抗 原 的 进一步 研究 , 证 实 上 述 的 抗原 决定 得 构造 原则 是 普遍 适 用 的 。 特 别 有 兴 趣 的 ,“U” 族 具有 血型 B 的 抗原 专 一 性 ， 能 和 B 血型 物质 起 交叉 反应 。 对 “U?” 族 抗原 决定 簇 构造 的 研究 ， 发 现 其 “90?” 抗原 决定 簇 具 有 a-D-Gal-(1,3)-Gal- 的 构造 。 这 是 和 下 面 要 谈 到 的 B 血型 物质 的 决定 簇 构造 相似 的 。 (三 ) 血型 抗原 “ABO” 系 统 是 人 类 最 重要 的 血型 系统 。 各 型 红血球 (及 其 他 细胞 ) 表面 均 有 相应 的 血型 抗原 存在 ， 而 血清 中 则 存在 着 天 然 的 抗 A 或 抗 B 抗体 。A 血型 的 人 ,红血球 上 有 全 型 抗原 , 而 血 请 中 天 然 存 在 抗 也 抗体。B 血型 的 人 ， 红 血球 上 有 也 型 抗原 ， 而 血清 中 天 然 存 在 抗 A 抗体 。O 血型 的 人 ， 红 血球 上 A,、B 型 抗原 都 不 存在 ， 而 在 血清 中 却 同时 存 在 抗 A 和 抗 B。 因 此 ， 在 正常 情形 下 ， 人 体内 红血球 不 会 发 生 凝 集 现象 ， 而 在 血型 不 配 合 的 个 体 间 输 血 时 ， 就 会 发 生 凝 集 并 引起 严重 的 输血 反应 。“ABO” 血型 抗原 是 受 三 个 等 位 基因 A,B,O 控制 的 。A,B 基因 对 O 基因 是 显 性 的 。 基 因 型 AA MAO, 或 基因 型 BB 和 BO， 在 血 请 学 上 没有 区 别 ， 仍 可 按 表 型 相应 地 划分 为 A 型 或 B 型 。 因 此 ， 虽 然 ”80 « 存在 六 种 基因 型 ， 实 际 上 只 存在 四 种 表 型 (0,A,B,AB)， 即 四 种 血型 。 红血球 表面 上 的 血型 抗原 是 以 糖 脂 的 形式 和 膜 结 合 的 ， 因 而 分 离 上 颇 为 困难 。 幸 好 在 多 数 人 ( 占 人 口 80%) 的 消化 道 、 生 殖 道 等 粘膜 面 的 分 刻 流 (唾液 .胃液 .卵巢 滤 泡 液 等 ) 中 ， 都 含有 相当 于 红血球 表面 血型 抗原 的 可 溶性 血型 物质 ， 能 较为 方便 地 提取 出 来 。 从 A 血型 的 人 可 提取 出 A 血型 物质 ， 从 B 血型 的 人 可 提取 出 B 血型 物质 从 AB 血型 的 人 可 提取 出 A、B 血型 物质 ， 从 O 型 的 人 ， 则 可 提取 出 互 血 型 物质 。 后 者 被 认为 A, B 血型 物质 生物 合成 的 前 体 物 。A、B、H 血型 物质 的 分 记 是 受 分 这 基 因 (Se) 控制 的 。 人 类 80% 个 体能 分 记 徊 型 物质 , 称 为 "分泌 者 >， 其 余 20% 不 分 这 ， 称 为 “ 非 分 记者 ”。 这 些 不 分 记 “ABO” 系 统 血型 物质 的 个 体 ， 能 分 这 另 一 种 血型 物质 ， 称 为 Le*、Les 是 不 同 于 “ABO” 的 一 个 新 血型 系统 , 受 另 一 个 独立 的 基因 系统 (Le) BH, 总 之 ， 这 几 种 血 型 抗原 (A、B,、H fle) 是 受 三 个 独立 的 基因 系统 (ABO, Se, Le) HHA. AAR 定 每 一 个 基因 决定 一 个 糖 基 转移 酶 ， 并 专 一 地 把 一 个 单 糖 残 基 按 照 一 定 的 顺序 依次 连接 到 共同 前 体 物 上 去 ， 从 而 形成 这 几 种 不 同 的 血型 物质 。 对 血型 物质 的 抗原 结构 和 专 一 性 的 研究 结果 ,支持 这 一 假说 。 1. 血型 物质 的 抗原 构造 和 专 一 性 所 有 纯化 的 血型 物质 都 是 高 分 子 量 的 糖 蛋白 ,分 子 量 介 于 200,000 一 1,000,000 之 间 。 人 类 血型 物质 都 含有 4 种 糖 成 分 : 志 = 岩 藻 糖 ，D- 半 乳糖 ，D- 氮 基 葡 萄 糖 和 D- 氮 基 半 乳 糖 ， 并 含有 相同 的 11 或 12 种 氨基 酸 ， 其 中 Pro, Ser, Threo 含量 较 丰 富 。 应 用 半 抗 原 抑 制 抗原 抗体 反应 的 方法 ， 阐 明了 血型 物质 的 免疫 学 专 一 性 决定 于 多 糖 链 末端 的 排列 顺序 。 在 血型 物质 A 和 抗 人 反应 系统 中 , A A. BL H Le 物质 所 含 的 各 种 单 糖 成 分 作 抑制 实验 ,表明 其 中 只 有 N- 乙 酰 -D- 氢 基 半 乳糖 (简称 w-D-GalNAc) 至 现 明显 的 抑制 效应 。 同样 地 ， 在 B 和 抗 B 反 应 系统 中 ， 只 有 半 乳 BH (简称 c-D- 80 冯 60 u j = it care ed tk = ae: 4 a a a eaeR es see rt oi 20 ° 10 20 30 40 50 60 加 入 扣 制 物 浓度 《微克 分 子 ) 图 2-13 各 种 糖 对 抗 -B- 抗 血清 和 B- 血 型 物质 沉淀 反应 的 抑制 。(a ) 甲 基 -x-D- 半 驰 糖苷 ; (全 )D- 半 乳糖 ; (oO ) 甲 基 -6-D- 半 乳糖 昔 ; (Cw) L- 岩 菠 糖 ， (a )N- 乙 酰 -D- 氨 基 葡 萄 六 Co ) N- 乙 酰 -D- 氨 基 半 乳糖 ( 据 Kabat 和 Leskowitz, 1955), "省 了 0 #R2-3 人 类 血型 物质 专 一 性 的 决定 徐 抗原 抗 mh 清 决 定 & RER KSSH CH,0OH CH,OH sees, Ho 人 OH HO O “An “An a-IN- H ARCA 人 抗 A $i (1>3) 4 3 By NOH H Ow H fa x H NHCOCH, H. Of A m2 BR (x =.4) CH,OH CH, HO ° H pele Oo «BR» 抗 “B> cx-D- 半 乳糖 CI->67) H H Ct BE FL HNOH H HONCH H x H OH H NHCOCH, B 血型 物质 (x 4) Lt me) 抗 *H> 四 一下、 CH; adie HH 血型 物质 (x 7 H Oo CH, B-D- F841 > 3) D-N- RE 人 抗 page seme, Ze) HONE HOA, yin ae 基 葡 萄 糖 =e HAL cx-L- 岩 藻 糖 ~ HA CH,0H oO H NHCOCH, HO e 6-D-N-Z, RSE WH 人 类 血型 物 | XIV 型 肺炎 球 H 质 降解 产物 | BO Sone 氨基 葡萄 糖 Bop H a 6D ye MST * 鳗鱼 血清 天 然 含 抗 “H>。 ## 由 唾液 中 无 血型 物质 分 泌 的 人 提取 出 是 由 与 “ABO” 系 统 无 关 的 Se 基因 决定 的 ( 据 Boyd，1962)。 Gal); 在 互 和 抗 瑞 系统 中 只 有 工 - 岩 藻 糖 (简称 工 -Fuc) 表现 明显 的 抑制 作用 。 进 一 步 研 究 还 发 现在 B 和 抗 B 系统 中 ， 甲 基 -c-D- 半 乳糖 苷 对 这 一 抗原 抗体 系统 的 沉淀 反应 的 抑制 能 力 要 比 甲 基 -8- 半 乳糖 苷 强 得 多 ,并且 D- 半 乳糖 也 要 比 后 者 强 ( 图 2-13) 。 由 此 推论 ，B 血型 物质 多 糖 链 末端 第 二 个 糖 单位 可 能 是 通过 半 乳 糖 c- 配 糖 键 连 接 的 。 后 来 ， 从 也 血型 物质 水 解 产物 中 ， 分 离 出 一 个 双 糖 (ac-D- 半 乳糖 -=(1-~3) 半 乳 糖 ) ,其 抑制 能 力 比 甲 基 -c-D- 半 乳糖 苷 还 要 强 ; 另外 一 个 三 糖 又 比 此 双 糖 的 抑制 能 力 更 强 。 通过 系统 地 运用 这 种 方法 进行 研究 ， 终 于 测定 出 各 种 血型 物质 的 抗原 决定 得 的 结构 , 列 于 表 2-3。 上 述 用 免疫 化 学 方法 得 到 的 结果 ， 也 得 到 血型 物质 逐步 酶 解 实验 结果 的 有 力 支持。 当 用 某 些 细菌 〈 如 Trichomonas foetus) 或 动 植物 (蜗牛 ,咖啡 豆 等 ) 的 专 一 酶 来 逐步 切断 A 或 B 血 型 物质 多 糖 链 的 末端 时 , 血型 物质 的 抗原 专 一 性 就 发 生 顺 序 性 变化 (图 2- 14) (Watkins，1966) 。 从 图 2-14 可 见 ，A,B 血型 物质 在 专 一 的 酶 作用 下 ,各 自 失 去 一 个 末端 糖 残 基 后 , PREAH 物质 的 抗原 专 一 性 ; 而 后 者 被 酶 解 ， 失 去 一 个 岩 菠 糖 后 ,就 转变 为 Le Mik; 当 再 失去 一 个 岩 菠 糖 时 ， 最 后 转变 成 一 个 具有 XIV 型 肺炎 球菌 抗原 专 一 性 的 共同 前 体 物 。 逐 步 酶 解 时 表现 出 的 这 种 顺序 性 变化 ， 提 示 A.B、H、Les 抗原 决 。， 82 。 wy 5 | & a pF | "(961 Ieqey BE) IMM By DAA fo MO CHE ORM —K Ty ae zz w HS RYXUMEX SHRM SWW ARM got th wT ‘tH ‘a ‘v Y sI-z7 Gi ond EY AY ASE G8 fo leD-d-9 ee ae I Mee MSH + I ?nd-T-2 TI 2nd-T-2 € y + y pA ae ES os 4) 配 糖 GEE aN, Rem “Le” MR. MAMA LALA (8-D-Gal) 通过 a (1>2) 配 糖 键 连接 一 个 岩 菠 糖 时 ， 则 转化 为 “H” 物 质 。 若 在 上 述 两 位 置 同 时 连接 两 个 岩 菠 糖 时 ， 便 转化 成 “Le"” 物 质 。“H” 物 质 又 链 末 端的 半 乳 糖 通过 o(1>3) 配 糖 键 如 连 接 一 个 乙酰 氨基 半 乳 糖 (a-D-GalNAc-) 则 转化 成 *A” 物 质 ; 如 改 为 连接 一 个 半 乳 糖 ， 则 转化 为 “B” 物 质 。 根 据 上 述 的 血型 抗原 结构 复合 模型 ， 就 可 解释 当 用 酶 逐步 切断 多 糖 链 未 端 时 , 发 生 的 抗原 专 一 性 的 顺序 性 变化 了 。 在 了 解 血 型 物质 的 抗原 结构 以 后 ， 就 可 以 再 回 到 前 面 提 到 过 的 血型 抗原 的 专 一 性 和 决定 得 的 空间 构象 的 关系 问题 。 已 经 知道 ， 多 糖 链 末 端的 N- 乙 酰 -D- 氮 基 半 乳糖 是 A 血型 抗原 的 免疫 优势 基 团 ， 而 多 糖 链 末端 的 双 糖 o-D-GalNAc- (1->3)-Gal 和 三 糖 o- D-GalNAc-(1->3)-5-D-Gal-(1-~>3)-GNAc 对 A 和 抗 A 反 应 系统 的 抑制 能 力 ， 依 次 递增 。 这 从 上 述 的 血型 物质 的 结构 看 来 是 容易 了 解 的 。 可 是 ， 有 人 发 现 一 个 四 糖 (ARz * 血型 抗原 糖 蛋白 上 的 多 糖 链 是 不 均一 的 ,由 于 遗传 组 成 不 同 或 合成 不 完全 以 及 其 他 未 知 的 原因 而 长 短 不 齐 。 此 图 中 只 是 例 举 一 种 可 能 的 构造 。 es。 84 。 0.52)， cx-L-Fuc-1 y SANA is pO Ce ones 含有 一 个 未 端 o-L-Fuc 侧 链 和 上 述 三 糖 相连 。 它 对 A 和 抗 A 反 应 的 抑制 能 力 却 比 此 三 糖 还 要 高 。 这 一 现象 就 有 一 些 费 解 了 。 为 了 解释 这 种 抑制 能 力 增高 的 现象 ， 首 先 可 以 假定 “A?” 血 型 抗原 专 一 性 还 依赖 包括 c-L-Fuc 和 ca-D-GalNAc 的 又 链 决定 簇 。 倘 若 这 一 假定 成 立 ， 则 缺少 末端 的 一 个 ae-D-GalNAec 残 基 的 AR 0.52 低 聚 糖 〈 也 就 是 相 当 于 “H” 物 质 尾 段 的 低 聚 糖 ) 对 A 和 抗 A 反应 系统 也 应 当 表 现 一 定 程度 的 抑制 。 事实 却 并 不 是 这 样 。 显 然 ， 这 一 假定 是 不 能 成 立 的 。 另 一 种 可 能 的 假定 是 L-Fuc 侧 链 本 身 并 不 参与 抗原 决定 往 的 构成 ， 但 此 侧 链 的 存在 能 使 三 糖 保持 一 个 固定 的 构象 ， 而 抗 A 抗 体 的 结合 专 一 性 是 和 此 构象 互补 的 。 这 一 假定 受到 下 述 事 实 的 支持 ， 和 ARrz 0.52 相同 的 构造 , 在 N- 乙 酰 -D- 氮 基 葡 萄 糖 残 基 (8-D-GNAc) 位 置 多 连接 上 第 二 个 Fuc RE, F 了 这 种 构造 的 低 聚 糖 的 抑制 能 力 便 降 低 了 。 从 空间 模型 可 见 ， 第 二 个 岩 菠 糖 残 基 的 存 在 ， 可 能 阻碍 了 为 第 一 个 岩 藻 糖 残 基 所 稳定 的 三 糖 抗 原 决定 往 和 抗 A 抗体 结合 部 位 的 接近 。 因 此 ，A 血型 物质 的 抗原 专 一 性 可 能 依赖 决定 得 的 空间 构象 。 2. 血型 抗原 生物 合成 的 遗传 控制 根据 ABH fl Le 血型 物质 的 化 学 结构 和 抗原 专 一 性 转化 的 分 析 , 提示 各 种 血型 物质 的 生物 合成 是 一 系列 基因 对 共同 的 多 糖 链 前 体 物 按 顺序 作用 的 结果 。 已 知 ABH 和 Le 血型 物质 的 合成 和 分 弯 是 受 三 个 独立 的 基因 A 统 Le\Se、ABO 的 活动 控制 的 。 对 Le, Se\A、B 基因 功能 的 简单 的 解释 是 假定 每 一 个 基因 控制 一 个 专 一 的 糖 基 转 移 酶 的 产生 和 活动 ， 将 一 个 特定 的 糖 按照 一 定 的 连接 方式 ， 加 到 预先 形成 的 多 糖 链 的 末端 ， 或 生成 一 个 又 链 ， 从 而 产生 一 个 新 的 血型 抗原 专 一 性 。 这 种 新 出 现 的 专 一 性 主要 是 由 新 加 上 的 糖 残 基 决 定 的 ， 不 过 在 空间 构象 上 也 可 能 依赖 原先 存在 的 多 糖 链 的 顺序 和 键 的 性 质 。 这 种 8-D-Gal-(1 + 3)-8-D-Gle NAc-1 > 3)-R GDP-Fuc GDP-Fuc HE (RSH Se 基因 和) Mie Le 基因 GDP GDP eins a-L-Fuc H | 2 {3 Le? 人 > 3)-8-D-Gle NAc-(1 一 3)-R 6-D-GaIT> 3)-8-D-GlcNAc-(1 -> 3)-R UDP-GalNAC AEB Le 基因 UDP A 2 \. 8-D-Gal-(1 > 3)-8-D-GleNAc-(1 > 3)-R a@-L-Fuc 1 2 | 1 \ @-D-Gal-(1 ~ 3)-8-D-Gal-(1 > 3)-8-D-GicNAc-(1 > 3)-R a-D-GalNAC-(1 > 3)-8-D-Gal-(1 > 3)-8-D-GicNAc-R 图 2-17 在 专 一 基因 控制 的 糖 基 转 移 酶 的 作用 下 ，A，B，H，Les 和 Le? RERMEWA 成 的 步 又 ( 录 自 Kabat, 1976), * 85 。 新 的 抗原 专 一 性 又 可 能 被 在 另 一 基因 作用 下 新 加 上 去 的 另 一 个 糖 残 基 掩 盖 ， 同 时 出 现 另 一 个 新 的 抗原 专 一 性 。 由 于 一 系列 基因 按照 一 定 的 顺序 性 所 起 的 一 系列 转化 作用 的 结 果 ， 从 共同 的 前 体 物 便 衍 生出 各 种 血型 物质 。 这 些 基 因 的 等 位 基因 le，se fo 是 隐 性 的 ， 缺 少 这 种 转化 能 力 。 从 控制 血型 物质 合成 来 说 ， 可 认为 是 不 活动 的 (Morgan,1960， 1970; Watkin, 1962, 1972), 从 图 2-17 可 见 ， 血 型 抗原 的 共同 多 糖 链 是 由 两 种 类 型 的 低 聚 糖 支 链 联 合 形成 的 又 链 结 构 。1 型 支 链 具 有 :，p-D-Gal-(1~3)-p8-D-GNAc- 的 结构 ; 2 型 支 链 具 有: p-D- Gal-(1->4)-8-D-GNAc- 的 结构 。1 型 和 2 型 支 链 又 是 分 别 通 过 5 (1>3) 和 68(1->6) 配 糖 键 的 方式 和 半 乳 糖 连接 形成 一 个 叉 链 结构 : BD: Gel 9) BESSA eee 5 8-D-Gal-(1>4)-8-D-GNAc 这 一 叉 链 构造 又 和 下 列 低 聚 糖 : B-D-Gal 1 4 eee 6 a-D-GalNAc-Thr 或 Ser 的 GalNAc 直接 连接 ， 从 而 通过 后 者 ， 又 和 多 肽 骨架 上 的 苏 氨 酸 或 丝氨酸 连结 。 KE 就 形成 了 血型 抗原 共有 的 多 糖 又 链 结构 (图 2-14 虚线 框 内 的 结构 ) 。 这 种 血型 抗原 共同 的 叉 链 结构 的 1 型 和 2 型 支 链 决定 簇 可 作为 受 特定 基因 控制 的 糖 基 转 移 酶 的 受 体 ， 在 专 一 酶 的 作用 下 依次 连接 上 适当 的 糖 残 基 ， 从 而 构成 A，B, HA, Le? 血型 物质 的 优势 抗原 决定 往 。 图 2-17 表 示 在 专 一 基因 控制 的 糖 基 转 移 酶 的 作用 下 ,人 A、 B,H, Le file’ 决定 簇 的 生物 合成 步 又。 图 中 所 示 的 受 体 是 以 8 (1-~>3) 方式 连接 的 1 型 支 链 。2 型 支 链 上 再 ,A,B 决定 簇 的 合成 大 体 上 亦 复 如 此 。 唯一 的 区 别 是 在 Le 决定 RICKI, FIA EI Ae BES 2 型 支 链 的 GNAce 的 第 3 碳 原 子 上 ,而 不 是 象 在 第 1 支 链 是 连接 在 第 4 碳 原 子 上 。 因 此 ， 应 当 有 另 一 个 新 的 基因 参与 作用 ， 有 关 的 血 清 学 专 一 性 尚未 鉴别 出 来 。 最 后 ， 还 要 提 到 AB 血型 ，A、B 基因 都 同时 存在 。 有 人 假定 它们 各 自决 定 的 两 种 酶 ， 可 能 竞争 共同 的 多 糖 链 ， 结 果 在 同一 分 子 上 同时 形成 A 和 B 的 抗原 决定 簇 。 至 于 各 型 红血球 表面 的 抗原 结构 将 留待 第 四 章 中 讨论 。 这 里 顺便 还 要 提 到 的 是 对 于 血型 抗原 的 结构 及 其 合成 的 遗传 控制 的 阐明 ， 提 供 了 改变 红血球 血型 的 可 能 性 。 目 前 已 有 人 利用 BARKS AW ac-D- 半 乳糖 基 转 移 酶 处 理 人 O 型 红血球 ,在 酶 的 专 一 作用 下 能 使 9 型 红血球 转化 为 有 了 吾 型 抗原 活力 的 红血球 (Kogure 和 Furukawa, 1976). (四 ) 异 嗜 性 抗原 彼此 无 血缘 关系 的 动物 、 微 生物 的 细胞 和 体液 内 ， 存 在 一 类 抗原 ， 它 们 的 抗原 性 很 相近 ， 以 致 其 中 任 一 种 抗原 的 抗体 能 对 这 一 类 的 其 它 抗 原 起 强烈 的 交叉 反应 。 这 一 类 抗 » 86 。 原 总 称 为 异 嗜 性 抗原 (Heterophii antigen) 。 最 著名 的 例子 是 Forssman 抗原 ， 它 存 在 于 许多 种 动物 红血球 和 其 他 组 织 细胞 内 ， 以 及 某 些 细菌 , RRA. AAG 寒 的 某 些 菌 株 ( 可 能 为 细胞 壁 成 分 ) 。 另 一 方面 ， 不 含 Forssman 抗原 的 动物 (如 人 、 大 饼 、 免 ) 的 体液 内 存在 异 嗜 性 抗体 ， 能 使 含 Forssman 抗原 的 动物 (绵羊 、 马 、 豚 鼠 ) 的 红 血球 凝集 。 各 种 Forssman 抗原 有 相似 的 决定 簇 ， 可 能 为 一 个 脂 多 糖 复合 物 , 并 和 一 个 蛋白 质 松散 地 结合 。 脂 多 糖 部 分 能 起 半 抗 原 的 作用 ， 称 为 Forssman 半 抗 原 。 近年 来 ， 从 大 量 羊 红 血球 分 离 出 经 硅胶 薄板 层 析 鉴 定 为 高 度 纯 化 的 Forssman 半 抗 原 。 其 化 学 性 质 为 一 种 脂 多 糖 ， 其 糖 部 分 含有 半 乳 糖 、 葡 萄 糖 和 氨基 半 乳 糖 (2:1:1)。 类 虽 部 分 含有 双 氢 鞘 氨 醇 (Dihydrosphingosine) 、 神 经 酸 (Nervonic acid) 、 士 四 烷 酸 (Lignoceric acid) 和 山区 酸 (Behenic acid) (Mallete 和 Rush，1972) 。 最 近 ， Fraser 和 Mallete 改进 了 提取 和 分 离 方 法 ， 进 一 步 证 明 羊 红 血球 Forssman 半 抗 原 的 多 糖 部 分 的 构造 为 ， N- 乙 酰 氨基 半 乳 糖 一 (cl1-~3) 一 N- 乙 酰 - 氮 基 半 乳 糖 一 (51-~3) 一 半 乳 糖 一 (al 一 4) 一 半 乳 糖 一 (51 — 4) 一 葡萄糖 一 (81 > 1) 脑 脂 胺 (Ceramides) (A 2-18), 其 类 脂 部 分 的 组 成 仍 和 从 前 报告 的 相似 (Fraser 和 Mallette, 1973, 1974; Ziolkowski 等 ，1975) 。 OH NHCOCH; HO OH HOCH, CH,OH OH oO CH,OH OH CH;CONH ` 一 O OH 15 Q ae NHCR pote etre HOB H H Po bee sont 2-18 羊 红血球 Forssman 半 抗 原 的 构造 。R = CH 一 (lignoceric acid), CH;(CH,), C=C (CH,) 3— 神经 酸 ; 或 CaH4 一 wat Fraser 和 Mallette, 1974), 某 些 细菌 的 异 嗜 性 抗原 和 人 类 血型 物质 有 共同 的 抗原 性 。 如 前 述 ， 沙 门 氏 菌 “U? 族 ， 以 及 大 肠 杆 菌 (086) 的 “9” 抗 原 能 和 血型 物质 “B” 有 交叉 反应 ; 抗 痢疾 杆菌 的 山羊 抗 血 清和 血型 物质 “ 责 ” 有 交叉 反应 ; 肺炎 球菌 XIV 型 的 荚 膜 多 糖 和 血型 物质 “A” 或 其 它 血 型 物质 降解 产物 有 交叉 反应 ， 如 此 等 等 。 有 人 根据 这 些 事实 来 解释 人 类 血清 中 天 然 同族 凝集 素 (Isoagglutinin) 的 起 源 ， 假 定 它们 是 在 婴儿 期 肠 道 或 呼吸 道 受 带 有 人 A、B 血型 抗原 专 一 性 的 细菌 刺激 而 产生 的 无 耐 受 性 的 抗体 (如 血型 A 的 人 产生 抗 B 抗体 ， 如 此 等 等 ) 。 在 无 菌 动物 (小 鸡 . 小 猪 ) 上 的 实验 似乎 也 支持 这 一 假定 。 正 常 带 菌 的 小 鸡 和 小 猪 很 早 就 能 产生 抗 B， 而 无 菌 动物 则 不 能 。 然 后 ， 若 对 无 菌 动物 喂 大 肠 杆 菌 (086) (i 5 87 & 型 B 抗原 专 一 性 的 异 嗜 性 抗原 )， 很 快 就 产生 抗 妃 抗体 ， 并 且 这 种 异 嗜 性 抗体 存在 于 血 清 的 巨 球 蛋白 (19 S) 部 分 ,与 正常 红血球 凝集 素 相 同 。 除去 理论 上 的 兴趣 以 外 ， 腊 嗜 性 抗原 系统 在 医学 实践 上 也 有 其 重要 性 。 因 为 ， 一 方 面 它 们 可 能 混淆 某 些 血清 学 诊断 ; 另 一 方面 ， 在 某 些 情形 下 又 可 能 有 助 于 鉴别 诊断 。 后 一 情形 的 例子 ， 如 伤寒 的 Weil-Felix 反应 (B. proteus 凝集 反应 ); 原 发 性 非典 型 肺 REE MG 菌株 的 凝集 反应 ; 以 及 传染 性 单 核 球 增 多 症 的 Paul-Bunnell 反应 ,在 这 种 病人 能 产生 和 羊 红 血球 的 耐 热 性 抗原 (和 和 牛 的 细胞 ， 而 不 和 豚鼠 肾脏 细胞 共有 的 一 种 Forssman 抗原 ) 反应 的 抗体 。 这 些 反 应 对 于 上 述 疾病 的 鉴别 诊断 是 有 价值 的 。 BE BE -+ oo 类 脂 分 子 由 于 分 子 量 小 ,无 固定 的 构 型 ,免疫 原 性 弱 。 另 一 方面 ， 它 们 易 被 体内 其 他 物质 吸附 而 起 半 抗 原 的 作用 。 上述 Forssman 半 抗 原 就 是 一 个 著名 的 例子 。 目前 还 没 有 任何 纯化 的 类 脂 物 疲 证 明 单 独 具 有 免疫 原 性 。 虽 然 从 M. pneumonia 提纯 的 一 种 糖 类 脂 能 表现 很 弱 的 免疫 原 性 (Razin 等 ，1970) ， 一 般 说 来 ， 类 脂 物 必须 加 载体 蛋白 质 ， 合成 多 肽 或 与 红血球 结合 后 ， 才 能 引起 对 类 脂 物 的 抗体 。 不 过 ,临床 上 也 有 人 报告 , 某 些 中 枢 神 经 系统 疾患 的 病人 血清 中 存在 天 然 的 抗 神经 节 背 脂 的 抗体 。 研究 最 多 的 类 脂 半 抗原 是 心脏 类 脂 〈Cardiolipin) 。 梅 毒 病 人 产生 的 抗体 ， 在 一 定 条 件 下 能 和 心脏 类 脂 起 专 一 反应 ,可 作为 梅毒 血清 学 检定 的 方法 ， 称 为 WasseriImann 反 应 。 心脏 类 脂 在 许多 动 、. 植 物 组 织 内 都 有 存在 , 通常 是 从 牛 心 提 取 的 。 其 基本 化 学 构造 是 三 个 甘 铀 分 子 和 两 个 磷酸 二 酯 相连 而 成 。 甘 油 的 产 基 可 能 被 不 饱和 脂肪 酸 CR) 酯 化 : CH,—OR mets O- CH,—o = 二 GT Cita $ woo oo oe, ate —O —CH, : Heo ber OR 另 一 类 重要 的 类 脂 半 抗原 是 细胞 类 脂 〈Cytolipin DH, CHRMARR MMM — AAS, ARAMA MED: CH,—(CH,) ;,—CH—CH—CH (OH) —CH (NH,)—CH,0H 其 氨基 和 脂肪 酸 相 连 ， 而 末端 的 羟基 可 被 单 糖 或 双 糖 (乳糖 ) 取代 ， 糖 残 基 决 定 其 半 抗 原 专 一 性 。 类 脂 物 由 于 在 水 中 的 溶解 度 很 有 限 ， 因 而 在 测试 其 半 抗 原 活 力 的 系统 中 ， 除 非 加 其 他 辅助 的 类 脂 物 ( 如 卵 磷 脂 . 胆 固 醇 ) 使 其 乳化 ， 否 则 无 活力 。 在 这 种 条 件 下 ， 才 能 产生 絮 状 反应 或 补体 结合 反应 。 据 对 许多 类 脂 半 抗原 系统 的 研究 结果 ， 补 体 固 定 反应 较 其 他 方法 更 好 。 因 此 ， 这 也 就 是 Wassermann 反应 采用 的 方法 。 es 88 。 @, #.ok-8 多 糖 和 含 多 糖 抗原 专著 和 综述 Boyd, W. C. (1962). Introduction to immunochemical specificity, Intersciences. Kabat, E. A, (1976). Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd. ed., Holt, Rinehart and Winston. Kabat, E. A. and Mayer, M. M. (1961). Experimental Immunochemistry, 2nd ed., Charles, C Thomas. Sprinfield, [linois. Hakomori, 8. I, and Kobata, A. (1974). Blood Group Antigens. In; ‘‘The Antigens,’’ Vol. II., p, 79, Academie Press. Morgan, W. T. T. (1960). Croonian lecture: A contribution to human biochemical] genetics, the chemical basis of blood group specificity. Proce, Rey. Soc. B 151, 308. Liideritz, O., Saub, A. M. and Westphal, O. (1966). Immunochemistry of O and RK antigens of Sal- monella and related enterobacteriaceae. Bact. Rev. 30, 192. Liideritz, O., et al. (1973). Lipid A: Chemical structure and biological activity. In: ‘‘ Bacterial Lipo- polysaccharides,’’ Kass. E. H. & Wolff, S. M. ed., Chicago University Press. Pardoe, G. I (1971). Genetics and immunochemistry of blood group antigens. 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Immunochemistry 12, 297. a 第 三 章 BR RB 核酸 是 荷载 遗传 信息 的 大 分 子 。 核 酸 结 构 和 功能 的 研究 已 经 相当 广泛 深信。 但 是 ,其 免疫 学 方面 的 研究 , 直到 最 近 几 年 才 取得 较 大 的 进展 。 核 酸 抗原 性 研究 的 困难 , 首先 在 于 分 离 和 纯化 ,很 难 完全 去 除 蛋白 质 和 多 糖 的 混杂 。 其 次 ,核酸 分 子 的 电荷 密度 高 ， 容 易 与 蛋白 质 相互 作用 产生 非 专 一 的 反应 。 此 外 , 核酸 的 化 学 结构 ( 核 背 酸 排列 顺序 ) 和 空间 梅 象 的 研究 比 蛋 白质 发 展 迟 ,也 是 重要 的 原因 。 DNA 分 子 是 由 两 条 多 核 苷 酸 链 ， 互 相 盘 绕 形 成 的 一 个 双 螺 旋 构 造 。 每 一 条 多 核 背 酸 链 是 一 条 很 长 的 多 聚 脱氧 核糖 磷酸 骨架 ， 其 上 有 四 种 碱 基 (A、T、G、C) 通过 脱氧 核糖 而 与 磷酸 基 团 连接 。 碱 基 排 列 顺序 决定 遗传 信息 。 双 螺旋 的 两 条 链 间 存在 一 条 大 槽 和 小 槽 。 碱 基 朝 向 螺旋 的 中 心 ， 埋 于 槽 内 ， 而 负电 性 强 的 磷酸 二 酯 骨架 则 朝向 外 方 。 螺 旋 构 象 主要 是 靠 碱 基 堆 集 的 疏水 力 和 碱 基 对 之 间 的 氢 键 维持 稳定 的 (A 3-1). DNA 的 抗原 性 和 这 种 结构 特点 有 密切 的 关系 。 RNA 分 子 含 有 核糖 和 四 种 碱 基 (A,U,G,C)。RNA 的 二 级 结构 没有 DNA 研究 得 那样 清楚 。 有 三 类 RNA， 即 核糖 核 蛋白 体 RNA (rRNA)， 信 使 RNA (mRNA) 和 转移 RNA (tRNA)， 可 能 各 不 相同 。rRNA 和 某 些 病毒 的 RNA 分 子 也 可 能 含有 不 完 全 的 双 螺 旋 区 域 ( 图 3-2) 。 最 近 ， 对 已 知 碱 基 排列 顺序 的 tRNA WX HATHA 果 表 明 ， 不 但 存在 双 螺 旋 结 构 ， 而 且 有 固定 的 空间 构象 (图 3-3) (Robertus 等 ,1974) 。 经 过 近 廿 年 的 研究 ,核酸 具有 抗原 性 和 免疫 原 性 已 是 肯定 无 疑 的 了 。 天 然 的 抗 DNA 抗体 ， 最 先是 1957 年 在 一 种 自体 免疫 病 一 一 全 身 性 红斑 狼疮 (SLE) 病人 血清 中 发 现 的 。 后 来 ， 用 实验 方法 也 能 在 几 种 实验 动物 上 引起 抗 DNA 抗体 。 一 般 说 来 ， 不 论 用 什 3-1 (fz) Watson 和 Crick 设计 的 DNA 分 子 模 型 图 。 二 条 带 表 示 磷酸 糖 链 , 槛 棍 表 示 连 搂 两 条 链 的 碱 基 对 。( 右 ) DNA RRA, ie 线 表示 连接 碱 基 的 氢 键 。 * 90 « 图 3-2 RNA 的 三 级 结构 。( 右 ) 表 示 在 一 条 多 核 昔 酸 链 中 有 好 几 个 螺旋 区 ( 据 Spirin，1963)。 《 左 ) 示 它 具 有 互补 的 碱 基 配 对 的 螺旋 区 。X 处 表示 螺旋 的 突 环 部 分 ( 据 Fresco, 1963), 加 强 的 D 螺旋 f D + 37 34 14 33 [ ey 15 \| \) \ aa $F 26 | DZ \ 31 > L cS Gio 92 5 is 「 65 491 a Os} Ales ‘stan ih Gis ea TYC 于 SET ae | 46 i parale | tw Se ~ 53 a 外 加 环 这。 ¢ 人 Sof7 /一 / \ yf 1%C 环 a fn 18 A ID 图 3-3 酵母 (RNAP 的 立体 结构 简 图 。 粗 线 代表 核糖 磷酸 骨架 , 细 线 代表 双 链 区 域 的 配对 碱 基 。 (a. ap )RRBF (a. c 干 ) 反 密码 子 干 ( 据 Robertus 等 ,1974)。 么 免疫 原 , 诱 导出 来 的 抗 DNA 抗体 都 和 变性 DNA ( 单 链 ) 的 反应 强 。 仅 和 天 然 DNA 反应 的 抗体 ， 迄 今 为 止 只 有 在 一 些 SLBE 病人 血清 中 ， 以 及 NZB /到 小 鼠 类 似 SLZE 病 的 血清 中 发 现 过 〈Avara 和 Seligman, 1966; Povrenny 等 ，1966) 。 试图 用 实验 方法 得 到 抗 天 然 DNA 抗体 的 实验 ， 至 今 都 未 成 功 (Stollar, 1970, 1973; Tan J Natali, 1i970) 。 这 可 能 是 和 上 述 的 DNA 结构 特点 有 关 。 天 然 DNA 分 子 中 ， 碱 基 位 于 双 螺 旋 的 沟 槽 内 ， 不 能 和 抗体 发 生 结 合 反 应 ， 因 为 抗体 的 结合 位 点 也 是 一 条 沟 槽 ， 只 能 识别 分 子 的 突出 部 分 。 只 有 当 变 性 时 ， 碱 基 才 能 朝向 水 溶液 ， 呈 现 出 有 效 的 决定 敌 ( 图 3-8) 。 另 2 QL e 一 方面 ， 双 链 RNA 抗体 不 但 天 然 就 存在 着 ， 而 且 很 容易 用 实验 方法 产生 (Stollar， 1970) 。 近 来 用 各 种 合成 的 多 核 背 酸 链 作 免疫 原 研 究 的 结果 , 发 现 核酸 的 抗原 专 一 性 主要 依赖 空间 构象 ， 特 别 是 二 级 结构 。 一 级 结构 与 抗原 性 也 有 些 关系 ， 但 不 那么 严格 。 关于 核酸 抗原 性 研究 进展 情况 ， 可 参看 下 列 专 著 和 综述 : Levine 和 Van Vunakis (1967), Levine 和 Stollar (1968), Plesia 和 Braun (1967), Stollar (1973) 。 一 、 天 然 的 抗 DNA 抗体 (一 ) SLE 血清 中 抗 DNA 抗体 存在 的 证 明 1957 年 几 个 实验 室 用 不 同 的 方法 (沉淀 反应 .被动 血 凝 反 应 和 补体 固定 反应 ) 差不多 同时 发 现 ， 一 种 自体 免疫 病 一 一 全 身 性 红斑 狼疮 (Systemic Lupus Erythematosus, 简称 SLE) 病人 血清 中 存在 天 然 的 抗 DNA 抗体 (Seligman, 1957; Miescher 4, 1957; Robbins 等 ，1957) 。 SLE 血清 和 DNA 反应 是 专 一 的 免疫 学 反应 的 证 据 : 1) 抗原 纯度 ”加 和 反应 系统 的 抗原 为 纯 的 DNA; 2) 对 酶 解 的 易 感 性 ， 抗 原 经 DNA 酶 处 理 失 去 免疫 学 活性 ，RNA ee 则 无 影响 ; 3) 免疫 复合 物 中 DNA 的 回收 ”从 反应 系 绕 产 生 的 免疫 复合 物 沉淀 中 , 能 全 部 回收 所 加 入 的 DNA; 4) 反应 条 件 “ 核 酸 和 正常 或 SLE 血清 间 的 非 专 一 反应 只 在 低 p 联 区 域 发 生 ， 而 不 fe > pH7.4 区 域 发 生 ， 而 SLE 血清 和 DNA 的 反应 是 在 p 也 7.4 KH; 5) 剂量 反应 曲线 特性 ”对 于 非 专 一 反应 ， 在 DNA 过 量 时 ,不 存在 抑制 沉淀 形成 现 象 ， 而 在 SLE 血清 和 DNA 反应 系统 ， 则 表现 出 典型 的 抗体 抗原 反应 的 剂量 曲线 的 特 点 ， 即 存在 明显 的 抗体 过 剩 抑 制 区 .平衡 区 和 抗原 过 剩 抑制 区 (参看 第 十 一 章 ,289 页 ); 6) 从 免疫 复合 物 中 分 离 出 抗体 ”最 后 也 是 最 重要 的 证 据 是 能 从 SLBEE 血 清和 DNA 形成 的 复合 物 中 ， 分 离 出 保持 抗 DNA 抗体 活力 的 Y- 球 蛋白 ， 并 经 抗 -Y- 球 蛋白 抗体 鉴 定 为 免疫 球 蛋 白 。 后 来 ， 还 进一步 证 明 DNA 是 和 免疫 球 蛋 白 的 Fab， 而 不 是 和 了 ec- 片 段 起 反应 的 (Pincus 和 Kaplan, 1970), 所 以 ，SL 了 血清 中 确实 存在 真正 的 扩 DNA tif, 并且 DNA MSLE 血清 的 反应 是 专 一 的 免疫 学 反应 。 (二 ) SLE 血清 中 抗 DNA 抗体 的 多 样 性 SLE 血 铺 中 的 抗体 是 非常 复杂 的 ， 除 去 存在 抗 天 然 DNA 和 变性 DNA 抗体 外 ， 还 可 能 存在 单 链 和 双 链 RNA 以 及 核 蛋 白 的 抗体 。 多 数 SLBE 血清 主要 和 变性 DNA， 或 同 时 和 天 然 DNA 起 反应 。 极 少数 SL 了 血清 主要 和 天 然 DNA 起 反应 (图 3-4) 。 ° 92 « 人 ie, , BE tier /350) 100+ b GB(1/200) 100- ¢ ©A-N.(1/250) 75 50 25 0.05 0.10 0.1 0.2 0.05 0.10 100Fd = #581 /600) 100F e Em(1/500) 75 50 25 0.05 0.10 0.05 0.10 微克 DNA 图 3-4 SLE 血清 与 天 然 的 (o ) 和 变性 的 (@) 小 牛 胸腺 DNA 之 补体 固定 反应 ( 据 Levine 和 Stollar，1968)。 (=) DNA 抗原 决定 徐 的 大 小 利用 长 度 不 同 的 寡 聚 核 背 酸 ， 对 SLBE 抗体 和 DNA 反应 系统 的 抑制 实验 证 明 5 HR 胸腺 喀 啶 核 昔 酸 能 产生 最 大 的 抑制 (图 3-5) 。 因此 ，DNA 抗原 决定 答 的 大 小 约 相当 于 4 一 5 核 背 酸 单 位 。 这 和 其 他 几 类 抗原 决定 簇 的 大 小 是 相近 的 ( 表 3-1) 。 R31 几 种 抗原 结合 位 点 (决定 徐 ) 的 估 测 大 小 i BR 结合 部 位 的 组 成 “| 大 小 (Ai fh 据 KR Pressman 和 Grossberg (1968) 半 抗 原 | 一 个 简单 有 机 分 子 | 5 一 15 补体 固定 抑制 % Cebra (1961); BAR| 5 一 12 个 氨基 酸 残 基 | 25-45 | Kabat (1966) Goodman (1969) 合成 多 驮 | 4 一 9 个 氨基 酸 残 基 20—35 Sela (1970) 图 3-5 SLE 血清 (mm.) 和 Bb. natto 变 性 DNA 反应 系统 中 ,增加 单 核 苷 酸 (一 一 )， 一 -———_—_————— 2 RRR (4), 3 RERER(O), 4K 核 mB | 4—S wale ReH | 15—20 | Stollar (1962) HRECO), S RRMA) CRA (OD, TRB ROXOON RE R dill ($B Stollar 451962), Zz Bi 6 单 糖 残 基 35 Kabat (1966) RE REA FEMME PT ES HEARS He, RANSAMRRMA (Stollar 等 ， 1962; Stollar 和 Levine, 1963), e O23 « 二 、 实 验方 法 产生 的 抗 核 酸 抗 体 这 方面 的 研究 主要 是 分 两 方面 进行 的 ; 1) 利用 纯化 的 天 然 DNA 或 RNA 大 分 子 作 RRs 2) 利用 单 核 背 、 单 核 苷 酸 或 低 聚 核 苷 酸 ( 作 半 抗 原 ) 和 载体 蛋白 质 (或 人 工 合成 多 肽 ) 结 合 , 作为 免疫 原 。 现 分 述 如 下 : (—) 高 分 子 量 核酸 的 免疫 由 于 前 面 提 到 过 的 困难 ， 用 提取 的 DNA 大 分 子 作 免疫 原 ， 在 动物 上 诱导 抗体 的 早 期 工作 进行 得 不 顺利 ,结果 也 很 紊乱 。 提 纯 的 天 然 的 或 变性 的 DNA， 提 纯 的 RNA 单独 都 不 能 引起 抗体 。 可 是 ， 破 碎 的 T- 偶 数 大 肠 杆菌 噬菌体 (含有 50% DNA EAM, 或 核糖 核 蛋白 体 却 表现 很 强 的 免疫 原 性 。 因 此 ， 这 似乎 提示 核酸 需要 和 蛋白质 络 合 后 才 能 引起 抗体 。 由 于 这 种 启发 ， 有 人 用 带 正 电 荷 的 甲 基 化 牛 血清 白 蛋白 (简称 MBSA) 与 单 链 DNA 络 合作 为 免疫 原 ， 结 果 能 在 动物 上 引起 很 强 的 抗 DNA 抗体 (Plescia 等 ， t964，1965) 。 人 工 合成 的 多 核 苷 酸 和 MBSA 络 合 也 有 免疫 原 性 (Seaman 等 ,1965) 。 实验 方法 上 的 这 种 改进 ， 打 破 了 核酸 抗原 性 研究 初期 的 困难 局 面 ， 从 而 有 可 能 比较 深信 地 研究 抗体 专 一 性 问题 。 1. DNA 抗体 的 血清 学 专 一 性 IT- 偶数 大 肠 杆菌 只 菌 体 DNA， 含 有 独特 的 碱 基 一 一 葡萄 糖 基 产 甲 基 胞 啼 啶 (Gly- 1007 4 E. coli DNA cosyl qdHMP)， 免 疫 家 免 时 得 到 的 抗 DNA 抗体 具有 高 度 的 物种 专 一 性 。 根 据 对 动 植物 和 微生物 中 提取 的 38 个 DNA 样品 研究 的 结果 ， 只 有 了 T:，T4、Te 大 肠 杆 著 噬 菌 体 的 DNA 才能 与 抗 Ti-DNA 抗 血清 起 反 应 (Murakami 等 ，1962) 。 半 抗 原 抑 制 实验 也 证 明 糖 或 dHMP 2 T- BMA AMA DNA 抗原 决 Fe BRAY 2 BK BR 没有 特异 碱 基 的 DNA 产生 的 抗体 的 专 一 性 就 很 低 了 。 如 大 肠 杆 菌 (Escheyrichia coli) DNA 和 MBSA oO eae nan” 络 合 物 免疫 家 免得 到 的 抗 血 清和 许多 种 DNA 发 生 图 3-6 ti E. coli DNA 抗体 和 几 种 变性 “广泛 的 交叉 反应 (图 3-6)。 用 小 牛 胸腺 DNA Jn Cr ene. re a BAA: MBSA, 产生 的 抗 血清 也 是 这 样 (Plescia 等 ,1964)。 (4) Ab.b,; (A) B. subtilis; (@) Haemophilus influenzae; 2.% RNA 抗体 的 血清 学 专 一 性 ( 口 ) Pseudomonas aeruginosa; ( 据 Levine 和 Stollar, 1968), 和 RNA 反应 的 抗 血清 可 以 用 多 种 方法 制备 。 从 细菌 或 哺乳 类 细胞 分 离 的 核糖 核 蛋 白 体 (Barbu 和 Panijel, 1960; Lacour 等 ,1962)， tRNA 和 MBSA 的 络 合 物 (Plescia 等 ，1965) 以 及 和 和 蛋白质 或 合成 多 肽 的 共 价 结 合 物 (Bonavida 等 ，1970) 作为 免疫 原 都 能 有 效 地 诱导 出 能 和 RNA 反应 的 抗体 。 单 © G4 e 补体 固定 92 用 tRNA (无 蛋白 质 载 体 ) 免疫 时 产生 的 抗体 只 能 和 tRNA HAST RRM, 而 不 能 和 完整 的 分 子 反 应 〈(Herandez 等 ，1968) 。 各 种 来 源 的 核糖 核 蛋白 体 产生 的 抗体 的 专 一 性 都 很 低 ， 不 但 能 和 多 种 来 源 的 RNA 反应 ， 而 且 还 能 与 合成 的 多 核 苷 酸 (PolyA, PolyU, PolyC) 起 沉淀 反应 。 如 用 细菌 核糖 核 蛋白 体 免疫 家 免得 到 的 抗 RNA 抗 血清 ， 也 表现 出 广泛 的 专 一 性 ， 能 和 腹水 瘤 细 Hl.) BF. AK ERR. ABA RU RB SSA RNA 起 反应 (Lacour 等 ，1962) 。 核 糖 核 蛋白 体 的 马 抗 血清 能 和 mRNA，rRNA， 和 tRNA 反应 ， 也 能 沉淀 PolyA, PolyU (Nahon 等 ，1965) 。 有 人 进一步 研究 了 抗 P. vulgaris 的 70S 核糖 核 蛋白 的 马 抗体 的 血清 学 专 一 性 (Panijel 等 ，1966) 。 用 PolyA 沉淀 后 ， 分 离 纯化 得 到 的 抗 RNA 抗体 ,在 无 电解 质 或 低 离 子 强度 溶液 内 的 沉淀 反应 实验 证 明 ， 这 种 抗 RNA 抗体 的 专 一 性 主要 是 针对 磷酸 二 酯 骨架 ， 而 没有 或 很 少 有 对 碱 基 的 专 一 性 。 因 此 ， 当 改变 多 核 昔 酸 而 改变 骨架 的 构象 时 ， 大 分 子 的 血清 学 专 一 性 也 会 发 生 改 变 。 另 一 方面 ， 多 聚 核糖 核 背 酸 的 抗体 则 不 同 ， 其 专 一 性 主要 是 针对 碱 基 而 不 是 磷酸 二 酯 骨架 ， 并 能 和 DNA 交叉 反应 。 (=) 含 核酸 组 成 成 分 或 寡 聚 核 背 酸 结合 物 的 免疫 1. 碱 基 专 一 抗体 的 制备 单 核 背 、 单 核 苷 酸 或 寡 聚 核 苷 酸 作 半 抗原 能 和 载体 蛋白 质 ( 或 多 肽 ) 形成 共 价 结合 物 。 REBAR Ara (Erlanger 和 Beiser, 1964): pH9-9.5[R'NH, o—————_ O a3! H NaBH, ) a H P—C—cC—OH HC—C—CH,OR <— p—C—C—OH HO—C—C—CH,OR | ied | | N | ms | | R’ R 稳定 酸 内 不 稳定 OH R=H X — ec { SoH R= RECA 6- 氮 基 ]) 用 这 样 的 方法 合成 的 味 叭 或 喀 啶 蛋白 质 结合 物 免疫 动物 时 能 产生 碱 基 专 一 的 抗 体 ， 并 能 和 多 种 变性 DNA 反应 。 核 若 酸 多 肽 结合 物 还 可 以 用 碳化 二 亚 胺 法 将 一 定 的 核 苷 -5- 羧 酸 连结 到 人 工 合 成 的 又 链 多 聚 氨 基 酸 上 得 到 。 这 些 结合 物 免 疫 家 免 可 得 到 抗 尿 喀 啶 核 昔 酸 ， 抗 脱氧 尿 喀 啶 核 苷 酸 ， 抗 物 腺 喀 啶 核 昔 酸 ， 抗 胞 旷 啶 核 苷 酸 和 抗 腺 味 叭 核 苷 酸 的 抗体 (Sela S, 1964; Unger-Waron 等 ，1967) 。 同样 地 ， 还 可 以 把 寡 聚 核 苷 酸 和 HSA, BGG, 以 及 多 聚 赖 ° 95 + AMER. 这 些 结合 物产 生 的 抗体 ， 专 一 性 针对 相应 的 半 抗 原 ， 其 中 一 些 抗体 还 能 和 DNA 发 生 广 泛 的 交叉 反应 。 2. 碱 基 顺 序 专 一 性 抗体 以 二 聚 或 寡 聚 核 背 酸 作 半 抗 原 能 不 能 产生 具有 了 碱 基 顺序 专 一 性 的 抗体 呢 ? 这 是 一 个 在 核酸 结构 和 功能 研究 上 可 能 有 重要 的 应 用 潜力 ， 而 又 难于 解决 的 问题 。 早 期 对 一 系列 二 核 背 酸 -蛋白 质 结 合 物 (ApC-, ApA-, CpA-, ApU 和 UpA- 蛋 白质) 研究 的 结果 ， 发 现 抗 体 专 一 性 主要 是 针对 内 侧 ( 即 和 蛋白质 相 连 的 ) RE, Wh CPA-= 和 蛋白 质 抗 体能 和 PolyA RW, ti ApC- 蛋 白质 抗体 则 不 能 和 PolyA 反应 (Beiser 和 - Erlanger, 1966) 。 后 来 对 到 叭 - 嘎 叭 二 核 背 酸 的 研究 也 得 到 类 似 的 结果 ， 抗 体 对 这 两 个 碱 基 都 能 识 别 ， 不 过 专 一 性 主要 是 由 内 侧 碱 基 决 定 的 (Wallace 等 ，1971; Bonavida, 1972b) it 外 ， 两 种 三 核 苷 酸 蛋 白 结合 物 (ApApU-BSA 和 ApApC-BSA)， 抗 体 专 一 性 也 主要 是 由 内 侧 碱 基 决 定 的 。 这 些 抗 三 核 背 酸 抗体 和 变性 DNA 无 交叉 反应 (Bonavida 等 ， 1972b) 。 对 另 一 系统 ， 即 碱 基 通 过 光 氧 化 岛 味 叭 残 基 和 蛋白质 结合 ， 如 蛋白 质 -G( 和 氧化 ) pA-3' -OO 了， 抗体 的 专 一 性 则 是 针对 末端 游离 的 核 背 酸 之 -3 -OH 面 的 构造 。 这 种 抗体 也 不 能 和 变性 DNA 反应 (Van Vunaki 等 ,1968) 。 近 来 ,用 不 同 的 方法 对 几 种 三 联 密码 的 抗 体 的 碱 基 顺 序 专 一 性 的 分 析 ， 证 明 抗 ApApA 抗体 只 和 原来 的 半 抗 原 (ApApA) 专 一 地 反应 , 而 一 点 也 不 和 人 A，ApA 结合 。 这 种 高 度 的 专 一 性 可 能 反映 了 抗体 是 和 ApApA 独特 的 空间 构象 互补 。 利 用 放射 免疫 法 也 证 明 抗 ApUpG 抗体 对 ApUpG 顺序 有 高 度 专 一 人 性。 在 用 沉淀 反应 分 析 时 , 抗 APAPC- 和 搞 ApUpG 抗体 , 虽 能 识别 整个 三 核 苷 酸 顺序 ， 但 也 能 和 紧邻 载体 蛋白 的 碱 基 成 分 起 交叉 反应 (D’ Alisa 和 Erlanger， 1974). 另 一 实验 室 的 工作 也 证 实 抗 双核 背 酸 和 抗 三 核 背 酸 的 抗体 具有 高 度 的 顺序 专 一 性 (Khan 和 Jacob, 1977; Khan &, 1977). FAS PAE EN AR A EK RK 抑制 SH-dpApTpA 和 抗体 的 结合 ， 结 果 发 现 半 抗原 dpApTPA 本 身 对 这 一 反应 系统 的 抑制 最 强 。 pik KR dpApApTpA (其 构造 中 包含 有 dpApTpA 顺序 ) WARE 史 ao ow) Aa oe 力 有 所 减弱 ， 这 可 能 是 由 于 蓉 加 的 一 个 单 核 isl ty CRA "EPR 2S A RS RE aE ATE. HRT 3-7 SAP EBU RRB R dpApApT, dpApT 和 dpTpA 的 反应 非 *H-dpApTpA-fi dpApTpA 结合 的 抑制 。 常 弱 , 而 去 磷酸 的 二 核 苷 酸 dApT 则 不 起 反 Cd Conn) deere 应 (图 3-7)。 Se 9-2 TR (—a—); dpTpA; (—a—) dApT, MRK ARM *H-dpApTPA- 抗 体 和 *H- dpApApT- 抗 体系 统 的 抑制 作用 。 参 与 这 两 个 三 核 苷 酸 组 成 的 dpT、dpA、dpApT 和 dpTPA 对 抗体 的 亲 合 力 很 低 ， 表 明 抗 体 专 一 性 可 能 是 和 整个 三 核 苷 酸 分 子 互补 。 BR WR dpTpT, dpTpC, dpApG, dpTpTpT 对 *H-dpApTpA 和 抗体 的 抑制 作用 很 es。 96 。 100 80 20 232 SHSRERBARRAERA 'H-dpApTPA- 抗 体 和 "HH-dpApApT- 抗 体系 统 的 抑制 50% 抑制 所 需 的 浓度 CM) © No m 制 DB Hi-dpApTpA 抗 体 抗 -dpApApT 抗 体 1 dpApTpA 2.0% 10-° 2.505¢10 2 dpApApT 3.33% 10-4 2.70% 10-7 3 dpApApTpA 3.70% 10-* 33a 10 4 dpTpTpT 3.33%10-° 2.80% 10° 5 dpApT 1.80% 10-° 1.50%10-> 6 dpTpA 6.7010 3.33X104¢ 7 dpApG 3.70%10- 3.433% 104d 8 dpTpT 4.0x10- 3.33X10e 9 dpTpC Sis oh) pe 区 10 dApT = 3.33xX104g 11 dpA 2:70%1074 3.33X107h 12 dpT 2.305610 SoD LOR 13 dpG 3.33X10-b 3.33X10> j * 此 浓度 时 2090 抑制 =b. 18% 抑制 c. 26% 抑制 d. 25% 抑制 ec. 4% 抑制 f. 2% 抑制 ge. 6% 抑制 h. 28% 抑制 i. 15% 抑制 j. 8% 抑制 。 ( 据 Khan 和 Jacob, 1977), 弱 。 这 些 材料 清楚 地 证 明 此 三 核 背 酸 抗体 有 高 度 的 顺序 专 一 性 。 另 一 方面 , 抗 dpApTPA 抗体 和 变性 的 小 牛 胸腺 DNA 有 交叉 反应 。 这 可 能 是 由 于 DNA 中 存在 dpApTpA Ii 序 。 3. 核酸 抗原 专 一 性 的 特点 从 上 述 几 节 材 料 可 见 ， 用 实验 方法 产生 的 抗 核酸 抗体 是 不 均一 的 ， 并 和 各 种 来 源 的 核酸 表现 广泛 的 交叉 反应 。 各 种 抗 核酸 及 其 结构 成 分 的 抗体 的 专 一 性 列 于 下 表 :; 表 3-3 用 各 种 实验 方法 产生 的 核酸 抗体 的 专 一 性 测试 抗原 (c 固定 ,沉淀 反应 ) HR FERIGE RK 变性 小 牛 胸腺 DNA + MBSA ASHE T, 噬菌体 DNA + MBSA S-RNA + MBSA 一 一 十 于 we 合成 4AT 共聚 物 + MBSA 一 一 十 + + 合成 均 聚 物 十 MBSA 一 一 +? “ + FEE hi FAB + MBSA 这 ? 十 RGR + MBSA 一 一 + + ERR + BSA 一 一 一 十 an + BSA 一 一 十 十 Rei + BSA 之 ms 核糖 核 蛋白 体 一 一 + + 一 a。 只 和 含 葡萄 糖 基 碱 基 反 应 b. 只 和 同型 均 聚 物 反应 。 ( 据 Plescia 和 Braun, 1967), ee 97 。 总 结 以 上 各 方面 材料 可 见 ， 就 核酸 大 分 子 上 一 定 的 决定 镁 和 抗体 的 反应 而 论 ， 同 样 存在 着 和 和 蛋白质、 多糖 以 及 其 他 大 工 合成 的 决定 簇 相 似 的 抗原 专 一 性 。 然 而 , 当 比 较 不 同 物种 来 源 的 核酸 的 血清 学 反应 时 ， 就 表现 出 和 和 蛋白质. 多 糖 抗 原 有 非常 明显 的 区 别 了 。 和 和 蛋白质、 多 糖 显 然 不 同 ， 核 酸 抗体 很 少 有 种 属 专 一 性 。 除 去 有 独特 碱 基 的 核酸 ， 如 了 T 偶 UG EK ( glycosyl] dHMP) 外 ， 核 酸 抗体 的 种 属 专 一 性 很 低 ， 能 和 不 同 来 源 的 碱 基 组 成 和 排列 非常 不 同 的 核酸 发 生 广 泛 的 交叉 反应 。 虽 然 能 否 用 实验 方法 得 到 某 一 核酸 的 均一 的 专 一 抗体 还 是 未 解决 的 问题 ， 不 过 仍 可 以 从 蛋白 质 和 核酸 大 分 子 结构 上 的 区 al, 作 一 些 理 论 上 的 推测 。 蛋 日 质 抗 原 抗体 系统 具有 高 度 的 种 属 专 一 性 。 这 应 归 因 于 多 肽 链 是 由 20 种 氨基 酸 按 特定 的 顺序 排列 ， 不 同 的 排列 顺序 决定 不 同 的 空间 构象 。 不 同 物种 的 同 源 蛋 白质 《如 溶菌 酶 .细胞 色素 C) 的 排列 顺序 不 同 ， 因 而 其 抗原 专 一 性 也 就 不 同 。 至 于 核酸 ， 多 核 昔 酸 链 的 排列 只 包括 四 种 碱 基 的 变化 (虽然 存在 某 些 稀有 碱 基 , 往往 也 不 是 某 一 物种 的 核酸 所 独 有 ) 。 如 前 述 , 核酸 抗原 决定 签 的 大 小 只 包含 5 一 6 BARB fH SKK Bee 码 计算 ， 一 个 抗体 结合 位 点 , 至 多 只 能 识别 2 个 密码 。 因 此 ,对 于 DNA KOT LEK Rie MR 2 个 三 聚 核 昔 酸 顺 序 ) 专 一 的 抗体 ， 就 有 可 能 和 任 一 排列 顺序 中 含有 此 2 个 密码 的 核酸 起 反应 。 由 于 DNA 大 分 子 含 有 3,000 一 600,000 核 痛 酸 单位 ， 含 有 这 2 个 密 码 的 机 率 是 相当 高 的 。 因 此 ， 核 酸 抗体 的 专 一 性 不 能 不 是 很 广泛 的 ， 能 和 许多 来 源 和 结 构 极 不 相同 的 核酸 起 交叉 反应 。 只 有 假定 相当 长 的 一 段 排列 顺序 (为 某 一 基因 专 一 的 ) 构 成 一 个 决定 簇 时 ， 才 有 可 能 产生 对 特定 的 一 个 核酸 分 子 专 一 的 抗体 ， 而 这 又 是 和 抗体 结 合 位 点 的 大 小 实际 止 不 相 容 的 。 由 于 核酸 一 级 结构 的 特殊 性 ， 抗 核酸 抗体 通过 碱 基 排 列 顺序 来 识别 核酸 大 分 子 受 到 很 大 的 限制 ， 但 是 抗 核酸 抗体 的 专 一 性 对 核酸 大 分 子 的 空间 构象 (特别 是 二 级 结构 )， 却 表现 出 明显 的 依赖 关系 。 已 知 tRNA 具有 三 叶 草 形状 的 固定 的 空间 构象 ( 见 图 3-3) me UE NZB/NZW 杂种 小 鼠 血清 中 发 现 抗 天 然 tRNA 的 抗体 ， 它 能 专 一 地 识别 天 和 然 tRNA 和 变性 的 tRNA， 但 不 能 区 分 这 种 天 然 +RNA 是 来 源 于 大 鼠 ， 还 是 大 肠 杆 菌 (Eilat 等 ，1976) 。 换 句 话说 ， 抗 核酸 抗体 虽 难 于 区 分 核酸 分 子 结构 的 “细节 ”， 却 能 识 别 分 子 的 大 致 "轮廓 ”。 三 、 核 酸 抗 原 性 和 空间 构象 的 关系 和 蛋白 质 抗原 相 比 较 ， 核 酸 分 子 可 能 不 存在 相当 于 多 肽 那样 严格 的 “顺序 ”决定 簇 ， 但 是 存在 着 相当 于 多 肽 的 “构象 ?决定 簇 ， 特 别 是 依赖 二 级 结构 的 “螺旋 ?构象 决定 簇 。 这 从 变性 和 复 性 过 程 中 ，DNA 抗原 性 的 变化 ， 以 及 近来 对 人 工 合成 的 单 链 、 双 链 和 三 链 多 聚 核 痛 酸 抗原 性 的 研究 得 到 阐明 。 (—) DNA 变性 和 分 子 量 对 抗原 性 的 影响 由 于 前 面 提 过 的 分 子 结构 特点 ， 天 然 DNA 分 子 中 ， 碱 基 朝 向 双 螺 旋 的 中 央 ， 埋 于 AEA, 因而 不 能 提供 有 效 的 碱 基 顺 序 决定 徐 , 而 只 能 提供 包含 一 条 或 两 条 磷酸 二 酯 骨 架 的 e 98 .6 图 3-8 示 可 能 提供 几 种 不 同 的 抗原 决定 和 伐 的 DNA 分 子 形式 。 天 然 的 双 螺 旋 的 多 核 苷 酸 ( 左 ), 代 表 包 括 一 条 链 或 两 条 链 骨 架 的 决定 徐 。 加 热 时 ,两 条 链 拆 开 ,， 保持 相当 的 伸展 状态 (中 )。 低 浓度 迅速 冷却 时 ， 多 核 苷 酸 链 卷曲 成 线 团 状 变性 形式 ， 碱 基 外 露 易 起 反应 (〈 右 下 )。 相 当 匀 一 的 样品 ,缓慢 冷却 时 , 产生 有 部 分 螺旋 的 复 性 的 分 子 (右上 ),， 同时 提供 碱 基 顺 序 决 定 徐 和 螺旋 构象 决定 簇 ( 据 Stollar，1973)。 “构象 ?决定 复 。 加 热 时 ， 双 螺旋 拆 开 ， 结 果 每 一 条 单 链 保持 相当 伸展 的 状态 。 这 时 若 迅 速 冷 却 ， 单 链 便 会 卷曲 呈 线 团 状 ， 碱 基 外 露 。 变 性 的 单 链 DNA 的 抗原 性 因而 大 大 提高 《图 3-8) 。 一 般 说 来 , 变性 的 单 链 DNA 是 分 子 的 免疫 活性 形式 。 通 常用 实验 方法 产生 的 抗 DNA 抗 血清 ， 主 要 是 和 变性 的 单 链 DNA 起 反应 〈 图 3-9)。DNA 加 热 后 缓慢 冷 却 时 ,能 恢复 部 分 的 螺旋 结构 。 复 性 的 DNA 分 子 ， 用 3' 端 专 一 的 磷酸 二 酯 酶 处 理 时 , 便 失去 部 分 活性 。 这 提示 复 性 分 子 末 端 有 单 链 区 域 存在 ， 也 就 是 说 可 能 同时 存在 “螺旋 ” 构 象 决 定 往 和 碱 基 顺 序 决定 簇 ( 图 3-8) 。 40 | 藉 下 30 mitk 60 & 4 G % 70 oH 40 10 O * nine 6 e 20 0 4 & be togeco 24 I 0 SFR 图 3-9 KRAAABH 14 DNA 的 补体 固定 。 图 3-10 14 DNA 之 抗原 活性 为 平均 分 子 量 的 函数 。 (--@—) 热 变性 DNA (100°C, 10 分 钟 ); (一 29 一) 天然 DNA。 。 99 。 DNA 分 子 量 的 大 小 和 抗原 活性 也 有 一 定 的 关系 。 将 T4 MK DNA 经 超声 波 破 碎 成 大 小 不 等 的 碎片 。 分 子 量 关 2 x 10 "的 片段 ， 免 疫 学 活性 和 原来 的 DNA 分 子 相 同 ， 没有 改变 。 在 此 范围 以 下 , 随 着 分 子 量 的 降低 ,片段 的 免疫 学 活性 也 降低 (图 3-10)。 不 过 ， 那 些 失去 免疫 学 活性 的 小 片段 ， 仍 具有 抑制 单 链 DNA Mit DNA 抗体 间 的 反应 的 能 力 。 (=) 人 工 合 成 多 核 彰 酸 的 二 级 结构 和 免疫 学 专 一 性 近年 来 利用 人 工 合成 的 双 链 、 单 链 多 核 苷 酸 和 MBSA 的 复合 物 诱导 的 抗 血 清 进行 的 研究 ， 清 楚 地 证 明了 抗体 的 专 一 性 依赖 于 免疫 原 的 二 级 结构 “螺旋 ?构象 。 用 合成 的 双 链 多 核 苷 酸 ， 如 PolyA . PolyU，PolyI. PolyC 以 及 PolyG-PolyC 5 MBSA 的 复合 物 ， 免 疫 家 免 时 都 能 产生 专 一 性 针对 双 螺 旋 构 造 的 抗体 ， 能 沉淀 同型 的 或 异型 的 双 链 多 核 音 酸 ， 并 能 与 同型 单 链 均 聚 核 背 酸 反 应 ， 而 不 能 与 异型 均 聚 核 背 酸 反应 (Lacour，1968) 。 如 抗 PolyI。 PolyC 的 抗 血清 ， 除 和 同型 抗原 (PolyI。Poly C) 发 生 反应 外 ， 还 能 和 几 种 异型 双 链 多 核 背 酸 发 生 程度 不 等 的 交叉 反应 ， 其 中 以 Poly A .了 PolyU 反应 最 强 ，PolyrG。 了 PolyrC 最 弱 。 后 者 甚至 比 含 有 相同 碱 基 的 双 链 多 育 脱氧 核 苷 酸 PolydG。 了 PolydC 4 #2 5% (A 3-11) (Nahon-Merlin 等 1973). i Polyl + PolyC 抗 血 清 还 能 和 天 然 RNA 反应 。 比较 双 链 多 核 背 酸 和 单 链 均 聚 多 核 背 酸 对 此 反应 系统 的 抑制 能 力 , 以 及 用 多 核 背 酸 、Reovirus RNA 的 吸附 实验 ， 都 表明 抗体 是 和 RNA 分 子 的 双 链 区 域 起 反应 的 。 此 外 ， 还 观察 到 ft PolyI。PolyC 抗 血清 和 rRNA 的 反应 程度 比 和 tRNA 的 反应 程度 高 。 除 去 tRNA 的 空间 构象 (图 3-3) 可 能 造 成 某 种 空间 障碍 外 ， 还 可 能 是 由 于 rRNA 比 tRNA 含有 更 多 的 螺旋 构象 决定 答 ， 因 为 有 证 据 提 示 TRNA 可 能 含有 更 多 碱 基 配 对 区 域 。 顺 便 要 提 及 ， 由 于 这 种 类 型 的 抗 血 请 有 基 有 针对 双 螺 旋 构象 的 专 一 性 ， 因 此 可 以 用 来 测定 Arbovirus 感染 的 哺乳 类 细胞 市 ， 小 量 的 双 链 RNA 的 存在 (Stollar 和 Stollar, 1970), 还 可 能 用 于 研究 各 类 天 然 RNA 的 构象 (分 子 中 双 螺 旋 结 构 的 含量 ) 。 沉淀 内 抗体 N 量 (微克 ) N Les) > WM CN “I MAB UR G CRE) 图 3-11 $¢ Polyl. PolyC 血清 No. 929 (1:10 稀释 ，0.5 毫 升 ) 和 各 种 抗原 的 沉淀 反应 。 (+ @—) Polyl- PolyC (—X—); PolyA. PolyU; (一 口 一 ) PolyrG .polyrc (—//—) Polyd G. PolydC; (—O—) Poly]; (—A—) Poly G; (一 上 国 一 ) 小 鼠 腹水 瘤 细 胞 总 RNA 〈 据 Nahon-Merlin 等 ,1973)。 « 100 。 .更 有 趣 的 是 ， 抗 三 链 多 核 背 酸 (PolyA2- PolyU) 的 抗 血 清 只 能 和 三 链 抗 原 起 ' 反 应 ， 而 不 能 和 同型 单 链 、 双 链 多 核 背 酸 起 反应 ， 虽 然后 二 者 都 是 前 者 组 成 的 一 部 分 。 以 上 这 些 事实 都 有 力 地 提示 ， 核 酸 抗 原 大 分 子 螺旋 的 空间 构象 特性 (包括 螺 距 、 碱 基 方位 、 碱 基 对 相对 于 螺 轴 的 倾角 ， 以 及 大 槽 ,小 槽 的 相对 大 小 等 ) ， 特 别 是 成 糖 磷酸 二 酯 链 的 外 表 几 何 形 状 对 免疫 学 专 一 性 起 重要 的 作用 。 利用 这 一 类 抗体 还 能 发 现 天 然 DNA 和 天 然 双 链 RNA 构象 上 的 区 别 。 抗 双 链 多 核 Fm (PolyA+ PolyU) 的 免 抗 体能 和 合成 的 或 天 然 的 双 链 RNA 发 生 免疫 反应 ， 但 不 能 和 天 然 的 双 链 DNA 分 子 反 应 。 反 之 ，SLE 血清 中 存在 的 抗 天 然 DNA 抗体 却 不 能 和 双 链 RNA 反应 。 以 上 这 两 类 抗体 各 自 和 RNA-DNA 杂交 分 子 都 能 发 生 程度 不 同 (1%—50%) 的 交叉 反应 。 可 是 ， 用 这 种 杂交 分 子 诱 导出 来 的 抗体 ， 则 既 不 能 和 双 链 RNA 起 反应 ， 又 不 能 和 天 然 DNA 起 反应 。 此 外 , 抗 Poly dG- Poly dC -抗体 也 不 能 和 和 天然 DNA 分 子 反应 。 物理 学 测量 (如 旋光 色散 、 圆 二 色 性 等 ) 证 明 双 链 DNA 和 双 链 RNA 的 构象 存在 多 方面 的 美 别 (Young 和 Samejima，1969) 。 这 种 构象 上 的 不 同 可 能 是 它们 相互 缺少 免疫 化 学 上 的 交叉 反应 的 原因 。BRNA-DNA 杂交 分 子 的 构象 和 KR DNA, RNA 分 子 ， 也 都 有 不 同 。 这 也 许可 以 解释 为 什么 它 和 双 链 RNA 或 双 链 DNA 的 抗 血 清 只 有 低 的 交叉 反应 ， 特 别 是 杂交 分 子 本 身 的 抗 血 清 具 有 高 度 的 专 一 性 。 同 样 地 ，PolydG. PolydC 虽然 和 DNA 一 样 ， 能 和 SL 了 BE 血清 反应 ， 可 是 它 的 和 射线 衍 HARA DNA 仍 有 所 不 同 。 抗 Poly dG. Poly dC 的 抗 血清 竟 能 将 它 和 天 然 DND 构象 上 细致 的 差别 区 分 出 来 。 很 有 趣 的 是 , 抗 Poly dG。 Poly dC 的 抗 血 清 甚 至 不 能 和 Pseudomonas fluorescens 的 DNA 起 免疫 化 学 反应 ， 虽 然 在 这 种 DNA 中 ，dG . dc 碱 基 对 的 含量 高 达 72% 。 这 说 明 单 是 dG' dC 碱 基 对 高 含量 这 种 碱 基 组 成 上 的 特点 ， 并 不 能 使 这 种 分 子 得 到 同 Poly dG“。 了 Poly dC 相似 的 免疫 学 专 一 性 , 更 为 重要 得 多 的 是 分 子 的 构象 。 以 上 这 些 事实 ， 更 加 证 实 了 上 述 的 假定 ， 即 这 类 抗 核酸 抗体 的 免疫 学 专 一 性 依赖 螺旋 构象 的 空间 特点 ， 而 不 是 其 碱 基 组 成 或 成 糖 的 性 质 (Stollar, 1970, 1973; Stollar 和 Raso，1974) 。 总 结 起 来 , 核酸 的 抗原 专 一 性 有 如 下 特点 : 1) 除 具 有 独一无二 的 碱 基 的 少数 几 种 核酸 之 外 , 抗 核酸 抗体 通过 碱 基 顺 序 来 识别 核 酸 大 分 子 是 有 很 大 限制 性 的 。 也 就 是 说 没有 相当 于 多 肽 链 那样 严格 的 “顺序 ?决定 往 ; 2) 另 一 类 依赖 核酸 构象 的 抗体 ， 却 能 相当 严格 地 区 分 单 链 、 双 链 、 三 链 以 及 杂交 核 酸 分 子 的 空间 构象 。 也 就 是 说 存在 相当 于 和 蛋白质 的 “构象 ?决定 往 ; 最 后 ， 还 要 谈 一 下 核酸 的 免疫 原 性 的 问题 。 用 实验 方法 易于 引起 变性 DNA ( 单 链 ) 的 抗体 ， 但 迄今 还 不 能 引起 抗 天 然 DNA 的 抗体 。 天 然 DNA 的 抗体 仅 发 现存 在 于 SLEE 病人 或 NZB /INZW 杂种 小 鼠 血 清 中 。 合成 的 双 链 多 核 苷 酸 只 有 在 构象 和 天 然 DNA 有 明显 差别 时 ， 才 能 在 家 免 引 起 抗体 。 同 时 这 些 抗体 都 不 能 和 天 然 DNA 起 免疫 反应 。 Poly dAT Poly dAT 分 子 构象 和 天 然 DNA 很 相似 , RARER Slik. BH 面 ， 天 然 双 链 RNA 却 易于 引起 抗体 。 从 上 述 这 些 事实 看 来 ， 家 免 似 乎 对 天 然 DNA 分 子 构象 有 耐 受 性 ， 而 对 天 然 'RNA 分 子 构象 则 无 耐 受 性 。 这 可 能 是 由 于 在 正常 情形 下 ， 天 然 的 双 链 DNA 和 单 链 RNA 在 每 一 个 细胞 内 都 普遍 存在 ， 机 体 显 然 对 它们 有 耐 受 性 ; 而 新 的 构象 〈 去 螺旋 化 的 单 链 » 101。 DNA, RH RNA) 作为 外 源 抗原 就 易于 被 机 体 的 免疫 机 制 识别 。 只 有 当 机 体 的 正常 免 疫 自 稳 机 制 破坏 时 ， 如 SL 了 病人， 才 会 产生 抗 天 然 DNA 的 抗体 。 、 抗 核酸 抗体 的 应 用 随 着 对 抗 核酸 抗体 及 其 专 一 性 的 认识 逐步 深入 ,利用 这 些 抗 体 作为 分 析 工 具 , 来 研究 核酸 的 结构 和 功能 的 工作 也 开始 增多 。 现 将 一 些 主要 方面 例 举 如 下 : (—) 对 核酸 组 成 成 分 专 一 的 抗体 一 些 特 殊 碱 基 或 核 苷 酸 具 有 重要 的 生理 或 药理 作用 。 如 5- 溴 尿 喀 啶 、5- 碘 尿 喀 啶 等 常用 于 诱 变 或 抗 肿瘤 。 它们 和 BSA 的 结合 物产 生 的 抗体 ， 可 用 来 测定 它们 参 信 DNA 分 子 的 情况 (Sawicki 等 ，1971) 。 目前 受到 重视 的 环 核 昔 酸 (cAMP, cGMP) 是 激 素 作 用 于 细胞 的 第 二 信使 分 子 。 应 用 它们 的 专 一 抗体 ， 结 合 放射 免疫 法 和 萤 光 标记 抗体 法 ， 可 显示 这 两 种 分 子 在 靶 细 胞 内 分 布 的 动态 变化 ， 从 而 推测 其 功能 (Fallen 等 ， 1974) 。 再 如 一 种 特殊 碱 基 IA (N?*- 异 戊 烯 基 腺 苷 ) 的 专 一 抗体 ， 能 和 酵母 tRNA 的 位 于 反 密 码 子 突 环 上 的 iA 残 基 起 反应 。 因此 ， 这 一 类 抗体 可 能 用 来 研究 含 iAA 的 tRNA 的 生物 学 功 . 能 (Hacker 2S, 1972). } 已 知 大 肠 杆 菌 核 糖 体 16SRNA 的 3 端 24 和 25 残 基 位 置 上 存在 相连 的 两 个 特殊 碱 基 Ne, Ne 二 甲 基 腺 苷 , 这 是 分 子 其 他 部 位 所 没有 的 特殊 标记 。 最 近 ， 有 人 用 抗 N*，N"- 二 甲 基 腺 车 的 专 一 抗体 处 ee ee ee 理 分 离 的 大 肠 杆菌 核糖 体 小 亚 基 ， 电 子 显微镜 观察 IERIE ASR ECE Polite 和 Glitz 1977】 ”发 现 含 此 特殊 碱 基 的 16S RNA 的 .3' 端 在 小 亚 基 上 分 布 的 区 域 正 好 和 起 始 因子 (IE-3) 分 布 区 域 相同 ， 这 提示 小 亚 基 的 上 部 是 蛋白 合成 开始 的 地 方 〈 图 3-12) (Politz 和 Glitz,1977) 。 抗体 还 可 用 来 研究 核 苷 酸 分 子 的 构象 变化 。 如 有 人 用 免 抗 AMP- 卵 白 蛋白 坑 体 来 研究 ADP，ATP 分 子 在 水 溶液 中 的 构象 , 发现 ADP, ATP 在 有 Mg++ 离子 存在 时 ,分 FUTHEAR, AMARA AMP 抗体 反应 ;去 除 Mg+i+， 分 子 又 恢复 伸展 状态 ， 又 易于 和 该 抗体 结合 (Estrada-Parra 和 Garcia-Ortigoza, 1972) 0° 50° 110° (=) DNA 的 变性 和 复 性 单 链 的 变性 DNA 分 子 比 双 链 天 然 分 子 的 抗原 性 大 大 加 强 。 因此 ， 可 以 用 抗 单 链 ， DNA 抗体 来 测定 DNA 的 变性 , 从 双 链 结构 到 单 链 结构 的 转变 过 程 。 用 免疫 化 学 方法 测 得 的 50% 变性 温度 (Tm) 和 用 测量 260 毫 微米 增色 性 变化 得 到 的 Tm 是 一 致 的 〈Levi- ne 和 Van Vunakis，1967) 。 利 用 这 类 抗体 还 可 以 检测 天 然 双 链 分 子 内 是 否 有 局 部 的 “ 单 链 ”区域 存在 。 。 102 。 (=) 辐射 损伤 抗 核酸 抗体 能 检测 天 然 DNA 分 子 中 单 链 区 域 的 专 一 性 ， 其 另 一 重要 用 途 是 研究 DNA 的 辐射 损伤 问题 。 1. 次 甲 基 蓝 的 光 氧 化 作用 在 存在 O, 和 光敏 染料 一 一 次 甲 基 蓝 的 条 件 下 ，DNA 受到 可 见 光 照射 能 引起 岛 苷 残 基 专 一 的 损伤 ， 称 为 光 氧 化 作用 。 用 免疫 化 学 方法 测 出 , 随 光 氧化 时 间 延 长 ，T4-DNA 的 免疫 学 活性 (补体 固定 ) 也 增高 ， 提 示 分 子 局 部 破坏 ， 单 链 结构 增加 。 长 期 照射 后 的 T4-DNA, 再 加 热 变性 时 ， 就 会 失去 固定 补体 的 能 力 ， 但 仍 保持 抑制 T4-DNA- 抗 T4- DNA 系统 反应 的 能 力 。 这 说 明 长 期 照射 可 能 导致 天 然 大 分 子 骨 架 上 的 多 点 破坏 ， 变 性 结果 产生 的 片 眉 分 子 量 过 小 (Levine 等 ，1968) 。 2.U. V. 损伤 与 修复 大 剂量 紫外 辐射 能 使 DNA 中 相 邻 的 喀 啶 核 苷 酸 之 间 形 成 化 学 键 (产生 喀 啶 二 聚 物 )， 阻 碍 DNA 聚合 酶 的 作用 , 而 造成 细胞 的 辐射 损伤 。 这 种 被 损伤 的 细胞 ， 如 暴露 在 强烈 的 可 见 光源 下 ， 有 很 大 比例 的 损伤 细胞 又 可 能 恢复 ， 这 一 现象 称 为 光 致 复活 作用 。 当 用 经 U. V. 辐射 损伤 的 DNA 免疫 时 ,能 产生 对 这 种 损伤 DNA 专 一 的 抗体 ,并 证 明 其 专 一 性 是 针对 胸腺 旷 啶 二 聚 物 的 。 利 用 萤 光 标记 的 这 种 专 一 抗体 可 以 显示 染色 体 上 DNA 的 损伤 部 位 。 对 于 经 U. V. 辐射 (300 尔格 /毫米 ?> 的 离 体 培养 的 羊膜 细胞 ， 可 以 追踪 核 内 二 聚 物 在 4 小 时 内 消失 。 这 和 用 其 他 生化 方法 推测 的 修复 时 间 (5 小 时 ) 是 相近 的 (Lucas, 1972), ;经 大 剂量 U. V. 照射 (10 尔格 /毫米 2 DNA 能 引起 和 损伤 构造 起 反应 的 抗体 * 而 水 剂 量 照 射 (2 x 10 尔格/ 毫米”) 则 不 能 产生 抗体 。 假定 这 可 能 是 由 于 小 剂量 照射 时 ， 二 级 结构 的 改变 不 大 。 小 剂量 照射 过 的 DNA， 经 加 热 变 性 后 再 用 来 免疫 动物 ， 就 可 以 产生 能 和 U. V. 损伤 的 DNA 起 反应 的 抗体 (Poverenny 等 ，1973) 。 (四 ) 2 & fh 25 49 染色 体 结构 是 目前 生物 学 中 尚未 解决 的 重要 问题 。 Crick (1971) 提出 染色 体 结 梅 模型 , 假定 一 条 妆 色 单 体 是 由 球状 控制 DNA 和 纤维 状 密码 DNA 相间 排列 构成 的 。 这 一 假说 的 要 点 是 球状 控制 区 存在 由 碱 基 不 配对 的 单 链 DNA 构成 的 “辨认 位 点 ?”， 能 和 辨认 BAR CRNA 相互 作用 ， 从 而 使 基因 激活 。 因 此 , 这 一 假说 也 称 为 不 配对 假说 。 染 色 体 结构 中 有 无 局 部 的 单 链 构象 存在 ， 是 这 一 假说 能 否 成 立 的 关键 。Levy 和 Simpson (1973) 用 对 单 链 构象 专 一 抗 血 清 作 补体 结合 抑制 实验 ， 测 定 出 染色 质 DNA 中 只 有 大 约 0.01% 是 单 链 的 。 作 者 认为 这 一 事实 不 支持 Crick 模型 。 | 哺乳 类 动物 和 人 染色 体 ， 经 Giemsa HARARE A (Quinacrine) 萤 光 染料 染 色 时 ， 均 呈现 出 每 条 染色 体 特 异 的 区 带 图 案 。 利 用 免疫 枇 学 方法 可 证 明 这 种 横 纹 是 有 其 «103 。 图 3-13 人 第 3,7 和 12 SAK, RAP WR 术 得 到 的 染色 区 带 间 的 对 应 关系 : (a) Giemsa R-#§+ (b) Giemsa G-#§: (c) 抗 一 Att; (4d) 抗 一 C 带 。 WA: 中 粒 ; WA: (a) 和 (d) 行 染 色 体 上 染色 深 的 带 ; (b) 和 (c) 行 染 色 浅 的 带 的 对 应 关系 。 注意 Giemsa R- 带 和 抗 一 C 带 间 ，Giemsa G- 带 和 抗 一 A 带 之 闻 的 对 应 关系 ( 据 Schreck 等 ,1973)。 3-14 利用 间接 免疫 草 光 法 检测 原 位 形成 的 RNA-DNA 杂交 分 子 ,， 以 显示 果 蝇 多 线 染色 体 之 5S rRNA 基因 。 两 条 同型 2R 染色 体 , 除 去 远 端 部 分 外 ,没有 配对 。5S rRNA 基因 位 于 不 配 对 部 分 ,每 一 条 同型 染色 体 上 至 少 可见 两 条 草 光 带 C 上 )。 箭头 示 同 一 染色 体 经 酷 酸 地 衣 红 染色 后 的 SSrRNA 基因 区 域 ( 下 ) CE Rudkin 和 Stollar, 1977), 5} FE TAS o MOREE 6 hk BUR FR EE SG AR DNA REA PADRE 胞 喀 啶 专 一 抗体 ( 抗 -C) 作 间接 法 染色 时 , 显示 出 和 用 G 带 法 Giemsa 3 ay 4eN) ARIE 料 染 色 时 相反 的 区 带 图 案 。 若 用 甲 酰胺 变性 后 ,再 用 莉 光 标记 抗 腺 嘎 叭 专 一 抗体 ( 抗 -A) 染 色 时 , 则 显 出 同 G 带 法 Giemsa 染色 或 奎 旷 因 萤 光 染 色相 同 的 图 案 ( 图 3-13)。 这 提示 染 色 体 区 带 图 案 可 能 反映 染色 质 DNA 纵向 排列 上 ， 碱 基 组 成 的 有 规则 的 差别 〈Shreck 等 ，1973; Dev -等 ，1972) 。 此 外 ,利用 曹 光 标记 抗 单 链 DNA 的 专 一 抗体 ,还 证 明 染 色 体 着 丝 点 ( 异 染色 质 区 域 ) 存在 着 高 度 重 复 顺 序 结构 (Mace 等 ，1972) 。 最 近 , 还 有 人 利用 莉 光 标记 的 抗 DNA-RNA 杂交 分 子 的 构象 专 一 抗体 ， 能 显示 果 蝇 多 线 染 色 体 上 以 杂交 分 子 形式 存在 的 RNA (图 3-14) 。 由 于 染色 位 置 在 幼虫 期 和 预 肾 期 发 育 中 发 生变 化 ， 这 提示 此 种 RNA 分 子 可 能 参与 转录 和 (或 ) 复制 的 控制 (Rudkin 和 Stollar, 1977) 。 最 近 , 这 方面 最 重要 的 进展 是 用 专 一 的 抗 Z-DNA 抗体 在 果 蝇 多 线 染 色 体 上 证 实 有 左旋 构象 的 DNA 存 在 ,从 而 提示 DNA 构 象 的 转变 可 能 对 染色 体 上 基因 功能 活动 的 调控 有 重要 作用 (参看 补 注 1, 第 542 页 ) 。 总 之 ;这些 例 子 说 明 免 疫 组 织 化 学 方法 , 特别 是 把 核酸 和 和 蛋白 质 的 细胞 内 定位 方法 结合 起 来 使 用 ， 对 于 研究 染色 体 的 结构 可 能 是 很 有 用 处 的 。 (hi) 抗 核酸 抗体 的 生物 学 效应 fi. DNA 抗体 曾 用 于 分 析 细菌 转变 因子 对 细胞 诱 变 的 机 制 。 也 有 人 利用 抗 核酸 碱 基 抗体 来 分 析 发 育 问题 。\Rosenkranz (1964) 哈 、 一 抗 血清 处 理 海 胆 sie 发 现 抗体 能 进入 细胞 ,并 专 一 地 抑制 发 育 ， 发 育 ， 使 发 育 停顿 于 一 ENN. BRAKE 面 清 百 蛋白 结合 物 免疫 动物 ， 初 步 观 察 到 移植 肿瘤 的 生长 受到 抑制 (Sinai,1965)。 « 104 « 后 来 ， 还 发 现 抗 胸腺 喀 啶 杭 休 和 正常 的 免疫 球 蛋 白 都 能 进入 癌变 的 中 国 田 鼠 肺 细胞 ， 但 不 能 进 人 同样 培养 条 件 下 的 正常 肺 细胞 。 人 而 正常 的 免疫 球 蛋白 则 无 此 作用 〈Liebeskind 等 ，1971)。 ; 一 和 总结 起 来 ， 起 来 ， 和 其 他 大 分 子 抗原 一 样 ， 核酸 也 具有 免疫 原 性 和 抗原 专 一 性 。 目 前 ,应 用 免疫 学 方法 来 研究 核酸 的 结构 和 功能 尚 处 于 初期 阶段 ,还 大 有 发 展 前 途 。 可 以 乐观 地 设 想 , 随 着 有 关 核 酸 结 构 的 知识 的 增多 以 及 已 知 排列 顺序 的 片段 的 分 离 和 合成 技术 的 进步 ， 来 可 能 得 到 体 ， 用 来 分 析 核 酸 和 染色 体 的 结构 ， 或 专 一 地 影响 基因 表现 ,从 而 为 控制 生长 ,发 育 和 肿瘤 ,提供 一 个 新 的 手段 。 SE tee ts as # t§ 资料 综述 Beiser, S. M,. and Erlanger, B. F. (1966). Antibodies which react with nucleic acids. Cancer Res 26， 2012. , Levine, L. and Van Vunakis, H. (1967). Serologic activities of the nucleic acids. 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Biol. 9, 223. ¢ 107 « 第 四 章 ”细胞 表面 抗原 有 机 体 的 重要 免疫 学 功能 是 识别 细胞 的 个 性 。 细 胞 的 个 性 集中 表现 在 细胞 表面 。 在 高 等 动物 细胞 , 血型 抗原 .组 织 相 容 性 抗原 器 官 (组 织 ) 专 一 抗原 、 物 种 专 一 抗原 ， 以 及 对 病毒 、 植 物 血 球 凝集 素 的 受 体 等 细胞 表面 抗原 的 总 和 构成 了 细胞 的 个 性 。 遗 传 变 卉 、 病 毒 感染 和 瘤 变 等 病理 过 程 也 可 以 从 细胞 表面 抗原 的 改变 中 精细 地 反映 出 来 。 另 一 方面 ,识别 细胞 个 性 的 功能 又 是 一 般 细 胞 表面 的 基本 特性 。 个 体 的 形成 海绵) 受精 、 组 织 细胞 间 的 选择 杀 合 都 是 细胞 表面 这 种 基本 特性 的 表现 。 这 种 特性 在 免疫 活性 细胞 得 到 最 高 度 的 发 展 , 这 些 细胞 表面 出 现 类 似 免疫 球 蛋白 的 特殊 受 体 ,能 识别 “自我 和”“ 非 我 ”的 细胞 或 其 他 抗原 。 因 此 ,各 种 基本 的 免疫 生物 学 现象 , 诸如 抗原 的 识别 ,抗体 和 补体 对 细胞 的 亲 合 , 与 此 有 关 的 吞噬 .凝集 和 免疫 附着 现象 等 ， 以 及 病毒 感染 ,细菌 或 植物 毒素 、 植 物 血球 凝集 素 对 细胞 的 专 一 作用 , 无 一 不 是 和 细胞 表面 抗原 有 密切 关系 的 。 本 章 主要 从 细胞 表面 分 子 构造 的 现代 概念 出 发 ， 简 略 地 讨论 几 种 主要 的 细胞 表面 搞 原 〈 细 胞 表面 的 抗原 结构 ) 以 及 细胞 表面 受 体 的 概念 。 至 于 淋巴 细胞 表面 的 抗原 识别 受 体 , 将 留待 有 关 章 节 再 作 专门 的 论述 。 一 、 细 胞 表面 分 子 构造 的 现代 概念 细胞 表面 的 分 子 构造 很 复杂 至今 还 不 甚 清楚 。 但 已 知 多 糖分 子 (主要 以 糖 蛋白 或 糖 CAE) 在 细胞 表面 有 关 的 免疫 生物 学 现象 中 起 重要 的 作用 。 过 去 关于 细胞 膜 分 子 构 sik 透明 质 酸 细胞 壁 AM: M, T. 5 抗原 Kew N-C MAE 筷 李 糖 肽 聚 糖 N- 乙 酰 氨基 荷 糖 N-Acccoyl urami; id Ala, Glu, Lys, Arg ee 图 4-1 和 A 族 溶血 性 链球 菌 细胞 表面 构造 简 图 ( 据 Krause, 1972), SERV «108 « | | | | 人 造 的 学 说 ,大 都 忽视 了 多 糖 , 因而 不 能 全 面 地 反映 细胞 表面 构造 和 解释 细胞 的 各 种 免疫 学 功能 。 所 谓 细胞 表面 是 指 细 胞 与 环境 间 的 界面 构造 ， 包 括 质 膜 及 其 外 层 的 大 分 子 构造 。 原 核 细 胞 (如 细菌 ) ， 质 膜 外 面 还 有 细胞 壁 及 莹 膜 。 如 前 所 述 : 73: 页， 细胞 壁 内 含有 血清 学 专 一 的 胞 体 脂 多 糖 抗原 ( 族 抗原 ) 和 蛋白 质 抗 原 区 及 肽 聚 糖 骨架 (图 4-1) 。 真 核 细 胞 (如 高 等 动物 ) 只 有 质 膜 及 其 外 被 (Cell coat) ， 有 时 合 称 为 较 厚 膜 ,或 简称 为 细胞 膜 。 真 核 细 胞 的 细胞 膜 具 有 复杂 的 结构 和 多 种 功能 ， 包 括 物 质 交 换 、 信 息 传 递 、 能 量 转换 、 分 涂 排泄 ,兴奋 传 导 、 运 动 以 及 各 种 免疫 学 功能 (抗原 识别 ,吞噬 .凝集 ,附着 等 ) 。 这 里 主要 讨论 与 细胞 表面 的 抗原 结构 和 免疫 学 功能 有 关 的 细胞 膜 的 构造 问题 。 (一 ) 细菌 细胞 壁 的 分 子 构造 模型 根据 对 大 肠 杆菌 以 及 沙门 氏 菌 细胞 壁 化 学 构造 的 分 析 ，Braun (1973) 提出 了 细菌 细胞 壁 的 分 子 构 造 模型 (图 4-2) 。 简略 地 说 ,细胞 壁 的 骨架 是 由 一 层 肽 聚 糖 网 (Murein net) (其 上 均匀 地 连接 着 大 约 250,000 脂 蛋 白 分子 ) 构 成 的 。 肽 聚 糖 网 是 许多 多 糖 链 被 短 肽 共 价 连 成 的 一 个 把 整个 细菌 表面 包 右 起 来 的 网 袋 。 每 一 条 多 糖 链 又 是 由 许多 双 糖 单位 〈(-N- 乙 酰 -muramyl-N- 乙 酰 氨基 葡 糖 -) 构成 的 。 每 一 个 双 糖 单位 的 长 度 为 10.3 A 。 相 邻 的 多 糖 链 是 由 短 肽 〈(-L-Ala-D-Glu-meso-DPM-D-Ala-) 通过 meso-—& 基 庚 二 酸 (meso-DPM) 的 光学 不 对 称 中 心 的 氨基 和 了 D- 丙 氮 酸 末端 的 羧基 间 形 成 的 肽 键 连接 的 (图 4-4， 图 4-5) 。 相 邻 的 两 条 多 糖 链 之 间 的 间距 约 为 12 一 13A 。 脂 蛋白 分 子 是 通过 其 肽 链 C 末端 Lys 的 s 氮 基 取 代 肽 聚 糖 网 上 的 丙 氨 酸 而 和 meso- 二 氮 基 庚 二 酸 的 羧基 相连 的 。 据 统计 每 隔 10 或 12 双 糖 单位 的 地 方 就 有 一 个 脂 蛋白 分 子 和 肽 聚 糖 网 共 价 连接 。 由 此 脂 蛋 白 分 子 之 间 的 间距 约 为 100 一 120A (图 4-3) 。 由 于 整个 骨架 是 通过 共 价 键 相连 而 成 ， 可 以 看 作 一 个 结构 坚实 的 巨 分 子 (分 子 量 拓 1 一 4x10?) 。 因此 甚至 在 剧 烈 条 件 处 理 时 ， 如 4% 煮沸 的 硫酸 十 二 烷 基 钠 提取 时 ， 它 仍 能 保持 完整 的 构造 。 这 时 所 有 绍 胞 壁 外 层 的 其 他 成 分 ( 脂 多 糖 、 蛋 白 和 磷脂 ) 都 被 溶解 ， 只 剩 下 一 层 肽 聚 糖 - 脂 蛋白 网 。 只 有 再 用 胰 蛋 白 酶 和 溶菌 酶 处 理 ， 才 能 把 网 架 进 一 步 拆散 , 得 到 游离 的 短 肽 聚 糖 。 这 也 就 是 相当 于 下 一 章 将 要 提 到 的 细菌 的 佐 剂 有 效 成 分 (参看 160 页 ) 。 每 一 个 脂 蛋 白 分 子 通过 C 端的 Lys 和 肽 聚 糖 网 连接 ， 而 N 端 通过 丝 毛 酸 和 类 脂 相 连 。 类 脂 可 能 主要 含 棕榈 酸 和 一 个 未 知 的 化 合 物 (或 许 是 一 个 w- 氮 基 多 羟基 碳酸 ) 。 脂 蛋 白 的 构造 特点 是 其 多 肽 顺序 表现 明显 的 重复 性 。 从 图 4-2 可 见 ， 从 肽 链 的 第 3 个 残 基 开 始 , 相连 的 两 段 (14 一 15 RH) 几乎 有 相同 的 顺序 ， 续 后 还 存在 四 段 顺序 相似 的 短 肽 段 。 兵 有 和 类 脂 相 连 的 N 端 (类 脂 -(ser)-ser) 及 和 肽 聚 糖 网 相连 的 C 端 (-tyr-Arg-Lys- 肽 聚 糖 网 ) 才 不 表现 重复 性 。 脂 蛋 白 的 另 一 个 重要 的 构造 特点 是 分 子 构象 上 的 两 面 异 性 (Amphipathic proper- ties) ， 即 分 子 的 一 面 为 朴 水 的 , 另 一 面 为 亲 水 的 。 这 是 由 于 多 肽 链 每 隔 2 一 3 个 残 基 , 即 每 逢 第 4 (或 第 3) 氨基 酸 残 基 便 具有 朴 水 性 侧 链 ， 也 就 是 平均 约 每 3.5 氮 基 酸 残 基 有 一 个 蔚 水 性 侧 链 。 由 于 每 3.6 氨基 酸 残 基 构 成 w- 螺 旋 的 一 圈 , 只 要 脂 蛋 白 具 有 oc Bie R, MARKERRBED HE w- 螺 旋 的 一 面 。 实 际 上 , 圆 二 色 性 测量 的 结果 表明 脂 蛋 «109 。 [a2 | | (Ser) Ser Asn Ala Lys Ile Asp Glu Leu Ser Ser Asp Val Gln Thr Leu— | | Asn Ala Lys Val Asp Glu Leu Ser Asn Asp Val Asn Ala Met Arg | ——— 一 一 一 一 一 一 一 王 一 - 一 - 一 一 | Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys 一 一 一 Asp Asp 一 一 Ala Ala Arg 一 一 Ala Asn Glu 一 Arg 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 - | 57 Leu 一 Asp Asn Met 一 Ala Thr Lys Tyr Arg Lys D-Ala H f 4H tf § == (0) NH, ~C~CH,~CH2"CH,*CH ~CO"NH *-COOH (X) D-D-Glu CH, i L-Ala MurNAc , meso—Dpm COOH GICNAc 图 4-2， 肽 聚 糖 网 及 相连 的 脂 蛋白 分 子 的 模式 图 。 平 行 的 粗 线 示 多 糖 链 ,它们 被 “T? 字 形 的 短 肽 侧 链 相 连 成 网 状 。“T> 字形 侧 链 的 平均 长 度 约 为 12.4 信 (青霉素 的 抗菌 作用 就 是 由 于 它 能 阻止 侧 链 的 连接 ,因而 导致 细胞 的 解体 )。 平 均 每 10 一 12 个 双 糖 单位 * 便 有 一 个 脂 蛋白 分 子 连接 。 脂 蛋白 通 过 其 C 端 Lys We 氨基 取代 肽 聚 糖 网 上 的 丙 氨 酸 , 而 和 m- 二 氨基 庚 二 酸 (meso-DPM) 的 羧基 相 连接 。 脂 蛋白 的 多 肽 按 最 大 同 源 性 排列 ,以 显示 其 重复 结构 ( 据 Braun, 1973), 100—120A A443 BEADFEKSRMLYDA. 两 个 脂 蛋 白 分 子 在 网 上 分 布 间隔 约 为 100 一 120&A ， 而 多 糖 链 间 的 距离 为 12 一 13 久 。(CMLP) 脂 蛋 白 ; (P) 短 肽 ; (PS) 多 糖 链 《Braun，1973)。 白 确 有 高 度 的 性 螺 旋 构 象 (至 少 大 于 70%)。 脂 蛋白 的 这 种 特性 对 细胞 壁 的 结构 有 着 重要 的 意义 。 从 免 痿 学 研究 证 明 , 这 些 脂 蛋 白 分 子 可 能 从 细胞 壁 的 最 内 层 延 伸 到 表面 。 由 于 脂 ¢ 110° FERET RMB TI | p HOH ig Ho yp NHGOCI ag ‘Oo’ WN oT ah ie NHCOCH; CHOH n HC-CHy Mur NAc== Gle NAc : . L-Ala E= acoo Gos " meso- oo yearend -CH adD) 全 4-4 大 肠 杆 菌 肽 聚 糖 的 重复 双 糖 单位 的 构造 。 双 糖 单 位 (N-acetyl-muramyl-N-acetyl-glucosamine) 的 长 度 10.3A ~ -7- snipi 下 来 。 两 类 蛋白 质 和 膜 的 结合 方 式 不 同 ， 分 离 的 方法 也 不 同 。 这 对 于 膜 的 分 离 是 很 重要 的 。 用 不 能 穿 透 细胞 膜 的 放射 性 蛋白 试剂 ( 甲 酰 甲 二 磺 酰 硕 甲 基础 酸 ) ， 标 记 完 整 红血球 ( 仅 细 胞 膜 外 表面 的 膜 蛋白 能 与 试剂 反应 ) 和 分 离 的 红血球 细胞 膜 ( 膜 内 、 外 两 表面 都 能 和 试剂 反应 ) ， 结 果 表 明 , 红 血球 膜 的 内 、 外 两 表面 蛋白 质 分 布 是 不 对 称 的 ,并且 有 的 糖 蛋白 分 子 贯 穿 整 个 膜 的 脂 双 层 。 这 些 蛋 白质 分 子 的 亲 水 性 氨基 酸 和 臣 水 氨基 酸 在 蛋白 链 的 两 端 还 可 能 不 对 称 的 分 布 , 亲 水 性 部 分 包括 多 糖 基 团 , 位 于 膜 的 外 表面 ， 而 蕊 水 性 部 分 埋 到 膜 内 。 露 出 在 外 表面 的 部 分 为 不 规则 线 团 状 , 易 被 蛋白 酶 酶 解 ,贯穿 膜 的 部 分 可 能 呈 oR 旋 状 (图 4-7D)。 应 用 电子 显微镜 “冰冻 蚀刻 ?技术 ， 同 样 观察 到 膜 蛋白 峰 人 到 膜 内 。 这 种 方法 利用 低温 使 标本 的 臣 水 键 大 大 减弱 ， 切 片 时 裂 面 因 而 总 是 沿 着 膜 的 脂 双 层 牙 水 区 中 间 臂 开 ( 图 2-7 了 ) 。 露出 的 有 裂 面 再 经 过 金属 投影 , 制作 铀 摹 本 后 ,就 可 用 于 电子 显微镜 WM. FERTUMAS AOR Lk a AER BL (50 一 85 信 ) 。 用 标记 抗体 示 踪 法 ， 还 可 以 证 明 它 们 是 糖 蛋白 或 糖 脂 蛋 白 性 质 的 (参看 132 页 ) 。 此 外 ,许多 细胞 学 现象 表明 , 细胞 膜 是 一 个 动态 结构 。 小 鼠 和 人 的 融合 细胞 ， 用 萤 光 标记 抗体 追踪 专 一 的 表面 抗原 ， 发 现 开 始 时 小 鼠 和 人 的 抗原 各 居 融 合 细胞 表面 的 一 半 ， © 112，。 000 iii TONED, a! BOQ0N “| Ts 和 SS WWANWYM"0 Et Ka PQ big isi. JS COOH /A COOH 类 脂 图 4-7 细胞 膜 结构 模型 。(Ay》 Gorter 和 Grendel (1925) 提 出 的 脂 双 层 模型 。 小 圆 球 代表 极 性 基 团 ,排列 朝 水 相 。 长 方 棒 代表 脂肪 酸 烃 链 ， 朝 内 相向 排列 。 (B) Danielli-Davson (1934) 模型 。 脂 双 层 的 极 性 基 困 被 亲 水 性 蛋白 包 盖 ( 大 圆 球 表 FR)o (C) Lucy(1968) 模 型 s- EK, 形 脂 胶 粒 和 脂 双 层 构 造 处 于 动 态 平衡 。 AAI RAK 薄 切 片 的 电子 显微镜 图 象 是 总 厚度 为 75 一 100 人 的 三 层 结构 。 这 种 构造 称 为 单 位 膜 CRobert- 一 OOO RATES son, 1966), (D) SHE F tit Taos ctaeereressaee etee 于 脂 双 层 内 的 模型 。 三 角 代表 ¥ 26 ea Ge ee SERIE. | ANG UAT AR ees FANE T DAE 下 的 Ao (E) Singer—Nicolson(1972) 流 MAREBORDH). 芯 水 的 球形 固有 蛋白 和 不 连续 的 脂 双 BH Sikh dA BARA 嵌入 的 深度 依 分 子 的 大 小 和 9 造 而 定 。 箭头 示 冰 冻 蚀 刻 的 裂 Ho (CF) 流动 镶 谈 模型 《立体 及 横 切 面 )? 示 固有 蛋白 (表面 点 小 点 ) 在 脂 双 层 膜 内 的 分 布 〈 据 Cook 和 和 Stoddart, 1973; Singer 和 Nicolson，1972)。 15 40 分 钟 (37°C) 后 表面 抗原 迅速 融合 镶 艇 排列 (Frye & Edidin, 1970), 进一步 实验 证 明 , 代谢 抑制 物 不 影响 表面 抗原 的 流动 , 而 低温 却 能 影响 其 流动 。 这 支持 膜 内 的 蛋白 能 在 一 个 粘度 大 的 介质 内 漂移 的 看 法 。 概括 这 些 事实 ，Singer “提出 膜 结构 的 “流动 镶 艇 模型 ” (Singer 和 Nicolson, 1971) ， 主 张 膜 的 基本 结构 是 球形 的 疏水 性 蛋白 ， 灸 嵌 在 脂 双 层 内 ， 球 蛋白 极 性 部 分 〈 包 括 多 糖 ) 位 于 水 相 ， 而 疏水 部 分 则 埋 在 膜 的 疏水 区 内 , 也 可 能 贯穿 整个 膜 的 脂 双 层 ( 图 4- 7 了 ,FF) 。 膜 蛋白 在 膜 内 外 的 分 布 是 不 对 称 的 。 朴 水 的 膜 蛋 白 在 脂 双 层 中 还 能 在 水 平方 向 等 移 。 这 一 模型 的 优点 是 考虑 到 细胞 膜 内 糖 蛋 白 的 存在 ， 并 把 膜 视 为 一 个 动态 结构 。 因 而 能 较 好 地 解释 许多 和 细胞 表面 有 关 的 免疫 学 现象 , 如 饮 液 和 吞噬 作用 , 以 及 表面 受 体 的 移动 等 。 吞噬 作用 通常 可 分 为 两 步 : 颗粒 选择 地 附着 到 吞噬 细胞 表面 ; 带 着 颗粒 的 质 膜 内 陷 ， 然后 与 溶 酶 体 融 合 ， 颗 粒 被 消化 。 某 些 细胞 亲 合 抗体 能 加 强 吞 吻 细 胞 对 附着 颗粒 的 反 应 。 和 颗粒 选择 地 接触 的 细胞 表面 受 体 的 性 质 还 不 清楚 。 不 过 有 证 据 表 明 ， 它 们 直接 或 间接 地 和 糖 蛋白 有 关系 (Allen 和 Cook，1970) 。 吞 噬 活 动 的 发 动 过 程 , 有 人 假定 首先 是 细胞 亲 合 抗体 的 Fe 和 巨 噬 细 胞 表面 受 体 亲 合 。 膜 上 的 抗体 的 抗原 结合 位 点 ， 再 与 抗 原 结 合 时 , 抗体 分 子 发 生 构象 变化 , 引起 横贯 细胞 膜 的 蛋白 簇 集 , 形 成 离子 通 透 管道 , BS 子 进 入 细胞 ， 因 而 引起 邻近 的 肌 动 球 肝 微 纤维 的 收缩 ， 结 果 细 胞 膜 带 着 颗粒 一 同 陷 人 。 刀 豆 凝集 素 (Concanavalin A) 能 抑制 吞噬 活动 ， 这 可 能 是 和 膜 受 体 相 互 作用 , 因而 限 制 了 膜 成 分 的 移动 (Allison 等 ，1971) 。 淋巴 球 表面 存在 类 似 抗体 的 受 体 。 当 用 抗 表面 免疫 球 蛋 白 的 抗体 处 理 时 ， 这 些 表面 受 体 便 簇 集 在 细胞 的 一 极 ， 形 成 所 谓 的 “ 极 冠 >。 然 后 ， 这 些 免疫 球 蛋白 分 子 可 以 通过 饮 液 活 动 , 进入 细胞 内 部 ， 而 从 表面 消失 (Taylor 等 ,1971) 。 低温 (0°C) 或 用 刀 豆 凝集 素 处 理 ， 都 能 抑制 “ 极 冠 2 的 形成 (Yahara 和 Edelman，1972) 。 这 表明 膜 上 的 免疫 球 蛋白 受 体 的 自由 扩散 受到 抑制 。 这 些 事实 都 是 和 流动 镶 舱 模型 符合 ， 为 经 典 的 膜 结 构 模 型 所 不 能 解释 的 。 总 之 ， 细 胞 膜 的 结构 模型 必须 考虑 到 细胞 表面 活动 的 专 一 性 和 动态 过 程 ， 才 能 较 好 地 解释 和 膜 有 关 的 各 种 免疫 学 现象 。 最 后 ， 还 要 谈 到 细胞 膜 结 构 概 念 ， 对 于 细胞 表面 抗原 的 分 离 纯化 的 意义 。 为 了 研究 细胞 表面 抗原 的 化 学 性 质 ， 首 先 就 必须 把 它们 从 膜 上 溶解 下 来 ， 并 尽 可 能 得 到 最 大 的 产 量 和 保持 原来 在 膜 上 的 天 然 结 构 和 抗原 性 。 根 据 前 述 膜 蛋 白 和 膜 的 结合 方式 ， 以 及 在 膜 上 排列 的 特点 ， 一 般 说 来 ， 溶 解 膜 抗 原 主要 采取 两 类 方法 : 解 离 非 共 价 键 和 破坏 共 价 键 (蛋白 酶 酶 解 ) 。 如 前 述 , 外 周 蛋白 通过 较 弱 的 非 共 价 键 (主要 是 静电 相互 作用 ) 和 膜 表 面 结合 ， 因 此 只 需要 较 温 和 的 方法 ,通常 是 用 3MKC1 处 理 就 能 把 它们 从 膜 上 溶解 下 来 。 膜 上 的 固有 蛋白 深 埋 于 脂 双 层 内 ， 靠 疏水 性 相互 作用 ， 和 膜 牢 固 结合 ， 就 需要 较 剧 烈 的 处 FE, 如 用 去 氧 胆 酸 、NP-40，Triton X-100 等 表面 活性 剂 处 理 ， 才 能 溶解 。 比较 用 三 种 不 同 的 方法 ,溶解 同一 种 细胞 (小 鼠 浆 细胞 瘤 MOPC-460) 的 膜 抗 原 的 效 果 时 ， 可 看 出 表面 活性 剂 去 氧 胆 酸 钠 (DOC) ， 所 溶解 的 细胞 膜 蛋白 的 量 最 大 , 达到 膜 蛋 白 总 量 的 80%， 而 3MKCl 和 木瓜 蛋白 酶 处 理 各 自 只 能 溶解 16% 和 10%。SDS RAM 酰胺 凝 胶 电 泳 表明 ，DOC 溶解 的 蛋白 成 分 最 多 ,分子量 也 较 大 ，. 至 少 要 比 3MKC1 处 理 。 114。 1 6 KCI-SMA 1.50 1.25 18 ey | a & 2 22 a 2 " 3 5 ; G 此 17 0.50} :'s ' 0.25 27 29 336: ® 2% 4 «2460 8010 © @ 3. 0 8 wee Oo A M. WX 103 = M. W.X 10° sis PAP-SMA 1.50 1.25 1.00 E E 5 & 10575 : q q S fe) 0.50 0.25 四 2 40 60 80 100 i) ® 2 40 60 80100 © C M. W. xX 10° D M. W.X 10? 图 4-8 不 同方 法 溶解 的 膜 蛋 白 在 SDS-2R PA Mi Pie A ee BE KAN. «=(A) DOC 溶解 的 膜 蛋白 。 区 分 出 31 条 分 子 量 不 同 的 带 , 并 按 相 对 迁移 率 依 次 编号 〈B 一 D 采用 同样 的 编号 , 以便 互相 比较 )。 凝 胶 柱 顶端 在 图 的 右 方 。 (B) 高 离子 强度 (3MKC1) 溶解 的 膜 蛋白 。 编号 大 于 31 的 带 不 存在 于 DOC 和 木 爪 酶 消化 的 电 AID. (C) 木瓜 酶 消化 (3715 分 钟 )。 编号 大 于 36 的 带 不 存在 于 DOC 和 KC! 电泳 图 形 中 。 (D) 3M7KC1 溶解 的 膜 蛋白 在 4"C 长 时 间 存 放 。 未 标明 号 码 的 峰 指 示 C 中 未 发 现 过 的 带 。 这 种 变化 是 由 于 内 源 酶 解 的 结果 ( 据 Prat 等 ,1975)。 "115 。 R4-1 不 同方 法 溶解 的 膜 抗原 与 它们 相应 的 抗 血清 之 间 的 交叉 沉淀 反应 和 交叉 吸收 AFWKR ht RR KK 家 免 抗 血清 未 吸 收 DOC | KCl PAP A. 用 KCl Sie Rite Mix 一 0 1 抗 -KCl 4 0 | 0 | 1 抗 -PAP 2 0 B. 用 DOC 溶解 膜 抗原 测试 0 0 1 0 FE 2 0 #{-DOC | 3* $4-KCl 3 抗 -DOC | 3 抗 -PAP 2 抗 =DOC C. 用 木瓜 酶 咨 解 膜 抗原 测试 抗 -KCl 2 抗 -PAP 2 0 4 | 0 * 染色 后 计数 的 沉淀 线 数目 ( 据 Prat 等 ,1975)。 要 多 9 个 蛋白 成 分 (图 4-8 A,B) 。 然 而 ，DOC 溶解 的 蛋白 对 家 免 的 免疫 原 性 较 弱 , 并 不 ELF 3MKC1 处 理 溶 解 的 膜 蛋白 能 引起 更 多 的 沉淀 抗体 ( 表 4-1) 。DOC 由 于 剧烈 地 干扰 细胞 膜 结构 成 分 间 的 疏水 性 相互 作用 ， 能 同时 使 固有 蛋白 和 外 周 蛋白 次 解 。 其 优点 是 深 解 的 膜 蛋白 产量 最 高 ， 分 子 量 较 大 , 比较 能 反映 抗原 大 分 子 在 膜 上 的 存在 形式 ,但 其 缺点 是 溶解 下 来 的 成 分 过 杂 , 不 易 进 一 步 分 离 纯化 ,并 且 DOC 还 可 能 和 膜 蛋 白 结合 ， 影响 免 疫 原 性 。3 MKC1 处 理 比较 能 选择 地 溶解 外 周 蛋 白 ， 膜 脂 蛋白 释放 减少 ， 便 利 以 后 的 分 离 纯化 。 不 过 由 于 内 在 酶 解 ， 还 可 能 有 一 部 分 埋 在 脂 双 层 中 的 固有 蛋白 也 释放 出 来 。 至 FAME, 主要 是 将 外 露 在 细胞 表面 的 多 肽 链 在 原 位 ,或 溶液 中 切断 。 由 于 低 聚 糖 在 糖 蛋 白 分子 上 的 不 对 称 分 布 , 溶 解 下 来 的 断 片 的 糖 含量 较 高 (图 4-8，C) 。 这 一 方法 得 到 的 膜 蛋白 产量 最 低 ， 并 且 出 现 许 多 DOC 处 理 时 所 没有 的 成 分 ， 主 要 是 被 降解 的 低 分 子 量 的 Bik (Prat 等 ，1975) 。 由 于 各 种 方法 的 作用 方式 不 同 , 从 膜 上 溶解 下 来 的 解 离 程度 不 等 的 抗原 断 片 ， 其 分 子 量 大 小 和 化 学 组 成 也 不 相同 ,各 实验 室 报告 的 结果 , 很 难 比较 。 这 是 在 研究 膜 抗原 时 ， 最 感 困 难 的 地 方 ,也 是 应 注意 的 地 方 。 2 Q Oo oo 二 、 植 物 血 球 凝 集 素 及 细胞 表面 受 体 Boyd (1945) 发 现 利 马 豆 (Phaseolus limensis) 的 提取 物 ， 能 专 一 地 凝集 人 A 型 红血球 。 继 之 进行 的 广泛 研究 发 现 ， 许 多 豆 科 植物 的 种 子 都 含有 能 和 红血球 或 其 他 细胞 表面 的 糖 残 基 专 一 地 结合 ， 引 起 细胞 凝集 的 物质 ， 统 称 为 植物 血球 凝集 素 (Phytohe- magglutinin， 简 称 PHA), 其 实 ， 这 一 名 词 并 不 确切 ， 因为 在 动物 组 织 , 如 软体 动物 的 蛋白 腺 、 鱼 卵 也 有 这 一 类 物质 存在 。 因 此 ,有 人 主张 似乎 用 选择 素 (Lectin) 一 词 较 为 ¥%~4 (Boyd, 1962), 植物 血球 凝集 素 能 和 细胞 表面 特殊 的 抗原 的 一 定 糖 残 基 专 一 地 结合 。 细 胞 表面 的 这 种 特殊 构造 ， 称 为 植物 血球 凝集 素 受 体 (PHA receptor site) 。 各 种 PHA 具有 不 同 的 结合 专 一 性 。 用 萤 光 染料 或 同位 素 标记 已 知 专 一 性 的 PHA， 就 可 以 用 来 显示 细胞 表 面 *。 116。 的 一 定 糖 残 基 或 低 聚 糖 的 分 布 或 动态 变化 。 如 用 铁 和 蛋白 或 过 氧化 物 酶 标记 时 ， 更 可 以 用 电子 显微镜 作 分 子 水 平 的 定位 观察 。 因 此 ， 对 于 分 析 正 常 和 恶性 细胞 表面 的 多 糖分 子 构 造 是 很 有 用 处 的 。 故 有 人 形象 地 称 之 为 细胞 表面 的 “分 子 探 针 ”。 此 外 ， 一 些 植 物 血 球 凝 集 素 能 和 淋巴 球 表面 受 体 专 一 地 结合 ， 并 刺激 这 些 细胞 的 分 Ries. Alt. 对 植物 血球 凝集 素 及 其 受 体 相 互 作 用 的 研究 ,不 但 有 助 于 了 解 细胞 膜 的 多 糖 构造 ,而 且 有 助 于 了 解 这 些 构 造 如 何 参与 细胞 的 功能 活动 ,特别 是 淋巴 球 表面 受 体 接受 抗原 刺激 而 起 反应 的 机 制 。 (—) 植物 血球 凝集 素 多 糖 结合 点 的 性 质 各 种 植物 血球 凝集 素 结合 专 一 性 的 研究 方法 ， 同 样 采用 研究 同族 凝集 抗体 和 血型 物 质 结 合 专 一 性 时 采用 的 半 抗 原 抑制 法 。 即 用 各 种 单 糖 、 低 聚 糖 或 从 细胞 表面 分 离 的 糖 多 肽 测定 其 对 PHA 引起 的 细胞 〈 通 常 是 用 不 同 血 型 的 红血球 ) 凝集 作用 的 抑制 能 力 。 根 据 这 种 方 法 测定 的 结果 ， 一 些 常 用 于 细胞 表面 研究 的 植物 血球 凝集 素 的 结合 专 一 性 ， 列 于 表 4-2。 对 于 一 些 PHEA， 单 糖 和 有 关 的 低 聚 糖 有 同 等 的 抑制 能 力 ,而 在 另 一 些 PEA， 低 聚 糖 的 抑制 能 力 要 比 单 糖 强 几 千 倍 。 例 如 ,具有 A 血型 专 一 PERN INE Fs SEER A 专 一 性 的 5 聚 糖 的 抑制 能 力 只 比 有 关 的 单 糖 甲 基 -a-D-GalNAe 强 两 倍 。 反 之 ， 从 人 红血球 细胞 膜 提 取出 的 一 个 糖 多 肽 ， 对 四 季 豆 凝集 素 的 抑制 能 力 要 比 有 关 的 单 糖 约 强 3,000 倍 (Kornfeld 和 Kornfeld, 1969), 根据 这 些 结果 推测 ， 前 一 类 PHA 似乎 只 和 一 个 ”图 4-9 洋 刀 豆 凝集 素 (ConA) 四 聚 体 模型 ， 从 糖 残 基 结合 ， 后 一 类 则 可 能 要 求 和 两 个 以 上 的 残 分 届 用 os eee pore ik 基 结 合 。 32 — B-D-WR ARTE) GE Becker 等 ,1975)。 植物 血球 凝集 素 的 细胞 结合 专 一 性 和 凝集 能 力 ， 是 与 其 特殊 的 分 子 构造 有 关系 的。 TIGRE (Con A) 的 高 分 辩 率 (2A) X 相思 于 守重 自 SReEG 射线 晶体 学 分 析 发 现 ， 分 子 是 由 4 个 球形 亚 pos DER ele 基 构 成 的 。 每 一 个 亚 基 有 一 个 大 小 约 为 6 有 BRE : x75Ax18A 的 袋 形 构造 。 从 p-IPG 和 Cn ne mmm} Con A 复合 物 上 标记 原子 的 位 置 看 来 ,这 一 袋 形 构造 似乎 是 糖 结合 位 点 。 金属 原子 (Mn*+, Cat+) 和 结合 位 点 相距 约 20A, HK a+ = alae ira fy iy 参加 和 糖 的 结合 (Edelman “©, 1972), 是 ， 同 一 实验 室 后 来 却 认为 糖 结合 位 点 是 位 于 金属 原子 附近 的 残 基 ， 和 Mnt+t+ 相距 约 13 A ， 而 不 是 象 从 前 曾 认 为 的 位 于 袋 形 构造 内 。 金 属 原子 可 能 直接 对 维持 糖 结合 位 点 的 构象 起 重要 作用 (Becker 等 ,1976)( 图 4-9)。 © 117 。 表 4-2 细胞 表面 研究 中 常用 的 几 种 凝集 素 具有 广泛 专 一 性 的 纯化 凝集 素 的 特性 ah D ee eS inet 55,000 { 110,000 4 a-D-Gle 来 源 名 “ - 称 #E7IG. (Canavalia enstformis)| ConcanavalinA 大 豆 (Glycine max) 110,000 D-GalNAc Fa (Lens esculenta) 42 ,000—69 ,000 2 a-D-man WW (Trificum vulgaris) WGA 26,000 (D-GIcNAc), 120,000 8-D-Gal FER (Ricinus communis) Ricin 60,000 o> oe 具有 血型 专 一 性 的 凝集 素 a 来 源 一 备 注 人 类 血型 me 一 ;人 性 双 花 扁豆 (Dolichor biflorus) A a-D-GalN Ac ge LPR E, gel 球 PRIN RHR (Lotus tetragonolobus) H(O) fF uc FEE (Vicia graminea) N Gal~>GalNAc= 与 M Sim ERE A SSRI VW NANA 1-3 @ | 2-6 峰 宝 化 (Iberis amara) M Sane Ss NANA =N 一 乙酰 神经 氮 酸 (N-acetyl-neuraminic acid), ( 据 Cook 和 Stoddart, 1973), ASAT, PUR Con A 分 子 和 糖 的 结合 价 数 是 多 价 的 ， 因 而 能 使 细胞 凝集 ; 解 离 成 单价 的 亚 基 后 ， 虽然 仍旧 能 和 特定 的 糖 残 基 结合 ， 但 不 再 能 凝集 细胞 。 这 和 同族 凝集 抗体 的 凝结 血球 的 机 制 也 是 相似 的 。 和 植物 血球 凝集 素 有 关 的 ， 植 物 毒 蛋 白 ， 如 草 麻 毒 蛋白 (Ricin) AEF SEA (Abrin) ， 对 细胞 的 毒性 作用 似乎 也 有 一 定 的 专 一 性 ， 并 且 对 肿瘤 细胞 比 正常 细胞 有 较 大 的 毒性 。 对 其 分 子 结构 的 研究 发 现 ， 它 们 是 由 两 条 肽 链 组 成 的 (图 4-10) 。B 链 具 有 和 植物 血球 凝集 素 相同 的 结合 专 一 性 ; 能 和 细胞 表面 含 半 乳 糖 的 受 体 专 一 地 结合 ， 因 而 可 称 为 结合 子 (Haptomer), A 链 有 毒性 活力 ， 能 破坏 核糖 核 蛋 白 体 ， 抑 制 蛋白 质 合 成 ， 因 而 可 称 为 发 效 子 (Effectomer), 当 用 和 斑 基 乙醇 ， 将 A 链 和 B 链 拆 开 ， 单 独 的 A 链 不 能 和 细胞 表面 结合 ， 因 而 不 能 进入 细胞 ， 发 挥 其 毒性 作用 。 重 结合 的 蛋白 ， 又 恢 复 其 毒性 活力 。 葛 麻 毒 蛋白 的 A 链 和 相思 子 毒 蛋白 也 链 构成 的 杂种 分 子 , 也 保持 原来 的 毒性 作用 (Olsnes 等 ，1974) 。 这 些 实验 结果 对 于 寻找 有 细胞 专 一 性 的 抗 交 药 物 有 一 定 的 启发 。 可 以 设想 也 许 有 可 能 利用 某 种 和 癌 细 胞 有 结合 专 一 性 的 植物 血球 凝集 素 的 亚 基 作为 “结合 子 >， 和 毒 蛋 白 的 “发 效 子 > 人 工地 构成 一 个 杂种 分 子 ， 便 能 够 选择 地 杀伤 肿瘤 细胞 。 a (=) 细胞 表面 的 PHA 受 体 i eet see aeons a. Kornfeld 实验 室 用 胰 蛋 白 酶 处 理 人 红血球 细胞 膜 ， 分 离 出 一 个 糖 多 肽 ， 能 和 四 季 ©1186 豆 凝 集 素 .了 -PHA 专 一 地 结合 (图 4-11); 并 能 抑制 E-PHA 引起 的 血球 凝集 反应 。 其 抑制 能 力 比 有 关 的 单 糖 〈8-D- 半 乳糖 ) 强 约 3,000 倍 。 根据 顺序 酶 解法 测定 ， 红 血球 膜 E-PHA 受 体 的 结构 如 图 4-12 Pim, (eK 糖 链 很 可 能 通过 N- 乙 酰 氮 基 天 门 冬 氮 酸 键 和 多 肽 链 相 连 。 去 除 此 低 聚 糖 链 末 端的 唾 酸 残 基 ， 不 影响 对 红血球 凝集 的 抑制 能 力 。 然 而 ,去 除 半 乳 糖 残 基 , 抑制 活力 就 降低 70%。 这 些 结果 说 明 半 乳糖 残 基 在 受 体 和 了 -PHA 的 结合 中 起 主要 作用 。 AUR A 部 的 糖 残 基 ， 尤 其 是 甘露 糖 残 基 对 结合 专 一 性 也 有 一 定 影 响 。 所 以 ， 四 季 豆 E-PHA 的 结合 点 可 能 比 双 花 扁 豆 凝集 素 的 结合 点 更 复 杂 ， 后 者 的 结合 点 可 能 只 和 末端 的 一 个 单 糖 有 关系 〈Kornfeld 和 Kornfeld，1971) 。 对 各 种 细胞 研究 的 结果 表明 ， 不 同 细 胞 《如 淋巴 球 、 血 小 板 等 ) 的 同一 种 PHA 受 体 可 能 有 相似 的 或 相同 的 结构 ， 不 过 在 细胞 表 面 的 密度 可 能 不 同 ; 而 同一 种 细胞 表面 上 的 AAD PHA 受 体 ( 如 Con A, WGA 受 体 等 )， 则 可 能 有 不 同 的 结构 , 分 布 也 不 同 。 根 2 I-PHA 和 细胞 结合 的 实验 ， 测 定 出 人 红 凋 球 表 面 的 四 季 豆 了 -PHA 受 体 的 数目 为 5.2Xx105， 白 血球 为 2.7 x105， 慢 性 淋巴 白 10 hE Kk 糖 多 肽 + 白 蛋 白 -4 本 ‘ 4 1 } ° 1 一 一 一 一 一 -<---- 三 en oor 0 5 10 15 20 糖 多 肽 + PHA 。 一 。mApm 唾 酸 /0.5cc。 0 ONS 10 15 20 SK Al 4-11 纯化 的 红血球 膜 糖 多 肽 和 四 季 豆 E-PHA 的 专 一 结合 。 糖 多 肽 单独 ， 或 加 白 蛋 白 或 PHA 保温 一 小 时 (37%C)， 然 后 经 Sephadex-G-75 BR. MER 含量 定 糖 多 肽 的 位 置 ， 测 280 ma 光 密 度 定 白 蛋白 和 PHA 的 位 置 。 糖 多 肽 和 E-PHA 结合 ,因而 改变 洗 脱 的 位 置 ( 据 Kornfeld 和 Kornfeld, 1971), 血 病 淋巴 球 为 1.15 x10*( 表 4-3)。 肿 瘤 细 胞 表面 受 体 有 显著 的 变化 , 可 作为 肿瘤 细胞 的 一 个 特征 。 表 4-3 植物 血球 凝集 素 结合 实验 细 胞 类 型 AAA 慢性 淋巴 白血病 淋巴 球 人 红血球 分 离 的 红血球 膜 糖 多 肽 ( 受 体 ) (4 Kornfeld 和 Kornfeld, 1971), 受 体 数目 /细胞 结合 常数 (K) 2.7% 10° 1.1% 107/M- 0.8 10° 2.1% 107/M— 2.4% 10° 4.4% 107 /M- 1.15% 10° 1.3% 107/M" 5.2 10° 5.7X10°/M— 1.6% 10°/M- 4.7% 103/M— © 119. Gal Gal Bi+3,4| \p1>3.4 GlcNAc GleNAc pi>2| gl? al>2 al—>? Man GlcNAc———~> Asp 4-12 红血球 膜 糖 多 肽 (四 季 豆 E-PHA 受 体 ) 的 构造 (Kornfeld 和 Kornfeld, 1971), 某 些 植物 血球 凝集 素 ， 如 麦芽 凝集 素 (简称 WGA) ， 能 使 大 多 数 肿瘤 细胞 凝集 ,而 不 能 使 正常 细胞 凝集 (Aub，1963; Burger, 1967). 这 种 凝集 现象 能 被 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 或 壳 二 糖 专 一 地 抑制 。 因 此 ， 瘤 细胞 表面 应 存在 含有 N- 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 残 基 的 WGA 受 体 。 正 常 细胞 (如 小 鼠 成 纤维 细胞 3T3 株 ) 经 病毒 (如 SV) 转化 为 桨 细胞 ,或 (=) 病毒 转化 的 瘤 细 胞 表面 特性 的 变化 ] 者 用 蛋白 酶 处 理 后 ， 原 来 不 能 被 WGA 凝集 的 细胞 就 变 成 可 以 凝集 的 了 。 由 此 推测 在 转 oy 化 过 程 中 ， 细 胞 表面 可 能 发 生 几 种 变化 ， 原 来 存在 于 正常 正常 表面 RUMAH 细胞 表面 的 WGA Stk 处 于 掩盖 或 半 掩 盖 状 态 ， 而 在 转 Se 化 细胞 表面 上 暴露 出 来 ; BLED Ae ae AL RHE RRR 集 位 点 在 转化 或 蛋白 酶 处 理 时 被 激活 (图 4-13)。 用 同位 素 标记 的 刀 豆 凝集 素 (Con A) 和 WGA (Cline .和 Livin- gston, 1971; Ozanne 和 Sambrook，1971) ， 或 大 豆 凝 集 素 (Sela 等 ，1971) 证 明 ， 正 常 细胞 和 转化 细胞 所 结合 的 植物 血球 凝集 素 在 数量 上 没有 区 别 。 因 些 ， 瘤 细胞 的 凝 集 作 用 不 能 简单 地 用 转化 细胞 表面 ，PHA 受 体外 露 数目 3 Se 增多 来 解释 。Nicolson (1971) 电子 显微镜 观察 发 现 ， 正 常 细胞 和 转化 细胞 表面 PHA 受 体 的 分 布 不同 。 用 铁 蛋 白 ， A sh Nee 标记 的 ConA 显示 ， 小 鼠 3T3 细胞 表面 ，PHA 受 体 主 ie cen 要 是 随机 分 布 的 ,而 同一 株 细胞 被 SV, 病毒 转化 后 ,标记 有 , “的 ConA 就 集聚 成 伐 的 分 布 。 正常 细胞 经 胰 蛋 白 酶 处 ay B A UE, PHA SkHRBO, MHEIIESHO. 因 413 病毒 转化 的 瘤 细胞 PHA 此 ， 作 者 认为 转化 细胞 PHA SEHR RMA reign: eee a iam g, 胞 表面 PHA 受 体 分 布 变化 , 集 Re 成 He, MATS 3) 重 分 布 机 制 。 《4) 代谢 位 点 ”的 受 体 数目 增多 。 这 又 可 能 反映 了 PHA 受 体 在 瘤 变 或 aR a ry 3 蛋白 酶 处 理 的 细胞 表面 上 的 移动 能 力 增加 (了 Rosenblith 位 点 决定 凝集 。 25 #4 KR TGESH. 坚 等 ，1973) 。 还 有 一 种 可 能 的 解释 是 假定 细胞 表面 的 结合 | 线 区 示 不 活动 。 胰 蛋 白 酶 可 能 激活 ”点 分 两 类 : 一 类 和 植物 血球 凝集 素 结合 ,一 类 管 凝 集 细胞 。 A 位 点 ( 据 Kemp 等 ,1973)。 = ‘ 4 了 前 一 类 结合 点 不 受 温度 影响 , 并 且 在 正常 细胞 和 瘤 细 胞 , 同 样 有 活力 。 后 一 类 结合 点 对 温度 敏感 , 只 有 在 瘤 变 或 蛋白 酶 处 理 时 ， 才 被 激活 (Inbar 全 和风 了 ta ui 定 。120。 体外 单 层 培养 的 正常 细胞 ， 细 胞 密度 达到 饱和 ,彼此 接触 时 ， 细 胞 的 生长 就 停止 了 。 这 一 现象 称 为 生长 的 接触 抑制 。 已 知 这 一 “in 现象 和 细胞 表面 特性 有 密切 关系 。 然而 ， 驯 瘤 细胞 或 病毒 转化 的 瘤 细胞 ， 失 去 了 这 Vv 一 ih cid 种 类 型 的 生长 控制 。 这 表明 瘤 变 过 程 中 ， So 细胞 表面 特性 发 生 了 根本 的 变化 。 肿 交 细 Ke” 胞 的 侵 泣 和 转移 ， 也 都 可 能 和 细胞 表面 特 倒流 ln 性 的 这 种 变化 有 关系 。 4s 。 Burger (1971,b) 实验 表明 ,肿瘤 细 RE 和 3 @ 3T3-E(TK-) 胞 的 这 种 异常 行为 似乎 和 细胞 表面 抗原 的 变化 有 一 定 关系 。 从 图 4-14 可 见 生长 接 SG， 触 抑制 的 丧失 程度 和 细胞 凝集 程度 是 平行 Lot Ht 的 。 因 此 ， 作 者 进一步 假定 转化 细胞 表面 饱和 密度 [细胞 /证 米 : x 10-4] WGA 受 体 的 暴露 和 生长 控制 的 丧失 可 能 “图 4-14 来 源 于 小 鼠 3T3 成 纤维 细胞 的 细胞 株 依赖 细胞 有 关系 * 从 这 一 假说 出 发 ,用 单价 的 Con A SHER MMR. 依赖 细胞 密度 的 生长 处 理 病 毒 转化 的 肿瘤 细胞 ， 掩 盖 表 面 受 体 80 和 5 全 大 天 相 卫 的 -3T2 mie 3112 2 ae 后 ， 细 胞 生长 的 控制 又 恢复 正常 。 这 一 实 ” 变 的 313 细 胸 ，3T3-ECTK-) 为 酶 突变 细胞 株 ，FP 一 验 似乎 支持 上 述 假说 (Burger & Noonan ， jnyegie oT? 抗原 ,但 失去 高 人 和 窗 度 生长 能 力 , 同时 1970) 。 但 是 , 前 面 已 提 到 过 ， 转 化 的 细胞 亦 失 去 凝集 能 力 ( 据 Jansons 和 Burger, 1971), 表面 外 露 的 PHA 受 体 数目 并 没有 变化 ,而 是 分 布 上 有 所 改变 (Sela 等 ，1971) 。 因 此 ， 对 这 一 实验 的 解释 可 能 并 不 正确 。 最 近 的 实验 对 和 蛋白酶 引起 的 细胞 表面 的 变化 和 生 长 控制 的 关系 进一步 提出 了 疑问 。 用 一 种 蛋白 酶 Pronase 处 理 已 停止 生长 的 3T3 细 胞 ， 虽 然 细 胞 被 凝集 素 凝 集 的 能 力 增 加 ， 但 并 不 能 发 动 生长 。 因此 ， 和 蛋白 酶 引起 的 细 臣 表 面 的 凝集 特性 的 变化 和 生长 控制 是 两 回 事 。 如 果 和 蛋白酶 消 化 有 助 于 解除 生长 的 接触 抑制 ， 这 可 能 是 通过 其 他 的 机 制 (Glynn 等 ，1973) 。 总 之 ， 细 胞 表面 某 些 糖 蛋白 (如 PHA 受 体 ) 和 维持 生长 控制 的 关系 ， 还 是 一 个 很 复杂 的 ， 未 完全 解决 的 问题 。 肿瘤 细胞 表面 的 另 一 个 特点 是 有 大 量 唾 酸 存 在 。 恶性 转变 的 细胞 用 神经 氨 酸 酶 处 BARRA. RAE WGA 引起 的 凝集 作用 。 从 大 鼠 腹 水 型 肝癌 细胞 表面 ， 还 分 离 出 一 种 三 酸 糖 多 肽 ， 能 和 WGA 结合 。 这 些 事实 表明 ， WGA 的 凝集 机 制 可 能 通过 唾 酸 。 最 近 ， 进 一 步 的 研究 才 发 现 ，WGA 对 瘤 细 胞 的 凝集 过 程 分 两 步 ， 第 一 步 先 要 和 细 胞 表面 的 唾 酸 非 专 一 的 结合 ， 然 后 才 易 于 和 细胞 表面 的 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 专 一 的 结合 ， 造成 细胞 的 凝集 现象 (Greenaway 和 Levine，1973) 。 对 于 瘤 细 胞 表面 特性 的 了 解 ， 对 于 控制 肿瘤 是 有 实践 意义 的 。 用 神经 氮 酸 酶 处 理 瘤 细胞 可 以 增强 细胞 的 抗原 性 ， 能 使 被 免疫 的 动物 获得 免疫 力 ， 部 分 地 或 全 部 地 抑制 肿瘤 块 的 生长 ， 使 实体 性 肿瘤 消退 。 胜 瘤 的 免疫 治疗 在 理论 上 遇 到 许多 困难 ， 其 中 一 个 困难 是 肿瘤 专 一 表面 抗原 〈 或 称 肿瘤 专 一 移植 抗原 TSTA) 的 抗原 专 一 性 是 每 一 肿瘤 各 不 相同 的 ， 因此 对 一 种 肿瘤 有 效 的 抗体 对 其 他 肿瘤 就 可 能 没有 作用 。 是 否 能 制造 对 所 有 或 许多 种 肿瘤 细胞 都 有 效 的 抗 肿瘤 的 疫苗 昵 ? 从 理论 上 考虑 ,既然 几乎 所 有 瘤 细胞 表面 都 有 WGA 受 体 ， 就 有 可 能 利 用 WGA 受 体 , 合 成 对 许多 肿瘤 有 效 的 ”人 工 肿 瘤 抗原 ”。 最 近 有 人 在 这 方面 作 了 有 趣 的 举 e 121。 it (Shier, 1971). BA] WGA 和 细胞 表面 专 一 受 体 的 结合 点 壳 双 糖 ,并且 从 瘤 细 胞 表面 分 离 出 来 的 WGA 受 体 已 证 明 是 含有 N- 乙 酰 氮 基 葡萄 fe AY §§ & EK (Burger. 1969). 所 有 已 知 可 溶性 糖 蛋白 中 ， 当 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 位 于 糖 和 多 肽 连接 处 时 ， 都 是 以 8-D- 糖 彰 键 和 工 -天 门 冬 氮 酸 的 胺 基 连 接 。 因 此 ， 可 以 假定 WGA 受 体 的 部 分 结构 如 he: | | —CH—CO—NH—CH—CO—NH—CH— Ai A — S814 FY WE AS FR-1- JZ RABWE, - CH,OH T= et yk "Nam en wer | ane | ? 合成 "人 工 肿 瘤 抗原 ”， —NH—CH—(NH—CH—CO)x—(NHCH—CO—)y | | | —CH,HCOCH, CH, ZRIAIZ ARH Pe UP Seer rae aoe ine 二 -0 OV. hy a OH » o | OH > cual [rey CH, COONa “A” ila 用 这 种 “人 工 肿瘤 抗原 ?免疫 小 鼠 后 ， 对 几 种 不 同 种 类 的 肿瘤 均 表 现 出 一 定 程 度 的 杀伤 作 用 。 这 一 实验 还 是 很 初步 的 ， 可 以 说 还 是 “模式 实验 ”。 严格 说 来 ， 应 先 从 肿瘤 细胞 找到 专 一 的 表面 抗原 决定 复 , 测定 其 结构 , 然后 才 谈 得 上 模拟 合成 。 然 而 ， 这 一 实验 毕竟 还 是 很 有 启发 性 的 。 它 说 明 肿 瘤 的 表面 抗原 特性 ， 以 及 许多 肿瘤 共同 的 特异 的 表面 抗原 的 探 寻 , 分 离 ,提纯 和 结构 的 研究 ， 是 免疫 化 学 家 们 面临 的 一 个 非常 引 人 注 目的 重要 任务 。 我 们 将 在 讨论 正常 细胞 的 表面 抗原 后 再 回 到 这 一 问题 。 三 、 红 血球 膜 上 的 血型 抗原 如 81 页 所 述 ， 人 类 红血球 膜 上 含有 许多 血型 抗原 ， 其 中 A、B、 抗原 和 Le’, Le’ 抗原 主要 是 以 糖 脂 形 式 存在 于 膜 上 ， 而 M\N 抗原 是 以 糖 蛋白 形式 存在 于 膜 上 。 红 血球 谎 的 抗原 构造 很 复杂 。 除 血型 抗原 外 ,已 经 研究 过 的 以 糖 脂 形式 存在 的， 如 Fors- sman 抗原 等 , 以 糖 蛋 白 形 式 存在 的 ， 如 植物 血球 凝集 素 受 体 、 病 毒 受 体 等 ( 表 4-4) 。 由 TO RA 人 红血球 细胞 膜 上 已 发 现 的 抗原 系 BE 专 一 抗 血 清 测定 的 抗原 化 学 性 i 异 嗜 性 抗原 Forssman 糖 脂 物种 专 一 [ 蛋 自 质 (? ) ABO AuB,H le. aA M,N,S.d M,N3S.ssUsMgoM,Tm, Be dE Ah 16 fh BEA P P,,PX,Luke KA Rh D,C,c,C*,C*,E.e, Best fh 13 种 糖 脂 (? ) Lutherian Lu*, Lu® 糖 蛋白 (? ) Kell K,k,Kp*,Kp®, Js*, Js° 未 知 Lewis . Le®, Le® 糖 脂 Duffy Fya,Fyb 未 知 Kidd yk, Jk 未 知 Diego Dis,Dib 未 知 (#2 Nowotny, 1972), 于 取材 方便 ， 红 血球 细胞 膜 的 抗原 结构 研究 最 早 ， 也 最 广泛 ， 可 作为 一 般 细 胞 的 代表 。 (—) ABH 和 Let, Leb 系统 血型 抗原 及 有 关 的 糖 脂 根据 Watkin (1972) 等 的 研究 ， 人 红血球 膜 上 有 在 型 专 一 性 的 糖 脂 ， 按 前 体 物 糖 BAAR, 分 为 两 个 不 同 的 系列 。 糖 链 2 型 (乳糖 -N- 新 4 糖 ) 系列 不 能 产生 Le* 和 Le? 抗原 (图 4-15) 。 和 分 泌 的 血型 物质 比较 ， 红 血球 膜 上 的 血型 糖 脂 ， 其 糖 链 末端 几 个 残 基 是 和 血型 物 质 相同 的 ， 它 们 决定 血型 的 专 一 性 ， 合 成 它们 的 基因 控制 也 是 相同 的 (Watkin，1972) 。 所 不 同 的 是 血型 糖 脂 的 糖 链 通过 脑 脂 胺 (Ceramide) 和 膜 上 的 臣 水 结构 相连 , 因而 是 不 YE; 血型 物质 的 糖 链 则 是 通过 丝氨酸 或 苏 氮 酸 残 基 和 多 肽 链 相 连 ， 因 而 是 可 溶 的 ， 分 泌 性 的 。 新 近 有 人 从 A 型 红血球 膜 分 离 出 一 个 糖 脂 蛋白 ， 约 占 膜 蛋 白 总 量 的 9% ， 分 子 量 大 于 250,000。 提 纯 的 这 一 糖 脂 蛋白 A 型 抗原 的 比 活力 比 原来 的 纯 细胞 膜 强 九 倍 (Davis 和 Bakerman，1972) 。 很 可 能 血型 糖 脂 是 和 膜 上 载体 蛋白 相连 ， 多 糖 抗 原 决 定 往 露 在 牙 的 外 表面 。 利 用 铁 蛋 白 标记 的 抗 A 抗体 研究 ， 证 明 抗 原 存 在 于 膜 的 外 表面 的 颗粒 上 。 多 糖 末端 酶 解 后 ， 就 失去 抗原 活力 。 因 此 , 多糖 血 型 抗原 决定 簇 , 可 能 通过 脂 质 的 臣 水 部 分 和 膜 上 的 固有 和 蛋白 结合 。 Bz, ABH 血型 抗原 载体 是 以 脂 蛋 白 形 式 参加 红血球 膜 的 构造 (图 4-16) 。 不 过 也 有 证 据 表 明 ABH 血型 抗原 还 可 以 糖 蛋白 形式 存在 于 膜 上 (Ko- scielak，1973) 。 最 近 发 现 一 个 新 的 糖 脂 前 体 ， 可 能 通过 两 条 互相 竞争 的 代谢 支 路 ， 一 条 支 路 是 和 糖 连接 形成 A、B、 互 抗原 ; 另 一 条 支 路 是 和 唾 酸 连 接 ， 无 抗原 活性 。 由 于 局 一 支 路 的 存 在 ， 在 某 些 白血病 的 白血球 上 导致 血型 抗原 的 丧失 (Kogcielak，1973) 。 21236 一 ”Gal. B. 1,3. GlcNAc. 6. 1,3 Gal. 6. 1,4 Gleg. 1, 1 脑 脂 胺 — +eRe 乳糖 -N- 四 糖 脑 脂 胺 Gal. 68. 1, 3. GlcNAc. 8. 1, 3. Gal. 8. 1,4. Glc. A_1, 1 eRe AR 4 a | Lea 糖 脂 +ERe Fuc (Fuc) Gal. 6. 1, 3. GlcNAc. B. 1,3. Gal. 8B. 1,4. Gle. @. 1,1 脑 脂 胺 2 4 Lee] a| Le” 糖 脂 Fuc Fuc Gal. 6. 1,3. GlcNAc. 8. 1,3. Gal. 6. 1,4. Gle. 8. 1,1 脑 脂肪 2 H 糖 脂 [+ N- 7, Mig et ALS GalNAc. a. 1,3. Gal. 8. 1,3.°GlcNAc. B. 1,3. Gal. B. 1, 4. Gle. B. 1,1 SARE 2 a| A tails Fuc —> Gal. a. 1, 3. Gal. 6. 1, 3. GleNAc. B. 1, 3. Gal. B. 1,4. Gle. 6B. 1, 1 脑 脂 胺 2 a | B 糖 脂 Fuc ft 284K + a) 糖 链 1 Gal. 6. 1,4. GleNAc. 8. 1,3. Gal. 8. 1, 1 fpeAbHe 岩 菠 糖 乳糖 -N- 新 四 糖 脑 脂 胺 Gal. 8. 1, 4. GlcNAc。p. 1, 3. Gal. 6. 1, 1 脑 脂 胺 2 E 糖 脂 a| Fuc + N-C RRB FL g,| GalNAc. a. 1,3. Gal. 8. 1,4. GleNAc. @. 1,3. Gal. B. 1,4. Gle. B. 1,1 Balla 2 Ci A 糖 脂 Fuc ——» Gal. a. 1, 3 Gal. B. 1, 4. GlcNAc. 8. 1, 3. Gal. 6. 1, 4. Gle. 8. 1,1 jpiHB B 糖 脂 b)， 糖 链 2 型 《不 能 产生 Lewis 抗原 ) 图 4-15 红血球 膜 A，B，H，Les 和 Le? 系统 的 糖 脂 的 结构 , 按 前 体 物 糖 链 的 不 同 分 为 两 个 系列 CB Watkins, 1972), EGER aoe EAM wwww 脂 质 O-O ih 图 4-16 血型 抗原 载体 ( 脂 蛋 白 ) 参 与 红血球 膜 的 构造 模型 ( 据 Davis 和 Bakerman. 1972), 除 血 型 抗原 糖 脂 外 ， 人 红血球 膜 的 中 性 糖 脂 部 分 还 含有 许多 糖 脂 ， 都 含有 -Glu-p- 1,1- 脑 脂 胺 的 共同 构造 ， 总 称 为 球 昔 脂 “〈Globsides) 。 几 种 重要 的 球 苷 脂 见 图 4-17. & 名 的 异 嗜 性 抗原 〈Forssman 抗原 ) 的 半 抗 原 〈 见 87 页 ) 也 属于 这 一 类 , 它 同 样 可 能 通过 ©1246 Gle. 8. le Le 脑 脂 胺 葡萄 糖 脑 脂 胺 Gal.B. 1.4. Glc.。8. 1.1. 脑 脂 胺 细胞 脂 匡 Gale 1.4. Gal. 8. 1.4. Glc。86. 1.1 脑 脂 胺 HOA Ae = a Gal. NAc. 6. 1.3. Gal. a1. 4. Gal. 61.4. Gle. 61.1 脑 脂 胺 球 昔 脂 1( 细 胞 脂 K) NANAa@. 2.3. Gal. 8. 1.4. Gle. 81.1， 脑 脂 胺 m4 $F HS NANA. Gal. Gle.. 脑 脂 胺 神经 节 埋 脂 GM3 GalNAc. Gal. Glc. 脑 脂 胺 神经 节 昔 脂 GM2 NANA Gal. GalNAc. Gal. Gle. 脑 脂 胺 eA 5+ ig GM1 NANA 图 4-17 红血球 膜 的 一 些 糖 脂 (在 其 他 细胞 类 型 也 可 能 存在 )。 脑 脂 胺 和 膜 上 的 载体 蛋白 相连 接 。 这 些 糖 脂 还 可 能 在 其 他 细胞 表面 存在 并 在 病理 过 程 中 发 生 典 型 的 变化 。 某 些 中 枢 神 经 系统 的 遗传 性 疾病 ， 缺 少 8-D-N- 乙 酰 已 糖 胺 酶 ， 神 经 节 苷 脂 GM2 不 能 降解 ,结果 便 积聚 在 神经 原 内 ， 成 为 这 种 病 的 典型 特征 (Okada 和 Brien，1969) 。 病 毒 诱发 的 瘤 变 过 程 中 ， 除 GM3 外 ， 链 长 更 长 的 神经 节 苷 脂 的 合成 受阻 (Brady, 1973b) 。 化 学 诱 变 时 ， 则 略 有 不 同 ，GM2 占 优势 。 某 些 肝 癌 也 是 低级 的 神经 节 背 脂 占 优 势 。 有 人 发 现 正常 细胞 生长 密度 增加 时 ， 糖 脂 链 长 也 增加 ， 而 在 病毒 引起 瘤 变 过 程 中 ， 这 种 效应 就 消失 了 (Hakomori，1970) 。 伴 随 糖 脂 链 的 缩短 ,细胞 表面 的 接触 抑制 也 消失 了 。 这 表明 细胞 表 面 糖 脂 的 变化 ， 也 和 细胞 的 行为 有 一 定 的 关系 。 总 之 ， 这 说 明 瘤 细胞 生长 接触 抑制 的 消 失 , 很 可 能 是 细胞 表面 特性 的 多 方面 改变 的 结果 。 (=) MLN 血型 抗原 及 有 关 的 糖 蛋白 M.N 系统 是 发 现 的 第 二 个 人 类 血型 系统 ， 受 两 个 等 位 基因 控制 。 人 红血球 经 神经 氢 酸 酶 处 理 便 失 去 M、N 抗原 专 一 性 ， 以 及 和 流 感 病毒 结合 的 能 力 ; 同时 释放 出 N- 乙 酰 神经 氧 酸 (NANA), 另 一 方面 ， 遗 传 上 病毒 受 体 和 M，KN 抗原 受 同 一 基因 座 控 制 。 这 8000° 5000° —2000° 一 4000? 图 4-18 人 血型 抗原 和 病毒 受 体 的 远 紫 外 旋光 色散 光谱 。 〈CA825) 红血球 膜 的 NN 血型 抗原 和 病毒 受 体 。 (CAI014) 红 血球 膜 的 MM 血型 抗原 和 病毒 受 体 。 (CA 851) MIRRORS Ve 血型 抗原 和 病毒 受 体 作为 无 构象 秩序 性 的 例子 CE Jirgensons 和 Springer, 1968), ©1256 表 4-5 A O, MM 和 O, NN 血型 抗原 的 离 体 活力 对 分 子 量 的 依赖 SS Sm TT 完全 抑制 用 四 倍 凝 集 剂 量 引 起 O 型 红 ee ES 血球 凝集 所 需 的 最 低 量 (微克 /毫升 六 人 血清 流感 病毒 PR8 抗 -M #H-N MM Ca 979 L256 LO" 1 0.05 Ca 980 6X 10° 3 0.2 Ca 1014 1.8X 10° 5 90.8 NN Ca 825 5.9X10° ” 10 1.5 Ca 745 1.5 10° 50 “ M,N 3.1% 10* 500 3,500 10 * 1 WeEnAR aatAa me. ee SiH, MLN 血型 抗原 和 流感 病毒 受 体 有 共同 的 分 子 基础 。 已 知 禾 草 豆 (Vicia graminia) 凝集 素 有 和 血型 抗原 结合 的 专 一 性 8s M、N 型 红 血球 经 神经 氨 酸 酶 轻 度 处理 时 ,去 除 唾 酸 ， 便 失去 M 专 一 性 ， 同 时 出 现 N SH. KR FAN 可 能 是 M 的 前 体 物 。 此 外 ,大 肠 杆菌 的 6- 半 乳糖 糖苷 酶 可 破坏 N 抗原 专 一 性 ， 表 明 8-D- 半 乳糖 吡 喃 糖 基 可 能 是 和 禾 草 豆 凝 集 素 反应 的 优势 抗原 决定 簇 ( 见 表 4-2)。 M、N 血型 抗原 的 化 学 性 质 是 糖 蛋 白 。 随 采 用 的 从 膜 上 离 解 下 来 的 方法 的 剧烈 程度 不 同 ， 得 到 的 制品 的 分 子 量 相差 很 ae 远 。 用 蛋白 酶 处 理 ， 得 到 的 分 子 量 约 为 .30,000。 用 较 刘 和 的 分 离 方 法 ， 得 到 的 分 子 量 约 为 150,000 到 12,000;000， 这 可 能 接近 在 膜 上 存 在 时 的 分 子 大 小 。 血 型 抗原 活力 及 抗 病毒 活力 和 分 子 量 有 一 定 关系 ， 分 子 量 增加 , 活力 也 升 高 ( 表 4-5)。 根据 旋光 色散 ， 圆 二 色谱 分 析 ， 红 血球 膜 M、N 抗原 和 病毒 受 体 分 Beal ey 子 ， 有 16% o- 螺 旋 及 广泛 的 构 Neat Gee 象 。 分 子 量 减 小 ， 构 象 的 秩序 性 也 减少 (图 4-18) 。 这 说 明 抗原 专 一 a Bae a 性 和 活性 是 不 同 的 。 前 者 仅仅 和 优 a DRERAKA, MARBLES 图 4-19 A AL iM ERI BES AA Tih AR Fea FE BY RR 抗原 大 分 子 的 构象 的 影响 (Sprin- Winzler, 1972), 造 〈 据 Winzler ) ger “, 1971, 1972). FRE ARE M, NSH, RAW KAREN BSE (DF 1x 10‘), 80% SHR, 20% SAM, 而 不 溶 的 细胞 膜 残 酒 只 含 3% 多 糖 。 和 细胞 膜 原 料 、 残 秸 比较， 可 溶性 多 肽 所 含 的 Ser, Thr 要 丰富 得 多 ，Asp hi RS, Aid HAE 氨基 酸 (Winzler, 1972), At, 假定 原来 膜 上 的 抗原 糖 蛋白 大 分 子 可 能 具有 不 对 称 的 es。 126。 CO,H HOC 200 4 2 3 2 Pardee & #2 Marchesi 等 if2 Morawieki & Uhlenbriick (1971) (1972) Winzler 4-20 人 红血球 膜 主 要 糖 蛋 白 的 几 种 建议 构造 。(1) Pardoe 和 Uhlenbritck (1971) 模型 ,依据 酷 抗 原 及 有 关 构 造 的 免疫 化 学 定位 研究 © MN 血型 抗原 决定 簇 更 靠近 亲 水 的 N 端 。 流 感 病毒 受 体 (MYXO) 位 于 更 靠 C 端 的 地 方 。U 和 SS 抗原 系统 位 于 易 被 蛋白 酶 酶 解 的 “连接 ?区 。(@) 代表 神经 氨 酸 基 轩 。 分 子 之 无 抗原 性 的 、 芯 水 的 “ 尾 ” 部 呈 5- 螺旋 构造 。 (2) Marchesi 等 (1972) 模 型 ,依据 CNBr 裂解 断 片 的 化 学 分 析 〈C1 一 5 断 片 )。 分 子 的 亲 水 部 分 标记 的 地 方 易于 被 胰 和 蛋白 酶 酶 解 。C 端 深 埋 在 膜 内 ,N 端 未 被 取 代 。 (3) Morawicki(1964) 和 Winzler(1972) 模型 ,蛋白 有 亲 水 的 “ 头 2? 和 臣 水 的 “ 尾 ?。 糖分 布 在 头 部 ,靠近 和 N 端 ( 据 Cook 和 Stoddart, 1973), 构造 ， 糖 及 其 他 亲 水 性 残 基 和 了 朴 水 性 残 基 各 自 集 中 在 分 子 的 两 端 。 低 聚 糖 集中 在 分 子 的 亲 水 端 ， 位 于 细胞 表面 ， 易 于 被 酶 解 。 朴 水 端 埋 在 膜 内 , 酶 处 理 时 ， 因 而 留 在 膜 残 酒 内 ， 不 释放 出 来 。 此 可 溶性 糖 多 肽 经 碱 处 理 释 放出 一 个 四 聚 糖 ， 结 构 如 图 4-19 所 示 。 这 一 低 聚 糖 是 MM, MN, NN 红血球 共有 的 ,没有 证 据说 明 参 与 血型 抗原 决定 纂 的 组 成 ， 但 可 能 和 病 毒 结 合 有 关系 (Cook 和 Eylar, 1965). 1 根据 这 些 实验 事实 ，Winzler (1972) 提出 红血球 细胞 膜 的 主要 糖 蛋白 的 结构 模型 (图 4-20; 3)， 多 糖 集中 分 布 在 分 子 的 N 端 ， 形 成 亲 水 的 头 段 ， 露 在 细胞 膜 的 外 表面 ， FRM: TKO BR (Ci), ， 深 理 在 细胞 膜 内 ， 靠 芒 水 性 相互 作用 ， 和 膜 紧密 的 结 合 。Marchesi 等 (1972) 用 二 夏 水 杨 酸 锂 法 ， 从 红血球 膜 分 离 出 的 大 分 子 糖 蛋白 ， 经 CNBr WRAY. ARI, KREMER ARM Ht, BSR 水 性 残 基 集 中 在 靠 N HOHE, HEAD NEAL Pee SR 〈 图 4- 。127。 “N ™ , Cees. HOXCHO ee H OOO Mm. SOGomoOoOSOvoOeooOoCOoeed i ee GLy) Eno: CN Euag ™ cay. . 0 Eun Gun ‘CHO 50 60 COSSCOOMOCOCOOSOM UCDO CO SOCSTCOSSCOSSOSCCE OS Al4-21 人 红血球 MN 血型 糖 蛋白 〈Glycophorin A) 的 氨基 酸 排列 顺序 。 CHO, (KA. CO) O— 糖 昔 键 连接 : (CO) N 一 糖苷 键 连接 ( 据 Tomita 和 Marchesi, 1975), 20 40 60 80 100 120 131 胰 凝 乳 蛋白 酶 | ,CH1 CH6 人 CH4 tonsil | CH2 CH3 | 胰 蛋 白 酶 | Tl t ane T6 a T4 | | TZ: tral 一 -一 一 一 一 上 | < dTIT2 dT5 2 TIC1 pK r 图 4 -22 ”人 红血球 MN VRS MERA MK RRA GE Tomita 和 Marchesi, 1975), 20; 2). Pardoe 等 (1971) 根据 多 糖 抗 原 及 有 关 构 造 的 免疫 化 学 定位 方法 ， 证 明 .MN 应 型 抗原 靠近 糖 蛋白 大 分 子 的 亲 水 的 N 端 ， 而 分 子 疏 水 的 “尾部 ”， 呈 x- 螺 旋 构 造 ， RA 抗原 性 (图 4-20; 1). 从 图 4-20 可 见 ， 用 三 种 不 同 的 方法 得 出 糖 蛋白 分 子 构造 模型 是 大 体 上 相似 的 ， 这 表明 它 可 能 反映 真实 的 构造 。 根 据 这 一 模型 ， 可 以 解释 M、N 系统 ， 以 及 某 些 罕见 的 血型 亚 型 的 复杂 情况 ， 可 以 假定 M、KN 抗原 决定 簇 位 于 多 肽 链 的 亲 水 性 * 128。 N 端 ， 某 些 罕见 的 亚 型 (如 Me9 的 决定 簇 也 可 能 位 于 同一 区 域 ， 流 感 病毒 受 体 可 能 位 于 更 靠近 C 端的 地 方 ,不 过 仍然 处 于 易 被 酶 解 的 区 域 。U 和 S 抗原 系统 可 能 存在 于 分 子 亲 水 部 分 和 朴 水 部 分 的 “连接 区 ”， 仍 然 对 蛋白 酶 敏感 的 区 域 。 抗原 U 可 能 包括 多 肤 链 x-- 螺旋 区 的 开头 部 分 , 而 在 罕见 的 “u” 型 个 体 ，S,s 决定 簇 的 侧 链 “ 倒 转 >， 不 再 位 于 最 上 端的 位 置 。 分 子 尾部 的 w- 螺 旋 构 造 的 大 部 分 ， 虽 然 本 身 和 抗原 专 一 性 没有 关系 ， 但 可 能 和 维持 整个 分 子 的 构象 有 关系 ， 因 而 也 可 能 间接 地 影响 抗原 活力 的 大 小 。 现在 已 经 把 MN 血型 抗原 从 人 红血球 膜 上 分 离 出 来 ， 定 名 为 血型 糖 蛋白 A (glyco- phorin A)， 并 且 测 定 了 全 部 一 级 结构 (图 4-21) (Tomita 和 Marchesi，1975) 。 血 型 ， 糖 蛋白 有 是 二 个 唾 酸 糖 蛋白 ， 分 子 量 为 31,000, 道 尔 顿 。 它 是 由 131 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 二 条 单 链 ， 含 有 16 个 低 聚 糖 残 基 ， 糖 链 部 分 约 占 分 子 总 体积 的 60 % 。 分 子 一 级 结构 的 主要 特点 是 所 有 的 低 聚 糖 链 都 集中 在 靠 N 端的 一 段 肽 链 上 ， 而 C 端 则 有 很 多 MEA 基 酸 形成 团 簇 状 ， 可 能 易于 和 阳离子 (如 Catt 等 ) 或 碱 性 多 肽 结合 。 多 肽 链 的 中 段 (从 73 到 92 RA) 约 包括 20 TEMBER, AMDB. 血型 糖 蛋白 A 的 一 级 结构 的 这 些 特 点 提示 ， 分 子 的 两 端 可 能 分 布 在 细胞 膜 两 侧 的 表面 上 ， 与 亲 水 基 团 相互 作 用 站 中 间 二 段 肽 链 则 可 能 横贯 膜 的 脂 双 分 子 层 (图 4-22) 。 这 和 图 4-20 的 分 子 模型 是 完 全 符合 -- 致 的 。 最 近 ， 还 进一步 发 现 M，NN 两 个 等 位 基因 决定 血型 糖 蛋白 A 氨基 酸 排 列 顺 序 上 两 个 位 置 的 差异 。 血型 糖 蛋白 A 在 1 和 5 的 位 置 为 Ser 和 GIy， 而 血型 糖 EA A” 的 相应 位 置 则 被 Leu 和 Glu 所 代替 。 这 一 事实 可 以 解释 图 4-21 中 1 和 5 置 氨 基 酸 残 基 的 不 均一 性 (Furthmayr, 1973), 最 后 ,还 需要 指出 ， 血 型 糖 蛋白 A 上 的 寡 聚 糖 链 和 红血球 膜 MN 抗原 性 有 关 。 但 是 ， 当 低 聚 糖 从 膜 上 分 离 下 来 后 ， 就 不 能 表 Hl MN 抗原 性 说 明 抗 原 性 还 依赖 多 肽 链 上 的 氨基 酸 残 基 参 加 。 对 于 Rh 抗原 的 了 解 ， 比 MN 系统 还 要 少 得 多 。 近来 才 有 人 用 脱氧 胆 酸 把 Rh(D) 抗原 内 人 大 红血球 膜 上 溶解 下 来 。 这 样 初步 分 离 的 膜 蛋 白 重 聚 成 小 泡 时 ， 仍 表现 出 专 一 的 Rh 抗原 活力 (Lorusso 和 Green，1975) 。 (=) 红血球 膜 上 抗原 的 空间 分 布 血型 抗原 在 膜 上 的 空间 分 布 ， 对 于 了 解 细胞 膜 的 结构 是 很 重要 的 。 应 用 电子 显微镜 六 冻 蚀 刻 技术 (Freeze-etching Technique) ， 可 以 直接 观察 膜 的 外 表面 以 及 膜 的 内 部 的 大 分 子 结构 。 标 本 先 经 深 低 温 处 理 ， 使 芷 水 键 大 大 减弱 ， 因 而 切片 时 裂 面 总 是 沿 脂 双 层 芯 水 区 中 间 辟 开 ， 把 细胞 膜 斯 成 两 层 , 露出 疏水 的 裂 面 (图 4-23， 上 ) 。 膜 的 天 然 外 表面 可 通过 蚀刻 步骤 ， 使 永和 升华 而 显露 出 来 (图 4-23， 下 ) 。 然 后 再 经 过 金属 投影 、 制 成 铂 摹 本 等 手续 ， 便 可 供电 子 显 微 镜 观 察 。 经 过 冰冻 蚀刻 处 理 ， 人 正常 红血球 (Ar 型 ) 膜 的 裂 面 上 可 观察 到 约 85A 大 小 的 球形 颗粒 ,在 膜 上 均匀 的 分 布 。 这 些 球形 颗粒 显然 是 埋 在 膜 内 的 。 如 果 细 胞 膜 经 过 蒸馏 水 处 理 ， 这 些 球形 颗粒 便 簇 集 成 团 , 裂 面 (F) 上 便 清楚 地 区 SHIRA MAK, MEA CE) 上 则 呈现 粗糙 区 (图 4-24，a) 。 用 铁 蛋 白 标 记 的 抗 入 抗体， 能 专 一 地 和 蚀刻 面 上 的 这 些 球形 颗粒 结合 ， 证 明 它 们 就 是 A 抗原 所 在 的 位 置 (图 4-24，by,c) 。 根据 其 他 方法 估计 ， Ai 红血球 的 抗原 位 点 的 数目 约 为 8 一 11 x105， 直接 观测 到 的 膜 上 颗粒 数目 约 为 6.2 x105 (或 4,200 /um? 膜 面积 ) ,两 者 大 体 上 是 符合 的 e 129 oe ; . 蚀刻 4-24 冰冻 蚀刻 的 人 A. 型 红血球 膜 , 用 铁 蛋 白 抗 体 结 合 物 直接 标记 A 抗 原 位 点 (aX75,060, b, C 图 4-23 ”冰冻 蚀刻 步骤 。 上 图 示 经 深 低 130,000) ii (E) MPAA. ER ii Wh FEA HR. DA A. A i =) RE PALE CHCA)» 而 在 蚀刻 面 上 这 些 .颗粒 来 埋 在 膜 内 的 球形 颗粒 在 裂 面 (FE) 上 部 突出 , 呈 粗 糙 区 (CC 中 ,线条 范围 内 区 域 )。 蚀 刻 面 粗 分 露出 。 下 图 示 进 一 步 使 冰晶 升华 , 冰 层 料 区 的 轮廓 是 和 有 裂 面 上 颗粒 往 沟 通 的 。 标记 抗体 上 降低 露出 粗糙 的 “ 刻 蚀 2? 表面 (CE) GE 的 铁 和 蛋白 分 子 (圆圈 ), 亦 即 A 抗 原 位 点 》 是 和 蚀刻 面 Marchesi 等 ,1971; da Silva, 1971), 上 突起 的 膜 颗 粒 结合 的 〈da Silva 等 ，1971)。 (daSilva 等 ，1971; Howe 和 Bachi, 1973). 用 免疫 电子 显微镜 技术 ,观察 到 红 血 RO. RACE, 细胞 表面 血型 抗原 的 密度 逐渐 增加 。 这 也 许可 以 解释 年 青 的 和 成 熟 的 红血球 ， 对 免疫 溶血 的 敏感 度 为 何不 同 的 缘故 (Skatelsky 4, 1974; Reyes,1974). 用 铁 蛋 白 标 记 的 植物 血球 凝集 素 (PHA-F) 和 流感 病毒 (FLU) ， 显示 其 受 体 (已 知 为 糖 蛋 白 ) 在 红血球 膜 内 的 分 布 ， 同 样 证 明 各 种 受 体 是 和 膜 内 颗粒 的 分 布 一 致 的 。 当 红 血球 膜 经 过 胰 和 蛋白酶 处 理 后 ， 膜 内 颗粒 便 簇 集成 网 状 ， 用 PHA-F 显示 PHA 受 体 的 分 布 也 相应 地 呈 网 状 ( 图 4-25; 4-26) (Marchesi 等 ,1971) 。 流 感 病毒 (FLU) 能 和 同 一 糖 蛋白 分 子 的 唾 酸 残 基 结合 。 病 毒 和 膜 结 合 时 ， 结 合 的 地 方 凹 陷 下 去 ， 结 果 有 裂 面 上 便 留 下 一 个 “印迹 ”。 根 据 这 个 “印迹 ”就 可 以 确定 病毒 原来 在 膜 上 结合 的 位 置 。 当 用 度 感 病 毒 处 理 经 过 胰 酶 作用 的 红血球 膜 时 ， 病 毒 在 膜 上 的 “印迹 ”， 只 留 在 有 球形 颗粒 往 集 的 地 方 。 这 也 就 是 说 病毒 只 和 这 些 簇 集 的 颗粒 部 位 结合 (图 4-27) 。 因 此 ， 可 以 做 出 结论 ， 各 种 PHA 和 病毒 受 体 也 是 和 这 些 膜 内 颗粒 相 联系 的 。 这 些 球形 颗粒 也 应 含有 糖 蛋白 。 综合 用 电子 显微镜 和 化 学 方法 ， 对 血型 抗原 、PHA 和 病毒 受 体 的 研究 结果 时 ,可 以 作出 结论 ， 这 些 糖 蛋白 或 糖 脂 蛋白 是 和 膜 内 球形 颗粒 有 密切 关系 的 。 根 据 这 些 实验 结果 ， 可 以 设想 红血球 的 这 些 主要 表面 抗原 是 散布 在 膜 内 的 球形 的 糖 蛋白 或 糖 脂 蛋白 大 分 子 上 的 。 这 些 分 子 具 有 不 对 称 的 构造 分子 的 主要 抗原 决定 簇 ,集中 在 多 肽 链 亲 水 性 的 端 ， 露出 在 膜 的 外 表面 ， 因 而 易 和 抗体 、PHA 或 病毒 结合 并 被 酶 解 。 分 子 的 朴 水 部 分 ,存在 othe RA p- 构 象 ?) ， 形 成 球形 构造 ， 通 过 下 水 性 相互 作用 和 膜 牢固 的 结合 ， 蛋 在 脂 双 层 内 。 冰 冻 蚀 刻 时 , 膜 裂 成 两 层 ， 因 而 部 分 地 暴露 出 来 (图 4-28) 。 或 许 还 可 以 设想 ， 。130 。 Ath a 4-25 ee ra REA Rt AY A So un ERR eT ok ES RL HE RDA: (PHA-F) Se 0 6 UH SESH 的 定位 ，PHA 受 体 呈现 网 状 分 布 (X150,000)( 据 Marchesi 34,1971), be t : + PHA-F @ TRYPSIN pal ay 4 7 + PHA-F me Sat 9 : 426 红血球 膜 PHA 受 体 的 定位 。 带 有 PHA 受 体 的 糖 蛋白 外 露 在 细胞 外 表面 ， — 并 和 膜 内 颗粒 连接 ( 据 Marchesi 451971), nae i) RK 5 六、 ee eae ie 二 sali 图 4-27 红血球 膜 先 经 胰 酶 处 理 使 颗粒 签 集 , 再 加 流感 病毒 。 病 毒 和 膜 结合 留 下 的 “印迹 ?只 限于 膜 内 颗粒 簇 集成 团 的 区 域 ,光滑 区 域 没 有 病毒 结合 。 了 膜 的 外 表面 上 还 可 看 见 完整 的 病毒 (X55,000)( 据 Marchesi 等 ,1971)。 na «131° ee es 图 4-28 血型 抗原 及 PHA 受 体 在 红血球 膜 上 的 构造 示意 图 。 糖 蛋白 的 亲 水 部 分 露 在 外 表面 ， 能 和 标记 抗体 结合 。 埋 于 膜 内 的 球形 颗粒 相当 于 分 子 的 臣 水 部 分 ， 在 冰冻 蚀刻 的 裂 面 上 部 分 地 暴露 出 来 〈 据 Marchesi, 1971), 膜 上 的 每 一 个 球形 颗粒 (70 一 80A) 连同 其 亲 水 性 的 糖 多 肽 链 ， 构 成 一 个 天 然 的 “抗原 结 构 单位 >， 它 们 还 可 能 担负 着 目前 还 未 知 的 其 他 功能 。 由 于 “抗原 结构 单位 2 的 各 组 成 部 分 和 细胞 膜 结合 的 牢固 程度 以 及 所 处 的 空间 位 置 不 同 ， 用 不 同 的 方法 分 离 、 提 取 时 , 这 些 组 成 部 分 便 不 同 程度 地 从 膜 上 “溶解 >? 下来。 因此， 得 到 一 系列 分 子 量 大 小 不 同 的 抗原 制 品 。 低 活 液 或 酶 处 理 时 ， 球 形 颗粒 在 膜 上 移动 , 簇 集成 团 , 说 明 膜 结构 的 动态 性 质 。 总 之 ， 所 有 这 些 事实 都 是 和 细胞 膜 的 流动 锐 骨 横 型 相 容 的 。 从 这 些 结论 得 出 的 关于 细胞 表面 抗 原 结构 的 概念 以 及 研究 方法 ， 或 许 对 于 研究 其 他 细胞 的 表面 抗原 ,也 是 可 以 引 为 借鉴 的 。 、 组 织 相 容 性 抗原 组 织 相 容 性 抗原 ,或 移植 抗原 , 是 决定 细胞 生物 学 个 性 的 主要 标记 。 由 于 这 些 抗原 的 存在 ， 同 一 物种 某 个 体 的 组 织 移植 到 另 一 在 抗原 组 成 上 不 相 容 的 个 体 时 ， 就 会 引起 免疫 反应 ， 导 致 移植 物 加 速 排斥 。 和 这 些 抗原 形成 有 关 的 许多 基因 ， 称 为 组 织 相 容 性 基因 。 它们 在 染色 体 上 的 位 点 ， 称 为 组 织 相 容 性 基因 座 ( 简 称 再 -基因 座 ) ,每 一 基因 座 上 又 有 一 系列 等 位 基因 。 组 织 相 容 性 等 位 基因 是 共 显 性 的 ， 基 因 的 最 后 产物 在 杂 合 子 细胞 中 能 各 自 显 现 出 来 ,表现 出 各 样 的 同 种 漠 体 抗原 专 一 性 。 因 此 , 同一 物种 不 同 个 体 之 间 组 织 相 容 性 抗原 的 组 成 ， 呈 现 极 其 纷繁 复杂 的 多 型 现象 。 不 同 的 了 -基因 座 产 生 的 抗原 ， 强 弱 不 同 , 移植 免疫 反应 主要 是 由 主 基因 座 决 定 的 。 小 鼠 的 主 基 因 座 是 孔 -2 系统 ， 包 括 至 少 20 个 不 同 的 等 位 基因 ， 决 定 红血球 .白血球 .血小板 和 其 他 器 官 、 组 织 的 抗原 性 。 人 类 的 主 基因 座 是 HLA 系统 *， 包 括 30 个 以 上 不 同 的 等 位 基因 ,决定 除 红血球 以 外 的 各 种 器 官 、 组 织 的 抗原 性 。 通 常 是 以 白血球 的 抗原 性 作为 代表 。HLA flH-2 系统 是 移植 免疫 中 最 重要 的 抗原 系统 ， 也 是 研究 得 最 多 的 系统 (Billingham 和 Silvers，1971) 。 HLA 抗原 系统 对 于 临床 医学 上 的 重要 性 是 显而易见 的 。 虽然 用 血清 学 方法 已 经 区 别 出 21 种 抗原 专 一 性 ， 它 们 在 化 学 上 的 鉴别 仍然 进展 很 慢 。 这 主要 是 由 于 抗原 和 细胞 膜 结合 牢固 ， 从 膜 上 溶解 和 纯化 很 困难 。 其 次 ， 很 难得 到 遗传 上 均一 的 大 量 材料 ， 也 是 * 根据 WHO 新 的 命名 原则 ，1976 年 后 文献 中 HL-A 改称 为 HLA, « 132 « 一 个 重要 的 限制 。 近 年 来 由 于 纯 系 淋巴 球 大 量 培养 成 功 ， 能 供应 足够 的 遗传 性 均一 的 材 料 ， 以 及 细胞 表面 抗原 的 分 离 、. 纯 化 技术 的 进步 ,移植 抗原 的 化 学 性 质 的 研究 才 打开 了 局 面 。 人 类 HLA 和 小 鼠 H-2 移植 抗原 都 是 存在 于 细胞 膜 上 的 糖 蛋白 。 在 完整 的 细胞 腊 上 ， 很 可 能 多 肽 和 糖 都 和 抗原 活性 有 关系 ， 不 过 不 同 作者 对 它们 的 相对 重要 性 ， 仍 有 不 同 的 看 法 。 这 些 分 子 在 细胞 表面 的 排列 还 不 太 清楚 ， 据 推测 很 可 能 和 其 他 抗原 〈 血 型 搞 原 、. 其 他 系统 的 同 种 异体 抗原 ) RSG, 交错 地 镶嵌 排列 (Boyse 等 ,1968) 。 据 标记 杂交 抗体 法 ， 对 小 鼠 淋巴 球 表面 电子 显微镜 连续 切片 观察 和 重组 的 模型 看 来 ，H-2 抗原 在 细胞 表面 是 不 连续 地 , 大 小 不 等 地 成 片 分 布 的 (Old 和 Boyse, 1973) (图 4-29) 。 。 从 细胞 膜 上 分 离 可 溶性 移植 抗原 的 方法 ， 主 要 有 几 类 : 1) 表面 活性 剂 处 理 ， 如 非 离 子 型 的 表面 活性 剂 NP-40，Triton X-100, Brijgg 等 ;. 2) 酶 解 ， 用 木瓜 酶 处 理 , 从 膜 上 释放 出 有 抗原 性 的 糖 多 肽 断 片 ; 3) 低频 声波 击 碎 ; 4) 3MKCI1 提取 。 用 不 同方 法 得 到 的 抗原 制品 的 分 子 量 和 化 学 组 成 都 有 很 大 不 同 。 用 表面 活性 剂 “溶解 的 糖 蛋白 容易 形成 大 分 子 聚 集 物 ,分 子 量 达 到 200,000 一 380,000; 用 其 他 几 种 方法 分 离 的 分 子 量 较 小 , 约 在 35,000—55,000 之 间 。 木 瓜 酶 酶 解 的 为 糖 蛋白 (含有 3 一 8% SR), ， 而 3MKC1 提取 和 声波 处 理 的 都 几乎 不 含 糖 (天 1% 多 糖 ) 。 这 些 差 别 很 可 能 是 膜 的 “抗原 结构 单位 > 在 用 不 同方 法 提取 时 , 发 生 不 同 程度 的 解 离 ,以 及 多 糖 和 载体 蛋白 分 子 分 离 的 结果 。 这 一 点 对 于 分 析 不 同 研究 者 用 不 同方 法 得 到 的 结果 时 ， 是 很 重要 的 。 (—) 移植 抗原 的 分 离 、 纯 化 和 化 学 性 质 Reisfeld 和 Kahn (1970 一 72) 从 大 量 培养 的 人 纯 系 ( 同 基因 型 ) 淋巴 球 的 细胞 膜 ， 3MKC1 提取 的 可 次 部 分 ， ,经 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 制 备 电 泳 , 一 次 分 离 , 得 到 的 迁移 率 Rf = 0.78 一 0.80 的 部 分 ， 表 现 HLA. 抗 原 活 力 ( 图 4-30) 。 这 一 成 分 再 经 分 析 凝 胶 电泳 鉴定 为 一 个 均一 的 成 分 ，Rf 仍 保持 0-78, FIA 32,000 (图 4-31)。 此 外 ， 用 低频 声波 法 得 到 的 可 溶性 抗原 ， 分 子 量 为 34,600。 电 泳 迁 移 率 、 氮 基 酸 组 成 也 都 和 前 一 方法 纯化 的 抗 原 成 分 相同 。 这 表明 用 两 种 方法 分 离 的 抗原 成 分 可 能 代表 原来 细胞 膜 上 的 同一 分 子 构 造 。 移植 抗原 的 专 一 性 主要 是 由 糖 蛋白 的 多 肽 部 分 还 是 多 糖 部 分 决定 的 ， 这 是 曾经 长 期 争论 的 问题 (Sanderson 等 ，1971; Nathenson, 1970; Nossal，1972) 。 对 上 述 纯化 的 抗原 成 分 的 化 学 性 质 研 究 的 结果 表明 ， 抗 原 决 定 簇 主 要 位 于 多 肽 链 上 ,结构 还 不 清楚 。 这 主要 有 以 下 几 方 面 的 证 据 :， 首先 ， 纯化 的 移植 抗原 成 分 是 分 子 量 约 32,000 的 一 条 多 肽 链 ( 具 有 2 个 分 子 内 二 硫 桥 ) ， 几 乎 不 含 糖 (和 1%) 。 蛋白 酶 处 理 、 变 性 都 能 破坏 其 抗 原 性 。 其 次 ， 从 组 织 相合 性 抗原 不 同 的 动物 品系 ， 或 HLA 表 型 不 同 的 淋巴 细胞 株 ， 纯 化 的 移植 抗原 , 其 氨基 酸 组 成 和 酶 解 肽 段 图 谱 , 都 有 明显 的 可 重复 的 区 别 。 在 这 些 有 不 同 的 同 种 异体 抗原 专 一 性 的 蛋白 质 的 酶 解 图 谐 上 ，24 个 肽 眉 中 , 大 多 数 是 相同 的 ， 只 有 6 个 肽 侦 不 同 。 这 有 力 地 表明 移植 抗原 遗传 上 分 离 的 同 种 异体 专 一 性 是 和 蛋白 质 构 造 有 关 的 ， 不 同 的 HLA 等 位 基因 直接 控制 不 同 肽 链 的 合成 (Reisfeld 和 Kahn, 1972). jit 传 学 分 析 也 支持 组 织 相 容 性 基因 座 是 控制 多 肽 链 的 结构 顺序 ， 而 不 是 如 ABO 血型 系 绕 © 133。 Al4-29 据 标 记 杂 交 抗 体 免 疫 电子 显微镜 法 ， 显 示 的 淋巴 球 表面 H-2 抗原 的 分 布 。 根 据 同一 淋巴 球 连续 切片 重组 的 模型 的 两 面 观 ( 据 Old 和 Boyse,1973)。 那样 控制 低 聚 糖 链 示 端的 区 个 糖 残 基 的 顺序 。 这 和 免疫 球 蛋白 有 些 相 似 〈Ceppellini， 1971) 。 另 一 方面 ， 对 小 鼠 H-2 同 种 异体 抗原 多 糖 部 分 的 研究 表明 ， 不 同 H-2 RH Co H-2°, H-2°) 的 抗原 含有 的 多 糖 部 分 帮 乎 有 相同 的 构造 (图 4-32) 。 因此 ， 多 糖 部 分 不 直接 决定 H-2 抗原 的 专 一 性 (Nathenson 和 Muramatsu，1971)。 hin H-2 基因 座 精 细 构 造 的 遗传 分 析 证 明 ， 存 在 两 个 亚 基因 座 ， BAH-2K fl H-2D。 由 于 这 两 个 紧密 连锁 的 基因 是 共 显 性 的 ,每 一 个 细胞 在 表 型 上 可 能 表现 出 生 种 主 要 也 -2 抗原 专 一 性 。 此 共 显 性 系统 充分 表现 时 全 部 抗原 专 一 性 的 一 半 , 即 相当 于 一 条 染 色 体 的 基因 决定 的 抗原 专 一 性 ， 称 为 单元 型 (Haplotype). mM H-2 基因 座 为 纯 合 子 的 - 134» HE) 11,4, H-2° 决定 的 专 一 性 为 33,2。 iz5fcpm X 10° * B40] - 30. | 120 160 洗 脱 体积 (毫升 ) 图 4-30 HL-A 抗原 .CRPMI1788; 100mg) 的 KCL 提 4-31 HL-A SRA (a) eR RRAAARRAR SHARMA. ABA 胺 制备 电泳 前 的 KCl 提取 滚 。(Cb) 制 备 电泳 分 有 抗原 活性 的 区 域 (Reisfeld 和 Pellegrino, 1972), 离 的 抗原 成 分 (Reisfeld 和 了 Pellegrino,1972)。 (EE). 神经 氨 酸 酶 Se ‘ C4 FLD) 6-4 一 (氨基 葡萄 糖 ) 8-N- 忆 酰 氨基 葡萄 糖 酶 一 一 一 一 一 一 ane Gee eae 内 切 -糖苷 酶 [EDJ+ 敏感 LORS Se KIRA 4-32 H-2 PSHM, BA aE RIE 这 些 结构 所 采用 的 酶 或 化 学 处 理 《 据 Nathenson #] Muramatsu, 1971), FAS) ELA 4 (H-=2* /H-2* 4] H-2>/H-2), EIS BWW H-2* 决定 的 抗原 专 一 REF LA (H-2°/H-2°) 含有 来 自 双 亲 的 两 种 单元 型 ，H-2* 和 再 -2"， 因 此 表现 4 种 抗原 专 一 性 ， 即 11,4,33 和 2 (图 4-33 A). A ZEA HLA 基因 座 也 具有 同样 的 构造 。 一 性 是 否 分 别 位 于 不 同 的 抗原 分 子 上 呢 ? 对 于 这 一 问题 ， 可 以 把 瑞 -2 基因 座 为 纯 合 子 (H-2? /H-2°, H-2>/H-2>) 或 杂 人 合子“〈H-2:/ 世 -2 细胞 的 蕊 -2 抗原 从 细胞 膜 上 溶解 六 于 区 二 同一 基因 型 的 条 合子 细胞 的 四 种 主要 移植 抗原 专 A. 基因 水 平 BAF: H-2/H-2 RAT, H-2/H-2> saz H-28/H-2 H-2K H-2D H-2K H-2D H-2K H-2D H-2* ll 4 H-2* 11 4 H-2> 33 2 H-2? 11 4 H-2° 33 2 H=25 33 2 B. 细胞 水 平 (细胞 膜 ) K LP Lk Lp | 89 Atma @ A fA a DLT? 24h 4 1133, Ar e7 35 Sser 2. 2 图 4-33 H-2 系统 之 分 子 遗 传 学 关系 ,抗原 用 NP-40 从 膜 上 溶解 并 用 免疫 沉淀 法 鉴定 。 (A) 基因 水 平 : 两 个 纯 合 子 品系 〈H-2?/H-2*，H-2?/H-25) 及 其 杂 合 子 品系 (H-2a/H-2b) 的 单元 型 《Haplotype). 每 一 个 单元 型 的 也 -2K 和 H-2D 基因 的 下 方 只 列 出 该 基因 决定 的 主 要 抗原 专 一 性 ,如 H-2*/H-2*, H-2K* 基因 的 专 一 性 为 11， 了 -2D? 的 专 一 性 为 4。 (B) 细胞 水 平 (细胞 膜 简 图 ): 具有 主要 专 一 性 抗原 决定 笠 的 多 肽 用 ~ 一 ~ 表示 。 对 于 纯 合 子 细胞 至 少 可 以 分 离 出 两 种 同 种 异型 抗原 。 如 H-2*/H-2° 细胞 ， 能 测 出 对 专 一 性 11、4 反应 的 糖 蛋白 分 子 。 H-2*/ 孔 -2” 杂 合子 细胞 至 少 有 四 种 抗原 分 子 , 每 一 种 分 子 只 具有 H-2 的 四 种 专 一 性 〈11，33，4 或 2 中 的 一 种 专 一 性 〈Cullen 等 ,1972)。 预 处 理 血 清 100 对 照 °° 100 2(H-28) 50 100 4(H-2*) 50 100 33(H-2*) 50 100 TUCH-2a) 50 024628102468 1024 6 8 1024 6 8102 4 6 810 4-34 NP-40 从 膜 上 溶解 的 抗原 经 免疫 沉淀 法 分 析 鉴 定 。 *H 标记 的 抗原 提取 波 先 用 单 专 一 性 抗 血清 (图 上 方 7 预 处 理 , 去 除 产生 的 沉淀 , 剩 下 的 上 清 液 和 测试 抗 血清 (图 左 ) 产 生 的 沉淀 的 SDS AA MOK RR BAA. CH- 岩 营 糖 标记 的 抗原 的 放射 强度 (cpm) 用 纵 坐 标 表示 。 预 处 理 血 清 完 全 去 除 某 一 抗原 后 ， 再 用 测试 血清 检测 时 就 缺少 一 个 专 一 的 H-2 抗原 峰 。 除 此 以 外 还 剩 下 3 个 专 一 的 H-2 抗原 峰 证 明 还 存在 -3 个 基因 产物 。 因此 , 四 种 抗原 专 一 性 存在 于 4 个 不 同 的 分 子 上 ( 据 Cullen 等 ,1972)。 下 来 ， 并 用 间接 免疫 沉淀 法 和 SDS 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ， 逐个 加 以 分 离 、 鉴定 “图 4 34) 。 从 图 4-32 B 总 结 的 结果 可 见 对 于 了 英 -2D M1 H-2K 基因 为 纯 合 子 的 小 鼠 脾脏 细 胞 ， 至 少 存在 2 种 不 同 专 一 性 的 抗原 分 子 ， 而 对 于 也 -2D MH-2K 杂 合子 细胞 ， 则 至 少 存在 * 136 。 OT a a aS a Ras i a a a 四 种 不 同 专 一 性 的 抗原 分 子 。 这 一 发 现 说 明 杂 合子 细胞 内 ， 基 因 共 显 性 表现 的 分 子 基 础 是 4 种 互 -2 抗原 专 一 性 分 别 表现 在 四 种 不 同 的 分 子 上 (Cullen 等 1972) 。 对 于 人 类 HLA 系统 ， 同 样 证 明 为 不 同 的 等 位 基因 决定 的 专 一 性 各 自 独立 地 表现 在 不 同 的 抗 原 分 子 上 (Thieme 等 ，1974) 。 此 外 ,用 同样 方法 还 证 明 大 鼠 淋巴 细胞 的 物种 专 一 抗原 和 主要 移植 抗原 (Ag-B) 于 细胞 膜 的 不 同 分 子 上 (Callahan 等 ，1974) 。 (=) HLA 和 H-2 抗原 的 亚 基 结 构 Pressman 和 Cresswell 实验 室 同 时 发 现 ， 人 淋巴 球 细胞 膜 经 木瓜 酶 处 理 ， 溶解 下 来 的 HLA 抗原 (分 子 量 =48,000) 是 由 以 非 共 价 键 结合 的 两 条 肽 链 组 成 的 。 分 子 量 较 大 的 肽 链 (30,000 一 31,000) 是 一 个 糖 蛋白 ， 载 有 各 种 同 种 异体 的 抗原 专 一 性 。 分 子 量 小 的 肽 链 (11,000) 是 所 有 HLA 同 种 异体 抗原 共有 的 ， 但 没有 HLA 抗原 活 (Tani- gaki 等 ，1973; Cresswell 等 ，1973) 。 进 一 步 研究 发 现 ， 这 一 “共同 肽 链 ? 的 氨基 酸 组 :成 、 分 子 量 ` 电 泳 迁移 率 以 及 免疫 学 性 质 都 和 p-2-= 微 球 蛋白 相同 (Nakamuro &, 1973; b ; R-ALS £ 2 FITC-ii-Rlg B-2m HLA。 Rhee —RER (ALS) 三 图 4-35 细胞 膜 抗原 移动 聚集 形成 " 极 冠 ?>。 淋 巴 球 先 用 第 一 组 抗体 在 室温 处 理 ， 然 后 在 37°C R 温 30 分 钟 , 诱 发 膜 抗原 移动 ,形成 * 极 冠 2。 细 胞 在 49C 再 用 第 二 套 抗 体 处 理 , 判 定 第 二 套 抗体 显示 的 抗原 决定 簇 是 否 和 第 一 套 抗体 显示 的 抗原 一 起 移动 :并 形成 Rie”. (a) 绿色 草 光 (@ ) 和 红色 蓝光 (Oo ) 在 细胞 的 一 极 混 融 , 表 明 8-2-m 和 HLA 在 一 起 移动 。 (b) RABI OMA ARH 《9J) 在 细胞 一 极 混 融 ， 但 其 余地 区 仍 有 绿色 草 光 ， 这 也 许 是 由 于 有 过 剩 的 6-2-m MERE. 《c) 绿色 曹 光 ( 册 ?集中 在 一 极 , 而 红色 草 光 (O ) 弥 散 分 布 ,表明 ALS 抗原 和 HLA 抗原 不 一 起 移 Mo R- 抗 -6-2m: 家 免 抗 人 8-2- 微 球 蛋 白 ; R-ALS: 家 免 抗 人 淋巴 球 血 清 ;- 抗 -HLA: 混合 的 多 专 一 性 的 抗 -HLA; FITC- 抗 -=RIg: 曹 光 标记 猪 抗 家 免 免 疫 球 蛋白 ; TRITC- 抗 -HIg: Rhoda- mine 标记 山羊 抗 人 免疫 球 蛋 白 ( 据 Solheim 和 Thorsby, 1974), Cresswell 等 ，1974; Peterson 等 , 1974) 。 已 知 8-2- 微 球 蛋白 是 细胞 膜 的 固有 成 分 ， 同时 也 在 体液 内 存在 。 于 是 便 产 生 了 一 个 问题 ， 这 种 复合 分 子 是 在 从 膜 上 溶解 下 来 的 过 程 中 ， 人 为 地 络 合 在 一 起 的 还 是 细胞 膜 上 天 然 存 在 的 亚 基 构 造 。 这 个 间 题 可 以 用 抗体 空间 重 释 阻 遇 (Overlapping Blocking) 方法 ， 对 两 个 亚 基 在 细胞 膜 上 的 位 置 关 系 进行 分 析 。 