原核 生物 和 真 核 生 物 总 论 i ot we 2 ; oo “ rae Ki A ee a i x * YS ig hele ‘ [5 me mi A HLH ae st i i 19.9 | A FF ff FF 本 节 共 有 三 大 部 分 ; 分 子 生 物 学 研究 中 的 生物 系统 和 大 分 子 的 基本 性 质 ; 大 分 子 的 生物 合成 和 调节 ; 真 核 生物 系统 的 分 子 生 物 学 。 重点 是 原核 生物 和 真 核 生物 的 基本 分 子 过 程 (DNA, RNA 和 蛋白质 的 生物 合成 )、 it 传 现象 以 及 基因 表达 的 调节 控制 。 全 书 分 上 ,下 两 册 出 版 。 下 册 内 容 包 括 鸣 菌 体 及 质粒 的 分 子 生物 学 ， 真 核 病毒 ,肿瘤 病毒 及 致癌 基因 的 分 子 生 物 学 。 遗传 物质 的 交换 与 重组 一 一 同 源 重组 、 转 座 作用 及 遗传 工程 ,以 及 原核 生物 和 真 核 生物 中 基因 表达 的 调节 控制 。 可 供 分 子 生物 学 ,生物 化 学 、 遗 传 学 、， 基础 医学 工作 者 以 及 高 等 院 校 有 关 专 业 师 生 人 参考。 David Freifelder MOLECULAR BIOLOGY A Comprehensive Introduction to Prokaryotes and Eukaryotes Science Books International, Van Nostrand Reinhold Company 1983 分 子 生 物 学 原核 生物 和 真 核 生物 总 论 F ft (5) D. 弗 雷 费 尔 德 著 fries XE 译 责任 编辑 “ 吴 铁 双 He ema ih K 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 : 100707 GAZ Ke Aly All 新 华 书店 北京 发 行 所 发 行 各 地 新 华 书店 经 售 4 来 1991 年 6 月 第 一 版 开本 : 787x 1092 1/16 1991 年 6 月 第 一 次 印刷 EDSK 2 21 WX ; 0001—1 900 字数 ; 477 000 ISBN 7-03-002128-2/Q - 294 定价 ; 20.90 元 译 者 的 if 分 子 生 物 学 是 近 30 年 来 迅速 发 展 形成 的 一 门 比较 年 轻 的 学 科 。 它 和 其 他 许多 学 科 《如 生物 化 学 、 遗传 学 、 微 生物 学 病毒 学 、 细 胞 生物 学 \ 有 机 化 学 、 物 理化 学 、 医 学 乃至 技 术科 学 ) 都 有 交叉 。 我 国 随 着 分 子 生 物 学 领域 研究 工作 的 深入 ,高 科技 生物 技术 和 生物 工 程 研 究 的 开展 ， 以 及 高 等 学 校 相 继 设置 分 子 生 物 学 课程 ， 广 大 研究 人 员 和 师 生 都 迫切 地 ”需要 参考 书 。 为 适应 当前 的 需要 ,我 们 翻译 了 本 书 , 它 是 目前 国外 在 分 子 生 物 学 方面 最 新 最 全 面 的 一 本 教科 书 。 当前 ， 分 子 生物 学 发 展 迅 猛 , 正 值 本 书 翻 译 期 间 , 作 者 D . 弗 雷 费 尔 德 又 推出 了 本 书 的 第 二 版 (1987)。 为 此 我 们 又 参照 新 版 本 对 某 些 章节 作 了 修改 与 增补 。 因 新 版 本 内 容 增 多 ,所 以 将 第 一 版 (1983) 中 的 真 核 病 毒 及 肿瘤 病毒 (第 二 十 一 章 ) 分 别 列 为 两 章 译 出 ;而且 还 按 新 版 本 的 体例 ,在 肿瘤 病毒 一 章 中 加 人 了 致癌 基因 部 分 ,使 这 一 章 作为 比较 新 颖 而 完 整 的 肿瘤 分 子 生物 学 基础 提供 给 读者 。 新 版 本 真 核 生 物 基因 及 基因 产物 活性 调节 一 章 与 第 一 版 相 比 变化 较 大 。 除 了 保留 第 一 版 中 已 有 的 $X174 WRK, 2 KR Ae 灰质 炎 病 毒 . 逆 转录 病毒 、SV40 病毒 、 病 毒 的 转化 作用 、 真 核 基因 扩 增 、RecA BA, Al 源 重组 作用 机 理 、 转 座 作 用 、 真 核 细胞 细胞 质 多 聚 蛋白 质 以 及 遗传 工程 等 以 外 ， 还 增添 了 不 少 新 内 容 ， 例 如 蛋白 质 和 核酸 的 相互 作用 机 理 (CAMP-CRP 和 cll 蛋白 等 与 DNA 的 结合 ), 基 因 拼 接 和 RNA 拼接 对 基因 表达 的 调节 ,酵母 的 转化 作用 和 基因 表达 的 调节 , 甲 基 化 及 其 在 基因 表达 调节 中 的 作用 等 ， 这 些 新 内 容 均 分 别 在 下 册 中 予以 译 出 。 译 文中 不 妥 之 处 ,请 读者 批评 指正 。 译 者 1989 年 12 月 于 北京 é 7 7 ; ff ' 4 " 1 和 hs : 和 2D Shh Poe ey AY ee 4 ¥ “pr rs ‘a ‘ PEF ' iv avs Sarre: : ‘ ek”, it 4 yy fol id ; Te we we. Me bad } p ar Vw ae PEEK a oer < a cok ee ae veh iP ee Et ia pater Pk aR Re he Re es 如 和 iin a . ide ts at Agel c an igh age a 2 g Be ae 第 十 四 章 原核 生物 基因 及 基因 产物 活性 的 调节 seevoeooeoooooeooosoeossioosoooosseoooo ssesoos 1 调节 作用 概 这 mic aidlb Sie Ain © 0 6.016 Coe PRaceepaiadn pegmnes aninaecescnesenecetpkeme ebuinhu es Usicles sible sdube 1 FH FE PESTA EM ee 1 细菌 代谢 调节 的 一 般 机 理 ee 2 转录 调节 的 类 型 eeeennr rn 2 乳糖 操纵 子 模型 和 乳糖 体系 .pp ere Sy 3 乳糖 降解 需要 两 个 蛋白 质 的 遗传 学 和 生物 化 学 证 据 cee eececeece cere eeeeeeeeeeeeeeeenenneeeneees 3 lac 体 系 受 调 节 的 证 据 : 诱导 型 和 组 成 型 的 合成 和 阻 明 ee 4 O° 突变 体 的 显 性 : 操纵 基因 。 eeceeceeceeceecenenceenceneneransanseneneceesensensensessansaeeeannerens 5 操纵 子 模型 seseeeeeeeceeeceesennentenseecenseneanenneencaesesiaaseeserseeceasoananeneceeseesaeeeanenseneens 6 本 底 水 平 的 组 成 型 合成 ee 7 Lact 细菌 培养 物 对 乳糖 的 反应 ee 7 Lac 阻 遇 物 的 纯化 ee 8 葡萄 糖 对 乳糖 操纵 子 活 性 的 影 腾 ove ee eeeceecerceeceecneeneeecaneeeceereeeneceereaeeeteeceeeneceecees 9 四 10 与 CAMP 有 关 的 其 他 体系 ee 12 乳糖 操纵 子 DNA 的 调节 区 域 pe 12 CAMP-CAP $5 4-7 Jy BASE YAY FAL EEL ceeeeeeececceccceserscnccccenssnsnccecenceeseaceesoernesees 15 ARSE BER ABUL BBE [Bienes ee eeeceeceececcccecncanccenecceesseensseccsscerseeeeerenescseeesereecssneecaeeees 15 从 一 个 lae mRNA 分 子 翻译 出 的 8- 半 乳糖 音 酶 、 透 性 酶 及 转 乙酰 基 酶 在 数量 上 的 差异 …… 16 无 诱导 物 存在 时 阻 遇 状态 的 解除 ee 16 乳糖 操纵 子 与 其 他 操纵 子 的 融合 ee 17 半 有 乳糖 操纵 子 站 pe 18 和 18 两 个 gal 启动 子 以 及 PGF BE 0 TB ence e eee ce eceeeeeceeceneeeeeeececeeeeceeersreeseeecseeesseesenneneees 36 负 反 馈 抑 制 oooooooooooooooooooooesooooooooooooooooooooooooooosoooeosoeoocoooooeoeoeeooeooooooeooosseoeou 38 基因 产物 对 翻译 的 影 咱 pp 40 第 十 五 章 叹 菌 体 了) pe 42 烈性 噬菌体 pep 42 噬菌体 的 一 般 性 质 Woooooooovoooeooeeovooooovoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooon。 42 WEE PEA GE HY wns eeenceneceeerecenccceseeserscrnessseeaseccesssesessasceecensseseesnsaseeesessansunasenens 42 典型 唆 菌 体 的 裂解 途径 re 44 叭 菌 体 感染 的 细菌 培养 物 的 性 质 9。 46 喉 菌 体 的 必需 和 非 必 需 基 因 seovsovosvosossyososovesyeviosvosoosyoooosooooosooesoosooooooooovosoosseosest 48 喉 菌 体感 染 的 专 一 性 : 吸附 作用 er is 49 鸣 菌 体感 染 的 专 一 性 : 寄主 限制 ae 50 吻 菌 体 专 论 和 ppp 51 PAG AL ade cie ae accl) Soe 51 T4 DNA GRE ]RT pe 52. 了 入 吹 菌 体 的 基因 梅 造 2 入 54 IT4 生活 周期 概述 c-ceececceccccccccsessccsccsccssceesecaatonsscescecsccnscuesssssesasssssssssccnesceseesans 55 细菌 天 分 子 合 成 的 关闭 56. T4 喉 菌 体 DNA 的 转录 peer Yo 58 T4 DNA [So Sill---seecccccececcccccecccecceccccccaseccnedeccessessseccacebdasseesdccacnuessccoccasenerbssses 59 T4 TE EAA BILAL PEE peeeeee 62 大 肠 杆 菌 I7 噬菌体 pp 65 T7 Ob aa 4p See 66: T7 的 生活 周期 9 9ieeee9eie ee eeeee 67 T7 DNA 注入 宿主 细胞 ee ee eeoeeeeeeeeeeee _ 68 T7 DNA 转录 作用 的 调控 ,ee oo 68 T7 DNA 复制 csseesecececccecceeccsccseccecccsenccecncenccensenseescessesecsessenseeseecesesessnsacenesees 70 T7 WE EUR AY ICR coerce ees eeveenceceecescccseceseccesceeseeesceseesesenecerseeeeesenssesesanseesescenenes 70 DA PHAR EA ER EB Rie ee eee erect ee eceecc ence cncceccescencesncenssseeeees cece eccreccscccccecees 71 WE ER TA PBS-2: FASS HE TE HK FRA ieee ee cece sev ecccncccccencecscseascecascecsecenccuecensensescuensns 71 WE BEL SPO .ev ee eve 72 大 肠 杆 菌 1 噬菌体 pp [2 AWE EAA DNA 及 其 注入 后 的 转变 ………………: ceececcccccveccccccccesscccecseccsooescescscsuscccsoss 72 BATTAL oon eo se secveeecccceccscctecvcuseccecesscsscossessetegusednds dsadttesmneam 73. BI fee A RARIEP IAMS <-secceevecceccecsecccccccccsecccocscccecscseccacseccscseccvecdecucscerssvedssesues 73 OBE AF Teg ER Fe FEELS Dh BER Ewes encecceccceccccsneccecsscssesseseseeeseepeseeeessssesesessesees 74 ° i¥ e 又 的 转录 顺序 cee eeeeeeeeeccccecenesecccsnecscscassessssnesssnseneseesasessesaseneteanseneenssrersssseeeses 74 晚期 转录 的 时 间 顺 序 ee Oy ie 裂解 周期 中 和 转录 的 小 结 ceveeceececeececeecseneceerecseeecneescenenesensesesascesenseeseerecseeesnenes 77 DNA 复制 和 成 部 :和 价 联 过 程 ee。 soeeseeeossnoooooeoosoo seoooooooo oocoas 78 Kio MEEK pb X174 Ae Saas Ke canna wninas bse eens nia mae beu Mae meaeeeibies Rake 下 Jake cay 80 FH BEER pe 82 有 吸附 和 穿 透 ee 82 中 X174 DNA 的 复制 See beccccnacaccacccuddestntoawabedeevas udesubesboudes shbcddcbisaduuebbdvccetstancpebean 83 ~X174 DNA 的 转录 wo cee dese nes cscueteeseceues ccc cst ecveveneccoccec cccescccccccecccccscccsceccccccscccccces 84 PX174 DNA fh] Be eeeweeseenecceeesceeneeenaes Vt BENE RANE ROR Ee SME EOE 5 9 =) SAN RD 84 2e1k DNA IE Ba fa Sinalainid pivid:a kin ufvictalahslola(@'s Wela/es'a aisgidiuicuimutas mmimmalg-eicionn'c.enjaaee emilee slesinia casita esse 85 PASE RNA TREAT pp 87 一 种 双 链 RNA 鸣 菌 体 :由 6 89 第 十 六 章 Meet )-**----:------- SER OBGici ot peicinS bOCC CSO GROEOT LOO CHE CCE COO CBURIDOD ANE too “anion 93 温和 鸣 菌 体 及 溶 源 生 活 周 期 oo eee w cece cc ve sccecasencensncceccccescesecnsepachesasebicnmscsiocieno 93 溶 源 周 期 和 pe 93 PS URAL TE HAWETR ececcencescecncesccnccsscsecencnssscccacenscecenssescesssesaenecagneseonsasseesensens 93 一 些 有 用 的 术语 wweeececceececscececcceceessnceecnccecceesseseuesessecanesereerencsssearacnsessseoenescees 94 PES Ie SALVE FA — BEBE IL. .snsercorcecsccrccnccscescosasccccensgssocccnrecscenganasscetenssescccees 94 大 肠 杆 菌 1 鸭 菌 体 站 PP 95 对 感染 的 免疫 性 pe 95 前 喉 菌 体 的 整合 .ee 97 诱导 及 前 只 菌 体 的 切除 “ee Ce 2 101 Pm Fc Acl BHI YA PIPE BUT HH BMHACR lac mRNA, 5 cAMP 有 关 的 其 他 体系 还 有 许多 其 他 的 糖 ( 如 半 乳 糖 ,麦芽 糖 、 阿拉伯 糖 山梨 醇 等 ) ,它们 在 降解 过 程 中 被 转 化 成 葡萄 糖 或 酵 解 途径 中 的 其 他 中 间 产 物 。 这 些 糖 中 的 每 一 个 糖 的 糖 代 谢 中 有 关 的 酶 都 是 由 可 诱导 的 操纵 子 合成 的 ; 可 以 想像 得 到 ,如 果 有 葡萄 糖 存 在 ， 这 些 操 纵 子 都 不 能 被 诱 导 : 它 们 被 称 作 降解 产物 敏感 型 操纵 子 (catabolite-sensitive operons)。 有 个 简单 的 遗传 学 实验 可 以 证 明 这 些 操纵 子 都 是 由 cAMP-CAP 调节 的 。 在 一 个 糖 代谢 的 操纵 子 上 ， 以 10” 的 频率 出 现 单 一 突变 (如 lac” 或 mal-)， 双 突变 lac” mal” 出 现 的 频率 则 是 10"2， 这 在 实验 中 是 无 法 检测 出 来 的 。 但 是 表现 型 为 Lac” Mal” 或 Gal” Ara” 的 双 突 变 却 能 够 以 可 以 检测 的 频率 出 现 。 这 种 明显 的 双 突 变 并 非 由 两 个 操纵 子 上 的 突变 引起 ， 而 常 eA crp 或 不 能 合成 腺 背 酰 环 化 酶 所 致 。 进一步 发 现 ， 如 果 一 个 突变 体 是 Lac- Mal-， 它 同时 常常 也 是 Gal- Ara -、Lac- Ara 等 等 。 对 少数 几 个 降解 产物 敏感 型 操纵 子 进行 生化 分 析 , 结果 表明 在 这 些 体 系 的 每 一 个 操纵 子 中 都 有 CAMP-CAP 结合 在 启动 子 区 域 。 阿拉 伯 糖 〈 以 及 某 些 其 他 五 碳 糖 ) 的 分 解 代 谢 中 需要 cAMP 的 原因 还 不 很 清楚 , 因 为 这 些 糖 并 不 转化 为 葡萄 糖 。 这 说 明 CAMP 的 作用 还 有 其 更 为 一 般 的 特征 。 我 们 还 记 得 前 面 讲 过 ,葡萄 糖 作为 最 理想 的 碳 源 ,其 浓度 决定 着 细胞 内 的 cAMP 浓度 。 当 葡萄 糖 的 供应 不 很 充分 时 ， 大 量 地 产生 cAMP; 即 大 量 cAMP 的 出 现 是 葡萄 糖 不 足 的 一 个 信 号 。 当 葡萄 糖 耗 尽 时 ，cAMP 浓度 升 高 使 很 多 糖 代 谢 的 操纵 子 处 于 备用 状态 。 因 此 ， 一 且 这 些 糖 中 的 某 种 糖 提 供给 细胞 ,操纵 子 就 能 迅速 地 作出 反应 ,如 果 葡 萄 糖 又 出 现 ， 那 么 信号 就 不 存在 了 ,因为 这 时 细胞 已 没有 必要 再 处 于 备用 状态 。 乳糖 操纵 子 DNA 的 调节 区 域 利用 前 面 研究 核 小 体 ( 见 第 六 章 ) 和 RNA 聚合 酶 结合 位 点 (第 十 一 章 ) 时 所 用 到 过 的 核酸 酶 -保护 技术 (nuclease-protection proceduce)， 我 们 可 以 分 离 到 含有 乳糖 操纵 子 的 DNA 片段 。 在 这 个 技术 的 操作 过 程 里 ,首先 将 纯化 的 阻 遏 物 吸 附 到 从 转 导 唉 菌 体 ( 称 为 lac) 中 提取 出 的 DNA 上 (该 种 吻 菌 体 携带 着 大 肠 杆菌 的 乳糖 操纵 子 )o 然 后 加 和 人 DNase, 将 得 到 一 段 在 酶 解 反 应 之 后 仍然 保持 完整 的 很 短 的 DNA FrBe (24 ET) o ATH 的 碱 基 序列 以 及 用 其 他 的 方法 得 到 的 一 个 稍 大 的 片 妥 的 碱 基 序列 见 图 14-8。 这 种 序列 是 s [2 @ TGTT C 7 ACAA G A rah Me | A T | 阻 过 物 保护 的 区 域 | 图 14-8 lac 操纵 子 的 碱 基 序 列 。 对 称 的 有 关 区 域 用 灰色 表示 。 坚 箭头 指出 所 观察 到 的 突变 性 改变 ,这 些 碱 基 改 变 使 操纵 子 变 为 组 成 型 的 。 很 特别 的 ,人 们 和 常常 会 遇见 这 种 序列 。 它 具有 被 调节 因子 所 识别 的 碱 基 序 列 的 特点 , 即 倒 转 重 复 顺 序 (inaverted repeat)*。 关于 这 个 发 夹 结 构 就 是 操纵 基因 的 证 据 来 自 于 对 操纵 基因 突变 体 的 研究 。 因 为 阻 遇 物 不 能 与 突变 的 操纵 基因 结合 ,所 以 就 无 法 用 核酸 酶 -保护 技术 分 离 出 与 阻 遏 物 相 结合 的 突变 的 操纵 基因 。 但 是 利用 重组 DNA 技术 〈 见 第 二 十 章 ) 可 以 分 离 得 到 含有 操纵 基因 的 较 长 的 片段 ,根据 图 14-8 中 操纵 基因 所 在 位 置 的 特点 ， 就 可 以 在 这 个 片 眉 中 鉴定 出 操纵 基因 。 这 个 方法 同时 也 可 用 以 确定 操纵 基因 两 愤 的 一 些 碱 基 顺 序 。 这 时 如 果 在 一 些 已 经 鉴定 过 的 两 贾 序 列 之 间 找 到 一 般 与 野生 型 序列 有 关 的 序 列 , 就 可 以 鉴定 突变 的 操纵 基因 ,它们 可 能 只 与 野生 型 相差 1 或 2 个 碱 基 。 实 验 工作 者 从 携带 着 不 同 % 突变 的 几 种 1 lac 鸣 菌 体 中 得 到 一 些 有 关 片 段 , 并 观察 到 如 图 14-8 所 示 的 碱 基 变 化 。 注意 ,无 论 单 个 碱 基 变化 发 生 在 倒转 重复 序列 或 者 发 生 在 其 他 的 碱 基 序列 中 ， 都 会 改变 甚至 消除 阻 遏 物 与 操纵 基因 结合 的 能 力 。 一 -人 一 一 一 一 -一 一 一 起 一 -一 四 -~ -~ -~ -= - - - - -一 一 -一 一 rere = = we = = = 一 一 一 一 一 “= 一 一 一 一 一 -一 -= 一 四 一 一 一 一 一 ~ 一 ~ 一 一 =" 14-9 具有 两 个 倒转 重复 序列 的 DNA 分 子 可 能 具有 的 不 同形 式 。(a) 两 个 倒转 重复 序列 是 紧 紧 相 邻 的 ; 〈b) 两 个 倒转 重复 序列 由 一 个 间隔 区 隅 开 。 水 平 箭头 表示 序列 的 方向 。 用 核酸 酶 -保护 技术 还 可 以 分 离 到 cAMP-CAP 结合 位 点 ， 这 个 位 点 的 序列 如 下 : * 这 个 名 词 表示 一 种 像 ABCDEE'D'C'B'A' 的 序列 , 在 此 序列 中 A 及 A’ 代表 可 以 形成 普通 碱 基 对 的 碱 基 。 这 种 序列 又 可 称 为 回 文 结构 (palindrome)。 人 们 设想 ?并 且 已 在 某 种 情况 下 证 实 , EAA Cin vivo) 这 种 序列 可 能 可 以 偶然 形成 双 发 夹 (double hairpins) 或 双 柄 与 泡 (double-stem and loop) 的 结构 ( 见 图 14- ?)。 GTIGAGTTAGCTCAG ES REARDATREZSY, DA-TARBEPI, DANRWAF TAR Mo 过 遗传 学 及 生理 学 实验 已 证 明 有 两 种 “启动 子 向 下 坠落 ”(promoter-down) 的 突变 《 即 这 些 突变 阻止 合成 mRNA) 就 是 这 种 序列 中 的 碱 基 发 生 了 变化 而 引起 的 ,这 种 突变 阻碍 了 cAMP-CAP 的 结合 , 这 同时 也 证 实 了 cAMP-CAP 的 结合 是 转录 作用 从 lac 启动 于 处 开始 的 前 提 条 件 。 图 14-10 示 出 分 离 出 来 的 含有 cAMP-CAP 结合 位 点 、RNA RGAE MILAM 纵 基因 及 其 两 翼 序 列 的 DNA 的 一 个 长 片 眉 。 通 过 测定 纯化 的 lac mRNA 5 端的 大 基 序列 ,从 而 在 上 述 DNA 长 片 眉 中 找到 与 之 互补 的 序列 ,这 样 便 确 定 了 mRNA 合成 的 起 始 位 点 。p8- 半 乳糖 背 酶 的 起 始 密码 子 及 i 基因 的 终止 序列 , 则 从 已 知 的 6- 半 乳 糖 音 酶 各 阻 遇 物 的 氨基 酸 序列 而 得 到 确定 。 这 个 完整 区 域 的 特点 有 几 个 值得 注意 的 性 质 : HSS agi POT at See -i | cCAMP-CAP 的 结合 位 点 RNA 聚合 酶 的 作用 位 点 操纵 基因 SRT og: , RNA 26; Be GRD? HY BB AMP-CAP A cine re 阻 过 物 保护 | f= JF 的 区 域 起 始 hy | | p> mRNA 二 | Pa AGTGAGCOCAAEGCAATTAATGTGAGT TAGCTCACTCAT TAGGCACCCCAGGCIT TACALS ITA IGE TCCGGCTCGIATGTIGTGIGGAATIGTGAGCGGATAACAAT T TCACACAGGAAACAGCT A STC ACTCGCGTTGCGTTAAT T ACACTCAATCGAGTGAGTAATCCGIGGGGTCCGAAATGTGAAAT ACGAAGGCCGAGCATACAACACACCT I AACACTCGCCTAT IGT IT AAAGTG tetecrtteteGatacty tap jp i? 40 680s 70 ||80 9 100 0 © 120 一 一 图 14-10 大 肠 杆 菌 lac 操纵 子 的 调节 区 的 DNA 碱 基 序列 。 下 图 中 的 阴影 区 表示 cAMP-CAP 结合 位 点 中 的 倒转 重复 序列 。 图 上 表示 了 DNA 上 受 各 种 蛋白 质 所 保护 的 \ 能 抵抗 DNA ABA IE 的 区 域 。 图 中 也 指出 了 几 种 碱 基 改变 使 启动 子 发 生 突变 : 产生 一 种 无 活性 的 启动 子 ( 向 下 坠落 )， 或 产生 一 种 有 特别 高 活性 的 启动 子 ? 或 是 产生 一 种 不 依赖 于 cAMBP-CAP 的 启动 于 。 民 图 中 还 分 别 指出 了 在 z 基因 中 的 起 始 密码 子 和 i 基因 中 的 终止 密码 子 。 1.mRNA 合成 的 起 始 位 点 在 操纵 基因 中 , 当 阻 遏 物 蛋白 存在 时 ， 起 始 位 点 被 阻 遏 物 2. 当 RNA 聚合 酶 结合 在 操纵 基因 上 时 ， 这 一 段 结合 序列 可 以 免 受 DNase 的 降 3.cAMP-CAP 的 结合 位 点 非常 接近 于 RNA 聚合 酶 的 作用 位 点 ， 但 不 与 之 重 Ge 4. 调节 区 域 的 长 度 为 115 碱 基 对 , 约 为 DNA 螺旋 的 12 圈 。 5. 这 一 区 域 的 顺序 为 ipoz， 这 个 顺序 与 遗传 学 分 析 的 结果 是 一 致 的 。 cAMP-CAP SepRiis pH rE lac mRNA 合成 的 起 始 必 须 有 cAMP-CAP 结合 在 启动 子 上 ， 而 且 这 时 阻 遏 物 必 须 与 操纵 基因 结合 ( 见 图 14-7)。 目 前 对 cAMP-CAP 激活 转录 和 阻 遏 物 抑制 转录 的 机 理 还 没有 详细 地 了 解 。 但 是 ,从 对 于 DNA 中 的 与 RNA 聚合 酶 和 与 阻 过 物 相 接触 的 碱 基 序 列 (这 些 复 杂 的 实验 不 准备 在 这 里 叙述 ) 的 分 析 , 以 及 从 以 下 的 事实 ,已 经 推论 出 一 个 合理 的 模型 1. 在 体外 ，cAMP-CAP 的 存在 促进 RNA 聚合 酶 与 lac DNA 的 结合 。 2. 如 果 RNA 聚合 酶 已 结合 到 lac DNA 上 上， 那么 接着 再 加 人 阻 遏 物 ， 并 不 能 把 RNA 聚合 酶 取代 下 来 。 3. 如 果 阻 遏 物 已 先 与 操纵 基因 结合 ， 那 么 RNA 聚合 酶 便 不 再 能 形成 稳定 的 RNA 聚合 酶 -操纵 基因 复合 体 , 但 是 在 这 个 位 点 上 还 是 会 发 生 瞬 间 的 微弱 结合 。 从 上 面 给 出 的 信息 ,可 以 对 转录 的 起 始 机 理 作 出 以 下 假设 : 1. 像 第 十 一 章 中 所 介绍 的 那 种 复合 物 一 样 ，RNA 聚合 酶 可 以 和 lac 启动 子 区 域 形 成 松散 的 复合 体 。 2. cAMP-CAP 的 结合 很 可 能 使 DNA 双 螺 旋 结 构 松 弛 , 从 而 促进 形成 一 个 稳定 的 开放 型 启动 子 复合 体 ( 第 十 一 章 )。 3. 阻 遏 物 是 一 个 抗 融 解 蛋白 质 (antimelting protein), 这 样 它 就 能 够 阻止 形成 开放 的 复合 体 。 也 就 是 说 ,结合 着 的 阻 遏 物 可 能 阻碍 RNA 聚 合 酶 去 接近 开放 型 启动 子 中 的 碱 基 。 4. 当 开 放 型 的 启动 子 复合 体形 成 时 ，RNA RAR) lac mRNA 的 合成 。 不 完整 体系 的 生理 性 质 如 果 调 节 机 理 对 一 个 细胞 来 说 是 至 关 重 要 的 ， 那 么 失去 调节 能 力 的 突变 型 操纵 子 在 RAAMRAARS RM BIA AL i 及 % 突变 体 上 所 观察 到 的 不 足 , 只 是 生 长 速度 略微 降低 。 虽 然 这 种 降低 只 是 在 实验 室 里 才能 看 到 ， 但 是 从 进化 的 角度 上 讲 则 是 很 有 意义 的 。 一 个 生命 体系 如 果 由 于 具备 了 调节 功能 而 提高 了 生长 速度 ， 尽 管 这 种 增加 是 很 小 的 ， 可 是 对 于 细胞 来 说 却 是 一 种 非常 重要 的 优势 一 -这些 细胞 能 够 因此 而 在 目 然 选择 中 保留 下 来 。 在 某 些 条 件 下 (可 以 想像 这 些 现 象 在 自然 界 中 发 生得 会 更 为 频繁 ), 组 成 型 lac 突变 体 的 生长 速度 显著 地 下 降 。 对 这 些 条 件 进 行 分 析 时 ,人 们 发 现在 lac 操纵 子 中 还 应 当 有 第 四 个 基因 , 即 我 们 前 面 曾 提 到 过 的 as 基因。 该 基因 编码 6- 半 乳糖 苷 转 乙酰 基 酶 ， 乳 糖 本 身 不 能 被 乙酰 化 ， 但 是 这 个 酶 能 够 把 乙酰 基 从 酰基 供 体 上 转移 到 许多 个 半 乳 糖苷 分 子 上 。 我们 将 会 看 到 这 是 一 个 非常 重要 的 性 质 。 在 上 自然界 中 存在 着 许多 种 能 被 8- 半 乳糖 音 酶 降解 的 \ 被 取代 的 半 乳 糖 背 分 子 。 这 些 被 取代 的 半 乳 糖 背 的 分 解 产物 往往 不 能 参加 进一步 的 代谢 ， 因 而 在 体内 积累 到 很 高 的 浓 度 。 这 在 很 多 情况 下 都 是 有 害 的 ， 因 为 有 几 种 半 乳 糖苷 衍生 物 在 高 浓度 时 是 细胞 正常 生 * 近来 在 物理 学 实验 中 已 经 观察 到 ，DNA 的 双 螺 旋 的 稳定 性 在 离 某 个 蛋白 质 结合 位 点 有 一 定 距 离 的 一 个 位 点 上 发 生动 摇 , 这 种 现象 被 称 为 远 距 稳 定性 〈telestability)。 长 的 抑制 物 , 例如 作为 诱导 物 的 IPTC ,这 种 半 乳 糖 背 衍生 物 虽然 并 不 是 天 然 物质 。 人 们 发 现 , 在 IPTG FEN, SAR 1 MOREA ME a” 的 突变 体 时 , 它 的 生长 显 然 要 比 相应 的 at 对 应 体 的 生长 缓慢 得 多 ，a” 与 at 细胞 的 区 别 在 于 a+' 细胞 中 IPTG 是 乙酰 化 的 ， 而 乙酰 化 的 .IPTG 不 能 被 8- 半 乳糖 苷 酶 所 分 解 , 如 下 所 示 ; itor; ; IPTG ee SR YR EEO Dey -> 微弱 的 抑制 作用 。 ia (Be ofa IPTG LOTR (oc ve Be Hl HE LS 4) > 抑制 作用 。 iat BY: oat. IPTG ROMER 7 酰 化 一 IPTG_ “8 没有 降解 产物 > 没有 抑制 作用 因此 a 基因 可 能 并 不 在 乳糖 的 降解 过 程 中 起 作用 ,但 它 能 够 在 8- 半 乳糖 背 酶 存在 时 防止 抑制 性 的 半 乳 糖 衍生 物 在 细胞 内 的 积累 。 人 们 自然 会 想到 的 一 个 问题 ， 为 什么 细胞 在 甚至 只 有 乳糖 作为 唯一 的 半 乳 糖 OY, 还 要 花费 能 量 去 合成 可 能 被 独立 调控 的 转 乙 酰基 酶 ”这 个 酶 独立 地 受到 调节 ( 即 不 与 68- 半 乳 糖苷 酶 合成 的 调节 相 偶 联 ) 显 然 是 不 合理 的 ， 因 为 只 有 在 8- 半 乳糖 背 酶 存在 时 才 需 要 转 乙 酰基 酶 。 也 许 乳 糖 操 纵 子 中 还 有 一 个 二 级 调 市 体系 ， 但 这 可 能 需要 花费 更 多 的 能 . 量 。 可 能 在 目 然 界 中 ， 当 细菌 生长 在 以 乳糖 作为 基本 碳 源 的 环境 中 时 被 取代 的 半 乳 糖 音 大 量 地 存在 着 ,因此 这 时 a 基因 直接 偶 联 到 z 基因 上 是 十 分 必要 的 。 从 一 个 lac mRNA 分 子 翻 译 出 的 8- 半 乳糖 苷 酶 、 透 性 酶 及 转 乙酰 基 酶 在 数量 上 的 差 本 ie 在 一 个 完全 被 诱导 的 细胞 中 ，p- 半 乳糖 昔 酶 、 透 性 酶 及 转 乙 酰基 酶 的 拷贝 数 比 例 为 1:0.5:0.2。 作 为 几 百 万 年 进化 过 程 演 变 的 结果 ,这 个 比例 在 一 定 程度 上 反映 了 在 以 p- 半 乳糖 背 作 为 唯一 碳 源 时 细胞 的 需要 。 不 同 的 酶 在 数量 上 的 差异 是 由 于 在 翻译 水 平 上 受到 调节 所 致 。 这 种 调节 有 以 下 两 种 方式 : 1. lac mRNA 经 常 离开 它 进行 翻译 的 核糖 体 ， 从 而 终止 蛋白 质 链 的 翻译 过 程 。 这 种 现象 发 生 的 频率 取决 于 每 一 个 后 续 的 AUG 密码 子 再 度 起 始 翻译 的 概率 。 因 此 ， 就 存 在 着 一 个 从 mRNA AS’ 末端 到 3 末端 的 蛋 昌 质 合成 梯度 。 对 于 大 多 数 多 顺 反 子 的 mRNA 分 子 发 挥 功能 来 说 确实 存在 着 这 种 现象 。 2. lac mRNA 在 内 切 酶 作用 下 发 生 的 降解 , 在 : 基因 中 比 在 z 基因 中 更 加 频繁 些 s 因此 ,在 任何 时 候 , z 基因 的 完整 拷贝 要 比 a 基因 的 多 。 在 这 一 章 里 我 们 会 看 到 ,这 种 调节 模式 是 经 常 发 生 的 , 即 一 个 操纵 子 活性 全 面 表达 受 到 的 调控 作用 是 通过 控制 多 顺 反 子 mRNA 的 转录 来 实现 的 ， 而 该 mRNA 所 编码 的 各 种 蛋 白 质 的 相对 浓度 则 由 每 一 个 顺 反 子 翻译 频率 受到 的 调控 作用 所 决定 。 无 诱导 物 存在 时 阻 过 状态 的 解除 如 果 lac 操纵 子 处 在 无 阻 遇 物 的 细胞 中 ,转录 将 会 发 生 。 我 们 可 以 通过 将 lac 操纵 子 从 基因 型 为 这 z* 的 Hfr 雄性 细胞 \ 见 第 一 章 ) 转 移 到 iz ”的 雌性 细胞 〈 这 种 细胞 婚 TO ARTE REI hE 8- 半 乳糖 背 酶 )， 当 lac DNA HAR ATA MAURER ， 细胞 内 立即 产生 lac ipRNA， 从 而 在 肉 性 细胞 中 也 随 之 合成 出 8- 半 乳糖 彰 酶 ( 见 图 14- 11)。 又 因为 在 这 种 雌性 细胞 里 ,转移 进来 的 lac DNA 中 的 i 也 被 转录 ,产生 i*mRNA, 因此 也 能 够 合成 阻 遇 物 《虽然 相对 于 6- 半 乳糖 背 酶 来 说 合成 速度 要 低 得 多 )。 因 此 ， 在 这 种 情况 下 8- 半 乳糖 昔 酶 的 合成 不 能 无 限制 地 继续 进行 下 去 。 现 在 已 经 在 所 有 的 负 调控 的 操纵 子 中 观察 到 这 种 现象 9 在 肉 位 细胞 中 形成 的 有 8- 半 乳糖 蔡 酶 的 酶 量 2 4 Afr 细胞 与 肉 性 细胞 混合 后 的 时 间 〈 小 时 7 14-11 lac DNA 由 itz* 的 Hfr 雄性 细胞 转移 到 iz” 或 itz” 的 雌性 细胞 后 ?在 峻 性 细 胞 中 合成 B-HAMES. itz 的 细胞 中 不 合成 该 酶 ,因为 在 这 种 细胞 中 总 是 存在 着 阻 遇 物 。 在 iz 的 细胞 中 该 酶 的 合成 到 一 定 程度 终止 ;最 终 建 立 起 阻 过 作用 。 乳糖 操纵 子 与 其 他 操纵 子 的 融合 基因 融合 在 自然 界 能 不 能 发 生 ， 对 研究 来 说 是 非常 有 价值 的 。 一 个 研究 得 较 多 的 例 子 是 lac 操纵 子 与 pu 操纵 子 的 偶 联 ,后 者 是 负责 味 聆 合成 的 基因 。 这 个 操纵 子 以 完全 不 同 于 乳糖 操纵 子 的 方式 进行 调节 ， 但 我 们 在 这 里 不 打算 讨论 这 种 调节 的 机 理 。pur 操 纵 子 在 大 肠 杆 菌 的 染色 体 上 位 于 lac 操纵 子 的 下 游 ( 沿 转录 方向 ) ( 见 图 14-12)。 在 这 两 个 操纵 子 之 间 的 是 tsx 基因 ,这 个 基因 控制 着 细胞 对 T6 鸣 菌 体 的 敏感 性 。 从 tsx-s zt 细胞 中 分 离 到 tsxz-r， 同 时 它 又 是 z- 的 突变 体 。 这 种 突变 体 具 有 的 缺失 : 从 lac 操纵 子 的 z 基因 内 开始 ,一 直 包括 了 所 有 tsx 基因 ,并 延 促 到 pur 操纵 子 中 ,及 至 越过 pur 的 操纵 基因 和 启动 子 的 一 部 分 。 这 种 缺失 使 lac 操纵 子 失 去 了 RNA RAMEE lac 操纵 子 中 的 终止 序列 , 所 以 当 转 录 作用 从 lac 启动 子 处 开始 起 始 时 ， 就 合成 出 由 一 部 分 z 基 SS SS SS ee eee Ae! Ri Piak ced sill AEST cig th E ae z ve a Opur,... Ppur pur 基因 pee Paw Nae ge 0 a lac 一 pur 融 合 pur BD Gin 22 purist (基因 型 =1i+p+ot+z-tSX-T purt) 图 14-12 lac-pur 的 融合 及 其 起 始点 。 因 区 域 再 加 上 所 有 的 pur 基因 所 转录 出 的 mRNA 分 子 。 因 此 ,在 这 个 融合 体系 中 ，Ppar 操纵 子 的 转录 过 程 可 以 受 8- 半 乳糖 背 的 诱导 。 利用 将 lac RAT EAI aR ERE BAL (relocation) 的 技术 可 以 将 很 多 基因 与 lac 启动 子 融 合 。 这 种 技术 对 于 生物 化 学 家 来 说 是 非常 有 用 的 ,因为 lac 启动 子 是 一 个 很 强 的 启动 子 , 通 过 它 可 以 使 较 弱 启动 子 的 mRNA 的 转录 增强 ,从 而 增加 蛋白 质 的 合 成 量 。 在 某 些 情况 下 ， 从 细菌 培养 荒 中 经 过 提取 得 到 某 种 特定 蛋白 质 的 回收 量 可 以 增加 L¥ Bo 2B ZL BR HR YI = 半 乳 糖 也 是 大 肠 杆菌 可 以 用 来 作为 碳 源 的 另 一 种 糖 。 它 的 代谢 过 程 由 三 个 酶 完成 : 半 乳 糖 激酶 、 半 乳糖 转移 酶 及 半 乳 糖 差 向 异 构 酶 〈galactokinase，galactose transferase 及 galactose epimerase)， 它 们 的 作用 顺序 如 下 : 半 乳 糖 十 ATP RATIO yo 糖 -1- 磷 酸 十 ADP + Ht “9 1 BRR + UDP- 7 A SUPE Fe + a1 UDP-2 9) 5 pag gee 总 的 反应 式 为 : 半 乳 糖 十 ATP 一 葡萄糖-1- 磷 酸 + ADP + Ht 半 乳 糖 操纵 子 (gal operon) 的 调节 ,原则 上 与 lac 操纵 子 的 调节 相似 ,但 还 存在 着 一 些 很 有 意思 的 细 贡 差异 ,这 些 差异 反映 了 半 乳 糖 在 细胞 代谢 过 程 中 的 双重 作用 。 gal 操纵 子 的 遗传 组 成 相应 于 乳糖 代谢 的 三 个 酶 〈LILII) 的 基因 分 别 为 galK, galT 和 galE。 它 们 育 集 在 一 起 ,共用 一 个 操纵 基因 〈gal o)、 一 个 启动 子 区 域 (eal p) 以 及 一 个 阻 遏 物 基 因 (gal R)， 以 上 这 些 基因 共同 组 成 了 一 个 操纵 子 。 gal 操纵 子 与 lac 操纵 子 最 显著 的 不 同 是 gal R〈 阻 遏 物 的 结构 基因 ) 远 离 包括 操纵 A, BOTA gal 基因 的 基因 往 ( 见 图 14-13)。 事实 上 因为 阻 遇 物 是 一 种 可 以 扩散 的 激酶 转移 酶 Gal Gal-1-P UDP-Gal + Glu-1-P “ 4 差 向 异 构 酶 | 1 UDP- 1 Glu I 1 1 mee SS galkK galT galE 5G < galR ee eee eee eee i eS ° galmRNA 14-13 ”大 肠 杆 菌 gal 操纵 子 的 有 关 酶 及 因子 。 缩 写 : Gal， 半 乳糖 ; Gal-1-P， 半 乳糖 -1- wii; UDP-Gal， 尿 喀 啶 二 磷酸 半 乳 糖 ; Glu-1-p， 葡 葡 糖 -1- 碘 酸 ; UDP-Glu, Rane — a KG. gal R 阻 近 物 基因 离 操纵 子 的 其 他 部 分 很 远 。 垂直 的 直线 箭头 将 基因 与 对 应 的 酶 联 系 起 来 。 物质 ， 所 以 没有 什么 理由 要 求 阻 遏 物 基 因 必 须 与 操纵 基因 紧密 相 邻 。 并 且 实 际 上 也 证 明 了 这 一 点 : 自然 界 中 阻 遏 物 基 因 与 结构 基因 直接 相 邻 的 操纵 子 与 这 类 两 种 基因 相互 分 开 的 操纵 子 几乎 是 一 样 多 。gal 阻 遏 物 (目前 尚未 纯化 ) 的 作用 很 像 lac 阻 遏 物 的 作用 ，, 那 就 是 gal R 与 galo* 突变 体 都 具有 组 成 型 的 表现 型 。 当 然 , 操 纵 基 因 与 启动 子 (一 个 以 上 ) 与 那些 总 是 以 适宜 的 方式 排列 着 的 结构 基因 相 邻 接 。 诱 导 物 很 可 能 不 是 某 个 代谢 产物 而 是 半 乳 糖 本 身 。 两 个 gal 启动 子 以 及 cAMP-CAP 对 它们 活性 的 影响 半 乳 糖 不 能 像 葡 萄 糖 那样 有 效 地 被 利用 ， 这 使 人 们 以 为 在 葡萄 糖 存在 时 半 乳 糖 操纵 子 会 处 于 非 诱导 状态 ,然而 ,事情 恰恰 相反 ， 即 使 有 葡萄 糖 存在 ， 这 个 操纵 子 也 是 可 诱导 的 。 关 于 这 点 的 理由 将 很 快 就 会 明白 。 人 们 已 经 分 离 到 若干 个 启动 子 的 突变 体 ， 令 人 惊 讶 的 是 ,这 些 突变 体 仅仅 可 归纳 为 两 类 ,一 类 突变 体 只 是 在 葡萄 糖 存 在 时 才 失 去 高 水 平 合 成 gal 酶 的 能 力 ; 另 一 类 在 葡萄 糖 不 存在 时 也 不 能 进行 酶 的 合成 。 从 cal 操纵 子 具 有 两 个 启动 子 的 事实 出 发 ， 以 上 两 种 现象 都 能 够 得 到 解释 。 从 这 两 个 启动 子 开始 合 成 的 mRNA 分 子 只 是 在 碱 基 序列 的 长 度 上 相差 五 个 核 昔 酸 ， 所 以 两 个 转录 子 的 DNA 中 都 含有 galK 基因 、galT 基因 和 galE 基因 ; 事实 上 这 两 个 mRNA 所 含 的 信息 容量 是 同 No 进一步 了 解 这 两 个 启动 子 的 性 质 需 要 分 析 启 动 子 -操纵 基因 区 域 的 碱 基 序 列 。 人 们 已 经 分 离 得 到 含有 启动 子 -操纵 基因 区 域 的 具有 .139 + HE KER DNA FER, 并 测定 了 该 片 眉 中 适当 部 分 的 碱 基 序列 COLA 14-14)。 图 中 表示 出 了 两 个 gal mRNA 分 子 的 起 始点 S1 和 S2， 这 些 位 点 的 确定 是 通过 分 离 mRNA 分 子 并 测定 其 了 末端 序 列 。S1 和 S2 在 功能 上 有 以 下 不 同 之 处 : mRNA + (cAMP-CAP) mRNA-(CAMP-CAP) gal 差 向 异 构 酶 re 的 起 始 =%6to-47 ESO 20 -10 : #1 +10 #20 AMP-CAP TTTCGCATCTITGTTATGC AT GGT TATTT CATACCATAAGCCTAATGGAGCGAATTATGAGA ¢ s 位 0 AAAGTATGGTATTGGGATTACCTCGCTTAATACTCT H i $2 st 图 14-14 lac 操纵 子 和 gal MATH cAMP-CAP 结合 位 点 。 在 这 两 个 操纵 子 中 具有 相似 碱 基 序 列 的 区 域 用 虚线 标 出 。 只 在 没有 葡萄 糖 存在 时 才能 从 Sl 位 点 开始 发 生 转录 ; 在 crp- 和 腺 苷 酸 环 化 酶 aoe 都 不 能 进行 转录 。 在 体外 ,只 在 有 cAMP-CAP 存在 时 才能 产生 转录 子 。 2. 有 葡萄 糖 存在 时 ,从 S2 起 始 的 转录 可 以 进行 s; 这 一 过 程 不 需要 cAMP-CAP 的 存在 ;事实 上 ,后 者 甚至 对 转录 有 抑制 作用 。 显然 ,葡萄 糖 不 能 对 半 乳 糖 操纵 子 的 诱导 作用 进行 抑制 ,因为 这 个 操纵 子 中 有 一 个 起 始 位 点 并 不 需要 cAMP-CAP, 即使 在 有 葡萄 糖 存在 的 情况 下 ,该 位 点 也 处 于 活跃 状态 。 因 而 在 有 葡萄 糖 存在 的 情况 下 , 阻 断 合成 那些 gal 酶 的 启动 子 的 突变 必然 是 在 S2 中 发 生 的 突变 ;而 那 种 在 没有 葡萄 糖 时 不 能 进行 酶 合成 的 突变 ,就 必定 是 S1 位 点 中 的 突变 。 6 19S © cAMP-CAP 和 gal [Aja MAE ALE 利用 核酸 酶 -保护 技术 ,人 们 已 鉴定 了 cAMP-CAP 作用 的 位 点 ,该 位 点 与 S1 的 距离 与 乳糖 操纵 子 中 的 相应 距离 大 致 相同 ,而 且 碱 基 序 列 也 表现 出 一 定 程度 的 对 称 性 ,但 不 如 在 乳糖 操纵 子 中 这 个 区 域 的 对 称 性 那么 严格 也 许 有 人 以 为 cAMP-CAP 在 所 有 操纵 子 上 的 结合 位 点 都 是 相同 的 (因为 DNA 都 是 与 同一 种 蛋白 质 结 合 ), 但 是 事实 并 非 如 此 ,在 lac 和 gal 操纵 子 中 该 序列 有 一 定 的 相似 性 ( 见 图 14-15)， 但 在 后 面 将 要 讨论 到 的 阿拉 伯 糖 操纵 子 中 ， 它 的 结合 序列 就 与 乳糖 操纵 子 大 不 一 样 了 。cAMP-CAP 激活 Sl 而 抑制 S2 的 机 理 尚 不 清楚 。 有 一 种 观点 认为 Sl 受 激活 的 方式 与 乳糖 操纵 子 相似 〈 即 促进 形成 一 个 开放 型 的 启动 子 复合 物 ), 而 对 在 S1 位 点 起 始 的 转录 过 程 的 激活 可 能 会 干扰 从 S2 起 始 的 转录 。 eT 对 称 中 心 本 ce AA! ree A Gr TIA GC 5 14-15 lac 操纵 子 与 gal 操纵 子 上 cAMP-CAP 的 结合 位 点 。 图 中 阴影 部 分 表示 两 个 操纵 子 中 的 上 述 区 域 具有 类 似 的 碱 基 序列 。 gal 阻 遏 物 的 作用 机 理 也 是 非常 复杂 的 ,所 有 已 知 的 操纵 基因 突变 都 发 生 在 ;ANDP- CAP 的 结合 部 位 点 中 ,而 这 个 结合 位 点 对 于 Sl 和 S2 的 两 个 Pribaow boxes (EB) RNA 聚合 酶 的 结合 位 点 ， 见 第 十 一 章 ) 则 相距 甚 远 。 在 这 种 情况 下 gal BAF HED 不 可 能 像 乳 糖 操纵 子 中 的 lac 阻 遏 物 那 样 去 阻碍 RNA RAMA. 现在 认 为 gal 阻 歇 物 结合 在 cAMP-CAP 位 点 上 ， 这 种 结合 可 能 以 两 种 方式 阻 断 从 S1 的 转录 起 始 作 FA: 或 者 通过 干扰 cAMP-CAP 与 DNA 的 相互 作用 来 阻 断 ,或 者 通过 改变 cAMP-CAP 对 RNA 聚合 酶 结合 的 效应 而 阻 断 。 而 在 S2 位 点 的 阻 遏 作用 似乎 有 着 全 然 不 同 的 机 理 。 如 果 有 gal BME, 那么 转录 的 起 始 作 用 能 够 在 S2 发 生 ， 但 当 转 录 向 下 游 进 行 10 一 20 个 碱 基 之 后 便 停止 了 ,这 个 过 程 是 怎么 发 生 的 ,原因 尚 不 清楚 。 gal 操纵 子 中 两 个 启动 子 的 意义 为 什么 半 乳 糖 操纵 子 需要 两 个 转录 起 始 位 点 ”对 这 个 问题 还 没有 明确 的 答案 ， 但 这 可 能 与 半 乳 糖 在 细胞 代谢 中 的 双重 作用 有 关 。 半 乳 糖 不 仅 可 以 作为 唯一 碳 源 供 细胞 生 长 ， 而 且 与 之 相关 的 物质 尿 苷 二 磷酸 半 乳 糖 (UDPGal) 是 大 肠 杆 菌 细胞 壁 合成 的 前 体 。 在 没有 外 源 半 乳糖 的 情况 下 ，UDPGal 是 通过 半 乳 糖 差 向 异 构 酶 《galactose epimerase) 的 作用 由 UDP- 葡 萄 糖 合成 的 ,该 酶 是 galE 基因 的 产物 。 因 此 ， 如 果 细 胞 是 生长 的 那 么 在 生长 过 程 中 的 所 有 时 间 里 细胞 必须 能 够 合成 差 向 异 构 酶 ， 这 个 作用 也 许可 以 通过 不 属于 gal 操纵 子 的 第 二 个 galE 基因 来 完成 。 另 一 方面 ， 因 为 在 合成 细胞 壁 的 过 程 中 对 异 构 酶 的 需要 量 很 小 ， 本 底 水 平 的 组 成 型 合成 可 能 就 已 经 可 以 满足 需要 了 。 实际 上 gal mRNA 的 组 成 型 合成 水 平 已 高 于 乳糖 操纵 子 所 合成 的 lac mRNA 的 水 平 ， 显然 这 个 es 20 « mRNA 是 在 没有 半 乳 糖 的 情况 下 作为 酶 合成 的 模板 而 存在 的 。 设想 如 果 只 有 Sl 一 个 启动 子 , 那 么 由 于 这 个 启动 子 的 活性 依赖 于 cAMP-CAP, % 葡萄 糖 出 现时 异 构 酶 就 不 能 组 成 型 地 产生 。 假设 如 果 唯 一 的 启动 子 是 S2 ， 这 种 情况 下 即使 在 有 葡萄 糖 存在 的 情况 下 半 乳 糖 也 将 使 操纵 子 处 于 充分 脱 阻 遏 (诱导 ) 状 态 ， 这 对 细 胞 来 说 无 疑 是 一 种 浪费 。 所 以 从 必要 性 及 经 济 上 来 考虑 ， 剖 需要 一 个 不 依赖 于 cAMP- CAP 的 启动 子 〈S2) 进行 本 底 水 平 的 组 成 型 合成 ,以 及 一 个 依赖 于 cAMP-CAP 的 启动 子 (S1) 对 高 水 平 合成 进行 调节 ;进一步 说 ,只 有 在 S2 活性 完全 被 cAMP-CAP 抑制 时 调 控 作 用 才 是 有 效 的 ”。 对 于 gal 酶 合成 的 调节 机 理 的 研究 还 很 不 充分 ,这 里 还 涉及 到 另 一 个 调节 因子 ， 已 通过 在 一 个 叫做 capR 的 基因 中 发 生 的 突变 对 此 调节 因子 做 过 鉴定 《注意 capR 基因 与 CAP 蛋白 毫 无 关系 )o capR ”突变 体 的 表现 型 非常 复杂 ， 即 包括 提高 所 有 gal BAA 产量 \ 对 紫外 线 的 高 度 敏 感性 ， 缺 陷 型 细胞 发 生 分 有 裂 \ 细 胞 要 生长 到 帮 倍 于 正常 细胞 的 长 度 时 才 发 生 分 裂 ), 以 及 产生 粘性 (细胞 分 泌 多 糖 ,致使 菌落 表面 上 附着 一 层 有 光泽 的 粘性 物质 )* 但 是 还 不 知道 在 capR ”突变 体 中 的 分 子 缺 陷 是 什么 。 阿拉 伯 糖 操纵 子 阿拉 伯 糖 是 另 一 个 可 以 为 代谢 提供 碳 源 的 糖 ( 五 碳 糖 )。 在 大 肠 杆菌 中 阿拉 伯 糖 的 降 解 需 要 三 个 基因 : araB, araA 和 araD， 它 们 形成 一 个 基因 簇 ， 简 写 为 araBAD (AA 14-16)o 这 些 基 因 分 别 编码 三 个 酶 : araB 基因 编码 核 酮 糖 激酶 (ribulokinase),araA 编码 工 - 阿 拉 伯 糖 异 构 酶 〈(L-arabinose isomerase)， 以 及 araD 编码 直 - 核 酮 糖 -=5- 磷 酸 -4- 差 向 异 构 酶 〈L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)。 在 半 乳 糖 操纵 子 中 , 基因 的 排列 顺序 就 是 代谢 途径 中 酶 的 作用 顺序 。 这 个 操纵 子 却 不 同 ，ara 操纵 子 中 的 酶 是 以 araA \araB、 araD 的 顺序 起 作用 的 。 另外 还 有 两 个 负责 将 阿拉 伯 糖 运 人 细胞 里 的 基因 ， 即 araE 和 ey L- 核 酮 糖 - 工 -阿拉 伯 糖 L- 核 酮 粮 5- Be R-4- f 异 构 酶 L - 核 图 差 向 异 构 酶 ”D- . L iil LB 激酶 wegen aS, D-*AME —" 5- RR jk 1 I 图 14-16 ABH BA ara 操纵 子 及 其 调控 途径 。pBAD 代表 ara BAD 基因 的 启动 子 ，pC 代表 araC 基因 的 启动 子 ; 正文 中 将 对 这 些 启动 子 的 重合 作出 介绍 。 ““ 高 水 平 "是 一 种 通常 的 用 法 ,用 来 表示 高 浓度 或 高 速度 (正确 的 含意 通常 要 从 上 下 文 获得 ); RZ. “RKP 来 表示 低 浓 度 或 低速 度 。 ‘2h s araF ， 它 们 位 于 远离 这 组 基因 的 地 方 。 araE 和 araF 分 别 地 编码 一 个 膜 蛋白 和 一 不 在 细胞 壁 与 细胞 膜 之 间 的 阿拉 伯 糖 结合 蛋白 ; 但 是 目前 我 们 对 这 两 个 基因 还 很 不 了 解 , 所 以 不 准备 在 这 里 作 进一步 讨论 。 与 araBAD 相 邻 的 是 一 个 复合 的 启动 子 区 域 和 一 个 调节 基因 araC， 这 个 调节 基因 的 性 质 与 我 们 已 介绍 过 的 lac 及 gal 操纵 子 中 的 调节 基因 的 性 质 全 然 不 同 。 我 们 将 看 到 AraC 蛋白 同时 显示 正 负 调节 因子 的 功能 。 与 之 相反 , 在 lac 和 gal RUTH, BBE 白 只 能 作为 负 调节 因子 ， 而 cAMP-CAP 蛋白 只 能 是 正 调节 因子 。 araBAD 和 araC 基 因 的 转录 是 分 别 在 两 条 链 上 以 相反 的 方向 进行 的 。 在 标准 的 遗传 学 图 谱 上 ，araBAD 基 ARM EA BSE pBAD 开始 向 左 进行 转录 ,而 araC 基因 则 是 从 pC 向 右 转 录 。 ara 操纵 子 也 是 可 诱导 的 ,阿拉 伯 糖 本 身 就 是 诱导 物 。 即 在 野生 型 操纵 子 中 , 只 有 阿 拉 伯 糖 存在 时 才 转 录 出 araBAD mRNA， 而 在 葡萄 糖 存在 时 则 不 转录 。 在 腺 苷 酸 环 化 酶 的 缺陷 型 和 crp- 突变 株 中 ,细胞 也 都 不 能 形成 araBAD mRNA。 这 些 都 说 明了 从 pBAD 起 始 的 转录 过 程 需 要 cAMP-CAP。 AraC 蛋白 的 正 负 调 节 作用 araC 基因 产物 有 正 调节 活性 ， 以 下 结果 可 以 说 明 这 种 活性 : 1. 在 araC 基因 内 发 生 点 突变 或 缺失 突变 ,产生 出 称 为 araC- 的 突变 体 。 两 种 araC- 都 不 能 合成 ara BAD mRNA, 如 果 知 道 的 仅 此 而 已 ,那么 人 们 可 能 会 认为 或 者 可 能 是 araC ”细胞 产生 了 突变 型 的 阻 遏 物 ,这 种 阻 遇 物 ,不 能 与 诱导 物 结合 ,或 者 可 能 araC 基因 的 位 置 就 是 启动 子 的 位 置 。 通 过 下 面 两 项 观察 结果 确认 这 两 种 可 能 性 都 不 存在 。 2. 基 因 型 为 F'araC+/araC” 的 局 部 双 倍 体 的 操纵 子 是 完全 可 以 诱导 的 。 这 意味 着 araC” 等 位 基因 是 隐 性 的 。 假如 一 些 araC 突变 体 的 产物 是 不 可 诱导 的 阻 遇 物 ， 那 么 araC” 对 于 araC+ 来 说 则 应 当 是 显 性 的 ， 然 而 这 种 看 法 与 2 中 观察 到 的 实验 事实 不 符 。 3. 基因 型 为 F'araCtaraA- /araC-araA+ 的 局 部 双 倍 体 的 操纵 子 对 于 合成 araA 产 物 来 说 是 完全 可 诱导 的 。 假 如 araC 就 是 启动 子 ， 又 由 于 araA* 与 araC” 突 变 处 于 同 一 个 DNA 分 子 上 ,那么 araA+ 基因 就 应 当 不 被 转录 。 事 实 表 明 araC 基因 产物 互补 于 一 个 反 式 的 构象 (trans configuration)， 所 以 说 araC 基因 不 是 启动 子 ， 它 与 启动 子 并 不 在 同一 个 位 置 上 ,那么 araC 基因 的 产物 则 必然 是 一 种 可 扩散 的 分 子 , 所 以 才能 诱导 合 成 出 araA 基因 产物 。 遗传 学 上 还 有 一 些 其 他 的 证 据 ， 即 araC 基因 上 的 一 些 琥珀 突变 说 明 araC 产物 是 一 种 蛋白 质 ， 这 些 遗 传 学 结果 由 于 AraC 蛋白 的 纯化 而 得 到 进一步 的 证 实 ;而 且 更 进 一 ， 步 ， 我 们 现在 已 经 知道 了 该 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 。 关 于 以 上 结果 的 实验 细节 我 们 没有 必 要 去 讨论 ,关键 问题 是 要 懂得 araBAD mRNA 的 合成 需要 一 个 有 功能 的 AraC BAe araC 基因 产物 对 于 从 pBAD 起 始 的 转录 也 有 微弱 的 阻 遇 作 用 ， 这 种 看 法 是 通过 几 个 复杂 的 遗传 学 实验 而 得 出 的 ,在 这 里 不 打算 详细 和 叙述。 总 的 说 来 ,阿拉 伯 糖 操纵 子 的 一 ERMA RE HAMA AraC 蛋白 存在 (因为 它 是 araBAD 转录 所 必需 的 )， 在 无 阿拉 伯 糖 时 也 可 以 产生 一 些 ara BAD mRNA。 这 一 现象 使 我 们 回忆 起 乳糖 操纵 子 的 操 纵 基因 发 生 突变 的 情形 ,虽然 二 者 之 间 差 异 多 于 相似 之 处 。 例 如 ， 比 起 有 lacO* 突变 的 es 22 。 FL PER AAT OK BH EERE) BY, lacOe 突变 可 以 使 操纵 子 基因 完全 表达 ， 然而 在 ara 操纵 子 中 , 当 阻 遏 活性 被 排除 时 ， 产 生 的 araBAD mRNA 的 量 仅 是 阿拉 伯 糖 存在 时 《也 就 是 说 ， 当 ara 操纵 子 处 于 被 诱导 状态 ) 的 1 多 。 这 种 弱化 阻 遏 作用 的 机 理 尚 不 清 楚 。 我 们 即将 看 到 AraC 蛋白 还 有 另外 的 阻 遏 活性 ,这 次 是 对 pC 启动 子 的 。 有 两 方面 的 体外 实验 进一步 证 实 起 始 转录 需要 CAMP-CAP 及 AraC 蛋白 〈 当 以 正 调控 因子 起 作用 时 ) 的 共同 作用 。 在 第 一 个 实验 里 ， 当 反应 混合 物 中 或 者 是 〈a) 只 含有 ara DNA 和 RNA RAM. RAE 〈b) 含有 DNA, RNA 聚合 酶 以 及 蛋白 质 中 的 仅仅 一 种 〈《 只 有 AraC 蛋白 或 只 有 cAMP-CAP) 时 , 都 不 能 合成 ara BAD mRNA, 说 明 反 应 的 进行 需要 两 种 蛋白 质 共 同 起 作用 。 在 第 二 个 系列 实验 中 ,利用 电镜 检测 araDNA( 这 种 技术 可 以 看 到 结合 了 RNA RAMAN DNA HF) ,这些 实验 中 的 一 个 结果 表明 ,除非 同时 存在 着 这 两 种 蛋白 质 , 否 则 RNA 聚合 酶 是 不 能 结合 到 DNA 上 的 。 后 面 我 们 将 要 对 这 两 种 蛋白 质 是 如 何 促 进 ara BAD 转录 的 进行 一 些 解 释 。 AraC 蛋白 的 两 种 形式 AraC 蛋白 可 作为 pBAD 活性 正 负 调节 子 的 双重 作用 ， 通 过 假设 该 种 蛋白 质 具 有 两 种 异 构 体 已 经 作出 了 一 些 解释 。 一 种 形式 称 为 P.， 是 起 阻 过 作用 的 形式 , 可 以 与 尚未 鉴 定 的 类 操纵 基因 位 点 〈operatorlike site) HAG. 另 一 种 Pi 是 起 诱导 作用 的 形式 ， 它 通过 与 pPBAD .启动 子 结合 进行 调节 。 推测 P.M Pi 这 两 种 结构 处 于 一 种 相互 平衡 之 中 。 在 没有 阿拉 伯 糖 时 ，P: 形式 占 优 势 ; 一 旦 有 阿拉 伯 糖 存在 ,阿拉 伯 糖 就 能 够 与 AraC 蛋白 结合 使 平衡 趋向 于 Pi 形式 。 这 样 ， 阿 拉 伯 糖 的 诱导 作用 就 可 以 解释 为 阿拉 伯 糖 与 P, 的 结合 使 P. 离开 它 的 结合 位 点 ,然后 ,产生 大 量 的 Pi，Pi 再 与 启动 子 结合 。 关于 Pi FP. 的 转变 还 有 许多 未 知 的 问题 。 例 如 ， 仍 然 不 清楚 阿拉 伯 糖 是 怎样 话 导 这 种 转变 作用 的 。 纯 化 的 AraC 蛋白 的 物理 性 质 表 明 阿拉 伯 糖 可 以 与 它 结合 , 并 进行 诱导 ,使 它 的 构象 发 生变 化 。 但 其 他 一 些 实验 指出 Pi 并 不 是 一 种 简单 的 阿拉 伯 糖 -AraC 蛋白 复合 物 。 AraC 蛋白 合成 的 调节 AraC 蛋白 的 合成 也 是 受到 调 市 的 , 像 lac 操纵 子 中 的 lacl PER BHP, 它 的 合成 过 程 也 是 受到 自我 调节 的 。 即 AraC 蛋白 本 身 作为 pC 的 负 调 节 子 来 控制 其 自身 的 合成 过 程 ， 这 种 现象 称 为 自我 调节 〈autogenous regulation), 令 人 吃惊 的 是 ，AraC 蛋白 的 合成 也 受到 cAMP-CAP 的 调节 。 即 葡萄 糖 存在 时 ,没有 AraC 蛋白 产生 。 因 此 ， ara BAD Fr RR araC 基因 的 转录 是 协同 调节 的 ,这 样 做 是 比较 符合 经 济 原则 的 , 因为 如 果 没 有 其 他 几 种 蛋白 质 , 仅 仅 单独 地 存在 着 一 种 蛋白 质 是 没有 意义 的 。 对 araC 基因 产物 调节 机 理 的 研究 采用 了 一 项 新 技术 ， 从 而 避免 了 令 人 乏味 的 直接 分 析 AraC 蛋白 的 操作 步骤 。 现 在 通过 基因 操作 技术 ， 将 乳糖 操纵 子 的 lacZ 基因 从 大 肠 杆 菌 中 的 正常 位 置 上 转移 出 来 ,并 连接 到 AraC 蛋白 的 启动 子 pC 上 (这 被 称 为 lacZ- araC 启动 子 融合 )。 这 种 重 排 过 的 细菌 不 再 具有 araC 基因 (已 被 删除 )， 但 还 是 可 以 测 到 这 个 基因 的 转录 活性 ;因为 lacZ 不 再 与 自己 原来 的 启动 子 偶 联 ,而 是 处 在 araC 的 启 动 子 PC 的 控制 下 ，p- 半 乳糖 童 酶 仅仅 由 pC 开始 的 mRNA 上 翻译 出 来 。 因 此 , HA ¢ 23508 成 出 来 的 酶 量 (这 是 很 容易 检测 的 ) 就 反映 了 AraC 蛋白 的 合成 。 在 测定 大 肠 杆菌 中 经 过 基因 融合 的 5- 半 乳 糖 昔 酶 的 含量 时 , 如 果 培 养 基 中 有 葡萄 糖 , 则 酶 产量 降低 ,这 说 明 araC 基因 的 转录 需要 } EI 14-19 ”大肠 杆菌 的 trp 操纵 子 。 为 清楚 起 见 ? 将 调节 区 放大 (相对 于 编码 区 而 言 )。 实 际 上 每 一 个 区 域 的 合适 的 大 小 已 用 碱 基数 标 出 。 工 是 前 导 序 列 , 调 节 区 域 用 虚线 表示 。 trp 的 阻 遏 蛋白 -操纵 基因 体系 与 乳糖 操纵 子 一 样 ,如 果 在 trp 操纵 子 的 trpR 基因 中 和 在 操纵 基因 中 发 生 突 变 , 将 起 始 组 成 型 trp mRNA 的 合成 。 除 非 在 色 氢 酸 存在 下 ， 和 否则 trp 基因 的 蛋白 产物 是 不 会 与 操纵 基因 结合 的 。rpR 基因 的 蛋白 产物 常常 被 称 为 up 的 辅 阻 过 蛋白 。 辅 阻 遏 蛋 日 (aporepressor) 与 色 氮 酸 在 一 起 则 形成 一 个 有 活性 的 阻 遇 物 ,这 个 有 活性 的 阻 遏 物 可 以 再 与 操纵 基因 结合 ,使 操纵 基因 失去 活性 ,进一步 抑制 转录 。 这 一 反应 可 图 示 如 下 : 输 阻 遏 蛋白 十 操纵 基因 一 有 活性 的 操纵 基因 (能 发 生 转 录 ) 输 阻 过 蛋白 + fake — 有 活性 的 阻 过 物 十 (trpR 的 产物 ) 操纵 基因 无 活性 的 操纵 基因 (不 能 发 生 转 录 ) 如 果 停 止 外 源 性 色 氮 酸 的 供应 (或 大 幅度 降低 供应 ), 以 上 反应 式 的 平衡 向 左 移动 , 操 纵 基 因 的 位 置 空 出 来 ,又 开始 转录 。 这 就 是 基本 的 开启 -关闭 调节 机 理 。 启动 子 与 操纵 基因 的 区 域 有 很 大 程度 的 重 登 ， 有 活性 的 阻 过 物 的 结合 与 RNA RG MN AAR ERS. CAN, WRIA SD, Il RNA 聚合 酶 不 能 结合 ， 反 过 来 也 一 样 。 至 于 阻 遏 物 在 这 里 是 否 像 Lac 阻 遏 物 那样 作为 一 个 抗 融 解 蛋白 〈antimelting protein) 起 作用 , 则 还 不 是 十 分 清楚 。 图 14-20 表示 启动 子 -操纵 基因 及 与 其 相 邻 的 区 域 的 碱 基 序 列 ， 这 个 相 邻 区 包括 e 27 e trp mRNA 合成 的 起 始 位 点 。 操 纵 基 因 的 20 个 碱 基 对 中 的 18 个 碱 基 对 形成 了 倒转 重复 的 对 称 结构 。 RNA 聚合 酶 结合 位 点 -50 AG 一 30 一 20 一 10 +1 +10 iGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTFAACTAGTACGCAAGTTCAC GTAAAAA | OB TT LAT AARIREIIncT Rin Mi teed aetna Ae Tee ATGCGTTCAAGTGCATTTIT 4 ---> ae te 操纵 基因 -一 --- ~ mRNA 合成 起 始 启动 子 图 14-20 trp 操纵 子 的 启动 子 -操纵 基因 的 碱 基 序列 。 阴 影 区 表示 操纵 基因 对称 中 心 为 操纵 基 因 上 方 的 箭头 所 指 之 处 。trp 操纵 子 中 第 一 个 基因 的 AUG 起 始 密码 子 在 十 162 位 置 处 。 阻 遏 物 - 操 纵 基 因 形 成 了 trp 操纵 子 的 一 个 有 效 的 “开启 -关闭 "开关 。 然 而， 在 氨基 酸 生 物 合成 的 操纵 子 中 还 有 另外 的 更 为 精细 的 调控 机 理 使 酶 浓度 能 够 随 着 氨基 酸 浓 度 而 变化 。 这 种 调控 来 自 两 方面 的 效应 : 〈1) 在 转录 到 第 一 个 结构 基因 前 时 就 发 生 转 录 作 用 的 早熟 性 终止 ; (2) 氨基 酸 的 浓度 控制 这 种 终止 转录 的 频率 。 在 下 面 一 节 里 我 们 将 详细 地 描述 这 个 过 程 。 衰减 子 和 前 导 多 肽 从 trp mRNA AY 5’ 端 开 始 ,在 trpE 基因 的 起 始 密码 子 的 前 面 有 162 个 碱 基 ( 见 图 14-19 的 左 部 )。 这 一 委 mRNA 称 之 为 前 导 序 列 〈 对 这 个 区 域 的 一 般 性 描述 见 第 十 元 章 )。 如 果 在 先导 序列 中 删 A—Be DNA 《第 123 一 150 碱 基 对 )，, 那 么 不 论 在 脱 阻 遏 的 还 是 在 组 成 型 的 突变 细胞 中 , 这 些 trp 酶 的 产量 都 将 增加 约 6 倍 。 所 以 , 123 到 150 KR 列 必定 具有 调控 活性 。 而 且 发 现 ， 在 mRNA 合成 起 始 以 后 ， 除 了 在 完全 没有 色 氨 酸 的 情况 下 以 外 ,大 多 数 mRNA 分 子 都 将 在 这 一 区 域 终 止 ,从 而 产生 一 个 具有 仅仅 140 个 核 BRAY RNA 分 子 , 即 在 编码 trp 酶 的 基因 还 没有 被 转录 之 前 就 终止 了 转录 ; 这 就 解释 了 为 什么 一 旦 这 个 区 域 发 生 缺 失 ， 就 会 增加 基因 表达 。 在 这 个 转录 作用 终止 并 受到 调 市 110 120 130 140 ag AUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGG6CUUUUUuuyuu 衰减 耶 mRNA 中 的 AAU 最 后 的 碱 基 U G ge 1201 c-GI 1G-Cr 1¢-G! 130 IC-G! IorGt iG:cl 110 sAUt 140 AUACCC UUUUUUUYU 图 14-21 trp 衰减 子 mRNA 的 终止 区 。 图 中 所 示 的 碱 基 序列 一 直 延 伸 到 终止 位 点 ， 终 止 位 点 处 于 mRNA 中 的 140 处 ， 是 一 连 率 组 成 的 序列 。 图 中 用 虚线 标 出 的 碱 基 形 成 倒转 重复 序列 ， 这 种 倒转 重复 序列 可 以 造成 图 中 下 部 所 示 的 柄 与 泡 结构 。 的 区 域 被 称 为 衰减 子 〈attenuator)。 仔细 地 分 析 终止 发 生 的 这 个 区 域 的 碱 基 序列 〈 见 图 14-21)， 发 现 它 具有 终止 位 点 的 一 般 结构 ， 即 如 第 十 一 章 中 所 介绍 的 一 个 柄 与 泡 的 结构 (stem-and-loop) 以 及 随 之 而 来 的 一 连 串 为 五 个 碱 基 的 _A.T 序列 。 来 自 各 方面 的 实验 表明 衰减 作用 需要 有 带 负载 的 tRNArre 参与 ,这 意味 着 前 导 序列 的 某 些 部 分 被 翻译 了 。 分 析 前 导 序 列 , 发 现 它 包括 一 个 AUG 密码 子 ,随后 还 有 一 个 同 时 协调 的 _UGA 终止 密码 子 ;如 果 翻 译 起 始 于 AUG ,将 产生 一 个 含有 14 个 氨基 酸 的 多 肽 ( 见 图 14-22)。 这 个 假设 的 多 肽 (还 未 实际 观察 到 ) 被 称 为 前 导 多 肤 (leader peptide), 有 二 些 证 据 表 明 这 个 肽 可 能 实际 上 是 存在 的 。 例 如 ， 刚 好 在 mRNA 上 的 AUG 位 点 的 5 一 侧 中 有 一 个 核糖 体 的 结合 位 点 。 此 外 ， 前 导 肽 的 编码 区 与 trpE 基因 末端 的 融合 能 够 产生 一 种 融合 蛋白 质 ,该 蛋白 质 具 有 与 前 导 肽 同样 的 N 未 端 序列 。 fe AS BS & AK | | TrpE 蛋白 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly ee x 2 Arg Thr Ser— Stop Met Gin Thr Glin BPPAAG.. (23)...AUG AAA GCA AUU UUC GUA CUG AAA GGU UGG CGC ACU UCC UGA...(91),..AUG CAA ACA CAA 图 14-22 trp 操纵 子 的 前 导 mRNA 碱 基 序列 和 假设 的 前 导 多 肽 序列 。 图 中 还 指出 了 两 个 编码 SAR trp 的 密码 子 (阴影 部 分 ) 和 IrpE 蛋白 质 的 起 始 部 分 。 为 了 清晰 起 见 ， 删 去 的 碱 基数 用 数字 (23 及 91) 表 示 。 前 导 多 肽 有 一 个 非常 有 意思 的 性 质 , 即 在 第 10 和 11 位 上 有 两 个 紧 靠 着 的 色 氮 酸 密码 子 。 与 组 氨 酸 操纵 子 比 较 ， 我 们 可 以 看 到 这 一 性 质 的 重要 意义 。 在 组 氮 酸 操纵 子 中 同样 也 有 一 个 衰减 子 体系 ( 即 有 一 个 尚未 完全 成 熟 就 被 终止 合成 的 mRNA), 站 Ee 个 相似 的 编码 前 导 多 肽 的 序列 。 这 个 序列 具有 7 个 紧 靠 着 的 组 氮 酸 密码 子 ( 见 图 14-23)， 我 们 接着 就 要 讨论 这 些 重 复 密 码 子 的 意义 。 (al Met Lys’ His lle Pro @3RGS RRR Ala 者 ER Thr PEG Pro Stop -"" _ § AUG AAA CAC AUA CCG UUU UUC UUG GCA UUC UUU UUU ACC UCC CCC UGA 3 人) Met Thr Arg Val Gin Phe Lys S7RRISUSHRGEHIERCHIRISISSEMEe Pro Asp 4 AUG ACA CGC GUU CAA UUU AAA CAC CAC CAU CAU CAC CAU CAU CCU GAC 3 14-23 (2) 葵 丙 氨 酸 操纵 子 和 (〈b) 组 氨 酸 操纵 子 的 前 导 多 肽 的 氨基 酸 序列 和 mRNA 相应 部 分 的 碱 基 序列 。 重 复 的 氨基 酸 用 阴影 表示 。 mRNA 前 导 序列 中 的 碱 基 配 对 trp 前 导 序列 的 碱 基 顺 序 已 测定 出 来 ， 其 中 引 人 注 目的 是 其 中 的 四 个 片段 用 1、2、3 和 4 代表 , 它们 能 够 以 两 种 方式 进行 碱 基 配 对 ( 见 图 14-24), 即 可 以 以 1 一 2 和 3 一 4 或 只 是 2 一 3 的 方式 在 它们 之 间 形 成 互补 配对 。 利 用 RNase Tl 〈 此 酶 不 能 水 解 配 对 的 .RNA) 的 作用 表明 纯化 的 trp 前 导 mRNA 中 只 有 1 一 2 和 3 一 4 的 配对 方式 。 因 为 由 这 样 定位 的 3 一 4 配对 区 应 当 处 于 终止 密码 子 的 识别 区 域 之 内 ， 所 以 它 的 确 是 转录 终止 所 必需 的 ， 即 在 这 一 区 域内 发 生 的 几 种 突变 ,或 是 在 体内 实验 中 阻止 了 转录 的 终止 ,或 是 在 体外 实验 « 29 e ‘ \ 一 人 \ 1 1 1 \ 继续 转录 作用 3 A 八 ‘| 4 har S) prs C) (a) 自由 的 mRNA . 1-2 (b) 在 低 浓 度 的 色 氨 酸 条 件 下 。 (c) 在 高 浓度 的 色 氨 酸 条 件 下 。 之 间 .3-4 之 间 形 成 碱 基 对 当 “4” 区 的 转录 完成 时 ， 在 “4” 区 转录 完成 之 前 ， 核糖 体 被 堵塞 在 “L” 区 核糖 体 就 已 移动 到 “2” 区 mm 14-24 已 被 人 们 接受 的 大 肠 杆 菌 trp 操纵 子 中 的 衰减 作用 机 理 的 模型 。 中 降低 了 这 个 区 域 对 RNase Tl 酶 的 抗 性 。 值 得 注意 的 是 ,由 于 双 螺 旋 的 1 一 2 片段 和 3 一 4 片段 中 的 2 与 3 序列 相互 配对 ， 于 是 有 2 一 3 区 ， 而 不 可 能 同时 存在 1 一 2 区 和 3 一 4 区 。 这 也 就 意味 着 如 果 条 件 适宜 于 形成 2 一 3 区 ,那么 1 一 2 区 和 3 一 4 区 便 不 复 存在 ， 这 是 很 重要 的 一 点 。 从 以 上 这 些 现象 中 可 以 总 结 出 关于 trp 前 导 序 列 过 早 终 止 转录 的 机 理 ， 这 一 理论 虽然 尚未 得 到 严格 证 明 ,但 已 被 广泛 地 接受 RN FTN. 衰减 的 机 理 这 一 理论 ( 见 图 14-24) 提出 前 导 多 肽 “基因 ”的 翻译 促进 了 mRNA 的 终止 。 因 为 这 个 基因 里 有 两 个 色 氮 酸 密码 子 , 这 段 序列 的 翻译 能 力 将 对 携带 了 色 氨 酸 的 节 NATe 的 浓 度 敏感 , 即 如 果 色 氮 酸 的 量 是 有 限 的 ,那么 就 会 使 名 有 色 氨 酸 的 tRNAT? 不 足 , 从 而 穿 过 色 氨 酸 密码 子 的 翻译 作用 的 速率 就 应 当 非 常 低 。 这 一 理论 还 推测 像 细 菌 中 的 一 般 情况 那 样 ,转录 和 翻译 过 程 是 偶 联 在 一 起 的 ,而 且 ， 在 mRNA 与 核糖 体 接触 的 区 域 中 根本 没有 碱 基 配 对 。 图 14-24 中 指出 trp 前 导 肽 的 未 端 位 于 第 一 区 。 通 常 , 进行 翻译 的 核糖 体 越 过 那些 正 被 翻译 的 密码 子 与 mRNA 中 的 大 约 10 个 碱 基 相 互 接触 ,这 样 当 最 后 一 个 密码 子 被 翻译 完毕 时 ,第 1 区 和 第 2 区 还 不 能 配对 。 在 转录 -翻译 的 偶 联 体系 中 ， 前 导 的 核糖 体 不 会 远 远 地 落 在 RNA 聚合 酶 之 后 。 因 此 ;, 当 第 4 区 正在 完成 其 转录 合成 时 ,核糖 体 就 与 第 2 区 接触 ;然后 ,第 3 及 第 4 区 可 以 自由 地 形成 3 一 4 区 双 螺 旋 区 ,而 不 会 有 第 2 区 为 了 形成 双 螺旋 而 产生 的 竞争 。3 一 4 区 的 柄 与 泡 结 构 的 存在 , 使 得 RNA 聚合 酶 一 旦 达到 7 个 的 终止 序列 时 ,转录 作用 立即 终止 。 如 果 不 再 加 入 色 氨 酸 , 有 负载 的 tRNATe 的 浓 度 降低 到 一 定 的 限度 。 正 在 翻译 着 的 核糖 体 将 偶尔 地 在 色 氨 酸 密 码 子 处 滞留 (这 些 密码 子 位 于 第 2 区 开始 前 的 16 个 碱 基 处 )。 因 此 ,在 第 4 区 被 合成 之 前 ,第 2 区 可 以 自由 地 形成 2 一 3 区 的 双 螺 旋 。 在 没有 3 一 4 区 的 柄 与 泡 结构 的 情况 下 ,转录 不 能 终止 ,从 而 可 以 把 包 括 所 有 的 trp 基因 在 内 的 序列 转录 成 一 个 完整 的 mRNA 分 子 。 所 以 如 果 色 氨 酸 过 量 , 就 使 转录 作用 终止 ,几乎 不 产生 酶 ;如果 没有 色 氨 酸 , 则 转录 不 终止 ,所 有 的 trp 酶 都 能 合成 « 30 。 Bie’ 1 阻 歇 作用 与 衰减 作用 的 对 抗 trp 的 阻 遇 物 -操纵 基因 体系 不 能 像 “ 开 启 -关闭 "开关 那样 地 起 作用 ， 但 是 能 够 使 细 菌 产生 中 等 浓度 的 色 氨 酸 。 人 们 已 经 知道 ,在 不 加 色 氮 酸 的 条 件 下 ,在 细胞 生长 的 全 部 时 闻 里 trp mRNA 的 合成 都 受到 部 分 阻 过 ， 因 为 在 一 个 阻 遏 物 发 生 突变 的 (无 活性 ) 细 胞 中 trp 酶 系 的 浓度 要 比 一 个 野生 型 细胞 中 该 酶 系 的 浓度 高 出 10 倍 。 人 们 观察 到 的 上 述 现象 表明 ， 如 果 内 源 的 色 氮 酸 浓度 由 于 任何 原因 引起 起 伏 不 定 ， 那 么 野生 型 细胞 中 有 活 性 的 阻 遇 物 与 无 活性 的 阻 遏 物 之 间 的 平衡 就 会 倾向 到 能 使 色 氨 酸 有 较为 方便 来 源 的 那 一 侧 ; 使 色 氨 酸 维持 在 一 定 的 水 平 上 。 因 此 ,人 们 现在 还 没有 完全 和 弄 清楚 为 什么 还 需要 衰减 子 体系 。 有 可 能 ,有 活性 的 阻 遏 物 向 无 活性 的 阻 遏 物 的 转变 速度 极 低 ,这 种 极 低 的 转变 速度 就 需要 存在 一 种 衰减 体系 。 这 种 衰减 体系 能 更 迅速 地 作出 反应 ， 使 色 氨 酸 能 从 较 高 的 浓度 迅速 地 下 降 为 中 等 浓度 。 也 有 可 能 ,在 有 外 源 性 色 氢 酸 存在 时 需要 有 衰减 体系 如 在 外 源 性 色 氢 酸 浓度 实在 太 低 ， 生 物 本 身 又 没有 另外 的 内 源 性 的 色 毛 酸 合成 体系 ， 细 菌 甚 至 无 法 支持 其 自身 的 生长 时 ， 需 要 有 衰减 体系 加 以 调节 。 例 如 ， 外 源 性 色 氨 酸 的 浓度 很 低 的 信号 对 于 增强 阻 遏 作 用 已 是 足够 的 了 ， 但 是 这 个 信号 的 强度 还 不 足以 像 合成 一 些 必需 蛋白 质 时 那样 能 触发 和 加 强 内 源 性 合成 色 氮 酸 的 过 程 。 于 是 ,在 这 种 环境 下 ,衰减 子 就 应 当 对 总 的 较 低 的 内 源 性 色 氢 酸 的 浓度 作出 反应 一 一 通过 不 终止 ( 即 抗 终止 ) mRNA 的 合成 来 增加 trp BANS 成 从 而 提高 内 源 性 色 毛 酸 的 浓度 。 在 这 种 情况 下 ， 当 内 部 色 氨 酸 浓度 由 于 环境 影响 而 变 动 很 大 时 ,衰减 子 盖 可 以 被 看 作 是 一 个 对 这 种 变动 起 调控 作用 的 调节 器 。 人 们 可 能 会 问 为 什么 要 有 阻 遇 体 系 ; 没有 阻 遏 体 系 ， 似 乎 只 有 衰减 子 也 可 以 调节 色 氨 酸 酶 系 的 合成 。 阻 过 物 的 作用 可 能 是 当 有 大 量 外 源 色 氨 酸 存在 时 ， 阻 止 非 必需 的 先导 mRNA 的 合成 , 它 使 这 个 合成 系统 更 加 经 济 。 事 实 上 ， 自 然 界 中 存在 着 不 同类 型 的 合成 体系 ， 例 如 组 氨 酸 操纵 子 ， 它 拥有 在 功能 上 与 色 氨 酸 操纵 子 中 的 衰减 子 完全 相同 的 衰减 子 ， 这 个 衰减 子 能 够 形成 一 个 有 三 个 碱 基 对 的 区 域 ,但 组 氮 酸 操纵 子 没有 阻 遇 物 ,这 说 明 完全 只 是 受 衰减 子 调节 的 。 目前 ,我 们 不 知道 为 什么 色 氮 酸 操 纵 子 具有 双重 调节 体系 ,而 组 氨 酸 操纵 子 却 不 具有 双重 调节 体系 ,这 些 都 需要 作 进 一 步 的 探讨 。 许多 负责 合成 氨基 酸 的 操纵 子 都 像 色 氨 酸 操纵 子 那样 ， 是 受到 衰减 子 调节 的 。 这 些 衰减 子 都 有 碱 基 配 对 机 理 ， 就 像 色 毛 酸 操纵 子 里 的 竞争 配对 那样 。 虽 然 现 在 人 们 对 于 大 肠 杆 菌 、 鼠 伤寒 沙门 氏 杆 菌 和 沙 雷 菌 属 的 粘 质 赛 氏 杆菌 (Serratia marcescens) HAR BRR. HAR FEAB-BABURAARARSHWRATH TH, SteeRRa 子 相 比 , 所 了 解 的 细节 较 少 ,但 也 已 经 见 到 不 少 对 它们 的 介绍 。 利用 组 受 酸 的 操纵 子 许多 氨基 酸 除 了 能 被 用 来 合成 蛋白 质 以 外 ， 还 可 以 在 碳 源 或 氮 源 不 足 的 时 候 ， 作 为 碳 原子 或 氮 原 子 的 来 源 维 持 细胞 的 生长 。 由 于 这 种 双重 作用 ， 氮 基 酸 的 降解 必须 受到 严 «.34,° hutH hutU hutI hutG . ARR > 尿 刊 酸 “一 咪唑 丙 本 mares —> 谷 所 本 NH, 四 酰胺 图 .14-25 “利用 组 氨 酸 的 途径 ?图 中 示 出 对 每 个 反应 负责 的 基因 。 格 的 调节 。 利 用 组 氮 酸 的 操纵 子 (hut)〈 负 责 降 解 组 氮 酸 ) 就 是 这 样 的 一 个 操纵 体系 ( 见 图 14-25)。 这 种 生化 降解 非常 复杂 ,人 们 对 它 的 调节 区 的 碱 基 序 列 知道 得 还 很 少 * ,然而 去 认识 这 个 操纵 子 又 很 重要 ， 因 为 它 是 一 个 多 重 调节 操纵 子 的 良好 实例 : 它 有 两 个 启动 子 ,两 个 操纵 基因 以 及 两 个 正 调 节 子 (对 于 每 一 个 启动 子 - 操 纵 基 因 单 位 来 说 )， 其 中 的 一 个 正 调 节 子 不 仅 是 一 种 调节 蛋白 ,而 且 也 是 一 种 酶 ,这 种 复杂 性 的 原因 很 快 将 会 搞 清 楚 。 hut 操纵 子 共 编码 四 种 酶 和 一 个 阻 遇 物 。 四 种 酶 分 别 由 hutG,，hutH，hutI 及 hutU 基因 编码 , 阻 过 物 则 由 hutC 基因 编码 。 在 产 气 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella aerogenes) 中 ， 以 上 这 些 基因 组 构成 为 两 个 转录 单位 , 即 含 hutI、hutG、hnutcC 的 单位 和 含 hutU、hutH 的 单位 (图 14-26)**。 这 两 个 转录 单位 各 自 都 有 一 个 启动 子 和 一 个 操纵 基因 ， 并 如 图 所 示 ， 其 转录 过 程 都 是 从 左 向 右 进行 的 。 推 测 两 个 操纵 基因 是 相同 或 近似 于 相同 的 ，hutC 阻 遇 物 分 子 与 每 一 个 操纵 基因 结合 。 虽 然 , 实际 上 的 诱导 物 是 组 氮 酸 被 hutH 的 基因 产 物 作用 而 形成 的 产物 尿 刊 酸 盐 (urocanate)， 但 是 ,诱导 过 程 的 完成 要 人 靠 加 入 组 氨 酸 。 尿 刊 酸 盐 与 阻 遏 物 结合 ,将 阻 遏 物 转 变 成 无 活性 形式 ,使 合成 mRNA 的 每 个 启动 子 能 处 于 自由 状态 。 然 而 ， 由 于 像 lac 操纵 子 那样 ， 也 需要 有 一 个 正 调节 子 , 所 以 这 时 仍然 没有 转录 出 hut mRNA, hut 操纵 子 的 一 个 有 趣 之 处 ， 就 是 它 有 两 种 不 同 的 正 调节 子 〈 像 ara 操纵 子 一 样 ) ， 但 是 对 于 RNA 聚合 酶 结合 到 启动 子 上 的 过 程 ， 只 需要 其 中 的 一 个 正 调 节 子 。 一 :一 一 一 -一 一 一 - 一- es pe Ce pl 9 hutl hutG hutC pU 0 hutU hutH ( BiH) , 图 14-26 hut 操纵 子 的 遗传 学 图 谱 。 图 中 用 虚线 表示 两 个 mRNA 分 子 。 当 碳 源 或 氮 源 都 有 限时 ,hut 操纵 子 负责 供给 细胞 碳 和 氮 。 如 果 以 组 氮 酸 作为 唯一 碳 源 ,同时 氮 源 供给 是 适当 并 充足 时 ,那么 hut 操纵 子 必须 维持 在 有 活性 的 状态 下 ; 反 过 来 ， 当 碳 源 供 给 适当 并 充足 ,而 氮 源 却 有 限时 ，hut 操纵 子 也 必须 处 于 有 活性 的 状态 * 就 像 在 讨论 lac 操纵 子 时 所 谈 到 的 那样 cAMP 系统 能 够 感受 到 可 提供 的 碳 源 的 数量 , 即 : 当 碳 源 缺 乏 时 ,就 合成 cAMP, HS cAMP-CAP BAK hut 操纵 子 的 每 一 个 启动 子 中 都 有 一 个 cAMP-CAP 的 结合 位 点 ， 当 cAMP-CAP 结合 到 这 个 位 点 上 后 ， 就 足以 使 转录 发 生 。 然 而 ,对 于 氮 源 受 限制 的 信号 是 什么 物质 目前 还 不 知道 ,但 几乎 能 肯定 它 是 一 个 正 效 应 子 ， 当 氮 源 不 足 时 它 表 现 为 有 活性 。 这 个 产物 的 合成 通过 一 种 很 复杂 的 、 了 解 甚 少 的 * 最 近 , 这 些 区 域 已 被 克隆 并 分 离 得 到 ,这 对 于 敌 清 一 些 很 多 年 来 不 清楚 的 问题 来 说 ,是 一 个 巨大 的 进步 。 * 产 气 克 雷 伯 氏 菌 和 沙门 氏 杆 菌 的 hut 操纵 子 是 研究 得 最 彻底 的 ， 大 肠 杆 菌 中 没有 hut RAF. e132 方式 与 谷 氮 酰 胺 合成 酶 的 合成 相关 联 ( 谷 氨 酰 胺 合成 酶 负责 将 氨 用 于 合成 含 氮 化 合 物 )。 最 近 ， 已 分 离 到 几 种 氮 调 节 体 系 的 组 分 ,并且 已 经 建立 了 hut 操纵 子 的 体外 转录 体系 。 因此 ， 不 久 将 能 更 加 清楚 地 了 解 hut 体系 的 功能 。 表 14-6 总 结 了 hue 操纵 子 的 主要 活性 。 请 注意 ， 许 多 教科 书 和 叙述 了 谷 氨 酰 胺 合成 酶 在 感受 氮 量 体系 中 的 直接 作用 以 及 加 人 AMP 后 就 失去 活性 。 最 近 已 经 证 明 这 些 看 法 是 错误 的 。 表 14-6 ”在 不 同 培养 基 条 件 下 hut 操纵 子 活性 的 总 结 操纵 子 的 活性 {(“ 开 7 his bi A 源 i ik cAMP* ae “36”) rr 一 充足 76 BORE RR) 低 充足 只 来 自 组 氮 酸 高 局 开 汗水 迷 只 来 自 于 组 氢 酸 | 充足 (来 自 于 基 糖 ) 低 只 来 自 于 组 氮 酸 ae (ARB Fi 高 oH at et at | 注意 : 横 线 表示 该 项 无 关 紧 要 。 * RRS cAMP 浓度 的 联系 是 : 高 [C] 一 > 低 [cAMP] 和 低 [C] 一 > 高 [cAMP], + 只 要 cAMP 是 处 于 高 浓度 时 ,操纵 子 就 是 有 活性 的 。 recA 操纵 子 在 第 九 章 介绍 了 SOS 修复 系统 ,这 是 一 个 可 诱导 的 体系 ， 当 DNA WEP BHM 时 ,细菌 中 这 个 体系 就 会 被 启动 。 这 个 可 诱导 体系 的 一 个 主要 产物 就 是 recA 基因 的 产 物 。 这 个 蛋白 质 在 修复 与 遗传 重组 (对 于 细菌 ,这些 过 程 是 十 分 重要 的 ) 中 起 作用 , 它 有 好 几 种 活性 : 它 能 与 单 链 和 双 链 DNA BA, CRA ATP 酶 的 活性 ， 同 时 它 还 是 一 种 蛋 白 酶 。 对 大 部 分 蛋白 质 起 作用 时 这 种 蛋白 水 解 酶 的 活性 是 很 弱 的 ， 但 它 对 唉 菌 体 中 特定 的 阻 遏 物 的 水 解 活性 却 很 强 , 它 将 在 一 个 独特 的 位 点 把 每 一 个 阻 遇 物 切 开 。 不 久 ,我 们 将 转向 讨论 这 个 重要 之 点 。 细菌 被 紫外 线 照 射 其 DNA 受到 损伤 之 后 ， 突 然 大 量 地 合 成 recA 的 mRNA。 但 是 ,如 果 recA 突变 成 recA ， 这 种 合成 就 不 会 发 生 ,这 与 至 此 所 介 绍 过 的 各 种 操纵 子 中 所 观察 到 的 情况 大 不 相同 。 例 如 ,在 一 个 具有 galK- 的 细菌 突变 株 中 加 入 半 乳 糖 ,虽然 它 合成 出 的 galK 产物 是 有 缺陷 的 ,是 没有 酶 活性 的 ,但 是 半 乳 糖 仍 然 能 够 开动 这 个 gal 操纵 子 。 对 于 recA 操纵 子 ， 则 必须 有 有 功能 的 RecA 蛋白 才能 启动 这 个 操纵 子 。 对 于 这 种 自控 活性 〈autoregulating activity) 解释 为 ， RecA 蛋白 像 araC 产物 一 样 ， 是 一 个 正 调 节 子 ， 另 一 种 解释 为 recA WO 我 们 将 会 看 到 后 一 种 解释 是 正确 的 。 recA 操纵 子 中 的 另 一 个 组 分 是 lexA 基因 ，lexA 可 能 编码 操纵 子 的 一 个 简单 的 阻 遏 物 。 已 分 离 到 一 些 LexA” 的 突变 体 , 其 表现 型 为 RecA-， 这些 突变 体 显然 是 不 可 诱 导 的 ,因为 它们 受到 紫外 线 照 射 后 不 能 作出 反应 ， 即 不 能 相应 地 增加 RecA 蛋白 的 合成 量 。 许多 遗传 学 的 证 据 以 及 体外 生化 试验 的 证 据 都 指出 , 在 未 受 损伤 的 细胞 中 RecA 和 蛋 e 33 。 白 只 有 结合 DNA 的 活性 而 没有 蛋白 水 解 酶 的 活性 ;反之 ， 纯 化 了 的 RecA 蛋白 却 具 有 蛋白 水 解 酶 的 活性 。 所 以 大 们 认为 ， 这 种 体外 观察 到 的 现象 与 体内 观察 到 的 结果 的 区 别 是 因为 在 蛋白 质 分 离 过 程 中 或 是 有 活化 作用 或 是 丢失 了 一 个 抑制 子 Cinhibitor), 目前 认为 ,在 DNA 损伤 后 会 发 生 以 下 两 种 情况 中 的 一 种 : (1)RecA 蛋白 结合 到 在 修复 早期 中 所 产生 的 DNA 单 链 区 上 ， 从 而 转变 成 为 有 活性 的 蛋白 酶 ， 推 测 这 可 能 是 由 于 构象 改 变 造成 的 ;(27) 某 些 是 修复 早期 的 一 些 副产品 , 即 某 些 效应 物 分 子 ， 对 RecA 蛋白 进行 活 化 。 目 前 关于 这 两 点 熟 是 熟 非 还 在 广泛 地 进行 讨论 。 已 分 离 到 LexA 蛋白 。 在 体外 ， 纯 化 了 的 RecA 蛋白 将 LexA 蛋白 切 成 两 个 片段 已 经 分 离 得 到 一 种 突变 株 LexA3 的 基因 产物 。 它 不 具有 LexA+ 细 蓝 的 特点 ,也 就 是 说 它 不 能 增加 RecA 蛋白 的 合成 量 , 体 外 实验 指出 ，LexA3 蛋白 对 于 纯化 了 的 -RecA BA 对 它 的 切割 作用 有 抗 性 。 所 以 ,纯化 了 的 RecA 蛋白 不 能 切 开 LexA3 蛋白 。 上 述 的 这 些 实验 事实 和 理论 可 以 对 recA 操纵 子 的 调控 作出 解释 。 正 常情 况 下 ， 正 在 生长 的 细胞 含有 组 成 型 水 平 量 的 RecA HA, 这 种 组 成 型 RecA 蛋白 没有 水 解 蛋白 酶 的 活性 。 在 DNA 受到 损伤 之 后 , 通过 一 种 未 知 的 机 理 这 种 少量 的 RecA 蛋白 分 子 被 激 活 ， 转 变 成 有 蛋白 水 解 酶 活性 的 形式 。 然 后 ，RecA 蛋白 水 解 酶 切断 所 有 的 LexA Ais 物 分 子 。 因 此 ，recA RAFAH HARA, RecA 蛋白 的 合成 就 增加 了 。 只 要 活化 信号 还 存在 着 ， 操 纵 子 就 一 直 处 于 活化 状态 ， 但 是 当 修 复 完 成 后 ,活化 信号 就 立刻 消失 ， RecA 蛋白 又 回 到 非 蛋白 水 解 酶 的 形式 。 一 直 连 续 不 断 地 合成 着 的 LexA BA, MME 出 现 这 种 形式 时 ， 才 能 积累 起 来 ， 并 重新 建立 阻 过 作用 。 RecA 蛋白 的 脱 阻 遏 的 合成 停 止 ,细菌 又 开始 生长 并 进行 分 裂 ，RecA 蛋白 又 逐渐 地 稀释 到 组 成 型 的 水 平 。 核糖 体 合成 的 调节 在 前 一 节 中 已 介绍 了 一 些 操 纵 子 ,它们 的 调控 作用 已 研究 得 很 清楚 ,这 里 我 们 将 要 讨 论 一 个 很 复杂 的 调控 体系 ,这 个 调控 体系 已 研究 了 30 年 ,虽然 已 掌握 了 许多 信息 ,但 是 它 的 机 理 对 于 我 们 仍然 还 是 一 个 谜 。. 所 有 各 个 种 类 的 细菌 的 生长 速度 都 会 因 培 养 基 不 同 而 不 同 的 。 在 含有 足够 碳 源 〈 如 蔗糖 ) 的 培养 基 上 ,大 肠 杆菌 在 37%C 下 每 45 分 钟 分 裂 一 代 ; ARAM RE MAD Bit , 则 要 经 过 500 分 钟 才 分 裂 一 代 。 在 极为 丰富 的 含有 蔗糖 、 氮 基 酸 、 核 酸 碱 基 、 维 生 素 和 脂肪 酸 的 完全 培养 基 上 ,细菌 不 必 合 成 这 些 物 质 ,因此 能 快速 地 生长 ;典型 的 情况 下 ,在 这 种 丰富 培养 基 上 ， 细 菌 大 约 每 25 分 钟 就 分 裂 一 次 。 细菌 能 有 这 些 不 同 的 生长 速度 是 通过 对 蛋白 质 合 成 的 能 力 加 以 调节 而 达到 的 。 这 种 调节 作用 可 以 通过 改变 以 下 几 个 方面 而 完成 : (1) 因 加 和 氨基酸 肽 链 延 长 的 速度 不 同 ; (2) 起 始 一 条 新 的 肽 链 分 子 的 速度 不 同 。 事 实 上 , 肽 链 的 合成 速度 是 固定 的 ,蛋白 质 合 成 的 总 速度 是 由 每 个 细胞 中 的 核糖 体 数 目 决 定 的 。 在 快速 生长 的 细胞 中 ，, 细菌 的 分 裂 晚 于 DNA 的 合成 ， 因 此 快速 生长 的 细胞 中 的 DNA 多 于 生长 较 慢 的 细胞 中 的 DNA。 例 如 , 表 14-7 所 指出 的 在 三 种 不 同 生长 速 度 的 细胞 中 每 个 细胞 中 的 DNA 分 子 数 不 同 。 还 应 当 注 意 到 表 中 所 示 的 细胞 中 核糖 体 数目 与 DNA 分 子 数目 虽然 并 不 成 比例 , 但 是 也 随 着 生长 的 加 快 而 增多 。 进 一 步 还 发 现 tRNA、 翻 译 起 始 因 子 、 翻 译 延 长 因子 以 及 氨基 本 -tRNA 合成 酶 等 的 数目 也 都 与 表 14-7 。34 。 ee ee 表 14-7 不 同 生长 速度 的 大 肠 杆菌 的 一 些 特点 分 裂 时 间 ( 分 钟 ) 每 个 细胞 中 的 DNA 分 子 数 与 每 个 DNA 分 子 相关 的 核糖 体 数 25 4.5 15 500 50 2.4 6 800 100 1.7 4 200 200 1.4 1 450 中 每 种 DNA 分 子 数 目 相 关 的 核糖 体 的 数目 有 关 。 因 此 , 人 们 认为 蛋白 质 生 物 合 成 过 程 中 的 核糖 体 蛋白 质 、rRNA 以 及 蛋白 质 合成 装置 中 的 其 他 一 些 组 分 的 合成 也 都 是 受 调节 的 。 以 上 这 些 物 质 ， 至 少 其 中 一 部 分 的 合成 过 程 是 通过 被 组 构 到 操纵 子 中 而 受到 调节 的 。 基 因 定 位 图 谱 实 验 指出 ,大 肠 杆菌 中 编码 53 个 核糖 体 蛋 白质 的 基因 都 位 于 染色 体 的 一 个 小 区 段 中 ， 但 是 这 些 基 因 不 是 一 个 一 个 地 转录 ， 而 是 被 转录 成 大 约 20 个 多 顺 RF mRNA, rRNA 的 基因 分 布 在 其 中 的 三 个 几乎 相同 ， 但 不 连 在 一 起 的 区 域 中 ， 这 些 区 域 靠近 核糖 体 蛋白 的 基因 。 在 这 些 rRNA 的 基因 簇 中 ， 如 第 十 一 章 所 述 ， 也 包含 有 某 些 tRNA 基因 ; 剩 下 的 其 他 tRNA 基因 则 位 于 分 散在 整个 染色 体 上 的 几 个 基因 往 中 。 目 前 还 不 清楚 这 些 DNA 片 妇 是 否 为 协同 调控 的 ,但 看 来 是 不 可 能 的 ,因为 人 们 还 可 以 作出 以 下 更 为 合理 的 设想 : 一 个 操纵 子 的 产物 调节 着 另 一 个 操纵 子 , 因 为 在 这 种 调控 方式 中 ,各 个 操纵 子 可 以 产生 出 有 恒定 比例 的 产物 。 实 际 上 ， 编 码 核糖 体 蛋 白质 的 6 个 mRNA 分 子 的 翻译 过 程 都 是 由 几 种 特定 的 核糖 体 蛋白 质 ( 每 一 个 多 顺 反 子 mRNA 提供 一 种 核糖 体 蛋白 质 ) 的 浓度 自动 调节 的 。 因 此 ,受到 控制 的 核糖 体 的 装配 速度 ,是 部 分 地 由 rRNA 的 合成 速度 来 调节 的 ; 而 核糖 体 的 装配 又 反 过 来 间接 地 调节 了 这 些 蛋 白质 的 生物 合成 过 程 。 如 果 将 细菌 培养 物 从 快速 生长 的 培养 基 中 转移 到 一 种 让 细菌 只 能 慢 速 生长 的 培养 基 中 《这 种 降 速 生长 被 称 作 “下 移 *，downshift) 时 ， 每 一 个 细胞 中 的 核糖 体 数目 就 会 减 少 。 由 在 快速 培养 基 中 的 较 高 水 平 下 降 到 在 慢 速 培养 基 中 才 具 有 的 特征 性 的 较 低 水 平 ; 这 是 合理 的 ,否则 的 话 , 每 个 细胞 中 就 会 有 多 于 它 所 需要 量 的 核糖 体 。 只 要 让 细菌 继续 地 进行 :DNA WAR, 而 不 允许 合成 TRNA， 细菌 就 可 以 完成 上 述 降 速生 长 过 程 。 每 个 缓慢 生长 着 的 细胞 必定 是 感受 到 某 些 信号 ， 而 且 这 些 信号 必然 抑制 rRNA 基因 的 转录 。 在 下 移 时 ,由 于 提供 的 碳 源 减少 ,所 以 在 慢 速 培养 基 中 ， 氮 基 酸 的 合成 要 比 在 快速 培养 基 中 慢 。 有 几 个 证 据 暗示 出 这 种 氨基 酸 浓 度 的 减少 就 是 刚才 所 提 到 的 信号 之 一 。 将 需要 某 氨基 酸 的 突变 菌 培养 物 从 含有 这 种 氨基 酸 的 培养 基 上 转移 到 具有 相同 碳 源 但 无 该 氨基 本 的 培养 基 中 ，, 这样 就 可 以 模拟 出 降 速 生长 的 效果 。 事 实 上 ,在 转移 之 后 ,rRNA 的 合成 很 快 就 停止 了 ,这 种 随 着 氨基 酸 的 耗 尽 而 抑制 rRNA 的 合成 的 联系 被 称 作 是 严 紧 反应 (stri- ngent response), 人 们 通过 研究 一 些 突变 株 , 逐 渐 地 明白 了 负责 严 紧 反应 的 一 些 因子 ,这 些 突变 株 在 氮 基 酸 饥饿 时 ,丝毫 不 减弱 合成 rRNA 的 过 程 。 这 些 突变 株 的 表现 型 被 称 为 是 松弛 型 (relaxed), 在 几 个 基因 的 突变 图 谱 中 这 些 突变 的 位 置 被 记 作 rel, 在 rel 基 因 中 完全 弄 清 楚 的 唯一 基因 就 rel A。 在 氨基 酸 饥 狐 时 ,会 产生 两 种 不 同 寻 常 的 多 核 彰 酸 : ppGpp 和 pppGpp (5 二 磷酸 =- sa 35 。 Sw -3'’ 二 磷酸 和 5 三 磷酸 - 鸟 叮 叭 -=3 二 磷酸 )。 由 于 某 些 历 史 原 因 , 人 们 分 别 把 这 两 个 . 化 合 物 称 为 魔 斑 1 和 魔 斑 2 Cmagic spot 1 and 2), relA 的 产物 是 一 种 称 作 严 紧 因子 (stringent factor) 的 蛋白 质 , 它 是 负责 合成 -ppGpp 的 一 段 酶 。 严 紧 因子 独占 性 地 处 在 508S 核糖 体 上 ; 在 正常 蛋白 质 合成 期 间 严 紧 因 子 无 活 性 ,因此 不 能 合成 ppPGpp。 只 有 在 以 下 两 种 条 件 下 严 紧 因子 才 被 活化 : C1) 50S WH 必 须 在 完整 的 0S 核糖 体 之 中 ， 而 且 这 个 核糖 体 必 须 已 与 mRNA 结合 并 正 参与 翻译 作 用 ; (2) 核糖 体 上 的 A 位 点 上 必须 有 一 个 空 载 的 tRNA ， 而 不 是 一 个 负载 着 氨基 栈 的 tRNA。 在 正常 的 生长 条 件 下 , 空 载 的 tRNA 的 浓度 比 氨基 酰 tRNA 的 浓度 低 得 多 ， 这 就 意味 着 A 位 点 只 在 极 少 的 情况 下 才 被 空 载 的 tRNA 占据 。 然而 ， 在 某 种 氨基 酸 缺 乏 时 ,正常 情况 下 运输 该 种 氨基 酸 的 tRNA 就 会 是 空 载 的 。 通 过 这 种 方式 ， 缺 乏 氨基 酸 就 导致 产生 ppGpp。 因 此 认为 ppGPpp 就 是 使 蛋白 合成 停止 的 信号 ; 因此 也 不 再 产生 额外 的 -TRNA。 TFS ppGpp 是 如 何 调节 rRNA 的 合成 ， 人 们 付出 了 很 大 努力 。 MIRE 了 ppGpp 5 RNA 聚合 酶 结合 的 某 些 证 据 , 已 经 知道 rRNA 和 tRNA 基因 的 启动 子 与 其 他 一 些 操纵 子 , 如 lac. gal 等 中 的 启动 子 不 同 , 特 别 是 因为 rRNA 基因 转录 的 起 始 与 众 不 同 , 它 的 转录 强度 是 全 诱导 状态 的 lac 操纵 子 的 四 倍 , 这 就 使 人 们 认识 到 rRNA 的 启 动 子 是 最 为 有 效 的 启动 子 。 有 人 提出 , 当 RNA 聚合 酶 与 ppGpp 结合 时 , 它 就 丢失 了 与 tRNA 启动 子 结合 的 能 力 , 但 是 对 于 这 个 很 吸引 人 的 假说 至 今 还 没有 得 到 证 据 。 沙门 氏 杆菌 鞭毛 的 相 变异 到 目前 为 止 所 描述 的 体系 都 是 响应 外 界 物质 如 糖 或 氨基 酸 浓度 的 变化 的 细菌 操纵 子 。 细 菌 中 的 绝 大 多 数 生物 合成 途径 与 降解 途径 都 在 一 定 程度 上 采用 了 类 似 于 上 述 的 铝 纵 子 的 体系 。 在 这 一 节 中 将 讨论 另 一 种 体系 ; 它 是 一 种 不 随 RNA RAMEBS ADT 结合 而 决定 “开启 -关闭 ”状态 的 体系 。 这 个 体系 的 开启 或 关闭 是 由 启动 了 与 结构 基因 之 fg AO BE A (BE be SIX AR A) MRE o eS BH WE, (14-27), BRK, LR 似 的 由 蛋白 质 构成 的 附件 。 它 能 够 推动 细菌 游 走 于 液体 介 质 之 间或 通过 固态 的 表面 ， 一 般 是 朝向 具有 所 需要 的 营养 的 地 方 ， 或 者 是 避 开 有 毒物 质 的 地 方 。 鞭 毛 主要 由 夫 量 的 称 为 鞭毛 蛋白 flagellin) HER WHR, 沙门 氏 杆 菌 具 有 两 个 称 为 HIl 5 H2 的 基因 ,它们 分 别 负责 侣 成 两 种 不 同 的 鞭毛 蛋白 。 这 两 种 鞭毛 蛋白 都 能 聚 图 44-27 BRL | 集 形成 鞭毛 ;但 它们 的 免疫 性 不 同 。 在 任何 一 种 特定 的 细 电镜 图 ( 承 Mel Simom 氏 提供 )。， 菌 中 两 个 互 基因 中 只 有 一 个 能 转录 。 因 此 这 个 细菌 或 者 形成 HI 型 鞭毛 ,或 者 形成 H2 WME. oR Al 型 鞭毛 的 细菌 可 以 生长 许多 世代 ,产生 一 个 很 大 的 细胞 群体 , 那么 在 这 个 细菌 群体 中 总 会 有 某 些 细菌 具有 H2 BE, HD 型 周 毛 出 现 的 频率 大 约 是 每 个 世代 的 每 个 细胞 上 有 107-107? 个 〈 严 格 的 频率 则 取决 于 个 别 的 细菌 菌株 ) 。 如 果 筛 选 出 带 有 H2 型 鞭毛 的 细菌 ， 并 多 许 它 生 长 ， 那 么 在 一 定 的 。 36 。 了 时间 之 后 , 终 将 显现 出 一 些 带 有 OH 型 鞭毛 的 细菌 ,这 个 频率 也 是 10-°— 107? (每 个 世代 的 每 个 细胞 ) 。 这 个 现象 被 称 作 相 变异 (phase variation). 这 两 种 基因 的 DNA 已 被 分 离 到 ,用 它们 作 探 针 再 通过 分 子 杂 交 实 验 去 检测 mRNA. 这 些 实验 的 结果 表明 ， 在 给 出 的 任何 一 个 细菌 中 只 有 一 种 基因 被 转录 。 在 沙门 氏 杆 菌 染 色 体 上 HI1 与 H2 基因 互相 离 得 很 远 , 这 就 意味 着 在 相 的 转变 中 这 种 细菌 必然 使 用 某 些 可 以 扩散 的 基因 产物 。 我 们 会 看 到 事实 也 的 确 如 此 。 已 分 离 出 HI 和 H2 基因 ,并 且 测 出 了 其 中 的 一 部 分 序列 。HI1 基因 没有 什么 不 平 常 之 处 ,但 是 在 多 次 分 析 H2 基因 时 ,发 现 这 个 基因 存在 着 两 种 不 同 的 形式 : H2 基因 的 一 端 是 一 个 970 碱 基 对 的 片段 ;比较 特殊 的 是 ,这 个 片段 在 一 些 H2 基因 中 是 一 种 方向 ， 而 在 另 一 些 中 却 是 相反 的 方向 。 从 HIl 型 办 毛细 菌 群 体 中 只 能 分 离 得 到 共有 一 种 方向 的 未 端 , 另 一 种 反 向 的 末端 则 全 部 是 从 有 H2 型 鞭毛 的 细菌 中 得 到 的 。 因 此 ,看 来 970 碱 基 对 末端 的 倒转 与 HI 和 H2 基因 的 活性 有 关系 。 了 解 这 种 调控 的 关键 就 是 当 这 个 片 有 段 处 于 一 种 方向 时 ，H2 RRR; 当 这 个 片段 的 方向 相反 时 ， 了 2 就 没有 活性 ， 不 被 转 录 。 图 14-28 给 出 了 对 两 种 活性 状态 的 解释 : 可 倒转 的 970 碱 基 对 的 片 妥 中 含有 H2 的 启动 子 。 因 此 在 这 个 启动 子 处 ,起 始 一 个 方向 的 mRNA 合成 ,导致 H2 基因 的 转录 ; 然 而 在 另 一 个 方向 ( 即 “ 关 ”的 方向 ), 则 不 对 H2 基因 进行 转录 。 因 此 , H2 的 这 种 倒转 说 明了 H2 基因 的 活化 与 去 活化 调节 ， 但 是 未 说 明 H 的 调控 。 前 面 我 们 曾 提 到 过 有 一 个 可 以 扩散 的 基因 产物 在 这 个 体系 中 起 调节 作用 。 当 H2 被 转录 时 ,形成 一 个 多 顺 反 子 mRNA, 这 个 mRNA 分 子 不 仅 编码 H2 鞭毛 蛋白 ,而 且 还 编码 一 个 抑制 H1 转录 的 蛋白 质 。 因 此 ,在 H2 顺 向 时 ( 即 定向 为 有 活性 ) 能 够 形成 H2 型 鞭毛 蛋白 ,而 不 能 形成 JHL 型 鞭毛 蛋白 ,在 H2 反 向 时 ( 即 定向 为 无 活性 ) 被 合成 出 来 的 是 Hl 型 的 鞭毛 蛋白 ， 而 不 是 H2 型 的 鞭毛 蛋白 。 (a) Hitt, Hek® 日 2 启动 子 Hi BaF (b) H1X,H2F isa sd e H2 HEE 7 ¢ rs a 日 1 站 毛重 各 无 HImRNA 14-28 沙门 氏 杆 菌 的 两 种 次 毛 蛋 白 基 因 的 调节 。 粗 虚线 表示 含有 互 2 启动 子 的 可 倒转 的 片 Broek i AAA mRNA 分 子 。 这 个 体系 是 位 点 专 一 性 倒转 (site-specific inversion) 方式 进行 调节 的 一 个 例子 。 Bi 970 碱 基 对 序列 从 染色 体 上 以 某 种 方式 前 切 下 来 ,然后 以 相反 的 方向 再 插 回 去 。 进 一 步 再 对 H2 多 顺 反 子 mRNA 所 编码 的 产物 进行 分 析 , 结 果 表 明 在 可 倒转 的 片 有 中 除了 有 H2 ea37 %。 启动 子 和 编码 Hl 转录 抑制 物 的 序列 之 外 ,还 含有 一 个 基因 ， 它 的 产物 对 于 倒转 作用 来 说 是 必需 的 。 我 们 还 未 解释 什么 物质 决定 着 倒转 的 发 生 。 在 本 章 前 面 一 些 体系 的 分 析 中 已 经 指 : 出 , 某 些 基因 的 表达 是 对 一 些 外 部 影响 作出 的 反应 ,虽然 目前 还 未 发 现 影响 上 述 相 变异 转 : 换 频率 的 外 部 因素 ， 但 是 基因 表达 引起 的 相 变异 可 能 就 是 属于 这 种 情况 。 它 有 可 能 是 一 个 随机 的 事件 ,这 在 下 述 的 情况 中 将 具有 明显 的 优越 性 。 假 设 一 个 动物 被 一 些 形 成 HIl 鞭毛 的 细菌 感染 ,在 细菌 生长 的 同时 ,动物 的 免疫 系统 将 产生 针对 于 HI REA, A 而 这 种 细菌 最 终 会 被 动物 产生 的 抗体 消灭 。 然 而 ， HR ES H2 型 鞭毛 , 这 样 的 细菌 就 能 逃避 抗体 的 杀伤 。 相 变 异 的 优越 性 与 我 们 已 经 讨论 过 的 各 种 操纵 子 的 优越 性 有 很 重要 的 不 同 之 处 。 那 些 操纵 子 具 有 打开 一 个 所 需要 的 体系 或 关闭 一 个 浪费 的 体系 的 能 力 ， 这 对 于 一 个 细菌 个 体 来 说 是 很 有 用 处 的 。 然 而 相 变 异 对 于 一 个 细菌 个 体 的 生存 却 并 没有 什么 好 处 ， 但 是 它 能 保证 细菌 群体 逃 过 抗体 的 攻击 。 细 菌 的 很 多 体系 都 很 可 能 沿用 了 这 个 原理 。 在 二 十 三 章 我 们 还 将 看 到 把 位 点 专 一 性 交换 作用 用 来 程序 化 地 调控 真 核 细胞 的 基因 表达 ,例如 ,用 在 产生 抗体 的 过 程 中 和 改变 酵母 的 交配 类 型 的 过 程 中 。 负 反 馈 抑 制 在 这 一 节 将 介绍 不 致 变 转 录 的 调节 作用 。 某 细菌 具有 脱 阻 遇 作 用 的 trp BAT. oo 果 把 这 种 细菌 的 培养 物 突 然 地 加 到 含有 色 氮 酸 的 培养 基 中 ,那么 很 快 将 建立 起 阻 遇 作用 。， 一 步 只 能 合成 出 很 少量 的 trp 酶 系 。 但 是 ，trp 酶 系 仍 然 保 留 其 活性 ， 并 且 ， 如 果 没 有 第 二 种 调节 机 理 ， 就 会 发 生 色 氮 酸 的 浪费 性 合成 以 及 色 氨 酸 前 体 和 能 量 的 非 必要 性 消 耗 。 通过 反馈 作用 (feedback) 和 末端 产物 抑制 作用 (end product inhibition) 可 以 各 免 发 生 上 述 的 情况 。 其 机 理 是 该 途径 的 末端 产物 关闭 了 一 些 酶 的 活性 。 在 细菌 中 ， 生 等 合成 中 的 反馈 抑制 是 很 常见 的 。 在 合成 色 氮 酸 的 途径 中 ， 前 两 个 反应 由 trpD 和 trpE 基因 的 产物 催化 《图 14 一 29)。 e 二 2 trpC trpB ErpA oes selfs re Fr PRA Ay: CdRP ——»> Bo A MAK PRPP 14-29 trp 基因 产物 作用 位 点 。 基因 D、 基 因 了 E、 基 因 B 和 基因 和信 的 产物 形成 有 活性 的 吓 Retk (E,D,) 和 二 聚 体 (BA)。 反 馈 抑制 的 位 置 是 了:D:。 这 个 反应 序列 的 过 程 中 的 各 个 成 分 缩 GA: PRPP: 磷酸 核糖 焦 磷酸 ; PRA: 磷酸 核糖 酰 氨 基 茜 甲酸; CdRP: 羧基 茶 氨 基 - 脱 氧 核 : 酮 糖 磷酸 ; InGP: 虽 品 甘油 磷酸 ; Trp: Baw. | e 38» 两 种 蛋白 质 的 两 个 亚 基 聚 集 在 一 起 组 成 一 个 四 聚 体 蛋 白质 。 trpE 亚 基 催化 分 梳 酸 (chorismate) 和 谷 氨 酰 胺 形成 氨基 葵 甲 酸 (anthranilate)。trpD 亚 基 再 对 此 产物 磷酸 化 ， 形成 磷酸 核糖 酰 氨 基 葵 甲酸 (PRA，phosphoribosyl anthranilate), trpE 亚 基 中 还 含有 一 个 结合 色 氨 酸 的 位 点 。 但 是 只 有 当 色 氨 酸 过 量 时 才能 结合 到 它 上 面 。 色 氢 酸 占据 这 个 位 点 会 引起 trpE 亚 基 的 构象 发 生变 化 。 这 种 变化 使 酶 失去 活性 (图 14-30) KPOREA 是 一 个 别 构 蛋 白质 ( 见 第 六 章 )。trpE 亚 基 的 构象 变化 还 进一步 诱导 trpD 亚 基 构 象 发 生 类 似 的 变化 ,其 活性 也 因此 被 抑制 。 无 活性 的 14-30 色 氮 酸 使 得 对 形成 分 枝 酸 和 分 解 分 枝 酸 起 催化 作用 的 E:D: 复合 体 失 去 活性 。 最 普遍 的 反馈 抑制 类 型 是 生物 合成 途径 的 最 终 产物 抑制 该 生物 合成 的 第 一 步 酶 促 反 Mo 例如 ,在 以 下 途径 中 : CS pees 5 FARS 1, 2, 3 来 催化 ,产物 D 作 用 于 酶 1。 这 显然 是 最 经 济 的 一 种 抑制 方式 。 这 就 意味 着 酶 1 必须 有 两 个 结合 位 点 。 一 个 是 底 物 结合 位 点 , 另 一 个 是 产物 D 的 结合 位 点 。 常 常 是 产 物 的 结合 抑制 了 底 物 的 结合 。 这 是 由 于 两 个 位 点 有 重 县 或 是 构象 发 生变 化 ， 这 种 变化 减 弱 或 取消 了 底 物 的 结合 位 点 。 在 第 六 章 中 介绍 过 第 二 种 机 理 的 例子 ， 即 CTP 抑制 了 天 冬 氨 酸 转 氨 甲 酰 酶 。 某 些 生物 合成 途径 是 分 校 状 的 。 即 从 一 个 共同 前 体能 合成 出 两 种 产物 ， 下 面 是 这 种 合成 途径 的 一 个 假设 例子 : 5 a a iit 和 2 /Cr—sD 在 这 种 合成 途径 中 ,不 希望 有 一 个 产物 去 抑制 酶 1; 因为 那样 会 使 两 个 途径 都 受到 抑制。 一 般 来 说 ,最 经 济 的 抑制 是 D 抑 制 酶 2、F 抑制 酶 4。 通过 这 种 方式 ,D 或 了 都 不 抑制 对 方 欧 合 成 。 如 果 D 和 了 都 存在 时 ,A 向 B 的 转换 就 是 一 个 浪费 的 过 程 。 因 此 在 许多 途径 中 RADA 都 过 量 时 ， 它 们 共同 去 抑制 酶 1。 这 两 种 不 同 的 分 子 可 以 通过 四 种 主要 的 方 式 去 抑制 一 个 酶 促 反 应 步骤 : C1.) 产物 B 由 于 酶 2 和 4 被 阻塞 而 积累 ， 酶 1 就 被 大 量 的 产物 B 所 抑制 ; 2) 酶 1 有 被 D 和 F 结 合 的 两 个 位 点 , 当 这 两 个 位 点 都 被 占据 时 , 酶 就 失 e 39 ° 活 了 ; (3) DAF 对 酶 1 都 能 分 别 轻微 进行 抑制 , 例如 分 别 抑制 d HS te, FE 酶 共同 抑制 酶 1 时 ， 抑 制 强度 就 成 了 d x fe; (4) 在 某 些 途径 中 ， 有 两 种 不 同 的 酶 (ULB, isoenzymes) HEL A 转化 为 B， 一 个 同 工 酶 受 D 抑 制 ， 另 一 个 同 工 酶 则 受 抑制 。 图 14-31 表示 一 个 分 枝 状 途径 的 精巧 的 反馈 抑制 过 程 。 这 是 一 个 研究 得 比较 透彻 的 多 分 枝 的 合成 途径 ， 包 括 从 天 冬 氨 酸 合成 赖 氨 酸 、 蛋 氨 酸 、 苏 氨 酸 。 注 意 每 一 种 氨基 酸 如 何 立刻 抑制 紧 接 在 分 枝 后 面 的 那个 酶 , 即 酶 4.6、8 。 三 个 同 工 酶 1a, 1b, 1c FARM 酸 、 高 丝氨酸 和 苏 氨 酸 抑制 。 这 三 个 同 工 酶 具有 不 同 的 酶 活性 ;每 一 个 酶 都 能 各 自 合 成 一 定数 量 的 天 冬 氨 酰 磷酸 , 当 这 些 天 冬 氨 酰 磷酸 的 合成 量 超过 适宜 的 水 平时 ,它们 会 反 过 来 分 别 地 抑制 相应 的 同 工 酶 。 因 此 ;, 当 一 种 同 工 酶 受到 抑制 后 ,细菌 仍然 能 够 合成 出 正确 数 量 的 天 冬 氨 酰 磷酸 。 天 冬 氨 酸 peed Se a oe we we ee ee ee ee 图 14-31 合成 赖 氨 酸 、 蛋 氨 酸 、 苏 氨 酸 途径 的 反馈 抑制 作用 。 框 中 的 分 子 是 抑制 物 ， 虚 线 箭 头 从 抑制 子 指向 被 抑制 的 酶 。 基因 产物 对 翻译 的 影响 本 章 多 处 提 到 了 翻译 的 调节 ,通常 这 种 调节 限 指 以 下 事实 , 即 多 顺 反 子 的 mRNA 翻 译 出 的 蛋白 质 产 物 拷 贝 数 随 不 同 基因 而 有 所 不 同 。 通 常 ,从 mRNA5' 末端 到 3 末端 , 翻 译 能 力 逐 级 下 降 。 有 几 个 过 程 能 说 明 这 个 现象 ; 不 同 基因 翻译 起 始 效率 有 所 不 同 ， 各 链 的 终止 密码 子 与 其 后 面 的 AUG 密码 子 之 闻 的 距离 不 同 ， mRNA 不 同 区 域 对 于 被 降解 的 敏感 性 不 同 。 在 少数 几 种 细菌 噬菌体 中 发 现 了 一 个 新 的 机 理 , 即 某 个 特定 基因 的 翻译 过 程 受到 该 特定 基因 的 基因 产物 的 抑制 。 大 肠 杆 菌 噬菌体 R17 仅仅 含有 三 个 基因 产物 , 即 两 个 结构 蛋白 〈A SAMAR 外 壳 蛋 白 ) 和 一 个 酶 (复制 酶 )。 唉 菌 体 对 外 壳 蛋 白 的 需要 量 远 远 大 于 对 复制 酶 的 需要 量 ， 复制 酶 只 需 有 催化 量 即 可 。 mRNA 分 子 在 外 壳 蛋 白 的 终止 密码 和 复制 酶 的 AUG 密码 ie 40 « 子 之 间 有 一 个 与 核糖 体 结合 位 点 。 由 于 不 断 地 合成 外 壳 蛋 白 ， 这 个 结合 位 点 逐渐 地 被 蛋 白质 分 子 充满 ， 核 糖 体 不 易 再 进来 ,这 就 阻 抑 了 核糖 体 对 复制 酶 区 域 的 翻译 作用 (图 14- 32). CP 基因 (A SE Eee ee 终止 密码 ”起 始 密码 e wif Ce mee CO. 2 = O , BRKRE, 因为 它 无 法 通过 SN 已 被 占据 的 CP 结合 位 点 14-32 ”由 于 外 壳 蛋 白 分 子 的 封 阻 " 鸣 菌 体 R17 的 rep 基因 翻译 的 抑制 作用 。 oe oN Clark, B. F. C., H. Klenow, and J. Zeuthen, (eds.). 1978. Gene Expression, Pergamon. Gilbert, W., and B. Muller-Hill. 1966. “Isolation of the Jac repressor.” Proc. Nat. Acad. Sci. 56, 1891—-1898. Jacob, F. and J. Monod 1961. “Genetic regnletory mechanisms in the synthesis of proteins.” J, Mol. Biol. 3, 318—356. Johnson, H. M., W. M. Barnes, F. G. Chumley, L. Bossi, and J, R. Roth. 1980. “Model for regulation of the his- tidine operon of Salmonella,” Proc. Nat. Acad. Sci. 77, 508—512. Lee, N., W. O. Gielow. and R. G. Wallace, 1981. “Mechanism of araC autoregulation and the domain of two overlapping promoters. pC and pBAD in the L-arabinose regulatory region. of E. coli.’? Proc. Nat, Acad. Sei. 78, 752—756. Lindahl, L., and J. M. Zengel. 1982. “Expression of ribosomal genes in bacteria.” Adv, Genet, 21, 53—122. 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Yanofsky, C. 1981. “Attenuation in the control of expression of bacterial operons.” Nature, 289, 751—-758. 41 第 十 五 章 Wa OD 烈性 噬菌体 轻 苗 体 对 分 子 生物 学 的 发 展 起 了 重要 的 作用 。 很 多 噬菌体 是 目前 了 解 最 清楚 、 研 究 最 深入 的 有 机 体 。 由 于 噬菌体 的 结构 比 细菌 和 高 等 细胞 简单 得 多 ， 而 且 我 们 可 以 获得 大 量 的 突变 体 ,噬菌体 广泛 应 用 于 复制 、 转 录 和 调节 机 理 的 研究 中 。 史 菌 体 的 一 般 性 质 噬菌体 寄生 于 细菌 中 。 它 本 身 虽 然 可 以 生存 ， 但 只 有 寄生 时 才能 够 生长 和 繁殖 。 尽 管 多 数 鸭 菌 体 都 具有 编码 各 种 不 同 蛋 白质 的 基因 ， 人 然而 目前 已 知 的 噬菌体 都 是 利用 寄主 细胞 的 核糖 体 、 蛋 白质 合成 因子 、 氮 基 酸 以 及 产能 装置 。 这 说 明 鸣 菌 体 只 能 在 有 代谢 活 性 的 细菌 中 生长 。 因 此 ， RAPES SE 1 SE Ge MS Pe 以 保证 细菌 具有 代谢 活性 。 吻 菌 体 为 维持 生存 应 具有 一 定 的 最 基本 的 功能 : 1. 保护 其 本 身 的 核酸 免 受 环境 中 化 学 物质 的 破坏 (核酸 分 子 的 断裂 和 突变 )e 2. 使 其 本 身 的 核酸 可 以 侵入 细菌 内 部 。 3. 使 被 感染 的 细菌 产生 大 量 的 子 代 史 菌 体 。 4. 能 使 被 感染 的 细菌 裂解 ,释放 出 吻 菌 体 。 本 章 将 详细 讨论 几 种 不 同 种 类 的 史 寻 体 ， 从 中 可 以 得 到 以 上 问题 的 答案 。 这 些 吻 菌 体 具 有 某 些 共性 ， 但 其 细微 的 差异 性 却 表 明 特 异 的 生物 学 功能 是 通过 不 同 的 途径 来 完成 的 。 本 章 应 特别 引起 读者 注意 的 是 各 种 噬菌体 对 寄主 细胞 装置 的 利用 程度 。 基 因数 少 于 10 UME AIL See RT aE; BARE 30 至 50 之 间 的 鸣 菌 体 的 依赖 性 就 要 小 些 ; 而 一 些 较 大 的 噬菌体 甚至 不 需要 寄主 的 基因 ,它们 本 身 含 有 很 多 基因 ,可 独立 完成 DNA 复制 等 功能 。 令 人 吃惊 的 一 点 是 ， 茶 些 噬菌体 的 基因 儿科 就 是 寄主 基因 的 翻版 ,这 是 功能 上 的 重复 吗 ? 我 们 将 在 后 面 的 ` 非 必需 基因 -的 题目 下 讨论 。 唉 菌 体 因 种 类 不 同 而 具有 不 同 的 物理 结构 ， 因 而 也 就 有 不 同 的 生活 史 。 后 面 我 们 也 将 涉及 到 其 结构 上 的 区 别 。 读者 最 好 能 先 复 习 一 下 第 一 章 中 的 喉 菌 体 生物 学 及 叭 菌 体 的 检 出 和 计数 技术 。 di mi a Hb a A 噬菌体 有 三 种 基本 结构 : 20 面体 无 尾部 噬菌体 、20 TARA RBM eR 体 。 噬 菌 体 一 般 只 含有 一 种 核酸 分 子 ( 单 链 的 或 双 链 的 线性 DNA, FRR DNA, 或 单 链 线性 RNA); 一 种 或 几 种 蛋白 质 分 子 〈 已 知 的 唯一 例外 是 6 MRA, DARE MERA: 每 个 _b6 噬菌体 含有 碱 基 序列 不 同 的 三 个 线性 双 链 DNA 分 子 )。 和 蛋白 质 构 « 42 « 20 面 体 无 尾 20 面 体 有 尾 丝 状 噬菌体 噬菌体 we Hk 图 15-1 三 种 鸣 菌 体 结构 的 二 维 图 谱 。 有 尾 叹 菌 体 并 不 总 是 含有 有 颈 部 ， 并 可 以 根据 不 同 种 类 有 着 不 同 数量 的 尾 丝 ;: 0 一 6 根 尾 丝 。 (a) (b) (c) (gd) 图 15-2 - 叹 菌 体 的 三 种 主要 形态 。 (a) 20 面体 无 尾 的 : PM-2; (b) 20 面体 有 尾 的 : SPOI; (c) 丝 状 体 的 : M13( 承 Edward Kellenberger i(k); (d) 从 其 破裂 的 头 部 释放 出 DNA 的 : T4 叭 菌 体 ( 承 Robley Williams 提供 )。 成 的 外 壳 一 一 核 衣 壳 包 住 了 核酸 ,使 之 不 被 核酸 酶 水 解 ， 不 受 有 害 物质 侵蚀 。 图 15-1 和 图 15-2 是 这 三 种 基本 结构 的 模式 图 。 要 点 如 下 : 1. 在 无 尾部 和 有 尾部 的 20 面体 噬菌体 中 ， 核 酸 紧密 缠绕 而 存在 于 外 壳 的 中 空 部 位 。 在 丝 状 输 菌 体 中 ,伸展 的 螺旋 状 的 核酸 被 包 埋 在 外 壳 里 。 。43 。 2. ARR ,A—R RAY DNA 从 外 壳 伸 向 尾部 。 3. 尾部 是 终止 于 尾 丝 的 复合 结构 。 4. DNA 分 子 比 其 头 部 任何 角度 的 长 度 大 得 多 。 有 尾 鸣 菌 体 的 结构 有 很 多 变化 如 头 部 的 长 度 可 大 于 或 等 于 其 宽度 ,小 于 其 宽度 的 还 未 见 到 。 最 短 的 尾部 仅仅 在 电镜 下 可 见 ， 而 最 长 的 可 达 其 头 部 长 度 的 4 倍 。 尾 部 的 基板 可 能 是 非常 复杂 的 ,但 也 可 能 根本 就 不 存在 ; 它 存 在 时 ,通常 有 1 一 6 RZ. AS, SE 头 尾 连接 点 的 须 部 也 并 非 一 定 存在 。 典型 噬菌体 的 裂解 途径 只 菌 体 的 生活 史 分 为 两 类 一 一 裂解 和 溶 源 。 有 裂解 反 应 中 ， 鸣 菌 体 可 使 被 感染 的 细胞 释放 出 很 多 子 代 唉 菌 体 。 仅 能 裂解 生长 的 噬菌体 叫做 烈性 噬菌体 〈virulent)。 溶 源 反 应 只 在 双 链 DNA 的 唉 菌 体 中 观察 到 ,这 类 噬菌体 称 为 温和 噬菌体 (temperate). RABE Ja, WRAY DNA 整合 为 细菌 染色 体 的 一 部 分 ， 并 不 产生 子 代 鸣 菌 体 。 本 章 只 介绍 裂 解 途径 ,在 研究 几 种 特殊 种 类 的 烈性 噬菌体 后 ,下 一 章 再 来 讨论 深 源 反应 。 - 不 同 的 烈性 噬菌体 的 生活 史 各 不 相同 。 我 们 先 介绍 一 种 基本 的 裂解 途径 (图 15-37: = —— fi) HOE AE ARs Rie Ma fk DNA ; RAE DNA we Ba PA) DNA 成 分 包装 到 ma Bk 3 ape i SD 9538 yA 噬菌体 的 工厂 w“Iy-"# att ak ak FI 15-3 一 个 典型 的 叹 菌 体 生活 周期 图 解 。 1. 噬菌体 对 细 著 表面 专 一 性 受 体 的 吸附 (图 15-4)。 这 些 受 体形 态 差异 很 大 , 它们 是 为 细菌 本 身 服务 而 不 是 为 噬菌体 吸附 服务 的 〈 因 为 噬菌体 吸附 对 细菌 来 说 无 疑 是 一 个 致 FAX), 例如 某 些 是 用 于 转运 莽 糖 的 蛋白 质 (大 肠 杆 菌 1 噬菌体 ), 某 些 用 于 运输 Fe 的 蛋白 质 (大 肠 杆 菌 T1 MK). 2. 噬菌体 DNA 通过 细菌 细胞 壁 进入 细菌 细胞 的 通道 。 图 15-5 介绍 了 有 尾 噬菌体 DNA 注射 进入 细胞 的 过 程 。 这 里 ,核酸 不 暴露 在 受 体 细胞 周围 的 介质 中 而 是 直接 转运 到 细胞 中 。 其 他 几 种 类 型 叹 菌 体 的 转运 机 理 还 不 很 清楚 。 无 尾 叹 菌 体 的 核酸 对 核酸 酶 瞬时 性 地 敏感 ,因此 认为 可 能 是 只 菌 体外 壳 先 破裂 ,释放 其 核酸 于 细胞 壁 上 ,然后 再 进入 细胞 。 es 44 。 15-4 FERRARA BNERRREABHARNRT DAMM. RAR AE Ap 而 不 是 14 {FE ER AS I 5X PH Bh se Ba PRS Pb AF FS HI Bo Cb) 815-5 (2) 有 尾 叹 菌 体 的 注射 顺序 过 程 。 PRN eae SRA ie Bee 中 ， 像 进行 皮下 注射 那样 将 DNA 注 人 。(b) T4 噬菌体 吸附 于 大 肠 杆 菌 细胞 壁 时 的 电镜 照片 。 RAGS, 颈 中 避 部 蛋白 质 坚 牢 地 固定 到 细菌 的 细胞 壁 中 。 箭头 所 指 的 是 偶 部 经 过 细胞 壁 而 庙 出 的 部 分 。 