(fo & Pye wet S = ee e , » 4 A Wi ; —- iz > f t 他 Pet 4 : rae kl 1 Wi ~~ < < 了 - ° .* LJ Z nes ‘ 多 at £ i Fe ay Tt he : ert : aes Wee ¢ + 3 . » ts 3 ue 社 版 tay aes 人 [ee one een e.\73 300 : RR Wh F CRAG) D. O. HE 闭 hese Ane TOM BT BR F Nese F He Bh ee BO 中 科 院 # WY | | i I til Ae 2 ee Bate ‘ AinzHxz we HORAN WAP ERR MBIA TE SiH HL AUB , DOLE TT EC, ans 作风 学 过 和 中 所 产 和 的 至 作用 有 -入 的 本 书 可 供 化 学 ,生物 化 学 ,生息 学 、 医学 \ 家 学 工作 者 以 及 有 a 关 高 等 院 校 师 生 的 参考 。 ees a Se nce. es THE CHEMISTRY OF NUCLEIC ACIDS 3. OF Jordan i, ; _ Butterworths, 1960 oo OR. 核酸 的 化 学 Hexen 郑 最 略 TE RCE all fie = 亮 Be 上 海 科学 技术 出 版 社 出 版 (上 海 瑞金 二 路 450 a) ESTAS TH ae ee Ta HY 093 号 iy Seti 大 东 焦 成 联合 印刷 厂 印 刷 SN 开本 850X1156 1/32 印张 11 4/32 ”排版 字数 294,000 - 1965 年 工 月 第 1I 版 1965 年 工 月 第 1 次 印刷 a4 air 4 1—3,700 : ’ cee Na . . 统一 书号 13119.621 定价 ( 科 六 ) 1.70 58 . ee ' OVI ae & 他 ae , Mite ao, 5 a 7 » TSA Lp eae A = ‘ve Wwe da bier ket) eee? Pe a te ee ee ee ee a me eo .°: "> ie 7a Th EET eT UL ine Serr es HE Pe Bede Seg RC ek te at Abts ce aa ae 有 Saat Se rn > 4 - ‘ - > . “Kote, ree re eC 研究 而 来 ， 其 中 涉及 从 物理 到 化 学 以 及 从 生物 化 学 到 生物 学 和 得 传 学 的 研究 。 一 个 包括 核酸 千 构 及 功能 的 各 方面 的 广泛 著述 将 需 要 几 答 的 篇 幅 加 以 如 载 ,而 且 亦 在 任何 著者 能 力 范围 以 外 。 因 此 ， 的 。 SES 大 手头 了 的 相对 位 得、 多 本 狂 以 及 术 酸 大 分 了 的 天 小 | AUG Ae RRA ROMA KARE Tc eee 的 叙述 显然 是 需要 的 ,因为 如 果 象 现在 所 相信 的 ,核酸 传递 遗传 密 a nal Mailaaiibarte eRe D. 0. 佐登 8119 FF 录 第 一 章 引 时 第 二 章 核酸 的 提取 al ARES ANGER ET nn ri 4 各 种 脱氧 成 糖 核酸 钠 制 备 方法 的 比较 成 糖 楼 蛋白 的 提取 人 肥 氧 成 糖 核酸 钠 的 提取 pe 13 第 三 章 “核酸 的 不 均一 性 和 分 航 分 高 S| a 和 人 SEES EES EEEEEES ya iy Sale wle peas digs cla vevececndsacds od ntecessacsipeeduea ey aimee fe ccvesee 0 QD ESA Dee AIR A EAA — EER BS HES pe He ASE TOP A) BRIE] Bis eeseeesecersecsaccenrenseceeeeaseacensecnaees 37 eR ARIE ARS es A Mea BEF A PR ER 第 四 章 核酸 租 分 的 提取 和 核酸 的 租 成 ttt teeeeeesccscssecsecsercenssescesecssone 62 oe ae SOF 1 3 a= 9 Ee 引 FETA AYRE iGo reer cece eerevceeccecerensceevorverseseoecersessssssessesensessasessesee ty 2 CD BFA OR i aR AY AS He Hg DAAC HET ASHES tity 苷 键 的 位 置 苷 键 的 构 型 和 “ 楼 苷 的 合成 第 六 章 “” 核 苷 酸 的 千 构 及 其 合成 引 PERTH IRN FARR BE eR 向 123 7 FOC HEHEHE HEHE HEHE HERE EREEAEHESEEH HEED EOSE OHH T OSES EEEses FRIBIGAETR IATL ee 130 { ‘WRAITH A UR ，…………. Eine Spas Li Aiea Phavisateds Waaenarmeaheags 132 ”第 七 章 “ 核酸 租 分 的 酸 碱 性 质 ee Re nea 135 Py. | MUS PRRAMGE WER, -ce-sseerecesseceessacesssacescssnsessnrsessessesserseersrsenes 135 BEE RISEFIR wvsteeeteesee tee tesecseesteetesten testes tcnesestesenseasegntgnas 137 BAR “核酸 的 千 构 (一 ) ARIE ee eee evel a | 引导 141 区 -. 成 糖 棚 酸 中 杷 并 酸 闻 的 键 ee，…， 2 141 BSCS EFT GE neste tees te ee teet tees estenteee 150 4 各 思 章 “入 本 的 结构 (二 ) RALAR MEARE Watson 和 Crick BORE 和 构 站 0 157 a 人 157 En Spier erry famed. 157 a 电位 滴定 的 研究 cocceetce ecw eceseacencescuessecsessesesersensuesenssesaseeeen 171 = Watson 和 Crick 模型 的 分 析 化 学 证 上 明 Ne 9 Watson 和 Crick 芋 构 的 可 能 的 修改 pp 人 三 177 4 第 十 章 PARTS) SPARTAN. 