如 果 有 HLA 专 一 性 的 蛋白 和 2- 微 球 蛋白 在 细胞 膜 上 确 是 组 成 同一 个 分 子 的 两 个 亚 基 的 话 ， 当 其 中 一 个 亚 基 与 其 专 一 抗体 结合 时 就 可 能 在 空间 上 阻碍 另 一 个 亚 基 与 其 专 一 的 抗体 结合 。 从 表 4-6 的 结果 可 见 ， 用 抗 8-2- 微 球 蛋 7 » R46 Fab’ 片段 预 处 理 对 抗 8B-2- 微 球 蛋白 和 抗 HLA 抗体 淋巴 球 杀 伤 作用 的 影响 * Fab” 专 一 性 ## 抗体 专 一 性 细胞 毒性 作用 29O### 三 二 = B-2-M >75 8-2- 微 球 蛋 白 6-2-M <15 免疫 球 蛋白 轻 链 B-2-M >75 = HL A-1 >75 HLA-1 HL A-1 <15 — HL A-8 >75 HLA-8 HL A-8 <15 HLA-1 HL A-8 >75 B-2-M HL A-l <15 免疫 球 蛋白 轻 链 HL A-1l >75 B-2-M HL A-8 <15 免疫 球 蛋 白 轻 链 HL A-8 > HLA-1 f-2-M >50 HLA-8 B-2-M >50 HLA-1,8 B-2-M >25 * 细胞 在 Eagle 维持 培养 液 中 37%C 保温 45 分 钟 。 ** FEMME HLA-1 和 HLA-8 专 一 性 为 纯 合 子 的 人 体 。 + 细胞 毒性 作用 程度 用 人 台 盼 蓝 染 色 细胞 的 百分率 表示 ( 据 Ostberg 等 , 1974)。 白 抗体 的 Fab ' 断 片 预先 处 理 淋 巴 细胞 ， 就 能 完全 地 和 专 一 地 抑制 各 种 抗 HLA 抗体 的 细胞 毒性 作用 。 同 样 地 ，HLA-=1 抗 或 HLA-8 抗体 的 Fab’ 能 略微 地 抑制 抗 8-2- 微 球 蛋 白 抗体 的 毒性 作用 ， 而 HLA-1 抗 和 HLA-8 抗体 的 Fab': 同时 使 用 时 就 能 产生 显著 的 抑 制 效应 。 因 此 ,8-2- 微 球 蛋白 和 具有 同 种 异体 抗原 专 一 性 的 较 大 的 肽 链 在 细胞 膜 上 的 位 置 是 紧密 靠近 的 。 另 一 方面 ， 用 蓝光 标记 抗体 示 踪 的 方法 ， 还 观察 到 抗 5-2- 微 球 蛋白 抗体 和 HLA 抗体 在 细胞 表面 一 同 移动 形成 * 极 冠 ”。 因 此 ，p-2- 微 球 蛋 白 和 HLA 抗原 成 分 不 但 紧密 靠近 ， 而 且 作为 一 个 相连 的 整体 在 膜 上 一 块 移 动 ( 图 4-35)(Ostberg 等 ,1974; Solheim 和 Thorsby, 1974), WT)RH-2 同 种 异体 抗原 ， 得 到 同样 的 结果 , 也 发 现 类 似 人 类 p-2- 微 球 蛋白 的 亚 基 存在 (Rask 等 ，1974) 。 因 此 ，8p-2- 微 球 蛋白 无 论 在 可 溶性 抗原 分 子 或 完整 的 细胞 膜 上 都 可 能 参与 HLA 或 了 -2 同 种 异体 抗原 的 亚 基 构 造 。 进一步 的 研究 还 发 现 8-2- 微 球 蛋白 和 淋巴 细胞 的 抗原 受 体 有 密切 关系 。 专 一 的 抗 p-2- 微 球 蛋 白 的 抗 血 清 能 够 抑制 同 种 异体 抗原 或 PHA 引起 的 淋巴 细胞 转化 反应 。 已 知 这 种 反应 是 了 淋巴 细胞 表面 受 体 受到 刺激 引起 的 。 此 外 ， 抗 HLA 血清 也 有 同样 的 作 用 。 这 些 实验 表明 HLA 抗原 的 亚 基 和 了 淋巴 球 的 抗原 受 体 在 空间 位 置 上 或 功能 上 是 有 紧密 联系 的 (Poulik “£, 1973; Lightbody 等 ，1974; Solheim 和 Thorsby, 1974). p-2- 微 球 蛋白 参与 HLA 抗原 的 亚 基 结 构 以 及 它 和 了 T 淋巴 球 受 体 的 密切 关系 的 发 现 有 着 重要 的 理论 意义 。 已 知 8-2- 微 球 蛋白 的 一 级 结构 和 免疫 球 蛋白 重 链 与 轻 链 的 不 变 区 有 广泛 的 同 源 性 (Peterson 等 ，1972; Smithes 和 Poulik，1972 Cunningham, 1974) 。 最 近 还 证 明 8-2- 微 球 蛋 白 具 有 抗体 的 发 效 器 功能 (Painter 等 ，1974)。 这 些 事 实 似乎 提示 移植 抗原 的 一 个 亚 基 成 分 和 免疫 球 蛋白 可 能 在 进化 上 有 共同 的 起 源 。 并 且 移 植 抗原 和 了 细胞 的 抗原 识别 受 体 可 能 有 密切 的 关系 。 这 种 相互 关系 对 于 了 解 HLA 抗原 的 功能 意义 或 许 会 有 所 启示 。 *。 138 。 至 于 组 织 相 容 性 抗原 在 细胞 膜 土 的 存在 形式 ， 目 前 还 不 完全 清楚 。 但 根据 破坏 共 价 键 ( 酶 解 ) 或 非 共 价 键 提取 方法 释放 的 产物 的 分 子 量 和 组 成 的 不 同 ， 可 以 得 到 一 些 线 索 。 用 非 离 子 型 表面 洁 性 剂 ( 如 NP-40，Brijgg 等 )， 从 血小板 .淋巴 球 膜 上 分 离 下 来 的 H- 抗原 成 分 容易 形成 大 分 子 量 聚 集 物 ， 分 子 量 达到 200,000—380,000 (Dautigny 等 ,1973; Schwartz “, 1973). H-2 聚集 物 可 能 解 离 为 分 子 量 43,000—47,000 的 单 体 或 “ 双 体 ” ，(2x43,000) (Schwartz 等 ，1973)。 用 Brijgg 溶解 的 HLA 抗 原 是 由 44,000 和 12,000 两 个 亚 基 组 成 。 大 的 亚 基 经 木瓜 酶 处 理 得 到 一 个 分 子 量 为 34,000 的 糖 蛋白 ,这 和 用 木瓜 酶 直接 从 膜 上 溶解 下 来 的 抗原 成 分 是 相等 的 《Springer 等 ，1974) 。 此 外 ， 木 瓜 酶 酶 解 得 到 的 H-2 抗原 成 分 在 3M KCI 溢 液 中 层 析 时 ,又 可 以 解 离 成 分 子 量 约 40,000 Fl 11,000 的 两 个 亚 成 分 ,后 者 可 能 相当 于 p-2- 微 球 蛋白 (Rask 等 ，1974) 。 由 此 可 见 木瓜 酶 和 3MKCI 处 理 从 细胞 膜 上 释 放 的 抗原 成 分 可 能 都 是 分 离 过 程 中 产 生 的 降解 断 片 ， 它 们 的 含 糖 量 的 显著 ， S+S tral 不 同 〈 前 者 为 糖 蛋白 ， 后 者 几乎 不 含 糖 ) 以 及 分 子 量 的 差别 ， 可 能 是 由 于 wae 从 膜 上 解 离 下 来 的 部 位 不 同 。 (1163000) (51 900) 近来 有 大 用 未 瓜 酶 处 理 小 鼠 细胞 Ht 了 coon a 膜 或 借 非 离子 型 表面 活性 剂 (NP=40) 从 膜 上 溶解 干 来 的 H-2 抗原 ， 得 到 分 FHA 37,000 的 糖 蛋白 片段 和 与 其 4-36 H-2 抗原 的 分 子 解剖 和 在 细胞 表面 的 排列 。 用 表面 活 相连 的 8-2- 微 球 蛋 白 。 对 了 英 -2 HRA 性 剂 溶解 下 来 的 H-2 抗原 是 以 两 条 重 链 和 两 条 轻 链 ( 重 链 间 至 外 下” 少 有 一 个 二 硫 桥 连 接 ) 的 形式 存在 。 木 瓜 酶 处 理 细胞 表面 或 表面 Pe CURR SR LY N 末端 分 析 的 Fe 活性 剂 提取 物 , 均 得 到 大 小 相同 的 片 展 CBs), CHL) 为 H-2 重 链 ; 证 明 , AR AB4ATKADFHN te L(82) 为 H-2 Bee 《B-2- 微 球 蛋 白 ); Fs 为 用 木瓜 酶 处 理 细 了 可 | 再 切断 再-2 抗原 分 子 , 结果 分 子 的 羧基 PWeeEHRAHR.HMAADTH (Henning 等 , 1976)。 端 部 分 仍然 留 在 膜 上 ， 而 N 端 部 分 释放 到 溶 沪 内 。 这 提示 天 然 英 -2 抗原 分 子 的 羧基 端 是 埋 在 细胞 膜 脂 双 层 内 ， 而 N 端 则 露 在 膜 外 的 盗 液 内 (Ewenstein 等 ，1976) 。 根据 这 许多 方面 的 证 据 ， 有 人 推测 英 - 抗 原 分 子 在 细胞 膜 上 的 天 然 存 在 形式 是 由 四 条 链 构成 的 类 似 免 疫 球 蛋白 的 双 体 构造 〈 分 子 量 约 为 130,000) 。 两 条 轻 链 〈p-2- 微 球 蛋 白 ) 通 过 非 共 价 相 互 作 用 和 两 条 重 链 相连 。 两 条 重 链 的 羧基 端 埋 在 膜 内 ,并 由 位 于 分 子 贴 近 细 胞 膜 处 的 二 硫 桥 相 连接 。 对 重 链 进行 部 分 酶 解 表 明 ， 它 又 是 由 三 个 致密 的 功能 区 彼 此 通过 伸展 的 一 段 肽 链 连 接 起 来 的 (Peterson 等 ，1975) 。 不 过 ， 也 有 人 不 同意 此 分 子 模型 ， 认 为 膜 上 不 存在 双 体 构造 (Goodfellow 等 ，1975) 。 最 近 ， 了 delman 实验 室 系统 地 比较 了 用 表面 活性 剂 或 木瓜 酶 从 细胞 表面 溶解 下 来 A H-2 抗原 及 其 断 片 的 分 子 量 和 部 分 排列 顺序 , 使 这 一 问题 得 到 了 澄清 。 用 表面 活性 剂 溶解 的 再 -2 抗原 的 分 子 量 为 116;000， 是 由 二 硫 桥 连接 的 两 条 重 链 (分子 量 46,000) 和 两 条 由 非 共 价 键 相连 的 轻 链 (分 子 量 12,000) 形成 的 四 条 链 的 构造 ,也 就 是 说 溶液 内 的 H-2 抗原 是 以 双 体 形式 存在 的 。 为 了 了 解 了 -2 抗原 在 细胞 表面 存在 的 分 子 形式 ， 在 用 表面 活性 剂 提 取 前 ， 先 用 碘 乙 酰胺 烷 基 化 ， 以 防止 重 链 间 二 硫 桥 的 形成 。 当 再 用 木瓜 酶 消化 。 139 。 F,(7, MESES 7Cyl SIE 细胞 或 表面 活性 剂 的 提取 物 时 ， 都 可 以 得 到 由 一 条 分 子 量 39,000 的 重 链 HB (FH) 和 一 条 完整 的 轻 链 共 同 组 成 的 水 溶性 片段 FS (分 子 量 51,000) 。 因 此 ， 重 链 的 一 S H 键 应 位 于 剩 留 在 膜 上 的 Fm PRE. WFR 片段 的 部 分 氨基 酸 排 列 顺序 的 分 析 证 明 是 和 用 表 面 活性 剂 从 膜 上 溶解 下 来 的 英 -2 抗原 的 重 链 相同 的 ， 并 且 相 当 于 重 链 的 N 端 。 这 些 结果 表明 再 -2 抗原 在 膜 上 是 以 一 条 重 链 和 一 条 轻 链 组 成 的 单 体 形式 存在 的 ， 重 链 的 C 端 埋 在 膜 内 ， 而 人 N 端 露 在 外 面 (图 4-36) (Henning 等 ，1976) 。 (三 ) 移植 抗原 的 一 级 结构 由 于 移植 抗原 纯化 和 亚 基 结 构 研 究 方面 所 取得 的 进展 ， 一 级 结构 分 析 也 开始 进行 了 。 利 用 氮 基 酸 顺 序 自动 分 析 仪 对 小 分 子 亚 基 进 行 的 放射 性 同位 素 标记 的 氮 基 酸 顺 序 分 析 ， 确 定 了 3 和 10 残 基 位 置 的 氨基 酸 分 别 为 lys 和 tyr。 WMA. RoR. WH 6-2= 微 球 蛋 白 的 顺序 是 相符 的 。 也 进一步 证 实 小 分 子 亚 基 相当 于 p-2- 微 球 蛋 白 (Silver 和 了 Ho- od，1975) 。 最 近 ,， 用 同一 方法 确定 了 小 鼠 再 -2 天 分 子 N 端 27 氨基 酸 中 18 残 基 的 顺序 表 4-7 [Li HLA 抗原 重 链 部 分 氨基 酸 排列 顺序 的 比较 鉴定 的 氮 基 RB ow Re HLA-2** HLA-7,12 HLA-7 1 Gly Gly Gly 2 Ser Ser Ser 3 一 要 - - —_ 全 Ser Ser Ser 5 Met Met Met 6 Arg Arg, Val Arg 7 Tyr Tyr Tyr 8 Phe Phe Phe 9 Phe Tyr Tyr 10 Thr Thr Thr 11 Ser Ala Ser 12 Val Val Val 13 Ser Ser Ser 14 Arg Arg Arg 15 Pro Pro Pro E 16 Gly Gly Gly == ma! pe 18 Gly Gly Gly 19 Glu Glu Glu 20 一 一 一 21 一 = = 22 Phe Phe Phe 23 Ile Ile [le 24 Ala Ala 一 25 Val Val Val * Beckman 908B 自动 顺序 分 析 仪 对 雁 端 部 分 排列 顺序 的 分 析 结 果 。 数 字 为 分 析 步 骤 * 示 氨基 酸 顺 序 。 “* 两 个 HLA-2 样品 分 析 结 果 相 同 。 ( 据 Terhorst 4, 1976), 。140 。 “96T ‘premozy St) Bt Bh ht AGH 9261 Ss UOSprrg $9761 S assoysoy o761SH ena £9767 ‘poor MY s9aqts Soz61 Sse 38uruusH By CM PZKHMU A Be GHz HC WE SE Se AID| Md Bry |zIV| eA | FIV [49S IAL kL | AL Bry | WW Jeg T9S 5T 88 JIJ9$ 49S. JUL Ud Ud IAL TeA TI Ud NID 人 MID 4ID}] Cd Bry | IsS| [FA Ig IT IAL saUd | II Sly |} WW JES Jag 人 [ID 1a VIH IAL, IEA FLV el Ud NID 《ID AID} Md Bry | yes} 1A | FS YL Pd Ud | IIL SIV | PW 9S JI9S 41D cv ¥ IAL, Old _ Old IZA By IFA pad IIL | Bry | Ud | -一 org | 31y IeA PIV i ad ‘ (4d) pu IKY, StH IEA PIV SHH | (0d) ad IAJ, IeA ely eA |(sdd) Lo (9% SCE eer CR oe «GL Ter 219 oh ET I WW HM MHRE SSMU vIn ZH She *1l41le (Vitetta 等 ,1976) ， 如 下 : ns 10 15 Met Pro Soa Arg Tyr Phe His—Ala Val—lIle Pro 25 —Leu—Lys Pro Phe Ala———-Tyreeeeee xX} A HLA-A 和 HLA-B 亚 基 因 座 产生 的 四 种 HLA Si, N 端 部 分 排列 顺序 ， 以 及 氨基 酸 组 成 分 析 还 证 明 这 些 抗原 的 一 级 结构 存在 很 大 的 同 源 性 ( 表 4-7) 。 同 时 ， 它 们 和 小 鼠 H-2 抗原 也 有 一 定 程 度 的 同 源 性 (Terhost &, 1976)”, /)\ & H-2K*, H-2K‘, H-2K*，H-2D” 和 H-2D* 的 基因 产物 的 N 端 部 分 排列 顺序 也 是 恒定 的 〈Henning 等 ， 1976) 。 表 4.8 总 结 了 现 有 的 了 -2 和 HLA 部 分 排列 顺序 相关 性 的 资料 。 这 些 资料 支 持 人 类 的 HLA-A 和 HLA-B， 人 小 鼠 的 了 -2K #1 H-2D 亚 基因 座 都 可 能 是 通过 基因 倍增 起 源 于 一 个 祖先 基因 的 看 法 。 从 了 -2 和 HLA 排列 顺序 上 的 一 定 程度 的 同 源 性 看 来 ， H-2 Al HLA 基因 在 进化 上 也 可 能 有 共同 的 起 源 (再 oward，1976) 。 总 之 ， 目 前 关于 移植 抗原 〈 主 组 织 相 容 性 基因 产物 ) 的 化 学 特性 已 得 到 下 述 初 步 了 解 : 小 鼠 H-2 和 人 了 LA 的 基因 产物 是 位 于 细胞 表面 的 糖 蛋白 ， 分 子 量 约 为 .60000。 分 子 是 由 重 链 ( 分 子 量 为 45,000) 和 轻 链 (已 知 为 6-2- 微 球 蛋白 ， 分 子 量 为 12,000) 两 个 亚 基 非 共 价 相 连 而 成 。 天 然 分 子 在 细胞 膜 上 很 可 能 是 以 单 体形 式 存在 ， 分 子 的 'C 端 埋 在 膜 A. 完整 的 分 子 只 能 被 表面 活性 剂 从 膜 上 溶解 下 来 ， 在 溶液 内 分 子 可 能 以 双 体 形式 存 在 。 木 瓜 酶 能 将 分 子 从 近 C 端 处 切断 ， 酶 解 片段 仍 保持 全 部 抗原 活性 。 移 秆 抗 原 的 血清 学 专 一 性 依赖 于 多 肽 链 特定 的 排列 顺序 。 移植 抗原 的 化 学 性 质 研 究 所 取得 的 这 些 进 展 ， 在 理论 上 和 实践 上 都 是 很 重要 的 。 随 着 移植 抗原 一 级 结构 的 逐步 阐明 ， 目 前 移植 免疫 方面 采用 的 免疫 遗传 上 的 血清 学 专 一 性 系统 将 可 能 改变 为 用 结构 基因 及 其 产物 的 氨基 酸 排列 顺序 表示 的 系统 。 这 对 于 了 了解 移植 抗原 的 遗传 控制 和 分 子 进 化 以 及 生物 学 功能 都 将 有 很 大 意义 。 在 临床 实践 止 ， 不 同 分 子 量 大 小 的 HLA 抗原 片段 还 可 能 作为 有 用 的 工具 ， 来 探讨 移植 免疫 的 耐 受 性 ， 免 疫 促进 现象 或 封 阻抗 体 的 诱导 等 问题 。 研究 这 些 问题 对 村 从 根本 上 苑 服 异 体 组 织 移植 的 排斥 ， 也 无 疑 是 极为 重要 的 (Nossal，1972) 。 五 、 生 殖 细胞 的 表面 抗原 两 性 生殖 细胞 含有 未 来 个 体 全 部 抗原 的 遗传 信息 。 然 而 ， 这 些 细胞 本 身 的 抗原 性 却 相当 贫乏 ， 只 是 在 以 后 的 发 育 过 程 中 才 逐 渐 显 现 出 来 。 卵 表面 抗原 的 表现 很 弱 。 小 鼠 未 受精 卵 和 早期 分 裂 的 胚胎 ， 用 萤 光 标记 抗体 均 不 能 显示 出 主要 组 织 相合 性 抗原 ( 世 -2) ， 只 有 一 些 弱 的 组 织 相 合 性 抗原 (如 H-1, H-6) 存在 (Palm 等 ，1971) 。 未 受精 卵 对 抗 了 -2 细胞 毒性 抗体 也 不 敏感 。 精子 表面 有 较 多 的 抗原 。 现 在 已 经 知道 精子 表面 和 体 细胞 一 样 ， 也 有 组 织 相合 性 抗 原 、 血 型 抗原 以 及 植物 凝集 素 、 病 毒 的 受 体 存在 。 成 熟 的 精子 只 具有 单 倍 染 色 体 。 在 哺乳 动物 ,性 别 的 决定 是 由 于 精子 的 两 型 性 ， 半 数 的 精子 有 x- 染 色 体 ， 另 一 半数 精子 有 7- 染 色 体 。 精 子 在 细胞 遗传 学 上 的 这 些 特点 、 单 倍 性 以 及 遗传 上 的 两 型 性 是 否 在 精子 表面 抗 1) 目前 已 完成 了 小 鼠 H-2K> 分 子 的 全 部 一 级 结构 测定 ,人 类 HLA-B7 和 HLA-A2 的 顺序 测定 也 接近 完成 。 这 些 材料 证 明 H-2 和 HLA 抗原 之 氨基 酸 排列 顺序 存在 很 高 的 同 源 性 (参见 补 注 2， 第 544 页 )。 。142 。 原 上 也 反映 出 来 ， 是 很 有 理论 意义 的 问题 。 精 子 是 一 个 十 分 特 化 的 细胞 。 精 子 的 表面 搞 原 对 于 受精 的 功能 意义 ， 也 是 值得 注意 的 问题 。 这 里 主要 讨论 几 种 精子 表面 抗原 。 (一 ) 植物 血球 凝集 素 受 体 植物 面 球 凝集 素 作 为 “分 子 探 针 ?， 用 于 分 析 生 殖 细 胞 的 表面 抗原 构造 也 是 卓有成效 的 。 有 人 发 现 刀 豆 凝集 素 (Concanavalin A) 能 使 哺乳 类 精子 凝集 。 这 种 凝集 作用 能 被 wx- 甲 基 -D- 甘 露 糖苷 或 葡萄 糖 专 一 地 抑制 。 这 表明 精子 表面 有 含 这 些 糖 基 团 的 受 体 存 fo 利用 萤 光 标记 的 刀 豆 凝集 素 观 察 到 凝集 素 集中 分 布 在 精子 头 部 顶 体 区 域 ， 在 尾部 也 呈现 微弱 的 草 光 。:!25I 标记 刀 豆 凝集 素 定量 测定 的 结果 表明 ， 小 鼠 精 子 和 其 他 体 细 胞 的 刀 豆 凝集 素 受 体 的 数目 大 致 相同 ， 但 是 它们 在 精子 表面 的 分 布 不 平均 , 主要 位 于 头 部 ( 表 4-9) (Edelman 和 Millette，1971) 。 此 外 ， 还 有 人 发 现 仙人 台 副 流感 病毒 能 选择 地 和 免 精 子 顶 体 细胞 膜 附着 (Buthala 等 ，1971) 。 这 些 事实 说 明 精 子 膜 上 受 体 的 分 布 有 局 部 的 分 化 。 哺乳 类 卵 受 精 时 ， 精 子 必 须 穿 过 透明 带 。 透 明 带 和 受精 的 物种 专 一 性 与 防止 多 精 人 卵 都 有 重要 的 关系 。 AZFRES (WGA) 处 理 金黄 田鼠 的 卵 时 ， 发 现 WGA 能 和 透 明 带 专 一 地 结合 ， 并 阻止 精子 的 字 人 和 受精 。 同 时 透明 带 的 外 表面 的 光 散 射 性 增加 ， 不 再 能 被 蛋白 酶 酶 解 。 这 些 事实 说 明 透 明 带 的 分 子 结构 发 生 了 明显 的 变化 。WGA 的 这 种 效应 能 被 N- 乙 酰 -D- 氮 基 葡 萄 糖 专 一 地 抑制 , 表明 透明 带 表 面 有 这 些 基 团 存在 。 这 提示 透明 带 上 的 这 些 基 团 可 能 与 精 、 卵 专 一 的 结合 有 关系 ,掩盖 这 些 基 团 就 可 能 阻止 受精 (Oi- kawa 等 ，1973) 。 虽然 透明 带 只 是 细胞 的 分 这 产 物 ， 而 不 是 卵 的 表面 抗原 ， 但 是 上 述 实验 间接 地 说 明 透 明 带 上 的 某 些 基 团 和 精子 表面 某 些 构造 之 间 存 在 专 一 结合 的 关系 。 已 知 某 些 无 状 椎 动物 ， 如 海胆 卵 的 受精 素 〈 卵 膜 ) 和 精子 表面 的 抗 受精 素 之 间 存 在 类 似 抗 原 抗体 的 相互 作用 ， 这 种 相互 作用 和 受精 的 物种 专 一 性 有 很 大 的 关系 (Tyler, 1955), 以 上 的 发 现 提 示 ， 哺 乳 类 生殖 细胞 之 间 也 可 能 存在 类 似 的 关系 。 对 卵 膜 和 精子 表面 抗原 的 座 人 研究 ， 对 于 了 解 受 精 的 机 制 以 及 探索 在 受精 环节 控制 生育 的 可 能 性 ， 都 将 有 重要 表 4-9 精子 和 体 细胞 表面 刀 豆 凝集 素 义 受 体 的 数目 4 fa 类 .型 每 一 细胞 上 受 体 的 数目 精子 “4.9 又 107 头 部 7.9X10s 尾部 2.5% 10° 胸腺 1.6% 10" ie 1.4% 10° 淋巴 球 1.3107 红血球 6.8X10s 从 3.4107 AF 3.0% 107 AL 5.110’ (4 Edelman 和 Millette, 1971), 的 意义 。 (二 ) 组 织 相 容 性 抗原 应 用 莉 光 标记 抗体 .细胞 毒性 实验 等 方法 , 都 证 明 小 鼠 精 子 表面 有 H-2、 弱 的 也 -3 各 H-13 抗原 存在 (Vojtiskova, 1969; Goldberg “%, 1970), 也 证 明 人 类 精子 表面 有 HLA 抗原 存在 ， 并 且 可 能 相当 于 单 倍 基因 组 的 表现 。 有 人 在 精子 表面 测 出 八 种 HELA 抗原 。 当 用 其 中 一 种 抗原 的 抗 血 清 处 理 杂 合子 男人 的 精子 时 ， 约 一 半 粮 子 溶解 。 由 此 下 结论 ， 精 子 表面 的 HLA 抗原 或 许 是 由 单 倍 基 因 组 决定 的 。 对 于 双 基 因 杂 合子 男人 精子 的 研究 更 加 证 实 了 这 一 结论 。 这 些 人 的 精子 可 能 分 为 两 种 类 型 : 1) 此 两 基因 分 别 位 于 成 对 染色 体 的 每 一 个 染色 体 上 ;2) 此 两 基因 同时 位 于 一 条 染色 体 上 ， 其 中 任 一 基因 都 不 位 于 另 一 条 染色 体 上 。 如 果 在 精子 成 熟 过 程 中 , 染色 体 减 数 和 分 离 后 基因 活动 仍 有 表现 的 话 , 当 用 此 两 抗原 的 抗 血 清 处 理 时 ， 则 1) 型 精子 将 全 部 溶解 ，2) 型 只 有 -=- 半 溶解 。 实 验 结果 证 实 了 这 种 预计 (Fellous 和 Dausset，1970) 。 酶 标记 免疫 电子 显 微 锁 观 察 ， 发 现 HLA 抗原 均匀 地 成 片 分 布 或 偶尔 分 散 地 分 布 在 精子 头 部 ， 而 器 官 专 一 抗原 则 分 布 在 头 部 ， 有 时 分 布 在 中 段 (Keuk 等 ，1973; Vojtiskova 等 ，1974) 。 从 以 上 这 些 观察 结 果 以 及 上 述 受 体 的 分 布 的 情形 看 来 ， 精 子 上 功能 不 同 的 区 域 ， 抗 原 分 布 也 有 所 不 同 。 膜 抗原 分 布 的 这 种 局 部 分 化 反映 了 精子 细胞 膜 的 特点 ， 膜 成 分 的 六 动 性 似乎 受到 某 些 限 制 。 (=) H-Y & FE 在 同 基因 型 纯 系 小 鼠 之 间 ， 将 雄 鼠 皮肤 移植 到 雌 鼠 能 引起 排斥 反应 。 反 之 ， 将 肉 鼠 皮肤 移植 到 雄 鼠 ， 或 肉 鼠 彼此 之 间 皮 肤 移 植 ， 均 不 发 生 移植 免疫 反应 。 这 表明 有 和 Y 染 色 体 相连 的 移植 抗原 存在 , A H-YGUR. Goldberg (1971) 用 专 一 的 抗 H-Y his 进行 的 细胞 毒性 实验 证 明 ，50%% 以 上 的 小 鼠 精子 表面 存在 H-YGUR. LW TMV 作 标 记 之 免疫 电子 显微镜 研究 , 还 观察 到 瑞 -Y 抗 原 的 分 布 限于 精子 头 部 顶 体 区 域 〈 开 oo 等 ,1973) (图 4-37) 。 既 然 精子 由 于 性 染色 体 的 差异 而 在 表面 抗原 上 (至 少 部 分 地 ) 呈现 两 型 差异 ， 理论 上 ， 就 有 可 能 用 免疫 选择 方法 改变 精子 和 了 精子 的 比例 ， 从 而 改变 子 代 的 性 比 。 最 近 , 有 人 在 这 方面 进行 了 初步 的 尝试 。 在 离 体 条 件 下 ， 用 抗 杏 -Y 血 清和 补体 处 理 小 鼠 精子 ， 期 望 能 选择 地 杀 死 Y 精子 。 然 后 用 这 样 处 理 过 的 精子 对 雌 鼠 作 人 工 授精 。 结 果 在 产生 的 子 代 中 ， 性 比 表 现 出 微小 的 在 统计 上 有 意义 的 变化 。 对 照 组 雄性 占 53%， 而 实验 组 占 45% 。 也 就 是 说 , 在 实验 组 肉 性 增加 了 8% (Bennett 和 Boyse，1973) 。 这 说 明 在 一 定 程度 上 对 Y- 精 子 进 行 免疫 选择 是 可 能 的 。 最 近 ， 用 专 一 的 抗 小 鼠 了 -Y 血 清 进行 的 混合 吸附 和 细胞 毒性 实验 还 证 明 ， 大 鼠 、 豚 鼠 ,. 家 兔 和 人 的 也 -Y 抗原 和 小 鼠 的 了-Y 抗 原 在 血清 学 上 有 交叉 反应 (Wachtel 等 ，1974) 。 这 种 交叉 反应 是 否 可 用 来 对 异种 的 Y 精子 作 免 疫 选择 ， 值 得 用 实验 去 验证 。 最 近 ，Bennett LMA RIV) PARED, ， 畸 态 癌 和 精子 上 存在 一 个 共同 细胞 表面 抗原 (Yanagisawa 等 ，1974) 。 Jak, 进一步 发 现 人 类 精子 上 也 有 这 一 共同 。 144 。 一 4-37 TMV #] H-Y HRS SOME LK TMV 标记 分 布 限 于 顶 体 区 域 (1 ， 顶 体 后 区 (2 和 联合 侦 (3) 都 没有 《〈X17:,000)。 FA: ”标记 的 顶 体 区 域 之 较 高 的 放大 倍数 (X50,540), 示 TMV 标记 的 规则 的 分 布 ( 据 Koo 等 ,1974)。 抗原 存在 。 在 小 鼠 ， 这 一 共同 抗原 是 由 t 基 因 座 野生 型 等 位 基因 决定 的 ， 其 突变 等 位 基 A(t") 为 纯 合 子 时 是 致死 的 。 发 育 停 顿 在 桑 棋 期 导致 胚胎 的 死亡 。 由 此 可 见 ， 此 细胞 表面 抗原 很 可 能 在 早期 胚胎 发 育 中 起 某 种 重要 的 作用 (Buc-Caron 等 ，1974) 。-: 在 正常 发 育 过 程 中 ， 不 同 发 育 时 期 的 胚胎 都 可 能 有 时 期 专 一 的 表面 抗原 出 现 ， 完 成 一 定 的 形态 发 生 的 或 生理 的 功能 ， 而 在 成 体 就 消失 或 量 上 大 大 减少 。 只 有 在 瘤 变 时 ， 基 因 去 抑制 ， 才 可 能 重新 表现 出 来 ， 呈 现 为 所 谓 的 “ 癌 胚 性 抗原 ”(oldovsky，1974) 。 。145 。 六 、 肿 瘤 细 胞 表面 抗原 如 前 所 述 ， 肿 瘤 细 胞 表面 抗原 的 变化 是 正常 细胞 转化 为 恶性 细胞 时 最 早出 现 的 特 征 。 这 种 变化 非常 复杂 ， 既 可 能 包括 正常 细胞 原 有 的 几 类 主要 表面 抗原 (物种 专 一 抗原 、 组 织 专 一 抗原 .组 织 相 容 性 抗原 .植物 血球 凝集 素 受 体 等 ) 在 数量 上 和 空间 分 布 上 的 变动 ， 也 可 能 出 现 新 的 .肿瘤 专 一 的 抗原 。 肿 瘤 细 胞 抗原 的 复杂 性 ,从简 图 4-38 可 看 出 来 。 目前 在 实验 动物 上 有 大 量 证 据 证 明 ， 无 论 肿瘤 病毒 ， 化 学 致癌 物质 或 物理 因子 引起 的 肿瘤 都 具有 肿瘤 专 一 抗原 。 所 谓 肿瘤 专 一 是 指 该 类 抗原 是 宿主 正常 组 织 没 有 的 、 癌 变 过 程 中 新 产生 的 ， 因 而 对 原 发 宿主 表现 相当 强 的 外 源 性 ， 能 被 宿主 识别 ， 产 生 抗体 或 其 他 免疫 反应 。 这 些 新 抗原 ， 若 位 于 细胞 膜 上 则 可 能 在 自体 或 同 基因 型 异体 宿主 引起 移植 免疫 反应 ， 导致 肿瘤 的 排斥 。 因此 ， 也 可 以 称 为 肿瘤 专 一 移植 抗原 (Tumor specific transplantation antigen， 简 称 T. S. T. A.) 。 一 般 说 来 ， 化 学 致癌 物质 引起 的 T. S. T. A. 是 每 一 肿瘤 细胞 株 专 一 的 ， 而 与 其 他 肿瘤 ， 甚至 同一 化 学 致癌 物质 在 其 他 个 体 上 诱发 的 同一 类 型 的 肿瘤 也 没有 交叉 反应 ”。 另 一 方面 ， 同 一 种 病毒 诱发 的 所 有 肿瘤 ， 不 论 其 组 织 发 生 或 动物 来 源 的 不 同 ， 都 可 能 存在 共同 的 病毒 诱发 的 细胞 表面 抗原 TSTA Se vcsA A4-38 况 细 胞 表面 抗原 和 细胞 内 抗原 示意 图 。 (SP) 为 物种 专 一 抗原 ,CH-2\H-Y) 为 组 织 相 容 人 性 抗原 ,(ITI) 为 组 织 专 一 抗原 ,CCE) 为 瘤 胚 竹 抗 原 ,(ISTA) 为 肿瘤 专 一 移植 抗原 ,(YCSA) 为 病毒 诱发 细胞 表面 抗原 (RS) 为 植物 血球 凝集 素 受 体 ,(Ve，Vi) 为 病毒 体 结 构 抗 原 ,(N，CE) 为 DNA 病毒 诱发 的 新 抗原 ,CP) 为 瘤 胎盘 抗原 ( 据 Hauschka, 1973), 1) 最 近 发 现 H-24 基因 型 纯 系 小 鼠 的 化 学 致癌 物质 诱发 的 肿瘤 表现 出 属于 其 他 品系 的 H- 抗 原 〈《H-2” 和 H-2*)， 并 认为 就 是 该 肿瘤 的 肿瘤 专 一 移植 抗原 。 这 提示 化 学 透 发 的 肿瘤 专 一 抗原 是 组 织 相 容 性 基因 随机 突 变 的 产物 ,因此 其 抗原 性 可 能 是 瘤 株 专 一 的 。 不 过 ,肿瘤 专 一 抗原 是 去 抑制 的 或 突变 的 互 -基因 的 产物 ;有 无 普 遍 意义 还 不 能 肯定 。 目 前 至 少 已 知 一 种 肿瘤 的 肿瘤 专 一 抗原 和 互 -抗原 是 不 同 的 分 子 ( 据 Davies, 1975), es。 146» (VCSA) 。 这 种 出 现在 纪 胞 表面 的 抗原 是 受 病毒 基因 控制 的 宿主 细胞 的 产物 ， 而 不 是 病 毒 本 身 的 抗原 。 在 这 些 新 出 现 的 抗原 中 ， 其 中 一 些 并 非 真 正 是 肿瘤 特有 的 抗原 ， 它 们 实 际 上 可 能 在 一 定 的 胚胎 发 育 时 期 曾经 出 现 过 ， 或 者 在 其 他 正常 的 成 体 组织 就 有 存在 。 和 它们 有 关 的 基因 ， 在 正常 情形 下 受到 抑制 ,只 是 在 瘤 变 过 程 中 由 于 基因 表达 失常 , 才 在 错 误 的 时 间或 错误 的 地 点 表现 出 来 。 属 于 前 一 情形 的 ， 如 所 谓 的 癌 胚 性 抗原 (CE) 。 属于 后 一 情形 的 ， 如 某 些 非 内 分 刻 器 官 在 形成 肿瘤 后 可 以 分 记 某 些 激素 ， 所谓 外 位 性 抗原 ， 或 产生 胎盘 组 织 特有 的 抗原 ， 所 谓 癌 胎 盘 抗原 (CCP). 严格 说 来 ,只 有 在 任何 发 育 时 期 、 任何 正常 组 织 中 从 来 未 出 现 过 的 抗原 ， 才 能 算是 真正 的 肿瘤 专 一 抗原 。 这 种 抗原 是 否 存 在 , 还 是 一 个 有 争论 的 问题 。 肿瘤 的 免疫 诊断 和 免疫 治疗 都 取决 于 肿瘤 有 没有 专 一 的 抗原 。 从 理论 上 讲 ， 很 可 能 只 有 肿瘤 细胞 表面 抗原 才能 有 效 地 引起 保护 性 免疫 反应 ， 用 于 肿瘤 的 免疫 治疗 。 同 时 , 这 些 抗 原 从 细胞 膜 上 溶解 下 来 后 ,又 可 能 用 于 免疫 诊断 。 近 年 来 ,国外 许多 实验 室 正 致力 于 表面 抗原 的 分 离 、 纯 化 的 研究 。 但 遇 到 除 研究 一 般 细胞 膜 抗原 的 困难 外 ， 还 存在 同 种 异 体 抗 原 的 干扰 等 特殊 困难 , 这 方面 的 进展 仍 很 缓慢 。 关于 肿瘤 抗原 化 学 结构 的 知识 几乎 还 是 空白 。 目 前 对 于 这 样 一 个 重要 的 问题 还 只 能 粗 陈 梗概 。 (—) 化 学 诱发 肿瘤 的 表面 抗原 化 学 致癌 物质 诱发 的 肿瘤 ， 用 超声 处 理 等 方法 从 细胞 膜 上 溶解 下 来 的 抗原 ， 能 在 同 基因 型 的 豚鼠 引起 移植 免疫 反应 ， 并 且 保 持 瘤 株 专 一 的 抗原 性 (Oettgen 等 ，1968; Ho- Imes 等 ，1970) 。 后 来 ,用 3M KCl 也 成 功 地 从 二 乙 基 硝 胺 诱发 的 豚鼠 肝癌 细胞 分 离 出 一 个 膜 抗原 ， 分 子 量 范围 约 在 75,000 一 150,000 之 间 ， 用 迟 发 型 皮肤 超 敏 反 应 测试 时 , 表 现 出 专 一 的 肿瘤 抗原 活性 (Meltzer 等 ，1971) 。 此 外 ， 从 氨基 偶 氮 染料 诱发 的 大 鼠 肝 癌 ， 用 木瓜 酶 有 限制 消化 ， 从 膜 上 溶解 下 来 的 成 分 ， 再 经 Deae- 纤 维 素 层 析 分 离 出 一 个 抗原 成 分 ， 它 能 专 一 地 抑制 曹 光标 记 的 肝癌 抗 血 清和 肝癌 细胞 膜 的 结合 (Baldwin 和 Glaves，1972) 。 (二 ) 病毒 诱发 肿瘤 的 表面 抗原 Smith 等 (1970) 最 先 报告 从 SV 40 病毒 诱发 的 肿瘤 ， 用 木瓜 酶 消化 法 ， 从 细胞 膜 溶解 和 分 离 出 肿瘤 专 一 的 抗原 ， 能 专 一 地 抑制 离 体 的 细胞 毒性 反应 。 但 是 ， 在 Sepha- dex-G 150 分 离 的 各 部 分 中 ， 抗 原 活力 分 布 很 广 ， 因 而 无 法 判断 其 分 子 性 质 。 后 来 有 人 从 小 鼠 RBL-5 白血病 细胞 分 离 出 一 个 初步 纯化 的 可 溶性 表面 抗原 ， 能 引起 专 一 的 移植 免疫 反应 。 从 凝 胶 过 滤 的 洗 脱 行为 估计 分 子 量 约 为 50,000 一 60,000。 同 时 ， 还 证 明 它 不 是 白 血 病 病毒 的 抗原 成 分 ， 而 可 能 代表 病毒 转化 的 瘤 细 胞 的 一 个 新 的 表面 抗原 成 分 (Law #1 Appella, 1973), (=) 人 消化 道 癌 胚 性 抗原 (CEA) Gold 实验 室 经 过 严格 的 对 照 实验 ， 用 取 自 同一 肠 段 的 正常 组 织 作 对 照 ， 以 减少 同 © 147 。 图 4-39 体外 暂 养 的 直肠 癌 细 胞 知 铁 蛋白 - 抗 CEA 结合 物 一 起 保温 ， 因 定时， 9 和 固定 后 均 未 加 钉 红 染 糖 蛋白 (X 240,000)( 据 Gold 等 ,1970)。 种 异体 抗原 的 干扰 , 证 明 人 类 结肠 癌 组 织 存在 一 种 专 一 的 抗原 (Gold 和 Freedman, 1965) 。 这 种 抗原 是 正常 结肠 组 织 所 没有 的 ， 而 在 2 一 6 个 月 胎儿 的 肠胃 、 胰 等 组 织 中 存 在 ， 因 此 称 为 癌 胚 性 抗原 (Carcinoembryonic antigen, 简称 CEA). 。 他 们 还 假定 这 种 抗原 是 内 胚层 来 源 的 胎儿 消化 道 组 织 共 同 的 发 育 时 期 专 一 的 抗原 ， 癌 变 时 由 于 基因 的 去 抑制 ， 又 重新 表现 出 来 。 进一步 萤 光 免疫 组 织 化 学 和 铁 蛋 白 标 记 抗 体 电子 显 微 镜 观 察 , 证明 CEA 位 于 癌 细 胞 表面 的 糖 蛋白 外 被 上 (图 4-39) (Gold 等 ，1970) ,并 能 释放 进 。148 。 i 2 表 4-10 CEA 的 氨基 酸 和 单 糖 组 成 BR 分 析 a &£& 酸 分 析 单 糖 微克 分 子 /mgCEA a #& & 微克 分 子 /mgCEA L-# Bi 0.15 赖 氨 酸 0.06 D- 甘 露 糖 0.49 组 氨 酸 0.03 D- 半 乳糖 0.62 精 氨 酸 0.08 N- 乙 酰 -D- 0.97 | 天 冬 氨 酸 ; 0.375 氨基 葡萄 糖 : HAR 0.22 Inge is 0.24 丝氨酸 0.27 SAB 0.26 hip ARE 0.19 甘氨酸 0.13 Aas 0.14 5 5 0.16 Fe 0.12 AR 0.22 iam 0.06 AA AR 0.05 _ GE Banjo 等 ,1972)。 表 4-11 纯化 CEA 的 低 聚 糖 片段 的 单 糖 组 成 和 免疫 学 活力 低 聚 糖 片段 之 单 糖 组 成 (微克 分 子 ) Pa HB REP EN cy) 6% Bh CEA 2 RBG a RACs | ERC - ” eam tem) saa [OR RS 一 一 一 一 一 一 | 一 | fn | | | 一 一 一 0.016 一 一 一 0.365 0.024 一 0.25 = 0.006 0.013 一 一 = 0.047 0.016 bes 全 二 0.254 0.000 = 二 a aa ui fF WN = * 86°C 7K MEIN ALL TE 56 CE 60°C 水 解 48 小 时 后 再 在 此 温度 水 解 的 小 时 数 。 《〈 据 Banjo 等 ,1972)。 和信 血 流 中 ， 六 而 可 能 对 消化 系统 癌症 有 诊断 价值 。 因 此 ， 这 一 发 现在 理论 上 和 临床 实 路 上 都 曾 引起 很 大 的 兴趣 (Gold，1971) 。 结肠 癌 组 织 的 过 氧 酸 (1.0M) 提取 液 ， 可 经 凝 胶 过 滤 和 制备 电泳 等 步骤 纯化 。 纯 化 的 CEA 在 理化 性 质 上 是 均一 的 ， 超 离心 沉降 常数 为 8.05 S， 免 疫 电泳 上 表现 为 8- 球 蛋 BRRW—ARe (Krupey 等 ，1972) 。 化 学 性 质 上 ， CEA 是 一 个 糖 蛋白 ( 糖 和 蛋白 的 比例 约 为 23:1) 。 根据 间接 的 证 据 提 示 抗 原 决定 簇 可 能 和 糖 基 团 有 关系 (Gold 等 ， 1371)。 对 CEA 化 学 组 成 的 分 析 表 明 ， 其 特点 是 不 含 N- 乙 酰 - 氮 基 半 乳 糖 ， 而 含有 相当 量 的 甘露 糖 ( 表 4-10) 。 已 知 前 者 是 血型 A 抗原 的 免疫 优势 基 团 ,，- 而 后 者 又 是 血型 A 抗 原 所 没有 的 。 因 此 ， 纯 化 的 CEA 分 子 并 不 含 血型 A 的 抗原 决定 簇 。 利 用 聚 茶 乙烯 磺 酸 对 CEA 作 可 控制 的 水 解 ， 得 到 4 个 低 聚 糖 片 假 ， 用 放射 免疫 法 测定 时 ， 均 表 现 抗原 活 性 ( 表 4-11)。 所 有 这 4 个 低 聚 糖 片段 ,都 含有 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 。 在 片段 1.3、.4 这 实 «© 149 « 际 上 是 唯一 的 单 糖 成 分 。 片段 2 的 免疫 学 活性 和 其 他 几 个 片段 比 起 来 最 高 ， 它 的 N- 乙 酰 氮 基 葡 萄 糖 的 含量 相当 低 ， 并 含有 甘露 糖 。 虽然 N- 乙 酰 氮 基 葡萄 糖 本 身 并 不 能 抑制 CEA- 抗 CEA 的 结合 , 但 是 这 些 结果 似乎 提示 ， 含 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 的 低 聚 糖 可 能 和 CEA 的 抗原 决定 簇 有 重要 关系 。 这 一 氨基 糖 或 许可 能 作为 免疫 优势 基 团 的 核心 ， 或 许 也 可 能 是 肿瘤 抗原 决定 签 本 身 的 一 个 组 成 部 分 (Banjo 等 ,1972) 。 近 来 ,利用 一 系列 低 聚 糖 对 CEA 抗原 抗体 系统 的 抑制 实验 进一步 证 明 三 -N- 乙 酰 壳 三 糖 (Tri-N-Acety- lchitotriose) 类 型 的 构造 可 能 是 CEA 的 一 个 抗原 决定 簇 (Anderson 等 ，1975) 。 最 近 ， 另 一 些 作者 报道 ， 即 使 从 同一 个 肠 癌 材料 也 可 以 分 离 出 分 子 量 不 同 的 CEA (6.8S 和 10.1S) ， 通 常 为 6.8S (Coligan 等 ，1972) 。 这 样 纯化 的 CEA 若 用 BEcteola- 纤维 素 和 等 电 点 聚焦 法 进一步 分 析 时 ， 又 表现 出 不 均一 性 。 由 此 得 到 的 几 个 部 分 的 唾 酸 和 氨基 糖 含 量 也 是 不 均一 的 ， 但 都 表现 抗原 活性 。 当 用 神经 氮 酸 酶 处 理 , 去 除 唾 酸 后 , 等 pipe 8 程度 就 减少 了 (Coligan 等 ,1973) 。 这 说 明 CEA 电荷 不 均一 可 能 是 受到 唾 酸 含量 不 同 的 影响 。 另 一 方面 ， 不 同 实验 室 和 不 同 病 人 的 CEA 样品 的 expat, 说 明 所 有 结肠 癌 CEA 抗原 的 蛋白 部 分 是 相似 的 。 由 此 可 见 ， 纯化 CEA 表现 的 电荷 不 均一 性 可 能 是 由 于 同一 抗原 在 分 离 、 纯 化 过 程 中 唾 酸 和 氮 基 糖 有 不 同 程度 的 解 离 所 致 。 这 再 次 表明 了 细胞 表面 糖 蛋白 抗原 分 离 和 纯化 的 特殊 困难 。 NaS CEA 过 程 中 ,还 伴随 出 现 一 个 分 子 量 较 小 的 糖 蛋白 (大 约 3-48), £ 琼脂 双 扩 散 上 和 CEA 有 部 分 的 免疫 学 交叉 反应 (图 4-40) 。 然 而 ， 它 在 其 他 正常 组 织 中 也 可 能 存在 ， 既 不 是 器 官 专 一 的 、 也 不 是 肿瘤 专 一 的 抗原 ， 因 而 称 为 非 专 三 的 交叉 反应 抗原 (NCA), IKE CEA 放射 免疫 测定 中 , 某 些 非 消化 道 癌症 病人 出 现 假 阳 性 ， 可 能 就 是 由 于 iA Www MCA| ， 它 的 干扰 (Kleist 等 ，1972)。 相 隔 不 久 + AE 的 作者 都 证 实 此 抗原 的 存在 ,所 谓 “NGP”(Mach 和 Puszataszeri, 1972), “CCEA-2” 都 可 能 是 AU NCA 相同 的 或 相近 的 抗原 (Turberille 等 ， 1973) 。 由 于 CEA FINCA 两 种 抗原 具有 一 部 分 - 共同 的 抗原 决定 答 ， 用 CEA 免疫 动物 时 得 到 的 OS f ANET MERE CARS. 2 stu AEAKEIe—H, MICRA 分 子 上 的 的 抗原 结构 。(aCEA) 为 抗 CEA 血清 ;CaCN) 为 ”不同 抗 原 决 定 簇 起 反应 。 一 种 抗 血 清 能 和 存在 于 抗 正常 结肠 粘 肛 血清 ( 据 Kleist 等 4272)。 恶性 和 正常 组 织 中 的 NCA 起 反 应》 表 因 两 种 分 子 有 共同 的 抗原 决定 簇 。 第 二 种 抗 血清 只 能 和 CEA 起 反应 ， 而 不 能 和 NCA 起 交叉 反 应 ， 证 明 CEA 有 独特 的 抗原 决定 做 的 存在 。 第 三 种 ， 也 是 最 常见 的 一 种 抗 血 清 不 能 区 分 CEA 和 NCA， 和 它们 有 同样 好 的 反应 。 倘若 用 这 种 抗 血清 来 探讨 CEA 的 独特 抗原 REHM, RSS (Tomita 等 ，1974) 。 因 此 , 在 区 别 肿 瘤 和 正常 组 织 的 抗原 异同 时 ， 选 择 适当 专 一 性 的 抗 血 清 有 决定 性 意义 。 这 是 肿瘤 免疫 诊断 特别 应 注意 的 地 方 。 Bz, CEA 是 位 于 结肠 癌 细 胞 表面 的 糖 蛋白 外 被 上 的 大 分 子 抗原 。 严 格 说 来 ,并 不 是 细胞 膜 杰 身 的 结构 抗原 。 和 其 他 消化 道上 皮 的 糖 蛋 白 外 被 一 样 ， 它 们 是 在 细胞 内 合成 后 输送 到 细胞 表面 的 。 这 些 高 度 水 溶性 的 糖 蛋白 ， 能 释放 到 肠 道 内 ， 再 进 和 循环， 因而 。，150。 可 以 在 血液 中 测 出 来 。 虽 然 在 多 数 局 限 性 肠 癌 病 人 血液 内 有 抗 CEA 抗体 存在 ， 但 没 有 抑制 肿瘤 生长 的 保护 作用 。 另 一 方面 ， 也 没有 证 据 能 肯定 CEA 可 能 引起 细胞 免疫 反 应 。 这 些 特 点 都 可 能 是 和 CEA 在 细胞 表面 上 的 地 位 以 及 抗原 特性 有 关系 的 。 起 初 曾 认 为 血清 CEA 可 作为 消化 道 肿瘤 免疫 诊断 的 专 一 抗原 。 后 来 临床 上 发 现 一 些 其 他 肿瘤 或 疾病 ， 如 乳癌 ,肺癌 和 结肠 溃疡 等 ， 也 可 能 呈现 假 阳性 。 这 可 能 是 受到 NCA 这 类 抗原 的 干扰 。 因 此 ， 诊 断 的 专 一 性 仍 有 疑问 , 还 需 在 实践 中 研究 改进 ， 而 关键 又 在 于 选择 只 和 CEA 独特 的 抗原 决定 搁 反 应 的 抗 血 清 。 此 外 , 肠 癌 全 部 切除 时 , 血 流 中 CEA 相当 迅速 消失 ， 复 发 时 又 重新 出 现 。 这 说 明 CEA 在 肠 癌 手术 预后 方面 ， 仍 然 是 有 价值 的 。 — 在 严格 的 意义 上 ， 人 类 肿瘤 是 否 存在 真正 专 一 的 肿瘤 抗原 ,还 是 一 个 有 争论 的 问题 。 如 果 认 为 就 基因 表现 而 论 ， 在 全 部 正常 发 育 过 程 中 从 未 出 现 过 的 抗原 ， 才 能 算是 专 一 的 话 , 那 上 只 有 起 源 于 遗传 变异 的 瘤 细 胞 ， 理 论 上 才 可 能 有 “肿瘤 专 一 ”抗原 存在 。 如 果 对 “ 专 一 抗原 ”理解 为 和 恶性 生长 共同 特征 相关 联 的 抗原 ， 则 不 能 排斥 其 较 普遍 存在 的 可 能 性 。 有 人 发 现 所 有 测试 过 的 恶性 肿瘤 (良性 肿瘤 除外 ) 病人 的 淋巴 球 都 能 和 诱发 自体 免疫 性 脑 SAN MMMHEA (A. I.) ， 以 及 按 和 提取 A. I， 蛋 白质 相同 的 方法 从 许多 种 肿瘤 提取 出 的 蛋白 质 起 专 一 的 免疫 反应 ， 产 生 能 使 正常 豚鼠 的 巨 叹 细 胞 在 电泳 场 中 移动 速度 ” 诚 慢 的 因子 (Macrophage slowing factor，MSF) 。 从 经 过 长 期 培养 的 HeLa nia 分 离 细胞 膜 ， 还 证 明 这 一 抗原 存在 于 细胞 膜 上 (Dickinson 等 ，1972) 。 所 以 ， 理 论 上 这 一 抗原 可 能 用 于 恶性 肿瘤 的 鉴别 诊断 ， 或 许 还 可 能 用 于 免疫 治疗 。 近 来 在 临床 上 已 开 始 试用 于 恶性 肿瘤 的 诊断 (Pritchard 等 ，1972，1973; Preece 和 Light，1974) 。 总 括 起 来 ， 癌 细胞 的 恶性 特征 , 侵 润 . 转 移 和 失去 生长 控制 等 ， 都 是 和 细胞 表面 抗原 的 改变 有 密切 关系 的 。 肿 瘤 专 一 抗原 的 存在 是 肿瘤 免疫 诊断 和 免疫 治疗 的 前 担 。 并 且 在 理论 上 很 可 能 只 有 肿瘤 细胞 表面 抗原 才能 产生 有 效 的 保护 性 免疫 反应 ， 达 到 排斥 肿瘤 的 目的 ， 因 为 无 论 抗体 或 致 敏 的 淋巴 球 都 必须 通过 瘤 细 胞 表面 ， 才 能 识别 和 选择 地 杀伤 瘤 细胞 。 由 此 可 见 , 肿瘤 细胞 表面 抗原 的 分 离 ` 纯 化 和 结构 研究 的 重要 性 。 推 而 广 之 ， 移 植 免疫 间 题 的 解 决 也 有 待 于 对 组 织 相 容 性 抗原 的 更 深信 的 了 解 ， 选 择 或 改变 一 定 的 ht 以 期 在 成 体 诱 导 免 疫 耐 受 性 或 封 阻抗 体 ， 达 到 克服 异体 移植 的 免疫 排斥 的 目的 。 同 样 地 ， 生殖 细胞 表面 抗原 的 研究 对 于 控制 生育 的 意义 也 是 显而易见 的 。 目 前 这 些 方面 的 研究 还 很 初步 。 这 主要 是 由 于 对 细胞 膜 结构 知识 还 相当 贫乏 ,以 及 膜 抗 原 的 分 离 . 纯 化 和 结构 分 析 方 法 不 完善 的 限制 。 由 于 上 述 肿瘤 免 变 和 异体 移植 等 方面 的 实际 需要 ， 儿 然 会 促进 细 胞 表面 抗原 研究 工作 的 加 强 并 加 速 其 进展 。 参 /“ 考 小 "资料 专著 和 综述 '， Billingham, R. and Silvers. W (1971). The Immunobiology of Transplantation, Englewood Cliffs. Pren- tice-Hall. Boyd. W. C. (1962). Introduction to immunochemical specificity, Interscience. Braun, V. (1973). Molecular organization of the rigid layer and the cell wall of Escherichia coli. In: ‘“) 复合 佐 剂 Freund 佐 剂 。 佐 剂 安全 性 的 改进 Freund (1951) 把 抗原 和 石蜡 油 混合 、， 借 助 乳 化 剂 ( 羊 毛 脂 或 Arlacel A) 的 作 用 ， 研 磨 成 为 一 种 油 包 水 ( 双 /0O) 的 乳液 。 通常 在 注射 一 .二 次 后 ,就 可 能 产生 效 价 高 而 持 入 的 抗体 。 这 种 佐 剂 称 为 Freund AGLEMM( Gish + AA). 如 果 在 不 完全 优 TAL, 再 加 死 的 分 校 杆 菌 (Mycobacterium), mA SERIF 〈M. tuberculosis) 或 卡 StH 〈B. C. G)， 还 可 能 再 增高 抗体 效 价 ， 并 且 引 起 迟 发 型 超 敏 反应 (图 5-1) 。 这 种 佐 as。 157 « 剂 称 为 Freund 完全 佐 剂 (石蜡 油 + 乳 化 剂 + 分 枝 杆 菌 ) 。 Freund 佐 剂 的 作用 还 依赖 注射 途径 。 对 一 般 实验 动物 说 来 ， 足 掌 或 皮 内 注射 效果 最 好 。 如 家 免 , 足 掌 或 皮 内 注射 能 诱发 过 敏 性 脑 脊 髓 炎 , 而 腹腔 内 或 皮下 注射 则 不 能 。 豚 UES EN ARM Freund 完全 佐 剂 一 小 时 后 ;切除 该 足 ， 也 能 出 现 脑 脊 伐 炎 。 这 可 能 是 由 于 在 这 一 短暂 时 间 内 已 经 有 足够 量 的 脑 抗 原 和 佐 剂 ， 经 过 淋巴 管 分 布 到 体 内 。 皮 内 注射 效果 较 好 ， 可 能 是 由 于 这 一 部 位 小 淋巴 管 的 分 布 较 多 ， 易 于 进入 引 度 淋巴 bt “Ae bins teil RRS EM 《月 数 ) 图 5-1 Freund 完全 佐 州 和 不 完全 佐 剂 对 于 家 免 在 皮下 接种 死伤 寒 杆 菌 后 所 呈现 的 凝集 效 价 的 加 强 作用 ( 据 Carpenter，1956)。 注射 Freund 完全 佐 剂 后 , 注射 部 位 经 常 出 现 肉芽 肿 和 持久 的 误 疡 。 组 织 学 上 注 射 部 位 局 部 有 巨 哦 细胞、 上 皮 状 细胞 .淋巴 球 和 浆 细 胞 聚集 成 团 。 动物 经 病理 学 检查 发 现 肺 . 肝 、 肾 、 肌 肉 等 器 官 都 有 散在 的 肉芽 肿 。 同 时 , 淋巴 结 增 重 , MERE REARS) 内 浆 细 胞 广泛 增生 。 除 去 主要 由 分 校 杆菌 引起 的 毒性 作用 外 ， 乳 化 剂 甘 露 栈 单 油 酸 酯 (Arlacel A) 易 被 体内 酯 酶 水 解 ， 释放 出 的 游离 的 油 酸 也 能 造成 组 织 的 损伤 〈Berlin 和 Wyman，1971) 。 由 于 这 种 毒性 作用 ，Freund 佐 剂 在 临床 上 (如 肿瘤 免疫 治疗 ) 应 用 时 , 对 病人 增加 不 少 痛 苦 。 近来 ,发展 了 一 种 比较 安全 的 佐 剂 ， 即 佐 剂 65 〈 花 生 油 ， 单 硬 脂 酸 铝 和 - Arlacel A). 这 种 佐 剂 当 和 流感 疫苗 共同 使 用 于 预防 接种 时 ， 在 提高 抗体 水 平和 持续 时 间 方 面 都 取得 很 好 的 效果 ,并 能 在 安全 范围 内 在 人 体 使 用 , 只 引起 很 轻 的 炎症 反应 。 据 报告 504 例 使 用 五 年 以 上 ,未 发 现 全 身 或 局 部 不 利 影响 。 这 种 佐 剂 可 以 很 快 地 代谢 , 从 组 织 内 排除 出 去 (Woodhour “, 1964; Peak 等 ，1964; Weibel 等 ，1970) 。 当 佐 剂 65 MAM StS RRR (Poly I:C 或 Poly A:U) 时 ， 佐 剂 作 用 还 要 加 强 很 多 (Woodhour 等 ， 1969) 。 佐 剂 65 对 细胞 免疫 有 无 促进 作用 ， 还 不 清楚 。 人 工 合成 双 链 多 聚 核 背 酸 (Poly A:U) 或 Poly C 和 甲 基 化 BSA 络 合 物 ， 都 能 加 强 细胞 抗原 和 颗粒 抗原 引起 的 免疫 反应 。 免 疫 动物 的 脾脏 内 浆 细胞 早期 增加 的 速度 加 快 。 这 可 能 是 由 于 核 苷 酸 激酶 活力 加 强 的 结果 (Braun 和 Nakano, 1967), 从 不 介 苗 提取 出 的 RNA， 人 工 合成 的 Poly A:U 都 能 促进 T 细 胞 群 的 增生 ,并 在 豚鼠 能 帮助 抗原 诱 es le vt ay ve A REZ (Gumbiner 等 ，1973; Paterson 和 Drobish, 1974), 自体 免疫 病 发 病 学 说 中 ;病毒 潜伏 或 持续 存在 ， 常 被 认为 是 诱发 自体 免疫 反应 的 关键 。 近 来 在 某 些 全 身 性 红斑 狼疮 病人 血液 中 发 现 有 双 链 RNA 存在 。 病 毒 双 链 RNA 作为 天 然 。158 。 佐 剂 ， 在 诱发 自体 免疫 病 中 所 起 的 作用 是 值得 注意 的 。 人 工 合成 双 链 多 聚 核 苷 酸 ， 虽然 对 体 滚 免疫 和 细胞 免疫 都 有 促进 作用 ， 但 在 动物 毒性 实验 上 表现 较 显 著 的 毒性 作用 。 因 此 其 安全 性 仍 是 没有 保证 的 (Beers 和 Braun, 1970). 鉴于 佐 剂 对 于 加 强 免疫 反应 、 调 节 免 疫 反 应 的 类 型 和 诱发 实验 性 自身 免疫 病 等 方面 的 作用 ， 实 践 土 对 安全 佐 剂 的 迫切 需要 ， 以 及 卡介苗 作为 非 专 一 佐 剂 在 肿瘤 免疫 治疗 上 有 一 定价 值 (Simmons 和 Rios, 1971; Zbar 等 ，1972; Marx 和 Rios, 1974), & 剂 作用 原理 ， 特 别 是 分 枝 杆 菌 有 效 成 分 的 分 离 、 纯 化 和 佐 剂 作用 的 研究 ， 近 年 来 受到 相 当 大 的 注意 。 (=) 佐 剂 作用 原理 有 佐 剂 作用 的 物质 是 多 种 多 样 的 ， 它 们 的 一 个 共同 性 质 就 是 表面 活性 。 对 于 脂肪 族 含 所 化 合 物 的 系统 地 研究 表明 ， 佐 剂 活力 必须 同时 具备 两 个 条 件 : 化 合 物 必须 是 碱 性 的 和 含有 长 的 烃 链 。 如 二 甲 基 腺 的 同系 物 , 佐 剂 活性 从 10 碳 原子 链 长 开始 出 现 ,12 KAM 速 增高 ， 此 后 增加 减 慢 (Gal1，1966)。 许多 种 能 使 溶 酶 体 的 膜 不 稳定 ， 从 而 释放 出 内 含 的 水 解 酶 的 物质 ， 同 时 也 具有 佐 剂 活力 。 如 维生素 A， 内 毒素 ( 脂 多 糖 )， 百日咳 菌 ， 硅 颗 粒 等 都 可 能 通过 这 一 机 制 (影响 巨 噬 细胞 活动 ) 而 起 作用 (Spitznagel 和 Allison, 1970), Freund 不 完全 佐 剂 中 ， 蛋 白质 抗原 存在 于 油 包 水 〈(W/O) 乳液 的 水 相 内 就 能 产生 显著 的 佐 齐 效应。 如果 油 相 内 再 加 分 校 杆 菌 更 可 以 大 大 加 强 这 种 效应 。 因 此 ， 其 作用 是 多 方面 的 。 可 分 别 从 胶体 化 学 方面 和 细菌 专 一 作用 等 方面 ,加 以 讨论 。 1. 胶体 结构 稳定 性 的 作用 Freund 不 完全 佐 剂 (AMARA) 的 作用 是 由 于 在 某 些 乳化 剂 (Arlacel A 或 羊毛 脂 ) 的 作用 下 ， 能 形成 稳定 的 油 包 水 乳 流 。 蛋 白质 抗原 存在 于 水 相 内 , 因而 能 保持 长 期 的 ` 缓 慢 的 释放 。 乳 液 稳 定性 与 其 粘度 有 密切 关系 。 对 乳液 结构 的 电子 显微镜 观察 表 BA, 粘度 大 的 乳 流 ( 流 速 为 1 一 3 分 钟 /0.1; 毫 升 )， 具 有 很 稳定 的 三 维 网 状 构造 ， 含 抗原 的 水 相 分 散在 油 相 内 ， 呈 细 丝 状 。 如 果 油 相 内 加 分 枝 杆 菌 ， 只 有 当 细 菌 被 邻近 的 水 滴 包 被 时 ,才能 呈现 典型 的 完全 佐 齐 效应。 如 用 吐 温 80 作 乳化 剂 ， 形 成 水 包 油 (9 /到 ) 乳 波 , 则 无 佐 剂 效应 。 其 次 ， 即 使 乳液 粘度 较 低 ， 只 要 分 枝 杆 菌 和 水 相 保持 大 量 接触 ， 就 能 产生 很 好 的 佐 剂 效应 。 因 此 ， 完 全 佐 剂 的 胶体 结构 所 起 的 作用 是 使 水 咨 性 抗原 和 分 梳 杆 菌 保 持 稳 定 而 密切 的 接触 ， 由 此 产生 类 似 分 枝 杆 菌 本 身 的 抗原 一 一 结核 菌 素 引 起 的 免疫 反应 ( 据 Dvorak 和 Dvorak，1974) 。 反 之 ， 当 用 分 枝 杆菌 的 一 种 有 效 成 分 糖 脂 CP.) 作为 佐 剂 时 ， 蛋 白质 抗原 只 有 存在 于 水 包 油 :(O /W) 乳液 状态 ， 才 能 诱发 迟 发 型 超 敏 反应 和 肉芽 肿 。 抗 原 加 Ps 和 Freund 不 完全 佐 剂 混合 形成 油 包 水 乳液 时 ， 就 不 表现 佐 剂 效应 。 At, fet Ps 乳液 的 物理 状态 (位 于 油 滴 内 或 表面 ) 似乎 对 于 免疫 原 性 有 重要 的 作用 (Granger 等 ，1976) 。 Freund 不 完全 佐 剂 ， 由 于 具有 稳定 的 油 包 水 胶体 结构 ， 还 能 起 以 下 几 种 作用 : 1) -延迟 抗原 在 局 部 的 破坏 并 保持 缓慢 释放 。 如 志 贺 氏 杆 菌 抗 原 参 人 油 包 水 乳液 中 ， © 159» 注射 后 可 保持 22 周 ; 2) 引 六 淋 巴结 内 ， 产 生 抗 体 的 细胞 增多 ; 这 可 能 是 由 于 抗原 和 淋巴 结 内 细胞 接 刊 时 间 延 长 ， 或 抗原 分 子 在 乳化 时 物理 状态 改变 (聚集 )。 总 之 ， 油 包 水 乳液 中 抗原 能 保持 很 长 久 的 时 间 , 缓慢 释放 , 并 易于 进入 淋巴 管 。 而 其 他 种 类 佐 剂 ， 如 明 碘 沉淀 的 抗原 很 快 就 被 结缔 组 织 包 围 ， 不 易 对 抗体 形成 系统 起 刺激 作 用 。 最 后 ， 还 应 考虑 一 个 问题 Freund 完全 佐 剂 乳化 过 程 中 是 否 会 使 蛋白 质 抗原 变性 。 这 对 于 借助 Freund 完全 佐 剂 诱导 抗体 来 研究 蛋白 质 抗原 构象 的 可 靠 性 是 有 决定 BM 的 。 有 人 应 用 有 顺 磁 共振 (EPR) 直接 观察 乳液 中 的 蛋白 质 , 证 明 血 红 蛋 白 在 乳化 过 程 中 ， 或 在 乳 该 状态 放置 24 小 时 (4"C) (相当 于 通常 免疫 前 的 操作 条 件 ) 都 没有 变性 (Berzo- fsky 等 ，1976) 。 2. 细 蔚 的 专 一 作用 Freund 不 完全 佐 剂 内 加 入 分 枝 杆 菌 后 ， 所 引起 的 免疫 反应 发 生 很 大 的 质 的 变 化: 促进 迟 发 型 超 敏 肥 应 的 出 现 或 加 强 ; 合成 不 同类 型 的 免疫 球 蛋白 。 如 豚鼠 用 卵 白 蛋白 单 独 注射 主要 引起 IgG 抗体 ， 而 加 Freund 完全 佐 剂 时 ， 主 要 产生 IgM 抗体 。IgM 的 增 加 和 迟 发 型 超 敏 反 应 强度 有 平行 的 关系 。 并 易于 引起 实验 过 敏 性 自身 免疫 病 ， 如 脑 养 散 炎 和 塞 丸 炎 ， 或 “ 佐 剂 病 ” 。 诱 发 强 的 到 发 型 超 敏 反应 是 分 梳 杆 菌 , 以 及 其 他 几 种 细菌 ,如 小 棒状 杆菌 〈Corynebacteriumm parvum) 的 独特 的 作用 。 其 他 大 多 数 佐 剂 一 般 能 促进 抗体 产生 ， 但 不 能 同时 促进 迟 发 型 超 敏 反应 。 3. 分 梳 杆 菌 有 效 成 分 的 分 离 、 纯 化 从 50 年 代 起 ， 曾 作 过 许多 努力 来 分 离 分 枝 杆菌 的 有 效 成 分 。 最 早 得 到 的 有 效 制品 ， 如 了 蜡 是 一 种 短 肽 糖 脂 (Peptidoglycolipid) 。 其 化 学 组 成 的 特点 是 类 脂 部 分 含有 独特 的 分 枝 杆菌 酸 (Mycolic acid), 一 种 又 链 的 8- 羟 酸 ; 同时 还 含有 为 细胞 壁 之 短 肽 聚 糖 (Peptidoglycans) 所 特有 的 氨基 酸 ( 丙 氨 酸 、 谷 氮 酸 、m- 二 氮 基 庚 二 酸 ) 。 当时 有 人 认 为 这 种 特殊 的 分 子 构造 可 能 满足 Gall (1966) 所 设想 的 表面 活性 的 要 求 。 最 近 几 年 , 这 方面 的 工作 获得 迅速 的 进展 。Adam 等 (1972) 借助 溶菌 酶 ， 首 先 从 一 种 分 枝 杆 菌 〈M. smegmatis) 细胞 壁 分 离 出 一 种 水 溶性 大 分 子 ， 是 由 细胞 壁 短 肽 育 糖 和 阿拉 伯 - 半 乳 聚 糖 相 连 构成 。 当 把 它 加 到 Freund 不 完全 佐 剂 内 ， 它 能 完全 代替 分 校 杆菌 起 加 强 体液 免 痕 和 引起 细胞 免疫 的 作用 ， 同 时 不 呈现 毒性 (Chedid 等 ，1972)。 其 他 作者 用 不 同方 法 ， 也 得 到 类 似 的 水 溶性 有 效 成 分 (Hiu, 1972; Migliore-Samour 和 Jolles，1972) 。 后 来 ， 又 从 一 种 人 结核 杆菌 (H37Ra) 的 脱脂 细胞 壁 提出 一 个 水 溶性 佐 剂 有 效 成 分 ， 化 学 性 质 为 一 个 4 糖 -7 肽 。 用 33 微克 髓 和 芋 碱 性 蛋白 抗原 加 12.5 微克 这 PENI AMMO, BAEK HRA AES (Westall 等 ，1975) 。 此 外 ， 有 从 一 种 结核 杆菌 (DT) 的 培养 液 中 ， 也 能 提取 出 大 量 的 无 毒性 的 有 佐 剂 活性 的 成 分 ， 为 一 种 IK MER HES HK (Stewart-Tull 等 ，1975) 。 对 于 分 枝 杆菌 的 水 溶性 优 剂 成 分 的 进一步 分 析 ， 还 发 现 不 含 中 性 糖 的 短 肽 聚 糖 也 有 同样 的 佐 剂 作用 〈Adams 等 ，1973) 。 后 来 ， 更 进一步 证 明 最 小 的 有 效 片 段 是 一 个 双 糖 * 1606 4k (): p81 一 4 N- 羟 乙酰 胞 辟 酸 N- 乙 酰 氨 基 葡 萄 糖 一 一 > (N-glycolymuraimic acid) L- 丙 氨 酸 D- 谷 氨 酸 一 一 NH， m- 二 氨基 庚 二 酸 一 NHL D_ 丙 所 本 RE 4K (D 《细胞 壁 短 肽 育 糖 亚 基 ) 的 构造 它 相 当 于 细胞 壁 短 肽 聚 肽 的 亚 基 ， 能 提高 对 卵 白 蛋白 的 循环 抗体 ， 并 引起 迟 发 型 超 敏 反应 (Adam 等 ，1974) ky, 从 革 兰 氏 阴 性 细菌 (如 大 肠 杆 菌 ) 和 革 兰 氏 阳 性 细菌 (如 Streptococcus faecalis, Lactobasillus-casei 和 S. epidermidis), 也 都 能 得 到 结构 类 似 的 具有 佐 剂 活力 的 化 合 物 。 可 见 ， 这 类 物质 不 限于 在 抗 酸性 细菌 中 存在 。 这 些 化 合 物 和 分 枝 杆菌 双 糖 4 肽 (IT) 在 结构 上 的 唯一 差别 是 在 大 肠 杆菌 中 ，N- 产 乙 酰 胞 壁 酸 (N-glycolymuramic acid) 被 乙酰 胞 壁 酸 (Acetylmuramic acid) 代替 ，D- 谷 氮 酸 和 症 - 二 氨基 庚 二 酸 不 氨基 化 ;而 在 革 兰 氏 阳 性 细菌 中 ，m- 二 氨基 庚 二 酸 则 RLM 氨 BA (Nauciel 等 ，1974) 。- 再 进一步 分 析 佐 剂 活力 和 短 肽 聚 糖 分 子 结构 的 关系 ， 发 现 大 肠 杆菌 到. coli) 之 短 肽 聚 糖 去 除 双 糖 后 的 短 肽 片段 , 也 能 保持 原 分 子 的 佐 剂 活力 (# 5-1) 。 因 此 ， 短 肽 L-Ala-D-Glu-R3-D-Ala (其 中 了 3 为 m- 二 氮 基 庚 二 酸 或 N 取代 的 工 :Lys)。 似乎 可 能 是 代表 佐 剂 活性 的 最 小 构造 。 很 可 能 具有 这 种 特殊 结构 的 短 肽 在 动物 细胞 内 很 难 被 分 解 ， 并 因 之 而 起 佐 剂 作用 (Fleck 等 ，1974) 。 表 5-1 HBTS KEE (peptidoglycan) 及 其 片段 之 佐 剂 活力 整 kK 聚 糖 ， 提 取 自 E. coli KK Hi HR E. col: S. faecalis*| L. cases®* |S. epzder7z215##| 双 糖 肽 单 体 | 肽 双 体 肽 单 体 双 糖 Be le ee be oe ce be aC) | aaa] oe Oe 50 4/4cs) | . 6/7012) | 6/7012) 4/4(12) 10 4/4014) 3/4(13) | 7/18(16) | 3/413) 0/4 1 2/4(13) 6/8(12) | 7/8(14) 0/4 1/4 1/4 0/4 0/10 “将 细胞 壁 物质 加 入 到 偶 氮 苯 砷 酸 -N- 乙 酰 -L- 酷 氨 酸 溶液 中 。 此 混合 物 加 等 体积 Freund 不 完全 佐 剂 乳化 。 豚 鼠 足 掌 和 注射 0.2 毫升 乳液 ,含有 2X10” 克 分 子 抗原 和 表 内 指明 剂量 的 佐 剂 。 致 敏 12 天 后 ， 用 10 rR ARR 奴 鼠 血清 白 蛋 自作 皮 试 。 24 小 时 后 观测 ， 色 肤 反应 超过 直径 8 毫米 为 阻 性 。 结果 用 阳性 动物 数 和 实验 动物 总 数 的 比值 表示 , 括 弧 内 数字 为 皮肤 反应 的 平均 直径 。 4 肽 单位 的 基本 分 子 构造 如 下 : * L-Ala-D-Glu(NH,) -—L-Lys-D-Ala | 81| D-Asp(NH,) ** | -Ala~D-Glu(NH,) ex" ean: 8 | (Gly),, L-Ser (# Fleck 等 ,1974)。 e161 6 最 近 ， 还 合成 了 一 个 含 糖 短 肽 ，N-acetylmuramyl-L- 丙 氨 酸 - 异 谷 氮 酰 胺 ,在 水 深 液 内 (代替 油 包 水 乳剂 ) 就 能 起 促进 体 流 抗 体 的 佐 剂 作用 。 当 此 化 合 物 中 的 工 - 丙 氨 酸 改 变 为 D- 丙 氮 酸 时 ， 免 疫 反 应 就 被 抑制 (Chedid 等 ，1969) 。 细菌 佐 剂 有 效 成 分 具有 无 毒性 的 优点 。 这 一 发 现 为 研制 用 于 人 体 的 安全 佐 剂 准备 了 条 件 。 4. 细胞 学 机 制 分 枝 杆菌 及 其 有 效 成 分 的 生物 学 作用 的 特点 是 刺激 组 织 内 巨 噬 细 胞 的 增生 。 注 射 局 部 出 现 一 个 包含 类 上 皮 细 胞 ， 巨 吻 细 胞 的 肉芽 肿 。 局 部 淋巴 结 内 巨 吻 细 胞 广泛 增生 。 在 小 鼠 造 成 引 度 淋巴 结 付 皮 质 ( 胸 腺 依赖 ) 区 域 扩大 ， 注 射 第 四 天 时 此 区 域 出 现 类 淋巴 母 组 胞 ,然后 出 现 生发 中 心 和 低 部 浆 细胞 的 增生 (Taub 等 ，1970) 。 这 些 事实 提 示 分 枝 杆菌 的 作用 可 能 主要 是 影响 巨 噬 细 胞 ,并 刺激 T 细 胞 群 的 增生 ， 从 而 促进 迟 发 型 超 敏 反应 。 要 了 解 佐 剂 如 何 调节 免疫 反应 问题 ， 首 先 应 知道 哪些 细胞 参与 佐 剂 影响 的 免疫 反应 过 程 。 早期 的 工作 认为 佐 剂 首先 是 影响 巨 唉 细 胞 。 佐 剂 和 抗原 经 巨 鸣 细 胞 吞 喉 处 理 后 ,再 注 射 到 其 他 动物 ， 引 起 的 免疫 反应 大 大 加 强 。 目 前 已 经 知道 ,对 于 大 多 数 抗 原 , 形成 抗体 需要 了 细胞 和 了 吾 细胞 间 的 配合 。 Allison 和 Davies (1971) 用 实验 方法 造成 缺乏 了 T 细胞 的 小 鼠 。 这 样 的 动物 ， 当 注射 BSA 和 Freund 完全 佐 剂 时 , 佐 剂 对 免疫 反应 的 促进 作用 便 明 显 地 减弱 。 如 果 再 移植 胸腺 组 织 到 这 些 动物 ， 佐 剂 促 进 抗 as? anumcompan_teameng STRUPANARERT. HULA, Heh mai, ABERMAA, 另外 两 个 合成 抗体 的 ”的 促进 作用 需要 T 细胞 的 参加 。 鉴 于 佐 剂 可 能 浆 细 胞 和 巨 噬 细 胞 的 细胞 肛 贴 近 ， 其 中 一 个 冰 细 胞 ”最 先 作用 于 巨 噬 细 胞 ， 有 人 假定 佐 剂 可 能 加 强 的 训 人 位 内 有 过 生化 和 本 0 关 Ai 全 下 噬 细胞 对 下 细胞 的 影响 ， 刺 激 下 细胞 增生 ， pee 进一步 促进 了 细胞 和 B 细胞 的 相互 作用 , 从 而 加 强 抗 体 的 产生 。 电 子 显微镜 观察 发 现 含有 Freund 完全 佐 剂 的 巨 史 细胞 与 淋巴 细胞 ， 和 正在 产生 抗体 的 浆 细胞 之 间 有 紧密 的 接触 ， 也 支持 这 一 看 法 (Miller 和 Avrameas, 1971) (Al5-2). BCG 非 专 一 地 促进 肿瘤 免疫 的 机 制 ， 至 少 部 分 可 能 是 通过 巨 噬 细 胞 刺激 了 Bi 细 胞 。 全 身 注 射 BCG 的 小 鼠 ， 其 脾脏 细胞 产生 的 淋巴 球 激 活 因子 比 正常 小 鼠 增 高 2 一 3 倍 ， 明 显 地 刺激 T 细胞 在 离 体 条 件 下 表现 的 杀伤 作用 (Mitchell 等 ，1973) 。 此 外 ， 也 有 证 据 表 明 BCG 还 可 能 直接 加 强 巨 吻 细胞 本 身 对 瘤 细 胞 的 杀伤 作用 《〈 了 Evans 和 Ale- Xander，1972) 。 Freund 完全 佐 剂 还 能 改变 两 种 以 上 的 抗原 混合 物 引 起 的 抗体 的 比例 。 这 可 能 是 由 于 佐 剂 刺激 了 细胞 ， 加 强 某 一 抗原 成 分 的 竞争 作用 ， 从 而 改变 免疫 反应 的 专 一 性 (Tau- 。162。 ssig，1974) 。 这 一 问题 将 留待 后 面谈 抗原 竞争 作用 时 再 一 起 讨论 。 总 之 , 佐 剂 的 作用 机 制 是 十 分 复杂 的 ， 涉 及 到 抗原 的 选择 性 分 布 , BM, 免 疫 活 性 细胞 间 的 相互 作用 等 细胞 免疫 学 理论 问题 。 因 此 ， 目 前 对 这 一 问题 了 解 的 深度 还 难免 不 受到 对 这 些 问 题 的 认识 程度 的 限制 。 二 、 动 物 的 反应 性 任何 免疫 反应 都 是 动物 体 对 抗原 反应 的 结果 。 免疫 反应 不 能 不 受到 动物 的 遗传 性 、 发 育 时 期 和 生理 状态 等 整体 因素 的 影响 。 由 于 本 书 范围 的 限制 ， 这 里 只 能 作 非 党 简略 的 Wit. eat test igh hase <= 对 于 同一 种 抗原 ,不同 物种 , 不 同 品系 , 甚至 不 同 个 体 (如 人 类 对 应 变 原 的 敏感 性 ) 产 生 免 疫 反应 的 能 力 都 不 同 。 例 如 ， 品 系 13 豚鼠 对 胰岛 素 的 某 些 决定 簇 起 反应 ， 而 品系 2 叹 鼠 则 不 能 。 反之 ， 品 系 2 豚鼠 能 对 DNP-4R-1-MARHN DNP 决定 簇 起 免疫 反应 ， 而 品系 13 则 不 能 。 这 种 反应 能 力 的 差别 是 遗传 的 , 受 一 个 显 性 基因 控制 。 ARPRASA (Bp) 蛋白 质 ， 偶 氮 蛋 白质 对 这 两 个 品系 都 能 引起 免疫 反应 。 然而 ， Bp- 多 聚 -1- 赖 氨 酸 或 偶 氮 -多 聚 -1- 赖 氮 酸 却 只 能 在 品系 2 引起 抗体 产生 。 这 两 类 抗原 的 半 抗 原 相 同 ， 差 别 只 是 载体 不 同 。 因 此 ， 抗 体 的 产生 主要 依赖 于 动物 对 载体 蛋白 质 的 反 应 性 。 目前 认为 免疫 反应 性 的 遗传 是 受 两 类 免疫 反应 基因 Cr genes) 控制 的 。T 细胞 对 抗原 载体 决定 往 的 识别 是 受 和 组 织 相 容 性 基因 连锁 的 Ir 基因 控制 的 ;而 了 细胞 对 抗 原 的 半 抗 原 决 定 簇 的 识别 是 受 和 免疫 球 蛋白 同 种 异型 基因 连锁 的 Ir 基因 控制 的 。 这 些 基因 分 别 地 决定 工 细胞 和 了 B 细胞 表面 受 体 的 构造 (MecDevitt 和 Landy，1972) 。 (=) 抗原 竞争 现象 当 一 个 动物 注射 两 种 或 两 种 以 上 的 抗原 时 ， 它 们 引起 的 抗体 的 量 通常 是 不 相等 的 ， 一 种 抗原 可 能 抑制 对 另 一 种 抗原 的 反应 。 这 一 现象 称 为 抗原 竞争 〈Antigenic competi- tion) 。 如 家 兔 的 球 蛋 白 和 白 蛋 白 分 别 注 射 到 小 鼠 ， 都 能 引起 很 强 的 抗体 反应 。 但 是 , 将 此 两 种 抗原 混合 注射 时 ， 产 生 的 抗 球 蛋白 抗体 占 绝对 优势 (95%)， 而 抗 白 蛋 白 抗 体 的 产 生 则 受到 显著 的 抑制 。 品系 13 豚鼠 对 多 聚 -1- 赖 毛 酸 无 反应 性 。 对 免 血 清白 蛋白 (RSA) 则 有 反应 性 , 能 产生 抗 RbSA 抗体 。 当 多 缀 -1- 赖 氨 酸 和 免 血 清白 蛋白 混合 注射 时 ， 结 果 抗 RbSA 和 抗 多 聚 -1- 赖 氨 酸 抗体 都 不 能 产生 。 显 然 ， 这 同样 可 能 是 由 于 抗原 竞争 在 这 里 起 作用 。 多 聚 -1- 赖 氨 酸 的 存在 抑制 了 抗 RbSA 抗体 的 形成 。 同一 个 蛋白 质 分 子 被 两 个 半 抗 原 取 代 { 如 蛋白 质 分 子 的 1ys 残 基 上 连接 DNP- 基 团 ， Tyr. 或 Hist. 残 基 上 连接 P- 偶 氮 葵 砷 酸 (Ars) 基 团 ]。 当 把 这 种 抗原 注射 到 动物 体内 « 1636 时 ， 世 出 现 抗 原 竞争 现象 ， 结 果 只 形成 抗 -DNP 抗体 ， 而 不 形成 抗 -Ars 抗体 。 如 果 注 射 DNP- 蛋 白质 和 Ars- 和 蛋白 质 的 混合 物 时 ， 两 半 抗 原 各 位 于 一 个 载体 分 子 上 ， RHE 时 产生 两 种 抗体 。 显然 ， 只 有 当 两 个 半 抗 原 位 于 同一 载体 分 子 上 并 和 同一 细胞 起 反应 时 ，DNP 基 团 才能 抑制 抗 -Ars 抗体 的 产生 。 抗原 竞争 现象 对 于 了 解 抗 原 在 抗体 形成 中 所 起 的 作用 ,可 能 是 一 个 重要 的 线索 。 可 是 ， 对 这 一 现象 产生 的 机 制 ， 一 直 不 清楚 ， 直 到 Radovich 和 Talmage (1967) KB 经 和 射线 照射 的 寄主 ， 接 种 脾脏 细胞 愈 多 ， 产 生 的 抗原 竞争 现象 愈 强 , 这 才 开 始 找 到 了 线索 。 进 一 步 研究 还 发 现 ， 在 继承 性 免疫 传递 实验 里 ， 把 同 基因 型 的 淋巴 球 接种 到 一 个 存在 抗原 竞争 的 寄主 环境 内 ， 这 些 细胞 的 抗体 形成 便 受到 抑制 。 抗 原 竞 争 现象 依赖 胸腺 的 存在 。 小 鼠 切 除 胸腺 后 ， 便 不 能 表现 出 抗原 竞争 现象 。 如 果 这 些 去 胸腺 的 小 鼠 再 输入 胸腺 细胞 时 ， 随 着 输入 细胞 数量 的 增加 ， 抗 原 竞争 程度 也 增加 (Gershon 和 Kondo, 1971) 。 此 外 ， 非 专 一 的 了 细胞 刺激 物 也 能 引起 类 似 抗原 竞争 的 效应 。 当 有 Freund 5 全 佐 剂 存在 时 ， 对 两 种 抗原 混合 物 的 抗体 反应 专 一 性 发 生 显著 的 改变 。 如 用 家 免 球 蛋白 和 和 白 蛋 白 ， 不 加 佐 剂 注射 到 小 鼠 ， 所 产生 的 抗体 中 95 % 为 抗 球 蛋 白 抗 体 , 5% 为 抗 白 蛋 白 抗 体 。 加 Freund 完全 佐 剂 后 ， 两 种 抗体 的 比例 就 发 生 明 显 的 变化 。 这 时 约 40% 抗 体 为 抗 球 蛋 白 抗体 ，60% 为 抗 白 蛋 白 抗 体 。 这 在 很 大 程度 上 是 由 于 抗 球 蛋白 抗体 的 产生 受到 了 抑制 。 已 知 Freund 完全 佐 剂 本 身 对 单独 注射 球 蛋 白 一 种 抗原 的 免疫 反应 ,没有 抑制 影响 。 并 且 如 前 节 所 述 ，Freund 完全 佐 剂 有 非 专 一 地 激活 工 细胞 的 作用 。 因此 ， 它 很 可 能 是 通过 加 强 了 细胞 活动 ， 从 而 促进 两 种 抗原 的 竞争 作用 ， 导 致 抗体 反应 专 一 性 的 改变 (Taussig，1974) 。 总 之 ， 以 上 这 些 实验 提示 抗原 竞争 现象 是 依赖 胸腺 的 ， 并 且 可 能 是 受 了 细胞 作用 下 产生 的 非 专 一 免疫 抑制 物 影响 的 结果 。 至 于 这 种 非 专 一 的 抑制 物 是 工 细胞 本 身 产 生 的 ， 还 是 被 了 细胞 激活 的 巨 唉 细 胞 产生 的 ,还 有 不 同 的 看 法 。 关于 抗 原 竟 争 现象 的 详细 论述 ， 可 参看 Taussig (1973) 和 Gershon (1974) 的 专 论 。 (三 ) 抗原 剂量 抗原 剂量 对 免疫 反应 的 质 和 量 方面 都 有 影响 。 大 多 数 蛋白 质 抗 原 , 不 加 佐 剂 ,注射 一 次 , 只 能 缓慢 地 引起 微弱 的 抗体 反应 。 通 常 要 经 过 多 次 注射 才能 达到 高 的 抗体 水 平 。 对 于 不 同 的 免疫 原 ， 放 导 抗 体 反 应 所 需 的 最 低 剂 量 有 很 大 的 差别 ， 如 葛 毛 素 和 白喉 类 毒素 只 需 0.01 一 0.1 微克 ， 而 BSA 需要 比 这 一 剂量 大 1,000 倍 。 当 超过 最 低 剂 量 的 冰 值 后 ， 随 着 剂量 的 增高 ， 达 到 一 个 最 适 抗体 反应 区 , 然后 又 下 降 ， 不 起 抗体 反应 , 即 达到 高 区 耐 受 性 (High-zone tolerance) 或 免疫 麻 闸 (Immunological paralysis) 。 对 于 所 有 低 分 子 量 和 中 等 分 子 量 的 可 溶性 蛋白 质 ( 如 血清 蛋白 、 核 糖 核酸 酶 ， 白 喉 类 毒素 和 办 毛 素 等 ) ， 还 可 能 诱导 低 区 耐 受 性 (Low-zone tolerance) 。 也 就 是 说 ， 随 着 剂 量 的 增加 ， 存 在 从 低 区 耐 受 性 到 最 适 抗体 反 应 区 ， 再 到 高 区 耐 受 性 的 过 渡 。 除 鞭毛 素 外 ， 上 述 其 他 几 种 抗原 在 小 鼠 上 诱导 低 区 耐 受 性 的 阔 值 是 相当 恒定 的 ,大约 在 1.0 和 微克 附 近 。 各 种 抗原 随 其 免疫 原 性 不 同 ， 诱 导 低 区 耐 受 性 的 条 件 也 不 同 。 一 些 抗原 如 牛 丙种 球 蛋白 (BGG) ， 高 速 离心 去 除 聚 集 物 后 ， 对 小 鼠 完全 没有 免疫 原 性 。 换 名 话说 , 只 要 超过 诱导 耐 受 性 所 需 的 阔 值 ， 便 一 直 能 诱导 耐 受 性 。 第 二 类 抗原 ， 如 白喉 类 毒素 ， 对 于 小 鼠 。164 。 只 有 在 免疫 抑制 状态 (如 亚 致死 照射 ) 时 ， 才 能 诱导 低 区 耐 受 性 。 对 于 正常 动物 ， 在 小 于 诱导 耐 受 性 剂量 ， 以 及 整个 免疫 耐 受 性 剂量 范围 内 都 能 诱导 抗体 的 形成 。 第 三 类 抗原 ， 如 和 牛 血 清白 蛋白 (BSA) 在 低 于 诱导 低 区 耐 受 性 最 小 剂量 时 ,什么 反应 也 不 发 生 。 等 于 或 略 100 。 超过 诱导 低 区 栈 受 性 的 阔 值 时 , 便 出 现 耐 受 性 。 剂量 愁 续 增加 便 进入 最 适 抗体 反应 区 。 再 继续 增加 ， 便 达到 高 区 耐 受 性 。 由 于 多 数 抗原 属于 第 二 类 ， 即 免疫 所 需 的 最 低 剂 量 远 低 于 低 区 而 受 性 的 益 值 ， 因 此 ， 在 通常 免疫 程序 中 ， 不 会 遇 到 这 类 耐 受 性 。 不 过 在 受到 免疫 抑制 后 ， 诱 导 耐 受 性 的 可 能 性 就 大 大 增加 了 。 凌 毛 素 抗 原 清楚 地 表现 两 个 区 域 的 耐 受 性 (图 5-3) 。 然 而 ,诱导 低 区 耐 受 性 的 剂量 要 比 其 他 抗原 低 得 多 。 其 间 的 对 应 关系 还 不 清楚 。 因 此 ， 也 有 人 称 之 为 超 低 区 耐 受 性 。 Ns 当 抗 原 剂量 达到 毫克 范围 时 ， 总 是 诱导 高 a ee Risse. (RR SHEA) AER eq T ani. mh WEKHR/H kB /K 高 区 耐 受 性 可 能 影响 T 细胞 和 了 细胞 。 图 5-3 S. edclorde 内 毛 素 剂量 和 免疫 反应 类 型 的 关系 , 示 高 区 和 低 区 耐 受 性 , 用 对 照 组 平均 效 价 的 百 (WU) 激 素 分 数 表 示 。 实 验 步 最 : HAAR ER 10-°—10~" ye 鞭毛 素 / 克 体 重 , 连 续 两 周 。 在 此 期 间 对 照 组 动物 只 Cn oo oO oO 相当 于 对 照 组 8 局 时 免疫 反应 的 百分数 ee 注射 盐水 。 在 第 一 轮 注 射 停止 后 ， 两 组 所 有 的 大 鼠 ss Se 每 周 两 次 ,注射 10 微克 鞭毛 素 ， 继 续 到 动物 的 年 龄 激素 对 免疫 反应 可 能 产生 两 类 非 专 的 影 为 10 周 时 为 止 。 年 龄 为 12 周 时 ,所 有 动物 再 注射 10 响 ， PFE EK MIRE Diener, 1970), 1. 对 体液 抗体 合成 速度 的 影响 垂体 肾上腺 皮质 系统 对 淋巴 组 织 的 构造 和 功能 有 很 大 影响 。 长 期 使 用 ACTH XRF 上 腺 皮质 当 体 激素 都 能 造成 淋巴 组 织 的 退化 ， 并 抑制 抗体 形成 。 然 而 ， 对 于 已 免疫 的 动 物 ,使 用 小 量 ( 生 理 量 ) 的 皮质 激素 却 能 使 血 流 内 抗体 水 平 暂时 升 高 。 这 可 能 是 由 于 抗体 形成 细胞 被 破坏 ， 而 释放 出 细胞 内 含 的 抗体 的 结果 。 峻 激素 能 促进 淋巴 细胞 增生 ， 因 而 可 能 加 强 抗体 形成 。 生 长 素 和 甲状 腺 素 单 独 或 协同 地 影响 淋巴 组 织 的 成 熟 和 分 化 ， 从 而 加 强 抗体 的 合成 。 2. 对 纪 胞 免疫 的 影响 胸腺 的 内 皮 细 胞 分 记 的 胸腺 素 CThymosin) 能 影响 细胞 免疫 反应 能 力 , 而 不 影响 体 波 抗 体 的 合成 。 这 提示 可 能 存在 两 类 依赖 胸腺 的 了 淋巴 球 : 一 类 的 成 熟 需要 胸腺 激素 的 刺激 ， 但 不 一 定 需要 位 于 胸 踩 内 ， 另 一 类 的 成 熟 必 须 在 胸腺 内 〈White .和 Goldstein, 1972) 。 除 激 素 外 ， 机 体 的 营养 状态 (维生素 、 氮 基 酸 等 ) 以 及 凡 能 影响 一 般 蛋 白 合成 代谢 的 因素 ,也 都 可 能 非 专 一 地 影响 抗体 合成 速度 。 ¢ 165 。 总 之 ， 一 个 抗原 诱导 的 免疫 反应 的 类 型 和 强度 受到 极其 复杂 的 因素 的 影响 。 除 抗原 本 身 的 理化 特性 外 , 在 细胞 水 平 还 受到 剂量 时间、 被 网 状 内 皮 系 统 阻 留 或 吞噬 的 能 力 , 和 免疫 活性 细胞 受 体 的 亲 合 力 、 反 应 的 T、B 细胞 的 数量 和 相互 作用 ， 以 及 免疫 反应 产物 《抗体 等 ) 的 反馈 调节 等 因素 的 影响 (图 5-4) 。 在 整体 水 平 ， 还 要 加 上 遗传 因素 ， 以 及 发 育 时 期 ,神经 体 波 系 统 和 营养 状态 等 非 专 一 的 因素 的 影响 。 ; 剂量 受 体 亲 | | 细胞 Freund wen [Me ke 88 | 2 图 5 于 ”影响 抗原 诱导 的 免疫 反应 的 因素 。 SS SY Bits te fil Fo te il eR 专著 和 综述 Beers, R. 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Co., Amsterdam, London. 。 167 « 第 二 篇 “抗体 :结构 和 功能 抗体 是 能 和 相应 的 抗原 专 一 地 结合 的 蛋白 质 分 子 。 抗 体 属 于 血清 Y- 球 蛋白 类 , 但 并 不 是 所 有 的 Y- 球 蛋白 都 表现 抗体 的 活力 。 血 清 Y- 球 蛋白 在 理化 性 质 等 方面 和 抗体 十 分 相似 , 因而 一 般 假定 所 有 的 >- 球 蛋白 都 可 能 与 适当 的 抗原 结合 , 不 过 这 样 的 抗原 暂时 还 未 被 发 现 喷 了。 根据 这 种 看 法 ， 于 是 便 把 抗体 及 一 些 化 学 构造 和 抗原 性 与 其 有 关 的 蛋白 质 ， 总 称 为 免疫 球 蛋 白 (Immunoglobulin) 。 这 些 有 关 的 蛋白 质 包 括 多 发 性 骨 骨 瘤 病人 血清 中 的 戏 细 胞 瘤 蛋白 质 (Myeloma protein) ， 尿 中 的 Bence Jones 蛋白 质 , 以 及 天 然 存 在 的 免疫 球 蛋 白 的 亚 基 。 前 者 中 许多 已 证 明 有 抗体 活力 。 . 人 类 正常 的 免疫 球 蛋白 已 发 现 有 五 类 : IgG, IgM, IgA, IgE 和 IgD, 担 任 着 不 同 的 免疫 学 功能 。 它 们 的 分 布 不 限于 血清 内 ， 在 其 他 体液 ,如 呼吸 道 、. 消 化 道 和 生殖 道 的 分 谱 液 以 及 初 乳 内 都 可 能 存在 。 血清 中 的 抗体 是 极其 多 种 多 样 的 免疫 球 蛋白 分 子 的 混合 物 。 抗体 的 这 种 高 度 不 均一 性 增加 了 研究 其 化 学 结构 的 困难 。 抗体 是 免疫 系统 的 关键 分 子 。 它 们 担负 着 两 类 免疫 学 功能 ;对 抗原 的 识别 功能 和 效 应 功能 (固定 补体 ， 结 合 细胞 ， 穿 过 胎盘 屏障 等 ) ， 而 其 最 显著 的 特征 是 作用 的 高 度 专 一 性 。 抗 体 分 子 如何 识 别 成 千 上 万 结构 不 同 的 抗原 ， 又 如 何 完成 其 效应 功能 ? 抗体 分 子 的 结构 和 功能 的 关系 ， 尤 其 是 抗原 结合 专 一 性 的 结构 基础 ， 是 分 子 免疫 学 研究 的 中 心 问 题 。 从 上 世纪 末期 Emil von Behring 首先 发 现 抗 体 以 来 ， 抗体 的 结构 和 功能 的 研究 经 历 了 几 个 主要 的 发 展 时 期 。Paul Ehrlich (1906) 采用 “ 锁 和 钥 ? 的 假说 来 解释 免疫 反 立 。 抗 体 和 对 应 的 抗原 之 间 的 结合 专 一 性 依赖 于 两 种 分 子 表面 构造 的 互补 性 ， 就 如 同 锁 和 钥 的 关系 一 样 。 空间 结构 互补 的 思想 对 于 抗体 的 研究 有 次 远 的 影响 。 Hm, Karl Landsteiner (1917) 对 人 工 半 抗原 的 研究 阐明 了 抗体 能 识别 抗原 分 子 结构 的 微小 差异 ， 并 且 证 明了 对 于 各 种 各 样 的 抗原 ， 动 物体 能 相应 地 产生 多 种 多 样 的 不 同 专 一 性 的 抗体 。 再 一 个 重要 的 进展 ， 是 在 五 十 年 代 未 期 由 Niel Jerne 和 MacFarlane Burnet 提出 的 获得 免疫 性 的 无 性 繁殖 细胞 系 选 择 学 说 (Clonal selection theory of acquired im- munity) 。 这 个 学 说 的 要 点 是 动物 体 的 免疫 活性 细胞 在 和 抗原 接触 以 前 ， 就 已 经 具有 制 造 各 种 抗体 分 子 所 需 的 遗传 信息 。 抗 原 分 子 不 是 诱导 抗体 形成 细胞 塑造 结构 上 和 它 互 补 的 抗体 分 子 ， 而 是 选择 已 经 含有 能 制造 在 结构 上 和 它 互 补 的 抗体 分 子 的 遗传 信息 的 细 胞 ， 刺 激 它 们 增生 并 产生 大 量 的 抗体 (图 6-1) 。 这 一 学 说 不 但 商定 了 细胞 免疫 学 的 理论 基础 ， 而 且 对 抗体 分 子 的 结构 、 遗传 和 进化 的 研究 有 很 大 的 启发 。 从 六 十 年 代 初 期 起 ， R. R. Porter 和 G. M. Edelman 创始 的 对 抗体 分 子 的 两 条 肽 链 〈 重 链 和 轻 链 ) AR 解 片段 的 一 级 结构 的 测定 ， 开 有 辟 了 抗体 结构 研究 的 新 时 期 ， 取 得 了 极其 重要 的 进展 。 目 前 已 经 乔 请 楚 了 一 种 人 类 骨 细 胞 瘤 蛋 白质 的 全 部 一 级 结构 ， 它 能 代表 IgE G HAH. IgM 的 一 级 结构 也 已 经 弄 清 楚 了 ， 其 它 几 类 免疫 球 蛋 白化 学 结构 的 研究 也 相继 取得 不 同 程度 的 进展 。 由 于 对 各 类 免疫 球 蛋 白 的 轻 链 和 重 链 的 一 级 结构 测定 积累 的 资料 日 益 增 多 ， 对 > 168+ 未 转化 细胞 图 6-1 抗体 形成 的 无 性 细胞 繁殖 系 选择 学 说 ( 据 Edelman, 1970), 这 些 肽 链 细微 结构 的 比较 分 析 发 现 了 许多 奇异 的 结果 。 这 些 结果 对 于 深入 了 解 抗体 分 子 的 结构 和 功能 的 分 化 ， 抗 原 结 合 位 点 的 专 一 性 和 多 样 性 的 结构 基础 ， 以 及 抗体 分 子 合成 的 遗传 控制 和 进化 等 ， 都 提供 了 重要 的 知识 或 线索 。 电子 显微镜 对 抗体 分 子 的 直接 观 察 ， 和 射线 晶体 分 析 的 结果 ， 也 可 以 和 化 学 结构 测定 的 结果 互相 印证 。 且 前 这 方面 的 研 究 还 在 日 新 月 异地 莲 勃 发展 ， 不 断 取得 新 的 成 果 。 对 免疫 反应 的 关键 分 子 一 一 抗体 构造 的 深入 研究 ， 对 于 了 解 一 般 的 分 子 识别 机 制 ， 高 等 动物 细胞 的 基因 表现 ， 生 物 大 分 子 的 功能 分 化 、 遗 传 控 制 和 进化 等 基本 生物 学 问题 有 密切 的 关系 。 因 此 ， 在 分 子 生 物 学 中 也 可 以 认为 抗体 是 能 和 遗传 信息 分 子 一 一 核酸 相 提 并 论 的 “关键 分子。 同时 ， 这 些 基础 理论 研究 成 果 也 必然 会 促进 对 免疫 而 受 性 、 器 官 移植 .变态 反应 ,自身 免疫 病 和 肿瘤 免疫 等 基本 医学 问题 的 认识 。 如 下 面 将 讲 到 的 ，IgE 的 反应 素 功 能 及 其 作用 机 制 的 发 现 必 将 促进 对 变态 反应 的 认识 和 对 变态 反应 性 疾病 的 控 制 。 。169。 第 六 章 “” 抗体 的 一 般 性 质 、 分 离 和 纯化 一 、 抗 体 的 一 般 性 质 (—) 人 类 的 免疫 球 蛋 白 在 Tiselius (1937) 发 现 血清 蛋白 质 在 自由 电泳 场 中 根据 其 迁移 率 区 分 为 四 个 主要 部 分 (和 白 蛋 白 ，x- 球 蛋白 ，68- 球 蛋白 ，7Y- 球 蛋 日 ) 之 后 不 入, 就 证 明了 抗体 存在 于 血清 的 7- 球 蛋白 或 迁移 较 慢 的 &- 球 蛋白 (pz- 或 了 T- 球 蛋白 ) 部 分 内 (图 6-2,6-3) 。 BRK (单位 /毫升 ) 0 19.5 988 laaaad 图 6-2 家 免 对 肺炎 链球 菌 II 型 的 抗 血清 之 自 6-3 用 白喉 类 毒素 免疫 后 不 A BHAA () 加 抗原 专 一 地 沉淀 去 除 抗体 时 期 的 马 血 清 之 自由 电泳 图 形 。 当 之 前 ; (b) 去 除 抗体 之 后 ， 7- 球 蛋白 部 分 显著 抗体 ( 抗 毒 素 ) 效 价 增高 时 ,迁移 率 - 减少 。 箭头 指示 电泳 的 方向 。 最 前 面 的 峰 是 较 慢 的 8- 球 蛋白 (I- 球 蛋白 ) 也 增 白 蛋白 。 高 。 箭 头 指示 电泳 的 方向 。 抗体 早期 的 分 类 是 根据 电泳 迁移 率 的 不 同 分 为 三 类 。 其 中 两 类 属于 b- 球 蛋白 ; 一 种 分 子 量 大 (4 1,000,000) ， 称 为 6: M; 另 一 种 称 为 6: A (分 子 量 约 为 150,000); 第 三 类 属于 y- 球 蛋白 (分 子 量 约 150,000) 。 六 十 年 代 初 期 流行 着 一 种 看 法 ， 认 为 所 有 的 抗体 同属 于 Y- 球 蛋白 。 它 们 在 理化 性 质 上 彼此 有 关系 , 但 在 电泳 迁移 率 和 分 子 量 上 很 不 均 一 。 因 此 , 当时 曾 将 此 三 类 抗体 重新 命名 为 Y; M (=p. M) ，7:A (=6, A) Flv, RE 白 。 后 来 发 现 所 有 抗体 都 具有 四 条 肽 链 的 基本 结构 ， 二 条 相同 的 轻 链 和 二 条 相同 的 重 链 ， 它 们 又 靠 链 间 二 硫 桥 连接 起 来 (图 6-4) 。 这 种 由 四 条 链 组 成 的 基本 结构 ( 亚 基 ) 又 可 以 经 共 价 键 连接 成 多 聚 体 ， 形 成 高 分 子 量 的 抗体 ， 如 IEM 是 由 五 个 亚 基 组 成 的 (图 6- 5); 分 刻 型 IgE A 是 由 两 个 亚 基 组 成 的 。 各 类 抗体 的 轻 链 的 抗原 性 是 相同 的 (上 型 或 1 型 ) ,而 重 链 的 抗原 性 则 各 不 相同 , 分别 为 Y-，ax-，ApA-，56-，8- 链 。 除 重 链 和 轻 链 之 外 ， 多 聚 体 免疫 球 蛋 白 (IgM 和 分 认 型 IE A) ， 还 含有 JJ 链 。 这 种 基本 结构 的 阐明 为 免疫 球 蛋白 的 合理 分 类 ， 打 下 了 基础 。 *。 170 。 Fab Fe ar EE a ee S S S : > HEA Ca F(ab’), 图 6-4 IgG 的 四 条 肤 链 模型 ， 链 间 由 图 6-5 IgM 分 子 是 由 五 个 四 条 肽 链 的 亚 基 ， 二 硫 桥 连接 。 经 链 间 二 硫 键 共 价 连 接 成 的 五 聚 体 。 #6-1 免疫 球 蛋白 及 其 亚 基 的 命名 (Bull. W. H. O 30: 447, 1964) 物 质 绕 一 名 i 原 用 名 称 免疫 球 蛋白 IgG 或 rG r, 7Sr, 6.6Sr IgA 或 TA YA, B.A IgM 或 7YM YiM，68:M，19Sry，7Y- 巨 球 蛋 白 IgD 或 7YD IgE 或 rE 链 H，A Ls BER 5 IgG IgA IgM IgD IgE 轻 链 型 别 I, B. Hj Ar * 1972 年 世界 卫生 组 织 人 类 免疫 球 蛋白 命名 会 议 建 议 只 使 用 一 个 符号 Ig， 废 除 使 用 符号 >。 ( 据 Bull. W. H.O. 46:67, 1972), 1964 年 世界 卫生 组 织 在 日 内 瓦 召 集 的 人 类 免疫 球 蛋 白 命 名 会 议 , 根据 各 类 免疫 球 蛋 扎 的 化 学 结构 ， 主 要 是 重 链 抗原 性 的 区 别 ， 重 新 统一 命名 为 免疫 球 蛋白 M (简称 IgM), 免疫 球 蛋 白人 IgA) 和 免疫 球 蛋白 G (Ig G) 。 同 时 ,为 了 读音 上 的 方便 ， 又 称 为 YM， YA 和 7YG。 此 后 ,又 陆续 发 现 两 类 新 的 免疫 球 蛋 白 ， 称 为 IED (7D) 和 IgE (vE), 相应 地 ， 它 们 各 自 含 有 特异 的 重 链 ，IgEM 含 链 ，IgEA 含 “ 链 ，IgEG 含 Y 链 ，IgD 含 6 链 ，Ig 卫 含 s 链 ( 表 6-1)。 各 类 免疫 球 蛋白 的 理化 性 质 和 生物 学 特性 列 于 表 6-2 和 图 6-6。 现 简要 地 说 BA 如 Pi. 1. 免疫 球 蛋 白 G(IgG) IgG 在 血清 免疫 球 蛋白 中 含量 最 高 ， 约 占 总 量 的 70%。 人 IgG 的 分 子 量 约 为 143,000—149,000, 在 偏 碱 性 的 电泳 场 中 ，Ig G 的 电泳 速度 是 所 有 血清 蛋白 中 最 慢 的 RAL 表 6-2 人 类 免疫 球 蛋 白 的 性 质 结构 血清 型 : 分 子 式 (cakz) 或 (a,A,) (7rakz) 或 (7,4, (H2k2)5-J (6,62) (8zkz) (a,«,)n-SC-J 或 或 或 或 (M2A2)5-J (6,A,) (@,A,) (a,A,)n-SC-J jtrh n=2 a3 4y F(X 10-°) 143—149 158—162 800—950 175—180 185—190 沉降 常数 S20,W 6.17S 6.18—11.45S 19.0S 6.68 8.0S 重 链 类 别 r a 有 6 8 wa TaghVanitss UM: Oyj, Os 轻 链 型 号 Kya Ksek es «,A «, A 同 种 异型 专 一 性 Gm 十 一 一 Inv +(« 链 ) 一 十 多 糖 含量 (92) IID, 5—10 5 一 10 10 12 生物 学 性 质 抗体 活力 3 十 十 十 抗体 价 数 2 2 5—10 2 固定 补体 Hoc Tos it ce ame Be 0 = 0 0 穿 过 胎盘 ee ee ee ee 0 0 分 这 0 十 ci @ ta 0 BARR: 同 种 0 0 0 十 异种 +11, Yr Ys 0 0 0 合 类 风湿 性 因子 | +1. Te Ta 1%, eerie 2 0.4 0.1 0.003 0.00004* 各 类 ie SNR 70 3 6 0.17 7° CH/K) 23 Zo 0.4 生物 学 半衰期 (天 ) 23 6 5 2.8 23 * 过 敏 性 病人 血清 中 含量 增高 。 ** Ja J SC 示 分 沁 片 ( 据 Cohn, 1971; Gally, 1973), (图 6-6) 。 分 子 由 相同 的 两 条 重 链 (>) 和 相同 的 两 条 轻 链 (上 或 1 ) 构 成 。 因 此 , 分 子 式 可 用 (7Yia#z) 或 (7z1a) 表示 。 分 子 含 糖 量 为 2.5%. 所 有 已 经 研究 过 的 物种 的 IEG， 按 电泳 速度 又 可 区 分 为 两 部 分 : 迁移 较 慢 的 72 和 迁移 较 快 的 Y1。7Y2 又 可 根据 免疫 电泳 行为 再 分 为 二 ,三 个 亚 部 分 : Y2a，72b，7Y2c。 人 类 IgG 按照 电泳 行为 可 区 分 为 四 个 亚 类 : IgG,, IgG,, IgG;, IgG,. IgG, 含量 最 高 ， 占 IgE G 总 量 的 ~70% 。 其 余 G., Gs, G, 分 别 占 18%，8%，3%。 各 亚 类 的 抗原 性 不 同 ， 这 是 由 于 它们 的 重 链 的 不 变 区 的 结构 不 同 。 人 类 IgG 具有 特殊 的 基因 记号 ( 同 种 异型 专 一 性 ) 一 一 Gm 因子 。IgG 的 生物 学 特性 是 能 固定 补体 ， 穿 过 胎盘 屏障 ， 并 具有 使 异种 皮肤 被 动 致 敏 以 及 和 某 些 细胞 ( 单 核 球 ,，B e172. 超 离心 沉降 RHE ok Fi eH tk (pH 8.6) a ee Alb | OA Va a wh 5 —> Z1AT Ee : XIAGP 免疫 电泳 | bee — ————— —— 7 三 一 一 一 二 二 -到 | ( 抗 rCG 十 抗 rA 十 抗 rM) A6-6 ”人 免疫 球 蛋白 及 其 他 血清 蛋白 ( 脂 蛋 白 除 外 ) 的 电泳 和 超 离心 沉降 性 质 。(Alb) AS (TrPA) 前 白 蛋白 , 色 氨 酸 含量 高 ; 〈cx:AGP) ci- 酸性 糖 蛋白 ; 〈c:ATr) wi- 抗 胰 蛋 白 酶 ; (a@,PGP) 易 沉 淀 糖 蛋白 ; 〈4,6SPoA) 4,6 S- 后 白 蛋白 ; (Trpa,) xi- 糖 蛋白 ， SAMAR; (TBG) 甲状 腺 素 球 蛋 白 ; (GC) GC- RBA; (ax) wrtx- 糖 蛋白 ; Cal) cx- 间 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 CHp)》 接 联 珠 蛋白 ; (Cer) 铜 兰 蛋白 ; (aM) wz- 巨 球 蛋 白 ; (@.HS) wzHS- 糖 蛋白 ;(《%2Zn) Zn-x:- 糖 蛋白 ; (a,NGP) wz- 神 经 氨 酸 - 糖 蛋白 ;，Tr- 转 铁 蛋 白 ; 〈B:A，68C) BA- 和 BC- REA; (Hpx) 血红 素 结合 蛋白 ; (6.E) 86:E- 球 蛋白 ; (Pmq) 血浆 溶解 酶 原 ; CB.G,) 62- 糖 蛋 白 ( 气 Nezlin，1972; Kabat, 1971), 淋巴 球 等 ) 亲 合 的 能 力 。 2. 免疫 球 蛋 白 M (Ig M) Ig M 的 特点 是 有 很 高 的 分 子 量 800,006 一 950,000。 分 子 由 五 个 亚 基 构成 。 每 个 亚 基 具有 和 IEG 类 似 的 四 条 链 构造 * 即 两 条 相同 的 重 链 《z) 和 两 条 相同 的 轻 链 (或 A. A 入 前 还 发 现 每 个 五 聚 体 的 IgE M 分 子 还 含有 一 条 了 链 。 因 此 ， 分 子 式 可 用 (wacz)s-J 或 (wz0z)5- 可 表示 。IgM 在 电泳 场 中 的 迁移 率 相当 于 8- 球 蛋白 部 分 。 根 据 抗原 性 和 一 级 结 e 173° WHA, IGM 可 分 为 两 个 亚 类 。Ig M 的 生物 学 特性 是 能 固定 补体 ,并 表现 很 强 的 溶血 素 和 凝集 素 的 抗体 活性 。 3. 免疫 球 蛋 白 A(iIgA) 这 一 类 免疫 球 蛋 白 的 特点 是 除 在 血清 内 存在 外 ， 还 在 各 种 外 分 这 被 内 存在 。 人 类 血 清 IgA 是 以 单 体 形式 存在 ， 分 子 式 可 用 (caez) 或 (ord. 表示 。 Dwg A 通常 以 多 聚 体 〈 二 聚 体 或 三 聚 体 ) 形式 存在 ， 并 含有 分 证 片 (SC) MI Hs; 分 子 式 可 用 (wacz)，- SC-J 或 (xz),-SC-J 表 示 ( 其 路 =2 或 3)。IgA 单 体 的 分 子 量 比 IgG 大， 电泳 迁移 率 比 IEM 快 ， 含 糖 量 也 比 IgM 高。Ig A 有 两 个 亚 类 ,它们 的 重 链 和 轻 链 的 连结 方式 彼 此 不 同 。Ig A 的 生物 学 功能 是 负责 呼吸 道 、 消 化 道 等 粘膜 面 的 局 部 免疫 防御 。 4. 其 他 血清 免疫 球 蛋 白 人 血清 中 还 有 小 量 IE 了 和 IgD 存在 。 它 们 的 分 子 结构 基本 上 和 IgG 相似 , 可 各 用 gz5k2 或 End, 和 Ook. 或 24。 表示 其 分 子 式 。sE、5 重 链 的 分 子 量 和 糖 含量 都 比 IgEG 的 7 和 链 要 高 。 这 两 种 免疫 球 蛋白 都 有 抗体 活性 。Ig 也 已 证 明 是 在 异 位 性 过 敏 反应 中 起 重要 作用 的 反应 素 抗体 (Reaginic antibody), IgD 的 生物 学 功能 还 不 清楚 。 (=) 实验 动物 的 免疫 球 蛋 白 其 他 哺乳 动物 免疫 球 蛋白 的 类 别 和 分 子 构造 与 人 类 的 基本 上 相似 。 因 此 ， 也 应 尽 可 能 采用 相同 的 命名 原则 。 所 有 已 研究 过 的 实验 室 常 用 的 哺乳 动物 都 存在 IEG、IEM 和 IgA。 近来 在 豚鼠 (Margniand 和 Hajos, 1973) 和 大 鼠 血 清 (Isersky 等 ，1974) 均 证 明 有 和 人 类 IgE 相似 的 反应 素 抗体 存在 。Ig G 亚 类 的 变化 较 大 ， 在 不 同 物种 之 间 其 理化 性 质 和 功能 也 有 很 大 的 差别 ， 彼 此 之 间 的 对 应 关系 还 不 清楚 ， 因 此 还 不 能 有 统一 的 命名 ( 表 6-3) 。 RE 述 主要 类 别 外 ， 有 的 物种 还 可 能 存在 独特 的 免疫 球 蛋 白 。 1. RR 同样 存在 和 人 类 IgG、IgEM、IgEA、Ig 卫 在 理化 性 质 和 功能 上 相似 的 四 类 免疫 球 蛋 白 (Mage，1971) ， 以 及 相应 的 四 类 重 链 Y、.x\we。 轻 链 主要 为 上 型 ，1 型 轻 链 含量 一 20% 。 大 多 数 7 链 均 属 于 一 个 亚 类 。 家 免 免 疫 球 蛋白 分 子 结构 的 研究 开始 最 早 (Porter，1959) ， 主 要 是 用 正常 的 、 不 均 一 的 IgG 抗体 进行 的 。 最 近 才 开 始 采 用 某 些 单 细胞 株 之 均一 抗体 (Monoclonal anti- body) 进行 研究 。 2. 大 鼠 和 小 鼠 大 鼠 和 小 鼠 的 某 些 品系 都 能 诱发 分 泌 各 类 免疫 球 蛋白 的 浆 细 胞 瘤 ， 为 研究 各 类 免疫 球 蛋白 的 性 质 和 结构 提供 了 方便 (参看 Potter，1972) 。 如 LOU/WSe 纯 系 大 鼠 AY 184 种 分 弯 型 浆 细胞 瘤 ， 经 鉴定 存在 7 类 (或 亚 类 ) 免疫 球 蛋白 : IEM，IgA，1IgBE，Ig Gi， 。i74 。 表 6-3 各 种 哺乳 动物 IJgG TH 物 种 亚 类 区 链 电泳 相对 迁移 速度 固定 补体 Br BL BZ AR 人 G, 7i 12 i a G, YT, 慢 a 时 G; as 慢 二 3 G, 7 快 一 一 小 鼠 G,(F) 中 快 = G,,(G) .° 慢 1 十 (对 蜡 种 ) G.»(H) 27 慢 + G, 1S 一 一 豚鼠 G, Ti 快 十 G, v2 tS + = 牛 G, Ti 快 十 十 G, 7: 慢 马 G(T) Tr; 快 = G(a) Yr 慢 二 G(b) 7 慢 ie G(c) v2 慢 = AR G, 7， 快 Gy 3 1 + Grp Tob 慢 十 狗 G, Ya 快 ， 2% Giz 7 慢 十 Gry Yop 慢 G,, v2 慢 RR G, Yi 快 G, YT, 1S 十 田鼠 G, i 快 = ES G, 7: 慢 十 十 ( 据 Nezlin. 1972), IgG,,, IgG,,, IgG... IgM, IgA, IgE 的 理化 性 质 、 抗 原 性 和 生物 学 功能 都 和 人 类 相 对 应 的 类 别 相似 。IgG,，IgG:.，IgG:。 的 重 链 的 抗原 性 彼此 相似 , 和 人 类 的 > 链 也 有 交 又 反应 ， 因 此 可 能 相当 人 类 Ie G 的 几 个 亚 类 。IgG: 的 性 质 特殊 , 很 可 能 是 大 鼠 特有 的 另 一 类 别 (或 亚 类 ) (Bazin 等 ，1974) 。 正常 小 鼠 (Cs:H 和 BALB/C) 也 发 现 有 五 类 (RUA) :免疫 球 蛋白 存在 ， 即 IgE A， IgM, IgG,, IgG,,, IgG,, (Kalpaktsoglou 等 ，1973) 。 另 一 些 作 者 报告 ,小 鼠 Ig G 分 为 4 亚 类 ， 彼 此 间 的 差异 似乎 比 人 类 各 亚 类 之 间 更 大 。 3. 豚鼠 豚鼠 Ig A (Vaerman 和 Heremans, 1972), Ig E (Margniand #] Hajos, 1973) 的 相继 发 现 ， 证 明 同 样 也 有 和 人 类 相似 的 几 大 类 免疫 球 蛋 白 存在 。Ig G 分 为 两 个 亚 类 ， ©1756 BO IgG, 和 Ig G,. IgG, 为 同 种 细胞 亲 合 抗体 〈 匠 omocytotropic antibody), 能 传说 PCA 反应 。 但 有 耐 热 性 ，PCA 反应 的 潜伏 期 短 〈3 小 时 )， 因 而 可 和 Ig 卫 区 别 开 来 (Margniand 和 Hajos, 1973), IgG, 则 不 能 传递 PCA 反应 。 最 近 有 人 用 卵 白 蛋 自 免 没 豚 鼠 时 ， 还 发 现 特殊 的 免疫 球 蛋白 ， 称 为 JS。 具有 耐 热 性 ， 不 参与 PCA 反应 。 其 他 抗原 免疫 时 不 能 引起 (Van Es 等 ，1973) 。 4. 鸡 SECC) 也 是 免疫 学 上 常用 的 实验 动物 。 鸡 正常 血清 中 的 免疫 球 蛋白 主要 分 为 WA: 7.1S 和 16.7S。 高 分 子 量 成 分 (16.7 S) 相当 于 哺乳 类 的 IgM;， 低 分 子 量 成 分 (7.1S) 和 哺乳 类 IgG 有 较 大 差异 。 其 重 链 的 分 子 量 和 糖 含 量 都 比 7Y 链 高 ， 因 此 称 为 IgEY， 以 示 区 别 (Leslie 和 Clem，1969) 。 不 过 也 有 人 不 加 区 别 , 仍 称 它 为 IEG。 近 来 发 现 鸡 肠 道 分 刻 物 内 存在 类 似 哺 乳 类 IgE A 的 成 分 ， 称 为 IEa (Lebacquerheyden 等 ， 1972) 或 称 为 IgE A (Bienenstock 等 ，1972) 。 二 、 抗 体 的 分 离 和 纯化 抗体 的 纯化 对 于 研究 抗体 的 结构 和 功能 、 抗 原 抗体 的 相互 作用 、 抗 体 的 测定 以 及 临 床上 的 应 用 都 是 很 需要 的 。 抗体 分 离 、 纯 化 的 方法 主要 分 两 大 类 : 1) 非 专 一 方法 (化 学 方法 ) ， 提 纯 或 浓 聚 某 一 类 别 的 免疫 球 蛋白 ， 供 直接 应 用 ， 或 供 进一步 再 用 其 他 方法 纯化 之 需 。2) 专 一 的 方法 ， 利用 免疫 吸附 剂 〈 主 要 是 固 相 免疫 吸附 剂 ) ， 可 以 得 到 在 免疫 学 专 一 性 上 相当 纯 的 抗体 ， 包括 抗 半 抗 原 抗 体 。 后 者 在 免疫 学 研究 中 有 很 广泛 的 用 途 。 (—) 免疫 球 蛋 白 的 分 离 从 血清 中 分 离 比较 纯 的 免疫 球 蛋白 有 几 种 方法 (Kabat 和 Mayer, 1961; Chase 和 Williams, 1968), 其 中 最 主要 的 方法 是 Cohn 创立 的 冷 酒精 沉淀 法 〈Cohn ) 等 ， 1946) 。 至 今 在 大 量 制备 供 医 疗 用 途 的 Y- 球 蛋白 方面 ， 仍 被 广泛 采用 。 1. 冷 酒 精 帝 淀 法 全 部 分 离 过 程 如 图 6-7 所 示 。 血清 加 3 PAR RB KBE, WA pH 27.7 ( 土 0.1) ， 冷却 到 0"C。 在 激烈 搅拌 的 条 件 下 ， 加 预 冷 的 酒精 (=- 20?*C) 到 最 后 浓度 为 20%, 保持 在 -=5"C。 产生 的 沉淀 (A) ， 含 有 大 多 数 种 类 的 免疫 球 蛋白 。 沉淀 (A) SB 浮 于 25 倍 体积 的 0.015 一 0.02 M NaCl ( 冷 ) 中 ， 加 0.05 M 醋酸 调节 pH ZF 5.1, FAN 沉淀 (B) ， 包 括 大 部 分 的 IEA 和 IgM, 而 IgG 留 在 上 清 液 内 。 调 节 上 清 液 的 p 互 到 7.4， 加 冷 酒 精 (-20 至 -30"C) 到 最 后 浓度 为 25% ， 维 持 在 -5"C。 所 得 到 的 沉淀 含有 90 一 98% IEG。 不 同 动物 ，IgEG 分 离 的 条 件 和 产量 略 有 不 同 ， 列 于 表 6-4。 从 沉淀 (B) 可 按 下 述 方法 进一步 分 离 出 IEA 和 IgM 的 混合 物 ; 将 沉淀 (B) 悬浮 在 0?"C 水 中 ， 调 节 pH 到 5.1， 离 心 去 除 不 溶 的 蛋白 。 调 节 离 子 强度 到 0.01 一 0.0075，pH5.5。 然后 加 冷 酒精 "176。 血清 十 3 倍 体积 蒸馏 水 CO 7 调节 酸度 至 pHZ7.7 y tn 50% a (—20°C), 至 最 后 酒精 浓度 20% CREF —-5°C) | a A(igG, IgA, IgM 和 杂 和 蛋白 ) BF 0.015 一 0.02MNaCl ( 冷 ), 用 0.05M 栈 酸 中公 pH5.1(<0°C) | 清 液 IgG) 沉淀 BUgA, IgM, EA) 用 0.5MNaH,PO, 调节 至 pH7.4 悬 于 蒸馏 水 , 调 至 pH5.1 加 9590 酒精 《一 20 至 —30°C) 到 ba be Sab Mo sche al 县 后 酒精 浓度 2590， 维 持 在 | 丫 清流 沉淀 B-A te 调节 pH 25.5 i p = 0.01 — 0.0075 沉淀 CGIgG) 加 50% 冷 酒 精 到 冰 干 最 | | mt baa Ri ok = x 3 7 Hite B-B (IgA, IgM) 6-7 冷 酒 精 沉淀 法 从 血清 分 离 免疫 球 蛋白 ( 据 Chase 和 Williams, 1968) R64 从 几 种 动物 和 人 血清 沉淀 信 分 离 lgG 的 条 件 a D 种 IgG 产量 酒精 浓度 (92) 离子 强度 类 0.01 65 山羊 5.2 0 0.01 65 家 免 5.2 10 1 0.01 > 70 KE 5.0 15 0.01 50 豚鼠 5.1 15 0.01 70 鸡 5.1 15 0.01 30 马 5.8 20 0.005 20 (48 Chase 和 Williams, 1968), 到 最 后 浓度 为 10% ， 保 持 在 -2"C 或 -3"C 低温 ， 所 得 到 的 沉淀 (B-B) 主要 含 IE A 和 IgM。 各 中 间 步 骤 和 最 后 产物 所 含 蛋白 成 分 可 用 自由 电泳 鉴定 。 由 图 6-8 可 见 ， 沉 淀 C 主要 含 IEG， 沉 淀 B-B 主要 含 IgA 和 IgM (Chase 和 Williams, 1968), 2. 中 性 盐分 段 沉淀 法 通 贡 采用 更 简便 的 硫酸 匀 或 硫酸 钠 法 沉淀 免疫 球 蛋白 。 和 酒精 沉淀 法 比较 ， 其 优点 是 简便 , 蛋白 质变 性 的 危险 较 小 ,缺点 是 分 离 的 纯度 较 差 。 血 清 在 低温 条 件 下 ,经 50% ta 和 硫酸 铵 多 次 反复 沉淀 ， 脱盐 后 就 可 以 得 到 Ig G 的 粗 制 品 (Kendall, 1938) (图 6- 9) 。 按 照 Kekwick (1940) 提出 的 步骤 ， 血 清 在 室温 连续 用 18% 硫酸 钠 , 12% 硫酸 钠 和 有 再 一 次 12% 硫酸 钠 帝 证 ， 最 后 的 沉淀 主要 含 IEG (图 6-10) 。 除 此 以 外 ,用 雷 凡 诺 (Rivanol) 沉淀 也 可 以 达到 同样 的 目的 。 血 清 先 和 0.4% BY © 177 IgA + IgM IgG IgG IgA + IgM 沉淀 A 沉淀 B-A ]gA + IgM IgG 沉淀 C 帝 淀 B-B 图 6-8 Cohn 氏 冷 酒精 沉淀 法 各 中 间 步 又 及 最 后 产物 的 蛋白 成 分 的 自 由 电泳 鉴定 ( 据 Chase 和 Williams,1968)。 100 毫升 血清 ZH Mme | | 沉淀 咨 于 50 maa 22 ZH Mite | I REE 45 ER SephadexG-25 BB oe IgG 粗 制 品 图 6-9 硫酸 铵 沉淀 法 制备 IgG 粗 制 品 。 整 个 过 程 在 低温 (<55C) 下 进行 ( 据 Kendall, 1938). 100ml 血清 (对 磷酸 缓冲 流 ，pH8, 几 三 0.1， 透 析 ) GEM ae al, SRR, o w=0. 4, 稀释 ) Na,SO, 100 2 54 Laie +12 克 Na,SO, ; mt | | | HAG OR fet Vid (pH8) 体积 和 | 十 Me 毫升 上 清 液 十 12 克 Na,SO, | | 沉淀 (初步 纯化 的 IgG) 图 6-10 ”硫酸 钠 沉 淀 法 初步 纯化 IgG。 全 过 程 在 室温 下 进行 ， 加 一 滴 甲 共 防 腐 ( 据 Kekmick, 1940), 诺 混 合 ， 调 节 pH 到 7.6 一 7.8。 在 这 一 条 件 下 ， 除 Ig G 外 的 大 部 分 蛋白 质 均 沉 淀 。 再 加 酒精 或 硫酸 钠 沉 证 上 清 液 中 的 IEG， 沉 淀 中 含 80 一 90% IgG (Hoiejsi 和 Smetana, 1956) 。 用 上 述 几 种 方法 得 到 的 免疫 球 蛋 白 的 粗 制 品 可 以 采用 下 述 方法 进一步 纯化 。 «178. 3. igG 的 分 离 和 纯化 最 常用 于 纯化 IgG 的 方法 是 Deae- 纤 维 素 柱 层 析 (Levy 和 Sober，1960) 。 血 清 或 用 上 述 方 法 得 到 的 免疫 球 蛋白 粗 制 品 ， 先 对 磷酸 缓冲 液 (PH6.3，0.0175 M) 透析 ， ”然后 通过 事先 用 此 缓冲 液 平 衡 过 的 Deae- 纤 维 素 柱 ，Ig G 不 被 阻 留 ， 便 洗 脱 下 来 , 所 有 其 他 血清 蛋白 均 被 阻 留 。 这 样 就 可 以 得 到 在 免疫 化 学 上 纯 的 IgG。 用 Deae-Sephadex (和 氧 式 ) 可 以 简便 、 快 速 分 离 IEG。 其 步骤 简 述 如 下 : Deae- Sephadex-A 50 ( 粗 颗粒 ) 在 水 中 溶 涨 后 ， 再 经 0.5N NaOH 和 -0.5N 盐酸 反复 处 理 , 然 后 和 0.01 M 磷酸 缓冲 液 (PH6.5) 平衡 。 50 毫升 人 血清 (无需 透析 ) 加 10 克 处 理 过 的 Deae-Sephadex。 这 一 稠 的 混合 物 在 冷 处 搅拌 1 小 时 ,， Wi. 再 用 25 毫升 同一 缓冲 液 分 4 次 洗涤 沉淀 。 合 并 滤 洲 ， 再 加 10 克 新 的 处 理 过 的 Deae-Sephadex， 置 冷 处 搅拌 。 过 滤 ，Deae-Sephadex 沉淀 再 用 200 毫升 缓冲 液 分 多 次 〈 每 次 15 一 20 毫升 ) 洗涤 。 滤 液 几乎 含有 血清 中 的 全 部 IEG， 用 1 M K,HPO, 溶液 迅速 中 和 到 pH7.5。 纯 IgG 产量 为 160 毫克 (97%) 。 用 同一 方法 从 50 毫升 家 免 血 清 可 得 到 400 毫克 纯 的 IgG。 Deae- Sephadex 在 pH， 离 子 强度 改变 时 ， 凝 胶 颗 粒 的 体积 改变 很 大 ， 因 而 不 适宜 在 柱 层 析 土 反复 使 用 。 如 改 用 Qae-Sephadex 则 可 用 于 柱 层 析 ， 在 pH7.0，w=0.1 的 缓冲 波 条 件 下 ， 分 离 免疫 学 纯 IgG 可 得 到 最 好 的 结果 (Joustra 和 Lundgren，1969)。 为 了 便 于 保存 ， 应 将 得 到 的 IgG 溶液 迅速 浓缩 到 3 %， 然 后 冰冻 干燥 。 在 利用 了 eae- 纤 维 素 分 离 IE G 时 ， 应 注意 不 超过 离子 交换 柱 的 交换 容量 。 当 血清 或 浓缩 的 免疫 球 蛋白 过 量 时 , 洗 脱 液 中 就 可 能 混 进 杂 蛋 白 ( 主 要 是 转 铁 蛋 白 ) ,影响 分 离 的 效 果 。 为 了 避免 这 一 缺点 起 见 ， 应 增加 离子 交换 剂 的 量 和 柱 长 ， 或 改 用 交换 容量 更 大 的 离 子 交 换 剂 。 此 外 ， 还 应 注意 ， 在 通常 采用 的 层 析 条 件 下 ，Deae- 纤 维 素 并 不 能 分 离 IE G 的 所 有 亚 类 。 例 如 当 用 Tris- 绥 冲 液 (0.01M，pH8.0) 分 离 人 IgG 时 , 柱 上 还 残留 着 一 个 IgG 亚 类 (IgG,) (Skvaril 和 Morel1l，1970) 。 在 低 离 子 强度 缓冲 液 条 件 下 , 电泳 迁移 率 最 低 的 成 分 (>?) 能 从 柱 上 洗 脱 下 来 。 由 此 在 0.005M，PpH8.0 条 件 下 ， 可 分 离 出 纯 的 大 鼠 IgG,。(Stchschulte 和 Austen, 1970), 4. IgM 的 分 离 和 纯化 根据 分 子 的 特性 ，Ig M 的 分 离 通常 采用 几 个 步 又。 人 类 Ig M 贷 细胞 瘤 蛋白 已 知 是 真 球 蛋 白 ， 因 此 分 离 最 初步 又 是 先 用 低 离 子 强度 盐 溶液 沉淀 。 沉淀 内 还 夹杂 的 1 一 5% IgG， 可 经 过 Deae- 纤 维 素 柱 层 析 去 除 。 以 后 的 纯化 步骤 可 以 采用 凝 胶 制 备 电泳 或 凝 胶 过 庆 方 法 。 凝 胶 过 滤 尤 其 适用 ， 因 为 除 w- 巨 球 蛋 白 外 ，Ig M 的 分 子 量 比 所 有 其 他 血清 蛋白 的 分 子 量 大 。w:- 巨 球 蛋 白 可 以 容易 地 在 电泳 上 除去 。 MBIA Sepha- dex-G200 或 Bio-gel P-300， 或 琼脂 糖 珠 均 可 。 近来 还 有 人 用 聚 乙 二 醇 或 真 球 蛋白 沉淀 ， 脱 脂 ， 琼 脂 凝 胶 电 泳 和 免疫 吸附 等 步骤 从 正常 人 血清 的 Cohn III 部 分 ， 分 离 出 免疫 化 学 纯 的 IgM (Van der Hoven 等 ， 1979). IER Allis VK PRHED SB IlgeM. 418% 硫酸 铵 沉淀 免疫 球 蛋白 。 沉 淀 经 透析 后 ， 再 在 Deae- 纤 维 素 柱 上 分 段 洗 脱 ， 收 集 pH 6.9 磷酸 缓冲 液 (0.0175 M, 加 0.15 179，。 M NaCl) 洗 脱 的 部 分 。 再 在 同一 离子 交换 剂 上 作 第 二 次 层 析 ， 并 且 收 集 0.2 M Tris- eth (pH 8.6) 洗 脱 的 部 分 。 然 后 再 在 Bio-gel P-200 上 作 凝 胶 过 泪 。 最 后 得 到 免 闪 化 学 上 纯 的 IE M， 产 量 约 为 0.025 B50 /1 毫升 血 请 。 5. 其 他 种 类 免疫 球 和 蛋白 的 分 离 从 正常 血清 分 离 其 他 类 别 的 免疫 球 蛋白 ， 开 初 遇 到 很 大 的 困难 。 因 此 ，Ig A，IgE， Ig D 结构 的 研究 ， 大 多 数 是 用 相应 的 髓 细胞 瘤 作 材料 。 从 正常 血清 分 离 IE A 的 一 种 方 法 是 先 在 CM- 纤 维 素 上 和 Ig G 分 离 。 然后 在 Teae- 纤 维 素 层 析 上 和 其 他 残留 的 杂 和 蛋白 (主要 是 w- 球 蛋白 和 白 蛋白 ) 分 离 (Fahey 等 ，1966) 。 此 方法 的 缺点 是 产量 低 ， 并 可 能 有 其 他 蛋白 质 混 杂 。 有 人 提出 从 正常 人 血浆 分 离 相 当 大 量 纯 IgE A 的 方法 (Zschocke 等 ，1969) 。 先 用 2M 硫酸 铵 沉淀 血浆 蛋白 ， 溶 解 沉 淀 并 对 0.025 M 巴 比 吐 缓冲 液 (pH6.9) 透析 。 FH 沉淀 ， 用 Deae-Sephadex-A 50 处 理 上 清和 被 ,逐步 增加 磷酸 缓冲 液 的 盐 浓 度 洗 脱 吸附 在 交换 剂 上 的 蛋白 质 ， 并 在 瓷 漏 斗 上 将 每 次 洗 脱 的 溶液 和 沉淀 分 离 。 向 第 四 次 洗 脱 液 (0.2 M RRA, pH7.5) 加 冷 酒 精 至 25% 浓度 (-5"C，Pp 也 7.0， 离 子 强 度 0.03) 沉淀 蛋白 。 沉 淀 含 有 大 部 分 IE A。 再 用 硫酸 竹 沉 淀 一 次 。 溶解 沉淀 ， 并 在 Teae- 纤 维 素 上 (PH 6.7) DRM. WH 0.05 M 磷酸 缓 训 液 洗 脱 的 部 分 ， 含 有 Ig A 和 人 少量 的 Ig G。 夹 杂 的 IgG 可 用 专 一 的 免疫 吸附 剂 ( 固 定 在 纤维 素 上 的 抗 -IgE G 抗体 ) SR. 用 此 方法 从 350 毫升 血浆 可 以 分 离 到 77 毫克 的 免疫 电泳 纯 的 IgE A。 后 来 ,还 有 人 用 免疫 吸附 剂 从 正 常人 血 请 分 离 出 IgA (Anderson 等 ，1970) 。 同 理 可 以 利用 抗 -re 重 链 抗体 ， 借 免疫 吸附 法 从 正常 人 血清 分 离 IE 卫 (Carrel 等 ， 1971) 。 先 用 从 髓 细胞 瘤 提纯 的 IgE 卫 免疫 动物 ， 得 到 抗 -IgE 卫 抗体 。 将 抗 -Ig 卫 抗体 加 到 聚合 中 的 聚 丙烯 酰胺 内 ， 做 成 固 相 免疫 吸附 剂 。 用 这 种 免疫 吸附 剂 , 从 40 毫升 正常 血清 中 可 以 分 离 出 约 70 毫克 蛋白 质 ， 主 要 为 T5 卫 ， 夹 杂 有 20% 的 Ig G。 (二 ) 抗 蛋白 质 和 什 抗 原 的 抗体 的 分 离 利用 抗体 和 抗原 (蛋白 质 或 半 抗 原 ) 的 结合 专 一 性 ， 从 抗 血 清 中 分 离 专 一 的 抗体 具有 操作 简便 和 专 一 性 强 的 优点 。 这 种 方法 包括 几 个 主要 的 步骤 : 1) 抗 原 抗 体 复 合 物 的 分 Bo 将 抗原 加 到 对 应 的 抗 血清 中 形成 抗原 抗体 复合 物 。 ”洗涤 去 除非 专 一 的 血清 蛋白 后 ， 分 离 出 抗原 抗体 复合 物 ; 2) 抗原 抗体 复合 物 的 解 离 ; 3) 将 解 离 的 抗原 和 抗体 分 开 。 当 使 用 固 相 免 疫 吸附 剂 ， 即 将 抗原 结合 在 纤维 素 、 葡 聚 糖 凝 胶 或 琼脂 糖 颗粒 的 大 分 子 载 体 上 时 ， 就 可 以 把 上 述 步骤 简化 为 专 一 的 吸附 和 洗 脱 两 步 。 抗 血清 通过 专 一 的 固 相 免 疫 吸附 柱 时 ， 同 型 抗体 便 被 选择 地 结合 在 柱 上 ;异型 抗体 和 杂 蛋 白 不 结合 而 通过 。 再 用 低 酸度 的 缓冲 小 或 其 他 方法 使 结合 的 抗体 从 柱 上 解 离 洗 脱 下 来 ， 便 可 以 得 到 对 抗原 或 半 抗 原 专 一 的 抗体 (Wofsy 和 Burr, 1969). 1. 利用 免疫 吸附 剂 分 离 抗 蛋 白质 抗体 制备 免疫 吸附 剂 最 常用 的 高 聚 物 载体 是 纤维 素 ， 其 优点 是 对 蛋白 质 的 非 专 一 的 吸附 。 180 。 Se 量 最 小 。 各 种 葡 聚 糖 凝 胶 珠 和 琼脂 糖 珠 也 是 常用 的 载体 。 这 些 多 糖 载体 需 先 活化 ， 才 能 和 和 蛋白 质 的 一 定 基 团 共 价 结合 。 目 前 常用 的 活化 方法 主要 有 以 下 几 类 ; (1) 通过 重 气 键 结合 Campbell 等 (1951) 最 先 使 用 这 一 类 免疫 吸附 剂 。 先 用 n- 硝 基 和 毛茶 处 理 纤 维 素 , 形 成 n- 硝 基 苯 纤维 素 。 再 经 过 还 原 和 重 氮 化 ， 由 此 产生 固定 在 纤维 素 上 的 能 和 蛋白 质 抗 原 反 应 的 重 氮 活 性 基 团 。 再 加 入 蛋白 质 抗原 溶液 ， 短 暂 保 刘 后 , 洗 去 未 结合 的 多 余 抗 原 ， 便 得 到 专 一 的 免疫 吸附 剂 。 具有 [有 一 0 一 CH, 一 NR3] Cl 构造 的 季 腕 盐 ， 也 很 容易 和 纤维 素 结合 。 如 N-(m= 硝 基 葵 氧 )- 甲 基 吡 啶 氧 盐 ， 在 125"C 能 和 纤维 素 结合 ,再 经 过 还 原 和 重 氮 化 ， 就 可 以 得 到 能 和 蛋白 质 结合 的 纤维 素 重 氮 盐 。 其 制备 过 程 如 下 : NO, pe eth cH 0—CH,-0_-###&* a NO, | 15%Na,S,0,, 60°C € >-c,—0~cu,—0—-4#® ee | 1.5%NaNO, + 5%HCl, 0°C € > 一 cB, 一 o 一 cH. 一 o 一 纤维 过 N=NtCI- 纤维 素 重 氮 盐 和 2% 蛋白 质 抗 原 溶液 在 低温 反应 ， 就 可 以 形成 稳定 的 结合 物 。 抗 原 的 结合 量 决定 于 纤维 素 上 的 重 氮 基 团 数目 。 1 克 粉 末 纤 维 素 免疫 吸附 剂 可 固 定 10 一 50 毫克 以 上 的 蛋白 质 。 这 种 限制 可 能 不 是 由 于 重 氮 基 团 数目 不 够 ， 而 是 由 于 纤维 素 颗 粒 表 面积 的 限制 。 颗 粒 愈 细 ， 表 面积 增加 ， 结 合 容 量 也 增加 。 为 了 固定 多 糖 抗 原 ， 可 先 用 过 碘 酸 处 理 使 出 现 活泼 的 醛 基 。 后 者 能 和 NH:- 基 反应 (Sanderson 和 Wilson，1971) 。 (2) 澳 乙 酰 纤 维 素 省 乙酰 纤维 素 也 常用 于 免疫 吸附 剂 的 制备 (Robbins 等 ，1967; Gill 和 Bern- - ard，1969) 。 制 备 的 方法 如 下 : AF 30 毫升 二 氧 杂 环 已 烷 的 100 克 溴 乙酸 加 10 克 纤 维 素 粉 ,室温 搅拌 20 小 时 。 然 后 再 加 75 毫升 省 乙酰 省 。 搅 拌 10 一 12 小 时 后 ， 再 倒 人 7 升 水 中 。 洗 涤 纤 维 素 沉淀 ， 在 湿 的 状态 下 低温 保存 。 和 抗原 蛋白 质 的 结合 是 在 pH8.9 K 酸 氢 钠 缓 冲 液 内 进行 的 。 洗 去 多 余 蛋 白质 ， 将 吸附 剂 漫 于 0.05 M 2- 所 基 乙 醇 溶液 (pH 8.9) 内 抑制 未 反应 的 省 。 悬浮 24 小 时 后 ， 洗 去 未 起 反应 的 蛋白 质 。 然 后 再 悬浮 在 8 M 尿素 内 24 小 时 ， 去 除 和 纤维 素 非 共 价 结合 的 蛋白 质 。 ws 181 。 (3) ARMA F RASA FBR 用 CNBr 在 碱 性 溶 沾 中 处 理 纤 维 素 、 葡 聚 糖 凝 胶 珠 ， 琼 脂 糖 珠 等 多 糖 载体 时 ， 就 可 以 使 这 些 多 糖 载体 活化 〈Porath，1967) 。 SAE Hey oT AEST La EAA 酸 。 反应 过 程 如 下 : —O—C=N \cH—oH pH10-12 = Ne, Rig ee | CE | ee pee ARAL / aes aot 7 在 中 性 或 弱 碱 性 溶液 内 ， 活 化 的 多 糖 载体 可 以 和 和 蛋白质 抗 原 的 氨基 反应 : SN 1 全 全 1 | C=NH + HzN 一 C 一 蛋白 质 一 -一 一 | C 一 N 一 C 一 蛋白 质 CH 一 O i CH-o0”% A 然后 再 通过 缓慢 的 水 解 过 程 ,转化 为 稳定 的 氨基 甲酸 酯 : ea-oN\ R 1 oa CreB Ee eee 一 一 -> “GE 0: CONE eau as | Fe CH 一 oB H 连接 蛋白 质 和 多 糖 载体 的 键 在 强酸 、 中 性 或 弱 碱 溶液 内 都 是 稳定 的 ， 并 且 用 CNBr 处 理 葡 聚 糖 凝 胶 珠 或 琼脂 糖 珠 时 ， 是 在 比较 温和 的 条 件 下 进行 的 ， EBA BR 粒 。 因此 ， 对 纤维 素 、. 葡 聚 糖 凝 胶 珠 和 琼脂 糖 珠 都 可 以 广泛 应 用 。 此 外 ， 还 可 以 用 成 二 醛 使 蛋白 质 凝 集 (Arrameas 和 Guilbert，1971) 或 将 蛋白 质 混合 在 正在 聚合 中 的 聚 丙烯 酰胺 中 (Carrel 和 Barandun, 1971) ， 均 可 以 用 作 固 相 免疫 吸附 剂 ， 但 没有 前 述 的 几 种 那样 有 效 。 (4) 结合 抗体 的 洗 脱 抗体 溶液 通过 专 一 的 免疫 吸附 柱 时 ， 便 和 固定 在 大 分 子 载体 上 的 抗原 结合 ， 形 成 抗 原 抗体 复合 物 而 被 吸附 在 柱 上 。 已 和 固 相 抗原 结合 的 抗体 ， 通 常 可 用 低 酸 度 缓冲 液 ， 如 pH 2.2 甘氨酸 缓冲 液 洗 脱 。 然 后 迅速 加 浓 的 中 性 缓冲 液 或 固体 的 碳酸 氢 钠 中 和 。 也 有 人 尝试 在 接近 中 性 条 件 下 洗 脱 ,如 加 浓 的 硫 氰 酸 盐 溶 液 (pPH6.0 一 6.8) 可 分 BH 1/2—3/4 抗体 (Dandliker 和 Saussure, 1968; Carrel 和 Barandun，1971) 。 加 浓 氧 化 位、 碘 化 钠 或 碘化钾 溶 流 也 有 有效。 在 p 蔚 7.5， 这 些 试 剂 可 解 离 出 和 低 酸 度 缓冲 液 解 离 的 等 量 的 抗体 。 为 了 减少 非 专 一 的 吸附 ， 在 抗体 洗 脱 以 前 ， 还 可 以 先 用 3 M 尿素 溶液 (PH 8) 处 理 免 疫 吸附 剂 ， 洗 去 非 专 一 吸附 的 蛋白 质 。 在 上 述 条 件 下 ， 免 疫 吸 附 剂 和 抗体 的 复合 物 不致 解 离 。 2. 抗 半 抗 原 抗 体 的 分 离 近年 来 多 用 与 固 相 载 体 结合 的 半 抗 原作 为 免疫 吸附 剂 来 分 离 抗 半 抗 原 抗 体 。 制 备 免 疹 吸 附 剂 常用 的 载体 仍 可 用 纤维 素 (Borek 和 Fabian, 1970; Vannier “4%, 1965), 5x Sheek (Wufsy 和 Burr，1969) ， 变 性 蛋白 亦 有 采用 (Szafran 等 ，1969)。 例 如 ,党 用 的 DNP-，Dansy1l- 半 抗原 基 团 都 易于 和 和 氮 基 纤维 素 结合 。 * 182 。 吸附 在 免疫 吸附 剂 上 的 抗 半 抗 原 抗 体 的 洗 脱 方法 的 选择 ， 应 根据 半 抗 原 的 化 学 性 质 来 决定 (Hoyer 等 ，1968) 。 带 负 电荷 的 半 抗 原 ， 如 葵 甲 酸 或 共 砷 酸 等 ， 其 抗体 和 半 抗 原 纤维 素 的 复合 物 在 PH 5 一 7， 或 PHI 一 3， 能 很 好 地 解 离 。 用 pH 5 一 7 的 磷酸 缓冲 液 洗 脱 时 ， 若 加 1 MNaC1， 抗 葵 甲 酸 抗体 的 洗 脱 产量 可 增多 。 对 于 正 电荷 半 抗 原 , mee 三 里 基 贸 以 及 中 性 的 亲 水 性 半 抗 原 ， 如 葵 基 -8- 吡 喃 背 , 其 抗体 和 专 一 免疫 吸附 剂 的 复合 物 在 低 于 pH4 的 酸性 溶液 中 解 离 。 对 于 中 性 蕊 水 性 半 抗 原 ， 如 DNP, 其 抗体 一 般 在 低 酸度 条 件 下 不 能 洗 脱 。 因 此 ， 只 好 用 相应 的 半 抗 原来 竞争 取代 。 用 同一 半 抗 原 载体 结合 物 免疫 动物 时 ， 随 免疫 时 间 不 同 ， 产 生 的 抗 半 原 抗体 的 亲 合 力也 不 同 。 因 而 从 专 一 的 免疫 吸附 柱 上 洗 脱 的 行为 也 不 同 ( 参 看 第 十 一 章 ,308 页 )。 这 说 明 抗体 的 高 度 不 均一 性 。 三 、 抗 体 的 不 均一 性 和 匀 一 的 抗体 ”如 上 所 述 ， 用 一 个 纯化 的 抗原 来 免疫 动物 ， 产 生 的 抗 血清 与 同一 抗原 专 一 地 结 合 ， 再 使 这 样 的 抗原 抗体 复合 物 解 离 ， 可 得 到 纯化 的 抗体 。 可 是 ， 经 过 这 样 复杂 手续 提纯 的 抗体 仍旧 是 一 群 多 种 多 样 的 免疫 球 蛋 白 分 子 的 混合 物 。 抗 体 的 这 种 不 均一 性 主要 是 由 于 以 下 两 方面 的 原因 造成 的 。 (—) 外 源 不 均一 性 抗原 大 分 子 具 有 许多 抗原 决定 簇 ,每 一 个 决定 簇 可 能 引起 一 种 抗体 。 因 此 ,一 个 蛋白 质 的 抗 血清 不 含有 与 整个 分 子 的 全 部 决定 簇 起 反应 的 单一 的 抗体 ,而 是 包含 着 针对 个 别 抗原 决定 簇 的 许 多 不 同 的 抗体 的 混合 物 。 一 些 动物 可 能 产生 对 某 些 决定 簇 的 抗体 ， 另 一 些 个体 可 能 产生 对 另 一 些 决 定 徐 的 抗体 。 现 已 经 可 以 用 免疫 吸附 剂 制备 半 抗 原 专 一 的 抗体 。 例 如 ， 注 射 一 种 偶 氮 蛋白 质 后 产生 的 抗 血 和 下- 多 0 as mies: ? We 合 的 纤维 素 柱 ， 然 后 再 通过 一 个 和 (4) DNP- 赖 氨 酰 基 团 平 铺 在 蛋白 质 分 子 表面 ,和 邻近 氨基 酸 残 基 载体 蛋白 质 结合 的 纤维 素 柱 ， 分 别 共同 组 成 一 个 决定 簇 ( 据 Brenneman 和 Singer, 1970), 选择 地 吸附 ， 用 这 样 的 方法 就 可 以 把 半 抗 原 专 一 的 抗体 和 载体 蛋白 质 专 一 的 抗体 分 离开 来 。 同 理 ， 两 个 不 同 的 半 抗 原 专 一 的 抗体 也 可 以 彼此 分 离开 来 。 然 而 ， 甚 至 经 过 这 样 纯 化 的 半 抗 原 专 一 的 抗体 仍然 是 不 均一 的 ， 因 为 同一 半 抗 原 决 往 在 不 同 蛋白 质 载 体 分 子 上 所 处 的 空间 关 系 可 能 不 同 。 这 种 不 均一 性 又 称 为 地 位 不 均一 性 (图 6-11)。 外 源 不 均一 性 在 评定 抗 血 清 的 效用 时 有 重要 的 实际 意义 。 例 如 ， 注 射 白喉 类 毒素 可 fer tire B (细胞 专 一 性 基 团 ) 的 抗体 和 抗 片 眉 A〈 毒 性 基 团 ) 的 抗体 , 而 只 有 前 者 对 as。 1836 机 体 有 保护 作用 (参看 第 一 章 ，52 TA). (=) 内 源 不 均一 性 和 抗体 的 血清 学 专 一 性 内 源 不 均一 性 是 指 免疫 球 蛋白 分 子 的 化 学 结构 上 的 差异 和 多 样 性 。 这 种 结构 上 的 差 异 通常 可 以 用 血清 学 方法 检验 出 来 ， 据 此 可 将 免疫 球 蛋 白 及 其 肽 链 ( 重 链 和 轻 链 ) 分 为 不 同 的 血清 学 类 型 。 抗 体 的 血清 学 类 型 的 差别 反映 了 抗体 形成 细胞 的 遗传 性 差异 ， 因 此 可 以 作为 抗体 分 子 的 遗传 标记 。 免 疫 球 蛋白 的 这 些 血清 学 专 一 性 可 分 为 三 类 ， 反 映 了 抗体 分 子 结构 在 不 同 水 平 的 变化 AER 1) 同族 专 一 性 (Isotypic specificities) 同一 物种 所 有 个 体 共 同 具有 的 抗原 专 一 性 。 握 此 可 将 免疫 球 蛋白 区 分 为 类 (Class) 和 型 (Type)， 以 及 亚 类 (Subclass) ; 2) 同 种 异型 专 一 性 (Allotypic specificities) 同一 物种 的 不 同 个 体 间 存在 几 种 形 式 的 抗原 专 一 性 ， 即 多 型 现象 (Polymorphism) ; 3) 个 体型 专 一 性 〈Idiotypic specificities) 每 一 个 体 的 个 别 抗体 (或 髓 细胞 瘤 蛋白 质 ) 具有 的 独特 的 抗原 专 一 性 。 根 据 上 述 血 清 学 专 一 性 ,免疫 球 蛋白 又 可 作 如 下 区 分 : 1. 类 别 (Classes ) 根据 重 链 的 血清 学 类 型 ， 分 子 量 大 小 ( 亚 基 数目 ) ， 糖 含量 等 方面 的 不 同 ， 同 一 物种 的 抗体 可 分 为 几 类 (Class), 各 类 抗体 的 轻 链 的 血清 学 类 型 是 相同 的 (RAM), it 重 链 则 各 不 相同 。 人 类 的 抗体 已 知 有 五 类 : IEG，IgEM，IgEA，IED 或 IgE 了 E。 它 们 所 含 的 重 链 ( 按 血 靖 学 类 型 的 区 别 ) 分 别 为 ”5 no, 6,8 链 。 各 类 抗体 所 含 的 轻 链 的 血清 学 类 型 是 相同 的 ， 或 者 为 上 链 ， 或 者 为 1 链 。 每 一 类 抗体 中 ， 按 其 重 链 构 造 的 变异 又 可 分 成 几 个 亚 类 (Subclass) 。 如 人 类 Ig G 可 分 为 四 个 亚 类 : Ig G，Ig G:，Ig Gs，Ig G，( 或 称 yi，y:，7Ys，74) 。 它 们 除了 重 链 的 抗原 性 有 差别 外 ， 链 间 二 硫 键 的 数目 和 位 置 也 有 不 同 (参看 第 七 章 ， 图 7-6)。Ig A 和 [g M 的 重 链 也 至 少 存在 两 个 亚 类 。 决定 亚 类 血清 学 专 一 性 的 抗原 决定 篮 都 位 于 抗体 的 Fe HE, MBIA LE. 抗体 的 抗原 结合 专 一 性 和 类 别 之 间 没 有 关系 。 任 何 一 类 的 抗体 都 可 能 产生 任何 一 种 结合 专 一 性 的 抗体 。 换 名 话说, 对 同一 抗原 ， 体 内 可 能 形成 几 类 (IgEG、Ig M 等 ) 具 有 相 同 的 结合 专 一 性 的 抗体 。 萤 光标 记 抗 体 法 显示 ， 各 类 抗体 是 由 不 同 的 浆 细胞 产生 的 。 一 般 认 为 ， 一 个 细胞 只 能 产生 一 类 抗体 ， 不 能 同时 产生 两 类 抗体 。 抗 体 的 类 别 是 由 几 个 不 同 的 基因 控制 的 。 | 2. 型 别 (Type) 各 类 抗体 的 轻 链 是 相同 的 ， 或 者 为 上 链 ,或 者 为 1 链 。 因 此 , 同一 物种 的 各 类 抗体 又 各 自 可 因 其 所 含 轻 链 的 型 别 分 为 两 型 。 人 类 Ig G 的 轻 链 平均 约 70%% 为 上 型 , 30% Aa 型 。 然 而 ， 同一 物种 的 个 别 抗体 的 轻 链 型 别 的 相对 量 可 能 和 平均 值 有 很 大 差别 。 例如 ， 人 冷 性 凝集 素 的 轻 链 只 有 上 型， 豚鼠 抗 DNP 抗体 也 只 有 这 一 型 的 轻 链 。 轻 链 近 N hot 女 的 氨基 酸 排 列 顺序 存在 差异 ， 据 此 又 可 分 为 亚 型 (Subtype) 。 人 类 上 链 可 分 为 三 个 «184-6 亚 型 ，1 链 可 分 为 五 个 亚 型 (Hood 和 Talmage, 1970), 型 和 亚 型 各 自 都 是 由 不 同 的 非 等 位 基因 控制 的 。 各 亚 型 的 区 别 ， 由 于 其 氨基 酸 排列 顺序 还 不 清楚 ， 和 暂时 用 专 一 的 抗 原 记 号 表示 ， 如 人 类 1 链 的 Kern*, Kern’; Oz*, Oz, 3. 同 种 异型 (Allotypes) _ 重 链 的 每 一 亚 类 和 轻 链 的 每 一 亚 型 ， 又 可 根据 存在 这 一 个 或 另 一 个 等 位 基因 ， 而 发 生 结 构 ( 抗 原 性 ) 的 改变 ， 称 为 同 种 异型 。 同 种 异型 是 由 同一 个 基因 座 的 几 个 等 位 基因 控 制 的 ， 通 常 包括 肽 链 上 一 定位 置 的 一 个 氨基 酸 的 置换 。 例 如 ， 人 类 上 链 的 191 位 置 在 Inv (a+)， 现 名 Inv (1+), % Leu; Inv (b+), 现 名 Inv(3+)， 则 为 Val (图 7-3)。 抗体 的 同 种 异型 专 一 性 是 和 抗体 的 类 别 和 型 别 专 一 性 互 不 相关 的 。 纯 系 动 物 只 产生 一 种 同 种 异型 的 抗体 ， 照 旧 产 生 各 种 类 别 和 型 别 的 抗体 。 人 类 控制 同 种 异型 专 一 性 的 基因 在 染色 体 上 的 位 置 还 没有 确定 ， 暂 时 按照 控制 重 链 和 轻 链 的 抗原 结构 的 因子 分 为 两 个 系统 : 控制 重 链 的 称 为 Gm， 控制 轻 链 的 称 ZH Inv. Gm. 和 Inv. 系统 是 由 一 些 独立 的 基因 座 控制 的 ， 它 们 各 自 又 包括 一 系列 的 等 位 基 因 ( 表 6-5; 表 6-6) 。 每 一 个 体 按 表 型 ( 肽 链 的 抗原 性 类 型 ) 可 记录 如 : Gm (1，-2，3，,4， 一 5)， Inv CLs = h9 3); 或 只 记 正 结果 ; Gm (1394) Inv (153) 4 或 者 按 遗 传 学 基 因 型 的 记 法 可 写 为 ， Gml，Gmm4…… = (Buli. W. H. O. 33, 721, 1965; Grubb, 1970) 。 | 表 6-5 ABB Gm 因子 的 名 称 表 6-6 AHR Inv 因子 的 名 称 原 用 名 称 现 用 名 称 ” 3 1 Xx 2 bY = b* 3 : : * (Bull. W. H. O. 33, 721, 1965) b=b’ 7 c 6 r 7 ; e 8 6-7 RE Aa, Ab 因子 的 名 称 P 9 be 10 正式 名 称 be 11 RE ae br 12 Aal Be (Fd FE) b? 13 real b* 14 Aa3 : 15 Ab4 轻 链 t 16 assl : Ab6 g 21 4 7 a) Be (Fe 1B) n 24 Ab8 * (Bull. W. H. O. 33. 721, 1965) (Adv. in immunology 7:18) © 185.6 其 他 物种 ， 如 家 兔 , 有 两 个 基因 座 Aa，Ab， 分 别 控制 重 链 和 轻 链 的 同 种 异型 特性 。 每 一 基因 座 又 至 少 包 含 三 个 以 上 的 等 位 基因 ( 表 .6-7) 。 Gm 系 统 只 在 Ig G 分 子 出 现 ， 而 Iny 系统 在 IEG，IgEA 和 IgEM， 以 及 某 些 Benee Jones SAMA HA. 4. 个 体型 (Idiotype ) 一 种 动物 某 一 个 体 产生 自己 特有 的 抗体 分 子 ， 不 但 和 同 种 动物 其 他 个 体 的 同一 抗原 结合 专 一 性 的 抗体 不 同 ， 而 且 和 自身 的 具有 其 他 抗原 结合 专 一 性 的 抗体 也 不 同 ， 这 种 抗 体 称 为 个 体型 抗体 (Idiotypie antibody) 。 例 如 ， 用 某 甲 的 专 一 抗体 GA 而 型 物质 ) 免疫 家 免 ， 得 到 的 抗 血 清 经 过 正常 人 Y- 球 蛋白 吸附 后 ,所 剩余 的 抗体 只 能 和 某 甲 的 抗 A 起 反应 ， 而 不 能 和 其 他 人 的 抗体 起 反应 ， 也 不 能 和 某 甲 自己 的 其 他 专 一 的 抗体 〈 如 抗 右 旋 糖 的 抗体 ) 起 反应 (Kunkel 等 ，1963; 1965) 。 家 免 也 存在 同样 的 现象 。 此 外 ， 这 类 抗体 还 可 能 是 由 同一 个 体 之 不 同 的 抗体 形成 细胞 ， 针 对 同一 抗原 决定 得 产生 的 ， 它 们 的 差别 反映 这 些 细 胞 内 在 的 遗传 性 的 差别 (Slater 等 ，1955; Oudin，1966) 。 有 证 据 表明 个 体型 抗体 的 抗原 专 一 性 位 于 该 抗体 分 子 的 Fab WEE, mA 是 位 于 Fe FEE (Oudin 和 Michel, ix 1969), 抗 个 体型 抗体 的 抗 血 清 能 抑制 ， 半 抗 原 (如 P- 硝 基 葵 甲酸 ) 和 相应 的 个 AN 体型 抗体 结合 (Brient 和 Nisonoff, 1970) 。 反之 ， 半 抗原 的 存在 也 能 抑制 免疫 球 蛋 白 MEBE HES AAD 根据 重 链 钩 造 的 不 同 分 为 5 类 IgG IgM IgA IgED IgE 抗 个 体型 抗体 的 抗 血清 和 该 个 体型 抗体 的 反应 (Brient 等 ，1971) 。 每 一 只 家 IN 免 对 一 定 抗原 可 形成 几 种 个 体型 专 一 性 本 不 同 的 抗体 ,并且 在 动物 和 疫 过 程 中 , 它 BK 们 出 现 、 持 续 和 消失 的 时 间 也 各 不 相同 (McDonald 和 Nisonoff，1970) 。 以 go 上 这 些 事实 提示 个 体型 抗体 的 抗原 专 一 性 是 和 该 抗体 的 易 变 区 结构 相关 连 的 。 个 体型 专 一 性 决定 簇 可 能 包括 或 紧 靠 近 该 抗体 的 结合 位 点， 并 受到 结合 位 点 天 Hem, 然而 ， 它 们 表现 出 的 多 样 性 ， aie" job aan 为 了 简化 起 见 每 一 水 平 只 “超过 结合 位 点 本 身 的 专 一 性 的 多 样 性 。 举 一 个 分 枝 为 例 。 个 体型 为 每 一 个 体 所 特有 , 可 同时 包括 重 链 各 类 免疫 球 蛋 白 的 抗原 结构 是 十 分 a ECON 复杂 的 。 除去 上 述 几 种 抗原 决定 做 外 ， 还 存在 肽 链 或 亚 基 重组 合 时 共同 形成 的 决定 繁 。 例 如 ， 人 类 上 轻 链 的 某 些 决定 笠 只 有 在 和 上 久 重 链 重组 合 出 才能 表现 出 来 。 Ig G 人 允 细 胞 瘤 蛋 白质 Fab 片段 的 某 些 抗原 决定 敌 也 是 这 样 。 多 聚 体 免疫 球 蛋 白 ， 如 分 刻 型 ITg A， 亚 基 聚 合 时 出 现 单 体 原来 没有 的 抗原 决定 =, 和 其 他 球 蛋白 抗原 一 样 ， 有 些 原来 位 于 抗体 分 子 内 部 的 决定 簇 ， 如 多 聚 体 IgA 的 « 186 « SUH, RAAT A, 原来 被 掩盖 的 抗原 决定 簇 才 能 表现 出 来 。 总 之 ， 由 上 述 可 见 ， 正 常人 和 动物 的 抗体 是 具有 各 种 抗原 专 一 性 的 免疫 球 蛋白 分 子 ”之 高 度 复杂 的 混合 物 。 两 种 型 的 轻 链 (上 或 2) 可 以 和 各 类 、 亚 类 的 重 链 配合 , 而 重 链 、 轻 ” 链 本 身 又 可 能 有 各 种 同 种 异型 , 专 一 性 不 同 的 抗体 分 子 又 可 以 有 各 种 的 个 体型 。 由 于 上 述 几 重 的 差异 ， 任 何 个 体 的 血清 都 是 极其 多 种 多 样 的 免疫 球 蛋 白 分子 的 混合 物 (图 6-12) 。 然而 ， 抗 体 种 类 的 这 种 多 样 性 和 抗体 的 结合 位 点 的 抗原 结合 专 一 性 没有 直接 的 关系 。 就 目前 所 知 的 ， 各 种 各 类 的 免疫 球 蛋白 分 子 都 可 能 具有 任何 一 种 抗原 结合 专 一 性 。 因 此, 搞 体 一 般 结构 的 多 样 性 和 抗体 结合 位 点 的 多 样 性 (能 和 多 种 多 样 的 抗原 结合 ) 是 两 回 事 , 它 们 的 遗传 控制 也 应 当 是 两 回 事 。 抗体 的 高 度 不 均一 性 给 抗体 细微 结构 (氨基 酸 排列 顺序 ) 的 测定 造成 了 似乎 难于 克服 “的 困难 。 然 而 ， 幸 好 天 然 存在 某 些 抗体 形成 细胞 的 肿瘤 ， 能 产生 各 种 类 型 的 ， 均 一 的 锡 疫 球 蛋 白 , 为 一 级 结构 测定 提供 了 好 材料 。 (=) 散 细 胞 瘤 蛋 白质 的 均一 性 人 类 和 小 鼠 多 发 性 骨髓 瘤 的 浆 细 胞 合成 的 髓 细胞 瘤 蛋 白质 是 化 学 结构 上 均一 的 免疫 球 蛋 白 。 每 一 种 允 细 胞 瘤 蛋 白质 相当 于 一 定 类 型 的 免疫 球 蛋白 , 只 具有 一 型 的 轻 链 , 一 个 亚 类 的 重 链 ， 它 们 只 属于 一 定 的 同 种 异型 ， 并 且 每 条 链 只 具有 一 种 特异 的 氮 基 酸 排 列 顺 序 。 因 此 ， 只 属于 一 种 特异 的 个 体型 。 在 聚 丙烯 酰胺 圆 盘 电 泳 或 淀粉 凝 胶 电泳 上 ， 艇 细 胞 瘤 蛋 白质 的 轻 链 和 重 链 , 各 呈现 一 条 或 少数 几 条 清楚 的 带 ， 这 和 正常 IE G 的 轻 链 呈 现 为 一 条 弥散 的 区 域 (不 均一 混合 物 ) 形成 明显 的 对 比 ( 图 6-13) 。 从 Burnet 的 无 性 繁殖 细胞 系 选 择 学 说 看 来 ， 每 一 种 允 细 胞 瘤 蛋 白质 可 看 作 是 发 源 于 一 个 突变 细胞 的 ， 浆 细胞 的 无 性 繁殖 系 (Clone) 的 产物 ， 或 者 简称 为 单 细 胞 株 蛋 白质 (Monoclonal protein)”, 照 此 类 推 , 正 常 血 清 中 种 类 繁多 的 抗体 群 可 认为 是 多 种 多 样 的 单 株 蛋白 质 的 混合 物 。 多 发 性 骨 骨 癌 病 人 血清 中 ， 散 细胞 瘤 蛋 白质 的 含量 相当 高 ， 其 浓度 比 其 他 的 免疫 球 蛋 自 高 几 倍 ,易于 分 离 和 提纯 。 此 外 ， 约 有 半数 的 病人 尿 内 排泄 大 量 的 异常 的 蛋白 质 。 这 种 蛋白 质 是 Bence Jones 在 1847 年 发 现 的 ， 故 称 为 Bence-Jones 蛋白 质 。 后 来 ，G. Edelman 和 Galley (1962) 证 明 Bence-Jones 和 蛋白质 相 当 于 同一 病人 血清 中 的 散 细 胞 瘤 蛋 自 质 的 轻 链 ， 并 且 化 学 结构 是 均一 的 (图 6-14) 。 6-13 几 个 病人 骼 细胞 瘤 蛋白 质 和 正常 人 免疫 球 蛋白 的 淀粉 凝 胺 电泳 的 比 较 。 (A) 完整 的 免疫 球 蛋 白 电 泳 行为 近似 。(B) 解 离 成 重 链 和 轻 链 后 , 骨 细 胞 瘤 蛋 白质 在 轻 链 位 置 表现 为 清楚 的 带 , 而 正常 蛋白 质 表 现 为 一 条 弥散 区 域 (不 均一 的 混合 物 )。 No. 8 为 Bence Jones 蛋 白质 ,因此 没有 重 链 ( 据 (Edelman, 1970) 1) 无 人 性 繁殖 系 \clone), 亦 译作 “克隆 ”是 指 发源 于 单个 细胞 的 ,具有 相同 遗传 性 的 细胞 群 ， 所 产生 的 抗体 称 为 单 株 抗 体 (或 单 克 隆 抗 体 ) (monoclonal antibody)， 具 有 均一 的 抗原 结合 专 一 性 。 e 187 。 aoa 6-14 Bence Jones BAMA AWBSA MARSA 8M RAAZEMRREKA 的 比较 a. 病人 Haw, b. 病人 S. (1) HIMBA (2) Bence-Jiones. BAR. (3) Bence-Jones 蛋白 质 经 还 原 和 煤化。〈4) HARE ARARR Mee. ( 据 Edelman 和 Gally, 1962), BALB/C 小 鼠 或 BALB/C Zfv)ik, TER AiR JAR. thee ERISA Waldenstrém 巨 球 蛋白 (相当 于 IgM) (Potter, 1972; Cohn, 1967). 迄今 已 研究 过 的 散 细 胞 瘤 蛋白 质 ( 包 括 小 鼠 浆 细 胞 瘤 蛋 白质 ) 有 几 百 种 ， 它 们 分 别 属 F IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 这 些 蛋 白质 的 发 现 为 免疫 球 蛋白 一 级 结构 的 测定 提供 了 方便 的 材料 。 截 至 1971 年 ， 已 经 测定 过 一 级 结构 的 Bence-Jones HAI, * 有 50 种，1 链 也 有 50 种 ， 没 有 发 现 其 中 任何 两 种 的 氮 基 酸 排 列 顺 序 是 完全 相同 的 。 (四 ) 均一 的 抗体 虽然 髓 细胞 瘤 蛋白 质 提 供 了 研究 各 类 免疫 球 蛋白 一 级 结构 的 好 材料 ， 抗 体 结合 位 点 结构 的 研究 还 需要 得 到 对 已 知 抗原 或 半 抗 原 有 专 一 结合 能 力 的 均一 抗体 。 鉴 别 均一 抗体 的 标准 ， 除 要 求 免疫 球 蛋白 属于 同一 类 和 亚 类 , 基因 记号 相同 ， 轻 链 属于 同一 型 或 亚 型 ， 电泳 行为 均一 外 , 还 要 求 个 体型 专 一 性 和 结合 位 点 也 是 均一 的 。 这 就 是 说 要 求 得 到 全 部 化 学 结构 相同 的 单 株 抗体 。 目 前 寻找 均一 抗体 的 途径 有 两 方面 : 1. 有 抗体 活力 的 仙 细 胞 瘤 蛋 白质 近来 陆续 发 现 许 多 种 小 鼠 骨 细胞 瘤 蛋白 质 对 已 知 的 抗原 或 半 抗 原 有 专 一 的 抗体 活 力 ， 如 对 DNP-，TNP- 基 团 、 葡 聚 糖 、 肺 炎 球 菌 C 多 糖 、p-N- 乙 酰 氨基 葡 萄 糖 等 抗原 和 半 抗 原 的 专 一 结合 能 力 (Potter, 1970; Eisen 等 ，1970; Vicari 等 ，1970) 。 具有 DNP 专 一 结合 能 力 的 殴 细胞 瘤 蛋白 质 用 免疫 平衡 透析 法 测定 时 ,表现 出 对 半 抗 原 的 均一 的 结合 能 力 ， 因 而 认为 其 抗原 结合 位 点 是 均一 的 。 人 类 也 发 现 有 类 似 抗体 活力 的 髓 细胞 瘤 蛋白 质 ， 如 与 肝素 ,心脏 类 脂 、 细 菌 抗原 (肺炎 球菌 SI，III，VIII， 和 X) 起 专 一 反应 的 IgG 和 IgM 单 株 蛋 白质 (Freedman 等 ，1976) 。 。188 。 2. 均一 抗原 诱导 的 抗体 有 人 利用 化 学 构造 简单 的 决定 徐 ， 尤 其 是 多 糖 ， 如 葡 聚 糖果 又 糖 ,肺炎 球菌 莱 膜 多 糖 等 ， 在 特定 的 免疫 条 件 下 能 在 人 和 动物 上 得 到 均一 性 近似 髓 细胞 瘤 蛋 白质 的 抗体 。 例 如 ， 从 一 个 人 得 到 的 果 聚 糖 抗体 ，100% BFIgG,, 100% Ht, 85% HGm(-) 《虽然 此 大 的 遗传 型 为 杂 合 子 ) ， 不 过 不 清楚 结合 位 点 是 否 是 均一 的 (Yount 等 ，1968) 。 同样 地 ， 一 部 家 免 对 链球 菌 的 C 多 糖 (Krause, 1970), 或 III 和 VIII 型 肺炎 球菌 莱 膜 多 糖 (Haber, 1970) 产生 的 抗体 ， 在 电泳 行为 ， 重 链 和 轻 链 的 性 质 ， 个 体型 专 一 性 等 方面 都 是 均一 的 。 免 疫 平衡 透析 实验 表明 抗原 结合 位 点 也 是 均一 的 。 因 此 ， 也 许 同 样 可 以 看 作 是 单 株 抗 体 。 对 家 免 抗 链球 菌 多 糖 的 均一 抗体 ( 同 种 异型 a2) 的 重 链 的 BA 基 酸 排 列 顺 序 分 析 结 果 发 现 其 N 端 70 氮 基 酸 残 基 和 Ca 区 127 一 179 残 基 存在 单一 的 排列 顺序 (Fleishman, 1971, 1973). M6 只 部 分 纯 系 家 免得 到 的 抗 链球 菌 A 抗原 〈 鼠 李 糖 均 聚 物 ) 的 均一 抗体 (b4K) 的 轻 链 之 N 端 42 残 基 也 有 基本 上 相同 的 排列 顺 序 (Braun 等 ， 1975) 。 这 些 事实 均 证 实 了 上 述 看 法 。 蛋白 质 抗 原 有 许多 不 同 的 抗原 决定 入 ， 引 起 的 抗体 是 非常 不 均一 的 。 但 是 ， 从 天 然 蛋 自 质 分 子 分 离 出 来 的 一 定 决 定 找 (如 溶菌 酶 的 “ 环 肽 ”2” ， 则 可 能 产生 比较 均一 的 抗体 。 例如 ， 溶 菌 酶 的 抗体 用 等 电 点 聚焦 法 可 区 分 出 24 条 以 上 的 带 , 而 “ 环 肽 2 的 抗体 只 有 9 条 带 ， 其 中 2 条 特别 显著 。 抗 天 然 溶菌 酶 抗体 的 轻 链 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 上 分 出 6 条 带 ， 而 抗 “ 环 肽 2 抗体 的 轻 链 只 有 2 KH (Maron 等 ，1971) 。 这 一 实验 虽然 还 是 初步 的 ， 但 指出 了 将 来 用 实验 方法 得 到 天 然 蛋 白质 抗原 一 定 决定 往 的 均一 抗体 的 可 能 性 。 总 之 ,用 类 似 上 述 方法 得 到 均一 抗体 是 有 成 功 希 望 的 "。 将 来 对 这 些 有 一 定 结合 专 一 性 的 均一 抗体 的 化 学 结构 ， 以 及 抗原 结合 位 点 结构 的 测定 ， 可 望 对 抗体 的 结构 提供 更 直 接 的 结果 。 Ss + RR FB 一 般 参考 书 和 综述 Cohn, §, (1971), Structural and function of immunoglobulin. In: ‘‘New concepts in allergy and clinical immunology ’’. Cohn, 8. and Milstein, C. (1967). Structure and properties of immunoglobulins. Advan. immunol. 7, 1. Day, E. D. (1972). Advanced Immunochemistry. 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Crpoenne H Buocuntes Antuten, a3. «, Mocxsa., 1) 自从 Kohler 和 milstein 在 1975 年 首先 用 杂交 细胞 瘤 技术 (Hybridoma technicque) 产生 均一 的 单 株 抗体 获得 成 功 以 来 ,这 一 方法 已 在 各 方面 得 到 广泛 的 应 用 (参看 十 四 章 460 页 )。 «189 « 论文 抗体 的 一 般 性 质 和 命名 Bazin, H. Beckers, A. and Querinjean, P, (1974). Three classes and four (sub) classes of rat immunoglo- bulins; IgM. IgA, IgE and IgGi, IgGea, IgG, IgGo.. Hurop. J. Imm. 4, 44. Isersky, C., Kulezycki, A. and Metzger, H. (1974). Isolation of IgE from reaginic rat serum. J. Immunol. 112, 1909. Kalpaktsoglou, P. K., Hong, R. and Good, R. A, (1973). The five classes of Igs in normal CsH and BALB/C mice. Immunol. 24 303. Margniand, R. A. and Hajos, S. E, (1973). Guinea-pig reaginie antibody. I. Isolation and purificat‘on of an antibody protein with characteristics of IgE. Immunol. 25, 323. II. Physicochemical and biological properties. Immunol. 25, 333. Potter, M, (1972). Immunoglobulin-producing tumors and myeloma proteins of mice. Physiol. Rev. 52, 631. Mage. R. J. 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Med. 127, 633. - 1926 第 七 章 “免疫 球 蛋 日 G 的 结构 和 功能 几 类 抗体 中 ，IgSG 的 含量 最 高 ,研究 也 最 清楚 , 可 作为 几 类 免疫 球 蛋 白 结 构 和 功能 的 代表 。 一 、 分 子 的 基本 结构 根据 G. Edelman (1959) 的 研究 ,IgG 分 子 是 由 四 条 多 肽 链 , 两 条 重 链 和 两 条 轻 链 , 靠 二 硫 键 连接 而 成 的 。 如 果 在 酸性 条 件 下 (PH2.5), ASH iA ECS) 使 重 链 间 的 二 硫 键 还 原 , 抗体 就 解 离 为 两 个 相等 的 半分 子 。 每 个 半分 子 具 有 一 个 抗原 结 合 位 点 。 如 果 在 有 SH 试剂 存在 时 , 再 用 尿素 或 毛 化 吸 处 理 , 每 一 个 半分 子 进 一 步 解 离 为 一 条 重 链 和 一 条 轻 链 , 同 时 失去 结合 抗原 的 能 力 。 如 果 用 烷 化 剂 ( 碘 乙 酸 酰 胺 , 碘 乙 酸 等 ) KPA SH 基 团 烷 基 化 ,防止 被 还 原 了 的 连接 重 链 和 轻 链 的 二 硫 键 的 重新 形成 , 而 使 重 链 和 轻 链 处 于 游离 状态 ， 于 是 就 可 以 通过 葡 聚 糖 凝 胶 过 滤 , 依据 两 种 链 的 分 子 量 的 不 同 ， 而 把 它们 分 离 ( 图 7-1) 。 依 来 源 而 定 , 轻 链 的 分 子 量 为 20,000 一 24,000, SAH 210 一 230 氨基 酸 单 位 ; 重 链 分 子 量 约 为 5,5000 一 60,000, 约 含 420 一 430 氮 基 酸 单 位 。 R. R. Porter (1959) 发 现 家 免 IgG 可 被 蛋白 酶 (木瓜 酶 ) 分解 为 三 个 大 小 约 相等 WA EA 7-2). 其 中 两 个 片 眉 “抗原 结合 片段 >, 称 为 Fab, 是 相同 的 ;第 三 个 片段 ,“ 结 REE’. #4 Rec， 和 前 两 个 片段 的 性 质 不 同 。 Fab 能 和 抗原 结合 ， 但 不 能 共同 形成 沉 淀 。 这 是 因为 每 一 个 Fapb 片段 只 有 一 个 抗原 结合 位 点 ,或 者 说 它 的 结合 抗原 能 力 是 单价 0 0 640 800 i, 2 a0 sae oad 160 320 48 800 960 1120 1280 洗 脱 液体 积 ( 毫 升 ) 图 7-1 还 原 和 烷 基 化 的 抗体 重 链 和 轻 链 经 Sephadex G-100 凝 胶 过 滤 分 离 (0.5N 丙 酸 ) (A) 还 原 和 烷 基 化 的 抗 线 ME BR HK it 体 。 〈B) 还 原 和 烷 基 化 的 抗 和 WE BA tk it 体 。 IABBWRERY HAH LA 既 链 ( 据 Edelman 等 ,1963)。 洗 脱 体积 (毫升 ) 图 7-2 Rw IgG AAAS RA BAA CM- 纤维 素 层 析 分 离 。 洗 脱 液 梯度 :0.1M 酷 酸 钠 (pH5.5)->0.9M 栈 酸 钠 CpH5.5).LII 为 Fab (分 子 量 = 50,000 一 55,0007:III 为 Fe (分 Ff =80,000)(#2 Porter, 1959), ° 193 « eet OO ~ 一 吻 变 区 一 |- 一 不 变 区 — Val-Inv (b+) Leu-Inv (a+) } 107 108 191214" Cys(K); CysSer(L) 轻 链 i 胃 和 蛋白 酶 切断 处 iGmZ 或 Gmf \ S ain ol 重 链 Ser Pro Gl = y PCAA 重 链 之 ra HE mens Gna Gig! Gu ape ! Gm" 对 于 rGi) | | aK 重 链 之 FRR — axel rca” bk 木瓜 酶 切断 处 S i | ee cRFERE -eeom Be ee 3 上 Fab 一 1 轻 链 十 重 链 之 Fd_ -| be Fab’ 一 1 + Fd’ B® nN Be + 重 链 之 >| nu COOH 图 7-3 IgG 免疫 球 蛋 白 之 基本 的 四 链 构造 ( 据 Kabat, 1971), 的 ;而 原 抗 体 分 子 有 两 个 Fab 片段 ,也 就 有 两 个 抗原 结合 位 点 ,或 者 说 是 双 价 的 。 Fe 片 段 易于 形成 结晶 , 由 此 推测 构成 Fe RR BRM EM ARAD TA RSA. MK AB SAAS, WI IgG 抗体 分 子 切 断 成 大 小 不 等 的 两 个 片 假 。 小 的 片段 类 似 Fe, 称 为 Fc 。 大 的 片段 (5S) 是 一 个 双 体 , 称 为 F(ab'):。 经 SH 试剂 (如 斑 基 乙醇 等 ) 处 理 使 二 硫 键 还 原 , 就 可 产生 两 个 3.5S 片段 了 (at)。5S 片 眉 能 和 两 个 抗原 分 子 结合 , 而 3.5S 片 眉 只 能 和 一 个 抗原 分 子 结合 。 所 有 Fab 片段 的 专 一 性 是 相同 的 ， 表明 原来 抗体 分 子 的 两 个 结合 位 点 的 专 一 性 是 相同 的 。 木 瓜 酶 的 专 一 性 不 高 , 可 能 水 解 许多 肽 键 。 然 而 ， IgG 的 重 链 只 能 在 近 中 段 处 (219 残 基 位 置 ) 被 切断 ,其 他 部 位 酶 不 能 接近 。 结 合 其 他 方面 的 证 据 , 因而 推测 IgG 分 子 是 由 三 个 致密 的 集团 (Fab, Fe), 通过 两 条 短 而 柔 曲 的 部 53 — Pri“ He RK” (“Hinge region”) 而 连接 在 一 起 的 。 将 上 述 抗体 IgG 分 子 肽 链 的 拆 合 和 酶 解 实验 结果 合并 起 来 考虑 ,就 可 以 得 出 IgG 抗体 分 子 基 本 构造 的 模式 图 (图 7-3) 。 从 图 上 可 见 ， 木瓜 酶 在 连接 两 条 重 链 的 靠 N 端 处 (219 位 置 ) 将 抗体 分 子 切 成 Fc 和 2Fab FR. 其 中 ，Rc= 重 链 靠 C 端的 一 半 ， 而 Fab=1 轻 链 + 重 链 Fd (人 靠 N 端的 一 半 ) 。 胃 有 蛋白酶 的 作用 点 在 连接 两 条 重 链 的 二 Tit 键 的 靠 C 端 处 (232 fre), 结果 这 个 二 硫 键 得 以 保留 在 5S 片段 上 并 把 两 个 F(ab ) 连 接 起 来 成 为 FE(ab' )*， 因 而 保留 着 两 个 抗原 结合 位 点 。 根据 这 些 实验 事实 ,关于 抗体 分 子 的 结构 和 功能 的 关系 可 以 得 出 重要 的 结论 : 1) 由 于 抗体 分 子 失去 Fec' 片段 后 ,不 影响 和 抗原 的 结合 , 因此 抗原 结合 位 点 应 位 于 F(ab'), 上 。 每 一 个 Fab’ 有 一 个 专 一 性 相同 的 结合 位 点 ; 2) 重 链 和 轻 链 拆 开 后 就 失去 结合 抗原 的 能 力 。 因 此 , 抗原 结合 位 点 的 功能 依赖 于 这 两 条 链 共 同形 成 的 结构 ; 3) Fe 含有 分 子 的 大 部 分 糖 基 团 。 Porter (1962) 认为 Fe 的 功能 可 能 和 固定 补体 有 关系 。 在 此 之 前 ，Ishizaka (1961) 已 提出 IgG 固定 补体 的 功能 可 能 位 于 BRc， 而 不 位 于 。194。 1 ea fA gi Oy A GST RRL, : . Se as nie come Hif H, {Hs H, ss 1 { Hy fHjHs Hot Ho CNBr 35 Se) EI i his ie SS) eae) coon 3 Sees Ed Ss S 55 图 7-4 一 种 篮 细 胞 瘤 IgG (MOPC 173 rG2a) 之 CNBr 片段 的 固定 补体 活力 存在 于 H, --BE(4 Kehoe 和 Fougereau, 1970), % 7-1 一 种 IgG (MOPC173 YG2a) 及 其 片段 的 补体 结合 的 测定 (固定 C, H—50 单位 /50 微克 和 蛋白质) * RIERA CML, 4°C ( 据 Kehoe 和 Fougereau, 1970), ** fal_£,20%, Fab 的 证 据 。 和 聚集 的 IEG 分 子 一 样 ,聚集 的 Fec 人 能 固定 补体 ， 而 聚集 的 Fab 或 了 (ab'), 都 不 能 。 后 来 进一步 确定 了 固定 补体 功能 在 Fec 上 的 位 置 是 在 重 链 从 N 端 起 第 三 个 链 内 三 硫 环 的 “H5” 肽 段 ( 包 括 大 约 50 氨基 酸 残 基 , 分 子 量 约 为 7,000) 。“H5” 应 具 有 和 补体 系统 的 一 个 成 分 结合 的 受 体 部 位 (图 7-4; 表 7-1) (Utsumi, 1969; Kehoe 和 Fougereau, 1970). 这 些 事实 提示 抗体 分 子 的 功能 有 区 域 分 化 ， 结 合 抗原 的 功能 和 效应 功能 ( 画 定 补体 ) 位 于 分 子 的 不 同 部 位 。 二 、 免 疫 球 蛋 白 一 级 结构 的 测定 方法 已 知 蛋白 质 的 立体 结构 依赖 于 参与 组 成 的 多 肽 链 的 一 级 结构 。 当 了 解 免疫 球 蛋白 的 基本 肽 链 组 成 后 , 下 一 步 最 基本 的 也 是 最 艰巨 的 工作 是 测定 重 链 和 轻 链 的 氨基 酸 排列 顺 序 。 在 证 明 Bence-Jones 蛋白 质 是 均一 的 轻 链 以 后 ,许多 实验 室 开 始 了 对 这 一 蛋白 质 的 氮 基 酸 排列 顺序 的 研究 。 多 肽 链 氢 基 酸 排列 顺序 测定 的 基本 方法 , 如 图 7-5 所 示 , 包括 两 道 步骤 。 第 一 道 步骤 ”多肽 链 经 省 化 氰 (CNBr) 裂解 ,并 确定 产生 的 片 妇 的 次 序 (1) 。 溴 化 氰 在 链 a 的 甲 硫 氮 酸 残 基 位 置 切断 , 甲 硫 氮 酸 被 转化 为 高 丝氨酸 (HSR) (1b), FF IgG 分 子 所 含 甲 硫 氮 酸 残 基数 目 不 多 , 可 以 得 到 少数 几 个 较 大 的 片段 , 如 轻 链 被 切 成 三 和 侦 ， 重 © 195 « 链 被 切 成 七 段 。 再 用 Sephadex BRU SKLAR. MERA AY SE HE (lc) 。 另 一 方面 , 链 a 改 用 胰 蛋 白 酶 切断 ,分 离 含 甲 硫 氢 酸 的 酶 解 片段 (1d), 测定 其 排 歼 顺序 ,并 和 CNBr 裂解 片 人 段 末端 的 排列 顺序 相 比 较 , 由 此 确定 这 些 CNBr 有 裂解 片段 在 原 多 肽 链 上 连结 的 先后 次 序 。 第 二 道 步 又 ”测定 每 一 段 CNBr 裂解 片段 的 氨基 酸 排 列 顺 序 。 这 可 以 采用 San- «ger 测定 胰岛 素 一 级 结构 的 经 典 方法 , CARS HT CNBr 有 裂解 片段 (2a)， 测 定 所 产生 的 每 一 段 胰 蛋 白 酶 酶 解 片 妥 的 排列 顺 序 (2b) 。 再 和 同一 肽 段 (2a) 用 胰 凝 乳 蛋 白 酶 酶 解 片段 的 排列 顺序 (2c) 相 比 较 , 以 决定 胰 蛋 白 酶 酶 解 片段 在 原 肽 眉 (2a) 上 的 先 后 次 序 。 最 后 ,再 把 所 有 这 些 片 段 的 排列 顺序 , 互相 核对 , 依次 排列 起 来 , 就 得 到 整个 多 肽 i 链 的 排列 顺序 。 la| [| TYROSINE [| | «Glutamine | LEUCINE | 许多 实验 室 对 几 十 种 Ben- CNBr ce-Jones 蛋白质 一 级 结 梅 HOMCOSERINEYGIUTAMINE CT 名 于 eeT 一 测定 的 结果 ， 发 现 没 有 任何 两 HSR 个 人 产生 的 Bence-Jones & 白质 的 一 级 结构 是 相同 的 。 每 一 一 一 人 -一 和 一 一 天 一 种 都 有 其 独特 的 氨基 酸 排 列 (laa Ee | 大 了 | | 1 ano 顺序 。 然 而 ,对 许多 种 Bence- ari Jones 蛋白 质 排列 顺序 的 比 us; 较 , 却 显 出 一 定 的 特征 。 每 一 2 | er Re See ee BEAR HSR 6s FAA, IAN 端 算 起 的 109 位 置 开 始 , 各 种 Bence-Jones RAAB | ae | as | ome memwran a alal eile Fe, PRA AK (Constant re- 图 7-5 ” 肽 链 的 初级 结构 测定 的 < 两 步 法 *。 《1) 抗体 的 肽 链 经 时 bac CNBr-2 2, 322252 PERO BUA. (2) 测定 每 一 恨 CNBr Ss gion) 。 与 此 相反 ,各 种 Ben 片 妇 的 氨基 酸 排 列 顺序 ( 据 Edelman,1970), ce-Jones 蛋白 质 前 108 氨基 酸 残 基 的 排列 有 很 大 变化 ,各 不 相同 , 称 为 易 变 区 (Variable region) (Hilschmann 和 Craig, 1965), 后 来 对 人 细 胞 瘤 蛋白 质 重 链 的 研究 表明 也 可 分 为 不 变 区 和 易 变 区 。 B 链 和 轻 链 的 这 种 结构 上 的 分 化 对 于 了 解 抗 体 分 子 的 功能 分 化 和 遗传 控制 是 一 个 很 重要 的 基本 事实 。 这 在 后 面 还 要 详细 讨论 。 三 、 二 硫 键 及 RR” 的 特性 (一 ) 链 间 和 链 内 二 硫 键 IgG 分 子 有 12 一 16 个 链 内 二 硫 键 ( 轻 链 有 2 一 3 +, 重 链 有 4 一 -5 个 )， 以 及 3 个 以 上 的 链 间 二 硫 键 。 人 和 动物 的 IEG 各 亚 类 的 链 间 二 硫 键 有 很 大 变异 ， 数 目 和 位 置 都 有 不 同 ( 图 7-6; 表 7-2) (Frangione 等 , 1968; Milstein 和 Pink, 1970). 人 IgG, 分 子 有 4 个 链 间 二 硫 键 , 其 中 2 个 连接 重 链 和 轻 链 ，2 个 连接 两 条 重 链 。 木 ¢ 196 « 表 7-2 人 和 各 种 动物 IgG 重 链 间 二 硫 桥 数目 的 变异 免疫 球 蛋 白 重 詹 间 二 硫 桥 数目 免疫 球 蛋 白 重 链 间 二 硫 桥 数目 IgG, 2 IgG, 3 IgG, 4 Gah NR 3 1gG, [人 5 IgG,b 4 IgG, 2 IgG, i BS 3 [gG, AR WF 1 23 88 13ae (194 274 SSS s— SS 22) i220. 229 $s os. 22 96 144 200i 4/ 261 gel 867 A425, ° IgGl § 一 一 -一 一 A J S Gee er se See Se s—2-s stzs SSqbls 559 5 I m Mm SIV 7otk Vor, xX xk” XI s-s 66 V ‘VI VIL 由 IgG2 5 EY 1 Il ee Vv S-S (a) 146 gS 1gG3 $ ‘¢ S.S 6.S1721 2227s.S S.S 了 ot 22 97, ys-s20E .262 322 368 426 q S 124 s- sooo Se S-S SS SS S.S S:S 了 IgG4 = Ss 9 eae N 一 -一 一 一 (b) A7-6 A IgG 各 亚 类 的 链 间 图 7-7 IgG 分 子 内 二 硫 键 的 排列 。 (a) A IgGIK 二 硫 键 排列 ( 据 Milstein 和 Pink, (Gall 和 Edelman, 1970),(b) 家 免 IgG (O’Donnell 1970), 等 , 1970)。 阿 拉 伯 数字 表示 半 胱 氨 酸 残 基 在 肽 链 上 的 位 置 。 罗 马 数字 表示 这 些 残 基 在 重 链 和 轻 链 上 的 顺序 。 NAS, ”+ 链 在 连接 重 链 和 轻 链 的 二 硫 键 与 连接 重 链 本 身 的 二 硫 键 之 间 的 地 方 水 解 。 胃 和 蛋白酶 处 理 时 , 则 在 连接 重 链 本 身 的 二 硫 键 靠 C 端 一 侧 酶 解 (图 7-6) IgG, 和 IgG 一样, 具有 2 个 重 链 间 二 硫 键 和 2 个 重 链 和 轻 链 间 二 硫 键 ; 不 过 后 者 在 重 链 上 的 位 置 不 同 ,更 靠近 N 端 (Frangeone 等 , 1969; Pink 等 , 1970) 。 IgG, 和 IgG， 有 很 大 的 区 别 。 它 共有 7 个 二 硫 键 , 其 中 5 个 为 连接 重 链 本 身 之 间 的 。 连 接 重 链 和 轻 链 之 间 的 半 胱 氨 酸 残 基 在 ys* 链 上 的 位 置 和 在 7, 链 上 相同 ,都 比较 靠 WN tm. 7s 链 上 重 链 间 第 一 个 二 硫 键 的 位 置 相当 于 >, 链 上 连接 重 链 和 轻 链 间 的 半 胱 氨 酸 残 基 的 位 置 。 胰 蛋 白 酶 能 在 两 个 重 链 间 的 二 硫 键 之 间 将 7. 链 切断 。 BR, XRT 重 链 间 二 硫 键 应 是 彼此 平行 的 。 IgG, 分 子 共 有 6 个 二 硫 键 , 其 中 4 个 是 连接 重 链 间 的 。 连接 重 链 和 轻 链 间 二 硫 键 的 半 胱 氮 酸 残 基 附 近 的 排列 顺序 与 IgGs IgG, 相同 。 但 是 连接 7. 重 链 间 二 硫 键 附近 的 排 列 顺序 ， 和 其 他 亚 类 重 链 在 该 区 域 的 排列 顺序 有 很 大 的 不 同 。 参与 这 些 重 链 间 二 硫 键 。197 。 。(/96T Saungan th 中 krus ‘7767 “ITzeN HE) eS wos—so-—24,1,—-M (GPa WE