从 右边 的 两 个 图 菌 体 可 以 看 到 DNA 进入 到 细胞 中 。 o 45 @ 3. 被 感染 的 细菌 转变 为 产生 噬菌体 的 细胞 。 被 噬菌体 DNA 感染 后 , 很 多 细菌 丧失 了 复制 或 转录 本 身 DNA 的 能 力 ,或 同时 丧失 这 两 种 功能 。 寄 主 DNA 或 RNA 合成 的 关闭 过 程 因 噬菌体 的 种 类 而 异 。 4. 鸣 菌 体 核酸 和 和 蛋白质 的 产生 。 鸣 菌 体 通过 合成 噬菌体 专 一 性 聚合 酶 或 在 细菌 的 酶 中 加 入 某 些 特殊 因子 ,使 细菌 细胞 复制 系统 专 一 性 地 复制 噬菌体 核酸 。 上 述 两 种 情形 都 使 用 了 许多 细菌 的 复制 蛋白 ， 因 而 RNA 鸣 菌 体 局 限 性 很 大 一 一 细菌 不 含 复制 RNA AY 酶 , 它 必 须 编 码 本 身 的 复制 酶 转录 一 般 都 由 细菌 的 RNA RAM, 后 面 的 过 程 则 由 以 下 两 种 酶 之 一 来 催化 : 被 修饰 后 能 识别 吻 菌 体 启动 子 的 细菌 聚合 酶 或 噬菌体 的 专 一 的 RNA 聚合 酶 。 转录 是 被 调控 的 ;, 鸣 菌 体 的 蛋白 质 在 需要 时 及 时 有 序 地 合成 。 RNA 只 菌 体 所 含 的 单 链 RNA 作为 其 本 身 的 mRNA, KERR, KERB 控制 其 翻译 效率 而 受到 调控 。 本 章 后 半 部 分 将 介绍 几 种 调节 过 程 。 一 般 来 说 合成 的 核酸 和 蛋白 质 的 数量 可 以 组 装 50 一 100 MERA, RC ES 体 的 种 类 而 定 。 5. 鸣 菌 体 颗粒 的 装配 。 这 个 过 程 又 称 为 形态 发 生 过 程 。 装配 过 程 需要 两 类 蛋白 质 : 结构 蛋白 和 催化 蛋白 。 前 者 以 被 修饰 的 形式 存在 于 史 菌 体 中 ; 后 者 参与 装配 过 程 但 并 不 出 现在 只 菌 体 颗粒 中 。 催 化 蛋白 还 包括 一 类 成 熟 蛋白 , WIAA DNA 转化 为 适 于 被 包装 进入 1 鸣 菌 体 颗 粒 的 形式 。 20 面体 噬菌体 的 包装 过 程 如 下 : (1) 积累 鸣 菌 体 结构 蛋白 ,形成 吻 菌 体 的 头 部 ;有 尾 叹 菌 体 还 形成 尾部 ; (2) 核酸 浓 缩 入 组 装 好 的 头 部 ; (3) 尾部 附着 到 充满 核酸 的 头 部 上 。 丝 状 叹 菌 体 的 核酸 和 和 蛋白质 的 形成 只 需 一 步 , 浓 缩 的 机 理 尚 不 清楚 。 6. 新 合成 噬菌体 的 释放 。 多 数 叹 菌 体 在 感染 的 后 期 合成 一 种 蛋白 质 :溶菌 酶 或 内 溶菌 素 〈endolysin)， 可 使 细菌 细胞 壁 破 裂 ;或 合成 另 一 种 蛋白 质 : 膜 解 酶 (membranases) , 溶 解 细胞 膜 。 在 这 两 种 酶 的 作用 下 ,细胞 被 完全 毁坏 , 鸣 菌 体 释放 到 周围 介质 中 ， 此 过 程 叫 做 裂解 〈lysis)。 几 种 丝 状 叭 菌 体 通过 细胞 壁 的 突起 连续 地 释放 子 代 史 菌 体 一 -出芽 过 程 。 被 这 类 鸣 菌 体感 染 的 细胞 并 不 被 降解 ， 而 能 在 一 段 较 长 的 时 间 内 连续 产生 病毒 颗 KLo ‘ 25 Oa Bl as ER SR BY) 2 SFE HD Ie Bi i FR THA ST A RR Ao RRR, PEAKE 体 颗粒 去 感染 菌 液 。 下 面 介绍 几 个 参数 ， 在 本 节 和 下 面 三 节 中 我 们 将 使 用 它们 来 描述 此 . ' 种 过 程 。 只 菌 体 对 菌落 的 吸附 是 一 个 随机 的 ,无 序 的 过 程 , 泊 松 定律 可 用 于 表达 这 种 随机 吸附 : 时 细菌 中 叹 菌 体 分 布 的 情况 : p(n) 一 mre /11 在 这 里 ， 当 被 吸附 的 叭 菌 体 数 为 ”>， 每 个 细菌 平均 所 吸附 的 噬菌体 数 ( 即 感染 倍数 multiplicity of infection， 或 简称 为 MOI) Hm, p(n) 为 被 感染 的 细菌 的 比例 数 。 « 46 。 BUF 0,1,2,3,…… STB RRR , ATR ALAA BS AYLL IBC pCO), pC1),+--pli)o | 负 此 ,如 果 有 3 x 10° 个 噬菌体 吸附 在 10 个 细菌 上 时 (Cm = 3), Ill p(0), pC1), p(2), p(3)- ++] 0.05,0.15, 0.22, 0.22,-+ FHF p(0) 一 0.05， 所 以 pC) + p(2) + --*+ eG) 就 等 于 1 一 0.05* = 0.95。 也 就 是 说 ,有 95% 的 细菌 被 至 少 1 SRA 另外 ，2(0) 的 值 亦 可 说 明 已 吸附 的 叹 菌 体 的 比例 。 例 如 ， 在 以 上 的 感染 过 程 中 , 假 若 所 有 加 和 人 的 噬菌体 都 吸附 在 细菌 上 ,对 于 om = 3 Ri, pCO) 就 应 等 于 0.05; 然而 在 滞 一 实验 中 使 用 了 3 x 10 个 喉 菌 体 ， 10 个 细菌 ， 却 观察 到 有 12 多 的 细菌 未 被 感染 ， 2(0) 等 于 0.12， 运 用 泊 松 定律 p00) =e" HE, Be m = 2.12—MOl 的 真实 值 2.12/3 一 0.71。 因 此 加 入 的 吧 菌 体 实际 上 只 有 71% 吸附 到 了 细菌 上 面 。 pCO) 可 以 用 简单 的 方法 测量 〈 图 15-6)e。 将 经 过 吸附 期 的 细菌 涂 布 于 琼脂 表面 ， 我 们 再 测量 可 以 形成 菌落 的 细菌 的 比例 被 感染 的 细胞 可 用 如 下 方法 测定 。 首 先 ,将 能 使 未 被 吸附 的 鸣 菌 体 失 活 的 抗体 “加 人 到 感染 了 的 培养 物 中 ,再 把 喉 菌 体 悬 序 液 倒 在 对 噬菌体 敏感 的 细菌 所 形成 的 菌 营 上 , 此 细 狐 由 于 是 在 裂解 前 涂 布 于 平板 上 的 ,每 个 被 感染 的 细胞 将 只 产生 一 个 叹 菌 开 。 将 噬菌体 与 细菌 混合 骸 感 染 的 细 菌 十 噬菌体 二 a sm y+ A a f ey me Hs 下 中 入 抗体 使 未 吸着 的 \ OH PS 人 .未 受 感染 的 细菌 所 形成 的 菌落 MAR RMA doe 的 细菌 ; 涂 布 平板 oA EB cima 生 溶菌 过 程 BARR ， 。 C. 唆 菌 班 。。D. 噬菌体 子 代 FE Fie BA BE AB WK EL = ik BAR / BBE 图 15-6 测定 叹 菌 体感 染 实验 值 过 程 的 图 解 。A. 测定 未 感染 的 细菌 数 。B. 测定 未 吸着 的 叹 菌 KR. C. 测定 感染 中 心 。D. 测定 子 代 叹 菌 体 数 及 爆破 值 (D/C)。 通过 此 种 途径 形成 一 个 噬 菌 斑 的 一 个 细胞 称 为 一 个 感染 中 心 (infective center)。 在 吸附 期 之 后 ,通过 加 氯仿 至 培养 液 中 ,可 测 出 未 被 吸附 的 吧 菌 体 数 目 : 游离 的 噬菌体 不 受 氯仿 处 理 的 影响 ,而 感染 中 心 则 将 被 氯仿 杀 死 。 因 此 ,加 入 氯仿 后 形成 的 噬 菌 斑 数 就 代表 未 吸附 的 噬菌体 数 。 在 进行 得 很 好 的 实验 中 ,常常 要 测量 感染 中 心 的 数目 、 游 离 噬菌体 的 数目 以 及 MOI ” 原 书 误 为 1 一 0.005。 一 一 译 者 注 ** 抗体 来 自 注 射 了 纯 噬 菌 斑 悬 浮 液 的 兔子 的 血液 ° 47 。 的 真实 值 ,因为 许多 实验 结果 都 依赖 于 MOI 值 。 一 个 被 感染 细胞 所 产生 的 叹 菌 体 数 叫做 只 菌 体 爆破 值 (burst size)o 在 许多 实验 中 ， 它 都 是 一 个 重要 的 参数 ,因为 它 是 鸣 菌 体 产生 效率 的 量度 。 将 细菌 培养 物 裂 解 后 产生 的 鸣 菌 体 数 (通过 对 鸣 菌 瘟 进 行 计数 而 得 到 ) 除 以 感染 中 心 的 数 就 可 得 到 此 值 ( 见 图 15-6)。 吧 菌 体 的 增殖 比 细菌 快 得 多 。 细菌 经 过 一 个 世代 才 增加 一 倍 ， 而 叹 菌 体 经 过 一 个 生 活 周 期 后 的 增加 量 却 等 于 它 的 裂解 量 ， 表 15-1 可 明显 地 看 到 这 一 点 。 这 里 ， 一 个 平均 裂解 量 为 100， 生 活 周 期 为 25 分 钟 的 鸣 菌 体感 染 1 毫升 增殖 周期 为 25 分 钟 的 细菌 培养 物 。 计 算 时 ,假定 吸附 是 迅速 而 彻底 的 。 请 注意 ,四 个 世代 以 后 ， 细 菌 数量 增加 了 14 倍 ， 而 噬菌体 数值 则 增加 了 10 FEF, 此 时 叹 菌 体 数 约 为 细菌 数 的 8 倍 , 因 此 ， 所 有 的 细菌 都 会 被 感染 。 所 以 ,在 125 分 钟 后 ， 细 菌 全 都 裂解 了 ， 而 原来 的 噬菌体 则 产生 了 1.4 x 10? 个 子 代 吃 菌 体 。 噬菌体 的 必需 和 非 必需 基因 本 章 其 余 篇 幅 主要 用 于 讨论 各 种 噬菌体 。 对 于 它们 ,什么 是 必需 和 非 必需 基因 呢 ? on 果 鸣 菌 体 的 一 个 基因 突变 后 仍 能 形成 噬 菌 斑 ， 这 个 基因 就 是 非 必需 基因 ; RZ, REA 不 能 形成 吻 菌 斑 的 基因 就 是 必需 基因 。 对 这 个 定义 应 该 小 心地 说 明 ， 因 为 对 于 一 个 被 感 染 细菌 来 说 ， 典 型 的 爆破 值 为 50—100, 爆破 值 为 4 就 足以 形成 噬 菌 斑 。 实际 上 ， 许 多 所 谓 的 非 必需 基因 的 突变 尽管 还 不 足以 妨碍 形成 噬 菌 资 ,但 仍 能 显著 地 减 小 爆破 值 。 表 15-1 若干 细菌 世代 后 噬菌体 和 细菌 数值 的 计算 浓 度 细菌 数 /毫升 近似 值 精 确 值 Q's? 10° 10° 10? 2X 10° 2X(10°—1) 4X 10° (4X 10°)—(2X%107)—4 10° 7.98X 10° (8% 10°)—(2X 104) —(4X 102) 一 8 叹 菌 体 数 /毫升 Ww wR & © 一 o > 4 10° 1.4X 107 (1.6 X107)—(2%10*)—(4 %104)—(8 X 10?)— 16 5 1.4% 10°=1.4% 107 X 100 0 0 * 细 蓝 培养 起 始 时 用 1 个 叹 菌 体感 染 10° 个 细胞 /毫升 浓度 的 细菌 菌 液 。 细菌 的 增殖 周期 与 噬菌体 的 生活 周期 时 间 相 同 。 因为 下 述 四 种 原因 ,基因 可 能 是 非 必需 基因 : 《1) 细菌 中 有 与 之 结构 相同 或 功能 相同 的 基因 。 此 种 加 倍 可 以 提高 必需 酶 浓度 而 使 鸣 菌 体 爆 破 值 提高 ， 因 而 可 能 对 噬菌体 是 有 利 的 ， 另 一 方面 ， 自 然 界 中 有 些 宿 主 可 能 缺 乏 某 个 基因 ,而 它 对 于 噬菌体 生长 来 说 , 却 是 必需 的 ; (2) 这 个 基因 并 不 与 细菌 基因 完全 相同 ， 而 仅仅 通过 某 种 途径 可 提高 噬菌体 产生 的 速度 或 爆破 值 。 上 述 两 点 在 进化 上 部 是 有 利 的 ; (3) 实验 室 条 件 下 并 不 需要 这 个 基因 , 但 在 自然 界 中 需要 应 付 一 些 特殊 情况 时 需要 它 去 倍增 噬菌体 ; (4) 另外 ,还 有 一 种 情况 , 即 经 常 地 不 需要 这 个 基因 。 这 种 可 能 性 很 小 ,因为 噬菌体 不 会 保留 一 个 真正 无 用 的 基因 。 « 48 e RATE B SIT BED REARREET HSH MAN KK Po 噬菌体 感染 的 专 一 性 : 吸附 作用 现 已 分 离 出 几 千 种 噬菌体 。 一 种 噬菌体 只 能 感染 一 个 种 属 ， 而 且 常 常 只 是 一 个 种 属 里 的 几 株 细菌 *o 例 如 ,没有 一 种 既 能 感染 假 单 胞 菌 属 (Prexdomozras) 又 能 感染 大 肠 杆 WOME tk; 甚至 能 在 Ps. fluorescens 中 生长 的 噬菌体 ,不 能 生长 于 Ps. aeruginos 中 。 在 研究 得 最 广泛 的 大 肠 杆菌 的 噬菌体 中 ， 可 以 观察 到 这 种 高 度 特 异性 。 如 XI174 可 在 大 肠 杆 菌 C 株 中 很 好 地 成 活 ,而 在 大 肠 杆菌 的 其 他 实验 菌株 内 却 不 能 成 活 8。 不 过 ,也 有 例 外 ,如 大 肠 杆 菌 的 T4 噬菌体 能 在 大 肠 杆 菌 的 很 多 菌株 和 志 贺 菌 〈Sjigel1a) 属 中 的 一 些 种 中 生长 。 这 种 专 一 性 是 由 好 几 种 因素 决定 的 。 其 一 为 吸附 能 力 。 细 菌 细胞 壁 .E 存 在 有 受 叹 蔓 体 吸附 的 专 一 受 体 ， 所 以 大 肠 杆菌 的 叹 菌 体 不 能 吸附 到 任何 假 单 胞 菌 属 上 。 MR 体 吸 附 在 细菌 上 ,并 杀 死 细菌 ,对 细菌 来 说 无 疑 是 一 件 很 不 好 的 事 , 因 而 在 进化 时 ,细菌 细胞 壁 的 成 分 要 发 生变 化 ,使 大 多 数 吧 菌 体 不 能 识别 它 ; 同 时 , 鸣 菌 体 也 在 演化 ,通过 这 样 地 变化 去 识别 一 些 细菌 。 如 果 某 一 种 吧 菌 体 不 会 这 样 地 去 识别 细菌 ， 它 也 就 不 能 生存 。 实 验 室 中 的 一 个 小 实验 可 以 为 这 种 进化 提供 一 个 例证 。 用 10" 个 T6 WEE ARRAY 10° 个 大 肠 杆菌 B 细胞 ， er ER. 形成 100 个 菌落 。 由 这 些 菌 落 繁 殖 的 细菌 , HAR TR To 感染 的 能 力 ， 鸣 菌 体 不 能 再 吸 附 于 突变 的 细胞 上 (当然 这 些 细 胞 不 是 由 非 感染 过 程 繁殖 产生 ,而 是 感染 后 存在 于 培养 物 中 的 ;并 通过 与 过 量 噬菌体 生长 在 一 起 而 筛选 到 的 )。 这 些 细菌 的 突变 株 叫 做 T6 抗 性 株 《图 15-7)， 用 -B/6 Be Tsx-r 表示 。 若 琼脂 培养 基 上 有 10 个 Tsx=r 细胞 形成 的 菌 苔 ， 再 加 入 10° 个 T6 BK, ZOE 10 个 噬 菌 斑 。 鸣 菌 斑 中 的 这 些 叹 菌 体 是 携带 着 尾部 纤维 基因 突变 体 的 ， 有 吸附 于 Tsx-r 细胞 的 能 力 。 这 类 鸣 菌 体 叫做 h 突变 体 (寄主 范 围 )。 通 常 它们 还 有 可 以 在 Tsx-s 细菌 上 形成 噬 菌 开 的 能 力 , 被 认为 有 较 大 寄主 范围 。 在 几 种 情况 下 ,吸附 是 跨 种 感染 的 唯一 障碍 。T4 喉 菌 体 不 能 吸附 于 产 气 杆菌 (4ero- bactor) 属 便 是 一 个 例 对 ,但 使 用 某 些 特殊 的 技术 可 人 迫使 T4DNA BEA A. aerogenes 的 原生 质 体 ， 产 生子 代 叹 菌 体 。 ae Te . Te 在 细菌 上 的 [。 | 《不 能 吸附 》 再 人 i | Cay DLE BHD 突变 的 噬菌体 (Thh) te nl 可 以 生存 一 一 一 -一 一 B B/6 B/6 图 15-7，” 抗 噬菌体 的 抗 性 细菌 以 及 叹 菌 体 的 h 突变 体 的 产生 。 尽管 突变 时 只 是 尾 丝 受 到 修 饰 * 但 为 了 图 解 的 需要 *, 尾 板 也 被 修饰 。 ”一 个 有 趣 的 例外 是 PRR, WK. CRRA RP4 质粒 的 任何 革 兰 氏 阴 性 菌 。 e 49 e 鸣 菌 体感 染 的 专 一 性 : 寄主 限制 前 面 我 们 谈 到 了 鸣 菌 体 不 具有 对 大 多 数 细菌 专 一 吸附 的 能 力 ， 但 对 某 些 细菌 来 说 和 更 重要 的 一 个 障碍 是 “外 源 ” 的 细菌 RNA 聚合 酶 不 能 识别 噬菌体 启动 子 。 甚 至 当 噬 菌 体 可 以 进行 吸附 和 转录 时 ,多 数 细菌 还 有 宿主 限制 和 宿主 修饰 的 问题 。 也 就 是 说 X 型 细菌 可 以 区 分 在 X 型 细菌 中 生长 的 和 在 其 他 如 Y 型 细菌 中 生长 的 鸣 菌 体 ， 并 能 防止 在 Y 王 生长 的 噬菌体 对 和 进行 有 较 的 感染 。 这 里 所 涉及 的 重要 符号 为 : 在 X 型 细菌 中 生长 的 噬菌体 p 记 为 P .Xe 宿主 限制 和 宿主 修饰 的 资料 见 表 15-2。 注 意 , 在 大 肠 杆菌 人 菌株 上 正常 而 在 B 株 上 形成 效率 极 低 的 噬 菌 斑 的 2 + K 是 被 B 菌株 限制 的 。 在 所 形成 的 极 少量 的 噬 菌 席 《1。B) 中 的 噬菌体 已 经 被 B 株 修饰 ,可 以 在 B 上 有 效 生 长 ,然而 , 1。B 却 不 能 在 开标 上 生 长 了 -一 它 被 也 株 限制 了 。 从 分 子 水 平 来 说 ,就 是 大 肠 杆菌 了 B 含 一 种 限制 性 内 切 酶 或 一 种 限制 酶 一 一 在 这 里 就 是 EcoB 核酸 酶 , 它 是 一 种 位 点 专 一 的 核酸 酶 ,只 能 切割 DNA 链 的 特异 碱 基 序 列 。1。K 就 含有 这 个 序列 ; 当 - 2。K 的 DNA 射 人 大 肠 杆菌 B 时 , 它 就 被 切 Wo KBAR 也 含 这 种 序列 , 若 未 被 修饰 ,同样 也 会 被 水 解 ; 一 种 位 点 专 一 的 甲 基 化 酶 (EcoB 甲 基 化 酶 ) 对 这 有 段 序列 中 的 巍 叮 吟 甲 基 化 ， 使 得 这 段 序列 不 被 EcoB 核酸 酶 水 解 。 当 1.K 感染 B 株 时 , 大量 被 感染 细胞 内 的 几 个 亲 代 噬菌体 DNA 分 子 在 限制 前 被 甲 基 化 ， 因 而 产生 少量 B 型 修饰 (1。B) 的 噬菌体 。 大 肠 杆菌 K 同 样 也 含有 一 种 位 置 专 一 性 的 核酸 酶 叫做 EcoK 酶 , 它 与 EcoB 识别 的 序列 不 同 , 一 种 EcoK 甲 基 化 酶 也 能 产生 K 修 饰 , 使 大 肠 杆菌 尽 的 DNA 不 自我 降解 。 能 在 K 株 中 生长 的 1 噬菌体 1。 民 ， 在 EcoK 的 专 一 性 序列 甲 基 化 ,从 而 对 EcoK 酶 产生 抗 性 。 2。B 有 未 甲 基 化 的 Ecok FAI, %4 1。B DNA 感染 K 株 细胞 时 总 是 被 降解 。2。B DNA 分 子 偶 尔 因 复制 而 未 被 限制 ,其 复 制 物 则 含有 一 个 甲 基 化 的 K 专 一 性 序列 。 因 此 , 当 1。B 有 效 感染 大 肠 杆菌 人 时 ,产生 少 量 的 子 代 鸣 菌 体 为 1-K, CARA BET, 当 它 感染 B 时 就 会 被 限制 。 表 ,15-2 中, C 株 中 生长 的 叹 菌 体 1。C， 不 能 在 B 和 开 株 中 生长 ，C 株 对 2。B 和 24。K 却 都 不 限制 ,这 是 由 于 C 株 不 含水 解 .IDNA 内 任何 碱 基 序 列 的 限制 性 内 切 酶 。C FMA BALK FI, BALK ASSIS 1。C MERI. 表 15-2 大 肠 杆菌 4 噬菌体 的 限制 和 修饰 me cs] 体 注意 : 数字 表示 相对 的 涂 布 效率 。 宿主 限制 和 修饰 是 一 个 普遍 过 程 , 它 也 许 是 用 于 破坏 外 源 DNA 的 。 在 第 二 十 章 中 将 可 以 知道 ,限制 性 内 切 酶 是 重组 DNA 技术 的 基础 。 es。 50 。 噬菌体 专 论 从 生物 学 水 平 上 看 , 叭 菌 体 是 一 种 相对 简单 的 生命 形式 。 实 际 上 它 也 十 分 复杂 ,还 没 有 一 种 噬菌体 的 生命 过 程 的 分 子 机 理 被 完全 搞 清 楚 。 主 要 的 进展 是 通过 研究 生长 在 大 肠 杆菌 、 枯 草 杆菌 (Bacillus sublilis) 和 沙门 氏 杆 菌 〈$Sclpzozel1e typhimurium) 的 几 种 喉 菌 体 而 得 到 的 。 不 同 的 喉 菌 体 用 于 研究 不 同 的 过 程 可 能 收效 更 大 : 用 1 和 T7 ee 得 以 最 清楚 地 了 解 转录 的 调控 ;用 T4 和 1 唉 菌 体 研究 形态 发 生 取 得 很 大 成 功 ; P1 和 P22 WEAR Bote 供 了 转 导 的 材料 ; 用 T5 说 明 DNA 的 侵 染 ; T4 A DNA WAR; T4 和 T7 用 于 研究 鸣 菌 体 如何 取 代 细 茵 等 ,都 取得 重要 进展 。 下 面 我 们 将 详细 介绍 其 中 的 几 个 (及 另外 几 个 ) 叭 菌 体 。 重 点 放 在 了 解 得 很 清楚 的 性 质 上 ,其 他 性 质 仅 简 述 。 尽 可 能 介绍 每 个 噬菌体 的 生活 周期 。 表 15-3 WH ST LARK ”的 某 些 重要 性 质 。 表 15-3 几 种 噬菌体 核酸 的 性 质 噬菌体 .| @ 主 |DNA 或 RNA| 形 HK | 分 子 量 X104 稀有 了 碱 基 中 X174 E DNA SS5circ 1.8 5 M13,fd,fl E DNA ss )]in ok AS PM2 PB DNA ds circ 9 Fs 186 E DNA ds,lin 18 无 B3 PA DNA ds,lin 20 无 Mu E DNA ds,lin 25 IG T7 E DNA ds ;lin 26 无 A, E DNA ds,lin 31 无 N4 E DNA ds,lin 40 ZG Pi E DNA ds,lin 59 De -T5 Bie: DNA ds,lin 75 Is SPO1 B DNA ds,lin — 100 HMU #{T Uy Be i E DNA ds,lin 108 i HE CHMC 代 多 PBS1 B DAN ds,lin 200 Ui «er MS2,Q86 5f2 E RNA ds,lin 1.0 iG $6 PP RNA ds, lin 2.3 元 3.1 5.0* EM: 表 中 使 用 的 缩写 含意 如 下 : E: 大 肠 杆菌 ; B: Bacillus Subtilis, {REFERS PA: Pseudomonas aer- uginosa {RRs PB; Ps. aeruginosa BAL-31, 假 单 胞 菌 BAL-31; PP: Ps. ppareolicca, 假 芸豆 菌 ; SS:sin- gle strand， 单 链 ;ds: double strand， 双 链 ; circ: circular， 环 状 ; lin: linear， 线 状 ; HMU: hydroxyme- thyluracil, AZ RRMeE; HMC: hydroxymethyl cytosine, BPE hgmene, *d6 含有 三 个 分 子 。 大 肠 杆菌 I4 噬菌体 1939—1941 年 间 ，Milislav Demerec 分 离 出 一 系列 生长 于 大 肠 杆菌 的 B 菌 株 上 的 喉 菌 体 ，T1,T2,…… .IT7。 和 凭借 这 些 吻 菌 体 ,把 生化 实验 和 遗传 学 分 析 联 系 起 来 ， 使 遗传 学 发 生 了 一 场 革命 。 后 来 发 现 这 些 叹 菌 体 的 遗传 材料 为 双 链 DNA 《第 七 章 ) ,它们 的 结 « Sf « 构 和 生活 史 有 很 大 区 别 , 据 此 把 它们 分 为 4 组 : T1;T2,T4, Toé (T 偶数 噬菌体 ); T3. ay Wels Ce eae eis DNA * ee 要 工作 是 使 用 这 一 组 中 的 14 niet Je Wz 15-8, 尽管 其 分 子 较 大 ， fon 期 较 复 杂 仍 有 一 些 未 知 数 ,我 们 还 是 获得 了 大 量 知识 。 其 他 类 型 的 只 有 TS 和 T7 ZA 较 详 细 的 分 子 信息 ;我 们 将 在 分 析 完 T4 的 生活 周期 后 讨论 T7 的 性 质 。 图 15-8 大肠 杆 菌 了 4 A. 哗 菌 体 头 部 含有 DNA ， 尾 端 部 的 极 板 上 伸 出 尾 丝 ( 承 Robley Williams 提供 )。 T4 DNA 的 性 质 T4 作为 一 个 唉 菌 体 来 说 , 其 DNA 相当 大 ,分子量 约 为 1.1 & 108, & 166 000 个 碱 基 对 ,长 为 55 微米 , 头 部 宽 约 0.06 微米 ,长 约 0.09 微米 。 当 DNA RAEN, CHARS 表 15-4 在 工 偶 数 噬菌体 DNA 中 的 5- 羟 甲 基 胞 喀 啶 (HMC) 的 葡萄 糖 糖 基 化 作用 方式 总 HMC 9% 4a) “id BBE ACE FA T2 T4 T6 非 糖 基 化 的 25 . ris 2&- 糖 基 化 70 70 3 B- HEHE AL 0 30 0 ee- 糖 基 化 -6- 糖 基 化 5 0 72 LL * T1,T3,T5 和 T7 又 称 T GAMBK HBAGMMWAR=]RRTAMEXA Ke * 32 4 ie (SULA 15-2). H DNA & A.T.G, R&C, CHB THAME, RIS-AR 基 胞 喀 啶 (HMC) 代替 ， HMC 与 G 配 对 ( 见 图 15-9),HMC ie Brim —F Ke 饰 一 一 一 种 糖 与 HMC 上 的 产 基 相连 。 上 面 提 到 的 三 种 十 分 相似 的 T 偶数 噬菌体 只 是 在 糖 的 成 分 上 有 所 不 同 。HMG 上 有 足够 多 的 糖 将 T4 DNA 包围 起 来 ,因此 纯 T4 DNA 对 各 种 DNase 有 抗 性 。 CH,OH NH, we 0 < wee : CH,OH yee oH. -0.K Ho he = OH oiling NG 0” Sy >H | OH a 3 H 5- 羟 甲 基 胞 哮 喧 (HMC) 葡萄 糖 基 HMC 图 15-9 非 葡萄 糖 基 化 及 糖 基 化 的 5- 羟 甲 基 胞 喀 啶 。 如 果 HMC 中 的 CH;OH 是 H, PAR NADER EINE 四) 未 端 元 余 的 DNA CR 3 ，A'B'C'D'E'F'G' W'X'Y'ZA'B'C， (b) 在 用 5 -外 切 酶 消化 之 后 S'KBCDEFG F’G’ (c) (b) 状态 的 分 子 经 环 化 之 后 局 15-10 未 端 元 休 分 子 以 及 通过 外 切 酶 消化 和 环 化 的 鉴定 。 非 元 余 的 D NA .不 能 通 过 本 法 环 化 。 T4 DNA 的 碱 基 顺 序 在 分 子 的 两 端 是 重复 的 ,这 种 现象 叫做 末端 元 余 [图 15-10(a) ]。 在 多 种 噬菌体 中 出 现 的 末端 元 余 现 象 是 这 样 证 明 的 [图 15-10(b\c)]: 将 DNA 样品 用 DNA 外 切 酶 处 理 ， 从 每 条 单 链 的 3 一 OH 末端 依次 切 去 核 昔 酸 ，DNA 样品 不 再 能 复 性 ,一旦 被 移 去 的 碱 基数 目 超过 末端 元 余 区 域 的 碱 基数 时 ,就 可 形成 一 环 状 结构 ， 它 含有 相当 于 末端 元 余 长 度 的 一 段 短 的 双 链 结构 ,研究 发 现 末 端 宛 余 长 度 为 1 600 碱 基 对 。 T4DNA 还 有 一 个 重要 的 性 质 : 虽然 每 个 叹 菌 体 仅 含 1 个 DNA 分 子 , 但 每 个 叹 蓝 体 的 DNA 分 子 各 不 相同 ,甚至 由 一 个 噬菌体 和 其 子 代 所 产生 的 群体 的 DNA 分 子 也 不 &.3a° * 尽 相同 。T4 DNA 分 子 是 环 状 排列 的 ， 见 图 15-11, 此 图 系统 地 说 明了 在 种 群 中 DNA 分 子 的 未 端 碱 基 可 以 是 整个 序列 中 的 许多 不 同 碱 基 ,确切 地 说 ,也 许 是 整个 序列 中 的 任何 一 个 碱 基 。 请 注意 , 环 状 排列 是 噬菌体 种 群 的 性 质 , 而 未 端 元 余 则 是 个 体 鸣 菌 体 DNA 分 子 的 性 质 。 A'B'C'D: Z'A'B'C: a 和 TI 二 和 m EE a ee ae 2 ee ee 这 LET TS CDE ZABCDE C’D'E’ Z’A‘B’C’D'E’ me et eee SS ee ee EFG ZABCDEFG E’F'G’ Z'A'B'C'D'E'F'G GH! ZABCDEFGH} G'H'’ 2’A‘B’C’D'E'F'’G'H'I" 图 15-11 末端 重复 DNA 分 子 的 环 状 排列 。 很 多 种 类 的 喉 菌 体 可 以 产生 末端 宛 余 和 环 状 排列 的 DNA 分 子 。 有 些 有 未 端 宛 余 现象 但 并 未 形成 环 , 但 成 环 的 则 必 有 末端 元 余 。 下 面 介绍 噬菌体 DNA 的 包装 时 ， 我 们 就 可 以 得 知 这 些 性 质 的 由 来 。 T4 噬菌体 的 基因 构造 到 目前 为 止 ,已 经 鉴定 出 了 135 个 T4 噬菌体 基因 ,这 些 基因 约 占 整个 基因 的 90 多， 核 苷 酸 代谢 图 15-12 14 鸣 菌 体 的 遗传 学 图 谱 一 -表示 了 部 分 的 但 不 是 全 部 的 基因 。 从 图 谱 中 可 以 见 到 具 有 相关 功能 的 一 些 基因 缘 集 成 镁 。 虽 和 然 那些 编码 尾 板 及 尾 丝 的 基因 聚 成 大 徐 ， 但 是 还 有 一 些 形成 尾部 其 他 部 分 的 基因 散 开 分 布 于 图 谱 中 。 图 中 黑色 区 表示 必须 基因 区 ， 空 白 区 表示 非 必 须 基因 区 。“ 控 制 表 示 那 些 起 始 各 种 的 转录 作用 所 需要 的 基因 。 图 谱 圆 圈 内 的 小 箭头 表示 各 种 转录 作用 的 方向 及 起 点 (但 不 是 表示 长 度 )。 es 54 。 WA 15 一 20 个 基因 尚 待 发 现 。 基因 的 遗传 学 图 谱 见 图 15-12。 功 能 相关 的 基因 常常 相 邻 ,并 可 作为 多 顺 反 子 mRNA 分 子 的 一 部 分 而 转录 。 这 种 排列 是 非常 有 效 的 ,使 得 功能 相关 的 蛋白 质 的 合成 几乎 同时 进行 ， 并 可 减少 所 需 的 调节 元 素 的 量 。 但 是 并 非 所 有 功能 相关 的 基因 都 作为 一 个 转录 单位 ， 某 些 转录 单位 也 含有 与 功能 无 关 的 基因 。 将 功能 相关 的 基因 聚集 在 一 起 是 很 多 哦 菌 体 系统 的 普遍 现象 ， 几 乎 无 一 例外 。 后面 我 们 可 以 看 到 大 肠 杆菌 2 WEA KAY IX PPE J T4 基因 可 分 为 两 类 : 82 个 代谢 基因 和 53 个 颗粒 装配 基因 。 82 个 代谢 基因 中 仅 有 22 个 是 必需 的 ,它们 参与 DNA 合成 ,转录 ,裂解 ;其 他 60 个 代谢 基因 只 是 细菌 基因 的 翻 版 ,这些 基因 发 生 突变 的 噬菌体 仍 可 以 生长 ,只 是 有 时 裂解 量 较 少 。 在 53 个 装配 基因 中 ， 34 个 编码 结构 蛋白 ，19 个 编码 催化 装配 所 需 的 酶 和 蛋白 质 因子 。 因此 ，T4 DNA 基因 的 17 9% 编码 与 主要 代谢 过 程 相 关 的 蛋白 质 , 39%` 用 于 噬菌体 的 装配 ，44 匈 编码 与 次 要 代谢 过 程 有 关 的 蛋白 质 。 将 T4 基因 功能 分 类 的 很 有 用 方法 见 图 15-13 , 待 谈 到 生命 活动 的 各 步 时 ,这 些 功 能 就 很 清楚 了 。 "eis 十 一 一 一 .一 一 一 if em “giz oan Hi wanes ii nnn 1 — CRT Sey | ee ea i Ee mmm em cere ne ane od 一 六 } | pes J ember als | 人 ren, 1 时 结 松 an Ree flee em | Pw WE om om 的 维持 vow ase nee MELO tt Bs 4 “A 15-13 14 噬菌体 基因 按 功能 的 分 类 (虚线 框 内 )。 产 物 及 一 般 功 能 列 在 实 线 框 中 ， 连 线 表 明 各 种 各 样 的 功能 和 成 分 是 把 样 地 结合 起 来 而 产生 出 许多 不 同 的 产物 的 。 T4 生活 周期 概述 T4 的 整个 生活 周期 见 图 15-14， 现 总 结 如 下 ,温度 为 37*C ， 时 间 单 位 为 分 。 一 0， 噬菌体 吸附 在 细菌 的 细胞 壁 上 ,其 DNA 的 注 人 发 生 在 吸附 后 的 几 秘 内 。 1 一 1， 宿主 DNA, RNA 和 蛋白质 的 合成 完全 停止 。 1 一 2， 第 一 个 mRNA 开始 合成 。 t= 3, AIR DNA 开始 降解 。 t=5, KKK DNA 的 合成 启动 。 1 一 9，“ 晚 期 ”mRNA 开始 合成 。 1 一 12， 出 现 完整 的 头 尾 。 e955 "e LBA 注入 形成 早期 宿主 DNA -_ 一 形成 噬菌体 DNA 形成 晚期 < 二 ——— sel aS 12 9 5 DNA [en 头 部 图 15-14 T4 噬菌体 的 生活 周期 图 解 。 数 字 表示 注入 DNA 后 的 时 间 。 为 清晰 明了 起 见 ，mRNA 只 在 它 合成 开始 时 才 画 出 来 。 zi 一 15， 出 现 第 一 个 完整 的 吻 菌 体 周 期 。 1 一 22， 细 菌 裂 解释 放出 约 300 F(t 这 里 应 注意 各 个 过 程 的 顺序 。 图 15-15 的 电镜 照片 也 部 分 说 明了 这 个 序列 。 后 面 将 详细 介绍 其 中 的 几 个 步骤 。 7 细菌 大 分 子 合成 的 关闭 感染 后 不 久 , 一 些 能 有 效 地 阻止 宿主 DNA 转 录 和 复制 的 吻 菌 体 蛋 白质 就 合成 出 来 了 。 如 宿主 RNA 到 合 酶 被 修饰 后 几乎 不 能 识别 启动 子 , 而 且 第 一 个 吻 菌 体 mRNA 编码 的 DNase 可 迅速 降解 宿主 DNA， 使 得 细 离 DNA 几乎 全 部 被 降解 为 核 苷 酸 ,不 能 再 作为 复制 和 转录 的 模板 了 。 但 是 宿主 DNA, RNA 和 和 蛋白质 合 成 的 关闭 是 发 生 在 这 些 核酸 酶 的 合成 之 前 ,有 些 还 是 出 现在 不 能 合成 核酸 酶 的 噬菌体 侵 染 的 大 肠 杆 菌 , 因 此 ， 还 需要 另 一 种 解释 才能 说 明 宿 主 大 分 子 合成 的 抑制 过 程 。 通 过 遗传 学 和 生物 化 学 方法 可 以 制备 一 些 缺 乏 DNA AYRE A—— BARU (ghosts), EARN FAM A» AP Re 主 大 分 子 的 合成 关闭 ， 说 明 这 种 抑制 作用 不 需要 吸附 后 迅速 合成 的 任何 产物 。 有 证 据 表 明 ,在 被 完整 的 吻 菌 体 或 幽灵 叹 菌 体 吸 附 后 ,细胞 壁 和 膜 释放 一 些 可 溶性 物质 进 和 周围 的 环境 。 有 一 种 未 经 证 实 的 假设 , 即 T4 尾部 的 吸附 改变 了 大 肠 杆 菌 的 细胞 膜 ,进而 影响 了 宿主 大 分 子 的 合成 ， 这 可 能 是 由 于 改变 了 细胞 膜 的 通 透 性 或 影响 了 宿主 染色 体 与 膜 的 结 合 ， 而 这 两 者 的 结合 被 认为 是 宿主 复制 和 转录 所 必需 的 。 « 506 。 ~~ 2 oe a TE Se 图 15-15 T4 MBAR AAS RH. FAH PASI EAA 30°C 感染 后 的 时 间 。0 分 : 感 后 立即 摄影 ?表现 出 未 受 感染 的 细胞 形态 。 亮 区 为 含 DNA 的 类 核 部 分 。 5 分 : MAKER 裂 。 在 这 个 阶 眉 ， 发现 宿主 DNA RAMA ME BA ee A Ee. 15 分 : 约 在 感 染 细 菌 8 分 钟 后 ? 噬 蕊 体 的 用 于 装配 及 成 熟 的 结构 蛋白 质 开 始 形成 。 再 过 几 分钟 , 显 现 出 第 一 个 叹 菌 体 颗 粒 。 此 后 ? 叭 菌 体 按 大 约 5 个 吻 菌 体 颗粒 /分 钟 的 速度 逐渐 地 呈现 出 来 。 大 约 7 分 钟 装配 出 一 个 颗粒 。 首 先 形 成 一 个 不 含 或 几乎 不 含 DNA 的 空 的 头 部 。 相 似 于 细菌 的 核 DNA 的 细 丝 状 Din BRISA RAM AA DNA。30 分 :. 出 现 许 多 装配 完成 的 头 部 。 因 为 这 是 宿主 细胞 的 超 薄 切片 ， 因 此 每 个 细菌 细胞 中 的 鸣 菌 体 颗粒 的 实际 数目 为 图 中 数目 的 20 fF CK Edward Kel- lenberger 提供 )。 T4 mits DNA 的 转录 MHAEA RRNA SE REA, Pl, 若 T4 溶菌 酶 在 生活 周期 的 早期 就 大 量 合成 , 可 能 在 子 代 叹 菌 体形 成 前 细菌 就 裂解 了 。 再 如 ， 若 在 DNA 复制 开始 前 就 装配 头 部 , 就 有 可 能 将 注入 的 噬菌体 DNA 包装 起 来 而 不 能 增加 噬菌体 的 数量 。 这 种 调 控 的 主要 机 理 就 是 控制 mRNA 的 合成 ,在 T4 噬菌体 中 ,调控 过 程 还 包括 改变 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 使 之 识别 专 一 的 启动 子 并 越过 终止 子 。 T4DNA 可 被 转录 产生 多 种 mRNA 分 子 , 各 类 mRNA 在 不 同时 间 开 始 转录 ,在 一 定 的 时 间 间 隔 内 完成 。 我 们 将 讨论 主要 的 两 类 : 早期 mRNA (DNA 合成 前 转录 ) 和 晚期 mRNA (复制 后 转录 )。 1. 早 期 mRNA 分 子 编码 有 关 DNA 合成 、mRNA 合成 调控 、 遗 传 重组 中 的 酶 和 蛋白 质 因 子 及 各 种 非 必需 蛋白 。 2 .晚期 mRNA 分 子 含有 噬菌体 结构 蛋白 、 粒 子 的 装配 和 裂解 的 信息 。 T4 DNA 早期 转录 的 完整 过 程 包括 十 多 种 早期 mRNA 的 合成 ,其 中 多 数 为 重 伙 的 序列 ,并 有 几 个 衰减 子 (类 似 于 大 肠 杆 菌 trp 和 his 操纵 子 中 的 衰减 子 )。 符 合 上 述 基本 过 程 的 噬菌体 借助 于 大 肠 杆 菌 ,RNA 聚合 酶 〈 这 是 细胞 中 唯一 的 聚合 酶 )， 早 期 mRNA 的 转录 起 始 于 一 组 启动 子 ; 被 激活 或 由 于 鸣 菌 体 专 一 性 蛋白 质 的 加 人 使 此 RNA 聚合 酶 受到 修饰 , 它 不 再 能 识别 宿主 启动 子 , 而 只 能 识别 噬菌体 启动 子 , 于 是 开始 晚期 mRNA 的 转录 。 有 效 的 修饰 可 对 多 种 T4 早期 mRNA 合成 提供 暂时 性 调控 。 下 面 可 以 见 到 其 他 一 些 种 类 的 噬菌体 ,最终 可 使 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 失 活 并 产生 出 噬菌体 编码 的 聚合 酶 。 T4 编码 的 蛋白 有 效 地 修饰 大 肠 杆菌 RNA RSME, 其 主要 步 又 如 下 1. 未 被 修饰 的 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 的 转录 作用 。 感 染 后 不 久 ， 第 一 个 T4 mRNA 分 子 由 宿主 RNA HAHA, 2. 转换 作用 。 T4 噬菌体 头 部 含 几 种 小 分 子 蛋 白 ， 即 内 部 蛋白 ， 在 感染 后 不 久 ， 随 DNA 一 起 注 和 细菌。 其 中 的 一 种 一 一 转换 蛋白 ,把 一 种 小 分 子 : ADP- 核 糖 ( 即 ADPR) 连接 到 聚合 酶 的 一 个 “ 亚 基 上 (图 15-16), 从 而 修饰 RNA RAB 3. 修饰 作用 。 转 换 发 生 后, 宿主 的 RNA 聚合 酶 很 快 地 被 修饰 ;也 就 是 加 人 了 一 个 以 上 的 ADPR: 据 认为 转换 和 修饰 作用 降低 了 RNA RAMS o 亚 基 结 合 的 能 力 , 这 样 就 开 始 了 利用 宿主 启动 子 的 转录 过 程 。 但 这 些 可 能 都 是 非 必需 的 功能 。 4. 专 一 性 变化 。 一 种 吻 菌 体 编 码 的 蛋白 质 : Mot (可 能 是 DNA 结合 蛋白 )， 降 低 RNA 聚合 酶 识别 早期 启动 子 的 能 力 并 使 之 结合 到 下 一 组 启动 子 上 。 are ADPR e es Oh ae 90 iy MO Ol OC 15-16 AMHE RNA 聚合 酶 由 于 连续 地 加 入 两 个 分 子 的 ADPR 而 受到 改变 与 修饰 。 ‘58 记 净 结 果 为 按照 时 间 的 顺序 合成 早期 mRNA, RNA 聚合 酶 专 一 性 发 生变 化 表明 ， 当 不 再 需要 某 些 基因 mRNA 连续 地 合成 它 的 表达 产物 时 ,就 不 再 生成 这 些 mRNA, 新 的 mRNA 分 子 将 应 运 而 生 。 专 一 性 mRNA 合成 终止 不 久 ,由 于 mRNA 被 快速 降解 ,被 它 编码 的 蛋白 质 也 不 再 存在 。 那 些 长 期 需要 的 蛋白 质 的 合成 可 通过 连续 性 合 成 mRNA 或 通过 抵抗 该 编码 mRNA 降解 的 两 种 途径 来 实现 。 前 者 是 一 种 普遍 的 途径 。 其 他 的 修饰 作用 能 产生 更 多 类 型 的 早期 mRNA, © 当晚 期 mRNA 开始 合成 时 ，RNA 聚合 酶 战 为 一 类 极 复 杂 的 酶 一 “其 两 个 c WE 携带 两 个 ADPR 分 子 及 四 个 修饰 性 蛋白 。 有 时 , 称 它 为 “ 超 修 饰 ”(hypermodified) 的 RNA 聚合 酶 。 然 而 ， 这 个 酶 本 身 是 不 能 使 晚期 转录 得 到 起 始 的 。 晚期 mRNA 仅仅 在 DNA 复制 开始 后 才 会 形成 ;在 突变 体 中 ，DNA 不 能 复制 ,所 以 ,也 从 不 发 生 晚 期 转录 作 用 。 因 此 可 以 理解 ,这 种 程序 化 的 类 型 是 非常 有 效 的 ,因为 直到 复制 作用 达到 一 定 阶段 之 后 才 需 要 晚期 mRNA 所 编码 的 一 些 蛋白 质 ; 头 、 尾 、 装 配 蛋白 及 溶菌 酶 。 关 于 晚期 mRNA 合成 时 为 什么 需要 有 DNA 复制 的 机 理 尚 不 清楚 ,但 这 种 情况 也 已 在 体外 实验 中 观察 到 。 例 如 ,在 体外 实验 中 ,无 论 是 把 纯化 了 的 正常 RNA 聚合 酶 或 是 把 纯化 了 的 超 修 饰 的 RNA 聚合 酶 与 从 纯化 了 的 鸣 菌 体 中 分 离 出 的 DNA 放 在 一 起 , 都 不 能 合成 出 晚期 mRNA。 这 些 结果 以 及 其 他 一 些 结果 都 指出 ，DNA 本 身 在 它 能 作为 转录 的 模板 之 前 , 必 然 地 具有 某 些 由 正常 复制 作用 所 造成 的 特定 构象 。 注 意 ， 这 种 调节 作用 在 本 书 中 的 前 面 部 分 从 未 提 及 。1983 年 , 发 现 了 一 个 可 以 进行 晚期 转录 的 体外 实验 体系 。 对 这 个 体系 的 性 质 进行 研究 ， 肯 定 地 将 使 我 们 对 这 个 令 人 困惑 的 现象 得 以 了 解 。 T4 DNA 的 复制 T4 DNA 复制 中 的 以 下 五 点 是 很 有 趣 的 :〈1) 核 苷 酸 来 源 ; (2) 替代 C Cane) dUMP ——* dgTMP ——> dTDP —>dTTP -—-~ 葡萄 糖 酰 转 移 酶 葡萄 糖 基 化 的 HMC-DN4 15-17 由 工 4 MARSH HMC 的 生物 合成 途径 。 方 框 中 是 大 分 子 物 质 ; MAREK, 粗 线 框 表 示 DNA。 所 发 现 的 只 存在 于 受 噬 菌 体感 当 的 细胞 中 的 物质 下 面 加 一 横 线 表示 。 的 HMC (5-72 Samm) 的 合成 ; (3) 阻止 CAYBA; (4) T4 DNA 的 糖 基 化 :(5? 复制 作用 的 酶 学 。 下 面 将 分 别 讨论 。 1. T4 DNA 核 苷 酸 的 来 源 一 宿主 DNA 的 降解 。T4 生活 周期 的 一 个 早期 事件 是 将 宿主 的 DNA 降解 为 脱氧 单 磷酸 核 苷 酸 (dNMP)。denA 基因 和 denB 基因 产生 的 两 种 内 切 酶 起 始 上 述 降解 作用 。 这 两 种 酶 只 被 含有 胞 连 啶 的 DNA 所 活化 。 它 们 先 切断 宿 主 DNA 产生 双 链 片 候 ， 这 些 片段 再 由 基因 46 和 基因 47 所 控制 的 外 切 酶 逐步 降解 叉 dNMP。 这 些 单 核 苷 酸 再 由 通常 的 大 肠 杆菌 酶 系 催化 ,合成 出 dATP 、dTTP、dGTP 和 dCTP, 这 些 充足 的 dNTP 再 进一步 合成 30 种 T4. DNA 分 子 ， 这 些 吃 菌 傈 2DNA 前 体 同样 也 是 从 头 合成 (de novo) 出 来 的 。 但 为 保证 提供 充足 的 daNTP, 合 成 了 在 活性 正 与 大 肠 杆 蓝 酶 系 相同 的 五 种 酶 它们 是 胸 苷 酸 合成 酶 、 二 磷酸 核 苷 还 原 酶 、dCNP IRB, 二 所 叶酸 还 原 酶 和 脱氧 核 音 酸 激酶 ， 这 些 酶 为 非 必需 的 。 2. 5- 羟 甲 基 胞 喀 啶 (HMC) 的 合成 。T4 DNA KAHUNA HMC, (KBE 莲 并 不 含 形成 HMC， 的 酶 。 因 此 ,由 两 种 唆 菌 体 酶 将 dCMP 转变 为 dHDP, 此 过 程 如 Ps | T4 RAB dCMP dHMP HM 激酶 dHMP dHDP 大 肠 杆 菌 的 核 背 酸 激酶 能 形成 大 肠 杆 菌 中 所 有 的 核 昔 三 磷酸 ,， 它 再 将 dHDP 转变 成 噬菌体 DNA 中 HMC 的 直接 前 体 aHTP。 这 些 合成 途径 见 图 15-17。 3. 阻 止 胞 喀 啶 挫 人 到 T4 DNA 中 从 第 八 章 我 们 已 经 知道 ,由 于 dUTP 和 dTTP 分 子 有 相同 的 互 键 性 质 。 所 以 ,大 肠 杆菌 的 DNA 聚合 酶 不 能 迅速 地 区 分 dTTP 和 dUTP, 因而 还 需要 其 他 酶 来 协助 以 防 IER MEBE] DNA 中 。 同 样 , 由 于 dHTP 和 dCTP 均 可 与 岛 背 形成 百 键 ， 所 以 DNA RE HEA BEM dHTP 中 识别 出 dCTP。T4 内 切 酶 可 以 作用 于 含 胞 喀 喧 的 宿主 DNA, 此 胞 喀 啶 次 不 能 存在 于 T4 DNA 子 链 中 。 并 且 ， 含 C 的 DNA 也 不能 作为 鹏 期 转 孙 的 模板 ， 其 原因 还 不 清楚 。 宿主 大 肠 杆菌 并 不 形成 阻止 C 进 入 DNA 的 酶 ,所 以 一 定 是 叹 菌 体 编 码 这 些 酶 。 若 C 成 为 子 代 DNA 的 一 部 分 ，dCMP 就 可 转变 为 dCDP 和 dCTP, 一 种 噬菌体 的 酶 ， 通常 叫做 dCTPase， 即 dCDP-dCTP 和 焦 磷酸 化 酶 ， 将 dCDP 和 dCTP 降解 为 dCMP。 可 是 形成 dCTP 时 要 耗 用 ATP， 所 以 这 个 过 程 有 些 浪费 。 然 而 ， 由 于 大 肠 杆菌 中 只 有 一 种 酶 〈 核 苷 酸 激酶 ) 负责 形成 全 部 的 核 昔 三 磷酸 ， 因 而 在 大 肠 杆 菌 中 为 了 阻止 形成 dCTP 的 反应 似乎 很 难 有 更 经 济 的 过 程 。 而 且 ,在 大 肠 杆菌 中 , 绝 大 多 数 脱 氧 核 苷 二 磷酸 是 由 核 音 一 磷酸 通过 一 种 单个 的 酶 所 催化 的 酶 促 反 应 形成 的 〈《 见 第 八 章 )o 所 以 ， 在 大 肠 杆菌 中 阻止 dCMP->dCDP 的 反应 也 是 无 效 的 。 另 一 种 噬菌体 酶 ,4dCMP 脱 氮 酶 ,可 将 dCMP 转变 为 dUMP( 在 合成 dIMP 中 )， 见 图 15-17。 这 个 酶 的 活性 相当 于 大 肠 杆菌 中 类 似 酶 的 两 倍 〈 因 此 是 一 个 非 必 需 基 因 的 产 物 )。 它 具有 很 有 趣 的 节约 功能 。 大 肠 杆菌 DNA 和 T4 DNA 的 碱 基 组 成 中 含 的 《〈A 十 T) 分 别 为 50 多 和 66%, 在 大 肠 杆菌 中 ，dTTP 和 dCTP 的 比例 同 DNA 中 T:C 一 样 ， 也 是 1:1。 当 细 菌 的 与 噬菌体 的 dCMP 脱 氨 酶 共同 作用 时 ，dCMP 减少 而 dIMP $n. Aidt, dTTP: dHTP 为 2:1， 就 像 T4 DNA 中 的 工 比 HMC 刘 为 2:1 一 样 。 « 60 。 Rea Rea YAR th LE RMR tk DNA 中 ,假设 T4 内 切 酶 在 此 种 DNA 合成 后 不 久 就 将 之 降解 。 因 为 胞 喀 啶 只 存在 于 每 个 子 代 双 螺旋 的 -- 条 链 上 , 所 以 DNA 可 以 通过 正常 地 修复 合成 途径 得 到 修复 。 同 样 , 在 大 肠 杆 菌 DNA 合成 中 , 尿 喀 啶 偶尔 也 插 到 子 代 DNA 中 (通过 dUTP WBA). SHORE BR ee- N- 糖 基 化 酶 (u-N-glu- cosylase) 除去 ( 见 第 八 章 )。 4. T4 DNA 的 糖 基 化 。T4 DNA 中 的 HMC 分 子 给 鸣 菌 体 带 来 了 问题 ,因为 大 肠 杆菌 中 具有 一 种 内 切 酶 , 它 可 以 作用 于 含有 HMC 的 特定 核 昔 酸 序列 ， 所 以 噬菌体 的 糖 基 化 作用 就 可 以 避免 T4 DNA 中 的 HMC 受 这 种 内 切 酶 破坏 。 此 类 糖 基 化 作用 涉及 到 两 种 噬菌体 酶 , 即 c 糖 基 转移 酶 (cgt) 和 8- 糖 基 转移 酶 〈pgt)。 由 于 从 尿 喀 啶 核 苷 =A (UDPG) 上 转移 一 个 葡萄 糖 到 叹 菌 体 DNA 中 的 HMC 上 ,因此 糖 基 化 .作用 是 复制 后 《Bestreplicative) 的 修饰 作用 。 大 肠 杆 菌 的 内 切 酶 不 能 作用 于 糖 基 化 的 DNA， 可 见 糖 基 化 作用 是 一 个 保护 性 的 手 妇 。 简 单 的 遗传 学 实验 表明 , 保护 作用 是 糖 基 化 作用 仅 有 的 基本 功能 。T4 ugt 突变 型 不 能 进行 糖 基 化 过 程 ， 新 合成 的 DNA 迅速 地 被 天 肠 杆 菌 HMC 内 切 酶 降解 。 然而 ， 用 一 种 缺乏 HMC 内 切 酶 的 大 肠 杆菌 的 突变 株 (rglB-) 作为 宿主 菌 时 ，T4 ogt 和 T4 sgt” 甚至 在 DNA 不 能 糖 基 化 时 ,也 都 能 正常 地 生长 。 5. T4 DNA 复制 作用 的 酶 学 机 理 和 复制 DNA 的 形式 。 许 多 叭 菌 体 基因 参与 复制 过 程 ， 其 中 一 些 可 使 大 肠 杆菌 基因 的 功能 加 倍 。 但 重建 一 个 含 4 种 dTP 的 体外 系统 ，， 只 能 得 到 7 种 T4 基因 产物 , 即 第 32,41,43,44,45,61,62 号 基因 的 产物 ,它们 的 性 质 见 表 15-5, 在 这 个 系统 中 有 上 生物 学 活性 的 T4 DNA 是 以 纯化 了 的 轻 菌 体 DNA 作为 模板 来 合成 的 ,合成 的 速度 接近 于 体内 复制 及 许多 正常 的 细胞 内 结构 ( 见 后 ) 合 成 的 速度 ,可 见 这 个 系统 可 以 再 生出 体内 Cin vivo) 复制 所 使 用 的 体系 。 因此 ，T4 DNA 复制 不 需 任 何 大 肠 杆 菌 复 制 基因 。 七 种 蛋白 质 组 成 一 个 大 分 子 集合 体 ， 如 基因 43 产物 (T4 DNA 聚合 酶 ), 基 因 32 产物 (螺旋 脱 稳定 蛋白 ) 和 T4_DNA 组 成 一 个 稳定 的 复合 体 ;基因 44 和 62 的 产物 亦 同样 ,基因 45 SA 44/62 一 起 ,形成 依赖 DNA 的 ATP 酶 ， 它 的 功能 多 半 与 大 肠 杆 菌 中 的 解 链 酶 (helicases) 或 Dna B 蛋白 类 似 。 基 因 41 产物 有 引物 酶 (pri- mase) 活性 ,用 于 前 导 链 的 合成 , 它 在 此 过 程 中 也 与 基因 61 产物 共同 配合 使 用 。T4 DNA 复制 的 酶 学 机 理 尚 不 清楚 ,但 可 以 认为 ,对 这 种 体外 体系 进行 认真 研究 很 快 就 能 搞 清 楚 。 ek %15-5 T4 噬菌体 中 DNA 复制 必需 的 基因 T4 x Bs 基因 产物 的 功能 32 二 螺旋 脱 稳定 作用 * 单 链 DNA 结合 蛋白 43 DNA 聚合 酶 [44,62]* 结合 到 聚合 酶 45 ， 结合 到 育 合 酶 (41,61]* 引发 玉 框 中 每 一 对 基因 产物 在 分 离 出 来 时 是 紧密 结合 的 复合 物 。 e 61 « T4 DNA 复制 结构 相当 复杂 ， 一 个 原因 是 可 使 合成 子 代 DNA 的 速度 极 高 (因而 在 短 时 间 内 产生 极 大量 的 DNA), 在 一 个 生长 中 的 复制 叉 上 ，T4 DNA 聚合 酶 每 秒 可 合 成 800 ARR 〈 几 乎 能 与 体内 的 大 肠 杆 著 聚 合 酶 I 相 比拟 )， 而 体内 T4 DNA 复制 的 实际 速度 更 高 ， 为 5X10+ 核 昔 酸 / 秒 . 每 个 细胞 。 这 是 由 于 从 两 个 (或 更 多 个 ) 复 制 起 点 进行 双向 复制 ,形成 复制 泡 (bubbles)， 并 且 在 一 个 复制 周期 未 完全 结束 时 ,再 在 新 的 复制 起 点 处 又 起 始 下 一 次 的 复制 。 结 构 复 杂 的 第 二 个 原因 是 T4 DNA 频繁 地 发 生 着 遗 传 重组 过 程 ,每 个 分 子 的 双 螺旋 经 常 地 发 生 断 裂 和 重 接 。 人 们 可 以 从 被 感染 的 细胞 中 分 离 ”出 高 达 亲 本 分 子 长 度 6 倍 的 线 型 连环 体 〈cancateme) DNA 分 子 ; 这 些 连环 体 并 非 产生 于 滚 环 复制 ,而 是 由 于 剩余 的 未 端 经 过 遗传 重组 而 形成 的 。 另 外 ,似乎 有 这 种 情况 ， 在 单 一 感染 的 和 多 重 感染 的 细胞 中 ,在 复制 的 子 代 分 子 间 发 生 极 为 频繁 的 重组 作用 ,结果 细胞 中 所 有 未 包装 的 噬菌体 DNA 都 是 一 个 含有 着 几 百 个 复制 叉 的 、 巨 大 的 、 相 互 连 系 着 的 单位 中 的 一 个 部 分 ( 见 图 15-18)。 这 种 结构 的 复杂 性 严重 地 阻碍 着 研究 的 深入 进行 。 T4 噬菌体 颗粒 的 产生 、 完整 T4 RAMEE DAMS: 装配 头 、 尾 及 其 他 结构 ; BREN DNA， 以 使 噬菌体 头 中 具有 略 多 于 一 套 基因 的 DNA。 TI4(〈《 以 及 其 他 许多 噬菌体 ) 装 配 的 研究 通过 两 种 技术 来 完成 ,这 两 种 技术 都 需 用 一 大 组 不 能 产生 完全 颗粒 的 噬菌体 突变 株 。 第 一 种 技术 是 将 分 别 被 各 种 特殊 的 突变 株 所 感染 . 的 不 同 的 细菌 培养 物 进行 盗 菌 处 理 , 然 后 用 电镜 检测 = 该 过 程 指出 头 部 及 尾部 的 合成 为 相 互 独立 过 程 ， 而 头 及 尾 的 装配 则 为 互相 依赖 的 过 程 。 第 二 种 技术 是 广泛 地 采用 纯净 蛋白 质 进 行 互 补 的 测定 方法 。 先 得 到 一 个 只 含有 头 部 物质 的 鸣 菌 体 所 感染 过 的 细菌 培养 物 ,再 得 到 另 一 个 只 含有 尾部 物质 的 喉 菌 体感 染 过 的 细菌 培养 物 ， 分 别 地 再 对 这 两 种 细菌 培养 15-18 T4 DNA 复制 复合 物 的 电镜 照片 。 注 意 , 它 相似 于 图 6-11 所 示 的 大 肠 杆 菌 DNA 的 结构 ( 承 Joel Huberman 提供 )。 。 62 。 Wy vt F7 HE BL Bb HE BE RIE BJ» A cB KA CA 15-19)。“ 无 SL ERMTWRDARD SS Nite — Aa Ie ERS RBA SA RK o 此 外 ,用 这 种 方法 还 可 以 分 离 并 鉴定 出 另 一 种 在 尾部 装配 途径 中 所 需要 的 蛋白 质 。 研究 表明 有 两 类 成 分 , 即 结构 蛋 白 质 (structural proteins) 和 形态 发 生 酶 (morphogen- etic enzymes)。 某 些 结构 成 分 可 目 发 地 装配 ， 形 成 噬菌体 结构 ， 而 另 一 些 则 需要 酶 的 帮 助 。 装 配 吻 菌 体 头 部 还 需要 几 种 宿主 编码 的 因子 oT4《〈 以 及 1) 的 装配 途径 已 经 基本 上 清 RAD AULA 15-20. FAR BE AE A 45H FARE Bh AE Bl 4 He “a eet eG "FA" “RE A 图 15-19 通过 体外 互补 作用 产生 完整 的 T4 噬菌体 。 尽 委 已 经 可 以 在 体外 将 T4 DNA 装配 到 噬菌体 头 中 ,但 机 理 尚 不 完全 清楚 。 主 要 的 问题 就 是 长 链 的 DNA 是 如 何 紧密 地 折叠 从 而 装 人 噬菌体 头 部 的 。 据 认为 ,包装 过 程 是 DNA 分 子 的 一 端 附着 到 噬菌体 头 部 的 一 种 蛋白 质 上 ， 接 着 有 一 种 压缩 蛋白 或 一 种 小 的 、 基 本 的 分 子 〈 如 多 胺 ) 诱导 折 释 ( 见 图 15-21)。 此 过 程 最 明确 的 一 点 是 DNA 分 于 是 从 长 的 串联 体 上 一 一 切割 下 来 的 ,由 于 T4 DNA 的 环 化 位 置 是 可 变 的 ,因而 ,基因 切 割 位 点 不 是 在 DNA 中 某 个 特定 的 、 单 一 的 碱 基 序列 上 ， 而 只 能 由 可 能 愉 好 装 人 叭 蓝 体 $163) «< 头 4 12 Y 四 dion 15, 6, 7, 8,10,°25, 26 | 127, 28, 29, 51, 53 Lee 12 \ mH. 48 ‘M54 15-20 T4 噬菌体 的 形态 遗传 学 途径 ( 承 William Wood 提供 )。 头 部 的 DNA 的 量 来 决定 “ 头 部 充 塞 机 理 ” 假 设 ， 先 是 DNA 的 自由 端 不 断 地 进入 头 部 ,直至 头 部 没有 空间 ， 然 后 DNA 串联 体 被 切断 。 这 个 假设 解释 了 出 现 终端 过 剩 〈te- rminal redundancy) 和 环 状 化 互 换 排列 〈cyclic permutation) 两 种 现象 的 原因 CA 15- 22)。 最 重要 的 一 点 是 T4 鸣 菌 体 颗粒 中 所 含 的 DNA 的 量 略 高 于 需 用 来 编码 T4 蛋白 质 的 DNA 的 量 。 所 以 , 当 从 DNA 串联 分 子 上 切割 下 一 份 充 塞 头 部 的 DNA IY, 最 后 被 包装 到 头 部 的 DNA 片段 是 最 早 被 包装 的 DNA 片段 的 复制 品 , 即 被 包装 的 DNA 的 终端 是 有 剩余 的 。 被 包装 到 第 二 个 噬菌体 头 部 的 DNA 分 子 的 第 一 片段 不 同 于 第 一 个 叹 菌 体 头 部 中 第 一 片段 。 进 一 步 ,因为 第 二 个 噬菌体 的 DNA AAW A. B= Wik DNA 分 子 当 然 地 从 长 的 串联 状 的 DNA 分 子 一 个 部 分 起 始 。 因 此 , 由 一 个 受 感 染 的 细菌 产生 的 那些 噬菌体 DNA 分 子 是 一 套 环 状 化 互 换 排 列 的 分 了 于。 关于 “ 头 部 充 塞 机 理 ” 假 设 ,还 有 两 方面 重要 的 证 据 : 〈1) 若 一 个 突变 噬菌体 缺失 了 一 段 非 必需 基因 , 则 es 64 。， _ vonage’ DNA 继续 填充 、 拉 长 头 部 ; 当头 部 充 湛 时 切断 DNA 含有 螺 管 状 蛋白 质 的 空 DNA wal a 螺 管 上 图 15-21 sige TA HBR ELAS. oe DNA DUAR SARE BEAR ee a IARI EE 终端 过 剩 的 末代 ABC... .XYZABC DNA 分 子 js RSTUVW- . .RSTUVWXYZ.. .UVWXYZABC. . . .XYZABC 人 got. oe. Se eee PRE he 垂直 的 箭头 表示 切断 DNA 处 ， 然后 顺序 地 装 入 只 落体 头 部 。 两 个 箭头 之 间 的 DNA 的 长 度 服从 于 * 塞 满 头 部 "的 规则 ， 即 DNA 的 量 必须 装 满 噬菌体 头 部 PC “A a Z oa: 子 代 噬菌体 图 15-22 T4 DNA 分 子 环 状 化 互 换 排列 的 起 点 。 终端 过 剩 区 域 就 增加 一 段 和 所 缺失 的 DNA SHSM; (2) 在 体积 上 ，0.65 ,0.8 ,1.2 和 5 倍 于 正常 噬菌体 头 部 体积 的 突变 噬菌体 ,其 DNA 的 长 度 也 为 正常 噬菌体 DNA 的 0.65,0.8,1.2 Al5 大 肠 杆菌 工 ak bal AS T7 鸣 菌 体 是 中 等 大 小 的 叭 菌 体 ( 表 15-13)， 其 DNA 的 分 子 量 为 26X10， 含 有 等 BAY A,T,G,C 碱 基 ,不 含 稀有 碱 基 。 终 端 剩余 160 碱 基 对 ， 但 它 不 是 环 状 化 互 换 排列 的 序列 。DNA 分 子 被 装 人 头 部 ,一 个 很 短 的 尾巴 附着 在 头 上 , 见 图 15-23。 T7 ep ery 因此 对 其 生活 周期 进行 分 析 比 较 简单 易 行 , 所 以 近年 来 ，T7 引起 人 们 的 极 大 光 趣 。 大 部 分 基因 产物 经 凝 胶 电 泳 分 离 进 行 了 鉴定 ,其 中 34 种 已 被 纯 化 (1982 年 以 前 ), 许 多 产物 已 用 化 学 方法 测定 了 序列 。 最 重要 的 成 果 是 最 近 已 前 明 工 7 DNA 的 39 930 碱 基 对 的 全 部 序列 ,人 们 可 以 通过 直接 观察 ,对 所 有 的 启动 子 、 终 止 位 点 、 调 节 ° 65° 15-23 T7 叹 菌 体 的 电镜 照片 。 注 意 , 它 具有 很 短 的 许 部 。 图 中 还 有 三 个 空 者 的 头 部 。 位 氮 \ 间 隔 区 ,前 导 序 列 ` 起 始 密码 子 \ 终 止 密码 子 和 基因 等 进行 定位 。 实 际 上 ， 通 过 在 相 同 的 阅读 框架 中 注意 AUG 起 始 密码 子 和 终止 密码 子 的 位 置 , 已 经 很 容易 地 把 以 前 未 知 的 几 个 基因 检测 出 来 了 。 本 ae 寸 每 个 基因 的 碱 基 序 列 推 译 出 每 种 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 。 T7 的 基因 构造 图 15-24 给 出 了 近乎 完整 的 T7 的 遗传 学 图 谱 (为 简单 起 见 省 略 了 几 个 未 知 功能 的 基因 )。 在 标明 的 41 个 基因 中 ,已 鉴定 了 34 个 基因 的 产物 ,并 已 知 26 个 基因 的 功能 。 下 面 将 看 到 ,从 基因 0.3 起 将 按 数 字 的 次 序 顺 次 地 合成 出 各 个 基因 的 产物 。 T7 DNA 的 量 还 不 到 T4 DNA 的 四 分 之 一 ,可 以 预计 它 只 复制 较 少量 的 宿主 基因 。 对 于 T4 来 说 ， 至 少 在 82 个 已 知 的 代谢 基因 中 , 有 60 个 是 非 必 需 的 。 即 在 所 有 已 知 的 基 因 中 ， 非 必需 的 基因 占 T4 总 基因 的 39% ， 其 中 大 多 数 和 宿主 DNA 的 功能 相同 。 然 而 对 于 T7 来 说 则 相反 ， 在 已 知 功能 的 26 RAH, RA 2 (5 8%) 是 非 必需 的 。 通过 测定 基因 的 碱 基 序列 还 证 明了 T7 DNA 的 其 他 一 些 较为 经 济 的 特点 。 例如 ， 即使 存在 着 前 导 序列 〈leaders) 和 基因 间 的 间隔 区 (spacers)， 这 些 部 分 也 只 有 几 人 小 芒 彰 软 而 在 细 离 的 浊 传 条 六 中 这 些 部 分 则 有 几 百 个 核 首 本 。 ry mire oe 4 的 左边 ,用 于 使 mRNA 结合 到 核糖 体 上 的 Shine-Dalgarno 序列 ( 见 第 十 二 章 ) 就 在 基 ， 因 4 左边 的 一 些 先 导 基 因 gene ) Ye RE REBaS> ch o 并 且 一 个 顺 反 子 〈cistron ) 的 终止 密码 子 常常 与 下 一 个 顺 反 子 的 起 始 密码 子 重合 ,例如 序列 UGAUG 终止 基因 1.7， 并 起 始 基因 1.8, 序列 UAAUG 也 有 双重 功能 ,能 对 基因 05 和 基因 0.6 都 起 作用 。 还 有 第 三 种 情况 , 即 相 邻 基因 的 编码 区 是 重合 的 ,其 中 最 大 的 重 翁 是 23 个 碱 基 ,所 以 这 种 重 登 LE pX174 (AR PRA) 和 许多 动物 病毒 (第 二 十 一 章 ) 中 的 重 登 小 得 多 。 最 后 , MB 体 生 活 周期 的 早期 所 产生 的 分 解 蛋白 质 比 一 般 细 菌 蛋 白质 要 小 得 多 ， 具 有 29 一 883 +H 基 酸 。 T7 的 基因 根据 其 功能 而 聚集 成 基因 簇 ; 并 且 按 其 执行 功能 的 先后 排列 成 一 个 连续 的 es 66 。 基因 数 AM ， 功能 及 产物 3 1A 功能 及 产物 fe Pl 6 | ~—5' 9b Hy) Bie oe — Pil 38 — fi) di 4s Fs 9 BR a HE 7 奴 BE: 一 or ‘ -一 Rew ---RNA ZAM 一 PPII 一 -DNA if 72 fi 及 一 人/ 一 失 活 宿主 RNA -一 单 链 DNA # Aa 右 端 15-24 工 7 叹 菌 体 的 遗传 学 及 物理 学 图 谱 。 基因 均 已 标 以 数码 。 图 中 没有 标明 功能 的 基因 。 或 是 并 不 重要 或 是 功能 尚 不 明了 。 图 中 方块 的 大 小 是 其 蛋白 质 产 物 大 致 的 比例 。 方 块 中 阴影 的 深 浅 仅 仅 是 用 来 区 分 彼此 相 邻 的 基因 ， 并 无 其 他 含意 。 启 动 子 用 pPI，pII，pIII 表示 ,终止 子 用 tl 表示 。 次 序 。 第 一 个 基因 (在 图 15-24 中 ,在 遗传 学 图 谱 中 从 上 到 下 阅读 ,或 按 图 谱 的 标准 方向 从 左 到 右 阅 读 ) 是 感染 宿主 细胞 后 噬菌体 DNA 存活 所 必需 的 基因 ; T7 的 一 个 普通 的 宿 主 一 一 大 肠 杆菌 B 株 ;含有 一 种 限制 性 内 切 酶 , 它 可 以 切断 T7 DNA 中 的 专 一 性 碱 基 序 列 , 噬菌体 DNA 中 的 第 一 个 基因 的 产物 直接 地 结合 在 这 个 酶 上 ， 从 而 抑制 这 个 核酸 酶 的 活性 。 紧 接着 是 几 个 控制 转录 作用 的 基因 ，, 然后 是 DNA 复制 基因 ， 再 后 是 编码 叭 菌 体 颗粒 的 结构 蛋白 质 的 基因 ，, 最 后 则 是 几 个 能 将 新 合成 的 DNA 装 人 到 鸣 菌 体 头 部 的 基因 。 T7 的 生活 周期 T7 的 生活 周期 总 结 如 下 \30?" ,时 间 单 位 为 分 钟 ): t= 0 哈 郊 体 的 吸附 。 ¢ 67 。 t= 0—1 起 始 噬菌体 DNA 的 缓慢 注射 t= 2 起 始 噬菌体 mRNA 合成 的 起 始 。 t= 4 开始 关闭 宿主 的 转录 作用 。 1 一 8 一 9 HMR DNA WARK :一 8 一 10 起 始 结构 蛋白 的 合成 , 叭 菌 体 DNA 注射 完毕 。 += 15 出 现 第 一 个 叹 菌 体 。 t= 25 裂 解 并 释放 子 代 吻 菌 体 。 下 面 将 对 大 部 分 阶段 进行 介绍 。 T7 DNA 注入 宿主 细胞 T4 及 其 他 多 数 吻 菌 体 的 DNA 在 吸附 后 不 到 | 分钟 就 迅速 地 注 人 到 宿主 细 胞 中 ， 而 T7 约 需 10 分 钟 才能 将 全 部 DNA 注 人 ,其 原因 还 不 清楚 (其 他 噬菌体 注射 机 理 同 样 也 不 完全 清楚 )。 缓慢 地 注 和 人 这 一 特点 在 T7 的 生活 史 中 非 常 有 意义 ， 因 为 一 个 基因 在 它 被 注入 之 前 是 不 能 被 转录 的 事实 上 ,转录 的 时 间 在 部 分 程度 上 取决 于 注 和 人 过 程 的 动力 学 ,我 们 将 在 下 面 讨论 。 T7 DNA 转录 作用 的 调控 T7 的 生活 周期 通常 可 分 早期 和 晚期 两 个 转录 阶段 。 早 期 转录 是 利用 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 ,对 基因 '0.3 至 基因 1.3 这 一 段 进行 转录 。 晚 期 转录 是 使 用 一 个 新 合成 的 T7 RNA 聚合 酶 。I7 的 转录 被 短暂 地 调控 。 转 录 子 〈transcripts) 可 以 分 为 主要 的 三 类 ， 分 别 标 以 1,11, UIC GUA 15-25), 其 中 每 一 类 都 从 同一 个 DNA 链 即 5 链 ( 当 DNA 分 子 按 标 准 方向 画 出 时 ， 转 录 方 向 为 右 向 ) 开始 转录 。 第 1 类 转录 子 由 大 肠 杆菌 的 RNA RABE 成 ,组 成 早期 mRNA。 第 工 类 转录 子 有 三 个 不 同 的 启动 子 ,它们 的 位 置 很 近 ,因而 每 一 个 mRNA 都 包含 着 相同 的 基因 的 转录 产物 。 若 把 这 些 mRNA 分 子 中 的 每 一 个 都 看 作 是 从 一 个 单个 的 启动 子 pl 开始 的 被 称 为 转录 子 工 的 一 个 mRNA 分 子 , 那 么 这 对 于 我 们 讨论 转录 的 调控 将 是 很 方便 的 。 三 个 启动 子 的 存在 很 可 能 仅仅 是 使 mRNA 的 合成 的 净 速度 提高 3 倍 。 1 a 一 ”一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 oar! ) | ie eRe —— — ie 1 | 1 | 1 L484 | 1 中 1 1 018% | "Sa 67 10 { 基因 终止 位 点 15-25 简化 了 的 T7 转录 图 谱 。DNA 及 基因 数目 用 实 线 表 示 ， 三 类 转录 作用 用 一 … 一 表示 《其 上 的 数字 表示 时 间 间 隔 〈37*C， 分 钟 ))， 在 这 段 时 间 间 隔 中 完成 转录 作用 。 终 止 位 点 用 垂直 箭头 表示 ， 大 约 可 有 90% 的 终止 效率 ;因此 大 约 有 10% 的 第 II 类 和 第 III 类 分 子 进一步 转录 ， 图 中 用 虚线 (一 一 一 ) 表 示 。 a 68 。 转录 子 工 的 合成 是 在 感染 后 2 分 钟 开 始 的 。 这 段 时 间 的 延迟 可 能 是 由 于 DNA 的 组 慢 注 射 。 细菌 RNA 聚合 酶 参与 转录 ， 在 基因 1.3 之 后 的 地 方 终止 转录 。 KBE RNase Ill 将 转录 子 工 切割 为 5 个 mRNA OT, 但 在 实验 室 条 件 下 此 过 程 不 是 必需 的 ， 因为 ,如 果 是 缺乏 RNase III 的 大 肠 杆菌 突变 株 ,转录 子 仍 保持 完整 , 产生 出 的 噬菌体 似 乎 是 正常 的 。 然 而 在 自然 条 件 下 或 在 其 他 细菌 宿主 内 可 能 需要 有 上 述 加 工 过 程 。 .转录 子 工 可 翻译 产生 几 种 蛋白 质 , 其 中 一 种 是 蛋白 激酶 (protein kinase, 基 因 0.7 的 产物 )， 它 可 使 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 磷酸 化 ,而 使 之 失 活 , 从 而 减少 大 肠 杆菌 DNA 的 转录 ,这 是 叭 菌 体 取代 细菌 的 第 一 步 。T7 只 菌 体 对 大 多 数 大 肠 杆菌 的 实验 菌株 的 感染 过 程 ， 并 不 需要 这 个 激酶 。 然而 ，T7 噬菌体 的 基因 0.7 突变 株 与 正常 的 野生 型 吻 菌 体 相 比 ,产生 一 个 较 小 的 爆破 值 , 这 多 半 是 因为 细胞 继续 地 合成 着 大 肠 杆菌 的 RNA， 而 大 肠 杆菌 RNA 对 于 T7 无 用 ,因而 使 形成 T7 颗粒 的 来 源 减少 。 我 们 还 将 看 到 ,基因 0.7 后 来 形成 一 个 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 的 抑制 物 。 转录 子 I 的 第 二 个 翻译 产物 是 T7 RNA 聚合 酶 (基因 1 的 产物 ) ,这 是 一 个 必需 的 酶 , 它 关 系 到 进一步 的 转录 。 与 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 相反 ，T7 RNA 聚合 酶 是 一 个 单 链 的 多 肽 ,而 前 者 是 一 个 多 亚 基 的 复合 物 。 比 起 大 肠 杆 菌 来 ,推测 它 的 转录 作用 的 起 始 与 终止 的 要 求 很 简单 ,而 大 肠 杆 菌 则 有 较为 复杂 的 要 求 。 : 转录 子 I 及 转录 子 I 代表 着 各 种 类 型 的 、 起 始 于 不 同 启动 子 的 mRNA, KER 动 子 不 能 被 大 肠 杆菌 的 RNA 聚合 酶 识别 ,它们 只 被 转录 子 I 翻译 产生 的 T7 RNA 聚合 酶 识别 。 但 是 ,这 些 启动 子 并 没有 立刻 在 T7 RNA 聚合 酶 形成 时 就 开始 转录 ,而 是 有 一 段 滞后 的 时 间 。 第 II 类 转录 子 HR I) 先 合成 出 来 ,然而 它 的 启动 子 却 比 第 II RK 录 子 (转录 子 IUD) 的 启动 子 弱 得 多 。 对 于 第 UU 类 转录 子 出 现 的 延迟 以 及 这 两 类 转录 子 的 转录 在 起 始 时 间 上 的 差异 ,有 着 同样 的 解释 。 这 是 因为 T7 DNA 缓慢 地 注射 以 及 因 为 第 II 类 的 启动 子 进入 细胞 比 第 II 类 进入 细胞 早 几 分 钟 。 转录 子 II 的 转录 作用 起 始 于 第 I 类 转录 子 的 终止 位 点 的 上 游 ,因此 ， 在 转录 子 工 及 转录 子 II 中 都 含有 基因 13, 原因 尚 不 明 ,特别 是 缺少 T7 DNA 连接 酶 的 基因 1.3 突变 tk, 可 以 在 提供 大 肠 杆菌 DNA 连接 酶 的 情况 下 很 好 地 生长 一 -至 少 在 实验 室 条 件 下 是 如 此 。 在 自然 界 , 可 能 T7 经 常 遇 到 宿主 菌株 ， 而 宿主 菌株 不 能 为 迅速 生长 的 吻 菌 体 提 供 足 够 量 的 连接 酶 ， 于 是 演化 出 能 生长 于 这 种 宿主 中 的 T7， 或 者 说 T7 的 酶 系 具 有 是 够 的 优势 , 即 能 使 T7 的 拖延 时 间 的 RNA 合成 仍然 得 到 保证 。T7 RNA 聚合 酶 可 以 忽 略 引 起 转录 子 工 终止 的 位 点 ,使 转录 子 右 向 地 转录 到 第 二 个 终止 位 点 〈 见 图 15-25), 终 止 位 点 90 多 有 效 , 这 意味 着 有 10% 的 转录 子 不 终止 ,继续 前 进 ， 直 到 DNA 分 子 的 末端 处 。 因 为 终止 位 点 刚好 在 基因 10 之 后 (基因 10 编码 主要 的 头 部 蛋白 ) ,所 以 人 们 认为 终 止 位 点 的 位 置 有 利于 增加 基因 10 的 产物 浓度 。 就 在 此 终止 位 点 之 后 ， 又 有 编码 各 种 尾 部 蛋白 及 一 些 次 要 的 头 部 蛋白 的 各 个 基因 ， 鸣 菌 体 对 于 这 些 基因 的 蛋白 产物 的 需求 量 较 低 。 ll 类 转录 子 的 基因 (AA I) 形成 对 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 第 二 种 抑制 物 。 这 种 抑制 物 与 前 面 曾 提 过 的 基因 0.7 的 蛋白 产物 : BAMA (MIRAE RNA 聚合 酶 活性 ) 结 合 , 就 使 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 活性 被 完全 抑制 因此 ,于 感染 后 8 分 钟 不 再 有 大 肠 杆菌 的 RNA 的 合成 , 鸣 菌 体 已 完成 取代 细菌 的 全 部 过 程 。 这 时 由 大 肠 杆菌 RNA ea。 69 。 聚合 酶 形成 的 转录 子 工 也 不 再 合成 了 。 停 止 合成 转录 子 IMU T7 来 说 ,是 十 分 经 FH ,因为 此 时 已 有 足够 的 T7 RNA 聚合 酶 去 完成 其 生活 周期 ,而 不 再 需要 这 个 转录 子 的 产物 了 。 转录 子 IW DNA 还 含有 参与 DNA 复制 的 各 种 酶 和 蛋白 质 因 子 的 基因 以 及 形成 结构 蛋白 的 其 他 一 些 基 因 。 事 实 上 ,在 对 复制 作用 的 基因 转录 以 后 不 久 ,就 开始 转录 结构 蛋白 的 基因 。 初 看 似乎 转录 的 量 不 够 ， 因 为 噬菌体 颗粒 的 成 熟 前 的 装配 过 程 及 唤 菌 体 DNA 的 包装 过 程 可 能 会 导致 复制 过 程 终止 或 至 少 大 大 地 减少 复制 作用 的 模板 数 。 这 种 安排 与 T4 中 所 见 到 的 过 程 相反 ，T4 结构 蛋白 的 合成 因为 涉及 复制 的 酶 系 是 延 澡 的 。 然而 在 T7 中 ， 虽 然 它 的 DNA 分 子 很 少 ， 但 它 可 以 迅速 地 复制 《〈 约 20 秒 一 次 六 一 些 ， 与 成 熟 作 用 有 关 的 蛋白 质 《〈 基 因 18 及 基因 19 的 蛋白 产物 ) 则 翻译 得 晚 ， 头 部 的 装配 过 程 很 慢 ; 在 复制 作用 合成 出 许多 新 的 DNA 分 子 之 前 ,实际 上 没有 DNA 分 子 的 包装 这 程 。 一 且 合 成 出 DNA 复制 作用 所 需要 的 酶 系 ,就 应 当 不 再 需要 对 这 个 区 域 进行 转录 ， 因 为 对 于 大 部 分 情况 来 说 ， 已 经 具有 复制 作用 所 需 的 各 种 蛋白 质 。 然 而 ,使 转录 子 正 的 合 成 结束 ,也 就 停止 了 结构 蛋白 基因 的 转录 ,但 是 噬菌体 对 这 些 结构 蛋白 基因 的 产物 的 需要 量 是 符合 化 学 计算 的 。 所 以 ， 通 过 翻译 两 种 晚期 mRNA 分 子 〈I 及 II) 以 及 停止 合成 ERT 工 来 达到 对 效率 及 对 连续 合成 结构 蛋白 的 要 求 。 人 们 认为 ， 如 果 转 录 子 I 在 遇 到 转录 子 III 的 启动 子 之 前 就 终止 转录 ,也 会 得 到 与 上 面相 同 的 结果 ， 但 是 目 然 午 的 进化 选 用 了 另 一 条 途径 。 在 感染 后 15 分 钟 转录 子 工 的 合成 停止 。 这 种 关闭 作用 带 有 普遍 性 意义 , 它 关 系 到 转 RF LW 的 启动 子 , 影 响 启动 子 pPII 和 pill 的 相对 强度 。 于 是 ， 转 录 作 用 全 面 地 减 弱 ,仅仅 较 强 的 启动 子 pIII 还 保留 活性 。 转 录 活 性 全 面 减弱 的 机 理 尚 不 清楚 ， 但 是 已 知 这 个 过 程 需 要 基因 3.5 的 蛋白 产物 CN- 乙 酰 胞 壁 酰 - 工 - 丙 氮 酰 - 脱 酰胺 酶 )。 这 个 蛋白 质 是 一 种 类 溶菌 酶 的 酶 ,对 细胞 溶解 也 有 作用 。 T7 DNA 复制 T7 DNA 复制 期 间 所 专 一 性 使 用 的 一 些 蛋白 质 是 转录 子 UME BAZ 及 基因 6 编码 两 种 核酸 酶 ,它们 的 作用 是 打 断 宿主 的 DNA。 此 作用 为 噬菌体 DNA 合成 提 供 大 部 分 核 背 酸 。 基 因 5 的 蛋白 产物 为 T7 DNA RAM, CRZ 5 一 3 RBA 这 种 活性 改 由 基因 6 蛋白 提供 。 基因 4 的 蛋白 产物 有 引物 酶 及 解 链 酶 两 种 活性 。 基因 2.5 编码 单 链 DNA 结合 蛋白 。 T7 DNA 复制 的 模式 详 述 于 第 八 章 〈 见 图 8-46 至 图 8-48)。 推 荐 读者 读 一 读 该 部 分 ,最 重要 之 点 为 原初 的 亲 代 分 子 产生 一 个 长 的 ,线性 串联 体 。 终 端 剩余 单位 的 分 子 从 这 个 串联 体 上 切 下 ,切断 的 方式 将 在 后 面 介 绍 。 T7 噬菌体 的 成 熟 T7 DNA 包装 到 鸣 菌 体 中 的 过 程 与 T4 DNA 的 包装 过 程 很 不 相同 ,例如 ，(《1) T7 DNA 也 有 未 端 宛 余 现象 ,但 是 没有 环 状 化 互 换 排列 现象 ;〈2) 凡 具 有 遗传 缺失 的 突变 HK 唉 菌 体 所 含 的 DNA 少 于 野生 型 吻 菌 体 的 。T7 成 熟 的 机 理 尚 不 清楚 ， 但 有 人 提出 一 0 方案 〈 见 图 15-26)， 其 要 点 是 通过 在 3'-OH 及 5-P 终端 产生 一 个 缺 刻 nick), 串 联 fk LA) DNA 对 一 些 酶 的 作用 变 得 敏感 。 这 些 酶 可 以 形成 在 T7 RRR CAEL Bley 有 平整 未 端 (blunt-ended) 的 末端 宛 余 的 DNA 分 子 。 关于 17 头 部 、T7 尾部 的 形成 以 及 T7 体外 装配 的 详细 过 程 已 经 了 解 清楚 ， 可 以 阅读 本 章 未 列 出 的 参考 文献 。 Doe es se 了 和 3 外 SN Il. 延长 并 取代 5 3， I. 两 个 相 邻 的 单位 分 离开 来 WV. 3' 未 端的 延 伟 天 图 15-26 从 串联 体 上 产生 出 成 获 的 T7 _DNA- 的 假设 图 解 。 三 处 碱 基 配 对 区 表示 三 个 宛 余 的 DNA 区 域 。 步 又 如 下 : |. 在 每 一 个 元 余 区 的 末端 形成 缺 刻 ,产生 出 两 个 3-OH 末端 IIL. DNA 聚合 酶 将 核 背 酸 加 到 由 缺 刻 作用 而 生成 的 3 未 端 上 ， 取 代 原 先 的 5 未 端 亲 代 链 。III. 当 上 述 取 代 反 应 进行 到 第 二 个 缺 刻 时 ,两 个 双 链 片 眉 就 分 离开 来 产生 一 个 完全 的 子 代 分 子 。IV. 另 一 个 尚 不 完全 的 子 代 分 子 的 3 末端 由 DNA 聚合 酶 进行 延展 ， 最 后 形成 第 二 个 完全 的 子 代 分 子 (由 I. D. Watson 提出 的 模型 )。 两 种 枯草 杆菌 噬菌体 这 两 种 噬菌体 ，PBS-2 和 SPOIL, RAMESH T4、T7 相关 的 有 趣 的 调节 性 能 ,下 面 我 们 将 简 述 之 。 as PBS-2: 不 需要 宿主 的 聚合 酶 到 目前 为 止 , 我 们 讨论 的 叹 菌 体 由 于 在 感染 时 没有 其 他 RNA 聚合 酶 ， 所 以 都 要 利 用 宿主 的 RNA 聚合 酶 来 起 始 转录 作用 。 对 于 一 个 唉 菌 体 来 说 必须 建立 起 一 套 转 录 体 系 使 本 身 的 DNA 比 宿主 DNA 得 到 优先 转录 。 一 般 ， 是 合成 一 个 新 的 RNA RAK 〈《IT7) 和 /或 修饰 宿主 的 RNA RAS (T4 和 T7)。 (HMA (Bacillus su- btilis) Wit PBS-2 则 有 不 同 的 机 理 。 它 合成 一 个 专 一 于 鸣 菌 体 的 RNA 聚合 酶 ， 该 酶 被 包装 在 噬菌体 头 部 并 与 吻 菌 体 DNA 一 起 注射 到 宿主 细胞 中 , 这 种 现象 在 噬菌体 中 很 少见 到 ,但 正如 将 在 第 二 十 一 章 中 所 述 ,这 种 情况 在 动物 病毒 中 并 不 罕见 mi His SPO 1 iT EA SPO] 的 调节 过 程 兼 有 T4 和 T7 的 特点 。 它 有 起 始 于 三 组 AAAS pl, pl, pl 的 三 类 SPO 1 RR. MEA RA RNA 聚合 酶 是 一 种 与 大 肠 杆菌 的 聚合 酶 类 似 的 多 亚 基 蛋白 质 , 它 不 从 pI 或 pill 而 只 从 pl 开始 转录 。 基 因 28 的 蛋白 产物 是 由 转录 子 I 翻译 而 得 。 它 是 一 种 因子 ， 可 以 取代 宿主 酶 上 的 “ 亚 基 。 被 基因 28 产 物 修饰 过 的 RNA 聚 合 酶 不 能 再 在 宿主 的 启动 子 和 枯草 芽孢 杆菌 吧 菌 体 的 pl 处 起 作用 ,但 它 可 在 pI 处 起 始 转录 。 另 外 两 种 蛋白 质 , 基 因 33 和 基因 34 的 蛋白 产物 是 从 转录 子 开 转 译 的 。 它 们 在 -起 可 以 取代 基因 28 的 蛋白 产物 的 作用 。 而 形成 第 二 个 修饰 过 的 RNA 聚合 酶 ,仅仅 能 在 pill 处 起 始 转录 。 通 过 这 些 RNA RAMMED 即 5 亚 基 ) 的 顺 次 级 联合 成 ,使 噬菌体 得 到 了 一 个 早 \ 中 、 晚 期 mRNA 的 有 序 合成 程序 。 大 肠 杆菌 1 噬菌体 大 肠 杆 菌 2 吻 菌 体 〈 见 图 15-27) 有 两 种 交替 的 生活 周期 , 即 裂解 与 溶 源 。 本 章 我 们 仅 研 究 裂 解 , 溶 源 周期 将 在 第 十 六 章 讨 论 。 目前 ， 2 喉 菌 体 可 能 是 研究 得 最 透彻 的 双 链 DNA WREST ,尤其 是 关于 它 的 转录 的 调节 过 程 的 精巧 方式 。 对 1 鸣 菌 体 的 详细 研究 已 对 分 子 生物 学 的 发 展 做 出 了 许多 重大 贡献 。 此 处 仅 举 几 个 例 子 , 如 双向 复制 、 转 录 终 止 、Rho 蛋白 、 抗 终止 蛋 白 、DNA 连接 酶 、DNA 解 旋 酶 〈gyrase)、 位 点 专 一 的 重组 (site-specific recombination)、 环 KK DNA 分子、 断裂 和 再 接合 遗传 重组 的 (break ， and rejoin genetic recombination), SOS 修复 等 的 发 现 。 进 一 步 ，1 RAE ATI Te 许多 其 他 生物 学 过 程 的 体系 。 15=27 A, i EPR PSF, BEI FAK Robley a wie Eel DNA Poe is . Williams 提供 )。 4 wie a SF cla Se HO (# To 3)， 分 子 量 为 31 X 10° (50 000 碱 基 对 )， 是 双 链 DNA FT. KH DNA 分 子 具 有 特殊 结构 一 一 在 双 链 分 子 的 两 端 ，5 未 端 比 3 末端 多 12 个 碱 基 。 两 个 单 链 末 端 区 域 粘性 末 端的 碱 基 顺 序 是 彼此 互补 的 ( 见 图 15-28)。 因 此 ,通过 这 两 个 单 链 未 端 形成 碱 基 对 ,线性 DNA 分 子 可 以 环 化 ,产生 含有 两 个 单 链 缺口 的 不 闭合 环 。 在 此 环 化 过 程 中 ,新 形成 的 双 链 区 中 不 缺失 任何 碱 基 ，DNA 连接 酶 可 将 其 转变 为 共 价 的 闭合 环 。 这 个 环 化 过 程 在 实 验 室 条 件 下 很 易 进行 ,在 被 感染 的 细菌 中 亦 可 按 下 述 时 间 顺 序 进行 (37sC ,分 钟 ): t= 0， 鸣 菌 体 吸附 ,线性 DNA 分 子 注入 。 t= 1 一 2， 不 闭合 环形 成 。 ; 一 3 一 6， 大 肠 杆菌 DNA 连接 酶 使 环 闭合 ,大 肠 杆菌 DNA 解 旋 酶 使 之 形成 超 蝶 2 a CCCGCCGCTGGA 3' | 一 一 一 一 一 一 一 =- 一 -= 一 一- 一 一 -p 5' Po —_———— 一 一 一 一 一 一 一 ‘ GGGRASRGACET es 3 II Trp. Xt i C Fr (b) 图 15-28 A mB DNA, (2) A MRR RDNA 分 子 的 线性 图 式 * 示 出 互补 的 单 链 末 端 (粘性 末 Yao 注意 ，12 a 10 SEG aR Co Cb) 通过 粘性 末端 中 的 碱 基 进 行 配 对 ， 使 线性 分 子 发 生 环 化 作用 。 新 形成 的 双 链 区 叫做 cos Ko 旋 。 4 基因 的 构造 和 调节 位 点 现在 已 鉴定 出 46 个 1 基因 ,其 中 有 14 个 对 裂解 过 程 是 非 必需 的 ,只 有 7 SER 解 和 溶 源 两 者 都 是 非 必 需 的 。 通 过 凝 胶 电 泳 ;已 分 离 或 纯化 了 大 部 分 1 蛋白 质 。 2. DNA 的 许多 区 域 及 大 部 分 调节 位 点 启动 子 以 及 终止 位 点 的 碱 基 序 列 已 经 测定 出 来 ,从 蛋白 质 和 DNA 分 子 的 大 小 来 估计 可 以 知道 ,被 人 们 鉴定 过 的 基因 已 占 全 部 基因 的 90 多 。 1 鸣 菌 体 的 遗传 学 图 谱 见 图 15-29。 待 讨论 过 溶 源 过 程 之 后 ,就 可 以 理解 该 图 谱 。 它 通常 被 画 为 环形 。 和 鸣 菌 体 T7 一 样 ，) 噬菌体 的 基因 也 按 功能 聚集 成 笠 ， 如 头 、 尾 、 复 制 和 重组 基因 分 别 地 形成 四 个 不 同 的 基因 簇 。 许 多 1 鸣 菌 体 蛋白 质 , 例 如 调节 蛋白 以 及 与 DNA 合成 有 关 和 蛋白 质 ,在 DNA 上 的 特定 部 位 起 作用 。 一 般 说 来 ,编码 这 些 蛋白 质 的 区 域 都 相 邻 于 它们 的 作用 位 点 ( 当 只 有 一 个 作用 位 点 时 ) ,例如 , DNA 复制 起 始点 〈origin) 处 在 基因 0 的 编码 序列 中 ,而 基因 0 就 是 DNA 复制 起 始 蛋 白 的 基因 。 裂解 周期 的 时 间 顺 序 1 裂解 周期 的 时 间 过 程 极 其 复杂 ， 这 很 可 能 是 由 于 某 些 基因 既 用 于 有 裂解 又 用 于 溶 源 所 致 大 致 顺序 如 下 (37*%cC ,分 钟 ): : 一 0 鸣 菌 体 吸附 和 DNA 注入 。 1 一 3 前 早期 mRNA 合成 ( 即 pre-early， 第 一 个 mRNA 的 合成 )e :一 25 早期 mRNA 合成 (两 类 早期 MRNA 合成 )。 t= 6 DNA 复制 开始 。 裂解 ”成 部 -区 一 2 晚期 控制 oR A 图 15-29 图 菌 体 的 遗传 学 图 谱 。 图 中 调节 基因 及 调节 功能 的 下 面 用 一 小 横 线 表示 。 图 中 并 未 显示 所 有 的 基因 。 主 要 的 调节 位 点 用 黑色 圆 点 表示 。 对 于 洲 菌 和 溶 源 两 个 循环 均 不 重要 的 _DNA 区 域 用 粗 黑 线 表示 。 1 一 Hei mRNA 合成 开始 。 t= 10 结构 蛋白 开始 生成 。 t= 22 第 一 个 噬菌体 颗粒 完成 。 :一 45 裂解 和 释放 子 代 噬 菌 体 。 请 注意 ,循环 周期 为 45 分 钟 , 而 T4 和 T7 是 22 一 25 分 钟 。 这 段 时 间 较 长 ,反映 出 具有 两 种 交替 的 生活 周期 的 噬菌体 需要 有 较为 复杂 的 调控 途径 。 维持 宿主 体系 完整 性 的 必要 条 件 T4 和 IT7 生活 周期 的 一 个 基本 特征 就 是 迅速 杀 死 宿主 并 溶解 宿主 DNA, ffi Ve RAAT ,在 其 溶 源 周 期 中 ,其 宿主 必须 存活 下 去 。 确 实 有 1 的 基因 产物 缓慢 地 减弱 宿 主 大 分 子 的 合成 进而 杀 死 宿主 细胞 ,但 这 些 产 物 是 非 必需 的 , 即 ， 若 这 些 1 的 基因 在 遗传 学 上 缺失 , 1 仍然 能 正常 地 发 育 ， 其 爆破 值 (burst size， 见 图 15-6) 也 并 不 明显 地 减少 《这 些 基 因 产 物 是 如 何 工作 的 ?在 2 的 生活 周期 中 有 何 作用 尚 不 清楚 ,本 书 不 做 讨论 )。 最 后 ,裂解 相 〈lytic phase) 中 受 感 染 的 细胞 的 DNA 复制 系统 被 破坏 的 结果 就 是 细胞 死亡 并 裂解。 本 章 后 面 我 们 还 将 讨论 一 种 噬菌体 〈M137)， 它 由 被 感染 的 细胞 连续 地 生成 ,但 它 永 不 杀 死 该 细菌 ;所 以 ,宿主 细胞 甚至 可 以 成 为 产生 鸣 菌 体 的 机 器 ， 而 不 丧失 其 本 身 人 存活 与 复制 能 力 。 2 的 转录 顺序 在 前 述 的 噬菌体 中 ， 各 种 mRNA 分 子 的 合成 时 间 主要 由 决定 可 以 供给 多 少 个 启动 。74 ， 子 的 机 理 所 限 定 , 即 由 新 的 RNA 聚合 酶 的 合成 宿主 RNA 聚合 酶 的 修饰 或 启动 子 进 入 宿主 细胞 内 的 时 间 等 决定 。 在 2 中 ,宿主 的 _RNA_ 聚合 酶 亦 被 修饰 ,但 不 是 为 了 去 识别 鸣 茵 体 的 启动 子 , 而 是 修饰 作用 使 得 聚合 酶 能 通过 终止 位 点 上 事实 上 ,晚期 mRNA 合成 受 阻 ( 延 滞 ) 的 主要 原因 是 转录 和 翻译 编码 抗 终止 蛋白 的 基因 需要 一 定时 间 。 图 15-30 是 1 的 遗传 学 图 谱 ;, 它 包括 三 个 调节 基因 : crov N MQ; 三 个 启动 子 ， PL\pR 和 pR2; 五 个 终止 位 点 : tL1,tR1,\tR2,tR3 Al tR4; 七 个 mRNA 分 子 。 其 中 工 和 有 R 系列 分 别 从 互 补 的 双 链 DNA 分 子 左 向 和 右 向 转录 ,希望 读者 在 下 面 的 讨论 中 参考 图 15-30。 既然 不 需要 宿主 丧失 功能 ( 见 前 面 )， 可 预见 转录 的 方式 如 下 。 首 先是 O、P 基因 被 转录 ,它们 的 产物 为 DNA 合成 所 必需 ,接着 是 转录 编码 结构 蛋白 的 基因 ,最 后 是 产生 包 装 体系 和 裂解 蛋白 。 以 上 这 些 是 最 基本 的 ,同时 形成 另外 一 些小 转录 子 ;, 它 们 分 别 编码 一 些 调节 蛋白 ,使 转录 在 适当 时 候 开 启 或 停止 ,起 到 修饰 作用 。 转录 序列 见 下 文 ,下 面 基因 、 位 点 、mRNA 分 子 的 意义 见 图 15-30 和 表 15-6。 在 相 同 的 或 接近 的 时 间 的 开始 的 两 个 过 程 , 使 用 相同 的 数字 ,如 LA 和 1B。 aie i a a EL | Sar or cers a ~ att int xis red NY ff cry tha en OP Q Y 晚 基 因 tLi nutL pLoR oRpR nutR tRi tR2 tR3 pR2 tR4 L1 R1 (qut) ee ee ee ee ee a ee ee ee 一 = 一 一 一 一 -一 一 一 >- -一 一 一 一 一 二 = ed _—————— L2 - R2 - _ R3 R4 15-30 AMARKHI PA AOMEL A. LASER LE ASESR Pe be 虚线 箭头 表示 N 和 蛋白 、Cro 蛋白 \Q 蛋 白 的 作用 位 点 。mRNA- 分 子 用 虚线 表示 。 表 15-6 1 噬菌体 中 的 某 些 位 点 及 某 些 基 因 位 点 或 基因 产物 Hi 述 位 点 : oL,oR 左 向 或 右 向 操纵 子 pL, pR 左 向 或 右 向 启动 子 tL(1, 2) 左 向 转录 作用 的 终止 位 点 tR(1,2,3,4, 5) 右 向 转录 作用 的 终止 位 点 EAD: Cro 蛋白 对 于 由 pL 和 PR 开始 的 转录 过 程 进 行 抑制 的 蛋白 质 ell 蛋白 推迟 晚 转 录 的 蛋白 质 (在 溶 源 途径 中 起 其 他 的 作用 ， 如 十 六 章 所 述 ) N 蛋白 抗 终止 作用 的 蛋白 质 ? 作 用 于 tL1，tR1 及 tR2 OP 和 蛋白 DNA 复制 所 需要 的 蛋白 质 Q 蛋白 抗 终止 作用 的 和 蛋白质, 作 用 于 tR4 R 右 向 合成 出 的 mRNA L 左 向 合成 出 的 mRNA R4 构造 型 合成 的 mRNA 1A. RRF LI 的 合成 。 起 始 于 启动 子 PL， 终 止 于 位 点 tL1。 此 转录 子 只 编码 基 因 N 的 蛋白 ,N 蛋白 是 一 个 允许 DNA 的 某 些 区 域 转录 的 正 调 节 因子 。 1B. 转录 子 RI 的 合成 。 起 始 于 启动 子 pR， 终 正 于 位 点 tR1, A Cro 编码 Cro 蛋白 , Cre 蛋白 是 一 个 负 调 节 因子 , 它 最 终 关闭 从 pL 和 从 pR 起 始 的 转录 。 2. 转录 子 R2 的 合成 。 疏 1 是 一 个 弱 的 终止 位 点 , 约 有 一 半 的 转录 子 RL mRNA 一 直 延 伸 到 终止 位 点 tR2 处 才 停 止 转录 。Cro 蛋白 (功能 见 4) 从 这 两 类 mRNA 分 子 上 转译 出 来 。 不 在 RI 内 的 R2 部 分 包含 着 基因 O 及 基因 P， 它 们 的 产物 在 DNA 复制 中 是 必需 的 ，O\ 了 的 产物 在 此 时 由 了 2 转译 出 来 ,但 它们 的 浓度 只 够 DNA 复制 一 次 所 用 。 | 3A. 在 tL] 位 点 上 的 抗 终止 作用 和 转录 子 L2 的 合成 。 基 因 N 蛋 白 一 且 被 合成 ,就 与 一 个 宿主 蛋 自 质 ( 称 作 NasA BA) 结合 到 一 起 ,去 修饰 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 ,使 之 不 在 (Ll 处 终止 。 这 样 ， 转 录 子 LI 不 再 生成 ， 但 可 延伸 而 形成 转录 子 L2, L2 mRNANA 转 译 , 产 生出 几 种 蛋白 产物 ,它们 都 是 非 必需 的 ,但 使 得 形成 叹 菌 体 的 效率 更 高 ,这 些 蛋 白质 的 功能 尚 不 清楚 。 对 N 蛋白 所 参与 的 抗 终 止 作 用 的 机 理 的 探讨 仍 为 一 个 活路 的 研 究 令 域 。 这 时 显然 还 需要 ) DNA 上 的 一 个 被 称 为 nut AIL (N-utilization), 5NEA 的 利用 有 关 , 此 位 点 处 于 pL 的 “下 游 ”(down stream)。 尽 管 目前 的 证 据 很 少 ,但 是 N 蛋 白 有 可 能 结合 在 nut 位 点 上 ,在 RNA 聚合 酶 沿 着 DNA 分 子 运动 ,形成 转录 子 L1 和 转录 子 R1 时 ,被 RNA 聚合 酶 识别 出 来 。 3B. 在 终止 位 点 tR1 处 和 终止 位 点 tR2 处 的 抗 终止 作用 、 转 录 子 R3 的 合成 及 DNA 复制 蛋白 的 产生 。N 蛋白 一 旦 合成 ,被 修饰 过 的 RNA 聚合 酶 就 不 再 在 tR1 处 终 止 , 也 不 再 形成 转录 子 Ri, RNA 聚合 酶 也 越过 tR2 位 点 ， 而 延长 转录 子 R2， 使 它 在 终止 位 点 tR3 处 停止 ,形成 转录 子 R3。 即 使 RNA 聚合 酶 被 修饰 , 它 也 得 在 户 3 处 停 IER (R3 位 点 对 于 N 蛋白 的 抗 终止 效应 不 敏感 ，R3 的 合成 提供 足够 的 mRNA, 使 0、B 蛋白 的 浓度 足以 用 于 DNA 的 复制 。cII 蛋白 也 是 由 转录 子 R2 和 转录 子 R3 翻 译 出 来 的 蛋白 质 , 其 功能 是 延迟 晚期 mRNA 的 合成 。 4. 关闭 转录 子 L2 的 合成 。 当前 面 的 现象 发 生 时 ，Cro 蛋白 的 浓度 已 经 开始 增加 。 Cro 蛋白 为 一 种 阻 歇 蛋 白 ， 它 结合 到 左 向 操纵 子 oL 上 ，, 阻 断 从 左 向 启动 子 pL 处 开始 的 转录 。 因 此 ,在 这 一 时 刻 , 已 形成 足够 量 的 N 蛋白 ， 不 再 需要 转录 子 L1 及 工 2?， 也 就 不 再 去 合成 L1 及 L2 To SA. 开 闭 转录 子 R3 的 合成 。Cro BANE pL 的 转录 后 不 久 ，Cro BA 浓度 增 到 一 定 程度 ,使 得 操纵 子 oR 也 被 占据 ， 从 而 阻 断 了 由 右 向 启动 子 pR 处 开始 的 转录 子 - R3 的 合成 。 由 于 有 足够 量 的 R3 所 编码 的 蛋白 质 ,所 以 终止 是 很 完全 的 。 5B. 从 转录 子 R3 翻译 出 基因 Q 蛋白 产物 和 晚期 mRNA 的 合成 。 从 感染 时 刻 起 ， 微量 的 转录 子 R4 就 已 开始 连续 不 断 地 合成 , 它 从 右 向 启动 子 PR2 处 开始 ,到 终止 位 点 tR4 处 停止 。 这 个 转录 子 不 编码 任何 已 知 的 基因 产物 。 但 为 晚期 mRNA 编 一 个 前 导 序 列 (leader)。 一 旦 转录 子 R3 开始 形成 ( 见 3), 立即 就 生成 基因 Q 蛋白 的 产物 。 WHE 关系 到 晚期 mRNA 的 合成 ,而 晚期 mRNA 又 编码 结构 蛋白 质 、\ 装 配 蛋白 \ 成 熟 体系 以 及 裂解 酶 。Q 蛋白 也 是 一 个 抗 终 止 因子 , 它 作用 于 qu 位 点 ,使 大 肠 杆菌 的 RNA Rie 不 在 iR4 处 终止 转录 ,因此 转录 子 R4 延伸 形成 转录 子 R5, 即 晚期 mRNA。 ea 7T6 。 6 BA SSS AY BS 8 由 于 OP 和 Q 基 因 的 产物 是 由 同一 个 转录 子 〈R3) 产生 的 , 很 重要 的 一 点 就 是 在 产生 大 量 的 DNA 复制 蛋白 之 前 ， 晚期 蛋白 《例如 构成 DNA 包装 体系 的 一 些 蛋 白质 )， 是 不 会 合成 出 来 的 。 调 控 因 子 将 DNA 复制 的 时 间 与 晚期 mRNA 翻译 产生 活化 因子 的 时 间 区 分 开 来 。 这 些 调节 因子 有 以 下 四 个 特点 : 1. 某 些 OP 基因 的 产物 是 从 转录 子 R2 转译 而 得 ,使 DNA 复制 有 一 个 小 的 头 部 起 点 。 2. Q 基 因 产 物 的 形成 及 Q 蛋白 积累 到 足以 发 生 抗 终 止 作用 的 浓度 是 需要 一 定时 间 的 ;在 此 期 间 之 内 ,领先 发 生 的 是 复制 作用 。 3. 转录 了 予 RS 的 合成 被 基因 cll 蛋白 所 延 滞 (途径 不 明 )o* 4. 晚期 转录 子 很 长 并 含有 许多 顺 反 子 , 因 此 ,需要 几 分 钟 来 完成 其 合成 。 基 因 处 于 下 游 时 ， 它 们 的 翻译 过 程 比 上 游 的 晚 几 分 钟 开 始 。 最 后 ， 装 配 头 部 的 和 切断 2&DNA 进行 包 装 的 体系 都 十 分 复杂 ,这 些 过程 都 是 很 耗 时 的 ; 另外 ,裂解 酶 效率 极 低 , 需 达到 足够 高 的 浓 度 才 能 使 裂解 发 生 。 总 之 ,需要 大 量 的 晚期 mRNA 所 编码 的 结构 蛋白 质 。 因此 ， 震 需 使 晚期 mRNA 合 成 高 速度 进行 ， 就 必须 解除 cll 蛋白 对 Q 蛋白 介 导 的 抗 终止 作用 的 抑制 。 这 可 以 由 Cro 蛋白 通过 关闭 转录 子 R3 的 合成 作用 来 实现 〈 见 前 面 5A)。 R3 编码 cll BA HL 于 mRNA 是 不 稳定 的 ， 在 几 分钟 之 内 就 不 再 有 供 cll 蛋白 合成 的 模板 存在 。 这 个 蛋 白质 是 短 寿 命 的 。 一 旦 停止 合成 转录 子 R3, cll 蛋白 的 浓度 就 迅速 降低 。 FE, OF 白 参与 的 抗 终止 作用 不 再 受 抑制 , 晚期 mRNA 合成 就 开始 (实际 上 ，cH 蛋白 的 延迟 对 cll 突变 株 形 成 吻 菌 斑 并 不 重要 。 然而 ， 这 些 突变 株 的 裂解 比 野 生 型 鸣 有 而 且 只 产生 约 为 噬菌体 正常 数目 一 半 的 子 代 )。 产生 大 量 晚期 mRNA 需要 进行 DNA 的 复制 ,但 与 噬菌体 T4 的 情况 相反 ， 这 仅 仅 是 个 “基因 剂量 ”(gene dosage) 效应 ,一旦 形成 了 OP 基因 的 蛋白 产物 ，DNA 的 复 制 就 开始 。 复 制作 用 不 仅 为 新 噬菌体 准备 子 代 DNA 分 子 , 而 且 也 扩 增 RNA 聚合 酶 的 作用 模板 一 晚期 基因 。 因 此 ,当头 、 尾 和 其 他 颗粒 的 组 分 开始 合成 时 ， 由 于 DNA 模 板 数 目的 增加 ， 使 晚期 mRNA 的 合成 速度 〈 用 每 分 钟 的 分 子 数 来 测量 ) 也 增加 了 。 于 是 随 着 转录 作用 的 增强 ， 就 加 快 了 噬菌体 结构 成 分 的 合成 速度 ， 从 而 加 速 哦 菌 体 的 装配 速度 。 裂解 周期 中 / 转录 的 小 结 让 我 们 回顾 这 个 精致 的 调控 体系 的 重要 特点 。 很 重要 的 一 点 是 没有 使 用 1 的 专 一 性 的 RNA RSM; 而 是 在 全 部 生活 周期 中 一 直 使 用 大 肠 杆菌 的 RNA 聚合 酶 ( 同 T4 一 样 ) 并 且 通 过 附加 蛋白 质 对 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 进行 修饰 ， 改 变 此 聚合 酶 对 于 各 种 DNA 碱 基 序列 的 专 一 性 。 然 而 ,在 任何 时 候 此 酶 对 于 启动 子 的 活性 也 不 被 修饰 , REE 对 某 些 特定 的 终止 位 点 的 识别 ， 即 接受 对 转录 的 终止 信号 的 能 力 受到 破坏 。 转 录 作用 被 阻止 是 Cro 蛋白 发 挥 其 阻 遏 活性 的 后 果 。 而 不 是 Cro 蛋白 对 RNA 聚合 酶 有 什么 直接 的 作用 。 通 过 标准 的 阻 歇 作 用 ， 鸣 菌 体 不 能 再 使 用 启动 子 pL 和 pR。 1DNA 上 特定 2 ag 2 区 域 开始 转录 的 时 间 是 由 下 面 几 个 需要 时 间 的 过 程 所 决定 的 : CL) 对 基因 N 及 基因 Q 的 ' 蛋白 产物 的 转录 及 翻译 过 程 ; 〈2) Cro 蛋白 对 cll 蛋白 合成 的 阻 断 过 程 ; G) 残存 的 ， cll 蛋白 的 降解 过 程 ; Cro 蛋白 的 抑制 活性 避免 了 浪费 性 的 合成 。 最 后 一 点 ,由 于 一 个 巨大 的 mRNA 分 子 编码 所 有 的 结构 成 分 ,这 些 成 分 还 将 被 依次 地 转译 ,这 个 全 成 分 的 mRNA 的 合成 也 需要 很 多 分 钟 。 因 而 ,完整 的 头 部 的 合成 及 有 功能 的 噬菌体 成 熟 体系 的 合成 ,都 推迟 到 DNA 复制 体系 可 提供 出 足够 多 的 1DNA 拷贝 数 时 才能 完成 。 延 滞 作 用 的 结果 使 噬菌体 在 成 熟 体系 建立 之 前 形成 约 30 个 拷贝 的 ADNA, 并 使 宿主 细胞 在 它 遭 到 有 裂解 ， 之 前 已 形成 约 100 个 完整 的 吻 菌 体 颗粒 。 DNA 复制 和 成 熟 : 偶 联 过 程 OP 基因 的 产物 合成 后 , 环 状 的 4 DNA 开始 复制 , DNA 复制 有 两 种 模式 ， 即 8 Ae il MAAK Bil (A 15-31， 也 见 第 八 章 )。 9 模式 增加 了 转录 的 和 进一步 复制 的 模 板 数 。 滚 环 模式 提供 出 大 量 的 \ 形 成 子 代 噬菌体 的 DNA。 当 进行 生活 周期 的 循环 时 ,8 式 复制 停止 ， 滚 环 式 复制 成 为 主要 形式 。 对 于 6 模式 已 经 了 解 得 很 多 了 。 事 实 上 ， 对 于 6 式 分 子 的 分 析 为 在 所 有 的 有 机 体内 的 复制 叉 的 双向 移动 提供 了 第 一 个 证 据 ( 图 15-31 见 第 八 章 )。 复 制 起 点 的 碱 基 序列 已 被 测定 。 起 点 中 有 很 高 的 A 十 工 含量 ， 可 能 有 不 寻 委 的 结构 。 与 复制 起 始 作 用 有 关 的 早期 现象 是 在 复制 起 点 处 发 生 单 链 断裂 。 oe al 图 15-31 ADNA ZERAFPEN FEES MER. A TE YH Hh AE AB SC PRL 部 中 存在 的 线性 DNA 分 子 的 末端 ) 被 称 为 “os〈 即 指 粘性 末端 )。 有 关 滚 环 式 复制 作用 的 知识 以 及 这 种 复制 是 如 何 起 始 的 ， 目 前 知道 的 比 8 式 的 要 少 得 多 。 由 于 IDNA 的 切割 机 理 和 前 面 已 经 讨论 过 的 其 他 噬菌体 的 不 同 ， 因 而 对 我 们 来 说 ,这 部 分 要 讨论 的 最 重要 的 一 点 ,就 是 1DNA 的 复制 作用 与 噬菌体 成 熟 作用 之 间 的 关 系 。 EA 鸣 菌 体 颗粒 中 见 到 的 DNA 是 线性 的 ,有 单 链 的 未 端的 分 子 。 当 形成 环 状 DNA 时 ,这 些 单 链 末 端 相互 连接 ,如 此 形成 的 双 链 区 叫 粘性 位 点 (cohesive site)。 所 以 ， 每 一 个 单 体 的 1 环 含有 一 个 cos 位 点 ;而 一 个 多 体 的 滚 环 分 支 则 含有 许多 个 cos 位 点 。 在 1 WEEE BURL, DNA 分 子 的 末端 总 是 单 链 的 末端 ， 所 以 一 定 存在 着 一 种 机 理 来 对 cos 位 点 切割 ,产生 出 这 些 单 链 未 端 。 有 两 种 可 能 的 切割 方式 ; 按 位 点 专 一 性 的 方 式 切割 和 按 测量 长 度 进行 切割 的 两 种 体系 。 因 为 切割 精确 性 的 要 求 太 苛刻 〈 测 量 一 个 具 有 50 000 碱 基 对 的 DNA 分 子 , 要 求 精确 到 1 个 碱 基 , 所 以 用 第 二 种 方式 立即 去 识别 出 切割 点 进行 切割 , 看 来 是 不 可 能 的 。 又 通过 观察 4 突变 体 的 不 同 长 度 的 DNA 的 包装 效 es。 78° 率 , 也 认为 第 二 种 方式 是 不 可 能 的 ,因为 只 有 DNA 长 度 不 小 于 正常 1DNA KEE 73%, 或 不 大 于 正常 1 DNA 长 度 107 狗 ,并 且 其 单 链 未 端 为 与 正常 大 小 的 DNA 的 未 端的 碱 基 序列 相同 的 ，DNA 才能 够 被 有 效 地 包装 到 噬菌体 头 部 。 因 此 ， 似乎 位 点 - 专 一 性 的 切割 体系 是 更 可 能 存在 的 方式 ,这 种 体系 被 称 之 为 终止 酶 (terminase) 或 终止 体系 (ter syst- em),， 这 种 _ DNA- 切 割 就 被 称 为 终端 切割 (ter-cutting)。 15-31 示 出 了 三 种 主要 的 细胞 内 的 1DNA- 环 状 分 子 \ 6 式 分 子 及 滚 环 式 分 子 。 随 着 时 间 发 展 , 鸣 菌 体 的 头 部 及 尾部 已 经 合成 ，Ter 体系 被 活化 , 滚 环 式 复制 就 成 为 主要 的 方式 。 因 为 潜 环 有 两 类 粘性 位 点 一 一 类 在 环 中 , 另 一 类 在 线性 分 支 中 ,必然 地 存在 着 某 些 方式 以 避免 切 开 在 环 中 的 那 种 粘性 位 点 。 如 果 环 中 的 粘性 位 点 被 打 断 ， 那 么 复制 作用 “就 要 被 中 止 。 这 个 难题 通过 Ter 体系 对 位 点 的 要 求 而 克服 了 , 即 只 有 单个 cos 位 点 时 并 不 发 生 有 效 的 切割 ;但 如 果 存 在 着 两 个 cos 位 点 ,而 且 它们 都 在 同一 个 DNA 片 朋 上 ; 那 委 切 割 就 可 能 发 生 。 切割 两 个 相 邻 的 粘性 位 点 ， 可 以 从 aDNA 的 线性 分 支 上 切 下 一 个 MDNA 分 子 ; 但 是 如 果 这 一 对 切 点 ,一 个 处 于 线性 分 支 中 ,一 个 处 于 环 中 , 则 不 可 能 切 出 一 个 IDNA 分 子 。 虽 然 对 于 形成 一 个 切割 并 不 需要 IDNA 分 子 一 定 是 线性 的 ,因为 单个 的 1 单位 也 能 从 在 遗传 重组 作用 中 已 经 形成 的 二 聚 体 的 环 状 分 子 上 切 下 来 ， 但 是 在 单 体 的 环 状 分 子 中 决 不 会 发 生 切 割 。 两 个 cos 位 点 ”的 规则 解释 了 为 什么 第 1 个 1DNA 单位 一 定 是 从 深 环 的 串联 分 支 上 切 下 来 的 ,然而 ,这 个 规则 并 没有 人 允许 切除 第 2 个 〈 即 相 邻 的 那个 ) 1 单位。 因为 第 2 个 单位 只 有 一 头 有 一 个 粘性 位 点 , 另 一 头 是 一 个 游离 的 粘性 未 端 ， 因此 这 份 DNA 只 有 一 半 是 可 用 的 ， 因 为 只 有 交错 着 的 DNA 片段 才能 被 包 装 〈 见 图 15-32)。 这 个 过 程 是 不 经 济 的 ， 其 实 ， 游 离 的 粘性 未 端 再 加 上 相 邻 的 cos 位 点 也 足够 发 生 DNA 切割 , 并 且 这 样 的 切割 还 可 以 顺序 地 进行 包装 。 因 此 ， 可 能 存在 着 精确 的 终 端 切割 规则 。 | | Ter ; we BT 1 : : Sn 4 14H (1 cos) y 模式 工人 | | ie 活化 15 cos 位 点 噬菌体 3 = EB KD 模式 了 meade at) 1Ter 只 活化 成 对 的 cos 位 点 vy IE BR PE 图 15-32 包装 的 两 种 规则 : 第 I 种 模式 中 每 一 个 1 单位 都 被 包装 。 第 II 种 模式 是 较 受 限制 的 模式 , 带 有 交错 末端 片 妇 的 单位 (3) 才 被 包装 。; 其 中 第 一 种 模式 较为 经 济 , 和 噬菌体 使 用 的 是 第 一 种 。 图 15-33 中 给 出 的 一 个 精巧 的 实验 , 示 出 游离 的 末端 必然 是 接近 于 A 基 因 的 一 端 ( 见 2 79 图 15-29)*。 在 这 个 实验 中 , 先 制备 三 种 类 型 的 1DNA 分 子 ， 即 用 体外 的 粘性 未 端 连 接 法 , 将 或 者 是 两 个 完整 的 DNA 分 子 连接 (ID)， 或 者 是 一 个 完整 的 DNA 4 FH#E—-B 含有 基因 和 A 粘性 末端 的 DNA Fin (Dl 或 者 是 一 个 完整 的 DNA 分 子 连 上 一 段 含 有 基 AR 粘性 末端 的 片段 〈II) 这 类 片段 的 制备 法 是 : 先 将 完整 的 DNA 分 子 在 接近 中 央 处 切断 ,然后 将 带 有 特定 末端 的 片段 与 带 着 另 一 种 特定 末端 的 片段 分 离 , 从 而 获得 所 需要 的 片段 )。 这 些 分 子 在 了 基因 处 都 有 一 个 突变 ， 所 以 不 可 能 发 生 DNA SH, 将 具有 这 类 DNA 的 噬菌体 分 别 地 去 感染 三 份 大 肠 杆 菌 的 细菌 培养 液 。 在 感染 中 不 会 发 生 DNA 复制 作用 ,但 是 有 转录 作用 ,结果 合成 出 头 、 尾 及 Te 体系 的 成 分 。 如 果 Ter 体系 可 以 内 这 些 杂 交 分 子 上 切 下 ANA 单位 ， 那 么 就 会 产生 叹 菌 体 颗粒 ,其 结果 如 图 所 示 。 当 大 肠 杆 菌 细胞 受 二 聚 体 分 子 感染 ,或 受 带 有 游离 A 基 因 的 分 子 感染 ,都 能 产生 唉 菌 体 ; 而 用 仅仅 带 有 游离 R 未 端的 杂交 分 子 去 转 染 时 ， 不 产生 只 菌 体 。 这 个 实验 以 及 其 他 的 实验 指出 . 2DNA 本 TCM Ata, FEE R 端的 。 ol He R A cos ee PS 呈 + pee ne Wiad cae 3 a ee R A cos 一 一 一 一 一 一 一 十 eae a -_—>- 1 eS ER ae R cos ; mt beeen - 一 一 一 a WR 了- 大 1, ee 图 15-33 ”这 个 实验 表明 一 个 cos 位 点 和 一 个 游离 的 A 基 因 的 粘性 末端 对 于 Ter 系统 的 活性 -是 足够 的 。 粘 性 末端 用 小 竖 线 表 示 。 所 有 的 分 子 都 在 和 的 P 基因 中 有 一 个 突变 ,以 避免 DNA 复 Hl, RRMA RAS AMR DNA 的 感染 。 在 cos 位 点 的 切割 和 ADNA 的 包装 以 某 种 方式 相 偶 联 ， 事 实 上 如 果 Ter 蛋白 质 不 是 空 的 ALAA KD, PARAL Ter 体系 是 无 活性 的 。 因 此, 4A 菌 被 一 个 不 能 形成 完整 头 部 的 1 突变 体感 染 时 《例如 E ”突变 体 就 不 能 制造 主要 的 头 部 蛋白 )，DNA 次 动 环 的 线性 分 支 就 不 被 切断 。 在 这 样 的 突变 体系 中 ,只 有 两 个 cos 位 点 的 二 聚 体 间 样 地 也 不 能 被 切断 。 大 肠 杆 菌 噬菌体 由 174 以 下 多 方面 的 原因 表明 对 于 大 肠 杆 菌 %X174 的 研究 是 非常 重要 的 。4X174 是 人 们 * A 基因 及 及 基因 并 不 重要 ， 我 们 用 这 些 基因 的 符号 给 和 DNA 的 两 端 定名 ， Dil fe ERK Lid 边 时 混 ， oe « 80° 发 现 的 第 一 个 以 单 链 环 状 DNA 作为 遗传 物质 的 有 机 体 ; 该 DNA 是 第 一 个 能 在 体外 复 制 产 生 具 有 生物 活性 的 DNA， 并 且 通 过 对 该 DNA 复制 方式 的 研究 产生 了 DNA RH 复制 假说 ; 这 种 噬菌体 非常 小 ， 只 有 少数 几 个 基因 ， 而 且 是 相当 简单 的 〈 表 15-3); 对 $X174 噬菌体 DNA 的 碱 基 序 列 的 研究 以 及 对 其 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 的 研究 首次 指 出 基因 能 够 按 重 私 的 阅读 框架 被 翻译 等 。 Ait RMR 6X174 是 一 个 环 状 . 单 链 的 DNA 分 子 (图 15-34)。 15-34 ARR $X174 DNA HF. 此 照片 显示 的 是 用 电子 显微镜 所 看 到 的 最 初 的 单 链 DNA 分 子 ( 承 Albrecht kleinschmidt 提供 )。 CRA 5 386 个 核 音 酸 , 并 且 已 知 其 碱 基 序列 ， 这 个 DNA 分 子 被 包 在 一 个 由 三 种 外 壳 蛋 折 及 一 种 内 部 蛋白 组 成 的 .20 面体 的 头 部 中 《图 15—35), (a) 图 15-35 WEB PX174, (a) 电子 显微镜 图 ( 承 Robley williams 提供 )o (b) MEK PX174 颗粒 中 亚 基 (上 图 ) 和 放大 的 穗 状 区 域 ( 下 图 ) 的 示意 图 。 表明 了 基因 再 、 基 因 G 和 主要 的 外 壳 和 蛋白 的 基因 了 的 定位 排列 。 “ers Bash 表 15-7 Win SRA 由 X174 所 具有 的 11 个 基因 ， 而 且 每 个 基因 的 产物 都 已 被 分 离 出 来 ， 这 些 蛋 白质 所 含有 的 所 基 酸 总 数 超出 了 $X174 这 个 很 小 的 DNA 分 子 的 编码 容量 。 但 是 ,$X174 已 经 有 效 地 进化 ,产生 一 些 可 以 用 不 同 的 阅读 框架 进行 翻译 的 重 著 基因 ， 如 图 15-36 中 的 基因 图 所 示 。 例如 基因 了 3 和 蕊 分 别 被 包含 在 基因 A 和 基因 D 中 。 重 登 阅读 框架 是 如 何 进 行 翻 译 的 将 在 第 十 二 章 进 一 步 介 绍 。 表 15-7 mee %X174 基因 和 功能 基 因 功 能 > RF 复制 ?病毒 链 合成 e 关闭 宿主 的 DNA 合成 形成 衣 壳 (capsid) 形成 吻 菌 体 的 单位 长 度 的 DNA 形成 外 壳 的 | Be 主要 的 外 壳 蛋 白 〈coat protein) — 主要 的 突 穗 状 蛋 白 〈spike protein) 次 要 的 突 穗 状 蛋白 ; 对 宿主 的 吸附 BoE oF RDNAFAR RARE 未 知 。 > * Ae TODmmOO 台 A* 见 图 15-36。 图 15-36 pX174 的 遗传 图 谱 。 表 示 叹 菌 体 基 因 以 及 复制 和 转录 起 始 位 点 间隔 区 为 粗 黑 色 部 分 。 吸附 和 穿 透 与 那些 注射 时 才 把 蛋白 质 注 和 的 工 系 列 的 噬菌体 不 同 ,噬菌体 wX174 通过 突 穗 状 蛋 ， 白 〈spike protein) 先 吸附 到 大 肠 杆菌 上 (图 15-35)。%X174 的 末端 突 穗 状 蛋白 《基因 H 和 G 的 产物 ) 和 %X174 DNA 一 起 进入 细菌 中 , 它 ( 基 因 五 产物 ) 以 一 种 未 知 的 方式 发 生 ， 作用 ,使 细菌 转变 为 噬菌体 工厂 。 人 们 已 经 观察 到 一 些 被 称 为 导航 蛋白 (pilot protein) es。 82 。 WWE AES UNA A KB E/E AA RAK ABERKD FA RAL 理 , 因 此 人 们 假设 这 些 蛋白 质 通 过 某 种 方式 把 细菌 DNA 聚合 酶 引导 到 吻 菌 体 DNA 上 ， fA SME tk DNA 进 到 宿主 DNA 复制 装置 (replication apparatus) 上 。 虽然 这 种 功能 还 没有 实验 证 明 , 但 是 人 们 认为 这 种 功能 对 于 叹 菌 体 DNA 的 复制 速度 和 效率 是 必要 的 。 通过 这 样 的 速度 和 效率 ,小 的 鸣 获 体 DNA 分 子 才 得 以 和 大 大 过 量 的 细菌 DNA 分 村 进 行 竞争 。 %X174 DNA 不 注 和 细菌， 而 是 在 细胞 表面 释放 喉 菌 体 DNA, 因为 当 吻 菌 体 颗粒 吸附 到 细菌 上 的 短 时 间 内 ， 如 果 将 DNA 酶 加 入 到 这 个 细菌 -噬菌体 的 悬 笃 培养 被 Csus- pending medium) 中 ,噬菌体 DNA 将 被 降解 (对 于 任何 有 尾 的 吻 菌 体 来 说 ,其 DNA 并 A DNA 酶 消化 )o 外 壳 蛋 白 的 除去 和 亲 代 DNA 的 复制 是 互相 偶 联 的 .关于 DNA 外 壳 蛋白 除去 、DNA 分 子 转移 到 细胞 内 以 及 转移 过 程 中 的 复制 作用 等 的 机 理 目 前 尚 不 了 解 。 9X174DNA 的 复制 为 了 讨论 单 链 DNA 分 子 的 复制 ,将 使 用 下 面 这 些 专 有 名 词 。 病毒 颗粒 中 含有 的 以 及 任何 具有 相同 碱 基 序 列 的 DNA 链 都 称 为 (十 ) 链 ;具有 与 其 碱 基 序 列 互补 的 DNA 链 称 为 (一 ) 链 。RNA 是 从 DNA 《一 ) 链 转录 的 。 9X174 DNA 的 复制 包括 以 下 几 步 \ 表 15-8); 表 15-8 %X174 的 复制 环 步 mR It [AC St C 4E 33°C ) 事 件 SS—RF o—1 吸附 和 穿 透 ; 病毒 单 链 转变 为 亲 代 的 RF; RF 转录 RF>RF 1—20 aft RF 复制 ,形成 60 个 子 代 RF; 25 RF 分 子 及 宿主 DNA 的 复制 停止 REF->SS 20 一 33 大 约 从 子 代 RE 产生 35 FRE 4 此 产生 大 约 500 个 SS 分 子 ; DNA 插入 到 鸣 菌 体 颗粒 中 发 生发 解 过 程 注 : SS AMHR DNA, RF 代表 环 状 复制 型 。 1. 由 亲 代 单 链 DNA 分 子 (病毒 的 或 (十 ) 链 DNA ) 转 变 成 共 价 闭环 的 双 链 分 子 , 这 种 分 子 称 为 复制 型 IIRFI)。 由 于 此 步 发 生 在 转录 开始 之 前 ,所 以 仅仅 依靠 宿主 的 酶 。 新 生 链 即 (一 ) 链 是 编码 链 ， 只 有 此 链 才 能 够 被 转录 。 由 (十 ) 链 转 化 为 RE 的 酶 学 机 理 将 在 第 八 章 详 细 论述 。 2. 合成 RFI 的 多 个 拷贝 转录 (一 ) 链 ,并 产生 一 个 多 功能 的 蛋白 质 , 即 基因 A 蛋白 。 A 产 物 在 (十 ) 链 上 的 4297 和 4298 碱 基 之 间 产 生 一 个 缺 刻 (此 处 称 为 复制 起 始点 ，ori)， A 蛋白 本 身 则 共 价 地 连接 在 5 -P 末端 ， 如 图 15-37 所 示 。 这 个 有 缺 刻 的 DNA OF 被 称 为 RFU, 然后 ， 在 侵 染 之 前 就 已 合成 出 来 的 一 些 大 肠 杆 菌 蛋白 质 引起 RFU RK (十 ) 链 DNA 分 子 的 一 部 分 被 新 加 入 的 〈 十 ) 链 取代 。 这 个 取代 是 通过 带 泡 的 滚动 环 复制 方式 Clooped rolling circle replication) 完成 的 〈 细 节 已 在 第 八 章 讨论 过 )。 当 完成 复制 的 一 个 循环 时 ,这 条 被 取代 的 (十 ) 链 又 从 带 泡 的 滚动 环 上 被 切 下 来 重新 环 化 ,并 作为 合成 另 一 条 (一 ) 链 的 模板 起 作用 ,结果 产生 一 个 新 的 RFI 分 子 。 ° 83 。 合成 出 2 (一 ) 链 ,DNA 转变 成 rere sob ei RFI ,##ssb__ C28 OB Cysts eso . 亲 代 噬菌体 Lee 互补 于 环 状 (+) 链 REGAN He 并 与 A 产物 解 离 Hie A 将 A 基 因 和 蛋白 和 rep 包 起 来 F .G Hit (+ Jen sani aoe . ze) 3 BE J St (+) - AZ RBH 噬菌体 复合 物 图 15-37 @X174 DNA 复制 的 两 个 阶段 。 首 先 亲 代 叹 菌 体 DNA 转变 为 双 链 超 螺旋 RFI, K 后 ?基因 和 A 蛋 白 在 其 上 制造 一 个 缺口 滚动 环 复制 开始 ， 进 而 在 形成 RFI 的 过 程 中 复制 出 来 的 子 代 ( 十 ) 链 取代 RFU 中 的 一 部 分 。 在 有 叹 菌 体 编码 的 成 熟 蛋白 和 外 壳 蛋 白 同时 存在 时 ， 子 代 的 (+ ) 链 环 被 包装 ?而 不 是 转变 成 RFI 分 子 。 除 了 叭 菌 体 的 基因 A 蛋 白 * 所 有 复制 过 程 中 所 使 用 的 蛋白 质 都 是 细菌 的 蛋白 质 。 3. 用 于 包装 的 (十 ) 链 的 合成 。 在 合成 RFI 过 程 转变 为 合成 自由 的 (十 ) 链 的 过 程 的 控制 中 ， 不 存在 什么 开关 。 相 反 , 在 子 代 ( 十 ) 链 作为 模板 合成 新 的 (一 ) 链 之 前 ,包装 体系 就 已 捕获 子 代 (二 ) 链 。 这 三 捕 获 过 程 妥 等 到 完整 的 噬菌体 头 部 几乎 已 合成 完毕 ， 并 且 大 约 已 有 35 个 拷贝 的 RFI 时 才 开始 。 此 时 ,大 部 分 DNA 还 在 进行 滚动 环 复 制 , 产生 新 的 RFI 分 子 和 一 些 用 于 包装 的 (+), HE DNA 的 合成 这 时 已 完全 停止 。 造 成 这 种 结果 的 部 分 原因 是 由 于 A 蛋白 的 一 种 未 知 功 能 ; 另外 的 原因 是 所 有 的 宿主 的 DNA 聚合 酶 都 被 用 来 合成 wX174 DNA To 当 更 多 的 头 部 被 合成 时 ,所 有 被 取代 下 来 的 (十 ) 链 都 被 包装 起 来 ,由 于 缺乏 模板 ,REFI 的 合成 也 随 之 停止 了 。 包 装机 理 将 在 后 面 的 章节 中 讨论 。 $X174 DNA 的 转录 $X174 BRARA 3 个 启动 子 , 并 且 这 三 个 启动 子 同 时 被 激活 RA BS) A 要 任何 短暂 性 调节 。 所 有 的 转录 都 是 以 (一 ) 链 为 模板 进行 的 ， 因 此 只 有 当 最 初 的 (一 ) 链 被 合成 时 ,才能 开始 转录 过 程 ; 从 这 时 起 ，REFI 的 合成 一 直 继 续 下 去 ,直到 形成 足够 量 的 头 部 蛋白 并 开始 包装 ， REFI 的 合成 才 停止 。 由 于 %X174 MAR), 在 头 部 蛋白 合成 出 来 并 装配 成 头 部 之 前 ，%X174 已 完成 了 很 多 次 的 复制 过 程 ( 大 约 每 两 秒 钟 一 个 复制 周 期 ), 在 感染 24 分 钟 后 出 现 第 一 个 完整 的 wX174 颗粒 。 由 于 翻译 过 程 较 慢 , 而 且 深 施 酶 不 是 很 活跃 ,所 以 溶菌 酶 的 活性 被 延 滞 ,因此 ,直到 感染 40 分 钟 之 后 裂解 才 会 发 生 ， 此 时 大 约 合 成 出 500 个 噬菌体 颗粒 。 4X174DNA 的 包装 dX174DNA 的 包装 需要 7 种 噬菌体 蛋白 质 ， 其 中 4 种 存在 于 完整 的 颗粒 中 。 装配 _ © 84. 的 步骤 如 下 (如 图 15-38 fitz): 15-38 ”9X174 噬菌体 装 配 模型 。 字 母 代表 %X174 蛋白 。B 蛋白 催化 5 个 F 蛋白 分 子 (主要 的 头 部 蛋白 ) 与 5 个 G 蛋白 分 子 ( 穗 状 蛋白 ) 的 聚合 ,形成 一 个 128 单位 。D 蛋白 在 形成 108S 颗粒 WE AE RAKIM (scaffolding) 功能 。C 蛋白 加 速 %X174 DNA 分 子 的 包装 。A 蛋白 测 量 DNA 的 单位 长 度 , 并 且 使 之 形成 环 状 。 对 本 蛋白 则 了 解 甚 少 。 1 头 部 蛋白 《基因 FE) 和 穗 状 蛋白 《基因 G) 形成 五 聚 体 。 在 基因 了 蛋 日 的 影响 下 ,该 五 聚 体 进一步 形成 称 为 12S 颗粒 的 聚合 体 。 2. ZAHBASSRE (spike) 的 形成 过 程 。 3. 基因 D 和 蛋白 形成 一 个 框架 ,在 这 个 框架 上 ,由 128 单位 形成 头 部 前 体 。 4. 图 中 的 基因 C 蛋白 结合 在 取代 的 (十 ) 链 5 端 上 ,在 一 定 程度 上 引导 5 端 进 人 头 部 前 体 。 基 因 丁 蛋 白 很 可 能 最 初 结合 在 头 部 前 体 的 DNA 外 面 ， or 种 未 知 的 方式 编排 头 内 的 DNA， 并 巩固 所 形成 的 结构 。 5. 基因 和 A 蛋 白 在 滚动 环 DNA 上 切割 取代 的 《十 ) 链 ， 形 成 泡 状 的 滚动 环 ， 并 环 化 〈 十 ) 链 。 6. 基因 D 和 蛋 自 被 移 走 \ 很 可 能 是 自动 地 在 头 部 关闭 之 后 被 移 走 )， 从 而 形成 完整 的 叭 BA HK BAL 目前 已 可 在 体外 合成 亲 代 的 第 一 个 RFI 分 子 和 子 代 的 RFI 分 子 , 并 能 进行 滚动 环 复 制 。 同 时 ,如 果 存 在 着 7 种 有 关 形 态 发 生 的 蛋白 质 , 那 么 ,可 以 同时 发 生 包装 反应 和 滚动 环 复制 。 既 然 已 存在 着 偶 联 的 转录 -翻译 体外 体系 ,那么 应 当 可 能 从 RFI 合成 出 所 有 的 鸣 莫 KEAo SHAKER ARKASI—EN, OX174 将 可 能 是 第 一 个 完全 由 已 确定 的 分 子 所 合 成 的 完整 的 生物 有 机 体 。 丝 状 DNA theta Ps 已 经 系统 地 研究 了 三 种 丝 状 大 肠 杆菌 噬菌体 ; MI13、fd 和 fl (图 15-39)。 这 几 种 鸣 菌 体 都 有 一 个 环 状 的 单 链 DNA 分 子 。 它 们 非常 相似 , 通过 研究 其 各 自 的 情况 并 进行 综合 ， 确 定 了 各 个 唆 菌 体 的 生活 周期 。 由 于 这 些 噬 菌 体 的 生命 周期 与 %X174 有 许多 相 似 之 处 ,所 以 不 作 进一步 介绍 ,只 讨论 噬菌体 DNA 的 穿 透 作用 和 完整 的 噬菌体 颗粒 的 释 e 85 。 