^jriï i;nffl .('t/.>w4lilri'^C,[-'-'r "(^ '"■■ ■'■' ■■'■ - ■ ',-':;J^ -:!>;v-r' i'm'Z':.-:.::, FOLIA MICROBIOLOGICA. HOLLÄNDISCHE BEITRÄGE ZUR GESAMTEN MIKROBIOLOGIE. HERAUSGEGEBEN VON: M. W. BEIJERINCK, Delft- A. KLEIN, Groningen. J. POELS, Rotterdam. J. G. SLEESWIJK, Delft. unter MITWIRKUNG VON: C. W. BROERS, Utrecht — R. P. VAN CALCAR, Leiden — L. POLAK DANIELS, Haag - C. EIJKMAN, Utrecht — H. J. HAMBURGER, Groningen - H. C. JACOBSEN, Delft — D. A. DE JONG, Leiden — R. DE JOSSELIN DE JONG, Rotterdam — J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam — L. LOURENS, Rotterdam - H. MARKUS, Utrecht — C A. PEKELHARING, Utrecht — H. E. REESER, Rotterdam — N. L. SÖHNGEN, Delft - C H. H. SPRONCK, Utrecht - C S. STOKVIS, Amsterdam. III. JAHRGANG. : 1914. : UBRAÄ's; tJEW YOT& ADMINISTRATION UND VERLAG DER FOLIA MICROBIOLOGICA: PHOENIXSTRAAT 18 DELFT. v. 3, BOTANICAL AUTORENREGISTER. Seite Beijerinck. M. W 91 Broers, C. W • • i99 Hekman, J 126 Idzerda, J 227 Jacobsen, H. C i55 Jong, D. A. de i Loghem, J. J. van 212 Markus, H 141 Misson, L, 49 Raaff, A 89 Reeser, H. E 15 Schornagel, H 220 Scheuten, S. L 114 Söhngen, N. L 15 ^ Steenhuis, T. S 76 Wisselingh, C. van 165 SACHREGISTER. Aorte (sclérose de 1') 76 Anindologenes (bacterium Proteus) 212 Artbildung (physiologische) 91 Bakterienharpune 89 Bakterienmenge (in Fäzes) 227 Bacterium Proteus anindologenes 212 Bétail européen (en Brésil) 49 Dematium pullulans de Bary 114 Diphtherie 126, 199 Essigbakterien 151 Fäzes (Bakterien menschlicher) 227 Immunisation artificielle (contre la Piroplasmose) 49 Konglutinationsmethode 15 Mammifères (tuberculose aviaire chez les) i Nitratferment 91 Oxydation (durch Bakterien) 155 Phycomyces Agardh 114 Phytomikrochemische Untersuchung 165 IV Seite Piroplasmose (du bétail européen) 49 Putréfaction intestinale 'j^ Réinoculation (de la tuberculose porcine de l'homme au veau) 141 Schwefelwasserstoff (Oxydation von) 155 Serological research (in tuberculosis) 126 Tuberculose aviaire i Tuberculose porcine 141 Tuberkulinprobe (nach van Es und Schalk) 220 FOLIA MlCROBlOLOölCA. HOLLÄNDISCHE BEITRAGE ZUR GESAMTEN MIKROBIOLOGIE. HERAUSGEGEBEN VON: M. W. BEIJERINCK, Delft. Ä. KLEIN, GRONINGEN. J. P O E L S, ROTTERDAM. J. G. SLEÉSWIJK, DELFT III. JAHRG A N G, H E FT 1. AUSGEGEBEN AM 27. JUNI 1914. (FÜR INHALT UND VERZEICHNIS DER MITAR* BEITER, SIEHE INNENSEITE DES UMSCHLAGES). ADMINISTRATION UND VERLAG DER FOLIA MICROBIOLOGICA : PHOENIXSTRAAT 18, DELFT. (Holland.) ^ .-■ „ ^. -—-—■— P— ;.^.— -— — ^.^— — .. , _.,-.—... -,r-r - T«BT.Tm-Tr— m« NAAMLOOZE VENNOOTSCHAP : VOORHEEN : : J. C TH. MARI US : GANZENMARKT 440, UTRECHT SPECIALITEIT; INRICHTING EN COMPLETEERÏNG VAN WETENSCHAPPELIJKE LÄBORATORI A MICROSCOPEN EN NEVENAPP ARATEN VAN CARL ZEISS TE JENA en R. WINKEL TE GÖTTINGEN MICRO. PHOTOGRAPHISCHE EN MICRO. PROJECTIE APPARATEN OP AANVRAGE WORDEN GATALOGI TOEGEZONDEN INHALT. Stit« D. A. DE JONG. Sur le bacille de la tuberculose aviaire chez les mammifères ^ 1 H. E. REESER. Die Konglutinationsmethode ... 15 L. MISSON. Immunisation artificielle contre la piro* plasmose du bétail européen importé au Brésil. (Avec 3 planches) 49 T. S. STEENHUIS. La putréfaction intestinale et la sclérose de Taorte. (Avec 1 planche) 76 A. RAAFF. Eine praktische Bakterienharpune. (Mit 2 Tafehi) 89 [Laboratoire de Pathologie Comparée de l'Université de Leyde]. SUR LE BACILLE DE LA TUBERCULOSE AVIAIRE CHEZ LES MAMMIFÈRES, PAR Le professeur Dr. D. A. DE JONG. Il est bien universellement connu qu'on a voulu modifier l'opinion émise par ROBERT KOCH en 1882 (i) et 1884 (2), à savoir que le bacille de la tuberculose serait la cause unique de la tuberculose humaine et animale. Déjà en 1889 (3) on réussit à démontrer que le bacille isolé des oiseaux ne possédait pas précisément les mêmes caractères que celui des mammifères. KoCH (4) lui-même et Maffucci (5) l'ont confirmé en 1890, et notamment StrauS et Gamaleia (6) ont étudié au fond, par voie expérimentale, les différences qui peuvent exister entre les bacilles tuberculeux des oiseaux et des mammifères. Après ce temps, surtout en Allemagne, on ne s'occupait que très peu de la question ; beaucoup plus en France oij la plupart des pathologistes continuait à croire qu'ils n'existaient point de différences principielles entre les bacilles des oiseaux et ceux des mammifères tandis que les superficielles seraient les con- séquences des milieux d'existence si différents. La situation restait la même jusqu'à 1901. A ce moment, il était de nouveau ROBERT KoCH (7) qui abordait la matière en déclarant, se basant sur les expériences exécutées par lui en collaboration avec SCHÜTZ, que les bacilles tuberculeux humain et bovin offrent des différences permanentes ; que d'un point de vue pratique l'infection de l'homme ne serait pas causée par la tuberculose du bœuf et enfin, qu'il serait assez facile de différencier les deux bacilles par la culture et par l'expérience. I De divers côtés on s'est opposé contre ce verdict et quant à la partie principielle de la question, le plus grand obstacle contre la doctrine de KOCH restait sans doute le fait que les différences, proclamées par lui, ne se montraient pas constantes, ni permanentes. Plus tard on s'est adressé de nouveau à la tuberculose aviaire, instituant d'autres recherches expérimentales. Non seulement fut-il prouvé que les bacilles aviaires se trouvent assez fréquemment dans les corps de mammifères, mais aussi qu'il est bien imprudent de croire à l'invariabilité des caractères des bacilles, isolés des mammifères ou des oiseaux. Il est notamment à Arloing (8) qu'on doit des expériences remarquables à ce sujet ; il réussit à cultiver les bacilles tuberculeux des mammi- fères dans des cultures homogènes, où ils obtiennent plusieurs des qualités connues du bacille aviaire. Les différences principales entre les bacilles des mammifères et des oiseaux, laissant à part celles d'une moindre importance, seraient les suivantes : i^ Les bacilles des mammifères donnent une culture sèche et verruqueuse, ceux des oiseaux une couche humide et visqueuse, tout en employant des milieux solides ; 2" Les bacilles des mammifères sont très virulents pour le cobaye et y causent la mort en peu de temps par une tuber- culose type ViLLEMiN (c'est-a-dire avec des tubercules visibles); au contraire les bacilles aviaires ne sont que très peu pathogènes pour le cobaye, y donnent un abcès au lieu d'inoculation avec gonflement du ganglion lymphatique régionnair ou, si vraiment l'animal meurt, le cadavre ne montre pas des lésions tuber- culeuses visibles et point de tubercules (tuberculose type Yersin); 3^ Les gallinacés (et d'autres oiseaux) ne sont qu'exception- nellement à infecter par les bacilles des mammifères, au contraire assez facile par celui des oiseaux. Quant aux difïérences qu'on veut créer entre les bacilles tuberculeux de Xhomme et du hœuf on accuse notamment les suivantes : i^ Les bacilles de l'homme sont généralement un peu plus longs que celui du bœuf, et en cultures ils poussent un peu plus vite. 2^ Le bacille de l'homme n'est que très peu virulent pour le lapin, tandis que celui du bœuf est doué d'une grande virulence envers cet animal. 3^ Le bacille de l'homme inoculé par voie sous-cutanée chez le veau ne causerait qu'une tuberculose locale peu grave et non-progressive, tandis que celui du bœuf y causerait une tuber- culose grave et souvent mortelle. J'y tiens à accentuer que j'ai mentionné seulement les diffé- rences principales dont on veut se servir. Dans la littérature on en peut trouver encore d'autres moins prononcées. Pourtant, selon mon opinion, on n'a jamais réussi à démontrer que dans ces sortes de différences on devrait voir les preuves d'une différenciation permanente, les T^r&n\ç.s à' nwe dißerence d'espèce ; au contraire, précisém.ent la littérature nous apprend qu'on veut admettre toutes sortes d'exceptions aux règles, tandis que les recherches expérimentales ont prouvé qu'on n'a pas affaire à des différences constantes. D'ailleurs on comprendra que la solution de telles questions ne se laisse pas obtenir en peu de temps., justement aussi à cause de celui que prend l'isolation des bacilles, et l'exécution des expériences chez des animaux. Ensuite, qu'on n'arrivera pas au but en étudiant seulement des bacilles isolés d'hommes, de bœufs et d'oiseaux, et en oubliant les autres animaux qui peuvent souffrir de la tuberculose. A coté de l'homme, du bœuf et des oiseaux ce sont le porc, le cheval, le mouton, la chèvre, le chien, le chat, le singe, le lapin, la souris, les animaux à sang froid, etc. qui peuvent fournir des cultures du bacille tuberculeux ! Il va sans dire que celui qui veut proclamer la séparation des bacilles mentionnés, ayant pour conséquence naturelle la séparation des maladies, doit apporter les preuves de l'existance de différences permanentes. Il ne peut pas admettre des passages, des formes intermédiaires, des variations ou des mutations spontanées ou artificielles, ou même des exceptions à la règle. Eh bien, la réalité s'oppose contre de telles con- clusions des communications de KOCH. Vraiment, on pourra le trouver assez commode de parler d'un typus humanus, bovinus ou gallinaceus du bacille tuberculeux pour annoncer que les bacilles isolés de l'homme, du bœuf ou des oiseaux montrent souvent leur origine par des caractères quelconques, mais on a seulement le droit d'accepter des différences principielles du moment, où l'on donne la preuve d'une barrière permanente et insurmontable. Jusqu'à maintenant, on n'a prouvé rien de la sorte. Toujours en rapport au sujet que je veux traiter je dois signaler les conclusions erronées, aussi en ce qui concerne la biologie des microbes pathogènes et la pathologie expérimentale, dérivées de l'opinion de KOCH. Après avoir observé le fait qu'un bacille tuberculeux isolé de l'homme, et un autre isolé du bœuf, montraient ordinaire- ment les différences envisagées plus haut, KoCH et ses colla- borateurs signalaient tout bacille qui présentait l'une ou l'autre des groupes de caractères soit comme bacille humain ou bien comme bacille bovin. Il n'y avait plus de place pour les bacilles avec des caractères divergents, variants ou intermédiaires. La même manière de voir est suivie pour les bacilles aviaires. De cette façon, comme il s'entend, il leur est bien facile d'indiquer l'origine de tout bacille tuberculeux — cependant, ils n'inter- prètent point les formes intermédiaires et ne s'occupent non plus de la variation de caractères, soit naturelle ou bien artificielle. Or, cette manière de voir n'est pas admissible, ni pratiquement ni théorétiquement ! Car les bacilles avec des qualités déviantes et intermédiares existent, et les cas de variation naturelle et artificielle sont des faits ! Pour cette raison l'opinion des savants allemands est inacceptable. Il est impossible de diviser les bacilles tuberculeux chez les animaux à sang chaud dans trois classes avec des caractères bien limités, ne comptant pas à ce moment les autres microorganismes qui s'en approchent. Bientôt l'application pratique de la nouvelle doctrine de KoCH se montrait peu recommandable. Il avait supposé que la tuberculose du bœuf ne présenterait pas un danger envers l'homme. Les expériences ultérieures, inspirées par lui-même, faisaient voir, que des bacilles avec les qualités que lui et son école avaient proclamées pour ceux des bacilles bovins, se rencontraient sur l'homme beaucoup plus fréquemment qu'on ne l'avait pensé. Et parce que le critérium créé par lui, ne pouvait pas faire découvrir tous ces cas, parce que les bacilles bovins ne possèdent point des caractères mathématiquement limités, il s'entend qu'on n'est pas informé sur les cas de tuberculose bovine sur l'homme où le bacille possède des propriétés moins nettes. Et en tout cas la tuberculose bovine reste dangereuse pour V homme l Comment en est-il avec la tuberculose aviaire ? Il me semble bien difficile de nier qu'aussi les différences entre les bacilles aviaires et ceux des mammifères, quoique souvent bien marquées, ne soient pas si constantes et si caractéristiques, qu'elles donnent le droit de parler de différences permanentes. Aussi dans ce cas on voit que celui-ci qui étend ses recherches pendant plusieurs années et montre un peu de patience, découvre des faits prouvant qu'il n'y a pas lieu de parler de différences principielles d^ espèce ; on rencontre des formes de variation naturelle ou artificielle, et les caractères qu'on veut proclamer comme typiques montrent peu de constance. Donc aussi dans ce cas la conclusion que, vraiment en plusieurs cas, on pourra présumer l'origine du bacille, sans en obtenir la certitude. Toujours l'origine pourra être une auter que celle suggérée par les qualités soi-disant typiques. De tout ce qu'on sait des caractères de culture et de virulence des bacilles humains, bovins ou aviaires il en résulte, qu'ils ne sont pas assez précises pour en pouvoir dériver un moyen de diagnostie certain dans tous les cas. Il est précisément la constance qui manque parmi les qualités. Et serait il possible, en effet, que ces bacilles, séjournant dans un corps étranger, pourraient changer leurs propriétés, soit-il très lentement, mais en accord avec le nouveau milieu, il en résulterait, qu'il est extrêmement imprudent de créer des espèces, ou des types avec les qualités d^espèce, du bacille tuberculeux. Se basant sur les données acquises il ne sera pas donc certain qu'un bacille tuberculeux quelconque isolé d'une certaine espèce d'animal, montrant les caractères qu'on voit d'ordinaire chez le bacille humain, bovin ou aviaire, soit nécessairement d'une telle origine. On pourra proclamer la vraisemblance, mais devra s'arrêter là. Néanmoins de tels cas preuvent sans doute, qu'un certain bacille tuberculeux qui dans une espèce animale quelconque montre souvent des qualités assez bien définies, n'' est pas absolument lié à cette dernière espèce, ce qui d'un point de vue pratique veut dire que le bacille en question peut infecter aussi d'autres. Mais il n'est pas permis de taxer la fréquence de ces infections d'après le nombre des cas où l'on trouve le bacille avec les caractères divergents, justement à cause de la non- constance des différences que peuvent montrer les bacilles. Il est possible qu'on taxe beaucotip trop bas. Et quand on serait incliné a taxer les cas de tuberculose aviaire chez les mammifères d'après les cas où l'on trouve des bacilles avec les propriétés ordinaires du bacille aviaire, on risque de commettre la même faute que celui qui veut dériver les cas d'infection de l'homme par la tuberculose du bœuf d'après les cas dans lesquels on peut isoler de l'homme un bacille avec les qualités soi-disant typiques du bacille bovin. Probablement on taxe trop bas parce que la variation des bacilles peut faire naître des formes intermédiaires ou de passage ! Quoi qu'il en soit, le problème de la possibilité de l'infection mutu- elle, et l'hygiène à cause de la fréquence de la tuberculose aviaire, sont intéressées à la question si vraiment, chez des mammifères, n'importe quels, on a pu trouver des bacilles tuberculeux avec les propriétés pathogènes et de culture qu'on observe ordinaire- ment chez les bacilles isolés des oiseaux. Ce sont donc notam- ment les caractères signalés plus hauts. La question est d'une valeur pratique réelle. Malgré les recherches de Koch on admet partout la possibilité de l'infection de l'homme par la tuberculose du bœuf. Existent-ils des faits qui démontrent le même danger du côté de la tuberculose aviaire? Il est bien évident que pour résoudre la question il ne faut pas s'arrêter exclusivement aux cas d'infection de l'homme. Si d'après l'opinion des séparatistes, la tuberculose des oiseaux possède son bacille pour elle, la présence de ce bacille chez un mammifère, n'importe l'espèce, sera un fait bien important, parce qu'il prouve que ce bacille n'est pas nécessairement associé aux attributs du corps aviaire, dont notamment la température diffère considérablement de celle du corps des mammifères. Et, si l'on réussit a trouver un cas d'infection, il est vraisemblable que des autres suivront. Vraiment, les récherches des dernières années semblent vouloir prouver, qu'il est bien ainsi. On pourrait diviser les observations en anciennes et modernes. Peut-être les anciennes n'ont pas été élaborées toutes en détails. Néanmoins, elles ont attiré l'attention des cercles scientifiques et ont causé qu'on n'a pas oublié l'importance de la question. Elles sont datées de peu de temps après 1890 et 1891, c'est-a-dire peu de temps après les recherches mentionnées de Maffucci, de KOCH et de StrauS et GamaLEIA. Kruse (g) réussit à isoler quatre bacilles tuberculeux, trois de l'homme et un du bœuf, qui dans la culture et par leur action pathogène se montraient comme des bacilles aviaires. FlSCHEL(io) à cultivé du corps d'un singe un bacille avec les caractères d'un bacille aviaire. Pansini (ii) encore réussit à obtenir des bacilles aviaires des matières provenant de l'homme et du bœuf. NOCARD (12) avait inoculé des cobayes avec des crachats humains ; les cultures obtenues dans ce cas étaient celles de bacilles aviaires. Et plus tôt déjà le même auteur pensait avoir démontré (13) que la tuberculose abdominale du cheval est d'origine aviaire, opinion qui d'ailleurs n'a pas été confirmée encore. Puissent toutes ces observations ne pas posséder une valeur absolue, il est néanmoins bien justifié d'en conclure que des bacilles tuberculeux avec les propriétés du bacille aviaire se trouveront chez des mammifères et parmi eux chez l'homme. Les observations modernes sont faites dans l'époque des recherches récentes sur la tuberculose, c'est-à-dire après le Congrès de Londres en igoi. Il s'agit aussi de cas où l'on a trouvé comme cause de la tuberculose chez des mammifères des bacilles possédant les caractères de ceux qu'on peut isoler ordinairement dans les cas de tuberculose spontanée des oiseaux, notamment les gallinacés, et que j'indiquerai dorénavant comme des bacilles aviaires. La série est ouverte, peut-être, par une observation de moi- même, concernant des cas de tuberculose spontanée chez des souris blanches, examinés en 1903, et causés par des bacilles aviaires (14). Les caractères des bacilles isolés furent examinés avec soin aussi en ce qui concerne l'action sur de grands 8 mammifères, le tout en rapport avec des recherches antérieures sur l'action des bacilles provenant de la poule chez la chèvre (15). Aussi en 1903, WlENER {16) publia un travail sur la possi- bilité de transformer des bacilles de cheval en bacilles aviaires, en les cultivant en sacs de collodion dans la cavité abdominale des poules ; c'était une imitation des expériences antérieures de NOCARD (12). WlENER inocula aussi des poules avec ces bacilles de cheval ; les animaux succombèrent après quelque temps et il en isola un bacille aviaire. Il est possible que ce fait forme un appui à une publication antérieure de NoCARD (13) concernant la nature aviaire de la tuberculose abdominale du cheval. Dans un autre travail j'ai analysé déjà (17) les recherches de WlENER. En tout cas il est bien curieux que jusqu'à maintenant on n'a pas réussi à isoler le bacille aviaire du corps de cheval ; de même des recherches exécutées par moi-même dans cette direction ont échoué (voir 18). Bientôt, en 1904, RabinowitsCH confirma mes observations concernant les souris, et isola même des bacilles aviaires du corps du rat (19) et dans la même année Weber et BOFINGER (20) pouvaient cultiver un bacille aviaire d'un ganglion mésentérique casifié du porc. Ensuite Lydia Rabinowitsch (21) publia en 1906 un cas bien intéressant de tuberculose aviaire de V homme; il fut découvert par l'examen d'un nombre de cas de tuberculose de l'homme avec le but de vérifier l'opinion de KOCH. La possi- bilité de l'infection de l'homme par des bacilles aviaires était ainsi démontrée de nouveau. Et encore en 1906 la même savante pouvait écrire (22) que parmi un assez grand nombre de singes tuberculeux on en avait trouvé un qui était infecté par le bacille aviaire, tandis que dans un autre cas on avait isolé un bacille intermédiaire entre Vaviaire et V humain ! Après ce temps les communications se sont succédées régu- lièrement et on a ajouté aux souris, rat, porc, homme et singe d'autres mammifères. En 1909 StuURMAN (23) a nourri un lapin avec les ganglions mésentériques d'une vache souffrant d'entérite paratuberculeuse ; le bacille isolé du lapin était un bacille aviaire. Il en dérivait la nature aviaire de cette entérite. A ce moment on sait que l'entérite indiquée possède son propre bacille, et l'expérience de STUURMAN peut prouver seulement que le lapin peut avoir une tuberculose aviaire. Aussi en 1909 O. Bang (24) l'a confirmé par la description d'un cas de tuberculose aviaire spontanée chez le lapin. Dans l'intervalle, en 1908, j'avais publié un cas de tuberculose congénitale du veau (25) où l'inoculation des cobayes, révélait les altérations ordinaires de la tuberculose des mammifères tandis que le bacille isolé fut un bacille aviaire. Ce cas bien intéressant, montrant une contradiction entre les résultats de l'inoculation et les propriétés de la culture, m'a donné le conviction qu'il est impossible de séparer bien nettement le bacille aviaire de celui des mammifères. Quoi qu'il en soit, les cas mentionnés avaient prouvé que bien probablement aussi le (5^?// pourrait soufïrir d'une tuberculose causée par le bacille aviaire. D'ailleurs StuURMAN (26), toujours en expérimentant sur l'entérite chronique, l'avait prouvé encore par l'inoculation d'un cobaye avec de la matière provenant de l'intestin d'une vache malade ; le cobaye obtenait un processus localisé qui faisait isoler un bacille aviaire. Bien certainement dans ce cas le bacille provenait du bœuf! Il me semblait justifié d'accorder une assez grande importance à une trouvaille faite par moi avec Keyzer en 1909 (27). Tandis que Weber et BOFINGER avaient démontré que le bacille aviaire peut causer chez le porc une affection tuberculose localisée, ce qui d'ailleurs était en parfaite concordance avec des expériences exécutées par moi chez des porcs avec des bacilles aviaires (28), nous avons réussi à prouver par l'examen d'un porc saisi à V abattoir de Leyde à cause de tuberculose généralisée, que cette dernière tuberculose bien étendue fut causée par des bacilles aviaires. Précisément l'extension con- sidérable de la maladie permettait de démontrer d'une façon bien nette le danger que présente la tuberculose aviaire, tandis que les caractères de culture et l'examen expérimental ont appris, que sans aucune doute on avait affaire à un bacille aviaire. Dans la même année MOHLER et Washburn (29) ont relaté que la tuberculose aviaire peut acquérir une fréquence bien dangereuse parmi les porcs, comme l'avaient fait présumer plusieurs cas observés en Amérique ; le fait fut confirmé par des expériences d'ingestion. Et plus récemment encore le lO danger qu'offre la tuberculose aviaire pour le porc a été démontré par une publication de O. BANG et de RaSMUSSEN (30), qui viennent de prouver qu'en Danemarc la tuberculose aviaire du porc présente en effet un danger économique, parce qu'un grand nombre d'animaux dans les mêmes élevages peuvent être affectés, soit-il que la maladie n'est pas tellement généralisée comme dans le cas décrit par nous. Aussi la Commission anglaise nous a fourni des contributions à l'étude de la tuberculose aviaire du porc (31). Parmi 26 cas de tuberculose localisée du porc, 6 furent causés par des bacilles aviaires. La commission estime qu'en Angleterre 10 pour 100 de la totalité des cas de tuberculose du porc est causé par le bacille aviaire. Dernièrement des recherches nouvelles ont confirmé la fréquence de la tuberculose aviaire du porc. JUNACK réussit à isoler des bacilles aviaires dans plusieurs cas de tuberculose localisée du porc (32) et plus tard il a étudié les caractères des cultures de quelques-uns de ces bacilles (33). Christiansen (34) eut l'occassion d'examiner plusieurs cas de tuberculose du porc, ordinairement de tuberculose ganglion- naire localisée, mais aussi quelques cas de tuberculose plus étendue. En tout, de 118 porcs, il a isolé 86 bacilles aviaires, 28 du type dit bovin, et dans les 4 cas restants des bacilles de caractères moins typiques, cependant s'approchant du bacille aviaire. Et aussi, chez nous en Hollande, il semble que les cas se multiplieront comme le nouveau de M. Stuurman, à publier bientôt, le prouvera. L'expérience acquise en ce qui concerne la tuberculose aviaire du porc, faisait de nouveau poser la question si vraiment aussi chez le bœuf la tuberculose, causée par le bacille aviaire, ne serait pas plus fréquente et plus nette qu'il ne fut le cas dans ceux mentionnés plus haut. La réponse a été donnée par une observation récente faite par moi avec le Dr. StuURMaN. Il s'agit d'une vache abattue à l'abattoir de Leyde en igii et saisie à cause d'une tuberculose générale. L'examen expérimental, poursuivi aussi en 19 12 et 1913, comme les recherches bactério- logiques, ont démontré nettement qu'il existait une tuberculose aviaire. Des inoculations pratiquées chez des oiseaux, des II cobayes, des lapins, des chèvres et des veaux ne laissent aucun doute à cet égard. Une description détaillée sera donnée ailleurs i) ; cependant ce qui mérite bien l'attention dans ce cas, c'est le fait que le bacille aviaire isolé du bœuf se cultivait un peu plus sèche, un peu moins visqueuse que les bacilles aviaires ordinaires et que sa virulence envers la chèvre et le veau n'était pas si grande que celle des bacilles employés dans mes expériences antérieures. Ce fait-ci me semble avoir un intérêt spécial justement par ce qu'il est de nouveau en contradiction avec les idées de stabilité, défendues par d'autres auteurs, et plus spécialement par ce qu'il s'agit d'un bacille aviaire du bœuf. Aussi le bœuf peut souffrir d'une tuberculose grave, causée par des bacilles aviaires, et surtout les cas de tuberculose aviaire chez le porc et chez le bœuf nous imposent le devoir de penser aux conséquences pratiques des infections d'une telle sorte chez les mammifères, c'est-à-dire aussi chez V homme. La littérature récente nous porte la preuve de cette opinion. Déjà en 1905, avant la publication du cas de Rabinowitsch (1906), LOEWENSTEIN a fait savoir que dans un cas de tuber- culose sur l'homme, dont il donne une description détaillée, il avait isolé un bacille intermédiaire entre celui des mammifères et des oiseaux (35). En 1910 Jancso et Elfer (36), réussirent à cultiver un bacille aviaire d'un ganglion mésentérique d'un enfant qui avait souffert d'une tuberculose généralisée chronique compliquée par une méningite tuberculeuse aiguë. 11 était probable que les autres altérations tuberculeuses que celles du ganglion furent de même causées par des bacilles aviaires. Mais dernièrement LOEWENSTEIN vient de donner une des- cription de trois nouveaux cas de tuberculose aviaire chez Vhomme\ l'examen est fait dans le laboratoire de PaltaUF (37). Il nous rappelle le cas observé par lui autrefois, et ceux de Rabinowitsch et de Jancso et Elfer. Sur les cas nouveaux il dit que dans deux d'entre eux les bacilles isolés possédaient tous les caractères du bacille aviaire ; dans le troisième la 1) J'ai donné un aperçue des différentes expériences dans la séance de la société vétérinaire néerlandaise en Septembre 1913. 12 culture âtait sèche comme chez le bacille des mammifères et la virulence du bacille différait un peu de celle du bacille aviaire. Dans les deux premiers cas il s'agissait d'une tuberculose rénale, dans le dernier d'altérations ulcéreuses de la peau, du tissu conjonctif, des cavités nasales et buccales et de la muqueuse intestinale. LOEWENSTEIN soupçonne comme cause la digestion d'œufs provenant de poules tuberculeuses. La série assez longue de mammifères, et parmi eux X homme, qui peuvent souffrir d'une tuberculose causée par le bacille aviaire preuve nettement que les bacilles de cette origine ne se trouvent pas exclusivement chez les oiseaux. Les lésions étendues, observées sur le porc et le bœuf, mais de même chez l'homme, démontrent la gravité de la nature de ces infections. Je ne veux pas m'arrêter de nouveau chez le fait que ceux qui acceptent des différences constantes entre les bacilles des oiseaux et des mammifères maintiennent une opinion bien res- treinte et pratiquement bien dangereuse, tandis que pour eux qui n'acceptent pas ces différences permanentes les cas d'in- fection doivent être plus fréquents qu'il ne soit prouvé par les cas où le bacille aviaire vient d'être isolé. Tout cela est nullement nécessaire pour démontrer que les propriétés biologiques du bacille aviaire le rendent dangereux pour Vhomme et pour les autres mammifères; les cas mentionnés plus haut en donnent la preuve irréfutible et l'hygiène doit en tenir compte. Leyde, le lo décembre 1913. LITTERATURE, 1. KocH. Die Aetiologie der Tuberkulose, Berliner Klinische Wochen- schrift, 1882. 2. Koch. Die Aetiologie der Tuberkulose. Mitt. a. d. Kaiserlichen Gesundheidsamte, 1884. 3. RivoLTA. Sulla tuberculosi degli Uccelli, Giorn. di Anat. e. Fisiol., Pisa, 1889. 13 4. Koch. Ueber bakteriologische Forschung. Verh. des X. Intern, med. Congresses, 1890, 5. Maffucci. Beitrag zur Aetiologie der Tuberkulose (Hühnertuber- kulose). Centralbl. für Allg. Path, und Path. Anat., 1890. 6. Straus et Gamaleia. Recherches expérimentales sur la tuberculose. La tuberculose humaine, sa distinction de la tuberculose des oiseaux. Arch, de méd, exp., 1891. 7. KocH. The combating of Tuberculosis in the Light of the Ex- perience that has been gained in the succesful combating of other infection diseases. British Congress on tuberculosis, 1 901 . 8. Arloing. Voir la littérature chez : D. A. de Jong. Sur la fréquence du bacille tuberculeux du bœuf chez l'homme et sur l'incon- stance des types du bacille de la tuberculose. Comptes rendus du Congrès de Pathologie Comparée, Paris. 191 2, et: Revue générale de Medicine vétérinaire, 19 13. 9. Kruse. Ueber das Vorkommen der sogenannten Hühnertuber- kulose beim Menschen und bei Säugetieren, Ziegler's Bieträge, Bd. XIL IG. FiscHEL. Zur Morphologie und Biologie des Tuberkelbazillus Berl. Klin. Wochenschrift, 1893. 11. Pansini. Einige neue Fälle von Geflügeltuberkulose bei Menschen und bei Säugetieren. D. Med. Woch., 1894. 12. Nocard. Sur les relations qui existent entre la tuberculose humaine et la tuberculose aviaire. Congrès de la tuberculose, Paris, 1898. 13. Nocard. Le type abdominal de la tuberculose du cheval est d'origine aviaire. Recueil de médecine vétérinaire, 1896. 14. De Jong. La tuberculose spontanée des souris. Rapport pour le congrès d'hygiène et de démographie à Bruxelles, 1903. — La tuberculose aviaire, dans : Rapports entre la tuberculose de l'homme, du gros bétail, de la volaille et d'autres animaux domestiques (notamment du chien). Ville Congrès de médecine vétérinaire, Budapest, 1905. 15. De Jong. Intraveneuze injectie van vogeltuberkelbacillen bij gelten. Herinneringsbundel, Rozenstein, Leiden, 1902. 16. Wiener. Beitrag zur Uebertragbarkeit der Tuberkulose auf ver- schiedene Tierarten. Wiener klinische Wochenschrift, 1903, 17. De Jong. Het verband tusschen vogel- en zoogdiertuberculose . Vétérinaire Pathologie en Hygiene, 4'^^ reeks, Leiden, 1908. 18. De Jong. Beiträge zur Klinik und zur Pathologie der Tuberkulose des Pferdes. Vétérinaire Pathologie en Hygiene, 4*^^ reeks, Leiden, 1908. 14 1 9- Rabinowitsch. Die Geflügeltuberkulose und ihre Beziehungen zur Säugetiertuberculose, D. Med. Woch., 1904. 20. Weber et Bofinger. Die Hühnertuberkulose. Tuberkulose-Ar- beiten aus dem Kaiserlichen Gesundheitsamte, 1904. 21. Rabinowitsch. Untersuchungen über die Beziehungen zwischen der Tuberculose des Menschen und der Tiere (Arbeiten aus dem Pathologischen Institut zu Berlin), 1906. 22. Rabinowitsch. lieber spontane Affentuberkulose, D. Med. Wochenschrift, 1906. 23. Stuurman. Die spezifische hypertrophische Darmentzündung des Rindes. Travaux du TXe Congrès international de Medicine vétérinaire à La Haye, 1909. 24. Bang. (O.) Die Tuberkulose des Geflügels in ihren Beziehungen zu der Tuberkulose der Säugetiere. Travaux du Congrès à La Haye, 1909. 25. Voir: 17. 26. Voir: 23. 27. De Jong. Rapport entre la tuberculose aviaire et celle des mam- mifères. Annales de l'Institut Pasteur, 19 10. 28. De Jong. Comptes rendus du Congrès de Budapest, 1905 (voir: 14). 29. Mohler and Washburn. The transmission of Avian tuberculosis to Mammals. Travaux du Congrès de La Haye, 1909. 30. Bang (O.). Tuberkulöses Geflügel als Ursache von Tuberkulose bei Schweinen. Zeitschr. f. Inf. Kr., paras. Kr. und Hygiene der Haustiere, 191 3. 31. Royal Commission on Tuberculosis, Final Report, Part. I, London, 1911. 32. Junack. Ueber das Vorkommen von Geflügeltuberkelbazillen beim Schweine. Zeitschrift für Fleisch- und Milchhygiene, 15 Juni, 1913. 33. JuNACK. Idem, II Mitteilung. Le même journal, 15 März 1914. 34. Christiansen. Ueber die Bedeutung der Geflügeltuberkulose für das Schwein. Zeitschr. für Inf. Kr., parasitaire Kr. und Hygiene der Haust., 1913, Bd. 14. 35. Loewenstein. Ueber Septikämie bei Tuberkulose. Zeitschr. für Tuberkulose und Heilstättenw., Bd. 7, 1905. 36. Jancso und Elfer. Vergleichende Untersuchungen mit den praktisch wichtigeren säurefesten Bazillen. Beiträge zur Klinik der Tuberkulose, 19 10. 37. Loewenstein. Ueber das Vorkommen von Geflügeltuberkulose beim Menschen, Wiener klinische Wochenschrift, 19 13. Aus dem Immunitätslaboratorium des Reichs- saruminstituts in Rotterdam. DIE KONGLUTINATIONSMETHODE VON Dr. H. E. REESER. Die Konglutinationsreaktion verdankt ihre Entstehung dem EHRLICH-SACHSschen Experiment (i), welches aufgestellt worden war in der Absicht zu beweisen, dass die Hämolyse beruht auf der Wirkung bestimmter Sensibilisatoren, welche sich sowohl mit den Blutkörperchen als mit dem Komplement banden und wobei diese beiden Forscher sich von 3 Faktoren bedienten, nämlich Meerschweinchenblutkörperchen, inaktives Rinderserum und frisches Pferdeserum. Sie konstatierten, dass die Meer- schweinchenblutkörperchen intakt blieben in dem frischen Pferdeserum, aber schnell hämolysierten in einer Mischung dieses Serums mit inaktivem Rinderserum, was die Voraus- setzung rechtfertigte, dass in dem Rinderserum ein Sensibilisator anwesend sein würde, welcher die roten Blutkörperchen band an das Komplement des Pferdes, wodurch die Blutkörperchen hämolysierten. Bis soweit nichts besonders. Aber EHRLICH und Sachs sahen auch, dass, wenn die Blutkörperchen erst mit inaktivem Rinderserum in Kontakt gebracht wurden und darauf das Letzte durch Zentrifugation entfernt wurde, die Hämolyse zurückblieb, wenn die dermaszen vorbehandelten Blutkörperchen i6 mit frischem Pferdeserum in Berührung kamen, aus welchem Umstand sie den Schlusz zogen, dass die cytophile Gruppe des Rindersensibilisators nur dann in Tätigkeit treten könnte, wenn die komplementophile des Sensibilisators voraus mit dem Alexin verbunden war. Bei ihrem Studium über denselben Gegenstand gelangten BORDET und Parker Gay (2) aber zu einer ganz andern Meinung. Ihrer Behauptung nach besteht in dem Rinderserum noch ein besonderer Stoff, welcher weder Sensibilisator, noch Agglutinin, noch Alexin sein sollte und welcher von allen andern bekannten Immunkörpern abweichen sollte; er sollte das Vermögen haben die mit Sensibilisator und Alexin geladenen Blutkörperchen zu präzipitieren, welche Präzipitation die Hämolyse begünstigen sollte. Dieser spezielle Stofï des Rinderserums ertragt eine Erhitzung auf 56° C. und w^urde von B. und G. ,, colloïde de bœuf" genannt. Er präzipitiert nur Zellen, welche voraus mit Sensibilisator und Alexin geladen sind und diese Adsorption des ,, colloïde de bœuf", durch die sensibilisierten und alexinierten Blutkörperchen äuszert sich nun unter deutlich sichtbaren Erscheinungen ; die Zellen agglu- tinieren stark zu voluminösen Klumpen und hämolysieren dann leichter (ausgenommen in einigen Fällen). Beim Ehrlich- SACHSschen Experiment gelang es ihnen also 4 wirksame Stoffe nachzuweisen und zwar in dem aktiven Pferdeserum : ein thermolabiles Komplement und einen starken gleichfalls thermo- labilen Sensibilisator (Ambozeptor) ; in dem inaktiven Rinder- serum : einen thermostabilen Sensibilisator und einen Stoff albuminoider und kolloider Natur, »Colloïde de bœuf«. Fügt man also Meerschweinchenblutkörperchen, inaktives Rinderserum und aktives Pferdeserum zusammen, dann ver- binden sich, nach BORDET und GAY, die Blutkörperchen mit dem Normalsensibilisator (gleichviel ob er der thermostabile Rindersensibilisator oder der thermolabile Pferdesensibilisator ist) ; dieser neue Komplex zieht das Alexin an (aus dem frischen Pferdeserum) und durch diese Bindung bekommen die Blut- körperchen das Vermögen das »Colloïde de bœuf« anzuziehen, welcher Stoff dann seine agglutinierende und hämolytische Wirkung entfaltet. Dieser letzte Stoff, von dem die Wirkung sich äuszerst in der Agglutination der Blutkörperchen zu voluminösen Flocken, I? darf nicht verwechselt werden mit den gewöhnlichen Aggluti- ninen ; aus diesem Grunde gaben BORDET und STRENG (3) diesem speziellen Stoffe des Rinderserums den Namen »Kon- glutinin«, während Sie die Agglutination, welche er bewerk- stelligte, mit dem Namen »Konglutination« bezeichneten. Ein der Hauptargumente, welche SACHS und BAUER (4) gegen diese Theorie von BORDET und Gay anführten, war, dass es ihnen unwahrscheinlich vorkam, dass in dem Rinder- serum ein spezieller Stoff anwesend war, welcher man niemals in anderen Sera hatte nachweisen können. In einer späteren Arbeit untersuchte STRENG (5) aber eine grosse Anzahl andere Tier- und auch Menschensera auf ihre konglutinierenden Eigenschaften, Ausser Ziegen- und Schafserum kontrollierte er auch Sera von exotischen Wiederkäuern (Alpakka, Kamel, Zebu und Antilope) und weiter Sera von Hund, Schwein, Kaninchen, Meerschweinchen, Pferd, Katze und Taube. Es stellte sich heraus, dass konglutinierende Substanzen nicht nur in Rinderseris vorkommen, sondern ziemlich verbreitet sind bei den Wiederkäuern. Nur mit Ziegenserum bekam er keine Konglutination, was er zurückführte auf den Umstand, dass die von ihm benutzten Ziegen zu jung waren (Auch bei Kälbern sind die Konglutinine weit schwächer als bei erwachsenen Rindern). Das Antilopenserum hatte auf sensibilisierte und alexinierte Blutkörperchen eine noch stärkere zusammenballende Eigen- schaft als das Rinderserum und würde vielleicht noch besser als dieses zu Konglutinationsversuchen dienen können. Hunde-, Tauben- und Katzensera riefen keine Zusammenballung der Blutkörperchen hervor und scheinen also keine Konglutinine zu enthalten. Kaninchen-, Hühner-, Schweine- und Menschensera gaben zweifelhafte Resultate^ während Pferdeserum oft ein variables Verhalten zeigte. Von welchem Tier das Alexin stammt ist gleichgültig, weil man bei Verwendung von frischem Pferde-, Kaninchen- Meer- schweinchen-, Menschen- und selbst Rinderserum dasselbe Resultat bekommt; im letzten Falle verwendet man, an Stelle des inaktiven Rinderserums, frisches Rinderserum allein. Auch die Herkunft der Blutkörperchen ist belanglos. STRENG verwendete nicht nur Meerschweinchen- und Rinderblutkörper- 2 chen, sondern auch Ziegen- und Pferdeblutkörperchen. Gewöhn- lich wird, wie schon mitgeteilt wurde, nach der Konglutination der Blutkörperchen Hämolyse wahrgenommen. Eine Eigentümlichkeit in dieser Hinsicht zeigten Ziegen- und Hammelblutkörperchen, welche zwar stark zusammenballen, aber nicht hämolysiert werden, was BORDET und STRENG zurückführen auf den Umstand, dass Rind, Schaf und Ziege mit einander verwandt sind. So hämolysiert auch Rinder- komplement nicht oder nur äuszerst schwach die Blutkörperchen von Schaf und Ziege, wenn diese Blutkörperchen geladen sind mit einem spezifischen, hämolytischen Immumserum. In seinem Studium über das Verhalten des Rinderserums den Mikroben gegenüber (Versuch einer neuen serodiagnosti- schen Methode) forschte STRENG (6) nach, welche Wirkung inaktives Rinderserum und aktives Pferdeserum auf Bakte- rien ausübten, mit andern Worten, ob sensibilisierte und alexinierte Mikroben von Rinderserum ausgeflockt wurden. Auch die Mikroben nehmen, wie bekannt, das Alexin unter der Bedingung auf, dass sie erst mit einem entsprechenden, Sensi- bilisatoren enthaltenden Serum, sensibilisiert worden sind. Die Alexinabnahme kann in Vitro nicht direkt makroskopisch gesehen werden ; nur indirect, durch die Komplementbindungs- methode, ist es mögUch gewesen, in Vitro, die Alexinaufname der Mikroben nachzuweisen. Wenn man zeigen könnte, dass Rinderserum nur solche Mikroben, welche mit entsprechenden ImmunsensibiUsatoren und mit Alexin vorbehandelt sind, ausflockt, ganz wie die Blutkörperchen, so würde man im Rinderserum ein Reagens haben, mit Hilfe dessen man, mit bekannten Mikroben, die Diagnose eines unbekannten Immunserums direkt in Vitro makroskopisch stellen könnte und womit andererseits mit be- kanntem Serum unbekannte Mikroben identifiziert werden könnten. In diesem Fall würde die Konglutinationsreaktion einen praktischen Wert haben, weil sie der Serodiagnostik dienstbar gemacht werden könnte. Streng experimentierte unter andern mit Typhusbazillen und Colibazillen und konnte mit dieser Reaktion sehr gut einen Unterschied zwischen diesen beiden verwandten Bakterien nachweisen. 19 Fügte er zusammen Typhusbazillen a (siehe Fig.) mit inaktivem Typhusimmunserum b und Alexin c (z.B. eines Meerschweinchens) so wurden die Bazillen sensibilisiert und alexiniert und zogen das Konglutinin d aus dem inaktiven Rinder- serum an, was makros- kopisch sichtbar wurde durch die Zusammenbal- lung, das Konglutinieren « der Typhusbazillen. Liesz / er einen der genannten « Faktoren weg oder er- ♦ ^' setzte er das Typhus- ^ • ^ . « - '^ ' immumserum durch Coli- immunserum, so blieb die Konglutination zurück. Er gelangte dann auch zu der Überzeugung, dass die Kon- glutination, ebenso wie die Agglutination, eine spezifische Reaktion war und zu diagnostischen ZAvecken sehr gut benutzt werden könnte. Diese Zusammenballung der Mikroben ist nicht mit der Agglutination zu verwechseln ; die Konglutinine lassen sich unter anderm, durch Dialyse von den Agglutininen trennen ; Agglutinine des Rinderserums bleiben nach 24 stündiger Dialyse noch gelöst in dem Serum, während die bei der Dialyse zurück- bleibenden Stoffe, die Konglutinine enthalten. Auch zeigte sich, dass die Gegenwart von Alexin, welche für das Entstehen der Zusammenballung der Mikroben eine conditio sine qua non war, auf die Agglutinationserscheinung hindernd wirkt. Die Konglutination ist also nicht als ein Ausdruck für die, durch Sensibilisierung und Alexinaufnahme vergrösserte Emp- findlichkeit der Mikroben, gegen die Agglutinine des Rinder- serums, zu verstehen. Konnte STRENG, wie oben mitgeteilt wurde, mit dieser Reaktion Typhus- und Colibazillen von einander unterscheiden, es gelang ihm auch, obgleich die Anzahl der diesbezüglichen Versuche gering war, nachzuweizen, dass diese Reaktion bei der Typhusdiagnose der GRÜBER-WiDALschen Reaktion ähnlich war. Zwischen normalem und tuberkulösem Rinderserum konnte er keine Differenz nachweisen ; ebenso wenig gelang ihm dies 20 zwischen normalem und tuberkulösem Menschenserum. Die weiter von ihm untersuchten Mikroben (B. tuberculosis, B. diptheriae, V. cholerae und Staphylococcus pyogenes) gaben alle mit Immunsensibilisatoren, Alexin und normalem Rinder- serum ein positives Resultat. Ob er zu diesen Versuchen lebende oder abgetötete Bakterien verwendete änderte nichts an dem Befund. Nach Streng wurde diese Reaktion von mehreren andern Forschern zu diagnostischen und andern Zwecken benutzt. So untersuchte COHEN (7) mit Hilfe dieser Methode den Unterschied zwischen dem Influenzabazillus von PFEIFFER und drei morphologisch und kulturell ähnlichen Bazillen, welche er kultivierte bei der septichaemischen Form von Cerebrospinal- meningitis. Er erzielte befriedigende Resultate. GAY und LUCAS (8) gebrauchten die Reaktion für die Dysenteriediagnose, SwiFT und ThrO (9) um Streptotokken nachzuweisen, LUGER (10) um Typhus- und Paratyphusbazillen, Dysenteriebazillen und Choleravibrionen zu determinieren, während SaULI (11) mit Hilfe dieser Methode, welche in vielen Fällen zuverlässiger war als die Präzipitation, das Eiweiss mehrerer Planzenarten zu differen- zieren wusste (Versuche mit Erbsen, Bohnen, Rüben, Klee). Zur Syphilisdiagnose wurde die Reaktion von STRENG (12) angegeben, in seinem Vortrag für die Finnländische Akademie der Wissenschaften (1909 und 19 10) und am ersten ausgear- beitet von KarvonEN (13). Ein Organextrakt (alkoholischer Rinderherzextrakt) wurde mit dem zu untersuchenden Serum und Pferdekomplement zusammengebracht. Nach einiger Zeit wurden Rinderserum und Meerschweinchenblutkörperchen hin- zugegeben. Tritt keine Konglutination ein, so ist Komplement in der ersten Phase absorbiert worden, d. h. das Serum reagiert positiv. Aus Grund seiner Untersuchung mit 552 Sera meint Kar- VONEN diese Reaktion als eine komplettierende Nebenmethode der Komplementbindung bezeichnen zu können. SiEBERT und Mironesen (14) haben es unternommen, diese Reaktion bei Syphilis an einer Anzahl von Seris (100) nachzu- prüfen. Hiervon waren 15 normale Sera, die in Uebereinstimmung mit der Wa. R. immer ein negatives Resultat gaben. Die übrigen 85 Fälle stammten von luetischen Patienten und von 21 diesen ergaben lo Fälle mit Wa. R. Differenzen ; acht Patienten hatten hiervon sichere Luesanamnese. Die genannten Forscher gaben darum die Syphilisreaktion nach Karvonen an neben der Original-Wa. R. Auch Hecht (15) forschte den Wert dieser neuen Methode bei der Syphylisreaktion nach und kontrollierte dieselbe ebenso mit der Komplementbindungsreaktion; er erzielte mit 150 Seris ungefähr ähnliche Resultate, aber konnte auch die Reaktion der Wa-R. nicht vorziehen, weil das Ablesen der Resultate bei der Konglutination weit schwerer war als bei der Komple- mentbindung. Zu ähnlichem Resultat gelangte JaCOBAEUS (16), der statt Meerschweinchenblutkörperchen Schaf blutkörperchen gebrauchte. Ueber das Ergebnis weiterer und sehr ausgedehnter Unter- suchungen hat Streng (17) zusammenfassend berichtet. Er untersuchte mehr als 1000 Sera und hat dabei die Resultate in 80 — 95% mit denen der WASSERMANschen Reaktion über- einstimmend gefunden. Zur Diagnose der Rotzkrankheit wurde diese Methode am ersten von PFEILER und WEBER (18, ig, 20) angegeben. In ihrer ersten Publikation teilen sie ihre Erfahrung mit der neuen serodiagnostischen Methode mit bei 8 Pferden, wobei sie die Methode kontrollierten mit der Agglutination und der Komplementbindung. Das Resultat war vortrefflich. In der zweiten Mitteilung ist die Rede von Bazillenkonglutination bei Malleus, welche Reaktion von ihnen nicht so zuverlässig ge- funden wurde als die Blutkörperchenkonglutination. Die dritte Arbeit der genannten Forscher betrift wieder die Verwendung dieser letzten Reaktion. Bei 45 rotzfreien Pferden (erste Gruppe) fiel die Reaktion negativ aus, ebenso wie die Agglutination und die Komplement- bindung. In der zweiten Gruppe handelte es sich um 45 Sera von Pferden, die auf Grund der Ergebnisse der Agglutinations- und Komplementbindungsmethode als rotzverdächtig bezeichnet werden mussten und die sich, bei der auf Grund davon vorgenommenen Tötung, auch als sicher rotzig erwiesen hatten. Diese 45 Sera gaben alle mit der Konglutination und der Komplementbindung positive Resultate ; mit der Agglutina- 22 tion erzielte man nur in 500/0 der Fälle ein positives Resultat. Die dritte Gruppe enthielt die Pferde, von denen das Serum mit der Agglutination und der Komplementbindung unsichere Resultate gegeben hatte und gerade in diesen Fällen, die schw^ersten für die Beurteilung, ergab die Konglutination, in Zusammenhang mit der Sektion, sicherere Resultate als die Komplementbindung. Zugleich stellte sich heraus, dass durch Malleïnisation bei gesunden Pferden Anti-Konglutinine entstanden, weil die Reaktion nach der Malleïnprobe positiv ausfiel. Auch Stranigg (21), der die Konglutination bei Malleus noch feiner ausarbeitete, erzielte sehr schöne Resultate mit 82 Seris, aber konnte die Reaktion der Komplementbindung nicht vorziehen. Ehe ich mit der Schilderung meiner Versuche mit dieser Reaktion anfange, will ich erst noch die Technik der Konglu- tinationsmethode behandeln, d.h. die erforderlichen Stoffe und deren Prüfung. Die Technik der Konglutinationsmethode ist der Komplementbindungsreaktion sehr ähnlich ; der Unterschied zwischen diesen beiden Reaktionen ist hauptsächlich, dass als Index bei der hier genannten Reaktion, statt der Hämolyse, die Zusammenballung der roten Blutkörperchen gebraucht wird. Zur Ausführung sind die folgenden Flüssigkeiten nötig: i) Komplement, wozu bei dieser Methode frisches Pferde- serum gebraucht wird, das noch an demselben Tage entnommen wurde. 2) Das zu untersuchende Serum, welches erst durch Erhitzung in einem Wasserbad (V2 Stunde auf 56° C.) seines Komplements beraubt werden muss. 3) Ein mit dem zu untersuchenden Serum korrespondierender Bazillenextrakt. 4) Inaktives Rinderserum (V2 Stunde auf 56° C.) als kon- glutininhaltender Stoff. 5) Blutkörperchenaufschwemmung. Dazu gebrauchte ich, ebenso wie bei der Komplementbindung, defibriniertes und darauf dreimal gewaschenes Schafblut. Um Irrtümmern vorzubeugen empfiehlt es sich bei jedem Versuch als Kontrolle ein sicher positives und ein sicher 23 negatives Serum zu gebrauchen. Ebenso wie bei der Komple- mentbindung der Fall ist, müssen auch hier die verschiedenen Flüssigkeiten, ehe der eigentliche Versuch angesetzt wird, titriert werden. Auch diese Reaktion ist streng quantitativ; wenn man eine zu grosse oder zu kleine Dosis nimmt, verliert die Reaktion ganz und gar ihren Wert. I. Titrierung des Komplements. Um die kleinste Dosis des frischen Pferdeserums (Komple- ment) zu bestimmen, fügt man einer sicher genügenden Quantität inaktiven Rinderserums abnehmende Quantitäten des Komplements zu, füllt mit physiologischer Kochsalzlösung an zu bleichen Volumina und füoj't, nachdem die Röhrchen i Stunde bei 37° C gestanden haben, 3 Tropfen 5% Hammel- blutkörperchenaufschwemmung zu. Nachdem die Röhrchen 4 Stunden bei 37° C. gestanden haben, liest man die Reaktion ab. Zur Kontrolle nimmt man ein Röhrchen (No. 8), in dem sich nur eine ziemlich grosse Quantität Komplement befindet und kein inaktives Rinderserum, um zu demonstrieren, dass das Pferdeserum allein nicht konglutinierend wirkt; ein Röhrchen TABELLE L No. Inaktives Rinderserum. Komplement. Physiol. Na Cl lösunjj. 5 % Hammel- blutaufschw. Befund. I 0 . I cM'^. 0 . 1 cTvI^. 3 Tropfen. + 2 » 0.08 » ^ » + 3 » 0.06 » 0 S _2 » + 4 5 » » 0 . 04 » 0.02 » > S 0 ja 0 » » + -±i 6 » O.Ol » ■53 'So n » ± 7 » 0.005 » S » — 8 — 0. 06 » J3 c <1 » — 9 0 . 1 cM^. — » — 10 — — » — 24 (No. g) um nachzuweisen, dasz inaktives Rinderserum allein ebenso wenig konglutinierend wirkt, während Röhrchen No. lo den Beweis liefert, dass auch die Hammelblutkörperchen nicht von selbst konglutinieren. Aus hervorgehender Tabelle I geht solches hervor. Eine schöne Konglutination wurde beobachtet in den Röhr- chen 1, 2, 3 und 4; in 5 und 6 war die Reaktion zweifelhaft, während in No. 7, ebenso wie in den 3 Kontrolleröhrchen, die Reaktion negativ ausfiel. Die minimale Quantität Komplement lag hier bei 0.04 cM^. Bei dem zweiten Vorversuch und dem eigentlichen Versuch wurde nun gearbeitet mit ein wenig grös- serer Quantität, (in diesem Fall 0.06 cM^). Nimmt man zweimal die minimale Dosis, so bekommt man, ebenso wie bei der Komplementbindung (Siehe meine Abhandlung in der Folia Microbiologica, 1 Jahrgang, Heft 3) einen Überschusz von Komplement und demzufolge ändern die schwach positiven Fälle sich in negative. Nimmt man die richtig minimale Quantität, so läuft man bei dem eigentlichen Versuch Gefahr, dass "diese Dosis zu klein ist, denn das zu untersuchende Serum und der Extrakt binden oft selber ein weinig Komplement, während man auch den Umstand berücksichtigen muss, dass der Titer des Komplements, in den Stunden, welche noch verlaufen, ehe man mit dem eigentlichen Versuch anfängt, ein wenig zurückgehen. II. Titerstelliing des inaktiven Rinderserums. Wenn man bei der ersten Titrierung die minimale Quantität des Komplements bestimmt hat, so muss bei dem zweiten Vorversuch die minimale Quantität des inaktiven Rinderserums festgestellt werden, welche mit der bestimmten Quantität des Komplements noch gerade Konglutination gibt. Diese Titrierung, mit der erforderlichen Kontrolle, wird im Tabelle II angegeben. Die Zufügung der verschiedenen Flüssigkeiten und das Hin- stellen in den Brutschrank bei 370 C, geschah in derselben Weise als in Tabelle I mitgeteilt worden ist. 35 TABELLE II No. Inaktives Rinderserum. Komplement. Physiol, NaCl lösung. 5 % Hammel- blutauf:^chw. Befund, I 0.05 cM*. 0 . 1 c]\I^ 3 Tropfen. + 2 » 0 . 08 » » + 3 » 0.06 » ^ » + 4 » 0 . 04 » s _2 » + 5 6 » » 0.02 » 0 . 0 1 » > S » » + 7 » 0.005 » » ±: 8 9 » » 0.003 * s c < » » - lO — 0.06 cM. » — II — — » — 12 0.04 cM. 0 . 