和 一 一 一 qe — whee a | | en. & ae naT-nlD-old-eTV-old-s4D-old-old-SAD-IU T-STH-IQI-SAT-dSV-SAD 一 TS | | 1D31 “eV ne-I-nl9-old-eTV-old-s4D-ord-old-S4D-I 工 -SIH=-IU 工 -SRT-GSV-SAD-J9S no | 只 D-nT 昌 一人 [回避 WW e198 。 组 成 的 4 个 半 胱 氨 酸 残 基 , 在 全 长 8 氨基 酸 残 基 的 肽 有 侦 上 , 彼此 靠 得 很 近 。 这 可 能 是 IgG, WANA BRERA. 由 于 人 类 IgG 各 亚 类 的 Y 重 链 间 二 硫 键 附 近 的 排列 顺序 不 同 ， 有 可 能 用 化 学 方法 ( 酶 解 图 谱 ) 来 鉴别 这 些 亚 类 (Frangione 等 , 1969) 。 IgG 分子 有 12 一 16 个 链 内 二 硫 键 ， 轻 链 (上 A) 上 有 2 一 3 个 , 重 链 上 有 4 一 5 个 。 如 图 7-7(a) 所 示 , 在 人 类 IgG 的 多 肽 链 上 ,它们 呈 周 期 性 排列 ,结果 每 一 个 链 内 二 硫 环 内 包含 大 约 等 长 的 肽 段 (60 一 70 残 基 ) (Gall 和 Edelman, 1970), 家 免 IgG 大 体 上 也 保持 这 样 的 规律 性 ,不 过 Fd HRI C 端 半 段 有 附加 的 一 个 链 内 二 硫 键 (图 7-7 (b)) 。 家 免 某 些 类 型 的 轻 链 (2 和 上 A) 也 有 两 个 链 内 二 硫 键 ， 而 另 一 亚 型 的 轻 链 “B WA 3 个 链 内 二 硫 键 (Rejnek 等 , 1969) 。 如 在 下 文中 将 见 到 的 , 链 内 二 硫 环 的 这 种 JA 期 性 分 布 , 对 于 抗体 分 子 结构 和 功能 的 分 化 有 重要 的 意义 。 (=) “BRR HO RE . IgG 分 子 是 由 三 个 致密 的 球 (Fab, Fe), Hu emMAH “RER” BHR ND “ 镶 链 区 ”的 存在 使 抗体 分 子 得 到 分 节 柔 曲 性 ( 见 220 TH), 并 易于 被 酶 解 。“ 贸 链 区 ”的 这 种 特性 是 和 其 一 级 结构 的 特点 有 密切 关系 的 。 首 先 , 重 链 间 二 硫 桥 多 集中 在 这 一 区 域 , 彼 此 平行 的 排 布 。 其 次 , 这 里 还 存在 相当 多 的 不 常见 的 且 氨 酸 。 某 些 物种 , 如 家 免 ， 还 可 能 存在 1 或 2 个 低 聚 糖 基 团 (图 7-8) 。 由 于 这 些 一 级 结构 特性 的 限制 ,尤其 是 重 链 间 二 硫 桥 的 排 布 , 以 及 且 氨 酸 的 存在 ,妨碍 了 亩 旋 构造 的 形成 , 结果 这 一 段 肽 链 不 能 盘 绕 成 二 级 结 构 , 因而 能 保持 相当 的 柔 曲 性 , 并 易于 被 各 种 专 一 性 不 同 的 蛋白 酶 接近 。 UES, “HER” ASH KE th A RARE, Pld, 和 人 的 Yi: 链 比较 ,家 免 的 Y 链 在 此 区 域 少 4 个 残 基 (224, 229, 230, 231)， 山 羊 要 少 9 个 残 基 (223，229 一 236), HA KR 糖 基 团 的 数目 和 位 置 也 可 能 不 同 。 、lgG 分 子 的 全 部 一 级 结构 在 上 述 工 作 的 基础 上 ，G. Edelman 等 (1969) 测定 了 一 种 允 细 胞 瘤 蛋 白质 IgG, (Eu) 的 全 部 氨基 酸 排列 顺序 和 二 硫 键 的 位 置 , 可 代表 IgG 的 化 学 结构 。IgG， (Eu) 的 分 子 量 为 150,000, 比 胰岛 素 大 25 倍 ,其 重 链 有 446 RERRE, RRA 214 氨基 酸 残 基 ， 共计 1,320 REM, AS 19,996 个 原子 。 分 子 结构 如 图 7-9 所 示 , 如 早期 研究 提示 的 , 分 子 是 由 两 条 相同 的 轻 链 和 两 条 相同 的 重 链 组 成 的 。 分 子 的 构造 是 对 称 的 ,每 一 个 半分 子 由 一 条 轻 链 和 一 条 重 链 构成 。 每 一 条 轻 链 和 相 邻 的 重 链 由 一 个 二 硫 键 CV) 连接 成 一 个 半分 子 。 两 个 半分 子 之 间 , 再 由 VI，VII 两 个 二 硫 键 连接 起 来 。 在 每 条 链 内 , 每 隔 大 约 相等 的 距离 也 形成 类 似 的 链 内 二 硫 键 ,结果 大 约 把 轻 链 等 分 为 两 段 , 重 链 分 为 大 约 相等 的 四 段 。 胰 和 蛋白酶 能 在 重 链 的 222 位 置 的 赖 氨 酸 残 基 处 将 多 肽 链 切 断 , 形 成 两 个 Fab(t) 和 一 个 Fe(t) 片段 。 轻 链 的 全 部 氮 基 KH (214 RA) 的 排列 顺序 见 图 7 一 10。 根据 和 其 他 许多 种 Bence-Jones 蛋白 质 氮 基 酸 排 «© 199 « 胰 和 蛋白 酶 切断 处 〈222) S S S S 5: 6 MIIMIJH7Z i 轻 链 7-9 7G, 免疫 球 蛋 白 (Eu) 的 肽 链 和 二 硫 键 排列 。 半 胱 氨 酸 残 基 , 从 N 端 起 始 , 用 I 一 XI 表示 。 个 为 分 子 在 重 链 的 222 位 置 被 胰 蛋 白 酶 切断 成 两 个 "抗原 结合 ?片段 和 一 个 “可 结晶 ? 片 妇 。 (VnVi) 重 链 和 轻 链 的 同 源 的 易 变 区 ;(Ca;; CH,C 吉 ) 重 链 不 变 区 的 同 源 区 ; (CL) HS Ch,Ch,Ch 的 同 源 区 ; (PCA) | Mi sed BE (Pyrollidonecarboxylic acid); (CHO) 糖 基 团 ( 据 Edelman 等 ,1969)。 10 20 1 Asp-Ile-Gln ~Met-Thr-Gln-Ser ~ Pro ~Ser -Thr—Leu-Ser-Ala - Ser -Val-Gly-Asp-Arg- Val -Thr- PORE Sa A 30 40 |. le -Thr-|Cys |-Arg-Ala -Ser -Gln- Ser - [le -Asn-Thr-Trp-Leu- Ala -Trp-Tyr—Gln —Gln - Lys -Pro- Aine 50 60 Gly-Lys-Ala -Pro -Lys -—Leu-Leu-Met-Tyr-Lys -Ala-Ser-Ser-ILeu-Glu-Ser-Gly-Val-Pro ~ Ser- 70 80 ” Arg—Phe- Ile -Gly -Ser -Gly -Ser- Gly. -Thr—Glu-Phe-Thr—Leu-Thr ~ {le -Ser - Ser -Leu-Gln - Pro- eee 90 100 Asp—Asp-— Phe ~Ala-Thr-Tyr-Tyr-|Cys|-Gln -Gln-Tyr-Asn-Ser- Asp — Ser —-Lys -Met-Phe-Gly —Gln- 110 = 120 Gly-Thr- Lys -Val -Glu-Val-Lys- Gly -Thr-Val —-Ala -Ala-Pro- Ser -Val —Phe- Ile -Phe- Pro - Pro- 130 140 Ser -Asp— Glu -Gln-Leu-Lys-Ser- Gly -Thr-Ala-Ser -Val -val-|Cys|-Leu-Leu-Asn-Asn- Phe -Tyr- 150 160 Pro-Arg- Glu -Ala -Lys -Val -Gln-Trp -Lys-Val -Asp-Asn-Ala- Leu —Gln-Ser - Gly —Asn-Ser -GJn- 170 180 Glu-Ser- Val -Thr-Glu-Gln-Asp- Ser —Lys—Asp-Ser -Thr-Tyr- Ser —Leu—Ser - Ser ~Thr-Leu-Thr- 190 met AS 2007 75 Leu-Ser —- Lys -Ala -Asp—Tyr-—Glu- Lys -His-Lys -Val-Tyr-Ala-|Cys |-Glu-val -Thr-His—Gln-Gly-. . 210 214 Leu-Ser- Ser -Pro -Val -IThr-Lys- Ser -Phe—Asn-Arg-Gly -Gu 图 7-10 IgG:(Eu) 轻 链 的 全 部 氨基 酸 排列 顺序 ( 据 Edelman，1969)。 列 顺 序 的 比较 可 看 出 , 轻 链 的 易 变 区 (VD MN 端 起 始 ， 延 长 到 108 位 置 。 191 位 置 的 Val 和 Inv(b*) 抗原 专 一 性 有 关系 。 重 链 的 全 部 氨基 酸 (446 RE) 的 排列 顺序 见 图 \7-11。 356 位 置 的 Glu 和 358 位 置 的 Met 可 能 和 Gm(1) 专 一 性 有 关系 ; 214 位 置 的 Arg 可 能 和 Gm(4) 专 一 性 有 关系 。 从 分 离 出 的 一 个 糖 多 肽 的 分 析 表 明 , 分 子 的 糖 基 团 是 和 227 位 置 的 Asx ERR. bb IgG, (Eu) 重 链 从 101 一 121 的 排列 顺序 和 另 一 种 通 细 « 200 « 1 10 20 Dea -Val -Gln-Leu -Val -Gln -Ser -Gly-Ala -Glu-Val -Lys -Lys -Pro -Gly-Ser -Ser -Val -Lys-Val 30 40 Ser -cys|-rr -Ala -Ser -Gly -Gly -Thr-Phe -Ser -Arg-Ser-Ala -Ile -Ile -Trp -Val-Arg-Gln -Ala - 50 60 Pro -Gly -Gln-Gly -Leu -Glu -Irp -Met-Gly -Gly-Ile -Val -Pro -Met-Phe-Gly -Pro -Pro -Asn-Tyr 一 70 80 Ala -Gln -Lys -Phe -Gln -Gly -Arg -Val -Thr -Ile -Thr-Ala -Asp-Glu-Sre -Thr -Asn-Thr-Ala-Tyr - 90 100 Met -Glu -Leu-Ser -Ser -Leu -Arg -Ser -Glu -Asp-Thr ~Ala-Phe~Tyr—Phe-|Cys |-Ala -Gly -Gly-Tyr - 110 120 Gly -Ile -Tyr-Ser -Pro -Glu -Glu -Tyr—Asn -Gly-Gly -Leu-Val -Thr-Val -Ser -Ser -Ala -Ser —Thr - 130 . 140 Lys -Gly -Pro-Ser -Va] -Phe -Pro -Leu-Ala -Pro -Ser -Ser -Lys -Ser -Thr-Ser -Gly -Gly-Thr —Aal- a 150 160 Ala -Leu-Gly- |cys |-Leu -Val -Lys -Asp -Tyr -Phe -Pro -Glu-Pro -Val -Thr-Val -Sre-Trp -Asn-Ser - 170 180 Gly -Ala -Leu-Thr -Ser -Gly -Val -His-Thr -Phe -Pro -Ala -Val -Leu-Gln-Ser -Ser -Gly-Leu-Tyr - 3 : 190 200 Ser -Leu -Ser -Ser -Val -Val -Thr-Val-Pro -Ser -Ser -Ser -Leu-Gly-Thr-Gln -Thr-Tyr-Ile -|cys 一 210 pc Asn -Va] ~Asn-His -Lys -Pro -Ser —Asn-Thr -Lys-Val -Asp-Lys -Arg-Val -Glu -Pro -Lys -Ser -cy — 2350 240 Asp -Lys -Thr-His -Thr -cx Pro -Pro-|cys |-Pro -Ala -Pro -Glu-Leu-Leu -Gly -Gly -Pro -Ser -Val - 250 260 Phe -Leu -Phe-Por -Por -Lys -Pro -Lys-Asp -Thr-Leu-Met-Ile -Ser -Arg-Thr -Pro -Glu-Val -Thr - 270 280 cs|-val -Val-Val -Asp -Val -Ser -His-Glu -Asp-Pro -Gln-Val-Lys-Phe=Asn -Trp-Tyr-Val -Asp - 290 300 Gly -Val -Gln-Val -His -Asn -Ala -Lys-Thr -Lys-Pro -Arg-Glu-Gln-Gln-Tyr -Asx-Ser -Thr-Tyr - 310 320 Arg -Val -Val-Ser -Val -Leu -Thr -Val-Leu -His -Gln-Asn-Trp-Leu-Asp-Gly -Lys-Glu-Tyr-Lys - — 330 340 |cys|-Lvs -Val-Ser -Asn -Lys -Ala -Leu-Pro -Ala -Pro -Ile -Glu-Lys-Thr-Ile -Ser -Lys-Ala -Lys - 350 360 Gly -Gln -Pro-Arg -Glu -Pre -Gln -Val-Tyr -Thr-Leu-Pro -Pro -Ser -Arg-Glu -Glu-Met-Thr-Lys ~- ; 370 380 Asn -Gln -Val-Ser -Leu -Thr [evs |-Leu-val —Lys -Gly -Phe-Tyr-—Pro -Ser -Asp--Ile -Ala -Val-Glu - 390 400 Trp -Glu -Ser -Asn -Asp -Gly -Glu -Pro -Glu -Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro -Pro -Val -Leu-Asp-Ser - 410 420 Asp -Gy -Ser -Phe -Phe -Leu -Tyr -Ser -Lys -Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser -Arg -Trp-Gln-Glu-Gly - 一 一 430 440 Asn -Val -Phe-Ser -|cys |-Ser -Val -Met-His -Glu-Ala -Leu-His -Asn-His -Tyr -Thr-Gln-Lys-Ser - 446 Leu -Ser -Leu-Ser -Pro -Gly 图 7-11 IgG:(Eu) 重 链 的 全 部 氨基 酸 排列 顺序 。 半 胱 氨 酸 残 基 在 方 框 内 ， 甲 硫 氨 酸 加 底线 ) ( 据 Edelman, 1969), 胞 瘤 蛋 白质 IgG(He) (Gm 专 一 性 和 Eu 相同 ) 重 链 的 相对 应 的 一 段 的 排列 顺序 ， 101 105 110 115 120 Eu: -Gly -Ile -Tyr-Ser -Pro-Glu-Glu-Tyr-—Asn-Gly-Gly-Leu-Val-Th r-Val-Ser-Ser—Ala-Ser-Thr-Lys- He: ~Thr-Leu-Ala-Phe-Asx-Val-Try-Gly-Glx-Gly-Thr-Lys-Val-A la|-Val-Ser-Ser-Ala-Ser—T hr-Lys-| 可 以 看 出 ,从 115 位 置 开始 氨基 酸 排 列 顺序 相同 。 后 来 进一步 的 研究 证 明 这 两 种 重 链 从 115 一 252 的 排列 顺序 都 相同 。 此 外 ，Eu 和 He 之 Fe 片段 的 酶 解 肽 段 < 指纹 ”图 * 201。 1 10 Eu UL (#3 1—108) Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Eu Un (&# 1—114) Pca Val Gln Leu Val Gln Ser Gly — Ala 20 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr 一 一 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Ser Arg Ser Ala Ile [le Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly. 50 60 Tyr Lys Ala Ser Ser — Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Ile Val Pro Met Phe Gly Pro Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gin Gly — Arg Val 70 80 Gly Thr Glu Phe Thr 一 一 一 一 一 一 — Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 一 Tyr Asn Ser Asp Ser Lys Met Phe Gly Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Tyr Gly [le Tyr Ser Pro Glu Glu Tyr 100 Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Gly Asn Gly Gly Leu Val Thr 图 7-12 人 IgG(Eu) 易 变 区 Vi 和 Va 氨基 酸 排列 顺序 的 比较 。 为 了 得 到 最 大 同 源 性 ， 引 人 的 缺失 肽 仆 用 虚线 表示 。 相 同 的 残 基 用 黑体 字 表示 ( 据 Edelman, 1971), VL Cr HW a Vy 一 -人 一 WWW or Ch 图 7-13 IgG 分 子 内 部 的 同 源 。 ZEK Vi 和 Vu 同 源 ， 重 链 的 不 变 区 Cu 分 为 大 约 相等 的 三 外 (Ch, Ch, Ch) 彼此 同 源 , 并 且 和 轻 链 的 Cr 同 源 。 重 链 的 Fo 是 由 同 源 区 C# 和 Ch 组 成 的 ( 据 Edelman, 1971), 谱 也 相同 。 根 据 所 有 这 些 材料 推论 , 重 链 的 易 变 区 (Va) MAREK (Cy) 的 转折 点 应 在 114 位 置 附近 。 IgG:(Eu) 分 子 结构 的 最 显著 的 特点 是 重 链 和 轻 链 都 可 区 分 为 易 变 区 和 不 变 区 两 部 分 。 重 链 的 易 变 区 〈Va) 和 轻 链 的 易 变 区 (Vi) 的 长 度 大 约 相等 。 当 把 各 种 免疫 球 蛋 白 易 变 区 的 氨基 酸 排 列 顺序 , 按 尽 可 能 有 最 大 的 同 源 性 ( 即 在 各 排列 位 置 上 有 尽 可 能 多 的 相同 的 残 基 ) 排 列 ,并 留 出 一 些 缺 失 ( 或 插 和 人 的) 肽 段 就 可 以 发 现 , 各 种 免疫 球 蛋白 的 易 变 区 的 氨基 酸 排列 尽管 有 高 度 的 变异 性 ,但 是 Va 和 Vr 仍 有 一 定 的 同 源 性 (图 7-12) Vu Vi 位 于 Fab 片段 的 近 N 端 半 段 ,相当 于 抗原 结合 位 点 的 位 置 。 由 此 可 以 假定 ,抗体 的 抗原 结合 位 点 的 专 一 性 可 能 依赖 于 重 链 和 轻 链 易 变 区 的 氨基 酸 排列 顺序 。 这 些 排列 顺序 的 多 变性 提供 了 专 一 的 免疫 反应 所 需 的 多 种 多 样 的 结合 专 一 性 。 另 一 个 值得 注意 的 特点 ,是 在 比较 不 变 区 的 排列 时 可 以 发 现 内 部 的 周期 性 。 实 际 上 ， 这 在 前 述 链 内 二 硫 环 的 等 距 分 布 现 象 中 已 经 反映 出 来 了 (图 7-9) 。 如 果 按 链 内 二 硫 环 的 位 置 把 重 链 的 不 变 区 分 为 大 约 相等 的 Ci、Ca、Ca 三 段 , 并 按 最 大 同 源 性 的 方式 排列 。 比 较 这 三 段 的 氨基 酸 排 列 顺序 就 会 发 现 一 个 奇异 的 现象 ， Ci、Ca， Ca 的 排列 顺序 很 相 似 , 有 高 度 的 同 源 性 (22 一 24/100 氨基 酸 残 基 排 列 位 置 相 同 ) , 而 每 一 段 又 是 和 轻 链 的 Cr 同 源 的 (图 7-13; 图 7-14) 。 这 种 同 源 性 很 可 能 不 是 偶然 的 ， 而 是 肥 映 了 抗体 分 子 各 同 源 区 在 进化 起 源 上 的 关联 。 *， 202。 110 120 Eu Cr ( 残 基 109 一 214) Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Eu Ch (F&3£119—220) Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Eu CH (FR 3£234—341) Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Eu Cy (FR3E342—446) Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Asp Glu Gin 一 一 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Ser Lys Ser 一 一 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Arg Glu Glu 一 — Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 140 150 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 一 一 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 一 一 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Lea Thr Ser Gly Ser His Glu Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Asp Gly Glu Pro Glu 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser — Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser _ 180 190 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ie Cys Asn Val Asn Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 200 210 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr — Lys Ser Phe 一 一 Asn Arg Gly Glu Cys His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val — Asp Lys Arg Val 一 一 Glu Pro Lys Ser Cys Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 一 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 图 7 14 人 igG(Eu) 不 变 区 各 同 源 区 Cr, Ch, Ch, Ch 氨基 酸 排列 顺序 的 比较 。 为 了 得 到 最 大 同 源 性 ， 引入 的 缺失 肽 段 用 虚线 表示 。 相 同 的 残 基 用 黑体 字 表 示 ( 据 Edelman, 1971), 总 之 ,从 IgG 免疫 球 蛋白 分 子 的 全 部 排列 顺序 得 出 的 最 有 理论 意义 的 结论 是 多 肽 链 可 以 清楚 地 划分 为 具有 不 同 的 结构 和 功能 的 区 域 。 抗体 担任 着 两 类 主要 的 免疫 学 功能 : 识别 抗原 和 对 抗原 或 靶 细 胞 产生 特定 的 效应 。 这 在 抗体 分 子 结构 上 的 要 求 ， 既 要 适应 于 极其 多 种 多 样 的 结合 专 一 性 ， 同 时 又 要 保持 某 一 类 抗体 相当 稳定 的 结构 来 担任 该 类 抗 体 特有 的 效应 器 功能 。 抗 体 分 子 就 是 借助 于 肽 链 结构 的 区 域 分 化 出 色 地 完成 了 这 种 双重 AES: 相配 成 对 的 Va 和 Vi 区 域 排列 顺序 的 高 度 变异 性 适应 于 抗原 结合 专 一 性 的 多 样 性 ;同时 Ca 和 Cy 区 域 排列 顺序 的 相对 稳定 又 适应 于 担任 特定 的 几 种 免疫 学 功能 。 抗 体 分 子 结构 和 功能 的 高 度 统 一 和 完美 性 是 亿 万 年 进化 过 程 中 自然 选择 的 结果 。 抗 体 分 子 的 这 种 结构 分 化 要 求 特别 的 遗传 机 制 。 如 上 所 述 , 重 链 的 不 变 部 分 Ch, Ch, Ch 和 轻 链 的 不 变 部 分 Cr 的 同 源 性 表明 它们 在 进化 起 源 上 是 有 联系 的 。 鉴 于 Ca 是 由 三 个 同 源 区 构成 的 ,因此 假定 抗体 很 可 能 是 通 过 基因 倍增 (Gene duplication) 过 程 而 进化 的 。 也 就 是 假定 重 链 和 轻 链 的 不 变 区 可 能 起 源 于 一 个 共同 的 “祖先 分 子 ”。 这 一 个 原始 的 基因 , 其 大 小 能 决定 一 个 同 源 区 的 排列 顺 序 , 它 自身 增 倍 或 增 三 倍 ,形成 一 个 较 大 的 基因 来 决定 Ca 的 排列 顺序 。 同 时 各 同 源 区 又 可 逐渐 发 生变 腊 , 造成 重 链 类 ,型 和 功能 的 分 化 。 另 一 方面 , 比较 易 变 区 (Va, Vi) 和 四 * 203 » BRAS ARB (Ch, Ch, Ch 和 Co ， 它 们 的 长 度 大 约 相等 , 而 排列 顺序 却 极 少 相 同 。 因 此 , 设想 易 变 区 (V) MABE (C) 是 由 不 同 的 基因 (CV 基因 和 C HH) 控制 的 。 在 抗体 分 子 进化 的 极 早 阶段 ，V,C 基因 的 构造 上 就 发 生 异 趋 现 象 , 以 适应 于 分 担 识别 抗 原 和 发 生效 应 的 不 同 功能 。 事 实 上 ,根据 遗传 学 分 析 , 不 变 区 (C) 是 受 少数 几 个 基因 中 的 一 个 基因 控制 的 ,而 在 同一 个 体 的 易 变 区 (V) 是 由 另外 许多 基因 中 的 一 个 基因 控制 的 (Hood 和 Ein, 1968; Milstein 和 Munro，1970) 。 换 句 话 说 ,抗体 的 每 条 肽 链 ( 重 链 或 轻 链 ) 是 由 两 个 基因 共同 来 决定 的 。 这 在 分 子 遗 传 学 上 是 十 分 独特 的 现象 ,因为 迄今 已 研究 过 的 所 有 其 他 蛋白 质 分 子 , 一 个 基因 就 能 决定 一 条 肽 链 。 在 一 个 体 中 , V 基因 如 何 有 许多 变异 形式 ， 从 而 决定 组 成 抗原 结合 位 点 的 易 变 区 的 结构 的 多 样 性 ? V 基因 (控制 抗原 结合 位 点 的 专 一 性 ) 又 如 何 与 C 基因 (控制 不 变 区 的 效应 功能 ) 连接 起 来 ， 共 同 决定 重 链 或 轻 链 的 结构 ? 对 于 前 一 问题 将 在 下 面 讨 论 抗原 结合 位 点 专 一 性 时 再 提 到 。 对 于 后 一 问题 , 目前 假定 是 通过 基因 移 位 来 实现 的 ,我 们 将 在 以 后 的 章节 中 再 作 讨论 。 五 、 功 能 区 和 抗体 的 效应 器 功能 (—) Sh fe & te te 从 免疫 球 蛋白 分 子 全 部 一 级 结构 的 考查 得 到 的 另 一 个 重要 理论 成 果 是 功能 区 假说 (Domain hypothesis) (Edelman, 1971), 抗体 分 子 内 , 同 源 区 的 沿 直线 重复 排列 , 易 变 区 (V) 和 不 变 区 (C) 的 每 一 同 产 区 各 有 一 个 链 内 二 硫 环 ， 以 及 链 间 二 硫 键 集 中 于 重 FMR i a See i any 链 中 段 的 狭小 区 域 而 将 两 个 半分 子 连接 起 eae 一 一 < eae) 来。 抗体 分 子 内 部 的 这 种 同 源 性 和 对 称 性 提示 各 同 源 区 的 肽 链 可 能 人 靠 链 内 二 硫 键 的 维系 ,折合 成 一 个 个 彼此 类 似 的 .致密 的 立 体 结构 ， 并 担负 特定 的 免疫 学 功能 ， 称 为 功能 区 。 抗体 分 子 的 功能 区 结构 可 以 用 IgG, (Eu) 的 念珠 模型 清楚 地 表示 “图 7-15) 。 分 子 假 定 呈 “T” 字 形 ， 由 一 串 功 oe 7 | “能 区 相连 而 成 。 每 一 个 功能 区 被 一 个 链 内 图 7-15 “IgG 之 念珠 模型 , 示 功 能 区 内 链 内 二 俩 环 的 安排 “一 硫 键 维 皖 结 构 的 稳定 ， 而 相 领 的 功能 区 ( 据 Edelman，1971)。 WU ER ar SERA A EEE. Alt, 每 一 功 能 区 各 自 能 维持 相对 稳定 的 空间 构象 (这 些 假定 后 来 已 为 抗体 分 子 的 X 射线 晶体 学 分 析 以 及 溶液 构象 的 研究 所 证 实 ， 见 下 节 ) 。Edelman (1971) 还 假定 Vu crt Cr? cr? 同 源 区 在 抗体 分 子 进 化 过 程 中 ， 各 功能 区 在 结构 和 功能 上 发 生 分 化 ， 各 自分 A) wi ei 担 该 类 抗体 特有 的 免疫 学 功能 ， 如 12.500 12,500 18,500 12,500 “观测 分 子 量 TEGAN TORR eels Ce 图 7-16 7 链 之 功能 区 模型 , CHO 示 糖 基 团 是 固定 补体 ,如 此 等 等 。 ( 据 Koch 等 ,1973)。 * 204 。 近来 ,用 胰 蛋 白 酶 对 7 重 链 进行 可 控制 的 酶 解 ,使 连接 各 功能 区 之 间 的 三 个 键 分 别 以 不 同 速度 断 开 ,结果 依次 得 到 一 系列 分 子 量 递减 的 含 功能 区 的 片 侦 和 全 部 功能 区 。 除 C? 因 含 糖 基 团 ,分 子 量 增加 6,000 外 , 其 余 三 个 功能 区 的 分 子 量 都 相等 , AA 12,500 (Koch 等 ，1973; Hellingwerf 等 ,1974) (图 7-16) 。 功能 区 和 含 功 能 区 片段 的 制备 成 功 , 为 研究 抗体 分 子 效应 功能 的 结构 基础 准备 了 条 件 。 (=) IgG 效应 器 功能 的 定位 抗体 的 生物 学 功能 要 求 同 一 分 子 专 一 地 识别 抗原 ,同时 又 保持 各 类 抗体 所 特 有 的 效 应 器 功能 。 分子 的 这 种 功能 分 化 是 基础 于 结构 的 分 化 。 按 照 功 能 区 假说 , 这 种 识别 功能 和 效应 器 功能 假定 是 分 别 位 于 分 子 之 Fab 的 易 变 区 和 Fe 的 不 变 区 , 而 每 一 类 抗体 所 特有 的 效应 器 功能 ,又 假定 分 布 在 Fe 的 不 同 功能 区 上 。 已 知 IgG 抗体 具有 固定 补体 (结合 Clq), RHA RIK (PCA 反应 ) , 亲 合 细胞 (与 单 核 球 . 巨 噬 细 胞 ,淋巴 细胞 等 的 Fe 受 KES) ,以 及 穿 过 生物 膜 等 功能 。 此 外 , 抗原 抗体 复合 物 被 淋巴 滤 泡 阻 留 ， 天 -一 -一 一 一 也 是 依赖 Fe 和 网 状 细胞 的 Fe Stk a -至 一 | | | i 结合 。 这 些 效应 器 功能 在 抗体 分 子 上 | ! im 定位 的 问题 是 抗体 结构 和 功能 研究 的 AAS 二 另 一 个 重要 方面 ， 目 前 还 刚 开始 有 初 ¥286029781 37 567 425! Neco 步 的 研究 。 二 一、 如 前 述 ( 见 194 页 ), 早期 研究 已 证 | 明 IgG 抗体 固定 补体 的 功能 位 于 分 pcre Ar FRY Fe FrEe. It PHE, 还 证 明 致 敏 异 图 7-17 人 IgG, > F。 HEL SHCH, Ch WRK AM B PRK (PCA 反应 ) 、 穿 过 胎盘 等 功 。 和 胃 蛋 白 酶 进一步 切断 成 F: 和 PF. 小 片段 。 数字 表示 二 硫 能 也 是 和 Fe 有 关 的 (Ishizaka 等 ， 2 1961)。 不 过 , 不 同 亚 类 的 IgG 则 有 所 不 同 。 如 IgG; WH Fe 能 固定 补体 , MAAR Beko MZ, IgG, 的 Fe 能 致 敏 异种 皮肤 , 却 不 能 固定 补体 (Ishizaka 等 ,1967) 。 由 此 可 见 , 虽然 和 这 两 种 功能 有 关 的 构造 都 位 于 Fe, 显然 致 敏 异 种 皮肤 和 固定 补体 有 关 的 构造 是 不 同 的 。 推 而 广 之 ,其 他 几 种 和 效应 器 功能 有 关 的 构造 也 可 能 是 不 同 的 ,并 可 能 分 布 在 Fe 的 不 同 功能 区 上 。 这 些 效应 器 功能 在 FRc 上 的 定位 ， 可 以 用 Fe 的 大 小 不 同 的 酶 解 片段 来 作 细 致 的 分 析 。 人 IgG, 的 Fe tA (Ch + Ca) 可 被 木瓜 酶 和 胃 和 蛋白 酶 进一步 切 成 Re A pF. 小 片段 (图 7-17) 。 FE< 和 pFc (都 只 包含 Ch 功能 区 )， 仍 然 保 持 和 巨 鸣 细 胞 的 亲 合 力 ， 以 及 和 某 些 类 风 如 因 子 的 结合 能 力 , 但 失去 Fe 原 有 的 其 他 生物 学 活性 (固定 补体 ， 致 敏 皮肤 , 穿 过 生物 膜 等 ) (Turner %, 1969; Natvig 等 , 1970) 。 另 一 方面 ,有 证 据 表 明 固 定 补体 (Clq) 的 功能 位 于 Ca 功能 区 (Okafor 等 , 1974) 。 近年 来 ,利用 分 离 的 C2 和 Cr 片段 进一步 验证 了 抗体 的 几 种 效应 器 功能 。 当 用 经 典 的 聚 葵 乙 烯 乳 胶 颗 粒 补 体 固 定 法 (抗原 吸附 于 乳胶 颗粒 表面 ) 测 定时 ，CF? 片 眉 只 表现 微弱 的 固定 补体 的 活性 (相当 于 完整 IgG 分 子 的 约 3%) 。 然而 , 改 用 液 相 补体 结合 法 测定 时 , 就 和 完整 的 IgG 分 子 或 « 205 « Re 片 仆 有 同样 大 小 的 活力 。 Cr 在 两 种 测定 中 都 完全 没有 活力 。 由 于 Cr 片段 只 代表 一 个 完整 的 功能 区 。 这 说 明 它 能 单独 地 和 充分 地 表现 结合 补体 的 全 部 能 力 。 同 样 地 ， 还 证 明了 IgG 和 豚鼠 巨 噬 细 胞 的 结合 功能 完全 属于 Cr 功能 区 。 对 放射 性 同位 素 标 记 的 IgG 及 Fab, Fc, Ci, Cr 等 片段 在 血 流 中 清除 速度 的 测量 表明 ，C?# 清除 的 半衰期 与 IgG 和 Fe 相同 ( 约 70 小 时 ) ,而 Cy 和 Fab 则 快 得 多 ( 约 15 小 时 ) 。 DEKE 楚 地 证 明 IgG 分 子 的 至 少 有 三 种 效应 器 功能 是 由 FRc 上 的 功能 区 各 自 独 立地 和 充分 地 实现 的 (Dorrington 和 Painter, 1974; Yasmeen 等 ,1976) 。 男 一 方面 的 研究 也 支持 这 一 结论 。 小 鼠 分 这 IgG, 的 浆 细 胞 瘤 (MOPC21) 的 某 些 突变 细胞 系 ,所 产生 的 IgG， 和 蛋白 几乎 完全 缺少 Ch 或 Ch 功能 区 。 这 提供 了 研究 效应 器 功能 定位 的 好 材 料 。 近 来 ， 有 人 利用 这 些 突变 细胞 系 分 刻 的 构造 不 同 的 IgG, 分 子 研究 它们 和 小 鼠 淋巴 细胞 表 Hi Fe 受 体 的 相互 作用 , 发 现 IF, 突变 细胞 系 分 UAH IgG, (缺少 Ch 功能 区 ) REM all Mk Ee He FE & MIXER (Rosette formation), ， 而 IF, 和 IF; 分 刻 的 IgG, (RZD Ch), 则 没有 这 种 抑制 作 用 。 因此, IgG, 和 淋巴 细胞 表面 Fe 受 体 的 亲 合 R718 A tC AFAR, RAABME NM TPG Ch 功能 区 ,而 和 Ch 无 关 (Ramasamy arn ait =, 1975). 此 外 ，IgG MARBR, KBR 细胞 的 Fe SKHARG, UDR E “K” Soi, 中 性 球 的 Fc 受 体 的 亲 合 也 都 是 和 Ci 功能 区 有 关 的 。 Alt, 1eG 的 Ca 功能 区 可 能 具有 和 免疫 系统 有 关 的 许多 种 细胞 的 Fe 受 体 亲 合 的 特性 。 综合 以 上 这 些 结果 , 可 以 把 IgG 各 功能 区 的 已 知 的 或 推测 可 能 有 的 生物 学 功能 ， 列 于 表 7-3 (Dorrington 和 Painter, 1974) 和 图 7-18。 IgG 还 有 一 些 效应 器 功能 的 定位 ,如 通过 胎盘 、 致 敏 异 种 皮肤 (PCA) ,目前 还 不 太 清楚 。 不 过 ， 新 近 有 证 据 提 示 致 敏 异种 皮肤 的 功能 依赖 完整 的 Fc,， 而 不 是 个 别 的 功能 区 (Ovary 等 , 1976) 。 小 鼠 卵 黄 RRA LARS Fe 受 体 (Elson 等 , 1975) 。 人 胎盘 细胞 膜 上 也 存在 能 和 IgG 专 一 结合 的 Fe 受 体 。 与 这 种 Fe 受 体 的 结合 同样 需要 完整 的 Rec; 个 别 的 功能 区 ,，Cy 或 Cr， 均 不 能 。 对 于 每 一 功能 区 担任 一 种 独立 的 生物 学 功能 的 假说 说 来 , 这 些 事实 似乎 是 例外 (McNabb 等 ,1976) 。 研究 抗体 Fe 的 效应 器 功能 , 还 可 以 采用 化 学 改 性 的 方法 , 即 改变 抗体 分 子 的 特定 的 氨基 酸 残 基 , 如 使 赖 氨 酸 酰胺 化 或 氨基 甲 酰 化 , 色 氮 酸 苯 化 ,能 分 别 地 改变 Fe 的 各 种 功 能 , 而 不 致 影响 抗体 结合 抗原 的 能 力 。 例 如 ,家 免 抗 卵 白 蛋 白 抗 体 经 过 这 样 处 理 后 ， 固 定 补体 、. 亲 合 巨 噬 细 胞 的 能 力 都 显著 地 降低 ， 而 致 敏 异种 皮肤 (PCA) 的 能 力 则 不 受 影 啊 (Cohn 和 Thracher，1973) 。 用 2-#6-5-THE PARE (NBB) KERR IgG RH Fe 的 酶 解 片段 的 色 氮 酸 残 基 的 实验 ,还 提示 IgG 分 子 和 Cla 的 结合 位 点 , 似乎 是 由 Fe 的 不 同 部 位 的 氨基 酸 残 基 共 同 组 成 的 ,而 Fe 结构 的 完整 性 是 激活 Cl 的 先决 条 件 (Allan 和 Isliker，1974) 。 另 一 种 可 能 的 解释 是 或 许 Cla 结合 位 点 确实 位 于 Ch 功能 区 上 ， *，206。 Fre 功能 区 结合 活 表 7-3 lgG 各 功能 区 的 生物 学 功能 功 能 区 B Am FT fH MD fe Vi + Vi 结合 抗原 Cy + Cr 抗原 结合 位 点 和 效应 器 之 闻 的 “间隔 物 ? Ch 1. 固定 补体 《Cl1q) 2， 控制 降解 代谢 率 Ct, 亲 合 细胞 : 1. 巨 史 细胞 和 单 核 球 2. 异种 肥大 细胞 3， 细 胞 毒性 “K?” 细胞 4. 淋巴 球 (B 细胞 ) 5. 中 性 球 (# Dorrington 和 Painter, 1974), 不 过 需要 Fe 各 功能 区 之 间 的 协同 作用 才能 维持 激活 Cl 所 需 的 构象 。 IgG 抗体 通过 分 子 上 的 这 些 效应 器 (功能 区 ) 能 够 进一步 激活 机 体 的 许多 免疫 学 效应 机 制 ， 包括 通过 和 Cla 的 结合 而 激活 补体 系统 ， 通 过 和 细胞 表面 Fe 受 体 的 亲 合 而 激 活 巨 噬 细 胞 和 中 性 球 对 细菌 的 吞噬 作用 以 及 细胞 毒性 “K” 细 胞 对 躬 细胞 的 杀伤 作用 等 ， 达到 中 和 或 处 理 抗原 的 防御 目的 。 然而 ,抗体 只 有 和 抗原 结合 后 ， 才 能 激活 这 些 效应 机 fill, 天 然 的 IgG 分 子 并 不 能 起 这 种 作用 。 不 过 ,在 没有 抗原 存在 的 条 件 下 ,一些 物 理 处 理 (加 热 . 聚 集 等 ) 也 能 模拟 激活 抗体 的 作用 (MacLennan 等 , 1973) 。 这 提示 抗体 和 抗原 结 合 时 ， 分 子 的 构象 要 发 生 某 种 变化 (物理 处 理 可 能 模拟 这 些 变化 ) 才能 起 这 种 作用 。 这 种 分 子 构象 的 变化 可 能 涉及 到 各 功能 区 之 间 的 协同 作用 。 (三 ) 各 功能 区 的 协同 作用 抗体 的 生物 学 功能 要 求 同 一 个 分 子 能 专 一 地 识别 无 数 的 抗原 ， 同 时 还 保持 各 类 抗体 所 特有 的 几 种 效应 器 功能 。 免 疫 球 蛋 白 分 子 的 结构 安排 ,各 功能 区 的 分 工 , 可 以 理想 地 适 应 于 这 种 功能 上 的 要 求 。 然 而 , 要 实现 这 些 功 能 , 抗体 分 子 的 不 同 功能 区 不 但 需要 有 “分 工 ， 而 且 还 需要 “协作 ”。 如 上 所 述 , 天 然 抗 体 分 子 单独 不 能 固定 补体 , 只 有 在 和 抗原 结合 后 ,或 非 专 一 地 聚集 后 (加 热 或 特别 化 学 处 理 ) 才能 固定 补体 。 细 胞 亲 合 抗体 也 只 有 通 过 和 抗原 的 相互 作用 ,才能 引起 靶 细 胞 释放 组 织 胺 等 物质 ， 而 导致 一 系列 速 发 型 过 敏 反应 。 G. Edelman (1971) 首先 用 各 功能 区 的 协同 作用 来 解释 这 些 现象 。 他 认为 抗体 分 子 象 一 个 开关 , 当 和 抗原 结合 时 , 触发 分 子 构象 的 变化 而 开动 其 效应 器 功能 ,如同 酶 分 子 和 底 物 结合 时 ,通过 变 构 作 用 而 开动 其 功能 一 样 。 他 还 进一步 设想 抗体 分 子 的 易 变 区 (V) 和 抗原 结合 后 , 可 能 引起 分 子 结构 的 重 排 , 通过 贸 链 区 的 转动 而 使 原来 被 掩盖 的 补体 结合 他 点 (Ca) 和 其 他 效应 器 部 位 暴露 出 来 , 导致 冯 细 胞 的 一 系列 反应 (图 7-19) 。 至 于 抗体 分 子 的 变 构 作用 的 细节 ,不 同 作 者 还 持 有 不 同 的 看 法 ,有待 于 进一步 立体 结构 和 溶液 内 构象 变 化 的 深信 人 研究 来 解决 。 不 过 ,无 论 如何 分 子 一 个 部 位 的 反应 能 影响 另 一 个 部 位 的 功能 活 动 的 看 法 , 则 是 一 致 的 。 这 表明 对 抗体 分 子 结构 和 功能 的 了 解 ,不 仅 需要 弄 清 楚 免 疫 球 蛋 *。207… 补体 结合 操 图 7-19 功能 区 假说 CDomain hypothesis), Vr，Va 一 易 变 同 源 区 组 成 的 功能 区 Cr, Ch» Ch, Ch= 不 变 同 源 区 组 成 的 功能 区 。 每 一 个 功能 区 具有 类 似 的 空间 结构 ， 分 担 一 定 的 免疫 学 功能 。 V 功 能 区 担任 识别 抗原 功能 ，C 功能 区 担任 发 效 器 功能 。 〈A) 游离 [eg 分 子 中 ， 功 能 区 假定 的 排列 。〈B)》 和 抗原 结合 后 的 重 排列 ， 补 体 结合 点 外 露 。( 据 Edelman, 1971), Gal Gal 8E1 一 6 B1l>6 GleNAc GleNAc GlcNAc GleNAc Bi-2| jel~: B1->2| jel~: man man man man W he Ni if al—3, f a1>6 al>3\, J a1>6 N\N 4 NEL i man man al>3,4 GleNAc Fuc al—2 pune \gi>4 al->3,4| GlcNAc GleNAc>GlcNAc ti Sih Gal B1>6 GlcNAc GleNAc p1>2| \ei>2 at WV Se man man A man Fuc GlcNAc Y GleNAc> GlcNAc 图 7-20 人 IgG fia RA RE ee FE PA A I EY a HS a A 所 示 ; 两 个 如 了 B 所 未 ;第 5 个 如 C 所 示 ( 据 Kornfeld 等 ,1971)。 *。 208 « OE A ae ee a a rel, | Nace ee ed <> ee 白 的 一 级 结构 , 而 且 尤 其 需要 用 物理 学 方法 研究 分 子 的 立体 结构 和 溶液 内 构象 , 以 及 分 子 各 部 分 相互 影响 时 构象 的 变化 。 (四 ) 糖 多 肽 的 构造 和 效应 器 功能 IgG 是 一 个 糖 蛋白 ,每 一 个 分 子 可 能 含有 一 个 或 一 个 以 上 的 低 聚 糖 基 团 , 其 化 学 构造 和 功能 还 不 太 清 楚 。 人 类 IgG 含有 一 个 低 聚 糖 基 团 ,位 于 分 子 的 Fe 片段 上 。 某 些 IgG HAs 白质 还 发 现 另 一 个 低 聚 糖 基 团 , 位 于 Fab FEE. Kornfeld 等 (1971) 研究 了 七 种 IgG 髓 细胞 瘤 蛋 白质 的 糖 多 肽 ,发 现存 在 几 种 类 型 的 构造 (图 7-20) 。 甚 至 同一 个 均一 的 通 细 胞 瘤 蛋 白质 的 低 聚 糖分 枝 的 末端 基 团 , 也 可 能 有 微小 的 差异 。 这 种 细微 的 不 均一 性 可 能 是 在 低 聚 糖 合 成 过 程 的 晚期 发 生 的 ,或 已 经 合成 好 的 糖 基 团 在 血 流 中 再 被 部 分 酶 解 的 BR. 此 外 , 还 观察 到 某 些 病人 糖 多 肽 构造 的 核心 部 分 也 有 差异 ， 原 因 和 意义 都 还 不 请 3B 0 人 类 11 重 链 的 一 个 低 聚 糖 基 团 是 和 297 位 置 的 门 冬 酰胺 连接 的 ,即位 于 C? 功能 区 的 中 部 。 家 免 Y 链 在 相应 的 位 置 同 样 也 有 一 个 低 聚 糖 基 团 存在 〈Hill 等 , 1966) 。 根 据 所 在 位 置 推 测 , 其 功能 可 能 和 结合 补体 有 关系 。 IgG 的 低 聚 糖 基 团 和 其 他 效应 器 功 能 , 特别 是 细胞 亲 合 功能 有 无 关系 , 是 值得 注意 的 问题 。 六 、LgG 分 子 的 形态 和 立体 结构 ”在 民 射 线 晶 体 分 析 和 电子 显微镜 技术 达到 目前 水 平 以 前 , 对 抗体 分 子 形状 的 早期 研 究 是 用 流体 动力 学 方法 ( 超 离 心 沉降 .扩散 和 粘度 测定 ) 进行 的 。 (—) 液体 动力 学 研究 早期 研究 提示 IgG 分 子 是 不 对 称 的 〈 轴 比 三 6:1)， 或 者 处 于 高 度 水 合 状态 (SBS Dorrington 和 Tanford, 1970) 。IgG 分 子 的 不 对 称 形 状 , 得 到 初期 的 电子 显微镜 观察 的 支持 。 一 段 时 期 内 ,曾经 认为 IgG 是 坚硬 的 棒 形 分 子 (Edelman 和 Galley, 1964) (图 7-21b) 。 然而 ,Noelken 等 (1965) 对 IgG 分 子 的 高 内 豪 粘 度 和 摩擦 系数 作 了 另外 的 解 释 。 他 们 观察 到 IgG 分 子 的 摩擦 系 数 高 达 1.47， 比 一 个 典型 的 球 蛋白 质 的 值 〈1.1 一 7-21 IgG 分 子 的 分 节 柔 曲 模型 (Noel kern 等 , 1965) (a) 和 硬 棒 状 模 型 (Edelman 和 Galley, 1964) (b) 的 比较 。 粗 短 黑 线 代表 链 间 二 硫 键 ( 据 Dorrington 和 Tanford, 1970), © 2096 1.3) 要 高 ;而 Fab, Fe 片段 却 表现 正常 的 内 豪 粘度 和 摩擦 系数 。 因 而 推 想 这 些 坚实 的 本 perks “Y” SI, ER REX”) 有 相当 的 柔 曲 性 , 并 处 于 高 度 水 合 状态 (图 图 7-22 家 免 抗 -DNP IgG 和 双 价 DNP 半 抗 原 混合 时 形成 的 各 种 IgG 多 聚 体 。 (〈A) 二 聚 体 。(B) 三 聚 体 。(C) BRA, (D) 五 聚 体 。 环形 多 聚 体 的 角 上 可 看 见 突起 (X 800,000)( 据 Valentine, 1967), 7-21a) 。 这 就 可 以 解释 高 的 摩擦 系数 和 连结 区 易于 受 酶 解 。 (=) 电子 显微镜 观察 电子 显微镜 观察 对 抗体 分 子 形状 提供 了 不 少 有 价值 的 知识 。 游 离 的 抗体 不 能 得 到 清 楚 的 图 象 , 提示 分 子 可 能 是 松动 的 , 没有 固定 形状 。 抗 体 和 多 价 抗原 或 半 抗 原 结合 后 就 可 以 得 到 清楚 的 图 象 。 通 常用 双 价 半 抗 原 (Bis- dinitrophenyl (DNP) -octa-methyldia- mine) 和 家 免 高 亲 合 力 的 DNP- 抗 体 结 合 后 ， 经 磷 钨 酸 钠 或 硅 钨 酸 盐 反 染 色 ， 抗 体 分 子 便 在 薄 层 重金 属 盐 的 深 色 背景 上 呈现 出 电子 密 度 低 的 清楚 的 印迹 (Valentine 和 Green, 1967; Green，1969) 。 3 一 5 个 抗体 分 子 经 双 价 半 抗 原 分 子 相连 成 为 多 角形 环 ， 转 角 处 有 突出 物 。 偶 尔 也 可 见 到 “Y” 字 形 的 单 体 或 两 “Y” 相 连 的 双 体 ( 图 7-22) 。 如 用 胃 和 蛋白 酶 消化 后 , 只 剩 下 多 角形 环 , 而 没有 突出 的 棒 (图 7-23b) 。 因此 , 突出 的 棒 应 为 Fe， 而 多 角形 环 应 为 几 个 “Y” 字形 的 IgG FHA Fab’), Amit i RHE iM Ko 切断 处 oONALyN 人 一 一 所 {_)-NO; NO, Ne ——= —«25k 一 c 图 7-23 ”电子 显微镜 观察 胃 和 蛋白酶 对 半 抗 原 抗体 复合 物 的 影响 。 (a) LBA. Cb) we 理 切 去 Fo 后 , 角 上 的 棒状 物 消 失 。(c) 据 抗 体 - 半 抗 原 复合 物 电 子 显微镜 图 形 重 绘 的 示意 图 。 三 个 双 价 半 抗 原 分子 把 3 个 IgG 分 子 连 接 成 三 角形 ( 据 Porter, 1967), ¢ 210° F(ab')， 两 臂 间 的 夹 角 可 能 变动 在 110" 一 180" 之 间 。 这 表明 Fab’ BL“ ReR” A Hid 可 作 相 当 大 幅度 的 转动 。 多 角形 环 每 边 的 长 度 为 120A, 相当 于 两 倍 Fab' SORA. 因 此 Fab’ BK4H60A, Fe 长 度 约 为 50 人 (图 7-23c) 。 (=) 和 射线 晶体 分 析 蛋白 质 分 子 的 全 部 立体 结构 ,包括 多 肽 链 的 空间 排 布 和 链 上 的 氨基 酸 排 列 , 目前 只 能 AX 射线 晶体 分 析 法 得 到 。 然 而 , 这 种 在 血红 蛋白 ,溶菌 酶 等 结晶 蛋白 质 上 行 之 有 效 的 方法 ,在 抗体 研究 上 却 遇 到 很 大 的 困难 。 首 先是 由 于 抗体 分 子 的 高 度 不 均一 性 ,不 能 形成 结晶 。 即 使 改 用 均一 的 通 细胞 瘤 蛋 白质 ,也 很 难得 到 稳定 的 结晶 以 供 高 分 辩 率 的 X 射线 衍射 分 析 。 1. IgG, (Dob) HEA SHEN WHERE 让 到 1971 年 才 有 人 报告 一 种 人 eG, BAKVHEAR (Dob) 的 低 分 辩 率 (6A) 的 立体 结构 模型 ， 以 及 对 同一 晶体 的 电子 显 微 镜 观 察 结 果 ( 图 7-24; 图 7-25) 。 这 种 蛋白 质 属 于 冷 性 结晶 球 蛋 白 (Cryoglobulin) , 在 4sC 时 能 自行 从 血清 或 血浆 中 结晶 出 来 。 纯 化 和 重 结晶 后 ,得 到 的 晶体 形态 为 单 斜 楼 晶 ， 平均 大 小 为 0.5 Ke EAM KH RH 感 , 易 被 破坏 , 因此 不 能 得 到 高 分 辩 率 的 衍射 图 形 。 根据 衍射 图 形 重组 的 分 子 立体 模 型 (FEXMD) 量 “T” 字 形 (图 7-24) 。“T” 形 分 子 有 三 个 球状 区 , 两 要 相当 于 Fab, 另 一 为 Fe, Fab 和 Fe 之 间 由 相当 于 “ 匀 链 区 ”的 IRE HA. QTM CERI Ney rouse RRM OMD. BABAR AF RR. Fab 和 Fe 的 大 小 同 从 其 他 子 的 Fe ARK wat Fab。 标 尺 代表 30A Cz 方面 得 到 的 结果 的 比较 , 列 于 表 7-4。 由 于 SMe heed 分 辩 率 低 只 能 看 出 分 子 大 体 的 轮廓 ,不 能 追踪 多 肽 链 盘 曲 的 走向 ,抗原 结合 位 点 的 精细 结 构 等 最 重要 的 问题 还 不 能 得 到 解决 。 这 方面 的 改进 办 法 ,除了 继续 寻找 新 的 更 稳定 的 锡 疫 球 蛋 白 晶体 之 外 ,还 可 以 先 用 比较 稳定 的 免疫 球 蛋 白 片 段 的 晶体 作 分 析 , 然后 再 拼凑 成 整个 分 子 的 模型 。 表 7-4 Fab 和 Fe 的 大 小 用 不 同方 法 得 到 的 结果 elie mM «= 电子 显微镜 观察 低 角 度 X- 射 线 散 身 Fab 70x50x40A 60x35 A(1) 98 x42x42A(3) , 60 x30A(2) Fe 85X45 x38A 45x40 A(1) 99 X47 x47 A(3) 50x35 A(2) (1) Valentine & Green (1967); (2) Labraw & Davies (1971) (3) Pilz (1970), e211. 2. Fab’ New 的 低 分 辩 率 的 立体 结构 模型 由 于 Fab 和 Fab! ee Sm EH A SEAR eS as 合 位 点 ,所 以 eer Oss See ie es 有 极 大 的 理论 兴趣 。 有 人 报告 4 了 人 免疫 球 蛋 白 Fab’ New 片段 的 分 辩 率 为 6A 的 晶体 构 造 (Poljak 等 ,1972) 。 Fab’ New 是 从 一 种 人 艇 细胞 瘤 蛋 白质 IgG, New(4,Gm(1, +3, -4, -5)) 制备 并 结晶 的 。 从 射线 衍射 图 形 重 组 的 Fab’ 立体 模型 (图 7-20 Bk, RE 著 的 特点 是 存在 大 小 近似 (30 x40x50A) 的 两 个 致密 的 球 形 “ 结 构 亚 基 ”。 两 个 球 相连 而 成 的 Fab' 的 大 小 为 40 x50 x 80A, XM EWR 7-4 的 结果 是 一 致 的 。 从 图 7-26 可 追溯 两 条 清楚 的 链 (或 许 相 当 于 工 链 和 Fd! 链 ) 从 一 个 球 延 伸 人 第 二 个 球 。 它们 似乎 从 Fab’ 一 端的 V 结构 亚 基 开始 , 先 经 过 短 而 直 的 一 段 ， 然 后 复杂 地 = = = = . 盘 曲 成 球形 (包括 一 个 环 ) ， 再 图 7-25 IgG, (Dob) 晶体 薄 切 片 的 电子 显微镜 照片 。 (a) 原 照片 By ye 经 “光学 平均 ”技术 处 理 后 的 图 象 。 (b) 图 为 (a) 再 经 过 第 二 次 光学 平 从 球 中 延伸 出 来 ， 经 一 段 直线 均 技术 处 理 后 得 到 的 图 象 ( 据 Labraw 和 Davies, 1971), 再 进入 第 二 个 球 (C 结构 亚 基 ) 。 由 上 述 推测 第 一 个 球状 结构 亚 基 V = (Vi+ VH)， 第 二 个 球状 结构 亚 基 C= (CL+Ch). EV 结构 亚 基 开始 处 , 两 条 链 共同 形成 一 个 空 穴 ， 其 大 小 相当 于 抗原 结合 位 点 的 大 小 。 如 前 述 ， 了 Edelman 的 功能 区 假说 主张 L 7H 链 的 每 一 同 源 区 〈 约 110 氨基 酸 残 基 ) 靠 一 个 链 内 二 硫 键 维系 , 折 倒 成 一 个 致密 的 三 级 结构 (功能 区 ) , 相 邻 的 功能 区 由 较 短 而 不 折 县 的 一 段 肽 链 相连 结 。 上 述 Fab’ New 立体 模型 和 这 一 假说 是 很 符合 的 。 表 7-5 各 结构 亚 基 组 成 结 构 亚 基 重 链 和 轻 链 的 同 源 区 as R V Vi “a Fab’ 或 Fab Ci Cy, Cy C, Ci Fc Cs 《C 直 7)2 -一 图 7-26 Fab’ New 6A 分 辩 率 模型 的 限 片 。 模 型 的 深 色 和 浅 色 都 分 代表 两 条 连续 的 肘 链 。 V，C 示 两 个 球形 亚 基 。 照片 右 侧 的 箭头 指 V 亚 基 内 的 空 穴 ， 相当 于 结合 位 点 。 (a) 模型 < 顶 面 ? 观 。 虚 线 指示 v 和 C 亚 基 之 间 相连 部 分 。 (b) 模型 底面 ? 观 。 (c) 村 型 侧面 ? 观 。 两 个 结构 亚 基 清 楚 可 见 。 (d) 模型 另 一 侧 ( 据 Poljak 等 ,1972)。 总 之 ,根据 这 一 假说 ，Fab' New 立体 模型 的 特点 是 存在 两 个 球状 结构 亚 基 (VY，C)， 而 每 一 个 结构 亚 基 又 是 由 两 个 功能 区 构成 的 。 从 以 上 结果 推 想 ，IgG 分 子 的 全 部 立体 结 构 的 轮廓 可 用 简 图 表示 (图 7-27) 。 其 中 各 结构 亚 基 组 成 见 表 7-5。 3. Fab'New 的 高 分 辩 率 立体 结构 模型 后 来 ，Poljak 等 (1973) 发 表 了 Fab’ New (IgG,) 的 2.8A 分 辩 率 的 立体 结构 。 在 根据 高 分 辩 率 电子 密度 Fourier 图 制作 的 立体 结构 模型 上 (图 7-28) ,除去 分 子 轮廓 和 亚 基 排列 与 6A 分 辩 率 的 结果 相同 外 ， 还 能 进 一 步 追溯 多 肽 链 在 亚 基 内 盘 曲 的 走 向 , 链 上 氮 基 酸 残 基 排 列 顺序 , 以 及 在 许多 情形 下 区 别 其 侧 链 。 如 可 预 料 到 的 ， 分 子 内 部 是 由 密集 排列 的 臣 水 性 侧 链 构成 的 ， 几 个 酷 氨 酸 酚 环 上 的 氧 原 子 和 天 门 冬 氨 酸 侧 链 之 间 形 成 氢 键 。 分 子 内 部 没有 x- 螺 旋 构 象 。 各 功能 区 (Vin Vu C,, 图 7-27 从 Fab' 片 眉 的 构造 和 对 称 , 推测 YG 分 子 的 立体 结构 。 2 这 里 只 表示 出 Fc 和 Fab’ 的 一 种 可 能 的 相对 安排 Cy) 内部， 伸展 的 多 肽 链 镶 着 ( 据 Poljak 等 ,1972)。 和 功能 区 长 轴 平 行 的 方向 往返 转折 , 紧凑 地 排 布 , 形 成 一 个 牢固 的 骨架 (8- 构 象 ),， 多肽 链 之 间 靠 氨 键 维持 稳定 。 这 些 观察 证 实 了 将 在 下 面 讲 到 的 溶液 内 圆 二 色谱 实验 的 结果 (Ghose 和 ,Jirgersons，1971) 。 此 外 , 还 能 确定 链 间 和 链 内 二 硫 键 和 个 别 氨基 酸 在 立 体 结构 上 的 恒定 位 置 。 从 这 些 分 子 结构 细节 的 研究 ,可 得 出 以 下 几 点 重要 的 结论 ; «2136 (1) 功能 区 空间 构象 的 相似 性 相当 于 了 蔬 , 工 链 同 源 区 的 四 个 功能 区 CV. Vu, Cr, Ch) 不 但 外 形 和 大 小 (40x NH,+ 25x25A) 相似 , 内 部 多 肽 链 盘 曲 的 样式 也 很 相似 。 这 110 是 和 这 些 功 能 区 一 级 结构 的 同 源 性 以 及 免疫 球 蛋 白 在 进 化 上 起 源 于 基因 倍增 的 假说 相符 合 的 。 各 同 源 区 一 级 结 构 的 相似 性 决定 其 空间 构象 的 相似 性 。 属 于 易 变 区 的 两 个 功能 区 (Vi 和 Va) 与 属于 不 变 区 的 两 个 功能 区 (CL, Ch) 是 同 源 的 (一 级 结构 按 最 大 同 源 性 原则 排列 是 相似 的 ) ， 因 而 其 立体 构象 是 大 体 上 相似 的 ,但 是 Ve 功能 区 的 一 级 结构 按 最 大 同 源 性 原则 排列 时 ， 还 多 出 一 段 多 余 的 肽 段 ， 在 立体 结构 上 也 就 多 一 段 环形 的 肽 侦 (A 7-29) 。 Vir 功能 区 和 Va 功能 区 比较 ， 缺 少 位 于 多 余 RA BEAD AY 7 个 氨基 酸 (54 一 60 位 置 ) , 因而 多 余 的 环形 肽 Regt ToT, Vi WRACL, Ch 的 相似 程度 ,应 比 Vu 和 CL, Ch 的 相似 程度 高 。 (2) 二 硫 键 的 位 置 Ae ee ee 所 有 免疫 球 蛋白 ， 链 间 二 硫 桥 的 半 胱 氨 酸 在 轻 链 上 型 。 实 线 表 示 不 变 区 功能 区 (cr，ci ”一 般 都 位 于 C 末端 。 至 于 在 重 链 上 则 可 能 有 两 个 不 同 的 Beet Be He OPH TO Be 位 置 。 人 类 71 重 链 (IEG,)， 链 间 二 硫 桥 的 半 胱 氨 酸 残 基 位 置 ) 的 残 基 位 置 。 虚 线 表 示 vt, va “ 基 位 于 214 位 置 处 ,靠近 Fd WC 末端 。 另 一 些 重 链 ， ae rial Ro: 如 人 类 72, 173, 7d HERE GE, RT HE, NEA 72a、 Sh 7r2b 链 以 及 豚鼠 的 720 SE, 相应 的 半 胱 氨 酸 残 基 却 位 于 131 位 置 附近 。 这 种 差别 过 去 很 难 解释 。 在 Fab’ New 立体 模型 上 , 这 三 个 位 置 (一 个 在 工 链 ， 两 个 在 H 链 ) 在 空间 上 都 靠 得 很 近 ( 相 距 约 6A), 这 就 使 得 链 间 二 硫 桥 在 重 链 上 改换 为 另 一 种 连接 位 置 [214 (L)—131 (H)] 时 ,不 致 改变 肽 链 总 的 折 肢 样式 。 又 tn, 人 类 yl 链 (Daw) 的 Va 区 的 不 常见 的 链 内 二 硫 桥 (35 一 101 位 置 )， 以 及 家 免 专 一 的 抗 多 糖 抗体 3315 的 工 链 (s) 的 不 常见 的 二 硫 桥 [80(Vi),171(Cru) 位 置 ], 当 换 成 在 Fab' New 立体 模型 上 的 位 置 时 ， 也 都 处 于 相距 很 近 的 空间 位 置 ( 约 6A 45.58). 总 之 ， Fab! New 立体 模型 提供 了 一 个 适当 的 构造 骨架 ， 可 以 圆满 地 解释 根据 一 级 结构 分 析 得 到 的 各 种 链 间 和 链 内 二 硫 桥 位 置 的 不 常见 的 变化 ， 因 为 这 些 位 置 在 立体 模型 上 都 处 于 彼 此 很 靠近 ( 约 6A)， 易 于 形成 二 硫 桥 的 空间 位 置 。 根据 这 些 观察 以 及 Fab 各 同 源 区 空间 构象 的 相似 性 , 可 以 得 出 一 个 重要 的 假说 :由 于 同 源 区 一 级 结构 的 相似 性 决定 其 空间 构象 的 相似 性 ,各 种 上 或 1 型 轻 链 的 VL. CL 同 源 区 应 具有 一 个 相似 的 总 空间 构象 。 AB, RBH (c，y，w 等 ) 的 _Va、Ca 同 源 区 也 应 具有 相似 的 总 空间 构象 。 不 同类 、 型 的 WH, L 链 的 各 同 源 区 ,各 按 最 大 同 源 性 原则 排列 时 ,缺失 或 多 余 的 肽 人 朋 将 只 造成 空间 构象 细节 上 的 变化 ,而 不 影响 它们 的 总 空间 构象 的 相 似 性 。 正 由 于 各 同 源 区 的 总 空间 构象 在 进化 过 程 中 能 保持 相对 稳定 性 ,整个 抗体 分 子 也 ss 214。 和 4 > 9 Fab’ New 的 记 (Oz 191 要 i ’ . 4 a ae Ba Sere 机 -AT ase a 四 -~ AR 性 二 sa 一 or 也。 ~ 才能 保持 结构 和 功能 的 统一 性 。 (3) 非 等 位 基因 控制 的 专 一 抗原 记号 的 位 置 轻 链 Ci 同 源 区 上 ，Ser 154 和 Lys 191 相当 于 人 类 1 型 轻 链 非 等 位 基因 决定 的 专 一 抗原 记号 Kern” 和 Oz+， 这 两 个 残 基 均 位 于 分 子 的 外 侧 表 面 ,彼此 相距 很 近 , 约 8A (图 7-29 箭头 所 示 ) ,很 可 能 也 就 是 由 于 这 种 外 露 的 空间 位 置 , 它们 才 成 为 优势 抗原 决 定 Ro (4) 高 变异 区 和 抗原 结合 位 点 L, H 链 排列 顺序 的 高 变异 区 位 于 Fab New 分 子 的 N tn, MR Vi. Vu 功能 区 之 恒定 的 构造 骨架 上 , 它们 的 侧 链 完 全 暴露 到 咨 液 中 (图 7-28) 。 位 于 此 区 域 的 抗原 结 合 位 点 ,只 是 一 条 由 重 链 和 轻 链 共同 组 成 的 浅 沟 (长 宽 15x6A, REA), MRER KD Pe ERATOR. 从 整个 F(ab’), a IgG 分 子 的 外 形 和 结构 亚 基 的 排列 看 来 ， Fab’ 的 一 些 区 域 ,从 分 子 外 部 是 难于 接近 的 , 因而 可 能 是 较 弱 的 抗原 决定 簇 ; 而 高 变异 顺 序 区 域 的 侧 链 则 外 露 在 分 子 一 端的 表面 ,例如 轻 链 上 29、51、92、93 位 置 的 氨基 酸 残 基 的 侧 链 , 至 少 象 Kern (gly /Ser) 和 Oz (lys/Arg) 基因 记号 一 样 显 露 在 分 子 表面 , 因 而 可 能 构成 优势 抗原 决定 徐 。 根 据 这 一 结构 模型 , 可 以 设想 高 变异 区 重 链 和 轻 链 排列 顺 序 的 变化 是 个 体型 抗原 专 一 性 的 结构 基础 ,易于 被 抗 个 体型 抗体 识别 。 此 外 , 专 一 半 抗 原 和 结合 位 点 结合 时 , 不 致 被 深 埋 到 这 一 条 浅 沟 内 , 因而 一 般 地 也 就 会 阻碍 抗 个 体型 抗体 对 结合 位 点 的 免疫 优势 基 团 的 识别 。 同 理 , 高 变异 区 重 链 和 轻 链 排列 顺序 的 变化 ,也 同样 是 抗原 结合 位 点 专 一 性 的 构造 基础 。 关于 这 一 问题 , 将 留待 抗原 结合 位 点 的 结构 一 章 再 讨 论 。 (四 ) 溶液 内 构象 的 研究 由 于 抗体 分 子 在 溶液 中 的 构象 可 能 比 晶 体 中 的 更 接近 天 然 状 态 ,因此 溶液 中 分 子 构 象 的 研究 特别 重要 。 虽 然 至 今 这 方面 的 研究 方法 还 不 够 完善 ,不 过 已 经 提供 了 不 少 重 要 的 知识 。 1. 分 子 形状 自从 根据 沪 体 动力 学 研究 提出 IgG 分 子 的 硬 棒 状 模 型 (Edelman 和 Galley, 1964) 和 分 节 柔 曲 模型 (Noelken 等 , 1965) 以 来 (图 7-21) ，IgG 分 子 在 溶液 中 的 天 然 形状 ,有 过 长 期 的 争论 。 利 用 萤 光 偏振 法 进行 的 早期 工作 ,未 能 得 到 肯定 的 结论 。 后 来 ， 改 用 毫 微 秒 (nsec) 范围 内 短 脉 冲 偏振 光 激 发 , 直接 测量 蓝光 发 射 各 向 异性 (Emission anisotropy) 的 时 程 , 始 获得 更 为 明确 的 结果 。 Wahl (1969) 用 DNS-IgG (发 色 团 DNS 和 蛋白质 共 价 结合 ) 进行 研究 , 发 现存 在 两 个 弛 和 驳 时 间 (Relaxation time), 一 个 弛 和 豫 时 间 为 370 毫 微 秒 ,是 由 于 整个 分 子 的 转动 ， 而 另 一 个 短 得 多 的 弛 豫 时 间 为 23 BH 秒 , 是 由 于 分 子 内 的 勃 郎 运 动 ,包括 分 子 的 一 个 球状 区 的 转动 (不 过 此 弛 豫 时 间 太 短 , 不 足 以 代表 象 Fab 那样 大 小 的 球状 区 ) 。 据 此 作者 认为 天 然 IgG 分 子 应 有 一 定 的 柔 曲 性 。 ©2156 另 一 些 作 者 采用 同样 的 方法 ,不 过 DNS 发 色 团 是 作为 一 个 半 抗 原 和 抗 DNS 抗体 (IgG) 结合 , 而 不 是 共 价 结合 。 他 们 同样 观测 到 两 个 弛 豫 时 间 : 一 个 为 500 Bike, A] Wahl 观 测 到 的 长 弛 驳 时 间 相 近 ; 另 一 个 为 100 毫 微 秒 ,相当 于 Wahl 的 短 弛 移 时 间 的 四 倍 。 但 是 , 当 DNS 半 抗 原 和 抗体 的 Fab 片段 结合 时 ,就 只 观测 到 一 个 弛 豫 时 间 ,，100 Se. 据 计 算 这 一 数值 正好 相当 于 Fab 大 小 的 一 个 硬 椭圆 球体 转动 时 所 测 到 的 数值 。 这 些 事 实 , 以 及 用 了 (ab' )。 得 到 的 结果 , 都 支持 天 然 IgG 分 子 的 分 节 柔 曲 模型 ,而 不 支持 硬 棱 状 模型 (Yguerabide 等 , 1970). 此 外 ,家 免 抗 DNP- 抗 体 〈IgG) 分 子 在 电场 中 作 定 向 排列 , 荷 电 半 抗 原 和 抗体 的 抗原 结合 位 点 结合 时 , 引起 分 子 内 电荷 分 布 变化 可 以 从 瞬时 电 双 折射 (Transient electric birefringence) 测量 反映 出 来 。 根 据 这 种 测量 结果 可 以 推测 结合 位 点 在 抗体 分 子 上 的 位 置 ， 并 提示 IgG 分 子 在 溶液 内 可 能 呈 “Y” 字 形 (Ca- thou 和 O'Konski, 1970), 总 之 ,所 有 这 些 实验 都 支持 IgG 在 溶液 中 的 分 子 形状 符 合 由 三 个 结实 的 球形 区 组 成 的 分 节 柔 曲 模型 。 至 于 连接 区 的 性 质 , 和 两 臂 间 夹 角 的 大 小 ， 则 还 有 争论 。 Pilz 等 (1970) 根据 低 角 度 X 射线 散射 的 研究 , 认为 溶液 中 游离 的 IgG 分 子 最 可 能 的 形状 是 “T?” 字 形 。 这 和 上 述 入 射线 晶体 模型 的 形状 是 一 致 的 。 抗体 分 子 只 有 和 抗 BAAR, Fab WEA ARRDKA, 而 改变 成 “Y” 字 形 。 此 外 , 还 发 现 半 抗原 能 诱导 抗体 分 子 的 体积 缩小 ,但 对 Fab 片段 则 无 影响 。 这 也 提示 半 抗 原 和 抗体 相互 作用 时 , 抗 体 分 子 的 构象 可 能 发 生变 化 (Pilz 等 ，1973; 1975) 。 Edelman 根据 这 些 材料 , 主张 抗体 和 抗原 结合 后 ,分 子 变形 , 抗体 分 子 的 两 璧 从“ 张 开 ” 状 态 改变 为 “合拢 ?状态 ， 于 是 位 于 Ch WHER NAMA OL ae 出 来 ， 导 致 一 系列 的 效应 器 反应 的 激 活 。 然 而 ，R2 R. Porter SS 注意 到 ,IgG 分 子 的 二 聚 物 和 三 聚 物 与 半 抗 原 连接 后 ,不 能 固定 补体 , 必须 是 更 高 的 聚集 物 才 有 效 。 电 子 显微镜 观察 发 现 有 效 的 和 无 效 的 聚集 物 之 间 ， 唯 一 可 见 的 区 别 是 Fab py ela 的 夹 角 的 大 小 。 无 效 的 聚集 物 中 抗体 分 子 的 夹 角 60"， 有 效 的 则 为 90 一 图 7-30 ， 抗 DNS- 抗 草 光 素 (ANT-FI) 杂种 分 子 - 半 抗 原 复合 “， 。 物 的 简 图 。(R)》 半 抗 原 结合 位 点 之 间 的 距离 ; (c) Fab 之 间 的 “180"。 因此 ， 推 想 原来 呈 Y ”字形 的 夹 朋 “〈Ae); 羧 次 甲 基 基 团 ( 据 Werner 等 ,1972) 。 IgG 分 子 在 和 抗原 结合 后 ， 两 臂 “ 张 开 ”, 引 起 Fe 的 构象 变化 , 因而 激活 固定 补体 的 部 位 (Hyslop 等 , 1970) 。 这 两 个 实验 室 的 看 法 显然 是 矛盾 的 。 Werner 等 (1972) 利用 单个 光量 子 的 能 量 传递 ,测量 抗体 两 结合 位 点 之 间 的 最 小 距 离 的 方法 ,研究 了 家 兔 IgG 分 子 在 溶液 内 的 形状 。 为 此 , 他 们 制备 了 一 个 结合 位 点 的 专 一 性 针对 能 量 供 体 (DNS) ， 另 一 结合 位 点 则 针对 能 量 受 体 ( 曹 光 素 ，FI) 的 “杂种 ”分 子 抗体 (图 7-30) 。 在 这 种 “杂种 ?抗体 分 子 上 , 并 不 能 观测 到 与 抗体 结合 的 这 两 个 基 团 之 间 有 能 量 传递 。 已 知 在 这 两 基 团 之 间 能 量 传递 的 最 大 有 效 距 离 不 能 超过 82A 。 由 此 推测 ， 溶液 内 IgG 分 子 两 结合 位 点 之 间 的 平均 距离 , 至 少 应 达到 92—100A. 假定 Fab 长 度 为 « 216 7 ee ee ee ee 70A, WU Fab 臂 间 相应 的 最 小 夹 角 (a) 就 应 为 80 一 95"， 而 不 应 小 于 80" 。 也 就 是 说 ， IgG 分 子 在 溶液 内 的 形状 比较 接近 “T” 字 形 , 而 不 是 “Y” 字 形 。 这 提示 电子 显微镜 下 ， 观察 到 的 抗原 抗体 复合 物 的 形状 ,或 许 不 能 能 代表 抗体 未 和 抗原 结合 时 的 天 然 构象 .电子 显微镜 中 所 观察 到 的 形状 ,很 可 能 是 由 于 在 标本 制作 过 程 中 脱水 而 造成 的 。 总 之 , 尽管 对 溶液 中 天 然 抗 体 分 子 的 形状 以 及 在 和 抗原 结合 后 分 子 形状 变化 的 细节 还 存在 不 同 的 看 法 ,分 子 一 个 部 位 的 反应 能 影响 另 一 个 部 位 的 反应 的 现象 ,无 论 如 何 是 十 分 重要 的 ， 需 要 进一步 深入 探讨 的 。 顺便 提 及 ， 动 力学 分 析 对 这 一 问题 也 可 以 提供 有 价值 的 材料 。 对 IgA (MOPC 460) 均一 抗体 在 和 三 种 不 同 的 半 抗 原 结合 达到 平衡 时 所 作 的 动力 学 分 析 ， 发 现存 在 两 个 明显 不 同 的 弛 豫 时 间 。 这 提示 同一 种 抗体 分 子 , 当 以 不 同 的 结合 常数 和 半 抗原 结合 时 , 可 能 处 于 两 个 可 互相 转化 的 构象 ;抗体 的 结合 位 点 和 半 抗 原 结合 时 可 能 触发 分 子 构象 的 转变 (Lancet 和 Pechet，1976) 。 此 外 ,单价 抗原 和 半 抗 原 对 IgM 抗体 的 亲 合 力也 有 不 同 。 单 价 抗原 的 亲 合 常数 (Ka) 比较 小 , 这 提示 一 部 分 结合 能 量 可 能 被 用 来 激活 Fe 的 补体 结合 位 点 (Brown 和 Kosland，1975) 。 2. 功能 区 内 的 构象 目前 溶液 内 蛋白 质 分 子 构象 的 主要 研究 方法 有 旋光 色散 (Optical rotatory dis- persion, ORD) 和 圆 二 色谱 (Circular dichroism, CD) 等 。 根 据 ORD 和 CD 5 谱 特 性 可 以 判断 天 然 蛋 白质 分 子 内 ， wx- 螺旋 构象 和 8- 构象 的 含量 。 对 IgG 分 子 及 其 片 Ee, a ORD 和 CD 法 研究 的 主要 结果 是 分 子 内 不 存在 任何 w- 螺 旋 构造 。 CD 光谱 的 另 一 个 特征 是 217mw 的 圆 二 色谱 有 最 小 值 , 提示 分 子 内 部 可 能 存在 靠 氨 键 维系 的 平行 排 FAIS ik BE, BN 6- 构 象 (图 7-31) (Cathou 等 , 1970; 1974) 。 如 前 213 页 提 过 的 ， 用 高 HER X 射线 晶体 分 析 得 到 的 Fab’ New (IgG,) 的 立体 结构 模型 也 证 实 了 这 些 结果 。 对 人 IgG HARE A RRA eH Ret RI (ORD) 的 分 析 发 现 ，Fab i. bi & 24 MN» 0 20} - 本 ee te 40 小 i aes . . 0 a 8 S 一 4 10 x Es) = aioe ps POUEE ®—12 > ok | | £14 一 20 - 16 Stok i er 240 2 200 220 240 260. 280 300 70,260, 270,289 ,290 波长 毫 微 米 ) nahi sate 图 7-31 A IgG 骼 细胞 瘤 蛋白 之 圆 二 色谱 。 图 7-32 人 IgG 艇 细胞 瘤 蛋 白质 及 其 酶 解 片 192, 217 和 240 毫 微米 处 有 负 谱 带 ; 202 和 Be Fab 和 Fe 之 旋光 色散 谱 。IgG 光谱 之 225 232 毫 微米 , 以 及 260 一 300 毫 微米 区 域 有 正 谱 和 240 2 TK Cotton 效应 最 小 值 是 由 于 Fab， 带 ( 据 Cathou 等 ,1968)。 而 230 一 232 毫 微米 最 小 值 是 由 于 Fc( 据 Dorr. ington 和 Tanford，1970 )。 eV 二 和 Fe 两 片段 的 光谱 之 和 等 于 整个 分 子 的 光谱 。 这 提示 各 片段 的 构象 有 相当 的 独立 性 ， 在 酶 解 过 程 中 大 体 上 没有 变化 (Dorrington 和 Tanford, 1968) (图 7-32) 。 BAX 色谱 法 ,对 型 轻 链 的 研究 也 同样 发 现 分 离 的 易 变 区 (V.) MABE (Ce。 的 CD 光 谱 之 和 等 于 整个 轻 链 分 子 的 CD 光谱 (Ghose 和 Jirgensons, 1971) 。 这 些 事实 说 明 ， 天 然 状 态 下 IgG 分 子 内 部 各 片 眉 和 功能 区 能 保持 相当 独立 和 稳定 的 构象 。 然 而 ,最 近 用 圆 二 色谱 对 Fe 及 其 分 离 的 功能 区 (Ci, Ce) 间 的 构象 关系 作 进一步 分 析 的 结果 ， 发 现 Fe 之 光谱 并 不 完全 等 于 组 成 它 的 分 离 的 功能 区 的 光谱 之 和 。 这 提示 Fe 内 也 可 能 存在 一 定 程度 的 功能 区 之 间 的 相互 作用 (了 Ellerson 等 , 1976) 。 总 之 ,这 些 事实 似乎 说 明天 然 状态 下 ,IgG 分 子 内 部 各 功能 区 能 保持 相当 独立 而 稳定 的 构象 , 同时 通过 功能 区 间 的 相互 作用 又 可 能 发 生 一 定 程度 的 改变 。 由 于 功能 区 结构 上 的 这 种 稳定 性 和 可 变性 ， 整 个 抗体 分 子 才 能 在 保持 各 功能 区 的 结构 完整 性 的 条 件 下 , 又 能 对 结合 抗原 作出 种 种 效应 器 反应 。 (五 ) 抗体 分 子 的 “ 变 构 作 用 "和 效应 器 功能 的 激活 .抗体 分 子 只 有 和 抗原 结合 后 ,固定 补体 的 效应 器 功能 才 被 激活 。 关于 抗体 Fec HR 应 器 功能 激活 的 机 制 ， 目 前 主要 存在 两 种 不 同 的 假说 ， 1) “变形 ”机制 (“Distortion” mechanism), 抗原 和 抗体 的 结合 位 点 结合 时 ,5 起 Fab 和 Fe 的 相对 移动 和 两 者 之 间 夹 角 的 改变 。 这 种 分 子 形状 的 变化 ,使 Ch 功能 区 暴露 出 来 并 导致 结合 补体 功能 的 激 活 。 这 在 前 一 节 已 讨论 过 ,不 再 费 述 。2)“ 变 构 ? 机 制 (“Allosteric”mechanism) 。 抗 原 和 位 于 Fab 的 抗原 结合 位 点 结合 时 ,引起 构象 变化 并 传递 到 Rec， 和 触发 效应 器 功能 的 激活 。 前 一 节 中 已 提 到 过 的 ,抗原 抗体 反应 的 动力 学 分 析 , 以 及 利用 小 角度 X 射线 散射 法 测量 抗体 体积 的 变化 等 结果 , 均 支 持 这 一 假说 。 抗原 和 抗体 相互 作用 中 , 抗体 的 构象 变化 与 其 效应 器 功能 激活 的 关系 是 抗体 结 构 和 功能 的 研究 中 的 一 个 基本 问题 。 对 于 这 一 重要 问题 , 从 七 十 年 代 初 期 以 来 , 虽 有 人 试图 用 测量 沉降 速度 的 微细 变化 (Werner 和 Schumaker, 1970) 、 圆 二 色谱 (Cathou 等 ， 1970), BAR (Ashman 等 , 1971) 以 及 对 酶 解 的 易 感 性 变化 等 方法 来 研究 抗原 抗体 反应 过 程 中 抗体 分 子 溶 液 构 象 的 变化 ,但 是 均 未 得 到 明确 的 结果 。 直 到 最 近 几 年 ,由 于 圆 偏振 激发 光谱 的 应 用 和 免疫 球 蛋 白 X 射线 晶体 分 析 方 面 的 新 发 现 , 始 取得 重要 的 进展 。 1. 圆 偏振 激发 光谱 (CPL) 最 近 有 人 利用 圆 偏振 激发 光谱 (Circular Polarization Luminescence， fa) BR CPL) 来 研究 抗体 和 抗原 结合 时 的 构象 变化 。 一 个 蛋白 质 分 子 内 的 不 对 称 发 色 团 ( 如 色 ARBRE) 之 激发 光波 能 部 分 地 圆 偏振 化 。 这 种 圆 偏振 激发 光谱 (CPL) 能 反映 分 子 的 不 对 称 性 , 因而 可 作为 分 析 蛋 白质 构 象 变化 的 灵敏 工具 。 免 疫 球 蛋白 的 各 功能 区 , 在 相对 应 的 空间 位 置 正 好 都 有 2 一 3 个 色 氮 酸 残 基 存 在 ,特别 适合 于 CPL 光谱 分 析 ( 图 7-33) 。 根据 对 几 种 抗体 ( 抗 RNase、 抗 磷酸 胆 碱 抗体 等 ) 和 抗原 结合 时 CPL 光谱 分 析 的 结果 ， 发 现 抗体 的 Fab 和 抗原 结合 时 ，Eab 和 Rec 内 色 氮 酸 残 基 的 不 对 称 性 都 发 生 改变 (图 7- 34) 。 这 说 明 位 于 抗体 之 Fab 上 的 抗原 结合 位 点 和 抗原 结合 时 引起 该 部 位 发 生 构象 变 化 , 这 种 变化 还 可 能 从 Fab 传递 到 Fe (Givol 等 , 1974) 。 "218。 SEE 人 二 酶 “ 环 肽 抗体 和 这 一 单价 抗原 决定 簇 或 双 价 抗原 利用 这 一 方法 作 进 一 步 研究 还 发 现 ， 抗 原 和 ab 相互 作用 时 ,也 引起 CPL 光谱 变 化 。 不 过 , 这 种 变化 和 整个 抗体 分 子 和 抗原 相互 作 用 时 观察 到 的 有 明显 的 不 同 。 这 提示 Fe 和 Fab 之 间 可 能 存在 相互 作用 ,并 导致 Fe 的 构象 变化 。 小 分 子 的 半 抗 原 无 论 和 完整 的 抗体 分 子 或 其 Fab 片段 结合 时 , 都 不 能 引起 CPL 光谱 变化 (Jaton 等 ，1975;Schlessinger 等 , 1975) 。 比 较 抗 盗 菌 [“ 环 肽 ”的 双 体 衍生 物 (bis-loop)]、 多 价 抗原 (poly-valent antigen loop-A—L) 相互 作用 时 的 补体 固定 能 力 和 CPL 光谱 变化 ， 结 果 发 现 抗 ”图 7-33 色 氨 酸 在 免疫 球 蛋 白 各 功能 区 的 分 布 。 体 的 两 个 结合 位 点 必须 都 和 抗原 结合 时 才能 固定 " paeamamweun 的 和 二 个、 小 补体 .只 有 一 个 结合 位 点 和 抗原 决定 簇 结 合 时 , 虽 4 然 也 能 引起 Fe 的 某 些 构象 变化 ， 但 不 足以 激活 其 固定 补体 的 功能 (Pecht 等 ，1977) 。 当 抗体 的 链 间 二 硫 键 还 原 时 ,抗原 诱发 的 Fec 部 分 的 构象 变化 便 消 失 了 。 这 提示 从 Fab 到 Fe 构象 变化 的 传递 需要 “ 贸 链 区 ”二 硫 键 的 存在 (Schlessinger 等 ,1975) 。 然而 ， 也 有 人 对 “ 镶 链 区 ”二 硫 键 的 作用 有 不 同 的 解释 。Isenman 等 (1975) 发 现 人 IgG,， 髓 细胞 瘤 蛋 白 之 “ 镶 链 区 ”三 硫 键 还 原 时 , 便 失 去 结合 C1 的 能 力 。 但 是 ,此 IgG, 的 7-34 CPL 郊 谱 测量 表示 的 抗原 诱发 的 抗体 色 氨 配 ”片段 ,不 论 其 链 间 二 硫 键 是 否 存在 都 能 结 不 对 称 性 的 改变 之 示意 图 ( 据 Givol 等 ,1974)。 & Cle. 更 为 有 趣 的 是 ,已 知 IgG 的 完整 分 子 不 能 结合 Cl。 可 是 ， 它 的 _ Fe 片段 却 能 和 IgG, 的 Fe 片段 一 样 结合 Cl. 根据 这些 事 实 , 该 作者 提出 一 个 新 的 解释 , 认为 链 间 二 硫 桥 对 IgG 完整 分 子 结合 补体 的 重要 性 主要 是 影响 分 子 的 柔 曲 性 , 而 不 是 影响 Cl 结合 位 点 本 身 的 构象 。 也 就 是 说 , 和 抗原 结 Git, Fe 和 Fab 相互 作用 并 引起 它们 相对 的 空间 位 置 的 改变 ,从 而 使 原来 被 阻碍 的 补 体 结合 位 点 暴露 出 来 。 并 且 Fe 和 Fab 间 的 这 种 相互 作用 , 只 有 在 “ 久 链 区 ”的 二 硫 桥 存在 时 才能 实现 。 至 于 IgG,， 由 于 其 " 匀 链 区 ”的 特殊 结构 ,不 能 实现 这 种 改变 。 Ast, 其 Fe 上 虽 有 补体 结合 位 点 存在 ,由 于 空间 障碍 也 不 能 起 作用 。 2. IgG,(Kol.) 的 X 射线 晶体 分 析 正如 同 对 于 抗原 结合 位 点 结构 和 功能 的 研究 一 样 , X 射线 晶体 分 析 对 于 抗体 分 子 Fe 的 结构 和 变 构 作用 提供 的 证 据 同 样 是 最 有 决定 意义 的 。 近 来 ，Huber 实验 室 发 表 了 对 IgG, (Kol.) 低 分 辩 率 (5A) 的 分 子 构造 (Coleman .等 , 1976) 。 从 这 种 低 分 辩 率 的 分 子 模型 上 只 能 分 出 几 个 功能 区 的 空间 排 布 , 而 不 能 分 请 结 构 的 细节 。 然 而 , 抗体 分 子 Feo 区 域 没 有 电子 密度 。 根 据 和 射线 晶体 分 析 的 经 验 , 晶体 的 某 一 部 分 或 侧 链 , 只 有 在 晶 格 中 占有 固定 的 空间 位 置 时 ,才能 显示 其 电子 密度 的 分 布 。 因 此 ,从 上 述 事实 必然 得 出 的 ， 。 219。 Bitte, Fe 在 晶 格 中 没有 固定 的 位 置 , 相 对 于 固定 Fab 区 至 少 有 两 种 可 能 的 空间 排列 。 或 者 形象 地 说 ,抗体 分 子 的 尾巴 一 一 Fec 2°83”. 根据 这 一 观察 以 及 其 他 事实 (Huber 等 , 1976) ， 作 者 们 假定 抗体 分 子 在 电子 SE 消失 的 部 位 , 即 紧 靠 重 链 间 二 硫 桥 C 端的 位 置 存在 一 个 新 的 “ 贸 链 区 “ 换 名 话说 ，Re 在 紧 靠 Ch 功能 区 前 的 一 段 肽 链 有 柔 曲 性 ) 。 此 外 ， 在 抗体 Fab BA V、C 功能 区 的 转 折 处 也 存在 一 个 新 的 “ 贸 链 区 ”。 由 于 存在 这 两 个 新 的 “ 匀 链 区 ”, 抗体 分 子 就 成 为 一 个 能 象 肘 臂 那样 曲 伸 自 如 的 变 构 蛋 白 。 当 抗体 的 抗原 结合 位 点 和 抗原 结合 时 ， 分 子 就 可 能 象 Nee Hh, fee Fab 和 Fe 之 间 , 以 及 Ch 和 Ch 之 间 贴 近 。 由 于 这 些 关 节 区 相 继 扣 紧 ， 原 来 柔 曲 的 分 子 就 变 硬 ， 变 成 更 密实 的 构象 ,结果 便 能 将 变 构 效应 从 一 个 功能 区 传递 到 另 一 个 功能 区 , 引起 Fo 构象 变化 ,激活 结合 补体 的 功能 。 对 抗体 分 子 内 部 ， 功 能 区 之 间 的 相对 运动 作 的 理论 分 析 也 支持 这 一 假说 (MacCammon 和 Karplus, 1977) 。 不 过 ,对 于 这 一 假说 的 最 后 验证 还 有 待 于 对 IgG,( Kol.) 抗体 半 抗 原 复 合 物 的 进一步 研究 。 简短 的 结论 1， 关 椎 动物 的 几 类 抗体 (免疫 球 蛋白 ) 中 ，I8gG 是 研究 得 最 清楚 的 , 可 作为 各 类 抗体 结构 的 代表 。 一 个 IgG 分 子 (分 子 量 约 为 180,000) 具有 四 条 多 肽 链 的 基本 构造 : 两 条 相同 的 轻 链 (分 子 量 =20,000 一 25,000) 和 两 条 相同 的 重 链 (分 子 量 约 为 55,000) 被 二 硫 键 和 其 他 非 共 价 键 连接 起 来 。 蛋 白 酶 能 够 在 分 子 的 “ 铵 链 区 ”把 IgG 分 子 切 成 几 个 主要 的 片 Re: “SUR a” 片段 (Fab 或 Fab )， 结 晶片 段 ”(Fc) 。 Fab 或 Fab ”是 整 条 轻 链 和 重 链 的 N 端 半 条 ( 即 Fd 或 Fd’) 构成 的 。 Fab 或 ab 含有 抗原 结合 位 点 。 Fe 含有 固定 补体 的 部 位 等 效应 器 。 2. 抗体 是 多 种 多 样 的 免疫 球 蛋 白 的 混合 物 , 很 难 作 结 构 分 析 。 Ak. 免疫 球 蛋 白 一 级 结构 分 析 是 用 成 分 均一 、 得 量 大 的 通 细 胞 瘤 蛋白 质 作 材料 的 。 目前 已 经 测定 了 一 种 人 IgG, (Eu) 的 全 部 一 级 结构 和 二 硫 键 的 位 置 , 可 作为 IgG SMIRK. MAS A he 细胞 瘤 蛋 白质 氨基 酸 排列 顺序 相 比 较 , 发现 重 链 和 轻 链 都 可 以 分 成 易 变 区 《〈VY) 和 不 变 区 (C); 重 链 的 易 变 区 (Va) 和 轻 链 的 易 变 区 (Vr) 是 同 源 的 ， 并 且 长 度 相似 。 重 链 的 不 变 K(C) 含有 三 个 同 源 区 〈Ci Ch, Ca)， 它 们 又 和 轻 链 的 不 变 区 (Cy) 同 源 ,长度 也 相似 。 易 变 区 和 不 变 区 的 每 一 个 同 源 区 都 各 有 一 个 链 内 二 硫 键 ， 连 接 两 个 半分 子 的 重 链 间 三 硫 键 集中 分 布 在 重 链 的 中 部 狭 扑 部 位 。 所 有 这 些 材料 均 支 持 这 样 的 假说 :在 免疫 球 蛋 自 早 期 进化 过 程 中 ,，V 基因 (决定 抗原 结合 专 一 性 ) 和 C 基因 (决定 抗体 其 他 功能 ) 发 生 异 趋 之 后 ,抗体 分 子 的 进化 可 能 是 通过 基因 倍增 和 基因 移 位 进行 的 。 因 此 , 抗体 的 重 链 和 轻 链 可 能 是 由 V、C 基因 融合 成 的 一 个 VC 基因 来 确定 的 (基因 移 位 假说 ) 。 另 一 方面 分子 内 部 的 同 源 性 和 对 称 性 提示 , 同 源 区 可 能 具有 类 似 的 立体 结构 并 分 担 至 少 一 种 免疫 学 功能 ， (功能 区 假说 ) 。 这 两 种 假说 都 是 和 抗体 分 子 沿 肽 链 的 长 度 的 结构 和 功能 的 分 化 是 一 致 的 。 3， 电 子 显 微 镜 观 察 和 射线 晶体 分 析 测 定 了 IgG 分 子 的 形状 和 大 小 。 晶 体 分 析 和 其 他 物理 学 方法 测定 的 结果 表明 ,游离 的 IgG (Dob) 分 子 可 能 呈 “T” 字形。 Fab 片 眉 的 晶体 分 析 表 明 存 在 两 个 球状 结构 亚 基 , 相当 于 由 重 链 和 轻 链 组 成 的 易 变 区 CV) 和 不 变 区 (C) 。 高 分 辩 率 (2.8A) 立体 结构 模型 上 , 还 可 以 追溯 结构 亚 基 内 肽 链 盘 曲 走向 。 220。 和 和 氨基酸 排 列 顺序 。 各 功能 区 有 相似 的 总 空间 构象 。 其 内 部 不 存在 w- 螺 旋 构 造 , 而 存在 6- 构 造 。 这 对 功能 区 假说 是 一 个 有 力 的 证 明 。 抗 体 和 抗原 结合 能 引起 分 子 的 变形 和 内 部 构象 的 变化 ,激发 Fe 部 分 的 效应 器 功能 (固定 补体 等 ) 。 关 于 这 种 分 子 变 构 作 用 的 细节 目前 还 有 不 同 的 看 法 。 4. 最 后 ,经 过 广泛 的 比较 研究 发 现 , 上 述 的 IgG 分 子 的 四 条 链 的 基本 构造 适用 于 所 有 已 知 的 冰 椎 动物 的 免疫 球 蛋白 。 此 外 ,同一 物种 的 各 类 和 亚 类 的 免疫 球 蛋 白 都 具 有 四 条 链 的 基本 结构 。 它 们 的 区 别 在 于 重 链 结构 和 链 间 二 硫 键 的 数目 和 位 置 的 不 同 。 S$ + A Allan, R. and Isliker, H. 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Biol. 51, 573. wa 223+ 第 八 章 “多 聚 体 免疫 球 蛋白 12M 和 IgA 高 分 子 量 的 抗体 是 四 条 链 的 亚 基 经 共 价 键 连接 而 成 的 多 聚 体 ， 如 哺乳 动物 血清 中 的 IgM 是 五 聚 体 ， 分 记性 Ig A 是 二 聚 体 。 除 重 链 和 轻 链 之 外 ， 它 们 还 含有 “天 链 。 KE 多 聚 体 免疫 球 蛋白 的 结构 和 功能 的 特点 将 在 下 面 分 别 讲述 。 一 、 免 疫 球 蛋 和 白 M(IgM) IgM 是 新 生动 物 、 初 级 免疫 反应 以 及 某 些 自身 免疫 病 ( 如 类 风湿 性 关节 炎 ) 中 的 主要 抗体 。 正常 免疫 过 程 中 ， 各 类 抗体 的 血清 含量 有 一 个 消长 过 程 。IgM 抗体 总 是 最 先 出 现 ， 然 后 逐渐 下 降 ， 而 Ig G 则 随 之 逐渐 升 高 。 当 能 作 直 接 比较 时 ，IgE M 对 颗粒 抗原 的 结合 总 比 其 他 抗体 牢 ， 凝 集 效 价 也 高 许多 。 当 用 红血球 作 抗原 时 ，IgE M 抗 体 的 溶血 效力 比 其 他 抗体 高 许多 倍 。 这 些 免疫 学 功能 上 的 特性 是 和 Ig M 化 学 结构 的 特点 有 关 的 。 (—) IgM 分 子 的 一 般 结 构 IgM 是 大 分 子 量 的 抗体 (分 子 量 为 900,000，19S) 。 人 巨 球 蛋白 质 血 病 〈(Waldqen- strm macroglobulinemia) 的 巨 球 蛋白 质 ， 如 IgM (lay.) 已 证 明 有 抗体 活力 ， 能 和 yard 人 IgG 专 一 地 结合 。 因此 ， 可 作为 sn IgM 分 子 的 代表 。 目 前 研究 得 最 清楚 pons nes: coon | ae ss 的 是 巨 球 蛋 白质 IEM (Oou) 。 当 IgM 四 C: O coo (OW BEDE, SEC HB. — ke 5 s 院 苏 糖 醇 (DTT) 等 SH 试剂 还 原 ， | coo 再 烷 基 化 后 ， 可 解 离 成 五 个 稳定 的 亚 si ” 基 (IgMs)。 这 表明 IgM 分 子 是 二 a meeig eryes 个 五 聚 体 。 每 一 个 亚 基 的 分 子 量 为 © HAN 180,000; 具有 类 似 Ig G 的 四 条 链 的 基本 结构 (图 8-1) 。 如 第 六 章 所 述 ， 图 8-1 人 巨 球 蛋白 IgM (Ou) 单 体 之 肽 链 结 构 (#2 Feinstein 等 ,1971)。 各 类 免疫 球 蛋白 化 学 结构 的 主要 区 别 是 重 链 类 别 不 同 ， 而 轻 链 是 相同 的 。 Ig Ms 亚 基 具 有 两 条 相同 的 重 链 (w) 和 两 条 相同 的 轻 链 (* 或 2)， 由 四 对 链 间 二 硫 键 连接 起 来 。 同 一 IgE M 分 子 (五 聚 体 ) 内 ， 所 有 轻 链 都 属于 同一 型 ， 如 为 “型 则 均 为 在 型 ,如 为 4 型 则 均 为 4 型 ,绝对 没有 既 有 上 链 又 有 1 链 的 混杂 分 子 。 新 近 还 发 现 每 一 个 五 聚 体 IEM 分 子 含 有 一 条 特别 的 “J” 链 。 因 此 ，Ig M 的 分 子 式 按 肽 链 组 成 可 写 为 (pa 心 )s-= 丁 或“〈ma 4)s-J. 各 IgE Ms 亚 基 又 经 过 亚 基 间 二 硫 键 相连 成 环形 (图 8-2) 。 每 一 个 亚 基 有 两 个 抗 、 。224 。 422 i a ek SE ee ee Faby Ps, | [45000 (315000) “7 we Wiz x of? 包 —_ ee ew ae me 图 8-2 A _igM 五 聚 体 构造 简 图 , 示 酶 解 分 析 结 果 ( 据 Dorrington 和 Mihaesco, 1970), 原 结合 位 点 ， 位 于 重 链 和 轻 链 易 变 区 的 末端 。 因 此 ，Ig M 抗体 从 化 学 结构 上 看 是 10 价 的 。 但 实际 上 常常 是 作为 5 价 起 作用 的 。 有 人 认为 这 是 由 于 在 与 抗原 大 分 子 结合 时 受到 空间 限制 的 缘故 (Metzger，1970) 。 IgM 经 胰 和 蛋白酶 处 理 可 得 到 F(ab'),, 片段 ; 进一步 消化 得 到 Fab’ eu 片段 。 每 一 个 亚 基 产生 两 个 Fabz hr. IgM 分 子 共计 产生 10 个 Fab'z Mfr, Fabu 具有 一 个 抗原 eA fLR. F(ab’). 4 RAT Fab' zw 片段 ， 由 二 硫 键 2 〈 及 与 二 硫 键 相 连 的 心 肽 段 ) 相连 而 成 的 。Eab “ 则 失去 上 肽 段 及 二 硫 键 2， 只 剩 下 连接 4 重 链 和 轻 链 的 二 硫 键 1。 此 yh, Ig M 经 木瓜 酶 处 理 , 还 可 得 到 Fesu 片段 。 完 整 的 了 cswu 片段 的 分 子 量 为 320,000， 还 原 时 解 离 成 五 个 非 共 价 结合 的 Fem 单位 ,如 再 经 盐酸 听 处 理 可 进一步 解 离 为 十 个 单 (Dorrington 和 Mihaesco，1970) (图 8-2) 。 (二 ) 电子 显微镜 观察 游离 的 IEM 分 子 经 过 反 染 色 后 作 电 子 显微镜 观察 ， 可 见 到 不 同形 状 的 分 子 ; 大 部 分 呈 五 角 星 形状 (直径 约 为 300 一 310A) ， 中 央 呈 圆 盘 形 ， 伸 出 五 条 臂 ， 臂 的 末端 常 有 分 又 (图 8-3) 。 每 条 臂 的 长 度 约 为 100A， 粗 细 约 为 25 一 30A; 分 叉 长 55 一 70A， 夹 角 约 为 30 一 110" ， 视 其 与 分 子 所 处 的 平面 的 相对 位 置 而 定 。 根 据 IgE M 抗体 和 抗原 结合 情况 的 观察 ， 可 见 到 抗原 结合 位 点 位 于 分 又 臂 的 末端 。 依据 电子 显微镜 观察 和 理化 分 析 ， 绘 制 的 IE M 分 子 形状 见 图 8-4。 分 子 和 亚 基 的 立 © 225° Cb) Ce) 图 8-3 IgM 分 子 的 电子 显微镜 图 形 。 (a) BEI IeM, (6) BA IgM、 (c) 人 Waldenstrém IgM (jg Feinstein 等 ， 1971), (a) (b) 图 8-4 IgM 五 聚 体 〈 根 据 电子 显微镜 观察 和 理化 分 析 资 料 绘制 )。 B 为 抗原 结合 位 点 。 IgEM 分子 内 ， 亚 基 闻 和 亚 基 内 二 硫 键 位 置 用 2,3,4,… 数字 指示 ( 据 Feinstein 等 ,1971)。 ee, Aes 图 8-5 IgM 分 子 及 其 亚 基 的 模型 ( 据 Feinstein 等 ,1971)。 体 模型 见 图 8-5。 图 8-5 简略 地 表示 亚 基 和 分 子 的 建造 过 程 ， 重 链 和 轻 链 由 二 硫 键 1 相 连 而 成 一 个 初级 单 体 ， 两 个 初级 单 体 经 过 2，4 二 硫 键 相 连 成 双 体 (图 8-5a) 55 个 双 体 经 二 硫 键 3 相连 成 环形 的 IgM 分 子 (图 8-5b)，Ig M 分 子 各 亚 基 的 臂 张 开 ， 呈 现 电子 显 向 «226. (a) (b) (c) Cd) gy 图 8-6 IgM 抗体 和 细菌 共 毛 结合 的 电子 显微镜 图 。 (a). ADF RIMM Reh. Cb) RM AIS) FAP RHR Ee IER. «6 Cc) 转变 成 “环形 钩针 ? 的 样子 。 《〈d)“ 环 形 钩针 ?。 (a) ib iii，(b) iv, v, Cc) 下 和 Cd) iii HHH IgM 抗体 (Cd) i. 为 羊 , 其 余 为 放 。 横 线 代表 250 及 (4#Feinstein 等 ,1971)。 1 ee Bina ar oan etn a = 下 Le, Sade ~~ ee RS LOY IR FA AA 1% 6 PY PK ys pee 路 wats IN Arig 8 8-7 fHEFE IgM 抗体 和 抗原 之 间 的 相互 作用 的 简 图 。 根据 图 8-6 照片 绘制 ,说 明 见 正文 ( 据 Feinstein 等 ,1971)。 镜 下 显示 的 形态 (图 8-5c) 。 Feinstein 等 (1971) 观察 了 IgM 抗体 分 子 对 沙门 氏 菌 凌 毛 的 附着 和 凝集 作用 (A 8-6; 8-7), 其 过 程 如 简 图 8-7 所 示 : 游离 的 IgM 分子 (1) 通 过 臂 的 末端 先 和 鞭毛 上 某 一 点 接触 (2); 然后 进一步 扩大 和 蒜 毛 的 接触 面 (3) ， 或 者 和 另 一 根 蒜 毛发 生 交 MER (4,5); 然后 经 过 过 渡 形 态 (6) 转变 成 环形 钩针 的 样子 ， 并 和 另 一 根 鞭 毛 交叉 连接 (7， 8); 同时 ， 臂 和 中 心 圆 盘 间 可 弯曲 成 各 种 角度 。Ig M 抗体 和 疹 伐 灰质 炎 病 毒 颗粒 连接 时 也 可 观察 到 类 似 的 图 象 (Svehag 和 Bloth，1967，1969) 。 曹 光 偏 振 法 测量 IgM OF 及 其 亚 基 的 旋转 弛 豫 时 间 的 结果 ， 也 表明 IE M 分 子 和 IgG 一 样 ， 也 具有 分 节 柔 曲 性 (Zagyansky 等 ，1972) ， 所 以 ， 分 子 的 形状 可 能 呈现 种 种 扭曲 。 BlgG 一 样 ， 节 M 抗体 只 有 和 抗原 结合 以 后 才能 固定 补体 。 如 上 述 ， 从 电子 显 和 。 227 » 上 | 镜 观 察 到 ，Ig M 分 子 和 鞭毛 抗原 交叉 连接 时 ，Fabw 臂 和 中 央 圆 盘 之 间 的 夹 角 常 接近 90。。 然 而 在 游离 的 IgE M 分 子 从 未 观察 到 过 这 种 现象 。 因 此 ， 这 种 现象 可 能 是 由 于 IgM 分 子 和 大 分 子 抗原 的 多 个 决定 簇 结合 后 ， 一 些 在 溶液 中 不 稳定 的 构象 受到 空间 排列 的 限 制 而 稳定 起 来 了 。 观 察 到 的 这 一 现象 支持 前 一 章 所 叙述 的 抗体 分 子 和 抗原 结合 后 引起 的 构象 改变 激发 了 抗体 分 子 的 补体 结合 部 位 而 起 作用 的 假说 。 (=) IgM 分 子 的 一 级 结构 和 不 变 区 的 同 源 性 1. IgM 分 子 的 一 级 结构 Ig M 分 子 的 一 级 结构 测定 工作 目前 已 接近 全 部 完成 。Putnam 等 自 1971 年 报告 了 ， 30 1 107 20 GLP-VAL-THR-L¥U-THR-GLU-SER-GLY-PRO-ALA-LEU-VAL-LYS-PRO-LYS-GLN-PRO-LEU-THR-LEU-THR-CY: $-THR-PHE-SER-CLY-PHE-SER-LEU-SER=- Fj 40 50 60 THR-SER-ARG-HET-ARG-VAL-SER-TRP-ILE~ARG~ARG-PRO-PRO-GLY-LYS~ALA-LEU-GLU-TRP-LEU-ALA~ARG-ILE-ASX~ASX-ASX~ASP-LYS-PHE-TYR- s a 70 £2 90 三 ‘TRP-SER*“THR-SER-LEU-ARG~THR-ARG-LEU-SER-ILE-SER-LYS-ASN-ASP-SER-LYS~ASN-GLN-VAL-VAL~LEU-ILE-MET-ILE~ASN-VAL~ASN-PRO-VAL~ 100 FS 110 F4 , 120 ASP-THR-ALA-THR-TYR-TY R-CYS-ALA-ARG-VAL-VAL~ASN-SER-VAL-MET/ ALA-GLY-TYR-TYR-TY R-TYR-TY eae i ee SS -一 VARIABLE | CONSTANT ae ian CHAIN ‘ 140 THR-VAL-THR-VAL-SER-SER-GLY-SER-ALA-SER-ALA-PRO-THR-LEU-PHE-PRO-LEU-VAL-SER-CYS-GLU-ASN-SER (ASX, PRO, SER, SER, THR) VAL~ALA- 5 - 160 Go 180 VAL-GLY-CYS-LEU~ALA-GLX-ASP-PHE-LEU-PRO-ASP-SER-ILE-THR-PHE-SER-TRP-LYS-TYR (ASX, ASX, SER, ASX , LYS) ILE-SER-SER-THR-ARG-GLY© 190 ， 200 :ES5| 210 了 PHE-PRO-SER-VAL-LEU-ARG-GLY-GLY-LYS-TYR-ALA~ALA-THR (SER, GLX) VAL-LEU-LEU-PRO-SER-LYS~ASP-VAL-MET-GLN-GLY-THR-ASP-GLU-HIS~ 1, > 220 230 ie 20 VAL-CYS-LYS-VAL~GLX-HIS-PRO (ASX, GLY , ASX) LYS-GLN-LYS~ASX-VAL-PRO-LEU-PRO-VAL-ILE-ALA~GLX(LEU, PRO, PRO)LYS-VAL~SER-VAL~PHE= 250 26 270 VAL-PRO-PRO-ARG-ASX-GLY-PHE-PHE-GLY-ASX-PRO-ARG-LYS~-SER-LYS-LEU-ILE-CYS-GLN-ALA-THR-GLY-PHE-SER-PRO-ARG-GLN/ (GLY ,ALA, ASX, 280 290 320 S GLX, VAL) LYS/—— SER-LEU-ARG-GLU-GLY-LYS-GLN-VAL-GLY-SER-GLY-VAL~THR-THR (ASX ,GLX) VAL-GLX-ALA-GLX-ALA-LYS-GLX-SER-GLY-PRO- $ 310 320 FG 3 “amet THR-THR-TY R-LYS-VAL-THR-SER-THR-LEU-THR-ILE-LYS~GLX-SER-ASP-TRP-TYR-LYS=ARG/GLX(ASX , SER) LEU-GLY-GLU-SER-MET-PHE-THR-CYS= S See HEAVY Fd } Fc zo 二 GHAIN ARG-VAL-ASP-HIS-ARG-CGLY-LEU-THR-PHE-CLN-CLX- - ALA-SER-SER-MET-CYS~-VAL-P RO-ASP-GLN-ASP-THR-ALA-ILE-ARG-VAL-PHE-ALA-ILE= n 380 390 PRO-PRO-SER-PHE-ALA-SER-ILE-FHE~LEU-THR-LYS-SER-THR-LYS-LEU-THR-CYS-LEU-VAL-THR-ASX-LEU(THR, THR, TYR) (ASX, SER) / VAL~SER-TPP ~ 400 GP 410 420 LEU(THR, SER,GLY)LYS/CLY-GLX(ALA, GLX, VAL) LYS-THR-HIS-THR- ~ ILE-SER-GLX-SER-HIS-PRO-, ~ALA-THR-PHE-SER-ALA-VAL-GLY-' - s INTER -< | SUBUNIT 430 440 4500 & ALA-SER-ILE~CYS-GLX-ASX-ASX-ASX-TRP-SER-GLY-GLU-ARG-PHE-THR-CYS-THR-VAL-THR-HIS-THR-ASP-LEU-PRO-SER-PRO-LEU-LYS-GLN-THR- 下 460 470 480 » ILE-SER-ARG-PRO-LYS-GLY-VAL~ALA-LEU-H IS-ARG-PRO-ASX-VAL~TYR-LEU-LEU-PRO-PRO-ALA-ARC-GLX-GLX-LEU-ASN-LEU-ARG-GLU-SER-ALA~ 8} 510 490 1 THR-ILE-THR-CYS-LEU-VAL-THR-GLY-PHE-SER-PRO-ALA-ASP-VAL-PHE-VAL-GCLX-TRP (GLX) MET-GLN-ARG-GLY -GLU-PRO-LEU-SER-PRO-GLN-LYS= F9) 520 540 { TYR-VAL-THR-SER-ALA-PRO-MET-PRO-CLU-PRO-CLN-ALA-PRO-CLY-ARG-TYR-PHE-ALA-HI S~SER-ILE-LZU-THR-VAL~SER-GLU-GLU-GLU-TRP-ASH= Ss . Gece. tassios reeliwik cts anwar Sar$~cu0-aLkbeng-rno-asw-aits-Wi-THn-cab Abeoriin-vALCUSP 链 的 排列 顺序 。 比较 几 种 7Y 链 和 玉 链 的 易 变 区 的 排列 顺序 对 于 验证 免疫 球 蛋白 的 进化 和 遗传 机 制 的 假说 是 很 有 意义 的 。 比较 各 类 重 链 易 变 区 的 排列 顺序 时 ， 发 现 可 按 其 排列 顺序 的 相似 性 划分 为 几 个 亚 族 (Subgroups) (图 8 一 10) 。 人 IgM (Oou) 的 人 链 易 变 区 的 排列 顺序 和 三 种 IgG 的 7l 链 (Cor., Daw., 和 He.) 同属 于 Var 亚 族 。 从 表 8-1 可 见 Ouw 链 的 N 端 100 氨基 酸 残 基 和 Cor., Daw., He. 的 7Yl1 链 有 61 一 75% 同 源 。 而 Ouyw 链 与 属于 Vum 亚 族 的 Nie. 71 链 就 只 有 47% Ais 与 属于 Var Eu. 71 链 的 同 源 性 更 低 , 只 有 31% 残 基 相 同 。 由 上 述 可 见 ， 人 类 免疫 球 蛋白 易 变 区 属于 同一 亚 族 的 上 链 和 7yl 链 ， 在 N 端 之 易 变 区 有 高 度 的 同 源 性 。 但 是 ， 当 比较 它们 的 不 变 区 的 排列 时 ， 就 发 现 一 种 显然 不 同 的 现象 ， 所 有 上 述 的 五 条 yl 链 ， 除 去 1 一 2 氨基 酸 残 基 外 ， 排 列 顺序 完全 相同 ;， 反之 ， 当 把 这 几 条 71 链 和 必 链 相 比 时 ， 同 源 性 就 很 低 ， 只 有 30% AR. 从 以 上 的 比较 可 得 出 几 点 重要 的 结 论 : 1) 重 链 的 类 特征 (Class Character) 表现 在 不 变 区 (Cu), 而 不 是 表现 在 易 变 区 (Va) 。 这 和 轻 链 不 同 ， 轻 链 的 易 变 区 和 不 变 区 都 表现 出 型 的 特征 (Type character); 2) 所 有 属于 Van 亚 族 的 重 链 易 变 区 (不 论 按 其 类 别 来 自 4 链 或 7Y 链 ) 的 排列 顺序 具 有 高 度 的 同 源 性 。 这 一 事实 表明 属于 不 同类 别 的 & 或 yl 链 之 易 变 区 彼此 之 间 的 相似 程 度 大 于 属于 同一 类 别 ， 而 不 属于 同一 亚 族 的 重 链 之 易 变 区 间 的 相似 程度 。 重 链 之 易 变 区 Vi 甚至 和 轻 链 的 易 变 区 Vi. 有 一 定 程度 的 同 源 性 。 这 些 事实 提示 所 有 控制 易 变 区 的 基 因 (V) 可 能 来 源 于 共同 的 祖先 分 子 ; * 230° VE rat R81 各 类 重 链 易 变 区 前 100 氨基 酸 残 基 内 排列 顺序 相同 的 残 基数 目 ( 据 Putnam 等 >1971)e vas, rl Gor! |) 57 week | Vu rl Daw. 72 79% +100 apa. Von Van Van Van VHIII 3) 同一 类 免疫 球 蛋 白 重 链 的 不 变 区 (Ca) 有 几乎 相同 的 排列 顺序 ， 而 属于 不 同类 的 重 链 之 间 则 同 源 性 很 低 。 重 链 的 不 变 区 (Cu) MZ 变 区 (Va) 有 了 明显 的 不 同 ， 不 变 区 保 持 类 的 特性 ， 而 易 变 区 则 适应 于 抗原 结合 位 点 的 功 能 需要 。 这 种 化 学 结构 上 的 区 别 是 和 关于 V、C 基因 在 进化 过 程 中 很 早 就 发 生 异 趋 以 及 基因 移 位 的 假说 是 一 致 的 。 最 后 ， 从 重 链 易 变 区 各 亚 族 的 一 级 结构 异同 的 分 析 ， 还 可 以 推测 重 链 易 变 区 的 各 亚 族 在 系统 发 生 上 的 关系 。 这 将 留待 讲 免疫 球 蛋白 进化 时 再 讨论 。 (VE) 糖 肽 段 的 构造 与 功能 的 关系 IgM(Ou) 的 糖 含量 为 IE G 的 五 倍 。Ig M (Ou) 分 子 的 每 一 亚 基 含 有 十 个 低 聚 糖 单位 ， 都 位 于 上 链 上 。 每 一 条 4 链 含 有 五 个 低 聚 糖 单位 ， 均 位 于 不 变 区 。 它 们 在 六 链 上 大 概 的 位 置 如 简 图 8-1 所 示 。 Ci 位 于 Rdw KA 170 REM; Cir TREK 342 位 置 附近 ; Cs, C,, Ctr Fez, 近来 ， 对 IgM (Ou) 4 链 的 这 五 个 含 糖 的 肽 段 的 初步 测定 结果 (Shimizu 等 ,1971) 介绍 如 下 : C,; Phe-Ser-Trp-Lys-Tyr (Ser, Lys, Asx, Asx, Asx, CHO) CHO | C,; Gly-Leu-Thr-Phe-Gln-Glx- Asx-Ala-Ser-Ser—Met- CHO | Cs: Val-Lys-Thr-His-Thr-Asx C,; Ile-Ser-Glx (Ser, His, Pro, Asx, CHO)* CHO Cs5: Leu-Tyr-Asx-Val-Ser-Leu-Val-Met ” 按 新 发 表 的 上 链 全 部 一 级 结构 (图 8-8; 图 8-9) BEE HAR BEATE RB: CHO 410 -LIle-Ser-Glx-Ser-His-Pro-Asx- «230% 按照 糖分 子 结构 的 复杂 程度 分 为 两 类 : CiyCsyCs 所 含 的 低 聚 糖 是 高 度 分 枝 的 复杂 分 子 ， 是 由 1 单位 岩 菠 糖 、2 一 3 单位 甘露 糖 ，2 单位 半 乳 糖 、3 一 5 单位 N- 乙 酰胺 基 葡 萄 糖 和 0 一 2 单位 唾 酸 组 成 ;》 Cy. Cs 所 含 的 低 聚 糖 为 简单 的 直线 分 子 ， 由 5 一 11 单位 甘 wifi 2 一 3 单位 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 组 成 。 已 知人 的 两 种 巨 球 蛋白 IgEM (Ou) 和 IgM (Di) 的 糖 含 量 、 组 成 和 排列 位 置 大 体 相 la] (Hurst 和 Bennett, 1972; Niedermier 等 ，1972) 。 这 可 能 反映 IgM 类 的 特征 。 各 类 免疫 球 蛋 白 可 能 具有 相同 的 抗原 结合 专 一 性 ， 但 却 分 担 不 同 的 效应 器 功能 。 这 是 由 于 多 肽 链 结构 的 区 域 分 化 的 结果 。 各 类 免疫 球 蛋白 特有 的 效应 器 功能 和 重 链 不 变 区 的 特殊 结构 有 密切 关系 。Ig M 分 子 所 有 五 个 低 聚 糖 单位 都 分 布 在 上 4 链 的 不 变 区 。 有 人 曾 经 根据 这 一 特点 假定 Fc 上 低 聚 糖 单位 的 结构 和 分 布 可 能 与 其 效应 器 功能 有 密切 的 关 系 。 近 来 ， 有 人 证 明 Ig M 的 固定 补体 和 亲 合 细胞 的 功能 都 是 由 C?# 功能 区 担任 的 (Hu- rst “£, 1974; Moritta =, 1975; Conradie 和 有 Bubb, 1977), .2 但 是 天 | 用 内 音 体 Ig M 分 离 出 来 的 两 种 完整 的 CL 功能 区 片段 (它们 的 多 肽 链 相 同 ， 唯 一 的 区 别 是 一 HS 糖 多 ,一 种 含 糖 少 ) 进一步 研究 ， 发 现 Cx 功能 区 片段 含 糖 量 的 多 少 对 其 亲 合 细胞 的 功能 没有 影响 (Conradie 和 Bubb，1977)， 似 乎 不 支持 上 述 假定 。 CH.) “J” 链 和 IgM 的 聚合 机 制 近来 ， 在 多 聚 体 免疫 球 蛋白 内 ， 如 IE M 和 分 泌 性 IgA， 都 发 现存 在 一 类 新 的 多 肽 链 ， 称 为 “J” 链 ， 原 意 为 连结 链 〈“Joining” chain) (Halper 和 Kosland, 1970; Mestecky 等 ，1971) 。“J” 链 的 分 子 量 为 20,100， 含 糖 量 约 为 8% 。 它 具有 独特 的 氨基 酸 组 成 ， 封 闭 的 N in, ARSENE. 不 同 物种 的 “JJ 链 之 间 有 交叉 反应 ， m5 H KL FEMAARNRM. MAX-WHAREWCEART H, L eH MWTN—-RoK . AERSANA MR MAE “I” HE HTES RATA RAI AY EL a) n a = UsMs),J =m (igMs),J J 图 8-11 IgM 五 聚 体内 ] 链 的 搭 钩 模型 以 及 其 形成 过 程 中 的 二 硫 键 交换 ( 据 Chapuis 和 Koshland, 1974), ea 232° “J?” 链 的 生物 学 功能 还 不 太 清 楚 。 由 于 “J? 链 只 在 多 聚 体 分 子 内 存在 , 而 不 在 单 体内 存在 ;定量 研究 还 发 现 每 一 个 五 聚 体 IEM 含有 一 条 “J” 链 ， 并 且 它 是 和 了 cxw， 而 不 是 Al Fabs FRR, Uk“ I’M EDD A — Bit EY Be ATR BEB IH BP “J” 链 等 事实 ， 因 而 推测 “J” 链 在 天 然 多 聚 体 分 子 中 可 能 起 连接 亚 基 的 作用 。 最 近 有 人 在 使 IgM 五 聚 体 有 限制 还 原 和 烷 基 化 以 后 ， 分 析 切 断 的 “J” 链 二 硫 键 和 释放 的 亚 基 之 间 的 定量 关系 ， 发 现 ; 1) 还 原 条 件 下 可 产生 相当 数量 的 单 体 ， 以 及 少量 的 二 体 、 三 体 和 四 体 ; 2) 断 开 的 “J” 链 二 硫 键 数目 和 Ig M 解 聚 程度 之 间 没 有 对 应 的 关系 ; 3) 有 限 还 原 Hye “I” 链 的 双 体 ,“J*” 链 二 硫 键 并 没有 断 开 。 这 些 材 料 表 明 , “J” 链 可 能 象 一 个 “ 拱 钩 ”， 把 两 个 Ig Ms 单 体 连 接 起 来 。 根 据 所 观察 到 的 各 种 连接 方式 ， 可 以 假定 IEM ARE 合 机 制 是 从 形成 含 “J” 链 的 二 聚 体 开始 ， 并 经 过 一 系列 按 顺序 的 二 硫 键 交换 而 完成 的 (图 8-11) (Chapuis 和 Kosland, 1974; Kosland，1975) 。 可 是 ， 有 人 提出 不 同 的 看 法 ， 认 为 “J” 链 并 非 Ig M 聚合 作用 所 必需 ， 而 是 和 分 记功 能 有 关系 的 。“J” 链 和 上 皮 细胞 产生 的 分 沁 片 有 专 一 的 亲 合 力 ， 因 而 假定 能 促使 IEM 分 刻 到 外 分 记 液 内 (Eske- land 和 Brandtzaeg，1974) 。 总 之 ,“J" 链 的 功能 还 是 一 个 争论 未 决 的 问题 。 最 后 ， 还 要 补充 一 个 新 发 现 的 事实 。 人 类 正常 的 初 乳 和 唾液 中 均 证 明 有 分 记性 IE M 存在 。 纯 化 的 分 记性 IgE M 分 子 含 有 “J” 链 ， 并 且 60 一 70% 分 子 还 含有 分 认 片 。 蓝 光标 记 抗 体 示 踪 研 究 还 证 明 IgM 在 结肠 分 这 上 皮 细 胞 内 的 分 布 和 IgA 相同 (参看 下 节 ) 。 A ke, IgM 和 IgEA 同样 是 分 记性 抗体 。 不 过 分 泌 性 IgM 的 四 级 结构 可 能 比分 记性 Ig A 较为 松散 (Brandtzaeg, 1975). (FX) IgM 抗体 的 有 效 价 数 IgM 抗体 是 一 个 五 聚 体 ， 每 一 亚 基 有 两 个 抗原 结合 位 点 。 因 此 ，IgM 抗体 从 化 学 D D D D D D D D D D D D D IM IM 015 028 04.3061 07.1 DIO D20 D40 D070 Dii0 D150 02500500 02,000 RADA COPIES cE) iso [19 [21 [20] 19] 2s [aofz2| 22] 1923] 19] 26] 20]20] «| 图 8-12 StF FAN IgM 抗体 实测 的 价 数 的 关系 。 上 方 示 各 种 葡 聚 糖分 子 的 形状 ,大 小 以 及 IgM 和 IgG 分 子 简 图 , 同一 放大 倍数 。 下 表 表 示 家 免 抗 葡 聚 糖 IgM 和 IgG 抗体 对 不 同 大 小 的 抗原 相应 的 价 数 。 IM HERE. Cie Van Oss 等 ,1973)。 。233。 RS-2 文献 记录 的 IJgM 抗体 的 价 数 i | Oo it 人 类 风湿 性 关节 炎 因 子 IgG % IgM BSA 人 IgM 葡萄 糖 -d4- 半 乳糖 甘露 糖 - 鼠 李 糖 & IgM 5-H 2£-3-fR-4-BAECE % IgM 1- 偶 氮 矿 一 - 磺 酸 ASM IgM DNP KE IgM DNP 结构 上 看 是 10 价 的 。 然 而 ， 在 实际 测定 时 ，Ig M 抗体 的 价 数 往往 是 5 Hr. 从 表 8-2 可 见 ， 对 于 小 分 子 量 抗原 或 半 抗 原 (分子量 二 1000)， 测定 的 价 数 是 和 理论 上 的 价 数 符合 Ns; 对 于 大 分 子 抗原 ， 测 定 的 价 数 就 总 是 只 有 5 价 了 。 但 是 ， 若 用 同一 IgEM 抗体 的 亚 基 作 测定 ， 推 算出 的 总 价 数 ， 仍 然 是 10 价 。 理 论 上 可 能 的 解释 是 , 当 和 大 分 子 抗原 结合 时 , 由 于 空间 障碍 ， 每 一 对 结合 位 点 中 , 只 有 一 个 实际 上 起 作用 ， 因 此 IgM 抗体 有 效 的 价 数 只 有 5 价 (Metzger，1970) 。 近来 ， 有 人 用 化 学 组 成 均一 而 分 子 量 大 小 递增 的 葡 聚 糖 作 抗原 ， 系 统 地 分 析 了 IEM 抗体 有 效 价 数 和 抗原 分 子 量 大 小 之 间 的 关系 。 当 分 子 量 从 342 (SRR) 到 1,870,000 (D. 2000) 范围 内 逐步 增加 时 ， 家 免 抗 葡 聚 糖 IE M 抗体 的 实测 的 价 数 ， 从 10 价 减少 到 2.3 价 ;而 在 从 6,000 (D. 7.1) 到 250,000 (D. 250) 整个 范围 内 ，IgEM 都 是 5 价 的 (图 8-12) 。 这 有 力 地 证 明了 上 述 的 假说 ，IgM 抗体 按 本 身 结 构 应 为 10 价 ， 和 高 分 子 抗原 结 合 时 ， 有 效 价 数 的 减少 是 由 于 空间 障碍 的 结果 (Van Oss 等 ，1973)。 小 结 1) IgM 是 以 多 聚 体形 式 存 在 的 免疫 球 蛋白 (人 类 和 其 他 哺乳 动物 的 IEM HARK, 某 些 低 等 脊椎 动物 可 能 为 四 聚 体 或 六 聚 体 ) 。 单 体 亚 基 (IgMs) 含有 两 条 相同 的 轻 链 ( 或 2) 和 两 条 相同 的 重 链 (ww) 。 每 个 五 聚 体 还 含有 一 条 “J” 链 ， 可 能 起 连接 亚 基 的 作用 。 每 条 上 4 链 上 有 五 个 低 聚 糖 相连 。 : 2) 已 经 测定 了 一 个 人 类 巨 球 蛋白 IgM (Ou) 的 全 部 一 级 结构 ， 可 作为 IEM 的 代 表 。& 链 的 氨基 酸 排列 顺序 同样 可 分 为 易 变 区 (V)， 包 括 123 残 基 ， 和 不 变 区 (C)， 包 括 约 460 残 基 。 史 链 共 有 五 个 同 源 区 , 即 Vu, Cr, Ci, Cr, CL; 7Y 链 只 有 四 个 同 源 区 。 轻 链 只 有 两 个 同 源 区 。 3) 上 链 的 类 特征 只 存在 于 不 变 部 分 (Ca) ， 而 不 存在 于 易 变 部 分 (Va) 。 各 类 重 链 的 易 变 区 (Ve) 的 一 级 结构 可 能 存在 高 度 的 同 源 性 , 按 此 可 区 分 为 w，7Y，% 链 所 共有 的 三 个 Vu WH (Vat，Vanr，VanD) 。IEM 和 IgG 等 其 他 类 别 的 免疫 球 蛋 白 具 有 相同 的 轻 链 , 重 链 也 可 能 属于 相同 的 Va 亚 族 。 但 4 HEALY 链 等 其 他 类 别 的 重 链 的 不 变 部 分 (Cu) 的 同 源 性 很 低 , 其 链 长 ,二 硫 键 和 低 取 糖 的 数目 和 位 置 也 不 相同 。 这 些 结果 再 次 支持 HW, L 链 的 一 级 结构 是 由 两 个 基因 (CV, C) 共同 决定 的 ,以 及 V，C 基因 在 进化 过 程 中 很 早 .234 。 ON I OO _—_ ,, — ee ne 时 Cee ee a 就 发 生 异 趋 和 独立 进化 的 假说 。 4) 重 链 和 轻 链 的 VY 区 决定 抗原 结合 位 点 的 专 一 性 ，C 区 决定 类 别 专 一 的 效应 器 功 能 和 其 他 特性 。Ig M 抗体 按 化 学 结构 应 为 10 价 ， 但 和 大 分 子 抗原 结合 时 ， 由 于 空间 障 碍 ， 往 往 表现 为 5 价 。 二 、 免 疫 球 蛋白 A(IgA) 1954 年 已 经 发 现 人 血清 中 存在 一 种 特殊 的 球 蛋白 成 分 。 当时 根据 其 电泳 行为 称 为 p A 球 蛋白 。 后 来 发 现 它 们 具有 抗体 功 能 ,是 一 类 新 的 免疫 球 蛋 白 , EAA IgA (Hermans 等 ，1958) 。 从 30 年 代 起 ,许多 临床 和 实验 观察 都 注意 到 , 在 消化 道 和 呼吸 道 感 染 中 , 保 护 性 免疫 力 似 乎 和 血清 中 的 抗体 没有 直 接 的 关系 ， 而 和 这 些 粘 膜 面 的 分 记 液 内 的 抗体 有 关系 (图 8-13) ， 并 提出 动物 体 除 去 循环 抗体 外 ， 还 存在 局 部 的 防御 \ 机 制 的 假说 。 往 后 发 现 这 些 分 这 液 中 的 ow ERA IgA (Tomasi 和 Zige- 图 8-13 豚鼠 经 霍乱 疫苗 免疫 后 ,血清 和 美 便 中 分 泌 抗体 效 lbaum, 1933), 并 且 证 明 分 沁 性 的 价 各 自 独立 地 变化 。 IP 示 腹 腔 内 注射 ( 据 Tomasi, 1976), IgA 是 局 部 产生 的 ，. eM Fut jp IgA 4/(t44 的 。 由 于 在 对 抗 某 些 感染 中 ， See rere 起 着 主要 的 作用 。 因 此 分 泌 性 IgA 的 研究 近来 受到 重视 。 血清 凝集 素 效 价 FE EEK AT (—) 血清 IgA 的 性 质 和 结构 大 血清 IgA 具有 多 种 抗体 活力 。 但 是 由 于 含量 小 , 在 血清 抗体 中 和 IgG、IgM 比 较 ， 居 于 次 要 的 位 置 。Ig A 抗体 的 特点 是 有 耐 热 性 (56*C) 。 过 去 认为 Ig A 没有 固定 补 体 的 能 力 。 然 而 , 近来 有 人 发 现 分 记性 Ig A, 的 Faba 片段 能 和 补体 成 分 C 3 一 9 起 作用 ， 但 不 能 和 C 1 起 作用 (Boackle 等 ，1974) 。 也 有 人 报告 IgE A 及 其 片段 经 化 学 处 理 凝 集 后 ， 能 激活 补体 系统 的 经 典 途 径 (Lida 等 ，1976) 。 IgA 最 显著 的 特性 是 趋向 于 以 不 同 的 聚合 形式 存在 ， 从 单 体 到 五 聚 体 (7S, 10S， 13S$，15S，17 一 18S) 。 人 血 铺 中 IEA 主要 以 单 体形 式 存在 。 在 其 他 哺乳 动物 , 如 小 鼠 血 清 中 ， 主 要 以 双 体 形式 存在 。 在 外 分 刻 液 中 和 在 血清 中 不 同 ， 所 有 物种 都 是 双 体 占 (11 S) 优势 ， 除 含有 ”“J” 链 外 ， 还 含有 一 条 特殊 的 多 肽 ， 称 为 “分 这 片 ”(“Secretory pie- ce”). IgA 单 体 是 由 两 条 相同 的 重 链 (w HE) PPR TEA AE (Ce BY) 组 成 , 分子量 为 162,000。 和 IgG 比较 ，Ig A 的 电泳 迁移 率 较 快 ， 重 链 的 含 糖 量 较 高 (IgE A 约 为 11 %， IgG 约 为 4%) 。 根 据 “ 链 的 抗原 性 的 不 同 ，Ig A 又 可 分 为 两 个 亚 类 。 0 1. 亚 类 人 类 Ig A 分 成 两 个 亚 类 : IGA, 和 1Ig A:， 两 者 的 相对 含量 为 9:1。 这 两 个 亚 类 ， 除 去 % 链 的 抗原 性 有 区 别 外 ， 肽 链 的 连接 方式 也 不 同 。Ig A (主要 成 分 ) 的 重 链 和 轻 链 之 闻 由 共 价 键 (二 硫 键 ) 连 结 。 某 些 IgE A, (次 要 成 分 ) 的 结构 非常 特别 ， 两 条 轻 链 之 间 是 由 共 价 键 连 接 的 ， 而 重 链 和 轻 链 之 间 反 而 是 非 共 价 键 连结 的 。 后 来 发 现 这 种 奇特 的 现象 只 出 现在 Am (2+) 的 同 种 异型 分 子 (高 加 索 人 的 主要 遗传 型 ) ， 而 Am (2 - ) 的 同 种 异型 分 子 仍然 具有 互 一 工 链 间 的 二 硫 键 (Jerry 等 ，1970) (图 8-14) 。 某 些 动物 品系 ,如 小 fi Balb/c 品系 的 IgA 缺少 互 一 工 二 硫 键 ，N2B 品系 则 保留 有 这 种 二 硫 键 。 对 IgA 两 亚 类 “ 镶 链 区 ” 氮 基 酸 排列 顺序 的 比较 ， 发 现 IE-A: Am (2+) 缺少 在 IgA, 中 连接 重 链 和 轻 链 的 Cys-131 RA; FARA MEK” tt IgA, 要 短 约 10 个 残 Zz, 缺少 低 聚 糖 (Frangione 等 ，1972) 。 所 有 Ig Ai 的 糖 组 成 中 均 含 有 氮 基 半 乳 糖 ， 而 Ig A, 则 不 含 此 成 分 (Abel 等 ,1971) 。 近来 , 从 人 类 xl 重 链 分 离 出 两 个 糖 多 肽 (1a， 4a)， 并 从 w 2 链 分 离 出 三 个 糖 多 肽 (1b，2b，3b)。 根 据 氮 基 酸 排列 顺序 测定 结果 ， 表明 w 2 链 的 1b，3b 与 xl 和 链 的 1a，4a 似乎 是 相同 的 。la 和 1lb 同位 于 C8 功 能 区 ,4a， 人 类 IgA 系统 ie tat 分 泌 IgA 7S 三 学 多 聚 体 〈10S,13S,15S,18S) 7S «11S» & Blk (m. w. 160,000) (m. w. 385,000) IgA,(90%) [gA,(10%) IgA,(60%) 1gA,C4096) Ame) Am(2)+ Am(2)— CRAK ey Anas (高 加 雪人》 ei > 8-14 人 类 IgA 系统 的 成 分 及 其 性 质 ( 据 Tomasi 44,1973), 表 8-3 al 和 ax2 链 糖 多 肽 的 排列 顺序 | al (la) Leu-Gly-Ser-Glx—A la—Asx—Leu-Thr Ch CHO | a2 (1b) Thr-Gly-Ser-Glx-A la—Asx—Leu-Thr | Val CHO | al (4a) Ala-—Gly-Lys—Pro-Thr-His—Val—Asx-Ser-Val Ci CHO | a2 (3b) Leu (Ala, Gly, Lys, Pro, Thr, His, Val, Asx, Ser, Val) Val—Met CHO | a2 (2b) Thr-Pro—Leu-Thr-—Ala-Asx-Ile-Thr-Lys ? 据 Jean-Pierre 等 ,1974。 。236。 3b 同位 于 CL 功能 区 。2b 为 wx 2 链 所 特有 的 糖 多 肽 ， 在 xl 链 内 从 未 发 现 过 (# 8-3) (Jean-Pierre 等 ，1974) 。 所 有 这 些 都 说 明 IgA 两 亚 类 的 一 级 结构 有 了 明显 的 区 别 。 这 可 能 和 它们 的 高 级 结构 的 差别 有 关系 。 2. 分 子 的 基本 结构 一 IgA 单 体 具 有 四 条 肽 链 的 基本 结构 ， 两 条 相同 的 重 链 (a) 和 两 条 相同 的 轻 链 ( 上 或 4), 分子式 可 写 为 (1aaz) 或 (cuz) 。 多 肽 链 化 学 结构 的 研究 进展 较 慢 ， 主 要 的 困难 是 不 FE) RK IgG 的 Fab fl Fe 那样 均一 的 酶 解 片段 。 从 小 鼠 Ig'A 经 木瓜 酶 分 解 后 ， 得 到 Fe (分 子 量 三 51,000) 和 Fab (分 子 量 三 53,000) .都 含 糖 。 根据 分 子 的 肽 链 组 成 ， 二 硫 键 和 糖 的 分 布 的 初步 结果 设想 的 小 鼠 IgEA — Fab 一 一 下- 分 子 的 结构 模型 如 图 8-15 所 示 (Grey 等 ， 木瓜 栈 CHO -21971)5 图 中 粗 线 表 示 不 稳定 的 二 硫 键 的 位 置 。 每 条 重 链 的 Fe 部 分 有 5 个 不 稳定 的 半 胱 氨 酸 了 _ Bede, Fab BORA. 这 一 模型 有 些 类 似 人 iL Ig A, Am (2+) 的 结构 。 L 3, IgA 的 一 级 结构 sis 3 eRe 1976 年 Putnam 实验 室 报 告 了 人 IgA, -= 4, 5 (Bur) 储 细胞 瘤 蛋白 质 的 全 部 一 级 结构 ， 包 括 本本 于 FT ol 重 链 ，1 轻 链 的 全 部 氨基 酸 排列 顺序 , RR ( 据 Grey 4$,1971). 糖 和 三 硫 桥 的 位 置 (图 8-16, 图 8-17)(Liu 等 ，1976) 。 从 图 8-16 可 见 ， IgA, (Bur) Kal 重 链 的 一 级 结构 有 如 下 的 特点 1) xl 重 链 的 链 长 为 472 氮 基 酸 残 基 。 同样 可 分 为 易 变 区 (V)， 包 括 N 端 119 氮 基 酸 残 基 ， 以 及 不 变 区 (C) ， 包 括 C 端 353 RHE; 2) 和 其 他 几 类 重 链 相 比 ， %1 重 链 的 半 胱 氨 酸 含量 特别 丰富 。 %1 重 链 ( 有 4 功能 区 ) 含 有 17 半 胱 氮 酸 残 基 , 而 Y1 重 链 (4 功能 区 ) 含 有 11，4& 重 链 (5 功能 区 ) AA 14, © 重 链 (5 功能 区 ) 含有 15 半 胱 氮 酸 残 基 。 除 去 4 链 内 二 硫 桥 以 及 重 链 和 轻 链 间 ， BHR 此 间 的 三 硫 桥 外 ,%1 重 链 上 的 某 些 半 胱 氨 酸 的 功能 不 清楚 。 不 过 , 位 于 “ 镶 链 区 ”的 两 个 额外 的 链 内 二 硫 桥 (Cys-196 至 Cys-220，Cys-242 28 Cys-299; 图 8-17 HN, HARA 或 许 和 IgA 不 易 酶 解 有 关系 。 位 于 C 末端 Cys-471 HOM “I” HER, i 位 + Cys-311 的 二 硫 桥 或 许 和 亚 基 间 的 连接 有 关系 ; 3) C1 链 的 另 一 个 特点 是 含 糖 高 ,共有 8 个 低 聚 糖 基 团 ， 其 中 2 个 位 于 Ed (1 个 在 易 变 区 ) ，6 个 在 Re (5 MEH LE HER”) © 随 着 “ 链 的 全 部 一 级 结构 的 阐明 ， 至 此 人 类 各 类 免疫 球 蛋 白 (IEG，IgM，IgA 和 IgE) 的 一 级 结构 都 已 弄 清 楚 了 。 这 对 于 了 解 各 类 免疫 球 蛋白 的 结构 和 功能 , 以 及 进化 上 的 关系 是 很 重要 的 。Putnam 等 比较 了 人 IgM, IgA, IgG,, MIgE Ay Fe WARM 排列 顺序 ， 发 现 它们 有 相当 程度 的 同 源 性 ( 约 30%)， 不 过 这 种 同 源 性 在 Fe 上 的 分 布 是 不 均匀 的 。 如 4 链 和 < 链 的 最 后 的 一 个 功能 区 (CLIC?) 之 间 的 同 源 性 最 高 ( 约 50%)， 而 Fe 第 一 功能 区 (Ci 和 Cax) 之 间 的 同 源 性 却 最 低 ( 约 13%)。 这 似乎 提示 在 进化 过 程 。 237。 Bur A 链 | oirt 10 f 20 27..a7y 籼 CLP-SER-ALA-LEU-THR-GLX-PRO-ARG-SER-VAL~SER-CLY ~SER-PRO-GLY=H1S=SER=VAL=THR=ILE=SER-CYS-ILE-GLY-THR=SER-SER-ASN-VAL-GLY Ss 30 40 50 1 C ® ASP-TYR-LYS-TYR-VAL-SER-TRP-TYR-CLX-GLX=H1S~PRO-GLY-LYS-ALA-PRO-LYS-LEU-ILE~ I LE-TYR-GLU-VAL~SER-SER~ARG-PRO-SER-GLY-VAL Ss 60 . 70 80 PRO-ASP~ARG-PHE-SER-GLY-SER-LYS-SER-CLY~ASX-THR-ALA~SER-LEU-THR=ILE~SER~CLY~LEU*CLN-ALA~GLU~ASP=GLU-ALA~ASX-TYR-TYR-CYS 90 100 : 110 CYS-SER 一 —— TYR-ILE-GLY-SER -一 TYR-VAL-PKE-GLY-THR-GLY-THR-LYS-VAL-LEU-VAL-ILE-GLY-GLX-PRO-LYS~ALA~ASN-PRO-THR-VAL 120 130 140 THR-LEU-PHE-PRO-PRO-SER-SER-GLX-GLX-LEU-GLX~ALA-ASX-LYS-ALA-THR-LEU-VAL-CYS-LEU- ILE-SER-ASX-PHE-TYR-PRO-GLY-ALA-VAL-THR & 150 - 160 170 VAL~ALA-TRP-LYS-ALA-ASP-GLY-S ER-PRO-VAL-LYSALA-CLY-VAL=GLX-THR-THR-LY S-PRO-SER-LYS-GLN-SER-ASX-ASX-LYS-TYR-ALA-ALA-SER 180 190 200 ° SER-TYR-LEU-SER-LEU-THR-PRO-GLX-GLX-TRP=LYS-SER-HIS-ARG-SER-TYR-SER-CYS-GLN-VAL-THR-HIS-GLX-GLY-SER-THR-VAL-GLX-LYS-THR VAL~ALA-PRO-TIR-GLX-CYS-SER~COUH BurQ1 # 5 10 20 PCA-VAL~GLN-LEU-VAI.~GLU-SER-GLY-GLY-GLY-VAL=VAL-GLN-ALA-GLY -THR-SER-LEU~ARG-LEU-SER-CY S-THR-ALA-SER-ALA~PHE-KS -LEU-SER 35 40 45 50 55 60 ASP-TYR~ALA-MET-H1S-TRP-VAI.-ARG-GLN-AI_A-PRO-GLY=LYS-GLY -LEU-GLX-TRP-VAL-ALA-LEU- I LE-SER -TY R-GLY -GLY -SER=ASK-THR-TYR-TYR s 65 70 79 80 85 90 ALA~ASP-SER-VAL-ARG~CLY-ARG- PHE-THR~ I LE~SER~ARG~AS X-I LE-SER~LYS-ASX-THR-LEU-TY ey te 95 100 105 110 THR-ALA-VAL-TYR-TY R-CY S-ALA~LYS~LEU~1LE=ALA=VAL~ALA-GLY=THR-ARG-ASX-PHE-TRP-CLY ~GLN-GLY ~THR-LEU-VAL-THR-VAL~SER-LEU-ALA 125 130 135 140 J \ 150 1 SER-PRO-THR-SER-PRO-LYS-VAL-PHE-PRO-LEU-SER-LEU-CYS-SER-THR-GLX-PRO-—ASX-GLY -ASX-VAL-VAL~ I LE~ALA-CYS~LEU-VAL-CLN-CLY-PHE S 155 160 165 170 175 180 PHE-PRO-GLN-GLN-PRO-LEU-SER-VAL-THR-TRP-SER-GLU~SER-GLY-CLX-CLY-VAL~THR-ALA-ARG~ASX-PHE~PRO-PRO-SER-GLX-ASX~ALA-SER-GLY Ss S 185 ~ alee 195 | 200 205 210 i ASX-LEU-TY R-THR-THR-SER-SER-GLN-LEU-THR-LEU-PRO-ALA-THR-GLX-CY S~LEU-ALA-GLY -LYS~-SER-VAI.-THR-CYS-HIS-VAL-LYS-HIS-TYR-THR lo eee : Fd)Fc 午 链 215 ， = Gd). 235 (CHO) ASN-PRO-SER-GLN-ASX-VAL-THR-VAL-PRO-C S-PRO-VAL-PRO- eA 4 ES k-PRO-SER-THR-PRO-PRO-THR-PRO-SER-PRO— IgA S ? | 245 250 ass 9 ; 260 265 “Ff 270 | t cyYs- S-HIS-PRO-ARG-LEU-SER-LEU-HIS-ARG-PRO=AI_A-LEU-GLX-ASX=LEU-LEU-LEU-CLY-SER-GLX-ALA-ASW LEU-THR-CYS-THR-LEU-THR-CLY ° Be 275° 280 W265 290 295 i) LEU-ARG~ASP-ALA-SER-GLY -VAL-THR-PHE-THR-TRP=PRO-SER=THR-SER-GLY ~LYS~SER-ALA-VAI.-GI.X-GLY ~PRO-PRO-GLU-ARG~ASP-LEU-CYS-GLY < 305 310 315 ; 320 325 Aw CYS-TYR-SER-VAL-SER-SER-VAL~LEU-PRO-CLY~CYS-AI.A-GLU-PRO-TRP-ASX-HI S-CLY-LYS-THR~PHE-THR- S-THR-ALA-ALA-TYR-PRO-GLU-SER = a ' 335 340 345 350 : 355 二 360 : 亚 基 | 8] ( ? ) LYS-THR-PRO-LEU-THR-AI.A-THR-LEU-SER-LY S-SER-GLY -ASN=THR=PHE-ARG=PRO-GLN-VAL-H1S-LEU-LEU-PRO-PRO-PRO-SER-GLX-GLX-LEU-ALA 365 | 370 375 380 2385 ; 390 1 上 EU-~ASX-CLX-LEU-VAL-THR-LEU-THR-CYS-LEU-AIA-ARG-CLY-PHE-SER-PRO-LYS-ASP-~VAL-LEU-VAL-ARG-TRP-LEU-~GCLN-CLY-SER-CLN-CLU-LEU Ss 395 400 405. 410 a taal 420 | PRO-ARC-~CLU-LYS-TYR-LEU-THR-TRP-ALA-SER-ARG-CLN-GLU-PRO-SER-CIN-CLY-THR-THR-THR-PHE-ALA-VAL-THR-SER-ILE-LEU 的 步骤 Ig A 双 体 中 ， 含有 一 个 “SP”。 ( 据 Tomasi 等 ,1968) “SP” Allg A 的 来 源 不 同 ， 是 由 粘膜 上 皮 或 腺 体 细胞 合成 的 ， 并 且 认为 是 在 IEA 双 体 分 子 形成 后 ， 穿 过 粘膜 过 程 中 ， 或 穿 过 粘 表 8-6 “分 泌 片 的 理化 性 质 膜 后 ， 才 和 Ig A 分 子 结合 的 。“SP” 的 生物 Sai = a 学 功能 还 不 甚 清楚 。 由 于 分 记性 IgA 比 血 ce) ae WlgA 更 能 抵抗 蛋白 酶 的 分 解 ， 因 此 推测 二 硫 键 克 分 子 数 / 克 分 子 5 “SP” 可 能 使 IgA (11S) 保持 稳定 ， 这 种 稳 定性 在 处 于 消化 道 等 富 含 蛋 百 酶 的 环境 中 尤 其 是 必要 的 。 没 有 足够 的 证 据说 明 “SP” 有 利于 IgE A 穿 过 粘膜 。 5. J” 链 的 功能 及 其 在 多 聚 体 IgA 上 连接 的 位 置 如 前 节 所 述 ,“J?” 链 最 先是 在 家 免 分 记性 IE ARB AY (Hapern #1 Kosland, ”近来 发 现 分 记性 IgM 分子 内 也 含有 “分泌 片 2, 见 前 节 , 第 233 页 。 。 2436 ag H,N ~»—Met+Ale-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr COOH S S 1 Meth Asp COOH “J? 链 S UE =—( CHO i i ( ) i : PCA S 1 S ' H,N«s+—Met+Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr COOH a 链 8-27 “J” 链 在 w 链 上 连接 的 位 置 。 此 线 示 CNBr 切断 的 地 点 ( 据 Mestecky 等 ,19747。 1970) 。 由 于 它 只 在 多 聚 体 分子 中 存在 ， 而 不 在 单 体 内 存在 , 故 假定 其 功能 与 亚 基 的 连接 有 关系 。 然 而 ， 最 近 有 人 对 这 一 点 提出 怀疑 。 因为 有 人 发 现 单 株 多 聚 体 IEM,， HAG “J?” 链 (Eskeland 和 Brandtzaeg, 1974), 而 且 缺 少 *J?” 链 的 IgMs 亚 基 仍旧 能 重新 聚合 〈Kownatzki，1972) 。 另 一 方面 ， 还 发 现 ^J? 链 和 上 上皮 细 胞 产生 的 “分 这 片 ” 有 亲 合力 。 因 此 ， 这 些 学 者 主张 *J” 链 并 非 IE A MIgM 聚合 所 必需 ,而 可 能 是 和 这 些 多 聚 体 抗体 的 分 这 有 关系 。 近 来 ， 还 用 免疫 草 光 组 织 化 学 法 ， 发 现 分 大 IED，IgEG, IgM 和 IgA 等 所 有 各 类 也 淋巴 球 在 一 定时 期 内 都 有 “J?” 链 存在 。 这 似乎 表明 “J?” 链 是 各 类 也 淋巴 球 共 有 的 基本 产物 ， 只 是 在 细胞 株 增生 的 晚期 ， 在 产生 IEM 和 IgA 以 外 的 细胞 内 ， 其 合成 才 受 到 抑制 。 同时 ， 可 以 假定 在 产生 IEM 和 IgA 的 B 淋 巴 球 表面 有 IgM 或 Ig A 双 体 和 *J?” 链 的 复合 物 存在 。 当 这 些 细 胞 和 产生 分 刻 片 的 上 皮 细 胞 、 或 游离 的 分 泌 片 接触 时 ， 就 会 发 生 专 一 的 结合 ， 从 而 受到 刺激 在 该 处 停留 下 来 ， 并 开始 增生 。 总 之 ， 这 些 学 者 主张 “J” 链 的 功能 除 假定 可 能 和 IgM，IgA 的 分 放 有 关系 外 ， 还 可 能 和 粘膜 局 部 免疫 系统 的 发 育 有 关系 (Brandtzaeg, 1974). 图 8-28 分 这 性 IgA 的 构造 模型 。J WH “JI” 链 ; CH “SP” 分 泌 片 ,缠绕 在 IgA 二 聚 体 的 Fe 表面 ( 据 Heremans, 1974), 。244 。 ABRK Ig A AREAS CNBr 处 理 后 可 分 离 出 一 个 含 “J” 链 的 片段 。 这 一 片 段 经 过 还 原 和 烷 基 化 以 后 ， 又 可 分 离 成 三 个 成 分 : 最 大 的 成 分 (分 子 量 =13,400) 相当 于 “J” 链 的 N 端 部 分 ， 含 有 一 个 高 丝氨酸 残 基 ; 第 二 个 成 分 ， 相 当 于 “J?” 链 的 C 端 部 分 ， 包 括 13 一 18 RE, 第 三 个 成 分 是 % 链 末 端的 8 肽 。 这 些 材料 表明 “I” HEA a 链 C 端 倒数 第 2 位 置 的 Cys. 和 链 相连 接 的 (Mestecky 等 ，1974) (图 8-27) 。 最 后 ， 还 应 提 到 分 记性 Ig A 的 结构 模型 问题 。 根 据 电子 显微镜 观察 ， 以 及 “SP” 和 “J” 链 的 资料 ，Hermans (1974) 提出 了 分 记性 Ug A).-J-SP 的 一 个 新 的 结构 模型 (图 8-28), 在 IgA 双 体 中 ,“J?” 链 通过 二 硫 桥 和 % 链 连 接 ， 并 处 于 分 子 内 部 隐蔽 的 位 置 。 分 刻 链 (“SP”) 假定 是 盘 绕 在 IgE A 双 体 Fe 的 表面 ， 从 一 个 单 体 的 “ 镶 链 区 ?” 伸 到 另 一 单 KARR”. 4OwWHEMa 位 置 盘 绕 到 b 位 置 时 ， 其 构象 发 生变 化 ， 抗 原 决 定 往 “I” | 部 分 地 失效 。 小 结 1. 动物 体 除 循环 抗体 外 ， 还 存在 局 部 免疫 防御 系统 。 在 呼吸 道 、. 肠 道 等 的 局 部 免疫 中 ， 分 记性 IgE A 起 着 主要 作用 。 这 些 抗体 是 由 于 抗原 和 粘膜 接触 后 , 由 局 部 的 大 量 浆 细 胞 合成 的 。 het bina Swe IgE A 和 血清 IgA 的 化 学 结构 不 同 ， 前 者 为 含有 “分 记 片 ?和 "“J?” 链 的 二 聚 体 。 分 记性 IgE A 由 于 其 独特 的 化 学 结构 ， 不 易 被 酶 解 , AMER ASABNND WRN 环境 中 仍 能 起 抗体 的 作用 。 3. 由 于 IgA 及 其 特殊 的 免疫 学 功能 的 发 现 ， 局 部 免疫 的 重要 性 愈益 受到 重视 。 外 在 人 体 的 研究 证 明 病 毒性 上 呼吸 道 感 染 的 痊愈 过 程 和 鼻 咽 道 分 废物 内 抗体 的 增加 有 密 切 的 关系 ， 而 和 血清 抗体 无 显著 的 关联 。 利 用 局 部 预防 免疫 来 预防 上 呼吸 道 感 染 AK 感 疫 苗 ) 的 研究 在 国外 已 取得 进展 。 至 今 霍 乱 疫 苗 还 是 采用 全 身 注 射 方式 , 在 疾病 预防 上 并 不 最 有 效 。 因 此 ， 有 人 建议 改 用 肠 道 局 部 免疫 的 方式 ， 以 期 取得 更 好 的 预防 效果 。 此 外 ， 通 过 峻 性 生殖 道 局 部 免疫 来 控制 生育 的 试探 性 研究 也 有 人 开始 进行 (Tomasi, Tera) s &¢ + 8 KRREZAM Brandtzaeg, P. 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Akt, rE R 蛋白 (gE) 具有 对 乐 草 变 应 原 的 抗体 活力 ， 并 且 同 一 专 一 性 的 反应 素 抗体 和 分 离 的 IE 卫 抗体 是 相关 连 的 (Ishizaka 等 ，1966) 。 2) RAW SRA MA P-K RIMM NKRS—A IgE HAWKE ALTX 系 。 然而 汪 和 同一 病人 血清 中 IgG，IgEA， 或 IEM 的 抗体 浓度 无 关系 (Ishizaka 4, 1967). 3) 反应 素 抗体 和 IgE 也 抗体 的 理化 性 质 相 同 。 异 位 过 敏 性 病人 的 血清 ,用 离子 交换 层 析 、 凝 胶 过 滤 、 莽 糖 密度 梯度 离心 ， 以 及 凝 胶 电泳 等 方法 分 离 时 ， 反 应 素 抗体 活力 的 分 布 是 和 IgE 了 一致 的 。 4) 反应 素 抗体 就 是 IgE 的 最 主要 证 据 ， 是 从 一 移 异 位 性 过 敏 病人 血清 提纯 的 Ig 卫 ©) aS 5 o>. “ (by (a) 图 9-1 放射 免疫 扩散 实验 。 〈a) RH (6) 相对 应 的 放射 自 显影 图 形 。 中 央 孔 〈c): K Ria! 标记 ) 与 抗 Frill 的 混合 物 ; (TE) 从 乐 草 过 敏 病人 血清 《〈U) 分 离 之 含 EW Ma; (1,2,4,8) 不 同 稀释 倍数 之 耻 草 过 敏 病 人 血清 CP), 含 反应 素 抗体 ; HANK Frill 吸附 之 系 草 过 敏 病人 血清 。 比 较 (a). (b) 两 图 可 见 , 只 有 专 一 性 和 YE- 抗 Frill 沉淀 带 相同 的 带 表 现 放射 性 ( 据 Ishisaka 等 ,1966)。 *。 250。 "Ceol “eezIUSI BE) S CPA eee Ye ee Ig ey Bplay ae. ak ip 二 Rn bg aad ae g AY BEY HIER T °C 9) Be UGB AF of AE BS COM GAs, BUM lis ROSE WAS BEY °C) FEZ, WWW A. VE BA AE ae 574 «HAT UG Oh HH SEB IY DY "oC UL) VBE He 34 BG Val HG (i WE UTNE TAT 20 Ce) AH 3d BEB NY AE GL § CZ) RUGS AS BC) MO EATS YY CPG as 1 El Be ee eh HR Se — LS 7-6 AHA W- a ee = 4 HAA W-Nd SW EE Bri SHB RZeRNY as | quae nna Z i aie 基 me 4 ° ae 人 eens wey 6H napa HE RRYY Y ¥ 能 引起 P-K 反应， 并 且 这 种 活力 能 被 Ig 也 的 专 一 抗体 所 去 除 (Ishizaka 和 Ishizaka， 1967) 。 这 些 实验 在 另外 20 种 以 上 的 变 应 原 - 反 应 素 系统 (包括 筷 草 花粉 .住宅 灰尘 、 马 皮 屑 .青霉素 以 及 卵 白 蛋白 等 ) 也 得 到 证 实 。 根 据 上 述 大 量 证 据 ， 人 类 的 反应 素 抗 体 是 IgE 的 看 法 ， 目 前 已 被 普遍 接受 。Ishizaka (1973) 把 反应 素 抗 体 属于 一 类 新 的 免疫 球 蛋 白 的 证 明 总 结 于 图 9-2。 (=) IgE 的 化 学 构造 1. 抗原 性 用 放射 免疫 电泳 法 证 明了 反应 素 抗体 (Y 卫 ) 具有 其 他 类 别 和 亚 类 的 免疫 球 蛋 白 所 没 af NOC Ee) 有 的 抗原 决定 簇 。 同 时 ， 还 具有 和 其 NO 和 sp 他 类 别 的 免疫 球 蛋白 相同 的 轻 链 Ce re fe “xO if = CL) RARE ERE. BIER YE aS Bx C) S ~~ (gh 2A REREA, Ee aA OQ “em WF QO 和 其 他 免疫 球 蛋 白 相 同 的 轻 链 和 独特 抗 7M \ 的 重 链 〈s 链 ) 构成 的 〈Ishizaka 等 ， (a) (b) 1967) 。 ! x Rr, ii wiesalk (ND) 图 9-3 ae, ARAMA (ND) 和 yE(IgE) 有 相同 的 抗原 性 C 为 反应 素 抗体 含量 高 的 血清 、PS 为 另 一 种 ”的 Fec 片段 的 抗 血清 能 和 抗 Y 卫 (IgE) iin HR (4B Merler, 1970) 的 抗 血 请 沉淀 同一 抗原 (图 9-3a) 。 与 此 一 致 的 是 , 髓 细胞 瘤 蛋 白质 (ND)、Y7 卫 (IgE) 和 抗 ND 蛋白 质 之 Fe 的 抗体 产生 相同 的 沉淀 带 (图 9-3b) 。 这 些 结果 证 明 仙 细 胞 瘤 蛋 白质 (ND) 属于 Ig 卫 免疫 球 蛋 白 一 类 ， 并 且 Ig 了 的 类 别 专 一 的 抗原 决定 簇 是 位 于 分 子 的 Re 部 分 (Bennich 等 ，1969) 。 2. Ig 王 的 化 学 构造 由 于 正常 人 血清 中 Ig 了 含量 极 少 ， 分 离 困 难 ， 所 有 化 学 构造 的 研究 都 是 用 骨 细 胞 瘤 蛋白 作 材 料 进行 的 (Bennich 和 Johansson，1971) 。 然 而 ， 在 已 经 得 到 专 一 的 抗 s 重 链 的 抗 血 清 后 ,就 有 可 能 用 固 相 免疫 吸附 法 , 从 正常 人 血清 中 比较 简便 地 分 离 和 纯化 IE 了 J (Carrel 4, 1971; Aalberse 等 ，1973) 。 IgE(ND) 的 分 子 量 为 196,000， 沉 降 常数 为 7.9S， 栈 含量 较 高 ,达到 10.71%, 电 IgECND) Lt (A) (214 氨基 酸 残 基 ) 重 链 (8) (ND) F(ab’), Fd’ 1/2%Fc” = (i ##-Fd’) 196,000 22,500 75,500 104,000 29,500 4, 6000 (4 Bennich 和 Johansson, 1968), = 25278 ?(YL6I1 “ua9zspurT-IUeg Hy yoruueg. B)YIHSEMN HA AB fo MISE ?A MEME shy tk ely KE ¢z tk 6 WISNER AMINA 9 CAN)aSIY +6 © 253° ShT-4[9-old=usV-IEA-I9S-IEA-EIV-3IVW 67S -U]D-[PA-1Y,L-U]-12S-04 J-Jog—e] Y—P]Y—N[D-StH-[BA-P] V—31 y-shQ-a] 1-24 d-n]-dsy-shJ—n[pj-u iDed3 I-19 60S -PIV-SIV-IUI-IePA-nI9-nsT-3IV-I9S-sUd-IeA-sUd-sUd-ATD=: aS-4I9-shT- QUI-s4T-32V-oId-uI9-IUI-IUI-I9S [8p -SIH-31V-eIV-dsV-ord-nsT-uT9-IEA-nI9-usV-sIH-naT-dII-ul9-IPA-13S-aH-d sy-njp-o3 d-13JN-add-asV-aI9 /Gy -slI-naJT-sS《D-PTV-nseT-IUI-3IV-sS4T-dsV-3IV-I3S-《I9-oid-dII-nID-old-1UL-PIV-add-PTV-I4L-IPA-nI9-oId €Eh -ezIV-eTV-31V-old-4TID-I19S-IUI-SAT-IUL-IUIL-I9S-3S1V-13JN-nsT-eIV-3IV-old-nsT-STH-oId-sSIH-IHUIL-TeA-3SIV 60h -SAD-xI9-I4I-IUT-nIDO-4《ID-nID-3II-dIIL-xsV-3IV-IU L-4ID-1e A-O1 g—noq—1y .-19S-1y T-Je@A-14,L-NeT-14 L-ATN 585 -USV-3IV-UID9-S4T-nID-nID-S4T-3IV-IUI-I aS-sIH-xsV-TE 人 -ofId-S4T- 人 ID-I3sS-eIV-3IV-Is9S-dI 工 -ITUI-naT-uSV [9¢ -LeA-IUI-XI9-s4T-JTeS-oId-eIV-naT-XxSV-IPA-IEA-nsT-S4D-IU.I-sII-IUL-oId-: ag-sh]-B1 V-9|I-24d-ney-dsy /¢¢ -saJdd-old-I9S-old-3IV-I9S-nsT-IAI-PIV-I9S-TeEA-4TD-SIV-old~d SV-IsS=d SV-PEIV-SA4D-SAT-SAT-IUI-I9S-XSV Cle -xI9-sadd-IUI-sIH-AI9-xI9-I4I-IHUI-IeA=nID-sS4D-IUIL-IAL-IUIL-8IV-dsV-I9S-naT-dTI-sSIH-S4T-uTD-I9S-neT “682 -QIL-nsJT-nI9-IeS-nID-JqUI-IaS-eIV-nsaT-nI9-4I9-nI9-19S-nI9-jUIL-I9S-PIV-JIUIL-I9S-nsT-dsV-IEAr-dsV-13 黄 59z -ieA-xI9-hl9-xsV-xI9-naT-dzI-aUI-all-usV-atI-adI-AI9-oxd-idI-IL-hI9-raS-IeA-naT-sD-nsT-xI9-all 1bZ -JUI-old-old-ayd-sSIH-4I9-nsJT-AT9-xSV-S4D-19S-19S-xI9=-nsT-esTI-s4T-IPA-IUIL-old-ord-IqIL-add-xsV-3IV L1Z -JI9S-ShD-IeA-IsS-aUd-IUIL-S《T-TEA-uUSV-xsV-IU.L-I9S-J9S-old-lUIL-SIH-PIV-IPA-SJV-SAD-IUI-sUd-I9N-uUI9 E61 -S4T-eIV-dII-PTV-AID-Is9S-IEA-IU.L-nsT-nsT-TeS-slI-JUIL-PTIV-IAI-SUH-ATD-I9S-nsT-IUIL-nsT-ITUL-IUIL-ETIV 69T -old-nsT-IqIL-IUIL-4ID-uUSV-naT-J9S-4TD-IU.L-xXSV-dJI-z UIZIeA-aN-IeA-oxd-nl9-oxd-add-: 4L-4I9-IUI-eIV Sb -naT-S4D-4ID-nsTJT-JII-IEA-1s9S-JUL-PIV-USV-I aS-ord-alI-xsV-sAT-s4D-SkD-3JV- 芭 L-naT-orxd (add'TeA'cUIL 1Z1 old ‘A[D ‘AULL IYL ‘49g AID TUL “49g “TRA ULL “TEA ‘MIDS ‘STH ‘AID ‘X19 “44,1 *xSV “19S ‘X1D ‘X1D ‘XS )ShT-BIV 16 -SAD-IJI 人 TI-sUd-IeA-eIV-JsS-xSV-XxSV-IaS-3JV-n 5 IN-=J4I-eIV-JIUI-J9S-seUd-IeS-PIV-XSV 5/ -3JV-JUL-I3JN-IqI-IEA-STV-MLIDO-xID-aqd-3JV=-old-eIV-IAI-XSV-J4L-AID-AI9-I9S-xsSV-ozd-xsSV-sl 一 一 二 的 — (diI-nl9-nsT-h4I9-hI9-sIHH-eIV-xl9-SzV-all-dJI-4I9-lPA) -II-19S-dsV-sll-sdd-IT( 一 一 5 一 )skT-skD-yes-IeA-SiV-IeA-laS-eTV-4I9-oad-shT-S1V-IeA-xl9-eTV-hI9-laS-xI9-TeA-nsT GIOTrA TD 1 9-5 8 链 \7 链 和 忆 链 构造 的 比较 。 示 重 链 间 二 硫 键 、 功 能 区 和 低 聚 糖 单位 〈A,B,C… 等 ) 的 位 置 。7 PETE RHE th DSF Ci 和 Ci 的 功能 区 ( 据 Bennich 和 Bahr-Lindstrom, 1974), 泳 行为 相当 于 Y1。 分 子 的 基本 构造 是 由 两 条 相同 的 轻 链 (上 “或 1 型 ) 和 两 条 特殊 的 重 链 (8 链 ) 组 成 的 。 木 瓜 酶 处 理 时 ， 分 子 被 切断 成 Fab 和 Rece 片 段 。 类别 专 一 的 抗原 决定 徐 位 于 了 ce 片段 上 。 经 胃 和 蛋白酶 切断 成 了 (ab )。 和 了 c 。。I8gZE 及 其 s HH. BRA RA 性 质 列 于 表 9-2。 1 1974 年 已 有 人 把 IgE (ND) 的 s 重 链 的 氨基 酸 排列 顺序 基本 上 弄 清楚 了 【图 :9-4) (Bennich 和 Bahr-Lindstrém, 1974), . 8 重 链 是 由 约 550 氨基 酸 残 基 构 成 的 。 根 据 链 内 二 硫 桥 的 分 布 位 置 和 排列 顺序 的 同 源 性 ，s 重 链 可 分 为 5 个 同 源 区 (功能 区 )。 . 除 易 变 区 (Vse) 外 ， 还 包括 不 变 区 的 4 个 同 HK (Cl, C2, CRMC!). 虽然 易 变 区 (Ve) 的 排列 顺序 还 有 两 段 不 清楚 ， 但 是 根据 N 端 是 封闭 的 ， 以 及 9 和 23 位置 是 Ala 和 Lys 等 特点 ， 表 明 IgE (ND) A V. 链 可 能 属于 Vn 亚 类 。 这 再 一 次 支持 重 链 易 变 区 (Va) 的 同 源 性 和 重 链 的 类 别 无 关 ， 而 独立 地 进化 的 假说 。 IgM 的 & 重 链 也 含有 5 个 同 源 区 。 和 由 链 比 较 ，s 链 的 显著 区 别 是 缺少 C 端的 19 KK (9-5). © HE (ND) 有 15 个 半 胱 氨 酸 ， 其 中 10 个 形成 功能 区 的 链 内 二 硫 键 。 * 链 只 有 3 个 链 间 二 硫 键 ， 一 个 连接 重 链 和 轻 链 ， 包 括 Cys-128 (或 Cys-129); 另 二 个 是 es 链 彼此 之 间 互 相连 接 的 ， 一 个 在 Cys-231 位 置 ， 另 一 个 在 Cys-318 位 置 。 剩 余 的 两 个 半 胱 氨 酸 Cys-129 (或 Cys-128) 和 Cys-215 构成 Ci 同 源 区 之 额外 的 一 个 链 内 二 tit 键 。 这 种 情况 ， 即 Ck 功能 区 有 两 个 链 内 二 硫 键 ， 还 见于 家 免 的 Y 链 。 然而 ， 两 个 重 链 间 二 。 254。 表 9-3 IgE(ND) s 链 的 低 聚 糖 组 成 及 糖 多 肽 的 氨基 酸 排列 顺序 每 克 分 子 糖 多 肽 的 糖 残 基数 目 ” 有 a EFL 唾 酸 135 A. -Ile—Pro-Ser-ASN-Ala-Thr-Ser- 3 2.5(2) 0.5¢1) 163 B. -Gly-Ser-Leu-ASN-Gly-Thr-Thr- - 2373) 0.7(1) 208 C. -Ser-Thr-Asx-ASN-Val-Lys-Thr- 2.6(2—3) 2252) D. -Gly-Thr-Ile-~ASN-Ile-Thr-T rp- 2.2(2) 1.4(1 一 2) 361 E。-Gly-Thr-Val-ASN-Leu-Thr-Trp= 2.0(2) 1.4(1—2) F. -Lys—Gln-Arg-ASN-Gly-Thr-Leu- 0.3(0) 一 12.3 6.3 每 一 条 8 RVR HE RK 8.5 9 a 转化 为 TMS- 衍 生物 ,用 气 液 相 层 析 法 测定 ; b 数字 表示 在 图 内 的 排列 顺序 ; “ 根据 Bennich,，H. 和 Lo- hansson, S. G. O. (1971), Adv. Immunol.V. 13. (42 Bennich 和 Bahr-Lindstrom, 1974), mei “Re” ARMNILE, :一 个 位 于 Ci MC? 之 间 ， 另 一 个 位 于 C: MC? 之 间 , 却 fe & 链 独特 的 地 方 。 IgE (ND) 的 酶 含量 很 高 。 e 链 (ND) 有 6 个 低 聚 糖 侧 链 : 一 个 位 于 V，C 之 间 ( 和 Asn-135 连接 ) ， 一 个 位 于 Cl (和 Asn-163 连接 ) ， 一 个 位 于 “ 镶 链 区 ”( 和 Asn-207 或 -208 连接 ) ， 一 个 位 于 C: (和 .Asn-255 EH), WRAP C2 (和 Asn-361, Asn-384 连接 )。 它 们 的 糖 组 成 和 糖 多 肽 的 氨基 酸 排列 顺序 列 于 表 9-3 (Bennich 和 Bahr-Lin- dstrm，1974) 。 和 IgM 的 上 链 相 比 较 ， 它 们 的 糖 侧 链 没 有 明显 的 同 源 性 。 根据 酶 解 片段 的 研究 ，Ig 卫 的 细胞 亲 合 性 和 了 ec 有 关 ， 而 和 Fe" Rt F(ab’), CX. ix 提示 Igk 的 细胞 亲 合 性 可 能 和 C2 BKC! 功能 区 有 关系 (图 9-6) 。 已 知 反应 素 抗体 的 特点 是 56"C 热 不 稳定 。 现 已 知道 ， 这 只 是 由 于 CMC! 功能 区 发 生 不 可 道 变 性 的 结果 ,而 不 是 由 于 二 硫 键 的 改变 。 抗原 性 分 析 也 发 现 ， 只 有 D2 抗 原 ( 限 于 Cs MC 功能 区 ) 在 轻 链 L___ no LER LIS Se RA ees es DD a nel eee .结合 抗原 结合 肥大 细胞 功能 9-6 8s- 链 功能 区 的 位 置 和 酶 解 片 咒 的 关系 ( 据 Bennich 和 Bahr-Lindstrom, 1974), 图 9-7 人 IgE (ND) 的 基本 化 学 结构 简 图 。 A,B, C.…. 为 低 聚 糖 ( 据 Bennich 和 Bahr-Lindstram 1974， 改 终 )。 56“C 时 ， 其 抗原 性 逐渐 消失 (Dorrington 和 Bennich, 1973), 根据 上 述 资料 Ig 了 分子 的 基本 结构 推 想 如 土 图 所 示 。 . 关于 Ig 了 分子 在 溶液 中 的 物理 性 质 ， 利 用 萤 光 偏振 和 电子 自 旋 共 振 (ESR) 两 种 方 法 ， 对 另 一 个 ICE (Yu) 髓 细胞 瘤 蛋白 研究 的 结果 ， RAE 分子 比 IgE G 分 子 的 柔 曲 性 要 小 得 多 (Nezlin S, 1973), KiemIgE HW Fab 之 间 可 能 有 更 多 的 键 连接 ， 或 者 可 能 和 前 述 IE 也 “ 贸 链 区 ”二 硫 键 独特 的 排列 方式 有 关系 。 如 前 所 述 ， 哺 乳 类 IEG，IgM 和 IgA 分 子 都 有 相当 大 的 柔 曲 性 ， 而 IgE 卫 和 它们 比较 起 来 柔 曲 性 要 小 得 多 。 已 知 前 几 类 抗体 分 子 都 能 和 抗原 相互 作用 ， 形 成 沉淀 ;而 Ig 了 抗体 则 不 能 形成 沉淀 。 因 此 ， 有 理 由 认为 这 种 功能 上 的 差别 可 能 和 分 子 一 般 构造 的 柔 曲 性 的 差别 有 关系 (Zagyansky 等 ， 1974). (=) IgE 的 含量 、 合 成 地 点 和 代谢 正常 成 年 人 血清 中 IgE 含量 极 少 ， 约 100 一 200 AGE Ft. ALPERT BURA. CE 路、 枯草 热 ,湿疹 等 ) ， 血 清 中 IgE 含量 平均 比 正 常 含量 高 3 一 10 倍 。 感染 量 虫 的 病 人 ， 血清 中 IgE 增加 更 为 显著 ， 可 达到 4,400 毫 微克 /毫升 ， 其 他 寄生 虫 病 , 如 血吸虫 、. 钩 虫 、 丝 虫 等 也 发 现 有 类 似 的 升 高 现象 (Johansson 等 ,1972) 。 已 知 IgE MKS 生物 学 半衰期 很 得 ， 只 有 2 一 3 K (Waldman，1969)， 而 IgG 可 长 达 25 天 。 因 此 ， 异 位 性 过 敏 病人 体内 应 不 断 地 合成 Ig 了 。 AARC RICA, BIT IgE 形成 细胞 的 组 织 学 分布 (Tada 和 Ishizaka， 1970) ， 观 察 到 在 重复 感染 的 病人 手术 切除 的 扁桃 腺 和 增殖 腺 内 含 ITg E 的 浆 细 胞 数目 最 多 ( 占 细 胞 总 数 的 5 一 6%) ， 位 于 滤 泡 周围 和 某 些 生发 中 心 。 气管 和 胸膜 的 淋巴 结 内 也 有 这 类 细胞 分 布 。 与 此 相反 ， 脾 胜 和 皮下 淋巴 结 内 却 很 少 。 最 值得 注意 的 是 IgB 合成 细胞 是 和 IgA 合成 细胞 相伴 随 的 , 在 呼吸 道 .消化 道 粘膜 以 及 这 些 部 位 的 局 部 淋巴 结 内 有 大 量 。256。 表 9-4 IgE 形成 细胞 在 淋巴 组 织 内 的 分 布 分 布 ( 表 9-4) 。 这 种 分 布 情况 说 明 Ig 卫 抗体 可 能 是 在 局 部 合成 的 , 并 参加 引起 这 些 器 官 的 变态 反应 性 疾病 。 实际 上 ， 从 哮喘 病人 鼻腔 洗 出 液 和 痰 中 可 测 出 IgE (Ishizaka 和 Newcomb, 1970)。 利用 抗 Ig 卫 免疫 吸附 剂 从 枯草 热 病 人 痰 中 提取 出 的 IgE 卫 表现 出 反应 素 抗 体 活 _ 力 ， 以 及 高 度 的 致 敏 皮肤 的 活力 。 所 有 这 些 事实 表明 ， 呼 吸 道 之 反应 素 抗体 参与 的 过 敏 反应 可 能 是 变 应 原 局 部 致 敏 的 结果 ， 局 部 形成 的 Ig 卫 抗体 可 能 在 这 些 器 官 的 变态 反应 性 疾病 的 发 病 过 程 中 起 主要 的 作用 。 (四 ) IgE 的 免疫 学 功能 _ 1. 红血球 凝集 作用 对 系 草 过 敏 病人 的 Ig 卫 抗体 能 使 镀 抗 原 的 红血球 被 动 凝集 。 根 据 IgE 肽 链 组 成 , 推 想 Ig 也 可 能 是 双 价 抗体 (Ishizaka 和 Ishizaka，1968b) 。 2. 固定 补体 问题 反应 素 超 敏 反应 中 ， 是 否 有 补体 参加 作用 ， 曾 经 是 长 期 争论 的 问题 。 用 一 般 方法 不 能 测 出 Ig 孔 抗体 有 固定 补体 的 能 力 。 为 了 排除 IE 也 具有 微弱 的 固定 补体 的 可 能 性 , 特别 研究 了 聚集 的 IgE 通 细胞 瘤 蛋白 的 固定 补体 的 能 力 ， 即 使 达到 800 微克 IgE AM /毫升 的 剂量 也 无 作用 。 RRW Ig 卫 不 能 固定 Cla， 也 不 能 从 纯化 的 C3 形成 过 敏 毒素 (Ishiza- ka 等 ，1970) 。 因 此 ， 认 为 Ig 卫 抗体 引起 的 过 敏 反应 可 能 没有 补体 参加 。 可 是 ,最 近 发 HARSH IGE 经 过 一 条 支 路 能 固定 补体 的 后 几 个 成 分 (C3 一 C9) RMIT C1、C4 和 C2， 而 单 体 IE 卫 则 不 能 (Ishizaka 等 ，1972) 。 这 一 问题 还 有 待 进一步 研究 解决 。 3. 致 敏 同 种 组 织 反应 素 抗 体 IgE) 最 重要 的 免疫 学 特性 是 臻 敏 同型 组 织 的 能 力 。 例 如 对 系 草 过 敏 病 。 257。 人 血清 的 IgE 抗体， 使 人 皮肤 致 敏 〈P- 开 反应 阳性 ) 的 剂量 为 4x10- 微 克 氟 /毫升 (Ishizaka 等 ，1967) ， 而 人 的 其 他 几 类 免疫 球 和 蛋白 IgG, IgM, IgA, IgD 都 不 能 使 人 皮肤 致 敏 。 4. PCA 反应 & IgE 抗体 的 异 位 性 过 敏 病 人 血清 注射 到 猴子 皮肤 内 能 引起 被 动 皮肤 过 敏 反 应 (PCA 反应 ) 。 对 一 种 猴子 (Macaca irus) 所 需 的 最 低 有 效 剂量 为 10° 微克 氮 /毫升 。 A IgE 抗体 对 豚鼠 不 能 引起 PCA 反应 。 后 来 ， 用 逆 PCA 反应 重新 研究 这 一 问题 。 豚 鼠 先 皮 内 注射 IgE 骨 细 胞 瘤 蛋 白质 ，3 小 时 后 静脉 注射 抗 -Ig 卫 抗体， 结果 表明 甚至 TIg 卫 浓度 增加 到 100 微克 氮 /毫升 也 无 效 。 因此 ， 人 IgE 只 能 使 同 种 或 血缘 关系 上 邻近 的 种 CHRIS) 的 皮肤 致 敏 , 而 不 能 使 豚鼠 皮肤 致 敏 。 5. Ba A IER 从 异 位 性 过 敏 病 人 分 离 的 白血球 接触 到 变 应 原 时 ， 就 能 释放 出 组 织 胺 (Lichtenste- in 和 Osler，1964) 。 含 反应 素 血 清 还 可 以 使 正常 白血球 被 动 致 敏 ， 再 和 抗 -Ig 卫 抗体 接触 时 也 能 释放 出 组 织 胺 。 显然 ， 在 被 动 致 敏 过 程 中 ，Ig 了 附着 到 和 白 血球 上 去 了 (图 9-8) (Ishizaka 等 ，1969) 。 这 一 发 现 支 持 变 应 原 80 A oN 诱发 白血球 释放 组 织 胺 可 能 是 和 i a ee ii aa SLA Sl Igk 有 关系 的 。 = 5 6. am mis 含 反应 素 的 血清 在 离 体 条 件 下 20 能 被 动 致 敏 猴 肺 组 织 ， 再 与 变 应 原 接触 就 能 诱发 释放 组 织 胺 和 慢性 作 eis claws FR (SRS-A)”, BAU HlgE peer a ee Bs EOL MS FH RI a BR SS Be 微克 抗体 氮 / 毫 升 抗 -IgE 力 o 此 时 , 血清 中 IgG,IEA,:ISM 的 浓 9-8 KAVA lek 抗体 引起 反应 素 被 动 致 敏 的 白血球 “ 度 未 变 。 因 此 ,这 提示 IgE 参与 变 应 释放 组 织 胺 直接 (抗原 @ 逆 反应 〈 抗 IgE) ( 据 Ishizaka 和 原 诱 发 的 肺 组 织 的 组 织 胺 和 SRS- aca an A 的 释放 。 