SaaS 图 15-39 4RABA RM M13 ETA. ADA) RRA ee (#& Robley Williams 提供 )。 放 。 在 所 有 已 知 的 烈性 的 只 菌 体 中 ， 只 有 丝 状 大 肠 杆菌 叹 菌 体 既 不 杀 死 宿主 也 不 引 起 裂解 。 丝 状 唤 菌 体 吸附 到 下 菌 毛 的 顶端 上 。F 以 一 种 未 知 的 方式 〈 已 有 许多 理论 讨论 这 种 方式 ), 将 噬菌体 颗粒 带 到 该 细菌 的 萌 毛 基部 的 细胞 壁 上 。 一 种 理论 是 颗粒 沿 着 菌 毛 一 侧 的 沟 槽 下 行进 入 细胞 ， 另 一 种 理论 是 菌 毛 通过 吸收 苗 毛 蛋 白质 到 细菌 内 而 发 生 作 用 (这 是 用 pili 所 观 察 到 的 现象 )。 WUE, EMEA 整 的 形态 穿 透 细胞 壁 并 附着 在 内 层 细胞 膜 上 。 这 时 ， 吻 菌 体 颗粒 除去 外 壳 ， 同 时 单 链 DNA 转变 为 RFI 型 。 这 些 过 程 和 $X174 相同 ， 都 是 偶 图 15-40 M13 外 壳 蛋 白 在 细胞 膜 上 定位 联 的 。 接 着 外 壳 被 降解 ， 蛋 白质 的 亚 基 在 子 代 颗 ie aie 粒 中 可 以 再 次 被 使 用 。 这 几 种 噬菌体 的 外 壳 蛋 白 质 能 透 人 细胞 是 非常 独特 的 。 丝 状 只 菌 体 复制 周期 的 细节 尚 不 很 清楚 。 它 像 $X174 一 样 有 一 个 通过 滚动 环 机 理 形 成 RFI 的 阶段 。 打 开 ( 十 ) 链 合成 的 开关 需要 基因 5 蛋白 ， 这 种 蛋白 质 是 一 种 单 链 DNA 结合 蛋白 ， 它 包 庄 着 滚动 环 的 尾部 ， 这 是 与 $X174 RASH. MA, KK 并 不 与 包装 作用 相 偶 联 ， 而 是 那个 被 基因 5 BE SHORE (+) 链 继续 地 在 滚动 环 上 被 切割 。 然 后 以 一 种 未 知 的 方式 环 化 。 因 此 在 细胞 内 存在 着 大 量 的 (十 ) 链 和 基因 5 蛋 白 的 复合 体 。 主要 的 包装 蛋白 即 基因 8 蛋白 大 量 地 合成 并 贮存 在 细胞 内 膜 上 。 在 细胞 质 内 没有 自 由 存在 形式 的 基因 8 蛋白 。 这 种 蛋白 质 是 一 个 具有 三 个 不 同 区 域 的 “螺旋 : 一 个 碱 性 未 端 、 一 个 朴 水 中 心 (hydrophobic center) 和 一 个 酸性 未 端 〈 图 15-40)。 人 们 假设 (基于 很 少 的 数据 ) 芯 水 中 心 使 得 该 蛋白 质 能 够 定位 在 朴 水 膜 上 ,酸性 未 端 朝 着 细胞 壁 ， 碱 性 未 端 朝 着 细胞 内 部 。 它 很 可 能 是 代替 基因 5 蛋白 ,并 结合 于 (十 ) 链 上 。 这 个 还 含有 其 他 两 种 蛋 ° 86 « 白质 的 噬菌体 颗粒 以 一 种 很 不 清楚 的 方式 在 细胞 内 膜 上 装配 。 对 每 -个 完整 的 颗粒 来 贡 ， 有 一 个 芽 在 细胞 表面 上 形成 ， 就 会 挤 出 一 个 菌 体 ( 图 15-41)。 这 一 过 程 可 以 无 限 地 进 行 下 去 ,而 对 细胞 没有 损害 。 挤 出 _ 细胞 壁 与 细胞 膜 ， 之 间 的 空间 图 15-41 M13 喉 菌 体 的 装配 和 分 泌 。 基 因 5 蛋白 覆盖 着 DNA, 在 一 定 程度 上 使 得 该 DNA 分 子 能 穿 透 细胞 膜 。 在 细胞 膜 中 外 壳 蛋 白 分 子 代替 基因 5 蛋白 结合 到 DNA 分 子 上 。 基因 3 蛋白 附着 在 该 颗粒 的 一 端 并 参与 吸附 作用 和 分 刻 作用 。 Heh HA OE CO HE, WA EG EE ORT ZETA ATE BTR SEAN AES RMR KAD L, (RS RAE 得 多 ， 推 测 可 能 是 因为 宿主 的 复制 机 器 在 宿主 细胞 生活 周期 的 很 大 部 分 中 被 用 来 制造 叹 Hitk DNA 了 。 这 种 缓慢 生长 足以 在 细菌 的 菌 苦 上 产生 一 个 较 混浊 的 区 域 ， 这 就 是 丝 TRUE EE AHO ERE POLE RAE MNRAS, AHS 上 未 被 感染 的 正常 细菌 由 于 营养 耗 尽 而 停止 在 培养 基 上 继续 生长 时 ， 那 些 被 感染 的 细胞 则 在 叭 菌 刘 处 还 可 以 继续 地 生长 大 约 一 个 世代 以 上 的 时 间 , 从 而 增加 鸣 菌 斑 处 的 浊 度 , 直 到 噬 菌 斑 消 失 。 单 链 RNA 噬菌体 已 分 离 到 几 种 单 链 RNA 的 唆 菌 体 , 了 解 得 最 清楚 的 是 大 肠 杆 菌 吻 菌 体 £2 R17, MS- 2 和 Qf. 每 一 种 都 像 $X174 一 样 ， 是 没有 尾 的 20 Gk CA 15-42). MS-2 的 遗传 图 谱 如 图 15-43 所 示 。 通 过 对 每 种 叹 菌 体 的 不 同性 质 进 行 比较 已 经 阐明 了 它们 的 很 简单 的 生活 周期 。 其 RNA 是 具有 大 量 分 子 内 氢 键 的 线性 分 子 。 HAA 3 600 个 核 痛 酸 组 成 CGA] RI7\MS-2 和 Qp 的 序列 ), 具 有 3 个 基因 ， 分 别 编码 外 壳 蛋 白 〈《CP7)、 吸 附 蛋白 (A) 和 RNA 复制 酶 《Rep)。 此 RNA 分 子 既 是 复制 模板 ,又 是 mRNA。 因 此 ,(1) 在 生活 周期 中 既 不 再 需要 DNA RGM. 也 不 再 需要 RNA 聚合 酶 ; 〈2) 调节 作用 必然 发 生 在 翻译 水 平 上 。 和 典型 的 噬菌体 爆破 值 是 5 000 一 10 000。 这 个 数值 和 典型 的 DNA TRE 体 爆破 值 相 比 是 非常 大 的 CDNA 只 菌 体 的 爆破 值 是 一 至 几 百 )。 这 些 颗 粒 在 每 个 细菌 中 形成 巨大 的 结晶 体 结构 〈 图 15-44)。 这 些 结晶 体 在 一 定 程度 上 损害 细胞 膜 ， 可 以 在 缺乏 溶菌 酶 的 情况 下 引起 细胞 裂解 。 因 此 ， 与 其 他 噬菌体 不 同 ， 它 的 裂解 时 间 是 不 严格 的 ,在 感染 30 一 60 分 钟 后 细菌 的 裂解 逐步 地 发 生 。 图 15-45 是 RNA 噬菌体 的 生活 周期 示意 图 ,分 阶段 介绍 如 下 ; 1. 进入 细胞 并 结合 到 核糖 体 上 。 在 进入 细胞 内 后 ， 一 个 核糖 体 就 立即 结合 到 ， CP 基因 起 始 区 的 结合 位 点 上 。 这 个 基因 是 RNA 分 子 中 最 中 心 的 基因 。 2. 翻译 作用 和 三 种 蛋白 中 每 一 种 的 量 的 调节 作用 。 如 同 第 十 三 章 中 的 解释 的 那样 ，RNA 的 二 级 结构 堵塞 了 R 17 中 的 A 蛋 白 和 Rep 蛋白 以 及 Rep 蛋白 和 核糖 体 的 结合 位 点 。 然而 ，CP 基因 的 翻译 却 又 打开 了 Rep 蛋白 的 结合 位 点 。 因 此 ,开始 两 种 蛋白 质 都 形成 ( 指 CP 蛋白 和 Rep BA), 但 是 后 来 由 于 结合 到 rep 位 点 上 的 CP 蛋白 量 不 断 地 增加 ,也 就 抑制 rep 基因 的 翻译 ,减少 Rep 蛋白 的 量 ( 见 第 十 四 章 )。 这 种 抑制 作用 是 符合 效率 要 求 的 ; 作为 10 000 个 噬菌体 的 结构 成 分 大 约 需要 2 x 10* HEN CP 蛋白 , 而 复制 酶 ( 即 rep 蛋白 ) 仅仅 需要 催化 量 即 可 。 和 A 蛋白 的 合成 将 以 后 再 作 简单 的 讨 15-42 BE MS-2 的 电子 “ 论 。 BAM. RDM «3. RNA 鸣 菌 体 的 复制 (图 15-46)。 只 详细 研究 了 OF Sg CER 复制 酶 。 此 酶 是 一 个 四 聚 体 ,由 1 个 Rep 蛋白 分 子 和 .3 个 窒 主 看 白 分 子 ,蛋白 质 合成 过 程 中 的 _EEF-Ts、EF_Tu 翻译 延长 因子 和 核糖 体 蛋 白 S1_《S1 的 功能 不 清楚 ) 所 组 成 。 复 制 酶 以 病毒 的 (十 ) 链 为 模板 ， 产 生出 (一 ) 链 。 在 进行 合成 时 ， 此 (一 ) 链 仅仅 只 在 聚合 作用 的 位 点 与 (十 ) 链 接触 ， 因 此 ， 大 部 分 复制 产物 是 单 链 的 。 在 第 一 个 (一 ) 链 的 合成 完成 之 前 ， 另 有 几 个 一) 链 开始 合成 ， 而 且 复制 的 形式 是 分 叉 状 的 。 复制 释 放出 的 (一 ) 链 立即 被 复制 酶 用 来 作为 模板 合成 (十 ) 链 ， 一 些 (+) SERB 糖 体 上 去 合成 更 多 的 CP 蛋白 ， 另 外 一 些 (十 ) 链 则 被 包装 。 所 有 的 子 代 叹 菌 体 中 都 只 人 有 (十 ) 链 。 4，A 和 蛋白 的 合成 。 由 于 碱 基 配对 ,在 自由 的 (十 ) 链 上 和 A 蛋 白 的 核糖 体 结合 位 点 总 是 关闭 的 。 但 是 ,( 一 ) 链 的 复制 则 起 始 于 紧 接着 A 基 因 的 5 , 端 。 在 (十 ) 链 刚刚 开始 合成 之 后 不 入, 有 一 个 A 蛋白 的 核糖 体 结合 位 点 处 于 自由 状态 的 短暂 阶段 ,这 时 (十 ) 链 的 互补 链 还 没有 开始 复制 (图 15-47)。 在 此 期 间 ，A 基 因 开始 被 翻译 。 在 上 述 结合 位 点 关闭 之 前 , 这 种 翻译 过 程 只 可 能 有 一 两 个 回合 。 因 此 和 A 蛋 白 的 数目 和 (十 ) 链 的 数目 大 体 上 保持 相等 。 由 于 每 一 个 病毒 颗粒 只 含有 一 个 A 蛋 白 分 子 ,所 以 这 种 设计 是 很 经 济 的 ,后 来 每 一 个 A 蛋 白 在 一 个 未 鉴定 的 结合 位 点 上 结合 一 个 RNA 分 子 。 因此 人 们 认为 A 蛋 白 促进 RNA AICP 分 子 的 相互 作用 。 A 蛋 白 保留 在 RNA 分 子 上 ,并 在 随后 的 感染 作用 中 进入， A CP rep Eee ‘ | Rw 人 1180 390 站 1700 1 \ 129 26 36 1174 15-43 ” 鸣 菌 体 MS-2 的 遗传 图 谱 。 表示 每 一 个 基因 的 所 在 位 置 和 碱 基数 。 斜 体 数字 表示 先 导 序 列 和 间隔 区 的 长 度 。 颗粒 中 的 结晶 体 结 构 。 bs RNA 进入 细胞 @ S83. =o. oF 翻译 ,合成 复制 酶 合成 出 〈 十 ) # e K+) REAR REA 35 is RL | SB UR & 15-45 RNA 叭 菌 体 生活 周期 示意 图 。 === = Py 15-44 大 肠 杆 菌 中 成 熟 的 MS-2 R11 RI2 5! 3" 5' 复制 完成 合成 过 程 \ 1 \ Ace pct: 1 > 1/ 子 代 (+) 链 BR RAR C+) 链 图 15-46 由 Q8 Agfe{tAy RNA 复制 。R1 代表 复制 中 间 物 。 当 这 个 区 域 复制 时 ，( 十 ) 链 与 含有 人 A 位 点 的 互补 区 配对 15-47 ”通过 开放 在 新 生 (+ ) 链 上 的 核糖 体 结合 位 点 ?可 以 进 行 基因 A 蛋 褒 的 合成 。 细胞 。 可 能 A 蛋白 的 功能 类 似 于 $X174 MANE 状 蛋 白 的 功能 。 5. 病毒 颗粒 的 装配 。 一 些 CP 蛋白 分 子 同 时 自发 地 在 一 个 新 合成 出 来 的 (十 ) 链 周围 聚集 , 形成 一 个 20 面体 外 壳 。 6. 细胞 裂解 。 在 大 约 有 10 000 个 叹 菌 体 颗粒 形 成 之 后 发 生 裂 解 。 但 是 没有 产生 鸣 菌 体 编码 的 裂解 酶 , 而 且 裂 解 机 理 尚 不 清楚 。 一 种 双 链 RNA tar: 由 6 CLAIR Mae RNA 鸣 菌 体 非 常 少 .研究 得 最 彻底 的 一 个 是 $6 MRK, REE BGS (Pseudomonas jpaseolica)。 这 种 噬菌体 在 结构 上 不 同 于 大 部 分 的 细 AK, CREA Reet HEA eM 类 所 组 成 的 被 膜 之 内 《“ 同 15-48), 66 最 特殊 的 性 质 。 89 。 是 具有 三 种 双 链 RNA 分 子 , 分 子 量 分 别 为 2.3.3.1 和 5.0X104。 每 一 个 RNA 分 子 携带 着 不 同 的 基因 ， 人 们 说 这 种 噬菌体 带 有 分 节 基 因 组 (segmented, genome) (在 第 二 十 一 章 中 将 给 出 具有 分 节 基 因 组 的 病毒 例子 )。 这 三 种 RNA 分 子 共 编码 至 少 12 种 蛋白 质 。 ete ; Wh ssh SS FA 15-48 9%6 MERA RR ERR PRAKASH EAL. 较 小 的 颗粒 缺少 8 HE RHR $6 的 复制 和 转录 作用 中 有 几 个 很 有 趣 的 问题 。 下 面 将 仅仅 讨论 $6 叹 菌 体 生 活 周 期 的 有 关 特 点 。 在 适当 的 条 件 下 细菌 RNA 聚合 酶 可 在 体外 以 单 链 RNA 为 模板 合成 出 双 链 RNA 产物 。 由 于 双 链 RNA 对 RNA 合成 来 说 并 不 是 很 好 的 模板 ,所 以 这 个 反 应 不 能 进一步 进行 下 去 , 因为 66 的 复制 需要 的 不 是 细菌 的 RNA 聚合 酶 ， 而 是 另外 的 酶 。 双 链 RNA 也 不 能 作为 翻译 的 模板 。 如 果 把 一 个 双 链 RNA 注 人 到 一 个 细菌 中 , 它 不 能 用 细菌 的 酶 进行 翻译 ,因此 也 就 不 能 产生 唉 菌 体 蛋 白 。 在 前 一 节 中 讲 到 的 单 链 RNA 叹 菌 体 避 免 上 述 困 难 的 手段 是 : 首先 对 注 人 的 单 链 RNA 进行 翻译 ;在 翻译 产物 中 有 一 Te BS RSET RNA 复制 酶 ,这 个 酶 是 可 以 用 来 产生 子 代 RNA 链 的 。 一 个 双 链 RNA 鸣 菌 体 可 以 有 两 种 选择 : C1) 或 者 是 它 必 须 解 链 , 以 产生 一 条 编码 链 ， 这 是 一 个 在 能 量 需 求 上 完全 不 可 能 的 过 程 ;《〈2) 或 者 它 把 一 个 能 复制 双 链 RNA 的 酶 携带 到 细菌 内 。6 噬菌体 使 用 的 是 第 二 种 机 理 , 即 噬菌体 颗粒 具有 一 个 它 所 编码 的 有 RNA 聚合 酶 活性 的 物质 , SMR RNA 进 人 细菌 时 , 这 个 物质 随 之 一 同 进 人。 这 种 活 性 物质 尚未 得 到 纯化 ， 它 对 于 产生 叹 菌 体 子 代 的 蛋白 外 壳 是 必需 的 。 人 们 估计 这 个 物质 是 由 噬菌体 头 部 中 几 种 不 同 蛋白 质 的 区 域 接合 到 一 起 而 产生 的 ， 其 产生 方式 在 很 多 方面 相同 于 几 个 核糖 体 蛋 白 聚 集 形 成 核糖 体 上 的 肽 酰 转移 酶 活性 区 域 的 方式 ( 见 第 十 三 章 )o $6 MEK RNA FFARR AA RNAR GEE DRI mRNA, 分 子 可 以 通过 链 的 取代 反应 产生 (图 15-49) RA RNA ZR GATE HE HEI OME RNA 的 一 端 起 始 的 合成 ， 拷 贝 出 非 编码 链 ， 将 编码 链 取 代 下 来 被 取代 的 编码 链 被 作 为 mRNA 起 作用 。 第 二 个 取代 反应 通常 在 第 一 个 取代 反应 完成 之 前 就 开始 了 ， 如 图 所 示 。 图 15-50 中 的 电子 显微镜 照片 示 出 了 一 个 正在 进行 这 种 取代 反应 的 RNA 分 子 和 一 « 90 « WH RNA 人 ar 亲 代 链 ieee 15-50 (a) 66 RNA 转录 作用 的 电子 显微镜 照片 。(b) 示意 图 。 虚 线 表 示 正 在 合成 的 链 。 个 正在 合成 中 的 单 链 。 $6 RAN =A RNA 分 子 中 的 每 一 种 都 可 以 通过 取代 反应 作为 转录 的 模板 ， 从 这 些 mRNA 可 以 翻译 出 至 少 14 种 蛋白 质 。 复制 过 程 存在 着 一 个 特殊 问题 ， 即 取代 反应 产生 子 代 单 链 而 不 能 增加 双 链 分 子 数 Bo 现在 通过 实验 已 经 排除 了 被 取代 的 单 链 RNA 再 转变 成 双 链 子 代 RNA 分 子 的 可 能 性 。 目前 虽然 已 经 了 解 到 6 鸣 菌 体 复 制作 用 和 转录 作用 使 用 着 同样 一 个 酶 活性 物 质 。 但 是 关于 $6 DNA 复制 的 机 理 尚 不 清楚 。 $6 喉 菌 体 子 代 叹 菌 体 颗粒 的 产生 需要 的 条 件 是 : .%6 鸣 菌 体 的 三 种 双 链 RNA 分 子 中 的 每 一 种 的 一 个 片段 被 包装 在 一 个 单个 的 吻 菌 体 颗粒 中 。 但 是 这 个 过 程 是 如 何 发 生 的 还 不 清楚 。 动 物 的 呼 肠 病毒 也 同样 都 具有 分 节 基 因 组 。 关 于 这 个 病毒 的 每 种 分 节 片 妇 的 各 个 片 妇 被 包装 到 噬菌体 颗粒 中 去 的 方式 将 在 第 二 十 一 章 讨 论 。 e gt 2 ean x mm Adhya, S., S. Garges, and D. F. Ward. 1981. “Regulatory circuits of bacteriophage lambda.” Prog. Nuclete Acid Res. and Mol. Biol. 26, 103—118. Arber, W., and §. Linn. 1967. “DNA modification and restriction.” Ann. Rev. Biochem. 38, 467—-500. Casjens, S., and J. King. 1975. “Virus assembly.” Ann. Rev. Biochem. 44, 555—611. ’ Dubow, M. S. (ed), 1981. Bacteriophage Assembly. Alan Liss. Dunn, J. J.. and F. W. Studier. 1981. “Nucleotide sequence for the genetic left end of bacteriophage T7 DNA to the beginning of gene 4” J. Mol. Biol. 148, 303-—330. Earnshaw, W. C., and S. R. Casjens. 1980. “DNA packaging by the double stranded DNA bacteriophages.” Cell. 21, 319—331. Echols. H. 1980. “Bacteriophage development.” In Molecular Genetics of Development. T. Leighton and W. F. Loomis. eds. Academic Press. Furth. M. E., J. L. Yates, and W. F. Dove. 1979. “Positive and negative control of bacteriophage lambda DNA replication.” Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 43, 147—153. Gottesman, M. E., S. Adhya, and A. 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Cold Spring Harbor Laboratory. es 92 。 第 十 7 < 章 噬菌体 (CD 温和 噬菌体 及 溶 源 生活 周期 在 上 面 所 讨论 的 噬菌体 的 生活 周期 中 ,宿主 细胞 裂解 ， 释 放出 许多 子 代 鸣 菌 体 ( 最 党 见 的 效果 )，, 或 者 是 不 断 地 放出 子 代 鸣 菌 体 而 不 杀 死 宿主 ( 丝 状 吻 菌 体 )。 这 一 章 中 所 讨论 是 另 一 种 生活 史 周 期 , 即 溶 源 生活 周期 。 在 这 种 周期 中 ,不 产生 噬菌体 ,宿主 细胞 能 生存 下 来 ,并 能 无 限 地 分 裂 。 然 而 ,宿主 细菌 在 经 历 了 很 多 世代 以 后 ,如 果 环 境 条 件 合适 ,噬菌体 的 溶 源 周 期 就 会 终止 而 开始 一 个 新 的 裂解 周期 。 一 且 发 生 这 种 情况 ,宿主 细胞 被 杀 死 ,并 释放 出 许多 子 代 叹 菌 体 ,就 像 被 噬菌体 感染 而 起 始 的 裂解 周期 一 样 。 能 够 进入 深 源 周期 的 噬菌体 被 称 为 温和 吻 菌 体 ,它们 有 一 个 吸引 人 的 方面 , 即 它们 也 可 以 起 动 前 一 章 所 描述 的 裂解 周期 。 细 菌 在 受 感染 之 前 的 生长 条 件 和 感染 的 倍数 (multip- licity of infection) 决定 着 吻 菌 体 进 入 哪 一 条 途径 。 至 于 最 终 走 哪 一 条 途径 则 是 噬菌体 的 优良 调控 体系 起 作用 的 结果 ,这 种 体系 不 仅 具 有 暂时 性 的 调控 作用 ,而 且 对 环境 条 件 十 分 敏感 ,例如 对 营养 的 供应 ,使 得 噬菌体 有 可 能 按 不 同 途 径 生 活 。 溶 va Jal 期 我 们 从 讨论 深 源 性 细菌 的 一 般 性 质 开 始 ， 然 后 探讨 大 肠 杆 菌 1 噬菌体 ， 它 是 研究 得 最 清楚 的 温和 吃 菌 体 。 溶 源 生活 周期 概述 有 两 种 溶 源 周期 ,最 普通 的 一 种 以 1 叹 菌 体 为 典型 代表 ,其 生活 周期 如 下 (图 16-1)。 Co) ee CO) eT Om oe J mip eat 转录 抑制 和 16-1 噬菌体 DNA 插 到 细 蓝 染色 体 而 完成 洲 源 作用 的 一 般 模式 。 1. DNA 分 子 注 人 到 细菌 中 。 2. 经 过 一 个 短 时 间 转 录 ，, 合 成 出 所 需要 的 整合 酶 Cantegration enzyme) 后 , 阻 遏 物 使 转录 终止 。 3. 噬菌体 DNA 插 到 细菌 DNA 中 。 4. 细菌 继续 生长 和 增殖 ,噬菌体 DNA 作 为 细菌 染色 体 的 一 部 分 随 之 进行 复制 。 第 二 种 较为 少见 ,以 大 肠 杆 菌 的 P1 鸣 菌 体 为 其 典型 代表 。 与 第 一 种 不 同 之 处 是 ,第 二 种 没有 整合 体 ,噬菌体 DNA 成 为 一 个 质粒 (一 个 独立 复 侧 的 环 状 DNA 分 子 ), 而 不 是 « 93 « BAVA BD. (XR EE HCAS BEE AMS 一 些 有 用 的 术语 下 面 的 术语 描述 溶 源 周期 的 不 同方 面 : 1. 既 能 进入 裂解 周期 又 能 进入 溶 源 周 期 的 喉 菌 体 ， 称 为 温和 吻 菌 体 〈temprate pha- ge)。 2. 含 有 一 套 完整 的 噬菌体 基因 的 细菌 , 称 作 溶 源 菌 〈lysogen)。 如 果 缺 少 了 某 些 喉 菌 体 基 因 ， 鸣 菌 体 在 其 中 就 不 能 完成 裂解 周期 ， 这 种 细菌 称 作 缺 陷 型 溶 源 菌 〈defective lysogen), A Fer Gc eo CIE RRL CR Ely sogenization)g 4. REA DNA 进入 了 细菌 DNA ,就 说 鸣 菌 体 DNA 224 (integrated) AY . DNA。 这 个 过 程 叫做 整合 或 插 信 (integration 或 insertion)， 以 质粒 形式 存在 着 的 喉 菌 体 DNA 是 不 整合 的 。 整 合 的 或 质粒 状 的 只 菌 体 都 称 作 前 吻 菌 体 〈prophage)。。 如 果 其 中 缺少 了 某 些 基因 ,这 种 前 吻 菌 体 就 是 缺陷 型 的 。 溶 源 及 溶 源 化 作用 的 一 般 性 质 溶 源 过程 有 两 个 重要 性 质 : 1. 一 种 吻 菌 体感 染 细菌 形成 溶 源 菌 之 后 ， 不 能 再 被 同 种 噬菌体 感染 ， 这 种 对 “ 超 感 Ze” (superinfection ANd HERE BBE arlene 2. ETFS EAR ZAP DR Ee BK th BE EA 2 fA BK Pt EES induction), | 鸣 菌 体 的 基因 作为 一 个 DNA 片段 被 剪 切 下 来 (图 16-2). 诱导 ， 复制 ; 产生 带 有 整合 的 前 噬菌体 (HE) 的 染色 体 16-2 AIMS (ERA. BMA DNA 用 虚线 表示 。 右 图 中 为 了 清楚 删 去 了 细菌 DNA, 很 快 将 要 讨论 免疫 性 的 分 子 机 理 及 环境 对 诱导 作用 增强 的 分 子 机 理 s FERAL T PRM ATH, 90% 以 上 属 温 和 性 的 。 这 些 噬 菌 体 通 笛 不 像 T4 17% Te oe BE FS ZU EWE Bad PAC EE 5 HE AFR (8) Dt 2 — RE 2 YP th —_ EAE 于 迅速 产生 子 代 的 环境 条 件 下 ， 它 们 仍 能 扩 增 。 当 我 们 观察 自然 春 中 一 个 噬菌体 可 能 遇 到 一 群 细菌 时 ,就 能 明白 上 述 的 情况 了 。 我 们 先 考 虑 正在 活跃 分 裂 的 一 大 群 细菌 。 如 果 一 个 噬菌体 侵入 了 一 个 细菌 并 扩 增 《在 裂解 周期 中 ), 子 代 叹 菌 体 的 数目 很 快 地 增加 。 然 而 ， 由 于 周围 的 营养 耗 尽 ,细菌 生长 变 得 缓慢 ， 在 裂解 周期 中 如 果 被 感染 的 细菌 停止 生长 ， 那 么 感染 的 喉 菌 体 就 会 中 途 天 折 《 叭 菌 体 只 能 生长 在 代谢 活跃 的 细菌 中 )。 当 细 菌 缺 乏 营养 时 ,在 进入 休眠 状态 之 前 ,它们 会 降解 自身 的 mRNA MEA, fF 恢复 供给 营养 后 ,细菌 又 重新 生长 。 但 是 被 吧 菌 体感 染 过 的 细菌 (其 中 史 菌 体 的 生活 周期 0 入 已 被 中 断 ) 就 不 是 这 样 。 一 般 来 说 ,首先 它 永 远 失去 了 产生 噬菌体 的 能 力 , 这 可 能 是 因为 宿主 mRNA 和 蛋白 质 的 降解 破坏 了 严格 平衡 的 噬菌体 功能 ; 接着 细菌 将 会 死去 。 如 采 细菌 有 溶 源 周 期 ,也 就 是 说 噬菌体 DNA 有 可 能 变 为 休眠 状态 ,那么 在 这 种 溶 源 菌 中 的 噬 菌 体 就 有 可 能 避免 受到 破坏 。 当 细菌 生长 得 到 恢复 时 ， 史 菌 体 基 因 作 为 细菌 染色 体 的 一 部 分 而 一 起 复制 ,即使 这 段 时 间 鸣 菌 体 的 产生 暂时 中 断 了 ,由 于 存在 着 诱导 现象 ， 所 以 仍 然 保 留 着 产生 叹 菌 体 的 潜在 可 能 性 。 现在 让 我 们 回 到 噬菌体 对 活跃 生长 着 的 细菌 群体 感染 的 问题 上 来 ， 这 时 鸣 菌 体 在 其 中 能 快速 地 增殖 扩 增 。 当 鸣 菌 体 数 目 超 过 细菌 数目 时 ， 鸣 菌 体 就 进入 了 它们 的 最 后 一 个 增殖 周期 ;裂解 以 后 ,因为 不 再 有 可 感染 的 细菌 ， 喉 菌 体 就 不 能 再 增殖 。 可 能 要 好 几 年 之 后 ;它们 才 会 再 遇 上 敏感 性 宿主 ,在 此 期 间 , 各 种 各 样 的 破坏 剂 (如 热 \ 酸 \ 蛋 白 酶 、 原 生动 物 ) 都 可 能 损坏 鸣 菌 体 颗粒 。 事 实 上 , 叹 菌 体 的 吸附 装置 最 易 被 化 学 试剂 破坏 。 在 再 度 遇 到 宿主 之 前 , 鸣 菌 体 是 没有 机 会 再 增加 它 的 数目 的 。 但 是 ,在 大 剂量 感染 〈 即 感染 倍数 很 高 ) 中 会 发 生 溶 源 化 过 程 , 当 营养 供应 充足 时 , 溶 源 菌 就 能 生长 ,从 而 使 噬菌体 基因 能 无 限 地 保留 下 来 。 事 实 上， 决定 温和 喉 菌 体 进 入 深 源 周期 的 两 个 条 件 正 是 营养 缺乏 和 大 剂量 的 感染 。 大 肠 杆菌 4 噬菌体 研究 得 最 清楚 的 温和 鸣 菌 体 是 大 肠 杆菌 的 4 噬菌体 ， 它 的 溶 源 周期 是 本 章 的 重点 内 容 。 在 此 之 前 ,读者 首先 应 阅读 一 次 前 一 章 中 所 和 令 述 的 1 叹 菌 体 的 裂解 周期 。 对 感染 的 免疫 性 烈性 史 闭 体形 成 的 噬 菌 斑 是 透明 的 ,因为 其 中 心 的 细菌 全 被 杀 死 并 有 裂解。 可 是 , 1 ME 早期 细菌 菌 若 O® 2 (b) 浊 斑 的 发 育 16-3 (a) 4 鸣 菌 体 的 清亮 透明 的 叹 菌 班 〈cI-) Spee (ct), (b) 温和 喉 菌 体 浊 斑 发 育 图 示 ( 放 大 了 5 一 10 fF): C1) 细菌 营 层 中 的 叭 菌 体 ;《〈2) 含有 几 个 溶 源 菌 (以 小 棒 表 示 ) 的 小 的 透 明 斑 ( 通 常 可 见 为 《3) 透明 斑 扩 大 ,其 中 有 溶 源 菌 的 生长 ; (4) 透明 斑 达到 最 大 ， 溶 源 菌 停止 生 长 ( 承 A. D. Kaiser 提供 >)。 ea 95 « PEBERO CH DAB 5) FEE BRAS CH HAE the a) (图 16-3), BRR MEARE DRS 深 源 菌 的 生长 造成 的 。 通 常 在 铺 培 养 平板 时 噬菌体 和 细菌 采 用 1: 10° 的 比例 , 细菌 能 很 快 生长 ,而 感染 倍数 低 , 因 此 能 保证 发 生 裂 解 。 经 过 几 个 裂解 周期 后 ,感染 倍数 增高 ,一 些 细菌 就 溶 源 化 了 。 此 时 营养 充足 不 限制 哗 菌 体 和 细菌 的 生长 ， 所 以 绝 大 多 数 细菌 仍 被 裂 ， 解 。 当 培养 基 中 的 营养 耗 尽 后 ,没有 受 感染 的 细胞 停止 生长 ， 噬 菌 玫 的 大 小 就 不 再 增加 。 但 是 ,在 噬 著 刘 中 一 些 细菌 生长 得 比较 慢 , 在 那里 还 有 营养 存在 ， 那 些 能 够 抵抗 4 继续 感 染 的 深 源 散 还 能 继续 生长 ,在 噬菌体 中 形成 洗 泪 的 币 心 。 / 1 溶 源 菌 能 抵抗 4 感染 的 性 质 , 称 为 免疫 性 。 下 面 介 绍 这 个 现象 的 原因 ,1 噬菌体 具 有 一 套 阻 遏 物 -操纵 基因 体系 (图 16-4)。 阻 遏 基因 叫做 cl; 阻 遏 物 蛋白 结合 在 oL MOR - 两 个 操纵 基因 上 ,oL、oR 分 别 与 pL 和 pR 两 个 启动 子 相 邻 ,L 和 了 两 字母 表示 按 标准 方 ， 向 绘制 基因 图 谱 时 ,两 个 早期 mRNA 合成 的 方向 ， 左 向 或 右 向 ( 见 第 十 五 章 图 15-29)o | aes 早期 右 向 mRNA ‘ gz a ee 1 cl oR PR za + << 基因 pL oL 一 早期 左 向 mRNA 图 16-4 。》 的 阻 过 物 -操纵 基因 体系 示 出 了 两 个 早期 mRNA HF, cl 表示 阻 坎 物 基因 ;了 P 玫 示 DFT > 9 表示 操纵 基因 ， 工 表示 左 向 ,了 表示 右 向 。 在 溶 源 菌 中 ，clI 阻 遏 物 不断 地 合成 ,而 且 对 操纵 基因 来 说 稍 过 量 一 些 。 这 样 ,oL 及 ， oR 都 有 结合 的 阻 遇 物 分子 ,而 使 RNA 聚合 酶 不 能 从 pPL 及 pR 启动 mRNA WAKA 此 ,在 溶 源 菌 中 ,从 两 个 早期 启动 子 进行 的 转录 是 被 阻止 的 。 在 后 面 可 以 看 到 ,这 足以 使 前 WEBS AST “SEA KAS, Alt , 溶 源 菌 能 无 限 地 生长 。 如 果 1 只 菌 体感 染 了 一 个 正常 的 细 菌 , 由 于 阻 遏 物 还 未 合成 ,侵入 的 IDNA 的 两 个 操纵 基因 还 未 被 阻 过 物 占 据 , 所 以 能 开始 转录 ;如 果 1 鸣 菌 体感 染 了 一 个 溶 源 菌 , 在 RNA RAMS pL 和 pR 位 点 结合 之 前 , 溶 源 菌 中 已 经 存在 着 过 多 的 阻 遏 物 ， 这 些 阻 遏 物 就 与 侵 和 的 1DNA 的 两 个 操纵 基因 结合 ， 这 样 就 阻止 了 鸣 菌 体 进 入 裂解 周期 。 人 们 把 这 种 抑制 作用 称 为 对 于 同 源 免 疫 超 感 染 抗 性 (resistance to homoimmune superinfection), 超 感染 的 DNA 将 出 现 什 么 情况 呢 ? 一 般 它 可 以 形成 超 螺旋 ， wi EL ZTE eA eR 不 需要 鸣 菌 体 的 基因 产物 ， 但 不 能 复制 。 在 这 种 超 螺旋 DNA 存在 的 情况 下 AA 受 影 响 , 仍 能 正常 地 生长 和 分 裂 , 于 是 超 感 染 的 DNA 就 逐渐 地 被 稀释 了 。 已 分 离 到 一 些 免疫 体系 突变 株 , 其 中 最 重要 的 两 种 类 型 是 cI- 和 vir 烈性 (virulent) 突变 。 1. cl” 突变 株 不 能 合成 出 有 功能 的 阻 过 物 ,因此 它 只 能 进 人 裂解 周期 ,形成 透明 的 鸣 PAPEL] 16-3(a)]。 2. vir 突变 株 的 oL 和 oR 都 发 生 突变 ,因为 它 不 能 建立 阻 遏 作用 ,所 以 vir 突变 株 ， 也 形成 透明 的 唆 菌 斑 ; 而 且 由 于 它 对 溶 源 菌 中 已 有 的 阻 遏 物 不 敏感 ,所 以 它 能 超 感染 蓉 源 | 葛 并 在 其 中 生长 。 © 96 e 表 16-1 FGPHRSCEARMAEGAFRAZEH BRELY RM BH EN YG MRAM B(A) B( 434) B(21) a 一 | 十 434 十 一 十 21 + + = 注 : BCP) AAP MAAN BARR. +HRRHERE.— RRA GER HH 大 肠 杆 菌 除了 1 外 还 有 许多 种 温和 唉 菌 体 ， 与 1 有 关 的 两 种 是 1 ERR 21 和 1 只 菌 体 434。 这 些 叹 菌 体 都 有 自己 的 免疫 系统 , 即 自己 的 阻 遏 物 和 专 一 于 这 种 阻 遏 物 的 操纵 基因 。 因 此 ，1?1 434 的 阻 遏 物 不 能 与 1 的 操纵 基因 结合 ，1 的 阻 遏 物 也 不 能 与 1434 的 操纵 基因 结合 ,这 样 一 对 叹 菌 体 被 称 为 相互 的 异 源 免疫 〈heteroimmune )。 由 于 溶 源 菌 中 的 阻 遏 物 不 能 与 异 源 超 感 染 吻 菌 体 的 操纵 基因 结合 ， 因 此 温和 型 噬菌体 能 在 异 源 免疫 的 溶 源 菌 中 形成 叹 菌 斑 , 这 些 情 况 总 结 在 表 16-1 中 。 一 些 包含 着 cl 基因 、 操纵 基因 、 启 动 子 (和 其 他 一 些 马上 就 要 讨论 的 成 分 ) 的 DNA 的 免疫 区 用 基因 符号 imm 表 示 ， 如 imm1， imm21、imm434 等 。 通过 对 两 种 异 源 免疫 鸣 菌 体 进 行 重组 ， 再 从 中 挑选 出 含有 一 个 了 蓝 体 的 免疫 区 基因 和 另 一 个 噬菌体 的 其 他 基因 的 重组 子 。 这 是 一 种 使 人 很 感 兴趣 的 杂 交 鸣 菌 体 ， 这 种 鸣 菌 体 在 实验 室 中 很 有 用 处 。 一 个 突出 的 例子 是 杂交 的 1434 WERK. 表 16-1 示 出 在 同 源 、 异 源 免 疫 溶 源 菌 中 不 同 噬菌体 的 成 次 能 方 。 基 因 符 号 为 imm434 《有 时 也 表示 成 1434hy), 如 图 16-5 所 示 。 入 oL cI oR s L cl 434 crisis ee a om oe — or ol, oR 入 imm434 入 Aimm434 图 16-5 A imm434 的 形成 。 前 鸣 菌 体 的 整合 在 1 或 与 其 类 似 的 鸣 菌 体 的 溶 源 周 期 中 ,噬菌体 DNA 分 子 插 和 人 (整合 ) 到 细菌 染色 体 DNA 上 ,形成 前 噬菌体 。 为 了 形成 溶 源 菌 ,对 鸣 菌 体 有 两 个 要 求 : 〈1) 叹 菌 体 必须 建 立 其 阻 遏 状态 ;2) 1 必须 使 其 DNA 分 子 插 人 到 细菌 染色 体形 成 前 喉 菌 体 。 2DNA 发 生 整合 时 , 插 到 大 肠 杆菌 染色 体 上 的 一 个 优先 的 位 点 上 , 这 个 位 点 位 于 半 乳 HEROS (eal) 和 生物 素 操 纵 子 〈bio) 之 间 , 称 作 2 的 附着 位 点 〈attachment site), 其 遗传 基因 符号 为 ato 绝 大 多 数 温 和 型 只 菌 体 的 整合 都 发 生 在 一 个 优先 插 人 的 位 点 上 。 We 发 育 生 长 型 的 A b att O at 从 16-6 WEEK DNA (AR AAI MATAR DNA 《前 叭 菌 体 上 顺序 ) 的 基因 顺序 。 为 了 标 出 参照 点 挑选 了 一 些 基因 注 以 字母 ,其 他 基因 是 任意 选 的 。 当然 也 有 才 种 叹 菌 体 ;它们 或 是 有 玫 个 插 大 位 点 ,或 者 在 大 肠 杆菌 染色 体 的 任意 位 点 土 都 可 以 播 和 信 。 对 2 前 噬 著 体 的 基因 顺序 的 观察 ,发 现 插 人 作用 的 一 个 重要 特点 即 基因 在 前 鸣 菌 体 中 的 顺序 与 在 噬菌体 中 的 顺序 不 一 样 (图 16-6)。 这 种 情况 可 以 用 人 们 熟知 的 整合 模 型 来 解释 ,这 个 模型 由 Allen Campbell 提出 ,就 称 作 Campbell 模型 。 在 这 个 恰当 的 模型 CLA 16-7) 中 ,1DNA 首先 环 化 ,然后 被 打开 ,与 宿主 DNA 连接 ,最 后 完成 前 叹 菌 体 的 整合 。 这 个 过 程 发 生 在 细菌 DNA 的 att freA AER DNA 上 靠近 中 心 的 噬菌体 的 att 位 点 ,由 鸣 菌 体 编码 的 整合 酶 (integrase， 其 基因 记 作 int) 识 别 噬 菌 体 DNA 与 细菌 DNA 的 附着 位 点 ,并 催化 物理 性 交换 ,其 结果 为 : 鸣 菌 体 整 合 到 细菌 的 DNA +, mA 所 示 。 环 化 和 整合 的 结果 是 感染 性 的 IDNA 的 线性 分 子 的 基因 顺序 改变 了 。 在 这 个 模 型 提出 之 后 又 产生 了 一 个 问题 ,既然 前 噬菌体 两 仙 有 结合 位 点 ,那么 在 整合 之 后 整合 酶 为 什么 不 很 快 地 将 前 叹 菌 体 剪 切 下 来 ,而 且 , 由 于 一 个 DNA 分 子 内 的 两 个 附着 位 点 《宿主 DNA 中 ) 的 相互 作用 应 当 比 不 同 DNA 分 子 (噬菌体 DNA 与 细菌 DNA7) 上 的 附着 位 点 相互 作用 得 更 快 一 些 , 所 以 从 动力 学 上 看 ,应 更 容易 发 生 剪 切 反应 ,为 什么 没 发 生 呢 ? 当 以 下 情况 被 发 现 后 ,上 面 这 个 问题 也 就 清楚 了 ， 那 就 是 叹 菌 体 DNA 和 细菌 DNA 中 的 附 着 位 点 是 不 同 的 ,它们 重组 到 一 起 ， 形 成 前 鸣 菌 体 的 附着 位 点 这 样 形成 的 前 噬菌体 的 附 着 位 点 与 原来 两 者 都 不 相同 。 16-7 和 前 叹 菌 体 整 合 与 切除 机 理 的 Campbell 模型 。 为 了 与 后 来 的 发 现 一 致 "只 菌 体 的 附 着 位 点 用 POP 表示。 细菌 为 BOB ,前 鸣 菌 体 两 侧 新 的 结合 位 点 分 别 是 BOP’ 和 POB’, 。98 。 所 有 的 的 附着 位 点 都 具有 三 个 不 同 的 组 分 ,其 中 一 个 存在 于 所 有 的 附着 位 点 之 中 ， 用 0* 表 示 。 喉 菌 体 附 着 位 点 写成 POP’ (P 代表 鸣 菌 体 ), 细 菌 附着 位 点 写成 BOB'(B ft 表 细 菌 )。 因 此 ,在 整合 反应 中 产生 两 个 新 的 附着 位 点 ( 见 图 16-7) BOP’ 和 POB"。 通 党 用 attL 和 attR 分 别 表示 前 噬菌体 两 端的 左 \ 右 两 个 附着 位 点 ,由 于 整合 酶 不 能 催化 BOP’ 和 POB’ 之 间 的 反应 ,因此 下 面 这 个 反应 在 有 整合 酶 时 是 不 可 逆 的 BOB’ + POP， 整 合 酶 BOP' + pop’ SHE MAK BRT Bil Ra BS fA 整合 的 结果 是 IDNA 以 线性 状态 插 在 细菌 染色 体 DNA 的 gal & bio 位 点 之 间 ， 作为 大 肠 杆菌 DNA 的 一 个 片段 一 起 复制 。 第 一 个 插 人 的 证 据 来 自 遗 传 学 实验 ， 表 明 C1) 在 前 叹 菌 体 中 ,基因 顺序 发 生 改 变 ; (2) 从 gal 到 POP’ 右边 一 些 基因 之 间 是 连锁 的 ;(3) 从 bio 到 POP 左边 的 一 些 基 因 也 是 连锁 的 ; (4) RRB gal 与 bio 之 间 的 距离 大 于 非 溶 源 菌 中 这 两 个 位 点 之 间 的 距离 。 最 终 的 插 人 证 据 来 自 下 面 的 物理 实验 。 将 鸣 菌 体 与 一 个 分 子 量 为 105X10 ”的 含有 BOB’ 位 点 的 环 状 质粒 进行 整合 形成 前 喉 菌 体 。 质 粒 仍然 保持 环 状 , 但 其 分 子 量 因 增 加 了 一 个 4 分子 的 分 子 量 G31X10') 而 达到 136 x iv, 现在 已 得 到 纯化 的 整合 酶 ,BOB” 和 POP’ 位 点 的 序列 也 已 知道 。 这 样 ,在 体外 就 可 进行 整合 反应 (图 16-8)。 整 合 酶 具有 与 DNA 结合 的 活性 ,能 与 POP” 强烈 地 结合 。 它 同时 也 是 工 型 拓扑 酶 ( 见 第 八 章 )， 能 将 双 螺旋 中 的 一 条 链 打 断 ,将 断 链 绕 着 连续 链 旋转 ， =I le ra (b) COCO CCCP (d) (c) 图 16-8 (a) 体外 整合 酶 催化 反应 的 电镜 照片 。 左 边 是 POP’ 的 ADNA 片段 ， 右 边 是 另 一 片 眉 纯 化 的 整合 酶 结合 在 它 上 面 。(b) 是 〈a) 图 中 两 个 分 子 的 图 解 ， 两 个 箭头 表示 整合 酶 结合 位 点 ?右边 的 分 子 的 因 上 述 两 个 位 点 (相距 250 碱 基 对 ) 接 近 而 乡 短 ， 说 明 整 合 酶 把 两 个 位 点 连 在 一 tT, (ce) 两 个 都 带 有 POP 位 点 的 超 螺 旋 的 ADNA 分 子 , 由 整合 酶 连接 到 一 起 。(d) 是 〈c) 图 中 两 个 分 子 的 图 解 ( 承 Mau Better 提供 )。 * 另 一 种 表示 BOB’ 的 方法 是 用 “@ 代替 O? 大 肠 杆 菌 整合 位 点 记 作 B@B'， 在 本 书 中 我 们 更 喜欢 用 BOB’. ae 99 。 AT AE HK ORT EAMES RMI — PY IHF 的 宿主 蛋白 (integra- se host factor， 整 合 酶 的 宿主 因子 )，IHEF 也 结合 到 整合 位 点 上 ， 但 其 生化 功能 还 不 清 楚 。IHF 是 一 个 二 聚 体 或 四 聚 体 , 它 的 一 个 亚 基 是 himA 基因 的 产物 ，himA 蛋白 也 以 某 种 形式 参与 对 溶 源 途 径 和 有 裂解 途径 的 选择 。 序 列 分 析 表 明 ;B, B',P 和 P' 的 序列 差别 很 大 ,而 通常 被 称 作 核 心 序列 〈core sequence) 的 O 序 列 ( 像 在 BOB’ 中 的 ) 中 会 有 大 量 A-T BET LA 16-9)。 还 不 详细 知道 整合 反应 的 机 理 , 但 已 清楚 了 几 点 。 首 先 , 如 图 16-10 所 示 ,在 每 个 整合 区 的 互补 链 上 相隔 7 个 碱 基 对 处 打开 两 个 单 链 缺口 ;第 二 ， 同 样 如 图 16-10 所 示 , 发 生 交换 ， 同 时 生成 两 个 由 核心 序列 的 链 形成 的 重 登 结合 接头 。 最 近 GCTTTTTTATACTAA “” CGAAAAAATATGATT 图 16-9 4att 区 核心 序列 的 碱 基 顺 序 。 + ‘SEC ROR OE eS Ce 个 | 在 TT 下 -Te ttcaGCTTTTTTATACTAAgtt 9 噬菌体 att(POP') aagt CGAAAAAATATGATTcaac a a SE 下 了 下 下 生生 en rr ee es es ee se ee se es ro gcct GCTTTTTTATACTAACt tg cggaC GAAAAAATATGATTgaac 细菌 att(BOB ) ac | sse ® gcctGCTTTG TTATACTAAgttg ’ cggaCGAAAAAATATGATTcaac 前 噬菌体 BOF ttcaGCTTTSTTATACTAActt9 POB， aagt Pea AATAT@ATT anes eee CT Ee Ct FE RE 16-10 在 整合 酶 催化 的 交换 反应 中 ，DNA 链 被 酶 切断 的 大 约 位 置 (箭头 所 指 )。attL 和 attR 中 带 圆圈 碱 基 的 来 源 未 能 确定 ,也 许 来 自 与 不 同 ( 虚 线 和 实 线 ) 的 整合 区 。 小 写字 母 表示 两 侧 BSB’, Pa P' 中 的 碱 基 , 大 写字 母 表示 O 区 中 的 碱 基 。 有 人 提出 了 整合 反应 酶 反应 的 模型 ( 见 图 16-11)， 认 为 整合 附着 位 点 处 是 易 熔 解 的 。 它 的 富 含 A 十 工 的 核心 序列 解 链 ,与 另 一 个 不 同 的 整合 位 点 的 互补 序列 互补 ,形成 四 链 片段 [步骤 (b)]。 在 步骤 (c) 中 同 源 区 形成 具有 两 个 单 链 缺 刻 的 配对 。 接 着 ,整合 酶 的 拓扑 酶 活性 使 每 个 双 链 区 旋转 270"。 然 后 ,来 自 两 个 核心 序列 的 相应 序列 连接 起 来 上 述 缺 刻 一 旋转 一 连接 ”过程 又 在 碱 基 互 补 区 的 另 一 侧 再 进行 一 次 [图 步骤 〈d)]。 然 后 , 带 有 重 登 结合 接头 的 两 条 链 所 形成 的 核心 序列 又 再 度 分 开 [步骤 〈e)]。 这 个 模型 在 大 的 步骤 方 面 基本 上 是 正确 的 ,但 还 需 再 进行 更 多 的 实验 以 证 明 其 细节 。 整合 酶 的 合成 与 cl 阻 遏 物 的 合成 相 偶 联 。 这 样 是 很 有 效 的 ,因为 在 溶 源 周期 中 两 步 都 是 必需 的 ,而 在 裂解 周期 中 两 者 都 是 不 需要 的 。 图 16-12 是 对 这 种 偶 联 进行 调节 的 概 要 说 明 。 在 缺乏 正 调控 因子 时 ，(?cI 基因 的 产物 ) int 和 cl 基因 的 启动 子 都 不 能 与 RNA 聚合 酶 结合 。 在 感染 后 不 久 ,cH 蛋白 被 合成 出 来 4 见 第 十 五 章 ), 当 cll SAREE «100° ¢2L)b-LipEGCLEET EBL Bie C C (a) sth oi CA A -ar-a twwsohe Pataca he odes bala oad le SERBAB ER, Bh IE BY WE FT SEH Oe | PASE FF) RAE he HE EBS 4 Fi TAL IE aR A s 站 pets ale ds ke w A ES pe 箭头 处 形成 缺 刻 ; 正 基 序列 发 生 旋 转 ,再 连接 = 5 wr rr cH ES Ae ee gig 9 Fa Ma. TAS C W w by RRR > BARRE TE: 两 个 双 螺 旋 相 互 分 江 SELLE EEE C A et SE a) a | (e) + Wr ae os ee w otto bet ti PA LITTLE, 图 16-11 整合 反应 模型 。 详 见 正文 。 粗 线 表示 打开 的 碱 基 对 ( 承 Howard Nash 提供 的 图 "已 经 过 修饰 )。 (d) GSH. CAAA I 基因 和 it 基因 的 启动 子 (分 别 用 pre 及 pl 表示 ) 附 近 的 位 点 上 ,使 pre 和 pl 能 与 RNA 聚合 酶 结合 (在 这 一 点 上 ，clI 蛋白 的 作用 与 乳糖 操纵 子 中 cAMP- CAP 的 复合 体 的 作用 类 似 )， 然 后 ，RNA 聚合 酶 转录 这 两 个 基因 ,生成 这 两 个 基因 的 产 物 ; 阻 过 物 与 整合 酶 。 以 后 我 们 会 看 到 , 通过 调节 ll 蛋白 的 浓度 来 决定 在 感染 中 1 噬 菌 体 是 进入 溶 源 周 期 或 是 进入 裂解 周期 。 BSR wee KIM 溶 源 性 细菌 一 般 都 很 稳定 ,并 且 能 在 不 释放 出 叹 菌 体 的 情况 下 无 限 地 复制 。 可 是 ,一 且 溶 源 性 细菌 遭 到 破坏 , 便 有 利于 噬菌体 , 它 就 脱 去 阻 遏 而 开始 其 裂解 循环 。 这 种 情况 确 实 存在 ， 并 且 去 阻 遏 作用 (前 叹 菌 体 诱导 作用 ，prophage induction) 的 信号 就 是 DNA *。， 101。 err tee ee wm ewww ew we ee 图 CIT 蛋 白 16-12 在 pre & pl 分 别 合成 出 cl mRNA 和 int mRNA 的 过 程 中 cII 蛋白 的 作用 。 带 箭头 粗 虚 线 表示 mRNA 分 子 , 箭 头 方向 表示 RNA 合成 方向 ,箭头 所 靠近 的 DNA 链 是 被 转录 的 链 。 圆 点 表示 cll 蛋白 。 细 虚线 箭头 指出 cll 蛋白 的 结合 位 点 。 损伤 。 目 前 还 不 知道 诱导 的 机 理 如 何 ， 图 16-13 表示 了 两 种 目前 流行 的 理论 。 半 今 为 止 ， 紫 外 线 照射 是 所 有 诱导 物 中 研究 得 最 广泛 的 ， 它 能 导致 DNA 损伤 从 而 引起 SOs 修复 系统 的 活化 ( 见 第 九 章 ) 并 且 在 DNA 中 产生 单 链 区 。 紫 外 线 照射 之 后 , 发 生 了 一 系 列 未 知 的 连续 过 程 ,使 得 RecA 产物 ( 见 第 十 四 章 ) 的 蛋白 酶 活性 对 cl 基因 编码 的 阻 遇 物 进行 切割 而 失去 活性 ,从 而 诱导 噬菌体 进入 裂解 循环 。RecA 蛋白 是 SOS 修复 作用 和 遗传 重组 作用 中 的 一 个 比较 重要 的 因子 。 HK Tb Be FA BY ee ee ee fF GR C1 fy DNA 无 活性 的 RecA 蛋白 CC > eS 1 让 RecA 蛋白 进行 的 切割 Be | 有 活性 的 i a RecA 蛋白 \ aa : &, ae 上 ii ; of HRB IE DAS IF te: x FESR (te MIE Ws 图 16-13 ”前 噬菌体 诱导 作用 的 两 种 途径 。 灰 色 表 示 阻 过 物 。 在 第 一 种 模型 中 ， 紫 外 线 照射 之 后 的 早期 步骤 是 活化 RecA 蛋白 ,这 可 能 是 通过 结合 到 紫外 修复 作用 诱导 产生 的 缺口 上 而 实现 的 。 这 个 活化 的 RecA 和 蛋白 切割 阻 遇 物 ,使 操纵 子 获得 自由 。 在 第 二 种 模型 中 ,由 于 紧密 地 结合 到 有 缺 口 处 的 DNA 上 而 使 阻 遇 物 离开 操纵 子 。 从 pL 开始 转录 的 产物 是 一 种 称 做 切除 酶 〈excisonase) 的 蛋白 质 ( 简 称 为 Xis) 它 是 由 xis 基因 编码 的 。 近 来 已 纯化 了 这 个 切除 酶 ,但 只 知道 它 的 少数 几 种 性 质 。 遗 传 学 证 担 及 结合 性 研究 表明 ,切除 酶 和 整合 酶 在 一 起 形成 一 个 复合 物 , 于 是 后 者 去 识别 前 噬菌体 的 附着 位 点 BOP’ #1 POB’; 一 旦 这 个 复合 物 与 这 些 位 点 结合 ， 整合 酶 即 可 在 核心 序列 进行 切割 ,重新 形成 . 5808 和 POP’ 位 点 。 最 近 通 过 电镜 研究 前 明 了 Xis 的 物理 作 ”102。 Flo HBS, POR He Xis 形成 了 一 个 紧密 的 复合 物 , 据 认 为 * 这 个 复合 物 中 也 包括 Int. 在 POB 和 BOP’ 相互 作用 之 前 就 形成 这 种 复合 物 。 于 是 Xis-Int SAH 使 整合 反应 逆转 ,导致 前 鸣 菌 体 被 切除 ( 见 前 面 的 图 16-7)。 所 有 附着 位 点 之 闻 的 反应 可 以 写作 Int BOB’ + POP’ S&S, BOP’ + POB’ Int,Xis Xis-Int 复合 物 不 能 催化 右 向 反应 ,所 以 , 当 切 除 酶 存在 过 多 时 ,切除 就 是 不 可 逆反 应 。 注意 ,切除 的 产物 是 一 个 完整 的 大 肠 杆 菌 染 色 体 和 一 个 环 状 的 1 叹 菌 体 分 子 , 并 且 在 刚 受 到 叹 菌 体感 染 的 细胞 中 存在 的 也 是 这 两 种 物质 。 合成 Acl 阻 遏 物 的 两 种 启动 子 在 溶 源 周期 中 很 重要 的 一 点 ,就 是 比 DNA 复制 快 的 阻 遏 物 分 子 的 合成 增加 了 操纵 基因 的 数量 。 如 果 操 纵 基 因 的 数量 对 于 阻 过 物 的 数量 太 多 了 ,就 会 发 生 转录 ,导致 大 量 产 生 叹 菌 体 和 细菌 死亡 。 因 此 , 当 进 入 溶 源 周 期 而 刚 被 感染 后 , 阻 遇 系统 就 会 突然 地 大 量 合 成 阻 遇 物 。 反 之 ,如 果 在 溶 源 菌 中 只 含有 一 个 1DNA 5 -F (CRIME, prophage), 4% 阻 遏 状 态 就 只 需要 较 少 的 cl FHM REA, Il 基因 必须 在 溶 源 性 细菌 中 才 转 录 ，, 但 是 转录 并 不 强烈 4 这 是 对 以 前 说 法 的 修饰 ,以 前 认为 在 溶 源 状 态 时 前 噬菌体 处 于 “关闭 状 态 )。 了 维持 的 mRNA <=_--—-:-——_—--* 建立 的 mRNA 图 16-14 4 鸣 菌 体 的 cl 基因 及 其 邻近 的 区 域 ， 标 出 了 合成 cl mRNA 的 两 个 启动 子 。 两 条 实 线 是 DNA 两 条 链 ， 下 面 带 箭头 的 虚线 代表 都 从 下 面 的 那 一 条 DNA 链 转录 出 来 的 两 个 mRNA 分 子 ? 上 面 的 链 向 右 转录 出 的 mRNA( 图 中 未 标 出 )? 翻 译 出 “II 基因 产物 ,这 个 蛋白 质 活 化 pre， 产生 建立 溶 源 状态 的 mRNA, cl 蛋白 激活 prmy 产 生 维持 咨 源 状 态 的 mRNA, 在 1 中 , 阻 遏 物 的 高 水 平 合成 和 低 水 平 合 成 是 通过 两 个 启动 子 控制 的 ( 见 图 16-14)。 《1) 2VWERKAN AMF pre, CR cll 蛋白 活化 ,并 在 被 感染 的 细菌 中 起 作用 。(2) 维持 溶 源 状态 的 启动 子 prm, 它 被 自身 阻 遏 物 调节 并 在 溶 源 菌 中 起 作用 。 因 此 , 当 溶 源 化 作用 发 生 之 后 《也 就 是 当 噬 菌 体 已 经 合成 出 足够 活化 pre II 蛋白 时 )， 开 始 于 启动 子 pre 的 mRNA 就 会 突然 地 大 量 合成 阻 遏 物 ,并 且 这 个 阻 遏 物 蛋白 质 又 去 活化 启动 子 prmo 当 阻 遏 物 的 数量 增加 时 ，cII 基因 的 转录 受到 阻 遇 ,并 且 不 再 产生 cll 蛋白 。 cll 蛋白 不 稳定 , 它 的 浓度 很 快 降 到 不 足以 使 pre 维持 在 有 活性 的 状态 ,于 是 pre mRNA 的 合成 就 终止 了 。cl 蛋白 活化 prm, 产 生 prm mRNA。prm mRNA 继续 不 断 地 合成 。 这 些 mRNA 。103。 在 以 后 许多 世代 都 能 翻译 , 这样 就 使 阻 遏 物 维持 在 一 定 的 浓度 水 平 上 SE 菌 体 。 正 像 我 们 已 经 说 明 的 那样 ,在 溶 源 菌 中 只 需要 很 少 的 阻 遇 物 ,从 效率 观点 讲 从 prm 开始 的 转录 应 该 少 一 些 。 但 是 事实 上 ,两 个 启动 子 都 处 于 全 开放 状态 ,以 同样 活跃 的 程度 与 RNA 聚合 酶 结合 。 然 而 由 于 从 pre 转录 下 来 的 mRNA 上 有 与 核糖 体 结合 很 强 的 结合 位 点 ,而 prm 的 转录 子 却 只 能 与 核糖 体 微弱 地 结合 , 所 以 生成 的 阻 遏 物 也 就 较 少 。 因此 ,翻译 效率 决定 了 来 自 两 种 mRNA 的 阻 遏 物 的 数量 不 同 。 表 16-12 是 阻 遏 物 合成 过 程 的 总 结 。 表 16-12 溶 源 途径 中 cl 阻 遇 物 合 成 的 大 致 步骤 1. 感 染 细胞 2. 从 PR 向 右 转录 出 mRNA 3. 活 化 pre 4. 从 pre RH Miz MBM AKA 成 ) 5.cl 阻 遏 物 活 化 prm 6, 从 prm 转录 并 翻译 出 阻 过 物 7.cl 蛋白 关闭 PR 8'cII 蛋白 降解 ;因此 pre 失 活 9. 从 prm 继续 合成 cl 蛋白 (从 低 水 平 合成 ) 我 们 刚 说 过 需要 阻 遏 物 去 开动 从 prm 开始 的 转录 , 当 阻 遏 物 浓 度 很 高 时 , 从 prm 开 始 的 转录 不 能 进行 ,这 是 因为 阻 遇 物 负 调 控 它 本 身 的 转录 ,这 个 调节 机 理 使 2 阻 遏 物 的 浓 度 维持 稳定 。 这 种 稳定 有 两 个 好 处 : 〈1) 由 于 营养 供应 波动 ;自然 界 中 细菌 的 生长 速度 也 是 不 断 变 化 的 。 这 种 稳定 可 以 使 阻 遏 物 的 浓度 不 致 于 少 到 自发 地 发 生 诱 导 作 用 。 (2) 如 果 没 有 调节 , 阻 遇 物 的 浓度 就 会 高 到 当 需 要 发 生 诱 导 时 却 不 能 发 生 诱 导 。 也 许 有 人 会 间 ，prm 为 什么 会 被 阻 遏 物 活化 ? 由 于 从 prm 合成 的 阻 过 物 比 从 pre 合成 的 少 , 那 么 ,如 果 1 只 有 溶 源 途 径 ，prm mRNA 的 合成 就 是 一 个 必要 的 过 程 ;但 是 当 鸣 菌 体 也 有 可 能 进入 有 裂解 周期 时 ， 就 应 避免 prm mRNA 的 组 成 型 合成 即 非 诱 导 型 的 合 p& (constitutive synthesis), 因 为 这 种 合成 能 造成 阻 遇 物 的 过 早 成 熟 , 并 且 这 将 会 阻止 启 动 裂 解 周 期 。 有 了 和 负 调 控 系 统 ， 只 需 控制 来 自 pre 的 阻 遏 物 的 爆发 性 合成 ， 就 不 能 从 prm AKAD o 为 了 理解 这 些 调节 循环 的 机 理 , 需 要 了 解 操纵 子 的 结构 ,这 将 在 下 一 节 中 介绍 。 操纵 基因 的 结构 以 及 阻 遏 物 的 结合 和 Cro 产物 oL 和 oR 操纵 基因 可 以 进一步 分 成 六 个 区 域 : oL1，oL2，oL3，oR1,oR2 和 oR3 (HUA 16-15)。 这 些 区 域 的 碱 基 序列 很 类 似 , 每 个 区 域 都 可 与 cI 阻 遏 物 结合 , 其 结合 力 各 不 相同 , 按 其 强 弱 顺 序 如 下 : oL1 > oL2 > oL3 oR1l > oR2 > oR3 +104 A att N cl cre R I an as a ~ ae ee eel - aa ee cut a. pR Ti : » a 4 ’ \ ee al oR3 oR2 ORI cro Se N Olt ob2 og ooo pL 图 16-15 4 的 操纵 基因 -启动 子 区 域 的 详 图 。 箭 头 方向 表示 cre 及 cl 基因 的 转录 方向 。 人 参考 图 16-4。 5 oLl, oL2 和 与 oR1，oR2 的 结合 是 有 顺序 的 ,同时 又 是 协同 的 ,与 oR3 和 oL3 的 结合 则 不 是 协同 的 。 当 阻 遏 物 的 浓度 很 低 时 ，oL1、oR1 fr A Rte oA. AT ply pR 分 别 与 oL1、oR1 相 邻 ,因此 当 阻 遏 物 结合 在 这 些 位 点 上 时 RNA 聚合 酶 与 PL、pPR 结合 受 到 阻碍 。 当 oL2, oR2 也 结合 了 阻 遏 物 时 ,这 种 堵塞 就 更 加 彻底 。 这 时 操纵 子 处 于 咨 源 周 期 的 状态 。 因 为 prm 启动 子 位 于 oR2 与 oR3 之 间 , 因 此 ,如 果 阻 遏 物 浓 度 很 高 ， prm 就 被 堵塞 ; 这 就 解释 了 阻 遏 物 对 自身 合成 的 负 调 控 作 用 。 同 时 ,只 有 当 oR] hie 占 据 时 ，prm 才能 与 RNA 聚合 酶 结合 。prm AAPL MA 8 218 AB SR], oR2 结合 是 阻 遏 物 合成 的 自身 正 调 挖 方式 ， 可 能 是 阻 遏 物 的 结合 使 prm 中 的 碱 基 配 对 减弱 ,从 而 容易 被 RNA 聚合 酶 形成 开 盒 式 的 启动 子 复合 体 , 这 很 像 cAMP-CAP BAK 对 乳糖 操纵 子 的 正 调控 ( 见 第 十 四 章 )。 因此 ,如 果 感 染 大 肠 杆 菌 的 2 吻 菌 体 要 进入 谥 源 状 态 , 就 会 发 生 下 面 的 事件 : 1. 开动 从 PL 和 pR 起 始 的 转录 。 2. 从 pR 开始 的 转录 产物 翻译 出 cII 蛋白 。 3. cll BA RNA 聚合 酶 能 从 pre 启动 子 处 开始 转录 ,合成 阻 遇 物 。 4. 阻 遏 物 结合 到 , oL1 与 oR1 上 去 ,关闭 cll 基因 的 转录 ,于 是 cll 蛋白 的 合成 随 之 停止 。cII 蛋白 是 不 稳定 的 ,不 久 , 从 pre 的 转录 也 就 停止 了 。 5. oR] 被 阻 遏 物 占据 ( 见 第 4 点 ) 使 prm 得 到 活化 ， 这 样 使 阻 遏 物 能 从 这 个 启动 子 合成 出 来 ,不 过 是 低 水 平 的 合成 。 6. cl (BWA HRA BG. Fee oL2, oR2 也 被 占据 了 。 从 pL, pR 开始 的 转录 就 被 完全 阻 抑 了 。 7. 如 果 阻 遏 物 浓 度 太 高 , 它 就 与 oR3 结合 , 阻 抑 从 prm BRR. Alt, BAe 物 浓度 在 小 范围 内 发 生 波动 都 会 影响 prm 的 活性 : 使 prm 处 于 “开启 ”或 “关闭 ”的 状 态 。 我 们 已 经 叙述 了 使 得 吻 菌 体 不 可 能 进入 裂解 周期 的 体系 。 叹 菌 体 进入 裂解 周期 必须 有 co 基因 产物 参与 ,这 个 蛋白 质 对 于 有 裂解 周期 中 的 几 个 步骤 是 必需 的 ， 而 且 可 以 防止 cl 阻 遏 物 的 合成 。Cro 蛋白 也 是 一 种 阻 遏 物 , 它 能 与 oL，oR 操纵 基因 结合 , 起 作用 的 方式 是 基于 它 对 操纵 基因 中 亚 位 点 〈subsites) 的 亲 合 性 有 所 不 同 。 这 种 亲 合 性 与 cI 对 这 些 亚 位 反 的 亲 合 性 正 相 反 : © 105 。 oR3 > oR2 = oR1 6oL3 > 0L2> oL! 其 过 程 如 下 : 1. 从 pR 转录 Cro 基因 (图 16-15)。 2. Cro 转录 之 后 ，cILI 基因 被 转录 ，cII 基因 产物 对 活化 pre 启动 子 是 必需 的 。 3. Cro 蛋白 合成 出 来 后 ,立即 结合 到 oR3 上 ,阻止 prm 的 活化 。 4. Cro 蛋白 浓度 增加 ， 可 逐渐 地 与 、oR2、oR1 结合 ， 当 oR2、oR1 全 被 占据 时 ， RNA KGMRARES PR 结合 ,最 终 Cro 蛋白 的 合成 也 就 停止 。 第 3.5 4 步 说 明 , Cro 蛋白 在 阻 抑 cll 蛋白 合成 的 同时 ,也 阻 抑 了 自身 的 合成 。 裂解 所 需要 的 大 部 分 基因 都 在 cro 基因 右边 ,因此 ,如 果 Cro 蛋白 是 一 个 高 效 阻 遏 物 ,那么 , 既 不 能 发 生 深 源 ( 因 为 不 能 产生 cl BAB). HARKER A CRD MM pR 开始 WHR) Ail, Co 蛋白 与 oR 的 结合 力 很 弱 , 当 细胞 中 已 有 足够 量 的 Cro 蛋白 是 去 关闭 右 向 的 转录 以 及 去 阻 抑 prm 时 ,细胞 中 同样 也 存在 着 很 多 cll 蛋白 ,这 些 cII 蛋白 促进 从 pre 开始 的 转录 ， 并 阻 抑 Cro 蛋白 的 合成 。 如 果 在 早期 合成 了 足够 的 cl BAB 物 ,那么 Cro 蛋白 就 不 能 合成 ,同时 会 建立 阻 遇 状 态 。 事 实 上 ，Cro 蛋白 的 合成 与 cI 阻 遏 物 的 合成 之 间 的 竞争 决定 了 叭 菌 体 是 进入 溶 源 周期 还 是 进入 裂解 周期 。 对 这 种 竟 争 进 行 调控 的 一 个 严格 的 调节 因子 就 是 cll 蛋白 ,在 下 一 节 中 我 们 将 叙述 cll 蛋白 。 裂解 周期 还 是 溶 源 周 期 的 决定 决定 进入 裂解 周期 还 是 进入 溶 源 周期 的 机 理 还 未 完全 得 出 *。 但 是 ，cll 蛋白 起 着 核 心 作用 ,这 是 很 清楚 的 。cIl 蛋白 有 三 个 重要 功能 : (1) 活化 pre 启动 子 ;〈2) 活化 Int 基因 的 启动 子 pH (3) 延迟 晚期 的 mRNA 的 合成 (这 个 mRNA 编码 叹 菌 体 的 头 、 尾 及 裂解 系统 )。 有 几 个 证 据 表明 当 MOI 较 低 时 ,有 活性 的 cll 蛋白 的 含量 限制 pre 启动 子 的 活化 ,其 原因 还 不 清楚 ,但 这 解释 了 进入 湾 源 状态 需要 有 很 高 的 MOI 的 原因 。 有 可 能 活化 pl 和 pre 的 cll 蛋白 含有 多 个 亚 基 ， 因此 ， 只 有 当 这 个 蛋白 质 的 总 浓度 维持 在 一 个 很 高 的 水 平时 ， 才 存在 它 的 活化 形式 。 而 这 种 情况 只 有 在 MOI 很 高 时 才 可 能 出 现 。 决定 进入 裂解 还 是 进入 溶 源 周期 的 两 个 重要 因子 是 大 肠 杆 菌 的 hfl 基因 和 himA 基 因 。 很 明显 ，hfl 基因 编码 (或 控制 ) 着 可 以 降解 Il 蛋白 的 二 个 蛋白 酶 中 一 个 。 然 而 它 的 活性 被 1 的 cll 基因 蛋白 抵 销 ，cIIL 基 因 和 蛋白 则 是 由 起 始 于 pL 的 mRNA 所 编码 的 。 HimA 在 溶 源 化 中 有 两 个 作用 : (1) 如 前 所 述 , 这 个 宿主 蛋白 作为 整合 酶 的 一 个 亚 基 参 与 整合 反应 , 它 是 一 个 必需 的 成 分 ;〈2) 当 对 himA 宿主 进行 感染 时 ， 在 这 个 体系 中 除 了 不 能 合成 出 整合 酶 之 外 ,还 不 能 合成 出 cI 阻 遏 物 。 此 外 ，himA 基因 还 参与 许多 细 胞 内 的 反应 ,例如 ，SOS 修复 和 和 遗传 重组 HimA 蛋白 的 量 随 细胞 生长 状态 的 变化 而 变化 。 可 能 是 HimA 蛋白 和 (或 ) Hfl 蛋白 的 浓度 随 细 胞 生长 变化 而 发 生 的 变化 影响 了 早期 所 说 的 溶 源 化 的 要 求 一 -细胞 生活 的 环境 必需 是 略微 缺乏 营养 的 。 至 于 HimA 蛋白 是 如 何 影响 对 裂解 和 深 源 的 选择 ,现在 还 不 清楚 。 但 是 关于 HimA 蛋白 是 一 个 对 环境 敏感 的 * 这 个 研究 得 很 活跃 的 题目 还 没有 完全 弄 清 楚 。 书 中 的 一 些 陈述 是 靠 推测 得 来 的 。 ¢ 106。 因子 以 及 它 对 于 整合 反应 是 必需 的 看 法 都 已 经 弄 得 很 清楚 了 。 因此 ， 对 于 整合 反应 来 说, 当 HimA 蛋白 的 浓度 过 低 时 ,建立 阻 遏 作用 ,合成 整合 酶 等 对 吻 菌 体 都 是 徒劳 的 。 溶 源 化 作用 过 程 中 的 切除 及 其 防止 溶 源 周期 中 , 在 cl BWA RA AAEM pL 起 的 转录 ,结果 是 int 基因 和 xis 基 因 的 转录 。 如 果 整 合 酶 〈integrase) 和 切除 酶 (excisonase) 同 时 出 现 , 那 么 已 插 到 染色 体 中 的 前 噬菌体 就 会 马上 被 剪 切 下 来 ,这 是 溶 源 化 过 程 中 必须 避免 的 。 图 16-16 给 出 了 防 止 这 种 切除 的 简单 机 理 。 pi” \ xis genes Mehta HTS @ cII 蛋白 FSC plmRNA e2 int 蛋白 没有 xis 蛋白 图 16-16 在 溶 源 化 过 程 中 防止 合成 xis 蛋白 。 黑 线 表 示 DNA FF RRA mRNA 分 子 ， cll 蛋白 活化 pl (int 基因 的 启动 子 )。pI 位 子 Xis 蛋白 的 核糖 体 结合 位 点 的 下 游 。 在 溶 源 化 途径 的 一 部 分 过 程 中 ，cII 蛋白 开动 从 pre 启动 子 起 始 的 cI 阻 遏 物 的 合 成 ,以 及 从 pl 启动 子 起 始 的 整合 酶 的 合成 。 然 后 cl 阻 遏 物 作用 于 pL, SRAM pL 开 始 的 int 及 xis 基因 的 转录 。pI 启动 子 位 于 xis 基因 中 的 核糖 体 结合 位 点 的 下 游 ， 这 样 ，mRNA 只 能 合成 整合 酶 而 不 是 切除 酶 。 AoA 筛选 致癌 物 人 们 除了 对 1 噬菌体 本 身 感 兴趣 外 ， 对 A 鸣 菌 体 的 认识 还 为 分 子 生物 学 研究 提供 了 一 种 了 解 基本 的 分 子 过 程 的 手段 。 最 近 , 已 证 明 1 吻 菌 体 可 用 来 筛选 致癌 物 。 在 第 九 章 中 描述 了 一 个 实验 ， 在 这 个 实验 中 由 于 致癌 物 能 诱导 沙门 氏 杆 菌 中 的 His ”突变 株 产生 回 复 突 变 ， 从 回复 突变 得 知 存在 着 致癌 物 。 人 们 用 含有 1 RANA LAB RIE SR 似 的 实验 (为 Devoret test)， 溶 源 菌 以 极 低 的 频率 自发 诱导 ,而 在 某 些 突变 株 中 , 这 个 频 率 更 低 。 然 而 ,许多 致癌 剂 可 以 引起 DNA 损伤 , 并 且 它 们 是 诱 变 剂 。 人 们 可 以 很 简便 地 测 出 这 种 诱 变 作 用 。 如 果 一 个 溶 源 菌 与 10” 个 细菌 混合 ， 铺 到 培养 基 上 ( 像 测 噬 菌 斑 那 样 做 ), 一 个 没有 受到 有 诱 变 的 深 源 菌 ,在 细菌 层 上 形成 一 个 微 菌 落 ( 最 多 只 有 1 000 个 细 Ho 偶然 ,在 菌 沙发 育 过 程 的 晚期 ;会 有 一 个 细菌 被 诱 变 ,但 是 这 种 诱 变通 常 并 不 能 产生 一 个 噬 菌 斑 ,因为 培养 基 已 经 缺乏 营养 ,限制 了 细菌 生长 ， 所 以 释放 出 的 吻 菌 体 不 能 增殖 《注意 ,噬菌体 只 能 在 生长 着 的 细菌 中 增殖 )。 然 而 ,如 果 培 养 基 中 含有 诱 变 剂 〈 在 这 种 情 | 况 下 ,加 的 是 致癌 剂 ), 当 细菌 开始 在 培养 基 上 生长 时 ,就 能 将 初始 的 那个 溶 源 菌 诱 变 ， 因 。 107。 ACCT DRO EA BE MUR ERIM IMA T 10° APSHA, Ames 氏 测 试 法 那样 ， 通 过 计量 产生 鸣 菌 开 细 胞 的 比例 就 可 以 知道 诱 变 剂 的 效率 。 这 个 实验 为 : 在 培养 基 中 加 入 于 提取 液 以 活化 致癌 剂 , 通 过 这 个 试验 成 功 地 将 这 些 已 在 Ames 氏 测 试 中 观察 到 的 致癌 剂 答 测 出 来 。Devoret 氏 试 验 法 灵敏 度 更 高 ,同时 , 它 也 只 要 更 低 浓 度 的 致癌 剂 ; 因 此 ,在 ， Ames 试验 中 测 不 到 的 弱 致癌 剂 可 再 用 Devoret 试验 法 进行 检测 。 这 两 个 试验 被 用 来 检 测 大 量 的 工业 生产 的 化 学 物质 及 食品 节 加 剂 。 其 他 形式 的 溶 源 菌 绝 大 多 数 溶 源 菌 按照 我 们 描述 的 1 的 方式 溶 源 化 。 一 般 ， 前 叹 菌 体 在 细菌 染色 休 上 的 唯一 的 一 个 位 点 上 插 和 人 ;而 能 在 染色 体 上 好 几 个 att 位 点 上 插 人 噬菌体 的 溶 源 菌 则 很 少见 到 。 在 本 章 开 始 时 我 们 曾 指出 ,大 肠 杆菌 P1 噬菌体 显然 与 此 不 同 , 它 的 前 噬菌体 不 “ 插入 到 染色 体 上 ,感染 之 后 Pl DNA 被 环 化 ,同时 被 阻 抑 。 在 溶 源 周 期 中 ， 每 一 个 细胞 中 含有 一 至 两 个 超 螺 旋 化 的 P1 DNA, 在 细菌 的 每 一 个 生活 周期 中 ，P1 DNA 只 复制 一 次 ,并 且 与 细菌 DNA 的 复制 偶 联 。 当 细菌 分 裂 时 ,每 一 个 子 代 细胞 得 到 一 个 P1 环 ， 但 还 不 清楚 这 些 有 序 事件 的 机 理 , 与 那些 将 DNA 插 人 到 细菌 染色 体 中 的 噬菌体 相 比 ,对 于 叹 菌 体 如 何 维持 其 溶 源 状态 的 机 理 知 道 的 也 不 多 。 例 如 ,在 每 一 次 细胞 分 裂 时 ,1000 个 细胞 中 有 ! 个 委 失 了 P1 环 ,这 究竟 是 由 于 Pl 偶然 地 未 复制 ,还 是 虽然 复制 了 但 是 没 能 ， -成 功 地 分 配 到 子 细胞 中 去 , 尚 不 清楚 。 溶 源 菌 的 某 些 性 质 当 所 有 敏感 的 宿主 细菌 都 被 吻 菌 体感 染 而 耗 尽 之 后 ， 溶 源 化 就 成 为 吻 菌 体 繁殖 的 手 段 。 细 菌 溶 源 化 的 能 力 对 细菌 也 很 有 价值 ， 因 为 它 能 使 细菌 在 受 感 染 期 间 存 活 下 来 并 对 同 源 免疫 的 超 感染 作用 Chomoimmune superinfection) 有 免疫 性 。 溶 源 化 作用 对 细菌 还 有 其 他 一 些 影 响 , 即 溶 源 菌 获 得 原来 细菌 所 没有 的 一 些 性 质 ， 这 称 做 溶 源 化 转变 〈lysogenic conversion)。 其 中 一 个 例子 就 是 2 鸣 菌 体 为 大 肠 杆菌 提供 对 T4 MRE KAY YIH 基因 的 突变 的 抗 性 ， 一 个 也 是 从 prm 启动 子 开 始 转录 的 4 基因 一 一 rex 阻 断 了 这 些 突变 株 感 染 的 早期 阶段 。 BURR (Corynebacterium diphther- iae) 中 ,只 有 当 细 获 成 为 8 吻 菌 体 的 溶 源 菌 时 ,才能 引起 白喉 。 史 菌 体 的 揪 人 位 点 可 能 在 细菌 基因 内 ,所 以 前 吻 菌 体 的 形成 活化 了 这 个 基因 。 具 有 这 种 性 质 的 例子 还 有 Mu Wee 体 , 它 可 在 任何 基因 中 形成 前 喉 菌 体 ， 所 以 它 是 强 突变 剂 ; 在 下 一 刷 将 要 讨论 Mu ea 体 。 大 肠 杆 菌 的 Mu 鸣 菌 体 是 一 种 温和 鸣 菌 体 , 它 既 能 深 源 化 ,也 能 裂解 细菌 。Mu 这 个 ， . 字 来 自 突 变 者 〈《mnutator), 因为 这 种 噬菌体 的 溶 源 菌 经 常 地 发 生 突变 , 所 以 采用 Mu 来 命 名 。 它 容易 发 生 突变 的 原因 ,是 在 Mu WERE, Mu AREOLA ADIT A A © 108° 色 体 上 ,而 这 些 插 人 位 点 经 常 地 处 于 大 肠 杆 菌 的 一 些 基 因 中 或 在 调控 序列 上 , 当 Mu Bip 菌 体 的 基因 与 调控 序列 分 开 时 ,调控 序列 也 就 失 活 了 。Mu 的 另 一 个 特性 在 于 , 它 插 人 到 痊 主 的 染色 体 上 的 过 程 ， 是 它 的 裂解 生活 周期 中 一 个 必要 的 步骤 。 鸟 类 中 的 逆转 录 病 毒 也 有 这 个 特性 (第 二 十 一 章 ), 这 个 RNA 病毒 引起 鸟 类 的 肿瘤 。 Mu DNA Mu DNA 具有 38 000 个 碱 基 对 ,是 线性 的 DNA。 它 既 不 是 末端 元 余 的 ,也 不 是 环 状 的 。 然 而 在 许多 Mu 噬菌体 中 ,每 个 DNA 分 子 都 互 不 相同 。 将 Mu DNA 变性 再 复 性 后 就 会 证 明 这 点 。 来 自 不 同 双 螺旋 的 单 链 分 子 经 复 性 后 ,用 电镜 观察 得 出 图 16-17 所 Mek he Orne aint iti Ber ; a NE pel 3 TIE RN 图 16-17 Mu DNA 变性 再 复 性 后 看 到 的 主要 图 形 。cw\C、G 及 S 等 符号 表示 杂交 双 链 中 可 以 区 分 开 的 区 域 。 示 的 图 形 。 所 有 单 链 都 含有 不 互补 的 序列 ,进一步 的 实验 说 明了 以 下 特点 : 1. 末端 的 非 互 补 序列 是 细菌 的 DNA Free, At, —+ DNA 分 子 的 末端 和 下 一 个 DNA 分 子 的 末端 不 同 。 2. 如 果 Mu DNA 的 一 个 片段 (如 在 “区 内 ) 的 一 段 长 度 增加 了 《由 于 有 外 源 DNA 的 插入 ), 左 端的 非 同 源 区 (c) 的 长 度 保持 野生 的 该 区 的 长 度 ， 那 么 右 端 的 〈《S) 区 就 会 变 短 。 3. 复 性 后 可 能 产生 一 个 非 互补 的 称 作 G 泡 〈G loop) 的 区 域 ，G 泡 中 两 条 链 是 一 样 AY, Siete fk DNA， 只 是 互相 之 间 方 向 相反 ， 会 出 现 图 16-18(a) 所 示 的 那 种 G 泡 结 Wo WF DNA 浓度 越 低 , 来 自 不 同 链 的 单 链 退火 就 越 不 能 形成 杂交 双 链 。 不 允许 单 链 94 eee ABCD (a) DEBS: (b) 图 16-18 (a) Mu DNA 的 G 泡 结构 (图 16-17), ABCD 表示 G 序 列 的 倒转 。(b) Mu DNA 一 条 链 的 退火 结果 表示 了 G 区 中 的 倒转 重复 。 图 中 只 示 出 一 部 分 链 。 ° 109° DNA ¢ DNA 低 浓度 下 发 生 自我 退火 ,那么 就 可 能 观察 到 图 16-18(b) 所 示 的 那 种 情况 ， g: 与 时 是 自我 互补 的 ,在 噬菌体 生活 周期 中 由 于 遗传 重组 G 片 眉 可 能 倒转 ， 正 常 与 倒转 的 构 型 称 作 * 抛 与 拍 ”(“flip and flop”), & flip 的 链 与 一 个 互补 的 含有 flop 的 链 退 火 ， 产 生 一 个 G 泡 。 含 有 flop RAHM ANAM DNA 与 其 附近 的 鸣 菌 体 的 联系 发 生 了 改变 ,因此 有 flip-DNA 的 噬菌体 和 有 flop-DNA 的 噬菌体 产生 出 不 同 的 尾 纤维 : 它 的 DNA 与 相 邻 的 噬菌体 的 启动 子 的 关系 不 同 了 , 这 样 就 扩大 了 鸣 菌 体 对 细菌 的 可 吸 附 范围 。 Mu DNA 的 复制 与 成 熟 对 上 一 节 中 的 第 1,2 点 ,可 用 Mu DNA 的 特殊 的 复制 方式 来 加 以 解释 。 在 正常 感染 中 的 DNA 复制 期 间 , 子 代 Mu DNA 分 子 插 人 到 含有 大 量 插 人 位 点 的 REE 这 个 还 未 弄 请 楚 的 现象 可 以 解释 第 1 uA: Mu DNA 与 大 量 的 细 蓝 DNA 相连 的 现象 噬菌体 DNA 可 能 是 按 下 列 方式 进行 包装 的 (图 16-19)。 成 熟 体系 识别 Mu DNA 的 C 未 端 ， 并 在 噬菌体 DNA 的 左 端 100 碱 基 对 处 将 宿主 DNA 切断 ， 以 这 点 开始 包 装 ,并 将 头 部 装 满 。 第 二 个 切割 位 点 在 $ 末端 ,其 位 置 取决 于 DNA 装 满 头 部 的 方式 (T4 也 用 此 方式 ) ,但 一 个 装 满 的 头 部 中 装着 超过 噬菌体 DNA 长 度 的 DNA， 这 就 解释 了 第 2 点。 因此 ,其 成 误 体 系 没 有 什么 特别 异常 的 ， 只 是 DNA 复制 的 方式 很 独特 〈 即 子 代 DNA 插入 到 染色 体 中 ) ,造成 噬菌体 含有 不 常见 的 DNA 结构 。 在 第 十 九 章 讨论 转 座 子 时 将 进一步 详 述 Mu 噬菌体 。 第 一 个 切割 ” 装 满 一 个 头 部 的 长 度 第 二 个 切割 (固定 的 位 点 》 | (在 测量 长 度 之 后 ) 成 熟 的 噬菌体 DNA 16-19 插入 的 Mu DNA 的 图 示 ( 虚 线 ) 表 明 切 割 过程 如 何在 末端 产生 出 宿主 的 DNA 序列 。 fe Se Ie bal 到 目前 为 止 ， 在 已 讨论 的 噬菌体 系 中 ，DNA 包装 进 头 部 的 方式 有 两 种 。 第 一 种 是 T4 唉 菌 体 所 采用 的 装 满 的 方式 ( 见 第 十 五 章 ), 叭 菌 体 头 部 装 进 定量 的 DNA; 第 二 种 是 确定 尾 端 方式 : 在 串联 着 的 DNA 的 固定 位 点 上 造成 两 个 切口 。1? 噬菌体 就 是 采用 后 一 ， “110。， 种 方式 〈 亦 见 第 十 五 章 )。 在 装 满 方式 中 ， 我 们 丝毫 没 讲 如 果 提 供 自 由 末端 去 启动 包装 ， 就 能 防止 将 宿主 DNA 包 进 去 。 由 于 鸣 菌 体 编码 的 核酸 酶 能 将 宿主 DNA 快速 地 降解 ， 所 以 刚才 那 种 情形 是 很 少见 到 的 。 开 始 包装 时 , 留 下 很 少量 的 宿主 DNA, 或 者 根本 没有 留 下 。 对 于 1 喉 菌 体 ,由 于 宿主 不 可 能 含有 适当 间隔 开 的 相当 于 cos 位 点 的 碱 基 序 列 , 所 以 1 鸣 菌 体 极 少将 宿主 DNA 包装 进去 。 但 我 们 还 会 看 到 有 时 1 DNA 带 着 一 些 宿 主 DNA 而 被 包装 的 事件 。 现 已 知道 的 几 种 能 包装 宿主 DNA 的 鸣 菌 体 , 人 们 把 它们 称 作 转 导购 菌 体 〈transdu- cing phage)。 含 有 宿主 DNA 的 鸣 菌 体 颗 粒 被 称 作 转 导 颗 粒 。 这 样 的 噬菌体 也 分 为 两 类 : 通用 转 导 鸣 菌 体 (generalized transduing phage), 它 能 产生 出 只 含有 细菌 宿主 PNA 的 颗粒 ;第 二 种 是 特 化 的 转 导 鸣 菌 体 (specialized transducing phages), 它 偶然 能 产生 出 SAME DNA 与 细菌 DNA 的 颗粒 。 两 种 转 导 颗粒 都 能 将 它们 的 DNA 注 人 到 宿主 细菌 中 ,并 且 因此 而 将 宿主 的 DNA 由 一 个 细菌 转移 到 另 一 个 细菌 中 ,这 个 过 程 就 称 作 转 导 。 特 化 的 转 导 颗粒 的 形成 是 溶 源 化 的 结果 ， 将 两 者 放 在 一 起 进行 讨论 是 很 方便 的 。 通用 转 导 颗 粒 的 性 质 Pl 感染 大 肠 杆菌 所 产生 的 颗粒 就 是 通用 转 导 颗粒 的 一 个 很 好 的 典型 例子 。P1 喉 菌 体 既 有 溶 源 周 期 ， 又 有 裂解 周期 。 有 裂解 周期 与 形成 通用 转 导 颗 粒 相 关 。 P1 的 裂解 周期 与 第 十 五 章 中 所 讨论 过 的 裂解 噬菌体 没有 很 大 不 同 。 与 这 个 讨论 有 关 的 性 质 是 : C1) 每 次 释放 的 数目 大 约 是 100 个 子 代 P1; (2) 鸣 菌 体 DNA 的 分 子 量 是 66 X 10°; (3) Pl 编码 一 个 核酸 酶 , 它 能 降解 宿主 DNA。 与 T4 的 核酸 酶 相 比 较 ，P1 的 核酸 酶 的 作用 非常 慢 。 因 此 , 当 包装 开始 时 ,宿主 DNA 成 为 大 部 分 分 子 量 为 10 一 10” 的 一 些 片 段 ,在 被 感染 的 细菌 中 大 约 有 百 分 之 一 的 宿主 DNA 片段 被 包装 到 噬菌体 的 头 部 中 。PI1 的 包装 体系 不 是 很 严格 的 ,因此 ,所 有 颗粒 中 的 DNA 分 子 的 大 小 不 完全 相同 。 而 且 ， 头 部 的 装配 过 程 能 装配 出 两 种 不 同 大 小 的 头 。 其 结果 受 鸣 菌 体 感染 的 细菌 裂解 ， 产 生 的 大 量 叹 菌 体 颗粒 有 一 些 通用 转 导 颗 粒 ,大 部 分 通用 转 导 颗粒 中 含有 一 个 分 子 量 为 20 一 25 X 10° 的 DNA 片段 。 由 于 宿主 DNA 被 随机 地 打 成 片 候 ， 而 且 这 些 转 导 颗粒 含有 宿 主 DNA 的 任何 一 个 片段 。 因 此 ,在 一 个 数量 足够 大 的 Pl 鸣 菌 体 群 体 中 ,至少 会 有 一 个 具 有 全 部 宿主 基因 的 颗粒 。 对 于 任何 特定 基因 来 说 ,大 约 每 10 个 存活 的 叹 菌 体 中 就 有 一 个 转 导 颗粒 ， 因 为 通用 转 导 颗 粒 不 含有 P1 DNA， 所 以 它 不 能 产生 Pl 噬菌体 的 子 代 。 但 是 ,在 有 启动 子 存在 的 情况 下 , 当 通 用 鸣 菌 体 中 的 细菌 DNA 被 注入 到 宿主 细胞 中 时 ， 基因 就 能 被 表达 。 我 们 现在 讨论 转 导 颗 粒 侵 染 细菌 时 发 生 的 事件 。 设 想 一 个 来 自 受 感染 的 野生 型 大 肠 杆菌 的 转 导 颗 粒 中 含有 合成 亮 氮 酸 的 基因 ， 这 样 的 颗粒 称 作 leu+ 颗粒 。 当 这 个 颗粒 吸 哇 到 基因 型 为 leu 的 细菌 上 时 ,就 将 DNA 注 和 人 细菌 ,有 时 细菌 能 生存 下 来 ; 一 种 可 能 是 注入 的 一 段 DNA 不 含有 鸣 菌 体 的 基因 ,而 且 这 段 线性 DNA 逐渐 地 被 细菌 的 核酸 外 切 酶 降解 ; 另 一 种 可 能 是 由 于 基因 重组 ， 鸣 菌 体 的 leu+ 片段 整合 到 宿主 DNA 上 ,取代 了 宿主 的 等 位 基因 leu ， 这 样 ， 宿 主 的 基因 型 就 会 从 leu” 变 为 leu+。 转 导 颗 粒 就 是 这 样 被 检测 出 并 被 发 现 的 。 WRAL, AMARA Xt 细菌 培养 物 ， 引 起 细菌 裂解 ， ells 再 用 释放 出 来 的 颗粒 去 感染 X ”细菌 ;然后 将 这 份 受 感染 的 X ”细菌 培养 物 接种 在 无 入 .的 培养 基 上 。 如 果 培 养 基 上 生长 出 菌落 ,那么 这 种 细菌 一 定 是 X+ 的 ， 一 定 发 生 了 转 恒 过 程 , 图 16-20 说 明了 这 整个 过 程 。 #3 Bia pee @ Pi nie ®, eo ez xt 可 存活 的 噬菌体 转 导 性 噬菌体 颗粒 &X -细菌 被 PIX+ 的 转 导 和 -片段 Ay ois 《将 被 消化 ) | Cj = 】 Ce oie x x HES 16-20 jit Pl 转 导 使 X- 细菌 向 X+ 的 基因 型 转变 ,在 上 半 部 分 图 中 ， 转 导 性 颗粒 的 发 生 率 为 11104。 另 一 种 研究 得 较 彻 底 的 是 产生 通用 转 导 颗粒 的 是 可 以 感染 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 (Sazwzox- ella typhimurium) 的 P22 唉 菌 体 。 对 此 叭 菌 体 进行 的 研究 为 人 们 提供 了 转 导 颗粒 只 含 有 细菌 DNA 的 证 握 。 这 个 实验 运用 了 Matthew Meselson 和 Franklin stahl 的 密 度 标记 技术 ,图 16-21 示 出 了 其 步骤 。 将 细菌 在 “N 培养 基 中 生长 很 多 代 , 然 后 用 ”N 标 VAY P22 去 感染 ,并 将 细菌 培养 在 “N 的 培养 基 中 ,再 将 唉 菌 体 子 代 进 行 CsCl 密度 梯 度 平 衡 离心 ,颗粒 按 密度 大 小 分 开 ,将 离心 管 底部 打 一 个 孔 ， 分 部 收集 潢 出 的 流体 。 这 样 就 将 离心 后 的 产物 分 开 了 。 检 测 每 个 收集 到 的 部 分 中 的 存活 着 的 噬菌体 和 转 导 颗粒 。 存 AMR ARA N“-fsid DNA 的 颗粒 密度 (向 较 高 的 密度 略 有 一 些 漂 移 ， 因 为 有 一 些 BAW N* 标记 DNA 是 从 降解 了 的 细菌 DNA 中 得 到 的 ， 所 以 DNA 密度 稍 大 一 些 ), 但 所 有 转 导 颗粒 都 位 于 含有 NY 标记 的 颗粒 密度 的 区 域 ,说 明 它 们 很 少 带 有 鸣 菌 体 DNA。 15N_15N 15N_1NI MN Nn ] MN _ psp 中 中 UNS HEH My re TB rp A CsCl 离心 iS | ENG ia i ari 2 1 1 1 1 ily 可 存活 的 了 22 | 16-21 证 明 P22 转 导 颗 粒 只 含有 细菌 DNA 的 实验 。 叹 菌 体 DNA 和 细菌 DNA 分 别 用 虚线 与 实 线 表示 。 。 112。， 在 1 ER HK Re I Ph ,也 发 现 过 通用 转 导 颗 粒 , 虽 然 形成 的 这 些 颗粒 是 没有 尾巴 的 。 能 够 形成 通用 转 导 颗 粒 ,是 因为 吻 菌 体 中 有 Ter KK, CARDS BEAN 1DNA 并 使 之 形成 粘性 未 端 , 它 在 低频 率 下 偶尔 有 可 能 识别 细菌 DNA 的 碱 基 顺序 ， 将 细菌 DNA 进行 部 分 降解 , 切 成 片段 而 包装 起 来 。 所 有 带 尾 巴 的 噬菌体 的 颗粒 都 是 DNA 先 充满 头 部 ,然后 尾巴 再 附 在 已 装 满 DNA 的 头 部 上 。 对 于 AOR, 如果 没有 从 头 部 伸 出 的 ADNA 的 左 端 粘性 未 端的 几 个 核 苷 酸 ,那么 其 尾巴 就 不 能 粘 附 到 它 的 头 部 。 推 测 可 能 是 要 与 头 部 结合 ,尾巴 必须 与 特定 碱 基 序 列 相互 作用 。 然 而 , 在 转 导 粒子 中 的 细菌 DNA 没有 正确 的 碱 基 序列 ,所 以 尾巴 不 能 与 头 部 结合 ,形成 无 尾 的 颗粒 。 在 体外 实验 条 件 下 ,如果 采 用 合适 的 条 件 可 将 1 尾巴 与 充满 了 DNA 的 头 部 结合 ,这 样 可 制备 出 含有 细 菌 DNA 的 通用 转 导 颗粒 。 通用 转 导 颗 粒 的 用 途 由 于 通用 转 导 颗粒 能 用 来 形成 新 的 细菌 菌株 和 绘制 基因 , 它 是 很 有 价值 的 实验 工具 。 最 简单 的 用 途 就 是 将 正 的 等 位 基因 引信 到 缺乏 这 个 基因 的 ( 即 有 负 的 等 位 基 四 的 ) 细 获 菌 株 中 。 例 如 ,将 表现 型 为 Leu ”Lac ”的 菌株 转变 成 Leu ”Lac+ 表 现 型 。 首 先 在 任 一 lac* REA Pl, RHR AAD A lact Pl 颗粒 ,用 它 来 转 导 Leu Lac 菌株 可 使 其 转 变 成 Leu Lac'。 为 了 进行 筛选 ,将 被 感染 的 细菌 培养 物 放 在 以 乳糖 作为 唯一 碳 源 的 培养 基 上 ， 这 样 可 以 将 Lac” 的 转 导 子 菌落 挑选 出 来 ， 这 就 是 具有 Leu Lact 表现 型 的 菌 株 。 转 导 也 可 以 将 负 的 等 位 基因 引入 到 带 有 正 的 等 位 基因 的 细菌 中 。 由 于 转 导 后 带 上 了 负 的 等 位 基因 的 细菌 ， 不 能 再 在 选择 性 培养 基 上 生长 并 形成 菌落 ， 于 是 无 法 直接 挑选 莫 沙 , 所 以 必须 采用 间接 的 筛选 方法 。 所 用 的 方法 是 在 第 一 章 描 述 的 做 基因 图 谱 时 的 连锁 过 程 ， 下 一 段 将 介绍 如 何 发 现 及 检测 出 连锁 以 及 怎样 将 它 用 到 转 导 体系 中 。 用 PL 去 感染 leutgal*bio* 细菌 ,制备 裂解 小。 此 有 裂解 液 中 的 颗粒 可 转 导 任何 含有 文 些 等 位 基因 的 细菌 。 也 就 是 说 ，leu” 细 戎 可 被 转变 成 leu+ ,或 bio ”可 转变 成 为 bio*。 MRS leu _ bio” 菌株， 就 能 产生 leutbiot 和 leu bio* 两 种 子 代 。 然而 不 会 产生 出 leutbio+ 细 菌 因 为 一 个 细菌 极 不 可 能 同时 被 leu+ 转 导 颗 粒 和 biot 转 导 颗 粒 两 种 一 起 感 染 ( 这 是 由 于 通用 转 导 作用 的 频率 很 低 所 致 )o 对 于 gal bio ”细菌 来 说 ,情况 就 不 同 了 。 也 就 是 说 ,不 仅 可 以 产生 galtbio” Al gal bio” 两 种 转 导 子 ， 而 且 也 会 产生 出 gal*bio” 细 诡 , 并 且 是 以 几乎 相同 于 转 导 一 个 单个 的 等 位 基因 的 频率 产生 的 。 这 是 因为 gal 和 bio ZEA Ziel Rela ROSA 15 x 10° 的 DNA。 因 为 转 导 的 DNA 的 分 子 量 可 达 20—25 x 10 ， 这 样 就 有 可 能 装 进 一 段 同时 含有 gal 和 bio 基因 的 DNA, 当 出 现 这 种 现 象 时 ,人 们 就 说 gal 与 bio 基因 是 连锁 〈linkage) 的 ( 见 图 16-22)。 当 然 ， 并 不 是 所 有 的 gal 转 导 颗 粒 都 是 biot 的 。 因 为 包装 的 DNA 从 细菌 上 切 下 时 ,其 切 点 有 时 位 于 两 个 基因 之 间 。 很 明显 ,连锁 可 能 性 的 大 小 决定 于 基因 之 间 的 距离 ,距离 越 近 ,连锁 的 机 率 就 越 大 。 对 于 gal-bio 两 基因 来 说 , 约 有 一 半 的 转 导 子 的 gal* 是 gal*bio*, 另 一 半 是 gal*bio 。 bio 也 很 相似 ，bio” 的 转 导 子 中 也 有 biotgal* 与 bio*gal” 两 种 ， 现在 我 们 来 看 看 连锁 过 程 是 如 何 将 一 个 负 的 等 位 基因 引信 到 一 个 细菌 中 的 。 设 想 有 一 个 很 难 分 离 得 到 的 x” 突变 株 , 它 与 b 基因 连锁 而 不 与 a 基因 连锁 ,我 们 想 要 得 到 是 基 vis * P) leu*DNA i a leu> ga} ———> 仅仅 leu* gaj* et gal, bio 或 paltbio= Bal bio 序 列 的 HE A ga]™ % bio- Se galt*bhige HET he) ‘ee bio+ PHF OAR) 16-22 gal 5 bio 基因 由 于 共 转 导 而 连锁 的 图 示 。 ABA ab* 的 菌株 。 如 果 b ”突变 株 很 易 分 离 得 到 ,那么 我 们 就 先 分 离 出 ab. Kea 用 PL 去 感染 b*x” ”细菌 , 再 将 Pl 噬菌体 b*x” 细 菌 的 培养 物 ( 其 中 有 有 裂解 Pl) 去 转 Sab 细 阔 ,于 是 细菌 转变 成 ab*。 由 于 b 与 x 基 因 是 连锁 的 ,所 以 所 得 到 的 abt 的 菌株 中 有 一 些 也 是 ax” 的 。 特 化 转 导 颗粒 的 性 质 到 目前 为 止 , 在 所 讨论 的 通用 转 导 体系 中 ,裂解 周期 由 于 包装 了 宿主 DNA ERR, 就 形成 了 转 导 颗粒 。 由 于 宿主 DNA 切 成 的 片 人 段 的 过 程 是 随机 的 ， 如 果 裂 解 产 生 的 噬 离 体 数目 很 大 , 在 不 均一 的 通用 转 导 颗粒 的 群体 中 就 会 含有 宿主 中 的 各 种 序列 。 已 经 整合 的 前 噬菌体 在 其 切除 作用 期 间 也 可 能 转变 ， 产 生出 各 种 不 同类 型 的 转 导 颗 和 粒 。 这 些 转 导 颗 粒 与 通用 转 导 颗粒 有 三 方面 不 同 : 〈1) 在 一 个 连续 分 子 中 ,含有 相连 的 宿 主 DNA SRR DNA;(〈2) 在 这 种 颗粒 中 只 含有 宿主 DNA 的 一 个 或 最 多 有 两 个 区 域 ， 特别 是 那些 处 于 前 叹 菌 体 两 愤 的 区 域 ; 《3) 可 用 一 个 转 导 颗 粒 作 为 产生 均一 性 群体 或 相 同 的 转 导 颗粒 群 的 模板 。 这 些 颗 粒 称 为 特 化 的 转 导 颗粒 。 从 4 溶 源 菌 形成 特 化 转 导 颗 粒 图 16-23 示 出 了 形成 特 化 转 导 颗粒 的 机 理 。 说 明了 1 鸣 菌 体 的 乳糖 与 生物 素 转 导 FRA 1gal 与 2bio) 的 形成 过 程 。 和 前 吻 菌 体 被 诱导 后 , 紧 接 着 发 生 一 系列 变化 。 前 噬菌体 DNA 从 宿主 DNA 上 被 精确 地 剪 切 下 来 ， 这 是 由 int 基因 及 xis 基因 的 产物 共同 地 作用 于 左右 两 个 前 喉 菌 体 的 整合 位 点 而 完成 的 。 但 是 ,错误 的 切除 也 会 发 生 , 尽 管 其 频率 很 低 〈10 一 107 个 细胞 中 *， 114 。 / \ 头 gal int xis N ] -一 一 一 -全 一 一 一 一 一 -一 人 一 一 -一 一 一 一 一 -一 一 = 一 一 Ke 7 or 人 下 正常 的 切除 gal int xis N cos 头 ye dD bio 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 a 不 正常 的 切除 fan einen x # »b bio ( |: 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 一 一 <+— | dS é \ Abio 5 bio 图 16-23 ”错误 的 切除 导致 产生 Agel 5 Abio MEK. 才 会 有 一 个 细胞 发 生 错 误 的 切除 ); 有 时 发 生 两 个 错误 的 切除 ,一 个 切 点 位 于 前 喉 菌 体 中 ， 另 一 个 在 细菌 DNA Ho 这 两 个 切 点 不 能 总 是 产生 适 于 装 人 头 部 的 合适 长 度 的 DNA, ANAK, ANA. RA4KERIEM 1 MRK DNA 的 79—106% It, 才能 进行 包 装 。 由 于 前 鸣 菌 体位 于 大 肠 杆 菌 的 gal 和 bio 基因 之 间 ; 同 时 , 宿主 DNA 中 的 切 点 既 可 以 在 前 噬菌体 的 左边 又 可 以 在 右边 ,因此 ,能 产生 出 带 有 bio 基因 ( 切 在 右边 ) RTA gal 基因 ( 切 在 左边 ) 的 转 导 颗 粒 。 但 是 Agal, Abio 转 导 颗粒 的 形成 引起 2 基因 丢失 。 dgal 颗粒 丢失 了 位 于 前 吧 菌 体 右 端 的 尾 基 因 ,， abio 颗粒 丢失 了 位 于 前 噬菌体 左 端 的 int，xXis……。 等 基因 。 丢 失 的 鸣 菌 体 基 因数 目 取决 于 生成 转 导 颗粒 时 所 切 的 位 置 以 及 粒 子 中 包含 的 细菌 DNA 的 量 。 由 于 丢失 的 吻 菌 体 基 因 总 是 位 于 前 吻 昔 体 的 两 端 , RA 所 示 的 那样 ,又 由 于 前 吻 菌 体 与 噬菌体 中 的 基因 顺序 是 可 以 交换 的 ,所 以 对 鸣 菌 体 来 说 丢 失 的 基因 来 自 它 的 中 央 部 分 。 通 常情 况 下 ， 缺 失 (deletion) 是 指 在 DNA 分 子 中 某 些 野生 型 的 序列 不 存在 了 ;然而 ,在 特 化 的 转 导 颗粒 中 ,细菌 基因 取代 了 失去 的 噬菌体 DNA， 因此 把 它们 称 作为 “缺失 -取代 颗粒 ”(deletion-substitution particles), Agal 和 Abio 颗粒 的 性 质 由 于 特 化 的 转 导 颗粒 缺少 一 些 噬菌体 的 基因 ,因此 ,它们 可 能 是 不 能 传代 的 。1gal 的 确 由 于 缺乏 合成 吃 菌 体 尾 部 的 必需 基因 ， 它 不 能 传代 , 而 那些 更 大 些 的 缺失 -取代 颗粒 , 即 头 部 基因 发 生 的 大 量 的 缺失 ,也 不 能 生存 下 去 ,它们 不 能 产生 子 代 。 我 们 以 字母 4 表示 这 种 缺失 现象 ， 因 此 gal 转 导 颗 粒 写 作 dgal〈《 有 时 也 写成 2dg)。 这 种 Adgal 颗粒 如 果 含有 粘性 末端 以 及 所 有 的 用 于 DNA 复制 与 转录 的 信息 ,那么 它 就 能 够 完成 一 个 正常 的 生活 周期 ,包括 细菌 裂解 。 事 实 上 , 如 果 这 种 转 导 颗 粒 没有 缺失 头 部 基因 ， 由 滚动 环 产生 的 串联 状 的 DNA 分 枝 能 够 被 Ter 体系 切割 下 来 而 进入 头 部 进行 包装 ;但 是 , 由 于 尾巴 不 能 与 装 满 了 DNA .的 头 部 相 接 ,在 有 裂解 液 中 也 就 不 能 找到 可 以 生存 下 去 的 叹 菌 体 颗 粒 ; 在 细菌 层 上 也 就 不 能 形成 噬 菌 斑 。 注 意 ， 这 种 Adgal 转 导 颗 粒 仍 能 复制 ,这 种 缺失 和 它 ©1156 的 复制 能 力 之 间 没 有 矛盾 。 只 有 在 也 缺少 尾巴 基因 的 情况 下 ，?1dgal 才 不 能 复制 ， 但 是 这 样 的 颗粒 只 由 具有 全 套 基 办 的 正常 前 噬菌体 衍生 而 来 。 Abio 颗粒 的 情况 就 不 同 了 , 它 通常 只 缺少 非 必需 基因 int, xis Fo RRA 化 中 起 作用 ,得 在 裂解 周期 中 不 起 作用 ， 因 此 , 这 些 颗 粒 能 复制 并 形成 噬 菌 斑 。 为 了 表示 这 种 颗粒 ,就 在 Abio 中 加 上 代表 成 斑 的 字母 p, Ste Apbiog bio 基因 可 以 将 包含 着 1 的 必需 基因 的 区 域 都 替换 下 去 ， 替 换 后 的 颗粒 是 有 缺 陷 的 ,因此 将 这 种 颗粒 记 作 ldbio。 通 过 基因 操作 可 以 去 掉 gal - 操 纵 子 与 前 叹 菌 体 之 间 的 宿主 基因 ,把 gl 基因 移 到 离 前 噬菌体 更 近 一 些 的 位 置 上 。 “对 这 样 的 溶 源 性 1gal 颗粒 进行 分 离 , 得 到 了 只 缺少 前 噬菌体 最 右 端 的 非 必需 的 > 基因 的 1gal 颗粒 (图 16-23), 这 种 Agal 颗粒 能 形成 噬 菌 斑 ,用 1pgal 记号 表示 。 非 溶 源 菌 的 特 化 转 导 作用 特 化 的 转 导 颗 粒 可 以 通过 几 种 机 理 去 转 导 突变 细菌 。4gal 45 Abio 颗粒 的 转 导 机 理 是 一 样 的 , 所 以 我 们 仅 用 1gal 作为 例子 来 说 明 。 先 对 1 MRA Gal* AP LET 导 , 再 用 诱导 产生 的 裂解 液 去 感染 Gal ”细胞 。 这 种 裂解 液 中 绝 大 多 数 是 正常 的 哦 菌 体 ， 少 部 分 是 Adgal* 噬菌体 。 采 用 可 以 建立 免疫 阻 遇 作 用 〈immunity repression) 的 实验 条 件 ， 这 样 噬菌体 就 不 能 通过 裂解 周期 而 将 宿主 细胞 杀 死 。 如 果 将 被 感染 的 细菌 涂 布 在 一 种 特殊 的 琼脂 培养 基 上 ,Gal* 菌落 是 紫色 的 ,能 从 Gal” 菌落 中 区 别 开 来 (在 该 种 培养 基 上 Galt 是 紫色 菌落 ，Gal” 是 白色 菌落 )。 紫色 菌落 出 现 的 频率 很 低 ( 约 占 被 感染 细胞 “ 的 0.001% )o REE BOC 2) PR RAC 图 16-24). 7~N aA i So 重组 作用 galt 一 一 一 一 —_--az-—— Ngal- 突 变 类 型 I AS 1 ee, ~ + - x 重组 作用 28 SBA ces Cay 2h gal AST | 通过 重组 作用 而 分 离 gal 分 离子 切除 gal” me we 图 16-24 类 型 I Agel REF SARA II Agel 转 导 子 的 产生 ;以 及 从 U 型 细胞 中 分 离 出 gal- 细 胞 。 I 型 由 非 溢 源 性 细胞 组 成 , 全 都 是 Gal-。 如 果 将 菌 稀释 , 使 单个 细菌 都 生成 菌落 , 形 成 的 菌落 都 是 紫色 的 。 这 些 菌 落 是 含有 稳定 的 galt 基因 型 的 细菌 ， 它们 是 由 两 个 gal 基 因 进 行 遗 传 学 双 交 换 产 生 的 , 如 图 中 所 示 。 I] 型 细胞 含有 前 鸣 菌 体 , 都 是 Gal+。 如 果 将 II 型 菌 稀释 进行 单 菌落 涂 布 培养 , 约 有 1 多 的 菌落 是 白色 的 (因此 是 Gal), MAAS AA AK. I 型 细胞 是 由 于 gal 基因 的 一 个 单 交 换 产生 的 ,因此 ,现在 这 种 细菌 含有 两 个 拷贝 的 gal 基因 , 即 一 个 gal+ 和 一 个 gal- 基因 。 这 些 转 导 子 称 作 杂 合 子 (heterogenotes), 而 那些 只 含 一 个 gal+ 基 因 的 工 型 细胞 则 都 * 116 。 是 单 倍 体 。 当 一 个 细胞 中 含有 两 个 拷贝 的 gal 基因 时 ， 能 按照 中 等 效率 发 生 分 子 内 的 遗传 重 组 。 这 可 以 说 明 图 中 所 示 的 情况 一 一 在 I 型 galt 转 导 子 连 续 生长 过 程 中 ,会 产生 非 和 盗 源 性 的 Gal” 细 获 。 FF aU AAR A BBE, ATLL II 型 细菌 不 能 被 诱导 产生 子 代 2dgal 颗 粒 。 但 是 ,许多 叱 菌 体 的 专 一 性 蛋白 质 的 基因 转录 及 蛋白 质 合 成 都 确实 在 进行 着 。 溶 源 菌 的 特 化 转 导 作用 1 溶 源 菌 可 以 被 转 导 形 成 杂 合 子 。 . 这 种 形成 过 程 以 两 种 方式 高 频率 地 发 生 着 。 第 一 种 机 理 与 产生 II 型 细胞 的 机 理 一 样 ， 即 单个 的 遗传 交换 ， 这 种 交换 或 发 生 在 gal FR 纵 子 上 或 发 生 在 前 噬菌体 上 。 注 意 , 如 果 前 噬菌体 具有 同 1dgal 一 样 的 免疫 性 阻 遏 物 ， 就 不 需 再 给 予 引 起 溶 源 化 反应 的 条 件 , 因 为 不 会 发 生 叹 菌 体 大 量 增殖 , 这 些 转 导 子 都 是 杂 合 子 一 一 对 于 cal 操纵 子 和 前 吻 菌 体 两 者 来 说 ， 都 是 如 此 。 他 们 与 前 面 所 讲 的 工 型 转 导 子 相 比较 不 稳定 。 因 为 引起 产生 gal 分 离子 (segregant) 的 分 子 内 遗传 交换 的 概率 BAK, gal 操纵 子 中 与 前 噬菌体 DNA 片 女 中 也 有 这 种 交换 ， 但 是 概率 比 上 面 那 种 小 — HE, as “RINE KAD 2dgal BSH (heteroimmune), RAAANMBMN, RES ”种 类 型 的 转 导 。 在 这 种 情况 下 ，?dgal 中 的 int 基因 表达 ， 在 前 吻 菌 体 与 感染 性 的 叱 菌 体 的 整 侣 位 点 之 间 发 生 一 个 单个 的 遗传 交换 ( 见 图 -16-25)。 如 图 所 示 , 这 同 笠 产 生 不 稳定 的 杂 合 子 (注意 ，1pbio HARA int 介 导 的 所 有 过 程 ， AX bio S&T im 基因 )。 int- 介 导 的 整合 作用 gal 一 gal- ; ERR REE | 通过 重组 作用 而 发 生 的 . 偶然 的 分 离 作用 gal* 分 离子 RS 图 16-25， 通 过 前 噬菌体 整合 作用 而 进行 的 转 导 作 用 。 由 于 遗传 重组 ,偶然 发 生 gal 基因 的 分 离 。 如 果 形 成 某 些 整 合 酶 ,这 种 分 离 也 会 发 生 在 att 位 点 上 。 感 染 人 狂 的 噬菌体 与 前 叱 菌 体 对 于 插入 作用 的 发 生 必须 是 异 源 免疫 的 。 高 频 转 导 裂 解 物 . 上 述 所 讲 的 异 源 免 疫 (heteroimmune) 与 同 源 免 疫 (homoimmuney) 的 转 导 子 都 很 埋 e 117 + a Agal -—Sse=—- - — ae attL cos att cos gal attR [| |i \ cos 1cOS ! U se" ‘ome ————ee ew ee ee bad + cee EZ A Aga) / 图 16-26 FBRERU RPA HALA Agal anpech 4: a 5 Agal. 用 ,因为 这 些 双 溶 源 化 细菌 含有 一 个 1dgal 和 一 个 正常 前 噬菌体 ， 它 们 带 有 有 功能 的 闫 和 尾 基 因 。 当 进行 诱导 时 ,这 些 基 因 能 提供 1dgal 包装 所 需 的 结构 组 分 。 因 此 ， 当 双 溶 源 菌 被 诱导 后 , 按 图 16-26 所 示 的 机 理 ， 可 以 产生 2dgal 与 正常 的 颗粒 ,两 种 颗粒 的 数 目 大 致 相等 ,由 于 1dgal 与 正常 1 的 蛋白 质 含量 都 一 样 ,而 其 DNA 含量 不 同 , 所 以 可 通 过 CsCl 密度 梯度 离心 将 两 种 颗粒 分 离开 来 *。 上 述 的 双 溢 源 化 细菌 裂解 液 中 有 一 半 是 转 导 性 颗粒 。 在 实验 室 术 语 中 ， 这 样 的 裂解 物 被 称 作 高 频 转 导 (HFT) 裂解 物 。 还 有 另 一 种 裂解 物 , 是 由 一 个 单个 溶 源 菌 形成 的 ,由 于 发 生 错误 的 剪 切 , 裂 解 物 几乎 没有 或 很 少 有 一 些 转 导 颗粒 , 这 种 裂解 物 被 称 作 低 频 转 导 裂解 物 《LEFT)。 a Ne ee Campbell, A. 1976. “How viruses insert their DNA into the DNA of a host cell.” Scient. Amer. December. pp. 102—113. . Campbell, A. 1977. “Defective bacteriophages and incomplete prophages. ” Comprehensive Virology, 8, 259—3z8. Devoret, R. 1979. “Bacterial test for potential carcinogens.” Scient. Amer., August, pp. 40—49. Ebel-Tsipis, J., D. 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Col 大 肠 杆 菌 素 生 成 因子 质粒 。 这 种 质粒 能 够 合成 大 肠 杆 菌 素 〈colicins)。 大 肠 杆菌 素 的 这 种 蛋白 质 能 够 杀 死 与 大 肠 杆 菌 亲 缘 关 系 很 近 但 没有 Col 质粒 的 菌株 。 本 章 将 进一步 讨论 以 上 的 每 一 种 质粒 。 已 经 知道 质粒 还 带 有 一 些 其 他 基因 s 有 一 种 在 临床 上 很 重要 的 质粒 ， 带 有 一 些 能 合 成 称 为 肠 毒素 的 肠 内 刺激 物 的 基因 。 这 些 质粒 称 作 Ent， 它 使 旅行 者 发 生 腹 泻 以 及 某 些 痢疾 疾病 。 另 一 种 质粒 使 枯草 杆菌 (Bacillxs zxrizgiexsis) 有 合成 毒素 的 能 力 , 这 种 毒素 对 于 舞 毒 蛾 和 幼虫 有 害 。 在 较 后 面 的 眉 落 中 将 不 再 介绍 细菌 中 的 质粒 ， 而 是 介绍 除 细 蓝 以 外 的 一 些 生 物 有 机 体 中 的 质粒 。 质粒 DNA: 性 质 及 分 离 方法 除了 一 个 例外 (酵母 的 杀伤 质粒 ,是 RNA 分 子 ), 所 有 质粒 都 是 超 螺旋 的 环 状 DNA 分 子 (图 17-2)。 最 小 的 质粒 分 子 量 为 10", 最 大 的 质粒 分 子 量 则 稍 大 于 10°, 表 17-1 列 出 了 几 种 研究 较 活跃 的 质粒 的 分 子 量 。 在 含有 质粒 的 细菌 中 ,经 常 发 现 质粒 的 二 聚 体 和 多 聚 体 ,这 些 形式 是 通过 遗传 重组 形 成 的 , 较 小 的 质粒 更 容易 形成 这 样 的 形式 。 质粒 DNA 一 般 可 以 用 简单 的 方法 从 细菌 中 提取 出 来 。 向 含有 质粒 的 细菌 培养 物 中 加 入 去 污 剂 使 细菌 裂 解 ,然后 离心 裂解 液 。 含 有 和 蛋白质 与 RNA 的 染色 质 复合 体 很 大 ,而 且 很 紧密 ,能 较 快 地 移 向 离心 管 的 底部 ,质粒 DNA 则 较 小 ， 留 在 上 清 液 中 。 向 清澈 的 列 解 液 的 上 清 液 加 入 CsCl, 离 心 直 至 裂解 液 的 密度 与 CsCl 密度 相互 平衡 为 止 。 在 裂解 液 中 通常 挫 有 一 些 染 色 体 DNA， 但 如 果 质 粒 DNA 的 `(G + C) 含量 与 染色 体 DNA 的 e121. 17-2. RL DNA .的 一 个 开 环形 式 与 两 An 大 肠 杆菌 质粒 ， ColE1 ColE2 (shigella) ColE3 性 质粒 R6K PSC101 Wie BA HK JA Adv 重组 质粒 PDM500 PBR322 PBR345 酵母 质粒 2pm e 122° 4.2 5.0 5.0 62 95 70 78 25 5.8 4.2 9.8 2.9 6.7 4.0 表 17-1 几 种 质粒 的 一 些 性 质 RL Re se 自我 可 转移 性 10 一 15 10-—15 10 一 15 > to 部 i ‘ 4 : 内: a 个 超 螺 旋 形式 在 超 螺旋 引入 一 个 缺 刻 时 * 就 产生 开 环 形式 。 -| 大 肠 杆 菌 素 EIC 膜 改变 ) 大 肠 杆 菌 素 E2(DNase) 天 肠 杆菌 素 E3(ribosomal FFE BF 纤毛 ; lac RAF Cam+Str+SulrTett TettStrt AmptStrt Tett 1 基因 cro, cl,0,P . “ ve rt Fi ‘ ase) va . 果 蝇 melanogaster #48 白 基 因 a AK ColE1 类 型 复制 没有 已 知 的 基因 《G 十 C) 各 量 不 同 , 那 么 两 种 分 子 会 形成 不 同 的 带 ， 那 就 能 够 分 别 取 出 。 但 在 通常 的 情 _ 况 下 ,两 者 的 〈G + C) 含量 没有 什么 差别 ， 因 此 ,我 们 必须 利用 质粒 是 超 螺旋 化 的 这 一 事实 。 为 了 造成 超 螺旋 与 线 型 DNA 分 子 在 密度 上 的 不 同 , 在 CsCl 密度 梯度 离心 中 ,加 人 省 化 乙 锭 《〈《 见 第 四 章 )， 超 螺旋 就 具有 较 高 的 密度 。 这 种 广泛 应 用 的 技术 的 唯一 缺点 是 ,在 分 离 中 偶然 形成 的 带 缺 刻 的 环 状 DNA 和 非 超 螺旋 型 的 复制 型 的 分 子 会 随 着 染 色 体 DNA 一 起 被 弃 去 。 通过 电泳 以 一 种 极 理想 的 方式 可 检测 出 一 个 单个 的 细菌 克隆 中 的 质粒 DNA (AM 17-3)o 取 一 个 细菌 克隆 ,将 细菌 裂解 ,然后 进行 电泳 。 由 于 细菌 的 染色 体 DNA 很 大 不 能 进 和 人 凝 胶 ( 虽 然 它 的 一 些 族 眉 能 进入 )， 但 质粒 DNA HEB ARR. DNA 分 子 通过 凝 胶 的 电泳 速度 随 DNA 的 分 子 量 减 小 而 加 大 ,因此 如 果 含 有 质粒 DNA, 它 就 会 在 凝 胶 中 反映 其 分 子 量 的 特定 位 置 上 形成 一 条 很 窑 的 带 。 通 过 溴 化 乙 锭 染色 ， 可 以 见 到 这 个 条 ro HCG DNA 紧密 结合 ,在 紫外 线 照射 下 能 发 出 荧光 。 如 图 所 示 ， 从 一 段 时 间 内 未 知 的 质粒 DNA 移动 距离 与 一 个 已 知 分 子 量 的 质粒 所 移动 的 距离 进行 比较 ,可 以 计 算出 质粒 DNA 的 分 子 量 。 以 上 筛选 方法 在 重组 DNA 技术 中 非常 有 用 ,读者 将 于 第 二 十 章 见 到 。 用 电泳 技术 也 可 从 清澈 的 裂解 液 ( 见 上 ) 中 检测 到 质粒 DNA, A 17-3 质粒 的 凝 胶 电 泳 表示 出 8 种 不 同 质粒 的 迁移 。 泳 动 从 上 到 下 进行 ;每 一 个 紧 行 “ 泳 道 ? 代 囊 一 种 质粒 ?电泳 后 将 凝 胶 尖 人 省 化 乙 锭 溶液 。 待 漂洗 后 ,再 用 近 紫 外 线 照 射 ， 与 DNA 结合 的 省 化 乙 锭 发 出 荧光 。 在 每 条 泳 道 中 的 单个 亮 带 就 是 超 螺旋 DNA 分 子 ， 移 动 得 较 慢 的 暗 些 的 条 带 是 缺 刻 环 或 超 螺旋 的 二 聚 体 ? 电 泳 的 装置 见 图 3-14( 承 Elaine Locuzzo 和 Pieter Wensink 提供 )。 ° 123 6 3 DNA 通常 还 必须 有 除去 蛋白 质 的 步骤 ,如 果 不 用 除 蛋 白质 步骤 ,那么 从 某 些 大 肠 杆 菌 用 上 述 方法 分 离 DNA 分 子 , 大 约 有 一 半 的 超 螺旋 质粒 DNA 分 子 上 附带 着 三 种 紧密 结合 的 蛋白 质 分 子 5 Kh} DNA- 和 蛋白 称 作 松弛 型 复 合 HK (relaxation complex), 如 有 果 对 这 个 复合 体 加 热 或 用 碱 处 理 , 或 者 用 蛋白 酶 处 理 或 者 用 去 污 剂 处 理 , 留 下 有 核酸 酶 活性 的 蛋白 质 , 它 在 DNA 的 一 条 链 上 形成 缺 刻 ,从 而 将 超 螺 旋 放 松 并 对 环 状 DNA 形成 缺 刻 (图 17-472, 这 种 缺 刻 只 发 生 在 一 条 链 上 并 只 发 生 在 一 个 专 一 的 位 点 上 。 在 松弛 过 程 中 ,释放 出 两 个 较 小 的 蛋白 质 , 最 大 的 那个 蛋白 质 则 共 价 连接 到 缺 刻 的 5-P 末端 上 e 如 果 在 松弛 之 前 用 一 些 实验 室 技 术 使 超 螺 旋 DNA 形 成 缺 刻 ,那么 上 述 引 起 松弛 的 核酸 酶 就 不 再 能 形成 上 面 提 到 的 位 点 专 一 的 缺 刻 。 这 说 明 这 种 松弛 型 核酸 酶 只 作用 于 超 螺旋 DNA。 人 们 认为 这 种 缺 刻 在 质粒 通过 接合 转移 而 转 到 另 一 个 细菌 的 过 程 中 起 作用 (参见 下 节 )e RAKE Ot 蛋白 质 有 3， fe 连接 到 5"-P 上 = Qs. 人 \ \ Ji newueit 17-4 在 超 螺旋 DNA 松弛 性 复合 体 的 一 条 链 上 缺 刻 的 形成 。 质粒 DNA 的 转移 许多 种 质粒 能 将 质粒 复制 子 从 供 体 细菌 转移 到 受 体 细菌 中 。 例 如 ， 如 果 将 含有 F 质 粒 的 大 肠 杆菌 加 到 正在 生长 的 无 F 的 细胞 培养 液 中 ,在 细菌 生长 了 许多 世代 之 后 ,大 部 分 细胞 都 含有 F。 这 是 F 复制 子 从 FY 细胞 中 以 不 丢失 下 的 方式 转移 到 F” 细 胞 的 结果 。 转移 之 后 ,原来 细胞 中 的 质粒 仍 能 复制 ,复制 物 可 再 转 人 新 的 F 细胞。 每 个 获得 F 质 粒 的 受 体 细胞 又 成 了 供 体 , 可 对 FE” 细胞 供给 F 质粒 。 每 个 世代 可 发 生 一 至 两 次 转移 ,所 DAF 很 快 地 在 细菌 群体 中 扩散 开 来 。 对 于 质粒 来 说 ,其 接合 能 力 是 它 达 到 成 功 的 进化 的 策 略 之 一 。 在 细菌 接合 期 间 ,宿主 的 DNA 不 能 复制 ,质粒 基因 能 复制 ; 这 种 质粒 的 复制 过 程 为 质粒 的 散布 提供 了 明显 的 有 利 条 件 。 质粒 通过 转移 增强 这 种 散布 过 程 并 在 许多 种 宿 主 中 稳定 地 遗传 着 。 转移 的 大 致 步骤 及 某 些 定义 质粒 转移 过 程 可 分 为 四 个 时 期 : 1. 形成 专 一 性 的 供 体 - 受 体 对 (又 称 为 有 效 接触 ，effective en 2. 准备 DNA 转移 (又 称 为 移动 ，mobilization )。 3.DNA 进行 转移 。 4. 在 受 体 中 形成 有 复制 功能 的 质粒 (又 称 为 形成 复制 ，repliconation )e 许多 质粒 不 能 实现 上 述 全 部 过 程 , 所 以 又 发 展 出 下 面 几 个 术语 : 接合 性 质粒 《conjugation plasmid): 带 有 决定 有 效 接 触 功能 基因 的 ) 质粒 。 。12 4 。 可 动 质粒 (mobilizable plasmid): 有 可 能 将 其 DNA 进行 移动 的 质粒 。 自身 转移 质粒 (self-transmissible plasmid): 例 如 了 F 质粒 ， 兼 有 可 接合 性 及 可 动 性 的 质粒 。 其 他 一 些 质粒 如 ColE1, 是 可 动 的 但 不 是 接合 性 质粒 。 自然 界 中 不 存在 是 接合 性 的 但 又 是 不 可 动 性 的 质粒 。 但 是 ,突变 了 的 质粒 则 有 可 能 具有 这 种 性 质 。 一 个 细胞 中 可 以 含有 两 种 不 同 的 质粒 ,如 F 质粒 与 ColE1 质粒 。 因 为 F 既是 接合 性 的 ,又 是 可 动 的 〈 系 自转 质粒 )。 GAH ColE1 质粒 提供 接合 功能 ，ColE1 本 身 是 可 动 的 ,于 是 ColE1 也 就 能 被 转移 了 。 这 个 过 程 , 即 接合 性 质粒 所 形成 的 有 效 接触 可 以 帮助 非 接合 性 质粒 ,使 之 得 到 转移 , 称 作 供 体 作用 《donation)。 供 体 作用 的 特征 就 是 非 接合 性 质粒 的 有 效 转 移 。 此 外 ,一 个 接合 性 质粒 同样 也 能 帮助 一 个 非 可 动 质粒 得 到 转移 。 这 个 过 程 叫做 转 导 作用 〈conduction)， 以 区 别 于 供 体 作 用 。 转 导 作用 过 程 发 生 的 频率 很 低 , 它 是 由 两 个 质粒 之 间 发 生 基因 重组 形成 一 个 可 转移 的 DNA 的 单个 分 子 而 完成 的 。 一 个 非 自转 质粒 受 帮助 后 的 转移 频率 (高 对 低 ) 点 是 判断 一 个 质粒 通过 供 体 作用 或 是 通过 转 导 作用 是 否 是 一 个 可 动 质粒 的 有 用 标准 。 F 质粒 的 分 子 量 为 63 x 10*， 其 中 有 转移 所 需要 的 至 少 19 个 基因 ， 这 些 都 称 为 tra 基因 。 这 些 基因 中 的 任何 一 个 基因 发 生 突变 都 会 使 质粒 失去 自身 转移 能 力 ， 因 此 人 们 推测 对 于 任何 自身 转移 质粒 来 说 ,自身 转移 过 程 所 必需 的 基因 至 少 是 19 个 。 因 为 这 些 基因 和 需要 的 分 子 量 约 为 15 x 104 分 子 量 单 位 的 DNA (假设 基因 产物 的 平均 分 子 量 为 4 x 10)， 因 此 小 的 质粒 不 是 自身 转移 质粒 ,已 知 最 小 的 自身 转移 质粒 的 分 子 量 为 17 X 10°,F 质粒 将 作为 研究 转移 过 程 的 模型 在 下 面 加 以 介绍 。 F 质粒 转移 的 细节 有 效 接触 的 第 一 步 是 供 体 与 受 体 配对， 这 要 求 供 体 细 胞 上 有 称 作 性 纤毛 的 头发 样 蛋 质 附件 (图 17-5)， 含 有 FE 或 R 质粒 的 细胞 的 纤毛 分 别称 作 了 纤毛 〈F pili) 或 R 纤 毛 (R pili)。 纤 毛 是 一 个 空 管 , 由 称 为 纤毛 素 (pilin) 的 一 种 蛋白 质 构成 ,其 顶端 与 受 体 细胞 接触 。 合 成 纤毛 所 需 的 十 二 个 基因 中 只 有 一 个 是 用 于 合成 纤毛 素 的 。 人 们 已 经 假设 DNA 是 通过 纤毛 而 实现 转移 的 ,但 还 没有 很 好 的 证 据 支 持 这 种 看 法 。 在 配对 之 后 ,纤毛 又 缩 进 供 体 细胞 。 因 此 ,纤毛 很 可 能 首先 是 使 两 个 配对 的 细胞 相互 初步 地 接触 ,然后 再 使 两 个 细 胞 紧密 地 接触 。 当 质粒 所 编码 的 一 种 蛋白 质 在 单 链 上 的 一 个 称 之 为 转移 起 始 区 〈transfer origin 或 Ori T) 的 特殊 序列 处 形成 一 个 缺 刻 时 ， 转 移 过 程 就 开始 了 。 这 种 蛋白 质 很 可 能 是 松弛 复合 体 的 缺 刻 蛋白 ,还 没有 在 所 有 的 质粒 中 检测 到 松弛 复合 体 ,但 是 推测 有 二 种 蛋白 质 执 行 着 上 述 功能 。 形 成 缺 刻 ,起 始 着 滚动 环 复制 ,接着 ,滚动 环 复制 产生 的 线性 DNA 分 枝 再 被 转移 。 大 们 认为 形成 缺 刻 的 蛋白 质 与 ? 末端 结合 ,质粒 复制 的 方式 与 _ wX1741 鸣 菌 体 的 带 泡 的 潜 动 环 复制 方式 相同 ( 见 第 八 章 图 8-40), 图 17-6 表示 了 转移 顺序 过 程 中 各 个 事件 的 发 生 顺 序 。 在 供 体 和 受 体 细胞 中 都 进行 DNA 合成 。 在 供 体 中 称 为 供 体 的 接合 DNA 合成 (donor conjugal DNA synthesis)， 其 目的 是 代替 被 转移 走 的 单 链 。 在 受 体 中 称 为 受 体 的 接合 - DNA 合成 (recipient conjugal DNA synthssis), 是 将 转移 来 的 单 链 变 为 双 链 分 e125 。 ae (0) 74 图 17-5 (2) 具有 一 个 性 纤毛 的 大 肠 杆 菌 细胞 。 HAELRAAS—T FAM R17, R17 使 其 细 的 纤毛 附着 一 层 粗 黑色 吸附 物 而 可 以 观察 到 。 五 条 很 亮 的 纤维 是 鞭毛 ， 不 清晰 的 非常 细 的 是 纤 毛 ( 承 Barry Eisenstein 提供 )o。(b) 三 个 大 肠 杆 菌 细胞 结合 时 的 电镜 照片 ,小 的 是 了 细胞 * 大 的 是 有 F’lac 的 细胞 ( 承 Lueien Caro 提供 )。 子 。DNA 以 线 状 分 子 的 形式 进行 转移 。 但 形成 的 质粒 DNA 是 环 状 的 。 所 以 需要 二 个 ! 重新 环 化 的 过 程 ,但 这 个 过 程 还 不 清楚 。 ag 通常 情况 下 ， 在 转移 期 间 ， 被 转移 的 单 链 被 供 体 接合 合成 的 DNA 取代 ; AM, 过 受 体 的 接合 DNA 合成 ， 该 被 移 转 的 单 链 在 受 体 细胞 中 形成 双 链 DNA 分 子 。 下 列 现 ， 象 可 说 明 DNA 合 成 与 转移 并 不 偶 联 到 一 起 : (1) HARA DNA 合成 被 适当 的 宿主 突变 ， ”所 抑制 时 ,转移 仍 可 进行 ;(2) 当 转移 被 适当 的 质粒 突变 作用 所 阻止 时 , 供 体 接合 DNAS | *。，126， 1 F * ft F 受 体 发 生 缺 刻 ,蛋白 质 ree DNA 结合 到 5' 末端 带 泡 的 滚动 环 复制 及 取代 链 的 转移 Ei 2 A 4) 9% 多 (O)} ) SS O} ae 17-6 “IR TINULEM F+ 细胞 转移 F 质粒 DNA WMA, MHA HE, BS) F- 受 体 细 胞 并 在 那里 转变 成 双 键 DNA. 图 中 已 将 染色 体 DNA 省 略 。 残 也 仍 可 进行 ;3) 由 于 受 体 细胞 突变 使 受 体 接合 DNA 合成 不 能 进行 时 ,转移 也 仍 进 行 。 这 些 现象 清楚 地 说 明 DNA 复制 不 是 转移 的 动力 。 由 于 还 有 双 链 螺旋 DNA 分 子 解 旋 的 驱动 力 的 问题 ， 所 以 有 关 转 移 的 动力 学 问题 是 十 分 微妙 复杂 的 。 在 第 八 章 中 强调 了 DNA Zeer iis I 开 不 能 使 双 螺 旋 解 链 。 所 以 ,在 没有 其 他 因子 的 帮助 下 ,DNA 聚合 酶 III 不 能 单独 地 复制 双 链 DNA 分 子 。 解 链 需要 一 种 辅助 蛋白 一 一 解 链 酶 (helicase)。 因 此 , 当 转移 进行 时 ; 解 链 酶 必须 活化 ,以 便 供 体 DNA 解 链 , 使 转移 链 可 以 转移 。 在 解 链 酶 无 活 性 时 ， 复 制 不 能 进行 。 但 不 进行 复制 时 ， 解 链 酶 也 可 发 挥 作用 。 因 此 ， 有 人 提出 转移 起 始 时 需要 二 个 条 件 一 一 转移 起 始点 有 一 个 缺口 以 及 解 链 酶 的 活化 。 活 化 后 解 链 朴 将 供 体 DNA 分 子 解 链 ， 于 是 单 链 可 以 转移 。 解 链 酶 的 解 链 作用 将 引起 质粒 的 超 螺旋 程度 的 改 变 , 在 第 八 章 中 已 指出 由 此 引起 的 这 种 几何 紧张 状态 可 在 DNA 解 旋 酶 〈gyrase) 的 作用 焉 缓解。 所 以 可 以 预期 , 当 解 链 酶 或 解 旋 酶 的 活性 受到 抑制 时 , 转移 不 能 进行 。 蔡 啶 酮 酸 (nalidixic acid) 是 一 种 大 肠 杆菌 DNA 解 旋 酶 的 抑制 剂 , 当 把 它 加 到 细菌 培养 基 中 ,时 . 转移 就 不 能 进行 ,这 个 现象 可 以 支持 (但 不 能 证 实 ) 上 述 假设 。 遗憾 的 是 ,目前 还 没有 发 现 解 链 酶 的 抑制 剂 。 © 127° 通过 质粒 DNA 的 转化 作用 上 节 所 描述 的 质粒 DNA 的 自然 转移 是 通过 细胞 与 细胞 的 接触 进行 的 。 在 实验 室 中 则 通过 将 游离 的 质粒 DNA 与 经 过 适当 处 理 的 受 体 细 胞 混合 来 实现 转移 , 即 转化 。 如 果 将 细菌 用 经 过 预 冷 的 CaCl, 溶液 处 理 , 它 们 将 具有 接受 外 来 DNA 分 子 的 能 力 。 这 就 为 将 任何 可 分 离 的 质粒 转移 到 任 一 大 肠 杆 菌 菌 株 中 提供 了 可 能 性 。 这 种 转移 的 两 个 条 件 是 : 〈1) 受 体 菌 的 复制 酶 体系 同样 适用 于 质粒 。 当 受 体 与 供 体 是 同一 种 系 时 ， 总 是 如 此 。(2) 受 体 与 供 体 细胞 的 宿主 修饰 -限制 体系 (第 十 五 章 ) 要 相同 。 目 前 ，CaCl:- 转 化 作 用 是 将 不 能 传播 的 质粒 从 一 种 菌株 转移 到 另 一 种 菌株 的 最 普遍 和 最 重要 的 实验 技术 。 “质粒 的 复制 : 质粒 只 能 在 宿主 细胞 中 复制 。 人 们 可 以 由 此 而 猜想 ， 天 然 地 生长 在 同样 的 宿主 细胞 中 的 所 有 质粒 都 有 相同 的 复制 类 型 。 但 是 ， 与 那 二 些 仅仅 能 在 同一 种 宿主 细胞 内 复制 的 噬菌体 一 样 , 各 种 质粒 的 DNA 复制 在 其 酶 学 上 及 机 理 上 是 各 种 各 样 的 。 这 种 特点 将 在 下 面 两 节 中 予以 解释 。 对 宿主 蛋白 质 利 用 的 差异 质粒 的 复制 在 很 大 程度 上 依赖 宿主 的 复制 系统 。 实 际 上 ， 有 些 质粒 似乎 是 完全 地 靠 着 宿主 的 基因 产物 来 进行 复制 。 如 在 体外 将 纯 的 ColE1 DNA 加 入 到 不 含 ColE1 及 其 他 质粒 , 即 不 含有 任何 质粒 所 编码 的 基因 产物 的 细胞 提取 物 中 ,小 质粒 ColE1 可 以 在 这 个 体外 体系 中 进行 复制 人 《这 个 结果 表明 : 在 没有 质粒 蛋白 质 存 在 的 条 件 下 ，ColEL DNA 是 可 以 复制 的 。 