形状 -和 另外 几 种 性 质 和 esoooooes 180 nn: | i= cece eee Bich srbatdueg soael anh sau euaeete 180 ; DEM RIESE GASP AE TE asisdacsscccccvsvsncdassaacescocssssacscseeronsunecs 182 ’ = VSG WEA DE REIIR SASS ERD TY cccceeceecescsersccaeeeeeeesecsensaees 196 SBF BBSRC, ARIA fe 均一 性 ee 生生 下 各， 205 腊 氧 成 糖 核酸 的 酸 碱 上 性 质 pe PO eee et 209 BARRE EAHA TET creceeseecneeecrsescareacescnsrsersersasenees 219 RS: PEORIA 5 Se SAN PUPA EA coe ese eset 224 fe 在 非 水 洲 剂 中 脱氧 友 糖 楼 酸性 质 的 研究 coeeceeeeseesecseceecesseeneees 237 “第 十 一 章 “核酸 的 千 构 (四 ) 胸 氧 成 糖 核酸 的 变性 和 降解 ……… 和 和 245 和 245 觅 氧 肥 粮 术 酸 的 变性 PP 245 股 氧 成 糖 核酸 的 降解 pp pre SEK hf 269 第 十 二 章 。 核酸 的 千 构 ( 五 ) 成 糖 核酸 的 千 构 pp 280 本 280 Putten Ase Vey Bare, ete”, ube - Seay > nar Be Sal PERRI AT HO a = 中] a sees eeeseeecceees een eeseeeecr eee ssseeseeeeseseseeseseeaneesosee? HOSP EERO rh BEER AEFI 5 ic DOREAZER Hp ATER BEDI creeveecasseneecnetenenersecneesessens Z 末端 磷酸 基 团 ceeccecccccccccescscecscnseccecscerescecsscnasussssesessases 第 十 四 章 合成 的 多 柜 昔 酸 : 。 合成 的 腊 氧 桶 糖 多 柜 苦 酸 cnet eeeeeses este eeteneeenenereeenanennes «BEE 核酸 的 螺旋 千 构 和 和 复制， Pj Wats OR i , etd, PoE Met hes ire ed 3 : = bs oti : bine ‘ s- r= ~ ~. > > sl ~s =A 4 Ve ne a ‘ : a pt ee s ' * pg i - i am i ‘ A ‘ > \ 。 7 itl 第 一 章 4 化 学 、 和 胞 学 和 遗传 学 的 粽 合 研究 使 人 们 相信 核酸 在 控制 生 病 肠 的 新 陈 代谢 、 生 殖 以 及 年 长 方面 具有 非常 重要 的 意义 。 差不多 。 所 有 新 陈 代谢 的 进行 都 要 通过 酶 的 作用 ， 而 这 些 酶 的 合成 是 受 遗 ” 便 单 位 基因 所 控制 的 。 当 鼻 胞 分 裂 时 ,基因 必须 可 以 复制 ,而 村 新 的 还 自 后 分 子 的 合成 加 以 控制 。 在 过 去 有 二 冰 A, Pe BU SER AH EO BK Le 。 核酸 和 和 蛋 白质 。 但 近来 具有 可 以 信服 的 证 据 证 明基 因 所 具 的 重要 ER REM, TR EE BK 7 5S EH ESHER Avery, Macleod 和 McOarty™ ”的 发 现 。 这 个 发 现 指出 首先 由 Griffith” pry EM OS PEGE, ET RU RL FERE HH ARTA I 型 的 及 变形 体 完 全 转变 为 包含 在 囊 ”中 的 肺 类 球菌 III 型 的 8 竹 胞 。 这 种 工作 未 货 立 序 得 到 应 有 的 广 泛 承 认 , 主 要 因为 在 当时 关于 核酸 的 千 构 仍 趋向 于 错误 的 偏见 , 认 。 特征 后 ， 特 别 是 Hershey 和 Chase" 的 工作 指出 噬菌体 的 本 性 与 ， 作用 后 , Avery 及 其 同 工 者 的 工作 的 重要 性 和 途 得 到 普 逼 的 承认 。 Hershey 和 Ohasef 能 够 迹 明 当 大 肠 噬 菌 体 在 适当 的 环境 下 加 SBA ER RUS, ALCOR AE BPE ES, EA 0， 糖 核酸 和 一 小 部 分 可 溶性 蛋白 质 途 进入 竹 胞 中 ， 而 大 部 分 的 蛋 自 ， ， 质 则 遗留 在 租 胞 外 面 。 在 宿主 站 胞 中 后 期 所 发 生 的 噬菌体 生殖 过 bh, HAWES RAS Ak, LORS A 4a sea Ase 5 TEAR RE WY TAA HY FEAR RC 如 一 般 所 假定 的 种 属 特异 物质 是 在 特殊 的 遗传 决定 因素 影响 下 所 产生 的 。 在 生成 这 种 物质 时 ,不 是 胸 氧 友 糖 核酸 就 是 可 溶性 蛋白 ， 为 核酸 是 一 个 四 核 音 酸 分 子 。 但 是 , 当 洞察 到 核酸 具有 大 分 子 的 “、 2 第 一 章 引 F 质 进 入 竹 胞 中 ,或 且 两 者 均 进 入 。Hershey 四 人骨 指 出 , 进 丰 和 胞 的 易 JB , CDBG ITB HY “Se 3 By Jt” a 97 % 肌 氧 成 糖 核酸 和 39 蛋白 质 所 TLS, ALES 2 Sk — A Be — Fp BAST PR SERIE RB 在 目前 何不 可 能 。 但 是 ， Herriot py A Mm HORS ashy A I ARAL, FIGHT 8, EE SORBET I PJ — J Wes |. 们 注意 的 进入 灶 胞 的 选择 性 物质 。 