鉴 于 这 两 种 物 质 是 引起 人 类 哮喘 的 化 学 介质 ， 上 述 观 察 有 力 地 提示 IgE 抗体 参与 呼吸 道 变态 反应 的 发 病 机 制 。 7. 致 敏 大 鼠 的 肥大 细胞 以 往 认 为 反应 素 抗 体 的 特点 是 只 能 致 敏 同 种 组 织 ， 因 而 归并 到 同 种 亲 合 抗体 。 目 前 已 经 证 明 人 的 Ig 了 反应 素 抗体 ， 除 了 致 敏 同 种 组 织 外 ， 还 能 够 致 敏 大 鼠 腹 腔 内 的 或 离 体 培养 的 肥大 细胞 ， 当 再 遇 到 同型 抗原 或 抗 IE 卫 抗体 时 ， 便 能 引起 细胞 内 嗜 奏 性 颗粒 的 释 1) 1979 年 始 发 现 慢性 作用 物质 (SRS) 是 一 类 在 化 学 上 与 前 列 腺 素 相近 的 新 化 合 物 , 称 为 白血球 三 烯 (Leucotrie- nes), 它 们 可 能 参与 过 敏和 炎症 反应 (参看 : Science 215 %, 1380 页 ，1982)。 * 258。 放 〈Krotzer 和 Haddad, 1970; Orange 和 Austin，1973) 。 同 样 地 ， 小 鼠 Ig 卫 也 能 专 一 地 和 大 鼠 肥 大 细胞 结合 (Konig 等 ，1974) 。 因 此 ， 同 种 亲 合 性 抗体 的 概念 已 不 完全 适用 于 Ig 孔 抗体， 最 好 还 是 用 反应 素 抗体 一 词 为 宜 。 离 体 大 鼠 肥大 细胞 颗粒 释放 技术 (Rat mast cell degranulation technicque, {ij 称 RMCD 法 ) 对 于 检查 Ig 了 抗体 及 其 变 应 原 ， 以 及 筛选 抑制 反应 素 过 敏 反应 药物 是 一 个 很 有 用 的 方法 (Krotzer 等 ，1971; Johansson 等 ，1972) 。 (五 ) 反应 素 过 敏 反应 的 分 子 细胞 学 机 制 1 IgE 和 致 敏 细 胞 的 机 制 IgE 抗体 的 特性 是 使 同 种 组 织 致 敏 的 能 力 〈 后 来 发 现 对 某 些 异种 肥大 细胞 th BE Be 敏 ) 。 这 可 能 是 由 于 Ig 卫 对 参与 反应 素 过 敏 反应 的 靶 细 胞 有 特殊 的 亲 合 力 。 非 抗 体 的 IgE KIgk 髓 细胞 瘤 蛋白 质 都 能 封闭 反应 素 抗体 的 被 动 致 敏 作用 ， 而 其 他 四 类 免疫 球 蛋 自 , 则 没有 这 种 作用 (Stanworth 等 ，1967; Ishizaka 等 ，1967c) 。 另 一 方面 , 抗 Ig 卫 抗 血 清 能 引起 被 动 致 敏 的 肥大 细胞 的 “ 逆 过 敏 反应 ”(“ Reversed type” allergic seac- ions) ， 而 对 抗 其 他 几 类 免疫 球 蛋 白 的 抗 血 清 都 不 能 引起 这 种 反应 ， 也 证 明 靶 细胞 表面 确 有 IgE 了 存在 ， 而 没有 其 他 免疫 球 蛋 白 存 在 。 已 证 明 IgE 分 子 和 靶 细 胞 (如 肥大 细胞 ) 表面 受 体 亲 合 是 通过 Fe, LHW. Igk he 细胞 瘤 蛋 白质 的 了 cs 片段 能 专 一 地 封闭 反应 素 抗体 对 人 和 猴 皮 肤 的 被 动 致 敏 反 应 , 而 其 它 的 片段 Fab，F (ab' )， 都 不 能 (Stanworth 等 ，1968) 。 此 外 ， 在 “ 逆 过 敏 反 应 ?实验 fH, Fe, 还 能 使 人 白血球 ， 猴 肺 组 织 被 动 致 敏 (Ishizaka 等 ，1970) 。 猴 肺 组 织 经 1 微 克 /毫升 的 Res 被 动 致 敏 后 ， 再 用 抗 IE 也 抗 血 清 处 理 时 ， 便 能 诱发 组 织 胺 和 SRS-A 的 释放 。 以 上 这 些 事实 表明 IgE OF eM Fe. 部 分 和 靶 细 胞 表面 受 体 结合 的 ， 并 且 IgE 分 子 的 效应 器 也 应 位 于 FFcs 上 。 haa s- 链 的 一 级 结构 的 阐明 ， 已 有 可 能 用 按 一 定 排 列 顺序 合成 的 肽 段 来 研究 IgE 合 细 胞 功能 的 结构 基础 。 有 人 合成 了 位 于 s- 重 链 间 二 硫 桥 附 近 的 一 个 5 肽 (320 至 324 fit): Asp-Ser-Asp-Pro-Arg; 并 发 现 此 5 肽 能 专 一 地 抑制 P-K 反应 和 已 知 的 皮 试 阳性 反应 ， 而 其 他 合成 的 结构 类 似 物 没有 或 只 有 较 小 的 抑制 能 力 ( 表 9-5) 。 Alt, VE 者 认为 这 一 五 肽 的 排列 顺序 很 可 能 代表 和 肥大 细胞 和 嘻 碱 性 细胞 表面 IgE 瑟 受 体 专 一 结 合 的 主要 抗原 决定 簇 的 构造 (Hamburger, 1976), FAT pric it IsE 抗 血清 的 放射 自 显影 实验 表明 ，Ig 了 对 白血球 的 结合 有 高 度 的 专 一 性 ， 只 和 嘻 碱 性 白血球 结合 。 已 知 嗜 碱 性 白血球 内 的 嗜 碱 性 颗粒 含有 大 量 与 肝素 蛋 白质 复合 物 结合 的 组 织 胺 。 4A 标记 的 抗 Ig 卫 抗 血 清 处 理 后 ， 细 胞 学 检查 发 现 有 放 射 径 迹 的 嗜 碱 性 白血球 内 的 嗜 碱 性 颗粒 消失 了 。 已 知 组 织 胺 的 释放 依赖 Ca*+。 如 果 用 EDTA 抑制 组 织 胺 释放 ， 结 果 几 乎 所 有 2sI 标记 的 细胞 都 保留 着 嗜 碱 性 颗粒 。 这 些 实验 表明 :，Ig 了 能 选择 地 结合 在 嗜 碱 性 白血球 上 ， 当 再 和 变 应 原 或 抗 Ig 孔 抗体 相互 作用 时 ， 便 导 致 组 织 胺 等 化 学 介质 的 释放 (Ishizaka 等 ，1970)。 用 同样 的 方法 证 明了 儿 皮 肤 、 大 网 膜 ,小 肠 等 组 织 内 ，Ig 了 的 妓 细 胞 是 肥大 细胞 ， 并 存在 类 似 的 释放 机 制 。 一 般 说 来 ， 各 类 细胞 亲 合 抗体 各 有 其 细胞 结合 专 一 性 。 和 IgEB Al, IgG 只 和 嘻 中 性 球 和 单 核 球 和 259 « 表 9-5 人工 合成 的 肽 段 对 P-K 反应 的 抑制 , 示 结 构 和 功能 的 关系 HK 4 平 | OD i] fe | No. | HE FN ihe % 范 国 I Asp-Pro-Arg 15 0 一 38 Il Ser—Asp-Pro-Arg 18 0 一 50 III Asp-Ser-Asp-Pro-Arg 72 60—89 IV Ala—Asp-Ser—Asp-Pro-Arg 46 10—61 V Asp-Thr-Glu-Ala-Arg 58 38 一 80 VI Tos-Arg-Ser-Met 24 0 一 40 ( 据 Hamburger, 1976), ( 巨 吻 细 胞 ) 结合， 而 不 和 哮 碱 性 白血球 结合 ， 因 而 引起 不 同 的 继 发 反应 。 这 种 免疫 学 功 能 的 区 别 的 基础 又 在 于 各 类 免疫 球 蛋白 Fe 结构 的 分 化 。 2. 反应 素 过 敏 反 应 的 分 子 细胞 学 机 制 为 什么 变 应 原 或 抗 Ig 孔 抗体 与 结合 在 细胞 表面 上 的 Ig 也 起 反应 时 能 引起 反 应 素 过 敏 反 应 呢 ? 为 了 探讨 这 一 问题 ， 曾 有 人 利用 豚鼠 抗 IE 也 抗体 的 酶 解 片段 处 理 经 Ig 孔 致 敏 . 的 细胞 ， 发 现 双 价 的 了 (ab), HERES | IAHR ERA AA, Aor Fab’ HEE, Bl 使 浓度 增加 100 倍 也 不 能 引起 阳性 反应 〈Ishizaka , 1969), 对 于 被 动 致 敏 的 猴 肺 组 织 ， 也 得 到 同样 的 结果 (Ishizaka 等 ，1970) 。 这 些 实验 结果 似乎 提示 诱发 靶 细 胞 的 反 应 可 能 要 求 结合 在 细胞 表面 的 两 个 Ig 卫 分 子 之 间 “ 搭 桥 >。 为 了 验证 这 一 假说 ， 进 一 步 的 实验 发 现 非 专 一 地 聚集 的 Ig 卫 分 子 也 能 引起 人 AURA RRR, tm IgE 的 单 体 ， 即 使 剂量 增 加 1 00 倍 仍然 不 能 引起 阳性 反应 (Ishizaka 等 ， 1970) 。 此 外 , 还 发 现 聚 集 的 Fe 片段 (0.1 一 0.3 这 微克 氮 ) 就 能 在 正常 人 引起 皮肤 反应 ， 而 Fe 单 体 1 毫 微克 的 剂量 也 不 能 引起 反应 。 同 样 地 ， 聚 集 的 Fe 或 Ig 了 都 能 引起 正常 人 的 白血球 、 猴 肺 组 织 释 放 组 织 胺 和 SRS-A， 而 了 ec 单 体 或 聚集 的 Ig 了 的 了 (ab' )* 都 无 此 作用 。 另 一 方面 , 用 超 离 心 法 鉴别 免疫 复合 物 内 抗原 抗体 的 比例 ， 也 发 现 形成 一 个 有 致 敏 活力 的 复合 物 ， 至 少 必须 有 2 个 Ig 孔 分子。 所 有 这 些 事实 都 支持 上 述 的 假说 ， 即 图 9-9 变 应 原 引起 靶 细 胞 释放 组 织 胺 通过 抗原 的 “搭桥 ?>， 使 结合 在 靶 细 胞 表面 的 两 个 SORA LES IgE 分 子 互相 贴近 而 引起 的 分 子 间 的 相互 作用 或 分 子 内 构象 的 变化 ， 是 和 靶 细 胞 的 化 学 介质 的 释放 有 关系 的 (图 9-9)。 另 一 方面 ， 用 DNP 或 BPO 半 抗 原 载 体 结合 物 免疫 家 免 ， 产 生 专 一 的 反应 素 抗体 。 取 其 白血球 , 经 洗涤 后 作 体外 组 织 胺 释放 实验 ， 发 现 当 免疫 时 仅 含 一 种 半 抗 原 (DNP 或 BPO) ， 只 有 相应 的 双 价 半 抗 原 (Di-DNP 或 Di-BPO) 才能 引起 白血球 的 释放 反应 ,而 * 260° 单价 半 抗 原则 能 专 一 地 抑制 双 价 半 抗 原 引 起 的 释放 反应 。 可 是 ， 混 合 双 价 半 抗 原 (混合 - BPO 和 DNP) 却 和 单价 半 抗 原 一 样 ， 也 能 抑制 仅 含 一 种 半 抗 原 (BPO 或 DNP) 的 结合 物 免 疫 的 家 免 白血球 的 释放 反应 。 对 于 用 两 种 半 抗 原 (DNP 和 BPO) 载体 结合 物 同时 免疫 的 家 兔 的 白血球 ， 混 合 双 价 半 抗原 (混合 -BPO 71 DNP) 则 能 引起 组 织 胺 杰 放 反应 ; 并 且 两 种 半 抗 原 (DNP 或 BPO) 都 能 抑制 组 织 胺 释放 反应 。 这 些 实验 证 明 双 价 半 抗原 引起 组 织 胺 释放 反应 时 ， 必 须 能 使 结合 在 膜 上 的 两 个 抗体 分 子 之 间 “ 搭 桥 ” (Magro 和 Alexander，1974) 。 根据 这 些 实验 结果 ， 可 以 设想 反应 素 过 敏 反 应 的 分 子 细胞 学 机 制 是 : 在 致 敏 状 态 下 ，Ig 了 抗体 分 子 通过 Fe 能 选择 地 和 某 些 组 织 细胞 的 表面 受 体 杂 合 。 由 于 多 价 的 抗原 和 这 些 固定 在 靶 细 胞 表面 的 抗体 结合 ， 形 成 免疫 复合 物 的 结果 ,和 同一 多 价 抗原 结合 的 Ig 卫 抗体 分 子 之 间 便 可 能 发 生 相 互 作用 ， 导致 抗体 Fe 部 分 发 生 构象 变化 ， 从 而 触发 细胞 的 释放 机 制 。 另 一 种 可 能 的 解释 是 多 价 抗原 和 细胞 表面 结合 的 Ig 卫 分 子 “ 搭 桥 ? 时 ， 也 就 引 起 了 细胞 表面 Fe. 受 体 的 簇 集 和 构象 变化 ， 从 而 触发 细胞 内 的 释放 机 制 。 近 来 ， 有 人 从 肥大 细胞 和 嗜 碱 性 白血病 细胞 表面 分 离 出 IE 也 受 体 (Conrad 等 ，1976) ， 并 证 明 IgE 受 体 和 了 cs。 是 单价 结合 的 (Newman 等 ，1977) 。 这 提示 肥大 细胞 的 释放 机 制 很 可 能 是 在 IgE 分子“ 搭桥 ?时 ， 引 起 细胞 表面 Fe. 受 体 的 签 集 或 聚合 而 发 动 的 。 3. 肥大 细胞 颗粒 的 释放 和 抑制 临床 上 很 早 就 发 现 甲 基 黄 叮 叭 衍生 物 ， 如 咖啡 碱 、 茶 叶 碱 (Theophylline) 等 ,能 减轻 反应 素 过 敏 反应 (如 哮喘 等 ) 病人 的 症状 。 但 过 去 对 这 些 药物 的 作用 原理 不 清楚 。 离 体 培养 的 人 肺 组 织 ， 尤 其 是 离 体 大 鼠 肥 大 细胞 颗粒 释放 技术 (RMCD) 的 建立 ， 提 供 了 研究 肥大 细胞 杰 放 组 织 胺 和 SRS-A 等 化 学 介质 的 机 制 及 其 抑制 的 方便 的 模型 ， 这 方面 的 研究 才 得 到 较 快 的 进展 。 在 离 体 模型 上 进行 的 这 些 实验 发 现 ， 凡 是 能 刺激 细胞 膜 腺 嗓 聆 环 化 酶 ， 促 进 C-AMP 合成 的 药物 ， 如 肾上腺 素 、isoprenaline、 前 列 腺 素 EE. E, 等 以 及 能 抑制 C-AMBP 分 解 的 药物 ， 甲 基 黄 味 叭 衍生 物 ， 如 茶叶 碱 或 氮 条 碱 等 ， 都 能 抑制 表 9-6 药物 处 理 对 IgE 抗 IgE 反应 引起 的 肥大 细胞 颗粒 释放 的 抑制 影响 下 列 浓 度 对 细胞 颗粒 释放 的 抑制 百分率 92: 药 物 10-°M 10-*M 10M 10-*M 10-7M 10-*M 10-°M 10-°M | | Te | | Isoprenaline (|85.2+6.16|74.2+4.67|21.0+7.48 肾上腺 素 80.444.24|72.043.06/19.34+2.16/15.04+3.2 茶叶 碱 87.5 土 4.50|78.8 士 4.78|72.5 土 1.88|13 -6 土 6.88 氮 茶 碱 58.5 土 16.2|12.8 土 3.20|10.0 士 1.63 fH RE AN 87.241.40|78.742.94|72.24+3.7913.7+40.81 Chlorphenesin |79.447.76162.3+4.08|44.648.8614.2+1.24 前 列 腺 素 py | 86 .6+5.09183.0-+3.10\70.244.90|12.8+1.22 if E, | / | 85.4+1.63/83.046.78|33.6-+5.89|10.8+2.94 E,，E， 抑 制 效 应 在 很 低 浓 度 (10*—10°M) 起 作用 。 (# Kimura 等 ,1974)。 ¢ 261° 肥大 细胞 颗粒 的 释放 ( 表 9-6) 。 此 外 ， 二 丁 基 -C-AMP 本 身 也 有 这 种 抑制 作用 。 总 之 ,凡是 能 直接 或 避 接 地 增加 细 胞 内 C-AMBP 水 平 的 药物 都 能 产生 这 种 效果 。 这 些 事实 提示 ， 在 反应 素 抗体 引起 的 肥大 细胞 和 嘻 碱 性 白血球 的 颗粒 释放 机 制 中 ,C-AMBP 可 能 起 关键 作用 (图 9-10), C-AMP 能 pee et 肾上腺 素 抑制 TIg 也 诱发 的 人 皮肤 过 敏 反 应 也 支 Propranolol Phenoxy- wn, 持 这 一 看 法 (Yamamoto “4, 1972), 此 外 , 增加 细胞 膜 的 稳定 性 的 药物 , 如 色 甘 酸 钠 (Cromoglycate) 也 能 抑 制 这 些 细胞 颗粒 的 释 HK (Orange 和 Austin, 1973; Kimura 等 ，1974) 。 以 上 这 些 发 现 对 于 合成 和 筛选 抗 过 敏 药 物 的 意义 是 显而易见 的 。 近 来 有 人 报告 一 种 氧 代 黄 厢 叭 衍生 物 ies oe ee te [=| —- | ae | (2-O-propoxyphenyl-8-azapurin- 6-one) 在 实验 模型 上 抑制 反应 素 过 敏 反 应 的 能 力 比 目前 临床 上 治疗 哮喘 9-10 ”反应 素 抗 体 引 起 的 肥大 细胞 化 学 介质 的 释放 和 抑制 示 “最 有 效 的 药物 一 一 色 甘 酸 钠 ， 还 要 强 BA. IgE 抗体 和 专 一 抗原 的 相互 作用 激发 一 系列 酶 促 反应 (CE ”20 一 50 fr, 很 可 能 有 临 床 应 用 价值 =F), SEERA SRS-A 的 释放 。 此 反应 系列 受 细胞 内 C-AMP 水 平 调节 .肾上腺 素 或 fsoproterenol 等 刺激 6- 受 体 的 “〈Brughton 等 ，1974) 。 药物 能 激活 细胞 膜 上 的 聊 呆 叭 环 化 酶 ,从 而 促进 C-AMP 的 合成 ， 结果 细胞 内 C-AMP 增 加 ， 抑 制 组 织 胺 和 SRS-A 的 释放 。 用 Phenoxybenzamine 抑制 肾上腺 素 的 刺激 c=- 受 体 的 作用 也 可 以 小 “A 加 强 肾上腺 素 的 抑制 作用 。 反之 ， 用 Propranol 4M EB 的 _B- 受 体 刺 激 作用 时 ,细胞 内 C-AMP 降 低 ， 结 果 化 学 介质 的 释 放 增 加 。 C-AMP 通 常 被 磷酸 二 柄 酶 分 解 ， 当 此 酶 的 作用 被 甲 基 1. 人 的 反应 素 抗 体 属 于 一 类 新 黄 呆 叭 类 药物 抑制 时 ，C-AMP 水 平 增加 ,化 学 介质 的 释放 也 受到 “的 免疫 球 蛋白 IgE， 其 化 学 性 质 为 二 抑制 ( 仿 Orange 和 Austen，1973)。 种 Y1- 酷 蛋白 ,分 子 量 为 196,000。 分 子 的 基本 构造 含有 两 条 相同 的 轻 链 OMe) 和 两 条 特殊 的 重 链 (s) 。 重 链 的 一 级 结构 已 差不多 弄 清 楚 了 。 2. Ig 了 在 血 生 中 的 含量 极 低 ， 在 异 位 性 过 敏 病人 ， 尤 其 是 寄生 虫 病 病人 血清 中 含量 Ri. IgE 的 生物 学 半衰期 只 有 2 一 3 天 。 I8g 了 的 合成 地 点 可 能 主要 是 在 呼吸 道 和 消化 道 局 部 的 淋巴 组 织 。 从 呼吸 道 异 位 性 过 敏 病人 的 痰 内 可 检测 出 IE 也 抗体 。 这 些 事实 表明 局 部 形成 的 Ig 也 抗体 可 能 在 哮喘 等 呼吸 道 异 位 性 过 敏 反 应 的 发 病 机 制 中 起 主要 作用 。 3. Ig 了 抗体 能 被 动 凝集 红血球 ， 因 此 可 能 是 双 价 的 。 然 而 ，Ig 卫 用 一 般 方 法 不 能 测 出 固定 补体 的 能 力 。 人 IgE 可 使 人 和 猴 的 皮肤 致 往 ， 但 对 豚鼠 无 作用 。 人 的 白血球 、 猴 肺 组 织 经 IE 卫 致 敏 后 ， 与 变 应 原 或 抗 Ig 也 抗体 接触 便 被 触发 ， 释 放出 组 织 胺 等 化 学 介 Jk. Igk si sia TE a RY Fe, 片段 能 抑制 IgE 也 和 人 白血球 和 猴 肺 组 织 的 结合 ， 表明 IgE 分 子 是 通过 Fe, 和 疤 细胞 表面 的 Fe. 受 体 结合 的 。 较 近 的 实验 证 明 IgE 和 嗜 碱 性 白血球 结合 ， 而 不 和 其 它 颗 粒 白血球 或 淋巴 球 结合 。 在 肺 和 皮肤 等 组 织 内 Ig 了 的 靶 细胞 是 肥大 细胞 。 4. 反应 素 抗 体 过 敏 反 应 的 初始 机 制 可 能 是 和 靶 细 胞 表面 结合 的 IgE 分 子 之 间 被 多 * 262。 E 价 变 应 原 “ 搭 桥 ? 所 引起 的 IgEB 分 子 间 的 相互 作用 。 这 种 相互 作用 引起 IgB 的 Fe ty RAE 化 ， 从 而 诱发 靶 细胞 表面 的 一 系列 酶 反应 ， 导 致 组 织 胺 等 化 学 介质 的 释放 。 反应 素 抗体 的 化 学 本 质 的 发 现 ， 以 及 其 作用 的 分 子 细胞 学 机 制 的 初步 阐明 ， 对 于 了 解 和 控制 变态 反应 性 疾病 有 重要 的 理论 和 实践 意义 。 这 对 于 变 应 性 学 (Allergology) 可 认为 是 和 组 织 胺 的 发 现 有 同等 的 或 更 为 重要 的 意义 。 (A) 免疫 球 蛋 白 D(IgD) IgED 是 由 于 对 一 种 特殊 的 人 人 细 胞 瘤 蛋白 质 的 研究 而 发 现 的 (Rowe 和 Faheg, 1965) 。 血 清 中 IgD 的 含量 很 低 ， 并 且 在 提取 过 程 中 易于 聚合 ， 又 易 降 解 。 因 此 ，IgD 化 学 结构 的 研究 进展 很 慢 。 关 于 IgD 的 抗体 活力 ， 目 前 还 只 有 一 些 零 星 的 资料 , 也 没有 发 现 和 其 他 种 类 免疫 球 蛋 白 共同 的 免疫 学 功能 。 总 之 , 这 方面 的 研究 还 处 于 初始 阶段 , 材 料 很 少 。 所 以 暂且 附 在 这 一 章 ， 作 一 些 简 略 的 介绍 。 1. 理化 性 质 (1) 提取 IgED 通 滑 是 从 通 细 胞 瘤 病 人 血清 中 提取 的 。 由 于 IgED 很 容易 被 血清 中 的 蛋白 酶 ( 盗 纤 酶 等 ) 分解， 因此 整个 提取 过 程 都 应 加 氨基 已 酸 (0.02 M) 保护 。 提取 步骤 是 先 经 过 Deae- 纤 维 素 层 析 ， 再 经 Sephadex-G200 凝 胶 过 滤 ， 就 可 以 得 到 相当 纯 的 IED。 MH 接 从 正常 血清 开始 ， 产 物 可 能 杂 有 相当 大 量 的 IEA 和 - 球 蛋 白 ， 需 用 抗 IEA 免疫 吸附 剂 进 一 步 纯化 。 (2) 基本 理化 性 质 根据 对 七 种 IgD 骼 细胞 瘤 蛋白 质 的 研究 结果 ， 发 现 IgD 的 沉降 常数 Siow 为 6.14 一 7.04， 平 均 为 6.55。 分 子 量 范 围 约 为 172,000 一 200,000(Spiegelberg，1970; Rowe 等 ， Fab[Fd + L] Fe CHO CHO Glu-NH, Gla-NH, “自发 断裂 ? boty by4 | (Plasmin REARS) 木瓜 酶 (无 还 原 剂 ) | AAS CBR A) 图 9-11 IgD 分 子 构造 的 初步 模型 (Spiegelberg，1972)。 e。 263° 1969). IgD 分 子 是 由 两 条 相同 的 轻 链 (或 0》 和 两 条 特殊 的 重 链 (6 链 )， 被 3 个 链 间 二 硫 桥 相连 而 成 的 。 每 条 8 链 (分 子 量 为 60,000 一 70,000) ， 含有 4 个 链 内 二 硫 键 ， 2 个 位 于 Fd, 24frF Fe. IgD 重 链 的 抗原 性 不 均一 ， 提 示 可 能 存在 两 个 IED 亚 类 或 同 种 异型 (Rivat 和 Ropartz, 1971). IgED 含 酷 量 相 当 高 ， 达到 12%， 分 布 在 至 少 3 KE. 以 含 氨基 半 乳 糖 为 特点 的 糖 多 肽 位 于 “ 久 链 区 ”; 另 2 个 含 氨基 葡萄 糖 为 特点 的 糖 多 肽 位 于 了 c。 在 无 还 原 剂 存在 时 ， 木 瓜 酶 能 在 含 氨基 半 乳 糖 的 糖 多 肽 段 靠 N 端的 一 侧 将 IgE D 的 5 链 切断 。 有 还 原 剂 时 ， 则 可 以 从 多 处 切断 。IgED 的 另 一 特点 是 容易 被 蛋白 酶 酶 解 ， 并 且 易 于 “自发 ?地 断裂 (图 9-11) 。 2. 生物 学 性 质 (1) 含量 和 代谢 率 大 多 数 正 常人 (70%) 血清 内 ，IgD 含量 很 低 (20 一 50 微克 /毫升 )， 少 数 人 偏 高 ( 约 100 一 400 微克 /毫升 ) 或 偏 低 (二 3 微克 /毫升 ) 。 血清 IgD 浓度 变异 的 原因 还 不 清楚 , 只 知道 这 不 大 可 能 是 由 于 遗传 的 原因 ， 因 为 同 卵 双生 子 也 有 差别 。 据 推测 很 可 能 人 体 只 对 少数 抗原 刺激 起 反应 才 产生 IED 抗体 ， 因 而 在 个 别 被 抗原 致 敏 的 个 体 ，IgD 浓度 有 所 增 加 。 各 种 疾病 时 ，IgD 浓度 有 明显 变化 ,但 还 找 不 出 规律 性 联系 。 过 敏 或 自身 免疫 病人 ， 没有 发 现 IgED 含量 的 反常 现象 。 用 曹 光 标记 抗体 法 ,在 脾 、 淋 巴结 和 增殖 腺 内 偶尔 可 见 染 IED 的 浆 细胞 。IgD 代谢 很 快 ,血清 内 半衰期 约 为 三 天 。 (2) 抗体 活力 目前 所 有 关于 IgD 抗体 活力 的 证 据 都 是 间接 得 到 的 ， 1) 草 光 标记 抗体 法 “ 某 些 自身 免疫 病 ， 如 40 一 50% 的 全 身 性 红 开 狼 疮 病人 血清 中 存在 IgD 抗 细胞 核 抗 体 ; 420% 的 类 风湿 性 关节 炎 病 人 ， 以 及 少数 (1/26) 的 桥 本 氏 病 人 (自身 免疫 性 甲状 腺 炎 ) 中 ， 也 都 存在 IED 抗体 。 2) 某 些 过 敏 病人 血清 中 ， 存 在 抗 青霉素 的 IED 抗体 (Gliech 等 ，1969)， Hikes 素 的 IgED 抗体 ， 以 及 少数 对 牛奶 过 敏 病 人 (3/20) 血清 中 存在 抗 BSA A BGG 的 IgD 抗 体 。 (3) 其 他 免疫 学 功能 IgED 不 能 固定 补体 ; 不 能 使 豚鼠 皮肤 致 敏 ， 不 能 诱发 嗜 中 性 球 释 放 盗 酶 体 酶 。 近 来 才 有 人 发 现 4.5% 新 生 儿 脐带 血 内 含 IED， 其 中 至 少 一 半 来 自 胎 儿 。 鉴 于 已 知 新 生 儿 血 清 内 IgEM 的 高 水 平和 先天 性 感染 有 关系 ， 脐 带 血 内 IgD 的 存在 有 无 诊断 上 的 意义 ， 尚 需 进 一 步 的 研究 (Leslie 和 Swate, 1972). S$ <3 Ri BF HIIREA IgE Bennich, H. and Johansson, § G. O, (1971). Structure and function of human IgE, Adv. Immunol. 13, iL: ° 2646 Bennich, H. and H. von Bahr-Lindstém (1974). Structure of immunoglobulin E (IgE). Progress Im- munol. II., Vol. 1. Immunochem. Asp., p. 49. Bennich, H., Ishizaka, K., Ishizaka, T. and Johansson, S. G. (1969). A comparative antigenic study of y E-globulin and myeloma-IgND. J. Immunol. 102, 826. Broghton, B. J., et al. (1974). New inhibitors of reagin-mediated anaphylaxis. Natwre 251, 650. Conrad, D. H., Berezi, I. and Froese, A, (1976). Characterization of the target cell receptor for IgE. I. Solubilization of IgE-receptor complexes from rat mast cells and rat basophilic leukemia cells. Immunochemistry 13, 329. Hamburger, R. N. (1976). Peptide inhibition of the Prausnitz-Kiistner reaction, Science 189. 389. Ishizaka. K. (1970). Immunoglobulin E. In: ‘‘Immunoglobulins’’, ed. by Merler, Nat. Acad. Sci, Washington D. C., p. 122. | Ishizaka_ K. (1973). 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Vol. 1, p. 165. ¢ 266° 第 十 章 ” 抗原 结合 位 点 的 结构 抗体 的 最 显著 的 特性 是 和 抗原 结合 的 高 度 专 一 性 和 这 种 专 一 性 的 多 样 性 。 抗 体 的 搞 原 结 合 专 一 性 无 疑 地 依赖 于 抗原 结合 位 点 的 空间 构象 ,因而 归根 结 蒂 依 赖 于 其 一 级 结构 。 Qi, 一 个 结构 稳定 的 抗体 分 子 如 何 发 生 排 列 顺序 上 足够 多 的 变异 以 适应 于 识别 多 种 多 - 样 的 抗原 决定 签 的 需要 而 又 不 致 于 破坏 这 种 分 子 的 稳定 性 , 曾经 是 一 个 难以 思议 的 问题 。 如 第 七 章 所 述 , 直到 抗体 分 子 的 重 链 和 轻 链 可 区 分 为 不 变 区 (C) MARE (V) 的 发 现 ， 才 开 始 找到 了 解决 这 一 难题 的 门 径 。 根 据 现 有 的 抗体 分 子 结构 的 知识 ， 抗 原 结合 位 点 位 于 Fab 未 端 ,并 由 重 链 和 轻 链 的 易 变 区 共同 组 成 。 因 此 , 进一步 的 研究 便 集中 到 从 各 方 面 来 探索 易 变 区 多 肽 链 的 微细 结构 .空间 排 布 与 结合 专 一 性 的 关系 , 以 及 抗原 结合 位 点 变 异性 的 遗传 控制 等 问题 。 一 、 抗 原 结 合 位 点 的 大 小 和 一 般 性 质 以 往 关于 抗原 结合 位 点 的 大 小 和 性 质 的 概念 , 主要 是 从 抗原 决定 簇 的 空间 互补 性 的 研究 得 到 的 。 从 第 一 章 18 页 已 知 ， 抗 原 结合 位 点 的 大 小 相当 于 4 一 6 肽 或 6 聚 糖 ， 即 大 约 34x12x7 有 A 大 沙 。 Fab! New 的 低 分 辩 率 晶体 模型 所 显示 的 抗原 结合 位 点 的 大 小 ， 也 是 与 此 相符 合 的 〈Poljak，1972) 。 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 大 小 和 了 酶 的 专 一 的 活性 中 心 大 小 很 相近 , 例如 溶菌 酶 的 底 物 结合 位 点 相当 于 6 单 糖 单位 (Philips, 1967); 木瓜 酶 的 底 物 结合 位 点 相当 于 7 氨基 酸 单 位 ; 羧 肽 酶 的 底 物 结合 位 点 相当 于 4 或 5 氨基 酸 单 位 。 因此 , 酶 活性 中 心 的 知识 和 研究 方法 也 可 供 抗 体 的 抗原 结合 位 点 研究 的 借鉴 。 从 已 知 立体 结构 的 近 12 种 酶 看 来 , 酶 的 活性 中 心 是 由 分 散在 多 肽 链 不 同 段 落 上 的 15 一 20 氨基 酸 残 基 共 同 组 成 的 一 条 沟 或 梭 。 同 样 的 ,抗体 的 抗原 结合 位 点 也 可 能 是 由 分 散在 重 链 和 轻 链 的 易 变 区 上 的 10 一 20 个 氨基 酸 残 基 构成 的 。 对 各 类 免疫 球 蛋 白 的 抗原 性 和 化 学 结构 的 研究 表明 , 抗体 的 结合 专 一 性 是 由 Fab 上 重 链 和 轻 链 的 易 变 区 (Vi + Va) 共同 决定 的 ,而 与 不 变 区 无 关 。 免 疫 球 蛋 白 之 类 、 型 . 亚 类 的 构造 区 别 和 结合 专 一 性 没有 恒定 的 联系 , 因为 各 种 类 、 型 的 抗体 都 可 能 具有 相同 的 结合 专 一 性 。 同 种 异型 专 一 性 之 决定 做 通 常 分 布 在 轻 链 和 重 链 的 不 变 区 , 显然 和 抗原 结 合 专 一 性 无 关 。 唯一 已 知 的 例外 是 家 免 重 链 的 同 种 异型 决定 敌 分 散在 易 变 区 (Ve) 的 10、 13,15,16.17,.27,.28,29 #133, LAR 80、81、.82、33、8427 和 "85 位 置 (Eleishman，1971; Mole 等 , 1971) 。 可 是 ,其 同 种 异型 专 一 性 和 抗原 结合 专 一 性 仍然 没有 确定 的 联系 。 此 外 , 抗体 和 抗原 的 结合 不 影响 同 种 异型 专 一 性 的 表现 ;反之 , 抗 同 种 异型 血清 和 相应 的 搞 KAS, 也 不 能 封闭 抗体 的 抗原 结合 位 点 。 这 些 事实 也 支持 同 种 异型 专 一 性 和 抗原 结合 专 一 性 没有 内 在 联系 的 结论 。 然 而 , 却 有 事实 表明 专 一 的 半 抗 原 ( 如 P- 硝 基 葵 甲酸 ) 能 抑 制 抗 个 体型 抗体 的 抗 血清 和 该 个 体型 抗体 的 结合 。 这 一 事实 可 能 是 由 于 有 关 的 某 些 个 体 as。 267 « 型 抗原 决定 和 伐 包含 在 抗原 结合 位 点 的 区 域内 ， 或 者 抗体 和 半 抗 原 的 相互 作用 改变 了 F(ab' ) ,上面 的 个 体型 决定 簇 的 构象 (Brient 和 Nisonoff, 1970) (参看 第 六 章 186 页 ) 。 二 、 抗 原 结合 位 点 的 结构 基础 如 上 所 述 , 抗 体 的 抗原 结合 位 点 可 能 位 于 Fab 末端 ,分 散在 重 链 和 轻 链 易 变 区 上 , 相 当 于 10 一 20 氮 基 酸 残 基 的 区 域 , 其 构象 特性 决定 免疫 反应 的 专 一 性 。 这 一 看 法 得 到 以 下 四 方面 研究 结果 的 支持 。 (—) 半 抗 原 的 存在 和 抗体 结构 的 稳定 性 家 免 抗 DNP- 抗 体 对 s-DNP- 赖 氮 酸 有 很 高 的 亲 合力 〈KKa =108 升 / 克 分 子 ) 。 当 抗 体 和 半 抗 原 结 合 后 ， 用 4M 盐酸 叫 处 理 也 不 能 使 抗体 - 半 抗 原 复 合 物 解 离 ， 需 要 增加 到 7.5M 浓度 才能 使 它 全 部 解 离 。 没 有 半 抗 原 存 在 时 ， 抗 体 只 要 经 4M 盐酸 叫 处 理 6 小 时 就 变性 ; 可 是 和 半 抗 原 结合 后 ,同样 条 件 下 只 发 生 部 分 变性 。 莉 光 灭 活 测定 也 表明 半 抗 原 存在 对 抗体 的 构象 有 明显 的 稳定 影响 (Cathou 和 Werner, 1970), 半 抗 原 和 抗体 结 合 后 能 使 抗体 构象 趋 于 稳定 的 事实 提示 ， 分 散在 重 链 和 轻 链 的 不 同 段落 的 氨基 酸 残 基 可 能 共同 参与 抗原 结合 位 点 的 组 成 ,因而 半 抗 原 和 抗原 结合 位 点 的 相互 作用 可 维持 这 种 构 象 的 稳定 (图 10-1) 。 目前 认为 重 链 和 轻 链 可 能 各 自 提 供 部 分 的 抗原 结合 位 点 ;或 者 对 于 一 些 抗 体 也 可 能 主要 由 重 链 提 供 抗原 结合 位 点 ,不 过 必须 要 有 轻 链 的 同时 存在 才能 维持 抗原 结合 位 点 的 有 效能 的 构象 (Edelman 等 ,1964) 。 (二 ) 杂 合 标记 研究 对 于 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 细微 结构 更 直接 的 研究 方法 是 在 酶 的 活性 中 心 研 究 上 行 之 有 效 的 亲 合 标记 法 (Affinity-labeling method), 这 种 研究 方法 的 原理 是 采用 一 种 和 抗体 有 高 度 亲 合力 并 带 有 反应 基 团 的 半 抗 原作 为 标记 剂 。 标 记 剂 半 抗 原 决定 簇 先 和 抗 体 的 抗原 结合 位 点 专 一 地 结合 ， 然 后 所 带 的 反应 基 团 再 和 结合 位 点 附近 的 氨基 酸 残 基 的 侧 链 发 生 牢固 的 共 价 结合 CA 10- oo 2)。 将 抗体 分 子 解 离 . 酶 解 后 ,分 离 + | : 出 带 标记 的 肽 段 ,测定 其 排列 顺序 ， mt 再 和 已 知 的 重 链 或 轻 链 的 排列 顺序 oem 相 比 较 ， 就 可 以 确定 标记 地 点 在 多 肽 链 上 的 位 置 ， 并 据 此 推测 结合 10-1 盐酸 昕 对 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 变性 作用 。 (a) 无 半 “位 点 的 构造 。 这 一 方法 曾 用 于 几 种 抗原 存在 ; (b) 有 半 抗 原 存在 , 构象 趋 于 稳定 GE Cathou «= . 酶 的 活性 中 心 的 分 析 。 后 来 冬 射线 了 晶体 分 析 的 实验 结果 ， 证 实 了 这 一 方法 的 可 靠 性 (Singer,1967) 。 ¢ 268。 Wofsy 等 (1962) 最 先 用 这 一 方法 来 分 析 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 微细 和 构造。 他 们 用 P- 砷 酸 - 苯 氟 硼酸 重 氮 盐 (P-arso- nic acid-benzenediazonium fluo- roborate) 作为 标记 剂 ， 处 理 家 锡 抗 苯 砷 酸 抗体 。 根 据 吸收 光谱 变化 J — 判断 ,标记 反应 完全 发 生 在 Ty AN 基 。 重 链 和 轻 链 都 被 标记 , 标记 量 的 比例 , 重 链 比 轻 链 多 一 倍 。 酶 解 后 分 “图 10-2? 亲 合 标记 机 制 。(1)， 半 抗原 决定 徐 和 抗体 的 结合 位 点 结 RICHI EL. 从 重 链 得 到 -Tyr* 合 ;(2) 扩 原 上 的 反应 基因 各 结合 位 人 过 的 所 基本 共 从 结合 -Tyr*-, 从 轻 链 得 到 -Val-Tyr”-。 Franék (1971) 用 m- 硝 基 葵 氟 硼 酸 重 氮 盐 标 记 猪 抗体 ,结果 从 轻 链 (1 链 ) 的 消化 产物 分 离 出 两 个 标记 的 肽 眉 。 根 据 和 已 知 猪 1 链 排列 顺序 相 比 较 , 可 确定 两 个 标记 肽 段 都 含有 Tyr 残 基 , 一 个 位 于 33 位 置 , 另 一 个 位 于 93 位 置 。 另 一 些 工 作者 ,用 同一 亲 合 标 记 剂 处 理 小 鼠 散 细胞 瘤 IgA (MOPC 315) ， 发 现 标记 剂 几乎 全 和 轻 链 结合 (1.4 BOF 标记 剂 /1 克 分 子 蛋白 质 ) ,标记 的 片段 相当 于 顺序 24 一 56. 肽 段 ,其 中 标记 的 Tyr 残 基 位 于 34 人 位置。 有趣 的 是 ,这 和 上 述 猪 抗体 的 标记 肽 疏 有 相当 大 的 相似 性 ， 小 鼠 : ”-Val-Thr-Thr-Ser-Asp-ITyrk (-Ala, Ser) Try-Ile- 猪 : -Val-Thr-Thr-Ser—Asn-Tyr*-Pro-Gly-T ry—Phe- 用 链 长 不 同 的 BADE 同系 物 DNP 亲 合 标记 剂 ( 均 含 有 “C- 省 乙酰 反应 基 团 ) , 标 试剂 标记 的 残 基 和 和 链 Jol yr JoLys (L) (AH) BADE DNP-NH-CH,-CH,-NH-X 96 4 -BADB DNP-NH-CH,-CH,-CH-NH-X 87 13 COOH BADO DNP-NH-CH,-CH,-CH,-CH-NH-X 66 34 COOH BADL | DNP-NH-CH,-CH,-CH,-CH,-CH-NH-X 5 95 COOH 12 13 14 15 16 试剂 链 长 (&A ) 图 10-3 链 长 不 等 的 几 种 BADE 同系 物 试 剂 对 MOPC315 HiME 白 之 亲 合 标记 专 一 性 。 图 上 方 示 不 同 试剂 标记 的 肽 链 和 氨基 酸 残 基 的 比例 。 下 图 示 标 记 专 一 性 和 试 剂 链 长 的 关系 (x = COCH,Br) (Givol, 1973), * 269 « BADE-315 0 人 BADL-315 () DIBAB-315 () tb x | NH DNP—NH—CH,—CH,—CH—CO—NH—NH-—X (—) Aszon m 人 fen ; . 距离 (厘米 ) 图 10-4 DIBAB, BADL 和 BADE 标记 的 MOPC315 之 - SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 。 (A) # 合 标记 的 MOPC315 的 肽 链 的 电泳 图 ,从 上 向 下 迁移 。 (B) DIBAB 标记 的 蛋白 在 凝 胶 内 了 肽 链 和 放射 性 的 分 布 。 HAR, LARK, H-L 为 交 连 的 重 链 和 轻 链 ( 据 Givol, 1973), 记 同 一 种 具有 抗 -DNP 抗体 活力 的 小 鼠 髓 细胞 瘤 蛋 白 (MOPC 315) ， 结 果 发 现 BADE, BADB 在 很 大 程度 上 标记 工 链 的 Tyr RA, fh BADL 则 标记 H HH Lys RH (图 10-3), BADL 和 BADE 的 链 长 差别 约 为 5A， 而 标记 专 一 性 无 论 在 链 的 种 类 和 残 基 的 类 别 方面 都 改变 了 。 这 提示 两 种 试剂 反应 专 一 性 的 差别 很 可 能 和 标记 剂 的 链 长 ， 即 省 乙酰 基 团 在 链 上 的 位 置 有 关系 。 如 果 这 一 假定 是 对 的 ,一 个 双 功 能 基 试 剂 , 其 两 个 省 乙酰 基 团 之 间 的 距离 正好 相当 于 BADL 和 BADE 链 长 之 差 ( 约 5A) ， 就 应 有 可 能 同时 和 10-5 抗原 结合 位 点 简 图 ， 示 双 功 能 基 标 记 剂 (DIBAB) 交叉 连接 重 链 和 轻 链 。 ,数字 表示 重 链 和 轻 链 上 亲 合 标记 和 交 又 亲 合 标记 的 位 置 ( 据 Givol, 1973), Lys. 和 Tyr 残 基 反 应 , 从 而 把 H HA L 链 交叉 连接 起 来 。 实际 上 , 如 图 10-4 的 数据 表明 的 ,一 个 双 功 能 基 的 亲 合 标记 剂 : DNPHN—(CH,),—CH—(—HNCOCH,Br) CO(NH,) COCH,Br(DIBAB) 确实 能 和 H\L 链 交叉 连接 ,产生 一 个 分 子 量 为 72,000 的 复合 分 子 (Givol 等 ,1971) 。 对 两 条 链 的 交叉 连结 的 实验 证 明 , 抗原 结合 位 点 构造 内 , HAL 链 在 空间 排 布 上 , 彼此 很 靠近 ,如 简 图 10-5 所 示 。 这 些 结 果 还 提示 ， 抗 原 结合 位 点 的 构造 可 能 是 相当 固定 的 ， 半 抗原 在 其 中 很 少 有 活动 的 余地 ， 因 而 与 之 结合 的 半 抗 原 亲 合 标 记 剂 的 化 学 反应 完全 依赖 于 省 乙酰 反应 基 团 所 处 的 精确 位 置 ， 标 记 上 和 它 最 靠近 的 一 个 残 基 。 因此 ， 系 统 地 改变 亲 合 标记 剂 的 结构 ， 在 理论 上 就 有 可 能 测绘 出 抗原 结合 位 点 附近 肽 链 排列 顺序 和 组 成 搞 © 27I0。 原 结 合 位 点 的 残 基 之 间 的 空间 关系 。 对 于 亲 合 力 低 的 免疫 球 蛋白 ,或 天 然 的 抗体 混合 物 , 最 好 采用 在 和 抗体 的 抗原 结合 在 点 结合 后 ,其 反应 基 团 才 被 激活 的 亲 合 标记 剂 。 目 前 已 有 两 种 这 样 的 亲 合 标记 剂 可 供 使 用 ,一 种 是 重 氮 酮 类 (Diazoketone) ， 另 一 种 是 芳香 族 登 氮 (Aromatic azide), HR 应 机 制 如 下 ， :N: NHECR; ge ° ES ic H—CR; /\ ond —NH—CH,— C—CH=N=N | , | Z a iE} oS PES alan (FB ARIMA ( 热 或 银 接触 催化 ) 个 nitrene 可 加 入 C 一 互 链 ，N 一 H 链 或 一 SH 基 。 因 此 ,可 与 任何 asa Ot ail es 氨基 酸 残 基 起 反应 。) - og ates carbene oN _S—NH—CH,—cH=c—o Sid. DNP—glycine ketene (Ketene 可 与 Tyr, Lys, His 残 基 起 RW. Carbene 可 加 入 C—H 链 ， 而 与 任何 氨基 酸 残 基 起 反应 。) 重 氨 毅 类 试剂 SERRA WILBR (Nitroazide) HATA, WDE EES PAE AB OK “bey PERN URE Se Pe AE SEL I ETS PEE NOK ORE AKOTA RR HE Zi BRT ETE TE UES (29 —/M LDR DE ATR SURE OA A 活 条 件 下 ， 潜 在 活性 团 被 激活 ， 结 果 重 能 直接 标记 构成 抗 夭 结合 位 点 的 es[ | ag) LO 氨基 酸 残 基 ， 而 不 是 标记 邻近 的 残 ag TTT rahele (9013 * Goetzl Metzger (1970) = resi 上 述 三 类 亲 合 标记 剂 对 家 免 搞 © Cebra et al (1971) 体 ， 都 优先 标记 重 链 ( 标 记 量 H:L= 2:1 至 4:1)。 通常 在 重 链 邻近 Cys- So 本 94 的 用 汞 氨基 酸 残 基 常 被 标记 上 (Th- Sele ge meta orpe 和 Singer, 1969; Press 4, | 1971), BAKLALBRHEE, M B+ ， 重 链 和 轻 链 的 不 变 区 和 易 变 区 。 MRAM “分析 测定 高 变异 区 的 位 置 。 符号 指示 亲 合 标记 残 基 的 位 置 〈 据 tEFR10-1, Haber 和 Cathou, 1972), 从 下 表 可 见 , Pa Ah i a He a SA. 几 种 抗 -DNP 抗体 ,用 不 同 的 亲 合 标记 剂 试验 的 结 采 , 都 说 明 轻 链 和 重 链 上 有 三 个 段落 , 即 靠近 轻 链 易 变 区 (VL) Cys-22 一 侧 的 30 位 置 附近 的 残 基 , 邻近 Cys-94 的 几 个 残 基 以 及 50 位 置 附近 的 残 基 都 可 能 被 标记 ， 并 且 在 重 链 上 和 轻 链 上 几乎 是 对 称 的 位 置 , 也 同样 可 能 被 标记 (图 10-6)。 从 下 一 节 可 以 看 到 ， 这 些 肽 段 正好 位 于 Vu VL 的 高 变异 区 内 。 因 此 , 可 以 假定 这 些 段 落 册 的 高 变异 的 残 基 很 可 能 由 于 多 肽 链 的 折 倒 而 彼此 在 空间 上 人 靠近, 共同 组 成 专 一 的 抗原 结合 位 点 (图 10-7) es。 27]1。 表 10-1 各 种 抗 -PNP 免疫 球 蛋白 亲 合 标记 的 残 基 的 比较 | ZA 质 试 Al | kaw Rw | > MOPC 315 BADL 重 链 Lys54 | Haimorich 4$,(1972) 315 BADE iZet Tyr34 | 同 上 460 BADE 轻 链 Lys54 | AE 猪 抗 2DNP MNBD isk Tyr33 和 Tyr93 | Franek (1971) 315 MNBD 轻 链 Tyr34 | Goetzl 和 Metzger,(1970) 家 免 抗 -DNP MNBD 重 链 Tyr96 | Singer 和 Thorpe, (1968) 小 鼠 抗 -DNP MNBD 经 链 Tyr86 | Thorpe 和 Singer, (1969) 豚鼠 抗 -DNP MNBD 重 链 Tyr33, Tyr60 | Cebra 等 ,(1971) 以 及 99 一 119 之 间 位 置 | 家 免 抗 -NAP NAP Hi HE Cyst98 和 | Porter (1971) Ala99 | Press 4(1971) 、 抗原 结合 位 点 图 10-7“ 易 变 区 抗原 结合 位 点 的 一 条 多 肽 链 折 倒 示意 图 。 主要 表示 三 个 亲 合 标记 肽 侦 ( 高 变异 区 ) 如 何 由 于 多 肽 链 的 折 受 而 彼此 靠近 , 共同 组 成 抗原 结合 点 。 排 列 顺序 数字 按 _Va。 Vn -或 Ve 上 的 标记 位 置 按 表 10-1 的 资料 。 黑 圈 代 表 高 度 变异 区 的 位 置 ( 据 Givol, 1973)。 ~ i: SA (Givol, 1973) 6 (=) 重 链 和 轻 链 易 变 区 氨基 酸 排列 顺序 的 统计 分 析 由 于 各 种 免疫 球 蛋白 轻 链 和 重 链 排列 顺序 测定 资料 日 益 增 多 ， 这 就 提供 了 通过 对 这 些 排列 顺序 的 比较 研究 来 了 解 抗 原 结 合 位 点 的 细微 结构 和 建造 规律 的 可 能 性 。 «= We Kabat (1970) 把 所 有 已 知 排列 顺序 的 小 鼠 和 人 的 轻 链 , 按 尽 可 能 有 最 大 同 源 性 的 方式 排 列 , 留 出 一 些 缺失 和 揪 人 的 肽 段 , 然 后 再 加 以 统计 分 析 。 用 下 述 公 式 求 出 变异 率 “ VD) 恋 异 率 (T) = 二 定位 置 出 现 过 的 不 同 的 氮 基 酸 种 类 的 数目 CN) 此 位 置 最 常见 的 氨基 酸 的 频率 (FP) 例如 在 轻 链 的 7 位 置 , 共 63 条 轻 链 的 数据 中 ， 出 现 过 四 种 不 同 种 类 的 氨基 酸 (Pro, Thr，Ser，Asp)， 故 W=4s 其 中 最 常见 的 是 Ser， 出 现在 41 条 链 上 。 所 以 其 频 率 (F) =41/63=0.665。 从 上 式 得 出 变异 率 : V =WN/R=4/0.65=6.15. 按 上 述 公 式 , 二 个 不 变 残 基 的 变异 率 应 为 1, 而 理论 上 的 最 大 变异 率 应 为 400。 人 150 a GAP GAP. GAP 10-8 轻 链 易 变 区 不 同 氨基 酸 位 置 的 变异 率 。 GAP 为 插入 的 肽 眉 ( 据 Wu 和 Kabat, 1970), 50 75 100 ” 按 上 述 方 法 求 出 轻 链 易 变 区 各 位 置 的 变异 率 ， 并 对 排列 位 置 作 图 ， 结 果 见 图 10-8。 从 图 上 可 见 , 轻 链 上 存在 三 个 高 变异 区 , 即 24 一 34, 50 一 56 和 89 一 97 区 域 。 其 中 28,50 和 96 位 置 变异 率 达 到 最 高 峰 。 缺 失 或 插 人 的 肽 段位 于 28 和 9%6 位 置 。 已 知 轻 链 易 变 区 (Vi) 二 硫 键 位 于 Cys-23 和 Cys-88 (Wu 和 Kabat，1970) 。 特别 值得 注意 的 ， 变 异 率 最 高 的 区 域 正 好 都 是 在 易 变 区 链 内 二 硫 键 的 两 个 半 胱 氮 酸 (Cys-23 和 Cys-88) 人 靠 C 端 区 域 。 其 次 , 才 是 50 一 60 位 置 之 间 的 区 域 (图 10-8; 图 10-10) 。 同样 奇异 的 现象 是 易 变 区 内 某 些 位 置 (尤其 是 二 硫 键 ) 是 恒定 不 变 的 (在 各 条 轻 链 上 出 现 的 频率 达到 88 一 100%) 。 如 果 把 各 条 轻 链 的 易 变 区 , 按 最 大 同 源 性 排列 ， 留 出 缺失 或 插 人 肽 段 时 ,就 会 发 现 链 内 二 硫 键 的 位 置 总 是 恒定 的 ,其 邻近 的 某 些 氨基 酸 残 基 也 几乎 是 恒定 的 。 Kabat (1967) 注意 到 人 类 上 和 1 链 各 有 27 个 这 样 的 不 变 位置 , 其 中 7 个 位 置 是 Gly, 这 些 恒定 位 置 很 靠近 高 变异 率 区 ， 特 别 是 99 和 101 位 置 的 两 个 不 变 的 Gly 很 接近 变异 率 最 高 的 位 置 ( 图 10-9) 。 由 于 Gly 是 唯一 没有 侧 链 的 氨基 酸 残 基 , GC 出 现 于 高 变异 率 区 附近 ,可 解释 为 留 出 在 这 些 位 置 上 毛 基 酸 残 基 置换 时 所 需要 的 伸 缩 余 地 的 空间 。 重 链 易 变 区 的 初步 分 析 同 样 发 现 类 似 的 情况 , 也 有 4 个 高 变异 区 存在 ,包括 31 一 35， 50—65, 81—87 和 .95 一 102 位 置 (Kabat 和 Wu, 1971) (图 10-10) 。 总 之 ,根据 现 有 资料 的 统计 分 析 表 明 , 轻 链 上 有 3 个 高 变异 区 , 变异 率 最 高 的 位 置 是 在 95 一 96 范围 。 第 1 高 变异 区 起 始 于 Cys-23 之 后 , 终止 于 恒定 残 基 Try-35， 而 第 3 个 高 变异 区 起 始 于 Cys-88 之 后 ,终止 于 恒定 残 基 Phe-97 和 Gly-99,-101. 这 两 个 高 变 寞 区 被 Vi 之 链 内 二 硫 键 拉拢 ,在 空间 上 彼此 靠 得 很 近 。 第 2 高 变异 区 50 一 56 之 后 ， 也 有 一 段 低 变 异 的 区 域 。 同 样 地 , 重 链 上 也 有 4 个 高 变异 区 存在 ,变异 率 最 高 的 位 置 也 是 273 . 64165166 545253 54 55 56 Gly 58 Progo 5gl6o161162 163 | 7 ESI po ATG phe 15758 Series 4 Ser 170 47 Leu 156 af? Gly. 155 "72 : == 154 i é ele as Gly 3 Asp | vol = TO 150 Ala 39 a iys [lle ed v bas ne fee 36 id P Iie Val - id es 2 33o 109 Ala 局 Leu 187 29 Gly et ee = TY Phe Hisl88 1 83A 3 日 282726 2524 87 Tyr 8540 ; = 138137136 135 193 Tyr 191190 lie ik === SC 6 14 105 Vai 89 Leu Phe 195 向 a? 90 Val Rg ie Val aS 196 Thr His 199200 150!7 91 The Een Phe 132 Yen “201 Ie on Gly Pro 131 Alo oe ai Ie 0 I00 一 Gly Pro Als one 2 ral 9536 07 mo . Ser 129 205 (22 | 128 206 10. fa t Glu 127 124 1 Lys 87enmxve 321 A Lev I26 Cy8 Glu 212 211 210 209 208 Me! vol Leu 重 链 10-9 Bence-Jones 蛋白 的 排列 顺序 。 人 -ke、4 链 和 小 鼠 & 链 的 恒定 残 基 列 人 此 排列 顺序 。 恒 定 残 基 是 指 在 已 知 排列 顺序 的 蛋白 中 , 88 一 100% 在 该 位 置 有 此 氨基 酸 。 方 框 内 为 置换 的 茧 水 性 氨基 酸 残 基 。 易 变 区 有 两 个 插入 的 肽 外 ( 据 Kabat, 1971), PARE A). Re. Se Be At 80 GAP GAP GAP GAP _ 40 变异 率 变异 率 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 - 图 10-10 “ 重 链 易 变 区 不 同 氨基 酸 位 置 的 变异 率 。 GAP HMAWKERGE Kabat 和 Wu, 1971), 在 96 附近 。 已 知 Va 之 链 内 二 硫 键 的 位 置 是 在 22 和 92。 因 此 ,第 二 高 变异 区 31 35) 和 第 4 高 变异 区 (95 一 102) 也 被 这 一 对 链 内 二 硫 键 拉拢 。 对 照 前 一 节 的 结果 比较 图 10-7 和 图 10-9)， 可 以 清楚 地 看 出 ， 轻 链 和 重 链 的 这 些 高 变异 区 正好 和 上 述 亲 合 标记 实 验 中 经 常 被 标记 的 肤 段 重合 ， 并 且 这 些 区 域 被 链 内 二 硫 键 拉拢 ， 并 借助 于 恒定 残 基 的 支 持 , 彼 此 在 空间 止 很 靠近 。 这 两 方面 的 事实 相互 印证 , 有 力 地 支持 这 样 的 看 法 :高 变异 区 的 残 基 参 与 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 组 成 ,而 恒定 残 基 则 维持 易 变 区 基本 结构 的 稳定 性 ;由 于 高 变异 区 残 基 的 高 度 变异 性 , 从 而 保证 了 抗原 结合 位 点 能 有 极其 多 种 多 样 的 结合 专 一 Hie gna SipK AS ORE & fie AOD BE ESE Py LAO SR EEO RE, I MRE AK 构 的 稳定 性 。 在 易 变 区 全 部 107 氨基 酸 残 基 中 , 80 个 位 置 可 能 发 生 置 换 的 情形 下 多肽 链 又 如 何 能 保持 基本 的 立体 构象 的 稳定 性 呢 ? 从 上 述 可 见 , 以 易 变 区 二 硫 键 为 中 心 ( 轻 链 “274。 EEE Cys-23 和 Cys-388; 重 链 Cys-22 和 Cys-94), 在 高 变异 区 的 附近 有 很 稳定 的 排 烈 顺序 ， 这 些 位 置 可 能 包括 同 种 异型 专 一 性 的 肽 段 (如 家 免 了 链 的 27 一 29 和 85 一 90 位 置 ) 以 及 人 类 轻 链 的 亚 型 决定 签 肽 人 段 。 可 以 设想 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 结构 就 是 以 这 些 稳定 的 残 基 作 骨架 (尤其 是 二 硫 键 ) ， 因 而 保 证 了 高 度 变异 的 结合 位 点 的 基 本 结构 的 稳定 性 。 其 中 , 链 内 ， 二 硫 键 在 保持 抗原 结合 位 点 的 基本 结构 的 稳定 性 上 起 关键 作 用 。 链 内 一 硫 键 附近 ， 变 蜡 率 $i ot 10-1] FERN RRR ERRUES ALAMO RA ° - (A) 轻 链 二 硫 环 。 排 列 顺序 上 的 变异 位 置 用 短 黑 线 表示 , 线 的 长 度 示 : 最 高 。 在 此 稳定 地 点 出 现 的 变 (Aye | 顺序 上 的 变异 位 置 用 短 黑 线 表 示 , 线 的 长 度 示 变异 异 ; 不 致 波及 其 他 部 位 引起 抗 ， 的 大 小 。 (B) 重 链 和 轻 链 共 同 组 成 的 结合 位 点 方 框 内 。 (C) HO) fx 氨基 酸 残 基 的 置换 , 通过 接触 、 调 整 和 补偿 残 基 的 变化 所 引起 的 二 硫 键 附 原 结 合 位 点 结构 上 过 大 的 变 。 近 构 造 变化 ， 导 致 结 合 位 点 构象 的 变化 黑 点 示 置 换 的 残 基 位 置 。 肽 链 动 ， 而 影响 其 基本 结构 的 稳定 折叠 形 状 是 假想 的 ( 据 Edelman, 1971), 性 〈 图 10-11)。 ;抗体 分 子 的 这 种 结构 模型 对 于 在 进化 过 程 中 保持 分 子 总 的 构象 的 稳定 性 ,同时 又 适应 功能 上 的 高 度 变 异性 ,是 有 重要 意义 的 。 止 述 抗 体 的 抗原 结合 位 点 的 构造 模型 ， 可 以 和 几 种 已 知 立体 结构 的 酶 的 底 物 结合 位 点 相 比较 。 所 有 这 些 酶 的 底 物 结 合 位 点 都 是 由 分 散在 一 条 盘 曲 的 多 肽 链 梅 成 的 恒定 骨架 不 同 段落 止 的 410 一 20 氮 基 酸 残 基 共 同 构成 的 一 道 槽 或 沟 。 如 以 溶菌 酶 分 子 为 例 , 其 中 一 些 残 基 的 改变 (如 Asp-101) 对 整个 分 子 的 基本 结构 没有 大 的 影响 。 而 另 一 个 残 基 (Asp- 52) 和 分 子 其 他 部 分 关系 密切 ,任何 改变 都 必然 引起 其 他 区 域 发 生 补偿 性 改变 , 否则 整个 分 子 构造 就 不 能 维持 原来 总 的 构象 。 另 一 方面 ,比较 胰 魔 蛋白酶 (Bizrktott , 1970) 和 胰 蛋 白 酶 (Hartley 等 , 1970) 假定 的 活性 中 心 ,可 以 看 出 酶 和 小 分 子 底 物 的 结合 专 一 性 随 活 性 中 心 结构 的 微小 变化 而 发 生 很 大 的 变化 。 这 两 种 酶 活性 中 心 的 结构 差异 仅 在 189 位 置 胰 廉 蛋白酶 是 Ser， 如 改换 为 .Asp， 就 成 为 胰 蛋 白 酶 的 底 物 结合 专 一 性 了 。 由 此 可 见 , 在 整个 分 子 其 他 部 分 保持 不 变 , 而 上 共有 活性 中 心 局 部 发 生 微 小 变化 时 ， 对 底 物 结 合 专 一 性 就 会 发 生 很 大 变化 ,从 胰 廉 蛋白 酶 之 对 含 芳香 环 氮 基 酸 残 基 或 Leu RANKER 结合 专 一 性 ,改变 成 胰 和 蛋白 酶 之 对 含 碱 性 氨基 酸 残 基 的 肽 段 结合 专 一 性 。 这 些 看 法 对 于 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 构造 模型 是 有 很 大 启发 的 。 同 理 , 也 可 以 设想 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 构造 是 由 分 散在 重 链 和 轻 链 易 变 区 恒定 骨架 不 同 段落 上 的 10 一 20 高 度 变 异 的 氨基 ， 酸 残 基 共 同 构成 的 一 条 模 形 (或 沟 形 ) 构造 抗原 结合 位 点 内 , 这 些 高 度 变 异 的 氨基 酸 残 基 的 任何 置换 ,都 必然 引起 抗原 结合 位 点 局 部 构象 的 很 大 变化 ,因而 也 就 导致 抗原 结合 专 一 性 的 很 大 变化 。 ”总 之 ,根据 以 上 的 论述 ,抗体 的 抗原 结合 位 点 的 结构 模型 可 设想 为 由 分 散在 重 链 和 轻 链 易 变 区 恒定 骨架 上 的 10 一 20 氮 基 酸 残 基 共 同 组 成 的 一 条 槽 形 (或 沟 形 ) 构造 ,其 中 一 些 氨基酸 残 基 的 高 度 变异 性 提供 了 各 种 各 样 的 抗原 结合 专 一 性 的 构造 基础 。 同 时 ,还 可 以 s 275。 ee wetted 设想 这 种 槽 的 形状 具有 某 些 柔 曲 性 ,可 以 适应 于 比较 广泛 的 专 一 亲人 合力。 这 种 结构 :模型 保证 了 抗原 结合 位 点 的 高 度 变 异性 和 基本 结构 稳定 性 之 间 矛 盾 的 统一 。 虽 然 利 用 现 有 的 化 学 方法 已 经 对 抗原 结合 位 点 的 恒定 骨架 内 多 种 多 样 的 专 一 性 和 亲 合 力 之 结构 基础 提供 了 不 少 的 知识 ,但 是 这 种 模型 的 真实 性 * 还 有 待 高 分 辩 率 X 射线 晶体 分 析 的 证 实 。 (四 ) 抗原 结合 位 点 及 抗原 结合 位 点 一 全 抗原 复合 物 之 X 射线 卓 体 学 分 析 1. 抗原 结合 位 点 的 构造 上 述 用 化 学 方法 得 到 的 关于 抗体 的 抗原 结合 位 点 结构 模型 的 概念 , 是 和 Fab! New 高 分 辩 率 (2.8A) 的 立体 模型 完全 符合 的 。 从 图 7-28 TR, Vi 1 Vn WREEA 部 , 多 肽 链 沿 功能 区 长 轴 平 行 方向 往返 转折 ， 形 成 稳定 的 骨架 ， 结 果 重 把 原来 分 散在 肽 链 各 段落 上 的 高 变异 残 基 ( 如 轻 链 上 的 29,51,92,93 fre) BRB Fab HRN 端 这 些 高 变异 残 基 (包括 几 个 Tyr) 的 侧 链 完全 外 露 到 溶液 中 ,共同 形成 一 条 位 于 -了 ab 末端 的 浅 槽 (长 宽 15x6A, 深 6A)。 重 链 55 一 65 和 .30 一 33 REM RBH. PR’ Be 27 一 30， 以 及 .50 附近 的 残 基 , 形成 槽 的 ”上 缘 ”。 轻 链 的 90 一 95 附近 的 残 基 形 成 槽 的 “ 堪 侧 壁 ;而 重 链 的 102 一 107 RAC REY Ae”. RECANRBEM, KERACR RA) 出 现 的 位 置 , 推测 起 来 抗原 结合 位 点 的 几何 形状 可 因 残 基 的 置换 /或 肽 女 的 播 入 (或 RATT AAMAS. Blt, AA 1 链 的 一 个 亚 型 在 27a, 27b, 27c 位 置 缺 失 三 个 残 基 :) 在 Fab New 立体 模型 上 , 这 三 个 残 基 位 于 一 个 螺旋 环 上 ， 缺 失 时 不 致 引起 肽 链 走 向 HB 要 变化 。 然 而 ,这 种 局 部 构象 的 微细 变化 却 足 以 改变 其 抗原 结合 专 一 性 :5 HAH. Fab New 立体 模型 作 基础 ,根据 已 知 的 高 变异 区 排列 顺序 变化 的 资料 , 就 可 以 推测 在 一 个 稳定 的 骨架 上 , 抗原 结合 位 点 的 空间 结构 ; 因而 其 结合 专 一 性 能 发 生 千 差 万 别 的 变化 。 此 外 ,按照 和 Fab! New 排列 顺序 的 同 源 性 , 对 比 起 来 ,前 述 亲 合 标记 实验 中 ,许多 被 标 记 位 置 的 残 基 侧 链 都 可 能 外 露 在 咨 液 中 , 因而 可 以 解释 它们 何 i sepa els, kek 接触 (Poljak “£, 1973). ; 2. 抗原 结合 位 点 一 半 抗 原 复 合 物 的 构造 近来 ,同一 组 工作 者 进一步 发 现 IgG (New) ;能 和 许多 半 抗 原 ( 自 括 维 竺 素 Ki 的 e 1-H D ES (图 10=12)。 -这 就 提供 CO 了 有 利 条 件 ， 对 抗原 结合 位 点 二 半 抗 原 复合 4 ty(Fab' New 和 K,OH) 进行 和 射线 晶体 学 分 析 ， 直 接 观 察 半 抗 原 和 抗原 结合 位 点 之 cH, 闻 的 空间 互补 关系 (Amzel 4, 1974) Me Hc’ YeacaictHoajica， 到 的 抗原 结合 位 点 一 半 抗 原 的 3.5A 立体 模 亲 合 常数 K, = 1.7X10* 升 / 克 分 子 型 上 (图 10-14)， 可 以 看 到 维生素 K,OH 的 ADT? RAEN (RAO BOE 蔡 酚 环 和 Fab New 抗原 结合 位 点 浅 槽 的 上 部 结合 , 处 于 Ls: 的 Tyr-30 (FRED 的 酚 环 ，H。 的 103 残 基 , 以 及 五 的 Gly-29, Asn-30 残 基 的 骨架 和 侧 链 的 紧密 包围 中 。 KON 的 植 基 链 向 上 绕 曲 * 先 和 了 的 Gly-29, Asn-30 接触 ,然后 折 向 下 方 而 与 Ls 的 Ser-93，Leu-94 贴近 ,末端 则 和 ° 276。 10-13 #4:% K,OH—Fab’NeW .的 立体 模型 ， 表 示 维 生 素 K,O 了 (白色 ) 与 工 链 (加 标签 ) 和 互 链 (长 方 标签 ) 的 高 变异 残 基 的 空间 关系 。 Fab’New 模型 是 根据 2.8A 分 辩 率 Fourier ABE AIG Amzel 等 ;1974)。 A Ry 54 (恒定 的 Trp)、57 和 67 残 基 的 侧 链 贴近 。 由 此 可 见 , 维生素 KiIOH 结合 位 点 是 由 分 散在 HL 链 上 各 高 变异 区 域 的 10 一 12 个 氨基 酸 残 基 共同 构成 的 一 个 大 小 为 15x6x6A 的 浅 槽 。 这 里 初步 确定 的 构成 抗原 结合 位 点 的 氨基 酸 残 基数 目 可 能 是 最 起 码 的 数目 。 后 来 作者 们 又 对 抗原 结合 位 点 的 氨基 酸 排 列 的 细节 作 了 补充 , 如 图 10-13 和 图 10-15 所 示 。 对 小 鼠 授 细胞 瘤 蛋白 MecPC603 IgA 之 Fab' 片段 和 磷酸 胆 碱 半 抗 原 复合 物 的 3.1 A DREN 和 射线 晶体 学 分 析 对 Fab 片段 的 构造 ,以 及 半 抗 原 和 结合 位 点 的 结合 «277° re 一 Asn 30 105 10-14 维生素 K,OH 与 IgGNew 结合 位 点 结合 的 模式 图 。 L: 和 Ls 表示 工 链 之 第 1 和 第 3 高 变异 区 大 约 的 位 置 。Hi， 互 , 和 Hi 表示 芯 链 的 高 变异 区 。 工 链 上 的 Tyr90 和 Arg95 位 THAL 链 共同 形成 的 浅 槽 的 底部 。Trp54〈 人 类 五 链 上 的 恒定 残 基 ) 和 Glu35 和 维生素 K,OH 的 植 基 末 端 接触 ( 据 Amzel 等 ,19747。 式 也 提供 了 很 有 价值 的 资料 (Segal 等 ,1974) 。 McPC603 蛋白 质 之 Fab’ 片段 的 四 个 功能 区 (Vu, VL, Ch, C.) 有 相似 的 空间 构造 。 Va 功能 区 之 碳 原子 结构 模型 如 图 10-16 所 示 。 各 功能 区 的 基本 结构 可 以 看 作 是 由 两 层 彼此 平行 的 肽 段 往返 转折 形成 的 8 折 登 ,包围 中 心 的 疏水 区 而 成 的 “三 夹层 构 造 。 如 简 图 10-17 Pram, V 功能 区 可 以 看 作 是 由 9 ABW 8 个 折 曲 构成 的 , 其 中 S,,S..S, 1S, 形成 V 功能 区 的 第 一 层 , 而 S:.S, MS. CRAB. MEZA S， AS, 的 二 硫 桥 维系 。 C 功能 区 只 有 7 条 直 段 和 6 个 折 曲 , 缺少 包含 着 第 2 高 变异 区 的 由 S,、B,s。 和 S。 形 成 的 环 。 各 功能 区 在 外 部 轮廓 上 大 致 相似 。 MBA Fab! (New) 各 功能 区 的 外 部 轮廓 比较 时 , 发 现 小 鼠 和 大 的 Vi 功能 区 的 外 部 轮廓 之 间 的 相似 性 比 小 鼠 本 身 的 Vi 和 Va 功能 区 之 间 的 相似 性 还 要 大 一 些 。 这 支持 前 面谈 到 过 的 从 一 级 结构 的 比较 分 析 得 出 的 结论 (第 七 章 , 204 页 )， Bl Vu 和 Vi 在 进化 过 程 中 的 歧 蜡 RP RAE, 可 能 早 于 哺乳 类 起 源 的 时 代 。 迄今 已 研究 过 的 几 种 伐 细 胞 瘤 抗 体 的 抗原 结合 位 点 的 大 小 .形状 各 半 抗 原 结合 专 一 性 都 有 显著 的 不 同 。 如 前 述 ， 人 Fab’ (New) 的 抗原 结合 位 点 是 一 条 小 槽 而 小 鼠 McPC603 Fab’ 的 抗原 结合 位 点 则 是 一 个 较 次 的 ZS 7X (Segal 等 ，1974; Padlan 等 ， 1976). 另外 一 种 Bence-Jones 蛋白 质 双 体 (Mcg) 的 抗原 结合 位 点 是 一 个 更 涂 的 口 « 278。 Se [ gasest fl tee QALA'102 e € 0 Pp EE XL 一 SSLY 103 If SY? \ | @ 一 一 @ QZ j 四 四 \ | 12 SB [= Joo ALA 104 ARG 92 fe oe TYR9 e Z ss LO ae late a 0 ON es! 1 | uno, 7. Gao 9 VY LEU 100 SER.93 ARG 95 | = ASP 99 AK | ( ASN 58 = CS=oARGco98 FS Re f AIA 31 图 .10-16 /)\ il AAA McPC603 Fab 片段 之 碳 原子 骨架 。 整个 片段 分 为 由 重 链 和 轻 链 的 成 对 的 功能 区 构成 的 Y 区 和 C 区 ,其 间 由 伸展 的 “ 铵 链 区 ?连接 起 来 。 片段 顶端 的 结合 位 点 是 由 重 链 和 轻 链 提供 的 相 邻 的 高 变异 的 肽 环 ( 黑 球 ) 构 成 的 ( 据 Capra #1 Edmundson, 1977), 279。 2 1 B12 25 S I Ti S2 了 7 aetna ne a gc ae Bae B67 | S6 67 1 S6 3 (oe ee Saeed B23 & ss = B56 B23 168 ea ae 1 B34 $3 + 7 SE 4] 141 151 1 }-—<$_$ $$ _ 199 B89 = S9 93 5 B39 8 <9 190 16 a 202 211 图 10-17 ”功能 区 构造 的 示意 图 。 KREME SS. SHR EBEMMTH EA B12, B23.… 等 表示 , 细 线 画 的 直 妥 表示 “三 夹层 的 一 层 , 粗 线 画 的 表示 另 一 层 , 高 变异 区 用 十 字 表 示 。 左 图 ，Va; GAs Cr. 在 C 功 能 区 缺少 S.. Bs, Ss. CHEK MIME SMV WHER 持 同 源 性 ( 据 Segal ,1974), 袋 形 (Schiffer 等 , 1973) 。 这 种 构造 的 不 同 主要 是 由 于 高 变异 肽 环 的 长 短 ( 揪 人 或 缺 失 ) 和 排列 顺序 的 不 同 造成 的 。 一 般 假 定 抗体 的 抗原 结合 位 点 是 由 位 于 Fab N 端 表面 的 工 链 的 3 个 高 变异 肽 环 a Al H 链 的 3 SHAH RA to 的 。 2 McPC603 的 抗原 结合 位 点 只 包含 5 个 高 变异 肽 环 : L 链 的 第 1、 S3MH 链 的 第 1、 第 2 和 第 3 肽 环 (图 10-18) 。 工 链 的 第 2 高 变异 肽 环 受到 工 链 第 1 高 变异 大 环 的 空间 阻 碍 不 能 参加 抗原 结合 位 点 的 构成 。 和 人 了 ab (New) 相 比 较 ，McPFC603 高 变异 肽 环比 Fab (New) 的 要 长 一 些 ，L， 和 也 肽 环 要 长 3 Re, Hy 要 长 2 RE, Hr, Fab’ (New) 的 L， 还 缺失 7 残 基 长 的 肽 段 。 由 于 这 些 区 别 , 特 别 是 较 长 的 二 HA HH, 环 10_18 McPC603 IgA 做 细胞 瘤 鼻 白 之 高 杰 异 玫 面 。L,， 的 存在 ，McPC603 的 抗原 结合 位 点 Ly Ls 和 Hy Hy Hs MERME OMSK, EM RHR IZA, ISA 和 长 20 碱 的 键 用 黑 线 表示 ( 据 Segal ,1974), Wie ayaa? eee ee (New) FBeERI—ARRM (Padlan &, 1976), 3. 抗原 结合 专 一 性 的 结构 基础 关于 抗原 结合 位 点 和 抗原 或 半 抗 原 结合 的 高 度 专 一 性 的 结构 基础 的 问题 , 从 上 述 搞 原 结合 位 点 一 半 抗 原 复 合 物 的 .和 射线 晶体 学 分 析 结 果 也 可 以 得 到 满意 的 回答 s 首先 , 这 是 依赖 于 结合 位 点 的 形状 和 抗原 决定 簇 的 空间 互补 性 。 其 次 ， 还 依赖 于 构成 结 从 位 点 的 准确 排列 的 高 变异 肽 环 的 氨基 酸 侧 链 所 提供 的 键 的 性 质 。 例如 , 上述 小 鼠 McPC603 Fab 的 磷酸 胆 碱 结合 位 点 是 一 个 槐 形 的 空 穴 状 构造 。 磷 酸 胆 碱 和 结合 位 点 结合 时 ,只 占据 其 空间 的 一 小 部 分 , 并且 距 重 链 比 距 轻 链 更 近 一 些 。 磷 “280。 酸 胆 碱 的 三 甲 基 忽 部 分 朝向 空 穴 内 部 , 而 碘 酸 部 分 靠 外 一 些 (图 10-19)。 从 图 上 可 以 看 出 , 磷酸 胆 碱 半 抗原 和 结合 位 点 的 专 一 结合 是 通过 它们 在 空间 互补 位 置 上 形成 的 氢 键 、 珍 图 10-19 磷酸 胆 碱 半 抗 原 和 McPC603 抗体 的 结合 位 点 结合 的 模 示 图 ， 表 示 结 合 位 点 和 半 抗 原 “” 间 精确 的 空间 互补 关系 。 构 成 结合 位 点 的 氨基 酸 侧 链 通 过 静电 键 \ 氢 键 和 Van der Waals 相互 作 ” 用 和 半 抗 原 结合 ( 据 Capra 和 Edmundson, 1977), 电 键 以 及 Van der Waals 相互 作用 来 实现 的 ， 1) 半 抗 原 的 带 负 电荷 的 磷酸 基 团 的 氧 原子 和 重 链 Tyr-33 (H) 的 羟基 之 间 可 能 形 成 一 个 氢 键 。 磷 酸 基 团 的 另 一 氧 原子 和 重 链 Arg-52 (H) 的 叫 基 也 可 能 形成 一 个 氨 键 ; 2) 磷酸 基 团 的 负电 荷 和 重 链 Arg-52 (H) 有 呈 基 的 正 电 荷 之 间 存 在 静电 相互 作 用 。 此 外 ，Lys-54 (H) 的 氨基 也 可 能 参与 和 磷酸 基 团 的 静电 相互 作用 ; 3) 半 抗 原 的 胆 碱 基 团 的 带 正 电荷 的 N 原子 靠近 Glu-35 (H) 带 负 电荷 的 羧基 ( 相 PBRASA), 并且 胆 碱 基 团 和 重 链 的 102 一 103 残 基 和 轻 链 91 一 94 残 基 之 间 也 可 能 发 生 Van der Waals 相互 作用 。 整 个 半 抗 原 和 Tyr-33 (H) 的 酚 环 很 靠近 ,也 可 能 存在 相 互 作 用 。 * 281° McPC603 Fab' 和 半 抗 原 结 合 后 , X 射线 晶体 分 析 并 未 观察 到 抗体 蛋白 质 构 象 的 变 化 。 但 这 并 不 能 排除 在 溶液 中 , 抗体 和 抗原 (而 不 是 半 抗 原 ) 结 合 时 发 生变 构 作 用 的 可 能 性 。 其 次 ,组 成 抗原 结合 位 点 的 那些 高 变异 肽 环 , 尤 其 是 那些 伸展 到 围绕 着 抗体 分 子 的 水 溶液 中 的 氨基 酸 残 基 的 侧 链 ， 似乎 是 有 和 柔 曲 性 的 , 它们 很 可 能 包围 抗原 表面 的 更 大 的 面 积 。 总 之 ， 以 上 这 些 研究 结果 的 理论 意义 是 直接 证 明了 关于 抗体 的 抗原 结合 位 点 的 结构 模型 的 假说 ， 即 抗原 结合 位 点 是 由 分 散在 重 链 和 轻 链 易 变 区 恒定 骨架 上 分 属于 各 高 变异 区 的 10 一 20 氨基 酸 残 基 共 同 组 成 的 一 个 槽 形 或 空 穴 形 构造 ,其 中 一 些 氨基 酸 的 高 度 变 异 性 提供 了 各 种 各 样 的 结合 专 一 性 。 此 外 ， 这 一 模型 还 可 能 回答 许多 重要 的 问题 : 抗原 结 合 专 一 性 和 亲 合 力 的 结构 基础 ; 抗体 和 抗原 结合 的 键 的 性 质 ;抗原 和 抗体 结合 时 ,抗体 分 子 有 没有 发 生 变 构 作 用 ， 这 种 构象 变化 被 假定 是 和 抗体 的 效应 功能 有 密切 的 关系 。 这 些 都 是 正在 进一步 深入 研究 的 重要 问题 。 可 以 期 待 对 更 多 的 不 同 结合 专 一 性 的 结合 位 点 的 结构 分 析 ,还 将 大 大 有 助 于 抗体 多 样 性 起 源 的 结构 基础 和 遗传 控制 ,这 一 免疫 学 的 基本 问题 的 解决 。 最 后 ， 还 应 当 指出 以 上 关于 抗原 结合 专 一 性 结构 基础 的 研究 都 是 用 髓 细胞 瘤 蛋 白 作 的 。 显 然 更 为 重要 的 是 直接 研究 诱导 的 抗体 的 结合 位 点 的 立体 结构 及 其 与 相应 的 抗原 决 定 往 的 空间 关系 。 目 前 已 有 人 把 家 免 抗 P- 葵 甲酸 抗体 Fab 片段 初步 结晶 出 来 了 ,可 以 期 待 不 久 将 会 见 到 进一步 的 立体 结构 的 研究 结果 的 报道 ( 据 Roholt 等 ,1977)e 三 、 抗 原 结合 位 点 多 样 性 的 结构 基础 和 遗传 控制 从 以 上 的 讨论 可 以 清楚 地 看 出 ， 抗 体 的 抗原 结合 位 点 多 样 性 的 结构 基础 在 于 组 成 搞 原 结 合 位 点 的 Va 和 Vi 高 变异 肽 侦 的 变异 所 造成 的 结合 位 点 结构 的 变化 。 结合 位 点 的 空间 形态 或 性 质 改 变 了 , 对 抗原 的 结合 专 一 性 也 随 之 改变 。 结合 位 点 的 结构 变 兹 至 少 有 三 种 可 能 产生 的 方式 : 1) 个 别 氨基 酸 的 置换 。 如 小 鼠 MePC 603 Fab 结构 模型 上 ，Arg-52(H) 被 Glu 置换 ,结合 位 点 总 的 空间 形态 不 会 受到 影响 ,但 是 电荷 性 质 改 变 了 ， 结 果 结 合 专 一 性 就 会 发 生 剧 烈 的 改变 ; 2) :构成 抗原 结合 位 点 的 高 变异 区 存在 “ 插 人 肽 段 "或 “缺失 肽 段 "。 这 可 能 严重 影响 高 变异 肽 环 的 折 且 而 造成 整个 抗原 结合 位 点 的 空间 形态 和 大 小 的 改变 ; 3) Va 和 Vi 相互 作用 区 域 发 生 氨 基 酸 的 置换 \ 肽 段 的 插 大 或 缺失 ,结果 Va WM Vi 两 功能 区 的 相对 空间 位 置 发 生变 化 ,也 能 改变 抗原 结合 位 点 总 的 空间 形态 ,从 而 导致 结合 专 一 性 的 显著 改变 。 总 之 , 组 成 抗原 结合 位 点 的 _VYa、Vr 功能 区 的 高 变异 氨基 酸 残 基 的 置换 、 肽 段 的 插 和 人 或 缺失 都 可 能 造成 结合 位 点 的 空间 形态 和 性 质 的 改变 ， 而 导致 抗原 结合 专 一 性 的 改 变 。 于 是 ,抗体 多 样 性 的 起 源 问 题 便 归结 到 易 变 区 (VV) 肽 链 结构 的 这 些 变异 的 遗传 控制 是 以 何 种 特殊 的 方式 实现 的 。 对 于 人 类 和 动物 各 种 免疫 球 蛋 白 一 级 结构 的 比较 研究 的 结 果 , 对 这 一 问题 提供 了 一 些 线索 。 如 果 把 所 有 已 知 的 人 类 «. 4 链 和 小 鼠 拉链 之 易 变 区 (V) 和 不 变 区 〈C) 的 二 级 。 282。 结构 加 以 比较 ,就 可 发 现 一 个 奇异 的 现象 : 不 变 区 的 排列 顺序 表现 明显 的 物种 专 一 性 (小 鼠 和 人 上 链 之 107 氮 基 酸 残 基 中 有 36 个 物种 专 一 的 置换 位 置 ) ; 而 易 变 区 却 基 本 上 不 表 现 物种 专 一 性 ,只 有 人 少数 几 个 这 样 的 物种 专 一 :的 位 置 (Kabat, 1967; 1970), Kabat 认为 易 变 区 (V) 没有 物种 专 一 性 的 事实 ， 提 示 它 的 基因 在 进化 过 程 中 没有 出 现 异 趋 现 象 ; 并 且 也 不 支持 易 变 区 的 多 样 性 是 受 多 种 多 样 的 基因 决定 的 假说 , 因为 这 种 遗传 机 制 必 然 会 导致 异 趋 。 这 说 明 易 变 区 可 能 是 独立 地 进化 的 ,并 且 可 能 存在 特殊 的 遗传 机 制 。 上 面 讲 过 , 缺失 或 插 人 肽 段 总 是 位 于 高 变异 区 23 一 34 和 89 一 97 位 置 附近 (273 页 ) 。 根据 这 一 事实 ，Kabat (1971) 提出 了 一 个 控制 抗原 结合 位 点 多 样 性 的 特殊 遗传 机 制 的 假说 〈Kabat，1971) 。 他 假定 抗原 结合 位 点 的 结合 专 一 性 的 遗传 信息 是 由 相当 于 这 些 “HR ARK BR” A tk EA” (“Episome”) 所 荷载 的 “染色 体外 基因 ”的 这 一 段 或 另 一 段 核 昔 酸 链 插 人 重 链 或 轻 链 易 变 区 结构 基因 的 DNA 内。 许多 能 自身 繁殖 的 “染色 体 外 基因 ”含有 大 量 的 核 苷 酸 排 列 顺序 ， 也 就 是 说 大 量 的 决定 抗原 结合 专 一 性 的 遗传 信 息 。 按 照 这 种 插 人 机制, 就 可 以 供给 多 种 多 样 的 结合 专 一 性 而 无 需 改变 整个 抗体 分 子 的 基本 结构 。 还 可 以 进一步 设想 , 这 种 “插入 ”的 过 程 是 在 胚胎 发 生 期 中 进行 的 。 一 个 免疫 活性 细胞 是 多 潜能 的 , 可 设想 为 可 能 具有 几 个 这 样 的 “插入 段 ”, 或 者 全 部 的 “染色 体 外 基 A”, 而 单 潜能 的 免疫 活性 细胞 之 结构 基因 只 具有 相当 于 一 定 抗原 结合 专 一 性 的 “ 插 人 段 核 背 酸 顺 序 ”。 这 各 细胞 分 化 过 程 又 可 能 是 在 细胞 间 的 相互 作用 下 (如 两 类 淋巴 细胞 或 其 亚 类 之 间 ) 或 抗原 刺激 下 进行 的 。 以 上 关于 抗原 结合 位 点 多 样 性 的 遗传 控制 的 假设 目前 尚 属 初步 的 膀 想 。 此 外 , 还 存 在 其 他 的 假说 。 port 抗原 结合 位 点 的 结构 Amzel, L. 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Med. 132, 211. * 2846 第 三 篇 抗原 抗体 的 相互 作用 及 补体 抗原 和 抗体 分 子 的 专 一 结合 是 各 种 体 流 免疫 反应 的 基础 。 抗原 抗体 反应 的 动力 学 、 热力 学 以 及 免疫 反应 专 一 性 的 结构 基础 ， 曾 经 是 早期 免疫 化 学 研究 的 中 心 课题 。 随 着 抗 体 的 结合 位 点 的 空间 构造 的 阐明 以 及 快速 动力 学 方法 的 应 用 ， 抗 体 抗原 反应 的 结构 基础 和 动力 学 等 问题 的 研究 又 重新 活跃 起 来 了 。 鉴于 各 种 免疫 学 测定 方法 ， 特 别 是 放射 免疫 测定 和 标记 抗体 示 踪 法 在 生物 学 和 医学 中 的 应 用 愈 来 您 广泛 ,简要 地 介绍 这 些 方法 的 原理 也 是 必要 的 。 补体 系统 是 扩大 抗原 抗体 反应 的 作用 ， 清 除外 来 抗原 的 主要 效应 机 制 。 并 且 在 各 种 免疫 病理 机 制 中 也 起 重要 的 作用 。 各 种 补体 成 分 的 分 子 构 造 及 其 作用 的 分 子 基 础 ， 也 是 分 子 免疫 学 研究 的 一 个 重要 领域 。 。 2856 第 十 一 章 ” 抗原 抗体 的 相互 作用 抗原 和 抗体 分 子 的 专 一 结合 是 体液 免疫 反应 的 基础 。 免 疫 化 学 的 历史 亦 发 端 于 对 抗 原 抗 体 相 互 作 用 的 研究 。 著名 的 物理 化 学 家 Arrhenius (1907) 在 本 世纪 初期 就 兽 试图 用 质量 作用 定律 来 解释 抗 毒素 和 毒素 的 中 和 反应 。 30 年 代 期 间 ，Heidelberger (1935, 1939) 建立 了 抗体 的 定量 测定 方法 ，Marrack (1934, 1939) 根据 抗原 和 抗体 的 多 价 性 概念 ， 提 出 网 格 学 说 (Lattice theory) 来 解释 沉淀 反应 的 机 制 ， 从 而 商定 了 免疫 化 学 的 初步 基础 。 抗 原 抗体 反应 动力 学 和 热力 学 研究 ， 特 别 是 Pauling, Pressman (1942) 开创 的 半 抗 原 对 抗原 抗体 反应 专 一 地 抑制 的 研究 ， 对 参与 免疫 反应 的 分 子 间 力 的 性 质 、 反应 能 量 以 及 专 一 性 的 结构 基础 提供 了 大 量 精确 的 知识 。 和 非 专 一 的 相互 作用 不 同 ， 抗 原 抗 体 相互 作用 只 局 限于 这 些 大 分 子 表面 的 特定 部 位 ， 即 抗原 决定 徐 和 抗体 的 结合 位 点 之 间 。 抗 原 抗 体 的 结合 ， 其 间 并 没有 共 价 键 形 成 ， 而 是 由 这 些 特定 部 位 之 间 的 短程 分 子 力 相 互 作 用 的 结果 。 这 些 吸 引力 只 有 在 极 短 的 距离 内 才 有 效 。 因 此 ， 抗 原 决定 徐 和 抗体 的 结合 位 点 在 空间 上 必须 处 于 紧密 接触 状态 , 才能 产生 足够 的 结合 力 , 而 使 抗原 和 抗体 分 子 结合 在 一 起 。 如 果 抗 原 决 定 簇 的 形状 和 抗原 结合 位 点 相差 过 大 , 彼此 不 能 紧密 接触 ,也 就 不 能 结合 。 抗 原 和 抗体 反应 的 专 一 性 依赖 于 分 子 间 的 空间 互补 性 ， 也 就 是 由 于 这 个 原 ， 因 。 抗原 抗体 反应 专 一 性 的 研究 具有 广泛 的 生物 学 意义 。 许 多 重要 的 生命 过 程 , 如 受精 ， 形态 发 生 过 程 中 细胞 间 的 相互 作用 ， 病 毒 进 和 人 易 感 细胞 , 以 及 酶 和 底 物 之 间 , 酶 和 变 构 调 节 因 子 之 间 的 相互 作用 专 一 性 都 是 以 分 子 表面 互补 性 为 基础 的 。 抗 体 ， 特 别 是 抗 半 抗 原 抗体 可 作为 研究 一 般 生 物 接受 部 位 的 模型 。 应 用 抗原 抗体 反应 测定 抗原 或 抗体 的 方法 对 生物 学 和 医学 也 有 广泛 的 影响 。 由 于 免 疫 反应 的 高 度 专 一 性 和 灵敏 性 可 作为 鉴别 结构 非常 近似 的 物质 ， 特 别 是 蛋白 质 的 有 力 工 具 ， 也 可 用 于 简单 物质 在 溶液 中 的 构象 的 研究 。 放 射 免 疫 测定 法 的 建立 ， 对 许多 种 激素 (HAR. SKS A) MERA BARBERS) 的 超人 微量 分 析 的 灵敏 度 达 到 毫 微克 (ng) 或 微微 克 (pg) 水 平 。 标记 抗体 示 踪 法 能 在 显 微 和 亚 显 微 水 平 追 踪 抗 原 在 细 HAW. 这 些 方法 对 于 蛋白 质 化 学 ， 内 分 泌 学 等 学 科 的 发 展 起 了 很 大 的 促进 作用 。 最 近 发 展 起 来 的 核酸 各 级 结构 的 免疫 化 学 测定 法 ， 尤 其 是 细胞 内 原 位 分 析 ， 也 颇 引 人 注 本 章 先 讨论 抗原 和 抗体 的 沉淀 反应 ， 进 一 步 从 已 知 化 学 结构 的 半 抗 原 和 抗体 的 相互 作用 出 发 ， 探 讨 抗原 抗体 反应 的 动力 学 、 亲 合力 和 参与 反应 的 分 子 间 力 的 性 质 等 问题。 最 后 ， 简 略 地 讨论 颗粒 抗原 的 凝集 作用 以 及 应 用 抗原 抗体 反应 测定 抗原 或 抗体 的 一 些 方 法 学 问题 。 。280 。 一 、 抗 原 抗体 不 溶性 复合 物 的 形成 ”沉淀 反应 (一 ) 沉淀 反应 和 抗体 的 定量 测定 “Danyz 效应 一 般 血 清 学 研究 中 ， 抗 体 的 量 通常 用 沉淀 反应 或 凝集 反应 的 效 价 来 近似 地 表示 就 足 够 了 。 效 价 是 用 免疫 血清 稀释 的 倍数 ，2:，2 ,2 ……。 2"( 如 2!0=1,024，25=32,768) 来 表示 的 。 这 种 滴定 法 有 很 大 的 分 析 误 差 ， 如 效 价 为 1,024 时 ， 实 际 上 只 有 第 一 位 数字 是 可 靠 的， 第 二 位 数字 就 可 疑 了 。 因 此 , 效 价 最 好 用 2 的 方 次 表示 ， 或 用 10 的 方 次 并 在 半 对 数 坐 标 纸 上 作 图 表示 。 更 为 精确 的 定量 分 析 方 法 是 M. Heidelberger (1935, 1956) 建立 的 。 免疫 血清 所 含 抗体 的 定量 分 析 ， 简 单 说 来 ,包括 三 个 步 邓 : 1) 加 同型 抗原 ; 2) 分 离 和 洗涤 沉淀 ;3) 测定 沉淀 中 抗体 量 。 实 际 操作 中 却 会 遇 到 不 少 复杂 的 问题 。 现 将 各 步骤 分 述 如 下 : (1) 加 抗原 正式 测定 前 ， 应 先 找 出 产生 最 大 量 沉 淀 所 需 之 最 适 抗原 量 ， 避 免 加 入 过 量 抗原 致使 沉淀 溶解 。 如 果 有 大 量 抗 血 清 供 使 用 时 ， 可 在 一 系列 的 试管 内 各 放置 等 量 的 抗 血 清 ， 然 后 在 每 一 试管 内 加 入 依次 增多 的 不 同 量 的 抗原 ， 选 择 产 生 最 大 沉淀 量 的 一 管用 于 分 析 。 如 果 可 供 使 用 的 抗 血清 的 量 很 少 ， 可 先 加 少量 抗原 , 离心 去 除 产生 的 沉淀 , 得 到 的 上 清 液 内 再 加 人 少量 抗原 ， 多 次 重复 上 述 手续 ， 直 到 不 再 产生 沉淀 为 止 。 比较 上 述 两 种 步骤 时 ， 发 现 一 次 加 入 最 适 剂量 的 抗原 所 产生 的 沉淀 量 比分 几 次 连续 加 入 小 量 抗 原 产 生 的 沉淀 量 要 大 ( 表 11-1)。 这 一 现象 称 为 Danyz 效应 。 产生 这 一 现象 的 原因 是 多 方面 的 。 首先 ， 当 一 次 加 和 人 最 适 剂量 抗原 时 ， 产 生 的 大 量 沉 淀 可 引起 非 沉 淀 抗 体 或 非 专 一 蛋白 质 共同 沉淀 ， 而 依次 加 人 小 量 抗原 时 ， 则 不 致 发生 共 同 沉淀 。 其 次 , 由 于 抗体 的 不 均一 性 ， 当 一 次 加 入 最 适量 抗原 时 , 亲 合力 低 的 同型 抗体 可 能 共同 这 淀 ， 而 依次 加 和 人 小 量 抗原 时 ， 它们 仍然 留 在 溶液 内 不 被 沉淀 。 在 连续 沉淀 操作 过 程 中 ， 需 用 抗体 来 测定 沉淀 的 上 清 液 内 有 无 过 剩 的 抗原 残留 ， 或 用 抗原 来 测定 有 无 抗体 残留 ， 并 继续 加 抗原 ， 直 到 上 清 液 内 表 11-1 抗 豚鼠 血红 蛋白 家 免 血 清 〈10ml) 经 不 同方 式 加 入 抗原 后 的 沉淀 反应 Khe yD A RK x= & | 加 入 抗原 量 (毫克 ) gee 总 重量 (毫克 ) 抗原 (毫克 ) 抗体 (计算 ) 毫克) 连续 加 入 小 量 抗原 ; 6.0 37.11 3.0 34.1 . 6.0 12.74 3.0 9.7 3.0 2.74 ey ic 1.5 3.0 微量 微量 18.0 52.59 "所 45.3 一 次 加 入 同 量 的 抗原 18.0 67.31 12.0 | 55.3 * DRAKE-KRRYAE— Weis. asl all ga NaOH :溶液 中 后 ,用 比 色 法 测定 的 。 ( 据 Haurowitz, 1968), 。 287 + 用 以 上 两 种 方法 测定 均 无 阳性 反应 时 为 止 。 通 常 假定 这 时 上 清 液 内 已 经 没有 抗原 和 抗体 了 。 人 然而， 这 是 不 完全 正确 的 。 因 为 帝 淀 可 能 有 一 定 程度 的 解 离 ， 上 清 液 内 总 会 有 微量 的 抗体 或 抗原 存在 。 人 就 可 能 严重 地 影响 结果 。 抗原 和 抗体 的 结合 是 和 但 是 ， 抗 原 抗 体 复合 物 聚 集 形 成 沉淀 却 是 一 个 很 缓 慢 的 过 程 。 由 于 增高 温度 可 以 加 快 沉淀 形成 的 速度 ， 通 常 将 抗原 抗体 复合 物 在 37*C 条 件 下 静 置 30 一 120 分 钟 。 然 后 冷却 到 0"C， 再 放 在 冰箱 内 ， 过 几 天 就 会 产生 最 大 量 的 沉 淀 。 经 过 这 样 处 理 后 ,回复 到 室温 ,也 较 不 易 解 离 。 (2) 抗原 抗体 复合 物 的 分 离 以 往 认 为 用 生理 盐水 或 缓冲 和 补 洗涤 时 ， 沉 这 的 溶解 是 可 以 忽略 不 计 的 ， 并 不 影响 沉 淀 内 抗原 抗体 的 比例 。 然 而 ， 用 同位 素 标记 抗原 或 抗体 的 实验 证 明 沉 证 物 (AgxAby) 会 发 生 解 离 ， 而 失去 一 部 分 抗体 : AgxAby == AgxAb(y-z)+zAb 为 了 去 除非 专 一 的 Y 球 蛋白 ， 不 能 不 洗涤 帝 证 。 因 此 应 尽量 用 小 量 体 积 的 盐水 或 组 冲 流 洗 桨 ， 并 严格 的 保持 相同 的 操作 条 件 。 (3) me 分 析 由 于 技术 上 的 困难 ， 沉 淀 内 的 抗体 量 不 是 把 抗体 从 抗原 抗体 复合 物 中 分 离 出 来 后 接 测 定 的 ， 而 是 从 测定 整个 沉淀 的 量 间接 推算 出 来 的 。 vehpaneeetne: 1) 微量 克 氏 定 氮 法 ; 2) Folin 和 Ciocalteu 法 测 蛋 白质 量 如 抗原 为 不 含 氮 的 多 酶 ,用 上 述 方法 测 得 的 沉淀 含 氮 量 或 蛋白 质量 , 即 为 抗体 的 量 。 3) haath ”如 抗原 为 有 色 物 质 ( 血 红 蛋 白 、 偶 氮 蛋 白质 等 ) 可 直接 用 比 色 法 测定 沉 证 中 的 抗原 量 ， 并 根据 沉淀 的 总 蛋白 量 由 此 推算 出 抗体 量 (抗体 量 = 沉淀 总 蛋白 量 -抗原 量 ) ; 4) 放射 性 同位 素 标记 法 ”用 放射 性 同位 素 Col .°S) 标记 抗原 。 计数 沉淀 的 Wie CET) 4.0 J 加 入 的 测试 抗原 量 ( 毫 克 ) 图 11-1 抗 马 血 清 球 蛋白 -p- 偶 氮 苯 砷 酸 家 免 血 清 中 半 抗 原 专 一 抗体 的 测定 。 图 中 表示 加 入 小 量 测试 抗原 (家 免 血 清 球 蛋白 -p- 偶 氮 苯 砷 酸 ， 含 2.89%6 砷 ) 到 10ml 抗 血清 中 。 (-O-) 每 次 加 抗 原 后 产生 的 总 沉淀 量 ; 〈-@-) 总 沉淀 中 的 抗原 量 。 图 中 各 点 的 数值 是 逐次 分 析 所 得 的 数值 的 和 ( 据 Haurowitz，1968)。 ° 288。 ae 放射 性 量 表示 抗原 的 量 。 抗 原 抗体 复合 物 能 被 50 % 饱和 的 硫酸 铁 沉 淀 。 如 果 抗 原 在 这 一 条 件 下 不 沉淀 时 ， 就 可 以 用 这 一 方法 把 和 抗体 结合 的 抗原 与 游离 的 抗原 分 开 。 沉 淀 物 经 50% WARE RUS, 计数 放射 性 量 就 可 以 测 出 抗原 含量 。 这 是 目前 最 灵敏 的 方法 ， 我 们 在 以 后 还 要 讲 到 。 实际 操作 时 ,最 好 在 一 定量 的 抗体 溶液 内 ,逐步 加 入 少量 抗原 ， 分 别 地 测定 各 沉淀 内 抗原 或 抗体 的 含量 ,并 作 图 (图 11-1) 。 (=) 沉淀 反应 的 机 制 免疫 学 初期 的 研究 已 经 发 现 ， 毒 素 和 抗 毒素 的 中 和 反应 可 能 按 下 列 反应 式 产生 可 逆 的 沉淀 : 毒素 + 抗 毒素 = 毒素 抗 毒 素 复 合 物 这 一 反应 表面 上 似乎 和 酸 碱 中 和 反应 相似 ，Arrhenius (1907) 因而 试图 根据 质量 作用 定律 来 求 出 该 免疫 反应 的 平衡 常数 ， 但 未 获 成 功 。 这 主要 是 由 于 不 了 解 参 与 免疫 反 应 的 抗原 和 抗体 都 是 大 分 子 , 可 能 具有 “多 价 性 ”。 后 来 的 研究 表明 ， 沉 淀 抗体 是 双 价 或 多 价 的 (具有 两 个 以 上 的 抗原 接受 位 点 ) ， 而 单 价 抗体 (如 Fab) 则 不 能 产生 沉淀 ， 只 能 形成 可 溶性 复合 物 。 另 一 方面 ,天 然 蛋 白质 或 多 栈 大 分 子 具 有 许多 决定 锐 ， 但 具体 的 数目 却 不 易 测 定 。 为 了 研究 方便 起 见 ， 有 人 在 一 个 抗原 大 分 子 上 连结 已 知 数目 的 半 抗 原 ， 发 现 只 有 当 半 抗原 的 数目 在 2 以 上 时 ， 才 能 和 相 应 的 抗体 产生 沉 演 反应。 因此， 抗原 和 抗体 的 多 价 性 是 形成 沉淀 的 必要 条 件 。Marrack (1934) 根据 抗原 抗体 多 价 性 概念 ， 以 及 沉淀 内 抗原 抗体 组 成 的 定量 测定 , 提出 了 网 格 学 说 来 解释 沉淀 反应 的 机 制 。 1. 网 格 学 说 (Lattice theory) 这 一 学 说 是 Marrack 在 1934 年 提出 ， 并 经 过 Heidelberger， 了 Pauling 与 其 他 许 多 学 者 的 修改 。 基 本 的 概念 是 : 具有 两 价 以 上 的 抗体 和 多 价 的 抗原 相互 作用 ， 连 接 成 一 个 大 的 网 格 样 聚集 物 ， 而 发 生 沉淀 。 为 了 验证 这 一 假说 ， 必 须 先 对 抗体 抗原 的 结合 反应 作 定 量 的 测定 。 这 方面 的 工作 是 由 Heidelberger 开创 的 。 他 最 初 是 用 III 型 肺炎 球菌 莱 膜 多 糖 作 抗原 。 这 种 抗原 本 身 不 含 氮 ， 因 此 大 大 减少 了 对 抗原 抗体 沉淀 物 组 成 分 析 的 复杂 性 。 在 一 定量 的 抗 血清 中 ， 逐步 增加 加 入 的 抗原 量 。 待 反应 完全 后 ， 洗 涤 去 除 未 反应 物 ， 再 用 微量 克 氏 定 氮 法 测定 沉淀 中 的 总 氮 量 。 由 于 抗原 不 含 氮 ， 沉 淀 中 所 有 的 氮 都 来 自 抗体 。 对 于 一 个 蛋白 质 抗 原 , 沉淀 中 抗体 的 测定 就 需要 从 洗涤 过 的 沉淀 的 总 氮 量 中 减 除 抗原 的 量 。 如 前 所 述 , 为 了 使 抗原 能 和 抗体 区 别 开 来 ， 通 常 是 用 化 学 的 或 放射 性 同位 素 标记 抗原 ， 从 而 测 出 抗原 的 量 。 用 这 样 的 方法 可 得 出 如 图 11-2 所 示 的 沉淀 量 曲线 。 这 一 曲线 显而易见 的 特点 是 ， 随 着 加 入 的 抗原 量 的 增加 ， 沉 淀 的 抗体 量 和 逐渐 增加 到 最 大 值 ， 然 后 相当 迅速 地 下 降 ， 结 果 在 抗原 极端 过 量 时 ， 反 而 不 能 形成 沉淀 。 从 上 图 可 见 ， 沉 淀 量 曲线 可 分 成 几 个 区 域 。 OP 区 (抗体 过 剩 区 ) ， 抗 原 完 全 KM te, 上 清 沾 内 可 测 出 游离 抗体 。PB 区 (平衡 区 ) ， 上 清 沪 内 既 无 可 测 出 的 抗原 , 亦 无 抗体 。 。 289。 Se -一 aeronn 一 sw 超过 B 点 ， 便 进入 到 抗原 过 剩 区 ， 上 清 液 内 可 测 出 游离 抗原 。 抗 原 若 再 继续 增加 ， 党 党 家 全 所 完全 抑制 了 沉淀 的 形成 。 事实 上 ， ee eek as 当 抗原 略微 过 量 时 ， 可 得 到 抗原 抗 体 复合 物 的 最 大 沉淀 量 。 抗原 抗体 反应 的 最 适 比 例 。 从 ， 上 图 还 可 以 看 出 ， 沉 淀 量 随 反应 溶 液 中 抗原 抗体 的 比例 的 改变 而 变 化 。 在 平衡 区 偏 右 侧 处 ， 能 最 迅速 地 产生 最 大 量 的 沉淀 。 此 时 ， 抗 原 抗体 的 比例 称 为 最 适 比 例 咏 对 于 一 定 的 抗原 和 抗体 系统 ， 不 论 两 者 的 稀释 度 如 何 ， 此 比值 是 固定 不 赤 的 。 丰 抗体 过 剩 区 ， 沉 淀 中 这 一 成 分 的 含量 要 相对 地 多 。 反 之 亦 然 。 按照 网 格 学 说 ,如 图 11-3，11- 4 所 示 ， 假设 抗体 为 2 价 ， 抗 原 的 图 11-2，” 饰 白 蛋白 和 抗 孵 白 蛋白 沉淀 反应 的 定量 过 程 . 模 坐标: 加 ” 价 数 = N。 当 抗体 大 量 过 剩 时 ， 抗 入 抗原 量 用 微克 N 表示 。(-o-) RMON: (e+ Hie HUANG; (-*-) 沉淀 中 抗体 N 和 抗原 N 的 比值 。 分 离 去 除 沉淀 “” 原 所 有 的 价 均 被 过 量 的 抗体 饱和， 后 上 清 液 测定 的 结果 : (D 抗体 ;ID 抗原 ( 孵 白 蛋白 ) (tr) 痕 量 。 结果 产生 可 溶性 复合 物 。 34 Ab/ umphre ite, 1964 SR se Renae Ag LEZEN /2 附近 时 ， 形 成 大 的 复合 物 而 发 生 沉 省 的 机 会 愈 增 加 。 过 此 , 抗原 大 量 过 剩 时 , 抗体 又 被 过 量 的 抗原 饱和 ， 结 果 仍 产生 可 溶性 复合 物 。 MER Hy 14 N Pid EEG 0 d 一 一 ”十 十 十 十 十 十 8 Rik SRN ee ce cae vide eet nd Yer |B 2. 抗原 抗体 复合 物 形成 的 分 子 机 制 ”电子 显微镜 观察 按照 网 格 学 说 可 以 推论 ， 一 个 双 价 抗体 显然 不 能 和 两 个 以 上 的 单价 抗原 (或 半 抗原 ) 结合 并 且 产 生 的 复合 物 是 可 溶 的 。 当 抗 原 (或 半 抗 原 ) 为 2 价 时 ， 就 能 产生 直 链 的 @ Ag 多 价 => Ab 双 价 Ab 过 剩 时 的 Ag 过 剩 时 的 可 溶性 复合 物 可 溶性 复合 物 平衡 时 的 沉淀 2 Ag 过 量 时 的 沉淀 Ab 过 量 时 的 沉淀 | | log Silk (Ag) 浓度 图 11-3 在 一 定量 抗体 内 加 入 不 同 抗原 量 时 沉淀 量 的 曲线 。 示 在 抗体 过 简 、 平 衡 点 和 抗原 过 剩 时 ， FLSA MUIR GE Pauling, 1940), 。 290 « ae ie rst = er > ae Ag 比例 了 世 11-4 按照 网 格 假说 ,抗原 抗体 复合 物 内 抗原 (@ 7 和 抗体 ( 吕 ) 分 子 假定 的 排列 图 :〈A) 抗体 极 度 过 剩 ; 抗 原 的 所 有 价 (5) 均 被 过 量 的 抗体 所 饱和 。(B) 抗体 略微 过 量 。(C7“ 最 适 比 例 ?2。(D) 搞 原 过 量 。(E) 抗 原 极 度 过 量 ,， 抗体 双 价 均 被 饱和 (HZ Humphrey 和 White, 1964), senses Ag-Ab-Ag-Ab--- RH BNEAW. MRHRA=TM=ETU LORE BM, a 可 能 产生 又 链 ， 交 错 地 形成 立体 的 网 格 结构 : Ab 一 Ag 一 … Ab 一 Ag 一 Ab 一 Ag SS Ab 二 ew, ey Cle | Pe, ey 因而 易于 沉淀 。 在 有 过 量 的 抗原 (或 半 抗 原 ) 时 ， 免 疫 复合 物 沉淀 就 又 溶解 ， 这 是 由 于 加 人 的 抗原 (或 半 抗 原 ) 分 子 和 网 格 中 结合 的 抗原 分 子 竞争 双 价 的 抗体 分 子 ， 而 将 后 者 转变 成 可 溶性 复合 物 (Ag-Ab-Ag) 的 缘故 。 近年 来 对 免疫 复合 物 的 电子 显微镜 观察 ， 有 力 地 证 实 了 上 述 抗原 抗体 复合 物 形 成 分 子 机 制 的 推论 。 如 第 七 章 已 讲 过 的 ， 当 “Y” 字 形 的 IEG 双 价 抗体 分 子 与 双 决 定 簇 的 半 抗原 结合 时 , 电镜 下 可 观察 到 多 角形 或 环形 的 构造 。 如 果 经 过 斑 基 乙醇 处 理 , 抗体 被 解 离 为 单价 的 半分 子 后 ， 沉 淀 就 溶解 了 (Feinstein 和 Rowe，1965) 。 小 鼠 Ig A 双 体 和 双 功能 基 半 抗原 (bis-DNP-glycyl-lysine) 可 形成 梯形 的 网 格 构造 。 由 于 这 种 构造 ， 任 何 连接 处 断 开 后 ， 又 可 能 相当 迅速 地 恢复 ， 因 而 复合 物 能 保持 稳定 。IgA 单 体 和 半 抗 原 只 能 形成 可 溶性 复合 物 ， 电 镜 下 呈 螺 旋 浆 的 形状 (Munn， 等 ，1971) 〈 图 11-5) 。 3. 沉淀 反应 的 数学 公式 许多 人 曾经 试图 用 数学 公式 表示 抗原 抗体 反应 中 ， 沉 淀 量 及 Ab/Ag tes LB 肉 抗原 和 抗体 的 量 的 关系 。 这 类 计算 大 多 数 都 假定 抗原 和 同型 家 免 抗 体形 成 的 沉淀 在 抗 体 过 剩 时 是 不 溶 的 。 另 一 假定 是 所 有 抗体 的 结合 位 点 是 相同 的 ,所 有 抗原 的 决定 簇 也 是 相 A. SEE 这 两 个 假定 都 过 于 简单 化 了 ， 在 实验 上 都 是 没有 根据 的 。 从 前 述 表 11-1 可 看 出 ， 既 使 对 于 家 免 抗 体 ， 在 抗体 过 剩 区 也 有 可 溶性 抗原 抗体 复合 物 形成 。 其 次 ， 早 已 知道 一 般 的 抗体 是 对 抗原 决定 簇 的 亲 合 力 有 很 大 差别 的 、 非 常 不 均一 的 混合 分 子 群 。 由 于 这 种 复杂 性 ， 刻 今 提 出 的 所 有 的 方程 式 都 不 能 满意 地 描述 从 抗体 过 剩 区 到 抗原 过 剩 区 整个 抗原 抗体 反应 范围 内 的 实验 结果 。 同 时 ， 对 家 免 抗 体 提出 的 方程 式 也 不 适用 于 马 抗体 , 因为 后 者 在 抗体 过 剩 区 也 不 产生 沉淀 。 ea 291。 11-5 小 鼠 MOPC315 IgA 双 体 和 双 价 半 抗 原 (bis-DNP-glycyl-lysine) 形 成 的 “ 梯 形 ?抗原 抗体 复合 物 的 电子 显微镜 图 象 (a)， 以 及 还 原 的 和 烷 基 化 的 IgA 单 体形 成 的 类 似 的 抗原 抗体 复合 物 (b)。(a) 图 内 的 插图 示 一 个 “梯形 构造， 其 四 角 有 突起 伸 出 。 横 线 长 度 =200A, (c) 双 体 IgA 和 双 价 半 抗 原形 成 的 “梯形 > 免疫 复合 物 构造 的 示意 图 ( 据 Munn 等 ,1971)。 (1) Heidelberger 和 Kendell 方程 式 Heidelberger 和 Kendell (1935) 对 于 一 定 的 抗原 抗体 系统 (如 卵 白 蛋 白 Ea 和 家 免 抗 卵 白 蛋 和 白 抗 体 Anti-Ea) ， 在 一 定量 的 抗 血 清 中 依次 增加 加 入 的 抗原 量 (Ag VW) 后 ， 相应 地 测定 每 次 沉淀 量 及 抗体 抗原 比值 (AbN /AgN) 。 在 抗体 过 剩 区 内 , AbN/AgN 比值 对 所 加 入 的 抗原 量 作 图 ， 则 得 到 一 条 直线 。 这 条 直线 将 遵守 下 列 方程 式 ， ADN ppid anig®. ® x BY AbNpptd=az 一 b2? @ 其 中 z= 所 加 入 抗原 量 (AgN) 。 这 人 一方 程式 表示 :， 从 抗体 过 剩 区 到 最 大 沉淀 点 之 间 ， 加 入 的 抗原 量 (z) 与 沉淀 的 抗体 (AbN pptd.) 之 间 的 关系 。 参 数 o 为 直线 在 4 轴 上 的 截 距 ，b 为 直线 的 斜率 。 对 于 不 同 的 抗原 抗体 系统 ， 人 参数 o,b 的 值 不 同 ， 需 用 实验 求 得 。( 如 在 家 兔 Ba-Anti-Ea 系统 中 ，a=15.8，b = 83， 代 人 @@ 式 ， 可 得 到 适用 于 该 系 统 的 经 验方 程式 AbNpptd.=15.82-832"), a 依赖 于 抗体 的 特性 ，b 依赖 于 抗体 特性 及 存在 的 抗体 量 。 由 于 在 抗体 过 剩 区 沉淀 也 不 能 完全 ， 加 入 的 抗原 量 总 是 超过 沉淀 物 中 的 抗原 量 。 根 据 实验 数据 作出 图 ， 在 某 些 系 统 往往 和 直线 略 有 偏离 。 因 此 ， 他 们 又 提出 一 个 更 适合 于 这 些 系统 的 经 验方 程式 : AbNpptd.=cz - dx?” @ 其 中 参数 c，d， 可 从 AN /AgN 对 V z 作 图 求 出 。 他 们 又 根据 质量 作用 定律 ， 进 一 步 推 导出 一 个 理论 方程 式 : 9 292 » R?* AbNpptd.=(2R) x - (E) i @) 其 中 ， 常 数 4 = 平衡 点 (平衡 区 的 中 点 ) 上帝 淀 的 抗体 量 (AbN)， R=fAI—AL, WEA ABN /AgN 比值 。 与 四 式 比 较 ， 可 见 =2R8，b= (BR:1/4) 。 由 此 即 可 算出 一 个 未 知 血 清 中 抗体 的 总 含 量 。 例 如 ， 在 上 述 Ea-AntiEa 系统 中 ， 已 知 =15.8,，b=83。 由 此 可 算出 尺 =a/2= 7.9，4= 尼 也 =0.75。 这 和 实验 得 到 的 数据 是 相近 的 。 (2) 吸附 方程 式 由 于 大 多 数 抗原 是 “多 价 的 ?大 分 子 ， 能 以 不 同比 例 和 多 个 双 价 抗体 分 子 结合 。 因 此 ， 可 以 把 抗原 抗体 反应 看 作 抗体 被 抗原 吸附 的 反应 ， 而 使 用 Langmuir 吸附 方程 式 来 近 似 地 描述 此 过 程 。 在 抗原 过 剩 区 ， 此 方程 式 可 写作 : 7 =nK(G) /[1+K(G)] © 其 中 ，7 = 沉淀 物 内 抗原 对 抗体 的 比值 和 = 单位 抗体 的 结合 部 位 的 数目 玉 = 抗 体 和 抗原 决定 簇 之 间 内 在 的 结合 常数 G = 平衡 时 上 清流 内 游离 抗原 浓度 在 毒素 抗 毒 素 系统 中 ， 这 一 方程 式 能 够 很 好 地 符合 实测 的 数据 ， 并 能 预测 沉淀 的 组 成 。 (3) Goldberg 方程 式 Goldberg (1952) 将 关于 计算 叉 链 高 聚 物 中 分 子 大 小 分 布 的 方法 应 用 到 抗原 抗体 系 统 。 假 定 抗原 是 多 价 的 ， 抗 体 是 双 价 的 。 并 且 还 假定 抗原 抗体 反应 过 程 中 不 断 地 形成 直 链 和 叉 链 小 的 聚集 物 ， 直 到 此 系统 达到 一 个 临界 点 为 止 。 此 时 ， 该 系统 从 主要 是 由 小 的 聚集 物 组 成 ， 转 变 为 由 数量 相当 少 的 大 聚集 物 组 成 ， 于 是 开始 出 现 沉淀 。 此 外 ， 还 假定 聚集 物 内 的 反应 不 形成 环 状 构造 ， 并 且 未 起 反应 的 结合 部 位 和 其 他 的 结合 部 位 的 反应 能 力 相 同 ， 不 论 和 它们 相连 的 聚集 物 的 形状 和 大 小 如 何 。 根据 这 些 假 定 ，Goldberg 发 现 m,, (HiP>MPRADT, I 个 单价 抗体 分 子 和 k 个 抗原 分 子 所 组 成 的 聚集 物 的 数目 ) 为 : a Ck —k)! rk=tpktims ik = [G ———IR A 一 tess | (ax 05 oe we RT x pkHtiC1 — pyeki-74101 — pp ik — p) © Hie 8 i=k-1+q oM 抗体 产 生 的 沉淀 则 不 能 溶解 。 家 免 等 实验 动物 的 抗体 (7G) 产生 的 沉淀 ， 在 抗体 过 剩 时， 溶解 度 很 小 。 而 马 抗 血 清 对 蛋白 质 抗原 5 产生 的 沉淀 ， 在 抗体 过 剩 时 ， 却 易 2 于 溶解 (图 11-7) 。 这 种 溶解 度 不 同 的 原因 还 不 清楚 。 有 人 推测 可 能 和 两 种 抗体 的 结合 部 位 在 分 子 上 的 排 列 位 置 不 同 有 关系 。 如 果 抗 体 分 子 的 两 个 结合 部 位 很 靠近 ， 一 个 结合 部 位 和 抗原 结合 就 可 能 在 空间 上 ”妨碍 另 一 结合 部 位 的 结合 ， 从 而 1.0 2.0 3.0 se 干扰 网 格 的 形成 。 这 类 抗体 从 结 ia 构 上 讲 是 双 价 的 ， 而 实际 上 只 能 图 11-7 家 免 和 马 抗 体 与 同型 抗原 的 沉淀 曲线 。 抗体 过 剩 区 ,家 免 起 单价 的 作用 。 因此 ， 在 抗体 过 人 ( 据 Haurowitz, 1964), 剩 时 易 形 成 可 溶 的 抗原 抗体 复合 物 。 此 外 ， 动 物 免疫 时 程 的 长 短 ， 对 抗 血清 的 沉淀 行为 也 有 影响 。 免 疫 时 程 长 的 血清 的 平衡 区 比 短期 免疫 的 血清 的 平衡 区 宽 。 这 反映 了 免疫 过 程 中 ， 抗 体 分 子 组 成 (类 别 , 亲 合 力 等 ) 的 变迁 。 “296。 0.2 0.4 0.6 豪 克 N 总 沉淀 好 ”毫克 (3) 离子 强度 抗原 抗体 复合 物 的 沉淀 的 溶解 度 ， 在 一 定 程度 上 依赖 反应 溶液 的 离子 强度 。 家 免 免 疫 血 清 产生 的 沉淀 ， 通 常用 等 渗 盐 水 〈0.15 M NaCl) 或 PBS 洗涤 ， 较 低 或 较 高 的 离子 强度 都 10 可 能 减少 沉淀 物 的 形成 。 这 似乎 不 是 由 于 沉淀 的 溶解 度 的 增加 ， 而 是 由 于 反应 物 之 间 平 衡 点 的 移 动 ,结果 同 量 的 抗原 只 能 和 较 小 量 的 抗体 结合 。 种 盐 效 应 常常 被 用 来 解 离 沉淀 ， 以 得 到 提纯 的 抗 体 。 有 人 研究 了 各 种 卤素 和 硫 氰 基 的 钾 盐 对 卵 白 蛋白 一 “家 免 抗体 系统 的 影响 ， 发 现 抑制 沉淀 形 成 的 能 力 ，CNS->I->Br->>Cl- > 了 PR 似乎 和 这 些 离子 的 水 合 能 成 反比 。 这 可 能 是 由 于 水 和 能 的 减少 使 这 些 离子 更 易于 和 和 蛋白质 结 合 的 缘故 。 岛 类 抗 血 清 很 特别 ， 在 生理 盐水 中 的 沉淀 量 ， 图 11-8 pH 对 煞 自 蛋白 抗 旷 自重 白 之 沉 汪 反应 反而 要 比 在 高 浓度 盐水 (8% 或 1.36MNaCl) 中 SEY Re Paa rele et 的 少 。 最 大 沉淀 量 % (4) pH 对 于 卵 白 蛋 白 家 免 抗 体系 统 ， 在 pH6.4 和 7.8 之 间 , 沉淀 量 没有 差别 ， 超 过 此 pH 范围 时 ， 痪 淀 便 趋向 于 解 离 (图 11-8)。 毒 素 和 抗 毒 素 中 和 时 ， 反 应 溶液 的 pH 也 没有 可 测 出 的 变化 。 沉 淀 反应 抑制 区 形成 的 可 溶性 复合 物 ， 在 pH7.5 和 4.6 之 间 不 受 影响 ,P 开 再 降低 就 会 发 生 解 离 。 5. 沉淀 物 的 解 离 帝 淀 反应 中 ， 沉 泻 和 上 清 液 中 的 反应 物 处 于 平衡 状态 , 当 用 盐水 洗涤 时 , 沉淀 可 能 解 离 。 抗原 抗体 的 帝 淀 物 〈 其 中 抗原 或 抗体 经 放射 性 同位 素 标记 ) 用 0.9% 盐 水 重复 洗 涤 时 ,发 现 抗 体 有 一 定 的 损失 ， 不 过 损失 量 一 次 比 一 次 减少 , 而 抗原 只 有 极 微量 的 损失 。 A 此 , 免疫 复合 物 的 解 离 可 能 是 按照 下 列 公式 进行 的 : AgAbn (ppt) == AgAbn-™m (ppt) +m Ab (solu.) 由 于 上 述 溶液 可 以 看 作 是 几乎 不 溶 的 AgAb 复合 物 的 饱和 溶液 ，AgAb 的 浓度 维 持 恒定 。 因 此 ， 此 反应 的 平衡 常数 入 =[Ab]， 即 可 用 溶解 的 抗体 的 克 分 子 浓 度 表 示 。 平 is K 相当 于 解 离 常 数 d， 其 单位 为 (moles /liter); 逆反 应 的 平衡 常数 相当 于 结 合 常数 久 a =1 / 玉 dG， 其 单位 为 〈( 升 / 克 分 子 ) 。 抗原 抗体 况 淀 在 高 盐 浓 度 、 低 PH 以 及 半 抗 原 过 剩 均 可 能 解 离 。 在 牛 血清 白 蛋 白 和 家 免 抗 牛 血清 白 蛋白 系统 ， 用 超速 离心 法 观察 不 同 pH 条 件 下 AgAb 混合 物 的 沉降 行 A, RAS p 联 降低 时 ,游离 的 抗体 愈 来 全 增加 ,而 AgAb 复合 物 愈 减少 (图 11-9) 。 这 种 变化 显然 是 pH 的 函数 ， 并 且 是 完全 可 逆 的 。 这 提示 静电 力 可 能 参与 抗原 抗体 的 结合 。 “257 § a 11-9 和 牛 血 清白 蛋白 和 其 抗体 的 混合 物 在 不 同 pH 时 的 超 离心 沉降 图 形 。(Ag) 王 抗原 (Ab) = 7 一 抗体 (a)=Ag,Ab BAY (b) 一 AgsAb， BAY. 出现 游离 抗体 (7)， 复 合 物 同时 减少 CE Singer, 1957), 此 外 ， 高 浓度 的 尿素 和 洗涤 剂 (硫酸 十 二 烷 基 钠 等 ) 也 可 能 引起 解 离 。 此 时 ， 抗 体 从 沉淀 物 释放 出 来 ， 可 能 是 由 于 构象 的 变化 ， 而 使 抗原 和 抗体 之 间 亲 合力 降低 的 缘故 。 二 、 可 溶性 抗原 抗体 复合 物 在 抗原 过 剩 区 ， 家 免 或 马 抗体 都 能 形成 可 溶性 免疫 复合 物 。 抗原 和 单价 抗体 结合 时 ， 则 只 能 形成 可 溶性 复合 物 。 在 抗原 过 剩 区 ， 可 溶性 复合 物 的 存在 可 由 超 离心 场 中 AgAb 混合 物 的 沉降 行为 显示 出 来 (参看 图 11-9) : 离心 场 内 出 现 两 个 峰 , 一 为 游离 抗原 ， 一 为 抗原 抗体 复合 物 。 根 据 Singer 和 Campbell 等 (1955，1959) 的 研究 ,所 产生 的 复合 物 中 ， 抗 原 和 抗体 的 克 分 子 比值 (Ag/Ab) RAAT 2, 这 是 和 沉淀 抗体 的 双 价 性 一 致 的 。 根据 在 不 同 的 Ag/Ab 比值 条 件 下 的 超 离 心 实验 ， 还 可 以 测定 抗原 抗体 的 亲 合 力 常数 。 非常 奇怪 的 是 ， 半 饱和 硫酸 铵 对 BSA 和 抗 BSA 抗体 的 结合 没有 明显 的 影响 ， 并 且 游离 的 BSA (F) 和 与 抗体 结合 的 BSA (B) 的 比值 (了 /B)， 在 这 样 高 的 离子 强度 下 也 没 有 改变 。 如 果 使 用 标记 抗原 BSA-' 1, 就 可 以 用 加 硫酸 铵 达 半 饱和 度 前 后 计数 的 放射 性 me, SKM int PMRW MAGH BSA 的 浓度 (Farr RH). 这 一 简便 的 方法 也 可 以 用 到 某 些 其 他 的 放射 免疫 测定 系统 ， 如 wx- 胎 儿 球 蛋白 的 测定 。 抗原 抗体 沉淀 的 形成 不 仅 依 赖 于 抗原 的 多 价 性 和 抗体 的 双 价 性 ， 而 且 还 依赖 于 这 两 种 成 分 的 理化 性 质 。 例 如 家 免 的 抗 BSA 抗体 ， 原 为 沉淀 抗体 ， 经 过 乙酰 化 后 ， 虽然 仍 然 能 和 相应 的 抗原 或 半 抗 原 结合 ， 但 不 能 产生 沉淀 ， 转 变 为 非 沉淀 抗体 了 。 豚 鼠 注射 胰 岛 素 以 后 也 能 形成 非 沉 淀 抗体 。 利 用 胰岛 素 -:?I 放射 免疫 电泳 实验 可 以 证 明 胰 岛 素 - 抗 体 复合 物 的 形成 。 游离 的 胰岛 素 留 在 原点 ， 结 合 的 胰岛 素 - 抗 体 复 合 物 和 其 他 球 蛋 白 一 同 移动 。 虽然 可 溶性 抗原 抗体 复合 物 的 形成 机 制 要 比 抗原 抗体 沉淀 形成 的 机 制 要 简单 一 些 ， 抗体 抗原 的 相互 作用 仍然 可 能 受到 两 种 大 分 子 之 间 的 非 专 一 的 相互 作用 的 干扰 。 三 、 抗 体 分子 和 半 抗 原 的 结合 当 用 小 分 子 的 半 抗 原来 代替 抗原 大 分 子 时 ， 抗 原 抗体 大 分 子 之 间 由 于 非 专 二 的 相互 作用 力 造 成 的 复杂 性 就 可 以 消除 了 。 因 此 ,关于 抗原 抗体 反应 的 热力 学 、 动 力学 以 及 结合 专 一 性 的 构造 基础 等 方面 的 研究 ， 都 是 在 半 抗 原 抗体 系统 上 进行 的 。 ° 298 ， a —— ea ee ee ea ee ee ec ww a 二 (一 ) 亲 合 力 概念 。 抗 体 和 半 抗 原 结合 能 力 的 测定 抗原 抗体 反应 中 ， 抗 原 ( 半 抗原 ) 和 抗体 之 间 的 结合 强度 称 为 亲 合力 (Affinity 或 Avidity)*， 可 用 反应 过 程 中 自由 能 的 变化 来 量度 。 亲 合 力 的 大 小 依赖 于 抗体 的 结合 位 点 和 抗原 ( 半 抗 原 ) 决 定 敌 在 空间 上 的 密 合 程度 以 及 相互 作用 力 的 性 质 。 一 般 说 来 ， 抗 体 抗原 结合 松散 、 易 于 解 离 者 ， 亲 合力 低 ， 而 结合 牢 , 不 易 解 离 者 ， 亲 合力 高 。 因 之 ， 在 实 际 应 用 中 , 亲 合 力 常用 下 列 反应 式 的 平衡 常数 来 表示 : 半 抗 原 + 抗体 结合 位 点 = 一 半 抗 原 抗 体 复 合 物 RM H+Ab=~HAb He pee _ CHAb] 平衡 常数 Ku LAD)” 其 中 平衡 常数 Ku 称 为 此 反应 的 结合 常数 ， 亦 可 称 为 亲 合 常数 。 在 结合 专 一 性 的 构造 基础 的 研究 中 ， 通 常用 某 一 半 抗 原 的 结合 常数 (Ky) 与 另 一 参 考 半 抗 原 的 结合 常数 ( 开 ,-) 相 比 较 ， 来 表示 半 抗 原 构造 的 变化 对 结合 的 影响 : K 相对 结合 常数 K,. ==" Kye 一 般 的 抗体 制品 都 是 不 均一 的 ， 存 在 着 多 种 多 样 的 亲 合 力 不 同 的 结合 位 点 。 Alt, 对 于 某 一 半 抗 原 ， 存 在 一 群 结合 常数 的 分 布 曲 线 。 此 情形 下 ， 可 测定 几 个 不 同 半 抗 原 浓 度 的 结合 情况 ， 并 根据 假定 的 分 布 函数 计数 出 该 系统 的 平均 结合 常数 Ku (参看 Pres- sman 和 Grossberg，1968，238 页 ) 。 测定 半 抗 原 抗 原 反应 系统 的 平衡 常数 ， 常 用 下 列 的 几 种 方法 : 1. 平衡 透析 法 测定 平衡 常数 Ka 最 常用 的 方法 是 平衡 透析 法 (Equilibrium dialysis) 。 将 透析 袋 内 盛 以 一 定量 的 抗体 溶液 ， 放 人 溶 于 绥 冲 液 的 半 抗 原 溶 液 中 ， 作 其 平衡 。 当 达到 平衡 时 ， 透析 袋 内 外 游离 半 抗 原 的 浓度 [五 ] 相等 , 而 袋 内 半 抗 原 总 浓度 [C]， 大 于 袋 外 半 抗 原 浓 度 [ 互 ]， 内 外 半 抗 原 浓 度 的 差 [C] 一 [ 互 ] 就 相当 于 和 抗体 结合 的 半 抗 原 浓 度 [Ab] 〈 图 11-10) 。 半 抗 原 浓度 可 用 比 色 分 析 或 同位 素 标记 法 来 WE. KEN, 它们 之 间 存 在 下 述 关 系 : 透析 袋 内 半 抗原 总 浓度 [C] 一 透析 袋 外 半 抗 原 浓度 CDI Panne = 和 抗体 结合 的 半 ti Ei 浓度 [Ab 五] 或 游离 的 结合 位 点 浓度 = 抗体 结合 位 点 总 浓度 - [Ab 五 ] 如 抗体 为 2 价 的 ， 就 可 以 计算 出 抗体 的 总 浓度 =1/2 抗 体 结合 位 点 的 总 浓度 。 11-10 平衡 透析 装置 示意 图 。 ”在 外 文 文献 中 ,“Avidityg” 和 “Affinity” 近来 常 当 作 同义词 使 用 , 表示 抗原 抗体 反应 的 结合 能 。 严格 说 来 ， “Avidity” 是 专 指 抗体 的 结合 位 点 的 性 质 , 而 “Attinity” 则 是 指 抗原 决定 得 的 性 质 而 言 。 用 结合 能 表示 时 ， 抗体 对 抗原 的 “Avidity” 与 抗原 对 抗体 的 “Atffinity?” 在 数值 上 是 相等 的 。 为 简明 起 见 ， 本 书 中 文 名 词 只 采 用 “ 亲 合 力 ? 一 词 , 其 单位 为 升 / 克 分 子 。 2 299 s 通常 抗体 的 总 浓度 是 未 知 的 。 因此 ， 在 不 同 的 半 抗 原 浓度 时 ， Dal MICAH] 和 CH], ah OlRtm, Bite i Kue 例 “ 设 在 相同 的 实验 条 件 下 (透析 袋 内 外 的 体积 ， 抗 体 总 浓度 相等 ) ， 两 次 实验 测 得 之 游离 半 抗 原 浓 度 分 别 为 [ 互 ] 和 [五 ]。 平 衡 时 ， 测 得 透析 袋 内 半 抗 原 总 浓度 分 别 为 Ci 和 Cs， 则 与 抗体 结合 的 半 抗 原 浓度 分 别 应 为 : [LAbH,] = Ci 一 [五 [AbH,] =C,-(H,] 由 于 两 次 实验 的 抗体 总 浓度 (z) 相同 ， 游 离 抗体 浓度 LAb] 应 分 别 为 :， [Ab,] =2-[CAbH,] [CAb,])=2-[AbH,], 当 达 到 平衡 时 ，[Ab] +CH,] = [Ab 万 ] @ [Ab,] + [H,]==[AbH,] @ 由 此 ， 结 合 常 数 Ky= [ARH] _ _CAbH,] _ [AbH,] [Ab,JCH:] ([CAbJCH,J [x-[AbH,J](H,] : [AbH,] 区 [a -[AbH,]] [H,] MO, Ki z 值 ， 再 代 人 轿 式 ， 即 可 求 出 Ka 值 。 2. BRIE (fluorescence quenching ) 抗体 蛋白 质 的 色 氮 酸 残 基 ， 在 紫外 光 激 活 下 能 发 射 蓝 光 。 当 抗体 分 子 和 半 抗 原 结 合 时 ， 抗 体 的 曹 光 就 减弱 ， 这 一 现象 称 为 草 光 灭 活 。 萤 光 灭 活 程 度 和 抗体 结合 位 点 被 半 抗 原 结 合 的 比例 有 关系 ， 因 此 可 以 用 来 测定 抗体 半 抗 原平 衡 中 的 各 数值 。 当 半 抗 原 的 吸收 光谱 和 色 氨 酸 残 基 的 萤 光 发 射 光谱 (330 一 360 mz) 重合 时 ， 萤 光 灭 活 效 应 最 显著 。 因 此 ， 黄色 的 半 抗 原 , 如 2,4 二 硝 基 酚 (DNP-) RAR, 测量 操作 法 是 在 一 定量 的 抗体 溶液 内 逐次 加 入 小 量 的 半 抗 原 ， 每 加 一 次 后 随即 测 萤 光 强 度 ， 由 此 得 到 一 系列 的 滴定 数据 。 根 据 这 些 数 据 就 可 求 出 抗体 溶液 内 结合 部 位 的 浓 度 和 Ka 值 。 这 一 方法 只 需要 微量 抗体 (20 一 200 微克 ) ， 操 作 简 便 ， 迅 速 。 但 缺点 是 需 用 纯化 的 抗体 ， 并 限于 黄色 半 抗 原 ， 因 而 在 应 用 范围 上 受到 限制 。 3. 半 抗 原 抑 制 沉 淀 反 应 法 抗体 和 半 抗 原 结合 的 结合 常数 (Ky) 最 常用 沉淀 反应 抑制 实验 来 测定 。 在 免疫 血清 或 抗 林 溶液 中 ， 先 加 不 同 量 的 半 抗 原 ， 然 后 再 加 入 抗原 。 由 于 半 抗 原 和 抗原 竞争 抗体 分 子 的 结合 位 点 ，AgAb 复合 物 的 形成 受到 半 抗 原 的 抑制 。 抑 制程 度 随 半 抗原 量 的 增加 而 增加 。 当 有 过 量 半 抗 原 [ 五 ] 存在 时 ， 它 们 之 间 的 关系 可 用 下 述 的 化 学 平衡 来 表示 : AgAb+ H=—HAb+ Ag 由 此 ，[AgAb] =K 人 二 ， 其 中 开 = 平衡 常数 。 从 上 式 可 见 ， 当 半 抗 原 浓度 CH] 增加 时 ，[AgAb] 的 形成 就 减少 。 。 300。 在 半 抗 原 结 构 和 结合 专 一 性 的 关系 的 研究 中 ， 最 常用 这 一 方法 来 测定 半 抗 原 的 相对 亲 合 常数 (Ka), MERKUR (AE) 和 参考 半 抗 原 〈 瓦 -) ， 各 自在 不 同 浓度 时 对 沉淀 反应 的 影响 。 实 际 作 近似 测量 时 ， 只 需 测 定 产生 50% 抑制 时 所 需 的 半 抗 RMS 考 半 抗 原 的 浓度 ， 就 可 求 出 Ke。 由 于 在 此 抑制 程度 时 , 游离 抗体 浓度 [Ab] 是 相同 的 ， 半 抗 原 抗体 复合 物 浓 度 [ 互 Ab] 也 是 相同 的 。 Ai, 相对 亲 合 常数 Ki = 元 refH _ __ CHAbI50% CH, AbI50% [H]50% [Ab] 50%/ (H,.3150% [Ab]50% _ CH 50% [H150% 在 通常 实验 条 件 下 ， 抗 体 的 总 浓度 和 半 抗 原 的 总 浓度 相 比 之 下 是 很 小 的 ， 因 此 游离 半 抗原 浓度 大 略 相当 于 总 半 抗 原 浓度 。 于 是 上 式 可 进一步 简化 为 ; K,, = [产生 50% 抑制 所 需 参考 半 抗 原 总 浓度 ] ， [产生 50% 抑制 所 需 加 入 的 半 抗原 总 浓度 ] 半 抗 原 抑 制 实验 亡 需 的 抗体 量 比 平衡 透析 法 要 少 ， 并 且 准 确 性 高 。 因 此 应 用 最 广 。 “( 二 ) 抗体 抗原 反应 中 的 能 量变 化 1. 自由 能 的 相对 变化 抗体 抗原 反应 中 ， 抗 体 与 半 抗 原 ( 抗 原 ) 结 合 的 自由 能 的 相对 变化 可 用 下 述 公式 来 表 AF,,., = —RT1nKrel. Erp, R=“ (2.0 卡 / 克 分 子 AA), T= 绝对 温度 HEA, AF. FESR 玉 ,-， 的 对 数 呈 直线 关系 。 研究 半 抗 原 结构 变 化 对 半 抗 原 抗体 反应 的 影响 时 ， 自 由 能 的 相对 变化 CAF...) 和 相对 亲 合 常数 的 计量 是 很 有 用 处 的 。 例 如 ， 半 抗原 的 一 个 所 原子 被 某 一 基 团 取代 后 ， 亲 合 常 数 增加 二 倍 时 ， 该 反应 的 自由 能 的 变化 达到 380 卡 ， 如 果 另 一 结构 变化 使 亲 合 常数 增加 四 倍 时 ， 反 应 的 自 由 能 变化 达到 760 卡 。 因 此 ,测量 亲 合 常数 和 自由 能 的 变化 就 能 够 把 半 抗 原 的 结构 变化 和 专 一 性 及 亲 合 力 的 关系 用 精确 的 数量 关系 表示 出 来 。 2. #4 (Enthalpy) 的 变化 如 果 平 衡 透析 是 在 两 种 不 同 的 温度 下 进行 的 ， 可 得 到 两 个 Ka 数值 ， 由 此 可 以 计算 出 半 抗 原 和 抗体 结合 位 点 结合 时 ， 总 能 量 , 即 热 函 的 变化 。 设 两 温度 分 别 为 Ti，T:， 相应 的 结合 常数 为 K,, K,. HR Van't Hoff HER, 热 函 应 为 ， AH =RT,T, In (K,/K,) /T, 一 了， [ 例 ]， 设 某 一 半 抗 原 抗 体 反 应 中 ， 已 测 知 T, =25°C (298°K) « 301 « T,=35°C (308°K) Ky=2'% 108 R= 10° Wl] AH = 2.0 x 298 x 308 x 2.3 x log (1/2) /10 = -1270 F/R OF M-1.27 FRIED F. 也 就 是 说 当 K 增加 二 倍 时 ， 总 能 量 AH 的 变化 为 -1.27 和 干 卡 / 克 分 子 。 VADAVEE, CH: AH=AF+TAS 其 中 ，AS Aji (Entropy) 的 变化 ， 单 位 为 eu (leu=1K/WOT/E). wiz 系统 的 无 秩序 性 的 量度 。 业 的 增加 的 物理 意义 是 自由 度 的 增加 。 例 如 ， 大 分 子 降解 为 小 分 子 时 ， 双 键 加 氢 成 为 能 沿 一 C 一 C 一 轴 自 由 转动 的 单 键 时 ， BAHN. 各 种 半 抗 原 抗 体系 统 的 A 互 测定 值 , 表 现 很 大 的 波动 。 一 些 实验 里 ，A 互 三 AR， 表明 AS->O。 另 一 些 实验 里 ，A 互 数值 很 低 , 表 明 AS BREA IE. A. KH 与 半 抗 原 和 抗体 结合 时 ， 抗 体 表面 亲 水 性 基 团 所 束缚 的 有 一 定 排列 秩序 的 水 分 子 层 的 破 坏 有 关系 。 这 一 问题 在 讨论 抗体 抗原 反应 的 分 子 间 力 的 性 质 时 将 作 进 一 步 说 明 。 (=) 抗体 亲 合 常数 的 不 均一 性 由 于 抗体 分 子 群 的 不 均一 性 ， 用 以 上 几 种 方法 测定 的 亲 合 常数 (入 a) ,是 不 同 的 抗体 分 子 和 某 一 半 抗 原 结 合 的 许多 不 同 的 亲 合 常数 的 平均 值 。 Eisen 和 Siskind (1964) 用 DNP-7- 球 蛋白 免疫 家 免 后 得 到 的 抗体 ,用 DNP-7-= 球 蛋 白 连续 闹 淀 法 分 离 出 对 DNBP 决定 簇 亲 合力 不 同 的 抗体 。 在 三 只 家 免 上 ， 每 一 只 得 到 九 或 十 部 分 抗体 ， 并 用 平衡 透析 法 或 草 光 灭 活 法 测定 每 一 部 分 与 IDNP 的 亲 合 常数 。 三 只 家 免 的 第 一 部 分 抗体 的 Ka 分 别 为 : 1.6 x 107?，1.0 x10*， 和 1.4 x10s， 个 体 间 有 很 大 的 差别 。 连 续 沉 淀 的 几 部 分 抗体 ， 亲 合力 逐次 降低 。 最 后 的 一 部 分 ， 三 只 家 免 各 为 : 9Xx104，1.1X105 和 4Xx104。 由 于 这 些 差异 达到 几 个 数量 级 ， 当 加 入 小 量 半 抗原 时 ， 半 抗原 分 子 主要 和 亲人 合力 高 的 抗体 结合 ， 只 有 加 入 过 量 的 半 抗 原 时 ， 亲 合力 低 的 抗体 才能 和 加 入 的 半 抗 原 结合 。 因此 ， 用 平衡 透析 法 得 到 的 平均 Ky 就 在 颇 大 程度 上 失去 了 意 不 但 在 个 体 之 间 抗 体 的 亲 合 常数 是 高 度 不 均一 的 ， 同 一 个 体 在 免疫 过 程 中 抗体 的 杀 合力 也 有 很 大 的 改变 。 用 萤 光 灭 活 法 证 明 ， 对 于 DNP 系统 在 免疫 过 程 中 , 抗 DNP 抗体 对 DNP 半 抗 原 的 亲 合 力 有 相当 大 的 增加 (Fujio 和 Karush, 1966); 离 体 培养 的 抗体 形成 细胞 的 生长 过 程 中 ， 也 有 类 似 的 表现 (Steiner 和 Eisen, 1966). 个 体 之 间 以 及 同一 个 体 免 疫 过 程 中 ， 抗 体 的 Kui 不 均一 性 ， 在 选择 供 放射 免疫 测定 用 的 抗体 时 ， 应 特 别 加 以 注意 。 (四 ) 抗体 价 的 测定 平衡 透析 法 也 可 用 于 抗体 半 抗 原 系 统 中 ， 抗 体 结合 的 价 数 ， 即 每 一 抗体 分 子 结合 位 点 的 数目 的 测定 。 。302 。 Karush (1963) 发 现 每 一 抗体 分 子 所 结合 的 半 抗 原 分 子 的 平均 数 , 随 半 抗 原 浓 度 的 增加 而 增加 ， 最 后 接近 一 个 最 大 的 正 整数 值 w。 对 于 单价 抗体 &=1.0， 双 价 抗 体 忆 = oh. 设 平衡 透析 法 测定 的 游离 半 抗 原 浓度 为 c， 每 一 抗体 分 子 上 结合 的 半 抗 原 分 子平 A 数目 为 Y>， 则 >，e 之 间 存 在 下 述 关系 : 7 y/c=nK-7vK 如 以 >/e 对 7Y 作 图 ， 理 论 上 应 得 到 一 直线 。 当 yy/ec=0 时 ， 直 线 在 横 坐 标 上 的 截 距 即 为 > 的 最 大 值 ， 即 加。 实际 上 ， 通 常 由 于 抗体 分 子 的 不 均一 性 ， 得 出 的 是 一 条 和 直线 偏离 的 曲线 。 然 而 ， 仍 可 以 外 推 到 >Y， 由 此 确定 忆 值 (图 11-11) 。 图 11-11 D-Ip 染料 D-phenyl-p- (p- dimethylaminobenzeneazo)benzoylamino acetate, 或 (CHa):N.CeoH4.N:N.CcH4， CO-NH-CH(C,H,)-COOH 与 提纯 的 抗 D-Ip- 抗 体 在 25" 和 7.1sC 结合 的 结果 。7 示 在 游离 半 抗 原 浓度 C 时 ， 已 与 半 抗 原 结 合 的 每 一 抗体 分 子 结合 部 位 的 平均 数 。 (# Haurowitz, 1968), y/c X 107 、 抗 体 半 抗 原 结 合 的 结构 基础 (一 ) 半 抗 原 结构 变化 对 抗体 全 抗原 相互 作用 的 影响 利用 前 述 半 抗 原 抑制 抗原 抗体 沉淀 反应 的 方法 ， 能 够 系统 地 研究 半 抗 原 结构 变化 对 抗体 半 抗 原 结合 的 影响 。 由 于 这 种 变化 的 影响 可 用 K,. 或 AR KBE, 因此 可 以 得 到 抗体 与 半 抗 原 结合 能 力 和 专 一 性 的 构造 基础 的 精确 知识 。 今 举 p- 偶 氮 葵 甲酸 半 抗 原 系统 为 例 ， 比 较 葵 甲酸 的 茶 环 不 同位 置 被 氯 原子 取代 ， 对 抗 -p- 偶 氮 茜 甲酸 抗体 专 一 沉淀 的 抑制 影响 。 以 最 适量 抗原 所 产生 的 沉淀 量 的 %% 表 示 抑 制程 度 ， 并 对 加 和 人 的 半 抗 原 克 分 子 浓度 作 图 。 由 图 11-12 可 见 各 种 葵 甲 酸 衍 生物 的 抑制 沉淀 反应 的 能 力 不 等 : P- (P'-BARBA) APR>p-AAPR>mM-AAAROAPR( AD) >O-AA RR, 计算 各 种 葵 甲 酸 衍 生物 相对 于 苯 甲 酸 的 K,... 值 : p-(p -BAREBA) 茶 甲 酸 为 23，P- was ARBA 2.8, m-RA ABH 1.6, O-MAA MA 017, 相应 的 AR 见 表 11-4。 p- 偶 氮 葵 甲酸 基 团 的 Van der Waals 轮廓 如 图 11-13 所 示 , 并 假设 抗 p- 偶 氮 茶 甲酸 抗体 的 结合 位 点 能 够 和 它 紧 密 地 结合 (图 11-4) 。 至 于 p-(Pp'- 羟 葵 基 偶 氮 ) 苯 甲酸 ， 与 葵 。303 。 表 11-4 ， 茶 甲 酸 的 葵 环 置换 后 对 抗 -p- 偶 氨 苯 甲酸 系统 结合 的 影响 。 | 抗 BR Kye1 | AF ye, (cal) Peis 5, AAR 一 C Ne p-(Pp'- 羟 葵 基 偶 氮 ) 苯 甲酸 100 沉淀 的 抗体 %. 100 200 300 400 半 抗 原 浓度 -M X 10°) 图 11-12 各 种 半 抗 原 对 抗 -p- 偶 氮 葵 甲 酸 抗体 专 一 沉淀 的 抑制 。(-@-》 氢 茉 甲酸 ; (-0-) * 甲酸 ; 〈-^-)m- 氧 ; 〈-X-) p- 氧 ; (- 全 -)p- 羟 东 基 偶 氮 ( 据 Pressman 51954), 甲酸 比较 ,Kxr 4 23(4F,..= -1700 卡 )， 和 抗体 结合 甚至 比 葵 甲 酸 还 要 强 。 对 这 一 事实 可 能 的 解释 是 抗体 不 仅 与 葵 甲 酸 基 团结 合 ， 而 且 与 偶 氮 茶 甲 酸 以 及 其 附着 到 蛋白 质 上 的 部 位 结合 。p-(p- 羟 葵 基 偶 须 ) 葵 甲酸 除 含 有 p- 偶 氮 共 甲酸 构造 外 ， 还 含有 和 栈 氮 酸 相 似 的 茶 环 ， 因 此 与 抗体 结合 部 位 有 最 大 的 接触 。 对 于 其 他 衍生 物 ， 当 氧 位 于 间 位 (m) 时 ， 结 合力 也 比 葵 甲酸 强 (CK, = 1.8)， 但 比 p- 氧 葵 甲 酸 低 。 这 可 能 是 由 于 抗体 结合 部 位 在 此 区 域 的 密 合 程度 不 够 高 ， ABET ths 另 一 可 能 的 解释 是 氧 原子 有 较 大 的 范 德 瓦 耳 吸引 力 ， 抵 销 了 干扰 的 影响 。 当 氯 在 邻 位 取代 时 ， 结 合 能 降 到 最 低 (K,.=0-17, AF,.=+950-—). 这 是 由 于 空间 阻碍 的 结 s。 304 。 果 : ”首先 ， 氧 原子 的 体积 较 大 ; 其 次 ， 葵 甲酸 的 羧基 和 来 环 由 于 共振 而 位 于 同一 平面 As 邻 位 被 氧 原子 取代 可 能 使 羧基 偏离 葵 环 平面 。 对 O- 氯 葵 甲 酸 之 和 射线 晶体 分 析 发 现 羧基 偏离 共 环 平面 达 14"， 也 证 实 了 JX— Fie 研究 各 种 和 葵 甲 酸 有 关 的 化 合 物 与 抗 pb- 偶 氮 葵 甲酸 抗体 的 结合 ， 对 抗体 结合 专 一 性 问题 增订 了 许多 知识 。 例 如 ， 用 其 他 基 团 , 如 磺 酸 、 砷 酸 或 硝 基 ( 大 小 和 羧基 相似 , 但 不 带电 荷 ) 置换 羧基 的 实验 表明 羧基 对 于 结合 是 非常 重要 的 : 带 负 电荷 而 大 小 不 同 的 基 团 ,或 者 外 形 大 小 相似 而 不 带电 荷 的 基 团 都 不 能 结合 。 同 样 地 ， 用 不 同 大 小 的 原子 来 取代 邻 位 和 间 位 的 所 原子 也 可 以 显示 抗体 在 半 抗 原 周围 的 密 合 程度 。 用 其 他 基 团 来 取代 偶 氮 基 团 ， 或 用 环 己 烷 来 置换 葵 环 ,也 可 以 对 结合 专 一 性 提供 知识 。 L. Pauling, D. Pressman 等 从 1942 年 以 来 ， 用 上 述 方 法 ， 图 11-13 ，p- 偶 氨 苯 四 BRN DUR Re RA Van der Waals 轮廓 (5% 氮 酸 残 基 相 连 )。 系统 地 研究 了 几 百 个 结构 上 彼此 有 关系 的 半 抗 原 对 各 种 抗原 抗体 沉淀 反应 的 抑制 影响 。 其 结果 总 结 在 一 本 专 著 《 抗 体 专 一 性 的 构造 基础 》(Pressman 和 Grossberg，1968) 中 。 其 主要 的 结论 简 述 如 下 : 1) 半 抗 原 抑制 实验 有 力 地 支持 ， 抗 体 结合 位 点 与 抗原 决定 得 的 空间 互补 性 是 免疫 ©) Cd (e) 图 11-!4 Shiki 5Sti-p-BAAPRRAZAARHNBGRENARA. (a) p- 侦 氮 苯 甲酸 。 (b) AIRE, (c) p- 氧 苯 甲 酸 。 (d) m- 氧 茶 甲 酸 。 (e) o MMM GB Pre- ssman 和 Grossberg, 1968), * 305° 表 11-5 抗 D- 和 抗 L-#2 (P- 偶 氨 苯 甲 酰 氨 基 7 醋 酸 系统 中 光学 异 构 物 和 抗体 的 结合 a 抗 原 Anti-D Krel Anti-L Krel D-phenyl ‘Ae 1 H Jew (p-nitrobenzoyl- O,N—< 2 一 c 一 NH 一 c 一 5 1.00 0.0090 amino )acetate | No CY \ « 全 L-phenyl- O NA = | (p-hitrobenzoyl- oNn-€ > C—NH—c 0.006 1.00 H amino )acetate ( 据 Pressman 和 Grossberg, 1968), 学 专 一 性 的 基础 。 如 上 述 葵 甲 酸 系统 ， 改 变 半 抗原 分 子 形状 ( 范 德 瓦 耳 轮廓 )。 置换 某 些 基 团 ， 或 改变 其 位 置 ， 并 比较 这 些 构造 变化 的 抑制 效应 ， 就 可 推算 出 每 一 个 半 抗 原 的 相 对 亲 合 常数 K... 如 图 11-14， 表 11-4 所 示 ， 很 高 的 负 AF 值 (表示 高 的 亲人 合力) 是 和 半 抗 原 的 范 瓦 德 耳 轮廓 与 抗体 的 结合 位 点 的 高 度 密 合 有 关系 的 ， 而 正 AR A 〈 表 示 亲 合 力 低 ) ， 空 间 的 互补 性 也 就 低 。 因 此 , 免疫 学 专 一 性 依赖 于 分 子 轮廓 间 的 相合 性 。 2) 如 果 抗 原 决 定 簇 含有 带 正 电荷 或 带 负 电荷 基 团 , 其 电荷 参与 抗原 和 抗体 之 间 的 亲 合力 。 例 如 ， 带 电荷 的 p-BARB—N—= HRTF (—N=N—C,H,N*(CH,),) 和 不 带电 荷 的 p- 偶 氮 苯 基 三 甲 基 甲 烷 ( 一 N =N 一 CeH, 。C(CH。)。) 。 这 两 个 分 子 具 有 相同 的 分 子 形状 ， 三 个 甲 基 也 有 相似 的 空间 排列 。 然而 ， 不 带电 荷 的 分 子 的 相对 亲 合 常数 Ky. 只 有 带电 荷 的 分 子 的 KK 之 118。 因 此 ， 抗 体 结合 位 点 和 半 抗 原 之 间 可 能 存在 静电 吸引 力 ， 结 合 位 点 之 负电 和 荷 的 羧基 可 能 参与 和 阳离子 半 抗 原 的 结合 。 3) 立体 构 型 的 影响 。 从 光学 异 构 物 , 顺 、 反 式 异 构 物 之 间 玫 ,- 的 差别 ， 更 可 看 出 半 抗原 与 对 应 的 抗体 结合 位 点 之 间 密 合 程度 的 重要 性 。 由 于 抗体 分 子 是 由 1- 氨基酸 组 成 的 ， 其 结合 位 点 总 是 光学 不 对 称 的 。 在 葵 基 (p- 偶 氮 葵 甲 酰 氨基 ) 乙酸 系统 中 ， 发 现 搞 D- 构 型 半 抗 原 的 抗体 与 D- 构 型 半 抗 原 的 结合 比 与 工 - 构 型 半 抗 原 结合 的 效率 要 高 100 倍 ， 反 之 亦 然 ( 表 11-5) 。 抗 工 - 构 型 的 抗体 对 一 个 大 小 相差 一 点 的 工 - 构 型 的 半 抗 原 ， 仍 然 比 对 一 个 大 小 相等 的 D- 构 型 的 半 抗 原 较 易 结 合 。 总 之 ， 以 上 这 些 事实 再 次 证 明 ,， 抗原 抗体 分 子 之 间 空 间 结 构 的 互补 性 是 免疫 学 专 一 性 的 基础 ,并 由 于 相互 作用 力 的 性 质 , 要 求 两 反应 物 的 反应 表面 彼此 接近 到 相距 1 或 2A 的 距离 以 内 。 (=) 抗体 亲 合 力 不 均 一 性 的 结构 基础 抗 血清 可 能 包括 不 同类 别 的 免疫 球 蛋白 IgG, IgM, IgA), ENHAAMINE 质 自然 会 有 差别 。 即 使 同一 类 别 的 免疫 球 蛋白 ， 并 且 针 对 同一 半 抗 原 决定 得 的 抗体 ， 结 合 位 点 的 性 质 仍 然 可 能 有 差别 。 这 可 能 是 由 于 半 抗 原 决 定 簇 位 于 载体 蛋白 质 大 分 子 的 不 同 部 位 ; 其 次 ， 半 抗原 在 载体 分 子 表面 可 能 处 于 不 同 的 空间 位 置 , 即 所 谓 的 位 置 效应 (图 。306。 We ai ea 和 11-15) (参看 第 六 章 183 页 ) 。 同一 种 抗 半 抗 原 抗体 的 亲 合 常数 和 结合 位 点 的 氨基酸 组 成 都 可 能 不 同 。 因 此 ， 人 能 用 免疫 化 学 方法 把 这 种 不 均一 的 抗 半 抗 原 抗体 分 离 为 许多 具有 不 同 的 结合 能 力 的 部 分 ， 并 且 能 证 明 这 些 抗体 的 不 同 的 结合 位 点 是 适合 于 同一 半 抗 原 分 子 的 不 同 部 位 。 1. H-GIL 系统 GIL 基 团 是 一 个 异 葵 二 酸 基 团 ， 其 中 一 个 羧基 和 甘氨酸 的 氨基 ， 另 一 个 羧基 和 亮 氨 酸 的 氨基 相连 而 成 。 分 子 的 葵 环 通过 偶 氮 基 与 载体 蛋白 质 相 连 (图 11-16) 。 Kreiter 和 Pressman (1964c) 将 抗 -GIL 血清 吸附 到 一 个 把 GIL 基 团 连 接 到 纤维 素 做 成 的 固 相 免疫 吸附 柱 上 。 先 将 非 抗 体 蛋 白质 洗 脱 ， 然 后 依次 再 用 5x10-*M 浓 度 的 m- 硝 基 ARR (L- 半 抗原 ) 、m- 硝 基 葵 甲 酰 甘氨酸 (G- 半 抗原 ) 和 蜡 葵 二 酰 -甘氨酸 -D,L- 亮 毛 酸 〈(GIL- 半 抗 原 ) 分 段 洗 脱 。 洗 脱 的 各 部 分 相应 地 称 为 下 G, GIL 部 分 (图 11-17) 。 用 平衡 透析 法 测定 各 抗体 部 分 之 亲 合 常 数 ， 结 果 见 表 11-6。 从 表 11-6 可 见 ， 从 抗 GIL 抗 血 清 分 离 出 之 G- 部 分 与 oe ©, G- 偶 氮 半 抗原 的 结合 能 力 大 概 和 全 (ce) ; , ] Loge, 抗 血 清 相近 。 G- 部 分 不 能 和 工 - 偶 氮 gis 同一 个 半 抗原 位 于 抗原 分 子 表面 的 不 同位 置 。 p- 偶 半 抗 原 结 合 。 反之 ，L- 部 分 能 与 工 - ” 氨 苯 甲酸 基 团 , 从 载体 蛋白 表面 伸 出 〈a), 侧 卧 (b), 或 背 卧 《c) Reese smite me G-emee RRB Prom BY Crombere, OOD)> 抗原 结合 ;并 且 与 工 - 偶 氮 半 抗 原 的 结合 能 力也 约 和 全 抗 血清 相近 。 虽然 G- 和 工 -抗体 部 分 各 与 G- 和 工 - 半 抗 原 专 一 地 结合 ，GIL- 半 抗原 分 子 的 其 余 构造 也 有 影响 。 AA, in 表 11-6 所 示 ，G- 和 工 -部 分 的 抗体 与 GIL- 偶 氮 半 抗原 的 结合 更 为 加 强 ，-AR 值 的 变化 各 从 6.9 于 卡 ~>7.3 干 卡 ，6.5 FK>74 千 卡 。 和 G- 偶 氮 半 抗原 和 工 - 偶 氮 半 抗 原 比 较 ， GIL- 偶 氮 半 抗原 都 多 一 个 氮 基 酸 残 基 。 GIL 半 抗 原 分 子 的 范 德 瓦 耳 轮廓 ， 以 及 各 部 分 抗体 的 结合 位 点 推 起 的 轮廓 如 图 11- 18 Aras: 从 主要 针对 GIL 分 子 的 G 部 分 的 抗体 接受 部 位 (a,b) 开始 ， 经 过 同时 针对 G- 和 工 -的 过 渡 类 型 (c, d) ,然后 到 主要 针对 工 -的 (e,f) 。 从 表 11-6 已 见 到 ,G- 和 工 -部 分 的 。307 。 一 一 一 一 wa 一 一 ie CH H、 | Cc Oo Oo H HO N/E ae oe SNE eNO Mae No Zea 0% 六 3; WU + No | N nd 蛋白 质 5.X%. 10>, Si, 10s Sst Osa 图 11-16 GIL ain( mmm ] os G 亮 氨 酸 半 抗 原 浓度 图 11-17 抗 GIL dA. AL, G, 和 GIL 半 抗原 从 GIL 固 相 吸 附 剂 上 分 段 洗 脱 。 表 11-6 抗 -GIL、 抗 -G 和 抗 -L 抗体 部 分 用 G-，L- 和 GIL- 偶 氮 半 抗原 测定 时 的 性 质 * GIL- 偶 氮 半 抗原 抗 体 部 分 ee SS Ae ee ae Es K'w X 10-* K’n X% 10-4 K’n x 10 GH/BAE)| AFH EH) | tgaey GHIA) | AFa CR 全 7- 球 蛋白 一 6950 9.5 17 — 6650 G 部 分 8 一 6900 59 Sia. 工 部 分 Sea 69 —7400 GIL 部 分 一 6150 106 一 7650 抗 G 血 清 之 G 部 分 一 7450 65 一 7350 抗 工 血 清 之 工 部 分 54 —7250 * G-, L-, GIL-S 5 BE. (4 Pressiman 和 Grossberg, 1968), yea oe a ee a an. eee 图 11-18 GIL 基 团 的 轮廓 以 及 有 关 的 不 同 抗体 结合 部 位 的 轮廓 (4 Kreiter 和 Pressman，1964)。 抗体 与 GIL- 偶 氮 半 抗原 的 结合 能 量 比 单独 和 G- 或 工 - 偶 氮 半 抗 原 的 结合 能 各 要 大 400 卡 和 900 卡 。 从 分 子 构 造 上 来 看 ， 这 种 能 量 的 增加 可 能 是 由 于 和 多 一 个 氨基 酸 残 基 结 合 的 缘故 。 这 些 部 分 的 结合 部 位 所 针对 的 GILE 半 抗 原 分 子 的 部 分 由 图 11-18 中 b，e 表示 。 GIL- 部 分 的 抗体 能 与 G- 和 工 - 偶 氮 半 抗 原 结 合 , 但 与 GIL- 半 抗原 的 结合 能 量 更 高 (AF 减少 1500 卡 ) 。 此 外 ，GIL 部 分 的 抗体 比 G- 和 世 - 部 分 抗体 与 GIL- 偶 氮 半 抗原 结合 更 。308。 (a) 表 11-7 Anti-Rp 抗体 各 部 分 的 结合 性 质 Ate 35 (BA) 4 HB AY 杀 囊 酸 洗 脱 液 浓度 Gio Kin x0" Gi/et)| Raselo™ GH ao 10-°M 12.0 10 一 M Ded 10 一 M 2.4 10-7M 22 10-'M 0.9 p- 碘 茶 砷 酸 的 结合 能 力 a) 全 部 ant-Rp 7 球 蛋 白 4.2 (#2 Kreiter 和 Pressman, 1964b), 强 ， 相 差 约 300 卡 从 构造 上 看 ，GIL- 部 分 抗体 似乎 可 能 是 针对 偶 氮 半 抗 原 分 子 的 中 间 部 分 的 抗体 (cy, d) 。 2. 抗 -p- 偶 氢 葵 砷 酸 抗体 (Anti-Rp) 增加 半 抗 原 浓度 的 分 段 洗 脱 分 离 抗 半 抗 原 抗 体 被 专 一 的 固 相 免疫 吸附 柱 〈 含 结合 的 半 抗 原 ) 吸附 后 ， 逐 步 增加 半 抗 原 浓度 而 被 分 段 洗 脱 ， 半 抗原 浓度 低 时 洗 脱 量 小 ， 浓 度 增 加 时 洗 脱 量 随 之 增加 。 Anti-Rp 抗体 被 茶 砷 酸 洗 脱 之 典型 的 分 段 洗 脱 图 型 见 图 11-19。 如 图 所 示 ， 每 一 个 抗 血 清 样品 各 具有 如 ig 可 重复 的 特异 的 图 形 ， 并 且 为 不 同 的 半 抗 原 浓 度 洗 脱 的 部 分 具有 不 同 的 结合 性 质 。 当 把 分 离 的 每 一 部 分 再 作 一 次 层 析 时 ， 各 部 分 仍然 是 不 均一 的 ， 并 且 表 现 出 不 同 的 洗 脱 图 形 。 用 这 样 的 方法 分 离 的 各 部 分 抗体 ， 用 平衡 透析 法 测定 与 p-(P- 羟 茶 基 偶 氮 ) 葵 砷 酸 的 亲 合 常 数 各 不 相同 ( 表 11-7) 。 由 表 可 见 , 随 洗 脱 时 所 需 苯 砷 酸 浓度 的 增加 ， 对 p-(P'- 羟 茶 基 偶 氮 ) 苯 砷 酸 的 合 常 数 相应 地 减 小 ,也 就 是 说 , 半 抗 原 浓 度 低 时 ， 亲 合力 高 的 抗体 先 被 洗 脱 , 半 抗 原 浓度 高 时 , 亲 合力 低 的 抗体 才 被 洗 脱 。 上 述 方法 对 纯化 抗 半 抗 原 抗体 很 有 用 处 。 五 、 抗 体 与 半 抗 原 或 抗原 结合 的 动力 学 由 于 抗体 和 半 抗 原 或 抗原 结合 是 在 溶液 系统 中 发 生 的 ， 故 可 作 动 力学 研究 。 通过 这 一 类 实验 发 现 抗 体 和 相应 的 半 抗 原 专 一 地 结合 进行 得 非常 迅速 。 这 有 要 比 同 一 半 抗 原 与 血清 白 蛋 白 非 专 一 的 结合 要 快 得 多 。 5X 1L0-*5 X 10-3 5 y 49-4 半 抗 原 浓 度 ，M 11-19 _p- 硝 基 葵 砷 酸 将 Anti-Rp r-R 蛋白 从 Rp- 固 相 吸 附 剂 洗 脱 的 图 形 。 注 意 3 个 血清 样品 的 洗 脱 图 形 不 同 CGB Kreiter 和 Pressman, 1964), © 309 。 Cel] ” 蔡 酚 - 偶 氮 葵 葵 基 砷 酸 (Naphthol-azobenzenephenylarsonate) iE 砷 酸 决定 簇 抗 体 结合 的 反应 速度 常数 K,=2x10T 升 / 克 分 子 / 秒 ， 而 此 半 抗 原 与 在 清白 蛋白 非 专 一 结合 的 反应 速度 常数 民 , =2 x105 升 / 克 分 子 / 秒 。 逆 反应 的 速度 要 慢 得 多 , 对 于 这 两 个 系统 ， 反 应 速度 常数 K, 分 别 为 50 7135, HPRABMK=K,/K.. 对 于 此 半 抗 原 和 抗体 系 绕 fi. 200 x k0F Ky = 一 上 = =4*x 10° / it ad shea Ft / 克 分 同样 地 , 对 于 半 抗 原 - 血 清 蛋白 系统 ， K, _21X10° 2S = = 10 +. K, = /更 分 另 一 半 抗 原 系统 4，5- 二 羟 -3-(p- 硝 基 葵 偶 氮 )-2，7- 蔡 -二 磺 酸 , K, =1.8x10° Fa F /#, K, =7.6 X 10? wT. k= = =5.8X105 升 / 克 分 子 2 DNP ¥ii Rink as, K, 也 可 达 10 升 / 克 分 子 / 秘 。 抗体 和 半 抗 原 结 合 的 反应 速度 常数 这 样 高 ， 表 明 这 种 结合 反应 时 没有 共 价 键 形 成， 表 11-8 链 细胞 瘤 蛋白 MOPC315 与 (1) DNP 烷 基 胺 同系 衍生 物 及 (27 含 又 链 、 环 或 芳香 侧 链 的 DNP- 衍 生物 之 间 相 互 作 用 的 反应 速度 和 平衡 常数 及 点 X 10-*/ Ke X 10“ Pa oo ; 5a) F/R YF| RAF NO, 10N—¢ S—nH—|-cn, 3.540.24 | 373430 hee 2 —on/ cH, 2.8+0.18 | 143-24 2.04 3 —CH,=CH,.—CcH, 2.6+0.18 | 94-11 4 —CH,—CH,—CH,—CH, 2.540.3 79+10 3.40 5 —CH,—CH,—CH,—CH,—CH, 1.2+0.12 123+18 1.10 Va te 6 —cH¢ 3.70.22 | 108+8.6 cH, ‘ CHLCH 7 -coH4 Po ee 2.5540.25 | 116-410 CH,CH,” vcB， 8 FE 2.0+0.14 2.70 CH, cH, | (CH, 9 —c 3.6+0.3 CH, 10 eee oN 840. cH,—¢ 1,840.15 (42 Pecht, 1974), es 310° 因为 这 些 变 化 都 需要 较 长 的 时 间 。 半 抗 原 和 抗体 的 结合 是 小 分 子 半 抗 原 和 抗体 大 分 子 的 结合 位 点 之 间 的 一 个 简单 的 双 分 子 反应 , 而 抗原 和 抗体 大 分 子 之 间 的 反应 , 则 因 抗原 抗体 聚集 物 之 长 链 和 又 链 的 形成 更 趋 复 ” 杂 。 抗 体 抗原 的 总 反应 在 动力 学 上 可 分 为 两 个 Bt Be: 1) 抗原 决定 镁 和 抗体 结合 位 点 间 的 结合 ， 反应 非常 迅速 的 阶段 ; 2) 抗原 抗体 网 格 生长 的 缓慢 阶段 。 通常 假定 阶段 (1) 的 反应 速度 与 抗体 和 半 抗原 的 反应 速度 大 约 相等 。 而 阶段 (2), 网 格 的 生长 速度 就 缓慢 得 多 ， 在 很 大 程度 上 依赖 于 温 度 、 离 子 强度 等 条 件 。 用 光 散 射 比 浊 法 可 以 佑 计 抗 原 抗 体 相互 作用 第 二 时 相 的 反应 速度 常 数 。 对 于 DNP 抗原 和 抗体 系统 , 反应 过 程 中 如 果 用 草 光 灭 活 法 和 光 散 射 法 同时 进行 测定 ， Wien bse 区 二 (Kh/K) X 102M K¥, X 10-8M-! Sec" Ci) 6 fee. 9 1 Bw A 图 11-20 (a) K,, (—e—#il-m-), Kn (—O— 和 - 口 -) 与 (b) 天 (一 全 一 ) 对 非 极 性 侧 链 的 羧基 或 REA DNP 环 之 间距 离 的 依赖 关系 ( 据 Pecht1974)。 结果 表明 参与 抗原 抗体 聚集 物 生长 的 基 团 与 在 快速 反应 阶段 与 抗体 结合 的 基 团 是 不 相同 的 (Tengendy, 1966). 在 溶液 中 抗体 -抗原 ( 半 抗 原 ) 复合 物 存在 于 动态 的 结合 平衡 ,可 应 用 快速 动力 学 方法 — {4th Rig BRERA (Chemical relaxation-temperature jump technique) 对 抗体 结合 位 点 的 微细 结构 作 动力 学 定位 (Pecht 4, 1972; Haselkorn 等 ,1974) 。 半 抗 原 抗体 在 溶液 中 的 相互 作用 是 一 个 包括 双 分 子 结合 和 单 分 子 解 离 的 过 程 : K,, Ab + 五 = AbH K,, 其 中 Ky, 为 结合 速度 常数 , Ky ORE BR, HOR GK = 专 一 的 结合 速 度 常 数 (Ki) 只 在 一 个 有 限 范围 内 变动 ， 而 专 一 的 解 离 速度 常数 (K.), 当 用 半 抗 原 在 结合 位 点 内 暂 留 时 间 ( 结 合 位 点 - 半 抗 原 复 合 物 寿 命 的 倒数 ) 表 示 时 , 可 反映 半 抗 原 和 结合 位 点 之 间 的 相互 作用 力 和 互补 性 。 因此 ， 对 于 一 系列 具有 不 同 侧 链 结构 的 半 抗原 ， 研 究 其 结构 特点 与 抗体 结合 位 点 相互 作用 的 结合 和 解 离 速度 常数 的 关系 时 ， 就 有 可 能 区 分 一 个 均一 的 结合 位 点 内 的 不 同 的 相互 作用 力 ， 并 对 其 定位 。 小 鼠 髓 细胞 瘤 蛋白 MOPC 315 具有 均一 的 结合 位 点， 能 对 一 系列 的 二 硝 基 茶 (DNBP-) 衍 生物 以 不 同 的 亲 合 力 结合 。 用 化 学 弛 和 驳 温 度 跃迁 技术 测量 其 反应 速度 常数 和 平衡 常数 ， 结 果 列 于 表 11-8。 从 表 11-8 AM, KA 玫 :> 随 非 极 性 侧 链 的 长 度 和 构造 的 改变 而 发 生 相 应 的 改变 ， 也 就 是 说 ， 结合 位 点 - 半 抗 原 复 合 物 寿命 的 倒数 (Ki) 是 非 极 性 侧 链 长 度 的 函数 。 当 非 极 性 侧 链 的 长 度 从 一 CHs 增加 到 一 CH: 一 CH: 一 CH 一 CH。、 时 ， Ki: )\\ 373 秒 一 减 小 到 79 秒 -: ( 表 11-8，1-4) 。 若 侧 链 为 叉 链 或 葵 环 时 ， 这 种 效应 尤其 显著 ， 如 一 个 大 的 下 水 性 基 团 位 于 硝 基 葵 胺 的 第 一 胺 基 N 邻近 时 ， 开 :有 最 小 值 ( 表 11- 8，10) 。 此 外 ， 侧 链 的 长 度 和 大 小 超过 一 定 范围 时 ， 也 会 影响 玉 : 值 ， 使 其 增加 ( 表 11- = 31+ 8，5-7) 。 根 据 这 些 数 据 可 以 推测 ， 此 抗体 结合 位 点 内 的 一 定位 置 上 存在 蕊 水 性 亚 位 点 (了 ydrophobic subsite), 只 有 当 非 极 性 侧 链 位 置 〈 长 度 和 大 小 ) 适当 时 , 才能 在 空间 上 配 合 。 因 此 ， 系 统 地 改变 非 极 性 侧 链 的 长 度 可 以 推测 出 下 水 性 亚 位 点 的 位 置 在 离 硝 基 葵 环 中 心 8A 的 地 方 。 系统 地 改变 和 DNP 侧 链 末端 相连 的 羧基 ( 负 电 性 ) 与 硝 基 茶 (CDNP) 环 中 心 之 间 的 距离 ， 进 一 步 证 明了 这 一 点 (图 11-20) 。 由 图 11-20 可 见 ， K,, GRAM DNP 环 之 间 的 距离 发 生 明 显 的 改 变 。 当 羧 基 和 环 很 靠近 时 ， 1.54 K,,=10°#7; 当 距 离 增加 时 ， 便 逐 渐 减 小 ， 距 离 环 中 心 8.5 和 A 时 ,达到 最 小 值 45 BO. 上 距 离 继续 增加 时 ， 设 有 明显 的 进 一 步 变 化 。 另 一 方面 ， 系 统 地 改变 和 DNP 侧 链 未 端 相连 的 Fe 3 (TE fa) 与 DNP 环 中 心 之 间 的 距离 ， 测 量 K,, 值 的 变 化 ， 同 样 可 以 确定 静电 性 亚 位 点 (Electrostatic subsite) ted OX ye at meta g \ \ : fet, Kiel wwe Sr ona Cea 图 11-21 J \ REI MOPC315 结合 位 点 的 的 位 置 。 总 结 这些 实 验 结果 ， 两 种 模型 , 示 几 种 相互 作用 亚 位 点 。(SD) 1-N-2, 4DNP Ee i ad 结合 亚 位 点 ; (S,) BOKMAL; (Ss) BOB 可 得 出 结论 , SIA ED 水 性 亚 位 点 ; 〈S4》》 IER ATMEL AR GE Pecht. 1974), 和 抗体 结合 位 点 的 结合 ， 除 去 二 硝 基 苯 环 的 相互 作用 外 ,还 存在 疏水 性 和 静电 相互 作用 。 并 且 根 据 对 这 些 专 一 的 相互 作用 力 在 结合 位 点 上 的 动力 学 定位 , 可 以 绘制 出 两 个 朴 水 性 亚 位 点 (S:,S:) 和 一 个 正 电 荷 亚 位 点 (S4) 相对 于 硝 基 茶 环 位 点 (S,) 的 位 置 ( 图 11-21)。 六 、 抗 原 抗体 反应 中 的 分 子 间 力 抗原 抗体 反应 的 动力 学 研究 表明 ， 反 应 过 程 中 没有 共 价 键 形成 。 半 抗原 和 抗体 结合 专 一 性 的 构造 基础 的 研究 还 表明 ， 半 抗原 和 抗体 结合 位 点 之 间 必 须 紧 密 接触 ， 才 能 产生 足够 大 小 的 结合 力 。 这 是 由 于 参与 抗体 抗原 相互 作用 的 分 子 间 力 都 是 短程 分 子 力 的 缘 故 。 这 些 分 子 间 力 有 下 述 几 种 : 。312。 可 ee -po 一 a» ae a 2 Nef yO gs WOO gS SN Tea eae (1) 静电 相互 作用 抗原 的 带电 荷 基 团 与 抗体 上 互补 的 带 相反 电荷 基 团 之 间 的 静电 相互 作用 力 。 其 反应 能 量 与 两 电荷 间 的 距离 平方 成 反比 ， 并 与 介质 的 介 电 常 数 成 反比 。 抗体 是 蛋白 质 分 子 ， 其 负电 荷 基 团 限于 羧基 , 正 电 荷 基 团 限 于 ys，Arg,， His 或 N 末 端的 氨基 ; 而 抗原 上 的 带电 荷 基 团 则 可 能 是 多 种 多 样 的 。 (2) 疏水 性 力 (Hydrophobic forces) 抗原 和 抗体 大 分 子 表面 的 蕊 水 性 基 团 (on Leu, Ile, Phe 等 的 非 极 性 侧 链 ) 附近 ， 能 形成 有 秩序 地 稳定 排列 的 水 分 子 层 。 当 水 分 子 从 这 些 基 团 表面 移 走时 ， 排 列 秩序 性 破 坏 ， 相 应 地 灶 增 加 ， 而 使 六 水 性 基 团 相互 靠拢。 (3) Van der Waals 吸引 力 当 两 个 原子 距离 很 近 时 ， 每 一 原子 的 电子 云 发 生变 形 而 极 化 ， 结 果 一 原子 的 电子 和 另 一 原子 的 正 电 荷 之 间 相 互 吸 引 ， 产 生 London 分 散 力 (Dispersion force), HH 闻 的 最 大 吸引 力 和 它们 极 化 程度 的 乘积 成 正比 。 (4) A‘ 氢 键 是 一 个 负电 性 原子 (质子 供 体 ) LAZU FBTR ORF SR) 上 的 一 对 未 配对 电子 之 间 的 吸引 力 。 如 一 个 氧 原子 或 氮 原 子 上 的 质子 和 另 一 氧 原 子 或 氮 原 子 上 未 配 对 电子 间 的 相互 作用 。 抗 原 抗体 反应 是 在 水 溶液 中 进行 的 ， 它 们 原来 和 水 分 子 之 间 就 有 氢 键 存在 。 这 些 和 水 分 子 间 的 氢 键 必须 先 破坏 ， 才 能 再 形成 抗原 和 抗体 之 间 的 氢 键 。 (5) 偶 极 子 相 互 作 用 由 于 各 种 元 素 的 原子 具有 不 同 的 负电 性 , 由 这 些 元 素 的 原子 组 成 的 化 合 物 中 , 电子 在 这 些 原子 之 间 的 分 布 是 不 平均 的 ,结果 形成 偶 极 子 (dipo- le), 一 个 偶 极 子 可 受到 按 适 当 方 向 排列 的 偶 极 子 的 吸 0 抗体 Ca) Al 2 ay, OGA HO ae (6) 38493820 3 dee imate JL 抗原 抗体 分 子 间 的 另 一 作用 力 是 由 于 荷 电 基 团 在 水 溶液 中 ,其 表面 有 水 分 子 层 结合 ,并 有 秩序 地 排列 。 当 两 Ob) 个 电荷 相反 的 基 团 相互 吸引 时 ， 这 些 结合 水 被 排出 。 由 FROF RIN HIA EL, FRAN A REMI, 增加 ， 并 产生 一 种 力 使 两 种 分 子 结合 在 一 起 。 理论 上 抗原 抗体 结合 专 一 性 与 分 子 间 空 间 相 合 程度 © 及 各 种 基 团 分 布 的 关系 ,可 用 简 图 表示 (图 11-22) 如 下 : 1) 抗原 决定 挨 和 抗体 结合 位 点 在 空间 上 紧密 相合 。 四 11.2? HRA S wee to TURR Ee LNE DAT RE, 质子 供 体 ， 空间 相合 性 和 基 团 分 析 的 配合 。 © 3136 一 个 偶 极 子 和 一 个 非 极 化 区 。 抗体 表面 与 之 紧密 相合 ， 具 有 互补 的 正 电 荷 ， 质 子 受 体 ， 偶 极 子 和 非 极 化 区 。 它们 在 空间 上 和 分 子 间 力 的 分 布 和 性 质 上 都 能 很 好 配合 ， 因 此 ,能 够 有 效 的 结合 ; 2) 抗原 决定 簇 的 形状 略 有 改变 ,而 其 上 基 团 的 分 布 没有 改变 。 抗 原 抗体 分 子 不 能 紧 密 接 触 以 形成 足够 的 结合 力 。 因 此 ， 不 能 有 效 结合 ; 3) 同一 抗原 和 抗体 ， 空 间 互 补 相合 性 很 好 ， 但 基 团 改变 ， 彼 此 不 能 吸引 , 甚至 相互 排斥 。 因 此 ， 仍 然 不 能 有 效 的 结合 。 因此 , 从 上 述 可 见 , 抗 原 和 抗体 的 专 一 的 结合 ,除了 要 求 在 空间 上 紧密 的 互补 性 外 , 同 时 还 要 求 两 种 分 子 表面 基 团 的 分 布 和 性 质 也 必须 配合 。 两 者 缺 一 不 可 。 近年 来 半 抗 原 - 半 抗原 抗体 复合 物 结构 的 晶体 学 分 析 对 半 抗 原 决 定 徐 和 抗体 结合 位 点 的 微细 结构 , 及 其 相互 间 的 空间 关系 的 阐明 ,为 上 述 的 抗原 抗体 结合 的 分 子 间 力 的 性 质 的 理论 推测 提供 了 非常 具体 而 又 精确 的 证 据 。 对 于 天 然 球 蛋白 分 子 抗原 决定 往 微 细 结 构 的 研究 表明 ， 抗 原 决 定 往 的 大 小 不 超过 6 一 7 氨基 酸 残 基 的 范围 。 构 成 抗原 决定 往 的 氨基 酸 的 类 型 主要 是 极 性 氨基 酸 (如 Asp，Glu，His 等 ) 。 由 此 推测 抗原 决定 往 和 抗体 结合 位 点 之 间 的 相互 作用 主要 是 极 性 性 质 的 。 非 极 性 氨基 酸 则 可 能 通过 氧 键 和 朴 水 性 相互 作 用 起 稳定 作用 (参看 第 一 章 33 页 ,37 页 ) 。 对 小 鼠 McPC603Fab 和 磷酸 胆 碱 复合 物 的 晶体 学 分 析 ， 证 明 半 抗原 和 抗体 结合 位 点 之 间 的 专 一 结合 是 通过 处 于 空间 互补 位 置 的 基 团 之 间 形 成 的 氨 键 和 静电 键 实现 的 。 构 成 抗体 结合 位 点 的 重 链 Tyr 33( 瑞 ) 的 羟基 和 空间 上 邻近 的 磷酸 的 氧 原 子 之 间 ， BHA Arg 52(H) 的 吓 基 和 磷酸 的 另 一 个 氧 原 子 之 间 形 成 的 氢 键 ， 以 及 Arg52(H) 的 吸 基 的 正 电 荷 和 磷酸 的 负电 荷 之 间 ，Lys 54(H) 的 氨基 和 磷酸 之 间 的 静电 相互 作用 ， 均 体现 了 半 抗 原 和 抗体 之 间 的 结合 力 。 其 次 ， 胆 碱 基 团 和 结合 位 点 互 链 和 工 链 在 空间 上 靠近 的 残 基 之 间 (一 5A) ， 也 可 能 发 生 静 电 和 Van der Waals 相互 作用 (人 参看 第 十 章 图 10- 19) (Segal 等 ，1974) 。 对 Fab! (New)- 半 抗原 复合 物 的 晶体 分 析 ， 还 对 半 抗 原 抗 体 反应 亲 合 力 的 结构 基 础 提供 了 直接 的 证 气 (Amzel 4%, 1974), Fab’ (New) 能 和 许多 半 抗 原 结合 ， 其 中 对 7Y- 羟 基 维 生 素 玉 , 有 较 高 的 亲人 合力 〈 开 ,=1.7 x105 升 / 克 分 子 ) ， 而 对 苔 红 素 、 REM FAZER (Menadione) 的 亲人 合力 则 低 很 多 〈( 开 , 三 1 x 10s 升 / 克 分 子 ) 。 从 Fab! (New)- K,OH 之 3.5A 分 辩 率 的 立体 模型 (参看 第 十 章 , 图 10-14) ， 可 见 维生素 KOH FAM 环 部 分 模 人 由 互 和 工 链 的 高 变异 区 构成 的 结合 位 点 浅 槽 (大 小 为 16 x7x6 有 A) 的 上 部 ,而 分 子 的 植 酸 链 则 向 上 延伸 与 工 链 的 Gly-27 (L), Asn-30 (L) 贴近 , 然后 折 向 下 方 与 工 链 的 93 和 94 及 互 链 的 104 和 残 基 的 骨架 贴近 , 其 尾 端 则 和 互 链 的 54，57 和 67 MAA MM 链 贴近 。 甲 蔡 柄 半 抗 原 的 结构 只 相当 于 KOH 分 子 的 柄 环 部 分 ， 并 且 其 亲 合 力 比 K,OH 低 很 多 。 对 Fab (New)- 甲 蔡 配 复合 物 的 晶体 分 析 表 明 ， PRAY DURA KOH 的 本 环 占据 抗 体 结合 位 点 浅 上 部 的 同一 位 置 ， 其 他 一 些 亲 合力 低 的 半 抗 原 ( 苔 红 素 和 Rw 啶 ) 也 是 和 同一 部 位 结合 。 因 此 ， 可 以 把 维生素 KOH 整个 半 抗 原 的 亲 合 力 看 作 是 分 子 的 柄 环 部 分 和 植 酸 链 部 分 分 别 和 结合 位 点 的 相互 作用 力 的 总 合 。 甲 蔡 柄 和 其 他 亲 合 力 低 的 半 抗 原 只 和 抗体 结合 位 点 之 相当 于 与 配 环 相互 作用 的 一 部 分 结合 ， 亲 合力 自然 要 低 得 多 。 这 一 实验 有 力 地 说 明 , 不 同 的 蔡 柄 化 合 物 ( 维 生 素 KOH, FAAS) 只 要 分 子 的 Van se 314 。 表 11-9 opi PK IJgA315 和 各 种 半 抗 原 的 反应 半 抗 原 亲 合 常数 ( 升 / 克 分 子 ) 7r-DNP- 氨 基 丁 酸 7X10’ DNP-86- 丙 氨 酸 4.9X107 é-DNP-L-m a 酸 2X 10’ e-DNP-D-#j a 1.7X 10’ 6-DNP-L- 8,4 & 1.4X 10’ 2,4-— MEEK 9X 10° ac-DNP-L- 亮 氨 酸 8.7X10° FA EAB 6.1 10° 2,4-—_MERH 1.1 10° 咖啡 碱 4.6X10* 5-H RSE 3.2x10* BRE 2.8% 10* 2;,4- 二 硝 基 酚 ~4.5X 10° (#2 Leslie 和 Cohen, 1973), der Waals 轮廓 有 部 分 相似 的 地 方 ， 就 可 能 有 相似 的 结合 专 一 性 。 并 且 不 同 的 半 抗 原 的 Van der Waals 轮廓 和 抗体 结合 位 点 之 空间 互补 的 大 小 范围 不 同 ， 密 合 程度 不 同 ， 也 就 决定 了 它们 和 抗体 之 间 亲 合力 的 不 同 。 总 之 ， 半 抗原 以 及 抗原 大 分 子 表面 的 决定 得 的 空间 图 式 (Topography) 及 其 和 抗体 结合 位 点 的 互补 性 是 结合 专 一 性 和 亲 合 力 的 结 构 基础 。 也 就 是 说 ， 体 液 抗 体 或 免疫 活性 细胞 的 表面 抗原 受 体 的 结合 位 点 所 能 识别 的 只 是 半 抗 原 决 定 徐 大 概 的 Van der Waals 轮廓 。 这 一 概念 在 理论 上 有 重要 的 意义 ,也许 可 以 对 抗原 结构 的 无 限 复 杂 性 和 抗体 结合 位 点 专 一 性 的 有 限 性 之 间 的 矛盾 ， 提 供 一 个 合 理 的 解释 ， 因 为 无 限 数目 的 抗原 按 其 有 效 决定 繁 的 空间 图 式 的 相似 性 也 可 以 归结 为 有 限 的 种 类 。 实际 上 ， 近来 对 诱导 的 抗体 和 单 株 免疫 球 蛋白 (Monoclonal immuno- globulin) 的 研究 均 发 现 ， 一 个 抗体 可 能 和 2 个 或 许多 个 结构 上 很 少 相关 的 ， 甚 至 无 关 的 半 抗 原 结 合 ， 不 过 其 亲 合 力 可 能 有 很 大 范围 的 差异 (从 玉 =10: 到 107 升 / 克 分 子 ) CR 11-9) (Leslie 和 Cohen，1973) 。 进一步 研究 还 提示 ， 抗 原 诱 导 的 抗体 也 同样 可 能 存 在 多 功能 结合 位 点 ， 即 一 种 抗原 ( 半 抗 原 ) 诱 导 的 抗体 可 能 和 多 种 半 抗 原 〈 在 结构 上 和 诱 导 抗 原 很 少 相 关 或 无 关 ) 结合 (Richards 等 ，1974) 。 出 人 意料 之 外 , 在 一 些 情形 下 ,一 种 半 抗 原 诱 导 的 抗体 对 其 他 的 半 抗 原 反 而 有 更 高 的 亲 合 力 。 如 小 鼠 对 于 HERA (NP) 产生 的 抗体 对 于 硝 基础 葵 基 (NIP) 的 亲 合 力 比 对 NP 的 亲 合 力 还 要 高 (Imani- shi 和 Maikelai，1973) 。 这 类 抗体 由 于 它 的 这 种 异常 的 特性 被 称 为 反常 抗体 (Hetero- clitic antibody), 所 有 这 些 事 实 都 表明 过 去 关于 一 个 抗体 只 对 一 种 抗原 决定 簇 或 一 些 和 它 的 结构 相近 的 决定 得 结 合 的 传统 概念 已 经 和 事实 不 符合 了 ， 因 而 应 当 改 变 了 。 如 果 承认 抗体 结合 位 点 有 多 种 结合 功能 ， 于 是 便 产 生 了 一 个 问题 ， 即 个 别 抗体 分 子 的 多 种 专 一 性 和 免疫 血清 的 高 度 专 一 性 的 矛盾 ， 又 作 何 解 释 呢 ? 一 个 免疫 血清 的 高 度 专 一 性 应 看 群 中 的 每 一 分 子 的 结合 位 点 都 可 能 各 自 具 有 多 种 专 一 性 ,然而 它们 彼此 之 间 , 一 个 分 子 和 e+ 315¢e 另 一 分 子 的 多 种 专 一 性 则 不 必 是 相同 的 。 