当 然 我 们 也 不 排除 在 体内 复制 时 利用 质粒 蛋白 质 的 可 能 性 )。 而 另外 一 些 质 粒 则 还 是 需要 某 些 质粒 所 编码 的 基因 产物 。 例如 ， 已 知 F 质粒 的 温度 敏感 突 变 体 (F ) 在 42°C 不 能 复制 ， 但 在 此 温度 下 细菌 DNA 仍 可 正常 地 合成 。 把 含有 温度 敏感 的 F ”质粒 的 细胞 放 在 42°C 培养 几 代 之 后 ,将 得 到 有 FP 的 子 代 细 胞 。 许多 质粒 的 复 制 过 程 并 不 需要 全 部 的 宿主 基因 产物 。 这 既 可 能 是 由 于 质粒 的 基因 能 编码 出 一 种 与 宿主 | 中 存在 的 蛋白 质 相 类 似 的 基因 产物 ,又 可 能 是 存在 着 一 种 截然 不 同 的 复制 模式 s 例如 ,下 可 在 大 肠 杆 菌 dna A(Ts) 突变 株 中 ,于 42° 的 高 温 下 进行 复制 。 而 此 时 细菌 的 染色 体 DNA 不 能 复制 。 所 以 , F 的 复制 并 不 需要 大 肠 杆菌 的 dnaA 基因 。 此 外 ,还 有 一 些 质粒 , 它们 所 需要 的 宿主 产物 对 宿主 来 说 也 是 有 用 的 ， 但 不 是 那么 严 格 需要 。 例 如 ,在 某 些 细菌 的 突变 株 中 ，DNA 聚合 酶 I 的 活性 很 低 ， 全 和 区 生长 , 而 在 这 种 细菌 突变 株 中 ,ColE1 质粒 不 能 进行 DNA 复制 。 复制 机 理 的 差别 所 有 质粒 已 被 证 实 为 半 保 留 复制 ， 并 且 在 复制 周期 内 保持 环 状 。 可 是 不 同 的 质粒 的 复制 类 型 如 同 我 们 已 知 的 噬菌体 体系 一 样 , 存 在 着 显著 的 差别 。 下 面 所 列 的 就 是 一 些 不 同 点 : 1. 方 向 性 : 现 已 观察 到 , 有 的 质粒 只 有 单 向 复制 , 有 的 质粒 只 有 双向 复制 ;此 外 , 也 见 *。128。 到 有 两 种 复制 类 型 的 质粒 。 例 如 PK6 质粒 , 首先 沿 一 个 方向 复制 ,一 段 时 间 后 ， 又 在 同 一 起 点 沿 相 反方 向 复制 。 2. 终止 : 单 向 复制 的 质粒 经 一 个 复制 周期 后 ， 其 复制 一 定 终止 在 起 点 处 。 双 向 复制 的 终止 点 已 观察 到 有 两 种 类 型 : 一 种 是 当 生 长 着 的 两 个 复制 叉 相 遇 到 达 同 一 区 域 时 ， 复 制 终止 。 如 1 ACB) 另 一 种 是 有 固定 的 终止 位 点 ss 有 时 ,一 个 复制 叉 比 另 一 个 复制 又 先 到 达 该 点 。 目 前 ,尚未 弄 清楚 DNA 复制 的 终止 信号 究竟 是 什么 。 3. 复制 类 型 : 对 质粒 的 认真 研究 发 现 质粒 的 复制 是 所 谓 蝴 蝶 型 的 ， 这 种 蝴蝶 型 方式 首先 在 动物 病毒 中 观察 到 《图 17-7)。 在 部 分 复制 的 分 子 中 ， 复 制 的 那些 部 分 是 不 扭 旋 的 , 即 是 通常 所 说 的 6 型 复制 ,但 不 复制 的 那些 部 分 则 是 超 螺 旋 化 的 。 当 复制 周期 结束 时 两 个 环 状 分 子 中 的 一 个 一 定 被 切 开 CDNA 解 旋 酶 可 能 起 作用 )。 于 是 ， 一 个 复制 周期 产 生出 一 个 有 缺 刻 的 分 子 和 一 个 超 螺旋 的 分 子 。 有 缺 刻 的 分 子 ， 经 过 一 段 时 间 后 被 补 上 缺 口 。 并 且 ， 再 过 一 段 时 间 后 又 变 为 超 螺旋 状态 。 目 前 还 不 清楚 这 是 否 就 是 质粒 复制 的 一 AMPLE pgs Se : be a (c) 图 17-7 ColE1 DNA 复制 。(a) 蝴蝶 型 分 子 示意 图 ,虚线 是 新 合成 链 。(b) 蝴蝶 型 分 子 的 电镜 照片 Co) 有 缺 刻 的 蝴蝶 型 分 子 , 缺 刻 使 蝴蝶 型 分 子 变 成 9 型 分 子 ( 承 Donald Helinski 提供 )。 拷贝 数 的 控制 有 些 质粒 在 细胞 中 是 低 找 贝 的 一 每 个 细胞 中 有 一 个 或 几 个 。 同时 ， 也 存在 其 他 一 些 高 拷贝 数 的 质粒 ,每 个 细胞 中 有 10— 100 个 质粒 。 下 面 通 过 简单 的 实验 可 以 说 明 拷 贝 数 的 确立 和 调节 是 受 DNA 合成 起 始 速度 控 制 的 。 如 果 将 单 找 贝 质粒 或 低 拷贝 质粒 转化 到 细胞 中 , 在 细胞 分 裂 之 前 ,质粒 DNA Re 制 一 次 或 二 次 。 而 细胞 若 经 转化 得 到 一 种 高 拷贝 数 的 质粒 ,这 种 质粒 DNA 将 反复 地 复 * 129° 制 ,直至 达到 合适 的 拷贝 数 为 止 。 对 此 现象 ， 人 们 所 能 接受 的 解释 是 :质粒 所 编码 的 阻 过 物 结合 到 质粒 的 操纵 基因 上 ， 抑制 复制 , 从 而 实现 对 拷贝 数 的 调控 。 首 先 ,让 我 们 利用 这 个 想法 来 解释 质粒 的 拷贝 数 从 上 一 代 到 下 一 代 是 如 何 保持 稳定 的 s 目 前 的 理论 ,假定 阻 过 物 只 有 在 多 个 亚 基 形 成 完整 的 蛋白 质 时 才 有 活性 ， 单 体 与 多 体 之 间 的 平衡 紧密 地 依赖 于 阻 遏 物 的 浓度 。 因 而 当 细胞 生 KN, FB WIRE EME, 变 为 无 活性 的 单 体形 式 ; 复 制作 用 的 抑制 因此 而 解除 , 质粒 DNA © 分 子 数 成 倍 地 增加 。 此 时 , 阻 遏 物 基因 的 数目 也 变 为 开始 时 的 二 倍 。 接 着 ,通过 蛋白 质 生 物 合成 也 使 基因 产物 一 一 阻 遏 物 的 浓度 由 此 加 倍 。 结 果 形 成 有 活性 的 阻 遏 物 ， 于 是 质粒 的 复制 终止 。 如 果 起 始 时 只 有 一 个 高 拷贝 型 的 质粒 ,情况 也 类 似 : 复制 继续 不 断 地 进行 HAA RBI, RM DNA 的 复制 才 终止 。 这 种 看 法 又 是 如 何 解释 拷贝 数 的 不 同 呢 ? 最 大 的 可 能 性 是 ,对 于 高 拷贝 数 的 质粒 来 说 ,需要 有 比 低 拷 贝 数 质 粒 更 多 的 有 活性 的 阻 遏 物 ,才能 使 复制 终止 。 因 此 ,相对 于 低 拷 贝 数 质粒 ， 它 所 需要 的 单 休 阻 遏 物 浓度 要 更 高 一 些 , 以 便 缔 合 出 更 多 的 \ 有 活性 的 多 体 阻 遏 物 分 子 。 因 此 ， 只 要 当 每 个 细胞 内 的 质粒 的 拷贝 数 高 到 可 以 产生 出 足够 量 的 有 活性 的 阻 遏 物 时 ,， 即 “基因 剂量 ”(gene dosage) 高 达 一 定 程 度 时 ， 质 粒 的 复制 才能 终止 。 下 面 的 实验 支持 以 上 看 法 一 即 每 种 质粒 控制 自 正常 的 质粒 在 polA+ 细胞 或 polA-” 钮 胞 中 的 复制 ral =i OOD gh O 重组 DNA 技术 7s 转化 一 + “ _ pSC134 _pSC134 在 pSC10k 上 复制 的 影响 、 Coe pag pra in wan ©) - (@ GS) ha ?SC101 不 能 复制 17-8 ColE1,pSC101 及 杂交 质粒 PSC134 复制 示意 图 。 开始 时 每 个 细胞 中 有 一 个 描 由 ,质粒 环 上 的 方块 及 圆 点 代表 pSC101 和 ColE1 的 复制 起 点 。DNA 分 子 内 的 数字 《〈1*。6 和 16) 代 表 每 个 细胞 内 的 找 贝 数 , 实 线 框 中 的 数字 (1， 2 和 3) 代 表 文 中 的 三 个 实验 现象 。 *。，130。 CAF WK, 杂交 质粒 pSC134 是 ColE1 质粒 和 PSC101 质粒 通过 重组 DNA 技术 而 构建 的 。 这 两 种 质粒 的 拷贝 数 分 别 是 18 和 6。 以 下 三 点 事实 是 从 pSC134 的 实验 获得 的 '〈 图 ”17-8): 1.pSC134 质粒 ,从 ColE1 的 复制 起 点 开始 复制 。 其 拷贝 数 是 16, 大 致 等 于 ColEl 的 拷贝 数 。 2. ColE1 质粒 在 polA- 细胞 中 不 能 复制 。 如 果 把 pSC134 质粒 放 到 polA ”细胞 中 , 则 质粒 pSC101 质粒 的 起 点 就 被 启用 。pSC134 的 拷贝 数 变 为 6。 与 pSC101 相同 。 这 二 个 结果 表明 拷贝 数目 与 所 用 的 复制 起 点 相关 联 。 3. 如 果 pSC101 DNA 进入 到 具有 16 个 拷贝 pSC134 的 细菌 中 ，pSC101 不 能 复 制 ,表明 pSC134 产生 出 pSC10l SAAN, 以 上 三 个 结果 表明 : 如 果 在 细胞 中 pSC134 的 拷贝 数 比 6 少 ,PSC101 和 ColE1l 的 起 点 都 有 活性 ,从 两 个 起 点 开始 的 复制 则 使 拷贝 数 增加 。 如 果 拷 贝 数 比 6 多 ,pSC101 的 起 点 失 活 ; 因为 对 pSC101 复 制 起 限制 作用 的 阻 遏 物 的 浓度 已 高 于 抑制 水 平 。 虽 然 假 若 还 有 自动 调节 ，pSC101 DNA 还 可 继续 合成 ,可 是 其 阻 遏 物 的 浓度 也 决 不 会 超过 6 个 拷贝 所 产生 的 量 。ColE1 起 点 保持 活性 ,只 有 当 找 贝 数 比 正常 值 多 1 的 时 候 才 关闭 在 polA- 细胞 中 ，ColE1 ARES Hl, 拷贝 数 完全 由 pSC101 的 阻 遏 物 浓 度 控 制 。 MU, SAR 不 会 超过 pSCI101 的 正常 值 。 这 完全 可 以 解释 以 上 现象 。 同 时 ,还 有 其 他 一 些 实验 也 支持 ”由 阻 遏 物 调 节 质 粒 拷贝 数 的 模型 。 接 下 去 我 们 必须 对 阻 遏 物 模型 的 重点 有 所 理解 ， 因 为 所 有 存在 于 一 个 特定 细胞 内 的 质粒 是 相同 的 , 阻 遏 物 不 能 分 辨 出 不 同 的 分 子 , 因 此 ， 当 活性 阻 遏 物 的 浓度 低 到 不 足以 使 所 有 DNA 分 子 的 复制 都 受到 抑制 时 , 阻 遏 物 将 随机 地 只 使 其 中 一 些 分 子 的 复制 受到 抑 制 。 这 就 意味 着 , 当 一 个 质粒 复制 成 两 个 子 代 质粒 时 , 每 一 个 单独 的 子 代 质粒 与 其 他 分 子 《第 一 次 复制 ) 有 着 同样 的 机 率 再 进行 复制 (第 二 次 复制 )。 这 就 是 说 , 在 任何 情况 下 ,全 部 质粒 的 每 一 个 分 子 可 以 进行 复制 的 机 会 是 随机 的 。 这 个 假设 已 被 含有 “N 标记 质粒 的 细菌 生长 在 含有 YN 标记 的 培养 基 中 的 情况 所 证 实 。 如 果 人 允许 这 种 质粒 的 群体 进行 几 次 复制 循环 ,那么 在 所 有 “NI!N 标记 的 质粒 都 转变 成 为 YNZ5N 状态 的 杂 合子 (只 进行 了 一 次 复制 ) 之 前 ， 就 可 以 观察 到 有 一 些 PNYN 标记 的 质粒 〈 这 些 质 粒 已 经 经 过 两 个 复制 循 TR )o 不 相 容 性 通常 一 对 对 密切 相关 的 质粒 是 不 能 同时 地 存在 于 一 个 单个 细胞 的 子 代 细胞 中 的 。 人 们 称 这 些 质 粒 是 “不 相 容 的 ”(incompatible)。 上 述 阻 遏 物 抑 制 质粒 复制 的 模型 ， 可 以 解 释 这 种 现象 。 首先 考虑 一 个 细胞 内 同时 存在 着 两 种 具有 不 同 阻 歇 物 的 质粒 (an F #1 ColE1) 的 情 况 。 由 于 一 种 质粒 (如 F) 产 生 的 阻 遏 物 不 能 调节 另 一 种 质粒 (如 ColE1) 的 复制 ， 所 以 它 们 的 复制 是 彼此 独立 的 ,是 相 容 的 ,因而 说 它们 属于 不 同 的 “不 相 容 性 组 群 ”\incompatib- ”jlity groups)o 当 存 在 着 两 种 具有 相同 或 相似 阻 遏 物 的 质粒 A 和 了 B 时 ， 阻 遏 和 调节 复制 的 情况 将 完 es。 131 。 全 不 同 。 A 可 以 调节 B 的 复制 ， 反 之 亦 然 。 让 我 们 看 一 看 一 个 细胞 内 有 一 个 A 和 一 个 了 B 的 情况 ;这 时 细胞 已 经 生长 得 足够 大 ， 正 在 发 生 着 脱 阻 遏 作 用 《〈derepress) (Al 17-9), 由 于 二 种 质粒 是 随机 复制 的 ,所 以 第 一 次 复制 后 ,细胞 中 可 能 有 1 个 A 和 2 个 B〈IA;2B》 或 2 个 A1 个 B(2A,1B)。 第 二 次 复制 后 每 个 细胞 中 将 有 4 个 质粒 。 由 于 这 次 被 复制 的 质粒 不 同 , 所 以 质粒 的 成 分 可 能 有 几 种 ， 如 图 所 示 ; 〈1A,3B),(2A,2B) 或 〈3A;1B)。 此 时 ， 具 有 原来 质粒 数 两 倍 的 细胞 可 以 进行 分 裂 。 两 个 子 代 细 胞 中 所 具有 质粒 的 情 殉 将 如 PF: (1A, 3B) 2824 (1A,1B) + (1B, 1B). (2A, 2B) 38% (1A,1A) + (1B, 1B) Be (1A, 1B) + (1A, 1B)o (3A,1B) 28%) (1A31A) + (1A, 1B)o 第 二 ee 2A,1B 现代 细胞 © @ SJ 1A, 2B Oe (og SR ~ oe No (ges : Ne! Nad, 1A,3B (0.8) 图 17-9 含有 不 相 容 质粒 AB A—-THAl. DRA TRABAARAH OH Tete. MEX. 注意 : (1A, 1A)Al (1B, 1B) 这 两 种 细胞 只 含有 一 种 质粒 ,它们 的 子 代 细 胞 当然 也 员 有 一 种 质粒 。 含 有 1 个 A 和 1 个 了 B 的 细胞 继续 分 裂 。 子 代 细胞 有 50 和 多 可 能 失去 一 种 质 粒 。 因 而 ,含有 二 个 不 相 容 性 质粒 的 细胞 ， 随 着 细胞 分 裂 的 不 断 进行 ,只 含有 一 种 质粒 的 子 代 群 体 的 百分数 将 逐步 增加 。 因此 ， 不 相 容 此 是 由 两 种 质 交 具有 类 人 的 阻 过 物 和 质粒 DNA 随机 地 复制 两 个 因素 导致 的 结果 。 复制 的 抑制 质粒 的 复制 受 多 种 玫 合 剂 的 抑制 ， 特 别 是 咱 啶 类 (如 原 黄 素 proflavin; My me fe acrid- ine orange)o 但 是 它们 并 不 抑制 染色 体 DNA 的 复制 。 这 种 抑制 可 能 导致 质粒 的 丢失 ( 叶 REIT IK, .aeridine curing)。 这 种 现象 在 质粒 含有 宿主 基因 时 ,很 容易 发 现 , 由 图 17-10 说 ”132。 Hy MA ny we te a | RSS i CH, eee. > a Meee 一 个 lac+ 一 个 lac- 治愈 的 细胞 一 个 lac+ 一 个 lac-~ 细胞 细胞 | Py 细胞 RF lac“ FR 17-10 SAN MERRIE RA Flact (ABA A Mia aT De. 表 。 如 果 一 个 细菌 培养 物 的 基因 型 是 Flac+/lac“ 即 染色 体 是 lac ， 同 时 了 因子 上 带 有 lact 等 位 基因 ), 把 它 放 在 含有 时 了 啶 橙 的 培养 基 中 生长 ,细菌 可 以 不 断 地 生长 增殖 。 然 而 经 过 一 个 细胞 周期 后 ，Lac+ 的 细胞 数 保持 不 变 , 而 Lac 的 细胞 数 则 增加 。 这 是 由 于 加 人 了 时 了 喧 栖 时 ,几乎 所 有 的 细胞 都 具有 两 个 拷贝 的 F lace 一 个 细胞 周期 后 ,每 个 细胞 只 含 有 一 个 Flac, 由 于 质粒 的 复制 被 抑制 ,因而 随 着 下 一 次 细胞 分 裂 ,二 个 子 代 细胞 中 只 有 一 个 含有 质粒 , 这样 就 产生 不 含 质粒 的 细胞 。 特殊 细菌 质粒 的 性 质 在 这 二 节 将 详细 讨论 FR 和 Col 质粒 以 及 其 他 几 种 质粒 的 性 质 。 性 质粒 CE 质粒 ) F 是 一 环 状 的 DNA 分 子 , 分 子 量 为 62.5X10° (945kb). 它 已 被 广泛 地 进行 过 遗 传 学 和 物理 学 图 谱 的 分 析 。 令 人 感 兴趣 的 是 182,183 和 7Y6 序列 示 于 图 17-11, 这 些 区 域 叫 转 座 子 〈transposons)， 将 在 本 章 及 第 十 九 章 进 一 步 讨 论 。 F 的 一 个 重要 性 质 是 , 它 上 共有 整合 进入 细菌 染色 体 从 而 产生 Hfr 《第 一 章 ) 细 胞 的 能 力 。 这 种 整合 与 1 吻 菌 体形 成 溶 源 菌 非常 相似 〈 参 见 图 16-7)。 但 它 整合 进入 大 肠 杆 蓝 染色 体 与 4 前 鸭 菌 体 有 以 下 几 点 不 同 :〈1) 在 F 中 ,整合 不 只 在 一 个 位 氮 上 进行 整合 主 要 在 物理 图 谱 中 94.5 附近 的 IS3 处 进行 ;另外 ,整合 也 可 在 其 他 的 IS3 Mrs 上 发 生 , 如 图 17-12 所 示 。(2) 在 染色 体 上 现 已 知道 在 20 个 以 上 的 主要 位 点 上 都 可 发 生 整 合 〈 图 17-13)o 了 对 染色 体 上 的 多 个 整合 位 点 的 亲和力 是 不 同 的 ， 所 以 由 此 去 形成 各 个 特 定 Af 栎 的 闫 率 也 是 不 同 的 。 人 们 认为 这 些 位 点 是 IS2,IS3 和 76 在 染色 体 上 的 拷贝 ,所 = 1'33 © 17-11 FRED. HUETRE ASFSEUMHST tra ROH ARE HERE 71d,1S2 和 183 序列 。 2, “ROM. 于 | TREEDio (a) se yee nn ee ee erp eat Pa Ne ee ee ee ee -* Sa eS F- 染 色 体 DNA 0 10 40 94.5 te fe st 一 一 -一 一 ee 2 ee ( 4 Ni i a te nnn enn ee purE Hfr3 DNA ( 插 到 的 IS3 中 ) ) 8.5 94.5/0 8.5 gal bio Oe ee ( | 2. TS ja; tam Gam OX SOEs Sun sn Gnd GD GD GD GED GED UD OED ew ME GED OD ee OS cans WS em Coy ein OD OS On UE SHO pas Das ww May NN GO ED UD en purE Hfr8 DNA 〈 插 到 F 的 rob) 图 17-12 两 种 不 同 Hfr 株 的 形成 。(a) F- 染色 体 和 了 质粒。 交换 发 生 在 实 线 双 箭头 所 指 的 Ps. (b) (a) 中 的 交换 结果 。(c) (a) 中 ;虚线 双 箭头 两 端 发 生 交换 的 结果 。 以 有 进行 交换 的 可 能 。 亲 和 性 则 代表 着 FF 中 的 1S2,183,70 与 染色 体 中 的 这 些 位 点 片 外 进行 交换 的 概率 。 3) 整合 方向 : F 的 整合 既 可 以 是 顺 时 针 方向 的 ， 也 可 以 是 逆 时 针 方 回 的 ( 见 图 17-13), F 到 雌性 细胞 的 转移 是 从 一 个 单一 位 点 沿 单一 方向 进行 的 ; 而 有 一 Hi 株 转移 染色 体 却 是 沿 两 个 方向 的 。 事 实 上 , 有 少数 几 个 例子 ,其 下 质粒 可 在 同一 个 位 点 上 沿 两 个 方向 进行 整合 。 F 质粒 整合 进入 细菌 的 某 些 dna- 突变 株 所 引起 的 现象 叫做 整合 性 抑制 (integrative suppression)o 前 面 我 们 已 提 到 了 不 需要 大 肠 杆菌 的 dnaA 基因 产物 ,而 这 个 基因 产物 却 是 染色 体 复 制 起 始 所 必需 的 蛋白 质 。 如 果 dnaA(Ts) 〈 即 dnaA 的 温度 敏感 突变 株 ) 中 +1346 17-13 大 肠 杆 菌 的 遗传 学 图 谱 。 表 示 出 Hf 转移 的 20 个 不 同 转移 起 点 。 箭 头 指出 转移 的 方向 。 含有 一 个 游离 的 F 质粒 ， 当 温度 升 高 到 42°C 时 染色 体 不 可 能 起 始 复制 作用 。 而 下 仍然 可 以 复制 。 与 此 相对 ,在 Hf BRP 是 整合 的 ;同样 地 ,这 个 菌 也 是 一 个 dnaA(Ts) 突 7 6 ie 5 有 六 ( sat “ARE hE cae ise 7 6 2 Me 3 4 ed eee imrr umelid jiag 本 C aq’. 8 OF en 早期 & if * SEE 信 UP. Reh LES ME |p ; (Bion) t pee A “一 5 2 5 5 s 全 ei we 4 eu 4 ane” 3 4 Mad putes a 4 Ane 3 ey c | ll lll IV V 有 缺陷 的 有 活性 ; 带 有 。 。 有 活性 ; 带 有 ABR BH 和 活性 : 带 有 早 基因 早期 和 晚期 基因 晚期 基因 17-14 从 特定 的 Hir 株 中 经 异常 切除 所 产生 的 不 同 F 质 粒 的 情况 。 I 及 IV 质粒 失去 了 了 基因 * 所 以 是 有 缺陷 的 。 如 果 质 粒 是 复制 缺陷 型 的 , 它 将 不 能 被 保存 下 来 ;也 就 无 法 观察 到 。 通 常 F” 质 粒 是 通过 它 所 带 的 基因 而 被 检测 到 的 ;一 般 正 常情 况 下 ，Hfr 细胞 只 转移 晚期 基因 ， 而 不 转移 早期 基因 。 所 以 ,II 和 IV 通常 是 观察 不 到 的 ,因为 它们 是 有 缺陷 的 。 同 样 ， 也 观察 不 到 Il RAN AA CHA MER. ° 135° 变 株 , 在 高 温 时 染色 体 可 以 无 限 地 复制 ,但 复制 不 是 在 染色 体 的 复制 起 始点 处 起 始 ， 而 是 在 FE 的 oriT 位 点 处 开始 复制 。 因 此 , F 质粒 的 整合 ,抑制 了 表现 型 DnaA(Ts)《〈 非 常 有 趣 的 是 ， 在 低温 时 复制 是 由 通常 的 染色 体 上 的 起 始点 起 始 的 。 至 于 为 什么 此 时 了 的 复制 起 始点 不 活化 ,还 不 清楚 )e F 的 切除 偶尔 也 会 发 生 。 通 常 的 切除 是 不 完善 的 。 切 除 FE 有 二 个 切 点 ， 一 个 切 点 在 整合 的 F DNA 的 两 个 末端 中 的 一 端 ， 而 另 一 个 切 点 则 在 相 邻 的 染色 fk DNA 中 《〈 图 17-14), 这 个 过 程 与 从 1 溶 源 菌 产生 专 一 性 转 导 颗 粒 的 过 程 相似 (第 十 六 章 )o 含有 染色 体 基 因 的 F 叫做 F 质粒 (F plasmids)。F 质粒 的 命名 及 遗传 学 性 质 在 第 一 章 和 第 十 四 章 中 已 有 叙述 。 F ”质粒 是 分 子 生 物 学 研究 中 非常 有 用 的 工具 。 下 列 几 种 情况 表明 它 的 意义 :〈17) 可 用 于 带 有 局 部 双 倍 体 的 遗传 学 显 性 研究 。 例如 用 于 对 lac 操纵 子 的 分 析 《〈 见 第 十 四 #). (2) 在 发 现 重组 DNA 技术 (第 二 十 章 ) 以 前 , 提供 了 一 个 供给 特定 的 染色 体 基 因 的 方法 。 甚 至 还 可 以 通过 某 些 专门 技术 作为 分 离 特定 基因 的 手段 。(《3) AFR 的 整合 。 例 如 ， 最初 有 关 线 性 1 DNA 整合 的 现象 ,就 是 在 具有 F atta 的 溶 源 菌 中 观察 到 的 。 它 表 明 F atta 的 分 子 量 是 由 于 一 个 1 DNA 分 子 而 增加 的 。 同 时 具有 F atta 的 前 鸣 菌 体 分 子 仍 为 一 个 连续 的 环 状 分 子 。 在 这 个 实验 中 ， 也 观察 到 了 具有 两 个 相 邻 的 前 吻 菌 体 的 双 溶 源 现象 。 抗 药性 质粒 〈R MA) 抗 药性 (或 称 R) 质 粒 首 次 是 在 日 本 的 一 次 痢疾 流行 性 爆发 中 在 志 贺 杆 菌 《〈85igel1c dysenteriae) 里 被 发 现 的 。 以 后 , 又 在 大 肠 杆 菌 以 及 其 他 种 属 如 沙门 氏 菌 (Salmonella), ME (Vibrio), RAH (Bacillus), ( % i A (Pseudomonas) FA wR A (Staphylococcus) 中 发 现 。 它们 的 抗 药性 是 使 宿主 对 一 些 真 菌 所 产生 的 抗生素 产 生 抗 性 。 通 常 这 种 抗 药性 是 自我 遗传 的 。- KERR 质粒 是 由 相 邻 的 二 个 DNA 片 女 组 成 的 (图 17-15), —*- FERRY RTF ( 抗 性 转移 因子 ，resistance transfer factor)e 它 带 有 调控 DNA 复制 和 拷贝 数 的 基因 及 转移 基因 ， 有 时 还 有 抗 四 环 素 基 因 (tet) 其 分 子 量 为 11 X 10°65 BH—-A RRA 工 因子 或 工 决定 子 (r-determinant), 这 一 部 分 大 小 不 同 〈 分 FHM 10' 到 大 于 100 x 10'), 它 带 有 对 其 他 抗生素 有 抗 性 的 基因 。 常见 的 有 抗 青霉素 (Pen) ARE BACAm), ABA (Cam), #BA(Str), KABA Kam) 和 磺胺 (Sul) 中 的 一 种 或 几 种 。 小 的 抗 药性 质粒 缺乏 转移 能 力 ， 但 仍 带 有 抗 四 环 素 (tet) 基 因 。 如 已 N\ ie. / \ + 上 mr \ / had c RTF 质粒 r 决定 子 (转移 及 复制 ( 抗 药性 基因 ) 基因 ) ‘akin R 质粒 图 17-15， 有 感染 性 的 R 质粒 的 组 成 。 在 第 十 八 章 我 们 将 介绍 及 质粒 上 的 两 个 IS 片段 的 形成 机 理 : 它们 是 由 在 5 决定 子 中 存在 的 一 个 单个 的 IS 所 形成 的 。 ° 136。 “kay pSC101 质粒 ,其 分 子 量 为 5.8 X 104; 常 用 于 重组 DNA 技术 (第 二 十 章 )。 由 两 部 分 组 成 的 R 质粒 就 如 同 F'” 质粒 。 但 抗 性 基因 不 是 通过 RIF 的 整合 并 接着 异常 切除 而 得 到 , 而 是 通过 转 座 子 转移 而 来 。 这 在 第 十 九 章 将 讨论 。 小 的 抗 性 质粒 ， 通 常 不 称 为 R 质粒 。 尽 管 它们 十 分 小 ， 但 在 革 兰 氏 阳 性 菌 中 也 有 发 现 ， 如 在 金黄 色 葡 萄 球菌 中 发 现 的 抗 青霉素 质粒 。 详 细 情 况 请 参看 本 章 的 参考 文献 。 产 大 肠 杆 菌 素 的 质粒 或 Col 质粒 Col 质粒 是 能 够 产生 大 肠 杆 菌 素 的 大 肠 杆菌 质粒 。 它 可 以 抑制 不 含 Col RAR 株 的 生长 。 用 字母 来 表示 不 同类 型 的 大 肠 杆 菌 素 ( 如 大 肠 杆 菌 素 B)。 每 种 大 肠 杆 菌 素 都 有 抑制 敏感 细胞 的 特殊 方式 ( 表 17-2)o 大 肠 杆 蓝 素 的 检测 方法 与 唆 菌 体检 测 方法 十 分 相 似 。 将 一 个 产生 大 肠 杆 菌 素 的 细胞 放 在 一 个 铺 有 敏感 菌 的 平板 上 。 大 肠 杆 菌 素 抑制 周围 细菌 的 生长 , 因而 在 混浊 细菌 层 内 产生 一 个 清亮 区 一 Hs lacuna )o 表 17-2 一 些 大 肠 杆菌 的 大 肠 杆菌 素 的 性 质 大 肠 杆 菌 素 大 肠 杆 菌 素 的 作用 大 肠 杆 菌 素 了 B | 破坏 细胞 质 腊 大 肠 杆菌 素 E1l \ 通过 一 种 作用 于 膜 上 的 未 知 效应 大 肠 杆菌 素 开 解除 偶 联 的 能 量 依赖 过 程 大 肠 杆 菌 素 E2 降解 DNA 大 肠 杆 菌 素 E3 分 解 16 S TRNA * Col 质粒 是 细菌 素 生 长 质粒 中 的 一 种 。- 这 些 质 粒 可 在 许多 种 细菌 中 产生 细菌 素 。 大 肠 杆菌 素 就 是 其 中 的 一 种 。 这 些 细菌 素 是 蛋白 质 结 合 在 细胞 壁 上 抑制 一 种 或 几 种 基本 的 过 程 如 复制 ;转录 翻译 ,或 能 量 代谢 。 大 肠 杆 著 素 的 产生 是 可 以 诱导 的 ， 诱 导 因 素 就 是 那些 使 诱导 性 深 源 菌 产生 唉 菌 体 的 因素 ,例如 紫外 线 。 如 同 诱导 前 史 菌 体 一 样 ,产生 大 肠 杆 获 素 的 细胞 也 被 杀 死 ， 但 其 机 理 尚 不 请 楚 。 每 个 具有 Col 质粒 的 细胞 群体 中 都 有 一 小 部 分 细胞 也 组 成 型 地 产生 着 大 肠 杆菌 素 。 因 此 ，Col 质粒 的 存在 ,对 细胞 群体 的 生存 是 有 意义 的 。 它 可 以 使 该 细胞 群体 在 与 那些 对 大 肠 杆 蓝 素 敏感 的 细胞 进行 争夺 共同 所 需 的 食物 时 处 于 更 有 利 的 地 位 。 然 而 ,这 对 于 那些 产生 大 肠 杆 菌 素 的 单个 的 细胞 来 说 , 则 是 没有 什么 选择 性 意义 的 ， 因 为 产 生 大 肠 杆 族 素 后 它们 就 将 死去 。 大 肠 杆 蓝 素 很 可 能 是 两 种 类 型 。 一 种 是 真正 的 大 肠 杆菌 素 , 另 一 种 ,实际 上 是 有 缺陷 的 噬菌体 颗粒 。 后 一 种 是 通过 对 许多 纯化 了 的 大 肠 杆菌 素 的 研究 而 发 现 的 。 事 实 上 ， 只 有 少数 几 种 大 肠 杆 菌 素 是 简单 的 单 体 蛋白 质 。 而 其 他 的 在 电镜 下 观察 则 像 是 叹 菌 休 的 尾 部 。 推 测 它们 可 能 是 从 古代 原始 的 前 鸣 菌 体 的 残留 物 上 转录 出 的 基因 产物 。 有 一 种 假说 认为 ,可 能 由 于 多 次 重复 地 突变 ,结果 唉 菌 体 丢失 了 复制 的 基因 、 头 部 蛋白 的 基因 以 及 有 裂 解 的 基因 ， 但 是 完整 地 保存 下 编码 阻 遏 物 的 基因 及 尾部 蛋白 的 基因 。 推 测 这 些 噬 菌 体 具 有 I4 的 某 些 性 质 : 它们 吸附 于 细菌 上 ,不 需要 将 DNA 注 和 人， 这 种 吸附 作用 抑制 大 分 1 子 物 质 的 合成 。 ° 137 。 Col 质粒 的 分 子 量 范 围 是 几 百 万 (不 能 自我 遗传 的 质粒 ) 一 大 于 60 x 105( 可 以 自我 遗传 的 质粒 )*。 在 Col 质粒 中 研究 得 最 多 的 是 Col El, 它 的 分 子 量 是 4.2 x 10, BH 大 量 地 应 用 于 重组 DNA 研究 和 体外 DNA 复制 系统 中 。 Col El] 是 可 以 移动 的 ,但 是 为 非 接合 型 的 质粒 。 在 遗传 学 研究 中 , 它 已 用 来 证 明 从 Col El 供 体 细胞 到 受 体 细胞 需要 一 种 质粒 编码 的 核酸 酶 一 一 其 编码 基因 被 称 为 mob 基 因 , 和 一 和 疏 特 殊 的 碱 基 序 列 (移动 的 基础 )。 这 个 结论 是 从 图 17-16 中 所 进行 的 实验 而 得 到 的 。 相 容 的 质粒 F 和 Col El 存在 于 一 个 细菌 中 。F 贡献 出 Col El1 所 没有 的 接合 能 力 , 所 以 它 能 使 Col El 转移 。(a) 中 显示 了 在 F Sale Col El 的 状态 。mob 基因 转录 了 ，mob 基因 的 产物 在 bom 位 点 产生 缺 刻 ,使 Col El 由 超 螺旋 环 变 为 一 个 有 缺 刻 的 环 。 但 由 于 Col El1 没有 产生 性 纤毛 的 能 力 , 所 以 不 能 通过 接合 配对 进行 转移 。 又 由 于 超 螺旋 状态 与 缺 刻 状态 之 间 存 在 平衡 。 所 以 上 述 过 程 可 以 回复 。 在 〈b) 中 ,细胞 内 4 F 质粒 和 Col El 质粒 , F 可 以 合成 出 纤毛 并 产生 转移 器 官 。 于 是 CIE 可 以 转移 ， Col El 的 mob 突变 体 在 F 提供 的 转移 器 官 存在 下 也 不 能 转移 。 某 些 较 大 的 质粒 ,例如 ColVK， 是 带 有 产生 大 肠 杆 菌 素 基因 的 F 质粒 。 遗 传 学 分 析 发 现 mob 编码 一 个 蛋白 质 。 进而 分 离 突 变 体质 粒 ,发 现 它 没有 形成 松散 的 复合 物 。F 不 能 帮助 mob 突变 体 转移 , 见 mob 产物 bom 位 点 oA O 因为 没有 转移 (a) a @® a —Y ESP LLAR ‘ 能 转移 F- mob 基 因 bqm 缺 刻 转移 装备 纤毛 O (OO) 一 LO O-* F+mob+bom+ 转移 装备 CO (© ©) ffi 因为 bom 位 点 是 未 曾 缺 刻 的 ,所 以 F+*mob~ fk Z| 不 能 转移 多 人力 一 oO CO 因为 bom 位 点 是 ARS GRAY AS, F*mobtbom= 不 能 转移 17-16 了 帮助 Col El 质粒 转移 的 条 件 。 斜 线 区 是 mob 基因 及 其 产物 。 黑色 的 实心 方块 表示 有 功能 的 bom 位 点 。 空心 框 表 示 bom 位 点 丢失 或 突变 。 只 有 在 ColE1 产生 有 活性 的 mob 产物 并 作用 于 有 功能 的 bom 的 位 点 *F 提供 转移 装备 的 情况 下 才 可 发 生 转 移 。 * 某 些 较 大 的 质粒 * 如 ColV 玫 ， 实 际 上 是 携带 着 产生 大 肠 杆 获 素 的 基因 的 了 质粒 。 *，138 。 (c) 所 示 。 此 时 已 形成 了 纤毛 及 转移 器 官 , 但 是 Col E1 DNA 上 不 发 生 缺 刻 。(〈d) 中 又 表示 了 另 一 个 Col El 突变 体 , 它 有 Mob” 表 型 ,是 一 个 顺 式 显 性 突变 。 这 种 突变 是 一 种 缺失 突变 ,丢失 了 bom 位 点 ，mob 蛋 白 质 虽 可 形成 ， 但 不 形成 缺 刻 ， 它 不 能 进行 转 移 "。 其 他 细菌 质粒 还 有 两 种 质粒 也 需要 特别 提 到 。 一 些 不 同 株 的 假 单 胞 菌 可 将 大 量 异 乎 寻常 的 有 机 化 合 物 作为 能 量 来 源 ， 因 而 细胞 就 需要 极其 大 量 的 酶 。 对 这 些 酶 进行 编码 的 要 求 已 大 大 地 超过 染色 体 的 编码 容量 。 这 些 酶 的 许多 基因 存在 于 一 些 大 的 质粒 上 的 。 例 如 有 一 种 能 够 利 用 樟脑 为 碳 源 的 细菌 所 携带 的 质粒 ,就 具有 编码 此 种 特殊 用 途 的 必要 的 酶 的 基因 。 不 能 做 到 这 一 点 的 细菌 , 并 不 是 因为 它 是 携带 着 缺陷 型 基因 的 突变 体 , 而 是 因为 它 根 本 就 没有 这 种 质粒 。 自 然 界 中 没有 单一 的 一 种 假 单 胞 菌 可 以 利用 所 有 的 碳 源 ;不 同 的 假 单 胞 菌 菌株 ，. 能 对 不 同 的 物质 进行 代谢 。 分 解 不 同 物质 的 基因 则 是 分 布 在 形形色色 不 同 的 质粒 上 面 。 在 许多 双子 叶 植物 中 发 现 了 由 根瘤 土壤 农 杆菌 所 引起 的 冠 瘦 肿 瘤 。 引 起 肿瘤 的 是 一 种 称 做 Ti 的 质粒 。 在 被 感染 的 植物 中 , 这 种 细菌 进入 植物 细胞 , 在 其 中 生长 ,并 裂解 , 释 放出 它们 的 DNA, 此 时 细菌 对 肿瘤 的 形成 已 无 作用 。 由 于 一 种 未 知 的 机 理 ， Ti 质粒 中 含有 复制 基因 的 一 小 部 分 整合 进入 植物 细胞 染色 体 中 , 这 种 整合 的 TiDNA 片段 破坏 正 常 时 控制 细胞 分 裂 的 植物 激素 的 调控 系统 。 结 果 正 常 的 植物 细胞 变 为 肿瘤 细胞 。 现 在 这 种 质粒 已 成 为 植物 育种 的 一 个 重要 工具 。 因为 通过 重组 DNA 技术 可 将 特定 基因 插 人 Ti 质粒 ,有 时 这 些 特 定 基 因 可 整合 进入 植物 染色 体 ， 从 而 永久 性 地 改变 植物 的 基因 型 和 表现 型 。 人 们 认为 ,可 以 用 这 种 方式 ， 把 一 些 无 亲缘 关系 的 品种 中 的 优良 的 有 经 济 价值 的 特性 转移 到 已 有 的 植物 上 , 创造 出 植物 的 新 变种 。 ” 真 核 生物 中 的 质粒 在 动物 细胞 中 已 发 现 环 状 DNA 分 子 ， 并 在 实验 室 中 保存 于 培养 基 中 , 它们 可 能 是 .质粒 ,也 可 能 是 污染 的 病毒 。 这 类 因子 的 分 布 情 况 还 知之 甚 少 。 可 以 预测 在 高 等 生物 的 细 胞 中 ，, 既 使 存在 质粒 , 它们 也 将 大 大 地 不 如 在 细菌 中 那样 普遍 。 而 且 ， 在 具有 有 性 繁殖 体 系 的 高 等 生物 的 细胞 中 , 几乎 没有 质粒 DNA 进行 转移 的 机 会 。 在 单 细胞 真 核 生 物 酵 母 中 已 发 现 质粒 。 杀 伤 微粒 〈killer particle) 是 最 吸引 人 的 一 种 。 它 是 一 个 双 链 RNA 人 分子， 分子量 为 15 x 16“， 这 是 已 知 的 唯一 没有 DNA 的 质 粒 。 这 个 微粒 有 十 个 基因 用 于 复制 ， 人 的 杀伤 性 物质 。 在 酵母 中 研究 最 多 是 所 谓 2um 质粒 。 一 个 2 pm 长 的 DNA 分 子 , 其 分 子 量 为 4 X 10'。 每 个 细胞 中 有 60 个 拷贝 ,全 部 位 于 酵母 细胞 核 内 。 这 种 位 置 表明 ,2 om 质粒 与 酵 ”编写 本 文 时 还 没有 得 到 关于 bom 位 点 就 是 转移 起 点 以 及 bom 突变 不 能 形成 有 缺 刻 的 松散 复合 物 的 证 据 。 也 没有 得 到 关于 转移 是 通过 滚 环 复制 而 进行 的 证 据 ; 但 已 存在 着 单 链 分 子 在 供 体 中 重新 环 化 以 及 这 种 环 化 分 子 可 转移 的 可 能 性 (尽管 还 没有 强 有 力 的 证 据 , 如 MB RRA RK). 在 未 证 明 它 是 不 正确 的 之 前 ,我们 仍 然 必 须 考虑 存在 有 这 种 可 能 性 。 © 139+ 母 染 色 体 需要 相同 的 有 关 复 制 酶 ,而 且 质 粒 DNA 与 核 DNA 一 样 也 包 右 有 组 蛋白 。 质 粒 DNA 显然 没有 整合 到 缩 主 DNA 中 。 2um 质粒 的 碱 基 序 列 包括 2 个 反 向 重复 序列 ， 每 个 都 有 599 个 碱 基 对 。 它 们 被 含 有 2346 个 和 2774 个 碱 基 对 的 两 个 单一 序列 分 开 , 如 图 17-17 所 示 。 在 酵母 细胞 中 有 两 种 不 同形 式 的 2um 质粒 ， 它 们 的 区 别 在 于 其 中 一 个 单一 序列 的 取 疝 不 同 。 这 两 种 质 粒 的 数量 相同 。 如 图 所 示 , 由 于 反 向 重复 序列 之 间 发 生 着 频繁 的 重组 作用 , 可 以 使 质粒 进 行内 部 交换 , 质粒 中 促进 这 种 内 部 交换 的 基因 叫 flp 基因 。 关 于 这 种 内 部 转换 作用 的 功 能 目前 还 不 清楚 。 同时 ， 在 实验 室 中 发 现 flp” 质粒 在 宿主 酵母 细胞 中 的 复制 显然 并 没 有 缺陷 。 在 自然 界 中 内 部 转换 作用 是 很 有 价值 的 ， 因 为 质粒 的 40 多 的 编码 能 力 都 是 在 flp 基因 上 。 17-17 两 种 2 Am 质粒 之 闻 发 生 交换 的 机 理 。 虚 线 片 侦 是 反 向 重复 序列 。 四 个 片 妥 的 大 小 并 不 是 按 比 例 绘 出 的 。 2pwm 质 粒 在 复制 时 有 一 个 与 其 他 质粒 截然 不 同 的 特点 , 即 它 是 一 个 高 拷贝 数 的 质粒 。 推测 它 的 拷贝 数 受 一 个 阻 遏 物体 系 调节 ， 这 个 体系 与 前 面 我 们 介绍 过 的 大 肠 杆 菌 质粒 pSC101 和 Col El 有 关 。 在 前 面谈 到 实行 该 种 调控 机 理 时 ， 质 粒 是 随机 复制 的 。 但 是 2am 质粒 却 不 是 那样 , 而 是 在 宿主 细胞 的 每 一 个 分 裂 周 期 内 ,每 个 DNA 分 子 都 只 复制 一 次 , 它 是 如 何 调控 的 目前 还 不 清楚 。 2um 质粒 为 研究 酵母 DNA 复制 组 构 了 一 个 很 有 用 的 体系 。 在 目前 , 它 的 最 大 用 途 是 作为 一 个 载体 。 通 过 重组 DNA 技术 , 它 可 以 将 外 源 基 因 克 隆 到 酵母 中 去 。 这 些 将 在 第 二 十 章 讨 论 。 遗传 工程 中 质粒 的 应 用 第 二 十 章 将 讨论 DNA 重组 技术 及 其 在 遗传 工程 中 的 应 用 。 这 里 只 作 简 单 介 绍 , 着 重 强调 质粒 的 作用 。 | ; 限制 性 内 切 酶 在 质粒 的 非 必需 基因 上 产生 一 个 单一 切口 ,形成 一 个 DNA HR 二 个 线性 片段 甚至 可 能 来 自 于 另 一 种 不 同 的 有 机 体 ， 它 可 以 附着 到 上 述 被 切割 过 的 质粒 的 两 个 游离 未 端 上 , 从 而 重新 成 环 , 环 再 被 DNA 连接 酶 焊接 ,形成 封闭 的 DNA 分 子 。 我 们 设想 : CL) 加 入 的 DNA 是 68- 半 乳糖 背 酶 基因 的 DNA;(2) 质粒 的 基因 型 是 tett (BAR); (3) 质粒 有 50 个 拷贝 。 这 个 外 来 DNA 可 以 转化 Lac Tet 的 细胞 ,于 * 140° 是 就 可 租 选 到 LactTett 的 细胞 。 如 果 质 粒 是 高 拷贝 数 的 因子 , 这样， 细胞 中 就 有 50 个 拷贝 的 lac 基因 ,因此 能 产生 大 量 的 8- 半 乳糖 苷 酶 。 这 个 例子 说 明了 质粒 在 基因 工程 中 的 一 个 重要 用 途 一 一 大 量 地 扩 增 特定 的 蛋 白 质 。 和 Broach, J. 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Genetics, 14, 41— 76. ° 141+ SBtN\S BRwMRBHNRAME UD 同 源 DNA 序列 间 的 重组 进化 依赖 于 遗传 物质 在 世代 中 的 变异 。 遗 传 变异 的 第 一 步 是 突变 。 不 同 品系 的 突变 作用 在 交配 配对 中 结合 到 一 起 并 在 子 代 中 表现 为 重组 。 经 过 许多 世代 过 程 ， 通 过 正常 结 合 ,使 大 量 突变 进行 组 合 从 而 产生 特异 的 变异 品系 。 在 双 倍 体 生 物 中 , 这 种 重 排 发 生 在 有 性 繁殖 中 。 来 自 亲 代 的 染色 体 在 形成 生殖 细胞 ( 卵 及 精子 ) 时 分 离 ， 在 形成 子 代 时 又 重新 组 合 。 第 二 种 变异 也 发 生 在 形成 生殖 细胞 的 过 程 中 ， 即 配对 的 染色 体 拆 开 及 重新 组 合 。 这 个 过 程 最 初 被 称 为 交换 (crossing over), 现 在 称 为 重组 (recombination), Fix—BA F 一 章 将 讨论 重组 发 生 的 机 理 。 对 于 重组 的 具体 机 理 ,我 们 将 采用 研究 微生物 得 到 的 成 果 进 行 讨 论 ， 即 通过 对 细菌 、 噬菌体 ,酵母 及 真菌 等 微生物 的 研究 所 得 到 的 结论 以 及 其 他 的 生化 机 理 。 虽 然 在 细节 上 有 所 不 同 , 但 也 都 适用 于 高 等 生物 。 对 酵母 \ 真 菌 及 高 等 生物 遗传 学 有 兴趣 的 读者 可 参看 本 章 后 的 参考 文献 。 微生物 中 重组 的 类 型 遗传 变异 在 微生物 进化 中 是 非常 重要 的 。 由 于 微生物 是 单 倍 体 ， 不 同 的 等 位 基因 通 常 不 能 存在 于 同一 个 细胞 内 。 因 此 产生 出 一 些 可 以 使 微生物 从 其 他 细胞 获得 遗传 信息 ( 即 DNA) 的 机 理 , 或 者 说 可 以 使 外 来 DNA, 或 DNA 片段 挨 人 到 该 微生物 细胞 的 DNA 中 的 机 理 。 关 于 这 个 过 程 的 例子 之 一 是 转化 作用 (transformation) 〈 第 七 章 ); 死 去 的 供 体 FAY DNA 释放 到 周围 环境 中 ,然后 进入 受 体 菌 。 例子 之 二 是 转 导 作用 (transduction) (CATA), RAIDER EAH IMRT HAR DNA, 然后 将 此 供 体 DNA 注入 到 受 体 细胞 中 。 最 后 的 例子 是 接合 作用 (conjugation)\(A+tR), Hfr 细胞 DNA《( 见 第 一 章 ) 或 者 通过 细胞 之 间 的 接合 与 接触 ,从 一 个 细胞 转移 到 另 一 个 细胞 中 。 除 了 质粒 的 转移 , 凡 进入 到 受 体 细胞 中 的 遗传 信息 ,必须 抄 人 到 新 细胞 的 遗传 器 官 中 ， 才 能 在 细胞 分 裂 周 期 中 成 功 地 保存 下 来 。 在 第 十 七 章 中 ,已 知 质粒 是 一 个 完整 的 复制 单位 ,有 目 己 的 复制 起 点 和 复制 循环 ,因而 可 以 保存 下 来 。 质 粒 的 保存 下 来 是 质粒 DNA 复制 的 结果 。 可 是 ， 在 其 他 情况 下 ， 被 转移 的 DNA 不 能 继续 复制 。 它 们 的 保存 必须 通过 插 人 到 宿主 DNA 中 ,通常 是 通过 取代 机 理 而 实现 。 这 个 插 人 过 程 一 定 需要 受 体 DNA 产生 某 种 断裂 然后 使 供 体 DNA 与 受 体 DNA 重新 连接 , 这 个 过 程 称 之 为 遗传 重组 (genetic recombination), 前 面 我 们 所 介绍 的 前 噬菌体 整合 〈 第 十 六 章 ) 就 是 一 种 遗传 重组 ， 即 通过 1 ee in 基因 的 参与 发 生 位 点 专 一 性 重组 (site-specific recombination), X WEN RAE 。142 。 OS ee ee — a —aaeeowlmemrmlc,hlhlhleorle 在 4 个 不 定位 点 (B，B'，P 和 P') 旁 的 二 个 相同 的 短 序列 (15 个 碱 基 对 ) 间 发 生 交换 ,这 种 方式 为 专 一 性 交换 提供 了 一 个 重要 的 方法 。 但 是 ,上 面 我 们 所 提 到 的 各 种 过 程 ( 转 化 \ 转 导 和 通过 接合 而 进行 的 DNA 整合 等 ) 都 要 求 较 大 的 DNA 片段 进行 交换 (很 可 能 为 几 百 个 碱 基 对 )， 而 且 它 们 的 序列 是 相同 的 或 接近 于 相同 的 。 即 两 个 发 生 作用 的 序列 必须 是 同 源 的 (homologous)。 因 此 ,这 个 过 程 也 叫 做 同 源 重 组 (homologous recombination)( 图 18-1)o。 这 类 重组 的 另 一 个 基本 特点 是 必 须 有 盖 定 的 宿主 基因 ,在 大 肠 杆 菌 中 这 个 基因 就 是 recA 基因 。recA 基因 的 产物 将 在 本 章 的 后 面部 分 具体 地 讨论 , 它 是 DNA 配对 早期 所 需要 的 物质 。 在 其 他 细菌 中 也 存在 类 似 的 一 些 基因 。 所 以 这 种 重组 类 型 称 为 依赖 于 recA ,型 的 重组 。 ABCDEFGHIJKLM ABCDEFGHIJKLM ‘a : ABCDEFGHIJKLM ABCDEFGHIJKLM. ABCDEFGHIJKLM. ABCDEFJKLM. i BA 非 同 源 重 组 18-1 ， 同 源 重组 与 非 同 源 重组 间 的 区 别 。 横 线 为 双 链 DNA FFE. FRM. MA 头 指示 发 生 遗 传 交换 的 位 点 。 重组 的 第 三 种 类 型 发 生 在 特定 的 DNA 片段 ， 即 转 座 因 子 (transposable elements) 上 。 人 们 发 现 转 座 因 子 可 以 把 一 个 DNA 分 子 的 一 部 分 转移 到 另 一 个 DNA 分 子 上 ,或 者 在 双 倍 体 细胞 中 把 一 部 分 DNA 从 一 个 染色 体 转 移 到 另 一 个 染色 体 上 。 这 个 现象 称 为 转 座 作用 。 这 是 第 三 类 重组 一 一 转 座 重组 (transposition recombination)。 转 座 作 用 既 不 需要 DNA 片段 有 同 源 性 ,也 不 需要 recA 基因 ,因此 , 转 座 作 用 是 一 种 不 依赖 recA 型 的 重组 作用 。 第 四 种 重组 作用 , 既 不 需要 recA 基因 的 产物 也 不 需要 转 座 因 子 。 它 发 生 于 非 同 源 性 序列 之 间 ,被 称 为 不 正常 重组 (illegitimate recombination), 我 们 对 这 种 重组 过 程 还 完全 不 了 解 。 表 18-1 中 列 出 了 这 四 种 类 型 重组 的 一 些 性 质 。 表 18-1 四 种 类 型 遗传 重组 的 特性 重组 类 型 是 否 需要 同 源 性 是 否 需要 recA 基因 产物 “| 是 否 需 要 序列 专 一 性 的 酶 位 点 专 一 性 重组 是 否 是 同 源 性 重组 是 是 否 转 座 重 组 否 否 是 AER BA 否 否 ? 本 章 只 讨论 同 源 性 的 或 依赖 于 recA 的 重组 ， 第 三 及 第 四 种 类 型 的 重组 将 在 第 十 九 章 讨 论 。 。143 。 同 源 重组 的 基本 特征 在 所 有 类 似 的 重组 作用 中 ,重组 的 两 个 DNA 分 子 或 同一 分 子 的 两 个 片 外 发 生 相互 作用 ,这 种 相互 作用 叫做 配对 (pairing )。 本 章 对 同 源 重组 的 基本 特征 将 讨论 如 下 : 一 些 相 应 配对 的 蛋白 质 对 于 碱 基 序 列 本 身 并 无 专 一 性 要 求 ， 不 过 它们 确实 需要 具有 相同 的 或 接近 于 相同 的 序列 的 两 个 片 朋 , 以 便 通 过 配对 在 两 个 DNA 分 子 中 进行 识 “Fillo 根据 以 上 认识 ,用 图 18-2 表示 一 个 遗传 重组 的 基本 模型 。 在 这 个 模型 中 ;在 不 同 链 上 的 单 链 产生 交错 断 有 ,在 互补 链 间 形成 碱 基 配 对 ,使 来 自 不 同 链 的 片 妥 结合 在 一 起 。 不 幸 的 是 ,这 种 简单 的 模型 不 能 解释 遗传 重组 是 如 何 发 生 的 ;但 即使 是 更 复杂 的 模型 也 无 法 解释 许多 普通 的 重组 事件 的 特点 。 可 是 我 们 可 以 利用 与 检查 其 中 的 某 一 些 模 腻 ， 因为 它 们 能 说 明 人 们 是 如 何 思考 与 理解 重组 过 程 的 。 许多 生物 实验 清楚 地 表明 以 下 事实 : 1. 亲 代 DNA 分 子 产 生 断 裂 并 重新 连接 。 2. 连接 需要 同 源 配对 。 3. 重 倒 区 (又 称 伍 接 区 ) 在 重组 的 几 个 阶段 中 出 现 。 4. 重组 不 需要 DNA 的 复制 ， 尽 管 在 某 些 吻 菌 体系 统 中 ,只 有 通过 重组 后 的 复制 才 能 进行 包装 ; 而 且 在 高 等 生物 中 ， 类 似 于 修复 的 复制 作用 对 完成 重组 可 能 是 需要 的 。 近年 来 ,已 建立 了 体外 重组 体系 ,而 且 这 些 体系 已 经 帮助 我 们 和 弄 请 遗传 重组 的 一 些 步 又 ， 如 分 支 移动 (branch migration)、 单 链 侵 人 (single-strand invasion) 和 反 式 切割 (trans-cutting )。 进 一 步 又 发 现 了 一 些 重组 的 缺陷 型 突变 体 ,它们 可 以 使 体内 重组 在 某 一 步骤 上 被 阻 断 。 所 有 这 些 结果 都 利于 建立 更 精巧 的 、 可 测试 的 \ 符 合 实际 的 重组 模型 。 对 这 些 将 简单 地 加 以 讨论 。 XxX 在 每 条 链 的 相近 的 位 点 处 形成 缺 刻 ; 片段 分 开 链 分 开 HE .配对 二 以 及 再 连 重 得 区 18-2 一 个 简单 的 但 不 很 恰当 的 同 源 重 组 入 型 。 实 际 上 在 重组 子 中 存在 着 重 登 区 ， 但 是 在 重 组 作用 中 相近 位 点 形成 缺 刻 并 不 是 一 个 正常 的 阶段 。 。144 。 Fa) ist 2 EI 在 这 一 节 我 们 将 仔细 讨论 同 源 重 组 的 几 个 特殊 性 质 。 在 后 面 一 节 中 通过 对 几 个 遗传 现象 的 讨论 ,可 知 这 几 个 特殊 性 质 是 目前 流行 的 遗传 学 理论 的 组 成 部 分 。 断裂 - 重 接 及 杂 合 现象 两 个 DNA 片 妇 在 同 源 重 组 时 ,都 产生 断裂 。 通 过 碱 基 的 互补 配对 ， 片段 再 重新 连 接 起 来 。 图 18-2 所 示 的 就 是 一 个 有 关 断 裂 - 重 接 现 象 的 总 体 的 、 十 分 简单 的 〈 但 又 有 祠 发 性 的 ) 模 型 。 要 特别 注意 重 登 区 。 在 这 个 区 域 中 ,配对 产生 了 重组 分 子 ， 相 互 配 对 时 并 非 每 条 链 的 序列 完全 一 样 。 如 果 重 县 区 足够 大 ,那么 ,并 不 要 求 在 每 条 链 中 有 相同 的 碱 基 序列 ,因为 个 别 错 配 的 碱 基 不 会 使 整个 结构 的 稳定 性 变 弱 ,所 以 是 可 以 忍受 并 修复 的 。 的 确 , 由 于 重 颂 区 一 般 有 几 百 到 几 千 个 碱 基 对 ,这 种 情况 完全 会 发 生 。 进 一 步 ， 双 链 分 子 的 单 链 发 生 断 裂 ,产生 出 形成 重 伙 区 的 两 个 部 分 ,此 断裂 的 位 点 也 不 必 完 全 相同 ,如 图 18-3。 可 以 有 如 同 〈a) 的 情景 : 有 缺口 保留 着 , 它 可 能 有 游离 的 3'-OH 和 5-@ 基 团 。 这 些 缺口 可 以 被 DNA 聚合 酶 工 填充 并 被 DNA 连接 酶 焊 封 。 此 外 也 可 能 出 现 (b) 的 情 景 ,此 时 多 余 的 DNA 可 被 核酸 外 切 酶 切除 。 利用 这 个 极其 简单 的 机 理 ， 在 两 个 标记 位 点 之 间 的 重组 情况 如 图 18-4(a)。 如 果 这 个 交换 包括 三 个 遗传 标记 a*,b* 和 o% 情 况 则 如 图 18-4(b) 所 示 。 在 这 个 例子 中 ,由 于 断裂 后 b 与 b” 配对 ,使 重 登 区 内 有 错 配 碱 基 对 。 这 个 重 登 区 是 杂 合 的 (heterozygosis)， (a) (b) 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 = 赤 分 离 及 配对 由 分 离 及 配对 —— — — 本 =<--—— - a rd 天 RAMI, : 除去 多 余 的 HE BS DNA ee es ee eee ee a: — — 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 — -二 一 一 一 连接 酶 焊 封 缺 刻 图 18-3 在 不 同位 置 切割 单 链 的 影响 。 用 垂直 虚线 表示 切割 位 点 。(a) 连接 遗留 下 缺口 。 这 种 缺口 后 来 再 依次 用 聚合 酶 ! 和 连接 酶 填补 。(b) 连接 遗留 下 多 余 的 DNA, 箭头 指出 3’/-OH 基 团 。 在 每 一 行 中 ,只 指出 了 一 个 重组 分 子 。 注 意 , 如 果 一 个 重组 子 具 有 缺口 ?那么 其 他 的 则 一 定 具 有 多 余 的 DNA。 。145 。 即 b/b* 的 杂 合 体 ( 记 住 无 论 何 时 如 有 b/b* 杂 合 体 存在 ,那么 “外 边 ” 的 标记 都 在 一 个 重 组 重 排 体 之 内 )。 (a) a a° a FA c aé c° BF 4 W FE AE (b) , Ph gee x a + §oL oe oe De ee at a c a’ bs Ce Bi 18-4 在 带 有 遗传 记号 的 亲 代 DNA 之 间 进行 重组 的 例子 。(a) 在 两 个 记号 之 间 进 行 交换 。(b) 跨越 一 个 记号 进行 交换 ,因此 产生 杂 合 体 子 代 。* 号 表示 等 位 突变 。 (a) 通过 复制 作用 使 杂 合 子 解 体 c jemmas C 图 18-5 使 杂 合体 解体 的 两 种 途径 〈 a) 通过 复制 。(b) 通过 错 配 修复 。 ° 146° DNA 分 子 上 的 杂 合 性 是 不 稳定 状态 s。 当 基 因 型 为 ab/b*c 的 杂 合 体 进行 复制 时 ，b 和 b* 两 个 等 位 基因 分 别 进 入 两 个 子 代 分 子 中 [图 18-5(a) ], 它 们 的 基因 型 是 abc 和 ai ca 杂 合 体 状态 也 可 通过 错 配 修复 (mismatch repair) 被 消除 。 即 可 以 切除 一 般 含有 b-b* 错 对 中 的 那个 碱 基 的 序列 ， 再 根据 破 基 配对 原则 加 上 一 些 碱 基 ， 形 成 或 是 bb’ 对 或 是 b*b* 对 ， 见 图 18-5(b)。 图 中 符号 用 来 表示 正确 的 互补 性 。 如 果 发 生 了 这 种 情况 ,那么 究竟 是 形成 基因 型 abc, 还 是 形成 基因 型 ab*c, 则 取决 于 哪 一 条 链 被 修复 ;但 是 , 决 不 会 同 时 存在 以 上 两 种 基因 型 。 这 种 错 配 的 修复 是 极其 普遍 的 。 通 常用 子 代 在 一 个 单一 的 遗传 事件 中 失去 一 个 遗传 标记 来 观察 这 种 修复 。 例 如 ,在 上 述 所 讨论 过 的 交换 中 , 子 代 的 基因 型 或 者 为 abc， 这 时 b* 标记 已 丢失 ;或 者 是 ab*c, 这 时 b 标记 被 丢失。 分 支 移动 在 第 四 章 讨论 过 DNA 的 呼吸 。 呼吸 是 指 DNA 中 的 氢 键 随机 地 和 暂时 地 打开 与 复合 的 现象 。 分 支 移动 (branch migration) Tam ME RARE, RAPA 以 配对 的 链 所 取代 。 这 种 现象 的 基础 是 上 述 呼吸 作用 。 这 可 以 通过 图 18-6 中 示 出 的 检 查 人 工 合成 的 DNA 多 聚 物 实验 来 理解 。 分 子 中 双 链 延伸 ， 链 工 和 I 可 以 与 W 链 互补 ， C 链 LI 结合 后 的 长 度 超过 到 链 。 严格 地 说 C 链 中 的 黑 粗 线 区 与 粗 虚 线 区 具有 相同 的 碱 基 序 列 ， 它 们 都 与 双 链 的 细 虚 线 区 互补 。 当 发 生 呼吸 作用 时 ， 链 工 的 右 末端 暂 时 打 开 ， 可 能 发 生 二 种 情况 : HI Re I 延长 它 的 氢 键 区 ， 如 (b) 所 示 。 当 呼吸 再 次 发 生 时 ,可 能 (Ca) 中 分 子 回复 ,这 可 能 进一步 产生 变化 如 〈c)。 呼 吸 作 用 从 来 不 停止 ,所 以 分 子 不 同 状态 的 变化 也 将 继续 下 去 。 在 后 面 将 叙述 的 一 个 重组 模型 中 ， 分 支 移动 起 着 18-6 分校 移动 。 重 区 ( 粗 黑 线 及 粗 虚 线 ) 都 与 双 链 中 的 虞 线 区 互补 。 图 〈a): 粗 黑 线 区 通过 氢 键 束 缚 在 虚线 请 息 上 。 图 〈b): 粗 黑 线 区 的 游离 端 偶尔 因 两 条 链 的 张 合 ( “呼吸 ”) 而 不 受 束缚 ,这 样 就 允许 粗 虚 线 区 与 细 虚 线 区 片 眉 进 行 配对 。 图 〈c): 通 过 连续 的 张 合 (“ 呼 吸 ”)* 更 多 的 粗 虚 线 区 与 虚线 区 片段 进行 配对 ;或 分 子 转变 成 图 (a) 的 状态 。 当 然 * 也 可 能 有 许 许多 多 像 图 (b) 的 中 间 状 态 类 型 。 AERA 单 链 侵入 也 依赖 于 呼吸 作用 ,设想 一 个 环形 DNA 分 子 与 一 个 单 链 DNA 片段 ， 此 片段 与 该 环形 分 子 有 一 段 具有 同 源 性 的 碱 基 序 列 , 见 图 18-7。 如 果 在 同 源 区 发 生 呼 吸 作 用 ;* 则 此 单 链 可 能 会 与 环形 分 子 中 的 一 段 配对 ,产生 一 个 三 链 区 。 通 过 分 支 移 动 ， 侵 入 的 ， 单 链 可 能 全 被 同化 ,如 图 所 示 。 在 体外 ,这 样 的 单 链 侵 人 不 会 自动 地 发 生 。 然 而 ， 如 果 这 个 双 链 环 状 分 子 是 超 螺 旋 的 ,那么 与 超 螺旋 相连 系 的 解 旋 过 程 将 增加 单 链 泡 (single-stra- nd bubbles) 的 大 小 并 延长 其 存在 时 间 《 第 四 章 )。 但 是 ， 如 果 温 度 升 高 至 60 一 70"C 之 。147 。 间 ， 那 么 上 述 的 单 链 同 化 过 程 将 自动 地 、 有 效率 地 发 生 。 细 胞 内 的 过 程 当 然 是 不 可 能 在 如 此 高 的 温度 下 进行 的 ;但 是 如 果 向 研究 体系 中 加 入 大 肠 杆 菌 recA 基因 产物 ,那么 这 种 单 链 同 化 并 进入 超 螺旋 分 子 的 过 程 就 可 以 在 常温 下 进行 。 我 们 很 快 就 会 看 到 ， 单 链 侵入 可 能 是 两 个 DNA 分 子 进行 配对 的 最 早期 步骤 之 一 。 催化 这 种 相互 作用 的 过 程 可 能 是 RecA 蛋白 在 同 源 重 组 中 的 重要 功能 之 一 。 mme O=070-9 ， 分 子 张 合 〈 呼 吸 ) 带 D 环 的 分 子 图 18-7， 单 链 同 化 作用 。 互 补 单 链 侵 和 人 到 一 个 环 状 DNA 分 子 中 并 形成 一 个 替代 环 (D 环 )。 相互 和 非 相 互 交 换 “考虑 基因 型 为 afb- 和 arbt+ 的 两 个 噬菌体 之 间 的 杂交 。 如 果 发 生 交换 并 回收 到 atb* 和 ab 重组 体 ,那么 交换 就 是 相互 的 〈reciprocal), 因 为 回收 到 相互 重新 配对 的 重 组 体 。 但 如 果 只 找到 一 种 重组 体 ， 那 么 交换 就 是 非 相 互 的 。 遗 传 学 的 非 相 互 交 换 和 物理 性 的 非 相互 交换 之 间 , 有 着 巨大 的 不 同 。 图 18-8 可 以 说 明 这 种 不 同 之 处 。 在 〈ay 中 , 交 换 在 ab 标记 之 间 发 生 。 这 里 没有 丢失 DNA, 交 换 是 物理 性 的 相互 交换 ;人 们 找到 了 两 种 类 型 的 重组 体 ,因此 这 既是 物理 性 的 相互 交换 ,也 是 遗传 学 的 相互 交换 。 在 (b) 中 ,在 a 标记 的 两 侧 发 生 断 裂 。 第 一 排 分 子 进行 交换 后 的 产物 \ 见 第 二 排 ) 是 物理 性 的 相互 交换 分 子 。 BARB at/a 杂 合 体 。 这 是 非常 重要 的 ， 因 为 物理 实验 表明 重 伍 区 非常 大 。 假如 说 没有 错误 配对 ,上 述 每 个 分 子 都 复制 , 那 就 应 当 产 生 两 种 亲 代 基 因 型 的 分 子 及 两 种 重组 基因 型 的 分 子 , 这 时 的 交换 是 物理 性 的 相互 交换 。 假 如 说 错 配 修复 发 生 在 复制 之 前 ， viet ae 负 的 等 位 基因 被 转变 成 正常 的 等 位 基因 (a > a*), RAF 代 产 物 只 出 现 一 种 亲 代 分 子 和 一 种 重组 体 分 子 ， 如 第 三 排 所 示 。 此 时 的 交换 为 遗 忧 学 的 ae 实际 上 在 许多 情况 下 ， 物 理性 的 相互 交换 可 以 通过 多 种 方式 表现 出 遗传 学 上 的 非 相互 交换 ; 然而 目前 还 没有 一 个 简单 模型 可 以 使 一 个 物理 性 的 非 相互 交换 产生 出 了 所 以 ， 物 理性 的 相互 交换 可 以 是 遗传 学 上 的 相互 交换 ， 或 非 相 交换 ;而 物理 性 的 非 相 互 交 换 只 可 以 是 遗传 学 上 的 非 相互 交换 ， 而 不 产生 相互 交换 。 因 1 eM = Bette Sa Soe ara ae 不 能 只 以 物理 事件 的 现象 来 推出 假说 。 通常 ,重组 作用 是 在 很 大 数量 的 有 机 体 上 进行 的 ,同时 ， 这 个 过 程 往 往 撼 盖 了 另 一 方 面 事实 : 一 些 单个 个 别 的 事件 是 非 相 互 的 交换 。 从 图 18-8(b) 中 看 出 ， 在 最 后 一 排 中 ， 错 配 修复 产生 遗传 学 非 相 互 交换 。 从 图 中 可 推测 ， 错 配 修复 是 使 RAH ay, MR at EH 3-， 也 可 以 看 到 非 相 互 交换 。 假若 错 配 修复 随意 地 校正 ， 就 可 能 产生 四 种 结 果 : atbt+ ath 《〈 非 相互 交换 )，a b 十 a b+ 〈 非 相互 交换 )，a*b* + ab” 《相互 交 换 )， 以 及 ath +a bt GRRE); 如 果 重 组 在 很 大 数量 的 有 机 体 里 完成 ， 并 且 如 果 对 全 部 子 代 群 体 进行 检测 ， 那 么 a*b+ 与 ab” 两 种 重组 体 的 数目 是 相等 的 ， 表 现 为 相 互 交换 。 事 实 击 ， 当 重组 作用 在 群体 上 完成 时 ， 交 换 几 乎 总 是 表现 为 相互 性 的 。 非 相互 - 148。 (a) 物理 性 的 和 遗传 学 的 相互 交换 at oes at b> at | b+ at 5. pay FAK | be Ri Abele hi cal a be at b- at 中 “ig | OR OR) 1S PP eR a~ bt ab aly at b- bi eR IT RSs 2 ie at bt a~ b- 下 二 和 本 相 复 和 总 是 产生 at/at A a a deli eT ig b- ph, at NS SEI pe Shes ob 及 FE os wh Sau ; Ft at bit at b- 重组 子 亲 代 的 基因 型 图 18-8 相互 及 非 相互 交换 的 含义 。 交换 性 只 是 针对 一 些 单个 的 重组 圳 件 的 性 质 而 言 ， 而 不 是 对 重组 事件 总 体 而 言 。 对 于 非 相互 交换 ,往往 需要 人 们 分 离 出 单个 的 因素 ,才能 检 出 。 下 面 将 介绍 进行 这 种 研究 的 两 种 方法 。 单个 重组 事件 子 代 的 检测 酵母 及 其 他 一 些 真 菌 提供 了 一 个 检测 子 代 分 子 发 生 某 些 类 型 重组 事件 的 简单 方法 。 这 些 生物 的 细胞 ， 既 有 单 倍 体形 式 又 有 双 倍 体形 式 。 当 一 个 双 倍 体 细胞 进行 减 数 分 裂 产 生 单 倍 体 细胞 时 (酵母 与 多 数 真 菌 产 生 4 个 单 倍 体 ,少数 特殊 真菌 产生 8 个 单 倍 体 ), 同 源 染色 体 之 间 发 生 重组 。 对 一 种 被 人 们 普遍 注意 的 子囊 菌 〈《ascomycetes) 生物 进行 研究 发 现 , 由 一 个 双 倍 体 细胞 产生 的 4 个 单 倍 体 细 胞 一 一 子囊 孢子 〈ascospores) 都 存在 于 一 个 “Se HIF BE (ascus) 中 ; 即 每 一 个 重组 事件 的 产物 分 装 在 一 个 单独 的 子囊 中 ,于 是 可 以 对 单个 重组 事件 进行 分 析 。 | 下 面 是 有 关 酵 母 的 遗传 过 程 。 将 已 知 基因 型 的 双 倍 体 细 胞 培养 物 涂 布 在 一 个 无 氮 源 的 琼脂 板 上 ,这 种 过 程 将 诱导 产生 减 数 分 裂 。 在 光学 显微镜 下 观察 ， 可 以 见 到 一 些 子囊 。 通过 显 微 操 作 将 这 些 子 囊 筛 选 出 来 并 转移 到 第 二 个 琼脂 板 上 。 于 是 子宫 破裂 ， 每 个 子 圳 e 'T49 © 产生 出 4 个 子囊 孢子 ,将 子囊 孢子 一 一 进行 机 械 性 分 离 , 任 其 分 别 长 成 一 个 个 克隆 。 再 通 过 各 种 遗传 学 技术 ,可 确定 每 一 个 克隆 的 基因 型 。 这 个 完 长 的 过 程 称 做 四 分 体 分 析 (tetrad analysis)。 用 这 个 方法 可 以 获得 单个 个 别 的 重组 事件 的 全 部 产物 。 这 显然 是 一 种 广泛 适 用 于 研究 重组 作用 的 最 有 效 而 又 精确 的 遗传 学 技术 。 在 吗 菌 体系 统 中 有 一 种 与 上 面 不 同 的 称 为 单个 爆破 实验 (single burst experiment) 的 技术 。 在 这 种 实验 中 ,大量 的 细菌 被 两 种 具有 不 同 遗 传 标记 的 叹 菌 体感 染 。 当 宿主 细 胞 被 吗 菌 体 吸 附 之 后 ,将 被 感染 细胞 的 培养 物 用 培养 基 进 行 稀释 ,使 每 毫升 中 有 0.05 个 被 感染 的 细胞 。 然 后 按 每 个 试管 装 1 毫升 上 述 悬 滚 ， 将 全 部 培养 物 分 装 于 几 百 只 试管 中 。 依照 泊 松 分 布 ， 在 这 个 浓度 下 ，95.1 多 的 试管 中 没有 被 感染 的 细胞 ，4.8 驳 的 试管 中 有 1 个 被 感染 的 细胞 ,0.1 多 的 试管 中 有 1 个 以 上 的 被 感染 细胞 。 因 此 ，, 在 含有 受 感染 细胞 的 试管 中 ,98 匈 Bi 4.8/4.9 的 试管 中 只 具有 1 个 受 感染 的 细胞 。 继 续 培 养 使 细胞 裂解 ,将 每 个 试管 中 的 产物 涂 布 于 有 指示 菌 的 琼脂 板 上 ， 于 是 将 产生 叹 菌 斑 。 接 着 是 确定 吧 菌 体 的 基因 型 是 什么 。 如 果 发 生 重 组 (如 果 用 于 感染 的 是 1 及 T4 鸣 菌 体 ,通常 会 发 生 重 组 ), 那 么 通过 研究 它们 的 基因 型 ， 可 以 得 出 感染 期 间 所 发 生 的 遗传 交换 的 数目 及 位 置 。 一 个 典 型 的 实验 一 般 应 研究 100 个 受 感染 细胞 , 即 意味 着 要 使 用 2000 个 平 亚 ,其 中 1900 个 平 血 上 将 没有 鸣 菌 斑 。 这 种 实验 除了 浪费 之 外 , 另 一 个 不 足 之 处 是 ,在 单个 爆破 实验 中 受 感染 的 细胞 只 有 一 半 的 子 代 叹 菌 体 DNA 被 包装 , 某 些 基因 型 可 能 丢失 了 。 而 且 ;在 一 个 已 发 生 相 互 交换 事件 的 细胞 中 ,每 次 相互 重组 只 产生 1 个 拷贝 的 重组 体 ,而 一 个 重组 体 有 50% 的 机 会 在 爆破 中 不 被 释放 ,这 有 可 能 造成 把 相互 交换 判断 为 非 相互 交换 的 错觉 。 为 了 减少 这 个 因素 的 影响 ,就 需要 研究 更 多 的 感染 细胞 的 内 含 物 ,并 且 对 这 些 实验 数据 进行 统计 学 分 析 。 酵母 和 T+. 噬菌体 都 已 通过 上 述 方法 广泛 深入 地 研究 过 。 这 三 种 生物 的 非 相 互 交 换 都 是 通过 对 数据 进行 统计 学 分 析 推算 出 来 的 。 对 重组 机 理 的 物理 研究 推测 《但 没有 证 实 )，DNA 的 物理 的 机 械 交 换 都 是 相互 的 ,而 非 相互 交换 是 由 一 些 较 后 面 的 步骤 ， 如 和 错 配 修复 等 过 程 造成 的 。 在 下 面 的 章节 中 我 们 将 看 到 这 些 讯 息 所 建立 的 几 种 重组 模型 。 DNA 片段 与 染色 体 之 间 的 重组 参与 遗传 重组 的 二 个 DNA 分 子 可 能 是 完整 的 染色 体 ( 环 状 的 及 线 状 的 入 双 链 的 片 段 或 单 链 的 片 朋 。 在 这 一 节 我 们 将 讨论 一 个 片段 与 一 个 完整 的 染色 体 之 闻 的 重组 作用 的 某 些 性 质 。 细菌 转化 中 的 重组 在 细菌 转化 中 ,染色体 DNA 与 外 源 DNA 发 生 重 组 。 在 肺炎 球菌 〈Pzaexzzococcxs, 已 研究 得 最 清楚 ) 的 转化 中 ; 当 转 化 DNA 进入 细胞 时 ,其 一 条 链 被 分 解 , 于 是 ,只 有 一 条 链 可 与 受 体 DNA 重组 。 这 条 单 链 由 于 某 种 未 知 的 原因 可 以 不 被 核酸 酶 攻击 一 可 能 因 它 gage DNA 结合 蛋白 所 包 囊 。 在 实验 中 用 密度 标记 ( 重 链 ) 过 的 DNA 去 转化 细菌 ( 细 菌 的 DNA 是 轻 链 ) , 单 链 的 供 体 DNA 线性 地 插入 到 受 体 DNA 中 (图 18-9(a))o 通 党 被 人 们 接受 的 关于 这 个 过 程 的 模型 如 图 18-9(b) 所 示 。 在 一 种 细菌 蛋白 质 的 帮助 下 \ 此 蛋白 ° 150° (a) sha 重 的 供 体 DNA Cu (b) > 5 alte ee ne oe ahs oT ee i | I VARS II 人 DNA 呼吸 受 体 链 发 生 fk Zi] 分 枝 移动 ya coy or 和 修剪 > [ae AG Hh 一 一 18-9 细菌 的 转化 。(a) 双 链 供 体 DNA 转变 为 单 链 ,然后 插 人 。(b) 单 链 供 体 DNA BA 的 一 种 假设 机 理 。 很 可 能 相当 于 大 肠 杆 菌 的 RecA 蛋白 )， 进 入 细胞 的 单 链 供 体 DNA 片段 插 和 人 到 受 fk DNA 中 ,由 于 一 个 未 知 的 机 理 ( 人 参看 下 节 反 向 切割 trans-cutting), 被 取代 的 单 链 被 切除 。 这 个 过 程 是 非常 有 效 的 。 然 后 发 生 分 支 移动 ， 从 而 逐渐 增加 与 受 体 链 进行 碱 基 配 对 的 插 A DNA 的 比例 ,修剪 酶 (trimming enzyme) 再 切除 供 体 或 受 体 DNA 的 游离 末端 。 然 后 ， 利 用 连接 酶 使 缺口 焊 封 。 最 后 ， 产 生出 一 个 带 有 错 配 碱 基 对 的 杂 合 区 。 假 者 此 杂 合 区 内 有 来 自 供 体 的 标记 ， 那 么 它 能 否 在 子 代 中 出 现 ， 即 能 否 在 子 代 细 胞 中 回收 得 到 供 体 DNA“ 重 标记 , 则 取决 于 有 无 错 配 修复 ;如 果 有 ， 那 么 取决 于 供 体 的 “ 重 " 标 记 碱 基 或 受 体 所 得 到 的 “ 重 标记 碱 基 是 否 被 切除 。 对 于 某 些 标记 物 ,如 高 效 标记 物 来 说 ,或 者 错 配 总 按照 是 供 体 的 碱 基 序列 被 校正 ,或 者 很 少 甚至 根本 没有 什么 修复 。 在 后 一 种 情况 下 ,细胞 分 裂 之 后 ， 两 个 细胞 中 一 个 具有 供 体 基因 型 ， 而 另 一 个 具有 受 体 基因 型 。 由 于 用 于 检测 重组 体 所 采用 的 培养 基 通 党 只 允许 重组 后 的 细菌 生长 〈 如 在 一 般 培 养 基 中 加 入 抗菌素 或 使 培养 基 缺 乏 某 种 必需 氮 基 酸 ), 所 以 ,培养 四 中 产生 的 菌落 ,都 是 重组 体 细菌 。 对 于 低 效 标记 物 来 说 , 错 配 修复 通 省 从 供 体 上 移 走 错 配 碱 基 ,使 组 胞 仍 为 受 体 型 。 以 上 是 关于 两 种 类 型 标记 物 的 正确 解释 。 它 的 证 据 来 自 最 近 分 离 到 的 错 配 修复 的 \ 缺 陷 型 的 突变 体 。 当 这 些 突变 体 被 转化 时 ,所 有 标记 物 都 像 高 效 标记 物 那样 地 被 转化 ,因为 细胞 分 裂 产 生 的 两 个 子 代 细 胞 中 总 有 一 个 细胞 具有 供 体 的 基因 型 。 细菌 接合 中 的 重组 大 肠 杆 菌 Hfr 和 FO 细胞 杂交 时 ， 单 链 DNA 可 以 挨 人 到 -F” 的 染色 体 中 。 重 组 体 的 形成 需要 RecA 蛋白 和 一 个 二 聚 体 的 酶 ， 它 是 recB 和 recC 基因 的 产物 ， 叫 做 RecBC 蛋白 。 这 个 蛋白 质 有 多 种 酶 活性 ,其 中 包括 一 种 很 强 的 核酸 酶 的 活性 。 图 18-10 e151» 所 示 的 一 个 精巧 的 实验 证 明 RecA BAST RecBC 蛋白 起 作用 。RecBC 蛋白 对 于 侵入 链 的 插 人 是 不 需要 的 。 如 果 具 有 lacZ” 基因 型 的 Hfr 细胞 与 携带 着 另 一 种 lacZ- 突变 的 F- 细胞 进行 杂交 ,在 杂交 作用 开始 后 不 久 , 即 可 产生 8- 半 乳糖 背 酶 在 没有 形成 lac+ 重组 体 的 RecBC- F- 细胞 中 ,也 可 以 生成 p- 半 乳糖 昔 酶 。 因 此 ， 认 为 上 述 供 体 与 受 体 DNA 必然 是 以 互补 双 链 的 形式 排列 ,lac+ mRNA 在 RecBC 蛋白 起 作用 之 前 就 已 转录 出 来 。 如 果 Fo 细胞 是 RecA” 的 ， 那 么 8- 半 乳糖 苷 酶 就 不 能 合成 。 因 此 , 链 的 侵入 一 定 只 发 生 在 RecBC- 的 细胞 中 ,而 不 能 在 RecA” 的 细胞 中 , 并 且 RecBC 酶 一 定 是 一 种 结束 人 性 的 酶 。 到 目前 为 止 ，RecBC 酶 的 功能 仍然 还 是 一 个 谜 。 Hfr X F 的 重组 过 程 的 众多 的 特点 预示 着 对 于 转化 作用 来 说 ,其 重组 的 机 理 并 非 像 图 18-9 所 示 那 么 简单 。 转 导 作用 中 的 重组 MH DNA 片段 与 染色 体 之 间 的 重组 ,在 特 化 的 和 通用 的 转 导 中 都 可 以 发 生 。 其 中 转 导 的 一 部 分 线 状 双 链 DNA 插 人 到 细菌 染色 体 上 ( 见 图 18-11)。 注 意 , 转 导 与 细菌 转 化 不 同 : 转 导 中 鸣 菌 体 在 感染 宿主 细胞 时 把 外 来 的 双 链 DNA 直接 地 注 和 人 细胞 ;而 转化 . 时 ,和 宿主 细胞 吸收 外 来 DNA 的 过 程 必须 将 外 来 的 双 链 DNA 转变 为 内 部 的 单 链 DNA, MW 链 转 录 的 “突变 体 碱 基 配 对 因为 突变 作用 ,从 mRNA | , mRNA #6 ji 2 \ . 陷 的 蛋白 质 RE 一 一 er me eee er ele) 可 划 可 本 总 村 本 站 本 本 可 证 本 十 二 汀 本 本 二 十 生 二 二 是 本 本 可 吕 间 日本 > we: SAE i IE 编码 有 功能 的 B- AB ‘ 2 A on ca Lam aa oe FLEE Be RAY 下 em ad 加) op eee ee ee er pm om cu 图 18-10 实验 指出 单 链 侵 入 需要 RecA 和 蛋白 ,不 需要 Rec BC 和 蛋白。 长 虚线 代表 mRNA; fe 线 上 的 粗 线 代 表 lacZ 基因 在 编码 链 W f€ ERDF Bee 图 18-11 SEALE. A A © 152. ¢ 在 大 肠 杆 菌 中 进行 转 导 时 ,对 两 种 蛋白 质 : RecA BAR RecBC 蛋白 都 需要 。 这 个 过 程 与 以 前 讨论 的 各 种 类 型 有 显著 的 不 同 。 因为 转 导 时 不 仅 要 发 生 二 次 交换 ， 而 且 转 导 的 DNA 的 两 条 链 都 要 整合 到 染色 体 上 ， 其 DNA 又 是 线 状 的 ， 所 以 染色 体 双 链 中 的 两 条 链 都 要 打开 。 有 关 转 导 作 用 中 重组 的 机 理 还 知之 甚 少 ,不 能 作 更 进一步 的 讨论 。 反 式 切割 在 图 18-9 建议 的 转化 机 理 中 ,被 取代 的 受 体 链 上 产生 一 个 缺口 对 于 受 体 DNA 最 终 被 供 体 DNA 置换 是 必需 的 。 我 们 将 看 到 一 些 更 普通 的 重组 模型 中 这 种 缺口 总 是 必然 在 某 些 阶段 产生 。 近 来 却 在 被 人 侵 的 DNA 上 观察 到 发 生 缺 刻 的 事实 ,这 种 现象 称 之 为 反 式 切割 (trans-cutting)。 在 图 18-12(a) 的 实验 中 ,一 个 1 喉 菌 体 溶 源 细胞 被 二 个 相同 的 1 Wie BE RE ,它们 与 前 噬菌体 发 生 同 源 免疫 作用 (homoimmune)。 由 于 复制 作用 被 前 史 菌 体 的 免疫 系统 所 抵制 ,进入 细胞 的 噬菌体 DNA 径直 地 变 成 超 螺旋 状态 。 其 中 一 个 1DNA 具有 放射 活性 ， 另 一 个 无 放射 活性 但 已 预先 用 psoralen 试剂 处 理 。 YR 体感 染 后 ,用 近 紫 外 波段 的 紫外 线 照 射 , 细 胞 中 仅仅 是 经 psoralen 处 理 的 DNA 受到 损 ， 伤 。 接 着 把 生长 在 培养 基 中 的 受 感染 细胞 经 一 个 短暂 的 保温 处 理 。 人 们 发 现 ， 如 果 此 细 胞 为 RecA+ 并 带 有 切除 修复 基因 (参见 第 十 章 )， 那 么 其 中 带 有 放射 性 的 DNA 分 子 产 生出 缺 刻 。 图 18-12(b) 是 对 这 个 实验 的 一 种 解释 。 经 psoralen 处 理 过 的 DNA 因 照 射 而 造成 的 损伤 ( 留 下 一 段 缺 口 ) 被 切除 。 带 有 放射 性 的 那个 双 链 DNA 分 子 在 呼吸 过 程 中 (由 于 为 超 螺旋 状态 ,所 以 它 具 有 一 个 大 的 单 链 区 ,其 解释 在 第 四 章 ), 在 RecA 蛋白 的 促进 下 ,被 普 索 若 仑 (psoralen) 处 理 过 的 DNA 分 子 上 的 一 段 缺口 中 的 单 链 侵 和 人。 为 使 被 人 侵 的 、 带 放射 性 的 DNA 分 子 中 的 单 链 区 与 人 侵 的 单 链 的 配对 达到 足够 的 稳定 状态 ， 核酸 酶 在 其 带 放射 性 的 另 一 条 链 上 打出 一 缺口 。 尽 管 现在 还 没有 分 离 得 到 这 种 核酸 酶 ,但 (a) 用 噬菌体 c 感染 /放射 性 同位 素 标记 普 索 若 仑 处 理 损伤 的 环 有 缺 刻 的 环 “\\ 光 re 保温 OK< 一 一 一 一 2 { ! -一 一 一 > \y 1) O Sw O LY a4 有 放射 性 的 (b) ms 切除 损伤 A ” 298 We 0) : 侵入 作用 形成 缺 刻 be $s te | ae t= ‘ Nay eal Wes 被 普 索 若 仑 处 理 me 并 且 被 照射 的 图 18-12 反 式 切割 。(a) 证 明 反 式 切 割 的 实验 。 (b) 对 上 述 实验 现象 的 解释 说 明 。 实 线 分 子 被 虚线 分 子 的 单 链 侵入 。 以 上 解释 还 没有 得 到 实验 证 明 。 超 螺旋 DNA 分子 在 图 中 画 成 环 状 并 标 以 sc 字样 。 目前 已 有 很 好 的 实验 证 据 支 持 这 种 解释 。 完整 DNA 分 子 之 间 的 重组 在 以 上 所 讨论 的 例子 中 ,参加 重组 的 两 个 DNA 分 子 中 都 有 一 个 是 DNA HE. GE 们 不 如 本 节 将 讨论 的 完整 分 子 之 间 的 重组 那么 普遍 和 典型 。 除 了 几 个 例外 ， 细 胸中 的 完 整 的 DNA 几乎 都 是 环 状 的 ,这 就 产生 了 一 个 我 们 还 没有 遇 到 的 问题 , 即 重组 分 子 没有 游 离 未 端 。 目 前 ,许多 实验 室 都 在 研究 这 种 类 型 的 重组 ， 并 提出 了 大 量 的 有 关 模 型 ;我 们 将 讨论 其 中 的 几 种 。 现 有 两 种 不 同 模型 : (1) 在 有 一 些 环形 DNA 分 子 中 首先 打 一 个 切 口 , 切 出 一 个 游离 未 端 ,然后 游离 末端 再 侵入 到 未 被 打 断 的 环 状 分 子 中 BERS (2) 最 近 的 新 看 法 认为 ， 同 源 配对 的 过 程 早 于 形成 缺 刻 的 过 程 。 所 有 的 模型 都 重视 考虑 以 下 事 实 ; 1. 重组 机 理 中 包括 一 个 重 倒 连接 的 步骤 。 2. BARI K. 3. 重组 作用 既 可 以 是 相互 的 ,也 可 是 非 相 互 的 。 4. 错 配 修复 是 一 个 共同 的 、 终 结 性 的 事件 。 除 了 不 同 的 模式 外 ,自然 界 中 很 可 能 至 少 存在 着 二 种 不 同类 型 的 同 源 重组 。 一 种 是 依赖 RecA 蛋白 类 型 。 CREEMBK WE 及 真菌 体系 中 ,不 需要 大 量 的 DNA 合成 ( 指 除 了 填补 缺口 gap-filling RW) AIA RecA 蛋白 《在 大 肠 杆 菌 中 ) 或 具有 相似 性 质 的 其 他 蛋白 。“ 它 可 能 是 重组 作用 最 普 闹 的 一 种 类 型 。 另 一 种 是 不 依赖 RecA 蛋白 类 型 , 它 依 赖 于 复制 作用 利用 一 些 编码 吧 菌 体 的 基因 ,目前 已 在 大 肠 杆 菌 的 1 噬菌体 (Red (KA) 及 T7、T4 叭 菌 体 中 对 这 种 类 型 进行 了 仔细 的 研究 ,但 还 没有 完全 搞 清 楚 。 这 一 节 只 讨论 依赖 RecA 蛋白 的 类 型 。 Holliday 结构 有 关 重 组 的 一 个 早期 模型 是 Robin Holliday 建立 的 。 如 图 18-13 Pm, 它 假 设 存 在 着 一 个 由 两 条 单 链 进行 重组 而 将 两 个 分 子 连 接 到 一 起 所 形成 的 一 个 单位 ， 这 种 结构 被 称 为 Holliday 中 间 物 (Holliday intermediate)( 此 处 不 讨论 它 是 如 何 提出 的 )。 如 果 在 杂交 (cross) 区 (Holliday 连接 ，Holliday junction) 的 对 应 位 置 上 产生 两 个 切口 ， 那 么 配对 的 重组 分 子 将 产生 如 (c) 的 结果 。 另 一 方面 ,如 果 切 点 位 于 未 破坏 链 的 对 应 位 点 上 将 产生 (d) 的 结果 。(c) 和 (d) 类 型 的 分 子 都 有 重 登 区 ， 如 果 有 遗传 标记 BALBBSK 可 能 会 是 杂 合 的 。 为 了 简单 起 见 ,将 分 子 画 成 线 状 ， 如 图 中 (a) 到 (d) 部 分 。(e) 部 分 表示 配对 的 环 状 分 子 形成 一 个 Holliday 中 间 物 的 情况 。“8” 型 结构 是 一 个 配对 的 环 状 分 子 PER Holliday 中 间 物 ， 这 种 分 子 已 从 具有 多 个 拷贝 质粒 的 细胞 和 受 OX174 Oe 菌 体感 染 的 . RecA+ 细胞 中 所 分 离 得 到 的 DNA 通过 电镜 检查 而 观察 到 [图 18-4(a)]。 进一步 证 实 “8” 形 结构 存在 的 证 据 , 是 用 只 在 单一 位 点 产生 一 个 切口 的 限制 性 内 切 酶 处 理 “8" 型 分 子 * 如 果 “8” 型 分 子 中 的 二 个 环 状 分 子 是 通过 同 源 区 连接 的 ,那么 处 理 后 的 分 子 应 当 转 变 为 具有 两 对 相同 长 度 的 臂 的 X 型 分 子 [图 18-14(b, c)]。 为 了 进一步 证 实 Hollid- ay 结构 是 重组 中 走 正 存在 的 中 间 物 ,要 对 “8” 型 连接 的 细节 进行 更 详细 的 研究 。 在 图 18-13 的 (b) 行 中 所 未 的 结构 的 一 个 环 状 组 分 可 以 按照 图 18-15(a) 所 示 那 样 。154 。 (a) + 人 | tb) i— ey Holliday mere == 中 间 物 在 箭头 1 和 2 处 切割 :正确 的 ， 加。 、 在 箭头 3 和 4 处 切割 ;正确 的 ， ue 末 江 连接 到 一 起 ae RE @) 1S (d) + a SN \ Holliday 中 间 物 的 8 字形 式 18-13 Holliday 中 间 物 (b) 的 形成 及 重组 分 子 的 结构 。 两 个 带 缺 刻 的 DNA 分 子 (a) 转 变 为 Holliday 中 间 物 (b), 形 成 两 套 重组 子 , 他 们 的 结构 见 (“) 和 (d)。(e) 也 是 Holliday 中 间 物 ， 与 (b) 一 样 ， 只 是 它 是 环 式 的 ; 注意 ， 8 字 型 分 子 由 两 个 单 链 的 单 体 D DNA 环 组 成 。 NA 环 和 一 个 单 链 的 二 体 aA ‘one angio” 18-14 (a) 8 字 型 DNA 分 子 的 电子 显微镜 照片 。 分 子 由 两 个 %X-174 DNA 的 单 体 环 经 重 组 作用 形成 。(b)X 型 DNA 分 子 的 电子 显微镜 照片 。 分 子 是 由 8 型 分 子 被 限制 性 内 切 酶 在 特殊 位 置 上 切 一 下 而 形成 的 。(c) 是 对 《〈a)\(b) 中 分 子 的 图 解 ( 承 Robert Warner 提供 )。 旋转 360o。 如 果 这 个 区 域 的 单 链 组 分 都 处 于 伸展 状态 ， 那 么 结合 点 就 会 像 图 18-15 中 那 伴 呈 直 角 的 样子 。 如 果 在 甲 酰胺 存在 的 情况 下 《使 单 链 伸展 ) 通过 电镜 观察 到 了 名 。 155° Tyre eerie pededddi sista, FI 18-15 (a) 按 图 示 的 轴 , 将 Holliday 结构 的 上 半 部 进行 旋转 ( 担 住 下 半 都 ) 产 生 一 个 开 伪 式 ae (open-box) #5, (b) 一 个 线性 DNA 片 朋 与 一 个 噬菌体 的 环 状 DNA 之 间 发 生 重组 作用 ) = 产生 中 间 物 。 图 为 该 中 间 物 的 电镜 照片 。 箭 头 表示 Holliday 结构 的 连接 处 ;右上 角 是 这 个 连接 处 vt 的 放大 照片 。(c) 对 Holliday 结构 周转 区域 的 图 解说 明 。 左 边 的 图 表示 开 盒 式 构象 ( 见 b) AD if 的 图 表示 一 种 可 能 的 交换 联 会 结构 (crossed structure)( Manuel Valenzuela 提供 ) se ‘ 二 1 有 2% : LU 18-13(b) 所 示 的 X 形 结构 ,也 就 找到 了 图 18-15(b) 中 所 示 的 那 种 分 子 。 这 些 电 锁 照 片 再 加 上 其 他 一 些 证 据 , 证 实 Holliday 结构 是 RecA 和 蛋白 所 介 导 的 重组 作用 的 中 间 物 质 。 下 一 节 我 们 将 对 可 能 产生 Holliday 的 一 种 途径 进行 讨论 。 链 转 移 或 Aviemore 模型 对 于 Holliday 模型 原来 的 观点 认为 链 交换 是 一 个 断裂 -转换 -连接 的 过 程 ， 在 此 过 程 中 两 条 链 在 同一 个 位 置 处 开始 断裂 。 人 们 发 现 这 是 一 个 相互 的 过 程 。 但 是 ， 若 干 年 后 积累 的 事实 证 明 交 换 并 不 总 是 相互 的 一 一 最 显著 的 发 现 是 图 18-13 中 见 到 的 (c) 行 及 (d) 。156。 行 分 别 所 示 的 来 自 两 个 亲 代 的 充 僵 区 (filled-in region) 和 重合 区 (overlap region), if 常 仅 仅 是 由 相互 作用 的 两 个 DNA 分 子 中 的 一 个 分 子 衍 生 而 来 。 因 此 , 人 们 花费 了 巨大 的 努力 企图 得 到 一 个 包含 Holliday 结构 作为 中 介 物 的 模型 。 其 中 的 一 个 模型 就 是 链 转 移 模型 ， 我 们 就 在 下 面 加 以 介绍 。 在 解释 链 转移 模型 之 前 ， 必 须 先 明日 图 18-16 中 所 示 的 DNA 5 #4 Bl & (DNA isomerization)。 异 构 化 能 使 Holliday 结构 从 工 型 变 为 V 型 。 在 解 堆 迭 过 程 中 , 每 条 双 螺旋 弯曲 ,接近 到 Holliday 接口 处 ,这样 就 使 Holliday 结构 中 的 链 都 变 成 了 直 的 。 结 构 I 中 的 右 半边 旋转 180“( 由 顶部 转 成 底部 ) 形 成 结构 II。 结 构 II 的 上 面部 分 (A 分 枝 与 b 分 枝 ) 旋 转 180?( 由 右 端 转 成 堪 端 ) 产 生 结构 IV. 已 弯曲 的 双 链 再 堆积 形成 结构 V, 至 此 , 异 构 化 作用 已 全 部 完成 。 注 意 ,在 异 构 化 的 过 程 中 链 发 生 了 什么 变化 一 Holli- day 结构 中 的 交叉 链 变 成 了 骨架 链 ,骨架 链 变 成 了 交叉 链 。 对 于 上 面 刚刚 描述 过 的 无 论 是 广泛 的 解 堆 迭 作 用 ,还 是 旋转 性 扩散 作用 ,都 不 能 直接 地 在 物理 学 实验 中 得 到 证 明 。 然 而 ,采用 分 子 模型 则 可 以 很 容易 地 解释 图 18-16 中 所 说 明 的 弯曲 与 旋转 ， 而 不 会 出 现 立 体 结 构 或 张力 限制 等 问题 。 图 18-17 说 明了 链 转移 模型 。 其 步骤 如 下 : 1. 形成 缺 刻 。 通 过 一 种 未 知 的 机 理 使 双 螺 旋 中 的 一 条 链 断 开 ， 缺 刻 处 两 个 核 苷 酸 分 别 带 3 -OH 基 团 与 5-P 基 团 。 在 某 种 意义 上 讲 ,细胞 内 DNA 可 能 (而 且 极 为 可 能 ) 是 不 断 地 随机 地 形成 缺 刻 (被 核酸 酶 作用 ) 并 进行 封闭 (被 连接 酶 作用 )。 换 句 话 说， 可 能 有 一 种 机 理 使 同 源 部 分 靠 在 一 起 ， 而 形成 缺 刻 只 为 了 对 这 种 同 源 结合 作出 反应 。 注 意 这 种 模型 只 在 一 条 链 中 形成 缺 刻 ,而 在 Holliday 模型 中 则 要 使 两 条 链 形成 缺 刻 。 2. tt. Kia DNA 聚合 酶 I 能 作用 于 带 游 离 3 -OH 基因 的 缺 刻 ,向 3” 末端 A ,va 4 NE Ay 2 Cs St 4 Be 2 N\ 1 1 | 4 ° 8 5 | NZ Gian 4 沿 虚 线 轴 2 再 旋转 180* 1 沿 虚 线 轴 1 旋 转 180" os Be Ne | 图 18-16 Holliday 中 间 物 异 构 化 的 机 理 。 I RAMA VRAIS M. Meselson 和 C. Redeling 1975 年 在 Proc， Nat. Acad. Sci., 72,358 中 提出 的 模型 类 似 )。 ° 157 © x 7. 分 枝 的 移动 18-17 链 交换 成 Aviemore 模型 。 由 Meselson 及 C.Radding 提议 (1975 年 )yProc.Naer. Acad. Sci.，72，358)。 虚 线 表 示 新 合成 的 DNA。 一 一 -一 一 一 一 一 -一 EMBER ,取代 有 5 末端 的 链 ( 见 第 八 章 )。 这 种 取代 反应 能 无 限 进行 , 因而 能 形成 很 长 的 5 -P 为 末端 的 游离 单 链 *。 3. 侵入。 游离 单 链 可 在 双 螺 旋 形 成 泡 的 地 方 侵入 ( 泡 是 由 张 合 反应 或 因 有 DNA 结 合 蛋 白 而 形成 的 )。 很 明显 ， 这 个 过 程 需 RecA 蛋白 的 帮助 。 在 以 后 的 章节 中 将 讨论 RecA 蛋白 的 作用 方式 。 4. 泡 的 切断 。 游 离 链 的 侵 和 人 使 得 被 蔡 换 的 那 部 分 DNA 降解 。 降解 反应 至 少 需 要 一 种 核酸 内 切 酶 ,而 且 如 果 这 种 酶 只 有 一 个 切 点 , 那 就 还 需要 对 3 -OH. 和 5-P 的 专 一 性 外 切 酶 。 也 有 可 能 除去 的 是 侵 人 和 链 而 不 是 被 蔡 换 的 链 ， 它 被 外 切 酶 除去 。 上述 过 程 可 能 是 反 式 - 缺 刻 (trans-nicking) 在 起 始 步骤 的 一 个 例子 。 5. 碎 链 的 吸收 。 在 第 4 步骤 中 形成 的 带 3 -OH 末端 的 缺口 被 DNA RHE LT, 并 由 DNA 连接 酶 将 它 与 侵入 链 连接 起 来 。 同 时 ，5 -P 末端 的 缺口 可 以 进一步 扩大 ，, 容 许 更 多 的 侵 人 链 与 被 侵 人 分子 的 其 余部 分 碱 基 配 对 。 注 意 ， 在 两 条 双 螺 旋 中 仅仅 只 存在 一 个 螺旋 杂交 区 ( 含 一 条 黑 链 和 一 条 虚线 链 的 双 链 区 )o * 在 这 点 上 读者 也 许 不 清楚 我 们 什么 时 候 开 始 讨 论 了 重组 模型 (这 个 题目 是 指 不 依赖 于 复制 的 重组 过 程 ) 由 于 三 个 原因 ， 链 转移 模型 被 认为 是 能 解释 这 种 重组 的 模型 。(《1) 只 发 生 少量 DNA AK LHL ABE KOR 基 对 ， 对 下 面 描述 的 插入 过 程 就 已 是 足够 的 了 (虽然 这 个 过 程 总 共 要 涉及 几 百 个 碱 基 对 7)(2) 这 种 DNA G 成 不 需要 复制 酶 一 -DNA RS IIL 并 且 可 能 只 需要 很 少 的 复制 因子 交 37) 这 种 复制 是 修复 复制 。 。 158。 6. 异 构 化 。 同 图 18-15 中 所 示 的 异 构 化 类 型 一 样 产生 异 构 化 作用 。 并 且 使 结构 中 的 几 个 劈 端 都 放 在 重组 构 型 中 链 交 叉 区 的 外 必 位 置 上 一 一 形成 Holliday 结构 。 7. 分 枝 的 移动 。 分 枝 移 动 既 可 以 向 左 进行 也 可 以 向 右 进 行 。 在 任何 一 种 情况 下 ， 在 两 条 双 螺 旋 中 都 能 形成 杂交 的 双 链 区 。 至 此 ,已 经 得 到 了 图 18-13(b) 中 所 示 的 Holliday 中 间 物 ,而 且 重组 子 还 可 形成 图 中 后 面 几 行 所 示 的 形式 。 重 要 的 是 Holliday 结构 中 交叉 链 的 交叉 点 可 能 距 侵入 的 地 方 很 远 。 所 以 ,在 图 18-17 的 第 7 时 期 之 后 ,发 生 缺 刻 的 位 置 不 一 定 非得 在 第 1 期 的 缺 刻 的 所 在 位 置 上 , 即 不 一 定 如 原初 设想 的 Holliday 模型 所 示 的 那样 (图 18-13)。 这 就 表明 造成 遗传 交换 过 程 的 重组 作用 最 终 发 生 在 两 个 遗传 标记 之 间 ; 然 而 , 这 种 遗传 交换 的 初始 阶段 的 缺 刻 -侵入 事件 却 不 一 定 需要 发 生 在 两 个 遗传 标记 之 间 。 许多 实验 都 支持 链 转 移 模型 ,但 也 偶然 有 一 些 现象 与 之 并 不 一 致 ,使 得 这 个 模型 必需 加 以 修改 。 在 下 一 节 中 将 描述 另 一 种 完全 不 同 的 产生 Holliday 中 间 物 的 方法 。 一 个 先 配 对 ,后 切割 的 重组 模型 ” 链 转移 模型 和 其 他 许多 模型 都 假定 链 切割 过 程 发 生 在 链 配 对 过 程 之 前 。 然 而 ， 有 一 个 模型 认为 先 发 生 链 切割 并 无 必要 。 在 这 个 模型 中 (图 18-18) 两 个 同 源 的 区 域 先 解 链 (或 通过 张 合 反应 或 在 附加 蛋白 质 的 帮助 下 ), 然后 形成 杂 合 的 双 螺旋 。 也 就 是 说 , 如 果 在 分 子 1 中 A T.-M, 在 分 子 2 中 A, 和 T: 是 一 对 , 杂 合 配对 后 就 形成 Ai，T: 和 A:，T， 的 两 种 配对 形式 。 其 空间 结构 (图 中 II7 在 主 平面 图 中 很 难看 清楚 , 但 是 此 模型 说 明 内 部 曼 旋 化 的 杂 合 双 螺 旋 在 结构 上 是 可 行 的 ， 并 且 可 以 靠 氢 链 和 碱 基 堆 砌 力 得 到 稳定 。 在 图 “COCO I 十 TTLTCITL Perer 7 | 解 链 ie a SAGO eh ee a Il Sey aig Mee ae PRIN 相互 交叉 | as r= 、 已 完成 交叉 ， 在 箭头 处 切割 ; 分 叉 处 移动 图 18-18 先 配对 后 切割 模型 。 。 159。 中 内 部 螺旋 上 的 箭头 所 指 处 打开 两 个 缺 刻 可 以 产生 Holliday 中 间 物 。 这 个 模型 有 一 点 ” 不 利 的 地 方 , 那 就 是 这 些 缺 刻 必须 产生 在 两 条 螺旋 的 相应 位 点 上 。 一 些 最 近 的 研究 , 如 用 刀 种 拓扑 酶 如 大 肠 杆 菌 DNA 解 旋 酶 Ceyrase) 和 大 肠 杆菌 解 链 酶 〈w protein) (KER 都 有 形成 缺 刻 和 闭合 的 活性 , 即 有 张 合 的 功能 ) 所 做 的 实验 表明 ， 这 些 酶 可 能 参与 了 这 些 过 程 。 但 只 有 很 少 的 证 据 支 持 这 个 模型 。 很 多 实验 说 明 带 有 缺 刻 的 DNA 《或 由 外 来 试 剂 引 起 ， 或 在 修复 碱 基 损 伤 的 过 程 中 形成 ) 以 及 具有 缺 口 或 自由 末端 的 DNA 更易 发 生 同 源 重 组 。 这 些 结果 都 支持 了 链 转移 模型 ,并且 不 是 简单 地 与 配对、 切割 模型 一 致 。 然 而 ， 在 没有 得 到 相反 的 证 据 之 前 ,我们 还 是 要 认真 地 考虑 “配对 、 切 割 ` 模 型。 8 型 分 子 的 解体 Al 18-13 表明 了 由 两 条 线 状 分 子 形成 的 Holliday 中 间 物 可 以 以 两 种 不 同形 式 解 体 。 如 果 使 双 螺旋 分 开 的 切 点 位 于 二 聚 体 中 的 链 交叉 区 内 ， 就 产生 类 似 于 单 链 插入 的 形 式 (图 c); 然而 , 如 果 切 点 位 于 别处 ,就 产生 具有 重 倒 的 连接 部 分 的 两 个 分 子 ( 图 d)。 如 果 重组 分 子 是 环 状 分 子 二 聚 体 而 不 是 线 状 分 子 时 , 切割 后 也 有 两 种 可 能 的 结果 ,但 是 这 时 产 生 的 两 种 结果 在 结构 上 过 然 不 同 。 图 18-19 给 出 了 作用 于 8 型 分 子 的 三 种 可 能 切割 方式 。 为 了 清楚 起 见 ,我 们 把 8 型 分 子 中 的 一 个 环 旋转 180" 形成 一 个 新 的 结构 。 首 先 ， 我 们 假定 这 种 结构 很 易 断 链 而 且 只 发 生 单 链 断 裂 。 这 意味 着 断 链 只 能 在 图 中 四 个 箭头 之 中 的 一 个 所 指 的 地 方 断裂 。 第 二 ， 我 们 假定 断裂 总 是 成 对 地 发 生 ， 因 为 断裂 处 不 足以 使 8 型 分 子 解体 。 这 样 就 有 三 种 再 度 配对 的 可 能 方式 : C1) 在 二 聚 体 中 链 的 相对 部 分 ;〈2) 在 单 环 中 链 的 相对 部 分 : (3) 在 带 链 的 环 中 的 两 个 邻近 点 (一 个 在 单 环 上 ， 另 一 个 在 两 育 体 的 链 上 )。 这样 三 种 再 度 配对 方式 可 产生 三 种 结果 : 两 个 单 体 , 一 个 二 聚 体 , 一 个 滚动 环 , 如 图 18-19 所 示 。 这 三 种 不 同形 式 可 能 在 不 同 的 系统 中 有 着 很 不 同 的 功能 。 例 如 ， 如 果 重 组 事件 的 最 原本 的 接受 者 是 只 有 单 体 长 度 的 真 核 染色 体 或 细菌 染色 体 , 就 既 不 能 形成 二 聚 体 也 不 能 形成 滚动 环 , 也 不 能 进行 其 他 必要 的 进一步 进程 。 而 另 一 方面 , 在 噬菌体 系统 中 , 如 果 重 组 过 程 只 形成 单 体 ,那么 将 最 终 导致 死亡 。 例 如 1 MEK, 由 于 包装 需要 两 个 cos 位 点 (第 十 五 章 ), 所 以 只 有 形成 二 聚 体 或 滚动 环 ( 可 以 不 断 地 复制 ) 才 能 形成 重组 的 1 叹 菌 体 。 但 是 目前 还 没有 将 其 中 的 一 个 环 对 着 gir [Am =-SN as -;° (0S 另 一 个 旋转 180 PN —_— + 7 \ Mt \ . 4} 4a | ti it ° ¢ = om =o me 于 箭头 2 和 4 处 产生 相对 的 于 箭头 1 和 2 或 3 和 4 处 ， 切口 ,形成 三 联 体 切口 ;形成 单 体 环 产生 邻近 的 切 只 18-19 8 型 分 子 的 解体 。 * 160 » 在 任何 系统 中 发 现任 何 有 重组 作用 介 人 的 滚动 环 的 证 据 。 然 而 ， 在 recA* 细菌 中 经 常 可 以 发 现 小 质粒 的 二 聚 作 用 。 毫 无 疑问 ,8 型 分 子 至 少 在 遗传 重组 中 是 一 种 中 介 物 ,但 是 ， 现在 对 于 它 是 如 何 形成 重组 分 子 的 以 及 它 是 如 何 转变 成 重组 分 子 的 则 还 并 不 清楚 。 RecA 和 RecBC 蛋白 的 性 质 在 大 肠 杆 菌 中 存在 着 几 种 同 源 重 组 的 途径 。 最 主要 的 一 种 途径 需要 有 RecA 和 RecBC 蛋白 以 及 可 能 还 需要 其 他 一 些 蛋白 , 如 单 链 DNA 结合 蛋白 《这 个 蛋白 质 还 参与 其 他 反 应 ) 参 与 。 人 们 已 经 能 得 到 RecA 蛋白 及 RecBC 蛋白 的 纯 品 , 而 且 花 了 很 大 力气 对 它们 的 DNA 结合 活性 和 酶 活性 进行 研究 这 些 研究 的 结果 已 暗示 出 这 些 蛋白 质 的 生理 功能 ， 但 还 没 能 给 出 很 清晰 的 讯息 。 RecA 蛋白 RecA 蛋白 有 两 个 主要 的 化 学 活性 : 〈1) 它 是 一 个 依赖 于 ATP 的 单 链 结合 蛋白 。 (2) 它 是 一 种 蛋白 水 解 酶 。 其 蛋白 酶 活性 在 调节 它 自 身 的 生物 合成 中 是 必须 的 ， 因 为 它 可 以 水 解 LexA 阻 遏 物 〈 看 第 十 四 章 )， 所 以 它 的 DNA 结合 活性 与 重组 作用 有 关 。 RecA 蛋白 的 主要 功能 是 催化 游离 单 链 的 侵入 ， 图 18-20 表明 了 好 几 种 在 体 外 进 行 的 、 由 RecA 蛋白 介 导 的 DNA 5 DNA 的 相互 作用 。 图 中 所 示 的 各 种 结构 是 稳定 的 ， 由 同 源 序列 之 间 的 正常 的 碱 基 配 对 而 靠拢 到 一 起 。 证 明 这 个 结论 的 证 据 ， 就 是 这 些 结构 只 有 在 被 加 热 到 DNA 的 正常 融 解 温度 时 才能 解 离 。 图 中 的 每 种 反应 都 需要 两 种 DNA 分 子 、RecA 蛋白 (不 需 其 他 和 蛋白质) 和 ATP。 在 反应 中 ATP 被 水 解 ,这 意味 着 链 的 侵 和 是 一 种 耗 能 过 程 ,但 其 中 ATP 的 具体 作用 还 不 清楚 。 (a) 十 “= “一 一 “一 一 上 一 ~、 本 ) NA Aa N 和 一” See +e 0 Oe Mis Dh acd ~- MS ea fy cite +{ }— CK \ id aoe eS cS (d) ro 和 | cota Sa 18-20 RecA 蛋白 调节 的 四 种 反应 。sc 表示 超 螺旋 。 *。，161。 图 中 所 示 的 四 个 反应 有 三 个 要 求 : 1. 其 中 一 个 分 子 必 须 是 单 链 分 子 , 或 者 有 足够 长 度 的 单 链 区 , 这 种 分 子 用 虚线 表示 。 2. 另 一 个 分 子 ( 用 实 线 表 示 ) 必 须 含 有 游离 末端 或 者 单 链 区 。 在 图 (a) 和 图 (d) 中 ， 共 价 环 的 单 链 区 由 超 螺旋 提供 , 如 果 不 是 超 螺旋 分 子 ，a\d 中 的 相互 作用 就 不 会 发 生 。 3. 其 中 一 个 分 子 必 须 有 自由 的 (游离 的 ) 末 端 。 这 种 相互 作用 的 详细 机 理 还 不 清楚 ,但 可 以 简单 地 认为 RecA 蛋白 能 使 一 个 单 链 分 子 的 自由 末端 侵入 到 另 一 个 双 链 DNA 分 子 中 的 同 源 单 链 区 。 由 于 RecA 蛋白 没有 解 旋 活 性 , 它 不 能 使 被 侵入 的 分 子 中 产生 单 链 区 , 这 样 就 解释 了 为 什么 需 有 第 二 个 要 求 。 然 而 ,更 精细 的 实验 (图 18-21) 表 明 , 在 两 个 DNA 分 子 之 间 的 原初 的 相互 作用 并 不 需要 第 二 个 要 求 , 这 与 图 18-20 中 所 示 的 为 了 形成 该 图 中 稳定 的 结构 而 需要 一 个 自由 末端 的 要 求 相反 。 这 个 实验 利用 了 两 种 DNA 分 子 : (1) G4 鸣 菌 体 的 双 链 复制 型 DNA (49 6 000 Tx 基 对 ), 用 限制 性 内 切 酶 把 它 切 成 线 状 双 链 DNA 分 子 ; (2) 由 插 人 的 274 碱 基 对 的 G4 DNA 序列 插 到 几 个 千 碱 基 对 的 M13 的 DNA 序列 中 ， 组 成 M13-G4 单 链 的 单 链 杂交 体 分 子 ( 见 图 18-21 上 部 )e 这 两 种 分 子 只 有 274bp 碱 基 对 的 G4 序列 是 同 源 的 ， 所 以 G4DNA 分 子 的 双 链 末端 则 和 M13-G4 杂交 分 子 的 任何 地 方 都 不 可 能 发 生 相 互 作 Flo im, RecA 蛋白 却 能 使 这 两 种 分 子 发 生 相 互 作用 。 这 说 明 对 于 两 个 分 子 的 靠拢 与 联结 来 说 ， 并 不 需要 有 自由 的 同 源 末 端 。 这 个 结论 又 被 下 面 的 一 个 实验 证 明 。 在 这 个 实 验 中 ， 使 用 了 未 切 开 的 超 螺旋 的 G4DNA 分 子 , G4DNA 与 M13DNA-G4DNA 靠拢 在 一 起 。M13-G4 5 G4 的 复合 体 与 图 18-12 中 所 示 的 那些 复合 体 有 一 个 重要 区 别 ， 那 就 是 M13-G4 与 G4 形成 的 复合 体 不 很 稳定 ,在 远 远 低 于 DNA 熔点 温度 (20*C) wi 况 下 就 解 离 了 。 这 个 结果 表明 这 种 相互 作用 与 图 18-20 中 所 示 的 不 同 。 显 然 ，M13-G4 y M3 ae Pi G4 插 入 _——— -8 oes oe — ——— eee — — RecA 蛋白 ‘@) —— = | n— ——. _—-—— ee oo 图 18-21 大 分 子 DNA 通过 RecA 蛋白 介 导 与 线性 G4DNA 的 结合 。 KASAM 带 有 274 碱 基 对 的 G4DNA 插入 序列 的 单 链 M13 而 完成 的 。M13 的 其 他 部 分 与 大 分 于 DNA 都 是 不 同 源 的 ,只 有 粗 线 的 部 分 (G4DNA) 能 够 碱 基 配 对 。 。 162。 与 G4 的 相互 作用 不 能 形成 大 段 的 互补 区 ,因为 那样 形成 的 DNA 必须 解 链 ， 不 能 形成 螺旋 〈 记 住 : ”螺旋 的 每 一 圈 只 有 10 个 碱 基 对 被 拆 开 )。 然而 ， 相 互 识别 又 一 定 要 借助 于 碱 基 配 对 。 上 述 反应 形成 的 产物 的 热 稳定 性 较 差 ， 也 表明 碱 基 互 补 区 非常 短 ， 多 半 短 于 10 个 碱 基 对 〈 密 码 子 与 反 密 码 子 的 相互 作用 只 需要 三 个 碱 基 对 )。 所 以 这 三 条 链 之 间 的 相互 作用 也 可 能 符合 图 18-18 中 图 II 启示 的 先 配 对 再 切除 "的 模型 ,但 在 完全 弄 清 相互 作用 的 实质 之 前 还 需 进 一 步 深 人 研究 。 上 述 实验 的 重要 性 就 在 于 它 明确 指出 了 RecA 蛋白 能 够 介 导 不 需 DNA WE HOA 端的 较 弱 的 相互 作用 。 因 此 说 明 , 链 与 链 的 识别 并 非 必 需 有 目 由 末端 。 推 测 , 相 互 作用 的 区 域 可 沿 着 双 螺 旋 移 动 (通过 某 种 分 梳 移 动 ), 直到 遇 上 一 个 目 由 末端 ;然后 ， 从 自由 来 端 处 ,发 生 解 链 , 如 图 18-20 所 示 ， 接 着 在 由 各 个 反应 分 子 所 提供 的 一 条 链 与 一 条 链 之 间 就 会 形成 具有 许多 碱 基 配 对 的 _Wastson-Crick 双 螺 旋 。 人 们 可 以 进一步 去 推测 已 在 许多 生 物 系统 中 人 工 形成 的 单 链 缺 口 会 引起 刺激 作用 ， 它 可 能 会 缩短 弱 相 互 作 用 的 DNA 分 子 在 解 离 之 前 遇见 自由 末端 并 形成 稳定 的 双 螺 旋 所 需要 的 时 间 。 这 种 刺激 作用 已 经 在 许多 种 生物 体系 中 有 记载 。 至 此 ,我 们 还 没有 谈 到 RecA 蛋白 怎样 参与 完成 所 有 这 些 过 程 的 。 原 因 很 简单 , 那 就 是 虽然 最 近 的 发 现 给 我 们 不 少 启示 , 但 我 们 还 并 不 知道 RecA 蛋白 究竟 是 怎样 完成 这 些 过 程 的 。 已 经 发 现在 一 定 的 条 件 下 , 单 链 DNA FEE DNA 分 子 和 RecA 蛋白 之 间 也 会 形成 弱 的 复合 体 , 甚至 当 两 种 DNA 分 子 之 间 没 有 同 源 性 时 也 会 形成 这 种 复合 体 。 这 暗示 出 , 当 两 种 DNA 分 子 之 间 有 同 源 性 的 时 候 ，RecA 蛋白 使 两 个 DNA 分 子 之 间 的 任何 区 域 发 生 相互 作用 ,然后 允许 这 些 分 子 作 前 后 移动 , 直到 遇见 同 源 区 为 止 。 图 18-22 RecBC 蛋白质 帮助 双 链 DNA 解 链 的 模型 。 "163 > RecBC 蛋白 RecBC 蛋白 是 一 种 多 功能 的 蛋白 质 。 它 具有 内 切 酶 活性 以 及 很 强 的 作用 于 单 、 双 链 DNA 的 外 切 酶 活性 。 由 于 首先 发 现 它 具有 外 切 酶 活性 ， 所 以 这 种 蛋白 又 称 作 核酸 外 切 i V ,在 一 定 的 实验 条 件 下 可 以 抑制 其 核酸 酶 活性 ,这 时 这 种 酶 就 表现 出 使 双 链 DNA 解 旋 的 能 力 , 解 旋 的 同时 发 生 ATP 水 解 。 当 这 种 核酸 酶 活力 被 抑制 的 时 候 , 使 DNA 发 生 解 旋 的 现象 是 不 寻常 的 , 像 图 18-22 RARER. MS DNA 分 子 的 一 端 结合 ， 使 DNA Whe. ERS DNA 的 一 条 链 移动 ,但 与 这 条 链 的 两 个 区 域 保 持 接触 ,使 这 条 链 的 未 端 罕 过 酶 ,这 样 就 形成 了 如 图 (b) 所 示 的 单 链 环 。 当 单 链 尾巴 的 长 度 不 断 增 加 时 ， 由 于 与 另 二 条 链 之 间 发 生 同 源 互 补 , 就 形成 了 如 〈c) 所 示 的 双 泡 结构 。 这 可 能 就 是 体内 产生 单 链 区 的 一 种 机 理 ， 而 不 可 能 是 以 下 的 那 种 为 recA 基因 所 介 导 的 配对 作用 提供 单 链 区 域 的 机 理 。 因 为 前 面 的 实验 看 来 暗示 出 RecA 蛋白 的 作用 已 先 于 RecBC 蛋白 的 作用 。 如 果 核 酸 酶 活性 未 被 抑制 ,那么 在 单 链 上 相距 几 千 个 核 背 酸 之 处 会 发 生 缺 刻 。RecBC 和 蛋白 也 能 5 DNA 聚合 酶 I 形成 复合 体 , 但 此 复合 体 的 性 质 还 不 清楚 。RecBC 酶 的 酶 活性 已 证 明 在 许多 同 源 重 组 的 模型 中 有 作用 ， 但 还 没有 实验 对 它 在 重组 作用 的 特殊 阶段 中 的 精确 作 用 作出 证 明 。 缺乏 重组 蛋白 体系 的 性 质 缺乏 重组 能 力 的 突变 细胞 有 一 种 另外 的 现象 ， 即 他 们 对 自己 的 DNA 损伤 过 & 敏 Ro Pilon, recA” 或 recBC” 的 细菌 都 可 能 被 大 大 低 于 正常 细胞 trec* 细胞 ) 致 死 量 的 紫 IRAP AK recA 突变 的 数据 可 在 第 九 章 的 图 9-10 中 看 到 。 敏 感 的 主要 原因 是 ,在 recA ”或 recBC 细胞 中 缺乏 一 种 主要 的 修复 途径 一 一 重组 修复 。 recA ”细胞 的 DNA 是 不 稳定 的 一 一 它们 不 断 地 被 降解 而 又 不 断 地 重新 合成 , AR 外 线 照 射 后 的 最 显著 的 特点 就 是 -DNA RMB; 然后 ， 一 半 以 上 的 细菌 DNA 再 被 RecBC 酶 促 降 解 成 短 的 核 彰 酸 片段 。 这 种 猛烈 的 降解 称 作 粗 率 〈reckless) WR. recA” 细胞 的 另 一 个 特征 就 是 它们 比 fecA+ 细胞 生长 得 慢 ， 这 表明 它 还 有 其 他 缺陷 ， 但 人 们 还 不 了 解 它 的 大 部 分 缺陷 。rec+ 大 肠 杆菌 在 丰富 的 培养 基 中 ,于 37°C 下 大 约 25 分 钟 就 分 裂 一 次 上 粗 比 之 下 ,典型 的 recA- 突变 体 细 菌 则 需 40 一 60 分 钟 。 生 长 慢 的 一 个 原因 可 能 是 由 于 粗 率 降 解 现象 。 而 recBC” 在 生长 中 表现 的 缺陷 更 是 极端 严重 ， 它 需要 100—200 分 钟 才能 分 裂 一 次 。 这 些 生长 缺陷 无 疑 地 是 由 许多 过 程 造成 的 , 即 rec” 细 胞 中 有 许多 过 程 或 者 是 根本 不 起 作用 或 者 是 功能 性 的 效率 低下 。 在 吻 菌 体 体 系 中 ， 重 组 的 能 力 有 时 与 DNA 复制 有 关 。 Pi, ORR eK P22 含有 一 个 线性 DNA ,但 在 其 复制 之 前 必须 环 化 。P22DNA 分 子 不 含有 互补 的 单 链 末端 ， 但 它 是 未 端 元 余 的 。 宛 余 未 端 序列 之 间 的 重组 使 得 DNA 分 子 环 化 。 这 4 反应 由 P22 的 erf 基因 催化 ,而 erf ”的 琥珀 突变 噬菌体 又 不 能 生长 在 那些 缺乏 琥 珀 校正 子 (amber suppresor) 的 recA ”宿主 细胞 中 。 大 肠 杆菌 1 噬菌体 是 一 个 典型 的 例子 , 它 的 一 些 重组 基因 起 着 生命 依 关 的 作用 ,虽然 还 不 完全 清楚 这 些 基因 的 主要 功能 是 否 就 是 关系 到 重组 作用 。 例 如 red MAK, EE 。164 。 ——— ———— er rl TC —_ frecA- fH =EAH Hah AR REPS HE BEA AFR Eo Ared™ WARES IA RRA TIA REA TK, (He, 在 受 它 感 染 的 recA+ 宿主 细胞 或 recA™ 宿主 细胞 中 ， red” WREATHS RM A A 数量 只 是 那些 受 redt 鸣 菌 体感 染 的 细胞 中 产生 的 子 代 史 菌 体 数量 的 一 半 。 因 此 重组 作 用 (或 者 至 少 是 1 的 red 基因 的 功能 ) 对 于 产生 大 约 50% 子 代 喉 菌 体 是 必需 的 。 ANA 一 个 叫做 gam 的 基因 的 作用 主要 是 在 感染 早期 使 宿主 的 RecBC 蛋白 失 活 。red gam WE 菌 体 比 red+ gam- 吧 菌 体 的 生长 能 力 更 差 。 如 果 宿 主 是 RecA” 型 的 细菌 ,那么 red gam™ 鸣 菌 体感 染 它 后 根本 就 不 能 产生 子 代 。 但 是 宿主 同时 又 是 RecBC- 的 时 候 , 产 生子 代 的 能 力 就 能 得 到 恢复 ,这 就 说 明 有 活性 的 RecBC 蛋白 的 功能 是 破坏 INRA. Ak, 当 有 功 能 的 red 基因 的 产物 与 无 活性 的 RecBC 蛋白 同时 存在 时 ，1 能 生长 得 更 好 些 。 我 们 并 不 想 阐 明 这 个 非常 复杂 的 现象 〈 已 有 许多 模型 ， 但 都 不 很 适当 )， 只 是 要 指出 :这些 突 变 作 用 中 的 每 一 种 (redr- 、gam- 以 及 recA-) 都 以 某 些 方式 使 DNA 合成 发 生 失 常 。 例 如 , 当 用 red- 突变 体 去 感染 大 肠 杆 菌 时 ， 在 感染 周期 完成 之 前 , 1 的 DNA 复制 就 BK. 关闭 。 当 用 Mred-gam- 去 感染 recA” (HAIN, 1 EAA DNA 滚动 环 复 制 受到 严重 损害 ， 同 时 也 发 现 有 一 些 不 正常 的 复制 产品 。 关 于 这 些 复 制 产 品 的 结构 细节 以 及 缺 少 的 那些 分 子 的 细节 都 还 不 清楚 ,但 有 一 点 是 清楚 的 , 那 就 是 除了 对 遗传 记号 进行 重组 之 Sp, 2 中 的 这 些 重 组 基因 还 有 其 他 的 功能 。 大 肠 杆 菌 的 其 他 重组 体系 前 面 我 们 已 经 提 到 ,大 肠 杆菌 有 几 种 同 源 重组 的 途径 ,每 一 种 途径 都 需要 RecA 蛋 白 ， .出 才 讨论 的 那 种 还 需要 RecBC RAMA Hfr 的 细胞 与 recBC ”型 的 F ”的 细胞 进行 杂交 时 ,可 以 证 明 还 存在 有 其 他 的 重组 途径 。 如 果 F- 细胞 是 recA-， 重 组 频率 就 下 降 104 倍 ， 而 如 果 F- 细胞 是 recA+ recBC- ， 重 组 率 只 下 降 100 倍 。 在 recBC- 的 细胞 中 发 生 的 重组 依赖 于 几 个 基因 ; 研究 得 最 清楚 也 最 重要 的 是 recE 与 recF 基因 (下 面 的 讨论 很 复杂 ,需要 经 常 地 参考 表 18-2 和 图 18-23， 初 学 者 则 可 中 过 本 段 看 下 一 章 )。 在 正常 细胞 中 RecF 途径 效率 极 低 ,基本 上 被 核酸 外 切 酶 工 抑制 ; 外 切 酶 工 是 由 sbc 基因 合成 的 图 18-23 说 明了 这 个 现象 , 据 认 为 其 过 程 如 下 : 在 通过 RecBC 途径 形成 重组 子 时 ,一 个 重要 的 中 间 物 “Y” 被 RecBC 蛋白 变 成 重组 子 。 这 个 转变 也 许可 以 分 为 几 个 步 又。 可 以 表 18-2 几 种 大 肠 杆 菌 突 变 体 的 重组 能 手 基 因 组 是 重组 能 手 吗 ? 活性 体系 recA- 不 是 没有 TecBC- 不 是 没有 sbcB- 是 RecBC TecBC-sbcB- 是 RecF — beGBO- feck 不 是 wa recBC-sbcA- 是 RecE,RecF recBC-sbcA-recE- 不 是 没有 © 165+ DNA ‘ins lL. recBC+ i Ge (x) = Eel —-(y) RecBC 体系 是 有 活性 的 1 ‘ x Cpe Ac 组 作用 是 正常 的 Exo vin, a Exo Vill | ; a4 Exo vill,” 2 Exo Vill 2) : ga tgs ay @----@®—-® Ore Obie @)<— (Ft) rect \, Me ty Race il. recBC~ — Ill. reeBC~ sbcB~ (Exo IT-) - IV.recBC~ sbcA7(E 仅仅 RecF 体系 是 有 RecF 活性 强 ; 重 组 作用 是 正常 的 RecF 活性 强 ; ah 活性 的 ,但 是 微弱 的 fait cs 18-23 GRABARAHARZENRN, 长 虚线 箭头 表示 很 弱 的 反应 。 问号 表示 对 相应 于 这 一 步 反 应 的 酶 尚 不 了 解 。 通过 非 专 一 性 的 途径 形成 了 或 由 sbcB 产物 将 和 转变 成 Y。 因 此 ,recBC- sbcB+ 突变 体 的 重组 活性 只 相当 于 野生 型 的 重组 活性 的 1%, AX RecBC 途径 不 起 作用 。RecF RE 需要 中 间 物 Z,Z 可 以 由 X 通 过 非 专 一 性 途径 转变 而 成 。 只 要 外 切 酶 I 具有 活性 ， 大 部 分 入 被 转变 成 Y， 少 部 分 和 形成 很 少 的 Z 去 参与 RecF 途径 ， 很 低 的 重组 频率 1%) 反映 了 由 民 转 变 成 的 少量 的 乙 所 参与 的 RecF 蛋白 的 活性 。 由 于 recBC shcB ik spy 酶 活性 ， 广 就 不 可 能 转变 成 了 了， 全 都 变 成 Z。 所 以 recBC sbcB- 突变 体 表 现 出 正常 的 RecF 重组 途径 。 中 间 物 Z 也 可 利用 外 DW BS VIL 来 形成 ,这 个 酶 是 recE 基因 的 产物 > recE 基因 的 活性 能 被 sbcA 基因 抑制 。 因此 ,sbcA- sbcB+ recBC- 突变 体 也 可 以 表现 出 正常 的 重组 率 ， 这 是 因为 Z 可 以 通过 外 切 酶 VIII 的 作用 直接 形成 ,而 不 必 来 自 于 X; 这 时 的 _RecF 途径 是 有 全 部 活性 的 途径 。 当然 ，sbcA- recE- sbcB+ recBC 突变 体 是 重 组 缺陷 型 的 突变 体 ( 又 是 只 有 1% 重组 率 ),， 这 是 因为 在 外 切 酶 工 存在 下 , X 很 少 转变 成 Zo 如果 recF 的 活性 也 被 除去 了 ， 就 不 再 有 重组 途径 ， 因 此 ，recBC” ”recF” 5 recA 一 样 ， 完 全 是 缺陷 型 的 ， 重 组 率 极 低 。 这 个 体系 及 其 相互 作用 见 图 18-23 所 示 ， 都 很 复 杂 。 然 而 这 里 还 有 更 多 的 几 个 rec HA CM recJ 到 recM) 未 表示 出 来 。recJ 到 recM 基因 的 产物 与 前 面 所 提 到 的 基因 的 产物 之 间 的 关系 还 不 清楚 。 ae Alberts, B., and C. F. Fox (eds.) 1980. Mechanistic Studies of DNA Replication and Recombination Vol. 19- ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology. Academic Press. Cunningham, R. P. T. Shibata, C. Das Gupta, and C. M. Radding 1979. “Single strands induce RecA protein to * 166° unwind duplex DNA for homologous pairing.” Nature, 281, 191—195. Eisenstark, A., 1977. “Genetic recombination in bacteria.” Ann. Rev. Genetics, 11, 369—396. Fox, M. S. 1978. “Some features of genetic recombination in procaryotes.” Ann. Rev. Genetics, 12, 47—-68. Holliday, R. 1964. “A mechanism for gene conversion in fungi.” Genet. Res. 5, 282—304. Hotchkiss, R. D. 1974. “Models of general recombination.’ Ann, Rev. Microbiol, 28, 445—468. Lacks, S. 1962. “Molecular fate of DNA in genetic trans ormation in Pneumococcus.” J. Mol. Biol. 5, 119—131- McEntee, K., G. M. Weinstock, and I. R. Lehman. 1979. “Initiation of genetic recombination catalyzed in vitro "by the RecA protein of E, colli.” Proc. Nat. Acad. 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Sci.. 76, 3641—3645. © 167 。 BLE ”遗传 物质 重 排 与 交换 机 理 CUI) Ri aA + 在 前 一 章 我 们 讨论 了 能 在 同 源 DNA 序列 发 生 交换 的 重组 体系 的 性 质 。 在 细菌 中 ， 这 种 形式 的 交换 依赖 于 recA 基因 产物 或 其 等 效 物 。 在 第 十 六 章 我 们 讨论 了 依靠 处 于 同 源 序列 两 责 的 伸展 的 非 同 源 性 识别 序列 而 进行 的 短 的 同 源 区 域 的 交换 作用 ; 这 些 交 换 作 用 要 利用 位 点 专 一 的 重组 酶 ,例如 ? 噬菌体 的 整合 酶 。 在 这 一 章 中 ,我 们 将 讨论 另 一 种 重 组 类 型 ， 叫 作 转 位 〈transposition)。 在 这 个 过 程 中 经 常 可 检测 到 出 现 的 一 段 称 为 可 转 位 因子 〈transposable element) 的 线形 DNA 片段 。 这 种 可 转 位 因子 本 来 就 存在 于 细胞 中 ， 而 且 可 在 同一 细胞 的 DNA 分 子 上 的 一 个 第 二 位 点 上 上。 可 转 位 因子 这 个 新 的 插 和 人 位 点 是 一 段 与 可 转 位 因子 没有 同 源 性 的 碱 基 序 列 , 而 且 这 个 插 人 过 程 不 依赖 于 细菌 recA 基因 。 在 早期 的 研究 中 ， 人 们 认为 出 现 的 可 转 位 因子 可 以 从 一 个 位 点 移动 或 转 位 到 另 一 个 位 点 上 。 因 此 将 这 个 过 程 称 作 转 位 。 但 是 后 来 发 现 这 个 命名 是 错误 的 ,因为 在 转 位 的 过 程 中 ， 可 转 位 因子 的 一 个 拷贝 仍 留 在 原来 的 位 点 上 ,同时 在 新 位 点 上 出 现 第 二 个 拷贝 因此 转 位 与 同 源 重组 不 同 , 转 位 过 程 必须 进行 DNA 复制 ,更 进一步 ， 这 种 重组 的 唯一 可 能 的 后 果 . 就 是 可 转 位 因子 的 移动 。 与 同 源 重 组 不 同 , 转 位 作用 通 营 是 低频 发 生 的 。 但 它 仍然 是 很 有 意义 的 ,这 不 仅 是 因 为 它 能 说 明 在 细菌 中 发 现 的 许多 基因 缺失 与 基因 倒转 现象 ， 而 且 对 研究 人 员 来 说 它 是 创 造 突变 体 的 很 有 价值 的 方法 。 el eres 可 转 位 因子 通常 也 被 称 作 转 座 子 (transposons), B—-HRETBPAAT RAN mM BEA ,特别 是 那些 抗生素 的 抗 性 基因 。 由 于 历史 的 原因 ,许多 转 座 子 用 后 面 跟 着 一 个 数 字 的 简略 符号 Tn 来 表示 《如 Tn5)。 这 个 数目 是 为 了 与 其 他 转 座 子 区 别 。 按 国际 的 标 准 ,一 个 新 发 现 的 细菌 的 转 座 子 ,即使 它 不 带 有 标记 基因 ， 也 应 以 这 种 方式 命名 。 当 我 位 需要 涉及 到 转 座 子 携带 的 基因 时 ,可 以 用 标准 的 基因 型 表示 方法 来 表示 。 如 Tnl(amp*), 其 中 amp+ 表示 转 座 子 带 有 对 氮 共 青霉素 的 抗 性 基因 。 最 初 发 现 的 转 座 子 不 含有 任何 已 知 的 宿主 基因 ; 由 于 这 个 历史 原因 , 又 把 它们 称 作 插 人 序列 Cinsertion sequences) 或 称 Ye IS Al CIS element), FA 1S1 或 IS2 等 来 表示 。 有 时 ， 转 座 子 也 用 不 甚 标准 的 方法 来 表示 ,如 了 质粒 中 的 转 座 子 就 表示 成 Y5。 对 于 真 核 系统 中 的 转 座 子 还 没有 一 个 统 一 的 系统 命名 , 果 蝇 中 的 一 个 转 座 子 称 为 copia， 另 一 个 叫做 497, 等 等 。 某 个 转 座 子 常常 被 定位 到 一 个 特定 基因 中 ,这样 就 形成 了 这 个 基因 的 突变 型 。 用 标 准 命名 法 对 这 些 突变 可 给 以 编号 。 