这 种 见解 为 Doermann Chase 和 tahl ”从 受 紫 外 光 作 用 失去 活力 的 噬菌体 去 找寻 其 中 采 坝 冬 扣 的 遭 传 信息 载体 的 研究 千 果 以 及 Stentm 用 同位 素 示 踪 作 同 FSET HS RE RITA. AEWA Bye SSL RS ri pe enh ”作用 的 进一步 证 明 SA Hraenkel-Oonrat 加 与 Gierer 和 Sch- ramm ” 的 各 自 独立 的 观察 ， 序 从 烟草 花 叶 病毒 分 离 出 来 的 友 业 全 本 具有 病毒 的 活 仁 ， 而 这 些 活性 可 以 认为 差不多 完 侍 为 天 然 病 SN RAVAN SR TE ASEAN th 2 a EDR AT AE ERED, — BEI aise Ay STE ET Te GA PE ES OMA I, Te UTE BEES IR TSP EHR BE My A | RATES F DLR RET WR OD q BCE HEISE AE, C—O ge BS TCSP REAR PP RII — BIB A tk ER — 1 PSUR DE BS — “Ne RRR EEA, AEE at apse rh a AS Fb LBs 24s 0 AR a me a aR ee ee ORR ST Fe ACTER SOR, (LICE RE AOE TY DSA tte He EEE se seRen AEA T REET, BR HH Ree sc ERP ET FAHEY APLAR, 15 AE — Lebo dm Hi steps 二 省 物 亦 一 定 不 相同 ， 象 沉降 系数 的 广大 分 布 所 表示 的 吧 二 级 有 光 “性 可 以 都 分 地 在 提取 时 人 为 地 产生 。 但是, mae) FADS Zee 进行 的 核酸 分 狼 分 离 麦 示 出 洗 腊 液 的 成 分 SUL REVERENCE, FELD Paty TUK aA He ot a 3 — aan elleelgaaigigl He. BEARER SURI RN BRINN HRA, BMD RA TK EK DALE 研究 核酸 ， 特 别 研究 其 生物 学 功能 ,近年 来 已 因 1958 年 Watson 和 Orick™® 所 建 凡 的 腊 氧 友 糖 核酸 的 灶 构 模型 而 大 大 地 SIRE. 这 个 烙 构 模型 除 小 部 分 靶 修 改 外 , BIE BIER 。 和 碱 和 喀 啶 碱 互 补 排列 所 成 的 两 条 多 核 背 酸 键 使 Watson 和 Orick ， 6 TRB IR SSEANE HS. XV TEJS JL BE PN i FALTER ERS , DBC yd A Ee OR Te (A 8 DS TL PAS Tl ATURE DBL TT SD EE FE, ORE a UABIRA FA DA —-A SE REA AAS RNR 板 而 直接 自行 复制 。 这 个 分 人 兴奋 的 建议 却 引起 了 很 多 问题 ， 其 中 包括 这 两 条 绒 和 绕 在 一 起 的 多 核 苷 酸 链 的 分 开 以 及 Delbriick 和 Stent ” 所 群 租 诗 论 过 的 几 个 复制 方法 的 修改 。 虽然 Watson 和 Crick 所 建 玉 的 原来 核酸 结构 及 其 复制 机 制 均 便 沟 修 改 ， 但 他 全 根据 几 个 不 同 实验 室 所 累积 的 化 学 的 与 物理 的 证 据 所 作出 的 页 。 献 ,在 核酸 知识 的 发 展 方面 可 算是 一 个 划时代 的 事件 。 核酸 的 发 现 为 Mieseher 研究 工作 的 结果。 他 在 1868 ~ 69 年 在 Tbpingen bk Hoppe-Seyler Wy Scie ss C/E it WSK HEL AY A LAY 牛 提 取出 一 种 物质 ,他 称 之 为 ' 核 素 ;(Nuclein)。 这 个 具有 酸性 的 物 — 质 特 别 使 人 感到 兴趣 ,因为 它 含 有 相当 高 的 磅 成 分 ,而 在 当时 所 知 — PHAR PRS ALI A RAPE a . Miescher 把 他 的 工作 告知 也 oppe-8eyler,， 他 感到 非常 有 兴趣 而 惊奇 ， 因 此 他 。 素 自 重复 了 Miescher 的 用 和 胞 的 实验 , 卉 且 请 他 的 两 个 学 生 Plbsz 和 Litbavin 用 除 肌 外 的 物质 \ 如 蛋黄 酵母 . 乳 酷 和 篇 类 及 怜 虫 类 动物 的 红血球 ) 求 检查 Miescher 的 方法 。 当 MSR’ WARE 后 , Miescher 和 Hoppe-geyler 及 其 学 生 的 工作 郎 于 1871 年 aa 发 表 于 Hoppe-Seyler 的 Medicimisch-chemische Untersuchungen 2% 志 中 。 继 后 Altmann”, Bp Ame’ — Ay AAAS, 发 表 了 ' 核 素 ， 的 简便 的 一 般 制 法 。 4 ee og] OS 不 幸 得 很 ，Miescher 充分 证 明 核酸 为 高 聚 物 的 工作 和 被 后 来 的 研究 工作 者 们 所 忽 秽 ， 他 们 利用 有 机 化 学 中 的 降解 方法 将 用 酸 和 碱 并 用 加 热处理 的 方法 从 组 绫 中 提取 出 来 的 物质 作为 研究 。 用 这 样 提取 方法 所 得 的 产物 ， 虽 然 只 适宜 于 作为 核酸 水 解 产 胸 的 检查 和 核酸 降解 产物 的 研究 ,但 与 天 然 核酸 很 少 相 似 之 处 。 许多 根据 利用 降解 物质 进行 研究 而 作出 的 假定 常 导 致 鱼 训 的 “下 猪 论 ， 其 中 有 些 还 严重 地 阻碍 着 关于 核酸 和 结构 与 功能 的 知 误 的 进 一 步 发 展 。 例 如 ,过 去 将 近 10~15 年 间 认 为 核酸 分 子 是 一 个 四 核 昔 酸 的 概念 是 由 于 发 现 酵 母 核酸 的 水 解 物 中 含有 4 个 几乎 等 分 子 比例 的 核 苷 酸 分 子 以 及 以 后 被 证 明 是 错误 的 22 Fy BT 而 来 的 。 这 个 错 避 的 测定 表示 核酸 粒子 的 大 小 相当 于 4 个 核 背 酸 分 子 。 但 是 不 管 这 样 的 批 币 , 利用 古典 有 机 化 学 的 方法 以 进行 隆 解 的 研究 对 于 确定 硼 成 核酸 的 基本 分 子 仍 具 非 常 重要 的 意义 。 从 这 个 工作 的 车 果 产生 了 核酸 存在 着 两 种 显然 不 同类 型 的 概 念 。 一 种 是 从 酵母 而 来 的 核酸 , 47K REN A RO 喀 吓 、 尿 喀 吓 、 磷 酸 和 一 种 外 Hammarsten 认为 是 一 种 成 糖 ， 而 Levene 和 Jacobs23 则 确定 为 核糖 的 糖 。 另 一 种 是 从 胸腺 而 来 的 核酸 , IKI JTS ARO RU me Ag DRE (5- 甲 基 尿 喀 啶 ) 、 磷 酸 和 一 种 彼 Levene 和 London”! 认为 是 股 氧 皮 糖 ,而 Levene, Mikeska 和 Morrica 则 确定 为 腊 氧 核糖 的 糖 。 这 两 种 核 酸 因而 分 别 叫做 核糖 枝 酸 和 脱氧 核糖 核酸 。 