1 cM3. » + Die minimale Quantität inaktiven Rinderserums, welche mit der bestimmten Quantität des Komplements noch eine positive Konglutination gibt, ist hier 0.02 cM^. Der Umstand, dass die zu verwendende Dosis möglichst dicht bei der minimalen liegen muss, was für das Komplement ein Haupterfordernis ist, hat hier gar nicht so viel Gewicht, Ein Überschusz von Rinderserum hat bei weitem nicht solche nachteilige Erfolge als ein Über- schusz von Komplement. Zu dem eigentlichen Versuch benutzte ich denn auch immer die doppelte minimale Quantität, hier also 0,04 cM.3. Obgleich man die Komplementdosis für jeden Versuch aufs neue bestimmen muss, so ist bei dem inaktiven Rinderserum die bestimmte Dosis mehr konstant; wie mitgeteilt wird, ist diese Dosis nach einigen Wochen noch zu gebrauchen. Dennoch geht, wie ich zeigen werde, die Konglutinindosis zurück. III. Titrierung des Extraktes. Da es eine bekannte Tatsache ist, dass die grösseren Dosen 26 der verschiedenen Extrakte allein schon Komplement binden und also die Konglutination hemmen können, so ist est not- wendig voraus die Quantität des Extraktes zu bestimmen, welche allein nicht mehr hemmend wirkt. Gewöhnlich wird bei der Komplementbindung die Hälfte dieser Dosis als Titer verwendet ; darum gebrauchte ich bei der Konglutination ebenso diese Quantität. IV. Titrierung der Blutkörperchenanfschtvemmung. Dieser Vorversuch, welcher bei der Komplementbindung aus- bleiben kann, ist hier viel wichtiger. Man arbeitet hier nämlich mit weit kleineren Dosen, sodass die Unterschiede in der Zahl der roten Blutkörperchen pro c.M^. schärfer hervorkommen. Es ist darum notwendig, wenn man eine neue 50/0 Blutauf- schwemmung gemacht hat, diese zu titrieren, hinsichtlich der bestimmten Quantität des inaktiven Serums. Zu diesem Zweck bringt man zusammen, auszer der Titer- dosis des Konglutinins, Komplement (des Pferdes) und abnehmen- de Quantitäten einer 50/^ Hammelblutkörperchenaufschwemmung. Das erste Röhrchen, dass eine vollständige Konglutination zeigt, enthält den Titer der Blutkörperchenaufschwemmung. Verfügt man aber über ein Schaf, dem man wöchentlich nur ein wenig Blut entnimmt, in welcher günstigen Lage ich mich am Reichsseruminstitut befand, so kann man, ohne schädliche Erfolge, immer mit derselben Blutkörperchen-Quantität arbeiten. Die Dosis, welche ich für meine Versuche gebrauchte, war 3 Tropfen einer 50/^ Aufschwemmung. Weiss man, auf obenerwähnte Weise, über die S^'ärke der verschiedenen Flüssigkeiten, Bescheid, so kann man mit dem eigentlichen Versuch anfangen, der, wie schon mitgeteilt wurde, der Komplementbindung sehr ähnlich ist. Auch hier ist das Komplement der Index ; aber die Hämolyse wird bei der Konglutination durch die Zusammenballung der roten Blutkör- perchen ersetzt. Ich habe diese Reaktion verwendet bei Malleus, Abortus der Rinder und Syphilis. In den beiden ersteren Fällen kontrol- lierte ich dieselbe mit der Komplementbindung und der Agglu- tination, in dem letzten Falle nur mit der Komplementbinding. 27 A. Konglufination bei Malleus. Zur Untersuchung auf Malleus konnten, wegen des spora- dischen Auftretens dieser Krankheit in unsrem Lande, nur 7 Sera bekommen werden. Drei dieser Sera stammten von Pferden des Furhrherrn L. in Rotterdam ; diese Pferde reagierten auf die subkutane Mallein- injektion und auf die Ophtalmoreaktion in sehr typischer Weise. Ein wenig Blut dieser Pferde wurde genommen und auf Agglu- tination und Komplementbindung untersucht. Beide Reaktionen waren schön positiv. (Serum II am stärksten und Serum III am schwächsten). Wie verhielten die Sera I, II und III sich nun zu der Kon- glutinationsreaktion ? Bei dem ersten Vorversuch, der Einstellung des Komplements, ergab sich, dass die minimale Quantität des Komplements, welche nötig war um 3 Tropfen einer 5 % Aufschwimmung von Hammelblutkörperchen, mit einer gewissen Dosis konglutinierenden Serums zu konglutinieren, 0.04 cM^. war. Bei dem zweiten Vorversuch und dem eigentlichen Versuch arbeitete ich mit 0.06 cM^. Die Titrierung des inaktiven Rinderserums (2er Vorversuch) gab als minimale Dosis o.oi cMs. an; gearbeitet wurde mit 0.02 cM^. Der eigentliche Versuch. Als Rotzbazillenextrakt gebrauchte ich Malleine brute und weil dieser Stoff in grösseren Dosen schon von selbst bindend wirkt, so musste voraus die Quantität bestimmt werden, welche nicht mehr hemmend wirkte. Es stellte sich heraus, dass diese Quantität o.ooi cM^. war; die Hälfte dieser Dosis (0.0005 cM^.) wurde als Titer verwendet. Nun fügte ich der bestimmten Titerdosis des Extraktes abnehmende Quantitäten der zu untersuchenden Sera zu, nebst der bei dem ersten Vorversuch bestimmten Quantität Komple- ment, füllte mit physiologischer Kochsalzlösung an zu gleichen Volumina und stellte die Röhrchen i^ Stunde bei 37 0 C. Es versteht sich, dass bei diesem Versuch die benötigte Kon- Malleus- Zu unter- Physiolo- S^/oHammel- No. Komplement extrakt suchende gische Na Cl blutauf- Inaktives Rinderserum Befund. (Mallein) inaktive Sera lösung schwemm. I 0.06 cM.3 0.0005 ^^^-^ 0,1 cM.3l 3 Tropfen 0,02 cM.3 keine Kongluünation 2 » » 0,08 » » » » » » 3 » » 0,06 » » » » » » 4 » » 0,04 » » » » » » 5 » » 0,02 » » » » teilweise » 6 » » 0,01 » » » » Konglutination 7 » » 0,005 » » » » » 8 » » 0, 1 » II » « keine Konglutination 9 » » 0,08 » » » » » » lO » » 0,06 » » » » » » II » » 0,04 » » » » » » 12 » » 0,02 » » » » » » 13 » » 0,01 » » » » » » H » » 0,005 * * » » teilweise » 15 » » 0,1 » m » » keine Konglutination i6 » » 0,08 » » » » » » 17 » » 0,06 » » » » » » i8 » » 0,04 » » » » teilweise » 19 » » 0,02 » » C » » » » 20 21 » » » » 0,01 » » 0,005 * >> 1) a » » » » Konglutination » 22 » 0,002 » — » » keine Konglutination 23 » 0,001 » — 0 > » » Konglutination 24 » 0,0005 » — » » » 25 » — 0, 1 » I S » » » 26 » — • 0,04 » » D » » » 27 » — 0,1 » II 0 » >; » 28 » — 0,04 » » » » » 29 » — 0,1 »m 1> » » » 30 » — 0,04 » » w » » » 31 — 0,001 cM.3 0,1 I Ö >/ » keine Konglutination 32 — 0,0005 » 0,1 I N » » » » 33 — 0,001 » 0,1 II c » » » » 34 — 0,0005 » 0,1 II 0) » » » » 35 — 0,001 » 0,1 III :3 » » » » 36 — 0,0005 » 0,1 III » » » » 37 — — — < » » » » 38 0,06 C]\1.3 — — » » Konglutination 39 0,06 » Inaktives Normal Serum-Pferd. » keine Konglutination 40 » 0,0005 cM.3 0,1 cM.3 » 0,02 cM.' Konglutination 41 » » o;o8 » » » » 42 » » 0,06 » » » » 43 » » 0,04 » » » » 44 » » 0,02 » » » » 45 » » 0,0 1 » » » » 46 » » 0,005 » » » » 47 » — 0,1 » » » » 48 » — 0,04 » » » » 49 — q,ooi cM.3 0,1 » » » keine Konglutination 50 0,0005 » 0,1 » » » » » 51 — 0,001 » — » » » » 52 — 0,0005 » — » » » » 53 — 0,1 » » » » » 29 trolle aufgenomme wurde, hinsichtlich welcher Kontrolle auf hervorstehende Tabelle verwiesen werden kann. Nachdem die verschiedenen Flüssigkeiten in den Röhrchen 1I/2 Stunde bei 37 » C. auf einander eingewirkt hatten, wurde jedem der Röhrchen 3 Tropfen einer 5 % Hammelblutkörperchen- aufschwemmung und die Titerdosis des Rinderserums {0.02 cM 3.) zugefügt, die Röhrchen gut geschüttelt und wieder bei 37 0 C. gestellt, aber nun während 4 — 6 Stunden. Nachdem die Röhrchen 8 Stunden bei Zimmertemperatur verweilt hatten, wurde das Resultat abgelesen. Es wird mit abnehmenden Quantitäten der zu untersuchenden Sera gearbeitet, weil Pferdeserum oft schon spontan hemmende Stoffe enthält. Um diese nicht spezifischen Stoffe auszuschalten (1/2 Stunde erhitzen auf 56° C. genügt nicht) muss man die- jenige Quantitäten der Sera gebrauchen, welche nicht mehr von selbst hemmend wirken. Aus diesem Grunde verwendet man die abnehmende Dosis der zu untersuchenden Sera, wo- durch eine vorhergehende Titrierung unnötig ist. Gewöhnlich aber beobachtet man die nicht spezifische Hemmung der Sera erst in Dosen über 0,2 cM^. Aus hervorstehender Tabelle geht hervor, dass alle 3 zu unter- suchende Sera mit Malleusextrakt Komplement binden und man also mit Malleusseris zu tun hat. Ein ganz analoges Resultat also als mit Komplementbindung und Agglutination erzielt wurde. Serum II, das bei der Komplementbindung und Agglutination am stärksten positiv war, war dies auch bei der Konglutination, während Serum III, das bei der Komplementbindung und Agglutination am schwächsten war, hier ein Resultat in gleichem Sinne gab. Normalserum gab mit Malleusextrakt gar keine Hemmung der Konglutination (Kontrolle 40 — 47). Die übrigen Kontroll- proben sprechen genügend für sich selbst ; es stellte sich heraus, dass das Malleusextrakt in der Dosis von 0,002 cM^. schon von selbst hemmend wirkte (Kontrolle 22) ; unter dieser Dosis aber nicht mehr (Kontrolle 23 und 24) ; die benutzten Sera wirkten ohne Extrakt nicht hemmend (Kontrolle 25 — 31). Kontrolle 39 gibt an, dass frisches Pferdekomplement (0,06 cM^.) ohne Rinderserum, nicht konglutinierend wirkt auf Hammelblut- 30 körperchen, ; dennoch soll Pferdeserum (STRENG (5) teilt es mit) ebenso wie Rinderserum, neben Agglutinine auch Konglutine für Meerschweinchenblutkörperchen enthalten , sodass auch frisches Pferdeserum allein vielleicht Hammelblutkörperchen zusammenballen könnte. Am Ende meines Artikels komme ich hierauf in einem besonderen Abschnitt, über die Wirkung mehrerer Sera auf verschiedene Blutarten, zurück. Ausser diesen 3 Seris von Pferden von einem Fuhrherrn, wurden noch an verschiedenen Zeiten 4 Sera auf Malleus untersucht und zwar von 4 verschiedenen Fällen. Zwei dieser Sera (I und III) gaben mit der Komplementbindungsreaktion und mit der Agglutination ein positives Resultat ; die beiden anderen (II und IV) waren mit beiden Reaktionen negativ. Die Konglutinationsreaktion mit diesen 4 Seris fand ganz in der obenerwähnten Weise statt. Auch jetzt wurde als Malleus- extrakt Malleïn brute gebraucht, von dem die Quantität bei Titrierung wieder auf 0,005 cM^. bestimmt wurde. Die zu ver- wendende Dosis des Komplements und die Quantität inaktiven Rinderserums wurden für jeden Versuch besonders festgestellt. Hinsichtlich des weiteren Verlaufs des Versuchs kann auf die erste Tabelle verwiesen werden. Die mit der Konglutinations- reaktion erzielten Resultate, waren auch mit diesen 4 Seris ganz dieselben als mit der Komplementbindung und der Agglutination; I und III waren positiv; II und IV negativ. Normalserum gab in keinem der 4 Fälle ein positives Resultat. Obgleich ich also nur eine ziemlich geringe Zahl von Malleus- fällen mit der Konglutinationsreaktion untersucht habe, so wage ich es dennoch, mit Rücksicht auf die analogen Resultate mit den beiden andern Methoden, diese neue Reaktion in geeigneten Fällen (bei Malleus) neben den beiden andern, zu empfehlen. B. Konglutination bei Syphilis. Meine Untersuchungen mit dieser Reaktion bei Syphilis beziehen sich auf 25 Fälle. Die zu diesen Versuchen erforder- lichen Sera wurden mir wohlwollend verschafft von Dr. J. F. Maas, Hautarzt in Rotterdam, der mir auch von jedem Serum das Resultat der Komplementbindungsreaktion mitteilte. 31 Als Syphilisextrakt benutzte ich das bekannte alkoholische Meerschweinchenherzextrakt, von dem ich zuvor die hemmende Wirkung bestimmte; 0,2 cM^ war die kleinste Dosis, welche Eigenhemmung zeigte ; bei den Versuchen gebrauchte ich daher die Hälfte dieser Dosis. Das zu untersuchende Serum fügte ich in abnehmenden Quantitäten hinzu. Bei dem Vorversuch stellte ich heraus, dass die erforderliche Quantität des Komplements (frisches Pferdeserum) 0,05 cM.^ war. Nachdem die verschie- denen Röhrchen 1 1/2 Stunde bei 37° C. gestanden hatten, wurden die voraus bestimmte Dosis inaktiven Rinderserums (0,02 cM.'^) und 3 Tropfen einer 50/0 Hammelblutaufschwemmung (dreimal gewaschen) hinzugefügt ; darauf wurden die Röhrchen 5 Stunden bei 37° C. hingestellt und nach 10 Stunden oder eher das Resultat abgelesen. Aus untenstehender Tabelle geht der Versuch mit der nötigen Kontrolle deutlich hervor. Das zu unter- 5*/oHammel- Inaktives Rinder- serum. No. Komple- ment Syphilis- extrakt suchende inaktives Serum Phys. Na Cl biut-Auf- schwem- mung. Befund I 0,05 cM.3 0,1 cM.3 0,1 cM.3 3 Tropfen 0,02 cM.3 keine Konglutination 2 » » 0,09 » » » » » 3 » » 0,08 » » » » » 4 » » 0.07 » » » » » 5 » » 0,06 » e » » » » 6 » » 0,05 » V » » » » 7 » » 0,04 » S » » » » 8 » » 0,03 » a » » » » 9 » » 0,02 » 0 » » teilweise » 10 » » 0,01 » > » » Konglutination II » 0,2 — S » » keine Konglutination 12 » 0,15 — 1> » » Konglutination 13 » o.i — j3 » » » 14 » — 0,1 » .-. » » » IS » — 0,08 » D » » » 16 » — 0.06 » W) » » » »7 » — 0,04 » 3 » » » 18 » — 0,02 » N » » » Ï9 » — 0,01 » c » » » 20 » — — lU » » » 21 » 0,2 — ::3 » » keine Konglutination 22 » 0,15 — V.I » » » » 23 » 0,1 — C < » » » » 24 » — 0,1 » » » » » 25 » — 0,08 » » » » » 26 » — 0,06 » » » » » 27 » 0,2 0.1 » » » » » 28 » 0,2 0,08 » » » » » 32 No. Komple- ment Syphilis- extrakt Normales inaktives Menschen- serura Phys. Na CI S^/oHammel- blut-Auf- schwem- mung Inaktives Rinder- serum Befund 29 0,05 cM.3 0,1 cM.3 0, 1 cM.3 3 Tropfen 0,02 cM.3 Ko nglutination 30 » » 0,09 » » » » 31 » » 0,08 » » » » 32 » » 0,07 » » » » 33 » 1) 0,06 » » » » 34 » » 0,05 » » » » 35 » » 0,04 » » » » 36 » » 0,03 » C » » » 37 » » 0,02 » 1) 6 3 » » » 38 » » 0,0 1 » » » » 39 » — 0,1 » » » » 40 » — 0,08 » 0 > » » » 41 » — 0,06 » » » » 42 » — 0,04 » S » » » 43 » — 0,02 » D » » » 44 » — 0,01 » 0 » » » 45 — — 0,1 » » » keine Konglutination 46 — — 0,08 » D » » » » 47 — — 0,06 » bD » » » » 48 — 0,2 0,1 » P » » » » 49 — 0,2 0,08 » N » » » » 50 Zu unter- suchendes Serum c :3 » » » » 51 0,05 cM.3 0,1 cM.3 0. 1 cM.3 S < » — » » 52 » » 0,06 » » — » » 53 » » 0,02 » Normal- serum » » » » » » 54 » » 0,1 cM.3 » — » » 55 » » 0,06 » » — » » 56 » » 0,02 » » — » » Das zu untersuchende Serum, das von einem Patienten mit secundärer Syphilis stammte, hatte, wie Dr. MAAS mir mitteilte, mit der Komplementbindungsreaktion ein stark positives Resultat gegeben. Auch bei der Konglutinationsreaktion wurde ein stark positives Resultat erzielt. Es stellte sich ja heraus, das dieses Serum, bis in der Menge von 0,02 cM^,, noch imstande war den Eintritt der Konglutination zu hemmen (No. I — X). Mit normalem Menschenserum tratt eine schöne Konglutination ein (No. 29—39). Ohne Komplement (21 — 2g und 45 — 50) und ohne inaktives Rinderserum (51 — 56) blieb Konglutination aus. Auch die übrigen Kontrollversuche fielen gut aus. 33 Hier wurde also ein analoges Resultat erzielt sowohl mit der Konglutinations- als mit der Komplementbindungsreaktion. Dies war aber nicht der Fall mit allen untersuchten Seris. Um kurz zu sein und zu gleicher Zeit eine deutliche Über- sicht der Versuche zu geben, scheint es mir erwünscht diese, die Diagnose und die Resultate, in einer Tabelle zusammen- zufassen und hier unten anzugeben. Die Untersuchung bezog sich, wie schon mitgeteilt wurde, auf 25 verschiedene Sera. Resultat der Resultat der Serum. Diagnose. Komplementbindungs- Konglutinations- reaktion. reaktion. I Syphilis. + + II keine » — — III » » — IV » » — — V Syphilis. schwach -f schwach -(- VI » + — VII » + + VIII zweifelhaft. schwach -|- schwach + IX keine Syphilis. — — X Syphilis. schwach + + XI » + — XII keine » XIII » » — — XIV Syphilis. + + XV » + + XVI keine » — , XVII zweifelhaft. sehr schwach -f — XVIII Syphilis. + + XIX » + + XX » + + XXI » + + XXII » schwach -|- schwach + XXIII » + — XXIV keine Syphilis. — XXV » » — — Mit + Konglutinationsreaktion wird gemeint, dass das zu untersuchende Serum positiv war, sodass in den betreffenden Röhrchen keine Zusammenballung der Blutkörperchen zu beob- achten war; umgekehrt, also wenn das Serum negativ ist, so wird wohl Konglutination beobachtet. Wenn die Resultate der Komplementbindung und der Kon- glutination mit einander verglichen werden, so stellt sich heraus, 3 34 dass mit den 25 untersuchten Seris in 20 Fällen, ein gleich- lautendes Resultat erzielt wurde. In 5 Fällen wichen die mit beiden Reaktionen bekommenen Resultate von einander ab ; die Sera 6, 9 und 23 gaben, der Diagnose gemäss, mit der Komplementbindung ein positives Resultat, aber mit der Kon- glutination ein negatives. Um ganz sicher zu sein untersuchte ich nun selbst diese drei Sera mit der Komplementbindungsreaktion, hinsichtlich desselben Extraktes, das ich für die Konglutination gebrauchte. Auch ich erzielte bei diesen 3 Seris mit der Komplementbindung ein positives Resultat. Die beiden andern Abweichungen in den Reaktionen sind von weniger Wichtigkeit. Serum X gab ein schwach positives Resultat mit der Kom- plementbindung, indem die Konglutinationsreaktion deutlich positiv war (Diagnose Syphilis) ; Serum XVII, das von einem Patienten stammte, von dem die Diagnose nicht mit Gewissheit zu stellen war, gab mit der Konglutinationsreaktion ein nega- tives und mit der Komplementbindung ein sehr schwach positives Resultat. Wenn wir von diesen beiden letzten Fällen Abstand nehmen, so stellt sich heraus, dass von den 25 untersuchten Seris 3 ein abweichendes Resultat gaben, abweichend sowohl von der Diagnose als von der Komplementbindung, was total 12 % Abweichungen sein würde, um das Wort Fehler noch nicht zu gebrauchen. In Bezug hierauf scheint es mir nicht angewiesen die Kon- glutinationsreaktion bei Syphilis neben die Komplementbindung zu stellen, darüber in keinem Fall, denn die letztere ergab sich zuverlässiger, während mit der ersteren noch mehrere Be- schwerden verbunden sind (worauf ich später zurückkomme), welche bei der Komplementbindungsreaktion nicht anwesend sind. C. Konglutination beim seuchenhaften Verwerfen des Rindes. Für die Diagnose des seuchenhaften Verwerfens bei Rindern sind in den letzten Jahren besonders 2 Reaktionen von sehr grosser Wichtigkeit geworden, namentlich die Agglutination und die Komplementbindung. Das Serum von Rindern, welche verwerfen werden oder welche schon vor sreräumen Zeit ver- 35 worfen haben, gibt eine schöne Komplementbindung mit einem Extrakt des Abortusbazillus nach BaNG ; auch enthält ein derartiges Serum Agglutinine gegen diese Bazillen, sei es, dass der Titer der Agglutination oft nicht höher ist als i : too. Beide Reaktionen sind denn auch für die gewisse Diagnose des seuchenhaften Verwerfens unentbehrlich geworden. Bedürfnis an eine dritte Reaktion, die Konglutinationsreaktion, besteht hier nicht, aber von einem wissenschaftlichen Stand- punkt betrachtet, darf es für wichtig gehalten werden nachzu- forschen, welche Resultate diese neue Reaktion beim Abortus der Rinder liefert. Ich fange an die Aufmerksamkeit darauf zu lenken, dass es bei dieser Reaktion eine Schwierigkeit ist, dass für die Unter- suchung von Rinderserum, es keinen Zweck hat voraus die Dosis des konglutinierenden Serums zu bestimmen, weil man für das zu untersuchende Serum ebenso Rinderserum gebraucht und zwar in grosser Quantität (0,1 cM^. — 0,05 cM^.); dazu kommt noch, dass das zu untersuchende Serum schon beim Anfang des Versuchs mit dem Komplement und dem Extrakt anwesend ist und also nicht 1% Stunde nach der Bindung als konglutinierendes Serum hinzugefügt wird. Um diesen Schwierig- keiten so viel wie möglich vorzubeugen, habe ich von dem zu untersuchenden Serum niemals Dosen über 0.05 cM^. genommen und dann abnehmende Quantitäten, wobei man aber wieder Gefahr läuft schwach positive Sera in negative zu verwandeln. Der Titer des konglutinierenden Serums bestimmte ich für jedem Versuch ins besondere und fügte es 1 1/2 Stunde nach der Bindung hinzu. Als Abortusextrakt wurden eine Serumbouillonkultur von Abortusbazillen, welcher Kultur 1/2 ^!q Karbol zugefügt war, und ein klares Extrakt von Abortusbazillen gebraucht. Die minimale, noch von selbst hemmende Wirkung der Serum- bouillonkultur lag bei 0,2 cM.^, aus welchem Grunde ich bei den Versuchen die Hälfte dieser Dosis verwendete. Von dem Extrakt der Abortusbazillen, dass ich durch Erhitzung, schütteln, zentrifugieren und zerreiben der Bazillen bekam, {Folia Micro- biologica I Jahrgang Heft 3) konnte immer eine Quantität von 0,2 0,1 und 0,05 cM.3 gebraucht werden. Sowohl für die Kom- plementbindung als für die Konglutination benutzte ich bei 36 jedem Versuch, beide Extrakte ; in keinem einzigen Fall sah ich, zwischen den beiden Stoffen, irgend eine Abweichung. Auszer dem Titer des konglutinierenden Serums wurde, ehe ich einen Versuch anstellte, selbstverständlich, der Titer des Komple- ments, wozu wieder frisches Pferdeserum diente, bestimmt. Im Ganzen untersuchte ich mit diesen 3 Reaktionen 38 Sera auf seuchenhaftes Verwerfen. Die erzielten Resultate werden, ebenso wie bei Syphilis, in unterstehender Tabelle verzeichnet. Serum. Resultat der Agglutination. Resultat der Resultat der No. Komplementbindungs- reaktion. Konglutinations reaktion. I + + II + + — III + + + IV — — V + + + VI — VII + + 4- VIII + + IX + + » X + + XI — XII — XIII — XIV + + + XV + + + XVI + (schwach) + (schwach) XVII + + + XVIII + + XIX — XX + + + XXI + + + XXII — XXIII + + XXIV — XXV — XXVI + + + XXVII + (schwach) -f (schwach) XXVIII — XXIX + (schwach) + XXX + + XXXI + + + XXXII + (schwach) + XXXIII — XXXIV — -f (schwach) XXXV + + + XXXVI + + XXXVII . XXXVIII - — — 37 Ebenso wie bei Syphilis mitgeteilt worden ist, wird auch hier unter + Konglutinationsreaktion verstanden, dass das un- tersuchte Serum positiv war. In den betreffenden Röhrchen war also keine Zusammen- ballung der Blutkörperchen zu beobachten. Wenn wir hier die mit den drei verschiedenen Reaktionen erzielten Resultate genauer betrachten, so bemerken wir sofort, dass sie noch weit weniger schön sind als bei Syphilis. Von den 38 untersuchten Seris gaben nur 25 mit den 3 Reaktionen dasselbe Resultat. Die grosse Ähnlichkeit in Resultat, zwischen der Agglutination und der Komplementbindung fällt aber sofort auf ; nur in zwei Fällen (Sera XXXIX und XXXII) war die Agglutination schwach und die Komplementbindung deutlich positiv, während in einem Fall (Serum XXXIV) eine negative Agglutination neben einer schwach positiven Komplementbindung zu beob- achten war. Um so mehr fiel darum der grosse Unterschied zwischen diesen beiden Reaktionen einerseits und der Konglutination anderseits auf. Von den 38 Seris gaben 13 ein abweichendes Resultat. Wenn wir dabei die negativen Resultate, welche die drei Reaktionen gemein haben, auszer Acht lassen und betrachten wir die 25 positiven Fälle, welche mit der Komplementbindung erreicht wurden, so sehen wir, dass von diesen 25 Fällen nur 1 1 mit der Konglutinationsreaktion positiv waren. Bei positiven Seris würde man also in 560/0 der Fälle, mit der Konglutina- tionsreaktion ein negatives Resultat erzielen. Sei es, dass die neue Reaktion bei Malleus und auch noch wohl bei Syphilis zu gebrauchen ist, (meiner Meinung nach ist im Laboratorium kein Bedürfnis daran), für die Diagnose von Abortus ist sie unbrauchbar. Aller Wahrscheinlichkeit nach spielt hier die Tatsache, dass das zu untersuchende Serum ein konglutinierendes Serum ist, die Hauptrolle. Ehe ich zu dem letzten Abschnitt »die Wirkung verschiedener Blutsera auf verschiedene Blutarten« übergehe, will ich noch die Aufmerksamkeit darauf lenken, dass an der Konglutinations- methode sei es dass sie in der Zukunft noch in bestimmter Weise zu vervollständigen wäre, noch Fehler kleben, welche wir bei der Komplementbindungsreaktion nicht kennen. Fügt 38 man hier noch hinzu, dass die Übergänge von Konglutination und nicht-Konglutination, also die zweifelhaften Fälle, nicht so deutlich zu beobachten sind (obgleich ich gestehe, dass mit Übung hier viel zu erreichen ist) so habe ich meiner Meinung nach, die wichtigsten Bedenken gegen diese neue Reaktion erhoben. Der Vorteil über die Komplementbindung besteht nur darin, dass nicht nötig ist für jeden Versuch ein Meerschweinchen zu töten. Die Bereitung von hämolytischem Serum is zu einfach um sie als ein Bedenken gegen die Komplementbindung zu nennen. Die Wirkung verschiedener Sera auf verschiedene Blutarten. A. Rinderserum. Um die Wirkung frischen Rinderserums auf verschiedene Blutarten nachzuforschen, bereitete ich von den letzteren jedes- mal eine 5 0/0 Aufschwemmung, brachte davon 3 Tropfen in Röhrchen, welche abnehmende Quantitäten frischen Rinder- serums enthielten, füllte dieselben mit physiologischer Koch- salzlösung an zu gleichem Volumen und stellte die Röhrchen dann 4 Stunden bei 37° C, wonach das Resultat abgelesen wurde. Pferdeblutkörperchen verhalten sich verschieden hinsichtlich frischen Rinderserums. In einigen Fällen beobachtet man Kon- glutination, in andern wieder nicht. Als Regel kann man sagen, dass grössere Quantitäten frischen Rinderserums (0,1 cM^. und höher) Pferdeblutkörperchen (3 Tropfen einer 5 % Aufschwem- mung) hämolysieren. Quantitäten frischen Rinderserums von 0,05 cM^. und weniger wirken bald konglutinierend, bald nimmt man keine Zusammen- ballung wahr. Hammelblutkörperchen werden mittels frisschen Rinderserums konglutiniert. Gewöhnlich beobachtet man noch Konglutination mit einer Quantität von 0,05 und 0,1 cM3. Mit kleineren Quantitäten bleibt Konglutination meistens aus. Dass bei den kleineren Quantitäten die Rede ist von Erschöpfung des Kom- plements (nicht der Konglutinine) geht aus dem Umstand hervor, dass, wenn man frisches Pferdeserum hinzufügt, (von dem man 39 voraus bestimmt hat, dass es keine Konglutinine enthält) auch mit noch kleineren Quantitäten frischen Rinderserums (bis 0,0 1 cM3.) Konglutination erhalten wird. Dasselbe gilt für alle andre Blutkörperchen, die mit frischem Rinderserum konglutinieren. Ziegenhlutkörperchen zeigen viel Ähnlichkeit mit Hammel- blutkörperchen. Mit sehr grossen Quantitäten frischen Rinder- serums (über 0,04 cM^.) beobachtet man Hämolyse ; mit kleineren Quantitäten, bis einer Menge von ungefähr 0,1 cM^., nimmt man Konglutination wahr, während Dosen kleiner als 0,1 cM^. gewöhn- lich keine Zusammenballung der Blutkörperchen veranlassen. Scfnveinebbitkörpcrchen werden konglutiniert mittels frischen Rinderserums bis einer Quantität von 0,2 cM^. und 0,1 cM^. Mit kleineren Quantitäten ist keine Konglutination zu beobachten. Meerschwcinchenblutkörpcrchen werden mittels frischen Rinder- serums viel schneller hämolysiert als die andern Blutkörperchen. Oft beachtet man noch mit Quantitäten von 0,03 cM^. totale Hämolyse. Selbstverständlich werden Rinderblutkörperchen mittels Rinderserum nicht konglutiniert. Auch mit andern ähnUchen Seris und Blutkörperchen ist dies der Fall. B. Pferdeserum. Die roten Blutkörperchen des Rindes, Schafes und der Ziege werden auch mittels grösseren Quantitäten frischen Pferdeserums nicht konglutiniert. Auch wirkt eine Dosis von 0,3 cM-"^. noch nicht hämolytisch auf diese Blutkörperchen. Ebenso wenig beobachtet man Konglutination, wenn man frisches Pferdeserum auf die Schweine- und Meerschweinchenblutkörperchen ein- wirken lässt. Diese beiden letzten Arten von Blutkörperchen werden aber ein wenig leichter hämolysiert ; eine Dosis von 0,2 cM^. wirkt gewöhnlich hämolytisch. C. Schaf serum. Pferdeblutkörperchen werden mittels grösserer Quantitäten frischen Schafserums (bis ungefähr 0,2 cM^.) hämolysiert. Unter dieser Quantität beobachtet man Konglutination ; oft aber kann diese schwach sein. Rinderblutkörperchen zeigen mit frischem Schafserum gewöhn- lich keine Konglutination. Bisweilen aber wirken wohl gros- 40 sere Dosen dieses Serums (über o,i cM^.) konglutinierend. Ziegenblutkörperchen werden nicht konglutiniert mittels frischen Schafserums. Schweinehliitkörperchen werden gewöhnlich nicht kongluti- niert ; bisweilen ist mit grösseren Dosen frischen Schafserums (über 0,2 cM^.) eine schwache Konglutination zu beobachten. Meerschweinschenbhttkörperchen werden mittels Schafserums (ebenso wie dies mit Rinderserum der Fall ist) leichter hämo- lysiert als andere rote Blutkörperchen. Mit kleineren Quanti- täten (unter 0,05 cM^) tritt keine Konglutination ein. D. Ziegenserum. Pferdehlutkörperchen werden mittels grösserer Quantitäten frischen Ziegenserums (über 0,1 cM.^) hämolysiert. Unter dieser Quantität nimmt man gewöhnlich keine, bisweilen aber eine deutliche Konglutination war. Rinder- und H aniynelblutk'àrperchen werden nicht konglu- tiniert. Schiüeineblutkörpcrchcn werden bald nicht, bald wohl kon- glutiniert ; im letzteren Fall durch grössere Dosen Serum (über 0,2 cM3). Meerschweinchenblutkörperchen werden auch mittels frischen Ziegenserums leichter hämolysiert als die andern. Quantitäten von 0,03 cM,^ und darüber wirken gewöhnlich hämolysierend. Unter dieser Dosis tritt keine Konglutination ein. E. Schweineserum. Pferdeblutkörperchen werden hämolysiert mittels grösserer Quantitäten frischen Schweineserums; in einigen Fällen kann die Dosis, wobei noch vollständige Hämolyse dieser Blutkör- perchen eintritt, sehr niedrig liegen (bei 0,03 cM.'^). Mit klei- neren Quantitäten tritt bald Konglutination ein, bald bleibt sie aus, Rinderblutkörperchen werden ziemlich leicht hämolysiert mittels Schweineserums. Mit kleineren Quantitäten (Grenzdosis ungefähr 0,05 cM.^) tritt keine Konglutination ein. Schafeblutkörperchen werden noch leichter hämolysiert mittels frischen Rinderserums. Gewöhnlich wirkt eine Dosis 41 von 0,03 cM.^ noch hämolytisch. Kongkitination tritt nicht ein. Ziegenblutkörperchen und Meerschweinschenblutkörperchen verhalten sich, hinsichtlich frischen Schweineserums, ganz wie die des Schafes. F. Meerschweinchenserum. Frisches Meerschweinchenserum wirkt auf keine einzige der 5 von mir gebrauchten Blutarten konglutinierend. In grösseren Quantitäten (über 0,20 cM.^) ist bei allen Hämolyse zu beob- achten ; bei Rinderblutkörperchen ist diese am schwächsten. Der oben gegeben kurzen Beschreibung der angestellten Versuche mit verschiedenen Scris und Blutarten, will ich sofort zufügen, dass es sehr gut möglich ist, dasz bei Wiederholung der Versuche, kleine Abweichungen, nicht nur hinsichtlich der genannten Quantitäten, sondern auch betreffs des hier und dort Auftretens der Konglutination gefunden werden. Aus vorstehendem Résumé geht genügend hervor, welches Resultat man zu erwarten hat. Wenn man kurz das Resultat dieser Versuche zusammenfasst, stellt es sich heraus, dass man nicht berechtigt ist im allgemeinen zu sprechen von einem Serum, das konglutinierend wirkt. Dies darf man nur tun, wenn man dazu die Art oder Arten der Blutkörperchen in Bezug auf welche es konglutinierend wirken sollte, nennt. Wenn man ja die erzielten Resultate nachliest, so wird es jedesmal klar sein, dass in Bezug auf ein bestimmtes Serum verschiedene Blutarten sich ganz verschieden betragen können. Sogar Rinderserum, das konglutinierende Serum im höchsten Grade, ist oft nicht imstande Pferdeblutkörperchen zu konglutinieren. Es ergibt sich, dass die meisten Sera, in grösseren Quanti- täten, genügende Normalhämolysine enthalten um mehrere Blutkörperchenarten zu lösen ; ins besondere scheint es, dass Meerschweinchenblutkörperchen leicht hämolysiert werden. Schweineserum scheint die grösste Zahl von Normalhämolysinen zu enthalten. Vorstehende Versuche beziehen sich auf frische, eben ge- wonnene Blutsera ; die unten verzeichneten aber sind angestellt 42 worden um nachzuforschen, welche Wirkung inaktives Rinder- serum (1/2 Stunde 58° C.) auf die verschiedenen Blutarten ausübt. Da ich bei diesen Versuchen auf eine eigentümliche Erscheinung gestossen habe, so will ich, um diese Erscheinung deutlich hervorzuheben, die Versuche ganz in Tabellen wiedergeben. Diese Versuche beziehen sich auf 2 verschiedene Rinderseris (R. S. I. & II.), welche ich nach Inaktivierung auf mehrere Blutarten des Pferdes, Schafes, der Ziege, des Schweines und des Meerschweinchens einwirken Hess. Zur Kontrolle wurde jede Reaktion wiederholt, aber nun unter Hinzufügung von Komplement (frisches Pferdeserum P.S.) Die Einwirkung der verschiedenen Flüssigkeiten auf einander geschah bei 37° C. während 4 Stunden, Wieder 4 Stunden später wurden die Resultate abgelesen, nachdem die Röhrchen erst vorsichtig auf dem Finger umgekehrt waren. No. Inaktives Pferdeblut Phys. Frisches Resultat. R. S 1. 5 %■ Na Cl P. S. I 0,4 cM.3 3 Tropfen 0,1 cM3. Konglutination \ gelbl. klareFlüssig- 2 0,3 » » » » V keit mit kleinen, 3 0,2 » » » V ] roten Flöckchen. 4 0,1 » » » » (teilweise). S 0,05 » » » » (teilweise). 6 0.03 » » » keine Konglutination. 7 9,01 » » » » » 8 0,005 » » é » » » 9 0,4 » » S — Konglutination \ vollkommen was- 10 0,3 » » _2 "0 — » y serhelle Flüssig- II 0,2 » » > — » ( keit, in dem sich 12 0,1 » » s — » ( einige schöne, 13 0,05 » » J3 — » \ grosse, dunkelrote 14 0,03 >v » 0 — » / Flocken befinden. 15 0,01 » » "Sj — » (teilweise). 16 0,005 » » Schafeblut 5 % » (teilweise). 17 0,4 » 3 Tropfen < 0,1 cM.3 Konglutination. 18 0,3 » » » 19 0,2 » » » 20 o>i » » » 21 0,05 » » » 22 0,03 » » » 23 O.Ol » » » 24 0,005 » » keine Konglutination. 25 0,4 » » — teilweise Konglutination. 43 No. Inakti ves Schafeblut Phys. Frisches Resultat. R. S. I. 5 %■ Na Cl P. S. 26 0,3 :M.3 3 Tropfen teilweise Konglutiiiation. 27 0,2 » » — sehr geringe » 28 0,1 » » — keine Konglutination. 29 0,05 » » — » » 30 0,03 » » — » » 31 0,01 » » — » » 32 0,005 » » Ziegenblul 5 %• » » 33 0,4 » 3 Tropfen 0,1 cM.3 Konglutination. 34 0,3 » » » » 35 0,2 » » » » 36 0,1 » » » » 37 0,05 » » » » 38 0,03 » » » » 39 0,01 » » 0) » teilweise Konglutination. 40 0,005 » » £ » keine » 41 0,4 » » 3 — » » 42 0,3 » » c — » » 43 0,2 » » K* — » » 44 0,1 » » £ — » » 45 0,05 » » i> — » » 46 0.03 » » jü — » » 47 0,01 » » 0 — » » 48 0,005 » » Schweine- blut 5 %. 1) » » 49 0,4 » 3 Tropfen d 0,1 cM.2 Konglutination. 50 0,3 » » 11 » » 51 0,2 » >' :=i » » 52 0,1 » » » » 53 0.05 » » <; » » 54 0,03 » ■>> » » 55 0,01 » » » » 56 0,005 » » » teilweise » 57 0,4 » » — Konglutination. 58 0,3 » » — teilweise » 59 0,2 » » — keine » 60 0,1 » » — » » 61 0,05 » » — » » 62 0,03 » » — » » 63 0,01 » » — » » 64 0,005 » » Meerschvv.- blut 5 %. » » 65 0,4 » 3 Tropfen 0,1 cM.^ Konglutination. 66 0,3 » » » » 67 0,2 » » » » 44 No. 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 7S 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Inaktives R. S. I. Meerschw. blut 5%. 0,1 cM.' 0,05 » 0,03 » 0,01 » 0,005 >^ 0,4 » 0,3 » 0,2 » 0,1 » 0,05 » 0,03 » 0,01 » 0,005 * Inaktives R. S. II. 0,4 o>3 0.2 0,1 0,05 0,03 0,01 0,005 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05 0,03 0,01 0,005 cM. 97 0,4 98 0,3 99 0,2 100 0,1 lOI 0,05 102 0,03 103 9,01 104 0,005 105 0,4 106 0,3 107 0,2 108 0,1 109 0,05 no 0,03 III 0,01 112 0,005 3 Tropfen Phys. Na CI Pferdeblut 5 %• 3 Tropfen Schafeblul 5 %■ 3 Tropfen Frisches P. S. 0,1 cM.3 0,1 cM.3 Resultat. 0,1 cM.s Konçlutination. teilweise Konglutination. keine Konglutination. Konglutination ^ ym^igkeit ist * ( hellrot gefärbt. » ) teilweise Konglutination. keine Konglutination. — Konglutination Die Flüssigkeit in den Röhrchen isf wasserhell. teilweise Konglutination. Konglutination. teilweise » » » K(jnglutitiation. teilweise Konglutination. » » keine » 45 No. Inaktives Ziegenblut R. S. II. 5 % Phys. NaCl Frisches P. S, Resultat. 113 0,4 cM^. 3 Tropfen 0,1 cM.3 Konglutination. 114 "5 0,3 » 0,2 » » » » » » » 116 0,1 » » » » 117 0,05 » » » » 118 0,03 » » » » 119 0,01 » » » » 120 121 0,005 » 0,4 » » » » teilweise keine » » 122 Ol 3 » » — » » 123 0,2 » » — » » 124 0,1 » » — » » 125 126 0,05 » 0,03 » » » ' » 127 0,01 » » » » 128 0,005 » » Schweine- c » » 129 0,4 » blut 5 %. 3 Tropfen 1) S 0,1 cM.^ Konglutination. 130 131 132 0)3 » 0,2 » 0,1 » » » 0 > » » » » » » 133 134 13s 136 0,05 » 0,03 » 0,01 » 0.005 » » » » » 0 » » » » » » » » 137 138 139 0,4 » 0,3 » 0,2 » » » — teilweise keine » Konglutination. » 140 0,1 » » N — » » 141 0,05 » » c — » » 142 143 144 145 0,03 » 0,01 » 0,005 » 0,4 » » » » Meerschw.; blut 5 %. 3 Tropfen (U C < 0,1 cIVI.3 » » » » » » Konglutination. 146 147 0,3 » 0,2 » » » » » » 148 0,1 » » » » 149 150 0,05 » 0,03 » » » » » » » 151 152 0,01 » 0,005 » » » » » teilweise » » 153 154 155 0,4 » o>3 » 0,2 » » » » — » » keine » » 15Ö 0,1 » » — » » 157 158 159 0,05 » 0,03 » 0,01 » » » » — » » » » » 160 0,005 » » — » » 46 Wenn wir aus vorstehenden Tabellen erst die Resultate be- trachten, erzielt durch die Einwirkung inaktiven Rinderserums auf die verschiedenen Blutarten, unter Hinzufügung frischen Pferdeserums und wir vergleichen diese mit den Resultaten, erzielt durch Einwirkung frischen Rinderserums auf die Blut- arten, so fallen dabei zwei Besonderheiten auf. 1. Durch inaktives Rinderserum + eine konstante Quantität frischen Pferdeserums, ist mit weit kleineren Dosen Konglutina- tion wahrzunehmen, als wenn man nur frisches Rinderserum gebraucht, was zweifellos seine Ursache darin findet, dass bei den kleineren Dosen frischen Rinderserums die Komplement- menge zu gering wird. 2. Das Hämolysieren der verschiedenen Blutkörperchenarten durch die Normalhämolysine aus dem frischen Rinderserum verschwindet fast ganz, wenn man inaktives Rinderserum und frisches Pferdeserum gebraucht. Es scheint, dass die Normal- hämolysine durch das Inaktivieren zum grössten Teil vernichtet werden und dasz frisches Pferdeserum wenig oder keine Normal- hämolysine für die verschiedenen Blutkörperchen enthält. Die wichtigste Besonderheit in vorstehenden Tabellen nimmt man aber wahr, wenn man die Resultate betrachtet, welche erzielt worden sind durch die Einwirkung inaktiven Rinder serums auf die verschiedenen Blutarten, ohne Zufügung von Komplement. Dann fällt sofort auf, dass grössere Dosen inaktiven Rinder- serums die verschiedenen Blutkörperchen (ausgenommen die der Ziege) auch ohne Komplement, konglutinieren können, aber vor allem, dass Pferdeblutkörperchen durch inaktives Rinder- serum, ohne Zufügung von Komplement, noch schöner konglu- tiniert werden als durch inaktives Rinderserum + frissches Pferdeserum. Vergleicht man No. i — 8 mit 9 — 16 so ergibt sich, dass inaktives Rinderserum + frisches Pferdeserum Pferdeblutkör- perchen schon bei einer Dosis von 0,1 cM^. teilweise zu konglutinieren anfängt, während bei 0,03 cM3. gar keine Kon- glutination mehr eintritt. Wenn man nur inaktives Rinderserum gebraucht, ohne frisches Pferdeserum, so beobachtet man erst bei 0,01 cM^. teilweise Konglutination, sodass also das Komplement gerade die Kon- glutination hintertreibt. Auch die Farbe der Flüssigkeit ist 47 anders; obgleich die Flüssigkeit bei No. i — 4 schwachrot gefärbt ist, was verursacht wird durch eine schwache Hämolyse der Blutkörperchen mittels der Normalhämolysine, welche durch die Inaktivierung noch nicht ganz vernichtet sind, bei No. g — 14 ist die Flüssigkeit wie klares Wasser. Die noch anwesenden Normalhämolysine finden hier kein Komplement um die Blut- körperchen zu hämolysieren, sodass man also gelangt zu der wichtigsten Tatsache: »ohne Komplement keine Hämolyse; ohne Komplement wohl Konglutination«. Wenn man in den Tabellen No. 81 — 88 mit No. 8g — g6, wobei ein andres, inaktives Rinderserum gebraucht wurde, ver- gleicht, so gelangt man zu demselben Resultat ; auch geht die Konglutination eben so gut weiter ohne Komplement als mit Komplement. Auch die Art der Flocken ist anders. Wenn Komplement anwesend ist, so teilen die niedergeschla- genen Blutkörperchen sich, nach schwachem Umschütteln, in feine Flöckchen ; ist kein Komplement anwesend, so beobachtet man in einer wasserhellen Flüssigkeit nur i à 2 schwere Flocken. Bei allen andern Blutarten (ausgenommen die der Ziege) ist auch diese Konglutination wahrzunehmen, aber nur, wenn grössere Quantitäten inaktiven Rinderserums gebraucht werden. Diese Versuche mit Pferdeblutkörperchen und inaktivem Rinderserum habe ich wiederholt mit 20 verschiedenen inaktiven Rinderseris und verschiedenen Arten von Pferdeblutkörperchen. Bei allen diesen Versuchen stiess ich nur einmal auf ein inaktives Rinderserum, das ohne Komplement Pferdeblutkörper- chen nicht zu konglutinieren vermochte ; bei allen andern trat ohne Hinzufügung von Komplement eine schöne Konglutination ein, welche Konglutination in allen Fällen auch wieder schöner war, als wenn Komplement hinzugefügt worden war. Auf diese wichtige Erscheinung: »Ohne Komplement doch Konglutination«, was nicht passt in der Theorie von BORDET und Gay über das Wesen der Konglutination, hoffe ich später zurückzukommen. Das Einzige was man anführen könnte ist, dass man es in den Fällen wo Konglutination auftritt ohne Komplement, nicht zu tun hat mit Konglutination im vollsten Sinne des Wortes, sondern mit Agglutination. LITERATUR. 1. Ehrlich und Sachs. Berl. Klin. Wochenschr. 1902. S. 492. 2. BoRDET et Parker Gay. Annal, de l'Inst. Past. Bd. 20, S. 467. 3. Bürdet et Streng. Centr.bl. f. Bakt. orig. Bd. 49, S. 260. 4. Sachs und Bauer, Arb. a. d. Königl. Inst. f. experiment. Therapie zu Frankfort am Main. 1907. 5. Streng. Zeitschr. f. Imm. forsch. Orig. Bd. 2, S. 415. 6. Idem. Centr.bl. f. Bakt. orig. Bd. 50, S. 47. 7. Cohen. Annal, de l'Inst. Past. Bd. 23, S. 273. 8. Gay and Lucas. Proc. of the Society f. exp. Biol. and Med. 1910. 9. Swift and Thro. Arch. Intern, med. 19 11. IG. Luger. Centr.bl. f. Bakt. orig. Bd. 65, S. 390. 11. Sauli. Zeitschr. f. Imm. forschr. orig. Bd. 9. S. 359. 12. Streng. Finska läkares ällskapets handlingar. 19 10. 13. Karvonen. Arch. f. Dermat. u. Syphilis. Bd. 108. Heft 3. 14. Siebert und MiRONESCU. Deutsche med. Wochenschr. 191 1. S. 2084. 15. Hecht. Berl. Klin. Wochenschr. Bd. 1912. S. 58. 16. Jacobäus. Zeitschr. f. Imm. forsch, orig. Bd. 8, S. 445. 17. Streng. Zieglers Beiträge zur path. Anatomie. Bd. 51, S. 279. 18. Pfeiler und Weber. Berl. tierärztl.Wochenschr. i9i2.No.43,S.785. 19. Idem. » » » » » 47, » 873. 20. Idem. Zeitschr. f. Inf. Kr.heiten der Haustieren. Bd. 12, S. 397. 21. Stranigg. Zeitschr. f. Inf. Kr.heiten der Haustiere. Bd. 14, S. 166, S. 297. IMMUNISATION ARTIFICIELLE CONTRE LA PIROPLASMOSE DU BÉTAIL EUROPÉEN IMPORTÉ AU BRÉSIL PAR L. MISSON. Directeur de r Industrie Animale de V Etat de Sao Paulo. Dans un article publié précédemment dans le numéro du 1er Août 1912, des Annales de Gembloux, en même temps que je justifiais l'importation au Brésil des meilleures races de bétail européen, dans le but de les croiser avec les races indigènes, j'indiquais les insuccès qui avaient marqué les premières impor- tations et la raison principale de ces échecs. Je veux parler de la piroplasmose bovine, connue dans presque toute l'Amérique du Sud sous le nom de tristeza. Pour la clarté de cet article, je reverrai rapidement tout ce que j'ai déjà dit au sujet de cette maladie, la découverte, par NUTTAL et Hadwen, des effets du bleu de trypan sur le protozoaire qui en est la cause et enfin les expériences aux- quelles se sont livrés Stockman à Londres et le Dr. Theiler dans l'Afrique du Sud. Avec mon collègue et ami le Dr. RaQUET, qui à ce moment était chargé de l'organisation du Poste Zootechnique de Sao Paulo, nous pûmes déjà, en 1907, avec les animaux importés à cette époque, arriver à la conclusion que la maladie, jusqu' alors non déterminée, qui décimait le bétail importé, n'était autre que la piroplasmose bovine, produite par le piroplasma bigeminum, transmis aux animaux par les tiques et constater, d'accord avec les indications de SMITH et KiLBORNE, que ce piroplasma produisait une maladie très grave, contre laquelle les animaux étaient généralement immunisés après une première attaque assez forte. 4 50 Il nous fut possible aussi de constater que les pertes étaient beaucoup moindres lorsque l'on avait soin de prendre les pré- cautions suivantes : i". de n'importer que des animaux jeunes, âgés de 12 à 14 mois, qui, toujours se sont montrés beaucoup plus résistants que les animaux ayant atteint leur complet développement; 2'^. de s'abestenir d'importer des génisses pleines, qui toujours avortent quand elles sont atteintes de la maladie et souvent y succombent ; 3^. de ne faire l'importation au Brésil que pendant la saison d'hiver, d'Avril à fin Septembre, afin que les ^animaux souffrent moins du changement de climat ; 40. afin de pratiquer le plus tôt possible l'immunisation naturelle par l'application de tiques virulents en quantité limitée, ou l'immunisation artificielle par l'injection sous-cutanée, aux animaux importés, de sang virulent d'un animal rétabli depuis peu d'une attaque de piroplasmose. Lors des importations qui furent faites les années suivantes, il fut tenu compte des conseils énumérés plus haut et les pertes, qui autrefois étaient de go 0/0 et plus, diminuèrent rapidement ; elles furent réduites à 33 0/0 c" 1908, à 13 0/0 en 1909 et tombèrent à 7 0/0 en 19 10. En 191 1, elles furent un peu plus élevées. En présence de cette importante diminution de la mortalité, les importations augmentèrent rapidement et pendant les 4 dernières années, j'ai acheté en Europe, tant pour le Gouver- nement que pour les particuliers dont l'Etat subventionnait les achats, de 51 bovidés en 1909, de 115 en 1910, de 115 en 191 1 et de 138 en 191 2, soit un total de 419 en 4 ans. Par les études réalisées à Sao Paulo, tant par le Dr. CariNI, Directeur de l'Institut PASTEUR, que par notre service vétéri- naire et spécialement par le Dr. LuiZ PiCOLLO, qui pendant longtemps fut le seul vétérinaire de la Direction de l'Industrie animale, nous avons pu nous convaincre que la piroplasmose existe pour ainsi dire dans toutes les fermes de l'Etat de Sao Paulo, où tous les animaux bovins qui y sont nés et qui y ont été élevés ont eu la maladie et conservent dans le sang le piroplasme virulent. La meilleure preuve de ce que j'avance réside dans le fait PLANCHE I. Folia Microbiologica III. (Misson). Tiques avec leurs œufs, chaque division correspond à un milimètre carré. PLANCHE II. Folia Microbiologica III. (Misson). Jeunes tiques sur un pieux d'enclos. 5î que de 721 vaches et génisses qui ont été envoyées au Poste Zootechnique Central depuis sa fondation, de tous les coins de l'Etat, pour les reproducteurs du Gouvernement, une seule, a été atteinte de tristeza. Il s'agissait d'une génisse née et élevée dans un étable de la ville, qui n'avait jamais été piquée par les tiques, et qui, par conséquent, n'avait jamais pu avoir la maladie ni être immunisée. Aucune des autres, provenant des fermes d'élevage de l'inté- rieur du pays, n'a présenté le moindre signe de maladie, ce qui prouve que toute étaient déjà immunisées et que, par con- séquent, la tristeza existait dans les fermes d'où elles venaient. Il est donc indispensable, que tous les reproducteurs bovins importés soient eux-mêmes immunisés de suite, si nous voulons que plus tard, quand ils auront acquis un plus grand dévelop- pement et que, pour cette même raison, ils seront plus sen- sibles, ils ne succombent pas à la maladie. Les recherches effectuées par le Dr. CarINI lui ont permis de constater que nous possédons aussi, à S~'o Paulo, V anaplasma marginale, découvert par le Dr. ARNOLD Theiler au Transvaal en 1910, et que les animaux importés sont très souvent atteints des deux maladies, la seconde, l'anaplasmose étant généralement plus grave encore que la première. Immunisation. En 1909, le professeur NUTTALL, de Cambridge, en colla- boration avec Hadwen, montrait l'efficacité de l'application du bleu de trypan dans la piroplasmose du chien et cette efficacité fut confirmée, quelque temps après par des expériences de Mr. JOWETT, de Capetown, et du Dr. K. F. Meyer, de l'Institut bactériologique d'Onderstepoort. Peu après, NUTTALL et Hadwen entreprirent de nouvelles expériences ayant pour but d'étudier les effets de ce même médicament sur les animaux souffrant de la piroplasmose bovine, et ils conclurent que le bleu de trypan serait probablement un remède efficace pour le traitement de la piroplasmose. Ils prouvèrent de plus que ce médicament n'avait aucun effet nui- sible sur la santé des animaux. La même année, Mr. Stockman, chef du service vétérinaire 52 du Gouvernement anglais, de Londres, entreprit une série d'ex- périences qui corroberèrent pleinement les résultats obtenus par NUTTALL. Enfin, le Dr. Theiler, de Pretoria, confirma abso- lument les observations précédentes dans un article très complet qu'il publia en Novembre 1911 dans »1' Agricultural Journal of South Africa«, en conseillant franchement son emploi dans les cas d'infection artificielle. Jugeant cette découverte comme étant d'une importance capitale pour les éleveurs de SSo Paulo, je fis la traduction complète de cet article et le publiai dans le »Criador Paulista« de Décembre 191 1. Peu de temps après, le 18 Février 1912, j'eus l'occasion d'appliquer le bleu de trypan sur un taureau BoUed Angus, importé d'Argentine, qui était bien attaqué de piroplasmose contractée naturellement. Il était déjà atteint d'hématurie et l'examen microscopique démontra la présence de nombreux piroplasmes dans le sang. Je dois ajouter que cet animal était déjà d'un certain âge, ce qui, ajouté au fait que l'immunisation était naturelle, rendait la guérison plus difficile. Il lui fût appliqué 200 cent, cubes de solution de bleu de trypan, et l'effet de cette injection sous cutanée ne se fit pas attendre. Les parasites, très nombreux dans les préparations faites avant l'injection, avaient disparu complètement dans celles qui furent préparées avec le sang prélevé le lendemain ; l'urine rouge avait cessé et le taureau, fort triste la veille mangeait et ruminait comme un animal absolument sain. Le 5 et le 12 Mars, deux nouvelles injections de bleu de trypan furent faites, absolument dans les mêmes conditions, sur deux génisses de même race, toutes deux se rétablissant par- faitement en quelques jours. Je dois faire remarquer que ces résultats, tous obtenus dans des cas d'infection naturelle^ sont d'autant plus remarquables, que 3 autres animaux, (i taureau et 2 génisses), de même race, de même âge et de même origine, qui ne furent pas traités lorsqu'ls tombèrent malades, (parce que à ce moment le remède n'était pas encore connu ici), moururent tous trois, rapidement, peu de temps après l'apparation de la maladie. D'autres applications de bleu de trypan furent faites plus tard par le service vétérinaire de la Direction de l'Industrie animale : 53 1°. le I e»" Mars, sur une génisse Hereford importée d'Argentine et atteinte d'anaplasmose, confirmée par l'examen microscopique. Elle mourut subitement, le même jour ; 2^. le 14 Mars, sur une génisse Schwyz née au Poste Zoo- technique Central, atteinte de anaplasmose? et qui était guérie le 20 du même mois ; 3". le 15 Avril, sur une autre vache Hereford importé d'Ar- gentine, infectée naturellement de piroplasmose, et qui de même, guérit rapidement. Tous ces animaux, traités par le bleu de trypan, depuis 10 mois, ont, à diverses reprises, été attaqués et infectés par les tiques, au Poste Zootechnique Central ou dans les fermes de l'intérieur où ils ont été envoyés et où quelques uns vivent en pleine liberté dans la campagne. Aucun d'eux, jusqu'à présent, n'a présenté le moindre signe de nouvelle atteinte de la maladie. Non seulement ils ont été guéris, mais ils sont donc par- faitement immusisés. Nous pouvons en déduire : Que dans certains cas, c'est à dire lorsque l'injection sous cutanée de la solution de bleu de trypan est faite au moment opportun, ce remède peut être efficace dans les cas de piroplas- mose contractée naturellement, mais, comme le dit très bien le Dr. Theiler dans son article, il ne faut pas généraliser, car souvent l'intervention dans ces cas naturels peut arriver trop tard. C'est surtout dans l'immunisation artificielle contre la piro- plasmose que ce remède est utile, car il permet d'en contenir et d'en réduire le danger. Il a soin d'ajouter que cette immu- nisation artificielle doit être faite par des personnes compétentes, disposant en même temps du matériel nécessaire. Immunisation artificielle. En vue des heureux résultats obtenus par StOCKMAN à Londres et surtout par Theiler au Transval, j'avais demandé, en Janvier dernier à la Secretaria d'Etat, à ce que tous les reproducteurs d'espèce bovine que je devais acquérir cette année en Europe, tant pour le Gouvernement que pour les fermiers de l'Etat, fussent immunisés artificiellement, aussitôt leur arrivée au Brésil. 54 Par suite de circonstances spéciales, lors de mon retour au Brésil, le Novembre dernier, je retrouvai tous ces animaux, (arrivées depuis le 23 Août à Sao Paulo), conservés dans les étables et baignés périodiquement dans une solution de sarnol, pour les empêcher d'être piqués par les tiques et infectés de Piroplasmose. A un moment donné cependent, vers le commencement de Septembre, quelques uns d'entre eux, (28 de différentes races), avaient été lâchés dans la prairie, mais comme 6 d'entre eux étaient morts, à la suite d'une infection naturelle de Piroplas- mose, on les avait ensuite rentré tous et protégés contre une nouvelle infection. Vu le péril qu'il pouvait y avoir à laisser l'infection se pro- duire naturellement et la nécessité de ne vendre, à la hausse publique annuelle, aux èlevours de l'Etat, que des animaux dûment immunisés, je m'empressai de solliciter de Mr. le Dr. PAULO DE MORAES, Secrétaire de l'Agriculture, l'autorisation de pratiquer, sur tous les animaux, importés par le Gouvernement, l'immuni- sation artificielle contre le piroplasmose, que je demandais à pouvoir appliquer, depuis plusieurs années, en employant en même temps le bleu de trypan, c'est à dire le procédé découvert par NUTTALL et Hadwen et recommandé par Stockman et Theiler. Le Dr. PAULO DE MORAES. très compétent en la matière, discuta longuement avec moi cette question, qui l'intéressait vivement, non seulement parce que médecin distingué, mais encore comme Secrétaire de l'Agriculture soucieux des intérêts de son département, et s'empressa de m'accorder l'autorisation demandée. Je dois ajouter que pendant les deux mois que durèrent ces immunisations, ce me fût un réel plaisir et un grand stimulant que de voir l'intérêt qu'il montrait aux ren- seignements que je lui donnais chaque semaine sur la marche des immunisations. L'autorisation n'ayant été accordée le 17 Novembre, je choisis, le lendemain, comme sujets de la première expérience, parmi les animaux importés cette année d'Europe, 8 bovins qui, d'après les notes du service vétérinaire, n'avaient présenté aucun signe de maladie depuis 3 mois qu'ils étaient arrivés. Nous choisîmes ensuite, avec Mr. M. ROUSSEAU, le chef du service vétérinaire, TLANCHE III. Folia Microbiologica III. (Misson), Taureau llamand >Jan II«, malade de Piroplasmose sous forme naturelle (Rétabli par la suite». 55 2 jeunes taureaux de race flamande, tous deux de la même importation que les autres, mais qui avaient eu la piroplasmose, bien caractérisée, au commencement d'Octobre et chez lesquels il y avait presque certitude de trouver du sang virulent en même temps que la probabilité de ne pas rencontrer d'ana- plasmose dans ce sang. Je fis prendre, pour cette première expérience, du sang de 2 animaux différents, afin de déterminer, si possible, pour les expériences suivantes, le degré de virulence du sang de chacun d'eux et d'obtenir ainsi, pour les infections futures, un animal dont le sang pût s'employer avec certitude de transmettre la piroplasmose à des animaux jusqu'alors indemnes. Le premier essai nous montra que tous deux possédaient un sang virulent et par la suite, nous fûmes à même de constater que ce sang était libre d'anaplasmes. Lors de la première expérience, une partie des injections furent faites avec du sang pur, les autres avec le même sang défibriné, sans que les résultats fussent différents quant à l'infection. Pratique de l'immunisation par Theiler. La pratique de l'immunisation est assez simple. Les animaux importés étant un peu remis de leur voyage, on fait à chacun d'eux, au moyen d'une seringue, une injection sous-cutané de 5 c. cubes de sang virulent pris à la jugulaire d'un animal remis depuis peu de temps de la piroplasmose. Vers le 5ème ou le 6ème jour, la fièvre se déclare et la température augmente sensiblement; vers le yème jour, parfois un peu plus tôt, les piroplasmes commencent à apparaître dans le sang, tandis que le jour suivant, les lamelles microscopiques décèlent la présence d'un nombre beaucoup plus considérable de parasites et que, parfois, apparait en même temps l'urine rouge. A ce moment, c'est à dire lorsque les piroplasmes sont nom- breux, en pratique une injection sous-cutanée de 100 à 200 c. cubes, (200 ce. pour des animaux de 600 kgs. de poids vif), d'une solution de bleu de trypan à la dose de 1 gramme de cristaux de bleu de trypan pour 100 c. cubes d'eau bouillie et refroidie. 