下 面 的 命名 法 用 来 表示 由 Tot 产生 的 galT 基因 的 135 号 突变 : *。168。 galT135::Tn4 注意 使 用 了 两 个 冒号 。 IS jE Bl 1967 年 ， 人 们 第 一 次 观察 到 的 可 转 位 因子 就 是 IS 序列 。 发 现 IS 序列 的 过 程 十 分 有 趣 。 现 在 已 经 知道 IS 序列 只 是 转 座 子 的 一 种 ,然而 可 以 很 容易 地 通过 对 IS 序列 这 个 特殊 类 别 进行 仔细 观察 ， 而 看 到 转 座 子 的 某 些 极为 重要 的 性 质 和 各 种 各 样 的 检测 转 座 子 存在 的 方法 。 ; IS 序列 的 发 现 人 们 在 分 离 大 肠 杆 菌 的 gal 操纵 子 和 lac 操纵 子 等 一 类 高 度 极 性 的 突变 株 时 ,首次 RAT IS 序列 。 gal 和 lac 突变 都 位 于 操纵 子 的 第 一 个 结构 基因 中 ， 突 变 点 下 游 不 能 产生 所 编码 的 蛋白 产物 了 。 但 是 如 果 这 个 细菌 含有 rho (ts) 突变 〈 生 长 对 温度 敏 感 的 突变 )， 那 么 这 种 极 性 突变 就 可 以 被 抵 销 。 很 显然 ， 极 性 突变 依赖 于 Rho 蛋白 的 终止 序列 的 存在 。 这 些 极 性 突变 的 另 一 个 特点 就 是 它们 不 能 被 碱 基 类 似 物 或 移 码 突变 逆 转 成 野生 型 ， 因 此 ， 极 性 突变 不 可 能 是 由 于 碱 基 突 变 造成 的 。 对 含有 极 性 突变 的 质粒 进 行 物 理 图 谱 分 析 , 表明 极 性 突变 的 操纵 子 中 含有 一 段 插入 的 DNA 片段 。 在 帮 个 噬菌体 At Cy I4 和 2), 明 显 的 插 人 作用 是 由 于 复制 错误 造成 的 。 复 制 错 误 产 生 了 碱 基 序列 的 串联 复制 s 但 是 几 个 方面 的 证 据 证 明 插 人 的 片段 并 不 是 简单 地 由 邻近 序列 的 复制 所 形 成 的 。 因 此 ,这 段 插 人 序列 的 来 源 还 不 完全 清楚 。 有 假说 认为 ,它们 是 能 从 一 个 染色 体 上 转移 到 另 一 个 染色 体 上 的 可 移动 的 序列 。 下 面 将 简单 地 说 明 它 们 的 可 移动 性 。 IS DNA 的 大 小 及 性 质 用 电子 显微镜 观察 携带 着 上 面 介绍 的 极 性 突变 的 特 化 的 转 导 噬菌体 颗粒 。 将 从 携带 着 突变 的 转 导 颗粒 中 提取 出 来 的 DNA 与 从 没有 突变 的 转 导 颗粒 中 提取 出 来 的 DNA 进 - 行 分 子 杂 交 ,杂交 后 出 现 一 个 泡 〈 见 图 19-1)， 这 个 泡 表 明 该 突变 是 由 一 个 长 度 相等 于 一 个 泡 的 插入 片段 引起 的 。 比 较 不 同 的 含有 极 性 突变 的 转 导 颗粒 ,指出 一 个 颗粒 的 DNA 移 可 以 和 另 一 个 颗粒 的 DNA 泡 杂 交 , 这 表明 在 每 一 个 突变 了 的 位 点 中 存在 着 相同 的 序 正常 的 转 导 DNA 突变 的 转 导 DNA 19-1 示 出 IS 序列 是 一 段 插 入 DNA 片段 的 杂交 实验 。 在 复 性 后 )* 有 一 半 的 分 子 已 再 度 形 成 正常 的 和 突变 的 转 导 分 子 《〈 图 中 仅 示 出 杂交 双 链 分 子 )。 ”169 e 列 。 从 插 人 了 IS 因子 的 大 肠 杆菌 染色 体 的 各 个 区 域 提取 得 到 许多 基因 ,把 它们 转 到 鸣 菌 体 的 转 导 颗粒 上 ;又 将 插 人 序列 引 和 人 到 某 些 质粒 上 。 通 过 对 含有 上 述 基 因 的 大 量 的 转 导 颗 . 粒 以 及 含有 插入 序列 的 质粒 进行 研究 ,发 现 有 好 几 种 不 同 的 IS 因子 。 这 些 因 子 中 的 某 一 些 已 经 从 转 导 颗粒 的 DNA 中 分 离 出 来 , 并 测定 了 它们 的 碱 基 序列 。 那 些 能 产生 极 性 突 变 的 片段 都 含有 依赖 于 Rho 的 转录 终止 信号 (不 包括 1S1 的 ), 并 在 所 有 可 能 的 阅读 框架 中 都 含有 链 终 正 突变 信号 ， 这 就 说 明了 极 性 一 EH, HIS FRR INE BRM TCAG CTGA 是 观察 到 此 因子 的 末端 有 倒转 重复 序列 《 见 < 一 图 19-2)。 这 些 倒 转 重复 序列 长 度 为 16 一 41 图 19-2 DNA 分 子 中 末端 倒转 重复 的 一 个 例 碱 基 对 ;具体 究竟 多 长 取决 于 转 座 子 。 在 许多 RCIOARER FEL. Aeammae «OC RCCL FFEREY gal 操纵 子 中 )， 揪 重复 的 情况 下 ， 上 面 一 条 链 中 的 DNA 序列 和 序列 既 可 以 按 左 一 右 ， 也 可 以 按 右 一 左 的 scale MM I NC 方向 指 到 插 人 位 点 上 。 人 们 可 能 认为 这 样 的 情况 发 生 在 所 有 的 插入 位 点 上 ,因为 倒转 重复 序列 是 对 称 的 ; 但是， 实际 上 还 观察 到 存在 着 许多 只 能 按 一 个 方向 插 人 的 位 点 .少数 IS 因子 的 某 些 更 为 重要 的 性 质 列 于 表 19-1 中 。 表 19-1 某 些 大 肠 杆菌 插入 因子 的 性 质 A OF MERBAR “ 大 小 碱 基 对 碱 基 序列 数据 IS1 染色 体 中 5 一 8 个 768 完全 的 IS2 染色 体 中 5 个 1327 ER FE 中 1 个 IS3 染色 体 中 5 个 约 1400 几乎 完全 的 FE 中 1 个 1S4 染色 体 中 1 一 2 个 约 1400 仅仅 有 未 端的 IS5 不 清楚 1 250 仅仅 有 末端 的 7r0 染色 体 1 个 或 多 个 5700 ， 仅仅 有 末端 的 Frit IS 序列 在 大 肠 杆 菌 DNA 1-H ae DNA 中 的 位 置 在 前 一 节 中 我 们 暗示 ;引起 极 性 插 人 的 IS 序列 是 来 自 细菌 ,事实 上 , 像 表 19-1 指出 的 那样 ， 确 实 如 此 。 大 肠 杆 菌 DNA 上 存在 着 许多 个 1S 序列 的 拷贝 。 通 过 杂交 试验 测 出 了 每 个 IS 序列 的 拷贝 数 。 它 们 在 大 肠 杆 菌 染 色 体 中 的 位 置 已 经 通过 电子 显微镜 检查 得 到 确定 。 人 们 从 质粒 或 带 有 大 肠 杆菌 染色 体 特 殊 区 域 的 特 化 的 转 导 鸣 菌 体 中 提取 到 DNA, 再 用 电镜 观察 那些 自我 退火 的 大 肠 杆菌 DNA 双 链 或 大 肠 杆菌 DNA 与 质粒 DNA 及 与 转 导 噬菌体 DNA 杂交 的 双 链 ,确定 了 IS 序列 的 所 在 位 置 。 例 如 ,有 两 个 IS 序列 位 于 一 个 arg 基因 的 两 侧 。 电 镜 观 察 表明 质粒 也 含有 IS 序列 ,如 IS2,1S3 和 75 就 存在 于 F 因子 中 ， 而 且 位 于 下 因子 整合 到 大 肠 杆 菌 染 色 体 形成 Hi 的 位 点 上 (LA 17-11 和 17-12, 第 十 七 章 )。 而 且 , 在 一 些 R 质粒 中 也 有 IS 序列 ,它们 位 于 抗 药性 基因 与 那些 负 责 复 制 及 结合 转移 (conjugal transfer) 基 因 ( 图 17-15) 之 间 的 区 域 的 边缘 。 在 质粒 中 的 这 些 位 点 的 重要 性 将 在 以 后 讨论 。 s。 170。 IS 序列 也 存在 于 大 肠 杆菌 的 几 种 噬菌体 中 ， 例 如 IS] sem Pl 的 一 个 正常 组 成 部 分 ; 在 1 噬菌体 的 一 些 特 殊 的 突变 株 中 也 有 IS， 而 且 这 些 各 种 各 样 的 IS 序列 已 被 定位 。 在 不 同 的 生物 中 还 发 现 了 一 些 引 人 注意 的 与 之 相 匹配 的 序列 ,例如 * 有 一 个 在 IS1 序列 两 端的 十 二 核 昔 酸 序列 , 它 与 1 前 噬菌体 整合 位 点 的 十 二 核 彰 酸 序列 相同 ;并 且 发 现 IS] 的 靠近 未 端 处 的 序列 ， 类 似 于 ,2 的 左 向 启动 子 @L) 和 tRNA™ 的 启动 子 的 序列 。 以 上 这 些 发 现 的 重要 性 现在 还 不 很 清楚 。 Fann yee... 于 IS 序列 是 转 座 子 的 一 种 特殊 种 类 ,在 这 部 分 中 ， 我 们 将 讨论 转 座 子 更 多 的 一 般 特 性 以 及 它们 被 发 现 的 过 程 。 转 座 子 的 发 现 在 前 一 节 中 ， 我 们 介绍 了 由 于 IS 因子 在 基因 上 产生 的 极 性 效应 而 使 我 们 能 够 用 生 物 学 方法 正常 地 检测 到 它们 。 但 是 对 于 典型 的 细菌 转 座 子 并 不 经 常 使 用 那些 方法 。 因 为 转 座 子 经 常 含 有 可 识别 的 细菌 基因 ,例如 ,对 抗菌 素 的 抗 性 基因 ， 通 常 通过 这 些 基因 我 们 就 可 以 更 简便 地 检测 到 转 座 子 的 存在 。 我 们 将 讨论 两 个 例子 ,如 图 19-3 和 19-4 所 示 。 . 噬菌体 “ee 产生 噬菌体 ae 物 Cros AEH amp+ 转 座 子 awit _.. URVBIE te gill . Tens 6 ma BS .在 含有 氨 某 青霉素 的 培 养 基 中 ， 以 低 的 感染 倍数 用 第 一 代 裂 解 物 去 感染 47zzb -细菌 所 有 的 携带 着 amp+ BF OF ime Bt & ae ME HA we Am DH, 防止 噬菌体 生长 和 细胞 死亡 。 细 胞 ES ARE RRL CO) | 含有 转 座 子 的 Amp+ 细 菌 19-3 证 明 转 座 作 用 的 实验 。 用 虚线 表示 转 座 子 , 细 节 见 正文 。 图 19-3 描 “ 述 了 检测 转 座 子 的 过 程 。 用 温和 鸣 菌 体 去 感染 一 种 同时 又 带 有 amp+ WR 质粒 的 recA” 细菌 ,而 且 这 个 amp+ 基因 位 于 转 座 子 上 。 这 样 ， MAAR KE ampt 基因 。 在 这 个 实验 中 运用 recA” 细菌 是 为 了 消除 一 切 同 源 重 组 的 可 能 。 在 这 个 实验 中 ， ° 171° kan+ HEF RE ampt 转 座 子 Amp+ kan+ 细 胞 CoeCO)- re No oe 从 染色 体 到 R 的 结合 转 座 作 用 具有 kant (> 转 座 子 的 质粒 与 Amp-Kan-R 细胞 交配 ， 然后 涂 布 于 含有 氨 茶 青霉素 和 卡 那 才 素 的 培养 基 上 ， 从 而 选 择 Amp+ Kan+ R 人 -细胞 Amp+ Kan+ Rf 细 胞 图 19-4 “证明 转 座 作用 的 实验 。 含有 amp+ 了 质粒 的 供 体 菌 将 质粒 转移 到 含有 kant 转 座 于 的 受 体 菌 中 去 。 在 下 一 代 中 kant 转 座 子 又 转移 到 及 质 梓 上 。 有 质粒 一 次 可 以 转移 ampt 5 kant 两 种 抗 药性 基因 的 现象 , 证 实 了 质粒 上 存在 着 第 二 个 了 质粒 。 用 amp+ 基因 表示 整个 转 座 子 就 像 大 部 分 的 抗 药性 决定 于 〈drug-resistante determinates)。 但 这 个 实验 对 于 证 明 转 座 作用 并 不 是 必需 的 。 当 细 菌 被 噬菌体 感染 后 , 一 小 部 分 子 代 噬 菌 体 〈1/11077 就 含有 了 带 amp* 基因 的 转 座 子 。 将 得 到 的 喉 菌 体 以 叹 菌 体 :细菌 为 1:10 的 比率 去 感染 Amp” 的 细菌 ， 同 时 在 培养 基 中 加 入 氮 休 青霉素 。 培 养 亚 中 未 受 感染 的 细菌 〈 仍 是 Amp") 都 被 杀 死 。 更 重要 的 是 ,不 带 有 amp+ 基因 的 鸣 菌 体 所 感染 的 细菌 〈 也 仍 是 Amp” AY) 不 能 生长 繁殖 ,也 不 会 产生 子 RMA, ， 因 为 被 氨 休 青霉素 杀 死 了 。 但 是 ， 如 果 带 有 amp* 基因 的 喉 菌 体 去 感染 细菌 时 ， 细 菌 就 会 存活 下 来 ， 产 生 带 有 amp* 的 子 代 鸣 菌 体 。 这 样 , 在 有 氨 半 青霉素 存在 的 条 件 下 ， 只 有 带 有 amp* 转 座 子 的 1 MRA REA KR; 因此 受 感染 细菌 的 裂解 物 是 由 同 源 的 1amp* 噬菌体 群体 组 成 的 。 为 了 证 明 amp* 基因 是 转 座 子 的 一 个 部 分 ， 用 1amp+ 史 菌 体 去 感染 一 个 amp- recA ”的 1 溶 源 菌 。 由 于 溶 源 化 细菌 对 造成 溶 源 化 的 噬菌体 有 同 源 免疫 性 , 即 对 同 源 的 喉 菌 体 的 侵入 共有 抵抗 力 , 所 以 史 菌 体 不 能 发 育 扩 增 ,于 是 细菌 能 生存 下 去 。 然 后 将 被 感 染 的 细 著 涂 布 在 含有 氮 茜 青 堆 素 的 琼脂 培养 基 上 进行 培养 。 amp* 鸣 菌 体 使 细胞 仍然 能 够 生长 ,但 是 叹 菌 体 本 身 却 不 能 复制 (由 于 1 噬菌体 的 阻 遏 物 的 存在 ), 所 以 在 每 一 次 细胞 分 裂 周期 中 ， 子 代 细 胞 不 能 得 到 1 amp* 的 DNA 分 子 ， 因 此 细菌 也 不 能 形成 菌落 。 然 而 ， 在 少数 细菌 中 ,确实 发 生 转 座 作用 ,细菌 染色 体 获得 了 amp+ 转 座 子 。 因 此 ， 这 种 子 细胞 也 确实 都 获得 了 amp* 基因 。 于 是 可 以 见 到 细菌 菌落 的 形成 。 这 样 ， 通 过 能 够 形成 菌落 也 就 说 明 发 生 了 转 座 作用 。 注 意 , 这 样 产生 的 amp+ 细菌 能 被 正常 噬菌体 再 度 重 新 | 感染 ,产生 第 二 个 《 即 新 的 ) 噬菌体 的 群体 ,其 中 少数 带 有 转 座 子 。 人 们 可 以 利用 这 种 方法 来 产生 带 有 特殊 基因 的 突变 株 。 例 如 ， 一 个 转 座 子 可 以 插 到 | 。 172 。 4 1 | L ’ ac 基因 中 。 这 样 ， 如 果 上 图 的 最 后 阶段 用 的 amp~ 溶 源 菌 是 Lac+， 而 我 们 想 要 得 到 Lac ,那么 我 们 可 以 在 几 百 个 Amp+ 的 菌落 中 寻找 到 一 个 Amp+ Lact 的 菌落 。 这 个 工 作 可 以 通过 下 列 步 又 很 容易 地 做 到 ， 那 就 是 把 受 感染 的 细菌 培养 在 含有 乳糖 和 氨 葵 青 霉 素 的 \ 有 带 色 指示 剂 的 琼脂 培养 基 上 ; 通过 不 同 的 颜色 即 可 将 Lact 菌落 和 Lac 菌落 区 分 开 来 。 这 种 方法 是 用 来 制备 缺陷 型 突变 株 的 一 个 很 有 用 的 技术 。 因 为 用 这 种 方法 使 细 菌 中 产生 某 一 个 特定 基因 发 生 穴 变 的 抗 药 性 菌落 的 比例 要 高 于 用 大 部 分 突变 剂 诱导 产生 的 突变 型 细胞 的 比例 。 因为 编码 序列 中 插 人 了 转 座 子 , 所 以 ,如 此 形成 的 突变 当然 是 绝对 的 缺陷 型 突变 ,而 不 是 条 件 性 突变 。 在 图 19-4 中 所 示 的 第 二 个 实验 中 , 含 amp+ 转 座 子 的 R 质 粒 通过 结合 ,转移 到 含有 kant 转 座 子 的 recA” 受 体 菌 中 。 在 两 种 抗生素 都 存在 的 情况 下 继续 生长 ,偶然 会 发 生 转 座 作 用 ，R 质粒 带 有 两 种 抗 药 性 标记 及 两 个 转 座 子 〈 每 一 个 转 座 子 含有 一 种 抗 药性 基 ， 因 )。 通 过 结合 ,这 种 双 转 座 子 的 R 质粒 能 转 人 到 Kan- Amp- 细菌 中 , 并 生长 在 含有 双 抗生素 的 培养 基 上 ， 这 样 就 证 实 了 带 有 双 转 座 子 的 R 质粒 的 存在 。 如 果 需 要 的 话 ， 在 培 养 的 过 程 还 能 再 次 观察 到 转 座 作 用 ， 因 为 在 培养 很 多 世代 以 后 , 其 中 某 种 转 座 子 〈 例 如 ampt 转 座 子 ) 还 可 以 转 座 到 染色 体 上 。 如 果 这 种 情况 确实 发 生 了 ，, 那么 用 遗传 学 方法 从 细胞 中 移 去 质粒 《如 时 了 啶 疗法 acridine curing， 见 十 七 章 ) 后 ， 细胞 仍 保持 Amp+。 这 种 在 染色 体 与 R 质粒 以 及 在 两 个 抗 药性 质粒 之 间 的 转 座 作用 是 形成 一 些 具有 多 种 抗 药性 的 质粒 的 主要 途径 。 在 医院 里 ,对 受 感染 的 病人 施 给 药物 ， 有 时 会 遇 到 多 重 抗 药性 反应 ， 这 就 是 由 上 述 质粒 引起 的 。 在 图 19-3 与 图 19-4 所 示 的 实验 中 ， 含 有 两 种 抗 药性 的 唉 菌 体 或 质粒 可 以 与 原来 的 史 菌 体 或 质粒 杂交 ,并且 可 以 用 电镜 检验 。 从 图 19-1 中 我 们 可 以 看 到 一 些 泡 ， 这 些 泡 就 表明 存在 着 插 人 的 DNA 序列 。 转 座 子 插入 位 点 的 定位 当 发 生 转 座 作 用 时 ,通常 一 个 特殊 的 转 座 子 Tn 可 以 在 很 多 地 方 发 生 插 人 。 例 如 , 当 一 个 带 有 可 转 座 的 抗生素 抗 性 标记 的 噬菌体 去 侵 染 野 生 型 recA” 大肠 杆菌 时 ， 就 会 像 图 19-3 下 部 所 示 的 那样 ,人们 通过 检验 到 产生 了 抗 药性 细菌 而 检测 到 有 转 座 事 件 发 生 。 例 如 ， 在 被 感染 的 lact leu+ amp” ”细菌 培养 物 中 可 以 产生 出 lac ”amp*+ 或 leu amp* 的 突变 体 。 如 果 检 验 上 于 个 Amp+ 细菌 菌落 ,通过 测试 细菌 所 需要 的 营养 成 分 以 及 利用 某 种 糖 作为 碳 源 的 能 力 , 结 果 发 现在 大 部 分 带 有 大 转 座 子 的 菌落 内 ,几乎 任何 的 基因 都 会 发 生 突变 ;只 是 在 不 同 的 菌落 中 ,突变 的 基因 不 一 样 ， 所 有 突变 体 的 突变 基因 的 总 和 襄 括 了 大 肠 杆菌 的 所 有 基因 。 这 说 明 对 于 大 转 座 子 的 转 座 作 用 来 说 , 插 人 位 点 很 多 ,散布 在 整个 Ref bo (he. REF lim IS AF) 来 说 , 插 人 位 点 的 数目 则 看 来 似乎 是 有 限 的 。 另 有 一 个 类 似 的 实验 说 明 即 使 在 很 小 的 DNA 片段 (分 子 量 约 为 10 x 10 ) 中 ，, 转 座 子 的 插 和 人 位 点 也 是 很 多 的 。 例 如 ， 在 利用 P22 鸣 菌 体 做 的 实验 中 〈 如 图 19-3 上 半 部 分 所 示 )， 能 分 离 到 带 有 抗 药性 标记 的 、 许 多 不 同 的 P22 突变 体 。 为 了 确定 插 人 位 点 ， 先 从 这 些 噬 菌 体 中 分 离 出 DNA， 将 这 些 DNA 分 别 地 与 野生 型 P22 的 DNA 进行 杂 交 ， 然 后 再 在 电镜 下 观察 泡 〈loop) 的 位 置 (图 19-1)， 泡 说 明了 插 人 位 点 的 位 置 。 而 且 ks [ea G 与 ot A ANE AS 野生 型 P22DNA 杂交 5 一 IT ———— AN ee eee 遍 四 个 不 同 的 对 抗生素 有 抗 药性 的 用 电子 显微镜 噬菌体 的 DNA 分 子 看 到 的 分 子 19-5 说 明 特 定 转 座 子 可 插 和 人 到 P22 DNA 的 不 同位 点 上 的 一 个 实验 。 如 图 19-5 所 示 ,在 许多 位 点 上 都 可 发 现存 在 着 泡 状 结构 。 虽然 已 经 确定 在 P22 与 1 中 必定 有 许多 插 人 位 点 ,但 是 很 显然 ,这 些 位 点 也 并 不 是 随机 分 布 的 。 有 一 些 是 不 易 被 插 和 人 的， 而 另 一 个 则 可 重复 地 使 用 《这 些 位 点 被 称 为 热点 hot spots)o 检验 已 知 序 列 的 很 小 区 域 中 的 插 人 位 点 就 可 以 看 到 上 述 现象 。 这 种 研究 表明 从 一 个 转 座 子 到 另 一 个 转 座 子 的 插 和 人 作用 专 一 性 的 范围 很 宽 。 一 个 极端 的 例子 就 是 IS4， 人 们 观察 到 它 在 - gal T 基因 中 的 20 个 独立 的 插 人 事件 ,所 有 这 些 插 人 事件 多 半 是 插 到 具有 同样 的 核 背 酸 序列 的 位 点 上 。 另 一 个 极端 的 例子 是 Mu 鸣 菌 体 ， Mu 几乎 能 在 任 . 何 地 方 插入 ， 这 将 在 以 后 再 讨论 。 大 多 数 转 座 子 显示 的 插 人 作用 专 一 性 则 是 介 于 上 述 两 个 极端 例子 之 间 。 例 如 ， 转 座 子 Tn9 在 lac Z 基因 的 最 后 160 碱 基 对 中 的 插 人 位 点 的 序列 已 经 测 出 ;总 共有 28 种 揪 人 作用 ,插入 位 点 则 有 16 个 ， 其 中 5 个 是 多 次 发 生 插 人 的 地 方 。 转 座 子 Tn 10 更 特别 , 人 们 已 注意 到 它 在 鼠 伤寒 沙门 氏 杆 菌 的 his 操纵 子 中 有 22 个 不 同 的 播 人 位 点 ,但 是 已 知 的 转 座 作用 约 有 40 匈 都 发 生 在 同一 个 核 音 酸 序列 的 位 置 上 。 对 于 引起 插入 的 热点 则 知道 得 还 很 少 。 转 座 子 的 类 型 . 转 座 子 可 以 分 成 三 种 类 型 : C1) IS 序列 以 及 含 IS 的 转 座 子 ;(2) Tn3 类 ;(3) Mu WEA KERMA PEM: 1. IS 序列 和 复合 式 转 座 子 。 已 讨论 的 IS 序列 为 长 度 750 一 1 500 碱 基 对 的 DNA 小 片段 ( 见 表 19-1)。 遗传 学 分 析 以 及 对 碱 基 序列 中 起 始 密码 与 终止 密码 的 鉴定 指出 IS 序 列 至 少 编码 一 种 蛋白 质 ， 而 这 种 蛋白 质 对 于 转 座 作 用 是 必 不 可 少 的 。 一 些 IS 序列 还 能 编码 第 二 种 蛋白 质 , 这 种 蛋白 质 很 可 能 起 着 调节 作用 。 一 种 携带 着 一 些 抗 药性 基因 的 转 座 子 的 变种 ， 是 由 那 种 两 翼 具 有 两 个 相同 的 或 近乎 相同 的 IS 序列 拷贝 的 可 转移 因子 所 组 成 ， 其 中 的 抗 药性 基因 本 身 也 是 其 他 转 座 子 的 组 成 成 分 。 这 些 转 座 子 被 称 为 复合 式 (composite) 类 型 I 转 座 子 。 在 这 些 复 合式 转 座 子 单位 中 的 Is 序列 可 以 是 倒转 重复 的 构 型 ,也 可 以 是 正 向 重复 的 构 型 (图 19-6). AA IS 的 两 个 未 端 是 它们 本 身 的 倒转 重复 ， 所 以 复合 式 转 座 子 的 两 愤 的 相对 方向 ( 反 辐 或 正 向 ) 并 不 改变 它们 的 末端 序列 ; 也 就 是 说 ， 在 倒转 重复 的 排列 中 它们 仍然 保持 着 相同 的 序列 。 ?174。 倒转 重复 re << = oe ES RE == we tr t isi Be 对 抗生素 有 -1S1 抗 性 的 片段 正 向 重复 oe ee = ET Bd = oe a Ne ped ISsi—> isi 一 ~ 19-6 两 侧 带 有 倒转 重复 或 正 向 重复 的 SI1 序列 的 两 个 复合 式 类 型 I REF. 在 大 多 数 情 况 下 , 转 座 子 的 转 座 能 力 是 由 IS 序列 决定 并 调节 的 ， 表 19-2 列 出 了 几 种 经 过 较 详 细 研 究 的 复合 式 转 座 子 和 它们 的 一 些 性 质 。 表 19-2 大 肠 杆菌 的 几 种 复合 式 类 型 | 转 座 子 的 性 质 末端 的 IS 因子 及 其 | 末端 的 IS 因子 的 相 A 于 Ady Cbp) 关 方 向 Tn5 (1500) Rw Tn9 (768) « 正 向 Tnl0 (1 400) Ria Tn204 cam,fus (768) 正 向 Tn903 kan (1050) RA Tn1681 ent (768) 反 向 * cam, ABA; ent. HMBR; tus, MHWM; kan， 卡 那 霉 素 ; tet， 四 环 素 。 绝 大 多 数 复合 式 类 型 工 转 座 子 是 在 它 由 一 个 质粒 转 座 到 另 一 个 质粒 时 或 转 座 到 喉 菌 体 时 首次 作为 遗传 因子 而 被 观察 到 的 。 当 这 些 质粒 DNA 被 变性 ， 然 后 再 复 性 时 ， 在 电 简 下 观察 到 带 有 柄 与 泡 结构 的 单 链 环 。 如 图 19-7 所 示 ， 这 样 的 形状 表明 倒转 重复 序列 的 存在 。 用 这 些 质粒 与 其 他 已 经 带 有 已 知 IS 序列 〈 例 如 IS1) 的 分 子 进 行 杂交 分 析 指出 ， 其 中 有 一 些 质粒 确实 含有 IS 序列 。 用 这 种 方法 说 明了 Tn9 ( 表 19-2) SHITE 倒转 重复 的 1S1 序列 。 其 他 的 不 具有 能 与 已 知 IS 因子 杂交 的 序列 的 质粒 ， 由 于 其 柄 与 泡 结 构 中 的 柄 差不多 都 一 样 大 ， 所 以 人 们 设想 这 些 转 座 子 可 能 也 有 由 尚未 鉴定 的 IS 因子 所 组 成 的 两 村 。 在 退火 之 后 也 可 能 见 到 双 链 环 。 这 些 双 链 环 中 含有 由 DNA 中 的 同一 位 点 而 产生 的 两 个 柄 与 泡 结构 , 这 种 _DNA 也 是 由 倒转 重复 序列 组 成 的 。 另 外 的 杂交 实验 表明 ,还 有 一 些 含 已 知 IS 序列 的 质粒 并 不 形成 柄 与 泡 的 结构 。 事实 证 明 其 中 HIS 序列 是 正 向 重复 的 。 2. Tn3 转 座 子 家 族 。Tn3 家 几 转 座 子 由 一 些 非常 大 的 〈 约 5 000 碱 基 对 ) 转 座 子 组 成 。 每 个 转 座 子 带 有 三 个 基因 ,其 中 一 个 编码 68- 内 酰胺 酶 ( 它 提供 出 amp 抗 性 ), 另 两 个 是 转 座 作 用 所 必须 的 (将 在 以 后 讨论 )。 所 有 的 类 -Tn3 的 转 座 子 含有 短 的 (38 碱 基 对 ) 倒 Be ,而 且 两 村 不 具有 IS 序列 。 最 近 有 人 认为 以 前 兽 被 认为 是 Tn3 家 族 的 转 座 子 ( 例 如 Tn501，Tn551，Tn1721 和 r56) 可 能 属于 第 四 类 型 。 3. HFA PERU BSR (Mu 类 )。 两 种 有 关 的 叭 菌 体 Mu 与 D108 把 转 座 作用 作为 瑟 们 产生 子 代 叹 菌 体 的 正常 方式 的 一 部 分 。 在 感染 的 早期 ,这些 喉 菌 体 将 他 们 的 _DNA 可 下 7 迅速 地 冷却 ,使 其 只 能 产生 自我 退火 He WN gia 图 19-7 SHSM NRM RNR RARE VHS (stem-and-loop) 结构 。 标记 着 电镜 两 字 的 构 型 是 在 电镜 下 看 到 的 情况 。 细 线 \ 粗 线 分 别 表示 单 \ 双 链 。 整合 到 染色 体 上 《〈 染 色 体 上 有 许多 个 整合 位 点 ,这 个 整合 先 发 生 在 其 中 一 点 上 )， 产 生 红 型 的 转 座 子 序列 , 即 噬菌体 DNA 夹 在 两 个 复制 了 的 靶 序 列 〈 作 为 侧 丑 ) 之 间 s。 按 转 座 作用 普遍 存在 着 的 原理 来 看 ,噬菌体 DNA 的 多 个 拷贝 转 座 到 染色 体 DNA 上 的 许多 位 点 上 ,最终 由 这 些 染色 体 上 的 转 座 单位 进行 噬菌体 包装 。 正 像 在 第 十 六 章 所 解释 的 那样 , 包 装 要 将 噬菌体 的 头 壳 装 满 , 包 装 进 去 的 DNA KEK FRE AAAI; Ak, 鸣 菌 条 PAL ARAN DNA 的 末端 总 含有 细菌 DNA} 转 ie fF AA 转 座 过 程 的 最 终结 果 是 受 体 DNA 分 子 的 两 个 碱 基 序 列 中 间 插 人 了 转 座 子 。 对 许多 转 座 子 及 他 们 的 插 人 位 点 进行 序列 分 析 ， 说 明 它们 之 间 没 有 序列 的 同 源 性 。 这 与 它们 不 需要 大 肠 杆菌 recA 系统 是 一 致 的 。 然 而 受 体 DNA 的 插 人 位 点 区 域 的 序列 很 令 人 吃惊 ，， 我 们 将 在 下 一 节 加 以 讨论 。 播 人 位 点 的 靶 序 列 的 复制 转 座 时 发 生 的 插入 作用 有 一 个 普遍 的 特征 , 那 就 是 在 受 体 DNA 分 子 中 有 一 段 很 短 的 碱 基 序列 《〈3 一 12 HREM), AMIE TE, 它 会 进行 复制 。 插 人 的 转 座 子 就 被 炎 ° 176。 在 受 体 DNA hf EES or rr ero Bee ABCOEPS 2 ge AABCOE Pues a A'B'C'D'E' Pa a 2 f) A'B'C'D’E’ ee re ae 19-8 RF MBA BRR AN fille 在 两 个 重复 着 的 靶 序 列 之 间 ,这 种 排列 见 图 19-8. 我 们 再 强调 一 下 ,在 转 座 子 插 人 之 前 ， 受 体 DNA 中 只 有 一 个 拷贝 的 待 复制 的 丢 序列 , 转 座 子 本 身 不 存在 这 种 靶 序 列 。 不 同 转 座 子 的 靶 序 列 的 长 度 不 同 ,但 是 对 于 某 一 个 转 座 子 来 说 , 它 的 所 有 的 靶 序 列 的 长 度 都 是 一 样 的 。 例 如 ，IS1 的 两 辟 总 是 有 9 碱 基 对 的 一 段 靶 序列 ， 而 Tn 3 的 两 丑 总 是 5 碱 基 对 的 序列 。 注 意 ， 对 于 某 种 特定 的 转 座 子 来 说 ， 每 一 种 插 人 位 点 的 靶 序 列 都 不 同 ,只 是 复制 的 序列 的 长 度 是 恒定 的 。 下 面 对 负 责 靶 序列 复制 的 机 理 作 一 些 介绍 ,但 其 细节 还 不 清楚 ， 在 图 19-9 只 表示 了 大 概 的 过 程 。 EFI | 座 子 的 附着 一 一 一 一 一 一 一 一 | =m 吧 志 座 子 FRA BS (2) 填 满 并 用 DNA 连接 酶 (2) 焊 封 图 19-9 FER WIS A — AN FT Be He ET SS RAE RG SER SK DNA HAVRE EA (其 选择 方式 还 不 清楚 ), FFE A BEER Ae RS ERY. RIG EMF DNA 附着 SFA RANTE AS OR mE, Ake EF AA SH IRAE. BAG SRD WN — 5 EET EBA RE ESE RMR, Shi 口 跨 在 靶 序 列 的 一 条 链 上 ,然后 , 缺口 被 填补 起 来 〈 可 能 是 DNA RABI 的 作用 )， 进 一 步 缺 刻 被 焊 封 起 来 《可 能 是 DNA 连接 酶 的 作用 ); Bit, 形成 了 连续 的 双 链 的 受 休 DNA, fH ,在 转 座 子 两 翼 有 两 个 靶 序 列 。 注 意 , 当 转 座 子 与 受 体 DNA 结合 时 FRG mien» 用 末端 的 同 源 性 。 在 本 章 的 后 面部 分 将 更 详细 地 说 明 产 生 复 制 的 靶 序 列 的 机 理 。 因为 每 个 整合 了 的 转 座 子 都 被 夹 在 两 个 复制 过 的 靶 序 列 中 间 ， 甚 至 那些 转 座 子 呆 在 男 定 位 点 时 也 是 这 样 ( 如 了 质粒 中 的 转 座 子 )。 人 们 不 禁 要 问 ,这 种 复制 作用 对 于 从 供 体 : 位 点 起 的 转 座 作用 来 说 复制 是 否 也 是 必需 的 ? 事实 上 肯定 不 是 必需 的 ， 因 为 已 经 构建 出 《用 重组 DNA KA) 两 桶 没有 直接 连 着 重复 序列 的 转 座 子 ,这些 转 座 子 仍然 能 够 发 生 转 座 作 用 。 转 座 子 的 结构 和 转 座 子 - 靶 序 列 复 合体 的 性 质 已 用 限制 性 内 切 酶 对 含 转 座 子 的 DNA 进行 切割 ,从 而 分 离 到 了 含有 转 座 子 的 DNA 片 眉 ( 见 第 二 十 章 )。 役 序列 以 及 相 邻 的 转 座 子 的 碱 基 顺 序 都 已 测 出 。 通 过 这 些 分 析 发 现 了 两 个 重要 事实 : 1. 对 于 一 个 特定 的 转 座 子 的 每 一 个 插 和 人 作用 来 说 ， 与 两 个 靶 序 列 为 邻 的 转 座 序 列 都 是 一 样 的 《图 19-10)。 每 一 种 转 座 子 都 有 自己 专 一 的 序列 。 这 说 明 每 一 种 转 座 子 都 有 严 格 确定 的 末端 ， 并 说 明 转 座 过 程 是 通过 转 座 子 的 末端 与 靶 序 列 的 相反 一 侧 上 的 缺 刻 相互 连接 而 完成 的 。 $5 FF I] / dee ABCDE:1 B84 hrewatt 4'3'21’ABCDE 插入 作用 1 © A’B’C'D’E’ 1'2'3’4’ secscceseees 4321 A'B’C'D'E’ FGHIJ 1234 senses 4327 FGHIS 插入 作用 2 UY! 12°94 cocccsceres 4321 F/GH'I' J 和 KLMNO 562 B ecaccorconce 8'7'6'5'K LMNO 插入 作用 3 /LM’N'0'5'6/7'B’ -anenenenees 8765 K'L'IM'N'O PQORST5678. 8765'PORST 插入 作用 4 P'Q'R'ST' 5'6'7'8! eco 8765 P'O'R'S'T’ 图 19-10 ”图 示 同 一 个 转 座 子 在 两 个 不 同 插 和 位 点 插入 时 ， 转 座 子 与 四 序列 连接 处 的 序 列 。 即 1234 是 转 座 子 工 在 插 到 所 有 插入 位 点 时 的 左 端 序列 。 转 座 子 IIL 插 人 时 的 左 端 序列 则 总 是 5678。 每 个 数字 及 字母 都 代表 一 个 碱 基 。 带 “的 表示 互补 碱 基 。 数 字 与 字母 只 是 一 种 符号 ;5678 表示 与 1234 不 同 的 序列 而 不 是 眼 在 1234 后 面 的 序列 。 2. 上 述 的 转 座 子 的 两 个 末端 由 一 种 倒转 重复 的 序列 排列 而 成 (可 发 生 转 座 的 Mu Met 菌 体 除 外 ， 后 面 将 简单 地 讨论 Mu 噬菌体 ), 如 图 19-10 所 示 。 注 意 , 按 5 一 3 方向 进行 阅读 的 时 候 ， 转 座 子 工 的 左上 部 分 的 序列 与 右 下 部 分 的 序列 都 是 1234。 因 转 座 子 不 同 ， 倒转 重复 序列 的 碱 基数 可 以 变动 于 8 一 38 ， 在 图 19 一 11 中 给 出 了 其 中 几 个 序列 。 两 个 末端 的 相互 对 称 并 不 像 图 中 的 直立 箭头 所 示 的 那样 完好 。 对 Mu RAR, BREA 许多 更 为 复杂 的 部 分 是 对 称 的 ， 但 是 它 的 末端 却 不 是 倒转 重复 的 。 许多 遗传 学 证 据说 明 转 座 子 的 末端 序列 是 转 座 作用 所 必需 的 。 例 如 ， 已 经 分 离 到 一 些 发 生 了 一 个 碱 基 对 改变 的 \ 有 小 的 缺失 和 小 的 插 人 的 倒转 重复 序列 。 一 且 出 现 以 上 的 这 些 变化 , 转 座 作用 就 受到 阻碍 。 © 178。 —_— qe i ”一 =- a en nr GGGGTCCGAGCGCACGAGAAATTTGTATCGAT Tn551 1S4 5 A mr FF FF GGAAGGTGCGAACAAG ISS ISSOR * STGACTCTT Qo es ，，，，，，， TAGCTATGTTTAAAGAGCACGCGAGCCTGGGG 8 a ee ee es ee eS ee eeeee Se ee —=—_— om 5’ TTCTCTGTC _ ere eee ee ee eee ee. ee ee 5 re 图 19-11 四 个 转 座 子 的 未 端 序列 。 图 中 表示 了 此 种 序列 的 倒转 重复 。 除 了 由 黑 点 表示 出 的 个 别 情况 以 外 ,如 果 按 箭头 方向 阅读 虚线 表示 的 序列 与 实 线 表 示 的 序列 是 一 样 的 。 转 座 机 理 至 此 ,还 未 提 到 转 座 的 分 子 机 理 , 这 主要 是 由 于 还 不 清楚 这 种 机 理 。 下 面 介绍 由 转 座 子 介 导 的 称 作 共 整合 的 现象 ， 将 有 可 能 使 我 们 能 更 好 地 了 解 转 座 子 。 下 面 我 们 将 要 讨论 在 转 座 过程 中 假设 的 共 整 合 的 作用 以 及 几 个 有 关 这 种 机 理 的 假说 。 KES 首先 考虑 一 个 带 有 两 个 质粒 的 细胞 ,其 中 每 一 个 都 含有 一 个 转 座 子 。 在 每 一 个 细胞 世 FE ,两 个 质粒 融合 形成 一 个 质粒 的 频率 为 10“, 即 占 细 跑 总 数 的 于 万 分 之 一 的 细胞 中 才 会 发 生 上 述 现象 ,这 个 过 程 就 称 作 共 整合 〈cointegration)， 有 时 也 称 作 复 制 子 融合 〈rep- licon fusion)。 这 个 杂交 的 质粒 并 不 简单 地 就 是 两 个 质粒 的 融合 ,因为 它 有 两 个 拷贝 的 转 座 子 (而 不 是 仅仅 为 一 个 )。 这 两 个 转 座 子 拷贝 的 方向 是 相同 的 〈 即 是 正 向 重复 的 ), 而 且 它们 严格 地 位 于 供 体 与 受 体质 粒 之 间 ( 图 19-12)o 按 目前 所 知 ， 所 有 的 转 座 子 都 可 以 介 导 共 整 合作 用 ， 虽 然 有 时 产生 的 共 整 合 物 并 不 稳定 。 由 于 两 个 原因 使 共 整 合 的 形成 很 有 意义 。 首 先 ， 人 们 认为 共 整 合 产物 是 转 座 过 程 必要 的 中 间 物 ; 第 二 ， 在 共 整 合 前 只 有 一 个 拷贝 的 转 座 子 ， 而 在 共 整 合 后 却 出 现 两 个 拷 图 19-12” 由 转 座 子 介 导 的 AB 质粒 融合 而 形成 的 共 整 合 。 在 这 个 过 程 中 产生 两 个 措 贝 的 转 座 子 。 箭 头 是 按 任 意 方向 画 的 ,只 是 为 了 表明 在 共 整 合 中 两 个 转 座 子 的 方向 是 相同 的 。 WREST HES, 清楚 地 说 明了 转 座 子 DNA 发 生 了 复制 过 程 。 在 下 两 节 中 将 更 进 一 1179 © 步 讨论 这 两 点。 在 两 个 质粒 之 间 发 生 转 座 时 转 座 子 的 复制 过 程 在 上 一 节 中 说 明了 一 个 含有 一 个 转 座 子 的 质粒 可 以 与 第 二 个 质粒 融合 y 形成 一 个 共 整合 物 , 即 含有 正 疝 重复 的 两 个 拷 页 的 转 座 子 。 但 是 观察 到 的 更 多 的 是 真正 的 转 座 作用 。， 如 图 19-13 所 示 。 也 就 是 说 ， 一 个 含有 带 转 座 子 的 质粒 人 与 不 带 转 座 子 的 质粒 了 经 过 许 AQ 19-13 RBS VARA BAL Be 多 世代 以 后 ,就 会 产生 含有 带 转 座 子 的 质粒 B 《也 称 作 B’) 的 细胞 。 其 中 重要 的 发 现 就 是 ,如 果 在 一 个 细胞 中 含有 两 个 质粒 ,那么 在 两 个 质粒 中 就 都 有 同样 的 转 座 子 拷贝 。 这 就 和 就 像 前 一 节 所 叙述 的 那样 , 转 座 过 程 是 一 个 复制 的 过 程 。 另 一 个 很 重要 的 发 现 就 是 ， 如 果 含有 共 整 合 物 的 细胞 〈 当 然 已 具有 两 个 拷贝 的 转 座 © 子 ) 生长 很 多 世代 以 后 ,就 会 产生 一 些 只 各 带 有 一 个 转 座 子 拷贝 的 质粒 的 细胞 ,其 中 没有 共 整 合 物 了 ， 这 再 次 暗示 共 整 合作 用 可 能 是 转 座 作用 的 第 一 个 步 又。 在 下 一 节 将 再 讨论 这 个 观点 。 在 In3 的 转 座 作 用 中 共 整 合 物 作为 中 间 物 存在 用 Tn 3 转 座 子 做 的 一 些 实验 明显 地 表明 ， 共 整合 物 的 形成 是 转 座 过 程 中 的 一 个 中 Ia Ro ; a De EA (TnpR) 倒转 重复 转 座 酶 (TnpA) 5- 内 酰胺 酶 倒转 LN <= osama arta > PY fF 19-14. Tn3 转 座 子 的 物理 图 谱 。 共 有 4 957 碱 基 对 ;每 个 倒转 重复 序列 都 含有 38 REM. 在 三 个 箭头 的 上 面 标明 了 三 个 基因 。 Ta 3 的 结构 在 图 19-14 中 给 出 。 像 所 有 的 转 座 子 一 样 ,Tn3 有 一 对 倒转 重复 序列 ， 在 这 两 个 侧 必 中 间 夹 着 三 个 基因 。 已 经 分 离 到 这 三 个 基因 的 产物 ,从 它们 的 大 小 以 及 Tn3 ， 的 序列 可 知 ,这 三 个 基因 利用 了 倒转 重复 序列 之 间 的 全 部 碱 基 ,最 左边 的 基因 编码 一 个 很 大 的 蛋白 质 〈1 015 个 氨基 酸 )。 这 个 蛋白 质 记 作 TnpA， 它 是 一 个 转产 酶 并 负责 形成 夫 整合 物 。 最 右边 的 基因 编码 8- 内 酰胺 酶 ,这 个 酶 使 氮 共 青霉素 失去 活性 中间 的 基因 编码 一 个 小 的 蛋白 质 (185 个 氨基 酸 ) BRE TnpR。 这 个 蛋白 质 具 有 两 个 功能 , 即 负 调 控 作 用 或 者 说 是 阻 抑 TnpA 的 合成 ,以 及 局 动 转 座 的 第 二 步 : 专 一 性 的 位 点 交换 ,这 种 交换 解 开 转 *，180。 si Tal 座 过 程 的 第 二 步 中 的 共 整 合作 用 。 在 编码 TnpA 蛋白 基因 与 编码 TopR 蛋白 基因 的 交 田 处 的 前 后 ,是 一 段 被 称 作 “ 内 部 解体 位 点 “ 即 内 解 区 ， internal resolution site) 的 DNA 序 列 ，TnpR 蛋白 作用 于 其 中 的 一 段 序列 。 遗传 学 实验 得 出 了 如 下 的 结果 : 所 有 的 tnpA- 突变 都 不 能 转 座 或 形成 共 整 合 物 o 而 且 ，tnpR 突 恋 以 及 内 解 区 中 有 缺失 的 形式 只 能 形成 共 整合 物 但 不 能 转 座 。 因 此 ， 在 一 个 含有 两 个 质粒 的 细胞 中 ， 其 中 一 个 质粒 带 有 tnpR ”拷贝 的 .In3， 另 一 个 不 带 Tn3， 会 发 生 图 19-12 所 示 的 过 程 ， 而 不 会 发 生 19-13 所 示 的 过 程 。 这 些 发 现 说 明 Tn 3 介 导 的 转 座 过 程 分 为 两 步 ， 首先 ，TapA 诱导 共 整 合 ， 然 后 ，InpR 促进 发 生 在 内 解 位 所 的 专 一 性 位 点 交换 。 图 =13 给 出 了 这 个 过 程 的 图 解 5 有 一 些 转 座 子 不 带 有 类 TnpR 〈TnpR-like) 的 专 一 性 位 点 重组 体系 ， 但 是 仍然 能 发 生 转 座 s 推测 这 些 体系 是 利用 了 焦 (人 赖 于 同 源 交 换 的 体系 ， 因 为 ， 一 旦 共 整合 发 生 ， 就 有 两 个 相同 yer 的 序列 ， 即 转 座 子 及 其 拷贝 。 所 以 任何 依赖 于 同 源 序列 的 过 程 ae 都 能 实现 图 19-15 所 示 的 那 种 过 程 实 验 事实 支持 这 各 看法, 那 就 是 如 果 在 宿主 细胞 中 存在 recA HA, GE TnR 或 缺失 内 解 区 的 Tn 3 也 能 实现 图 19-13 所 示 的 过 程 , 即 把 共 整 合 物 转变 wee 成 为 单独 的 质粒 ; 事实 上 ， 在 已 经 形成 共 整 合 物 的 RecA” Al rs ae 胸中 ,通过 转 导 颗 粒 引入 等 位 基因 recA+， 就 能 发 生 转 座 作用 。 。 [Stee 转 座 作 用 的 两 种 模型 转 座 的 机 理 还 不 清楚 ， 但 现在 的 说 法 已 有 很 多 。 这 些 说 法 必须 能 解释 下 述 事实 : 〈1) 转 座 发 生 后 ， 在 原来 转 座 子 的 位 置 ahs 上 还 保留 着 转 座 子 ， 即 转 座 过 程 是 复制 过 程 ; 2) 共 整 合 物 的 2 存在 ; (3) 产生 短 的 重复 靶 序 列 DNA, MME ， 一 = Sy RMR RAW; (4) 一 些 转 座 子 需要 有 内 解 区 ， 而 另 一 些 ”图 19-15 利用 共 整 合 物 则 依赖 于 同 源 性 的 交换 作为 中 间 物 的 转 座 全 型。 已 经 提出 过 许多 关于 转 座 子 的 模型 ， 其 中 有 一 些 是 大 同 小 异 的 , 另 一 些 则 差别 很 大 ， 所 有 的 模型 都 有 两 个 共同 的 特点 : 1. 两 不 单 链 被 连 到 二 起 (是 连接 的 ), 而 不 必 靠 碱 基 配 对 指出 连接 的 位 置 。 2. 连接 作用 产生 一 个 复制 又 。 读者 应 当 注意 在 下 面 两 个 模型 中 的 这 些 特点 。 19-16 给 出 了 一 个 为 人 们 普遍 接受 的 模型 。 在 第 一 个 模型 中 ， 共 整合 物 被 认为 是 一 个 中 间 物 。 在 第 二 个 模型 中 , 共 整 合 物 不 被 认为 是 一 个 中 间 物 ,只 是 转 座 子 简单 地 插 人 ， 这 第 二 个 模型 很 可 能 解释 不 了 Tn 3 的 转 座 作 用 ， 只 适用 于 其 他 那些 没有 内 解 区 的 转 座 >a 我 们 首先 考虑 带 有 一 个 转 座 子 的 供 体质 粒 和 一 个 受 体质 粒 〈 供 体 和 受 体 都 不 一 定 必 须 是 质粒 ， 甚 至 可 以 不 是 环形 的 DNA, 图 中 所 示 那 种 方式 是 研究 得 最 多 的 排列 方式 )。 在 受 体 中 ， 转 座 子 发 生 整合 的 位 点 是 一 段 短 的 碱 基 序列 一 一般 序 列 。 还 无 人 提出 关于 转 座 子 与 靶 序 列 如 何 连接 的 设想 。 有 人 建议 转 座 步 又 如 下 (文中 的 编号 与 图 19-16 相同 )。 。 181， C 一 一 一 一 一 RE 一 一 一 一 一 ~ AI 一 一 DO) 一 一 一 -~ 二 人 \ 具 有 转 座 子 ia _ 忆 和 复制 的 对 ‘Slits ------ + ------- 2 i a PS ets al a ae acd Se a onl ae AR 图 19-16 转 座 作 用 的 一 种 模型 (由 J. A. Shapiro 提出 ， 见 参考 文献 3S. N. Cohen 及 J.A.- Shapiro，1980)。(1) 按 箭头 所 指 处 将 DNA 分 子 在 一 定位 点 上 前 开 形 成 缺 刻 。(II) 链 在 缺 刻 之 “ 间 分 开 , 与 非 同 源 性 链 进行 连接 结果 产生 复制 又 。(III) 通过 DNA 合成 (中 空 线 ), 形 成 图 中 杠 线 所 示 的 结构 。 具 有 专 一 性 位 点 的 链 在 内 解 区 HA) 之 间 发 生 链 的 交换 。 或 者 也 有 可 能 在 转 座 子 的 任何 地 方 发 生 依赖 于 同 源 性 的 链 的 交换 。(IV) 质粒 分 开 。 大 写字 母 表 示 碱 基 序 列 。 I 在 靶 序 列 上 打开 两 个 缺 刻 (通过 转 座 酶 ，transposase?)， 这 两 个 缺 刻 是 交错 的 ; 因 - 此 当 靶 序列 被 打 断 时 ,产生 两 个 互补 的 单 链 。 Il. 在 转 座 子 的 不 同 链 的 \ 相 对 的 两 个 未 端 上 打开 两 个 相对 的 单 链 缺 刻 ; 这 样 产 生 两 个 自由 的 未 端 。 通 过 每 一 个 自由 的 未 端 连接 到 靶 位 点 序列 上 交错 切割 所 产生 的 、 突 出 的 单 链 上 ,产生 两 个 复制 又 。 Il. 以 靶 序 列 的 突出 未 端 为 模板 ， 合 成 一 条 互补 链 ， 开 始 其 复制 过 程 。 当 复制 完成 以 后 ,形成 含有 两 个 拷贝 的 转 座 子 的 共 整 合 物 。 IV. 最 后 ， 在 两 个 拷贝 的 转 座 子 之 间 发 生 双 链 交换 过 程 。 这 个 交换 可 能 发 生 在 未 端 ”重复 的 地 方 ， 而 在 Tn 3 中 ， 很 可 能 发 生 在 内 解 区 处 。 交 换 的 结果 是 将 共 整 合 物 分开 成 供 体 单 位 与 受 体 单位 ,其 中 各 含有 一 个 拷贝 的 转 座 子 。 在 受 体 中 , 转 座 子 两 村 有 着 正 向 重 复 的 靶 序 列 ;其 长 度 就 是 交错 切口 之 间 的 碱 基 序列 的 长 度 ( 即 相当 的 碱 基 对 数目 )。 *。182。 下 面 我 们 将 讨论 另 一 种 称 之 为 不 对 称 的 模型 (asymmetric model), 这 个 模型 也 已 普遍 地 为 人 们 所 接受 ， 它 是 几 种 模型 的 综合 物 。 与 上 面 的 那 种 模型 有 两 点 重要 的 区 别 : C1) 在 转 座 子 两 个 末端 的 切割 作用 不 是 同时 进行 的 ,而 是 在 插 人 过 程 的 不 同 阶段 进行 的 ; (2) 共 整 合 物 不 是 一 个 中 间 物 ,而 只 是 两 种 不 同 产物 中 的 一 种 ， 另 一 种 只 是 简单 的 插入 ， 而 且 ， 共 整合 可 能 发 生 在 这 个 过 程 的 最 后 时 刻 。 图 19-17 给 出 了 这 个 模型 的 图 示 。 它 的 在 靶 序 列 中 有 两 个 缺点 I an Poot oe ‘er -- Se SBar~_ -> EF Steere ore LAF a 连接 到 一 起 “ Tl =_— tone _ aoa besa ee 从 靶 序 列 的 箭头 处 的 复制 作用 填充 着 转 座 子 中 的 缺口 a 5} f ie = 3 mag to umn, ® AY Nl gt 王 ae 一 一 @nee? he. -一 一 名 5 第 ase Lia oo mee =\ a aemawer—_" { Rete eee LP a ee 在 小 箭头 处 形成 一 个 在 小 箭头 处 形成 断口 * 断口 : 图 中 的 三 角 和 环 、 三 角 及 小 方块 指出 环 指出 将 要 联合 到 一 将 要 联合 的 一 些 末 兴 起 的 一 些 未 端 RS、 ea < ie oSurFe 3 4 Blue em re W 11 共 整 合 eo } 1 ~t8 Pee ee } Sere. " Po a tong eae SE ee Af 两 个 分 开 的 质粒 reas 图 19-17 ” 转 座 作 用 的 不 对 称 模型 。 这 个 模型 以 简单 的 插入 或 形成 共 整合 物 为 结束 CLS IV 行 ,分 别 列 于 左右 的 两 个 小 图 )。 第 Wl 行 图 中 所 示 的 两 个 结构 是 相同 的 ; 画 出 两 个 图 只 是 为 了 清楚 地 说 明 为 了 得 到 第 IV 行 图 示 的 结构 所 需要 进行 的 切割 与 连接 。 步骤 如 下 文中 的 编号 与 图 中 的 相同 )。 I. 在 靶 序 列 上 产生 两 个 切口 ,但 是 在 转 座 子 上 只 在 左 端 有 一 个 切口 。 I， 般 序列 的 一 个 未 端 与 转 座 子 的 自由 末端 连接 到 一 起 。 II， 人 然后 进行 复制 ,形成 如 图 所 示 的 中 间 物 。 注 意 , 复 制 终止 于 转 座 子 的 末端 ， 推 测 可 能 某 些 碱 基 序 列 是 它 的 终止 信号 IV. 复制 作用 终止 之 后 ,可 能 发 生 两 种 切割 与 连接 ,产生 带 有 正常 复制 作用 的 转 座 子 。，183。 简单 插 人 的 质粒 《第 IV TEA) MRAM CB IV TAA) 目前 ， 只 有 很 少 的 证 据 支持 这 个 模型 ， 这 个 模型 应 当 被 看 作 是 不 对 称 模 BPE 型 。 现在 人 们 正在 大 力 进行 研究 ， 以 便 对 众多 的 模型 《主要 有 两 种 类 型 ) 作出 正确 判断 。 转 座 子 介 导 的 其 他 遗传 学 现象 转 座 子 参与 许多 遗传 现象 ， 例 如 这 一 节 将 要 讲 到 的 基因 重 排 与 质粒 -染色 体 整合 等 。 基因 重 排 在 进化 中 非常 重要 ， 它 可 能 是 由 转 座 子 介 导 的 。 例 如 转 座 子 可 能 负责 将 一 些 原 来 在 染色 体 上 相距 甚 远 的 基因 拉 在 一 起 ， 组 成 现在 的 被 构建 到 一 起 的 协调 地 控制 着 的 一 些 操纵 子 。 也 有 可 能 把 两 侦 分 离 着 的 碱 基 序 列 转变 成 连 在 一 起 的 DNA, 这 样 的 大 踏步 前 进 的 进化 过 程 就 可 能 产生 一 些 新 的 蛋白 质 分 子 。 在 细胞 繁殖 的 一 个 世代 中 ,基因 重 排 可 能 也 是 非常 重要 的 。 例 如 ,可 转 座 因子 可 以 被 看 作 是 一 个 开关 ;在 一 个 特殊 的 位 点 发 生 插 人 作用 或 是 倒转 一 个 含有 启动 子 的 序列 ,就 可 以 使 基因 打开 或 者 关闭 。 在 下 面 的 讨论 中 ,值得 注意 的 一 点 是 下 面 的 每 一 个 现象 与 过 程 都 是 由 转 座 子 介 导 的 ， 但 并 不 发 生 如 图 19-16《〈 第 IV 行 ) 中 所 示 的 那 种 最 后 的 解体 步 又 。 然而 ， 不 能 以 为 这 些 事件 是 不 正常 的 ,因为 所 有 缺乏 解体 体系 《例如 ，IS AT) 的 转 座 子 都 发 生 基 因 重 排 等 现象 ;一 些 虽 然 能 够 解体 但 是 其 解体 频率 很 低 的 转 座 子 ,也 都 能 发 生 这 些 现 象 。 复制 子 融合 图 19-16 的 检测 指出 ,如 果 不 发 生 解 体 步 又 (图 中 步骤 IV)， 那 么 发 生 图 中 步骤 工 所 示 的 转 座 子 介 导 的 两 个 环形 分 子 的 重组 融合 过 程 ， 就 会 形成 步骤 III 所 示 的 一 个 单 环 分 子 。 这 个 新 的 DNA 分 子 含有 原来 两 个 DNA 分 子 的 所 有 基因 以 及 两 个 拷贝 的 转 座 子 。 但 是 要 注意 ， 在 这 个 过 程 中 ， 每 一 个 拷贝 的 转 座 子 都 没有 复制 的 两 愤 靶 序列 ， 代 之 的 却 是 一 个 转 座 子 与 一 个 靶 序 列 互相 邻接 。 这 种 类 型 的 重组 作用 已 在 两 个 质粒 之 间 观 察 到 ， 两 个 质粒 中 的 一 个 携带 着 原 有 的 一 个 转 座 子 ,. 这 个 过 程 称 作 质粒 融合 〈plasmid fusion), 它 只 是 更 为 普遍 的 称 之 为 复制 子 融 合 (replicon fusion) 现象 中 的 一 种 特例 。 复制 于 融合 是 指 由 转 座 于 介 导 的 两 个 完整 的 复制 体系 的 融合 由 转 座 子 引起 的 缺失 与 倒转 当 转 座 子 出 现在 染色 体 或 质粒 中 lacZ 基 因 -HL 本 一时， 其 邻近 序列 发 生 缺 失 的 频率 比 无 转 eye ee 座 子 时 大 100 一 1 000 售 。 在 发 生 缺 失 时 经 常 发 现 《〈1) 转 座 子 仍 存在 ;(2) 缺失 1g 8 。 -是 从 转 座 子 的 末端 开始 的 ;3) BREF 和 只 与 一 个 四 序 列 捞 贝 相 接 (也 就 是 转 座 图 19-18 转 座 子 造成 的 缺失 的 特点 。2，34，5 片 子 的 两 翼 没 有 正 向 重复 的 序列 ) 图 ca : VF RAO “999% q RMU ET ATA. 19-18 给 出 了 这 些 特 点 。 这 个 现象 在 。184。 G) ee NR ae i. yl oS 一 一 TREE -一 一 一 一 一 一 -一 一 一 -一 [3] ——__—_—_--- Sk ais ie A’ o” sf ue A,B,CADAR—+DNASFE, BSC 连锁 在 一 起 ， A 与 吕 连 锁 在 一 起 ,复制 起 始 区 ( 生 ) 处 于 A 与 D 之 间 ， ec AEF PB Bb GH : Ee ee 倒 苇 19-19 按 图 19-16 中 的 Shapiro i AUP ie ARH RE 5 BBE CEP AM. 工行 所 示 的 排列 与 gg 19-16 中 的 相同 。 除 了 使 用 两 种 不 同方 向 的 彼 序 烈 之 外 ,3 与 3 对 应 于 图 19-16 中 的 II。 实 心 粗 箭 闫 表示 装 录 方向 ?其 他 符号 与 图 19-16 所 用 的 一 样 。 19-19 中 得 到 了 简单 的 解释 ,这 个 解释 可 用 图 19-16 的 模型 表示 。 在 这 个 图 中 , 又 重复 了 图 19-16 所 示 的 那 种 排列 ,也 就 是 说 ，A\B 片段 被 转 座 子 分 割 知 ，C 和 了 片段 夹 着 四 序列 ,与 前 面 两 个 图 中 所 示 的 步骤 工 的 图 及 1 片段 一 样 。 步 又 3 表示 通过 图 19-16 中 的 步骤 I 之 后 到 步骤 II 时 ,围绕 着 两 个 转 座 子 的 排列 已 经 完成 。 如 ABR 1 中 所 用 每 一 个 DNA 片段 都 是 环 状 的 ,那么 步骤 3 中 的 两 个 片段 就 会 融合 成 一 个 环 。 这 些 在 前 面 的 章节 中 已 经 作 了 解释 。 然 而 ， 如 果 转 座 的 两 个 片段 都 来 自 一 个 单个 DNA 分 子 《 例 如 ,同一 个 染色 体 )， 转 座 作 用 将 产生 步骤 5 所 示 的 两 个 分 子 。 注 意 ,在 这 个 步 又 中 只 有 一 个 分 子 含有 复制 起 始点 ,而 且 这 个 分 子 也 丢失 了 含有 B 和 C 的 片段 ;也 就 是 说 这 个 分 子 缺失 了 B 和 C。 如 果 含 有 BC 片段 的 较 小 的 环 不 含有 复制 起 始点 ， 就 不 能 进行 复制 。 因 此 ,如 果 这 整个 的 过 程 在 一 个 细菌 中 发 生 ; 那 么 当 细胞 进行 分 裂 时 ， 这 个 ° 185» 较 小 的 环 就 不 能 增多 XT RIERA PAR SARA T RAW kh HER AiR 失 的 部 分 紧 挨 着 转 座 子 的 一 侧 , 并 且 包含 了 转 座 子 与 靶 序 列 之 间 的 所 有 物质 。 图 19-19 的 下 面部 分 表示 倒转 是 如 何 发 生 的 ,在 这 种 情况 下 ,基因 初始 时 的 排列 与 产 生 缺 失 时 是 一 样 的 ,但 其 靶 序 列 的 方向 与 转 座 子 方向 相反 〈 也 就 是 说 , 按 图 19-16 步骤 I 的 相反 方向 连接 )。 这 相当 于 转 座 子 按 相反 的 方向 插 人 ,然后 转 座 过 程 产生 步骤 3 中 的 结 Wo THEM, A 和 C 的 排列 与 开始 时 的 排列 相 比 ， 其 方向 发 生 了 倒转 , C 和 D 也 是 同样 。 所 以 ,如 果 起 始 的 一 些 片 段 来 有 目 同一 个 DNA OF, 结果 就 会 产生 步骤 6 的 排列 方式 (在 这 种 情况 下 ,并 没有 发 生 缺 失 DNA)， 但 是 处 于 转 座 子 的 一 侧 与 丢 序 列 之 间 的 片段 , 与 另 一 个 片段 相 比较 就 发 生 了 倒转 ,也 就 是 说 发 生 了 基因 倒 位 〈genetic invertion), 虽然 绝 大 多 数 转 座 子 所 介 导 的 倒转 过 程 都 是 按 这 种 方式 进行 的 , 即 没 有 解体 过 程 ; 但 其 他 的 一 些 倒转 过 程 也 有 可 能 通过 解体 或 很 有 可 能 通过 recA 蛋白 介 导 的 重组 来 完成 ,图 侧 转 b _ 无 功能 的 ,因为 N 没有 DNA 复制 = ‘C), 有 功能 的 缺失 图 19-20 产生 缺失 与 倒转 的 模型 。 转 座 子 DNA 按 I 或 I 两 种 方向 插 人 轩 序 列 中 。 图 中 的 环 可 以 是 质粒 ?也 可 以 是 染色 体 。 通 过 具有 专 一 性 位 点 的 链 在 位 点 处 的 交换 ( 双 箭 头 指出 之 处 )? 或 者 通过 同 源 序列 的 交换 〈 双 向 箭头 所 示 ) 的 解体 过 程 , 从 I 产生 出 缺失 ,从 U 产生 出 倒 位 。 19-20 的 图 解 对 此 给 出 了 一 个 简单 的 机 理 。 这 个 转 座 过 程 发 生 在 一 个 含有 转 座 子 的 DNA 分 子 的 疲 序 列 之 内 ( 即 这 个 分 子 既 有 转 座 子 ， 又 有 冰 序 列 , 在 图 中 最 左边 的 那个 环 上 用 小 ”的 方块 表示 靶 序 列 )o 所 发 生 的 插 人 过 程 既 可 以 是 正 向 插 人 (图 中 的 D ， 也 可 以 是 反 向 插 人 (图 中 的 ID)。 如 果 某 个 转 座 子 能 够 解体 ,那么 在 它 的 两 个 转 座 子 之 间 就 会 发 生 专 一 性 位 点 的 交换 ， 也 可 能 会 发 生 由 转 座 子 基因 或 recA 蛋白 介 导 的 依赖 于 同 源 性 的 交换 《如 果 细 胞 是 recA+)。 如 果 转 座 子 是 以 正 向 排列 ,交换 后 产生 两 个 环 。 如 图 19-19 所 示 ， 为 染色 体 或 质粒 一 般 只 含 一 个 复制 起 始点 ， 所 以 只 有 拥有 复制 起 始点 的 片段 才能 存在 下 去 ;但 是 这 个 片段 与 原来 的 相 比 ,已 经 丢失 了 一 段 DNA FER, 因此 它 是 缺失 突变 体 。 如 果 转 座 子 是 反 向 排列 的 ,那么 就 会 产生 出 像 图 中 右边 部 分 那样 的 倒转 序列 。 注意 图 19-19 与 图 19-20 所 示 的 最 终结 果 是 相同 的 。 t 复制 起 始点 靶 序 列 利用 同一 转 座 子 两 个 拷贝 之 间 同 源 性 的 过 程 一 些 已 知 的 专 一 性 交换 的 过 程 是 由 recA 介 导 的 、 在 多 个 转 座 子 拷贝 之 间 进 行 AR 重组 的 结果 。 下 面 讨论 其 中 的 两 个 ，Hfr 细胞 的 形成 和 基因 的 扩 增 作用 。 * 1866 在 Hf 形成 过 程 中 IS 序列 的 作用 通过 了 因子 的 整合 会 产生 He 细胞 。 几 个 证 据 《主要 是 确定 F' 质粒 的 结构 ) 表 明 整 合 了 的 了 序列 的 两 机 总 是 有 IS 序列 的 两 个 拷贝 (它们 是 正 向 重复 的 ); 这 种 Is 序 列 是 存在 于 F 质粒 中 的 序列 ;另外 ,在 染色 体 中 也 发 现 了 F 质粒 中 所 带 的 IS 序列 ， 这 两 个 事实 说 明 转 座 子 参与 了 Hf 的 形成 。 含有 E 质粒 的 细胞 可 以 通过 两 种 方式 形成 Hi 细胞 。 一 个 方法 是 通过 两 个 相同 的 IS 序列 发 生 同 源 重组 而 形成 Hfr 细胞 ;这 两 个 IS 序列 一 个 在 染色 体 上 , 另 一 个 在 F 质 粒 上。 如 果 这 个 重组 事件 是 物理 性 的 交互 过 程 ， 那 么 按照 这 个 机 理 就 会 在 转 座 子 的 两 辟 产生 两 个 IS 序列 ， 并 且 可 能 利用 细菌 的 Rec 体系 、\ 转 座 子 基因 产物 或 了 质粒 中 的 可 以 想见 的 某 些 基因 产物 形成 Hi 细胞 。 另 一 种 形成 Hfr 细胞 的 途径 则 是 通过 F 质粒 中 IS 序列 所 介 导 的 共 整 合 途径 以 及 通过 染色 体 中 丢 序 列 的 复制 《例如 复制 子 融合 )。 很 重 要 的 一 点 是 应 当 认 识 到 这 两 种 机 理 的 结果 是 同样 的 。 也 就 是 将， 它们 的 结果 都 是 正 向 重 复 的 两 个 拷贝 的 IS 序列 夹 着 FAT. Hir 细胞 通过 以 上 两 个 途径 而 形成 Hfr 细胞 是 完 全 可 能 的 ,其 原因 将 在 下 面 接着 叙述 。 F 整 合 存在 着 许多 个 位 点 。 但 在 一 些 被 称 为 热点 ;Chot 和 的 位 点 上 ， 比 起 其 他 的 位 点 《〈 称 之 为 次 位 点 minor sites) 更 容易 发 生 整 合作 用 。 现在 已 经 测 出 包括 热点 在 内 的 几 段 染色 体 片 眉 的 碱 基 序列 ,在 每 一 个 片 眉 中 都 发 现 有 IS 序列 。 更 进一步 ,大 多 数 Hfr 细胞 曾经 是 rec"F” 细胞 ， 因 此 似乎 很 可 能 这 些 Hfr 细胞 株 是 由 recA 蛋白 所 介 导 的 同 源 重 组 作用 产生 的 。 发 生 在 次 位 点 的 整合 作用 频率 低 得 多 * 而 且 常 常 发 生 在 recA- 细胞 中 ;最 终 的 Hir 细胞 株 可 能 是 通过 共 整 合 途径 而 产生 出 来 的 。 细菌 中 的 基因 扩 增 recA 蛋白 所 介 导 的 、 转 座 子 的 多 个 拷贝 之 间 的 重组 作用 被 人 们 用 来 解释 另 一 个 现 象 : 细菌 中 的 基因 扩 增 。 一 些 有 质粒 《但 不 是 所 有 的 ) 有 这 样 一 种 性 质 ;， 如 果 把 含有 这 种 质粒 的 细胞 放 在 含 RAI fir ABR HER FT 图 19-21 ZAP MMA Re Riis ER Rec 介 导 的 IS 序列 之 间 发 生 的 重组 作用 。 在 第 本 个 模型 中 ,重组 发 生 在 复制 期 间 ; 在 第 II 个 模型 中 ,有 两 次 Rec 介 导 的 重组 作用 。 第 二 次 重组 发 生 在 已 切除 的 小 环 与 原初 质粒 的 另 一 个 找 贝 之 间 。 * 187 » 有 低 于 其 最 大 耐 受 量 的 抗生素 的 培养 基 上 进行 培养 ,经 过 很 多 世代 以 后 ,这 些 细胞 就 对 逐 渐 提 高 浓度 的 抗生素 有 抵抗 力 。 这 种 抵抗 力 是 因为 R 质粒 中 的 抗 药 性 基因 逐渐 增加 所 致 。 也 就 是 说 , 当 抗 药性 基因 不 断 地 串联 复制 时 , R 质粒 的 大 小 就 不 断 地 增 大 。 这 个 过 程 中 要 求 有 一 个 有 活性 的 细菌 rec 体系 ,说 明 这 个 复制 作用 不 是 一 个 转 座 过 程 。 基 于 质粒 中 的 抗 药 性 基因 的 两 村 有 转 座 子 的 事实 ,图 19-21 中 给 出 了 基因 扩 增 的 两 种 模型 (其 实 还 有 其 他 的 模型 ,只 是 这 两 个 特别 简单 )。 注意 ,这 两 个 模型 有 两 个 基本 要 求 , 即 首先 是 待 扩 增 的 基因 的 两 村 有 相同 的 序列 ,第 二 是 Rec 体系 能 够 有 效 地 使 同 源 区 进行 配对 。 但 是 现在 还 没有 支持 这 些 模 型 的 事实 。 真 核 细胞 中 的 转 座 子 首先 ,证 明生 物 中 存在 着 转 座 因子 的 证 据 不 是 来 目 细菌 ,而 是 来 目 Barbaro McClinto- ck 对 玉米 的 巧妙 研究 。 她 的 发 现 指出 ,玉米 中 一 些 遗 传 位 点 的 活性 受到 一 种 控制 因子 的 影响 ,而 且 只 有 当 这 个 因子 靠近 这 些 位 点 时 ， 它 才能 抑制 这 些 位 点 的 活性 ;这 些 位 点 的 基 因 活 性 水 平 ,只 有 当 这 种 控制 因子 进 和 人 或 离开 它 的 抑制 位 置 时 才 发 生变 化 。 最 近 ,物理 图 谱 的 数据 说 明 玉 米 中 的 这 个 控制 因子 就 是 转 座 子 。 在 啤酒 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) FISH (Drosophila melanogaster) 中 也 发 现 了 转 座 子 ， 还 分 离 到 了 酵母 转 座 子 中 的 一 个 sg。8 因子 含有 338 碱 基 对 ， 在 每 一 个 单 倍 体 细胞 中 约 含 有 100 个 拷贝 。 一 个 类 转 座 子 样 的 片段 Tyl 也 已 从 酵母 中 分 离 出 来 。Ty1 KNA 5100 碱 基 对 ,两 村 有 两 个 拷贝 的 85。 每 一 个 单 倍 体 细胞 中 约 含 有 35 个 拷贝 的 Tyl。Tyl 的 揪 人 能 引起 极 性 突变 ,转录 的 起 始点 靠近 8 的 末端 。 在 那些 少数 已 知 碱 基 序列 的 转 座 过程 中 ，Tyl BAN, CHWARAE 5 碱 基 对 的 序列 一 -这 是 大 肠 杆菌 中 的 转 座 子 信号 。 在 果 蝇 中 约 有 3 多 的 DNA 组 成 由 约 为 5 000 碱 基 对 的 各 种 倒转 重复 序列 组 成 。 其 中 大 多 数 片段 含有 大 约 50 一 200 碱 基 对 。 有 一 个 叫做 copia 的 转 座 子 约 含 有 4 400 ZEN, CH WB 300 碱 基 对 长 的 正 向 重复 序列 。copia 发 生 转 座 时 影响 某 些 基因 的 活性 ， 推 测 可 能 是 由 于 调节 位 点 发 生 移动 造成 的 。 例 如 启动 子 以 及 其 他 一 些 蛋白 质 的 结合 位 点 《这 些 位 点 位 于 copia 中 ) 移动 了 。 copia 的 两 辟 也 有 一 对 5 碱 基 对 的 正 向 重复 序列 。 果 蝇 的 一 些 遗 传 现象 可 以 用 转 座 子 的 存在 来 解释 。 例 如 ， 有 一 些 能 抑制 邻近 的 重组 作用 的 突变 是 极 性 突变 ,而 且 已 知 这 种 突变 是 由 于 插 人 而 造成 的 。 还 有 一 个 很 重要 的 发 现 , 就 是 一 些 《〈 也 可 能 是 全 部 ) RNA 肿瘤 病毒 本 身 可 能 就 是 转 座 子 ;然而 ,目前 只 有 一 个 事实 支持 这 个 观点 ， 即 几 种 整合 后 的 肿瘤 病毒 的 两 愤 有 600 碱 基 对 的 正 向 重复 序列 ;此 外 ,还 有 短 的 靶 序 列 的 复制 品 。 这 些 将 在 第 二 十 二 章 肿瘤 病毒 中 进行 次 入 讨论 。 = + xX mR Bukhari, A. 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Immunol. 75, 111—152. © 189» 第 二 十 章 B4DNA 及 遗传 工程 在 过 去 的 40 年 中 ， 一 些 新 技术 的 发 展 使 人 们 对 分 子 生 物 学 的 理解 向 前 迈进 了 一 大 步 。 例 如 ,和 X 射 线 衍 射 使 研究 者 们 能 对 大 分 子 结构 进行 明细 的 观察 ,氧化 钨 梯度 离心 技术 则 为 认识 DNA 复制 的 机 理 敞 开 了 大 门 。 最 近 的 新 进展 则 是 体外 连接 DNA 分 子 的 技术 ， 即 重组 DNA 技术 。 这 项 基本 技术 和 它 的 许多 发 展 已 经 彻底 地 变革 了 人 们 对 真 核 生 物 的 研究 ， 并 且 已 经 对 一 些 至 今 还 被 人 们 认为 是 几乎 无 法 大 量 取得 的 特殊 蛋 百 质 提 供 了 大 量 获得 它们 的 办 法 。 本 书 到 此 ， 已 经 着 重地 介绍 了 分 子 生物 学 中 的 各 种 重要 现象 、 基 本 概念 及 生物 学 机 理 ,而 对 技术 方面 讨论 得 较 少 。 但 是 ， 重 组 DNA 技术 或 遗传 工程 在 最 近 这 些 年 来 则 是 一 个 很 重要 的 研究 方面 ,确实 应 当 给 以 充分 的 注意 。 DNA 分 于 的 连接 重组 DNA 技术 的 基本 操作 包括 两 个 步骤 : (1) 将 DNA HEGRE RSE 因而 使 人 们 感到 兴趣 ), 连 到 一 个 可 以 复制 的 DNA 分 子 上 ;(2) 提 供 一 个 可 让 以 上 DNA 连接 物 进 行 繁殖 的 环境 ( 见 图 20-1)。 当 做 完 这 部 分 工作 后 ,就 说 供 体 片 月 上 的 基因 被 克 = 1+ (人 隆 了 ， 而 携带 分 子 就 是 载体 或 克隆 运载 图 20-1 一 个 克隆 的 实例 。 蛙 DNA 的 一 个 片 妇 被 结合 到 切割 过 的 质粒 载体 上 。 杂交 载体 转化 一 个 细菌 。 进 一 步 * 通 过 质粒 的 复制 蛙 卵 DNA 被 携带 到 所 有 的 子 代 细菌 中 。 。 190。 Ape ONE ne 被 切 开 的 质粒 体 。 在 这 个 部 分 将 要 介绍 DNA 片段 与 ce a ie olay 载体 连接 的 操作 步骤 和 许多 类 型 的 可 以 | 使 用 的 载体 。 GB 重组 DNA 分 也 载体 ETE 为 了 成 为 一 个 有 用 的 载体 ， 载 体 必 eee. ae i Ate = Ge 它 必须 能 复 和 2. 必须 有 可 以 检测 其 存在 的 某 些 方 细菌 Os sm 3. 必须 有 办 法 将 载体 DNA 引 人 细 5 使 用 得 最 普遍 的 三 类 载体 是 质粒 、 jeeon 大 肠 杆 菌 的 2 噬菌体 和 病毒 。 因 为 这 三 hs ieee 种 中 的 每 一 种 的 DNA 都 符合 上 面 提 到 的 三 种 性 质 。 例 如 ， 如 果 把 细 效 细胞 分 子 悬 浮 于 冷 的 CaCl, ARH, HA DNA 分 子 可 以 透 入 到 许多 种 细 效 的 细 胞 中 。 如 果 这 种 DNA 分 子 是 质粒 DNA， 某 些 时 候 质 粒 会 稳定 地 洗 在 于 细菌 之 中 。 在 大 部 分 的 实验 方案 中 ,每 个 细胞 中 大 约 可 进入 30 个 DNA 分 子 , 在 大 约 '8I 允 的 细胞 内 质粒 可 稳定 地 建立 于 其 中 。 含 质粒 的 细胞 可 以 很 容易 地 从 一 般 细 胞 中 分 离 出 来 ， 有 关 分 离 的 操作 步骤 将 在 本 章 后 面 一 些 部 分 介绍 。 当 使 用 1 ORE KAS DNA 时 ，10 症 受 感 染 的 细 隐 中 的 一 个 细胞 会 产生 子 代 喉 菌 体 。 对 于 酵母 (yeast; 或 Saccharomyces) 及 其 质粒 ,也 已 经 发 展 出 转化 的 操作 步骤 。 一 般 ， 动 物 病 毒 很 容易 透 人 到 动物 细胞 中 ， 加 火 Cax(PO)， MARE MARIN DNA ， 量 和 穿 透 的 速度 会 有 一 定 的 增加 。 以 这 种 方式 感染 的 动 物 细胞 只 有 一 小 部 分 产生 子 代 病 毒 。 接 着 ， 或 是 让 具有 质粒 的 细胞 生长 ， 或 是 让 吻 菌 体 或 病毒 感染 细胞 。 作为 这 些 过 程 对 于 质粒 DNA 来 说 ， 叫 做 转化 作用 ; 对 于 噬菌体 DNA 或 病毒 DNA 来 说 ,叫做 转 染 作用 ) 的 结果 ,是 重组 DNA 分 子 得 以 维持 并 繁殖 。 普遍 使 用 的 只 是 少数 的 载体 ;其 中 的 某 一 些 和 它们 的 性 质 列 于 表 20-1 中。 % 20-1 现在 使 用 的 某 些 克 隆 载体 基因 型 或 性 质 pSC 101 tetT Col El imm El . pMB9 tett immEl pBR322 . tet+ amp* pBR 325 tet? amp* camt Yeast 2um None Ws BS 4 Agt4-AB WAAR; ARE TES A-Charon a lacZt+ 3 ates 插入 作用 发 生 于 lacZ 基因 内 M13mp2 含有 lacP, lacO, lacZ 基因 met DNA; 在 序列 分 析 中 很 有 用 病毒 SV40 病毒 感染 动物 细胞 。 可 以 加 进去 的 DNA 的 大 小 不 能 大 于 3X10° 分 子 量 缩写 : tet? 四 环 素 ; imm， 免 疫 性 ; amp, AKHBK; cam, MBH; lacP, WHRATWAMF; lacO,7 糖 操 纵 子 的 操纵 基因 ; 1acZ， 编 码 8- 半 乳糖 背 酶 的 基因 。 对 于 抗生素 基因 来 说 ,十 表示 抗 性 。 限制 性 内 切 栈 限制 性 内 切 酶 是 可 以 识别 DNA 分 子 中 专 一 性 序列 的 一 类 DNA 内 切 酶 , 它 分 别 在 DNA 双 链 分 子 的 两 条 链 上 打下 一 个 切口 ， 产 生 3'-OH 及 5 末端 。 大 约 已 从 250 种 不 同 的 微生物 中 分 离 纯化 了 400 种 左右 的 不 同 的 限制 性 内 切 酶 。 在 这 么 多 种 的 酶 中 几 平 只 有 少数 的 一 些 酶 能 够 识别 具有 旋转 对 称 性 的 序列 ， 即 其 识别 位 点 有 如 下 形式 的 序 列 : ABC ; CBA’ ABxB’A’ _ AB : BYA’ A'B'C' :CBA ain ee Ww 或 A'B' :BA 在 上 面 的 这 些 形 式 中 ,大 写字 母 表示 碱 基 ,一 撤 表 示 互 补 的 碱 基 , x 是 任何 碱 基 , 虚 线 e 191° 代表 对 称 轴 。 现 在 已 经 知道 有 多 于 6 SPEAR IE ARIA IR, HERRA ILE DF 4 个 碱 基 的 识别 序列 。 存在 着 两 种 不 同类 型 的 限制 性 内 切 酶 。 类 型 I 酶 可 以 识别 专 一 性 的 序列 ， 但 其 切割 作用 位 点 则 在 另外 的 地 方 ， 类 型 II 酶 的 切割 作用 位 点 就 在 于 识别 的 专 一 性 序列 之 中 *。 在 本 章 我 们 仅仅 考虑 类 型 II 酶 。 所 有 的 限制 性 内 切 酶 ,都 造成 两 个 单 链 缺 口 , 每 条 链 上 一 个 。 这 些 缺 口 可 能 有 两 种 不 同 的 排列 方式 : 1. 形成 平整 未 端 〈flush 或 blunt ends): 两 个 缺口 都 在 对 称 中 心 处 。 2. 形 成 粘性 未 端 〈cohesive ends): 两 个 缺口 分 别 对 称 地 分 布 在 对 称 轴 的 两 侧 。 这 些 排列 及 酶 作用 的 后 果 见 图 20-2。 (a) 切割 点 就 在 “(b) 切割 点 对 称 地 分 布 ， 对 称 轴 上 在 对 称 轴 的 两 便 了 1 TCIGA... --GAAITTC.., | =AGICT.: .-CTTIAAG... 4 4 [wma he 2 o——— ——_ 3 aC + SGA: cs 2G + AATTC AG Gilives Me Th BA ey 3! ee - i oo 平整 未 端 分 子 粘性 未 端 分 子 20-2 限制 性 内 切 酶 造成 的 两 种 切割 类 型 。 箭 头 表示 切割 位 点 ? 虞 线 表 示 对 称 序列 的 中 心 。 表 20-2 列 出 了 12 种 比较 有 用 的 限制 性 内 切 酶 的 识别 序列 及 切割 位 点 ， 其 中 9 种 产 生 粘 性 末端 ，3 种 产生 平整 末端 。 因为 每 一 种 限制 性 内 切 酶 只 能 识别 一 种 独特 的 序列 ， 因 此 这 些 限制 性 内 切 酶 都 有 一 个 重要 的 特点 , 那 就 是 对 于 从 某 一 种 有 机 体 中 分 离 出 来 的 DNA 来 说 ,一 般 其 作用 位 点 的 数目 是 较 少 的 。 例 如 ,典型 的 细菌 DNA 分 子 大 约 有 3X 10° 碱 基 对 ,经 限制 性 内 切 酶 作用 后 ,被 切 成 几 百 个 片 毁 ;更 小 一 些 的 DNA 分 子 如 噬菌体 DNA 或 质粒 DNA 受 限 制 性 内 切 酶 作用 , 酶 的 切 点 可 能 少 于 10 个 《更 常见 的 情况 ,只 有 1 个 或 2 个 ,有 时 连 一 个 也 没有 )o 我 们 将 很 快 可 以 看 到 那些 对 于 特定 的 限制 性 内 切 酶 只 提供 一 个 作用 位 点 的 质粒 ， 它 们 特 别 值得 选 来 用 作 载 体 。 内 因为 前 面 已 经 提 到 过 限制 性 内 切 酶 作用 的 专 一 性 ,因此 ,一 种 特定 的 限制 性 内 切 酶 对 某 种 特殊 的 DNA 作用 ,可 产生 一 族 独特 的 DNA 片 奶 。 而 另 一 种 限制 性 内 切 酶 作用 于 同 异 源 梅 (isoschizomers), 它 们 彼此 有 相同 的 专 一 性 ,产生 同样 一 族 DNA }rB)o 图 20-3 (a) 表示 了 大 肠 杆菌 4 MER RAY DNA 被 限制 性 内 切 酶 EcoRI 及 Bam HI 切割 的 位 点 。 被 单个 酶 作用 产生 的 片段 族 通常 可 以 通过 消化 过 的 DNA 样品 进行 凝 胶 电 泳 而 检 出 〈 见 近东 2 生生 村 半 区 、 Be eee ae 基 构 成 。 ©1926 i =_ 3 20-2 某 些 限 制 性 内 切 酶 及 它们 的 切割 位 点 一 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 -- Mm +: Ff 酶 的 名 称 MRA Dai 产生 粘性 末端 GAA:TTC E. coli EcoRI | CTT IAAG t ebarrce Bacillus amyloliquefaciens H BamHI CCT :AGG 1) ak ‘TCT B. globigii Bgll TCT: AGA 4 y F : PuGCiGC Py Haemophilus aegyptius Hae Il PyCGi:CGPu Y AAG:CTT Haemophilus influenza Hind Tl 本 个 Y CTG:CAG Providencia stuartii Pst I GaAcieTe * exc ‘GAC Streptococcus albus G eft | CAG:CTG 个 TOTIAGA Xanthomonas badrii Xbal | AGA:TCT t Me . Thermus aquaticus Taq TCiGA AG:TC 产生 平整 末端 t y TGG :CCA Brevibacterium albidum Ball 5 : ACC :GGT 4 M Haemophilus aegyptius Hae I holo T/CCiGG\A CCC:!GGG Serratia marcescens Sma I GGG:CCC 个 注意 : 垂直 的 虚线 表示 每 个 序列 中 的 旋转 对 称 轴 。 箭头 表示 切割 的 位 点 。Taq II 酶 产生 含有 两 个 核 背 酸 的 粘 性 未 端 片 蛋 ? 而 其 他 的 酶 产生 的 粘性 末端 片 女 都 具有 4 TAR. Hael 酶 识别 GGCC 序列 ， 而 其 邻近 的 碱 基 对 A-T 或 工 A 也 应 对 称 地 留 在 GGCC Pipl, Pu 及 Py 分 别 表示 味 叭 或 障 啶 。 图 20-3 \b))。DNA 片段 泳 动 的 速度 与 分 子 量 大 小 相关 ,这些 片 侦 的 分 子 量 可 以 参照 同 © 193。 BO0B Ba A 20-3 (a) A DNA 对 于 EcoRI 酶 及 BamHI 酶 的 限制 性 内 切 酶 酶 谱 。 垂直 的 棒 表 示 酶 的 切割 位 点 。 上 排 数 字 表 示 从 ADNA 的 A 基 因 起 到 每 个 切 点 所 占 和 全 长 的 百分率 。 全 长 是 指 测 BM 4DNA 的 A 基 因 起 到 ADNA 右 侧 末端 止 所 得 到 的 全 部 距离 。 下 排 数字 是 每 一 个 片 外 的 长 度 ， 长 度 也 用 总 入 长 度 的 百分数 来 表示 。(b) EcoRI 酶 及 Bam HI 酶 消化 ADNA 后 得 到 的 凝 胶 电泳 图 谱 。 用 粘性 未 端 标志 的 条 带 表 示 由 ADNA 的 正常 粘性 末端 连接 两 个 末端 片 侦 所 组 成 的 分 子 所 形成 的 条 带 。 数 字 顺 序 表示 从 最 大 到 最 小 的 6 SHR. BamHI 作用 下 5.6 两 个 条 带 未 能 分 开 ( 承 Anderson 及 Lynn Enquist 提供 )。 时 泳 动 的 已 知 分 子 量 的 片段 所 移动 的 距离 而 测 出 。 测定 切割 位 点 ;限制 性 内 切 酶 图 谱 限制 性 内 切 酶 在 4 DNA 中 的 切割 位 置 , 即 限制 性 内 切 酶 图 谱 可 用 下 面 介绍 的 方法 测定 出 来 (图 20-4)。 1. 比较 酶 切线 性 DNA 及 酶 切 环 式 DNA 的 电泳 泳 动 图 谱 。 通 过 比较 可 以 看 出 , 环 式 DNA 比 线 性 DNA 少 两 条 相应 于 末端 片段 的 条 带 ， 多 具有 一 个 由 末端 连接 而 形成 的 新 条 带 。 因 此 ,认为 处 于 线性 DNA 分 子 两 个 未 端的 片段 是 在 环 式 DNA 消化 样品 中 不 见 了 的 片段 。 再 比较 完全 消化 及 部 分 消化 样品 的 电泳 结果 。 在 一 个 典型 的 消化 即 完全 消 化 反应 中 ,并 不 一 定 每 一 个 分 子 都 被 限制 性 内 切 酶 切割 ,有 时 能 看 到 未 被 切割 的 分 子 形成 的 极为 细弱 的 条 带 。 如 果 缩 短 酶 反应 的 时 间 ， 就 可 以 增强 此 细弱 的 条 带 ， 这 种 酶 反应 过 程 被 称 之 为 部 分 消化 (partial digest), 在 这 种 部 分 消化 反应 之 后 ,再 进行 电泳 ， 除 去 极 为 细 弱 的 条 带 外 ， 将 泳 动 图 上 其 他 条 带 与 完全 消化 样品 的 泳 动 图 作 比 较 ， 部 分 消化 样品 中 的 这 些 条 带 比 完全 消化 样品 中 相应 的 条 带 的 红色 荧光 的 强度 弱 得 多 。 又 发 现 增强 条 带 的 分 子 量 必 定 是 两 个 减弱 条 带 所 含有 的 片段 的 分 子 量 之 和 。 这 表明 减弱 条 带 是 原初 的 未 切割 分 子 ， 它 由 邻近 的 、 靠 在 一 起 的 两 个 片段 组 成 。 如 果 切 割 点 的 数量 不 很 多 《例如 6 个 ), 采 用 此 法 可 以 去 和 弄 清 楚 一 些 确 定 片段 的 排列 次 序 。 +1946 meta Hk DNA 分 子 A B C D E. OH B 3.0 7.0 "6.2 12.5 3.8 D 在 左 半 部 分 子 中 已 删除 完全 的 消化 切割 ,| 10 色 的 总 和 DNA 分 子 A ae 的 进行 完全 的 消化 ,可 能 产生 如 下 长 度 的 片段 3.0, 3,8, 5.2, 7.0, 12.5 3.0,3.8, 4.7, 7.0,12.5 YN A aan ’ : ; 5 < 4 环 状 ADNA 分 子 部 分 的 消化 作用 ， ip sl isabel 进行 完全 地 消化 ， 可 能 产生 如 下 长 因此 ,C EAE PFS eh 可 以 产生 如 下 长 度 度 的 片段 : 的 片段 : 5.2, 3.0 + 7.0 (= 10.0), 12.5 + 3.8(= 16.3) 5.2, 3.0 + 3.8(= 6.8), 7.0,12.5 (A) (B) (A+B) (0) (E)(+E) (A) (E) (A + E) (B) (D) Ait ASBAS,DSE 相 邻 Bib, AME 是 未 端 ies 图 20-4 测定 叹 菌 体 DNA 分 子 中 限制 竹内 切 酶 切 点 位 置 的 可 能 图 式 。 2. 也 还 可 以 利用 测定 遗传 删除 突变 体 而 鉴定 出 一 个 DNA 片段 在 一 个 完整 的 DNA 分 子 中 应 有 的 位 置 。 如 果 某 型 除 作用 并 不 消灭 一 个 限制 性 内 切 酶 作用 点 ,那么 就 是 在 一 个 FRAER—-BD DNA, 于 是 就 会 产生 一 个 新 的 片段 ; 这 个 片段 小 于 野生 型 中 的 相应 的 一 个 片 妥 。 新 片 豚 与 野生 型 中 的 相应 片段 比较 , 少 去 的 正好 是 被 删除 的 那 一 部 分 。 反 之 ,如 HRW DNA 中 包含 有 限制 性 内 切 酶 作用 位 点 , 即 去 掉 了 一 个 限制 性 内 切 酶 作用 位 点 ,那么 ,就 会 少 去 两 个 条 带 而 出 现 一 个 新 的 条 带 。 这 个 新 的 条 带 所 代表 的 DNA 的 分 子 量 相 当 于 从 上 述 两 个 下 落 不 明 的 片段 的 分 子 量 之 和 再 减 去 被 删除 的 那 一 部 分 DNA 分 子 量 。 所 叙述 的 这 种 类 型 的 实验 产生 的 切割 图 式 〈 限 制 性 内 切 酶 图 谱 ) 可 见 图 中 。 3. 虽然 前 面 介 绍 的 方法 通常 是 可 行 的 ， 但 最 普通 的 用 于 制作 限制 性 内 切 酶 图 谱 的 方 法 是 使 用 两 种 不 同 的 限制 性 内 切 酶 。 其 操作 步骤 为 从 同一 种 标定 DNA 中 取 三 份 样 品 ， 对 其 中 两 份 各 加 一 种 限制 性 内 切 酶 ， 对 余下 的 那 份 加 入 以 上 两 种 酶 〈 双 消化 ，double digest)， 保 温 消 化 , 然后 电泳 ， 再 比较 三 份 样 品 产生 的 三 组 片段 。 图 20-5 给 出 了 一 个 例 子 ， 表 示 可 能 产生 的 片段 组 。 这 个 操作 步骤 的 价值 是 可 以 得到 两 种 酶 共同 作 用 的 限制 性 内 切 酶 图 谱 。 我 们 假设 ,通常 也 就 是 这 种 情况 , 首先 需要 确定 哪个 片段 是 末端 片段 ， 为 达到 这 个 目的 ,或 者 用 图 20-4 介绍 的 比较 线性 及 环 式 DNA 消化 产物 的 方法 ， 或 者 在 限 制 性 内 切 酶 作用 之 前 ,用 多 核 萌 酸 磷酸 激酶 对 待 测 片段 进行 ? 未 端的 ?P 标记 , 再 于 限制 性 内 切 酶 作用 后 通过 放射 性 来 找 出 处 于 未 端的 片段 。 掌 握 了 这 项 信息 ， 就 能 鉴定 出 与 最 末端 的 片段 相 邻 的 片段 。 首 先 ,让 我 们 在 样品 工 的 消化 产物 中 寻找 邻近 于 片段 A 的 片段 。 在 双 消 化 中 ,那个 在 消化 W 中 形成 片段 F 的 切 点 必然 地 要 把 消化 I hie Be A RYE 个 片段 分 裂 成 两 半 , 从 而 产生 出 一 个 长 度 为 2.3 一 1 一 1.3 的 小 片 疏 和 另 一 个 长 度 为 * 的 小 . 片段 ;因此 ,1.3 + x 必须 等 于 片段 B`C 或 D 的 长 度 。 从 双 消 化 的 结果 去 推断 ,排除 两 端的 两 个 末端 片段 , 即 一 边 的 1.7 及 另 一 边 的 1.0, HEAR PAA Beh eee, x AAAS Al BE 值 只 能 是 0.7。 因 此 ,邻近 A 的 片段 必然 是 1.3 十 0.7 二 2， 这 恰恰 是 片段 B 的 长 度 , 所 以 B 邻近 于 A。 现在 我 们 再 来 查找 在 消化 I 中 邻近 片段 F 的 片段 。B 的 右 端 必定 去 分 裂 邻 * 1956 MT PMR AX A 十 B 一 3，F 一 2.3, 于 是 3 一 2.3 十 ?长度 的 片段 的 长 度 必 然 相 等 于 消化 工 中 邻近 于 的 那个 非 末 端的 片段 , ? 仅 有 的 可 能 值 是 2.5e 因 此 邻近 于 下 的 片段 的 长 度 为 3.2, 它 必然 是 片段 G。 我 们 再 把 注意 力 转 到 DNA 分 子 的 右 端 。 片段 E【《 消 化 ， I 中 ) 的 切 点 邻近 于 片段 J 《消化 Ih) WAR Ab, RIA I 中 有 长 度 为 己 的 Fr Be ,5—L7+Z 必须 等 于 1.7 十 在 消化 UW 中 某 长 度 的 一 个 片段 ,Z 只 可 能 是 5.4，, 邻 近 于 片段 的 片段 的 长 度 就 是 8.7 了 , 这 只 能 是 片段 Io。 这 个 过 程 可 以 不 断 地 继续 下 去 ,最 终 能 建立 一 个 读者 应 当 确认 的 \ 对 于 两 种 限制 性 内 切 酶 都 是 完全 消化 的 限制 性 内 切 酶 图 谱 。 这 种 方法 在 有 的 情况 下 , 即 当 存在 着 相同 长 度 的 片段 时 ,会 更 加 复杂 一 些 。 用 工 酶 消化 A B C D 三 + 证 4 一 -一 -一 -一 一 一 < 3 al 12.0 5 17.0 用 II 酶 消化 F 二 Go Bo. : t a - 一 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 -一 Ce 23 23 32 55116.6 8.7 15.3 17 17.0 双 消 化 X y Zz ay > 1.0 1.3 0.7 ee 2.5 0.5 0.6 5.4 Jun eZ. 20-5 RE PR iE Ps I = Pe al ECE ao BI PETC I, 酶 II 产生 消 46 11, A 1 Ras II 共同 产生 双 消 化 。 虽 然 真正 的 次 序 要 待 数据 进行 分 析 后 才 知 道 ， 但 为 了 简化 讨论 过 程 , 先 给 片 女 一 一 编 上 次 序 。 由 许多 限制 性 肉 切 酶 产生 的 具有 互补 单 链 末端 的 片段 在 研究 限制 性 内 切 酶 中 最 令 人 激动 的 事件 之 一 是 1972 年 Janet Mertz 及 Ronald Davis 在 斯 坦 福 大 学 发 现 的 事实 : 如 果 把 限制 性 内 切 酶 产生 的 片段 保存 于 高 盐 浓 度 的 组 冲 液 中 ,并 置 于 适当 的 复 性 条 件 下 ,许多 限制 性 内 切 酶 产生 的 片段 会 自动 地 环 化 。 这 个 观 察 是 证 明 某 些 限 制 性 内 切 酶 产生 带 有 粘性 末端 的 DNA 片段 的 第 一 个 依据 。 这 个 实验 简 示 于 图 20-6。 : 当然 ， 也 如 我 们 已 经 介绍 过 的 ， 并 不 是 所 有 的 限制 性 内 切 酶 都 产生 带 粘 性 未 端的 单 链 。 因 此 ,有 的 只 产生 带 有 平整 末端 片段 的 分 子 , 这 种 平整 端的 片 豚 不 能 环 化 。 具有 粘性 末端 的 限制 性 内 切 酶 片段 的 连接 一 种 特定 的 限制 性 内 切 酶 只 识别 一 种 简单 的 碱 基 序列 。 因 此 ， 某 特定 的 限制 性 内 切 酶 作用 于 一 种 DNA 分 子 产生 的 粘性 末端 , 相同 于 此 酶 作用 于 另 一 种 不 同 的 DNA 分 子 所 产生 的 粘性 未 端 (因为 两 种 DNA 分 子 都 有 被 此 种 酶 所 识别 的 序列 )。 如 果 某 个 片 女 的 两 个 粘性 未 端 有 互补 的 碱 基 序列 ,那么 此 片段 本 身 就 可 以 环 化 ;同样 地 ， 两 个 片段 也 可 以 通过 粘性 末端 的 互补 性 而 配对 。 因 此 来 自 两 种 有 机 体 的 DNA( 例 如 细菌 的 及 蛙 的 ) 可 以 配 对 粘 结 ( 如 图 20-7 所 示 )。 进一步 ,在 碱 基 配 对 之 后 再 进行 钊 封 连 接 , 则 两 个 片 外 可 以 永 久 性 地 连接 到 一 起 。 ° 196。 连接 产生 的 DNA 不 总 是 有 功能 的 ,DNA 序列 。 例 如 ,考虑 一 个 被 切 成 ABC 及 了 四 个 片 眉 的 DNA 分 子 。 重 新 将 这 四 个 片段 进行 装配 当然 可 以 产生 原初 的 分 子 ， 其 序 列 假 设 为 A.B\C\D。 但 是 因为 B 与 C 有 同样 的 粘性 末端 , 因此 ACBD 序列 的 分 子 就 有 可 能 以 与 ABCD 分 子 同 样 的 概率 产生 。 在 重 装配 过 程 中 ,也 有 可 能 产生 出 含有 多 个 某 -- FRWD+F, lg ABBD 或 ACCD 分 子 。 因 此 ， 只 产生 出 1/4 有 功能 的 序列 。 RW 地 ;如 果 DNA 分 子 可 以 被 切 成 五 个 片段 A\`B\C、D 及 王 , 那 么 再 行 组 装 时 ，A(CBCD)E、 | | TGCA TGCA 《 TGCA ACGT ACGT ACGT ee es eee GCA i 工 ACG 下 ACG 混合 ,退火 ,用 DNA 3 [screen AIH Bai - REAR CL 图 20-7 用 限制 性 内 切 酶 把 来 自 不 同 有 机 体 的 片段 组 建成 一 个 杂交 DNA 分 子 。 这 种 种 间 杂 交 ti RAK aK (chimeras), Aff ARAN DHL ° 197 ¢ A(BDC)E, A(CBD)E,A(CDB)E, ACDBC)E 及 ACDCB)E 以 及 那些 其 中 含有 两 个 某 片 段 或 三 个 某 片 段 的 分 子 就 都 可 能 以 相等 的 概率 存在 。 在 这 种 情况 下 ， 当 把 由 两 种 不 同 DNA 分 子 生 成 的 片段 进行 再 退火 时 ,得 到 有 功能 的 DNA 分 子 的 概率 当然 是 很 低 的 。 因 此 ,如 果 质 粒 DNA 被 切 成 四 个 片段 , 蛙 DNA 被 切 成 1 000 个 片段 ,大 部 分 组 装 的 质粒 将 是 杂乱 拼凑 并 且 无 功能 的 。 另 一 方面 ,如 果 用 遗传 学 的 方法 选择 出 有 功能 的 质粒 ;并 且 在 B、C 之 间 有 可 能 有 插 和 作用， 那么 得 到 含有 任意 的 蛙 DNA 片段 的 杂交 质粒 的 可 能 性 非 稼 高 ,但 若 要 求 插入 一 个 特定 的 DNA 片 女 ,那么 这 种 可 能 性 将 降低 1 000 倍 。 通过 外 加 均 聚 物 连接 DNA 片段 重组 DNA 研究 的 领域 开始 于 1972 年 ， 这 恰好 在 限制 性 内 切 酶 性 质 被 人 们 了 解 之 前 。 斯 坦 福 大 学 的 Peter Lobban 及 Dale Kaiser 发 展 出 连接 任何 两 个 DNA 分 子 的 一 种 一 般 性 方法 。 他 们 的 方法 是 采用 末端 转移 酶 (terminal nucleotidyl transferase), ix 种 酶 是 从 动物 组 织 中 分 离 得 到 的 一 种 不 寻常 的 DNA RAM, 它 把 核 背 酸 〈 通 过 三 磷酸 ABA AIMS] DNA 突出 单 链 的 3'0OH 上 。 酶 作用 时 不 需要 模板 链 , 因 此 这 个 过 程 很 引 人 注 意 。 为 了 形成 突出 的 单 链 , 应 当先 用 5 端 专 一 性 的 外 切 酶 去 移 走 少量 的 末端 核 背 酸 。 反 应 混合 物 中 应 有 外 切 酶 处 理 过 的 DNA, dATP 以 及 未 端 转 移 酶 ,反应 后 在 DNA 的 两 个 3 -OH 末端 形成 poly(dA) 尾 〈 见 图 20-8)。 同样 ,如果 供 给 dTTP 为 底 物 , 那 么 DNA 分 子 将 会 有 poly(dT) 尾 。 因 此 ， 如 果 多 聚 (dA) 尾 安装 在 一 个 DNA 分 子 上 ,多 聚 〈dT) 尾 安装 到 第 二 个 DNA 分 子 上 ,并 令 多 聚 《dA) 与 多 聚 CAT) BKC 图 所 示 )， 再 利用 DNA RAB I 的 缺口 填补 作用 (gap-filling) 使 分 子 连接 过 程 得 以 完成 ,最 后 可 再 用 DNA 连接 酶 将 剩 下 的 缺 刻 彻底 封 满 。 这 个 方法 叫做 均 聚 尾 连接 法 。 此 法 对 那些 缺乏 粘性 未 端 又 欲 进行 配对 的 DNA 分 子 非常 有 用 。 这 种 分 子 可 能 是 某 些 产生 平整 未 端 片 段 的 限制 性 内 切 酶 的 作用 产物， 也 AR 生生 EL 3 一 一 一 一 一 一 一 一 一 宁 3 一 一 一 一 一 一 一 —~5' hs 5' ~ 专 一 性 外 切 酶 末端 脱氧 核 背 酰 转 移 酶 Y+dTTP 人 A 从 一 一 -一 一 一 一 一 TTTT 夫人 信人 ww 下 缺口 退火 ,用 聚合 酶 工 填补 ， 并 用 DNA ee BH 一 图 20-8 带 有 互补 的 均 聚 尾 的 两 个 DNA 分 子 的 连接 。 © 198° —— — —— —_ 可 能 是 大 的 DNA 分 子 经 机 械 力作 用 而 制备 得 到 的 产物 ， 甚 至 可 能 是 cDNA 分 子 。 cDNA 是 在 实验 室 中 以 RNA 为 模板 ,经 逆转 录 酶 作用 而 产生 的 DNA 分 子 ， 它 也 是 平 整 未 端的 分 子 ,这 种 分 子 在 重组 DNA 技术 中 有 极端 重要 的 作用 。 平整 末端 的 连接 ”大肠 杆 菌 T 4 叭 菌 体 编码 一 种 DNA 连接 酶 。 受 T 4 感染 的 大 肠 杆菌 能 产生 大 量 的 这 种 酶 。 它 对 双 链 DNA 中 的 3’-OH WER 5'-P 未 端 之 间 的 缺 刻 可 以 焊 封 ,因此 是 一 种 典型 的 连接 酶 。 此 外 ， 它 还 有 另 一 种 特性 ， 即 可 以 把 两 个 具有 完全 碱 基 配 对 的 末端 DNA 分 子 连接 到 一 起 ( 见 图 20-9)。 这 个 反应 是 怎样 发 生 的 尚 不 清楚 。 但 是 对 于 带 有 平 整 未 端的 DNA 分 子 的 连接 ,使 用 起 来 效果 很 好 ,因此 , 它 是 有 别 于 均 聚 物 连接 的 又 一 个 很 有 用 处 的 方法 。 T4DNA 连接 酶 ; ， i [DNA] 一 一 -一 - 一 一 一 二 一 二 二 低 LDNAI] | © @ © 20-9 两 个 平整 末端 分 子 的 连接 反应 。 由 图 可 见 ; 在 DNA 浓度 较 低 的 情况 下 ，* 优 先 发 生 分 子 内 的 环 化 作用 。 用 连接 器 连接 有 时 ,一 个 带 有 平整 末端 的 分 子 连 到 另 一 个 具有 粘性 未 端的 分 子 上 的 做 法 非常 有 用 ， 待 插入 的 DNA GAATTC CTTAAG Vector ae i ~-GAATTC-- 人 工 合成 的 一 CTTAAG-- 十 二 聚 体 连 接 器 T4DNA 3 EcoR] f | ; 连接 酶 t y = *GAATTC= GAATTC 一 时 和 ET 全 4 EcoRI] AATTC G HE 有 hana GAATTC= = GAATTC CTTAAG™ CTTAAG 重组 DNA . 20-10 通过 使 用 一 个 连接 器 而 形成 重组 DNA 分 子 。 短 箭头 表示 EcoRI 酶 的 切割 位 点 。 291 这 里 提 到 的 具有 粘性 末端 的 片段 是 由 某 些 产生 单 链 未 端的 限制 性 内 切 酶 所 产生 的 。 以 上 考虑 是 有 可 能 实现 的 。 如 果 两 段 短小 的 含有 限制 性 内 切 酶 位 点 的 DNA 片段 (连接 器 ， adaptor) 偶 联 到 那个 带 平整 末端 的 分 子 的 两 端 上 ， 就 可 以 达到 以 上 目的 。 图 20-10 表示 了 实现 上 述 目的 的 简明 过 程 。 在 上 述 过 程 中 ， 平 整 末 端 分 子 得 以 插入 到 载体 的 EcoRI 位 点 中 。 这 种 方法 很 有 用 处 ,因为 ,一 旦 需要 回收 插 和 人 的 带 平整 末端 的 DNA 片段 时 ， 可 以 用 连接 器 中 有 切 制 位 点 的 那 种 限制 性 内 切 酶 作用 于 重组 分 子 上 。 但 是 ， 如 果 采 用 的 是 均 聚 尾 连 接 法 将 不 能 回收 插入 的 片段 。 利用 流体 动力 的 剪 切 力 产生 DNA 片段 让 我 们 先 来 考虑 一 个 将 被 克隆 到 质粒 中 去 的 基因 G。 最 简单 的 克隆 方法 就 是 用 同 种 的 限制 性 内 切 酶 作用 于 质粒 DNA 和 含 G 的 DNA ， 然 后 退火 。 但 是 有 可 能 能 切割 某 质 粒 的 各 种 限制 性 内 切 酶 都 在 基因 G 上 有 切 点 , 从 而 使 基因 G 失 活 。 因 此 显然 还 必须 要 有 其 他 的 切割 DNA 的 方法 。 人 们 发 现 ， 用 机 械 法 , 也 就 是 用 流体 动力 学 的 剪 切 力 的 方法 代替 限制 性 内 切 酶 法 可 以 使 带 有 基因 G 的 供 体 DNA 断裂 , 并 可 以 消除 专 一 性 作用 位 点 切割 DNA 所 引起 的 基因 失 活 作用 。 如 果 使 DNA 溶液 迅速 地 通过 皮下 注射 用 的 针头 或 小 孔 ,或 受到 剧烈 地 搅拌 ，DNA 分 子 就 被 打 断 成 分 子 量 为 2 x 10°—20 x 105 的 片段 。 某 些 DNA 分 子 , 如 基因 G，, 它 的 典型 分 子 量 为 105。 这 些 分 子 有 可 能 被 打 断 ,但 是 总 的 来 说 ,基因 将 保持 其 完整 性 。 剪 切 力作 用 下 产生 的 分 子 通常 都 是 平整 末端 的 分 子 。 虽 然 平整 末端 DNA 分 子 可 以 直接 地 连接 ,但 是 为 了 更 有 效 地 连接 到 那些 已 经 经 过 限制 性 内 切 酶 作用 的 质粒 上 ,加 上 一 个 合适 的 连接 器 接头 可 能 更 佳 , 见 图 20-10。 特定 DNA 分 子 加 到 载体 中 的 插入 作用 至 此 ,我 们 已 经 介绍 了 取得 的 一 组 DNA 片段 的 各 种 方式 (例如 ,限制 性 内 切 酶 消化 或 机 械 剪 切 ), 以 及 该 片段 与 载体 一 起 退火 ,产生 大 量 的 杂交 载体 的 一 些 方法 。 如 果 委 克隆 一 个 特定 的 基因 ， 那 么 必定 首先 要 从 所 有 具有 外 来 DNA 的 载体 中 分 离 出 带 有 此 基因 的 载体 。 虽 然 这 种 分 离 带 有 特定 基因 的 杂交 载体 的 做 法 在 许多 情况 下 是 适用 的 。 但 是 ,也 确 实 还 存在 着 许多 其 他 的 情况 : 人 们 所 感 兴趣 的 克隆 或 者 是 太 少 ,或 者 是 太 难 于 检测 。 因 此 如 果 能 提纯 含有 所 感 兴趣 的 基因 的 DNA 片 假 人们 还 是 宁愿 先 采用 别 的 办 法 , 即 进行 杂 交 实 验 检 测 出 所 要 的 克隆 。 本 部 分 将 要 介绍 克隆 一 个 特定 DNA 分 子 的 三 类 方法 。 cDNA 及 逆转 录 酶 的 使 用 某 一 特定 基因 是 否 已 正确 地 插 人 到 载体 中 ， 可 以 很 容易 地 通过 观察 基因 的 表达 产物 而 证 实 。 例 如 , lac 操纵 子 是 否 已 正确 地 插 进 质粒 ， 可 以 通过 它 合成 p- 半 乳糖 背 酶 的 能 力 而 被 检 出 。 但 是 去 了 解 某 一 个 真 核 基因 是 否 已 插 人 到 细菌 DNA 载体 则 有 可 能 会 成 为 一 个 问题 。 因 为 ,一般 地 讲 , 一 个 真 核 基 因 不 能 转录 与 翻译 出 一 种 有 功能 的 蛋白 质 。 但 寿 采用 本 章 所 介绍 的 技术 , 则 检测 插 人 的 真 核 基 因 就 是 一 个 相当 直接 了 当 的 工作 了 。 。 200。 a es i re 让 我 们 假设 ， 把 免 的 珠 蛋白 〈 血 红 蛋 白 的 一 个 亚 基 ) 基因 克隆 到 一 个 细菌 质粒 中 *。 其 过 程 为 : 用 同一 种 限制 性 内 切 酶 处 理 兔 的 细胞 质 DNA 及 大 肠 杆 菌 质粒 DNA, BURA iB kK ER ,形成 重组 质粒 ,最 后 再 用 含有 杂交 质粒 ( 即 重组 质粒 ) 的 DNA 混合 物 去 感染 大 肠 杆 菌 。 主 要 的 问题 是 如 何 鉴别 出 那些 含有 携带 着 这 种 基因 的 质粒 的 细菌 菌落 。 如 果 被 克隆 的 是 细菌 的 gal 基因 ， 我 们 就 可 以 在 适当 的 培养 基 上 用 Gal 宿主 去 选择 Galt 菌落 。 然 而 ,因为 珠 蛋 白 基因 有 内 含 子 ( 见 第 十 一 章 ) ,而 且 所 有 的 人 都 知道 细菌 缺少 加 工 真 核 mRNA 分 子 的 酶 ， 所 以 含 珠 蛋白 基因 的 细菌 不 能 合成 珠 蛋 白 。 当 然 可 采用 其 他 的 手段 找 出 目的 细胞 ， 例 如 用 纯 的 珠 蛋白 mRNA 与 细菌 DNA 杂交 。 但 是 因为 10: 个 细胞 中 约 仅 有 一 个 细胞 含有 带 珠 蛋 白 基 因 的 杂交 质粒 ， 因 此 这 个 方法 也 许 会 因 工作 量 太 大 而 令 人 厌烦 。 本 章 的 下 一 部 分 将 为 某 些 这 类 介绍 另 一 类 方法 。 某 些 动物 细胞 ， 其 中 之 一 例 是 产生 珠 蛋 白 的 网 状 细胞 ， 只 形成 一 种 或 少数 几 种 蛋白 质 。 在 这 些 细胞 中 ,已 经 加 工 过 了 的 、 专 一 性 的 mRNA 分 子 构 成 细胞 中 总 mRNA 中 的 大 部 分 。 因此 ， 通 常 获 得 的 mRNA 样品 可 以 几乎 只 由 一 种 mRNA 组 成 ,在 这 种 情况 下 ,只 有 珠 蛋白 mRNA。 所 以 若 对 那些 最 终 的 基因 表达 产物 就 是 细胞 蛋白 质 的 主要 成 分 的 基因 进行 克隆 时 ,这 种 类 型 细胞 中 的 纯 mRNA 就 可 以 作为 起 始 物质 ,由 它 创建 出 仅仅 只 含有 我 们 所 感 兴趣 的 基因 的 重组 质粒 。 从 动物 病毒 中 分 离 出 的 逆转 录 酶 可 以 用 RNA 为 模板 合成 出 双 链 _DNA 分 子 ( 其 机 理 , 见 第 二 十 一 章 )。 用 这 种 方式 制备 的 双 链 DNA 分 子 叫 做 互补 DNA 或 cDNA。 如 果 用 作 模 板 的 RNA 分 子 在 从 体内 分 离 出 来 之 前 已 被 加 工 过 〈 即 内 含 子 已 被 移 走 )， 那么 与 之 相对 应 的 cDNA 就 含有 一 个 不 会 被 打 断 的 编码 序列 s 因此 ,如果 可 以 分 离 得 到 加 工 后 的 mRNA ， 形 成 重组 DNA 分 子 的 目的 是 在 细菌 中 合成 一 种 真 核 基 因 的 产物 ,而 且 那 么 就 可 以 选择 加 工 后 的 mRNA 所 形成 的 cDNA YH AMR. cDNA 具有 平整 未 端 ， 一 般 可 通过 采用 连接 器 方法 把 它 连 到 载体 上 ， 如 图 20-10 所 示 。 插入 互补 的 人 工 合成 基因 高 等 有 机 体 ,例如 入 ,产生 许多 多 肽 激素 ,它们 都 有 很 大 的 医学 价值 ,而 且 典 型 的 组 成 是 少 于 20 个 氨基 酸 残 基 的 肽 类 。 在 许多 情况 下 ,多 肽 激素 的 基因 或 其 mRNA 都 还 未 分 离 出 来 。 目 前 ,已 经 可 能 采用 简单 的 技术 去 合成 短小 的 有 一 定 序列 的 片段 。 又 因为 目前 已 经 知道 了 大 部 分 多 肽 激素 的 氨基 酸 序列 。 因 此 ， 可 以 由 遗传 密码 推 绎 出 特定 基因 的 核 音 酸 序列 。 合 成 的 基因 的 碱 基 序 列 不 一 定 非 要 与 天 然 基因 的 完全 相同 ， 因 为 〈1) 密码 的 TUR (redundancy) 允许 大 幅度 调换 密码 子 ,而 并 不 改变 信息 的 内 容 ; 〈2) 天 然 基因 中 可 能 包含 有 内 含 子 ， 从 工 合成 的 则 无 。 而 且 ， 为 了 生成 一 个 有 功能 的 人 工 合成 基因 ， 合 成 的 DNA 分 子 中 必须 包括 起 始 密码 和 终止 密码 ， 碱 基 序 列 应 以 起 始 密码 子 开 始 ， 以 终 正 密 码 子 告终 。 一 且 基 因 合成 ， 就 可 以 用 已 经 介绍 过 的 任何 一 种 插 人 平整 末端 DNA 片 朋 的 方法 把 合成 基因 连接 到 载体 上 。 目前 用 这 种 方式 合成 的 最 大 的 DNA 片段 是 有 514 个 碱 基 对 的 人 干扰 素 的 基因 ， 它 足够 用 于 合成 出 具有 170 个 氨基 酸 残 基 的 蛋白 质 。 在 介绍 生长 激素 释放 抑制 因子 (somatostatin) 基因 的 克隆 时 ,我 们 将 对 合成 基因 进 * 克隆 一 个 特定 的 基因 是 一 种 通俗 的 说 法 ， 它 的 意思 是 形成 一 个 含有 一 种 特定 基因 的 克隆 。 es。 201° 行 表 达 所 要 求 的 条 件 进行 介绍 。 用 限制 性 内 切 酶 切割 大 供 体 分 子 获 得 特定 DNA 片段 特定 的 喉 菌 体 基因 克隆 到 质粒 中 的 技术 对 于 叹 菌 体 基因 表达 的 调节 的 研究 有 很 大 的 ， 帮助 。 如 果 首 先 纯化 出 含有 基因 的 片 疏 ， 那 么 ， 克 隆 吻 菌 体 基因 的 工作 就 便利 得 多 。 图 20-4 中 示 出 一 个 特定 叹 菌 体 的 限制 性 内 切 酶 酶 切 图 谱 ; 假设 有 人 想 要 克隆 一 个 已 杀 知道 是 处 于 片段 C 中 的 基因 。 一 种 办 法 是 把 完全 消化 的 酶 解 样 品 加 到 含 切 割 过 的 载体 ARH, Pt DNA 退火 , 然后 ,搜寻 含有 携带 着 所 感 兴趣 的 基因 的 质粒 的 细 胞 。 因 为 DNA SHAE ELLESMERE A DNA 的 质粒 中 ,最 多 也 只 能 有 二 具有 所 感 兴趣 的 特定 基因 。 在 某 些 情 况 下 ,值得 去 增加 这 个 部 分 。 为 达到 增加 此 部 分 的 目的 ,可 以 先 纯化 片 眉 C ,将 这 个 片段 与 切割 过 的 载体 混合 ,再 进行 退火 。 分 离 一 个 片 眉 最 直接 的 办 法 ,是 在 电泳 分 离 后 取出 含有 这 个 片段 的 条 带 ,再 对 其 进行 抽 提 而 得 到 纯化 的 某 片 段 。 具 体 做 法 如 下 : 把 限制 性 内 切 酶 消化 样品 加 到 凝 胶 上 ， 电 泳 一 段 时 间 , 关 断 电源 ,将 凝 胶 取 出 ,浸泡 于 含有 溴 化 乙 锭 (ethidium bromide) 的 缓冲 该 中 ;DNA 条 带 就 可 显现 出 来 [也 可 见 图 20-3 \b)]。 AA BRICK <7 4 Nini eae 插 到 DNA 分 子 中 后 , 它 的 荧光 显著 地 加 强 了 。 因 此 ， 使 用 近 紫 外 波段 的 光线 _ 照射 凝 胶 ， 并 由 发 出 很 强 荧光 的 位 置 ， Boi WB LS a 对 DNA 条 带 的 存在 进行 定位 。 然 后 在 Gabi ame Beets Beal ltd ws I bP RK RE DH | mma Ty takes as is 小 井 ,向 小 井 内 注 满 缓冲 液 。 再 通电 , 随 mT — 之 ， 可 以 见 到 片段 在 向 前 移动 。 当 所 感 兴趣 的 族 段 移动 到 含 缓冲 让 的 小 井 时 ， 关闭 电源 。 这 时 缓冲 芒 中 含有 DNA Fr 有 Bio W& DNA 片段 的 缓冲 液 吸 出 ， 即 20-11 分 离 一 个 特定 限制 往 内 切 酶 片段 的 方法 。 得 到 纯化 了 的 片段 〈 见 图 20-11)o 重组 DNA 分 子 的 检测 从 理论 上 讲 ， 如 前 面 章 节 所 述 ，DNA 分 子 的 连接 是 一 个 直接 的 过 程 。 但 实际 情况 要 复杂 一 些 。 如 果 将 已 由 限制 性 内 切 酶 切割 过 的 载体 ， 与 一 组 未 经 分 级 分 离 的 DNA 的 BR fall HE A Bs Fr BK ,结果 会 形成 好 几 种 类 型 的 分 子 , 如 不 带 有 任何 外 来 DNA Fr 段 的 载体 的 自我 连接 的 分 子 , 带 有 一 个 或 多 个 外 来 DNA 片段 的 载体 ,以 及 外 来 DNA Fr 段 的 自我 连接 的 多 聚 体 。 第 三 类 仅 由 外 来 DNA 形成 的 多 聚 体 分 子 不 能 稳定 地 转化 已 由 CaCl, 处理 过 的 细胞 。 因 为 一 般 地 说 ， 这 类 分 子 缺 乏 复制 起 点 及 复制 基因 。 形 成 这 类 分 子 ,除了 消耗 外 来 DNA 片段 的 不 利之 外 , 并 不 造成 对 重组 分 子 检 出 的 任何 困难 。 然 而 ， 在 工作 中 确实 需要 用 一 些 方法 去 检测 经 CaCl， 处 理 过 的 转化 细胞 中 的 质粒 《或 噬菌体 ) 是 否 的 确 携 带 了 插 人 的 外 来 DNA 片段 。 更 进一步 说 ,即使 质粒 携带 了 外 来 的 供 法 DNA 。 202。 eee Ss 。，，， FE, bHMRIEM THA REE REM. Alt, t-PA RM 手段 应 当 是 用 于 检测 是 否 含 有 目的 质粒 的 方法 。 同 样 地 ,以 噬菌体 及 病毒 为 载体 的 工作 ， 也 存在 着 这 种 任务 。 本 章 将 要 介绍 几 种 解决 这 种 问题 的 方法 。 保证 质粒 载体 含有 插入 DNA 片段 的 方法 pBR 322 是 DNA 克隆 中 使 用 得 最 广泛 的 质粒 ; 它 是 一 个 较 小 的 DNA 4F, OF 量 为 29X10, 有 两 个 不 同 的 抗生素 抗 性 记号 ， 即 抗 四 环 素 (tet) 及 抗 氨 共 青 霉 素 《amp+)e。 因此 ， 可 以 通过 把 一 个 转化 了 DNA 的 细菌 培养 物 接种 到 含有 四 环 素 或 AK 青霉素 的 培养 基 土 ?并 置 于 生长 温度 条 件 下 , 凡 在 这 种 培养 基 上 能 生长 的 菌 一 定 含 有 上 述 pBR 322 质粒 ,利用 此 特性 可 以 检 出 PBR 322 质粒 。 又 因 pBR 322 具有 七 个 不 同 的 限 制 性 内 切 酶 的 切 点 ,外 来 DNA 可 以 插 到 这 些 位 点 上 。 检测 插 人 作用 的 一 种 最 普通 的 方法 是 插入 失 活 作用 Cansertional inactivation), 这 个 pBR322 下 amp- ter-r- 切割 ,并 与 外 来 DNA 一 起 退火 amp-rtet-r oe amp-r tet-s a be Amp=-Tet- 的 细胞 ECG Amp-Tet~ imp-r Tet-r Amp-r Tet-s ' 生 长 在 含 环 丝氨酸 和 四 环 素 的 培养 基 上 Amp Tet- : Amp-r Tet-s RFS ARGEK 的 琼脂 板 上 Ce Amp-r Tet-s 20-12 分 离 含 有 外 来 DNA FRONRARKITE He ° 203 。 ‘-OH .. \\5-P! | see 3 一 一 一 -一 -一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 -一 @ec =——8 === 一 一 -一 一 一 or-… 一 一 一 人 ——- 无 外 来 DNA 带 有 外 来 DNA 连接 酶 | (只 对 3' -OH 及 5' -了 连接 ) (se aes sem em =o 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 == = > === 升温 使 温度 足够 于 了 融 解 小 片段 片段 是 分 开 的 重 登 区 的 长 度 足够 稳定 ,故此 | 转化 ”连接 单位 仍 保持 其 完整 性 无 转化 作用 有 转化 作用 图 20-13 防止 限制 性 内 切 酶 切割 后 的 质粒 重新 再 组 建 到 一 起 的 方法 : 用 碱 性 磷酸 单 酯 酶 处 理 质 粒 DNA. 过 程 的 进行 示 于 图 20-12。BamHI 及 Sall 的 位 点 处 于 tet 基因 之 中 。 因此 ， 在 这 两 个 位 点 插入 外 来 DNA WEL, 就 产生 具有 amp+ tet 特点 的 质粒 ,因为 tet 基因 《 指 对 四 环 素 有 抗 性 的 基因 ) 已 经 失去 活性 。 野 生 型 细胞 (Amp” Tet) 不 能 在 含有 氨 趟 青 老 素 或 含 四 环 素 的 培养 基 上 上 生 长。 如 果 一 个 由 限制 性 内 切 酶 切割 而 产生 的 DNA 片段 与 一 个 经 限制 性 内 切 酶 切割 过 的 pBR 322 质粒 一 起 退火 ， 然 后 用 这 个 连接 的 杂交 质粒 去 转 化 细 著 细胞 ， 再 将 此 种 细菌 细胞 悬 汉 液 涂 布 于 含有 氨 共 青霉素 的 琼脂 平板 上 。 存活 下 来 的 细菌 必然 是 Amp+ 的 ,它们 必定 具有 上 述 质粒 。 又 因为 pBR 322 还 携带 着 tet 等 位 基因 ,因此 ,除非 有 一 段 外 来 DNA 插 到 tet+ 等 位 基因 上 ,否则 这 种 Amp 的 菌落 也 必然 有 Tett 的 特性 。 那 些 表 现 为 Amp+ Tet 的 细菌 细胞 则 不 仅 有 PBR 322 质粒 ， 而 日 此 质粒 的 tet 基因 上 还 插 有 外 来 供 体 的 DNA 片 疏 。 这 有 段 操作 可 以 通过 在 将 细 画 县 液 涂 布 之 前 ;让 细菌 在 含有 环 丝氨酸 及 四 环 素 的 培养 液 中 生长 一 段 时 间 而 得 到 简化 水 乞 握 酸 杀 死 生长 着 的 细胞 。 但 是 Tett 细胞 仅仅 是 被 四 环 素 抑制 着 ,并 不 被 四 环 素 杀 死 。 因此 ， 在 这 个 培养 液 中，Tet- 细胞 (它们 生长 着 ) 被 杀 死 了 ,而 Tet ”细胞 《它们 被 抑 制 善 ) 没 有 被 杀 死 。 把 接受 过 这 种 处 理 的 细菌 悬浮 液 再 涂 布 于 含有 氨 共 青霉素 的 培养 基 平板 上 , 产生 Amp* Tet” 的 细菌 菌落 ， 所 有 这 些 菌 落 都 具有 携带 着 供 体 DNA 片段 的 pBR 322o pBR 322 质粒 中 的 Pstl 位 点 处 于 amp 基因 中 ， 因 此 ,插入 失 活 作用 也 可 以 用 在 这 个 位 点 上 。 如 果 确 实 进一步 这 么 做 了 ,就 应 当选 择 Amp ”Tet 菌落。 EcoRI 是 一 种 经 常 使 用 的 限制 性 内 切 酶 ,但 是 pBR 322 的 amp 基因 和 tet BAL 。204。 都 没有 EcoRI 的 作用 位 点 ,为 此 人 们 用 重组 DNA 技术 组 建 了 一 个 新 的 质粒 PBR 325, pBR 325 中 有 一 个 抗 氯 霉 素 的 抗 性 基因 ，EcoRI 酶 的 作用 位 点 就 在 这 个 抗 性 基因 内 。 因 此 ， 这 个 质粒 的 EcoRI 位 点 的 插 人 失 活 作 用 ， 可 以 通过 细胞 失去 对 毛 霉 素 的 抗 性 而 测 出 。 按 上 述 设计 已 构建 出 许多 普遍 使 用 的 有 插 人 失 活 作 用 的 质粒 。 对 它们 的 介绍 可 见 本 章 后 面 的 参考 文献 。 还 有 三 种 方法 被 选用 来 阻止 无 外 来 片段 的 质粒 重新 组 建 到 一 起 。 其 中 的 一 种 方法 就 是 用 碱 性 磷酸 单 酯 酶 〈alkaline phosphatase) 作用 于 那些 已 经 被 限制 性 内 切 酶 切割 的 质粒 。 碱 性 磷酸 单 酯 酶 移 去 了 5 -P, 留 下 了 5 -OH 基 。 除 非 插 和 人 外 来 的 DNA 片段 ,不 然 , 经 过 这 种 处 理 之 后 的 质粒 不 可 能 再 度 形成 有 功能 的 质粒 ， 如 图 20-13。 第 二 种 方法 ,用 均 聚 尾 法 进行 连接 自动 地 选择 ,从 而 防止 再 度 组 成 质粒 。 因 为 被 切割 过 的 质粒 的 两 个 3 -OH 末端 都 抽 上 了 由 同样 的 碱 基 组 成 的 均 聚 尾 。 方法 之 三 是 利用 特殊 类 型 的 质粒 ， 叫 做 柯 斯 质粒 〈cosmids ，cos-site-carrying plasmids)， 这 个 方法 将 在 下 面 介 绍 - 柯 斯 质粒 是 一 种 新 颖 的 载体 ,是 携带 着 cos 位 点 的 质粒 。 它 结合 了 质粒 及 1 RK 两 者 的 特性 ， 以 便 增加 选择 出 携 有 外 来 基因 的 重组 质粒 的 概率 。 一 种 典型 的 柯 斯 质粒 是 同时 携带 着 利 福 霉 素 抗 性 基因 (rift) 和 1 WESTBY cos 位 点 两 者 的 环 状 的 ColE1 质粒 《 见 第 十 七 章 )o 在 柯 斯 质粒 上 有 两 个 Hind III 的 作用 位 点 ,它们 把 rif 基因 和 cos 位 点 及 ColE 1 区 分 离开 来 在 第 十 五 章 已 经 介绍 过 cos 位 点 切割 体系 , EM 1 噬菌体 DNA 装 人 鸣 菌 体 头 部 有 应 答 反 应 。 如 果 能 够 满足 下 面 两 个 条 件 : (1) DNA 分 子 必须 含有 两 个 cos 位 点 ,(27) 两 个 cos 位 点 之 间 的 距离 一 定 不 小 于 3.8kb， 不 大 于 4.5 kb 时 ，Ter 体系 就 可 以 作用 于 DNA 分 子 。 柯 斯 质粒 可 以 用 作 载 体 是 基于 1 DNA .的 体外 包装 技术 ， 这 项 技术 的 要 求 就 是 刚才 已 经 提 过 的 Ter 体系 的 要 求 。 图 20-14 中 的 柯 斯 质粒 和 它 的 “Hind II 消化 产物 都 不 能 用 作 体 外 包装 〈in vitro packaging RW, AXA DNA 仅 有 一 个 cos 位 点 。 图 中 (Ma) 行 表示 如 果 这 种 分 子 与 另 一 种 分 子 一 起 退火 ， 在 许多 个 最 终 分 子 中 总 会 有 一 个 二 聚 体 ( 或 高 一 些 的 多 聚 体 ) 含 有 两 个 cos 位 点 o 但 是 Ter 体系 仍 不 能 在 这 个 分 子 上 起 作用 ,因为 cos 位 点 相距 太 近 ,只 少数 几 个 千 碱 基 对 ob) 行 表示 如 果 有 另 一 种 有 机 体 的 DNA (如 骆驼 的 DNA) 的 Hind III 限制 性 内 切 酶 片段 与 切割 过 的 柯 斯 质粒 的 DNA 混合 , 允许 它们 再 退火 , 那么 将 出 现 许 多 不 同 于 (a) 行 中 产生 分 子 , 这 些 分 子 中 一 定 会 有 一 种 两 个 cos 位 点 的 距离 适合 于 1 包装 体系 、 其 两 个 cos 位 点 由 足够 量 的 外 来 DNA 片段 所 分 开 的 线性 二 聚 体 分 子 。 因 些 , 这 种 体外 包装 过 程 有 可 能 产生 出 一 群 转 导 颗 粒 , 这 些 颗 粒 都 含有 一 条 线性 的 ,在 每 一 端 都 有 一 个 正常 4 IE fe DNA 的 粘性 末端 的 \ 重 组 的 柯 斯 质粒 DNA 的 分 子 。 注 意 , 这 种 包装 仅仅 发 生 在 柯 斯 质粒 含有 外 来 DNA 片段 的 情况 下 (虽然 也 有 可 能 装 人 含有 多 个 rif 基因 的 拷贝 的 BRB). (Cc) 行 表 示 用 带 有 柯 斯 质粒 的 转 导 颗粒 去 感染 Rift 型 的 大 肠 杆菌 细胞 的 结 Re: ”不 再 形成 只 菌 体 ， 因 为 转 导 颗粒 中 已 没有 鸣 菌 体 基 因 。 柯 斯 质粒 DNA 被 注射 到 细 效 细胞 中 ， 通 过 2 DNA 的 cos 位 点 粘性 末端 而 环 化 。 柯 斯 DNA 一 且 被 环 化 并 被 连接 完全 , 它 就 可 以 使 用 ColEl 的 复制 体系 进行 复制 。 将 这 种 受 感 染 的 细菌 接种 到 含 利 和 福 霉 素 的 琼脂 培养 基 上 ,选择 含有 rif BW, ColEl 区 及 外 来 DNA 的 细胞 。 。205。 (e) Hind Ill 点 FA Hind Ill 分 解 . ColE1 cos rif ee ee ee 一 一 一 5th Be 一 起 退火 ColE1 cos rif ColE1 [orem Fit cos ti RMB AI, 故 不 形成 噬菌体 颗粒 (9 了 平 WE 骆驼 的 DNA 与 柯 斯 质粒 片段 一 起 退火 cos rif ColE1 cos rif ne Cay —_ oo ae eet Cee ColE1 cos rif 体外 包装 a ae Onir ae ColE1 | ven eaten a -__ aE | Rif-s 的 细菌 柯 斯 质粒 用 ColE1 复 制 体系 进行 复制 带 骆 驼 DNA 的 Rif-r 4 图 20-14 用 柯 斯 质粒 作为 质粒 〈a) 切割 柯 斯 质粒 。(b) 形成 转 导 颗粒 。(c) RSE: 保证 噬菌体 载体 含有 外 来 DNA 片段 的 方法 有 两 种 方法 可 用 于 克隆 基因 到 大 肠 杆菌 的 1 噬菌体 中 。 这 两 种 方法 都 是 基于 1 吻 菌 体 DNA 有 一 些 为 溶菌 生长 途径 所 不 需要 的 中 央 区 基因 ( 即 b2、int\xis\red、8gam 及 cIIE 基因 等 )。 这 些 基 因 被 称 之 为 非 必需 区 域 的 基因 〈 见 第 十 五 章 )。 1 的 变种 1g! 4。18 在 近 非 必需 区 域 的 末端 有 两 个 EcoRI 限制 性 内 切 酶 作用 位 点 《野生 型 1 有 五 个 EcoRI 位 点 ,但 在 制作 1gt4。2p 时 ,用 遗传 操作 法 去 除了 三 个 位 点 )。 使 用 这 个 1g8t4，18 载体 时 ， 先 用 EcoRI 酶 作用 于 载体 DNA ,再 电泳 ， 分 离 出 三 个 片 段 ， 弃 去 中 间 的 片 眉 , 保 留 两 个 末端 片 腿 〈 图 20-15)。 这 两 个 末端 片段 可 以 通过 互补 的 > 206° 单 链 未 端 而 连接 到 一 起 ， 但 是 连接 后 的 分 子 没 有 感染 性 ， 因 为 些 分 子 的 长 度 只 有 野生 型 1DNA 的 72%, 而 可 以 装 到 A 噬菌体 头 部 的 最 短 DNA 长 度 应 当 是 野生 型 1DNA 的 77 免 。 然 而 ,如 果 插 人 外 来 DNA 片段 到 两 个 末端 片 朋 之 间 ， 产 生出 的 杂交 DNA 分 子 就 有 感染 性 了 , 即 能 产生 子 代 唆 苗 体 , 因 为 杂交 DNA 已 可 以 包装 到 1 MAS Agt-AB 用 限制 性 内 切 酶 消化 及 部。 因此 , 如 果 用 两 个 未 端 DNA 片段 [semen worm ne 和 外 来 DNA 片段 的 混合 物 进行 退火 而 pepe 得 到 的 DNA 去 感染 大 肠 杆 菌 细 菌 培养 maa DNA ie ee 一 ee ich at DNA, | #8 1 MERKR—AAS Rh eG lac 操 纵 子 (前 已 提 到 ,是 指 乳糖 操纵 子 ) 的 一 部 分 ， 其 中 包括 lacZ 基因 、lacP 启动 子 及 lacO 操纵 基因 。 在 lac 操纵 子 部 分 有 一 个 限制 性 内 切 酶 的 切割 位 点 ， 所 图 20-15 重组 DNA 包装 到 噬菌体 颗粒 中 。 以 当 外 来 基因 在 喉 菌 体 中 的 这 个 位 点 上 揪 人 时 ,就 产生 出 一 个 有 组 成 型 合成 8- 半 乳糖 背 酶 性 质 的 噬菌体 。 有 几 种 8- 半 乳糖 背 酶 的 底 物 ,它们 是 非 诱 导 型 的 底 物 ,能 在 p- 半 乳糖 音 酶 的 切割 下 产生 有 色 化 合 物 。 如 果 把 这 种 底 物 抄 人 到 培养 基 琼 脂 中 , 再 涂 布 接种 lac OF 细胞 及 lac O 细胞 (构成 型 ) 的 混合 悬 六 于 琼脂 平板 上 , 含 lac O- 的 菌落 将 是 有 颜色 的 ， 因为 只 有 这 些 细胞 合成 6- 半 乳 糖苷 酶 。 同 样 ,如 果 把 生 色 底 物 抄 人 到 培养 基 琼 脂 中 ， 在 其 上 人 允许 长 出 布 满 lac OF 细菌 的 菌 昔 ,再 涂 布 接种 lacO+ 噬菌体 及 lac O” 鸣 菌 体 的 混合 液 于 lacO+ BALE, lacOt 鸣 菌 体 将 产生 无 色 吻 菌 斑 ， 而 lacO” 噬菌体 〈 它 含有 插入 的 外 来 DNA 片段 ) 将 产生 有 色 的 喉 菌 斑 。 鉴定 含有 外 来 DNA 片段 的 质粒 的 物理 学 方法 对 于 某 些 实验 来 说 , 并 不 需要 特定 的 外 来 DNA RATER lin, Ze 某 些 真 核 DNA 的 遗传 学 结构 的 研究 中 需要 相互 独立 的 DNA 区 域 的 克隆 片段 ,但 是 并 不 需要 携带 特定 基因 的 片 疏 。 这 样 的 质粒 也 许 能 因为 它 的 分 子 量 大 于 野生 型 的 而 易 被 检 出 。 如 果 插 人 一 个 重组 从 某 个 纯 mRNA 制备 得 到 的 独特 的 cDNA ， 这 时 分 子 量 上 特殊 的 增加 就 也 是 一 种 很 有 用 的 标准 。 直接 表示 分 子 大 小 的 方法 是 分 离 质粒 DNA, 测量 其 长 度 。 