因 为 大 部 分 动物 来 源 “的 核酸 类 似 从 胸腺 所 得 的 核酸 而 植物 来 源 的 核酸 类 似 从 酵母 而 来 ， 的 核酸 ,因此 一 般 均 认 为 成 糖 核酸 具有 植物 的 特征 ,市 腊 氧 成 糖 核 酸 则 具有 动物 碍 绫 的 特征 。 但 是 这 样 的 区 分 永远 不 能 和 避 香 人 们 的 反对 ， 而 且 当 这 样 的 区 “分 开始 时 ， 即 不 断 有 例外 的 发 现 。 它 的 不 准确 人 狂 的 有 力 证 明 来 自 Brachet 2 fy HAL SEALE , Oaspersson?” Fr 4px ny HARA : | 外 分 光 的 测定 以 及 Davidson 和 Waymouth®* fy Ami LAER HS ZIT So HLA RAY HOSE KD A BE EG HS A BT EL BS ps AUSF AC ABA) ke FAT Ey AY AB, PR OPER, — aes BBR 5 : SNE AIL TE PO LAS ees , TT AEH LD FLA AUR RAEN Ty OER. LE PRE RET SR IP, OPAL BK URS, FREE HO EE ee Ee 。 或 几乎 完全 存在 于 和 胞 核 中 。 核酸 中 粳 的 鉴定 仅 严格 地 进行 过 几 次 。 到 目前 为 止 ， 从 核酸 £ RSS ES HSBC D-eeiiA 2-I-D-eE EP, PEE , ANE fy eR Atty eae BE DRE, 但 从 层 析 fy D- 核 糖 相 同 。 MU Io WR 4S BUG IESE EE EP WE SA BBE Dy 2-DAY , (LE RT tO EB SER ， 源 所 得 到 的 脱氧 成 糖 枝 酸 中 的 糖 亦 与 2- 氧 -D- 核 糖 相 同 。 在 “本 书 中 “ 友 粳 核酸， 与 “ 腊 氧 皮 粳 枝 酸 ， 将 作为 属 名 在 书 中 各 处 使 ”用 ,除非 在 个 别 的 地 方 涉及 某 些 特 殊 的 、 成 分 已 知 的 核酸 时 旭 不 采 ”用 此 属 名 。 : cs oa hy > as Shae pales vor i. exes =) 3 套 考 TR 人 J 7 >: p. 137 人 [2] Griffith, F. 7. Hyg., Camb. 1928, 27, p. 113 [8] Soe Zamenhof, 8. Progr. Biophys. 1956, 6, p. 86; A Symposium on the ss Ohemical Basis of Heredity (Ed. W. D. McElroy and B. Glass): Johns = Hopkins Press, Baltimore, 1957, p. 351 [4] Hershey, A. D. and Chase, M. J. gen. Physiol. 1952, 36, p. 39 [6] Hershey, A. D. Virology 1955, 1, p. 108 [6] Herriott, R. M. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity (Ed. W. 了 了 . McElroy and B. Glass): Johns Hopkins Press, Baltimore, 1957, p. 399 £7] Doermann, A. H., Obase, M. and Stahl, F. W. J. cell. comp. Physiol. ORR A RES ARSSWIR” 所 得 到 的 成 糖 核酸 中 Be [1] Avery, O. T., Macleod, O. M. and McOarty, M. J. exp. Med. 1944, 79, RRIF RABE, TRE [20] [21] [22] [23 ] [24] [25] [26] 第 一 章 5) F 1955, 45, Supplement 2, p. 51 Stent, G. 8. Proc. nat. ‘Acad. Sci., Wash. 1953, 39, p. 1234 Stent, G. S. and Fuerst, O. R. J. gen. Physiol. 1955, 38, p. 441 Fraenkel-Conrat, H. J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, p. 882 See also Fraenkel-Conrat, H., Singer, B. A. and Williams, R. 0. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity (Ed. W. D. McElroy and B. Glass): Johns Hopkins Press, Baltimore, 1957, p. 501 | Gierer, A. and Schramm, G. Nature, Lond. 1956, 177, p. 702 Glass, B. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity (Ed. W. D. McElroy and B. Glass): Johns Hopkins Press, Baltimore, 1957, p. 757 Shooter, K. V. and Butlor, J. A. V. Trans. ‘a Soc. 1956, 52, p. 734; J. Polym. Sci. 1957, 23, p. 705 Schumaker, V. N. and Schachman, H. K. Biochim. biophys. Acta 1987, 23, p. 628 . Bradley, D. F. and Rich, A. J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, p. 5898 Bendich, A., Pahl, H. B., Rosenkranz, H. 8. and Rosoff, M. Symp. Soe. exp. Biol. 1958, 12, p. 31 Watson, J. D. and Crick, F. H. OC. Nature, Lond. 1953, 171, pp. 737, 964 Watson, J. D. and Crick, F. H. O. Cold Spr. Harb. in quant. Biol. 1953, 18, p. 123 Delbriick, M. and Stent, G. s. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity (Ed. W. D. McElroy and B. Glass): Johns Hopkins Press, Baltimore, 1957, p. 699 Miescher, F. Med.-chem. Unters. 1871, 4, p. 441 Plész, P. Med.-chem. Unters. 1871, 4, p. 461 Liibavin, N. Med.-chem. Unters. 1871, 4, p. 463 Hoppe-Seyler, F. Med.-chem. Unters. 1871, 4, p. 486 Miescher, F. Med.-chem. Unters. 1871, 4, p. 502 Altmann, R. Arch. Anat. Physiol., Lpz. 1889, p. 524 Myrbiick, K. and Jorpes, E. Hoppe-Seyl. Z. 1935, 237, p. 159 Fletcher, W. E. Thesis, University of London, 1948 Levene, P. A. and Jacobs, W. A. Ber. dtsch. chem. Ges. 1909, 42, pp. 2102, 2469, 2474, 2703 Levene, P. A. and London, E. 8. J.biol. Chem. 1929, 81, p. 711 and 83, p. 793 Levene, P. A., Mikeska, L. A. and Mori, T. J. biol. Chem. 1930, 85, p. 785 Brachet, J. Arch. Biol., Lidge 1983, 44, p. 519; 1987, 48, p. 529; 1940, 51, pp. 161, 167; C. R. Soc. Biol., Paris 1940, 188, pp. 88, 90 [82] cs Z Caspersson, T. Skand. Arch. Physiol. 1936, 74, Supplement 8 Oaspersson, T. and Schultz, J. Nature, Lond. 1939, 143, p. 602 Oaspersson, T. J. R. micr. Soc. 1940, 60, p. 8 Caspersson, T. and Schultz, J. Proc. nat. Acad. Sci., Wash. 1940, 26, p. a . OCaspersson, T. Naturwissenschaften 1941, 29, p. 33 Oaspersson, T. and Thorell, B. Chromosoma 1941, 2, p. 132 Oaspersson, T., Nystrém, OC. and Santesson, L. Naturwissenschaften 1941, 29, p. 29; Acia radiol., Stockh. 1942, p. 46 Davidson, J. N. and Waymouth, O. Nature, Lond. 1943, 152, p. 47; Bio- chem. J. 1944, 38, pp. 39, 375, 379 Wyatt, G. R. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff and J. N. David- son): Academic Press, New York, 1955, p. 243 Ohargaff, E. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff and J. N. David- son): Academic Press, New York, 1955, p. 307 ae ) : Magasanik, B. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff and J. N. Davidson): Academic Press, New York, 1955, p. 373 Oohn, W. E. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff and J. N. David- son): Academic Press, New York, 1955, p. 211 Davidson, J. N. and Waymouth, O. Biochem. J. 1944, 38, p. 379 BRR | fa” eer | 第 二 章 核酸 的 提取 can 研 完 核酸 的 目的 和 许多 生物 化 学 研究 的 目的 相同 ， 是 将 提取 出 来 的 核酸 的 化 学 辣 构 和 反应 性 能 与 它 在 生物 机 体 证 的 动能 联系 起 求 。 高 分 子 量 和 烙 构 复杂 的 壮 胞 成 分 的 提取 必然 要 涉及 这 样 的 Dil 问题 : HIM SRE ES HARM hy 同 。 合 乎 理想 的 提取 方法 必须 能 使 所 得 到 的 制备 物 在 每 一 点 上 都 能 保持 它 在 原来 普 胞 中 的 烙 构 。 但 是 ,条 胞 中 的 核酸 总 是 和 蛋白 ”，” 质 烙 合 在 一 起 的 。 现 在 还 不 能 说 ， 究 竟 竹 胞 中 所 有 的 核酸 是 否 都 以 核 蛋白 的 形式 存在 。 但 是 豪 无 疑 冯 ， 即 使 不 是 所 有 的 核酸 ,至 少 是 大 部 分 的 核酸 是 以 具有 生物 活性 的 核 蛋 和 白 形 式 存在 。 和 核 蛋 自 可 以 在 一 定 程度 上 以 不 发 生变 化 的 状态 彼 提 取出 来 ， 但 是 很 难 ， 区 别 天 然 的 核 蛋 自 与 从 类 胞 中 同时 提取 出 来 的 蛋 自 质 和 核酸 所 形 成 的 类 似 蛋 白质 核酸 盐 那 样 的 矫 作物 。 全 猎 采 用 过 许多 方法 从 蛋 白质 中 分 离 出 核酸 。 但 是 ,不 葵 这 些 方法 是 温和 的 或 是 激烈 的 ,一 个 事实 总 是 存在 , 即 翘 胞 中 的 核酸 车 使 是 和 蛋白 质 烙 合 在 一 起 , 则 原来 和 蛋白 质 和 结合 的 基 团 将 被 释放 出 来 ， 并 且 很 可 能 有 引起 副 反 ” 应 的 危险 。 核酸 的 提取 还 因 缺 乏 对 它 在 站 胞 中 的 芙 正 功能 的 了 解 而 更 加 复杂 起 来 。 