56 Après l'injection de bleu de trypan, on note presque toujours une augmentation presque immédiate de la température ; elle est probablement due à la destruction des parasites et à la mise en liberté rapide des toxines dans le plasma du sang. Après 24 ou 48 heures, elle redevient presque toujours normale. Parfois, les parasites, qui semblent complètement éliminés immédiatement après l'injection, réapparaissent dans le sang après quelques jours mais toujours en petite quantité, ce qui indique bien que la préparation ne détruit pas tous les parasites. Jamais cependant, ces piroplasnies qui restent ne produisent de rechute de la maladie. Le bleu de trypan ne tuant pas tous les parasites dans le sang, la conséquence doit être une immunité durable. Je ne veux pas étudier séparément les différentes expériences faites dernièrement ; je préfère donner tout d'abord le tableau des temperatures constatées chez tous les animaux infectés artificiellement et traités par le trypanbleu d'abord avec les indications ci-dessus et indiquer ensuite les observations les plus intéressantes qu'il nous a été donné de faire. Dans les expériences faites ici, on voit donc que sur 72 animaux qui ont été infectés artificiellement, avec du sang virulent d'un animal ayant eu la piroplasmose par suite d'une infection naturelle, 62 ont réagi, c'est à dire qu'ils ont eux- mêmes eu la piroplasmose, parfaitement caractérisée par l'examen microscopique du sang. La réaction, c'est à dire la présence de nombreux piroplasnies dans le sang, sur les lamelles préparées, a été constatée : dans 2 cas, le 5ème jour après l'infection, 16 cas, le 6ème 15 cas. le aème 9 cas, le gème 10 cas, le çème 9 cas. le loème I cas. le I^ème \Jurine rouge a été notée dans 4 cas seulement. Uinjection sous-cutanée de la solution de bleu de trypan, faite chaque fois par moitié à Vendrait même de Vinfection, par moitié du coté opposé toujours derrière l'épaule, presque Folia Microbiologica III. (Misson). '&, "^ rt « '^ bn s a rr C- >, ■*-• (I) » 15 taureaux Schwyz infectés, 7 » » » 10 génisses Schwyz infectées, 10 » » » 6 » flamandes infectées, 6 » >' soit un total de 62 réactions sur 72 infections artificielles. 10 de ces animaux n'ont pas présenté de réaction, ce sont: 8 taureaux Schwyz, i taureau Hollandais et i génisse Hollan- daise, mais on ne peut cependant en déduire que les taureaux Schwyz aient été plus résistants. Cette apparence de plus forte résistance provient de ce que ces animaux, qui comme tous les autres, étaient ici depuis le 23 Août, c'est à dire depuis 4 mois, avaient été lâchés dans la prairie peu de temps après leur arrivée, au commencement de Septembre, avaient étépiqués par les tiques et, par la suite, avaient eu la piroplasmose. Chez 59 quelques uns d'entre eux, elle fut parfaitement constatée, chez d'autres, au contraire, elle était passée inaperçue. Tous cepen- dant avaient acquis une immunité suffisante pour résister à une nouvelle infection, puisqu'aucun d'entre eux n'a présenté de température abnormale pendant toute la période d'observation qui suivit l'infection artificielle et que, toujours, l'examen microscopique des lamelles préparées avec leur sang a été négatif. Huit jeunes taureaux flamands qui faisaient partie de la même importation ont été malades, la plupart atteints de piroplasmose comme suite à une infection naturelle, fin Septembre ou commen- cement d'Octobre, mais tous se sont rétablis assez rapidement, sans qu'il fut nécessaire de leux appliquer le bleu de trypan. Ce fait, qui semblerait montrer que l'infection qui se produit à cette époque, c'est à dire vers la fin de l'hiver ou le commencement du printemps, serait moins grave que celle qui se déclare, (ici au Poste) de Décembre à Février, ou que les tiques sont à ce moment moins nombreux ou moins virulents, confirme par conséquent ce que j'ai toujours dit de l'avantage qu'il y a à importer les animaux en hiver, (fin Mai à fin Août au Brésil), et à les immuniser le plus tôt possible après leur arrivée. Dans les nombreuses expériences faites ici, nous avons seu- lement eu 4 cas dans lesquels l'urine rouge a été constatée, sans que cependant les animaux sur lesquels elle fut observée présentissent des symptômes plus graves que les autres et sans que leur guérison fut plus lente. Lors de la troisième expérience, en plus des infections pra- tiquées avec le sang des taurillons flamands qui donnèrent toujours des infections bien caractérisées, il en fut fait trois autres, à deux taureaux Schwyz et à un taureau Hollandais, avec 5 ce. de sang d'un taureau No. 3, qui avait été atteint de piroplasmose le 25 Septembre, à la suite d'une infection naturelle. Aucun d'entre eux ne présent de réaction, les deux Schwyz, pendant les 12 jours qu'ils restèrent en observation accusant des températures toujours comprises entre 38° et 39°, la tem- pérature du Hollandais, pendant la même période, oscillant entre 38°4' et 39°8'. A aucun moment il ne fut possible de constater la présence de piroplasmes dans le sang d'aucun d'entre eux. 6o A la suite de ce résultat négatif, qui pouvait s'attribuer à la non virulence du sang employé ou bien à ce que les 3 autres taureaux avaient déjà acquis l'immunité, je résolue de les sou- mettre tous à une nouvelle infection, cette fois avec du sang du taurillon flamand, dont la virulence était bien connue. Je fis en même temps infecter, avec le même sang, le taureau Schwyz No. 3 dont le sang n'avait pas produit de réaction sur les 3 autres. Des recherches faites dans les notes du service vétérinaire, j'avais pu voir que ce taureau, lorsqu'il avait été malade en Septembre, avait reçu une injection de bleu de trypan. Tous quatre réagirent cette fois-ci parfaitement, comme on peut le voir par le diagramme ci- joint des températures enregistrés chez le taureau Schwyz Medor No. 3 et par celui du taureau Hollandais »Concurrent« No. 342. Tandis que l'injection de bleu de trypan était faite en temps voulu aux trois premiers, c'est à dire lorsque leur sang accusa, au microscope, le présence de nombreux piroplasmes, je m'ab- stins d'appliquer ce remède au taureau No. 3 lorsque, le yème jour, sa température atteignit 40°2' et lorsque son sang ren- fermait de nombreux piroplasmes. Je voulais voir si l'infection naturelle qu'il avait subie précé- demment lui avait conféré l'immunité. Comme il est facile de le voir par le diagramme, sa tempé- rature descendait dès le lendemain à 39°8' et, 10 heures plus tard, elle était retombée à 38°4' à la normale. Quant aux piro- plasmes, ils étaient déjà beaucoup moins nombreux le Sème jour. On peut donc en conclure que le taureau était déjà immu- nisé et que la présence du bleu de trypan injecté 3 mois plus tôt empêchait encore l'évolution des piroplasmes qui lui furent injectés lors de l'infection avec le sang virulent. On peut aussi en déduire que, probablement à cause de l'injection de bleu de trypan faite 3 mois et 6 jours auparavant, son sang avait perdu sa virulence. C'est là un point important, parce qu'il nous indique que le sang d'un animal traité par le bleu de trypan perd sa virulence pendant un temps plus ou moins long et qu'il faut s'abstenir de l'employer pour les infections artificielles peu de temps après l'application de ce remède. 6t Une déduction plus importante encore, c'est que son emploi nous sera d'un grand appoint dans la lutte contre la Piroplas- mose. En effet, il est bien probable que tous les tiques qui auront, pendant îine période de j mois au moins, attaqué un animal traité par le bleu de trypan, dont le sang, comme nous venons de le voir, ne sera pas virulent, ne s'infecteront pas eux-mêmes et ne donneront pas naissance à des tiques virulents. La Piroplasmose se transmettra donc moins et tendra par conséquent à disparaître. Dans la Piroplasmose contractée par suite d'une infection natu- relle, Vavortement est une conséquence presque inévitable de la maladie. Lors des essais que nous avons faits ici, plusieurs génisses étaient en état de gestation plus ou moins avancée, mais aucune d'elles n'a avorté, toutes ont parfaitement supporté la maladie produite artificiellement. Pendant tout le temps que les animaux ont été en observation, ils se sont conservées dans d'excellentes conditions, presque toujours ils ont mangé et ruminé parfaitement; c'est à peine si quelques uns d'entre eux, et ils sont peu nombreux, ont montré un peu d'inapétence après l'injection de la solution du bleu de trypan, c'est à dire au moment ou la fièvre était la plus forte. Jamais cependant nous n'avons du intervenir et aucun des animaux en traitement, pendant toute la période d'observation, n'a reçu le moindre médicament ou même le moindre stimulant. Les premières expériences m'avaient fait voir parfaitement la différence entre la piroplasmose naturelle et la piroplasmose artificielle avec emploi du bleu de trypan quant à l'état de santé des animaux avant et après la maladie. Dans la piroplasmose contractée naturellement, les animaux souffrent en effet un temps plus ou moins long et leur conva- lescence est souvent lente. Après la maladie ils sont toujours très affaiblis, manquent presque complètement d'appétit et généralement maigrissent a vue d'oeil. Leur convalescence est presque toujours fort longue. Dans l'infection artificielle, au contraire, ils souffrent géné- ralement très peu ; la maladie en effet évolue rapidement et est presqu' instantanément arrêtée par l'injection de bleu de Folia Microbiologlca III. (Misson). : - u e c •"SUS °3 ^ § '^, •^ '.^^■- :i- S ; 7^ 5 •^ ■ä J f^ 4 41- ff' 1 é B ^ 63 trypan ; les animaux ne cessent pour ainsi dire pas de s'alimenter parfaitement. La conséquence est qu'il est presque impossible à une per- sonne non prévenue de noter que les animaux sont malades. Dans les expériences ultérieures, afin de m'assurer de l'avantage de l'infection artificielle, j'ai pesé les animaux avant l'infection et à leur sortie de l'infirmerie mais les différences n'étaient pas bien fortes. Je dois faire remarquer que nulle modification n'a été apportée dans la nourriture de ces animaux pendant tout le temps qu'ils ont été traités et sont restés en obser- vation ; leur alimentation est toujours restée la même depuis qu'ils étaient ici. Nous pouvons tirer une autre preuve de l'avantage de cette méthode du fait intéressant qu'une génisse flamande, celle qui justement a accusé la température la plus haute, (42°4)', a présenté des signes de chaleur et a été fécondée 14 jours après avoir montré cette fièvre si forte ainsi que de l'hémoglobinurie et qu'une autre génisse Schwyz, dans le sang de laquelle on avait trouvé de nombreux piroplasmes le 14 Décembre, se trouvait dans le même cas 8 jours plus tard. Ces manifestations physiologiques spéciales montrent bien que les animaux se rétablissent rapidement de l'infection artificielle combinée avec l'application du bleu de trypan. Pour les animaux qui ont déjà été infectés, l'infection artifi- cielle par injection de sang virulent ne présente aucun danger, à la condition naturellement, que cette injection soit faite avec les précautions antiseptiques indispensables. Comme il est facile de le voir par le tableau de toutes les températures constatées chez tous les animaux immunisés, plusieurs d'entre eux n'ont présenté aucune modification dans la courbe des températures pendant toute la période d'observation. L'infection avec du sang virulent constitue dans ce cas un véritable réactif négatif et permet de s'assurer si certains animaux qui sont douteux ont été réellement immunisés, ou si, au contraire, ils sont encore sensibles. Les principaux avantages de cette méthode résident dans le fait qu'elle est rapide, pratique et économique. Elle est pratique, parce qu'elle permet, par l'examen des températures constatées, de suivre le développement de l'in- 64 fection pour ainsi dire heure par heure et, lorsque cette tem- pérature monte brusquement, de faire l'examen microscopique du sang, qui, presque chaque fois, à ce moment, décèle la présence des piroplasmes en plus ou moins grande quantité. A plusieurs reprises, pendant les expériences dont nous nous occupons, un seul examen du sang a suffi et très rarement il fut nécessaire de répéter cet examen plus de deux fois pour acquérir la certitude que les piroplasmes étaient nombreux et qu'il était nécessaire de pratiquer l'injection de bleu de trypan. L'examen microscopique du sang est cependant absolument nécessaire lorsque cette immunisation doit être faite méthodique- ment, car il arrive que, pendant les premiers jours après l'infection, l'augmentation de la température ne correspond pas toujours avec l'apparition des piroplasmes en nombre plus ou moins considérable. Ce système est infiniment plus méthodique et par conséquent plus sûr que l'infection naturelle, dans laquelle la période d'incubation est plus lente et dans laquelle le moment où il est nécessaire d'intervenir est plus difficile à déterminer. // est rapide, car dans la grande majorité des cas que nous avons traités, il n'a pas fallu plus de lo à ii jours pour que les animaux infectés fussent guéris parfaitement rétablis. Dans l'immunisation artificielle, la période qui s'écoule entre le moment où l'animal est infecté par les tiques et celui où l'infection se déclare parfaitement est toujours plus longue, l'animal souffre et s'affaiblit beaucoup plus, de sorte que, même si l'on intervient à temps avec le bleu de trypan, il s'écoule un temps beaucoup plus long avant qu'il ne soit parfaitement rétabli. // est économique, parce qu'il est plus rapide. Si nous prenons comme exemple les animaux que nous avons immunisés dernièrement au Poste Zootechnique Central, il est facile de calculer l'économie qui aurait été réalisée par le Gouvernement si cette immunisation artificielle avait été pratiquée sur les 72 animaux peu de temps après leur arrivée. Ces animaux sont arrivés le 23 Août et conservés ici pour être immunisées jusqu'au 1er Février, c'est à dire pendant 160 jours. Je dois ajouter que malgré cela beaucoup d'entre eux n'avaient 65 pas eu la tristeza et que le but que l'on se proposait n'avait par conséquent pas encore été atteint. Si nous calculons, ce qui est loin d'être exagéré, qu'ils coûtent par jour, pour le nourriture et les soins, 2 francs par tête, nous aurons, comme dépense totale pour les 72 animaux, pendant ce laps de temps, une somme de 2 X 72 X 160 ou 23,040 frs. Si l'immunisation de ces reproducteurs avait été commencée une quinzaine de jours après leur arrivée, c'est à dire aussitôt qu'ils auraient été remis des fatigues du voyage par mer, il ont été parfaitement possible, en immunisant la moitié chaque fois, de tout terminer vers la fin du mois de Septembre. Ces animaux, dans ces conditions, auraient coûté à l'Etat, qui se charge de leur nourriture et de leur entretien pendant la période d'accli- matation, (réduite dans ce cas à 40 jours environ), une som me de 2 X 72 X 40 ou 5.760 frs. On aurait donc, de cette façon, réalisé une économie de 17.280 frs. Il convient d'ajouter que le temps pendant lequel tout ces animaux ont été conservés ici pour être acclimatés, correspond exactement à la saison de monte, torminée maintenant, et que l'Etat ou les particuliers qui les ont importés, et qui ne pourront plus guère les employer avant le printemps prochain dans leurs troupeaux, ont perdu les produits de toute une saison. Si l'on estime seulement à 10 le nombre de veaux que chacun pouvait produire cette année et que l'on compte que ces produits, pour le moins de demi-sang, aient seulement une valeur de 80 frs. par tête, on arrive à constater pour l'élevage une porte de 57.600 frs. Comme je l'ai dit plus haut, en résumant le tableau des températures constatées, 10 animaux, sur les 72 immunisés, n'ont pas réagi à la suite de l'infection artificielle parce qu'ils avaient acquis l'immunité par suite d'une infection naturelle. 7 taureaux flamands, un taureau Schwyz et un taureau Hollandais étaient dans le même cas. Cette immunisation naturelle de 19 animaux, pour quelques uns desquels on a employé le bleu de trypan, n'a pas été obtenue qu'avec une porte de 5 autres, morts en Septembre ou commen- cement d'Octobre, de piroplasmose parfaitement caractérisée, soit de près de 21 %. 5 66 Il est donc probable que si les 62 animaux qui ont réagi à l'immunisation artificielle et qui par conséquent étaient encore sensibles, avaient été immunisés naturellement, nous aurions eu, parmi eux, une perte d'au moins 21 ^/^ soit de 15 animaux, dont il conviendrait encore d'ajouter la valeur aux deux sommes indiquées plus haut pour évaluer l'économie totale que le Gouver- nement aurait réalisée si l'immunisation artificielle, avec emploi de bleu de trypan, avait été pratiquée de suite après l'arrivée des animaux. Chez certains des animaux, chez lesquels l'injection de la solution de bleu de trypan, appliquée lorsque les piroplasmes étaient nombreux et la fièvre assez forte, a provoqué cependant un abaissement assez rapide de la température, on constate assez souvent, après quelque temps, (du iième au i5ème jour), une nouvelle poussée de fièvre avec une température parfois aussi élevée que celle notée au moment de la première. Le cas s'est présenté chez plusieurs des animaux qui ont été traités ici, comme on peut le voir par le diagramme du taureau »Concurrent«, mais, quoique on ne soit jamais intervenu, il ne s'est jamais produit de rechute de la maladie, et après quelques jours, la température revenait à la normale et l'animal recouvrait tout son appétit, qui avait un peu diminué pendant 2 ou 3 jours. Cette fièvre secondaire correspond probablement à la réapparition dans le sang, de piroplasmes qui paraissaient avoir disparu complètement de suite après l'injection de bleu de try- pan, et elle vient confirmer l'affirmation de NUTTALL que le remède ne tue pas tous les protozoaires. Preuves de Vimjnunisation. Le bleu de trypan ne tuant pas tous les piroplasmes, la conséquence doit être une immunité durable. Ceux qui restent produisent en effet une nouvelle infection, peu grave en elle même, mais suffisante cependant pour garantir les animaux contre une infection naturelle subséquente. De très nombreuses expériences, faites aux Etats Unis et en Australie, (sur plus de 9.000 animaux), montrent que les bovidés immunisés artificiellement, sans emploi de bleu de trypan, ont parfaitement résisté par la suite à la tristeza, lorsqu'ils étaient exposés aux piqûres des tiques. Folîa Microbiologica III. (Misson). 68 Le Dr. STOCKMAN, de Londres, a immunisé, en Angleterre, en employant le bleu de trypan, de nombreux animaux exportés par la suite au Transvaal dans l'Afrique du Sud, et le Dr. ThEILER n'a pu constater, aucune rechute sur 200 animaux qui, peu de temps après leur arrivée, avaient été lâchés en plein champs, et y avaient été conservés pendant un an. Ici même, comme je le dis plus haut, nous avons pu nous assurer parfaitement qu'un taureau immunisé naturellement et traité par le trypan ne présentait aucune réaction lors de l'infection artificielle avec du sang dont la virulence avait été absolument démontrée dans de nombreux cas. Afin d'obtenir, par la pratique, quelques preuves de plus, j'avais donné ordre que les 5 génisses flamandes et les 6 gé- nisses Schwyz immunisées artificiellement et traitées par le bleu de trypan le 18 Novembre et le 5 Décembre derniers fussent lâchées journellement dans un champs dans lequel je savais qu'il y avait de nombreuses tiques, que l'on prit soin de ne pas les baigner et de s'enlever que les tiques mûres, sur le point de se détacher d'elles mêmes. Jusqu'à ce jour, c'est à dire après plus de 2 mois, aucune d'elles n'a eu de rechute de piroplasmose et comme elles ont, à certains moments, été absolument couvertes de tiques, je crois pouvoir dire qu'elles sont tout à fait immunisées contre la tristeza. Anaplasmose. Lors des recherches auxquelles il s'était livrées au Transvaal, il y a un peu plus d'un an, pour prouver la dualité des deux maladies, la piroplasmose et l'anaplasmose, le Dr. Theiler avait découvert, dans le sang d'animaux provenant de la région du Karoo, un anaplasme spécial, qu'il avait appelé l'anaplasma marginale, var. centrale. Il avait constaté que la maladie produite chez un animal par cet anaplasme spécial était généralement bénigne, mais cependant suffisante pour lui conférer l'immunité contre l'anaplasmose commune et il conseillait, pour les injections, l'emploi du sang d'un animal ayant été atteint simultanément de piroplasmose et d'anaplas- mose centrale pour immuniser contre les deux maladies les animaux importés. La piroplasmose, qui se déclarait la première, était traitée, au moment opportun par le bleu de trypan, quant à l'anaplas- mose, qui ne survenait que plus tard, il n'était pas nécessaire 69 de la traiter spécialement, il suffisait de bien soigner l'alimentation des animaux pendant cette période. Le Dr. StOCKMAN, que j'avais consulté sur ce point lors de mon dernier voyage en Angleterre, n'a pu me confirmer l'effi- cacité du procède, il ma conseille d'attendre encore avant de considérer comme définitifs les résultats obtenus par le Dr. Theiler et de me limiter, en attendant de nouvelles expé- riences, à pratiquer seulement l'immunisation artificielle contre la Piroplasmose. Je n'aurais du reste pas pu procéder en même temps aux deux immunisations, parce que nous ne possédons pas encore, ici au Brésil, de données bien certaines quant à l'existence, dans un endroit déterminé, de l'anaplasma marginale var. centrale. Le Dr. Torres Cotrim, a cependant constaté, que dans sa propriété de Campo Bello, certains animaux résistaient parfai- tement à l'anaplasmose, tandis que d'autres, faisant partie de la même importation, y succombaient rapidement et les recherches qui ont été faites par les bactériologistes de l'Institut de Man- guinhos, paraissent montrer que le sang des premiers renfer- maient des anaplasmes de le variété centrale. Le fait n'est pas encore confirmé d'une façon bien précise, mais comme les recherches continuent, il est probable que nous serons fixés avant peu sur ce point. Dans les nombreuses importations qui ont été faites en Afrique du Sud, la pratique a montré que les animaux qui avaient été immunisés artificiellement contre la piroplasmose et chez lesquels la maladie avait été arrêtée par le bleu de trypan, étaient, comme le dit le Dr. StOCKMAN, considérablement plus résistants que les autres à l'anaplasmose. Les cas que nous avons pu étudier ici dernièrement semblent le confirmer. Un taureau de race flamande qui, en Septembre dernier, avait été atteint de piroplasmose sous forme naturelle et auquel il ne fut pas fait (V application de bleu de trypan, est tombé malade, d'anaplasmose bien caractérisée par l'examen micros- copique, le 19 Décembre dernier. Les températures successives, depuis le moment ou la maladie a été nettement constatée, ont été les suivantes: Folia Microbiologica III. (Misson), s) .-< ^ — ja von 1/20 Prozent Pepton siccum oder Natriumazetat können unter Umständen vertragen werden ; gewöhnlich sind solche geringe Menge jedoch schon verderblich. Der Zustand der Keime ist also nicht gleichgültig ; worin dieser Zustand aber besteht ist nicht bekannt. In einzelnen Fällen habe ich gute Nitratationen erhalten bei der Aussaat von auf Fleischbouillongelatine erhaltenen, gemischten Kolonien, welche sich entwickelt hatten aus darauf ausgesäten Nitratationen. Viel- leicht handelte es sich dabei um Keime, welche infolge ihrer zufälligen Lage nicht ernährt und nicht gewachsen waren, denn die Regel : „ohne Wachstum keine Veränderung", dürfte auch hier gelten. Die Reinkultur des Nitratfermentes im nitratierenden Zustand ist mühsam und erfordert imganzen einige Wochen. Zunächst wird auf bekannte Weise, und in Uebereinstimmung mit WinOGRADSKY'S schönem Versuche, eine Rohnitratation ange- fertigt. Dazu wird in ein ERLENMEYER-kolben, mit einer dünnen Schicht einer Lösung von: Leitungswasser 100, Natri- umnitrit 0,05 à 0,1 und Bikaliumfosfat 0,01, infiziert mit Garten- oder Ackererde, kultiviert bei 30". Nach 10 bis 14 Tagen ist das Nitrit völlig verschwunden und das Nitratferment der- weise angehäuft, dass eine Ueberimpfung weniger Tropfen in eine neue Nährlösung bei übrigens gleichen Bedingungen, jedoch in klarer Lösung, schon nach ungefähr einer Woche das Nitrit zum Verschwinden bringen kann. Bei Versuchen im Laboratorium entsteht nun ebenfalls die für die Rohnitrata- tionen so eigentümliche ,, Kahmhaut", welche aus ein paar Bak- terienarten besteht, worauf wir noch zurückkommen. In Kolben, welche im Freien aufgestellt sind, entsteht diese Kahmhaut zwar ebenfalls, jedoch in viel schwächerer Ausbildung und wird erst bei genauem Zusehen bemerkt. Einen Einblick in die Mikrobenbevölkerung der nitratierenden Lösungen, bekommt man am besten durch Aussaat auf Kiesel- oder Agarplatten. Das Agar muss vorher ausgelaugt werden um 94 daraus die löslichen organischen Körper zu entfernen, und es soll nicht mehr wie ^'^ Proz. Natriumnitrit zugesetzt werden, weil anders das Verschwinden dieses Salzes zu spät zur Beobach- tung kommt. Die Anfertigung der Kieselplatten habe ich schon in den Jahren 1896 und 1903 beschrieben. 1) Gegenwärtig verwende ich das getrocknete und pulverisierte Natriumsilikat des Handels, welches in 8-prozentiger, wässeriger Lösung, gekocht und filtriert wird. Eine solche Lösung ist beinahe halb-normal; 100 cc. werden also durch 50 cc. Normalsalzsäure neutralisiert. Die Erstarrung findet bei dieser Verdünnng noch langsam genug statt, um die Silikatlösung und die Säure vollständig zu ver- mischen und ruhig auszugiessen in die Glasdose. Hat die Vermischung nur unvollständig stattgefunden, so bilden sich während der Erstarrung Schlieren, welche die Beobachtung der Kolonien auf der Oberfläche erschweren. Die erstarrte Platte wird durch Auslaugen mit destilliertem Wasser von Kochsalz befreit, mit der Nitrit haltigen Nährlösung übergössen und, wenn die Salze hineindiffundiert sind so lange , .getrock- net", bis die äusserlich anhängende Flüssigkeit entfernt ist, und schliesslich flambiert. Humatzusatz zum Wasserglas, welcher natürlich vor dem Vermischen mit der Salzsäure stattfinden muss, begünstigt einigermassen das Bakterienwachstum, jedoch nicht den Nitrifikationsvorgang in den Platten. Obschon die Humus- säure durch die zugesetzte Salzsäure unlöslich wird, bleibt dieselbe, sehr gleichmässig kolloidal in der Kieselplatte verteilt, kann jedoch wegen ihrer Unlöslichkeit in Wasser, nicht hinaus diffundieren. Durch viele spezielle Versuche wurde in meinem Laboratorium nachgewiesen, dass die günstige Wirkung der Humate, sowohl bei den Nitrifikation, wie beim Azofobac^erwa-chsium, jedenfalls der Hauptsache nach auf die katalytische Tätigkeit der gelösten kolloidalen Kieselsäure beruht, während eine günstige Wirkung des kolloidalen Eisenhydroxyds in viel geringerem Maasse nach- ^) Centralblatt für Bakteriologie Bd. 19, S. 259. 1896, und Centralblatt für Bakteriologie, 2e Abt. Bd. 10, S. 38, 1903. Wie geeignet solche Platten sind für die Kultur der Diatomeen, habe ich ebenfalls daselbst nachgewiesen. Auch Grün- und Blaualgen wachsen darauf vorzüglich. 95 weisbar war, obschon in der Literatur eben dem letztgenannten Körper eine besondes günstige Wirkung bei der Nitratation zugeschrieben wird. Es war darum denn auch zu erwarten, dass Humatzusatz zu den Kieselplatten sich nur wenig bemerkbar machen würde. Bei guter Vermischung des Wasserglases und der Salzsäure erhalt man Platten, welche nach der Sättigung mit der Nähr- salzlösung und nach dem ,, Abtrocknen", eine gleichmässig spiegelnde Oberfläche besitzen, worauf selbst die kleinsten und durchsichtigsten Bakterienkolonien erkennbar sind. Die Platten sind sehr wasserreich und enthalten 3 bis 4 Proz. Kieselsäure als Trockensubstanz. Unterhalb 3 Proz. werden sie so weich, dass sie bei der leisesten Berührung mit dem Platinfaden geschädigt werden. Gut gefertigte Kieselplatten sind fest und elastisch und geben beim Anschlag der Glasdose mit dem Finger, einen eigen- tümlichen Ton. Vorgreifend muss ich jedoch bemerken, dass solche Kieselplatten zwar sehr geeignet sind um eine Trennung des Nitratfermentes von den gröberen Verunreinigungen vorzu- nehmen, weil die Nitrifikation darin leicht stattfindet, allein dass es ausserordentlich schwierig ist wirklich reine Kolonien des Nitratfermentes von den Kieselplatten zu bekommen : beinahe jede Kolonie ergiebt sich nämlich als eine Mischkolonie, sodass man wohl annehmen muss, dass die Einzelkeime des Nitrat- fermentes viel schwieriger zur Entwicklung kommen, wie die mit anderen Keimen verklebten. Welche diese Symbionten sind werden wir bald sehen. Die Reinkultur geschieht viel leichter durch die Verwendung von Nitritagarplatten, obschon man darin die Nitrifikation erst später beobachtet. Offenbar sind die im Agar gegenwärtigen Spuren von löslichen organischen Substanzen für die erste Entwicklung des Nitratfermentes günstig. Für die Untersuchung der Nitritfermente, welche die Ammon- salze oxydieren, und die noch viel empfindlicher sind für gelöste organische Stoffe, wie das Nitratferment, können richtig ange- fertigte Kieselplatten sehr nützlich werden, und bei einer anderen Gelegenheit hoffe ich darauf noch zurückzukommen. 2. Flora der Rohnitratationen. Ebenso wie in der Natur sind die Rohnitrifikationen in den Laboratoriumsflüssigkeiten essentiell symbiotische Vorgänge. 96 Die Reinkulturen geben in keiner Beziehung bessere Erfolge- wie die Rohanhäufungeni können denselben jedoch, bei guter Ausführung gleich kommen. Vergleicht man diesen Umstand mit den wundervollen Resultaten, welche man mit Reinkulturen z.B. von Leucht- und Pigmentbakterien erhalten kann, deren Rohkulturen wertlos sind, so sieht man, dass der Unterschied von prinzipieller Bedeutung ist. Obschon die äusserlich sichtbaren Eigenschaften, sowohl der Rohnitrifikationen von Ammonsalzen, wie die der rohen nitra- tierenden Kulturen, ungemein charakteristisch sind, habe ich davon nirgend eine Beschreibung gefunden, was um so auf- fälliger ist, als es sich dabei handelt um eine Frage, welche von der grössten praktischen Bedeutung ist für die Landwirt- schaft, und von nicht geringerer theoretischen Wichtigkeit durch die damit in Verbindung stehenden Probleme der Chemo- synthese und der physiologischen Artbildung. Wenn auch die für Nitratation bestimmten Nährsalzlösungen frei oder nahezu frei von loslichen organischen Körpern sein müssen, so sind doch die in verwesenen Bodenproben gegen- wärtigen organischen Stoffe der Nitratation nicht ungünstig, Und wenn auch kräftig nitratierende Flüssigkeiten gänzlich klar und durchsichtig sein, und unter Umstanden, z.B. bei der Verwendung von Reinkulturen auch bleiben können, so braucht dieses bei den Rohnitratationen (so wie bei den Rohnitrifikationen aus Ammon- salzen) jedoch gar nicht der Fall zu sein : dieselben überdecken sich im Laboratorium schnell, im Grünhause und im Freien langsamer, mit der durchaus eigentümlichen, äusserlich wie ,, Bierkahm" aussehenden Haut, welche ich schon im Jahre 1903 beschrieben habe, ohne damals das Nitratferment selbst noch genügend zu kennen. 1) Seitdem sind meine Kenntnisse der hierbei waltenden Wachstumsvorgänge und Bedingungen viel verbessert. Die treibende Haut enthält gewöhnlich zahlreiche Keime des Nitratfermentes und kann dann, mit einigem Rechte, als ,, Nitrat- mutter" bezeichnet werden. Der Hauptsache nach besteht dieselbe *) Farblose Bakterien deren Kohlenstoff aus der atmosphärischen Luft herrührt, Centralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. 10, Pag. 38, 1903. In dieser Abhande- lung steht : paucitrophus^ lies : patilotr opinis . 97 jedoch aus zwei nicht nitrifizierenden Arten, welche ich damals Bacillus oligocarbophilus und Actinomyces (Strephtothrix) paulotrophus genannt habe, ohne ihre Verwandschaft richtig zu verstehen. Seitdem erkannte ich aber, dass B. oligocarbophilus ein echter Actinomycet ist, und der von NEUMANN und LEHMANN aufgestellten Gattung Mycobacterium zwar nahe steht, davon jedoch generisch getrennt werden muss. *) Ich schlage darum vor diese wichtige Art als Actinobacillus oligocarbophilus zu bezeichnen, und bringe auch die zweite genannte Form zu der- selben Gattung als Actinobacillus paulotrophus. 2) Echte Actinomyces-?ixtç.VL^ wie besonders A. ?'ö(5/^r Krainsky 3) und A. griseus Kry, finden sich in der treibenden Haut ebenfalls, jedoch in viel geringerer Anzahl, und nur dann, wenn die Kulturen lange aufbewahrt werden. A. diastaticus Kry und A. cellulosae Kry, wurden bisweilen auch aufgefunden, jedoch in noch gerin- gerer Anzahl. Diese Actinomyces-a.rten gehören nicht zu der Normalflora der Rohnitrifikationen, obschon sie dem Vorgang nicht ungünstig sind. Wie ich das früher (1. c.) gezeigt habe, leben alle diese Haut- bewohnende Mikroben von den organischen Stoffen, welche sich in merklichen Menge in der Laboratoriumsluft und gewiss auch in der Bodenluft vorfinden. Diese Stoffe sind in der freien Aussenluft, sowie in den Grünhäusern, wie ich durch viele spezielle Versuche festgestellt habe, nur in einer sehr viel geringeren Menge gegenwärtig, obschon sie auch darin niemals gänzlich fehlen. Versucht man die verschiedenen Haut-bewohnenden Arten auf bessere Kulturböden, z. B. auf Bouillongelatine, zu kultivieren so stöstman dabei auf Schwierigkeiten. Actinobacillus oligocarbophilus wird dabei zunächts unkenntlich, indem die Kolonien das „Kahm- merkmal" verlieren, was sie auf einem armen Kulturboden jedoch wieder zurückbekommen. Actinobacillus paulotrophus konnte ich auf bessere Kulturböden überhaupt nicht kultivieren. Die echten Actinojnyces-a.rten wachsen auf solche Böden, wenn 1) Bakteriologische Diagnostik, le Aufl. 1899, 5e Aufl. Pag. 582, 1912. 2) Vor kurzem (Folia Microbiologica, Bd. 2. Pag. 196, 1914) habe ich noch eine weitere Actinomycetengattung aufgestellt, nämlich Actinococcus, welche bis dahin zu Micrococcus gerechnet war. ^) A. Krainsky, Die Aktinomyceten und ihre Bedeutung in der Natur. Cen- tralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. 41, Pag. 649, 19 14. 98 einmal in Reinkultur, nicht schlecht, viel besser jedoch auf feste Böden mit verdünnter Nahrung, wofür übrigens die verschie- densten organischen Stoffe geeignet sind. Wenn in den nitratierenden Nährlösungen das Nitrit völlig in Nitrat umgewandelt ist, hört das Wachstum der Actino- bacillus-hsiut nicht auf, sondern geht ungestört fort. Offenbar steht die Nitritoxydation nicht in direkter Beziehung zu diesem Wachstum, i) Auch in den vollständigen Nitrifikationen mit Ammonsalzen, kann die Hautbildung auf die gleiche Weise stattfinden, wie in den Nitratationen. Dabei beobachtet man aber die folgende wichtige Erscheinung: beim Ueberimpfen der Nitritphase, ehe darin Nitratbildung stattfindet, ist schon bei ein oder zwei Wiederholungen die Hautbildung vollständig beseitigt, sodass weder AcL oligocarbophilus noch Act. paulotrophns aus solchen stark Nitrit erzeugenden Lösungen überhaupt mehr zur Ent- wicklung zu bringen sind. Dieses ist desshalb so bemerkenswert, weil das Verschwinden der genannten Arten aus den Kulturen, begleitet ist von dem Verschwinden des Nitratfermentes selbst. Die Gegenwart selbst vereinzelter Keime des Nitratfermentes lässt sich leicht nachweisen durch Aussaat auf Agarplatten worin -^-^ Proz. Pepton. Das Ferment erscheint darauf in der polytrophen, sehr charakteristischen Form. Die Beseitigung des Nitratfermentes aus den Rohnitrifikationen z. B. von Ammonsulfat, geschieht am schnellsten, wenn man der Lösung keine Kreide oder Magsesiumcarbonat zusetzt. Es ist also leicht zwei Arten von Rohnitrifikationen der Ammonsalze beim ersten Blicke zu unterschieden, nämlich, erstens, Nitrifikationen, welche kein Nitrat bilden und an ihre Oberfläche klar bleiben,, und zweitens vollständige Nitrifikationen, welche neben Nitritferment auch Nitratferment enthalten und sich an ihrer Oberfläche gewöhnlich (aber nicht notwendig) mit der beschriebenen Kahmhaut be- decken. Die Erklärung dieses Umstandes beruht auf zwei Eigen- schaften des Nitratfermentes, welche ebenfalls bei den Actino- ^) Ob das Nitratferment selbst auch noch wachsen und sich vermehren kann nachdem die Nitrite völlig oxydiert sind, ohne dabei dieses Oxydationsvermögen zu verlieren, konnte ich trotz vieler Versuche noch nicht einwandsfrei feststellen. Weil die Frage offenbar eine interessante ist, hoffe ich später die definitive Antwort geben zu können. 99 bacillen gefunden werden, nämlich, ihre Empfindlichkeit für freie Säure, und ihre, wenn auch geringere Empfindlichkeit für Ammon- salze, wovon besonders die erstere ausschlaggebend ist. Anderseits stellt sich heraus, dass die in den Nitritationen herrschende sauere Reaktion dem Nitritfermente viel weniger schädlich, ist wie dem Nitratferment. Wenn also in den Rohnitri- fikationen der Ammonsalze Calciumcarbonat und andere Basen in ungenügender Menge vorkommen um alle Säure zu binden, führt dieses zum Verschwinden der Nitratflora. Verwendet man Ammonsulfat, oder besser noch Ammonmagnesiumfosfat, ohne weiteren Zusatz von Carbonaten, so kann eine weitgehende Nitritation stattfinden und wegen der sich langsam anhäufenden Säure, wird die Nitratflora dabei von Anfang an unterdrückt, um schliesslich vollständig zu verschwinden. Weil die Hautbildung auf den nitrifizierenden Flüssigkeiten in der Aussenluft, sowie im Grünhause, nur schwach ist, muss man um die beschriebenen Verhältnissse unter diesen Umstän- den zu beobachten, schärfer zusehen als wenn der Versuch in der Laboratoriumsluft stattfindet. Niemals habe ich aber voll- ständige Rohnitrifikationen gesehen, wo die Haut der Actino- bacillen gänzlich fehlte, solche lassen sich im allgemeinen nui durch partielle Reinkultur vermittelst der Plattenmethode erhalten, obschon sie natürlich auch zufällig, bei den gewöhnlichen Rohkulturversuchen müssen entstehen können. Hat man Reinkulturen des Nitratfermentes angefertigt, so bleiben die damit stattfindenden weiteren Kulturen durchsichtig und wasserklar. Hautbildung findet darauf niemal statt, nur an der Glaswand der Gefässer ist eine sehr dünne Schleimschicht -bemerkbar, welche aus den kleinen Nitrobakterien besteht. Wie zu erwarten war entwickelen sich in den Rohnitri- fikationen massenhaft Amoeben, welche auch auf den Platten wachsen und sich dabei oft derweise vermehren, dass sie die Erzielung reiner Bakterienkolonien unmöglich machen, weil sie beim Herumkriechen die an ihrem Körper haftenden fremden Keime überall auf die Platte bringen. Ausser der früher beschriebenen Amoeba nitrophila, i) ist es besonders eine sehr *) Kulturversuche mit Amoeben auf festem Substrate, Centralbl. f. Bakterio- logie Bd. 19, S. 258, 1896. lOO kleine und weit verbreitete Art, welche ich Amoeba nana nenne, die sich in den Nitrifikationen ansiedelt und sich daselbst massen- haft vermehrt, auf Kosten des Nitratfermentes selbst. Auf Kieselplatten habe ich mehrfach kleine Acarinen gefunden, welche sich ebenfalls mit den Nitratfermenten ernährten. Eine merkwürdige Eigentümlichkeit, speziell der Rohnitrationen, viel weniger der Rohnitritationen, ist ihre Fähigkeit sich mit Pigmentbakterien zu bevölkern, welche zu der Familie der Actinomyceten und wahrscheinlich zur Gattung Actinohacülus und nicht zu Mycobacterium gehören, weil sie sich durchaus nicht verzweigen. Dieselben sind ausgezeichnet durch braune oder rein rote Pigmente, welche am Bakterienkörper gebunden sind, sodass diese Bakterien als »chromatophore« bezeichnet werden müssen. Das rote Pigment ist sicher Carotin, denn die roten Kolonien färben sich in concentrierter Schwefelsäure schön indigoblau. Auch kann das Pigment leicht mit Chloroform extra- hiert werden ; nach Verdunstung bleibt dann das Carotin zurück, das sich mit starker Schwefelsäure wieder indigoblau färbt. Weil diese Pigmentbakterien sich auf den Nitritagarplatten auf eine ähnliche Weise ernähren, wie die Actinobacillen, und aus atmosferischen Kohlenstoffverbindungen ihre Körpersubstanz aufbauen, lässt sich verstehen, dass ihre Kolonien denjenigen des Nitratfermentes überwuchern und, dass es schwierig ist die- selben von dem Letzteren zu reinigen. Man kann dadurch leicht in den Irrtum verfallen, dass sie imstande sind zu nitratieren, doch ergiebt die genauere Untersuchung, dass diese Auffassung unrichtig ist. Solche mit Nitratferment infizierte Kolonien dieser eigentümlichen Pigmentbakterien sind aber für Nitratations- versuche, besonders auf Platten, sehr geeignet. Dabei kann es vor- kommen, dass durch unbekannte Ursachen, die Pigmenterzeugung gänzlich ausbleibt, sodass diese Bakterien veränderlich sind. Dagegen ist sowohl das rote wie das braune Pigment selbst ausserordentlich stabil, sowohl in Dunkeln wie im Lichte. Platten mit diesen Pigmentkolonien habe ich im feuchten Zustande zwei Jahre lang aufbewahrt, ohne die geringste Farbänderung zu bemerken. Wünscht man Reinkulturen des Nitratfermentes anzufertigen, so ist es geeignet zunächst durch das Plattenverfahren eine vorläufige Trennung auszuführen, wobei bei der Impfung in loi die zu nitratierenden Lösungen eine partielle Rohkultur erhalten wird, die dann später, auf dieselbe Weise, weiter zerlegt wird. Die grösste Schwierigkeit, welche man dabei begegnet ist die Trennung des Nitratfermentes von Bacillus nitroxus, worauf wir weiter werden zurückkommen. 3. Reinkultur. Die mechanische Schwierigkeit der Erkennung des Nitrat- fermentes auf den Platten hängt damit zusammen, dass der Nachweis, ob eine Bakterienkolonie, auf einer Kulturplatte wachsend, Nitrite in Nitrate überführt, nicht direkt möglich ist. Dieses ist besonders augenfällig beim Vergleich dieser Um- wandelung mit der Nitritbildung auf Platten mit Ammonsalzen, wobei jede einzelne Salpeterigesäure erzeugende Kolonie sofort daran zu erkennen ist, dass sie, z. B. beim Wachstum auf einer Kieselplatte, worin fein verteiltes Ammonmagnesium- fosfat suspendiert ist, Mittelpunkt eines hellen Diffusionsfeldes in der trüben Platte wird, welches Feld dann noch überdies die so empfindlichen Farbereaktionen der Nitrite geben kann.i) Vergebens habe ich versucht diesen Umstand zu beseitigen durch die Verwendung unlöslicher Nitritsalze, deren Umwande- lung in Nitrate zu löslichen Verbindungen führt, nämlich das schön gelbe Kalium-Cobalt-Nitrit, Co(No2)3.3KN03.i|H20, und das weisse Kalium-Iridium-Nitrit. Diese Salze sind aber für das Nitratferment giftig und werden nicht merklich nitratiert. Weil nun die Nitratkolonien auf den Nitritplatten morfologisch wenig charakteristisch sind, ist man genötigt die Einzelkolonien gesondert zu untersuchen. Bisher musste dieses durch den Nitratationsvorgang selbst geschehen, was sehr viel Zeit be- ansprucht. Es hat sich nun aber herausgestellt, dass die Um- wandelung bei besserer Ernährung des Nitratfermentes in die polytrophe Art, diese Erkennung sehr vereinfacht. Für die Reinkultur des Nitratfermentes sind Agarkulturplatten ^) Die Verwendung von Ammonmagnesiumfosfat beim Plattenverfaliren, hat mehrere Vorzüge vor derjenigen von Ammonsulfat mit Kreide oder Magnesium- carbonat. Ich bringe das Ammonmagnesiumfosfat auf die Oberfläche der schon fertigen Kiesel- oder Agarplatte, durch Aufgiessen einer neuen, papierdünnen Schicht Kiesel- oder Agarlösung, worin das Salz suspendiert ist. I02 viel geeigneter wie Kieselplatten. Es muss jedoch durch Auslaugen mit destilliertem Wasser aus dem Agar das Lösliche vorher entfernt werden, damit das Nitratationsvermögen in den Kolonien erhalten bleiben soll. Jedenfalls steht fest, dass in den Nitritagarplatten, welche nicht vollständig ausgelaugt sind, wenn sich darauf relativ grosse Nitratfermentkolonien entwickelen, diese gar nicht mehr nitratieren, und, wenn sie klein bleiben, erst dann zu deutlicher Nitratbildung veranlassen, wenn man keine Vergrösserung derselben mehr bemerken kann. Letztere Beobachtung ist in Uebereinstimmung mit der Auffassung, dass Wachstum und Nitratation nicht zugleich zustande kommen, und erst die erwachsenen, sich nicht mehr vermehrenden Bakterien, die Nitratation bewirken. Weil das Nitratferment, sowie die übrigen in den Rohnitri- fikationen vorkommenden Mikroben das Agar nicht angreifen, muss, für die Entwicklung ihrer Kolonien auf der Platte, ein geringer Gehalt an lösliche organische Substanz vorhanden sein, welche Substanz den Nitratationsvorgang überhaupt erst ermöglicht, i) Die Nitratkolonien bilden bei dichter Aussaat auf den Agar- platten (Tafel VII Fig. i) kleine Kolonien von | à i m.M. Mittel- linie, welche als glasartig durchsichtige Plättchen, selbst mit der Lupe etwas schwierig sichtbar, unter dem Mikroskop bei 20 bis 50-maliger Vergrösserung jedoch sehr charakteristisch sind. Bei weniger dichter Aussaat und in Impfstrichen können sie, durch seitliche Ausbreitung, viel grössere Dimensionen annehmen, bleiben aber immer sehr dünn. Ist der Wassergehalt des Agars relativ gering, so können die Kolonien rund bleiben ; auf wasserreicheren Agar bilden sie dagegen leicht Ausläufer, was zu medusenartiger oder dendritischer Verzweigung der Kolonien veranlasst. Diese Verzweigungen können ausseror- ^) Die Agar verflüssigenden und daraus Zucker erzeugenden Gelasebakterien, können in Grabenmoder vorkommen ; auf dem Laade fand ich dieselben nicht. Bei deren Gegenwart kann die direkte Isolierung des Nitratfermentes im nitra- tierenden Zustande auf Agarplatten Schwierigkeiten bieten. Bei Anhäufung und Ueberimpfung in Nitritlösung verschwinden die Gelasebakterien jedoch bald. Im Schlamme des Schififahrtkanales zu Delft sind besonders sporenbildende Gelase- bakterien häufig, während die nicht sporenbildenden Arten besonders in der Nordsee vorkommen. Doch kommen auch im Kanalschlamme nicht sporen- bildende Arten dieser Gruppe vor. T03 dentlich fein werden und zugleich zu einer grossen seitlichen Ausdehnung führen, wodurch dann Kolonien von mehreren Millimetern Durchschnitt entstehen. Solche stark verzweigte Nitratkolonien wachsen leicht in die Kolonien anderer Arten hinein, was man erst bei mikroskopischer Beobachtung bemerkt (siehe die Tafel). Für die Reinkultur müssen die Kolonien auf der Oberfläche gut abgetrockneter Agarplatten liegen, und in so grosser Entfernung von ihren Nachbarn, dass man über ihre Randbegrenzung nicht im Zweifel ist. Obschon in gut zubereiteten Kieselplatten die Nitratation leichter stattfindet, wie in Agarplatten, ist dennoch die Erhaltung von Reinkulturen von den Ersteren schwieriger wie von Agar. Es stellt sich nämlich heraus, dass bei weitem die meisten auf Kieselplatten entwickelten Nitratkolonien, obschon sie gänz- lich homogen aussehen, Mischkolonien sind und zwar seltener mit Act. oligocarbophilus, viel öfter dagegen mit dem höchst eigentümlichen, und hier sicher nicht erwarteten sporenbil- denden und denitrifizierenden Bacillus nitroxus. i) Diese letztere Art ist bei allen meinen Versuchen, — welche jedoch nur mit Gartenerde aus Delft angestellt wurden, — in den Rohnitratationen ausnahmslos in ungefähr gleicher Indivi- duenzahl gefunden, wie das Nitratferment selbst, und hat auch bei der Verwendung von Agarplatten erhebliche Schwierigkeiten bei der Trennung gegeben. Während langer Zeit meinte ich nämlich, dass eben B. nitroxus nitratieren konnte, was jedoch durchaus nicht der Fall ist. Uebrigens kann ich gegenwärtig, nun ich den Tatbestand gut übersehe, angeben, wie man verfahren muss um in der kürzesten Zeit das Nitratferment und B. nitroxus neben ein ander zu erkennen. Dabei muss man Verwendung machen von der schon mehrfach genannten Eigenschaft des Nitrat- fermentes, bei besserer organischer Nahrung, sich in eine gewöhnliche saprophytische Bakterie umzuwandelen, welche leicht kenntliche Eigenschaften besitzt. Weil dabei das Vermögen zur Nitratation völlig verloren geht, und eine rückläufige Verwande- ^) Näheres über diese schwierige Art in: Bildung und Verbrauch von Stickoxydul durch Bakterien. Centralbl. f. Bakteriol. 2te Abt. Bd. 25, Pag. 45. 1910- 104 lung bisher nicht gelungen ist, muss man vorher durch Versuche sich von der Richtigkeit dieser Angabe überzeugt haben. Etwas Aehnliches gilt bei der Virulenzbeurteilung gewisser pathogener Mikroben, wobei jedoch von einer so grundsätzlichen Verände- rung, wie beim Nitratferment, niemals Rede ist. Bevor wir auf diese Unterscheidung von B. nitroxus noch etwas näher eingehen, muss die zuletzt genannte sehr wichtige Eigen- schaft des Nitratfermentes genauer betrachtet werden. 4. Oligotropher und polytropher Zustand des Nitratfermentes: Physiologische Artbildung. Das Hauptresultat der gegenwärtigen Untersuchung ist die Erkenntniss der beiden hier genannten Zustände des Nitrat- fermentes. Die Umwandelung der nitratierenden oligotrophen, in die nicht nitratierende polytrophe Form, findet, wie wir schon gesehen haben, statt bei besserer Ernährung, nicht nur bei der Impfung auf Platten, sondern auch in Nährlösungen. Impft man z. B. die reine nitratierende Form in Bouillon, so erhält man schon den zweiten oder dritten Tag bei 30 0 C. eine sich ziemlich lebhaft entwickelnde Kultur von dünnen Stäbchen und Fäden, wovon sich viele bewegen. Sie verzweigen sich niemals und ihre Beweglichkeit beweist, dass das Nitratferment unmöglich zur Familie der Actinomyceten gehören kann, welche typisch unbeweglich sind. Ich hebe dieses deshalb besonders hervor, weil der nitratierende Zustand des Fermentes niemals Bewegungs- erscheinungen zeigt, und unter den gleichen, so eigentümlichen Ernährungsbedingungen lebt, welche für die Actinomyceten Actinobacillus oligocarhophilus und A. paiilotrophus so charak- teristisch sind. Wie man sieht ist die in den Handbüchern vorkommende Angabe, dass das Nitratferment in Bouillon nicht wachsen kann, durchaus unrichtig: es wächst darin vorzüglich, nur geht dabei das Nitratations ver mögen verloren. Auf Bouillonagar oder auf Peptonagarplatten entwickelt das Ferment sich ebenfalls ausgezeichnet. Bouillongelatine wird anfangs nicht, später stark verflüssigt, wobei viel Amnion entsteht. Bei Gegenwart von Pepton entwickelt sich ein schwacher Î05 Fäulnissgeruch ; Pigmente oder fluorescierende Körper werden nicht erzeugt. Auf reine Gelatinplatten, das heisst Gelatin gelöst in Wasser, mit oder ohne Salzen, findet kein Wachstum und keine deut- liche Verflüssigung statt, obschon dabei das Nitratationsvermögen verloren geht. Diastase, Tyrosinase und Glukosidenzyme werden durch das Nitratferment nicht erzeugt ; ebensowenig werden dadurch Kohle- hydrate unter Gasbildung vergoren ; auch Denitrifikation findet nicht statt, was allerdings zu erwarten war, weil die Stickstoff- bildung aus wässeriger Salpetrigesäure ein endothermischer Vor- gang ist, wobei 308 Kai. absorbiert werden. 1) Weil die jungen Nitratkolonien auf Bouillongelatine, (Tafel VII Fig. 2 c, d), so lange sie diese nicht verflüssigen, sowie auf Peptonagarplatten sehr charakteristisch sind, und sich von allen anderen Arten unterscheiden durch die ,, trockene", und rauhe Oberfläche und ihre flache Ausbreitung, muss es möglich sein, dieselben in Erdproben durch das gewöhnliche Plattenverfahren, bei oberflächlicher Aussaat, zu erkennen, was mir in einigen Fällen auch wirklich gelungen ist. Natürlich fehlt dabei jedoch die Contrôle der Nitratation, weil nur der polytrophe, nicht nitratierende Zustand erhalten wird, sodass man für die Erken- nung Uebung haben muss. Der Versuch wird am besten aus- geführt durch Aussaat der Bodenproben auf Agarplatten, welche -^^ Proz. Pepton siccum und weiter nichts enthalten, und vor dem Gebrauch bei einer Temperatur unterhalb 40» abgetrocknet sind, so dass kriechende Bakterienarten, besonders der Subtilh- gruppe, welche in Kulturerde allgemein sind, sich nicht allzusehr ausbreiten können. Die Conzentration löslicher organischer Stoffe, welche die Nitratationsfunktion zum Verschwinden bringt, kann sehr gering sein. Mengen von 1/20 Proz. Glukose, Rohrzucker, Stärke, Man- nit, Natrium- und Calciumazetat, Pepton, Tyrosin, Asparagin *) Ostwald giebt die Formel : HNOg (aq) = H + N + 2 O + Aq — 308 Kai. Dagegen soll die Zerlegung des Anhydrids exothermisch sein und stattfinden nach : N2O3 aq = 2 N + 3 O + aq + 68 Kai. (W. Ostwald, AUg. Chemie, 2te Aufl. Bd. 2, Th. i, Pag. 143, 1893). Hier findet sich bei Ostwald ein Druckfehler. io6 veranlassen mehr oder weniger starkes Wachstum und Verlust des Nitratationsvermögens. Ist die Conzentration der gelösten organischen Substanzen noch viel geringer, verwendet man z.B. nicht ausgelaugten Agar, übrigens ohne jeden weiteren Zusatz, so kann bei dichter Aussaat das Nitratferment anfangs wachsen und später dennoch nitra- tieren, welcher letzterer Vorgang, wie wir gesehen, erst anfangt, wenn die für das Wachstum verbrauchten gelösten organischen Substanzen verschwunden sind. Das kann aber Monate dauern und manche Versuche misslingen gänzlich. Ich schliesse noch aus folgendem Umstände, dass das Nitra- tieren auch bei den Reinkulturen erst dann beginnt, wenn die löslichen organischen Stoffe völlig verschwunden sind. Die kürzeste Zeit, worin ich 0,1 Proz. Nitriumnitrit oxydieren konnte war drei bis vier Tage. Dazu musste aber eine sehr grosse von einer Kulturplatte herkünftigen Bakterienmenge in eine sehr kleine Menge der Nitritlösung gebracht wer- den, und die dazu verwendeten Bakterien müssen auf der Platte, wovon sie hergenommen werden, völlig aktiv sein. Es stellte sich nun heraus, dass so lange die Kolonien oder Impfstriche auf der Platte noch im Wachstum begriffen waren, das davon genommene Material erst nach viel längerer Zeit, z.B. nachdem es zwei bis drei Wochen in der Lösung verweilt hatte, das Nitrit völlig oxydierte, woraus hervorgeht, dass die noch in den Bakterienleibern angehäuften Nährsubstanzen zuerst aufgebraucht werden müssen, ehe Nitratation möglich ist. Nitrata- tion und Wachstum scheinen also unter allen Umständen Funk- tionen zu sein, welche einander ausschliessen. Dieser Fall steht im Mikrobenleben nicht vereinzelt, doch wird auch bei anderen Oxydationsvorgängen beobachtet, z. B. bei der Melaninbildung aus Tyrosin durch Actinomyces tyrosinaticus, welcher Vorgang nur dann kräftig stattfindet, wenn das Wachstum der Kolonien vollständig aufhört. Wie lange eine solche Oxydation dauern kann, der offenbar stattfinden muss ohne Vernichtung, oder vielleicht richtiger, ohne Regeneration lebender Substanz, ist unbekannt. Nach Analogie mit den enzymatischen Vorgängen wird diese Zeit nicht lange sein und also auch das Nitratferment unter diesen Bedingungen seine Funktion nicht lange fortzetzen können. Es muss aber als Î07 möglich betrachtet werden, dass in der Natur, in ein und demselben Bakterienkörper, lokalisiert an verschiedenen Stellen, Regeneration der bei den Oxydation verschwindenden lebenden Substanz, und, die durch andere Molekülgruppen dieser Substanz bewirkten Oxydation neben einander zustande kommen können. Volständig umgewandelter Dünger bringt das Nitratations- vermögen nicht zum Verschwinden. Dagegen führen aus Pflanzen, gepresste Säfte, selbst bei starker Verdünnung, die oligotrophe in die polytrophe Form über, was unter gewissen Bedingungen auch im Boden muss vorkommen können. Natriumhumat, selbst in grosser Conzentration in Platten oder Nitritlösungen gebracht, beeinträchtigt die Nitratation nicht. Auch Paraffinöl wird gut vertragen, obschon dadurch der Eintritt des Vorganges verzögert wird, vielleicht durch im Parafiinöl vorhandene Verunreinigungen. 