一 般 , 直 接 用 电子 显微镜 技术 扫描 是 令 人 乏味 的 ,因此 已 用 简单 的 电泳 技术 取而代之 ， 这 在 第 十 七 章 及 图 17-4 中 已 经 介绍 过 。 取 含有 质粒 的 细胞 的 单 菌落 培养 物 的 溶菌 体 进行 电泳 (通常 一 次 同时 进行 16 个 不 同 的 菌落 电泳 ); 电泳 中 , 每 一 个 单 菌落 样品 中 的 质粒 DNA 的 量 足 够 作为 一 个 单个 的 条 带 而 被 观察 到 ， 它 泳 动 在 染色 质 的 前 方 。 质粒 DNA 移动 的 距离 与 它 的 分 子 量 相关 ,质粒 DNA 的 分 子 量 愈 大 , 它 移 动 的 距离 就 傅 短 。 因 此 那些 含有 供 体 DNA 的 较 大 的 质粒 就 移动 得 比 那些 不 含 供 体 DNA 的 质粒 略 慢 一 些 , 于 是 含有 供 体 DNA BAY ARIK RAR RAE KT o 如 果 认 为 质粒 含有 外 来 DNA 的 一 个 特定 的 片段 ,又 有 mRNA， 就 可 以 采用 两 种 不 ° 207。 同 的 杂交 手段 去 鉴别 证 实 外 来 特定 DNA 片段 的 存在 。 第 一 种 方法 是 ,如 果 使 用 放射 性 mRNA, ， 而 且 此 mRNA 又 只 与 外 来 的 目的 DNA HEA, BAILA AKT RRO Ae DNA 变性 后 固定 于 硝酸 纤维 素 滤 膜 上 , BAH mRNA, 在 DNA 与 mRNA 互补 复 性 之 后 ,洗涤 滤 膜 ， 滤 膜 上 存在 有 放射 性 ,表明 质粒 中 已 含有 互补 于 mRNA 的 、 待 测 的 外 来 DNA 片 奶 。 如 果 这 种 mRNA 也 与 宿主 DNA 的 一 部 分 互补 (例如 ， 一 个 天 肠 杆 菌 的 基因 克隆 到 大 肠 杆菌 中 ) ,那么 在 进行 杂交 实验 之 前 , 必须 先 把 质粒 DNA ot 出 来 ,使 质粒 DNA 与 放射 性 mRNA 杂交 , 以 找 出 质粒 中 与 mRNA 互补 的 那 一 段 外 来 DNA 片 段 。 第 二 种 方法 是 用 了 成 泡 法 (R-looping )。 如 果 已 得 到 纯 质 粒 DNA( 见 贺 20-16), 可 以 使 用 一 种 精巧 的 电子 显微镜 技术 : 将 质粒 DNA 在 一 含有 mRNA 的 缓冲 液 中 进行 ， 部 分 变性 ， 在 这 种 环境 中 ，DNA-RNA 杂交 体 比 双 链 DNA 更 加 稳定 。 因 此 ,如 曙 存 在 着 可 以 互补 的 RNA，, 那么 这 种 RNA 就 会 侵入 双 螺 旋 , 产 生 一 个 泡 状 物 ， 此 泡 由 一 单 链 分 支 (DNA) 及 一 双 链 分 支 (DNA-RNA) 所 组 成 。 (a) R 泡 的 形成 if 环 部 分 变性 ， — + Stat < 然后 冷却 7 mRNA 质粒 (b) 显现 于 电子 显微镜 下 ee 20-16 及 泡 的 形成 。 因 为 环 状 DNA 分 子 总 是 超 螺旋 的 ,在 变性 之 前 * 单 链 切口 (未 指出 ) 通 常 被 引进 质粒 中 ， 因 此 质粒 分 子 将 较为 每 展 并 更 加 容易 被 观察 到 。 对 于 含有 特定 DNA 片段 的 质粒 的 集群 般 选 检测 特定 外 来 基因 最 简便 的 方法 是 互补 作用 。 最 早报 道 的 实验 是 检测 酵母 组 氨 酸 合 成 中 的 一 个 特定 基因 ,是 通过 质粒 与 酵母 染色 质 片段 重组 , 再 把 一 群 重组 DNA 分 子 转化 到 一 种 特殊 的 His 大 肠 杆 菌 突变 株 中 而 检测 得 到 的 ， 转 化 后 有 些 细胞 就 含有 了 酬 母 基 因 ， 然 后 在 缺乏 组 氨 酸 的 培养 基 上 挑选 能 生长 的 Hist 菌落 。 但 以 上 方法 只 对 那些 可 以 互补 的 基因 有 用 ,对 于 被 克隆 到 细菌 中 的 动物 基因 此 法 一 般 不 成 功 。 因 为 通常 动物 DNA 在 细菌 中 或 是 不 表达 ， 或 是 没有 相应 的 细菌 基因 。 这 一 部 分 将 要 介绍 两 种 较 常 使 用 的 方 法 。 一 种 是 菌落 或 原 位 杂交 检验 法 (colony or in situ hybridization assay), 此 法 可 用 于 检验 是 否 存在 着 特定 基因 〈 图 20-17)。 另 一 种 是 免疫 化 学 检验 法 , 此 法 可 检验 是 否 存在 着 特定 基因 产生 的 人 们 所 感 兴趣 的 蛋白 质 产物 。 在 第 一 种 原 位 杂交 法 中 ， 先 把 被 测定 的 菌落 从 培养 血 中 琼脂 培养 基 表 面 转移 到 滤 膜 上 。 每 一 个 菌落 的 一 部 分 遗留 在 琼脂 上 ， 这 一 部 分 构成 参考 攻 。 BH NaOH 处 理 ， NaOH 溶解 细菌 ， 释 放 变 性 DNA ， 然 后 ， 烤 干 这 张 滤 膜 ,变性 的 DNA 就 证 固定 于 滤 Blo 将 此 烤 干 了 的 滤 膜 再 淄 于 °P 标记 的 、 与 被 搜索 的 基因 互补 的 mRNA HY 液 “208。 用 “P- 标 记 的 mRNA Wi Ww 然后 干燥 MEM KER (2 ye) He kK Cm / 菌落 在 滤 膜 上 DNA EERE mRNA 黑 点 指出 菌落 了 结合 到 滤 膜 上 的 所 在 位 置 20-17) 菌落 杂交 。 图 中 未 表示 出 参考 血 , 滤 膜 上 的 菌落 就 是 由 参考 血 复印 而 来 。 并 置 于 最 良好 的 复 性 条 件 之 下 ;使 mRNA 与 DNA 杂交 。 然后 洗涤 滤 膜 以 除去 未 2 fy @P-mRNA; 遗留 在 油膜 上 的 结合 的 放射 性 仅仅 是 那些 被 杂交 了 的 >P mRNA 的 cle SRT HBA LPR L RTSEe BM RARER MR MMH, Ra TSA ME a o | “REPO ARO TTI RRL te. USC OSL UES, SE RMB MMT RS ERE Sh BEAU ES ISR LL, RL eR BE DIE DNA 固定 并 变性 。 用 上 述 杂 交 过 程 来 检定 含有 人 们 所 感 兴趣 的 基因 的 噬菌体 所 形成 的 噬 菌 丙 , 然 后 从 参考 下 上 将 目的 噬 菌 班 移出 。 | 3 图 20-18 放射 性 抗体 试验 。(ayb) RAH DKA BNA Re a 培养 四 中 菌落 的 表面 上 。(c) 从 产生 莱 岛 素 的 菌落 中 形成 的 胰岛 素 分 子 结合 到 抗体 上 。(d) 塑料 圆 膜 尖 人 放射 性 抗 胰岛 素 的 抗体 溶液 中 。(e) 放射 性 粘着 到 塑料 圆 膜 上 产生 胰岛 素 的 菌落 处 。 另 -一 种 是 免疫 检验 法 。 如 果 形 成 了 目的 基因 的 蛋白质 产 物 ， 就 可 以 采用 两 种 免疫 学 技 休 来 鉴定 产生 蛋白 质 的 菌落 。 如 果 和 蛋白 质 被 分 这 出 来 ， 就 使 用 放射 性 抗体 试验 (A 20-18), 在 这 个 试验 中 ， 将 一 张 涂 有 能 与 基因 的 蛋白 产物 相 结合 的 抗体 的 圆 盘 状 塑 料 薄 路 于 到 菌落 上 面 。 如 果 菌 落 上 存在 着 蛋白 质 产物 ,这 种 蛋白 质 就 会 因 抗原 - 狗 体 关系 结合 刘 薄 膜 上 ,然后 把 这 张 圆 盘 状 塑料 薄膜 再 漫 人 到 一 个 含 放射 性 抗体 的 溶液 中 , 放射 性 抗体 © 209 - 就 结合 到 塑料 圆 盘 状 薄膜 上 的 蛋白 质 上 ,此 圆 盘 经 过 洗涤 后 ,进行 放射 自 显 影 。 放 射 性 的 位 置 表 示 了 能 合成 基因 产物 的 菌落 所 在 的 位 置 。 在 某 些 情况 下 ， 插 人 的 基因 可 取代 一 个 已 在 质粒 中 编码 的 蛋白 质 的 终止 密码 子 〈 即 质粒 基因 本 身 的 终止 子 )， 并 把 这 个 播 信 的、 人们 感 兴趣 的 基因 偶 联 到 质粒 基因 上 去 。 这 样 的 结果 是 产生 出 一 个 称 之 为 融合 蛋白 质 〈fused protein) 的 杂交 蛋白 质 分 子 。 这 个 杂 交 蛋 白质 分 子 带 着 一 部 分 质粒 蛋白 质 的 序列 ,起 始 于 氨基 末端 ,终止 于 所 感 兴趣 的 蛋白 质 序列 的 羧基 末端 。 前 面 介绍 的 免疫 学 方法 通常 也 适用 于 这 种 融合 蛋白 质 。 在 某 些 情 况 下 ， 融 合作 用 有 特殊 的 意义 。 如 正常 情况 下 细菌 不 把 人 们 感 兴趣 的 某 蛋 白质 分 刻 出 来 ,就 可 将 目的 基因 插入 到 同时 也 编码 8- 内 酰胺 酶 的 pBR 322 载体 上 。 一 且 所 感 兴趣 的 基因 被 插 人 载体 , 它 的 基因 产物 茶 蛋 白质 就 与 6- 内 酰胺 酶 融合 在 一 起 。p- 内 酰胺 酶 是 可 以 分 论 的 , 它 携带 着 人 们 感 兴趣 的 某 蛋 白质 穿 过 细胞 壁 ,来 到 细胞 外 , 这 时 ， 就 可 以 用 上 面 介绍 过 的 放射 性 抗体 法 或 下 面 将 要 介绍 的 免疫 沉淀 法 进行 化 验 。 在 检验 蛋 白质 产物 是 否 出 现 之 前 ， 可 以 根据 pBR 322 载体 对 四 环 素 的 抗 性 来 选择 Tet 细胞 《这 些 细胞 都 含有 pBR 322)， 并 通过 揪 人 的 失 活 作 用 来 检定 是 否 有 外 来 DNA Fr Bei FR 体 上 。 即 通过 在 Tet 细胞 中 选择 Amp” 特 性 ,可 以 把 Tet? Amp” 细 胞 选 出 ,再 用 上 述 方法 或 下 面 将 介绍 的 方法 对 这 些 被 选中 的 细胞 作 进 一 步 的 蛋白 质 产物 的 检验 工作 。 (a) (b) 图 20-19 免疫 沉淀 试验 。 在 含有 抗 -8 半 乳 糖苷 酶 抗体 的 琼脂 培养 基 上 形成 产生 6--EIE 酶 的 菌落 。(a) 围绕 着 每 一 个 菌落 形成 沉淀 素 区 带 。(b) Lact 菌落 (有 沉淀 素 区 带 ) 及 Lac w 沙 ( 无 区 带 ) 的 混合 物 。 还 有 一 种 是 免疫 沉淀 检验 法 〈immuno precipitation)。 此 法 也 可 以 用 来 鉴定 菌落 是 否 产生 蛋白 质 。 如 果 菌 落 分 记 蛋 白质, 那么 被 称 之 为 沉淀 素 (precipition) 的 抗体 -抗原 复 合 物 将 围绕 在 菌落 周围 ， 在 含有 抗体 的 培养 基 上 形成 一 个 用 肉眼 可 以 看 得 见 的 上 色 的 沉 . 淀 环 〈 见 图 20-19)。 将 上 面 这 个 免疫 沉淀 法 作 一 些微 小 的 修改 ,就 适用 于 测定 那些 并 不 分 泌 到 细胞 外 的 蛋白 质 。 第 一 种 修改 是 选用 对 于 叹 菌 体 1 cl 857 HARRY EA i, a cl857 是 含有 温度 敏感 阻 过 物 〈heat-sensitive repressor) AY’ 罕 变 株 ， 它 的 盗 源 性 在 温度 升 高 到 42sC 时 失去 。 测 试 过 程 为 : 先 把 含有 待 测 菌落 的 主 培养 下 中 的 菌落 经 复印 法 接种 到 一 个 含有 抗体 的 琼脂 的 复印 严 中 , 37sC 培养 ， 当 复印 严 中 开始 可 以 看 到 菌 *。210。 IN. GSA MBE 42°C 下 培养 。 KA 1 小 时 之 后 ,温度 升 到 42*C， 诱 导 许 多 细胞 进入 溶菌 过 程 ,细菌 细胞 溶解 ,因而 释放 出 细胞 内 含 物 。 于 是 所 感 兴趣 的 蛋白 质 得 以 与 琼脂 培 养 基 中 的 抗体 反应 ， 在 菌落 周围 生成 沉淀 环 。 第 二 种 修改 是 把 含有 抗体 和 溶菌 酶 的 温 热 的 琼脂 培养 基 倒 在 菌落 上 , 待 培养 基 冷 却 变 硬 ,溶菌 酶 在 细菌 表面 逐步 地 溶解 细胞 ， 细 胞 内 的 蛋白 质 逐 步 地 释放 出 来 。 同 样 地 , 在 人 们 感 兴趣 的 菌落 周围 形成 了 沉淀 环 。 es A See: 许多 实验 室 反复 利用 重组 DNA 技术 从 一 种 单一 的 生物 中 分 离 特定 的 基因 或 DNA 片段 。 例 如 ， 已 经 通过 对 一 族 克隆 了 的 DNA 片段 进行 分 析 , 研究 了 果 蝇 (Droroppile) 中 基因 的 空间 结构 (spatial organization) ， 这 部 分 将 在 第 二 十 二 章 讨论 。 要 完成 一 个 所 需 要 的 DNA 片 外 的 完全 的 克隆 过 程 是 很 花费 时 间 的 。 为 此 ,已 经 建立 了 含有 杂交 质粒 的 细菌 集群 ， 这 个 细菌 集群 有 足够 的 容量 ， 因 此 细胞 总 DNA 的 每 一 个 部 分 都 在 集群 中 可 出 现 一 次 《有 时 可 出 现 多 次 )。 这 个 集群 被 称 为 菌落 银行 (colony banks) 或 基因 文 库 (gene library)o 在 这 一 部 分 我 们 将 讨论 如 何 建立 基因 文库 ,以 及 如 何 测定 能 反映 每 个 序列 所 需要 的 克隆 数 。 酵母 DNA 文库 已 在 加 利 福 尼 亚 大 学 的 Santa Barbara 分 校 建立 。 载体 是 ColEl 质粒 。 为 了 形成 文库 ,可 用 EcoRI 酶 切割 ColE1 DNA,EcoRI 酶 在 ColE1 质粒 上 有 一 个 切 点 。 做 这 个 工作 要 避免 从 文库 中 得 到 的 许多 基因 是 以 一 个 完整 的 单位 存在 ， 但 是 用 限制 性 内 切 酶 又 会 把 某 些 基 因 切 开 。 因此 不 要 用 限制 性 内 切 酶 作用 于 酵母 DNA, 而 是 应 当 采 用 流体 剪 切 力 无 序 地 打 断 (通过 迅速 地 搅拌 酵母 DNA 溶液 )。 为 了 把 酵母 DNA 片段 连接 到 ColE1 RL, RAT SREB, MBSR (dT) 尾 加 到 切 开 的 ColEl DNA 的 3-OH 未 端 上 ,并 在 酵母 DNA HELMS (dA) 尾 ,然后 进行 分 子 连接 ， 再 转化 细菌 。 含 有 ColE1 后 的 细菌 细胞 对 加 到 培养 基 琼 脂 中 的 细菌 素 EL 有 抗 性 ,因此 可 以 利用 这 个 特性 很 容易 地 把 含有 ColE1 质粒 的 细胞 分 离 出 来 。 再 把 分 离 到 的 菌落 一 一 ” 深 刺 接种 到 一 个 塑料 板 上 的 各 个 小 井中 。 在 每 一 个 这 种 塑料 板 上 有 96 个 小 井 ,每 个 小 井 中 都 充满 着 固体 的 储存 培养 基 。 将 塑料 板 储 于 一 80"C。 在 一 80sc 的 温度 下 ,于 特殊 的 储 存 培养 基 中 ,细菌 大 约 可 以 维持 存活 的 状态 。 这 个 塑料 板 中 包含 了 一 个 完整 的 基因 文库 。 现 已 观察 到 至 少 有 70% 的 菌落 中 含有 酵 母 DNA。 下 面 给 出 简单 的 计算 式 , 使 人 们 可 以 测 出 为 形成 一 个 完全 的 文库 需要 多 少 个 菌落 。 假定 现在 有 一 个 DNA 分 子 , 这 个 分 子 含 有 一 些 一 定 大 小 的 DNA HED SEH f 表示 每 一 个 片 朋 占 该 有 机 体 总 'DNA 的 组 分 数 , 用 YN 表示 集群 中 的 菌落 数目 ， 用 己 表示 某 特殊 基因 在 这 个 集群 菌落 中 出 现 的 概率 ,于 是 P 一 (1 一 Ps 或 . N = In(1 — P)/\n(1 — f) 假设 我 们 希望 概率 达到 0.99， 即 每 一 段 序列 都 在 文库 之 中 , 即 P= 099。 如 果 供 体 DNA 是 单 倍 体 酵 母 〈 其 分 子 量 约 为 10%), 而 且 剪 切 出 的 DNA 片 女 的 平均 分 子 量 为 e。 211。 8 x 10°, #kA f= 8 < 106/10" = 0.0008 于 是 六 一 [ln(1l 一 0.99)]/[in(kl 一 0.0008)] = 5754 因此 , 当 文库 中 大 约 有 5 800 个 菌落 时 ,就 有 99 9 的 把 握 说 , 任何 一 个 酵母 基因 至 俏 座 沙 于 一 个 菌落 之 中 。 如 果 要 进一步 细 究 , 可 随意 挑选 少数 菌落 ,酵母 DNA 的 序列 在 它们 中 {Ruy REAR BSA 对 于 具有 大 DNA 分 子 的 细胞 〈 如 果 蝇 ) 来 说 , 产生 基因 文库 所 必需 的 菌落 数 约 为 30000 个 。 如 加 大 构成 DNA 片段 的 大 小 倍 ,那么 菌落 数 约 可 减少 2 倍 。 如 果 需 要 一 个 含有 特定 DNA 片段 的 克隆 ,在 原则 上 可 以 采用 本 章 前 面部 分 所 介绍 的 任何 一 种 方法 进行 筛选 。 也 可 以 用 1 鸣 菌 体 为 克隆 载体 建立 基因 文库 ， 通 过 对 保存 在 多 井 塑料 板 中 的 重组 鸣 菌 体 进行 悬浮 可 以 得 到 文库 中 的 多 个 基因 。 鸣 菌 体 文 库 揪 进 到 单个 鸣 菌 体 颗粒 中 的 DNA 的 最 大 容量 是 有 限 的 。 对 于 一 种 有 机 体 来 说 ， 建 立 一 个 完全 的 文库 所 需要 的 最 少 的 鸣 菌 体 数目 ， 可 以 由 人 允许 揪 到 单个 吻 菌 体 中 的 外 来 DNA 的 最 大 容量 而 测定 出 来 。 对 已 有 的 1 载体 来 说 ,插入 的 DNA 片段 分 子 量 不 能 超过 8 x 10 。 因 此 建立 一 个 鸣 蓝 体 文库 所 需 的 最 少 鸣 菌 体 数 目 对 于 大 肠 杆菌 酵母 和 果 量 来 说 ,分 别 是 2900、5 800 及 300000。 从 克隆 的 基因 生产 蛋白 质 基因 工程 的 目标 之 一 是 大 量 地 生产 一 些 难于 取得 的 特殊 蛋白 质 (例如 ,在 每 个 原 有 细 胞 中 仅 有 很 少数 几 个 分 子 的 某 蛋 白质 ;或 是 某 种 本 身 有 致 病 性 的 蛋白 质 ,其 操作 一 般 是 有 Bi). 遗传 工程 方法 从 原理 上 讲 是 很 简单 的 : 把 基因 偶 联 到 有 启动 子 的 载体 上 ， 进 行 测试 以 保证 基因 在 正确 的 方向 上 , 因此 编码 链 被 转录 , 进而 被 翻译 成 蛋白 质 。 所 选用 的 载 体 通常 是 一 种 高 拷贝 数 的 质粒 ,或 是 一 种 活跃 复制 的 噬菌体 〈 如 1)， 因 此 细胞 中 存在 着 大 量 拷贝 的 基因 。 这 就 能 使 细胞 合成 出 高 达 细 胞 总 蛋白 质 含量 的 1 一 5%% 之 多 的 基因 产 物 一 一 某 特 定 蛋 白质 ， 或 以 每 升 培养 基 形 成 10 一 50 mg 蛋白 质 的 产量 生产 这 种 特定 的 蛋 白质 。 : 实际 上 ,不 会 总 是 遇 到 生产 大 量 目的 蛋白 质 的 目标 , 因为 还 有 各 种 各 样 的 理论 的 和 技 © 术 性 的 问题 。 下 一 部 分 将 要 介绍 某 些 这 类 问题 以 及 如 何 解决 这 些 问 题 的 种 种 办 法 。 生产 真 核 生 物 蛋白 质 中 的 问题 如 果 要 得 到 细菌 基因 或 噬菌体 基因 产生 的 蛋白 质 ， 可 以 用 直接 的 方法 生产 它们 。 但 如 果 是 真 核 基因 ,就 会 遇 到 下 列 一 些 特殊 的 问题 : 1. 可 能 细菌 的 RNA 聚合 酶 不 能 识别 真 核 的 启动 子 。 2. 由 真 核 基 因 转 录 生 成 的 mRNA 可 能 缺乏 结合 到 细菌 核糖 体 上 的 Shine-Dalgarno 序列 。 3. 真 核 mRNA 可 能 含有 必须 除去 的 内 含 子 。 4. 真 核 基因 的 产物 通常 必须 再 进行 加 工 处 理 。 。 212。 5. 细菌 本 身 具 有 的 蛋白 酶 常常 识别 出 由 细 蓝 合成 的 真 核 蛋 白质 是 外 来 蛋白 酶 ， 而 加 以 破坏 。 其 中 第 1、 第 2 个 问题 通常 可 以 通过 把 基因 偶 联 到 lac 或 1 的 启动 子 上 而 解决 ， 下 面 将 要 叙述 。 内 含 子 的 问题 是 可 以 避免 的 。 如 若 我 们 可 以 从 细胞 中 获得 充分 加 工 过 的 mRNA, 那么 可 以 由 它 来 制备 cDNA ， 再 把 这 种 cDNA 连 到 载体 上 就 可 以 迎 避 内 含 于 问题 ; 另 一 种 做 法 ,如 若 已 知 蛋白 质 分 子 并 不 很 大 ,其 氨基 酸 序列 又 已 弄 请 楚 , 那 么 可 以 直接 合成 该 蛋白 质 的 基因 ， 再 把 此 合成 基因 连接 到 载体 上 。 关 于 加 工 问题 相对 地 说 比较 难 解决 虽然 在 某 些 情 况 下 ; 先 分 离 出 新 生 蛋 白质 ,然后 可 以 在 体外 对 它 进行 加 工 , 然 而 许 多 成 熟 的 蛋白 质 是 初始 翻译 产物 的 修饰 形式 ， 这 个 事实 对 于 使 用 细菌 来 生产 真 核 蛋白 质 有 一 定 的 限制 作用 。 细 菌 蛋白 酶 对 真 核 蛋 白质 的 破坏 则 推测 可 以 通过 突变 作用 而 加 以 消 除 , 至 少 部 分 地 消除 。 下 面 还 将 简短 地 介绍 一 些 用 细菌 合成 的 动物 蛋白 质 。 近来 ,酵母 的 2 微米 质粒 〈 见 第 十 七 章 ) 已 经 用 作 真 核 基因 克隆 的 运载 物 了 。 到 目前 为 止 已 经 进行 过 的 研究 结果 表明 ,对 于 酵母 这 个 体系 来 说 ,并 不 存在 前 面 所 述 的 真 核 基 因 在 细菌 中 表达 可 能 遇 到 的 种 种 困难 及 问题 ,或 者 说 这 些 问 题 在 酵母 体系 中 已 得 到 解决 。 酵 母 的 RNA 聚合 酶 能 识别 动物 基因 的 启动 子 ,酵母 中 的 加 工 体系 显然 可 以 移 去 动物 基因 中 的 内 含 子 并 对 某 些 动物 蛋白 质 进 行 加工 。 还 有 ,在 酵母 体系 中 ,外 来 的 真 核 蛋 白质 降解 得 较 少 ,这 一 特点 很 令 人 注目 ,因为 也 许 许 多 真 核 蛋白 质 和 原核 蛋白 质 有 着 至 今 还 未 被 人 们 认识 的 某 些 很 不 寻常 的 性 质 。 酵母 体系 在 1982 年 之 前 ， 还 没有 被 适当 地 开发 使 用 ， 至 今 已 发 现 有 众多 的 潜在 用 途 。 此 外 ,上 面 的 结果 ,也 预示 着 原核 生物 与 真 核 生 物 之 间 的 进 化 过 渡 (evolutionary transition) 是 一 个 有 重大 意义 的 生物 化 学 事件 一 一 没 有 真正 的 细胞 核 的 细胞 与 已 经 有 真正 的 细胞 核 的 细胞 确实 有 某 些 同一 性 。 一 个 克隆 基因 的 表达 克隆 基因 的 表达 要 求 基因 能 够 转录 并 能 够 翻译 。 认 我 们 来 看 一 看 人 们 是 如 何 设计 一 个 使 克隆 基因 可 以 表达 的 体系 的 。 通常 ,限制 性 内 切 酶 的 位 点 把 基因 的 编码 区 与 其 启动 子 分 割 开 , 因 此 ， 除 非 再 提供 另 一 个 启动 子 , 当 该 目的 基因 被 插 人 到 一 载体 之 后 , 方 能 被 转录 出 相应 的 mRNA。 如 果 这 个 载体 在 插 人 位 点 附近 含有 一 个 载体 的 启动 子 , 那 就 可 以 利用 这 个 启动 子 〈 通 常 ,这 个 启动 子 应 当 是 与 插 人 位 点 相 邻 的 那个 基因 的 RNA 聚合 酶 的 结合 位 点 )。 但 是 ,对 于 许多 载体 来 讲 , 常 常 不 存在 这 样 一 种 启动 子 , 于 是 就 必须 再 外 加 一 个 启动 子 到 克隆 载体 上 。 因 此 , 进 行 这 类 工作 时 显然 应 当 插 人 一 个 很 强 的 启动 子 以 达到 最 大 的 转录 效果 。 最 普遍 的 办 法 是 用 重组 技术 再 设计 一 个 质粒 , 它 或 是 具有 大 肠 杆 菌 乳 糖 操纵 子 的 启动 基因 -操纵 基因 区 域 《第 十 四 章 ) 或 是 具有 大 肠 杆 菌 4 噬菌体 的 cl 阻 遏 基因 -oL-pL 区 域 ( 见 第 十 五 章 )。 这 两 种 体系 都 可 以 对 克隆 系 的 基因 的 转录 作用 进行 调控 。 例 如 ,在 第 一 种 情况 下 ,可 以 通过 加 和 乳糖 操纵 子 的 诱导 物 ( 如 弛 糖 或 IPTG) 而 使 转录 开始 ,也 可 以 通过 加 入 葡萄 糖 (降低 CAMP 的 浓度 ) 而 终止 转录 。 对 于 a 体系 ,如 果 使 用 有 温度 敏感 阻 遏 物 的 噬 菌 株 (tempratu- re-sensitive repressor， 被 称 之 为 cl 857)， 当 温度 升 高 到 40° 以 上 时 ,转录 开始 ,在 这 种 较 高 的 温度 下 阻 遏 物 变 性 ;然而 当 温度 下 降 到 34°C 时 ,转录 就 会 终止 〈 在 该 温度 下 , 阻 歇 物 又 有 活性 了 )e ZEBRA EEA RSE ROI PF RES SF LA A HEA ; 序列 与 核糖 体 结合 位 点 切 开 。 因 此 ,进行 表达 时 还 必须 提供 这 个 位 点 。 在 这 方面 ,以 上 介绍 的 插 和 人 lac 及 1 体系 是 经 过 很 好 的 设计 而 产生 的 , 它们 具有 很 强 的 核糖 体 结 合 位 点 。 但 是 ， 如 果 将 一 个 具有 目的 基因 的 限制 性 内 切 酶 片 有 侦 偶 联 到 有 功能 的 启动 子 及 核糖 体 结合 位 点 上 并 不 能 保证 基因 一 定 能 正确 地 表达 (图 20-20)。 基 因 的 限制 性 内 切 酶 片 眉 的 两 端 oye 一 一 一 和 一 一 一 载体 — 片段 ra 指出 方向 正确 的 mRNA 无 用 的 mRNA 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 和 四 四 四 到 直到 到 — a 连接 单位 aja een 2 正确 方向 不 正确 方向 图 20-20 ”一 个 克隆 基因 以 相对 于 启动 子 p 的 两 种 方向 插 人 到 载体 中 。 具有 相同 的 单 链 末端 ,因此 基因 可 以 以 两 种 可 能 的 方向 插入 到 载体 中 。 鉴 于 任何 基因 只 有 一 条 链 是 编码 链 , 因 此 ,只 有 按 某 个 方向 插 人 ,才能 产生 有 用 的 mRNA。 两 种 方向 的 插 大 作用 以 同样 的 概率 发 生 着 ,因此 ,人 们 必须 从 中 选择 出 一 种 重组 载体 ， 在 这 种 载体 中 基因 处 于 正确 的 方向 。 如 果 有 目的 基因 产物 的 合成 ,那么 ,可 以 很 容易 地 检测 出 具有 正确 插 人 方向 的 克隆 。 然 而 ,如 果 没有 发 生产 物 合成 作用 ,那么 就 要 应 用 前 面部 分 所 叙述 的 一 些 方 pBR322 DNA 生长 激素 释放 抑制 基因 转录 及 翻译 - 二 HIN- 一 一 一 一 一 -一 一 -Met-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-~Phe- Phe \ SN Trp fe —Cys—Ser—Thr=Phe-Thr —Lys ~ HO | RAL N—_— Oo 4 a + H,N—-Ala—Gly— eves Cys-C | =m —Vet OH 片段 生长 激素 释放 抑制 因子 20-21 化 学 合成 的 生长 激素 释放 抑制 因 了 于 基因 连接 到 PBR322 lac 上 。 se。 214。 —_ 和 7 Py ae 法 进行 检测 。 下 面 将 要 介绍 合成 真 核 蛋 白质 的 两 种 成 功 的 尝试 。 从 细菌 的 基因 表达 调节 以 及 蛋白 质 合成 的 基础 研究 得 到 许多 详细 的 知识 ， 我 们 可 以 看 到 研究 者 是 如 何 运 用 这 些 知 识 作出 贡献 ,取得 成 功 的。 生长 激素 释放 抑制 因子 的 合成 生长 激素 释放 抑制 因子 是 在 下 丘脑 合成 的 由 14 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 一 种 多 肽 激素 。 这 个 很 短 的 多 肽 已 经 在 大 肠 杆 菌 中 用 一 个 很 简便 的 方法 合成 。 先 通过 化 学 合成 技术 合成 出 一 个 含有 51 个 碱 基 对 的 双 链 DNA 分 子 , 其 编码 链 的 碱 基 对 序列 是 TAC-(42 个 编码 生长 激素 释放 抑制 因子 的 碱 基 )-ACTATC; 相应 的 mRNA 的 碱 基 序 列 是 : AUG-(42 个 编码 生长 激素 释放 抑制 因子 的 碱 基 )-UG AUAG 因此 ,这 个 mRNA 有 一 个 蛋氨酸 密码 子 (这 个 密码 子 不 是 用 于 起 始 作 用 ), 一 个 生长 激素 释放 抑制 因子 的 编码 序列 ,以 及 两 个 终止 密码 子 。 所 采用 的 载体 是 经 过 修改 的 pBR322, 这 个 修改 质粒 含有 lac 的 启动 -操纵 基因 和 lack 基因 的 一 部 分 ， 这 一 部 分 编码 6- 半 乳 RSA NEH:- 端 片 仆 。 载体 被 限制 性 内 切 酶 作用 ， 在 lacZ A CA 20-21) 的 一 个 位 点 处 被 切 开 ,形成 平整 末端 ;然后 , 化 学 合成 的 DNA 分 子 用 平整 末端 连接 法 连 到 被 切 割 的 质粒 上 。 当 乳糖 操纵 子 被 诱导 时 ,就 形成 一 种 蛋白 质 ， 它 是 通过 蛋氨酸 将 8- 半 乳糖 背 酶 的 NH, 端的 部 分 序列 和 生长 激素 释放 抑制 因子 偶 联 到 一 起 的 一 种 融合 蛋白 质 , 并 且 被 化 学 合成 的 DNA 的 两 个 重复 终止 密码 子 所 中 止 。 提 纯 这 个 蛋白 质 , 再 用 省 化 氰 处 理 ， 溴 化 氰 仅 在 蛋 氮 酸 的 羧基 侧 进行 切割 。 后 来 ， 连 接 物 蛋 氮 酸 继续 附着 在 p- 半 乳糖 音 酶 ， 片 和 侦 上 ,而 生长 激素 释放 抑制 因子 则 被 释放 出 来 。 因 此 ,采用 溴 化 氰 对 偶 联 着 的 蛋氨酸 的 切割 技术 ， 对 从 细菌 蛋白 质 中 分 离 出 的 任何 一 种 本 身 并 不 含有 蛋 氮 酸 的 融合 多 肽 ， 是 一 种 很 有 用 的 处 理 方法 。 _ 胰 外 素 原 和 胰岛 素 的 合成 胰岛 素 是 一 种 激素 , 它 调 节 糖 代谢 ,是 临床 上 处 理 糖尿 病 患者 的 重要 药物 。 正 常情 况 下 人 们 可 从 牛 胰腺 中 获得 制剂 。 胰 岛 素 本 身 不 是 基因 的 直接 产物 ， 而 是 基因 合成 产物 再 通过 几 步 后 处 理 而 形成 的 物质 (图 20-22)。 基因 的 直接 产物 是 前 胰岛 素 原 。 经 第 一 次 切割 后 产生 胰岛 素 原 ， 即 首先 得 到 在 两 个 ieee GARBER) 具有 两 个 二 硫 键 的 胰岛 素 原 ， 然后 再 移 去 中 间 片 眉 〈C 片 眉 六 最 终 形成 胰岛 素 。 这 个 过 程 的 终结 是 两 条 分 别 含有 21 个 氨基 酸 残 基 及 30 个 氨基 酸 残 基 的 肽 链 ， 通 过 两 个 二 硫 键 组 成 一 个 胰岛 素 分 子 。 | 胰岛 素 已 经 以 两 种 不 同 的 方式 在 大 肠 杆菌 中 合成 。 第 一 种 方法 类 似 于 生长 激素 抑制 因子 合成 的 办 法 ,但 有 些 外 加 的 步 又。 首先 分 别 合成 编码 A 链 的 DNA 及 编码 B 链 的 DNA， 接着 分 别 把 这 两 个 DNA 片段 各 自 融 合 到 p- 半 乳糖 童 酶 的 基因 上 ， 并 再 克隆 到 两 个 不 同 的 细菌 中 。 然 后 ,分 离 出 融合 蛋白 质 8-gal-A 及 融合 蛋白 质 65-gal-B， 再 从 这 两 个 融 合 蛋白 质 中 提纯 出 A 链 及 B 链 。 最 后 将 A 链 B 链 混合 ， 二 硫 键 自发 形成 。 在 A 链 和 了 链 的 6 个 半 胱 氨 酸 之 间 无 序 地 形成 着 二 硫 键 ， 因 此 有 活性 的 胰岛 素 的 产量 很 低 。 第 二 种 方 *。 215。 OOH COOH HRS KE 胰岛 素 原 MER Ay 20-22 前 胰岛 素 原 体内 转变 成 胰岛 素 原 及 胰岛 素 。 书 中 内 容 讨 论 涉及 图 中 四 个 氨基 酸 的 位 置 。 (b) (a) FA Pst I 切割 ， 并 将 胰岛 素 原 基因 插入 一 一 一 -一 一 一 一 一 睛 yy 一 N tet Ae A pst pt ke ee RSRREA 基因 “基因 切割 位 点 -一 a a Bete 二 (c) -- (12 图 2?0-23 猪 胰岛 素 在 大 肠 杆菌 中 的 生产 。(a) 载体 pBR 322 质粒 。(b) 含有 胰岛 素 原 基 因 序 列 的 PBR 322。(c) 杂交 基因 产物 ,指出 了 胰岛 素 原 的 部 分 ( 斜 线 ) 及 二 硫 刍 《虚线 )。(d) AB 白 酶 消化 杂交 基因 产物 的 结果 。 法 ,将 编码 胰岛 素 原 的 DNA 克隆 到 pBR 322 质粒 中 。 这 个 方法 首先 要 从 猪 的 胰 脏 细胞 中 分 离 mRNA, BAS mRNA 制剂 混杂 着 各 种 细胞 质 mRNA, 但 是 它 富 含 前 胰岛 素 BR mRNA， 因 为 前 胰岛 素 原 是 胰 脏 细胞 的 主要 产物 。 利用 这 种 mRNA I AER RE ”合成 “DNA ,接着 再 用 限制 性 内 切 酶 Pst I 作用 后 得 出 一 定 的 DNA }FBt, 再 将 此 DNA 手段 克隆 到 pBR322 的 8 内 酰胺 酶 中 的 Pst I 位 点 中 (图 20-23)。pBR322 的 基因 型 是 tet”amp*。 上 述 杂交 pBR322 则 是 tettamp-,xt Tet- Amp 型 的 大 肠 杆菌 培养 物 进行 转化 之 后 ,筛选 出 Tet* Amp-， 以 保证 某 些 DNA 插 人 到 质粒 基因 中 。 然 后 再 用 放射 性 抗 胰岛 素 的 抗体 对 Tet+ Amp- 菌落 进行 筛选 ， 以 探测 类 胰岛 素 物质 存在 。 找 到 有 能 力 “216。 产生 胰岛 素 的 菌落 ， 再 测定 这 种 质粒 中 的 Pstl RARER 〈 见 图 20-23), SHR 然 其 中 存在 着 胰岛 素 原 序 列 , 但 是 PstI 作用 后 这 种 片 假 中 失去 了 前 胰岛 素 原 的 基因 的 一 部 分 。 体 内 转录 及 翻译 的 最 终 产 物 是 HIN-8- 内 酰胺 酶 -胰岛 素 原 -COOH 的 杂交 分 子 。 这 种 胰岛 素 原 分 子 中 的 C 片 眉 使 胰岛 素 原 能 正确 折合 。 另 一 方面 ，p- 内 酰胺 酶 片段 是 那 和 大 ,使 得 细菌 蛋白 质 酶 未 能 识别 出 胰岛 素 原 是 外 来 蛋白 质 , 因 此 胰岛 素 原 没有 被 蛋白 酶 降解 而 能 保留 下 来 ,并 在 以 后 能 发 挥 生物 活性 。 进一步 胰岛 素 分 子 可 以 于 体外 从 上 述 杂 交 和 蛋白 质 上 被 切 下 来 。 注 意 ,在 图 20-22 中 近 C 片 段 的 未 端 处 有 三 个 精 氨 酸 ,这 是 很 有 用 的 ,因为 胰 蛋 白 酶 仅仅 在 精 氮 酸 及 赖 氨 酸 的 羧 基 侧 切断 肤 链 ,这 一 点 可 以 在 工程 性 研究 中 加 以 利用 。 十 分 短暂 地 处 理 8- 内 酰胺 酶 -胰岛 素 原 的 杂交 分 子 (短促 地 处 理 使 酶 不 至 于 在 每 一 个 胰 蛋 白 酶 的 敏感 位 点 上 都 作用 ,而 把 底 物 完全 切 成 片 月 ) ,在 A、C 片 眉 之 间 适 当 的 位 置 上 临时 形成 一 个 切 点 ,而 在 B 链 的 羧基 端 有 另 一 个 切 点 ,使 之 只 留 下 一 二 个 多 余 的 精 氨 酸 。 另 外 也 还 需要 有 一 个 切 点 以 便 将 B 链 与 p- 内 酰胺 酶 分 开 。 但 是 ， 在 切 开 两 者 的 位 置 上 既 没 有 赖 氨 酸 也 没有 精 氨 酸 ,因此 从 8- 内 酰胺 酶 而 来 的 少数 几 个 氨基 酸 还 留 在 B 链 ， 这 样 的 胰岛 素 并 不 完美 ;不 过 ,这 个 修饰 过 的 分 子 也 有 生物 学 功能 。 目 前 还 不 清楚 这 种 修饰 方法 所 形成 的 产物 在 临床 上 是 否 有 用 。 从 克隆 的 基因 合成 其 他 的 真 核 生 物 蛋 白质 在 细菌 中 已 经 合成 了 几 种 其 他 真 核 生物 蛋白 质 。 酵 母 的 组 氨 酸 合成 体系 中 的 一 个 酶 的 基因 插 到 1 喉 菌 体 上 ,于 大 肠 杆 菌 中 有 效 地 表达 出 活性 。 还 在 大 肠 杆菌 中 生成 了 鸡 卵 清 蛋白 。 干 扰 素 也 已 经 可 以 在 大 肠 杆菌 中 合成 。 人 们 对 人 的 干扰 素 非 常 感 兴趣 ,因为 干扰 素 有 抗 病毒 作用 ,而 且 可 能 是 抗 肿 瘤 的 物质 。 现 在 每 个 细胞 中 干扰 素 产生 的 量 还 较 低 ,但 是 在 一 个 经 充分 诱导 的 lac” 细胞 中 却 可 产生 100000 拷贝 的 8- 半 乳糖 苷 酶 。 免 的 PRE ABA C 也 被 克隆 插 人 到 SV 40 病毒 中 。 当 用 这 个 杂交 病毒 去 感染 猴 肾 细胞 时 ， 合 成 了 兔 8 珠 蛋白 。 原则 上 ,任何 真 核 生物 蛋 白质 都 能 在 适当 组 建 的 细菌 中 合成 出 来 ,大 量 的 研究 正在 逐 步 地 取得 成 就 。 用 这 些 方法 使 与 医学 有 关 的 重要 的 物质 能 够 人 工 合成 出 来 ， 这 种 巨大 的 潜力 说 明 人 们 有 理由 为 之 付出 巨大 的 努力 。 重组 DNA 技术 的 应 用 2k, 我 们 已 经 讨论 了 利用 重组 DNA 技术 生产 有 用 的 蛋白 质 的 主要 方面 ， 这 当然 是 极其 重要 的 ， 同 时 ， 这 种 技术 还 在 其 他 两 方面 很 有 用 处 : 〈1) 作为 改变 有 机 体 基 因 型 的 方法 ; (2) 作为 一 种 研究 工具 。 细菌 可 以 完成 大 量 的 化 学 反应 ,但 是 没有 任何 一 种 细菌 可 以 进行 所 有 的 各 种 反应 。 然 而 ,通过 遗传 工程 ,可 以 把 细菌 有 机 体 改 造成 具有 好 几 种 细菌 特点 的 集合 体 。 例 如 ， 由 不 同 细菌 中 分 离 得 到 的 好 几 种 基因 已 经 被 插 到 同一 个 质粒 中 ， 这 种 质粒 又 被 置 于 海洋 细 菌 中 ， 这 样 产生 出 来 的 细菌 具有 代谢 石油 的 能 力 。 现 在 已 将 这 种 细菌 用 在 清除 海洋 中 石 油 盗 流 污染 的 工作 中 。 进 一 步 , 还 有 许多 生物 技术 公司 正在 制作 人 工 设 计 的 、` 可 以 合成 工 业 上 许多 重要 的 化 学 产品 的 细菌 。 还 有 , 现 已 选用 了 一 些 有 机 体 , 它 们 能 够 生产 大 量 的 极 oZ21j/s 其 昂贵 的 抗生素 药物 。 其 生产 过 程 成 本 低 得 多 ， 因 此 药物 的 售 价 可 能 会 相当 低廉 。 还 有 人 工 设 计 的 组 菌 可 以 比较 有 效 地 分 解 废物 ,以 及 固氮 〈 去 改良 土壤 的 肥力 )。 近 来 还 有 人 以 很 大 的 努力 去 创造 能 够 将 生物 废物 转变 为 乙醇 的 细菌 。 这 些 遗 传 工 程 在 世界 经 济 、 环 境 保护 及 生活 水 平 上 将 会 引起 巨大 的 冲击 。 改变 植物 的 基因 型 也 是 重组 DNA 技术 的 重要 应 用 。 在 第 十 七 章 我 们 已 讨论 过 致癌 BRIFER (Agrobacterium tumefaciens) 及 其 Ti 质粒 。 致 癌 农 杆菌 在 质粒 中 产生 冠 玖 肿瘤 。 这 些 肿瘤 致使 整合 了 外 来 目的 基因 的 质粒 DNA 进 到 植物 染色 体 中 , 通过 遗传 工程 就 有 可 能 把 特定 基因 由 一 种 植物 中 分 离 出 来 ,引入 到 这 种 Ti 质粒 中 ,然后 用 具有 杂交 Ti 粒 的 细菌 感染 第 二 种 植物 ,把 基因 从 第 一 种 植物 转移 到 第 二 种 植物 中 ,人 们 企图 以 这 种 方 式 进 行 植物 育种 。 有 一 个 例子 就 是 企图 通过 引入 豆 科 (HS. KE) 的 基因 改变 谷物 如 小 麦 的 根部 表面 的 结构 ,以 便 使 谷 科 植 物 兼 有 豆 科 植物 的 特点 ,如 建立 固氮 菌 的 根瘤 ; 如 ” 果 能 成 功 ,可 使 生长 谷物 的 土壤 对 氮肥 的 需要 减少 。 重组 DNA 技术 对 基础 研究 也 有 巨大 的 冲击 。 本 书 已 经 介绍 了 一 些 细菌 突变 株 , 这 些 突变 株 有 简化 了 的 体系 ， 使 得 突变 株 细菌 更 加 便于 人 们 对 它们 进行 研究 《如 lac 操纵 子 的 大 量 突变 体 )。 对 于 一 些 简单 的 突变 体 可 以 采用 标准 的 遗传 学 技术 直接 获得 (如 突变 作用 及 遗传 重组 ); 但 是 对 于 一 些 需要 许多 种 遗传 记号 的 复杂 的 突变 体 〈 这 些 记号 也 许 十 分 紧密 地 靠 在 一 起 ) 来 说 ， 因 为 产生 突变 体 的 频率 可 能 很 低 , 因而 分 离 获得 这 些 突变 体 的 工作 是 极为 庞杂 而 乏味 的 。 重 组 DNA 技术 则 可 以 简化 获得 突变 体 的 步 又 ， 因 为 可 以 提纯 含有 遗传 学 记号 的 片 眉 并 且 可 以 在 试管 内 使 它们 结合 到 一 起 。 这 样 做 可 大 大 节省 时 闻 ， 并 且 可 以 组 建 出 一 些 用 其 他 方式 往往 不 可 能 制 成 的 突变 体 。 此 项 新 技术 对 基础 研究 冲击 最 大 的 是 真 核 生 物 ， 特 别 是 真 核 基因 的 调节 。 在 第 十 四 章 介绍 的 观察 细菌 操 纵 子 的 实验 ,这样 的 研究 手段 在 真 核 生物 中 是 行 不 通 的 。 因 为 真 核 生物 是 双 倍 体 ,分 离 突变 体 的 工作 极端 困难 。 而 且 , 除 了 像 酵 母 那样 的 高 等 单 细 胞 生物 之 外 ,没有 简单 的 办 法 可 以 对 真 核 细胞 生物 进行 多 种 多 样 的 遗传 学 操作 。 $a 关于 细菌 中 基因 的 活性 可 以 通过 在 各 种 条 件 下 研究 mRNA 合成 而 测 得 。 最 方便 的 测定 法 是 DNA-RNA 杂交 反应 ,这 种 检验 需要 有 来 源 丰 富 的 含 待 研究 基因 的 DNA。 用 标准 的 遗传 学 方法 或 是 用 重组 DNA 技术 得 到 的 转录 颗粒 就 是 进行 这 类 实验 的 DNA 来 源 。 例 如 ， 测 定 lac mRNA 可 通过 它 与 1lac DNA 的 杂交 。 真 核 体 系 并 不 存在 转录 颗 粒 , 但 是 ,通过 DNA 技术 可 以 获得 , 即 把 待 研究 其 调节 作用 的 真 核 基因 先 克 隆 到 噬菌体 或 质粒 载体 中 ,然后 让 这 种 鸣 菌 体 生长 ,或 让 被 上 述 质粒 转化 了 的 细菌 生长 ,以 积累 DNA， 从 而 为 研究 者 提供 出 大 量 的 真 核 基因 DNA, 含有 这 种 特定 DNA 序列 的 载体 被 用 作 mRNA 的 探 针 : 将 这 种 DNA 进行 变性 后 ,再 加 到 细胞 中 , 细胞 内 含有 已 被 放射 性 标记 的 各 种 mRNA。 变 性 的 DNA 就 可 以 从 大 量 的 _ mRNA 中 搜查 到 特定 的 mRNA, LR 检定 mRNA 的 方法 是 基于 其 本 身 具 有 可以 与 DNA 杂交 的 特殊 能 力 。 应 用 这 项 技术 进 行 检测 ;先是 把 变性 的 DNA 探 针 附 着 到 硝酸 纤维 素 滤 膜 上 ,然后 将 特定 的 mRNA 再 结 合 到 滤 膜 上 , 即 除了 能 杂交 到 变性 DNA 上 的 mRNA 外 ,一 般 的 mRNA 并 不 能 结合 到 泪 膜 上 ,这 样 就 能 检测 到 特定 RNA 的 存在 。 这 项 技术 已 将 真 核 基因 调节 的 研究 工作 大 大 推进 了 一 步 , 也 为 第 二 十 二 章 所 介绍 的 大 量 内 容 提 供 了 信息 来 源 。 *。218。 关于 重组 DNA 的 辩论 70 年 代 晚 期 ,很 多 科学 家 \ 政 治 家 和 有 兴趣 的 非 专业 人 员 曾 争论 重组 DNA 技术 的 安 全 性 ， 这 个 问题 首先 是 由 科学 家 们 自己 提出 的 。 不 久 大 们 认识 到 ,创造 显然 有 害 的 有 机 体 是 不 值得 的 。 例 如 ;68- 内 酰胺 酶 基因 被 引入 到 链球 菌 〈Streptococcxwsr boyogene5), 引 起 机 体 产生 “ 链 霉 " 喉 及 风湿 热 ;如 果 这 种 杂交 细菌 从 实验 室 逸 出 进入 自然 界 ,那么 用 来 治疗 链球 菌 感染 的 青霉素 就 将 失效 。 人 们 对 于 从 肉 毒 杆 菌 中 得 到 的 肉 毒素 基因 引入 到 大 肠 杆菌 中 的 可 能 性 作出 更 强烈 的 警告 ， 因 为 如 果 这 种 细菌 菌株 建立 到 大 肠 杆 菌 的 天 然 所 在 地 一 人 的 大 肠 中 就 可 能 让 肉 毒素 引起 很 高 的 致死 态 感染 ， 一 天 之 内 便 死 亡 。 国 际 上 一 致 同意 禁止 组 建 这 些 显然 有 危险 性 的 细菌 。 辩 论 仍 在 继续 着 ， 然 而 争论 集中 在 组 建 的 带 有 外 来 基因 的 细菌 株 是 否 有 毒性 上 ,人 们 相信 当 释 放 到 自然 界 时 不 至 于 引起 明显 的 毒害 作用 。 有 人 认为 ， 科 学 家 没有 办 法 去 预言 真 核 基因 将 是 怎样 地 在 大 肠 杆 菌 中 得 到 表达 。 讨 论 的 各 种 意见 开始 在 展开 ， 关 于 这 方面 可 见 下 面 的 一 个 例子 。 假 若 在 一 段 含 有 人 们 所 感 兴趣 的 基因 的 DNA 中 可 能 还 含有 另 一 个 基因 ，, 这 个 基因 在 正常 情况 下 不 在 动物 的 细胞 中 表达 ， 但 是 在 细菌 中 则 表达 。 人 可 能 被 这 种 重组 细菌 感染 ,如 果 这 种 基因 产物 分 记 的 话 , 它 可 能 引起 疾病 。 因 为 还 没有 足够 的 证 据 表明 这 样 一 种 方案 可 能 有 害 ,或 可 能 无 害 。 因 此 ,两 种 看 法 相持 着 ,有 些 人 希望 看 到 所 有 的 重组 DNA 研究 都 被 禁止 , 另 一些 人 则 认为 如 果 使 用 适当 的 测量 可 以 保证 安全 。 现 在 没有 任何 集团 否认 重组 DNA 研究 对 科学 和 人 类 带 来 的 巨大 利益 ， 但 是 ， 老 的 研究 组 织 则 坚决 主张 不 能 因 这 种 利益 而 为 其 危险 性 作 辩护 。 争论 的 结果 是 美国 政府 出 面 制定 了 二 个 近乎 干预 的 书面 资料 ， 称 之 为 国家 健康 研究 院 对 于 重组 DNA 分 子 的 研究 的 规则 , 即 人 们 通常 所 知 的 NIH 准则 。 这 个 准则 规定 了 防止 实验 室 中 的 生物 逃逸 到 环境 中 去 的 物理 性 遇 制 (physical containment) 的 方法 ， 包 括 各 种 隔离 工作 区 以 及 污 物 处 理 。 生 物 学 的 遏制 涉及 到 宿主 细胞 方面 应 当 创建 一 些 有 生 物 学 缺陷 的 细菌 ， 这 种 细菌 生存 所 需要 的 条 件 在 自然 界 中 不 存在 。 为 符合 这 种 要 求 ， 进 行 遗 传 学 设计 ,” 创造 出 一 些 宿主 细胞 ， 例 如 大 肠 杆菌 X1776( 它 创建 于 美国 二 百 周 年 )。 这 种 细菌 必须 有 好 几 种 特殊 营养 物质 作为 其 生活 的 底 物 ,这 些 物质 在 污水 中 ,土壤 中 或 人 的 内 脏 中 并 不 常见 ,这 种 细菌 通常 被 污水 中 的 离子 去 污 剂 杀 死 ,或 被 存在 于 人 消化 道中 的 胆汁 酸 盐 杀 死 , 它 不 能 在 37°C (人 的 体温 ) 以 上 生长 。 因 此 ,如 果 没 有 发 生 好 几 次 的 返 祖 遗 传 过 程 ,那么 这 种 X1776 菌 就 绝 不 可 能 顺利 地 生长 在 人 体 之 中 。 后 来 人 们 还 使 用 了 一 些 其 他 的 缺陷 型 宿主 以 及 缺陷 型 的 鸣 茵 体 载体 。 所 有 使 用 的 质粒 载体 都 不 能 自我 转移 ,因此 ， 它们 自己 不 能 转移 到 非 缺陷 型 的 细菌 中 。 大 部 分 的 预防 措施 已 为 研究 工作 者 接受 〈 但 是 某 些 科研 小 组 对 这 些 条 款 并 没有 全 都 愉快 地 接受 )。 随 着 时 间 的 推移 以 及 获得 更 多 的 知识 ,以 上 的 顾虑 变 得 少 了 ，NIH 对 某 些 方面 的 限 制 也 逐步 地 放松 了 。 关 于 对 健康 有 毒害 的 假设 现在 似乎 已 经 不 那么 具有 权威 性 了 ,虽然 这 些 假 设 仍然 有 着 社会 性 的 及 政治 性 的 价值 。 到 现在 为 止 ， 还 没有 报道 过 重组 DNA 研究 ”产生 了 不 利 影响 ,也 没有 人 报道 过 由 此 而 引起 的 什么 启示 或 暗示 。 相 反 , 此 项 新 技术 潜在 的 巨大 利益 已 被 研究 者 们 甚至 外 行 们 所 认识 。 但 是 ,又 出 现 了 许多 新 的 问题 ,例如 遗传 工 程 已 经 有 工业 上 的 重要 性 ， 并 成 为 产生 经 济 效益 的 一 个 重要 分 支 。 这 些 新 的 问题 是 :第 ea ZL9 es Wu, R. (ed.) 1979. Recombinant DNA. Methods Enzymol. Vol. 68, Academic Press. 下 ry 一 ， 公 司 应 当 得 到 在 他 们 的 实验 室 创 造 新 的 生产 形式 的 专利 权 吗 ?美国 最 高 法 院 已 经 肯 定 了 他 们 的 这 种 权利 。 第 二 ,这 种 经 济 效益 激发 人 们 对 未 来 的 研究 方向 作出 新 的 规划 ,这 种 新 的 规划 应 当 允 许 达 到 怎样 的 规模 呢 ? 即 政府 是 否 应 当 支持 “ 纯 " 学 术 的 研究 ， 而 把 有 经 济 效益 目标 的 项 目 留 给 公司 ? 第 三 ， 工 业 竞争 是 否 会 使 得 科学 研究 的 新 信息 和 新 思路 的 相互 交流 减少 ?第 四 ， 得 不 到 经 济 效益 的 研究 所 和 大 学 怎样 才能 通过 竞争 而 得 到 一 些 年 青 的 、 最 优秀 的 研究 工作 者 ,因为 很 普遍 的 情况 是 ,研究 所 在 经 济 上 是 很 困难 的 ,而 较 富 有 的 公司 则 为 年 青 研究 者 提供 高 薪 。 对 于 这 样 一 类 问题 目前 尚 无 法 简单 地 作出 回答 ,人 们 正在 广泛 地 争论 着 。 So eee Abelson, J., and E. Butz, 1980. “Recombinant DNA.” Science. 209, 1317—1438. Anderson, W. F., and E. G. Diacumakos. 1981. “Genetic engineering in mammalian cells.” Sctent, Amer, July. pp- 106—121. ; : Beers. R. F., and E. G. Bassett (eds.) 1977, Recombinant Molecules: Impact on Science and Society. Raven. Brown. D. D. 1973. “The isolation of genes.” Scient. Amer. August. pp. 20—29. Dohen, S. 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将 单 链 DNA 芯 变 成 双 链 DNA; 核糖 核酸 酶 H 从 双 链 RNA 转录 出 单 链 RNA 从 DNA 转录 出 mRNA 从 单 链 RNA 转录 出 单 链 RNA 将 DNA 降解 为 赛 核 苷 酸 、 及 单 BAR APF fe MH DNA 产生 切口 DH ie ARS 磷酸 化 蛋白 质 使 tRNA 带电 荷 ee Bre DNA 中 的 缺口 在 部 分 多 化 的 病毒 样品 中 ， 经 常 发 现 空 外 壳 ， 说 明 核 酸 对 外 这 的 装配 并 不 是 必需 的 。 空 外 壳 的 结构 和 核 壳 的 结构 略 有 不 同 。 有 被 膜 的 病毒 颗粒 并 不 具有 特征 结构 5 在 一 个 有 被 膜 的 螺旋 病毒 颗粒 中 ， 螺 旋 的 或 20 面体 的 核 外 壳 被 包 囊 在 一 层 疏 松 的 \ 大 致 呈 球形 的 被 膜 中 。 病毒 颗粒 的 形状 是 可 变 的 ， 因为 被 膜 并 不 坚硬 。 被 膜 来 源 于 细胞 膜 。 图 .21-4 示 出 了 几 种 有 被 膜 病 毒 的 例子 。 很 多 病毒 颖 粒 具 有 宿主 细胞 中 不 存在 的 编码 病毒 的 酶 〈 表 21-2), 在 某 些 情况 下 ,这 些 酶 或 是 核酸 复制 酶 和 转录 酶 ,或 是 病毒 颗粒 吸着 到 宿主 细胞 上 所 必需 的 因子 。. 但 在 很 多 情况 下 ， 这 些 酶 的 确切 的 功能 尚 不 清楚 。 * 223 21-4 几 种 有 被 膜 的 病毒 (2) 流感 病毒 (influenza virus), (b) Sindbis 病毒 。(c) MKOARAWBCK Robley Willanis 提供 )。 wim Bm 病毒 核酸 分 子 量变 化 范围 很 大 ( 见 表 21-1), ME, Ae DNA 和 RNA BASH 形式 。 病毒 的 DNA 病毒 DNA， 仅 在 一 个 病毒 的 小 家 族 中 发 现 单 链 线 状 DNA, 而 双 链 DNA 分 子 一 一 线 状 的 、 环 状 非 螺旋 的 及 环 状 螺旋 的 ,就 像 它们 在 鸣 著 体 中 一 样 。 然 而 ， 在 其 他 有 机 体 中 CLIILD 图 21-5 jeje DNA 的 封闭 式 发 卡 结构 短 的 坚 线 表示 碱 基 对 。 (a) 末端 倒转 重复 abc c’b’a’ 细小 病毒 abc c’b’a’ 7 腺 病毒 a’ c ha cba 5 (b) HBAS PHARAK ES : ; t a’b’d’ ebaa’c’f’ gca ER 2 AS Tak : La Sh ) 出 芽 过 程 的 电镜 照片 ( 承 Edward Kellenberger 提供 )。 分 ， 细 胞 膜 中 含有 病毒 的 蛋白 质 而 没有 细胞 质 中 的 蛋白 质 。 宿主 霓 胞 被 病毒 接管 ; 在 我 们 讨论 噬菌体 生活 周期 时 ,有 一 个 阶段 定义 为 喉 菌 体 " 接 管 ”(takeover) 细菌 宿 主 。 在 这 个 时 期 ， 细 菌 被 转化 成 为 制造 噬菌体 的 机 器 ， 这 种 接管 作用 的 一 部 分 是 指 在 鸣 菌 体 生活 周期 的 早期 ,停止 或 减少 宿主 DNA, RNA 及 蛋白 质 的 合成 。 人们 注意 到 典型 的 动物 病毒 生活 周期 中 缺少 这 一 阶段 。 这 种 典型 阶段 经 过 验证 ， 确 实 存在 于 某 些 病毒 生 活 周期 中 ,但 当然 不 是 立 遍 的 。 实 际 上 ,病毒 和 宿主 常常 共生 一 段 时 间 ， 只 是 在 感染 晚期 宿主 的 功能 才 被 破坏 。 有 些 病 毒 的 生活 周期 中 有 特定 的 时 期 ,在 这 些 时 期 中 宿主 受到 剧烈 地 改造 ,但 还 不 清 楚 这 种 改造 对 于 病毒 的 最 适 产生 是 否 必需 ,在 少数 体系 中 已 经 发 现 有 以 下 三 种 不 同形 式 : 1. 有 时 ,宿主 RNA 和 DNA 的 合成 一 直到 病毒 的 生活 周期 的 很 晚期 才 受到 抑制 ,这 种 抑制 很 可 能 是 在 病毒 核酸 的 复制 作用 开始 之 后 才 起 作用 。 2. 有 时 ,核糖 体 的 合成 受到 削弱 ; rRNA 基因 的 转录 是 正常 的 ,但 rRNA 前 体 的 加 工 受 到 抑制 。 3. 细胞 质 蛋 白质 的 合成 受到 抑制 ,这 是 一 种 普遍 现象 ,虽然 抑制 的 程度 和 时 间 因 不 局 病毒 而 有 很 大 变化 。 兰 颈 灰 质 炎 病 毒 和 腺 病毒 的 这 一 过 程 是 已 知 的 ,在 峭 髓 灰质 炎 病 毒 的 2 229! 感染 中 ， 宿 主 多 肽 链 的 起 始 受到 抑制 。 宿 主 蛋 白质 合成 的 起 始 ZAM mRNA- 核 糖 体 -tRNAmet 的 形成 有 缺陷 。 在 病毒 RNA 结构 那 部 分 已 提 到 糊 髓 灰质 炎 病 毒 颗粒 RNA 是 C+ ) 链 的 缺少 帽子 的 核糖 核酸 。 显 然 ,病毒 蛋白 质 (目前 尚未 分 离 到 这 种 蛋白 质 ) 对 于 了 MSF RNA 翻译 成 蛋白 质 的 过 程 有 影响 ， 它 干扰 翻译 起 始 物 的 形成 ， 但 是 对 无 贝 RNA 的 翻译 不 干扰 。 对 于 腺 病毒 来 说 ,宿主 的 细胞 mRNA 是 在 核 中 制造 的 ， 这 时 运 来 被 加 工 , 病 毒 蛋 白 质 的 干扰 就 阻止 了 它 向 细胞 质 的 转运 ,因此 这 种 mRNA 得 不 到 翻译 。 而 那些 在 腺 病毒 感染 前 就 已 存在 的 簿 主 细胞 质 中 的 长 寿 的 mRNA 也 不 能 翻译 。 病毒 颗粒 的 鉴定 无 论 作 什么 实验 ， 我 们 都 要 知道 病毒 和 细胞 的 比率 一 -感染 倍数 (MOL multipli- city of infection), 病毒 可 以 通过 电子 显微镜 进行 计数 , 但 是 这 个 方法 有 以 下 两 个 缺点 : 《1) 由 于 技术 上 的 原因 测量 值 可 以 偏 大 或 偏 小 3 倍 之 多 ; (2) 没有 办 法 知道 哪 部 分 颗粒 是 有 感染 性 的 。 因 此 ， 发 展 了 类 似 于 滴定 噬菌体 形成 噬 菌 斑 的 鉴定 计数 方法 。 下 面 就 介 绍 其 中 的 一 些 方法 。 病毒 的 生物 学 鉴定 许多 动物 细胞 可 在 培养 中 中 生长 成 为 单 层 细胞 。 当 生长 完成 时 ， 可 被 各 种 染料 着 色 . 的 细胞 的 融合 形成 一 个 有 色 的 细胞 层 。 往 培养 咀 中 先 加 入 细胞 , 紧 接着 加 病毒 ,于 是 其 中 一 些 病毒 将 会 感染 生长 层 中 的 细胞 。 如 果 是 致死 型 的 病毒 (如 兰 项 灰质 炎 病 毒 ) ,或 者 至 少 是 对 细胞 生长 有 显著 抑制 作用 的 病毒 ,那么 当 单 层 细胞 停止 生长 时 ,在 这 二 单 层 中 就 会 出 现 一 个 区 域 , 其 中 极 少 或 甚至 没有 细胞 。 因 此 ,在 染色 背景 上 将 出 现 无 色 的 环 状 区 域 一 一 WERE (plaque) (图 21-11(a))。 与 叹 菌 体形 成 叹 斑 只 需要 3 一 12 小 时 相 比 ， 后 者 需要 3 一 21 天 ， 因 为 动物 细胞 生长 缓慢 ,不 同 的 病毒 生成 哦 斑 的 天 数 不 同 。 x 有 些 病毒 并 不 形成 噬 斑 ， 因 为 它们 不 能 尽快 地 杀 死 细胞 。 但 是 ， 如 果 一 种 病毒 (如 流感 病毒 ) 能 惠 激 红细胞 凝集 素 (hemagglutinin) 的 合成 ， 那 么 也 有 办 法 鉴定 感染 颗粒 。 凝集 素 是 一 种 糖 蛋白 ,在 感染 细胞 的 表面 形成 。 它 使 感染 细胞 与 红细胞 结合 。 因 此 ,如 果 细 上 胞 的 融合 层 中 含有 的 感染 集中 区 病灶 不 像 叹 斑 那样 容易 看 到 ， 那 么 ， 我 们 就 可 以 再 铺 一 明 红 细胞 悬浮 液 进行 观测 ; 铺 层 , 再 清洗 ,经 过 以 上 处 理 后 ， 就 可 以 从 单 层 细胞 表面 上 的 红斑 点 鉴别 出 这 种 病灶 的 存在 。 在 喉 斑 鉴定 法 出 现 以 前 ， 某 些 病毒 〈 如 牛 总 病毒 和 疱疹 病毒 ) BWR (pock method) 鉴定 的 。 如 果 使 发 育 10 天 的 鸡 胚 的 绒毛 膜 受 病毒 感染 ,然后 再 培养 36 一 72 小 时 ,在 透明 的 膜 上 就 出 现 了 不 透明 的 集中 区 , 称 之 为 总 交 。 冶 疱 相当 明显 ,容易 计数 。 肿瘤 病毒 (例如 劳 氏 肉瘤 病毒 ) 也 可 以 在 融合 细胞 上 计数 。 这 些 病毒 可 以 使 受 感染 的 细胞 在 融合 层 停 止 生长 之 后 ,还 继续 生长 好 几 天 ,形成 称 之 为 病灶 的 生长 区 ， 它 在 单 层 细 胞 上 好 像 突起 的 一 团 , 见 图 21-11(b)。 植物 病毒 (如 烟草 花 叶 病毒 ) 的 计数 方法 如 下 ; 刊 下 一 层 叶 表 面 ， 在 其 上 铺 上 一 滴 病 毒 悬浮 液 ， 于 是 叶子 上 就 形成 了 死 兽 (又 称 为 侵蚀 斑 ，lesions); 每 个 侵蚀 斑 都 是 由 一 个 病毒 颗粒 侵 染 所 形成 的 。 oj230 Be’ , angen , a : : : a eee ee ee sisataSDaaaE au 一 Re eg $ s 5 a 》 Sl eo 6 BNE? RE sae (c) : 21-11 检测 病毒 的 三 种 生物 学 方法 。(a) RASER AND DABNMAH REV R MR. (>) 肿瘤 病毒 的 病灶 。 有 照片 显示 劳 氏 肉瘤 病毒 的 病灶 ， 其 中 的 黑色 区 域 是 一 团 受 病毒 感染 的 细胞 所 形成 的 细胞 签 , 它 们 是 生长 于 未 受 感染 的 单 层 鸡 胚 细 胞 上 的 多 层 细 胞 (cs) 受 烟草 花 叶 病毒 感染 的 烟草 叶子 ,照片 显示 了 王 性 组 织 的 侵蚀 斑 。 检测 病毒 的 效率 上 述 各 种 生物 学 鉴定 病毒 的 方法 效率 都 很 低 ， 而 且 随 病毒 的 不 同 而 变化 〈 见 表 21- 4)o 与 在 电镜 下 所 见 的 颗粒 数 相 比较 ,只 有 0.01 一 10 多 的 动物 病毒 颗粒 产生 可 见 到 的 感染 《 塞 姆 利 基 氏 森 林 病 毒 和 单纯 性 疱疹 病毒 , 则 是 值得 注意 的 例外 的 情况 。 在 最 适 条 件 下 进 行 鉴定 ,最 好 的 制剂 可 以 给 出 100 多 感染 效率 )。 植 物 病毒 的 效率 更 低 , 如 表 中 所 列 , 低 效 感染 的 原因 可 能 有 以 下 三 种 : 1. 由 于 装配 出 有 缺陷 的 颗粒 或 在 装配 后 受到 某 种 损伤 ， 大 多 数 病毒 颗粒 是 无 感染 力 表 24-2 病毒 颗 粒 与 感染 单位 之 比 ( 用 各 种 测定 方法 ) 病 过 比 例 * ， 动物 病毒 塞 姆 利 基 氏 森 林 病 毒 〈Semliki forest virus) 1 fe Ae (Poxvirus) 1—100 Rtas (Influenza) 7—10 BY ise (Reovirus) 5 Rig (Adenovirus) 10—20 SHEIK LI BE (Poliovirus) 30—1000 | —- PRS RPE 40 (SV40) : AMA 烟草 花 叶 病毒 (Tobacco mosaic virus) 5X104 一 108 * 比例 范围 很 宽 表 明 因 选用 的 测定 方法 不 同 , 所 以 差异 较 大 。 231。 的 。 2. 可 能 由 于 某 些 未 知 的 原因 ， 使 检测 病毒 的 条 件 限 制 了 病毒 形成 叹 痪 、 癌 瘤 、 病 灶 或 其 他 最 终 斑点 的 能 力 。 | | 3. 成 功 的 感染 需要 许多 有 功能 的 病毒 颗粒 的 共同 作用 。 如 果 有 人 要 了 解 病毒 生活 周 期 的 分 子 学 基础 ,那么 很 重要 的 一 点 就 是 要 确定 这 一 条 是 否 正确 , 即 是 否 为 共同 作用 。 与 动物 病毒 及 噬菌体 不 同 , 多 组 分 的 植物 病毒 不 同 颗粒 携带 着 不 同 RNA 分 子 (图 21-8)。 此 外 对 动物 病毒 来 说 ,成 功 的 感染 总 是 只 需要 一 个 有 功能 的 病毒 颗粒 ;对 鸣 菌 体 的 感染 来 说 ， 也 是 这 样 。 这 个 看 法 已 由 动物 病毒 形成 叭 丙 〈 或 其 他 病毒 所 形成 的 病灶) 的 数目 与 所 加 入 的 病毒 颗粒 的 数目 直接 地 成 正比 的 事实 证 实 。 如 果 有 人 对 这 个 结论 的 争论 有 兴趣 ， 他 可 以 按照 一 个 成 功 的 感染 需要 两 个 病毒 的 假说 去 考虑 ， 那 么 他 就 能 很 容易 地 作出 正确 的 判断 。 按照 泊 松 分 布 ， 如 果 病 毒 颗粒 总 数 /细胞 数 为 巡 ( 在 常规 化 验 中 培养 四 上 的 数目 是 很 少 的 ), 那 么 细胞 被 个 颗粒 感染 的 比例 PCA) CHSC RRL ABER) 4: P(k) 一 2 14/AI 如 果 认 为 非 要 有 两 个 病毒 颗粒 才能 实现 成 功 的 感染 ， 于 是 就 可 以 认为 有 两 种 形式 的 未 感 染 细胞 : 一 种 是 未 受 病毒 颗粒 感染 的 细胞 ,其 比例 PCR) 为 。"”， 另 一 种 是 只 受 一 个 病 毒 颗粒 感染 的 细胞 ， 其 比例 为 me-?”， 因 此 ， 不 产生 鸣 斑 细胞 的 比例 值 P(0) = eW”+ men" BR en" + m)ofE m IBN, LARA BH: P(0) 一 由 一 m?。 因 为 受 感 | 桨 细胞 的 比例 Pi 一 1 一 P(0)， 所 以 Pi 一 — me 这 就 意味 着 咽 资 的 数目 与 加 和 病毒 颗粒 数 的 平方 成 正比 。 很 明显 ,如 果 造 成 一 次 成 功 的 感染 ,所 需 病 毒 颗 粒 数 大 于 2， 那么 ， 唉 斑 的 数目 将 随 着 加 入 的 病毒 颗粒 数 的 平方 le oe 而 增加 。 如 果 是 另 一 种 情况 ， 即 成 功 的 感染 过 程 必 需 的 病毒 粒子 数 只 是 1， 则 未 受 感染 时 2 细胞 的 部 分 是 。-"。 受 感染 细胞 的 部 分 是 1 一 …。 如 果 加 入 的 病毒 颗粒 增加 ?2 倍 , 那 10 25 50 75 100 么 受 感染 的 细胞 的 部 分 将 是 1 一 ee。 比值 . riled i aes (1 一 )/ 作 1 一 ) 就 是 当 加 入 4 倍 的 病 胞 的 堵 养 下 中 加 入 一 定 体积 的 病毒 悬浮 液 形成 “于 go 因此 , 当 加 入 的 病毒 增加 4 倍 时 MBE es 的 数 亦 增加 4 倍 。 由 于 之 值 很 小 ,所 以 此 结论 独立 于 入 值 , 即 此 结论 不 受 加 入 的 颗粒 数 影 响 。 图 21-12 中 的 线性 曲线 表明 每 一 个 病毒 颗粒 就 可 以 引起 一 次 感染 ,从 而 证 实 了 前 面 提 到 的 看 法 。 动物 病毒 的 分 类 动物 病毒 将 是 未 章 的 主要 课题 ,在 分 子 生物 学 研究 中 使 用 了 很 多 动物 病毒 ,并 且 它 们 的 名 称 是 如 此 地 复杂 ,因此 , 列 出 表 21-5 以 供 进一步 参考 。 此 表 列 出 了 动物 病毒 的 主要 ， “232 ie OMEGA REM BK SURE ERR Se HE “snsra eaoded) MMUS ELM (snita Bunejonseya) RMAMIY (emodjog) RMEE ‘(ewojpideg) MME » (iomnl Aieumem osnow) MEE (ewoores snoy) #MAMMSe (Asuojopm) MAME (ermeynay pueIIJ) REMMM Elm Ze (ermeynoy outiny) MME By (stsoyno] ueray) fe SMI Ese ig VNU 88 at® My KALE ony (snitaonoy) Bhim 本 (eolIIded adoqS) BME TE VN SP [CAA ARM) He OE Ko OLE e1iidedg (euolltded) EM be ik (okAS)0y BE Sk BA & Ah MY 者 (CemokTod) ME Z VNG SP | cBitl»e euro ‘etl, H 4Tod XL (eur0d]oq ) x Bt MB = (snitaoay) fA tu VNU SP WME REA Re i i (snitaooy) MA in (autnbe usajseq) MiG (saIojJ ITITmasS) BREMEN Ae Se [i fy BE (stqpurs) fa BAG pee See Ie suroq-podosgiie £YMPK snitaoqie (snitaoqie SZ (r0A03 MoTToA) BMAiYM (+) VNU ss ot hn BoA LEH e301 YS snstaesoy) He Miah hh Ye Be Mew Y (stanemois sepnoiso,) BMH Yk Bs (-) VNX ss WRG Hl A rh He sopqeyy (snitaopqeqy) ZeMtyt Hy a (ezuonyzuy) HEM VNU ss AMY ch LE xsw (sniraoxhw) $y (snitaoduew) SM | (oHOa) BM My = pd Corjog) REM MVE | (we) VN ss CVNU M8) eur UGS oI, oor (snitaeusoorg) Bt Sk sal eh As (emoxtw) SMB iy aa —& (emosqry) BM Rs 3 it : (erursoe,) SEMA BIL VNG SP Bt BEA Af (snataxog) Bt SB Bt (I xejdurs sodiopy) BM ARKIy anit (is1soz sadsazy) FE Sf MBit igK VNa SP cca o XH SE QE afradrzsH (snirasodiozy) Be SA AM ait (snitaouopy) SMM | (38x) VNG SP Bae 8) (snitaouspy) Mii ow &# Mn ¥ Y ; i a i 次 迪 Awe et SAUNA beEMAGPEG s-1z 从 * 1233 © 家 族 \ 研 究 中 最 常见 的 特殊 病毒 以 及 它们 名 称 的 来 源 。 动物 RNA 病毒 研究 动物 RNA 病毒 必须 考虑 以 下 几 点 : 1. mRNA 的 产生 机 理 可 以 用 来 区 分 各 类 RNA 病毒 的 基本 特征 ;也 就 是 说 ， 特 定 的 机 理 决 定 着 复制 和 翻译 的 基本 形式 。 2. 所 有 的 真 核 mRNA 分 子 都 是 单 顺 反 子 ,而 且 真 核 核糖 体 很 少 可 能 从 单个 的 mRNA 分 子 翻 译 出 一 个 以 上 的 多 肽 链 ;然而 ， 所 有 已 知 的 RNA 病毒 都 指导 合成 几 种 蛋白 质 。 3.(—)# RNA 病毒 在 翻译 前 必须 合成 一 个 (十 ) 链 RNA. ES, BKRASEM 胞 中 有 能 够 拷贝 出 RNA 分 子 的 RNA 复制 酶 。 4. 单 链 病毒 颗粒 的 RNA 分 子 不 能 作为 模板 直接 地 复制 颗粒 的 RNA; 因此 ， 为 了 RNA 的 复制 ,必须 制造 出 含有 互补 链 的 或 可 组 成 互补 链 的 中 间 物 。 对 于 许多 RNA 动物 病毒 来 说 ,复制 作用 和 产生 病毒 mRNA 的 过 程 是 互相 依赖 的 ， 最 好 是 放 在 一 起 加 以 讨论 。 产 生 mRNA 有 四 种 主要 的 机 理 ， 这 四 种 形式 还 有 许多 变化 形式 ,图 21-13 描绘 了 这 四 种 主要 机 理 。 在 每 种 类 型 中 可 以 很 方便 地 挑选 一 种 特定 的 病 毒 为 例 , 检 查 这 种 病毒 的 复制 .转录 和 翻译 模式 。 所 选择 的 病毒 在 图 中 已 标明 所 选择 的 病 毒 的 名 称 。 (0 RNA poe la “| 呼 肠 病 毒 2 A HE HI VI 披 膜 病毒 — SME (+) RNA ——> (-) RNA——> <— (+)me# DNA ~<— (-)DNA <— (+)RNA 类 型 V 泡 状 口 | 炎 病 毒 (—) RNA 图 21-13. mRNA 产生 的 四 种 机 理 。 与 这 些 机 理 相关 ,文中 讨论 的 病毒 分 类 也 在 图 中 示 出 。I 型 、II 型 都 是 DNA 病毒 ,将 在 别处 加 以 讨论 。 病毒 的 RNA ROH 在 我 们 讨论 个 别 病毒 之 前 ， 有 必要 对 聚合 酶 作 一 些 介绍 。 许 多 病毒 颗粒 携带 着 它们 自己 的 RNA AGH WF (—) 链 RNA 病毒 不 能 在 没有 自己 的 聚合 酶 的 条 件 下 发 挥 、 功能 ， 因 为 动物 细胞 不 含有 依赖 于 RNA 的 RNA 聚合 酶 ,所 以 在 感染 中 ， 这 种 病毒 的 感染 性 〈 一 ) 链 被 定义 为 不 可 翻译 的 链 。 对 于 双 链 的 RNA 病毒 来 说 ,病毒 的 聚合 酶 也 是 关键 的 ,因为 双 螺 旋 中 没有 可 供 使 用 的 (十 ) 链 去 结合 到 核糖 体 上 并 进行 翻译 ,必须 任 其 《一 ) 链 再 复制 出 一 条 新 (十 ) 链 ,才能 翻译 。 而 且 宿 主 细胞 细胞 质 中 ,没有 已 知 的 聚合 酶 能 Wie RNA 为 模板 合成 RNA。 对 于 (十 ) 链 RNA 病毒 ， 这 种 病毒 对 结合 到 病毒 核酸 上 的 RNA 聚合 酶 无 明显 的 要 求 。 但 是 ， 对 于 具有 DNA 中 间 物 的 逆 病 毒 CDNA 是 这 。234。 类 病毒 生活 周期 的 独特 特征 ), 则 一 定 需 要 能 结合 到 病毒 RNA EA DNA EA BRCRIDE 转录 酶 )， 因 为 在 已 知 的 动物 细胞 中 ,从 未 见 到 在 RNA 模板 上 合成 出 DNA, 泡 状 口 炎 病毒 泡 状 口 炎 病毒 , 即 VSV (vesicular stomatitis virus) 是 一 种 小 牛 疾病 的 病原 体 , 它 包含 一 个 分 子 BX 4.0 x 10° 的 〈 一 ) 链 RNA 分 子 〈 见 图 21-14)。 这 个 (一 ) 链 RNA 分 子 既 无 5 -帽子 ,也 无 3’-polyA 尾 ， 它 编码 以 下 五 种 蛋白 质 : N 主要 的 病毒 外 壳 蛋 L, NS 发 现 于 外 壳 中 ， A Ay RNA 合成 所 21-14 ， 泡 状 口 炎 病 毒 的 电镜 照片 ( 承 需要 。 Robley Williams 提供 )。 M 被 膜 蛋白 。 G REA. 为 了 合成 这 五 种 蛋白 ，VSV 必须 形成 (十 ) 链 mRNA， 并 必须 克服 动物 细胞 不 能 对 多 顺 反 子 mRNA 进行 翻译 的 问题 。VSV 解决 这 些 问题 的 办 法 是 合成 五 种 不 同 的 mRNA 分 子 , 如 图 21-15 所 示 。 这 些 mRNA 分 子 通过 工 和 NS 酶 的 共同 作用 而 合成 ，L, NS 酶 则 被 带 人 细胞 中 , 在 N 蛋 白 分 子 所 包 右 的 (一 ) 链 RNA 病毒 粒子 上 。 这 些 mRNA 的 链 病毒 RNA ET L ) 基因 ! 复制 | | 转录 ( LINSN ) t ’ Se ee es ee es ee owes Sees ee em ee ee ey ee o=L (+) 链 中 间 物 ee 复制 -=M oe 一 一 NS (二 ) 链 病毒 RNA (eae : man | 装配 ae os L, NS, N Y A 21-15 泡 状 口 炎 病毒 的 复制 作用 与 伟 录 作用 的 图 解 。 © 235“ 每 一 个 分 子 都 带 有 5 -帽子 , 并 有 3’ -polyA 尾 , 而 且 都 只 包含 一 个 顺 反 子 。 还 不 能 确切 知道 究竟 是 先 合 成 一 个 大 分 子 ( 十 ) 链 RNA， 然 后 再 切 成 五 个 小 RNA 分 子 ， 还 是 通过 _ 相继 的 起 始 和 终止 ， 先 后 地 合成 五 个 分 子 RNA, 已 有 初步 的 证 据 表 明 ， 不 同 的 (十 ) 链 RNA 分 子 是 通过 一 系列 连续 的 起 始 和 终止 而 依次 合成 的 。 VSYV 的 复制 也 是 通过 先 从 病毒 mRNA 拷贝 出 一 个 (十 ) 链 RNA 而 进行 的 , RES 长 的 RNA 链 也 是 在 L 和 NS 蛋白 的 作用 下 形成 的 。 但 是 ,它们 不 被 切割 (它们 无 mRNA 功能 )， 而 是 立即 作为 模板 ,在 L 和 NS 酶 催化 下 ,复制 出 一 个 (一 ) 链 病毒 RNA, 当 ( 一 ) 链 RNA 形成 时 ， 那 些 早 些 时 候 合 成 的 mRNA 已 经 翻译 出 很 多 的 N 蛋 白 了 ; 于 是 病毒 RNA 和 N 蛋 白 迅 速 地 结合 ,形成 核 壳 。 被 切割 的 (十 ) 链 mRNA 的 转录 过 程 和 以 (十 ) 链 为 模板 形成 (一 ) 链 RNA 的 复制 过 程 是 以 某 种 方式 相互 分 开 的 。 人 们 找到 了 只 有 其 中 一 个 过 程 受 抑制 的 突变 株 ， 从 而 得 出 以 上 看 法 。 节 片 状 \ 一 ) 链 病毒 关于 节 片 状 ( 一 ) 链 病毒 ( 即 分 段 基 因 组 (一 ) 链 病毒 ) (segmented (—) strand viruses) 复制 和 转录 的 模式 ,还 不 是 很 清楚 。 流 感 病毒 即 是 其 中 的 一 个 成 员 。 但 是 ,既然 每 个 片 眉 只 包含 一 个 顺 反 子 ,就 不 需要 产生 单 顺 反 子 mRNA 分 子 的 特殊 步骤 。 相 反 , 这 些 病 毒 所 面 对 的 问题 是 如 何在 每 个 核 过 中 得 到 一 套 完整 的 片段 ， 有 两 种 可 能 性 : (1) 有 一 种 特殊 ”机理 ,为 每 一 个 核 壳 在 每 种 型 式 中 选 出 一 个 分 子 ; 2) 分 子 装配 是 随机 的 ,因此 大 多 数 病 毒 颗粒 是 不 完整 的 ,是 有 缺陷 的 。 虽 然 , 还 没有 很 确定 的 事实 ， 然 而 ， 流 感 病毒 的 情况 似 乎 很 可 能 是 随机 装配 的 。 FRRRRAS Sia RRAWS (poliovirus)(A 21-16) 是 了 解 得 最 清楚 的 病毒 之 一 , 它 包 含 一 个 分 子 量 为 2.5X10 的 (十 ) 链 RNA 分 子 。 病 毒 在 敏感 细胞 的 细胞 质 中 复制 ， 形 成 成 熟 病毒 颗粒 的 、 大 的 结晶 状 包 诅 体 (A 21-17). 当 受 损伤 的 细胞 裂解 时 ， 病毒 颗粒 就 释放 出 来 。 病毒 颗粒 RNA 有 一 个 3 -poly A 尾 , 但 5 端 未 被 帽子 化 ,而 是 共 价 地 连接 着 一 个 功能 未 知 的 小 蛋白 质 。RNA 分 子 编码 七 个 蛋白 质 一 四 个 膜 蛋白 、 一 个 RNA 复制 酶 及 两 个 功能 未 知 的 蛋白 质 。 外 壳 中 不 携带 酶 ,病毒 RNA 有 一 些 mRNA 的 活性 ,但 并 不 指导 所 有 的 蛋白 质 合成 PUD RATER BERT 图 21-17 Cem en NN ch RE SA ( 承 Robley Williams 提供 )。 内 含 物 ( 承 J._ Meyer, M. Weiss 和 R. Boni yeft). 6 进入 细胞 后 ,病毒 RNA 链 立 即 部 分 地 被 翻译 ,合成 出 RNA 复制 酶 。RNA 复制 酶 是 从 一 个 较 大 的 多 肽 链 经 加 工 而 成 ,这 将 在 下 一 部 分 介绍 。 此 酶 催化 合成 出 (一 ) 链 RNA (图 21-18)。 此 (一 ) 链 RNA 唯一 的 功能 显然 就 是 作为 进一步 合成 (+) HE RNA 的 模 板 。 从 -3' 未 端 起 始 ,拷贝 出 (一 ) 链 RNA。 注 意 , 第 二 条 (十 ) 链 的 合成 并 不 是 要 等 到 第 一 条 链 完成 后 才 开 始 ， 而 通常 是 五 条 (十 ) 链 同时 以 (一 ) 链 RNA 为 模板 ,通过 一 个 多 分 枝 的 复制 中 间 物 而 形成 。 这 些 新 〈 十 ) 链 起 三 种 作用 : C1) 用 作 mRNA; (2) 用 作 进 一 步 合成 (一 ) 链 的 模板 ; (3) 作为 子 代 病毒 颗粒 中 的 病毒 RNA。 此 时 ,这 些 (十 ) 链 缺乏 5 端 蛋白 。5' 端 蛋白 是 在 装配 过 程 中 加 上 去 的 糊 伐 灰质 炎 病 毒 复制 过 程 的 四 个 特征 需要 进一步 评论 ,下 面 列 出 这 些 特征 ,并 加 以 讨 论 : 1. 新 生 RNA 并 不 完全 与 模板 碱 基 配 对 。 图 21-18 所 示 分 子 中 ， 包 括 一 个 完整 的 《十 ) 链 和 一 个 不 完全 的 (一 ) 链 。 有 人 也 许 以 为 新 生 的 _RNA 将 与 (一 ) 链 的 互补 片段 进行 碱 基 配 对 ， 形成 一 个 双 链 区 域 。 虽 然 还 没有 得 到 证 实 ， 人 们 还 是 认为 新 生 的 RNA 被 一 种 蛋白 质 所 包 右 ,蛋白 质 的 结合 阻碍 了 这 种 配对 过 程 。 阶段 1 蛋白 质 4 十 ) (=) 5' 3' : | (十 ) 链 3 | 一 (+) RNA +5 i 酶 \5 Sie 3 3 5 a 阶段 工 3" a Rp eC Ee | | poate ——> | ira | | | 1 | -3%， ; 于 8 (十 ) 链 Y 在 晚 些 时 候 ， 这 些 〈 十 ) 链 RNA. 可 用 作 . 不 再 存在 游离 ”mRNA 被 翻译 ， 也 可 以 用 作 形式 的 这 种 RNA ”模板 ,进一步 形成 更 多 的 〈 一 》 链 RNA ;还 可 以 被 加 上 蛋白 质 ,然后 被 包装 A 21-18 #iMiKARAE RNA 的 复制 。 在 阶段 I 产生 (一 ) SER EM Be II 产生 许多 (二 ) 链 。 2. 在 感染 的 细胞 中 发 现 了 双 链 RNA, WH RNA 的 存在 引出 了 一 种 看 法 :; 复制 的 第 一 阶段 是 由 (十 ) 链 病毒 RNA 向 双 链 RNA 的 一 种 转变 。 后 来 , 这 种 看 法 又 因为 有 几 点 证 据 而 取消 。 现 在 认为 , 子 代 链 〈 如 图 21-18 中 的 阶段 II 中 的 第 一 个 分 子 ) 可 能 由 于 缺少 一 种 通常 抑制 碱 基 配 对 的 RNA 结合 蛋白 , 因而 可 与 模板 通过 氢 键 形成 双 链 RNA, WH RNA 在 病毒 的 生活 周期 中 被 认为 是 没有 功能 的 。 3. 可 以 分 离 得 到 复制 中 间 物 , 它 包含 着 一 个 长 的 有 缺 刻 的 、 带 有 单 链 分 枝 的 双 链 片 段 。 这 种 结构 只 能 在 RNA 成 分 非常 纯净 、 那 种 阻碍 新 生 RNA 进行 碱 基 配对 的 蛋白 质 ¢ 237 ° 已 被 除去 的 制品 中 才 被 发 现 。 人 们 认为 这 种 复制 中 间 物 结构 也 许 是 由 于 纯化 分 离 而 造成 的 一 种 假 像 。 图 21-19 示 出 了 这 个 机 理 。 在 分 离 RNA 期 间 ， 抑制 物 被 移 去 aE. 双 链 RNA ; Le) — 这 些 分 子 抑 制 碱 基 配 对 图 21-19 在 分 离 过 程 中 产生 复制 中 间 物 假 像 的 可 能 机 理 。 4. SHRI RNA 的 量 先 以 指数 方式 增长 几 个 小 时 ， 然 后 随时 间 而 线性 地 增 加 。 图 21-18 RHAMKRARARS RNA 的 复制 按 两 个 阶段 进行 。 在 合成 (一 ) 链 RNA 的 阶段 I AR, AROS EMR I, VIBE I 合成 的 (一 ) 链 为 模板 ， 合 成 出 许多 条 子 代 ( 十 ) 链 。 亲 代 ( 十 ) 链 可 以 再 作为 模板 ， 合 成 出 另 一 条 (一 ) 链 。 如 图 所 示 ， 在 阶段 IT 中 , 几 条 (十 ) 链 可 同时 合成 。 然 而 在 感染 早期 因为 复制 酶 分 子 有 缺陷 ， 所 以 ， 开 始 时 的 阶段 II 只 形成 一 个 子 代 ( 十 ) 链 。 因 此 ,在 阶段 II 合成 的 早期 ,合成 完成 时 ,产生 4 个 RNA 分 子 ; 当 阶段 1 和 下 的 循环 同时 再 度 重复 时 ， 产 生出 8 个 分 子 ; 第 三 次 重复 产生 出 16 个 分 子 ;依次 类 推 。 进 一 步 可 以 了 解 到 ,在 每 个 复制 循环 之 间 还 有 明显 的 时 间 延 迟 ,因为 ,每 SRT RAISE RNA 分 子 只 需 一 分 钟 ， 而 上 述 几 个 分 子 复制 的 表 观 倍增 时 间 却 是 15 分 钟 。 这 种 倍增 过 程 是 指数 方式 增长 的 过 程 , 大 约 维持 2 小 时 , 直到 有 大 约 600 个 分 子 为 止 。 在 此 扩 增 循环 中 ,复制 酶 分 子 的 数目 通过 反复 地 翻译 和 加 工 而 逐渐 地 加 多 ,多 至 像 外 壳 蛋 白 分 子 的 数目 那样 。 于 是 ,多 分 枝 的 复制 方式 占 了 优势 。 从 此 +) 链 RNA 分 子 数 随 着 时 间 呈 线性 增长 。 新 产生 的 (十 ) 链 被 翻译 或 者 被 装配 ,而 (一 ) 链 则 只 是 偶然 地 产生 着 。 因 此 在 后 期 主要 的 合成 就 是 按 线性 动力 学 产生 (十 ) 链 。 SK ARIAS mRNA 编码 七 种 蛋白 质 。 如 前 所 述 ,既然 真 核 细胞 中 一 个 mRNA» 子 一 般 只 能 翻译 一 个 多 肽 链 ,那么 要 产生 这 些 蛋 白质 就 需要 一 些 特殊 机 理 。 从 以 下 两 个 观 察 中 可 以 看 出 ,在 背 嵌 灰质 炎 病毒 感染 的 细胞 中 ,蛋白 质 的 合成 有 以 下 特殊 的 特征 : 1. 在 知道 脊髓 灰质 炎 病 毒 基 因数 目 之 前 , 曾 发 现 受 ”S- 蛋 氨 酸 ( 它 可 以 标记 蛋白 质 ) 标 记 并 受 这 种 病毒 感染 的 细胞 合成 出 十 种 蛋白 质 ， 这 些 蛋白 质 的 分 子 量 超出 了 mRNA 的 编码 容量 。 对 此 现象 的 可 能 解释 为 基因 是 重合 的 〈 当 时 这 个 想法 曾 被 认为 是 荒 衣 的 ), 有 些 蛋白 质 是 某 些 蛋白 质 的 切割 产物 。 现 在 ,这 种 解释 已 被 人 们 承认 *。 2. 在 *S- 蛋 氮 酸 的 脉冲 -追踪 实验 中 ,有 些 标 记 的 蛋白 质 在 追踪 中 消失 了 。 与 此 同时 ， 放射 性 标记 又 出 现在 那些 分 子 量 比 最 初 标记 的 蛋白 质 分 子 量 低 一 些 的 蛋白 质 中 。 这 些 情 * 在 这 些 实验 完成 时 ”一 个 基因 一 个 酶 "的 假说 已 被 承认 为 学 说 。 遗传 学 分 析 与 碱 基 序列 分 析 对 大 肠 杆 菌 OX 174 得 出 清楚 的 \ 很 能 说 明 问 题 的 数据 之 后 ,人 们 才 开 始 认真 地 考虑 “基因 也 许 有 重 受 "的 可 能 性 。 *。238。 Duis FE HHA. TEA BI 次 质 炎 病 毒 蛋白 质 的 形成 中 有 切割 过 程 。 几 个 脉冲 标记 实验 导致 了 下 面 关于 状 风 灰 质 炎 病毒 鼻 白质 产生 的 说 明 图 (图 21- 20)。 从 mRNA 翻译 的 单个 巨大 多 肽 , 称 为 多 聚 蛋 白 〈polyprotein)。 在 多 聚 蛋白 中 , 当 处 于 蛋白 质 NX 两 头 的 两 个 肽 键 被 切 开 时 ,立刻 形成 两 个 切割 片 眉 NI 及 NX, Ait, 蛋白 Nl MBAR NX 在 蛋白 N1.5 完全 合成 之 前 就 从 正在 生长 的 多 聚 蛋白 链 上 释放 出 来 。 这 些 切 割 片段 叫做 新 生 片 眉 ， 因 为 它们 是 从 一 个 生长 新生) 多肽 链 上 合成 的 。 一 且 N1.5 释放 出 来 , 就 再 从 N1.5 中 移 走 一 个 小 的 NH, ba BE N3，N1.5 就 转变 成 N2,N2 再 被 切割 形成 N4 和 N5。 对 这 些 连 在 一 起 的 N 蛋 白 质 还 未 进行 很 好 的 研究 ,但 知道 至 少 其 中 的 一 些 参 与 RNA 的 合成 。RNA 复制 酶 还 未 纯化 ， 还 不 知道 复制 酶 是 这 些 蛋 白质 中 的 一 个 ,还 是 这 些 蛋白 质 中 的 某 几 个 所 组 成 的 聚集 体 。 - # HERR RIG HEH MRNA 新 的 切割 slo gap la | ad 核糖 体 mt < 切割 形成 形成 蛋白 质 外 壳 游 高 分 子 时 的 切割 dad VP3 . VP1 N3 N2 切割 形成 游离 分 子 | nates wpa VP2 N5 N4 病毒 蛋白 质 ae BEAK 图 21-20 HELE MIA ARR RAREST. HS VP 和 分 别 表示 病毒 的 外 壳 蛋 白 和 非 病毒 的 蛋白 质 。 tor oe EE SAY, oy 5 个 N1 蛋 白质 5 个 [VPo—VP1-VP3] 单位 各 自 以 单 个 的 聚集 体形 式 存在 SERRA as # RNA cS VE0 受 到 切割 后 形成 病毒 颗粒 前 这 其 大 RNA: ({[VP1— VP2— VP3— VP4]s)12 图 21-21 CHM KARARHV HEA wml. NI 蛋白 质 在 形成 病毒 外 壳 过 程 中 将 受到 一 系列 的 切割 ， 见 图 21-21. A NI B 白 分 子 聚 合 物 形成 一 个 5 体 〈pentamer)e。 将 各 个 Ni 彼此 切 开 ， 形 成 五 个 单位 。 每 个 单位 (NI) 中 含有 一 个 YP0， 一 个 VP1 和 一 个 VP3 蛋白 ,这 些 蛋白 质 聚 集 形 成 的 单 ° 239% 病毒 的 外 壳 [VP0-VP1-VP3] 3 位 被 称 为 5 体 原 〈propenton)。 十 二 个 这 种 5 体 原 进一步 聚合 ,形成 外 壳 原 (procapsid)o 这 是 一 个 大 小 和 形状 相同 于 病毒 颗粒 的 空 粒子 。 当 宥 髓 灰质 炎 病 毒 的 (十 ) 链 RNA 进入 外 壳 原 后 ,形成 一 个 病毒 原 。 最后, 当 VPO 被 切割 形成 VP2 和 VP4， 四 种 蛋白 质 VP1 ， VP2，VP3，VP4 再 经 过 细心 地 重 排 ,于 是 ,产生 出 完整 的 病毒 粒子 。 小 结 一 下 , 兰 髓 灰质 病毒 使 用 一 个 单个 的 mRNA 分 子 ， 由 这 个 mRNA 翻译 出 的 单 省 后 者 从 (一 ) 链 病毒 RNA 合成 一 系列 单 顺 反 子 的 mRNA 分 子 。 FH ,我 们 看 看 披 膜 病 毒 ， 它 像 养 髓 灰质 炎 病 毒 一 样 有 (十 ) 链 病毒 mRNA， 但 它 的 TE AAA A BK RRS AKO RASA HES BRAS 披 膜 病毒 (togavirus) 含有 一 个 单个 的 〈 十 ) H RNA， 它 编码 8 个 蛋白 质 ; 这 个 RNA 分 子 包含 两 个 AUG 起 始 信号 \ 见 图 21-22) jam RNA 不 被 加 工 , 而 用 作 mRNA 翻译 出 一 个 多 聚 蛋白 I 。 合成 起 始 于 最 靠近 5 端的 起 始 密码 ,接着 ,此 AUG，AUG 病毒 的 (二 ) 链 RNA 5 一 人 一 一 有 一 一 一 -一 3/ 从 AUG Bi = | ne re (ZREAI) we NE 复制 Bees sind 白质 __ | | 3 ——$—$———— es 5! (一 ) 链 | 合成 短 的 Ra 合成 许多 拷贝 的 | mRNA ‘ (+) 链 RNAII nve.t Im 5 一 一 一 下 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 各 一 -一生 一 一 一 一 一 一 一 3 | = 许多 拷贝 ane 从 AUG :翻译 MA EA AR Se 过 省 (ZREAII) | 将 用 于 装配 病毒 颗粒 ak \ | og CL, mite me 图 21-22 #MARNAE AN WERT RRMA EA. WBN -— ) 链 复制 子 在 晚期 进行 找 贝 产生 短 的 mRNA 分 子 ( 缺 AUG1)， 后 者 再 被 翻译 成 病毒 粒子 蛋白 。 。240 。 多 聚 蛋白 质 被 切 下 ,以 产生 出 RNA 复制 所 需要 的 蛋白 质 。 此 后 这 些 复制 蛋白 质 被 用 来 从 病毒 RNA 模板 上 合成 出 一 个 (一 ) 链 。 这 个 〈 一 ) 链 起 两 个 作用 : 〈1) 它 是 合成 更 多 的 、 最 终 装 配子 代 病 毒 粒 的 (十 ) 链 (RNA I, 见 图 21-22 中 部 ) 的 模板 。 (2) 它 是 形成 一 个 包含 AUG, 起 始 密码 而 不 是 AUG, 密码 的 mRNA 分 子 (mRNA I) 的 模板 。 人 们 还 认为 从 多 聚 蛋白 工 切 下 的 若干 蛋白 质 中 的 一 种 与 mRNA II 的 产生 有 关 。 目 前， 还 不 知 if mRNAII 是 从 RNA I 完整 〈 十 ) 链 上 切 下 来 的 ,还 是 从 一 个 内 部 的 特殊 的 复制 酶 识 别 位 点 开始 合成 的 。 mRNA Il 被 翻译 先 产 生 多 聚 蛋白 II， 这 个 大 蛋白 质 再 经 切 ， 割 产 生 蛋 白质 C、PE， 和 Ei。PE， 蛋白 又 进一步 被 切割 产生 E ME. AA, BA C. E,, E; 和 Es 一 起 装配 形成 外 壳 ， 其 内 装 人 RNA。 注 意 ， 两 类 暂时 性 的 mRNA ( 即 “ 早 期 "病毒 mRNA 和 “晚期 ”mRNA IT) 可 以 使 披 膜 病 毒 调 节 合成 的 复制 酶 的 量 以 及 病毒 颗粒 蛋白 质 的 量 。 也 就 是 说 ,最 初 的 病毒 RNA 的 一 个 单 拷贝 被 用 来 产生 所 需 浓 度 甚 低 的 催化 性 蛋白 质 , 而 mRNA II 翻译 产生 的 多 聚 蛋白 II 的 合成 则 推迟 , 直到 需要 结 构 蛋白 时 才 进 行 合成 。 由 于 有 许多 mRNA 下 分 子 ， 因 此 可 大 量 制造 结构 蛋白 。 推 测 披 膜 ”病毒 的 产生 比 细 小 RNA 病毒 (并 爸 灰质 炎 病 毒 ) 的 产生 有 效 得 多 。 目 前 还 没有 观察 到 比 这 更 高 效 的 病毒 产生 过 程 ,而 且 , 披 膜 病 毒 与 细小 RNA 病毒 (只 在 哺乳 动物 细胞 中 生长 ) 相 比 ,有 更 为 广泛 的 宿主 (前 者 在 昆虫 和 兰 椎 动物 中 都 能 生长 )。 事 实 上 ,经 过 一 般 的 观察 已 看 出 ,凡是 复制 和 转录 分 开 作 用 (就 像 在 泡 状 口 炎 病 毒 中 那样 ) ,对 种 种 蛋白 质 合 成 的 相 对 量 以 及 合成 时 间 的 调控 有 加 强 作用 的 动物 病毒 来 说 ， 往 往 都 伴随 有 宿主 范围 的 扩大 。 呼 肠 病 毒 呼 肠 病 毒 5 《图 21-23) 具有 10 个 双 链 RNA OT, 它 代 表 着 第 三 种 类 型 的 病毒 遗传 体系 , 它 比 迄今 为 止 见 到 的 其 他 病毒 都 要 复杂 。 呼 肠 病 毒 与 其 他 病毒 最 大 的 不 同 ， 在 于 病毒 颗粒 的 RNA 分 子 在 感染 过 程 的 任何 时 刻 都 不 以 游离 形式 从 病毒 颗粒 中 释放 出 来 。 图 21- 3 呼 肠 病毒 的 电镜 各 自 能 编码 一 个 多 肽 链 的 10 个 病毒 RNA 片段 互相 照片 ( 承 Robley Williams 结合 在 一 起 ,构成 包 计 于 20 面体 外 壳 内 的 复合 核 蛋白 核心 提供 )。 的 一 部 分 《核酸 部 分 )。 当 病毒 进入 细胞 后 便 除 去 外 壳 ， 同 时 ， 构 成 核心 组 分 之 一 的 RNA 复制 酶 被 激活 (图 21-24)。 复 制 酶 以 10 个 RNA 双 链 片段 为 模板 , 催化 合成 (十 ) 链 分 子 〈 即 mRNA). 核心 内 其 他 的 酶 催化 每 一 个 (十 ) 链 的 戴 帽 过 程 。 但 是 没有 加 上 多 RAR. > bias RNA 是 唯一 已 知 的 不 具有 多 聚 A 尾 的 病毒 RNA 分 子 。 新 合 成 的 (十 ) 链 从 核心 中 伸展 出 来 (图 21-25)。 但 是 双 链 部 分 仍 保持 在 核心 内 。 每 一 条 (十 ) 链 分 别 地 翻译 出 一 条 单个 的 多 肽 链 。 这 10 个 不 同 多 肽 链 中 的 某 几 条 经 过 切割 形成 最 终 ” 的 蛋白 质 。 10 个 双 链 片段 的 产生 是 复制 所 必需 的 , 这 个 过 程 是 通过 拷贝 子 代 (十 ) 链 ， 而 不 是 通 过 半 保 留 地 复制 双 链 RNA 完成 的 。 这 10 个 片 朋 不 多 不 少 地 包装 在 外 壳 中 ,形成 新 的 病 毒 颖 粒 。 在 呼 肠 病 毒 中 ， 组 合 过 程 是 在 调节 下 而 且 是 在 复制 之 前 进行 的 。 通 过 一 种 现在 尚未 知晓 的 途径 ，10 个 (十 ) 链 中 的 每 一 个 都 与 核心 蛋白 质 结 合 在 一 起 ;形成 一 个 核心 前 体 《precore)。 10 个 (十 ) 链 以 特定 顺序 依次 被 拷贝 ， 这 个 过 程 可 能 是 由 核心 蛋白 质 决定 。241 。 病毒 颗粒 印 去 外 壳 复制 酶 被 活化 fe +) y 释放 (十 ) 链 --+ QO =: (+) & 1 聚集 核心 蛋白 质 图 21-24 呼 肠 沉 毒 的 生活 周期 。 _ (a) (b) } 图 21-25 (2) 呼 肠 病毒 的 核心 。 (b) # (a) 的 一 部 分 放大 。 mRNA HF 从 黑色 核心 中 呈 线 状 伸展 出 来 C(N，M. Bartlett,S. G. Gillies, S. Bullivant 及 A. R. Bellamy 于 1974 J. Virol., 14: 324), 的 。 复 制 的 结果 形成 了 一 个 由 一 整套 双 链 片 候 和 核心 蛋白 质 所 构成 的 聚集 体 ( 注 意 , 任 何 “ 时 候 都 没有 出 现 游离 的 (一 ) 链 ), 然 后 迅速 形成 最 终 的 核心 接着 20 面体 外 壳 国 绕 着 核 心包 装 起 来 。 an . Tiras Gate, 是 病毒 颗粒 的 RNA 的 (十 ) 链 从 未 被 征用 过 。 其 (一 ) 链 是 合成 所 有 子 代 ( 十 ) 链 的 模板 , 子 代 ( 十 ) 链 则 是 合成 双 链 病毒 RNA 的 模板 。 VERBS 逆转 录 病 毒 (retrovirus) 含有 维系 在 一 个 复合 体 中 的 完全 相同 的 两 条 主要 的 、 大 的 及 两 条 小 的 单 链 的 RNA 分 子 。 逆 转录 病毒 在 所 有 已 知 病毒 中 是 独特 的 , 唯 有 它 在 生 活 周期 中 有 一 个 逆转 一 般 信息 流 的 阶段 〈 即 RNA 一 DNA)。 而 不 是 像 通常 的 机 理 那 样 (CDNA 一 RNA)。 在 所 有 逆转 录 病 毒 的 生活 周期 中 ， 还 有 另 一 个 不 寻常 的 特征 : 要 经 过 一 个 形成 DNA 中 间 体 的 必要 步骤 , 此 中 间 体 就 像 噬菌体 Mu 那样 插 人 到 宿主 的 染色 体 中 。 大 部 分 逆转 录 病 毒 都 引起 肿瘤 ,因而 引起 人 们 特殊 的 兴趣 。 在 这 一 部 分 我 们 不 讨论 它们 的 致 瘤 能 力 , 只 是 八 虑 产生 后 代 病 毒 的 复制 方式 。 。242。 到 目前 为 止 ,了 解 得 最 多 的 逆转 录 病 毒 是 侵 染 鸡 的 劳 氏 肉瘤 病毒 〈Rous sarcoma vi- rus, 简写 为 RSV), 1964 年 Howard Temin 观察 到 ，RSV 的 增殖 可 以 被 氨 甲 蝶 吟 、 阿 Bie (DNA 合成 的 抑制 剂 ) 以 及 放 线 菌 素 DRM DNA 的 RNA 合成 的 抑制 剂 ) 所 阻 断 。 在 这 一 观察 的 基础 上 ， 他 提出 ， 这 个 病毒 的 生命 周期 中 包括 着 一 个 DNA 中 间 物 (DNA intermediate)， 他 命名 这 个 中 间 物 为 原 病毒 (provirus )。 这 一 假说 提出 了 一 个 轩 新 的 观点 ， 即 DNA 可 以 依照 RNA 而 合成 出 来 。1970 年 Temin 和 David Baltimore 进一步 分 别 证 实 并 指出 : 在 一 些 岛 类 及 鼠 类 的 逆转 录 病 毒 中 存在 逆转 录 酶 ， 这 个 酶 能 以 单 链 RNA 为 模板 合成 出 双 链 DNA。 从 此 以 后 ,人 们 才 改 变 了 一 直 对 此 观点 抱 有 的 怀疑 态度 。 逆转 录 酶 逆转 录 酶 具有 三 种 酶 活性 : 1. 拷贝 一 个 RNA 分 子 , 得 到 一 个 双 链 RNA-DNA 杂 合 体 , 使 用 引物 ,以 3 -5 磷酸 二 酯 键 的 方式 与 了 -脱氧 核糖 核 痛 三 磷酸 连接 。 2. 可 拷贝 一 个 带 有 引物 的 单 链 DNA， 形 成 双 链 DNA。 3. 降解 DNA-RNA 杂 合 体 中 的 RNA《〈 有 核糖 核酸 梅 五 活性 )oe 在 体外 ,如 果 提 供 合适 的 引物 , 单 链 RNA 可 以 逆转 录 出 一 互补 的 DNA 链 ; 接着 ， 这 一 单 链 可 以 成 为 双 链 DNA， 如 图 21-26 所 示 。 5’ -2 聚合 酶 3° 3'5 各 | | (再 次 需要 |! RNase | 引物 ) | | =n aria’ init | | | | | 3， 3 1 | 引物 > 本 r a | 5'3' 5' 5'3 “RNA 的 . 带 引 物 的 RNA DNA .RNA 杂 合 体 DNA 拷贝 双 链 DNA 21-26 WR RM BE RNA 转变 成 双 链 DNA 的 假设 过 程 。 其 中 引物 可 能 是 DNA， 也 可 能 是 RNA， 它 杂交 到 模板 的 3 末端 。 目前 并 不 了 解 在 自 然 界 是 否 在 模板 的 末端 发 生 引物 化 过 程 。 因 此 ， 袁 实 的 一 系列 过 程 必 然 比 上 述 图 示 的 要 复杂 得 多 。 如 图 中 简单 所 示 ，, 需要 一 守 聚 脱氧 核糖 核 背 酸 做 引物 , 以 避免 线性 DNA 分 子 末端 复 制 的 问题 。 这 一 问题 已 在 第 十 五 章 结合 噬菌体 T7 的 复制 进行 讨论 。 这 种 末端 引物 在 自 然 雾 是 得 不 到 的 ,因此 ,需要 一 复杂 得 多 的 方案 来 加 以 解释 ， 不 久 就 会 讨论 RSV 的 方案 。 劳 氏 肉瘤 病毒 的 生活 周期 : eH ,逆转 录 病 毒 的 基本 生活 周期 如 图 21-27 所 示 ， 分 为 两 个 阶段 。 在 第 一 阶段 ,病毒 颗粒 中 含有 的 逆转 录 梅 催化 从 单 链 病毒 RNA 到 双 链 DNA 原 病 毒 的 合成 反应 。 在 病毒 发 育 过 程 中 一 个 必 不 可 少 的 步骤 是 双 链 DNA 原 病毒 整合 到 宿主 染色 体 中 。 人 们 设想 原 病 毒 以 环 状 分 子 整合 ,但 证 据 不 足 。 插 和 DNA 的 基因 顺序 与 病毒 DNA 中 的 次 序 完全 相同 ， 这 一 后 和 1 噬菌体 不 同 ,， 所 以 病毒 DNA 环 化 及 整合 位 点 必然 是 相同 的 。 在 第 二 阶段 转 。243 。 图 21-27 逆转 录 病 毒 的 生活 周期 .病毒 RNA 进入 细胞 ,通过 逆转 录 酶 转变 为 双 链 DNA, WH DNA 再 整合 到 宿主 染色 体 中 成 为 原 病 毒 。 然后 再 转录 出 RNA 本 RNA。 进 一 步 再 包装 ， 产 生子 代 病 录 发 生 了 。 转 录 子 经 加 工 修饰 后 成 为 mRNA 分 子 ， 然 后 翻译 成 两 个 最 终 蛋 白质 和 两 个 多 聚 蛋白 质 。 这 两 个 多 聚 蛋白 质 经 切割 得 到 6 个 以 上 的 多 肽 链 ， 其 中 两 个 蛋白 质 聚 合 形 成 逆转 录 酶 ,四 个 蛋白 质 形成 外 壳 〈capsid)。 另 外 两 个 蛋 日 质 形 成 被 模 (envelope), 通 过 一 种 尚 不 为 人 所 知 的 方式 ,合成 病毒 RNA 。 装 配 完成 的 病毒 粒子 以 出 芽 方 式 , 不 断 地 从 被 感染 细胞 中 吓 出 而 脱落 ,未 给 宿主 细胞 造成 明显 的 伤害 。 以 下 部 分 将 对 劳 氏 肉瘤 病毒 的 各 种 生物 学 特性 作 进 一 步 介绍 。 RSV 病毒 的 RNA HER - 前 面 说 过 ，RSV 不 是 仅 含有 单条 的 RNA， 而 是 有 四 条 以 氢 键 结合 在 一 起 的 RNA (图 21-28)。 较 大 的 一 对 ( 称 为 38S 链 或 单 体 链 ) 携 带 所 有 的 遗传 信息 , 而 且 完 全 相同 。 两 条 较 小 的 链 是 宿主 的 tRNA 分 子 。 这 种 tRNA 存在 于 所 有 鸟 类 的 逆转 录 病 毒 粒 子 中 。 鼠 逆转 录 病 毒 则 携带 宿主 的 tRNAe。 分 子 。 在 后 面 我 们 将 看 到 ，tRNA 分 子 的 位 置 对 于 复制 是 至 关 重 要 的 。 每 一 个 tRNA 分 子 的 3 末端 部 分 ,通过 气 键 与 388 链 的 距 其 了 端 101 个 碱 基 对 的 被 称 为 pbs 的 区 域 联系 在 一 起 。 劳 氏 肉瘤 病毒 RNA 的 另 一 个 重要 特征 ,是 每 个 388 分 子 中 含有 两 个 相同 的 或 非 党 相似 的 21 个 碱 基 的 非 编 码 序列 。 这 些 序列 标记 为 r (图 21-28)。 + RMA 5 子 和 3' ERA) 尾 序列 之 邻 。 另 外 ,还 有 两 个 非 编码 未 端 序列 , 即 马上 就 要 讨论 的 us 5 帽子 | poly(A)290 At kK poly(A)zee 图 21-28 RAMA RNA 的 结构 。 注 意 , 两 个 单 体 之 间 的 氢 键 区 形成 两 条 平行 的 链 ， 而 不 是 形成 两 条 反 平 行 链 。 目 前 对 这 个 非 寻 常 区 域 了 解 甚 少 。r、u3、45 代表 一 定 的 碱 基 序 列 详 见 正文 。 这 些 序列 的 DNA BAA R、u3 Rus AA, 。244 。 和 u3,g ud Fl 5’ 端 序列 相 邻 ， u3 和 3/ 端 r Fr ITA Bo 病毒 RNA Hx DNA 中 间 体 的 转化 病毒 RNA 向 双 链 DNA 分 子 转化 过 程 中 ， 所 有 的 中 间 物 都 只 含有 一 条 38S RNA 链 。 推 测 这些 中 间 物 在 病毒 进入 细胞 质 不 久 后 便 与 38S 部 分 分 离 。 RSV RNA 的 合成 早 在 转录 和 翻译 之 前 就 已 进行 。 这 是 因为 RSV 本 身 携 带 着 它 自 身 的 复制 酶 , 即 逆 转录 酶 。 如 同 许多 复制 酶 一 样 , 此 酶 也 需要 引物 ; 道 转 录 病 毒 因为 自身 具有 tRNA 分 子 作为 引物 而 解决 了 这 个 引发 问题 引物 位 于 38S RNA Ay 5 Ml GER, 在 生长 着 的 DNA 链 到 达 模 板 RNA 分 子 的 宁 端 之 前 ， 只 有 一 小 月 DNA 能 从 tRNA 的 3 羟基 聚合 生成 。 病毒 RNA 向 双 链 DNA 中 间 物 转化 的 确切 机 理 还 不 清楚 ,这 里 要 说 明 的 主要 特性 是 病毒 RNA 碱 基 和 DNA 拷贝 碱 基 之 间 的 差异 ,如 图 21-29 所 示 。 人 们 发 现 ，RNA Ay FAY 5 de r-u5 片段 与 3 端 u3-r 片段 结合 在 一 起 所 形成 的 DNA 序列 。U3-R-U5 出 现在 双 链 DNA 分 子 的 两 端 , 即 这 个 DNA 分 子 是 末端 过 剩 的 (terminally redundant), — U3-R-U5 通常 又 写成 LTR， 即 长 末端 重复 。 UESAC ak Ma 图 21-30。 它 包括 以 下 步骤 : 1. 逆转 录 酶 使 一 个 tRNA 分 子 从 其 3 羟基 端 向 模板 5” 端 延 伸 , 生 成 一 个 RU5) 的 DNA 拷贝 2. 对 应 于 RU5) 序列 的 RNA 碱 基 被 移 去 (可 能 是 逆转 录 酶 的 另 一 种 活性 ), 从 而 使 新 合成 的 DNA 的 R\U5) 可 以 提供 待 互补 序列 ;成 为 形成 氢 键 的 一 方 。 假 设 此 时 幅 子 和 多 聚 A 尾 也 被 除去 。 3. tRNA 与 其 互补 序列 之 间 的 氢 键 分 开 ， 新 合成 的 DNA 375 RNA 分 开 ， 然 后 此 DNA FERS RNA 的 另 一 端 通过 rz 和 R 之 间 的 氢 键 连接 在 一 起 。 4.DNA RGAE DNA 的 3 端 逐 个 地 添加 核 背 酸 ,合成 一 条 几乎 完全 的 双 链 分 Fe 5. RNA 3) 端的 .u3-r 序列 被 水 解除 去 。 6. DNA RARE RNA 的 3 端 逐个 地 应 加 核 苷 酸 ， 完 成 双 链 分 子 ， 并 形成 第 一 个 PER 7. 所 有 RNA 都 被 水 解除 去 ， 此 水 解 反 应 大 概 就 是 由 逆转 录 酶 的 核糖 核酸 酶 活性 催 化 的 。 8. 第 一 个 LTR 解 链 ， 在 分 子 的 另 一 端 形成 (pbs) (PBS) WH. 这 种 配对 为 形成 人 wr, RNA € / | 有 DNA __, U3-R-US5 U3-R-US ,, 3 5° —--——~ Uu—,- 产 LTR LTR 21-29 在 一 个 38S 的 病毒 RNA 链 上 及 其 DNA 找 贝 上 (用 大 写字 母 表 示 ) 的 末端 序列 。DNA 中 的 U3-R-US 序列 亦 被 称 为 LTR 或 长 未 端 重复 序列 。 。245 。 病毒 的 10kbRNA tRNA cap ru5, pbs u3-r ‘ é |; 在 逆转 录 酶 作用 下 tRNA 3 fe or R' (U5)' pee aes eat. ruU5 pbs ; u3—r |e BEM BAKA ru5; 移 去 帽子 RUS)’ Al poly A Fe nic! = u3—r ， p08) . |: tRNA 45 pbs 序列 分 开 ;R" 。 \ 和 | _ (pbs) u3—r 双 螺 旋 形 成 5 | "本 一 一 一 一 Pe ius I |. DNA 从 3 端 延 人 5 Sees) u3—r » 3 ES 7 (U3yRQU5y 1 5 从 3' 端 移 走 u3-r 末端 b , (pbs) (He Teme. TS ag Je DNA 从 RNA 93" 端 延伸 ， 了 U3-R-U5 (PBS) “fy CUS 7 把 所 有 的 RNA 移 走 9- (PBS), FTRTTTT TOORO5 8 双 螺 旋 融 解 ; (PBS) - (PBS)' Us-R-U5 (PBS) ,, 双 螺 旋 形成 3 FE 一 一 一 一 屏 于 (0055 {s DNA 从 3' 端 延伸 到 分 子 末端 _U3-R-U5 (PBS) U3-R-U5 -~ DER 人 U3) (U3)'R: (US) (PBS) (U3)R (U5)’ 二 这 be ime eed LTR LTR 图 21-30 从 劳 氏 肉瘤 病毒 RNA 产生 一 个 具有 两 个 末端 LTR 序列 的 双 链 DNA 分 子 的 假设 图 解 。pbs 序列 与 tRNA 互补 ; 横 线 上 面 的 字母 与 横 线 下 面 的 字母 以 及 数字 分 别 表示 RNA 的 序列 与 DNA 的 序列 。““ “表示 互补 。 RNA 用 实 线 表示 ，DNA 用 虚线 表示 。 第 二 个 LTR 提供 了 模板 。 9.DNA 聚合 酶 向 两 个 3 端 分 别 落 加 核 背 酸 ， 生 成 一 个 以 LTR 为 两 端 序列 的 完全 的 双 链 DNA 分 子 。 注意 ,第 8 步 生成 的 分 子 具 有 两 个 互补 LIR 序列 ， 因 此 第 9 步 也 可 以 是 另 一 种 方 式 ， 即 两 个 互补 的 LTR 序列 可 以 通过 氢 键 形成 双 链 LTR, DNA RAB RK—A BA 。246 。 3' 端 延 伸 到 一 定 程度 ， 就 可 能 合成 出 一 个 只 带 有 单个 LTR 拷贝 的 双 链 的 环形 分 子 。 这 样 的 分 子 已 经 在 被 感染 的 细胞 中 观察 到 。 不 过 线形 分 子 的 数目 远 远 超过 环形 分 子 的 数目 。 图 21-30 中 所 示 的 最 终 分 子 以 后 整合 到 染色 体 中 ,并 在 那里 被 转录 。 在 生活 周期 中 的 某 些 时 刻 ， 模 板 必须 被 拷贝 以 再 产生 病毒 RNA。 显 然 这 个 过 程 应 当 发 生 在 转录 步骤 ， 但 具体 细节 还 不 了 解 。 因为 只 有 百 分 之 一 的 RSV 颗粒 具有 侵 染 力 , 因 此 ,对 于 所 观察 的 病毒 ， 难 于 将 它 在 细胞 内 的 种 种 结构 与 其 生活 周期 联系 起 来 。 实 验 中 必须 使 用 比 100 个 病毒 粒子 去 感染 一 个 细胞 (100:1) 更 大 些 的 比例 去 感染 宿主 细胞 ,才能 得 到 足够 的 感染 细胞 来 进行 研究 。 由 于 99 多 的 病毒 条 粒 是 非 感染 性 (缺陷 型 ) 的 ,所 以 ,如 果 每 一 个 RNA 分 子 在 被 感染 细胞 中 都 发 生 了 某 些 改变 ,那么 所 观察 到 的 99 多 的 分 子 完全 有 可 能 是 从 这 些 缺 陷 型 颗粒 发 育 而 产生 的 ,这 些 缺 陷 型 颗粒 还 能 感染 细胞 。 因 此 , 很 可 能 不 常见 到 的 环形 分 子 恰 恰 成 为 仅 有 的 繁殖 中 间 体 。 很 清楚 ,为 了 和 弄 明 日 这 种 病毒 的 复制 机 理 尚 需 进 行 大 量 的 深 人 研究 。 病毒 DNA 的 整合 原 病 毒 形成 机 理 的 任何 细节 都 不 清楚 ， 但 是 原 病毒 的 结构 却 给 人 们 提示 了 一 种 可 能 的 而 且 有 些 令 人 吃惊 的 机 理 。 用 重组 DNA 技术 把 从 被 感染 细胞 中 得 到 的 原 病 毒 克隆 到 大 肋 杆 菌 2 噬菌体 上 , 由 此 对 整合 进行 研究 。 科 学 家 分 离 了 原 病 毒 DNA， 用 限制 性 内 切 酶 对 其 进行 切割 ,并 测定 宿主 和 病毒 DNA 的 两 个 接点 处 附近 的 碱 基 序 列 , 然后 把 这 些 序 列 与 未 整合 的 病毒 RNA 端 部 的 序列 进行 比较 。 这 一 实验 没有 采用 RSV, 而 是 改 用 7 个 其 他 的 逆转 录 病 毒 作为 实验 体系 ， 用 妥 坏 死 病毒 KKSNYV， spleen necrosis virus) 的 实 (a) 病毒 形式 _ 5'AAITGT ACA.....8300 bp.....TGT ACAITT 3! ; ' : 569 bp: LTR 569 bp: LTR (b) 整合 形式 5 —>= ”一 -~ — — > AAAAT|TGT ACA|.....8300 bp.....|TOT ACAJAAAAT #2 itR---——- > LIR--=—--= > = 21-31 未 整合 的 和 整合 的 脾 坏 死 病 毒 DNA 序列 。 病 毒 DNA 序列 用 实 RAR BE DNA 用 虚线 表示 。 同 种 的 箭头 对 〔〈 实 线 、 虚 线 及 长 虚线 的 ) 代 表 相应 的 序列 。 如 果 箭 头 的 指向 相同 ， 那 么 它 所 代表 的 序列 是 直接 重复 的 ; 如 果 箭头 的 指向 相反 ,那么 它 所 代表 的 序列 是 倒转 重复 。 验 结果 图 示 在 图 21-31 中 。(a) TART HS BRE 3 多 聚 A 尾 的 病毒 RNA, 之 所 以 略 去 了 这 些 末端 区 域 是 因为 在 逆转 录 复 制 中 它们 不 被 拷贝 。 可 以 看 到 , 长度 为 569 个 碱 ze (LTR) 位 于 每 条 链 的 末端 ,而且 每 个 LTR 末端 的 最 终 三 个 碱 基 呈 倒转 重复 。 图 中 两 条 垂直 虚线 标明 了 原 病 毒 的 碱 基 界限 ; 也 就 是 说 ， 末 端的 TT 和 AA 不 被 整合 。 (b) 展示 了 整合 态 的 原 病 毒 DNA 链 的 结构 。 它 有 三 点 重要 特征 : 1. 569 个 碱 基 长 的 序列 是 重复 的 。 2. 包含 有 569 碱 基 重 复 序列 的 完整 插 人 区域 以 9%-TG 和 CA-3' 为 未 端 。 3. 接点 处 宿主 DNA 是 同 向 重复 的 5 个 碱 基 。 因 此 ,整合 的 DNA 序列 可 以 写成 LTR LTR 5H-3V-563V-3V-8300V-3V-563V-3V-5H >247 。 H 和 YV 分 别 表示 宿主 和 病毒 。 从 上 表示 式 中 可 以 看 到 : (1) 病毒 DNA 两 端 是 顺 向 重 复 的 两 个 长 序列 (LTR), SP LTR 的 两 端 是 反 向 重复 的 短 序 列 (3V)。(2) 病毒 DNA 插 人 序列 两 端 为 宿主 DNA 的 顺 向 重复 的 短 序 列 。 在 检查 过 的 每 一 种 属 逆转 录 病 毒 中 都 发 现 这 一 格局 ; 唯一 变化 的 是 不 同 种 病毒 的 短 重 复 序列 的 长 度 和 碱 基 序列 有 所 不 同 ; 并 且 , 至今 观 察 过 的 所 有 整合 的 逆转 录 病 毒 DNA 都 以 5%-TG 和 CA-3' HAM. KAA 们 提示 ， 可 能 存在 着 一 种 适合 于 所 有 逆转 录 病 毒 的 共同 的 整合 机 理 。 而 当 检查 同一 种 属 的 、 相 互 独立 的 一 些 原 病毒 时 ,发 现在 每 一 个 样品 中 , 同 向 重复 的 宿主 短 序列 都 不 相同 ,所 以 ,整合 可 能 发 生 在 宿主 DNA 的 许多 位 点 上 。 原 病毒 及 邻近 区 域 的 序列 使 人 联想 起 转 座 子 的 性 质 。 在 第 十 九 章 中 曾 指出 ， 经 过 转 座 作 用 后 , 可 移动 的 遗传 因子 总 是 在 其 两 个 未 端 倒转 重复 序列 〈2 一 1500 个 碱 基 对 ) 的 两 侧 再 各 接 一 个 小 的 、 同 向 重复 的 细胞 DNA (4-12 个 碱 基 对 ), 而 且 ,酵母 转 座 因子 Tyl、 果 晶 转 座 因 子 Copia DAMME Mu 的 整合 DNA 也 都 以 TG 和 CA HAH REE 们 的 相似 是 偶然 的 9 太 不 可 能 。 因 此 ， 人 们 设想 ， 逆 转录 病毒 的 整合 机 理 是 类 似 于 转 座 . 作用 机 理 。 实 际 上 还 没有 证 据 表 明 逆 转 病毒 的 整合 中 确实 发 生 了 转 座 ， 因 为 转 座 作 用 的 标志 是 既 要 有 靶 序 列 的 复制 ,还 要 有 转 座 子 自身 的 复制 。 在 逆转 录 病 毒 中 ,染色 体 靶 序列 复制 了 , 但 无 人 知道 究竟 是 逆转 录 酶 合成 出 的 双 链 DNA 分 子 本 身 整 合 进 染 色 体 , 还 是 这 个 DNA 分 子 的 拷贝 从 细胞 质 中 转 座 到 染色 体 的 位 点 上 。 然 而 ,在 序列 分 析 数 据 的 基础 上 ，Howard Temin 对 此 提出 看 法 :逆转 录 病 毒 是 从 古代 的 可 转 座 因 子 经 衍生 而 形成 ,并 且 有 了 复制 和 被 壳 化 的 能 力 。 一 旦 整合 后 , 原 病 毒 DNA 就 待 在 宿主 细胞 染色 体 上 而 不 被 切除 。 原 病 毒 的 存在 并 不 抑制 细胞 分 裂 ,所 以 子 细胞 也 继承 了 整合 的 原 病毒 ,这些 子 细胞 (以 及 后 续 世 代 的 细胞 ) 继续 产生 有 活性 的 病毒 颗粒 。 RSV 的 转录 作用 转录 开始 了 RSV 生活 周期 的 第 二 阶段 ,如 图 21-27 所 示 。 单 一 的 转录 子 ( 标 为 38S RNA) 包含 了 所 有 的 病毒 基因 (图 21-32)， 一 部 分 转录 子 保持 其 完整 性 以 作为 病毒 RNA- 的 来 源 以 及 作为 合成 多 聚 蛋 白 的 mRNA 分 子 ， 多 聚 蛋白 经 切割 生成 Gag ZAR Pol 蛋白 。 许多 388 分 子 被 切割 ， 形 成 编码 env 和 src 基因 的 蛋白 产物 的 mRNA 分 子 。 Gag 蛋白 被 切 成 病毒 核心 中 的 4 个 蛋白 质 。 作 为 逆转 录 酶 8 亚 基 的 Pol SAK, HRY 割 成 两 个 片 朋 ,其 中 一 个 片 眉 称 为 " 链 , 它 与 8 亚 基 结合 形成 有 活性 的 逆转 录 酶 。enY 基 因 的 蛋白 产物 是 病毒 粒子 被 膜 中 的 病毒 蛋白 。Src 蛋白 是 致癌 反应 所 必需 的 ;这 一 点 将 EAST Pio sro 基因 突变 后 仍 能 产生 有 活性 的 病毒 ,但 是 不 能 诱导 向 瘤 细胞 的 转化 。 前 面 提 到 过 ,病毒 DNA 的 插 人 (实际 上 是 逆转 录 病 毒 的 活性 ) 是 病毒 成 功 地 完成 其 生活 周期 必 不 可 少 的 。 通 过 分 析 LTR 及 38S mRNA 分 子 的 碱 基 序列 ， 这 种 需求 的 原 因 之 一 便 清 楚 了 ，8gag 基因 的 编码 序列 开始 于 US 序列 ( 见 图 21-29) 右 侧 ， 然 而 38s mRNA 的 启动 子 却 在 U3 区 域 。 所 以 ,在 病毒 RNA 中 , 启动 子 与 编码 区 并 不 相连 。 当 U3 与 R-U5 序列 相连 形成 LTR, 就 把 启动 子 带 到 编码 序列 的 上 游 位 置 ， 于 是 38s mRNA 得 以 合成 。 “248。 HREAH gag pol env src 的 原 病 毒 DNA | 38S mRNA 一 一 一 ah a 一 一 一 一 一 ~ nn 2 iain Be arene ae : ; | NA ek1-3 4 翻译 ee a EAR AUG 一 一 -一 -一 pT oe oa i 翻译 {2 [a | ee ane | 被 膜 蛋白 质 Src 蛋白 质 21-32 ” 劳 氏 肉瘤 病毒 的 基因 顺序 。 并 图 示 了 其 mRNA 分 子 (虚线 ) 及 其 蛋白 质 。 动物 DNA 病毒 有 人 可 能 认为 DNA 病毒 会 比 RNA 病毒 少 一 些 麻 烦 , 因为 DNA 病毒 的 复制 及 转 录 应 遵循 DNA MERAH. mA DNA 病毒 不 需要 逆转 录 酶 那样 的 特殊 酶 。 理 论 上 it, —4+ DNA 病毒 只 含有 一 个 DNA 分 子 , 此 DNA 编码 一 或 两 种 外 壳 蛋 白 。 微 小 病 # (parvoviruse) 确实 遵循 这 种 简单 的 方式 。 但 是 我 们 将 看 到 大 多 数 DNA 病毒 的 生活 周期 要 复杂 得 多 。 有 些 病 毒 进 化 形成 100 多 个 基因 , 比 起 只 有 区 区 几 个 基因 的 病毒 来 说 县 有 较 大 的 多 变性 ,从 而 成 为 极端 复杂 的 结构 。 本 部 分 我 们 仅仅 介绍 多 种 DNA 病毒 中 的 很 少 几 种 , 即 挑选 那些 生活 周期 较为 明了 的 几 类 DNA 病毒 进行 讨论 。 这 些 病 毒 包括 微小 病毒 、 乳 多 和 孔 病 毒 〈papovaviruses) 及 腺 病毒 〈adenovirus )。 为 了 讨论 已 经 充分 研 究 过 的 疱疹 病毒 〈herpesviruses) 和 冶 病 病毒 (pboxviruses),， 例 如 牛 癌 苗 病毒 (vaccinia) _ 和 及 乳头 病毒 《papilloma)， 读 者 应 参考 在 本 章 后 所 列 参考 文献 微小 病毒 微小 病毒 有 两 类 : 自主 型 的 和 缺陷 型 的 。 自 主 型 的 病毒 凭借 它们 自己 及 宿主 的 基因 产物 便 可 产生 后 代 。 而 缺陷 型 的 病毒 还 需要 一 些 外 加 的 蛋白 质 ， 它 们 婚 非 病毒 本 身 的 核 酸 又 非 宿主 的 核酸 所 形成 的 基因 产物 。 这 类 病毒 只 有 在 宿主 被 另 一 种 含 DNA 的 病毒 ， 例如 腺 病毒 感染 时 才能 复制 。 推 测 腺 病毒 可 能 对 它 提 供 了 必需 的 蛋白 质 。 。249 = 微小 病毒 含有 一 个 非常 小 的 单 链 DNA FEE. KK} DNA 一 般 含 有 4800 个 碱 基 ， 它 编码 三 个 蛋白 质 ， 分 子 量 分 别 为 61000, 64000 和 83 000。 这 三 个 分 子 量 的 总 和 比 .4 800 个 碱 基 的 编码 容量 〈 若 在 一 个 阅读 框架 中 它 所 编码 的 蛋白 质 的 最 大 分 子 量 应 为 176 000) 超出 了 32 000。 因 为 它 是 使 用 了 三 个 阅读 框架 (目前 , 除了 大 肠 杆 菌 噬菌体 ox 174 之 外 ， 微 小 病毒 是 唯一 已 知 的 具有 重 登 基因 的 病毒 )。 生成 的 这 三 种 病毒 蛋白 只 用 于 建造 外 壳 。 微 小 病毒 利用 宿主 的 酶 去 进行 转录 和 复制 。 人 们 注意 到 这 种 现象 ， 即 这 些 病毒 只 是 在 宿主 DNA 复制 时 才能 复制 ， 而 且 病 毒 DNA 的 复制 只 在 宿主 细胞 核 中 进 行 。 推 测 ,病毒 复制 所 必需 的 一 些 宿主 的 酶 只 在 彼 时 彼 地 才能 得 到 。 不 论 自主 型 的 还 是 缺陷 型 的 微小 病毒 , 虽然 细节 有 所 不 同 , 其 复制 过 程 都 很 相似 。 了 解 得 最 多 的 是 腺 联 病毒 (adeno-associated virus，AAV) 一 一 种 缺陷 型 病毒 的 复制 ， 这 病毒 DNA “ 翻 过 去 ” i) ® 1 3 a’ b’dse b a- efgh fe’ | sara Pes Se —) ef g - d b’ 7 y 5's f’ h ; 3' -OH 末端 延伸 ， 打开 5 -P 末端 bat (=) efghfe’., II PR A PEP BHT | j d b75 (+) e’f'g’h’fe 5 ee (—) 链 延 伸 / c FE a’ 处 延伸 ,取代 (+ ) 链 中 弯曲 部 分 5, et (=) 了 sse 人 ae “pa (+) 和 机 但 全 全 证人 oe efg' hfe ., (ES ep a ee o arma tary (+) Sabedba (+) ere A 21-33 ”微小 病毒 DNA 的 复制 图 示 。 这 个 DNA 在 子 代 (-- ) 链 中 产生 一 个 倒转 的 序列 (图 中 阴影 部 分 )。 短 的 垂直 箭头 指出 发 生 专 一 性 位 点 切割 的 位 置 产 生 3-OH 基 ， 从 这 个 3 -OH 基 处 可 以 再 生长 出 一 女 新 链 。 图 中 所 示 的 各 种 分 子 可 以 进一步 生长 ;延伸 并 将 能 产生 在 末端 片段 中 、 有 倒转 的 其 他 序列 。 s。250。 部 分 所 描述 的 图 示 正 是 该 种 病毒 。 只 有 一 个 单 链 DNA 的 微小 病毒 同样 面临 着 通常 的 问题 一 -为 DNA 合成 的 起 始 怎样 提供 引物 。 然而 ， 其 DNA 碱 基 序列 的 排列 使 其 可 以 自行 引发 复制 。 这 一 单 链 含 有 了 两 个 未 端 反 向 的 重复 序列 ,其 末端 表 折 ,形成 终端 发 夹 环 ,如 图 21-33 所 示 , 其 中 一 个 发 KABA 3'-OH 末端 碱 基 对 。 这 提出 了 引发 的 完美 备件 ， 图 中 展示 了 引发 后 DNA 复 制 的 各 个 阶 息 ， 这 一 复制 模型 有 时 称 为 发 夹 转移 模型 (hairpin transfer model)。 首 先 ， 3 -OH 端 延伸 , 当 伸 长 的 链 到 达 5° 端 时 ,发生 位 移 反应 ，5 端 发 夹 环 打开 , 从 而 保证 链 什 长 到 5 端 。 在 这 个 阶段 ,分 子 是 一 个 完整 的 双 链 发 夹 (II)。 然 后 在 图 中 小 箭头 所 示 处 断 ， 开 ，, 继 续 延 伸 , 生 成 一 个 双 链 线性 分 子 (IIID)。 接 着 ， 未 端 发 生 解 链 ， 各 个 末端 的 反 向 重复 序列 分 别 形 成 两 个 短 的 发 夹 环 , 又 出 现 3 端 发 夹 环 ，3'-OH 引物 又 可 用 于 链 的 延伸 。 这 样 的 末端 有 两 个 ,一 个 或 两 个 都 可 被 征用 。 若 两 个 同时 征用 ,将 出 现 结构 很 大 的 分 子 〈 已 经 观察 到 )。 在 这 里 我 们 看 看 仅 用 一 个 活性 引物 的 分 子 。 从 中 间 物 左边 3 端 延 伸 得 到 分 FW 和 Vo 从 另 一 个 3 端 延伸 得 到 分 子 T 和 IV。 如 同 亲 代 分 子 一 样 ， 分 子 了 BH 链 ,但 其 短 反 向 重复 片 假 即 3 端 序列 为 ab'c'd' ba(IID) ， 而 亲 代 中 为 ab'dcba(II)。 倒 位 同样 也 存在 于 其 他 三 个 分 子 中 ,这 两 个 序列 称 做 “ 翻 过 去 ”(flip) 和 “ 翻 过 来 ”(flop)。 正 是 在 后 代 病 毒 中 发 现 有 这 两 个 序列 存在 ， 支 持 了 图 中 所 示 的 复制 方式 。 复 制 过 程 可 能 在 箭头 后 面 对 分 子 下 和 IV 切割 ， 从 而 生成 类 型 III 分 子 一 双 链 线性 分 子 。 它 可 能 再 转变 成 四 重 发 夹 中 间 体 ,分 子 V 也 同样 依照 途径 LIA 进行 复制 。 然 而 , 正 像 图 示 模 型 ， 起 始 分 子 工 为 一 条 (一 ) 链 ,而 分 子 V 却 为 一 条 (十 ) 链 。 在 某 种 范围 , 它 也 被 包装 ， 而 且 可 有 这 些 分 子 的 颗粒 也 是 有 感染 性 的 。( 十 ) 链 的 复制 与 图 示 的 方案 一 样 ,( 十 )( 一 ) 链 均 可 生 成 。 这 样 ,在 一 组 大 量 的 病毒 样品 中 ,可 以 发 现 ( 十 ) 链 病毒 及 (一 ) 链 病毒 两 种 ,而 且 在 “ 翻 过 去 ”和 “ 翻 过 来 ”两 种 构 型 中 都 有 。 但 在 自主 型 的 微小 病毒 中 还 未 发 现 “ 翻 过 去 "和 *“ 翻 过 来 ”颗粒 。 所 以 它们 可 能 启用 另 一 种 复制 途径 。 微小 病毒 的 转录 方式 目前 还 一 无 所 知 。 乳 多 和 孔 病 毒 : 多 瘤 病 毒 和 SV40 多 瘤 病 毒 和 狼 猴 病毒 40(SV40) 是 两 个 研究 得 较 清 楚 的 乳 多 和 孔 病毒 (图 21-34)。 它 和 在 感染 某 些 宿主 时 都 非常 高 效 地 致癌 ;在 另 一 些 宿主 中 , 它们 是 烈性 的 ， 以 破裂 被 感染 细胞 和 释放 子 代 病 毒 为 结局 。 在 这 一 部 分 我 们 只 讨论 其 裂解 周期 。 乳 多 孔 病 毒 颗 粒 及 其 DNA 的 性 质 所 有 乳 多 和 孔 病毒 颗粒 都 含有 一 个 环 状 DNA 分 子 的 裸露 20 面体, 纯化 后 ，DNA & 超 螺旋 状 ， 外 壳 包 括 一 个 主要 的 外 壳 蛋 白 VP1 和 两 个 较 次 要 的 外 壳 蛋 白 VP2 和 VP3。 除了 组 蛋白 HI 之 外 ,此 病毒 的 DNA 能 与 所 有 宿主 组 蛋白 结合 ,这 些 组 蛋白 引起 DNA 分 子 紧缩 而 形成 真 核 染色 质 特 有 的 珠 状 核 小 体 结构 ( 见 图 21-35 和 第 六 章 ), 这 些 珠 状 结 构 被 称 为 小 型 染色 体 (minichromosome), 由 于 组 蛋白 的 结合 引起 双 螺旋 轻微 解 链 ， 而 且 组 蛋白 在 复制 中 自始至终 与 DNA 结合 ,所 以 在 一 圈 复 制 结束 时 , 子 代 分 子 也 处 于 轻微 的 解 链 状态 。 但 在 小 型 染色 体 中 , 由 于 DNA 围绕 组 蛋白 旋转 而 使 其 轻微 解 链 状态 变 得 不 易 察 觉 。 