核酸 和 多 种 蛋白 质 (例如 酶 和 抗体 等 ) 不 同 , EERE 有 容易 衡量 的 生物 活 猎 ， 所 以 拟定 一 种 能 合 人 满意 的 核酸 提取 方 法 的 标准 要 上 比 在 相似 的 情况 下 拟定 蛋 自 质 的 提取 方法 的 标准 困难 得 多 , 因此 多 常 采用 很 多 随意 制定 的 标准 , 其 中 包括 化 学 分 析 、 分 FRE SEO CC KE LE ESE, Ph NE ewe HER ADF HEHE MMA Lowe, HATER A a 引 OU . ee ea ee eT ae a DURES HH RAR S OE EAI: Bh 总 的 核酸 制备 方法 还 没有 相对 的 标准 。 Miescher™ , Altmann” +5 Kossel 和 Neumann™ 3 #) Ht BL SL A A, ll 45 FE EAR IE Re RR TAY, BAKE | ADI, FEVER ALBEE ARAN E HE. 这 个 假定 至 今 被 公认 为 是 正确 的 ， 因 此 所 有 近代 的 制备 方法 都 尽 可 能 地 和 采 用 最 温和 的 条 件 。 可 是 在 1899 年 Neumann 描述 了 一 个 改进 Altmiann 法 的 方法 ,这 个 方法 包括 将 切 碎 的 生物 器 官 在 8 多 LAL 2 蝎 型 方法 各。 因此 Levene 和 Bass St: “已 纸 消 除了 对 用 激烈 的 :方法 从 蛋 自 质 中 分 离 核酸 的 传 葬 顾虑 ?。 这 个 发 展 可 能 加 速 了 运用 有 机 化 学 中 的 古典 方法 以 研究 核酸 的 水解 产物 ， 然 而 这 也 是 采 业 一 个 极端 错 弥 的 核酸 分 子 量 数值 的 。 原因 。 因 此， 虽然 当时 Miescher 和 Kossel 可 能 都 已 烃 意 哉 到 核 。 酸 的 复杂 性 质 及 其 五 大 分 子 烙 构 ， 而 后 来 的 工作 者 却 认为 核酸 的 分 子 还 是 比较 小 的 。 这 个 见解 一 直 都 没有 被 怀疑 过 , 直到 重新 采 。 用 温和 方法 制 取 核 酸 时 ， 核 酸 的 大 分 子 性 质 才 又 重新 被 人 们 Vik. | SP RAMEY ORE BP SK. BEEN BAUS TE, ME BO HEIL, GAY DDL ”状态 ， 或 不 以 固体 的 状态 稚 提 取出 来 。 其 次 是 使 核酸 与 蛋白 质 分 宛 。 在 这 个 方法 中 ， 当 脱氧 友 糖 核酸 和 戊 糖 核酸 都 是 和 蛋白 质 精 合 在 一 起 时 ， 戊 糖 核酸 与 胸 氧 戊 糖 核酸 的 分 离 是 根据 Mirsky 和 ”了 Pollisterm 所 描述 的 方法 ， 即 利用 这 两 种 核 蛋白 在 电解 质 溶液 中 洲 解 度 的 显著 差别 来 进行 分 离 。 过 去 在 核酸 与 蛋白 质 分 离 后 用 以 ”分离 皮 糖 核酸 和 股 氧 成 糖 核酸 四 以 及 采用 强烈 献 剂 的 方法 ， 都 不 能 合 人 满意 。 化 钠 盗 液 中 进行 加 热 ,这 在 以 后 30 年 的 时 间 中 一 直 是 制备 核酸 的 狂 胞 中 的 核酸 是 和 蛋 自 质 紧密 地 联 千 在 一 起 的 。 在 核酸 的 制 ， 10 第 二 章 核酸 的 提取 Wi HEE Ss BEAL ERRAND, BDU 9 Ae Be Fo TARA EY 22 IEF DALE Oe Fs ESE BABE ARTF 5b — AH te EF Ak RS BE IO PT 1 Ae FS FF BE YOR? 9 = a ae PAPE AS 5 FT DFA 5 (LR fil OE SB) DS — A Hy He ,因为 有 FAS 2 fi aie DE aE , FESR LSI UR VAY (LIM) ee eR ALE JLB Fab ag R080. 8rt0~82) | EE Pea eT Bk — ph bate pe AUR RE BRA AYE ER, | Fil ISSA SORE 2 ETE Il vi EJ Yes We fe BE By Fa = 同 ， 可 以 使 这 种 核 蛋 白 和 戊 糖 核 蛋白 完全 分 离 。 ricktao eee 地 探 夺 过 肌 氧 友 糖 核 蛋 白 在 不 同 省 度 的 氧化 钠 游 液 中 的 洲 解 度 间 题 ， 他 指出 在 0.14W 氧化 钠 洲 液 (生理 盐水 ) 中 ， BEA BEY FR YA APB R RG ZEB AK Hh HPA BEN 19%, Tate 1M at rege 溶液 中 , ENA Dopey FE 0.14M 氧化 钠 溶液 中 的 洲 解 度 最 低 。 相反 的 ,成 糖 核 蛋白 通常 比 鼓 容易 溶解 ,尤其 是 能 够 在 0.14M 氧化 钠 溶液 中 洲 解 。 因 此 用 0.14M 氧化 钠 溶液 洗涤 切 碎 的 粗 钠 可 以 使 用 有 氧 友 糖 核 蛋 自 与 上 糖 核 蛋 自分 离 。、 在 从 和 胞 中 提取 核 蛋白 时 ， 必须 防止 酶 降解 ; 著 是 不 可 能 防 Ik, 至少 也 要 使 酶 降解 减少 到 可 以 忽 坑 的 程度 。 ABAD PAAR IHS SHO EZR, 在 提取 时 , 在 同一 洲 液 十 这 各 酶 和 核 蛋白 都 以 游离 状态 存在 , 因此 有 可 能 相互 起 反应 。 为 了 藏 “ 少 或 阻止 酶 的 作用 ,全 沟 提 出 过 许多 预防 的 方法 ， 例如 ,所 有 的 制 备 过程 均 应 在 O°O 或 更 低温 度 下 进行 以 降低 酶 反应 的 速度 ; 通 沉 代 要 加 入 酶 的 毒物 如 砷 酸 盐 "a PER 0 Sor Py py a ae ay 如 乙 二 胺 四 乙酸 钠 等 以 进一步 抑制 酶 的 作用 。 二 沟 强 调 过 ， 在 核酸 和 核 蛋白 的 提取 过 程 中 必须 避 巡 加 热 以 eee _— 脱氧 皮 糖 核 蛋白 的 提取 a 及 使用 能 全 pH 显著 偏离 中 性 的 强烈 化 学 喜 漠 。 此外， 如 Ober pe 所 普 先 指出 的 ,也 要 如 锡 使 用 高 速 冬 碎 器 。 现 在 已 经 肯定 ， fe REPL SS ER CH AAR II) AA PIRI. SEMTE Ah POMS MALIN PAAR “的 后 果 。 但 是 , 为 了 打 碎 番 胞 , 似乎 仍 有 使 用 这 种 绞 碎 器 的 必要 ， 但 使 用 的 时 间 应 尽 可 能 地 粹 短 。 以 下 列举 丙种 典型 的 制备 方法 ,一 种 用 低 离子 强度 的 溶液 , 另 ”一 种 用 高 离子 强度 的 溶液 。 sale SISA AMR HHS, 立即 冰冻 并 迅速 加 以 处 理 。 