对 于 一 个 免疫 血清 来 说 ， 只 有 大 多 数 抗体 分 子 共同 具有 的 专 一 性 才 是 在 宏观 上 有 重要 性 的 专 一 性 ， 这 也 就 是 针对 免疫 原 的 专 一 性 。 其 他 的 各 种 专 一 性 虽然 存在 ， 但 由 于 一 个 抗体 和 另 一 抗体 各 不 相同 , 因而 被 稀释 ,不 能 在 宏 观 上 表现 出 作用 来 了 。 因 此 ， 在 一 免疫 血清 的 全 部 抗体 分 子 群 中 可 以 期 望 存在 极 大 量 的 高 度 专 一 的 抗体 (它们 共同 的 专 一 性 代表 抗 血 清 的 专 一 性 ) ， 以 及 极 少 量 的 各 种 不 同 专 一 性 的 抗体 一 一 包括 被 免疫 动物 从 未 接触 过 的 抗原 的 抗体 (有 大 量 证 据 表 明确 实 存在 后 一 类 “天 然 ? 抗 体 ) 。 个 别 抗体 分 子 的 多 种 专 一 性 和 整个 免疫 血清 的 高 度 专 一 性 , 作为 一 个 抗 体 分 子 群 的 统计 现象 来 看 ， 并 不 是 矛盾 的 (Richards, 1974; Secher, 1977; Cameron 和 Erlanger，1977) 。 这 一 概念 对 于 抗体 专 一 性 及 其 多 样 性 的 起 源 有 重要 的 理论 意义 ， 我 们 将 在 以 后 有 关 章 节 再 作 深 入 的 讨论 。 七 、 颗 粒 抗原 的 凝集 反应 如 第 一 节 所 述 ，Ab /Ag 的 重量 比值 与 抗原 分 子 量 成 反比 。 如 果 抗 原 的 天 小 从 分 子 范围 ( 约 102A) 增 加 到 细胞 范围 (如 细菌 直径 约 1 微米 ， 细 胞 为 5 一 10 微米 ) ， 则 颗粒 的 大 小 增加 100 到 1,000 倍 ， Ab/Ag 的 比值 就 要 小 100 一 1000 倍 ， 于 是 只 需要 少数 双 价 抗体 就 能 形成 颗粒 抗原 〈 细 胞 ) 和 抗体 的 凝集 物 (图 11- 23)o 因 此 ， 红 血球 或 其 他 颗粒 抗原 的 凝集 反应 是 很 灵敏 的 分 析 方 法 ， 可 测 出 一 1 微克 的 抗体 。 每 一 细胞 表面 结合 的 抗体 分 子 的 数目 不 仅 依赖 于 细胞 的 大 小 ， 而 且 依 赖 于 细胞 表面 抗原 决定 簇 的 数目 。 当 使 用 铁 蛋 白 标记 抗体 ( 抗 人 血型 物质 抗体 ) 时， 电镜 观察 可 发 现 一 条 宽 200 一 400A 的 颖 把 凝集 的 细胞 分 隔 开 来 , 这 条 颖 的 大 小 是 和 双 价 抗体 分 子 的 大 小 相符 合 的 。 计 算 铁 蛋白 标记 11-23 血 凝 反应 血细胞 被 双 价 抗 “抗体 分 子 数 目 就 可 以 测量 出 红血球 表面 抗原 决定 往 的 数 体 凝 集 ( 据 Haurowitz，1968)。 目 。 应 用 扫描 电子 显微镜 观察 各 种 血型 抗体 对 红血球 的 凝集 现 象 ， 可 看 到 抗 A- 抗 体 (IgM 和 IgG) 使 Ai, D 血型 阳性 的 红血球 凝集 时 ， 血 球 表面 变形 , 出 现 许多 棘 状 突起 ， 彼此 相连 成 团 ( 图 11-24b) ， 而 用 完全 抗 D- 血 清 凝 集 Ai，D 血型 阳性 的 红血球 时 ， 血 球 仍然 保持 原来 的 形态 ， 从 图 上 可 见 到 许多 平滑 的 双 凹 圆 盘 形 的 红血球 ,连接 徐 集 成 团 ( 图 11-24c) 。 凝集 过 程 受 p 再 、 离 子 强度 、 温 度 等 因素 的 影响 。 这 可 能 是 由 于 细胞 表面 电荷 状态 改变 的 缘故 。 Heidelberger 和 Kabat (1937) 对 细菌 (肺炎 球菌 工 型 ) 细胞 的 凝集 作用 ， 作 定量 研究 发 现 抗体 N 和 细菌 N 的 比值 ， 从 抗体 过 剩 时 的 ~3 变动 到 细菌 过 剩 时 的 0.4。 这 些 比值 和 可 溶性 抗原 沉淀 反应 中 观察 到 的 相近 似 。 这 表明 被 凝集 物 携 带 沉降 的 抗体 量 远 远 超过 了 在 细菌 表面 结合 一 层 抗体 分 子 所 预期 的 量 。 抗 体 分 子 或 许可 能 透 人 肺炎 球菌 细胞 表面 多 糖 外 壳 ， 在 其 中 形成 抗原 抗体 网 格 。 病 毒 或 噬菌体 和 同型 抗体 产生 的 抗原 抗体 复 s。 316。 11-24 在 扫描 电子 显微镜 下 观察 到 的 各 种 血型 抗体 对 A. D 血型 阳性 红血球 的 凝集 现象 。(a) 正常 的 A, D 血型 阳性 的 红血球 ,经 固定 和 洗涤 (X7,000)。 (b) A, D 血型 阳性 红血球 ,在 室温 和 生理 盐水 中 ， 被 抗 =A, 免疫 血清 凝集 。 红血球 表面 有 棘 状 突起 彼此 连接 。 经 固定 和 洗涤 (X7,000), (c) Ar D 血型 阳 性 红血球 ,被 完全 的 抗 -D 血清 凝集 。 血 球 保 持原 来 的 形态 。 经 固定 和 洗涤 (X2;000)。(d) Ay D 血型 阳 性 红血球 ,生理 盐水 内 和 不 完全 抗 =D 血清 保温 30 分 钟 , 洗 涤 后 ,再 被 抗 人 IgG 家 免 血 清 凝 集 。 经 固定 和 洗涤 (X7:,000)( 据 Van Oss 和 Mohn, 1970), 合 物 ， 由 于 它们 的 大 小 超出 了 光学 显微镜 分 辩 率 的 范围 ， 通 常 也 被 看 作 是 “沉淀 >， 而 不 是 凝集 物 。 流 感 病 毒 和 同位 素 标记 的 同型 家 免 抗 体 产 生 的 沉淀 中 ， 每 一 个 病毒 分 子平 均 能 结合 2 一 3 x10: 抗 体 分 子 。 有 人 测定 在 有 专 一 的 血球 凝集 素 存在 时 红血球 悬 液 和 血球 凝集 素 之 间 的 平衡 ， 并 将 测 得 的 平衡 常数 到 换算 为 在 不 同 温 度 的 结合 自由 能 ， 由 此 得 出 A 刀 = -6.5 王 卡 / 克 分 sa。 317 。 子 ，AS= +8 卡 / 克 分 子 ' 度 。 这 些 数 值 和 帝 淀 反应 的 数值 是 相近 的 。 (一 ) 被 动 血 凝 反 应 (Passive haemagglutination) 将 可 溶性 抗原 用 化 学 方法 连接 到 红血球 表面 ， 然 后 加 微量 的 相应 的 抗 血 清 就 可 引起 红血球 凝集 作用 (图 11-25) 。 这 种 方法 称 为 被 动 血 凝 反 立 ， 可 用 于 测定 微量 可 溶性 抗原 的 抗体 。 通常 用 靶 酸 处 理 红 血球 ， 再 “ 镀 ” 上 可 溶性 蛋白 质 抗 原 。 也 可 以 用 甲醛 或 成 醛 处 理 红 血球 ， 这 样 的 红血球 比 较 稳 定 , 可 以 保存 几 天 , SHE Loe. Eth 常用 的 连接 蛋白 质 和 红血球 表面 的 连接 剂 有 联 苯胺 等 。 被 动 血 凝 反 应 中 ， 红 血球 表面 固着 的 抗原 分 子 数量 很 大 。 例 如 , 用 双重 氮 化 联 苯胺 作 连 接 剂 时 , 每 一 个 细胞 表面 可 连结 上 1.3 x10* BSA 分 子 ， 相 应 地 凝集 这 样 的 “se” BSA 的 红血球 需要 约 5x105 抗 BSA 抗体 分 子 。 被 动 血 凝 反 应 是 测定 双 价 沉淀 抗体 的 很 灵敏 的 方法 。 但 ie a 是 ， 应 注意 防止 一 些 非 专 一 因素 〈 如 正常 Y REORR 两 个 镜 BSA 的 红血球 被 双 价 抗 BSA“' 物 ) 的 干扰 。 有 人 改 用 乳胶 〈latex)、 皂 土 颗 粒 代替 红 抗体 凝集 在 一 起 ( 据 Haurowitz)。 血球 吸附 抗原 ,效果 也 很 好 。 (=) 不 完全 抗体 和 间接 被 动 血 凝 反 应 〈Coomb's test) 如 前 所 述 ， 只 有 双 价 抗体 才能 产生 不 溢 的 沉淀 ， 而 单价 抗体 则 不 能 。 同 理 ， 血 凝 反 应 也 是 如 此 。 人 类 抗 Rh 因子 抗体 ， 不 能 使 同型 红血球 凝集 ， 但 能 和 这 些 血球 结合 并 阻 止 其 他 种 类 的 凝集 素 使 这 些 红血球 凝集 。 这 类 抗体 称 为 不 完全 抗体 (Incomplete anti- body), 不 完全 抗体 的 这 种 特性 可 能 是 由 于 其 分 子 的 理化 特性 仿 碍 了 同时 和 两 个 抗原 决 ERA. 如 果 用 不 完全 抗体 致 敏 红血球 ,然后 再 用 抗 人 7 球 蛋 白 家 免 抗体 来 处 理 时 ， 这 些 细胞 就 会 发 生 凝 集 作 用 (图 11-26) 。 这 种 方法 称 为 Coomb 氏 法 ， 非 常 灵敏 ， 能 测 定 出 直接 被 动 血 凝 反 应 所 不 能 测 出 的 微量 抗原 或 不 完全 抗体 。 扫 描 电 子 显微镜 观察 ， 发 现 经 Coomb 氏 法 ， 即 Ai,，D 阳性 红血球 先 经 不 完全 抗 D- 血 清 致 敏 , 再 用 抗 人 7Y RE 白 抗体 处 理 凝 集 的 红血球 呈 柠 檬 形 ， 表 面 被 一 层 薄 膜 被 盖 ， 在 几 处 还 可 以 看 见 细胞 通过 表面 上 的 细 丝 连接 在 一 起 (图 11-24d) 。 Grubb (1956) 利用 经 改进 的 Coomb 氏 法 ， 发 现 了 人 类 免疫 球 蛋 白 抗原 性 的 同 种 异型 现象 (参看 第 三 章 ) 。 所 用 方法 的 原理 如 下 : Rh 人 红血球 先 经 具有 已 知 的 同 种 异型 性 状 , 如 Gm(a+) 的 人 抗 Rh 抗体 (不 完全 抗体 ) 处 理 。 然 后 加 和 人 具有 同一 遗传 标记 的 类 风湿 性 关节 炎 因 子 ( 人 类 抗 Y 球 蛋白 抗体 )， 这 些 处 理 过 的 红血球 就 会 发 生 凝 集 现象 。 如 果 在 此 测定 系统 中 ， 加 入 过 量 的 具有 同一 Gm 决定 簇 的 免疫 球 蛋白 时 ， 这 些 决定 簇 就 将 竞争 类 风 惕 性 关节 炎 因 子 ， 因而 抑制 凝集 现象 ， 这 为 正 反 应 。 如 果 加 入 的 免疫 球 蛋 白 的 抗原 决定 簇 属 于 不 同 的 遗传 类 型 ,就 不 能 抑制 凝集 现象 ， 这 为 负 反 应 (图 11-27)。 * 318 。 IE R W 抑制 反 应 CE Dating — om p<) ies = 11-26 Coomb 氏 法 测定 不 完 11_27 AKAERESGS MSR MIE 全 抗体 。 红血球 镀 上 人 单价 抗体 G2) BMRA y REA 体 , 产 生 凝 集 反 应 ( 据 Haurowitz, 1968), 人 类 抗 人 类 Y 球 蛋 白 目 前 是 一 个 在 免疫 遗传 学 和 医学 上 广泛 应 用 的 分 析 工 具 。 例 如 ， 在 区 别 免疫 球 蛋 白 遗 传 标记 的 Gm 系统 ， 以 及 个 体型 现象 〈Idiotypia) ， 新 生 儿 溶血 证 的 诊断 等 方面 都 是 非常 有 用 处 的 。 八 、 抗 体 的 测定 根据 上 述 抗体 和 抗原 相互 作用 原理 ， 建 立 了 许多 种 抗体 定量 或 定性 的 测定 方法 ， 其 中 一 些 方法 达到 很 高 的 灵敏 度 。 抗 体 的 各 种 测定 方法 及 其 灵敏 度 见 表 11-10。 上 述 这 些 方法 中 , 有 许多 种 方法 所 测 得 的 结果 不 只 是 依赖 于 抗体 的 量 , 而 且 还 依赖 搞 体 的 性 质 (类 别 、 价 数 、 亲 合力 等 )， 以 及 有 无 补体 存在 等 条 件 。 整 体内 的 测定 还 要 受到 寄 主 内 环境 因素 的 影响 。 换 名 话 说 ,实际 上 它们 只 是 抗体 功能 的 量度 , 而 不 是 抗体 总 量 的 量 度 。 因 此 ， 用 不 同 的 方法 得 到 的 结果 ， 往 往 难 于 互相 比较 ， 甚 至 互相 矛盾 。 为 了 解释 这 些 复杂 的 结果 ， 以 及 选择 能 更 好 地 反映 抗体 总 量 或 适合 特定 实验 目的 的 方法 ， 就 有 必要 把 这 些 方法 按 其 抗体 抗原 相互 作用 的 方式 ， 区 分 为 三 大 类 ， 即 初级 .二 级 和 三 级 反应 。 抗 体 和 抗原 分 子 的 初级 反应 (抗原 决定 徐 和 抗体 结合 位 点 的 结合 ) 是 一 切 免疫 反应 最 初 的 和 基本 的 过 程 ， 可 以 用 和 抗体 结合 位 点 结合 的 抗原 量 来 量度 。 因 此 ， 根 据 初 级 反应 的 测定 方法 能 够 比较 直接 地 反映 抗体 的 量 。 通 常 条 件 下 ， 这 种 初级 反应 需要 通过 与 补体 系统 以 及 反应 环境 间 一 系列 相互 作用 的 放大 ， 才 能 成 为 肉眼 可 观测 到 的 现象 ， 呈 现 为 沉淀 、 北 ， 集 ` 固 定 补体 (溶血 ) 以 及 中 和 反应 等 次 级 反应 。 三 级 反应 又 是 次 级 反应 在 整体 内 通过 组 织 细胞 间 的 相互 作用 而 表现 出 来 的 更 为 复杂 的 现象 。 因 此 ， 根 据 后 两 类 反应 建立 的 测定 方法 所 测定 的 是 一 定 种 类 抗体 的 功能 表现 ， 只 是 在 不 同 程度 上 间接 地 反映 了 抗体 的 存在 和 含量 。 如 前 所 述 ， 抗 体 和 抗原 的 结合 (初级 反应 ) 可 用 下 式 表 示 : Ka Ag + Ab === Ag: Ab Kd «3196 "So | 表 11-10 抗体 测定 的 各 种 方法 及 灵敏 度 测定 S 类 别 方 法 利用 沉淀 抗原 抗体 复合 物 分 离 结合 抗原 和 游离 抗原 5092 硫 酸 贸 沉 淀 《Farr RRR) 抗 免疫 球 蛋白 ( 双 抗 体 法 ) 放射 免疫 测定 法 Att | 免疫 吸附 剂 比 色 法 同位 素 标记 抗体 放射 免疫 电泳 (加 抗 免疫 球 蛋 白 ) Coos 氏 免 疫 莉 光 法 (定位 ) el tat ‘all ea 微量 克 氏 定 氮 法 比 色 法 Lowry 法 微量 Lowry 法 环 状 测定 p-80 结合 琼脂 扩散 二 级 单 疝 单 扩 散 法 〈Oudin 法 ) 单 向 双 扩 散 法 (Preer 法 ) 双向 双 扩 散 法 (Ouchterlony 法 ) 圆 径 扩 散 (Mancini 法 ) 免疫 电泳 Grabar 微量 法 对 流 免 疫 电泳 法 〈Laurell 法 ) “320 。 抗体 最 小 检测 量 |o.05 一 0.1 微克 /毫升 |Farr，R. S. (1958), J. Inf. Dis. 103,239, 微克 一 毫 微克 /毫升 范 |McDevitt，H。O.。 48(1965), J. Exp.m ed. 122, 517. 毫 微克 一 微微 克 / 毫 FL /Yalow, R. S. 和 Berson, S. A. in“Me 范围 0.5 一 10 微 克 / 毫 升 thods of Biochem. Analysis” V. 12, p. 69:“Methods in investigative dia gnostic endocrinology” 2A, part I. p. 84, Gill & Bernard (1969) Immunochem. 6, 567. 0.001—0. 017433 /ZEF+|Mann, L. & (1969) J. Imm, 102, 0.02 微 克 / 毫 升 Stechschulte & Aurten (1970) J. lmm 618. 104, 1052. 一 个 产生 抗体 的 细胞 |Coons，A.。H.“gemzeral cytochem, me 120i 58 / Ft 10 微克 /毫升 0.5 微 克 / 毫 升 20—30$h 58 / Ft <1 foe /EFt 12—110 微克 /毫升 20 一 50 微克 /毫升 >40 微克 /毫升 10 微克 /毫升 100 微 克 / 毫 升 >100 微克 /毫升 | thods” Vol. 1, p. 339, Kabat, E. A.(1961) Exp. (mmunoc hem., 2nd. Ed. Marrack, J. R. (1963) .Brit. Med- Bull. 19, 178. Ackroyd, J. F+ (1964) Imm. Meth ods Talmage, D. W. & Maurer, P. H. (1953) J. Inf. Dis. 92,288. Kabat, E. A. (1961) Exp. Immuno chem, 2nd. Ed. 4 Williams, C. A. & Chase, N> W. (1968) Meth, in Imm. & Immuno chem. V. 1, Il. Ouchterlony, O. 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Arthus 反应 60 微克 /毫升 SATA RRRK) 2 微克 /毫升 ( 据 Gill, 1970, Nezlin, 1972), 血清 样品 中 抗体 总 浓度 是 游离 的 和 结合 的 抗体 结合 位 点 的 和 ， 而 游离 抗体 结合 位 点 浓度 (LAb])， 按 照 质量 作用 定律 遵守 下 式 ， [AgICAD] _ x causes [Ag Ab] a FRB RRO » 按照 玫 d 值 的 大 小 ， 抗 体 可 分 为 非 亲 合 抗体 群 (Nonavid antibody population) 和 亲 合 抗体 群 (Avid antibody population)， 前 者 玉 d 值 相当 高 ， 后 者 必 d 值 相当 低 。 从 实际 应 用 上 看 ， 亲 合 抗体 群 和 抗原 的 结合 程度 对 抗原 浓度 变化 的 反应 比 非 亲 合 抗体 群 更 敏感 。 大 部 分 含 亲 合 抗体 群 的 抗 血 清 ， 在 抗原 过 剩 区 内 ， 和 抗体 结合 的 抗原 量 能 近似 地 反映 该 抗 血 清 结合 抗原 的 总 能 力 。 因 此 ,加 入 的 抗原 浓度 的 变化 , 就 会 使 结合 抗原 和 游 离 抗原 的 比值 (B /F) 起 显著 变化 。 反 之 ,大 部 分 含 非 亲 合 抗体 的 抗 血清 中 ， 抗 原 浓度 的 变化 虽 能 引起 结合 抗原 的 量 显著 增加 或 减少 ， 而 结合 比值 (B /FE) 的 变化 却 不 大 。 此 外 ， « 321 吕 束 11-11 根据 抗原 抗体 初级 相互 作用 的 测定 方法 定量 测定 表 11-12 ”根据 抗原 抗体 次 级 相互 作用 的 测定 A. 利用 沉淀 抗原 抗体 复合 物 分 离 游 离 抗原 和 结合 抗原 A. 沉淀 反应 1. 50% Bike (Farr 氏 法 ) ee rd : r of HERE pelea eee B. 凝集 反应 2. SEM He 3. BER here C. 抗原 的 表面 物理 吸附 Me D. 溶血 反应 1. 纸 层 析 2. RSH, Bat 3. BRB ARNE R D. 专 一 免疫 吸附 剂 定性 测定 A. 利用 抗原 和 不 溶性 抗原 抗体 复合 物 结合 1. 间接 放射 免疫 电泳 表 11-13 根据 抗原 抗体 三 级 相互 作用 的 测定 2. 免疫 TK A. P-K 测定 (反应 素 ) 3. 直接 免疫 扩散 和 免疫 电泳 B. 被 动 皮肤 过 敏 反应 (PCA) se Fe BEBE : C. Arthus 反应 B. 利用 结合 和 游离 抗原 电泳 速度 的 差异 D. 毒素 中 和 反应 1. 放射 凝 胶 电 泳 2. 自由 电泳 还 应 注意 到 无 论 亲 合 或 非 亲 合 抗体 群 ,在 上 述 条 件 下 , 对 抗体 浓度 变化 都 很 敏感 。 由 于 这 一 原因 ， 当 和 欲 测定 一 抗 血清 之 总 抗原 结合 能 力 时 , 最 好 增加 抗原 和 抗体 的 浓度 ,并 在 抗原 极度 过 剩 时 进行 测定 。 根 据 初 级 反应 的 定量 和 定性 的 方法 见 表 11-11。 次 级 相互 作用 是 一 系列 初级 反应 在 一 定 条 件 下 的 表现 。 常 用 的 次 级 反应 测定 法 如 表 11-12 所 示 。 区 分 初级 和 次 级 测定 的 必要 性 ， 可 以 从 以 下 事实 看 出 来 。 就 沉淀 反应 而 论 ， 一 些 抗体 群 能 和 抗原 产生 沉淀 ， 而 另 一 些 抗体 (如 反应 素 ) 则 不 能 。 因 此 ， 帝 演 反 应 只 能 表示 抗 血清 的 沉淀 能 力 ， 而 不 能 测量 抗体 总 量 。 同 样 地 ， 补 体 固定 法 是 表示 某 些 种 类 的 抗体 (主要 是 IgG 和 IgM) 利用 补体 成 分 的 能 力 , 而 另 一 些 种 类 的 抗体 (如 IgB,IgA) 则 不 能 固定 补体 。 溶血 反应 同样 也 依赖 补体 ， 并 且 IgM 比 IgG 的 溶血 能 力 要 强 许多 倍 《参看 第 八 章 ) 。 凝 集 反 应 是 测定 抗 血清 凝集 带 有 或 “ 镀 >” 有 抗原 的 颗粒 的 能 力 。 已 知 IEM 比 IgG 的 凝集 能 力 要 高 50 到 500 fF. 总 之 ， 次 级 反应 测定 法 只 能 反映 抗 血 清 中 某 些 抗 体 某 方面 的 功能 ， 而 不 能 测量 抗体 总 量 。 由 于 这 种 原因 ， 对 于 非 均 一 的 或 未 知 的 抗体 系 统 , 用 某 一 种 次 级 测定 法 时 得 到 负 结 果 , 改 用 另 一 种 方法 时 又 可 能 得 到 正 结果 ， 各 种 方法 之 间 往 往 缺 乏 可 比 性 。 虽 然 如 此 ， 次 级 测定 法 (特别 是 凝集 反应 和 补体 结合 反应 等 ) 实际 应 用 仍然 很 广泛 。 不 过 对 所 得 结果 作 解 释 时 ， 应 当 充 分 考虑 到 这 类 方法 上 述 的 限制 性 。 三 级 反应 是 初级 反应 在 整体 内 的 表现 ( 表 11-13) 。 除去 受 影 响 初级 和 次 级 反应 的 因 素 控 制 外 , 还 要 受 整 体内 的 因素 ,包括 组 织 细胞 的 抗体 受 体 和 化 学 受 体 、 寄 主 补 体 水 平 、 白 血球 和 肥大 细胞 数目 以 及 神经 体液 调节 因素 等 的 影响 。 因此 ， 又 要 比 次 级 反应 复 RE 多 。 同 样 应 当 着 重 指出 ， 三 级 反应 只 是 某 类 抗体 某 方面 的 功能 表现 , 而 不 代表 抗体 总 量 。 用 某 一 种 三 级 测定 法 得 到 负 结 果 ， 并 不 能 说 明 就 没有 抗体 存在 。 此 外 还 应 指出 ， 由 抗原 ° 322.6 抗体 相互 作用 产生 的 免疫 防御 和 免疫 损伤 机 制 ， 实 际 上 都 是 整体 内 三 级 反应 的 表现 〈 通 常 还 需要 补体 系统 的 参加 ) 。 (—) 初级 相互 作用 定量 测定 法 抗体 抗原 的 结合 是 一 系列 免疫 反应 的 起 点 , 依 条 件 而 定 , 它们 可 能 导致 或 不 导致 次 级 和 三 级 反应 的 发 生 。 初级 相互 作用 测定 法 直接 反映 一 定 抗体 能 结合 多 少 抗原 量 的 能 力 ， 而 无 需 依 赖 那些 影响 次 级 和 三 级 反应 的 因素 。 因 此 ， 当 其 他 两 类 测定 呈 阴 性 时 ， 初 级 测 定 仍 可 能 呈 阳 性 。 一 般 说 来 ， 初 级 相互 作用 定量 测定 需要 满足 下 述 三 个 共同 的 条 件 : 1) 每 一 测定 系统 需要 一 个 纯化 的 抗原 或 抗体 ; 2) 需要 把 可 溶性 抗原 抗体 复合 物 与 游离 的 抗原 或 抗体 分 离 ; 3) 需 用 高 度 灵 敏 的 方法 测定 抗原 或 抗体 , 通常 是 借助 放射 性 同位 素 或 草 光 标记 抗原 或 抗体 。 由 于 放射 性 同位 素 标记 物 的 放射 强度 可 以 极为 灵敏 的 测定 ， 因 而 大 大 提高 了 测 定 的 灵敏 度 , 达 到 超 微量 (ng 一 pg 范围 ) 水 平 。 根据 初级 相互 作用 中 未 标记 抗原 对 标记 抗原 和 专 一 抗体 结合 的 竞争 性 抑制 原理 而 发 展 起 来 的 放射 免疫 测定 (Radioimmunoassay) ， 是 目前 体液 内 微量 抗原 ( 半 抗 原 ) 超 微量 测定 的 最 好 方法 ， 将 留待 附录 里 专门 讨论 。 这 里 先 叙 述 几 种 根据 不 同 的 抗原 抗体 复合 物 分 离 法 而 建立 起 来 的 抗体 定量 测定 的 简单 原理 : 1. 使 抗原 抗体 复合 物 沉 淀 从 而 分 离 结合 抗原 和 游离 抗原 (1) eee (Farr 氏 法 ) 这 是 一 种 适合 于 一 些 非 透析 抗原 的 初级 测定 法 。 它 测量 抗 血 清 结合 可 溶性 大 分 子 抗 原 的 能 力 ， 对 这 淀 抗体 和 非 沉 淀 抗体 都 适用 。 最 初 用 于 BSA- 抗 BSA AR. 其 原理 是 ”IT-BSA 〈 标 记 抗原 ) 溶解 于 50% 饱和 硫酸 匀 (SAS /2) ， 而 可 溶性 "'I-BSA- 抗 体 复合 物 在 同一 条 件 下 则 不 溶解 。 将 一 定量 的 ''I-BSA 标记 抗原 加 入 到 一 系列 逐次 稀释 的 抗 -BSA 血清 中 ， 在 抗原 过 剩 点 ， 可 溶性 免疫 复合 物 (”:I-BSA- 抗 体 ) 在 溶液 中 达到 平衡 ， 但 不 能 自动 形成 集聚 物 沉淀 。 此 时 若 加 硫酸 铵 至 50% 饱和 度 (SAS /2) 后 ,原来 可 溶 的 免疫 复合 物 便 被 沉淀 。 SAS /2 能 显著 地 抑制 此 免疫 复合 物 的 形成 和 解 离 ， 因 而 不 会 改变 加 硫酸 铵 以 前 存在 的 ， 与 抗体 结合 的 和 游离 的 ”I-BSA 的 比值 ( 即 B/E 值 ) 。 实际 操作 是 把 定量 的 标记 抗原 加 到 经 一 系列 稀释 的 抗 血清 中 ， 加 SAS /2 后 ,测量 沉 淀 抗原 的 百分比 ， 并 求 出 能 沉淀 33% 加 入 的 抗原 之 抗 血 清 稀释 度 ， 称 为 “ABC-33” & 点 。SAS /2 沉淀 的 放射 性 强度 表示 抗 血清 中 的 抗体 和 抗原 结合 能 力 ， 并 非 自 动 沉淀 的 抗 原 或 抗体 的 量 。 测定 结果 可 用 每 毫升 未 稀释 血清 中 所 含 抗体 能 结合 的 ”:I-BSA 的 含 A EB (ugN) 表示。ABC-33 终点 是 任意 选 定 的 ， 因 为 在 这 种 抗原 过 剩 程度 时 , 不 发 生 自动 沉淀 ， 同 时 SAS /2 沉淀 中 所 含 标记 抗原 的 放射 强度 又 可 供 精 确 测量 (Farr，1958) 。 这 一 方法 在 许多 免疫 学 问题 的 研究 中 ， 得 到 广泛 应 用 ， 如 用 于 比较 人 和 家 免 抗 血清 之 抗原 结合 能 力 和 沉淀 能 力 , 区 别 微量 的 同 种 的 和 异种 的 交叉 反应 的 抗原 决定 簇 ,抗原 抗 体 相互 作用 中 结合 和 解 离 速度 .以 及 非 沉 淀 抗 体 的 测定 等 。 除 最 先 用 于 BSA- 抗 BSA A * 323° SAS/2 Anti-RGG 1:10 1:30 1:2400 137000 1265000 稀释 度 图 11-28 ”家 免 抗 血清 加 SAS 或 抗 家 免 丙 种 球 蛋白 (Anti-RGG) 后 -3 BSA 抗原 沉淀 百分比 。 用 这 两 种 方法 时 ，ABC-33 终点 ,或 加 入 抗原 达 33% 沉淀 时 抗 血清 的 稀释 度 , 均 约 为 1 : 5000( 据 Minden 等 ,1969)。 统 外 ， 还 可 应 用 于 其 他 抗原 抗体 系统 ， 如 卵 白 蛋白 ,wx- 乳 白 蛋 白 ， 链 球菌 M SARK 草花 粉 抗原 ， 细 菌 内 毒素 ， 人 IgG 的 片段 Fab 和 了 Fc， 以 及 甲 胎 蛋 白 的 测定 。 本 方法 目 然 限 于 SAS /2 不 沉淀 的 大 分 子 抗原 。 (2) 抗 免疫 球 蛋 和 白 沉淀 抗原 抗体 复合 物 ( 双 抗体 法 ) 用 异种 的 抗 IEG (二 级 抗体 ， 如 用 免 抗 体 作 一 级 抗体 时 ， 常 用 羊 抗 免 IgG HOR 体 ) 代替 硫酸 匀 ， 共 同 况 淀 可 溶性 ”IT- 抗 原 抗 体 复合 物 (Skom 和 Talmage, 1958; Schalach 和 Parker，1964) 。 对 于 家 免 抗 BSA-BSA 系统 ， 硫 酸 撤 法 和 双 抗 体 法 的 灵 敏 度 是 相近 的 (图 11-28) 。 两 种 方法 中 ， 产 生 33% 抗原 沉淀 时 所 需 的 抗 血 清 稀释 度 ( 即 ABC-33 终点 ) 均 为 115000。 双 抗 体 法 的 局 限 性 首先 在 于 需要 相当 大 量 浓 的 二 级 抗体 来 沉淀 抗原 抗体 复合 物 。 其 次 ， 抗 IgG 和 标记 测试 抗原 之 闻 ， 若 存在 交叉 反应 就 不 能 应 用 。 此 方法 已 成 功 地 应 用 于 下 列 抗 原 的 抗体 测定 ， 如 胰岛 素 ，BSA， 马 血清 白 蛋 白 , 人 生长 素 等 ， 以 及 互 CG 抗原 的 测定 。 2. 表面 物理 吸附 某 些 抗原 或 半 抗 原 易 被 惰性 表面 (如 滤纸 、 玻 璃 , 硅 酸 盐 颗 粒 等 ) 非 专 一 的 吸附 ， 而 它 们 的 可 溶性 抗原 抗体 复合 物 则 不 被 吸附 。 利 用 这 种 性 质 ， 就 可 把 标记 的 结合 抗原 (B) 和 游离 抗原 (了 ) 分 离 。 这 一 原理 曾 被 首先 应 用 于 激素 的 放射 免疫 测定 。 (1) 滤纸 层 析 法 Berson 等 (1956) 最 先 利用 游离 的 胰岛 素 易 于 被 滤纸 吸附 的 原理 于 血液 中 胰岛 素 的 放射 免疫 测定 。 将 标记 抗原 (2I- 胰 岛 素 ) 和 抗 血清 保温 后 ,把 此 混合 物 点 在 请 纸 上 作 电 tk, WSR Ra FP) 被 滤纸 吸附 留 在 原点 ， 而 结合 的 ”2*I 胰 岛 素 (B) 和 抗体 一 起 向 阴极 移动 。 计 数 泪 纸 不 同 部 位 的 放射 强度 ， 求 出 B / 耻 值 。 利用 和 未 标记 抗原 的 竞争 * 3246 结合 法 ,- 从 标准 曲线 就 可 求 出 未 知 样品 中 胰岛 素 浓度 。 这 一 方法 已 经 应 用 到 其 他 多 肽 和 蛋白 激素 , 如 胰 升 血糖 素 、 生 长 素 和 副 甲 状 腺 素 等 的 测定 中 。 这 一 方法 的 优点 是 取样 时 吸 量 误差 不 影响 测定 结果 ， 因 为 所 求 的 只 是 B 了 比值 。 其 限制 是 每 一 滤纸 条 上 试 样 须 小 于 300 一 400 微 升 。 各 种 牧 号 的 滤纸 , 对 血清 中 的 胰岛 素 或 其 他 蛋白 激素 之 吸附 能 力 不 同 ， 差 异 相当 大 。 长 时 间 电 泳 还 可 能 导致 抗原 抗体 复合 物 的 解 离 。 这 些 都 是 缺点 。 (2) 硅 酸 盐 颗 粒 吸附 利用 各 种 硅 酸 盐 颗 粒 的 表面 ， 如 更 身 粉 〈 水 合 硅 酸 镁 ) ， 硅 微粒 ,漂白 土 (Fullers- earth, 复杂 的 硅 酸 盐 ) 等 ,能 吸附 标记 的 游离 抗原 (FE) ， 而 和 抗体 结合 的 抗原 (B) 则 不 被 吸附 的 特性 ， 也 可 以 测定 某 些 多 肽 激素 。 实际 操作 时 , 把 硅 酸 盐 微 粒 直接 加 入 到 含 一 定量 的 标记 激素 , 专 一 抗体 和 未 知 血清 样 品 的 试管 中 。 经 激烈 振荡 后 , 离心 , 倒 去 上 清 液 。 计 数 每 管 沉淀 物 的 放射 强度 ， 代 表 未 结 合 标 记 抗 原 量 。 从 已 知 加 入 标记 抗原 的 总 量 ， 就 可 求 出 B/F 值 。 再 从 标准 曲线 就 可 算出 未 知 血 清 样 品 中 激素 的 量 。 此 方法 可 以 分 析 较 大 量 溶液 。 当 血浆 中 内 源 激 素 的 浓度 很 低 ， 如 ATCH, 或 不 易 制 备 高 比 强 的 标记 抗原 时 ， 这 一 方法 是 有 实用 价值 的 。 应 用 此 法 测定 过 的 抗原 有 人 的 生长 素 ， 副 甲状 腺 素 ， 胰 岛 素 ，ACTH & (Rosselin 等 ，1966) 。 (3) Ria) Reo we 和 镀 葡 聚 糖 (分 子 量 =80,000) 的 活性 碳 颗粒 能 吸附 分 子 量 不 大 的 抗原 ， 如 胰岛 素 ， 而 不 能 吸附 其 免疫 复合 物 。 因 此 可 用 于 胰岛 素 B 外 值 测定 。 此 法 的 优点 是 简便 、 迅 速 。 所 得 结果 和 其 他 放射 免疫 测定 也 不 相 上 下 (Herbert “, 1965; Meyer 等 ，1967) 。 (4) 专 一 抗体 吸附 到 高 聚 物 表面 ( 国 相 法 ) 一 些 塑 料 , 如 聚 丙二醇 和 聚 茶 乙 烯 的 表面 能 吸附 专 一 抗体 , 这 种 吸附 了 专 一 抗体 的 固 相 表 面 又 可 以 吸附 放射 性 标记 抗原 。 实 际 操作 是 用 大 小 适合 于 闪烁 计数 器 内 测量 的 塑料 管 ， 内 表面 涂 上 一 层 专 一 抗体 。 这 种 涂 上 抗体 的 管 壁 就 可 用 来 和 标记 抗原 结合 ， 并 作为 和 非 标记 抗原 竞争 结合 的 地 点 。 经 一 定时 间 保 温 免疫 反应 完成 后 , 洗 去 游离 的 标记 抗原 。 计数 管 壁 的 放射 强度 ， 代 表 与 抗体 结合 的 标记 抗原 量 (B) ， 由 此 求 出 B/F 值 。 此 方法 的 优点 是 简便 ,迅速 ,所 有 操作 步骤 ,从 保温 、 结 合 和 游离 抗原 的 分 离 到 测量 ， 都 在 同一 逆 料 管 中 完 成 (Catt 和 Tregear, 1967), 3. 专 一 免疫 吸附 剂 (Immunoadsorbents) 将 抗原 结合 到 固 相 载体 上 制 成 的 免疫 吸附 剂 ， 除 去 对 抗体 纯化 有 很 大 用 处 外 ， 也 可 用 于 抗体 或 抗原 的 微量 测定 。 (1) 抗体 的 测定 先 将 纯化 的 抗原 和 固 相 载体 结合 ， 制 备 成 专 一 的 免疫 吸附 剂 。 对 一 定量 的 免疫 吸附 。325 。 表 11-14 抗 白 蛋白 抗体 的 定量 测定 (免疫 吸附 剂 法 ) 加 大. CEH) 正常 家 免 血 消 免疫 血清 对 照 一 一 非 专 一 血清 CIN NaOH 洗 脱 》 1 = 104 一 1 128 ea ” 808 对 照 一 一 非 专 一 吸附 剂 CAN HCL 洗 脱 ) a fo: anaes 结合 自 蛋 白 3 毫克 一 1 1950 36 1914 ( 据 Hesnun, 1972), Wl, MACSHNHWHNKMEARRARK ANGER BS-RAHra. HNEAKKPSAREa Se, 即 为 抗体 量 (4211-14. 常用 的 固 相 载 体 有 省 乙酰 纤维 素 (Gill #1 Bernard, 1969), CNBr 活化 的 琼脂 炉 珠 (Porath 等 1967; Axen， 等 ， 1967), Sephadex 的 异 硫 氰 酸 衍生 物 (Wide 和 Porath，1966) 等 。 测 定 的 灵敏 度 决 定 于 最 后 一 步 中 采取 的 测定 蛋白 质 的 方法 。 如 用 Lowry Ket, Wile 1 或 二 1 答 克 的 抗体 蛋白 质 。 抗 体 体外 合成 实验 中 ， 有 放射 性 标记 氮 基 酸 参 人 的 新 合成 的 抗体 ， 或 :5I 直接 标记 的 抗体 ， 借 助 闪烁 计数 器 测量 放射 性 ， 测 定 灵 敏 度 可 提高 到 毫 微克 (ng) 水 平 。 这 一 方法 能 够 准确 定量 , 灵敏 度 高 , 重复 性 好 ， 操 作 简 便 ， 迅 速 〈 整 个 测定 过 程 只 需 2 一 3 小 时 ) 。 抗原 偶 联 在 固 相 吸 附 剂 上 ， 排除 了 形成 可 溶性 抗原 抗体 复合 物 的 可 能 性 ， 因而 无 论 帝 淀 抗体 和 非 沉 淀 抗体 都 可 以 测定 。 由 于 具有 这 许多 优点 ， 这 一 方法 在 抗体 生 物 合成 等 生化 实验 中 很 有 用 处 。 此 外 ， 若 加 以 适当 改变 还 可 以 用 于 抗原 测定 。 分 离 的 蛋白 质 《微克 ) 非 专 一 吸附 免疫 吸附 剂量 (微克 ) 0.85% NaCl ee oe 24 | @AABAE 6.6 By 同上 24 结合 酷 蛋 白 3 Bye (2) 抗原 测定 ( 夹心 "吸附 剂 法 ) 按 上 法 制备 专 一 的 固 相 免 疫 吸 附 剂 (纤维 素 -抗原 ), 再 用 同型 免疫 血清 处 理 ， 洗 去 多 余 的 血清 ， 做 成 “夹心 ”免疫 吸附 剂 [( 纤 维 素 -抗原 )- 抗 体 ]。 然 后 加 入 欲 测 定 的 含 抗原 的 溶液 ， 抗 原 便 被 “夹心 ”免疫 吸附 剂 上 结合 的 抗体 专 一 地 吸附 ， 经 洗涤 去 除 未 结合 的 抗原 后 ， 用 洗 脱 芒 洗 脱 (使 抗原 抗体 复合 物 解 离 ) ， 测 量 洗 脱 液 中 蛋白 质 含 量 。 以 实验 组 的 洗 脱 蛋 白质 量 ， 减 去 对 照 组 中 洗 脱 的 蛋白 质量 (免疫 吸附 剂 -抗体 + 对 照 抗原 ， 或 另 一 种 免 疫 吸 附 剂 -抗体 + 测试 抗原 ) ， 就 可 以 得 到 专 一 结合 的 抗原 量 。 如 表 11-15 中 ， 实 验 组 抗 原 蛋 白 增加 量 为 37 微克 /毫克 吸附 剂 ， 减 去 非 专 一 增加 量 5 微克 /毫克 吸附 剂 , 得 到 专 一 结合 的 抗原 量 为 32 微克 /毫克 吸附 剂 。 通常 1 克 “ 夹 心 ? 免 疫 吸 附 剂 能 专 一 地 吸附 40 一 50 毫克 抗原 。 所 用 抗 血 清 ， 如 改 为 纯化 的 抗体 ， 结 合 能 力 还 可 提高 2 一 3 倍 。 (3) 免疫 吸附 抑制 法 (Immunoadsorbent-inhibition test) 利用 非 标记 抗原 对 标记 抗原 和 固 相 抗体 (免疫 吸附 剂 -抗体 ) 结 合 的 抑制 反应 ,能够 区 别 各 种 抗原 之 抗原 性 的 微小 差异 。 如 果 非 标记 抗原 和 标记 抗原 的 抗原 性 略 有 不 同 ， 甚 至 当 非 标记 抗原 过 剩 时 ， 仍 不 能 完全 抑制 标记 抗原 和 同型 固 相 抗体 的 专 一 结合 。 这 一 方法 在 比较 许多 种 蛋白 质 抗原 (如 同 种 异型 抗原 ) 的 抗原 性 异同 时 ,特别 有 用 处 。 。 326。 表 11-15 抗原 的 定量 测定 (夹心 ?吸附 剂 法 ) m A # 1 毫克 吸附 剂 | 1 章 克 吸附 剂 抗 马 Y 球 蛋白 锡 洗 脱 重 白质 | 抗原 自白 增加 量 eave ARMA EH | OOSWNAC | eae yay | AGE ie) | Gee aE ee (毫升 一 一 一 一 250《〈 卵 白 蛋白 ) 250(45 r REA) ( 据 Nezlin, 1972), ee ee Arenas | 因此 也 可 以 用 于 抗原 的 定 量 测定 (Mann，1969) (图 11-29) 。 以 上 这 几 种 分 离 结合 抗原 和 筹 离 抗原 的 方法 ， 在 放射 免疫 中 也 得 到 广泛 应 用 。 下 面 要 谈 到 的 是 不 需要 这 种 分 离 手 续 ， 直 接 测量 抗原 ( 半 抗 原 ) 和 . ° 抗体 反应 中 所 引起 的 莉 光 变化 的 方法 , 即 草 光 法 。 on 4. SKE BI WLA DBL MTR RETR FAB fe 时 引起 草 光 强度 或 偏振 程度 的 变化 ， 可 被 萤 光 分 光 光 度 计 或 = oo 萤 光 偏振 仪 极 灵敏 地 测定 。 因 此 ， 此 类 方法 也 属于 初级 相互 抗原 (微克 ) $i 略 snp geen 图 11-29 “IgG 和 相应 的 抗 作用 测定 法 的 范围 。 除去 本 章 已 介绍 过 的 曹 光 灭 活 法 以 外 ， Onc cima Pea e 平 述 两 种 萤 光 法 在 免疫 化 学 研究 中 ， 也 有 重要 的 用 途 : 非 标记 同型 抗原 量 的 依赖 关系 。 90 't-IgG CPM X 10- po (1) 莹 光 加 强 (Fluorescence enhancement) 某 些 半 抗 原 分 子 ， 如 蔡 磺 酸 衍生 物 ， 在 溶液 中 无 萤 光 ， 当 和 抗体 结合 后 就 呈现 强 曹 > 并且 在 一 定 范围 内 萤 光 增强 度 和 所 加 抗体 量 成 比例 。 由 此 可 测定 抗体 的 量 (图 11- 30) 。 这 一 方法 的 优点 是 无 需 纯化 的 抗体 ， 简 便 , 灵敏 。 不 se + Bea 过 只 限于 少数 在 光谱 性 质 上 适合 上 述 条 件 的 抗原 ， 应 用 范 80 围 因而 很 有 限 。 相对 丝光 强度 (2) X44 (Fluorescence polarization) he 2 Ways af 在 一 定 条 件 下 ， 反 应 过 程 中 分 子 大 小 和 形状 〈 不 对 称 ey, ea: HE) 的 改变 能 影响 曹 光 偏 振 程 度 。 这 一 原理 也 可 应 用 于 抗 ANS 和 相 忆 为 关 2 时 0 全 和， 原 抗体 相互 作用 的 研究 。 当 一 个 半 抗 原 或 蛋白 质 抗原 和 抗 Bo 发射 曹 光 在 440 mp 测量 ( 据 “ 体 分 子 结合 时 ， 由 于 分 子 量 的 增加 和 形状 的 改变 ， 勃 朗 运 ge 动 速率 降低 而 引起 草 光 偏振 增加 。 抗 原 偏振 程度 随 抗体 浓度 而 定量 地 增高 ， 并 可 用 曹 光 偏振 仪 测 出 。 实际 操作 时 ， 要 求 抗原 先 用 其 萤 光 发 射 光 谱 不 被 蛋白 质 基 团 干扰 的 萤 光 分 子 标 记 ， 并 且 欲 测定 成 分 的 分 子 大 小 不 应 比 测定 物 过 小 。 此 方法 可 应 用 于 许多 抗原 抗体 反应 动力 学 和 平衡 的 基本 研究 ， 如 求 结合 常数 ， 结 合 位 点 浓度 , 不 均一 性 常数 , 化 学 反应 级 别 ， 反 应 速度 等 。 并 且 还 具有 操作 简便 ,迅速 , 灵敏 度 高 (可 测量 024 微克 7 之 升 抗 林 ) 等 优点 。 主 要 的 限制 是 如 用 全 抗 血清 时 ， 背 景 草 光 过 高 ，， 因 此 最 好 用 纯化 的 免疫 球 蛋 外 或 抗体 aa 327 。 (Dandliker 和 Saussure, 1970), (二 ) 初级 相互 作用 定性 测定 法 1. 根据 抗原 和 不 溶性 抗原 抗体 沉淀 物 结合 的 方法 此 方法 主要 应 用 于 免疫 球 蛋白 及 其 亚 基 对 抗原 结合 的 特 竹 的 研究 。 对 于 鉴别 一 个 专 一 抗体 属于 何 种 免疫 球 蛋 白 类 型 ， 如 反应 素 和 IsSE 的 关系 ， 很 有 用 处 。 (1) 间接 放射 免疫 电泳 法 和 微量 免疫 电泳 相似 ， 在 载 玻 片上 铺 一 薄 层 琼脂 ， 按 需要 打 孔 和 开 槽 。 测 试 而 清 或 血清 成 分 (含有 某 种 类 型 的 专 一 抗体 ， 如 抗 -BSA 的 IgG) 加 在 一 侧 样 品 孔 内 ， 对 照样 品 (正常 免疫 球 蛋白 ,如 IEG) 加 在 另 一 侧 孔 内 。 电 泳 以 后 ,在 槽 内 加 能 沉淀 测试 血清 中 的 专 一 抗体 免疫 球 蛋 白 的 抗 血 清 ( 如 抗 IEG) ， 静 置 候 其 扩散 ， 产 生 沉淀 线 。 洗 去 多 余 抗 血清 ， 再 加 和 专 一 抗体 相应 的 :TI- 标记 抗 原 ( 如 ”IT-BSA)， 再 作 一 次 扩散 。 放 24 小 时 后 ,洗涤 去 除 多 余 的 未 结合 抗 原 。 将 载 玻 片 覆盖 在 X 光 感 光 胶 片 上 显影 ， 经 24 一 36 小 时 后 , 冲洗 出 底 片 ， 就 可 见 到 放射 性 图 象 (图 11-31) 。 (2) 直接 放射 免疫 电泳 法 与 上 法 唯一 的 不 同 之 处 ， 是 将 :TI 标记 抗原 和 抗 IgG 血清 同时 加 到 槽 内 。 此 外 ， 仿 照 上 述 原 理 还 可 以 做 放射 免疫 扩散 (间接 法 和 直接 法 ) 。 所 有 这 些 方法 都 十 分 灵敏 ， 如 对 于 上 述 11-31 家 免 抗 -BSA 沉淀 抗体 (IgG)， 放 射 免疫 电泳 可 检测 出 和 每 毫升 抗 -BSA 结合 的 抗原 量 为 0.025 wgN， 而 放射 免疫 扩散 能 检测 出 的 结合 量 低 至 0.003 wgN。 但 是 ， 应 注意 到 这 些 方法 的 缺点 是 有 时 出 现 非 专 一 的 反应 。 如 上 图 所 示 ， 免 疫 电 泳 图 上 方 的 专 一 抗体 IgG 沉淀 绝 显 现 很 强 的 放射 影 象 , 而 下 方正 常 IgG 沉淀 弧 也 显现 一 条 淡 的 ,但 清 OBR. 这 种 假象 产生 的 原因 可 能 是 由 于 上 方 孔 内 的 专 一 抗体 IgG 分 子 扩散 到 另 一 A, 泥人 正常 IgG 和 抗 IgG 形成 的 沉淀 弧 ， 并 与 II-BSA 结合 的 缘故 。 所 以 ， 为 了 避 免 产 生 这 种 假象 ,放射 免疫 电泳 的 载 玻 片 上 最 好 只 放 含 专 一 抗体 的 一 种 样品 ;在 放射 免疫 扩散 中 , 相 邻 的 孔 不 要 放 有 交叉 反应 或 部 分 交叉 反应 的 样品 。 2. 免疫 莉 光 法 ( 董 光 标记 抗体 法 ) 免疫 董 光 法 是 一 种 初级 定性 测定 方法 ， 可 以 观察 和 精确 地 测定 组 织 和 细胞 内 微量 搞 « 328 。 AAAE a Epa PenDEA Get ODT GE Pa 原 抗 体 反应 的 位 置 。 其 原理 是 用 一 种 萤 光 染料 异 硫 氰 草 光 素 (Fluoresein isothiocyan- ate, 简称 FITC) 与 抗体 结合 。 然后 用 这 种 莉 光 标记 的 专 一 抗体 染 冰冻 的 或 冰 干 的 组 织 切 片 或 涂 片 。 结 果 标 记 的 专 一 抗 体 便 和 组 织 细胞 内 相应 的 抗原 在 原 位 结合 。 洗 涤 去 除 不 结合 的 抗体 。 用 萤 光 显微镜 观察 ， CERISE (RUE ATE) 的 激发 下 ， 有 萤 光 标记 抗体 结合 的 部 ”位 便 曙 现 绿色 萤 光 (520 mz) 9 这 种 方法 称 为 直接 草 光 抗体 法 (Coons 等 ,1941) (图 11-32， A) 。 这 一 方法 的 灵敏 度 很 高 ， 据 估 计 在 5 微米 厚 的 组 织 切片 内 可 检测 出 大 约 1-.4x10~* tk 克 (BREN DUR. Jak MIMD Wot % [Bl He BE 光 抗 体 法 ( 双 抗 体 靶 ) 。 组 织 切 CA) (B) (c) (D) @ 蔓 光 标记 抗体 O 未 标记 抗体 © 补体 O tik 图 11-32 ” 几 种 草 光 标记 抗体 对 组 织 细胞 内 抗原 和 抗体 定位 方法 示意 图 。 (A) BRE: 蓝光 标记 的 专 一 抗体 直接 和 组 织 内 的 抗原 结合 。 《〈B) 间 HERE): 组 织 内 抗原 先 和 未 标记 的 专 一 抗体 结合 , 然后 再 和 董 光 标记 的 抗体 〈 羊 抗 免 IgEG) Hao (C) “KDE”: ”组 织 内 抗体 先 和 抗原 专 一 地 结合 ， 再 和 莉 光 标记 的 专 一 抗体 结合 。 (D) 有 补体 参加 的 间接 法 : 组 织 切片 经 专 一 抗体 加 补体 (新 鲜 的 豚鼠 血清 ?处 理 后 ,再 用 草 光 标记 的 抗 豚 鼠 补 体 的 抗体 显示 被 固定 的 补体 〈 据 Humphrey 和 White, 1963), FARR CMAMICNS-KhKAS, BASRA, BASIC A 11-33 自体 免疫 增生 性 肾 小 球 炎 病人 (Goodpasture’s disease) 之 肾 小 球 的 免疫 蓉 光 。 AR 切片 经 草 光 标记 的 免 抗 人 IgG 抗体 处 理 。 专 一 的 草 光 表示 IgG 沿 肾 小 球 微血管 壁 沉 积 (4 Lerner &, 1967), * 3296 抗体 〈 羊 抗 免 Y- 球 和 蛋白) 处理, 使 和 专 一 抗体 结合 。 结果 在 抗原 和 抗体 反应 的 位 置 便 旦 Dest (图 11-32, B) 。 间接 法 除 比 直接 法 更 为 灵敏 外 ， 另 一 优点 是 只 需要 制备 一 种 草 光标 记 的 抗 Y 球 蛋白 抗体 , 便 可 以 用 来 检测 多 种 抗原 的 同 种 的 抗 血清 。 免疫 曹 光 法 对 细菌 、 病 毒 等 微生物 .原生 动物 、 寄 生 虫 以 及 动物 组 织 抗原 的 鉴定 和 定 位 ， 组 织 内 抗体 的 定位 ， 以 及 血清 抗体 的 鉴定 等 方面 得 到 广泛 的 应 用 。 利 用 免疫 草 光 法 测定 病理 切片 上 抗体 和 补体 的 存在 ， 对 于 鉴定 组 织 的 免疫 损伤 也 有 重要 意义 (图 11-32， C; 图 11-33)。 关于 草 光 免疫 法 的 制 片 、 萤 光标 记 、 染 色 以 及 应 用 可 参看 Kawamura (1969) 的 专著 。 用 含 重金 属 原子 即 电子 密度 高 的 分 子 ， 如 铁 蛋 白 和 辣 根 过 氧化 物 酶 (Horse-radish peroxidase) 标记 抗体 ， 还 可 以 把 这 种 方法 扩大 到 借助 电子 显微镜 观察 ， 在 分 子 水 平 对 抗原 定位 ， 称 为 免疫 电镜 术 (Immuno-electronscopy) (Singer, 1975; Nakane 和 Pierce, 1966; Kawarai 和 Nakane，1970) 。 免 疫 电 镜 术 在 免疫 学 研究 中 ， 特 别 是 细 胞 表面 抗原 和 受 体 方面 ， 正 得 到 日 益 广 泛 的 应 用 (人 参看 第 十 三 章 ， 图 13-4b)。 (三 ) 初级 测定 与 次 级 和 三 级 测定 的 比较 区 分 初级 、 次 级 和 三 级 测定 不 但 在 理论 上 是 重要 的 ， 而 且 在 临床 医学 上 也 有 实际 意 义 。 现 举 一 个 例子 来 说 明 。 饮 用 牛奶 的 人 中 有 一 部 分 产生 过 敏 反应 ， 血 液 中 出 现 牛奶 中 含有 的 一 种 蛋白 质 , 牛 血清 白 蛋 白 (BSA) 的 抗体 。 有 人 对 15 个 病人 以 及 两 只 家 兔 血 清 中 的 BSA 抗体 ， 用 各 种 方法 进行 系统 地 比较 分 析 ， 结 果 列 于 表 11-16。 所 采用 的 方法 中 ， 硫 酸 铵 法 (ABC-33) 和 放射 免疫 电泳 法 属于 初级 测定 ; P-80、 血 凝 反应 和 琼脂 扩散 属于 次 级 测定 ;被 动 皮 肤 过 敏 反应 (PCA) 和 了 - 愉 反应 属于 三 级 测定 。 现 分 述 如 下 : 1. 初级 反应 如 前 述 , 硫酸 匀 法 测定 血清 中 抗体 对 抗原 的 结合 能 力 , 当 0.02 微克 /毫升 标准 抗 原 浓度 时 ， 可 用 每 毫升 未 稀释 血清 结合 的 :2I-BSA 微克 表示 。 放 射 免疫 电泳 能 定性 地 指出 专 一 抗体 所 属 的 免疫 球 蛋白 类 型 。 从 表 11-16 可 见 ， 硫 酸 铵 法 测定 结果 所 有 血清 都 呈 阳 性 ， 同 时 所 有 ”TI-BSA 都 和 IgG 结合， 而 5/15 样品 和 IgA 结合 。 也 就 是 两 种 初级 测 定 都 证 明 有 专 一 抗体 存在 ， 并 且 所 有 样品 均 含 属于 Ig G AMMA, 5/15 含有 属 于 IgA 的 抗体 。 2. 次 级 反应 虽然 两 种 初级 测定 都 星 阳 性 反应 ， 而 次 级 反应 从 下 述 结果 可 见 往往 呈 阴 性 反应 。 (1) 抗原 沉淀 能 力 (P-80 法 ) :TI-BSA 标记 抗原 加 入 到 一 系列 稀释 的 抗 血 请 中 ， 以 达到 80% 标记 抗原 沉淀 的 稀 释 度 作为 终点 ， 再 换算 成 每 毫升 未 稀释 血 请 沉淀 的 微克 ”TI-BSA N， 作 为 P-80 值 (Ta- Image 和 Maurer，1953) 。 从 表 11-16 可 见 ,14 个 血清 样品 中 ,7 个 P-80 测定 为 阴性 。 其 余 7 个 中 ，3 个 达到 了 - ¢ 830.¢ °(L961 & ‘uopuiw Hf) MAUI go SHMS Ks ‘SY MReiX > SRK SYARMK? SYR WBEK I TY MEGHYKSRCHM BE MA MbwIGd oe MA DRY *P “BAO “HDMI ‘Ol ‘1 wkwe b 1 €*1 9 8 5 c € b € 1 I I en} 4% 3 AA Ml 8Z 8 bE bb 8 OF 19 8 6€ 61 9 81 8 ZI “i a ty Px Px 一 = Er Px ms 3 Px = = = = a SUF Px “i M-d + “ts = 本 mt = = an 二 = = =a Px at a a =~ VODd 十 + = on = 一 — 区 = = a 三 i + 一 一 一 MA GS 8402/1 | 9606/1 0 0 0 0 8ZT/ | ze/1 | $9/1 | ze/1 | Oo | 9T/1 | 9¢z/T}zIs/T|9¢z/1} ze/T | ¥9/1 WAH M 86°0 | ZI‘0 三 一 = « 车 E = = *~ —s Gn nse 0 | 24 | 11% |" = 55-Dg9V/08-d bz°z | £9°0 = Px 一 一 一 一 一 一 = - | 70] 87°T}] — | 0Z'0| — | I@/N VSdlier HH 20"0 ‘08-4 08< 08< an 人 — = CER — | 6ZE | C69 = —" | G< hh Os< | RSE | Oss I= = EVE MU% + + + + + + + + + 十 十 十 十 十 十 十 十 H4- Vt é é = = = = 二 = x = = 己 二 三 be 三 = w--14 é é 一 一 二 一 十 一 一 一 一 一 一 十 十 十 十 VX- 呼 十 + 十 + + + + + + 十 十 + + + + + + LI A HRS fe b6°S e8'e I5 0 ?5 0 ZE~0 cy 0 99°0 | ££°0 | 96 0 | 96°0 | 21 | Ze" | LZzZ°Z | 79°F | z055 | LO°9 | OIL | 1/NVSE lier OM Z0°O 55-DgV BAMBLD itp Ue SRY g1-11 ¥ * 331° 80 终点 ，4 点 只 有 极 微弱 的 沉淀 反应 。 和 硫酸 较 法 的 结果 比较 , :aiI-BSA 结合 能 力 最 高 的 样品 ， 却 反而 测 不 出 沉 省 能力 。 由 此 可 见 ， 两 种 方法 的 相关 性 很 差 。 (2) 抗原 沉淀 率 者 用 了 P-80 /ABC-33 比值 来 表示 一 个 抗 血清 的 抗原 沉淀 效率 ， 就 可 以 清楚 看 出 人 抗 血清 的 抗原 沉淀 效率 比 家 免 抗 血清 低 。 这 不 只 是 见于 BSA- 抗 BSA 系统 ， 在 M-12 链 球 菌 提取 物 系统 也 可 观察 到 这 一 现象 。 (3) 琼脂 扩散 从 表 11-14 可 见 ， 人 血清 中 只 有 沉淀 效率 最 高 的 样品 (4 号 ) 才 出 现 沉淀 线 。 这 说 明 琼脂 扩散 比 P-80 法 的 灵敏 度 差 ， 并 且 高 帝 淀 效率 有 利于 在 琼脂 内 产生 沉淀 线 。 (4) 血 凝 反应 结果 表明 ， 血 凝 反 应 的 灵敏 度 较 高 , 15 个 人 血清 样品 中 有 10 个 呈 阳 性 反应 ,但 是 和 其 他 方法 之 间 同 样 呐 乏 相 关 性 。 此 外 ， 虽 然 有 的 人 血清 样品 的 抗原 结合 能 力 比 家 免 高 ， 家 免 血 清 的 凝集 效 价 一 般 都 比 人 血清 高 。 已 知 不 同 种 类 抗体 的 血 凝 效率 有 所 不 同 二 IgE M 抗体 比 IgG 高 ， 而 抗原 结合 能 力 则 正 相 反 。 因 此 ， 上 述 现象 可 能 是 由 于 家 兔 和 人 血 请 中 所 含 的 两 类 抗体 的 比例 不 同 所 致 。 3. 三 级 反应 (1) 被 动 皮 肤 过 敏 反应 (PCA) 豚鼠 皮 内 注射 0.1 毫升 测试 血清 。16 小 时 后 再 静脉 注射 BSA 抗原 和 Evan Rik 的 混合 溶液 ， 观 察 45 分 钟 内 局 部 的 反应 。 若 反应 不 明显 , 可 杀 死 动物 并 剥 上 度 。 检 查 皮 肤 内 面 ， 注 射 抗 体 部 位 有 无 染料 浓 集 。 用 这 一 方法 测试 的 结果 表明 , 14 个 经 测试 的 人 血清 样 品 都 无 PCA 活力 ， 而 家 免 血 清 表现 强 的 PCA 活力 。 表 11-17 初级 测定 和 次 级 三 级 测定 的 比较 We 例 数 阳 性 AK 初级 测定 it PR BIE 15 15 “放射 免疫 电泳 法 15 15 次 级 测定 | p-80 | 14 3 琼脂 扩散 | 15 1 血 凝 反应 | 15 10 三 级 测定 | | PCA 14 0 p-k 12 4 饮 牛 奶 后 的 临床 症状 15 0 (2) Prausnitz-Kiistner 反应 ( 卫 . 开 .) 将 0.1 毫升 测试 血清 皮 内 注射 到 先 经 皮 试 呈 阴 性 的 受 试 人 体 背 部 ，48 小 时 后 再 注射 测试 抗原 (BSA) ，20 分 钟 后 观察 结果 。 这 一 方法 陨 于 蜡 位 性 过 敏 病人 ， 血 清 中 反应 素 抗体 (IgE) 的 测定 (参看 第 九 章 ,249 页 ) 。 从 表 11-15 可 见 ， 已 测试 过 的 人 血清 样品 中 ， 只 有 4 个 呈 阳 性 反应 。 但 是 ， 值 得 注意 的 这 四 个 呈 阳 性 反应 的 病人 ,在 吃 牛奶 或 牛肉 后 ， 都 并 没有 表现 可 观察 出 的 临床 过 敏 症 状 。 在 其 他 抗原 抗体 系统 ， 也 发 现 过 用 抗原 皮 试 时 呈现 专 一 的 立即 型 阳性 反应 ， 但 不 一 定 华 有 过 敏 症 状 。 上 述 各 种 初级 .次 级 和 三 级 测定 的 相互 关连 ,总 结 在 表 11-17 中 。 虽 然 用 两 种 初级 测 定 ， 所 有 人 血清 样品 都 呈 阳 性 反应 ， 但 是 次 级 测定 却 往往 呈 阴 性 反应 ; 三 级 测定 和 初级 测定 的 关系 更 为 间接 ， 同 样 不 能 提供 是 否 有 抗体 存在 的 确定 的 知识 。 既 使 在 二 级 、 三 级 反应 呈 阳 性 时 ， 这 些 测 定 结果 和 存在 的 抗体 量 之 间 也 没有 确定 的 相关 性 。 这 再 一 次 强调 说 明 ,， 次 级 反应 中 抗体 的 性 质 ， 三 级 反应 中 还 要 加 上 寄主 整体 因素 对 反应 结果 的 表现 的 重要 性 。 由 于 次 级 .三 级 反应 的 复杂 性 , 甚至 当 用 初级 反应 测 出 有 大 量 抗体 存在 时 ， 仍 不 能 用 次 级 或 三 级 方法 测 出 。 这 些 事实 提示 我 们 ， 在 研究 有 无 抗体 存在 和 测定 抗体 的 量 的 实验 中 ， 设 计 实 验 时 应 注意 采用 几 种 方法 ， 最 好 至 少 包括 一 种 初级 测定 法 。 免 疫 化 学 研 究 中 ， 抗 体 的 生物 合成 等 最 好 采用 专 一 的 免疫 吸附 剂 法 ， 半 抗原 抗体 相互 作用 的 动力 学 和 化 学 平衡 的 研究 ,多 采用 莉 光 法 。 次 级 和 三 级 反应 的 其 他 一 些 方法 ,如 血 凝 反应 ， 补 体 结合 与 PCA 反应 等 , 仍然 得 到 广泛 的 应 用 ,不 过 在 解释 结果 时 ,应 当 了 解 其 局 限 性 。 hs PON Rie SRP a 一 般 参考 书 Abramoff, P. and Lavia, M. 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(p.m) (a.m.) 胰岛 素 100% 10-" Fr im ts (Glucagon) 100% 10-" 生长 素 60% 10-" 副 甲 状 腺 激素 30 勾 10-2 ACTH 1 一 10X10-2 (Fla) Cai) (#2 Yalow & Berson, 1968), 表 2， 放 射 免疫 法 的 应 用 范围 胰岛 素 生长 素 ACTH 副 甲 状 腺 素 升 血 糖 素 TSH HCG FSH LH HCS 前 胰岛 素 Secretin MER 催产 素 血管 紧张 素 组 激 肽 甲状 腺 球 蛋 白 a-MSH 6-MSH 促 胃 该 素 FAK BR PES Ze 前 胰岛 素 C- 肽 链 PZ-CCK ( 据 Yalow 和 Berson, 1971), © 336° 蛋白 质 和 多 肽 激素 非 多 肽 激素 AE iS Aid 1) WA 2 fi i — BS bi = BF Bie Ala 2-72 06 Ail 前 列 腺 素 三 碘 甲 状 腺 素 非 激 素 类 物质 Intrinsic factor 异 羟 基 洋 地 黄 毒 苷 FURS 吗啡 环 核 苷 酸 : cAMP, cGMP cIMP ,cUMP C, Bais 葡萄 糖 -1,6- 二 磷酸 类 风湿 因子 人 [IgG 叶酸 Neurophysin TBG 尿 白 蛋 白 乙 型 肝炎 抗原 肿瘤 抗原 : CEA a-FG 1) 。 过 去 所 用 的 免疫 学 测定 法 , 显然 不 能 适应 这 方面 研究 工作 的 需要 。 从 Berson 和 Yalow (1959) 首先 报道 了 放射 免疫 测定 法 的 基本 原理 和 定量 测 定 血浆 中 胰岛 素 含 量 的 结果 以 来 , 这 一 方法 由 于 具有 专 一 性 强 、 灵敏 度 高 等 多 方面 的 优点 ， 因此 受到 很 大 的 重视 并 取得 了 很 大 的 发 展 。 目 前 已 经 建立 了 许多 种 激素 (蛋白 质 、 多 肽 、 当 体 和 前 列 腺 素 ) 和 某 些 非 激 素 的 生物 活性 物质 ( 核 背 酸 、 维 生 素 等 ) 的 放射 免疫 超人 微量 测 定 法 ,灵敏 度 达 到 毫 微克 (ng) ， 以 至 微微 克 (pg) 水 平 。 这 对 其 他 学 科 , 如 内 分 论 学 和 生殖 生理 学 等 的 发 展 起 了 很 大 的 促进 作用 ,而 且 在 临床 上 (如 妇女 正常 月 经 周期 内 和 疾病 时 激素 水 平 的 变化 ,肿瘤 和 肝炎 的 诊断 等 ) 也 得 到 越 来 越 广泛 的 应 用 ( 表 2) 。 这 里 只 打算 从 已 讲述 过 的 抗原 抗体 相互 作用 理论 来 阐明 放射 免疫 的 简单 原理 和 有 关 的 一 些 理论 问题 。 要 求 对 方法 学 作 进 一 步 的 了 解 时 , 可 参考 下 述 著作 和 综述 : Odell 和 Daughaday (1971), Berson 和 Yalow (1973), Peron 和 Caldmell (1970), Ba- gshawe (1974). (一 ) 基本 RH 放射 免疫 的 基本 诛 理 是 根据 欲 测 定 的 未 标记 抗原 (Ag) ， 对 放射 性 同位 素 标 记 的 it 原 (Ag ) 与 其 相应 的 专 一 抗体 游离 的 标记 抗原 “， 专 一 抗体 标记 的 抗原 抗体 复合 物 (Ab) 的 结合 的 竞争 性 抑制 作 Ast weal 5 5 phe Ag*-Ab Ao 在 图 工 所 示 的 反应 系统 中 ， 十 当 Ag” 和 Ab 的 含量 保持 恒 Ag 未 标记 抗原 定 ， 则 标记 的 抗原 抗体 复合 物 Sa aaa (Ag*-Ab) 的 形成 量 是 受 未 标记 Ag -Ab 未 标记 抗原 抗体 复合 物 抗原 (Ag) 的 量 制约 的 。 如 欲 测 1 放射 免疫 法 根据 的 竞争 结合 反应 。 定 的 未 标记 抗原 的 量 减少 , Ag -Ab 复合 物 的 形成 量 就 增多 ; 反之 , 如 Ag 含量 增多 ， 则 Ag `-Ab 复 合 物 形 成 量 就 减少 。 也 就 是 说 ，Ag*-Ab 复合 物 形 成 量 是 Ag 含量 的 函数 。 因此 ,从 Ag -Ab 复合 物 形成 量 , 就 能 够 推算 出 欲 测 的 Ag Gi. Ag*-Ab 复合 物 可 用 不 同方 法 从 上 述 反 应 系统 中 分 离 出 来 (参看 第 十 一 章 323 页 ) ,测定 其 放射 性 强度 。 由 于 标 记 的 放射 性 复合 物 可 极为 灵敏 地 测定 出 来 〈 特 别 是 采用 流体 闪烁 计数 器 时 )， 因 而 大 大 提高 了 这 一 方法 的 灵敏 度 。 目 前 利用 放射 免疫 法 对 血清 中 激素 含量 的 测定 达到 ng-pg 水 Fo Ag -Ab 复合 物 和 Ag 间 的 特定 函数 关系 可 用 图 示 法 (“ 标 准 曲线 ”) 表示 。 为 方便 起 见 , 制 定 “ 标 准 曲线 ?时 , 通常 用 结合 的 和 游离 的 标记 抗原 的 比值 也 / 严 值 来 表示 剂量 反应 KA HH, B= 和 抗体 结合 的 标记 抗原 浓度 ， 忆 = 游离 的 (未 结合 的 ) 标记 抗原 浓度 , 并 假定 b 和 了 分 别 代表 结合 的 标记 抗原 和 游离 的 标记 抗原 的 比率 ,因此 b+ 了 =1。 在 图 1 所 示 的 反应 系统 中 , 当 未 标记 抗原 的 浓度 CH] 增加 时 ,Ag*-Ab 减少 ,也 就 是 说 ,结合 的 标记 抗原 的 比率 (b) 降低 , 而 未 结合 的 标记 抗原 的 比率 ( 力 相应 地 增高 。 因 此 ， 可 以 用 BF， bf， K1/b 中 的 任 一 量 对 加 入 反应 系统 的 已 知 的 未 标记 抗原 量 [H] 作 图 ， 制 定 标准 曲线 (图 2) 。 未 知 样品 内 的 激素 或 其 他 欲 测定 的 抗原 量 , 可 根据 实验 操作 中 分 离 结 合 的 和 游离 抗原 后 , 实际 测量 得 到 的 标记 抗原 的 结合 程度 (以 BF, b, f, R1/b 表示 )， * 337 。 从 相应 的 标准 曲线 上 查 出 。 如 图 2， 人 胰岛 素 测 定 系统 中 , 如 某 一 未 知 血清 样品 ， 实 测 的 B/F=0.82, K\ B/F 对 互 作 图 的 标 准 曲线 上 可 查 出 该 未 知 样品 之 胰岛 素 含量 为 0.1 毫 微克 /毫升 。 同 理 * 若 用 f.b,1/b Rm, MAMA eee Rte 可 得 出 同样 的 结果 。 由 于 放射 免疫 所 a 4 测量 的 是 结合 的 和 游离 的 标记 抗原 的 人 放射 性 的 比值 (B /PE)， 因 此 实际 操作 uf O10 ME/SA ”中 由 于 吸 量 而 产生 的 误差 不 会 影响 实 sie atti 。 验 的 结果 ， 因 而 增加 了 测定 的 精密 0.9 度 。 7) ea (=) 几 个 理论 问题 Le £ = 0.54 。 WERE 对 于 放射 免疫 测定 的 灵敏 度 = 0.14( 毫 微克 /毫升 》 (Sensitivity)、 精 密度 (Precision) 和 专 一 性 (Specificity), FUMIO 质 有 决定 性 影响 。 这 要 求 抗 血清 有 适 当 的 效 价 、 专 一 性 和 亲 合 力 。 一 个 抗 血 pore am 95 0H ， 清 中 的 专 一 抗体 含量 ， 及 其 对 抗原 的 人 胰岛 素 浓度 毫 微克 /毫升 亲 合 力 的 大 小 ， 在 不 同 的 免疫 动物 之 图 2 ee eee '], SHEMMAES, HEB 体 在 免疫 过 程 中 也 有 变化 。 因 此 ， 应 当 挑选 最 适合 的 抗 血清。 通常 这 是 通过 抗 血清 最 适 稀有 释 度 的 滴定 来 选择 的 。 品质 好 的 抗 血 清 经 过 适当 稀 释 后 ， 在 有 微量 标记 抗原 存在 的 条 件 下 ， 其 B 人 ER 比值 在 0.5 一 1.0 时 ,标准 曲线 的 斜率 最 大 , 亦 即 灵敏 度 最 高 。 目 前 还 没有 制备 品质 好 的 抗 血 清 的 完全 可 靠 的 方法 。 最 好 的 办 法 仍然 是 多 免疫 一 些 动物 ， 从 其 中 进行 挑选 。 方 法 的 专 一 性 ,可 靠 性 灵敏 度 和 精密 度 也 主 要 靠 实验 验证 。 然 而 ,下 述 理论 方面 的 了 解 对 于 进行 这 些 实验 工作 是 有 一 定 的 指导 意义 的 。 胰岛 素 浓度 ， 王 0.10 毫 微克 /毫升 b 0.1 0.1 1. 专 一 性 概念 在 一 个 放射 免疫 测定 系统 内 , 如 下 图 所 示 : Ab, > H, Ab, - H, Ab, - Hf +H, = Ab, - H, + H¥ Ab, > H, Ab, « H; 所 用 的 抗 血 清 含 有 多 种 抗体 , 包括 对 其 他 激素 或 非 激素 物质 (如 H,, H.,H,,H.) 的 抗体 , 仍然 可 以 作为 供 激素 To 的 放射 免疫 测定 的 专 一 抗 血清 ,只 要 Ab Ab,, Ab,, Abs 。 338。 AA HS 结合 (交叉 反应 ) 就行 。 因 此 ,所 谓 专 一 性 是 指 H MAS 对 相应 抗体 Abs 竞争 结 合 的 专 一 性 ， 而 不 依赖 于 此 抗 血清 是 否 为 有 “ 单 专 一 性 ?的 (mono-specific) 抗 血清 。 这 一 抗 血清 所 含 的 各 种 抗体 , 如 能 与 Hi, H, HH 和 相应 的 标记 抗原 各 自 专 一 地 竞 争 结 合 , 也 可 能 作为 这 些 抗原 的 专 一 的 测定 系统 。 反之 ,如 一 放射 免疫 测定 系统 中 ,如 下 图 所 示 : +H, = Ab, - H, + H} Ab, . H# +H, => Ab, . H, + H¥ +H, == Ab, - H, +H; 其 中 抗 血 清 只 含有 一 种 抗体 〈Abs)， 也 不 能 作为 一 个 专 一 的 测定 系统 ,因为 Abs 和 H;# 的 结合 不 仅 受到 未 标记 的 He 竞争 ,而 且 还 受 未 标记 的 HH, 竞争 。 在 这 一 系统 中 ， 即使 具有 一 种 抗 WH Hk (Abs:) 存在 ,仍然 不 是 专 一 的 。 实践 上 ,一 个 放射 免疫 测定 系统 的 专 一 性 首先 决定 于 所 测 抗原 和 其 他 抗原 之 间 有 无 交叉 反应 。 如 HCG 测定 系统 特别 要 注意 和 FSH, LH, TSH 的 交叉 反应 , 因为 这 些 激 素 分 子 的 “ 亚 基 存在 交叉 反应 的 决定 簇 〈 参 看 第 一 章 60 页 ) 。 至 于 抗 血 清 所 含 抗体 是 否 是 单一 的 ,并 不 重要 , 因此 不 需要 高 度 纯化 ,相应 地 免疫 原 也 不 一 定 需要 高 度 纯化 。 一 般 说 来 ,血清 样品 无 需 分 离 就 可 直接 作 测定 。 当 体 激 素 的 放射 免疫 测定 , 目前 还 很 难得 到 绝对 专 一 的 (无 交叉 反应 的 ) 抗 血清 ,因此 血清 样品 在 测定 前 还 需 用 简便 的 方法 进行 初步 分 离 。 2. 最 大 灵敏 度 与 最 大 精密 度 的 条 件 假定 标记 和 未 标记 抗原 分 子 在 反应 系统 中 的 行为 是 相同 的 , 均 遵 守 质 量 作用 定律 ,并 且 为 均一 的 单价 抗原 和 均一 的 抗体 结合 位 点 之 间 的 双 分 子 反 应 , 则 测定 系统 中 的 基 本 反 应 如 下 式 所 示 : K [Ag] +(Ab]———[Ag (1) 《未 结 At) RE BUR) K’ 绕 合 的 抗原 ) 并 设 了 = 未 结合 抗原 [Ag] ete = 结合 的 抗原 CAg: Ab] 的 克 分 子 浓 度 Att REE EG A DUA ES AL AZ FRE [Ab"] = 全 部 抗体 结合 位 点 之 总 克 分 子 浓度 =[Ab]j+L[Ag。Ab]j] 则 (1) 式 的 平衡 常数 ( 即 亲 合力 常数 ) = B di B K' [Ag][Ab] F(LAb°]-[Ag+Ab]) F([Ab‘°]-B) 移 项 可 得 到 = K(LAb°] —B) (2) 如 设 CH) = 抗原 的 总 浓度 = 结合 抗原 的 比率 按 定 义 则 B=b[H] * 3396 B b eee = RT Ai Of sags eA Shy wae 8), (2a) 从 Qa) 可 见 , 当 结合 抗原 浓度 B=b(H] IN, B/F 就 减少 。 但 是 ,如 果 OCH] 比 [Ab ] 小 得 太 多 ,对 于 同样 的 [五 ] OM, BF 的 减少 就 很 难 测 出 。 因 此 ， 要 求 所 用 的 抗 血 清高 度 稀释 , 以 减少 抗体 结合 位 点 总 浓度 [LAb"] BBDA CA] 大 得 太 多 的 程度 (免疫 血清 内 抗体 浓度 通常 在 0.1 一 2 毫克 /毫升 。 若 以 2 毫克 /毫升 计算 ， 抗 体 结合 位 点 的 总 死 分 子 浓度 应 为 24.04M， 而 血清 中 激素 的 浓度 仅 有 1 一 100x10”“M。 这 就 是 抗 血 清 必 须 高 度 稀 杰 的 原因 ) 。 实 际 操 作 时 ,通常 是 选择 在 没有 加 未 标记 抗原 , 只 有 微 量 标 记 抗 原 存 在 的 条 件 下 ，B/R=1.0 〈 即 50% 标记 抗原 结合 ) 时 的 血清 稀释 度 , 作为 最 适 稀释 度 。 如 微量 标记 抗原 的 浓度 极 低 , Aims AeA, BCH] 一 0。 因此 (2a) 可 简 化 为 : 1 < K[Ab*] Fé. WAR RIL is EE EE BEE, (fe LAD] =(HI], HEMRBA BIF=1 条 件 时 ,就 必须 满足 下 述 条 件 1 < K(H RS 4s 1 CH] xX rH] 在 上 述 选择 条 件 下 ， 抗 原 (激素 ) 浓度 为 [BE]， 可 以 证 明 , 如 果 oe 则 B/F 比值 将 降低 约 37.5% ， 而 此 K 值 若 再 减 小 10 BUF 比值 就 只 降低 5% 了 。 因此 ,对 于 任何 一 个 抗 血清 存在 一 个 内 在 的 灵敏 度 的 限制 ,这 主要 依赖 于 该 抗 血清 中 主要 的 专 一 抗体 之 亲 合 力 常数 玉 的 值 。 如 人 抗 牛 胰岛 素 抗 血清 之 最 高 玉 值 =10 Hla FT, 此 ,最 好 的 这 种 抗 血 清 所 能 测定 的 浓度 极限 为 10”M。 (1) 最 大 灵敏 度 的 条 件 按照 Berson 和 Yalow (1971)， 放 射 免疫 测定 的 灵敏 度 可 定义 为 剂量 反应 曲 线 (bb 对 [H]) 的 斜率 。 若 用 函数 O=f(CH]) 表示 此 曲线 时 ， 函 数 b 的 导数 dans 表示 曲线 的 斜率 。 按 此 定义 ， 最 大 灵敏 度 的 条 件 ， 也 就 是 该 曲线 的 最 大 斜率 ， 或 二 qc 为 最 大 值 时 的 条 件 。 从 (2a) 式 两 侧 微分 ， 简化 后 得 出 : 过 相册 (3) d(H] 1+K[{H](1 -b)? 从 (3) 式 可 见 , 对 任 一 b 值 , 当 CH]>0 时 ,斜率 b' =db/dlH] 可 能 趋向 一 个 最 大 值 。 为 了 求 出 最 大 灵敏 度 的 条 件 , 当 (CH]>0 时 ,可 使 (3) 式 右 侧 的 导数 =0。 由 此 得 到 d - — [ —Kb(1 —-—}b)*] =0 db - 1 -K(1-b)?+2Kb(1—b) =0 简化 后 得 出 « 340 。 3b?— 4b +1=0 (4) 解 (4) 式 起 二 12 b=1/3 Mm 1 4 b=1/3 时 ,有 一 最 大 值 ，b =1 时 ,有 最 小 值 。 因 此 ,对 于 任 一 b fe, (H)>0, 灵敏 度 趋 向 于 最 大 值 ; 而 在 =113 时 ,也 就 是 当 gps Sax d[H] 27 WH RRERK. BZ, RAE K MK 决定 的 。 设 实验 条 件 下 所 能 测 的 激 素 的 最 小 浓度 为 AH, 在 上 述 最 适 条 件 下 ,， 即 [五 ]-0， =1/3 时 , 若 所 用 抗 血清 的 亲 合 力 常数 民 =10” 升 / 克 分 子 。 则 由 Ba 可 得 出 AH = av /(=4%) = 0.02 /(0.148 x 10'2) =1.35 x 10-13( 克 分 子 / 升 ) (3a) (2) 景 大 精密 度 的 条 件 如 一 激素 浓度 为 [6] ,其 测定 的 绝对 测 不 准 度 为 A[LH]， 则 该 测定 的 相对 测 不 准 度 应 为 AU) 求 最 大 精密 度 的 条 件 ， 就 是 求 对 于 一 定 的 剂量 反应 变化 Ab， 相 对 测 不 [H] 准 度 有 最 小 值 的 条 件 。 由 此 , 可 以 把 精密 度 定 义 为 rie ， 并 求 出 此 函数 有 最 大 值 的 Can) 条 件 。 Fa (3) 式 乘 CHI, ui _db _ -bKLH](1-6)? _ -b pss TY [LH] BE) (i a) 对 于 一 定 的 值 , 当 CH] 增加 时 , eee the, KCH](1-b)? >1 时 ， 达 到 最 大 值 。 此 时 db =-b (tH) (6) [CH] 或 由 (6) 式 积分 ,得 到 lnb =In[Ab°] - ln[ 五 ] (7) 因此 ,理论 上 最 大 精密 度 在 必 [HE](1-b)2 >1 条 件 下 ,和 下 也 就 是 对 所 有 抗体 都 是 一 样 的 。 其 次 ,还 可 以 证 明 后 一 条 件 表 明 K[Ab°] 尼 T= 因此 ,最 大 精密 度 要 求 闹 体 和 激素 的 浓度 都 相当 高 ,这 些 都 是 和 最 大 灵 铀 度 不 同 的 后 二 K 的 函数 ,并 在 [8] 一 0 的 条 件 下 得 到 的 。 虽 然 如 此 ,但 从 最 大 精密 度 的 条 件 KCH](1-b)? >1, 5 可 看 出 , 对 于 得 到 一 定 的 精密 度 ，K 值 愈 高 ,所 需 的 CH] 浓度 愈 小 。 3. 亲 合 常数 的 估计 由 上 述 已 知 , 最 大 灵敏 度 依赖 于 亲 合 力 常 数 K, 为 了 选择 最 合用 的 抗 血清 和 确定 放 sa。 341 。 _ 一 | 9 1h! } 平均 斜率 <---)= 一 1.87 ih 4 K = 1.87 X 10M" 去 | 7 二 m6 4a “Ta 8 ， rae Row ieA)=T— 8 i = 0 Ld 本 = = See = 0.575 X 107M 3 = 1 AR x F(50% fam) 0.575 x 107” i = 1.7 X 107 1 i 23 £ 5S 6 7 = ieee 05 1 :2 3 4 Xx 107M Digoxin FREE WREH (总 量 ) (1) 图 3 SBRAMASE (Digoxin) 抗 血清 之 平均 亲 合 At 蜡 羟 洋 地黄 毒 昔 抗 血清 之 平均 亲人 合力 Vig K OR CARE). K = 1.87X10°F- /HA FT. 常数 玉 估 测 之 饱和 曲线 射 免疫 的 最 适 条 件 , 需 要 测定 抗 血清 的 平均 亲 合 力 常 数 。 在 第 五 章 已 介绍 过 的 K 值 的 精 确 测定 方法 ,或 者 手续 过 于 繁复 ,或 者 对 某 些 系统 不 适用 。 这 里 介绍 两 种 简便 的 方法 ， 也 能 估计 出 足够 精确 的 K 值 。 (1) 图 解法 (Scatchard plot) (Berson & Yalow, 1959) 7 ERRREN HIMBA, MACHR S HS, 使 抗体 饱和 。 以 BIF 值 对 结合 抗原 量 B 作 图 (图 3) 。 如 抗体 所 有 结合 位 点 的 亲 合 力 是 均一 的 , 则 应 得 到 一 直线 ,其 斜率 SYT-K. Am, 由 于 抗体 亲 合 力 的 不 均一 性 ， 实 际 上 常 呈 一 曲线 。 此 方法 的 另 一 优点 ， 还 可 以 根据 直线 在 横 轴 上 的 截 距 , 估计 抗体 结合 部 位 的 浓度 。 (2) 饱和 法 (Saturation method) (Odell ¥, 1969) 此 方法 的 原理 是 仿照 酶 反应 的 Michaelis 常数 测定 法 。 对 于 一 定 的 酶 反应 系统 : yh E+S=~— E:S P+E K, K, 按 定义 ，Michaelis 常数 = tks, K, : 可 用 酶 ( 卫 ) 被 底 物 (S) 50% ta 和 时 之 底 物 浓度 的 倒数 来 表示 。 在 抗原 抗体 反应 系统 中 ， 开 * =0。 因此 ,对 于 供 放 射 免疫 测定 的 抗 血清 的 饱和 曲线 ， 表 3 一 些 放 射 免 疫 抗 血清 的 平均 亲 合 力 常数 K, 抗 -HTSH 310° 抗 -HCG 1.2 10° i-E, 2.8% 10° 抗 -P 2.9X10，” 三 ~1.0 x10? 有 ( 据 W.D Odell 1971), © 342 。 当 50% 饱和 时 ,游离 抗原 的 浓度 的 倒数 , 就 等 于 该 系统 的 平均 亲 合 力 常数 K (图 4) 。 从 以 上 两 图 可 看 出 , 两 种 方法 得 到 的 异 羟基 洋 地 黄 毒 背 抗 血 清 的 平均 亲 合力 常数 是 相近 的 。 用 这 些 方法 测定 的 一 些 放射 免疫 抗 血 请 之 平均 玉 , 值 见 表 。 4. 抗 血 清 的 制备 和 选择 放射 免疫 的 抗 血清 要 求 有 适当 的 效 价 、 很 高 的 专 一 性 和 亲 合 力 。 由 于 灵敏 度 的 限制 因素 是 抗体 的 亲 合 力 常数 K 值 的 大 小 , 供 放射 免疫 用 的 抗 血清 的 制备 中 ， 首 先 应 注意 提 高 专 一 抗体 的 亲人 合力 。 然 而 ,实际 工作 中 遇 到 的 困难 是 ,即使 用 同一 个 纯化 的 抗原 ， 相 同 的 免疫 程序 进行 免疫 ， 不 同 的 个 体 之 间 抗 体 的 6 亲 合 力也 有 很 大 的 差异 ， 并 且 同 一 个 体 免疫 过 程 中 ， 随 注射 抗原 次 数 和 免疫 时 间 长 短 不 同 ， K 值 也 有 变化 。 因 此 ,目前 最 好 的 办 法 仍然 是 4 多 免疫 一 些 动物 , 从 其 中 选择 最 适用 的 抗 血 清 。 § Hs Soa 通常 采用 的 方法 是 ， 免 疫 过 程 中 每 次 放血 得 到 的 样品 , 作 一 系列 稀 释 ,加 微量 的 标记 抗原 (Ag*) 保温 ， 通 过 测定 得 到 一 系列 的 剂量 反应 曲线 (图 5) 。 这 些 资料 对 于 推测 得 到 最 高 效 价 的 抗 血 清 所 需 的 注射 次 数 和 总 抗原 剂量 是 有 参考 价值 的 。 同时 也 可 用 于 最 后 作 放 射 免疫 测 定 时 ,选择 抗 血 请 景 天 稀释 度 的 参考 。 TEES 放量 反应 曲线 。 RIL ROH LAL B/F=1 ( 即 50% Ag* 被 结合 ) 时 的 稀释 度 *。 对 结合 的 标记 抗原 与 未 标记 抗原 之 比值 《B/E) 在 这 一 条 件 下 ， 测 定 的 灵敏 度 和 精密 度 可 达 最 rt? Bee oe 适 比 例 。 今 举 抗 人 RSH 血 清 为 例 ， 说 明 抗 血清 的 制备 和 选择 的 一 些 经 验 (Odell 和 Hescox，1971) 。 FARR BBEKR (HESH) 对 新 西 兰 品 系 的 家 免 进 行 免疫 。 免疫 程序 是 用 5.0 国际 单位 (I.U.) 的 HFSH， 溶 于 1 毫升 生理 盐水 ,加 等 体积 的 Freund 完全 佐 剂 制 成 乳液 ,分 两 处 皮下 注射 。 如 图 6 箭头 所 示 , 每 隔 10 天 加 强 注 射 一 次 。 免疫 第 五 周 后 放 血 , 并 测定 抗 备 清 对 0.1ng ”TI-FSH 产生 50% 结合 所 需 的 稀 杰 度 。 以 稀 杰 倍 数 的 倒数 对 免疫 的 周 数 作 图 (图 6) 。 从 这 一 类 实验 可 看 出 免疫 原 的 剂量 ,注射 频率 与 抗 血 清 效 价 之 间 有 几 点 值得 注意 的 关系 : 1) 抗原 的 总 剂量 。 抗 血清 的 效 价 在 免疫 过 程 中 随 累 积 的 抗原 剂量 增加 而 逐渐 升 高 ， 达到 一 坪 值 后 (127I. U. 时 , 效 价 为 105)， 当 抗原 剂量 继续 增加 时 , 抗 血 清 的 效 价 也 不 再 升 高 (图 7); 2) 注射 频率 。 两 次 免疫 注射 的 间隔 时 间 超 过 10 一 14 天 , 抗体 效 价 增高 的 速度 就 降 低 ( 图 8) 。 以 上 是 就 抗 血 清 的 效 价 而 论 , 然而 抗 血清 的 品质 更 应 当 注 意 的 是 有 特别 高 的 HEH (K ffi). 根据 抗体 形成 的 选择 理论 , 抗原 分 子 进 入 体内 后 便 和 淋巴 球 表面 的 抗原 受 体 选 择 地 杭 血 清 稀释 度 的 倒数 ”有 的 测定 系统 选择 B/F = 0.5 一 1， 亦 可 得 到 好 的 测定 结果 。 ee 343 * 免疫 二 105 HFSH 5.0 国际 单位 _ oO > _ 抗 血清 最 后 稀释 度 的 倒数 抗 血清 最 后 稀释 度 的 倒数 1.1 5.0 25.4 63.6 127 254 530 免疫 剂量 〈I.U.) 图 ” HFSH 免疫 剂量 (加 Freund 完全 佐 剂 ,每 隔 10 一 14 天 注射 一 次 ) 和 5 次 注射 后 得 到 的 效 价 之 间 的 关系 。 注射 剂量 超过 127I.u。 后 效 价 不 再 升 高 (#8 Odell 和 Hescox, 1971), 结合 ， 一 些 受 体 和 抗原 决定 得 的 适合 性 高 〈 亲 合力 高 )， 另 一 些 适 合 性 差 〈 亲 合力 低 )a A 免疫 B DY Na coms oman 636 国 际 间 位 104 最 后 稀释 度 的 倒数 8 3 组 家 免 用 63.6 国际 单位 人 FSH 免疫 的 RM. 一 组 每 隔 10 天 免疫 一 次 〈(A)。 HRA 组 先 相隔 10 天 注射 2 次 ，8 周 后 再 每 隔 10 天 进 行 第 3、 第 4、 和 第 5 次 注射 (B)。 注 意 (A) 组 比 (CB) 组 的 效 价 高 ( 气 Odell 和 Hescox, 1971) (Siskind，1970) 。 由 于 受 体 的 适合 性 主要 是 随机 分 布 的 ， 高 亲 合 力 受 体 的 数量 总 比 低 亲 合力 的 受 体 少 。 TR EX (MARA, MERE KR DAR 同 程度 地 结合 的 受 体 的 数量 依赖 于 D 的 浓度 ， 因而 也 就 依赖 于 抗原 的 总 剂量 。 因此 ， 大 量 抗 原 趋 向 于 产生 平均 亲 合 力 低 的 大 量 抗 休 〈( 效 价 高 ) ; 而 低 剂 量 趋 向 于 产生 平均 亲 合 力 高 的 小 量 抗 体 ( 效 价 低 ) 。 其 次 ,免疫 过 程 中 ， 随 免疫 时 间 的 延 长 趋向 于 逐渐 产生 亲 合 力 愈 来 愈 高 的 抗体 ， 并 且 两 次 免疫 间隔 时 间 愈 长 ， 最 后 产生 的 抗体 的 亲 合 力 愈 高 。 这 可 能 是 由 于 免疫 过 程 中 ， 有 高 亲 合 力 受 体 的 B- 淋 巴 球 逐渐 被 选择 的 结果 (Mitchison, 1972) 。 抗体 亲 合 力 随 免疫 时 程 而 逐渐 增加 ， 也 受到 抗原 剂量 的 影响 。 对 于 产生 最 大 亲 合 力 抗体 的 过 程 存在 一 个 最 适 的 剂量 ,超过 最 适 剂 量 , 抗 体 亲 合 力 开头 增加 快 , 随 即 就 缓慢 下 来 ,维持 在 一 个 较 低 的 水 平 。 如 用 DNP-BGG 免疫 家 免 时 ， 最 适 剂 量 为 0.5 毫克 , >0.5 毫克 反而 亲人 合力 降低 如 前 述 , 血浆 内 激素 ,特别 是 多 肽 激素 的 含量 极 微 , 浓度 在 1 一 100x10 一 M KFC 1)， 因 此 ,放射 免疫 抗 血清 要 求 要 有 极 高 的 亲 合 力 ( 对 于 循环 中 含量 较 大 的 激素 , MHCG, as 3446 氢 皮 质 酮 , 甲状 腺 素 等 , 亲 合 力 的 要 求 相 应 地 要 低 一 些 ) 。 Mitchison (1972) 根据 以 上 的 考虑 ,建议 在 多 肽 激素 放射 免疫 的 抗 血清 制备 中 , 如 免疫 家 免 , 最 好 用 0.1 一 5.0 毫克 激 素 的 较 粗 制品 ,加 Freund 完全 佐 剂 作 初 级 免疫 ,此 后 注射 量 还 要 减 半 。 初级 免疫 过 程 中 ,抗体 水 平缓 慢 升 高 ,6 周 时 达到 高 峰 。 加 强 注射 和 第 一 次 注射 应 相 工 较 长 时 间 , 不 应 短 于 四 周 , 此 后 也 不 应 相距 太 长 ,超过 每 一 个 月 一 次 。 每 次 加 强 注 射 后 10 天 左右 , 抗体 水 平 达到 最 大 值 , 因此 动物 应 在 第 7 一 14 天 放血 ,并 作 剂 量 反应 曲线 测定 ,检查 抗 血 清 品质 , 以 供 选 择 。 Hurn 和 London (1970) 用 实验 证 明 , 初级 免疫 和 加 强 注 射 之 间 保 持 一 段 较 长 的 休息 时 间 有 利于 提高 抗 血清 的 亲人 合力, 并 且 还 证 明 这 种 亲 合 力 高 的 抗 血 清 , 效 价 相当 低 。 这 是 和 前 述 抗体 产生 的 选择 理论 , 和 Odell 及 Hescox (1971) 实验 相 一 致 的 。 从 以 上 的 讨论 可 见 , 抗 血 清 产生 中 , 影响 效 价 ( 抗 体 的 数量 ) 和 亲 合 力 (KD 的 因素 似乎 是 矛盾 的 。 放 射 免疫 测定 中 , 抗 血 清 的 亲 合 力 是 决定 灵敏 度 的 关键 因素 。 不 过 效 价 ( 最 适 稀 FE) 和 测定 的 精密 度 也 有 一 定 关系 。 因 此 ,一 个 好 的 供 放 射 免疫 的 抗 血清 首先 应 具备 足 够 高 的 平均 亲 合 力 ( 开 值 ) (适合 于 欲 测 激素 血清 中 浓度 ,浓度 愈 低 要 求 K 值 愈 高 ) ,同时 也 应 有 适当 的 效 价 , 使 测定 的 灵敏 度 和 精密 度 达到 最 适 的 配合 。 为 了 达到 这 一 要 求 , 目前 最 可 靠 的 办 法 仍然 是 根据 上 述 的 理论 原则 ,多 免疫 一 些 动 物 , 从 中 挑选 最 适合 的 抗 血 清 。 不 过 也 积累 了 一 些 可 供 参 考 的 经 验 。 产 生 抗 体 的 动物 最 好 用 非 纯 系 动物 , 以 免 遇 到 对 一 定 抗原 反应 能 力 低 的 纯 系 。 对 于 人 类 多 肽 激素 ,一 般 说 来 豚鼠 比 家 免 能 产生 更 好 的 抗体 。 其 次 , 较 粗 的 激素 制品 和 高 度 纯化 的 制品 作 免 疫 原 都 能 得 到 成 功 , 有 时 粗 制 品 反而 能 产生 亲 合 力 更 高 的 抗体 。 关 于 注射 途径 ,过 去 一 般 是 用 抗原 乳液 皮下 或 肌肉 内 注射 。 近 来 ,为 了 节省 稀少 的 抗原 ， 有 人 改 用 淋巴 结 内 注射 〈 肋 淋巴结) ， 有 时 也 能 得 到 满意 的 结果 (Boyd 和 Peart，1968) 。 更 易 掌 握 的 方法 是 多 点 皮 内 注射 ,在 遍及 全 身 相 当 大 的 面积 ， 上 ,分 许多 点 (多 于 40 点 ) 作 皮 内 注射 (Vaitukaitis 等 , 1971) 。 经 过 这 样 一 次 注射 后 ， 抗体 产生 迅速 达到 高 峰 , 无 需 再 作 第 二 次 加 强 注 射 。 因 此 , 这 一 方法 被 认为 是 能 在 较 短 时 闻 内 了 迅速 产生 抗体 , 并 节省 抗原 的 好 方法 。 总 之 ,为 了 制备 亲 合 力 最 高 的 供 放射 免疫 用 的 抗 血清 , 应 掌握 的 要 点 是 免疫 原 的 量 应 减少 到 最 低 有 效 剂 量 (一 般 说 来 , 100 微克 纯 免 疫 原 就 足够 了 , 粗 制 品 可 酌 量 增加 ) ， 而 两 次 注射 间隔 时 间 尽 可 能 延长 。 最 好 的 办 法 是 低 剂 量 多 点 注射 (Hurn，1974) 。 (=) eo 放射 免疫 测定 ,由 于 有 很 高 的 灵敏 度 和 专 一 性 , AD WS A Ee El 广泛 的 应 用 。 近 年 来 ,在 国外 随 着 测定 方法 的 自动 化 和 成 套 试剂 的 供应 ,为 临床 上 的 应 用 更 加 提供 了 方便 。 在 设备 完善 的 化 验 室 一 个 技术 员 每 周 能 够 测定 几 千 个 样品 。 在 国内 ， ACG 和 肿瘤 相关 抗原 ( 甲 胎 蛋 白 ) 等 的 放射 免疫 测定 也 开始 应 用 。 目 前 已 证 明 有 临床 应 用 价值 的 放射 免疫 测定 法 列 于 表 4。 现 将 其 中 几 类 择 要 叙述 如 下 ; 1. 垂体 和 胎盘 糖 蛋白 质 激素 这 一 类 的 糖 蛋 白 激 素 在 加 Freund 完全 佐 剂 时 有 足够 强 的 免疫 原 性 。 抗 血清 的 制 备 , 以 人 类 HFSH 作 代 表 , 在 前 一 节 已 叙述 过 了 。 虽 然 在 制备 抗 血清 时 可 以 用 较 粗 的 激 s。 345 。 Ri 有 俐 床 应 用 价值 的 放射 免疫 测定 方法 多 肽 和 和 蛋白质 激 素 委 体 前 叶 黄体 化 激素 (LH); WIR MAE KBR (FSH): 促 甲状 腺 激素 CTS HD; 人 生长 素 CHGH); 催乳 素 ; 促 肾上腺 皮质 激素 (ACTHD) 垂体 后 叶 精 氨 酸 一 加 压 素 (AVP) Bll AR AR 副 甲 状 腺 激素 (PTH) BE 胰岛 素 胎盘 AIBSESLE CHPL); 人 绒毛 膜 促 性 逐 激 素 〈(HCG) 其 他 血管 紧张 素 [和 II; 血管 紧张 素 原 酶 (renin); 促 胃液 素 Cgastrin) 其 他 多 肽 和 蛋白质 血浆 蛋白 IgE; 纤维 蛋白 原 ;其 他 血 凝 因子 微生物 抗原 肝炎 相关 抗原 (HAA) 肿瘤 抗原 c- 甲 胎 蛋 白 〈c-FG); 痪 胚胎 抗原 (CEA) “ i 原 激素 FRIAR BR 甲状 腺 素 〈T,); 三 碘 甲 腺 氨 酸 (TS) 肾上腺 皮质 醇 :去 氧 皮质 酮 ; 醛 当 柄 ARAB SA: A & PEE 前 列 腺 素 PGF,,, PGE; 其 他 半 抗 原 药物 | 异 羟基 洋 地 黄 毒 苷 ;吗啡 ;二 苯 基 海 因 其 他 叶酸 ; 环 状 AMP; 维生素 Ba，D ” 素 制品 作为 免疫 原 , 但 是 在 放射 免疫 测定 系统 中 ,用 于 同位 素 标记 的 标准 抗原 则 要 求 是 高 度 纯化 的 抗原 (至 少 90 % 以 上 的 纯度 ) 。 对 于 像 人 类 垂体 激素 (如 HFSH) 这 样 稀少 的 材 料 ,很 难得 到 足够 量 的 高 度 纯化 的 抗原 。 为 了 节省 材料 起 见 , 也 有 人 采用 先 标记 部 分 纯化 的 抗原 (HEFSH) ， 然 后 再 用 此 标记 物 进行 最 后 几 步 的 纯化 (Franchimont，1966)。 有 一 些 蛋白 质 激 素 抗原 虽然 在 化 学 性 质 上 不 均一 , 而 在 抗原 性 上 是 均一 的 。 例 如 人 类 生长 激素 (HGH) 在 提取 过 程 中 易于 脱 氮 基 而 产生 理化 性 质 略 有 不 同 的 分 子 , 而 抗原 性 却 无 改变 。 此 时 , 也 不 妨 直接 用 这 种 免疫 学 上 纯 的 抗原 作为 标记 抗原 (Berson and Yalow, 1966) 。 建立 垂体 糖 蛋白 激素 (LH, FSH, TSH) 放射 免疫 测定 的 主要 困难 ,除了 不 易 得 到 足 够 量 的 纯化 抗原 以 外 , 还 在 于 这 些 激 素 之 间 , 以 及 和 胎盘 绒毛 膜 促 性 腺 激素 (HCG) 之 间 由 于 结构 上 的 相似 而 存在 着 免疫 学 上 的 交叉 反应 。 近 来 关于 这 些 激素 亚 基 结 构 的 知识 方 面 取得 的 进展 ,为 放射 免疫 方法 学 上 的 改进 提供 了 理论 基础 (参看 第 一 章 60 页 ) 。 LH, FSH, TSH 和 HCG 都 是 由 «, 6 两 个 含 酷 的 亚 基 组 成 的 。 所 有 这 些 激素 的 x- 亚 基 的 化 学 结构 和 抗原 性 都 很 相似 ， 这 可 能 是 它们 之 间 在 免疫 学 上 交叉 反应 的 主要 原 因 。 各 种 激素 的 6- 亚 基 则 彼此 不 同 ， 各 具有 生物 学 上 和 免疫 学 上 的 专 一 性 。 用 不 同 的 8- 亚 基 免疫 时 , 可 以 得 到 不 同 的 专 一 的 抗 血 清 (Pierce, 1971; Amir, 1972; Rabinowitz 等 ,1973) 。 因此 , 可 以 利用 各 种 激素 的 6- 亚 基 作 免疫 原 , 建立 更 为 专 一 的 测定 法 。 由 于 比较 纯 的 HCG 较 易 制备 , 同时 不 含有 垂体 糖 蛋 白 ，LH 的 放射 免疫 测定 过 去 是 利用 LH 和 抗 HCG 血清 之 间 的 交叉 反应 (Midgley, 1966; Saxena 等 , 1968) 。 这 - 346 。 ee ee: ee rw ae 种 方法 自然 无 法 区 分 血清 中 的 LH 和 HCG, 近年 来 , 用 LH-p 亚 基 制 备 的 抗 血 清 能 够 区 分 LH 和 HCG (这 两 种 激素 的 抑制 曲线 的 斜率 的 差别 在 统计 学 上 是 有 意义 的 ) 。 这 种 抗 血 清 经 适当 吸收 后 ,在 有 HCG 存在 的 条 件 下 , 可 用 于 血清 中 LH 的 测定 (Vaitu- kaitis 等 ,1972b) 。 另 一 方面 ，HCG-5 亚 基 的 专 一 抗 血清 能 在 有 生理 量 的 LH 存在 条 件 下 ,区 别 地 测定 HCG, 并 且 灵 敏 度 也 有 显著 提高 (Ross 等 ，1972a) 。 因此 ， 这 种 改进 了 的 方法 可 以 应 用 到 滋养 层 细 胞 疾病 治疗 过 程 中 血清 HCG 微量 变化 的 测定 (Bra- unstein 等 , 1973; Tashjian 等 ,1973) 。 人 类 FSH 比 LH 更 难得 到 足够 量 的 纯化 抗原 ,并 且 和 HCG, LH, TSH 有 交叉 反应 。 专 一 的 抗 HFSH 血清 的 制备 是 相当 困难 的 。 如 前 一 节 所 述 , 通 常 是 采用 HFSH 免疫 家 免 , 得 到 的 抗 血 清 再 经 过 HCG 吸收 的 方法 `(Odell 和 Hescox, 1972). 直到 最 近 才 有 人 用 少量 高 度 纯 化 的 HRFS 瑞 ,利用 "“ 低 剂量 多 点 注射 法 ?得 到 无 需 吸收 的 专 一 的 抗 HFSH 血清 (Butt，1974) 。 为 了 减少 不 易 得 到 纯化 HEFSH 的 困难 和 提高 专 一 性 ， 有 人 建立 了 “异种 测定 系统 ”(Midgley，1971; Hendrick 等 ，1971) ， 即 用 一 物种 的 激 素 ( 如 羊 FSH) 的 抗 血清 来 测定 另 一 物种 的 同一 种 激素 (如 人 BBSH)， 结 果 测 定 专 一 性 有 所 提高 。 如 像 原来 的 羊 FSH 标记 抗原 和 抗 羊 RSH 血清 测定 系统 ， 与 羊 LH 和 TSH 都 有 相当 程度 的 交叉 反应 , 以 致 不 能 作为 有 效 的 测定 方法 。 然 而 ,经 改 为 用 HFSH 标记 抗原 和 抗 羊 FS 互 血清 的 “异种 测定 系统 ”, RAGIN. ARMA FSH 的 专 一 的 测定 结果 。 AH, 也 建立 了 LH (Niswender 等 ，1968) 和 TSH (Franchimont, 1972) 的 “ 异 源 测定 系统 ?>。 这 种 专 一 性 的 提高 可 以 用 已 知 的 激素 亚 基 结构 的 知识 来 解释 。 在 FSH-6 亚 基 放 射 免疫 测定 中 , 羊 、 大 鼠 、 和 牛 的 FSH-¢ 亚 基 和 人 类 HRFSH-b WH 之 间 全 部 有 交叉 反应 ,而 在 人 类 w- 亚 基 放 射 免疫 测定 系统 中 , 这 些 物 种 的 w- 亚 基 和 人 的 © ca- 亚 基 之 间 完 全 没有 交叉 反应 。 换 句 话说 , 同一 物种 内 各 激素 之 间 的 交叉 反应 是 由 cx- 亚 基 决 定 的 ， 而 不 同 物种 间 同 一 激素 的 交叉 反应 却 是 由 _8- 亚 基 决 定 的 。“ 蜡 种 测定 系统 ” 显然 是 通过 同一 激素 之 8- 亚 基 的 种 间 交 叉 反应 起 作用 的 ,而 种 内 的 几 种 激素 间 的 交叉 反 应 则 不 能 起 作用 , 因而 自然 地 加 强 了 抗 血 清 对 该 激素 测定 的 专 一 性 。 近年 来 对 于 这 些 糖 蛋白 激素 分 子 的 多 糖 部 分 的 研究 得 到 的 知识 ， 也 有 助 于 解释 这 些 激素 的 免疫 学 活性 和 生物 学 活性 之 间 的 复杂 关系 。 HCG, FSH, LH 用 不 同方 法 提取 过 程 中 , 激素 分 子 上 的 唾 酸 可 能 有 不 同 程度 的 贿 失 。 激 素 分 子 上 唾 酸 含量 和 激素 在 血 流 内 持续 时 间 有 密切 的 关系 , 这 种 含量 的 变化 自然 会 影响 生物 测定 的 结果 。 另 一 方面 , 唾 酸 含 量 的 变化 对 放射 免疫 测定 并 无 影响 。 这 样 就 造成 了 两 种 测定 方法 得 到 的 结果 之 间 的 差 异 。 由 于 这 一 原因 ,放射 免疫 测定 结果 不 应 当 用 生物 活性 单位 表示 , 而 最 好 用 一 定 标 准 样 品 的 重量 单位 来 表示 。 尿 内 排泄 的 糖 蛋白 激素 的 测定 是 一 个 较 复 杂 的 问题 。 虽 然 由 于 妊娠 和 滋养 层 细胞 疾 病 时 尿 内 HCG 排出 量 很 大 , 通常 未 经 处 理 的 尿 就 可 进行 HCG 的 放射 免疫 测定 , 可 是 对 于 FSH 和 LH 用 未 经 处 理 的 尿 作 测定 就 不 可 靠 了 (Ryan，1969) 。 IR A HCG, LH, FSH 的 放射 免疫 测定 结果 比 生 物 测定 的 结果 偏 高 。 尿 内 游离 亚 基 的 存在 ， 各 种 处 理 尿 该 的 方法 不 同 程度 地 去 除了 亚 基 和 咋 酸 ， 都 可 能 是 造成 这 种 差别 的 原因 (Stevens, 1969; Franchimont, 1969), 此 外 ,用 尿 内 FSH 作 免 疫 原 制 备 的 未 经 吸收 的 抗 血清 ， 和 用 垂体 FSH 作 免 疫 原 制 备 的 抗 血 请 的 免疫 反应 性 也 有 不 同 , 这 也 可 能 是 一 个 影响 as。 347 。 3% (Olivieri 等 ，1974) 。 2. 多 肽 激素 由 于 分 子 量 太 小 ,多 肽 激素 即使 有 佐 剂 时 , 也 只 表现 弱 的 或 者 没有 免疫 原 性 。 为 了 制 备 适 合 放射 免疫 测定 的 抗 血 铺 , 需 要 把 多 肽 激素 当 作 一 个 半 抗 原 , 和 载体 蛋白 质 〈 如 牛 凋 清白 蛋白 ) 结 合 。 这 样 得 到 的 抗 血 清 , 经 过 载体 蛋白 质 吸收 后 ， 就 可 以 得 到 对 半 抗 原 一 一 多 肽 专 一 的 抗 血 清 。 和 常用 的 结合 剂 和 反应 方式 如 下 : | (1) 活化 蛋白 质 或 多 肽 的 游离 凌 基 形成 肽 键 的 结合 剂 1) 碳化 二 亚 胺 类 (Carbodiimides) RCOOH + C 了 :一 CH 一 N 一 C 一 N 一 (CH) 一 N+ 一 (CH3)， 碳化 三 亚 胺 [EDC = 41:- 乙 基 -3-(3- 二 甲 基 - 氨 基 丙 基 ) 碳 化 二 亚 胺 盐酸 ] H5.5 a CH,—CH,—NH— C=N—(CH, );—N,—(CH,), 2 | O ER R’—NH, O R— Ny ae + CH;—CH,—NH— © —NH—(CH,);—N,—(CH), O 其 中 ，RCOOH 和 R-NH, 代表 多 肽 或 载体 蛋白 质 。 通 过 碳化 二 亚 胺 对 RCOOH 羧基 的 活化 , 而 与 R-NH, 的 氮 基 缩合 ,形成 肽 键 。 oar 2) Semgweeh2s (Isoxazolium salts) Oo scoo + Z)=c=n—cH.—cH, 083.5 7\_b_nn—ce, 08, Ao FES SS 六 Di 志良 See 7 (K RHI A) VS : R’—NH, O VaR R—C—NHR’ 3) GEER ABA (Alkylchloroformates) (C,H,)3N >- LARK he pea AP Re CIBCF 一 异 丁 基 氧 甲 酸 ) Bit R’—NH, ER R 一 C 一 NHR' + CO, 1 1 RCOOH + CICO,C,H,—i R—-C = —COic Ey * 348 。 (2) 联接 气 基 的 结合 剂 a. —FieRA (Diisocyanates) OCN WAN pH7.5 aS nih Sea oe ( RC asd RNH—CO an A Rie Wd OCN | 3 — Se R—nH,/ OocN (TDI =H 2, 4-— Seg) Geer iRise \ R’—-NH—CO—NH” 7 \cu, b. pafttih}#t# (Halonitrobenzene) NO, NO, NO, | | - | ih FL A. _PH8.4 een” 会 R’—NH, R NAN H,0- Sa fir \/ wo, Ny ne: : R’—NH 夜 代 硝 基 葵 (DNDFB = 2, 4 二 硝 基 -1, 5- 二 氟 苯 ) c. —WhRE#g (Diimidoester) +NH +NH, +NH， +NH, R—NH, + CH,—CH,— O— C —CH,— C —CH,CH; 一 > R—NH—C—CH,— C—NHR’ R’—NH, 三 亚 胺 酯 (DEM 一 diethyl malonimidate) (3) £R2X (Diazonium Salts) Seer - rs Sele — ae \ | R—x, R’—x + N=N-€ 9K D-NEN a 4 BAR ‘~ (DBD = 二 - 重 氮 化 联 茶 胺 7 sgh Sie its id Hm x=His., Tyr., Lys. Dl cee es BUN: ta FF SG HSK I Cl HI WRA. BABS). Av 应 当 注意 , 多 肽 或 其 他 半 抗 原 连 接 到 和 蛋白质 上 的 方式 不 同 , 可 能 对 抗体 的 专 一 性 产生 不 同 影响 。 例 如 血管 紧张 素 -II、( 一 个 8 肽 ,，N 端 有 一 个 游离 的 氨基 ，C 端 有 一 个 游离 WR 基 )，* 若 用 碳化 二 亚 胺 法 时 ,结果 将 以 分 子 的 任 一 端 或 两 端 同时 和 载体 蛋白 质 连 接 。 血管 紧张 素 -II 的 这 三 种 结合 形式 将 产生 不 同 的 抗体 。 以 C 端 和 载体 蛋白 质 相 连 的 血管 紧张 素 -II 将 产生 专 一 性 针对 N 端的 抗体 。 这 些 抗体 将 会 与 血管 紧张 素 -I 发 生 广泛 的 交叉 反应 * 因 为 这 两 种 激素 的 唯一 区 别 在 于 血管 紧张 素 -I 在 C 端 9,10 位 置 多 两 个 氨基 酸 残 基 。 如 果 测 定 的 目的 是 血管 紧张 素 -II, 并 要 求 避免 血管 紧张 素 -I NTH, 这 种 连接 方式 显然 就 不 适用 了 。 如 果 改 用 一 种 连接 氮 基 的 结合 剂 , 特别 是 对 氨基 有 高 度 专 一 性 的 双 功 能 基 的 二 亚 胺 酯 ,就 可 以 避免 这 种 困难 , 而 得 到 满意 的 结果 (图 9) 。 ea 349 。 血管 紧张 素 原 (Angiotensinogen) 〈 一 种 @, 球 蛋白 ) | ses (Renin) 血管 紧张 素 -[(Angiotensin-D) (无 活性 ) H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ileu-His—Pro—Phe—His—Leu-OH 1 了 | 转化 本 血管 紧张 素 - ICAngiotensin-II) (A FE) H-Asp-Arg-Val-Tyr—Ileu—His—Pro—-Phe-OH 2 ya: —S Re NH 一 工 一 NH 一 血管 紧张 素 -I (TDI) 1 8 (1) me AKA-I 载体 蛋白 质 1 碳化 二 亚 胺 NH 一 C 一 血管 紧张 素 -I (EDC) | 8 1 (2) 血管 紧张 素 -I ere he i hla alll 图 9 MBAKA- 和 蛋白 质 连 接 方式 。 许多 情形 下 , 半 抗 原 不 能 直接 和 载体 蛋白 质 连 接 , 或 者 由 于 这 些 半 抗原 没有 能 结合 的 功能 基 , 或 者 为 了 要 得 到 专 一 性 最 高 的 抗体 , 必须 保留 这 些 基 团 不 被 取代 。 这 时 就 需要 合 成 这 些 半 抗 原 的 适当 的 衍生 物 。 对 于 当 体 激素 , 这 点 尤其 重要 ,我们 将 在 下 面 讲 到 。 目前 已 经 能 用 放射 免疫 测定 法 测定 的 多 肽 激素 主要 有 : 肠胃 道 多 肽 激素 ， 包 括 促 骨 液 素 、 胰 升 血 糖 素 、 促 胰腺 分 这 素 等 (参看 Bloom，1974 的 综述 ) ; 垂体 后 时 多 肽 激素 , 包 括 加 血压 素 、 催 产 素 和 Neurophysin 等 (参看 Chard 和 Martin, 1974 的 综述 )3 垂体 前 叶 的 促 肾 上 腺 皮质 激素 (Matsukura, S. 等 ,1971) ; 以 及 下 丘 脑 的 黄体 化 激素 释放 因 子 (LH-RF) (Jeffcoate 等 , 1974) 等 。 3. 省 体 体液 中 的 省 体 激素 (性 激素 和 肾上腺 皮质 激素 ) 种 类 繁多 , 含量 极 微 ,需要 很 灵敏 和 很 专 一 的 方法 才能 有 效 地 测定 。 Erlanger 等 (1957) 曾 初 步 建 立 了 制备 抗 当 体 血 清 的 基 本 方法 ,但 专 一 性 不 够 强 , 还 不 适用 于 当 体 激素 的 放射 免疫 测定 。 60 年 代 初 期 ，Murphy 等 (1963) 利用 一 些 天 然 蛋白 质 ( 血 浆 和 靶 组 织 蛋 白质 ) 和 某 些 当 体 专 一 结合 的 特性 , 建立 了 当 体 激素 的 蛋白 竞争 结合 测定 法 。 这 才 使 得 有 可 能 对 小 量 体 流 和 小 动物 上 进行 当 体 数 素 的 超 微量 分 析 。 近 年 来 , 抗 省 体 血 清 的 制备 方法 有 了 很 大 的 改进 , 在 专 一 性 和 亲 合 力 方 面 都 超过 了 蛋白 竞争 结合 法 。 因 此 , 目前 当 体 超 微量 分 析 的 研究 重点 又 转 到 放射 免疫 法 方面 来 了 。 当 体 激素 的 抗 血清 的 制备 方法 大 体 上 分 以 下 几 步 : (1) 符 体 -和 蛤 白质 结合 物 的 合成 基本 方法 仍然 是 按照 Erlanger “ (1957) 加 以 改进 。 由 于 当 体 激素 的 羟基 和 酮 基 © 350 。 Me .不 能 直接 和 载体 蛋白 质 形 成 有 效 的 共 价 键 , 因 此 需要 制备 当 体 的 衍生 物 ( 含 有 游离 的 羚 %) ABSA, 免 或 牛 血清 白 蛋 白 上 赖 氨 酸 的 s- 氮 基 缩 合 。 1) 省 体 衍生 物 的 制备 (i) 琥珀 酸 衍 生物 当 体 分 子 如 只 含 一 个 羟基 (如 峻 酮 , SAS) . 琥珀 酸化 可 直接 将 当 体 和 琥珀 酸 栈 加 入 到 吡啶 内 ,室温 下 保持 3 天 ,反应 就 可 完成 。 售 有 两 个 羟基 的 当 体 分 子 , 如 肉 二 醇 -178\ 了 :) ， 可 利用 3 位 的 羟基 ( 酚 ) 和 17 位 的 羟基 ( 仲 醇 ) 的 反应 能 力 不 同 ( 酚 基 较 活 泼 ) ,而 选择 地 酯 化 一 定位 置 的 羟基 。 当 在 25"C 条 件 下 ， 了 BE 和 琥珀 酸 本 在 吡啶 内 反应 5 分 钟 , 则 3 位 的 酚 羟 基 被 选择 地 酯 化 : 5 OH OH { Oo YS, N72? wero es 一 一 一 一 一 A. eet ea 4 CH Ca 了 ( N RA HO” On HO— C—(CH,),— oo ow 1 毫克 分 子 E, 3 毫克 分 子 琥珀 酸 酝 3- 雌 二 醇 单 琥珀 酸 (产量 55 一 8090) 如 果 上 述 反应 继续 进行 三 天 , 则 可 得 3,17- 了 E。 双 琥珀 酸 。 再 将 此 双 琥 珀 酸 衍生 物 在 甲醇 (碳酸 钠 ) 内 选择 地 使 3 位 的 酯 键 水 解 ,就 可 以 得 到 EL 的 17- 单 琥珀 酸 衍 生物 。 (ii) 5 (oxime) FAW AFA (O-#F) BRAS ANAK WANS Si, SSMS TED (Fu- ruyama 等 , 1970) 。 反应 如 下 式 : Rs oO Hy R, pf? C=O + H,N—O—CH,—C KOH/ZB C=N—O—CH,— C R, Nou R,7 Nou SKM (O- FE) (AZ (O-38 EDI 此 外 ,近来 还 有 人 制备 省 体 的 硫 解 衍生 物 (Thiol derivatives) 也 得 到 成 功 (Lin- dner 等 ,1972) 。 2) 省 体 衍生 物 和 蛋白 质 的 结合 反应 及 结合 位 置 当 休 衍生 物 的 游离 羧基 , 可 经 碳化 二 亚 胺 缩合 反应 而 与 白 蛋白 所 含 赖 氨 酸 的 e- 氨 基 形成 肽 键 。 此 反应 过 程 中 , 蛋白质 分 子 内 或 分 子 间 常 发 生 交叉 结合 ,产生 干扰 。 因 此 ， 常 改 用 混合 酸 栈 反 应 (Mixed anhydride reaction) (Erlanger 等 , 1957) 。 每 ab (全 C=0 二 区 分 子 载体 白 蛋白 上 结合 的 省 体 的 克 ga em 分 子 数 很 少 超过 30。 MKSTHES ADV o 数目 似乎 和 抗 血清 的 效 价 、 亲 合力 或 专 AP ite 一 性 没有 什么 关系 。 pe 许多 省 体 激素 的 功能 基 位 于 分 子 A a: LH Ho “SS (HO {HO 环 的 3 位 和 D 环 的 17 AL 初期 的 研 究 Ee ei BF EReOM aa gow in LHRH, ER MRE 。 图 10 pu sienck RRR AF-I78 之 构造 式 , 虚线 加 白质 结合 的 。 用 这 样 的 结合 物 免疫 动物 ”内 表示 和 亩 责 的 分 子 构造 不 同 的 部 分 〈 据 Niswender 和 后 得 到 的 抗 血 清 ， 其 专 一 性 是 针对 远离 RE | 分 子 结合 点 一 端的 构造 。 由 于 各 种 中 性 当 体 结构 的 大 多 数 区 别 在 C 环 或 D 环 上 的 功能 * 351。 ih — a Zid “O% 基 ( 图 10)， 因 此 17 位 结合 的 睾酮 的 抗 血 请 的 专 一 性 很 低 ， 和 许多 A^-3- 酮 当 体 发 生 广泛 的 交叉 反应 ,不 能 区 分 军 酮 \ 表 军 酮 、 雄 烯 二 酮 和 孕 酮 (Jettcoate,1971)。 同 理 , 经 17 位 结合 的 峻 二 醇 的 抗 血 请 和 其 它 在 A 环 有 酚 基 的 峻 激素 也 有 广 这 的 交叉 反应 ， 因为 它们 主要 在 17 位 存在 区 别 ( 图 11) 。 反之 ,经 过 3 位 结合 的 当 体 的 抗 血清 , 则 有 相反 的 性 质 , 能 测 出 D 环 的 差异 ,而 和 :A 环 的 差异 有 关 的 当 体 之 间 便 出 现 交 又 反应。 c 根据 上 述 发 现 ， 为 了 提高 OH Or) oH ，， 抗 血清 的 专 一 性 ， 当 体 半 抗 原 应 当 造 免 在 分 子 的 A 环 或 了 (ALB) Al | 25 HAA HOA (One) = —- RAV AL, 而 最 好 在 3 环 或 C 肉 二 酵 -178 it — 83-170 ; any OH Co FNS MRA EAR 7 ane 合 。 孕 酮 -11 位 结合 物 的 抗 血 ss or 清和 孕 酮 -3 位 结合 物 的 抗 血 ie Ra ie = 8 清 相 比 较 ， 对 孕 酮 的 专 一 性 要 All “四 种 肉 激 素 \ 拟 柄 和 孕 柄 之 结构 式 。 虚 线圈 内 表示 和 雌 二 苹 -78 fo 这 可 能 就 是 由 于 在 11 位 或 瞧 责 的 分 子 构造 的 不 同 部 分 ( 据 Niswender 和 Midgley, 1971), 结合 时 , 留 下 孕 酮 分 子 的 两 端 ， 保持 更 多 的 和 抗体 结合 的 专 一 性 结构 (Morgan 和 Cook, 1972; Youssefinejadian 4, 1972) 。 最 成 功 的 例子 是 雌 二 醇 -6 位 结合 物 ， 其 抗体 和 用 酮 或 肉 三 醇 的 交叉 反应 很 低 (只 有 1% R<1%) (Exley 等 ,1971; Jeffcoate 和 Searle, 1972; Kuss 和 Goebel, 1972; Lindner $,1972), HWE, R=B-6 位 结合 物 的 抗 血清 ， 和 败 二 醇 的 交 驻 反应 却 很 高 (>20%) (Gross 等 ，1971) 。 这 似乎 提示 , 当 体 的 抗 血 清 对 于 少 一 个 基 团 的 构造 (如 对 于 雌 三 醇 抗 血清 而 言 , 肉 二 醇 在 16 位 少 一 个 羟基 ) 要 比 多 一 个 基 团 的 构造 ， 更 不 容 易 识 别 。 (2) 抗 血 清 的 制备 和 鉴定 有 了 适当 的 省 体 -蛋白 质 结合 物 之 后 ， 按 照 前 述 的 “ 低 剂 量 多 点 注射 法 ”(Hurn， 1974) 得 到 高 效 价 的 抗 血 清 , 通常 是 没有 困难 的 。 不 过 应 注意 ,制备 抗 当 体 血清 所 需 的 时 MK. MEO 个 月 或 9 个 月 以 上 , 抗 血 清 的 效 价 和 亲 合 力 才能 达到 最 大 值 (Abraham 和 Grove，1971)。 抗 血清 的 鉴定 可 用 前 述 的 相同 方法 ( 见 343 页 ) 不 过 ， 专 一 性 的 检查 除了 结构 相似 的 那些 省 体 以 外 , 还 应 当 注 意 生理 浓度 的 皮质 醇和 胆固醇 (这 两 种 物质 的 浓 度 比 所 测 的 省 体 激 素 可 能 高 近 1,000 倍 ) 的 影响 ,特别 是 未 经 层 析 纯 化 的 血清 样品 龙 其 如 此 。 此 外 ,还 要 注意 体液 中 非 专 一 因素 (如 血清 蛋白 , 尿素 等 ) 可 能 的 干扰 。 (3) 同位 素 标记 放射 免疫 测定 中 ,用 于 和 专 一 抗体 结合 的 标记 半 抗 原 通常 是 用 CH 标记 的 当 体 。 每 一 个 沼 体 分 子 最 多 能 标记 上 4 个 sH 原子 [如 1, 2, 6, 7-H) -tkE OB]. Aim, 325I 标记 比 5H 标记 具有 测试 效率 高 (一 个 I 原子 比 4 个 OH 原子 的 测试 效率 约 高 25 倍 ) Hid Bw 制备 较 简 便 等 许多 优点 。 此 外 ,有 一 些 专 一 性 很 高 的 抗 血清 ,甚至 能 区 别 OH 标记 的 和 未 标记 的 省 体 分 子 。 例 如 , 对 于 峻 二 醇 -6 位 结合 物 的 抗 血 清 ，(1，2，6，7-: 瑟 )- 峻 三 醇 的 结 合 能 力 只 有 未 标记 的 雌 二 醇 的 50% (Edwards 等 , 1974) 。 At. 若 用 AH 标记 物 时 , 测 。352。 i 4 oe. 定 的 灵敏 度 和 专 一 性 都 将 大 大 降低 。 Ail 标记 省 体 -蛋白 质 结合 物 的 研究 近来 主要 是 在 两 方面 进行 的 。 一 方面 是 用 25I 直接 标记 省 体 - 蛋 白质 结合 物 , "2sI 仅 参 人 载体 蛋白 质 ( 肉 激素 的 酚 环 也 可 能 碘 化 ) 。 此 方 法 的 主要 缺点 是 标记 物 的 可 使 用 期 太 短 。 (Jeffcoate，1971; Jeffcoate 等 , 1973) 。 另 一 种 较 好 的 方法 是 用 Il 标记 含 酷 氨 酸 甲 酯 或 组 织 胺 残 基 的 当 体 衍生 物 (Midgley 等 ， 1971; Gilby 等 ,1973) (图 12) 。 碘 化 反 应 还 可 以 在 这 些 残 基 和 省 体 结 合 以 前 就 进行 ， 如 先 用 I 标记 组 织 胺 ， 再 使 此 标记 物 与 肉 三 醇 -6=( 羧 甲 基 ) 肝 结合 (Nars 和 Hunter, Q 0° 1973); 这 样 就 可 以 避免 因 碘 化 引起 的 省 体 分 on ¢ 子 本 身 的 损伤 。 上 述 两 种 标记 物 比 较 起 来 ,组 nO as ane 1) H 织 胺 又 比 酷 氨 酸 甲 酯 要 好 。 酷 氨 酸 标记 物 较 难 制 备 , 可 使 用 时 间 也 较 短 , 而 组 织 氮 标 记 物 FIGEAR FEL. AR (Edwards 等 , 1974) 。 此 外 , 组 织 胺 标记 物 还 有 一 个 优点 , 它们 和 当 体 连接 的 空间 关系 与 当 体 和 载体 蛋白 质 连 接 的 空间 关系 是 相似 的 ;如 皖 酮 -3-:I- 组 织 胺 ， 酷 氨 酸 甲 酯 (CD 《D 组 织 胺 其 中 组 织 胺 是 通过 “ 肝 桥 > 和 尝 酮 分 子 的 3 图 12” 酷 氨 酸 衍生 物 和 组 织 胺 的 碘 标 记 物 ,其 中 相连 接 的 。 已 知 一 些 抗体 能 够 识别 委 体 -蛋白 7 TG James 和 Jeffcoate, 1974), RACDZAN BH”. 如 蛙 酮 -3 位 结合 物 的 抗 血清 不 仅 能 够 识别 塞 酮 分 子 本 身 ， 而 且 还 能 识别 与 载体 蛋白 相连 的 “ 肝 桥 > 和 白 蛋 白 的 赖 氨 酸 残 基 , 对 军 酮 . 罕 酮 肝 衍 生物 和 罕 酮 -3- 肝 - 赖 氮 酸 的 亲人 合力 常数 分 别 为 0.3，1.6 和 5.9x10?" 升 / 克 分 子 (Gilby 和 Jeff- coate, 1973)。 因 此 ， 如 用 宇 酮 -3-25I- 组 织 胺 作 标 记 物 时 ,， 它 和 专 一 的 抗 血 清 ( 竺 酮 -3- 自 蛋 白 接合 物 的 抗 血清 ) 的 亲 合 力 要 比 "也 - 诗 酮 高 。 (4) 结合 和 游离 半 抗 原 的 分 离 除 活 性 碳 吸 附 法 外 , 常 采用 固 相 法 (Abraham ff] Odell, 1970), FiRBeRWIHA 双 抗 体 法 。 (5) Bam tt eH Be 省 体 激 素 在 生物 样品 中 的 含量 极 微 , 一 般 需 要 经 过 初步 纯化 后 才能 测定 。 常 用 的 方法 有 溶剂 分 配 法 , 北 胶 过 滤 (Sephadex LH-20) 和 层 析 法 。 后 者 使 用 最 广 , 包 括 薄板 层 析 ， 柱 层 析 ( 和 硅胶 、 氧 化 银 和 Celite) 。Celite 微量 柱 层 析 (Abraham 等 ，1972) 和 Seph- adex LH-20 Sébtwt a (Murphy 等 , 1971) 的 效果 最 好 , 可 分 离 许 多 种 极 性 不 同 的 省 体 。 目前 鲁 体 激素 的 放射 免疫 测定 已 经 在 内 分 刻 学 和 生殖 生理 学 等 方面 广泛 采用 。 除 天 然 的 省 体 激 素 外 , 还 开始 用 于 合成 的 当 体 避孕 药物 ， 如 甲 孕 酮 的 测定 (Cornette, J. C. 等 ，1971)， 正 在 成 为 计划 生育 基础 研究 所 不 可 缺少 的 技术 。 最 好 的 抗 血 清 的 测定 极限 可 iA 1 一 2 微微 克 /毫升 。 这 方面 的 文献 可 参考 下 列 Diczfalusy，1970; Peron 和 Ca- ldwell，1970; Odell 和 Daughaday, 1971; James 和 Jeffcoate, 1974 的 专著 和 综 述 。 。353。 be ial 4. 肿瘤 相关 抗原 目前 已 经 证 明 , 肿 瘤 能 分 这 一 定 的 多 肽 抗原 (包括 激素 、 酶 和 其 他 抗原 ) 到 体液 中 ， 并 且 这 些 抗 原 和 肿瘤 之 间 存 在 一 定 的 相关 性 , 因而 称 为 肿瘤 相关 抗原 。 这 些 抗 原 按 其 和 该 肿 瘙 的 组 织 来 源 是 否 相合 , 又 可 分 为 “相合 性 ?抗原 (如 副 甲状 腺 瘤 产 生 副 甲 状 腺 素 ， 绒 毛 膜 上 皮 癌 产生 HCG， 如 此 等 等 ) 和 “外 位 性 ?抗原 (如 支气管 癌 能 产生 正常 支气管 组 织 所 不 能 产生 的 激素 ,包括 ACTH, FSH, TSH 和 GH， 绕 癌 产 生 TSH， 如 此 等 等 ) 。 另外 一 些 肿瘤 能 产生 “ 癌 胚 性 抗原 , 这 些 抗原 在 胎儿 期 存在 , 正常 成 体 组 织 内 消失 ， 而 在 癌变 后 又 出 现 , 因 此 称 为 “ 癌 胚 性 抗原 ,如 原 发 性 肝癌 产生 的 甲 种 胎儿 球 蛋白 (xc=FP) 和 直肠 HA“ ke DUR” (CEA), 肿瘤 相关 抗原 在 体液 中 的 含量 极 微 ,用 放射 免疫 法 定量 地 测定 这 些 抗原 , ADT 的 诊断 和 对 治疗 过 程 的 掌握 。 HCG 的 测定 在 绒毛 膜 上 皮 癌 (简称 绒 瘤 ) 上 的 应 用 是 比较 成 功 的 例子 。 HCG 放射 免疫 测定 所 能 确 诊 的 最 小 的 绒 癌 的 大 小 约 为 1 一 5 BK ( 约 10* 一 107 细胞 ) ， 这 比 其 他 诊断 方法 优 越 。 每 一 个 癌 细 胞 每 天 产生 10-sI. U. HCG, Ww TD > co Ww 400000 从 100000 8 es ==! 血浆 CEA( 毫 微克 /毫升 ) _ oO 比 , 治疗 过 程 中 连续 测定 HCG 浓度 就 可 以 反映 癌 细 胞 群生 长 或 退化 的 动态 (图 13)。 8 LR AK AA hh, HCG 浓度 的 比 ‘Vi VE 4 值 ， 还 可 以 确定 有 无 脑 转 移 以 及 在 治疗 过 4 8 12 a6 程 中 的 变化 (Bagshawe, 1969; 1974). 开始 化 疗 的 周 数 RARER HOH ee Fe Sis MEET AR NCO BARMERA COR sou Gold 实 路 宣 创 夫 的 ， 他 们 将 血清 急剧 升 高 ,然后 CEA 和 HCG 都 降低 ,同时 肿瘤 体积 相应 ”的 过 氧 酸 提 取 物 ,用 硫酸 铵 共 沉 淀 法 测定 ， Sei Be eisO- BH OT HE ARB, CEA 含量 均 比 正常 成 人 血清 有 显著 的 升 高 (Thomson 等 , 1969) 。 后 经 改 用 双 抗 林 荡 ， 血清 不 需 提 取 就 可 直接 测定 ， (了 gan 等 , 1972) 。 最 近 ， 测 定 灵 敏 度 又 有 提高 ,达到 1 一 2 微微 克 CEA /毫升 (Searle 等 , 1974) 。 4 另 一 种 “ 癌 胚 性 抗原 ”cx-FP 也 可 以 用 于 肿瘤 的 诊断 。 用 放射 免疫 法 测定 正常 成 人 血 WH, a-FP 的 浓度 极 低 (2 一 16 微微 克 /毫升 ) (Rouslahti 和 Seppalé, 1971)。 正 常 妊娠 过 程 中 ,从 第 7 个 月 开始 升 高 (Brock 和 Sutcliffe, 1972). 葡萄 胎 和 绒 癌 病 人 ,血清 中 含量 低 ， 这 也 提供 了 区 分 这 些 肿瘤 和 正常 妊娠 的 一 个 方法 (Seppala 等 ， 1972) 。 肝炎 急性 期 (HBAg fA) 儿童 肝 硬 化 和 肝 再 生 期 ,血清 中 xc-EP 均 有 暂时 升 高 。 原 发 性 肝 细 了 胞 癌 病 人 , 随 着 肿瘤 生长 ， 血 清 .wx=FP 逐渐 增加 ， 有 时 可 高 达 4000 微 克 /毫升 。 肿 瘤 切除 后 就 降低 。 可 是 , 畸 态 瘤 ,. 宇 丸 瘤 . 胃 交 的 肝 转 移 , 胆囊 癌 前列腺 瘤 和 支气管 瘤 等 肿瘤 患者 ，w-FP 也 可 能 呈 阳 性 。 虽 然 o-FP 不 是 某 一 类 肿瘤 独特 的 抗原 ， 但 对 于 原 发 性 肝癌 的 诊断 仍 有 肯定 的 价值 。 国内 应 用 a FP 放射 免疫 测定 于 原 发 性 肝 细胞 癌 的 诊断 ,提高 了 阳性 检 出 率 , 对 临床 确定 诊断 有 一 定 的 帮助 (上 海 实验 生物 研 究 所 。354 。 尿 HCGG.U.) ge HCG DWE Ia BRM 了 as 等 ,1973) 。 5. 病毒 病毒 在 体液 中 可 能 以 游离 的 或 和 抗体 结合 的 形式 存在 ,病毒 表面 的 抗原 决定 簇 又 很 复杂 , 还 可 能 吸附 寄主 抗原 参与 病毒 外 壳 的 组 成 。 这 些 情 况 增加 了 病毒 抗原 纯化 的 困难 。 直到 近 两 三 年 , 由 于 肝炎 抗原 检测 需要 的 推动 , 才 开 始 应 用 放射 免疫 法 到 病毒 抗原 和 抗体 的 检测 。 Walsh 等 (1970) 最 先 应 用 层 析 电泳 分 离 游离 抗原 和 结合 抗原 的 方法 测定 血清 中 的 乙 型 肝炎 抗原 (HBAg) ,但 所 需 时 间 太 长 (2 一 3 天 以 上 ) ,不 能 满足 血库 普查 的 需要 。 后 来 ， 有 人 改 用 双 抗 体 法 ,测定 时 间 缩 短 到 18 小 时 (Aach 等 , 1971; Coller 等 , 1971) 。 固 相 法 (Hollinger 等 , 1971) ， 和 标记 抗体 的 固 “MRK” (“Sandwich” technique) (Ling 和 Overby 1972) 的 采用 , 操作 手续 更 加 简化 ,适用 于 大 规模 普查 。 这 些 方法 略 加 改变 ,也 适用 于 抗体 的 测定 。 最 后 , 还 要 提 到 放射 免疫 测定 近来 的 一 个 发 展 趋向 是 对 小 分 子 半 抗 原 的 测定 。 对 于 各 种 小 分 子 药物 , 如 麻醉 剂 (吗啡 ,， 巴 比 吐 酸 ) 、 心 脏 糖 背 ( 洋 地 黄 毒 昔 、 蜡 羟基 洋 地 黄 毒 苷 ) ,重要 的 生物 活性 物质 , 如 前 列 腺 素 、 维 生 素 (Ds, Bi), ARARRARS WARK 愈 广泛 (参看 Marks 等 , 1974) 。 另 一 方面 ,方法 学 本 身 , 如 半 抗 原 专 一 抗 血 清 制 备 方法 的 改进 ,分 析 方 法 的 简化 和 自动 化 ,使 能 适应 临床 化 验 室 的 需要 ,也 是 正在 解决 的 问题 。 正 如 过 去 蛋白 质 . 多 肽 激素 的 放射 免疫 测定 曾经 推动 了 内 分 记 学 的 迅速 发 展 一 样 ,对 各 种 小 分 子 半 抗原 的 放射 免疫 测定 的 广泛 应 用 , 也 必 将 促进 药物 学 ,特别 是 药物 对 细胞 作用 机 制 研究 的 进展 。 总 之 ,放射 免疫 测定 是 研究 内 分 证 学 \ 生 殖 生 理学 ,微生物 学 ,药物 学 等 学 科 和 解决 计划 生育 、 肿 瘤 等 任务 的 重要 的 超 微量 分 析 工 具 , 是 值得 大 力 发 展 和 应 用 的 一 种 新 技术 。 S Sse 专著 和 综述 Berson §S, A. and Yalow. 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Storiod Biochem. 3, 893. 上 海 实 验 生物 研究 所 .瑞金 医院 (1973) 中 华 医 学 杂志 1978 F 8 HH, 163 页 。 * 356 * 第 十 二 章 。 补体 及 其 作用 的 分 子 基础 免疫 学 早期 研究 已 经 注意 到 免疫 血清 的 杀菌 和 溶 细胞 作用 。 免 疫 学 经 典 实验 中 ， 把 羊 红血球 注射 到 家 免 , 产 生 抗 羊 红血球 抗 血清 。 这 种 抗 血清 能 使 羊 红血球 凝集 ,同时 也 能 使 之 溶解 。 这 二 现象 称 为 免疫 溶 和 面 作 用 (Immune hemolysis), 有关 的 抗体 称 为 溶血 素 (Hemolysines), 这 种 抗 血 清 使 用 前 经 56°C 保温 30 DH. 便 失 去 溶血 能 力 。 但 仍然 保 持 使 羊 红 血球 凝集 的 活力 。 此 时 如 果 #1 2 管 3 再 加 大 其 他 动物 (如 豚鼠 ) 新 鲜 的 正常 “次 由 。 不 溶血 Fit 血清 ,溶血 能 力 又 可 恢复 ,而 加 过 热 的 “| PRES | | ose Em 血清 则 没有 这 种 作用 。 新 鲜血 清 中 存 | | | 十 ee 在 的 这 种 不 耐 热 的 , 非 专 一 的 成 分 ,能 多 + 补充 完成 抗体 的 作用 ， 因 此 称 为 补体 (Complement, faj#K C) 。 从 图 12-1 所 示 的 实验 , 可 以 看 出 抗体 首先 要 与 红血球 结合 ， 然 后 正常 血清 成 分 (C) 才能 发 生 作用 而 引起 盗 血 。 因 此 ， 免 疫 溶血 作用 包括 依次 进 行 的 两 个 主要 过 程 ， 和 esvasinte a SEE ALAEEARAK Cin eM) A 13 mS. A iy 和 二 各 体 (A) 一 红血球 表面 抗原 抗体 复合 物体 (正常 血清 )。 根 据 管 2.3 以 及 测定 其 上 清 液 和 沉淀 物 的 结果 ， (EA) 可 以 证 明 抗体 先 与 抗原 结合 ， 然 后 再 与 补体 作用 引起 溶血 《〈 据 抗体 和 红血球 表面 抗原 专 一 地 结 eee 合 ,而 使 细胞 致 敏 。 此 过 程 决定 溶血 作用 的 专 一 性 。 2) 溶血 过 程 : 也 A + C 一 溶血 补体 〈C) 被 细胞 表面 抗原 抗体 复合 物 固定 而 被 激活 ,导致 细胞 溶解 。 此 过 程 是 非 专 2 根据 现 有 的 知识 ,补体 系统 是 一 组 血清 蛋白 质 (包括 至 少 11 种 血清 球 蛋白 ) BRE 有 细胞 结合 的 抗原 抗体 复合 物 存在 时 被 依次 地 激活 ,形成 一 系列 的 酶 , 引起 细胞 膜 的 不 可 逆 的 变化 ,终于 造成 膜 的 完整 性 破坏 。 补 体 激 活 过 程 中 ， 产 生 许 多 具有 生物 活性 的 片段 ， 如 过 敏 毒 素 (Anaphylatoxin)， 多 形 核 白 血球 化 学 吸引 素 , 调理 素 (Opsonin) 等 。 许 多 重要 的 免疫 学 现象 ,如 免疫 粘着 (Immune-adherence)， 共 凝集 作用 (Conglutina- tion) ， 过 敏 反 应 ,正常 和 肿瘤 细胞 的 杀伤 等 ,都 有 补体 或 其 产物 参加 。 近 来 还 发 现 补体 能 产生 类 似 激 肽 作用 的 物质 , 并 参与 正常 的 凝血 机 制 。 由 于 这 些 多 种 多 样 的 作用 ,补体 具有 重要 的 生理 和 病理 的 意义 。 总 之 ,补体 作为 辅助 抗体 效应 功能 的 分 子 , 一 方面 参与 对 抗 感 染 因素 的 防御 机 制 ; 另 一 方面 ,又 是 免疫 病理 过 程 中 引起 组 织 损伤 , 炎 证 反应 和 过 敏 反 应 ° 357° 的 介 导 物质 。 本 章 讨论 补体 系统 的 特性 及 其 生物 活力 ,补体 反应 的 初级 途径 及 支 路 , 深 细 胞 作用 机 制 , 以 及 在 机 体 的 防御 机 制 和 病理 生物 学 现象 中 的 作用 。 、 血 清 补体 效 价 的 滴定 和 补体 固定 (一 ) 血清 补体 效 价 的 滴定 血清 补体 效 价 滴定 ,常用 的 标准 系统 包括 : 羊 红血球 (CE) 和 溶血 素 ,， 即 用 羊 红血球 免 疫 家 免得 到 的 抗 血 清 。 由 于 豚鼠 血清 含有 充分 多 的 各 种 补体 成 分 , 故 普遍 用 作 补 体 的 来 源 。 补 体 滴 定 前 ,溶血 素 ( 家 免 抗 羊 红血球 免 鸡 疫 血 清 ) 须 先 在 56°C 灭 活 30 一 50 分 钟 。 KR 7 和 活 的 溶血 素 应 含有 有 效 的 抗体 (人 A) ， 能 与 红 Hes (MER Ae TH ta TH EB CGB MK EA). 血清 补体 含量 ( 效 价 ) 是 用 能 引起 致 敏 的 羊 红 0.4 血球 50%% 溶血 所 需 的 补体 最 小 量 来 表示 的 ， 称 为 Coo 单位 。 溶血 程度 是 在 离心 去 除 完 好 的 红血球 "148 毫升 引 起 50% 溶 血 后 ， 用 比 色 法 测量 上 清 液 中 血红 素 的 量 来 表 和。 示 。 例 如 , 加 1 毫升 稀释 250.500 和 1000 倍 的 / 豚鼠 血清 后 , 致 敏 红血球 发 生 的 溶血 程度 分 别 为 30、50 和 75% 时 , 则 1 SAA 血清 的 补体 效 价 为 500 Case 单位 。 mR RA 血 百 分 率 对 所 用 豚鼠 血清 体积 作 图 时 ， 得 到 (0.02 .0.04 0.1 0.2 0.4 S 形 曲 线 。 此 曲线 可 用 下 述 公 式 表 示 ， log x y Yn- 图 12-2 ”豚鼠 血清 中 补体 效 价 的 测定 。 横 坐标 为 加 入 be K ( ) 100—y 5 = y 的 豚鼠 血清 体积 (毫升 ); 纵 坐标 为 log (ots) te «2 (42 Haurowitz, 1968), 其 中 ， 卫 释 豚鼠 血清 的 量 (毫升 ct cag 指数 1 儿 通 稼 条 件 下 接近 村 0.2。 450% 溶血 时 , 括 弧 内 的 一 TRA are #48 log (7) 对 lowe 作 图 ,得 到 一 条 直线 ,其 在 loge Hh LAME K, HARMS 于 lfm (图 12-2) 。 从 图 12-2 可 见 ，0.18 毫升 血清 引起 50% 湾 血 , 原 血清 1 毫升 应 为 5.6 Cs, 单位 (参看 Mayer，1961) 。 (二 ) 补体 固定 补体 不 只 是 能 与 红血球 (CE) 和 抗体 (A) 的 复合 物 结合 , 而 且 可 以 和 大 多 数 抗 原 抗 。358。 1 结果 Ke. 由 此 可 确定 Kile 体 (IgM, IgG) 复合 物 结合 。 例 如 , 抗 BSA 抗体 和 相应 的 抗原 在 新 鲜 豚 鼠 血清 中 形成 沉淀 , 除去 沉淀 后 的 上 清 液 不 能 再 使 致 敏 的 红血球 溶血 。 这 种 补体 与 抗原 抗体 复合 WA 合 而 在 溶血 系统 中 消失 的 现象 ， 称 为 补 体 固 定 (Complement fixation) 。 游 离 的 极 微量 的 补体 可 用 致 敏 的 羊 红血球 溶血 作用 测 出 。 当 补体 完全 被 另 一 抗原 抗体 复合 物 固定 后 ,就 无 溶血 作用 发 生 。 os ta 因此 ， 补 体 固定 常用 作 测 定 抗原 抗体 复 合 物 形成 的 很 灵敏 的 方法 。 其 原理 可 用 ” 简 图 12-3 表示 。 绵羊 红血球 临床 医学 检验 常用 的 一 些 方法 ， 如 梅毒 的 华氏 反应 (Wassermann reac- EIR tion) 就 是 根据 补体 固定 原理 。 这 一 方 法 也 可 用 作 其 他 抗原 的 测定 ， 其 灵敏 度 达到 1 微微 克 (10 毫克 ) (BA May- er, 1961), 补体 结合 中 的 反应 剂 补体 GA theres ZF; 介 体 ) 4 二 、 补 体系 统 各 成 分 的 特性 (—-) 化 学 性 质 和 分 子 构造 不 溶血 抗原 itn. (S38 48) 补体 系统 〈(C) BHOK ARK 图 12-3 ”和 卵 白 蛋白 补体 结合 反应 。 圆 圈 中 的 数字 表示 实验 中 ‘a ee AFF 成 所 加 反应 物 的 次 序 。 各 反应 物 的 量 应 加 调节 ,使 在 实际 实验 中 分 ,或 至 少 11 个 血清 球 蛋 白 组 成 的 ， 分 “有 卵 白 蛋白 的 抗体 时 , 不 发 生 溶血 , 反之 , MEWARA GM BPR C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8 ， 清 , 则 补体 游离 ,可 与 致 敏 红 血球 结合 ,结果 发 生 溶血 。 和 C9。 成 分 C1 至 少 又 是 由 三 个 亚 成 分 Clq，C1r，Cls 组 成 的 。 这 11 种 血 请 蛋白 质 现 已 分 离 提 纯 并 鉴定 其 功能 。 1. 补体 各 成 分 的 分 离 和 纯化 人 类 各 补体 成 分 先后 分 离 提纯 的 年 代 如 下 :Cl1q (Miiller-Eberhard ,和 Kunkel, 1961); Cir (de Bracco 和 Stroud, 1971; Vaiet 和 Cooper, 1974); Cls (Haines 和 Le- pow, 1964; Nagaki 和 Stroud, 1969); C2(Polley 和 Miiller-Eberhard, 1968); C3 (Nilson 和 Miiller-Eberhard, 1965; Molenaar “, 1973); C4 (Miiller-Eberhard 和 Biro, 1963); C5 (Nilsson 和 Miiller-Eberhard, 1965; Nilsson 4, 1972); C6 (Arroyave #] Miller-Eberhard, 1971); C7(Arroyave 和 Miiller-Eberhard,1972a), Cs (Manni 和 Miller-Eberhard, 1968); C9 (Hadding 等 , 1969) 。 近 来 ,已 成 功 地 从 同一 个 人 血清 样品 中 系统 地 分 离 出 所 有 9 种 功能 上 纯 的 补体 成 分 其 步骤 见 图 12-4 (Vroon 等 ,1970)。 利 用 这 些 纯化 的 补体 成 分 作 抗原 , 已 能 得 到 人 类 各 种 补体 成 分 的 专 一 的 抗 血清 , 因而 便 能 用 免疫 电 访 法 鉴别 它们 。 同 时 , 还 为 临床 检验 提供 了 血清 中 各 种 补体 成 分 比较 简便 的 免疫 化 学 定量 测定 方法 (Nilsson 和 Miiller-Eberhard，1965; Kohler © 359° "046I“ 苇 VOOIA)M MRI: = osu “Mige Gy Cte tik I5D) pennies pitied alt 2G Ha 21 “Tuaynoso 000r 1™_00Z ~~~ ‘ (60 ) ~~ 4 ZORA AR ype) > | oo 00Z9 xepeydags Tuu/n0sD00Z Tu/no"D000T Tua OS lur O81 (mp 27 名 W Z8T 0 一 05T"0 = OSU 一 Ta/n '"qryul05T (zo ) 站 (99 ) z 1011 aaa ya -一 、 TIuu/n "qtUuJI VI OPEL “TurcZ AMR AAW WHF MiP yw (110) = [ez/n D081 =e ae A 2 (iso ) rar O12 i al os A W 20°0=OSU a fae oe = dike chi: 1u/n%oooor MI IW (so %2) aaa 36 Tj 1-20 a 7 He 1m 085 (. 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C1 大 分 子 复 合 物 及 其 亚 成 分 的 构造 和 相互 作用 Cl 之 三 个 亚 成 分 (Clq，Clr，Ccls) ， 在 血清 Catt 离子 强度 条 件 下 ， 被 Cat+ 连 site ) 结 成 一 个 18S 复合 物 形式 存在 。 用 EDTA 处 理 去 除 Catt Ht, BAD 解 离 为 Clq, Cir,Cis WH, DT K\4> 5H 118, 78, 45. 再 加 钙 又 可 恢复 。 因 此 ， 一 般 认 为 在 生 理 条 件 下 ，Cl 复合 物 是 作为 一 个 功能 单位 起 作用 的 ， 即 通过 Clq 与 免疫 复合 物 结合 ， 引 起 亚 基 间 的 相互 作用 ,而 使 酶 原 亚 基 〈Cls) 激 图 12-5” 碱 性 1 RRR A isewtkan es Mase NAS al be sees a 7X AHS a a, EMMRAH C, 复合 物 解 离 的 3 成 分 Clq 居 上 ，clr 居 BRM. Wits 近来 发 现 纯化 的 i, Cls BF, Cy Co C, 和 C, 样品 中 常 出 现 电泳 速度 转 快 ”Clq、C1r 和 Cls 加 钙 离 子 时 形 ， 的 物质 。 由 于 和 主要 补体 成 分 在 免疫 化 学 上 有 关系 ， 这 些 物质 是 补 体 成 分 的 不 活动 转化 产物 ,这 表明 这 些 鼻 白 质 很 不 稳定 ( 据 Maller- ”成 的 大 分 子 复 合 物 ， 其 沉降 常数 只 Eberhard, 1972), 有 15—16S, 比 上 述 血 清 C1 复合 物 的 沉降 常数 小 。 这 提示 可 能 存在 另 一 个 亚 成 分 Clt。 后 来 果然 从 血清 中 分 离 出 来 ， 并 证 明 是 一 个 分 子 量 为 233,000 (9.5S) 的 on HABA 电子 显微镜 下 , 分 子 呈 五 角形 ( 直 URES ai oa ic 沉降 方向 图 12-6 密度 梯度 超 离心 法 显示 天 然 补体 蛋白 质 的 可 逆 相互 作用 。 (a) 缺 Cat+ 条 件 下 ， Clq, Clr, Cls 各 以 11S, 7S, 4S 速度 分 别 沉降 ; 有 Catt 时 ，3 种 蛋白 络 合成 一 个 18 S 复 合 物 。 (b) 无 Cs 时 ，C: 以 5.5S 速度 沉降 ; 有 C4(S = 10S), C24 C4 范围 内 沉降 。 (c) C6 和 C7 沉降 率 为 6S; 有 C5(S 一 8.7S)， 两 蛋白 质 均 在 C5 范围 内 沉降 。(d) C9 沉降 率 为 4.5S， 当 和 C8(S = 8S) 混合 时 ,沉降 速度 大 于 8S GZ Miller-Eberhard, 1972), es。 362。 径 85A) (Assimeh ff] Painter, 1975; Pinteric 等 ，1976) 。 因此 ， 该 作者 认为 Cl 是 Ciq, Cir, Cis 和 Cit 四 个 亚 成 分 的 大 分 子 复合 物 。 对 于 Cl1 激活 过 程 中 ， 各 亚 基 相 互 作 用 关系 的 看 法 自然 也 应 有 所 改变 。 不 过 ，Clt 的 存在 , 目前 尚未 得 到 普遍 承认 。 另 一 些 补体 蛋白 质 在 激活 以 前 也 表现 出 选择 的 亲 合 性 ,形成 可 逆 的 复合 物 , 如 天 然 的 C2, C4 形成 13S BAM; C5,C6 和 C7 形成 一 个 9 一 108 复合 物 。 这 些 过 程 可 以 从 超 离心 场 中 的 沉降 行为 检测 出 来 (Miiller-Eberhard，1969) (图 12-6) 。 (1) Clq 构造 特点 一 一 类 似 胶原 的 糖 肥 和 白 一 些 补 体 成 分 的 氨基 酸 组 成 已 有 报告 。 C3，C4，C5 的 氨基 酸 组 成 具有 血清 球 蛋白 的 特点 。 可 是 ,，C1q 一 一 血清 蛋白 中 碱 性 最 强 的 蛋白 质 ， 其 化 学 组 成 却 很 特别 ,含有 羟 赖 氨 酸 、 产 有 睛 氨 酸 和 大 量 甘氨酸 ;其 糖 基 团 主要 含 葡 萄 糖 和 半 乳 糖 , 并 且 葡 萄 糖 , 半 乳 糖 与 羟 赖 氨 酸 几乎 是 等 克 分 子 量 的 ( 表 12-3)。 这 种 化 学 组 成 有 些 类 似 胶原 , 而 不 象 血 清 球 蛋 白 。 #12-3 Cla 糖 蛋白 的 性 质 分 子 量 400,000 亚 基 分 子 量 67,000 PA dE PR Jow/w fi 2a 5.4 HAR 10.0 OH- 赖 氨 酸 2.0 OH fifi Sa Be 4.9 BE Jow|w 中 性 已 糖 8.5 4 Aa Pe | > FLAS 2.7 (4 Calcott 和 Miller-Eberhard, 1972), 很 可 能 和 胶原 一 样 ，C1q 也 具有 葡萄 糖 - 半 乳 糖 双 糖 单位 ,通过 羟基 和 羟 赖 氨 酸 相连 接 的 构造 。 这 种 奇特 的 化 学 组 成 和 Cla 分 子 构造 的 特点 有 关系 。 对 Cla 的 亚 基 和 肽 链 结构 研 究 发 现 ，Cld 经 8M 尿素 解 离 成 两 种 非 共 价 结合 的 亚 基 ，A 亚 基 ( 分 子 量 69,000) MB 亚 基 (分 子 量 54;000) 。 Cla 经 还 原 和 烷 基 化 后 ,产生 等 克 分 子 量 的 三 种 多 肽 链 (A,B, C)， 其 分 子 量 均 约 为 23,000 一 24,000。 这 些 多 肽 链 的 共同 特点 是 具有 类 似 胶 原 的 结构 ,都 含有 很 高 量 的 甘氨酸 (~18%) 和 胶原 特有 的 羟 赖 氯 酸 和 羟 且 氮 酸 (Calcott 和 Miiller-Eberhard, 1972), 对 人 Cla WA 链 (全 长 191 氨基 酸 残 基 ) 的 部 分 排列 顺序 测定 结果 发 现 , 其 N 端 半 段 (78 残 基 ) 具有 和 胶原 类 似 的 _Gly—x—y 重复 顺序 (x 多 为 Pro，y SHIA)» ,而 C 端 则 有 非 胶 原 类 型 的 排列 顺序 。 B 链 和 C 链 也 可 能 存在 同样 的 类 似 胶原 的 区 域 (Reid，1974) 。 最 近 ， 还 发现 Clq 经 胃 和 蛋白 酶 在 pPH4.4 部 分 酶 解 时 ， 非 胶原 排列 顺序 被 切 成 碎片 ， 而 类 似 胶原 结构 部 分 仍 保持 完整 。 对 这 些 残 留 的 片段 分 析 表 明 , 一 种 片段 是 A HEM B 链 在 近 N 端 处 经 二 硫 键 连 成 的 双 链 ， 另 一 种 片段 是 两 条 C 链 在 近 N 端 处 经 二 硫 键 连 成 的 双 链 (Reid, 1976) 。 另 一 方面 ,电子 显微镜 观察 发 现 ，C1q 分 子 形状 像 一 把 没有 完全 打开 的 折 扇 (Svehag 。 363。 | 站 机 全 { i | FB 图 12-7 Cla 分 子 之 不 同方 面 的 电子 显微镜 图 。 (X500,000), (a) 三 个 不 同 的 Clq HTH MM. Cb) Al (c) Cla 分 子 的 双 体 的 两 种 排列 方式 ; (b) PRUE, (Cc) 周 沿 亚 基 相连 。 (d) Cl1q 分 子 上 面 观 。 〈e) Cla 分 子 侧面 观 。 中 央 亚 基 似 乎 再 纵 分 为 两 部 分 ( 据 Kno- bel 等 ,1975)。 等 , 1972; Shelton 等 , 1972; Knobl 等 , 1975) (图 12-7, 12-8) 。“ 扇 柄 (中央 亚 基 ) 350— 400 WAV) 4% 50A x100A, 由 两 个 | 部 分 组 成 ; 周 沿 排列 着 6 个 球形 亚 周 沿 亚 基 假 定 . 基 ， 以 细 丝 和 ”“ 扇 柄 相连。 这 些 周 REE 沿 球形 亚 基 的 大 小 为 66 只 ，Knobl 等 推测 可 能 和 亚 基 A 的 大 小 大 致 符合 ， 而 相连 的 细 丝 (15A x100 一 co cle clr mates 300A) 从 其 粗细 推测 其 结构 可 能 300 TA] 类 似 三 股 螺旋 的 胶原 。 因 此 ,每 一 条 AT 细 丝 可 能 代表 类 似 胶原 的 三 股 螺旋 图 12-8 .根据 电子 显微镜 观察 作出 的 Cla 分 子 简 图 结构 ， 而 细 丝 末端 的 球 相当 于 这 些 2) 多 肽 链 C 端 非 胶原 结构 的 区 域 。 至 于 中 央 亚 基 则 假定 可 能 相当 于 B 亚 基 由 两 条 小 的 肽 链 (26,500) 组 成 〈Knobl © #1975) o 最 近 ，Porter 和 Reid (1976) 根据 前 述 对 Clq 胃 和 蛋白 酶 酶 解 片 段 的 研究 结果 ， 并 参考 电子 显微镜 观测 资料 , 提出 一 个 Cla 新 的 分 子 结构 模型 。 假 定 每 一 个 Cla DF (分 子 量 410,000) 是 由 9 个 非 共 价 结合 的 亚 基 (6 个 为 A—B WH, 3 个 为 C 一 C MH) 组 成 的 。 每 两 个 A 一 B 双 链 和 一 个 C—C 双 链 作为 一 个 结构 单位 ,其 中 A,B, C 链 的 类 似 胶 原 区 域 (78 RE) 盘 绕 成 一 条 三 股 螺旋 的 纤维 ,而 C 端 非 胶 原 区 域 的 肽 链 折合 成 一 ° 3646 等 克 分 子 量 的 A，B, C 链 每 条 链 的 分 子 量 为 23,000 一 24,000 SA | N 端 非 胶 原 区 ”类似 胶 原 区 非 胶原 区 (2 一 8 残 基 ) (78 HE). (103—108 残 基 ) | 2A x 454 C 端 球状 区 一 一 45A ES Clq 分 子 (分 子 量 410,000) 3X| A, B, C 链 的 螺旋 端 盘 绕 成 三 股 螺旋 图 12-9 人 Cl1q 的 分 子 模型 和 肽 链 构造 。 根 据 对 Cla 胃 和 蛋白酶 酶 解 片段 的 研究 结果 〈Reid，1976) 及 电 子 显微镜 观测 (Shelton 等 ;1972; Knobel 等 ;1975), 并 假定 A, B, C 链 的 三 个 类 似 胶原 区 盘 绕 成 类 似 胶 原 的 三 股 螺旋 的 纤维 构造 ，C 端 非 胶原 区 折 私 成 周 沿 球形 构造 。( 一 一 ) 分 子 朝 外 的 部 分 ; (一 一 一 ) 分 子 朝 内 的 部 分 ; (~~) 类 似 胶原 的 三 股 螺旋 构造 ( 据 Reid 和 Porter, 1976), 个 周 治 的 球形 构造 。 结 果 每 一 个 结构 单位 有 两 条 三 股 螺旋 及 与 其 相连 的 两 个 球形 构 造 。 整个 Clq 和 合 , 形 成 电子 显微镜 下 所 见 的 “扇形 ? 构 造 ( 图 12-9) 。 已 知 完整 的 Cla 分 子 和 IgG 相互 作用 的 价 数 为 5 一 6 价 。 上 述 的 分 子 亚 显 微 结构 提示 ,每 一 个 周 沿 球形 亚 基 也 许 相 当 于 一 个 和 IgG 的 结合 点 ,而 中 央 亚 基 则 可 能 和 Cir 或 (和 )Cls 相互 作用 。 利 用 同位 素 标记 的 胶原 酶 酶 解 片段 (I-Cl1qd Fre) 作 的 实验 证 实 了 这 种 看 法 ,相当 于 球形 亚 基 的 片段 能 和 免疫 复合 物 结合 (Isliker 等 , 1974) 。 (2) C1 大 分 子 复合 物 中 各 亚 成 分 的 相互 作用 纯化 的 Clr 是 一 个 7.0S 大 小 的 糖 蛋 白 。 在 生理 条 件 下 , 是 由 分 子 量 95,000 的 两 条 相同 的 多 肽 链 非 共 价 结合 而 成 的 。 在 有 和 钙 离 子 存 在 的 条 件 下 ，Clr 对 Cls 或 激活 的 Cls 都 有 很 高 的 亲 合力 (Ziccardi 和 Cooper，1976) 。 纯化 的 Clr 经 体外 保温 后 能 自动 地 激活 Cls， 这 种 激活 作用 能 被 DFP (二 蜡 两 基 所 磷酸 Diisopropyl flurophosphate) 抑制 。”I-C17 和 致 敏 羊 红 血球 的 结合 需要 Cla 和 钙 离 子 存 在 , 而 不 需要 Cis. Kin, 25I-C1s 和 致 敏 羊 红血球 的 结合 , 则 需要 Clq, Clr 和 和 钙 离 子 同 时 存在 。 由 此 可 见 ，Clr 。365。 让 的 作用 可 能 不 只 是 激活 Cls， 并 且 在 形成 Cl 大 分 子 复合 物 时 似乎 还 可 能 充当 Cla 和 Cls 之 间 的 连结 环节 (Ziccardi 和 Cooper，1976) 。 此 外 , 还 发 现 标 记 拍 制 物 *P- DFP 能 和 Cls 的 一 个 小 片段 结合 , 提示 这 一 片段 上 可 能 存在 和 Clr 相互 作用 的 活性 位 点 (Sakai 和 Stroud，1974) 。 关于 C1 大 分 子 复合 物 的 构造 ,近来 又 有 新 的 报告 。 有 人 用 亲 合 层 析 (琼脂 糖 -IEG) 法 从 血清 中 分 离 出 一 个 新 的 亚 成 分 Cit. 还 进一步 研究 了 血清 C1 复合 物 和 纯化 的 Cl1 亚 成 分 在 琼脂 糖 -IgG 柱 上 的 亲 合 层 析 行 为 (Assimeh 和 Painter，1975) 。 血清 通过 琼脂 糖 -IgEG 柱 时 ，C1 各 亚 成 分 便 被 结合 在 柱 上 。 再 用 EDTA 洗 脱 时 ,只 有 Cis 和 Cit 解 离 , mm RK. RZ AAI EDTA 的 血清 上 柱 , 则 只 有 Cl1q 和 Cir 被 结合 。 当 用 纯化 的 四 种 C1 亚 成 分 作 亲 合 层 析 时 , 进一步 证 实 Clq 和 Clr 各 自 独 立地 和 IgG 结合 (有 证 据 表明 Clq 和 Cir 是 和 IgG 的 Fe 上 不 同 部 位 结合 ) ;而 Cls 和 Cit 则 需要 通过 Cat++， 和 这 些 复合 物 结合 。 这 些 证 据 表 明 血 清 中 Cl 大 分 子 复合 物 可 能 是 按 ， 琼脂 糖 -I8G:C1q:Clt:Cls:Cl1r:ISEG- 琼 脂 糖 ， 这 样 的 空间 顺序 和 相 邻 的 两 个 IgG 分 子 结合 的 , 而 不 是 像 过 去 一 般 认 为 只 是 通过 Cla 和 IgG 结合 的 。 从 这 种 CI 大 分 子 构造 的 新 认识 出 发 ,对 于 Cl 激活 过 程 中 各 亚 基 相 互 作 用 关系 的 看 法 也 应 有 所 改变 。 Cl 的 激活 过 程 可 设想 为 Clr 和 Cla 各 自 独 立地 和 相 邻 的 IgG 分 子 Fe 不 同 部 位 结 Go BAN Clr 不 依赖 Cla, 便 能 直接 激活 Cls。 不 过 要 引起 溶 细胞 作用 ，, 则 需要 Clq 和 Cir 同时 各 自 独 立地 和 相 邻 的 IgG 分 子 结 合 。 总 之 ,从 上 述 可 见 ,，C1 大 分 子 复合 物 亚 基 间 的 相互 作用 是 非常 复杂 的 现象 , 目前 还 不 甚 清楚 。 此 外 ，Clt 的 存在 目前 并 未 得 到 普遍 承认 。 因 此 我 们 在 下 一 节 中 讨论 Cl 激活 的 分 子 机 制 时 , ANG RIAA 4. C3 的 多 肽 链 构造 C3 在 补体 系统 的 功能 活动 中 起 关键 作用 ,其 分 子 构造 和 功能 的 关系 也 是 颅 为 复杂 的 。 纯化 的 C3 分 子 是 由 两 FE 条 多 肽 链 共 价 连 接 而 成 的 ， «so $5} BY 120,000, 8 HEH e 75,000, FEA 195,000. C3 C3 Feith C3b KGAF i 7 Se 2 在 经 C3 ULB BIEN, Mo Pre Sear Pes eres PET 链 的 N- 端 切 下 一 个 小 片段 C3a (分 子 量 9,000)， 剩 下 的 S 5 S ee AH BE C3b (4}-F4E 181,000) 图 12-10 C3 分 子 模型 。 表 示 多 肽 链 与 生理 的 及 酶 解 的 片 侦 之 间 的 关系 ”上 原来 被 掩盖 的 结合 点 暂时 便 /和 暴露 出 来 了 ， 并 能 和 细胞 膜 上 的 受 体 非 专 一 地 结合 。 新 产生 的 C3b 和 膜 的 结合 似乎 是 通过 C3d， 因 为 当 C3 灭 活 因 子 或 胰 蛋 白 酶 作用 于 和 膜 结合 的 C3b 时 ,释放 出 C3c 而 不 是 C3d。 C3a(al), C3d(a2) 都 是 “ PENA E. im C3b 则 包括 两 条 链 (a FB), C3c 则 是 完整 的 8 链 和 < 链 的 一 系列 片段 ， 经 几 个 二 硫 键 相连 构成 的 〈 图 12-10) (Bokisch 等 ,1975) 。 C3a 是 一 个 碱 性 很 强 的 多 肽 ,其 结构 特点 是 含有 大 量 的 “ 螺旋 构造 , 可 能 与 其 过 敏 毒素 的 生物 活性 有 关 系 ( 见 385 页 ) 。 * 366° 5.C4 和 CS 的 多 肽 链 构造 C4 的 分 子 量 为 206,000。 Ha, B; 95,000, 78,000 和 33,000 (Schreiber 和 Miiller-Eberhard, 1974), C4 的 a 链 被 C15 酶 解 为 C4a 和 C4b 两 个 FE. Clb 有 一 个 新 的 稳定 的 结合 点 ， 能 和 许多 哺乳 动物 细胞 表面 的 免疫 附着 受 体 结合 。C4b Wo 链 进 一 步 被 C4b RAT BBA C4d 和 Che 两 个 片 段 ， 并 失去 原 有 的 C4b 活力 (A 12- Los C5 的 分 子 量 为 180,000, Ha, BR 条 链 组 成 。% 链 分 子 量 约 为 110,000，6 链 约 为 70,000 (Bokisch 和 Miller- Eberhard, 1975), C5 的 ac 链 可 被 C5 转化 酶 切 成 C5a 和 C5b 两 个 片段 (图 - 了 2 7Y 三 条 多 肽 链 构成 ， 几 条 链 的 分 子 量 各 为 C4 2 als Sa a 1 C5 转化 酶 图 12-11 C4 和 C5 的 分 子 模 型 。 表示 多 肽 链 与 生理 的 片 女 之 间 的 关系 ( 据 Miller-Eberhard, 1975), 其 他 补体 成 分 的 分 子 构造 , 目前 还 不 甚 清楚 。 ©) 血清 内 含量 补体 系统 的 11 种 以 上 的 蛋白 质 共 占 血清 球 蛋白 部 分 总 量 的 约 10% 。 血清 中 各 补体 1000 补体 蛋白 质 (微克 /毫升 ) 成 分 含量 的 差异 很 大 ， 从 二 10 微克 到 120 微克 /毫升 ( 表 12-2, 图 12-12) 。 不 同 物 种 ,各 成 分 的 相对 浓度 不 同 。 这 种 浓度 差异 可 能 反映 了 补 体 最 适 生 物 学 功能 所 需 的 个 别 成 分 的 量 。 补 体 担负 的 各 种 生物 学 功能 ， 如 溶 细胞 作 用 或 加 强 吞 噬 作 用 等 在 机 体 防御 系统 中 的 相对 重要 性 ， 在 不 同 物种 或 同 物种 不 同 品 系 之 间 可 能 不 同 。 因 此 ， 某 些 种 或 品系 的 某 些 成 分 可 能 图 12-12 “人 类 补体 蛋白 质 之 分 子 量 、 电泳 迁移 率 和 血清 内 浓度 。 背景 示人 全 血清 之 电泳 图 形 。 若 按 左 侧 浓 度 标 尺 , 峰 的 高 度 应 放大 20 倍 GE Maller- ”含量 较 高 。 如 对 于 溶 细胞 作 Eberhard, 1972), 用 要 求 Co 分 子 特别 多 , 实 际 上 人 类 血清 中 ，C3 含量 也 最 高 。 这 表明 在 人 类 溶 细胞 作用 可 能 是 维持 个 体 完整 性 的 * 367 。 重要 机 制 。 各 种 疾病 情况 下 ， 血 清 内 补体 成 分 含量 常 发 生 典 型 的 变化 (Schur 和 Austen, 1968) 。 许 多 炎症 , 如 类 风湿 性 关节 炎 、 皮 肌 炎 、 集 结 性 动脉 外 膜 炎 患者 , 血清 内 补体 水 平 升 高 。 许多 严重 蛋白 尿 病 人 ， 血 清 中 C3 水 平 升 高 ;Bence-Jones 髓 细胞 瘤 病 人 血清 中 ，C4 水 平 比 正常 人 升 高 八 倍 。 血 清 中 补体 水 平 升 高 的 原因 还 不 清楚 。 有 人 认为 这 可 能 是 由 于 补体 合成 过 多 , 如 果 天 然 的 补体 抑制 物 又 失效 的 话 , 结 果 就 可 能 造成 溶 细胞 能 力 的 增高 。 反 之 ,在 有 些 疾病 开始 后 , 溶 细胞 活力 降低 。 如 和 急性 肾 小 球 肾 炎 , 补体 的 总 活力 连续 3 一 5 周 保持 在 低 水 平 ,其 中 C2、C3 水 平 降低 ,而 C1、C4 水 平 不 降低 。 活 动 性 全 身 性 红 开 狠 疮 病人 补体 总 量 和 C3 都 降低 。 但 与 链球 菌 感染 后 继 发 的 急性 肾 小 球 肾 炎 不 I], Clq 和 C4 水 平 也 降低 而 CS 水 平 保持 正常 ， 故 可 作为 两 种 疾病 鉴别 诊断 的 指标 (Kohler 和 Ten Bensel 1969) 。 (=) 补体 的 生物 合成 和 代谢 根据 胚胎 发 育 和 组 织 培养 等 方面 研究 ,证 明 补 体 不 同 成 分 是 在 不 同 的 组 织 内 合成 的 。 已 知 C1 是 在 肠胃 道上 皮 细 胞 内 合成 的 〈Colten 等 , 1966; 1968); C2 和 C4 BAG 鸣 细 胞 合成 的 (Rubin 等 , 1971; Stecher 等 , 1967); C3 主要 是 由 肝脏 合成 的 (Alper 等 , 1969); C6 和 CO 也 可 能 是 肝脏 合成 的 ; Co 和 C8 是 由 脾脏 凡 细胞 合成 的 s C7 合成 地 点 还 不 清楚 。 大 多 数 补体 成 分 的 代谢 率 不 清楚 。 放 射 性 同位 素 标记 实验 证 明 C3 在 健康 人 体内 的 合成 率 为 1.16 毫克 /公斤 体重 /小 时 ;血清 内 消失 半衰期 为 58 小 时 。 近 来 ,用 离 体 培养 的 豚鼠 腹膜 细胞 (HV W 细胞 株 ) 实验 表明 ,每 一 细胞 每 小 时 能 合成 310 SARA C2 pat (Wyatt, 1974a,b), 在 人 类 和 动物 ,都 可 能 出 现 缺 少 某 些 补体 成 分 的 遗传 病 (Alper 和 Rosen, 1972), 如 人 类 C3 缺乏 病 (Alper 等 ，1970) 和 C5 缺乏 病 (Miller 和 Nilsson, 1970), ， 小 鼠 C5 缺乏 病 (Shin 等 ，1969) 和 家 免 Co 缺乏 病 (Rother 等 ，1966) 等 。 在 患 有 这 种 遗传 缺陷 造成 的 分 子 病 的 个 体 , 补体 反应 链 锁 由 于 失去 某 一 环节 而 不 能 行使 正常 的 防御 功能 ,结果 机 体 对 抗 感染 的 能 力 便 大 大 降低 了 。 近 来 ,' 有 人 发 现 对 于 缺乏 C4 为 纯 合 子 的 豚鼠 , 其 腹膜 细胞 在 离 体 培养 时 能 产生 一 种 调节 因子 ,诱导 来 源 于 人 类 肿瘤 的 HeLa 细胞 合成 有 效 的 C4 分 子 。 并 且 这 种 有 遗传 缺陷 的 细胞 产生 这 种 因子 的 能 力 比 正常 豚鼠 细胞 要 大 5 一 10 倍 。 从 豚鼠 细胞 产生 的 调节 因子 能 调节 人 类 有 关 细 胞 的 基因 功能 看 来 ， 这 种 因子 的 作用 似乎 是 没有 物种 专 一 性 的 〈Colten 和 Wyatt, 1972), 更 值得 注意 的 是 对 这 类 遗传 缺陷 进行 “修复 ?的 符 试 。 对 于 正常 小 鼠 , 已 知 脾脏 BEAR Co 的 地 点 之 一 。 遗传 上 缺乏 CS 的 小 鼠 (B10-D2/O) 的 脾脏 巨 噬 细 胞 丧失 了 合成 Co 的 能 力 。 如 果 把 这 种 有 遗传 缺陷 的 巨 鸣 细 胞 和 正常 小 鼠 的 肾脏 细胞 或 鸡 红 血球 作 细 胞 杂交 ， 这 样 产生 的 杂交 细胞 便 能 在 体 外 产生 C5。 把 这 些 杂交 细胞 接 种 到 缺乏 C5 小 鼠 体 内 ,结果 血清 内 便 出 现 有 生物 活力 的 C5， 并 且 抗 原 性 和 小 鼠 C5 相同 。 这 一 实验 证 明 在 哺乳 类 遗传 缺陷 “修复 ?的 可 能 性 ， 并 为 人 类 补体 遗传 缺陷 病 的 治疗 提 供 了 一 线 希 望 (Levy 等 ，1973) 。 * 368° OO a ee 三 、 免 疫 溶 细 胞 作用 免疫 溶 细 胞 作用 是 最 引 人 注 目的 免疫 学 现象 ， 需 要 全 套 补 体 反 应 成 分 (经 典 ? 成 分 ) BM, 可 作为 补体 功能 活动 的 代表 。 这 一 过 程 包括 细胞 表面 抗原 . 专 一 的 抗体 和 补体 系统 闻 的 复杂 的 相互 作用 , 而 使 补体 各 成 分 依次 地 激活 ,最 后 导致 细胞 表面 不 可 逆 的 损伤 和 细 胞 的 溶解 。 溶 细胞 作用 机 制 主要 是 用 溶血 系统 进行 研究 的 。 为 了 便于 了 解 这 一 复杂 过 程 , 先 将 溶血 过 程 的 梗概 简 述 如 下 : (一 ) 免疫 溶 细 胞 作用 中 补体 反应 的 顺序 (初级 途径 或 经典" 途径 ) 细胞 膜 表 面 抗原 和 专 一 抗体 分 子 (IEM 或 IgG) 的 Fab 抗原 结合 位 点 相互 作用 的 结果 , 激活 或 暴露 出 位 于 Fe oS ee 片段 上 的 补体 结合 位 点 ， 而 与 一 一 一 一 athe KR 细胞 膜 补体 第 一 成 分 的 Cla 起 反应 ， 抗体 和 细胞 胡 三 由 此 发 动 至 少 有 11 个 补体 蛋 面 的 抗原 结合 =e 白质 参与 的 链 锁 反 应 ， 最 后 导 INA SHUR Ch 抗体 复合 物 结合 并 释 ee 致 膜 的 损伤 。 这 种 从 免 疫 复 BCH TE AAG (CT) , ---- 合 物 和 Cla 相互 作用 开始 , 包 wee 括 全 套 补体 成 分 参加 的 反应 系 cnet ae we ae 列 ， 称 为 补体 反应 的 初级 途径 i aie 或 “经 典 ” 途 径 (Primary or “classical” cascade) (Mii- C3a ller-Eberhard, 1969;1972) 。 cen C42 酶 复合 物 使 C3 补体 反应 的 初级 途径 如 简 。，c453 一 一 细胞 结合 的 复合 物 (c423) E 图 12-13 所 示 ， 首 先是 专 一 的 人 抗体 (1 IgM 分 子 或 2 IEG 分 C423 对 补体 其 余 成 © 分 起 作用 ， 激 活 并 C6 子 ) 和 细胞 表面 抗原 结合 ， 形 aes 'h aT 成 一 个 固定 补体 的 点 〈 细 胞 致 过 敏 ) 。 Cl BAM (Clq, r,s) 化 学 吸引 被 膜 上 结合 的 抗体 固定 而 被 激 °° 一 一 细胞 溶解 活 ， 转 化 为 具有 酯 酶 活力 的 激 活 的 CI。 Cl 酶 催化 C4， 激 TAY C4 附着 到 膜 上 新 的 地 点 (或 CI1- 抗 原 抗 体 复合 物 上 ) 。 同时 Cl 酶 也 催化 C2， 激 活 的 C2 和 C4 连接 共同 形成 一 个 酶 复合 物 C4,2， 能 催化 C3， 称 为 C3 转化 酶 (C3 Convertase) 。 C3 转化 酶 再 作用 于 C3， 使 C3 分 解 为 C3a 和 C3b 两 个 片段 。 *。 369 。 Cn 激活 的 补体 成 分 12-13 ”补体 反应 顺序 简 图 ( 据 Herbert 和 Wilkinson, 1971), Cab 与 G453 形 成 能 与 细胞 膜 结合 的 新 的 肽 酶 C433, 而 Coa 游离 , 表现 过 敏 毒 素 和 白 血球 化 学 吸引 的 能 力 。 酶 C45258 再 和 C5 反应 ,使 C5 SHR Coa 《过敏 毒 素 和 化 学 吸引 和 Cob PTE. Cob 再 与 C6、C7 形成 复合 物 。 YH Ce MCT 存在 时 ，C 72,3 对 C5 的 作用 更 有 效 得 多 。 因 此 ，C5、6、7 可 能 作为 一 个 复合 物 而 起 作用 。 激 活 的 C5,6,7 和 膜 附着 。 C5.6,7 又 激活 C8， 使 后 者 附着 到 膜 上 。 当 没有 Co 存在 时 ， C8 可 持久 地 但 微弱 地 造成 膜 的 损伤 。 CO 可 以 大 大 加 强 c8 的 溶 细胞 活力 ,而 迅速 地 导致 不 可 着 损 伤 (离子 主动 运送 被 破坏 ,释放 出 血红 蛋白 和 其 他 内 合 物 ) ,造成 渗透 压 不 平衡， 最 后 发 生 细胞 的 裂解 。 从 上 述 可 见 , 完 成 免疫 溶 细胞 作用 ,需要 全 套 补体 成 分 , 按 严格 时 空 顺序 ， 依 次 激活 。 为 什么 免疫 溶 细胞 作用 需要 这 样 复杂 的 、 按 顺序 触发 的 多 分 子 酶 系统 ,而 不 能 由 一 、 两 种 酶 来 完成 呢 ? 如 果 考 虑 到 补体 系统 的 功能 是 杀伤 蔓 细 胞 (微生物 或 转化 的 寄主 细胞 ) ,同时 又 要 避免 损伤 寄主 正常 细胞 的 危险 性 , 对 于 上 述 复杂 机 制 的 需要 ,就 不 难 理解 了 。 从 理论 上 考虑 ,补体 系统 只 有 区 分 为 “识别 "“ 激 活 ?和 “攻击 "三 个 功能 单位 ,同时 又 各 以 不 活动 形式 存在 , 才 有 可 能 有 效 地 和 安全 地 完成 这 一 任务 (图 12-14) 。 既 然 对 葛 细 胞 的 识别 功能 - ill 是 由 抗体 担任 的 ， 补 体 的 < 识别 "单位 就 应 该 和 抗体 有 ot Ra, MRIS A Ie, FET “激活 "单位 。 其 次 ,“ 激 活 ?单位 应 对 细胞 膜 有 亲 合力 。 Ize BEBE Let Ga” LER oe A, “Cnn SAI ONES. Bi LBD + OS 动 都 是 在 外 细胞 膜 的 局 部 发 生 的 。“ 激 活 ” 和 “攻击 ” 音 In 位 、 处 于 活动 状态 的 分 子 或 复合 物 都 是 非常 不 稳定 的 ， 除非 与 膜 结合 否则 很 快 就 会 晓 变 失去 活力 。 因 此 ， 补 图 12-14 “补体 作用 系 绕 的 三 单位 理论 模 、 体 造成 的 损伤 作用 ， 只 能 局 限 在 为 抗体 识别 的 外 源 细 ee ett ae 胞 的 局 部 , 而 不 致 扩展 到 邻近 的 正常 细胞 。 只 要 抗体 的 识别 能 力 是 正常 的 , 这 种 机 制 就 能 保证 免疫 溶 细胞 作用 对 驾 细胞 有 选择 地 和 有 效 地 攻 ii, 而 不 致 有 误伤 正常 细胞 的 危险 。 如 果 抗 体 的 正常 识别 机 制 破坏 了 , 不 能 区 分 自我 "和 “ 非 我 ” 随 之 而 来 地 就 会 招致 正常 细胞 的 杀伤 , 引起 自身 免疫 病 。 上 述 这 种 三 功能 单位 组 合 的 理论 模型 和 实验 事实 也 是 符合 的 ,不 过 每 一 功能 单 位 可 能 包括 几 种 补体 蛋白 质 。 其 组 成 如 下 : 1) “识别 ?单位 ，C1d，CIr，C1s; 2) “Hie” Afr, C2, C3, C4; 3) “Oct” #fir: C5, C6, C7, C8, C9, 前 面 讲 过 , HMA bw, Clq, Cir 和 Cis; C2 和 C4; C5. C6 和 C7; C8 和 Co 倾向 于 结合 成 可 逆 的 复合 物 (图 12-6)， 也 似乎 支持 上 述 看 法 。 (=) 靳 细胞 表面 结合 抗体 使 补体 激活 的 分 子 机 制 按照 上 述 理论 模型 , 免疫 溶 细 胞 作用 的 分 子 机 制 可 分 为 三 个 步骤 ,讨论 如 下 ; 。370。 Ci 的 产生 1. 补体 “识别 "单位 被 靶 细 胞 表面 结合 抗体 激活 (1) Cl 复合 物 和 抗体 的 相互 作用 血清 中 Clq, r,s 三 个 亚 成 分 由 Cat+ 连结 成 一 个 18S 复合 物 , 作为 一 个 功能 单 位 起 作用 。 Cl 复合 物 通 过 Cla 结合 点 而 与 抗原 抗体 复合 物 或 免疫 球 蛋白 聚集 物 相 结 合 。 这 种 结合 是 专 一 的 ，C19q 只 与 IgG, IgM 结合 ,而 不 与 IED 或 IgE 聚集 物 结合 。 IgG 的 各 亚 类 中 ，IgG:、IgG:、IgG。 能 固定 C1, fy IgG, WARE (Ishizaka 等 ,1966; 1967) 。 如 七 章 所 述 (205 页 ) ， 固 定 补体 的 专 一 性 是 和 重 链 Fe 的 特殊 结构 有 关系 的 。 C1 复合 物 对 抗体 分 子 的 亲人 合力 和 专 一 性 位 于 Cla 上 ,这 为 纯化 的 Cla 在 超 离心 场 中 能 和 IgG AIRE ABS EAR Cl1q-IgG 复合 物 的 实验 所 证 实 。 由 此 还 可 测定 Clq 和 IgG 的 结合 价 , 已 测 知 为 5 一 6 价 , 即 每 一 个 Clq DA 5 一 6 个 结合 位 点 ,其 结合 常数 为 104 一 5 x105 L/M (Miiller-Eberhard, 1972), Ciq 和 IgG 各 亚 类 的 亲 合 力 不 同 , IgG,>IgGi:>IgG,, IgM 也 能 与 C1q 结合 (Miiller-Eberhard 和 Calcott，1966) 。 因此 , 可 认为 Clq 是 补体 系统 的 “识别 ?单位 ,通过 它 把 抗原 抗体 系统 和 补体 系统 在 功能 上 连结 起 来 ,扩大 抗体 分 子 的 效应 功能 。 (2) Cl 的 激活 补体 各 成 分 至 少 具 有 两 类 功能 点 : 1) 结合 点 ,选择 地 和 IgE、 补 体 成 分 或 生物 膜 的 受 体 结合 ;2) 效应 点 ,完成 在 免疫 溶 细胞 反应 中 所 分 担 的 特殊 功能 。 天 然 的 补体 成 分 不 表 现 这 些 功 能 。 补体 成 分 表现 功能 需要 激活 。 不 过 ，C1 是 唯一 的 例外 ， 其 结合 点 位 于 Clq, 无 需 激活 就 能 直接 和 抗原 抗体 复合 物 起 反应 。 当 C1 复合 物 ( 有 Cat 存在 时 ) 通 过 Clq 和 细胞 膜 上 的 免疫 复合 物 (EA) 结合 后 ， Clr 便 被 激活 。 后 者 再 作用 于 Cls 〈 酶 原 ) ,使 它 转变 为 有 活性 的 酶 ": 激活 的 EAC] RABE: 酶 活力 位 于 Cis 上 。 C15 酶 的 天 然 底 物 是 C2 和 C4; 也 能 水 解 对 -甲苯 磺 酰 精 氨 酸 甲 酯 〈TAME) ， 并 可 被 二 异 两 基 氟 磷酸 (DFP) 抑制 。 正 常 血 清 内 也 含有 Cl 的 天 然 抑 制 物 , 抑制 其 酯 酶 活力 。 一 些 蛋 白 酶 如 溶 纤 酶 或 胰 蛋 白 酶 也 可 能 使 C1 直接 转变 为 Cl。 Cl 的 激活 作用 的 分 子 机 制 可 能 是 由 于 Cla 和 抗原 抗体 复合 物 结合 时 , 发 生 构 象 变 化 ,引起 Cl 复合 物 内 亚 基 之 间 的 空间 重 排列 的 结果 。 近 来 的 研究 结果 认为 ，C1 复合 物 内 部 的 激活 始 于 Cl1q 的 构象 变化 ,继而 诱发 Clr 的 构象 变化 ,使 Clr 获得 酶 活力 ， 作 用 于 C1s, 将 后 者 转化 为 活化 的 Cls。 这 一 转化 过 程 包括 多 肽 链 在 一 处 切断 , 结果 产生 由 二 硫 键 连接 起 来 的 两 个 片段 (BHRMDF 量 为 59,000, 轻 片段 为 27,000) ，Cls 的 酶 活性 中 心 位 于 轻 片 段 (Sakai 和 Stroud, 1973; Valet 和 Cooper, 1974), * 如 前 一 节 (366 页 ) 所 述 ' 有 人 认为 Clqa 和 Clr 都 能 分 别 独 立地 和 IgG 之 Fe 的 不 同 部 位 结合 。 纯 化 的 Cli 经 体外 保温 后 ,还 能 自发 地 激活 Cl1s， 而 无 需 依 赖 Cl1q。 在 生理 条 件 下 是 否 同样 如 此 ,还 不 清楚 。 * 371。 激活 的 CI 酶 可 催化 C4 和 C2 与 细胞 膜 结 合 ,形成 C3 转化 酶 〈C4,2) 。 在 CI 作用 下 ，C4 分 解 为 两 个 片 假 C4a (分 子 量 约 为 15,000) 和 C4b (ATR 约 为 230,000) 〈 图 12-11) 。 大 片段 C4b 可 以 和 细胞 膜 的 结合 点 (或 抗体 ) 结 合 。 但 是 ， 只 有 少量 C4b 分 子 有 机 会 和 细胞 表面 牢固 结合 , 其余 大 多 数 分 子 留 在 溶液 内 , 迅速 失去 结合 能 力 而 旷 化 成 无 活力 的 〈C4b)i。 此 反应 过 程 可 用 下 式 表 示 ， C4UC4a + (C4b ih § AC ae ne es Cl 酶 还 将 C2 切 成 两 个 片段 : C2a (4FBAX 85,000) 和 C2b. 44 Mgt* & 在 时 ，C2a 与 固定 在 膜 上 的 C4b 结合 ,形成 有 肽 酶 活力 的 C4b, 2a 复合 物 , 称 为 C3 FEAL. C2b 不 表现 生物 活性 。 未 能 和 膜 结 合 的 游离 的 C2a， 迅 速 失去 活性 ， 虹 化 成 (C2a)i。 膜 上 结合 的 C2a 也 可 能 被 释放 出 来 , 晓 变 成 无 活性 的 。 此 过 程 简 述 如 下 式 ， < C2\4C2b + (C2 i ha AE a ot -< EACI1, 4b alate Seen EAC1,4b,2a 一 > C2a‘+EAC1, 4b (C3 转化 酶 ) C3 转化 酶 的 特点 是 从 两 个 无 酶 活力 的 前 身 物 C2 和 C4 相互 作用 产生 的 。 