5. Unterscheidung des Nitratfermentes von Bacillus nitroxus und Actinobacillus. Auf bessere Nährböden wachsen das Nitratferment und Bacillus nitroxus gleich gut und geben darauf, bei 250 à 30» C. in 2 Tagen deutliche Kolonien. Verwendet man als Kulturboden Agar in Leitungswasser mit 1/20 Proz. Pepton siccum und eine Spur Kaliumfosfat (oder auch gewöhnlichen Bouillonagar, welcher jedoch kein deutlicheres Resultat giebt), so erkennt man das Nitratferment leicht an die anfangs trockenen, wie Kahmpilz aussehenden Kolonien, welche erst nach mehreren Tagen glänzend feucht werden. Vom Anfang an ist der Rand dieser Kolonien mehr oder weniger unregelmässig ausgeschnitten oder gelappt, während ihre Oberfläche anfangs glatt, später, beim Feucht- werden, sich mit radialen Leisten oder Rippen bedeckt. Bis zum Ende bleiben die Kolonien flach und dünn und können eine sehr beträchtliche Ausdehnung erlangen. Auf Bouillongelatine sind dieselben ebenfalls sehr charakteristisch durch ihre anfangs gekörnte, rohe und ,, trockene" Oberfläche. Später verändert sich dieses Bild, weil dann eine starke Verflüssigung der Nähr- gelatine stattfindet. Die Nitroxus-\i.o\on\en sind unter diesen Bedingungen sofort daran kenntlich, dass sie vom Anfange an, als kleine, feuchte, runde, wenig abgeflächte Massen auf den Platten vorkommen. io8 Sie bleiben viel kleiner wie die Nitratkolonien, und, wenn mit letzteren in Berührung, werden sie von diesen überwachsen und bedeckt, gleich wie der Nährboden selbst. Beim längeren Aufbewahren entstehen Sporen, was beim Nitratferment nicht stattfindet. Uebrigens ist das mikroskopische Bild der beiden, so weit verschiedenen Arten, sehr ähnlich : äusserst kleine meistens unbewegliche Stäbchen, welchen jedoch die Fäigkeit Schwärmer zu bilden nicht völlig fehlt. Auch Nitroxus verflüssigt schliesslich die Kulturgelatine sehr kräftig. Einzelne Nitroxus- stamme besitzen das Vermögen zu denitrifizieren, welche Eigen- schaft bei der Ueberimpfung aber verloren gehen kann. Bei der Aussaat auf für Nitratation geeignete Böden, arm an organische Nahrung, entwickelt Nitroxus sich zwar wenig, jedoch auf ähnliche Weise, wie bei besserer Ernährung und ist dann zwischen und in den sich seitlich viel stärker ausbreitenden Nitratkolonien leicht zu erkennen. In diesem Falle können auch die früher genannten, in den Rohnitratationen so häufigen Actinohacillus oligocarhophilus und A. paulotr opinis zwx'^n'v^'icV- lung gelangen; dieselben sind jedoch sofort durch die schmmel- artig, schneeweisse Farbe ihrer Kolonien kenntlich und leicht von den glasartig durchsichtigen Nitratkolonien zu unterscheiden. Bei besserer Ernährung ist A. oligocarhophilus eine nur langsam, zu kleinen feuchten Kolonien sich entwickelnde Art, ■welche durchaus nicht mehr an den Kahmpilzartigen oligotrophen Zustand erinnert. A. paulotrophus habe ich auf keinen einzigen guten Nährboden zur Entwicklung bringen können. Bisher erkannte ich nur eine einzige nitratierende Art. Das mag jedoch Folge des Umstandes sein, dass ich nur mit Böden aus dem Laboratoriumsgarten zu Delft Versuche anstellte. Weil ich aber mit gesonderten Beeten von Ton, Gartenerde, Sand und Moor arbeitete, welche erfahfungsgemäss sehr verschiedene Mikrobenfloren enthalten, und mit allen das gleiche Resultat erhielt, dürfte das Nitratferment sehr gleichmässig sein und auch anderswo in derselben Form vorkommen wie hier. Die hierbeigegebenen Bilder (Fig. i und 2 Taf. VII) sollen die Unterscheidung von B. nitroxus und dem Nitratferment erleichteren. Die übrigen für die Rohnitratationen charakteris- tischen Arten sind so leicht kenntlich, dass es nicht nötig erschien dieselben abzubilden. I09 Es scheint mir aber nicht überflüssig an dieser Stelle eine Recapitulation zu geben von den, in den Rohnitratationen hier in Delft stets vorkommenden Bewohnern, welche auch nach wiederholten Ueberimpfungen standhalten und desshalb, im Gegensatz zu der accidentellen (wozu z.B. die so merk- würdigen roten und braunen Pigmentbakterien gehören), als „Haupt-Flora" bezeichnet werden können. Dazu gehören : Erstens, Nitrohacter oUgotrophum >• Nitrobacter poly- trophmn, das Nitratferment selbst, i) Im nitratierenden, meist unbeweglichen Zustand als A''. oUgotrophum, im saprophytischen oft beweglichen nicht nitratierenden Zustand, aXs N. polytrophum, zu bezeichnen. Die beiden Formen müssen als physiologische Arten bezeichnet werden und verhalten sich zu einander als Modifikationen und nicht als Mutationen. Der Uebergang findet, wie der Pfeil andeutet, nur in eine Richtung statt. Zweitens, Bacillus nitroxus. Sehr kleine sporenerzeugende meist unbewegliche Stäbchen, welche nicht nitratieren, übrigens in ihren Lebensbedingungen dem Nitratferment ähnlich und davon schwer zu trennen sind. Einige Varietäten zeigen Denitrifikation. Drittens, die Gattung Actinohacillus, welche zu der Familie der Actinomyceten gehört und desshalb typisch unbeweglich ist. Unterscheidet sich von der von NEUMANN und LEHMANN aufgestellten Gattung Mycobacterium durch das vollständige Fehlen der Verzweigung, sodass man nur Stäbchen oder Fäden findet. Erzeugt die charakteristische treibende , .Kahmhaut" auf der Oberfläche der nitrifizirenden Flüssigkeiten. Darin finden sich zwei Arten nämlich : a. Actinohacillus oligocarbophilus, welche sich ernähren kann von den Kohlenstoffverbindungen der atmosferischen Luft und dann das ,, Kahmpilzmerkmal" zeigt; anderseits auf den ver- schiedensten organischen Nährböden wächst ohne das „Kahm- pilzmerkmal". Letzterer Zustand auf Kieselplatten zurückgeimpft zeigt das ,,Kahmpilzmerkmar' wieder. 2) Doch kann das Merkmal 1) In meiner Mitteilung in der Akademie der Wissenschaften zu Amsterdam, Bd. 23, Pag, 1163, 28 März (10 April) 1914, habe ich das Nitratferment, wegen seiner Beweglichkeit Nitribacillus genannt. Doch scheint es mir gegenwärtig, dass der von Winogradsky eingeführte Name Nitrobacter bleiben kann. 2) Diesen Tatbestand habe ich in meiner, in voriger Note, genannten Mitteilung etwas anders und nicht ganz richtig vorgestellt. IIÖ verloren gehen durch lange fortgesetzte saprophytische Lebens- weise. Verflüssigt Nährgelatine nicht. b. Actinobacülus paulotr opinis. Erzeugt auf den nitratierenden Platten schimmelartige Kolonien mit ,,Lufthyphen" ; besteht jedoch mikroskopisch anscheinend aus gleichartigen Stäbchen und Fäden. Wächst durchaus nicht bei Gegenwart organischer Substanz. Viertens, die Gattung Actinomyces, wovon verschiedene Arten, in geringer Anzahl in den „Kahmhäuten" von Aciinobacillus vorkommen können, daraus jedoch bei den Ueberimpfungen bisweilen gänzlich verschwinden. 6. Kann das Nitratferment Kohlensäure reduzieren? Die höchst auffallende Tatsache, dass das Nitratferment nur dann funktioniert, wenn gelöste organische Stoffe so vollständig wie möglich fehlen, führt, wie von selbst zur Hypothese, dass die bei der Nitritoxydation freikommende, nicht unbeträchtliche Energiemenge, nämlich 184 Kalorien nach der Formel HNO2 aq + O — > HNO3 + 184 K 1) vielleicht für die Reduktion atmosferischer Kohlensäure, also zur Chemosynthese dienen könnte. Beweise dafür habe ich bisher jedoch nicht finden können Kultiviert man das Ferment in Nährlösungen, so bleiben diese gänzlich klar, nur mit dem Mikroskop findet man, besonders an der mit einer äusserst, dünnen Schleimlage bekleideten Glaswand viele sehr kleine Bakterien. Die Masse dieser letzteren ist so gering, dass ein einzelnes Sonnenstäubchen, z.B. ein Fädchen Wolle oder Baumwolle in die Kulturflüssigkeit gefallen, eine Million derselben repräsentieren kann. Auf Kieselplatten, gesättigt mit Lösungen von 0,1 Proz. à 0,05 Proz. Natriumnitrit und 0,01 Bikaliumfosfat, bildet das Nitratferment erst mit der Lupe deutlich sichtbare, jedoch sehr aktive Kolonien, desto kleiner, aber nicht weniger aktiv, je vollständiger man gelöste organische Körper aus der Platte fernhält. Dass für das geringe Kohlenstofïbedurfniss, welches *) W. Ostwald, Allg. Chemie, 2^ Aufl. Bd. 2, Th. i, Pag. 145, 1893. hierbei in Betracht kommt, eine genügende Menge organisches Material als Verunreinigung in den Platten gegenwärtig ist, erscheint durchaus nicht unmöglich. Sollten die organischen Verunreinigungen der Platte dazu nicht ausreichen, so zeigt das kräftige Wachstum der Oligocar- bophilushäute auf der Oberfläche der nitratierenden Flüssig- keiten, sowie der Rohnitrifikationen im allgemeinen, dass die Atmosfere, wenigstens für deren Wachstum, genügend gebun- denen Kohlenstofï lieferen kann. Werden solche Rohkulturen auf Kieselplatten ausgesät, welche, so vollständig möglich von löslichen organischen Körpern befreit sind, so wachsen, neben den immer sehr klein bleibenden Kolonien des Nitratfermentes, diejenigen der genannten Arten als schneeweisse, trockene Platten (A. oligocarbophilus), oder als kleine, schimmelartige, sehr zarte Và\?,ttxc}L^ç.xi[A. pauloirophus), welche nach einigen Wochen, wenigstens was A. oUgocarho- philus betrifft, hundert oder tausendmal grösser werden können, wie die daneben liegenden Kolonien des Nitratfermentes. Da es nun feststeht, dass weder A. oligocarbophilus noch A.paulotrophus imstande sind Nitrite zu oxydieren und deshalb keine Chemo- synthese ausüben können, müssen diese Arten in ihrer Umgebung organisch gebundenen Kohlenstoff in genügender Menge vorfinden um damit ihrem, nicht so besonders kleinem Bedürfnis an dieses Element Genüge leisten zu können. Hieraus folgt jedoch mit Notwendigkeit, dass das so viel weniger bedürftige Nitratferment bei diesen Bedingungen dann doch auch sehr wohl eine genügende Nahrung an organisch gebundenen Kohlenstoff in der atmos- ferischen Luft muss finden können. Allerdings ist es noch unsicher von welcher Natur die hier in Betracht kommenden Substanzen sind. Vielleicht handelt es sich dabei um Kohlen- wasserstoffe, deren Gegenwart in geringer Menge in der Luft festgestellt ist. Die in meiner oben genannten Abhandelung i) zitierte Ansicht von Henriet, dass es sich dabei um Alkyla- minen handelen sollte, dürfte aber wenig wahrscheinlich sein. Jedenfalls konnte ich mit Formamid nichts erreichen ; ebenso- wenig mit Ammonformiat und Hexamethylentetramin. Anderseits muss es auch als möglich betrachtet werden, dass ^) Centralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. lo, Pag. 38, 1903. 112 flüchtige Stoffwechselprodukte anderer Mikroben dem Nitrat- ferment zur Ernährung dienen können. Ueberblicken wir das Vorgehende noch einmal, so ergiebt sich, dass wenn wir das Nitratferment, welches nur erblich stabil ist bei Gegenwart von Spuren von löslichen organischen Nährsubstan- zen mit den Namen Nitrobacter oligotrophum bezeichnen, daraus, bei besserer Ernährung, z.B. mit Bouillon, eine scheinbar ge- wöhnliche, schwach bewegliche, stark wachsende saprophytische Bakterie hervorgeht, mit sehr charakteristischen Eigenschaften welche Nitrobacter polytrophum genannt werden kann. Dieser Vorgang ist nicht umkehrbar, das heisst, bei Laboratoriums- versuchen gelingt es nicht die Umwandelung N.p > N.o zu stände zu bringen. Wie man sieht handelt es sich dabei um physiologische Art- bildung, und wenn man sich abfragt, wo diese in das System der Biologie unterzubringen ist, so kommt man zu folgendem Schlüsse. Ein Beispiel von Mutation, so wie ich diese für viele Mikroben, beschrieben habe, i) kann est nicht sein, denn die erblich mehr oder weniger stabilen Produkte des Mutationsprocesses entstehen neben der Hauptform und bestehen neben dieser, unter den verschiedensten Ernährungsbedingungen weiter fort. Allein es handelt sich dabei um ein neues und besonders auffallendes Beispiel erblich stabiler Modifikation, nur durch die Deuthchkeit verschieden von dem Virulenzverlust bei vielen pathogenen Mikroben ; vergleichbar mit der essentiell einseitig stattfindenden, nicht umkehrbaren Ontogenese der höheren Pflanzen und Tiere, deren Folge wür kennen in der Zellendifferenzierung. Die verschiedenen, bei der Ontogenese entstehenden Zellenformen, woraus schliesslich die erwachsenen Pflanzen und Tiere aufgebaut sind, müssen als Modifikationen der ursprünglichen embryonalen Zelle aufgefasst werden ; dass auch sie unter Umständen mehr oder weniger erblich stabil sind, lässt sich in vielen Fällen zeigen. Ich erinnere in dieser ^) Folia Microbiologica, Bd. i, Pag. i, 191 2. TAFEL VII. P'olia Microbiologica III (Beijerinck). I*'»- Ï (37j- J^'ilralfernieiit und B. Nitii>.\iis auf Nhritaçar, Fig. 2 (37). Nilratferment (i\ d) und B nifro.xits (a. b) auf Fleischbouillontjelatine. "3 Beziehung an die Wachstumsverhältnisse der Epidermiszellen der Tiere und der Korkzellen der Pflanzen, welche sich fortwährend aus ihren Mutterzellen regenerieren. Künstlich sind embryonale Bindegewebezellen und Muskelzellen des embryonalen Herzens, während einer Reihe von Generationen in Blutplasma, ohne sich zu änderen, reproduziert bei den Versuchen von Carrel. Es muss allerdings anerkannt werden, dass es sehr schwierig, wenn nicht unmöglich ist, Mutation und erblich stabile Modi- fikation in allen Fällen scharf von einander zu unterscheiden. Diese beide Vorgänge fliessen derweise zusammen, dass man manchmal in Zweifel verkehrt, wie ein Entwicklungsprozess, wobei eine neue Entwicklungsrichtung eingeschlagen wird, bezeichnet werden muss. Ich meine aber, dass, im Falle des Nitratfermentes die Verhältnisse deuthch sind, und niemand bestreiten wird, dass der Uebergang ,,oligotroph" zu ,,polytroph" wirklich als Modi- fikation zu betrachten ist. Es muss aber bemerkt werden, dass der Modifikationsbegriff zwei verschiedene Begriffe umfasst, welche bisher nicht durch bestimmte Worte angegeben werden, nämlich umkehrbare und nicht umkehrbare Modifikation. Damit parallel im Mutationsbegriff wären Mutation mit und ohne Atavismus. Es ist aus dem Vorgehenden klar, dass beim Nitrat- ferment nur nicht umkehrbare Modifikation stattfindet. Hierin liegt auch eine Verschiedenheit dieses Vorganges mit der Pleomorphic vieler Pilze, welche übrigens an die physiologische Artbildung beim Nitratferment erinnert. FIGURENERKLÄRUNG ZU TAFEL VIL Fig. I (37). Kolonien des oligotropen Nitratfermentes, Nitrobacter oligotrophum, und von Bacillus nitroxus auf Nitritagar. Die grossen, dendritisch verzweigten Kolonien sind das Nitratferment, die runden, kleinen B. nitroxus. Fig. 2 (37). Kolonien des umgewandelten, polytrophen Nitratfermentes, Nitrobacter polytrophum, und Bacillus nitroxus auf Bouillongelatine. Die grossen, körnigen Kolonien (c, d] sind das Nitratferment, zwei davon (c, cj fangen an die Gelatine zu verflüssigen ; die kleinen, runden Kolo- nien (a, b) sind B. nitroxus, im noch nicht verflüssigenden Zustande. EINE SPROSSLOSE FORM VON DEMATIUM PULLULANS DE Bary UND EINE STERILE ZWERQFORM VON PHYCOMYCES NITENS Aqardh. VON Dr. S. L. SCHOUTEN — Utrecht i). I. In einer Petrischale mit Glucose-Pepton-Agar folgender Zusammenstellung: Glucose techn. 5 0/0, Pepton Witte 1/2 Vo» Monokaliumfosfat 1/10 %5 Magnesiumsulfat V20 "/o» welche ich zum Auffangen von Luftkeimen aufgestellt hatte (und der ich I 0/00 Kupferazetat zu einem bestimmten Zweck, der mit der folgenden Untersuchung nichts zu machen hat, beigefügt hatte), entwickelten sich verschiedene Kolonien, welche aus gegliederten Hyphen und Hefezellen bestanden. Aus einer davon impfte ich nach einigen Tagen auf gewöhnlichen Glucose-Pepton-Agar (d. h. ohne Kupferazetat) über. Aus der darauf entstandenen Kultur isolierte ich unter dem Mikroskop eine Zelle. Die daraus entstandene Kolonie (also bestimmt eine Einzell-Kultur) ist der Ausgangspunkt der hier folgenden Untersuchung. Indem ich für eine weitläufigere Beschreibung nach früheren Publikationen verweise 2)^ will ich hier jedoch mit wenigen ^) Nach einem in der Niederländischen Vereinigung für Mikrobiologie am 8 Juli 1912 gehaltenen Vortrage. ^) Siehe u. A. : »Reinkulturen aus einer unter dem Mikroskop isolierten Zelle« in »Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für mikroskopische Technik. Bd. 22 (1905) S. 10 ff. Verbesserungen dieser Methode findet man in den Sitzungs-Berichten der Königl. Akademie der Wissenschaften zu Amsterdam ; Naturw. Abteilung, 24 Dec. 1910. "5 Worten sagen, dass für das Isolieren einer einzigen Zelle (Bakterie, Hefezelle, u. s. vv.) unter dem Mikroskop, das Material In einen hängenden Tropfen an der Unterseite eines Deck- gläschens gebracht wird, während diesem Tropfen gegenüber sterile Tropfen, worin die Reinkultur entstehen soll, angebracht sind. Mit Hilfe einer feinen, am Ende in ein Auge umge- bogenen Glasnadel, welche durch einen einfachen Mechanismus verstellt wird, kann man jetzt eine einzige Zelle, unter Kon- trolierung der stärksten Vergrösserung, aus diesem Tropfen isolieren und in einen der sterilen Tropfen hinüberbringen. Uebergeführt in ein gewöhnliches Kulturröhrchen mit Glucose- Pepton-Agar, hatte obengenannte Kultur nach 4 Tagen das Aussehen einer Hefekultur, gelbweiss von Farbe (Fig. 1). Mikroskopisch untersucht, sah ich, dass sie bestand aus Hefe- zellen, umsäumt durch einen Rand von Hyphen (Fig. 2). Einige Zeit später zeigten sich darin braune Flecke, und bisweilen ein brauner Rand (Fig. 3 und 4), und nach 3 Monaten hatte die Kultur die Gestalt von Fig. 5: ein flacher Teil, schmutzig rosa gefärbt, aus losen Hefezellen bestehend, und dicke schwarze Krusten, gebildet durch dunkelbraune Zellen, die Fetttropfen enthielten (auch etwa wie in Fig. 4). Die Vermutung, dass ich hier Dematium puUulans vor mir hatte, war hierdurch ein Gewiss- heit geworden. Ueber diesen Pilz, mit dem schon viele Untersucher sich be- schäftigt haben, besteht keine Uebereinstimmung, weder über den Platz, der ihm im System zukommt, noch was sein Verhalten bei verschiedenen Kulturbedingungen betrifft. Brefeld 1) teilt ihn bei Sphaerulina intermixta ein, eine Auffassung, die von Anderen bezweifelt wird. Für eine Verwandtschaft mit Hefe sind noch keine stichhaltigen Gründe angebracht. SEILER 2) behauptet sogar, dass man die Hefezellen mehrere Decennien hindurch kultiviert haben müsste, ohne dass sich Myzelium gezeigt hätte, und sich wohl Endosporen gebildet hätten, um das Recht zu haben, eine solche Verwandtschafft als sicher anzunehmen. *) »Untersuchungen aus dem Gesamtgebiet der Mykologie«, 1891, Heft 10. 2) »Studien über die Abstammung der Saccharomyceten« im »Centralblatt für Bakteriologie«. II Abt. 1896. S. 321. ii6 Nach LOEUW i) entwickelt sich eine weisse Konidie (so werden wir die Hefezellen nennen) unter günstigen Bedingungen immer zuerst zu einer Hyphe mit Seitenzweigen, welche Konidien hervorbringen, während die Konidien der zweiten Generation sich dann allein durch Sprossung vermehren. Ich selbst fand meistens das gleiche, aber doch auch wohl, dass eine Konidie sich unter denselben günstigen Umständen zu einer einfachen oder einer doppelten Riesenzelle (Fig. 6) entwickeln kann, welche dann wieder Konidien abschnürt, während bisweilen selbst das Aufschwellen zu einer Riesenzelle unterbleibt. Die braunen Zellen in älteren Kulturen weichen in dem von mir untersuchten Stamm in so fern ab von dem was andere Untersucher bei Dematium puUulans aufgeben, dass die runde Gemmen meistens vereinzelt, und beziehungsweise wenig in Ketten vorkamen. Die braunen Zellen können, nach früheren Untersuchern, zu Hyphen entkeimen, welche dann Konidien abschnüren, oder auch gleich Konidien erzeugen 2). Das Erstere solle dann geschehen bei guter, das Letztere bei geringer Nahrung. Ich fand auch Beides, aber unabhängig von der Nahrung. Abweichungen dürften hier auch übrigens nicht befremden. Mit Recht sagt ZoPF 3) — und das gilt auch noch jetzt — : „Wahrscheinlich sind unter dem, was man gewöhnlich D. p. nennt, mehrere Spezies versteckt". Ich stellte mir folgende Fragen : 1 . Was passiert, wenn man in der gewöhnlichen Weise aus dem flachen, schmutzig rosa gefärbtem Teil überimpft? Man bekommt dann eine Kultur, welche nach 6 Tagen noch weiss aussieht und aus Konidien und wenigen Hyphen besteht, aber nach 1 oder 2 Wochen schon schwarze Flecken zeigt — also die schon besprochene Kultur von Fig. i, 3 und 5. 2. Was passiert, wenn man in der gewöhnlichen Weise aus einer schwarzen Kruste überimpft ? Dasselbe ; die schwarzen Flecken werden aber später zahlreicher wie im vorherigen Falle, 3. Was passiert, wenn man eine Konidie aus dem rosa Teil isoliert? Ich brachte isolierte Zellen über in Tropfen flüssiger 1) »Ueber Dematium pullulans de Rary« in »Jahrbücher für Wissenschaftliche Botanik«. VI. S. 468—471. 2) Lafar, »Handbuch der technischen Mykologie« IV S. 277. 3) »Die Pilze« S. 480. Glucose-Pepton, und Hess die Entwickelung bei 250 C. statt- finden. Man bekommt dann, wie ich sagte, Konidien von sehr verschiedener Grösse und Gestalt (Fig. 6), oder ein Myzelium. Wenn man nun hieraus wieder entweder Hyphe-Fragmente oder grössere und gewöhnliche Konidien isoliert, so bekommt man immer eine Kultur wie sub i, eine Kultur also, die Konidien erzeugt. 4. Was passiert, wenn man eine dunkele Zelle aus einer schwarzen Kruste isoliert? Nach dem was ich hieroben mitteilte, würden sich dann auch immer Konidien entwickeln, entweder aus einem zuerst gebildeten Myzelium oder unmittelbar. Wenigstens, keiner der Untersucher, welche sich mit Dematium puUulans beschäftigt haben, haben je etwas anderes beobachtet. Wenn ich aber Zellen einer bestimmten Gestalt auswählte, und diese isolierte, fand ich eine merkwürdige Abweichung. Einige braune Zellen, unter volkommen normalen Bedingungen kultiviert, lieferten eine makroskopisch völlig abweichende, konidienlose Myzeliumform, die, unter welchen Bedingungen auch kultiviert, nie Konidien abschnürt, und sich jetzt während 3 1/2 Jahre als constant erwiesen hat. Um diese braune Zellen zu isolieren, muss man von der Ober- fläche vorsichtig ein wenig Material abkratzen und dieses in einen Tropfen steriler physiologischer Kochsalz-Lösung bringen. Es wird danach mit einem flambierten Glasstäbchen gerieben. Selbst nach längerem Drücken mit dem Stäbchen findet man noch wenige lose Zellen, welche isoliert werden können um die Myzeliumform zu liefern. Ich fing an mit einer Einzell-Kultur, die 3-| Monat alt war, zu arbeiten, und isolierte daraus (Fig. 7) 8 Zellen, jede Zelle in einen Tropfen Glucose-Pepton, und zwar No. i — 4 auf einem Gläschen, No. 5 — 8 auf einem andern. Die Gläschen wurden auf feuchte Kammern gelegt, welche bei 250 C. gesetzt wurden. Nach 24 Stunden zeigte sich die merkwürdige Erschei- nung, dass 4 Zellen (Fig. 7, No. t. 3, 5 und 8) zu einem kleinen Myzelium entkeimt waren, welches aber angefangen hatte Konidien abzuschnüren, während aus 3 Zellen (Fig. 7, No. 2, 4 und 7) ein Myzelium entstanden war, das keine Konidien abschnürte (Fig. 8). Eine Zelle — eine Seltenheit bei diesem Material — war nicht entkeimt. Nach 42 Stunden ii8 waren diese letzten 3 Myzelien so stark gewachsen, dass sie schon aus dem Tropfen herauswuchsen. Darauf wurde aus allen Tropfen in Röhrchen mit Glucose-Pepton-Agar geimpft. Schon nach 2 Tagen stellte sich heraus, dass i, 3, 5 und 8 sich wie eine gewöhnliche Dematiumkultur entwickelten, während 2, 4 und 7 sich als ein dicker Myzeliumpfropfen mit aufrecht stehenden kurzen Hyphenbündeln entwickelten. Nach 6 Tagen war es eine Scheibe, fast so hart wie Knorpel (Fig. 9), welche nur aus Hyphen bestand, die am Rande etwas länger ausliefen und im Zentrum kurz und gekrümmt [waren. Wenige Tage später beginnt die Kultur zu verschrumpfen (Fig. 10). Nach einigen Monaten ist sie schwarz (Fig. 11), an der Oberfläche grobkörnig, und ganz verschrumpft ; sie besteht dann aus braunen und weissen Hyphen von grilliger Form (Fig. 12). Später zeigt sich auf einer alten Kultur bisweilen noch eine weisse oder graue sehr dünne watte-ähnliche Schicht, aus weissen Hyphen von Zellen mit grossen Vacuolen geformt. Das Myzelium produziert Oel. Wenn man diese Kultur auf festem Boden in eine Lösung von Glucose-Pepton überbringt, entweder in Röhrchen, oder in Kolben, bleibt das Myzelium sprosslos ; ebenfalls wenn man gleich die entkeimende Zelle in Flüssigkeit überbringt. Immer sinkt das Myzelium teilweise auf den Boden, während ein anderer Teil eine Decke formt. Später wird alles schwarz, wie bei Kulturen auf festem Substrat. Gelatine wird verflüssigt. Auch auf anderen Nährböden bleibt diese Form sprosslos, wie sich aus Kulturen auf Sabouraud-Agar (Glucose 40/^ Pepton 2 0/0) Malzagar, Hefeextract 200/0 + Glucose 7V2V0, Brot, Kokosnuss, Banane, Agar i V2% ^^f Leitungswasser, erwiesen hat. Diese Versuche wurden, wie gesagt, genommen mit einer Kultur, welche aus einer einzigen unter dem Mikroskop isolier- ten Zelle entstanden war. Später wurden sie mit einer 4 Monate alten Kultur desselben Stammes wiederholt. Es wurden die Zellen von Fig. 13 isoliert. Davon lieferten No. i — 3 die Konidienform, No. 4 — 6 die Myzeliumform. Wenn man die Form und die Masze der Zellen welche die Myzeliumform geben, nachgeht, wird man bemerken, dass sie fast alle dem mehr länglichen Typus angehören. Wenn man Tig diejenige Zellen länglich nennt, deren Länge wenigstens 2 1/2 mal grösser ist wie die Breite, sieht man, dass von 7 Zellen, welche die Konidienform liefern, 6 nicht länglich sind und i länglich, indem von den 6 Zellen welche die Myzeliumform liefern, 5 länglich sind und i nicht länglich. Diese Tatsache brachte mich zu der Frage, weil längliche Zellen hier meistens aus Hyphen herstammen, ob es nicht die Zellen der braunen Hyphen sein könnten, welche die Myzeliumform geben, indem die braunen Zellen, welche vom Anfang ab lose in der Kultur vorkommen, oder vor dem Braunwerden als Konidien an den Hyphen entstanden sind, und die meistens einen mehr isodia- metrischen Form haben, die Konidienform geben könnten. Es ist mir nicht gelungen dem Zusammenhang dieser Zellen während des Wachsens der Kultur zu folgen. In einem mikroskopischen Praeparat, verfertigt aus einer ausgewachsenen, einige Monate alten Kultur ist dies selbstverständlich noch weniger zu entscheiden. Da liegen alle Zellen mehr oder weniger verwirrt durch einander. Aber doch hat diese Annahme wohl eine gewisse Wahrscheinlichkeit bekommen durch die folgenden Isolierversuche. Aus einer 25 Wochen alten Kultur isolierte ich 4 Zellen, und aus derselben, nur 2 Wochen älteren Kultur, wiederum 4 Zellen, welche alle zu dem mehr isodiametrischen Typus gehörten und jedenfalls den Eindruck machten, dass sie nicht aus Hyphen entsprossen waren. Sie lieferten alle die Konidienform. Aus einer andern, 19 Wochen alten Kultur isolierte ich 3 ganze Hyphen, und Stücke, wovon es einigermaszen zweifelhaft sein konnte, ob sie von Hyphen herstammten, welche alle die Myzeliumform gaben, und weiter eine zusammenklebende Masse Konidien und eine einzelne Konidie, welche beide die Konidienform gaben. Obgleich bei gewissenhafter Arbeit die Möglichkeit der Luftinfektion ausserordentlich klein ist, hat man damit doch immer zu rechnen. Ich meinte deshalb, dass ich diese Versuche nicht alle mit einer einzigen Kultur machen dürfte. Darum nahm ich für die letztbeschriebene Probe eine ganz neue Kultur, welche ich wiederum aus einer einzigen, unter dem Mikroskop isolierten, Konidie hatte entstehen lassen. Ich habe auch nachgeforscht, ob die obenbeschriebene Abspal- tung einer Myzeliumform bei jedem Dematiumstamm möglich Î20 ist. Dazu wurden einige an verschiedenen Stellen aus der Luft aufgefangen, und eine davon erwählt, wovon die braunen Zellen in den schwarzen Flecken ziemlich übereinstimmten mit den Zellen des bis jetzt benutzten Stammes. Obgleich ich in derselben Weise arbeitete wie mit dem vorigen Stamm, habe ich daraus aber in keiner Weise eine Myzeliumform erzeugen können. Einige wenige Worte will ich noch sagen über eine Erscheinung, worauf ich oben schon hingewiesen habe und die gewiss nicht allein bei Dematium vorkommt: die starken individuellen Unter- schiede was das Entkeimen der Konidien, sowohl weisse als braune, betrifft. Man kann, wenn man den hier beschriebenen Fall der sprosslosen Myzeliumform ausschliesst, 4 Typen unterscheiden : A. Es entwickelt sich aus der Konidie eine Hyphe, welche sich einigermaszen verzweigt und sehr bald (nämlich innerhalb 24 Stunden) zum Abschnüren von Konidien übergeht. B. Es entwickelt sich aus der Konidie eine Art Riesenzelle, welche gleich Konidien abschnürt. Diese 2 Arten der Entkeimung kommen am meisten vor ; viel seltener sind die folgenden Arten. C. Es entwickelt sich ein Myzelium, das erst spät, d.h. nach I oder 2 Tagen, Konidien abschnürt. D. Die Konidie schnürt gleich Töchterzellen ab. Von einigen Untersuchern, u. A. DE Bary, wird angenommen, dass alles dieses unter Einfluss verschiedener Kulturbedingungen stattfindet. Je besser diese sind, desto mehr Möglichkeit für Entwickelung von Myzelium wäre vorhanden. Dem kann ich aber nicht beistimmen. In meinen Tropfenkulturen sah ich nämlich alle diese Formen unter gleichen Bedingungen durch einander entstehen. In einem Tropfen z.B., worin man 20 Zellen ent- keimen lässt, können sich kurze und lange Hyphen entwickeln. Bringt man 4 Tropfen Glucose-Pepton auf ein Deckgläschen, und in jeden davon eine Konidie derselben Herkunft, dann kann der eine Tropfen ein sehr kräftiges Myzelium liefern, das Konidien erzeugt, ein anderer aber eine kurze Hyphe, woran Konidien entstehen, während in dem dritten gleich Zellen, abgeschnürt werden. Der Gedanke kam mir, ob hier vielleicht Erblichkeit bestehen könne, welche bei Ueberimpfung tausender Zellen zugleich Î2Î selbstverständlich unbemerkt bleibt, aber erst zu Tage kommt wenn man eine einzige Zelle isoliert. Um hier Sicherheit zu bekommen, wurde eine Anzahl Zellen in einen Tropfen gebracht, und, sobald sich eine zeigte, die nach dem Typus C. oder D. entkeimte,' wurde diese isoliert. Es war aber keine Spur von ErbUchkeit zu sehen. Die Nachkommenschaft einer Zelle von Typus C. zeigte bei der Entkeimung eben so gut die 4 Typen wie die von Typus D. Mit einer Kultur, abstammend von einem sehr stark ent- wickelten MyzeUum, dass erst spät Konidien abschnürte (Fig. 14) — man könnte sagen : ein Mutant mit Neigung zu Spross- losigkeit — habe ich noch probiert eine sprosslose Form zu bekommen, wie bei meinem ersten Stamm. Alle Bemühungen, u. A. das Abschneiden allerlei Teile des Myzeliums unter dem Mikroskop, und das Isolieren und weiter Kultivieren der abge- schnittenen Stücke, mislangen ; immer kamen wieder Konidien, bisweilen nachdem die isolierte Hyphe erst Chlamydosporen geformt hatte. Man könnte zum Schluss fragen, ob diese Untersuchung auch nicht mögUch gewesen wäre mit der Methode der Plattenkultur. Darauf antworte ich, dass hier für das Erlangen der sprosslosen Form immer längliche braune Zellen isoliert wurden, welche selten, selbst nach langem und intensem Reiben, lose vorkommen, sondern meistens mit andern braunen und weissen Zellen verbunden bleiben. Jetzt, wo es einmal bekannt ist, dass solch eine sprosslose Form erhalten werden kann, und die Form der jungen Kultur, also der Kolonie, bekannt ist, würde man sie vielleicht isolieren können wenn man sehr viele dünn besähte Platten gösse. Für das Entdecken einer solchen Form, wenn man ihre Existenz nicht weiss oder selbst nicht vermutet, scheint mir die Platten- kultur-Methode jedoch nicht die gewünschteste. Die Frage, ob die sprosslose Form selbstständig in der Natur vorkommt, ist schwer zu entscheiden. Vielleicht ist das so ; vielleicht wird sie in dem einen oder anderen Laboratorium rein gezüchtet, ohne dass man etwas von Zussammenhang mit Dematium vermutet. Vielleicht auch wird sie immer von der Konidienform, worin sie also mehr oder weniger verborgen ist, überwuchert. 122 II Aus einer Reinkultur von Phycomyces nitens -f- und — , welche Herr Prof. Went, Director des hiesigen botanischen Instituts mir in liebenswürdiger Weise zur Verfügung stellte, isolierte ich Sporen zur Erlangung von Einzellkulturen. Fast alle Sporen zeigten die normale elliptische, einige aber eine bizarre Form. (Fig. 15). Ich isolierte auch einige von diesen letzteren, um zu untersuchen ob sie vielleicht eine abweichende Kultur geben würden. Dies schien mir nicht der Fall zu sein, nur mit einer Ausnahme. Eine Spore, aus einer — Kultur herstammend, und abgebildet in Fig. 15 No. 2 wurde, zugleich mit 3 normalen Sporen, auf demselben Deckgläschen isoliert; nach 24 Stunden war sie gekeimt ; nach 48 Stunden wurde das sehr kleine Myzelium, und auch das Myzelium aus einer der gekeimten normalen Sporen, auf Röhrchen mit flüssiger Glucose-Pepton übertragen. Nachdem die Myzelien sich hierin in zwei Tagen gut entwickelt hatten, wurde auf festem Nährboden, auf Glucose-Pepton-Agar übergeimpft. Im Anfang wuchsen beide Myzelien darauf gleich schnell ; danach produzierten beide niedrige Sporangien. Während diesen aber beim Myzelium der normalen Sporen lange, in den Wattepfropfen des Röhrchens wachsenden Sporangirn folgten, war dies nicht der Fall mit dem Myzelium der abnormalen Spore ; dieses brachte somit nur niedrige Sporangien hervor. Der Unterschied blieb beim L'eberimpfen bestehen ; viel grösser war er aber auf Brot, das für Phycomyces ein weit besserer Nährboden ist als Glucose-Pepton-Agar. Um die Sporangien in eine Lage su bringen worin sie sich so hoch wie möglich entwickeln konnten, wurden zwei Bechergläser des höchsten Modelles mittels eines geeigneten, rinnenförmigen Verbindungs- stückes umgekehrt auf einander gesetzt. 1) Dadurch wurde ein steriler Raum von ^i 13 cm. Durchmesser und 60 cm. Höhe gewonnen. Der Apparat wurde dann in eine an der Innenseite geschwärzte Schachtel gestellt, so dass das Licht nur von oben her einfallen konnte. Hierin erreichten, auf Brot als Nährboden, *) Ich denke von diesem Apparat, der sich vorzügUch zum steril Züchten von — und Experimentieren mit hochaufwachsenden Pilzen und höheren Pflanzen eignet, später eine spezielle Beschreibung zu geben. 123 die Sporangienträger der normalen Stammform eine maximale Höhe von 37 cm, und die der Zwergrasse eine von 15 cm. (Fig. 17). Ist dies schon ein auffallender Unterschied, noch merkwürdiger ist es mit den Sporangien gestellt Das Sporan- gium der Zwergform ist meistens von einer feuchten Hülle umgeben, und enthält keine Sporen, sondern einen grobkörnigen, Fett- tropfen führenden Inhalt (Fig. 16). Auch auf Brot bleibt dieser Unterschied beim Ueberimpfen bestehen. Ich habe darum die Zwergform Phycomyces nitens var. nana steriHs genannt. Da 6 oder 7 Wochen sich wohl ungefähr als die Maximal- lebensdauer des Myzeliums erwiesen hat, tut man gut, alle 4 oder 5 Wochen überzuimpfen. Dazu werden — da dennoch mehrmals Partieen des Myzeliums abgestorben schienen — mehrere Stückchen aus verschiedenen Teilen des alten Nähr- bodens herausgenommen. Als die Zwergform so mehr als ein Jahr gezüchtet war, zeigten sich zwischen den sterilen Sporangien, einige normale. Darüber wird man sich nicht wundern, wenn man bedenkt, dass die Sporen von Phycomyces mehrkernig sind. Von 6 — 10 Kernen in der Spore, welche die sterile Zwergform lieferte, kann sehr gut einer noch die Eigenschaften der Stammform gehabt haben. Man vergleiche die Untersuchungen von BURGEFF 1), der aus einer Kultur von Phycomyces ein Myzelium bekam mit abnormal verdickten Sporangienträgern, das aber am Schluss der Vegetation wieder einige echte lange Nitens-Träger erzeugte, eine Erscheinung welche von BURGEFF auch mit Recht Heterocaryose zugeschrieben wird. Es ist jetzt zwei Jahr her, dass ich in meiner Zwergrasse zum ersten Mal einige normale Sporangien konstatierte ; seitdem hat sich die Erscheinung sporadisch wiederholt, aber ohne das die normalen Sporangien verhältnissmässig zahlreicher wurden ; mehrmals hatte ich Kulturen, worin ich sie gar nicht fand. Es scheint somit der Teil des Myzeliums mit den Nana- sterilis-Kernen leicht die Ueberhand zu behalten. ^) H. Burgeff: Ueber Sexualität, Variabilität und Vererbung bei Phycomyces nitens. Vorläufige Mitteilung. Ber. der deutschen bot. Ges. 191 2 Bd. 30, p. 679. 9 FIGUREN-ERKLÄRUNG. Fig. 1-14 Fig. 1—5- Fig. I. Fig. 2. Fig- 3 Fig. 4 Fig. 5 Fig- 6 Fig. 7. Fig. 8. Fig. 9—12. Fig. 9- Fig. 10. Fig. II. Fig. 12. Fig. 13. Dematium pullulans. Normale Form von Dem. pull. Kultur auf Glucose- Pepton.Agar. 4 Tage alt. Mikr. Bild aus Fig. i. 500 fach. Weisse Hyphen und Konidien. II Tage alt. Mikr. Bild aus Fig. 3. 500 fach. Weisse und braune Zellen und Zellenketten. 13 Wochen alt. Keimung von weissen Konidien. In i und 2 ist eine einfache, in 3 und 4 eine doppelte Riesenzelle geformt, In 5 hat die Konidie erst einen Myzelschlauch getrieben. 500 fach. Isolierte braune Zellen, von denen No. i, 3, 5 und 8 ein Konidien-abschnürendes Myzelium, No. 2, 4, und 7 ein sprossloses Myzelium lieferten. Skizze dieser beiden Keimungsarten. Sprosslose Form von Dem. pull. Kultur auf Glucose- Pepton-Agar. 6 Tage alt. II Tage alt. 13 Wochen alt. Mikr. Bild aus Fig. 11. 500 fach. Braune und weisse Hyphen von grilliger Form. Keine Konidien. Isolierte braune Zellen, von denen No. i — 3 ein Konidien- abschnürendes Myzelium, No. 4 — 6 ein sprossloses Myzelium lieferten. 500 fach. TAFEL VIII. 1. Folia Microbiologica III (Schouten). 3. 2. TAFEI, IX. 5. Folia Microbiologica III (Schouïen). il 8 ^^^^tF^ni^ ,-1» .^.l.a \J d.i'j TAFEL X. 9. Folia Microbiologica III (Schouten). 10. 12. 13. TAFEL XI. 11. Folia Microbiologica III (Schoutkn). Î4 à ' ^>> I". 1 ^ 15. (^ 16. TAFEL XII. 17. N°. 1. Folia Microbiologica III (Schouten). 17. N«. 2. 125 Fig, 14. Myzelium das erst spät Konidien abschnürt. Schwache Vergr. Fig. 15 — 17. Phycomyces nitens. Fig. 15. Sporen von Phyc. nitens. 500 fach. No. i normal, No. 2 — 4 abnormal. Fig. 16. Teil eines unter dem Deckglas zerquetschten Sporan- giums von Phyc. nana sterilis. 500 fach. a. Sporangiumträger. bb. Wand des Sporangiums, geöff- net, c. Inhalt, aus fetthaltendem Protoplasma bestehend. Fig. 17. No. I. Phyc. nitens normal auf Brot. 37 cM. hoch. No. 2. Phyc. nitens var. nana sterilis auf Brot. 15 cM. hoch. [From the Municipal Hospital, Bergweg, Rotterdam]. A NEW METHOD OF SEROLOGICAL RESEARCH, FOR THE FIRST TIME APPLIED TO SUFFERERS FROM TUBERCULOSIS BY Dr. J. HERMAN, First medical attendant at the above mentioned hospital. Introduction. For some time I have been engaged upon the analysis of the effect of tuberculine. In an earlier publication concerning this subject i) I already illustrated, that tuberculine, though as good as nonpoisonous to non-tuberculous individuals, may be made poisonous to them too by allowing the serum of a sufferer from tuberculosis to act upon tuberculine for a short time. I illustrated this in the following manner. Allow such a bloodserum to act upon a solution of old- tuberculine for about lo minutes in a living-room-temperature (the tuberculine-solution should be so strong, that, after the dilution with serum it is from 4 to 5 %) ; bring a few drops of this mixture into the connective tissue of the eye of a healthy, non-tuberculous cobaya. Very soon afterwards such an irritation of the connective tissue arises, that a thin secretion, sometimes even, a thick secretion containing much mucus, appears. The instillation of the serum alone, or of the 5 o/q tuberculine- solution alone can not cause such a reaction. ^) Dr. Herman. Bijdrage tot de Analyse der Tuberkuline-werking. Nederl. Tijdschr. v. Geneesk. 191 3 H, No 24.. 127 If blood serum obtained from a non-tuberculous individual is used for the action upon tuberculine, this reaction does not arise. So it already appeared from these experiments that in the bloodserum of sufferers from tuberculosis a substance occurs, which can transform tuberculine in such a way, that from non- poisonous it may be made poisonous also to non-tuberculous individuals. I further proved this by injecting a mixture of such blood- serum and tuberculine into the abdomen, into the veins and beneath the skin of healthy cobayas. In this way I could poison the experimental animals to a high degree. After injections into the veins of rabbits I could even cause important rises of temperature, which did not appear when I injected either only bloodserum or only tuberculine- solution. Neither did I see this, when I took bloodserum of healthy persons. It seems to me, that by means of these series of experiments I have supplied further proofs for the correctness of the theory, composed by WOLFF-ElSNER i) in order to explain the peculiarity of the tuberculine-action. A theory, also treated of in detail and defended by Sahli 2) in his well known booklet. After the finishing above mentioned experiments, I began to analyze the peculiar reaction of tuberculous tissues following an injection of tuberculine, administered to a tuberculous individual. Such a strong reaction of the tuberculous tissue has often been known to take place, that necrosis and decline may often be the result. I have made an endeavour to imitate these phenomena artificially. In the first place I asked myself, which factors co-operate in this reaction. It is probable that chiefly the tuber- culous tissue, white corpuscles, blood or tissue-fluid and the injected tuberculine must bring about the reaction together. "How" I now tried to unravel. In a test-tube I brought together the following substances : a tissue (for which I took fibrine obtained from horse-blood), white corpuscles (also extracted from horse-blood), tuberculine (Alt- Tuberkuline, KoCH, HÖCHST) and bloodserum, obtained from a Ï) WoLFF-ElSNER. Früh-Diagnose u. Tuberk. Immunilät. Berlin 1909. 2) Sahli. Tuberkulin-Behandlung u. Tuberk. Immunität. 1913. 128 sufferer of tuberculosis. In the first experiments I coloured the fibrine with methylic-blue and in the following with eosine. The mixtures obtained in this way, were placed in an incubator, for the time of 16 hours in a temperature of 37° C. If after i6 hours the fibrine had been consumed, the liquid became blue (resp. pink). If there was no consumption, the above-mentioned liquid remained colourless. As tissue I took fibrine, an indifferent substance, in order to be able to trace the influence of the nature of the tissue on the reaction. For, by replacing fibrine by tuberculous tissue I could trace, what influence the nature of the tissue had on the result of the reaction. I had expected, that I should see the most intense consump- tion of the fibrine, if I brought blood-serum, tuberculine and white corpuscles together. According to my train of thought, the leucocytes would be killed by the poisons, coming free by the action of serum on tuberculine. Out of the killed leucocytes would come free peptically working ferments and these would again especially transform the fibrine. But the result of the experiments was quite different. Comsumption of the fibrine did always arise, when I added it to blood-serum ; but was always less intense, when I moreover added either tuberculine, or white corpuscles or both. This greatly astonished me. Therefore I submitted the checking influence exercised by tuberculine and leucocytes on the transformation of coloured fibrine by means of human-serum, to a closer research. From this a new method of serological research has proceeded. Before setting forth this method I have first to treat of the preparatory researches first to be held. Preparatory researches. So I found as the result of the above-mentioned experiments that serum, obtained from tuberculous people can transform coloured horse-fibrine to a rather high degree. Immediately the two following questions present themselves : 1. Does the serum of every man possess the property of being able to transform fibrine ; or does this property specially belong to serum, obtained from tuberculous persons? 129 2. Can human serum also dissolve other albumina besides fibrine? ad. I. It is well-known, that in human serum different ferments occur, which partially occur in the serum itself, partially- come free with the falling asunder of the leucocytes. Besides fibrine-ferment, peptic-, amylolytic-, and lipolytic- ferments are known. To my knowledge, in the clinic no use has as yet been made, towards diagnostic purposes, of the fact that serum possesses one of these ferments in a more or les high degree. The anti-tryptic property of serum has indeed often been a point of research. If we remember e, g. the many researches, made after the method of JOCHMANN & MÜLLER, wich comes to this, that the anti-tryptic action is traced by mixing the serum on a smooth LÖFFLER-serumplate with tryptically acting liquid. The anti-tryptic property of serum especially seems to have increased, when abnormally much human albumen is lost (cancer, tuberculosi«;, pregnancy a. o.) Of late many researches by ABDERHALDEN i) and his pupils have appeared about the property of human serum being able to destroy certain organs under certain circumstances. In pregnancy specific ferments were said to occur in the blood, which can destroy placenta. With sufferers of cancer specific ferments were said to occur which can corrode cancer-tissue. Abderhalden used different methods. First he followed the dialysing method. To i gram of organ (e. g. placenta) in a dialyser, 1.5 cM^ serum is added. When this has been left undisturbed for 16 hours in a temperature of 37 <* C. we try to indicate the products formed from the placenta in the dialysiswater (15 c.M^ distilled water) by means of the biuret — (or better) the ninhydrin — reaction. This method is still universal and more used than the so called optic method. For this method we want a small and sensitive polarimeter; by means of this instrument we determine the refractive index, changed because of the formed transformation products. After- ^) Abderhalden. 4te Auflage der »Abwehrfermente« 1914. 130 wards the microkjeldahl method i) is used in order to be able to determine the quantity of nitrogen in the dialysis- liquid. Later still he makes use of an analogical method, the same as I have followed 2) ; viz. tissue (placenta) is coloured with carmine and from the colour coming free, the intensity of the consuming-process is judged. It would ask too much space, if I here entered in detail upon the researches made after these different methods. Let the short information suffice, that the results are very different. While Abderhalden and his school maintain that the ferments occurring e. g. in pregnancy in the serum of women, are specific and consequently can alone destroy placenta-tissue, there are on the other hand a great many other investigators, who cannot agree to this. According to the last, the serum of pregnant women destroys placenta offener and in a larger quantity than serum of not-pregnant women, but certainly it occurs not seldom that the serum of not-pregnant women can destroy placenta. Even the serum of men is said to be able to do this ! At all rates the Abderhalden-reaction has as yet not conquered a place of its own as a diagnostic expedient. Elabo- rate researches and a list of literature are to be found in the dissertations of GOUDSMIT 3) and BiJLEVELD 4). In searching the different tables given in the researches meant here, I have made it my particular study to find an indication of the solution of the problem on which we are now engaged, whether the serum of tuberculous individuals possessed a stronger peptic property than the serum of non-tuberculous persons. I consequently investigated, if perhaps the serum of the former, bjit not pregnant, destroyed placenta oftener than that of others, non-tuberculous and also not pregnant. For other states, of disease (cancer, lunacy etc.) I searched this in an analogical way. From the published tables I could not at all conclude that the bloodserum of tuberculous individuals regularly differred from the serum of non tuberculous persons. My own researches ') Munch, Mediz-Woche7ischrift, 7 April 19 14, No. 14. 2) Munch, Mediz- Wochenschrift, 21 April 1914, No. 16. ^) M. E. GoUDSMiT. De biologische Zwangerschapsreactie volgens Abderhalden. Diss. Amsterdam 1913. *) J.W. BiJLEVELD. De zwangerschapsreactie van Abderhalden. Diss. Leiden 1913. also taught me, that there zvas a great individual dißerence, while I did not find that, in general, blood serum of tuberculous persons possessed a stronger peptic power than that of non- tuberculous persons. As albumen, in regard to which I deter- mined the peptic power, I chose (as mentioned) horse-fibrine. This was coloured at first with methylic blue, afterwards with eosine. The fibrine freed from blood and blood-colour by means of washing, was put in a watery solution of methylic-blue or eosine for 24 hours. The fibrine absorbed much colour. The superfluous colour was removed by boiling the fibrine with constantly renewed water, until the water remained quite colour- less. This is indeed a work taking up much time, but in this way we can prepare coloured fibrine, which, when brought into the controlling-tube, filled with water or Na.