往 后 的 ”从 部 操作 均 须 在 4~6°C 的 冷 室 中 进行 。 将 每 份 50 g 的 胸腺 在 一 装 有 切 创 刀 ， 。 乒 的 高 速 泥 和 器 中 与 50 ml 预先 调整 到 pH 7 的 ` 含 有 0.1 氯 化 纳 和 0.05M 棒 楼 酸 钠 的 、 冰 瀹 的 混和 波 共 同 搞 碎 30 秒 钟 。 然 后 用 离心 机 在 2000g 下 转 30 分 钟 , 弃 去 上 层 清 液 。 将 所 得 沉降 物 重新 悬 浑 在 100ml 同样 的 氧化 俩 - 樟 檬 酸 钠 洲 液 中 , 再 进行 转 离 。 这 样 的 洗 洒 可 以 重复 进行 。 。 为 了 除去 电解 质 , 将 沉降 物 重新 殉 分 悬 学 在 水 中 , 并 加 以 转 离 。 用 这 样 | RR AEE TP Ut Mey WY AEN, 但 不 大 游 解 在 上 层 清 液 中 。 将 此 胶 状 ”沉降 物 在 高 速 混 和 器 中 与 250 ml 燕 饮水 (HHH) pH 7) 共同 拌和 15 H Fh, ， 划 卑 震 过 夜 。 此 时 应 成 极 粘 笛 的 溶液 , 这 个 溶液 在 高 速 泥 和 器 中 括 拌 一 些 时 天 后 ， 在 离心 机 中 在 2000 g THER 30 分 钟 。 然后 加 太 计算 量 的 毛 化 负 溶 HE Gi 0.20) 使 水 溶液 的 省 度 相当 于 0.150 氯 化 纳 以 沉 洗 杷 蛋白 。 径 转 离 | 30 分 钟 后 ， 将 沉 洗 出 的 核 蛋白 在 离心 机 中 用 0.150 氧化 纳 溶液 洗 潍 , 最 后 | AA ELAR AKT. ABaT BEA kalsé Fa Reese FAS AR. FERRER a AE 4 ~ 6 °C Bye se BET. Ag 50 g 的 小 牛 胸腺 在 一 装 有 切 创 刀片 的 高 速 混 和 器 中 与 50ml BERS) pH 7 的 含有 0.1 氯 化 销 和 O.05M 樟 檬 酸 钠 的 冰冷 的 混合 液 共同 拌和 30 PEE, ABO OLE 2000 g 下 圭 离 30 分 钟 , 弃 去 上 层 清 液 。 将 沉 RED RET 100 ml 氧化 纳 - 梯 机 酸 钠 溶液 中 ， 再 加 以 转 离 ， 这 样 的 洗 滋 可 以 重复 进行 。 PME, A ABU RNR ASNT SI pH 7 的 燕 馆 水 50ml。 在 最 12 第 二 章 核酸 的 提取 将 所 得 沉降 物 巧 将 于 100ml 0.15.M SLs Eee 15 分 钟 ,再 加 10% BN RULSAVATE, OVATE HY SACS ERERGEI 6% . WE 247 时 后 ， 将 所 得 的 粘 稠 溶液 用 粗 滤 器 过 滤 ， 浅 液 加 水 稀释 到 0.150, BRET Ho FA RSD PLESES 30 分 钟 ， 然后 收集 楼 蛋 白 沉 演 。 再 将 沉 洗 加 大 到 100 ml 5% 氧化 人 溶液 中 ,并 在 高 速 混和 器 中 括 拌 15 秒 钟 ， 使 其 重新 洲 解 将 溢 液 “ 稀释 到 0.15M, 使 沉 尝 再 析出 。 用 转 离 方法 收集 沉 演 ， 并 用 少量 东信 水 迅速 洗 桨 一 次 。 如 果 需 要 干燥 的 制品 , 则 最 好 在 冷冻 状态 下 干燥 。 上 壕 制 备 方法 及 其 改进 法 均 依 彼 应 用 于 从 多 种 粗 答 中 制 ie CREA. HbA he Aa, eA “FAS EAC ERIKA AEE (A, See 所 的 制备 , SF Sal) 2 A Se Bn bad FP till FCB , 就 需要 用 不 同 的 方法 ， 例 Ao FA Ra BIA Fe SE Doty 和 Zabay” @ Xt _b aA ee YE BY ll BL HE FT Sat, ER EA Aik ae BR BER PE, ， FEVA TP ARE SEE. HUT AeA A a “ 是 : (1) REPRE AARNE FE 0.08% 以 上 , (2) 9 0.16M fe ， 钠 溶液 或 乙醇 沉淀 核 蛋 自 ， 或 (3) 使 盐水 洗 过 的 沉降 物 在 水 中 与 用 Doty 及 Zubay®” yy Bea w NZ ee ya Hives YS 20 g Seif. TRATION DBE, He +5 200 ml 47 FY pH 8 Ay 0.075M Se {LAraves HAN 0.24 乙 二 胶 四 乙酸 钠 洲 液 及 几 渍 辛 醇 所 钥 成 的 上 混合 液 在 高 速 绞 隘 器 中 打 成 匀 浆 (在 蒂 秩 时 先 以 一 个 转 速 开 动 分 外 然后“ 再 用 仅 足 以 产生 提 拌 的 极 慢 速 度 再 携 拌 3 分 钟 )。 用 粗布 报 港 与 浆 ， 臣 流 以 2000 再 /分 的 转速 畏 离 20 分钟。 再 将 沉降 物 放 在 同体 积 的 游 液 中 用 高 速 绞 “ 碎 器 打 成 匀 浆 ( 慢 速 揽 择 3 分 钟 ) oO 如 前 再 用 离心 机 圭 离 ， 倾 册 上层 清流 。 重 _ 浆 前 放 填 过 久 和 多 浆 得 太 慢 。 用 下 述 方 法 取得 的 \ 在 pH6.8 的 ， 0.0007 PERRO HUE AYA DRE BAIT SEROPERAVENE 6 2. EAVES MED TeRERERS th 5 7AM, a 3 WE, 起 和 初 用 50 ml 7k, PRENZE LAD SH PY IN7RBY 1 Ft. pietiaieips os Piast 1 hy, Aa Xt pH 6.8 的 0.0007 磷酸 钙 深 液 进 行 透 柏 。 Doty 和 Zubay 主要 根据 颗粒 大 小 和 /了 比值 的 测定 ， 认为 用 上 渡 方法 可 以 获得 染色 体 的 主要 结构 单位 ， 工 且 核 蛋 白 示 论 在 EAE TEER Be AR 13 那 _ 方 面 都 没有 改变 其 原 求 的 “天 然 ， 状态 。 但 是 ,这 种 方法 最 近 人， 人 人 液 的 存在 ， 疑 胶 的 形成 是 不 可 避 允 的 ， 而 这 种 现象 是 未 受 损伤 的 腊 氧 友 糖 核 蛋 白 存在 的 特征 。 在 这 里 脱氧 成 糖 核酸 很 可 能 是 以 共 。 bem 自 部 分 相连 ea。 因此 他 们 认为 Doty 和 Zubay 所 和 采用 ”的 制 取 方法 会 产生 一 种 由 几 种 租 分 所 和 成 的 复杂 愧 质 ,与 Minky 和 Pollister™ 以 及 Mirsky 和 Ris®” 原先 所 获得 的 桨 色 体 并 无 区 ” 别 。 