C2 或 C4 单独 经 Cl 酯 酶 作用 ,都 不 能 产生 酶 活力 。 只 有 当 C4 HA Cl 酯 酶 作用 ,然后 将 C2 加 到 反应 物 内 ,在 有 Mg** 存在 时 ,才能 出 现 C3 转化 酶 活力 。 C4 和 C2 的 反应 顺序 不 能 颠倒 ,否则 就 无 效 。 因 此 , 这 些 结果 说 明 C4 在 C1 作用 下 转变 为 C2 的 接受 体 (acceptor) ， 激 活 的 C2 再 与 C4 结合 形成 酶 复合 物 。 当 C3 转化 酶 (了 AC1,4b,2a) 形成 后 , HR Ci 不 影响 以 后 反应 的 进行 。 这 时 EAC4b,2a 就 能 将 C3 WRATEE, C3a 和 C3b (图 12-10) 。 WHE C3a (分 子 量 约 7,000) 具有 过 敏 毒 素 和 多 形 核 白 血球 化 学 吸引 活力 。 少 量 C3b (H10%) 和 EAC4b,2a， 或 附近 的 膜 结 合 点 结合 , 而 其 余 游 离 的 C3b 迅速 变 为 〈C3b)i。 此 过 程 简 述 如 下 式 : A OSB EE met a tee EAC1,4b, 2a ———————> EAC1, 4b, 2a,3b 其 中 C4b,2a,3b 可 能 相当 于 依赖 C3 的 肽 酶 ,也 称 为 CO HLH. 3. 攻击 单位 在 膜 上 的 形成 (1) C5,6,7 AE C5 转化 酶 (C4,2,3) 和 C5 DF RM, PEATE, Coa (FH 10,000) 和 C5b (分 子 量 为 170,000) 。 大 片段 C5b 和 细胞 膜 结合 ,成 为 后 面 几 个 补体 成 分 相继 作 用 的 地 点 : \1C5a Sa C4,2,3 253 C4,2,3,5b Cha 也 是 一 种 过 敏 毒 素 ,其 作用 专 一 性 和 C3a Al. Cha 也 有 吸引 多 形 核 白 血球 (主要 为 嗜 中 性 球 ) 的 能 力 。 C6，C7 与 膜 上 的 C5 起 反应 的 方式 还 不 太 清楚 。 有 人 认为 C5，C6，C7 可 能 在 血清 中 形成 一 个 三 分 子 复合 物 C5,6,7 作为 一 个 功能 单位 和 膜 结 合 (Polly 和 Miller- Eberhard, 1971; Arroyave 和 Miller-Eberhard, 1971), «3726 C5,6,7 #1 EAC4,2,3 反应 方式 刘 直 | C5, 6, 7\4C5a 十 CC5，, 6, EAC4,2,3 ee an EAC4,2,3, 5b.6,7 此 反应 产生 的 三 分 子 复 合 物 C(5b,6,7) 对 白血球 有 化 学 吸引 力 。 (2) C8，Cg9 反应 当 C(5b,6,7) 复合 物 形成 时 ,一 个 C8 分 子 便 和 此 复合 物 结合 ,随后 6 Co 分 子 oer Cee, Ae NF 结果 形成 一 个 由 10 4S 5} FR 集成 的 大 分 子 集团 ， 分 子 量 达 到 100 万 。 这 一 复合 物 在 短暂 RUT A REM, Be ARB 双 层 内 ， 并 引起 细胞 的 溶解 (Kolb 和 Miiller-Eberhard, 1973) (12-15), 引起 细胞 溶解 的 免疫 损伤 地 点 很 可 能 就 是 “5b,6,7 复 合 物 戏 人 膜 内 的 细胞 受到 C8 作用 时 ， 只 ”图 12-15 MRR C(5 一 9)， 稳定 复合 物 的 形成 。 C5 激活 时 ，C5b 至 到 by Co 各 成 分 连结 成 一 个 牢固 的 复合 物 。 这 一 复合 物 在 短暂 时 间 内 有 和 细 能 发 生 轻 度 而 持续 的 溶解。 胞 表面 结合 并 引起 细胞 溶解 的 能 力 。 当 失 去 和 膜 的 结合 点 时 ， 在 水 淤 的 结合 就 能 够 加 快 和 加 强 这 一 液 内 仍 保持 稳定 的 排列 ， 但 失去 溶 细胞 的 能 力 ( 据 Kolb 和 Miiller-Eber 进程 ， 最 后 导致 细胞 膜 的 破裂 hard，1973 )。 和 细胞 的 溶解 (Miiller-Bberhard，1972) 。 膜 的 损伤 将 结合 电子 显微镜 观察 结果 在 下 pee ah, Set * BACT Catt ian + (C4b), EACI, 4b om Mg** | (C2a); + C2b _EACI, 4b, 2a |C。 3a +(C3b),) EACI, 4b, 2a, 3b C C5, 6, 7 | C5a 二 (C5b,6,7)j. EACT, 4b, 2a,3b, 5b, 6; 7 A EACT, 4b, 2a,3b, 5b, 6, 7, 8 {° AAD A; ——EACT, 4b, 2a, 3b, ‘5b, 6, 7; 8,9 12-16 抗体 和 补体 引起 细胞 膜 损伤 的 初级 途径 (Miiller-Eberhard, 1969)。 © 3736 | 让 二 12-17 Aa Cl 复合 物 和 其 他 复合 物 从 液 相 转移 到 般 细 胞 表面 的 三 种 结合 点 模型 。 Cl 复合 物 通过 Cla 和 了 膜 上 两 个 相 邻 的 IgG 抗体 分 子 结合 (点 D. Cl 复 合 物 内 亚 基 间 相互 作用 使 Cls BIE. Cls 激活 C2，C4 的 不 稳定 结合 点 ， 并 形成 C4,2, C4,2 (C3 转化 酶 ) 在 与 点 工 不 同 的 位 置 和 膜 结 合 CA ID, C42 将 C3 B 解 ,形成 c42,3〈C5 转化 酶 )， 并 与 膜 结 合 。 许多 C3b HERR C42 HH 境 周围 的 膜 上 ,它们 和 免疫 粘着 有 关系 。 C42.3 断裂 C5， 并 形成 C5b-9 BAY, 在 另 一 个 地 点 嵌入 膜 内 (点 UD), 结果 出 现 可 见 的 膜 损 伤 (Miiller-Eberhard，1975)。 一 节 讨论 。 总 结 上 述 补体 反应 初级 途径 及 副 产 物 , 可 用 图 12-16 表示 。 最 后 , 还 要 提 到 补体 和 层 细 胞 膜 结合 的 地 点 问题 。 Miiller-Eberhard (1975) 总 结 上 述 一 系列 工作 后 , 认为 补体 对 葛 细胞 膜 起 作用 的 “功能 单位 ?是 在 激活 过 程 中 形成 的 三 个 多 分 子 复合 物 ， 它 们 分 别 和 膜 上 不 同 的 位 置 结合 (图 12-17) 。 首先 ， Cl 复合 物 通过 Ciq 和 膜 上 两 个 相 邻 的 IgG 抗体 分 子 结合 CORD. 通过 Cl 复合 物 亚 基 间 的 相互 作 用 ,在 该 处 激活 的 Cls 酶 催化 形成 的 C4,2 复合 物 又 和 膜 上 另 一 位 置 (点 IT) 结合 ， 并 在 此 处 转化 为 C4,2,3。 后 者 再 发 动 形成 C5b-9 BAH. BAN C5b-9 复合 物 再 转 移 到 膜 上 另 一 位 置 (点 IIID) ， 钳 入 膜 内 , 并 转变 为 膜 损伤 。 (三 ) 细胞 膜 的 免疫 损伤 Mayer (1961) 根据 对 免疫 溶血 作用 的 动力 学 分 析 的 结果 , 提出 溶血 作用 是 红 血 球 膜 上 局 部 损伤 的 结果 ,一 处 损伤 就 足以 引起 细胞 的 溶解 ; 膜 的 一 处 损伤 又 是 由 于 补体 分 子 的 一 次 “碰撞 ?造成 的 ”， 而 不 是 一 个 累积 的 过 程 。 这 就 是 所 谓 " 一 次 碰撞 ”理论 (“One hit” theory), Green 等 (1959) M40 MER. Krebs 腹水 瘤 细 胞 的 免疫 溶 细胞 作用 的 研究 ,观察 到 细 胞 内 小 分 子 (K"， 游 离 氮 基 酸 等 ) 和 大 分 子 ( 蛋 白质、 核酸 等 ) 的 漏 失 现象 。 如 细胞 膜 外 加 * 最 初 曾 认为 一 个 补体 分 子 或 一 个 特定 补体 成 分 的 分 子 负责 一 次 碰撞 。 然 而 ， 不 久 就 弄 清楚 了 这 对 于 许多 补体 成 分 说 来 是 不 正确 的 。 于 是 ， 便 改 用 功能 分 子 ? 的 概念 来 代表 动力 学 分 析 上 与 一 次 碰撞 有 关 的 补体 成 分 或 复 合 物 。 如 前 述 C5b-9 多 分 子 复合 物 很 可 能 代表 这 样 一 次 碰撞 ,并 负责 造成 一 个 损伤 。 es 374。 足够 浓度 的 BSA 时 ,蛋白 质 的 漏 失 便 被 阻止 了 , 而 细胞 膜 维持 离子 主动 运送 的 能 力 OR 持 Kt, HEH Na*) 仍 不 能 恢复 。 因 此 , 假定 补体 引起 的 溶 细 胞 作用 始 于 膜 上 功能 性 “小 洞 2 的 形成 , 使 小 分 子 自 由 漏 失 , 渗透 压 不 平衡 ， 结 果 细 胞 因 吸 水 膨 涨 而 破裂 。 Dourma- shkin 和 Humphrey (1963) 最 先 用 电子 显微镜 观察 到 , 红血球 受到 免疫 损伤 时 能 产生 典型 的 孔洞 。 这 为 “一 次 碰撞 ?理论 提供 了 从 形态 学 上 验证 的 依据 。 此 后 , 他们 对 孔洞 的 形 态 、 性 质 和 产生 的 机 制 等 方面 作 了 系统 的 研究 (Humphrey 和 Dourmashkin，1969) 。 1. 亚 显 微 形 态 特 征 羊 红 血球 受 家 免 抗 Forssman 抗体 和 豚鼠 补体 作用 而 咨 血 时 , 电子 显微镜 观察 发 现 经 过 反 染 色 的 损伤 的 膜 上 呈现 典型 的 孔洞 。 和 孔洞 直径 约 为 80 一 100A ,通常 呈 圆 形 , 深 色 的 洞穴 ， 周 沿 有 一 圈 亮 的 环 。 这 些 孔 洞 在 膜 上 的 分 布 不 规则 (图 12-18) 。 各 类 抗体 (IgM, IgG) 和 各 种 动物 的 补体 产生 的 孔洞 ,形态 大 小 均 近 似 。 对 于 未 固定 的 膜 ， 人 补体 造成 的 孔洞 (100—110 A) 和 豚鼠 补体 造成 的 孔洞 (85—95A), 大 小 仅 略 有 差异 。 和 其 他 各 种 溶血 剂 , WBA. BAA MF (Streptoly- sin O)、 溶 血 卵 磷 酯 等 造成 的 孔洞 比较 ,无论 大 小 、 形 状 和 排列 方式 都 和 补体 造成 的 孔洞 有 了 明显 的 区 别 。 除 红血球 外 ， 补 体 对 其 他 的 细胞 和 病毒 也 能 引起 类 似 的 膜 损 伤 。 (1) 哺乳 类 有 核 细 胞 ANE Krebs -腹水 瘤 细 胞 经 家 免 抗 腹水 瘤 抗体 和 豚鼠 补体 处 理 时 ， 细 胞 膜 上 造成 形 态 上 类 似 的 孔洞 (《C” 了 和 孔洞 ) (Humphrey 和 Dourmashkin, 1965) 。 大 鼠 腹腔 肥大 细胞 经 家 免 抗 大 鼠 肥 大 细胞 抗体 和 补体 处 理 时 ， RE 也 造成 典型 的 “C” 了 孔洞 ,并 释放 出 组 织 胺 。 12-18 羊 红血球 膜 被 Forssmaa 抗体 和 豚鼠 补体 深 这 种 依赖 补体 的 组 织 腕 释放 和 过 敏 反 应 所 引 ， 亲生。 有 生 本国 四 人 0 有 个 时 和 起 的 是 不 同 的 。 如 大 鼠 对 卵 白 蛋 白 过 敏 时 ， 个 孔洞 的 让 大， 孔洞 周 沿 的 一 思 肥大 细胞 和 抗原 接触 时 ， 细胞 膜 不 产生 和 孔洞 a (X 780,000 倍 )( 据 Humphrey 和 Dourmashkin， 1965)。 但 出 现 直径 约 250 有 A 的 球状 突起 。 此 外 , IgB 抗体 引起 的 组 织 胺 释放 机 制 也 不 同 , 不 能 被 酯 酶 抑制 剂 抑制 (Humphrey，1968) 。 (2) 细菌 草 兰 氏 阴 性 细菌 可 被 抗 O- 胞 体 抗 原 抗体 和 补体 杀 死 ,并 产生 典型 的 “C? 和 孔洞 。G1y- nn 和 Milne (1967) 发 现 当 溶菌 酶 被 抗 溶菌 酶 抗体 抑制 时 ， 不 影响 大 肠 杆 菌 膜 上 “C” 孔洞 的 形成 ,但 是 溶菌 作用 被 显著 地 推迟 。 如 果 再 加 和 人 卵 清 溶菌 酶 时 , 溶菌 作用 又 加 * 375.6 Aika 速 。 因 此 , 免疫 损伤 是 由 抗体 和 补体 引起 的 。 溶 菌 酶 只 能 加 速 细菌 的 杀 死 和 溶解 , 但 不 影 响 孔 洞 的 形状 。 (3) 病毒 颗粒 鸡 传染 性 气管 炎 病 毒 经 未 加 热 的 家 免 抗 血清 处 理 时 ,病毒 包 膜 产 生 典 型 的 “C” 和 孔洞 (100A), 而 加 热 后 便 不 产生 。 此 外 ， 激 活 的 补体 还 能 溶解 AKR 白血病 病毒 和 其 它 C 型 RNA 病毒 (Qroszlan 和 Gilden, 1970), 这 些 病毒 成 熟 时 , 从 寄主 细胞 表面 出 伞 释放 出 来 ,并 在 这 过 程 中 包 上 一 层 酯 蛋白 膜 。 后 者 显然 对 补体 系统 敏感 。 顺 便 提 到 , 其 他 病毒 如 了 族 大 肠 杆菌 噬菌体 , 缺少 补体 攻击 的 底 物 。 然而 ， 它 们 的 感染 力 不 能 被 抗体 中 和 ，, 却 能 被 补体 中 和 。 并 且 这 种 作用 只 需要 补体 系统 的 前 几 个 成 分 把 病毒 包 盖 起 来 。 (4) 细菌 脂 多 糖 膜 Fixit (E. colt 12408) 脂 多 糖 做 成 的 膜 , 用 正常 豚鼠 血清 ( 含 天 然 抗体 和 补 体 ) 处 理 , 能 产生 典型 的 “C” 了 和 孔洞。 补体 激活 被 抑制 时 , 就 不 能 产生 孔洞 了 。 总 之 , 从 红血球 ` 有 核 细 胞 到 人 工 脂 多 糖 膜 , 补体 都 能 造成 典型 的 孔洞 。 92468 02 6 10 14 孔洞 数目 /血球 膜 ( 微 米 2 图 12-19 ”家 免 IgM 抗 Forssman 抗体 对 羊 红 血球 膜 产 生 的 孔洞 。 一 个 孔洞 代表 一 个 免疫 损伤 点 的 证 据 : 2X103 羊 红 血球 和 不 同 量 的 纯化 IgM Forssman 抗体 和 过 量 豚 鼠 补 体 (1/20) 温 育 一 小 时 (37*C)。 然 后 , 离心 收集 膜 的 碎片 ,经 反 染 后 , 电子 显微镜 观察 ， 测 量 单 位 面积 内 孔洞 数目 。 确定 引起 50% 溶血 所 需 IgM 抗体 的 量 ， 并 根据 "一 次 碰撞 ?理论 推算 出 这 一 数量 的 抗体 足以 引起 平均 每 个 细胞 1.4 损伤 。 假 设 1) 一 个 附着 的 IgM 抗体 分 子 足 够 激活 补体 引起 一 次 损伤 ， 2) 一 个 孔洞 代表 一 处 损伤 。 箭 头 所 指示 的 预期 每 它 膜 内 孔洞 的 数目 和 实际 观测 的 数目 是 一 致 的 “〈 横 格 长 方块 一 一 没有 和 孔 洞 的 照片 ; 黑 长 方块 一 一 每 平方 微米 有 数字 所 示 的 孔洞 数目 的 照片 )( 据 Humphrey 和 Dourmashkin,1969), 00206 10 ° 376° 2. 膜 损伤 的 分 子 机 制 (1) “C” 孔 洞 和 膜 免疫 损伤 的 关联 电子 显微镜 观察 到 的 膜 孔洞 是 否 能 真正 代表 膜 的 免疫 损伤 。 有 许多 证 据 表 明 ， 和 孔洞 的 产生 和 补体 引起 的 免疫 损伤 之 间 的 关联 是 肯定 无 疑 的 。 这 些 证 据 FE: 1) 所 有 免疫 损伤 的 细胞 (人 、 羊 红 血球 ，Krebs 腹水 瘤 细胞 , 大 鼠 肥 大 细 胞 , 格 兰 氏 阴 性 细菌 ) 膜 上 都 有 典型 的 孔 洞 ， 和 其 他 溶血 方法 造成 的 孔洞 形态 上 有 显著 不 同 ; 2) 当 补 体 溶 细胞 作用 不 完全 时 ,未 溶解 的 细胞 再 用 低 竣 压 处 理 使 其 破裂 ， 结果 细胞 膜 碎片 上 并 没有 孔洞。 未 激活 的 补体 ， 单 独 抗体 或 补体 也 不 能 造成 孔 洞 ; 。 3) 孔洞 能 代表 真正 的 免疫 损伤 的 最 重要 的 证 据 是 Borsos & (1964) 的 实验 。 在 家 兔 IgM 抗 Rorssman 抗 体 、. 羊 红血球 和 豚鼠 补体 系统 中 , 先 测量 出 在 补体 过 剩 的 标准 条 件 下 , 引起 50% 溶血 所 需 的 IEM 抗体 量 。 假定 每 一 个 溶血 损伤 相当 于 一 个 孔洞 , 按照 Poisson 分 布 ,在 抗体 量 足够 引起 50% 溶血 时 , 每 一 个 裂解 的 细胞 平均 应 有 1.4 个 损伤 。 然 后 , 在 相同 的 标准 条 件 下 ,用 上 述 经 确定 的 IgM ft 体 浓 度 的 不 同 倍数 来 处 理 红血球 , 并 用 电子 显微镜 观察 免疫 损伤 的 红血球 膜 碎 片 ,计数 相 当 于 一 个 红血球 全 部 细胞 膜 面积 262") 上 和 孔洞 的 数目 。 结果 发 现实 际 观察 到 的 数目 和 根据 “一 次 碰撞 ?理论 作 动 力学 计算 预期 的 损伤 点 数 是 颇 为 一 致 的 〈 图 12-19)。 因 此 , 这 些 实验 表明 在 这 一 系统 中 ， 一 个 孔洞 可 能 代表 一 个 有 效 的 足以 使 细胞 盗 解 的 免疫 损伤 。 这 是 符合 “一 次 碰撞 ?理论 的 。 但 是 , 在 另 一 实验 系统 中 ( 羊 红血球 ,家 免 IgG 抗 Forssman 抗体 和 豚鼠 补体 ), 当 补体 过 量 而 IgG 抗体 的 量 有 限制 时 , 实际 观察 到 的 孔洞 数目 和 据 “ 一 次 碰撞 ?理论 预计 的 数目 不 一 致 , 实际 观察 数目 偏 高 也 就 是 说 ,红血球 膜 上 一 损伤 点 可 能 出 现 一 群 孔 洞 (Hu- mphrey 和 Dourmashkin, 1969) 。 这 一 现象 可 能 使 补体 作用 放大 ,更 有 效 地 杀伤 细胞 。 此 外 , 对 于 某 些 实验 系统 ( 羊 红 血球 ,家 免 抗 Forssman IgM 抗体 和 人 补体 ) 也 观 察 到 免疫 损伤 造成 的 孔洞 的 实际 观测 数目 和 * 一 次 碰撞 ?理论 的 符合 程度 是 有 条 件 的 。 当 抗 体 的 量 有 限制 而 补体 过 量 时 , 膜 上 一 次 损伤 可 产生 一 群 孔洞 。 反 之 , 当 溶 细胞 作用 受到 补 体 浓度 限制 时 , 就 不 出 现 一 群 孔 洞 。 观 测 到 的 膜 孔 洞 数 目 和 按 “ 一 次 碰撞 ?理论 推测 的 Be 目 相 接 近 。 (2) 造成 一 次 免疫 损伤 (一 个 孔洞 ) 所 需 的 抗体 分 子 数目 先 利用 纯化 的 2sI 标记 的 家 免 抗 羊 红血球 Forssman 抗体 (IgM 和 IgG) 测量 每 一 个 红血球 表面 抗体 结合 点 的 最 大 数目 。 结 果 发 现 IgM 结合 点 约 为 90,000，IgG 约 为 600,000, 假定 结合 点 的 性 质 相 同 , 则 一 个 IgM 分 子 (具有 5 或 10 抗原 结合 位 点 ) 应 相 当 于 5 个 IgG 分 子 (假定 在 抗体 极端 过 量 时 IgG 通过 一 个 抗原 结合 位 点 和 膜 抗 原 结 合 ) 然后 ,可 以 用 两 种 方法 推算 造成 一 个 孔洞 所 需 的 抗体 分 子 的 数目 。 一 种 方法 是 测量 在 有 过 量 补 体 存在 时 , 引起 羊 红血球 50% 溶血 所 需 的 标记 抗体 分 子 数 量 。 假 定 每 个 溶解 细 胞 至 少 有 一 个 孔洞 ,完好 的 细胞 没有 孔洞。 于 是 , 按 “ 一 次 碰撞 理论 推算 50% 溶血 时 ， 每 细胞 平均 孔洞 数 应 为 1.4。 由 此 可 推算 出 产生 一 个 孔洞 所 需 的 抗体 量 。 另 一 种 方法 ， 用 较 大 的 已 知 量 的 标记 抗体 和 过 量 标记 补体 处 理 羊 红血球 ， 借 电子 显微镜 观察 膜 碎片 上 孔洞 的 数目 。 再 由 此 算出 产生 一 个 孔洞 所 需 的 抗体 量 。 两 种 方法 估计 的 结果 列 于 表 12-4 和 表 12-5。 表 12-4 造成 一 个 孔洞 所 需 IgM 抗体 分 子 数目 的 估计 电子 显微镜 直接 观察 法 限制 稀释 法 S076 HS LH Bt 加 入 抗体 分 子 | 观察 到 的 孔洞 CS RL) tae, | 抗体 分 子 数 /孔洞 | SPER Ei /aaia | 抗体 分 子 数 /孔洞 一 | 一 | 一 | 一 一 | 一 一 一 4.2 3.6 200 102 ae 6 34 8.2 4.1 } 3.8 3.5 2.4 3.0 3.25 IgM IgM (高 度 纯化 ) 71 34 60 21 3.4 14 fat 52 人 表 12-5 造成 一 个 孔洞 所 需 lgG 抗体 分 子 数 目的 估计 限 制 稀释 法 电子 显微镜 直接 观察 法 53092 溶 血 时 抗体 分 ; 加 人 抗体 分 子 观察 到 的 孔洞 9 一 | 一 -| 一 -一 |- -一 IgG《〔〈 高 度 纯化 ) 2,800 2,200 69,000 225 308 2,500 IgG (ERE SIAL) 9,000 6,200 510,000 211 4,100 - 8,500 206,000 213 960 从 上 表 可 以 看 出 , 2 一 3 个 IgM 抗体 分 子 就 能 产生 一 个 孔洞 ,而 IgG 需要 比 IgM 多 100 一 1000 倍数 目的 分 子 才 能 产生 一 个 孔洞 。 如 前 所 述 , HASTA kA IgM 抗体 结合 点 总 数 约 为 90,000。 因 此 必须 设想 一 个 IEM 抗体 分 子 和 膜 上 一 个 结合 点 附着 就 能 引起 一 个 孔洞 , 因为 很 难 设 想 2 一 3 个 IgM D+F 90,000 个 结合 位 置 中 , 如 何 能 有 机 会 同时 到 达 一 个 结合 点 。 同 样 地 , 据 估计 IgG 抗体 在 一 个 红血球 表面 总 共 约 有 600,000 结合 点 ,那么 至 少 要 有 800 个 IgG 抗体 分 子 随机 地 附着 , 才能 得 到 两 个 分 子 相 邻 的 机 会 。 如 果 假 定 在 此 实验 条 件 下 补体 效率 为 112.5， 则 前 一 数值 可 换算 为 1,950， 即 1950 IgG 分 子 / 孔 洞 。 这 和 实际 观测 的 数目 相差 不 远 。 因 此 , 可 以 假定 对 IEG 抗体 需要 两 个 分 子 附着 在 膜 上 相 邻 的 位 置 才 能 激活 补体 造成 一 次 免疫 损伤 (一 个 孔洞 ), IgM 则 只 需 一 个 分 子 就 能 造成 一 个 孔洞 。 这 或 许可 以 解释 IgEM 抗体 分 子 的 溶血 效率 为 什么 比 IEG 高 很 多 了 (Humphrey 和 Dourmashkin，1965) 。 (3) 孔洞 形成 的 时 期 现 已 证 明 膜 的 免疫 损伤 是 从 EACI,4,2,3,5 期 开始 的 。 将 补体 各 成 分 陆续 加 到 被 抗体 致 敏 的 红血球 时 , ROLY CS 和 膜 结合 后 ,细胞膜 上 便 开 始 出 现 可 见 的 亚 显 微 形态 的 损伤 (典型 的 孔洞 ) ; 并 且 当 继续 加 C6 一 C9 时 , 每 一 细胞 上 已 出 现 的 孔洞 数目 不 再 增多 (412-6). 如 果 用 胰 蛋 白 酶 去 除 和 膜 结合 的 Co 以 后 , 膜 损伤 仍 能 继续 存在 。 这 表明 一 当 膜 损伤 发 生 后 , 就 不 再 需要 Ch 的 存在 (Polley 等 , 1971) 。 至 于 C5 对 膜 损伤 的 作 用 方式 目前 还 不 铺 楚 。 有 人 假定 激活 的 C5 可 能 相当 于 一 种 表面 活性 剂 , 和 膜 的 脂 双 层 表 12-6 红血球 -补体 复合 物 之 亚 显 微 损 伤 复 合 物 每 一 细胞 上 损伤 数目 EA 0 EAC 1,4 0 EAC 1,4,2 0 EAC 1,4,2,3 0 EAC 1,4,2,3,5 1705 EAC 1,4,2,3,5,6 1120 EAC 1,4,2,3,5,6,7 1060 EAC 1,4,2,3,5,6,7,8 1680 EAC 1,4,2,3,5,6,7,8,9 1509 aI 2-8 @- 2 (#2 Polley 4,1971), es。 3786 发 生 站 水 性 相互 作用 ,造成 膜 的 形态 变化 。 (4) 孔洞 的 化 学 性 质 Humphrey 和 Dourmashkin (1969) 对 细胞 膜 “C” 孔 洞 的 性 质 作 过 初步 分 析 。 妆 “C” 和 孔洞 在 膜 上 出 现 后 不 久 , 用 胰 和 蛋白酶 或 pH2.5 处 理 , 使 抗体 或 补体 成 分 脱离 ,这 时 孔 洞 的 外 形 不 但 没有 变化 ,反而 轮廓 更 加 清楚 。 反 之 ,用 有 机 溶剂 处 理 , 则 全 部 消失 。 因 此 ， 推测 膜 上 的 孔洞 应 位 于 脂 双 层 , 并 假定 孔洞 的 产生 可 能 是 由 于 脂 双 层 的 重 排列 , 由 小 的 胶 束 形 成 的 环形 构造 。 Mayer (1973) 根据 细胞 膜 的 流动 镶 菊 模型 (参看 第 四 章 ，114 页 ), 进一步 提出 “C? 孔洞 构造 和 形成 机 制 的 假说 , 即 * 圈 饼 ” 模 型 (“Doughnut”model) (图 12-20) 。 他 假定 补体 的 后 几 个 成 分 ，C5 一 C9, 是 两 侧 异 性 蛋白 质 , 它们 能 穿 过 整个 细胞 膜 的 脂 双 层 , 互 相 连结 成 一 个 “ 圈 饼 ? 形 的 构造 。“ 圈 饼 ?” 外 壁 是 由 蛋白 质 分 子 的 蕊 水 性 侧 链 构 成 的 ， 亲 水 性 侧 链 则 朝 内 , 从 而 形成 一 个 稳定 的 沟通 细胞 内 外 供水 和 离子 进出 的 通道 。 由 于 活 透 压 不 平 i, 水 不 断 进 入 细胞 , 终于 造成 细胞 的 破裂 。 如 前 节 所 述 ，C5 一 9 复合 物 的 分 子 量 达 到 10°, 足以 形成 一 个 直径 100A 的 孔道 。 其 次 ,这 种 孔洞 能 被 脂 溶 剂 破坏 , 而 不 能 被 蛋白 酶 去 除 的 上 述 观察 ,也 可 以 作 这 样 的 解释 : 假定 孔洞 穿 过 整个 脂 双 层 , 当 蛋 白质 构造 被 去 除 后 , 留 下 来 的 孔洞 仍 可 能 相当 完整 地 保存 下 来 。 这 一 假说 后 来 得 到 一 些 电 子 显 微 镜 观察 结果 的 支持 。 有 人 用 冰冻 蚀刻 法 观察 羊 红 血 球 细胞 膜 , 发 现 当 用 抗体 和 补体 处 理 时 , 脂 双 层 的 内 层 有 “ 圈 饼 ” 样 的 蛋白 质 聚 集 ， 单 用 抗 体 处 理 则 没有 (Seeman 等 , 1973) (图 12-21) 。 电子 显微镜 观察 脂 微 体 膜 受 到 的 补 th 图 12-20 “Cc” 和 孔洞 的 构造 一 “ 圈 饼 > 模型 。 补 体 的 后 几 个 成 分 c5，C6，Cc7，C8 MICO 穿 过 膜 的 脂 双 层 ,连结 成 一 个 环形 的 孔道 。 由 于 渗透 压 不 平衡 ,水 和 离子 不 断 地 通过 这 一 孔洞 进入 细胞 而 使 细胞 破裂 ( 据 Mayer, 1973), © 379 。 j ee Mv 12-21 羊 红 血球 细胞 膜 之 冰冻 蚀刻 观察 ， 上 图 : 单 用 免 抗 羊 红血球 抗体 处 理 之 羊 红 血球 膜 脂 双 层 剥 离 的 内 层 表面 。 正常 存 在 的 球 蛋 白 颗粒 (9 毫 微米 ) 没 有 变化 。 义 210,000 倍 。 下 图 : 经 免 抗 体 和 补体 溶血 的 羊 红血球 细胞 膜 剥 离 的 内 层 表 面 。“ 圈 饼 ? 状 损伤 似 FREIME. X%210,000 倍 ( 据 Seeman 等 ;1973)。 损伤 , 发 现存 在 穿 过 脂 层 的 漏斗 形 构造 (Lachman 等 , 1973) (图 12-22) 。 无 其 有 趣 的 是 ,有 时 还 可 以 看 到 一 些 脱离 脂 膜 表面 的 游离 的 环形 构造 , 似乎 像 是 由 补体 蛋白 组 成 的 。 这 种 解释 是 否 属实 ,还 有 待 于 鉴定 其 上 是 否 确 有 补体 成 分 的 存在 。 近 来 用 I 标记 和 膜 结合 的 C5b,6,7 复合 物 , 再 用 胰 蛋 白 酶 消化 的 实验 , 提示 C5b,6,7 BAMA C5b 和 C7 亚 基 的 芷 水 性 侧 链 可 能 先 戏 人 脂 双 层 ,然后 再 和 C8，C9 Riv, 形成 穿 过 膜 层 的 孔道 (Hammer 4, 1975). (5) 细胞 膜 和 免疫 损 伤 的 生物 学 意义 补体 作为 辅助 抗原 抗体 反应 的 效应 分 子 , 起 着 扩大 免疫 反应 并 使 之 更 为 有 效 的 作用 。 如 一 个 IEM 抗体 分 子 和 细胞 表面 抗原 结合 , 在 有 补体 参加 时 ， 就 足以 杀 死 一 个 靶 细胞 。 这 一 过 程 中 , 专 一 抗体 分 子 起 着 识别 靶 细 胞 的 作用 ,再 由 补体 扩大 影响 ,完成 对 靶 细 胞 的 杀伤 。 这 对 于 抗体 对 抗 细菌 ,病毒 感染 和 肿瘤 免疫 等 防御 机 制 的 重要 意义 是 显而易见 的 。 另 一 方面 ,抗原 抗体 复合 物 和 补体 的 相互 作用 又 可 造成 正常 组 织 的 免疫 损伤 。 因 此 , 补体 溶 细 胞 作用 在 正常 和 病理 生物 学 方面 都 是 很 重要 的 。 免疫 溶 细胞 作用 的 效率 和 靶 细 胞 表面 抗原 决定 簇 的 排列 方式 有 密切 的 关系 。 当 靶 细 胞 表面 抗原 决定 簇 呈 规则 的 紧密 排列 时 ， 一 个 IEM 抗体 分 子 和 细胞 表面 抗原 呈 多 价 结 合 ,或 者 两 个 IgG 抗体 分 子 能 同时 相 邻 地 附着 到 细胞 表面 上 的 机 会 也 就 增多 ， 免 疫 损 伤 因而 也 较 易 发 生 。 红 血球 表面 的 Forssman 抗原 和 格 兰 氏 阴性 细菌 表面 的 “9” 抗 原 的 排列 结构 都 能 满足 这 种 要 求 。 另 一 方面 ,有 人 设想 肿瘤 细胞 在 癌变 过 程 中 , 表面 抗原 结构 。380。 图 12-22 ” 卵 磷 脂 制备 的 脂 微 体 膜 (10 或 11 毫 微米 ) 上 ,补体 造成 的 漏斗 形 的 损伤 ( 据 Lachman 等 ,1973)。 或 排列 发 生变 化 ， 不 能 满足 补体 有 效 作用 所 需 的 条 件 ， 因 而 可 能 逃脱 体液 抗体 的 杀伤 作 用 。 补体 激活 只 有 发 生 在 细胞 表面 上 或 非常 接近 表面 的 地 方 , 才能 产生 溶 细胞 作用 。 例 如 将 细菌 的 “9” 抗 原 ( 脂 多 糖 ) 附着 到 羊 红血球 膜 上 , 再 用 抗体 和 补体 处 理 时 ， 很 容易 产 生 免 疫 损伤 。 但 是 ,将 肺炎 球菌 3 型 芙 膜 多 糖 (Ss) 附着 到 红血球 膜 上 ,只 有 用 过 量 的 抗 Ss 抗体 远 超过 血 凝 反应 或 补 定 固定 的 需要 量 才能 引起 溶血 。 电 子 显 微 镜 观察 发 现 ,多糖 在 红血球 表面 堆 集成 不 均匀 的 团 块 不 贴近 表面 。 虽 有 广泛 的 补体 固定 ， 但 很 少 能 贴近 细 胞 表面 产生 效果 。 也 就 是 说 , 补体 只 能 在 非常 靠近 细胞 表面 的 距离 才 有 效 。 这 是 由 于 激 活 的 补体 成 分 半衰期 很 短促 的 缘故 。 由 于 这 种 特性 就 大 大 减少 了 激活 的 补体 对 细胞 的 非 专 一 损伤 的 可 能 性 。 已 知 某 些 类 别 的 抗体 (IgE, IgD 等 ) 不 能 激活 补体 。 能 激活 补体 的 抗体 的 效率 也 有 所 不 同 。 IgM 抗体 分 子 的 溶 细胞 效率 比 IgG 高 许多 倍 。 IgM 和 IgG 的 这 种 差异 ,也 许 说 明了 在 免疫 过 程 早期 暂时 出 现 的 , 亲 合 力 低 的 IEM 分 子 , 为 什么 在 进化 过 程 中 能 保 存 下 来 的 原因 。 对 格 兰 氏 阴性 细菌 ,溶菌 酶 能 加 强 抗体 和 补体 的 作用 。 整个 机 制 似乎 适 应 于 充分 利用 亲 合 力 低 的 “天 然 ”IEM 抗体 ， 以 及 在 初级 免疫 反应 早期 产生 的 IgM 抗 体 。 这 也 可 能 是 IGM 能 不 被 淘汰 的 另 一 个 原因 。 、 和 补体 有 关 的 免疫 学 现象 近年 来 发 现 补体 的 生物 学 作用 不 限于 溶 细 胞 作用 。 补 体 激 活 过 程 中 产生 的 中 间 复 as。 381 « Vi" SOMA ER, ILFRBRABESWEDMED. 补体 之 中 间 复 合 物 和 片段 的 生物 活力 列 于 5212-7. 127 补体 成 分 和 产物 的 生物 学 活力 补体 复合 物 ms ar et 功 能 Cl,4 免疫 共 凝 聚 作用 CT 区 到 附着 白血球 共 凝 聚 作 用 释放 组 织 胺 免疫 粘着 作用 免疫 共 凝 聚 作用 调理 作用 C3a 过 敏 毒 素 化 学 吸引 素 Cs5a 过 敏 毒 素 化 学 吸引 素 C154 52735516 Arthus 反应 释放 组 织 胺 C(567)a 化 学 吸引 素 ©O1)4, 38586579 缓慢 溶血 溶血 C1,4,2,3,5,6,7,8,9 溶 细菌 作用 溶 病毒 作用 ( 据 Ingram 和 Quinn, 1972), MERA, 免疫 学 中 许多 具有 重要 的 病理 生物 学 意义 的 现象 是 和 补体 或 其 产 物 有 关 的 。 这 些 现象 包括 吞噬 细胞 的 化 学 吸引 、 免 疫 粘 着 、 共 凝聚 作用 和 免疫 共 凝 聚 作用 、 过 敏 反应 和 灭 菌 素 (Properdin) 等 (Schultz，1971) 。 近来 还 发 现 C6 和 凝血 机 制 有 关系 。 现 分 述 如 下 : (—) 多 形 核 白血球 的 化 学 吸引 多 形 核 白 血球 被 吸引 ,向 局 部 集中 是 炎症 反应 的 先决 条 件 。 豚 鼠 和 家 免 的 血清 和 免 疫 复合 物 或 细菌 内 毒素 作用 时 ， 产 生 一 种 低 分 子 量 的 、 耐 热 的 多 形 核 白 血球 化 学 吸引 因 素 , 经 证 明 为 Cha 片段 。 人 类 嗜 中 性 球 至 少 对 三 种 补体 复合 物 或 产物 (C5,6,7，C3a 和 Cha) 起 化 学 吸引 反应 , 而 发 生 定向 的 移动 。 化 学 吸引 因素 的 作用 可 能 是 通过 细胞 膜 上 酯 酶 的 激活 (Ward，1972) 。 近来 还 有 人 从 大 鼠 血 清 中 分 离 出 过 敏 毒素 和 与 其 有 关 的 一 种 多 肽 , 称 为 助 细胞 吸 引 素 (Cocytotaxin), 后 者 是 一 种 碱 性 多 肽 (分 子 量 为 8,500) ， 本 身 并 没有 过 有 敏 毒素 活 和 性 ,单独 存在 时 也 不 表现 出 什么 中 性 球 化 学 吸引 活性 。 然 而 , 当 把 它 和 过 敏 毒素 混合 时 ， 便 表现 出 明显 的 对 中 性 球 的 化 学 吸引 作用 。 因 此 ， 中 性 球 的 化 学 吸引 是 两 种 多 肽 共同 作 “382。 用 的 结果 (Wissler，1972; Wissler 等 ,1972) 。 豚鼠 的 两 种 IgG 抗体 (71 和 Y2), 因 其 免疫 复合 物 固定 补体 能 力 不 同 , 引起 的 免 疫 反 应 也 不 同 。 7Y2 抗体 和 抗原 结合 后 能 固定 补体 ,产生 白血球 化 学 吸引 素 , 招致 大 量 多 形 核 白 血球 聚集 到 免疫 复合 物 沉积 的 地 方 ,造成 局 部 的 炎症 和 坏死 ,出 现 所 谓 的 Arthus 反应 。Y1 抗体 的 免疫 复合 物 不 能 固定 补体 ， 结 果 只 产生 被 动 皮 肤 过 敏 反 应 (PCA). Keller 等 (1968) 发 现 Y2 抗体 的 免疫 复合 物 和 正常 豚鼠 血清 保温 时 ,产生 的 白血球 化 学 吸引 力 比 Y1 引起 的 高 三 倍 。 这 一 实验 也 支持 上 述 解释 。 这 些 结果 表明 , 因 免 疫 球 蛋 白 固定 补体 能 力 不 同 而 影响 其 产生 的 白血球 化 学 吸引 活力 ,最 终 反 映 在 整体 水 平 的 免疫 反应 便 有 显著 的 不 同 。 (=) 免疫 粘着 现象 s 免疫 粘着 现象 (Immuno-adherence) 最 初 是 指 抗原 -抗体 -补体 复合 物 粘 着 到 灵 长 类 未 致 敏 的 红血球 上 的 现象 (Nelson，1953) 。 颗粒 抗原 的 免疫 复合 物 在 有 新 鲜血 清 存 EM, 便 被 粘 附 到 红血球 表面 ,然后 一 同 被 白血球 吞噬 。 此 过 程 需要 补体 C1I—C4, LH 是 C3 的 参加 。 近 年 来 发 现 这 一 现象 在 抵抗 感染 和 其 他 免疫 病理 学 效应 中 有 重要 意义 。 抗体 对 抗原 的 识别 而 形成 的 免疫 复合 物 , 在 有 补体 参加 时 , 又 能 被 许多 细胞 (包括 嗜 中 性 球 、 嗜 酸性 球 , 单 核 球 、 血小板 .红血球 .淋巴 球 以 及 网 状 内 皮 系 统 的 细胞 ) 识别 ， 而 被 粘 附 到 这 些 细胞 的 表面 ,进而 激发 细胞 的 吞 吻 活 动 或 释放 出 种 种 生物 活性 物质 ,5 引起 它们 对 抗 原 ( 微 生物 或 细胞 等 ) 的 吞噬 或 破坏 (图 12-23) 。 后 来 的 研究 发 现 这 些 细胞 对 抗原 -抗体 - 补体 复合 物 的 识别 是 由 于 它们 的 表面 存在 C3b 受 体 (McConnell 和 Lachman, 1977), Meh PEER, ER BAe) 和 抗原 -抗体 -补体 复合 物 粘 着 的 最 重要 结果 是 诱发 对 免疫 复合 物 的 吞 唆 活 动 ,结果 抗原 (微生物 .细胞 等 ) 被 吞噬 胞 内 释放 的 酶 消化 。 颗 粒 抗原 和 和 白血球 之 间 的 免疫 粘着 是 它们 被 吞噬 的 先决 条 件 。 然而 , 免疫 粘着 和 吞 吻 活 动 又 是 彼此 独立 的 过 程 ,可 被 一 些 抑制 因素 ,如 DFP, Gams 酸 等 区 别 开 来 , 即 只 发 生 免 疫 粘着 而 没有 吞 吻 活 动 。 当 嗜 中 性 球 和 一 个 面积 庞大 的 免疫 复合 物 , 如 大 片 基 膜 接触 时 , 虽 不 能 吞噬 它 , 但 仍 能 释放 出 各 种 溶 酶 体 酶 (包括 胶原 酶 、 弹 性 纤维 酶 .中 性 和 酸性 蛋白 酶 以 及 增加 血管 通 透 性 的 物质 ) 去 消化 它 。 Ak, 免疫 粘着 反 应 本 身 可 能 起 发 动 白血球 吞 吻 活 动 和 酶 的 释放 的 作用 。 另 一 方面 ,抗原 抗体 复合 物 RMR 附 在 酵母 多 糖 (Zymosan) 上 的 C3 和 血小板 粘着 时 ， 就 能 激发 血小板 释放 出 内 & 物 ， 如 组 织 胺 、5- 羟 色 胺 等 ,引起 各 种 病理 生物 学 效应 。 由 上 述 可 见 ， 免 疫 粘着 现象 在 一 些 免疫 性 疾病 和 自身 免疫 病 的 发 病 机 制 中 可 能 起 重 要 作用 。 例 如 , 肾 小 球 肾 炎 中 , 免疫 复合 物 ( 抗 体 、 补 体 ) 和 肾 小 球 基 膜 结合 ,吸引 嗜 中 性 球 粘着 到 基 膜 表面 ,并 释放 出 各 种 酶 破坏 基 膜 ,造成 肾 小 球 的 损伤 。 家 免 实 验 急 性 免疫 复合 物 病 中 , 免疫 复合 物 沉 积 在 血管 内 弹性 层 和 基 膜 上 , 结果 嗜 中 性 球 也 附着 到 这 些 表 面 ， 造 成 血管 内 弹性 层 的 破坏 和 内 部 的 坏死 。 总 之 , 免疫 复合 物 固定 补体 是 造成 组 织 损伤 的 第 一 步 , 由 此 诱发 的 补体 反应 的 产物 ,吸引 多 形 核 白血球 到 这 里 , 而 固定 的 C3 又 使 这 些 细 胞 粘着 于 局 部 并 释放 出 酶 和 其 他 生物 活性 物质 ， 造 成 组 织 损伤 或 其 他 病变 (Henson, 1972). pa | wire BAK art < « r 90 (a). °(oz6s X) BeKGe ova Rea He 本 ae sD: Se 819(0609%)8 KO 4.030) he “se a Y 要 Ame a ¥ a one my a 图 (ussouatz) 8 & te Hl fo “ae Gh. ee tr (00g“) SIGMA (va) Le Ne ae © “Coe! €x) eaees ove ae HAN SUT ER wee ry SO A NR €e-Z1 ©3846 =) 共 凝 集 作 用 和 免疫 共 凝 集 作 用 红血球 或 细菌 等 颗粒 抗原 , 当 有 某 些 抗体 或 类 似 抗体 的 反应 物 存在 并 结合 补体 时 , 发 生 的 凝集 现象 。 参 与 这 类 现象 的 有 两 类 反应 物 。 共 凝集 素 (Conglutinin) Ase RIE 集 素 (Immunoconglutinin), 相应 的 凝集 现象 称 为 共 凝 集 作 用 (Conglutination) 和 免疫 共 北 集 作 用 (Immunoconglutination) 。 共 凝 集 素 是 牛 血清 内 天 然 存 在 的 一 种 和 免疫 球 蛋白 无 关 的 血清 蛋白 质 〈8- 球 蛋白 )， 它 能 和 被 固定 的 补体 (C3b) 结合 ,而 引起 颗粒 抗原 的 凝集 现象 ,其 生物 学 意义 还 不 清楚 。 免疫 共 凝 集 素 是 一 种 自身 抗体 , 能 和 被 固定 的 补体 的 决定 簇 起 反应 。 在 大 多 数 哺乳 类 正常 血清 中 均 有 低 效 价 的 免疫 共 凝 集 素 存在 ,尤其 在 急性 感染 的 晚期 和 康复 期 较为 © 著 。 免 疫 共 凝 集 素 的 生物 学 意义 还 不 甚 清楚 。 目 前 知道 免疫 共 凝 集 素 能 加 强 补 体 的 活 力 , 增 强 抵 抗 感染 的 能 力 、 血 清 的 杀菌 能 力 和 吞噬 作用 。 但 是 ,免疫 共 凝 集 素 对 微生物 并 没有 专 一 的 作用 , 它 本 身 也 不 是 微生物 的 抑制 物 ,其 活力 依赖 补体 ， 可 能 是 通过 加 强 补体 的 效应 而 起 作用 的 (Ingram, 1972; Lachman 等 ,1972) 。 (四 ) xt te me 素 正常 豚鼠 血清 在 加 入 抗原 和 相应 的 抗体 后 能 产生 毒性 物质 。 除去 免疫 复合 物 外 , 高 I+. RD. 琼脂, 酵母 多 糖 和 眼镜 蛇 蛇 毒 等 也 能 使 正常 血清 产生 这 种 物质 。 早期 研究 者 曾 认 为 这 种 毒性 物质 就 是 引起 过 敏 性 休克 的 主要 原因 ， 因 此 称 为 过 敏 毒素 (Anaphy- latoxin) (Freideberger, 1910), 经 典 的 过 敏 毒 素 表现 下 述 生 物 学 活性 : 1) 引起 平滑 肌 标 本 (豚鼠 得 肠 ) 收缩 。 当 用 同一 种 过 敏 毒素 重复 刺激 时 , 对 刺激 不 再 起 反应 , 即 发 生 脱 敏 现 象 (Tachyphalaxis) 。 脱 敏 作 用 的 专 一 性 是 确定 过 敏 毒 素 之 功 能 专 一 性 的 最 有 效 的 方法 。 如 果 一 个 因素 引起 脱 敏 状态 后 , 改换 另 一 因素 刺激 时 仍 RA 起 反应 , 称 为 交叉 脱 敏 现 象 (Cross-Tachyphylaxis), 交叉 脱 敏 表明 它们 的 作用 方式 和 受 体 有 相似 的 地 方 。 2) 增加 血管 (微血管 后 小 静脉 ) 的 通 透 性 ; 3) 能 使 豚鼠 组 织 内 肥大 细胞 释放 组 织 胺 , 而 对 大 鼠 腹 腔 肥 大 细胞 则 无 作用 ; 4) 离 体 和 活体 条 件 下 , 均 能 吸引 多 形 核 白 血球 ; 5) 整体 血管 内 注射 引起 依赖 剂量 的 组 织 胺 休克 和 全 身 性 过 敏 ; 某 些 器 官 血 流 阻力 增 加 。 Osler 等 (1959) 发 现 将 免疫 复合 物 加 入 豚鼠 和 大 鼠 血 清 中 ,能 产生 过 敏 毒素 活力 ， 同时 血清 内 “经 典 的 C3” 减 少 。 因 此 , 推测 过 敏 毒素 和 补体 反应 有 关系 。 补 体 成 分 纯 化 成 功 后 , 发 现 当 Cis 加 入 到 C4, C2 和 C3 溶液 中 ,在 有 Mgt+ 存在 时 ,能 产生 过 敏 毒 素 活 力 。 进 一 步 的 分 析 证 明 ，C1s 作用 于 C4 和 C2， 形 成 C3 转化 酶 。 后 者 再 把 C3 切 成 C3a 和 C3b 两 个 片段 。C3a 表现 过 敏 毒 素 活力 和 白血球 化 学 吸引 活力 。 不 过 当 用 胰 和 蛋白酶 长 时 间 处 理 时 , 过 敏 毒素 活力 消失 而 化 学 吸引 活力 仍然 保留 下 来 。 由 此 可 见 ,二 者 在 化 学 性 质 上 是 不 同 的 。 除 C3 转化 酶 外 ,眼镜 蛇 蛇 毒 因 子 , 链 激酶 激活 的 纤 溶 酶 和 胰 *。385。 蛋白 酶 都 能 分 解 C3,， 产生 豚鼠 平滑 肌 收 素 因 素 。 如 前 节 所 述 ,现在 已 经 知道 ，C3 是 由 和 有 两 条 肽 链 构成 的 。 C3 转化 酶 作用 于 a 链 ,将 C3 分 解 为 两 个 片段 ; C3a 分子量 约 9,000) 和 C3b 分子量 约 181;000) (Nilsson- 和 :Mapes，1973) 。 C3a AUN 端 经 测定 为 Ser，C 端 为 Argo C3b 的 C 端 不 能 测 出 (Miller-Eberhard，1972) 。 已 知 原 C3 分 子 的 N 端 为 Ser，C 端 不 能 测 出 。 据 此 推测 ，Cs3a 是 从 原 分 子 靠 N 端 一 段 切 下 来 的 (图 12-24) 。 同 时 ，C3 转化 酶 能 切断 包含 Arg 残 基 的 羧基 的 肽 键 , 此 酶 的 性 质 是 和 胰 蛋 白 酶 相似 的 。 纯化 的 C3a 是 由 77 氨基 酸 残 基 组 成 的 一 条 多 肽 链 , 碱 性 很 强 。 分 子 的 碱 性 是 由 于 含有 相当 多 的 酰胺 基 团 , 尤其 是 靠 C 端 Arg 处 碱 性 残 基 的 密度 特别 高 ，C 端 13 个 残 基 中 有 6 个 为 碱 性 的 。 C3a 结构 的 另 一 个 特点 是 含有 大 量 的 w- 螺 旋 构 造 (40 一 45%) (Hugli，1974) 。 C3a 能 表现 过 敏 毒 素 的 种 种 生物 活性 ,如 引起 肥大 细胞 释放 组 织 胺 、 平 — nH, (Serjc5a( 过 敏 毒素 ) eS cal COOH ms COOH C3b( 激 活 ) 图 12-24 C3a 被 C3a 转化 酶 激活 并 释放 ,以 及 C3a 过 敏 毒素 失 活 的 假想 图 (图 中 AT- 抑 制剂 应 为 AT- 抑 制 因子 ) GE Miller-Eberhard, 1972), 滑 肌 收 缩 和 增加 血管 通 透 性 等 。 当 注 射 到 人 皮肤 内 ， 能 引起 红斑 和 肿块 ， 只 需 2x10 克 分 子 剂量 就 能 引起 典型 反应 (Miller-Eberhard，1972) 。 此 外 , 还 发 现 C3a 的 生物 活性 依赖 于 C 端 Arg 残 基 的 完整 性 , 此 残 基 被 酶 切除 时 , 多 肽 便 失 去 生物 活性 。 作 为 一 种 控制 机 制 , 人 血清 中 天 然 存 在 一 个 羧 肽 酶 ,能 将 C3a 的 C 端 Are 切除 ,因而 能 有 效 地 防止 人 血清 在 离 体 条 件 下 产生 过 敏 毒素 活 性 (Bokisch 和 Miller-Eberhard, 1970), 然而 , 当 用 免疫 吸附 法 去 除 此 天 然 的 抑制 因子 ,或 用 s- 氮 基 已 酸 抑 制 其 作用 时 ,人 血清 就 很 容易 产生 过 敏 毒素 活力 。 此 抑制 因子 经 鉴定 为 一 种 oR BA (FHA 300,000) (Vallota 和 Miiller-Eberhard, 1973), 人 和 猪 的 C3a 的 一 级 结构 已 见报 告 ( 图 12-25) 。 SFC 端 Arg 残 基 在 功能 上 的 重要 性 , 比较 了 这 两 种 分 子 的 C 端 排列 顺序 ,发现 C 端 5 7H (-Leu-Gly-Leu-Ala- Af-COOH) 是 完全 相同 的 。 因此 ， 推 想 C 端 5 肽 可 能 和 过 敏 毒素 活性 有 密切 的 关系 (Corbin 和 Hugli，1976) 。 Ch 转化 酶 或 胰 蛋 白 酶 作用 于 纯化 的 Co 时 ， 也 能 产生 过 敏 毒素 活力 (Jensen, 1967), 分 离 出 的 有 效 因 子 相 当 于 Cha 片段 (分 子 量 约 为 15,000) 。 Cha 同时 也 表现 化 学 吸引 活力 。 和 C3a 一 样 ，C5a 的 结构 特点 是 含有 大 量 的 wx- 螺旋 构造 。 当 用 人 斑 基 乙醇 处 理 时 ，wx- 螺 旋 构 造 的 特征 性 圆 二 色谱 和 其 过 敏 毒 素 活 力 都 逐渐 降低 到 一 极限 值 。 *。386。 NH,-Ser-Val—GIn-Leu-Met-Glu-Lys—Arg—Met- 10 _ 20 Asn-Lys-Leu-Gly-Gln-Tyr-Ser-Lys-Glu-Leu-Arg- 30 Arg-Cys-Cys-Glu-His-Gly-Met-Arg-Asn-Asn-Pro- 40 Met-Lys-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Ala-Gln-Phe- ; | ee Ile-His-Gln-Gly-Asn=Ala-Cys-Val-Lys-Ala-Phe- 人 60 Leu-Asn-Cys-Cys-Glu-Tyr-Ile-Ala-Lys-Leu-Arg- 70 Gln-Gln-His-Ser-Arg-Asn-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu- 77 Ala-Arg-COOH 图 12-25 %§% C3a 分 子 的 一 级 结构 ( 据 Corbin 和 Hugli, 1976), 这 说 明 其 生物 活性 和 w- 螺 旋 结构 的 完整 性 可 能 有 密切 的 关系 (Morgan 等 , 1974) 。 人 C3a 和 Cha 对 豚鼠 平滑 肌 没有 交叉 脱 敏 反 应 。 这 两 种 因子 和 豚鼠 的 过 敏 毒素 也 没有 交叉 脱 敏 反应 。 因 此 ,这 几 种 分 子 可 能 具有 不 同 的 化 学 结构 。 进 一 步 研 究 发 现 , 豚 饼 平 滑 肌 对 经 更 的 过 和 毒素 (经 琼脂 处 理 的 大 鼠 血 清 ) 的 连续 刺激 不 起 反应 ( 脱 敏 ) 以 后 ， tt Cha RAMA RM, MH C3a 则 能 起 反应 。 C5a 片 仆 和 经 典 的 过 敏 毒素 一 样 ， 都 不 能 引起 大 鼠 腹 腔 肥 大 细胞 释放 组 织 胺 ,但 能 使 豚鼠 肠系膜 肥大 细胞 的 颗粒 消失 。C3a SLAB. 能 使 大 鼠 腹 腔 肥 大 细胞 释放 组 织 胺 ,而 不 能 使 豚鼠 肥大 细胞 的 颗粒 消失 。 因 ik, Coa 的 作用 更 类 似 经 典 的 过 敏 毒素 ,可 能 代表 Freideberger (1910) 称 为 “过 丝 毒 素 ” 的 物质 。 (i) KR wR Pillmer (1954) 发 现 一 种 血清 蛋白 质 能 杀 死 某 些 细菌 、 原生 动物 ， 并 能 使 一 些 病 毒 失 活 , 称 之 为 灭 菌 素 (Properdim os 二 灭 菌 素 在 17"C， 当 有 镁 离子 和 某 些 不 能 透析 的 血清 因子 存在 时 , 能 和 酵母 多 糖 相互 作用 ,形成 一 个 复合 物 。 这 一 复合 物 能 使 C3 分 解 成 C3a 和 C3b。 不 能 透析 的 因子 包括 一 个 对 腊 敏 感 的 蛋白 质 (因子 A) 和 一 个 不 耐 热 的 蛋白 质 (因子 B) 。 后 来 查 明 , 因子 A 可 能 就 是 C3 或 C3 的 较 大 的 片段 ,类 似 C3b, 也 称 为 激活 的 肝 敏 因子 (HSFa) (Goodkofsky 等 , 1973) 。 因子 B 可 能 相当 于 一 个 血清 ARIE (C3 SUBIR, C3-Proactivator, fj C3PA), C3PA 激活 时 ,分 解 转化 成 C3A, 后 者 能 将 C3 分 解 为 C3a 和 C3b, C3PA 的 激活 又 是 由 于 血清 中 的 一 个 酶 ， 称 为 C3PA 转化 酶 催化 的 , 它 的 作用 要 求 HSFa (C3b) 和 镁 离子 存在 。 有 人 认为 灭 菌 素 的 作用 可 能 是 参与 C3PA 转化 酶 的 激活 ,从 而 发 动 补体 激活 支 路 , 达到 溶菌 作用 (Go- tze 等 , 1973)。 这 在 下 一 节 还 要 讲 到 。 关于 灭 菌 素 的 化 学 本 质 ， 很 长 时 间 不 清楚 。 有 人 曾 认为 它 是 一 种 抗 细菌 多 糖 的 “天 Ye” hie (Nelson，1958) 。 相隔 十 年 后 ，Pensky 等 (1968) 才 从 人 血清 得 到 纯化 的 灭 莫 素 , 证明 是 分 子 量 约 为 223,000 的 蛋白 质 。 它 在 免疫 电泳 上 位 于 8- 球 蛋白 区 ， 和 各 种 已 知 的 免疫 球 蛋白 , 补体 成 分 都 没有 交叉 反应 。 纯 化 的 灭 菌 素 加 人 到 缺少 灭 菌 素 的 血清 中 ,能够 恢复 杀菌 和 溶血 作用 。 因 此 , 灭 菌 素 是 一 种 不 同 于 已 知 的 免疫 球 蛋 白 或 补体 成 分 ¢ 387 « 的 血清 蛋白 ,能 参与 人 血清 的 某 些 免疫 反应 。 最 近 , 同 一 实验 室 进一步 证 明 ， 灭 菌 素 是 分 子 量 184,000 土 12,000 的 糖 蛋白 。 天 然 的 灭 菌 素 分 子 是 一 个 四 聚 体 ， 由 4 个 大 小 相同 的 亚 基 ( 分 子 量 =46,000) 以 非 共 价 键 相 连 而 成 。 因 此 , 和 免疫 球 蛋 白 有 完全 不 同 的 基本 结 构 (Minta 和 Lepow，1974) 。 CA) fe #E 8 fo 许多 能 够 激活 补体 的 物质 , 包括 菊 粉 ,细菌 内 毒素 、 链 球菌 蛋白 A、Ig ReDS, 能 通过 补体 介 导 途径 引起 凝血 。 这 些 物 质 能 显著 地 加 速 正 常 家 兔 血 凝 和 血块 收缩 速度 。 这 种 促进 凝血 活力 ,需要 完整 的 补体 系统 存在 。 遗 传 上 缺少 C6 的 家 免 , 几 乎 完全 失去 促 进 血 凝 的 能 力 , 当 加 和 少量 纯化 的 人 的 C6 后 ,就 又 恢复 正常 的 促进 能 力 。 进一步 研 究 发 现 , 这 种 家 兔 所 有 经 典 的 凝血 因子 都 齐全 ,无 一 缺失 ,并 且 纯 化 的 C6 内 也 不 夹杂 任何 BMAF. BBN, C6 蛋白 的 溶血 活力 和 促 血 凝 活力 也 重合 在 一 起 。 因 此 ，C6 很 A RAS RMA (Zimmerman 4, 1971; Zimmerman 和 Miiller-Eberhard, 1971)', 此 外 ， 还 有 大 发 现 C2 的 片段 有 类 似 激 肽 〈Kinin-like Substance) 的 活力 (Le- pow，1971) 。 总 之 ,补体 作为 机 体 防 御 系 统 不 可 缺少 的 组 成 部 分 ， 可 能 参与 炎症 反应 的 各 个 环节 ， 包括 组 织 胺 的 释放 、 血管 通 透 性 增加 ,吸引 白血球 以 及 促进 吞 哦 作用 等 。 补 体 ， 一 方面 通 过 和 抗原 抗体 系统 的 连接 , 扩大 抗体 的 效应 功能 , 而 起 专 一 的 防御 作用 ; 另 一 方面 ,各 种 非 专 一 的 损伤 刺激 , 化 学 的 或 物理 的 ,都 可 能 通过 各 种 反应 支 路 激活 补体 系统 和 引起 依赖 于 补体 产物 的 病理 过 程 , 如 炎症 反应 ,吞噬 活 动 等 ， Piper cae eae 的 防御 作用 。 这 些 KE FWRI 五 、 补 体 激活 支 路 除去 上 述 补体 激活 的 经 典 途 径 以 外 , 近年 来 还 发 现 补体 成 分 ， 特 别 是 C3 以 后 的 成 分 ,还 可 能 通过 其 他 的 支 路 , 即 不 通过 和 细胞 表面 抗原 抗体 复合 物 的 相互 作用 ， 而 被 某 些 物质 直接 激活 。 这 些 物质 中 了 解 得 最 清楚 的 有 酵母 多 糖 . 菊 糖 , 革 兰 氏 阴性 细菌 内 毒素 和 眼镜 蛇 蛇 毒 因子 (CVF) 等 。 它 们 能 固定 C3 一 C9 补体 成 分 , 但 相当 少 地 或 完全 不 能 固 定 C1,C4 和 C2。 其 中 一 些 物质 能 诱发 C3 以 后 的 整个 补体 反应 系列 ， 并 导致 溶 细胞 作用 。 关于 补体 激活 支 路 的 知识 主要 是 通过 酵母 多 糖 和 眼镜 蛇 蛇 毒 因子 对 血清 活力 影响 两 方面 独立 进行 的 工作 取得 的 。 如 前 节 所 述 ( 387 页 ) ，Pillemer (1954) 首先 发 现 ， 正 常 血清 中 天 然 存在 一 种 蛋白 质 成 分 一 一 灭 菌 素 , 在 没有 专 一 抗体 的 条 件 下 , 它 能 和 酵母 多 糖 起 反应 ,激活 补体 系统 。 灭 菌 素 系统 的 杀菌 作用 需要 一 种 肝 敏 因子 (A 因子 ) 和 一 种 不 耐 RAF (B 因子 ) 以 及 Mg ” 存在。 后 来 发 现 A 因子 就 是 C3， 而 B 因子 是 C3 激活 原 〈C3Proactivator，C3PA)。 当 B 因子 被 另 一 个 D 因子 激活 时 ，B 因子 的 分 子 就 裂 解 为 电泳 迁移 率 不 同 的 两 个 片段 ,Ba 和 Bb, 因此 ， 后 来 又 把 了 因子 称 为 C3PA 转 es 388。 化 酶 。 SL, 因子 的 功能 不 是 通过 灭 菌 素 系统 的 研究 ， 而 是 通过 对 眼镜 蛇 蛇毒 因子 作用 机 制 的 研究 才 发 现 的 。 Flexner 和 Noguchi (1903) 最 先 观察 到 眼镜 蛇 蛇 毒 对 补体 的 作用 ,并 且 不 久 就 发 现 蛇毒 作用 于 C3, 而 和 Cl1，C4， 及 C2 无 关 。 Miiller-Eberhard 和 Fjellstrom (1971) 证 明 纯 化 的 眼镜 蛇 蛇 毒 因子 (CVF) 本 身 不 表现 酶 活力 ,并 不 能 分 解 C3。 为 了 激活 C3， 至 少 还 需要 和 血清 中 的 一 个 辅助 因子 ,，C3 激活 原 (C3PA) 〈 也 就 是 B 因 子 ) 结 合 形成 一 个 复合 物 CVF-B, 才能 获得 酶 活力 在 C3PA 转化 酶 (D 因子 ?的 作用 下 ， CVF-B 复合 物 才 获得 C3 转化 酶 的 活性 , 能 把 C3 裂解 为 C3a 和 : C3b, HSRMABA 胞 活性 的 C5b-9 复合 物 的 形成 。 £5, Miiller-Eberhard (1974,1975) 在 总 结 这 两 方面 工作 的 基础 上 , 提出 一 个 通 过 灭 亩 素 起 始 的 补体 激活 支 路 的 假说 。 参 加 补体 支 路 的 蛋白 质 及 其 和 灭 菌 素 系统 诸 因 子 的 关系 列 于 表 12-8。 #128 参加 补体 反应 支 路 的 蛋白 质 a ae mu TRE 分 F 量 | 相对 电泳 迁移 率 一 起 始 因子 CF) 150,000 7 RAR 184,000 Y C3 AAT 180,000 B, C3b 171,000 a, C3 激活 原 (C3PA) BAT 93,000 B C3 激活 因子 〈C3A) B 63,000 r C3 激活 原 转 化 酶 (C3PA,e) 24,000 (4 Miller-Eberhard, 1975), 按照 这 一 假说 ,补体 反应 支 路 可 看 作 是 两 个 独立 的 反应 系列 , 即 依赖 灭 菌 素 的 反应 系 列 和 依赖 C3b 的 反应 系列 的 复合 过 程 。 这 两 个 独立 的 反应 系列 都 利用 B 因子 (C3PA)， 形成 一 个 有 C3 转化 酶 活力 的 酶 。 后 者 再 作用 于 C3, 产生 C3b， 并 通过 C3b 正 反馈 环 路 而 扩大 作用 。 1. 通过 灭 菌 素 的 发 动 Miiller-Eberhard (1974,1975) 根据 其 实验 室 新 近 的 结果 , 将 补体 激活 支 路 的 分 子 机 制作 了 一 个 初步 的 概括 ,强调 灭 菌 素 系统 在 补体 激活 支 路 的 早期 事件 中 起 关键 作用 ,并 假定 各 种 激活 因子 都 可 能 通过 起 始 因 子 , 发 动 灭 菌 素 系统 , 并 通过 对 C3 的 作用 而 与 补体 激活 的 经 典 途 径 相 衔接 ,产生 C3a 和 Coa, 以 及 有 溶 细胞 能 力 的 C5b-9 复合 物 。 如 简 图 “12-26 左 侧 所 示 , 血清 中 的 起 始 因子 〈I. 了 .) ， 当 和 各 种 支 路 激活 因子 接触 时 ， 便 转 变 为 激活 形式 的 起 始 因子 UF). 他 还 假定 后 者 可 能 相当 于 局 灶 性 肾 小 球 肾 炎 病 人 血清 中 的 肾炎 因子 (Nephritic factor), 不 过 ,起 始 因 子 也 很 可 能 不 只 一 种 。 本 E 能 激活 灭 菌 素 (P) 。 激活 的 灭 菌 素 (P) 又 再 激活 C3PA 转化 酶 (C3PAse) 。 在 天 然 C3 和 C3PA 转化 酶 的 相互 作用 下 ，C3PA 转化 酶 表现 出 裂解 C3PA 的 活力 。 C3PA 有 裂解 的 结果 ， 。 389 Hk CA. 后 者 在 其 初生 态 可 以 和 膜 受 体 结 合 。 结 合 的 C3A 将 C3 分 解 成 为 C3a 和 C3b 片段 。 一 当 有 C3b 产生 时 ,就 能 发 动 依赖 C3b 的 正 反馈 机 制 , 而 不 再 依赖 先 前 的 灭 菌 素 系统 而 独立 地 ,继续 不 断 地 起 作用 。 2. C3b 正 反馈 环 路 C3 的 支 路 激活 主要 是 通过 C3b 正 反馈 环 路 扩大 的 结果 。 C3b, 不 论 它 是 如 何 产生 药 , 在 有 Mg-” 存在 时 ,就 能 和 了 B 因子 (C3PA) 形成 一 个 松散 的 复合 物 。 这 种 复合 物 又 能 被 D 因子 〈C3PA 转化 酶 ) 裂解 形成 C3b,Bb， 即 支 路 C3 转化 酶 。 后 者 又 能 把 C3 有 裂解 成 C3a 和 C3b, 从 而 能 推动 这 一 反馈 环 路 周而复始 地 运转 (Miller- 了 berhard fu Gétze, 1972) 〈 图 12-26, 右 侧 ) 。 于 是 , 通过 不 断 产 生 的 C3b 和 补体 激活 的 经 碍 途径 相 衔接 , 形成 支 路 的 C3 转化 酶 。 后 者 再 通过 未 知 的 方式 转化 为 支 路 的 _C5 转化 酶 ,再 催化 形成 有 溶 细胞 活力 的 C5b-C9 BAW, 达到 和 补体 激活 经 典 途 径 相同 的 效果 。 膜 的 损伤 激活 因子 .C(5b-C9)* =< . ‘i | C6-C9 | 1X(?》 C5 | C5b# | a y(2) Nas, @ fs 正 反馈 机 制 [eer _C3bAse 并 (D 因子 ) Ms~- | 1 片段 C3b Ky FA C3 图 12-26 ”补体 激活 支 路 分 子 机 制 的 新 概念 。* 酶 激活 的 和 膜 受 体 结合 的 不 稳定 位 点 。 方 框 内 的 几 个 成 分 可 能 和 另 一 个 附加 因子 一 起 产生 CS 转化 酶 活力 (图 中 C3b 灭 活 剂 应 为 C3b 灭 活 因子 )( 据 Miller-Eberhard，1974 )。 a ”显而易见 ,这 样 一 种 正 反 馈 环 路 必须 有 自 稳 机 制 调节 ,否则 裂解 一 个 C3 分 子 就 会 导 致 大 量 补体 激活 ,造成 对 机 体 的 危害 。 机 体 的 这 种 自 稳 调节 是 通过 C3b 的 灭 活 因子 (KAF) 实现 的 。 KAF 是 一 种 酶 ,能 非常 有 效 地 使 C3b 失 活 ,破坏 它 的 触发 反馈 环 路 ， 参加 Cs 激活 。 以 及 和 膜 附 着 等 生物 活性 。 现 在 也 已 经 弄 清楚 , 眼镜 蛇 蛇毒 因子 (CVF) 实际 上 就 是 眼镜 蛇 的 C3b。 它 能 和 哺乳 类 的 C3b 一 样 作用 于 BAF (C3PA) 。 不 过 ，、 这 种 C3b 不 能 被 KAF 灭 活 , 而 是 形成 一 种 对 KAF 不 敏感 的 稳定 产物 CVE,B, 继续 不 断 地 消耗 C3 (Lachman 和 Nicol, 1973; Alper 和 Balavitch, 1976), 总 之 ,体内 外 的 各 种 因素 ,无 论 是 C4,2，C3b,B，CVF,B RAM, 只 要 能 把 C3 转化 为 C3b 的 机 制 都 不 可 避免 地 触发 这 一 正 反 馈 环 路 , 导致 补体 的 支 路 激活 。 已 知 细菌 的 酶 和 内 毒素 ,蛇毒 因子 .组 织 蛋白 酶 , 胰 蛋 白 酶 . 纤 溶 酶 等 都 有 可 能 通过 支 路 的 不 同 环节 as。 390 « ————— | 3 =e oe Se a kim ) —— eae) — eke sen 95 fi | “ wedi: MELAS i ne iia Gon oh 系 a > 二 hs Up att mo oe ly PF in BN oo Chasen 一 前列腺 素 ae) aa 上 人 were 类 让 一 | = isu 12-27 引起 炎症 反应 的 多 种 途径 的 关系 示意 图 ( 按 Willoughby，1970 修改 )。 激活 补体 。 机 体 因 组 织 损伤 ,外 源 毒素 的 侵 和 人 以 及 凝血 系统 、 纤 盗 酶 系统 和 激 肽 系统 的 酶 反应 ， 也 可 能 通过 支 路 激活 补体 系统 以 及 依赖 补体 产物 的 ， 继 发 的 病理 生物 学 过 程 (Gewurz, 1972), .其 结果 通常 是 导致 炎症 反应 。 和 补体 系统 有 关 的 ,引起 炎症 反应 的 多 种 途径 之 间 的 复杂 关系 ,可 以 用 简 图 12-27 表示 。 除 此 以 外 , 致 敏 细 胞 表面 产生 的 某 些 激活 的 补体 成 分 (如 C5,6,7) 可 能 转移 到 附近 未 致 敏 的 细胞 表面 ,引起 细胞 溶解 ， 称 为 反应 性 深 细 胞 作用 (Reactive lysis)。 因 此 ,补体 的 支 路 激活 在 人 类 多 种 免疫 性 疾病 , 如 Coomb 氏 阳 性 溶血 性 贫血 症 ， 遗 传 性 血管 神经 性 水 肿 , 某 些 肾 小 球 肾炎 的 发 病 机 制 中 都 可 能 起 作用 。 从 上 述 意 义 看 来 ,补体 在 机 体 的 防御 系统 中 , 不 只 是 作为 辅助 抗体 的 “补体 ” 起 作用 ,并 且 还 作为 能 引起 炎症 反应 的 中 介 因 素 而 独立 地 起 作用 , 甚至 几乎 补体 反应 每 一 步骤 的 产物 都 能 产生 独特 的 病理 生物 学 效应 。 因 此 , 在 本 章 开 始 时 提 到 的 ，Mayer 对 补 体 下 的 经 典 的 定义 ,补体 “为 抗原 抗体 复合 物 、Y=- 球 蛋白 聚集 物 或 其 他 物质 激活 的 溶 细 胞 反应 系统 ,已 经 不 能 概括 补体 作用 的 全 部 内 容 了 。 对 补体 系统 的 进化 起 源 的 研究 ， 似 乎 也 支持 这 种 观点 。 目 前 发 现 甚至 在 某 些 无 脊椎 动物 (如 党 ) 已 存在 功能 上 和 高 等 仁 椎 动物 的 补体 类 似 的 因子 (Day 等 , 1970) 。 或 许 补体 作 为 一 个 非 专 一 的 血 请 防御 系统 , 比 免疫 球 蛋 和 白 在 进化 上 有 更 为 古老 的 历史 , 也 不 是 不 可 能 的 。 六 、 补 体 反应 的 调节 补体 反应 在 时 、 空 上 受到 严格 的 限制 。 大 多 数 激活 的 补体 成 分 和 复合 物 迅 速 晓 变 , 失 去 和 细胞 膜 的 结合 能 力 , 因而 使 膜 的 损伤 能 局 限于 激活 点 的 附近 , 而 不 至 漫 无 止境 地 扩展 开 来 。 除 此 以 外 , 正常 血清 内 还 存在 种 种 抑制 因子 或 灭 活 因 子 。 如 从 血清 中 已 分 离 出 一 个 Cl 酶 活力 的 抑制 因子 ,能 定量 地 和 Cl 结合 (Lepow 等 ，1965) 。 几 种 动物 血清 中 RH C4 的 灭 活 因 子 (Jensen 等 ,1968) ,以 及 C3b 的 灭 活 因 子 ，C6b 的 灭 活 因子 。 此 外 ,人 血清 内 还 存在 过 敏 毒素 〈C3a，C5a) 的 灭 活 因 子 ， 它 们 属于 1S § o REA es。 391 。 (Bokish 等 ,1969) 。 在 正常 情形 下 , 通过 这 些 调 节 因 素 的 控制 ,补体 反应 才 得 以 在 严格 限制 的 范围 和 程度 上 进行 ,达到 防御 外 来 感染 的 目的 , 而 又 不 致 破坏 机 体 的 完整 性 。 简短 的 结论 1， 补 体系 统 是 一 组 血清 蛋白 质 , 能 被 依 顺序 地 激活 ,形成 一 系列 的 酶 ,引起 生物 膜 的 变化 ,最 后 导致 膜 的 损伤 和 溶 细胞 作用 。 目 前 已 知 补体 系统 包括 9 个 成 分 ;至 少 11 种 蛋 和 白质。 补体 激活 过 程 中 产生 具有 生物 活力 的 片段 或 复合 物 , 如 白血球 化 学 吸引 素 、. 过 敏 毒 素 等 。 2. 补体 系统 作为 抗体 抗原 系统 的 效应 分 子 在 机 体 防 御 系 统 中 起 重要 作用 。 抗体 通 过 对 靶 细 胞 (细菌 ,肿瘤 细胞 等 ) 表面 抗原 的 识别 和 相互 作用 ,激发 全 套 补 体 成 分 参加 的 链 锁 反 应 , 导致 膜 的 损伤 和 细胞 的 杀伤 。 除 去 通过 免疫 反应 激活 的 主要 途径 外 , 补体 系统 还 可 通过 支 路 激活 , 作为 一 个 独立 的 防御 系统 起 作用 。 3. 补体 的 生物 学 作用 和 生物 膜 有 密切 关系 。 补 体 的 激活 和 作用 也 局 限 在 膜 上 进行 。 补体 及 其 产物 至 少 从 四 方面 影响 膜 ， 1) 引起 细胞 膜 不 可 逆 损 伤 . 导致 细胞 的 死亡 ; 2) 引起 膜 结构 的 变化 ,释放 出 活性 物质 , 如 肥大 细胞 释放 组 织 胺 : ” 3) 激活 细胞 膜 上 的 酶 , 而 诱发 膜 的 行为 改变 ,如 多 形 核 白 血球 的 定向 迁移 ; 4) 补体 成 分 的 附着 诱发 膜 表面 性 质 的 变化 而 发 生 细胞 间 的 免疫 粘着 现象 并 促 ES Wie HE Fo 补体 直接 或 间接 地 作用 于 细胞 膜 而 诱发 依赖 补体 或 其 产物 的 继 发 的 病理 生物 学 过 程 , 如 溶 细胞 作用 , 白血球 定向 迁移 ,炎症 反应 、 吞 噬 活 动 和 过 人 敏 反应 等 重要 的 现象 总之， 补体 系统 ,不 论 通过 免疫 反应 或 独立 地 起 作用 ,都 是 维持 机 体 完整 性 ,或 在 各 种 免疫 病 理 条 件 下 引起 组 织 损伤 的 一 个 重要 的 化 学 介质 系统 。 SS “RF 专著 和 综述 Ingram, D. 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Med. 134, 1601. © 397 。 it kal 第 四 篇 “抗体 的 合成 一 信号 . 受 体 和 基因 近 十 多 年 来 分 子 生物 学 在 蛋白 质 合 成 的 遗传 控制 和 细胞 分 化 中 基因 表现 之 一 般 规 律 的 研究 成 果 ， 促 进 了 对 于 担任 特殊 免疫 功能 的 细胞 一 一 淋巴 球 的 基因 表现 和 抗体 合成 研 究 的 进展 。 分 子 生 物 学 在 微生物 上 阐明 了 蛋白 质 合 成 遗传 控制 的 信息 传递 途径 一 一 DNA 分 子 荷载 的 遗传 信息 ， 通 过 m RNA 的 转录 ， 到 达 核 糖 核 蛋 白 体 上 作为 蛋白 质 合成 的 样 板 ; 同时 还 提出 了 控制 基因 表现 的 操纵 子 学 说 。 高 等 动物 细胞 的 分 化 当然 要 复杂 得 多 。 但 从 分 子 水 平 看 来 ,归根 结 蒂 仍 然 是 基因 按 一 定时 、 空 顺序 选择 地 激活 的 结果 。 激 素 作 用 机 制 的 研究 还 表明 ， 信 息 分 子 ( 激 素 ) 如 何 通过 同 细 胞 表面 或 内 部 的 专 一 受 体 分 子 结 合 ， 再 经 次 级 信使 分 子 ( 环 式 核 背 酸 ) 或 其 他 方式 传人 核 内 ， 选 择 地 激活 有 关 基 因 ， 导 致 专 一 蛋白 质 的 合成 。 这 些 概念 无 疑 有 助 于 对 抗体 合成 分 子 机 制 的 了 解 。 男 一 方面 , 从 五 十 年 代 末 期 ，Jerne 和 Burnet 提出 获得 性 免疫 的 无 性 细胞 繁殖 系 选择 学 说 以 来 ， 随 着 小 淋巴 球 的 功能 ，T 和 了 B 淋巴 球 及 其 亚 群 的 功能 分 化 ， 以 及 它们 在 抗体 形成 中 之 协同 作用 的 发 现 ， 细 胞 免疫 学 的 这 些 新 成 就 ， 也 为 分 子 免疫 学 提出 了 许多 新 概念 和 新 问题。 既然 抗体 合成 是 一 个 特殊 功能 细胞 一 一 B 淋巴 球 的 基因 表现 问题 ， 对 这 个 问题 的 研究 就 不 能 局 限 在 抗体 分 子 , 而 应 当 深 入 到 淋巴 细胞 表面 分 子 结构 , 抗原 分 子 和 细胞 之 间 ， 细 胞 和 细胞 之 间 相 互 作 用 的 分 子 机 制 。 目 前 分 子 免疫 学 的 发 展 也 正 是 沿 着 向 细胞 免疫 学 渗透 .融合 的 方向 , 研究 各 类 淋巴 球 表面 抗原 受 体 的 构造 及 其 识别 功能 ， 抗 原 和 淋巴 球 表 面 受 体 的 相互 作用 ， 膜 上 的 信号 如 何 传 回 核 内 使 基因 选择 地 激活 ， 再 通过 转录 、 翻 译 过 程 合成 重 链 和 轻 链 ， 并 装配 成 完整 的 抗体 分 子 等 一 系列 基因 表现 的 调控 过 程 。 概 括 地 说 ， 当 前 分 子 免疫 学 在 这 方面 研究 的 主题 就 是 :信号 、 受 体 和 基因 。 其 中 为 免 疫 系 统 所 特有 的 , 也 是 最 困难 的 问题 是 抗体 多 样 性 起 源 及 其 遗传 控制 的 问题 。 这 些 问 题 的 研究 和 解决 也 必然 会 反 转 过 来 促进 对 于 一 般 细胞 的 识别 机 制 ,高 等 动物 细胞 分 化 .细胞 生 长 控制 .遗传 等 基本 生物 学 问题 研究 的 进展 。 这 也 许 是 淋巴 球 作为 真 核 细胞 基因 表现 的 调 节 控 制 的 模型 , 日 益 受 到 分 子 生 物 学 家 和 细胞 生物 学 家 重视 的 原因 。 以 下 各 章 将 分 别 讨论 淋巴 球 表面 抗原 受 体 的 性 质 和 构造 ， 抗 原 对 也 淋巴 球 的 激 活 ， 抗体 的 多 肽 链 的 合成 和 装配 ， 免 疫 球 蛋 白 的 基因 结构 ， 以 及 免疫 球 蛋白 和 免疫 反应 的 遗 传 控 制 等 方面 的 问题 。 关 于 抗体 多 样 性 起 源 问 题 了 解 还 很 少 ， 只 能 就 各 家 的 看 法 作 一 些 简略 的 介绍 。 ° 398 « 第 十 三 章 ” 抗原 和 淋巴 细胞 的 相互 作用 一 一 抗体 反应 的 触发 机 制 抗体 合成 的 最 初 阶段 一 一 即 抗原 和 了 B 淋巴 球 表面 受 体 的 相互 作用 ， 受 到 免疫 活性 细 胞 间 的 协同 作用 的 很 大 影响 。 对 于 大 多 数 抗原 ， 抗 体 反应 需要 B 淋巴 球 和 了 淋巴 球 间 的 协同 作用 ， 巨 噬 细 胞 也 可 能 参与 作用 。 如 第 一 章 已 讲 过 的 〈 见 14 页 ) ， 对 载体 效应 的 分 析 发 现 对 一 个 复杂 的 抗原 的 抗体 反应 需要 反应 细胞 对 同一 分 子 的 不 同 部 位 同时 地 和 分 别 地 进行 识别 ，T 细胞 专 一 地 识别 载体 决定 钳 ， 而 B 细胞 识别 半 抗 原 决定 往 。 免 疫 反应 的 专 一 性 又 取决 于 这 两 种 细胞 的 表面 受 体 对 抗原 的 结合 专 一 性 。 这 些 细胞 表面 受 体 的 性 质 和 构造 ， 以 及 几 种 细胞 间 的 协同 作用 的 机 制 ， 已 成 为 研究 抗体 合成 的 发 动 的 关键 。 在 讨论 从 分 子 水 平 来 探讨 这 些 问 题 得 到 的 结果 以 前 ， 先 谈 一 下 免疫 反应 中 细胞 相互 作用 的 现代 概念 。 一 、 免 疫 反应 中 细胞 协同 作用 的 现代 概念 六 十 年 代 细 胞 免疫 学 最 重要 的 研究 成 果 是 发 现 了 两 类 淋巴 球 功能 上 的 分 化 ， 以 及 它 们 在 抗体 形成 中 的 协同 作用 。 来 源 于 骨髓 的 B 淋巴 球 是 产生 抗体 的 前 体 细胞 。 但 是 对 于 大 多 数 抗原 (所 谓 胸腺 依赖 性 抗原 ) ， 还 需要 有 来 自 胸 腺 的 了 淋巴 球 以 及 巨 鸣 细 胞 参加 。 T 细胞 对 免疫 反应 起 着 关键 的 调节 作用 ， 控 制 着 反 记 的 类 型 (免疫 反应 或 耐 受 性 ) 、 抗 体 的 类 别 和 反应 的 强度 。 最 近 还 发 现 这些 起 调节 作用 的 T 细胞 在 功能 上 又 可 分 为 两 类 : 一 类 对 抗体 反应 起 促进 作用 ， 称 为 辅助 细胞 (Helper cell); 一 类 起 抑制 作用 ， 称 为 抑制 细胞 (Suppessor cell), 它们 可 以 根据 细胞 表面 的 标志 不 同 而 区 别 开 来 : 带 有 Lyl 表 面 标志 的 了 细胞 亚 群 起 促进 作用 ， 而 带 有 工 y 2 标志 的 亚 群 则 起 抑制 作用 〈Cantor 等 ， 1976; Jandinski 等 ，1976) 。 对 抗原 的 任何 反应 (产生 抗体 或 耐 受 性 ) 都 可 能 是 这 两 类 细胞 互相 持 抗 作用 的 结果 。 (一 ) 淋巴 细胞 间 的 协同 作用 关于 了 T,、B 细胞 间 协 同 作 用 的 机 制 ， 目 前 还 是 免疫 学 界 正在 热烈 争鸣 的 问题 。 一 般 认为 了 细胞 在 抗体 反应 中 的 作用 是 更 有 效 地 把 抗原 提供 给 B 细胞 。 最 初 有 人 假定 了 细 胞 表面 的 载体 决定 簇 受 体能 起 集中 抗原 的 作用 ， 把 形成 适当 空间 排 布 的 抗原 决定 簇 网 架 提供 到 B 细胞 表面 ， 从 而 激活 B 细胞 。 这 一 假定 的 机 制 要 求 了 细胞 和 也 细 胞 通过 抗原 分 子 的 “搭桥 ”而 互相 接触 (图 13-1) 。 然 而 , 也 有 证 据 表明 细胞 间 的 协同 作用 可 能 是 通过 T 细胞 产生 的 可 溶性 因子 进行 的 。 Nossal 实验 室 的 工作 者 利用 双 层 培养 小 室 ， 以 分 离 的 T、B 细胞 和 巨 叭 细胞 配合 成 。 399" 的 抗体 形成 系统 研究 这 一 问题 (图 13-2)。 当 了 细胞 和 B 细胞 被 一 层 细胞 通 不 过 的 微 孔 i Ww Fie DT 细 胞 受 体 Vv BIOS 图 13-2 离 体 抗 体形 成 系统 5 Feldman 和 Basten 双 层 培养 小 室 。 TRIKEL EB DSA, &B 细胞 的 脾脏 细胞 放 在 下 层 小 室内 ， 中 间 被 一 层 微 孔 膜 隔 开 ， 细 胞 不 能 通过 而 蛋白 分 子 可 自由 通过 。 培养 图 13-1 “细胞 协同 作用 可 能 的 机 制 ，T,B 细胞 直接 45 天 后 ， 检 测 脾脏 细胞 中 空 斑 形 成 细胞 (PFC) 的 通过 抗原 < 搭桥 ?。 数目 。 213-1 细胞 协同 作用 通过 专 一 的 可 溶性 工 细胞 因子 起 作用 的 证 明 下 层 小 室内 的 脾脏 细 胞 ， EBS 二 Bee oR ae | 对 DNP-KLH 的 反应 无 = Txca + DNP- 接 触 过 的 脾脏 细胞 ， a 工 KLH 后 DNP- 接 触 过 的 脾脏 细胞 . 中 TKcH | DNP- 接 触 过 的 脾 胜 细胞 + v3 (加 抗 -6 Se Bein HHA. C’ KeBEY 工 ( 未 受训 练 的 ) a DNP— $e feh ik 9 BE , ~ 无 村 DNP- 接 触 过 的 脾脏 细胞 = TFGcG DNP= 接 触 过 的 脾脏 细 跑 - Tea 示 用 钥 孔 总 血 蓝 叶 (KRLH) 训练 过 的 工 细胞 。 carl ELH Troe 示 用 鸡 IgGCFGG) 训练 过 的 工 细 胞 。 ae ay . (4 Feldman 和 Basten, 1972), ies : er tr al 薄膜 隔 开 时 ， 受 到 适当 抗原 刺激 的 了 细胞 仍然 能 产生 专 一 的 可 溶性 因子 ,7 促进 BA ie 的 抗体 反应 。 如 表 13.1 所 示 ， 在 上 层 小 室内 放 经 过 载体 蛋白 KLE ill A wt oy T Aol (Timm), 或 经 另 一 种 载体 蛋白 BRGG 训练 过 的 了 细胞 (Teco). 下 层 小 室内 放 和 半 抗 原 接触 过 的 脾 及 细胞 。 然 后 ， 当 用 DNP-KLH 再 激 时 , Tan 组 的 3B 细胞 能 形成 抗体 ,而 Troe 组 则 不 能 ， 表 现 出 对 抗原 反应 的 专 二 性 (Feldman fil Basten, 1972)。 进 一 步 分 析 发 现 ，T 细胞 因子 起 作用 还 需要 也 细胞 群 中 有 巨 噬 细 胞 存在 才 行 5 | 3 (二 ) 巨 噬 细 胞 和 淋巴 细胞 闻 的 相互 作用 淋巴 细胞 对 大 多 数 抗原 的 免疫 反应 都 需要 有 巨 鸣 细胞 参加 (Unanue,) 1972). Bae 细胞 的 作用 一 方面 是 处 理 抗原 ; 另 一 方面 ， 在 T、B 细胞 之 间 还 可 能 起 提供 抗原 的 居 间 作用 。RBeldman (1972) 发 现 T 细 胞 产生 的 专 一 的 辅助 因子 对 巨 叹 细胞 表面 有 杀 合 性 。 在 双 层 培养 小 室内 ， 如 果 下 层 小 室 只 放 巨 噬 细 胞 ,上 业 层 小 室 仍然 放 经 过 KDLH 训练 的 了 细胞 (Tun) 和 专 一 抗原 。 这样 培养 一 两 天 后 ， 再 把 经 过 洗 桨 的 巨 噬 细 MAD 和 DNP- 半 抗原 接触 过 的 B 细胞 培养 中 ， 无 需 加 抗原 就 能 有 效 地 促进 这 些 了 细胞 :产生 抗 DNP 抗体 。' 这 一 实验 证 明细 胞 间 协 同 作用 机 制 可 能 是 了 细胞 产生 的 专 一 因子 单独 地 或 + 400+ 与 抗原 结合 后 ， 能 附着 在 巨 噬 细 了 胞 表面 ， 再 通过 致 敏 的 巨 吹 细 胞 把 排列 在 其 表面 的 抗原 提供 给 也 细胞 表面 的 抗原 受 体 ， 引 发 抗体 反应 (图 13-3) 。 值得 注意 的 是 ， 有 证 据 表明 当 带 a os bUR A Be AUT KE RRA E Be 组 织 相 容 性 基因 复合 物 (MHC) 为 同 ae ES -抗原 一 一 一 (| 基因 型 配合 时 所 引起 也 细胞 的 增生 ded a » Aik Ros- 处 理 抗原 ?7 反应 , 要 比 异 基因 型 配合 时 更 大 (Ros es a ee anthal 和 Shevach, 1973), 这 提 7 Mo a ET eR | 原 ， 还 可 能 通过 某 种 细胞 识别 方式 参 AER 与 和 淋巴 球 的 相互 作用 。 同样 地 ,也 有 证 握 指 出 淋巴 细胞 表面 MHC 基因 产物 和 免疫 反应 中 细胞 相互 作用 有 密 sey 切 的 关系 。 MO. SRT AE B33 TEM RRM. heme Ard gra 双重 作用 ，-- 种 作用 是 处 理 抗原 ; 另 一 种 作用 是 集中 工 细胞 产生 球 间 ，T 淋巴 球 和 B 淋巴 球 间 相互 作 。 的 协作 因子 ,并 将 和 抗原 结合 的 这 些 因子 提供 给 未 受 刺激 的 B 细 用 关系 的 实验 事实 都 提示 MHC 及 I- WCB Feldman, 1972), 浆 细 胞 <- 吓 一 一 “区 基因 编码 的 抗原 决定 得 在 这 几 种 细胞 间 的 识别 和 免疫 反应 的 调节 中 ， 可 能 起 重要 的 作 FA (Paul 和 Benacerraf，1977) 。 细胞 免疫 学 揭示 的 免疫 反应 中 细胞 协同 作用 的 现代 看 法 向 分 子 免疫 学 提出 了 许多 新 课题 。 诸 如 各 类 淋巴 细胞 表面 抗原 受 体 的 性 质 和 构 迁 ,特别 是 下 淋巴 球 表面 的 识别 构造 和 工区 基因 产物 的 关系 ， 以 及 T，B 淋巴 细胞 各 亚 群 间 的 相互 识别 和 免疫 反应 的 调节 机 制 的 关系 ， 都 是 当前 分 子 免疫 学 正在 热烈 研究 而 未 完全 解决 的 问题 。 二 、 淋巴 细胞 表面 的 抗原 受 体 淋巴 细胞 表面 抗原 受 体 的 性 质 和 构造 是 多 年 来 使 免疫 放学 家 们 困惑 不 解 的 难题 。 远 在 1900 年 ，Ehrlich 鉴于 抗原 抗体 结合 的 高 度 专 一 性 ,曾经 推测 免疫 细胞 表面 的 抗原 受 体 可 能 就 是 抗体 。 目前 已 积累 了 大 量 证 据 和 免疫 学 现象 提示 了 淋巴 球 表面 的 抗原 受 体 是 免疫 球 蛋白 ,并且 又 直接 从 BB 细胞 表面 分 离 出 免疫 球 蛋 白 , 证 明 对 抗原 有 结合 专 一 性 。 至 于 了 淋巴 球 表面 抗原 受 体 的 性 质问 题 ， 还 存在 分 歧 意 见 , 尚 悬而未决 。 (一 )B 淋巴 球 表面 抗原 受 体 为 免疫 球 和 蛋白 的 间接 证 据 这 些 证 据 主 要 是 通过 对 抗原 和 淋巴 球 表面 的 结合 专 一 性 、 免 疫 球 蛋 白 抗 血清 能 专 一 地 抑制 抗原 和 淋巴 球 结合 等 方面 的 研究 工作 取得 的 (Warner 等 ，1970; Nossal 和 Ada, 1971; Ada 等 ，1973) 。 1. 抗原 和 也 淋巴 球 表面 专 一 一 的 结合 Nossal 实验 室 的 工作 者 利用 放射 性 同位 素 标记 的 抗原 (如 …I- 标 记 的 血 蓝 肝 或 鞭毛 。 401 。 Week = 二 yy a 4 的 4 34 TRAKERARMAACHEFTERAAR ()'"] MRPicHRERKHE DH 电子 显微镜 图 象 ,细胞 表面 少数 几 处 可 看 到 标记 抗原 , x20,000, (b) 铁 蛋 白 离 体 标记 的 淋巴 球 的 一 部 分 ，X115,000 CHE Nossal 和 Ada, 1971), A) 处 理 小 鼠 的 脾脏 细胞 ， 再 用 放射 自 显 影 法 检查 标记 的 细胞 。 结 果 发 现 全 部 细胞 群 中 只 有 极 少 数 细胞 被 标记 。 为 抗原 标记 的 细胞 数目 ， 随 所 用 抗原 浓度 而 变动 ， 其 上 限 在 1 一 2% 。 对 于 一 定 的 抗原 ,结合 抗原 的 细胞 的 频率 介 于 10 到 10“ 之 间 (Ada, 1970). 这 些 结果 是 和 Burnet 的 细胞 株 选 择 学 说 所 预测 的 相符 合 的 ,也 就 是 说 在 和 抗原 接触 前 ， 。402 。 淋巴 细胞 群 中 就 存在 多 种 多 样 的 抗原 结合 专 一 性 的 细胞 ， 其 中 个 别 细 胞 只 存在 一 种 结合 专 一 性 的 表面 抗原 受 体 。 用 电子 显微镜 观察 和 "sI- 标 记 抗原 结合 的 细胞 ， 从 放射 自 显影 图 象 上 银 粒 的 分 布 指 示 出 抗原 分 子 位 于 淋巴 球 的 表面 (图 13-4) (Mandel 等 ，1970) 。 加 过 量 的 未 标记 抗 原 ， 或 事先 用 免疫 球 蛋白 抗 血清 处 理 细 胞 ， 都 能 专 一 地 抑制 抗原 和 细胞 的 结合 。 这 些 事 实 都 提示 B 淋巴 球 表面 存在 专 一 的 抗原 受 体 ,其 性 质 可 能 是 免疫 球 蛋白 。 进 一 步 用 各 种 专 一 的 轻 链 或 重 链 抗 血 清 作 分 析 的 结果 表明 ， 小 鼠 脾 脏 细胞 表面 的 免疫 球 蛋白 主要 是 IgM (Warner 等 ，1970) 。 后 来 这 一 观察 得 到 广泛 的 证 实 (Raff, 1970; Rabilline 等 ，1971; Bankhurst 和 Warner, 1971; Vitteta 等 ,1971) 。 此 外 , 还 发 现 羊 和 家 免 B 淋巴 球 表面 受 体 主要 为 IgM (Pernis 等 ，1970)， 而 豚鼠 可 能 为 IgG (Davie 和 Paul, 1971), 2. 放射 性 标记 抗原 对 淋巴 细胞 的 专 一 杀伤 作用 在 用 受 氮 钠 抑制 细胞 的 主动 吞噬 活动 的 条 件 下 ， 把 标记 强度 很 高 的 “I- 抗 原 加 人 到 淋巴 细胞 培养 。 过 24 小 时 后 ， 再 把 这 样 处 理 过 的 细胞 接种 到 经 过 尽 射线 照射 过 的 小 鼠 体内 ,结果 寄主 对 于 这 一 抗原 产生 抗体 的 能 力 便 大 大 减弱 了 , 而 对 其 他 抗原 的 抗体 反应 却 不 受 影 响 。 对 照 实验 中 ， 细 胞 是 和 非 放射 性 ”TI 标记 抗原 结合 ， 则 不 出 现 上 述 现象 。 显 然 ， 和 细胞 结合 的 放射 性 标记 抗原 的 辐射 〈…I 放出 的 射线 的 穿 透 能 力 约 为 10 微米 ) 能 专 一 地 损伤 产生 针对 这 种 抗原 的 抗体 的 前 体 细胞 (Ada 和 Byrt, 1969). 3. 半 抗 原 对 抗原 和 淋巴 球 结合 的 专 一 抑制 如 果 淋 巴 细胞 表面 确实 存在 类 似 抗 体 分 子 的 抗原 受 体 ， 事 先 用 游离 的 半 抗 原 处 理 细 胞 ， 则 应 能 专 一 地 抑制 细胞 对 该 半 抗 原 和 载体 蛋白 复合 物 的 免疫 反应 。 许 多 实验 表明 确 系 如 此 。 Mitchison (1967) 最 先 发 现在 离 体系 统 中 , 加 入 能 和 某 一 半 抗 原 起 交叉 反应 的 结构 类 似 物 ， 便 能 抑制 淋巴 细胞 对 该 半 抗 原 的 次 级 免疫 反应 。 同 样 地 ， 若 在 把 接触 过 抗原 的 脾脏 或 淋巴 结 细胞 接种 到 经 X 射线 照射 过 的 受 主 体内 之 前 ， 这 些 细胞 先 和 半 抗 原 保 温 ， 结果 它们 后 来 在 体内 对 该 半 抗 原 的 次 级 反应 也 受到 抑制 (Cross 和 Maikelai，1968) 。 上 述 实验 中 ， 半 抗原 抑制 现象 是 暂时 的 ,可 逆 的 。 如 果 改 用 “ 亲 合 标记 ” 半 抗 原 , 使 和 抗体 的 结合 位 点 发 生 共 价 结合 ， 就 能 产生 持久 的 抑制 效果 。Segal 等 (1969) 利用 DNP 半 抗 原 的 溴 乙酰 衍生 物 作 抑制 实验 ， 发 现 这 种 “ 亲 合 标记 ? 半 抗 原 在 离 体系 统 中 能 持久 而 强烈 地 抑制 对 该 半 抗 原 的 次 级 免疫 反应 ; 而 在 对 照 的 抗体 诱导 系统 中 ， 对 其 他 抗原 的 产生 并 无 影响 。 这 说 明 不 是 对 细胞 的 毒性 作用 , 而 是 半 抗 原 专 一 的 抑制 现象 。 B 淋巴 球 表面 有 半 抗 原 受 体 存在 ， 还 被 这 些 细胞 能 被 固 相 半 抗 原 免疫 吸附 柱 选择 地 阻 留 所 证 实 。 正 常 或 免疫 的 动物 的 淋巴 细胞 ， 通 过 固 相 半 抗 原 〈 半 抗原 联结 到 琼脂 糖 珠 上 ) 敌 成 的 免疫 吸附 柱 时 ， 便 被 选择 地 阻 留 。 这 些 被 阻 留 的 细胞 还 能 被 同一 半 抗 原 从 柱 上 上 洗 脱 下 来 (Waltrs 和 Wigzell, 1970; Wofsy 等 ，1971) 。 这 些 被 选择 地 阻 留 的 细 胞 , 经 鉴定 全 是 B 细胞 。 以 上 这 些 实验 提示 B 淋巴 球 表面 可 能 存在 免疫 球 蛋白 。 然而 ， 鉴 于 B 细胞 表面 存 。403 。 在 Fe 受 体 ，B 细胞 表面 的 免疫 球 蛋白 有 没有 可 能 是 循环 中 的 抗体 分 子 附着 到 这 些 细 起 表面 , 而 不 是 细胞 表面 固有 的 呢 ? Gell 和 Sell (1965) 在 对 一 个 同 种 异型 基因 座 为 杂 合子 的 新 生 家 免 上 的 研究 结果 说 明 淋巴 球 表面 免疫 球 蛋 白 很 可 能 主要 不 是 来 自 循 环 抗 体 , 而 是 细胞 本 身 产 生 的 。 已 知 新 生 家 兔 血 清 中 的 免疫 球 蛋白 几乎 全 部 来 自 母 体 , 因为 在 杂 合 子 新 生 家 免 的 血清 中 测 不 出 有 父 方 同 种 异型 的 免疫 球 蛋白 存在 。 然 而 ， 用 抗 父 方 或 母 方 同 种 异型 的 抗 血清 处 理 ， 都 能 同样 充分 有 效 地 刺激 新 生 家 免 的 淋巴 球 发 生 转 化 、 增 生 。 因 此 , 这 些 起 反应 的 淋巴 细胞 表面 的 免疫 球 蛋白 很 可 能 主要 是 来 源 于 细胞 本 身 , 而 不 是 由 于 循环 抗体 附着 到 细胞 表面 上 。 淋 巴 细胞 表面 免疫 球 蛋 白 呈 现 的 等 位 基因 互 斥 现象 也 支持 这 一 结论 。 用 双 标 记 莉 光 抗 体 法 研究 杂 合子 家 兔 B 淋巴 球 表面 免疫 球 SA WD 布 时 ， 开 初 在 细胞 表面 可 找到 两 种 同 种 异型 的 免疫 球 蛋白 。 可 是 ， 当 用 酶 处 理 去 除 细胞 表面 免疫 球 蛋 白 后 继续 培养 一 段 时 间 ， 待 免疫 球 蛋白 重新 形成 后 ， 细 胞 表面 就 只 能 显示 出 一 种 同 种 异型 的 免疫 球 蛋白 了 。 这 有 力 地 提示 杂 合 子 淋 巴 球 表面 只 有 一 个 等 位 基因 产 物 是 膜 上 自己 产生 的 ， 而 另 一 种 可 能 是 附着 到 细胞 表面 上 去 的 (Pernis 等 ，1970; 参 看 Paul, 1973). 从 上 述 大 量 工作 可 以 肯定 BEER A AS Sek A EE 球 蛋 昌 存在 。 但 是 ,二 者 的 关系 如 何 , 抗原 受 体 的 性 质 是 否 就 是 免疫 球 蛋 白 ， 仍 然 是 没有 得 到 完全 证 明 的 。 标 记 抗体 示 踪 虽 能 指示 也 淋巴 细胞 表面 有 免疫 球 蛋 白 存在 ; 抗 免 疫 球 蛋白 的 抗 血 清 也 能 抑制 抗原 和 淋巴 球 的 结合 ， 然 而 这 些 实验 并 不 能 严格 证 明 这 些 位 于 细 胞 表面 的 免疫 球 蛋白 分 子 就 是 抗原 受 体 本 身 ， 因 为 所 有 利用 抗 免疫 球 蛋 和 白 的 抗 血清 得 到 的 间接 证 据 ， 并 不 足以 排除 这 些 表面 免疫 球 蛋白 本 身 不 是 抗原 受 体 ， 而 只 是 在 位 置 上 紧 密 地 贴近 它们 ;当前 者 和 抗 免疫 球 蛋白 的 抗体 结合 时 ， 就 可 能 在 空间 上 防 碍 抗原 和 真正 的 抗原 受 体 分 子 的 接近 。 此 外 ， 这 些 免 疫 球 蛋白 在 膜 上 具体 存在 的 分 子 形式 也 不 清楚 。 因此 ， 为 了 圆满 地 解决 这 些 问 题 ， 就 要 求 直接 从 淋巴 细胞 表面 分 离 出 膜 结 合 的 免疫 球 蛋 白 ， 并 鉴定 其 化 学 构造 和 抗原 结合 专 一 性 。 fi cat (=) 淋巴 细胞 表面 抗原 受 体 的 分 离 。 性 质 和 结构 。 淋巴 细胞 表面 抗原 受 体 蛋白 的 量 是 微乎其微 的 。 据 估计 淋巴 细胞 的 细胞 膜 蛋白 只 二 细胞 干 重 的 0.04 一 0.05%% (2—-3x10°" 克 /细胞 )， 而 膜 受 体 蛋 白 又 仅 占 膜 蛋白 总 量 的 41%! 因此 ,淋巴 细胞 表面 抗原 受 体 的 分 离 和 鉴定 是 很 困难 的 。 为 了 解决 这 些 困 难 ， 就 必须 采用 特别 精细 的 方法 。 1. 淋巴 细胞 表面 免疫 球 蛋 白 的 分 离 和 分 析 方 法 为 了 解决 这 一 问题 ，Marchalonis 等 (1969 一 1974) 建立 了 一 个 很 灵敏 的 和 专 一 的 分 离 . 分 析 淋 巴 细胞 表面 免疫 球 蛋白 的 方法 。 如 图 13-5 所 示 ， 其 原理 如 下 : 1) 膜 蛋 百 的 同位 素 标 记 。 借助 乳酸 过 氧化 物 酶 酶 促 碘 化 法 ， 将 5I 标记 到 活 细 胞 的 表面 膜 蛋 白 上 。 经 电子 显微镜 检查 ， 证 明 只 有 细胞 表面 的 膜 蛋白 被 标记 ， 而 细胞 内 部 的 蛋白 质 不 被 标记 。 2) BRAKE. ”用 酸性 尿素 溶液 OM 尿素 加 10% 醋酸 ) 或 用 非 离子 型 表面 。404 。 SEE EEE —— yy ———— Ae Se eae 专 一 的 抗 免疫 球 LAMAR A Uli ABE 淀 系统 (对 照 ) y Y Y as Huse Link ae 分 析 生 物 IE 分析 DRED Ig ari 性 CRAMER ”活性 is CAA kB (无 Ig) 凝 胶 电泳 ) Cig 存在 ) = RE BR Lk) 1 脉冲 数 Ff 迁移 率 图 13=5 1 标记 细胞 表面 蛋白 混合 物 中 免疫 球 蛋 白 〈Ig) 之 免疫 学 和 生化 分 析 的 : 流程 图 ( 据 Marchalonis, 1974), 活性 剂 NP-40 溶解 膜 蛋白 。 另 一 个 办 法 是 把 标记 细胞 在 体外 培养 一 定时 间 , 收集 由 于 细 了 允 的 代谢 更 新 ,释放 到 培 六 中 的 膜 蛋白 。 3) REE. - 在 有 严格 对 照 实验 的 条 件 下 ， 在 专 一 的 抗 免疫 球 蛋 白 沉 淀 系统 (如 免 抗 小 鼠 免疫 球 蛋 白 的 抗 血 清和 未 标记 的 小 鼠 免疫 球 蛋 白 ) 中 ， 选 择 地 沉淀 IT- 标记 的 膜 蛋 自 成 分 (包含 膜 结 合 的 免疫 球 蛋 白 的 免疫 共 帝 淀 物 ) 。 4) 分 析 。 将 专 一 的 免疫 共 沉 证 物 溶解 在 9M 尿素 溶液 内 ， 经 过 还 原 和 烷 基 化 后 ， 再 在 酸性 尿素 溶液 中 作 到 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ， 并 测量 其 放射 性 分 布 图 形 。 和 标准 的 各 类 重 链 、 轻 链 的 电泳 迁移 率 对 比 , 确定 其 性 质 。 1500 1G 2. 淋巴 球 表面 免疫 球 蛋 白 的 分 离 和 鉴定 结果 1000 Marchalonis 实验 室 应 用 上 述 方法 系统 地 研 究 了 小 鼠 和 人 的 各 类 淋巴 球 ,包括 胸腺 、 腺 胜 * 胸 导管 以 及 白血病 瘤 细胞 。 早 期 工作 发 现 小 鼠 和 人 的 了 淋巴 球 表面 的 主要 免疫 球 蛋 白 含 有 轻 链 和 ， > yo z 链 ， 分子量 约 为 200,000。 从 人 类 慢性 淋巴 白 看 病痛 细胞 《B 细胞 ) 分 离 出 的 膜 结合 免疫 球 蛋 tay 脉冲 数 /分 a 500 4 白 经 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 指出 ， 完整 有 的 Ig 分子 的 电泳 迁移 率 略 慢 于 IEG 分 子 ( 图 13- (Peat aaron | 6， 上 方 ); 经 过 还 原 的 多 肽 链 的 迁移 率 相 当 于 1114 RRA oe A L4t( Al 13-6, FA). 因此 ,可 能 是 :以 13-6。， 人 慢性 淋巴 白血病 细胞 CB 淋巴 球 ) 251 标记 的 表面 免疫 球 蛋 白 之 聚 两 烯 酰胺 电泳 分 析 。 IgM 里 体 形式 在 膜 上 存 fio KM (CBAXC57) Fi (上 几 ) 未 还 原 的 免疫 球 蛋 白 分 子 , 凝 胶 浓度 59 杂种 小 鼠 脾脏 淋巴 球 分 离 的 表面 免疫 球 蛋 白 ， 含 (一 o 一 ) 专 一 沉淀 的 免疫 球 蛋 白 。(…) 对 照 沉 淀 Lape ee he 4 KB. 1G: 人 标准 Y- 球 蛋白 (150,000 daltons ay 3 L be Se, > BK REE CUAL BE» MBE, LARD RAY 7 SER Sie, (FRAC RUA 分 (图 13-7) 。 不 过 , 后 来 的 实验 提示 这 些 少 量 的 “ 链 , 凝 胶 浓度 1095 4, 7, LAR PE, TEAL HEE Hh ee: bese _ «SHE, "5I 标 记 表 面 免疫 球 蛋 白 用 非 离子 型 % HE FY HE 2K EB I a 2 at AY 分 ue 抗体 (Mar 表面 活性 剂 Nonidet P-40 溶解 CMarchalonis, chalonis, 1975), 1975). 由 于 正常 小 鼠 脾 脏 细 胞 是 了 B 细 胞 和 T 细胞 的 混合 物 ， 不 能 清楚 地 说 明 问 题 。 因 此 , 后 asp 脉冲 数 / 分 钟 图 13-7 ”酸性 尿素 内 圆 盘 电泳 对 从 《CBAXC57B1)F, 小 鼠 脾脏 淋巴 球 分 离 的 免疫 球 蛋 白 多 肽 链 的 分 析 。〈 一 2 一 ) 表 面 经 过 碘 化 的 淋巴 球 在 培养 液 内 ，37”C 保温 3 小 时 。 培 养 RK 内 所 含 的 释放 的 免疫 球 蛋白 被 专 一 地 共同 沉淀 ， 电 泳 以 前 沉 淀 在 IM 尿素 内 还 原 和 烷 基 化 。 (--O--) 脾脏 淋巴 球 分 论 的 免疫 球 蛋白 的 多 肽 链 。 部 分 培养 液 重新 碘 化 并 专 一 地 共同 沉淀 。 沉 淀 物 在 9M 尿素 内 还 原 和 烷 基 化 。 共 同 沉淀 的 标准 来 又 选用 从 先天 性 无 胸腺 小 鼠 (nu /nu) 的 脾 胜 和 胸 导 管 淋巴 球 (IT 细胞 夹杂 二 1%) 作 材料 ,结果 发 现 从 这 些 B 细 胞 的 表 面膜 上 可 以 分 离 出 两 类 免疫 球 蛋 白 〈 图 13-8)。 一 类 从 电泳 迁移 率 和 抗原 性 证 明 BAY 链 ， 分 子 量 测 定 指出 可 能 为 IgM 单 体 。 另 一 类 迁移 较 快 的 重 链 (分 子 量 约 为 65,000) ， 电 泳 迁 移 率 和 人 上 FEY 链 都 不 同 , 抗 原 性 和 糖 含 量 也 不 同 , 可 能 相当 于 5 链 (Marchalonis，1975)。 一 些 学 者 先前 曾 发 现 小 鼠 B 淋 巴 球 表 面 还 存在 IE M 以 外 的 另 一 类 免疫 球 蛋白 ， 经 初步 鉴定 可 能 是 IgD (Melcher 等 ， 1974; Abney 和 Parkhouse, 1974; BORE SSRN wr, LAB: bet, ree Vitetta 和 Uhr，1975) 。 和 IgM 的 性 Al L $£(42 Marchalonis 4%, 1973), 也 许可 能 是 在 早期 研究 工作 中 没有 被 发 现 的 原因 表面 免疫 球 蛋 白 的 主要 形式 是 类 似 IgM 单 体 , 在 某 些 B 淋巴 球 还 可 能 存 在 另 一 类 免疫 球 蛋 白 IgED。 用 同样 的 方法 研究 了 淋巴 球 , 包括 被 蛋白 质 抗原 或 细胞 抗原 专 一 地 激活 的 周 沿 了 淋巴 球 和 T 淋巴 瘤 细 胞 ,结果 发 现 T 细 胞 表面 膜 上 只 存在 一 类 免疫 球 EA (图 13-9) 。 这 种 免疫 球 蛋白 的 分 子 量 近 200,000， 是 由 典型 的 轻 链 和 有 些 类 似 & 链 的 重 链 构成 的 。 不 过 这 种 重 链 无 论 在 抗原 性 、 电泳 迁移 率 和 Fe 的 功能 特性 方面 都 和 人 链 有 区 别 ， 可 能 代表 一 类 新 的 重 链 (Marchalonis， 1975) 。 最 近 ， 同 一 实验 室 用 免疫 电镜 术 (扫描 和 透 射 ) 观察 到 纯化 的 抗 小 鼠 IgG 之 (Fab’), 片段 的 鸡 抗体 能 和 豚鼠 T 淋巴 球 内 源 合成 的 膜 成 分 结 质 不 同 ，IgD 的 8 链 很 容易 被 酶 解 ， 这 。 总 结 起 来 , 现 有 的 材料 表明 B MER ph tate L 0 10 20 30 40 管 数 13-8 先天 性 无 胸腺 小 鼠 〈 突 变 nu HAF) 脾脏 B 淋巴 球 表面 免疫 球 蛋白 经 还 原 和 “ 工 标 记 后 之 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 , 缓冲 液 含 SDS。 免 疫 球 蛋白 用 对 “上 链 专 一 的 免疫 吸附 剂 分 离 。 My 7Y 和 L 指 小 鼠 上 、 7 和 轻 链 在 凝 胶 电 访 中 移动 的 位 置 。 表面 免疫 球 蛋 白 用 非 离子 型 表面 活性 剂 Nonidet P-40 溶解 ( 据 Marchalonis, 1975), 合 。 这 提供 了 T 淋巴 球 表面 存在 和 Ig 有 关 的 膜 抗原 的 直接 证 据 (Marchalonis 等 ， 1978). 3. 分 离 的 淋巴 球 表面 免疫 球 蛋 白 的 结合 专 一 性 虽然 从 淋巴 球 表面 可 以 分 离 出 免疫 球 蛋白 ， 但 要 肯定 这 些 膜 结合 的 免疫 球 蛋 白 就 是 抗原 受 体 ， 还 需要 证 明 它 们 对 抗原 确 有 结合 专 一 性 。 * 406 (1) BACH 已 知 先天 性 无 胸腺 小 鼠 (nu /nu) 之 未 经 免疫 的 B 细胞 群 中 ， 大 约 1% 的 细胞 能 和 DNP- 血 红 蛋 白 专 一 地 结合 。 从 这 些 细 胞 代谢 释放 的 ， 或 经 过 有 限制 酶 解 从 细胞 表面 分 离 出 来 的 免疫 球 蛋白 ， 同样 地 也 能 和 DNP 半 抗 原 结合 ， 并 且 这 种 结合 能 被 抗 免疫 球 蛋 折 的 抗 血 清 共 同 沉 淀 专 一 地 去 除 (Rolley 和 Marcha- lonis，1972) 。 (2) 激活 的 工 细 胞 Marchalonis 认为 CBA 小 鼠 体 内 被 羊 红血球 或 血 蓝 须 激活 的 了 辅助 细胞 能 代谢 释 放 类 似 IgM 的 表面 免疫 球 蛋白 , 并 且 这 些 分 子 还 能 和 相应 的 抗原 专 一 地 结合 。 此 外 , 似乎 还 有 证 据 指 出 激活 的 工 细胞 杰 放 的 免疫 球 蛋 白 能 和 巨 噬 细 胞 表面 亲 合 ， 而 B 细 胞 释放 的 表面 免疫 球 蛋白 则 不 能 亲 合 (Marchalonis 和 Co- ne, 1973; Cone，1974) 。 Marchalonis 通过 系统 的 工作 证 明 从 BAW 0.50 0.75 相对 迁移 率 13-9 从 小 鼠 胸 腺 淋巴 球 表面 免疫 球 蛋白 的 I 标记 多 肽 链 和 纯化 的 IgM 和 IgG 免疫 球 蛋白 多 肽 链 在 酸性 尿素 内 圆 盘 电泳 的 比较 。 CBA/H/WEHI 小 鼠 胸 腺 细胞 在 离 体 条 件 下 被 BALB/c 组 织 相 合 性 抗原 激活 。 (—X—) 激活 的 胸腺 细胞 的 表面 免疫 REA (c.p.s.); (—@—) 小 鼠 IgG SKE Cc. p-m.X10-7); (—O—) IgM 髓 细胞 瘤 免疫 球 蛋 白 (《c.p.s.XI10-:)。 标 准 多 肽 链 的 相对 迁移 率 : BH 0.55—0.75, vr # 0.40—0.48, met 0.27—0.33, 所 有 样品 均 为 专 一 地 共同 沉淀 物 ， 并 在 gM 尿素 内 经 还 原 和 人 烷 基 化 ( 据 Marchalonis 4,1972), 胞 表面 分 离 的 免疫 球 蛋白 ， 表 现 出 对 抗原 的 结 合 专 一 性 ,因而 可 能 就 是 膜 上 的 抗原 受 体 . 同 时 ， 也 有 一 些 证 据 提 示 至 少 某 些 了 细胞 (辅助 细胞 ) 表面 也 可 能 存在 类 似 IEM 的 抗原 受 体 , 不 过 其 重 链 和 上 & 链 在 结构 和 功能 上 都 有 不 同 。 Marchalonis 还 根据 从 激活 的 T 细 胞 分 离 的 免疫 球 蛋白 对 巨 史 细胞 有 亲 合 力 , 进一步 推测 这 种 分 子 可 能 就 是 参与 TI 和 了 B 细胞 协同 作用 的 中 介 因 子 ， 并 称 之 为 IEM (T) 。 不 过 后 一 看 法 没有 得 到 普遍 的 承认 。 除 上 述 实 验 室 的 工作 外 ,其 他 许多 实验 室 用 类 似 的 方法 也 证 实 也 细胞 表面 存在 IEM 抗原 受 体 。 然 而 ， 从 胸腺 细胞 或 激活 的 T 细 胞 都 不 能 证 实 有 免疫 球 蛋白 存在 ， 因 而 怀疑 细 胞 表面 抗原 受 体 可 能 不 是 免疫 球 蛋 白 (Lisowska-Berstein 等 ，1973; Parkhouse 和 Abney, 1972; Vitetta 和 Uhr，1975) 。 总 之 ,综合 各 方面 的 材料 看 来 , 对 于 B 细 胞 表面 抗原 受 体 是 免疫 球 蛋 白 的 结论 是 一 致 的 ,而 对 了 细胞 表面 抗原 受 体 的 性 质 则 存在 分 歧 的 意见 ， 至 今 尚 无 定论 。 (=) T 细胞 表面 抗原 受 体 的 性 质问 题 。 抗原 识别 构造 的 关系 。 如 上 所 述 ， 虽 然 Nossals，Marchalonis 实验 室 的 工作 提示 工 细 胞 抗原 受 体 可 能 是 类 似 IEM 的 免疫 球 蛋 白 , 但 是 没有 得 到 其 他 实验 室 的 证 实 。 目 前 ， 多 数 免 疫 学 家 倾向 于 认为 了 淋巴 球 表面 没有 自己 合成 的 任何 一 类 免疫 球 蛋白 ， 也 没有 存在 “或 1 轻 链 的 可 靠 e 407 « Ir 基因 产物 和 证 据 。 从 七 十 年 代 起 ， 几 方面 的 研究 工作 结果 影响 了 对 也 细胞 抗原 受 体 的 性 质 的 看 法 。 首 先 注意 到 的 是 ， 和 B 淋巴 球 不 同 , T 淋巴 球 的 功能 特点 在 于 识别 主要 组 织 相 容 性 基因 复 合 物 (MHC) 及 其 变异 的 产物 并 与 之 起 反应 。 其 次 ， 它 们 对 通常 的 胸腺 依赖 性 抗原 〈 和 蛋 白质 和 多 肽 ) 的 免疫 反应 能 力 受 到 位 于 MHC 区 域内 的 一 系列 的 Ir BABA. HER 传 学 研究 发 现 和 主要 组 织 相 容 性 基因 座 连 锁 的 免疫 反应 Ir) 基因 能 制约 了 细胞 对 抗 原 反应 的 能 力 (Benacerraf 和 McDevitt，1972) 。 由 于 ITr 基因 主要 表现 在 工 细胞 表面 ， Wk H-2 抗 血清 能 抑制 工 细胞 功能 ， 因 而 推测 开 细 胞 的 抗原 受 体 可 能 和 IFr 基因 产物 有 关系 (参看 十 五 章 503 页 ) 。 另 一 方面 ,有 证 据 表 明 对 同一 个 抗原 决定 簇 反应 的 下 、B 淋 巴 球 之 抗原 结合 部 位 有 同样 的 或 相似 的 个 体型 (Idiotype) (Binz 和 Wigzell, 1975; Eichmann, 1973, 1975), 也 就 是 说 两 类 淋巴 球 对 同一 抗原 决定 簇 的 受 体 分 子 具 有 共同 的 易 变 区 (V 区 ) 。 由 此 还 可 以 进一步 推论 ， 两 类 淋巴 球 可 能 是 用 共同 的 基因 来 建造 它们 的 抗原 受 体 的 结合 部 位 的 。 根 据 这 些 资料 ， 有 人 设想 T 细胞 抗原 受 体 可 能 是 一 个 婚 Alig 部 分 相似 ， 又 和 也 -2 抗原 部 分 相似 的 复合 构造 ， 也 可 能 是 具有 类 似 Ig 的 YY 区 和 I- 区 基因 产物 的 C 区 的 复合 分 子 (Galley 和 Edelman, 1972; Greaves, 1975). © 最 近 ， 发 现 激活 的 工 淋巴 球 能 fF BAY 40,000— 和 了 细胞 接受 都 位 的 编码 基因 ( 据 Munro 和 Taussig 1975), 60 .000 a ge geet re a ae tk peas 链 C 区 的 抗原 决定 符 ， 而 具有 Ia 抗原 决定 往 (Paul 和 Benacerraf，1977) 。 这 些 具 有 Ia 抗原 决定 笠 的 分 子 和 具有 抗原 结合 专 一 性 的 le 重 链 个 体型 决定 税 分 子 的 关系 如 fl, ARSE . 这 里 特别 要 提 到 Taussig 和 Munro (1975a,b) 的 一 个 实验 。 他 们 发 现 小 鼠 对 (T,G)-Az 上 抗原 的 免疫 反应 是 受 位 于 MHC 的 工区 的 两 个 不 同 功 能 的 基因 控制 的 六 一 个 基因 控制 了 细胞 对 抗原 的 识别 和 产生 细胞 协同 作用 因子 ; 另 一 个 基因 控制 了 B 细胞 对 工 细胞 因子 的 反应 (参看 第 十 五 章 ,504 页 ) 。 某 些 品 系 的 小 鼠 对 (T, G)-A-LE ARM, A fe 是 由 于 了 细胞 的 遗传 缺陷 , 不 能 产生 对 此 抗原 专 一 的 “T?” 因 子 , 而 另 一 些 遗 传 上 无 反应 能 力 的 品系 ， 则 是 由 于 了 细胞 缺少 接受 此 “T?” 因 子 的 接受 分 子 , 或 两 者 都 缺乏 。 当 把 遗传 上 瑞 细 胞 缺陷 的 小 鼠 和 了 B 细胞 缺陷 的 小 鼠 交配 时 ，Ri 子 代 便 能 恢复 对 此 抗原 的 反应 能 力 。 作者 的 解释 是 由 于 I- 区 基因 互补 的 结果 ， 并 由 此 推论 ，I 一 区 可 能 包含 有 T 和 BB 细胞 表面 识别 分 子 ( 具 Ia 抗原 性 的 糖 蛋白 分 子 ) 的 结构 基因 。 这 些 糖 蛋白 分 子 可 能 不 仅 。408 。 接受 部 位 Ja(B); Ir B Ania 对 抗原 识别 有 关系 ， 而 且 和 了 ,B 细胞 以 及 巨 史 细胞 闻 的 识别 有 关系 (图 13-10)。 如 果 这 一 看 法 是 正确 的 ，I- 区 基因 产物 不 仅 和 了 细胞 的 抗原 受 体 有 关系 ， 而 且 和 免疫 活性 细胞 闻 相 互 识别 系统 也 可 能 有 关系 。 这 就 向 分 子 免疫 学 提出 了 又 一 个 需要 深 人 细致 研究 的 重 要 课题 。 三 、 淋 巴 球 的 激活 -淋巴 球 通常 在 没有 受到 外 界 刺 激 时 ，- 停 顿 在 分 裂 静止 期 ( 早 G1 期 )， 功 能 上 不 活跃 。 当 马 淋巴 球 表 面 的 抗原 受 体 和 诱导 信和 号 激活 信号 “调节 信和 号 专 一 的 抗原 结合 时 ， 便 触发 一 | AASRORM, (Ave I 地 激活 ,导致 细胞 的 增生 、 分 化 eke Bay ey 和 专 一 抗体 的 合成 。B 淋巴 球 CN 人 i SRB MR. FLA << MASH, UOT Efe AB 淋巴 球 表面 抗原 受 < sea ”一 -一 一 体 的 相互 作用 在 这 一 触发 机 制 图 13_11， 淋 巴 球 生命 史 中 接 受 的 信号 和 反应 。 诱 导 信 中 起 主导 作用 。 不 过 , B 细胞 号 : 胸腺 或 法 氏 训 《相当 的 器 官 ) 的 诱导 因 于 诱导 干 细 表面 其 他 膜 构造 和 辅助 细胞 A T, B 淋 巴 球 及 其 亚 群 方向 分 化 。 激 活 信号 ; 主要 为 抗原 未 身 。 调节 信号 : 工 细 胞 产生 的 辅助 因子 或 抑 CT 细胞 和 巨 叹 细 胞 ) 产生 的 专 制 因 子 , 蒋 原 抗体 和 C3 复 合 物 ， 激 素 等 〈 据 Greaves, 一 因子 的 相互 作用 也 可 能 参加 1975). 作用 。 实际 上 ,一 个 有 免疫 反 应 能 力 的 B 细胞 的 抗体 反应 是 包括 激活 和 调整 的 多 步骤 的 复杂 过 程 ， 受 到 专 一 的 抗原 信 号 和 其 他 免疫 细胞 的 调节 信号 以 及 激素 的 影响 (图 13-11) 。 因此 ， 应 当 区 分 哪些 信号 是 初级 信号 ， 哪些 是 次 级 信号 ;什么 是 始 发 反应 ,什么 是 继 发 反应 。 除 抗原 能 专 一 地 触发 淋巴 球 的 免疫 反应 外 ， 还 发 现 一 些 非 专 一 的 物质 ， 如 植物 血球 凝集 素 ` 细 菌 内 毒素 . 脂 多 糖 等 也 能 触发 了 或 B 细胞 群 中 相当 大 的 一 部 分 细胞 进行 OR 活动 。 这 类 物质 因而 被 称 为 有 丝 分 裂 原 (Mitogen) 。 有 丝 分 裂 原 对 两 类 淋巴 球 的 作用 是 有 选择 性 的 。 植 物 凝 集 素 ， 如 刀 豆 凝集 素 (ConA)、 植 物 血球 凝集 素 (PHA) SHE 一 地 激活 了 细胞 ， 使 它们 增生 ,转化 并 释放 各 种 和 细胞 免疫 有 关 的 介 导 因子 。 另 一 方面 ， 美洲 商 陆 有 丝 分 裂 原 (Pokeweed mitogen) 和 细菌 脂 多 糖 (LPS)-- 等 能 选择 地 激活 也 淋巴 球 增生 、 分 化 成 浆 细 胞 ， 并 分 这 IgM 抗体 (Parkhouse 等 ,1972; Anderson 和 Melcher，.4973) 。 不 过 ， 这 样 产生 的 一 些 抗体 的 结合 专 一 性 可 能 是 多 种 多 样 的 ,并 且 和 原 用 来 激发 的 有 丝 分 裂 原本 身 的 抗原 性 可 能 没有 关系 (Anderson 等 ，1972) 。 因 此 , 这 一 类 物质 又 被 称 为 多 株 了 细胞 分 裂 原 (Polyclonal B cell activator, {ij # PBA). PBA 对 B 细 胞 的 作用 是 直接 的 ， 不 需要 辅助 细胞 (Tie, Baws. BAY 许多 PBA 同时 又 是 不 依赖 胸腺 的 抗原 。 或 者 ， 更 确切 地 说 ， 不 依赖 胸腺 抗原 的 载体 部 分 具有 内 在 的 多 株 B 细胞 分 裂 原 的 性 质 ( 表 13-2). 由 于 各 种 各 样 抗 原 结合 专 一 性 WB 。409。 | { 13-2 常见 的 多 株 B 细胞 激活 因子 和 不 依赖 胸腺 抗原 多 株 了 细胞 激活 因子 不 依赖 胸腺 抗原 脂 多 糖 (LPS) 脂 多 糖 CLPS) 肺炎 球菌 多 糖 SIII 肺炎 球菌 多 糖 SIT 多 聚 体 凌 毛 素 (POL) 多 聚 体 雁 毛 素 (POL) 果 聚 糖 RAIS WARS 葡 聚 糖 美洲 商 陆 有 丝 分 裂 原 (PWM) 某 些 KLH 制品 某 些 KLH 制品 ( 据 Coutinho 等 ，1975)。 细胞 都 能 被 激活 ，PBA 显然 和 抗原 受 体 之 间 不 存在 空间 互补 关系 ,或 者 说 这 种 激活 信号 是 不 专 一 的 。 然 而 ， 这 种 非 专 一 的 信号 和 抗原 的 专 一 信号 都 能 导致 共同 的 结果 : B 细胞 的 形态 转化 、 增 生 和 合成 抗体 。 这 说 明 PBA 对 B 细胞 的 激活 作用 可 能 通过 和 抗原 某 些 共同 的 机 制 ， 并 可 能 反映 了 细胞 激活 始 发 过 程 的 某 些 方面 。 一 般 抗 原 只 能 激活 淋巴 细胞 群 中 极 少 数 的 细胞 ， 因 此 很 难 直 接 研究 抗原 引起 的 膜 变 化 和 分 裂 的 发 动 过 程 ; 有丝分裂 原 却 能 够 激活 相当 大 的 一 部 淋巴 细胞 ， 这 就 为 分 析 研 究 提供 了 方便 。 因 此 ， 通 常 把 有 丝 分 裂 原 对 淋巴 细胞 的 激活 当 作 一 个 实验 模型 ， 来 帮助 我 们 分 析 和 了 解 抗原 对 淋巴 球 的 激 活 机 制 。 为 了 使 问题 简化 起 见 ， 这 里 只 限于 讨论 有 丝 分 裂 原 对 淋巴 球 激 活 的 一 个 初期 阶 段 ， 即 分 裂 的 发 动 。 同 时 ， 主 要 讨论 B 细胞 的 激活 ， 有 时 也 提 到 了 细胞 。 这 两 类 淋巴 球 在 分 裂 发 动机 制 的 主要 方面 是 相似 的 (Greaves 和 Janossy，1972) 。 一) 淋巴 球 的 激活 是 一 个 细胞 表面 现象 激素 对 效应 细胞 的 作用 机 制 可 以 作为 研究 信号 - 受 体 -基因 激活 系统 的 一 个 借鉴 。 已 知 激素 对 体 细 胞 的 作用 机 制 存 在 两 种 方式 。 一 种 方式 ， 如 某 些 当 体 激 素 ( 孕 酮 ) 直 接 进 入 股 细胞 ， 和 细胞 质 内 专 一 的 受 体 蛋白 结合 后 ,再 进入 细胞 核 , 选择 地 激活 基因 的 功 能 活动 。 另 一 种 方式 ,多 肽 或 蛋白 质 激素 ( 如 升 血 糖 素 .胰岛 素 等 ) 和 效应 细胞 膜 上 的 受 体 Kb 受 体 mma 腺 埋 酸 环 化 酶 MgATP gAT —O—m C-AMP D RNA ABS [-— mre = nat cAMP em cAMP 受 体 蛋白 (CRP) 5“AMP (a) (b) 图 13-12 多肽 激素 对 效应 细胞 的 作用 机 制 。(a) 激素 作用 于 膜 受 体 ,导致 次 级 信号 (CAMP) 的 产生 。 (b) cAMP 调节 基因 的 转录 (借用 E. coli 模型 )( 据 Greaves, 1975), 人 基因 转录 专 一 地 结合 , 激活 膜 上 的 腺 背 酸 环 化 酶 ， 产 生 环 化 腺 背 酸 (C-AMP) 作为 次 级 信号 ， 选 择 地 激活 基因 , 而 导致 专 一 的 激素 效应 (参阅 Sutherland 和 Robinson, 1966; Gre- aves, 1975) (图 13-12) 。 参照 上 述 激素 对 效应 细胞 作用 机 制 的 概念 ， 抗 原 ( 或 有 丝 分 裂 原 ) 和 淋巴 细胞 表面 受 体 结 合 ， 如 何 触发 细胞 的 增生 分化, 理论 上 同样 可 能 存在 这 两 种 作用 方式 。 已 知 孔 淋 巴 球 对 溶解 的 PHA 无 激活 反应 。 然 而 ， 当 把 PHEA 和 了 琼脂 糖 珠 共 价 连 接 , 形 成 固 相 复合 物 时 ， 便 能 刺激 B 细胞 增生 。 可 溶性 PHA 是 了 细胞 专 一 的 ,而 固 相 PHA 却 能 激活 B 细 ff. 这 一 事实 有 力 地 说 明 因 相 PHA 对 了 3 细胞 的 刺激 作用 不 是 由 于 从 琼脂 糖 珠 上 掉 下 来 的 可 谥 性 物质 引起 的 。 (Greaves 和 Bauminger, 1972; Anderson 等 ，1972) 。 同 样 地 ， 当 把 半 抗 原 共 价 连 接 到 固体 颗粒 表面 (如 TNP-KLH- 琼 脂 糖 珠 、TNP- 聚 丙烯 酰 RR), 这样 得 到 的 不 溶 的 半 抗 原 ， 也 能 在 离 体 条 件 下 , 激活 也 细胞 的 IEM 抗体 反应 (Feldman 等 ，1974) 。 ”这 些 观 察 提示 有 丝 分 裂 原 和 半 抗 原 很 可 能 直接 作用 于 细胞 表 面 。 不 过 也 不 能 完全 排除 它们 既 产 生 膜 效应 ， 又 有 少数 分 子 通过 饮 液 作用 进入 细胞 内 起 作用 的 可 能 性 。 既 然 了 淋巴 球 激 活 的 始 发 机 制 可 能 主要 是 一 个 膜 现象 ,于 是 , 便 可 以 提出 问题 ， 受 到 抗原 刺激 时 细胞 膜 内 发 生 了 什么 变化 ? 膜 内 的 变化 又 如 何 通 过 细胞 质 传 回 细 胞 核 内 ,选择 地 激活 基因 ， 发 动 分 裂 和 分 化 ? 其 次 ,既然 非 专 一 的 信号 (PBA) 和 专 一 的 as (UR) 都 能 激活 了 淋巴 球 ， 这 就 提出 了 一 个 激活 信号 的 本 质问 题 : 非 专 一 信号 和 专 一 信号 的 关系 如 何 ? B 细胞 对 抗原 的 反应 中 存在 单一 信号 ， 还 是 双重 信号 ? 我 们 将 依次 在 下 面 讨论 这 些 问题 。 (=) 淋巴 球 激活 时 细胞 膜 的 变化 、 相关 的 和 继 发 的 反应 淋巴 球 的 激活 是 专 一 的 抗原 或 非 专 一 的 有 丝 分 裂 原 和 细胞 表面 受 体 相互 作用 的 结 果 。 这 种 相互 作用 立即 触发 细胞 膜 内 以 及 和 膜 相 关 的 广泛 的 变化 〈 膜 的 流动 性 和 磷脂 代谢 增加 、 阳 离子 和 代谢 物 转运 ee 加 强 、 环 核 昔 酸 酶 活力 增加 等 )， 并 且 迅 速 反映 到 细胞 核 内 〈 染 色 质 组 蛋白 乙酰 he 化 ) 。 同 时 , 在 形态 上 可 观察 到 细胞 表面 受 体 聚 集成 镁 ， 并 向 细胞 一 端 移动 , 形 4 “his”. Fa, BRAKE 0.02 力 增加 ，RNA 和 蛋白 合成 增加 。 直到 48 一 72 小 时 后 ，DNA 开始 合成 ， 从 而 导致 细胞 分 裂 。 由 于 淋巴 球 激 活 时 细胞 膜 的 变化 出 现 很 早 ， 又 几乎 是 同时 发 生 时 间 ( 分 ) 的 ,很 难 确定 其 发 生 的 先后 和 因果 关系 。 图 13-13 小 鼠 脾 脏 淋 巴 球 加 有 丝 分 裂 原 ConA (3 微克 / 这 里 先 对 这 些 变化 作 现 象 上 的 描述 ， 然 ZF) 后 不 同时 间 对 细胞 膜 流 动 性 的 影响 。 人 AS = Surg eA = SconA» Sam = 0.52, 4S >l MH, KIRBY FBS, 后 再 作 分 析 讨 论 。 而 S~0 时 相当 于 液态 ( 据 Barnett 等 ，1974)。 。411 。 = nn 1 细胞 膜 磷脂 代谢 和 流动 性 的 改变 淋巴 球 激 活 的 早期 反应 之 一 是 细胞 膜 内 磷脂 (如 磷脂 酰 肌 醇 等 ) 的 代谢 率 增 高 〈Fi- sher 和 Mueller, 1968), PHA 刺激 淋巴 球 10 分 钟 后 ， 也 观察 到 “C- 油 酸 参 人 细胞 膜 的 卵 磷脂 增加 三 倍 以 上 CResh 等 ，1972) 。 有 人 用 电子 顺 磁 共振 ( 自 旋 标 记 ) 法 ， 观测 到 淋巴 球 受到 有 丝 分 裂 原 刺 激 的 几 分 钟 内 ， 细 胞 膜 的 流动 性 就 开始 增加 ，15 一 30 分 钟 达到 顶峰 (图 13-13) 。 值得 注意 的 ， 膜 流动 性 变化 的 时 程 正好 和 细胞 内 CGMP 和 cAMP 水 平 涨 落 的 时 程 大 体 上 是 平行 的 。 其 次 ， 各 种 植物 凝集 素 中 ， 只 有 那些 具备 有 丝 分 裂 原 活 力 的 (如 PHA，Con A 等 ) 才能 使 膜 流 动 性 增加 ， 而 不 具有 丝 分 裂 原 活 力 的 (如 WGA) 则 不 能 ， 并 且 即 使 是 前 者 ， 也 只 有 在 能 发 动 分 裂 的 有 效 浓 度 才 能 引起 膜 疲 动 性 的 变 化 。 这 提示 膜 疲 动 性 变化 和 分 裂 的 发 动 可 能 有 密切 关系 (Barnett 等 ，1974) 。 2. ABB (Catt, Kt) 转运 的 加 强 淋巴 球 激 活 的 早期 过 程 中 出 现 的 另 一 个 膜 现 象 是 阳离子 通 透 性 增加 。 (1) BAF 虽然 淋巴 球 激 活 时 各 种 膜 现象 出 现 的 先后 顺序 和 因果 关系 , 还 难于 确定 ,有 许多 证 所 表明 Ca ”起 着 重要 的 作用 。 在 加 了 PHA AA, Catt it Ae eM (Whitney 和 Sutherland, 1973; Allwood %, 1971), #H#BT+WAAHl (EGTA, EDTA) 能 Ay witb] PHA 请 发 的 淋巴 细胞 的 转化 (Alford, 1970; Whitney 和 Sutherland, 1973) 。 已 知 一 种 抗生素 A 23187 是 专 一 的 双 价 离子 载体 (Ionophore) 。 它 是 一 种 低 分 子 量 的 单 盐 基 的 羧 酸 。 当 两 个 分 子 和 双 价 阳离子 形成 一 个 脂 溶性 复合 物 时 ， 易 于 穿 过 细 ge (b) oo Z os & g 己 一 -@ BR 6 a 3 Si ~~ 2 Ps ry < E £. x & = E 4 é z Ww ts = at = &\ < 二 &\ 已 2 这 名 0 5 10 rapid 23187 0 20 40 60 80 100 200 500 PHA 小 时 微克 /108 细胞 /5 毫升 图 13-14 A23187 (一 0--) 和 PHA (—@—) 对 淋巴 球 的 激活 。 (2) “五 一 胸 腺 喀 啶 参 人 的 时 程 。 Cb) 对 磷 酯 酰 肌 醇 代谢 率 加 强 的 剂量 作用 曲线 ( 据 Crumpton 等 ，1975)。 六 1 胞 膜 。 当 用 A 23187 处 理 淋巴 球 时 ， 便 能 引起 和 了 PHA 引起 的 一 样 的 变化 ， 并 且 这 些 变 化 的 进程 大 体 上 是 平行 的 (图 13-14) 。 因此 ， 这 一 实验 有 力 地 提示 Ca”… 通 透 性 的 增加 和 淋巴 球 激活 可 能 有 直接 的 关系 。 Cat 流入 量 或 细胞 内 Ca 一 水平 的 增高 是 淋巴 球 激活 的 必要 兼 充分 条 件 (Maino 等 ，1974; Crumpton 等 ，1975; Quastel 等 ，1975) 。 (2) 十 高 到 初期 研究 发 现 淋巴 球 被 有 丝 分 裂 原 激活 的 头 几 分 钟 内 ，“ 必 的 流入 量 迅 速 增 加 。 细 胞 膜 土 KK,Na+*-ATP 酶 的 专 一 抑制 剂 fle H (Quabain) 能 可 逆 地 抑制 有 丝 分 裂 原 对 淋巴 细胞 的 激活 ， 而 外 界 愉 * 浓 度 升 高 能 减 小 或 抵 销 箭 毒 背 的 抑制 作用 , 并 且 还 观察 到 各 种 有 丝 分 裂 原 引 起 的 CH - Re RA BAK 流入 量 的 剂量 反应 曲线 是 相似 的 。 有 大 认为 这 些 事实 提示 有 丝 分 裂 原 可 能 激活 细胞 膜 K*,Nat-ATP 酶 ， 增 加 细胞 A Kt 流 大 量 和 Na 排出 量 ， 并 且 由 于 细胞 内 屎 "水平 的 增高 可 能 触发 促使 DNA 合成 的 代谢 过 程 %Averdunk 和 Lauf, 1975; Quastel, 1975). 然而 ， 用 原子 吸收 法 直接 测量 ConA 刺激 时 淋巴 细胞 内 KK 含量 的 变化 , 却 发 现 细 胞 内 愉 * 的 量 迅速 而 持续 地 降低 ， 而 Na 并 不 发 生 补偿 性 升 高 (Negendank 和 Colli- er, 1976), 因此 ， 目 前 只 能 说 Con A 刺激 能 改变 淋巴 球 K 通 透 性 ， 不 过 其 结果 是 及 * mA Bint Bit#s CABS SI. GABA (Valinomycin) 2-HAKRAA,. EVURAKAW, HRELMSA 向 环 的 中 心 ， 形成“ 穿 膜 孔 道 ”, 被 转运 的 KRAUS VA, 通过 构象 变化 而 将 玫 + 离 FRURGAABA. RE, GARMMARA REM il PHA 刺激 的 淋巴 细胞 的 增生 转 MGs 并 且 这 种 抑制 作用 可 被 增加 外 界 玉 “ 离 子 浓 度 所 阻止 (Daniele 和 Holian, 1976), 这 一 实验 似乎 提示 有 丝 分 裂 原 对 淋巴 球 的 激活 作用 可 能 涉及 影响 膜 电 位 变化 和 离子 通过 膜 的 转运 。 (3) 淋巴 球 激活 过 程 中 阳离子 作用 的 顺序 性 利用 专 一 的 鳌 合 剂 (EDTA 对 Ca* + ，O- 二 氮 杂 非 对 Zntt) 或 K+,Na+-ATP i 抑制 剂 ( 稍 毒 背 ) 分 析 淋 巴 球 被 有 丝 分 裂 原 激 活 各 时 期 对 阳离子 的 要 求 ， 得 出 阳离子 起 作 用 的 顺序 如 图 13-15 所 示 。 从 图 上 可 见 ， 有 丝 分 裂 原 和 淋巴 球 表面 结合 的 触发 作用 本 身 (SRD 似乎 并 不 需要 这 几 种 阳离子 。 和 其 他 两 种 阳离子 不 同 ，Ca' + 离子 只 是 在 刺激 后 几 小 时 内 (步骤 2) 是 必需 的 。 如 果 在 细胞 经 PHA 处 理 12 小 时 后 ,再 加 EDTA 去 除 4 Se . DNA 合成 a THe BADR Kt Kt K+ Znt+ 图 13-15 淋巴 细胞 激活 中 阳离子 作用 的 时 间 顺 序 。 步骤 1: 有 丝 分 裂 原 和 细胞 膜 结合 的 触 发 作用 。 步骤 3 和 6: RRA REM MEERA RNA A. HM 2,，3, 4: 激 活 状 态 A 和 DNA 合成 发 动 之 间 的 一 连 哩 中 间 过 程 ( 据 Kaplan 和 Quastel, 1975), “413。 Ca …， 对 淋巴 球 转化 就 不 再 会 起 抑制 作用 了 。 早 期 激活 过 程 不 需要 Zn ，O- 二 氮 杂 非 不 抑制 蛋白 质 或 RNA 合成 ， 而 完全 抑制 晚期 才 开 始 发 生 的 DNA 合成 (步骤 4) 。 HE 则 抑制 全 过 程 。 除 去 第 1 步 和 5,6 步骤 外 ,所 有 步骤 都 需要 K 离子 (Kaplan 和 Quas- tel, 1975). 3. FABER 已 知 环 式 核 苷 酸 (cAMP 和 cGMP) 是 哺乳 类 细胞 生长 、 分 化 和 功能 活动 的 细胞 内 调节 物 。 细 胞 生命 活动 的 许多 矛盾 过 程 ， 如 分 裂 的 发 动 和 抑制 、 糖 原 的 合成 和 分 解 等 ， 都 可 能 受 细胞 内 rh cAMP #1 cGMP 浓度 的 相对 变化 =z 调控 (Kolata, 1973), 例如 离 体 培养 的 成 纤维 细胞 受到 生长 因子 刺 激 而 增生 、 分 裂 时 ， 细 胞 内 cGMP 水 平 迅 速 升 高 , 而 cAMP 水平 却 很 少 变化 。 反 之 ,加 前 列 腺 素 PGI 时 ， 细 胞 内 CAMP 水 平 升 高 , 而 细 胞 的 DNA 合成 和 分 裂 却 受到 抑 filo 因此 ， 一 般 认 为 cGMP 似乎 @ . 可 能 作为 细胞 生长 调控 的 正信 号 ， 图 13-16 高 度 纯化 的 植物 血 凝 素 制 品 PHA 一 MR69 (3 微克 / 毫 bats : Ft) (一 @ 一 ) 对 淋巴 细胞 cGMP (4A) 和 cAMP (4B) 浓度 i cAMP 可 能 作为 负 信号 〈Rudl 的 影响 〈 一 一 ) 对 照 ( 据 Hadden 4, 1972), and #5, 1974), 对 于 免疫 系统 ，Hadden 等 (1972) 最 先 观察 到 当 用 ConA 和 PHA 处 理 淋 巴 细 胞 ，20 分 钟 内 细胞 里 的 cGMP 水 平 升 高 10 一 50 倍 ， 而 cAMP 水 平 则 维持 不 变 〈 图 13- 刺激 指数 16) 。 因此 ， 同 样 可 以 假定 淋巴 细 / cGMP 或 其 衍生 物 ， 就 应 和 ConA 一 样 ， 刺 激 淋 巴 细 胞 的 RNA 和 能 刺激 小 鼠 脾 脏 细胞 内 CGMP 3 (—e—) 二 丁 基 环 -GMP; (一 o 一 ) 8 溴 环 GMP] 对 °H 尿 喀 喧 (a) 和 35H 胸腺 喀 啶 (b) BA TCA 沉淀 的 大 分 子 部 分 之 刺激 作用 。 胞 激活 时 ，cGMP 的 暂时 升 高 可 能 作为 诱导 增生 的 正信 号 ， 而 cAMP DNA 的 合成 。 实验 结果 证 明确 系 / 如 此 (图 13-17) (Weinstein 等 ， 10-* 10-> 10-* 10-° 10-° 10-°°"10-* 10-74% 10° 速 而 短暂 的 升 高。 然而 ， 能 提高 细 ”刺激 指数 ( 纵 坐 标 ) 为 环 核 昔 酸 处 理 组 和 未 处 理 组 之 比值 ( 气 Wein 胞 内 cGMP 水 平 的 因素 (如 Carb- stein 等 ，1974)。 的 升 高 则 可 能 起 调节 或 限制 分 裂 的 作用 。 如 果 这 一 假定 是 对 的 ， 外 加 1974) 。Watson (1974，1975) 还 核 昔 酸 浓度 (M) 证 明 B falta 2220 22 A LPS 同样 “图 13-17 不 同 浓度 的 鸟 并 3，5 PREM [(-X-) cGMP; achol) ， 并 不 一 定 就 能 刺激 细胞 分 裂 。 有 证 据 表明 细胞 不 是 对 CGMP 的 绝对 水 平 的 变化 。414 。 起 反应 ,而 是 对 细胞 内 cAMP 和 cGMP 比值 的 变化 起 反应 。 这 些 证 据 是 ， 检 查 培 养 的 分 裂 细胞 和 不 分 裂 的 细胞 时 ， 发 现 虽 然 细 胞 内 ecAMP，cGMP 的 绝对 含量 可 能 各 不 相 Al, 可 是 不 分 裂 细 胞 和 分 裂 细 胞 有 很 明 确 的 区别。 不 分 裂 细 胞 的 cAMP /cGMP 比值 总 是 高 一 些 ， 而 分 裂 细 胞 就 低 很 多 (Rudland 等 ，1974) 。 另 一 方面 ， 培 养 的 脾脏 细胞 In cAMP 就 可 以 抑制 LPS 诱导 分 裂 的 作用 。 由 于 在 加 cAMP 时 细胞 内 原 有 的 cGMP 水 平 可 认为 维持 不 变 ， 而 cAMP/cGMP 比值 可 预料 应 有 所 上 升 (Watson，1974) 。 因 此 ， 认 为 细胞 内 cAMP /cGMP 比值 的 变化 可 能 是 调节 分 裂 的 发 动 的 信号 。B 细胞 有 丝 分 裂 原 的 共同 作用 可 能 是 引起 细 胞 内 CGMP 水 平 升 高 而 使 cAMP /cGMP 比值 降低 , 从 而 导致 细胞 分 裂 的 发 动 (Watson 等 ，1973;Watson，1975) 。 4. 微 管 和 微 丝 淋巴 球 表面 Ig 或 其 他 受 体 被 专 一 的 双 价 抗体 交叉 连接 后 ， 发 生 移动 ， 先 是 簇 集 成 片 , 然后 聚集 到 细胞 的 一 端 ,形成 * 极 冠 *(Taylor 等 ，1971) 该 作者 还 曾经 认为 这 一 现象 和 淋巴 球 的 激活 有 关系 。 (参看 第 四 章 ，114 页 ) 。 Edelman (1974) 实验 室 发 现 这 种 细胞 表面 受 体 的 移动 能 被 Con A 抑制 。 天 然 的 ConA BRAC). 衍生 物 琥珀 酰 -Con A 是 二 聚 体 ( 二 价 ) 。 这 两 种 分 子 在 低 浓度 时 都 能 刺激 淋巴 球 增生 。 可 是 ， KR ConA 在 高 浓度 时 反而 不 能 刺激 增生 ， 却 能 抑制 细胞 表面 受 体 的 移动 和 “ 极 冠 ? 形 成 。 琥 珀 酰 -ConA 即使 在 高 浓度 仍 能 刺激 增生 ， 同 时 并 不 抑制 受 体 的 移动 。 已 经 和 琥 珀 酰 - ConA 结合 的 淋巴 球 ， 如 果 再 用 抗 -ConA 抗 体 处 理 时 ， 受 体 的 移动 又 受到 抑制 。 由 此 可 见 ， 受 体 移动 的 抑制 是 和 受 体 被 广泛 地 交叉 连接 有 关系 ， 并 且 “ 极 冠 ?形成 和 淋巴 球 的 激 活 之 间 并 不 存在 Taylor 曾经 设想 的 那 种 因果 关系 。 进一步 实验 分 析 还 发 现 ， 秋 水 仙 碱 、 长 春花 碱 和 长 春 新 碱 等 破坏 细胞 微 管 的 药物 能 解除 ConA 引起 的 细胞 表面 受 体 移动 的 抑制 (图 13-18; 图 13-19) 。 此 外 ， 还 有 人 发 现 受 体 移动 和 “ 极 冠 " 形 成 受 对 松 胞 素 〈Cytochalasin B) 敏感 的 构造 一 一 微 丝 控 制 (de Oo AZ H,C—cC NJ Oo / H,C—cC SN 四 价 ConA oaA 十 细胞 | 十 细胞 细胞 表面 受 体 移动 不 抑制 ; | [ sane ate re = est ae H 1 微 管 系 很 少 改 - | 受 体 发 生 广泛 地 交 又 连接 ; den See ee | RHR | + Bok ui Soy sea ees | 受 体 状态 平衡 移 向 固定 (A) | TD es 1 | See wm. | 图 13-18 ConA 或 琥珀 酰 -ConA 和 小 鼠 脾脏 淋巴 球 结合 对 细胞 表面 受 体 状 态 的 影响 。 加 抗 ConA 抗体 到 和 细胞 表面 结合 的 琥珀 酰 -ConA 可 模拟 ConA《〔〈 四 价 ) 的 效应 。 秋 水仙 碱 能 逆转 ConA F#FFHR-ConA 加 抗 -ConA 的 效应 ( 据 Edelman, 1974), * 4156 受 体 平衡 状态 2 HERA) 游离 状态 (FE) A aT ARACERA Sere eeeetert re ua ity nr 站 i ny Pi Ta T 本 9 syd | 秋水 仙 碱 效应 固定 状态 游离 状态 十 秋水 仙 碱 ?了 9 ?9 PP? Abney oy ie ree nny @,'8 人 上 图 13-19 细胞 玫 面 受 体 和 微 管 系 的 相互 作用 ， 以 及 ConA 和 秋水 但 碱 对 这 种 相互 作用 的 影响 。 CQ) 各 类 受 体 : 一 些 受 体 可 能 穿 过 细胞 膜 的 脂 双 层 ,直接 地 或 间接 地 和 细胞 质 内 微 管 系 相互 作用 ， 另 一 些 受 体 可 能 停留 在 膜 内 或 膜 上 。(2) 前 一 类 受 体 和 微 管 系 的 相互 作用 可 能 处 于 固定 状态 (A) 和 游离 状态 (FE) 的 平衡 中 。 (3) ConA 和 ConA 受 体 的 交叉 连接 可 能 导致 油管 系 的 变化 ,并 影 Nal FS AS =F 平衡 ,连带 地 使 全 部 受 体 转 人 固定 态 。 《4) 秋水 仙 碱 使 微 管 系 统 解 离 成 亚 基 ，, 结 果 使 ASF 平衡 逆向 移动 ( 据 Edelman, 1974), Peteris 和 Raff，1973) 。 这 些 事实 提示 淋巴 细胞 表面 各 种 受 体 可 能 直接 地 或 间接 地 和 细胞 膜 下 的 微 管 和 微 丝 系统 相互 作用 ， 它 们 可 能 固定 在 微 管 和 微 丝 系统 上 ， 或 处 于 不 男 定 的 游离 状态 。 各 种 配 位 基 ( 有 丝 分 裂 原 抗原、 抗体 等 ) 和 受 体 的 交叉 连接 都 可 能 改变 这 种 相互 作用 ， 影 响 微 管 系 统 的 解 离 和 聚集 状态 间 的 平衡 ， 从 而 调节 受 体 的 固定 、 游 离 和 移动 。 利 用 和 固 相 颗粒 (琼脂 糖 珠 .血小板 ) 共 价 连结 的 Con A 作 的 实验 还 指出 ，Con A 只 需 和 淋巴 球 表面 的 一 小 部 分 结合 ， 就 足以 抑制 整个 细胞 的 全 部 受 体 的 移动 。 这 就 是 说 Con A 和 细胞 表面 的 一 部 分 受 体 交叉 连接 时 ,一 部 分 受 体 固定 到 微 管 系 上 就 能 连带 地 使 全 部 受 体 转 人 固定 态 (Wang 等 ，1976) 。 另 一 方面 ， 还 发 现 秋水 仙 碱 能 抑制 有 丝 分 裂 原 (ConA) 对 淋巴 球 分 裂 的 发 动 。 动 力学 分 析 指 出 这 种 抑制 作用 发 生 在 加 ConA 的 早期 ， 并 且 可 能 和 有 丝 分 裂 原 的 触发 过 程 有 关 ， 而 不 是 影响 晚期 的 有 丝 分 裂 的 进行 (Wang 等 ，1976) 。 这 些 发 现 提 示 细 胞 质 微 管 ( 微 丝 ) 系 统 在 调节 细胞 分 裂 的 发 动 中 ， 可 能 起 重要 作用 。 根据 上 述 各 方面 的 实验 事实 ， 了 Edelman 等 人 提出 假说 ,假定 淋巴 细胞 表面 各 类 受 体 都 可 能 固定 在 膜 下 的 由 微 管 和 微 丝 构成 的 共同 骨架 一 一 细胞 表面 调节 系统 (Surface Modulating Assembly， 简 称 SMA) 上 面 。 这 种 细胞 表面 调节 系统 既 可 能 控制 细胞 表 面 受 体 的 移动 ， 同 时 又 能 控制 对 外 源 信号 (4 有丝分裂 原 的 触发 信号 ) 的 反应 ， 并 且 是 连接 细胞 表面 变化 和 对 分 裂 刺 激 的 反应 的 中 间 环 节 。 有 丝 分 裂 原 和 淋巴 球 表面 受 体 结合 而 产 生 的 分 裂 刺 激 可 能 是 通过 这 种 调节 系统 起 作用 的 (Wang 等 ，1976; Cunningham 等 ， 。416 。 1976). 5. 细胞 核 内 的 激活 过 程 细胞 核 的 激活 最 先 从 染色 质 上 的 蛋白 的 变化 中 表现 出 来 。Mirsky 实验 室 早 就 发 现 淋巴 球 受 到 PHA 刺激 时 ， 几 分 钟 内 染色 质 上 的 组 蛋白 (主要 是 “ 富 精 氮 酸 ”组 蛋白 ) 的 乙 酰 化 迅速 增加 ， 继 之 核 内 的 RNA 合成 也 增加 (图 13-20) (Pogo 等 ，1966) 。 另 一 方面 ， 和 染色 质 缔 合 的 蛋白 的 磷酸 化 也 相当 迅速 地 增加 (Kleinsmith 等 ，1966) 。 后 来 对 细 胞 核 内 三 种 主要 的 核 蛋 白 成 分 的 研究 发 现 , 在 PHA 刺激 后 酸性 蛋白 最 先 合成 和 磷酸 化 ， 其 次 是 可 溶性 核 蛋 白 。 组 蛋白 的 合成 要 在 24 小 时 才 增 高 (图 13-21) (Pogo: 和 Katz, 1974) 。 随 着 组 蛋白 乙酰 化 的 进行 ， 几 种 RNA 聚合 酶 活力 也 逐次 增加 ，RNA 合成 也 相 继 进行 。 对 淋巴 球 分 离 的 细胞 核 的 研究 表明 ，PHA 处 理 15 分 钟 时 ，RNA RAMI HK 仁 ) 的 活力 便 开 始 增高 。RNA 聚合 酶 II 〈 核 液 ) 活力 ，1 小 时 后 开始 增高 ,6 小 时 内 继续 上 升 ，24 小 时 后 又 下 降 。RNA RA hy III 要 到 48 小 时 才 观 察 到 有 微弱 的 增加 (图 13- 22) (Pogo, 1972). 目前 一 般 认 为 组 蛋白 及 其 他 和 染色 质 缔 合 的 蛋白 的 乙酰 化 和 磷 酸 化 是 基因 激活 的 重要 标志 。 通 过 乙酰 化 和 磷酸 化 ， 使 组 蛋白 或 其 他 核 蛋 白 和 DNA 的 相 DL 丙 氨 酸 -1-C"” ~ 总 蛋白 质 FRmE-2-C'* > RNA D 2000 PHA 学 所 1600 +R = 1200 = a © 800 R HA + 408 i RAF D 3 “PHA + SM EK 0 1530 60 120 01530 60 120 保温 时 间 (分 ) AN [ 1 醋酸 - 甲 基 -H3 > < 6000 3 组 蛋白 RNA 名 #2 5000 > Wasaneme-2-C'* > DNA ge ehh anaes < 160 = 4000 ik aa 蛋白 Zz Cc fe) / a 120 PHA fe 3000 / A 4 . ie / 7 / werenmea = 80 D 000+ } 去 54 5) +R = 40 19 1000 ya lis Zz _--— SHAR” AEA R 0 24 48:72:96 0 15 30 60 Al PHA (Rif tla) (小 时 ) = = 13-20 PHA 对 人 外 周 淋巴 球 之 RNA、DNA、 和 蛋白 合成 及 组 蛋白 乙酰 化 的 影响 。 (A) 对 照 和 PHA 处 理 细 胞 RNA 合成 的 时 程 ， 示 放 线 菌 素 D 的 抑制 影响 。 《〈B) 蛋白 合成 的 时 程 ， 示 PHA 的 刺激 作用 ， 味 叭 霉 素 的 抑制 影响 ， 及 放 线 菌 素 对 PHA 诱发 的 蛋白 合成 峰 的 抑制。 (c) PHA 处 理 的 淋巴 球 DNA 合成 的 时 程 。 〈《D) 总 组 蛋白 和 电泳 纯化 部 分 之 乙酰 化 的 时 程 和 同一 细胞 群 RNA 合成 的 时 程 的 比较 ( 据 Pogo 等 ，1966)。 * 417 。 EARS. 便于 RNA 聚合 酶 或 其 它 专 一 的 基因 调节 物 和 DNA 起 作用 ， 并 开始 基因 的 转录 活动 。 细胞 化 学 研究 也 支持 这 种 看 法 。 应 用 显 微 萤 光 光 度 计 测 量 叫 啶 栓 (AO) 和 DNA 核 蛋白 的 结合 ， 也 观察 到 淋巴 细胞 在 加 PHA 后 几 分 钟 内 ， 蕴 光 染 料 和 染色 质 的 结合 点 非 常 迅 速 地 增加 ， 并且 如 果 在 PHA 刺激 的 早 期 不 出 现 AO 结合 值 的 增加 ， 就 不 会 发 生 淋巴 细 胞 的 转化 。 因此 ，AO 结 合 值 的 早期 升 高 似乎 也 反映 了 基因 激活 所 必需 的 染色 质 细微 结构 的 变化 和 染色 质 上 RNA 转录 的 地 点 (Killand- er 和 Rigler, 1969; Frenster,1971), mmoles，UMP-?H /毫克 DNA tu pmoles P/ 毫 克 蛋 白质 hi v We o o o =) oO i=) 和 @o e e pmoles 亮 氨 酸 /毫克 蛋白 质 036 24 48 72 "036 24 48 72 小 时 小 时 图 13-21 PHA 刺激 和 对 照 的 人 淋巴 球 核 蛋 白 的 合成 和 磷 13-22 淋巴 球 分 离 的 细胞 核 经 PHA 处 理 不 同 酸化 。( 一 2 一 ) PHA 处 理 的 淋巴 球 ;(-@-) 未 处 理 的 淋巴 球 ; 时 间 后 RNA RAM CU II) 的 活力 。 (一 9 一 ) PHA CHMME RISK Ce Pogo 和 (一 0 一 ) PHA 处 理 的 细胞 ;〈 一 @ 一 ) 对 照 细 胞 Katz, 1974), (HE Pogo, 1972), 值得 注意 的 ,已 知 环 化 核 苷 酸 (cAMP a cGMP) 有 和 刺激 组 蛋白 磷酸 激酶 的 作用 。 因 此 ， 有 丝 分 裂 原 对 淋巴 球 激 活 的 早期 ，cGMP 水 平 的 迅速 增高 很 可 能 和 核 内 的 激活 过 程 有 关系 。 至 于 DNA 合成 要 在 较 晚 时 期 才 开 始 发 生 。 :五 - 胸 腺 喀 啶 脉冲 参 人 实验 表明 ，DNA 合成 要 在 加 PHA 后 24 小 时 才 开 始 升 高 ， 大 约 60 小 时 达到 一 个 平 而 宽 的 坪 值 (Pogo- raro 和 Bernengo，1971) 。DNA RABE HAI (30 一 150 倍 ) 是 和 DNA 合成 的 增加 平行 的 。 胸 腺 喀 啶 激酶 和 胸腺 喀 啶 磷酸 激酶 活力 也 有 增加 (2 一 10 倍 ) ， 而 另 一 些 含 量 较 高 的 激酶 (如 脱氧 鸟 背 一 磷酸 激酶 ， 乌 背 一 磷酸 激酶 等 ) 则 不 增加 。 +418 。 Ra ea7 < ent ee PHA 诱发 的 这 些 酶 活力 的 增加 似乎 依赖 新 RNA 的 合成 。 当 用 放 线 菌 素 D 抑 制 RNA 合成 时 ，DNA 聚合 酶 .胸腺 喀 啶 激酶 以 及 胸腺 喀 喧 一 磷酸 激酶 的 合成 也 受到 抑制 ， DNA 合成 也 因而 停顿 。 然 而 ， 这 并 不 影响 淋巴 球形 态 上 的 转化 。 因 此 ， 淋 巴 球 形态 上 的 转化 似乎 不 依赖 新 RNA 合成 和 DNA 的 复制 。 反 之 ，DNA 合成 则 必须 DNA RA Bs 的 合成 (Loeb 44, 1970). 此 外 ， 淋 巴 球 激活 过 程 中 , 核 膜 孔 的 变化 也 是 值得 注意 的 。PHA 刺激 后 48 小 时 , 每 一 细胞 核 的 核 膜 孔 的 数目 大 约 增加 一 倍 。 这 种 增加 呈现 双 相 性 : 第 一 相似 乎 和 蛋白 合成 的 增加 有 关系 ; 第 二 相似 乎 和 核酸 合成 的 增加 有 关系 。 这 提示 核 膜 孔 既 可 能 是 核 质 交通 的 孔道 ,又 可 能 是 DNA 复制 的 起 点 (Maul 等 ，1972) 。 总 之 ， 淋 巴 球 激 活 的 始 发 机 制 是 有 丝 分 裂 原 ( 或 抗原 ) 和 细胞 膜 受 体 的 结合 〈 交 叉 连 接 ) 而 触发 的 膜 现象 。 这 种 结合 刺激 触发 的 原初 反应 经 过 在 膜 内 的 传播 和 放大 ,传递 到 细 胞 质 内 引起 广泛 的 代谢 变化 ， 再 经 过 未 知 的 信号 导致 细胞 核 内 基因 的 激活 和 分 裂 的 发 动 。 有 人 把 淋巴 球 激 活 时 相伴 发 生 的 生化 现象 ， 根 据 已 有 的 证 据 或 设想 可 能 存在 的 因果 关系 ， 初 步 绘 制 了 一 个 流程 图 ， 抄 录 在 这 里 供 进一步 讨论 的 参 4 (图 13-23) (Cooper, 1975). 虽然 淋巴 球 激 活 时 各 种 膜 现 象 及 相伴 行 的 生化 过 程 十 分 复杂 ， 其 出 现 顺序 和 因果 关 系 还 难于 确定 ， 有 证 据 表 明细 胞 内 钙 离 子 的 六 入 量 和 cGMP 水 平 的 升 高 起 着 重要 的 作 用 。 这 二 者 显然 又 是 和 膜 的 结构 和 功能 的 变化 有 密切 关系 的 。 现 在 就 这 几 方 面 的 关系 作 一 些 分 析 讨 论 。 RNase RNA ne RNA mRNA 聚合 酶 YY | 2b FB A ies SF mRNA 转录 抑制 DNA| 。 激活 图 13-23 ”与 淋巴 球 激活 相伴 发 生 的 生化 现象 的 流程 图 ( 据 Cooper, 1975, 修改 )。 。419 。 先 谈 膜 的 变化 。 淋巴 球 激活 时 和 膜 有 关 的 许多 生化 过 程 几乎 同时 地 和 广泛 地 发 生 ， 因此 需要 假定 有 丝 分 裂 原 和 细胞 膜 受 体 相互 作用 和 触发 的 原初 变化 在 膜 内 有 一 个 传播 和 放 大 的 机 制 。 曾 经 有 人 假定 淋巴 球 激 活 早期 膜 内 磷脂 代谢 的 改变 可 能 起 这 种 作用 。 由 于 膜 内 磷脂 代谢 率 增加 ， 导 致 膜 的 理化 性 质 的 广泛 改变 ， 结 果 造 成 膜 的 流动 性 和 功能 的 改变 (Ca 流入 人 量 增加 、 核 苷 酸 环 化 酶 的 激活 等 ) (Resh 和 Ferber, 1975). 然而 ， 近 来 有 证 据 表 明 Ca 载体 A 23187 能 和 PHA 同样 地 刺激 淋巴 细胞 的 增生 和 膜 磷 脂 酰 肌 醇 代 谢 率 的 增加 (图 13-14, b) 。 这 说 明 膜 磷脂 代谢 率 的 升 高 依赖 Ca++ 浓 度 的 升 高 ,而 不 是 磷 脂 代谢 率 的 升 高 引起 Ca* 流 入 量 的 增加 。 Ca 一 离子 是 对 细胞 功能 活动 有 广泛 意义 的 调节 因子 。 诉 素 、 神 经 递 质 等 都 可 能 通过 O 改变 细胞 内 Ca 流入 量 或 Ca** 在 细胞 内 不 同 区 域 之 间 的 分 布 而 起 作用 。 细 胞 分 裂 有 关 的 许多 过 程 也 受 Ca 控制 。 根据 “ 晶 格 和 镶 风 模 型 >， 生物 膜 的 脂 质 是 处 在 由 et th 无 序 《“ 流 动态 ) 到 有 序 “日 态 ”) 的 相 变 ee Pee, | 中 。 这 种 相 变 受到 Cat+ 离 子 的 调节 影响 。 me SELLE Catt BF mye AA AN OT HH 现 分 相 作 用 一 一 晶 态 和 液晶 态 分 开 ， 从 而 影响 膜 的 流动 性 。 Hk, Cat 离子 和 cGMP 也 有 密切 关系 。 在 一 些 细胞 ， 已 细胞 术 知 细胞 内 CGMP 水 平 可 能 受 Cat++ 离子 调 图 13-24 总 结 淋 巴 球 被 有 丝 分 裂 原 激活 的 早期 过 程 中 细节 。 缺 钙 时 ， 细 胞 内 cGMP 水 平 降 低 , A 胞 膜 调节 系统 各 成 分 相互 作用 的 示意 图 。 @ 受 体 的 移动 5 er BF 和 固定 ; @ Catt 的 转运 ; 图 cGMP 和 cAMP 环 化 时 细胞 对 刺激 CGMP 升 高 的 因素 (如 乙酰 ? _ 酶 系 的 激活 ; © 微 管 系 的 解 离 和 聚合 。 从 膜 到 核 的 最 近 “ 胆 碱 等 ) 不 能 起 反应 (Schultz S, 1973), 和 另 一 方面 , 几 种 能 增加 细胞 内 cGMP 水 平 的 调节 因子 也 能 增加 Ca+* 流 人 量 。 这 些 事实 说 明 Ca 离子 和 cGMP 间 存 在 复杂 的 相 互 作用 。 虽然 目前 对 淋巴 球 激活 的 始 发 机 制 还 不 清楚 ， 从 上 述 可 以 肯定 细胞 内 Ca 离子 的 mA CGMP 水 平 的 升 高， 在 有 丝 分 裂 的 发 动 中 可 能 同时 起 着 重要 作用 。 例 如 ,A23187 〈 钙 离子 载体 ) 和 Phorbol 酯 (提高 细胞 内 cGMP 水 平 ) 都 能 起 发 动 分 裂 的 作用 。 此 外 , 它 们 又 都 能 对 植物 凝集 素 的 分 裂 刺激 起 加 强 作用 。 这 提示 它们 三 者 可 能 通过 一 个 共同 的 途 径 ， 殊 途 而 同 归 地 起 作用 。 有 人 假定 有 丝 分 裂 原 和 膜 受 体 的 结合 可 能 通过 细胞 表面 调节 系统 ( 微 管 和 微 丝 ) 的 相互 作用 ， 引 起 膜 蛋白 的 流动 ， 造 成 酶 亚 基 或 膜 蛋白 的 聚合 状态 或 构象 的 变化 ， 形 成 离子 通道 和 核 苷 酸 环 化 酶 的 激活 (图 13-24) 。 另 一 方面 ， 细 胞 核 内 染 色 质 蛋白 的 迅速 变化 (乙酰 化 和 磷酸 化 ) 可 能 反映 基因 的 激活 。 剩 下 的 问题 是 从 膜 的 变化 到 核 内 基因 的 激活 ， 最 直接 的 信号 是 什么 ， 又 如 何 传递 , KUALA THEW 在 深入 讨论 这 一 问题 前 ， 需 要 先 谈 一 下 神经 递 质 和 激素 作用 机 制 研 究 的 最 新 成 果 。 对 神经 递 质 和 激素 作用 机 制 的 进一步 研究 发 现 ，cAMP (或 cGMP) 的 作用 方式 是 和 细胞 质 内 蛋白 激 酶 的 抑制 亚 基 结 合 ， 引 起 构象 变化 而 和 酶 的 活性 部 分 脱离 ， 从 而 使 蛋 白 激酶 激活 。 激 活 的 蛋白 激酶 再 进入 细胞 核 内 ， 把 ATP 上 的 一 个 磷酸 转移 给 和 染色 质 “420 。 于 的 基因 紧密 贴近 的 核 内 调节 蛋白 。 核 内 调节 蛋白 由 于 磷酸 化 ， 发 生 构 象 变化 而 与 DNA 双 螺 旋 脱 离 ， 从 而 使 基因 得 以 按 既 定 的 程序 进行 转录 活动 ， 导 致 新 的 mRNA 和 和 蛋 白质 的 合成 ， 并 表现 出 专 一 的 生物 学 效应 (图 13-25b) 。- 因此， 蛋白 激酶 可 看 作 是 激素 作用 产生 的 cAMP (或 cGMP) 和 与 激素 的 生物 学 效应 有 关 的 基因 激活 过 程 之 间 的 连结 环节 。 此 外 ，Ca… 离 子 也 可 能 通过 刺激 细胞 内 和 蛋白质 的 磷酸 化 而 起 特定 的 生理 作用 。 不 组 织 胺 CH;) 一 肾上腺 素 (pB) 五 羟色胺 cAMP) <¢— 3: FARR (8) PgE， OZER 多 肽 激素 BR 蛋白 质 磷酸 化 系统 : 蛋白 激酶 FA LAR (a) we 肾上腺 素 (a) 组 织 胺 CH) 乙酰 胆 碱 去 磷酸 底 物 RACE i RRS BGA Rt (如 神经 冲动 ) 某 些 调节 因子 (a) BAF UK, HBB RS) (b) 图 13-25 调节 因子 (省 体 激素 、 多 肽 激素 、 神 经 递 质 和 Catt SHANE ALA. (a) 各 种 调节 因子 通过 对 和 蛋白质 磷酸 化 系统 的 影响 ,而 引起 各 种 生物 学 效应 。 (b) WHAT (mse 素 ) 和 细胞 膜 受 体 结合 ,激活 腺 苷 酸 环 化 酶 ， 导 致 次 级 信号 (cAMP) 的 产生 。 cAMP 再 激活 细 胞 质 内 的 可 浴 性 蛋白 激酶 。 后 者 再 进 人 细胞 核 , 把 ATP 的 一 个 磷酸 基 团 转移 给 和 染色 质 上 的 基 因 茶 密 联 合 的 核 内 调节 蛋白 。 核 内 调节 蛋白 由 于 磷酸 化 ， 发 生 构象 变化 而 和 DNA 双 螺 旋 解 离 ， 基因 开始 按 既 定 程序 进行 转录 活动 ， 导 致 新 的 “mRNA 和 和 蛋白质 的 合成 〈 据 Greengard，1978; Nathanson 和 Greengard, 1978), - 4216 证 图 13-26 BREMEN. Cl) 抗原 或 非 专 一 的 配合 基 ( 有 丝 分 裂 原 、 抗 体 ) 和 了 膜 受 体 结合 通过 共同 的 细胞 表面 调节 系统 (SRA)7 的 相互 作用 ,引起 一 系列 膜 变化 ,并 在 膜 内 传播 ,扩大 结果 核 昔 酸 环 化 酶 激活 ， Cat+ 流入 量 增加 。 (2) Cat+ 流 和 人 量 增加 或 (和 ) < AMP/cGMP 比值 降低 ， 使 细胞 质 内 蛋白 激酶 激活 。 《3) 蛋白 激酶 进 和 细胞核， 使 核 内 基因 按 既 定 程序 激活 《染色 质 调 节 蛋 白 的 磷酸 化 和 乙酰 化 增加 )， MER 开始 增生 和 分 化 。 过 ,依赖 Ca 一 的 蛋白 质 磷酸 化 可 能 和 依赖 CGMP (或 c-AMP) 的 蛋白 质 磷 酸化 是 通过 不 同 的 蛋白 质 激酶 起 作用 的 。 总 之 ， 各 种 调节 因子 (激素 ` 神 经 递 质 和 Ca™) 虽然 作用 的 初 始 过 程 可 能 不 同 ， 都 可 能 通过 一 个 共同 的 环节 一 一 蛋白 质 磷酸 化 系统 ， 激 活 靶 细胞 核 内 的 基因 , 而 各 自发 挥 其 特定 的 生物 学 效应 (图 13-25a) (Greengard, 1978; Nathanson 和 Greengard，1978) 。 根据 上 述 概念 ， 可 以 设想 蛋白 激酶 很 可 能 是 从 有 丝 分 裂 原 触发 的 淋巴 球 的 膜 变 化 (Ca” 流 人 量 和 cGMP 增 加 ) 到 核 内 基因 激活 之 间 的 最 直接 的 环节 。 各 种 有 丝 分 裂 原 和 淋 巴 细胞 表面 受 体 结合 SRE) 都 可 能 通过 这 些 受 体 固着 在 其 上 的 细胞 表面 调节 系统 ( 微 管 和 微 丝 ) 的 相互 作用 ， 引 起 膜 蛋 白 的 流动 ， 酶 亚 基 或 其 它 膜 蛋白 构象 或 聚合 状态 的 AR, BR Cat wi ABA cGMP 的 增加 。 这 些 因 子 的 变化 又 可 能 通过 共同 的 环 节 一 一 蛋白 质 磷 酸化 系统 ， 使 核 内 的 基因 激活 〈 染 色 质 上 调节 有 蛋白 的 磷酸 化 和 乙酰 化 )， 并 开始 增生 和 分 化 (图 13-26) 。 这 一 假说 填补 了 Edelman 等 的 假说 的 空白 ， 并 可 以 方 便 地 解释 淋巴 球 激 活 早期 过 程 中 的 主要 事件 〈 膜 受 体 和 微 管 、 微 丝 系统 间 的 相互 作用、 Cat+ 流 人 量 增 加 ， 核 背 酸 环 化 酶 的 激活 ) 的 相互 关系 ， 以 及 单独 提高 细胞 内 Catt 离子 水 平 (A23187 处 理 ) 或 cGMP 水 平 (Phorbol 酯 处 理 ) 都 能 使 淋巴 球 激 活 的 事实 , 并且 还 能 把 这 些 膜 变化 和 观察 到 的 核 内 激活 过 的 早期 事件 ( 核 内 调节 蛋白 的 乙酰 化 和 磷酸 化 ) 连结 起 来 。 三 、B 淋巴 球 激活 的 几 种 假说 上 述 淋 巴 球 被 有 丝 分 裂 原 激活 的 一 些 实验 资料 和 理论 解释 可 能 作为 B 细胞 被 抗 原 。422 。 激活 机 制 的 重要 借鉴 。 然 而 ， 这 种 模型 是 过 于 简化 了 ,不 能 提供 :3 细胞 被 抗原 激活 中 真 正 起 作用 的 受 体 、 信 号 的 性 质 和 数目 以 及 调整 影响 等 方面 的 知识 。 B 细胞 的 激活 是 包括 抗原 的 专 一 结合 ， 以 及 细胞 〈T.、B BRA) 间 的 相互 作用 的 远 为 复杂 的 过 程 。 同 时 ， B 细胞 在 受到 抗原 刺激 发 动 分裂 后 ， 还 要 经 历 一 个 增生 ,分 化 的 阶段 ,才能 最 后 成 为 一 个 成 熟 的 合成 和 分 刻 抗 体 的 浆 细 胞 。B 细胞 受到 抗原 刺激 后 的 反应 有 两 种 可 能 性 : 诱导 产 生 抗体 或 耐 受 性 。 此 外 ， 一 些 抗原 不 依赖 了 细胞 就 能 刺激 B 细胞 产生 抗体 ， 而 另 一 些 搞 原则 必须 依赖 了 细胞 。 关于 B 细胞 被 抗原 激活 机 制 的 合理 的 假说 必须 能 圆满 地 解释 这 些 现象 。 其 中 几 个 主要 的 问题 是 : 受 体 的 性 质 、 信 号 的 性 质 和 数目 〈 单 一 信号 或 双重 信 号 )， 而 关键 问题 是 受 体 和 膜 转 换 机 制 的 关联 ， 即 抗原 和 受 体 的 结合 如 何 转换 为 激 活 信 号 ,又 如 何 传 回 核 内 使 基因 激活 。 根 据 对 这 些 问题 的 不 同 解 释 ， 提 出 了 几 种 不 同 的 假说 。 这 里 先 对 细胞 激活 的 本 质 作 一 般 地 讨论 ,然后 再 简略 地 介绍 几 种 主要 的 假说 。 (一 ) B 淋巴 球 激 活 过 程 的 本 质 。“ 多 型 反应 ”。 亚 显 微 形态 .生化 等 方面 的 研究 表明 ，B 细胞 对 专 一 抗原 或 非 专 一 配合 基 ( 有 丝 分 裂 原 ， 抗 Ig 抗体 等 ) 的 反应 过 程 是 大 致 相似 的 。 因 此 ，B 淋巴 球 的 激活 本 质 上 是 一 个 触发 过 程 13-27) (Greanes 和 Janossy, 1972). 激活 的 初始 机 制 可 能 是 非 专 一 的 , 而 细胞 的 专 一 反应 ( 具 有 特定 的 抗原 专 一 性 和 基因 记号 的 抗体 合成 ) 是 由 既定 的 基因 型 及 基因 活动 程序 决定 的 。 无 论 细 胞 表面 哪 一 个 或 哪 几 个 受 体 被 专 一 的 抗原 或 非 专 一 的 配合 基 ( 有 丝 分 裂 原 、 抗 体 ) 结合 (交叉 连接 ) 抗原 有 丝 分 裂 原 抗体 所 产生 的 触发 信号 ， 都 可 能 通过 13-27 ”淋巴 球 激活 的 简单 模型 。 “次 级 信号 ”和 一 个 共同 的 通路 使 《配合 基 : 抗原 和 类 似 免疫 球 蛋 白 的 细胞 表面 受 体 结合 ; 本 有 丝 分 裂 原 和 细胞 表面 的 糖 蛋白 结合 ; 核 门 基因 选择 地 和 按 顺 序 地 激 抗体 和 细胞 表面 膜 抗原 (ALS) 结合 。 活 。 目 前 ， 还 不 能 完全 断定 抗原 meg = ae V 一 C) 免 疫 球 蛋 白 重 链 和 轻 链 的 易 变 区 和 不 变 区 基因 ， 引起 的 触发 信号 是 和 哪 一 种 或 几 (M) 构成 抗体 和 有 丝 分 型 原 结合 位 点 的 膜 成 分 的 结 构 种 受 体 (或 膜 构 造 ) 有 关系 。 同 样 基因 ,其 中 一 些 为 淋巴 球 专 一 的 ; ae a (D) 控制 表 型 反应 的 去 抑制 或 激活 的 “分 化 ?基因 。 地 ， 这 种 触发 信号 的 性 质 也 还 不 RW: ， 多 型 的 ,大 多 数 或 所 有 激活 细胞 共同 的 ， 包 括 细胞 膜 、 细 太 清 楚 。 根 据 前 一 节 的 分 析 ， 各 胞 质 和 核 内 的 变化 ; 种 配合 基 〈 专 一 的 和 非 专 一 的 ) 专 一 的 ， 一 定 类 型 细胞 特有 的 〈 如 B 细胞 合成 Ig)。 ( 据 Greaves 和 Janossy，1972)。 和 膜 受 体 的 结合 (BEM) 都 可 能 通过 它们 共同 固着 在 其 上 的 细胞 表面 调节 系统 ( 微 管 和 微 丝 ) ， 引 起 一 系列 的 膜 变化 (Ca “ 流 人 量 增加 、cGMP 增加 等 ) 。 假定 这 些 变化 都 可 能 和 次 级 信号 有 关系 。 不 论 这 .423 。 i yh 些 次 级 信号 的 起 源 或 性 质 如 何 ， 它 们 都 可 能 传递 到 细胞 内 部 引起 共同 的 一 系列 生化 反应 (组 蛋白 乙酰 化 和 磷酸 化 增加 \ 基 因 转 录 和 转译 , 糖 酵 解 增高 ,细胞 表面 特性 变化 等 ) , 其 中 大 多 数 为 生长 活跃 的 细胞 所 共有 ， 称 为 “多 型 反应 ”(Pleiotypic response) 。 这 些 反应 之 间 的 因果 关系 还 不 很 清楚 。 根 据 前 一 节 的 分 析 ， 同 样 可 以 假定 各 种 次 级 信号 可 能 通过 一 个 共同 的 途径 一 一 蛋白 质 磷酸 化 系统 引起 “多 型 反应 ”。 于 是 ,从 了 细胞 被 抗原 触发 到 分 裂 发 动 的 过 程 都 可 能 用 有 丝 分 裂 原 对 淋巴 球 的 激活 模型 加 以 解释 。 不 过 ，B 细胞 被 抗 原 激 活 的 机 制 还 有 其 特殊 的 问题 需要 考虑 ， 这 些 问题 包括 激活 过 程 中 细胞 间 的 相互 作 用 ， 诱 导 抗 体形 成 或 耐 受 性 ， 依 赖 胸腺 抗原 和 不 依赖 胸腺 抗原 的 作用 ， 这 就 涉及 受 体 的 性 质 ， 触 发 信号 的 数目 (单一 或 双重 的 ) 等 问题 。 由 于 对 这 些 问题 的 看 法 不 同 ， 目 前 对 B 淋巴 球 的 激活 机 制 存 在 几 种 不 同 的 假说 。 (=) 关于 了 B 淋 巴 球 激活 机 制 的 假说 B 淋巴 球 被 抗原 〈 和 多 株 有 丝 分 裂 原 ) 激活 的 三 种 主要 的 理论 模型 如 简 图 13-28 所 示 。 现 将 几 种 假说 的 要 点 介绍 如 下 : 1. 单个 专 一 信号 假说 (或 网 架 假说 ) 这 一 假说 强调 抗原 决定 簇 和 也 细胞 表面 专 一 的 Ig 受 体 的 相互 作用 就 足以 触发 淋巴 球 的 激活 过 程 ， 只 要 提供 的 抗原 决定 得 的 空间 排列 能 使 Te 受 体 的 交叉 连结 达到 一 定 程 度 就 够 了 。 按 照 这 一 假说 ， 不 依赖 胸腺 抗原 (如 鞭毛 素 、LPS 等 ) 本 身 是 有 重复 结构 的 多 聚 体 ， 因 而 易于 和 了 B 细胞 表面 受 体 交叉 连结 。T 细胞 的 功能 是 能 把 非 多 聚 体 抗原 集中 排 列 在 其 表面 形成 一 种 “网 架构 造 ， 或 者 通过 了 细胞 产生 的 亲 合 细胞 的 IE 了 T 和 抗原 结合 模型 2 模型 3 第 工 信 号 ( 专 一 的 结合 点 ) 第 工 全 号 - 汪 二 (〈 非 专 一 的 结合 点 ) 致 有 丝 分 裂 活 力 是 生理 的 触发 因子 单一 信号 ”通过 非 专 一 的 《有丝分裂 原 ) 结合 点 13-28 B 淋巴 球 被 抗原 和 多 株 有 丝 分 裂 原 激活 的 三 种 模型 ( 据 Greaves，1975)。 。424 。 后 ， 排 列 在 巨 噬 细 胞 表面 形成 一 种 ^ 网 架 ” 构 造 提 供给 也 细胞 , 并 和 了 细胞 表面 IE 受 体 发 生 广泛 地 交叉 连接 。 因 此 这 一 假说 又 称 为 “网 架 ? 假 说 〈“Matrix” hypothesis) (Fe- Idman 等 ，1973) (参看 图 13-3) 。 这 一 假说 最 有 力 的 证 据 是 鞭毛 素 抗原 的 单 体 和 多 聚 体 在 离 体系 统 中 诱导 抗体 的 行为 。 不 过 ， 同 一 抗原 系统 在 体内 的 实验 结果 与 离 体 的 实验 结果 有 了 矛盾 (Langman 等 ，1971) 。 2. 单个 非 专 一 信号 假说 这 一 假说 主张 B 细胞 的 触发 只 需要 一 种 非 专 一 的 (不 涉及 Ig SAM) ES. le 受 体 并 不 产生 激活 信号 ， 而 只 是 被 动 地 起 集中 抗原 到 反应 细胞 表面 上 的 作用 。B 细胞 的 激活 或 产生 耐 受 性 依赖 触发 信号 量 的 不 同 ， 而 不 是 质 的 区 别 。B 细胞 只 有 接受 适当 量 的 非 专 一 的 触发 信号 才能 激活 ， 过 量 就 产生 耐 受 性 (免疫 麻 闸 ) (Coutinho， 1975; Coutinho 和 Méller, 1974; Coutinho 等 ，1975; Méller, 1975), 支持 这 一 假说 的 主要 证 据 是 : 1) 多 株 B 细胞 分 裂 原 (PBA) 能 对 B 细胞 起 非 专 一 的 激活 作用 。 2) 已 知 所 有 不 依赖 胸腺 的 抗原 (TD 也 都 是 多 株 B 细胞 分 裂 原 ， 即 有 直接 诱导 B 细 苞 合成 多 株 抗 体 的 能 力 ， 而 无 需 了 T 辅助 细胞 的 帮助 。TI 抗原 共有 的 激活 能 力 是 分 子 内 Ta RFE. 3) 半 抗 原 和 依 玖 胸腺 抗原 (TD) 载体 偶 联 后 不 能 在 离 体 诱导 抗体 合成 ， 即 使 所 用 的 半 抗 原 浓 度 改 变 10? 倍 。 然 而 , 同 一 半 抗 原 若 和 :TI 载体 (LPS) 偶 联 就 能 一 致 地 诱导 抗体 反应 。 因 此 ， 抗 体 反 应 是 否 发 生 决 定 于 载 EAD HE Jig (TI 或 TD)， 而 不 是 决 定 于 抗原 决定 簇 的 密度 。 后 者 的 作用 仅 在 于 促进 和 B 细胞 的 结 合 ， 集 中 半 抗 原 载 体 结合 物 。 4) 既然 专 一 抗 半 抗 原 反 应 的 触发 信号 可 能 是 由 PBA 载体 bo ; 发 出 的 ， 加 游离 的 PBA 应 能 显 ht Cae RaSh wt 着 地 影响 抗 半 抗 原 反 应 。 实 验 “图 13-29 验证 单个 非 专 一 信号 假说 的 一 个 实验 的 结果 。 EAN 确实 证 明 低 于 最 适 激活 剂量 的 ， 肚 细胞 在 不 同 浓度 NNP-LPs (培养 液 内 不 加 血清 ) 中 培养 二 天 。 测 定 DNA 合成 量 及 对 无 关 抗原 (SRC) 的 抗体 的 量 。 此 外 ， 还 测量 了 LPS 能 加 强 低 浓 度 的 NNP-LPS 对 专 一 的 NNP 半 抗原 的 高 亲 合力 抗体 的 合成 。( 一 X 一 ) cpm/ 培 养 诱导 的 抗 NNP 半 抗 原 抗 体 的 专 Cy: 051 84,000); (一 e 一 ) 抗 SRC 空 班 形成 细胞 数 /培养 〈Y: 0 到 一 反应 。 反 之 ， 半 抗原 -TD 结合 300); es ee CY: 0 到 物 决 不 能 和 LPS 起 这 样 的 协同 作用 。 5) 半 抗 原 -LPS 结合 物 在 低 浓 度 ( 高 稀释 倍数 ) 时， 诱导 专 一 的 高 亲 合 力 的 抗 半 抗原 抗体 ( 抗 NNP 抗体 ) ， 而 在 高 浓度 时 就 诱导 多 株 抗体 〈 包 括 对 无 关 抗原 SRC 的 抗体 ) 的 形成 ， 并 且 完 全 没有 专 一 的 抗 NNP 反应 (图 13-29) (Coutinho 等 ，1975) 。 如 果 将 游 。425 。 区 ee TCR 2 和 Seeeeeea ea 离 的 半 抗 原 加 到 此 免疫 反应 系统 内 ， 并 不 抑制 专 一 的 抗 -NNP 反应 ， 但 是 剂量 反应 曲线 完全 改观 ， 只 有 在 半 抗 原 -LPS 结合 物 达 到 高 浓度 (引起 多 株 抗体 反应 的 浓度 ) 才能 有 专 一 的 抗 半 原 抗 体 合 成 (Coutinho 4, 1975), Ast, Méller 认为 LPS 载体 是 唯一 的 触 发 信号 ，Ig 受 体 只 是 被 动 地 起 集中 半 抗 原 载体 结合 物 的 作用 。 这 和 双重 信号 假说 所 假定 的 诱导 半 抗 原 抗 体 同 时 需要 半 抗 原 和 载体 触发 的 信号 (信号 1+2) 是 不 相 容 的 。 这 一 假说 能 方便 地 解释 多 株 了 细胞 分 裂 原 对 B 细胞 的 非 专 一 的 激活 作用 。 实际 上 这 也 是 它 的 主要 事实 依据 。 在 抗原 诱导 的 专 一 的 抗体 反应 中 , Ig 受 体 只 是 起 着 把 抗原 集 中 到 能 对 专 一 抗原 反应 的 了 细胞 表面 的 作用 。 于 是 ， 具 有 对 TI 抗原 决定 簇 专 一 性 的 Ig 受 体 的 B 细胞 便 能 选择 地 结合 搞 EE SRN, 0 TRS HS 原 。 在 抗原 浓度 低 时 , 只 有 专 二 的 or Yo ~ ZN B 细胞 能 结合 足够 数量 的 有 发 动 分 裂 能 力 的 抗原 分 子 ， 不 过 这 种 触发 作用 完全 是 靠 TI 抗原 的 PBA 特 性 引起 的 。 非 专 一 细胞 〈 缺 乏 抗原 专 一 的 Ig 受 体 ) 在 TI 抗原 浓度 低 时 不 能 结合 足够 数量 的 抗原 分 子 ， 因而 不 能 被 触发 。 然 而 , 当 TI 抗原 浓度 增高 时 ， 非 专 一 细胞 也 能 结合 足够 数量 的 TI 抗原 , 而 触发 非 专 一 的 多 株 抗体 反应 。 此 时 专 一 细胞 由 图 .13-30， 简 图 表示 专 一 的 Ig 受 体 起 集中 抗原 的 作用 ， 不 依赖 胸 “ 于 结合 过 多 的 Ig 分 子 , 反 而 发 生 耐 BED AE NE RE fh Fe AUR IES 3 He (25 Se BE) (DSO 诱导 抗体 合成 或 耐 受 性 是 由 于 触发 信号 量 的 不 同 ， 而 不 是 由 于 质 的 区 别 。 此 外 ， 这 一 假说 能 解释 T 辅助 细胞 产生 的 非 专 一 因子 的 作用 , 但 不 能 解释 抗原 专 一 的 T 细 胞 因子 的 作用 (Taussig，1974) 。 3. 双重 信号 假说 Bretscher 和 Cohn (1968) 最 先 提出 也 细胞 的 激活 需要 双重 信号 。 只 有 当 B 细胞 Wig 受 体 先 和 抗原 的 半 抗 原 决 定 簇 相互 作用 (第 一 信号 ) 之 后 ， 再 接受 另 一 个 第 二 信号 ， 才能 被 激活 。 这 种 第 二 信号 可 能 是 由 于 抗原 的 载体 决定 徐 和 了 T 细胞 相互 作用 产生 的 了 辅助 因子 提供 的 。B 细胞 如 果 只 接受 第 一 信号 ， 而 不 和 第 二 信号 起 作用 ， 则 导致 耐 受 性 Watson (1973, 1975) 进一步 发 展 了 这 一 假说 。 他 认为 了 细胞 的 激活 过 程 是 受 两 个 不 同 的 受 体 位 置 的 膜 相 互 作 用 控制 的 。 第 一 个 受 体位 置 和 抗原 的 半 抗 原 决定 簇 结合 ， 第 二 受 体位 置 接受 了 T 细胞 信号 ， 并 各 自 产生 细胞 内 介 导 物质 一 cecAMP Fl cGMP, 抗原 和 了 B 细胞 受 体 相互 作用 使 膜 内 腺 背 酸 环 化 酶 激活 ， 细 胞 内 cAMP 水 平 增高 ， 结果 cAMP /cGMP 比值 增高 。 假定 这 一 变化 诱发 负 多 型 反应 ， 导 致 细胞 的 失 活 〈 和 免疫 耐 受 性 ) 。 另 一 方面 ，T 细胞 信号 和 了 B 细胞 膜 受 体 相 互 作用 使 鸟 背 酸 环 化 酶 激活 ， 细 胞 内 cGMP 升 高 ， 结 果 cAMP/cGMP 比值 降低 。 假 定 这 一 变化 诱发 正 多 型 反应 , 导致 DNA 。426 。 合成 的 发 动 ， 细 胞 的 增生 分 化 和 抗体 的 合成 (图 13-31) 。 这 一 假说 能 成 功 地 解释 半 抗 原 -无 免疫 原 性 载体 结合 物 能 产生 半 抗 原 专 一 的 耐 受 性 现象 (Katz 等 ，1974) 。 然 而 ， 这 一 假说 不 能 解释 不 依赖 胸腺 抗原 的 作用 ,以 及 多 聚 体 鞭毛 素 在 离 体 系统 诱导 抗体 反应 和 耐 受 性 的 剂量 依赖 关系 (Diener 和 Feldman, 1972), 4.“ 三 重信 号 ”假说 ”免疫 反应 中 ， 从 接受 抗原 刺激 到 抗体 的 合成 和 分 这 ，B 细胞 要 经 历 一 个 增生 和 分 化 的 过 程 。 B 细胞 的 增 生 和 分 化 是 两 个 性 质 不 同 的 过 程 ， 有 证 据 表明 其 发 动 可 能 受 不 同 的 信号 控 制 。 在 无 胸腺 小 鼠 (nu /nu) 的 脾脏 细胞 〈 缺 少 工 细胞 ) 和 异种 红血球 的 离 体 初 级 免疫 反应 系统 中 ， 单 独 加 抗 原 时 可 引起 B 细胞 增生 。 但 是 ， 没 有 或 很 少 能 产生 抗体 的 空 斑 形成 细 要 抗原 * | 环 人 本 铺 负 多 型 反应 ， (免疫 耐 受 性 ) 正 多 型 反应 《抗体 形成 ) GTP 图 13-31 细胞 内 cAMP/ cGMP 比值 假定 控制 B 细胞 的 两 个 预定 程序 的 反应 。 免 疫 耐 受 性 相当 于 一 个 负 多 型 反应 ,而 抗体 合 成 的 诱导 则 相当 于 一 个 正 多 型 反应 。 抗 原 和 细胞 表面 le 受 体 相 互 作用 激活 腺 昔 酸 环 化 酶 。 