-Cl. solution, does no longer let loose any colour. Afterwards I coloured the fibrine with eosine instead of methylic blue, because I found that the digestibility of this albumen suffered more by the colouring- process when I used methylic-blue than when I used eosine. It is desirable always to take fresh fibrine, for this digestibility of the fibrine also decreased during the time it was kept. The mixtures of serum and fibrine were always put in test- tubes of the same width and thickness, which were closed with a cork. The solutions were placed in an incubator for about 16 hours in a temperature of sy'^C. Great care was also taken to add equal pieces of fibrine to the different mixtures. This was necessary from the point of view of comparison, as the experiments taught that the intensity of the consuming process was greater when the surface of the albumen increased. The peptic property of human serum in regard to coloured horse-fibrine 1 determined in 2 ways : a. To equal quantities of undiluted or very little diluted serum I added equally big, equally fresh and equally coloured pieces of fibrine. From the stronger or weaker colour of the liquid the intensity of the consuming-process was judged. b. Each serum was so far diluted with 0.9 % Na. CI. solution, till consuming of fibrine no longer took place. The stronger the fibrolytic power of a serum, the more it had to be diluted in order to find this decisive point. Here is an example of an experiment. / T32 Of 6 persons, respectively suffering from tabes dorsalis, chlorosis, tubercul. pulm. II, tubercul. pulm. I, lues and liver- cancer the sera are investigated in regard to their fibrolytic power. If each serum was diluted 5 times, the dilutions, made from the sera, obtained from persons suffering from tabes dorsalis and chlorosis both proved to be coloured equally strong and strongest of all. Then followed: tubercul. pulm. II, tubercul, pulm. I, lues and liver-cancer. The final dilution of each serum, by which fibrine was no longer transformed, was of tabes i : goo ; chlorosis i : 800 ; tubercul. pulm. II i : 600; tuberc. pulm I i : 500; lues I : 450 ; cancer i : 350. Consequently there was a rather satis- fying harmony in the results obtained in both ways. From this series of experiments also appeared already the great indi- vidual variety of the fibrolytic power of the investigated sera. I found this confirmed in all my experiments. From these experiments I consequently obtained the following result: The fibrolytic power of human serum is not constant, hut individually shows great variety. I did not succeed at all in finding any fixed rules ; in no state of disease did I find the fibrolytic power constantly increased or decreased. With older people this power mostly seems to be stronger than with youn- ger people. ad. 2. In order to be able to answer the question, whether human serum can also transform other albumina instead of fibrine, I used for further consuniing experiments, hen's albumen, lung- and kidney-tissue ; these two last substances, obtained both from a man and a rabbit. (Healthy lungs and kidneys were used). These tissues I again coloured with eosine. Lung- and kidney-tissue, cut into small slices and then put in the colour, absorb much colour, but also lose a great deal of it again through the boiling. Moreover I found that even though the water was quite colourless, the coloured pieces of lung and kidney repeatedly let loose colour when in the controlling-tubes, if they remained in the incubator for i6 hours in a temperature of 37» C. The result of the consuming-experiments was, that every human serum that I have searched, corrodes hen^s albumen as well as kidney-tissue. Ï33 Whether these substances can be transformed to as high a degree as fibrine I cannot state with absolute certainty, as I was not quite sure that the quantity of colour occurring in all 3 substances was the same per unit of surface and capacity. Probably this was not the case, as hen's albumen was weaker coloured than fibrine. Also I again found (the same as I found for fibrine) that the consuming poiver of the ser inn with regard to hen's albunieti, lung and kidneytissue again individually shozved great variety. Mostly hen's albumen was still consumed in loo times diluted serum. Lung- and kidney-tissue in still stronger diluted serum. Serum, obtained from a sufferer from chronic disease of the kidneys-however, corroded kidney- tissîte to a niucJi higher degree than that of non-sufferers. And it makes little or no difference whether lung- and kidneytissue of a man or of a rabbit is taken for this purpose. In general however human serum could be further diluted still to be able to obtain transformation of fibrine, than to reach the same purpose for the other mentioned albumina. Therefore I think it probable that, with a reservation as to the just made restriction, human serum, speaking in general, can transform fibrine more strongly than hen's albumen, lung- or kidney-tissue. If, however, I investigated the consuming power of serum, obtained from a sufferer from chronic disease of the kidneys, both in respect to horse-fibrine and coloured kidney- tissue, the kidney-tissue was also repeatedly corroded in a still stronger dilution of the serum. This result, viz. that each serum can corrode organic albumen contradicts, what has been pretended bij ABDERHALDEN and his school (page 4 ). If A. however coloured the placenta with carmine, he also found that nearly every serum transformed placenta-tissue (sec note 4, page 5). Moreover BiJLEVELD (5) found that in dialysis continued for more than 16 hours every human serum corroded placenta-tissue in such a way, that this could be indicated by the ninhydrin-reaction. Apparently there is a harmony between these results and mine. The indica- tion of consumption of the organic tissue by means of colour, is, however, a much more sensitive method than the dialysis- method. Hence that every human serum can corrode organic 134 albumen while in using the dialysis method this cannot be proved in all cases. What kind of ferment may this be, which exercises such a consuming power in the serum ? If the serum is heated for half an hour to 56° C, the fibrolytic power has been weakened but not destroyed. Consequently it is not the complement. Nor does it only proceed from leucocytes, which have fallen asunder, for the activity of the serum is almost the same, when imme- diately after the coagulation the serum is centrifugated from the blood, as when this is not done till after some hours. Most probably in the last serum a rather greater number of leucocytes have fallen asunder than in the first; still the fibro- lytic power is almost the same. How is it to be explained that tuberculine checks the trans- formation of coloured fibrine by serum ? The solution of this problem is not so difficult, for from further experiment it soon appeared that this checking power belongs not only to tuber- culine, but to many other uncoloured albumina. If for instance, besides coloured fibrine, hen's albumen is added, the transfor- mation of fibrine is also impeded. The fibrine-transformation may even be absolutely checked, when the serum is sufficiently diluted (100 times or still further). The same thing takes place when, instead of hen's albumen, uncoloured kidney-tissue is taken. And when besides fibrine, coloured by eosine, fibrine coloured by methylic blue is added to serum, the transformation of the eosine-fibrine predominates. All the mentioned albumina check the fibrine transformation, because the digestibility of the fibrine has decreased because of the colouring ; the other albumina are now easier transformed and are now more corroded than fibrine. And, as methylic-blue fibrine is again less easy to digest than eosine-fibrine (pag. 6) in a mixture of both fibrine-kinds and serum, eosine-fibrine is most corroded. In order to explain this checking, we should also remember that in the serum now occur two instead of one albumen ; and that consequently the ferment now corrodes two substances instead of one, but by this the absolute checking cannot be explained. For by all the mentioned albumina the fibrine-trans- 135 formation can be absolutely checked and that in a much weaker solution of the serum than that in which (without addition of one of the mentioned albumina) fibrine alone is no longer transformed. Moreover I took care in my experiments that the surface of the uncoloured albumen was no larger than that of the fibrine. With an increasing digestion-surface the intensity of the diges- tion-process also increases. With this factor we must however reckon in order to explain the checking action of fibrine. For tuberculine contains a dissoluted albumen, viz. of the character of an albuminoid. As albuminoid is again easier to digest than ordinary albumen (e.g. hen's albumen) and the surface of tuberculine is so large because of its dissoluted state, the checking influence of this substance upon the transformation of coloured fibrine is therefore so great. And especially greater than that of hen's albumen. By a simple experiment may be indicated that each serum easily transforms tuberculine. For if we allow any serum to act upon tuberculine for 3 hours in a temperature of 37° C, and if we only then add the fibrine, no or nearly no fibrine, is transformed. If we place serum in the incubator for 3 hours in a temperature of 37*^ C, this has nearly no influence on the transformation of fibrine, then added. Probably this simple experiment also sufficiently explains why every man finally reacts upon an injection of a very large dose of tuberculine (more than 10 mG.) The quantity of tuberculine is so great that only by the action of the peptic ferment occurring in every human serum enough transformation-products can be formed to cause temperature rises, etc. A new method of serological research. All these preparatory researches were necessary clearly to understand the now to be treated new serological method. For soon it appeared to me that tuberculine, added to the blood-serum obtained from a sufferer from tuberculosis less checked the fibrine-transformation than when added to non- tuberculous serum. This I found repeatedly confirmed. Conse- quently : If the fihrolytic power of 2 sera, the one obtained 1^6 from a süßerer from tuberculosis, the other from a non- sufferer, is equal, absolute checking of fibrine-transformation by tuberculine appears with the first serum in a weaker dilution than with the second. If the fibrolytic power of the 2 sera is not equal, but e.g. that of the second much stronger than that of the first, the dilution for the absolute checking of the fibrine transformation need not be weaker for the first serum than for the second. I will illustrate this by some experiments. Serum A is obtained from a female sufferer from phthisis in the first stage with a temperature up to 38° C. Serum B originates from a female sufferer from ulcus ventriculi. Both sera are respecteivly diluted 50, 100, 200 and 400 times with Na. CI. solution. To all dilutions of both sera pieces of fibrine of the same size, the same date and the same colour-strength are added. The fibrine is fresh, 2 days old. The following mixtures are prepared : 1. 2 cM^. NaCl. + 0,5 M^. Serum A (10 X diluted) + fibrine. 2. 2 » » » + 0,5 » » » (20 X * ) + » 3. 2 » » » 4- 0,5 » » » (40 X » ) + » 4. 2 » » » + 0,5 » » » (80 X >> ) + » 5. 2 » » » + 0,5 » Na CI. -|- fibrine (to be contrôle!) 6, 7, 8, 9 and 10 are to be prepared in the same way from serum B. II. 1,5 cM». NaCl. + 0,5 cM'. Serum A (10 X diluted) + 0,5 cM^. 10O/0T+ fibrine. 1,5 » » » +0,5 » » » (20 X » ) + 0,5 » » + » 1,5 » » » + 0,5 » » » (40 X » ) + Oi5 » » + » 1,5 » » » + 0,5 » » » (80 X » ) + o,S » » + » 1,5 » » » +0,5 » NaCl. + 0,5 cM3. io°/o T + fibrine (contrôle!) 12 13 '4 15 16, 17, 18, 19 and 20 are to be prepared in the same way from serum B. For the preparation of the different mixtures, the dilutions are first prepared, then the tuberculine-solution is added. Then the mixtures serum-tuberculine are placed in the incubator for 15 minutes in a temperature of ßj^'C. Finally the pieces of fibrine are added. For experience teaches that when serum is first allowed to act upon tuberculine, the tuberculosis-serum is still less checked in its fibrolytic power by tuberculine than non-tuberculous serum., As we see, all sera are diluted 50, 100, 200 and 400 times. To the second series a 10 °/o tuberculine solution is added, but, as this is 5 times diluted, the T solution is 2 0/0. From 137 a practical point of view this has experimentally proved the most suitable solution, as a stronger T solution is too deeply brown-coloured and a weaker one checks too little. The controlling tubes 15 and 20 too, were prepared in order to be able to determine more easily, in comparison with a tuberculine-solution, in which dilution of the serum the fibrine was absolutely no longer corroded ; so where the absolute checking of the fibrine-transformation by tuberculine commenced. These mixtures were placed in the incubator for 16 hours in a temperature of 37 0 C. and then the result was examined. In comparing the tubes of the first series it appeared that the fibrine-transformation in serum B., obtained from a non tuber- culosis, is somewhat stronger than in serum A. In the 400 times diluted solution of both sera fibrine had still been transformed ; in serum B. however not much less than in serum A. Still almost absolute checking of the fibrine transformation of the 2 7o tuberculine-solution had already begun in the 100 times diluted solution of serum B. ; in the 200 times diluted solution no more eosine had been let loose at all. In the dilution of serum A it was quite different, however. In the 300 times diluted solution of this serum no absolute checking by the T solution had even as yet arisen. So quite a difference! This experiment beautifully illustrates the first part of the above-mentioned rule. If on the contrary, the fibrolytic power of the sera to be compared mutually, is not the same, but if that of non-tuberculous sera is much stronger than that of tuberculous sera, quite another result will be seen. For instance: From 2 patients, one healthy, the other suffering from abdominal tuberculosis the sera are examined. The decisive point of the fibrine-transformation of serum A. is reached when the serum is 1200 times diluted. With Serum B. this decisive point is already reached with the 400 th dilution. Absolute checking by a 2 0/0 tuberculinesolution in serum A. with a solution of i : 350 ; in serum B. with a solution of i : 250. Serum obtained from the non-tuberculous person must now be further diluted than that of the tuberculous individual. If we consider the results of our preparatory researches however, this is not difficult to understand. The stronger the primary peptic power of the serum is, the more tuberculine will have to be added, or the 138 further the serum will have to be diluted in order to obtain absolute checking of the same. Does the serum of every tuberculosis-sufferer possess this property? I cannot answer to this with absolute certainty, as we have only been able to indicate this peculiarity in the tuberculosis-serum, by comparing sera obtained from tubercu- lous and non-tuberculous individuals. Still I already have at my disposal more than loo obser- vations which all gave me a confirmation of this fact. Also I have already found that the checking influence of tuberculine is not the same in every tuberculosis-serum, even if the fibrolytic power is the same. With acute, active tubercu- losis the checking action of tuberculine is much weaker than with tuberculosis on the way to recovery. Only a short time ago I was able to indicate with miliair-tuberculosis how the checking action of T in the serum decreased the longer the illness lasted. And on the reverse we find that T in the serum checks more than before, when the illness passes into recovery, or is cured. In a period of 2 months we could often already perceive obvious differences. An increase of the checking action of tuberculine in tuberculosis serum I consider as a prognostic favourable sympton, except however zvith cachectic sufferers. There we often find very low numbers, and this sympton does not hold good. In order to increase the practical value of this reaction, I am now engaged in determining the checking-index of each serum. By this term I understand what follows: Determine the decisive dilution of the serum, in which fibrine is no longer transformed, exactly down to i : 50 * parts (consequently i : 700, or 1 : 750 etc.). Also investigate with which dilution of the serum a 2 0/(j tuberculine-solution absolutely checks the fibrine-trans- formation also exactly down to i : 50. The quotient of the first mimber, divided by the second, I propose to call checking-index. We need not demonstrate that this index is smaller in tuberculosis-serum than in other sera. Suppose e. g. that the decisive point of the fibrine-transformation of 2 sera A. (tuberculous) and B. (non-tuberculous) is for both in a dilution of i : 500. The decisive point of the absolute checking by tuberculine is of A 1 : 300 ; of B. I : 100. Checking-index of A. %%% = if ; of B \%% = 5. 139 It is necessary to determine the normal index from a great number of observations. I am engaged upon this and will soon publish it. How is it to be explained that tuberculine checks the ßbrine transformation to a lower degree'^ The following explanation seems to me the most reasonable. Before this (page 2) I could indicate, that in such serum a substance occurs, which can transform tuberculine in such a way as to make it poisonous to every individual. If the action of the serum on tuberculine lasts too long, the tuberculine is perfectly neutralised, so that it is then even no longer poisonous to a tuberculous individual. In the here-meant fibrolitic system-substance (bacteriolysine ?) also destroys the tuberculine, if tuberculine- serum is used. By this the checking influence of tuberculine will decrease. In normal serum that substance of the character of a bacteriolysine does not occur. The peptic ferment will now corrode both fibrine and tuberculine, while the tuberculine in the tuberculosis-serum (besides by the pectic ferment) is also destroyed by the specific ferment. Consequently the peptic ferment will be less weakened in the last serum through the co-existence of the specific ferment, and will be able to transform to a higher degree. If we heat tuberculosis-serum for half an hour to 56° C, the fibrolytic power has decreased (see page 9), but then the tuberculine proportionally more checks the fibrine-transformation than before the heating. Probably the specific ferment is conse- quently more weakened by the heating than the peptic ferment. 1 will also try to apply this principle of serological research in another department. If it is true that with different states of disease different defensive ferments circulate in the blood, by bringing together coloured fibrine (which is corroded by each serum), the albumen, in regard to which the specific ferment occurs in the blood, and the specific serum, it must be possible to indicate a smaller transformation of the fibrine, than when serum is used in which the here-meant specific ferment does not accur. It seems to me that especially in the department of the serological cancer-diagnostic important results may be obtained here. 10 t4o Synopsis. 1. In the blood-serum of every man a substance occurs, which can transform coloured horse-fibrine to a rather important degree. Hen 's albumen, lung and kidney-tissue, coloured with eosine, can also be transformed by human serum. With other albumina no experiments have been made. 2. In general the peptic power of the serum individually shows great variety ; fibrine is generally transformed to a higher degree than hen 's albumen, lung- and kidney-tissue, except that the serum of sufferers from a kidney-disease corrodes kidney-tissue to a higher degree. 3. These outcomes, differing from the results of the well- known researches of ABDERHALDEN and his school, may probably be brought in concord with these through the fact, that the method of research followed by me (colouring of tissues) is much more sensitive than the methods used by Abderhalden (dialysis, optic and other methods). BiJLEVELD. (Dissertation Leiden 191 3) too found, that by an action of serum on placenta continued for more than 16 hours it may be proved by the dialysis-method, that every human serum corrodes such a tissue. This result beautifully harmonizes with my results. 4. The transformation of coloured horse-fibrine may be absolutely checked by the addition of other uncoloured albumina : tuberculine, hen 's albumen, kidney-tissue. 5. As tuberculine checks the transformation of fibrine in tuberculosis serum to a lower degree than in non-tuberculous serum, from this a new principle of serological research for sufferers from tuberculosis has arisen. 6. The proposition is made to call the very last dilution of serum, the first in which fibrine is no longer transformed, divided by that dilution, in which a 2 0/0 tuberculine-solution just succeeds in quite checking the fibrine-transformation, the check ing-in dex . 7. This checking-index is smaller in tuberculous-serum than in non-tuberculous serum. The normal number of this index has still to be determined more exactly. [Institut de Pathologie de l'Ecole Vété- rinaire d'Utrecht]. TRANSMISSION DE LA TUBERCULOSE PORCINE À L'HOMME; RÉINOCULATION AU VEAU. PAR le Dr. H. MARKUS, i) Directeur de V Institut. Au printemps de igo8 le vétérinaire X. 2)^ âgé de 24 ans, était à plusieurs reprises incommodé par de petites gerçures ou déchirures de la face interne du pouce de la main droite. Ces gerçures se manifestaient dans une callosité de la peau à cet endroit. Malgré le peu d'importance de ces petites plaies, X. croit après coup que ce sont elles, qui ont dû constituer la porte d'entrée du virus. Cette supposition est d'autant plus fondée que X., en se servant de ce pouce blessé, a examiné un grand nombre de porcs tuberculeux. Il est vrai qu'il avait d'abord couvert une déchirure d'un morceau de taffetas gommé, mais pendant l'examen en question, ce morceau s'était facilement perdu. Quelques jours après cet examen, X. avait traité manuellement quelques vaches qui souffraient de la rétention des secondines. Peu après X. commença à soufïrir de douleurs du thenar du pouce droit. Les douleurs devinrent à la fin si violentes, que X. invoqua l'aide d'un médecin. Ce dernier appliqua d'abord pendant une journée un pansement-PRIESSNiTZ et incisa ensuite la partie la plus élevée du thenar ; un peu de ^) Conférence, faite à Delft le i^r juillet 19 14, à l'Association Néerlandaise de Microbiologie. ^) Mr. X. avait la bienveillance de me communiquer les détails suivants concernant le cours de sa maladie. 142 pus se dégagea. La petite plaie guérissait vite et les douleurs avaient disparu. Peu à peu cependant se développait sur le dos du pouce un bouton, entouré d'une zone hyperémique, qui s'étendait jus- qu'à l'endroit du thenar où l'abcès s'était trouvé caché. Après ces symptômes X. commençait à croire que son état était plus ou moins grave. Et il ne le croyait pas à tort. La preuve en est qu'au bout de quelques jours il pouvait constater des dou- leurs dans l'aisselle droite et le gonflement du ganglion lym- phatique axillaire, qui était devenu gros comme une bille. X. alla chez un autre médecin et lui mit au courant de son indisposition. Le thenar du pouce fut incisé une seconde fois assez profondément et dans la peau du bouton on fit une grande incision. Ensuite X. porta la main pendant plusieurs jours dans un bandage de sublimé. Le ganglion axillaire gonflé subissait d'abord un traitement d'onguent de mercure, puis un traitement de solution de BüROW. La plaie du thenar du pouce guérissait encore assez rapide- ment, mais le bouton se changeait en un petit ulcère. Sur cet ulcère se formait toujours une croûte, au dessous de laquelle était sécrété un pus liquide et gris, qui la soulevait. La tincture de iode, la pierre infernale ou l'onguent de zinc étaient impuissants à amener la guérison. Le gonflement du ganglion axillaire grossissait d'ailleurs toujours, malgré le traitement mentionné, sans que cependant les douleurs augmentent dans la même mesure. Sur ces entrefaites, plusieurs mois s'étaient écoulés et X. résolut d'aller consulter un spécialiste (chirurgien). On discutait longuement la nature de l'infection; X. attachait le plus d'im- portance à la possibilité d'une infection par les vaches souf- frant de la rétention des secondines. 11 ne pensait pas alors à l'examen des porcs tuberculeux. Le chirurgien traitait X. à l'aide de bandages élastiques et de ventouses, afin de causer de l'hyperémie veineuse. C'est que les vaisseaux lymphatiques du bras droit s'étaient enflam- més ; raccourcis qu'ils étaient par l'inflammation, on pouvait les palper facilement à la tension du bras. Pendant l'examen qui avait lieu régulièrement et pendant lequel les autres ganglions lymphatiques étaient contrôlés tou- 143 jours, on découvrit quelques petits nodules le long d'un des vaisseaux lymphatiques à la face interne du bras. C'est cette découverte qui immédiatement faisait supposer qu'on avait affaire à la tuberculose. Pour en être convaincu une partie du vaisseau lymphatique avec des nodules fut extirpé et exa- miné au microscope. Il parut alors que les petits nodules étaient des tubercules typiques, dans lesquels se trouvaient une très grande quantité de bacilles de KOCH. On résolut d'extirper le ganglion lymphatique axillaire et l'endroit ulcéré du pouce. On avait d'abord l'intention d'extir- per également les vaisseaux lymphatiques enflammés, mais on y renonça. Les plaies provenant de l'extirpation du ganglion lymphatique et du morceau de la peau guérissaient rapidement. Les vaisseaux lymphatiques atteints, dans lesquels on pouvait d'abord palper facilement les tubercules, furent traités à l'hyper- émie veineuse. A la suite de ce traitement le raccourcisse- ment de ces vaisseaux et les tubercules disparaissaient peu à peu. X. portait le bras en écharpe et le tenait en repos autant que possible. Plusieurs mois s'écoulaient avant que la guérison fût complète. Durant la maladie, l'état de santé de X. était du reste assez bon ; la température ne s'élevait pas sensiblement ; le malade prenait une nourriture substantielle et vivait d'une façon très hygiénique. Par l'intermédiaire du malade, je recevais dans une petite bouteille stérilisée une partie (à peu près la moitié) du gan- glion axillaire tuméfié, pour en faire l'examen. En coupant le ganglion on avait ouvert un foyer mou et caséeux, ayant environ la grandeur d'une noisette. Ce foyer était entouré d'une façon irrégulière par une zone de tissu lymphatique gonflé et hyperémié, large environ de 5 m. m., évidemment tuberculeux déjà. Dans les préparations, faites de la substance caséeuse, molle et jaune clair et colorées selon la méthode de KoCH-EhrliCH et avec la liqueur de ZiEHL, se trouvaient de rares bacilles, plus ou moins granuleux et relativement fins. L'examen histologique du tissu ganglionnaire faisait découvrir une tuberculose diffuse de l'organe avec une multitude de foyers caséeux. Le tissu tuberculeux abondait de cellules H4 épithéloides et de cellules géantes. Ces dernières étaient de grandes dimensions et renfermaient le plus souvent un grand nombre de noyaux, qui n'étaient pas toujours situés à la péri- phérie comme dans les cellules du type Langhans. Dans plusieurs cellules géantes ces noyaux étaient dispersés sans ordre dans le cytoplasme et y formaient parfois de grands amas. (PI. XIII). Il se trouva que dans les coupes aussi le nombre de bacilles était assez petit. Le lendemain deux cobayes furent inoculés sous la peau de la face interne de la cuisse gauche. L'injection se composait d'une emulsion de la substance caséeuse du ganglion dans de l'eau stérilisée. Cette emulsion avait été acquise en triturant la dite substance dans un pilon en porcelaine, qui avait été stérilisé par l'ébuUition pendant une demi-heure. La seringue-RECORD aussi était stérilisée de la même manière avant et après l'usage, La désinfection de la peau des animaux d'expérience avant l'injection se fait de la manière suivante. Après avoir éloigné les poils soit avec des ciseaux, soit (chez les grands animaux) par de la poudre à raser, on lave bien la peau à l'alcool savonneux, ensuite à l'alcool-jo o/o, puis au sublimé- i*>/„q. Le premier des cobayes, inoculés le 8 juillet 1908, succomba le 31 octobre de cette année, c'est à dire au bout de 114 jours; tandis que le second fut tué le ler novembre 1908, c'est à dire 115 jours après l'injection. Le premier cobaye pesait le jour de l'inoculation 427 grammes ; le poids montait malgré la tuber- culose expérimentale à 525 grammes le 9 septembre, pour baisser ensuite à 418 grammes le jour de la mort. Le second cobaye qui le jour de l'inoculation pesait 382 grammes, atteignait son maximum de 480 grammes également vers le 9 septembre et baissait ensuite jusqu' à 422 grammes le jour de la mort. A l'autopsie on trouvait chez les deux animaux de la tuber- culose généralisée ; pour un cas de tuberculose humaine expéri- mentale chez le cobaye, la maladie était très lente, ce qui pourrait indiquer un bacille peu virulent ou une grande rési- stance individuelle de ces cobayes. Des pommes de terre glycérinées et du serum glycérine, ense- mencés de pulpe de rate de ces deux cobayes, restaient stériles. 145 Le 2 novembre igo8 un autre cobaye fut inoculé de la façon susmentionnée avec la pulpe de rate tuberculeuse du cobaye, tué le i^i novembre; l'inoculation fut pratiquée en même temps plus ou moins intra-musculaire. Le poids de l'animal, qui au début de Texpérience était de 470 grammes, baissa rapidement; le 15 novembre l'animal pesait 410 grammes. Le poids diminuait toujours, de sorte que le 11 décembre il était de 370 grammes; le ganglion pré- crural gauche était un peu tuméfié et les muscles au lieu d'injection étaient fortement gonflés. C'est pourquoi je résolus de tuer ce cobaye le lendemain, afin d'acquérir une matière aussi pure que possible pour les expériences de culture. Le 12 décembre 1908, donc 40 jours après l'infection, ce cobaye fut tué par effusion sanguine et immédiatement après l'autopsie fut pratiquée. La désinfection de la peau fut effec- tuée de la façon susdite ; les pincettes, les scalpels, les ciseaux avaient été stérilisés auparavant dans de l'alcool savonneux et après avoir été lavés dans de ralcool-70 0/0, ils étaient déposés dans une solution aqueuse stérilisée d'acide borique, où ils se trouvaient prêts à l'usage. Après l'ouverture de la cavité abdominale ce fut d'abord la rate qu'on extirpa à l'aide d'instruments stérilisés et qu'on mit dans une boîte de PÉTRI stérile. Dans la rate se trouvaient un grand nombre de tubercules miliaires, souvent conflues et caséeux. Dans les préparations (ZiEHL) il se trouva que ces tubercules renfermaient beaucoup de bacilles de KOCH, ßns et colorés d'une façon homogène. Dans les muscles au lieu d'ino- culation se trouvait un abcès, ayant la grandeur environ d'une bille et qui renfermait une substance caséeuse et molle. Les préparations de cette substance montraient beaucoup de bacil- les de KocH, fins pour la plupart et réunis en petits tas ; ces bacilles étaient ou très granuleux ou colorés d'une façon homogène. Le ganglion précrural gauche n'était que médiocrement gon- flé, mais déjà en partie caséeux ; il renfermait beaucoup de bacilles de KoCH fins et souvent granuleux ou pâles. Dans le foie et les poumons on trouvait un grand nombre de tubercules miliaires, renfermant au centre souvent un petit foyer caséeux; dans le foie les tubercules étaient fortement conflues. 146 Le ganglion précrural droit, le ganglion iliaque gauche, les ganglions du foie et les ganglions cervicales et axillaires étaient tous plus ou moins considérablement agrandis et déjà caséeux en partie. De la tuberculose généralisée s'était donc développée chez ce cobaye en 40 jours. J'essayais de cultiver le bacille de KOCH en question, provenant de la rate tuberculeuse du cobaye, sur des milieux artificiels. C'est pourquoi une partie de l'organe fut coupée dans des morceaux aussi petits que possible dans une boîte de PÉTRI stérile avec des ciseaux stériles. La pulpe ainsi acquise fut ensemencée par un fil de platine en forme de spatule sur plusieurs tubes de sérum glycérine et de pommes de terre glycérinées, lesquels tubes furent placés à l'étuve à 38° C. Pendant les premières semaines suivantes il n'y avait pas de changement à remarquer. Peu à peu cependant de petits tas de cultures grises se montraient, de sorte que le 8 mars 1909, donc au bout de 85 jours, s'était déclarée sur le sérum une culture peu abondante, sèche, jaunâtre, verruqueuse ; sur chacune des pommes de terre s'étaient déclarées quelques protubérances globuleuses, blanches ou grises. A cette date les cultures sur sérum furent transplantées sur le même milieu. Le développement était un peu plus abondant maintenant, de façon que le ii juin 1909, donc 99 jours après, on se trouvait en présence d'une culture bien développée ; elle était moins sèche que la précédente, un peu graisseuse d'aspect et d'une consistance assez solide. En en prenant un peu de matière pour une préparation microscopique, la culture manifes- tait une cohésion assez grande ; il était plus facile de la détacher du fond, que d'en séparer une particule. Dans des prépara- tions de ZiEHL des cultures sur sérum, je trouvais des bacilles très longs, fins, colorés d'une façon homogène. Le 8 mars 1909, les cultures sur pommes de terre furent transplantées sur le même milieu et sur du sérum glycérine. Quant à ces dernières transplantations, il est à remarquer, que lorsque le bacille de KoCH avait été cultivé d'abord sur des pommes de terre, le développement sur du sérum glycérine était bien moindre, que lorsqu'il avait été emprunté à une culture sur sérum. Le sérum ensemencé de la pomme de terre 147 montrait ou uniquement un développement du bacille en forme de voile à la surface du liquide qui baigne le fond du tube ou en outre un développement peu abondant sur le milieu lui-même. Parmi les cultures sur pommes de terre, c'est la culture avec sa série, que j'indiquerai comme a, qui pour le moment est surtout importante. Cette culture a ayant été ensemencée comme culture primaire le 12 décembre igo8, montra le 8 mars igog un développement sous la forme de quelques petites protu- bérances blanches. A cette date elle fut transplantée sur des pommes de terre et elle montra le 11 juin 1909, donc au bout de 99 jours, une culture secondaire presque entièrement analogue à la culture primaire. A cette date la culture secon- daire fut transportée sur des pommes de terre et le 30 juillet 190g, donc en 49 jours, elle s'était bien développée sous la forme d'une quantité de granules sèches et blanches qu'on pouvait facilement détacher du milieu. Dans des préparations de ZiEHL faites de cette culttire tertiaire je trouvais des bacilles de KOCH ayant la forme de baguettes courtes et lourdes, souvent piriformes, colorés d'une façon homogène en rouge, ou étant plus clairs avec des endroits foncés. Après que cette culture tertiaire était transplantée le ler et le 30 juillet sur des pommes de terre, je résolus de me servir d'elle pour l'inoculation d'un veau, afin de découvrir quelle était la virulence de ce bacille de KoCH pour l'organisme bovin. Pour cette expérience nous avions à notre disposition une génisse vigoureuse et saine, âgée de 16 semaines. Le 15 juillet on l'avait tuberculinée avec un résultat négatif; (0,300 gramme de tuberculine bovine, préparée à l'institut). Le 30 juillet la culture tertiaire de la série a, suspendue dans de l'eau stérile, fut inoculée à ce veau sous la peau de la face droite du cou, dix centimètres environ avant l'articulation scapulaire. Le poids de la quantité injectée de bacilles humides (c. à. d. tels qu'ils sortaient de la pomme de terre) était de 0.061 gramme. Le lendemain, le 31 juillet, je constatai au lieu d'inoculation un gonflement ayant la grosseur d'un œuf de poule. Le 2 août ce gonflement était moindre, mais le ganglion lymphatique préscapulaire était un peu agrandi. Le 4 août le gonflement 148 au lieu d'inoculation était réduit à un endroit dur, grossi et douloureux dans la peau et au dessous ; le ganglion préscapu- laire était encore tuméfié davantage. Le 6 août le lieu d'inocu- lation était toujours douloureux ; l'enflure augmentait encore. La température du veau, qui avant l'injection ne dépassait pas les 39, 5*^ C. ne s'était pas élevée sensiblement jusqu'ici. La température la plus élevée qui avait été notée était de 39,7" C, (la température normale est selon Marek de 38,5 à 40 0 C). Peu à peu cependant la température s'élevait ; le 1 1 août à midi elle était de 40'' C, à 6 heures du soir de 40,3 " C, et à partir de cette date les températures notées s'élevaient con- tinuellement au dessus de 40", que ce fût à 8 heures du matin, à midi ou à 6 heures du soir. La température la plus élevée était de 40,70 C. le 14 août à 6 heures du soir. Le 1 1 août je constatai au lieu d'inoculation une tuméfaction ayant un diamètre de ='= 8 cm. et qui vers le bas se terminait en pointe ; le ganglion lymphatique préscapulaire avait main- tenant la grandeur d'un œuf de poule. Le 16 août le foyer au lieu d'inoculation était considérablement gonflé et se continuait vers le bas dans un ganglion lympha- tique prépectoral, ayant la grandeur d'une pomme de terre. Le ganglion préscapulaire était très grand et très douloureux. Le 23 août l'épaississement disciforme au lieu d'inoculation avait 13 cm. de long et 6 cm. de large; le ganglion pré- scapulaire avait maintenant 11 cm. de long. Le 7 septembre à 4 heures de l'après-midi la température était de 39, 8** C, la fréquence de la respiration était de 60 et celle du pouls très faible était de 82 par minute. A partir du 12 septembre la température restait au dessous de 400. Le 20 septembre la température la plus élevée était de 39, 40; la fréquence de la respiration était alors de 123 par minute. Dans l'après-midi du 21 septembre, donc 5J jours après V inoculation, le veau succombait. L'autopsie fut pratiquée dans la soirée du même jour. La peau au lieu d'inoculation était unie au foyer au des- sous par un tissu très fibreux. Ce foyer était disciforme ; il avait un diamètre de ± 10 cm. et + i cm. d'épaisseur. Il se composait d'une substance caséeuse solide, se trouvant dans le pcaucier cervical et au dessous. 149 Le ganglion lymphatique prêscapulaire droit était enveloppé d'un tissu conjonctif œdémateux et il était très agrandi. Il avait une longueur de lo^ cm. et une largeur de ^\ cm. A l'examen interne il se trouva, qu'il était presque entièrement caséeux d'une façon diffuse et avec de petites hémorragies. (PI. XIV). Les poumons étaient parsemés d'une façon diffuse et très dense de foyers miliaires, souvent confluents. (PI. XV). Les ganglions lymphatiques bronchiques et mêdiastinaux postérieurs étaient très agrandis et entièrement caséeux. Le foie montrait sous la capsule quelques tubercules miliaires ; les ganglions lymphatiques du hile étaient devenus plus volu- mineux et ils étaient caséeux, surtout à la périphérie. Dans la rate se trouvaient des tubercules miliaires. Dans le rein gauche se trouvait un seul foyer miliaire ; dans les capsules surrénales se trouvaient quelques foyers miliaires ; les ganglions lymphatiques rénales aussi étaient tuberculeux. La muqueuse de V intestin grêle était fortement hyperémiée et portait plusieurs petits foyers tuberculeux et caséeux de la grandeur environ d'un chènevis ; quelques-uns de ces foyers allaient percer vers l'intérieur de l'intestin. Les ganglions mésentériques étaient oedémateux, gonflés; de petits foyers caséeux et de petites hémorragies se trouvaient à la périphérie. Dans les tonsilles se trouvaient de petits foyers tuberculeux caséeux ; on en trouvait encore dans la partie postérieure de la muqueuse du nez. Les ganglions lymphatiques suivants étaient encore tuberculeux. Les ganglions brachiaux ; le ganglion prêscapulaire gauche ; les ganglions prêcruraux ; les ganglions supermami7iaires ] les ganglions lombo-aortiques \ les ganglions ilio-pelviens ; les ganglions poplitês, les ganglions maxillaires ; les ganglions prêpectoraux. Le feuillet viscéral du péricarde séreux était oedémateux et portait sur le paroi du ventricule droit et sur la pointe du cœur quelques petits foyers tuberculeux. Sur les plèvres diaphragmât ique et costale tt sur le péricarde je trouvais des flocons hémorragiques. T50 Les autres organes étaient normaux. Les préparations (ZiEHL) montraient ce qui suit : Le foyer au lieu d'inoculation : de très rares bacilles fins, très granuleux, de longueur moyenne. Le ganglion préscapulaire droit : de très rares bacilles longs, très granuleux. Les poumons: Une assez grande quantité de bacilles fins, point ou très peu granuleux ; ceux qui sont longs prédominent, mais il y en a aussi de très courts! Les ganglions bronchiques et mésentériques : peu de bacilles granuleux de longueur moyenne. Dans le mucus bronchial il ne se trouvait pas de bacilles. A l'examen histologique des différents organes se montrait l'image caractéristique du tissu tuberculeux. Il s'est donc trouvé que le bacille de KOCH, cultivé à tra- vers le cobaye, et provenant du ganglion lymphatique axillaire du vétérinaire X., est pour le veau d'un degré de virulence, qu'à l'ordinaire on trouve chez des bacilles d'origine bovine. Le développement lent et peu abondant sur les milieux artificiels indique également des qualités bovines. Ce résultat, en rapport avec la clinique, donne la certitude presque absolue, que X. a été infecté en examinant les porcs tuberculeux. La tuberculose des porcs est presque toujours de provenance bovine ; aussi n'est il pas étonnant qu'à l'examen expérimental du cas en question, le caractère bovine du bacille se manifestait clairement. Vétude de ce cas de tuberculose chez Vhomme a démontré que le bacille de KoCH, provenant du porc tuberculeux^ peut avoir également des qualités pathogènes pour V organisme humain. Quant à l'état de X. après l'extirpation du ganglion axillaire tuberculeux, il faut mentionner ce qui suit: X. ne s'est plus ressenti des suites de l'infection. Les cicatrices au pouce et dans l'aisselle ne montrent rien de particulier et pour le reste le bras est normal aussi. A des examens réitérés nul symptôme suspect n'a été trouvé. Octobre 191 4. PLANCHE XIII. Folia Microbiologica IXT. (Markus). -,.'-^ -ti^ ■yt^ Gançlion a.riUairc de f luvnmc. Coupe, montrant des cellules géantes et épithéloides, un centre caséeu\ et des lymphocythes (Jbj. A Ai. oc. 3 (Zeiss). PLANCHE XIV. Folia Microbiologica III. (Markus). Ganglion prcscapidaire droit du veau. Totalement caséeux et avec de petites hémorragies. (^/^ grandeur naturelle). PLANCHE XV. Folia Microbiologica III. (Markus). roumoii gauche dit veau. Parsemé de tubercules miliaires (//, grandeur naturelle). [Aus dem Institut für Mikrobiologie der Technischen Hochschule in Delft]. UEBER REDUZIERENDE EIGENSCHAFTEN DER ESSIQBAKTERIEN i) VON N. L. SÖHNGEN. Von den biochemischen Umwandlungen durch Essigbakterien sind bis heute diejenige mehr speziell erläutert worden, welche eine Folge der oxydierenden Eigenschaften dieser Mikroben sind. Diese Tatsache darf wohl daran zugeschrieben werden, dass diese Eigenschaften im allgemeinen und besonders das Ver- mögen Alkohol zu Essigsäure oxydieren zu können, für diese Bakteriengruppe von gröszter Bedeutung ist, während der tech- nische Wert des letztgenannten Prozesses sofort die Interesse für weitere Untersuchungen zufolge hatte. Zugleicherzeit aber, dass in Essigbakterienkulturen organische Substanzen oxydiert werden, entstehen reduzierte Verbindungen, welche aus den ursprünglich in der Kulturflüssigkeit anwesenden Substanzen wahrscheinlich durch hydrolytische Spaltung, Wasser- stoffaddition und Sauerstoffentziehung entstehen. Die Reduktions- erscheinungen mit anorganischen und einfachen organischen Verbindungen weisen darauf hin. Merkwürdig ist es, dass auf diesen Weg aus verschiedenen organischen Verbindungen wie Zuckerarten, organischen Säuren und Salzen sogar aus Essigsäure neben andern Produkten auch Alkohol gebildet wird. Der für die Essigbakterien kennzeichnende Prozess der Alkohol- oxydation zu Essigsäure kann also, sei es auch in geringem ^) Mitgeteilt in der Sitzung der Niederländischen Vereinigung für Mikrobiologie am I Juni 19 14 in Delft. i52 Masse und unter Hinzufügung von Energie der Oxydations- prozesse, in umgekehrtem Sinne stattfinden. O2 + C2 H5 OH :^=:± CH3 COO H + H^O. Die Wasserstoffadition und Sauerstoffentziehung an anorga- schen Verbindungen läszt sich leicht mittels der BEljERINCKschen Methoden 1) nachweisen. So werden Schwefel, Sulfite, Thio- sulfate und Sulfate in Essigbakterienkulturen zu Schwefelwasser- stoff reduziert. In Agar oder Gelatine-kulturen kann das Auf- treten von Schwefelwasserstoff mittels darin verteilten Bleicar- bonats sehr empfndlich angezeigt werden, indem Impfstriche von Essigbakterien sich auf solchen Böden durch Bildung von Bleisulfid schwarz färben. In flüssigen Kulturen wird die Schwefelwasserstoffbildung mittels darüber gehängtes Bleipapiers festgestellt. Auf dieselbe Weise werden auch Selen- und Tellurverbindungen zum elemen- taren Zustande und weiter zu den höchst übelriechenden Was- serstoffverbindungen reduziert. Ebenso entsteht durch Schwefel- wasserstoff aus Mangandioxyd Mangansulfid, dass an der Luft zu Mangansulfat oxydiert wird; doch muss bei diesem Versuch darauf geachtet werden, dass die Essigbakterien verschiedene Zuckerarten zu Oxysäuren oxydieren, welche mit Mangansuper- oxyd Manganosalze bilden. Ein Verschwinden des hinzugefügten Mangansuperoxyds in solchen Kulturen deutet also nicht nur auf Schwefelwasserstoffentwickling hin. Die folgenden Unter- suchungen über die Reduktion organischer Verbindungen durch Essigbakterien, wobei vornehmlich die Bildung von Alkohol und Fehlingsche Lösung reduzierenden Körpern nachgegangen wurde, geschahen in Erlenmeyerschen Kolben von 450 c. c. Inhalt, ver- sehen mit einem etwa 2 c. m. dicken Kulturflüssigkeitsschicht, während zwischen 28*' und 30° kultiviert wurde. Die Kultur fand also unter aeroben Verhältnissen statt. Als Kulturflüssigkeit diente meistens eine Lösung der orga- nischen Verbindungen in Hefenextrakt, das zuvor durch aus- kochen vom Alkohol volkommen befreit war. Es wurden aber auch einige Versuche mit Würze und eiweissfreien Kulturflüssig- keiten genommen. Wird an eine gut wachsende Essigbakterien- ^) Phénomènes de réduction produits par les microbes, Archives Néerlandaises des Sciences Exactes ec Naturelles. Serie II, Tome IX p. 131. 153 kultur, z. B. eine Xylinum-oder Pasteurianum-kultur in Malzex- trakt, Methylenblau hinzugefügt, so wird der Farbstoff bald in die Leukoverbindung umgewandelt und entsteht daraus wieder durch Schütteln der Kultur mit Luft. Unter der Oberfläche ist ein anaerober Zustand vorhanden und nur die Oberfläche, besonders an der Glaswand bleibt blaugefärbt. In diesem anae- roben Teil der Kultur werden die folgenden Reduktionsprozesse von organischen Verbindungen stattfinden. Glucose wird durch Essigbakterien zu Gluconsäure oxydiert, aber zugleicherzeit entsteht in den Kulturen Alkohol und Essigsäure. Sehr befrie- digend ist die Alkoholbildung unter Xylinum-und Pasteurianum- häuten, besonders wenn die Glucosekonzentration 20 0/0 bis 30 0/0 beträgt. Neben viel Gluconsäure enthält dann die Flüssig- keit nach 14 Tage Kultur bis zu i 0/0 Alkohol. Die ebenfalls gefundene Essigsäure kann durch Oxydation von Alkohol, vielleicht auch durch intramolekulare Atmung entstanden sein nach der Formel: Ce H12O6 = 3 C2H4O2. Aldehyde oder Ketone konnten in der Kulturflüssigkeit nicht nachgewiesen werden. Diese Prozesse finden also unter reichlichem Luftzutritt zur Kultur statt. Während der kräftigen Oxydation in der Ober- fläche enstehen die reduzierten Verbindungen, welche sich im anaeroben Teil der Kultur unter der Oberfläche anhäufen können. Unter anaeroben Umständen wird Glucose aber auch, sei es in sehr geringen Mengen, zu Kohlensäure und Alkohol zerlegt, wie dies aus Versuchen mit Xylinum-häuten in einer 5 ^/o-igen Glucoselösung in Leitungswasser in geschlossenen Stöpfel- flaschen hervorging. Essigsäure war nun aber nicht in der Lösung gebildet, sodass diese beim obengenannten Versuch sehr wahrscheinlich durch Oxydation des Alkohols entstanden war. Organische Säuren und Salze werden aber durch Acetobakter xylinum, so weit ich nachgehen konnte, unter anaeroben Umständen nicht zersetzt. Wird nun weiter aus Glucose gebildete Gluconsäure oder Calcium-gluconat in Hefenentrakt gelöst, den Essigbakterien unter aeroben Bedingungen als Nahrung geboten, so bilden sie 154 auch hieraus neben Dioxyaceton, Kohlensäure und Wasser wieder Alkohol, der nach 20 Tagen Kultur bei 28» C in einer 15 Vo'ig^'^ Calciumgluconatlösung in Hefenextrakt zu einem Betrage von fast 0,4 0/^ vorhanden war. Als Impfmaterial dienten bei diesen Versuchen Acetob. xylinum — Pasteurianum oder — rancens. Kulturen mit Gluconsäure als Kohlenstoffquelle enthielten nur Spuren Alkohol. Ich möchte hier beiläufig mitteilen, dass die Bereitung von Gluconsaurem Calcium aus Glucose zu einer Ausbeute von etwa 60 0/0 gelingt, wenn Hefenextrakt mit 50 o/q Glucose und einem Ueberschusz von Kreide in Erlenmeyerschen Kolben in 2 bis 3 Zentimeter dicker Schicht mit Acetob. Pasteurianum oder — rancens infiziert wird und die Kultur bei 280 bis 30" ge- trieben wird. Auf diese Weise lässt sich das sehr teuere Salz, und daraus Gluconsäure, billig herstellen. In ganz ähnlicher Weise wie mit Calciumgluconat wurden Versuche angestellt mit Milchsäure, Aepfelsäure, Brenztrauben- säure, Essigsäure und deren Calciumsalze, welche zum Resultat führten, dass auch aus diesen Verbindungen durch Essigbakterien kleine Mengen Alkohol gebildet werden. Eine Pasteurianum- kultur in Hefenextrakt mit 10 o/q Calciumlactat z. B. enthielt nach 10 Tagen Kultur bei 280 C o, 3% Alkohol. Die Essig- bakterien sind also imstande aus Milchsäure Alkohol und wie OSTERWALDER 1) beschrieb ebenfalss aus Alkohol Milchsäure zu bilden. OSTERWALDER kultivierte aber in Flaschen in hoher Flüssigkeitsschicht, während bei meinen Versuchen in Erlen- meyerschen Kolben bei gutem Luftzutritte kultiviert wurde. Die Versuche mit Essigsäure und Calciumacetat als Kohlenstoffnahrung, woraus die Essigbakterien auch Alkohol bilden, stellten die schon im Anfang dieser Mitteilung genannten Umkehrbarkeit des Prozesses der Alkoholoxydation zu Essigsäure fest. 1) Milchsäurebildung durch Essigbakterien, Centralbl. f. Bakt. Abt. 2. Bd. 37, 1913- S. 3";3. [Aus dem Institut für Mikrobiologie der Technischen Hochschule in Delft]. DIE OXYDATION VON SCHWEFELWASSERSTOFF DURCH BAKTERIEN i) VON H. C. JACOBSEN. Bekanntlich liefert die Natur fortwährend verhältnismässig grosse Quantitäten Schwefelwasserstoff. Nicht nur in den natür- lichen Schwefelwasserstoff-haltigen Quellen, welche die Fundorte der Schwefelbakterien WinogradSKY's 2) waren, sondern auch überall in den Kanälen und Gräben, also den Schmutzwässern, findet sich dieses Gas. Besonders der schwarze Meeresschlamm der Küsten ist an Schwefelwasserstoff sehr reich. Die Ursache für die Anwesenheit dieser Schwefelverbindung findet sich hauptsächlich in dem bekannten Prozess der Sul- fatreduktion durch Bakterien, welcher überall wo der atmos- phärische Sauerstoff schwer durchdringen kann und sonstige Bedingungen vorhanden sind, intensiv stattfindet. Dennoch ist das Ungemach, welches durch das fortwährende Entstehen eines so übelriechenden Gases verursacht wird, nicht im Verhältnis mit der gebildeten Quantität. Zufolge der Unbe- ständigkeit des Schwefelwasserstoffs, der in wässeriger Lösung leicht zu H2O und S oxydiert werden kann, gelangt meistens nicht eine Spur in die Atmosphäre. Nicht nur auf rein chemischen Weg verschwindet der Schwefel- wasserstoff, sondern auch und vermutlich wohl in erster Linie durch die Tätigkeit von Mikroorganismen. WiNOGRADSKY hat dies für eine bestimmte Gruppe von 1) Mitgeteilt in der Sitzung der Niederländischen Vereinigung für Mikrobiologie am I Juli 1914 in Delft. 2) WINOGRADSKY, S. Bot. Ztg. 1887. Bd 45 S. 489- II 156 Bakterien festgestellt. Innerhalb der Körper der von ihm »Schwefelbakterien« genannten Organismen scheidet der durch Oxydation entstandene Schwefel in feinsten Tröpfchen sich ab. Diese Schwefeltröpfchen werden, wie WiNOGRADSKY nach- wies, weiter oxydiert sodass, wenn Schwefelwasserstoffmangel eintritt, die anfangs mit Schwefel überfüllten Zellen schliess- lich ganz leer erscheinen. Der Schwefel wird zu Schwefel- säure oxydiert. Schon WiNOGRADSKY erkannte diesen Vorgang als ein an die Stelle der bei den meisten andern Organismen vorkommenden Atmung tredender Prozess, mit dem Unterschied, dass hier statt der Kohlenstoffverbindung der Schwefel als Energiequelle fungiert. Er studierte hauptsächlich ein Paar Vertreter der Gattung Beggiatoa, welche ihm als ein fast reines Material in einem an organischen Substanzen und Bakterien sehr armen Brunnen- wasser zur Verfügung stand. Die Frage nach dem Ursprung des Kohlenstoffs, welchen seine Beggiatoafäden zum Aufbau ihrer Zellsubstanz notwendig bedürften, meinte er auf die Anwesen- heit geringer Spuren humusartiger Verbindungen zurückführen zu müssen. Einen Beweis dafür hat er aber nicht erbracht. Später hat Keil i) für Beggiatoa und Thiothrix, die er in Reinkultur gezüchtet hatte, festgestellt, dass diese Bakterien die Kohlensäure zu reduzieren imstande sind und also zu den autotrophen Organismen zu rechnen sind. Mögen vielleicht andere Vertreter dieser Gruppe, ähnlich wie die von MOLISCH 2) beschriebenen nahe verwandten „Purpur- bakterien", ihren Kohlenstoff organischen Verbindungen ent- nehmen können (worüber bisjetzt noch nichts Sicheres bekannt ist) so kann man für Beggiatoa und Thiothrix wohl anneh- men, dass sie durch Chemosynthese sich ernähren. Nicht weniger belangreich als die Schwefelbakterien für das Verschwinden des Schwefelwasserstoffs sind die kleinen stäbchen- förmigen y> Thiobakterien" . Diese von Nathansohn 3) im Meer- wasser, später von Beijerinck 1) im Süsswasser als die Erreger ^) Keil, F. Beiträge zur Physiologie der farblosen Schwefelbakterien. Beitr. z. Biol. d. Pflanzen 1912. Bd. 11 S. 335 — 372. 2) Molisch, H. Die Purpurbakterien nach neuen Untersuchungen. Jena, 1907. ^) Nathansohn, A. Ueber eine neue Gruppe von Schwefelbakterien und ihren Stoffwechsel. Mitth. aus der Zoolog. Station zu Neapel. 1902, Bd. 15, Heft 4, S.655. T57 der Thiosulfatoxydation entdeckten und neuerdings von mir 2) als schwefeloxydierende Organismen beschriebenen Bakterien, oxy- diren den Schwefelwasserstoff in einer mit den »Schwefel- bakterien" analogen Weise. Auch bei der Schwefelwasserstoffoxydation durch die Thio- bakterien kann man zwei Phasen deutlich unterscheiden ; erstens diejenige, worin der H2S zu S und HgO, und eine zweite, worin der abgeschiedene Schwefel zu H2SO4 oxydiert wird. Durch nachstehende Versuchsanordnung lässt sich die H2S- Oxydation durch Bakterien leicht demonstrieren. Den Gebrauch der hierneben abgebildeten Glasapparate kann ich hierbei emp- fehlen. Sie ermöglichen den ganzen Vorgang, sowohl mikros- kopisch als auch quantativ zu verfolgen, ohne dass dabei der Geruch des Schwefelwasserstoffs hinderlich zu sein braucht. App. I. App. 2. Der Apparat i eignet sich mehr für die Rohkulturen. Er besteht aus einem Erlenmeyerkolben von etwa 300 — 400 cc. Inhalt, welcher mittels eines mit Trichter und gebogene Glas- röhre versehenen Gummistöpsels, verschlossen ist. ^) Beijerinck, M. W. Ueber die Bakterien, welche sich im Dunkeln mit Kohlensäure als Kohlenstoffquelle ernähren können. Centralbl. f. Bakt. 2. Abt. 1904, Bd. 11. ^) Jacobsen, H. C. Die Oxydation von elementarem Schwefel durch Bakterien. Folia Mikrobiologica 1912, Bd. i, Heft 4, S. 485. 