然 而 , 当 DNA 经 纯化 ,在 去 蛋白 一 步 除去 组 蛋白 后 (如 经 酚 抽 提 )，DNA 就 sa221re 图 21-34 SV40 病毒 的 电镜 照片 。 ”图 21-35 SV40 DNA 借助 宿主 的 组 蛋白 而 有 不 同 程度 浓缩 。 呈现 超 螺旋 构 型 。 | 多 瘤 病毒 及 SV40 的 DNA 分 子 顺序 已 完全 测 出 ;分 别 都 含有 5224 个 碱 基 对 。 在 下 面 将 讨论 SV40。 讨 论 结束 时 将 对 SV40 和 多 瘤 病毒 之 间 的 微小 差异 做 一 些 评 Bo SV40 的 生活 周期 SV40 在 猴 肾 细胞 中 以 裂解 方式 生长 。 如 同 许多 病毒 侵 染 一 样 ，SV40 的 生活 周期 可 分 为 早 、 晚 两 期 。 在 其 生活 周期 中 合成 出 五 种 病毒 编码 的 蛋白 质 ( 见 表 21-6)6 RRA 出 现 一 个 长 的 〈12 小 时 ) 潜 伏 期 ,此 期 间 病 毒 DNA 是 不 活化 的 ,它们 逐渐 向 宿主 细胞 核 迁移 。 不 论 转录 还 是 复制 都 无 法 在 核 外 进行 ， 大 概 所 需 的 多 聚 酶 只 存在 于 细胞 核 中 。 表 21-6 SV40 病毒 编码 的 蛋白 质 蛋 白 质 合成 时 间 到 功 。 人 能 T 抗原 fl _ 起 始 DNA 复制 t 抗原 、 星 未 知 VP1 晚 主要 的 外 壳 蛋 白 2 VP2 了 晚 次 要 的 外 壳 蛋 自 VP3 He 次 要 的 外 壳 蛋 白 在 感染 的 早期 ， 主 要 合成 的 病毒 蛋白 质 为 工 抗原 和 (+ 抗原 * (图 21-36)。 在 早期 . mRNA 合成 后 ， 宿 主 受 到 刺激 合成 一 些 酶 一 _DNA 聚合 酶 、 胸 腺 喀 啶 激酶 、dTMP 激酶 和 dCMP 脱 氨 酶 o- 不 久 会 看 到 ,这 些 宿主 酶 也 都 是 DNA 合成 所 必需 的 , TR 原 同样 是 病毒 DNA 合成 所 需要 的 。 几 个 小 时 后 ,宿主 DNA 也 受 刺 激 开始 合成 ， 但 不 清楚 这 是 病毒 生活 周期 不 可 缺少 的 ， 还 是 不 可 避免 的 同步 现象 。 大 约 在 病毒 和 宿主 复制 酶 合成 后 12 小 时 ,开始 合成 病毒 DNA, AA, Hai] mRNA 合成 了 ,显然 病毒 DNA 的 * 工 抗原 及 t 抗原 的 名 称 由 免疫 荧光 显微镜 观察 而 得 出 ,这 些 蛋 白质 位 于 那些 被 病毒 感染 而 转变 为 肿瘤 细胞 扯 细胞 核 之 中 。 as。 252。 合成 是 晚期 mRNA 合成 的 先决 条 件 。 这 正如 大 肠 杆 菌 噬菌体 T4 中 的 情景 二 样 ， 但 这 一 要 求 的 分 子 基 础 尚 不 为 人 所 知 。 24 -小 时 以 后 ,晚期 蛋白 质 和 DNA 聚集 成 病毒 颗粒 。 对 这 一 包装 过 程 已 了 解 得 相当 清楚 ,但 在 本 书 将 不 予 描述 。 KY 3 天 之 后 ,被 侵 染 的 细胞 裂解 ， 每 个 细胞 释放 出 10: 个 病毒 颗粒 , 裂解 很 可 能 是 由 于 很 大 的 病毒 粒子 结晶 体 状 排列 引起 的 机 械 损伤 所 致 ， 而 不 是 由 裂 解 莓 引起 的 。 早期 mRNA 及 工 抗原 任 定 的 单位 12 24 36 48 60 感染 后 的 时 间 “〈 小 时 ) SV40 DNA 的 物理 图 谱 图 21-37 展示 了 SV40 的 物理 图 谱 ， sly ila i mRNA 分 子 。 这 个 图 是 经 过 下 列 几 步 建成 的 : 用 许 晚期 mRNA 多 限制 性 内 切 酶 切割 病毒 DNA， Eee $B BERR HEI RR He HEN BAIS, BARS M meee AE He 中 分 离 到 的 、 标 记 了 的 SV40 mRNA 杂交 。 又 在 体外 翻译 体系 中 使 用 纯化 的 mRNA, 鉴别 出 对 应 于 上 述 mRNA 分 子 的 基因 产物 。 并 且 用 上 法 鉴定 了 特殊 mRNA 分 子 所 合成 的 蛋白 质 。 EcoRI 酶 在 SV40 上 只 有 一 个 切 点 ， 其 位 置 被 选 为 此 图 谱 的 参考 点 或 夫 Jd 21-36 SV40 生活 周期 中 发 生 各 种 过 程 的 时 刻 。 SV40 DNA 的 复制 图 21-37 SV40 的 物理 图 谱 。 ABARAT TS 除了 起 始 的 读 理 外 ，SV40 DNA VP1，VP2，VP3 5 个 基因 及 复制 起 始点 的 位 置 ， 以 复制 已 研究 得 相当 清楚 了 ， 复 制 起 始 及 早期 mRNA 分 子 和 了 晚期 mRNA 分 子 。 点 位 于 图 谱 0.67 位 置 处 。 这 是 工 抗原 | 的 结合 位 点 (图 21-38)。 T 抗原 是 一 个 必需 蛋白 质 ， 假 若 没 有 了 抗原 ， 那 么 SV40 的 DNA 合成 就 无 法 起 始 。 这 首先 是 由 如 下 事实 所 阐明 的 ， 即 温度 敏感 突变 株 ACTs) (T 抗原 的 基因 被 称 为 A 基因 ) 在 高 温 下 不 能 起 始 DNA 合成 。TI 抗 原 还 是 一 个 ATP BE 在 起 始 过 程 中 的 确切 功能 还 不 知道 不 过 它 的 其 他 功能 将 在 有 关 癌 病毒 部 分 进行 探讨 。 一 个 有 趣 的 观察 表明 ,复制 起 始点 必定 具备 不 寻常 的 结构 , 当 单 链 DNA 的 S1 核酸 酶 作用 于 超 螺旋 病毒 DNA 〈 已 脱 去 蛋白 质 ) 时 ,在 DNA 复制 起 点 处 形成 一 个 单一 切 点 *。 此 酶 只 作用 于 单 链 DNA， 对 于 非 超 螺旋 DNA 则 是 无 活性 的 。 在 第 四 章 中 曾 指 出 过 , 超 * SI 核酸 酶 是 一 种 从 真菌 Aspergillus oryzae 中 分 离 得 到 的 核 琶 内 切 酶 。 它 作用 于 单 链 DNA, RNA Ras 性 泡 的 单 链 分 枝 上 。 它 是 分 子 生物 学 中 的 一 种 很 有 用 的 试剂 : 早期 mRNA ¢ 253。 螺旋 DNA 分 子 中 的 很 大 一 部 分 碱 基 对 可 以 在 任何 时 刻 被 解 开 ， 而 且 这 些 融 解 区 又 可 以 被 连续 地 改变 ， 因 此 也 许可 以 设想 ,如果 DNA 是 超 螺旋 的 ,在 大 部 分 时 间 里 ，A 十 T 富 集 区 域 保持 单 链 形式 。 从 Sl 作用 的 结果 可 以 推测 ，SV40 复制 起 始 区 是 A+ TS 富 的 。 当 SV40 DNA 碱 基 序列 全 部 测 出 之 后 ， 这 一 想法 得 到 证 实 。 图 21-39 画 出 了 复制 起 始 区 的 碱 基 序列 ， 这 个 27 个 碱 基 对 的 ge a G-C 富 集 序列 。 在 这 个 序列 中 围绕 一 个 G-C M, 在 它 的 图 21- Sve 8H 两 侧 各 有 13 个 G-C 碱 基 对 的 反 向 重复 序列 ( 即 图 中 方 杠 观察 ( 承 Robley Williams 中 的 部 分 )， 其 一 边 的 外 侧 还 有 17 个 富 集 A-T 碱 基 对 序 列 。 一 个 抗原 的 四 聚 体 首先 结合 在 这 个 富 集 G-C WH 文 结 构 上 ,然后 ,另外 两 个 工 抗原 四 聚 体 协同 地 结合 到 余下 的 G-C 区 和 接着 的 两 喜 A-T 区 上 。 复 制 从 作为 两 个 反 向 复制 序列 的 对 称 轴 的 G-C . 碱 基 对 开始 。 有 意思 的 是 ， 这 一 位 点 与 晚期 mRNA 合成 起 始 位 置 也 很 近 。 不 久 将 会 讨论 这 个 问题 。 AGE 二 和 和 es CEG CATAAATAAAAAAAATTA EGE C EGGAGCCGGAGAC GTATTTATTTTTTTTAAT 图 21-39 SV40 复制 起 始点 的 碱 基 序列 。 在 0.67 处 的 一 个 G.C 对 的 两 MAA 13 个 碱 基 对 的 倒转 重复 序列 。 由 B. Hirt 建立 起 来 的 DNA 分 级 分 离 技术 ， 使 得 病毒 DNA 复制 的 研究 成 为 可 能 。B. Hirt 提取 法 包括 用 去 污 剂 十 二 烷 基 硫酸 钠 《〈《SDS) 和 高 摩尔 浓度 的 NaCl KR 地 处 理 被 感染 的 细胞 ，0sc 恒 温 过 夜 后 ,含有 SDS、NaCl、 细 胞 蛋白 质 及 高 分 子 量 DNA 《此 处 是 宿主 DNA) 的 复合 体 被 沉淀 下 来 ,上 清 液 中 含有 大 部 分 的 病毒 DNA 而 几乎 没 有 宿主 DNA。 这 些 病毒 DNA 既 有 复制 型 的 也 有 非 复制 型 的 ， 可 以 直接 用 电镜 检查 。 人 们 观察 到 SV40 DNA 复制 的 以 下 重要 特性 : 1. 复制 是 双向 的 ， 和 大肠 李 区 的 4 I bal A — FF 两 个 复制 又 在 相对 于 起 始 的 位 点 会 而 停止 复制 。 2. 部 分 复制 的 DNA 分 子 含 有 完整 的 亲 代 链 , 未 复制 区 域 仍然 是 超 曙 旋 结 构 CLA 21-40)。 在 这 一 中 间 体 内 ， 杂 合 的 子 代 环 展开 , 形 如 蝴蝶 , 故 有 时 称 为 蝴蝶 分 子 ， 某 些 亲 代 双 螺旋 分 子 必须 发 生 一 些 解 链 过 程 。 如 果 没 有 解 链 作用 去 解 开 扭力 矩 ， 整 个 结构 就 会 成 为 紧 紧 缠绕 的 一 团 。 捏 力 窍 的 释 解 是 由 拓扑 异 构 酶 催化 的 ， 不 过 这 一 特殊 酶 还 未 被 最 后 鉴定 。 3. 在 病毒 生活 周期 的 晚期 ,发 现 大 量 长 的 串联 状 的 SV40 DNA, 这 些 分 子 可 能 是 六 动 环 的 分 校 ， 不 过 滚动 环 还 几乎 未 被 分 离 到 *。 可 以 用 这 种 串联 体 分 子 去 侵 染 猴 肾 细胞 ; 人 们 发 现在 宿主 细胞 中 它们 被 切 成 单 体 , 然 后 被 用 于 产生 子 代 病毒 形成 串联 体 的 重要 性 尚 不 清楚 ,但 有 可 能 像 大 甩 杆 菌 的 2 噬菌体 那样 ,串联 体 是 病毒 DNA 的 前 体 。 * 偶然 见 到 过 带 有 一 小 段 线 性 分 枝 的 环 状 分 子 。 然 而 ,如 果 这 个 分 枝 的 长 度 小 于 环 状 分 子 的 周 长 那么 就 很 难 确 定 究竟 是 深 动 环 分 子 , 还 是 复制 又 处 断裂 的 6 型 分 子 。 。254。 除了 起 始 这 一 步 ,已 在 体外 进行 了 SV40 DNA 复制 的 研究 (就 是 说 ， 实 验 者 必须 从 一 些 已 部 分 复制 的 分 子 开始 研究 )。 这 些 体外 研究 给 出 了 以 下 事实 : 1. 一 条 子 链 是 连续 合成 , 另 一 条 则 是 不 连续 合成 的 。 2 延 洲 链 的 每 一 个 前 体 片 肛 用 10 核 昔 酸 链 为 引物 合成 ,此 引物 是 由 与 大 肠 杆菌 中 的 引物 酶 相像 的 酶 所 催化 合成 的 。 引 物 的 碱 基 序列 变化 很 大 ， 说 明 并 不 存在 识别 某 专 一 性 序列 的 过 程 。 3. 不 像 大 肠 杆 苗 那 样 , 引 物 的 除去 过 程 与 前 体 片 外 的 连接 过 程 并 不 偶 联 ,引物 的 除去 是 在 早 得 多 的 时 候 进行 的 。 _ 4 RSH DNA RAM ， 它 是 主要 的 宿主 DNA 复制 酶 。 目前 , 移 化 的 工 抗原 正在 体外 起 始 DNA 的 合成 中 试用 。 emi MRE HE @y;, 图 21-40 微小 病毒 DNA 的 复制 。(a) 复制 分 子 在 其 不 复制 的 部 分 保存 它 水 的 超 螺旋 形式 。(b) ST EMIT SV40 感染 过 程 中 Mik 。。 SV40 DNA 的 转录 是 一 个 复杂 的 过 程 , 涉 及 到 时 间 的 调控 ( 早 - 晚 ) 和 广泛 的 mRNA 的 加 工 过 程 。 在 这 些 过 程 中 ,选择 性 地 移 去 起 始 和 终止 密码 。 早 、 晚 期 mRNA 分 子 分 别 地 从 DNA 分 子 的 不 同 链 上 转录 下 来 ;它们 合成 的 方向 是 相反 的 。 而 且 , 它 们 可 能 从 毗邻 于 DNA 复制 起 始点 的 几 个 相近 的 位 点 处 起 始 转录 〔 见 图 21-37)。 图 21-41(a) 指出 ， 编码 早期 mRNA 分 子 是 从 图 谱 位 置 0.66 左边 的 一 个 启动 子 开始 合成 的 。 它 负责 编码 T 抗原 和 抗原 。 一 个 AUG 密码 子 负责 起 始 上 述 这 两 个 蛋白 质 的 合成 。 这 条 mRNA 通 过 两 种 不 同 修饰 途径 产生 两 个 单 顺 反 子 mRNA 分 子 , 一 个 编码 工 抗原 , 另 一 编码 + 抗原 。 7 AUG 终止 终 (a) Li ee ee ee 0.66 0563 spear enh of. riers Biko CFD» AUG, AUG, AUG, 终止 4.5 终止 3 | EEC on ESL \ 删除 内 Loe 、 AUG, 小 含 子 5 终止 一生 一 一 (b) 晚期 mRNA VP1 \ 1 1 1 1 | AUG, + 终止 4.5 VP2 > = Q ae Ee > o A 21-41 SV40 的 早期 mRNA 及 晚期 mRNA 的 加 工 。 一 表示 将 要 删除 的 内 含 子 ; 从 上 入 下 的 虚线 箭头 表示 从 未 加 工 的 mRNA 分 子 转变 到 删除 了 内 含 子 的 \ 已 加 工 的 mRNA 的 过 程 。 空 心 与 实心 的 小 方块 \ 圆 形 及 三 角形 表示 在 加 工 过 程 中 各 级 mRNA 分 子 上 相同 的 起 始 密码 与 终止 位 点 。mRNA 用 实 线 表示 ;蛋白 质 用 长 虚线 表示 。 在 第 一 种 加 工 模式 中 ,内 含 子 1 被 切 去 ,产生 mRNA， 于 是 ,翻译 就 从 AUG 开始 到 终止 点 1 停止 , 产生 出 上 抗原 。 而 工 抗原 则 是 通过 移 去 内 含 子 2 进一步 翻译 至 终止 点 2 而 形 成 的 。 内 含 子 2 SASF 1 的 3 端 相同 ,但 其 了 端 mRNA 的 5 末端 更 近 。 切 除 这 个 大 的 ， 内 含 子 时 移 去 了 终止 点 1 , 所 以 翻译 一 直 进 行 到 终止 点 2, 从 而 得 到 比 + 抗原 大 得 多 的 工 Ho Rt 抗原 和 工 抗原 的 氨基 末端 的 片 侦 完全 相同 。 晚期 mRNA 编码 三 个 蛋白 质 ， VP1、VP2 和 YP3。 剪接 的 方式 则 决定 了 哪 一 个 蛋 白质 被 翻译 ,使 用 重叠 的 阅读 框架 使 病毒 能 在 相当 小 的 一 段 DNA 中 储存 大 量 的 信息 。 只 有 一 个 晚期 mRNA 从 图 中 0.735 位 置 起 始 转录 而 成 。 图 21-41(b) 示 出 由 三 种 剪接 方 式 太 得 到 三 种 单 顺 反 子 mRNA 分 子 , 以 及 由 此 所 合成 的 三 个 蛋白 质 。 注 意 , 其 中 没有 一 种 蛋白 质 是 从 未 经 剪接 的 mRNA 分 子 上 翻译 出 来 的 。VP2 和 VP3 从 同一 个 阅读 框架 翻译 出 来 ,两 者 具有 相同 的 羧基 末端 ,所 以 ，VP3 实际 上 是 VP2 的 一 个 片 息 。 当 加 工 枚 、 作用 除去 编码 VP2 的 起 始 密码 子 AUG, 及 其 随后 的 一 段 RNA 后 ， AUG, BNA 一 个 起 始 密 码 子 AUG， 就 起 始 翻 译 ， 产 生 VP3。VP1 的 阅读 框架 与 VP2 和 VP3 的 不 同 ， 它 是 切 去 一 大 疏 RNA (其 中 包含 有 VP2 和 VYP3 的 起 始 密码 子 ) 后 形成 的 。 其 中 唯一 剩 下 的 起 始 信号 AUG, 就 用 于 翻译 VP1。 注意 SV40 的 这 些 基因 产物 都 不 是 由 多 聚 蛋白 切割 而 得 到 的 。 多 瘤 病 毒 DNA 的 复制 方式 与 SV40 DNA 的 相同 ,转录 也 几乎 相同 ,不 同 之 处 是 多 2 'Z26«* 瘤 病 毒 具有 三 种 (而 不 是 两 种 ) 加 工 早 期 mRNA 分 子 的 方式 ， 从 而 使 它 能 合成 第 三 个 蛋 白质 , 称 为 中 等 + 抗原 。 这 个 蛋白 质 的 功能 将 在 涉及 到 瘤 病毒 部 分 再 作 叙 述 。 成 元 病毒 颗粒 的 存在 部 位 SV40 是 致 液 泡 病毒 ,也 就 是 说 , 在 侵 染 晚期 ， 被 侵 染 的 细胞 积累 着 一 些 称 之 为 液 泡 (vacuoles) 的 袋 状 物 , CNAME HEARK AR DNA 在 细胞 核 中 合成 之 后 ,转移 到 合成 蛋白 质 的 细胞 质 内 。 病 毒 的 组 装 发 生 在 勾画 出 被 泡 轮 廓 的 细胞 质 膜 与 细胞 质 膜 之 间 的 地 方 (图 21-42)。 再 晚 些 时 候 ， 当 细胞 解体 = gem 时 , 膜 破裂 ,病毒 颗粒 从 细胞 中 释放 出 来 。 大 型 DNA 病毒 . 到 目前 为 目 ， 已 介绍 了 一 些 只 有 少量 基因 产 物 ， 而 且 mRNA 分 子 数 目 很 少 的 一 些 病 毒 。 还 `” 有 一 些 较 太 的 病毒 ,正如 所 预想 的 那样 ,它们 具有 7 4 极其 复杂 的 生活 周期 。 其 复杂 程度 在 任何 情况 下 图 21-42 ”细胞 膜 中 成 熟 的 SV40 颗粒 。 都 不 敢 说 已 将 它们 的 生活 周期 搞 清 楚 了 。 ”在 这 一 节 我 们 将 对 以 下 三 种 病毒 ; 腺 病毒 、 单 纯 疱 疹 病 毒 和 牛 阁 病 毒 进行 提纲 者 领 地 讨论 。 腺 病毒 是 研究 得 较 透 彻 的 一 大 组 裸露 20 面体 病毒 (图 21-43)， 每 个 病毒 含有 一 个 双 链 DNA 分 子 , 不 同 病 毒 的 DNA 的 分 子 量 范 围 为 23 一 30 x 10°. DNA 编码 至 少 20 种 蛋白 质 , 其 中 15 种 包含 在 病毒 颗粒 内 。4 种 病毒 蛋白 与 DNA 分 子 相 联 一 一 第 一 个 与 磷酸 EW Sn (oy 7 (c) Rl ea 43 腺 病毒 颗粒 。(a) 几 个 病毒 颗粒 的 电镜 照片 。 系 用 反差 技术 摄制 。 每 一 个 病毒 颗粒 由 252 个 壳 体 (在 显 微 照 片 中 每 个 壳 体 呈 白 色 部 球状 ) 排 列 形成 一 个 20 面体 。240 个 壳 体 是 有 6 个 相 《c): 中 一 个 个 白色 球状 体 j， 12 个 顶部 壳 体 是 具有 5 个 相 邻 面 的 五 体 ;每 一 个 顶部 壳 体 由 一 个 碱 基 和 一 个 突起 组 成 , 像 一 个 长 箱子。 〈b) 一 单个 病毒 颗粒 的 电镜 照片 ， 可 以 看 出 长 钉 状 结构 。(c》 一 个 人 工 制作 的 病毒 毒 粒 的 塑料 模型 。 其 上 白 球 表示 六 体 , 黑 球 表示 5 体 。 。257。 基 团 作用 ;第 二 个 使 DNA 形成 多 时 形 ,而 且 使 DNA 结合 在 被 膜 的 12 个 亚 基 上 ; 第 三 个 共 价 地 结合 到 DNA FHS R Sins 第 四 个 的 功能 还 不 清楚 。 这 些 连 毒 在 被 侵 染 细胞 中 形成 的 大 晶体 排列 于 绍 胞 核 中 (图 21-44). 人 们 对 于 腺 病毒 的 兴趣 最 初 很 大 程度 是 由 下 列 观 察 结 果 所 激 起 的 : 引 起 人 和 猿 猴 呼吸 道 感染 的 腺 病毒 对 于 新 生 大 鼠 和 小 鼠 是 致癌 的 。 而 且 ， 了 腺 Cs vos RE fe GY SUR Se BUM RD 21-44 ”在 受 感染 的 工 细胞 的 细胞 核 内 的 腺 病毒 结晶 。 ”的 细胞 成 为 转化 细胞 〈 见 后 面部 分 )。 所 以 ， 腺 病毒 一 直 被 当 作 病毒 致癌 作用 的 模型 来 研究 。 在 腺 病毒 中 发 现 了 mRNA 剪接 现象 之 后 ， 显 然 它 又 在 真 核 细 胞 转录 作用 的 研究 中 派 上 了 用 场 。 又 因为 腺 病毒 只 使 用 宿 主 的 复制 蛋白 ,所 以 它们 又 为 真 核 DNA 的 复制 过 程 提供 信息 。 腺 病毒 DNA % % Sin 腺 病毒 DNA 是 一 线性 分 子 , 它 具 有 的 反 向 重复 未 端 一 直 精确 地 延伸 到 分 子 的 尾 端 (图 21-45)。 在 腺 病毒 家 族 中 这 一 一 一 -- 和 和 和 和 一、 重复 序列 的 大 小 范围 是 103 一 162 ABCD DC’ RAGS 未 端的 ， 碱 基 对 。 不 同 病 毒 DNA 未 端的 ， 55-kd 午 最 前 面 50 RE, REY Key OPPO? Deeks 同 源 性 。 这 些 序列 中 A-T 极其 丰 [atta 富 。 由 于 腺 病毒 DNA 的 其 他 部 分 的 序列 变化 多 端 ， 腺 病毒 上 述 序列 中 的 明显 的 同 源 现象 说 明了 这 一 部 ABCD een 分 的 重要 人 性。 的确 ， 它 很 可 能 被 用 ABCD Tae 复制 的 起 始 。 图 21-45 ges DNA 的 结构 及 “扳手 ? 状 形式 (panhandle 后 来 发 现 了 腺 病毒 DNA 末端 form)。 后 者 是 在 实验 室 中 经 变性 又 复 性 而 形成 的 结构 。 “ 的 另 一 个 重大 性 质 , 即 当 人 们 从 病毒 颗粒 中 分 离 DNA 时 ，DNA 自发 地 形成 环 状 分 子 ARRAS Fo AMET 1 ERK DNA: 它 的 互补 单 链 未 端 可 以 形成 这 些 结构 。 但 是 , 腺 病毒 DNA 并 不 具有 单 链 末端 , 当 使 用 蛋白 酶 处 理 腺 病毒 DNA 后 , 它 便 失去 形 成 这 些 结构 的 能 力 。 对 腺 病毒 DNA 形成 环 状 结构 及 寡 聚 体 结构 ， 解 释 为 腺 病毒 DNA - 的 每 一 个 5 端 共 价 结合 着 一 个 端 基 蛋 白质 〈55kd 蛋白 质 ), 这 些 蛋白 质 可 以 形成 二 聚 体 甚至 更 高 的 多 聚 体 〈 图 21-46)。 蛋白 质 与 DNA 是 通过 55kd 蛋白 质 中 丝氨酸 残 基 的 OH 基 与 每 一 个 DNA 链 未 端 脱氧 胞 旷 啶 的 5 磷酸 基 之 间 的 磷酸 二 酯 键 连接 在 一 起 的 。 这 个 蛋白 质 在 DNA 复制 中 起 着 重要 作用 [在 其 他 生物 体 中 也 观察 到 端 基 蛋白 质 。 研 究 得 最 多 的 是 枯草 计 菌 噬菌体 29， 其 他 还 有 微小 病毒 HL、 小 鼠 小 型 病毒 (minute virus) 及 乙 型 肝炎 病毒 ]。 。 258。 接 蛋 白 在 后 面 还 将 详细 地 讨论 。 腺 病 ” 21-46 证明 逐 病毒 的 55kd 蛋白 质 具 有 形成 多 体 作 用 的 电镜 照片 。 图 示 各 自 带 有 两 个 端 基 蛋 白质 的 三 个 腺 病毒 DNA 分 子 。 55kd 蛋白 质 先 使 两 个 DNA 分 子 发 生 二 聚 作 用 ,再 通过 和 蛋白质 -蛋白 质 相互 作用 使 三 个 DNA AFR 合 到 一 起 形成 图 中 所 示 的 三 体 分 子 。 腺 病毒 DNA 的 复制 腺 病毒 DNA 复制 的 研究 表明 : 1. 复制 的 起 始 可 以 从 DNA 分 子 的 任 一 末端 开始 。 因 为 两 个 未 端 是 反 向 重复 , 无 法 区 别 它们 ,所 以 起 始 以 相同 的 频率 发 生 在 两 端 。 而 且 , 有 些 分 子 在 两 端 同时 起 始 复制 。 起 始 不 需要 RNA 引物 , 这 一 点 后 面 还 要 讨论 。 2. 生长 的 子 链 延 续 到 分 子 的 另 一 端 ,在 这 个 过 程 中 ， 一 条 母 链 被 一 条 新 生 的 子 链 取 代 。 在 两 端 同时 起 始 的 分 子 中 ,两 条 母 链 都 被 取代 ,这 意味 着 复制 中 间 物 具有 伸展 的 线性 单 链 分 核 。 这 种 分 子 状态 在 此 菌 体 和 细菌 中 相当 罕见 。 在 腺 病毒 复制 中 ， 这 样 的 中 间 体 却 构 成 了 大 量 的 胞 内 DNA( 图 21-47)。 图 21-48 是 目前 普遍 接受 的 腺 病毒 DNA 复制 模型 。 有 两 种 合成 途径 , 在 主要 途径 中 ,合成 和 置换 完成 后 (经 过 I 型 中 间 体 , 如 图 ), 产 生 一 个 双 链子 分 子 , 同 时 释放 一 个 母体 单 链 。 后 者 作为 模板 ,合成 一 互补 链 。 于 是 ,生成 两 个 半 保 留 的 复制 分 子 。 在 次 要 途径 中 ， 经 过 互补 合成 ,从 释放 链 的 3” 端 开始 ,生成 U Rhy, CER PRR REAR, 连接 着 一 条 长 的 单 链 。 这 一 中 间 体 继续 生长 ,成 为 完全 的 双 链 分 子 。 这 个 是 次 要 途径 , 因 为 起 始 作 用 是 从 分 子 的 两 端 偶然 地 引发 的 。 这 样 的 双 起 始 分 子 ， 当 两 个 相对 运动 的 复制 又 相遇 时 , 母 链 不 能 再 靠 碱 基 对 而 维系 在 一 起 ,而 是 相互 分 开 , 形 成 II 型 分 子 。 它 的 复制 通过 简单 延伸 而 完成 ， 这 一 事件 称 为 复制 又 潭 灭 (fork annihilation)。 不 久 还 将 讨论 图 21-48 中 括号 内 的 形式 。 腺 病毒 DNA 链 的 延长 机 理 不 同 于 我 们 至 今 所 考虑 过 的 其 他 双 链 叭 菌 体 和 病毒 体系 的 机 理 。 腺 病毒 DNA 的 1 链 和 x 链 分 开 来 复制 ,各 自 沿 着 适合 于 DNA RAMA HN 方向 进行 复制 。 这 样 ,正如 这 个 模型 所 设想 的 那样 ,并 不 进行 不 连续 复制 ， 即 不 需要 前 体 FR. BEL, 有 相当 的 实验 支持 这 种 看 法 , 即 两 条 链 都 进行 连续 复制 。 出 于 两 个 原因 ， 人 们 对 这 种 复制 的 起 始 给 予 非常 的 重视 : (1) 在 未 端的 起 始 带 来 了 SBT AMA T7 所 面临 过 的 同类 的 问题 〈 见 第 十 五 章 ); (2) 没有 使 用 RNA 引 “1259。 (a) f 了 5S (b) 图 21-47 DNA Syn. (2) 类 型 工分 子 。 在 平行 的 双 螺旋 中 其 一 条 单 链 分 枝 正在 被 取代 。(b) 类 型 II 分 子 。 完 全 被 取代 下 来 的 单 链 又 正在 转 变 成 双 链 DNA; 箭头 指出 生长 中 的 3° 未 端 。 萎 。 而 且 ; 如 模型 所 示 有 两 类 起 始 过 程 : 发 生 在 双 链 DNA 分 子 未 端 (产生 类 型 T 分 子 ) 和 发 生 在 单 链 3" 端 (产生 类 型 II 分 子 )。 也 有 人 认为 各 种 不 同 的 起 始 方式 可 能 更 多 的 是 表面 现象 ,而 不 是 实际 事实 。 由 于 未 端 反 向 重复 ， 所 以 它 的 单 链 可 以 形成 未 端 双 链 区 , 如 图 21-48 括号 中 所 示 , 这 些 区 域 称 为 “扳手 ”。 这 个 形式 有 一 个 未 端 双 链 区 ,与 在 线性 双 链 MURS DNA 中 所 发 现 的 一 样 。 因 此 起 始 一 个 “扳手 ”也 与 起 始 病毒 的 DNA 的 复制 相 同 。 目 前 ,尽管 "扳手 ”分 子 可 以 在 实验 室 中 经 连续 变性 和 复 性 而 得 到 ,但 在 被 感染 的 细胞 中 尚未 分 离 到 ,因此 还 不 知道 在 生物 体内 这 种 分 子 是 否 真正 存在 。 引发 是 通过 衍生 出 一 种 55kd 端 基 蛋 白质 完成 的 , 这 个 蛋白 质 与 非 生长 的 病毒 DNA 相连 接 。55kd 的 端 基 蛋白 质 是 由 一 个 编码 出 分 子 量 为 80 000 的 80kd 蛋白 的 病毒 基因 合成 出 来 的 。 生 长 链 的 5 端 共 价 地 连接 在 80kd 蛋白 质 上 ， 在 图 21-49 表示 的 机 理 中 ， 这 个 80kd 的 蛋白 质 用 于 起 始 。 原 初 起 始 事件 中 ，dCTP 的 o MRE 〈 连 到 脱氧 核 糖 上 的 磷酸 基 ) 与 80kd 蛋白 质 分 子 中 的 丝氨酸 的 p-OH 基因 之 间 形 成 酯 键 。 酯 键 的 形成 伴随 有 80kd BARA DNA 亲 代 链 未 端的 缔 合 作用 。 这 种 缔 合 作用 可 能 因 80kd 蛋白 质 结合 到 模板 链 中 的 特殊 碱 基 序 列 而 受到 促进 ， 也 可 能 通过 80kd 蛋白 质 结合 到 处 于 另 一 条 模板 链 上 的 55kd 蛋白 质 而 受到 促进 。 看 来 后 一 种 可 能 性 是 正确 的 。 因 为 从 * 260° 5' 3° RH iis Ft — — Oe ae PAS oie Yh =f ~sae 主要 途径 ， a + + | agp 1 We, Vi OO 和 次 要 途径 l C= = ry 1 1 + Y l CS 1 Or 1 Py OG RIIOR Te aaniger ail gah ne die ni = 4/ 到 | 3 are 7 eee ps he 子 代 DNA 图 21-48 腺 病毒 DNA 的 复制 图 。 粗 黑色 箭头 表示 主要 的 途径 ; 细 黑 色 箭头 表示 次 要 的 途径 ;虚线 箭头 表示 假设 的 反应 。 丝氨酸 一 0- P-5' me Serre rrr Tit ELL G pore 3 : 机 、 | 起 始 丝氨酸 时 OH P--P—P-dC 80kd 蛋白 质 dCTP 55kd ron 人 80kd Ea = 延长 80kd 蛋白 质 - 21-49 在 腺 病毒 DNA 复制 的 起 始 和 延长 中 终端 蛋白 质 的 功能 。 在 早期 识别 阶段 可 能 通过 连 着 dCTP 的 80kd 蛋白 质 把 它 结合 到 kd 蛋白 质 上 。 体外 实验 看 ,不 带 有 55kd 蛋白 质 的 DNA 作为 模板 对 于 复制 的 起 始 来 说 太 弱 。 子 链 的 生长 从 dCTP 引物 的 3 -OH 开始 。 在 晚 些 时 候 , 一 个 病毒 蛋白 质 切割 80kd 蛋白 质 , 使 其 成 为 55kd 蛋白 质 。 ° 261° 腺 病毒 DNA 的 转录 腺 病毒 DNA 的 转录 方式 非常 复杂 ,不 仅 有 早 、 晚 类 型 的 mRNA, 而 且 与 迄今 已 讨论 过 的 小 病毒 不 同 , 它 至 少 有 五 个 早期 转录 单位 ,每 一 个 单位 都 从 一 个 专 一 的 启动 子 起 始 。 这 五 个 单位 不 是 同时 被 活化 ,全 部 起 始 长 达 3 小 时 ,而 且 有 些 单位 受 它 们 的 基因 产物 的 负 调节 作用 。 最 后 ,每 一 个 早期 mRNA 在 翻译 之 前 都 经 过 一 个 拼接 过 程 (事实 上 ，mRNA 的 拼接 最 早 是 在 腺 病毒 的 研究 中 发 现 的 )。 晚 期 mRNA 的 形成 方式 更 为 复杂 。 关 于 这 种 复杂 性 的 一 个 例子 是 晚期 mRNA 的 合成 需要 有 病毒 DNA 复制 作用 的 开始 。 与 噬菌体 T4 的 情况 不 同 , 它 只 需要 复制 的 起 始 , 而 不 是 复制 本 身 ， 因 为 如 果 复 制 在 开始 后 不 久 就 被 抑 制 , 仍 能 继续 合成 晚期 mRNA。 实 际 上 ， 晚 期 mRNA 能 连续 不 断 地 起 始 和 形成 ， 但 在 DNA 复制 开始 之 前 ,这 种 转录 作用 便 会 在 起 始 密码 子 之 后 约 5 000 个 碱 基 的 地 方 终 止 。 晚期 mRNA 还 受到 广泛 的 加 工 ,形成 许多 不 同 的 mRNA 分 子 。 这 个 非常 复杂 的 加 工作 FE KEM EE DNA 中 得 到 最 大 信息 的 一 个 绝妙 的 例子 。 在 这 一 和 侦 DNA 中 ,有 一 个 晚期 启动 子 和 一 个 终止 信号 ,然而 , 却 在 mRNA 上 面 有 四 个 不 同 的 、 可 以 切割 并 且 可 加 上 多 聚 A 尾 的 位 点 。 五 个 片段 的 每 一 个 都 有 AUG 密码 子 , 故 可 以 被 翻译 。 然 而 ， 每 个 片 女 都 包含 着 几 个 毗邻 的 内 含 子 和 几 对 切 点 ， 于 是 可 以 进行 剪接 。 图 21-50 给 出 一 个 例子 ,说 明 不 同 的 拼接 可 以 产生 不 同 mRNA 分 子 。 通 过 这 个 多 重 拼接 方式 的 作用 ,在 一 个 启动 子 控制 下 可 以 合成 出 至 少 14 种 晚期 蛋白 质 。 注 意 , 每 一 次 晚期 转录 起 始 后 ， 只 生 成 一 个 mRNA 分 子 。 若 不 经 过 加 工 , 只 有 从 最 靠近 5 端 AUG 密码 子 的 序列 才能 翻译 出 蛋白 质 。 由 于 其 他 的 每 一 种 蛋白 质 的 合成 需要 有 一 次 或 多 次 剪接 过 程 ， 所 以 这 些 蛋 白质 的 合成 速率 或 是 其 中 每 一 种 晚期 蛋白 质 的 最 终 浓度 ， 都 是 由 每 个 剪接 事件 的 过 程 以 及 添 加 多 聚 A 尾 的 概率 所 决定 的 。 因 为 每 一 事件 的 概率 不 尽 相同 ， 所 以 得 到 不 同 浓度 的 蛋白 质 。 这 种 翻译 作用 的 调控 类 型 在 真 核 体系 中 是 常见 的 ， 但 不 存在 于 原核 体系 中 。 在 原核 中 ,多 顺 反 子 mRNA 中 不 同 顺 反 子 的 翻译 概率 取决 于 核糖 体 结合 位 点 的 强度 和 起 始 密 碍 子 到 后 面 终止 密码 子 的 远近 。 (Dyer 一 一 一 全 一 一 人 人 人 . -和 -一 二 -一 一 一 一 一 - rr ac ab C a | 翻译 HAR Vi TARE BRE 21-50 fis mRNA 形成 过 程 中 使 用 的 一 种 类 型 的 剪接 。 疱疹 病毒 疱疹 病毒 是 一 种 很 大 的 有 被 膜 的 病毒 ,含有 100 多 个 基因 ,它们 在 两 个 方面 有 别 于 其 * 262 。 #uk) DNA 病毒 : (1) FRAEREABALPU RARE RARASMAL; (2) 们 具有 三 类 mRNA, HH a, 6M 7Y, 每 一 类 合成 的 时 间 独 立 于 DNA 的 复制 过 程 。 初 步 数据 表明 ，c-mRNA 分 子 所 翻译 出 的 基因 产物 激发 B-mRNA 的 转录 ，p-mRNA 的 基因 产物 又 启动 Y-mRNA 的 转录 。 正 如 所 有 的 病毒 中 的 情况 ， 转 录 后 的 mRNA 前 体 还 要 再 经 过 广泛 的 拼接 ,才能 形成 有 功能 的 mRNA 分 子 。 +E 斗 病 病毒 (牛痘 苗 病毒 是 它 的 一 个 例子 ) 是 已 知 的 最 大 病毒 /有 些 含有 200 多 个 基因 (Al 21-51)。 正 像 非 常 大 的 噬菌体 一 样 , 痘 病 病毒 合成 出 大 y ™ 量 用 于 DNA 合成 和 蛋白 质 合成 的 酶 和 因 予 ;它们 可 以 通过 。 关闭 宿主 中 的 大 分 子 合成 而 从 中 获 利 。 事 实 上 , 正 是 这 一 关 闭 最 终 导致 宿主 细胞 的 破裂 和 子 代 病 毒 粒子 的 释放 。 引 起 人 们 特殊 兴趣 的 是 牛痘 苗 病 毒 DNA SHE. FSH 病毒 DNA 分 子 是 一 个 连续 的 环 状 单 链 ， 几 乎 全 部 碱 基 都 图 21-51 PRR 配对 ,从 而 形成 一 个 双 链 的 闭合 发 夹 ( 见 图 21-51)。 换 一 种 方式 讲 , 可 以 认为 形成 一 个 未 端 封闭 的 双 链 线性 分 子 。 引 发 在 复制 起 始点 发 生 , 然 后 双 螺 旋 打 开 , 使 得 先导 链 前 进 。 另 外 又 合成 出 前 体 片段 来 作为 滞后 链 的 成 分 。 当 分 子 几 乎 全 部 被 复制 出 来 时 ， 起 始点 处 产 : 生 一 个 单 链 缺 刻 。 使 得 亲 代 链 与 子 代 链 的 杂 合 体 分 子 上 产生 一 个 双 链 的 缺 刻 。 在 拷贝 最 后 一 个 碱 基 对 时 ， 在 正 对 着 起 始点 的 位 置 上 造成 另 一 个 缺 刻 ， 由 此 产生 两 个 完整 的 双 链 分 子 。 然 而 ， 这 些 分 子 是 如 何 成 为 双 链 闭合 发 夹 形式 的 ,目前 还 不 清楚 。 KK 病毒 在 许多 DNA 和 RNA 病毒 实验 中 观察 到 , 从 被 感染 细胞 培养 体系 中 得 到 的 子 代 病 =, 样品 中 含有 不 同 大 小 的 两 种 颗粒 。 用 速度 沉降 (velocity sedimentation) 或 平衡 (equilibrium) 法 都 可 以 将 它们 分 开 。 人 们 发 现 两 类 中 较 小 的 那 种 是 非 感染 性 的 , 称 为 缺 陷 型 舌 粒 。 也 许 有 人 奇怪 ,既然 它们 是 没有 感染 人 性 的 ,那么 它们 是 如 何 泥 人 到 新 鲜 繁殖 的 病毒 样品 中 的 呢 ? 事实 上， 这 些 缺 陷 型 病毒 只 有 在 被 大 颗粒 病毒 侵 染 过 的 细胞 再 进行 感 染 之 后 ,才能 够 繁殖 。 这 种 缺陷 型 病毒 称 为 关联 病毒 〈associated virus)。 在 这 种 病毒 中 ， 研究 最 为 深信 的 有 含 RNA 的 劳 氏 肉瘤 关联 病毒 CRous-associated virus, RAV) 和 含 DNA 的 腺 关联 病毒 (adenoassociated virus, AAV), 关联 病毒 有 两 类 : 其 中 一 些 是 大 颗粒 病毒 的 缺失 突变 型 ;而 其 他 一 些 则 是 完全 不 同 的 病毒 。 在 以 上 两 种 情况 中 ,它们 的 缺 陷 都 被 有 侵 染 性 的 病毒 颗粒 的 病毒 基因 所 补足 。 这 一 现象 已 经 偶尔 地 在 细菌 的 吻 菌 体 体 系 中 见 到 。 比 如 ,大 肠 杆 菌 的 鸣 菌 体 P4， 它 缺少 许多 必需 基因 。 但 是 如 果 先 用 鸣 菌 体 P2 去 感染 宿主 ,那么 P4 就 能 很 好 地 生长 在 也 受 P2 感染 的 宿主 细胞 中 。 因 此 ，P4 就 相当 于 病毒 中 的 关联 病毒 , 它 需 要 通 稼 被 称 为 助手 〈helper) 的 P2 的 协助 ,才能 完成 其 生活 周期 。 263。 感 Yu PM DNA 在 一 定 条 件 下 , MK DNA 能 感染 有 些 细菌 ， 从 而 引 动 一 个 感染 周期 。 这 个 过 程 往往 要 求 在 加 入 感染 性 DNA 之 前 , 先 用 溶 送 酶 处 理 细 菌 , 使 之 成 为 原生 质 球 , 或 者 将 感 YE DNA MABIBGE CaCh 溶液 中 的 细胞 外 \ 见 第 二 十 章 )。 许多 DNA 病毒 的 纯净 核酸 也 具有 感染 性 , 并 且 细 胞 通 第 不 需 妥 经 过 任何 预 处 理 或 处 于 任何 特殊 的 溶液 中 就 能 吸收 病毒 DNA。 负 链 病 毒 RNA 本 身 是 非 感染 性 的 , ANE 不 能 生成 复制 酶 或 逆转 录 酶 。 这 些 必要 的 酶 是 宿主 中 所 没有 的 , 通 贡 应 由 病毒 粒子 带 大 宿 主 细 胞 。 正 链 病 毒 RNA WHHEARREN, 植物 病毒 RNA 同样 也 是 有 感染 性 的 ol 纯化 的 病毒 核酸 引 动感 染 周 期 的 能 力 在 实验 病毒 学 中 十 分 重要 。 由 于 自然 界 中 绝 大 多 数 动 物 病毒 频频 地 进行 着 遗传 重组 ， 所 以 许多 年 来 很 难 选 育 出 像 噬菌体 研究 中 的 那样 一 些 相当 有 价值 的 多 重 性 突变 体 〈multiple mutant), 然而 ,运用 重组 DNA RAR, AS 接 的 方式 就 可 以 获得 DNA 病毒 的 多 重 性 突变 体 。 首 先 ， 两 个 突变 分 子 经 同一 种 限制 性 内 切 酶 作用 ,接着 纯化 所 得 到 的 片 有 侦 ,然后 再 将 适当 的 片段 进行 混合 ， 这 样 就 可 以 形成 一 个 含有 两 种 突变 的 分 子 。 最 后 再 用 纯化 了 的 这 种 DNA 分 子 去 感染 细胞 ， 终 于 产生 出 有 具 有 双 突变 的 病毒 。 FRR PO 干扰 素 是 一 种 糖 蛋白 , PAWS RAW MI EM RNA 病毒 的 感染 作出 反应 时 合成 并 分 这 干扰 素 。 分 刻 出 的 干扰 素 可 以 使 未 受 侵 染 的 细胞 在 感染 中 暂时 性 地 活 下 来 。 那 些 暂时 不 受 病毒 感染 之 害 的 细胞 处 于 抗 病毒 状态 。 虽 然 只 有 RNA 病毒 才 诱 导 产 生 干扰 素 ， 但 是 对 于 受 病 毒 感 染 的 细胞 来 说 ,干扰 素 对 于 所 有 的 动物 病毒 (包括 DNA 病毒 及 了 RNA 病毒 两 类 ) 造 成 的 感染 都 有 抑制 作用 。 @ 干 扰 素 被 连接 到 连接 物 一 一刻 料 小 球 上 21-52 ”干扰 素 在 细胞 膜 中 作用 的 一 个 试 输 。 干 扰 素 分 子 通过 二 个 短 的 (10 一 20 及 ) AEBS KEE) 连 到 一 个 在 显微镜 下 可 以 见 到 的 塑料 小 球 上 。 这 个 连接 物 比 细胞膜 的 厚度 还 小 一 些 。 当 实验 者 把 这 个 单位 加 到 细胞 中 后 ， 细 网 就 达到 搞 靖 玫 的 状态 虽然 塑料 小 球 不 能 进入 细胞 膜 。 很 小 浓度 的 干扰 素 〈10 "mol/L 或 10°%g/cm’) 就 能 产生 抗 病毒 状态 。 干 扰 素 即 使 与 一 个 不 能 穿 过 细胞 膜 的 人 工 合成 的 塑料 小 球 共 价 相连 ,也 仍 具 有 活性 , 这 意味 着 干扰 素 作用 于 细胞 表面 。 其 他 实验 表明 干扰 素 与 细胞 外 膜 紧 密 结 合 ， 说 明 这 个 若是 干扰 素 的 作 *。264。 用 位 点 。 一 般 认 为 干扰 素 是 多 数 脊 椎 动物 抵御 RNA 病毒 的 第 一 道 防 线 ， 因 为 被 RNA 病 毒 感染 的 细胞 产生 干扰 素 所 需 时 间 比 被 感染 动物 的 免疫 系统 产生 所 体 所 需要 的 时 间 短 得 多 。 这 个 概念 是 由 下 面 的 实验 结果 得 来 的 ,该 实验 已 用 很 多 种 不 同 的 形式 进行 过 。 用 一 种 可 在 细胞 培养 的 小 鼠 细 移 中 生长 的 病毒 去 感染 小 鼠 ， 一 般 不 会 引起 明显 的 症状 。 假 设 受 感染 的 小 鼠 在 被 感染 期 间 产 生 干 扰 素 ,如 果 在 感染 的 同时 注射 抗 小 鼠 干扰 素 的 抗体 (单独 地 从 免 或 山羊 中 制备 ), 小 鼠 得 不 到 防护 便 会 得 重病 甚至 死亡 ， 因 为 病毒 大 量 生长 而 造成 细胞 损伤 。 因 此 认为 只 有 依靠 小 鼠 中 产生 的 干扰 素 (是 对 RNA 病毒 感染 作出 反应 而 产 生 的 ) 发 挥 其 抵御 活性 ， 小 鼠 才 能 活 下 去 ;不 然 ， 病 毒 侵入 机 体 后 就 会 造成 感染 ， 甚 至 死 \。 因 为 对 于 小 鼠 来 说 ， 等 到 病毒 感染 几 天 后 它 才 产生 出 抗体 则 是 太 晚 ， 实 际 上 抗体 并 不 能 抑制 住 病毒 的 感染 。 干扰 素 的 研究 存在 两 个 问题 : 一 是 鉴定 出 在 病毒 生活 周期 中 能 使 被 感染 的 细胞 合成 出 干扰 素 的 那 种 物质 的 组 分 ; 二 是 干扰 素 对 后 续 的 病毒 合成 进行 抑制 的 机 理 。 鉴 定 上 述 诱导 物质 的 线索 是 干扰 素 几 乎 只 由 RNA 病毒 诱导 。 更 进一步 看 到 ， 除 非 是 双 链 RNA 病毒 感染 ， 一 般 地 说 在 复制 前 从 来 不 会 发 生 干 扰 素 的 合成 。 这 两 个 发 现 告诉 我 们 ， 双 链 RNA 可 能 是 合成 干扰 素 的 诱导 者 。 这 个 概念 已 经 通过 以 下 方法 测验 过 : 即 向 未 被 感染 MIS AALS RS RR, GROSS RRM In poly C 和 poly U 是 很 弱 的 诱导 者 ， TNHSRAEBARARHBSERAMAR. AAEM AR 诱导 剂 是 poly 1+ poly C， 其 中 I BRHEY, WH RNA 是 唯一 的 诱导 者 的 概念 不 是 很 严格 的 ， 因 为 单 链 RNA 也 能 诱导 干扰 素 的 合成 ， 虽 然 效率 很 低 。 现 在 ， 人 们 一 般 都 认为 RNA 病毒 感染 的 细胞 中 存在 的 双 链 RNA 很 可 能 是 诱导 者 (应 该 记得 , 双 链 RNA 并 不 是 复制 形式 ,而 可 能 只 是 RNA 病毒 生命 周期 中 一 个 无 用 的 副产品 )。 干扰 素 的 抗 病毒 效应 在 于 它 抑制 了 翻译 过 程 。 下 面 将 对 三 种 独立 的 抑制 途径 〈 见 图 21-53) 进行 讨论 。 1 第 一 条 途径 包含 一 种 弱化 抑制 作用 。 这 是 一 种 待命 状态 ， 它 通过 一 种 完全 不 清楚 的 方式 造成 RNA 的 不 足 ,可 能 使 细胞 变 得 喜 弱 ， 当 然 也 就 减 小 了 病毒 感染 的 效率 。 但 是 ,如 果 所 有 暴露 于 病毒 的 细胞 都 被 如 此 地 弱化 ， 至 少 在 一 段 时 间 内 也 将 对 动物 不 利 。 然 而 由 于 暴露 的 细胞 又 是 病毒 感染 的 直接 环境 ， 所 以 弱化 这 些 细 胞 对 动物 来 说 却 又 有 救 活 其 整个 机 体 的 价值 。 这 一 条 途径 很 可 能 也 能 用 来 说 明 DNA 病毒 的 感染 受到 弱化 的 抑制 作用 。 第 二 和 第 三 条 途径 直接 抑制 病毒 感染 。 在 没有 被 感染 的 ` 已 用 干扰 素 处 理 的 细胞 中 ， 这 两 条 途径 处 于 无 活性 状态 ; 当 加 入 双 链 RNA 时 ,它们 就 被 激活 了 。 2. 在 第 二 条 途径 中 ,一 种 能 分 解 病毒 mRNA 的 RNA 酶 被 激活 ,这 个 激活 作用 可 通 过 一 个 体外 实验 来 说 明 :向 已 用 干扰 素 处 理 过 的 细胞 提取 物 中 加 入 高 浓度 的 双 链 RNA ( 双 链 DNA 和 DNA-RNA 杂 合子 都 不 行 )。 于 是 一 种 合成 酶 (目前 还 未 被 提纯 ) 就 将 三 不 分 子 的 ATP XEWERERECEME pppA2' ps’ A255' A (简写 作 2.5A， 克 图 21-53), 新 生成 的 这 个 寡 聚 核 苷 酸 再 去 激活 早 就 存在 的 、 没 有 活性 的 宿主 _RNA 核酸 水 解 酶 ， 然后 这 种 酶 又 将 mRNA 降解 成 核 昔 酸 ,这 样 就 很 快 地 终止 了 感染 周期 。 、3. 当 双 链 RNA 浓度 很 低 的 时 候 则 发 生 第 三 条 途径 。 这 时 ,宿主 中 早已 存在 的 一 种 ° 265 。 1 干扰 素 + ATP ——— hGH tRNA 途径 JI Le RNA 了 和 人 用 全 si meet eee meet eee Ell cane: Ne hs RNA ——— [a2 LO 有 活性 无 活性 ADP A 21-53 干扰 素 抑制 翻译 过 程 的 二 种 途径 。 和 途径 Ul 及 途径 ill 是 主要 的 途径 。 核糖 体 蛋白 质 经 磷酸 化 作用 转变 成 蛋白 激酶 。 这 种 蛋白 激酶 能 使 有 活性 的 延长 因 了 于 elF- 2 受到 磷酸 化 作用 而 失去 活性 , 从 而 抑制 所 有 的 蛋白 质 合成 。 被 感染 细胞 产生 的 干扰 素 是 很 少 的 ,以 致 研究 工作 者 无 法 获得 足够 的 纯 的 干扰 素 , 使 干扰 素 的 研究 长 期 受到 阻碍 。 当 人 们 把 几 种 不 同 的 干扰 素 基 因 通 过 DNA 重组 技术 克隆 到 大 肠 杆 菌 中 后 , 才 克 服 了 这 个 困难 ,不 久 ， 就 有 大 量 的 纯 干 扰 素 供应 。 大 量 地 供应 纯 干 扰 素 使 人 们 把 它 作为 临床 上 的 抗 病毒 药剂 的 希望 变 成 可 能 。 人 们 也 认为 ， 当 肿 瘤 是 由 于 病毒 引起 的 时 候 , 干 扰 素 可 能 有 抗 肿瘤 活性 。 i» wR # oe 植物 病毒 都 是 RNA 病毒 。 对 它们 的 大 量 研究 落后 于 对 动物 病毒 的 研究 ， 首 先是 因 为 在 植物 中 为 了 起 始 病毒 的 发 育 需 投 入 的 感染 量 必须 极 大 ;而 且 , 还 不 得 不 用 生长 很 缓慢 的 植物 作为 宿主 。 在 最 近 几 年 中 ,已 有 几 种 方法 使 病毒 能 在 植物 细胞 的 原生 质 体 ( 除 去 了 细胞 壁 的 细胞 ) 中 增殖 ,这样 逐 渐 地 收集 到 了 一 些 关 于 植物 病毒 生活 周期 的 详细 材料 。 大 多 数 植物 病毒 的 基因 产物 的 分 子 很 大 ,其 分 子 量 超过 了 病毒 RNA《〈 如 果 不 重 登 ) 应 编码 的 信息 容量 .不 过 这 个 问题 可 以 通过 事实 上 存在 着 重 登 基因 来 解释 请 楚 。 目 前 对 烟草 花 叶 病 毒 (TMV) 研 究 很 透彻 ,在 图 21-54 中 给 出 了 TMV 的 基因 在 其 RNA 上 的 排列 。 据 认为 病毒 蛋白 YP1 和 VP2 是 由 同一 个 mRNA 分 子 翻译 并 且 不 再 经 切割 而 产生 的 。 但 是 ,在 体外 从 来 没有 实验 证 明 过 不 存在 多 聚 蛋白 在 体外 ,从 RNA 病毒 粒子 不 能 直接 地 翻译 出 外 壳 蛋 白 (coat protein), seo AER Rat mRNA 翻译 出 来 ,这 个 mRNA 与 * 266 G, AUG 闭 AUG os - - 本 3 'TMV RNA VP1 VP2 外 壳 蛋 白 图 21-54 ”从 烟草 花 叶 病毒 《TWV) 翻译 的 三 种 蛋白 质 。 病毒 颗粒 的 RNA 有 同样 的 长 度 ; 但 形状 不 同 。 气 认为 ,新 合成 但 还 未 包装 的 TMV RNA 有 二 个 开放 的 核糖 体 结合 位 点 ,但 在 RNA 病毒 颗粒 中 ， 这 个 位 点 被 关闭 。 如 果 是 这 样 ， 外 壳 蛋 白 的 合成 受到 的 调节 就 像 大 肠 杆 菌 噬菌体 M13 的 外 壳 蛋 白 的 合成 调节 一 样 。 ”植物 病毒 不 诱导 细胞 裂解 , 结果 在 植物 细胞 中 能 积累 巨大 数量 的 颗粒 多 至 -107 个 ( 见 图 21-55)。 敏 感 的 植物 细胞 继续 受 感染 是 病毒 颗粒 通过 细胞 异 上 的 孔 泣 和 连接 管 在 细胞 间 进 行 直接 运输 的 结果 。 有 时 颗粒 浓度 甚 高 ,高 达 可 在 细胞 中 形成 结晶 ,使 得 和 射线 衍射 家 能 对 病毒 结构 做 详细 的 研究 ， 由 于 TMV .容易 纯化 , 在 其 结构 研究 中 已 经 做 了 大 量 工 作 *。 在 病毒 结构 研究 中 给 人 印象 最 深刻 的 是 1955 年 Heinz Fraenkel-Conrat 和 Robleys Williams 的 工作 ， 他 们 揭示 出 纯化 的 _RNA 和 外 壳 蛋 白 分 子 可 以 重组 成 有 感染 能 力 的 TMV 病毒 颗粒。 通过 射线 衍射 研究 了 各 种 中 间 形 式 , 依 次 的 过 程 已 在 第 六 章 说 明 。 颗粒 的 排列 。 * 读者 也 许 还 记得 “一 个 碱 基 的 改变 足以 引起 一 个 氨基 酸 发 生变 化 ”的 第 一 个 工作 就 是 在 以 TMV HARES 为 材料 的 研究 中 做 出 来 的 。 。267。 Dy. mee eee RR Bishop, J. 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DNA 病毒 和 逆 病 毒 都 可 将 其 DNA 整合 到 宿主 的 染色 体 中 ， 但 是 形成 前 病毒 (provirus) 的 相对 或 然 率 (ralative probability) 即 可 能 性 很 不 相同 。 在 逆转 录 病 毒 的 生活 周期 中 ;整合 是 必 不 可 少 的 ( 见 第 二 十 一 章 真 核 病毒 )。 而 DNA 病毒 则 很 少 进行 整 - 合 , 因 为 其 繁殖 并 不 依赖 于 整合 。 在 下 面 我 们 还 要 讲 到 整合 。 病毒 致癌 研究 中 的 第 一 个 重大 突破 是 发 现 了 转化 细胞 (transforming cell)。 转 化 细 胞 与 正常 细胞 在 各 种 性 质 上 都 不 相同 ， 转 化 细胞 在 被 注射 到 适当 的 动物 中 后 常常 可 以 至 癌 。 因 此 在 这 一 章 我 们 首先 讲 讲 转化 细胞 。 re 16 a i 除了 一 些 特 殊 的 血细胞 和 免疫 系统 的 细胞 以 外 ， 动 物 细胞 在 培养 基 中 只 生长 在 培养 如 果 把 一 片 典型 的 组 织 放 在 玻璃 的 或 经 过 特别 处 理 的 塑料 的 表面 上 ， 这 片 组 织 会 长 出 各 种 类 型 的 成 纤维 细胞 。 另 外 ,用 胰 蛋 白 酶 可 将 该 组 织 分 散 为 单个 的 细胞 ,在 适当 的 培养 基 中 ,悬浮 的 成 纤维 细胞 会 吸附 到 容器 的 表面 上 ， 并 开始 生长 (大 多 数 其 他 的 细胞 基本 上 不 生长 )。 这 种 组 织 培养 物 叫 做 原初 培养 物 〈primary culture), 其 特点 为 细 胞 只 分 裂 几 代 以 后 大 多 数 就 死去 ,这 叫做 危机 《crisis)。 但 是 ,如 果 把 剩 下 的 几 个 细胞 在 培养 基 中 再 放置 几 个 月 (在 此 期 间 , 细 胞 几乎 不 或 完全 不 分 裂 ), 某 些 细胞 又 开始 生长 ,最 终 形 成 一 个 具有 生长 能 力 的 细胞 培养 物 。 这 种 细胞 培养 物 叫做 确立 细胞 株 〈established cell line)， 它 与 组 织 培 养 中 的 原初 细胞 大 不 相同 ,最 显著 的 是 原初 细胞 在 几 代 之 后 便 死 亡 ,而 这 些 细胞 能 无 限 地 生长 。 从 这 种 意义 上 来 说 ,他 们 是 "不朽 的 ,很 显然 ,这 种 细胞 是 不 正常 的 ;然而 ,在 大 多 数 的 细胞 生长 研究 中 ,人 们 用 的 都 是 这 种 细胞 。 如 条 把 典型 的 确立 细胞 株 放 在 培养 瓶 中 ,细胞 会 不 断 地 生长 和 分 裂 , 直 到 形成 连续 的 * 269 « 有 图 22-1 (a) 正常 的 小 白鼠 3T3 ant AR. (b) REMREREN stay AA ARB RA Mal » 8 AES be IE Fe AMIE AL 单 细 胞 层 , 生 长 才 停止 ,这 种 现象 称 为 密度 依赖 性 生 KE (density-dependent growth), DL 前 称 为 接触 抑制 (contact inhibition), 生长 停止 时 ,大 多 数 细胞 是 有 序 排列 的 〈 图 22-1 (a))。 用 胰 蛋 白 酶 可 把 这 些 连 绵 的 、 相 互 汇合 的 细胞 从 表面 上 洗 下 来 ,如果 再 把 这 些 细胞 放 在 新 的 表面 上 ,并 提供 新 的 培养 液 ,它们 又 能 分 裂 ` 生 长 ,再 度 形 成 连绵 的 单 层 细胞 。 如 果 一 种 确立 细胞 株 不 允许 某 特定 病毒 生长 (此 确立 细胞 株 就 是 非 受 纳 细 胞 , 它 可 以 被 转化 )， 当 它 的 原 代 细 胞 培养 物 被 该 种 病毒 感染 后 ,这 种 细胞 培养 物 继续 培养 的 结果 就 与 那些 未 受过 感染 的 细胞 培养 物 培养 后 的 结果 全 然 不 同 : 当 细 胞 生长 到 形成 汇合 的 单 细 胞 层 时 , 有些 细胞 生长 排列 不 规则 了 ,无 序 生长 的 细 驳 会 继续 增殖 ， 最 终 形成 一 个 混乱 的 多 层 细 胞 团 。 如 果 用 胰 蛋 白 酶 将 这 些 细胞 洗 下 并 分 散 开 来 再 继续 培养 ,这 时 所 形成 的 细胞 ， 培养 物 表 现 出 无 序 的 多 层 生长 [图 22-1(b)]。 当 细 胞 具有 这 种 特性 时 ,我 们 就 说 它们 是 被 转化 了 , 称 做 转化 细胞 。 转 化 也 可 由 其 他 方式 进行 。 例 如 ,接受 辐射 或 化 学 致癌 物 处 理 ( 后 面 将 要 谈 到 ), 或 甚至 强迫 细胞 在 高 浓度 + 的 条 件 下 生长 许多 世代 也 能 造成 转化 。 与 正常 细胞 相 比 ， 转 化 细胞 还 有 几 个 不 同 之 处 : 1. 可 在 悬 液 中 生长 (而 不 是 只 能 在 表面 上 生长 )。 2. 它们 需要 生长 在 含有 较 低 浓度 血清 的 培养 基 中 。 3. 细胞 表面 有 所 改变 ,细胞 膜 更 具有 流动 性 。 | 4. 染色 体 数 总 多 于 正常 的 双 倍 体 数 ,可 能 为 三 倍 体 ` 四 倍 体 ， 或 个 别 的 染色 体 具 有 晤 外 的 拷贝 数 。 但 是 ， 它 们 最 显著 的 特征 在 于 ， 如 果 将 这 些 转化 细胞 注射 到 同一 种 属 的 动物 中 (如 转 * 这 种 差别 在 浓度 上 可 能 是 很 小 的 。 例如 ， 在 小 鼠 细胞 系 建立 的 早期 阶 自 ， 细 胞 浓度 维持 在 3x 10° 个 细胞 / 毫 升 * 这 是 一 个 正常 的 细胞 系 ;但 如 果 使 细胞 浓度 维持 在 1.2X10“ 个 细胞 /毫升 的 条 件 下 (正好 是 4 倍 , 处 于 被 挤 压 的 状态 )? 就 可 由 转化 细胞 组 成 一 个 确立 细胞 株 。 ¢ 270。 化 的 小 鼠 细胞 注 和 人 小 鼠 ), 常 常 可 以 致癌 。 转 化 细胞 内 部 都 有 一 个 或 更 多 个 整合 了 的 病毒 DNA， 这 是 病毒 的 转化 细胞 的 一 个 共性 ,也 为 我 们 研究 转化 的 分 子 基础 提供 了 线索 。 检测 整合 的 病毒 DNA 在 研究 病毒 诱 变 的 转化 系统 中 , 人 们 不 仅 可 以 证 明 转 化 细胞 中 有 整合 的 病毒 DNA, 而 且 还 能 测定 该 整合 序列 的 数目 和 位 置 。 在 这 一 部 分 我 们 将 主要 介绍 这 些 测定 方法 。 首先 指出 病毒 转化 细胞 中 含有 病毒 DNA 的 是 杂交 实验 。 在 体外 , 将 纯化 的 多 瘤 病 毒 DNA 转录 为 RNA， 再 用 宇 标 记 该 RNA, 从 多 瘤 病毒 转化 细胞 中 提取 得 到 DNA 可 以 与 这 种 标记 -RNA 杂交 ， 而 未 被 转化 细胞 的 DNA WAT. 病毒 DNA 可 以 整合 到 宿主 DNA 中 ,也 可 以 以 质粒 形式 存在 (如 第 十 六 章 所 讲 到 的 两 种 溶 源 性 噬菌体 )。 用 一 个 简单 的 实验 即 可 区 分 这 两 种 情况 。 从 被 多 瘤 病毒 转化 的 细胞 中 提取 总 DNA， 将 DNA 随机 地 打 断 为 各 种 分 子 量 的 片段 ,通常 这 些 片 段 都 大 于 多 瘤 病 毒 DNA (OTHE 4.8X105)。 用 区 带 离心 将 这 些 片 段 分 离 , 然 后 使 之 变性 并 和 : 理 标记 的 多 瘤 病 毒 RNA 杂 交 ， 从 而 测定 是 否 含有 多 瘤 病 毒 DNA。 如 果 病 毒 DNA 以 质粒 形式 存在 ， 则 所 有 的 多 瘤 病毒 DNA 将 以 分 子 量 为 4.8 x 10' 的 单一 组 分 沉降 ， 但 如 果 该 DNA 是 整合 到 宿主 染色 体 中 ,而 且 细 胞 的 总 DNA 又 是 被 随机 打 断 的 ,那么 转化 细胞 含有 的 多 瘤 DNA 就 会 是 大 小 不 一 的 片 眉 。 实 验 结果 与 后 一 种 假设 相符 , ;*H 多 瘤 病 毒 mRNA 可 以 和 任意 大 小 AY DNA 片 眉 杂交 。 这 个 结果 清楚 地 说 明 多 瘤 病 毒 DNA 在 宿主 中 是 以 整合 状态 存在 的 。 可 能 的 排列 用 限制 性 @SV40DNA sy ARS WAR — on. SV40 标 准 Oi 0 泳 动 方向 a 图 22-2 转化 细胞 中 SV40 DNA 被 整合 到 细胞 染色 体 DNA 上 的 实验 。 上 图 黑色 实 线 代表 细胞 的 DNA3; 长 虚线 代表 与 此 无 关 的 大 片 收 DNA; SV40 DNA 用 点 虚线 表示 。“X” 是 限制 性 内 切 酶 的 作用 位 点 。 电 沪 图 谱 ; 如 果 SV40 DNA 以 游离 的 质粒 〈@) 形 式 存在 ,那么 将 示 出 与 纯 SV40 DNA 有 同样 泳 动 速度 的 单一 的 条 带 。 如 果 细 腹 DNA 上 存在 着 一 个 前 病毒 (D， 那 么 由 于 这 个 前 病毒 是 连 到 细胞 DNA 上 ， 所 以 人 们 可 以 想见 电泳 时 条 带 泳 动 得 较 慢 〈 因 为 有 较 高 的 分 子 量 )。 如 果 存 在 两 个 前 病毒 (ID 那么 电 瀛 后 会 有 两 个 条 带 ， 因 为 一 般 限制 性 内 切 酶 的 作用 位 点 分 布 在 围绕 着 两 个 前 病毒 的 不 同 地 方 。 电 泳 时 采用 超 螺旋 的 SV40 DNA 作为 标准 , 因 为 它 的 泳 动 速度 几乎 与 线性 的 \ 一 个 单位 长 度 的 SV40 DNA 的 相同 。 co “271 。 后 来 ,人 们 又 用 SV40 进行 了 更 为 巧妙 细致 的 研究 ,进一步 肯定 了 这 个 结论 : sv40 病毒 的 SV40 DNA 是 整合 的 。 在 这 些 实验 中 ， 人 们 不 仅 测 定 了 前 病毒 的 数目 ， 还 搞 清 了 整合 是 否 发 生 在 特定 位 点 上 。 实 验方 法 为 ; 用 限制 性 内 切 酶 将 转化 细胞 的 总 DNA 切 成 片段 ,然后 进行 凝 胶 电 泳 分 离 这 些 片段 ,并 使 之 变性 , 再 用 ”了 P 标记 变性 了 的 病毒 DNA 作为 探 针 , 进 行 Southern blotting 杂交 实验 ,鉴定 该 片段 中 是 否 含 有 病毒 DNA, 第 一 个 实验 (图 22-2) 表明 病毒 DNA 是 整合 在 转化 细胞 染色 体 DNA 的 一 个 单一 位 点 上 的 。 将 转化 细胞 的 总 DNA 用 限制 性 内 切 酶 消化 , 要 求 这 种 酶 在 SV40 DNA 中 没有 切 点 ,而 在 细胞 DNA 中 有 许多 切 点 。 将 切割 后 的 DNA 进行 电泳 。 因 为 SV40 Be 可 能 以 质粒 形式 存在 ， 也 可 能 整合 到 一 个 或 两 个 不 同位 点 上 ， 所 以 有 两 种 预期 的 电泳 结 果 。 观 察 到 的 实际 结果 只 与 一 种 情况 相符 ， 只 整合 在 一 个 位 点 上 。 已 经 从 大 量 不 同 的 转 化 细胞 克隆 中 分 离 DNA， 再 用 这 些 DNA 重复 了 这 一 实验 。 只 在 少数 克隆 中 有 两 个 条 带 ， 在 通常 情况 下 ， 电 泳 图 谱 中 只 有 一 个 条 带 。 因此 可 以 断定 ，SV40 通常 只 和 (a) -一 一 二 大 Er 一 一 一 一 一 :一 限制 性 内 切 酶 位 点 ee sto Ne hg (b) (c 图 22-3 处 于 不 同位 置 上 的 前 病毒 DNA 电泳 时 在 图 谱 上 的 位 置 。 〈a) 细胞 DNA 的 一 部 分 > 表示 在 四 种 不 同 的 转化 细胞 中 前 病毒 整合 的 四 种 可 能 位 置 。 〈b) 四 种 不 同 细胞 株 所 含 前 病 孝 DNA 的 酶 解 片 侦 ， 由 于 前 病毒 距 最 近 的 切 点 位 置 不 同 ， 所 以 含 前 病毒 的 片段 的 大 小 也 不 同 。(\c* | RRB. AR CIV) 代表 一 种 单独 的 转化 细胞 的 克隆 。 ig 3 1 2 =- 血 一 熏 一 一 一 一 -二 - - 一 -一 一 了 一 二 z 3 (a) 2 3 1 3 1 (b) -—-—* ---- + --*-— "> 5 Ce 3 (c) 22-4 从 三 种 SV40 转化 细胞 株 提取 DNA Ja, PR HIEA DA EA Rik aA, 设 病毒 DNA 的 整合 位 点 是 变化 的 。 如 果 位 点 是 固定 的 ?图谱 将 是 同样 的 。 图 中 没有 显 出 含 细 了 下 DNA 的 两 条 带 。 这 些 分 子 通常 比 条 带 中 DNA 片段 大 得 多 * 并 且 将 出 现在 空心 箭头 所 示 的 亿 置 。 ° 272° 整合 在 一 个 位 点 上 ,但 有 些 转化 细胞 会 在 不 同 的 位 点 上 整合 两 段 SV40 序列 。 当 检验 一 种 特殊 的 病毒 所 转化 的 许多 个 克隆 时 ， 发 现 各 个 克隆 的 一 条 电泳 带 或 几 条 电泳 带 的 位 置 一 般 都 不 同 ,在 极 少数 情况 下 一 个 克隆 的 条 带 与 其 他 克隆 的 条 带 相 重 合 (如 图 22-3)。 这 说 明 存 在 着 许多 潜在 的 整合 位 点 ,这 些 位 点 可 能 是 随机 分 布 的 。 如 果 选 用 前 病毒 中 有 几 个 切 点 的 限制 性 内 切 酶 ， 用 这 种 酶 就 可 以 测定 整合 是 否 发 生 在 病毒 DNA 某 一 特定 位 点 上 。 具 体 方法 见 图 22-4。 该 酶 在 病毒 DNA 内 有 切 点 ， 所 以 它 在 产生 的 切割 片 朋 中 有 一 些 片段 小 于 完整 的 SV40 DNA， 这 些 片 段 构成 一 个 亚 组 (用 同一 酶 切割 环形 病毒 DNA 所 得 的 片段 则 构成 总 的 群体 ， 亚 组 包括 在 此 群体 之 中 )。. 如 果 整 合 发 生 在 一 特定 位 点 上 ， 所 有 克隆 都 会 见 到 同样 的 片段 ， 但 如 果 整 合 位 点 是 不 定 ”的 ,该 酶 有 几 个 切 点 时 ,电泳 后 就 可 见 到 (一 1) 个 片段 ,表明 是 几 个 亚 组 。 实 验 所 观察 到 的 结果 正好 与 后 者 一 致 ,说 明 SV40 没有 固定 的 整合 位 点 。 很 显然 ，SV40 DNA 可 整合 到 宿主 DNA 的 许多 不 同位 点 上 。 一 个 有 趣 的 问题 是 ， 所 有 这 些 位 点 是 否 都 在 同一 个 染色 体 上 呢 ? 回答 是 否定 的 。 这 个 答案 是 应 用 了 细胞 融合 (cell fusion) 技术 得 到 的 。 在 实验 室 中 , 人 们 常常 使 用 极其 有 用 的 仙台 病 毒 (sendai vi- rus)， 因 为 它 可 以 诱导 被 它 感染 的 细胞 发 生 融合 + 在 同 种 细胞 或 异种 细胞 间 都 可 以 发 生 融合 。 例 如 鼠 和 人 的 细胞 就 可 以 融合 ， 所 形成 的 融合 细胞 通常 在 最 初 的 几 次 细胞 分 裂 期 间 随机 地 丢失 人 的 染色 体 ， 直 到 细胞 逐步 地 具 有 完整 的 一 套 小 白鼠 染色 体 和 少数 几 条 人 染色 体 之 后 形成 稳定 的 细胞 系 为 止 。 正 常 的 鼠 细胞 和 被 _SV40 转化 的 人 细胞 可 以 融合 ， 从 中 已 分 离 到 这 样 一 些 克隆 ,它们 类 似 于 鼠 细 胞 ,但 又 表现 出 转化 细胞 的 表现 型 特性 。 因 为 在 细胞 分 裂 中 期 , 鼠 - 人 的 染色 体 , 以 及 人 的 单个 的 各 条 染色 体 具 有 不 同 的 形态 ， 很 易 分 辨 区 分 。 因 此 ， 通 过 对 于 转化 的 鼠 细胞 克隆 进行 的 检测 ,可 以 确定 它 含 有 哪 一 些 人 的 染色 体 。 经 过 对 大 量 克隆 进行 分 析 ,发 现 每 个 克 隆 中 都 有 一 条 或 几 条 不 同 的 人 染色 体 ， 这 清楚 地 表明 SV40 DNA 可 整合 在 许多 染色 体 中 。 整合 的 病毒 DNA 的 结构 吧 菌 体 DNA 整合 到 染色 休 中 形成 前 病毒 ,这 种 前 病毒 是 喉 菌 体 DNA 的 真实 拷贝 虽然 有 时 会 有 顺序 改变 , 但 是 噬菌体 DNA 在 整合 过 程 中 既 不 会 有 任何 损失 也 没有 任何 收获 。 在 第 三 十 一 章 已 经 介绍 ， 当 逆转 录 病 毒 整 合 时 ， 病 毒 碱 基 序列 两 端 会 失去 几 个 碱 基 ; 而 一 个 大 片 臣 (LTR， 即 长 的 终端 重复 序列 ) 则 被 复制 加 倍 。 因 此 ， 逆转 录 DNA 整 合 时 ,会 有 精巧 的 DNA 重 排 ， 但 不 会 失去 编码 序列 。 这 对 于 逆转 录 病 毒 来 说 是 至 关 重 ， 要 的 ,因为 只 有 整合 的 DNA 才能 产生 子 代 病 毒 。 致癌 的 DNA 病毒 与 此 不 同 , 整 合 在 其 生活 周期 中 并 不 重要 。 实 际 上 ,只 有 在 感染 失 败 时 才 会 发 生 整 含 。 所 以 , 当 整 合 发 生 时 ， 并 不 存在 为 保持 全 部 编码 序列 的 选择 性 压力 。 因为 整合 能 力 对 于 病毒 来 说 并 不 具有 使 之 存活 的 价值 。 实 际 上 ， 人 们 发 现 病毒 常常 通过 ” 仙 合 病毒 是 有 被 膜 的 DNA 病毒 * 它 不 杀 死 宿主 ,但 促进 宿主 细胞 膜 的 弱化 过 程 ， 使 两 个 被 感染 细胞 能 高 频率 地 合并 ,从 而 形成 一 个 融合 细胞 ;或 形成 异 核 体 (heterokaryon)。 实 验 中 所 用 的 仙台 病毒 都 是 在 人 体 中 无 法 存活 或 失 活 的 ,不 过 这 种 病毒 孔 仍 能 促进 融合 。 失去 一 些 遗 传 信息 而 完成 整合 过 程 : DNA PRARHMR, Ba HaL, 这 些 变化 的 意义 还 不 清楚 ,显然 这 些 病 毒 的 整合 过 程 是 极其 复杂 的 。 在 这 方面 , 腺 病毒 是 最 突出 的 一 个 例 子 。 被 腺 病毒 转化 的 细胞 死 隆 总 包含 着 整合 的 病毒 DNA， 但 是 该 DNA 从 来 不 是 完整 的 腺 病毒 DNA 分 子 。 许 多 分 析 表 明 ,不 同 的 克隆 具有 不 同 的 腺 病毒 序列 。 但 是 ,有 一 个 片段 出 现在 所 有 的 转化 细胞 中 ,这 一 发 现 很 重要 ,因为 它 说 明 转 化 细胞 的 种 种 特性 可 能 是 由 某 一 个 或 某 一 套 特 定 基 因 造 成 的 。 病毒 整合 可 以 以 几 种 不 同方 式 导致 转化 : 1. 整合 可 以 发 生 在 宿主 的 某 一 基因 中 ,从 而 使 该 基因 失 活 。 如 果 该 基因 是 起 调节 作 用 的 ,就 会 导致 某 些 细胞 过 程 的 失调 。 2. 整合 可 使 某 一 基因 与 其 启动 子 分 离 , 从 而 使 该 基因 无 法 表达 。 3. 整合 可 使 某 一 宿主 基因 受到 病毒 启动 子 的 调控 ， 这 会 使 该 宿主 基因 的 产物 大 大 过 Eo 4. ERIKA FR AWRASE AP DB Be ae BE Le 5. Me A AY 5 | Ae CK Te AH, LE EIA RE 以 上 各 项 中 3 一 5 项 很 重要 。 肿瘤 病毒 与 溶 源 性 噬菌体 不 同 , 它 们 没有 阻 遏 物 。 实 际 上 ,它们 整合 的 DNA 可 持续 地 转录 。 而 溶 源 性 噬菌体 则 需要 有 阻 遏 物 ， 以 防止 杀 死 宿主 细菌 的 功能 得 到 活化 。 阻 歇 物 对 于 逆转 录 病 毒 来 说 也 是 不 必要 的 ,因为 逆 病 毒 并 不 杀 死 宿主 细胞 。 另 外 ,所 有 致癌 的 DNA 病毒 可 以 转化 ,也 不 需要 阻 遏 物 ,但 其 原因 不 同 。 所 有 的 致癌 DNA 病毒 都 有 早期 转录 和 晚期 转录 。 这 些 病 毒 具有 杀 死 宿主 细胞 的 功能 ,但 这 些 功 能 被 限制 在 晚期 才 表 达 。 关于 这 些 我 们 曾 介绍 过 。 回 忆 一 下 ，DNA 病毒 只 转化 非 受 纳 细胞 ,而 在 这 些 细胞 中 , 无 法 进行 晚期 转录 或 晚期 RNA 的 加 工 。 病毒 不 能 杀 死 宿主 细胞 的 事实 还 不 足以 解释 伴随 着 转化 的 复杂 的 细胞 学 改变 ,因此 ， 多 年 来 人 们 对 诱导 肿瘤 的 病毒 基因 进行 着 很 活跃 的 研究 。 下 面 将 介绍 这 些 基因 。 病毒 的 致癌 基因 在 上 一 部 分 ,我 们 已 指出 病毒 DNA 对 宿主 细胞 基因 表达 的 影响 ,以 及 致癌 病毒 基因 的 产物 可 以 引起 病毒 的 转化 ,也 知道 两 种 影响 的 一 些 实例 。 在 这 一 部 分 ,我 们 将 研究 逆转 录 病 毒 中 致癌 的 病毒 基因 ,它们 被 称 为 致癌 基因 《oncogenes)， 是 引起 肿瘤 的 一 类 病毒 基 因 中 的 一 部 分 。 蛋白 质 激酶 和 逆转 录 病 毒 引起 的 转化 在 1970 年 ,人 们 分 离 出 了 劳 氏 肉瘤 病毒 〈RSV) 的 温度 敏感 型 转化 突变 株 。 突 变 的 病 毒 在 允许 温度 和 非 允 许 温 度 下 都 能 正常 生长 并 产生 子 代 ; 但 只 在 允许 的 温度 下 有 转化 能 力 。 而 且 ， 将 在 允许 温度 下 转化 的 细胞 移 置 到 非 允许 温度 下 一 两 天 之 后 它 又 可 回复 正 稍 的 细胞 形态 。 但 无 论 是 非 转 化 的 \ 转 化 的 ,还 是 回复 的 细胞 都 可 产生 同样 的 病毒 。 这 些 实 。274 。 验 清 楚 地 说 明 RSV 的 转化 功能 和 复制 功能 是 分 离 的 。 与 此 同时 ， 人 们 还 分 离 出 一 RSV 的 非 条 件 性 缺失 型 突变 株 (nonconditional deletion mutant), EMISSize A T # 化 能 力 ,又 称 作 非 转化 性 突变 株 (aontransforming mutant)， 它 们 在 结构 上 与 野生 型 RSV 非常 类 似 5 负责 转化 功能 的 基因 叫做 stc (sarcoma-pibducing)， 它 与 形成 肉瘤 的 动能 有 Ko 通过 比较 野生 型 RSV 的 RNA 和 非 转 化 突变 株 的 RNA, 可 以 证 明 突 变 体 是 src” ik 失 突变 型 ， 它 缺少 了 大 约 1600 个 碱 基 的 RNA, 这 一 发 现 为 我 们 研究 src 基因 提供 了 有 利 的 生化 基础 。 一 个 令 人 激动 的 实验 证 实 了 转化 完全 是 由 src 单独 引起 的 。 人 们 将 分 离 出 只 包括 src 基因 的 限制 性 酶 切片 段 。 将 上 述 src 片段 加 到 鸡 组 织 培养 细胞 中 , 用 一 略 加 改变 的 CaCl, 技术 进行 转化 。 结果 ， 一 些 细胞 发 生 转 化 。 在 这 些 细 胞 中 ,发 现 有 整合 到 染色 体 中 的 src WR 在 其 他 几 种 逆转 录 病 毒 中 也 发 现 了 类 似 的 转化 基 src 基因 最 不 寻常 的 性 质 很 可 能 是 仅仅 一 个 简单 的 病毒 基因 编码 的 蛋白 质 就 可 以 引 起 多 种 与 转化 表现 型 相关 的 效应 。 人 们 对 此 解释 为 : src 基因 的 产物 是 一 个 酶 ;， 它 可 修 饰 许 多 种 蛋白 质 。 sro 基因 的 产物 为 一 种 称 之 为 pp60-v-Src 的 简单 蛋白 质 。 60 是 指 其 分 子 量 为 60000, Y 表明 该 基因 来 自 病毒 〈 我 们 将 会 发 现 这 种 命名 很 重要 )。 pp60-v-Src 是 一 种 酶 ， 它 可 将 磷酸 基 从 ATP 上 转移 到 细胞 蛋白 质 的 栈 氨 酸 残 基 上 ， 这 种 能 够 使 蛋白 质 磷酸 化 的 酶 叫做 蛋白 激酶 。 大 多 数 蛋白 激酶 作用 在 丝氨酸 残 基 上 ;而 sro 酶 却 作用 在 酷 氮 酸 残 基 上 。 这 很 特别 ， 因 此 ， 它 又 称 为 酷 氨 酸 专 一 性 EB A HM (tyrosine specific protein kinase), 天 们 发 现 其 他 逆转 录 病 毒 的 转化 基因 产物 也 是 与 此 类 似 的 酶 。 蛋白 激酶 在 动物 中 很 常见 ,它们 的 主要 功能 是 调控 其 他 蛋白 质 的 活性 。 对 某 些 蛋白 质 来 说 磷酸 化 使 之 活化 ;而 对 另 一 些 蛋 白质 来 说 , 则 使 之 失 活 。 一 种 蛋白 激酶 通常 可 使 许 多 蛋白 质 磷 酸化 ,因此 ， 这 些 激 酶 的 调控 功能 是 可 以 进行 远 距 离 控制 的 〈far-reaching)e 不 难 想像 , 像 src 蛋白 激酶 这 样 的 酶 的 合成 会 引起 细胞 的 生长 特性 发 生 戏 剧 性 的 变化 , 因 为 它们 可 以 使 许多 酶 活化 或 失 活 ; 而 其 中 有 些 酶 可 能 是 参与 生长 调控 的 人们 对 几 种 逆转 录 病 毒 的 致癌 基因 的 温度 敏感 突变 株 进行 了 研究 ,结果 表明 , 酷 氨 酸 激酶 的 活性 与 转化 能 力 是 一 致 的 。 在 人 允许 的 温度 下 ,突变 株 有 了 明显 的 酷 氨 酸 激酶 的 活性 ,同时 也 具有 转化 宿主 细胞 的 能 力 ， 在 转化 细胞 的 蛋白 质 中 也 包含 有 磷酸 化 了 的 酷 氨 酸 ;而 在 非 允 许 的 温度 下 ， 既 没 有 酷 氨 酸 激酶 活性 ,也 没有 转化 能 力 及 被 磷酸 化 了 的 酷 氮 酸 。 显然 ;要 想 了 解 该 激酶 的 作用 ,必须 鉴别 出 那些 被 磷酸 化 了 的 重要 蛋白 质 。 人 们 已 分 离 出 许多 被 src 激酶 磷酸 化 的 蛋白 质 ， 但 是 大 多 数 蛋 白质 的 功能 还 不 清楚 。 在 后 面 我 位 还 将 介绍 这 些 蛋 白质 的 一 些 情 况 。 癌 细 胞 中 的 致癌 基因 ”因为 认识 到 像 sro 这 样 的 一 个 单个 的 基因 就 可 以 引起 转化 作用 ,所 以 人们 开始 从 这 症 病 人 身上 经 外 科 手 术 切 除 下 来 的 瘤 细胞 中 寻找 致癌 基因 。 前 面 我 们 提 到 过 ，src 基因 可 以 以 两 种 方式 引起 转化 : 将 RSV 病毒 的 全 部 DNA 整合 到 一 个 染色 体 上 ;或 只 将 含 有 src 基因 的 DNA 片段 整合 进去 。 后 者 使 我 们 得 到 了 启发 结 从 大 体 瘤 细胞 中 分 离 出 DNA 片段 ,通过 测定 它们 是 否 具 有 转化 正常 培养 细胞 的 能 世 ; 戴 可 发 现 致癌 细胞 中 的 癌 ws 基因 。 人 们 首先 使 用 人 体 的 膀胱 癌 细 胞 系 的 细胞 DNA 作为 实验 材料 , 先 把 DNA 切割 为 片 眉 , 再 用 这 些 片 段 去 转 染 小 鼠 组 织 培养 细胞 CNIH 3T3 细胞 ,这 是 一 个 确立 细胞 株 s 这 类 研究 经 常 使 用 这 种 小 鼠 细 胞 株 ), 结 果 小 鼠 细胞 被 转化 ,说 明 膀 乃 癌 细胞 中 有 致癌 基 因 。 在 第 二 个 实验 中 , 人 们 把 DNA 片 女 分 为 许多 个 组 分 ,然后 分 别 测定 每 个 组 分 的 转 北 活性 ,结果 发 现 只 有 一 个 DNA 片段 可 以 诱发 转化 ,说 明 这 个 片段 中 含有 人 膀胱 癌 的 致癌 基因 。 在 另 一 套 实验 中 ,人 们 用 大 的 淋巴 腺 瘤 细 胞 为 实验 材料 MAD SIT MER 致癌 基因 在 发 现 尖 膀胱 癌 的 致癌 基因 以 后 ,有 人 提出 这 样 一 个 问题 : 它 是 从 哪里 来 的 % AN 给 出 了 各 种 各 样 的 理论 ,其 中 之 一 是 突变 理论 ,推测 膀胱 癌 的 致癌 基因 是 由 正常 的 基因 经 突变 而 形成 的 。 事 实 的 确 如 此 ,因为 从 正 汕 膀胱 细胞 中 可 分 离 出 一 种 DNA 片段 ,这 个 片 眉 的 编码 序列 与 膀胱 癌 致 癌 基 因 只 差 一 个 碱 基 : 正常 细胞 DNA 中 的 一 个 G 在 致癌 基因 中 被 工 所 取代 。 因 此 ,人 膀胱 癌 的 致癌 基因 是 正常 基因 的 突变 体 。 所 以 ， 对 某 些 (但 不 是 全 部 ) 其 他 的 致癌 基因 来 说 ,情况 也 是 如 此 。 在 下 一 部 分 ,我 们 将 会 看 到 在 正常 细胞 中 也 有 sro 基因。 sre 在 细胞 中 的 对 应 体 人 们 用 正 稼 鸡 细胞 的 总 DNA 和 放射 性 标记 的 src DNA 探 针 进行 Southern blo- tting 分 子 杂交 ， 结果 发 现在 正常 细胞 中 有 RSV src 基因 的 对 应 体 〈courterpart)o 用 这 种 方法 ,人 们 进一步 在 其 他 生物 中 寻找 类 似 src 的 基因 发 现在 鸟 类 \ 鱼 类 \ 哺 乳 类 和 人 的 DNA 中 也 都 有 src 基因 的 对 应 体 。 为 了 区 分 这 两 种 序列 ,人 们 把 病毒 中 含 sro 基因 的 DNA 序列 称 为 v-src， 而 细胞 中 的 对 应 序列 称 为 c-srce c-sre 也 编码 一 种 酷 氨 酸 激 酶 ， 但 活性 还 不 到 v-src 激酶 的 10%。 对 于 c-sre 和 v-src 的 起 源 , 人 们 已 提出 了 两 种 可 能 性 : 1. 在 漫长 的 进化 过 程 中 ,逆转 录 病 毒 反复 地 感染 这 些 生 物 , 从 而 使 它们 体内 也 出 现 了 c-srce。 这 就 是 说 ，c-src 是 v-sre 的 衍生 物 。 2. 病毒 在 一 个 事件 中 以 某 种 方式 从 细胞 中 获得 v-src， 并 由 此 产生 了 致癌 能 力 。 这 RAUL, v-sre 是 cr-src 的 衍生 物 。 事实 上 ，RSV 的 src 缺失 突变 体 可 以 正常 地 增殖 ， 这 说 明 第 二 种 解释 可 能 是 正确 的 ,对 c-src 和 v-src 结构 的 研究 也 证 明了 这 一 点 。 逆 转录 病毒 基因 没有 内 含 子 s 对 细胞 和 病毒 的 DNA 的 序列 分 析 表 明 : crsrc 序列 总 是 不 连续 的 ,而 vrsrc 是 连续 的 。 失去 内 含 子 的 例子 已 屡见不鲜 ,而 获得 内 含 子 的 情况 则 还 未 见报 道 。 因 此 , AME, v-sre 是 在 很 久 以 前 的 某 一 时 候 从 含有 c-src 的 细胞 里 获得 的 转变 体 。 有 些 实验 的 结果 使 人 们 推测 :成 熟 的 c-src mRNA AY DNA 拷贝 是 这 个 过 程 的 一 个 中 间 物 。c-src 存在 于 多 种 关 椎 动物 中 ， 这 说 明 它 在 这 些 动物 中 是 一 个 必需 基因 ， 多 半 在 正常 生物 体 的 发 育 中 起 着 调控 作用 。 其 他 逆转 录 病 毒 的 致癌 基因 在 细胞 中 也 有 其 对 应 体 。 这 些 细胞 基因 都 被 间隔 序列 (intervening sequences) 中 断 ， 因 而 具有 典型 的 细胞 基因 结构 。 逆转 录 病 毒 从 正 稼 的 细 胞 基因 (而 且 还 可 能 是 必需 基因 ) 中 “挑选 出 致癌 基因 似乎 是 一 种 普 损 现象 。 我 们 把 这 些 ° 276° 对 应 于 致癌 基因 的 细胞 基因 称 为 原 癌 基因 Cprotooncogenes), 膀胱 癌 的 致癌 基因 与 原 交 基 因 只 差 一 个 碱 基 。 这 是 一 种 普遍 现象 ， 还 是 致癌 基因 可 PES RIMM MAK AR BEA SHAE? 搞 请 楚 这 个 问题 是 很 重要 的 。 实 际 上 这 两 种 情况 都 已 经 观察 到 了 。 当 两 者 序列 确实 不 同时 ， 人 们 可 以 认为 原 瘤 基因 本 身 并 不 会 引起 转化 ,只 有 通过 突变 作用 才 可 致癌 。 但 是 当 两 者 序列 完全 相同 时 ,我 们 就 必须 回答 这 OG: 为 什么 这 个 基因 在 正常 细胞 中 无 害 ， 而 在 瘤 细 胞 中 则 变 得 如 此 危险 呢 ? 人 们 为 此 提出 了 许多 假设 ,但 其 中 只 有 一 部 分 假设 受到 实验 结果 的 支持 。 这 些 假设 为 : 1. 一 个 单个 拷贝 的 原 癌 基因 是 无 害 的 ， 但 当 拷贝 数 增加 时 (如 整合 的 病毒 DNA 可 提 | 供 多 个 拷贝 ) ,该 基因 的 产物 也 会 增多 ,从 而 使 细胞 的 生长 和 分 裂 失去 控制 。 这 一 假设 不 无 ， 道理 。 而 且 我 们 常常 可 见 到 几 个 拷贝 的 病毒 DNA 整合 到 宿主 DNA 中 , 这 就 使 得 这 个 BLE DEAT o | 2. 和 正常 细胞 相 比 ,病毒 的 致癌 基因 可 以 产生 更 多 的 蛋白 质 产 物 。 对 此 有 两 种 解释 : 或 是 因为 病毒 基因 的 调控 方式 与 细胞 基因 不 同 ; 或 是 因为 病毒 中 的 这 个 基因 与 细胞 中 的 该 基因 两 者 所 处 的 位 置 不 同 。 在 本章 的 后 _ 痢 分 ,我 们 还 会 讨论 到 这 两 种 假设 。 致癌 物 和 致癌 基因 人 们 曾 一 度 认 为 : 所 有 的 肿瘤 都 是 由 于 存在 于 正常 细胞 中 的 病毒 基因 受到 化 学 致癌 #j (chemical carcinogens) 和 辐射 的 激活 而 引起 的 。 支 持 这 一 观点 的 证 据 为: 许多 能 诱 发 转化 的 试剂 也 能 使 正常 动物 的 组 织 培养 细胞 中 出 现 逆转 录 病 毒 颗粒 。 人 们 让 此 得 出 结 论 ， 即 许多 细胞 都 含有 潜在 的 逆转 录 病 毒 ， 它 们 可 被 致癌 物 激 活 。 有 些 癌症 是 可 能 由 此 造成 的 。 多 年 以 来 ,虽然 人 们 一 直 在 努力 地 证 明 这 一 假设 , 却 始终 未 能 如 愿 。 而 且 ， 在 许 She HUE MRED ,或 是 未 发 现 有 病毒 产生 ， 或 是 根本 就 没有 病毒 以 任何 方式 参与 。 在 许多 实验 中 ,用 致癌 物 处 理 正 常 细胞 ,虽然 转化 发 生 了 ， 但 是 并 没有 看 到 病毒 粒 。 本 基因 产生 突变 ,从 而 转化 为 致癌 基因 。 为 了 验证 这 一 假设 ,人 们 最 近 做 了 如 下 这 样 一 个 实 验 : 用 致癌 物 亚 硝 基 甲 替 尿 (nitrosomethylurea) 处 理 大 鼠 后 ,在 许多 大 鼠 中 形成 了 乳腺 fio HiME THK, 再 把 从 癌 细 胞 中 分 离 出 的 DNA 切割 为 片段 ,然后 将 这 些 DNA 片段 加 到 小 鼠 的 3T3 的 组 织 培养 细胞 中 (在 证 明 人 膀胱 癌 基 因 的 存在 时 , 人 们 用 了 同样 的 实验 ) 以 测定 其 转化 能 力 , 结 果 出 现 了 转化 细胞 。 对 DNA 片段 进行 分 析 ，, 发 现 转化 的 DNA 含有 大 鼠 乳 腺 癌 的 致癌 基因 。 在 正常 的 大 鼠 组 织 中 ,人 们 寻找 并 发 现 了 该 基因 的 对 应 体 。 通 过 测定 乳腺 瘤 的 致癌 基因 和 细胞 的 对 应 体 基因 序列 ,我 们 得 到 两 个 突出 的 结果 : 《1) 乳 腺 原 癌 基因 和 膀胱 原 癌 基 因 具 有 相同 的 序列 ;(2) 乳腺 的 致癌 基因 与 对 应 的 细胞 原 冶 基 因 只 差 一 个 碱 基 ， 而 且 碱 基 改 变 的 所 在 位 置 与 人 膀胱 的 致癌 基因 所 改变 的 碱 基 的 位 置 相同 。 因 此 可 以 断定 : (1) 人 膀胱 癌 和 大 鼠 乳 腺 瘤 是 由 同一 基因 突变 造成 的 ; (2) 致 癌 物 使 大 鼠 正常 基因 出 现 了 突变 ,从 而 引起 乳腺 癌 。 在 此 实验 中 ,致癌 物 使 正常 基因 突变 为 致癌 基因 。 继 这 个 实验 之 后 ， 人 们 又 观察 到 了 许 许多 多 通过 这 样 的 致癌 物 形成 致癌 基 因 的 基因 突变 实例 。 © 277。 动物 细胞 中 的 致癌 基因 和 病毒 的 致癌 基因 之 间 的 关系 如 果 致 癌 基 因 是 正常 基因 的 变型 (或 不 正常 的 表达 形式 )， 而 这 些 正 常 基因 又 是 参与 细胞 的 生长 调控 的 ,那么 ,致癌 基因 的 种 类 就 应 该 很 有 限 。 因 此 如 果 我 们 对 大 量 的 肿瘤 病 毒 和 肿瘤 细胞 进行 致癌 基因 的 筛选 检测 的 话 ， 那 么 可 以 期 望 同 样 的 一 个 基因 会 出 现 许多 次 , 即 许多 的 致癌 基因 会 完全 相同 。 在 前 一 部 分 ,我们 已 看 到 了 这 样 的 例子 : ABD 致癌 基因 和 大 鼠 乳 腺 瘤 的 致癌 基因 是 完全 相同 的 。 而 且 ， 因 为 这 两 种 致癌 基因 是 分 别 从 人 和 大 鼠 的 肿瘤 中 得 到 的 ,测定 却 是 在 小 鼠 3T3 细胞 中 进行 的 ,结果 同样 地 可 引起 转化 。 因此 ， 认 为 致癌 基因 转化 细胞 的 能 力 不 受 物种 的 限制 (至 少 在 哺乳 类 是 这 样 )。 这 不 仅 说 明 各 种 哺乳 动物 的 生长 调控 可 能 有 许多 共同 之 处 ， 而 且 当 发 现在 正常 细胞 中 也 有 c=src 时 ,人 们 认为 病毒 和 正常 细胞 还 有 可 能 具有 相同 的 致癌 基因 和 原 瘤 基 因 。 致癌 基因 的 种 类 是 否 确实 很 有 限 呢 ?为 了 回答 这 一 问题 ， 人 们 分 离 大 量 的 逆转 录 病 毒 ,并 从 人 体 组 织 中 分 离 出 致癌 基因 ;同时 ,也 从 正常 组 织 中 分 离 出 对 应 的 原 总 基因 ;再 通 过 序列 测定 ,发 现 各 种 致癌 基因 的 确 非常 相似 。 最 初 检测 的 Kirsten 肉瘤 病毒 就 是 一 例 , 它 能 在 大 鼠 中 产生 肉瘤 。 在 Harvey 肉瘤 病毒 中 ,人 们 发 现 一 种 类 似 的 致癌 基因 ， 称 为 ras (ARRAS rat sarcoma), ras 基因 与 前 文 所 述 的 人 膀胱 癌 致 癌 基 因 只 差 一 个 碱 基 o 在 人 肺 和 大 肠 的 肿瘤 中 也 发 现 有 ras 基因 。 后 来 在 人 的 神经 胚 质 瘤 〈neuroblastoma) MF 表 22-1 某 些 致癌 基因 和 它们 的 来 源 eA pi abl ANE A » AB es 4 Ht B-lym 小 鸡 及 人 的 淋巴 细胞 erbA 小 鸡 和 白血病 细胞 erbB AVIS, Bis 28 Ha ets 小 鸡 和 白血病 细胞 fes i AIS fgr i A fa fms a A o fos 小 鼠 肉瘤 fps ING ATE Ha-ras AR AH>ARKER A EA i Ki-ras ， 大 鼠 和 肉瘤 ,人 的 肿瘤 ,肉瘤 及 白血病 细胞 r. mil 小 鸡肉 瘤 mos 7\\ BS PA » 7}. BR Ba LL 2H myb 小 鸡 和 白血病 ,人 白血病 细胞 myc NIG fs > A RE a a N-ras 人 白血病 及 肿瘤 细胞 raf 小 鼠 肉 痛 Tel 火 鸡 和 白血病 ros ; : N38, PA Ja sis AA ski 小 鸡肉 瘤 src 小 鸡肉 瘤 yes VISA ee ee we * 来 源 是 各 种 逆转 录 病 毒 ,除非 往 明 是 某 种 细胞 的 。 278。 维 肉瘤 (fibrosarcoma) 中 又 发 现 有 一 种 类 似 序列 ,但 变化 的 碱 基 不 同 。 人 们 把 这 个 序列 称 为 N-ras。 通 过 大 量 地 研究 病毒 和 肿瘤 (人 体 大 肠 ` 肺 、 胰 脏 \ 皮 肤 、 乳 腺 、 脑 和 白细胞 的 胜 瘤 ,以 及 许多 种 大 鼠 和 小 鼠 的 肿瘤 ), 人 们 发 现 了 20 SHARIR EA PTH 因 列 在 表 22-1 中 。 它 们 的 名 字 很 特别 ,都 是 病毒 或 来 源 组 织 的 缩写 或 首 写 字母 的 缩写 。 人 们 对 这 些 基 因 的 产物 进行 了 研究 ,发现 有 几 个 为 酪 氨 酸 激酶 (如 src)， 有 两 个 为 苏 氨 酸 激酶 ,少数 几 个 为 DNA 结合 蛋白 ,还 有 一 些 与 生长 因子 有 共同 之 处 〈 在 本 章 后 面 讨 论 )e 致癌 基因 和 致癌 的 多 重 步骤 到 现在 为 止 ,从 我 们 所 介绍 的 实验 来 看 ,似乎 只 需要 存在 着 有 活性 的 致癌 基因 ， 就 能 eNOS 实际 情况 并 非 如 此 。 有 许多 证 据 表明 ， 引 起 癌变 至 少 包括 两 步 : 初始 和 启动 〈initiation and promotion)。 尽 管 两 者 的 界限 还 不 甚 清楚 ,而 且 关 于 它们 的 分 子 基础 昌 发 展 甚 快 却 并 无 定论 ,但 人 们 普遍 认为 ,初始 是 获得 突变 的 过 程 ， 是 引起 癌变 的 早 期 步骤 ,而 启动 则 是 晚期 步骤 ,在 这 一 阶段 ,突变 得 以 表达 。 在 诱发 癌变 的 过 程 中 ,生长 调 节 的 失控 是 必 不 可 少 的 一 步 。 这 可 能 是 启动 所 造成 的 ,但 也 许 还 涉及 其 他 步 又。 请 注意 ， 测定 致癌 基因 转化 潜力 的 所 有 试验 都 是 使 用 小 鼠 的 一 种 确立 细胞 株 , 即 NIST 3 细胞 。 这 一 点 是 我 们 了 解 致癌 基因 如 何 引起 转化 的 机 理 的 关键 。 这 个 细胞 系 已 被 维持 数 千 代 了 ， 选用 它 做 试验 ， 是 因为 它 多 年 来 一 直 被 用 来 研究 病毒 转化 和 化 学 致癌 。 在 此 我 们 有 一 点 想法 提请 读者 注意 ，3IT3 细胞 很 可 能 已 经 经 历 了 癌变 的 一 步 或 几 步 早期 步骤 。) 这 不 是 赁 空想 象 ,因为 3T3 细胞 的 确 不 正常 ,它们 在 培养 基 中 可 无 限 地 生长 。 癌变 是 否 包括 多 重 步 又 呢 ? 为 了 回答 这 个 问题 ?我们 用 一 个 已 知 的 致癌 基因 去 转化 那 些 还 没有 开始 无 限 生 长 的 细胞 ,看 看 是 否 能 够 转化 成 功 。 但 很 不 幸 ,得 到 很 不 一 致 的 研究 结果 ,而 且 这 些 结果 还 取决 于 所 用 的 鉴定 转化 状态 的 标准 。 例 如 ,在 一 项 研究 中 ， 人 们 用 刚刚 分 离 出 来 的 正常 小 鼠 皮肤 细胞 (还 不 能 无 限 永 久 地 生长 ) 为 实验 材料 ， 所 定 的 转化 标 准 为 接触 抑制 , 可 在 悬浮 状态 下 生长 。 在 此 条 件 下 } 在 培养 基 中 ras 基因 不 能 转化 该 细 胞 。 但 是 如 果 先 用 X 射线 或 化 学 致癌 物 处 理 皮肤 的 组 织 培 养 细胞 ， 从 中 分 离 出 几 个 能 永 入 生长 的 细胞 穆 , 这 时 再 用 ras DNA 去 转 染 ,就 可 形成 转化 细胞 。 由 此 得 到 启发 : ias 基 因 ;或 更 准确 地 说 , ras 基因 的 产物 决定 了 致癌 过 程 的 一 个 较 晚 期 的 步骤 。 但是， 在 另 一 些 实验 中 ,把 能 在 低 浓度 血清 中 生长 的 能 力作 为 转化 标准 ,用 ras 去 转 染 原 初 细胞 , 那么 ras 就 可 以 转化 原初 细胞 。 目 前 阶段 , 对 于 v-ras, 我 们 只 能 说 它 可 以 诱发 癌变 过 程 的 一 步 或 几 步 ,对 此 我 们 实在 是 所 知 甚 少 *。 有 些 逆转 录 病 毒 的 致癌 基因 可 在 动物 中 致癌 ,但 用 小 鼠 3T3 细胞 测试 时 , 却 不 展现 为 致癌 基因 。 鸡 和 白血病 病毒 的 称 为 myc 的 致癌 基因 就 是 如 此 。 myc 不 能 转化 3T3 细 胞 ,但 对 其 他 细胞 系 却 有 转化 作用 。 然 而 ， 用 myc DNA 4) ras DNA 依次 地 处 理 术 鼠 的 原初 皮肤 细胞 时 ,就 可 发 生 转化 。 在 这 个 实验 中 ，myc 代替 了 前 面 介 绍 过 的 和 射线 或 化 学 致癌 物 的 作用 。 这 说 明 癌变 至 少 包括 两 步 ， 而 且 所 需 步 邓 的 多 少 随 细胞 类 型 的 不 同 而 不 同 。 在 这 方面 ,我 们 的 知识 少 得 可 怜 , 对 于 这 些 现象 目前 我 们 理解 得 还 很 不 够 。 ”致癌 基因 的 研究 是 那么 重要 * 其 研究 进展 迅 邦 惊人 * 人 们 也 正 提出 各 种 有 关 的 理论 。 ¢ 279。 请 注意 ,能 转化 NIH 373 细胞 的 致癌 基因 并 非 都 具有 ras 的 碱 基 序列 ， 这 一 点 很 重要 。 因为 许多 种 致癌 基因 都 转化 3T3 细胞 ， 显 然 细 胞 中 许多 不 同事 件 及 过 程 都 能 导 致 这 个 细胞 系 转变 为 癌 细 胞 。 也 就 是 说 ,癌变 可 以 通过 许多 不 同 的 途径 而 实现 。 致癌 基因 的 活化 我 们 曾经 指出 ,正常 细胞 中 有 致癌 基因 的 对 应 体 ,而 且 它们 与 致癌 基因 之 间 只 差 一 个 碱 基 对 。 在 这 种 情况 下 ， 致 癌 基 因 是 由 正常 基因 突变 而 来 的 。 尽 管 对 致癌 基因 的 产物 的 生物 学 功能 还 不 甚 了 解 ,我 们 还 是 应 该 对 其 致癌 过 程 作 一 些 合理 的 推测 : 1. 碱 基 的 变化 可 增强 或 降低 致癌 基因 蛋白 的 活性 从 而 使 基因 活化 。 例 如 ， 如 果 该 蛋 白质 是 起 调节 作用 的 ， 它 可 以 开动 某 生 长 蛋白 质 的 合成 ， 当 该 致癌 基因 的 产物 活性 升 高 时 ， 就 会 导致 此 生长 蛋白 质 的 过 量 合成 。 与 此 相反 ， 致 癌 基 因 的 产物 也 可 能 关闭 生长 抑 制 因 子 的 合成 ,在 此 情况 下 , 当 该 致癌 基因 的 产物 失 活 时 ,其 抑制 活性 也 消除 了 ,结果 也 会 导致 生长 蛋白 质 的 过 量 合成 。 2. 致癌 基因 的 产物 可 能 是 一 种 促进 生长 的 分 子 ， crf He Se A CRE 调控 的 。 该 致癌 基因 的 蛋白 质 产物 发 生 改 变 ( 由 碱 基 对 变化 造成 )， 使 它 失去 对 调控 蛋白 作出 反应 的 能 力 , 不 再 受 控 于 原来 的 调节 子 。 在 这 种 情况 下 ,调节 子 不 起 作用 ， 这 个 致癌 基因 的 产物 促进 生长 的 活性 就 会 变 得 过 量 。 3. 致癌 基因 的 产物 可 能 不 稳定 ， 它 的 活性 由 合成 与 分 解 这 个 蛋白 质 的 相对 速度 来 调 控 。 当 它 的 结构 改变 时 ;可 能 会 阻止 降解 或 降低 降解 速度 ,但 不 影响 其 生化 活性 。 在 这 种 情况 下 ,细胞 中 该 蛋白 质 的 总 活性 将 上 升 。 当 致 癌 基 因 与 其 细胞 中 的 对 应 体 完全 相同 时 ,上 述 假设 机 理 对 于 表 22-1 中 的 各 个 臻 癌 基 因 的 作用 就 不 一 定 适 用 了 。 在 细胞 生物 学 的 研究 中 ;人 们 已 很 清楚 地 认识 到 ,有 些 生 物 学 功能 不 是 简单 地 取决 于 特殊 基因 产物 的 有 无 ,而 是 取决 于 该 产物 的 浓度 。 因 此 ,基因 - 产物 浓度 发 生变 化 ,可 使 原 癌 基 因 转变 为 有 活性 的 致癌 基因 ， 并 诱导 出 癌变 状态 。 现 在 。 我 们 再 来 考虑 这 种 浓度 改变 发 生 的 机 理 ,并 提出 有 关 的 证 据 。 细胞 中 某 基 因 产 物 的 浓度 是 由 其 合成 速度 决定 的 (当然 ,也 由 降解 速度 决定 ,但 在 此 ， 我 们 不 考虑 这 种 情况 )。 大 多 数 蛋白 质 的 合成 速度 是 由 其 mRNA 的 产生 速度 决定 的 ,而 mRNA 的 合成 又 受到 DNA 结构 的 种 种 特性 的 影响 。 例 如 ,启动 子 的 强度 和 调节 区 。 很 . 明显 , 当 启 动 子 的 强度 和 调节 区 两 者 中 有 一 个 或 两 者 都 改变 时 ,与 其 相 邻 的 基因 的 活性 也 会 发 生 相应 的 改变 。 人 们 也 的 确 观察 到 这 种 现象 ， 有 些 致癌 基因 和 正常 对 应 体 相 比 ,只 在 启动 子 部 分 有 碱 基 变 化 。 推 测 这 种 变化 可 能 就 改变 了 RNA 合成 的 速度 。 另 一 种 重要 的 机 理 指 出 , 若 把 原 癌 基因 移 位 ,如 把 它 移 到 另 一 个 启动 子 边 上 ， 或 者 把 它 和 原来 相 邻 的 调节 序列 分 开 ,也 可 改变 此 原 癌 基 因 的 表达 。 这 可 能 就 是 为 什么 原 癌 基 因 被 放 到 病毒 中 就 变 成 了 致癌 基因 ,也 就 是 说 ,正常 细胞 中 与 原 癌 基因 相 邻 的 启动 子 和 病 毒 中 的 启动 子 相 比 , 其 强度 相差 很 多 。 或 者 ,病毒 中 有 增强 子 (这 种 情况 在 DNA 病毒 中 出 现 的 可 能 性 比 在 逆转 录 病 毒 中 更 大 些 )。 因 此 ; 当 病 毒 DNA 插 到 被 感染 细胞 的 染色 体 中 时 ,病毒 的 致癌 基因 的 表达 速度 要 比 原 癌 基 因 高 得 多 ,因为 原 癌 基因 还 处 于 它 的 正常 位 置 上 (图 22-5)。 “280。 许多 实验 表明 , 原 癌 基因 位 移 Celocation) 后 可 变 为 致癌 基因 。 例 如， 用 遗传 工程 WAH, BIER) RR EA c-ras ( 另 一 个 为 c-mos) 接 到 病毒 的 调节 序列 S 上 ;但 并 不 改变 其 碱 基 序 列 ( 就 像 v-ras PRS —FE) 5 XFS FIR Fe AY DNA 就 / 较 强 的 启动 子 npg te sais 能 转化 小 鼠 3T3 细胞 。 在 另 一 个 实验 on Ae | ae 中 ;从 们 分 离 出 了 含有 原 癌 基 因 的 DNA hearse es Fr Be FARE PR Se HEI Ee 2 mRNA 列 中 可 能 有 邻近 于 基因 的 调节 序列 的 部 病毒 DNA 的 ) 分 ,这 样 得 到 的 原 瘤 基因 也 有 能 力 去 转 rete 化 小 鼠 3T3 细胞 s > 癌 细 胞 的 标志 之 一 是 染色 体 发 生 改 ，，__ 致癌 基因 变 ; 其 中 最 常见 的 改变 是 易 位 (transloc- | | ation). 在 易 位 过 程 中 ,两 个 染色 体 进行 acy 之 了 明显 的 部 分 交换 。 例 如 ;在 Burkitt 淋 ZY fg ewe aia BM, 0% 的 病 大 第 8 和 第 14 号 染 FEM MRNA 分 子 色 体 进行 了 交换 ,:59 的 病人 第 8 AS 图 22-5 使 病毒 的 致癌 基因 产生 过 量 产物 的 一 种 方式 。 当 病 2 染色 体 进 行 了 交 光 , 在 另外 的 病人 和 中 ;第 ;8 和 第 .22 染色 体 进行 了 交换 。 请 DFA, 可 以 使 病毒 的 致 闪 基 因 达 到 以 上 的 结果 。 另 一 种 注意 ,在 所 有 情况 下 ,都 移动 了 第 8 染色 Ree a ERT (ENE. 原 癌 基因 c-myc 就 位 于 第 8 染色 体 上 , 在 所 有 的 易 位 过 程 中 ，c-mye 都 移 到 某 个 编码 抗体 的 基因 的 旁边 ， 这 就 -使 原 交 基因 受 控 于 一 个 新 的 调节 基因 之 下 ,这 个 基因 原来 是 调节 抗体 合成 的 ,在 这 种 情况 了 下, 原 瘤 基因 产物 被 大 量 地 合成 (但 这 是 否 对 说 明 Burkitt 淋巴 瘤 的 病因 有 很 大 意义 ， 并 不 清楚 )。 人 们 已 发 现 许多 原 瘤 基 因 易 位 的 例子 。 WH, BREPREA MAA (chronic myelogenous leukemia) 的 第 22 和 第 9 染色 体 之 闻 发 生 了 易 位 ， 原 癌 基 因 abl (HZ Abelson 小 鼠 和 白血病 病毒 的 致癌 基因 ) 从 它 所 在 的 正常 位 置 第 9 染色 体 上 移 到 了 第 22 染 色 体 上 。abl 在 这 个 新 位 置 上 ,使 c-abl mRNA 的 合成 速度 比 原来 增长 了 8 信 。 二 我 们 不 应 该 产生 这 样 一 种 错觉 ， 即 只 是 增加 某 原 癌 基 因 的 mRNA 数量 就 足以 致癌 《我 们 曾 讲 到 癌变 包括 两 步 )。 实 际 上 ,在 好 几 个 实验 中 ,人 们 用 遗传 工程 的 方法 使 原 癌 基 AL mRNA 的 合 蕊 增 强 , 但 这 并 没 能 引起 癌变 。 这 说 明 , 癌 变 发 生 的 条 件 不 仅 于 此 ， 但 有 具 . 体 还 需要 什么 尚 有 待 研究 。 致癌 基因 和 蛋白质 致癌 基因 和 原 癌 基 因 都 编码 蛋白 质 , 这 些 蛋 白质 必然 与 转化 有 关 。 在 这 一 部 分 ,我 们 将 研究 几 类 致癌 基因 和 蛋白质 ,在 可 能 的 情况 下 ,也 讲 一 讲 它们 的 作用 机 理 ， 即 它们 是 如 何 工作 的 。 。 281。 蛋白 激酶 在 本 章 的 开始 ,我们 提 到 几 种 致癌 基因 编码 的 蛋白 激酶 ,它们 可 以 使 栈 氨 酸 或 苏 扎 酸 磷酸 化 。 这 些 激酶 为 什么 可 以 引起 转化 呢 ? 为 了 搞 清 这 个 问题 ， 对 那些 含有 磷酸 陛 栈 氨 酸 或 磷酸 化 苏 氨 酸 的 蛋白 质 ， 需 要 看 看 它们 到 底 有 什么 功能 。 虽 然 这 类 研究 并 未 迭 到 预 期 目标 一 一 搞 清 转 化 过 程 ,但 是 我 们 确实 知道 了 为 什么 伴随 着 转化 作用 会 出 现 种 种 变 慈 。 在 被 劳 氏 肉瘤 病毒 (RSV) 感染 的 细胞 中 ,人 们 发 现 了 第 一 个 致癌 基因 蛋白 ; 症 名 为 P365 P36 位 于 细胞 膜 内 侧 ( 细 胞 质 一 侧 )。 在 某 些 类 型 的 细胞 中 ，P36 WMA RSA A 药 定 位 有 关 ( 微 丝 是 一 些 棒状 的 细胞 质 纤维 ， 由 肌 动 蛋白 构成 ， 而 肌 动 蛋白 则 与 维特 角 胞 的 形状 有 关 )。 在 瘤 细 胞 中 , 微 丝 的 排列 是 杂乱 无 章 的 , 对 观察 到 的 这 二 情况 的 意义 目 前 还 不 清楚 。Vinculin 是 另 一 个 含有 磷酸 化 栈 氨 酸 的 蛋白 质 , Cb FARR 〈 粘 合 斑 ) 中 ,这 些小 斑 有 利于 细胞 与 其 他 表面 或 其 他 细胞 相 粘 合 , 并 可 作为 微 歼 束 的 附着 点 。 但 磷酸 化 了 的 Vinculin 则 使 得 它 组 合 微 丝 的 能 力 下 降 ， 这 种 下 降 变化 很 可 能 是 对 于 "癌变 "作出 的 反应 。 癌 变 的 特点 表现 为 瘤 细胞 之 间 的 粘 和 力 低 于 正 沪 细胞， 而 且 瘤 细 胞 的 形状 比 正常 细胞 更 圆 一 些 。 磷脂 酰 肌 醇 是 细胞 膜 的 一 种 成 分 , 它 能 被 sro 激酶 磷酸 化 ,从 而 被 切 为 两 部 分 ! SE 酰 甘 油 和 磷酸 肌 醇 。 二 酯 酰 甘油 可 以 激活 一 种 丝氨酸 激酶 ,从 而 使 许多 蛋白 质 发 生变 作 。 而 磷酸 肌 醇 则 可 使 结合 在 膜 上 的 Co 释放 出 来 。 我 们 还 不 清楚 Ca 的 释放 在 此 处 完 疯 有 什么 意义 ， 但 许多 癌 细 胞 中 的 Ca+ 代谢 都 是 不 正常 的 。 磷脂 酰 肌 醇 的 两 个 谷 解 产 驳 所 造成 的 这 两 类 变化 可 能 都 会 改变 对 于 细胞 分 裂 的 调控 作用 以 及 对 于 转化 作用 市 的 其 他 过 程 。 ial 4 生长 因子 、 各 种 物质 都 可 影响 特殊 类 型 的 细胞 生长 速度 ， 它 们 中 的 一 些 被 称 为 生长 因子 《gifo- wth factor), 最 近 , 人 们 发 现 致癌 基因 产物 和 生长 因子 之 间 有 联系 。 鸟 类 红细胞 溶血 症 (avian eryth roblastosis) 病毒 可 导致 红细胞 细胞 瘤 。 这 个 病毒 有 一 种 叫做 v-erbB 的 致癌 基因 。 这 个 基因 很 大 ,其 中 一 部 分 编码 酷 氨 酸 蛋白 激酶 。 然 而 , 令 人 感 兴趣 的 是 该 蛋 ， 白质 的 另 一 部 分 ， 因 为 它 和 细胞 表面 的 上 皮 生 长 因子 〈epidermal growth facter, EGF) 的 受 体 很 相似 。 这 个 因子 的 正常 受 体 是 由 v-erbB 的 细胞 对 应 体 一 ec-erbB 基因 编码 的 。 这 个 正常 受 体 是 一 个 很 大 的 蛋白 质 ,能 够 横 穿 整个 细胞 膜 ov-erbB 只 编码 该 受 体 的 二 部 分 (位 于 膜 中 的 和 细胞 内 的 那 两 部 分 ), 病毒 只 获得 了 c-erbB 基因 的 一 部 分 在 有 些 细 胞 调控 体系 中 ,这 个 受 体 在 传递 信息 中 起 着 至 关 重 要 的 作用 。v-erbB 所 产生 的 变异 受 体 . 很 有 可 能 扰乱 这 种 细胞 调控 体系 。 有 趣 的 是 , 当 EGF 结合 到 这 种 变异 的 受 体 上 时 BA 酸 激酶 就 被 活化 。 读 者 肯定 会 感到 在 所 观察 的 这 些 现象 中 ， 里 面 一 定 有 某 些 意义 重大 的 事件 ,但 是 现在 还 没有 揭露 出 来 。 | 致癌 基因 v-sis 存在 于 猿 猴 肉 瘤 病 毒 中 , 它 所 编码 的 蛋白 质 与 原 癌 基 因 c-sis 编码 的 和 小 板 衍 生生 长 因子 (platelet-derived growth factor, PDGF) 相似 。 被 猿 猴 肉 瘤 病 毒 感 染 的 细胞 不 断 地 产生 变异 的 PPGF ， 它 又 可 与 细胞 表面 受 体 结合 ; 但 是 并 不 是 所 有 的 细 胞 都 能 产生 PDGF 受 体 。 因 此 ,很 可 能 这 种 转化 作用 只 能 发 生 在 那些 已 经 产生 出 受 体 的 。282。 细胞 受到 感染 时 。 六 样 可 能 引起 自发 促进 的 细胞 分 裂 。 这 种 假说 ,目前 我 们 还 没有 实验 证 据 。 res 蛋白 生物 春 的 一 种 基本 主题 是 在 所 有 的 生物 中 虽然 原核 和 真 核 生物 略 有 差别 ， 但 是 基本 的 革命 过 程 通常 都 以 极其 相似 的 方式 进行 。 例 如 , 所 有 的 生物 都 用 DNA 和 RNA 聚合 int DNA 和 RNA ， 糖 酵 解 是 葡萄 糖 代谢 的 普遍 途径 ， 原 核 自 核 生 物 的 蛋白 质 合 成 只 在 一 些 细节 上 有 所 不 同等 。 因 为 细胞 分 裂 是 所 有 细胞 的 共性 ,因此 大 们 猜想 ,各 种 细 胞 在 细胞 分 裂 的 机 理 和 调控 上 也 必然 有 共同 之 处 。 ”大 们 对 细菌 和 动物 的 细胞 分 裂 都 进行 了 研究 ,但 前 者 进展 较 快 。 在 一 定 的 时 间 和 培养 条 件 下 ;细菌 分 裂 的 频 度 比 动 物 细胞 高 约 50 倍 ,而 且 细 菌 只 有 一 个 染色 体 ,其 分 裂 机 理 要 比 动物 细胞 有 丝 分 裂 的 复杂 体系 简单 得 多 。 细 菌 和 动物 细胞 在 增殖 上 有 一 个 根本 的 差异 ， 即 细菌 的 细胞 分 裂 是 连续 的 ， 而 组 构 化 了 的 动物 细胞 则 不 是 这 样 。 酵母 细胞 以 及 其 他 单 细 胞 真 核 生 物 则 介 于 两 者 之 间 ; 它 们 像 细 菌 一 样 ,也 是 自由 生活 的 生物 体 ， 但 它们 又 总 还 是 真 核 生 物 ， 具 有 多 条 染色 体 。 因 为 原核 和 真 核 生 物 在 数 千 万 年 前 进入 了 不 同 的 进化 途径 ,所 以 人 们 有 希望 在 酵母 中 发 现 某 些 与 动物 细胞 相对 应 的 细胞 分 裂 调 控 机 理 。 me 事实 果真 如 此 ,那么 人 们 就 可 以 通过 实验 方式 去 对 细胞 分 裂 的 调控 进行 研究 了 ,因为 用 酵 母 作为 实验 材料 要 比 用 动物 细胞 方便 得 多 。 最 近 ,在 酵母 和 果 蝇 中 ,人 们 检测 到 src 基因 和 ras 基因 类 似 物 。 酵 母 中 有 两 个 ras 基因 , 当 两 者 都 因 突变 而 失 活 时 ， 酵 母 就 会 停止 生长 ;如 果 任 意 一 个 未 失 活 ,酵母 仍然 正常 生长 。 但 是 ,如 果 两 个 ras 基因 都 失 活 的 酵母 再 度 获得 含有 人 的 c-ras 基因 的 DNA 片段 时 ， 酵 母 生 长 又 得 以 照常 进行 。 这 是 80 年 代 最 信人 兴奋 和 发 现 之 一 ,这 个 发 现 给 人 们 以 信心 去 设想 : c-ras 基因 在 动物 细胞 中 起 着 调节 细胞 生长 和 细胞 分 裂 的 作用 。 ADs iis 更 为 有 趣 的 是 ,只 有 原 癌 基因 才能 校正 酵母 中 的 缺陷 ,而 那些 变异 形式 ， 例 如 各 种 逆 转录 病毒 中 一 些 不 同形 式 的 、 单 个 碱 基 被 改变 的 基因 ， 则 无 此 作用 ， 它 们 都 不 能 取代 一 个 有 缺陷 的 酵母 基因 。 由 于 这 一 现象 发 现 还 不 久 (1985 年 ), 所 以 人 们 对 正常 的 ras 基因 的 功能 还 了 解 得 不 太 清楚 。 此 外 ,人 们 发 现 正常 的 ras 蛋白 可 激活 产生 “AMP AUR 环 化 酶 ,这 一 现象 是 很 令 人 深思 的 。- DNA 病毒 中 的 转化 蛋白 质 DNA 肿瘤 病毒 \ 腺 病毒 ,多 瘤 病 毒 以 及 `SV40 病毒 都 可 产生 转化 蛋白 质 。 被 腺 病毒 转化 的 细胞 中 只 含有 一 部 分 腺 病毒 DNA, RIMM Bin, 腺 病毒 DNA 中 有 一 个 特定 的 区 域 出 现在 被 转化 的 细胞 中 s。 用 限制 性 内 切 酶 切 下 含有 上 述 特定 区 域 的 片段 ,其 中 包括 EIA 基因 和 EIB 基因 ,用 它 去 转 染 细胞 可 诱导 出 转化 作用 。 人 们 认为 这 两 个 基因 是 致癌 基因 。 然 而 ,这 些 基因 所 编码 的 产物 是 对 于 DNA 复制 必 不 可 少 的 早期 蛋 折 质 ,因此 ,它们 在 根本 上 不 同 于 逆转 录 病 毒 所 产生 的 非 必需 的 致 瘤 蛋白质 ， 因 为 后 者 对 其 本 身 的 生存 来 说 是 可 有 可 无 的 。 多 瘤 病 毒 的 a 基因 及 SV40 病毒 的 A 基 因 都 编码 抗原 ( 见 第 二 十 一 章 )， 在 受 纳 宿 主 (permissive host) 中 的 DNA 复制 以 及 在 非 受 纳 宿主 Cnonpermissive host) 中 的 转 “1283。 化 都 离 不 开工 抗原 。 但 DNA 复制 和 转化 的 关系 实际 上 比 人 们 早期 预想 的 要 复杂 得 多 。 这 有 许多 原因 ， 其 中 之 一 就 是 这 些 遗 传 位 点 都 编码 着 好 几 个 蛋白 质 〈 如 图 21-24 所 示 的 SV40), 其 编码 区 域 是 互相 重 伙 的 。 SV40 的 早期 区 域 编码 两 个 蛋白 质 : t 抗原 和 工 搞 原 ， 多 瘤 病 毒 编码 三 个 蛋白 质 :上 抗原 ， 中 t 抗原 和 工 抗 原 。 人 们 在 研究 SV40 的 二 和 T 区 中 的 A 基 因 突 变 时 发 现 , 在 有 些 细胞 系 中 ,转化 作用 只 需要 下 抗原 (在 某 些 细胞 系 中 ， 转化 还 需要 t 抗原 ,但 原因 不 明 )e T 抗原 是 具 多 种 功能 的 蛋白 质 , 其 分 子 的 不 同 区 域 有 着 不 同 的 功能 。 人 们 曾 分 离 到 一 种 工区 域 有 缺陷 的 突变 体 : 它 在 非 允 许 温度 焉 不 能 进行 DNA 复制 ;但 却 可 使 细胞 转化 。 因 此 ,对 于 SV40 病毒 来 说 ， 转化 不 一 定 需 要 DNA # 制 , 而 多 瘤 病 毒 的 情况 要 复杂 得 多 。 在 生物 界 中 可 能 有 好 几 种 类 型 的 致癌 基因 , 如 myc 型 和 ras 型 。 因 此 ;人们 对 于 DNA 病毒 所 引起 的 转化 的 认识 与 理解 也 有 了 一 点 进步 。 多 瘤 病毒 的 工区 和 腺 病毒 EIA 基因 似乎 与 myc 很 相似 ,而 多 瘤 病毒 的 中 ! 区 和 腺 病毒 的 EIB AMS ras 类 似 。 非常 有 意义 的 是 ,有 些 在 转化 中 具有 完全 相同 功能 的 DNA 病毒 基因 ,并 不 是 都 具有 相同 的 碱 基 序 列 。 这 再 次 证 明 , 不 同 的 基因 可 以 有 同样 的 功能 。 人 们 一 直 在 那些 被 DNA 病毒 转化 的 细胞 中 寻找 病毒 诱导 的 蛋白 激酶 ,但 是 至 今 还 没有 得 到 确定 的 结果 。 = s+ xX R Axel, R., T. 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Sci, 76, 630—634. e to 2» vi . 第 二 十 三 章 ” 真 核 生 物 基 因 及 基因 产物 活性 的 调节 原核 细胞 与 真 核 细胞 的 调控 有 很 大 差异 :原核 细胞 一 般 是 自由 生活 的 单 细胞 有 机 体 ， 只 要 有 合适 的 环境 条 件 和 充足 的 养料 供应 ;原核 细胞 能 无 限 地 生长 和 分 裂 。 因 此 ,它们 的 调控 系统 的 作用 是 在 一 个 特定 环境 中 为 细胞 提供 最 大 的 生长 速度 ,除非 生长 受到 伤害 。 这 个 最 佳 生长 是 通过 下 面 的 机 理 获 得 的 ， 即 通过 将 细胞 的 合成 和 酶 的 活性 控制 到 最 大 生长 速度 所 要 求 的 点 上 ， 也 就 是 去 除 合成 中 的 废物 ， 并 使 细胞 能 尽快 地 适应 变化 着 的 环境 条 件 。 因 为 原核 细胞 DNA LRM, DNA 可 以 很 快 地 接收 到 细胞 质 中 的 信号 。 这 样 ， 其 蛋白 质 合 成 开关 经 常 是 通过 控制 转录 的 起 始 来 调节 的 。 这 方面 在 第 十 四 章 中 介绍 的 几 个 操纵 子 已 可 看 到 。 除了 酵母 、 营 类 和 原生 动物 等 单 细 胞 真 核 生 物 以 外 ， 其 他 各 种 真 核 细 胞 对 基因 表达 的 调控 有 不 同 的 要 求 。 在 一 个 发 育 着 的 生物 (如 在 胚胎 ) 中 ,一 个 细胞 不 仅 要 生长 、 分 裂 ， 产生 很 多 子 代 细 胞 ,而且 这 些 子 代 细胞 在 形态 上 和 生化 方面 发 生 很 大 变化 ,并 为 维持 这 种 变化 状态 ,它们 还 必须 发 生 分 化 然而, 这些 细胞 的 生长 和 分 裂 却 比 细菌 简单 ,因为 它们 生 长 所 处 的 介质 的 成 分 和 浓度 比较 稳定 ， 这 些 介质 为 血液 、 淋 巴 液 或 其 他 体液 等 。 对 于 海 生动 物 ， 介 质 则 是 海水 在 一 个 成 年 有 机 体 中 ， 大 多 数 类 型 的 细胞 都 停止 生长 和 分 裂 ， 每 一 个 细胞 只 需 维 持 着 它们 自己 。 还 有 很 多 这 样 的 例子 。 重 要 的 一 点 是 由 于 典型 的 真 核 细胞 和 原核 细胞 的 要 求 不 同 , 所 以 它们 的 调控 机 理 基 本 上 是 不 同 的 。 由 此 ,人 们 可 能 认为 自由 生长 的 单 细 胞 真 核 生物 的 调节 机 理 类 似 于 原核 生物 ， 但 实际 上 并 不 是 这 样 。 在 远 二 时 期 , 核 区 被 膜 包围 是 进化 中 的 一 个 很 大 的 进步 。 这 一 进步 是 由 基因 的 结构 及 调控 发 生 重大 改变 而 完成 的 ,或 者 更 可 能 是 在 基因 的 结构 及 调控 发 生 重大 改变 之 前 就 已 完成 。 这 一 章 主要 研究 形成 一 定 结构 组 织 的 真 核 细胞 ,大 部 分 讯息 来 自 于 对 哺乳 动物 两栖 ， 类 动物 (Xenopus, MH HR). HR (Drosophila, RHR). YRGEK ES) RE 动物 (sea urchin, 海胆 ) 的 DNA 进行 的 详细 研究 ;此 外 ,对 于 啤酒 酵母 (Seccharomyce5) 的 基因 表达 的 研究 ,也 得 出 一 些 不 寻常 的 讯息 。 多 细胞 真 核 细 胞 基因 表达 调节 的 研究 普 因 两 方面 问题 受到 阻碍 ， 即 无 法 得 到 调控 的 突变 株 , 不 能 对 真 核 基因 进行 分 离 与 操作 ,而 且 缺 乏 体外 的 RNA RANG II 转录 系统 。 近 来 ,重组 DNA 技术 的 兴起 改变 了 这 一 切 。 这 种 技术 可 以 将 DNA RRA RRCLS 二 十 章 ), 克 隆 了 的 DNA 片段 可 以 用 来 研究 基因 结构 ,并 可 作为 探测 mRNA 的 探 针 "已 获得 的 资料 大 大 加 快 了 研究 的 进展 。 虽 然 现在 对 于 一 些 事实 的 概貌 还 没有 弄 得 很 清楚 ,但 是 已 掌握 了 大 量 的 讯息 材料 。 因 此 这 一 章 将 对 于 采用 各 种 不 同 的 细胞 所 观察 到 的 、 多 种 多 样 的 调控 机 理 作 概略 性 的 介绍 。 原核 细胞 和 真 核 细胞 基因 结构 的 重要 差异 原核 细胞 与 真 核 细 胞 在 基因 转录 、 翻 译 以 及 DNA 的 空间 结构 方面 有 很 大 差异 。 这 * 286。 些 差异 中 的 一 部 分 已 在 前 面 的 章节 中 讨论 过 ， 另 一 部 分 则 将 在 下 面 的 章节 中 讨论 。 其 中 七 点 差别 将 在 讨论 真 核 细胞 基因 表达 的 调节 中 重复 地 出 现 , 这 些 差别 如 下 : 1. 在 真 核 细胞 中 ,一 个 已 完成 的 mRNA 分 子 只 能 翻译 出 一 条 单个 的 肽 链 ( 见 第 十 三 章 )， 因 此 在 真 核 细胞 中 见 不 到 原核 细胞 中 所 存在 的 那 种 类 型 的 操纵 子 。 2. 真 核 细 胞 的 DNA 1 只 有 一 小 部 分 DNA 是 裸露 的 。 3. 责 核 细胞 中 有 一 部 分 很 重要 的 _DNA， 它 们 是 由 几 个 碱 基 组 成 的 短 序列 ， 重 复 几 百 次 一 几 百 万 次 形成 重复 序列 。 高 等 真 核 DNA 中 的 很 大 一 部 分 是 不 被 翻译 的 。 4. 真 核 细 胞 能 够 用 有 控制 的 方式 使 DNA 片段 进行 重 排 。 还 具有 能 在 需要 时 增加 基 因数 量 的 潜力 (这 种 潜力 在 原核 生物 中 也 有 ,但 似乎 很 少 )。 15 在 大 部 分 真 核 细胞 的 DNA 中 存在 着 内 含 子 。 6. 在 原核 生物 中 ， 转 录 作 用 的 调节 位 点 都 很 小 ， ART Em Wane aT OL 游 , 蛋 白质 结合 到 调节 位 点 上 可 直接 地 促进 或 抑制 RNA 聚合 酶 对 它 的 结合 。 在 真 核 生 物 中 ,调节 区 则 大 得 多 ,它们 可 能 远离 启动 子 达 几 百 个 碱 基 之 多 。 这 些 调节 区 也 能 结合 某 些 蛋 自 质 ,， 但 是 这 些 蛋白 质 离 启 动 子 太 远 以 致 不 能 在 结合 的 同时 对 启动 子 起 影响 作用 。 7. 在 真 核 生 物 中 ， RNA 是 在 细胞 核 中 合成 的 ， 但 是 它 必 须 经 运输 穿 过 核 膜 到 达 细 胞 质 后 ， 才 在 细胞 质 中 进行 翻译 。 这 样 严格 的 空间 间隔 的 影响 在 原核 生物 中 几乎 不 存 在 。 纵 观 本 章 ,我 们 将 看 到 以 上 这 些 性 质 是 如 何 地 表现 现 于 特殊 的 调节 模式 中 的 。 基因 家 BK 在 原核 细胞 中 ， 密 切 相 关 的 基因 往往 组 成 操纵 子 并 且 以 多 顺 反 子 mRNA 的 方式 进 行 转录 。 这 和 样 , 整 个 体系 就 置 于 一 个 启动 子 的 控制 之 下 ,通过 控制 这 个 启动 子 就 可 以 对 整 个 体系 进行 开启 和 关闭 。 因 为 真 核 DNA 都 是 单 顺 反 子 , 所 以 ,如 在 真 核 细胞 中 对 这 些 不 加 以 改变 ,那么 上 述 调 控 方 式 就 将 是 无 用 的 。 在 真 核 细胞 中 * 许 多 相关 的 基因 可 以 按 功能 组 合成 一 套 基 因 , 这 一 套 基因 被 称 作 基因 家 族 。 此 家 族 中 的 各 个 成 员 的 活性 虽然 有 时 不 很 协同 ,但 通常 是 协同 着 的 。 现 在 ,基因 重组 技术 已 用 于 克隆 基因 家 族 ; 偶然 ,也 发 现 过 同一 个 家 族 中 的 所 有 基因 都 可 以 克隆 到 一 个 单个 的 质粒 十 面 ; 这 就 很 清楚 地 表明 : 这 样 的 一 个 家 族 形成 一 个 基因 往 。 但 更 经 常 的 是 ， 一 得 相关 基因 太 大 以 致 不 能 整个 地 克隆 在 一 质粒 中 ,而 是 家 族 中 的 两 个 或 三 个 基因 作为 一 个 单位 被 克隆 。 这 个 不 完全 的 发 现 对 决定 基因 的 顺序 非常 有 用 。 例如 ， 如 果 一 个 克隆 含有 A 和 了 B, 另 一 个 含有 B 和 C， 第 三 个 含 ACAD, 则 基因 在 染色 体 上 的 顺序 必然 是 ABCD。 克 隆 实验 指出 ,还 有 许多 基因 ，, 它们 的 产物 相关 ,但 是 调节 并 不 协同 ,这些 基 因 也 能 成 徐 。 这 样 ,基因 家 族 的 称号 就 扩展 了 , 任 何 功能 相关 的 基因 往 都 可 包括 在 内 (例如 tRNA 基因 )。 基因 家 族 通 常 分 为 简单 的 多 基因 家 族 、 复 杂 的 多 基因 家 族 和 发 育 阶段 控制 的 复杂 多 基因 家 族 。 在 图 23-1 中 给 出 了 每 个 类 型 的 例子 。 2 简单 的 多 基因 家 族 简单 的 多 基因 家 族 是 指 在 家 族 中 有 一 个 或 几 个 基因 以 串联 排列 的 方式 重复 着 。 这 种 家 族 的 最 简单 的 例子 就 是 编码 SS rRNA 的 一 串 基 因 , 这 在 爪 蟾 中 已 作 过 详细 研究 。 这 一 组 rRNA 基因 形成 一 个 巨大 的 阵势 ,其 中 的 每 一 个 5S rRNA 基因 都 被 间隔 序列 分 开 , 从 而 形成 一 个 基因 簇 。 间 隔 序列 的 大 小 变动 于 2 一 6 倍 5S rRNA 基因 的 长 度 之 间 ，, 而 且 ， 间 隔 序列 还 含有 中 等 重复 序列 。 每 一 个 58 rRNA 基因 都 被 单独 地 转录 ,产生 出 一 个 与 别 的 部 分 之 间 分 开 的 RNA 分 子 , 这 些 RNA 分 子 再 经 过 加 工 成 为 成 熟 的 5S tRNA, NS 细胞 中 有 好 几 个 由 几 百 个 一 几 千 个 5S rRNA 基因 聚集 而 成 的 基因 簇 拷 帆 。 IMS AY 5.8S、18S 和 28SrRNA 基因 组 成 了 另 一 个 简单 的 多 基因 家 族 , 其 中 的 每 一 个 转录 单位 都 含有 这 三 种 rRNA 序列 ， 每 个 转录 单位 又 被 间隔 物 分 开 ，5.8S、18S、28S rRNA 分 子 在 加 工 酶 的 作用 下 从 初级 转录 子 上 剪 切 下 来 ,在 各 种 类 型 的 二 售 体 细胞 中 ,这 三 种 rRNA 基因 序列 在 每 个 细胞 中 的 拷贝 数 为 几 百 一 几 于 个 。 rRNA 基因 提供 了 原核 生物 细胞 、 单 细胞 真 核 生物 细 胞 以 及 多 细胞 真 核 生物 细胞 之 闻 有 趣 的 差别 。 例 如 ,在 大 肠 杆菌 中 , 5S、16S 和 23S 的 rRNA 联合 组 成 一 个 转录 单位 ， 各 种 rRNA 分 子 是 从 这 个 转录 单位 上 剪 切 下 来 的 。 而 在 酵母 中 , 许多 rRNA 分 子 形成 一 个 个 单独 的 重复 单位 ,每 个 单位 由 间隔 序列 分 开 。 然 而 5S rRNA 的 转录 则 独立 进行 ,与 5.8S-18S-28S 的 转录 单位 没有 关系 〈 这 种 组 合 也 许 有 进化 意义 ,因为 真 核 细胞 的 5.8S rRNA 与 原核 细胞 的 5S rRNA 的 功能 相对 应 )。 最 后 ,多 下 驳 真 该 生物 细胞 中 的 53 rRNA 基因 组 成 独特 家 族 , 前 面 已 经 讲 过 。 (a) 简单 的 多 基因 家 族 tb) 复杂 的 多 基因 家 族 组 蛋白 H1 H4 H2B H3 H2A H1 书本 一 “过 -一 一 lm 古人 ee ee eo er wee (海胆 ) : 一 ， 重复 单位 了 组 蛋白 H1 H3 H4 H2A -H2B rm ( 果 蜗 六 ra a EET ST Se Bis) IT ae —_-o-e 重复 单位 tRNA Arg lle Lys Lys Lys Asn Asn Asn : [aay aa a eee wom oes ome ap ae © 0 es = I> em iw er (c) 由 发 育 阶段 控制 的 多 基因 家 族 6B cl ey ae 一 一 一 三 一 一 二 二 ein 胎儿 的 成 年 人 的 图 23-1 基因 家 族 的 5 个 例子 。 箭 头 指出 转录 的 方向 。 © 2886 复杂 的 多 基因 家 族 复杂 的 多 基因 家 族 二 般 由 几 个 相关 基因 繁 组 成 ;每 个 基因 徐 被 间隔 序列 隔 开 ,独立 地 进行 转录 。 在 图 23-1(b) 中 给 出 了 三 个 例子 ,每 个 例子 都 有 其 本 身 的 特征 ,所 以 自然 界 里 有 好 下 种 不 同类 型 的 复杂 的 多 基因 家 族 。 首先 ,让 我 们 看 一 下 海胆 的 组 蛋白 基因 家 族 s。 在 这 种 动物 中 ,由 5 个 基因 编码 着 五 种 组 蛋白 ,; 这 5 个 基因 处 于 一 个 小 的 DNA 片 朋 中 ， 而 且 被 间隔 序列 分 隔 开 来 。 这 个 5 基 因 单 位 事 联 状 地 重复 约 1000 次 。 5 基因 单位 中 的 每 一 个 基因 分 别 地 被 转录 成 单 顺 反 子 RNA 〔〈 令 人 吃惊 的 是 这 些 RNA 都 没有 内 含 子 )。 注 意 ， 各 个 基因 都 是 按 同一 方向 进行 转录 ,也 就 是 从 DNA 的 同一 条 链 上 转录 。 每 个 基因 的 转录 与 翻译 的 速度 都 受到 调节 ， 但 目前 对 这 种 调节 的 方式 还 只 能 作 简单 的 讨论 。 首 先 ， 组 蛋白 在 适合 于 染色 体 复 制作 用 的 时 候 合 成 出 来 ; 其 次 是 有 控制 地 合成 出 相等 分 子 数 的 H2A、H2B、H3 和 H4 以 及 半 个 分 子 数 的 HL (这 是 染色 体 中 的 分 子 数 比例 )。 毫 无 疑问 , 5 基因 单位 具有 多 个 拷贝 可 以 使 细胞 在 DNA 复制 开始 时 快速 地 合成 出 大 量 的 组 蛋白 。 最 近 发 现 ,在 一 个 特定 的 细胞 中 并 不 是 所 有 的 5 基因 单位 的 拷贝 都 得 到 转录 ， 而 是 在 胚胎 发 育 的 不 同 阶段 和 不 同 组 织 中 ,有 着 不 同 的 5 基因 单位 在 进行 转录 。 这 暗示 出 在 不 同 的 发 育 时 期 ,可 能 存在 着 具有 不 同 专 一 性 的 组 蛋白 亚 类 〈 后 来 证 明 这 个 基因 家 族 是 发 育 调控 型 的 各 种 基因 家 族 类 别 中 的 一 个 成 员 )6 后 面 将 对 组 蛋白 基因 的 调控 作 更 多 的 介绍 。 检验 果 电 组 蛋白 基因 家 族 时 ， 发 现 了 它 与 海胆 的 不 同 之 处 : 这 5 个 基因 是 按 两 个 方 向 进行 转录 的 ;如 图 23-1 所 示 。 而 在 酵母 中 ， 组 蛋白 基因 的 排列 方式 与 海胆 中 的 差别 则 更 大 ,存在 着 两 个 相距 很 远 的 基因 簇 ,每 一 个 含有 HAA HB 基因 ,而 其 他 的 组 蛋 白 基 因 则 是 分 开 地 散布 于 整个 染色 体 中 。 ; 图 中 所 示 果 蝇 的 tRNA 基因 得 具有 两 个 上 述 组 蛋白 得 所 没有 的 特点 , 那 就 是 在 基因 笠 中 含有 同一 种 基因 的 几 个 拷贝 (如 三 个 良 NAlr 的 基因 )， 而 且 , 不 是 所 有 的 tRNA 基 因 都 在 这 个 基因 往 之 中 。 基 因 繁 中 的 每 一 个 基因 都 单独 地 转录 ， 并 且 是 按 两 个 方向 进行 转录 。 人 们 还 发 现 其 他 的 处 在 基因 得 中 的 RNA 基因 也 在 DNA 中 的 别处 存在 着 ， 甚 至 存在 于 其 他 一 条 染色 体 上 。tRNA 基因 的 成 簇 作 用 在 单 细胞 的 真 核 生 物 中 并 不 是 一 个 普遍 性 的 规律 。 例 如 ,酵母 tRNA 基因 已 知 有 360 个 ,其 中 175 个 已 经 克隆 到 质粒 中 ,只 在 个 别 情况 下 发 现在 一 个 重组 质粒 中 含有 两 个 tRNA 基因 。 更 进一步 , 八 个 酵母 RNAT: 基因 位 于 六 条 不 同 的 染色 体 上 。 受 发 育 控 制 的 复杂 多 基因 家 族 血红 蛋白 是 一 个 具有 两 条 o 链 和 两 条 8 链 的 四 聚 体 蛋 白质 。 然 而 ， 在 有 机 体 发 育 的 不 同 阶段 ， 却 出 现 有 一 个 或 几 个 氨基 酸 差别 的 几 种 不 同形 式 的 c 和 8& 亚 基 。 下 面 的 时 间 顺序 才 给 出 了 人 体 于 怀孕 后 不 同时 期 出 现 的 不 同 亚 基 ( 图 23-2) 0 胚胎 的 (<8 JA) 胎儿 的 《8 一 41 周 ) 6.7681 a € 7G 和 7A 成 年 人 的 (出 生 一 以 后 ) a 8 和 5 类 x- 珠 蛋白 *。 289。 类 o- KE A EA RE SLAY 六 型 的 类 GE, Re RC, 型 所 取代 。 在 胎儿 和 成 人 期 , 都 出 现 c 型 链 。 再 看 类 P-RE 白 ,在 胎儿 期 有 两 种 类 8 AUER 准 型 和 7 型 链 ( 在 肽 链 的 同一 个 位 点 上 ， 一 条 链 在 此 处 含有 甘氨酸 , 另 一 条 含有 丙 所 酸 ), 差 不 多 是 等 分 子 数 。 在 成 年 期 ”有 50 倍 的 8 型 及 5 型 链 。 这 些 变化 的 总 结 Re: 胚胎 型 的 血红 蛋白 中 含有 两 个 总 受精 后 的 周 数 型 链 和 两 个 e 型 链 ( 即 20,, 26)3 HAS 23-2 在 人 体 发 育 的 时 间 过 程 中 不 同 的 类 后 ，98 多 的 血红 蛋白 售 两 条 ng SL PA ir 8- 珠 蛋白 链 的 浓度 变化 。 和 两 个 8 亚 单位 《习惯 上 称 做 血红 蛋白 A),2% 的 血红 蛋白 含 两 个 ww 及 两 个 8 亚 单位 (血红 蛋白 Aro Eo AAAS F 的 基因 都 形成 独立 的 符 ，& ILA 23-1(c), 每 一 个 这 样 的 基因 答 有 一 个 显著 的 特点 * 即 基因 排列 的 顺序 就 是 它们 在 发 育 中 表达 的 顺序 (这 一 点 并 不 适用 于 所 有 的 发 育 控 制 型 的 基因 家 族 )。 人 们 现在 还 既 不 了 解 这 些 不 同形 式 的 重要 意义 ,也 不 了 解 程序 性 合成 方式 的 任何 细节 。 人 类 的 性 和 8- 珠 蛋白 基因 入 已 经 被 克隆 并 分 析 了 它们 的 重复 序列 。 其 中 某 些 区 域 的 碱 基 序 列 也 已 确定 。 从 上 述 分 析 中 得 到 的 最 重要 发 现 就 是 在 单个 的 基因 之 间 有 重复 序 列 。 a ae 有 某 些 调节 功能 的 见解 。 过 对 不 同 生 物 珠 蛋 日 基因 入 的 研究 ， 能 够 了 解 基因 簇 的 产生 过 程 以 及 可 能 维持 其 ck 5 pig 原始 鱼 类 、 海 乔 以 及 昆虫 都 有 单个 的 珠 蛋 白 基 因 ,而 两 栖 类 的 和 有 基 因 则 紧密 地 连锁 在 同一 条 染色 体 上 。 低 等 哺乳 动物 和 鸟 类 的 c 和 8 基因 都 有 多 种 亚 型 ， 而 且 两 个 基因 簇 位 于 不 同 的 染色 体 上 。 由 此 得 出 假说 : ”原始 的 珠 蛋 白 ( 大 约 产生 于 8 亿 p- 珠 蛋白 量 /g 体重 HORT 基因 [rene 在 减 数 分 烈 中 , 同 源 WA \ Resear Bf ay Bus X ; — ee \ 重复 的 基因 | —aee = 一 人 一 23-3 几 种 基因 重复 机 理 中 的 两 种 机 理 。 这 两 种 机 理 都 从 转 位 作用 事件 出 发 ， 即 移动 因子 从 染 色 体 中 的 一 个 位 点 移动 到 另 一 个 位 点 上 。 图 中 左边 的 途径 :” 带 有 两 个 移动 因子 久 列 侧 恬 的 基因 一 单位 经 过 第 一 次 转 位 作用 3 完成 基因 重复 过 程 5 右边 的 途径 :“ 在 两 个 转 位 因子 之 间 的 不 等 位 相互 交换 ;形成 一 个 带 有 重复 基因 的 染色 体 和 二 个 缺失 了 一 部 分 物质 的 染色 体 。 (He, MRM MES 两 侧 的 两 个 序列 对 于 不 等 位 交换 有 足够 的 同 源 性 ， 那 么 右边 的 途径 就 可 能 在 并 没有 转 位 因 巴 的 请 况 下 发 生 。 在 右边 途径 中 还 可 能 有 第 三 种 机 理 ， 如 果 在 侧 必 的 非 同 源 序列 之 间 发 生 重组 作用 ， 屎 么 就 会 发 生 很 罕见 的 \ 非 同 源 重 组 作用 。 aa790* A 23-4 串联 重复 过 程 的 不 等 位 交换 造成 染色 体 片 女 的 拷贝 数 增加 。 (4) 带 有 串联 重 复 的 染色 体 的 正常 配对 。(b) 错 配 。 下 面 的 染色 体 的 右边 部 分 与 上 面 的 染色 体 的 左边 部 分 配对 。 虚 线 指出 交换 的 潜在 位 点 《<) 错 配 复制 中 的 交换 ?产生 四 倍 的 染色 体 ， 如 图 所 示 。 再 进一步 形成 一 个 携带 着 一 个 单 找 贝 复制 区 的 染色 体 单 体 以 及 另外 三 倍 体 染 色 体 。 通过 一 个 细胞 而 获得 的 一 个 帘 变 , 给 这 个 细胞 带 来 好 处 OOOO 因为 这 种 突变 是 有 用 的 ,细胞 群体 随 着 时 间 的 推移 ,向 着 3 获得 杂 合子 成 分 的 方向 发 展 OOOO 在 一 个 细胞 中 野生 型 ” 基因 进行 复制 1 uae abate at Th | @ ERE TORE neo one eh | atest ma tar Ak 野生 基因 和 突变 基因 的 染 OOUW 图 23-5 在 整个 群体 中 将 一 个 有 用 的 突变 散布 开 来 ;而 不 丢失 野生 型 基因 。 年 前 ) 是 由 一 个 基因 编码 的 ,现代 的 珠 蛋白 基因 簇 则 是 由 一 个 祖先 基因 通过 一 系列 的 基因 重复 、 突 变 以 及 转 位 而 形成 的 。 有 人 提出 了 这 样 一 个 假设 的 顺序 事件 (这 个 假设 很 可 能 是 SS): 早期 生物 的 体积 很 小 ,虽然 血红 蛋白 由 一 个 亚 基 组 成 , 运 氧 能 力 有 限 , 也 能 满足 功 能 的 需要 。 通 过目 发 突变 ,血红 蛋白 基因 发 生 了 变异 ,从 而 使 杂 合子 基因 能 够 编码 出 运 氧 能 力 更 强 的 四 聚 体 蛋白 质 分 子 。 四 聚 体 分 子 对 在 组 织 中 它 所 结合 的 氧 的 释放 的 比例 要 比 Creep 4 链 的 基因 发 生 了 突变 和 重复 ， 形 成 了 胎儿 中 的 > 型 珠 蛋 白 。 胎 儿 血 红 蛋 白 对 氧 的 亲 和 力 比 成 人 血红 蛋白 还 要 大 ,因而 有 利于 胎儿 的 快速 发 育 ， 由 此 有 可 能 产生 更 复杂 的 生物 。 ss 291 。 在 灵 长 类 进化 期 间 , 还 发 生 了 进一步 的 突变 和 重复 ,从 而 产生 了 更 多 的 血红 蛋 日 的 型 态 。 基因 重复 以 及 随 之 发 生 的 重复 基因 扩散 到 整个 种 群 的 机 理 有 特殊 的 遗传 学 意义 。 图 23-3 表 示 了 理论 上 可 给 出 的 几 种 基因 重复 的 机 理 。 例 如 ,基因 一 端的 一 个 简单 的 转 位 因子 (可 运动 的 DNA 序列 ,在 第 十 九 章 中 讨论 过 ) 可 以 转 位 到 另 一 端 去 ,并 在 原先 的 位 置 上 留 下 一 个 完全 一 样 的 序列 ,从 而 形成 一 个 复杂 的 大 序列 。 这 个 复杂 的 大 序列 又 可 以 作为 一 个 整体 再 次 转 位 到 一 个 新 的 位 点 上 。 而 在 原先 位 置 上 仍 留 下 一 个 完全 一 样 的 序列 拷贝 并 从 而 产生 基因 重复 。 另 一 种 造成 基因 重复 的 方式 是 通过 非 等 位 基因 重复 。 这 样 可 以 造成 同 源 染 色 体 中 一 条 上 基因 重复 , 另 一 条 上 基因 和 缺失。 进一步 交换 可 以 产生 三 倍 重复 或 更 多 的 重复 ， 如 图 23-4 所 示 。 图 23-5 说 明 一 个 有 利 的 突变 型 怎样 与 原先 的 野生 型 基因 共存 。 这 里 描述 的 事件 虽然 发 生 在 很 久 以 前 ， 现 在 仍 有 遗迹 。 这 一 事实 有 力 地 支持 了 上 述 图 式 。 通 过 对 几 种 生物 中 珠 蛋 白 基 因 往 中 多 片段 的 研究 发 现 ， 有 些 无 功能 的 序列 几乎 与 正常 的 珠 蛋白 基因 完全 相同 。 这 些 序列 被 称 为 假 基 因 (pseudogenes), 假 基因 通常 被 认 为 是 进化 的 遗迹 , 它 是 曾经 有 功能 的 基因 经 过 重复 后 的 衍生 物 。 推 测 , 某 一 时 期 发 生 了 一 个 突变 ,使 这 个 基因 的 产物 失 活 。 因 为 这 个 基因 至 少 还 有 一 个 有 功能 的 基因 副本 存在 ,所 以 没有 很 强 的 选择 压力 来 消除 突变 基因 ， 以 后 再 生成 的 突变 就 将 逐渐 地 积累 起 来 。 假 基 因 在 基因 往 中 普遍 地 存在 着 。 一 般 它 经 常 地 在 转录 作用 、 内 含 子 切除 以 及 翻译 作用 等 方 面 有 缺陷 。 真 核 mRNA 分 子 的 多 种 类 型 我 们 已 讨论 了 原核 生物 不 同 种 的 mRNA 分 子 的 浓度 因 操 纵 子 不 同 而 不 同 。 在 “ 开 的 状态 下 ,最 丰富 与 最 不 丰富 的 mRNA 的 浓度 变化 范围 是 几 百 个 因 次 。 这 在 真 核 生 物 中 变化 范围 更 大 。 而 且 ， 多 数 丰 富 的 mRNA 分 子 的 合成 可 能 是 由 不 同 于 其 他 类 型 mRNA 合成 的 机 理 来 控制 的 。 因 此 ,有 必要 给 三 类 真 核 mRNA 分 子 下 定义 ; 低 找 贝 数 mRNA 分 子 (lew-copy number mRNAI) ,每 个 细胞 有 1 一 8 个 拷贝 。 中 度 拷 贝 数 mRNA (moderately prevalent mRNA), 每 个 细胞 中 有 几 百 个 拷贝 高 度 拷 贝 数 mRNA (super- prelent mRNA)， 每 个 细胞 中 可 达 10' 拷贝 。 最 后 这 种 分 子 由 发 育 中 的 卵细胞 以 及 只 担 负 着 合成 单一 蛋白 质 的 细胞 ， 如 合成 血红 蛋白 的 红细胞 合成 。 对 合成 低 找 贝 数 及 中 度 拷贝 数 的 - mRNA 分 子 的 调节 作用 的 了 解 不 像 对 合成 高 度 找 贝 数 的 mRNA 分 子 的 调节 作用 那样 详细 。 真 核 基 因 表 达 的 调节 策略 从 第 十 四 章 已 经 知道 调节 原核 基因 表达 的 许多 机 理 , 但 是 ,几乎 所 有 方式 都 是 控制 转 录 的 起 始 及 终止 ， 虽 然 亦 有 翻译 水 平 的 调节 ， 但 很 不 普遍 。 第 十 二 章 中 已 经 指出 , 真 核 mRNA 合成 比 原核 要 复杂 得 多 。 因 此 ,许多 个 控制 点 都 有 可 能 起 到 调节 作用 。 例 如 初级 转录 子 的 形成 , mRNA 的 产生 以 及 mRNA 运输 到 细胞 质 中 。 这 些 控制 点 也 还 可 能 有 几 个 不 同 水 平 的 调节 。 比 如 ,启动 子 的 可 供给 性 取决 于 染色 体 的 状态 ,也 取决 于 转录 因子 的 活性 或 浓度 ， 或 增强 子 的 可 供给 性 等 。 由 初级 转录 子 的 产生 到 mRNA 合成 的 调节 则 可 ”292 。 «fae; FE Sa 25 BEE EF RE RES oe ES 7 OS SE UAE Se A OE es RE TT" ES RD BAI RNA HR is THER. ALEK ORANSERADRHRREA RY BABS BRRERH pri anes eat. see ning 02 SEE en Ht. ses arena BIAS ee eae atacnaee RBS ORK AES HMR PE MRA BK. AERP ORR BAAAS He ABM | RALCRARBAPEPRIAKAD HORE SRE Roe DO DA Fea LBB A> » FRATE SY I 2S TS SS HH 2s — PN FR Be Boe Se EAs RARER RM Ss ate 因 Ae eet oe RRS SEAR 3 pie Alig Ria Fa? TL HRN Heth lis 38 9 Ye BEE ie ase BiH ANC ae ra eK HS A ins BARE MA ates BER aR AE | Rel Li Ee ARE RE BRERA 永久 性 变化 。 aps 2 Zee = Biv BARE ;后面 还 有 转录 水 平 , 转 录 后 水 平 以 及 翻译 水 平 的 变 BOE ‘i Ze "i 百 面 九 部 分 中 讨论 。 基因 丢失 FI AUCH HY | let SS Th Tee Fe SRN es FEA HD (CET, PARE — TEE Be EA ty SURE Mah BR EBB -ME Ao hs J A hy BB oe A gS UBD WES er 分 化 , 即 丢失 整个 染 色 体 。 在 这 些 生物 中 , (RAM beim aH er 告 殖 细胞 后 细胞 细 航 中 才 始终 维持 着 全 套 的 DNA 组 分 。 在 那些 较 高 等 人 obo 有 人 式 。 许多 原生 动物 含有 两 种 类 者 蔡 小 的 称 为 小 核 (micrdnutleus)， 大 的 称 为 大 核 (macronucleus). ii, 744e oe 1 上 小 核 , 当 进行 分 化 时 (很 多 原生 动 物 都 是 这 样 的 )， 小 核 经 大 和 加 人 这 种 分 八 健 用 的 最 终结 果 是 产生 拥有 一 个 大 核 和 一 个 小 核 的 细胞 。 小 核电 售 有 天 活性 的 D 芭 ,过 只 是 为 将 来 市 时 生殖 细胞 作为 一 个 遗 传 信息 的 贮藏 所 。 大 核 中 的 一 舟 DNA 4 Fhu 所 有 转录 采 板 。 | 大 们 对 原生 动物 Oxgtnicha ar 迁 程 进行 了 详细 的 研究 ,处 于 生殖 细胞 中 的 小 核 的 DNA, te eS LH 95 一 20 BEAL BEER BE HY ko RE 中 的 大 部 分 DNA 在 形成 上 述 片段 的 玻 彻底 地 降解 。 通 过 盖 种 目前 还 不 清楚 的 方 Ks a ae 000 种 不 同 片段 的 1 000 个 拷贝 为 止 。 这 些 众多 的 片段 进一步 建成 杰 核 ass 查 这 个 过 程 中 ,大 核 所 含 DNA 是 小 核 DNA 的 几 百 倍 ， 但 是 丢失 了 一 半 以 上 的 DNA 序列 。 虽然 最 近 的 实验 给 出 了 很 有 意义 的 结果 ， 但 是 这 种 有 选择 性 的 基因 丢失 的 机 和 钠 透 冰 不 清楚 。 一 个 最 有 意义 的 发 现 是 绝 大 SRA RWS —7P ROO AE HS a A RE Be PR SA ¥ 2934 25 #4) , BURER HEA Da SE AOE A BB ER HO 在 高 等 生物 中 ,现在 还 未 观察 到 基因 丢失 现象 。 这 种 调节 方式 可 能 仅 存 在 于 进化 程 度 相 当 低 的 一 些 生物 之 中 ， 当 然 也 不 能 肯定 在 较 高 等 的 生物 中 就 不 发 生 丢 失 ， 因 为 要 在 50 000 个 基因 中 测 查 出 丢失 一 个 基因 则 是 太 困难 了 。 然而 , 用 蛙 卵 所 进行 的 下 述 实 验 结 RAB ,在 发 育 过 程 中 必需 的 基因 是 不 丢失 的 。 在 这 个 实验 中 ,通过 显 微 操 作 将 蛙 受 精 卵 中 的 细胞 核 去 除 ， 而 使 细胞 仍然 保持 完整 ; 然后 再 从 晴 时 的 肠 细 胞 中 取出 细胞 核 , 将 这 个 核 注 射 到 去 核 的 蛙 受 精 卵 中 ,很 多 经 过 这 种 手术 修复 过 的 卵 能 继续 生长 ,分裂 并 发 育成 为 成 活 的 蛙 。 这 种 接受 外 来 的 已 分 化 的 肠 细 胞 核 的 受精 卵 是 否 会 缺乏 生长 发 育 所 必需 的 遗传 信息 呢 ? 上 面 的 实验 结果 理由 充分 地 作 出 以 下 结论 : 虽然 换 核 过 程 有 可 能 会 丢失 一 些 基 因 ，. 但 是 已 分 化 了 的 细胞 的 细胞 核 并 不 缺少 任何 遗传 物质 ; 若 有 丢失 ,丢失 的 也 是 一 些 非 必需 的 基因 。 所 以 说 分 化 的 细胞 核 是 全 能 性 的 〈totipotent)e 基因 扩 增 基因 扩 增 是 使 细胞 大 量 地 产生 某 一 种 特定 基因 产物 的 一 个 途径 。 研 究 得 最 深入 的 例 子 是 爪 蟾 卵 母 细 胞 Coocyte of the toad Xenopus laevis) 发 育 过 程 中 的 rRNA 基因 ,在 发 育 中 这 个 基因 的 数目 增加 了 4 000 FON WRAY SN ALAR AY BU A ,类 似 于 所 有 的 体 细胞 ( 非 ee ce 7 UPHAM LR. 以 滚动 环 模式 进行 复制 18 42 28 of 18 ci 18 18 28 28 18 28 a y tne 28 18s- 5 从 分 枝 处 〈?) 切割 附 加 出 来 的 一 些 环 . 更 多 的 环 滚 动 形成 核 仁 图 23-6 ie rDNA 扩 增 的 假设 机 理 。 间 隔 区 a\b.c 具有 不 同 的 长 度 。 。294 。 生殖 性 的 细胞 ), 含 有 约 500 个 CRNA 基因 单位 。 基因 扩 增 后 每 单位 有 2x10 AEM, 占 卵 母 细胞 的 细胞 核 DNA 的 75 % 。 这 使 得 卵 能 合成 出 10" 个 核 六 体 ,满足 了 受精 之 后 细胞 分 裂 不 同时 期 大 量 合成 蛋白 质 的 要 求 。 在 基因 扩 增 之 前 ，rDNA 区 域 由 串联 排列 着 的 500 个 cDNA 单位 所 组 成 。 每 一个 单位 中 含有 一 个 编码 18S RNA 和 28S rRNA 基因 。 每 个 基因 由 间隔 区 分 开 ( 见 图 23-6)。 间隔 区 的 大 小 不 恒定 ,一 个 单位 中 的 间隔 区 与 下 一 个 单位 中 的 并 不 相同 。 整 个 EDNA 位 于 一 个 单个 的 核 仁 中 (人 们 发 现 大 部 分 动物 细胞 中 都 有 这 样 _ 种 含有 rDNA 的 核 内 小 体 )。 基因 扩 增 需 用 的 时 间 , 大 约 在 三 周 以 上 , 前 体 细胞 发 育成 卵 母 细胞 , cDNA 的 量 增 加 4 000 倍 ， 核 仁 的 数量 增加 到 几 百 个 (图 23-7)。 在 基因 扩 增 期 间 和 扩 增 之 后 ,所 有 的 DNA 不 再 由 简单 的 连续 的 DNA HEAR, 而 代 之 出 现 的 是 大 量 的 小 环 和 复制 滚动 环 。 形成 这 些 结构 的 精确 机 理 还 不 清楚 ， 但 已 有 一 些 有 关 在 非 复制 环 中 及 复制 滚动 环 中 的 18$ 及 28S 组 分 之 间 的 间隔 区 的 大 小 及 讯息 。 图 23-6 是 处 在 三 个 深 动 环 中 的 rDNA 的 图 解 。 这 些 分 子 的 基本 特征 就 是 每 个 分 子 含有 的 间隔 区 都 是 同样 大 小 的 。 假 如 含有 -- 些 相 邻 EDNA 单位 的 染色 体 DNA 以 一 个 大 片 肌 的 形式 被 切除 下 来 并 被 复制 ， 那 么 在 一 个 滚动 环 中 就 应 当 含有 不 同 大 小 的 间隔 区 。 其 他 几 个 实验 的 结果 也 表明 DNA 单位 是 单 : 个 地 从 染色 体 上 一 一 剪 切 下 来 的 ， 如 图 中 所 图 23-7 扑 蟾 卵 中 分 离 出 来 的 核 经 过 染色 后 的 显 Re WIRE BRT. SET NA BAT MRE RAE TESA WEBI HE Se) 3 Zea EIR RDER EHH (1968), 160:272), 长 的 侧枝 形式 之 后 才 进 行 复制 的 。 令 人 奇怪 的 是 ， 在 多 数 滚动 环 中 ， 环 的 部 分 不 只 含有 一 个 DNA 单位 ， 而 经 常 售 2 一 4 个 ， 甚 至 多 到 16 个 。 关于 前 下 来 的 一 个 单位 的 环 如 何 转变 成 多 单位 的 环 的 机 理 还 不 清楚 ;这 个 问题 可 能 与 下 面 的 问题 有 关 。 一 个 DNA 单位 长 为 43um， 通过 滚动 环 复 制 形 成 一 个 单位 长 度 〈4.3um 太 的 何 核 大 约 需 1.5 水 时 。 基 因 扩 增 共 约 进行 72 小 时 ， 在 这 届时 间 内 ,每 个 单 体 片 朋 可 产生 144 个 拷贝 , 然而 观察 到 的 值 却 大 约 是 4 000 倍 。 所 以 为 了 合成 出 更 多 的 DNA， 至 少 有 一部分 被 切 下 来 的 单 体 必须 先 被 复制 ， 以 产生 出 进 一 步 复 制 所 需要 的 模板 ,这 可 能 通过 几 种 不 同 途 径 实现 。 例 如 ,一 个 环 可 能 是 在 滚动 环 复 抽 之 前 ,通过 9 方式 复制 亏 次 ;不 过 ， 很 少 观察 到 8 式 分 子 。 另 二 种 可 能 性 从 滚动 环 的 线性 侧枝 剪 下 几 个 单位 的 rDNA 然后 再 行 环 化 。 这 能 够 解释 上 面 提 到 的 存在 着 带 有 一 连 虽 串联 重复 的 DNA 单位 环 的 事实 。 很 显然 ,为 了 说 明 这 种 现象 还 需要 进行 更 多 的 工作 。 最 后 ,每 一 个 复制 单位 组 成 了 成 熟 卵 母 细胞 中 的 许多 核 仁 中 的 二 个 (图 23-7)， 到 这 个 阶段 , 扩 增 就 停止 了 。 很 有 意思 的 是 ， 在 一 个 特定 的 卵细胞 中 不 是 所 有 的 rDNA 基因 都 得 到 扩 增 ,而 且 所 扩 增 的 特定 基因 也 随 不 同 卵 母 细胞 而 有 不 同 。 一 且 卵 母 细胞 成 熟 ,多 余 的 cDNA 就 没有 用 了 , 将 逐渐 降解 。 紧 接受 精 之 后 ， 染 色 © 295.。 X, AO BNA 叶 洽 复制 ,并 开始 进行 有 丝 分 裂 ， 在 胚胎 发 育 过 程 中 不 断 地 重复 这 些 过 程 。 在 SSAA th rDNA 不 再 复制 ， 并 继续 降解 ,直到 形成 几 百 个 细胞 的 时 候 ， 这 . 就 全 都 不 存在 了 。 ~~ £7 PLO RA Eh BMS rRNA 基因 的 扩 增 过 程 ,例如 ,在 昆虫 Miah ty 76 BRO REE b OAD wh 1) AG Aas e BLP A AEP INE ZEN RAS AT, rere tre A: ON AE A ey. RW ch A) — APPR HON Anita Coogonium) 的 前 体 4H a, 4 4 Vea DPE 6 个 细胞 。 其 中 一 个 是 卵 母 细胞 (oocyte)， 它 注定 要 成 为 卵 ,其 他 15 个 是 营养 细胞 (nurse cell)， 它 们 为 卵 母 细胞 的 形成 提供 大 量 的 蛋白 质 及 其 他 天 分 Fis 曹 庆 有 颖 胞 纱 狼 以 能 够 产生 大 量 的 物质 是 因为 在 他 们 的 形成 中 发 生 了 多 次 特殊 的 DNA 复制 。 这 种 特殊 的 DNA 复制 没有 有 丝 分 裂 , 即 没有 子 代 DNA 分 子 ( 染 色 单 体 ) 的 分 离 。 BBE SARE Rha aS TY DNA 分 子 , 即 多 线 染色 体 (polytene), 蜡染 健 体 。 这 种 染色 体 广泛 地 用 于 细胞 遗传 学 的 研究 。 扩 增 的 第 一 步 是 染 d 通过 胞 浆 桥 相连 ， 让 基因 产物 进入 正在 增 大 的 卵细胞 。 在 peas: MAaRAKBNS ES CN PORES HTS 成 出 扩 增 是 通过 从 卵 壳 蛋白 基因 簇 的 复制 起 始点 进行 局 部 用 产生 网 状 的 复制 泡 。 如 图 23-8(a) -所 示 。” 泡 中 多 出 和 环 化 而 是 作为 染色 体 的 其 余部 分 而 存在 。 这 种 情况 可 能 使 细胞 在 短 时 间 内 产生 大 量 的 蛋白 质 。 以 后 还 可 以 看 到 , 姑 = 受 有 较 长 的 时 间 用 于 合成 ， 那么 基因 的 扩 增 就 不 很 必要 ,因为 这 时 可 以 通 HE mRNA 的 寿命 而 达到 目的 。 AT AREER ZO Bh RTD 因为 完成 一 个 复制 半期 以及 完 亡 床 代 分 严 的 分 离 , 最 终 将 只 能 中 生 一 个 有 基因 戏 的 分 子 (没有 “ 泡 ”). 然 而 在 这 样 的 休 REAR ARR EA SS IS A eB EAN” EATEN RZ BE SORES 联系 。 在 其 他 生物 和 其 他 基因 中 , 体 细 胞 的 分 化 过 程 有 时 存在 着 基因 扩 增 , 扩 增 后 进行 Tif S ASM as ANd S$—BARA EP COR CaY aR kee HT RO SMM EE Mot. KAR ees :让 THREE Ep i SR REKDIMEN SS CARI JA ta AE x heh a a ae CO 站 23-8 基因 CL Te THERE ECR EMR SRA - aE OR “296 < 多 次 细胞 分 裂 ,形成 特 化 细胞 的 克隆 。 这 种 体系 也 利用 DNA 反复 地 复制 来 增加 基因 的 找 山 数 ， 不 过 这 些 拷 贝 会 被 切除 ,从 而 形成 环 状 和 线性 片段 。 切除 过 程 是 由 重组 序列 之 间 的 同 源 重 组 所 造成 。 这 些 环 状 及 片段 没有 中 心 粒 ( 见 第 七 章 )》 因此 他 们 在 有 丝 分 裂 时 不 能 以 有 序 的 形式 分 开 。 但 是 ， 环 状 及 线 状 片段 的 数目 很 大 以 至 随机 分 离 到 子 细胞 中 已 足 够 使 每 个 子 细胞 得 到 多 个 拷贝 的 扩 增 基因 。 BASH: 免疫 系统 中 编码 序列 之 间 的 连接 一 个 基因 可 以 通过 从 远离 其 启动 子 的 地 方 移 到 距 其 启动 子 很 近 的 位 点 而 被 启动 转 录 , 这 种 基因 移动 就 叫 基 因 重 排 。 第 十 五 章 中 讨论 过 的 沙门 氏 菌 的 相 转变 phase varia- ion) 就 是 基因 位 B (gene relocation) 的 一 个 例子 。 人 们 还 知道 有 关 真 核 细胞 的 一 些 例 子 (如 酵母 中 的 交配 型 互 变 )e 但 是 这 些 例子 过 于 复杂 ,本 书 暂 不 涉及 ,而 且 目前 还 不 知道 酵母 中 的 这 种 位 移 是 否 受到 调控 ， 也 不 知道 是 否 受 内 外 原因 的 影响 而 改变 。 在 这 一 部 分 我 们 通过 有 计划 地 使 结构 基因 的 不 同 片 眉 并 联 或 串联 来 研究 激活 基因 表达 的 机 理 ， 也 就 是 以 免疫 球 蛋 白 , 即 抗体 (immunoglobulins，antibodies) 的 合成 为 例 ,研究 这 种 调节 机 理 。 人 类 能 够 合成 10 种 以 上 不 同 的 抗体 分 子 ， 其 “不 同 ” 在 于 一 种 抗体 可 对 一 种 不 同 的 FRG (antigen) 起 作用 。 如 果 各 抗体 分 子 被 不 同 的 基因 编码 ， 那 么 细胞 中 必须 有 很 大 一 部 分 DNA 用 于 抗体 合成 。 然 而 ,如 果 抗体 分 子 由 三 种 亚 基 A、 B、C -组 成 ， 共 有 100 个 不 同 的 A 基 因 ，100 个 不 同 的 B 基 因 ，100 个 不 同 的 C 基 因 ， 则 所 需 DNA 的 量 将 大 大 减少 。 RE, 100X100X100 一 10 种 不 同 蛋白 质 就 可 以 由 300 个 基因 编码 而 成 。 如 果 所 有 这 些 基因 在 每 个 细胞 中 都 有 活性 ， 也 就 是 说 每 个 产生 抗体 的 细胞 都 可 合成 300 种 不 同 的 蛋白 质 ， 那 么 每 个 细胞 都 可 以 合成 出 10' 种 不 同 的 抗体 。 然而 已 知 每 一 个 成 熟 的 产生 抗体 的 细 胸 都 只 能 合成 一 种 抗体 ,因此 肯定 存在 着 某 种 对 程序 化 的 每 个 细胞 作出 反应 的 机 理 。 通过 这 一 部 分 的 讨论 将 可 以 看 到 ,的 确 存在 着 这 样 的 程序 化 机 理 。 概 括 地 说 , 胚 原 基 型 细胞 (germ-line cell) 具有 一 整套 基因 ，, 这 套 基因 的 编码 序列 组 合 起 来 就 能 生成 所 有 可 能 的 抗体 分 子 。 在 细胞 分 裂 和 免 疼 系 统 形 成 的 过 程 中 , 这 套 基 因 的 大 部 分 都 从 子 细胞 中 被 切除 抛弃 了 。 这 种 切除 是 有 程序 的 。 在 这 种 情况 下 成 年 个 体 的 每 一 个 细胞 只 能 合 成 一 种 类 型 的 抗体 分 子 。10* 种 抗体 分 子 中 的 一 种 也 仅 由 一 个 细胞 合成 ,这 样 ， 大 约 共 10° 个 细胞 ,这 个 数字 只 是 成 年 人 总 数 为 10" 个 的 体 细胞 中 的 一 小 部 分 5 抗体 与 抗原 是 相 ， 互 中 和 的 ， 那 么 怎样 才能 产生 大 量 的 特定 的 抗体 呢 ? 这 是 通过 免疫 系统 对 特定 抗原 所 表 现 的 一 系列 复杂 的 反应 才 实现 的 。 在 这 一 反应 中 ， 特 定 抗原 能 使 产生 与 它 对 应 的 抗体 的 细胞 大 量 地 增殖 。 这 种 增殖 就 造成 了 一 个 细胞 克隆 ， 在 这 个 细胞 克隆 中 的 所 有 细胞 都 能 合成 这 种 特定 抗体 。 由 于 免疫 系统 由 许多 类 型 的 细胞 组 成 并 能 对 大 量 的 信号 发 生 反应 ， 因 而 是 一 个 十 分 复杂 的 系统 。 在 这 一 节 我 们 主要 关心 编码 抗体 的 基因 的 碱 基 序 列 是 怎样 形成 的 。 这 将 通 过 五 个 部 分 来 阐明 〈1) 抗体 分 子 的 氨基 酸 序列 的 特性 是 怎样 的 ; (2) 有 哪些 基因 的 编码 序列 ,通过 怎 衬 的 连接 才能 形成 抗体 基因 ; 〈3) 拼接 后 的 基因 的 碱 基 顺 序 是 怎样 的 ; (4) 促使 基因 拼接 的 可 能 信号 是 什么 ;5) 最 后 的 拼接 进程 如 何 。 然 后 我 们 再 简单 地 谈 谈 怎 样 指导 一 个 可 产生 抗体 的 细胞 克隆 去 合成 特定 的 专 一 性 抗体 。 an297 © 抗体 分 子 乞 基 酸 序列 的 特点 免疫 球 蛋 白 G(IgG) 是 几 类 免疫 球 蛋白 中 的 一 类 ,这 是 一 个 四 聚 体 分 子 ， 由 两 条 轻 链 (L) MWAH (CH) 组 成 ( 见 第 五 章 )。 通过 确定 许多 不 同 ( 不 同 之 处 在 于 对 不 同 的 抗原 发 生 的 反应 不 同 ) IgG 分 子 的 氨基 酸 序列 发 现 轻 链 和 重 链 都 由 两 个 不 同 的 部 分 组 成 。 其 中 一 部 分 称 为 恒定 区 (constant region) 或 C 区 , 对 于 特定 一 类 免疫 球 蛋白 来 说 ， 这 一 区 的 氨基 酸 序 列 几乎 不 变 ( 只 有 一 个 氨基 酸 可 能 有 变化 )。 另 一 区 称 为 可 变 区 《va- riable region) 或 V 区 ， 任 何 两 个 识别 不 同 抗原 的 IgG 分 子 的 这 一 区 域 的 氨基 酸 序列 都 AR, 工 链 和 互 链 上 的 V 区 和 C 区 的 位 置 和 长 度 见 图 23-9， 及 本 书 上 册 第 五 章 中 的 图 5-17,5-18， 和 5-19。 对 多 数 类 型 的 免疫 球 蛋白 来 说 , C 区 是 用 来 把 抗体 分 子 从 产生 抗 体 的 细胞 中 通过 其 细胞 膜 运输 到 血液 和 淋巴 系统 ， 并 用 于 最 后 对 中 和 的 抗原 进行 处 理 的 过 程 。V 区 则 负责 识别 和 结合 专 一 性 抗原 。 请 注意 ,在 图 23-9 HAL 链 的 Y 区 尽管 氢 基 酸 序列 很 不 同 , 却 有 着 同样 数目 的 氨基 酸 残 基 。 实际 上 有 两 种 全 然 不 同类 型 的 工 链 , 它 们 具有 相当 不 同 的 氨基 酸 酸 序列 ,被 称 之 为 链 与 1 链 。 它 们 在 功能 上 有 许多 相似 性 ,而 它们 的 差别 则 对 于 现在 的 讨论 并 不 重要 。 我 们 只 叙述 上 链 的 氨基 酸 序列 是 如 何 测 定 的 ,对 1 链 来 说 ,基本 的 机 理 是 一 样 的 ， 只 在 细节 上 有 些 区 别 。 L 链 可 变 的 恒定 的 (不 可 变 的 ) ems wee oa 一 COOH 214 1 109 可 变 的 恒定 的 (不 可 变 的 ) H 图 23-9 IgG 的 工 链 与 耳 链 的 V 区 与 C 区 的 长 度 和 位 置 。 图 中 的 数字 是 指 从 氨基 末端 起 氨基 酸 所 在 的 位 置 。 在 一 个 胚胎 细胞 中 的 基因 顺序 TV Prk eng oh A) NUS © Re MA a NS me Wg } 人 ny . tj) ts ieee ee wry + 在 失去 DNA 后 进行 重组 作用 在 一 个 产生 抗体 的 细胞 中 的 基因 顺序 Vis Jo: Jal Js Cc 一 一 一 拼接 后 的 可 变 区 23-10 ”在 形成 工 链 可 变 区 时 DNA 的 剪接 过 程 。 Vie=J; 之 间 的 部 分 已 被 移 去 ， 推 测 这 是 通过 位 点 专 一 性 重组 作用 实现 的 。 再 通过 同 源 重组 或 前 导 序 列 内 的 位 点 专 一 性 重组 ，Vas 左边 的 Y 基 因 也 被 除去 。 编码 序列 连接 的 基因 许多 基因 可 以 产生 * 型 的 工 链 ,这 些 类 型 有 三 种 类 型 ， 即 V`J 和 Co。 大 约 有 300 种 不 同 的 V 基 因 ( 负 责 合成 可 变 区 V 区 的 前 95 个 氨基 酸 )， 有 四 种 不 同 的 J 了 基因 ( 它 编码 V 。 298° 汉 的 最 后 12 个 氨基 酸 以 及 V 区 与 C 区 的 连接 ), 还 有 1 个 C 基 因 ( 它 编码 不 变 区 C 区 )e 在 还 胎 细 胞 中 ,V 基 因 形 成 一 个 紧凑 的 基因 往 , 在 距 V 基 因 禾 很 远 的 地 方 ， 丁 基因 形成 第 二 RH RAR, i CHAMIBE 本 基因 簇 后 面 不 远 处 。 像 图 23-10 所 示 那 样 , 所 有 这 些 V 基 因 前 面 都 有 一 - 巡 转 录 的 先导 区 ， 而 J 了 和 C 基 因 的 前 面 则 设 有 。 基 ARE HAD 编码 各 种 特定 IgG 分 子 的 基因 区 域 己 经 从 各 个 能 产生 特定 IgG 分 子 * 的 \ 众 多 的 小 鼠 细胞 株 中 克隆 (用 重组 DNA 技术 )。V-J-C 区 域 也 已 经 从 小 鼠 的 胚胎 细胞 中 克隆 ,这 些 胚 胎 细 胞 还 不 能 合成 抗体 ,因此 他 们 可 能 含有 未 发 生变 化 的 用 于 合成 抗体 的 原 套 基 因 。 用 从 产生 抗体 的 细胞 株 中 得 到 的 抗体 基因 的 克隆 进行 对 比 研究 ， 发 现 胚胎 细 苞 中 出 现 的 很 多 DNA 序列 在 产生 抗体 的 细胞 中 不 见 了 ; 而且 ,缺失 的 部 分 总 是 发 生 在 特定 的 V 基 因 区 (这 个 特定 区 编码 V 区 的 前 95 个 氨基 酸 ) 和 I EAR 〈 它 编码 V 区 的 后 12 SER). 这 可 以 通过 基因 重 排 来 解释 。 在 基因 重 排 中 , REN VA I AAR ZAR DNA 序列 缺失 了 ， 图 23-10 绘 出 了 这 样 重 排 的 例子 。 许多 编码 各 种 特定 IgG 蛋白 的 基因 序列 已 ， 被 克隆 ,同时 发 现在 每 个 克隆 中 所 缺失 的 是 不 同 的 DNA 片段 ,例如 ， 在 图 中 Vs Sh zZ 闻 的 片 眉 丢 失 了 ,而 在 另 一 个 克隆 中 缺失 也 许 在 Va 与 了 之 间 。 在 这 两 种 情况 下 ， 都 是 一 个 V 基 因 与 一 个 本 基因 拼接 在 一 起 形成 一 个 完整 的 编码 可 变 区 的 基因 。 请 注意 ,， 这 是 DNA 剪接 , 而 不 是 第 十 一 \ 十 五 及 二 十 一 章 所 提 到 的 RNA 拼接 。 对 于 已 克隆 的 IgG DNA 的 碱 基 序列 的 研究 表明 , 特定 Y 基 因 与 特定 J 基 因 之 间 的 接合 并 不 总 是 一 样 。 也 就 是 说 ,两 个 并 列 的 Y 基 因 和 了 基因 的 终端 三 联 体 可 以 在 产生 三 联 体 的 四 个 位 点 中 的 任何 一 个 位 点 处 发 生 交换 ,如 图 23-11 对 上 述 陈 述 作出 的 解释 ,其 中 的 接合 可 能 再 编码 出 三 种 氨基 酸 , 这 样 就 增加 了 可 变 区 的 多 变性 。 因为 有 300 种 不 同 的 V 基 因 ，4 种 不 同 的 J 基 因 ,连接 可 以 编码 2.5 种 (大 致 平均 ) 不 同 的 氨基 酸 , 这样 就 可 能 有 300X4X2.5 一 3 000 种 不 同 的 可 变 区 。 互 链 基因 的 结构 与 蕊 的 很 类 似 , 但 不 完全 相同 (有 四 种 不 同类 型 的 基因 ), 所 以 ,这 样 在 互 链 中 就 约 有 5 000 种 不 同 的 可 变 区 。 每 个 IgG 分 子 都 具有 两 个 相同 的 五 链 和 两 条 相同 的 工 链 ,所 以 , VL. Vd, Va 和 Ja 基因 大 约 可 形成 3000X5 000 一 1.5X10" 种 不 同 的 IgG 分 子 。 这 可 以 充分 地 说 明 抗体 分 子 的 多 样 性 。 5X10 种 不 同 的 抗体 专 一 性 这 个 数目 实际 上 是 个 保守 的 估计 ， 因为 还 有 其 他 的 方式 能 造成 抗体 多 样 性 。 在 生成 抗体 的 细胞 的 发 育 过 程 中 ，V 区 对 于 很 高 的 体 细胞 突变 率 是 敏感 的 。 因为 有 这 些 突变 ， 即 使 不 同 的 细胞 克隆 产生 的 抗体 有 完全 相同 的 V-J 连接 方 式 , 这 些 克 隆 产生 的 多 肽 的 序列 也 可 以 不 同 。 基因 拼接 的 可 能 信号 上 述 V 基 因 及 C 基 因 的 剪接 ,人 们 认为 是 通过 一 种 位 点 专 一 性 重组 的 机 理 而 进行 的 。 * 这 些 细胞 株 是 从 称 为 骨 做 瘤 〈《myelomas) 的 致癌 肿瘤 衍生 而 来 。 骨 骨 瘤 是 一 种 肿瘤 ,在 这 种 肿瘤 中 单个 细胞 可 以 程序 化 地 形成 一 种 抗体 将 这 种 单个 细胞 进行 繁殖 ,能 产生 出 一 个 很 大 的 细胞 克隆 。 这 种 细胞 克隆 中 的 每 一 个 细胞 都 只 产生 该 种 抗体 。 人们 可 以 分 离 到 单个 的 这 种 细胞 ， 单 个 的 这 种 细胞 在 细胞 培养 该 中 可 以 无 限 地 生长 ;细胞 分 刻 大 量 的 纯 抗 体 ;* 从 细胞 培养 液 中 可 以 回收 到 这 种 纯 抗 体 。 239-， 引起 V-J 连接 的 信号 很 可 能 分 别 在 V 基 因 右 边 和 J 基因 左边 的 一 对 专 一 性 的 碱 基 序列 中 。 先 看 与 V 基 因 相 关 的 序列 : V 基 因 -CACAGTG-11 碱 基 -ACAT AAAC 以 上 是 一 个 7 碱 基 对 的 回 文 结构 序列 、 一 个 11 碱 基 对 的 间隔 区 ， 和 一 个 富 含 〈A 十 工 ) 的 8 碱 基 对 的 序列 ,组 合 在 一 起 紧 接 在 每 个 V 基 因 的 右 侧 。 下 面 再 看 看 每 个 本 基因 左 侧 的 序列 : GTTTTTGT-22 碱 基 -CACTGTG-J 基因 这 个 序列 与 紧 靠 着 V 基 因 的 序列 相同 (除去 第 四 个 碱 基 )， 也 是 一 个 碱 基 对 的 回 文 结构 序 列 \ 从 右 向 左 读 )， 然 后 接着 一 个 22 碱 基 对 的 间隔 区 和 一 个 富 含 〈A 十 工 )8 碱 基 对 的 序 列 。 这 个 8 碱 基 对 的 序列 几乎 与 V 基 因 附 近 的 那个 8 碱 基 对 序列 互补 。 推 测 ， 这 些 序列 可 能 被 剪接 体系 识别 。 目 前 ,无 论 是 对 于 拼接 所 需要 的 酶 ,或 是 对 于 化 学 交换 过 程 的 性 质 以 及 触动 拼接 的 化 学 事件 都 不 了 解 。 可 能 交换 的 位 点 rae | Vie Js-ijJa- 3g Cc V 基因 C C C aT ee ce wows oe \\\ AAR ~< [ate L ViceJs Js Js ae ae ar er mRNA re pay 的 加 工 Arg LVisJ3 C ' es HI) TAM RNA a [name 4 Tb a @Z 8 a 图 23-11 在 V-J ERM AT REM ER AK 图 23-12 ”一 个 特定 IgG 分 子 的 工 链 的 产生 。 mRNA 中 由 此 可 能 增加 三 种 不 同 的 氨基 酸 。 粗 线 区 域 代 表 用 来 产生 最 终 工 链 的 编码 序列 。 最 后 的 拼接 事件 : RNA 的 拼接 图 23-12 指出 DNA 拼接 并 不 能 产生 最 终 的 工 链 , 这 是 因为 :\1) 本 基因 与 C 基 因 之 间 还 保留 着 间隔 序列 ;2) 实际 上 最 终 编 码 工 链 的 只 是 一 个 V 基 因 和 一 个 J 基 因 。 而 拼接 后 的 DNA 通常 仍 含 有 很 多 V 基 因 和 IEA 正确 的 氮 基 酸 序列 是 通过 最 后 的 RNA $F 接 才 获得 的 ， 如 图 中 所 示 。 应 当 注 意 特 定 的 V-J 接头 是 怎样 决定 RNA 拼接 形式 的 , 例 如 ,总 是 除去 前 导 序 列 与 V 基 因 之 间 的 RNA HER, Cee CBA SHE V-J 接头 中 本 基因 右 闪 之 间 的 RNA FE H 4) % AF 产生 互 链 的 氮 基 酸 序列 多 样 性 的 机 理 与 工 链 的 类 似 ， 虽 然 知 道 的 还 不 详细 。 互 链 也 « 300° 具有 许多 V 与 了 基因 ,但 是 孔 链 在 两 方面 比 工 链 复 杂 : (1) 在 V 和 了 基因 之 间 增 加 了 兰 大 套 基 因 。 称 作 D 基 因 ， 所 以 可 能 有 很 多 V-D，D-J 接 头 ;(2) 有 八 个 不 同 的 不 变 区 © XK), C 区 的 选择 决定 了 免疫 球 蛋 白 的 特定 种 类 (如 IgD, IgG, IgM 等 等 )。 很 有 意思 的 是 上 面 所 说 的 起 动工 链 中 V-J 连接 的 7 碱 基 对 的 明文 结构 也 出 现在 C 链 体 系 中 的 相应 位 置 上 。 产生 抗体 的 细胞 的 双 们 体 由 于 产生 抗体 的 细胞 是 双 倍 体 ， 因 此 出 现 了 一 个 很 有 意思 的 问题 : 一 种 特定 的 细胞 仅仅 产生 一 种 IgG 分 子 ， 那 么 ， 或 者 是 两 条 染色 体 上 发 生 同 样 的 重 排 事件 ,或 者 是 两 个 V-J-C 区 中 的 一 个 保持 沉默 ,到 底 是 哪 一 种 ? 现 已 得 到 的 证 据 表明 ， 在 从 胚胎 细胞 到 形 成 能 够 产生 抗体 的 细胞 的 发 育 过 程 期 间 一 个 完整 的 有 功能 的 基因 一 旦 装配 完毕 ， 基 因 重 排 就 立即 停止 。 而 那些 仍然 处 于 肥 胎 构 型 的 基因 或 未 完成 拼接 的 可 变 区 中 的 基因 ， 则 或 者 是 不 能 表达 ,或 者 它们 的 表达 产物 是 没有 功能 的 。 程序 性 一 个 重要 的 问题 是 ，DNA 重组 是 否 就 发 生 在 对 某 一 特定 抗原 作出 反应 时 ? 最 好 的 证 据 指出 这 些 重组 事件 随机 地 在 发 育 过 程 中 发 生 着 。 当 分 化 过 程 完 成 之 后 ， 大 约 形 成 了 1.5 X 1077 种 不 同类 型 的 产生 抗体 的 细胞 ， 其 中 的 每 一 种 细胞 都 能 合成 出 一 种 抗体 。 那 么 一 个 机 体 该 在 什么 时 候 大 量 地 产生 出 某 种 抗体 以 应 答 特 定 的 抗原 呢 ? 对 于 这 个 问题 的 答案 还 不 肯定 。 但 下 面 被 称 作 克 隆 选 择 〈clonal-selection) 的 机 理 至 少 从 大 体 上 说 很 可 能 是 正确 的 。 每 个 产生 抗体 的 细胞 产生 少量 的 专 一 性 抗体 。 这 种 抗体 中 的 某 些 结合 到 细 . 胞 表面 。 当 这 样 的 细胞 遇 到 一 种 能 与 这 种 专 一 性 抗体 反应 的 抗原 时 ， 就 形成 一 个 复杂 的 抗原 -抗体 复合 网 ,因为 每 个 抗体 可 以 和 两 个 抗原 分 子 相 互 作用 ， 而 每 一 个 抗原 又 能 与 两 个 抗体 分 子 结合 ( 见 第 六 章 ) 这 些 反应 与 细胞 膜 表 面 的 抗体 分 子 的 耗 能 运动 偶 联 ， 促 使 形成 一 个 称 为 细胞 由 《cell cap) 的 抗原 -抗体 网 〈 图 23-13)， 然 后 细胞 膜 向 内 折 伍 包围 图 23-13 帽 化 现象 。 免 淋 巴 细胞 产生 均匀 分 布 于 细胞 表面 上 的 抗体 IgG， 将 这 种 细胞 暴 露 于 抗原 中 ,于 是 抗原 与 抗体 分 子 互相 结合 。 这 个 过 程 是 一 个 需 能 过 程 ， 但 对 此 还 不 甚 了 解 ， 只 知道 是 IgG 分 子 向 抗原 分 子 靠 拢 。 如 果 抗 原 是 多 价 的 (有 多 个 结合 位 点 )， 就 形成 一 种 被 称 为 帽子 的 复 合 物 。 通 过 细胞 的 内 吞 作用， 帽子 被 吸收 到 细胞 内 。 在 这 个 过 程 之 后 细胞 程序 化 地 产生 大 量 抗体 。 若 将 抗原 与 效 光 素 偶 联 ,那么 用 荧光 显微镜 可 以 看 到 菊 光 帽 ; 若 抗原 是 有 放射 性 的 ， 那 么 在 放射 自 显影 照片 上 每 一 个 细胞 的 一 个 区 域 都 有 一 块 是 黑色 的 。 s。 301 。 这 个 帽子 ， 进 而 这 个 帽子 被 知人 细胞 (这 个 过 程 称 为 细胞 的 内 吞 作 用 ，endocytosis)o 然 后 ,在 一 个 总 的 说 来 是 模糊 不 清 的 方式 下 ,促进 着 细胞 分 裂 , 接 着 广泛 地 产生 抗体 。 于 是 ， 就 产生 了 一 个 能 合成 大 量 的 专 一 性 抗体 的 细胞 克隆 。 急 级 转录 产物 合成 的 调控 用 调节 转录 的 方法 可 以 控制 很 多 基因 产物 的 合成 。 这 多 半 是 低 拷 贝 数 和 中 等 拷贝 数 的 mRNA 编码 蛋白 质 的 主要 机 理 ; 这 一 机 理 也 同样 适用 于 多 拷贝 的 mRNA。 在 这 一 节 中 我 们 将 讨论 几 个 用 不 同方 式 开 启 和 关闭 转录 的 例子 。 首 先 讨 论 真 核 基 因 排 列 即 真 核 基 因 构 造 《organization) 的 一 些 特征 , 从 而 阐明 真 核 细胞 的 调节 不 同 于 原核 细胞 操纵 子 的 那 种 直接 调节 机 理 。 真 核 基 因 构 造影 响 调控 的 特征 原核 细胞 操纵 子 模式 以 及 它 的 许多 变种 的 一 大 特征 是 : 某 些 调节 分 子 作用 到 与 每 个 启动 子 相 邻 的 一 段 DNA 序列 上 ，, 这 种 作用 决定 转录 是 否 发 生 。 调 节 位 置 总 是 与 启动 子 相 邻 。 原核 生物 的 这 种 调节 机 理 的 简单 性 使 得 这 种 调节 位 置 不 可 能 与 启动 子 离 开 很 远 。 事实 上 ,由 于 20 多 年 来 我 们 对 于 细菌 操纵 子 的 研究 与 认识 ,使 得 我 们 很 难 转 而 理解 真 核 细 胞 的 基因 表达 的 调控 , 因为 在 真 核 系统 中 ,调节 位 置 极 少 邻近 于 启动 子 。 真 核 基因 调控 中 的 另 一 个 重要 问题 ,是 解释 在 DNA 上 相距 甚 远 (甚至 在 不 同 的 染色 体 上 ) 的 一 组 基因 是 怎样 地 能 够 同时 被 启动 或 被 关闭 的 。 有 人 提出 一 组 基因 中 的 每 一 个 基因 都 被 同样 的 调节 序列 引导 着 ， 所 以 一 个 简单 的 调节 因子 能 使 这 套 基 因 中 的 所 有 基因 同时 活化 或 同时 失 活 。 这 种 机 理 与 前 面 (第 十 四 章 ) 提 到 的 原核 基因 的 调节 相 类 似 。 然 而 ， 真 核 体系 还 受 一 些 Bi AS ee ST abe A PAS (RNA se em 的 调节 。 图 23-14 示 出 可 能 发 生 的 调节 zc) je 过 程 的 概要 途径 。 真 核 调节 的 另 一 个 普 a BREMNER, BASE MOT 受 体 。 结构 基因 要/ 几 种 不 同 的 信号 作出 反 应 而 合成 @| |@。。。 的。 例如， 两 各 不同 的 激素 可 以 诱导 同 一 种 蛋白 质 的 合成 。 更 有 甚 者 ， 自 然 界 @| |o 中 有 一 些 组 合式 基因 可 以 被 不 同 的 信号 Ham A mene 以 不 同 的 结合 所 激活 。 例 如 ,一 个 信号 能 ， 激 活 P 和 Q 基 因 ， 另 一 个 信号 激活 Q 和 图 23-14 ” 真 核 基因 调控 的 一 种 可 能 的 简单 方式 。 每 一 步 都 “有 基因 ,第 三 个 信号 激活 P MR EAM 按 其 发 生 顺 序 标号 ， 受 体 基因 在 第 3 步 或 是 被 RNA 或 是 被 、 2 a OEMS BME. 这 个 过 于 简单 的 并 型 很 可 能 并 不 普遍 适用 。 这 些 现象 可 以 用 以 下 假设 加 以 说 明 。 第 一 种 :有 多 组 分 的 信号 分 子 ( 复 合 的 激 活 基 因 ) 及 一 些 单个 的 受 体 基 因 ， 复合 激活 基因 中 的 一 个 激活 基因 产物 结合 到 一 个 受 体 302。 基因 上 ,打开 一 个 结构 基因 ;第 二 种 : 有 两 个 (或 多 个 ) 受 体 的 基因 (复合 的 受 体 基 因 ) 及 一 些 结构 基因 ,激活 基因 可 以 结合 到 复合 受 体 基 因 上 ;只 要 每 一 个 复合 的 受 体 基因 中 的 一 个 受 体 基因 受到 激活 , 紧 接 的 结构 基因 就 能 被 活化 关于 这 些 体系 是 如 何 工 作 的 ,在 图 23-14 中 进行 了 介绍 。 正如 我 们 已 经 申明 的 ,图 23-13 及 图 23-14 模型 都 肯定 地 过 于 简单 化 (未 达到 用 分 子 术语 解释 调控 )。 但 对 于 读者 来 说 ,重要 之 处 就 是 只 要 明了 相隔 甚 远 的 基因 是 怎样 被 协同 调节 的 ， 而 且 要 知道 调节 的 几 个 阶段 的 要 求 是 什么 。 下 面 的 模型 主要 为 思考 真 核 调 控 作 ” 用 的 某 些 性 质 提供 了 一 个 简要 的 框架 。 1 多 重 激活 子 A y x Ww SWE ZAZZZZZ4 B x W w W ome yo ON 2A EZ WA | t+ 1! W. 多 重 接受 子 A x B y—.-2 y yy P ma Q y ' z Sa FG AE oe SE DE ee he ae res ee C z BRBEZZ2 启动 子 区 激活 子 结构 基因 受 体 图 23-15 ” 受 多 重 调节 的 基因 家 族 的 可 能 结构 。 上 面 一 行 (D) 中 ,具有 复合 激活 基因 的 结构 单位 可 以 激活 几 个 结构 基因 。 下 面 一 行 (IID) 中 ， 一 个 单个 的 激活 基因 (或 称 激活 子 ) 可 以 打开 几 个 结 构 基 因 ，, 这 几 个 结构 基因 有 着 共同 的 复合 受 体 基因 (或 称 接受 子 )。 酵母 中 的 调节 单位 作为 非 寄生 的 单 细胞 有 机 体 的 酵母 ， 必 须 能 够 像 细 菌 那样 对 环境 的 改变 被 动 地 作出 快速 的 应 变 反 应 。 酵 母 中 以 此 种 方式 起 作用 的 一 组 基因 是 负责 半 乳 糖 代谢 的 GAL 体系 。 这 一 体系 由 位 于 几 个 染色 体 上 的 许多 个 基因 组 成 。 在 这 里 我 们 将 只 考虑 GALI 基因 的 调节 图 23-16 显示 了 它 的 调节 区 域 。 它 由 一 个 上 游 激活 位 点 (UASe)、 一 个 250 个 碱 基 对 的 间隔 区 、TATA 盒 以 及 GALL 基因 按 以 上 顺序 排列 组 成 。 在 玖 一 个 染色 体 上 只 有 一 个 称 为 GAL4 的 基因 , 它 的 基因 产物 是 一 个 正 调控 物质 ， 这 种 物质 可 因 结 合 半 乳 糖 而 被 激活 。 激 活 了 的 GAL4 蛋白 质 结合 到 UASe 中 的 一 段 15 个 碱 基 对 的 序列 土 ,开启 位 于 :TIATA 盒 下 游 几 个 碱 基 对 的 一 个 位 点 ， 于 是 开始 进行 转录 。UASe 和 GALIJTATA "303。 盒 间 的 距离 并 不 很 严格 ,例如 ,用 遗传 工程 的 方法 将 其 向 上 游 移 去 500 个 碱 基 对 ， 而 不 影 ii) GAL] 基因 的 可 诱导 性 。 显 然 ，UASe 多 半 是 转录 的 一 个 一 般 激 活 物 。 其 证 据 是 如 果 将 它 放 到 另 一 个 酵母 基因 CYC] 的 TATA 盒 上 游 的 几 百 个 碱 基 对 处 ，CYCI BR 可 以 因此 被 半 乳 糖 诱导 出 转录 作用 。 对 位 于 UASe 和 GALI\TATA 盒 之 间 的 间隔 区 进行 基因 操作 已 使 我 们 或 多 或 少 地 了 解 了 这 两 眉 序 列 之 间 的 关系 。 人 们 推 想 ， er ae AUR TS GAL4 BARS UASe 结合 促进 了 转录 作用 ,所 以 RNA 聚合 酶 应 当 结 合 到 与 激活 了 的 UAS. ARRAY . 能 近 的 地 方 , 以 便 与 GAL4 蛋白 接触 。 这 种 推 想 是 合理 的 ， 因为 至 少 这 是 用 原核 生物 调 控 方 式 去 思考 而 得 出 的 看 法 。 然 而 ，TATA 盒 是 形成 开 " 型 启动 子 复合 物 〈open=pro- motor complex) 的 位 点 ，RNA AHS Il Av AeBm UASe M TATA 之 间 的 距离 ，， 这 与 原核 系统 中 RNA 聚合 酶 可 以 同时 与 一 35 序列 区 以 及 :Pribnow 盒 区 相 接 触 相 反 。 有 三 种 简单 的 方式 使 得 RNA 聚合 酶 可 以 从 UASe 到 达 ( 接 触 ) TATA: 1. DNA 可 弯曲 ,使 得 UAS, 和 TATA 互相 毗邻 。 但 是 由 于 弯曲 很 可 能 发 生 在 一 RUE, AR UASe 可 能 被 重新 放置 到 或 者 是 TATA Ae te 个 结构 基 因 《〈《CYC1) 附近 ,这 一 想法 看 来 又 不 太 可 能 。 2. 将 被 激活 的 GAL4 蛋白 结合 到 UASe 处 ,这 样 可 以 改变 染色 质 的 结构 。 这 一 结 构 上 的 改变 又 可 能 向 下 游 波 及 到 TATA 区 ,人 们 已 假设 TATA 区 在 这 个 模型 中 是 RNA 聚合 临 的 唯一 的 结合 位 点 。 UASc TATA GAL, 一 一 一 一 一 一 一 一 一 GAL1 RNA A 23-16 酵母 的 GALI Ke GAL4 基因 产物 与 结合 着 的 半 乳 糖 ? 作 用 于 UASe， 结 果 合 成 出 GALI1 RNA, 3. RNA 聚合 酶 可 沿 DNA 从 UASe 滑动 到 TATA 区 。 人 们 通过 在 UASe 和 TATA 之 间 插 和 人 一 个 转录 终止 位 点 而 对 第 三 种 假设 进行 了 研究 。 这 一 插 人 取消 了 半 乳 糖 对 GAL1 转录 的 诱导 。 由 于 RNA 聚合 酶 可 能 在 终止 位 点 脱落 ， 所 以 该 结果 支持 滑动 候 说 。 然 而 ， 由 于 一 个 终止 蛋白 可 以 与 终止 位 点 结合 仿 碍 理论 上 假设 的 染色 质 结 构 发 生 波 及 TATA 的 改变 。 这 样 看 来 ， 第 二 种 解释 也 有 可 能 ;但 是 争论 的 焦点 是 , 在 真 核 细胞 中 还 没有 检测 到 有 终止 蛋白 的 存在 。 第 二 个 实验 同样 显示 了 干扰 UAS。 和 TATA 之 间 的 间隔 区 可 能 会 干扰 基因 表达 。 在 这 个 实验 中 ， 曾 把 大 肠 杆菌 lexA 的 操纵 基因 插 人 到 UASe 和 TATA 之 间 ， 此 举 对 GAL] 的 可 诱导 性 并 无 影响 。 然 而 , 如 果 把 lexA 基因 也 插 人 其 中 可 以 合成 出 LexA 蛋白 质 , 那 么 CALL 的 转录 则 就 受到 抑制 。 如 果 lexA 的 操纵 基因 位 于 UASe 的 上 游 ， 这 个 占据 位 置 的 lexA 操纵 基因 则 并 无 抑制 效应 。 这 些 结果 表明 UASe 和 TATA 之 间 的 结合 蛋白 阻挠 转录 的 启 始 ， 这 与 上 述 的 假设 2 和 假设 3 是 一 致 的 。 对 另 一 个 酵母 体系 (配对 型 互 变 mating-type interconversion) 的 观察 提示 ， 有 时 染 色 质 的 改变 可 起 关键 性 的 作用 。 在 这 个 体系 中 ,从 UAS 上 游 起 的 几 千 个 碱 基 对 的 区 域 是 称 为 沉默 子 S (silencer $) 的 位 点 。 那些 被 称 SIR 的 几 个 基因 的 产物 与 此 位 点 要 。304 。 互 作用 。 当 $ 被 它们 占据 时 ，S 范围 内 几 千 个 碱 基 对 中 的 几 个 启动 子 便 失 去 活性 。 这 个 结果 可 解释 为 SIR 诱导 染色 质 结构 发 生变 化 阻 昕 了 转录 作用 。 合成 异 细胞 色素 A CYC] 基因 有 两 个 上 游 位 点 UAScl 和 UASc2， 分 别 位 于 距 转 录 起 始点 一 275 和 一 225 的 地 方 。 这 两 个 位 点 的 活性 都 由 血红 素 ( 细 胞 色素 的 辅助 因子 ) 调控 。 基 因 HAP1 和 HAP2 编码 专 一 性 的 正 调节 蛋白 因子 ,这 两 种 蛋白 质 都 与 血红 素 结合 ,而 且 一 旦 血红 素 结合 到 以 上 两 个 位 点 后 ,这 两 种 驳 质 就 分 别 地 与 各 自 的 UAS 互相 作用 。 每 个 UAS .在 功能 上 是 分 别 发 挥 作用 的 ;而且 它 们 的 效应 是 相 加 性 的 。 具有 串联 (一 前 一 后 ) 性 UAS 的 酵母 可 以 对 特殊 的 调节 性 刺激 作出 反应 。 在 这 个 例子 中 ， 不 同 的 信号 分 子 决定 了 合成 异 细胞 色素 的 量 , 即 量 1, 量 2, 或 者 是 量 1 十 2。 王 述 例子 是 关于 正 调节 体系 的 。 酵母 也 有 一 个 负 调 节 体 系 。 两 个 几乎 相同 的 基因 ADRI 和 ADRII 编码 着 乙醇 脱氧 酶 。ADRI 基因 的 转录 是 组 成 型 (constitutive) 的 ,但 ADRIT 基因 的 转录 受 葡萄 糖 抑制 。 位 于 ADR 上 游 的 一 个 调控 区 与 葡萄 糖 的 抑制 有 关 : 车 这 个 区 域 缺 失 ， 便 发 生 对 葡萄 糖 不 敏感 的 组 成 型 转录 。 这 个 位 点 与 至 今 已 讨论 过 的 UAS 的 不 同 之 处 ,在 于 它 与 TATA 之 间 的 距离 是 很 严格 的 。 例 如 , 若 有 一 个 插 人 序 列 置 换 掉 它 的 上 游 区 , 则 失去 葡萄 糖 的 抑制 效应 。 还 有 ,这 个 区 域 不 是 基因 专 一 性 的 ， 因 为 如 果 用 遗传 工程 的 方法 移 去 ADRI 的 上 游 ， 那 么 ADRI 基因 的 转录 也 不 再 是 组 成 型 的 ,而 成 为 可 以 被 葡萄 糖 抑 制 的 。 这 个 区 域 的 行为 类似 于 原核 的 操纵 基因 ， 但 是 至 今 还 没 有 探测 到 相对 应 的 阻 遏 物 。 激素 对 转录 的 调控 在 已 知 的 真 核 细胞 的 基因 活性 的 调节 物 中 ,研究 得 最 广泛 深 人 的 是 一 些 激素 。 这 些 细胞 外 物质 ,或 者 是 小 分 子 ， 多 肽 ,或 者 是 小 的 蛋白 质 ， 由 产生 激素 的 细胞 运送 到 靶 细 胞 Eo 进一步 人 们 还 发 现 一 些 激 素 , 如 许多 类 固 醇 激素 (例如 雌 激 素 、` 孕 激素 \ 醛 固 酮 、 糖 皮 质 激素 和 雄 激 素 ), 以 及 一 般 的 代谢 性 激素 (例如 胰岛 素 )。 它们 频繁 的 调控 作用 是 通过 开 户 转 录 而 实现 的 。 若 一 种 激素 可 以 调节 转录 , 则 它 必 须 多 少 能 向 DNA 发 出 信号 。 激素 穿 人 到 一 个 靶 细 胞 中 并 运送 到 核 的 过 程 很 复杂 , 目前 也 只 了 解 其 概况 ， 如 图 23-17 所 示 。 ISSR (A) 是 疹 水 性 分 子 , 可 自由 地 出 人 细胞 膜 。 一 个 应 细 胞 具有 一 个 专 一 性 的 细 at fe BL maim RA = 图 23-17 APAMRHAMABIAA AMMAN AMAR) DNA 并 触发 苇 录 的 图 解 。 一 种 调节 蛋白 可 能 可 以 防止 H-R’ 复合 物 结合 到 启动 子 CP) 上 ;或 可 以 促进 它 结合 到 启动 子 上 。 * 305 ¢ 胞 质 受 体 , 它 可 与 激素 形成 复合 物 (H-R)。 受 体 R 在 H-R 复合 物 形成 后 通常 受到 一 定 的 修饰 (构象 的 或 是 化 学 组 成 的 ); 修 饰 过 的 受 体 以 R' 表示 。 然后 H-R' 复合 物 通 过 核 膜 进入 核 。 在 核 内 ， 无 论 是 _H-R' 复合 物 或 是 单独 的 激素 均 与 染色 质 结 合 ， 并 使 DNA 开始 转录 。 虽 然 在 某 些 体系 中 复合 物 可 能 直接 地 结合 到 DNA 上 ，, 但 是 一 般 来 说 结合 很 可 能 不 是 直接 的 ,而 是 通过 专 一 性 的 DNA 结合 蛋白 而 实现 的 。 一 个 研究 得 比较 透彻 的 激素 对 转录 的 诱导 作用 的 例子 ,是 峻 激素 (estrogen) 的 刺激 导致 鸡 输卵管 中 卵 白 蛋 白 (ovalbumin) 的 合成 。 将 肉 激 素 注 人 鸡 体内 时 ,输卵管 组 织 便 开始 合成 卵 白 蛋白 的 mRNA。 只 要 一 直 给 予 崔 激 素 或 肉 激 素 样 激素 (例如 二 乙 基 已 烯 肉 酚 〈diethylstilbesterol))， 该 合成 便 继续 下 去 。 一 旦 停止 供给 激素 ， 合 成 的 速度 便 下 降 。 无 论 是 给 激素 前 或 是 停 给 激素 后 60 小 时 ,都 不 能 检测 到 卵 白 蛋白 的 mRNA。 在 解释 这 个 实验 现象 时 必须 注意 避免 由 测量 转录 的 方法 而 带 来 的 假 像 以 及 内 含 子 的 存在 。 专 一 性 的 mRNA， 例 如 卵 白 蛋 白 mRNA， 是 由 标记 了 的 mRNA 与 含 cDNA 的 质粒 经 分 子 杂 交 而 检测 到 的 。 假 设 一 个 初级 转录 产物 有 大 量 的 大 内 含 子 , 这 也 许 会 干扰 特定 mRNA 与 cDNA 的 杂交 。 如 果 与 加 工 过 的 mRNA 进行 比较 ,初级 转录 子 与 cDNA 结合 得 很 少 ， 那么 用 这 种 方法 检测 mRNA 的 能 力也 许 只 能 说 明 加 工 过 程 , 而 不 能 表明 有 没有 RNA 的 从 头 起 始 〈de nove) 的 合成 过 程 。 另 有 两 种 直接 的 方法 已 指出 激素 的 作用 是 促进 转 录 而 不 是 加 工 mRNA。 一 种 方法 是 显示 新 合成 的 RNA 中 有 内 含 子 , 这 可 以 通过 在 杂交 试验 中 使 用 天 然 基因 的 含有 内 含 子 的 cDNA 的 克隆 而 达到 。 另 一 种 方法 是 测量 出 现 的 RNA 的 大 小 。 如 果 转 录 是 由 激素 开启 的 ,那么 应 当 可 以 检测 到 比 加 工 过 的 mRNA 更 大 些 的 初级 转录 产物 ， 而 且 应 当 在 比 加 工 过 的 mRNA 出 现 更 早 些 的 时 候 观 察 到 这 种 初级 转录 产物 。 但 是 如 果 仅 仅 是 促进 加 工 过 程 ,那么 被 检测 到 的 大 RNA 应 该 没有 量 的 变化 而 只 是 较 小 的 \ 加 工 过 的 mRNA RELATE. HE EEK RRR 激素 的 作用 是 前 者 , 它 的 确 促 进 了 卵 白 蛋白 初级 转录 产物 的 转录 过 程 。 当 给 鸡 注射 肉 激 素 时 ,只 有 输卵管 合成 mRNA; 其 他 组 织 因为 缺乏 细胞 质 的 激素 受 体 , 对 激素 的 刺激 并 不 敏感 。 这 种 类 型 的 缺陷 ( 指 缺乏 受 体 ) 毫 无 疑问 是 某 些 组 织 对 某 种 特殊 激素 不 敏感 的 原因 。 至 于 受 体 是 怎样 在 某 些 细胞 中 合成 ， 而 不 在 所 有 细胞 中 合成 的 原因 则 所 知 甚 少 。 这 是 另 一 个 问题 , 即 分 化 问题 。 到 目前 为 止 我 们 还 未 讨论 激素 是 怎样 开启 转录 的 ， 但 是 我 们 至 少 可 以 检查 五 种 可 能 的 基本 机 理 而 避免 去 讨论 复杂 的 细节 。 - 1. 激素 直接 与 DNA 结合 ， 并 促进 RNA 聚合 酶 或 促进 一 种 在 到 合 酶 在 与 DNA 相互 作用 时 必 不 可 少 的 蛋白 质 ( 转 录 因 子 ) 结 合 到 DNA 上 。 2. 激素 与 一 效应 蛋白 质 ( 例 如 lac 操纵 子 中 的 CRP 和 蛋白质) 的 结合 。 这 种 效应 蛋 自 SS] DNA 上 处 于 RNA RAMESH LALA LS 3.245 DNA 结合 的 一 个 蛋白 质 被 激素 激活 ,并 且 这 种 激活 了 的 形式 是 RNA R 合 酶 结合 时 所 需要 的 。 4. 激素 是 诱导 物 , 它 可 以 使 阻 遇 物 失 活 。 5. 激素 引起 染色 质 的 结构 改变 ,把 DNA 暴露 出 来 以 使 RNA 聚合 酶 能 结合 上 去 。 在 前 三 种 机 理 中 ,转录 受到 正 调节 ,在 第 4 和 第 5 种 机 理 中 ,转录 受到 负 调 节 。 目前 人 们 只 研究 了 几 种 受 激素 诱导 的 体系 ,并 且 对 它们 还 没有 清楚 的 认识 。 "306。 由 转录 因子 介 导 的 调控 在 第 十 一 章 我 们 已 经 看 到 ,在 很 多 真 核 体 系 中 转录 的 起 始 需 要 有 DNA, RNA 聚合 酶 以 及 一 个 或 多 个 称 作为 转录 因子 的 蛋白 质 所 形成 的 转录 复合 物 。 随 着 更 多 体系 得 到 研 究 ， 很 清楚 地 表明 ， 调 控 经 常 受到 转录 因子 的 作用 ， 并 且 也 已 观察 到 两 种 机 理 : 〈1) 转 录 复 合 物 形成 过 程 受 到 调控 作用 ; (2) 通过 一 个 小 分 子 的 促进 ，RNA RA HE A Bl DNA 上 的 过 程 受 到 早已 存在 的 转录 复合 物 的 调控 。 在 这 一 节 里 ,我 们 将 探讨 具有 这 种 效 应 的 几 个 例子 。 非洲 爪 蟾 基因 组 具有 两 组 编码 5$ rRNA 的 多 基因 家 族 ( 见 图 23-1)，, CURRIED 脉 细胞 型 家 族 和 体 细胞 型 家 族 。 占 2% KOS rRNA 基因 的 体 细胞 型 基因 家 族 担负 着 体 细胞 中 95% 以 上 的 5$S rRNA 的 合成 ， 而 在 卵 母 细胞 中 的 卵 母 细胞 型 基因 家 族 只 有 初级 转录 过 程 。 以 上 这 种 不 同 的 基因 表达 方式 是 因为 在 内 在 的 调控 区 中 转录 复合 物 的 形成 受 到 不 同 的 调控 所 致 。 若 把 染色 质 从 体 细 胞 中 分 离 出 来 ， 可 以 发 现 体 细胞 型 5S rRNA 基 因 是 活泼 的 转录 复合 物 中 的 一 部 分 。 这 一 复合 物 包 含 一 个 称 为 40-kd 转录 因子 的 蛋白 质 。 然 而 卵 母 细胞 型 基因 则 没有 这 种 与 它 结 合 的 转录 因子 。 而 且 事实 上 ,含有 组 蛋白 1 的 某 种 结构 阻止 它 与 转录 因子 的 结合 。 这 种 差异 亦 可 在 体外 重复 。 如 果 体 细胞 的 染色 质 “ 在 浓 盐 溶液 中 被 洗 去 一 个 40-kd 蛋白 质 ,那么 5S rRNA 基因 的 转录 将 消失 。 再 加 和 人 40- kd 蛋白 因子 后 又 恢复 转录 能 力 。 若 在 加 入 40-kd 因子 之 前 就 把 HL 加 入 ， 则 将 阻碍 转 录 复 合 物 的 形成 ,但 若 先 加 40-kd 因 子 则 不 阻碍 。 注意 H1 具有 原核 细胞 中 阻 遏 物 的 特 征 。 _ 40kd 蛋白 因子 在 胚胎 发 育 中 的 作用 尚未 得 到 完全 的 前 明 , 但 人 们 认为 以 下 种 种 事件 的 顺序 是 至 关 重 要 的 。 每 个 非洲 爪 蟾 细胞 中 包含 有 大 约 800 个 体 细胞 型 5S rRNA 和 40 000 个 卵 母 细胞 型 5S rRNA 基因 。 它 们 两 者 的 内 在 调控 区 都 具有 50 个 碱 基 对 ,但 是 有 两 个 碱 基 对 是 不 同 的 。 人 们 认为 这 个 差别 大 大 地 降低 了 40-kd 蛋白 质 对 卵 母 细 胞 基因 的 亲 和 性 。 幼 年 卵 母 细胞 包含 有 过 量 的 40-kd 蛋白 质 , 于 是 所 有 的 内 在 调控 区 都 被 激活 。 但 是 ,由 于 某 些 目前 还 不 清楚 的 原因 ，40-kd 蛋白 因子 的 量 在 晚期 的 卵子 发 生 中 以 及 在 减 数 分 裂 中 大 大 地 下 降 了 。 受精 之 后 以 及 在 胚胎 发 育 期 间 40-Kkd 蛋白 因子 总 量 是 恒定 的 ， 但 是 ,在 细胞 分 裂 后 , 它 在 每 一 个 细胞 中 的 含量 下 降 了 。 在 这 个 时 期 内 两 种 5S rRNA 都 不 合成 。 尽 管 原因 还 不 清楚 , 但 人 们 提出 了 种 种 假设 。 例 如 缺乏 足够 量 的 RNA RAM II， 在 转录 复合 物 中 , 以 及 在 核 小 体 的 复合 物 中 都 缺乏 所 需要 的 其 他 的 蛋白 因子 。 在 具 有 4 000 个 细胞 的 胚胎 阶段 胚胎 细胞 以 任意 的 速度 开始 合成 着 5$S rRNA。 在 这 时 ，, 每 个 5Sr RNA 基因 有 大 约 10 个 40-kd 蛋白 因子 分 子 , 即 因子 与 基因 的 比例 是 10。 而 且 卵 母 细胞 型 和 体 细 胞 型 的 5S rRNA 基因 都 被 转录 。 经 过 3 一 4 次 细胞 分 裂 后 ,因子 与 基因 的 比例 下 降 , 接 近 于 1,， 卵 母 细胞 型 5S rRNA 基因 的 转录 完全 被 阻 遇 了 。 推 测 ， 在 染色 质 复制 期 间 DNA- 和 蛋白 质 复合 物 发 生 解 离 。 而 且 ， 由 于 40-kd 因子 的 浓度 低 ，H1 的 阻 遏 性 结合 就 占 了 优势 。 从 这 以 后 , 40kd 因子 就 随 细 胞 分 裂 而 合成 ， 保 持 大 约 每 个 5S rRNA 基因 有 0.25 个 40-kd 因子 分 子 这 个 比例 。 这 样 ， 在 体 细 胞 中 就 因为 40kd 因子 分 子 比 5S rRNA 基因 少 ， 卵 母 细胞 型 5S rRNA 基因 便 不 转录 。 推测 ，40-kd 的 转录 蛋白 基 子 对 于 体 细 胞 基因 的 内 在 控制 区 的 高 度 亲 合 性 可 能 使 体 细胞 型 基因 得 以 优先 表达 。 « 307。 组 蛋白 基因 的 表达 也 是 由 转录 因子 介 导 的 。 只 有 当 DNA 复制 时 才 需 要 新 合成 的 组 蛋白 ,以 形成 染色 质 \ 第 八 章 )。 对 于 小 白鼠 ,在 细胞 周期 的 DNA 复制 相 中 各 种 组 蛋白 的 “转录 的 确 增加 了 20 倍 。 在 组 蛋白 H4 基因 的 转录 起 始点 上 游 70 一 110 碱 基 对 处 有 一 个 局 动 子 。 只 有 当 一 个 特定 的 转录 因子 结合 到 这 个 启动 子 上 后 ,H4 基因 才 发 生 转录 。 因 此 .HH4 基因 的 转录 作用 是 受到 一 定 的 调节 的 ; 这 种 调节 或 者 是 通过 激活 转录 因 了 于， 或 者 是 通过 供给 转录 因子 而 实现 。 在 这 里 ， 后 一 种 方式 的 可 能 性 更 大 。 这 是 因为 有 初步 材料 证 明 ， 在 转录 周期 的 前 期 ， 转 录 因 子 的 浓度 有 所 增加 。 因此 ，H4 基因 的 调控 不 是 直接 的 ， 而 是 通过 激活 转录 因子 的 合成 ,提供 可 使 用 的 转录 因子 而 实 现 的 《图 23-13). 目前 还 不 知道 这 种 激活 作用 过 程 的 机 理 。 因 为 在 同一 时 期 中 ， 所 有 组 BA CA2A, H2B 等 ) 或 是 全 需要 ,或 是 全 不 需要 ,所 以 人 们 很 容易 想到 所 有 的 组 蛋白 基因 会 使 用 同样 的 转录 因 子 。 然 而 进化 却 选择 了 另 一 条 途径 :小 白鼠 的 H2A 和 H3 基因 都 有 其 自己 的 转录 因子 。 各 个 转录 因子 的 合成 则 很 可 能 由 同样 的 信号 控制 ,但 是 还 没有 肯定 的 证 据 。 在 酵母 中 ， 组 蛋白 基因 的 表达 则 有 着 另 一 种 要 求 (小 鼠 没 有 这 种 要 求 )。 通 过 基因 工 程 手 段 可 以 分 别 移 走 一 些 序列 ， 使 基因 与 一 个 目 然 的 DNA 复制 起 点 之 间 的 相对 距离 依 次 不 同 ,然后 再 测试 基因 所 发 生 的 不 同 表现 。 结 果 发 现 , 只 有 在 这 些 基 因 与 复制 起 点 相距 甚 近 时 基因 才能 表达 。 很 可 能 是 转录 因子 结合 到 DNA 上 要 求 一 定 的 条 件 : 只 在 复制 起 始 点 使 那些 与 起 始点 相 联系 的 染色 质 的 结构 发 生 改变 时 才能 结合 到 启动 子 上 。 但 是 这 一 点 还 纯 属 推理 ,人 们 对 些 还 有 许多 怀疑 。 转录 因子 调控 的 另 一 个 著名 的 体系 是 果 晶 的 热 休 克 族 基因 。 这 正如 第 十 五 章 中 所 并 明 的 大肠 杆菌 的 热 休克 调控 子 那 样 ,很 多 生物 在 被 加 温 到 最 适 温度 范 围 以 上 时 ,受到 热 的 .压力 ,诱导 合成 出 称 之 为 热 体 克 蛋 白 〈heat shock protein) 的 一 系列 蛋白 质 。 无 论 在 细 菌 中 还 是 在 高 等 真 核 生 物 中 ， 热 休克 基因 都 在 整个 基因 组 中 散在 地 分 布 着 。 WRIA Hsp70 蛋白 有 过 较 详 细 的 研究 ,使 果 蝇 受热 能 引起 Hsp70 mRNA 分 子 数 增加 1000 fF, Hsp70 基 因 的 TATA 盒 位 于 转录 起 始点 上 游 10 REM. 再 往 上 游 60 碱 基 对 处 有 一 个 称 之 为 再 SE(Heat Shock regulatory Element) 的 调控 序列 。 热 休克 转录 因子 (HSTF) 能 结合 到 这 个 序列 上 ,以 激发 启动 转录 。 继 续 往 上 游 800 碱 基 对 还 有 另 一 个 HSE 序 列 。 要 理解 “ 热 " 对 于 Hsp70 mRNA 的 诱导 ,就 必须 了 解 热 效应 的 作用 。 有 两 种 可 能 性 : (1) 在 通常 情况 下 ，HSTEF 结合 到 接近 于 HSE 序列 的 位 置 上 上， 但 是 这 种 结合 作用 大 微 弱 ， 不 能 推动 转录 。 在 加 温 之 后 ，HSTEF 发 生 构 象 变 化 ， 形 成 可 紧密 结合 的 构象 ， Min 使 转录 开始 。(2) HSTF 通常 与 较 远 的 位 置 上 的 HSE 序列 微弱 地 结合 ; 加 温 使 HSTF 从 这 个 位 点 解 离 下 来 ;或 者 游离 的 HSTF 分 子 和 与 之 较 近 的 HSE 序列 随机 无 序 地 磁 撞 ， 或 者 是 HSTF 沿 DNA 请 动 ,直到 HSTF 接近 于 HSE 时 与 HSE 结合 ， 从 而 使 转录 起 始 。 但 是 对 于 这 两 种 可 能 性 目前 还 没有 实验 数据 去 区 分 。 | MINE @ REAR BARRT — SA IR. 从 出 生 9 天 的 小 鸡 的 红细胞 中 分 离 出 的 8 珠 蛋白 的 DNA， 在 基因 表达 时 发 现 其 上 有 一 个 超 敏感 位 点 (hepersensitive site)〈 第 十 二 章 )o 而 在 更 小 的 鸡 中 , 8 珠 蛋 白 基 因 不 表达 ， 也 没有 发 现 这 个 超 敏感 位 点 5 从 9 天 的 鸡 细 胞 中 分 离 出 了 一 种 蛋白 质 , 它 可 以 诱导 出 超 敏感 位 点 。 如 果 把 这 种 蛋白 质 加 到 从 更 小 的 鸡 细胞 中 提取 到 的 染色 质 上 ， 则 在 这 些 染色 质 上 也 出 现 超 敏感 位 点 。 这 个 蛋 白质 就 结合 到 受 切 割 区域 中 的 专 一 性 序列 上 ， 即 超 敏感 位 点 上 。 可 以 假设 ; 这 种 蛋白 质 “308。 5 DNA 的 结合 取代 了 组 蛋白 与 ,DNA 的 结合 ,或 者 至 少 是 减弱 了 组 蛋白 与 DNA 的 相 互 作用 ,从 而 改变 了 这 个 位 点 处 的 染色 质 的 结构 ,使 DNA 易于 受 核酸 酶 的 降解 。 以 上 所 述 的 各 个 体系 是 通过 控制 转录 因子 的 结合 来 实现 调控 的 例子 。 初 步 的 证 据 还 提供 了 一 个 由 小 分 子 物质 来 激活 已 结合 在 DNA 上 相应 位 点 的 转录 因子 的 例子 。 在 这 个 例子 中 ,只 有 当 一 个 激素 - 受 体 复 合 物 结合 到 转录 因子 上 后 , DNA 聚合 酶 才能 结合 到 启动 子 上 ,起 动 转录 作用 。 增强 子 活 性 的 调节 在 启动 子 上 游 或 下 游 几 百 个 碱 基 对 处 的 增强 子 Cenhancer) 可 以 显著 地 增加 启动 子 的 转录 速度 ( 见 第 十 二 章 )。 尽 管 增强 子 的 工作 机 理 还 不 清楚 ， 但 是 可 以 想象 控制 增强 子 的 活性 也 可 以 作为 一 种 调控 方式 。 人 们 通过 实验 手段 ， 可 以 把 增强 子 移 到 整个 基因 组 中 任 一 位 点 上 , 它 就 会 对 附近 的 任何 基因 的 表达 发 挥 增强 效应 。 因 此 ,增强 子 对 其 起 作用 的 基因 没有 专 一 性 。 另 一 方面 ,增强 子 经 常 表现 出 种 的 专 一 性 和 细胞 类 型 的 专 一 性 。 例 如 ， 小 自 鼠 的 免疫 球 蛋 白 的 互 链 增强 子 在 骨骼 瘤 细胞 (这 种 细胞 通常 合成 免疫 球 蛋 白 ) 中 是 有 活性 的 ， 但 在 成 纤维 细胞 ( 它 通常 不 合成 免疫 球 蛋 白 ) 中 则 无 活性 。 这 说 明 转 录 因 子 可 能 是 一 种 专 一 性 蛋白 质 , 增 强 子 增强 活力 时 需要 它 。 从 人 的 _HeLa 细胞 中 已 经 分 离 到 了 一 个 这 样 的 为 SV40 和 多 瘤 病毒 增强 子 所 必需 的 转录 因子 。 最 近 (1985 年 ) 的 一 个 实验 表明 ， 这 个 多 瘤 病毒 增强 子 的 活力 可 能 被 抑制 。 又 有 人 制备 了 两 个 质粒 : 〈I) 一 个 质粒 含有 多 瘤 病 毒 增强 子 和 人 的 8 球 蛋 白 基 因 和 《IIL) 另 一 个 质粒 含有 腺 病毒 的 EIA 调控 基因 ( 见 第 二 十 三 章 真 核 病毒 )。 当 质粒 T 进入 Hela 细胞 后 , 8 球 蛋 白 基 因 活 路 地 进行 转录 。 然 而 , 当 两 个 质粒 同 在 细胞 中 时 ,只 能 合成 出 很 少 的 8 球 蛋 白 RNA。 另 外 几 个 实验 证 明 , ELA 蛋白 就 是 这 个 增强 子 的 抑制 物 。 但 目前 还 不 清楚 究竟 是 EA 蛋白 直接 地 结合 到 增强 子 .(a) bert H C pee galas 人 图 23-18 (a) 胞 旷 啶 经 甲 基 化 后 形成 5- 甲 基 胞 喀 啶 。(b) 5- 氮 杂 胞 哮 啶 ， 示 出 一 个 N 原子 取代 了 胞 喀 啶 中 的 可 被 甲 基 化 的 那个 C 原子 。 在 5- 杂 氮 胞 昔 中 右 下 角 的 N 原 子 连 着 一 个 核糖 。 « 309。 上 ， 还 是 通过 一 些 由 EIA 蛋白 促进 合成 的 产物 来 抑制 。 考虑 到 在 腺 病毒 感染 的 细胞 中 EIA 蛋白 通常 对 细胞 基因 和 病毒 基因 的 转录 都 有 促进 作用 ,因此 ,后 一 种 说 法 更 有 可 能 6 正常 的 细胞 是 无 EIA 基因 又 无 多 瘤 病 毒 增强 子 的 ,因此 前 面 介 绍 的 是 一 个 完全 的 人 造 系统 。 尽 管 如 此 ， 以 上 结果 还 是 说 明了 增强 子 能 被 失 活 ， 因 而 很 可 能 存在 着 增强 子 的 阻 遏 物 ,不 过 目前 尚 无 直接 证 据 支持 这 种 观点 。 甲 基 化 作用 多 数 细 胞 都 有 几 种 DNA 甲 基 化 酶 。 有 一 些 就 是 限制 性 酶 的 甲 基 化 活性 , 这 是 用 来 使 限制 性 内 切 酶 的 作用 位 点 甲 基 化 以 免 目 身 DNA 受到 破坏 。 另 一 类 限制 性 酶 在 特定 的 CpG 序列 处 使 胞 喀 啶 甲 基 化 (图 23-18)。 在 少数 情况 下 ， 尤 其 是 在 峭 椎 动物 中 ， 特 定 的 CpG 序列 的 甲 基 化 能 够 阻止 某 些 基因 的 转录 。 有 人 提出 这 种 甲 基 化 可 能 对 真 核 细 胞 的 调 控 和 发 育 有 普遍 意义 ,然而 对 这 一 论点 还 有 许多 不 同意 见 。 这 个 论点 遇 到 的 主要 困难 是 在 无 状 椎 动物 中 很 少 发 生 甲 基 化 作用 ,而 在 昆虫 中 则 根本 不 发 生 甲 基 化 ,即使 在 哺乳 动物 中 关于 甲 基 化 对 转录 的 作用 也 有 许多 未 见 到 效果 的 例子 。 以 下 是 一 些 甲 基 化 作用 后 产生 调 控 效 果 的 证 据 : 1. 某 些 基因 在 不 表达 这 些 基因 的 细胞 中 高 度 甲 基 化 ， 而 在 表达 这 些 基 因 的 细胞 中 不 发 生 甲 基 化 。 2. 在 体外 使 克隆 了 的 7 球 蛋白 基因 的 上 游 位 点 ( 即 此 基因 的 5 端 ) 甲 基 化 ,接着 用 CaCl, 将 经 过 这 种 处 理 的 DNA 转化 到 敏感 细胞 中 ， 转 录 便 受到 阻止 。 如 果 甲 基 化 作用 发 生 在 基因 上 游 位 点 以 外 的 位 置 , 则 转录 不 受 抑 制 。 3. 如 果 在 培养 基 中 加 入 5- 氮 杂 胞 喀 啶 ,新 合成 的 DNA 中 就 含有 这 个 碱 基 类 似 物 。 含有 这 个 类 似 物 的 CpG 位 点 是 不 能 发 生 甲 基 化 的 (5- 氮 杂 胞 喀 啶 是 所 有 甲 基 化 的 普遍 拖 制剂 )。 在 这 种 培养 基 中 的 细胞 能 生成 一 些 通常 情况 下 不 能 合成 的 蛋白 质 。 4. 所 谓 的 看 家 基因 Chouse keeping gene) 就 是 那些 维持 一 般 细 胞 正常 功能 所 必须 的 而 且 始 终 继续 被 转录 的 基因 。 很 少 在 这 些 基因 的 起 始 区 或 起 始 区 附近 发 生 甲 基 化 作用 。 CH, CH, ee es TCGAATCGA 甲 基 化 TCGAATC GM 一 一 一 全 Sf Pe Ss AGCTTAGCGT 一 ~ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ao CH, CH, va Se ee TCGAATCGA AGCTTAGCT Age 7 ee = CH, . CH, Heh Cs TCGAATCGA 甲 基 化 TCGAATCGA ee AGCTTAGCT AGCTTAGCT CH, CH, 子 代 分 子 缺 乏 子 代 分 子 带 有 FA OE Sk OE a HF ANA F By 合成 链 甲 基 化 模式 图 23-19 亲 代 DNA 的 甲 基 化 作用 遗传 到 子 代 中 的 模式 的 图 解 。 只 有 与 已 甲 基 化 的 序列 互补 的 2pG 序列 中 的 C 才能 被 里 基 化 。 * 310 « FG FH RL ES HE ch AY RT A HE BS EE RF BER PL 可 以 假设 :“ 甲 基 化 是 在 进化 发 生 到 较 高 级 的 阶段 才 出 现 的 。 因而 可 以 期 望 它 只 对 很 近 期 才 进 化 产生 的 基因 有 调控 效应 。 这 可 以 解释 为 什么 甲 基 化 对 不 同 的 哺乳 动物 基 AS 不 同 的 效果 。 显 然 ， 在 得 到 更 多 的 事实 材料 之 前 ， 甲 基 化 的 作用 仍 将 是 一 个 有 争议 的 问 题 。 3 未 分 化 的 细胞 和 前 体 细 胞 常常 要 发 生 DNA 复制 和 细胞 分 裂 。 如 果 甲 基 化 的 确 在 某 些 细胞 类 型 中 阻止 基因 表达 ,那么 在 DNA 复制 期 间 ,一 个 有 抑制 作用 的 甲 基 化 位 点 一 定 会 遗传 下 去 ,这 种 位 点 在 其 子 链 中 也 必然 是 甲 基 化 位 点 。 关于 这 一 点 的 一 个 可 能 的 机 理 是 ,除非 甲 基 化 因 某 种 原因 被 阻止 ， 某 些 序列 永远 是 甲 基 化 的 。 然 而 事实 似乎 并 非 如 此 ; 而 且 子 链 上 的 甲 基 化 序列 与 亲 代 链 上 的 甲 基 化 序列 并 不 相同 ， 而 是 与 亲 代 链 中 的 甲 基 化 序列 互补 。 某 些 甲 基 化 酶 的 一 个 特点 说 明了 甲 基 化 的 亲 代 链 是 如 何 地 指导 相应 的 子 链 序 列 发 生 甲 基 化 的 : 也 就 是 说 ,这 些 酶 只 能 使 特定 序列 中 的 CpG 甲 基 化 ,而 且 只 有 在 反 向 链 上 的 CpG 已 经 甲 基 化 时 ,在 互补 链 上 才能 发 在 甲 基 化 反应 (图 23-19)。 这 样 ，DNA 亲 代 链 的 甲 基 化 模式 才 被 子 链 所 继承 。 。 有 人 用 高 度 甲 基 化 来 解释 和 染色 体 的 失 活 。 人 类 男性 的 性 染 名 体 的 组 成 是 XY, & 性 的 性 染色 体 是 XX。 如 果 有 一 位 男性 ,他 有 一 个 以 上 的 和 X 染 色 体 ( 如 XXY), 那 么 他 在 生 理 上 和 发 育 上 都 会 有 很 大 的 障碍 ,这 种 人 通常 智力 低下 。 这 提示 人 们 : 了 解 和 染色 体 的 基因 剂量 是 十 分 重要 的 。 在 女性 发 育 的 早期 ， 所 有 细胞 中 都 有 一 条 在 转录 上 是 沉默 不 动 没有 转录 活性 的 X 染 色 体 。 推测 用 这 种 方式 使 男性 和 女性 两 者 的 X 基因 剂量 维持 相等 。 至 于 失 活 哪 一 条 X 染 色 体 则 不 是 定向 选择 ,而 是 随机 无 序 选 择 的 结果 。 KEK RAK 失 活 ， 有 以 下 证 据 ; (1) 一 条 XX 染 色 体 高 度 浓 缩 并 且 异 染 质 化 ; 〈2) 如 果 女 性 的 一 些 基 因 是 杂 合 子 ; 那 办 她 将 表现 出 与 这 些 镶嵌 于 的 连锁 基因 的 相应 性 状 :、 一 条 失去 活性 的 和 不 表现 出 功能 ， 另 一 条 则 表现 出 基因 应 有 的 功能 。 如 果 一 女性 的 一 个 控制 汗腺 的 基因 是 杂 合 予 -她 的 皮肤 有 的 区 域 不 能 出 汗 《因为 野生 型 汗腺 基因 的 和 染色 体 失 去 活性 ， 不 RADE): 有 的 区 域 却 能 够 出 汗 〈 因 为 具有 等 位 突变 的 汗腺 基因 的 X 染 色 体 不 失 去 活 性 ， 它 表现 出 汗腺 基因 的 活性 ， 也 就 有 功能 )。 有 人 提出 , 失 活 的 X 染 色 体 是 被 甲 基 化 了 。 对 是 否 是 甲 基 化 还 没有 直接 的 观测 方法 ， 主 要 的 证 据 来 自 以 下 实验 : 如 果 把 一 个 对 许多 X 连 锁 基 因 都 是 杂 合 子 的 肉 性 细胞 系列 中 分 离 得 到 的 DNA 用 来 转化 ， 结 果 是 一 个 X 染 色 体 上 的 基因 能 够 表达 ,而 另 一 个 X 染 色 体 上 的 基因 不 能 表达 。 然 而 ,如 果 将 这 一 细 胞 株 放 在 含有 5- 氮 杂 胞 喀 喧 的 培养 基 中 生长 几 个 世代 ， 然 后 再 把 从 这 个 培养 物 中 分 离 得 到 的 DNA 用 于 转化 ， 则 两 个 X 染色 体 上 的 基因 都 是 有 功能 的 。 因 此 ,通过 在 5- 氮 杂 - 胞 喀 啶 中 复制 ， 也 就 是 通过 对 甲 基 化 过 程 进行 抑制 ， 原 先 失 活 的 和 染色 体 又 被 活化 了 。 事实 上 ,对 这 一 实验 的 解释 兽 有 过 很 大 争论 。 互补 的 转录 单位 我 们 曾 多 次 提 到 ， 通 常 每 一 DNA 片段 只 有 一 条 链 被 转录 。 然而 ， 已 发 现 有 几 个 DNA 片段 两 条 链 都 被 转录 。 这 并 不 是 说 两 个 基因 在 两 条 链 上 完全 重 叙 ， 而 是 两 个 反 向 转录 的 基因 的 起 始 或 终止 部 分 相 重要 。 这 两 起 反 向 转录 通常 在 不 同 程度 上 互相 影响 ， 而 这 种 相互 于 扰 能 起 调控 作用 。 例 如 ,基因 A 的 转录 能 抑制 互补 链 上 基因 也 转录 的 起 始 , 因 “sit 此 停止 A 的 转录 能 使 互补 链 上 基因 了 的 转录 开始 。 在 腺 病毒 中 ， 曾 观察 到 转录 终止 以 及 随后 的 加 工 处 理 的 作用 。 在 这 一 事例 中 两 个 转录 单位 在 终止 区 域 相 重 登 。 其 中 一 个 单位 (X) 的 转录 能 引起 另 一 单位 (Y) 的 初级 转录 片段 的 过 早 终止 。 这 种 过 早 终止 (以 及 随后 的 多 腺 苷 酸化) 决定 了 加 工 的 方式 ,也 就 决定 了 以 后 的 拼接 方式 和 由 此 得 出 的 mRNA Fe 列 。 在 这 一 病毒 的 生活 周期 后 期 ,不 再 形成 和 转录 子 , 因 此 Y 的 转录 也 就 不 被 终止 ; 这 一 更 长 的 初级 转录 子 以 另 一 种 方式 加 工 ， 这 种 方式 使 得 这 一 转录 单位 内 的 其 他 基因 能 够 表 达 。 加 工 过 程 的 调 于 转录 起 始 后 ， 最 终 产 生 一 个 初级 转录 子 。 在 高 等 真 核 生物 中 初级 转录 子 经 加 工 成 为 一 个 mRNA。 合 成 两 种 肌 球 蛋白 ( 称 为 碱 性 轻 链 LC] 和 LC3) 的 鸡 骨 骼 肌 细 胞 就 是 一 个 例子 。 肌 球 蛋白 的 基因 有 两 个 不 同 的 TATA 序列 ， 能 产生 两 个 不 同 的 初级 转 录 子 。 这 两 种 转录 子 以 不 同方 式 加 工 ， 形 成 编码 不 同 蛋白 质 的 mRNA OF CLA 23- 20)。 RR mRNA 以 四 种 不 同方 式 加 工 ， 具 体 使 用 哪 种 模式 取决 于 果 蝇 的 发 育 阶 段 。 肾 产生 一 种 肌 球 蛋白 ,而 晚 甜 期 及 幼虫 期 又 产生 另 一 种 。 加 工 模式 是 如 何 转 变 的 "至 A Vite Tio TATA TATA 肌 球 蛋白 的 碱 _ + 性 轻 键 基因 | 外 VLLLLLL VILL ee Ess, rears Dam Se DA 或 je (77777 LTT — | — | =: 切除 内 含 子 \ EE [TIT [| t LC1 mRNA AUG ° t LC3 mRNA AUG FA 23-20 鸡 的 LC1/LC3 基因 。 两 个 不 同 的 TATA 序列 引起 产生 不 同 的 初级 转录 子 。 这 些 转 录 子 有 着 相同 的 编码 序列 。 删 除 两 种 内 含 子 造成 形成 不 同 的 mRNA 分 子 。 这 些 mRNA 分 子 编码 出 具有 不 同 氨 基 末 端 而 有 相同 羧基 末端 的 蛋白 质 分 子 。 从 腺 病毒 中 发 现 了 一 些 最 好 的 加 工 调 节 的 例子 ( 见 第 二 十 三 章 真 核 病 毒 )。 腺 病毒 挫 有 很 少 几 个 启动 子 , 却 产 生 了 大 量 的 初级 转录 子 ， 并 由 此 产生 大 量 mRNA 《〈 见 第 二 十 二 章 图 22-35). 这样 ， 通 过 把 所 有 读 码 框架 中 的 DNA 都 用 于 翻译 ， 并 把 不 同 加 工 模式 所 造成 的 不 同 DNA 区 域 也 都 用 于 合成 蛋白 质 , 就 使 很 少量 的 DNA 得 到 充分 的 利用 。 每 种 mRNA 的 量 则 是 根据 感染 后 的 时 间 顺 序 分 别 受到 调节 的 。 例如 ，EIB 区 域 的 初 级 转录 子 以 不 同方 式 加 工 产生 几 种 不 同 的 mRNA, 其 中 两 个 见 图 23-21。mRNAL 和 mRNA2 都 是 在 初级 转录 子 产 生 后 不 久 形成 的 ,虽然 mRNA2 的 量 要 大 一 些 。 在 病毒 生活 “312。 周期 后 期 , mRNA2 很 多 ,而 mRNAI 的 合成 停止 了 。 如 果 在 拼接 模式 转变 之 前 加 和 蛋白 质 合成 抑制 剂 环 已 亚 胺 ,转变 就 不 会 发 生 。 这 一 抑制 说 明 , 一 种 新 合成 的 蛋白 质 是 这 个 转 变 的 正 调 节 A (positive effec- illo ee Sohal Cee tor)， 环 已 亚 胺 对 于 后 期 其 他 初 级 iho ath 转录 子 所 产生 的 mRNA 也 有 类 似 (| —— 效果 。 一 一 一 -一 -一 一 一 一 一 一 -全 初级 转 永 子 ee 经 常见 到 这 样 的 情况 : 两 种 细 | 胞 合成 同一 种 蛋白 质 ， 虽 然 蛋 白质 Da 是 由 两 种 不 同类 型 细胞 中 的 同一 种 基因 生成 的 ， 但 两 者 合成 出 来 的 蛋 23-21 RAE Eb 初级 转录 于 的 两 种 不 同 的 拼接 方式 。 癌 白质 的 量 很 不 相同 。 这 种 现象 经 常 伴随 着 还 有 其 他 的 mRNA 分 子 ,这 些 不 同 的 mRNA 分 子 被 翻译 的 效率 也 不 相同 。 在 大 鼠 合 成 “淀粉 酶 的 过 程 中 ,通过 不 同 的 加 工序 列 , 同 一 基因 产生 了 不 同 的 mRNA。 虽 然 在 动物 的 不 同 器 官 中 能 转录 出 相同 的 编码 序列 ,但 是 在 鼠 的 唾液 腺 中 合成 出 的 淀粉 酶 的 量 大 大 地 超过 肝脏 中 所 合成 的 。 在 两 种 细胞 中 ， 能 合 出 相同 的 初级 转录 子 ， 但 使 用 了 两 种 不 同 的 拼接 加 工 机 理 。 初 级 转录 子 的 起 始 部 分 见 图 23=22。 编 码 序 列 从 外 显 子 2 中 的 第 50 个 碱 基 对 开始 ， 通 过 与 外 显 子 3 及 后 面 的 外 显 子 相连 接 而 形成 。 在 唾液 腺 中 ， 初 级 转录 子 的 加 工 使 外 显 子 Ss 与 外 显 子 2 相 联 ( 也 就 是 说 ， 外 显 子 工 作为 内 含 子 1 和 2 的 一 部 分 被 切除 )。 在 肝脏 中 ,因为 外 显 子 s 与 内 含 子 1 和 先 导 序 列 工 一 起 被 切除 , 所 以 外 显 子 工 与 外 显 子 2 BK HEF SUL 成 为 淀粉 酶 的 两 种 先导 序列 ,这 样 就 产生 出 不 同 的 翻译 速度 。 fe #) {nie _ ae sé Rie) Re MRNA EE BRP BE sbi I ne LA BES 1 bp BFL 2 外 显 子 2 3 外 显 子 3 2 ey ae hg hs, | 一 一 一 一 一 ES mM A ek) hs MRNA AUG [nai 淀粉 酶 图 23-22 在 小 鼠 唾 液 腺 和 肝脏 细胞 中 通过 不 同 的 剪接 方式 产生 不 同 的 淀粉 酶 mRNA。 先 导 工 区 及 内 含 了 用 细 黑 线 表示 。 外 显 子 用 粗 黑 线 表 示 。 编 码 序列 于 外 显 子 2 的 AUG 密码 子 处 开始 。 另 一 种 类 型 的 加 工 调节 涉及 到 选择 不 同 的 多 腺 苷 酸化 位 点 。 不 同 组 织 中 激素 钙 调 素 的 不 等 速 合成 就 是 一 个 例子 。 另 一 个 例子 是 两 种 免疫 球 蛋 白 4 链 的 合成 。 在 合成 两 种 4 链 的 过 程 中 ,同样 的 初级 转录 子 的 不 同 加 工 过 程 都 包含 有 根本 不 同 的 内 含 子 切除 模式 ( 即 拼接 模式 )。 但 这 必然 需要 先 从 初 弘 转 录 子 上 选择 不 同 的 poly A 位 点 。 也 就 是 说 ,如 果 选择 更 加 靠近 启动 子 的 poly A 位 点 时 ， 那 么 就 失去 了 在 较 大 的 初级 转录 子 中 能 使 用 的 . 一 个 盘 接 位 反 。 于 是 产生 了 另 一 种 拼接 模式 。 因 此 ， 在 这 两 种 情况 下 可 能 翻译 出 略 有 不 313° 同 的 蛋白 质 。 腺 病毒 生活 周期 后 期 的 所 有 mRNA 都 只 有 一 个 启动 子 。 初 级 转录 子 在 五 个 主要 的 多 腺 苷 酸化 位 点 上 终止 (图 22-35)。 每 一 个 终止 位 点 通过 使 某 些 特殊 的 内 含 子 或 内 含 子 未 端的 存在 或 丢失 来 影响 拼接 。 五 个 位 点 的 使 用 频率 不 同 , 从 而 使 编码 各 基因 的 mRNA 的 量 不 同 。 这 是 在 病毒 的 生活 周期 后 期 中 决定 病毒 的 不 同 结构 蛋白 被 合成 出 不 同 的 相对 重 的 主要 视 理 。 多 聚 蛋白 质 ， 同 一 mRNA 产生 多 种 蛋白 质 在 原核 细胞 中 ， 对 几 个 基因 产物 的 协同 调节 是 通过 控制 对 编码 这 些 蛋白 质 一 个 多 顺 反 子 mRNA 分 子 的 合成 来 实现 的 。 在 真 核 细胞 中 , 与 此 类 似 的 机 理 是 多 聚 蛋 白质 〈po- lyprotein) 的 合成 。 多 聚 蛋白 质 是 一 个 很 大 的 多 肽 ， 在 翻译 后 能 被 切割 生成 好 几 种 蛋白 Ro 每 一 种 蛋白 质 可 以 被 看 作 是 一 个 基因 的 产物 。 在 这 个 体系 中 ， 形 成 多 聚 蛋白 质 的 DNA 中 各 个 基因 的 编码 序列 不 是 被 终止 密码 和 起 始 密码 隔 开 ,而 是 被 专 一 性 的 氨基 酸 序 列 隔 开 ， 这 些 序列 能 被 专 一 性 的 蛋白 质 切割 酶 作为 切割 位 点 识别 出 来 。 已 见 到 的 多 绢 蛋 白质 最 多 有 8 个 切 点 ( 痊 髓 灰质 炎 病 毒 , 见 第 二 十 一 章 图 21-12); 在 各 个 切割 位 点 上 并 不 是 同时 切割 ,而 是 以 特定 的 顺序 进行 切割 。 这 种 机 理 能 够 保证 各 组 成 蛋白 质 等 量 地 合成 ， RCA EAE HS rRNA 的 形成 中 所 见 到 的 。 而 且 , 某 些 位 点 切割 的 延迟 能 够 为 各 个 蛋白 质 的 合成 确定 时 间 顺 序 ,这 是 动物 病毒 常用 的 机 理 (第 二 十 章 图 22-22)。 已 知 有 很 多 多 聚 蛋白 质 的 例子 。 在 RNA 前 体 UTP 和 CTP 的 生物 合成 途径 中 的 某 一 阶 策 有 以 下 的 反应 顺序 : 前 体 | RRR FR ——__> KA MM N- 氨 甲 酰 天 冬 氨 酸 Ree | 三 气 乳 清 酸 本 SAAR Y 4 CTP EARP K= MRED MAR EREMHAE (Neurosporae) HASRAMEA - 质 : Me APLAR A—HE—-TAD RAM, CHER A AH he Re ok ie 天 冬 氮 酰 转 氨 甲 酰 酶 。 哺 乳 动 物 则 合成 一 种 包括 三 部 分 的 蛋白 质 ， 它 随后 被 切割 成 三 种 Bo 有 一 些 多 聚 蛋白 质 在 不 同 组 织 中 以 不 同方 式 受到 切割 。 前 促 黑 色素 促 肾 上 腺 皮质 激 素 原 《proopiomelanocortin) 就 是 一 个 例子 。 这 个 多 聚 蛋 白质 是 脑 下 垂体 中 合成 的 多 种 激素 的 来 源 。 在 丘脑 后 叶 ， 这 个 多 聚 蛋白 质 先 从 C 末端 切割 释放 出 5- 促 脂 激素 ， 见 图 23-22。 然 后 切割 N 端 ,释放 促 肾 上 腺 皮质 激素 (ACTH)oe 在 这 一 组 织 中 不 发 生 其 他 切割 。 然而 在 中 时 中 8- 促 脂 激素 进一步 切割 ， 释 放 C 未 端的 多 肽 : 8- 内 啡 肽 。ACTH 也 被 切 割 ,产生 “- 促 黑 激 素 。 总 之 ,在 后 叶 中 一 次 切割 产生 两 种 激素 ;在 中 时 中 第 二 次 切割 把 上 述 两 种 激素 再 转变 为 另 两 种 新 的 激素 。 以 上 所 述 的 各 种 多 聚 蛋白 质 都 被 切割 成 等 量 的 几 种 不 同 蛋白 质 〈 每 种 蛋白 质 一 个 找 es。 314。 | 促 肾 上 腺 皮 AMER 叶 rl 6- 促 脂 激素 ACTH al | ca- 促 黑 激 素 5- 内 啡 肽 图 23-23 ”切割 垂体 的 多 到 蛋 白质 前 促 黑 激素 促 肾 上 腺 皮质 激素 原 产生 四 个 激素 。 8- 促 脂 激素 及 ACTH 在 垂体 后 叶 中 形成 ，x- 促 黑 激 素 和 86- 内 UE 肽 在 垂体 中 叶 中 产生 。 垂 直 的 箭头 指出 切割 位 点 。 贝 )。 然 而 并 非 所 有 的 多 聚 蛋白 质 都 是 这 样 的 。 例 如 ， 内 啡 味 的 前 体 就 包含 着 六 个 Met- 内 啡 哑 和 一 个 Leu- AHEM 翻译 过 程 的 调控 翻译 过 程 的 控制 ,是 指 调节 控制 成 熟 了 的 mRNA 分 子 的 翻译 次 数 。mRNA 分 子 的 翻译 可 以 通过 以 下 三 种 方式 来 调节 : 〈1) mRNA Wee; (2) 起 始 翻 译 的 概率 ; 〈3) 控 制 蛋白 质 合 成 的 速度 。 在 这 一 部 分 中 ,我 们 接着 讨论 这 三 种 调控 模式 的 例子 。 延长 mRNA 的 寿命 22% (Bombyx mori) 的 丝 腺 主要 合成 一 种 蛋白 质 ， 即 丝 纤维 蛋白 。 丝 丢人 筑 造 麦草 达 数 天 之 久 , 因 此 丝 纤维 蛋白 的 合成 量 必 须 很 大 ， 而 对 合成 速度 却 没有 什么 要 求 。 因 此 ， 丝 蚕 可 以 利用 寿命 很 长 的 纤维 蛋白 mRNA 分 子 去 制造 丝 纤维 蛋白 。 一 般 认 为 丝 纤维 蛋白 基因 有 一 个 很 强 的 启动 子 , 当 等 接收 到 一 个 翻译 的 起 始 信号 (其 具体 性 质 尚 不 明 ) 后 ,在 几 天 内 就 能 合成 出 大 约 10'4 个 丝 纤维 蛋白 mRNA。 一 般 真 核 细胞 mRNA 在 降解 前 的 平均 寿命 大 约 有 3 小 时 。 然 而 , 丝 纤维 蛋白 的 mRNA 却 能 存在 几 天 ， 在 这 几 天 内 ,mRNA 分 子 可 以 不 断 地 翻译 ,每 一 个 mRNA 分 子 能 产生 10: 个 丝 纤维 蛋白 分 子 。 这 样 , 在 四 天 内 每 个 基因 就 可 以 合成 出 10' 个 蛋白 质 分 子 。 如 果 产 生丝 纤维 蛋白 的 细 胞 是 双 倍 体 , 那 么 每 一 套 双 倍 体 染 色 质 就 能 合成 出 2X 10 个 蛋白 质 分 子 。 整 个 丝 腺 若 在 :四 天 中 应 合成 300 微克 或 105 个 分 子 的 丝 纤维 蛋白 ,那么 大 约 共 需要 5X 10 个 双 倍 体 细 胞 。 然 而 , 丝 腺 在 发 育 过 程 中 有 一 独特 的 性 质 ， 即 丝 腺 是 从 一 个 双 倍 体 细胞 发 育 而 来 的 。 当 原 初 细胞 的 染色 体 加 倍 并 通过 有 丝 分 裂 而 分 开 时 ,细胞 并 不 分 裂 ,这样 就 产生 四 倍 体 细 胞 。 以 后 染色 体 继 续 地 加 倍 和 有 丝 分 裂 一 直 继 续 地 进行 ;但 总 是 没有 细胞 分 裂 , 直到 丝 腺 成 熟 为 止 。 这 时 丝 腺 已 是 一 个 大 约 有 10 倍 染 色 体 的 大 细胞 。 这 10' 套 染 色 体 中 的 每 一 个 染色 体 都 各 有 一 个 有 活性 的 丝 纤维 蛋白 基因 ,此 基因 能 合成 10? 个 丝 纤维 蛋白 分 子 。 | 此 ,这 个 与 众 不 同 的 细胞 就 能 合成 10" x 10 = 105 个 蛋白 质 分 子 。 目 前 还 不 知道 在 形成 | 丝 腺 的 过 程 中 细胞 分 裂 为 什么 会 受到 抑制 。 在 高 度 分 化 的 细 吃 中 ， 通 过 延长 mRNA 的 寿命 来 合成 大 量 的 某 种 单一 类 型 的 蛋白 ¢615 9 质 是 一 种 普遍 现象 。 例 如 ， 在 合成 卵 白 蛋 白 ( 以 便 形 成 蛋白 ) 的 鸡 的 卵巢 细胞 内 ， 虽 然 在 每 一 套 单 倍 体 染 色 体 中 只 具有 单 拷贝 的 卵 白 蛋白 基因 ， 但 是 细胞 质 mRNA 却 是 长 寿命 的 。 在 这 里 有 必要 把 这 种 有 时 被 称 为 翻译 放大 过 程 〈translational amplification) WS 白质 合成 方式 与 非洲 爪 蟾 卵 母 合成 所 需要 的 10" 个 rRNA 分 子 的 基因 扩 增 过 程 做 一 个 比较 。 丝 蛋 之 所 以 能 合成 大 量 蛋白 质 分 子 是 因为 有 两 步 扩 增 ， 即 以 DNA 为 模板 合成 104+ mRNA ie sis see 10°F, 然后 每 个 mRNA 再 反复 地 翻译 ， 从 而 又 办 增 10 倍 , 共 10 倍 。 然 而 ,在 rRNA 转录 的 合成 过 程 中 ,转录 是 最 后 的 一 步 ,没有 翻译 的 过 程 。 二 人 因 本 身 必 然 被 大 大 地 扩 增 。 我 们 已 经 提 到 ， 丝 乔 合 成 丝 纤维 蛋白 并 不 需要 速度 很 快 。 然 而 ,在 其 他 生物 或 其 他 细胞 系统 中 ,有 时 需要 快速 地 合成 蛋白 质 。 这 时 ， 仅 人 靠 翻译 扩 增 就 不 够 了 。 例 如 ,在 受精 卵 分 裂 时 , 必须 以 每 分 钟 约 3 x 10° 分子 的 速度 去 合成 构成 新 的 染 色 质 所 需 的 组 蛋白 ,才能 跟 上 DNA 合成 的 速度 。 如 果 按 照 通 常 的 合成 速度 , 每 分 钟 大 约 只 能 合成 1 000 个 分 子 。 受 精 卵 中 蛋白 质 合成 之 所 以 达到 了 所 要 求 的 高 速度 ,是 由 于 每 一 个 组 蛋白 基因 都 产生 了 几 百 个 初始 拷贝 。 请 注意 这 与 本 章 前 面 讨论 过 的 基因 扩 增 不 同 ， 因为 在 所 有 的 细胞 中 这 个 基因 的 拷贝 数 都 是 这 样 的 。 各 种 专 一 性 的 mRNA 分 子 有 着 不 同 的 半 寿 期 ， 这 一 点 在 腺 病毒 的 生活 周期 中 很 重 要 (第 二 十 一 章 )。 转 录 单 位 1B: 能 被 转录 ,产生 两 种 mRNA 分 子 : ”分别 是 14S 和 20So 这 种 区 别 是 由 于 初级 转录 子 有 不 同 的 剪接 方式 所 造成 的 。 在 病毒 生活 周期 的 后 期 ，14$ mRNA 的 量 与 20S mRNA 的 量 的 比例 远 较 前 期 的 要 大 ， 这 是 因为 后 期 14S mRNA 的 半 寿 期 变 长 的 结果 。 有 时 转录 的 调控 与 翻译 的 调控 是 相 结合 的 。 例 如 ,在 哺乳 动物 组 织 中 ,牛奶 中 的 蛋白 合成 要 求 胰岛 素 ( 能 调节 很 多 物质 的 合成 ) 和 催乳 素 ( 另 一 种 激素 ) 共 同 参与 ， 以 促进 酷 蛋白 (牛奶 蛋白 质 ) 的 合成 。 这 两 种 激素 ,对 于 起 始 酷 蛋 白 基 因 的 转录 都 是 必要 的 ; 此 外 ， 众 乳 素 还 能 增加 栈 蛋 白 mRNA 的 寿命 。 但 是 对 于 这 些 作 用 的 机 理 目 前 还 不 清楚 。 控制 翻译 的 起 始 翻译 调控 的 另 一 个 例子 是 被 掩盖 着 的 mRNA (masked mRNA) 的 调控 。 未 受精 的 海胆 卵 能 以 核 蛋白 颗粒 的 形式 很 容易 地 储存 大 量 mRNA 达 几 个 月 之 久 , 这 些 RNA 是 无 活性 的 ， 但 是 在 受精 之 后 几 分 钟 之 内 就 可 以 开始 翻译 这 些 mRNA 分 子 。 目 前 对 于 如 何 稳定 住 mRNA 以 保护 mRNA 不 受 核 酸 酶 作用 ， A Be on ee mRNA 活化 的 机 理 尚 不 清楚 。 因为 未 受精 的 成 熟 的 卵细胞 只 需要 保持 自己 的 生存 ,不 需要 生长 或 改变 状态 ,所 以 卵 中 的 蛋 白 质 合 成 速度 一 般 来 说 是 很 低 的 。 这 并 不 是 因为 mRNA 供应 不 足 , 而 是 因为 起 始 翻译 所 需 的 茶 些 因素 受到 限制 。 这 个 结论 是 从 一 个 特殊 的 实验 中 推出 来 的 ， 其 数据 见 图 23-24。 蝎 晓 卵 很 大 ,用 皮下 注射 器 就 能 很 容易 地 把 小 体积 的 液体 和 注入。 如 果 把 珠 蛋 白 的 mRNA( 从 红细胞 中 分 离 而 得 ) 与 一 种 放射 性 氨基 酸 一 起 注 人 蟾 晓 卵 , 就 能 够 合成 出 放射 性 ， 球 蛋 日 图 23-24\a) 表 示 逐 渐 增 大 注 和 人 的 珠 蛋白 mRNA 的 量 所 得 的 结果 。 珠 蛋白 的 mRNA 加 得 越 多 ， 所 合成 的 放射 性 珠 蛋 白 也 就 越 多 ， 但 正常 的 卵 蛋 白 的 合成 量 却 减 少 了 。 这 表 ¢ 316° -_ So a 一 o a BD 1) BON EA (cpm)/ 每 个 卵 母 细 胞 挨 入 的 放射 性 同位 素 (cpm )/ 4% 4 5B A 4a He 25 50 75 400 注射 的 mRNA # (ng) 注射 的 多 聚 核糖 体 量 (ng) (a) ©) BH 23-24 De oe mRNA (a 行 ) 或 网 织 红细胞 多 聚 核糖 体 〈b 行 ) 对 放射 性 氨基 酸 摊 人 到 卵 母 细胞 蛋白 质 的 影响 。 明 卵 利用 mRNA 的 能 力 已 达到 饱和 。 再 加 入 外 源 mRNA 就 会 与 内 源 mRNA 竞争 蛋白 质 合 成 的 装置 。 然 而 ,如 果 注 人 的 是 含有 珠 蛋 白 mRNA 的 网 织 红 细胞 的 多 聚 核 糖 体 , 而 不 是 纯化 的 珠 蛋 白 mRNA, 那么 卵 自 身 蛋 白 的 合成 的 减少 并 不 很 显著 [图 23-24 (b) 105K 就 是 说 氨基 酸 、 延 长 因子 以 及 终止 因子 的 供应 很 充足 。 综 合 这 两 个 实验 ,可 以 看 出 ， 限 速 因子 或 者 是 多 聚 核糖 体 的 数量 ， 或 者 是 形成 多 聚 核糖 体 所 必须 的 某 种 分 子 。 而 核糖 体 在 这 里 是 过 剩 的 ， 所 以 起 作用 的 很 可 能 是 某 种 其 他 因子 而 不 是 核糖 体 本 身 。 这 种 因子 被 称 为 补充 因子 Crecruitment factor), 某 些 蛋白 质 的 合成 是 由 mRNA 秆 的 蛋白 质 的 直接 作用 来 调控 的 。 例 如 ， 一 种 免疫 球 蛋 白 通 过 自我 阻 遏 翻译 来 使 其 浓度 保持 恒定 。 这 种 蛋白 质 与 其 他 所 有 的 免疫 球 蛋 白 一 样 , 都 有 两 个 互 链 和 两 个 工 链 。 这 个 四 体 分 子 专 一 性 地 与 五 链 的 mRNA 结合 ,从 而 阻 歇 翻译 的 起 始 。 关 于 世 链 合成 是 如 何 控制 的 ,目前 还 不 清楚 。 自我 调节 在 第 十 四 章 我 们 看 到 原核 细胞 中 有 许多 基因 ， 尤 其 是 那些 不 断 表达 的 基因 进行 自我 调节 〈autoregulation)。 在 真 核 细 胞 中 也 发 现 少量 自我 调节 的 例子 。 真 核 组 织 中 大 部 分 细 胞 具有 由 微 管 蛋 白 (tubulin) 构 成 的 称 之 为 微 管 纤维 网 络 的 结构 。 微 管 蛋白 是 纺锤 体 的 主 要 成 分 。 纺 锤 体 是 在 有 丝 分 裂 中 使 染色 体 疝 细胞 两 端 分 开 的 细胞 器 。 秋水 但 碱 〈colchi- cine) 和 长 春花 碱 〈vinblastine) 两 种 药物 能 抑制 微 管 蛋白 的 多 聚 化 作用 , 从 而 增加 细胞 内 游离 微 管 蛋白 的 浓度 。 向 组 织 培养 的 细胞 中 加 入 这 两 种 药物 中 的 任 一 种 ， 都 能 使 油管 蛋白 mRNA 消失 。 而 且 , 如 果 用 微量 注射 针头 把 微 管 蛋 白 注 入 到 哺乳 动物 细胞 中 ,新 的 微 管 蛋白 的 合成 速度 就 大 大 减 慢 。 这 些 实验 说 明 微 管 蛋白 能 抑制 其 自身 的 合成 。 然而 ， 在 以 上 两 个 实验 中 微 管 蛋白 的 初级 转录 子 的 合成 都 未 受到 阻碍 ， 因 此 ， 抑 制 或 是 发 生 在 RNA 拼接 水 平 上 ,或 是 发 生 在 翻译 水 平 上 。 目 前 还 没有 能 确定 这 方面 的 进一步 的 信息 。 蛋白 质 合成 总 速度 的 调节 只 合成 一 种 蛋白 质 的 细胞 ， 有 时 通过 控制 蛋白 质 合成 的 总 速度 来 调节 这 种 蛋白 质 的 。 317。 Ae URAL 4H ie CC SS BR I AT EE TESS CE 过 程 中 ， 网 织 红细胞 是 倒数 第 二 种 细胞 型 态 。 在 大 多 数 生 物 中 ， 网 织 红细胞 都 没有 细胞 _ 核 , 细胞 核 在 原 红细胞 〈erythroblast) 转变 成 网 织 红细胞 (reticulocyte) 时 被 排出 细胞 了 。 网 织 红细胞 依靠 原 红细胞 的 细胞 核 所 转录 出 的 mRNA 分 子 来 合成 -和 8- 珠 蛋白 亚 基 。 另 一 个 酶 系统 负责 合成 血红 蛋白 的 辅 基 血红 素 。 每 一 个 珠 蛋 白 亚 基 中 有 一 个 血红 素 , 而 且 为 了 要 得 到 最 佳 的 效率 ,每 一 种 类 型 的 珠 蛋 白 (c 和 8) 的 合成 速度 都 应 该 是 血红 素 合成 速度 的 两 倍 。 正 确 的 合成 速度 的 比例 是 通过 一 种 两 相 的 调控 体系 来 维持 的 。 在 这 个 调控 体系 中 : C1) 血红 素 阻 过 其 自身 的 合成 ; (2) 血红 素 使 一 种 珠 蛋 白 合成 的 抑制 物 失 去 活性 。 在 这 个 调控 体系 作用 下 ,如 果 血 红 素 比 珠 蛋 白 多 , 则 停止 血红 素 的 合成 ， 促 进 珠 蛋白 的 合成 ;反之 ,如 果 血 红 素 的 量 不 够 , 则 阻 遏 珠 蛋 白 的 合成 ， 并 再 开始 血红 素 的 合成 。 这 样 ,血红 素 与 珠 蛋 白 的 量 始终 保持 平衡 。 血 红 素 合成 的 控制 机 理 目 前 还 不 清楚 ,但 是 如 上 所 述 , 对 于 血红 素 是 如 何 控制 珠 蛋 白 的 合成 我 们 已 经 有 了 较 好 的 了 解 ,下 面 将 要 介绍 。 兔 网 织 红细胞 没有 核 , 因而 也 就 没有 DNA, 所 以 这 些 细胞 中 的 珠 蛋白 的 合成 无 法 在 转录 水 平 上 受到 调控 ， 而 只 能 在 翻译 水 平 上 被 调节 。 调 节 模 式 如 图 23-25 HR. Bie 始 翻译 过 程 必须 先 形成 一 个 三 聚 体 复合 物 , 它 包括 tRNAiuit、 起 始 因子 elF-2 和 一 个 被 称 为 促 真 核 起 始 因子 蛋白 的 分 子 ， 即 ESP (eIF-2-stimulating protein), 网 织 红细胞 中 有 一 个 被 称 为 控制 血红 素 阻 遇 物 即 HCR (hemin-controlled repressor) 的 蛋白 激酶 〈 它 是 一 种 蛋白 质 磷酸 化 酶 )。 这 个 阻 遏 物 能 够 使 eIF-2 的 小 亚 基 础 酸化 ， 从 而 阻止 eIF-2 与 ESP 形成 复合 物 。 而 HCR 本 身 也 受 一 个 依赖 于 cAMP 的 蛋白 激酶 激活 。 这 个 激酶 有 四 个 亚 基 ,两 个 相同 的 亚 基 称 为 R, 另 两 个 称 为 C， 所 以 此 酶 可 以 用 RC, 来 表 示 。R 与 C 亚 基 分 别 具 有 调控 和 催化 作用 。 两 个 R 亚 基 都 能 与 CAMP 结合 。 在 有 cAMP It, RC, WEES, RH C 亚 基 ; 这 样 的 C 亚 基 能 够 使 HCR 磷酸 化 。 然 后 被 激活 的 ,HCR 使 eIF-2 磷酸 化 ,从 而 阻止 蛋白 质 合成 的 起 始 。 血 红 素 能 与 R 亚 基 结 合 ， PURER 变化 ,从 而 阻碍 与 cAMP 结合 。 因 此 ,如 果 血 红 素 过 剩 ，HCR 就 不 能 被 激活 ,蛋白 质 hhc， Ae Aue C 结合 到 上 AMP fF, RzCs。 解 离 无 活性 的 RzCz| + cAMP 磷酸 化 的 无 活性 | ] AY eIF-2 自由 的 C 亚 基 ， 全 5 活化 蛋白 激酶 | 脱 磅 酸化 酶 | 5 FB BE BEAL, ee ~> [aigtemelr—] + tRNAs 十 —> 起 始 复合 物 mplex 23-25 和 氯 高 铁血 红 素 对 网 织 红细胞 中 蛋白 质 合 成 的 调节 。 “318。 合成 就 能 够 起 始 。 值得 一 提 的 是 , 珠 蛋白 和 HCR 都 能 与 血红 素 结合 ,只 是 珠 蛋白 的 结合 更 强 一 些 。 因 丰 , 当 珠 蛋白 合成 出 来 后 ,立即 与 血红 素 结合 ,从 而 减少 游离 血红 素 的 浓度 ,使 HCR 能 被 活化 。 接 着 珠 蛋白 的 合成 就 受到 抑制 ,直到 合成 出 更 多 的 血红 素 * 珠 蛋白 的 合成 才 得 到 恢 复 。 请 注意 ,这 里 并 不 是 专 一 性 地 控制 珠 蛋白 合成 的 开 与 关 ? 而 是 对 整个 蛋白 质 合成 的 速 度 进行 调控 。 这 样 的 调控 作用 只 有 在 仅仅 合成 一 种 蛋白 质 的 细胞 中 才能 做 到 。 光 对 植物 基因 表达 的 调 市 许多 高 等 植物 在 黑暗 中 生长 几 天 后 ,细胞 会 失去 叶绿体 ,也 就 失去 了 绿色 。 这 种 丢失 《 称 为 白化 ) 是 由 于 失去 了 催化 叶绿体 合成 的 酶 ,而 新 酶 又 不 能 再 合成 所 造成 的 。 当 白化 的 植物 重新 光照 后 , 几 个 小 时 就 能 开始 合成 60 种 以 上 光合 作用 所 需 的 酶 、 叶 绿 体 rRNA 和 叶 条 体 。 已 经 仔细 地 研究 过 双 磷 酸 核 酮 糖 糊 化 酶 即 RDC (ribulose diphosphate carbo- xylase) 一 -一 种 光合 作用 酶 的 一 个 亚 基 的 光照 再 合成 过 程 。 这 个 亚 基 的 合成 是 由 一 种 称 为 光敏 色素 (phytochrome) 的 分 子 为 中 介 的 ,光敏 色素 这 个 蛋白 质 常 有 一 个 共 价 结合 的 光 吸 收 色素 。 在 黑暗 中 光敏 色素 是 没有 活性 的 ;在 光照 下 它 就 转变 成 为 有 活性 的 形式 。 有 活性 的 光敏 色素 能 够 参与 转录 编码 RDC 小 亚 基 基 因 ( 以 及 一 些 其 他 基因 ) 过 程 的 诱导 作 用 。 其 作用 机 理 还 不 知道 ， 但 通常 认为 这 种 蛋白 质 是 一 个 光 激 活 的 转录 因子 。 大 亚 基 的 合成 也 由 光敏 色素 调节 ,一 些 其 他 蛋白 质 也 起 作用 ,但 是 对 这 些 则 了 解 甚 少 。 光敏 色素 同时 也 调节 其 自身 的 合成 (自我 调节 )5 EMH, 光敏 色素 的 基因 能 被 转 录 , 但 当 这 个 蛋白 质 被 光 激 活 之 后 ,其 转录 受到 抑制 。 注 意 ， 光 在 这 里 的 作用 与 光 对 光合 酶 类 的 光 诱导 激活 作用 正好 是 相反 的 。 集群 莹 类 (volyox) 的 基因 表达 也 是 由 光 调 节 的 。 在 有 光照 和 黑暗 时 ， 细 胞 中 的 mRNA 量 基 本 上 是 一 样 的 。 但 是 由 黑暗 向 光照 的 转变 能 够 引起 翻译 的 大 幅度 提高 。 关 于 这 个 现象 以 及 营 类 中 类 似 的 其 他 一 些 现 象 的 机 理 目前 还 是 一 个 这 。 匈 黄 扫 白 原 合 成 调节 的 一 个 例子 WRB AR (vetellogenin) 是 卵黄 中 的 卵黄 高 磷 蛋 白 (phosvitin) 和 卵黄 脂 磷 蛋白 Cipovitellin) 两 种 蛋白 质 的 前 体 。 卵 黄 蛋白 原 的 特别 有 趣 之 处 ， 在 于 其 合成 过 程 在 几 处 受到 调控 ,而 且 可 以 在 这 种 蛋白 质 的 合成 途径 中 见 到 前 面 已 讨论 过 的 许多 调控 特点 研究 Fo OPS ZEAE YS (Xenopus laevis) 中 的 卵黄 蛋白 原 的 合成 。 在 卵黄 蛋白 原 基因 家 族 中 至 少 有 四 个 基因 ,分 别称 为 Al、A2、81 和 B2 A 类 基因 的 翻译 产物 与 B 类 基因 的 翻译 产物 差别 较 大 , 约 20% 的 氨基 酸 有 差异 。 而 亚 组 1 基因 的 产物 与 亚 组 2 基因 的 产物 则 只 有 约 5% 的 氨基 酸 有 差异 。 四 种 基因 产物 的 合成 受到 同一 个 体系 的 调节 。 然 而 ,多 聚 蛋白 质 基因 产物 的 切割 模式 却 是 不 相同 的 PREGHSH 卵黄 高 磷 蛋 白 和 卵黄 脂 磷 蛋白 的 合成 途径 见 图 23-26。 合成 的 三 个 主要 阶段 如 下 : ° 319 pil 卵 母 细胞 | 7 2 血液 ot 基因 en mRNA | FRE 加 工 AAAAA fm — @6686 磷酸 基 前 -vit 亚 基 多 聚 核糖 体 图 23-26 难 二 醇 对 合成 卵黄 蛋白 原 的 促进 及 其 再 加 工 形 成 卵黄 高 确 蛋 白 原 (PVN), 卵黄 脂 磷 BAIR U CLV) 和 卵黄 磷 蛋 白 (PVT) 途径 的 概要 图 。 图 中 指出 了 在 卵 母 细胞 中 和 类 型 的 届 黄 高 磷 蛋 白 原 的 加 工 过 程 。 B 类 型 则 有 四 种 蛋白 质 ? 即 LVI, LVI, PVTI & PVTII, (1) 卵黄 蛋白 在 成 熟 的 瞧 性 动物 肝 中 合成 。 合 成 过 程 受 叭 性 性 激素 促进 。(2) 合成 的 煞 黄 蛋白 分 这 到 血液 中 ,运送 到 卵 俩 。(3) 在 卵 梨 中 ,发 育 中 的 卵 ( 卵 母 细胞 ) 选 择 性 地 将 角 黄 蛋白 原 吸收 ,然后 再 切割 成 为 卵黄 蛋白 。 卵黄 蛋白 原 的 合成 细节 如 下 : 卵黄 蛋白 的 合成 是 由 控制 转录 的 激素 调节 的 。 转 录 子 经 过 加 工 后 被 恶 译 出 二 个 多 聚 - 重 白质 ,进一步 再 受到 修饰 。 最 后 从 修饰 过 的 多 聚 蛋白 质 上 切割 下 一 个 多 肽 链 。 其 步 又 如 下 (图 23-26): 1. 卵黄 蛋白 原 合成 的 最 初 刺激 来 自 下 丘脑 ( 脑 的 一 部 分 )。 这 个 坤 激 使 脑 下 垂体 分 洲 促 性 腺 激素 。 2. 促 性 腺 激素 被 发 育 中 的 卵 外 面包 讲 着 的 卵泡 吸收 。 卵 泡 细胞 作出 的 反应 是 分 泌 皮 激素 到 血液 中 。 3. 瞧 激素 结 合 到 肝 细 胞 膜 中 的 受 体 上 面 , 肝 细胞 作出 反应 ,合成 卵黄 蛋白 原 。 雌 激素 的 这 个 作用 使 得 卵黄 蛋白 原 的 合成 成 为 一 个 很 有 价值 的 实验 体系 。 这 是 因为 母 鸡 与 公鸡 的 肝 细胞 都 能 合成 卵黄 蛋白 原 , 但 是 只 有 母 鸡 才能 合成 肉 激 素 。 如 果 使 用 公鸡 作 实验 ,就 有 可 能 通过 往 血 液 中 注射 肉 激 素 而 随时 使 这 个 体系 开始 合成 卵黄 蛋白 原 ， 从 而 使 人 们 能 * 320 * 够 有 座 制 地 ,仔细 地 观察 与 研究 这 个 蛋白 质 合成 的 初期 过 程 。 4. 唆 激素 被 运送 到 肝 细 胞 的 核 中 ， 在 细胞 核 中 开动 卵黄 蛋白 原 基 因 的 转录 。 雌 激素 对 卵黄 蛋白 原 合 成 的 激发 模式 与 以 前 所 叙述 的 激素 激发 转录 基本 机 理 有 一 些 区 别 。 首 次 ， 接触 肉 激素 时 ,每 个 肝 细 胞 的 核 上 大 约 有 200 个 肉 激 素 受 体 。12 个 小 时 以 后 ， 由 于 又 新 合成 了 许多 受 体 , 受 体 数 增加 到 1000 个 ,细胞 保持 这 个 受 体 数 目 达 8 天 之 久 。 受 体 数目 的 增加 使 人 们 可 以 解释 下 面 的 一 现象 : ”如 果 在 头 一 次 给 一 个 动物 注射 小 剂量 的 肉 激 烷 ， 几 天 以 后 不 再 合成 卵黄 蛋白 原 时 ,再 第 二 次 注射 肉 激 素 , 于 是 发 现 卵黄 蛋白 原 mRNA 的 合成 速度 比 第 一 次 大 多 了 。 5. 转录 子 经 加 帐 , 加 poly A 尾 ， 再 由 加 工 酶 除去 内 含 子 形成 mRNA, mRNA 被 运 送 到 细胞 质 中 之 后 ,形成 多 聚 核糖 体 。 令 人 感 兴趣 的 是 有 了 肉 激 素 ， 卵 黄 蛋白 原 mRNA -的 寿命 得 以 延长 。 只 要 有 雌 激 素 存在 ,mRNA 的 半 寿 期 大 约 是 24 小 时 。 但 是 如 果 用 雌 激 素 连续 处 理 几 天 之 后 再 撤去 肉 激素 ,mRNA 的 半 寿 期 缩短 到 3 小 时 。 6. 加 工 过 的 mRNA 开始 被 翻译 。 然 而 ， 虽 然 整 体 的 蛋白 质 合 成 是 在 继续 正常 地 进 行 , 但 是 翻译 过 程 并 不 立刻 开始 。 据 认为 ,需要 有 一 个 或 几 个 翻译 因子 才能 起 始 卵 黄 蛋 白 原 mRNA 的 翻译 过 程 ,而 这 些 因 子 也 是 在 肉 激 素 的 作用 下 才 合 成 出 来 的 。 关于 这 一 点 的 证 据 如 下 : 如 果 对 座 性 动物 给 予 肉 激 素 , 卵 黄 蛋 白 原 开 始 合成 之 后 ,撤去 峻 激素 ， 卵 黄 蛋白 原 的 合成 也 就 停止 了 。 这 是 因为 不 再 继续 为 卵黄 蛋白 原 合 成 其 新 的 mRNA; 而 已 有 的 mRNA 又 已 经 降解 。 如 果 此 时 再 给 予 肉 激 素 , 则 当 卵 黄 蛋 白 原 的 mRNA 刚 被 合成 出 来 ,就 立刻 被 翻译 ,此 处 不 存在 一 个 延迟 阶段 。 这 是 因为 已 经 具有 翻译 因子 了 。 7. 翻译 能 力 加 强 。 一 旦 卵黄 蛋白 原 的 合成 开始 以 后 ， 注 射 肉 激 素 使 肝 细 胞 能 够 比 以 前 更 快 地 合成 全 部 蛋白 质 。 这 是 通过 一 个 实验 证 实 的 。 在 这 个 实验 中 ,对 注射 肉 激素 前 、 后 的 两 种 动物 中 所 得 到 的 两 份 肝 细 胞 提取 液 进 行 测定 ,比较 了 它们 受 polyU 中 介 而 合成 多 聚 茶 丙 氨 酸 的 能 力 。 人 们 发 现 , 从 经 过 雌 激 素 处 理 的 雄性 动物 中 提取 的 肝 细胞 提取 液 ， 合成 多 聚 茶 丙 氨 酸 的 能 力 高 得 多 。 因 此 认为 翻译 受到 两 种 效应 使 肝 细 胞 能 够 合成 出 大 量 的 卵黄 蛋白 原 :1) 总 蛋白 质 合 成 的 速度 加 快 ,(2) 某 些 细胞 质 因 子 使 卵黄 蛋白 原 mRNA 能 够 很 有 效 地 与 其 他 mRNA 竞争 ,从 而 使 卵黄 蛋白 原 成 为 这 一 类 蛋白 质 合成 中 的 主要 产 物 。 8. 肝 细 胞 中 发 生 的 最 后 一 步 , 是 对 蛋白 质 进行 修饰 : 加 磷酸 基 团 , 加 脂 基 ,加糖 基 。 9. 已 完成 合成 过 程 的 卵黄 蛋白 原单 体 被 分 泌 到 血液 中 。 在 那里 ， 这 种 修饰 过 的 蛋白 质 分 子 又 聚合 成 双 体 ,这 就 是 通常 所 指 的 卵黄 蛋白 原 的 分 子 。 10. 卵 母 细 胞 从 血液 中 吸收 这 种 双 体 分 子 。 这 种 双 体 分 子 是 一 种 多 聚 蛋白 质 , 它 在 外 母 细胞 中 又 被 切割 。A 类 和 了 B 类 蛋白 的 切割 方式 不 同 。A 类 多 聚 蛋白 质 被 切割 成 卵黄 高 磷 蛋 白 ( 分 子 量 M = 35 000)、 卵 黄 脂 磷 蛋 白 I (M = 115 000) 和 卵黄 脂 磷 蛋 白 ICM= 31 000);B 类 多 聚 蛋白 质 则 形成 卵黄 脂 磷 蛋 白 I AVI, 以 及 phosvette 1(M = 14 000) 和 phosvette Il (M = 19000)。 存 在 多 型 卵黄 蛋白 原 的 重要 意义 目前 还 不 清楚 ,但 是 在 受到 切割 之 后 ,以 上 两 种 情况 下 产生 的 蛋白 质 是 被 装配 在 卵黄 小 板 〈yolk platlet) 中 ,以 形成 成 熟 的 卵 。 «321 © ts & 斗 院 植 物 所 图 书馆 Ww \ WAI 卵 清白 蛋白 的 协同 合成 鸟 关 币 两 栖 类 的 卵 有 卵黄 和 卵 清 。 卵 黄 与 卵 白 的 蛋白 质 合成 应 该 是 协同 调控 的 ， 因 为 这 两 者 唇齿 相依 ， 事 实 正 是 如 此 ， 调 节 因子 仍 是 峻 激素 。 雌 激素 不 仅 起 始 卵 黄 蛋 白 原 的 合成 ,也 起 始 卵 白 蛋白 《本 章 前 面 已 提 到 过 , 这 是 卵 清 蛋白 中 主要 的 蛋白 质 ) 的 合成 。 = 4+ xX mR Axel, R., et al. 1979.° Eukaryotic Gene Regulation. 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