工 细胞 信号 和 各 种 非 专 一 的 B 细 胞 225} 22) (LPS, PPD, Dx SO, 等 ) 和 膜 构 造 的 相互 作用 直 接地 或 间接 地 导致 鸟 蔡 酸 环 化 酶 的 激活 。 细 胞 内 < AMP/c GMP 比值 的 增加 发 动 负 多 型 反应 (免疫 耐 受 性 )* 而 比值 的 降低 发 动 正 多 型 反应 (诱导 抗体 的 形成 )( 据 Watson, 1975), 胞 (PFC) 出 现 (参看 434 页 )。 只 有 再 加 T 辅助 细胞 或 激活 的 了 T 辅助 细胞 产生 的 =| a! 10 0 天 UX Za x fA 13-32 40.5 2F+4 1X10’ nu/nu 脾脏 细 胞 加 或 不 加 小 牛 血 清 离 体 培 养 。 按 指定 时 间 加 工 细 胸 代 替 因子 (不 加 小 牛 血 清 )。 两 天 后 ， 所 有 培养 都 加 小 牛 血 清 ， 继 续 培 养 三 天 后 计数 空 斑 形成 细 fa (PFC) 数目 加 小 牛 血 清 ， ……- 不 加 小 牛 血 清 ( 据 Schimpl 和 Wecker, 1975), 一 种 非 专 一 的 因子 (T HRSA TF, TRE) 时 ， 空 斑 形 成 细胞 才 大 量 增多 。 尤 其 特别 的 是 ， 还 发 现 TRE 的 最 适 作 用 时 间 是 在 B 细 胞 和 抗原 接触 后 较 晚 的 时 间 (24 到 60 小 时 )， 这 时 了 B 细 胞 已 经 经 历 过 若干 周期 的 增生 (图 13-32) 。 此 ， 这 提示 抗原 虽然 单独 能 刺激 B 细胞 的 增 生 ， 而 了 细胞 的 分 化 还 需要 了 辅助 细胞 产生 的 非 专 一 的 信号 来 发动。 也 就 是 说 ， 除 去 前 述 和 发 动 分 裂 有 关 的 两 种 信号 以 外 ， 还 存在 和 发 动 分 化 有 关 的 第 三 种 信号 (Schimpl 和 Wecker, 1972; Dutton，1975) 。 根据 这 些 实 验 结 果 ，Schimpl 和 Wecker (1975) 假定 了 细胞 激活 的 全 过 程 可 分 为 三 个 阶 段 ， 分 别 受 按 顺序 地 起 作用 的 三 种 信号 控制 ; 阶段 1: 抗原 决定 簇 和 也 细胞 表面 Ig 受 体 相互 作用 一 第 一 信号 "， 它 本 身 并 不 能 导致 增 生 ， 而 是 使 B 细胞 获得 对 后 来 的 刺激 起 反应 的 能 力 ; 阶段 2: 了 细胞 表面 的 其 他 部 分 和 ”第 二 信号 ”( 包 括 T 细胞、 巨 噬 细 胞 、 激 活 的 C3， 427 ， 一 一 一 一 一- 一 一 浆 母 细胞 浆 细 胞 13-33 激活 的 B 细胞 的 分 化 受 两 个 不 同 的 遗传 程序 控制 的 假说 。(A) B 细胞 激活 的 时 期 阶段 ,出 现 免疫 球 蛋 白 合成 所 需 的 信息 (附着 在 多 聚 核糖 体 上 的 mRNA)。(B) 后 来 发 育 出 内 质 网 膜 成 分 ,不 同 B 细胞 量 上 有 不 同 。 假 定 增生 的 B 细胞 ,充分 表现 程序 *A?, 但 并 不 一 定 进入 终 末 细 胞 分 化 ,而 可 能 返 转 回去 成 为 (寿命 长 的 ?) B ZAM. MR “A”, “BBR 程序 都 进行 ,这 些 细胞 就 变 成 寿命 很 短促 的 效应 细胞 ( 终 末 细 胞 ) 据 Ganossy 和 Greaves,1975)。 KR LPS 等 ) 相 互 作 用 导致 B 细胞 的 增生 。 如 果 某 些 抗原 (不 依赖 胸腺 抗原 ) 能 同时 提供 信号 (1 + 2) ， 就 能 直接 发 动 B 细胞 的 增生 。 此 ALR LPS 外 ， 还 可 以 设想 ， 进 入 增生 期 (阶段 2) 的 了 细胞 信号 1 S52 4, 信号 3 ，， 后 来 失去 抗原 ,可 能 转变 为 记忆 细胞 。 顺 便 提 及 ， Janossy 和 Greaves (1975) 根据 DLPS 对 B 细 ae Ha LAB LE WL TEE EBT i 出 激活 的 B 细胞 的 分 化 可 能 受 两 个 不 同 的 遗传 程序 控制 的 假说 。 处 于 增生 阶段 的 B 细胞 ， 细 胞 上 -一 BAe SRO, TA ”9 网 的 发 育 程度 低 ( 完 成 程序 AD. GREAOMAIE, te 0 eT RRR RES ER 果 租 内 质 由 得 到 继续 发育 (完成 各 序 3) BEER 依 燥 胸 腺 抗原 CB) 能 同时 产生 “信号 1 十 2 的 短 寿 命 的 终 末 细 胞 一 一 浆 细 胞 ， 或 者 不 能 进行 程 TORI Cie. Scho, ie Weeks, ose 序 马 ， 就 转变 为 回忆 细胞 (图 13-33) 4 阶段 3: 当 有 足够 量 的 抗原 存在 和 进行 几 个 周期 的 增生 之 后 ， 还 需要 接受 开 细胞 提供 的 “第 三 信号 ”， 才 能 促进 B 细胞 的 分 化 ,并 活 跃 地 合成 和 分 刻 抗体 。 与 此 相应 地 ， 抗 原 按 其 本 身 固 有 的 刺激 B 细胞 增生 和 分 化 的 能 力 ， 也 可 以 区 分 为 三 种 类 型 (图 13-34) 。 至 于 “第 三 信号 ”的 性 质 及 其 与 B 细胞 作用 的 方式 ， 都 还 不 清楚 。 BS, ULILPRHBS AHIR, RAR B 细胞 激活 过 程 的 某 些 方面 。 实 际 上 ，B 细胞 的 激活 是 包括 B.T 细 乃 及 其 亚 群 之 间 极其 复杂 的 相互 作用 的 现象 。 特 别 是 B * 428 。 细胞 对 抗原 的 反应 类 型 (产生 抗体 或 耐 受 性 ) 可 能 是 受 了 T 辅助 细胞 和 了 T 抑制 细胞 相互 持 抗 作用 的 结果 。 另 一 方面 ，B 细 胞 本 身 在 功能 上 也 是 不 均一 的 (组 织 分 布 . 表 面 特 性 和 增 生 能 力 等 ) ， 不 同 的 亚 群 对 触发 信号 的 要 求 也 可 能 是 不 同 的 (Janossy 和 Greaves, 1975) 。 如 408 页 所 述 ，T 细胞 对 抗原 的 识别 以 及 T,、B 细胞 相互 间 的 识别 可 能 和 细胞 膜 上 的 Ir 基因 产物 有 关系 。 这 也 说 明了 抗原 和 T、B 细胞 相互 作用 中 受 体 和 信号 问题 的 复杂 性 。 目 前 对 淋巴 球 激活 机 制 的 上 述 几 种 假说 都 还 是 初步 的 理论 模型 ， 还 有 待 进一步 研究 和 发 展 。 $ 4 资 .和 料 专著 和 论文 集 Méller, G (1972). Lymohocyte activaion by mitogens. Transplan, Rev. V. 11. Méller, G. (1973). Lymphocyte immunoglobulin: synthesis and surface representation. ieee Rev Wo 4, Miller, G. (1975). Coneepts of B lymphocyte activation Transplan. Rev. V. 23. Nossal, G. J. V. and Ada, G. L. (1971). Antigens. lymphoid cells, and the immune response, Academic : Press. ; ’ Oppenheim, J. J. and Rosenstreich, D. L. (1976). Mitogens in immunobiology. Academic Press. Rosenthal, A, S. (1975). Immune recognition. Academic Press. 论文 Abney, E. R and Parkhouse, R. M. E. (1974). Candidate for immunoglobulin D present on murine B lymphocytes. Nature 252, 600. Ada, G. L, (1970). Antigen binding cells in tolerance and immunity. Transplan. Rev. 5, 105. Ada, G. L, and Byrt, P. (1969). Specific inaetivation of antigen reactive cells with 'I-labelled an- tigen. Nature 222, 1291. Ada, G. L., Cooper, M. G. and Langman, R. (1973). The reaction of antigen with lymphocytes. In: ‘ mRNA(L) 一 一 一 ~ L# | DNA - DNA (b) 两 个 mRNA 分 子 融合 Ae Vi —— mRNA (V1) ven 一 > mRNA(CL) 一 > 工 链 —_———> mRNA (C_) wah 1 ' Cr 喜爱 ©) 两 条 多 肽 链 融合 mRNA(V,_) 一 一 一 > Vr een — | 链 -二 一----F 一 上--- 1 DNA 图 14-7” 两 个 基因 编码 一 条 多 肽 链 的 遗传 控制 途径 。 V，C 基因 分 别 编码 的 信息 的 融合 可 能 发 生 在 不 同 的 水 平 。 途 径 〈a):Vr 和 Cr 在 DNA 水 平 融合 为 一 个 完整 的 世 基因 ,进行 转录 ;产生 的 mRNA(L) 再 转 PL Re Cb): Ve 和 Cr 独立 地 转录 ， 分 别 产生 的 mRNA 再 融合 为 一 ,融合 的 mRNA(L) 再 FEEL Ho HE (Cc): Vi M Cr 分 别 地 转录 和 转译 ,得 到 的 Vi, CL 肽 链 再 连接 成 一 条 工 链 。 + 439 。 与 此 不 同 ， 真 核 细胞 由 于 染色 体 组 成 和 结构 的 复杂 化 (组 蛋白 、 酸 性 蛋白 等 ) MRA 形成 ， 基 因 的 转录 和 和 蛋白 合成 是 在 细胞 内 被 核 膜 分 隔 的 不 同 区 域内 进行 的 。 在 核 内 ， 刚 从 DNA 转录 下 来 的 RNA (转录 本 ) 先是 以 较 大 的 MRNA 前 体 (前 -mRNA) 形式 存在 。 然后 在 从 核 内 到 核 外 的 转移 过 程 中 ， 要 经 过 一 段 复 杂 的 “加 工 ”， 才 能 成 为 有 功能 的 mRNA (图 14-6) 。 真 核 细胞 mRNA 存在 的 时 间 长 ， 有 功能 的 mRNA 在 细胞 质 内 的 寿命 可 长 达 几 小 时 到 几 天 。 由 于 遗传 物质 的 结构 和 信息 传递 的 复杂 性 ， 真 核 细胞 蛋白 合 成 的 调节 可 能 在 不 同 的 水 平 (转录 、mRNA 的 “加 工 ”、 转 译 和 转译 后 肽 链 的 改变 等 ) 上 进行 。 这 些 都 是 真 核 细 胞 的 基因 表现 不 同 于 原核 细胞 的 地 方 。 除去 上 述 真 核 细 胞 蛋白 合成 的 一 般 特 点 以 外 ， 抗 体 的 生物 合成 还 有 其 独特 之 处 。 免 疫 球 蛋白 具有 四 条 多 肽 链 的 基本 结构 。 每 一 条 多 肽 链 ( 重 链 或 轻 链 ) 的 结构 又 是 由 两 个 结 构 基 因 (V，C) 共同 决定 的 。 这 要 求 把 这 两 个 基因 的 信息 整合 为 一 。 如 图 14-7 所 示 ，, 这 种 整合 作用 发 生 在 遗传 信息 传递 途径 的 什么 水 平 CDNA，mRNA 或 多 肽 水 平 ) ， 免 疫 球 蛋白 多 肽 链 mRNA 的 结构 又 有 什么 特点 ? 这 些 特殊 的 问题 曾经 是 免疫 球 蛋 白 生 物 合 成 研究 的 主要 对 象 。 目 前 ， 通 过 下 述 几 方面 的 研究 已 基本 上 得 到 解决 。 (一 ) 合成 重 链 和 轻 链 的 多 聚 核糖 体 六 十 年 代 初期 ， 对 网 织 红血球 、 肝 细胞 和 HeLa 细胞 的 研究 发 现 蛋白 合成 是 在 由 mRNA 连 系 起 来 的 多 聚 核糖 体 上 进行 的 。 多 聚 核糖 体 是 蛋白 合成 的 功能 单位 。 根据 蛋白 质 合成 的 现代 概念 ， 抗 体 的 重 链 和 轻 链 的 合成 也 应 当 是 在 浆 细 胞 粗糙 内 质 网 的 多 聚 核 炉 体 上 进行 的 。 从 血红 及 合 成 的 资料 得 知 ， 多 聚 核糖 体 的 长 度 大 致 相当 于 mRNA 的 长 度 。 据 计量 ， 在 多 聚 核糖 体 上 两 个 核糖 体 之 间 的 距离 约 为 90 SRR, 一 长 度 大 约 相当 于 300A 。 假若 这 一 情况 有 普遍 性 ， 就 可 以 估计 出 参与 抗体 多 肽 链 合 成 的 多 聚 核糖 体 的 长 度 。 按照 三 字 密码 , 和 450 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 7 链 相 对 应 的 mRNA， 应 有 1,350 SABRE (分 子 量 约 为 450 万 )。 因 此 ,7Y 链 在 其 上 合成 的 多 聚 核糖 体 的 长 度 应 等 于 4,500A， 或 相当 于 15 个 核糖 体 相 连 的 长 度 。 轻 链 大 约 有 200 个 氨基 酸 残 基 ， 相 对 应 的 mRNA 应 由 600 个 核 苷 酸 残 基 组 成 (分子 量 约 为 18 万 ) 。 相 应 地 ,合成 轻 链 的 多 聚 核糖 体 的 长 度 应 为 1800A ， 或 相当 于 6 一 7 个 核糖 体 相 连 的 长 度 。 理 论 上 ， 在 抗体 形成 细胞 的 细胞 质 中 ， 应 当 找 到 这 两 种 大 小 不 同 的 多 聚 核糖 体 。 然 而 ， 脾 脏 和 淋巴 结 内 含有 大 量 RNA iS, ZF mRNA 降解 ， 从 而 使 多 聚 核糖 体 解 体 。 因此 ， 从 这 些 组 织 分 离 和 测量 多 聚 核糖 体 的 工作 往往 遇 到 困难 。 REACHES ERA SSR oR Ss Om RN CA SB, A 而 是 研究 这 一 问题 的 好 材料 。Williamson 和 Asconas (1967a) 为 了 避免 多 聚 核糖 体 被 RNA 酶 破坏 ， 在 用 0.5% 脱氧 胆 酸 处 理 瘤 细 胞 ,: 使 细胞 破碎 后 , 就 立即 把 这 一 混合 物 加 到 蔗糖 密度 梯度 表面 ， 马 上 进行 离心 分 离 。 在 这 种 实验 条 件 下 ， 发 现 大 小 不 同 的 两 种 多 聚 核糖 体 ， 并 用 抗 重 链 或 抗 轻 链 的 专 一 抗 血 清 进 行 检 测 ， 证 明 在 较 大 的 多 聚 核糖 体 (300 S) 上 有 重 链 存在 : 而 在 较 小 的 多 聚 核糖 体 (120 一 180S) 上 有 轻 链 存在 。 按 分 子 大 小 估 计 ， 前 者 可 能 含有 12 一 16 核糖 体 ， 后 者 含有 5 一 6 核糖 体 。 后 来 ， 对 同一 材料 进行 电子 显微镜 观察 ， 也 发 现 两 类 多 聚 核糖 体 ， 其 大 小 和 上 述 大 致 相当 。 此 外 ， 对 另 一 种 浆 细 胞 。440 。 Weve, Weep /5> - 10-* 总 放射 性 ， 脉冲 / 分 10- 5 10 15 放射 性 ， 脉 冲 / 分 10- 0 25 50 管 数 14-8 小 鼠 浆 细胞 瘤 MOPC-21 之 多 聚 核糖 体 的 蔗糖 梯度 分 离 。 细 胞 经 也- 亮 氢 酸 标记 10 分 钟 后 ,分 离 多 聚 核糖 体 , 并 用 抗 MOPC-21 IgG 抗 血清 沉淀 。 左 图 : (1) E260mu; (2) ITCA 沉 淀 的 放射 强度 ; (3) 血清 学 沉淀 的 放射 强度 。 AA: 多 聚 核糖 体 血 清 学 沉淀 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 。 (1) 重 的 多 聚 核糖 体 部 分 ; 2) 轻 的 多 聚 核糖 体 部 分 ; G) LB HL 是 重 链 和 轻 链 的 迁移 位 置 ( 据 Schubert, 1968), 5563 的 电子 显微镜 观察 ， 也 发 现 合成 工 链 的 多 聚 核糖 体 含有 4 一 5 个 核糖 体 ， 而 合成 H 链 的 , 则 含有 11 一 18 个 核糖 体 (PDePeteris, 1970). 这 些 数字 和 计算 预测 的 结果 颅 为 一 致 。 Schubert (1968) 用 小 鼠 骨髓 瘤 细胞 株 (MOPC- 21) 进行 实验 。 如 图 14-8 所 示 ， MRR MAR 糖 密度 梯度 离心 时 ， 在 多 聚 核糖 体 区 域 呈 现 出 能 被 抗 Ig 抗 血清 沉淀 的 两 个 清楚 的 峰 。 取 自 重 的 (沉降 较 RN) 多 聚 核糖 体 部 分 ， 在 凝 胶 电 泳 上 主要 呈现 出 重 链 ， 有 少量 轻 链 ;而 轻 的 多 聚 核糖 体 部 分 只 呈现 出 轻 链 (图 14-8) 。 用 免疫 动物 的 淋巴 结 细胞 进行 实验 ， 也 得 到 类 似 的 结果 。Kuechler 和 Rich(1969) ¥% °H-FRREMEYE At 到 次 级 免疫 后 不 同 天 数 的 家 免 淋 巴结 内 。25 分 钟 后 ， 分 离 淋巴 结 ， 制 备 细胞 提取 物 ， 立 即 作 蔗糖 密度 梯度 离心 ， 结 果 发 现 有 两 种 随 着 多 聚 核糖 体 消 长 迅速 标记 的 RNA。 从 图 14-9 可 见 ， 次 级 免疫 的 当天 ， 大 多 数 核糖 体 为 74S， 只 有 大 约 20% 作为 多 聚 核 糖 体 沉淀 。 次 级 免疫 后 2 天 时 ， 多 育 核 糖 体 迅速 增 多 (达到 50 一 60%) ， 较 轻 的 多 聚 核 糖 体 峰 (L) 明显 地 出 现 。 和 多 聚 核糖 体 一 起 沉降 的 被 *H- 尿 喀 啶 迅速 标记 的 RNA 放射 性 强度 也 增高 。 第 3 天 后 ， 多 聚 核糖 体 呈 现 明 显 的 双 峰 ( 工 和 互 )， 此 后 高 度 逐渐 降低 。 这 两 种 迅速 标 放射 性 ， 脉 种/ 分 X10” 14-9 ”家 免 次 级 免疫 后 不 同 天 数 淋 巴 结 细胞 内 多 聚 核糖 体 之 蔗糖 密度 梯度 分 BS ( 据 Kuechler 和 Rich, 1969), 。441 。 记 的 RNA 从 沉降 常数 估计 ， 分 子 量 各 为 3.7x105 和 2.2x105， 很 接近 编码 联 链 和 链 的 mRNA 的 分 子 量 。 总 之 ， 目 前 可 以 肯定 抗体 的 重 链 和 轻 链 是 分 别 在 两 种 大 小 不 同 的 多 聚 核糖 体 上 合成 的 ， 其 大 小 和 计算 值 相 近 。 由 此 可 以 推论 开 链 和 工 链 可 能 是 以 一 条 完整 的 多 肽 链 的 形 式 合 成 的 。 每 条 链 各 有 自己 专 一 的 mRNA 。 这 一 推论 得 到 下 述 实 验 的 支持 。 (二 ) 整 条 重 链 或 轻 链 的 合成 一 一 单一 的 起 点 如 前 所 述 ， 多 肽 链 是 从 N 末端 各 C 末端 依次 地 合成 的 。 当 用 放射 性 氨基 酸 作 短 暂 的 脉冲 标记 后 ， DRAMAS AeA, 就 会 发 现 近 C 末端 的 片段 放射 性 强 ， 向 N 末端 方向 逐步 减弱 ， 呈 现 一 个 明显 的 梯度 (Dintzis，1961) 。 由 此 ， 也 可 以 用 同样 模型 1 ‘2! 的 方法 来 判断 ， 免 疫 球 蛋 白 ES 人 一 AAA “的 重 链 和 轻 链 是 从 单一 的 起 Nw 5 NO AWC 始 端 向 一 个 方向 延长 ， 依 次 -二 撞 关 嫩 人 一 一 一 人 一人 合成 的 (图 14-10， 模 型 D; 或 者 重 链 和 轻 链 各 自 是 由 两 Baw A MAYS Hk, eu nies 接 起 来 的 〈 图 14-10， 模 型 = 3 pe 3 II) 。 he 2 = 2 Fleichman (1967) 研 是 1 m1 RT H- RBS ARS °N C ON C 巴 细胞 合成 7 链 的 过 程 ， 发 ,氨基酸 位 置 氨基 酸 位 置 现 经 过 短暂 温 育 时 (30 1 图 14_10 “经 过 短暂 脉冲 标记 后 , 新 合成 工 链 上 放射 狂 氨 基 酸 的 分 布 。 模型 ”分 ) ， 放 射 性 的 比 活力 从 [ 示 工 链 从 一 个 模板 mRNA 上 转译 。 模型 工 示 工 链 是 由 分 别 从 两 个 模板 “未 端 片 段 到 C 未 端 片 外 逐渐 上 苇 译 的 肽 人 连接 起 来 的 。 上 图 ; 短暂 脉冲 标记 后 放射 性 标记 (CA mE 标记 (一 一 ) 氨 基 酸 在 工 链 上 的 分 布 。 下 图 : 氨基 酸 的 比 活力 与 其 在 多 肽 链 “增加 〈 表 14-1)。 这 清楚 地 上 的 位 置 之 间 的 函数 关系 ( 据 Dintzis，1961)。 HH, IgG 的 7 链 的 合成 是 按照 模型 工 的 方式 ， 从 IN 末端 开始 ， 向 C 末端 依次 进行 ， 合 成 整 条 重 链 。 Lennox .等 (1967) 对 轻 链 合成 过 程 中 ,标记 氮 基 酸 参 人 的 实验 ， 也 得 到 基本 上 相同 的 结果 。 脉冲 标 记 的 轻 链 的 酶 解 片 段 的 比 活 力也 可 以 排列 成 符合 单 起 始点 模型 的 系列 。 表 14-1 家 免 重 链 (Y) 经 “*H- 亮 氨 酸 标记 的 省 化 氰 裂解 片段 之 比 活 力 * 和 ?HH- 亮 氨 酸 i rs 温 育 时 间 * HDA —A RAH 脉冲 数 与 均匀 标记 的 重 链 ( 温 育 4 小 时 ) 的 同一 片 外 的 *H 脉冲 数 的 比值 表示 。C1 的 比值 定 为 1.0( 据 Fleichman，1967 )。 。442 。 总 之 ， 以 上 两 方面 的 证 据 都 支持 也 链 和 工 链 是 作为 一 条 完整 的 多 肽 链 , 从 一 个 起 始 点 开始 依次 地 合成 的 。 因 此 , LAN 链 合成 在 转译 水 平原 则 上 和 其 他 蛋白 质 的 合成 没有 什么 区 别 。 由 此 还 可 以 推论 ， 瑞 链 和 工 链 各 自 有 自己 专 一 的 mRNA， 并 且 它 们 都 含有 合成 Y 区 和 C 区 的 全 部 信息 。 至 于 Y 区 和 C 区 信息 的 整合 是 发 生 在 DNA 水 平 还 是 转 录 水 平 (mRNA WMA), Dis Bet He L 链 的 mRNA 以 及 V、C 基因 的 结构 进行 深入 的 研究 才能 确定 。 (=) 重 链 和 轻 链 的 mRNA 目前 已 经 从 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 分 离 出 重 链 和 轻 链 的 mRNA， 并 且 在 无 细胞 系统 或 爪 蟾 卵 母 细胞 中 合成 了 相应 的 多 肽 链 或 免疫 球 蛋 白 。 1. 轻 链 mRNA Stavnezer 和 Huang (1971) W—-#EBARMAW « BE W OIE 4H ee (MOPC41 A) 的 微粒 体 部 分 ， 经 蔗糖 密度 梯度 离心 得 到 的 一 个 RNA 部 分 (9 一 13 S) ， 能 在 免 网 织 红血球 无 细胞 蛋白 合成 系统 中 转译 出 完整 的 轻 链 。 WZ, Brownlee 等 (1972) 用 另 一 种 小 鼠 浆 细胞 瘤 (MOPC 21) 证 实 了 这 一 实验 ， 同 样 发 现 轻 链 的 mRNA 存在 于 10 一 12S RNA 部 分 内 。 当 在 同一 无 细胞 蛋白 合成 系统 中 转译 时 ， 能 产生 一 条 比 正常 的 工 链 在 N 末端 多 14 或 15 个 氮 基 酸 残 基 的 多 肽 链 ， 并 认为 可 能 是 工 链 的 前 体 , 其 额外 肽 眉 可 能 和 内 质 网 的 膜 层 结合 ， 可 能 和 分 子 的 转运 .分 谈 有 关系 。 以 上 方法 得 到 的 轻 链 mRNA 还 是 不 均一 的 ， 转 译 产 物 也 有 其 他 多 肽 成 分 混杂 。 己 知 哺乳 类 细胞 的 大 多 数 mRNA 在 3' 端 具有 相当 长 的 Poly A 顺序 ， 它 和 这 些 mRNA 在 细胞 内 的 稳定 性 有 关系 (Huez 等 ，1978) 。 利 用 这 一 特点 ,就 可 以 用 PolyU- 纤维 素 或 PolydT- 纤 维 素 亲 合 层 析 法 来 纯化 这 一 类 mRNA, Schechter (1973) 用 抗 L 链 抗体 专 一 地 沉淀 MOPC-321 浆 细 胞 瘤 的 多 聚 核糖 体 ， 从 其 中 分 离 出 mRNA， 再 经 WHA (dT) -纤维 素 亲 合 层 析 纯化 。 这 样 得 到 的 工 链 mRNA 的 纯度 经 生物 活性 鉴定 达 到 >95% 。 在 无 细胞 测 活 系 统 中 ,证 实 纯化 的 工 链 mRNA 能 控制 合成 两 种 比 工 链 要 重 1300 和 4700 道 尔 顿 * 的 多 肽 链 。 同 时 ， 还 证 明 工 链 mRNA 主要 包括 两 种 大 小 不 同 的 分 子 ， 分 子 量 各 为 420,000 和 450,000 道 尔 顿 。 它们 比 编码 工 链 所 需 的 多 核 苷 酸 链 的 长 度 ( 约 250,000 道 尔 顿 ) 要 长 很 多 , 可 能 是 工 链 mRNA 的 前 体 。 过 剩 的 部 分 可 能 包括 PolyA 以 及 和 合成 上 述 多 肽 链 的 额外 部 分 有 关系 。 此 外 ， Mach 等 (1973) 也 从 微粒 体 得 到 含 PolyA 的 mRNA， 经 鉴定 包含 一 个 主要 成 分 ( 约 为 1100 REREAD) ALAR 分 。: 在 无 细胞 系统 中 转译 的 主要 产物 是 比 工 链 长 20 残 基 的 多 肽 链 以 及 另外 两 条 肽 链 。 总 之 ,从 几 种 分 刻 工 链 的 浆 细胞 瘤 分 离 出 含 Poly A 的 mRNA (9 一 14S) 在 离 体 合 成 系统 中 ， 都 能 转译 出 完整 的 工 链 或 工 链 的 前 体 。 这 种 工 链 mRNA 要 比 编码 工 链 所 需 的 多 核 背 酸 链 的 长 度 要 长 18 一 60 核 背 酸 单 位 ,甚至 更 多 。 这 一 多 余 的 部 分 可 能 转译 成 工 链 前 体 的 额外 肽 侦 ， 然 后 再 被 酶 切 去 。 * 分 子 量 的 单位 ,相当 于 UC 的 a ; 443 。 2. 重 链 mRNA Stevens 和 Williamson (1973a) 发 现在 Na+ 和 Mgt++ 离 子 浓度 分 别 为 75 mM 和 0.5mM, (Kime F, 5563 SEF SA (HLL,) 能 选择 地 和 相应 的 重 链 mRNA 结 合 , 并 且 这 种 结合 可 能 对 HHA MR 在 转译 水 平 的 调控 起 反馈 调节 作用 ( 见 455 页 ) 。 HL, 分 子 和 互 链 的 这 种 弱 相 互 作 用 可 能 被 外 加 的 抗 HL, 抗体 稳定 下 来 ,结果 互 链 m- RNA 便 和 H,L,-i H,L, 免疫 复合 物 共 同 沉淀 这 种 作用 是 专 一 的 。 因 此 ， 可 以 利用 抗 5563 髓 细胞 瘤 蛋 白 的 抗体 处 理 来 专 一 地 沉淀 此 RNA- 蛋白 质 复合 物 ， 由 此 可 以 得 到 高 度 纯化 的 互 链 mRNA。 这 样 分 离 的 mRNA 经 4% FA Ms Biche BE 电泳 分 析 可 区 分 出 分 子 量 不 同 的 三 条 带 (图 14-11)， 并 且 对 胰 RNase 图 14-11 抗体 沉淀 RNA SAMRAT. 5563 骨骼 Bet Ss ae 瘤 细胞 (107/ 毫 升 ) 经 3P- 正 磷酸 (100 微 居 里 /毫升 ) 标 记 6 小 时 后 ， RNA 能 和 PolyU 滤纸 结合 ， 并 分 离 总 RNA 和 细胞 质 RNA。 细胞 总 RNA(A)， 细 胞 质 RNA， 对 胰 RNase 酶 解 的 抵抗 力 较 强 富 含 mRNA(B) 和 细胞 质 RNA， 富 含 cRNA(C), 4} 514 0°CH 5563 伐 细 胞 交 蛋 白 和 抗 5563 抗 血 清 处 理 5 分 钟 ,收集 沉淀 ,洗涤 二 〈8%) 证明 可 能 具有 较 长 的 Po17A Ro 沉淀 内 加 °H 标记 骨骼 瘤 细胞 的 28S 和 18S 中 NA 和 大 肠 杆 “ 链 。 带 II 不 能 和 Poly U 滤纸 结 菌 的 23S 和 16S cRNA 作为 参考 。 混合 物 在 2% 聚 丙烯 酰胺 柱 上 分 析 , 并 切 成 1 毫米 片 女 测 放射 性 。 从 图 D 上 RNA 分 子 量 和 迁移 “ 合 , 对 胰 RNase 抵抗 力 小 (到 2%)e 率 标准 曲线 上 , 根据 RNA 带 《!，H，ILD 的 迁移 率 (*) 可 求 出 相 “因此 可 能 含有 较 短 的 Poly A 链 应 的 分 子 量 ( 据 St Williamson, 1973a), Paine in ard cae (Stevens #1 Williamson, 1973 32P-cpm X 10-7 离 原点 距离 (毫米 ) a) > NSS ON ELE TCE ARA RABE MRNA 转译 测试 系统 (Gurdon =, 1971; Gurdon，1974) 。 把 从 聚 丙烯 酰胺 柱 上 带 II 或 带 III Yel PEA RNA 注射 到 爪 昌 卵 母 细胞 内 ， 转 译 的 产物 经 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分析 证 明 只 存在 相当 FH 链 的 一 个 峰 (55,000 道 尔 顿 ) ， 而 完全 没有 工 H(A 14-12). (Stevens 和 Williamson, 1974) 。 这 证 明 用 抗体 沉淀 法 分 离 出 的 互 链 mRNA 在 功能 上 有 高 度 的 专 一 性 。 总 之 ， 上 述 几 方面 的 实验 证 明 存 在 工 链 和 互 链 的 专 一 的 mRNA。 这 些 mRNA 是 相当 稳定 的 ， 能 在 无 细胞 系统 或 异 源 细胞 系统 内 作为 样板 各 自 专 一 地 转译 成 完整 的 〈 包 HVACR) L#MH Ke. KHARERV EG LILI RNA 的 分 子 量 不 同 ， 它 们 很 可 能 相当 于 互 链 mRNA 的 不 同 的 前 体 物 。 3. H 链 mRNA 在 从 核 到 质 的 转移 过 程 中 的 加工” 真 核 细胞 的 细胞 核 内 含有 高 分 子 量 的 ,代谢 率 很 快 的 ,不 均一 的 RNA， 称 为 不 均 一 。444 。 Ok VS-cpm X 107* *H-cpm X 107? te 20? 'sp 00” 40 距 原点 距离 《毫米 7 14-12 从 5563 骨髓 瘤 细胞 专 一 地 纯化 的 RNA 的 转译 产物 。 爪 蟾 卵 母 细胞 注射 从 带 开 或 带 II( 图 14-11) 纯 化 的 RNA。 卵 母 细胞 在 室温 培养 24 小 时 后 匀 浆 ， 用 抗 -5563 抗 血 铺 沉 淀 新 合成 的 5563 蛋白 。 沉 淀 用 PBS 洗 4 次 ,加 3 标记 的 5563 蛋白 作为 记号 , 溶 于 292SDS。 此 样品 分 为 两 部 分 ,一 部 分 用 碘 乙 酸 酰 胺 (0.15M) 溶解 ， 另 一 部 分 在 溶解 前 先 经 玉 基 乙醇 〈0.1M) 还 原 。 从 TEs U 的 RNACA,C) 或 带 II RNA(B,D) 的 卵 母 细胞 得 到 的 经 过 还 原 的 和 未 还 原 的 样品 ， 在 7.592 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 柱 上 作 电 泳 分 析 。 电泳 后 , 凝 胶 切 成 1 SKA, Ki. WE. (一 "一 )35S， (一 一) (4 Stevens 和 Williamson. 1974), 、3P-cpm X 107? Daltons x 10° 10 .20 30 40 10." es 20 30 SEU ABE BS GEA) 14-13 从 5563 Bhi AIS 5563 蛋白 和 抗 -5563 抗 体 专 一 沉淀 得 到 的 细胞 核 RNA 的 电泳 图 。 右 图 , 专 一 RNA 带 的 迁移 率 和 rRNA 标准 品 的 迁移 率 的 比较 ,以 估计 分 子 量 。 培 养 的 小 鼠 骨 骨 瘤 细胞 (7 又 10* 细胞 /毫升 ) 在 无 磷酸 的 L-15 培 滚 中 , 含 250 微 居 里 /毫升 ”P- 正 磷酸 ,保温 5 NN. All% NP-40 在 4sc 保温 15 分 钟 后 ,分 离 细胞 核 和 细胞 质 , 制 备 RNA。 将 纯化 的 RNA BAY 0.5 ZFKIKAW (0.5mM MgCl,,75mm NaCl,20mM 磷酸 组 冲 滚 ，pH7.5), 离 心 (3000 g, 3 分 钟 ) 去 除 聚 集 的 RNA。 上 清 液 内 加 50 微克 纯化 的 5563 蛋白 ,混合 物 保温 1 分 钟 。 然 后 , 再 加 适量 的 抗 5563 抗体 ,继续 保温 2 分 钟 , 离 心 (3000 g, 5 分 钟 ) 收 集 沉 淀 , 用 溶液 A 洗 两 次 。 沉 淀 深 于 292 SDS, jn “*H- 标 记 的 rRNA 作为 分 子 量 标准 ,在 492 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 柱 上 作 电 泳 分 析 。 将 凝 胶 切 成 1 毫米 长 的 片 妇 ,经 浓 氨 水 水 解 , 测 放 射 性 强度 ,得 到 三 个 带 ( 据 Stevens 和 Williamson,1974), 核 内 RNA (简称 Hn RNA)。 目 前 有 证 据 表 明 它 们 可 能 相当 于 转化 为 细胞 质 内 mRNA 的 一 系列 前 体 分 子 。 Stevens 和 Williamson (1973b) 先 用 sP 短暂 地 标记 5563 Shami, HAS 一 抗体 沉淀 法 从 细胞 核 分 离 RNA。 这 样 得 到 的 核 内 RNA 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 柱 上 分 为 ° 445+ Wore 3H- 尿 喀 啶 cpm > Top:) i020 距 原点 距离 (毫米 ) 14-14 重 链 mRNA 前 体 的 合成 和 转运 。 5563 SHRM X10 细胞 /毫升 ) 和 -= 尿 咏 啶 (200 微 居 里 /毫升 ，26 毫 居 里 /毫克 分 子 ) 在 37%C 保温 20 分 钟 。 加 放 线 菌 素 D(10 微克 /毫升 ) 后 ， 继续 保温 30 分 钟 。 在 加 放 线 菌 素 D 后 , 0、15 和 30 分 钟 取 等 量 的 细胞 样品 。 制备 细胞 核 和 细胞 质 RNA。 每 一 RNA 样品 用 5563 蛋白 - 抗 5563 抗体 处 理 ( 如 图 14-I1 所 示 方 法 )。 沉 淀 内 的 专 一 RNA 在 4952 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 柱 上 作 电 访 分 析 。 a,b,c 代表 加 放 线 菌 素 D 后 , 0、15 和 30 分 钟 时 的 细胞 核 RNA FEEL; doe, (RRNA RNA 样品 ( 据 Stevens fq Williamson, 1974), 三 个 带 。 根 据 迁 移 率 估计 分 子 量 ， 其 中 两 条 带 (II\III) hor eras Ta A H 链 mRNA 的 大 小 ， 并 可 能 带 有 或 不 带 有 PolyA。 带 I 的 分 子 量 最 大 ， 其 分 布 限于 核 内 存在 (图 14-13) 。 这 一 结果 似乎 提示 细胞 质 内 的 互 链 mRNA 是 先 在 核 内 形成 的 ， 然 后 再 转移 到 核 外 。 进 一 步 作 脉冲 标记 竞争 实验 ( 先 用 "H- 尿 喀 啶 标记 20 分 钟 ， 再 加 放 线 苦 素 D 抑制 ) ， 发 现 当 细胞 经 * 责 - 尿 旷 啶 短暂 标记 后 ， 被 抗原 抗体 复合 物 专 一 地 沉淀 的 核 内 放射 性 标记 RNA 只 在 带 工 出 现 ( 图 14-14a) 。 MAAR D 抑制 新 的 RNA 合成 时 ， 核 昔 酸 数目 (x 107°) 便 发 现 带 工 的 放射 性 减弱 ， 同 时 带 开 BoP ey, «AP TIL BEI. ARORA L 留 在 细胞 核 内 (图 14-14，b) 。 当 保温 ce Hit 时 间 再 延长 时 ， 相 当 于 这 两 条 带 的 放 (图 14-14c) 。 如 果 将 带 I 的 RNA 14-15 上 链 和 五 链 mRNA 之 编码 长 度 和 实验 测 得 的 长 度 。 VE Et Bl & ws (ED) 预想 的 编码 长 度 (Cl) 根据 分 子 量 测定 ,附加 的 核 ”注射 到 爪 蟾 卵 母 细 胞 鼎 ， 就 能 合成 昔 酸 顺序 (ZZ) BS PolyA 的 顺序 。 GE Williamson, 5563H 链 。 这 证 明 其 中 存在 编码 重 ee 链 的 mRNA。 所 以 ， 这 些 实验 直接 证 明细 胞 核 内 存在 互 链 mRNA 的 分 子 量 较 大 的 前 体 物 ( 带 IT) ， 然 后 再 从 核 内 转移 到 核 外 ( 带 II\IIID) (Stevens 和 Williamson，1974) 。 进一步 研究 发 现 从 5563 瘤 细 胞 的 细胞 核 分 离 出 的 互 链 mRNA 前 体 ， 至 少 有 4300 核 苷 酸 单位 长 ， 其 3 端 含有 150 一 200 核 苷 酸 单 位 长 度 的 PolyA 链 。 从 细胞 质 内 分 离 出 的 互 链 mRNA 的 长 度 也 有 约 2000 核 苷 酸 单 位 ， 比 互 链 编码 所 需 的 长 度 也 超出 650 核 苷 酸 单位 (图 14-15) 。 这 说 明 核 内 的 Hf MRNA 前 体 分 子 在 从 核 内 到 核 外 的 转移 过 程 中 ， 可 能 有 一 个 “ 减 短 ?的 “加 工 ? 过 程 。446 + (Williamson，1973) 。 如 同 图 14-6 所 设想 的 那样 ， 可 以 假定 从 DNA HR PRA H mRNA (转录 本 ) 先 在 细胞 核 内 被 逐渐 切 成 细胞 质 内 mRNA 的 大 小 ， 经 短暂 停留 后 再 转移 到 细胞 质 内 。 后 来 有 人 利用 遗传 工程 方法 ， 先 以 上 轻 链 mRNA 作 模 板 通过 反 转 录 得 到 cDNA, 再 将 eDNA 和 质粒 连接 转移 到 细菌 内 扩 增 ， 得 到 重组 DNA 。 以 这 种 重组 DNA 作为 探 测 分 子 , 分 析 核 内 不 均一 RNA, 结果 发 现 核 内 存在 三 类 含 < 链 mRNA 顺序 的 大 分 子 RNA。 它 们 可 能 按 下 列 顺 序 ， 40SRNA~>24SRNA~>13SRNA gest 13S c¢ # mRNA (~11,000 FR) (~4000 BHR) (~1250 RHR) (~1250 KR) 转化 为 细胞 质 内 的 上 链 mRNA (Gilmore-Hebert 和 Wall, 1978), iX—# RAH 链 上 得 到 的 结论 是 一 致 的 。 总 之 ， 这 些 实验 证 明 核 内 不 均一 的 大 分 子 RNA 是 细胞 质 内 mRNA 的 前 体 。 这 是 和 在 其 他 真 核 细 胞 上 得 到 的 证 据 核 内 不 均一 RNA 是 细胞 质 内 mRNA 的 前 体 一 一 相 一 致 的 。 这 种 mRNA 前 体 的 “加 工 ? 过 程 ， 在 SV40 病毒 RNA 的 转录 过 程 中 曾 有 人 加 以 追溯 。 不 过 在 细胞 核 内 和 细胞 质 内 都 分 离 出 同一 个 确定 的 信使 分 子 并 证 实 其 相互 转 化 的 关系 ， 互 链 mRNA 还 是 第 一 个 例子 。 最 近 ， 对 真 核 细胞 的 基因 构造 (包括 免疫 球 蛋白 基因 ) 研究 的 一 个 重要 发 现 是 在 结构 基因 的 内 部 存在 间隔 顺序 或 插 人 顺序 。 这 种 顺序 可 能 在 转录 过 程 中 ,从 mRNA 前 体 分 子 的 中 段 被 删 去 ， 而 不 是 象 过 去 设想 的 那样 是 从 分 子 末 端 切 去 一 段 的 简单 的 “ 切 尾 巴 ? 的 过 程 (Brack 和 Tonegawa, 1977; Gilbert, 1978; Marx，1978) 。 关于 这 一 点 在 免疫 球 蛋白 分 子 的 遗传 和 进化 上 的 意义 下 一 章 还 要 讲 到 。 最 后 ， 还 要 提 到 一 个 较 早 期 的 实验 。 当 把 从 5563 SH BAD Rae Le 链 mRNA 注射 到 爪 蝎 的 卵 母 细 胞 内 时 ， 发 现 有 工 链 和 蔬 链 合 成 ， 并 且 可 能 装配 成 完整 的 IgG 分 子 (H,L,) (Stevens 和 Williamson，1972) 。 这 表明 卵 母 细胞 内 也 可 能 存在 Ig 分 子 装配 所 需 的 构造 。 三 、 免 疫 球 蛋 白 分 子 的 装配 、 转 运 和 分 沙 免疫 球 蛋白 是 一 个 糖 蛋白 ， 分 子 具 有 四 条 链 (EL, 的 基本 构造 ， 并 可 以 聚合 成 多 聚 体 。 分 子 是 靠 工 链 和 世 链 之 间 非 共 价 相互 作用 和 特异 的 二 硫 键 维持 构造 稳定 的 。 如 前 所 述 , 工 链 和 互 链 是 在 抗体 合成 细胞 的 粗糙 内 质 网 上 不 同 的 多 聚 核糖 体 上 分 别 合成 的 ， 然 后 再 装配 成 完全 的 抗体 分 子 。 分 子 的 装配 是 在 细胞 内 的 合成 地 点 到 分 谱 的 转 运 途中 逐步 完成 的 。 与 此 同时 ,分子 上 的 低 聚 糖 链 也 逐步 延长 。 多 到 体 的 形成 发 生得 很 晚 。 IgM 在 细胞 内 只 是 以 7S 亚 基 形 式 存在 ， 只 有 在 分 刻 时 或 前 不 久 才 形 成 19S WS RK. (—) 分 子 的 装配 一 般 认为 蛋白 质 高 级 结构 信息 包含 在 其 一 级 结构 之 中 。 然 而 ， 分 子 的 装配 还 受到 细 。447 « HA nd (PE、 离 子 组 成 和 强度 ,多肽 和 蛋白 的 浓度 .还 原状 态 、 二 硫 键 交换 酶 的 分 布 等 ) 的 影响 。 此 外 ,一 条 正在 合成 中 的 多 肽 链 达 到 一 系列 的 稳定 构象 在 热力 学 上 的 要 求 也 可 能 和 一 个 已 经 完全 合成 的 多 肽 链 有 所 不 同 。 这 些 情 况 说 明和 蛋白 质 分 子 在 细胞 内 的 装配 可 能 和 在 离 体 条 件 下 的 拆 合 有 很 大 的 不 同 ， 还 有 许多 不 清楚 的 地 方 。 免 疫 球 蛋白 具有 易 于 拆 合 的 四 条 肽 链 的 基本 构造 ， 互 链 和 工 链 在 抗原 性 上 易于 区 别 ，IgA 和 IgM 还 可 以 RAMSAR. 由 于 这 些 特点 ， 免疫 球 蛋 白 是 研究 多 链 蛋 白质 分 子 装配 和 聚合 的 好 材 料 。 1. 多 聚 核糖 体 上 肽 链 的 装配 已 知 互 链 和 工 链 是 在 大 小 不 同 的 多 聚 核糖 体 上 分 别 合 成 的 。 然 而 ， 游 离 的 也 链 很 脉冲 en 容易 自行 聚集 。 因 此 ， 有 人 假定 当 重 链 的 合成 还 正在 进行 的 时 候 ， 游 离 的 工 链 就 可 能 和 还 位 于 多 聚 核 AK LEN A 结合 ， 结果 互 链 是 以 和 工 链 的 复合 物 的 形式 ， 而 不 是 以 易于 形成 聚集 物 的 游 离 互 链 的 形式 从 大 的 多 聚 核糖 体 上 和 放出 来 。 也 就 是 说 免疫 球 蛋 白 分 子 装配 在 多 聚 核糖 体 上 就 已 经 开始 进行 了 。 这 一 假定 得 到 多 方面 的 支持 。 Shapiro 等 (1966) 对 分 沁 IgG2b 的 小 鼠 MPC 11 浆 细 胞 瘤 多 聚 核糖 体 上 新 产生 的 互 链 和 工 链 出 现 和 消失 的 动 HL |+ | +1+[+ [+/+ [-|-|-| 力学 做 过 详细 的 研究 。 当 用 标记 氨基 酸 15 30 90115 30 45 60 90 120 180( 秒 ) 短促 脉冲 标记 时 (15 秒 ) , BPIKHS HR 14-16 MPC 11 奖 细胞 瘤 之 也 和 世 链 在 多 聚 核糖 体 上 的 装配 示意 图 。 MPC11 瘤 细胞 和 放射 性 氨基 酸 保温 90 秒 (了 脉 ”核糖 体 ( 约 270S) ERAH 链 ， 而 小 的 冲 标记 )， 然 后 加 大 量 过 锌 的 非 标记 氨基 酸 停止 放射 性 参 人 ”多 聚 核糖 体 (190S) LRA LE ZC. ( 重 白 合成 仍 继续 进行 )(“ 赶 出 ?>)， 在 脉冲 标记 和 赶 出 的 不 同 ihe Sa BTA), FRPP REAR AR RC AE SRBC) 1908) 和 ”但 是 , 当 标记 时 间 延 长 时 (> 30 BH), K AS RHE (25 270S) 上 新 生 的 工 和 吕 链 。 上 方 表格 示 “的 多 聚 核糖 体 上 就 同时 存在 标记 的 HE 折 结 果 。 HAPS aMIOHM Lacon aria TIL 链 。 这 提示 新 合成 的 工 链 从 小 的 多 配 ( 据 Scharff 和 Laskov, 1970), 聚 核糖 休 上 释放 出 来 后 ， 可 能 转移 到 大 的 多 聚 核糖 体 上 ,和 正在 合成 的 互 链 结合 (图 14-16) 。 此 外 ，Schubert(1968) 对 三 种 小 鼠 浆 细胞 瘤 (MOPC 21, ADJPC5, MOPC 104) 的 研究 ， 也 同样 发 现 新 合成 的 工 链 可 能 和 大 多 聚 核糖 体 上 的 重 链 结 合 ( 据 Schubert，1968; Schubert 和 Cohn 1968), 为 了 证 实 这 种 可 能 性 ， 进 一 步 作 “脉冲 - 赶 出 ”(“Pulse-Chase”) 实验 ， 即 先 把 瘤 细 胞 和 放射 性 氨基 酸 一 起 保温 90 秒 ( 脉 冲 标记 )， 然 后 加 大 量 过 剩 的 非 标记 氮 基 酸 停止 放射 EBA (“ 赶 出 ”” 。 由 于 和 蛋白质 合成 仍 在 继续 进行 ， 结 果 经 过 一 段 短促 的 时 间 后 ， 新 产生 的 非 标 记 的 多 肽 链 便 会 把 原来 位 于 多 聚 核糖 体 上 的 标记 的 多 肽 链 “ 赶 出 "去 。 在 开始 “ 赶 出 后 的 不 同时 间 ， 检 查 两 种 多 聚 核糖 体 上 新 产生 的 工 链 和 瑞 链 ， 发 现 标记 的 工 链 在 30 MAR 从 小 的 多 聚 核糖 体 上 “ 赶 出 "来 了 ， 而 标记 的 HEXANE 60 秒 才 能 从 大 多 聚 核糖 体 上 。448 。 Lf[-|+|+|+|+[+]+ |+[+|—| y 完全 “ 赶 出 ?来 。 另 一 方面 ， 开 始 “ 赶 出 ”后 120 秒 时 ， 大 的 多 聚 核糖 体 上 仍然 可 以 测 出 标 记 的 工 链 (图 14-16) 。 对 于 这 些 结果 如 何 解释 呢 ? 可 以 假定 细胞 内 存在 一 个 处 于 动态 平 衡 中 的 游离 工 链 库 。 它 一 方面 由 于 和 大 多 聚 核 糖 体 上 正在 合成 的 互 链 结合 而 不 断 减 少 ， 一 方面 又 从 小 多 聚 核糖 体 上 新 合成 和 释放 的 工 链 得 到 源源 不 断 地 补充。 开 初 , 游离 工 链 库 内 完全 没有 标记 的 工 链 ， 因 此 大 多 聚 核糖 体 上 也 找 不 到 标记 的 工 链 。 MARA 成 和 释放 到 游离 工 链 库 内 的 标记 工 链 逐 渐 增 多 ， 大 的 多 聚 核糖 体 上 便 出 现 和 标记 的 五 链 结合 的 标记 的 工 链 。 再 往 后 ， 当 所 有 标记 的 联 链 都 从 大 的 多 聚 核糖 体 上 “ 赶 出 "时 ,游离 L 链 库 内 暂 存 的 标记 的 工 链 仍 然 可 以 继续 不 断 地 和 大 的 多 聚 核糖 体 上 的 非 标 ic BY H 结合 ， 直 到 120 秒 时 ， 游 离 工 链 库 内 标记 的 工 链 耗 尽 为 止 (Shapiro 等 ，1966) 。 后 来 的 确 发 现 所 有 合成 免疫 球 蛋 白 的 细胞 内 都 有 游离 的 工 链 库存 在 ， 但 是 却 很 难 找 YI J Ab/Ag 沉淀 放射 性 aR BE (CPM) 蔗糖 梯度 14-17 小 鼠 淋 巴结 细胞 内 “H- 氨 基 酸 对 游离 工 链 和 !gG 之 相对 参 人 量 。 淋巴 结 细 胞 与 H=- 亮 氨 酸 和 统 氨 酸 保温 10 分 钟 ( 左 ) 和 40 分 钟 ( 右 )。 制备 细胞 内 可 溶性 蛋白 ， 若 糖 梯度 离心 分 离 , 并 用 抗 血清 鉴定 。(……) 对 照 抗 家 兔 IgG 抗 血 清 ; (一 一 ) WL; (一 一 ) 抗 Fc， 与 IgG 反应 强 ( 据 Askonas 和 Williamson, 1967b), 到 游离 的 互 链 。. 对 免疫 小 鼠 淋巴 结 细胞 ， 标 记 氮 基 酸 参 人 庆 离 工 链 和 IgG 的 动态 过 程 的 观察 发 现 ， 在 加 入 标记 毛 基 酸 后 5 分 钟 ， 细 胞 内 游离 工 链 部 分 和 IgG 部 分 的 标记 量 是 相同 的 。 但 是 ， 在 40 分 钟 时 ，Ig G 部 分 的 标记 量 便 显 著 增 高 , 比 游 离 工 链 部 分 高 6 一 7 倍 〈 图 14-17) 。 这 说 明 游 离 工 链 库 内 的 新 合成 不 久 的 标记 工 链 不 断 转 移 到 新 装配 的 IgG 分 子 上 (Askonas 和 Williamson, 1967 b) 此 外 , 当 新 合成 的 多 肽 链 被 亚 胺 环 已 页 “冻结 ”在 多 聚 核糖 体 上 而 不 能 释放 出 来 时 ，I8gG 分 子 装 配 也 受到 严重 的 阻碍 (Willi- amson 和 Askonas, 1968), 离 体 实验 也 有 证 据 提 示 ”“ 工 标 记 的 工 链 能 选择 地 和 含 新 ， 合成 互 链 的 大 多 聚 核糖 体 结 合 (Askonas 等 ，1969) 。 总 之 ， 所 有 这 些 实 验 都 支持 le 分 子 的 装配 在 多 聚 核糖 体 上 就 已 经 开始 进行 了 。 新 合成 的 工 链 先 释放 到 细胞 之 迅速 更 新 的 游离 工 链 库 内 ， 然 后 再 和 大 的 多 聚 核糖 体 上 的 瑞 链 结合 ( 至 少 在 上 述 四 种 浆 细胞 瘤 是 如 此 ) 。 有 人 还 发 现在 MOPC21 Shea, IgG 分 子 在 多 聚 核糖 体 上 装配 时 ， 链 间 二 硫 桥 已 开始 形成 , 甚至 完全 形成 了 (Schubert 等 ， 1968) 。 但 是 ， 在 其 他 的 细胞 里 新 产生 的 工 链 和 互 链 间 却 找 不 到 二 硫 (Scharff 和 Laskov，1970) 。 实 际 上 ， 后 来 的 实验 证 明 重 链 和 轻 链 在 多 聚 核糖 体 上 的 装配 虽 已 开始 进行 了 ， 但 在 量 上 只 占 少数 ， 大 多 数 非 共 价 结合 和 几乎 全 部 的 共 价 结合 是 在 这 些 链 从 多 . 449 . 缘 核 糖 体 上 释放 出 来 后 才 形 成 的 (Baumal 和 Scharff, 1973). 2. 链 间 二 硫 键 形成 的 顺序 对 链 间 二 硫 键 形 成 顺序 的 研究 可 以 前 明 IE G 分 子 装 配 的 后 来 的 步 又。 从 IgG(H,L,) 的 分 子 构造 看 来 ， 理 论 上 这 一 个 四 条 链 共 价 结合 的 分 子 可 能 有 三 条 装配 途径 ， (A) @ 互 + 工 一 HL @) HL+HL-H,L, (B) @ H+H—H#H, @ H,+L—-H,L 8) H,L+L—-H,L, (C) @ H+L—>HL @ HL+H—-H,L G@) H,L+L—H,L, 对 人 和 小 鼠 各 种 骨髓 瘤 细 胞 之 免疫 球 蛋 自 链 间 二 硫 键 形 成 的 动力 学 研究 发 现 ， 细 胞 内 和 细胞 外 存在 着 各 种 各 样 的 部 分 装配 的 中 间 产 物 ( 表 14-2) 。 从 这 里 可 以 看 出 ， 不 同 的 骨髓 瘤 细胞 ， 链 间 二 硫 键 形成 的 顺序 可 能 是 不 同 的 。 表 14-2 小 鼠 骨 骼 瘤 细 胞 合成 和 分 泌 的 IgG 及 中 间 产 物 细胞 MOPC21 MOPC31B 5563 MOPC173 MOPC494 MPCI11 MPCII( 培 养 ] IgG，。 ( 据 Scharff 和 Laskov, 1970), 虽然 在 一 种 小 鼠 骨 通 瘤 MOPC 21， 所 有 或 几乎 所 有 链 间 二 硫 键 在 多 聚 核糖 体 上 就 已 经 形成 了 (Schubert S, 1968), (HERMAN, 2D-MD, EBILFS 部 二 硫 键 是 在 肽 链 从 多 聚 核糖 体 上 释放 下 来 后 才 形 成 的 。 如 MPC 11 SiGe. 3 放射 性 氨基 酸 标记 2 时 分 钟 ， 再 加 亚 胺 环 已 酮 抑制 多 聚 核 糖 体 上 新 合成 的 肽 链 的 释 放 。 结 果 在 10 分 钟 内 仍 能 继续 形成 链 间 二 硫 键 。 这 表明 在 MPC 11 瘤 细 胞 几乎 所 有 的 链 间 二 硫 键 是 在 肽 链 从 多 聚 核糖 体 释 放 后 才 合 成 的 。 因 此 ， 对 于 不 同 的 疤 细胞 ， 链 间 二 硫 键 形 成 的 顺序 是 明显 不 同 的 。 根据 现 有 的 研究 资料 大 体 说 来 ， 小 鼠 IgG, 和 IgGs, 的 装配 途径 是 不 同 的 。 已 经 研究 过 的 三 种 产生 IEG,, Hea, OF EMULE CRA BAW, ABAREH BEAL 链 间 的 共 价 连 接 (BREA. Pin, 产生 IgG,, 的 AdJPC-5 骨 通 瘤 ， 在 “ 赶 出 ”后 4 分 钟 ， 可 测 出 相当 大 量 的 荆 ， 囊 ， HLA H,L 中 间 产 物 。 后 来 在 18 分 钟 时 ， 这 些 中 间 产 物 已 大 部 分 装配 成 了 L:， 这 说 明 分 子 二 硫 键 形成 的 顺序 是 按照 也 途径 进行 的 (图 14-18) (Baumal 等 ，1971) 。 另 一 方面 ， 一 些 培 。450 。 FNS Rea, wo MOPC31B (IgG,), MOPC 21 (IgG,) 和 MOPC11 (IgG,,) 似 44 HB Li, CPM X 107? > ia 一 H | am, HH 0 10 20 3040 50 60 70). 0..2 Sas 1012 14 16 18 管 数 (分 ) 图 14-18 小 鼠 AdjPC-5 Hie JgG:。 共 价 装配 的 途径 和 动力 学 。 (A) 脉冲 标记 和 “ 赶 出 ?后 ， 4 分 和 18 分 时 ,细胞 提取 液 经 抗 小 鼠 也 和 工 链 抗 血清 沉淀 物 之 凝 胶 电 泳 图 。 (3B) “HH AAA Hil, 免疫 球 蛋白 合成 之 各 种 中 间 产 物 的 量 随 时 间 的 变化 ( 据 Baumel 等 ，1971)。 乎 是 先 形成 HL 间 的 二 硫 键 ， 然 后 再 和 两 条 互 链 共 价 连 接 ( 途 径 A) 。 不 过 , 这 并 不 是 绝 对 的 ， 其 他 二 硫 键 形 成 途径 也 可 能 在 一 定 程度 上 表现 出 来 。 例 如 ，MOPC 173 和 MOPC 494 瘤 细 胞 的 二 硫 键 形成 的 主要 途径 是 通过 HF HLL 中 间 产 物 (B 途径 ) ,但 是 也 可 能 形 成 小 量 的 HL 半分 子 ， 并 装配 成 完整 的 HL:。 总 之 ， 小 鼠 各 种 IgG 分 子 装 配 途 径 是 不 同 的 。 已 知 小 鼠 IgG 各 亚 类 的 结构 ,包括 链 间 二 硫 键 的 数目 和 位 置 有 明显 的 不 同 (B24 第 七 章 ， 图 7-6) 。 上 述 分 子 装 配 途 径 的 不 同 也 许可 能 和 IgG 各 亚 类 结构 的 不 同 有 关系 。 3.IgM 的 分 子 装 配 IgM 在 细胞 内 的 装配 过 程 还 不 太 清 楚 。 不 过 有 证 据 指 出 7S IgMs 亚 基 的 聚合 是 在 分 座 时 或 分 小 前 不 入 才 发 生 的 。 这 时 “J” 链 也 加 入 到 新 聚合 的 多 聚 体 分 子 中 〈 人 参看 第 八 章 ， 232 页 ) 。 从 细胞 内 分 离 出 来 的 IEMs 亚 基 ， 除 非 事先 经 过 还 原 剂 处 理 , 不 能 自发 地 聚合 。 这 提示 和 亚 基 闻 连接 有 关 的 半 胱 氮 酸 残 基 在 细胞 内 是 处 于 封闭 状态 的 (Parkhouse, 1973; 1974), (=) 转译 后 的 改变 已 装配 完 的 免疫 球 蛋白 ， 在 运输 过 程 中 其 肽 链 还 要 发 生 一 些 改变 ， 并 逐步 加 上 低 聚 糖 链 ， 才 能 分 刻 到 细胞 外 面 去 。 1. 肽 链 顺 序 的 改变 5563 浆 细 胞 瘤 产 生 的 一 种 免疫 球 蛋白 IgG.) 在 合成 后 到 分 这 出 细胞 以 前 ， 分 子 的 电荷 性 质 还 要 发 生 改 变 。 用 等 电 点 聚焦 法 分 析 脉 冲 标记 的 免疫 球 蛋白 ， 发 现 细胞 内 的 前 体 蛋白 (o)， 在 分 刻 到 血清 内 时 ， 就 转变 成 等 电 点 PD 较 低 的 免疫 球 蛋 白 (a) (图 14- 19a) (Awdeh 等 ，1970) 。 有 证 据 表 明 这 种 电荷 变化 不 是 由 于 N 末端 的 谷 毛 酸 环 化 形 。451 。 成 封闭 末端 的 结果 ， 而 是 由 于 肽 链 顺序 有 改变 。 MOPC 21 浆 细 胞 瘤 的 mRNA 在 网 织 红血球 无 细胞 蛋白 合成 系统 中 ， 能 合成 工 链 . 的 较 长 的 前 体 物 。 但 是 ， 当 加 入 Kreb II 腹水 瘤 的 上 清洲 因子 时 ，NN 末端 外 加 的 一 段 多 肽 (14 一 15 氮 基 酸 残 基 ) 就 消失 了 。 工 链 前 体 在 细胞 内 转化 为 工 链 进行 得 很 快 。 在 无 细胞 蛋白 质 合成 系统 中 ， 加 从 微粒 体 部 分 制备 的 多 聚 核 糖 体 时 , 能 合成 工 链 前 体 物 (了 ); 当 加 细胞 的 微粒 体 部 分 时 ， 就 只 能 形成 工 链 (图 14-19) (Milstein 等 ,1972) 。 后 来 的 研究 发 现 工 链 前 体 物 N 端的 额 外 肽 段 含 有 大 量 的 亮 氨 酸 残 基 ， 非 极 性 程度 很 高 。 因 此 ， 可 以 假定 工 链 前 体 的 非 极 性 额 外 肽 段 易于 和 内 质 网 膜 层 结合 ， 并 可 能 和 免 疫 球 蛋 白 的 转运 和 分 谈 有 关系 。 当 到 达 分 刻 地 点 时 , 额外 肽 段 被 切除 的 分 子 , 便 脱离 膜 层 而 被 分 刻 出 去 。 少 数 不 被 切除 的 分 子 继续 埋 原点 在 膜 层 内 ， 被 带 到 细胞 表面 成 为 抗原 受 体 (Schechter 和 Burstein，1976) 。 Gi) 10 分 钟 《ii 1 小 时 区 < i.c. 或 ec. H 2. 糖 的 参 人 Pp 本 各 类 (或 亚 类 ) 免疫 球 蛋 白 具 有 特异 的 低 聚 糖 链 。 放 射 性 标记 糖分 子 参 人 桨 细胞 内 免 人 Go 疫 球 蛋 白 的 动力 学 研究 ， 表 明 糖 残 基 是 在 锡 (>) 图 14-19 工 链 前 体 在 转译 后 的 改变 。 (a) 等 电 点 聚焦 AR IgG5563 前 体 及 其 转化 为 血清 5563 蛋白 。5563 细胞 PICA Aa, “Chr ichi Wiese A Se AREA i: CG) 105+), MIAME Cic.); Ci) 1 小 时 ， AAA Ci.c.) 或 细胞 外 (se.c.); Gil) 带 瘤 动 物 血 清 内 See eC Awdeh 等 ，1970)。(b) MOPC21L 疫 球 蛋白 的 合成 、 释 放 、 转 运 和 分 这 的 过 程 中 ,逐步 加 添 到 免疫 球 蛋 白 分 子 上 的 。 各 种 糖 残 基 参 人 浆 细 胞 内 正在 合成 和 转 运 的 免疫 球 蛋白 的 地 点 和 时 间 是 不 同 的 。 对 于 产生 IgG 的 桨 细胞 瘤 ， 有 人 发 现 ` 丽 - 毛 基 链 前 体 之 体外 合成 ， 无 细胞 系统 内 合成 的 区 链 : (D) ”葡萄糖 能 和 还 留 在 多 聚 核糖 体 上 的 肽 链 共 价 aN SRE. SS Rien be certs 结合 (Sherr 和 Uhr, 1969), *H-m ze Hi PCR REB CASE RICGE Milstein S$, 1972), 。 萄 糖 、*H- 甘 露 糖 、“H- 半 乳糖 都 能 标记 细胞 内 的 和 分 刻 的 免疫 球 蛋白 ,而 五 - 岩 藻 糖 只 能 标记 分 刻 的 ， 而 不 能 标记 细胞 内 的 免疫 - 球 蛋白 。 这 提示 岩 藻 糖 是 在 免疫 球 蛋 白 分 刻 的 最 后 阶段 才 加 上 去 的 . (Melcher，1970) 。 同 样 地 ,，*H- 唾 酸 标记 的 免疫 球 蛋 白 分 子 在 细胞 内 、 外 同时 出 现 。 这 提示 位 于 低 聚 糖 链 末端 的 糖 残 基 是 在 免疫 球 蛋白 分 子 离开 细胞 前 才 加 上 的 。 总 之 ， 这 些 事实 表明 低 聚 糖 链 不 是 作为 一 个 整体 加 入 到 免疫 球 蛋 白 分 子 上 去 的 ， 而 是 在 免疫 球 蛋白 合成 、 转 运 和 分 小 的 过 程 中 , 在 内 质 网 的 不 同 部 位 上 , 逐步 增添 、 加 长 的 。 氨 基 葡 萄 糖 、 甘 露 糖 是 在 粗糙 内 质 网 上 就 最 早 加 上 的 ， 部 分 半 乳 糖 和 神经 氮 酸 是 在 平滑 膜 上 加 上 的 ， 而 其 余 的 半 乳 糖 和 神经 氨 酸 以 及 大 部 分 岩 藻 糖 是 在 临 分 刻 时 才 加 上 去 的 (图 14-20) (Melcher，1973) 。 糖 参 人 IgEM 的 过 程 大 体 上 也 是 和 IgG 相似 的 。 对 于 产生 IEM 的 浆 细胞 瘤 ， 甘 露 糖 和 和 氮 基 葡萄 糖 同样 是 在 分 记过 程 的 早期 就 加 入 IgEM 分 子 的 ,而 半 乳 糖 和 岩 藻 糖 是 在 IgM 离开 细胞 时 或 前 不 久 才 加 上 的 。 HBA IgM 和 IgG 的 主要 不 同 点 也 就 在 于 半 乳 糖 加 入 * 452 。 的 时 间 ， 以 及 IgM 糖 总 量 的 35 一 40% 是 在 分 这 时 或 前 不 久 才 加 到 多 聚 体 分 子 上 的 ,也 就 是 说 在 从 IgMs 单 体 聚合 为 多 聚 体 时 才 发 生 的 (Parkhouse 和 Melcher, 1971). 4 SBT phen BY. RRA) Bn Se 7 23 内 五 链 糖 组 成 的 分 析 发 现 ， 粗糙 膜 部 Ac er i 45 WL $ & A 3GlcNAc 和 4 Man alls: 残 基 ， 平 滑 膜 部 分 的 工 AA 3Gle- 一 ~ NAc、4Man、2Gal 和 0.5 Fuc 残 基 ， 而 分 这 的 工 链 则 含有 全 部 的 糖 组 = 中 2 Fuck. 平滑 膜 和 分 泌 的 工 链 上 图 14-20 免疫 球 重 白 在 细胞 内 的 分 布 、 转 运 和 糖 基 团 加 深 的 示 分 ， 即 3GlcNAc、4Man、4Gal 和 意图 。 免疫 球 蛋白 是 在 和 粗糙 内 质 网 膜 结合 的 多 聚 核糖 体 上 合 含有 不 等 量 的 NGNA (0,1 或 2 RH 成 的 。 一 部 分 正在 加 长 的 多 肽 链 ,在 从 多 聚 核糖 体 上 释放 出 来 以 由 Lee ar Atl EET REARS IERIE 〈c)， 而 大 多 数 免疫 球 蛋 白 分子 是 基 )， 而 粗糙 膜 部 分 则 完全 没有 。 从 在 进入 粗 内 质 网 的 岩 池 中 , 才 加 上 氨基 葡 糖 (o ) 和 甘露 糖 (@ DR 这 些 结果 可 以 得 出 结论 ， 各 种 糖 基 转 。 基 。 免疫 球 蛋 白 分子 然 后 转运 到 类 似 高 尔 基 氏 体 的 平滑 膜 构造 内 ,在 该 处 再 加 添上 半 乳 糖 (2 7 和 神经 氮 酸 (一 )。 分 泌 的 免疫 球 移 酶 可 能 分 布 在 不 同 的 亚 细 胞 成 分 蛋白 上 的 糖 残 基 已 经 齐全 ,包括 全 部 的 甘露 糖 、 氨 基 葡 糖 、 半 乳 上 ; GlcNAc 和 Man 转移 酶 位 于 粗 ， 六 ,神经 氢 酸 和 岩 洛 糖 (A) 残 基 。 膜 结合 的 免疫 球 蛋 白 受 体 上 的 糙 膜 部 分 ，Gal 和 NGNA 转移 酶 位 糖 组 成 还 不 清楚 〔〈 据 Melcher, 1973), 于 平滑 膜 部 分 ,而 Ruc 转移 酶 位 于 细胞 膜 上 。 这 些 结果 也 支持 上 述 标记 糖分 子 参 人 动力 学 得 到 的 结论 (Melcher，1971，1973; Knopf, 1973), 至 于 糖 残 基 的 永 加 和 免疫 球 蛋 白 分 记过 程 的 控制 之 间 的 关系 ， 目 前 还 不 太 清 楚 。 糖 残 基 的 藻 加 可 能 调节 免疫 球 蛋白 分 子 在 细胞 内 的 转运 和 分 站， 或 者 这 可 能 仅仅 反映 内 质 网 不 同 部 分 糖 基 转 移 酶 的 分 布 。 有 实验 表明 2- 脱 氧 -D- 葡 萄 糖 能 抑制 新 合成 的 Ig Gi hk 链 从 粗糙 内 质 网 的 多 聚 核 糖 体 上 移动 到 晴 池 中 ， 以 及 IgG: 从 粗糙 膜 移 动 到 平滑 膜 , 但 不 AEM IEG Naw. GH 2- 脱 氧 -D- 葡 萄 糖 能 抑制 糖 残 基 加 入 IgG:。 因 此 , 糖 残 基 加 入 IgGi 似 乎 可 能 和 IgG, 从 粗糙 膜 到 平滑 膜 的 转运 有 关系 , 但 和 分 泌 无 关 (Melchers 和 Andersson， 1973) 。 然 而 ， 有 的 骨 仙 瘤 细胞 能 分 这 不 含 糖 的 工 链 (Parkhouse 和 Me- Ichers, 1971), 这 又 似乎 说 明 糖 的 参 人 和 免疫 球 蛋 白 肽 链 的 转运 和 分 认 无 关 。 总 之 , 这 还 是 一 个 需要 进一步 研究 的 问题 。 最 后 还 要 提 到 低 聚 糖 链 的 合成 ( 糖 残 基 的 加 落 ) 并 不 是 象 肽 链 合成 那样 受 遗 传 信息 严 格 控制 的 过 程 ， 因 而 免疫 球 蛋白 的 糖 含 量 可 能 有 变动 。 这 反映 在 血清 免疫 球 蛋 白糖 含量 呈现 的 微小 不 均一 性 。 例 如 ， 人 IEG Bhi AHAY Bence-Jones 蛋白 和 正常 IEGL 链 的 区 别 仅 在 于 唾 酸 含量 ， 每 一 条 工 链 只 含 一 个 旺 酸 ， 而 每 一 条 Bence-Jones 链 则 可 能 含 有 1 一 6 4(\ERR (Spiegelberg 等 ，1970) 。 质 膜 外 界 一 一 * GlcNAc 示 N- 乙 酰 -D- 氨 基 葡 荀 糖 ，Man 示 D-H ERI, Gal 示 D- 半 乳糖 ， Fuc 示 I- 岩 薄 糖 ，NGNA 示 N-=- 乙 醇 酰 -神经 氮 酸 。 2453 6 (=) 细胞 内 转运 和 分 泌 各 种 浆 细胞 合成 的 总 蛋白 量 中 ，5 一 40% 是 免疫 球 蛋白 ， 而 分 刻 的 蛋白 质 90 % BH 疫 球 蛋白 。 免 疫 球 蛋 白 合成 和 分 泌 的 动力 学 研究 发 现 SR 新 合成 的 免疫 球 蛋白 经 过 20 一 30 分 钟 的 迟滞 期 开始 分 沁 到 细胞 外 面 ，2 二 5 小 时 后 分 这 速度 便 达到 稳定 了 态 。 假 定 达 到 分 刻 稳 定 态 的 半 寿 期 (1 一 3) 小 时 ,可 以 代表 免疫 球 蛋 白 分 子 的 合成 和 分 刻 所 需 的 时 间 。 已 知 ; $e PEER SAGER BURR, JIE 1 一 2 分 钟 ;因此 绝 大 部 分 时 间 是 用 在 从 合成 地 点 转运 到 分 刻 地 点 和 分 a 分 泌 胞 泌 上 。 据 计算 一 个 浆 细胞 含有 1 x 10°—1 x 107 免 疫 球 人 2 sate AST, SUMED WU 50 一 200 分 子 《Me 上 i chers, 1973), 分 论 免 疫 球 蛋 白 的 浆 细 胞 具有 和 其 他 分 刻 蛋 白质 | | 的 细胞 同样 发 达 的 内 质 网 。 放 射 性 标记 氨基 酸 和 糖 的 参 人 动力 学 实验 、 亚 细胞 成 分 的 分 部 分 析 (Melch- 次 ay ers, 1971; Choi, 1971) 以 及 电子 显微镜 放射 自 显影 示 踪 (Zagury 等 ，1970) 等 研究 也 表明 免疫 球 BC in MOPARTS 由， 蛋白 的 分 刻 方 式 和 其 他 分 泌 蛋 白质 的 细胞 大 休止 是 相 芽 ? 脱 离 ,假定 此 步 邓 需 能 量 。 《〈ii) 和 膜 ” 似 的 。 新 合成 和 正在 装配 的 免疫 球 蛋白 分 子 ，- 众 粗糙 Re Gi 人 是 道生 呈 向 似 站 作 j 生 内 质 网 进入 到 平滑 内 质 网 ， 并 通过 “出 芽 ” 形成 囊 泡 5 将 IgG 分 泌 到 细胞 外 CHE Williamson, 这些 充满 装配 好 的 免疫 球 蛋白 分 子 的 襄 泡 ， 汇 集 在 细 lene 胞 的 高 尔 基体 区 域 ， 移 动 到 细胞 表面 和 细 胞 膜 融合 ; 并 可 能 通过 反 向 饮 液 作 用 ， 将 包含 的 免疫 球 蛋 白 分 刻 到 细胞 外 。 在 囊 泡 形成 和 移动 的 过 程 中 ， 在 和 膜 结合 的 糖 基 转 移 酶 的 催化 下 ， 免 疫 球 蛋 白 的 低 聚 糖 链 继续 加 长 (图 14-21) (Williamson，1973) 。 关于 免疫 球 蛋 白 转运 和 分 泌 的 机 制 还 不 甚 清楚 。 已 知 转运 过 程 的 某 一 步骤 ; (可 能 为 “出 芽 ”) 是 需要 能 量 的 ， 可 被 各 种 能 量 抑制 剂 或 低温 阻 过 。 不 过 ， 亚 胺 环 已 酮 (蛋白 合成 抑制 剂 ) 对 分 刻 并 无 不 利 影响 (图 14-22) (Baumel 和 Scharff, 1973), 抗体 合成 细胞 产生 的 免疫 球 蛋 白 或 者 参 人 细胞 膜 构造 ， 作 为 抗原 受 体 ;或 者 分 泌 到 细胞 外 ,作为 体液 搞 体 。 细 胞 如 何 控制 这 两 种 不 同 的 途径 ， 目 前 也 不 清楚 。 有 人 认为 可 能 主要 取决 于 正 链 ALL 链 在 膜 上 合成 的 地 点 。 免疫 球 蛋 白 肽 链 MRNA 的 非 转译 部 分 或 联 链 和 工 链 前 体 的 额外 肽 眉 可 能 和 粗糙 膜 一 定 部 位 有 选择 亲 合 力 ， 从 而 决定 它们 将 来 的 命运 (William- son, 1973). 、 免 疫 球 蛋 白 合成 的 调节 合成 免疫 球 蛋白 的 正常 细胞 中 ， 工 链 和 互 链 的 合成 是 平衡 的 。 在 某 些 病理 条 件 +4546 BING / 21% —> 37°C / J / / 4 CPM xX 10-° oe. 0 80 160 240 320 0 80. 160 240 320 分 钟 网 14-22“ 亚 胺 环 已 酮 和 低温 对 离 体 培养 的 小 鼠 MPC-11 骨 允 瘤 细胞 株 的 影响 。 MPC-11 (1x 10° 细胞 /毫升 ) 加 “C- 氮 基 酸 在 37°C 保温 ， 并 加 过 量 非 标记 氨基 酸 “ 赶 出 ” 《〈A》 赶 出 ?后 2 分 钟 ? 加 亚 胺 环 已 酮 (300 微克 /毫升 )。 〈B)“ 赶 出 ?后 3 分 钟 ， 取 出 一 部 分 细胞 移 至 低温 (21°C), 200 分 钟 时 再 从 低温 (21sC7) 保 温 的 细胞 中 取 一 部 分 细胞 移 回 到 常温 637) 比较 几 种 情形 下 ,可 沉 淀 的 分 这 的 fe 的 放射 性 ( 据 Baumal 和 Scharff, 1973), 下 ， 肽 链 合成 的 调控 机 制 受 到 破坏 ， 结 果 产 生 过 量 游 离 的 轻 链 分 刻 到 血 和 尿 内 ， 即 所 谓 的 Bence-Jones HH. 重 链 和 轻 链 合成 的 协调 是 如 何 维持 的 呢 ? 理论 上 这 种 调控 机 制 可 能 作用 于 不 同 的 水 平 , 重 链 和 轻 链 基因 激活 的 数量 ， 相 对 的 转录 或 转译 速度 和 效率 等 。 Ait, BRR mRNA 的 转译 直接 受 细胞 内 LLAMA, 因此 在 正常 条 件 下 这 种 调控 很 可 能 主要 发 生 在 转译 水 平 。 (—) 肽 链 合成 速度 的 调控 Stevens 和 Williamson (1973) 发 现 5563 浆 细 胞 六 的 重 链 合 成 存在 转录 水 平 的 调 OLE], AIA 吾 :L: 库 增高 时 ， 五 链 合成 便 专 一 地 降低 。 将 5563 瘤 细 胞 置 于 25”C 低 ii Rin, HL, Awe SEM, MH EM LENHART EMD whee CHAT 37°C IT AY 40—50%) , RAIA EER FLL. SSE 37"C 时 , 工 链 合成 很 快 就 REAEBRE, MHBAKAMA THM, BA 60 分 钟 才 能 恢复 到 正常 的 合 成 速度 (图 14-23) 。 反之 ， 若 用 亚 胺 环 已 酮 抑制 蛋白 质 合成 而 不 影响 分 泌 ， 使 HL: 库 耗 Jah, HOG RE I. AIA, 细胞 内 BLL, 库 的 大 小 可 以 反馈 调节 HSER 合成 速度 (Stevens 和 Williamson, 1973b,c), AALH—-H RE HH mRNA 上 存 HLL, —WaG A, FFA HLL, iil A 链 合成 速度 可 能 是 人 靠 HL, A HH MRNAIA 的 专 一 的 祖 互 作用 来 实现 的 。 虽 然 这 种 相互 作用 是 很 弱 的 ， 但 其 专 一 性 已 得 到 可 用 这 一 INER AME H He MRNA 的 事实 所 证 实 ( 见 444 页 ) 。 H,L,71 H # mRNA 在 细胞 内 相互 作用 的 方式 还 不 清楚 。 互 链 mRNA 的 转译 是 在 2455 。 ’ H # mRNA 35S-cpm X 1073 新 合成 联 链 14-24 H,L, MH mRNA 在 体内 相互 作用 的 一 一 一 ORR. —TREREGDT BAM ARH ah (37°C) ZABANIKHODLA. Ht CHAE mRNA 在 膜 的 一 侧 直接 接触 ;而 抗原 结合 位 点 则 暴露 在 膜 的 14-23 76 25°C 保温 细胞 内 HL, 增高 后 又 回 到 37"C 时 。， 另 一 侧 。 互 L， 和 五 链 mRNA 的 结合 点 假定 是 靠 HEMLBARHIRE. AHR AIA 25°C 保温 90 分 钟 。 RHE mRNA 转译 的 起 始点 (5 a) Stevens 和 然后 将 温度 升 高 到 37°C, 每 隔 15. 分 钟 取 样品 ;和 ”SS- 甲 硫 氨 Williamson, 1974), Be (50Ci/ml) Ri, WS anh Aa HE IRI BE Hy 5563 总 蛋白 。 样 品 经 过 还 原 > 烷 基 化 。 ERA MR aR Bk EM H 链 和 L 链 的 放射 性 ( 据 Stevens 和 Williamson, 1974), 和 膜 结合 的 多 聚 核糖 体 上 进行 的 ， 新 产生 的 互 链 释 放 到 内 质 网 的 晴 池 中 ， 这 些 互 链 因 而 和 位 于 多 聚 核糖 体 上 的 互 链 mRNA 是 处 于 膜 的 两 侧 的 ， 或 者 说 ， 是 被 膜 隔 开 的 。 此 ， 假 定 当 细胞 内 BLL, 库 增 高 时 ， 一 部 分 孔 :L: 的 Fec 部 分 便 可 能 穿 过 膜 层 和 H 链 mRNA 的 起 始 端 结合 ， 从 而 抑制 再 链 的 合成 (图 14-24) (Stevens 和 ”Williamson， 1974), Hz, HLA MRNA 的 相互 作用 提供 了 一 个 在 转译 水 平反 馈 调 控 的 模型 。 除 此 以 外 ， 在 DNA 水 平 、 转 录 水 平 、.mRNA 加 工 和 转运 水 平 是 否 也 存在 调控 机 制 , 这 仍然 是 需要 进一步 研究 的 地 方 。 (=) 免疫 球 蛋 白 合成 的 失控 和 分 子 病 许多 有 遗传 缺陷 的 浆 细 胞 瘤 株 ， 其 结构 基因 发 生 缺 失 或 突变 ,或 者 基因 表现 不 平衡 ， 结果 导致 免疫 球 蛋白 分 子 装配 的 异常 。 这 些 天 然 产 生 的 免疫 系统 的 分 子 病 ， 为 了 解 免疫 球 蛋 白 合 成 的 调控 提供 了 很 好 的 研究 材料 。 在 开 链 和 互 链 合成 不 平衡 的 情形 下 ， 总 是 倾向 于 工 : 开 的 比值 增加 ， 旦 现 从 工 链 略 占 优势 到 A 链 的 合成 完全 被 抑制 的 一 系列 中 间 状 态 (Potter, 1972), 4L HAM 占 优势 或 者 只 合成 工 链 时 ,细胞 就 可 能 大 量 分 让 工 链 ， 并 且 在 血液 和 尿 内 出 现 Bence- Jones 和 蛋白。 - 虽然 互 链 合成 被 抑制 的 情形 较 常 见 ， 而 工 链 合成 被 抑制 的 情形 却 极其 罕见 。 只 是 在 人 类 的 “ 重 链 病 ? 才 见 到 工 链 的 明显 缺少 。 在 这 些 “ 重 链 病 ” 病 人 的 尿 中 ， 出现 结 构 上 有 缺 损 的 游离 的 重 链 (xc\.7Y 或 上 4 链 ) 。 对 这 些 异 常 的 互 链 的 多 肽 顺序 分 析 发 现 ,它们 的 内 部 结 。456 。 Ce wei es 构 往 往 有 同时 包括 一 大 段 V 区 和 相 邻 的 C 区 的 缺失 (Frangione 和 Milstein, 1969; Terry 和 Ohms，i1970) 。 这 种 缺失 有 力 地 提示 在 这 些 发 生 突变 的 细胞 内 V、C 基因 可 能 是 整合 为 一 体 的 (参看 下 一 章 ，497 页 ) 。 ; 由 于 重 链 的 缺损 ， 也 可 能 造成 免疫 球 蛋白 分 子 装配 的 异常 。 例 如 ， 有 的 骨 侯 瘤 细 胞 ADWHL 半分 子 ， 而 不 能 装配 成 完全 的 HL, 分 子 (Mushinski，1971)3; 另 一 些 缺 损 的 & 链 ， 则 不 能 和 任何 工 链 结合 (Seligman 等 ，1969) 。 在 淋巴 球 增生 .全身 性 红斑 狼疮 等 病人 ，IgEM 聚合 受阻 ， 导致 以 7S IEMSs 亚 基 形 式 分 刻 到 血液 中 (Solomen 和 McLaughlin，1970) 。 聚 合作 用 被 阻 遏 的 原因 以 及 和 有 关 ”疾病 的 关系 也 都 不 清楚 。 五 、 基 因 表 现 的 调控 从 根本 上 讲 ， 各 种 类 型 的 免疫 反应 都 依赖 于 淋巴 细胞 内 编码 免疫 球 蛋白 的 结构 基因 的 选择 性 表现 。 肿 瘤 免 疫 、 移 植 免疫 以 及 过 敏 性 疾病 等 医学 实践 都 希望 产生 有 利 的 , 而 避 免 不 利 的 抗体 和 免疫 反应 ,也 就 是 希望 能 够 定向 地 控制 淋巴 细胞 的 基因 表现 。 因 此 ,淋巴 细胞 基因 表现 调控 的 研究 ， 在 实践 上 潜在 的 重要 意义 是 显而易见 的 。 目 前 ， 对 于 淋巴 细 胞 基因 表现 的 调控 的 分 子 机 制 所 知 甚 少 , 这 里 只 能 就 几 方面 现 有 的 知识 , 作 一 个 简略 的 介 绍 。 目 的 是 把 问题 提出 来 。 (—) 细胞 周期 内 基因 表现 的 变化 对 于 一 株连 续 培养 的 人 双 倍 体 淋巴 细胞 诱导 同步 分 裂 ， 再 研究 细胞 周期 不 同 阶段 的 免疫 球 蛋 白 合成 量 ， 实 验 结果 发 现在 晚 G1 期 和 早 S 期 的 合成 量 最 高 (图 14-25) (Huang 和 Moore, 1969). HTH #ML# mRNA WF 命 没 有 测定 ， 还 不 能 确定 免疫 球 蛋 白 合成 量 的 这 种 周期 性 变化 是 在 转录 或 转译 水 平 调节 的 。 另 一 方面 ， 一 种 小 鼠 骨髓 瘤 细胞 (来 源 于 MOPC 21 的 P3 细胞 株 ) 其 染色 体 是 异 倍 体 ， 在 细胞 周期 中 sH- 赖 氨 酸 参 人 免疫 球 蛋白 的 速度 却 几 乎 是 恒定 不 变 的 ， 不 呈现 周期 性 变化 (Cowan 和 Milstein,1972) 。 有 人 曾 证 明 中 国 田 鼠 双 倍 体 细 dab 胞 的 酶 合成 量 呈 现 周期 性 变化 ， 而 异 售 体 的 田鼠 期 oo tee coeoeoomm G3 细 胞 株 则 不 呈现 这 种 变化 (Klevecz, 1969), 〈 据 Finegold 等 ，1968)。 因此 ， 可 以 推测 上 述 两 株 细胞 的 区 别 或 许可 能 是 双 倍 体 和 蜡 倍 休 细胞 的 一 种 普遍 区 别 的 反映 。 值得 指出 的 ， 正 常 分 沁 抗 体 的 浆 细胞 是 可 能 停顿 在 G1 期 的 ， 不 分 裂 的 终 示 细胞， 因而 能 保证 抗体 的 旺盛 合成 。 免疫 球 蛋 白 合成 © 457 。 (=) B 淋巴 球 发 育 过 程 中 基因 表现 的 改变 已 发 现 的 编码 免疫 球 蛋白 的 结构 基因 (V,C 基因 ) 的 数目 正在 不 断 增加 。 以 人 类 重 链 的 C 基因 为 例 ， 至 少 有 10 种 :Cu Cur, Crs Cres Crs» Cras Cars Cars Cor C. (BA 下 一 章 ,482 页 ) 。B 淋 巴 球 在 发 育 过 程 中 和 与 抗原 接触 后 的 扩 增 过 程 中 , 重 链 C 基因 按 顺 序 地 和 选择 地 进行 转录 。 根据 Cooper 等 人 的 研究 结果 ，B 淋巴 球 在 发 育 和 与 抗原 接触 后 的 扩 增 过 程 中 的 基 因 表 现 可 分 为 三 个 阶段 : 1) 和 抗原 接触 前 的 分 化 。 来 源 于 卵黄 襄 的 造血 干细胞 , BARR RCSA) 或 相当 于 法 氏 圳 的 器 官 〈 哺 乳 类 胎儿 肝脏 ) (Owen 2, 1974), 受到 该 处 诱导 因子 的 影响 便 开 始 分 化 为 也 细胞 。 同 时 ，C。 基因 被 激活 ， 以 相当 低 的 速度 合成 IEM， 加 人 到 细胞 表面 ， 作为 抗原 受 体 ; 2) 依赖 抗原 的 分 化 。B 细胞 表面 的 抗原 受 体 和 专 一 抗原 结合 ， 刺激 B 细胞 进一步 的 增生 、 分 化 。B 细胞 合成 IEM 的 量 增 加 ， 并 分 让 到 细胞 外 ; 同时 ， 其 他 C,, Co A 抗原 推动 的 对 细胞 株 的 选择 诱导 物 细胞 分 化 时 期 免疫 球 蛋白 基因 表现 ER BAF cxnsonnan =| (nmi, ej IgM ee Vii 细胞 表面 IgM, IgA, IgG caer ee IgM ozs ae IgG FA 14-26 (A) B 细胞 株 各 发 育 阶段 的 理论 模型 ( 据 Cooper F, 1972), (B) B 细 胞 分 化 过 程 中 免疫 球 蛋白 基因 表现 的 理论 模型 HSC， 造 血 干细胞 ，PC， 浆 细胞 〈 据 Warner 和 Harris, 1973), ——_ —- - -_”.. — 等 基因 也 可 能 有 轻 度 的 表现 ， 结 果 B 细胞 表面 可 能 出 现 其 他 种 类 的 免疫 球 蛋 白 受 体 ; 3) 进一步 在 T. 辅 助 细胞 (及 巨 噬 细 胞 ) 的 影响 下 ，B 细胞 之 C,，C。， RC, 等 基因 中 ， 只 有 一 种 被 选择 地 加 强 表现 ， 产 生 相 应 的 IgG，IgA， 或 IgM 等 抗体 , 结果 最 后 转 化 为 只 分 泌 一 类 抗体 的 浆 细 胞 (图 14-26) (Warner 和 Harris 1973; Cooper, 1972; 1976). 以 上 这 些 看 法 ， 最 先是 根据 鸟 类 上 的 实验 得 出 的 。 哺 乳 类 B 淋巴 球 分 化 和 扩 增 过 程 ， h, C,, CAC 基因 同样 是 按 顺序 地 转录 的 。 这 方面 的 主要 证 据 是 ， 初 生 期 小 鼠 注射 抗 么 链 抗体 后 ， 所 有 各 种 成 熟 阶段 的 B 细胞 都 被 抑制 (Lawton 和 Cooper，1974)。 假 设 基因 表现 的 转换 是 按 IEM->IgG->IgA 顺序 进行 ,注射 抗 > 抗体 则 应 抑制 IgG 和 IgA 产生 ， 而 不 抑制 IgM。 可 是 迄今 只 有 一 个 实验 得 到 这 样 的 结果 。 因 此 ， 还 需要 进一步 的 研究 ， 才 能 断定 B 细胞 基因 表现 是 按 上 述 顺 序 进行 的 ， 还 是 按 另 一 种 可 能 的 顺序 IgE M 一 IgG 一 IgA 进行 的 。 B 细胞 株 的 发 育 和 扩 增 过 程 中 ， 为 了 保持 抗体 对 抗原 的 结合 专 一 性 , 在 C 基因 按 顺 序 转 录 的 同时 ， 还 必须 只 专 录 一 种 V 基因 ( 即 产生 一 种 个 体型 决定 簇 的 抗体 ) 。 这 方面 最 有 力 的 证 据 是 发 现 人 类 同一 骨 骨 瘤 (Ti) 分 泌 两 种 免疫 球 蛋白 (IEM 和 IgG) ， 然 而 它们 却 具 有 相同 的 个 体型 决定 簇 。 并 且 7. 链 和 产 链 的 V 区 有 相同 的 排列 顺序 (Wang 等 ， 1970) 。 此 外 ， 草 光 妈 标记 抗体 也 显示 出 家 免 淋 巴 细胞 的 C, 和 C。 基因 在 同一 细胞 上 可 能 同时 表现 (Pernis 等 ,1971) 。 这 些 证 据 有 力 地 支持 在 B 细胞 株 发 育 的 一 定时 期 , B 细 了 胞 可 以 从 合成 一 类 免疫 球 蛋白 转变 为 合成 另 一 类 免疫 球 蛋白 ， 同 时 还 保持 转录 相同 的 V ER. 同样 地 ， 可 以 设想 编码 gD, IEW CHA (GC, C.) 在 B 细胞 分 化 和 扩 增 过 程 中 是 按 同 样 的 方式 激活 的 。 近来 ， 在 脐带 血 内 的 淋巴 球 表面 同时 测 出 IEM 和 IgED (Rowe 等 ，1973)， 这 提示 Cs 基因 的 激活 也 发 生得 很 早 。 B 淋巴 球 分 化 过 程 中 ,法 氏 圳 (或 相当 的 器 官 ) 内 诱导 因子 的 性 质 ， 各 类 淋巴 球 〈 包 括 亚 群 ) 间 相互 作用 的 本 质 ， 以 及 C 基因 表现 的 更 递 的 机 制 等 问题 ， 都 还 不 清楚 ， 需 要 在 分 子 水 平 作 深入 的 研究 。 (=) 杂交 细胞 的 基因 表现 近年 来 ， 用 病毒 引起 细胞 融合 形成 杂交 细胞 和 异 核 体 的 方法 研究 高 等 动物 细胞 的 基 因 表 现 和 进行 遗传 分 析 ， 取 得 很 大 的 成 功 。 Periman (1970) 最 先 发 现 一 种 产生 免疫 球 蛋 白 的 小 鼠 骨 骨 瘤 细胞 (MOPC 315) 和 不 产生 免疫 球 蛋 白 的 工 细胞 (C11D WA) 融合 后 得 到 的 杂交 细胞 ， 能 继续 产生 和 分 谱 少量 免疫 球 蛋 白 。 不 久 ， 有 人 从 BALB/c 骨 骨 瘤 细胞 和 C57B1/6n 淋巴 瘤 细胞 的 杂交 细胞 株 ， 分 离 出 13 个 细胞 株 ， 其 中 11 个 细胞 株 只 合成 游离 的 上 链 ， 另 2 个 细胞 株 能 合 成 和 BALB /c 相同 类 型 的 IgG 和 游离 的 < 链 。 后 2 个 细胞 株 的 染色 体 数目 要 比 那 些 只 合成 游离 的 上 链 的 细胞 株 偏 高 (Mohit，1971) 。 对 于 一 个 杂 合子 动物 ， 一 个 免疫 球 蛋白 分 子 中 ， 两 条 轻 链 和 两 条 重 链 ， 各 自 具 有 相 同 的 同族 腊 型 决定 簇 ， 而 不 会 出 现 杂 种 分 子 。 这 表明 一 个 抗体 形成 细胞 中 ， 重 链 或 轻 链 。459 。 基因 座 的 许多 等 位 基因 中 ， 只 有 一 个 被 选择 地 激活 。 这 种 等 位 基因 互 斥 现象 (Allelic exclusion) 是 抗体 合成 的 基因 表现 的 一 个 特点 。 细胞 杂交 方法 也 可 以 用 来 分 析 此 一 亲 题 。 有 人 将 产生 免疫 球 蛋白 的 两 个 异种 的 细胞 株 (小 鼠 AdJPC5, 产生 IgG 和 游离 上 链 ; 大 鼠 S 210， 产 生 游离 上 链 ) 进行 融合 ,研究 杂交 细胞 之 V、C 基因 的 表现 ， 结 果 发 现 这些 细 胞 能 分 这 双亲 类 型 的 免疫 球 蛋 白 。 同 时 ， 还 出 现 免疫 球 蛋白 的 杂种 分 子 。 这 玫 明 在 同一 个 杂交 细胞 内 ， 双 亲 的 互 链 和 工 链 的 基因 都 能 表现 出 来 (Cotton 和 Milste- in，1973) 。 后 来 ， 用 同一 物种 (小 鼠 ) 的 两 种 骨髓 瘤 的 杂交 细胞 也 证 实 了 上 述 结果 〈(K5- hler 和 Milstein，1975) 。 因 此 ， 这 些 结果 表明 在 杂交 细胞 中 , 一 种 轻 链 (或 重 链 ) 的 表 现 并 不 妨碍 另 一 种 轻 链 (或 重 链 ) 的 表现 。 与 上 述 相似 ， 从 人 淋巴 细胞 和 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 得 到 的 杂交 细胞 , 能 合成 人 y、c 重 链 和 轻 链 ， 以 及 小 鼠 重 链 和 轻 链 ， 并 且 这 些 链 还 能 装配 成 杂交 分 子 (Sechwaber 和 Cohen，1974) 。 这 些 结果 都 表明 在 杂交 细胞 内 ，Ig 链 的 合成 不 受 等 位 基因 互 斥 的 限制 。 对 这 些 似 乎 例外 的 现象 ， 最 简单 的 解释 是 V 和 C 基 因 表现 的 限制 一 一 等 位 基因 互 斥 现象 ， 是 由 于 在 胚胎 发 育 早期 ， 亲 代 细 胞 中 的 V、C 基 因 通过 移 位 机 制 ， 早 已 经 整合 为 一 个 基因 了 (参看 下 一 章 , 485 页 ) 。 B 细胞 当 被 抗原 激 | 活 时 ， 只 有 整合 的 V-C 基因 能 表现 ， 而 其 他 未 整合 的 基因 (包括 另 一 单元 染色 体 ) 则 不 能 表现 。 于 是 ， 便 产生 等 位 基因 互 斥 现象 。 至 于 在 杂交 细胞 中 ,来 自 两 个 亲 代 细 胞 的 ,已 整合 的 V-C 基因 均 能 独立 地 表现 出 来 。 换 名 话说， 对 一 个 细胞 内 等 位 基因 表现 的 限制 发 生 在 V-C 基因 整合 阶段 ; 已 整合 的 V-C 基因 则 能 各 自 独 立地 表现 ， 不 论 有 无 其 他 类 似 的 或 同型 的 已 整合 的 V-C ERE (Cotton 和 Milstein，1973) 。 | 细胞 杂交 还 提供 了 通过 体外 连续 培养 的 细胞 制造 指定 专 一 性 的 抗体 的 可 能 性 。 KO | hler 和 Milstein (1975) 将 经 过 羊 红血球 免疫 的 小 鼠 脾 脏 细胞 和 同一 品系 小 鼠 骨 骨 瘤 细胞 融合 ， 得 到 一 个 能 连续 培养 和 分 泌 抗 羊 红 血球 抗体 的 细胞 株 。 顺 便 提 及 ， 利 用 病毒 转化 的 抗体 形成 细胞 也 可 能 达到 同样 的 目的 。 用 SV 40 病毒 感染 取 自 经 过 III 型 肺炎 球 苗 疫 苗 高 度 免疫 的 家 免 脾脏 的 离休 培养 的 脾脏 细胞 。 感 染 114 天 后 ， 从 转化 的 细胞 中 分 离 出 一 个 细胞 株 ， 能 大 量 产生 抗 肺炎 球菌 S-3 抗原 的 抗体 Collins 等 ，1974; Stros- berg，1974) 。 理论 上 ， 这 些 方法 同样 可 以 应 用 到 培养 的 人 类 细胞 。 利 用 细胞 杂交 或 病 毒 转化 的 人 淋巴 细胞 来 得 到 能 产生 任何 指定 专 一 性 抗体 的 细胞 株 ， 并 通过 大 量 培养 来 提 供 在 医学 上 有 应 用 价值 的 专 一 的 人 抗体 。 因 此 ， 这 些 理论 研究 成 果 在 医学 和 工业 上 应 用 的 潜力 是 值得 注意 的 。 Rage: | 最 近 ， 有 人 报告 从 经 过 破 伤风 类 毒素 高 度 免疫 的 人 体 取得 的 周 沿 淋巴 细胞 ， 离 体 条 | 件 下 用 Epstein-Barr 病毒 感染 后 ， 分 离 出 44 个 能 分 这 免疫 球 蛋白 的 淋巴 母 细胞 株 。 其 | 中 7 株 细胞 连续 培养 6 个 月 以 上 ， 并 能 分 沁 专 一 的 抗 破 伤风 类 毒素 抗体 。 这 说 明 已 有 实 | 际 可 能 利用 这 种 方法 来 生产 指定 专 一 性 的 、 单 株 的 人 抗体 (Zurawski 等 ，1978) 。 同 样 | 地 ,还 有 人 试图 用 体 细胞 杂交 来 产生 专 一 的 抗 人 黑色 素 瘤 抗体 (Koprowski 4, 1978) 。 | 六 、 % ¥ RNA i 免疫 RNA (Immune RNA) 是 指 从 巨 噬 细 胞 或 淋巴 组 织 提 取 的 RNA， 它 能 将 细 胞 的 免疫 专 一 性 ( 体 流 免 疲 或 细胞 免疫 ) 传递 给 其 他 的 淋巴 细胞 。 这 方面 的 研究 起 始 于 从 。 460 + Brel See RNA 部 分 (RNA- 抗 原 片 段 复合 物 ) 能 诱导 专 一 的 抗体 反 应 (Gar- vey 和 Campbell, 1956). 他 们 观察 到 免疫 动物 肝脏 内 存在 的 RNA- 抗 原 复 合 物 ， 能 保持 很 强 的 免疫 原 性 。 进 一 步 的 研究 扩大 到 从 淋巴 组 织 提取 的 RNA， 并 发 现 它 能 传 递 抗体 专 一 性 ， 因 此 称 为 信息 RNA (Informational RNA， 简 称 iRNA)。 早期 文献 里 提 到 的 免疫 RNA 实际 上 是 把 含义 不 同 的 两 类 免疫 活性 物质 RNA- 抗 原 复 合 物 和 信 息 RNA (后 来 证 明 即 为 mRNA) 混 奖 在 一 起 了 。 (一 ) 巨 吹 细 胞 的 RNA- 抗 原 复合 物 和 iRNA 巨 唉 细胞 在 对 许多 种 (不 是 全 部 ) 抗原 的 免疫 反应 中 起 着 重要 作用 。 但 是 到 底 如 何 起 作用 , 还 是 一 个 争论 未 决 的 问题 。 最 可 能 的 机 制 是 巨 噬 细 胞 能 起 集中 抗原 的 作用 , 把 基本 上 未 改变 的 大 分 子 抗原 汇集 在 细胞 表面 ， 提 供 淋 巴 球 和 抗原 之 间 有 效 地 相互 作用 的 机 会 (参看 第 十 三 章 ,401 页 ) 。 另 一 种 可 能 的 机 制 是 巨 吧 细 胞 能 “加 工 ? 抗 原 ， 形 成 一 种 代谢 上 稳定 的 RNA- 抗 原 ( 或 抗原 片段 ) 复合 物 ， 传 递 给 淋巴 细胞 ， 引 起 专 一 的 抗体 反应 。 当 然 ， 这 两 种 机 制 并 不 是 互相 排斥 的 。 这 方面 最 早 的 证 据 是 发 现 从 腹腔 疾 出 液 细胞 (主要 是 巨 吻 细 胞 ) 中 提取 的 富 含 RNA 部 分 能 传递 抗体 专 一 性 。 已 知 对 T2 鸣 菌 体 的 免疫 反应 需要 巨 噬 细 胞 参加 。 Fishman (1961) 最 先 发 现 ，T2 鸣 菌 体 和 巨 鸣 细 胞 一 起 保温 后 得 到 的 细胞 裂解 液 能 诱导 淋巴 结 细 胞 产生 专 一 的 抗 T2 抗体 。 如 果 把 和 了 T2 叹 菌 体 保 温 过 的 巨 噬 细 胞 的 RNA 分 离 出 来 ， 这 种 富 含 RNA 的 制品 也 能 诱导 淋巴 细胞 产生 专 一 的 抗体 (Fishman 和 Adler, 1963). 虽然 最 初 曾经 设想 RNA 是 专 一 地 传递 免疫 信息 的 有 效 分 子 ， 后 来 发 现 这 些 RNA 样 品 中 总 含有 抗原 片 贫 ， 于 是 就 使 问题 模糊 起 来 了 。 进 一 步 的 分 析 才 发 现 和 抗原 作用 过 的 已 MAHA RNA 产物 ， 实 际 上 包含 着 两 类 免疫 活性 物质 ，RNA- 抗 原 复 合 物 Mi-RNA, 它们 可 被 BSA- 硅 菠 土 柱 分 离开 来 ， 前 者 位 于 峰 III (23S) ， 后 者 位 于 峰 1 (~10—12S) (Fishman 和 Adler, 1967) 。 RNA- 抗 原 复合 物 和 iRNA 在 性 质 上 还 存在 其 他 方面 的 Kal, 首先 ，iRNA 本 身 的 形成 依赖 对 放 线 菌 素 D 敏感 的 系统 。 巨 鸣 细 胞 和 抗原 接触 前 ， 先 加 放 线 菌 素 D 便 能 抑制 IRNA 的 产生 ， 但 并 不 能 抑制 RNA- 抗 原 复 合 物 形 成 。 其 次 ， 诱 导 训 NA 只 需要 很 少量 的 抗原 (1 MEA BURL /1000 ERR), ， 而 产生 有 效 量 的 RNA- 抗 原 复 合 物 ， 则 需要 相当 大 量 的 抗原 (100 BABU /1000 BARI). 尤其 重要 的 ，RNA- 抗 原 复合 物 所 作用 的 靶 细 胞 是 具有 对 该 抗原 的 专 一 受 体 的 淋巴 球 。 当 用 抗原 亲 合 吸附 法 去 除 这 些 具 有 专 一 抗原 受 体 的 细胞 后 ， 剩 余下 来 的 淋巴 球 仍然 能 以 同样 的 程度 和 iRNA 起 反应 。 总 之 ， 这 些 实验 说 明 RNA- 抗 原 复 合 物 和 iRNA 的 产生 和 对 狠 细 胞 的 作用 方式 都 是 不 同 的 。 并 且 ， 还 有 证 据 提 示 它 们 是 腹腔 次 出 液 细 胞 中 不 同 的 细 胞 群 产 生 的 〈Fishman 和 Adler，1976) 。 实 际 上 , 它们 是 在 来 源 . 产 生 和 作用 方式 上 都 不 相同 的 两 类 免疫 活性 物质 。RNA- 抗 原 复 合 物 在 代谢 上 很 稳定 ,免疫 原 性 增强 20 一 200 倍 ， 因 而 可 能 起 着 所 谓 “ 超 抗原 ” (“Super-Antigin”) 的 作用 (Goodman, 1972; Got- tlieb 和 Schwartz, 1972), 5—AM, iRNA 则 可 能 把 专 一 的 免疫 信息 传递 到 原来 缺 少 专 一 的 抗原 受 体 的 淋巴 细胞 ， 起 扩大 “定型 细胞 ?数量 的 作用 。 不 过 ， 应 当 指 出 要 严格 地 证 明 RNA 中 绝对 没有 丝毫 的 抗原 夹杂 ， 仍 然 是 非常 困难 的 。 。461 。 Fishman 实验 室 曾 企图 使 用 一 种 含 砷 的 抗原 (ARS-NAT) 来 解决 这 一 难题 。 他 们 用 原子 吸收 光谱 法 证 明 URNA 中 ARS-NAT 抗原 含量 二 0.0000065% 时 ， 仍 然 能 将 产生 抗 ARS-NAT 免疫 反应 的 能 力 传 递 给 适当 的 细胞 (Schlagen 等 ，1974) 。 但 是 ， 应 当 注意 到 ， 在 这 种 RNA 制品 中 并 不 是 所 有 的 分 子 都 是 ARS-NAT 抗原 专 一 的 iRNA， 很 可 能 其 中 只 有 少数 RNA 分 子 才 是 抗原 专 一 的 。 因此 ， 据 推算 即使 残存 的 极其 微量 的 ARS-NAT 抗原 仍然 可 能 以 近乎 1:1 比 例 和 专 一 的 iRNA 结合 (Crouch，1976)。 由 此 可 见 ， 要 用 这 种 方法 来 证 明 ii 也 NA 中 绝对 没有 抗原 夹杂 是 极其 困难 的 (Adler, 1972). (=) 证 明 iRNA 之 信使 RNA 功能 的 实验 对 免疫 RNA 概念 的 最 有 力 的 支持 是 基于 带 有 遗传 标记 的 免疫 专 一 性 传递 实验 。 用 羊 红 血球 免疫 轻 链 的 遗传 标记 为 纯 合 子 (bist b5) 的 家 兔 ， 从 其 淋巴 结 或 腹腔 闯 出 液 细 胞 提取 出 RNA， 处 理 另 一 种 遗传 标记 为 纯 合 子 的 家 免 的 正常 淋巴 球 ， 或 体内 注射 ,结果 产生 的 抗体 一 部 分 表现 出 原来 的 抗原 结合 专 一 性 ， 并 且 具 有 和 施主 轻 链 相 同 的 遗传 标记 (Bell 和 Dray, 1969; 1972) 也 就 是 说 ， 从 A 同 种 异型 动物 的 淋巴 组 织 提取 的 记 NA 能 使 B 同 种 异型 的 淋巴 细胞 产生 A 同 种 异型 的 抗体 。 该 文 作 者 认为 既然 很 难 设想 iRNA 中 夹杂 的 抗原 本 身 能 诱发 细胞 表现 另 一 种 遗传 标记 ， 更 为 可 能 的 解释 是 iRNA 能 专 一 地 传递 免疫 信息 (包括 同 种 异型 和 抗原 结合 专 一 性 ) ， 也 就 是 说 ，iRNA 很 可 能 起 免 疫 球 蛋白 的 信使 RNA 的 作用 。 不 过 ， 也 有 人 对 此 解释 提出 异议 ， 认 为 这 一 实验 结果 可 能 是 由 于 控制 同 种 异型 的 调节 基因 表达 异常 引起 的 。 因为 普 经 有 人 观察 到 基因 型 为 (alas /b'?b?) 的 家 免 在 一 定 的 免疫 条 件 下 ， 产 生 的 抗体 呈现 原 寄 主动 物 从 未 有 过 的 遗传 标 记 (a"b“") (参看 第 十 五 章 479 页 ) 。 过 后 不 久 ， 利 用 从 骼 细胞 瘤 提 取 的 RNA 进行 的 实验 ,证 明了 所 谓 iRNA 很 可 能 就 相当 于 免疫 球 蛋白 的 mRNA。 从 通 细 胞 瘤 提取 的 iRNA 能 使 正常 淋巴 细胞 产生 和 施 主 细胞 有 相同 的 个 体型 专 一 性 的 免疫 球 蛋 白 (Bhoopaiam 等 ，1972; Giacomoni 等 ， 1974) 。 并 且 ， 这 种 iRNA 对 细胞 的 转化 作用 能 被 亚 胺 环 已 酮 和 味 叭 霉 素 等 蛋白 合成 抑 制剂 抑制 ， 而 不 被 放 线 菌 素 了 或 利 福 平抑 制 。 同 时 ， 这 种 iRNA 的 一 般 理 化 特性 [如 能 AIBR (dT) -F#AAA, MMAASIUA MRNA 相似 。 最 重要 的 证 据 是 ， 从 被 T2 噬菌体 免疫 的 家 免 腹 腔 液 渗 出 细胞 提取 的 让 NA， 在 小 鼠 工 细胞 无 细胞 蛋白 合成 系统 中 ,能 合成 专 一 地 中 和 了 T2 喉 菌 体 的 IgM 抗体 ， 并 带 有 和 施主 相同 的 遗传 标记 (Bilello 等 ，1975; 1976) 。 这 一 实验 事实 显然 很 难 用 调节 基因 异常 表现 来 解释 。 总 之 ,所 有 这 些 事实 都 证 明 iRNA 相当 于 mRNA， 并 含有 合成 专 一 的 IEM 抗体 所 需 的 全 部 信息 。 此 外 ， 利用 放射 性 同位 素 标记 的 iRNA 处 理 离 体 培养 的 淋巴 细胞 ， 还 证 明 iRNA 诱 导 抗 体 合 成 前 ， 确 实 能 进入 细胞 。 并且，iRNA 对 细胞 的 参 人 量 比 对 照 RNA (从 未 免疫 动物 提取 的 ) 要 高 两 倍 ，10s 脾 脏 细胞 内 有 6 x 10* 道 尔 顿 RNA 参 人 (Slomski 和 Latos, 1977; Wang 等 ，1973) 。 已 知 散 细胞 瘤 动物 的 淋巴 球 具 有 特殊 的 表面 免疫 球 蛋白 ,并 且 对 抗原 的 反应 能 力 大 大 减低 一 一 即 处 于 免疫 抑制 状态 。 从 一 种 允 细 胞 瘤 (LPC-1) 提取 的 iRNA 能 将 这 种 免 疫 抑制 状态 转移 到 正常 动物 ;反之 ，iRNA 也 可 使 处 于 免疫 抑制 状态 的 细胞 逆转 〈Ya- . 462 . ”_- eer mm 4 Kulis 等 ，1973; Bhoopalam 等 ，1976a,b) 。 这 些 结果 支持 这 样 的 假说 , 髓 细胞 瘤 的 免 疫 抑 制 状 态 可 能 是 由 于 瘤 细 胞 释 放 到 血浆 中 的 iRNA 使 其 他 正常 也 淋巴 球 表面 特性 发 生 转 化 的 结果 。 实 际 上 ， 在 通 细 胞 瘤 动 物 的 血浆 内 , 曾 发 现 一 些 颗 粒 , 能 把 正常 淋巴 球 转 化 为 具有 和 瘤 细 胞 相同 的 表面 免疫 球 蛋白 特性 的 细胞 (Katzman 等 ，1975) 。 进一步 的 实验 分 析 发 现 iRRNA 诱导 淋巴 细胞 的 转化 不 受 放 线 菌 素 卫 抑制 , 但 能 被 蛋 白 合成 抑制 剂 抑制 。 同 时 ， 有 证 据 提示 细胞 的 这 种 转化 是 长 期 的 和 稳定 的 ， 并 可 能 依赖 于 iRNA 本 身 在 受 体 细 胞 内 的 扩 增 。Bhoopalam 等 (1976a) 把 从 骨 细 胞 瘤 提 取 的 RNA 注射 到 正常 的 小 鼠 。 隔 12 小 时 后 ， 取 出 脾 胜 ， 切 下 一 半 立 即 提取 iRNA,， 另 一 半 继 续 培 养 7 天后， 再 提取 iRNA。 结果 发 现 从 培养 7 天 脾脏 细胞 提取 的 iRNA 比 立 即 提取 的 iRNA 对 正常 淋巴 细胞 的 转化 能 力 要 大 。 此 外 ， 还 用 同样 的 步 序 提取 iRNA， 连 续 传 递 五 代 ， 即 每 次 把 从 脾脏 提取 的 iRNA 注射 到 另 一 正常 小 鼠 ， 再 从 此 小 鼠 脾脏 提取 iRNA 继续 注射 到 另 一 支 正 常 小 鼠 ， 如 此 连续 传 五 代 。 结 果 发 现 立即 从 脾脏 提取 的 iRNA 传 二 伐 或 三 代 后 ， 对 细 了 胞 的 转化 能 力 就 消失 了 , 而 从 体外 培养 7 天 细胞 提取 的 iRNA, 即 使 经 ， 过 五 代 传递 ， 仍 然 能 保持 转化 细胞 的 活力 。 在 这 一 实验 以 前 ，Satonori 等 (1972) 也 观 察 到 iRNA 能 连续 几 代 传 递 免 疫 专 一 性 的 现象 。 总 之 ， 这 些 结果 提示 iRNA 对 淋巴 组 胞 的 转化 作用 是 稳定 的 和 长 期 的 并且 iRNA 在 受 体 细胞 内 可 能 扩 增 ， 虽 然 其 机 制 还 不 “ “最 后 , 需要 特别 说 明 的 ,以 上 讨论 的 都 是 在 实验 条 件 下 或 病理 条 件 下 的 情况 。 至 于 在 正常 免疫 系统 中 ，iRNA 是 否 也 和 免疫 信息 的 传递 .放大 和 记忆 有 关系 ， 目 前 还 不 清楚 。 不 过 应 注意 ， 在 实验 条 件 下 证 明 iRNA 能 专 一 地 传递 免疫 信息 ， 并 不 能 据 此 推论 在 正常 免疫 诱导 机 制 中 也 有 细胞 之 间 的 iBNA 传递 参与 作用 。 (三 ) IRNA 传递 细胞 免疫 性 及 应 用 于 肿瘤 免疫 治疗 的 探讨 用 从 免疫 动物 淋巴 结 提取 的 iRNA 处 理 未 免疫 动物 的 淋巴 球 时 ， 还 能 把 细胞 免 疫 性 《如 巨 鸣 细 胞 迁移 抑制 因子 释放 ， 退 发 型 皮肤 过 敏 反 应 等 ) 专 一 地 传递 给 这 些 细 胞 (Thor, 1967; Vyas，1974) 。 对 照 实验 表明 ， 单 是 抗原 或 从 未 免疫 动物 淋巴 结 提取 的 RNA 都 不 能 使 正常 淋巴 球 在 离 体 条 件 下 转化 为 致 敏 的 细胞 。 后 来 ， 还 发 现 iRNA 能 在 异种 之 间 传 递 细胞 免疫 性 ， 如 从 BCG 致 敏 的 小 牛 的 淋巴 结 提取 的 iRNA 能 将 BCG 过 敏 性 传递 至 豚鼠 (Wang 等 , 1974) 。 BRIRAVIRNA AEX KLH, PPD 的 过 敏 性 传递 到 人 (Paque 和 Dray，1972) 。 已 知 Hodgkin 氏 病 (淋巴 网 状 细胞 瘤 ) 病人 缺乏 细胞 免疫 能 力 。 从 对 PPD 过 敏 病 人 淋巴 球 提取 的 iRNA 能 将 对 PPD 的 迟 发 型 皮肤 反应 传 递 到 这 种 肿瘤 病人 (Han, 1973; Han 等 ，1975) 。 这 一 事实 清楚 地 证 明 在 人 类 ，iRNA 同样 能 专 一 地 传递 细胞 免疫 性 。 肿瘤 免疫 主要 是 细胞 免疫 。 因此 ， 理 论 上 存在 着 利用 iRNA 专 一 地 传递 细胞 免疫 性 ， 来 进行 肿瘤 免疫 治疗 的 可 能 性 。 如 第 四 章 所 述 ， 有 人 在 同 基 因 型 动物 之 间作 肿瘤 移植 实验 ， 发 现 无 论 化 学 或 病毒 诱 发 的 肿瘤 都 有 肿瘤 专 一 的 移植 抗原 存在 ; 并且 每 一 种 化 学 诱发 的 肿瘤 的 移植 抗原 是 瘤 株 专 一 的 ， 即 甚至 用 同一 种 致癌 物质 在 同一 品系 的 不 同 个 体 诱发 的 两 株 肉 瘤 细 胞 之 间 也 没 * 463» 有 交叉 反应 (参看 第 四 章 ，146 页 ) Alexander (1966, 1968) 就 利用 大 鼠 的 这 类 移植 肿瘤 作 材料 。 他 先 将 肿瘤 切 下 一 部 分 去 免疫 同 种 或 异种 动物 ( 羊 ) 。 免 疫 5 一 10 天 后 ， 从 胸 导 管 取 淋 巴 球 ,静脉 注射 到 原来 的 施主 ,或 移植 过 同一 株 瘤 细 胞 的 同 基 因 型 的 大 鼠 体 内 ， 结 果 发 现 都 能 显著 地 抑制 肿瘤 的 生长 。 后 来 ， 他 们 又 用 从 这 种 淋巴 球 提 取 的 RNA (含有 蛋白 质 ) ， 足 掌 注 射 到 大 鼠 ， 同 样 可 刺激 该 动物 的 淋巴 球 专 一 地 抑制 这 种 肿瘤 的 生 长 。 但 是 , 较 纯 的 RNA 制品 似乎 反而 无 效 。 继 之 ，Pilch 实验 室 进 行 了 一 系列 的 工作 (Ramming 和 Pilch 1970, 1971; Pi- Ich 和 Ramming, 1970; Deckers 和 Pilch，1971) 。 他 们 用 葵 吡 在 C;H 小 鼠 诱 发 的 肉瘤 (BP-4) 免疫 Hartley HARM. 免疫 10 一 14 AA, 从 豚鼠 脾脏 、 淋 巴结 提取 iRNA， 并 用 这 种 iRNA 来 处 理 同 基 因 型 的 CsH 小 鼠 的 正常 脾脏 细胞 。 然后 再 把 这 些 细胞 注射 到 带 瘤 的 CsH 小 鼠 腹 腔 内 , 便 能 专 一 地 抑制 BP-4 移植 肉瘤 的 生长 。iRNA 传 递 的 抑制 作用 是 瘤 株 专 一 的 。 从 BP-1 ying 肉瘤 提取 的 iRNA 只 能 抑制 BP-1 移植 A igphe 瘤 ， 而 不 能 抑制 BP-4 移植 瘤 的 生长 。 中 ae mean MR 根据 这 一 类 动物 实验 结果 ,Pileh 全 3 提出 一 个 将 iRNA 用 于 人 类 肿瘤 免疫 分 离 的 淋巴 球 治疗 的 方案 (图 14-27) (Deckers 和 RNA 提取 物 ， 皮 内 六 而 set Pilch, 1971). 肿瘤 病人 体内 注射 = Nt iRNA 或 静脉 注射 经 过 iRNA 处 理 过 pee ee a 的 自身 淋巴 球 ， 作 为 一 个 手术 治疗 后 的 “肿瘤 免疫 ?RNA、- 全 ”淋巴 球 加 RNA， OI i “AR ia HUFR, Dike BN 图 14-27 ”用 异种 “免疫 ” RNA 对 人 肿瘤 作 免 疫 治疗 的 模式 ”细胞 的 复发 ， 或 许 是 有 价值 的 。 由 于 问 图 ( 据 Deckers 和 Pilch, 1971), 题 的 复杂 性 ， iRNA 用 于 临床 肿瘤 治疗 的 结果 ， 还 存在 许多 疑问 和 争论 的 意见 。 这 方面 的 初步 试探 结果 ， 可 以 参看 Fritze 等 的 综述 (Fritze 等 ，1976) 。 这 里 不 再 元 述 了 。 最 后 ， 还 应 提 到 iRNA 传递 细胞 免疫 的 机 制 是 否 和 传递 体液 免疫 相似 ， 目前 还 不 清 楚 。 这 里 需要 考虑 一 个 和 转移 因子 的 关系 问题 。 后 者 能 传递 细胞 免疫 ， 但 不 能 传递 体液 免疫 。 目 前 ， 发 现 转移 因子 是 一 种 低 分 子 量 物质 (一 5000 BRM), FFA SRR 苷 酸 和 多 肽 的 复合 物 。 Be S 5S ， 资 料 专著 Kabat, E. 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Cell, Biol. 46, 52. Zurawski, V. R., Haber. E. and Black, P. H. (1978). Production of antibody to tetanus toxoid by con- tinuous human lymphoblastoid cell lines, Science 199, 1439. * 469 « - — d os a 一 一 一 一 一 ns -一 一 -一 -一 ——— - — = — 第 十 五 章 。 免疫 球 蛋白 和 免疫 反应 的 遗传 控制 鉴定 免疫 球 蛋白 和 免疫 反应 的 基因 , 并 研究 其 控制 影响 是 阐明 免疫 学 现象 的 分 子 基 础 的 重要 途径 。 免 疫 球 蛋 白 重 链 和 轻 链 C 区 和 区 遗传 标记 ( 同 种 异型 抗原 决定 簇 ) 的 发 现 , 使 有 可 能 对 免疫 球 蛋白 肽 链 的 结构 基因 进行 遗传 分 析 。 这 方面 研究 证 明 免 疫 球 蛋 白 肽 链 合成 是 受 位 于 常 染 色 体 上 , 彼此 不 连锁 的 三 群 基因 ( 重 链 的 ,21* 轻 链 的 和 上 轻 链 的 ) 编码 的 , 而 重 链 的 类 别 和 亚 类 又 是 由 彼此 紧密 连锁 的 不 同 的 结构 基因 决定 的 。 重 链 和 轻 链 的 Y 区 和 C 区 分 别 由 Y 基因 、C 基因 编码 。 两 个 基因 决定 一 条 多 肽 链 ， 而 不 是 一 个 基因 决定 一 条 多 肽 链 。 这 是 免疫 球 蛋白 肽 链 合成 的 遗传 控制 的 一 个 突出 的 特点 。 当前 免疫 学 的 一 个 根本 问题 是 抗体 多 样 性 起 源 的 遗传 控制 。 免 疫 系 统 如 何 产 生 如 此 多 种 多 样 的 抗体 ， 以 适应 识别 多 种 多 样 的 抗原 决定 签 的 需要 ， 这 显然 要 求 特殊 的 遗传 机 制 。 目 前 假定 一 个 相同 的 C 基因 可 能 和 许多 不 同 的 Y 基因 结合 ， 从 而 决定 抗原 结合 位 点 易 变 区 结构 的 多 样 性 。 然 而 ，V 基因 存在 多 少 变异 形式 ? 这 些 众多 的 变异 形式 是 在 进 化 过 程 中 起 源 , 并 通过 生殖 细胞 传递 下 来 的 , 还 是 在 个 体 发 育 过 程 中 通过 体 细 胞 突变 发 生 的 ? 不 同 的 Y 基因 如 何 与 C 基因 连接 起 来 ,共同 决定 重 链 和 轻 链 的 结构 ? 由 于 分 子 遗 传 学 和 遗传 工程 技术 的 进步 ， 对 这 些 问 题 的 研究 已 从 理论 上 的 探讨 进入 到 实验 验证 的 阶 段 。 随 着 免疫 球 蛋 白 肽 链 的 mRNA 和 基因 的 分 离 、 扩 增 的 成 功 , 目前 已 可 能 通过 分 子 杂 交 来 估计 细胞 内 免疫 球 蛋白 Y 基因 的 数目 和 排列 方式 , 甚至 直接 分 析 VY 基因 的 构造 。 这 方面 可 以 期 待 近期 内 将 有 很 大 的 进展 。 免疫 反应 的 诱导 是 一 个 十 分 复杂 的 过 程 。 对 于 大 多 数 抗原 ， 抗 体 合成 的 诱导 需要 T.B 两 类 淋巴 球 以 及 巨 叹 细 胞 的 协同 作用 。 这 一 复杂 过 程 的 每 一 步骤 都 可 能 是 受 基 A 控制 的 。 近 来 ,在 纯 系 豚鼠 和 小 鼠 对 特定 抗原 的 免疫 反应 能 力作 遗传 分 析 , TERA 反应 是 受 与 主 组 织 相 容 性 基因 座 连 锁 的 基因 (Ir 基因 ) 控 制 的 。 Ir 基因 座 的 性 质 和 芒 能 , 其 基因 产物 和 了 细胞 抗原 受 体 的 关系 ,都 是 目前 正在 研究 尚未 完全 解决 的 问题 ， a 只 能 作 一 些 简 略 的 叙述 。 一 、 免 疫 球 和 蛋白 的 遗传 标记 : 同 种 异型 和 个 体型 如 前 所 述 ( 见 第 六 章 ，184 页 ), 免疫 球 蛋白 抗原 性 的 不 均一 性 是 由 于 其 肽 链 结构 受 遗 传 控制 的 三 重 变异 的 结果 。 同 一 物种 所 有 个 体 的 免疫 球 蛋白 共同 具有 的 抗原 专 一 性 称 为 “ 同族 专 一 性 。 同 一 物种 的 不 同 个体 间 , 存在 几 种 形式 的 抗原 专 一 性 , 即 多 型 现象 ， 称 为 同 种 异型 专 一 性 。 每 一 个 体 的 个 别 抗体 (或 通 细 胞 瘤 蛋 白质 ) 具有 的 独特 的 抗原 专 一 性 称 为 个 体型 专 一 性 。 这 三 种 抗原 专 一 性 分 别 位 于 免疫 球 蛋白 肽 链 的 不 同 部 分 (图 15-1) 。 同 种 异型 在 遗传 上 是 受 位 于 常 染 色 体 上 基因 座 的 一 组 等 位 基因 控制 的 。 这 些 等 位 基 因 是 共 显 性 的 , 并 按 备 德尔 方式 遗传 。 这 些 位 于 免疫 球 蛋 白 多 肽 链 不 同位 置 上 的 抗 原 决 。470 。 V &G . G Y 同族 专 一 性 a a Se 图 15-1 三 种 抗原 专 一 往 在 人 免疫 球 蛋 白 重 链 上 的 定位 。 MRS—-H FC 区 ,是 不 同 的 结构 基因 的 产物 。 同 种 虹 型 是 特定 基因 座 的 等 位 基因 的 产物 ,相当 于 C 区 或 V 区 个 别 氨基 酸 残 基 的 置换 。 个 体型 专 一 性 位 于 V 区 ， 包 含 结合 位 点 的 抗原 决定 得 。 CER. 可 以 用 血清 学 方法 检测 出 来 。 因 此 ,可 以 当 作 遗 传 标记 , 提供 研究 抗体 构造 的 遗 传 控制 的 有 力 工 具 。 实 际 上 ,关于 免疫 球 蛋 白 遗 传 控 制 的 现 有 知识 (形式 遗传 ,群体 遗传 . 医 学 遗传 和 生化 遗传 等 ) 大 都 是 借助 这 些 遗 传 标记 的 研究 得 到 的 。 同 种 异型 已 在 大 多 数 哺 乳 类 物种 (包括 人 、 猴 ,家 免 . 小 鼠 和 大 鼠 等 ) 发 现 ,很 可 能 在 其 他 兰 椎 动物 也 存在 。 (小 入 太一 -类 Grubb (1956) 研究 低 Y 球 蛋白 血 症 病 人 血清 中 存在 的 抗 免疫 球 蛋白 抗体 时 ， 发 现 人 的 免疫 球 蛋 白 呈 现 同 种 异型 现象 。 由 此 开始 的 广泛 研究 ,发 现 人 免疫 球 蛋白 有 三 种 同 种 异型 标记 ，Gm，Am 和 Inv 系统 。Gm 因子 只 存在 于 .IgG 的 Y 链 上 ，Am 因子 存在 于 IEA, 的 w 链 上 。, Inv 因子 存在 于 上 轻 链 上 。 1 轻 链 尚 未 发 现 同 种 异型 标记 。 前 两 个 基因 系统 在 遗传 上 是 紧密 连锁 的 , 而 Inv 系统 则 和 二 者 不 连锁 。 人 类 同 种 异型 的 检测 方法 通常 是 采用 间接 被 动 血 凝 反 应 (Coomb’s test) (参看 第 十 一 章 ) (Grubb, 1970) 。 革命 名 Gm 和 Inv 系统 的 命名 在 第 六 章 已 有 过 叙述 。 然 而 ， 有 些 原来 认为 是 独立 的 因子 ， 后 来 证 明 并 非 如 此 。 例如 ，Gm(b*)，Gm(b2)，Gm(f) 可 能 是 同 二 个 因子 ; Gm(b) 和 Gm(b’) 也 是 这 样 。 现 将 经 世界 卫生 组 织 (WHO) 专门 会 议 修 订 后 的 命名 系统 列 于 表 156=+-¢--- a 2. 分 子 定位 (1) 站 传 标记 和 免疫 球 蛋 和 白 链 及 IgG 亚 类 的 关系 Gm 因子 在 IgG 的 四 个 亚 类 上 都 存在 。 但 是 , 它们 在 各 亚 类 上 的 分 布 是 不 平均 的 ， 特定 的 玫 个 Gm 因子 分 布 在 特定 亚 类 的 Y 链 上 。 例 如 ，Gm(a)，(x) ，(f) ,(z) 位 于 71 链 上 ; Gm(b), (c), (s), (t), (g) 等 位 于 7Y3 链 上 ;Gm(n) 位 于 7Y2 链 上 ( 见 表 15-1， 图 15-2) 。 位 于 同一 条 肽 链 上 的 几 个 Gm 因子 ,自然 在 遗传 上 总 是 相连 在 一 起 分 离 的 。 不 过 ,需要 指出 的 是 ,由 于 Gm 因子 在 遗传 上 呈现 多 型 现象 ,一 定 亚 类 的 IgG 分 子 只 表 现 有 关 基 因 座 之 部 分 标记 。 例 如 ,IgG。(7Y3 链 ) 可 能 具有 Gm(b) 或 Gm(g)， 而 不 能 AMA Zs 白 种 人 和 黑 种 人 的 IgG, (71 链 ) 可 能 具有 Gm(a) 或 Gm(f), 而 不 能 兼 而 有 之 (Natvig 等 , 1967) 。 AN, 还 需要 介绍 一 个 颇 为 费解 的 名 词 和 概念 。 试 举 IgG, WEY Gm(a) 同 种 异型 标记 为 例 。 早 期 血清 学 研究 发 现 IgG, 存在 一 对 交替 出 现 的 抗 REE PA IgG. BA (71 链 ) 或 者 是 Gm(a) ， 或 者 是 Gm(non-a) ， 而 不 能 兼 而 。471 。 表 15-1 人 类 免疫 球 蛋白 的 同 种 异型 建议 的 符号 位 置 曾 用 符 号 字 Ht ri Glim(1) Gm(a) Gm(1) (x) (2) (x) (2) (f) (3) (bw),(b2),(f) (3).(4) | @) a7) (2) a7) 12 G2m(n) G2m(23) (n) (23) 73 G3m(b0) G3m(11) (b*),(b”) (11) (b1) (5) (b),(b1) (5)(12) (b3) (13) (b3),(Bet) (13)(25) (b4) (14) (b5) (10) (ba),(b5) (10) (c3) (6) (Gm-like),(c),€¢3) (6) (z) (21) (z) (21) BL (26) Pa v (27) Ray (s) (15) (s) (15) CD (16) CD (16) a2 A2m(a) A2m(1) Am(1),Amt* Am(2), Am~ A2m(2) A2m(2) L ‘ K Km(1) Km(1) Inv(1) (2) (2) Inv(a), Inv(2) (3) (3) Inv(b), Inv(3) ( 据 W.H.O., Rouen, 1974), # 15-2 人 类 IgG 的 “ 非 等 位 ?标记 (isoallotypic marker). BUM HFS w (H 链 ) 曾 用 符号 字 a Te 72.79 Na NI1 non-a 22) Nb0 NI1 non-b0 x3 Nbl N5 non-bl r3 Ng N21 non-g rl, 73, r4(N4a) N4a N4a 4a, r4 non-a 2 72, r4(N4b) N4b 4b, 7y4 non-b (4 Frangione, 1975), 有 之 。 因 此 ,对 于 7l #, Gm(a) 和 Gm(non-a) 是 真正 等 位 的 抗原 决定 簇 。 可 是 ,又 发 现 所 有 v2 链 和 13 HEA Gm(non-a), 但 没有 Gm(a); 所 有 74 EMR - Gm(non-a) ， 亦 无 Gm(a) (Natvig 等 ,1969) (图 15-2) 。 因此 ， 在 IgG, (71 链 )， Gm(non-a) 和 Gm(a) 是 等 位 的 ;在 IgG, (v2 链 ) 和 IgG。(7Y3 链 ) , 虽然 存在 Gm(non- a) ,但 不 是 等 位 的 ;在 IgG4(74 链 ) 则 不 存在 。 具 有 类 似 特性 的 抗原 决定 簇 , 在 其 他 IEG 亚 类 也 发 现 ( 表 15-2) 。 这 些 在 一 个 亚 类 表现 为 等 位 的 , 而 在 另 一 个 或 几 个 亚 类 则 不 表现 为 等 位 的 抗原 决定 簇 , 称 为 “ 非 等 位 ?标记 〈“non”marker 或 Isoallotype) 。 。472 。 木瓜 酶 胃 和 蛋白酶 1 Cri Cr2 1 Cr3 (pFc’). ofi=a -bo ca b* bs a COOH Gm (b+) 3 | 1 non-a 74 i en COOH, Gm (-) A NN , ” YY 355-358 图 15-2 Gm-REREA 7 AWA EAL E, (OE RIL AMITAIE GE Nisonoft 4, 1971), Km (Bl Inv) 因子 位 于 * 型 轻 链 上 。 由 于 “上 型 轻 链 可 能 参加 所 有 各 类 免疫 球 蛋 白 的 组 成 。 因 而 Km eR IgG, IgM, IgA, I8D， 和 IgE 均 可 能 出 现 。 Km uae 一 性 是 受 三 个 等 位 基因 Km", Km', Km* 控制 的 。 (2) 章 传 标记 和 乞 基 酸 置 换 的 关系 理论 上 , 同 种 异型 标记 (抗原 决定 簇 ) 可 归结 于 免疫 球 蛋 白 肽 链 的 一 级 结构 , 糖 残 基 或 糖 和 多 肽 共同 形成 的 特异 的 结构 。 对 具 不 同 Km 专 一 性 的 上“ 轻 链 的 一 级 结构 的 比较 表 明 Km (1,2) 和 Km(3) 抗原 专 一 性 在 构造 上 的 区 别 仅 在 于 C 区 191 位 置 一 个 气 基 酸 残 基 的 互 换 ，Km(1,2) 为 Leu, Km(3) 为 Val。 当 出 现 罕 见 的 Km(1) 时 ,153 位 置 的 Ala 被 Val 置换 (Milstein 和 Pink，1970) 。 AAW, CAFS RRAS IRR 糖 。 因 此 ,也 证 明 Km RR ERA REE, Sm 因子 仅见 于 IgG. 大 多 数位 于 7Y 链 的 不 变 区 的 _Fe 部 分 , 少数 [Gm(f) 和 Sm(z)] 则 位 于 Fd 的 Cy:。 大 多 数 或 全 部 Gm 抗原 专 一 性 同样 只 是 和 肽 链 的 一 级 结 构 有 关系 。 对 不 同 Gm 专 一 性 的 人 71 链 的 酶 解 肽 段 图 谱 的 比较 ,发现 当 存在 _Gm(a) 因子 时 ， 图 谱 上 出 现 一 个 特异 的 肽 段 ，Gm(ay) KBs 当 存 在 Gm(non-a) 因子 时 ， 则 出 现 另 一 个 特异 的 肽 段 , Gm(non-a) [KE XMAS RF Fe 中 段 的 356 一 360 位 置 。 其 顺序 如 下 示 ; 356 360 Gm(a) KB Asp -Glu- Leu -Thr-Lys Gm(non-a) 肽 段 Glu| -Glu- |Met|-Thr-Lys 从 上 面 看 出 ,和 Gm(a) 同 种 异型 有 关 的 是 两 个 氨基 酸 残 基 的 置换 , 而 不 是 单个 残 基 . 473 . #15-3 人 IgG 各 种 同 种 异型 抗原 决定 簇 的 位 置 和 氨基 酸 差别 链 遗传 标记 | ff “站 残 基 ( 顺 序 ) 上 “Km(C1) 153---191 Val---Leu K Km(1,2) 153---191 Ala---Leu K Km(3) 153---191 Ala---Val rl Glm(z 或 17) 214 Lys rl Glm(a 5G 1) 356---358 Asp-Glu-Leu rl Gim(f 或 37 214 Arg - ral Na 或 N1 356---358 ” Glu-Glu-met r4 N4a 309 ; Leu r4 N4b 309 缺失 (# Frangione, 1975), 的 点 突变 。 关 于 这 一 点 在 IgG 分 子 进化 上 的 意义 , 以 后 还 要 谈 到 。 和 人 7 链 同 种 异型 有 关 的 氮 基 酸 置 换 的 现 有 资料 见 表 15-3。 从 表 上 可 见 , 当 Y1 链 的 遗传 标记 为 Gm(f, Na) 时，214 位 置 为 Arg, 356 和 358 位 置 分 别 为 Glu 和 Met; 当 分 子 的 遗传 标记 为 Gm (a, z) 时 ，214 位 置 则 改变 为 Lys，356 和 358 -位置 则 分 别 改变 为 Asp 和 Leu, 4 73 链 的 遗传 标记 为 Gm(bl) KH, 436 位 置 为 Phe; 而 分 子 为 Gm(g) 时 , 同一 位 置 则 改 为 Tyr。 当 74 链 的 遗传 标记 为 N4a 时 ,309 位 置 是 工 euy 而 在 N4b 分 子 ,同一 位 置 的 残 基 缺 失 。 此 外 ,还 有 证 据 表 明 同 种 异型 决定 簇 的 血清 学 活力 依赖 于 锡 疫 球 蛋白 分 子 的 四 级 结构 。 例 如 , 位 于 Fd 片段 上 的 Gm 因子 只 有 在 完整 的 免疫 球 蛋 白 分 子 上 才 表 现 出 来 (Polmar 和 Steinberg，1964) 。 | 关于 Am 因子 有 关 的 氨基 酸 置换 细节 , 还 不 清楚 。 已 知 Am(1) 阳性 的 wz 重 链 缺 少 重 链 和 轻 链 间 的 二 硫 桥 (参阅 第 八 章 236 页 ) 。 这 一 事实 提示 原来 Am(-1) 重 链 上 的 一 个 半 胱 氨 酸 残 基 在 Am(1) 上 可 能 被 另 一 氨基 酸 残 基 置 换 , 或 者 形成 了 重 链 间 二 硫 桥 。 3. 遗传 借助 同 种 异型 标记 ,对 人 类 免疫 球 蛋白 遗传 分 析 的 一 个 重要 结果 是 证 明了 这 些 遗 传 标记 是 以 两 个 独立 的 连锁 群 遗 传 的 , 重 链 连 锁 群 (包含 Gm 和 Am 系统 和 上 轻 链 连 锁 群 (Km 系统 ) 。 (1) Km 系统 (上 轻 链 ) 如 上 述 ，Km 系统 包括 Km(1), Km(1,2), Km(3) 因子 。 家 族 和 和 群体 遗传 分 析 证 明 这 些 因 子 是 受 Km 基因 座 的 三 个 等 位 基因 Km', Km'’, Km* 控制 的 。 这 些 等 位 基因 是 共 显 性 的 ,在 杂 合 子 个 体 , 两 个 等 位 基因 的 产物 都 可 能 表现 出 来 。 对 不 同 遗 传 标记 的 上 链 的 一 级 结构 分 析 证 明 ，Km(1) 和 Km(2) 的 差别 仅 在 于 153 位 置 一 个 氨基 酸 残 基 的 交换 。 这 说 明 上 轻 链 C 区 的 遗传 变异 是 和 血红 蛋白 相似 ， 通过 单个 点 突变 表现 出 来 。 RID TEA, Km 基因 座 和 Gm 基因 座 相 上 距 很 远 (至 少 30 交换 单位 ) 。 此 ,它们 很 可 能 位 于 不 同 的 染色 体 上 ,或 者 同一 染色 体 不 同 的 两 端 上 。 。474 。 (2) Am 系统 (oz 重 链 ) Am 系统 迄今 只 发 现 一 个 Am 因子 ,位 于 IgA, 的 m 重 链 C 区 。 家族 和 群体 遗 传 分 析 证 明 Am: 和 Am™ 是 共 显 性 的 等 位 基因 。 对 13 个 家 族 ( 包 括 41 个 子女 ) 的 连 锁 研 究 证 明 ，Am 基因 座 和 Gm 基因 是 紧密 连锁 的 。 这 一 结论 在 家 兔 和 小 鼠 上 也 得 到 证 实 。 所 有 免疫 球 蛋 白 重 链 的 CHA 〈C，, Co Cuw… 等 ) 都 很 可 能 位 于 同一 条 染色 体 上 ， 并 且 是 紧密 连锁 的 。 (3) Gm 系统 (7Y 链 ) ”家 族 和 群体 遗传 研究 同样 证 明 Y 链 的 四 个 亚 类 彼此 之 间 , 以 及 它们 和 ws 链 之 间 是 紧 密 连 锁 的 〈Kunkel 等 ,1969a) 。 fit, Gm 因子 在 IgG 各 亚 类 上 的 分 布 又 是 不 平均 的 ,特定 的 Gm 因子 位 于 特定 亚 类 的 Y 链 上 。 由 于 这 两 方面 的 原因 , 结果 位 于 两 条 同型 染色 体 之 任 一 条 上 的 一 组 共 显 性 等 位 基因 决定 的 几 个 Gm 因子 是 成 组 地 遗传 的 。 这 样 一 组 遗传 标记 称 为 表 型 群 (Phenogroup 或 allogroup) 。 由 于 一 个 表 型 群 是 受 位 于 同一 条 染色 体 上 的 等 位 基因 决定 的 ， 因 而 也 称 为 单元 型 (Haplotype) 。 群体 遗传 研究 发 现 Gm 表 型 群 在 不 同人 种 的 分 布 存在 明显 的 区 别 ( 表 15-4) 。 例如 , 在 白 种 人 Gm(a)，(z) ， (g) 是 一 个 常见 的 表 型 群 , 也 就 是 说 在 正常 个 体 这 些 因 子 或 者 全 呈 阳 性 , 或 者 全 呈 阴 性 。 同样 地 ，Gm(f)，(b), (bb) (b*) 和 (bt) 是 另 一 个 常见 的 表 型 群 ， 正常 个 体 或 者 为 Gm(f+,b+,b9+,b°+,b'+), R#4Gm(f-,b-,b°-,b°-,b'-), KRISH 表 15-4 不 同人 种 内 常见 的 Gm 表 型 群 表 型 群 种 ik IgG3 LgG2 白 种 人 b， b°, b3, b* Dn (Caucasian) b, b®, b*, b* ai g = g as RRA bok bi be " CNegroid) b, b®, c3, ce 5 b, Cc, b°, b* “Tr bobs 黄种 人 b°, bs s,t 7 (Mongoloid) b, b®, b, b* D aE BEA ‘% (Ainu) a 南非 卡拉 哈里 人 (Bushmen) = (PRK A ‘e (Pygmy) e (4 Fudenbug, 1972), ° 475.6 证 明 一 个 基因 型 为 Gm> ”9 的 杂 合子 , 其 中 Gm ”= 基因 来 自 亲 代 的 一 方 ， 而 Gm2e "基因 则 来 自 另 一 方 。 另 一 方面 ,对 个 别 伐 细胞 瘤 蛋白 的 _Gim 标记 的 研 究 ， 表 明 Gm(a),(f),(z) 专 一 性 只 限于 IgG, Ws; i Gm(b), (b*),(b*),(b*), (g) 则 限于 IgGs 亚 类 , 即 特定 的 Gm 标记 可 能 位 于 特定 亚 类 的 ”7- 链 上 。 此 外 》 在 正常 个 体 所 有 四 个 IgG 亚 类 都 同时 存在 ，. 但 含量 有 不 同 。 所 有 以 止 这 些 资料 提示 ，“Gm .基因 座 ” 可 以 进一步 划分 为 几 个 基因 座 ， 它 们 各 编码 一 个 IgG WR. MAA, :IgG 的 三 个 亚 类 (IgG,, IgG:, IgGs:) 各 受 一 个 基因 座 编码 , 而 这 些 基因 座 又 是 紧密 连锁 的 。 至 于 IgG4， 亚 类 是 否 呈 现 多 型 性 , 还 不 清楚 (参看 Grubb, 1970; Fudenberg, 1972; Mage 等 2973)'5 (4) IgG 结构 基因 的 数目 和 次 序 MELA, 至少 存在 四 个 不 同 的 Y 链 的 结构 基因 ( 顺 反 子 ),: 各自 编码 IgG 四 个 亚 类 。 同样 地 , 很 可 能 存在 两 个 IgA 结构 基因 。 至 于 IgM, IgD, IgBE 是 否 存 在 亚 类 还 不 清楚 。 据 现 有 资料 , 估计 各 类 免疫 球 蛋白 重 链 C. 基 因 总 数 当 不 少 于 9 个 ,或 许 不 超过 12 一 15 个 。 IgG 四 个 亚 类 重 链 (71,72,73,74 链 ) 的 结构 基因 之 间 的 重组 频率 非常 低 * 表 明 它 们 是 紧密 连锁 的 。 对 丹麦 两 个 家 族 非常 罕见 的 表 型 群 的 研究 , 发 现在 一 个 家 族 中 位 于 2 链 上 的 Gm(n) 和 位 于 7Y3 链 上 的 Gm(g) 可 能 发 生 交换 ; 而 在 另 一 个 家 族 , 位 于 711 链 上 的 Gm(f) 和 位 于 73 链 上 的 Gm(g) 可 能 一 EZB 列 -上 芷 :~ 发 生 交 换 (Kunkle “£,1969b) ; 这 表明 73 ae eat: Al v1 基因 ,74 和 72 基因 之 间 各 自 是 直接 和 人 和 人 宇和。 SH. Ih 由 于 73 和 YL 基因 DRA BMA Gm 标记 ,而 保留 non-a .标记 ( 据 Kun- ” 间 不 等 交换 (unequal homologous, cross- el Sy eee over) 产生 的 “Lepore” 型 杂种 IgG 分 子 的 发 现 ,表明 Y3 和 yl 基因 是 直接 连锁 的 ; 并 且 , 由 于 分 子 N 端 部 分 是 来 自 73, mC 端 是 来 自 7Yl, 推 测 7Y3 基因 应 位 于 7Y1 基因 的 靠 N 端 一 侧 ( 图 15-3) 。 综合 起 来 ， 这 些 资 料 提示 四 个 亚 类 7 FENN C 基因 在 染色 体 上 的 排列 次 序 可 能 是 : 7Y4-Y2-Y3-7Y1 (A 15-4) 。 2 wa 73 7r1 a Frm ae Ce eT TO ae oy sr Oe cars em ee -二 ”小 -七 sa 十 -二 sm 十 -上 "pcnoj- 图 15-4 ”人 7- 重 链 四 个 亚 类 的 'C 基因 在 染色 体 上 假定 的 排列 顺序 。 上 两 排 示 白 种 人 的 两 个 主要 的 等 位 基因 复合 物 。 下 面 一 排 示 黄 种 人 的 一 个 等 位 基因 复合 物 , 存在 基因 内 交 换 现 象 ( 据 Fudenberg, 1972), 已 知 IgA, fl IgG 紧密 连锁 (Kunkle 等 ，1969b) 。 很 可 能 IgA,, LAR IgM, IgD, IgE 等 所 有 重 链 C 基因 一 起 构成 一 个 大 的 连锁 群 。 不 过 ，IgA,，IEM，IgED 和 IgE 的 位 置 和 次 序 还 不 清楚 。 有 人 推 想 或 许 应 放 在 .IEG _ 顺 反 子 的 靠 N 端 一 侧 , 因为 它 们 和 IgG， 比 和 IgG,， 更 相似 一 些 (Natvig 和 Kunkle, 1973), ene ee a 免 Qudin (1956) 最 先 发 现 家 免 免 并 球 蛋白 存在 同 种 异型 决定 签 , 继 之 进行 了 广泛 的 研 究 。 目 前 已 知 家 免 的 主要 同 种 异型 专 一 性 ， 分 别 位 于 218 各 类 重 链 、 两 型 轻 链 及 分 这 片上 (18-6). Meee OW BETO 见 ， 几 类 重 链 的 易 变 区 上 都 存在 ay xy y 同 种 异型 ， | ae sy 链 的 不 变 区 存在 d,e Ho MM RERE fe 15 Ala 群 ; 产 链 的 不 变 区 存在 n 群 ,上 轻 链 存 在 b 群 ; 1 Re 4 tet 在 C BE; WUE Et BEC 15-5) 。 14 coon 对 家 免 免 疫 球 蛋白 同 种 异型 的 遗传 分 析 证 明 控 制 于 免疫 球 蛋 白 合成 的 基因 分 属于 BH. © Be Cr 链 三 个 连锁 群 。 最 近 还 发 现 分 泌 片 的 同 种 异型 同上 述 ee 任 一 同 种 & 型 均 不 连锁 , 因而 是 属于 第 四 个 独立 的 连 we 锁 群 。 a 3 家 免 免疫 球 蛋 白 的 特点 是 重 链 易 变 区 存在 遗传 标 1 id. 已 证 明 a 群 同 种 异型 位 于 Va 区。 已 知 同 种 异型 15-5 SH IgG 的 同族 异型 专 二 性 和 Va 区 肽 链 顺序 变异 的 关系 ， 列 于 图 15-6. ( 据 Kinde 等 ,19747。 从 图 上 可 见 ， 三 种 同 种 异型 肽 链 上 ， 两 个 同 种 异型 肽 链 的 顺序 相近 ， 而 第 三 个 的 差别 很 广泛 (特别 是 在 67 一 71 位 置 ) (Frangione, 1975), 这 里 需要 指出 的 ， 家 免 位 于 重 链 V 区 的 a HA BE bb 群 同 种 异型 可 能 涉及 许多 个 氨基 酸 的 互 换 。 这 是 和 gd 和 群 ,e HR RUS ”家 免 免 疫 球 蛋白 的 主要 同 种 异型 fi ££ tf @ Al 种 异型 群 同 种 异型 专 一 性 重 链 易 变 区 (>, w, 几 ,8 BE) a 1,2,3 x 32 y 33 不 变 区 IgG d 由 12 e 14, 15 不 变 区 .IgA f 69, 70, 71, 72, 73 不 变 区 IgA， g 74, 75,76, 77 不 变 区 IgM n 81, 82 Ki b 4,5,6,9 和 轻 链 c 7,21 5} ib Fr t 61, 62 〈 据 Kunkel 和 Kindt, 1975), 同 种 异型 Hei 1 val 5 10 15 al pGlu-Ser-) yp Clu- Glu-Ser-Gly-Gly-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Thr-Pro-Gly a2 Yat vose iy Glu —— Gly Phe Lys -一 -Asn Thr A a5 “一 一 Leu a Lys Gly Ala Ser 67 70 81 85 al Phe--Thr-Ile-Ser-Lys Ser-Leu-Thr-Thr-—Glu-Asp a2 Ser Thr Arg —Ala Gln a3 “一 一 一 一 -一 一 一 Ala Ala 图 15-6， 家 免 重 链 易 变 区 可 能 和 同 种 异型 a 群 氨基 酸 排列 顺序 变异 有 关 的 肽 侦 ( 据 Kunkel 和 Kindt, 1975), 涉及 单个 氨基 酸 的 置换 是 不 同 的 (图 15-5) 。 由 于 家 免 重 链 上 同时 存在 两 个 同 种 异型 决定 往 , 一 个 位 于 V 区 ,一 个 位 于 CC 区， 这 就 提供 了 研究 V, C 基因 在 遗传 上 的 关系 的 条 件 。 实 际 上 ,关于 编码 抗体 V 区 基因 的 知 识 大 部 分 来 自家 兔 Vu 同 种 异型 的 研究 。 '1 Vi 和 Ca 同 种 异型 的 连锁 和 交换 早期 观察 已 经 发 现 IgG 和 IgM 具有 相同 的 Va 同 种 异型 (Todd, 1963) 。 随后, 又 发 现 IgA 和 IgE 也 同样 具有 相同 .和 12/3511) aaa Le 的 Va 同 种 异型 (Kindt 和 Todd, 1970; Mage, 1971) 。 对 这 些 事 实 可 能 的 解释 是 各 类 和 亚 类 重 链 的 Ca 部 NA NA Al 15-7 IgG 2 Vu 和 Cy 区 等 位 基因 互 斥 现象 。 Vu 和 C， 遗传 标记 的 分 子 关 系 反 映 了 这 些 标 记 在 染色 体 上 的 连锁 关系 。 当 用 CNBr 处 理 时 , i All 同 种 异型 标记 的 IgG 产生 3.5S 片 Be, Al2 标记 的 IgG 产生 53 片 眉 。 因此 ， 在 基因 型 为 (1， 12/3，11) 的 家 免 ，a3 标记 仅 在 35S 片段 上 发 现 ;反之 ， 在 基 ABA C1, 11/3, 12) HAR, 3.58 FRERRM al 标记 ( 据 Kindt 4, 1970), 1969), 另 一 方面 ， 还 发 现 位 于 7 链 NIYA (ff CkwiemMd#RERSiTVE 的 a 群 决定 簇 是 连锁 的 (Tosi 等 ， 00 分 是 一 串 连 锁 的 顺 反 子 的 产物 ， 它 们 具有 共同 的 Va 基因 。 如 果 Va 基 A (atid Ca 基因 是 以 连续 一 串 顺 反 子 的 形式 位 于 一 复杂 的 基因 座 内 , 就 可 能 测 出 它们 之 间 的 交换 频率 。 对 家 免 的 家 族 分 析 发 现 Va 基因 (a 标记 ) 和 Ca 基因 (d tric) 之 间 确 实 存在 交换 ， 交 换 频 率 约 为 0.5 一 0.7% (Mage 等 ,1971; Kindt 和 Mandy，1972) 。 这 一 事实 有 力 地 证 明 重 链 的 V 区 和 C 区 是 受 不 同 的 ,然而 是 连锁 的 基因 控制 的 。 总 之 , 这 些 事实 都 支持 Va 基 因 和 Ca 基因 连结 成 一 个 VC 基因 ,决定 重 链 合成 的 假说 。 此 外 ， 对 于 V 和 C 同 种 异型 为 双重 杂 合 子 的 动物 之 免疫 球 蛋 白 上 的 这 些 遗 传 标 记 组 合 的 研究 , 发 现 亲 代 遗 传 标记 的 组 合 能 以 很 高 百分率 保存 下 来 。 也 就 是 说 , 父母 双方 的 这 两 组 遗传 标记 从 亲 代 到 子 代 是 各 自 相 连 在 一 起 遗传 的 。 例 如 ,双亲 的 基因 型 为 ， ta". dl Ja’, a‘*) x (al， dll fa‘, d!') TMAENMERATRHRAHMYA (a’,d" /al, di) ， 其 循环 抗体 具有 .al an SRR id - 478° 的 分 子 将 表现 dll 同 种 异型 标记 ; MAA a2 标记 的 分 子 将 表现 dl2 标记 (Kindt 等 ， 1970) 。 这 一 实验 除去 说 明 Va 基 因 (a 标记 ) 和 Ca 基因 ( 带 d 标记 ) 是 相连 在 一 起 遗传 外 ,还 说 明 可 能 存在 等 位 基因 互 斥 现象 。 玫 indt 等 (1970) 利用 Y 链 的 All,A12 标记 和 Vu AY al, a3, Landucci-Tosi 等 (1970) 用 7 链 的 Al14，Al5 标记 和 al, a2 标记 ， 也 证 明 至 少 95% 的 IgG 分 子 的 V, C 遗传 标记 都 呈现 等 位 基因 互 斥 现象 (图 15-7) 。 这 些 事实 还 提示 大 多 数 抗体 合成 细胞 是 利用 位 于 同一 条 染色 体 上 的 Va 和 Ca 基因 来 合 成 重 链 的 。 2. 同 种 异型 的 等 位 基因 互 斥 现象 ， ”上述 免 疫 球 蛋 白 同 种 异型 等 位 基因 互 斥 现象 是 哺乳 类 常 染色 体 等 位 基因 互 斥 的 唯一 例子 。 对 于 遗传 上 为 杂 合子 的 动物 , 虽然 某 一 同 种 异型 基因 座 的 两 个 等 位 基因 都 可 能 表现 出 来 ,但 在 个 别 免疫 球 蛋白 分 子 上 却 只 能 发 现 两 个 交替 的 等 位 基因 中 一 个 基因 的 产物 。 也 就 是 说 ,个 别 免疫 球 蛋 白 分 子 的 两 条 重 链 和 两 条 轻 链 都 各 自 具 有 相同 的 同 种 异型 , 而 不 会 出 现 两 条 链 有 不 同 遗 传 标 记 的 杂种 分 子 。 对 这 一 现象 的 解释 是 个 别 合成 抗体 的 浆 细胞 内 ， 决 定 免 疫 球 蛋白 肽 链 同 种 异型 的 任何 一 对 等 位 基因 中 ， 只 有 一 个 得 以 表现 出 来 。 然 而 ,就 整个 浆 细 胞 群 来 说 , 仍 可 观察 到 父 方 或 母 方 同 种 异型 的 各 种 组 合 ， 呈 现 表 型 上 的 获 合 现象 (图 15-8) 。 已 知 a 群 (位 于 Va) 和 hb 和 群 (位 于 上 链 ) 是 不 连锁 的 〈 可 能 位 于 不 同 染色 体 上 ) ,这 就 要 求 这 两 个 基因 座 的 等 位 基因 各 自 独 立地 选择 地 表现 (激活 或 抑制 ) 。 如 把 1 轻 链 的 同 种 异型 也 算 在 内 ， 浆 细胞 内 等 位 基因 的 选择 表现 就 可 能 涉及 位 于 四 条 常 染 色 体 上 的 四 个 不 同 的 基因 座 (Tosi 等 ,1974)。 由 此 可 见 , 同 种 异型 等 位 基因 互 斥 产生 的 机 制 可 能 是 相当 复杂 的 , 目前 还 不 太 清 楚 。 前 一 章 ( 人 参看 460 页 ) 已 提 到 ， 细 胞 杂交 研究 结 果 提 示 抗 体 合 成 细胞 A, 等 位 基因 表现 的 限制 可 能 Rs He de a 发 生 在 V-C 基因 整合 阶 xf | x 284 VCEAA J 论 有 无 其 他 整合 的 V-C 基 Ate RRL on ere 未 整合 的 其 他 基因 则 不 能 表现 (Cotton 和 Milstein， 1975)。 这 一 解释 在 下 一 抗体 形成 细胞 节 讨 论 VC 基因 整合 的 机 表现 的 表 型 制 (基因 移 位 ) 时 ， 还 要 谈 到 。 最 后 ,还 应 注意 到 这 样 seams (ED 一 种 可 能 性 , 其 些 呈现 “等 scams (EI) pow 位 性 ”的 同 种 异型 实际 上 可 能 是 染色 体 上 一 个 复杂 15-8， 基 因 型 为 ata?/b*b’/d'd? 的 家 免 的 抗体 形成 细胞 的 表 型 。5 一 8 细胞 基因 座 中 一 串 连 锁 的 顺 反 表现 a Ad 等 位 基因 重组 的 表 型 ( 据 Kunkel 和 Kindt, 1975), 子 的 产物 。 它 们 之 所 以 在 表面 上 显现 出 “等 位 性 ”可 能 是 由 于 控制 它们 的 调节 基因 呈现 等 位 性 的 结果 。 这 方面 的 证 据 是 有 人 观察 到 基因 型 为 (al,a* /b*, b°) AAS, 在 用 Micro- 。479 。 99% coceus lysodeikticus 免疫 后 产生 的 抗体 出 现 意 料 不 到 的 同 种 异型 标记 (a*b*®) (Stro- sberg 等 ，1974) 。 1 总 之 ,家 免 Y BHUK 1. BEN V 区 和 'C 区 遗传 标记 的 存在 使 有 可 能 发 现 Va Fl C, 基因 的 连锁 关系 ,而 Va < 和 1 HN a,b,c 基因 座 之 间 没 有 密切 的 连锁 关系 。 对 这 些 遗 传 现象 的 解释 是 可 能 存在 三 套 不 同 的 Y 区 亚 群 , 即 重 链 的 ，* 和 1 轻 链 的 。 有 理由 认为 至 少 存在 三 个 不 同 的 基因 座 , 各 相当 于 重 链 、 上 4 和 1 轻 链 的 V 和 C 区 的 结构 基 因 。 一 个 分 化 的 抗体 形成 细胞 , 假定 从 一 群 Va 基因 中 选择 一 个 , 并 将 它 移 位 到 同一 染色 体 的 几 个 Ca 基因 中 的 一 个 上 面 , 连 接 成 一 个 VC 基因 (Galley #1 Edelman, 1970). 同样 地 , 轻 链 亦 复 如 此 。 根 据 上 述 各 方面 遗传 学 研究 资料 ， 家 免 免 疫 球 蛋白 重 链 \ 上 和 1 轻 链 同 种 异型 标记 在 几 对 染色 体 上 假想 的 排列 位 置 ， 可 举 一 只 免 子 的 情况 ,作为 代表 (图 15-9) 。 3. 个 体型 和 V 区 同 种 异型 ( a" 群 ) 的 遗传 关系 如 前 述 ,个 体型 位 于 免疫 球 蛋 白 肽 链 的 Y 区 , 可 能 和 组 成 抗原 结合 位 点 的 高 变异 区 (HV) 有 关连 。 因 此 , 也 可 以 作为 Y 区 的 遗传 标记 。 家 免 家 族 遗 传 分 析 结 果 表 明 个 体型 标记 是 能 遗传 的 。 并 且 是 和 a 群 同 种 异型 连锁 的 。 RK, 至 少 一 种 个 体型 是 和 一 定 的 V。 亚 型 连锁 的 。 虽然 个 体型 和 V 区 同 种 异型 在 遗传 上 是 相关 连 的 , 半 抗 原 抑 制 实验 证 明 它 们 又 是 有 区 别 的 。 链 球菌 “ 族 多 糖 半 抗原 能 抑制 抗 个 体型 抗 血清 和 相应 的 抗体 的 反应 ， 但 不 能 抑 制 抗 a 群 同 种 异型 抗 血清 和 同一 些 抗体 的 反应 。 这 一 实验 说 明 a 群 同 种 异型 和 个 体型 虽 同位 于 V 区 ,但 又 各 有 不 同 的 抗原 决定 入 (Kindt S, 1974), 进一步 研究 还 发 现 从 一 只 基因 型 为 (aas) 的 家 免 分 离 的 两 个 具有 不 同 的 V 区 同 种 异型 标记 的 抗体 , (一 个 抗体 为 a3， 另 一 可 能 为 Y)， 可 能 具有 相同 的 个 体型 (和 unkel 和 Kindt, 1975). 另外 ,也 有 人 发 现 个 体型 专 一 性 呈现 交叉 反应 的 两 个 人 散 细 胞 瘤 蛋白 质 , 具有 不 同类 ,型 的 重 链 和 轻 链 (Hopher, 1973), 这 些 发 现 提示 V 区 可 能 再 划分 为 恒定 部 分 和 高 变异 部 分 ,前 者 重 链 CH Vi rena Cy Co, BY Q | ys) X 到 ag | no? yd? ns 人 | WE k 经 链 ie 链 A Be Vs C. MA Cr OF WangVcnye sos [Vieng el | gVar pVaig Ving ery 9 LVkyVciy sss {Val Loy 9 pV ang Varig wan pc) 15-9 根据 同 种 异型 遗传 确定 的 家 兔 免疫 球 蛋白 合成 有 关 的 基因 座 。 a, x 和 了 y 群 的 Va 基因 存在 单个 或 多 个 复 本 ,还 不 清楚 。 Vi 区 亚 群 的 观察 提示 可 | 能 存在 多 个 Vi 基因 复 未 ( 据 Kunkle .和 Kindt，1975)。 ° 480 。 是 由 少数 几 个 和 同 种 异型 有 关 的 基因 编码 ， 后 者 为 和 它们 不 同 的 一 组 基因 编码 。 也 就 是 说 ，V 区 是 由 不 只 一 个 基因 编码 的 。 这 些 基因 可 能 以 某 种 方式 相互 作用 ,形成 完整 的 V 基因 。 可 以 进一步 设想 V 区 同 种 异型 有 关 基 因 编 码 维持 V 区 恒定 结构 的 肽 链 骨 架 ， 而 V 区 抗原 结合 位 点 的 多 样 性 是 由 于 和 个 体型 有 关 的 高 变异 区 揪 人 的 结果 (Kindt 和 Mole, 1974; Kunckle 和 Kindt, 1975). 兽 有 人 假定 这 种 插 人 可 能 是 通过 “染色 体外 基因 ”实现 的 (Wu 和 Kabat, 1970) (参看 第 十 章 ，283 页 ) 。V 基因 是 否 确实 存在 这 种 假设 的 双重 结构 ,需要 弄 清 楚 V 基因 本 身 的 排列 顺序 ,才能 得 到 直接 的 证 明 。 由 于 家 免 重 链 V 区 存在 双重 遗传 标记 , 对 具有 确定 个 体型 和 同 种 异型 专 一 性 的 重 链 V 区 的 结构 和 遗传 的 研究 , 可 能 对 于 了 解 抗 体 多 样 性 的 起 源 有 关键 的 意义 。 (=) vb 鼠 小 鼠 作为 免疫 遗传 学 研究 材料 有 许多 优点 ,如 有 许多 纯 系 和 桨 细胞 瘤 可 供 使 用 。 不 过 ， 缺 点 是 已 肯定 的 同 种 异型 标记 限于 重 链 CK. 这 一 缺点 部 分 地 可 用 个 体型 作为 Vu 区 标记 , 得 到 补偿 。 Kelus 和 Moor-Jankowski (1961) 最 先 记 录 小 鼠 的 同 种 异型 。 当 他 们 用 BALB /C 纯 系 小 鼠 的 抗体 免疫 另 一 纯 系 C57Bi 时 ,产生 的 抗 同 种 异型 抗体 能 和 所 有 BALB/C 和 CsH 小 鼠 免疫 球 蛋白 的 一 个 抗原 决定 簇 起 反应 ,而 不 和 C57Bi 的 免疫 球 蛋 白 反 应 。 目 前 发 现 小 鼠 IgG 重 链 的 三 个 亚 类 (6. 7, n 链 ) 和 IgEA BH (“ 链 ) 的 C 区 都 存在 同 种 异型 标记 , 有 关 的 基因 座 分 别称 为 F, G, 了 , A. IgGs (7s 或 “ 链 ) 和 IgM (HH) Ret 轻 链 尚未 发 现 同 种 异型 标记 。 关 于 小 鼠 同 种 异型 的 详细 资料 可 参看 Mage 等 (1973) .的 综述 。 利用 遗传 标记 发 现 小 鼠 各 类 重 链 的 Ca 基因 是 紧密 连锁 的 , 形成 所 谓 的 “ 重 链 连 锁 群 "。 纯 系 小 鼠 同 种 异型 连锁 群 ,通常 用 该 纯 系 名 称 表示 。 例 如 ，BALBI/C 的 Ca 基因 连锁 群 为 (GLb6722， AR SLS 了 lw22; Pistsy. 简称 为 “BALB/C” 同 种 异型 。 在 重 链 连 锁 群 彼此 有 两 个 或 更 多 基因 差别 的 纯 系 小 鼠 之 间 的 杂交 实验 指出 ,在 2371 FRAN, RE 现 重组 。 这 表明 这 些 带 有 Ca 周 种 异型 标记 的 基因 之 间 的 重组 频率 是 很 低 的 ,或 者 说 它 们 是 紧密 连锁 的 。 利用 小 鼠 抗体 的 个 体型 作为 Y 区 遗传 标记 ;同样 观察 到 V 基因 和 | Ca 基因 存在 紧 密 的 连锁 。 Eichmann (1972) RH A/I 纯 系 小 鼠 不 同 个 体 产 生 的 抗 链 球菌 多 BA 抗体 存在 交叉 反应 的 个 体型 决定 徐 。 这 些 实 验 发 现在 一 定 基因 型 的 同一 纯 系 的 不 同 个体 可 能 得 到 具有 相同 或 相似 的 个 体型 决定 得 〈(V 区 构造 ) 的 抗体 ,而 在 另 一些 基 因 型 的 纯 系 个 体 则 不 能 , 从 而 开辟 了 深入 研究 个 体型 遗传 的 途径 。 对 于 同 种 异型 为 杂 合子 的 小 鼠 所 产生 的 有 交叉 反应 个 体型 决定 得 的 抗体 ;总 带 有 相同 的 个 体型 - 同 种 异型 组 合 (Ei chmann, 1973), 这 进一步 提示 控制 个 体型 的 基因 可 能 和 Ca 基因 位 于 同一 条 染色 体 上 。 此 外 , BMRB A/T 纯 系 小 鼠 的 两 个 不 同 的 个 体型 CASA 和 ARS) 都 与 A/T Ca 同 种 异型 连锁 。 并 且 , 在 一 支 雄性 杂种 小 鼠 (A/J+ BALB/C) 还 观察 到 ASA 个 体 型 与 BALB/C 同 种 异型 之 间 的 交换 现象 ， 于 是 便 提 供 了 分 析 两 种 个 体型 (A5A 和 ARS) 之 连锁 关系 的 机 会 。 用 这 一 支 小 鼠 进行 交配 繁殖 , 重组 的 单元 型 ( 表 型 群 ) 可 以 遗 。481 。 传 下 去 , 并 证 明 没 有 ARS 个 体型 。 根 据 这 些 资料 , 便 可 以 把 BALB /C，A1J, 重组 体 的 遗传 标记 在 染色 体 上 的 分 布 表示 为 ， Vu 个 体型 Ca 同 种 寞 型 A/J ED BALB/C vate gine eg Leal 重组 体 ASA* ARS- Lea 这 些 观 察 提示 V 基因 数目 相当 多 ,足以 观察 到 它们 之 间 的 交换 , 从 而 还 提示 有 可 能 see 类 实验 制作 出 小 鼠 Va 基因 图 (Eichmann %, 1974), 后 , 还 要 提 到 有 人 注意 到 某 些 品系 小 鼠 * BH VL 区 的 一 个 肽 朋 可 能 作为 遗 传 标 记 ， res “In-iKEe” (Edelman 和 Gottlieb, 1970). 后 来 ,又 发 现 l-KEMT fa 表面 抗原 Ly3-1 连锁 (Gottlieb, 1974), 根据 这 种 连锁 关系 , 可 以 推测 小 鼠 的 Vr 基 因 可 能 是 位 于 6 号 染色 体 (XI 连锁 群 ) 上 的 (Itakura 等 ,1972) 。 总 结 起 来 ,根据 人 家 兔 和 小 鼠 免 疫 球 蛋白 遗传 标记 的 研究 , 对 于 免疫 球 蛋白 遗传 控 制 可 以 得 出 几 点 重要 的 结论 : 1) 重 链 和 轻 链 的 同 种 异型 标记 是 遵守 Mendel 定律 的 方式 遗传 的 ,并 且 不 存在 性 连 锁 。 有 证 据 提 示 重 链 C 区 的 每 一 个 结构 基因 , 只 有 一 个 复 本 ; 2) 免疫 球 蛋白 重 链 , 0 和 上 轻 链 的 合成 是 受 位 于 常 染 色 体 上 , 彼此 不 相连 锁 的 HK 群 基因 编码 的 ;而 重 链 的 类 别 和 亚 类 又 是 由 彼此 连锁 的 不 同 的 结构 基因 编码 的 。 目前 已 证 明 人 类 重 链 基 因 位 于 第 六 号 染色 体 上 (Smith 和 Hirschorn, 1978), si « BHM 重 链 分 别 位 于 第 六 号 和 第 十 二 号 染色 体 上 (Hengartner 等 ,1978) ; 3) 免疫 球 蛋白 的 多 肽 链 ( 重 链 或 轻 链 ) 是 受 两 个 不 同 的 基因 ，V 和 C, 控制 的 ， 即 两 个 基因 决定 一 条 肽 链 。 这 要 求 在 一 定 发 育 时 期 存在 连接 V, C 基因 的 特殊 遗传 机 制 ; 4) 对 于 大 多 数 抗 体 分 变 细 胞 ,一 定时 间 只 有 一 个 亚 类 的 重 链 基因 和 一 个 型 的 轻 链 基 因 被 激活 。 同 时 , 任何 一 对 同 种 异型 等 位 基因 中 , 只 有 一 个 能 表现 出 来 , 即 存 在 等 位 基 互 斥 现象 ; 5) VY 和 C 基因 的 数目 。 根 据 遗 传 学 分 析 资 料 , 可 以 假定 C 区 结构 基因 的 数目 不 多 ， 人 V- 基 因 C- 基 因 3 K Ia Ib Il III 一 轻 链 a 贡 和 a 15-10， 人 类 免疫 球 蛋 白 和 小 鼠 轻 链 基因 的 最 低 数 目 和 可 能 的 排列 。 每 一 横 排 上 的 基因 假定 是 位 于 同一 条 染色 体 上 。 小 鼠 Ve* 基因 的 最 低 数 目 可 能 超过 8， 第 二 个 V; 基因 的 存 在 还 不 肯定 ( 据 Milstein 和 Munro, 1973), 。482 。 大 约 相 当 于 同族 专 一 性 的 总 和 。 如 在 人 类 至 少 存在 10 种 Ca 基因 和 4 种 Cr 基因 。 根 据 连锁 和 交换 等 资料 ,还 可 以 大 致 确定 它们 在 染色 体 上 的 排列 顺序 至 于 V 区 结构 基因 的 数 目 问题 , 则 更 为 复杂 。 显 然 , 在 高 等 脊椎 动物 可 能 存在 相当 于 重 链 ， 上 和 4% 轻 链 的 三 类 V 基因 , 即 V.. V. VV. 基因 ; 而 每 一 类 中 又 存在 不 少 于 肽 链 V 区 亚 群 数目 的 V BA, 如 人 类 可 能 有 3 个 Vu, 44% Vi, 7144 Vi 基因 (Milstein 和 Munro, 1973) (A 15-10). V 基因 的 数目 和 构造 是 抗体 多 样 性 起 源 的 关键 问题 , 将 在 下 一 节 讨 论 。 二 、 免 疫 球 蛋白 的 基因 结构 和 抗体 多 样 性 的 起 源 抗体 多 样 性 起 源 及 其 遗传 控制 是 现代 免疫 学 至 今 争论 未 决 的 中 心 问题 。 从 上 述 遗 伟 学 研究 结果 ,已 经 对 免疫 球 蛋白 的 肽 链 结构 基因 的 最 低 数 目 和 在 染色 体 上 的 排列 有 了 初 步 的 认识 ; 并 且 有 证 据 提示 一 个 相同 的 C 基因 可 能 和 若干 不 同 的 Y 基因 连接 成 一 个 VC 基因 ,决定 抗原 结合 位 点 易 变 区 的 多 样 性 。 然 而 ,一 些 关 键 问 题 仍 未 得 到 解决 。 在 一 个 体 HV 基因 究竟 存在 多 少 种 变异 形式 ? V 区 是 由 一 个 基因 ， 还 是 几 个 基因 相互 作用 编 码 的 ,是 否 存在 相当 于 高 变异 区 的 DNA ARR? Y 和 C 基因 又 是 通过 什么 机 制 连接 起 来 ,共同 编码 一 条 肽 链 ? 这 些 问 题 都 需要 在 分 子 水 平 对 抗体 合成 细胞 的 基因 组 及 免疫 球 蛋 白 基 因 结构 进 行 分 析 , 才 可 望 得 到 解决 。 (一 ) 免疫 球 蛋 白 基 因 结 构 和 移 位 机 制 随 着 免疫 球 蛋 白 肽 链 mRNA 的 纯化 ,以 及 其 基因 的 分 离 , 扩 增 的 成 功 , 目前 已 可 能 通过 分 子 杂交 估计 抗体 合成 细胞 内 Y 基因 的 数目 和 排列 方式 ,甚至 直接 分 析 Y HA 的 全 部 一 级 结构 。 现 将 这 些 方面 的 结果 , 简 述 如 下 : 1. 免疫 球 蛋 白 肽 链 mRNA 的 结构 Ig 链 mRNA 及 其 反 转 录 的 c-DNA 可 以 作为 分 子 杂 交 的 探测 分 子 (Probe) 来 估量 细胞 内 免疫 球 蛋 白 基 因 复 本 数目 和 排列 方式 。 为 了 进行 分 子 杂 交 实 验 ,就 应 知道 Ig 链 mRNA 的 构造 。 其 次 ,虽然 有 许多 证 据 表明 重 链 和 轻 链 的 合成 是 各 自 受 一 个 完整 的 mRNA 控制 的 ,并 提示 V, C 基因 的 连接 可 能 发 生 在 转录 或 转录 前 的 水 平 。 但 是 ， 这 一 假定 还 需要 从 Ig 链 mRNA 的 构造 得 到 直接 的 证 明 。 Milstein LHS OH Ule T/A HEI MOPC21 轻 链 mRNA 的 排列 顺序 ,包括 T 核糖 核酸 酶 酶 解 片段 (包括 25 个 豪 聚 核 苷 酸 ) ， 以 及 3 端 非 翻 译 区 (UT) 内 邻近 poly A 1,250(+ 100) < 150 >; 50 ;<— 321 —>.<— 321 —+,<— 200 —>,<— 200 一 > 1 | ee. SUT Pp V 让 ‘1-72.89 T. R22 Seip 图 15-11 MOPC21 轻 链 mRNA 构造 ， 示 各 区 域 的 长 度 。 mRNA 全 长 约 为 1, 50K MR, UT 为 了 端 不 翻译 部 分 ，3” UT 为 3 端 不 翻译 部 分 ， 了 为 前 体 区 域 ( 据 Milstein 等 ，1974)。 。 483° 的 52 核 背 酸 的 排列 顺序 (Milstein 等 ,1974) 。 同样 地 ， 又 测定 了 MOPC21 重 链 mRNA 的 部 分 排列 顺序 〈Cowan 等 , 1976) 。 根据 这 些 初 步 结果 ， 可 以 确定 轻 链 mRNA 的 大 体 构造 和 各 区 域 的 长 度 , 并 证 实 一 个 单一 的 mRNA 分 子 含 有 轻 链 C 区 和 区 全 部 顺序 的 信息 ,并 且 Y 区 和 C 区 是 紧密 相连 的 (图 15-11) 。 -顺便 提 及 ， 有 人 发 现 免 疫 球 蛋 £4 轻 链 ou mRNA Z 3’ 端 顺 序 和 珠 蛋白 mRNA 相应 部 分 是 同 源 的 ， 并 且 可 能 具有 两 个 特殊 的 发 夹 状 构造 (图 15-12) 。 它 们 或 许可 能 在 mRNA 从 核 内 到 核糖 体 的 转运 中 或 降解 速度 的 调控 ”中 起 识别 作用 (Proudfoot 和 Brownlee, 1974) 。 2. 基因 移 位 机 制 瑞士 巴塞 尔 免疫 学 研究 所 的 再 ozumi 和 Tonegawa (1976) 利用 核酸 分 子 杂 交 方 法 研究 小 鼠 胚 胎 和 分 化 细胞 CRA) 之 V, C eee py 基因 在 DNA 上 的 分 布 。 HEM 12-13 KM WA MOPC321 浆 细 胞 瘤 (分 这 上 轻 链 ) 分 eam oe mo 离 的 DNA, 用 BamHI 限制 性 核酸 酶 酶 解 ， g+ gt ti 再 经 过 琼脂 糖 电泳 分 离 成 大 小 不 同 的 片 Bo fi mm 7 然后 ， 同 :5I-MOPC321 « #% mRNA RE 杀人 Avu ”的 靠 C 端 半 段 ( 含 C 区 ) 进行 分 子 杂 交 ， 以 4A-G" cuT^A-^-U-A-^A"uc-c-poy4j 测定 上 < 链 的 V 区 和 C 区 在 DNA RE EA 图 15_12 小 鼠 免 疫 球 鼻 白 皮 链 mRNA 之 3 端 (a) 同 分 布 。 结 果 发 现 胚胎 DNA A PAS AA BE 家 免 8 珠 蛋白 mRNA Z 3’ 端 〈b) 的 比较 。 方 框 内 为 (600 万 道 尔 顿 和 390 万 道 尔 顿 ) 都 能 同 完整 ME Eee een Proudfoot 和 ig « mRNA ( 含 VAC 区 ) 杂交 。 可 是 ， 只 有 分 子 量 较 大 的 片段 (600 万 道 尔 顿 ) 才 能 lal « HE MRNA 的 3 端 半 段 ( 只 含 C 区 ) 杂交。 因此 ，C 基因 应 位 于 较 大 的 片段 上 。 F 一 方面 ， 成 体 细 胞 (MOPC321) RA—/\BDNA (240 万 道 尔 任 碱 基 对 im) 能 同时 和 V BAA, CHAZ Geax SE+V Eo MH RE Ve i boas: =e 和 C, ZAHA aH DNA 上 Che | aa Ct 的 分 布 可 能 相距 很 远 ， 而 在 淋巴 细胞 分 化 过 程 中 ， 通 过 某 种 方式 SE+V+C+3HE MOPC 321 肿瘤 的 移 位 ， 许 多 V。 基因 中 的 一 个 4 | 移动 到 CHAM, HACER 15-13 小 鼠 经 BamHI 限制 性 内 切 酶 作用 产生 之 DNA ER, # by ve AV. 和 Ce 基因 。 箭头 示 BamHI ARAMA, S'E 和 IE fe 起 来 了 (图 15-13) 。 sa ae 种 m-RNA 分 子 在 5 -和 3“- 端 的 不 翻译 部 分 ( 据 Hozumi 和 Tonega- 移 位 重 排 的 结果 ，VC 基因 连 成 wa, 1976), * 4846 _ 体 ,并 以 这 种 形式 进行 转录 ,结果 产生 的 mRNA SOTERA V 区 和 C 区 的 全 部 信息 。 至 于 V 基因 移 位 的 具体 方式 ,曾经 提出 过 许多 种 设想 的 模型 (图 15-14) 。 除去 “ 复 本 -插入 ”模型 (图 15-14, A) 外 ,其 他 三 个 模型 (图 15-14, B, C, D) 都 是 和 目前 的 实验 事 实 相 容 的 。 除 此 以 外 ， 还 提出 过 其 他 几 种 模型 ， 可 参看 Williamson 和 Fitzmaurice (1976) ， 这 里 不 再 歼 述 了 。 已 知 抗体 形成 细胞 只 产生 一 种 专 一 性 的 MERE Ly, 抗体 。 更 具体 地 说 , 只 表现 一 个 V 基因 。 如 “~ ES 果 存 在 多 个 V。 基因 ， 就 必须 有 一 种 机 制 来 jas 保证 只 激活 一 个 特定 的 V。 基 因 。 根 据 上 述 发 f= Ee rN 现 ,可 以 设想 当 一 个 V 基因 通过 移 位 和 C 基 因 连 接 时 ,这 件 事 本 身 就 可 能 激活 这 两 个 基 py pms Vi C 因 。 同 理 , 还 可 以 进一步 解释 “等 位 基因 互 斥 ” SS 现象 ， 即 只 有 已 连接 的 VC 基因 上 面 荷 载 的 同 种 异型 标记 才能 表现 出 来 。 并 且 还 可 以 假 定 这 一 条 同型 染色 体 还 可 能 通过 倍增 或 体 细 ssh 胞 交换 而 成 为 纯 合 子 的 (Hozumi 和 Tone-- gawa，1976) 。 C) 缺失 a V; 3. REREAHEARH. 插 人 顺序 的 发 TSS 现 。 1 同一 组 工作 者 还 采用 址 传 工程 技术 来 研 yn 究 免 疫 球 蛋 白 的 基因 结构 。 其 原理 是 把 分 离 ER RYZE A A — FE BY RR CA BE FL) FE | BAR SARE. 这 样 得 到 大 量 BS ee omen DD 的 ,均一 的 无 性 繁殖 的 DNA(ClonedDNA)， 便 可 以 供 进 行 基 因 组 或 基因 结构 分 析 之 需 (Tonegawa 等 , 1977; Brack 和 Tonegawa, 1977)。 他 们 先 从 HOPC2020 浆 细 胞 瘤 的 DNA 之 EcoRI 酶 解 片段 分 离 和 浓 集 含 Ig 基因 的 DNA FER. 将 这 些 DNA FEA 2gt Wam403 喉 菌 体 的 基因 组 重组 后 ， 转移 到 大 肠 杆菌 (E. coli 803) 内 扩 增 ， 并 用 1-2 链 mRNA 进行 原 位 杂交 , 筛选 出 各 种 含 Ig: 基 因 的 菌株 。 利用 这 种 方法 ， 他 们 从 浆 细 胞 瘤 (了 OPC2020) 得 到 了 一 个 含 AV, FC, 基因 的 无 性 繁殖 DNA (1g303) 的 菌株 (Brack 和 Tonegawa, 1977). 将 这 样 得 到 的 Ig303DNA 片段 (7.4 什 碱 基 ) 同 1 HE MRNA (HOPC2020) 进行 分 子 杂 交 ， 然后 用 电子 显微镜 观察 两 条 链 的 互补 配对 的 情况 。 在 所 采用 的 杂交 条 件 (57°C, 0.56M Na*, 70%Y/V 甲 酰胺 ) 下 ，DNA 片段 完全 变性 , mRNA 同 互补 的 ( 非 密码 的 ) DNA 单 链 杂 交 。 结果 形成 一 个 单 链 的 DNA 环 , 其 两 侧 各 有 一 个 杂交 区 段 ,随后 各 自 再 延伸 为 单 链 的 辟 〈 图 15-15) 。 然 后 ,可 见 及 环 (R=loop) 分 两 步 形成 。 当 在 .25"C 继 续 保 温 时 ， 男 一 条 密码 DNA 链 可 能 再 和 这 一 构造 的 左右 臂 互 补 结合 (A 15-16, a); 最 后 再 扩展 到 和 两 个 杂交 区 段 之 间 的 单 链 DNA 环 互补 结合 ,形成 一 个 三 环 构造 (Triple loop) 图 15- 16,b。 根据 对 许多 杂交 构造 的 测量 得 到 各 区 段 的 长 度 列 于 表 15-6。 从 表 上 的 数据 可 。485 。 mr 32 bai 图 15-15 变性 的 Ig 303 DNA Bef] HOPC2020mRNA 退 火 时 形成 的 杂交 构造 。 箭 头 示 DNAXRNA 杂交 区 段 的 终点 ? 注 意 b 图 上 ， 较 长 的 杂交 区 段 的 末端 有 一 短 的 尾巴 〈 如 右 下 角 简 图 上 ， 箭 头 所 示 ) ( 据 Brack 和 Tonegawa, 1977), 图 15-16 Ig303DNA 和 HOPC2020 mRNA © TERK R Wi 的 两 步骤 ( 据 Brack 和 Tonegawa, 1977), a 1 见 , 一 个 杂交 区 眉 (466 + 40 BERD LE (380 +30 BHR) 略 长 些 。 在 电镜 图 片上 ， 7 - 15-17 1g303DNA 和 Ig13HaeIIIB .片段 形成 的 杂交 构造 。 Ig13 片 有 的 一 端 和 1g303DNA 相应 的 V 区 杂交 ?箭头 示 杂 交 终 止 点 ( 据 Brack 和 Tonegawa，1977)。- 较 长 的 区 段 常常 拖 着 一 条 短 的 “ 尾 EL” (50 一 100 核 昔 酸 长 度 ， 可 能 相 当 于 mRNA 之 3 端 PolyA 部 分 ) ,位 于 DNA 片段 靠 右 端 (图 15- 15,b) 。 因 此 ,根据 已 知 轻 链 mRNA 的 分 子 构造 (图 15-11)， 这 提示 较 长 的 同 源 区 段 是 C 基因 顺序 , 而 较 短 的 区 段 是 VE 因 顺 序 。 利用 胚胎 的 一 个 Vi 2B Hr Be Clg13 HaeIIIB } B3,1-5 什 碱 基 ) 同 Ig303 DNA 片段 (7.4 (FOR HE) 杂交 进 一 步 证 实 较 短 的 同 源 区 就 是 基 因 顺 序 ( 图 15-17) 。 根据 这 些 观察 资料 ， 可 以 作出 Vx 和 Ci 基因 在 Ig303 DNA 上 的 分 布 图 ， 结 果 发 现 Vi 和 C; 基因 之 间 存 在 相隔 1250 BRIA Hr BE (或 间隔 片段 ) (图 15-18) 。 由 于 Ig303 无 性 繁殖 DNA 来 源 于 一 种 产生 1; 链 的 桨 细胞 “486 。 表 15-6 Ig303DNA 分 子 杂 交 构 造 的 长 度 测 量 间隔 顺序 RNA . DNA 杂交 分 子 Ig303XHOPC2020 | 3.75+0.37 | 1. .16 |0. .027|0. .027| 1.30-+0.13 mRNA(n = 23) R- 环 1g303 x HOPC2020 mRNACn = 53) 杂交 分 子 1g303 XIg13 HaeIIIB FrBe (n = 25) 7: Ig303DNA 各 区 段 的 长 度 是 根据 图 15-15a, 15-15b, 15-15c 的 杂交 分 子 构 造 的 电子 显 微 照 片 直接 测量 的 。 每 一 区 侦 的 平均 长 度 和 标准 误 均 用 任 碱 基 (Kb) 单位 表示 。n 三 测量 的 杂交 分 子 的 数目 。 * 包括 “C A” ANA aI Fe GE Brack 和 Tonegawa, 1977), 瘤 , 而 不 是 胚胎 细胞 。 Ig303 DNA 片段 的 . V, C 基因 应 该 已 经 经 历 过 移 位 重 排 。 后 来 , 了 他们 又 得 到 了 7.5 什 碱 基 胚 胎 Cx 基 因 片 侦 和 3.2 什 碱 基 胚 胎 V; 基因 片段 的 无 性 繁殖 DNA。 电 子 显微镜 检查 这 两 种 无 性 千 殖 DNA fil 1g303DNA 的 杂交 构造 ,同样 含有 1,250 碱 基 长 度 的 插 人 片 假 。 因 此 ， 这 种 插入 顺序 不 太 可 能 是 无 性 繁殖 过 程 中 产生 的 假象 ， 而 是 在 基因 内 原来 就 存在 的 。 总 之 ,目前 认为 在 胚胎 期 ,免疫 球 蛋白 的 Le V 基因 和 C EAR. 在 淋巴 细 | 胞 分 化 过 程 让 ,特定 的 一 个 立 基因 发 生 移 位 ， | PNT 下 结果 ViC 基因 靠近 。 但 并 不 是 紧密 地 连 图 15-18 1g303DNA 经 EcoRI Ag HRY 7.4 Kb BEE, 在 一 起 ， 两 个 基因 之 间 还 有 1,250 碱 基 的 间 。 v 和 Cc 基 因 的 结构 。 各 民 长 度 用 件 碱 基 (Kb) 单 位 表示 。 隔 。 如 前 述 , 轻 链 mRNA 编码 一 条 v,c x 箭头 示 转 录 方 向 GE Brack 和 Tonegawa, 1977), 紧密 连接 的 完整 的 多 肽 链 。 比 较 图 15-18 和 图 15-11， 可 以 看 出 DNA 上 存在 于 V 基因 和 C 基因 之 间 的 插 人 顺序 是 不 翻译 的 。 于 是 ， 便 发 生 了 一 个 有 兴趣 的 问题 ， 存在 不 翻译 的 插 人 顺序 的 DNA 如 何 转录 出 编码 一 条 连续 的 轻 链 MRNA 呢 ? 一 种 可 能 性 是 RNA Smet V,C 区 之 间 的 间隔 。 另 一 种 可 能 性 是 DNA 先 转录 出 一 条 保留 着 插 人 估 序 的 前 MRNA, 然后 在 “加 工 > 过 程 中 通过 特殊 的 “剪接 ”(Splicing) 机 制 , 把 不 转录 的 部 分 去 除 掉 。 目 前 的 证 据 支 持 后 一 种 机 制 。 除 免疫 球 蛋白 基因 外 , 目前 还 发 现 真 核 细胞 的 许多 结构 基因 (如 8- 珠 蛋白 基因 、 白 蛋 ARAN NRE ABAD) 内 部 都 存在 插 人 顺序 ( 亦 称 间隔 顺序 或 基因 内 含 子 ) (参看 Gjl- bert, 1978; Marx, 1978; Williamson, 1978), 目前 已 经 公认 真 核 细胞 结构 基因 的 存在 不 翻译 的 插 人 顺序 ， 因 而 把 基因 分 隔 成 几 段 ,表达 的 (编码 顺序 ) OMB (Exon) 和 不 表达 的 ( 非 编码 顺序 ) ASF 〈intron)， 相 间 排 列 。 这 是 真 核 基 因 结 构 的 一 个 重要 特 点 ,在 原核 基因 没有 发 现 过 这 种 情况 。 真 核 基 因 这 种 特殊 结构 有 什么 生物 学 意义 呢 ? 有 人 假定 “剪接 ”机制 的 精确 性 是 由 核 酸 酶 对 mRNA 基因 内 含 子 的 特殊 二 级 结构 的 识别 专 一 性 来 保证 的 。 因 此 , 基因 内 ST 边缘 的 点 突变 就 不 只 是 改变 单个 氨基 酸 ,而 且 可 能 改变 “剪接 ?地 点 , 从 而 导致 增加 或 丢失 一 段 肽 链 。 其 次 “剪接 ?机制 也 不 可 能 绝对 准确 , 通过 “ 移 码 ” 同 一 转录 单位 就 可 能 产生 完 全 不 同 的 另 一 条 肽 链 。 总 之 ,通过 这 些 机 制 可 能 增加 分 子 变 异 机 会 并 加 快 分 子 进化 的 速 度 。 © 487 * 4. V 基因 的 结构 为 了 得 到 可 供 核 背 酸 顺序 分 析 和 足够 数量 的 可 供 分 子 杂 交 的 纯 的 探测 分 子 ，Leder 实验 室 利 用 从 小 鼠 MOPC-149 « 轻 链 mRNA 制备 的 cDNA 5 pCR1-K40 质粒 体 外 重组 后 进行 无 性 繁殖 ， 并 开始 进行 上 轻 链 结构 基因 闫 序 的 初步 分 析 ' (Seidman 等 ， 1978a) 。 另 一 方面 ，Tonegawa 等 从 鼠 胚 DNA 的 EcoRI 内 切 酶 酶 解 片 眉 中 浓 集 了 一 个 含 1 轻 链 基因 的 4.8 什 碱 基 对 的 DNA 片段 。 然后 将 这 一 DNA APRA Agt Wam403 体外 重组 后 ,转移 到 E. coli803 内 ， 成 功 地 得 到 了 含有 Viz 基因 的 无 性 繁殖 DNA (Agt WE3-Ig13) (Tonegawa 等 ,1977) 。 Tonegawa (1978) 最 近 报 告 了 小 鼠 胚胎 无 性 繁殖 V; 基因 (包含 750 碱 基 对 的 DNA 片段 ) 的 全 部 排列 顺序 。 将 根据 DNA 顺序 推导 出 的 肽 链 顺序 同 和 入 链 的 V 40 OD 0 0 o0 a @ 0 0 00 mo Li 二 JD 有 ES OE) A SS SE A a0) Oo Bg 目 国 0 o 8 a an 3 Oe gine m0 | 20 3040 ， 50 | 60 as 90s 40 80 cn fee BL 15-19 小 鼠 A 和 An 轻 链 易 变 区 和 胚胎 Via 基因 DNA 比较 的 示意 图 。 图 中 部 几乎 连续 的 粗 黑 线 , 示 大 多 数 轻 链 相同 的 氨基 酸 排列 顺序 ， 空 格 示 它 们 不 同 的 位 置 。 黑 方 块 示 蛋 白 顺 序 和 DNA 顺 序 相 符合 的 位 置 。 在 4 和 An 链 的 V 区 之 15 个 不 同 的 位 置 中 ;DNA 和 Ai(CMOPC315) 符合 的 有 11 个 位 置 ,和 A, (MOPCI104E) 一 致 的 有 4 个 位 置 ( 据 Tonegawa 等 ，1978)。 区 顺序 比较 ,这 一 DNA 片段 的 顺序 和 an 链 的 顺序 更 为 符合 (图 15-19)。 因 此 ,应 是 Va 基因 ,并且 是 来 源 于 种 质 系 的 基因 。 图 15-20 WHT RE Vi, 轻 链 基因 之 DNA 顺序 ,以 及 同 已 知 1 轻 链 氨基 酸 顺 序 的 对 比 。 从 Vi ER DNA 顺序 图 , 可 得 出 几 点 重要 的 结论 : 1) DNA 顺序 证 实 Y 区 和 C 区 之 间 确 实 存在 插 人 顺序; FH KE Sh ON 端 19 肽 ) 靠近 轻 链 的 结构 基因 ,但 彼此 并 不 是 连续 的 ,领头 段 的 大 部 分 顺序 和 基因 的 其 余部 分 之 间 相 隔 93 碱 基 对 的 插 人 顺序 ; 2) Vi, DNA 顺序 中 存在 三 段 高 变异 区 密码 (AV, HV:,，HVs) 。 这 说 明 在 种 质 系 基因 顺序 内 部 确实 存在 高 变异 区 密码 ,这些 DNA HEARED CE he 种 机 制 插入 的。 总 之 ,根据 上 述 的 实验 结果 ,小 鼠 轻 链 有 功能 的 基因 具有 下 述 结构 : SSL BE (45 碱 基 对 ) 一 插 人 顺序 (93 碱 基 对 ) 一 V 区 (306 AER IH AME (1250 WER) —C 区 (348 REM). EV 区 内 还 分 布 着 三 段 高 变异 顺序 (AV, V2, HVs)o 以 上 这 几 点 是 评价 免疫 球 蛋白 多 样 性 起 源 的 理论 模型 时 ;必须 考虑 到 的 直接 证 据 * 5,“J” 基 因 片 段 和 V /J 连接 从 Tonegawa 工作 组 在 1976 年 对 免疫 球 蛋 白 基 因 结 构 的 研究 取得 重大 突破 以 后 ， 近年 来 这 方面 的 研究 在 国际 上 进展 很 快 ， 竞 争 非常 剧烈 。 除 瑞士 巴塞 尔 免 疫 学 研究 所 ”Tonegawa 实验 室外 ;美国 加 州 理 工学 院 Hood 实验 室 ， 国 立 卫 生 研究 院 Leder 实验 室 , 以 及 英国 剑桥 分 子 生 物 学 实验 室 是 主要 的 竞争 对 手 。 这 些 实验 室 对 轻 链 和 重 链 基 结构 的 深入 研 究 , 进一步 揭示 了 基因 移 位 机 制 的 许多 细节 。 对 NZB 纯 系 小 鼠 的 22 个 浆 *。488 。 CCCATACTAAGAGYTATATTATGTCTGTCTCACTGCCTGCT6CTGACCAATATTGAAAA- AATAGACTTGGTTTGTGA GGGTATGATTCTCAATATAATACAGACAGAGTGACGGACGACGACTGGTTATAACTTTTATTATCTGAACCAAACACT 4, MetAlaTrpIleSerLeuIleLeuSerLeuLeuAlaLeuSerSer * : ; * Ay HetAlaTrpThrSerLeulleLeuSerLeuLeuAlaleuCysSer MetAlaTrpThrSerLeulleLeuSerLeuLeuAlaLeuCysSerGly UGAPhe ATTATGGCCTGGACTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCTGCTCAGGTCAGCAGCCTTTCTACACTGCAGTGGGTATGCAACAATACACATCTTGICTCTGATIT "TAATACCGGACCTGAAGTGAATATGAGAGAGAGGACCGAGAGACGAG TCCAGTCGTCGGAAAGATGTGACGTCACCCATACGTTGTTATGTGTAGAACAGAGACTAAA A, GlyAlaIleSerGlpAlaValValThrGlnGluSerAlaLeuThrThrSerProGlyGluThrValThrLeuThr * * * Ay GlyAlaSerSerGlpAlaValValThrGlnGluSerAlaLeuThrThrSerProGlyGlyThrVallIleLeuThr 1 10 20 AlaThrAspAspTrpIleSerTyrLeuPheAlaGlyAlaSerSerGlnAlaValValThrGl1nGluSérAlaLeuThrThrSerProGlyGlyThrVallleLeuThr GCTACTGATGACTGGATTTCTTACCTGTTTGCAGGAGCCAGT TCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACT CGATGACTACTGACC TAAAGAATGGACAAACGTCCTCGGTCAAGGGTCCGACAACACTGAGTCCT TAGACGTGAGTGGTGTAGTGGACCACCTTGTCAGTATGAGTGA + ee Gly Leu Aan Val 严 + A CysArgSerSerThrGlyAlaValThrThrSerAenTyrAlaAsnTrpValGinGlnLysProdspHisLeuPheThrGlyLeulleGlyGlyThrAsndsnArgAla x. x * Ay CysArgSerSerThrGiyAlaValThrThrSerdAsenTyréladenTrplleGinGlubysProAsphisLeuPheThrGlyLeulleGlyGlyThrSerAspArgAla 30 40 50 : CysArgSerSerThrGlyAlaValThrThrSerAsniyrAlaAsnTrpValGinGluLysProAspHisLeuPheThrGlyLeulleGlyGlyThrSerAsnArgAla TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGT TCAAGAAAAACCAGATCATT TAT TCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAGCAACCGAGCT ACAGCGAGTTCATGACCCCGACAATGTTGATCATTGATACGGT TGACCCAAGTTCTTTTTGGTCTAGTAAATAAGTGACCAGATTATCCACCATGGTCGTTGGCTCGA HV1 HV2 为 ProGlyVal ProAlaArgPheSerGlySerLeuIleGlyAsnLyeAlaAlaLeuThri leThrGlyAlaGlnThrGluAspGluAlalleTyrPheCysAlaLeuTrp t * * * Ay ProGlyValProValArgPheSerGlySerLeulleGlyAspLysAlaAlaLeuThrileThrGlyAlaGlnThrGluAspAspAlaMetTyrPheCyeAlaLeuTrp 60 70 80 0 ProGlyValProvValIArgPheSer6lySerLeuIleGiyAspLysAlaAliaLeuThrIleThrGLyALaGlnThrGIuAspAspAIaMetTyrPHheCcySALaLeumTrp CCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGAT TGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTGCTCTATGG GGTCCACAAGGACAGTCTAAGAGTCCGAGGGACTAACCTCTGTTCCGACGGGAGTGGTAGTGTCCCCGTGTCTGACTCCTACTACGTTACATAAAGACACGAGATACC HV3 Cyc Arg | alPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlnProlysSerSerProserValThrLeuPheProProserSerGluGluLeuThr 100 * 110 * x * 120 * alPheGlyGlyGlyPhrLyeVal ThrValLeuclyGlnPro yeSerThrProThrLeuThrvValPheProProSerSerGluGluLeuLys txttygexggxggxacxaargtxacxgtxttrggxcarccxaartcxacxccxacxttracxgtxttyccexccxtcxtcxgargarttraar ctx : ctx agyagy ctx t t Ay TurSerAenkieTr x * * Ay PheArgAenHiePh isAsnAspMetCysArgTrpGlySerArgTnraArgThrLe orpTyrSerLeuThrThrIlePheLeuThrGlyGlyTyrMetSerLeuVal TACAGCACCCATTT ACAATGACATGTGTAGATGGGGAAGTAGAACAAGAACACTG GGTACAGTCTCACTACCATCTTCTTAACAGGTGGCTACATGTCCCTAGTC ATGTCGTGGGTAAAGETGTTACTGTACACATCTACCCCTTCATCTTGTTCTTGTGAGACCATGTCAGAGTGATGGTAGAAGAAT TGTCCACCGATGTACAGGGATCAG i vic TyrSerThrHisPh A CiuAenLysAlaThrLeuValCyeThrileThrAspPheTyrProGlyVal.... 130 * 180 去 * * Ae GluAenLyeAlaThrLeuValCyeLeulleSerAsnPheSerProGlySer.sss garaayaargexacxttrgtxtgyttratytcxaayttytcxcexggxtcx etx ctxataagy agy agy CysSerLeuLeuLeuvAG TGTTCTCTTTTACTATAGAGAAAT T TATAAAAGCTGT TGTCTCGAGCAACAAAAAGTTTTATTCAACAAATIGTATAATAATTATGCCTTGATGACAAGCTTTGTTTA ACAAGAGAAAATGATATCTCTTTAAATATT TTCGACAACAGAGCTCGTTGTTTTTCAAAATAAGTTGTT TAACATATTAT TAATACGGAACTACTGT TCGAAACAAAT 1-20 BR Vln 轻 链 基因 之 DNA 顺序 与 所 有 已 知 的 小 鼠 和 轻 链 之 氨基 酸 排列 顺序 的 直接 比较 。 基 AMR TRIS MOPC3154rr 轻 链 的 氨基 酸 顺 序 的 符合 程度 最 高 。 密码 从 臣 水 性 领头 仆 的 第 一 个 氨基 酸 (meth--19) 开 始 * 在 Ser.-5 起 被 一 个 93 碱 基 对 的 基因 内 含 子 (intron) 隔 开 ， 再 从 Gly.-4 继续 到 Phe 十 98， 突 然 终 止 。 Ai(MOPCI04E) 和 An(MOPC315) 轻 链 不 相同 的 位 置 用 〈 友 ) RAR AU 高 变异 区 (AV, HV» A HV.) 已 知 的 置换 用 (人 ) 表 示 。 加 横 线 的 氨基 酸 顺 序 受 其 下 方 的 DNA 编码 ， 加 横 线 的 DNA 顺序 和 上 方 至 少 一 种 蛋白 的 密码 符合 。 V/C (KR) 示 根 据 DNA 顺序 划分 的 V-C RRA, V/C (虚线 ) 示 根据 所 有 轻 链 顺 序 划 分 的 V-C 交界 点 ( 据 Tonegawa %, 1978), 细胞 瘤 株 上 轻 链 易 变 区 (V。) 的 氨基 酸 顺 序 的 比较 分 析 , 以 及 对 Ve 基因 部 分 核 苷 酸 顺 序 分 析 ， 均 证 明 编 码 上 轻 链 的 基因 可 分 为 三 段 , 即 易 变 区 V ( 残 基 1 一 98 或 99), 连接 区 “J” (FREE 99 或 100 一 102) 和 不 变 区 C ( 残 基 103 一 219) (Weigert 等 ，1978) 。 对 小 鼠 4 链 基因 顺序 分 析 也 发 现 有 类 似 的 “J? 片 段 存在 。 比 较 种 质 系 (胚胎 细胞 ) 2 轻 链 基 因 和 假定 已 经 过 重 排 和 突变 的 允 细 胞 瘤 1 轻 链 基因 的 核 苷 酸 顺 序 ， 进 一 步 发 现 胚胎 1 轻 。489。 REAR DNA rl 2 3 4 a Scar a DN NY Le. ba Ly a Pt J I, Cc yk 和 \ 1 让 让 ive Jie 浆 细胞 DNA 15-21， 小 鼠 胚 胎 和 产生 1， 链 的 浆 细 胞 之 A, 基因 的 排列 , 示 V. J 基因 片 段 通过 移 位 重 排 (Brack 等 ，1978)。 链 基因 的 V 区 又 分 为 两 个 编码 片段 , 即 领头 段 (L) 和 V;， 段 ,其 间 相 隔 一 个 93 碱 基 对 的 小 插 人 顺序 C1); “J” EAR eA C 基因 片段 之 间 相 隔 一 个 长 达 1250 碱 基 对 的 大 插 人 顺序 (TI) 。 然 而 , 在 已 分 化 的 骨髓 瘤 的 4 轻 链 基因 上 ,“J? 基 因 片 侦 和 Y 基因 片段 直接 相连 (图 15-21) 。 这 更 加 有 力 地 证 实 了 活跃 的 4 基因 是 由 于 V BARRA “I” ZAR 段 经 过 移 位 连接 形成 的 (Brack 等 , 1978) 。 至 于 “J” 和 C 基因 片段 的 连接 ， 则 可 能 是 通过 转录 后 核 内 1 链 RNA 的 剪接 ,加 工 实 现 的 (图 15-22)(Weigert 等 , 1978) 。 因 此 ， “J?” 基 因 片 段 可 能 同时 含有 连接 V,J,C 基因 片段 的 信息 , 而 在 基因 的 移 位 重 排 和 mRNA 的 剪接 中 起 关键 作用 。 对 上 轻 链 重 排 区 域 DNA 顺序 分 析 发 现 有 五 个 “J” 基 因 片 段 , 成 串 排 列 。 比 较 这 些 “J” 基 因 片 段 的 核 背 酸 顺 序 , 在 VY 基因 片段 和 “J?” 基 因 片 段 连接 点 附近 发 现 一 段 短 的 下 ike V V 人 J :. C 1 99 1 99 1 99 1 ,99 100 112 100 112 100 112 100 112 113 219 DNA Ff 1 os oe LIRR a peel DNA 己 分 化 1 99 112 100 112 100 112 113 219 DNASE 2 oy re oop ye FOR 己 分 化 1 99 112 113 219 { 转录 V3 Jp C pase Ve Jn C 一 | 1 99 112 113 219 1 99 112 100 112 190 112 113 219 核 内 大 转录 本 RNA BT { RNA 拼 接 ee Oia NEAR Se KS 2 : 13SmRNA 1 99 112 219 1 99 112 219 (a) (b) 15-22 s)\ii «ZEA DNA 片 眉 的 理论 模型 。 假 定 在 淋巴 球 分 化 过 程 中 ,各 基因 片段 在 DNA KF HEH, 并 通过 两 种 可 能 的 途径 产生 V/J 连接 : (2) DNA 水 平 第 二 次 重 排 ， 了 片段 移 至 靠近 C 片 段 的 地 方 , 其 间 的 本 顺序 缺失 ; Cb) 核 内 大 的 RNA CRAB MLR. AMBAW J PRG Weigert 等 ,1978)。 e 490 。 a 文 顺 序 一 一 CAC(CE)GTC ， 即 在 连接 点 两 侧 各 存在 一 段 反 向 的 重复 顺序 。 可 以 设 想 这 一 段 钥 文 顺序 可 能 形成 “ 逆 walk 2 IR iy YE” (“Inverted Stem yo hes Structure”), Mim V 和“J?” ArRaHE, 并 提供 酶 切 和 /1 连 \ 接 的 信息 ， 体 细 胞 水 平 的 DNA 重组 可 能 就 是 由 于 切除 V “I” kN i FrBezinlay — % Be DNA fff 5a - 成 的 (A 15-23) (Sakano 等 ， 1979;Max 等 , 1979) 。 从 上 述 事 实 , 可 以 推 想 不 同 的 V 基因 片段 fl “J” BARR, DARA 方式 连结 , WR VII 连结 点 的 任 何 移动 ， 都 可 能 在 体 细胞 水 平 产 生 抗 体 的 多 样 性 (Weigert 等 ， 1980), 这 将 在 下 一 节 再 讲 到 。 Y 顺便 提 及 , 重 链 基因 同样 存在 V， J,C S>R4&wW (Rabbitts 等 ， Vv V4l. J5 J4 1980a) ， 因 此 可 能 通过 同样 的 方 式 产 生 抗体 的 多 样 性 。 总 之 ， 由 于 免疫 球 蛋 白 基 因 结构 的 特点 ,基因 分 隔 为 许多 片 initia Te Te eT rr eee FRB ABH RNA RAW “ 幸 状 构造 ” 简 图 上 方 示 上 轻 链 V、] MCEREEHM, BH 剪接 ， 提 供 了 真 核 生 物 基 因 进 化 成 的 过 渡 构 造 , 下 方 示 此 "“ 茎 状 构造 ?之 假想 的 立体 模型 ， 在 V- 丁 连接 供 一 个 ax 等 1979), 的 新 方式 。 这 种 基因 进化 的 机 制 Be EO teres 在 正常 发 育 过 程 中 也 表现 出 来 B 细 胞 分 化 过 程 中 , 重 链 基 因 的 依 顺 序 表 达 就 是 一 个 例子 。 < < Q HO HOG Ooparaanran ne OOK Q2ADAOFO AAP 6. 重 链 基因 的 转换 B 细胞 分 化 过 程 中 , BREA (Cu) 依 顺 序 逐 次 表达 。 在 DNA K¥, 这 种 转换 可 能 是 由 同一 个 Va 基因 先 和 一 个 C。 基因 连接 起 来 ,共同 形成 一 个 活跃 的 转录 单位 ; 然后 又 转换 为 与 另 一 个 Ca 基因 (如 C;,) BR; 继 之 又 可 转换 为 与 另 一 个 Ca 基因 CHC.) 连 接 , 如 此 等 等 。 重 链 基 因 (Cu) 的 转换 机 制 , 假定 可 能 通过 下 列 几 种 模式 进行 (图 15-24) 。 这 些 模 式 都 可 以 用 实验 加 以 验证 , 而 目前 的 实验 结果 表明 可 能 是 按照 缺失 模式 进行 的 。 剑桥 分 子 生 物 学 实验 室 Rabbitts 等 (1980b) 用 含有 Cy» Ch 等 重 链 顺 序 的 无 性 扩 增 的 cDNA 作为 探测 分 子 , 用 Southern 吸 印 杂交 法 (Southern Blotting) 来 检 查 小 鼠 7 链 各 亚 类 (a, Yn 和 7Y1) 基因 在 各 种 抗体 分 泌 细胞 的 DNA 上 的 排列 。 实 验 结果 发 现在 分 刻 IgG., 和 IgG, WAH, 7. M7» 基因 在 DNA 上 都 发 生 过 移 位 重 排 。 其 次 ， 在 分 刻 IgG, 的 细胞 中 , 测 不 出 C;: BA; wm IgG, Ale PMA Cr 。491 。 BRA 和 Cr As MED wD IgA 的 细胞 ¥, Ne Ms Cy Crs Cr Crom Cres Ce Hh, WMA HC, 基 (Rabbitts 等 ， 1980b)。 同 样 地 , 对 14 个 表达 不 同类 别 重 HER! PEAT IZ HII. FA Southern 吸 印 杂 交 (A) 切除 -插入 模型 a s 法 检查 C,> Cas Cr， Ch 基因 的 数目 和 ea oe np i 顺序 与 胚胎 细胞 间 的 异同 ,也 得 到 类 似 的 结果 (Coleclough 等 ,1980; Cory (B) 复 本 - FMD ec Gay cf ic， 和 Adams，1980) 。 这 些 事实 支持 重 | | -- 链 Cy 基因 转换 可 能 是 按照 催 失 模型 进 4-H D> ue E 5 (C) 多 复 本 -同时 插入 模型 行 的 至 少 也 部 分 与 基因 缺失 有 关 Vv, Vv, Vs V2Cy V2C73V 2071 V2 V2 V2Ce 总 之 , 重 链 基因 表达 过 程 中 , 至 少 包 Sag oe a | Cae Cn. “” 括 两 次 DNA 水 平 的 移 位 重组 引 二 次 V 吕 (D) tty, Woe ee oe! 连接 和 一 次 Ca 转换 , 即 通过 基因 缺失 而 人 mt 发 生 的 Cu 基因 的 依 顺 序 表达 (Davis mex “=, 1980; Maki 等 , 1980). Ait, 也 有 Vist \a Gs 7 Sr ad was. fe 人 认为 Cs EAR BE E—TP PIS). “VERB: . 细胞 分 化 中 , 细胞 表面 IgD 出 现时 间 提 和 AR cv 基因 表达 可 能 通过 特殊 机 制 , 即 通 - = 4 图 15-24 ARRAY V/C 移 位 和 cn 转换 “过 mRNA 加 工 过 程 而 发 生 改 变 。 最 后 ， 之 理论 模型 。(A ) 一 个 Va 基 因 从 Vn 基因 库 中 切除 下 来 , 插 WHS] B 细胞 分 化 中 , 免疫 球 蛋 白 基 入 到 邻近 的 Ca 基因 ;然后 再 通过 一 系列 切除 和 插入 达到 CH 转换 ，(B ) 一 个 Va 基因 的 复 示 依次 插入 到 不 同 的 Ci 基 因 移 位 重组 还 支持 前 面 提 到 的 对 等 位 革 A; (C)—-+ Vu 基因 的 多 个 复 未 同时 插 人 到 所 有 的 Ca 基因 互 斥 现 象 的 解释 (485 页 ) 。 有 人 认为 A: (D) 先 通过 一 个 Vn 基因 和 将 要 表达 的 Ca 基因 之 间 we a! : 的 DNA EOD V-C 连接 ， 然 后 再 通过 Cu 这 一 现象 是 由 于 在 了 细胞 分 化 过 程 中 * 因 的 连续 缺失 而 实现 Ca 转换 ( 据 Cory 和 Adams, 1980), V/J 连 接 只 在 两 条 同型 染色 体 的 一 条 上 发 生 ， 形 成 一 个 活跃 的 转录 单位 的 结果 (Joho 和 Weissman, 1980), (二 ) 免疫 球 蛋 白 多 样 性 的 起 源 抗体 分 子 最 显著 的 特点 是 同 抗原 结合 的 专 一 性 , 以 及 这 种 专 一 性 的 多 样 性 。 例 如 , 一 种 纯 系 小 鼠 经 证 明 能 产生 近 8,000 种 抗 NIP 半 抗 原 的 不 同 的 抗体 分 子 〈 开 reth 和 Wil- liamson, 1973), 用 免疫 萤 光 法 , 估计 合成 1 轻 链 V- 区 特定 的 个 体型 的 浆 细 胞 的 数目 ， 也 推测 人 脾脏 内 至 少 存在 25,000 不 同 的 1 链 V- 区 的 细胞 (Pernis，1967) 。 对 于 抗体 多 样 性 的 起 源 , 虽然 有 各 种 推测 , 归结 起 来 存在 两 种 对 立 的 假说 ， 即 种 质 系 假说 (Germ-line hypothesis) 和 体 细 胞 突变 假说 (Somatic mutation hypothesis) 。 简要 说 来 ,种 质 系 假说 主张 编码 所 有 免疫 球 蛋 白 的 基因 都 包含 在 生殖 细胞 的 基因 组 内 , 抗 体 分 子 的 多 样 性 是 在 进化 过 程 中 通过 突变 和 选择 产生 的 。 反 之 , 体 细 胞 突变 假说 则 假定 抗体 的 多 样 性 , 至 少 一 部 分 ,是 为 数 较 少 的 种 质 系 基因 在 个 体 发 育 过 程 中 通过 体 细 胞 突变 产生 的 。 因 些 ， 体 细胞 罕 变 假说 所 设想 的 V 基因 数目 应 比 种 质 系 假说 设想 的 要 少 很 多 e 对 于 极端 的 种 质 系 立 场 ,每 一 类 \、 型 的 重 链 和 轻 链 至 少 要 假定 存在 10 种 质 系 基因 。 为 了 解释 V 区 亚 群 的 存在 , 还 要 假定 每 一 个 亚 群 可 能 包括 近 300 种 基因 复 本 ， 它 们 可 能 « 492 . 起 源 于 一 个 原始 基因 ， 通 过 大 量 的 纵 列 倍增 ， 以 及 缺失 或 插 人 而 产生 的 。 存 在 如 此 众多 的 纵 列 基因 复 本 的 情形 下 ， 通 过 不 等 交换 造成 基因 大 量 缺 失 的 机 率 显 著 地 增高 (例如 r- RNA 基因 ) ， 因 此 还 必须 假定 存在 特殊 的 机 制 以 保证 V 区 基因 的 稳定 性 〈(Milstein 和 Munso, 1973), 对 于 体 细 胞 突变 假说 , 则 假定 Y 区 种 质 系 基 因 大 约 相 当 于 V 亚 群 的 数目 ,然后 在 个 体 发 育 过 程 中 通过 体 细 胞 突变 增加 到 成 体 动物 之 全 套 抗 体 基因 数目 。 目 前 这 一 假说 遇 到 的 严重 困难 是 抗体 个 体型 遗传 现象 的 发 现 ,如果 能 遗传 的 个 体型 数目 很 大 的 话 , HRA V 基因 数目 也 要 相应 地 扩大 。 目前 的 一 个 折 囊 的 看 法 是 随 动物 种 类 或 链 的 类 型 不 同 , WFR SEAS 的 种 质 系 基 因 。 例 如 ,根据 肽 链 一 级 结构 和 统计 分 析 , DRA * EBD A SOV 基因 复 本 ，1/ 链 至 少 有 25 个 V 基因 复 本 (Cohn 等 , 1974) 。 在 现 有 的 种 质 系 基因 的 基础 上 , 淋巴 细胞 在 受 抗 原 刺 激 后 的 增生 分 化 过 程 中 , 还 可 能 通过 体 细 胞 突变 产生 更 多 的 免疫 球 蛋 白 基 因 (Cunningham, 1974; 1976) 。 对 于 这 几 种 假说 的 评介 ， 有 兴趣 的 读者 可 参 FS Gally (1973), Cohn 等 (1974), Milstein 和 Munro (1973), Williamson (1976) 的 综述 ， 以 及 Cunningham (1976) 编辑 的 《抗体 多 样 性 起 源 》 专 集 , 这 里 不 能 详 述 。 过 去 对 于 上 述 两 种 假说 的 检验 ,只 能 根据 间接 的 实验 证 据 ( 主 要 是 重 链 和 轻 链 的 一 级 结构 资料 ) 以 及 分 子 遗 传 和 进化 一 般 原理 进行 理论 上 的 探讨 。 然 而 , 问题 的 关键 在 于 直接 测定 种 质 系 细 胞 和 浆 细胞 基因 组 内 ，V 基因 数目 是 否 不 同 。 真 核 细 胞 基因 组 虽然 无 比 复 杂 , 由 于 分 子 遗 传 学 和 遗传 工程 技术 的 进步 已 开辟 了 直接 分 析 这 一 问题 的 可 能 性 。 目 前 ， 已 有 人 利用 同位 素 标记 的 重 链 (或 轻 链 ) mRNA 或 cDNA 作为 探测 分 子 , 通过 分 子 杂 交 技术 来 估计 免疫 球 蛋白 基因 的 数目 。(Tonegawa “, 1974; Tonegawa 和 Steinberg, 1976; Tonegawa 和 Hozumi, 1976; Rabbits 和 Milstein, 1977 Honjo 等 , 1976) 。 现 将 最 近 取 得 的 主要 结果 简 述 如 下 : 1. 种 质 系 免疫 球 蛋 白 基 因数 目 一 一 核酸 分 子 杂 交 瑞士 巴塞 尔 免 疫 研究 所 Tonegawa 实验 室 采 用 RNA-DNA 杂交 技术 来 研究 抗体 多 样 性 起 源 问题 。 为 了 方便 起 见 , 需 要 先 简单 介绍 一 下 这 一 技术 的 原理 (参看 Melli 等 ， 1971; Bishop, 1972), 当 双 链 DNA 变性 后 ,在 有 放射 性 标记 RNA 存在 时 , 在 退火 过 程 中 那些 同 DNA & 有 互补 顺序 的 RNA 分 子 就 可 能 形成 DNA-RNA 杂交 分 子 。 杂 交 的 RNA 分 子 不 被 RNAse 酶 破坏 ,易于 分 离 和 测量 。 在 一 定 退 火 条 件 下 , 产生 的 杂交 RNA AEE (CS) 依 赖 于 RNA 浓度 (R。),DNA 浓度 (C。 和 温 育 时 间 (t). 如 DNA 过 量 时 , 了 不 依赖 R,, 而 只 依赖 Cot 乘积。 这 一 原理 虽 似 简单 ,但 用 于 真 核 生 物 非 重复 (MEA) 基因 测量 时 ， 在 条 件 上 要 求 相 当 高 。 当 DNA 和 RNA 比值 太 小 于 10’ 时 , 便 不 能 测 出 单 复 本 基 因 。 因 此 ,对 RNA 碘 标 记 的 比 强度 要 求 相 当 高 。 根据 已 有 的 Balb/c 小 鼠 2 轻 链 氨基 酸 排 列 顺序 的 资料 , 18 条 链 中 有 12 条 有 相 同 的 顺序 (4, 型 ) ,其余 6 条 则 各 不 相同 ,和 2: 链 在 高 变异 区 有 1 一 3 氨基 酸 (相当 于 1 一 4 个 碱 基 ) 的 置换 (Cohn 等 , 1974) (图 15-25) 。 因此 ， 这 些 编码 V;, 基因 的 核 背 酸 I 序 之 间 假 定 应 存在 广泛 的 同 源 性 。 如 果 种 质 系 假说 是 对 的 ， 则 小 鼠 单 倍 基因 组 内 应 至 "493 。 t 8ZIS‘T TIA Z 0Z0ZH‘I IA 1 bhpSA‘T A 1 909SA‘T Al 1 0ZOdU‘T Wi 1 9ZI1S‘T I 0 & LOI ‘Z11 BF BR Y Gd 26 Sie FE 65 A li fi (4261 SH ugoD BE) AME MAM eH ay BN Be GUE A © 494 6 少 含 有 ?7 个 不 同 的 Vi 基因 。 一 个 编码 丸 链 的 mRNA 将 能 同 所 有 这 些 基 因 杂 交 。 因 此 ,Cot 曲线 应 指 示 每 单 倍 基因 组 内 应 有 7 个 复 本 。 反之 ,按照 体 细胞 突变 假说 , 如 果 dy 到 va 顺序 是 由 和 通过 体 细 胞 突变 过程 产生 的 , 则 Cot 曲线 将 指示 每 单 倍 基因 组 内 只 有 单个 复 本 。 实 际 上 ,Balb jc 小 鼠 Va 链 的 数目 远 超过 7， 据 统计 分 析 至 少 有 25 个 以 上 。 Tonegawa 等 制备 了 高 比 强 an 图 15-26 小 鼠 碘 标记 几 种 RNA 同 小 鼠 肝 DNA 的 杂交 。(〈@ ) M- 碘 标 记 的 MOPC-104E2 链 osname mRNA: (a) a, 6 HEH mRNA: (0) 18SrRNA mRNA (纯度 90% Dib; 使 同 箭头 指 Cot,, 值 ( 据 Tonegawa 和 Steinberg, 1976), 小 鼠 肝 胜 DNA “ 非 淋巴 组 织 ， 可 代表 种 质 系 基因 组 ) 杂交 。 从 图 15-26 所 示 结 果 可 Rl, Cot, 值 表明 V， 基 因 重 复 频 率 (Reiteration frequeney) 为 2 一 3。 此 外 , 从 图 EWA Ge], MRNA 和 小 鼠 珠 蛋 白 MRNA 的 Cot 曲线 几乎 是 重合 的 。 根 据 从 前 的 测 定 ; 已 知 小 鼠 珠 蛋 白 基 因 重 复 频 率 不 超过 3。18S rRNA 的 Cot 曲线 指示 的 基因 重复 频 率 约 为 200, 也 是 同 过 去 文献 数据 一 致 的 。 所 有 这 些 都 表明 实验 结果 是 可 信 的 。 因 此 , 这 些 结果 表明 能 和 MOPC-104E 2 链 mRNA 杂交 的 种 质 系 基因 数目 在 每 一 单 倍 基因 组 内 不 会 超过 几 个 。 剩 下 的 间 题 是 验证 编码 各 种 2 链 mRNA 之 间 碱 基 有 顺序 存在 广泛 同 源 性 DO ER 定 。 为 此 又 进行 了 HOPC-2020 1 链 mRNA 和 Mi104E 1 链 mRNA 之 间 的 竞争 杂交 实验 , 这 两 种 1 链 只 有 两 个 氨基 酸 的 差异 ( 见 图 15-25) 。 从 图 15-27 的 结果 可 见 , 异 源 的 (HOPC-2020) 2 # mRNA 分 子 和 同 源 的 (M104-E) 1 MRNA 分 子 位 于 同一 条 曲线 上 。 因 此 ,可 以 作出 结论 编码 这 两 条 1 链 V 区 的 核 背 酸 顺 序 彼 此 可 以 和 同一 基因 交叉 杂 交 ， 因而 是 很 相似 的 。 同 理 , 可 以 类 推 到 其 他 存在 氨基 酸 顺 序 广泛 同 源 性 的 2 链 。 因 此 , 从 上 述 核 酸 杂 交 测 定 的 结果 可 以 得 出 结论 ,种 质 系 基因 数目 太 少 ,不 足以 说 明 已 观察 到 的 小 i 2 链 的 多 样 性 (或 许 至 少 有 25 条 ) (Tonegawa 和 Steinberg, 1976; Tonegawa,1976) 。 英国 剑桥 分 子 生物 学 实验 室 利 用 小 鼠 几 种 浆 细胞 瘤 (MOPC21，MOPC321， MOPC41) 的 各 种 CemRNA 的 cDNA 复 本 进行 的 杂交 实验 证 明 每 单 倍 基因 组 内 只 存 在 1 一 5 基因 复 本 。 同 样 地 , 所 测 到 的 V. 基因 重复 频率 也 是 同上 述 C。 基 因 的 结果 相似 的 (Rabbits 和 Milstein, 1977; Milstein 等 , 1975; 1976) 。 此 外 ， 美 国 国立 卫生 研 究 院 Leder 实验 室 利 用 从 RPC-20 浆 细胞 A HE MRNA 制备 的 cDNA 作为 探测 分 于， 进行 的 核酸 杂交 实验 同样 证 明 在 产生 “或 1 链 的 瘤 细 胞 或 正常 组 织 的 DNA 中 ， 每 单 倍 基因 组 内 只 含有 大 约 两 个 基因 复 本 (Honjo 等 ,1976) 。 总 之 ， 从 几 个 实验 室 的 结果 看 来 ，V 和 V。 基 因 的 重复 数目 可 能 是 很 有 限 的 。 因此 , 没有 理由 相信 ， 这 些 基因 的 总 数 比 根据 蛋白 质 顺序 测定 得 出 的 亚 群 的 总 数 更 多 。 这 些 结果 似乎 排斥 了 每 一 种 1 或 对 链 变 异型 都 存在 相对 应 的 种 质 系 基因 的 可 能 性 。 或 者 。495 。 log Cot 说 ， 种 质 系 基因 的 总 数 太 少 ， 不 足以 解释 A 链 和 上 链 的 多 样 性 (如 前 述 , 根 据 氮 基 酸 顺序 和 统计 分 析 资 料 ，Vx 区 至 少 有 25 种 不 同 的 顺序 ) 。 最 近 ，Leder 实验 室 对 小 鼠 胚 胎 和 产 生 < 链 的 瘤 细胞 之 免疫 球 蛋 白 基 因 构 造 的 初步 分 析 却 得 出 不 同 的 结论 (Seideman 等 , 1978b; 1978c) 。 他 们 从 小 鼠 MOPC- . 149 Shae DNA 中 ,鉴定 出 至 少 6 个 编码 “ 链 V 区 基因 顺序 的 EcoRI 酶 解 片段 。 将 其 中 两 个 DNA 片段 制备 成 无 性 繁殖 DNA， 并 测定 其 V 区 基因 的 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 。 结果 发 现 这 两 个 基 因 在 1 至 站 97 密码 位 置 的 排列 顺序 是 很 相似 的 ， 但 是 图 台 -27” 碘 标记 M-104EAmRNA 和 未 标记 mRNAs 1 之 杂交 竞争 实验 。 (0) M104-EAmRNA; (e) H-2020 ”它们 在 高 变异 区 以 及 少数 恒定 区 域 同根 据 AmRNA ( 据 Tonegawa 和 Steinberg, 1976), MOPC-149 细 胞 之 < 链 推导 出 的 核 昔 酸 顺 序 有 少数 差异 ， 它 们 两 者 彼此 之 间 的 顺序 同样 也 有 少数 差异 。 因 此 ， 抗 体形 成 细胞 除 可 能 含有 其 表 型 上 表现 的 基因 的 顺序 (上 链 ) 外 , 还 可 能 存在 几 个 密切 相关 而 又 略 有 差别 的 基因 顺序 ， 它 们 属于 同一 个 亚 群 。 据 此 类 推 ， 小 鼠 < 轻 链 的 许多 亚 群 ， 其 中 每 一 个 亚 群 也 可 能 含有 类 似 的 一 组 基因 , 于 是 小 鼠 种 殖 系 基因 库 内 可 能 存在 足够 多 的 V 基因 (200 一 1000) 来 编码 多 种 多 样 的 上 链 。 此 外 , 这 两 个 来 自 同 一 亚 群 的 无 性 繁殖 Y 基因 片段 的 结构 特点 是 在 结构 基因 的 两 侧 都 存在 广泛 的 同 源 区 域 (包括 几 王 碱 基 对 )。 这 就 提供 了 顺序 相 似 的 基因 之 间 通 过 不 均等 交换 等 方式 进行 重组 ,并 产生 变异 的 机 会 (Seidman 等 ,1798c)。 另 一 方面 ，Hood 实验 室 根据 对 小 鼠 三 个 V. 亚 群 DNA 部 分 顺序 的 研究 , 认为 每 一 亚 群 可 能 存在 4 一 8 个 种 质 系 基因 。 由 此 推测 整个 V。 基因 库 约 包含 350 个 种 质 系 基因 。 反之 ,小 鼠 V; 基因 数目 很 少 , 可 能 只 有 一 ,二 个 种 质 系 基因 (Weigert S, 1978). 同样 地 ,分 子 杂 交 结 果 提 示人 和 小 鼠 DNA 内 所 含有 的 重 链 Van 亚 族 的 基因 数目 也 不 太 多 ,此 两 物种 Ve 基因 总 数 估 计 约 在 40 人 80 之 间 (Rabbits 等 ，1980) 。 总 之 ,虽然 不 同 作者 估计 的 YY 基因 数目 有 些 差 别 , 目前 得 到 的 一 般 结 论 是 种 质 系 基因 4A, Y 基 因 总 数 是 有 限 的 ,大 致 相当 于 或 十 数 倍 于 根据 蛋白 质 一 级 结构 测定 得 到 的 轻 链 或 重 链 亚 群 的 数目 。 因 此 ,种 质 系 Y 基 因数 目 太 少 ,不 足以 解释 1 链 或 上 链 Y 区 的 多 样 性 。 根据 这 些 结论 ,有 人 提出 种 质 系 V 基因 数目 和 免疫 球 蛋白 肽 链 变异 型 数目 之 间 的 差 距 是 通过 发 育 过 程 中 淋巴 细胞 的 突变 填补 起 来 的 。 核酸 分 子 杂 交 实 验 结果 似乎 支持 体 细 胞 突变 假说 , 而 不 支持 种 质 系 假说 。 然 而 , Y 基 因数 目 究竟 有 多 少 ,分子 杂交 并 不 能 给 予 肯 定 的 回答 ， 还 有 待 于 对 基因 组 的 直接 分 析 。 如 前 节 所 述 , 这 方面 的 工作 已 经 开始 进行 了 。 log RNA/DNA 2. 体 细 胞 突变 的 方式 真 核 生物 的 体 细胞 突变 常 被 看 作 是 抗体 多 样 性 起 源 的 原因 。 然 而 , 关于 哺乳 类 A A 。496 。 胞 突变 的 方式 在 分 子 水 平 的 知识 还 很 少 。 Milstein XMAS) RS he MOPC-21 细胞 株 之 变异 细胞 群 ,并 确定 了 免疫 球 蛋白 7 重 链 的 一 系列 自发 的 变异 型 。 他 们 分 离 了 自发 的 变异 细胞 群 ， 并 系统 地 分 析 了 所 产生 的 蛋白 质 和 mRNA HRA, URS MRNA 在 无 细胞 系统 内 的 翻译 情 况 。 通 过 多 方面 的 研究 ,鉴定 了 四 种 有 自发 的 构造 变异 的 免疫 球 蛋 白 分 子 , KAIF, IF,, IF, 和 IF,。 这 些 突变 分 子 的 主要 特点 是 ,IF IF, 和 IFs 的 重 链 都 有 特定 的 功能 区 的 RE, MIF, MIF; 之 Ch 功能 区 的 大 部 分 缺失 。IF: CRAM 358 残 基 位 置 发 生 一 个 “无 意义 ?突变 , 导致 转录 的 过 早 终 止 。IF: 在 341 残 基 位 置 出 现 2 个 碱 基 的 缺失 ， 引 起 移 码 突变 ,结果 在 畸变 顺序 的 354 残 基 位 置 过 早出 现 终止 密码 IF。 是 由 于 发 生 在 C-V 交 办 处 的 缺失 , 失去 C 功能 区 。 同 时 , 这 一 事实 也 有 力 地 说 明了 , 在 这 些 发 生 突 变 的 细胞 内 ， V、C 基 因 可 能 是 整合 在 一 起 的 。IF, 突变 分 子 则 包括 一 个 无 意义 突变 , 碱 基 G KET A, 相应 地 在 415 残 基 位 置 的 门 冬 酰 氨 变 成 了 门 冬 氨 酸 。 这 些 研 究 结果 肯定 了 过 去 仅 在 原核 生 物 和 酶 母 细胞 上 证 实 的 突变 事件 也 同样 能 在 真 核 生 物体 细胞 上 发 生 (Cotton 等 ,1973)。 另外 ,有 人 发 现 离 体 培养 的 小 鼠 S107 浆 细 胞 瘤 株 分 刻 的 抗体 经 常 自发 地 发 生 结合 专 一 性 的 变化 (Cook 和 Scharff, 1977; Scharff 等 , 1976) 。 这 些 例子 都 提示 在 培养 条 件 下 ,可 能 通过 体 细 胞 突变 产生 抗体 的 多 样 性 。 不 过 , 这 一 现象 在 多 大 程度 上 能 代表 免 疫 系 统 正常 发 育 过 程 中 抗体 多 样 性 的 起 源 的 真实 情况 , 还 不 能 肯定 ,需要 进一步 研究 。 迄今 关于 抗体 多 样 性 起 源 的 假说 都 是 假定 当 动 物 达 到 成 年 时 ,已 获得 全 套 抗体 专 一 性 , 表现 在 免疫 活性 细胞 表面 受 体 的 多 样 性 。 然 而 , 也 有 证 据 表 明 抗 体 的 多 样 性 是 在 免疫 活性 细胞 接受 专 一 的 抗原 刺激 后 ,细胞 增生 过 程 中 , 发 生 随 机 突变 而 产生 的 。 或 者 说 ， 成 体 动物 抗体 的 多 样 性 仍然 是 有 限 的 。 当 其 中 一 种 专 一 性 的 受 体 , 受到 抗原 刺激 时 , 在 细胞 Dd WUE, 细胞 表 型 由 于 随机 突变 而 出 现 大 量 的 专 一 性 。 抗 原则 选择 其 中 最 相 适 应 的 一 种 专 一 性 (Cunningham 和 Fordham, 1974; Cunningham, 1966), 这 是 又 一 个 疝 竺 深入 研究 的 问题 。 3. 抗体 多 样 性 起 源 的 机 制 根据 对 免疫 球 蛋白 基因 结构 的 知识 ,假定 抗体 多 样 性 起 源 可 能 存在 四 种 主要 机 制 ; (1) 许多 个 种 质 系 V 基因 这 是 指 在 抗体 分 子 进化 过 程 中 产生 , 并 保留 在 生殖 细胞 内 的 V 基因 。 其 数目 随 动物 种 类 或 链 的 类 型 而 有 不 同 。 对 小 鼠 V。 基因 顺序 分 析 结 果 表 明 ， 每 一 V。 亚 群 可 能 有 4 一 8 个 种 质 系 基因 , 因而 V。 总 计 应 约 有 350 种 质 系 基 因 (Weigert 等 , 1978) 。 WHR V 区 基因 类 似 地 估计 , 至 少 可 能 有 200 个 种 质 系 Vu 基因 (Rabbitts 等 ，1980) 。 小 鼠 V， 基因 数目 很 少 , 可 能 只 存在 1 或 2 个 种 质 系 Va KA. (2) 开 链 和 工 链 的 随机 组 合 不 同 的 重 链 和 轻 链 可 以 自由 地 随机 组 合 ,形成 结合 专 一 性 不 同 的 抗体 分 子 。 虽然 这 是 一 个 非 遗 传 的 机 制 ， 但 也 可 能 是 抗体 多 样 性 的 一 个 来 源 。 如 上 述 ， 种 质 系 V 基 因 库 内 ， VH 约 为 200,Vi 约 为 350, 则 VaxV 能 产生 ~7 x 104 不 同 的 抗体 分 子 。 如 果 假 定 哺乳 动 。497 。 物 抗体 分 子 总 数 超过 10“,， 则 90% 种 类 的 抗体 应 起 源 于 体 细 胞 变异 机 制 。 (3) 体 细 胞 突变 这 可 能 发 生 在 B 淋巴 细胞 分 化 过 程 中 ， 或 与 抗原 接触 后 的 增生 过 程 中 。 对 小 鼠 Vir 的 顺序 分 析 结 果 表 明 所 有 亚 群 内 氨基 酸 残 基 的 置换 主要 发 生 在 高 变异 区 , HARE 单个 碱 基 置 换 的 结果 。 显 然 , 这 些 可 能 起 源 于 自发 的 体 细胞 突变 。 (4) 重组 连接 (Combinatorial joining) 如 前 节 所 述 ，*，14 和 链 的 基因 结构 中 , 均 存 在 许多 个 “J” 基 因 片 眉 。 基 因 移 位 重 排 过 程 中 ,不同 的 V 片段 和 “J” 片 段 的 连接 , 以 及 这 种 连接 点 的 任何 移动 , 通过“ 移 框 ?， 都 可 能 产生 抗体 的 多 样 性 。 总 之 ,抗体 多 样 性 可 能 通过 多 种 机 制 产 生 。 一 些 机 制 是 遗传 的 (多 个 V 基因 ,重组 连 接 和 体 细 胞 突变 ), 另 一 些 是 非 遗 传 的 〈Vr， Ve 随机 组 合 ) 。 至 于 这 四 种 主要 机 制 在 产生 抗体 多 样 性 中 ,各 自 起 多 大 的 作用 , 还 是 一 个 未 解决 的 问题 。 总 的 说 来 ,抗体 多 样 性 起 源 及 其 遗传 控制 是 现代 免疫 学 中 一 个 非常 复杂 的 问题 .关于 种 质 系 Y 基因 的 数目 ， 体 细胞 突变 的 产生 机 制 等 关键 问题 的 研究 ， 目 前 已 取得 相当 的 进展 ,但 仍 未 解决 。 核 酸 分 子 杂交 实验 虽 有 较 多 证 据 支 持 体 细胞 突变 假说 , 但 是 对 免疫 球 蛋白 基因 结构 的 初步 分 析 似乎 又 得 出 不 同 的 看 法 。 不 过 , 有 一 点 是 可 以 肯定 的 ,解决 这 一 难题 的 正确 道路 应 当 是 对 于 B 淋巴 细胞 的 基因 组 及 免疫 球 蛋 白 基因 构造 进行 深信 的 实 验 分 析 , 而 不 是 理论 上 的 脐 测 。 三 、 免 疫 反应 的 遗传 控制 免疫 反应 是 一 个 需要 T,B 淋巴 球 和 巨 鸣 细 胞 参加 的 复杂 过 程 。 这 一 过 程 除 包 括 对 抗 抗原 的 专 一 的 识别 外 , 还 包括 这 些 细胞 相互 之 间 的 识别 及 其 相互 作用 , 其 中 每 一 步骤 都 可 能 受 基 因 控 制 。 近 年 来 已 经 证 明 存 在 许多 控制 免疫 反应 的 量 和 专 一 性 的 基因 ， 总 称 为 免 疫 反应 基因 (Immunoresponsive genes， 简 称 Ir 基因 ) 。 免 疫 反应 基因 的 作用 方式 可 能 各 有 不 同 , 有 的 控制 抗原 的 处 理 , 因而 非 专 一 地 影响 抗体 反应 的 总 水 平 。 另 一 些 免疫 反 应 基因 则 影响 对 专 一 抗原 的 反应 , 它们 又 可 分 为 两 类 。 一 类 是 和 免疫 球 蛋 白 同 种 腊 型 连 锁 的 ; 另 一 类 是 和 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 连锁 的 〈(H- 连 锁 的 Ir RA). 前 者 可 能 代表 可 遗传 的 个 体型 的 Y 基因 , 并 可 能 编码 B 细胞 表面 的 抗原 受 体 。 后 者 可 能 主要 和 了 细 胞 表面 抗原 受 体 以 及 T，B 细胞 和 巨 鸣 细胞 相互 之 间 的 识别 系 统 有 关系 。 本 节 主 要 讨 论 互 -连锁 的 Ir EA, 特别 是 其 基因 产物 和 了 细胞 抗原 受 体 ， 以 及 免疫 活性 细胞 相互 识 别 系统 在 结构 和 功能 上 的 关系 。 (一 ) 组 织 相 容 性 连锁 的 免疫 反应 基因 目前 已 证 明 豚 鼠 . 小 鼠 ,大 鼠 和 家 免 等 动物 对 特定 抗原 的 专 一 的 反应 能 力 是 受 与 组 织 相 容 性 连锁 的 基因 控制 的 , 这 些 基 因 是 位 于 常 染 色 体 上 的 显 性 基因 , 并 严格 地 按 备 德尔 方 。498 。 式 遗 传 。 llr 基因 和 免疫 反应 的 遗传 控制 专 一 的 Ir 基因 主要 是 在 研究 纯 系 动 物 对 一 些 化 学 构造 上 比较 均一 的 抗原 , 如 合成 的 SRABER, GIES R-L-MAM (PLL), (T,G)-A—L ff (Phe, G)-A—L, WX Al 种 Fe Se Ana) A A EEK A) AY ASL 早期 研究 发 现 不 同 的 纯 系 动物 对 这 些 抗 原 的 反应 能 力 不 同 。 有 些 纯 系 对 这 些 抗原 有 反应 能 力 , 称 为 反应 者 〈Responder); 另 一 些 纯 系 则 无 反应 能 力 ， 称 为 非 反应 者 (non- responder), 并 且 , 这 些 对 专 一 抗原 的 反应 性 是 可 以 遗传 的 。 例 如 ,豚鼠 品系 2 PLL MGA 有 反应 能 力 , 而 品系 13 则 无 反应 。 对 于 抗原 GT, 情况 则 正好 相反 。 同 样 地 , 小 鼠 各 种 纯 系 按 其 H-2 单元 型 的 不 同 ,对 合成 多 肽 抗原 的 反应 也 有 显著 的 不 同 ( 表 15-7) 。 表 15-7 不 同 纯 系 的 小 鼠 对 抗原 的 反应 能 力 和 H-2 单元 型 的 关系 H2 2. 7c 型 i 原 (a) 合成 多 肽 (T, G)-A--L (Phe, G)-A--L CH, G)-A--L (>) 同 种 异型 抗原 IgA IgG 十 “ 示 高 反应 者 ， 一 ， 示 低 反应 者 。 McDevitt 和 Chinitz (1969) 最 先 证 明 小 鼠 对 (T,G)-A—L, (Phe, G)-A—L, 和 (H,G)-A—L WRI H-2 类 型 有 密切 的 关系 。 他 们 发 现 Ir 基因 是 位 于 常 染色 体 上 的 显 性 基因 , 因为 高 反应 性 的 和 低 反 应 性 的 小 鼠 杂 交 子 代 FE 具有 高 反应 性 特征 。 并 且 ， SF, 子 代 和 亲 代 小 鼠 反 交 时 , 高 反应 性 和 低 反 应 性 随 一 定 的 H-2 型 分 离 , 证 明 这 些 基因 是 同 H-2 基因 座 连 锁 的 。 后 来 ,还 将 控制 对 〈T,G)-A 一 工 反应 能 力 的 Ir- 基因 定位 于 H-2 复合 物 之 玉 区 和 $S 区 之 间 的 一 个 新 区 域 , 称 为 工区 (McDevitt 等 ,1972) 。 H-2 连锁 的 Ir 基因 只 和 依赖 胸腺 抗原 (如 蛋白 质 和 多 肽 ) 的 反应 性 有 关系 ,并 且 同 专 一 的 迟 发 型 超 敏 反应 (DTH) AT 辅助 细胞 活动 有 关系 。 此 外 , 还 证 明 Ir 基因 主要 控 制 专 一 的 载体 的 识别 过 程 , 而 和 免疫 球 蛋白 V 区 的 遗传 控制 没有 关系 (Benacerraf 和 McDevitt, 1972), Alt, Ir 基因 及 其 分 子 产 物 具 有 抗原 专 一 的 作用 ， 并 且 主 要 是 和 依 赖 胸腺 抗原 的 免疫 反应 的 调节 有 关系 的 。 2. H-2 连锁 的 Is 基因 和 专 一 免疫 抑制 的 遗传 控制 免疫 反应 的 诱导 过 程 中 , 抑制 T 细胞 之 负 调 节 作用 发 现 后 (Gershon，1974) ， 自 然 提出 一 个 问题 , 即 这 种 抗原 专 一 的 负 调 节 作 用 是 否 也 同样 受 工 区 基因 的 控制 ?实验 研究 证 明确 系 如 此 。 对 Glu®, Ala, Tyr’? (GAT) 共聚 物 无 反应 性 的 动物 , 当 GAT 加 上 有 免疫 原 性 的 载体 MBSA 时 , 便 能 产生 对 GAT 的 抗体 反应 。 但 是 ,如果 事 先 用 GAT 免 。499 。 疫 , 后 来 对 GAT-MBSA 的 抗体 反应 , 便 被 专 一 地 抑制 了 。 并 且 ， 还 证 明 这 种 抑制 作用 是 由 于 产生 了 专 一 的 抑制 T 细胞 的 结果 (Kapp 等 ，1974a,b) 。 对 Gluso Tyr® (GT) 共聚 物 的 反应 也 存在 同样 的 情况 ， GT 预先 免疫 同样 能 抑制 后 来 对 GT-MBSA 的 抗 体 反 应 。 对 GT 系统 进一步 研究 还 证 明 ，GT 予 先 免疫 抑 制 对 GT-MBSA 的 抗体 反 应 只 在 具有 某 些 世 -2 M7eH (H-2", H-2°, H-2°) 的 纯 系 小 鼠 发 生 ， 而 不 能 在 另 一 些 H-2 单元 型 (H-2?",H-2a) 发 生 。 同 时 ， 还 证 明 产 生 GT 专 一 抑制 的 能 力 是 受 一 个 显 性 基因 控制 的 ， 因 为 抑制 和 非 抑 制品 系 杂 交 子 代 了 对 GT 的 反应 是 能 够 产生 抑制 T 细胞 (Debré 等 , 1975) 。 GT 专 一 的 免疫 抑制 基因 Us) 同样 位 于 H-2 复合 物 的 I 区 (Debre “=, 1976) 6 总 之 ,胸腺 依赖 抗原 的 免疫 反应 的 重要 特点 是 严格 地 受 和 MHC 联 锁 的 一 群 基因 控 制 , 这 些 基因 的 调节 作用 不 仅 限 于 正 调 节 , 而 且 也 能 调节 专 一 的 抑制 反应 。 换 名 话说 ， 抑 制 了 细胞 和 和 铺 助 T 细胞 的 抗原 专 一 的 功能 活动 都 受 再 -2 BASRA WI RWB. BF 控制 这 两 类 T 细胞 的 基因 之 间 的 关系 如 何 , 目前 还 不 清楚 (Paul 和 Benacerraf，1977; Benacerraf 和 Germain，1978) 。 (=) 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 和 工区 人 和 小 鼠 等 哺乳 动物 染色 体 上 同 控制 异体 组 织 和 器 官 移 植 有 主要 关系 的 遗传 区 域 ， 包括 同 移植 组 织 的 排斥 ， 移 植物 抗 寄主 反应 ， 混 合 淋巴 细胞 反应 ， 以 及 其 他 有 T 细胞 参 加 的 免疫 学 现象 有 关 的 紧密 连锁 的 一 群 基因 , 称 为 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 (Major His- tocompatibility Compbx， 简 称 为 MHC) 。 这 一 基因 复合 物 在 所 有 已 经 研究 过 的 哺乳 类 动物 上 都 存在 。 在 人 类 称 为 HLA 系统 ,在 小 鼠 称 为 H-2 系统 。 由 于 H-2 基因 复合 物 的 精细 构造 研究 得 最 深入 〈 习 lein，1975) ， 免 疫 反应 基因 的 功能 和 定位 的 工作 也 主要 是 在 这 一 系统 上 进行 的 。 1. H-2 基 因 复 合 物 的 基本 构造 小 鼠 H-2 基因 复合 物 位 于 第 9 连锁 群 (17 号 染色 体 ) 上 。 单 个 染色 体 上 携带 的 H-2 基因 , 称 为 H-2 单 倍 型 (Haplotype), 利用 不 同 H-2 单 倍 型 的 纯 系 之 间 免 疫 产生 的 同 种 异型 抗体 和 一 组 标准 的 动物 (包括 纯 系 和 已 知 同 种 异型 状态 的 纯 系 的 重组 体 )， 通 过 细 致 地 交配 实验 和 血清 学 分 析 , 便 可 以 作出 H-2 基因 复合 物 的 基因 图 ， 主 要 是 由 K,I,S, 来 色 体 17 ， H-2K Ir-I'A , Ir-IB, la-4 , Ia-5, Ja-3, Ss-Slp H-2GH-2D 4 Th, SAB ch La Ar 8) it Pe Ee “(ee ag , we. I S G'\D Ts Na mn 77 6 2 tf 7 8 20 W2L fa 抗原 to AG = 415 专 一 性 12 18 lara ie 15! 15-28 小 鼠 H-2 基因 复合 物 及 免疫 反应 基因 图 ( 据 Tachibana, 1977), s*。500。 表 15-8 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 各 区 的 揭 疫 学 功能 MHC 的 功能 H-2 区 1. .抗原 刺激 的 移植 物 排 斥 和 专 一 的 工 杀 伤 细胞 区 和 D>>I 2. 对 细胞 膜 抗原 专 一 的 工 杀 伤 细胞 : 病毒 抗原 ,肿瘤 相关 区 和 D 抗原 ,或 次 要 的 组 织 相 容 性 抗原 : 3. 混合 淋巴 细胞 反应 ;移植 物 抗 寄主 反应 。 (>K 和 D 4. 对 胸腺 依赖 抗原 的 专 一 的 免疫 反应 〈Ir 基因 ) . (I-A, I-B, I-C) 5. 工 细胞 的 专 一 免疫 抑制 ,免疫 抑制 基因 Us HA) I 6. 抑制 工 细胞 或 抑制 因子 的 Ia 抗原 专 一 性 I-J 7. IgG RAR WH TAB 细胞 协同 作用 I-A 8. Ex me aaa T Ante LDR. AT AR RR 1-A RARN BRRVBARW 9. 补体 成 分 : C4, C2 和 C3; BAF. SB MHC Pi shes (# Paul 和 Benacerraf, 1977), G,D 五 个 区 域 构成 的 (图 15-28) 。 各 区 域 控制 的 主要 免疫 学 功能 列 于 表 15-8 (Schref- fler 和 David, 1975; Paul -和 Benacerraf, 1977), 现 将 几 个 区 的 主要 功能 简 述 如 st (1) K4eD 区 包含 编码 主 组 织 相 容 性 抗原 (H-2K,H-2D 抗原 ) 的 基因 。 其 产物 分 布 在 体内 大 多 数 细胞 的 表面 ,为 膜 上 的 糖 蛋白 ,在 移植 物 的 排斥 反应 中 起 主要 作用 ， 它 们 是 同 种 异体 反 应 的 T 杀伤 细胞 的 主要 攻击 目标 (参看 第 四 章 , 132 页 ) 。 (2) S 区 (Ss-Slp 区 ) 控制 血清 内 与 补体 有 关 的 8 球 蛋白 的 水 平 (Demant 等 , 1973), 这 一 区 域 的 标记 基因 , Ss 基因 ,已 经 证 明 是 C4 的 结构 基因 (Lachmann 等 , 1975) 。 (3) 形 区 位 于 玉 和 D 区 之 间 , 控制 对 胸腺 依赖 抗原 的 免疫 反应 的 一 群 紧密 连锁 的 基因 。I 区 MPAA A I-A, I-B, I-J, I- 卫 , I-C 等 五 个 亚 区 。 考虑 到 了 细胞 的 主要 功能 是 识别 同一 物种 〈 或 其 他 物种 ) MHC 基因 产物 并 和 它们 起 反应 ,因此 同 MHC 连锁 的 Ir 基因 控制 对 胸腺 依赖 抗原 的 免疫 反应 并 位 于 MHC KR 内 ,应 有 更 深 一 层 的 意义 , 可 能 启示 整个 MHC 系统 各 区 在 进化 上 和 功能 上 的 联系 。 2. 六 区 的 构造 和 功能 如 上 述 , 小 鼠 I 区 是 17 号 染色 体 上 H-2 SAMS K KAD 区 间 的 一 段 (Schref- fler 和 David, 1975), 它 原 先是 代表 控制 专 一 免疫 反应 的 基因 所 在 的 遗传 区 域 。 后 来 发 现 编码 刺激 混合 淋巴 细胞 反应 (MLR) 的 抗原 的 基因 也 位 于 这 一 区 域 。 利用 几 种 不 同 的 研究 方法 来 分 析 工 区 的 构造 和 功能 , 并 将 它 划 分 为 几 个 亚 区 。 这 些 方面 的 研究 结果 简 述 如 下 ( 表 15-9) ， Ri. 1. 免疫 反应 基因 的 定位 根据 对 各 种 抗原 反应 性 的 Ir 基因 控制 可 将 I 区 再 分 为 I-A,I-B 和 TI-C 亚 区 (Me- Devitt 等 , 1972) 。 大 多 数 Ir 基因 [如 控制 roa teeta HE 《〈F,G)-A 一 L 等 抗原 的 Ir 基因 ] EF I-A 亚 区 。 人 少数 需要 互补 Ir 基因 的 抗原 的 基因 , 位 jee! st ae F I-B #1 I-C 亚 区 (图 15-29) 。 1-BGG L-OM 2.Ia 抗 原 专 一 性 的 定位 FS 在 发 现 Ir 基因 后 ， 有 人 用 除 I 区 有 差异 hy 外 ， 其 余 遗 传 背景 都 相同 的 小 鼠 的 淋巴 球 彼此 GLT 交叉 免疫 。 利 用 这 样 得 到 的 抗 血 清 就 可 以 鉴别 hon I 区 各 亚 区 的 基因 产物 ， 每 一 个 亚 区 和 特定 的 ae HRRERAKA. LAWRRRERESMT IgA Bik (McDevitt 44,1974), BREBM aoe | 细胞 和 T 细胞 上 也 发 现存 在 (Himmerling GAT 等 ,1975; David %, 1976); BRA Ia 抗原 。 5 Sem 用 血清 学 方法 还 发 现 一 个 新 的 LT WR, 它 GLO 编码 抑制 了 细胞 的 表面 抗原 (Murphy 等 ， 图 15-29 小 鼠 H-2 KASAM I KAT Ir 基 1976). 此 外 ,，I-J 亚 区 还 编码 抑制 工 细 胞 A 因 的 定位 ( 据 Benacerraf 和 Katz, 1975), 子 (Tada “, 1976;Greene 等 ,1977)， 而 I-A 亚 区 编码 辅助 工 细 胞 因子 (Taussig “, 1976; Mozes, 1976). Ir 基因 和 Ia 抗原 专 一 性 定位 于 Ir 基因 图 谱 的 同一 亚 区 内 , 它们 之 间 的 关系 如 何 呢 ? T 和 B 细胞 以 及 巨 鸣 细 胞 表面 的 Ia 抗原 分 子 是 否 就 是 Ir 基因 产物 本 身 或 仅仅 同 它 们 相关 连 呢 ? 最 近 的 研究 结果 表明 豚鼠 和 小 鼠 的 Ia 抗原 专 一 性 同 Ir 基因 控制 的 免疫 反应 之 间 存 在 非常 密切 的 相关 性 。 如 豚鼠 纯 系 13 之 Ia-1 和 Ir-GT 基因 之 间 ;， Ia-3 和 Ir- DNP-GPA 基因 之 间 ; 豚鼠 纯 系 2 之 Ia-2 同 Ir-DNP-GL 基 之 间 ;， 以 及 小 鼠 Ia=7 CI- C) fl Ir-GLdéat 基因 之 间 都 存在 明确 的 相关 性 (Benacerraf 和 Dorf, 1976). 3#H, fila 决定 簇 的 同 种 异体 抗 血 请 能 抑制 受 Ir 基因 控制 的 抗原 在 离 体 条 件 下 的 免疫 反 上 应 (Schwartz 等 , 1976) 。 这 些 结果 都 表明 Ia 抗原 专 一 性 和 lr 基因 控制 的 免疫 反应 存在 密切 的 关连 。 至 于 Ia 抗原 分 子 是 否 就 是 Ir 基因 产物 本 身 则 还 不 能 肯定 ， 还 有 待 于 对 Ia 分 子 的 化 学 构造 和 免疫 学 功能 的 进一步 研究 。 3. Ia 抗原 分 子 的 化 学 构造 利用 专 一 的 抗 Ia 同 种 异体 抗 血清 可 以 分 离 2:sI 标记 的 脾脏 细胞 表面 的 Ia 分 子 ， 鉴 别 其 种 类 和 化 学 构造 (Cullen 等 , 1974) 。 结果 在 小 鼠 发 现 两 种 Ia 分 子 ， 一 种 是 I- 人 A 亚 区 编码 的 ， 另 一 种 是 I-C 亚 区 编码 的 。 I-A 亚 区 编码 的 Ia 分 子 是 一 个 糖 蛋白， 由 25,000 和 33,000 道 尔 顿 的 两 条 肽 链 构 成 (Cullen 等 ,1976) 。 I-B WK MI-J VK 还 没有 找到 相应 的 Ia 分 子 。 Ia 分 子 的 构造 以 及 它们 在 免疫 活性 细胞 的 相互 识别 和 相互 © 502 。 表 15-9 小 鼠 , 工 区 的 性 质 —— | MA | | (a) 功能 Ir #A + a = Is 基因 (+) 一 MLR St = BHDHR 1 = 细胞 相互 作用 巨 鸣 细 胞 - 工 细 胞 + 工 细 胞 -B 细胞 业 抑制 工 细胞 一 DTH 传递 十 工 细 胞 抑制 因子 工 细胞 辅助 因子 (c) 化 学 用 专 一 的 同 种 异型 搞 血清 分 离 Ia 分 子 (+) 假定 存在 或 在 特殊 情况 下 存在 ， 习 一 ) 在 有 互补 Ir 基因 对 照 条 件 下 测 不 出 抗原 。 (4 Benacerraf 和 Germain, 1978), 作用 中 的 作用 是 需要 进一步 弄 请 楚 的 重要 课题 。 (=) 工区 基因 产物 和 免疫 活性 细胞 闻 的 相互 作用 与 MHC 连锁 的 Ir 基因 的 发 现 促进 了 对 体液 免疫 和 细胞 免疫 的 调节 机 制 的 研究 。 已 知 工 淋巴 球 在 免疫 反应 的 调节 中 起 主导 作用 。Ir 基因 产物 以 及 Ia 抗原 不 仅 在 B 细胞 AE be Fa eA AL HK. 而 且 也 在 各 类 T 细胞 表面 表现 出 来 , 同 抗原 一 起 决定 着 免疫 反应 中 细胞 相互 识别 和 相互 作用 的 专 一 性 。 有 证 据 表 明 T 淋巴 球 对 胸腺 依赖 抗原 的 识别 同时 还 依赖 对 位 于 细胞 表面 的 MHC 产物 的 识别 。 巨 史 细 胞 , T 细胞 和 B 细胞 的 相互 作用 中 , 要 求 参加 初级 反应 的 巨 噬 细 胞 或 B 细胞 同 参加 次 级 反应 的 巨 唆 细 胞 或 B 细胞 位 于 细胞 表面 的 I- 区 产物 具有 相同 的 性 质 。 也 就 是 说 免疫 反应 中 , 细胞 之 间 的 相互 作用 要 受 抗 原 专 一 性 和 MHC 产物 专 一 性 的 双重 限制 (Miller 等 , 1975; Katz 和 Benacerraf，1975) 。 各 亚 群 的 工 淋巴 球 ( 辅 促 细胞 或 抑制 细胞 ) 对 免疫 反应 的 调节 不 只 限于 正 调节 或 负 调 节 作 用 ,而 且 还 能 和 抗原 一 道 选择 具有 特定 功能 表 型 (如 合成 特定 类 别 、 亚 类 和 同 种 异型 的 免疫 球 蛋白 ) 的 B 前 体 细 胞 。 有 证 据 表 明成 体 脾脏 内 至 少 存在 两 个 B 细胞 亚 群 。 大 的 亚 群 细胞 表面 有 Ia 决定 簇 , 小 的 亚 群 则 没有 。 当 用 专 一 的 抗 Ia 血清 和 补体 破坏 带 Ia 抗原 的 B 细胞 亚 群 时 ， 则 *。503 。 对 胸腺 依赖 抗原 的 离 体 的 IgG 反应 就 被 破坏 ,而 IgM 反应 则 很 少 受 到 影响 (Press 等 ， 1976) 。 这 提示 分 这 IgG 的 B 前 体 细胞 表面 的 Ia 分 子 可 能 是 和 了 辅助 细胞 及 抗 原 相 互 作用 的 地 方 ,并 且 可 能 同 从 合成 IgM 到 合成 IgG 的 转换 机 制 有 关系 。 其 次 , 也 有 实验 表明 与 IgE 抗体 反应 和 IgEG /IgM 抗体 反应 有 关 的 载体 专 一 的 了 辅 动 细胞 是 不 相同 的 (Kishimoto 和 Ishizaka, 1973). 此 外 , T 辅助 细胞 还 可 能 参与 对 分 记 高 亲 合 力 抗体 的 细胞 株 的 选择 (Gershon 和 Paul，1971) 。 从 实 细 胞 的 这 些 十 分 专 一 的 调节 功能 看 来 , T 细胞 应 能 严格 地 识别 一 定 类 别 、 亚 类 , 同 种 异型 或 个 体型 的 了 前 体 细胞 表面 的 专 一 记号 。 这 些 专 一 的 表面 记号 可 能 是 B 前 体 细胞 表面 的 IgE 分 子 本 身 (Fe 或 Y 区 的 个 体型 决定 簇 ) 或 Ia Riek. KR BMRA Ia 抗原 可 能 作为 了 细胞 调节 因子 的 接受 分 子 。 Taussig 和 Munro (1975) 的 实验 提示 I 区 可 能 存在 编码 工 细胞 和 B 细 胞 表面 识别 分 子 的 结构 基因 。 一 个 基因 控制 T 细胞 对 抗原 的 识别 和 产生 工 细胞 调节 子 ; 另 一 个 基因 则 控制 产生 B 细胞 表面 的 T 细胞 调节 因子 的 接受 分 子 。 这 些 工 区 基因 产物 不 仅 可 能 和 抗原 识别 有 关系 ,而 且 可 能 和 TB 细胞 , 以 及 巨 鸣 细胞 间 的 识别 有 关系 。 也 就 是 说 I- 区 基因 产物 不 仅 同 T 细胞 的 抗原 受 体 有 关系 , 而 且 同 免疫 活性 细胞 之 间 相 互 识别 系统 也 可 能 有 关系 (参看 图 13-10,408 页 ) 。 可 进一步 设想 ,不 同 亚 群 的 了 细胞 表面 存在 由 I 区 不 同 功能 的 基因 编码 的 识别 分 子 或 产生 不 同 功能 的 调节 因子 〈 如 了 抑制 因子 受 I-J 亚 区 编码 ，T 辅助 因子 受 I-A 亚 区 编码 ), 因而 能 选择 地 识别 具有 不 同 的 表面 标记 (Ia 抗原 决定 簇 ) 的 免疫 活性 细胞 并 和 它们 相互 作用 , 由 此 调节 免疫 反应 的 类 型 。 这 种 对 抗原 专 一 性 和 Ia 专 一 性 的 双重 识别 ,保证 了 这 种 包括 复杂 的 细胞 相互 作用 的 免疫 调节 机 制 的 精确 性 和 灵活 性 。 总 之 , T 细胞 (及 其 亚 群 ) 主要 有 三 方面 的 识别 功能 : 1) 识别 MHC 之 H-2K #1 H-2D 的 基因 产物 并 与 之 反应 一 了 T 杀伤 细胞 ; 2) 识别 I- 区 产物 (Ia REP); 3) 识别 胸腺 依赖 抗原 。 5 MHC 连锁 的 Ir 基因 的 发 现 使 有 可 能 把 T 细胞 这 几 方 面 的 功能 在 共 同 的 遗传 基础 上 统一 起 来 。T 细胞 的 主要 功能 是 识别 MHC 基因 复合 物 编码 的 细胞 表面 抗原 ， 包 括 H-2D 和 再 -2K, 以 及 Ia 抗原 。 它们 通过 对 细胞 表面 主 组 织 相 容 性 抗原 的 变异 的 识 别 ( 区 别 自我 和 非 自我 ) 而 担负 起 对 外 源 细胞 和 突变 细胞 的 排斥 作用 ; 另 一 方面 ,通过 对 免 疫 活性 细胞 表面 Ia 抗原 决定 得 的 识别 又 在 抗原 专 一 刺激 引起 的 免疫 系统 细胞 相互 作用 中 起 调节 作用 。 在 这 一 过 程 中 , T 调节 细胞 像 同 抗原 专 一 地 相互 作用 一 样 同 免疫 活性 细 胞 专 一 地 相互 作用 。 至 于 了 淋巴 球 的 抗原 受 体 (识别 分 子 ) 的 性 质 ， 甚至 上 述 三 种 识别 功 能 是 由 几 个 分 子 担任 , 还 是 一 个 分 子 复合 物 同 时 识别 Ia 抗原 和 依赖 胸腺 抗原 都 还 不 清 楚 。 不 过 , 目前 一 般 认 为 T 淋巴 球 不 合成 IgE， 也 没有 可 鉴别 出 的 «. 14 Be. 然而 A 证 据 表明 T 淋巴 球 抗原 受 体 具有 和 抗 同 一 抗原 决定 得 的 抗体 重 链 相 同 的 个 体型 决定 簇 。 因此 ， 有 人 假定 le 重 链 V 区 可 能 是 了 淋巴 球 受 体 的 一 部 分 或 受 体 之 一 (参看 第 十 三 章 ， 408 页 ) 。 最 近 , 对 了 调节 因子 的 研究 发 现 这 种 分 子 (或 分 子 复合 物 ) 同时 具有 专 一 的 抗原 结合 能 力 和 Ia 决定 入 (Theze 等 ,1977) 。 这 种 具有 Ia 专 一 性 的 抗原 识别 分 子 同 具 有 Bt V 区 个 体型 专 一 性 的 分 子 的 关系 如 何 ; MHC 基因 产物 及 免疫 活性 细胞 间 调 节 、 识 别 的 分 子 同 参与 胸腺 依赖 抗原 识别 的 分 子 相 同 或 不 相同 , 这 些 都 是 迫切 需要 解决 的 问题 。 。504。 总 结 起 来 ,高 等 动物 的 免疫 防御 机 制 是 由 T 和 3B 淋巴 球 两 套 系统 构成 的 。B 淋巴 球 系统 的 主要 功能 是 产生 能 识别 极其 多 种 多 样 抗原 的 免疫 球 蛋白 ,以 适应 防御 外 来 的 无 法 预料 到 的 微生物 和 毒素 损伤 的 需要 。 另 一 方面 ，T 淋巴 球 系统 的 主要 功能 是 识别 细胞 表 面 抗原 , 并 由 此 区 别 自我 的 和 非 自我 的 细胞 。 T 细胞 的 这 种 功能 集中 在 识别 MHC 基因 产物 (包括 H-2K,H-2D 和 工区 产物 ) ,担负 对 同 种 异体 细胞 .突变 细胞 的 排斥 和 免疫 反 应 中 细胞 的 相互 作用 , 调节 这 两 方面 的 作用 。 这 种 在 进化 过 程 中 形成 的 双重 免疫 防 HA 统 , 每 一 系统 各 有 自己 的 抗原 识别 机 制 ,这 就 使 免疫 反应 和 抗体 合成 置 于 多 水 平 的 调节 控 制 下 ， 能 更 精确 、 灵活 地 适应 防御 内 外 环境 不 利 因素 的 需要 ， 而 避免 产生 自体 免疫 性 (Paul 和 Benacerraf, 1977). 最 后 , 还 应 提 到 MHC 连锁 的 Ir 基因 可 能 在 进化 上 具有 生存 适应 的 价值 。 人 类 的 某 些 疾病 (如 Hodgkin 氏 病 ,急性 淋巴 白血病 , 符 草 热 、 慢性 肝炎 、 全 身 性 红 RRA 等 ) 和 HLA 类 型 之 间 存 在 确定 的 相关 性 ,也 支持 这 种 看 法 (McDevitt 和 Landy, 1972), 目 前 这 方面 的 知识 还 不 多 ,但 是 可 以 预料 免疫 反应 基因 (及 Ia 抗原 ) 同 多 种 疾病 (包括 某 些 可 能 是 病毒 病因 的 肿瘤 ) 易 感性 的 相关 性 的 深入 研究 ,将 对 于 了 解 这 些 疾病 的 发 病 机 制 ， 以 及 预测 人 群 对 疾病 的 易 感 性 , 将 是 很 有 价值 的 。 和 专著 Benacerraf, B. ed. 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In: ‘ 颗粒 白血球 ,一 一 一 一 ~ 工 淋巴 球 和 受 体 球 THES BREE 1 I 1 1 细胞 或 | 免疫 识别 “原始 的 细胞 | 细胞 免疫 | 复杂 的 免疫 调 物种 专 一 一 ~> 人 一 > ”和 体液 、 一 > 节 ,各 类 和 亚 的 聚集 H 免疫 不 适合 性 | 免疫 记忆 \ 免疫 的 结合 类 免疫 球 蛋 白 植物 \ 原 生 腔 肠 动物 ， 环节 动物 ， 从 动物 海绵 a 棘皮 动物 ， 类 到 鸟 类 原始 鱼 ng Al 免疫 反应 能 力 系统 发 生 的 主要 阶段 。 从 腔 肠 动物 起 ， 已 开始 出 现 专 一 的 免疫 反应 能 力 。 高 等 无 脊 椎 动物 (环节 动物 、 床 皮 动物 ) 始 出 现 细胞 免疫 及 免疫 记忆 。 免 疫 反应 能 力 的 进化 是 随 淋 巴 样 系统 结构 和 功能 的 复杂 化 而 逐步 进化 的 ( 据 Hildemann，1974)。 在 原 索 动 物 如 海 鞘 已 有 类 似 淋 巴 球 的 细胞 , 并 表现 专 一 的 对 异体 移植 物 的 排斥 能 力 。 现存 兰 椎 动物 的 最 原始 种 类 圆 口 类 (如 八 目 鳗 ) 开始 出 现 原始 的 淋巴 样 系统 (构造 非 常 简 单 的 胸腺 和 脾脏 ) ,同时 在 不 同 程度 上 表现 出 脊 椎 动物 免疫 反应 能 力 的 各 种 特征 。 除 了 专 一 的 细胞 免疫 和 免疫 记忆 外 , 圆 口 类 还 表现 出 一 定 程度 的 体液 免疫 能 力 , 能 对 少数 抗原 起 反应 ， 产 生 类 似 IgM 的 抗体 。 在 软骨 鱼 类 淋巴 样 系统 的 发 育 程度 更 高 ， 出 现 真正 的 胸腺 和 脾脏 ， 体 入 免 疫 和 细胞 免疫 能 力 都 有 提高 。 随 着 浆 细 胞 的 出 现 ， 高 等 软骨 鱼 和 软骨 硬 鳞 鱼 的 抗体 合成 能 力 进一步 加 强 。 在 高 等 硬 骨 鱼 类 开始 出 现 和 Ig M 不 同类 型 的 免疫 球 蛋 折 。 两 栖 类 已 出 现 原始 的 淋巴 结 以 及 T 和 了 细胞 功能 的 初步 分 化 。 各 种 了 细胞 功能 ， 如 对 有 丝 分 裂 原 的 增生 反应 ，MELC 反应 、 移 植物 抗 寄主 反应 ，T 和 了 细胞 协同 效应 等 都 有 不 同 程度 的 表现 。 在 原始 疏 行 类 中 枢 淋巴 样 组 织 ( 如 扁桃 腺 ) 有 明显 的 发 育 ， 在 高 等 朴 行 类 还 出 现 Peyer 淋巴 细胞 团 。 鸟 类 出 现 法 氏 襄 ，T 和 了 B 细胞 的 功能 分 化 更 趋 完善 。 在 哺乳 类 免疫 系统 在 结构 和 功能 上 都 得 到 最 高 度 的 发 展 (图 2) 。 在 对 脊 椎 动物 免疫 系统 的 进化 作 过 粗略 叙述 后 ， 我 们 将 在 本 篇 内 讨论 冰 椎 动物 各 纲 ss51l1l1， Peete ~ P BAZAR TT | 本 | Te eee Egg 号 高 名 Fe A an f 2 lalaalileets Pome Pats -=-s=-===、 | 避 四 移植 物 排 太 | 国光 到 如 3 海 | 被 & 亚 门 ig a “(SS Sl Ob en = a BS ak a =i ak ae 欧 9004 原生 动物 图 2 免疫 系统 的 进化 ( 据 Du Pasquier, 1976),(M. L. R.) 混 合 淋巴 球 反应 《g- v- h.) 移植 物 抗 寄主 反应 (CM. H.C.) 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 。 免疫 球 蛋白 的 系统 发 生 ， 免 疫 球 蛋白 分 子 进 化 及 其 遗传 机 制 的 问题 。 由 于 补体 系统 和 组 织 相 容 性 抗原 与 免疫 球 蛋白 在 功能 上 和 遗传 控制 上 存在 密切 的 关系 ， 也 将 讨论 这 些 分 巴 和 免疫 球 蛋白 在 进化 上 可 能 存在 的 某 些 关联 。 ss 512 。 1 J : ‘a, 第 十 六 章 “免疫 球 蛋白 的 进化 对 现存 装 椎 动物 的 广泛 比较 研究 证 明 所 有 的 种 类 ( 除 最 原始 的 种 类 尚 有 疑问 外 ) 都 存 在 具有 四 条 链 基 本 构造 的 免疫 球 蛋白 。 如 前 述 ， 虽 然 在 某 些 无 脊椎 动物 已 出 现 适 应 免疫 现象 ， 但 是 从 未 发 现 过 在 结构 上 同 免疫 球 蛋白 相似 的 分 子 。 许 多 无 脊椎 动物 (如 党 、 蜗 牛 和 海星 等 ) 的 体液 中 存在 天 然 凝 集 素 (能 凝集 细菌 、 原 生动 物 和 红血球 等 ) 并 表现 出 促进 吞 噬 细 胞 的 吞噬 作用 的 能 力 。 然 而 ， 它 们 的 结构 却 设 有 和 免疫 球 蛋白 共同 之 处 。 显 然 ， 从 无 脊椎 动物 到 并 椎 动物 之 间 ， 过 湾 性 质 的 抗体 分 子 已 经 消失 在 瘟 长 的 进化 史 中 ， 已 无 从 查考 。 因 此 ， 我 们 目前 对 免疫 球 蛋白 分 子 进化 的 讨论 仅 限 于 壮 椎 动物 各 纲 的 范围 以 内 。 根据 对 哺乳 动物 的 研究 ， 同 一 物种 的 各 类 和 亚 类 的 免疫 球 蛋 白 都 是 由 一 个 或 多 个 具 有 四 条 链 ( 两 条 重 链 和 两 条 轻 链 ) 的 亚 基 构成 的 各 类 免疫 球 蛋 白 的 轻 链 都 是 相同 的 (1 或 < 型) 。 它 们 的 区 别 主 要 在 于 重 链 的 结构 以 及 链 间 二 硫 键 的 数目 和 位 置 的 不 同 。 按 照 结 构 上 的 差异 ， 重 链 可 区 分 为 w, 7Y, w，s，5 AME; 相应 地 免疫 球 蛋白 可 区 分 为 IEM， IgG, IgA, IgE, IgD 五 类 。 在 最 原始 的 宵 椎 动物 是 否 存在 和 哺乳 动物 的 免疫 球 蛋白 的 基本 构造 相似 的 抗体 分 子 ? 在 冰 椎 动物 系统 发 生 中 ， 各 类 免疫 球 蛋 白 出 现 的 先后 顺序 如 何 ? 是 否 存在 其 他 类 别 的 分 子 ? 这 些 是 首先 需要 讨论 的 问题 。 正如 比较 解剖 学 是 研究 动物 进化 的 古典 工具 一 样 ;“ 分 子 比 较 解 剖 学 ”一 一 蛋白 质 一 级 结构 的 比较 是 研究 分 子 进化 的 现代 工具 。 根 据 遗传 学 的 “中 心 法 则 ”， 蛋 白质 的 一 级 结 构 是 由 DNA 和 荷载 的 遗传 信息 决定 的 。 也 就 是 说 蛋白 质 的 一 级 结构 包含 着 基因 的 遗传 信 息 。 因 此 ， 蛋 白质 分 子 的 进化 反映 基因 的 进化 。 蛋 白质 分 子 进化 的 研究 ， 除 了 能 重建 现 存 物 种 的 进化 史 外 ， 还 能 提供 有 关 分 子 的 进化 速度 、 结 构 和 功能 演变 的 适应 意义 以 及 分 子 进化 的 遗传 机 制 等 方面 的 证 据 (Arnheim，1973;，Ayala，1976) 。 目 前 低 等 脊椎 动物 免疫 球 蛋 白 一 级 结构 的 研究 资料 还 很 少 ， 然 而 在 哺乳 类 方面 的 研究 已 取得 很 有 理论 意义 的 结果 。 如 前 所 述 ， 对 人 和 小 鼠 免疫 球 蛋白 肽 链 一 级 结构 的 比较 研究 ， 发 现 重 链 和 轻 链 都 可 分 成 易 变 区 (V) 和 不 变 区 〈C) 。 重 链 的 V 区 (Ve) 和 轻 链 的 V 区 (V) 有 相 当 高 的 同 源 性 。 重 链 的 C 区 含有 3 一 4 个 功能 区 〈Cty, Ca, Ca, Ca)， 彼 此 之 间 有 很 高 的 同 源 性 ， 它 们 又 和 轻 链 的 C 区 (Cy) 同 源 。 此 外 ，V 和 C 之 间 也 在 较 低 的 程度 上 同 源 。 从 这 些 结果 得 出 的 假 涪 ，VY 和 C 基因 可 能 起 源 于 共同 的 祖先 基因 。 在 免疫 球 蛋白 的 早期 进 化 过 程 中 ，V 和 C 基因 发 生 异 趋 后 是 各 自 独 立 进 化 的 。 对 YY 和 C 的 各 功能 区 一 级 结 构 的 比较 研究 ， 对 于 痢 明 轻 链 ( 上 和 1 )、 各 类 重 链 在 进化 上 的 起 源 和 这 变 (出 现年 代 , 相互 关系 等 ) 以 及 V 区 多 样 性 起 源 的 遗传 机 制 等 问题 是 有 重要 意义 的 。 根据 对 位 于 系统 发 育 不 同 水 平 的 脊椎 动物 免疫 球 蛋 白 的 特性 以 及 哺乳 类 重 链 和 轻 链 一 级 结构 比较 研究 的 现 有 资料 ， 对 于 上 述 问 题 已 能 得 到 一 些 初步 的 解答 。 ©5136 一 、 稍 椎 动物 各 纲 免疫 球 蛋白 的 系统 发 生 峭 椎 动物 各 纲 在 系统 发 生 上 的 关系 和 出 现 的 大 约 年 代 ， 如 图 16-1 所 示 。 它 们 的 免疫 反应 能 力 ( 产 生 抗 体 的 量 `, 类 别 和 多 样 性 ， 以 及 免疫 记忆 ) 也 是 随 淋巴 样 系统 在 组 织 结构 上 的 进步 而 逐渐 发 展 和 完善 起 来 的 ( 表 16-1) 。 鸟 类 (一 180) 哺乳 类 (一 180) 硬 骨 鱼 目 ( 大 多 数 现代 M47 AC — 300) 硬 骨 鱼 儿 一 1507 RAR a AGE, H) ”两 栖 类 (一 3507 一 ->(Coelacanth) aie & BCA, fF) re © ai ee Cate) _. 辐 鳍 鱼 类 . 肉 鳍 鱼 类 Be 硬 骨 鱼 类 (一 400) RAHA (—350) i (#@ a1) AREAS) FEA AA /\ A8B)(—450) BRN DWE 图 16-1 ADM. ASANRFRREKVER 出 现 的 大 约 年 代 ( 年 义 10-9) ( 据 Romer, 1970), (一 ) 圆 口 纲 现存 糊 椎 动物 最 原始 的 种 类 分 为 盲 鳗 目 (Myxinoidea) FIAMMA (Petromyzon- tia) , 1. Hi (Eptatretus stoutii， 英 俗名 Hagfish) F 属 言 鳗 目 。 免 疫 系统 的 构造 最 原始 。 成 体 有 淋巴 细胞 ， 但 没有 聚集 成 团 的 淋巴 样 组 织 (Theones 和 Hildemann，1970) 。 对 异体 移植 物 呈 现 免 疫 排斥 现象 。 早期 诱导 抗体 的 实验 没有 成 功 。 后 来 , 改进 了 饲养 条 件 ,结果 证 明 有 相当 广泛 的 产生 抗体 的 能 力 。 如 用 羊 红 血球 或 钥 孔 蛾 血 蓝 蛋白 免疫 后 ，2 一 3 个 月 后 能 形成 专 一 的 抗体 ， 不 过 效 价 很 低 〈Theones 和 Hildemann，1970) 。 抗 体 活 力 分 布 在 高 分 子 量 (238) WE 蛋白 部 分 。 同 IEM 的 同 源 性 尚 不 能 肯定 。 2. 八 目 鳗 (Petromyzor7z marinus) BARE, 比 盲 鳗 要 高 等 一 些 , 具有 原始 的 淋巴 样 系统 , 结构 很 简单 。 幼 鱼 鳃 区 有 *。514 。 表 16-1 肴 椎 动物 各 纲 免疫 系统 构造 和 功能 的 比较 4 淋巴 球 | 浆 细胞 | 胸腺 | meet | 淋巴 结 | eee | 抗体 PPM 被 囊 类 +(?) = = ? 十 (?) 圆 口 类 ABS + 原始 原始 二 一 +; og H# f (Hagfish) 者 未 发 现 | 未 发 现 = = “ie 板 鳃 类 低 等 种 类 下 十 + 一 + 一 高 等 种 类 十 二 ~ 一 一 十 4 硬 骨 硬 鳞 鱼 类 We + + + 一 一 一 加 软骨 硬 鳞 鱼 类 Ai + + + 一 十 十 硬 骨 鱼 类 一 十 十 一 一 > + 肺 鱼 类 十 + = 一 十 十 两 栖 类 AEA + ~ + 一 一 十 十 无 尾 类 一 + + +(7) 3 a: + MTA + + + 十 (?) +(?) + + BA + 十 十 +(2) + + 十 哺乳 类 原 兽 类 十 + + 十 (?) 十 (Eq.) 十 + 后 兽 类 十 十 一 一 +(Eq.) 一 - 真 兽 类 + + + +(Eq.) + + Eq 示 具 有 同等 功能 的 淋巴 样 器 官 。 ( 据 Marchalonis, 1977), 分 散 的 淋巴 细胞 团 , 可 能 相当 于 原始 的 胸腺 ,前 肠 折 陷 处 有 原始 的 脾脏 (Good 等 , 1966) 。 八 目 鳗 的 抗体 的 性 质 还 有 争论 。 对 鸣 菌 体 刀 能 形成 专 一 的 抗体 ; 对 羊 红血球 ,甚至 免 疫 一 个 月 后 , 仍 只 有 很 弱 的 抗体 反应 ; 对 血 兰 蛋白 没有 反应 。 抗 噬菌体 纪 抗体 的 活力 位 于 沉降 常数 为 14S 和 6.6S 的 球 蛋 白 部 分 , 后 者 占 优 势 。 分 子 量 高 低 不 同 的 这 两 部 分 表现 相同 的 或 相似 的 抗原 性 , 提示 14S 分 子 可 能 是 6.6S 分 子 的 多 聚 体 。 将 6.6S 分 子 溶 于 1M 丙 酸 内 凝 胶 过 滤 时 ， 分 离 为 约 呈 等 克 分 子 量 的 两 个 亚 基 ， 分 子 量 分 别 为 70,000 和 25,000， 表 明 可 能 是 缺少 链 间 二 硫 键 连接 的 互 链 和 工 链 。 另 一 方面 ，Zitmann 等 (1970) 却 不 能 找到 重 链 和 轻 链 。 他 们 用 人 红血球 长 期 免 疫 ， 得 到 一 个 抗体 部 分 (分 子 量 为 320,000; 9S) 。 放 置 时 ， 自动 降解 为 抗原 性 相同 的 亚 基 , 分 子 量 为 150,000 和 75,000。 这 两 个 实验 得 到 的 结果 不 一 致 ， 尚 待 进一步 研究 解决 。 然 而 ， 根 据 现 有 资料 仍 可 得 出 结论 ， 圆 口 类 已 有 初步 形成 抗体 的 能 力 。 (=) 板 鳃 纲 (软骨 鱼 类 ) 远古 原始 鱼 类 分 两 枝 进化 。 一 枝 为 软骨 鱼 类 ， 保 留 着 原始 的 性 质 ， 另 一 枝 为 硬 骨 鱼 类 ， 不 断 向 更 高 等 的 种 类 发 展 。 从 软骨 鱼 类 以 上 ， 所 有 疹 椎 动物 都 已 有 基本 组 织 结构 类 © 515% °(¢161 ‘8 JJOUOSIN HF) IRA PIV PIV ord XID JUL neJ eIV 一 一 v &X nas 丁 BTV PW J9g AID xsV xlD IYI, Mey — — dsV 1 Ba Neae 01 Jag 39g JUL AID 3yT, Sk_ 39S AIT IVT alT 19S ul9 AIH ne] 49g ATH Jog [RA 39S FIV Md 一 YO JJ NT PIV 29S STH (ota) My YY Cl IW XID Jes PIV Bry SAD JUI NT IVT [eA Siy dsy MID IPA 42S PIV Jeg Ne] Jeg Jog old JeS UH YL PW UD ?II dsy (no) In YY ny TRA C404 I) 97 Jag XID Jeg EIV IY SAO IGT MAT ML PIV AY UID AIO nsJ AIO IEA 39S NIT [PA Od Od JS NID UL co JUL ay] dsV 1B sn] ; > ney TeA (srouesy $14) 92 Tag xlD 39g PIV IML shD IYI, HT IVT. PIV AUT FID AID ne] AID 1zA J9S NIT IPA Old olId FPS MOD I4L ae JUIL ay dsy , 1B SAT . TeA (5ZZ 潮 地) Jag — IoS_eIV_IHL SO 三 L MN IMT PIV IT FID AID N87 AID IPA 29S Nay TeA Od old JS NIH WY yur syy, ayy] dsV 1B I Be CUBIST c7z BS ALM att SH ho HME BN KIEL 7 7-91 e ¢ 516» 似 哺 乳 动物 的 胸腺 和 脾脏 的 淋巴 样 器 官 ， 形 成 抗体 的 能 力 和 复杂 性 也 逐步 提高 。 软骨 鱼 已 有 较 强 的 形成 抗体 的 能 力 ， 能 对 细菌 、 病 毒 和 各 种 可 盗 性 抗原 和 半 抗 原 起 反应 ， 并 且 呈 现 典 型 的 次 级 反应 (免疫 记忆 ) 。 对 几 种 效 鱼 抗体 的 性 质 作 过 详细 研究 (Marchalonis 和 Edelman, 1965; Clem 等 ，1967; Clem 和 Small, 1967; From- mel 等 ，1971) ， 均 发 现存 在 分 子 大 小 为 19S 和 7S 的 两 类 免疫 球 蛋白 。 两 类 分 子 都 是 由 重 链 和 轻 链 构成 的 。 重 链 的 分 子 量 约 为 70,000， 轻 链 约 为 22,000。 两 类 分 子 的 重 链 的 分 子 量 、 酶 解 肽 毁 图 谱 、 电 泳 行为 和 抗原 性 以 及 糖 含 量 、 被 木瓜 酶 消化 的 性 质 都 是 相同 的 。 同 时 ， 涂 鱼 重 链 的 所 有 这 些 性 质 又 是 和 哺乳 类 人 链 相似 的 (Marchalonis 和 Ede- Iman, 1965), WHAMAS BS N 端 氨基 酸 排 列 顺序 的 比较 ， 指 明 19S M7S 免疫 球 蛋白 之 轻 链 和 轻 链 之 间 以 及 它们 和 哺乳 类 拉链 之 间 ， 均 有 许多 相似 的 地 方 ， 表 明 它 们 有 共同 的 起 源 ( 表 16-2) (Suran 和 Papermaster，1967) 。 在 离 体 非 变性 条 件 下 还 原 时 ，19S 分 子 便 降 解 为 TIS 分 子 。 这 一 事实 以 及 前 述 19 S 和 ?7 SS 分 子 的 重 链 有 相同 的 抗原 性 ， 表 明 7S 分 子 是 组 成 19S 分 子 的 单 体 , 它们 通过 链 间 二 硫 键 相连 成 多 聚 体 。 此 外 ， 还 发 现 只 有 19S DFHERU “NI” HANK (Klapper 和 Clem，1972) 。 电 子 显微镜 观察 还 看 到 瘤 的 19S 抗体 分 子 是 形态 类 似 IEM HARK ‘(Johnston 等 ，1971) 。 总 之 ， 所 有 以 上 的 证 据 都 表明 瘤 的 198 免疫 球 蛋白 可 能 是 和 哺乳 类 的 IgM 同 源 的 。 并 且 ， 如 以 后 将 提 到 的 ， 从 软骨 鱼 以 上 的 并 椎 动物 各 纲 都 普遍 存在 类 似 IEM 的 分 子 。 由 此 可 见 ， 这 类 免疫 球 蛋白 是 最 原始 的 ， 并 且 在 进化 过 程 中 有 很 明显 的 保守 性 。 (=) i eH A 在 地 球 史 上 ， 远 在 泥 盆 纪 中 期 ( 距 今 三 亿 多 年 前 ) 已 经 出 现 硬 骨 鱼 类 。 它 们 在 进化 上 循 两 枝 发 展 : 一 枝 为 辐 鳍 鱼 类 ， 演 进 为 现代 的 硬 骨 鱼 ; 另 一 枝 ， 肉 鳍 鱼 类 是 原始 两 栖 类 的 直接 祖先 (图 16-1) 。 辐 鳍 鱼 亚 纲 又 分 为 三 个 目 ， 软 骨 硬 鳞 鱼 ( 鲁 , ARS), Seale 、 鳝 、 亚 美 鱼 等 ) 和 硬 骨 鱼 目 ( 包 括 现代 硬 骨 鱼 的 大 多 数 种 类 ) 。 软 骨 硬 鳞 鱼 是 现存 硬 骨 鱼 类 最 原始 的 代表 。 从 泥 盆 纪 到 二 有 登 纪 ,软骨 硬 鳞 鱼 就 逐渐 被 全 骨 鱼 ( 硬 骨 硬 鳞 鱼 ) 所 代替 。 从 三 登 纪 到 白垩 纪 ， 全 骨 鱼 盛 极 复 误 ， 又 被 硬 骨 鱼 代替 ， 直 到 现代 。 另 一 方面 ， 总 鳍 鱼 是 从 肉 鳍 鱼 过 湾 到 原始 两 栖 类 的 直接 祖先 。 过 去 认为 它们 已 经 全 部 绝 灭 ， 后 来 发 现 只 剩 下 极 少数 非常 罕见 的 活化石， 如 矛 尾 鱼 。 残 存在 澳洲 和 非洲 的 肺 鱼 ， 虽 不 是 陆 生 宵 椎 动 物 的 直接 祖先 ， 但 是 相当 接近 从 总 鳍 鱼 到 原始 两 栖 类 进化 的 一 个 残存 的 分 枝 。 它 们 作为 向 陆 生 过 湾 类 型 的 现代 代表 ， 在 免疫 球 蛋 白 系 统 发 生 的 研究 上 仍然 是 有 珍贵 价值 的 。 1. 辐 鳍 鱼 类 所 有 已 经 研究 过 的 辐 鳍 鱼 类 ， 从 低 等 的 ( 白 鲁 ， 兴 鳝 ) 到 高 等 的 ( 鲤 、 钱 和 人 金鱼 等 ) 都 存在 高 分 子 量 的 ,类似 IEM 的 免疫 球 蛋白 ， 并 且 可 能 是 由 4 条 链 的 亚 基 构 成 的 四 聚 体 。 分 子 量 的 测定 (630,000 一 700,000) 和 电镜 观察 到 的 分 子 形态 (ADR) 都 支持 这 一 结论 (Shelton 和 Smith, 1970; Acton 4, 1971a,b,c), A. ERMRAN SOT E Ig «517. 的 糖 含量 虽然 和 人 IgM 相近 , 但 糖 的 组 成 有 明显 的 不 同 。 此 外 ， 其 重 链 的 分 子 量 的 修正 值 为 58,000 (Acton &, 1971b), 也 和 人 的 4 链 不 同 。 鉴于 分 子 的 这 些 特点 〈 重 链 分 子 量 和 糖 组 分 的 不 同 ， 四 聚 体 ) ， 辐 鳍 鱼 类 的 高 分 子 量 免 疫 球 蛋白 与 哺乳 类 的 IgM 有 多 KARE, MB SI. 至 于 是 否 存在 低 分 子 量 (7S) 抗体 ， 结 果 也 不 一 致 。 雀 鲜 和 金鱼 对 于 蛋白 质 抗 原 或 蛋白 质 半 抗 原 复 合 物 都 不 能 产生 低 分 子 量 抗体 。 可 是 ， 也 有 人 报告 鲁能 形成 位 于 6.4S 部 分 的 抗 -DNP 抗体 (Clem, 1971). 2. 肺 鱼 ;一 种 低 分 子 量 免疫 球 蛋 白 IgN 的 新 出 现 肺 鱼 是 肉 鳞 鱼 一 个 侧 校 残存 的 代表 ， 保 留 着 适应 陆 生 生活 的 原始 特征 ， 在 免疫 球 蛋 自 的 进化 上 也 占 重要 位 置 。 现存 的 两 种 肺 鱼 ， 澳 洲 肺 鱼 (Neoceratodxus) 和 非洲 肺 鱼 (Protopterus ue 刀 iopicvs) ， 具 有 分 子 量 大 小 和 抗原 性 都 不 相同 的 两 类 免疫 球 蛋白 。 这 种 低 分 子 量 的 免疫 球 蛋白 的 新 出 现 标志 着 抗体 分 子 进 化 的 一 个 新 阶段 ， 即 和 原来 存在 的 类 似 IgM 异 趋 的 一 类 新 的 免疫 球 蛋白 的 出 现 。 从 理论 上 推测 ， 这 一 异 趋 事件 至 少 应 发 生 在 两 种 肺 鱼 在 地 理 上 隔离 之 前 ， 即 至 少 在 两 亿 年 以 前 。 这 种 重 链 异 趋 的 过 程 继 续 不 断 地 进行 ， 其 结果 从 鱼 纲 以 上 ， 所 有 在 进化 上 更 高 等 的 类 型 (最 原始 两 枉 类 也 许 除外 ) 都 至 少 有 两 类 以 上 的 免疫 球 蛋白 ， 一 类 为 高 分 子 量 的 ， 其 他 类 为 低 分 子 量 的 。 澳洲 肺 鱼 和 非洲 肺 鱼 的 大 分 子 量 免疫 球 蛋白 的 沉降 常数 约 为 19$S， 并 可 能 是 由 4 条 链 的 亚 基 连 接 成 的 四 聚 体 ， 因 而 仍 具 有 IEM 的 基本 构造 特点 (Marchalonis, 1969; Li- tman 等 ，1971) 。 同 软骨 鱼 类 和 其 他 较 原 始 的 鱼 类 不 同 ， 肺 鱼 没 有 一 个 抗原 性 上 同 19S 分 子 相关 的 7S IE， 而 是 有 一 个 抗原 性 独特 的 5.8S 的 免疫 球 蛋白 。 这 一 类 新 出 现 的 免疫 球 蛋 白 的 分 子 量 为 120,000; 其 重 链 分 子 量 为 38,000， 可 能 只 包含 有 三 个 功能 区 。 198 Ig 的 重 链 的 分 子 量 为 70,000， 可 能 包含 五 个 功能 区 (Marchalonis, 1970). 肺 鱼 轻 链 本 端 9 氨基 酸 残 基 排 列 顺序 和 其 他 物种 的 比较 见 表 16-2。 它们 之 间 显 然 存在 某 种 同 源 性 ， 但 是 属于 上 型 还 是 2 型 尚 无 法 肯定 。 由 于 存在 上 述 许多 特点 , 肺 鱼 的 这 一 类 新 出 现 的 低 分 子 量 免 疫 球 蛋白 被 称 为 IEN, 相 应 的 重 链 称 为 > (niu) 链 。 BRATS, BUIENHOFREEF RAR, SK, RBH 些 哺乳 类 。IgN 和 哺乳 类 的 IgG 的 关系 如 何 ， 是 否 是 哺乳 类 IgG 的 先驱 分 子 ， 还 是 各 自 独立 起 源 ， 平 行进 化 的 ， 尚 不 能 断定 。 (四 ) 两 栖 纲 1. 无 尾 类 无 尾 两 柄 类 如 牛蛙 (Rana catesbiana) 的 抗体 存在 高 分 子 量 (18S) 和 低 分 子 量 (7 S) WK. 当 用 喉 菌 体 包 免疫 时 ， 早 期 (15 天内) 出现 的 抗体 完全 是 188S 分 子 。35 天 后 ， 同 时 存在 6.7S 和 18 S 抗体 分 子 。58 天 后 6.7 S 分 子 在 量 上 占 优势 ， 不 过 18 S 抗体 的 浓度 并 未 减少 。 这 两 类 抗体 重 链 的 抗原 性 有 差异 ; 分 子 量 各 为 72,000 和 53,000《 相 当 于 有 5 个 或 4 个 功能 区 ) ， 糖 含量 分 别 为 10.8% 和 2.1%。 此 外 ， 电泳 迁 移 率 也 各 自 同 人 iy & Se Ry 链 相 近 (Marchalonis 和 Edelman，1966) 。 这 些 资料 提示 这 两 类 抗体 可 能 518 。 相当 于 人 类 的 IEM 和 IEG。 其 它 无 尾 类 US) 也 存在 分 子 量 大 小 不 同 的 两 类 免疫 球 蛋白 。 无 尾 两 枉 类 抗体 反应 的 强度 (抗体 产生 的 速度 , 次 级 反应 的 强度 ， 效 价 等 ) 都 超过 鱼 类 。 特 别 值得 注意 的 ， 抗 体 反 应 对 温度 表现 明显 的 依赖 性 。 如 海 昌 (Bufo marinus) 用 细菌 鞭毛 免疫 时 ， 抗体 出 现 的 时 间 在 37°C 要 比 在 22"C 时 快 得 多 。 在 高 温 时 ， 免疫 后 第 3 天 就 出 现 抗体 形成 细胞 ，7 天 达到 高 峰 ， 在 低温 时 ， 则 分 别 延 长 到 7 天 和 14 天 。 抗 体 出 现 的 时 间 也 相应 地 延迟 ， 不 过 最 终 达 到 的 效 价 还 是 相同 的 (Diener 和 Marcha- 、 lonis，1970) 。 两 栖 类 个 体 发 育 的 特点 是 存在 变态 。 在 个 体 发 育 过 程 中 ， 两 类 免疫 球 和 蛋 白 出 现 的 顺序 如 何 呢 ? 研究 结果 发 现在 虹 时 期 已 经 出 现 这 两 类 免疫 球 蛋 白 。 2. 有 尾 类 Marchalonis 和 Cohn (1973) 从 一 种 低 等 的 有 尾 类 泥 狗 (Nectu7rus maculosis) 血清 中 分 离 出 一 种 类 似 IgEM 的 分 子 ， 分 子 量 约 为 900,000， 重 链 分 子 量 为 70,000， 轻 链 分 子 量 为 22,000。 但 是 ， 没 有 找到 低 分 子 量 的 抗体 。 很 有 趣 的 是 ， 原 始 两 栖 动 物 对 半 抗 原 载体 的 免疫 反应 中 ， 已 经 表现 出 细胞 协同 作用 。 总 之 ， 现 有 的 资料 说 明 ， 两 栖 类 已 出 现 一 类 与 IEN 不 同 的 可 能 相当 于 哺乳 动物 IgG 的 低 分 子 量 的 免疫 球 蛋白 。 这 似乎 提示 ， 非 IEM 的 低 分 子 量 免 疫 球 蛋白 可 能 在 低 等 肴 椎 动物 各 纲 内 独立 地 起 源 和 进化 。 (五 ) MR 行 # 这 一 纲 研究 过 的 种 类 很 少 ， 还 很 难 同 高 等 脊椎 动物 比较 。 对 三 种 龟 的 免疫 球 蛋 白 的 理化 性 质 作 较 详细 的 研究 后 ， 发 现存 在 高 分 子 量 和 低 分 子 量 的 免疫 球 蛋 A (Leslie 和 Clem, 1972; Chartrand “, 1971; Acton 等 ，1972) 。 高 分 子 量 的 免疫 球 蛋 白 的 分 子 大 小 、 肽 链 结 构 和 糖 含量 都 和 人 IgM 相似。 电镜 观察 到 的 分 子 形状 也 是 五 聚 体 。 KD 子 量 抗体 又 分 为 7.5S 和 5.7S 两 类 。 在 这 三 种 龟 ， 后 者 是 主要 的 低 分 子 量 抗体 ， 分 子 量 约 为 120,000， 其 重 链 的 分 子 量 约 为 38,000。 在 这 一 方面 ， 更 近似 肺 鱼 的 IgEN。 另 一 种 低 分 子 量 的 免疫 球 蛋白 (7.5S) 的 重 链 的 分 子 量 约 为 67,500。 鳃 晰 是 现存 最 原始 的 桶 行动 物 ， 具 有 分 子 量 高 低 不 同 的 两 类 免疫 球 蛋白 (188 和 7S)， 没 有 发 现 5.7S8 的 免疫 球 蛋 白 (Marchalonis 等 ，1969) ， 蜥 蝎 也 是 如 此 。 在 乌 始 初次 发 现 两 种 不 同类 型 的 轻 链 。 然 而 ， 是 否 相当 于 高 等 脊椎 动物 的 上 和 1 链 ， 还 有 待 进一步 的 研究 (Saluk 等 ,1970) 。 (A) SA: IgA 的 出 现 由 于 体温 恒定 和 淋巴 样 系统 组 织 构造 上 的 进步 (胸腺 和 法 氏 圳 以 及 T 和 B 细胞 的 功 能 分 化 ) ， 鸟 类 的 体液 免疫 能 力 获得 高 度 的 发 展 。 乌 类 抗体 研究 最 详细 的 两 个 种 是 鸡 和 鸭 。 根据 对 鸡 的 研究 ， 至 少 存 在 相当 于 人 的 IgM, IgG 和 IgA 的 三 类 抗体 。 前 两 类 抗体 存在 于 血清 内 ， 而 含量 以 IgG 为 主 。IgA 在 血清 内 的 含量 很 低 ， 可 是 在 胆汁 内 的 含量 却 很 高 (Orlans 和 Rose, 1972; Lebecq- *。519 。 Verheyden 等 ，1972) 。 这 一 类 抗体 能 专 一 地 同人 的 分 沁 片 结合 (Bienenstock 等 ， 1972)， 并 且 从 胆 眷 中 提取 的 IEA 比 血 清 IgA 要 多 一 个 抗原 决定 徐 ， 可 能 是 分 泌 片 或 “J” 链 。 所 有 这 些 证 据 都 表明 鸟 类 已 存在 相当 于 哺乳 类 IgA 的 抗体 。 至 于 更 低 等 的 养 椎 动物 ， 有 人 观察 到 蜂 晓 肠 粘 膜 内 存在 类 似 浆 细 胞 的 细胞 ， 但 不 能 断定 是 否 能 合成 Ig As 鸟 类 IgG 是 否 真 正 相 当 于 哺乳 类 的 IgG， 还 有 疑问 。 鸟 类 7S 免疫 球 蛋白 的 重 链 分 子 量 为 67,000， 要 比 哺乳 类 的 Y 链 长 。 据 推测 可 能 含有 .5 个 功能 区 ， 而 Y 链 只 有 4 个 功能 区 。 因 此 ，Leslie 和 Clem (1969) +5kj/2 SAW 7S 免疫 球 蛋白 称 为 IEY,， 以 示 和 哺 FLA IgG WEF. WO RRRE AR, LF TAA SME ZA Hi, MBA 在 三 类 免疫 球 蛋白 。 主 要 的 一 种 为 类 似 龟 警 的 5.7S 的 免疫 球 蛋白 。 BMH 19S KH IEM 和 7.18 的 IgY。5.78 抗体 的 重 链 的 分 子 量 为 35,000， 可 能 只 有 三 个 功能 区 (Zim- mermann，1971) 。 因 此 ， 有 人 认为 是 和 肺 鱼 的 IEN 属于 同一 类 型 。 实际 上 ，IEN 类 型 的 抗体 在 各 种 痊 椎 动物 分 布 很 广 ， 从 肺 鱼 开始 ， 在 看 行 类 、 鸟 类 的 一 些 种 ， 后 来 甚至 在 哺乳 类 的 袋鼠 (Thomas 等 ，1972) 和 家 免 (Steward 等 ,1969) 都 发 现 性 质 类 似 IgEN 的 分 子 存在 。 (七 ) mi al AW FEA) MEE BH, MPLA CE KA IZ RA RRA SARS. Me BONE FLAS REL A=MEA, BURSA PS St). ASA REM 兽 亚 纲 ( 绝 大 多 数 哺乳 动物 ) 。 发 生 在 低 等 并 椎 动物 中 的 免疫 球 蛋 白 分 子 进 化 的 趋势 ， 在 哺乳 类 几 个 亚 纲 中 继续 进 行 下 去 。 虽 然 在 两 栖 类 、 惧 行 类 和 鸟 类 都 存在 非 IEM 的 低 分 子 量 的 免疫 球 蛋 白 (Ign, IgY,IgG(?)), HiEMA IgG 同 源 的 抗体 分 子 在 原始 哺乳 类 才 出 现 。 原 兽 亚 纲 的 针 仍 和 后 兽 亚 纲 的 莲 尾 负 鼠 都 存在 7S IgE， 其 重 链 近 似 Y 链 。 并 且 , HEY EN 端的 部 分 顺序 ALA BSE Vinn 亚 族 相近 似 (Marchalonis，1977) 。 因 此 ， 可 以 合理 地 推测 原始 > 链 的 起 源 时 间 至 少 应 在 原 兽 类 和 它 的 爬行 类 祖先 异 趋 之 前 。 其 他 类 别 的 免疫 球 蛋 自 (IgA， Igk 等 ) 也 在 各 种 哺乳 动物 之 间 广 泛 分 布 。 与 导致 产生 重 链 类 别 相 似 的 基因 倍增 和 突变 的 遗传 事件 可 能 在 哺乳 类 的 目 和 属 的 进 化 过 程 中 进行 。IgG 亚 类 的 数目 在 不 同 物种 有 很 大 变化 ， 如 人 类 为 四 个 亚 类 ， 了 豚鼠 和 和牛 有 两 个 ， 家 兔 只 有 一 个 。 这 提示 IgG 亚 类 的 进化 在 不 同 的 物种 是 独立 进行 的 。 同样 地 ， 哺乳 类 各 目的 物种 形成 ， 也 出 现 重 链 Y 区 各 亚 族 的 分 化 。 总 之 ,哺乳 类 中 免疫 球 蛋 白 进化 的 趋势 是 增加 肽 链 结构 的 多 样 性 。 各 亚 类 、 亚 族 和 同 种 异型 的 分 化 是 进化 上 较 近 的 事件 , 它们 可 能 反映 出 各 类 免疫 球 蛋 白 进化 的 遗传 机 制 。 概括 起 来 ， 关 椎 动物 免疫 球 蛋 白 的 系统 发 生 可 得 出 几 点 重要 的 结论 : 1) 从 最 原始 的 种 类 开始 ， 免 疫 球 蛋白 四 条 链 构 造 的 基本 形式 ,在 冰 椎 动物 进化 早期 就 已 经 确立 了 。 因 此 ，V,C 基因 有 异 趋 应 追溯 到 状 椎 动物 起 源 或 以 前 的 时 候 ; 2) BD WKS BRIA, SHED DE MBER OAL eM 的 抗体 分 子 。 这 说 HR IgM 和 人 链 可 能 是 最 原始 的 ; 同时 在 进化 过 程 中 也 是 最 保守 的 。 另 一 方面 ，IgEM ZA © 520 。 a 表 16-3 ” 低 等 养 椎 动物 之 非 IgM 免疫 球 蛋白 的 特性 物种 名 me | 完整 分 于 | Bet Ht | cHo(%) | 2% 分 子 式 肺 鱼 hie AM 120,000 22,000 38,000 无 数据 IgN Tain, 牛蛙 | 两栖 纲 | (150,000) | 22,000 53,000 2.0 IgG(?) L.r(?): HS 两 栖 纲 160,000 22,500 53,000 4.2 IgG(?) L.7(?)s nit 两 栖 纲 无 数据 22,006 53,000 无 数据 IgG(7) L.r(?): 26,700 64,500 无 数据 IgG(?) L,7(?): 甲鱼 | RATA 180,000 22,500 67,500 IgGCY) L,7(Y), 120,000 22,500 38,000 0.9 IgN rae BE A RA 151,000 22,400 51,000 无 数据 IgG(?) L,r(2): ray 鸟 纲 178,000 22,400 68 ,000 5.0 IgG(Y) L,r(Y), 118,000 23,000 35,000 0.6 IgN L,v(2), 鸡 岛 纲 174,000 22,500 67,500 2.2 IgG(Y) L,r(¥), 无 数据 无 数据 无 数据 无 数据 IgA (L,@,) sag 哺乳 纲 单 孔 目 | 150,000 22,500 49 ,000 2.0 IgG Lay， (# Marchalonis, 1977), 合 状态 在 不 同 的 纲 却 可 能 不 同 。 从 Le m PANERA LEIARANEX. Pl, AME 的 IEM HARA 〈 效 血清 中 有 相当 数量 的 7S 单 体 )， 爪 蟾 为 六 聚 体 , 而 硬 骨 鱼 为 四 聚 体 。IgM 的 聚合 形式 在 一 个 纲 的 范围 内 是 恒定 的 ; 3) 从 肺 鱼 起 ， 在 系统 发 生 上 更 高 级 的 种 类 ， 逐次 出 现 与 IEM 不 同 的 各 类 免疫 球 蛋白 和 相应 的 Hitt ( 表 16-3) 。 在 低 等 脊椎 动物 (如 肺 鱼 ) BE 出 现 的 非 IgM 的 低 分 子 量 免疫 球 蛋 白 称 为 IEN。 其 重 链 的 分 子 量 较 Y 链 低 ， 可 能 只 包含 三 个 功能 区 。 无 尾 类 以 上 出 现 类 似 IgG 的 抗体 分 子 。 真 正 与 人 IgG 同 源 的 抗体 分 子 最 早 始 见于 原 兽 亚 纲 。 与 哺乳 类 IgA 同 源 的 抗体 分 子 ， 最 早 见 于 鸟 类 。 重 链 的 进化 可 能 是 以 4 链 为 基础 ， 通 过 功能 区 的 缺失 和 变异 进行 的 (图 16-2) IgG RW, WK 基 酸 排列 顺序 和 抗原 性 的 比较 看 来 ， 在 进化 上 是 较 近 的 产物 。 链 分 子 构造 VC« BA) CCK Be AD Bit CB OE | Vu Crery Crear Chery Chery gamma- 型 Vin Chiy Clay Chin gamma- 型 图 16-2 ” 壮 椎 动物 各 纲 免疫 球 蛋 白 肽 链 结构 的 演 变 。 每 一 单位 代表 一 个 功能 区 〈 包 含 约 NORE 酸 残 基 )e。( 据 Marchalonis, 1977), 4) 从 原始 状 椎 动物 到 人 类 ， 轻 链 的 分 子 量 保持 恒定 ( 约 23,000) 。 这 提示 在 进化 上 可 能 存在 直接 的 连续 性 。 在 软骨 鱼 类 (如 产 靶 藩 ) 可 能 已 存在 人 “上 链 的 前 体 ， 而 类 似 1 型 的 轻 链 则 最 先 出 现 于 鸟 类 。 二 、 免 疫 球 蛋 白 的 类 别 、 亚 类 的 起 源 和 进化 一 一 重 链 和 轻 链 一 级 结构 的 比较 研究 哺乳 类 (人 和 小 鼠 ) 免疫 球 蛋 白 重 链 和 轻 链 一 级 结构 的 比较 研究 ， 对 于 阐明 各 类 免疫 © 521.6 表 16-4 人 各 类 重 链 426 430 IgAl Met’ Val (Gly His. Glu "Alay Len Pro “Leu Ala” Phe) the + Gio IgM Val) J Wal. jAla), His, ‘GluAla,. Len Bro Asn’ Arg, Val) 7 abies IgGl Ses? Val Met Glu vfAla? Leu . (His) Asn lis Tyre Dae Gis 455 460 IgAl Vale (Glu Met. Ala Glu Val Asp (Gly. Thr | Cysiietyn IgM Leuy Val Met’) Seri, © Asp 9Thre “Ala. Gly & Thr “Gyspeityr (42 Chuang 4, 1973), 球 蛋 白 的 起 源 和 它们 在 进化 上 的 关连 以 及 YY 区 和 人 C 区 的 进化 提供 了 许多 知识 (参看 第 二 篇 有 关 章 节 ) 。 (一 ) 哺乳 类 各 类 免疫 球 蛋 白 在 进化 上 的 关连 对 几 类 免疫 球 蛋 白 的 重 链 (Y,w,A 链 ) 一 级 结构 的 比较 研究 , 已 阐明 各 类 重 链 的 易 变 X (Vp) 有 相当 高 的 同 源 性 ， 而 它们 的 不 变 区 (Cy) 间 的 同 源 性 却 很 低 ， 其 链 长 (功能 区 的 数目 ) 以 及 低 聚 糖 的 数目 也 不 相同 (Putnam 等 ，1973; Low 等 ，1976) 。 这 些 结果 支 持 重 链 是 由 两 个 基因 (V 和 C 基因 ) 决 定 的 观点 ， 这 两 个 基因 在 进化 中 很 早 就 发 生 分 上野， 各 自 独 立地 进化 。 免 疫 球 蛋白 的 类 别 和 亚 类 的 分 化 主要 是 由 于 重 链 C 区 的 分 化 所 致 。 此 ， 讨 论 各 类 重 链 的 起 源 以 及 它们 在 进化 上 的 关连 时 ， 只 需 比较 Ca 部 分 。 l.IgG 和 IgM 在 进化 上 的 关连 哺乳 类 IgG 和 IgM 的 重 链 排列 顺序 的 同 源 性 程度 相当 小 。 根 据 对 A IgGl (71 链 ) Al IgM (w 链 ) 最 大 同 源 性 的 比较 ， 发 现 大 约 只 有 32% 残 基 相 同 (Putnam 等 ，1973)。 除去 顺序 差异 外 ， 功 能 区 的 数目 不 同 (w 链 有 四 个 Ca 功能 区 , 7 链 只 有 三 个 )， 链 的 糖 含量 较 高 ， 并 且 还 存在 “J?" 链 。 这 些 重 要 区 别 反映 出 IgG 和 IgM 在 兰 椎 动物 进化 过 程 中 很 早 就 发 生 异 趋 ， 并 且 很 可 能 在 肺 鱼 出 现时 或 更 早 就 已 经 发 生 异 趋 。 有 AY Ale SERS Ca 区 的 相似 程度 很 低 ， 而 人 和 家 免 的 7 链 之 间 的 同 源 性 却 相当 高 ( 约 65 %) 。 这 一 事实 提示 ， 至 少 在 哺乳 类 ， 控制 IgG 和 IgM 的 Ca 区 的 基因 是 各 自 独 立 地 而 相连 续 地 平行 进化 的 。 2.1gA 的 起 源 根据 对 人 的 xc, YAY HEC 端 已 知 40 个 氨基 酸 排列 顺序 的 比较 ，Chuang (1973) UA IgA 和 IgM 的 同 源 性 超过 和 IgG 的 同 源 性 ( 表 16-4)， 并 且 假 定 IgA 是 在 IgG 出 现 以 后 ， 从 IgM 演变 而 来 的 。 从 表 16-4 看 出 ， 最 明显 的 特点 是 / 链 和 链 的 C 端 都 要 比 7Y1 链 多 一 段 (包含 19 氨基 酸 ) o & PERI GELE C 端 40 氨基 酸 的 同 源 性 为 55% ， 并 且 在 彼此 不 同 的 18 位 置 中 ， 站 522 。 二 端 排列 顺序 的 比较 440 450 fives ebhe re Asp AI REca Ala. Gly’, Lys) Proje;Thr Misi) Val As ‘Vali (Ser aro eth (Vale Asp» Lys Ser Thr Gly Lys; ‘Pro Thr, Leu’ Tyr eAsx’--Val’ ‘Ser Lys. Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 14 个 位 置 可 用 单个 碱 基 的 点 突变 来 解释 。 另 一 方面 ,4 链 和 7 链 的 总 同 源 性 只 有 32%, 虽然 在 近 C 端 处 略 高 。 Chuang 假定 “ 链 ( 和 7Y 链 一 样 ) 是 从 4 链 起 源 的 ， 不 过 发 生 在 较 晚 的 时 期 。 按 照 其 他 免疫 球 蛋白 进化 的 大 约 速度 估计 , % 链 大 约 起 源 于 两 亿 年 前 。 这 和 上 述 链 始 见于 鸟 类 的 事实 是 一 致 的 。 (=) 人 类 IgG. 各 亚 类 的 进化 哺乳 类 IgG 亚 类 的 进化 ,在 不 同 的 种 属 是 各 自 独 立地 进行 的 。 人 类 IgG 区 分 为 几 个 亚 类 可 能 是 在 进化 上 相当 晚 的 事情 ， 因 为 对 IgEGI1 和 IgG4 之 氮 基 酸 排 列 顺 序 的 比较 , 发 现 90% 以 上 的 位 置 是 同 源 的 。 根据 IgEG1 和 IgG4 之 Fe 顺序 差异 的 数目 计算， Pink (1970) 估计 人 类 IgG 各 亚 类 的 异 趋 可 能 发 生 在 20 一 30 x 10* 年 前 ， 即 大 约 相当 于 原始 人 类 出 现 前 不 久 的 时 间 。 Pink 这 种 粗略 的 估计 ， 还 得 到 对 灵 长 类 免疫 球 蛋白 的 Gm 同 种 异型 标记 和 亚 类 专 一 抗原 决定 得 的 研究 结果 的 支持 (参看 第 十 五 章 ,476 页 ) 。 人 IgG2 亚 类 专 一 的 抗原 决定 得 似乎 在 所 有 次 人 灵 长 类 都 普遍 存在 。 然 而 , 人 IgG1， IgG3， IgG4 亚 类 专 一 的 抗原 决定 簇 ， 仅 仅 在 旧 大 陆 钦 和 猿 类 发 现 (Van Loghem 和 Litwin, 1972), 这 提示 IgG1， IgG3 和 IgG4 应 起 源 于 新 大 陆 钦 和 旧 大 陆 钦 异 趋 的 时 间 ( 约 10 x 10* 年 前 ) 。 这 一 结论 也 是 和 人 IgG3 特有 的 同 种 异型 标记 仅 存在 于 巨 猿 和 旧 大 陆 猴 , 而 不 存在 于 新 大 陆 钦 是 一 致 的 。 (=) %% FE BY Eft 有 人 曾 假定 在 进化 过 程 中 ， 工 链 比 互 链 早出 现 。 这 种 推测 的 主要 根据 是 工 lt A 链 短 ， 只 含有 一 个 Cr 功能 区 ， 并 且 假定 Ca 基因 是 通过 CL 基因 倍增 及 以 后 的 突变 起 源 的 。 排 列 顺序 的 比较 分 析 也 支持 这 一 假说 ， AAC. 和 同一 物种 的 Ca 各 功能 区 之 间 的 同 源 性 远 超 过 Y 区 和 C 区 之 间 的 同 源 性 。 这 提示 如 果 所 有 的 免疫 球 蛋 白 起 源 于 一 个 共同 的 祖先 基因 的 话 ，C 基因 和 基因 的 异 趋 应 发 生 在 远 早 于 Ca 和 Cr AREA 时 ©5236 候 。 从 原始 背 椎 动物 到 人 类 ， 工 链 的 分 子 大 小 保持 恒定 ， 提 示 它 在 进化 上 可 能 保持 着 连 续 性 和 独立 性 。 lx 链 和 1 链 的 起 源 人 上 链 和 1 链 之 顺序 同 源 性 ( 约 39%)， 提 示 它 们 在 进化 上 有 共同 的 起 源 。 人 上 eA NER © 链 Cr 区 之 间 的 顺序 同 源 性 ( 约 60%) 远 超过 了 人 < 上 链 和 1 链 之 间 的 同 源 性 (39%) 或 小 鼠 < GEA A 链 之 间 的 同 源 性 (35%) 。 这 提示 上 链 和 1 链 在 异 趋 之 后 是 各 自 独 立 进 化 的 。 各 物种 之 间 轻 链 顺 序 的 相似 性 使 有 可 能 鉴别 它 是 属于 上 型 或 1 型 ， 并 追溯 两 型 轻 链 的 进化 途径 。 根 据 现 有 的 资料 , “ 和 1 型 轻 链 异 趋 起 源 于 何 时 尚 不 能 断定 。 有 人 认为 软 骨 鱼 类 (MP eZzS@) 似乎 已 出 现 类 似 守 链 的 前 体 物 。 鳃 虽然 存在 抗原 型 不 同 的 两 型 轻 链 ， 但 是 不 能 鉴别 它们 是 上 或 1 型 。 自 鸟 类 起 才能 肯定 与 哺乳 类 轻 链 型 别 的 关系 ， 如 鸡 的 轻 链 属 于 1 型 。 2. 两 型 轻 链 在 各 物种 内 的 分 布 在 哺乳 类 和 鸟 类 的 各 物种 中 , “型 和 1 型 轻 链 的 分 布 极为 不 同 ( 图 16-3) 。 两 型 轻 链 的 相对 比例 在 不 同 的 物种 也 有 很 大 的 变动 。 如 吐 齿 类 中 上 链 占 优势 ; 灵 长 类 中 上 :=2:1; 而 马 只 有 4 链 ， 找 不 到 “ Ge (Hood 等 , 1967)。 这 种 分 布 情况 提示 1 和 上 基因 ， 在 不 同 物种 是 各 自 独 立地 进化 的 。 (Po) V 区 的 进化 自从 Y 和 C 基 因 在 免疫 球 蛋白 进化 早期 发 生 异 趋 后 ， 它 们 各 目 是 独立 地 而 又 平行 地 进化 的 。 图 16-3 “和 41 轻 链 在 各 物种 的 分 布 ( 据 Hood %, 1967), es。 5246 1.，V 区 各 亚 族 之 间 的 系统 发 生 关系 比较 各 类 重 链 易 变 区 (Va) 的 排列 顺序 时 ， 发现 可 按 其 顺序 的 最 大 同 源 性 ， 划 分 为 几 个 亚 族 (Subgroup), BY Vin, Van» Vum (Putnam 等 ，1971) 。 如 人 的 IEM (ou) 的 上 链 易 变 区 的 排列 顺序 与 三 种 IgG ari 链 (Cor, Daw 和 了 He) 同属 于 Var 亚 族 , 它 们 之 间 有 很 高 的 同 源 性 (61 一 75%) 。 反 之 ，4 (ou) 链 与 属于 Van 亚 族 的 Y1 (Nie) 链 只 有 47% Awe, SBF Vn 71 (Eu) 链 的 同 源 性 更 低 ， 只 有 .31% 残 基 相 同 (参看 第 八 章 ， 表 8=1，231 页 ) 。 这 一 事实 表明 不 同类 别 (w 链 和 7Yl1 链 ) HE 链 之 易 变 区 彼此 之 间 的 相似 程度 大 于 同 一 类 别 而 属于 不 同 亚 族 的 重 链 之 易 变 区 间 的 相似 程度 。 上 “ 和 1 轻 链 的 易 变 区 同 样 可 以 划分 为 几 个 亚 族 。 “上 链 的 Vz 区 有 四 个 亚 族 ,1 链 有 五 个 亚 族 。 并 且 重 链 易 变 区 (Vu) 甚至 和 轻 链 易 变 区 (Vr) 也 有 一 定 程度 的 相似 性 。 这 些 事 实 提 示 ,， 所 有 编码 易 变 区 的 V 基因 可 能 来 源 于 共同 的 祖先 分 子 , 并 且 V 基因 和 编码 ”图 16-4a Av 和 Yi 重 链 易 变 区 各 亚 族 在 系统 发 生 上 的 关 TPO HE Cre BEE, Re A RSS Pama 971) 自 独立 进化 的 。 重 链 、“ 轻 链 和 1 轻 链 各 有 一 套 独立 进化 的 V 基因。 从 重 链 易 变 区 各 亚 族 的 氮 基 酸 排 列 顺序 异同 的 比较 分 析 ， 还 能 推测 重 链 各 亚 族 在 系 统 发 生 上 的 关系 (图 16-4a) 。 此 图 是 根据 表 8-1 (参看 第 八 章 ，231 页 ) 所 列 人 4 链 (ou) 和 五 种 Y1 链 (Cor，Daw，He，Nie 和 Eu) 之 NK 端 100 氮 基 酸 排列 顺序 的 差异 绘 制 的 。 从 一 共同 原点 起 始 的 分 枝 的 长 度 ， 代 表 从 此 原点 开始 在 进化 上 蜡 趋 的 两 免疫 球 蛋 白 分 子 的 共同 祖先 分 子 的 排列 顺序 被 置换 了 的 氮 基 酸 残 基数 目 。 任 何 两 个 蛋白 质 分 子 之 间 的 分 梳 长 度 的 总 和 ， 大 约 相当 于 这 一 对 蛋白 质 易 变 区 N 端 100 氨基 酸 排 列 顺序 的 差异 数 。 此 差异 数 愈 大 ， 系 统 发 生 上 的 亲缘 关系 愈 远 。 同 理 可 以 绘制 出 上 和 1 轻 链 V 区 各 亚 族 的 系谱 树 ( 图 16-4b)。 根据 对 许多 物种 的 细胞 色素 C 分 子 的 毛 基 酸 排列 顺序 的 差异 的 分 析 结 果 绘 制 的 系 谱 树 图 形 和 上 图 很 相 象 。 在 细胞 色素 C 分 子 的 进化 过 程 中 之 变异 率 ， 根 据 用 计算 机 分 析 的 结果 ， 对 于 一 个 140 氨基 酸 链 长 的 蛋白 质 分 子 ， 每 一 个 氨基 酸 残 基 的 置换 稳定 下 来 所 需 的 时 间 要 一 千 万 年 (Fitch 和 Margoliach, 1967; 1970) 。 假 定 人 类 重 链 的 进化 是 以 和 细胞 色素 C 分 子 相同 的 突变 率 进 行 的 ， 则 x (ou) 链 和 Y1 (Eu) 链 之 Va 基 因 的 异 趋 估计 应 发 生 在 几 亿 年 前 。 这 间 地 质 学 上 所 知 的 峭 椎 动物 各 纲 进化 时 程 是 不 符合 的 。 因 此 ， 推测 免疫 球 蛋 白 分 子 重 链 V 区 的 进化 , 应 当 以 比 已 知 蛋 白质 分 子 的 突变 率 要 高 许多 倍 的 速度 来 进行 。 2. Vim 亚 族 的 进化 一 般 说 来 ， 只 有 Van 亚 族 的 重 链 有 不 封闭 的 N 末端 (Capra 等 ，1973)， 这 就 提 ©5256 if DEE gy HAU. GAL BI , ROY NI AU REI TUR ZAP tir Il TI AG WAS TE 3 SCW EU 人 CUM TIE HBJ Th ITI 工 AY NEW B6 POM 了 HA JON VOR LEN) IV NIE TRON GAL BOH Ni NEI K VIL OU BO .BAU COR 下 x . DAW KERN DEL SH H ~ II 1 图 16-4b <，1 和 五 链 V 区 之 系谱 树 , 主要 分 枝 相 当 于 亚 族 ， 细 分 枝 相 当 于 个 别 的 蛋白 质 ( 据 Hilschmann, 1976), 供 了 鉴别 的 方便 。 已 知人 类 重 链 库 中 约 20% 属 于 Vanr 亚 族 。 根 据 广泛 的 N 端 排列 顺序 的 比较 分 析 ， 发 现在 许多 哺乳 动物 ， 凡 是 具有 不 封闭 的 N 未 端的 重 链 都 和 人 Van 的 排 列 顺序 有 高 度 的 同 源 性 。 在 重 链 库 中 ， 不 封闭 N 端 重 链 所 占 的 比例 可 从 0 Ge. AL. =e. DB, i) 变动 到 超过 95%〈 负 鼠 、 狗 、 项 、 猫 、 海 狮 、 海 鹏 ) ， 其 他 物种 约 为 19—29% (AVR. ABD KD 。 亲 缘 关 系 上 邻近 的 物种 ， 不 封闭 Van 链 一 般 具 有 相似 的 Et 值 。 最 近 的 研究 表明 ， 重 链 和 轻 链 的 变异 主要 限于 分 散在 几 处 的 高 变异 区 。Y 区 的 其 余 部 分 (恒定 骨架 ) 的 排列 顺序 在 邻近 的 物种 之 间 表 现 相 当 大 的 保守 性 (Kehoe 和 Capra, 1974) 。 根 据 这 些 资料 , 有 人 提出 一 个 假说 认为 免疫 球 蛋白 每 一 条 链 至 少 是 由 三 个 基因 的 相互 作用 形成 的 。Y 区 相对 恒定 的 骨架 是 由 为 数 有 限 (大 约 相 当 于 V 区 亚 族 的 数目 ) 的 基因 编码 的 ， 而 高 变异 区 则 可 能 是 由 另 一 大 群 基因 (50 一 100 个 ) 编码 的 (Capra 和 Kindt, 1975), 高 变异 区 基因 可 能 通过 某 种 整合 机 制 和 编码 V 区 恒定 骨架 的 Va WR 基因 相互 作用 ， 形 成 完整 的 易 变 区 。 后 者 再 通过 基因 移 位 机 制 和 C 基因 连接 起 来 ， 形 成 整 条 肽 链 的 完整 基因 (Hamlyn, 1976), 在 这 里 顺便 还 要 再 次 提 到 V 区 多 样 性 起 源 的 问题 。 从 上 述 可 以 推 想 ,V 区 的 多 样 性 可 能 是 由 在 进化 过 程 中 形成 的 数量 有 限 的 V 亚 族 基因 (种 质 系 基因 ) 和 编码 高 变异 区 的 基因 在 胚胎 发 生 期 中 相互 作用 的 结果 。 按 照 Kabat (1971) 的 假说 , 高 变异 区 的 肽 段 假 定 是 由 “染色 体外 基因 ”(“Episome”) 编码 的 。“ 染 色 体 外 基因 ”DNA 的 这 一 段 或 另 一 段 核 苷 酸 顺 序 插 人 重 链 或 轻 链 易 变 区 之 结构 基因 (恒定 骨架 ) 内 。 假定 能 自身 繁殖 的 “染色 体外 基因 ”含有 大 量 的 核 昔 酸 排列 顺序 ， 也 就 是 说 大 量 的 抗原 结合 专 一 性 的 信息 。 于 是 通过 这 种 遗传 机 制 就 可 以 提供 多 种 多 样 的 专 一 性 ， 而 无 需 改 变 整 个 分 子 的 基本 结 *。 26。 年 代 St 类 别 —400x10° ,一 200x168 脊椎 动物 出 现 两 栖 关 出 现 祖先 轻 链 (C) : a ————-__ c- 区 祖先 Arg 基因 PRS sl 祖先 重 链 (C) = Sa C- 区 基 (类 似 上 链 ) ET Y 祖先 重 链 [这 人 (N) Ge) cy _V- 区 基因 S (数目 未 知 ) 5 重 链 和 轻 链 V- 区 的 分 离 5 , kA 1 链 V- 区 的 分 离 16-5 ”人 免疫 球 蛋白 分 子 进化 途径 。 和 1 链 和 重 链 之 祖先 V- 区 的 进化 没有 画 出 来 ， 可 能 遵循 和 kK 链 相似 的 途径 ( 据 Fudenberg，1972)。( 图 中 纵向 倍增 应 为 纵 列 倍增 ) 构 。 最 近 ，Kabat 等 (1978) 提出 重 链 和 轻 链 YY 区 的 恒定 骨架 ， 又 可 分 为 四 个 段 (了 BR， FR,, FR;, FR,). 区 一 个 亚 族 的 每 一 个 了 BR 片段 是 由 一 个 “ 微 基 因 ” (“Microgene”) 编码 的 。 每 一 个 了 BR 片 恨 ， 按 排列 顺序 又 可 分 为 有 相同 顺序 的 几 个 组 。 胚 胎 发 育 中 ， 重 链 和 轻 链 Y 区 的 骨架 是 由 这 几 个 了 BR 片段 的 属于 不 同 组 的 微 基因 集合 起 来 形成 的 .上述 YY 区 结构 多 样 的 遗传 机 制 的 假说 尚 属 初步 膀 想 。 还 需要 对 生殖 细胞 基因 组 (精子 DNA) 的 结构 分 析 加 以 检验 。 四 、 免 疫 球 和 蛋白 进化 的 机 制 原始 的 免疫 球 蛋 白 出 现 以 后 ， 逐 步 演变 成 一 大 类 复杂 的 肽 链 。 根 据 系统 发 生 和 排列 顺序 比较 研究 的 资料 ， 可 以 设想 免疫 球 蛋 白 分子 选 化 经 历 三 个 主要 的 阶段 (图 16-5); 1) Y 区 和 C 区 ， 重 链 和 轻 链 的 分 化 ， 并 形成 有 功能 的 免疫 球 蛋 白 分 子 ; 2) 重 链 类 别 和 轻 链 型 别 的 分 化 ; 3) 各 类 重 链 的 亚 类 ,同族 异型 的 分 化 。 上 述 每 一 阶段 的 演变 可 能 主要 是 通过 基因 倍增 和 点 突变 的 积累 进行 的 。 (—) 蛋白 质 分 子 进化 的 机 制 根据 对 血红 蛋白 等 的 研究 结果 ， 和 蛋白 质 分 子 进化 主要 是 通过 基因 倍增 和 点 突变 进行 BY (Arnheim, 1973; Ohno，1970) 。 基 因 倍 增 又 可 能 分 为 两 种 方式 (图 16-6) : © 527° 1. 多 倍 体 倍增 (Polyploid duplication) 当 减 数 分 裂 过程 部 分 或 全 部 失败 时 ， 就 可 能 发 生 染 色 体 数目 或 套数 加 倍 的 现象 。 每 CR 一 个 倍增 的 位 点 将 有 4 个 而 不 是 2 个 基 人 因 复 本 。 它 们 位 于 不 同 的 染色 体 上 ， 人 彼 有 关 基 因 的 位 点 此 之 间 是 不 连锁 的 。 多 倍 体 倍增 纵 列 倍增 2. 纵 列 倍增 (Tadem duplication) 一 基因 的 纵 列 倍增 包括 染色 体 上 一 让 DNA 的 部 分 或 全 部 加 倍 。 结果 产生 的 Bg: BS ee 基因 编码 的 多 肤 链 变 比 原来 的 长 ， 或 者 图 16-6 ”基因 倍增 的 机 制 。 多 倍 体 倍增 可 能 是 成 熟 分 型 部 分 “得 到 一 个 完全 加 倍 的 基因 。 纵 列 倍增 通 失败 的 结果 ,导致 染色 体 的 加 倍 (可 能 包括 整套 染色 体 加 倍 )。 常 可 能 是 由 于 成 讨 分 裂 时 不 等 交换 产生 ST RRARIN REE. Meme ree Ao ATM AS fF aa AOE S055 GB Hobart, 1975), 旁 ， 它 们 是 紧密 连锁 的 。 染色 体 和 基因 加 倍 的 结果 提供 了 突变 和 选择 的 机 会 ， 由 此 产生 基因 结构 和 功能 上 的 分 化 ， 形 成 新 的 基因 。 另 一 方面 ， 纵 向 基因 倍增 产生 的 基因 重复 排列 ， 增 加 了 非 同型 配 对 和 不 等 交换 的 机 会 ， 造 成 遗传 上 的 不 稳定 性 。 由 于 不 等 交换 引起 的 相 邻 的 两 个 基因 的 融合 (如 象 “Lepore” 突变 血红 蛋白 是 由 和 4 两 个 顺 分 子 融合 的 结果 ) 也 可 能 是 免疫 球 蛋 白 进化 的 一 个 重要 的 机 制 。 总 之 ， 蛋 白质 分 子 进化 的 机 制 可 能 通过 基因 倍增 和 点 突变 的 积累 ， 导 致 基因 在 结构 和 功能 上 的 分 化 。 这 样 产生 的 家 邻 的 不 同 的 顺 反 子 又 可 能 通过 不 等 交换 发 生 基因 融合 又 产生 新 的 基因 。 (二 ) 假想 的 免疫 球 蛋 白 分 子 进化 进程 1. 原始 的 免疫 球 蛋 白 分 子 的 出 现 在 免疫 球 蛋 白 的 进化 中 ， 多 倍 体 倍 增 和 纵 列 倍增 都 可 能 起 作用 。 我 们 可 以 设想 编码 一 个 原始 功能 区 的 基因 通过 纵 列 倍增 进化 出 一 个 原始 的 Ig 链 。 其 中 一 个 基因 复 本 特 化 为 : 易 变 区 。 这 一 整个 系统 再 发 生 两 次 多 倍 体 倍 增 , 结 果 在 不 同 的 染色 体 上 产生 出 es 4 AB 链 的 前 体 基 因 。 原始 的 重 链 C 区 基因 再 经 过 多 次 纵 列 倍增 演变 出 各 类 重 链 (图 16-7) (Hobart，1975) 。 这 里 应 指出 的 ， 为 了 产生 <，12 和 重 链 三 个 不 连锁 的 基因 群 ， 需 要 两 次 多 倍 体 倍 增 。 理 论 上 ， 两 次 多 倍 体 倍 增 应 产生 四 个 独立 的 基因 群 ,而 实际 上 只 有 三 个 ， 还 缺失 一 个 。 很 有 兴趣 的 ， 有 证 据 表 明和 组 织 相 容 性 抗原 相连 的 P, 微 球 蛋白 与 免疫 球 蛋白 的 一 个 功能 区 大 小 相似 并 有 一 定 同 源 性 (Cunningham 等 ，1973) 。 因此 ， 可 以 假 设 8 微 球 蛋白 就 是 这 一 个 “缺失 ”的 基因 群 的 产物 。 需要 补充 的 ， 对 Va BWKS vu, 7,0, 1 HEN C 功能 区 排列 顺序 的 比较 分 析 证 明 V 和 C 区 可 能 起 源 于 共同 的 祖先 基因 ， 并 且 提 示 免 疫 球 蛋白 各 功能 区 在 进化 中 出 现 的 顺 Fe, Vu 和 Ca ( 重 链 C 区 的 第 一 个 功能 区 ) 可 能 是 最 古老 的 。 此 外 ， C,’ 功能 区 和 红 血 © 528 。 i oe LY /有 4 原始 Ig 链 a en 和 RUSE... L..... Ey EY eT Be & 多 倍 体 倍增 222 dar ere ye ve 纵向 倍增 4 微 球 蛋白 纵向 倍增 | ed ees EET et RT FT on POY on oe Pe OY. HOY. oo HOO ay VK, VK, VK; CK Vay Voi; ven Val Vad Vad - 纵向 倍增 AS | skate oo …. +} ee Oo, aor... Va, van ow 5 eae "Val Val Vad 等 OZ Kern omc} 图 16-7 各 类 免疫 球 蛋白 假定 是 由 编码 一 个 功能 区 的 祖先 基因 ,通过 一 系列 的 纵向 倍增 2 和 多 倍 体 倍增 进化 而 来 的 。 此 处 未 表示 V 区 的 进化 (图 中 纵向 倍增 应 为 纵 列 倍增 ) CG Hobart, 1975), 球 膜 上 的 MN 血型 糖 蛋白 (Glycophorin) 存在 颇 大 的 同 源 性 (Urbain, 1972; Wuil- wart 和 Urbain，1976) 。 这 一 事实 以 及 上 述 P: 微 球 蛋白 与 Ig 功能 区 同 源 的 事实 ， 都 提示 原始 的 免疫 球 蛋 白 和 某 些 膜 蛋 白 的 祖先 分 子 可 能 有 共同 的 起 源 。 2. 重 链 类 别 的 进化 从 免疫 球 蛋白 的 系统 发 生 和 一 级 结构 的 比较 研究 都 表明 , 4 链 是 最 古老 的 。 Y eM % 链 都 可 以 假定 是 通过 不 等 交换 机 制 ， 从 原始 的 上 4 链 失 去 一 个 功能 区 后 ,分 化 出 来 的 。 原 始 “ 链 失去 Co 功能 区 ， 衍 生出 Y 链 ; KACLMAR, PEW o H(A 16-38). © 链 则 可 能 是 通过 链 纵 列 倍增 衍生 出 来 的 。 3. 重 链 亚 类 的 进化 若 前述 纵 列 基因 倍增 是 产生 新 基因 的 一 个 不 稳定 的 方法 。 重 复 排列 的 基因 的 存在 有 利于 发 生 不 等 交换 ,结果 导致 基因 的 缺失 或 融合 。 哺乳 类 中 ，IgG 亚 类 数目 在 不 同 物种 有 很 大 的 变化 ， 人 类 为 四 个 亚 类 ， 奴 鼠 和 牛 有 二 个 ， 家 兔 只 有 一 个 。 这 种 数目 变动 本 身 显然 提示 7 链 基 因 的 数目 在 进化 过 程 中 波动 不 定 。 物 种 形成 往往 伴随 着 一 些 重 链 亚 类 的 丧失 和 另 一 些 新 的 亚 类 的 产生 。 有 清楚 的 证 据 担 示 ， +H IgG 亚 类 是 新 近 才 进化 出 来 的 。 牛 的 两 条 7 链 亚 类 C 端 排列 顺序 与 其 他 动物 的 比较 见 表 16-5。 这 两 条 链 在 C 端 和 6 位 置 都 有 物种 专 一 的 残 基 ， 可 认为 存在 共同 的 牛 的 祖先 基因 。 牛 了: 亚 类 在 10 th 有 一 个 独特 的 meth. RIE, 提示 这 条 链 是 从 一 个 类 似 Y1 链 的 原始 的 牛 祖先 基因 通过 一 个 点 突变 演变 来 的 。 因 此 ， 亚 类 的 分 化 似乎 象 一 个 天 然 的 实验 ， 揭 示 了 免疫 球 蛋 白 进 化 最 近 的 历程 。 4. 同 种 异型 的 进化 机 制 一 -点 突变 免疫 球 蛋白 基因 不 断 地 经 历 和 积累 个 别 的 突变 。 从 根本 上 说 , 突变 是 导致 一 个 免疫 球 1) “纵向 倍增 "应 为 “ 纵 列 倍增 ”。 © 529 。 Cal . Cy2 Ca3 © Cy -一 一 oH Sete 7 Wet Ga, Gay Gk / ae Cris. C3 UN 党 ----- |- 一 一 | 一 一 一-------y 链 基因 ee tg Oe, Cie cx 链 基 因 tt et ee en, ett Cul Cu? ,Ca2 Ca3 Ca4 “未 知 产物 Cul Er OSI 最 后 同 源 的 重 链 ne M5 > G1 Cy2_, C3 . C4 +19 残 基 rt Sl, G2? 63 a ar GA) ee Sug 34 ah Gad +19 残 基 图 16-8 各 类 免疫 球 蛋 白 假定 是 由 原始 由 链 的 功能 区 缺失 进化 而 来 的 《Hobart，1975)。 表 16-5 ” 几 种 哺乳 动物 各 亚 类 YY 链 C 端 排列 顺序 的 比较 链 顺 序 io ie 17 16 1 143 2 1 9! 8 6 CS ee We Vs 72 (Met) His-Glu-Ala-Leu-His—Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Pro-Gly-COOH 人 73Gm( 一 5) Arg K v4 Leu Br Ile Arg 马 IgG(T)r Val-Glu Asn-Val His oO, IgGr Val Lys #4 ri Thr Lys Ala + 72 Met Thr Lys Ala 除 指明 的 位 置 外 ,所 有 的 顺序 都 和 人 71 相同 。 ( 据 Milstein 和 Feinstein, 1968), 蛋白 亚 类 的 多 型 现象 的 原因 ， 如 Gm‘-Gm’, Inv'-Inv° 的 转变 均 可 用 单个 的 点 突变 来 解释 。 其 次 ， 某 些 亚 类 或 亚 型 的 变异 ， 如 Oz+*-Oz-， 也 可 能 用 单个 点 突变 来 解释 (参看 第 十 五 章 ，474 页 ) 。 因 此 ， 不 只 是 同 种 异型 标记 ,而 且 导 致 亚 类 蜡 趋 的 遗传 事件 也 是 从 点 突变 起 始 的 。 很 有 趣 的 是 ， 旧 大 陆 猴 的 重 链 存在 一 个 专 一 的 肽 段 ( 称 为 OWM 肽 眉 )， 其 排列 顺序 介 于 人 类 IgG 的 Gm(a) 和 Gm(non-a) 专 一 的 决定 簇 之 间 : 按 人 71 链 的 顺序 位 置 : 356 357 358 359 360 Gm(a)fkE: Asp Glu Leu Thr Lys | OWM ke: Glu Glu Leu Thr Lys Gm (non-a) 肽 段 :Glu Glu Met Thr Lys 比较 这 三 个 肽 段 ， 可 见 Gm (a) 和 Gm (non-a) 肽 段 都 可 能 通过 一 步 点 突变 起 源 于 * 530 « ES OWM KE (Wang 等 ，1969) 。 一 次 突变 使 OWM 肽 段 的 Glu* ->Asps"， 从 而 产生 Gm (a) KE, BRASH OWM KER Leus5->Metss， 从 而 产生 Gm (non-a) fk Ro MERBKNERBENE, RA AAKRERS-TPRMEKENAR: Leu(CUG) OWM kKEe Glu (GAA, GAG) Met (AUG) Gm(non-a) KEE = Gm(a) KE Asp (GAU, GAC) 这 些 发 现 表明 从 OWM BEEP Az Gm a) 和 Gm (non-a) 肽 段 的 突变 是 相当 晚 的 进 化 事件 ,可 能 发 生 在 不 到 两 千 万 年 前 。 根 据 Kunkel 实验 室 的 工作 ， 人 链 四 个 亚 类 的 C 区 是 受 四 个 紧密 连锁 的 基因 编码 的 。r2 链 ,73 链 以 及 Gm(a-)71 链 都 存在 Gm (non- a) 肽 妈 ， 并 且 在 旧 大 陆 猴 不 能 发 现 IgG2，IgG3 分 子 。 这 些 事实 提示 旧 大 陆 猴 的 了 链 C SAGER OWM KER EHGM vey nce | GG GUNG, (non-a) 肽 段 这 一 遗传 事件 之 后 , 至 少 io 倍增 过 两 次 。 这 清楚 地 表明 ,“ 迅 速 ” 进 “ 00 | 过 行 的 基因 倍增 是 免疫 球 蛋 白 C 基 进化 贞 ji 的 重要 机 Hl] (Fudenberg &, 1972), < 总 之 ， 所 有 上 述 的 事实 表明 ， 重 链 600 基因 的 进化 可 能 通过 一 系列 的 基因 倍 增 、 重 组 和 点 突变 进行 的 。“ 非 对 性 ” 因 “图 16-9 编码 免疫 球 蛋 白 肽 链 顺 反 子 进化 的 假想 图 。 假 定 V 基因 和 C 基 因 起 源 于 共同 的 祖先 基因 ， 并 且 在 进化 的 早期 就 子 ， 即 出 现在 不 同 亚 类 上 的 相同 的 抗原 形成 了 在 DNA 水 平 连接 这 两 个 基因 的 机 制 。 各 类 重 链 假定 ® fH [如 Gm(non-a)]， 可 以 作为 “是 由 C, 基因 通过 脱离 倍增 起 源 的 ( 据 Marchalonis, 1977), 证 据 提 示 亚 类 基因 起 源 于 倍增 ， 并 发 生 在 进化 上 相当 晚 的 时 期 ， 以 致 附加 的 突变 还 来 不 及 发 生 使 它们 转化 为 其 他 亚 类 的 同 种 异型 标记 。 当 研 究 次 人 灵 长 类 更 多 的 基因 标记 时 ， 或 许可 能 推测 出 人 7 链 各 亚 类 基因 的 进化 顺序 。 总 结 起 来 ， 免 疫 球 蛋白 多 肽 链 基因 进化 的 途径 可 以 用 一 个 简 图 来 表示 (图 16-9)。 特 别 要 指出 的 ， 有 证 据 提 示 免 疫 球 蛋 白 可 能 是 从 和 细胞 间 识 别 有 关 的 膜 蛋白 进化 而 来 的 。 最 原始 的 免疫 球 蛋 白 可 能 相当 于 一 个 Va 区 。 因为， 一 对 这 样 的 分 子 位 于 原始 淋巴 细胞 表面 就 可 能 构成 一 个 专 一 的 抗原 识别 单位 。 有 关 这 方面 的 证 据 将 在 下 一 章 讨 论 。 S FR. 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Biochemistry 10, 482. ©5346 第 十 七 章 ” 补 体 及 其 它 与 免疫 球 蛋 日 有 关 分 子 的 进化 脊椎 动物 普遍 存在 着 的 血清 抗体 虽然 能 专 一 地 识别 和 结合 外 源 的 抗原 ， 但 它们 单独 并 不 足以 对 病源 体 产生 显著 的 破坏 。 抗 体 的 生物 学 效应 还 需要 通过 补体 系统 的 放大 和 加 强 才 能 奏效 。 然 而 ， 在 高 等 脊椎 动物 的 防御 系统 中 ， 补 体 不 只 是 作为 辅助 抗体 的 效应 功 能 起 作用 ， 而 且 还 可 能 通过 支 路 激活 作为 能 引起 炎症 反应 的 中 介 因 素 独 立地 起 作用 。 对 补体 进化 起 源 的 研究 发 现 甚 至 在 尚未 出 现 抗体 的 某 些 无 脊椎 动物 的 血 淋 巴 内 ， 已 经 存在 原始 的 补体 支 路 系统 。 在 疹 椎 动物 随 着 免疫 球 蛋 白 的 出 现 ， 专 一 的 抗原 识别 系统 和 补体 系统 连接 起 来 了 ， 更 大 大 加 强 了 体液 免疫 防御 系统 的 效能 。 补 体系 统 的 进化 ， 特 别 是 补 体系 统 和 抗体 系统 在 进化 上 如 何 连 接 起 来 ， 是 免疫 性 的 进化 研究 的 一 个 重要 方面 。 所 有 壮 椎 动物 都 有 类 似 哺 乳 动物 免疫 球 蛋 白 的 血清 抗体 分 子 。 除 此 之 外 ， 还 存在 一 些 在 结构 上 或 功能 上 同 免疫 球 蛋白 有 关系 的 分 子 。 其 中 一 些 分 子 在 功能 上 能 结合 抗原 ， 但 在 构造 上 并 非 免疫 球 蛋白 ; 另 一 些 分 子 并 无 抗体 活力 ， 但 在 构造 上 与 免疫 球 蛋白 存在 一 定 的 同 源 性 。 对 这 些 分 子 的 比较 研究 可 能 对 了 解 免疫 球 蛋 白 在 进化 上 的 起 源 提供 一 些 线索 。 鉴于 主 组 织 相 容 性 抗原 在 功能 上 和 遗传 控制 上 都 和 免疫 球 蛋白 有 密切 的 关系 ， 因 此 主 组 织 相 容 性 抗原 和 免疫 球 蛋白 在 进化 上 的 关联 也 是 一 个 很 有 理论 意义 的 问题 。 一 、 补 体系 统 的 进化 补体 系统 按 功 能 可 分 为 三 个 分 子 群 ， 早期 成 分 (C1，4，2) 、 支 路 成 分 〈 包 括 B 和 D 因子 ) 和 晚期 成 分 (C3 一 C9) 。 经 典 的 补体 系统 通过 识别 单位 Clq, r,s 和 激活 的 抗原 抗体 复合 物 连 接 ， 从 而 触发 一 连 串 的 反应 ， 导 致 丢 细 胞 专 一 的 杀伤 。 另 一 方面 ， 非 专 一 的 因子 (如 眼镜 蛇 蛇毒 因子 ，CVE) ， 则 可 能 通过 对 支 路 因子 的 激活 ， 触 发 补体 晚期 成 分 的 一 系列 反应 ， 造 成 炎症 反应 和 细胞 非 专 一 的 损伤 。 目 前 有 证 据 提 示 补 体系 统 这 三 群 分 子 很 可 能 在 动物 界 先是 各 自 独 立 进化 ， 然 后 又 联合 起 来 的 。 (一 ) 补体 经 典 途径 的 系统 发 生 经 典 补体 活力 的 测定 采用 溶血 法 。 大 多 数 宵 椎 动物 的 血清 内 都 含有 天 然 的 抗 羊 红 血 球 抗体 。 因 此 ， 通 常 只 需要 检查 它们 的 新 鲜血 清 对 羊 红血球 有 无 溶血 能 力 ， 以 及 这 种 溶 血 能 力 能 否 被 56"C 加 热 或 双 价 金属 束 合 剂 (EDTA) 去 除 ， 就 能 决定 该 血清 是 否 含有 经 典 的 溶血 补体 系统 。 根 据 这 一 检验 标准 ， 发 现 除 最 原始 的 种 类 外 ,所 有 的 背 椎 动物 , 从 和 表 17-1 低 等 脊椎 动物 天 然 溶血 系统 (补体 ) 的 性 质 ( 据 Marchalonis, 1977), 软骨 鱼 到 哺乳 类 ， 都 存在 经 典 的 补体 溶血 系统 ( 表 17-1) 。 但 是 , 它们 的 某 些 性 质 ， 如 最 适 作用 温度 ， 加 强 溶血 反应 的 抗体 的 种 类 等 ， 则 各 有 不 同 〈Gewurz 等 ，1966; Gilgi 和 Austin，1971) 。 很 有 趣 的 是 ， 鸡 的 IEY 不 能 固定 哺乳 动物 的 补体 , 但 很 容易 固定 鸡 的 补体 ， 这 提示 IgEY 和 哺乳 类 IgG 的 Fe 性 质 不 同 ， 并 且 鸡 的 Cl1q 识别 能 力 存在 种 属 专 一 性 (Rose 和 Orlans，1962) 。 然 而 ， 却 有 证 据 表 明和 牛蛙 的 抗体 (IgM Al IgG(?)) 都 能 固定 豚鼠 的 补体 (Romano 等 ，1973) 。 这 些 事实 似乎 提示 状 椎 动物 各 纲 中 ， 补 体 系统 的 识别 成 分 在 进化 上 可 能 是 独立 发 生 的 。 现存 差 椎 动物 最 原始 的 种 类 圆 口 类 ， 虽 然 已 能 产生 体液 抗体 ， 但 是 无 论 在 量 和 质 方 面 ， 体 流 免 疫 反应 的 能 力 都 很 弱 。 对 八 目 鳗 的 研究 发 现 血 清 内 存在 家 免 红 血球 的 天 然 “溶血 素 ”， 但 是 其 性 质 和 高 等 峭 椎 动物 的 补体 溶血 系统 有 明显 的 不 同 。 这 种 溶血 素 是 热 稳定 的 ， 不 被 EDTA 抑制 ， 并 且 不 能 被 用 红血球 事先 免疫 加 强 (Gewurz 等 ，1966) 。 其 次 ， 从 Sephadex-G 200 凝 胶 过 滤 行 为 发 现 这 种 溶血 素 的 分 子 量 很 小 ,也 不 同 于 经 典 的 补体 成 分 (Pollara 等 ，1966) 。 因 此 ， 八 目 鳗 并 没有 经 典 的 补体 溶血 系统 ,而 可 能 存 在 另 一 种 改变 了 的 或 原始 的 溶血 系统 。 这 种 情况 很 可 能 是 同 它们 的 免疫 系统 和 体 波 免疫 能 力 还 处 于 很 低 的 发 展 阶段 相 联系 的 。 从 软骨 鱼 以 上 ， 随 着 体液 免疫 能 力 的 提高 ， 与 高 等 脊椎 动物 相同 的 经 典 补 体 咨 血 系统 才 逐 步 发展 起 来 了 。 目前 对 低 等 眷 椎 动物 补体 成 分 的 分 离 和 性 质 的 研究 还 极 少 。 cee Amel #@).C1 (Ross 和 Janson，1973) ， 发 现 其 沉降 常数 为 19.3S， 并 含有 三 个 明显 的 抗原 成 分 。 关 于 养 椎 动物 各 纲 补体 成 分 在 结构 上 的 同 源 性 ， 还 是 有 竺 研究 的 问题 。 (=) 无 兰 椎 动物 之 非 经 典 的 补体 溶血 系统 虽然 当 用 经 典 溶 血 方 法 检测 时 ， 无 冰 椎 动物 血 淋 巴 内 没有 溶血 活力 ， 但 是 ，Day 等 (1970, 1972) 证实 某 些 高 等 种 类 (海星 , BHA) 存在 能 被 眼镜 蛇毒 因子 (CBV) 激活 的 溶血 系统 。 进 一 步 分 析 发 现 堂 和 星 虫 内 存在 能 和 CBV 结合 的 支 路 辅助 因子 和 补体 的 晚 期 作用 成 分 ， 而 海星 只 存在 支 路 辅助 因子 。 这 些 事实 提示 无 疹 椎 动物 血 淋 巴 内 可 能 存在 。536。 Ee i 一 个 原始 的 类 似 补体 支 路 系统 。 这 种 原始 的 补体 支 路 和 在 高 等 无 脊椎 动物 已 证 明 存 在 细 胞 免疫 性 结合 起 来 ， 或 许可 能 充当 无 脊椎 动物 的 主要 防御 机 制 。 关 椎 动物 的 补体 系统 很 可 能 是 从 这 种 原始 的 补体 系统 交 变 而 来 的 。 总 之 ， 从 上 述 两 方面 的 初步 资料 ， 可 以 得 出 结论 : 1) 在 系统 发 生 上 最 早出 现 的 补体 成 分 是 晚期 作用 成 分 〈C3 一 C9) 以 及 支 路 激活 的 辅助 因子 。 补体 作为 一 个 非 专 一 的 血清 防御 系统 ， 比 免疫 球 蛋 白 可 能 有 更 古老 的 历史 ; 2) 经 典 的 补体 系统 是 同 免疫 球 蛋 白 共 同 起 源 和 进化 的 ;存在 典型 的 免疫 球 蛋白 的 物 种 也 存在 经 典 的 补体 系统 。 ”关于 后 一 点 需要 加 以 补充 说 明 。 在 最 原始 的 状 椎 动物 , 如 八 目 鳗 ， 虽 然 有 类 似 eM 的 重 链 和 轻 链 ， 但 无 链 间 二 硫 桥 构 造 ， 不 能 固定 补体 。 哺 乳 类 有 些 类 别 的 抗体 (如 IEA)， 由 于 结构 不 同 也 不 能 通过 经 典 途 径 固定 补体 ， 而 需要 通过 支 路 激活 。 (=) 补体 系统 和 抗体 在 进化 上 的 关联 补体 系统 ， 尤 其 是 晚期 作用 成 分 ， 在 进化 上 是 非常 古老 的 。 它 们 可 能 同 天 然 凝 集 素 一 起 ， 加 强 无 脊椎 动物 的 吞噬 活动 ， 而 起 破坏 病源 体 的 作用 。 在 圆 口 类 已 有 原始 的 抗体 和 补体 的 上 晚期 作用 成 分 (C9) 出 现 ， 可 能 代表 一 个 过 渡 状 态 。 可 以 设想 在 疹 椎 动物 进化 中 ， 更 古老 的 补体 系统 和 较 新 出 现 的 免疫 球 蛋白 之 间 从 软骨 鱼 类 开始 出 现 构造 和 功能 上 的 联系 。 这 一 联系 的 环节 是 出 现 补体 的 早期 作用 成 分 (C1，4，2) 。 这 要 求 产生 一 些 新 的 基因 ， 能 编码 既 能 识别 IE， 又 能 和 C3 一 C9 补体 成 分 相互 作用 的 蛋白 分 子 。 近 来 有 人 发 现 B 因子 ，C2 和 C4 在 遗传 上 是 同 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 (MHC) 连锁 的 ， 并 且 是 由 位 于 MHC 区 域内 的 基因 编码 的 (Eu 等 , 1974; Hobart，1977) 。 这 些 发 现在 补体 进 化 上 的 意义 需要 进一步 的 研究 ， 也 许 将 有 助 于 了 解 补体 早期 成 分 的 起 源 。 二 、 同 免疫 球 蛋 白 有 关 分 子 在 进化 上 的 关系 (—) 非 免疫 球 蛋 白 的 “抗体 ” 除去 具有 免疫 球 蛋白 典型 肽 链 构造 的 抗体 外 ， 许 多 养 椎 动物 , 从 八 目 鲁 到 人 , 血清 内 常 存在 对 常见 抗原 有 相当 强 的 结合 能 力 的 分 子 ( 表 17-2) 。 例 如 鲁 (Anguilla rostrata) 的 所 谓 * 抗 体 ? 是 一 种 天 然 的 血清 蛋白 ， 能 和 人 类 的 互 (O) 血型 抗原 选择 地 结合 。 其 物理 性 质 和 硬 骨 鱼 的 IEM 显然 不 同 ， 前 者 的 分 子 量 为 123,000， 并 且 是 由 分 子 量 为 40,000 的 亚 基 非 共 价 结合 的 (Bezkorovainy 等 ,1971) 。 产 娑 鳌 血 清 内 天 然 存 在 的 一 种 蛋白 质 ， 能 和 果 聚 糖 选 择 地 结合 ， 其 亲 合 常数 为 3.7 x 104 升 / 克 分 子 。 人 类 及 其 他 哺乳 动物 血清 中 天 然 存在 的 C- 反 应 蛋白 (C-reactive protein) ， 在 炎症 急性 期 浓度 升 高 。 这 种 蛋白 REMAKE C 多 糖 结 合 ， 过 去 兽 一 度 误 认为 是 一 种 抗体 。C- 反 应 蛋白 同 尿 喀 啶 单 磷 酸 的 亲 合 常数 为 3 x 104 升 / 克 分 子 。 它 的 分 子 量 为 129,000， 由 分 子 量 为 21,000 的 亚 基 构成 (Gotschlich 和 了 Edelman，1967) 。 这 一 类 蛋白 质 在 免疫 性 进化 中 的 地 位 以 及 在 体内 的 功能 都 还 不 清楚 。 很 有 趣 的 是 ， 有 人 注意 到 C- 反 应 蛋白 同 无 背 椎 动物 (Be) 的 天 ©5376 表 17-2， 与 免疫 球 蛋白 结构 不 同 的 类 似 抗体 的 蛋白 质 物 种 结 合 - 专 一 性 ae ae 于 WED FS x & BH BR 八 目 鳗 红血球 HCO) 抗原 320, 000(98) 75,000 N. C. 未 测 jem ep 280,500(10.68) | 55,000—77,000 3.7 X 10*L/M N.C. $8(Anguilla rostra- 红血球 HCO) 抗原 123,000(7.2S) 40,000 N. G. 未 测 ta) (4 x 10,000) 人 (C-R WEB) 肺炎 球菌 C- 多 糖 129,000(7.5S) 21,500 3.0 X 10*L./M CN- 乙 酰 -氨基 半 乳 糖 磷酸 ) N.C = 非 共 价 结合 。 ( 据 Marchalonis，1977)。 然 凝 集 素 有 许多 相似 的 地 方 。 这 两 种 分 子 都 能 结合 多 糖 ， 并 且 都 是 由 分 子 量 约 为 25,000 的 亚 基 构 成 的 多 聚 体 ， 其 聚合 需要 Ca 离子 。 根据 这 些 线索 ， 因 此 有 人 猜测 这 种 急性 炎 证 蛋白 可 能 代表 一 个 与 免疫 球 蛋 白 不 同 的 原始 的 抗原 识别 系统 的 遗迹 。 〈 尿 喀 啶 -5- 磷 酸 ， 5 °C) (=) 与 免疫 球 蛋 白 结 构 有 关 的 分 子 正常 人 体 或 病理 情况 下 出 现 的 一 些 蛋 白质 在 结构 上 同 免疫 球 蛋白 有 一 定 关 系 ( 表 17- 3) 。 对 这 些 蛋 白质 和 免疫 球 蛋 昌 结 构 上 的 比较 研究 ， 有 可 能 对 免疫 球 蛋 白 进化 上 的 起 源 提供 一 些 线索 。 人 类 血清 或 体液 内 存在 的 p:- 微 球 蛋白 (简称 BoM) 和 人 71 链 ， 特 别 是 CP 同 源 区 有 明显 的 同 源 性 (27% 残 基 相 同 )( 表 17-4) 。 其 次 ，p: 微 球 蛋白 含有 一 个 包括 57 个 氨基 酸 残 基 的 链 内 二 硫 环 ， 其 大 小 和 免疫 球 蛋白 不 变 区 的 一 个 二 硫 环 相似 。 这 些 事实 提示 记 微 表 17-3 同 免疫 球 蛋白 假定 有 关 的 蛋白 质 分 子 蛋 A 质 相 关 的 iE OB 淀粉 样 变性 蛋白 氨基 酸 排列 顺序 同 轻 链 同 源 68:- 微 球 蛋 白 氨基 酸 排 列 顺 序 同 7 链 同 源 ABA 氨基 酸 排列 顺序 同 轻 链 同 源 ci- 酸 性 糖 蛋白 (一 种 急性 炎症 蛋白 ) 氨基 酸 排列 顺序 同 轻 链 和 重 链 同 源 = C- 反 应 蛋白 (一 种 急性 炎症 蛋白 ) 氨基 酸 组 成 相似 组 织 相 容 性 抗原 氨基 酸 组 成 相似 ;功能 上 的 相关 ; 推测 有 较 远 的 共同 起 源 ( 据 Marchalonis, 1977), 球 蛋 白 可 能 相当 一 个 游离 的 Ig 功能 区 (Peterson 等 ，1972); 并 且 还 有 人 进一步 假定 包 微 球 蛋白 和 免疫 球 蛋 白 在 进化 上 有 共同 的 起 源 (Hobart, 1975) (参看 前 一 章 , 图 16- 7, 529 页 ) 。 此 外 ，wxi- 酸 性 糖 蛋白 (简称 w-AG) (一 种 急性 炎症 蛋白 ) 和 人 “ 轻 链 的 前 43 氮 基 酸 残 也 有 相当 大 的 同 源 性 (~27%) (Emura 等 ，1971) 。 非常 有 趣 的 ，P: 微 球 蛋白 一 方面 与 Y1 链 同 源 ， 另 一 方面 ， 它 也 可 能 是 HLA 抗原 的 一 个 亚 基 ， 存 在 于 淋巴 细胞 及 其 他 组 织 细胞 的 表面 (Nakamuro 等 ，1973; 参看 第 四 章 ， 。538。 a 表 17-4 BC， 微 球 蛋 白 和 IgGlCEu)C 同 源 区 氨基 酸 排列 顺序 的 相同 残 基数 目 ( 据 Peterson 等 ，1972)。 RS 人 免疫 球 蛋白 及 假定 与 它们 有 关 的 蛋白 分 子 氨基 酸 组 成 的 比较 SAF = 海绵 凝集 因子 。 〈 据 Marchalonis, 1977), 137 页 )。 这 就 提出 了 HLA 在 进化 上 同 免疫 球 蛋 白 的 关联 问题 。 关于 组 织 相 容 性 抗原 一 级 结构 的 研究 还 刚 开 始 ， 缺 乏 足 够 资料 以 供 比 较 。 然 而 ， 用 氨基 酸 组 成 统计 分 析 法 ， 比 较 人 HLA，pM，wAG Allg 肽 链 (w，Y 和 工 链 ) 的 SAQ 值 时 ， 发 现 HLA 和 AM 的 氨基 酸 组 成 十 分 相似 。 wm-AG ALM 的 氮 基 酸 组 成 虽 有 较 大 的 不 同 ， 但 是 SAQ 一 100 的 事实 仍然 提示 它们 在 HLA PM. L & 7 <1-AG 进化 上 可 能 有 某 种 关联 。 免 疫 球 蛋 白 肽 链 ， 特 别 是 Be, Ye eS ALA 的 差别 大 约 是 相同 的 (Mar- chalonis 和 Weltman,1971) ( 表 17-5) 。 根据 上 述 数 据 绘 制 的 系谱 树 表 示 出 这 几 种 分 子 在 进化 上 的 亲缘 关系 (图 17-1) 。 这 个 图 假想 HLA, 2M, Ig, xm-AG 有 共同 的 祖先 基因 。 通过 基因 倍增 和 突变 发 生 异 趋 ， 产 生出 HLA，p:M 一 枝 以 及 Ig 一 枝 和 wa-AG 一 梳 。 当然 从 氨基 酸 组 成 比较 得 出 的 初步 结论 ， 还 需要 一 级 结构 比较 分 析 的 资料 加 以 验 证 。 目前 得 到 的 关于 HLA 和 H-2 末端 的 部 分 顺序 的 共同 的 祖先 基因 资料 ， 并 不 支持 这 些 分 子 和 le 存在 同 源 性 (Howa- 人 rd，1976) 。 不 过 ， 目 前 还 不 能 排除 在 较 后 的 顺序 的 蛋白 质 在 进化 上 的 关系 图 。《〔 据 Mar- 出 现 同 源 性 ， 或 者 在 空间 构象 上 某 些 相似 的 可 能 ap 性 。 es。 39 。 三 、 组 织 相 容 性 抗原 的 进化 虽然 关于 主 组 织 相 容 性 抗原 的 遗传 多 型 现象 维持 的 原因 及 其 生物 学 意义 还 不 请 楚 ， 目前 许多 人 主张 组 织 相 容 性 抗原 的 进化 很 可 能 是 适应 在 发 育 和 形态 发 生 中 细胞 之 闻 相 互 识别 的 需要 而 产生 的 (Bodmer，1972) 。 人 和 小 鼠 的 组 织 相 容 性 抗原 是 由 位 于 两 个 基因 座 的 许多 等 位 基因 编码 的 ， 这 些 基 因 群 称 为 主 组 织 相 容 性 基因 复合 物 (MHC) 。 这 一 基因 群 又 是 和 许多 紧密 连锁 的 基因 ，, 其 中 包括 免疫 反应 基因 Ir 基因 ) 、 补 体 C2，C4 和 了 B 因子 的 基因 连 在 一 起 的 (参看 图 15-27， 500 页 ) 。 如 第 十 五 章 所 述 ， 组 织 相 容 性 抗原 是 和 了 T 细 胞 功能 紧密 相关 的 。 在 遗传 上 ， 位 于 MHC 内 的 IF 基因 控制 着 免疫 活性 细胞 之 间 的 相互 识别 和 相互 作用 。 AAW. 个 体 发 育 和 免疫 活性 细胞 分 化 过 程 中 ， 组 织 相 容 性 抗原 的 遗传 多 型 性 可 能 作为 刺激 推动 抗体 多 样 性 的 发 生 (Jerne 1971; 1973) 。 总 之 ,组 织 相 容 性 抗原 和 免疫 球 蛋白 在 遗传 控 制 上 和 功能 上 都 是 密切 相关 的 。 因 此 ， 对 MHC 基因 群 进 化 的 总 图 象 的 研究 对 于 了 解 免 疫 识 别 系统 的 起 源 也 是 有 密切 关系 的 。 二 Schrefler 等 (1971) 根据 对 小 鼠 | 外 列 倍增 H-2 遗传 结构 的 研究 ,提出 H-2 基因 群 区 进化 的 假说 。 他 假定 联 -2 基因 起 先 位 六 FIX Ss 标记 基因 附近 。 Ss 及 紧密 st te | he 相 邻 的 Slp 基因 控制 小 鼠 血 清 内 补体 的 水 平 (Demant 等 ，1973)。 原始 的 ug pee S21, ss 228, 于 -2 基因 发 生 纵 列 倍增 ， 产 生出 两 个 基 因 复 示 ， 每 一 个 又 独立 地 突变 。 然 后 再 突变 i is 发 生 倒 位 倍增 和 移 位 ,结果 使 Ss 标记 位 0 “1,5? Ssl hoe 3,851, 23 于 两 套 ao 基因 之 间 (图 ara rie sake tt FREES le ee 17-2 ”编码 小 鼠 组 织 相 容 性 抗原 (H-2) 和 连锁 的 标记 “有 些 相似 ， 都 是 通过 基因 倍增 和 移 位 进 (Ss) 的 基因 座 之 起 源 〈 据 Shrefler 等 ，1971)。 行 的 。 近年 来 ， 对 了 -2D MH-2K Ary N 端 部 分 顺序 的 分 析 结 果 表 骨 两 者 之 间 有 很 大 的 同 源 性 ,也 支持 这 两 个 基因 座 起 源 于 基因 倍增 (Howard，1976) (参看 第 四 章 , 114 页 ) 。 总 之 ， 从 这 一 章 提供 的 初步 资料 表明 一些 血清 蛋白 或 细胞 表面 蛋白 可 能 与 免疫 球 蛋 白 有 同 源 性 。 氮 基 酸 组 成 也 提供 免疫 球 蛋白 和 组 织 相 容 性 抗原 有 某 些 相似 。 这 些 资料 ， 以 及 上 一 章 提 到 的 C,? 功能 区 和 红血球 膜 上 的 MN 血型 糖 蛋白 存在 同 源 性 的 资料 ， 都 支 持 免疫 球 蛋白 可 能 是 从 细胞 间 识 别 有 关 的 膜 蛋白 进化 而 来 的 。 因 此 ， 组 织 相 容 性 基因 复 合 物 的 结构 和 进化 的 研究 ， 对 于 了 解 抗 体 及 其 多 样 性 的 起 源 有 重要 的 理论 意义 。 总 括 起 来 ， 可 以 设想 最 原始 的 免疫 球 蛋白 可 能 是 位 于 原始 淋巴 球 表 面 ， 相 当 于 区 大 小 的 一 对 多 肽 分 子 。 它 们 的 基因 通过 倍增 ， 分 化 出 Ch 基因 ， 并 从 细胞 表面 脱离 下 来 ， 成 为 有 结合 功能 的 抗体 分 子 。 随 着 C 区 基因 的 倍增 , 再 分 化 出 同 固定 补体 、 亲 合 细胞 等 效 应 功能 有 关 的 功能 区 。 此 后 ， 再 逐步 出 现 重 链 的 类 别 和 轻 链 型 别 以 及 亚 类 的 分 化 。 免 疫 « 540 。 球 蛋 白 的 进化 过 程 又 可 能 是 和 MHSC 基因 群 的 进化 密切 相关 地 进行 的 。 eS es OR 专著 Marchalonis, J. 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[ 补 注 1] Rich 实验 室 在 1979 年 对 人 工 合成 的 六 核 背 五 磷酸 (CpGpCpGpCpG) 晶体 作 高 分 辩 率 的 X 射 线 衍 射 分 析 时 ,发现 DNA 存在 一 种 新 的 ,奇异 的 构象 。 天 然 DNA (B-DNA) 的 双 螺 旋 是 右 旋 的 ， 而 这 种 新 的 DNA 构象 是 左旋 的 ,并 且 糖 磷酸 骨架 呈现 曲折 的 走向 〈zig-zag course)， 因 此 命名 为 Z-DNA(Wang 等 ，1979)( 图 1)。4M 浓 盐 溶液 可 以 引起 DNA 构象 的 转化 ,从 右 旋 的 B-DNA 转变 成 左旋 的 Z-DNA, 一 般 说 来 ， 具有 叮 叭 和 喀 啶 交替 排列 顺序 的 DNA 都 可 能 发 生 这 种 构象 的 转化 。 这 一 重要 发 现 当 时 兽 引起 争论 ;有 人 认为 这 一 现象 是 人 工 的 ,很 难 相信 有 生物 学 意义 。 All 左旋 Z-DNA 和 右 旋 的 天 然 DNA 之 结构 模型 ( 据 Wang 等 、1981)。 HO, Rich 实验 室 同 核酸 免疫 学 家 Stollar 合作 ， 制 备 了 抗 Z-DNA 构象 的 专 一 抗体 。 用 间接 曹 光标 记 抗体 法 ,发 现 抗 Z-DNA 抗体 能 同 果 蝇 多 线 染 色 体 的 带 间 区 域 (gnter band region) 专 一 地 结合 (A 2)。 这 一 实验 证 实 了 Z-DNA 构象 在 染色 体 上 存在 。 由 于 Z- 构 象 是 DNA 的 一 种 可 逆 的 结构 形 。542 。 式 , 因 此 假定 染色 体 上 一 定 区域 DNA 构象 的 转化 ,可 能 同 基因 功能 的 调控 有 密切 的 关系 (Nordheim 等 ， 1981), 参 5+ 次 料 Wang, A. H.-J. 等 〈1979) Nature 282, 680. Wang, A. H.-J. 2 (1981) Science 211, 1710, Nordheim, A. 4 (1981) Nature 294, 417, A2 抗 Z-DNA 抗体 对 果 蝇 多 线 染 色 体 之 染色 专 一 性 。(a) 标准 方法 染色 ， 带 间 区 域 呈 现 昔 光 ; (b) 在 用 抗 Z-DNA 抗体 染色 前 染色体 先 经 过 B- 构 象 的 Poly (dG-dC), Poly (dG-dC) 处 理 ， 结 果 染 色 体 的 染色 图 象 没有 变化 ; (c) 用 抗 Z-DNA 抗体 染色 前 ,染色体 先 经 过 Z- 构 象 的 省 化 Poly (dG-dC)。 Poly (dG-dC) 处 理 ， 专 一 的 萤 光 被 抑制 (Nordheim 等 ，1981)。 ©5436 [ 补 注 2] 最 近 ，Nathenson 实验 室 报告 了 小 鼠 H-2K> 分 子 的 全 部 一 级 结构 (Coligan 等 ，1981)， 以 及 其 他 H-2 分 子 的 部 分 顺序 (Nairn 等 ，1980; Coligan 等 ，1980; Maloy 等 ，1981)。 A2& HLA-B7 和 HLA-A2 分 子 的 顺序 测定 也 接近 完成 (Qt 等 ，1979) 〈 图 1)。 根据 H-2K* 分 子 一 级 结构 和 其 他 性 质 推测 主 移 植 抗原 (包括 82M) 分 子 的 形状 如 图 2 所 示 。H-2K* 分 子 全 长 为 346 氨基 酸 , 主要 分 为 三 个 功能 区 段 : 细胞 外 段 (~1—281), BABE (~282—308) 和 细胞 质 内 段 (~309—346), 分 子 的 细 胞 外 段 又 按 糖 基 团 分布 和 链 内 二 硫 键 的 同 源 性 划分 为 三 个 大 约 相等 的 亚 区 (N、cCT 和 C2), 比较 H-2K> 同人 类 HLA-B7 及 其 他 几 种 小 鼠 和 人 的 移植 抗原 的 部 分 顺序 ， 发 现 它们 之 间 存在 很 高 的 同 源 性 (图 1)。 人 和 小 鼠 之 间 , 氨 基 酸 顺序 约 有 70% 同 源 , 而 小 鼠 之 不 同 H-2 OTC, 同 源 性 更 高 , 达到 75 一 859%。 特别 值得 注意 的 ， 也 -2 分 子 上 氨基 酸 变异 的 位 置 集中 在 61 和 ' 83 位 置 , 人 类 HLA 分 子 也 是 如 此 。 这 些 事实 提示 , 移植 抗原 分 子 的 这 一 区 域 可 能 是 同 种 异体 抗体 和 激活 的 工 淋巴 球 的 主要 识别 位 置 ,很 可 能 这 一 区 域 的 任何 一 个 氨基 酸 的 突变 都 足以 被 激活 的 T 细 胞 识别 出 来 s 另 一 方面 对 小 鼠 和 人 的 移植 抗原 基因 的 分 离 和 核 背 酸 顺 序 的 分 析 也 正 取 得 顺利 进展 , 这 将 大 大 加 速 对 这 些 重要 抗原 的 一 级 结构 的 了 解 (Steinmetz 等 ，1981; Kvist S$, 1981; Ploegh 等 ，1980; Sood 4, 1981), S$ © & # Coligan 等 (1981) Nature 291, 35, Kvist & (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. (U. S. A+) 78, 2772, Qrr 4€ (1979) Ibid 76, 4395, Ploegh “ (1980) Ibid 77, 6081, Sood 4 (1981) Ibid 78, 616, Steinmetz “ (1981) Cell 24, 125, 25446 "(1961 SS up3IToD HE) WEE BAU YORI KML gy7-H St vIH Hae CAMIGHEIEY guZ-H Eien rey =o TASEEAGC OHD SIAL SK Sd SM STPA SA FILL {1 frag ‘g ‘Bry “y fuID ‘O fosg ‘a Susy ‘N Hew ‘W fneT “7 Ssh] Sy for ‘1 fstH ‘H MD ‘© feud ‘a frp ‘a fdsy 'dG fsh0 ‘0 fely Ky see PELHAM ATES SS AWAMIGRWL COKE WY Son LHS WA eae SLL guz7-H MAGE 1 一 一 (nod yVL18A0 一 DzyvS0 一 5y 一 0 一 5- 一 一 066M1 一 () 从 rv ViLTSAC—OOVSO—-IJV—OS—s $68 -一 ()03 一 YY 一 全 一 Ah 人 一 AVY OVA DA JAL8088463— 《BITH 一 一 一 一 at SHA AHAWAWIAPTIBIASLOSHOAVIVADDOHDDOLVYYYWWHWASVYAAVDLAIVVYOTAATAVALYWNSALSAHd BOMUIVE OH ove occ oze ore oe ez az — %-—— HO 一 一 3 一 $ v —— 8 $$$ vs — 1 0 — 0 83 9 a 8 td ed me 000TH 一 3 ano u— 3 一 8S V3 8 1 11 0 0 — 0 8 8 ee Se bm gr ym 4e-01H s 一 一 一 -一 一 一 ore — —x 一 一 一 一 -一 一 一 or 一 一 一 or-# “= i 一 站 "= one -w- 一 一 一 or TAODGIDOOAAHILAAOD INO IGAAASVMAOFSLOGOVAGHLAZATAMNGOIVAIZONIOMLILIGVdASDIVMIUTLANOOMUHUSHHLAHVNdGSOLY een ou ove osz Ope orz ozz oz "00x 061 B— GX 3 3 8 OY 0 -一 0 一 上 一 -51 一 1 一 | 一 0H 一 4 一 0 一 AnS 一 1 (ood) WH — "OO A COO —Anu—1 my 人 er 0 VV 0 —— ea | 人 40-1" 一 一 — Ao 一 一 一 一 一 一 ) 1 人 一 一 2- =<) ee =e ih = aie a > — Po ee ae = AW = PTZHH 一 一 一 一 — 1 eee ne paz-H 从 一 一 swung pyZ-H 一 w— 一 一 从 —" wo-4 @0t-H TILUHONHTAMMIMBADLOIIAVEIHIVIOVOAMHHHL | TVVMAVVAMINIGANIVIAGIOAAVAODAOUIIHDASDAIIOSIADILHOSO aie om out oo Osi Ops oct oz ou 00 PP. v3 ——— 9 — nn — 8 3-0 1 HA 1 —— 0-0 ——————_ 1 —- 4 ——_ 0 — 8 ¥ O—N v 1 3 — 0 一 1 一 -一 5 一 人 一 一 N 一 5 一 flood ——— 0 ALHVHY—A— 一 人 一 ] 和 二 可 一 一 一 一 zy mmH v 3 一 一 一 一 8 8— 0 A— vO V— A 1 — N 一 0 一 1 一 4 一 3 一 Sv ° sia u s—A—— w— 5 一 49-WVH —y> oo EARL i= 一 -一 一 一 a 4- =- = - -一 一 - AZ-H -一 一 一 一 从 1-Ii-— 一 一 一 X -一 一 1- 一 | | ern = — «— = 4 t= POZ-H 6 0 v— 14 S—— m— 4 S— Au 一 03 一 -一 (4 rr eneH -v— a 0-4 »N at 8 earn OASOHAAODTIAUIGAUSSOINONVHOLTHTMATDPIOZOIMMYVUMTAWUAINAVASAOIHVASTLAGAADABWAUATOIOPUYSAVAASAHTSHAD ane 2 2 本 中 科 院 秆 物 所 图 书 MT gy “Caggs ES I ETI A ARAM AAR AAA sD crAKEAAEAA IIIA RRA I LEER HHH OTANI QUOTA RAR OOOO MAD BAM SLL AMA AAR AAA XM AI CHRODOROEEDUDOTERSPUUT RD DOPEO EEE EEOD REED 906 BOO OOOCCCCCOCU COUT UU GUO U COCO UU UOC HUPEODDEDEDRTEOUETOR ETERS DDEADDODOOOEROH IES, XXXXXOOOKXXXXXXXXXXKXXXYXXXXXXXXXXOXXXXKX WAL MAMA SY ) BAA AAA AY UUM OU es WUUUUUUUUUUKX CHOPOUPROPERDROOHEEOERGUEAORORUNONNEE, RON NA am. 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