158 Man bringt loo ce. einer mit Graben schlämm, Gartenerde oder Meeresschlamm beimpften Kulturlösung : HoO — loo gramm K2HPO4 — 0,05 NH4CI — 0,05 Mg CI3 — 0,02 » CaCOg (MgCOg) 2 (NaCl — 3 ») Fe CI3 — Spur, in den Kolben und lässt nach dem Aufsetzen des Stöpsels aus dem graduierten mit Hahn und Stöpsel versehenen Trichter, welcher mit HgS-Wasser gefüllt wird, anfangs eine sehr kleine Quantität hinzufliessen. Der Gehalt des HgS-Wassers wird zuvor durch Titrieren mit Jodlösung bestimmt. Zu diesem Zwecke lässt man eine bestimmte Quantität in eine abgemessene überschüssige zehntelnormal Jod- lösung fliessen, worin der H2S zu HJ und S oxydiert wird. Das unverbrauchte Jod wird mit zehntelnormal Thiosulfatlösung zurücktitriert, Weil Schwefelwasserstoff ein starkes Bakteriengift ist, auch für die Thiobakterien, von denen die Süsswasserformen am empfindlichsten sind, füge man im Anfang nicht mehr als 1 — 2 Mgr. HgS pro 100 cc. der Flüssigkeit hinzu. Eine Kon- zentration von 50 Mgr. pro Liter tötet die meisten der Thio- bakterien innerhalb 24 Stunden, während kräftige Bakterien- arten wie Bac. coli, Bac. ßuorescens und Bac. prodigiosus darin noch lebendig geblieben sind. Die Anwesenheit der anfänglich zugegebene Menge des HgS (i — 2 Mgr.) ist an dem Geruch deutlich bemerkbar und nachdem man den Kolben ein bis zwei Tage im Brutschrank bei 30» C. kultiviert hat, kann man nach Abheben des Kautschukverschlusses feststellen, dass dieser Geruch verschwunden, der HgS also voll- ständig oxydiert worden ist. Mann kann nun aufs neue eine kleine Menge HgS zusetzen und nach dessen Verschwinden dasselbe wiederhohlen. Nach kurzer Zeit sieht man eine dünne Bakterienhaut an der Oberfläche der Flüssigkeit sich bilden. Man findet darin beim Mikroskopieren eine Unmenge kleiner Bakterien, welche teilweise stark beweglich sind oder auch in unbeweglichem «59 Zustande im Bakterienschleim sich vorfinden. Zugleicherzeit nimmt man eine grössere Anzahl kleiner stark lichtbrechender Schwefeltröpfchen wahr. Bemerkenswert ist es, dass man, auch bei sorgfältigster Beobachtung, niemals diese Schwefeltröpfchen in den Bakterien- körpern zu finden vermag. Wenigstens habe ich bei vielen Beobachtungen niemals den Eindruck bekommen, dass das erste Produkt der Oxydation, der elementare Schwefel, wie es bei den grösseren Schwefelbakterien WiNOGRADSKY's der Fall ist, in den Zellen sich absetzt ; im Gegenteil fand ich sie aus- schliesslich ausserhalb. In wiefern der Schwefel in gelöster bezw. kolloidal-gelöster Form in den kleinen Thiobakterien vorkommen kann, muss natürlich unentschieden bleiben. Der weitere Verlauf des Prozesses hat mich überdies in der Meinung gestärkt, dass die Schwefelabscheidung in den betreffenden Kulturen in der Tat »extrazellular« stattfindet. Sobald die Bakterienhaut sich gebildet hat, kann man die Mengen des Hg S — Wassers, welche man hinzufügt, steigern ohne dass dadurch die Bakterien wie im Anfang geschadet und der Prozess dadurch gehemmt wird. Ja, man kann bei den älteren Kulturen 20 — 30 Mgr. HgS zu gleicher Zeit zugeben ; eine Quantität, welche sonst sicher tötend wirkt. Man bemerkt alsdann, dass eine solche schleimige Haut, welche nach vollständiger Oxydation des Schwefels, nicht mehr weisslich trübe, sondern durchscheinend aussieht, inner- halb kurzer Zeit (eine halbe Stunde) nach Hinzufügung des H2S wieder stark getrübt ist durch ausgeschiedenen Schwefel. Diese Oxydation vollzieht sich sehr schnell und in wirksamen Kulturen kann nach etwa zwei Stunden der H2S schon gänzlich verschwunden sein. Die weitere darauffolgende Verbrennung des Schwefels in der Bakterienhaut beansprucht eine bedeutend längere Zeit. Während nämlich die erste Stufe der Oxydation zu S und H2O schon nach wenigen Stunden zuende geführt ist, dauert es 2 bis 3 Tage bevor die zweite Phase, die vollständige Verbrennung zu H2SO4, beendigt ist. Es stimmt dies mit meinen früheren Beobachtungen, wobei unter günstigen Bedingungen in drei Wochen maximal 180 Mgr. präzipitierter Schwefel oxydiert wurden, gut überein. Im Ver- i6o gleich mit andern bakteriellen Vorgängen gehören diese auf der Reduktion der Kohlensäure sich gründenden Prozesse, zu den langsamen. Auf Grund der Tatsache, dass die erste Phase in diesem Vorgang so schnell sich vollzieht, muss man wohl zum Schluss kommen, dass man es hier bei der Oxydation von HgS zu H2O und S nicht mit einer auf die hierbei freiwerdende Wärm- eenergie beruhenden chemo-synthetischen Ernährung zu tun hat. Nur kann man sagen, dass die an der Oberfläche der Flüssigkeit sich befindenden Thiobakterien auf den giftigen Schwefelwasserstoff eine spezifische oxydierende Wirkung ausüben und denselben in kurzer Zeit unschädlich machen. Offenbar erfüllt diese Bakterienhaut die Stelle eines Sauerstoff Übertragers. Diese Schlussfolgerung ist ganz im Einklang mit der miskros- kopischen Wahrnehmung, dass die Schwefeltröpfchen nur ausserhalb der Bakterien zu finden sind. Von welcher Natur die hier beschriebene oxydierende Wirkung der Thiobakterien ist, konnte ich bisjetzt noch nicht feststellen, beabsichtige aber diese Frage näher zu untersuchen. Sowie bei den Versuchen über die Oxydation des elementaren Schwefels, stellte es sich auch hier heraus, dass die Oxydation in den salzhaltigen mit Meeresschlamm infizierten Kulturen be- teutend schneller verlief wie in den Süss wasserproben. Auch konnte hierbei mit Vorteil statt des Calciumcarbonats das mehr alkalische Magnesiumcarbonat zur Bindung der Säure verwendet werden. Wie gross die maximale Quantität des H2S ist, welche in diesen Kulturen in einem bestimmten Volum verarbeitet werden kann, ist schwer zu sagen, weil dieser Stoff nicht in Übermass vorhanden sein kann und man ihn von Zeit zu Zeit in abge- messenen Dosen hinzufügen muss. Über die in den Rohkulturen auf den Vordergrund tretenden Bakterien sei hier hervorgehoben, dass sie zu der von Beijerinck Thiohacilliis thioparns genannten Art zurückzubringen sind. Die Erkennung und Reinkultur gelingt ziemlich leicht auf Agar- platten, welche ausser den gewöhnlichen Nährsalzen noch 0,5 Proz. NagSgOg 5 aq. und ein wenig CaCOa enthalten. Die Kolonien der Thiobakterien unterscheiden sich hierauf von den andern sich vorfindenden Bakterien, durch die Einlagerung von Schwefeltröpfchen und die Auflösung des CaCOg durch Säure- i6i bildung. Mit den Reinkulturen können die Versuche über die HaS-Oxydation ebensogut wie mit den Rohkulturen ausgeführt werden ; der Verlauf ist ganz derselbe. Alle die aus den H2S-Oxydationen isolierten Stämme waren imstande sowohl den elementaren Schwefel als das Thiosulfat zu oxydieren. Für die quantitative Bestimmung der aus dem Schwefelwasserstoff gebildeten Produkte fand der Apparat 2 Anwendung. Dieser Glasapparat, welcher sterilisiert werden kann, besteht aus einem Kulturgefäss (a) in der Gestalt eines Erlenmeyer- kolbens und einem Behälter (b) für H2S — Wasser. Diese zwei Teile stehen, wie es die Figur angibt, durch eine mit einem Glashahn d versehene gebogene Röhre mit einander in Verbindung und können durch die Hähne c und e geschlossen werden. Der Behälter b wird vorher evakuiert und man lässt dann eine genau gemessene HgS — Lösung von bekannter Konzen- tration aus einer Bürette, welche einerseits mit einem Reservoir mit HgS — Wasser in Verbindung steht und daraus gefüllt wird, anderseits mit einem kurzen Kautschukschlauch mit dem Hahn c verbunden ist, hineinfliessen. Darauf wird b mit Wasser- stoffgas ganz gefüllt. Durch Öffnen des Hahnes d ist man in der Lage eine behebige Menge des H2S — Wassers in den geimpften mit Nährlösung beschickten Kulturkolben hineinzu- lassen. Anfangs genügt hierzu der bei höherer Temperatur in dem Gefäss b auftretender Druck, später wird der Hahn c mit einem Wasserstoffapparat in Verbindung gebracht und also durch Öffnen der Hähne das H2S — Wasser übergepresst. Der Sauerstoff der Luft, der in dem Kulturgefäss verdrängt und durch die Bakterien verbraucht wird, kann wenn nötig durch Aussaugen eines Teiles des restierenden Gasgemisches und Einfüllen von reinem Sauerstoff oder durch Luft ersetzt werden. Nach Beendigung der Kultur, wenn der Vorrat des H2S- Wassers grösstenteils verbraucht ist, wird die übriggebliebene Quantität mit Jodlösung titriert und das gebildete Sulfat und der eventuell noch vorhandene freie Schwefel bestimmt. Die Kulturfîussigkeit wird dazu abfiltriert ; im Filtrat das Sulfat auf übliche Weise und der auf dem Filter zurückgebliebene Schwefel nach Oxydation mit Brom und Kalilauge ebenfalls als Ba SO4 bestimmt. l62 Es ergab sich, dass der verbrauchte Schwefelwasserstoff quan- titativ zu Schwefelsäure oxydiert wurde. Durch diese Versuchsanordnung konnte leicht nachgewiesen werden, dass auch bei der Oxydation von als Schwefelwasser- stoff den Bakterien dargebotenem Schwefel, das Bakterien- material durch Reduktion der Kohlensäure gebildet wird. Lässt man nämlich in dem ganz von der Luft abgeschlossenen Apparat 2 in der Kulturflüssigkeit absichtlich das Carbonat fort, so gelingt es nicht die Bildung von Schwefelsäure und Wachstum der Bakterien zu erzielen. In diesem Falle wurde statt des Magnesiumcarbonats, für die Neutralisierung" möglicher- weise sich bildender Säure, stark geglühtes Mg O zugefügt^ welches bei Anwesenheit von freier Kohlensäure, die Ent- wicklung ermöglicht. Wie gesagt blieb dieselbe vollständig aus. Dass bei Vorhandensein des Carbonats als Kohlensäurequelle in der anfangs an organischen Substanzen sehr armen Kultur- lösung bei der Oxydation des H2S eine Zunahme dieser Verbindungen tatsächlich stattfindet, wurde durch Analyse festgestellt. Der Inhalt des Kulturkolbens wird zu diesem Zwecke nach Zusatz von verdünnter Schwefelsäure zur Zerstörung des unzersetzten Carbonats auf dem Wasserbade bis etwa 30 cc. eingedampft. Darauf kann die organische Substanz darin nach der Methode Desgrez 1) als Kohlensäure bestimmt werden. In der ursprünglichen Kulturflüssigkeit wurde ebenfalls den Gehalt an organischen \'erbindungcn, welche nur sehr gering war, bestimmt. Auf diese Weise konnte eine ansehnliche Steigerung der organischen Subtanz nachgewiesen werden. Die genauen Zahlen der bei diesen Analysen erhaltenen Resultate hoffe ich später zu veröffentlichen. Durch die hier beschriebenen Versuche glaube ich bewiesen zu haben, dass die Thiobakterien bei der Oxydation des Schwefel- wasserstoffs in der zweiten Phase (die Verbrennung des abge- schiedenen Schwefels zu Schwefelsäure) autotroph sich ernähren. Es ist dies dann auch mit den bei dem Studium der Oxydation des freien Schwefels erhaltenen Resultaten in Übereinstimmung. ^) C.\LMETTE, A. Recherches sur l'épuration biol. et chim. des eaux d'égout. Analyse des eaux d'égout. i^r Supplément. 1908. p. 42. BUCHBESPRECHUNG. Tijdschrift voor vergelijkende geneeskunde, gezond- heidsleer en parasitaire en infectieuse dierziekten, onder redactie van Prof. Dr. D. A. de Jong, te Leiden. Deel I, Aflevering i, Leiden S. C. van Doesburgh. (Zeitschrift für vergleichende Medizin, Hygiene, parasitäre und infektiöse Tierkrankheiten. Heraus- gegeben van Prof. Dr. D. A. de Jong, Leiden. Band I, Heft I, Leiden, S. C. van Doesburgh.) Mitten im Europäischen Kriegsgewoge erscheint auf unsrem neutralen Boden, wo man glücklicherweise noch wissenschaftlich arbeiten kann, diese neue Zeitschrift, welche wohl von keinem Berufeneren als de Jong geleitet werden könnte. Die Arbeiten dieses Heftes sind alle in holländischer Sprache publiziert, obwohl unter den Mitarbeitern auch einzelne Ausländer genannt sind. Die Publikation dieses neuen Organs erscheint wohl berechtigt ; der Prospekt sagt darüber ungefähr Folgendes. Menschliche und Tiermedizin sind sehr eng mit einander verknüpft. Das zeigt sich bei verschiedenen, infektiösen sowie parasitären Tierkrankheiten, welche auf den Menschen übergreifen können. Auch können Tiere die Entwicklungsstadien mensch- licher Parasiten beherbergen. So bringt der Gebrauch tierischer Pro- dukte im menschlichen Haushalt vielerlei Gefahren mit sich. Es gibt also in dieser Richtung nicht nur rein wissenschaftliche, sondern auch wichtige praktisch-hygienische Fragen. Schliesslich deckt sich die experimentelle Pathologie, und i. Bes. die moderne Mikrobiologie mit dem Arbeitsgebiet der neuen Zeitschrift. Das erste Heft enthält die folgenden Arbeiten : D. G. Ubbels, Trichinenkrankheii in Holland. — Der Autor w-eist darauf hin, dass wir nocht nicht genau bekannt sind mit der Frequenz von Trichinosis bei Schweinen aus alle7i Teilen Hollands. Diese Kenntnis brauchen wir aber mit Rücksicht auf die Einführung eines Reichskontrollgesetz für Fleisch. i64 E. A. R. F. Baudet behandelt die Parasiten der Krätze und gibt an der Hand von instruktiven Mikrophotogrammen die differentialdiag- nostische Merkmale zwischen Sarcoptes, Psoroptes und Chorioptes. E. QuADEKKER empfehlt für die Diagnose von Milzbrand in Kada- vern Färbungsmethoden welche Kapselsubstanz und Stäbchen differen- zieren. Dazu kann man wählen zwischen den Methoden von Foth oder GlEMSA. J. R. F. Rassers behandelt drei Fälle von Milzbrand bei Menschen. Zwei davon waren atypisch, heilten leicht, während die bakteriologische Untersuchung eine Begleitinfektion mit Proteus, und mit Coli und Paratyphus (als Antagonisten) anzeigte. Ein dritter Fall von reiner Milzbrandinfektion dagegen verlief tötlich, und trotzte jeder Behandlung, D. A. DE JoNG publiziert die Arbeit über Vogeltuberkelbazillen bei Säugetieren, welche schon in dieser Zeitschrift (B. III, H. i.) erschienen ist. J. Rogs weist darauf hin, dass die Bakterien der paratyphus-enteritis- Gruppe die Saccharose nicht vergären dürfen. Hat man die Pepton- Kochsalzlösung mit Natriumkarbonat neutralisiert, so kann durch die Säurebildung Kohlensäure frei werden. Man soll darum, wenn über- haupt, den Nährboden nur mit NaOH alkalisieren. W. C. De Graaff bestätigt dass die Bakterien der paratyphus-enteritis- hogcholera-Gruppe die Saccharose nicht vergären. Einige (9) genau bestimmten Coli-Stämme verhielten sich in dieser Hinsicht verschieden : einzelne vergärten die Saccharose, andere nicht. Saccharose-haltige Nährböden sind also in diagnostischer Hinsicht für die coli-typhus- paratyphus-Gruppe ohne Wert. T. Van Heelsbergen beschreibt eine Entensterbe, verursacht durch eine Mischinfektion von Staphylokokken und Colibazillen. Nur die Kombination war töllich bei den Fütterungsversuchen, nicht jeder Stamm für sich. J. G. S. STÄNDIGE MITARBEItER DER FOLIA MICROBIOLOGICA: C. W. BROERS, Utrecht - R. P. VAN CALCAR, Leiden - L. POLAK DANIELS. Haag - C. EIJKMAN, Utrecht - H. J. HAMBURGER, Groningen - H C. JAÇOBSEN, Delft - D. A. DE JONG, Leiden - R. DE JOSSELJN DE JONG, Rotterdam - J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam - L. LOURENS, Rotterdam - H. M ARKUS.f, Utrecht - C A. PEKELHARING, Utrecht - HE. REESER, Rotterdam - N. L. SÖHNGEN, Delft - C H H SPRONCK, Utrecht - C. S. STOK VIS, Amsterdam. Die Zeitschrift „F o lia Mi er p biologie a*' veröfFentlickt Originalarbeiten, an erster Stelle von holländischen Mikitobiologen ; weitet zusammen« fassende üebersichte und event. Buchbesprechung gen, aber keine gewöhnliche Referate. Die Mitarbeit von Ausländern ist nicht ausgeschlossen. Die Arbeiten erscheinen in der deutschen, fran« zÖsischen oder englischen Sprache. Die Zeitschrift veröffentlicht u. Ä. die Verhandlungen der Nieder« ländischen Vereinigung für Mikrobiologie. Autoren erhalten 50 Abdrücke ihrer Artikel kostenfrei. Die Zeitschrift erscheint in zwanglosen Heften 3—4 Mal jährlich. Der Jahrgang vpn ± 20 Bogen mit Abbildungen und Register kostet (für nicht gewöhnliche Mitglieder der Niederländischen Ver^ einigung für Mikrobiologie) fl. 12.—, 20 Mark, fr. 24.— , £ 1,1; 5 (erhöht mit Portokosten). Arbeiten zur Aufnahme in die „Folia Micro» biologica** sind bei einem der Herren Heraus^* geber einzusenden. BECKER'S SONS Q H o H H W > FABRIKANTEN van WETENSCHAPPELIJKE CHEMI- SCHE, PHARMACEUTISCHE kn ANDERE SOORTEN Balansen en Gewichten LEVERANCIERS AAN ALLE BINNEN* EN BUITEN. LAN0SCHE UNIVERSITEITEN. LABORATORIA, MUNTEN, DE VERSCHILLENDE DEPARTEMENTEN VAN BESTUUR, ENz. ENz. BEKROOND MET DE HOOGSTE ONDERSCHEI* DINGEN OP ALLE WERELDTENTOONSTELLINGEN WERELDTENTOONSTELLING TE LUIK BUITEN MEDEDINGING, LID DER JURY FOLIA MICROBIOLOölCA. HOLLÄNDISCHE BEITRAGE ZUR GESAMTEN MIKROBIOLOGIE. HERAUSGEGEBEN VON: M. W. BEIJERINCK, Delft. A. KLEIN, GRONINGEN. J. POELS, ROTTERDAM. J. G. SLEESWIJK, DELFT. IIL J AHRG A N G, H E FT 3. AUSGEGEBEN AM 20. MAI 1915. SCHLUSSHEFT DES III. BANDES. (FÜR INHALT UND VERZEICHNIS DER MITAR« BEITER, SIEHE INNENSEITE DES UMSCHLAGES). ADMINISTRATION UND VERLAG DER FOLIA MICROBIOLOGICA: PHOENIXSTRAAT 18, DELFT. (Holland.) NAAMLOOZE VENNOOTSCHAP : VOORHEEN : : J. C TH. MARI US : GANZENMARKT 440, UTRECHT SPECIALITEIT: INRICHTING EN COMPLETEERING VAN WETENSCHAPPELIJKE LABORATORIA MICROSCOPEN EN NEVENAPP ARATEN VAN CARL ZEISS TE JENA en R. WINKEL TE GÖTTINGEN MICRO. PHOTOGRAPHISCHE EN MICRO. PROJECTIE APPARATEN OP AANVRAGE WORDEN CATALOGI TOEGEZONDEN INHALT. Saite C. VAN WISSELINGH. Ueber die Anwendung der in der organischen Chemie gebräuchlichen Reaktionen bei der Phytomikrochemischen Untersuchung. (Mit 1 Tafel) 165 C. W. BROERS, The bacteriological diagnosis of Diphtheria 199 J. J. VAN LOGHEM. Bacterium (Proteus) anindolo- genes n. sp. 212 H. SCHORNAGEL. Beitrag zur Wertbestimmung der Tuberkulinprobe beim Huhn nach van Es und Schalk (Mit 1 Tafel) 220 J. IDZERDA. Ueber die kultivierbare Bakterienmenge menschlicher Fäzes 227 VEKEEITIGIîTG Voor MIKHOSTOLOGIE Hst, Be^tuur bsricht aan de leden^ dat in het begin van Juli de ja.arlijkschs zomervergadering zal wor- den gshovidan» Zijj die eene voordracht of madcdoeling ten beste wenschen te ,:;even, worden uit^,enoodiôd, daarvan ten spoediti'^te aan onder,';et.eelcende mededeeling te doen,- Namens het Bestuur^ ift, Mei 1915. J".G»81eeswijk, SeoretaTis ÜBER DIE ANWENDUNG DER IN DER ORGANISCHEN CHEMIE GEBRÄUCHLICHEN REAKTIONEN BEI DER PHYTOMIKROCHEMISCHEN UNTERSUCHUNG. VON C. VAN WISSELINGH. Professor- dir Pharmazie an der Universität in Groningen. Einleitung. Besonders während der letzten zehn oder zwanzig Jahre hat es sich gezeigt, welche grosse Bedeutung die Chemie für das Studium der Botanik hat. Im Jahre 1905 erschien das Hand- buch von F. Czapek »Die Biochemie der Pflanzen«. Wie sehr diese grosze wertvolle Arbeit einem groszen Bedürfnis entsprach, geht daraus hervor, dasz schon im Jahre 1913 eine zweite, ganz umgearbeitete Auflage herausgegeben wurde. Auch das Studium der Mikrochemie der Pflanzen erregt während der letzten Zeit mehr das Interesse und demselben wird jetzt mehr Wert beigelegt als es früher der Fall war. Über diesen Teil der Phytochemie erschienen auch im Jahre 1913 ungefähr gleichzeitig zwei Handbücher, die »Pflanzenmikrochemie« von O. Tunmann und die »Mikrochemie der Pflanze« von H. MOLISCII, welche einem von mehreren Forschern gefühlten Bedürfnis entsprachen. TUNMANN sah mit Recht ein, dasz man für diesen Teil der Phytochemie einen Namen benötigte und gewisz werden die Namen Pflanzenmikrochemie und Phyto- mikrochemie Eingang finden. 12 i66 Wenn man die Frage stellt, ob man nicht nur der makro- chemischen Untersuchung der Pflanzen, sondern auch der Phytomikrochemie groszen Wert beilegen darf, so meine ich, dasz man diese Frage sehr bestimmt bejahen musz. Vorteile der phytomikrochemischen Untersuchung sind die geringe Quan- tität des Materials, welche erforderlich ist, die einfachen Hilfs- mittel, welche für die Untersuchung genügen und die relativ- kurze Zeit, welche sie beansprucht. Bei der makrochemischen Untersuchung musz man sich oft auf einige besonders dafür ge- eignete Objekte beschränken, weil man in vielen Fällen das Material nicht in hinreichender Quantität bekommen kann und die erforderliche Zeit fehlt. Sich stützend auf die Resultate der makrochemischen Untersuchung, kann man in solchen Fällen durch mikrochemische Versuche die Kenntnis der Chemie der Pflanzen oft bedeutend erweitern. Mit ein paar Beispielen will ich dieses erläutern. Als GiLSüN 1) und Winterstein 2) durch ihre bahnbrechende Untersuchungen über die Chemie der Pilzmembranen in einigen Fällen nachgewiesen hatten, dasz sie keine Zellulose sondern Chitin enthielten, wurde bald darauf eine mikrochemische Methode für den Chitinnachweis ausfindig gemacht 3). Dadurch konnte leicht die chemische Untersuchung der Pilzmembranen über einhundert Objekte ausgedehnt werden, wobei es sich zeigte, dasz mit wenigen Ausnahmen das Chitin bei Fungi allgemein vorkam *). 1) E. GiLSON, Recherches chimiq. sur la membr. cell, des champignons. Extr. de la Revue »La Cellule« t. XI, i^ fasc. (1894). — Bull, de la Soc. chimiq. de Paris, No. 23 (1894). — Das Chitin und die Membranen der Pilzzellen. Ber. d. D. ehem. Ges., Jahrg. XXVIII (l895\ Heft 7, p. 821. — De la présence de la Chitine dans la membr. cell, des champignons. Extr. des Compt. rend. d. séance de l'Acad. d. scienc, mai 1S95. 2) E. WiNTERSTEi.x, Zur Kenntnis der Pilzzellulose. Ber. d. D. bot. Ges. Bd. XI (1893), P- 441- — Über Pilzzell. ebenda Bd. XIII (1895), p. 65. — Zur Kenntn. der in den Membranen der Pilze enthaltenen Bestandteile. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. XIX (1893), p. 521 u. Bd. XXI (189Ç), p. 134- — Über ein Stickstoffhaltiges Spaltungsproduct der Pilzzell. Ber. d. D. ehem. Ges. Bd. XXVII (1894), p. 31 13. — Über die .Spaltungsprodukte der Pilzzellulose, ebenda Bd. XXVIII (1895), P- 167. 3) C. VAN WlssELiNGH, Jahrb. f. wlss. Bot. Bd. XXXI (1898;, p. 637. *■) 1. c. p. 684. 167 Von den gelben, orangenen und roten Farbstoffen, welche man unter dem Namen Carotinoide 1) zusammenfasst, sind bis jetzt nur einige makrochemisch untersucht worden. Hunderte von Kilogrammen Material müssen manchmal verarbeitet werden, um nur wenige Gramme reinen Farbstoffs zu erhalten. Eine einfache mikrochemische Untersuchung setzt uns instand in vielen Fällen wichtige Tatsachen betreffs der Anwesenheit dieser Körper in den Pflanzen festzustellen 2). Diesen beiden Beispielen können leicht noch andere hinzugefügt werden. Noch mehr fällt die Bedeutung der mikrochemischen Unter- suchung auf, wenn man berücksichtigt, dasz auf mikrochemischem Wege Resultate erzielt sind, welche anfangs nicht mit denen der makrochemischen Untersuchung übereinstimmten, aber später gerade durch solche Untersuchung bestätigt wurden. Als Beispiel nenne ich die Untersuchungen über die Korkzellwand. Ein Teil dieser Wand, nämlich die Korklamelle besteht aus eigentümlichem Zellstoff, dem sogenannten Korkstoff oder Suberin. Vor ungefähr 25 Jahren hatten die Forscher ver- schiedene Meinungen über die chemische Natur dieses Zell- stoffes. Auf Grund makrochemischer Untersuchungen betrachtete KÜGLER 3) das Suberin als ein Gemisch von echten Fetten. GiLSON 4) war mit dieser Ansicht nicht einverstanden, weil die Korklamelle beim Erwärmen bis auf ungefähr 300° C nicht schmilzt und weil sie in Alkohol, Aether und Chloroform unlös- lich ist. Er betrachtete das Suberin, gleichfalls auf Grund makrochemischer Untersuchungen, als ein Gemisch von zusam- mengesetzten Aethern, die wenig schmelzbar und unlösUch in Alkohol, Aether, Chloroform u.s.w. waren oder als ein Produkt von Kombination, Kondensation oder Polymerisation von Säuren oder ihren Derivaten. ^) Siehe besonders R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll usw. (1913), p. 231. ^j C. V.\N WiSSELiNGH, On the demonstration of Carotinoids in plants. Koninkl. Akad. van Wetensch. at Amsterdam, Proceeding 1912, p. 51 1, 686 u. 693. — Über die Nachweisung und das Vorkommen von Carotinoiden in der Pflanze. Flora, N. F. 7. Bd. Heft 4, (1915) p. 371. *) K. KÜGLER, Über den Kork von Quercus Suber. Archiv der Pharmacie 22. Bd., 6. Heft, p. 217. *) E. GiLSON, La subérine et les cellules du liège. La Cellule t. VI, i'' fasc. Sep. Abdruck p, 44. i68 Die von mir i) auf mikrochemischem Wege erzielten Resultate hielten die Mitte zwischen den Ansichten der beiden obengfe- nannten Forscher. Nach mir kommen in der Korklamelle bei ziemlich niederer Temperatur schmelzbare und nicht schmelz- bare Stoffe vor, wie aus der folgenden 1892 gegebenen Zusammenfassung meiner Resultate hervorgeht: Ich halte es für erwiesen, dasz schmelzbare und in Chloroform lösliche Stoffe eine wichtige Rolle bei der Zusammensetzung der ver- schiedenen Korklamellen spielen, dasz man diese Stoffe ver- seifen und aus denselben Säuren absondern kann. Wenn ich hierbei die Absonderung von Glyzerin aus dem Kork von Quercus Suber berücksichtige, so bin ich geneigt das Suberin in seinen verschiedenen Modifikationen als ein Produkt zu be- trachten, das aus Fetten oder mit diesen ähnlichen Stoffen, aus Glycerylestern oder anderen zusammengesetzten Aethern, und aus einem oder mehreren in Chloroform unlöslichen, nicht schmelzbaren Stoffen zusammengesetzt ist, welche alle durch Kalilauge auf eine mehr oder weniger ähnliche Weise zersetzt werden 2). Nach den späteren makrochemischen Untersuchungen von VON Schmidt 3) besteht der Korkstoff teils aus unlöslichen Anhydriden und Polymerisationsprodukten fester und flüssiger Fettsäuren und teils aus Glyzerinestern von Fettsäuren, zum Teil deshalb auch aus schmelzbaren und löslichen Stoffen. Die Resultate, die ich vor mehr als zwanzig Jahren auf mikroche- mischem Wege erhielt, sind also in Übereinstimmung mit denen der letzten makrochemischen Untersuchungen. Aus obigem geht hervor, dasz die mikrochemische Unter- suchung Fragen beleuchten kann, deren Lösung auf makro- chemischem Wege mit groszen Schwierigkeiten verbunden ist. Grosze Bedeutung hat die phytomikrochemische Untersuch- ung für das Studium der Lokalisation der chemischen Körper in den Geweben, den Zellwänden und dem Zellinhalt. Mit *) C. VAN WissELiNGH, Sur la lamelle subéreuse et la subérine. Arch. Néerl. T. XXVI, p. 305. 2) 1. c. p. 347. ') M. VON Schmidt, Zur Kenntnis der Korksubstanz, II. Mitteilung, Sitzungsb. d. kais. Akad. d. Wiss. Wien, CXII. Bd. Abt. II b, Jahrg, 1903, p. 1134 und III. Mitteilung, 1. c, CXIX. Bd. Abt. II. b, Jahrg. 1910, p. 241. log groszer Genauigkeit kann man bestimmen, welche Zellvvände oder Teile von Zelhvänden Zellulose und Chitin enthalten, aus suberinartigen Stoffen bestehen, kutikularisiert und verholzt sind. Für viele Bestandteile des Zellinhalts ist das Vorkommen im Cytoplasma, in den Chromatophoren, in dem Kern oder im Zellsaft festgestellt. Für das Studium des Wachstums der Zellwand halte ich es von groszer Bedeutung, dasz die chemischen Modifikationen, welche die Zelhvand während ihrer Entwicklung erleidet, fest- gestellt werden. Ungefähr vor einem Vierteljahrhundert wid- meten Forscher ersten Ranges dem Studium des Zellwach- stums ihre besten Kräfte. Es scheint, dasz jetzt dieses Studium durch andere Plobleme zurückgedrängt ist, obschon das eben- falls sehr interessante Problem des Zellwachstums bei weitem noch nicht in einer befriedigenden Weise gelöst ist. Gröszten- teils führe ich dieses auf die geringe Aufmerksamkeit zurück, welche man beim Studium des Zellwachstums den chemischen Modifikationen gewidmet hat. Dasz man beim Studium dieser Modifikationen besonders mikrochemische Arbeit leisten musz, liegt auf der Hand. Für das Studium vieler physiologischen Probleme ist die Feststellung der chemischen Änderungen in dem Zellinhalt von groszer Bedeutung. Sowohl von makrochemischen als von mikrochemischen Untersuchungen darf man auf diesem Gebiet wichtige Resultate erwarten. Wenn man aber die Änderungen des Zellinhalts beim lebenden Objekt studieren will, sind makro- chemische Untersuchungen ausgeschlossen, während man mikro- chemische Methoden manchmal mit Erfolg anwenden kann. Als Beispiel nenne ich die Antipyrin- und Caffein-Methode, welche ich bei der Untersuchung nach der physiologischen Bedeutung des Gerbstoffes anwendete i). Obschon ich, wie aus obigem ersichtlich, der phytomikro- chemischen Untersuchung groszen Wert beilege, kann ich nicht leugnen, dass diese Untersuchung mit besonderen Schwierigkeiten ^) C. VAN WissELiNGH, On the tests for tannin in the living plant and on the physiological significance of tannin. Koninkl. Akad. van Wetensch. te Amsterdam, Proceedings 1910, p. 685. — Cber den Nachweis des Gerbstoffes in der Pflanze und über seine physiologische Bedeutung. Beihefte z. Bot. Centralbl. Bd. XXXII (1914), Abt. I, p. 155. und Gefahren verbunden ist. Das erste Erfordernis bei makro- chemischen Untersuchungen ist Absonderung des Stoffes, den man untersuchen will, in hinreichender Menge und reinem Zustande. Der Forscher, der phytomikrochemische Versuche anstellt, wendet Reaktionen auf Stoffe an, welche in relativ geringer Quantität in der Zellwand oder in dem Zellinhalt anwesend sind und zwar oft neben anderen Stoffen, deren Anwesenheit Verwechselung und Modifikationen der Reaktionen veranlassen kann. Wenn man Schlüsse zieht, musz man deshalb allen Nebenumständen Rechnung tragen und möglichst vorsichtig sein. Beim Studium der Lokalisation der chemischen Körper musz man auszerdem die Tatsache berücksichtigen, dasz nach dem Tode des Proto- plasmas eine Wanderung von im Zellsaft gelösten Stoffen stattfinden kann. Die Unterschätzung und das Nichterkennen der Schwierig- keiten, welche mit der mikrochemischen Untersuchung verbunden sind, haben oft Veranlassung gegeben zur Verwechselung che- misch sehr verschiedener Körper. Mit einigen Beispielen will ich dieses erläutern. Bei den mikrochemischen Untersuchungen der Korkzellwand hat man die Violettfärbung, welche die Kork- lamelle nach Behandlung mit Kalilauge mit Chlorzinkjod infolge der Anwesenheit der Phellonsäure zeigt, für eine Zellulosereak- tion gehalten and Verseifungsprodukte, welche aus Kalium- phellonat bestanden, als Zellulosemembranen gedeutet i). Von den Fungi hat men lange Zeit allgemein behauptet, dasz ihre Membranen aus Zellulose mit fremden Beimischungen be- stehen, während später festgestellt wurde, dasz sie mit wenigen Ausnahmen keine Zellulose sondern Chitin enthalten. Die Violettfärbung, welche Chitosan, ein Zersetzungsprodukt des Chitins, mit Jod und verdünnter Schwefelsäure zeigt, hat man mit einer Zellulosereaktion verwechselt 2). Reaktionen mit Haematoxylin, Methylenblau und anderen Farbstoffen, hat man als Zellulosereaktionen beschrieben, während es sich später zeigte, dasz die Farben, welche die ^) C. VAN WISSELINGH, Sur la paroi des cellules subéreuses, Arch. Néerl. T. XXII, Sep. Abdruck p. 8. — La lamelle subéreuse el. la subérine 1. c. T. XXVI, p. 340. 2) C. VAN WissELiNGH, Mikrochemische Untersuchungen über die Zell wände der Fungi. Jahrb. f. wiss. Bot. Bd. XXXI (1898), p. 657. Zellwände erhielten, die Folge der Anwesenheit von Pektin- stoffen waren i). Carotin hat man verwechselt mit Chlorophyllan, einem Zer- setzungsprodukt des Chlorophylls 2). Gerbstoffniederschläge sind als Eiweiszniederschläge gedeutet worden 3). Manchmal hat man Körper, die zwar zu derselben Gruppe gehören, aber chemisch doch verschieden sind, für identisch erklärt. Man glaubte mit eben demselben Körper zu tun zu haben. So hat man z. B. gemeint, dasz in allen Korkzell- wänden und kutikularisierten Wänden als wesentlicher Bestand- teil ein bestimmter chemischer Körper, Korkstoff oder Suberin, vorkam, während es sich später gezeigt nat, dasz diese Zell- wände verschiedene Stoffe enthalten, welchen sie ihre eigen- tümliche Eigenschaften verdanken, und dasz sie sich chemisch oft bedeutend von einander unterscheiden *). Auch hat man gemeint, dasz alle carotinähnliche Farbstoffe oder Carotinoide, wie Carotin, Lycopin, die verschiedenen Xan- thophylle usw. ein und derselbe Körper, Carotin, wären, während spätere sorgfältige chemische Untersuchungen festgesteltt haben, dasz einige dieser Körper Sauerstoff enthalten und andere nicht und sie deshalb unter einander sehr verschieden sind ^). Oft fühlt man bei der phytomikrochemischen Untersuchung sehr den Mangel an zuverlässigen Reaktionen. Zwar klaget man bisweilen darüber mit Unrecht, aber es ist gewisz, dasz in vielen Fällen die bekannten makrochemischen Reaktionen für die mikrochemische Untersuchung untauglich sind, weil sie zu wenig empfindlich sind oder wegen anderer Ursachen. Der Botaniker hat in solchen Fällen oft zu Farbstoffen Zuflucht genommen. Hiermit kann man wohl sehr schöne Praeparate 1) L. Maxgin, Sur les composés pectiques. Journal de botanique, T. VI. (1892) p. 238. 2) C. VAN WisSELiNGH, On the demonstration of Carotinoids in plants. Koninkl. Akad. van Wetensch. at Amsterdam, Proceedings 191 2, p. 9. ^) C. v.\N WissELiNGH, On intravital precipitates. Koninkl. Akad, van Wetensch. at Amsterdam, Proceedings 191 3, p. 1329, Recueil des Travaux bot. Néerl. vol. XI. Livr. I, 1 9 14 p. 14 *) C. VAN WissELiNGH, Sur la paroi des cell, suber. 1. c. p. 43. Sur la lamelle subéreuse et la suberine, 1. c. p. 344. ^) Siehe besonders R. Wilstätter und A. Stole. Untersuchungen über Chlorophyll usw. p. 231. 172 erzielen, aber weil oft sehr verschiedene chemische Körper die- selben Farbstoffe speichern und festhalten können, kann man auf Grund der erhaltenen Resultate gewöhnlich keine sichere Schlüsse ziehen. Farbstoffe sind denn auch mehr geeignet, um bei Erhal- tung negativer Resultate die Abwesenheit von Körpern, die leicht Farbstoff speichern, festzustellen, als um beim positiven Befund damit die Anwesenheit bestimmter Körper zu beweisen 1). Da ich oft bei phytomikrochemischen Untersuchungen Mangel an zuverlässigen Reaktionen empfunden habe, so habe ich mir jetzt die Frage gestellt, ob man diesem Mangel durch Anwen- dung der in der organischen Chemie gebräuchlichen Reaktionen abhelfen könnte. Wenn man berücksichtigt, wie die Botaniker im allgemeinen zu ihren mikrochemischen Reaktionen gekommen sind, so musz man gestehen, dasz man sie zufälligerweise entdeckt hat oder dasz man sie erst bei makrochemischer Untersuchung gefunden und später bei der mikrochemischen Untersuchung angewendet hat. Von einer systematischen Forschung nach mikrochemischen Reaktionen, die sich gründet auf der chemischen Struktur der Körper und den Umsetzungen, welche man im Zusammen- hang mit der Anwesenheit bestimmter Atomgruppen erwarten kann, habe ich in der botanischen Literatur nichts entdecken können. In den beiden vor kurzem erschienenen, vorzüglichen Lehrbüchern über Pflanzenmikrochemie von TuNMANN und Molisch habe ich vergebens nach einer Behandlung" dieses Gegenstandes gesucht. Die vorliegende Arbeit musz man als einen Versuch betrachten, um in der angegebenen Richting etwas zu leisten. Der Körper, von dem ich dabei ausgegangen bin, ist das Chitin, welches im Tierreich bei Arthropoden, Vermes und Mollusken, im Pflanzen- reich bei Fungi vorkommt. Für den mikrochemischen Nachweis dieses Körpers habe ich früher schon eine Methode, welche sich auf die Umsetzung des Chitins in Chitosan und die sehr empfindliche Reaktion des letzteren mit Jod und verdünnter Schwefelsäure gründet, in Einzelheiten beschrieben 2). Auf ^) C. VAN WissELiNGH, Mikrochem. Unters, über die Zellwände der Fungi, 1, c. p. 644. ') C. VAN WisSELiNGH, Mikrochem. Unters, über die Zellwände der Fungi, 1. c. p. 637. 173 Grund dieser Tatsache würde man behaupten können, dass es nicht nötig sei, neue mikrochemische Reaktionen für das Chitin zu finden. Ich bemerke dazu, dasz für die Prüfung einer neuen Arbeitsmethode es erwünscht ist, die erhaltenen Resul- tate mit Hilfe einer schon bewährten Methode kontrollieren zu können. Weiter bemerke ich, dasz einige Forscher, zwar noch ohne hinreichende Gründe, von mehreren chitinartigen Körpern reden i). Es ist deshalb erwünscht, dasz man bei der Untersuchung mit neuen Reagenzien der Möglichkeit Rechnung trägt, dasz Chitin verschiedener Herkunft verschieden sei. Zuletzt mache ich noch darauf aufmerksam., dasz die Botaniker, was das Vorkommen des Chitins betrifft, noch uneinig sind. Einige behaupten nämlich, dass die Wand der Bakterien Chitin enthält, während andere in derselben diesen Körper nicht entdecken konnten 2). Im Zusammenhang mit dem Obenerwähnten glaube ich, dasz einige neue Methoden zum mikrochemischen Nachweis des Chitins den Forschern, die darüber Untersuchungen angestellt haben oder anzustellen wünschen, willkommen sein werden. Der Hauptzweck der vorliegenden Arbeit ist aber die Aufmerk- samheit auf die Tatsache zu richten, dasz man bei phytomi- krochemischen Untersuchungen von den in der organischen Chemie gebräuchlichen Reaktionen mit Erfolg mehr Gebrauch machen kann, als bis jetzt der Fall gewesen ist. Über die Chemie des Chitins. Das Chitin ist, wie man von einem Zellwandstoff wohl er- warten kann, ein in Wasser unlöslicher Körper. Auch ist es unlöslich in anderen einfachen Lösungsmitteln. Konzentrierte Säuren und starke Alkalilaugen zersetzen es beim Erwärmen. Im allgemeinen wird es aber durch Reagenzien nicht oder nur wenig angegriffen. Auch widersteht es ziemlich hoher Temperatur. *) N. P. Krwvkow, Uebev verschiedenartige Chitine. Zeilschr. f. Biologie, XXIX, Bd. 1S92, p. 177. — E. Zander, Vergl. und kril. Untersuchungen zum Verständnisse der Jodreaktion des Chitins. Archiv für die gesammte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66. Bd. 1897, p. 545. 2) Siehe F. Czapek, Biochemie der Pflanzen, i. Bd. 191 3, p. 630. Ï74 Wie Zellulose, kann man es bis auf 300" C in Glyzerin er- wärmen ohne, dasz es sich zersetzt 1). Die Methoden, welche man zur Reindarstellung des Chitins anwendet, gründen sich auf seiner Widerstandsfähigkeit Reagenzien gegenüber. In konzentrierter Salzsäure (37 ^/o), Salpetersäure (25 und 50 0/0) und in einigermaszen verdünnter Schwefelsäure (66 0/0) scheint Chitin, ohne sich dabei ganz zu zersetzen, löslich zu sein. Am besten geHngt solche Auflösung unter Abkühlung. Wenn man nicht zu lange wartet, kann man durch Verdünnen mit Wasser das Chitin teils noch unverändert niederschlagen. Man bekommt es dann wieder im amorphen Zustand 2). Wenn konzentrierte Säuren längere Zeit oder unter Erwärmung ein- wirken, wird das Chitin zersetzt. Ledderhose 3) erhielt durch Chitin mit konzentrierter Salzsäure zu kochen, am besten unter Hinzufügung von Zinn, einen schönen kristallinischen, in Wasser löslichen Körper, das salzsaure Glycosamin, Cg H13 NO5. HCl. Die Base, das d-Glucosamin, haben E. FISCHER und LeuCHS *) synthetisch bereitet und besonders durch ihre Untersuchungen ist die Frage nach seiner Struktur und Konfiguration in den wesentlichen Punkten gelöst. Man hat es zu betrachen als ein Derivat des Traubenzuckers oder der d-Mannose, in welcher das in der of-Stellung befindliche Hydroxyl durch Amid ersetzt ist. Fischer und LeuCHS geben ihm die folgende Konfigura- tionsformel : H H OH CH2OH.C— C— C.CH(NH2).C0H OH OH H 1) C. VAN WISSELINGH, Mikrocliem. Unters, über die Zelhvände der Fungi, 1. c, p. 643. 2) D. H. Wester, vStudien über das Chitin, Inaugural-Dissertation (1909), p. 28. ') G. Ledderhose, Über salzsaures Glykosamin. Ber. d. D. ehem. Ges. zu Berlin. 9. Jahrg. (1876;, p. 1200. — Über Chitin und seine Spaltungsprodukten. Zeitschr. f. physiol. Chem. 2. Bd. (1878;, p. 213. — Über Glykosamin. Ebenda 4. Bd. (1880), p. 139. *) Emil Fischer und Hermann Leuchs, Synthese des Serins, der 1-Glukosa- minsäure und anderer Oxyaminosäuren. Ber. d. D. chem. Ges. 35. Jahrg. (1902), P- 3787- — Synthese des d-Glukosamins, Ber. d. D. Chem. Ges. 36. Jahrg. (1903), P- 24- 175 Sic bemerken dabei, dasz nur die sterische Anordnung der Aminogruppe an dem «-Kohlenstoff noch unbestimmt ist und dasz für die Annahme der Aldehydgruppe der gleiche Vorbe- halt wie bei den Zuckern gilt. Bei der viel gröszerer Ver- breitung des Traubenzuckers in der Natur wird man selbst- verständlich der Annahme, dasz das Glucosamin sich von ihm ableite, die gröszere Wahrscheinlichkeit zumessen, aber der direkte Beweis dafür fehlt augenblicklich noch. Der Name Glucosamin ist von einigen Autoren in Chitosamin abgeändert worden. FISCHER und LeuchS sagen aber, dasz der alte von LedderhoSE gewählte Name Glucosamin in jeder Beziehung verdient rehabilitiert zu werden. SUNDWIK 1) und von FÜRTH und SCHOLL 2) erhielten durch Behandlung mit rauchender Salpetersäure salpetersaure Aether, sogenannte Nitrochitine und FräNKEL und KELLY s) durch Behandlung mit Schwefelsäure von 70 bis 72 0/0 Monoacetyl- chitosamin und Acetyldichitosamin. Wenn man Chitin bis auf 180° mit Kalilauge erhitzt, wird es unter Abspaltung von Essigsäure in Chitosan *) (Mykosin GilSON) verwandelt. Dieses Spaltungsprodukt ist, wie das Chitin, unlöslich in Wasser und in gewöhnlichen Lösungs- mitteln. Es besitzt basische Eigenschaften und bildet mit Säuren meist in Wasser lösliche Salze. Demzufolge löst es sich in vielen verdünnten Säuren, z. B. in 2 o/^iger Essig- säure und 2 1/2 Voig^'' Salzsäure. In konzentrierter Salzsäure ist es bei der gewöhnlichen Temperatur unlöslich. Verdünnte Schwefelsäure löst Chitosan auch nicht und schlägt es aus Lösungen anderer verdünnter Säuren als Chitosansulfat nieder. Nach LÖWY 5) präzipitieren auch Phosphowolframsäure, ') E. E. SuNDWiK, Zur Constitution des Chitins, Zeitschr. f. physiol. Chem. 5. Bd. (1881), p. 387. 2) O. VON FÜRTH und E.MiL Scholl, Über Nitrochitine. Beilr. zur chem. Physiologie und Pathologie, X. Bd. (1907), p. 188. 5) S. FräNKEL und A. Kelly, Beiträge zur Constitution des Chitins. Sit- zungsber. d. kais. Akad. d. Wiss. CX. Bd. 1901, Abt. II b, p. I147. *) F. Hoppe-Seyler, Über Chitin und Cellulose. Ben d. D. chem. Ges. 27. Jahrg. 1894, p. 3329. — E. Gilson, Recherches chimiques sur la membrane cellulaire des champignons, 1. c. p. 11. ^j E. LÖWY, Über krystaUinisches Chitosansulfat, Bloch. Zeitschr. 23. Bd. 1910, p. 47. Phosphomolybdäiisäure, Jodquecksilberkalium, Jodwisinutkalium, Pikrinsäure und Tannin das Chitosan und man erhält beim Schütteln mit Benzoyl-, Benzosulfo- und Naphtalinsulfochlorid sehr schwer lösliche Additionsprodukte. Jodjodkaliumlösung färbt Chitosan einigermaszen schmutzig braunviolett, aber sehr verdünnte Schwefelsäure genügt um diese Farbe in einem sehr schönen, dunkelen, rotvioletten umzuwandeln. Chlorzinkjod färbt Chitosan blau i) und Brom scharlachrot 2). Hoppe-Seyler 3) und Ch. Fischer haben Chitosan durch Erhitzen mit Essigsäureanhydrid in einen Körper umgewandelt, der Chitin sehr ähnlich war. Als die genannten Forscher diesen Körper näher untersuchten, zeigte es sich aber, dasz derselbe doch kein Chitin war. Nach Ch. FiSCHER erhielt er nämlich drei Acetylgruppen, gegen das Chitin zwei. Mit Propion- säureanhydrid und Benzoesäureanhydrid bereiteten HOPPE- Seyler und Ch. Fischer ähnliche Chitosanderivate. Araki ^), LÖWY 6) und andere haben nachgewiesen, dasz durch Kochen mit Salzsäure Chitosan, wie Chitin, in Gluco- samin umgewandelt wird. Nebst salzsaurem Glucosamin ent- stehen dabei Essigsäure und Ameisensäure. Während die Struktur und Konfiguration des Glucosamins der Hauptsache nach bekannt sind, sind diese von dem Chitin und dem interessanten Spaltungsprodukt, dem Chitosan, noch lange nicht aufgeklärt. Nach Ledderhose e) ist die Formel des Chitins wahrschein- lich Ci5 H26 N2 Ojo und die Spaltung in Glucosamin und Essig- säure, Avelche sie durch Kochen mit Salzsäure erfährt, sollte der folgenden Gleichung entsprechen : C,5 H26 N2 Oio + 3 H2 O = 2 Ce Hi3 NO5 + 3 C2 H4 O2 Chitin Glucosamin Essigsäure *) C. VAN WissELiNGii, Mikiochem. Unters, über die Zellwände der Fungi, 1. c. p. 642. 2) O. VON Fürth und M. Russo, Über kristallinische Chitosanverbindungen aus Sepienschulpen. Beiträge zur ehem. Physiol, und Pathol. 8. Bd. (1906), p. 163. 3) F. Hoppe-Seyler, Ueber Chitin und Cellulose, 1. c. — Ueber Umwandl- ungen des Chitins. Ber. d. D. ehem. Ges. 28. Jahrg. (1895), P- 82. *) F. Araki, Über das Chitosan, Zeitschr. f. physiol, Chemie, 20. Bd. (1895), p. 498- 5) 1. c. ®; G. Ledderuose, Über Chitin und seine Spaltungsprodukte, 1. c. 177 Schmiedeberg ») bemerkt, dasz diese Gleichung nicht richtig sein kann, dasz wahrscheinlich ein Druckfehler oder Irrtum sich eingeschlichen hat und dasz sie vielmehr lauten muss : Ci8 H30 N2 O12 + 4 H, O = 2 Ce Hi3 NO5 + 3 Co H4 O2. SUNDWIK 2) betrachtet das Chitin als ein reines Aminderivat eines Kohlenhydrats der allgemeinen Formel n (C13 Hoq 0^) und findet es sehr wahrscheinlich, dasz seine Formel Cßo Hjos Ng Ogg. n H.O ist. Araki 3) gibt dem Chitin die Formel Cis H30 Ng O12 unJ dem Chitosan die Formel C14 H26 Ng O^). Für die Umwandl- ungen, welche das Chitin durch Kochen mit konzentrierter Salzsäure und durch Erhitzen mit Kalilauge erfährt, stellt er die beiden folgenden Gleichungen auf: C,8 H30 Na O12 + 4 Ho O = 2 Ce Hi3 NO5 + 3 C2 H4 O, Chitin Glucosamin Essigsäure C,8 H30 N2 O12 + 2 H2 O = Cx4 H26 N2 0,0 + 2 Ca H4 O2 Chitin Chitosan Essigsäure Für die Zersetzung, welche Chitosan durch Kochen mit kon- zentrierter Salzsäure erfährt, gelangt er zu der folgenden Gleichung : Ci4 Hoe N2 Oio + 2 H2 O = 2 Ce Hi3 NO5 + C2 H4 O2 Chitosan Glucosamin Essigsäure FräNKEL und Kelly *) kommen auf Grund ihrer Unter- suchungen zu dem Resultat, dasz die Grundlage des Chitins Acetyl-n-Chitosamin ist und dasz das Chitin und das Chitosan keineswegs die angenommene einfache Zusammensetzung besit- zen, sondern vielmehr höher zusammengesetzte stickstoffhaltige am Stickstoff acetylierte, respektive mit Acetylacetessigsäure verbundene Polysaccharide sind. Nach Offer b) is das Chitin als ein polymères Monoacetyldi- glucosamin aufzufassen. Die Acetylgruppe ist am Stickstoff gebunden und die Bindung der beiden Glucosaminreste beruht einerseits auf der Reaktion zwischen Aldehyd und Amin, andererseits ist der zweite Glucosaminrest in äthylenoxydartiger BindunsT vorhanden. 1) O. Schmiedeberg, Über die chemische Zusammensetzung des Knorpels. Arch. f. exp. Pathol, und Pharmak. 28, Bd. (1891), p. 355. 2) 1. c. 3) 1. c. *) 1. c. 5; Th. R. Offer, Über Chitin, Biochem. Zeitschr. 7. Bd. (1908), s. 117. 178 Irvine 1) glaubt, dasz das Chitinmolekül C30 H50 N^ O^g ist und aus einem Molekül Aminoglucose und drei Molekülen Acetylaminoglucose zusammengesetzt ist, welche unter Elimina- tion von vier Molekülen Wasser kondensiert sind. Rothera 2) behauptet, dasz seine Resultate betreffs der Stickstoffbindung im Chitin nicht ohne weiteres mit der Ansicht in Einklang zu bringen sind, dasz das Chitin nur ein acetyliertes Glycosamin darstellt. Hugo Brach 3) ist zu dem Resultate gelangt, dasz aus Mono- acetylglucosaminen bestehende Viererkomplexe die kleinsten Bausteine des Chitins sind. Auf je ein Stickstoffatom kommt im Chitin ein Essigsäurerest und ein Glucosamin vor. Der Abbau des Chitins zu Monoacetylkomplexen resp. Glucosamin und Essigsäure vollzieht sich nach BRACH nach der Gleichung: (C32 H54 N4 Ooi) X + 3 (HoO) X = 4 (Ca Hi5 NOe) X bzw. (C32 H54 N, O2,) X + 7 (H.O) X = 4 (Ce Hia NO,) x + 4 (CH3 COOH) X und der Übergang des Chitins in Chitosan bei der Kalischmelze erfolgt unter Absprengung der Hälfte der in Chitin vorhandenen Essigsäuregruppen nach der Gleichung: (C32 H54 N4 O21 ) X + 2 (HoO) X = (C28 H30 N4 Ol«) X + 2 (CH3 COOH) X. Nach Brach kann von einer Bindung der Essigsäure im Chitin in Form von Acetessigsäure nicht gesprochen werden, hingegen ist anzunehmen, dasz die Essigsäure in säureamid- artiger Form am Stickstoff gebunden ist und zwar an je einem Stickstoffe eine Essigsäure. Die Gesammtmenge des im Chitin vorhandenen Stickstofïes ist bei geeigneter Hydrolyse in Form von Glycosamin nachweisbar und daneben treten keine anderen reduzierenden Kohlehydrate auf. Durch die Einwirkung der salpetrigen Säure wird der Stickstoff aus dem Chitosansulfat quantitativ abgespalten, wie auch WeSTER *) gefunden hat. Nach Brach spricht dieses Verhalten aber nicht gegen die Bindung von Acetylkomplexen an primären Aminogruppen im ^) J. C. Irvine, A Polarimetrie Method of Identifying Chitin. Joura. of the Chemical Society (1909) XCV. I. p. 564. ^) C. H. Rothera, Zur Kenntnis der Stickstoffbindung im Eiweisz. Beiträge zur ehem. Physiol, und Pathol. 5. Bd. (1904), p. 442. ^) Hugo Brach, Untersuchungen über den chemischen Aufbau des Chitins, Bioehem. Zeitschr. 38. Bd. (1912), p. 468. *) 1. c. p. 27. 179 Chitosan, bzw. Chitininolekül. Dagegen spricht diese Tatsache gegen die MögUchkeit, dasz etwa Stickstoffe untereinander oder mit anderen Teilen des Moleküls durch intramolekulare Bindung verkettet sind. Daraus, sowie aus dem Umstände, dasz im Chitinmolekül keine von Stickstoff und Acetyl freien Kohlehydrate vorhanden sind, ergibt sich, dasz die von OFFER für das Chitin aufgestellte Formel und die Annahme einer Amin-Aldehyd-Verkettung der substituierten Zucker den Tat- sachen nicht entspricht. Gröszere Wahrscheinlichkeit besitzt die Annahme von Monocarbonylbindungen nach Art der von Emil Fischer z. B. für Maltose aufgestellten Hypothese. Betreffs des Chitosans erhielten VON FÜRTH und Russo i) die folgenden Resultate : In Abweichung der von Araki aufge- stellten Chitosanformel fanden sie, dasz das Chitosan, je zwei N-Atomen entsprechend, etwa 13 C- Atomen, 26 H-Atome und 14 O- Atome enthalten dürfte und dasz das Molekül mindestens zweimal, vielleicht aber um ein Vielfaches gröszer ist, als der Gröszenordnung der ARAKI-schen Formel entspricht. Nach VON Fürth und Russo entspricht einem N-Atom annähernd i Molekül Essigsäure und 3/4 Molekül Glykosamin. Das Chitosan vermag je einem N-Atom entsprechend ein Molekül HCl zu binden. Sein Stickstoff trägt den Charakter eines secundären Amins. Bei Benzoylierungsversuchen nimmt es, je einem N-Atom entsprechend, nur eine Benzoylgruppe auf. Alle im Chitosan- molekül vorhandenen Glykosaminkomplexe scheinen acetyliert zu sein. Daneben dürfte aber noch eine kohlenstoffärmere acetylierte Stickstoffverbindung im Molekül vorkommen. Ein erheblicher Teil seines Sauerstoffs dürfte im Molekül in anderer als in Hydroxy Iform enthalten sein. Es enthält keine Aldehyd- und Carbonylgruppen. VON FÜRTH und RusSO bemerken, dasz das freie Chitosan sich leicht unter Sauerstoffabgabe verändert. Nach LüWY 2) ist das Chitosan tatsächlich als ein polymères Monoacetyldiglucosamin anzusehen. Für die Molekulargrösze besitzt man vorläufig keine Anhaltspunkte, doch ergitbt sich aus dem Schwefelsäurebindungsvermögen [2 C14 Hge Ng Oxo + 3H2SO4 = C28 H50 N4 Ol« (H2S04)3 + Hob], dasz min- destens zwei Monoacetyldiglucosamine im Chitosan verbunden ^) 1. c. S) 1. c. i8o sein müssen. Die Zusammensetzung des Chitosans entspricht also der Formel (Cgs H50 N4 O19) x und die hydrolytische Spaltung in Glucosamin und Essigsäure erfolgt nach der Gleichung : (C28 H50 N4 O,,) X + 5 X H2 O = 4 X (Ce H,3 NO5) 4- 2 X (CH3COOH). Das Chitosan vermag je einem Monoacetyldi- glucosaminkomplex entsprechend je ein Jod- oder Bromatom aufzunehmen. KOTAKE und Sera 1) kommen im Zusammenhang mit Unter- suchungen über neue Glukosaminverbindungen («- und (i-Lyko- perdin) zu der Meinung dasz im Chitin vier Glukosaminmoleküle, von welchen jedes an einer Aminogruppe acetyliert ist, mit einander verbunden sind und zwar auf die folgende Weise : CHgOH I CH OH I CH CHOH I CH NH CO CH Aus dem Obenerwähnten geht hervor, dasz die Ansichten der Chemiker, was die Zusammensetzung des Chitins und des Chito- sans betrifft, noch lange nicht übereinstimmen. Sowohl für das Chitin wie für das Chitosan sind die aufgestellten Formeln ver- schieden. Die Ansichten über die Zahl der Acetylgruppen im Chitin gehen auseinander. Während LedderhoSE, Schmiede- BERG und Araki im Chitin auf zwei N drei Acetyle, Irvine auf vier N drei Acetyle, OFFER auf zwei N ein Acetyl anneh- men, glaubt Brach, dass im Chitin auf vier N vier Acetylen vorkommen. Die Ansichten über die Bindung der Stick- stoffe und der Acetyl- und Glucosamingruppen im Chitin und Chitosan sind sehr verschieden. Auch die Frage, warum beim Erwärmen des Chitins in konzentrierter Kalilauge bis auf ^) Yashiro Kotake und Yoshita Sera, Über eine neue Glukosaminverbindung, zugleich ein Beitrag zur Konstitutionsfrage des Chitins. Zeitschr. für physiol. Chemie, S8. Bd. (1913), p. 56. i8i 1 80° nur ein Teil der Acetylgruppe abgespalten wird, ist noch ungelöst. Die mikrochemische Untersuchung. Obschon es noch viele Lücken in unserer chemischen Kenntnis des Chitins gibt, hat die makrochemische Untersuchung doch schon viel geleistet, das für die mikrochemische Untersuchung Bedeutung hat. Schon verfügen wir über eine sehr empfindliche mikrochemische Methode zum Nachweis des Chitosans, des unlöslichen Zersetzungsprodukts des Chitins, aber wie es sich unten zeigen wird, brauchen wir uns nicht auf diese Methode zu beschränken. Neue mikrochemische Methoden sind unten beschrieben. Die mikrochemische Untersuchung fand bei den folgenden Objekten statt, nämlich bei 10 pflanzlichen Objekten (Fungi): Agaricus campestris L. Polyporus versicolor L. Aspergillus giganteus Wehmer, Plasmodiophora Brassicae Woron. Peltigera canina Hoffm. Sphaerotheca Mors Uvae (Schw.) Berk, et Curt. Aecidium nymphoides DC. Roestelia cancellata Rebentisch [Gymnosporangium Sabi- nae (Dicks) Winter]. Telephora terrestris Ehrh. Scolecotrichum (auf Gurke) und bei zwei tierischen Objekten : Crangon vulgaris. Sepia officinalis (Sepia-Schale). Besonders habe ich von den pflanzlichen Objekten die fünf erstgenannten benutzt. Wie die tierischen Objekte, waren diese wegen des beträchtlichen Chitingehalts für das Studium der neuen mikrochemischen Methoden sehr geeignet. Bei phytomikrochemischen Untersuchungen musz man, im Gegensatz zu dem, was bei makrochemischen Untersuchungen stattfindet, einer Auflösung vorbeugen. Dementsprechend richten wir bei der mikrochemischen Nachweisung des Chitins unsere Aufmerksamkeit auf das Cliitosan, sein unlösliches Zersetzungs- 13 -l82 produkt, das im Gegensatz zu Chitin mit vielen Stoffen reagiert. Reaction zirm Nachzveis des Chitosans mit Jod und Säuren. (Fig. 1.) In 1898 habe ich 1) die Forscher auf die schöne Violettfärbung, welche das Chitosan mit Jod und verdünnter Schwefelsäure zeigt, aufmerksam gemacht. Diese Reaktion hatte GiLSON 2) bei der makrochemischen Untersuchung pflanz- licher Objekte beobachtet. Ich habe sie für die mikrochemische Untersuchung anwendbar gemacht. Die angewandte Methode ist von mir und später von anderen beschrieben worden. Im Zusammenhang hiermit erlaube ich mir einige Bemerkungen : Wie schon früher erwähnt, werden die Präparate in zuge- schmolzenen Glasröhrchen bis auf 1600 C (unkorr.) in kon- zentrierter oder 500/Qiger Kalilauge erhitzt, darauf mit absolu- tem oder 950/oigem Alkohol ausgewaschen und in destilliertes Wasser gebracht und schlieszlich mit Jodjodkaliumlösung und sehr verdünnter Schwefelsäure behandelt. Die Erwärmung der Röhrchen kann natürlich auf verschiedene Weise stattfinden^ z. B. in einem Ölbade, in einem Trockenschrank oder in einem Schränkchen von Asbestpappe. Bei Anwendung eines Ölbades hing ich die Röhrchen in Hüllen von Metalltuch möglichst nahe beim Reservoir des Thermometers. Überflüssig und unpraktisch ist ein Deckel mit Löchern auf dem Ölbade, wie einige Autoren abgebildet haben. Wenn man die Röhr- chen aus dem Ölbade herausnimmt, hindert ein derartiger Deckel nur. Die Anwendung zugeschmolzener Röhrchen und besonders das Auswaschen mit Alkohol dient dazu die Präparate intakt zu erhalten. Nach Umwandlung des Chitins in Chitosan haben die Präparate viel von ihrer Festigkeit eingebüszt und die direkte Übertragung aus der konzentrierten Kalilauge ins Wasser können sie nicht mehr ertragen. Die Anwendung des Alkohols leistet ausgezeichnete Dienste, aber bei der Übertragung aus dem Alkohol ins Wasser zeigt es sich noch manchmal, dasz die Präparate weniger fest sind als vorher. Die Behandlung 1) C. VAN WissELiNGH, Mikrochem. Unters, über die Zelhvünde der Fungi, 1. c. p. 639. ^) E. Gn.soN, Recliercheb cliimiques sur la membr. cell, des champignons, 1. c. p. II. i83 mit verschiedenen Reagenzien, unter anderen mit Jodjodkalium- lösung oder mit verdünnter Schwefelsäure, macht sie wieder fester. Anstatt erst Jodjodkaliumlösung und nachher verdünnte Schwefelsäure kann man auch erst verdünnte Schwefelsäure und dann Jodjodkaliumlösung hinzufügen. Statt verdünnter Schwefelsäure kann man auch andere verdünnte Säuren oder ein saures Salz anwenden, z. B. verdünnte Phosphorsäure, verdünnte Selensäure oder Kaliumbisulfat. Bei vielen Säuren ist es nicht einerlei, ob man erst die Jodjodkaliumlösung und nachher die Säure zuflieszen lässt oder umgekehrt. Dieses ist nämlich der P'all mit verdünnter Salzsäure (2 1/2 ^/o), verdünnter Essigsäure (2 %), Weinsteinsäure, Zitronensäure und Benzoesäure. In den verdünnten Lösungen dieser Säuren löst sich das Chitosan. Bringt man die Präparate auf den Objektträger in ein kleines Quantum der Lösung einer dieser Säuren, so findet Lösung des Chitosans statt. Fügt man darauf JodjodkaUumlösung hinzu, so bildet sich ein körniges, rotviolettes Präzipitat. Behandelt man die Präparate erst mit JodjodkaUumlösung und nachher mit der verdünnten Lösung einer der genannten Säuren, so bleiben die Präparate intakt und zeigen nur die schöne Violettfärbung. Die Farbe, welche Jod in Kombination mit sauer reagieren- den Stoffen hervorbringt, ist meist rotviolett (Kl. et V. 556^ bei Plasmodiophora Brassicae mit Jod und Schwefelsäure). Verschie- dene Ursachen scheinen die Nuance mehr oder weniger modi- fizieren zu können. JodjodkaUumlösung und Kaliumbisulfatlösung rief sogar eine blauviolette Färbung hervor. Wenn man die Chitosanpräparate mit JodjodkaUumlösung und sehr verdünnter Schwefelsäure, z, B. i o/oiger, violett gefärbt hat und darauf 661/2- oder 76 "/oige Schwefelsäure hinzufügt, so verschwindet die Violettfärbung. Falls die Präparate zellulose- haltige Membrane enthalten, so tritt dann bei diesen Blaufär- bung auf (Fig. 2). Wie oben erwähnt, zeigt Chitosan einen basischen Charakter und enthält gewisze Atomgruppen ; es geht demzufolge mit vielen Stoffen Verbindingen ein. Einige dieser Verbindungen sind in Wasser löslich, andere dagegen nicht. Aus den wässerigen Lösungen der löslichen Chitosansalzen kann das Chitosan durch viele Stoffe präzipitiert werden. Zu diesen Stoffen gehören auch i84 die, welche für die Präzipitation der Alkaloide benutzt werden. Ich bereitete mit 2%iger Essigsäure eine iVoig^ Lösung von Chitosan, das aus Chitin von Crangon vulgaris dargestellt war und das durch Präzipitation gereinigt war. Diese Lösung gab mit den folgenden Lösungen Präzipitate : verdünnte Schwefelsäure (Präzipitat, das aus losen Körnern besteht), Jodjodkaliumlösung (Jod 5, Jodkalium 10, Wasser bis 100, violettes Präzipitat), Pikrinsäure (1 : too, häutiges Präzi- pitat), Picrolonsäure (gesättigte Lösung), Trinitrokresol, Kali- umquecksilberjodidlösung (Mayer's Reagens, HgCl2 i, KJ 4, Wasser 95), Quecksilberchloridlösung (1 : 20), Goldchloridlösung (i : 20), Platinchloridlösung (i : 10), Palladiumchlorürlösung (i : 100), Kaliumwismutjodidlösung, Kaliumcadmiumjodidlösung, Phosphomolybdänsäurelösung (häutiges Präzipatat), Phospho- wolframlösung (häutiges Präzipitat), Ferrocyankaliumlösung (1 : lo, häutiges Präzipitat), FerricyankaUumlösung (i : 10, häutiges Präzipitat), Kaliumbichromatlösung, Kaliumchromatlösung, sehr verdünnte Chromsäurelösung und Lösung von i, 2-naphtochinon- 4-sulfosaurem Natrium (häutiges, orangefarbenes Präzipitat). Mit 10 Voiger Tanninlösung erhielt ich kein Präzipitat. Als ich aber eine konzentriertere Chitosanlösung benutzte, entstand mit 10 '^/oigev Tanninlösung ein häutiges Präzipitat im Überflusz, Wenn man anstatt Chitosanlösungen tierische und pflanzliche Präparate benutzt, in welchen auf die angegebene Weise das Chitin in Chitosan umgewandelt ist, so entstehen durch Behandl- ung mit Präzipitiermitteln dieselbe Verbindungen, welche sich sonst bei der Präzipitation bilden. Man kann dabei konstatieren, dasz die Chitosanpräparate, die weniger fest sind als die ursprüngliche Chitinpräparate, wieder fester werden. Falls die Chitosanverbindungen eine intensive Farbe besitzen, kann man nach Behandlung mit Reagenzien die Skeletteilen der Tiere und die Zellwände der Fungi, die ursprünglich aus Chitin bestanden oder chitinhaltig waren, an der erhaltenen Farbe erkennen. Falls die gebildete Chitosanverbindung farblos ist, so kann man versuchen, den Stoff, der durch das Chitosan festge- legt ist, in eine gefärbte Verbindung umzuwandeln. Wenn solches gelingt, so kann man die ursprünglich chitinhaltigen Skelet- teile und Zellwände an der hervorgerufenen Farbe unterscheiden. Pikrinsäure (Fig. 4), Picrolonsäure, Trinitronaplitol, Trini- i85 trokresol. Wie ein wollener oder seidener Faden durch eine Pikrinsäurelösungbleibendgelbgefärbtvvird.im Gegensatz zu einem baunjwollenen, welche durch Auswaschen mit Wasser die gelbe Farbe bald verliert, so werden auch tierische und pflanzliche Chitosanpräparate bleibend gelb gefärbt, während zellulose- haltige Zellwände den gelben Farbstoff nicht festhalten. Anstatt einer Pikrinsäurelösung kann man auch Lösungen von Picrolon- säure, Trinitronaphtol und Trinitrokresol benutzen. Die Farbe ist intensiver je nachdem der Chitosan- oder der ursprüng- liche Chitingehalt gröszer ist. Die untersuchten tierischen Präparate färbten sich intensiv gelb und von den pflanzlichen Objekten zeigten die folgenden intensive Gelbfärbung: Agaricus campestris, Polyporus versicolor, Peltigera canina, Aspergillus giganteus und Plasmodiophora Brassicae. Bei dem letzten Objekt bilden die gelb gefärbten Sporen einen Kontrast mit den farblos bleibenden Zellulosewänden von Brassica. Die gelbe Farbe, welche ich bei Agaricus campestris mit Pikrinsäure, Picrolonsäure, Trini- trokresol und Trinitronaphtol erhielt, stimmte resp. mit Nr. 226, 201, 211 und 176 der Code des Couleurs sow Klincksieck tX Valette überein. Wenn man Chitosanpräparate durch einen der vier oben- genannten Stoffe gelb färbt und nachher mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure behandelt, so wird die gelbe Farbe durch die bekannte violette ersetzt. Chitin wird durch die vier obengenannten Stoffe nicht gelb gefärbt. Ferrocyanwasser Stoff säure. (Fig. 3). Ferrocyanwasserstoff- säure bildet mit Chitosan eine unlösliche Verbindung. Auch wenn man Chitosanpräparate in eine Lösung von Ferrocyan- kalium, der man etwas verdünnte Schwefelsäure zugefügt hat, oder erst in verdünnte Schwefelsäure und später in i "/oige Ferrocyankaliumlösung bringt, entsteht die Verbindung. Man kann die Präparate mit Wasser auswaschen und auskochen, ohne dasz sie zersetzt wird. Wenn man, nachdem man auf diese Weise das Ferrocyankalium und die nicht gebundene Ferrocyanwasserstoffsäure sorgfältig entfernt hat, die Präparate mit einer Lösung eines Ferrisalzes, z. B. des Ammoniumferri- sulfats, behandelt, so wird Berlinerblau gebildet. Diese unlös- liche Verbindung entsteht in äuszerst feiner Verteilung in den Skeletteilen oder Zellwänden, so dasz diese sehr gleichmäszig blau gefärbt werden (Kl. et V. 401, 402 und 406). Die blaue i86 Farbe ist stärker, je nachdem der Chitosan- resp. Chitingehalt gröszer ist. Die untersuchten tierischen Chitosanpräparate werden dunkelblau gefärbt und das ist auch mit den Chitosan- präparaten von Agaricus campestris, Polyporus versicolor, Pel- tigera canina, Aspergillus giganteus und Plasmodiophora Bras- sicae der Fall. Bei dem letzten Objekt beobachtet man die blaugefärbten Sporen inmitten des farblos gebliebenen Parenchyms. Die Verbindung der Ferrocyanwasserstoffsäure mit dem Chi- tosan wird durch Jodjodkaliumlösung und verdünnte Schwefel- säure nicht zersetzt. Die mit Ferrocyanwasserstoffsäure behan- delten Chitosanpräparate werden dadurch nicht violett gefärbt. Wenn man Chitinpräparate auf die obenbeschriebene Weise mit Ferrocyanwasserstoffsäure und einem Ferrisalz behandelt, tritt keine Blaufärbung auf. Feryicyanwasserstoffsäiire. (Fig. 3). Anstatt sukzessiver Behandlung mit Ferrocyanwasserstoffsäure und einem Ferrisalz kann man auch sukzessive Behandlung mit Ferricyanwasserstoff- säure und einem Ferrosalz anwenden. Man verfährt, wie oben angegeben ist, aber benutzt statt Ferrocyankalium Ferricyan- kalium und statt Ammoniumferrisulfat ein Ferrosalz, z. B. Ammoniumferrosulfat. Anstatt Berlinerblau entsteht Turnbull 's Blau. Die Methode führt zu ähnlichen Resultaten wie die vorige und die Empfindlichkeit beider ist auch ungefähr dieselbe. Zellulose und Chitin werden nicht gefärbt. Phosphomolybdänsäure. (Fig. 3). Mit Phosphomolybdänsäure bildet Chitosan eine unlösliche Verbindung, die auch entsteht, wenn man Chitosanpräparate in eine lO/^ige Lösung von Phosphomolybdänsäure bringt. Wenn man die Präparate später mit Wasser auswäscht oder auskocht, um nicht gebundene Phosphomolybdänsäure zu entfernen, und darauf in sehr ver- dünnte Zinnchlorürlösung bringt, so färben alle Skeletteile oder Zellwände, die aus Chitosan bestehen oder chitosanhaltig sind, sich blau (Kl. et V. 401, 402, 403, 406, 432, 437). Die blaue Farbe ist dunkler, je nachdem der Chitosangehalt, resp. der Chitingehalt, gröszer ist. Dunkel ist die Farbe bei den unter- suchten tierischen Produkten und bei Agaricus campestris, Polyporus versicolor, Peltigera canina, Aspergillus giganteus und Plasmodiophora Brassicae. Die Zellulosewände bleiben vollkommen farblos. Wenn diese sich neben chitosanhaltigen i87 befinden, wie bei der Untersuchung von Plasmodiophora Brassicae der Fall ist, so kann man beide sehr deutlich von einander unterscheiden. Chitin wird nicht blau gefärbt. Anstatt der Phosphomolybdänsäurelösung kann man auch eine Natriumphosphomolybdänatlösung und verdünnte Schwefel- säure anwenden. Man legt die Präparate erst in verdünnte Schwefelsäure und behandelt sie darauf mit i Vo^g^r Natrium- phosphomolybdänatlösung. Anstatt der Zinnchlorürlösung kann man auch andere reduzierende Stoffe benutzen, um Blaufärbung hervorzurufen, z. B. Ferrosulfat oder Wasserstoff in statu nascenti. Zinnchlorür- lösung verdient aber den Vorzug. Ihre Anv/endung ist bequem und führt schnell zum Ziel. Phosphowolframsäure. Mit Phosphowolframsäure kann man bei Chitosanpräparaten eine ähnliche Reaktion hervorrufen, wie mit Phosphomolybdänsäure. Nach Behandlung mit einer i o/^- igen Phosphowolframsäurelösung, nach Auswaschen mit Wasser und nach langem Erwärmen mit verdünnter Zinnchlorürlösung bekommt man Blaufärbung (Kl. et V. 437). Diese Reaktion ist weniger empfelungswert als die mit Phosphomolybdänsäure, mittels welcher man die Färbung schnell und ohne Erwärmen erzielt. Goldchlorid, H Au CI4, 4 H2 O (3 Hg O). Mit Goldchlorid geht Chitosan eine unlösliche Verbindung ein, die auch entsteht, wenn man tierische oder pflanzliche Chitosanpräparate in Gold- chloridlösung bringt. Wie bekannt, erzeugt Oxalsäure beim Erwärmen in stark verdünnter Goldchloridlösung zunächst eine blaue Färbung, welche allmählich in einen rotbraunen Nieder- schlag von metallischem Gold übergeht. Eine gleiche Reaktion bewirkt Eisenvitriol- oder Eisenchlorürlösung schon in der Kälte. Zinnchlorürlösung verursacht in sehr verdünnter Gold- chloridlösung eine purpurrote bis rotbraune Färbung. In kon- zentrierteren Goldchloridlösungen bewirkt dieses Reagens einen dunkelpurperroten, bisweilen rotbraunen Niederschlag eines Gemisches, welches als Cassiusschtv Goldpurpur oder als Mineralpurpur bezeichnet wird. Dasselbe besteht nach ZsiGMONDY aus zinnoxydhaltigem, fein verteiltem, kolloidalem Gold, bzw. aus einem Gemenge von kolloidaler Zinnsäure mit kolloidalem Gold. Wenn man Chitosanpräparate mit Goldchlorid behandelt und mit Wasser sorgfältig auswäscht oder auskocht, um das nicht gebundene Goldchlorid zu entfernen, und nachher mit Oxal- säure-, Ferrosulfat- oder Zinnchlorürlösung behandelt, so kann man bei denselben ähnliche Färbungen wahrnehmen, wie obenerwähnt, nämlich nach schwachem Erwärmen mit Oxal- säure blauviolett oder rotviolett (Kl. et V. 487 — 587), mit Fer- rosulfat meist blau (407) und mit verdünnter Zinnchlorürlösung violett (502), rotviolett, orangerot oder orange (127 — 128). Die Färbungen, die Goldchlorid in Kombination mit reduzierenden Stoffen bei Chitosanpräparaten hervorruft, sind im allgemeinen sehr dunkel. Ich bemerke, dasz oft auch bei dem Zellinhalt Färbung eintritt, was die Untersuchung erschwert. Verholzte Zellwände werden durch Goldchlorid violett gefärbt. Chitin und Zellulose werden nicht gefärbt. Tannin. Tannin geht mit Chitosan eine Verbindung ein. Demzufolge bemerkt man, dasz Chitosanpräparate in lo/oiger Tanninlösung ein ganz anderes Aussehen bekommen. Wenn man die mit Tanninlösung behandelten Präparate wiederholt sorgfältig mit Wasser auswäscht und später mit Ferriacetat- lösung behandelt, färben sie sich schwärzlichblau, während man mit Kaliumbichromat- und Uranacetatlösungen braune Färbungen erhält. Für den Nachweis des Chitosans, resp. des Chitins, kann ich aus verschiedenen Ursachen Tannin nicht empfehlen. Die Färbungen, welche -Tannin in Kombination mit Gerbstoffrea- genzien den Chitosanpräparaten erteilt, sind verhältnismäszig schwach. Aus den nicht chitosanhaltigen Zell wänden kann man das Tannin nicht leicht entfernen, so dasz manchmal auch diese mit Ferriacetatlösung eine schwärzlichblaue Farbe zeigen. Wenn man die Präparate mit Wasser auskocht, wird die Tanninreaktion bei den chitosanhaltigen Wänden schwächer. Das Tannin wird dem Chitosan entzogen. Das Chitosan scheint also mit dem Tannin nur eine lose Verbindung einzugehen. Chitosanpräparate, die man mit Tanninlösung behandelt hat, färben sich mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefel- säure violett. Das Eintreten dieser Reaktion wird deshalb durch das Tannin nicht verhindert. Salpetrige Säure. BRACH 1) hat betont, das obschon man ») 1. c. i89 annehmen musz, das im Chitosanmolekül Acetylgruppen an primairen Aminogruppen gebunden sind, der Stickstoff durch die Einwirkung der salpetrigen Säure doch quantitativ abgespalten wird. In Übereinstimmung hiermit findet, wenn man ein Chitos- anpräparat in Kaliumnitritlösung legt und verdünnte Schwefel- säure zufügt, Gasentwicklung und Lösung des Präparates statt. Diese Lösung ist vollständig, wenn das Präparat ganz aus Chitosan besteht, während, wenn solches nicht der Fall ist, ein unlöslicher Rest zurückbleiben kann. Chitin zeigt in Kalium- nitritlösung und verdünnter Schwefelsäure keine Änderung. 1,2 - Naphtochinon - 4 - siilfosaurcs Natrium 1). (Fig 5). Wie bekannt, ist 1,2 - naphtochinon - 4 - sulfosaurcs Natrium zur Identifizierung von Aminoverbindungen empfohlen worden. Eine schwach saure Lösung von Anilin in Essigsäure z. R. gibt mit einer Lösung von 1,2 - naphtochinon - 4 - sulfosaurem Natrium ein orangerotes kristallinisches Präzipitat. O 00 ;0 / \/ \:0 /\/\.OH + CeIl5NHa->S03HNa + SOgNa NH. CgHp N.CgHg Obschon die meisten Chemiker annehmen, dasz der Stick- stofï im Chitosan secundair gebunden ist, habe ich doch untersucht, ob genanntes Reagens für den mikrochemischen Nachweis des Chitosans dienen konnte. Eine schwach saure Lösung von Chitosan in Essigsäure gibt mit einer Lösung von 1,2 - naphtochinon - 4 - sulfosaurem Natrium ein zimtfarbenes Präzipitat. Wenn man tierische oder pflanzliche Chitosanprä- parate in eine derartige Lösung bringt, so nehmen sie allmäh- lich eine zimtbraune Farbe an (Kl. et V. orange 102, 103, 106, 107, 126), die intensiver ist, je nachdem die Objekte, mehr Chitosan enthalten. Zu den Objekten, bei welchen die Farbe sehr intensiv wird, gehören die beiden tierischen Objekte und von den pflanzlichen Objekten Agaricus campestris, Polyporus versicolor, Peltigera canina, Aspergillus giganteus und Plas- modiophora Brassicae. SchAvaches Erwärmen beschleunigt die *) Th. Weyl, Die Methoden der Organischen Chemie, 2. Bd. (Bes. Teil), 2. Abt. (191 0. P- 1305- Reaktion. Bei der Untersuchung von Plasmodiophora Brassicae fallen die orangefarbenen Sporen inmitten des farblosen Paren- chyms sehr auf. Die gewöhnlichen Zellulosewände färben sich nicht. Auch bleibt Chitin in einer Lösung von 1,2 - naphto- chinon - 4 - sulfosaurem Natrium farblos. Wenn man die orange gefärbten Präparate mit verdünnter Salzsäure oder Schwefelsäure behandelt, so wird die Farbe wenig modifiziert. Bringt man sie aber in verdünnte Kalilauge oder Salmiakgeist, so wird die Orangefarbe in Olivengrün um- gewandelt (Kl. et V. gelb 202, 203, 207). Durch Jodjodkalium- lösung und verdünnte Schwefelsäure werden die orangefarbenen Präparate nicht violett gefärbt. ScJiJvefelkohlenstoff. Schwefelkohlenstoff reagiert mit primären und sekundären Aminen. Mit primären und secundären Aminen der alipathischen Reihe bildet er alkylierte resp. dialkylierte Dithiokarbaminsäure : 2C2H5.NH2 + CS2 -> C0H5.NH.CSSH, H2N.C2H5 Athylamin äthyldithiokarbaminsaures Äthylamin. 2(C2H5)2NH + CS3 -^ (CoH.5)2N.CSSH, HN(C2H5)2 Diäthylamin. di.Hthyldithiokarbaminsaures Diälhylamin. Es lag deshalb auf der Hand zu untersuchen, ob Schwefel- kohlenstoff auch mit Chitosan reagiert. Es zeigte sich, dasz das der Fall war. Weil das Reaktionsprodukt unlöslich ist, behalten die Präparate vollkommen ihre Struktur. Wenn man Chitosanpräparate aus absolutem Alkohol in Schwefelkohlenstoff überträgt und lange hiermit in einem Wasserbade erwärmt, so zeigt CS sich, dasz das Verhalten Reagenzien gegenüber sich ganz geändert hat. Mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure bekommt man keine Violettfärbung mehr; die Präparate färben sich gelb bis braun ; in verdünnter Essigsäure, verdünnter Salzsäure und in salpetriger Säure (Kaliumnitrit mit verdünnter Schwefelsäure) findet keine Auflösung mehr statt. Alkylierung. Jodmethyl lagert sich in der Mehrzahl der Fällen an primäre, sekundäre und tertiäre Basen an. Primäre und sekundäre Basen liefern Jodhydrate der methylierten Basen, aus welchen Verbindungen durch Alkali die freien methylierten Amine ausgeschieden werden : R.NHa 4-»JCH3 -> ^^^ > NII.JII (|- KOH) ^> ^^ > NH RjNH + JCH3 -> R > N.JII (+ KOII) -> R > N CH3 ^Hg Tertiäre Basen liefern durch Alkali nicht zerlegbaren substi- tuierten Ammoniumjodide : R > N + JCH3 — >- R > N < ?"» Nimmt man bei der Methylierung eines primären Amins den entstehenden Jodwasserstoff durch Alkali fort, so gelangt man durch weitere Einwirkung von Jodmethyl und Alkali stufen- weise bis zum Jodid der quaternären Base. Es lag auf der Hand zu untersuchen, welche Änderungen das Chitosan erfährt, wenn man es abwechslungsweise einige Male mit Jodmethyl und mit Alkali behandelt. Die Chitosanpräparate wurden aus absolutem Alkohol in das Jodmethyl übertragen und lange mit diesem und darauf mit alkoholischer Kalilauge er- wärmt. Dreimal wurde solches wiederholt. Das Resultat dieser Versuche war, dasz in allen Fällen sowohl bei tierischen als pflanzlichen Objekten das Chitosan in ein Produkt umgewan- delt wurde, das auch unlöslich war, so dasz die Präparate bei zweckmäsziger Behandlung intakt blieben, aber das Reagenzien gegenüber sich auf ganz andere Weise als Chitosan verhielt. Jodjodkaliumlösung und verdünnte Schwefelsäure rief keine Violettfärbung mehr hervor; die Präparate färbten sich orange. Weil das Übertragen ins Wasser den Präparaten manchmal schadet, ist es erwünscht sie mit Alkohol und Wasser auszuwaschen und darauf mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure zu behandeln. Acylieyting. Wie schon erwähnt, kommt im Chitosan primär oder secundär gebundener Stickstoff vor. Auch ist es möglich, dasz wie im Glucosamin auch im Chitosan Hydroxylgruppen an- wesend sind. Man kann deshalb erwarten, dasz Chitosan mit Säurechloriden und Säureanhydriden neue Verbindungen bilden wird, nämlich zusammengesetzten Äther oder Aminosäuren. Einige Chemiker haben schon durch Acylierung mit Essig- säureanhydrid und Propionsäureanhydrid Derivate von Chitosan erhalten. Es lag deshalb auf der Hand auch den Wert der 192 Acylierung für die mikrochemische Untersuchung zu studieren. Mit verschiedenen Stoffen habe ich Acylierungsversuche ange- stellt, nämlich mit Chloriden von Säureradikalen : Acethylchlorid und Benzoylchlorid und mit Anhydriden von Säuren : Essigsäure-, Bernsteinsäure-, Benzoesäure- und Phtalsäureanhydrid. Die Chloride der Säureradikale liesz ich bei der gewöhnlichen Temperatur auf die Chitosanpräparate einwirken und die Säureanhydride unter Erwärmen im Wasserbade. Die Säurechloride liesz ich als solche einwirken. Das flüssige Essigsäureanhydrid benutzte ich auch meist als solches, aber auch in alkoholischer Lösung. Die festen Säureanhydride wendete ich in Lösung an. Für Lösungsmittel dienten absoluter Alkohol, Benzol und Toluol. Die Lösungen enthielten gewöhnlich 5 0/0 Anhydrid. Freilich bilden sich beim Gebrauch vom absoluten Alkohol als Lösungs- mittel allmählich zusammengesetzte Äther und deshalb scheint seine Anwendung weniger rationell. Die Acylierung wird aber durch den Alkohol nicht verhindert. Bei den obenerwähnten Versuchen musz man darauf achtgeben, dasz die Flüssigkeit aus welcher man ein Präparat nimmt, mischbar ist mit der, in welche man es überträgt. Man musz z. B. kein Präparat direkt aus Wasser in Benzol oder Toluol bringen, sondern man musz es erst mit absolutem Alkohol auswaschen. Die Acylierung führte im allgemeinen zum Resultate, dasz das Chitosan in eine in Wasser unlösliche Verbindung umge- wandelt wurde, während die Zelhvände vollkommen intakt blieben. Die neuen Körper, welche man bei den Acylierungs- versuchen erhält, verhalten sich Reagenzien gegenüber anders als das Chitosan, während sie untereinander auch verschieden sind, was mit den eingeführten Säureresten zusammenhängt. Deshalb werde ich erst die Resultate, welche das Acetylieren lieferte, erwähnen. Nach dem Acetylieren verhalten sich die Präparate verschie- denen Reagenzien gegenüber, als ob sie aus Chitin beständen oder chitinhaltig wären. Hierbei musz ich aber bemerken, dasz man doch nicht annehmen darf, dasz man Chitin wiederbekommen hätte- Wenn man die acetylierten Präparate mit Jodjodkaliumlösung behandelt, so färben sie sich gelb oder orange ; nach Hinzufügung von verdünnter Schwefelsäure geht die Farbe aber nicht in violett über. Wie Chitin, widerstehen die Präparate eine ^93 Erwärmung bis auf 300 0 C in Glyzerin, während Chitosan- präparate dadurch zersetzt und gelöst werden. Verschiedene Reaktionen, welche Chitosan zeigt, kann man bei den Präparaten nicht mehr hervorrufen. Wenn man sie z. R. hintereinander mit Ferrocyanwasserstoffsäure (Ferrocyankaliumlösung und verdünnte Schwefelsäure) und mit einer Lösung eines Ferrisalzes oder mit Phosphomolybdänsäure und sehr verdünnter Zinnchlorürlösung behandelt, so färben sie sich nicht mehr blau. In salpetriger Säure (Kaliumnitritlösung und verdünnte Schwefelsäure) lösen sich die Präparate nicht mehr. Auch in verdünnter Essigsaure und verdünnter Salzsäure sind sie unlöslich geworden. Wenn man die Präparate wieder mit konzentrierter oder 500/oiger Kalilauge erwärmt, entsteht wieder Chitosan. Wenn man sie darauf mit absolutem Alkohol auswäscht und mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure behandelt, so zeigen sie wieder die schöne Violettfärbung der Chitosans. Auch die anderen Reaktionen, welche dem Chitosan zukommen, wie die Blaufärbung mit Ferrocyanwasserstoffsäure und einem Ferrisalz und mit Phosphomolybdänsäure und Zinnchlorür, kann man wieder bei den Präparaten hervorrufen. Verdünnte Essig- säure und verdünnte Salzsäure lösen die Präparate wieder ganz oder teilweise auf. Das Benzoylieren führt zu ähnlichen Resultaten wie das Acetylieren. Nach dem Benzoylieren ist das Chitosan in eine Verbindung umgewandelt, die sich mit Jodjodkaliumlösung gelb oder braun färbt, welche Farbe durch Hinzufügung ver- dünnter Schwefelsäure nicht in violett übergeht. Die benzoylierten Präparate werden durch Ferrocyanwasserstoffsäure und ein Ferrisalz, durch Ferricyanwasserstoffsäure und ein Ferrosalz und durch Phosphomolybdänsäure und Zinnchlorür nicht blau gefärbt. In verdünnter Essigsäure und verdünnter Salzsäure sind sie unlöslich. Wenn man sie mit konzentrierter Kalilauge erwärmt hat, so verhalten sie sich wieder wie Chitosanpräparate ; Jodjodkaliumlösung und verdünnte Schwefelsäure z. B. rufen wieder Violettfärbung hervor. Die mit i,2-naphtochinon-4-sulfosaurem Natrium behandelten Chitosanpräparate lösen sich unter Gasentwicklung in salpetriger Säure. Wenn man sie durch Erwärmen mit Essigsäureanhydrid oder mit einer alkoholischen Benzoesäureanhydridlösung acety- 194 liert oder benzoyliert, so zeigen sie keine Änderung ; nach der Acylierung haben sie auch ihre Orangefarbe behalten, aber sie widerstehen dann der Einwirkung der salpetrigen Säure. Mit Dikarbonsäureanhydriden erhielt ich zum Teil andere Resultate als mit Monokarbonsäureanhydriden. Phtalsäureanhy- drid reagiert mit Aminen und mit Alkoholen. Es bildet z. R. mit AniUn Phtalanilsäure COOH. Cg H4. CO. NH. Cg H5 und mit primären und sekundären Alkoholen in Sodalösung lös- liche Ester : Ce H4<(^^>0 + R. CH, O H --> Q H,<^^OCH, R Beim Acylieren von Chitosanpräparaten mit Phtalsäurean- hydrid erhielt ich die folgenden Resultate: Nach Erwärmen mit einer Lösung von Phtalsäureanhydrid färben die Präparate sich mit Jodjodkaliumlösung gelb oder orange, welche Farbe durch verdünnte Schwefelsäure nicht in violett übergeht. Durch Ferro- cyanwasserstofïsaure und ein Ferrisalz, durch Ferricyanwasser- stoffsäure und ein Ferrosalz und durch Phosphomolybdänsäure und Zinnchlorür werden sie nicht blau gefärbt. In verdünnter Essigsäure (2 "/o) und in verdünnter Salzsäure sind die Präpa- rate unlöslich. Auch in salpetriger Säure lösen sie sich nicht. Sie sind aber löslich in verdünnter Kalilauge (4 X N) und in Sodalösung. Die Auflösung ist vollständig oder ein unlöslicher Rest bleibt zurück (Plasmodiophora Brassicae). Die Löslichkeit in verdünnten Alkalien und kohlensauren Alkalien bildet einen Unterschied mit den Resultaten der Acetylierung und Ben- zoylierung. Beim Erwärmen der Chitosanpräparate mit einer Lösung von Bernsteinsäurennhydrld bekommt man ähnliche Resultate wie mit Phtalsäureanhydrid. Nach der Behandlung werden die Präparate durch Jodjodkaliumlösung gelb oder orange gefärbt und diese Farbe geht durch Hinzufügung von verdünnter Schwefelsäure nicht in violett über. In verdünnter Essigsäure und verdünnter Salzsäure findet keine Lösung statt, aber wohl ist das Reaktionsprodukt löslich in verdünnter Kalilauge und Sodalösung. Die folgende Methode kann man zur Kontrolle der oben- beschriebenen Versuche anwenden. Man behandelt die Chito- 195 sanpräparate mit einem Lösungsmittel, z. B. mit verdünnter Essigsäure und fügt darauf die Reagenzien hinzu. Man legt die Chitosanpräparate auf den Objektträger in ein Tröpfchen 2 Vo^o^^ Essigsäure. Hierin löst sich das Chitosan. Darauf läszt man unter dem Deckglase ein der Reagenzien zuflieszen, nämlich Ferrocyanwasserstoffsäure, Ferricyanwasser- stoffsäure, Phosphomolybdänsäure, naphtochinonsulfosaures Na- trium, Pikrinsäure oder Picrolonsäure. Genannte Reagenzien verursachen häutige oder körnige Niederschläge. Die, welche Ferrocyanwasserstoffsäure, Ferricyan wasserstoffsäure und Phos- [ihomolybdänsäure hervorrufen, ffirben sich resp. mit Ferrisalz, Ferrosalz und Zinnchlorür blau. In einer früheren Abhandlung über die Mikrochemie der Pilzzellwände habe ich i) erwähnt, dasz man chitinhaltige Zell- wände bis auf 300° C in Glyzerin erhitzen kann, ohne dasz das Chitin sich dabei zersetzt und ohne dasz das Gewebe destruiert wird, während viele andere Zellwandstoffe zersetzt und aufgelöst werden. Die chitinhaltigen Wände erfahren gleichsam eine Reinigung. Diese Methode kann man mit allen obenerwähnten Methoden kombinieren. Erst erhitzt man die Präparate bis auf 300° in Glyzerin, durch Erwärmen in konzentrierter Kalilauge verwandelt man das Chitin in Chitosan und darauf wendet man die verschiedenen Reaktionen an, welche B'ärbung und Auflösung hervorbringen. Die vorhergehende Erwärmung in Glyzerin dient zur Kontrolle und zur Verschärfung der Methode. Ohne Erhitzen in Glyzerin gelingt es z. B. nicht in den Sporenschläuchen von Peltigera canina Chitin nachzuweisen. Die Hyphen und Paraphysen zeigen nach Erwärmen bis auf 160° C in konzentrierter Kalilauge sehr deutlich die Violett- färbung mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure. Bei den Sporenschläuchen wird diese Reaktion durch das Lichenin (nach Berg 2) Isolichenin) maskiert, das in beträcht- licher Quantität anwesend ist und mit Jodreagenzien sich intensiv blau färbt. Mit anderen Reagenzien kann man bei den Hyphen und Paraphysen auch leicht Chitosan nachweisen, aber bei den Sporenschläuchen ist die Quantität dafür zu gering. Durch 1) 1. c. p. 643. 1) Berg, Jahresber. f. Chemie (1873), p. 849. Erhitzen bis auf 300° in Glyzerin wird das Lichenin (Isolichenin) aus der Zellwand entfernt und danach findet mit Jod keine Blaufärbung mehr statt. Wenn man nach dem Erhitzen in Glyzerin die Präparate bis auf 160° in konzentrierter Kalilauge erwärmt und mit absolutem Alkohol auswäscht, so färben auch die Sporenschläuche sich mit Jodjodkaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure violett. Die Farbe ist deutlich aber hell. Der Rest der Sporenschläuche ist zum Teil löslich in ver- dünnter Essigsäure ; er besteht deshalb nicht ganz aus Chitosan. Neben Lichenin (Isolichenin) und verschiedenen anderen Stoffen enthalten die Sporenschläuche offenbar auch etwas Chitin. Zusammenfassung. Chitin und Chitosan verhalten sich Reagenzien gegenüber sehr verschieden. Chitin ist ein verhältnismäszig indifferenter Körper. Es wird nur durch kräftige Reagenzien, wie starke Mineralsäuren, Ätzkalien und kräftige Oxydationsmittel ange- griffen. Chitosan dagegen reagiert mit einer Menge verschie- dener Stoffe. Was wir von der chemischen Struktur dieser beiden Körper wissen, reicht noch lange nicht aus, um das verschiedene Verhalteq Reagenzien gegenüber zu erklären. Unsere Kenntnis von der chemischen Struktur des Chitins ist noch sehr unvollständig und ungewisz. Die chemische Struktur des Chitosans ist zwar auch noch nicht vollständig bekannt, aber durch die Untersuchungen der Chemiker ist doch soviel ans Licht gekommen, dasz ich met Erfolg nach neuen mikro- chemischen Methoden suchen konnte zum Nachweis dieses Zersetzungsproduktes des Chitins. Aus dieser Publikation geht hervor, dasz man Chitosan nicht nur mittels Jod und einer Säure (verdünnte Schwefelsäure), sondern noch auf verschiedene andere Weisen mikrochemisch in den Zellwänden und Geweben nachweisen kann. Von den neuen Methoden erwähne ich zunächst einige, wobei die Zell- wand gefärbt wird, als die Nachweisung des Chitosans mittels Ferrocyanwasserstoffsäure (Ferrocyankalium und verdünnte Schwefelsäure) und eines Ferrisalzes (Ammoniumferrisulfat), mittels Ferricyanwasserstoffsäure (Ferricyankalium und verdünnte Schwefelsäure) und eines Fcrrosalzes (Ammoniumferrosulfat), 197 mittels Phosphomolybdänsäure und sehr verdünnter Zinnchlorür- lösung, mittels i,2-naphtochinon-4-sulfosaures Natriums, Pikrin- säure u. s. w. Bei Anwendung der drei ersten Methoden färben sich die Zellvvände und Gewebe, die ursprünglich Chitin ent- hielten, blau, mit naphtochinonsulfosaurem Natrium orange und mit Pikrinsäure gelb. Die Präparate bleiben bei zweckmäsziger und sorgfältiger Behandlung volkommen intakt. Die gfenannten neuen Methoden zum mikrochemischen Nach- weis des Chitins sind im allgemeinen sehr empfindlich und stehen der auszerordentlich empfindlichen Reaktion mit Jodjod- kaliumlösung und verdünnter Schwefelsäure nur wenig nach. Im Fall die Präparate viel Chitosan enthalten, ist die Färbung sehr intensiv. Auszer den genannten Methoden kann man noch andere anwenden, als Acylieren mit Essigsäureanhydrid, Phtalsäure- anhydrid, Bernsteinsäureanhydrid u.s.w. und Methylieren. Auch können verschiedene Methoden kombiniert werden. Zur näheren Kontrolle kann man noch die folgende Methode anwenden. Man legt die Chitosanpräparate auf den Objektträger in ein Tröpfchen verdünnter Essigsäure, in welcher das Chitosan sich löst ; darauf läszt man unter dem Deckglase Reagenzien zufliessen, die das Chitosan präzipitieren. Men erhält dann körnige oder häutige, manchmal gefärbte Präparate. Alle Methoden können durch vorhergehendes Erwärnen bis auf 3000 in Glyzerin empfindlicher gemacht werden. Hierdurch werden viele Zellstoffe zersetzt und aus der Wand entfernt, z. B, das Lichenin (Isolichenin), das durch Jod intensiv blau gefärbt wird und demzufolge die Chitosanreaktion mit Jod und ver- dünnter Schwefelsäure maskiert. Chitin wird durch die Erhitzung nicht angegriffen. Da sich in der Natur verschiedene Zellwandstoffe finden, die durch Jod blau oder violett gefärbt werden und auch Zellulose nach Behandlung mit konzentrierter Kalilauge Blau- oder Violett- färbung mit Jod zeigen kann, sind wiederholt Verwechslungen vom Chitin mit anderen Stoffen vorgekommen. Die neuen Methoden können jetzt zur Kontrolle angewendet werden. Bei allen 10 untersuchten Fungi und bei den beiden unter- suchten tierischen Objekten habe ich nach Erwärmung in kon- zentrierter Kalilauge bis auf 1600 sowohl mit Jod und verdünnter 14 Schwefelsäure als mittels der neuen Methoden Chitosan resp, Chitin nachgewiesen. Schlieszlich bemerke ich, dass meine Beobachtungen nicht zu Resultaten geführt haben, auf deren Grund man annehmen könnte, dasz in der Natur nicht ein einziges Chitin, sondern mehrere chemisch verschiedene chitinartige Körper vorkämen. FIGURENERKLÄRUNG. Die fünf Figuren stellen Präparate von Plasmodiophora Brassicae vor. Durch Erhitzen mit 50°/oiger Kalilauge bis auf i6o<' in zuge- schmolzenen gläsernen Röhrchen ist das Chitin in Chitosan umgewandelt. Darauf sind die Präparate mit absolutem oder g^'^/o'igem Alkohol ausgewaschen, in Wasser übertragen und, wie unten angegeben ist, mit verschiedenen Reagenzien behandelt worden. Fig. I, Mit verdünnter Jodjodkaliumlösung und lyoiger Schwefel- säure, wodurch Violettfärbung der chitosanhaltigen Membranen eintritt. Fig. 2. Nach der Behandlung mit Jodjodkaliumlösung und i^/oiger Schwefelsäure hat Einwirkung 66 '/2- oder yö^/oiger Schwefel- säure stattgefunden, wodurch die Violettfärbung der chitosan- haltigen Membranen verschwindet und die zellulosehaltigen sich blau färben. Fig. 3. Nach Behandlung mit Ferrocyan Wasserstoff säure (Ferrocyan- kalium und verdünnte Schwefelsäure), sorgfältigem Auswaschen oder Auskochen mit Wasser und Hinzufügung einer Ferrisalz- lösung (Ammoniumferrisulfat), wodurch die chitosanhaltigen Membranen infolge der Bildung von Berlinerblau sich blau färben. Wenn man anstatt Ferrocyankalium Ferricyankalium und anstatt eines Ferrisalzes ein Ferrosalz (Ammoniumferrosulfat) anwendet, färben sich die chitosanhaltigen Membranen infolge der Bildung von TurnbuU's Blau auf ähnliche Weise. Blaufärbung der chitosanhaltigen Membranen bekommt man auch, wenn man auf ähnliche Weise wie die oben- . genannten Reagenzien Phosphomolybdänsäurelösung und sehr verdünnte Zinnchlorürlösung anwendet. Fig. 4. Die chitosanhaltigen Membranen sind durch Pikrinsäurelösung gelb gefärbt. Fig. 5. Die chitosanhaltigen Membranen sind durch eine Lösung von i,2-naphtochinon-4-sulfosaurem Natrium orange gefärbt. EL XVI. Folia Microbiologica III. (v. WlSSEHNGH). THE BACTERIOLOGICAL DIAGNOSIS OF DIPHTHERIA i) BY Dr. C. W. BROERS. Director of the Central Laboratory of Public Health at Utrecht. Since more and more attention is being paid to the rôle, played by bacilli-carriers in the epidemiology of diphtheria, the importance of the bacteriological diagnosis of diphtheria has increased, but at the same time, the difficulties attached to it, have become better known. This is the chief reason why the bacteriology of diphtheria has enjoyed universal attention, specially of late. It therefore seemed to me a good idea, to make this subject a point of discussion in the Microbiological Society. The first question, that presents itself, of course is, what is a diphtheria bacillus? The answer may be very short, namely, that it is a coryne-bacterium which may cause diphtheria in man. The first part of this definition refers to a characteristic namely the appearance of club-shaped, rounded ends, which is typical for a large group of bacteria, to which the diphtheria bacillus also belongs. The second part is not open to experi- mental research. So in making a diagnosis the abovementioned definition does not hold good. The diphtheria bacillus has met with the same fate as so many other pathogenic microorganisms ; at first it was thought that the shape only would be enough to classify the microorga- nism, but very soon it got known, that the same morpho- logical characters belonged to many other, also non-pathogenic ^) Introductory to the discussion of this subject at the meeting of the Microbiological Society held on I5ch of January 1915 (translated by Jeanne S.mit). 200 bacteria and from that moment onward, other differentiating characters have been looked for. It would be no use to sum up everything, that has become known of late years to characterize the diphtheria bacillus. I should - only like to mention the most inportant. Beside shape and non motility, it is in the first place its reaction on diffe- rent stains, namely the irregular staining of the protoplasm by anilin dyes. The well-known staining method of Neisser, which makes the metachromatic bodies of Babes-Ernst clearly visible, is based on this characteristic of the diphtheria bacillus. In the second place its reaction on Gram's staining should be mentioned. Another character is found in the way in which it grows on different culture media, specially the rapidity and abundance of growth on LöFFLER'S serum (ox or horse serum mixed to a proportion of 3:1 with glucose broth) and the nature of colonies formed on it. As is the case with so many other bacteria, it has also been tried with the diphtheria bacillus, to find typical characteristics in its reaction on several carbohydrates ; especially the production of acid in glucose containing media plays an important part as a diagnosticum and special attention is paid to the amount of acid produced. Is it possible now to make out with the help of these details, which may be got in the way I suggested above and which belong all of them to morphological or cultural proper- ties, if a pure culture we are working on is one of true diphtheria bacilli? In many cases, it is no doubt likely to be so, but we dont get certainty, we only approach the truth and the more we extend our investigation this way, the nearer we get to it. Fortunately there are other characters which may help us somehow one way or the other. These are derived from the immuno-reactions and the experiments on animals. Analogical to what was taught by other pathogenic microorganisms, several serological reactions were tried for diphtheria too. In the first place I should like to mention the agglutination. If we follow the working-method, used for example in typhoid, we dont get any satisfactory result. But other methods have been worked out, for instance about 5 years ago in the laboratory of Prof. SprONCK in Utrecht, which gave very useful results. , 201 Very good too seems to be the method, which Miss Van RiEMSDIJK pubhshed some time ago in the »Centralblatt für Bakteriologie.« With a strong agglutinable serum we certainly obtain again and again very marked differences between diphtheria bacilli und bacteria, which are more or less allied to them. It is my experience though and, as the bacteriological literature teaches, that of most experimentors, who have occupied themselves with diphtheria agglutination, that most unexpected surprises are obtained. Thus one culture possessing every possible character of a diphtheria bacillus, virulence included, is not agglutinated, as another strain which was thought to be one of pseudo- diphtheria agglutinates very well indeed. This must of course be due to the imcomplete working-method and we may expect that the difficulties, that have presented themselves so far will disappear. The precipitation reaction has not yet been able to find a place in the examination of diphtheria either. We tried to get something suitable out of the application of the thermo- precipitation, with which Ascoli had such splendid results with anthrax, but have failed so far. The complement fixation test does not give any result equal to the very complicated techi- nical difficulties of this method. It is much safer all round, to call in the assistance of the experiment on animals. The diphteria bacillus is a toxin-producer and this toxin is not only harmful to man, but may also be very dangerous to a great many animals. In the guinea-pig we find an animal which specially suits our purposes. If a guinea-pig is injected subcutaneously with a sufficient dose of a toxincontaining medium, it will die in a few days and on obduction we will find the typical symptoms. If we bring only a small quantity of the toxin under the skin, in the way RÖMER suggested several years ago or after the method in which miss VAN RiEMSDIJK made some technical improvements, we get a very circumscript characteristic process on the skin. Although we shall find in this way a very excellent method of identifying a culture of diphteria, still more important are the results, that will be obtained by making use at the same time of the property of the toxin of being neutralised by its antitoxin. 202 If a second guinea-pig is injected with toxin and diphtheria antitoxin at the same time and if it is found that this guinea- pig remains without any symptoms, as another, being injected with taxin only, dies or gets some local reaction, it is proved with centainty, that the culture which produced the toxin is one of true diphtheria bacilli. So we find in this a method to make out with certainty if a given culture consists of real diphteria bacilli, but to my mind we must not conclude from the absence of a toxin harmful to guinea-pigs that the culture is not one of diphtheria. I have now given you an outline of the principal methods which may be used by the examination of diphtheria ; to wind up with I should like to mention the following : Give a culture to an experimenter trained in this part of bacteriology, put at his disposal a well-equipped laboratory and above all sufficient time, he will in most cases be able, though it may be after many weeks, to tell you with great probability if the culture you gave him was diphtheria or not. But if we face the practical side of the question another problem crops up, as one of the provisions made, namely that of having plenty of time, fails here completely. A result obtained after weeks or months is hardly ever of any use to the answering of questions that face us in practice. What we want here is to know in the shortest time possible, if a person has diphtheria bacilli in his throat, nose or other part of his body. In most cases the answer to this question cannot be given with absolute centainty in a short time, therefore we try to get as near to the truth as possible and all sorts of experiments are made to improve the working-methods. In the Central Laboratory we have organised the diphtheria examination as follows : The medical man receives a wooden box containing two testtubes, in one of which there is a sterile swab of cottonwool ; the other is a sloped tube of LOEFFLER 'S serum . The practitioner rubs the mucous membrane of the patient with the swab and after that he rubs it over the serum. As soon as possible all this is sent to the Central Laboratory and on arriving there the swab is brushed over the surface of a Petri dish containing LOEFFLER 'S serum. Both culture media, testtube and plate, are now incubated at 37" C. 203 After a certain time, varying from i8 to 24 hours, both media are examined. If there are separate colonies, which look very much like diphtheria colonies, microscopical preparations are made of them. If this is not the case and such colonies are not clearly visible we make a preparation of material taken from different parts of the plate. These films are stained by the new method of Neisser with the modification of GiNS. If trained assistants find bacilli which have the typical shape of diphtheria bacilli and contain the bodies of BabeS-Ernst, then the diagnosis diphtheria is made. By proceeding in this way we make use of the property of diphtheria bacilli to grow rapidly and abundantly on Loeffler's serum at body temperature in the shape of characteristic colonies and to exhibit within 24 hours by NeiSSER's stain very typically the metachromatic bodies. May we be perfectly sure now by working in this way that our diagnosis is the right one and that no diphtheria bacillus escapes our attention? I should be the last to be positive as to that. As mentioned before we only get near the truth and I am convinced that in proceeding like this, a mistake is made occasionally in one direction or the other. Being convinced of this it is easy to understand that people will try by all means to extend and improve upon the working methods. But at the same time the question arises whether the improvement achieved is proportional to the possibly longer duration of the examination. The solving of this problem will be the subject of the following lines. In the first place let us pay attention to these modifications or extensions of the technical part which do not lead to prolong the examination. Over and over again it has been tried to find a culture medium able to stimulate the growth of diphtheria bacilli and to inhibit at the same time the growth of other microorganisms, specially those who are nearly related to diphtheria bacilli. Of the methods, which have been published recently, I should like to mention those of RaNKIN and of Conradi-Troch. None of these culture media however came up to the expectation and up to the present the best results have been obtained with Loeffler's serum. When the staining method of Neisser is used it is considered 204 a drawback, that the shape of the bacteria is not always clearly visible ; therefore a methyleneblue preparation Avas often made at the same time. But since GiNS taught us how to avoid this difficulty, the double-stained preparation will do. In some laboratories a second film is made and stained after Gram, thus making use of the property of the diphteria bacillus of being Gram-positive. Wanting to know if the addition of this manipulation, which would not delay the diagnosis but only cause a great extension of the routine work, would be a benefit. Miss Smit has made pure cultures of a great many cases in which diphtheria bacilli were diagnosed by us and investigated their behaviour towards Gram's stain. Only one of them was not immediately stained after Gram. According to these investigations I cannot find sufïicient reason for extending our working-method in this way. So the shape and the relations to different stains not being able to procure any new information, let us now have a look at the other characteristics mentioned above. Before proceeding in this direction we must bear in mind that a pure culture of the microorganism we want to examine, is absolutely necessary and also that for investigating these characteristics we want some time, for the bacilli must grow in their new medium in order to show their characteristics. In many a case and especially in those of a doubtful nature the diphtheria bacilli or what looks like them, are overgrown by other microorganisms to such an extent, that no distinct separate colonies are formed on the medium. If we want to get a pure culture it is necessary to make a new culture on an other plate of the most suspected places and we have got a separate colony then in at least 20 hours. But this may not always be possible, not seldom we have to repeat this operation and every one, who does this work regularly, knows by experience that the isolation often fails altogether. It will be clear now, that there are some cases in which an almost pure culture, suitable for further investigations is obtained at once, but there are a great many cases in which we only succeed in 1 or 2 or more days. Now the question has to be raised as to whether a delay of 24 hours at least, but as a rule of two or more days, gives so much more certainty, that the 205 drawback of the delay is exceeded by the benefit of the greater correctness. The characteristics which have to be considered, are those of the acid-production out of carbohydrates, the behaviour toward serological reactions and the power of producing toxin (virulence). As long as there has been difference of opinion as regards the identity of the diphtheria bacillus the production of acid has played its part. Now ordinary broth was used, then again different carbohydrates were added, in most cases glucose-broth was employed. Some thought the acidproduction to be of difïerential-diagnostical value, others looked upon the amount of acid produced as a thing of great importance. Of late little attention has been paid to the results obtained by this method, only recently Miss VAN RiEMSDIJK in the »Centrallblatt für Bakteriologie« brought the acidproduction out of glucose into prominence again. For this examination she made a good simplification of the culture-medium by using a pepton- solution and adding glucose and litmus. She looks upon this qualititive reaction as an important diagnosticum for the diffe- rentiating of diphtheria and pseudo-diphtheria. It seemed very important to me, to investigate if by this method it would be easy to sort out our practical material. I expected that all diphtheria bacilli we diagnosed would produce acid in this medium. Miss Smit was so kind as to examine one hundred pure cultures, isolated by her without making any choice whatever. Under these lOO strains only one did not produce acid and this was a bacillus, which looked suspicious by the the routine examination too. For the working out of our practical material the acid-pro- duction does not give information of practical importance, so that I have not been able to find a reason why to extend our daily examination in this way. Against the drawback of the decision being delayed for one, or as a rule for more days, there is to my mind no sufficient advantage. In the second place I mentioned the serological reactions, which might be useful to the extension of the working-methods. From what has been said above it may be concluded, that in my opinion none of these reactions give sufficiently reliable 206 information to be used in the daily routine work of a practical laboratory. It is probable however that the agglutination-test may prove to be of great value for the diphtheria diagnosis. Much longer I should like to dwell on what was mentioned in the third place, namely the estimation of the virulence. For this purpose guinea-pigs are generally employed. A certain quantity of a toxin-containing medium is injected subcutaneously or a small portion of the culture is inoculated cutaneously. In the first case we try to give such a quantity of toxin that the animal is killed within a few days and on obduction the charteracistic symptoms of diphtheria-death are looked for, namely subcutaneous oedema at the seat of the inoculation, a serous exsudate in the pleural cavity and pericardium and enlargement with strong hyperaemia of the suprarenal glands. By the cutané inoculation we intend to get a local reaction, which presents itself at first as an infiltration, afterwards as a necrosis of the skin. As I noticed before the simultaneous inoculation of a control guinea-pig, having recieved a dose of antitoxin, may greatly increase the importance of a positive result. Let me now give an outline of the course which is followed by the method of such a virulence-estimation. Of a small portion of the mucous membrane of throat or nose a little of the secretion-product is taken, this is rubbed over the surface of a culture-medium, hoping that every bacterium present will form a separate colony and if necessary, culturing is repeated on a new medium till we reach our end. Thus we go out for our further investigations if possible from one or otherwise from a few bacilli. Of the descendents of this bacillus we want to make sure whether any toxin is formed or not. It is kwown however, that the toxinproduction is dependent on various circumstances, e. g. the composition of the medium, the length of growth, the temperature etc. By the estimation of the pathogenicity, as far as the practical side is concerned, no attention can be paid to these matters without making the experiment too extensive. In all cases one fixed scheme has to be followed. This takes place either by inoculation directly from a serum-culture as soon as a pure culture is obtained, or by inoculating after the bacteria have grown for a certain time, fixed for all cases, in some liquid medium. Now we al- 207 ways inject the animal with the same quantity of material and read of the result after a certain time, fixed in advance. If the virulence-estimation has a positive result we will probably not be far from the truth if we infer that the microorga- nism is a diphtheria bacillus, wich may produce a toxin also harmful to man. The same cannot be said of a negative result. As we have selected one or a few bacilli among millions and millions from one part of the mucous membrane of the throat, as we have cultivated it after à fixed schema and inocu- lated it on a guinea-pig, and as we now find that after a certain time the animal shows no signs of disease, we conclude, that in the throat of the person examined no diphtheria bacilli are to be found, which may produce by growth on a human mucous membrane a toxin, which may be harmful to man. This conclusion rests after all on too weak a basis even for praxis. What if we had altered the scheme a little? It we had swabbed another part of the throat, or selected another bacte- rium for further cultivation or if we had given it another medium for the toxinproduction and prolonged the time of the growth a little or injected a larger quantity and observed the guinea-pig a little longer? Might not the result have been different? And above all we have to bear in mind, that a guinea-pig cannot be compared in every way to man. .\ bacillus, which may be quite harmless to a cavia, may surely be patho- genic to man ; the following experience may illustrate this. In October 1914 a few soldiers in the south of our country got angina with membrane-formation and a few days slight raise of temperature. The medical man thought it diphtheria and material was sent to us. We found bacteria in it, which were positively diagnosed by us as real diphtheria bacilli. A small epidemic of angina arose among these soldiers ; persons in the same lodgings, or who came in some other way in closer contact, infected each other and in all 15 had to be taken to the infirmary with throataffections. Some of them were scarcely ill, others had distinct membranes in their throat and with the great majority diphtheria bacilli could be diagnosed. Of a great many we isolated a pure culture and it was tried in every way to get a toxin harmful to guinea-pigs. We were not successful however, neither by subcutaneous nor by 208 cutaneous inoculation Our cultures proved non -pathogenic for guinea-pigs. Now we had to do here with a small epidemic of throataffections, which resemble diphtheria clinically ; the infection passes from one person to another, but the virus is not very virulent to man. In most cases bacilli are isolated from the throat, be- having in every way like diphtheria bacilli, also as regards the acid-production, but non-virulent to guinea-pigs. Now what had we got here? I should like to say a diphtheria bacillus slightly pathogenic to man and non-pathogenic to guinea-pigs. To diagnose here that it were no diphtheria bacilli because the guinea-pigs remained healthy seems to me too theoretical. It will be undertood now, that the absence of virulence for guinea-pigs is not always easy to demonstrate and that a negative result does not always prove a valuable help to iden- tify the bacteria found. And above all if we think, that we obtain these results only after several days, it will be clear that not too much attention should be paid to the estimation of the virulence for the practical diphtheria-diagnosis. On reading all this one may get the impression, that the bacteriological diagnosis of diphtheria seems to be rather a desperate thing. But as a rule this is not the case, as may appear from the following lines. We shall have to draw a sharp line as to what is intended at with the examination. There is namely a great difference whether we get material for examination from diseased persons, convalescents or healthy individuals. If a person is attacked by an affection of some mucous membrane, which makes the general practitioner think of diph- theria and if the doctor sends material for examination, the diagnosis hardly ever affords many difficulties. If the method, used in this laboratory is applied and if within 24 hours bacilli are found, which are considered to be diphtheria bacilli and if on account of this state of affairs and of the clinical observations diphtheria is diagnosed, the chance of making a mistake is exceedingly small. The same cannot be said of a negative result of the bacterio- logical examination ; here we must bear in mind the possibility of the material not being taken from the right place or desin- 209 fectants being present in the throat or also of course the possibillity of diphtheria bacilli being overlooked by the laboratorium-examination. A repetition of the examination is desirable in such cases and as a rule will make the continued clinical observation correspond with the bacteriological exami- nation. The great difficulties of the bacteriological diphtheria diagnosis must not be looked for here. Secondly the question is raised daily, if in the throat or nose of a person, who has suffered from diphtheria, diphtheria bacilli are still present. This may be the case a long time, but it would not be right to think that it is the rule. In the larger majority of cases the bacilli are not to be found any more soon after the clinical recovery. Then we get rather a large group of individuals, with whom one or two weeks after the recovery diphtheria bacilli can still be demonstrated, and there only remains a small minority, with which after the time mentioned diphtheria bacilli can still be diagnosed. If an individual had a clinically and bacteriologically diagnosed diphtheria and if a short time after his clinical recovery bacteria are still found, which according to our examination have to be identified as diphtheria bacilli, we may diagnose without making too great a mistake, that they are in reality diphtheria bacilli. Here also the diphtheria-examiner is not running too great a risk. If the time during which the bacilli are still found, gets extraordinarly long and the difficulties caused by the measures which have to be taken, gets greater, the time has come to consider if the diagnosis of diphtheria is perhaps wrongly made and so we get here a material, exceedingly fit for elaboration in the smallest details of the methods of the bacteriological diphtheria diagnosis. In this case there is no reason for special hurry, because it does not matter very much, if the examination takes a few days longer. We perform these continued examinations repeatedly, mostly at the request of an impatient doctor'. We mostly find then that the bacilli present answered to the greatest demands, which we may put to a diphtheria bacillus and mostly they are also virulent to guinea-pigs. As so many others we have 2IO been able to isolate from the throat of recovered diphtheria patients bacilli, which were very virulent to guinea-pigs even after many months. So at the control-examination of convalescents the necessity of extension of the routine work is only felt as an exception. Now I have come to the most difficult part of the diphtheria examination, namely the searching for diphtheria bacilli in nose or throat of healthy individuals. In recent years a material extending over many thousand persons had to be examined in our laboratory in order te to discover diphtheria-carriers. It is my experience that the presence of bacilli in throat or nose, which we must consider as diphtheria bacilli, does not occur to so alarming a degree as some wanted to make us believe. It is not exceptional that we find at a school-examination, extending over many a hundred of children, only a few diphtheria-carriers. The search for diphtheria-carriers may often be very useful and very well practicable. For instance this was the case with an examination made last summer in a holiday-home (»Vacan- tie-kolonie«). A case of clinically and bacteriologically true diphtheria occurred there, while some other children had slight alïections of the throat. Now here the search for carriers seemed to be in the right place ; it only concerned a small number — 40 à 50 — the isolation of those individuals by whom the result was positive, was easily practicable and the danger of spreading the infection was very great. Now by this examination a number of slightly affected and perfectly normal bacilli-carriers were actually found, that is to say that they were diagnosed as positive by the quick method used by us for the discovery of diphteria bacilli. Here also the examination had to be made quickly, a too scrupulous weighing again and again of the diagnosis would have rendered the useful result very problematic and therefore we used in this also case the ordinary investigation methods. In some cases arbitrary chosen we finished the examination to the end and by this was shown, that the isolated microorganisms were really typical diphtheria bacilli virulent to guinea-pigs. Let us contrast to this example of a useful examination for diphtheria-carriers an unuseful one. In a village there is much 211 diphtheria and consequently also among the schoolchildren. The schools are closed and now by the reopening of the schools no children are admitted unless they are free from diphtheria bacilli; therefore all the schoolchildren have to be examined and if possible all looo together and if not then 250 daily. It is rightly observed, that if it is not finished at once, there may be a chance of the child being infected afterwards and therefore the examination would be of no use ; but the impos- sibility of doing such a huge investigation with due accuracy is not thought of. There are too many sources of mistakes on the long way between the throat of the person examined and the microscope of the bacteriologist. In the searching for diphtheria-carriers we miss the impor- tant help of the clinicus for making our diagnosis ; only in these cases, where a close contact has existed between the persons examined and a diphtheria-patient we get an indication which may be of some use to us. In other cases we are referred to the bacteriological examination only. Moreover this examination has to be done as soon as possible, for only by quick decision some succès of the measures taken may be expected. Therefore we are exposed at such examinations to far greater mistakes than at those of patients or convalescents. Only under special circumstances we may get any results valuable for the practical hygiene. As such favourable circum- stances may be mentioned : a small number of persons living in close contact with each other, provided that sufficient isola- tion of the individuals, diagnosed as carriers, is possible. Further it will be a great benefit to the result, if the regulation of the examination on the spot and the laboratory-work are in one hand or take place in mutual consultation. Under these favourable circumstances the examination of the childeren of one or two classes of a school may sometimes give useful results. The examination on a large scale of a whole school-population or of every schoolchild in a small town, is ■ not practicable in such a way, that the results can serve a? a foundation for practical hygienic measures. The trouble, which is caused and the work that has to be done, are certainly not in accordance to the results obtained. BACTERIUM (PROTEUS) ANINDOLOQENES N. SP. PAR J. J. VAN LOGHEM, — Amsterdam. En étudiant les urines d'un malade pneumaturique j'isolai i) — il y a dix ans — un bacille qui montre une forte ressemblance avec le bacille de Hauser (Bacterium vulgare Hauser): un bâtonnet mobile, liquéfiant rapidement la gélatine, faisant fer- menter des sucres, etc., et donnant une coloration rouge-vineux dans les cultures peptoniseés, aux quelles on a ajouté de l'acide sulfurique pur et de la nitrite de potassium (réaction de l'indol de Salkowski). Steensma 2) démontra que cette matière colorée n'était nullement identique au nitrosindol ; alors qu'on peut distiller l'indol, la substance-mère de la matière rouge de notre bacille ne quitte pas le milieu peptonisé, soumis à la distillation. Cette différence entre le bacterium (Proteus) vulgare et notre bacille s'est montrée d'une constance absolue. Les cultures de ce dernier en solution de peptone WiTTE donnent jusqu'aujourdhui une réaction forte de SalKOWSKI, tandis que les autres réactions de l'indol restent négatives. Notre nouveau bacille-Proteus est alors incapable de séparer l'indol de la peptone, par conséquent j'ai proposé de le considérer comme une espèce nouvelle sous le nom Bacterium (Proteus) anindologenes. Depuis on a rencontré plusieurs représentants de notre nou- velle espèce. J'ai pu isoler une deuxième culture du B. anindologenes du pus d'un abcès de la paroi abdominale d'un malade, soigné en 190G dans la clinique du Professeur RuiTINGA ; cet abcès provenait probablement de l'intestin. Aucune difïérence n'a pu être constatée entre le bacille du pus et celui de l'urine du malade pneumaturique ; ses cultures en milieu peptonisé donnaient la même pseudoréaction de 213 SalkowSKI et, ce qui était important : un sérum de lapin immunisé contre le bacille de l' urine agglutinait aussi le bacille du pus. Pendant notre séjour à Sumatra, ma femme et moi avons fait des recherches spéciales sur la fréquence du bacterium anindologenes 3). Sur 30 »bacilles-Proteus«, isolés du contenu de l'intestin humain, 27 donnaient les réactions de l'indol, et 3 la pseudoréaction de SalkowSKI. Ces trois derniers nous les avons examinés aussi au point de vue sérologique et comparés avec le bacille pneumaturique et des proteus indologènes. Nous avons immunisé des lapins contre nos bacilles »anindologenes«, et d'autres lapins contre les vrais Proteus Hauseri et nous avons examiné le pouvoir agglutinant des serums de tous ces lapins vis-à-vis des différents bacilles. Les résultats de ces expériences n'étaient pas douteux ; les »serums anindologenes« agglutinaient tous les quatre représen- tants de notre nouvelle espèce sans aucune influence spécifique sur des bacilles indologènes, tandis que toute action spécifique des > serums indologènes« vis-à-vis des bacilles anindologenes était absente (v. table !). Récemment M. BAUDET 4) a publié un mémoire sur les réactions de l'indol dans lequel il annonce avoir isolé à Leyde de nouveau trois bacilles proteus anindologenes, donnant la pseudoréaction de SalKOWSKI. Une des cultures provenait du pus d'un empyème, les deux autres furent isolés des urines. M. BAUDET a eu la bienveil- lance de mettre ces cultures à notre disposition. Au point de vue morphologique et biochimique (v. table II) les trois cultures isolées à Leyde se montrent identiques aux bacilles isolés autrefois à Amsterdam et aux Indes Néerlan- daises ; cependant, je n'ai pas réussi à démontrer directement leur identité mutuelle par les méthodes sérologiques. Des serums agglutinants, préparés avec un des bacilles de 15 214 M. Baudet, donnaient des réactions spécifiques avec les deux autres, isolés par ce bactériologiste ; leur identité mutuelle est donc hors de doute. Ces serums n'ont en général pas d'action agglutinante sur le bacille isolé autrefois par moi dans le cas de Pneumaturie (v. table III). Pas contre, un sérum préparé avec le bacille »pneumaturique« est négatif vis à vis les trois bacilles de Leyde (v. table IV). Seulement en certaines expériences avec des serums de lapins qui ont été injectés plusieurs fois on peut coyistater de la coagglutination (v. table V). Les mêmes expériences ont été répétées selon la méthode Bordet-Gengou. Un sérum, préparé vis à vis un des bacilles de Leyde, et laissé en contact avec des suspensions de ces bacilles, dévie le complément de cobaye, tandis que le complément n'est pas dévié si ce sérum est mélangé avec le bacille pneumaturique. Le même résultat négatif était obtenu en mélangeant un sérum pneumaturique avec les bacilles de Leyde. En résumant nous pouvons conclure que parmi les différentes espèces du groupe- »Proteus« il y a au moins une espèce qui se distingue des autres par l'impuissance de produire de l'indol en milieu peptonisé. Dans le milieu peptonisé on constate la présence d'une matière qui donne une coloration rouge-vineux (un peu plus rouge que le nitrosindol) avec l'acide nitrique et la nitrite de potassium (Steensma). Jusqu'ici des bacilles »anindologènes« ont été isolés huit fois : I. (Jrines d'un malade pneumaturique (Amsterdam). II. Pus d'un abcès de la paroi abdominale (Amsterdam). III. \ IV. > Contenu de l'intestin humain (Sumatra). V.) VI. / ,,j. > Urines de deux malades (Leyde). VIII. Pus d'un empyème (Leyde). I, II, III, IV et V se sont montrés identiques par la méthode de l'agglutination. 215 L'identité de VI, VII et VIII a été prouvée de la même manière et par la méthode Bordet-Gengou. La preuve sérologique de l'identité mutuelle de tous ces bacilles anindologènes n'est pas donnée ; en certaines expérien- ces seulement nous avons constaté de la coagglutination. Il me semble que ces résultats plutôt négatifs ne justifient pas encore la séparation des deux groupes de bacilles, isolés à Amsterdam-Sumatra et à Leyde. Ils existent dans la micro- biologie plusieurs faits qui prouvent que la sérologie n'est pas toujours capable de déterminer à quelle espèce un microbe quelconque appartient. Nous savons seulement que deux bacilles qui sont influencés de la même manière par le même sérum sont apparentés, souvent identiques; le résultat négatif de l'expérience sérologique ne justifie pas des conclusions si décisives. Il est nécessaire que nous disposions d'un grand nombre de »Proteus anindologènes« avant de pouvoir formuler une opinion plus précise sur l'identité des bacilles décrits ci-dessus. Provisoirement je propose de les considérer tous comme des représentants de la même espèce : Bacterium (Proteus) anin- dologènes. Tout récemment Berthelot 5) a publié la première partie de ses recherches sur un grand nombre de bacilles-proteus, qui preuvent que des bacilles »non-indologènes« isolés par cet auteur sont capables de produire de l'indol dans un milieu contenant du tryptophane. M. Berthelot n'a pas expérimenté avec les bacilles non indo- logènes isolés par nous, de sorte que nous ne savons pas si les bacilles examinés par lui sont identiques aux nôtres. C'est inutile alors de répondre en détail aux amples considérations de cet auteur qui l'amènent à la conclusion que »l'espèce Proteus anindologènes VAN Loghem n'a aucune raison d'être«. Les recherches de M. BERTHELOT ne changent rien au fait que notre bacille diffère du vrai Bacterium (Proteus) vulgare par l'impuissance de produire de l'indol en milieu peptonisé et qu'il y forme une substance qui donne une coloration rouge avec de l'acide sulfurique et de la nitrite. 2l6 Cette double propriété est tellement caractéristique et constante qu'il est impossible de l'ignorer; il ne peut être question qu'il s'agit ici de la variation d'une propriété biochimique comme M. BerthelOT le prétend. Au point de vue biologique nous considérons l'impuissance constante de notre bacille anindologène de séparer de l'indol de cet »édifice moléculaire très complexe« : la peptone, comme beaucoup plus importante que le fait qu'on peut trouver de temps en temps de l'indol dans des cultures qui contenaient d'avance déjà le tryptophane ou d'autres substances peu complexes i). Mars 1915. BIBLIOGRAPHIE. 1. J. J. VAN LoGHEM, Centralbl. f. Bakteriologie. Abt. I. Orig. Bnd. 38, 1905. S. 425. 2. F. A. Steensma, Centralbl. f. Bakteriologie. Abt. I. Orig. Bnd. 41, 1906. S. 295. 3. J. J. VAN LOGHEM Und J. C. W. VAN LoGHEM-Pouw, ibid. Bnd. 66., 1912. S. 19, 4. E. A. R. F. Baudet, Folia microbiologica. T. II, 1913 p. 261 5. A. Berthelot, Annales de l'Institut Pasteur, 1914, sept.-octobre. ^) Ce dernier point sera examiné de plus près par M. Steensma ; c'est donc a sa prochaine publication que je renvoie le lecteur. 217 TABLE I. Pouvoir agglutinant d'un sérum anindologène vis à vis des bacilles anindologènes et indologènes. Contrôle Dilutions. SO lOO 250 1000 B. proteus anindologènes V.C. l6 — clar. clar. clar. (clar.) » » » V.C. 8 — + + + + + + + + + + + » » » L.D. 2 — clar. clar. clar. + + + » » » Pneumaturie. — clar. clar. clar. + + + B. proteus indologènes V.C. 2 _ » » » V.C. 4 — + + — » » » V.C. 6 — — — » » » V.C. 12 — — — . » » » V.C. 13 — — — » » » V.C. 14 — — — — i » > V.C. 23 — — — » » » Pol. — — — — — — , réaction négative. -f i réaction très faible. + + +, ++ réaction plus au moins forte, sans clarification complète. clar. (clar.) clarification complète on presque complète. TABLE n. Morphologie et biochimie du Bacterium anindologènes. Cas de pneu- Abcès paioi abdom. Sumatra intestin humain. Leydc (Baudet). urines I. urines II. empyème Bâtonnet mobilité Gram aérob. facult . . . , liquéf. gélatine . , indol (distill.) . . , pseudoindol (Salkowski) glycose lactose saccharose mannite Petruschky pomme de terre.. Hémolysines . . , . + + 1\ + + + + gaz + 2) brunâtre + + + + + + + gaz + + + + + + gaz + + gaz , + gaz + + + + + + + + gaz brunâtre + + + + + + + gaz + ^) brunâtre + + + + + + gaz brunâtre + ^) Dans les cultures très jeunes on peut observer des bacilles qui prennent plus ou moins le Gram. 2) D'abord rouge, après quelques jours bleu. 2l8 TABLE III. Pouvoir agglutinant d'un sérum ') anindologène (Leyde Urines I) vis à vis les trois bacilles anindologènes de Leyde, le bacille Pneumaturie et un Proteus indologène. Con- trôle. Dilutions. 50 100 500 1000 B. proteiis anindologènes, Leyde Urines I. » » » » » II. » » » » Empyeme. » » » Pneumaturie. » » indologenes (Hauser). — (clar.) + + + + + + + + + + (clar.) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ') Le lapin a été injecté deux fois. TABLE IV. Pouvoir agglutinant d'un sérum ^) anindologène (Pneumaturie) vis à vis le bacille Pneumaturie, les trois b. anindologènes de Leyde et un Proteus indologène. Con- trôle. Dilutions. 50 100 j 500 B. proteus anindologènes Pneumaturie. » » » Leyde Urines I. » » » » » II. » » » » Empyeme. » » indologenes (Hauser. — + + + + + + + + + + + + + ^) Le lapin a été injecté deux fois. TABLE V. Sérum du même lapin de l'expérience Table IV, après 4 injections. Con- trôle. 50 500 1000 B. proteus anindologènes Pneumaturie. » Leyde Urines I. » » » II. » » Empyeme, indologenes (Hauser). (clar.) + + + (clar.) + + + + + + + + + + + + + + ni 219 TABLE VI. Déviation du complément dans les mélanges d'un sérum anindologène Leyde (Urines 11), d'un sérum anindologène pneumaturique et d'un sérum normal, avec le bacille Proteus pneumaturique, les bacilles anlndologènes de Leyde et un proteus indologène (Häuser). */^ c. c. sérum anindologène (Leyde Urines II) avec ICC suspension pendant i heure à 37" C. '^1^ c c sérum anindologène (Pneumaturie) avec ICC suspension pendant i heure à 37° C. ^j^ C C sérum normal avec ICC suspension pendant i heure à 37° C, B. auijjdologenes Urines I. » » » II. » » Empyeme. » » Pneumaturie. » indologenes (Hauser). B. anindologenes Urines I. » » » II. » » Empyeme. » » Pneumaturie, » indologenes (Hauser). B. anindologenes Urines I. » II. Empyeme. Pneumaturie. » indologenes (Hauser). Quantité du complément (sérum de cobaye i : 12). /a ce i c c D D D D D D + + + + + + (+) + + + + + (D) + + + ( + ) + ( + ) + + + + + D = déviation du complément = pas d'hémolyse après avoir ajouté le système hémolytique (chèvre-lapin). -f = pas de déviation (hémolyse). Il suffit de placer les tubes pendant une ^/g heure dans l'étuve, et après dans la glacière, pous éviter l'action hémolytique des bacilles. [Aus dem pathologischen Institut der Reichstierarzneischule zu Utrecht. Direktor: Dr. H. Markus]. BEITRAG ZUR WERTBESTIMMUNG DER TUBERKULINPROBE BEIM HUHN NACH VAN ES UND SCHALK VON Dr. H. SCHORNAGEL, Prosektor am Institut. Die Vogeltuberkulose ist bekanntlich eine sehr verbreitete Krankheit, welche speziell unter den Hühnern grosse Verluste verursachen kann. Zur Bekämpfung dieser Krankheit ist es in erster Linie notwendig, dieselbe möglichst früh zu erkennen. Es ist eine ziemlich leichte Aufgabe das Vorkommen chronischer Tuberkulose in einem Hühnerbestand zu diagnostisieren. Wenn die Tiere nach längerem Siechtum, unter Abmagerung das Eine nach dem Anderen sterben, kann man mit grosser Gewissheit die Diagnose Tuberkulose stellen ; besonders sei auch hinge- wiesen auf die Vergrösserung der Lymphknoten am kaudalen Ende des Halses, welche beim lebenden Tiere deutlich wahrnehm- bar ist. Die Sektion der gestorbenen Tiere bestätigt die Diagnose. Auch kann man, bei der geringen Wert des Einzeltieres ein verdächtiges Huhn töten und obduzieren. Ist die Tuberkulose also leicht zu erkennen bei schwerkranken und toten Tieren, unmöglich war dies bis vor kurzem bei Hühnern mit geringen Läsionen. Bei Versuchen zur Ausrottung der Krankheit kann man alle Tiere töten und Ställe und Hof desinfizieren, und dann wieder neue gesunde Tiere ankaufen, oder man tötet nur die kranken Tiere und lässt die übrigen, anscheinend gesunden Hühner in den desinfizierten Ställen. Sollen diese Massregeln Erfolg haben, so muss man ganz bestimmt sicher davon sein, dass unter den neuangekauften oder den am Leben gelassenen Tieren kein einziges, auch nur im 221 geringsten Grade, an Tuberkulose leidet ; ist dies doch der Fall, so kann man nach kurzer Zeit wieder aufs Neue anfangen. Es ist selbstverständlich, dass kurz nach der Einführung des Tuberkulins als Diagnostikum, ihre diagnostische Wert auch bei Vögeln geprüft worden ist. Mehrere Untersucher haben das Tuberkulin, bereitet von Tuberkelbazillenkulturen verschiedener Herkunft, auf den bekannten Weisen angewandt, subkutan, kutan und konjunktival, die Versuche schlugen alle fehl. Aus diesem Grunde schrieb Klimmer i) im Jahre igii : »Ist Tuberculose »in einen Geflügelbestand eingeschleppt, so bleibt zur sicheren »Tilgung, da eine exakte Erkennung der bereits Erkrankten »von den Gesunden nicht möglich und somit eine erfolgreiche »Absonderung ausgeschlossen ist, nichts anderes übrig, als den »ganzen verseuchten Bestand abzuschlachten und die Ställe, »Gerätschaften, und den Geflügelhof zu reinigen und zu »desinfizieren«. Im April 19 14 erschien ein »Bulletin of the North Dakota Agricultural Experiment Station« von L. VAN Es und A. F. Schalk über »Vogeltuberkulose« 2). In dieser Arbeit beschrei- ben die Autoren ihre Versuche über die Anwendung von aus V o g e Ituberkelbazillenkulturen bereitetes Tuberkulin bei Vögeln. Bekannt mit den Misserfolgen der obengenannten Methoden haben v. E. und S. die intrakutane Methode von MOUSSU und Mantoux 3) angewandt, und mit sehr guten Resultaten. Als Injektionsstellen sind Kehllappen und Kamm gewählt, weil die Haut an diesen Stellen nicht so äusserst dünn ist, als die befiederte Haut. Die Resultate von den Versuchen von v. E. und S. waren folgende : Anzahl der Tuberkulinproben 601. » der sezierten Hühner 227. » der sezierten Hühner mit Tuberkulose 125. Tuberkulöse Hühner mit positiver Reaktion 88 (97.77 "/o) Gesunde Hühner » » » 2 ( 2.23 o/o) Gesunde Hühner mit negativer Reaktion 120 (91.53 % ) Tuberkulöse Hühner » » » 10 ( 8.47 %) 222 Gesunde Hühner mit zweifelhafter Reaktion 30 (52.64 0 0) Tuberkulöse Hühner » » y> 2-] (47.36 o/^) Als im August 19 14 eines der Versuchshühner dieses Insti- tutes an spontaner Tuberkulose starb, Avar dies für mich An lass die Methode von v. E. und S. bei den 10 übrigen, scheinbar gesunden Tieren anzuwenden. Von diesen Tieren zeigten die Nummer 5, 6 und 7 eine positive und No. 8 eine zweifelhafte Reaktion 1). Da diese Versuche gerade in den Ferien statt- fanden habe ich die vier reagierenden Tiere nicht getötet, sondern isoliert und die Probe nach einigen Monaten wiederholt. Ich gebe hier die Beschreibung der zweiten Versuchsreihe ; ich habe hierbei den Angaben von v. E. und S. gefolgt. Beim ersten Versuch habe ich einige Tiere im Kehllappen, andere im Kamme injiziert, die letzte Stelle gefiel mir gar nicht ; erstens ist die Ausführung technisch viel schwerer, zweitens ist die Beurteilung, besonders bei platten Kämmen mit ihrer unregelmässigen Form, nicht so leicht. Die Injektion an einen Kehl- lappen hat noch den Vorteil, dass man den Verlauf der Reaktion vergleichen kann mit dem anderen, nicht injizierten Lappen. Statt 50 0/0 Vogeltuberkulin benutzte ich Roh-Tuberkulin. Das Tuberkulin stammte, weil momentan kein im hiesigen Institute bereitetes Vogeltuberkulin vorhanden war, in beiden Versuchsreihen vom Reichsseruminstitut zu Rotterdam. Zur Injektion benutze man eine kleine Rekordspritze und möglichst feine Hohlnadeln. Die Epidermis der Vogelhaut ist durchwegs dünn, zart und schichtenarm ; die Dicke der Ober- haut steht im umgekehrten Verhältniss zur Dichtigkeit der Befiederung. Man unterscheidet ein Stratum profundum und ein Stratum corneum. Ich fand das Stratum profundum der Brusthaut eines Huhnes nur 2 — 3 Zellschichten dick (kleine runde Zellen), das Stratum corneum war ungefähr zweimal so dick. Beim selben Huhn war das Str. profundum am Kamm und Kehllappen bis zu g Schichten dick, das Str. corneum dagegen nur sehr dünn. Es versteht sich das eine intrakutane Injektion in der nur 2 — 3 Zellschichten dicke Epidermis der befiederten Haut technisch unmögHch ist. Doch kostet es dem Anfänger auch viel Mühe die Nadel in der dickeren, aber doch noch sehr ») Siehe die Tabelle. 223 dünne Oberhaut vom Kehllappen und Kamm so einzustecken, dass die Flüssigkeit gerade in die untersten Schichten der Epider- mis gelangt ; der Umstand dass die Oberhaut der Vögel sehr bröcklig ist, erschwert die Injektion erheblich. Man muss die dünne Nadel fast parallel an der Hautoberfläche einstecken ; empfindet man nun bei der Injektion einen Widerstand und wird die Haut in der Umgebung blass, so ist der Einstich gelungen. Geht die Injektion leicht von Statten, so beweist dies, dass die Flüssigkeit ins Corium oder die Subkutis gelangt und ist der Versuch misslungen ; dies ist ebenfalls der Fall wenn eine Blase entsteht, diese berstet und das Tuberkulin fliesst ab. Es schadet nichts, die Injektion an eine naheliegende Stelle zu wieder- hohlen, der grosse Kehllappen bietet dazu auch Raum genug. Es scheint mir angemessen die Haut vorher mit Alkohol zu desinfizieren. Als Injektionsstelle wähle man die Mitte der äusseren Fläche des linken Kehllappens, weil dies für die Aus- führung die bequemste Stelle ist. Die Menge der injizierten Flüssigkeit ist sehr gering, weniger als ein Tropfen. Die Hühner werden am 2. November 1914, vormittags 11 Uhr injiziert. Huhn Tuberkulin- probe im August '14. Tuberkulinprobe am 2. November 1914, vormittags 11 Uhr. No. 5 St. nach Injekt. 24 St. 48 St. 72 St. nach nach nach Injekt. Injekt. Injekt. 96 St. 120 St. nach nach Injekt. Injekt. Sektionsbefund. I zt. _ _ 1 1 Tubeikulosefrei. 2 ± — — — — » 3 — zt — — — — — » 4 5 + + + + + + + + + + getötet getötet » Tuberkulös. 6 + + + + + + + + + getötet » 7 8 + + ± + + + + + + + + ±: getötet dr » » 9 — — — — — — — Tuberkulosefrei. 10 — — — — — — — Tuberkulös. — Keine Anschwellung. ± Sehr geringe Anschwellung. + Massige Anschwellung. + -f Starke Anschwellung. + + + Sehr starke Anschwellung. 224 5 Stunden nach der Injektion zeigen die Nummer i, 2 und 3 eine geringe örtliche Anschwellung an der Impfstelle ; die Nummer 4) 5» 6, 7 und 8 eine ödematöse Anschwellung des ganzen Kehllappens und die Nummer 9 und 10 gar keine Reaktion. 24 Stunden nach der Injektion ist die Anschwellung der Nummer 1, 2, 3 und 4 kaum merkbar mehr; die Nummer 5, 6, 7 und 8 zeigen eine sehr starke, ödematöse Anschwellung ; der Kehllappen ist sehr viel dicker und länger als der Kontroll-Lappen, dabei ein wenig blässer, die Temperatur des Lappens ist nicht erhöht, das Ganze macht den Eindruck einer mit Flüssigkeit gefüllten Tasche. Die Nummer 9 und 10 zeigen keine Reaktion. Nach 48 Stunden ist die Anschwellung der Nummer 5 und 6 noch eben so stark als am vorigen Tage ; die Anschwellung der Nummer 7 und 8 ist geringer. Behufs mikroskopischer Unter- suchung werden die Nummer 5 und 6 nach 48 Stunden getötet. No. 8 zeigt nach 72 Stunden eine kaum merkbare Anschwellung und wird dann getötet. Die Anschwellung der No. 7 ist nach 96 Stunden verschwunden ; das Tier wird nach 9 Tagen getötet. Die Nummer i, 2, 3 und 4 welche nach 5 Stunden eine geringe, örtliche Anschwellung zeigten, aber nach 24 Stunden und später gar keine, werden resp. 30, 9, 17 und 3 Tage nach der Injektion getötet ; sie sind alle völlig frei von Tuberkulose. No. 9 und 10 haben gar keine Anschwellung gehabt, sie werden resp. nach 35 und 30 Tagen getötet. No. 9 ist tuber- kulosefrei ; No. 10 hat in der Leber zwei stecknadelkopfgrosse, hyaline Knötchen w^elche Tuberkelbazillen enthalten. No. 5 positive Reaktion ; getötet nach 48 Stunden. Sektions- bild : Zwei verkäste Herdchen in den Lungen, viel Tuberkel- bazillen ; ein hyalines Knötchen in der Leber, keine Tuberkel- bazillen ; Halslymphknoten speckig geschwollen, sehr viel Bazillen. No. 6 positive Reaktion; getötet nach 48 Stunden. Sektions- bild: In der nicht vergrösserten Milz ein stecknadelkopfgrosses, verkästes Herdchen mit Tuberkelbazillen ; Halslymphknoten nicht vergrössert, wenig Tuberkelbazillen. (Reaktion: siehe die Photo). No. 7, positive Reaktion ; getötet nach 9 Tagen. Sektionsbild : Sehr vermagert, chronische Tuberkulose von Milz, Leber und Halslymphknoten, zahlreiche Tuberkelbazillen. No. 8 positive Reaktion ; getötet nach 3 Tagen. Sektionsbild : 225 Ein wenig vermagert ; chronische Tuberkulose von Milz, Leber und Halslymphknoten, sehr viel Bazillen. Von allen Hühnern wurden die Organe auf genaueste unter- sucht, und wurden Deckglaspreparate angefertigt nicht nur von verdächtigen Knötchen, sondern auch von Leber, Milz und Nieren, Halslymphknoten und Darmschleim, auch von den gesunden Tieren. Wenn man die sehr geringe Anschwellung einigen Stunden nach der Injektion nicht als eine Reaktion betrachtet, sondern nur die starke Vergrösserung des ganzen Kehllappens welche nach 24 Stunden und später anwesend war, dann haben wir folgende Resultate : Untersuchte Hühner 10 Tuberkulöse Hühner mit positiver Reaktion 4 » » » negativer » i Tuberkulosefreie » » » * 5 » » » positiver » o Von den tuberkulösen, reagierenden Tieren war nur eines sicht- bar krank (no. 7) die anderen waren klinisch vollkommen gesund. Auf 10 Fällen haben wir also i Misserfolg. Das betreffende Tier, ein sehr kräftiger, wohlernährter Hahn, ist erst 30 Tage nach der Tuberkulinprobe getötet worden ; die Tuberkulose war noch sehr jung und geringgradig, sodass die Möglichkeit, ja selbst eine grosse Wahrscheinlichket besteht, dass das Tier nach dem Versuch infiziert worden ist. Aus obigen Versuchen geht hervor, dass die von Van Es und Schalk angegebene Methode ein vorzügliches Diagnostikum und ein kräftiges Hilfsmittel zur Tilgung der Hühnertuberkulose ist ; besonders auch weil die Methode, nach einiger Übung, technisch nicht schwer ist, und die Beobachtung vom Verlauf der Reaktion leicht und schnell geschehen kann. Auch ist die Methode vorzüglich um Versuchshühner auf Tuberkulose zu prüfen ; wo die Spontantuberkulose bei dieser Tierart so häufig vorkommt, ist es natürlich vom grössten Wert ein Mittel zu besitzen die scheinbar gesunden Tieren auf dieser Krankheit untersuchen zu können. Zwar kommen Misserfolge vor, wenn aber von einer Sendung Hühner eines oder mehrere reagieren, sind alle anderen doch verdächtig und jedenfalls für Tuberkulose- 226 versuche nicht zu benutzen. — Auch scheint mir in Fällen wo ein oder mehrere Tiere reagieren eine Wiederhohlung des Versuches nach einiger Zeit sehr empfehlenswert, da die fehler- hafte, negative Reaktion auch durch technische Fehler verursacht sein kann. Mikroskopisch zeigen die geschwollenen Kehllappen ein starkes Ödem, das Bindegewebe ist aufgelockert und zwischen den Fasern findet sich eine teils homogene, teils körnige Masse ; w'eiter sieht man eine starke leukozytäre Infiltration, wobei besonders die eosinophilen Zellen in den Vordergrund treten. Die Blutgefässe zeigen keine Veränderungen ; nur enthalten sie relativ mehr weisse Blutkörperchen als normal. Im Februar 1915. LITERATUR. 1. Handbuch der Serumtherapie und Serumdiagnostik in der Veterinär- Medizin ; herausgegeben von Klimmer und Wolff — Eisner, 1911. S. 169. 2. L. VAN Es und A. F. Schalk, Avian Tuberculosis. Bulletin no. 108 of the North Dakota Agricultural Experiment Station, April 1914. — Ausgebreitete Literatur-verzeichnis. — Eine kürzere Arbeit über denselben Gegenstand von van Es erschien in »Zeitschrift f. Infektionskrankheiten, parasitäre Krankheiten und Hygiene der Haus- tiere, Bnd. XIV, 1913. S. 271«. 3. Bulletin de la Soc. centrale de médecine vétérinaire, T. 85. 1908. pag. 500. TAFEL XVII. Folia Microbiologica III. (.Schornagel.) Positive Real^tion; starke Anschwellung des linken Kehllappens 48 Stunden nach der Injektion. (Huhn n«. 6). [Aus dem Institut für Bakteriologie und Hygiène der Universität Groningen] UEBER DIE KULTIVIERBARE BAKTERIENMENQE MENSCHLICHER FÄZES VON J. IDZERDA Assistenten am Institut. Die Anwendung der mikroskopischen Zählungsmethode von A. Klein i) bei der bakteriologischen Untersuchung der Fäzes normaler, erwachsener Menschen mit gemischter Kost hat ergeben, dass in diesen Fäzes eine weit grössere Bakterienzahl vorhanden ist, als man auf Grund der bisher ausschliesslich benutzten Kulturmethoden annehmen zu dürfen meinte. Andere Untersucher 2)^ die gleichfalls die mikroskopische Zählungs- methode anwendeten, haben diese wichtige Tatsache vollends bestätigt. Auf Grund der angestellten Untersuchungen darf angenommen werden, dass die mittleren Bakterienzahlen, welche man mittels der Kulturmethode gefunden hat, zwischen 100.000 und 800.000, die, welche man mittels der mikroskopischen Zählungsmethode gefunden hat, zwischen 58 Millionen und 375 MilHonen, per mg frische Fäzes schwanken ^). Dieser ungeheure Überschuss mikroskopisch zählbarer Bak- terien kann auf verschiedene Weisen erklärt werden : lo Dieser Überschuss mikroskopisch zählbarer Bakterien besteht aus abgestorbenen Individuen ; 20 Diese Bakterien sind in lebendem Zustande in den Fäzes vorhanden, aber sie sind, wenigstens nach den für die 1) A, Klein, Zentralblatt f. Bakt. und Parasitenkunde, Abt. I, Bd. 27. 2) Siehe u. a. jNIacn'eal, Latzer und Kerr. The Journaal of Infectious Disaeses, Vol. 6. ä) A, Klein und F. Visser. Diese Folia, Bd. 2 228 kwantitative Bestimmung gebräuchlichen Methoden nicht kul- tivierbar. Eine dritte Möglichkeit: diese Bakterien sind wohl lebend, und unter gewöhnlichen Umständen auch wohl auf unseren gebräuchlichen Nährböden kultivierbar, aber in den Fäzes in derartig geschwächtem Zustande vorhanden, dass sie sich nicht mehr vermehren können, auch wenn sie unter die allergün- stigsten Lebensbedingungen gebracht werden, kann ausser Betracht bleiben. Bakterien, die sich nicht vermehren können und nur ein latentes Leben führen, können weder in den Fäzes, noch im Darmkanal irgend welche Rolle spielen ; der- gleichen geschwächte Bakterien sind praktisch den abgestor- benen Bakterien gleichzustellen. Die Frage, ob alle oder ein grosser Teil der mikroskopisch zählbaren Bakterien in lebendem Zustande anwesend sind, ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung des Sterili- tätsindex der Fäzes, d. i. der Sterbezahl der in den Fäzes befindlichen Bakterienbevölkerung; diese Sterbezahl ist die Resultante der bakteriziden Prozesse, welche sich im Darm- kanal abspielen. Im voraus ist es schon schwer anzunehmen, dass dieser Überschuss mikroskopisch zählbarer Bakterien sich wohl in den menschlichen Fäzes, nicht aber in unseren künstlichen Nähr- böden vermehren könnten. Ferner hat sich ergeben, dass durchschnittlich ungefähr 50 o/jj der mikroskopisch zählbaren Bakterien, was die Form betrifft, zu der Koligruppe gehört; von diesen 50 0/0 kommt nur eine äusserst kleine P>aktion auf den Platten zur Entwick- lung. Die Bakterien von der Koligruppe sind auf den meisten unserer künstlichen Nährböden sehr leicht kultivierbar, und es liegt also kein einziger Grund vor, dass dieser grosse Über- schuss mikroskopisch wahrnehmbarer koliforme Bakterien keine Kolonien auf unseren Nährböden erzeugen würden, wenn sie lebend wären. Weiter deuten die sogenannten Kadaverformen 1) der Bak- terien, welche zumal in grosser Zahl in den Kaninchenfäzes vorhanden sind (in den menschlichen Fäzes in kleinerer Anzahl) ^) A. Klein, Archiv für Hygiene. Bd. 45. 229 darauf hin, dass wenigstens ein Teil der mikroskopisch zähl- baren Bakterien abgestorben ist. Eine vollständige Ueberein- stimmung zwischen der Anzahl Kadaverformen und der Anzahl mikroskopisch zählbarer Bakterien, auch wenn diese grössten- teils abgestorben sind, kann nicht erwartet werden. Sogleich nach dem Tode der Bakterien wird das Bakterienprotoplasma noch schön gleichmässig tingiert. Erst längere Zeit nach dem Tode trennt sich die chromatische von der achromatischen Substanz des Bakterienprotoplasmas : erstere ist in der Form von einem oder mehreren Körnern angehäuft sichtbar, während dazwischen der Rest des Protoplasmas keinen oder nur wenig von dem Anilijifarbstoff aufnimmt. Noch später haben auch diese Körner das Vermögen verloren, den Farbstoff aufzunehmen, und ist die Bakterie nur noch als ein äusserst leicht gefärbter »Schatten" wahrnehmbar. Diese Kadaverformen sind so fragil, dass sie beim Färben der Präparate nach der KoCHschen Methode (vor- hergehende Trocknung der Präparate) grösstenteils auseinander- fallen und nicht mehr wahrgenommen werden ; bei der An- wendung der mehr schonenden Färbungsmethode nach A, KLEIN i) bleiben sie bestehen. Und schliesslich hat A. Klein 2) auf experimentellem Wege den Beweis geliefert, dass dieser Überschuss mikroskopisch zählbarer Fäzesbakterien auch in den Fäzes selber sich nicht mehr vermehren können. Zu diesem Zwecke wurden die menschlichen Fäzes mit physiologischer Salzlösung verdünnt, um eventuell vorhandene bakterizide Einflüsse zu verringeren, respektive aufzuheben, und bei 37° C. aufgestellt; nach einigen Tagen stimmte die Zunahme der Anzahl mikroskopisch zähl- barer Bakterien genau überein mit der während dieser Zeit erfolgten Zunahme der kultivierbaren Bakterien. Auf der anderen Seite ist es wohl völlig ausgeschlossen, dass es möglich wäre derartigen Lebensbedingungen bei der Kultur auszuwählen, dass alle lebende Bakterien der Fäzes ausnahmslos auf den Platten zur Entwicklung kommen würden. Zahlreiche Bakterienarten sind uns bekannt, welche sich auf unseren gewöhnUchen Nährböden nur schwer oder gar nicht 1) A. Klein, Zentralblatl für Bakt. und Parasitenkunde, Abt. I, Bd. 25. 2) A. Klein, 1. c 16 230 züchten lassen. Es ist aber hier die Frage, ob die Zahl solcher zwar lebenden, aber nicht züchtbaren Bakterien, welche even- tuell in den menschlichen Fäzes vorhanden sind, so gross sein kann, dass diese Anzahl eine mehr oder weniger wichtige Fraktion der mikroskopisch zählbaren Bakterien bildet und also auf die aus dem gegenseitigen Verhältnis zwischen kulti- vierbaren und mikroskopisch zählbaren Bakterien zu ziehenden Schlüsse von merkbarem Einfluss sein könnte. Zu einem der- artigen Einfluss müsste bei dem ungeheuren Überschuss mi- kroskopisch zählbarer Bakterien, welche in den menschlichen Fäzes vorhanden sind, die Zahl solcher lebenden, aber nicht züchtbaren Bakterien wirklich noch sehr gross sein. Zahlreiche Untersucher haben die Kulturverhältnisse für die Bakterien der menschlichen Fäzes auf verschiedene Weisen variiert, um so eine möglichst grosse Anzahl lebende Bakterien hervortreten zu lassen. Es gelang eben nicht aus den Fäzes eine Anzahl Bak- terien zu kultivieren, die mit der mikroskopischen Zahl auch nur einigermassen zu vergleichen wäre. Wohl wurden Difïerenzen angetroffen ; es waren aber im allgemeinen nur Differenzen, wie sie auch bei Kulturplatten gefunden werden, welche unter vollkommen denselben Verhältnissen gezüchtet werden. Nur zwei Untersuchter bilden hiervon eine Ausnahme. MATSUSHITA i) fand in der Regel eine weit grössere Anzahl kultivierbare Bak- terien (in einem Falle sogar i8 Millionen per mgr Fäzes) wenn er einen besonderen Nährboden verwendete, welcher aus Leber oder Leber und Galle (Leber-Agar und Leber-Galle-Agar) ange- fertigt war, wenn er bei 37° C. züchtete, und wenn er unter anaeroben Verhältnissen kultivierte. COHENDY 2) versuchte gleichfalls einen Nährboden herzustellen, welcher möglichst mit dem natürlichen Milieu, worin die Fäzesbakterien leben, über- einstimmte. Er machte eine Bouillon aus der Darmwand, Magenwand und angrenzenden Organen (Leber, Pankreas, u.s.w.) von Hunden, Schafen, Schweinen und Hühnern. Aus einer derartigen Bouillon machte er, nach Zusatz von 0,9 0/0 Glykose, einen Nähragar für die bakteriologische Untersuchung der menschlichen Fäzes. Bei Verwendung dieses Agars bekam er ^) Matsushita, Arichv für Hygiene, Bd. 41. ^) Cohendy, C. r. de la Soc. de Biol., T. 60 et 63. 231 aus menschlichen Fäzes ungefähr 70 Mal mehr Bakterien als auf gewöhnlichem Agar; unter anaeroben Bedingungen fand er 58 — 77 % der Gezamtzahl kultivierbarer Bakterien. Ich habe dieses Problem, der Kontroversen wegen, nochmals eingehend untersucht. Für die Untersuchung wurden gebraucht die frischen Fäzes erwachsener Menschen mit gemischter Kost. Eine gewisse Menge dieser Fäzes (immer mindestens einige Gramme) wurde genau abgewogen und in einem sterilisierten Mörser unter allmählicher Hinzufügung der 20-fachen Menge sterilisierter, physiologischer Kochsalzlösung zu einer Emulsion verrieben. Von dieser Emulsion wurde mittels einer sterilisierten Pipette loccm in einen sterilisierten Kolben mit sterilisierten Porzellan- kügelchen gebracht, und dieser Kolben, nach Hinzufügung von go ccm sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung, während längerer Zeit tüchtig geschüttelt. Von dieser letzteren Emulsion wurden mit einer Platinöse von bekannter Kapazität (3.37 mgr) die Platten gegossen. Für die Herstellung der Agarplatten wurde stets der Inhalt der Platinöse zuerst in ein sterilisiertes Reagenzröhrchen mit 1,5 ccm sterilisierter Salzlösung hinüber gebracht, die Flüssigkeiten gut gemischt, in das Röhrchen der flüssige Agar gegossen, gut geschüttelt, und schliesslich der Inhalt des Röhrchens zu einer Platte ausgegossen. Kultiviert wurde : 1. Auf gewöhnlichem Nähragav bei 37° C. unter aeroben Bedingungen 2. Auf gewöhnlicher Nährgelatine bei 20° C. » » » 3. Auf I %"^§^'^ Glykoseagar bei 37° C. » » » 4. Auf I %-igem » bei 37° C. » anaeroben » 5. Aut I %-iger Glyl^osegelatine bei 20° C. » » » 6. Auf Leber-Galle-Agar( nach Matsushita) bei 37° C. » aeroben » 7. Auf Leberagar ( » » ) bei 37° C. » » » 8. Auf » ( » » ) bei 37° C. » anaeroben » Von den Fäzes wurde zugleich der Gehalt an festem Stoff bestimmt. Die Ergebnisse sind dargestellt in Tabelle I. Die Zahlen beziehen sich stets auf die aus zwei Platten berechnete Durchschnittszahl. Unter aeroben Bedingungen sind die Differenzen zwischen den auf den verwendeten Nährböden gefundenen Bakterienzahlen untereinander nicht grösser als die, welche man auf einem und demselben Nährboden zwischen mehreren von einer Rein- 232 TABELLE L Bakterienzahl durch Kultur gefunden und berechnet auf j mgr. frischen Fäzes. Nr. der Prozent- gehalt fes- ten Stoffes der Fäzes. Kultiviert aerob bei 37' C. auf Kultiviert anaerob bei 37" C. auf Kultiviert aerob bei 20O C. auf Gelatine. Kultiviert anaerob Unter- suchung. Nähr- Agar. Glykose- Agar. Leber- Galle- Agar. Leber- Agar. bei 2o0 C. Glykose- Agar. Leber- Agar. auf Glykose- gelatine. I 25 % 3813 4.216 3.906 4.619 2.294 II 29 % 4-154 5-363 2.251 — 588 — — 620 III 31 % 2-542 6.541 2.852 — 2.418 — 2.604 0 IV 18 % 12.245 12.679 17-503 — 4.712 — 9-548 9-579 V 28 % 216.154 255-750 196.536 — 177-134 — 155.208 28.489 VI 34 % 23.498 11.346 20.770 — 26.412 — 22.894 3.007 VII 26 % 7.192 8.940 5-518 — 4.092 — 8.122 S-878 VIII 30 % 245.830 254.758 213.931 — 24.614 — 302.589 123.504 IX 27 % 159.216 179. 118 166.20S — 102.455 — 184.078 153-225 X 35 % 3-565 4.185 2.988 — 62 — 2.729 1.147 XI 27 % 2.666 4-154 5-394 — 415 — 2.976 818 XII 28 % 18.592 17-233 18.011 — 7-533 — 39-494 13.206 XIII 34 % 99-956 125.887 108.438 — 85.560 — 115-413 64.558 XIV 24 % 30-791 31.620 30.318 33-728 — 28.210 28.334 XV 32 % 5.580 5-404 4.278 5-456 5-332 4-774 3-346 1.480 XVI 25 % 13-392 16.120 21.390 23.312 2.666 5-356 26.102 341 XVII 30 5o 3.286 2.852 1.406 8.184 961 1.054 1.922 806 XVIII 27 % 16.430 16.430 II. 136 14.260 559 2-853 15.292 1.985 XIX 28 % 42.222 39.680 30.814 34.131 28.489 24.025 31.682 30.020 XX 29 % 525-413 508.496 507.501 447.005 31-930 28.703 527-403 394.059 XXI 26 % 2.052 2.133 1.767 2.076 837 775 I.Ol 6 279 kultur von Bakterien hergestellter Platten, antreffen kann i) ; die Nährmedien von MATSUSHITA bieten keinen einzigen Vorteil über den gewöhnlichen Nähragar und den Glykoseagar. Das Kultivieren bei 20° C. (Gelatine) weist ebensowenig einen be- deutenden Unterschied auf gegen das Züchten bei 37° C. Nur beim Kultivieren unter anaeroben Verhältnissen ist die Bakterien- zahl in der Regel kleiner, in vielen Fällen sogar ganz erheblich kleiner, als beim Züchten unter aeroben Bedingungen ; auch hier wies der Leberagar keinen einzigen Vorteil auf über den I %-igen Glykoseagar. Auf i 0/0-iger Glykosegelatine bei 20° C. war die Anzahl unter anaeroben Verhältnissen kultivierter Bak- ^) Hehewerth, Die mikroskopische Zählungsmethode der Bakterien von A. Klein und einige Anwendungen derselben. Inaag. Diss. Amsterdam, 1900 und Archiv für Hygiene, Bd. 39. 233 terien bald grösser, bald kleiner als die, welche gezüchtet war unter anaeroben Bedingungen auf i o/o-igem Glykoseagar bei 37° C. ; aber auch auf der Gelatine unter anaeroben Verhält- nissen blieb die Zahl der Kolonien regelmässig zurück, oft sehr viel zurück, hinter der Kolonienzahl, welche unter aeroben Bedingungen erzielt war, sowohl bei 37° C. wie auf Gelatine bei 20° C. Noch deutlicher treten diese Verhältnisse hervor, wenn man die Durchschnittszahlen von allen verrichteten Bestimmungen betrachtet. TABELLE II. Durchschnittszahlen berechnet aus Tabelle I. Zahl der untersuchten Fäzes. Nährböden. Aerob bei 37* C. Anaerob bei 37" C. Aerob bei 200 C. Anaerob bei 20 0 0. 21 Nähragar 68.599 71-567 65-415 71.016 25.568 9.649 77.928 21 20 Glykoseagar Glykoseagar 21 8 Leber-Galle-Agar Leber-Agar 7 19 20 Leber-Agar Gelatine Glykosegelatiiie 43-361 Die mittleren Bakterienzahlen, welche sowohl bei 37° C als bei 20" C. auf den verschiedenen Nährböden gefunden sind, zeigen eine sehr schöne Übereinstimmung ; nur die Kultur unter anaeroben Verhältnissen bietet weniger günstige Bedingungen für die Entwicklung der Fäzesbakterien. Man hat nicht das Recht die Anzahlen unter aeroben und anaeroben Verhältnissen kultivierter Bakterien zusammenzufügen, und diese Zahl als die Gesamtzahl der aus den Fäzes gezüchteten Bakterien anzugeben, so lange nicht der Nachweis geführt ist, dass die unter anaeroben Bedingungen kultivierten Platten andere Bak- terienarten gewähren als die unter aeroben Verhältnissen kulti- vierten. COHENDY >) berechnet, dass durchschnittlich 58 — 76 ^j^ der aus den menschlichen Fäzes kultivierbaren Bakterien aus anaeroben Bakterien bestehen ; der Rest wird von fakultativ 1) COHENDY, 1. C. 2j INIaTSUSHITA, 1. C. 234 anaeroben Bakterien gebildet. Ganz willkürlich nimmt COHENDY hierbei an, dass die unter anaeroben Bedingungen kultivierten Bakterien auch obligat anaerobe Bakterien sind, welche auf den aeroben Platten nicht wachsen. Die Sache verhält sich aber ganz anders. Auf den unter anaeroben Verhältnissen kultivierten Platten wachsen gleichfalls die fakultativ anaeroben Bakterien, welche auch auf den aeroben Platten mitgezählt werden. Um mich hiervon zu überzeugen, habe ich von einigen, unter anaeroben Bedingungen entwickelten Platten, eine grosse Anzahl verschiedene Kolonien abgeimpft, und untersucht zu welcher Gruppe von Bakterien sie gerechnet werden mussten. Ohne Ausnahme gediehen die isolierten Bakterien- arten, obgleich sie von anaeroben Platten herstammten, weit besser unter aeroben Verhältnissen als unter anaeroben ; bei näherer Untersuchung zeigte sich, dass alle isolierten Kolonien Koli- oder koliforme Bakterien w^aren. Die unter anaeroben Verhältnissen kultivierten Bakterien bestehen mithin zum weitaus grössten Teil aus fakultativ anaeroben Kolibakterien, welche also auch auf den aeroben Platten gefunden werden. In die- sem Zusammenhang erklärt es sich auch, dass MATSUSHITA, obgleich er in der Regel auf seinen anaeroben Platten weit mehr Kolonien zählen konnte als auf seinen aeroben, unter den 44 verschiedenen Bakterienarten, welche er bei seinen Unter- suchungen aus den menschlichen Fäzes isoliert hat, keine einzige obligat anaerobe Art erwähnt. Hiermit ist aber durchaus nicht gesagt, dass in den Fäzes normaler, erwachsener Menschen mit gemischter Nahrung obligat anaerobe Bakterien gänzlich fehlen würden ; im Gegenteil, durch bestimmtes Anreicherungsverfahren gelingt es regelmässig die- selben in den Fäzes nachzuweisen. Die Plattenkultur unter anaeroben Verhältnissen wird aber nur selten zu der Isolierung obligat anaerober Bakterien führen können, weil die Anzahl dieser Bakterien in den menschlichen Fäzes so ausserordentlich gering ist; die kleine Zahl dieser Bakterien kann der Anzahl unter aeroben Bedingungen kultivierter Bakterien gegenüber, völlig vernachlässigt werden. Von den untersuchten Fäzes habe ich überdies noch die Anzahl unter anaeroben und aeroben Verhältnissen kultivierbare Dauerformen der Bakterien bestimmt. Zu diesem Zweck wurde 235 ein Teil der zweiten Fäzesverdünnung während lo Min. bei 80° C. erwärmt und jedesmal mit 2 ccm dieser erwärmten Verdünnung Platten gegossen. Die Sporen wurden kultiviert auf : i". I %-igem Glykoseagar bei 37° C. unter anaerobeu Bedingungen. 2°. I %-iger Glykosegelatine » 20° C. » » » 3". Gewöhnlichem Nähragar » 37° C. » aeroben » 4". Gewöhnlicher Nährgelatine » 20° C. » » » Die Resultate dieser Bestimmungen sind dargetan in Ta- belle III ; die Sporenzahlen sind angegeben per 1000 mgr frische Fäzes. TABELLE III. Zahl der kultivierten Bakteriensporen in 1000 mg frischen Fäzes. Nr. der Kultiviert aerob auf Kultiviert anaerob auf Untersuchung. Nähragar bei 37° C. Gelatine bei 20° C. Glykoseagar bei 37° C. Glykosegela- tine bei 20° C. I _ II 10.200 3.200 0 0 III 600 100 1.700 100 IV 400 100 200 200 V 1.800 400 50 550 VI 600 400 15050 77.000 VII 200 0 1.600 100 VIII 350 100 — — IX 400 — 1.800 850 X 600 400 700 ISO XI 15.000 14.800 I.IOO 850 XII 600 — 3.100 — XIII 6.900 150 9.500 — XIV 1.400 900 3.600 350 XV 1.800 200 500 — XVI 4.400 400 I.IOO 300 XVII 1.700 1.500 300 500 XVIII I.OOO 600 2.300 300 XIX 6.200 600 5.900 300 XX 25.800 500 36.450 550 XXI 600 500 550 0 Die Zahl der kultivierbaren Dauerformen ergiebt sich als äusserst gering und beträgt für beide Gruppen, sowohl aerobe wie anaerobe, durchschnittlich 4 Sporen per mg frische Fäzes. Die Anzahl unter anaeroben Verhältnissen kultivierbarer Sporen beträgt also nur 0.057 Voo; tier Durchschnittszahl (± 70.000 per 236 mg frische Fäzes) der aus denselben Fäzes kultivierten, vege- tativen Bakterienformen gegenüber. Da weitaus die Mehrzahl der obligat anaeroben Bakterien zu den Sporenbildnern gehören, beweist auch dieses Ergebnis von neuem, welch eine geringe Anzahl obligat anaerober Bakterien in den Fäzes erwachsener Menschen anwesend sind. Wenn ich voraussetze, dass die unter aeroben und anaeroben Verhaltnissen kultivierten Sporen zu verschiedenen Bakterienarten gehören, finde ich im ganzen vorhanden 0.114 o/^^j kultivierbare Sporen, gegenüber der Gesamtzahl der aus den Fäzes kultivier- baren Bakterien; dem ungeheuren Überschuss der in diesen Fäzes vorhandenen mikroskopisch zählbaren Bakterien gegenüber, wird diese pro-Mille-Zahl natürlich noch viel kleiner. Aus den Untersuchungen von A. KLEIN und F. ViSSER 1) ist weiter hervorgegangen, dass die Anzahl mikroskopisch zählbarer Sporen in menschlichen Fäzes, als Durchschnittszahl aus einer grossen Reihe von Bestimmungen, 4V2 Voo ^^r Gesamtzahl vorhan- dener, mikroskopisch zählbarer Bakterien beträgt. Hieraus geht also hervor, dass in den Fäzes erwachsener Menschen, ebenso wie dies sich schon erwiesen hatte für die vegetativen Bakte- rienformen, nur eine äusserst kleine Fraktion der vorhandenen Sporen auf den Platten zur Entwicklung zu bringen ist ; weit- aus die Mehrzahl der mikroskopisch wahrnehmbaren Sporen in den menschlichen Fäzes ist wahrscheinlich abgestorben. Zusammenfassung. 1. Weder auf besonderen Nährböden, noch auch unter anaeroben Bedingungen oder bei 37° C. lässt sich eine bedeutend grössere Bakterienmenge aus den Fäzes normaler, erwachsener Menschen kultivieren. 2. Die Zahl der obligat anaeroben Bakterien in den Fäzes Erwachsener ist sehr gering. 3. Der ungeheuere Überschuss mikroskopisch zählbarer Bakterien in den Fäzes Erwachsener ist als abgestorben zu betrachten. 4. Die Zahl der Dauerformen in den Fäzes Erwachsener ist sehr gering ; die übergrosse Mehrheit dieser Dauerformen ist ebenfalls als abgestorben zu betrachten. ^) A. Klein und F. Visser, 1. c. STÄNDIGE IVUTARBEITER DER FOLIA MICROBIOLOGICA: C. W. BROERS, Utrecht - R. P. VAN CALCAR. Leiden - L. POLAK DANIELS, Haag - C. EIJKMAN, Utrecht - H. J. HAMBURGER, Groningen - H. C. JACOBSEN, Delft - D. A. DE JONG, Leiden - R. DE JOSSELIN DE JONG, Rotterdam - J. J. VAN LOGHEM, Amsterdam - L. LOURENS, Rotterdam - H. MARKUS, Utrecht - C. A. PEKELH ARING, Utrecht - H. E. REESER, Rotterdam - N. L. SÔHNGEN, Delft - C. H. H. SPRONCK, Utrecht - C. S. STOKVIS, Amsterdam. Die Zeitschrift „Folia Microbiologica" veröffentlicht Originalarbeiten, an erster Stelle von holländischen Mikrobiologen ; weiter zusammen« fassende Uebersichte und event. Buchbesprechung gen, aber keine gewöhnliche Referate. Die Mitarbeit von Ausländern ist nicht ausgeschlossen. Die Arbeiten erscheinen in der deutschen, frani« zösischen oder englischen Sprache. Die Zeitschrift veröffentlicht u. A. die Verhandlungen der Nieder* ländischen Vereinigung für Mikrobiologie. Autoren erhalten 50 Abdrücke ihrer Artikel kostenfrei. Die Zeitschrift erscheint in zwanglosen Heften 3—4 Mal jährlich. Der Jahrgang von ± 20 Bogen mit Abbildungen und Register kostet (für nicht gewöhnliche Mitglieder der Niederländischen Ver» einigung für Mikrobiologie) fl. 12.—, 20 Mark, fr. 24.—, £ 1, $ 5 (erhöht mit Portokosten). Arbeiten zur Aufnahme in die „Folia Micro«: biologic a** sind bei einem der Herren Heraus« geber einzusenden. BECKER'S SON BRUMMEN (Gelderland). 1 O H w ON es H < H 1^ 2 > k FABRIKANTEN van WETENSCHAPPELIJKE CHEMI. SCHE, PHARMACEUTISCHE en ANDERE SOORTEN Balansen EN Gewichten imÊmmmmÊmÊmiÊÊmiÊmmmiKKti^iiKaiiitmmÊmmÊmm^mmamÊmmmÊimtmÊmmamiÊÊmmmmÊBmÊmÊamimMmisB LEVERANCIERS AAN ALLE BINNEN. EN BUITEN» LANDSGHE UNIVERSITEITEN, LABORATORIA. MUNTEN, DE VERSCHILFENDE DEPARTEMENTEN — VAN BESTUUR, enz. enz. — BEKROOND MET DE HOOGSTE ONDERSCHEI- DINGEN OP ALLE WERELDTENTOONSTELLINGEN WERELDTENTOONSTELLING TE LUIK BUITEN MEDEDINGING, LID DER JURY 3 5185 00251 5292