因 此 他 们 作出 这 样 的 推断 : Doty 和 Zubay 所 认为 他 们 的 方 BAF Ui i ty EL AZ SC "ap | RSS ETE BETA OR, TE I 所 用 的 溶液 都 必须 具有 接近 中 性 的 pH 值 。 因 此 提取 所 得 的 产物 是 的 锁 夫 不是 于 的 术 本 这 伯 事 和 现 在 已 得 到 普 洒 的 夭 。 认 ,虽然 这 样 的 制备 仍 常 彼 不 大 让 确 地 称 为 核酸 的 制备 。 提取 用 RRR S K BAILA 2 RTH “杂质 ， 以 及 友 糖 核酸 和 无 机 盐 等 ; 一 般 而 言 , 在 所 用 的 方法 中 应 当 ， 只 采用 温和 的 试剂 。 此 外 象 上 面 所 改 的 ,加热 、 加 酸 、 加 碱 以 及 过 人 ” 程 中 要 避 锡 加热， 而且 在 以 后 配制 供 物 理化 学 研究 用 的 溶液 时 也 . 需要 如 名 加热, Hy Peacoke™! 全 指出 过 ， 在 110?0 TRATE | PER A SAAR MY AE Ht.. 最 近 , 主 要 根据 Thomas™ JAA IESE EE EE ORE, 已 光明 自在 低 江 度 的 核酸 盐 深 液 中 使 氧化 钠 或 其 他 中 性 无 机 盐 的 省 度 降 (EB) 10-°M 以 下 时 ， Ma 使 用 彻底 的 透析 使 觅 氧 友 精 核酸 溶液 中 的 氧化 钠 含量 降低 到 这 限 值 以 下 的 做 法 必须 避 有 驶 。 除非 用 极其 概略 的 间 法 ， 否 则 是 不 可 能 提出 一 个 满意 的 制备 14 | 第 二 章 核酸 的 提取 方法 的 标准 。 因 此 虽然 已 沟 知 道 一 个 满意 的 制备 物 必 须 只 有 高 的 PEER, 它 的 水 溶液 又 必须 具有 高 的 粘度 ,但 仍 无 法 提出 所 要 求 的 准确 分 子 量 和 特性 粘 数 。 虽然 如 此 ， Ohargaffasl gin 出 一 个 有 用 的 标准 , 工 已 成 功 地 为 好 几 个 实验 室 所 采用 。 这 就 是 在 pH7 时 含 有 和 氧化 钠 (总 度 >10-31 ) 的 腊 氧 友 糖 核酸 的 洲 液 在 257 和 261 mp 之 问 的 紫外 最 大 吸收 的 <(P) 值 必须 在 6600 F245 [ec\ 了 ) 表 示 每 克 原子 磷 的 消光 系数 ] 。 LS AALS BOL AP HE EA BR FY TES TED, ACEH (GUE REL) 以 干燥 固体 的 状 。 态 , 或 更 好 地 以 溶液 的 形式 分 出 ,然后 再 除去 蛋白 质 而 提取 出 腹 氧 友 久 核 酸 的 钠 盐 。 除 去 蛋白 质 的 主要 方法 共有 四 种 。 Hammarsten 0! 提出 了 一 种 方法 ,以 后 Signer 和 Schwan- der 双 加 以 改进 。 在 这 个 方法 中 ， SRP RE Fi pete Ha, ACSA E AORN ED Fe LUE HR. 2 SEO RP ea esc # 这 个 方法 没有 被 广泛 采用 ， 可 能 是 因为 使 蛋白 质 沉淀 所 需要 的 时 间 太 长 ,并 且 最 后 的 疲 量 看 白质 仍 不 易 除 尽 。 Gulland、Jordan 和 Threl 便 ]lea 采用 了 Sevag’! 及 Sevag、 Lackman 和 Smolens"5! PTW AYE 以 除去 任何 溶液 中 的 可 溶 : 济 ”性 蛋白 质 。 这 个 方法 是 将 含有 少量 去 泡沫 剂 ( 如 友 醇 ) 的 黎 液 与 氧 “ 2 仿 或 四 氧化 碳 共同 的 振 。 这 样 就 产生 了 一 种 稳定 的 凝 胶 ， 而 蛋白 RBI FES FL REBENCFERS LDL" LES Hie, AT WS Yes eth Bs Be & a ee 者 要 除去 所 有 的 蛋白 质 , BBE 行 多 艾 这 样 的 乳化 作用 。 虽然 这 个 方法 存在 一 些 缺点 , 但 是 可 以 得 到 没有 蛋白 质 的 胸 氧 友 糖 核酸 现在 最 常用 的 方法 是 用 阴离子 型 去 污 剂 解 离 核 丐 自 揽 公吨 二 村 使 蛋 自 质 沉淀 。1988 年 Sreenivasaya 和 Pirie 首先 采用 雪 面 活性 物质 分 离 烟草 花 叶 病 毒 中 的 蛋 自 质 和 核酸 。 所 用 的 阴离子 MTG AE Ee gh, Ll 后 在 1940 年 Bawden 和 Pirje!7l 双 nie DY , 当 有 碱 存在 时 ， 硫酸 十 二 酯 钠 能 立 朗 使 核酸 从 几 种 病毒 的 蛋 白质 中 分 2 但 是 在 1951 年 Marko 和 Butler5s) 及 Dounce_、 Sim- SS —_———— ee ‘mons 和 Kay®” 提出 采用 硫酸 十 二 酯 钠 以 前 ， 这 个 方法 没有 被 发 、 AHSAN HE. DL JG Dounce, Simmons 和 Kay | SAAR T WMA TE", WIL Dae TT BIZ HOR FH BAR iD — Bia SPs ee HE BAR I, (ELL BA BAO Ve 9 , BE A Ds 75 a EO 这 种 方法 通常 能 产生 一 种 无 蛋白 质 的 制备 物 ， 虽 然 不 一 定常 常 如 此 “。 如 能 接着 再 用 一 次 氯仿 -乳化 方法 , 则 更 能 保证 得 到 不 含有 ”有 蛋 自 质 的 制备 物 , 虽然 这 和 井 不 是 克 常 需要 如 此 (参见 下 面 )。 最 后 一 种 方法 是 Butler 、Oonway 和 James! 所 用 的 酶 降解 去 除 蛋白 质 的 方法 。 这 个 方法 除 在 Butler HY Seba SP bu Ft, 还 | RAB ERA} Pike Oa TE. HATS HE HE Kay, Sim- _ mons 和 Dounce” 所 用 的 阴离子 型 去 污 剂 沉淀 蛋 和 白质 的 方法 , 因 ”为 经 欢 证 明 ， 这 个 方法 可 以 生成 一 种 没有 分 级 作用 或 很 少 分 级 作 用 的 可 以 复制 的 腹 氧 友 糖 枝 酸 制品 。 井 且 它 还 有 一 个 优点 , 即 阴 离 了 于 型 去 滞 剂 既 能 解 离 核 蛋 白 络 合 物 使 它 分 离 成 为 核酸 与 蛋白 质 ， ”同时 又 能 使 蛋白 质 沉 证 。 至 于 其 他 方法 ,例如 氧 仿 - 凝 胶 方 法 , 这 ”似乎 是 只 有 丢 解 离 出 来 的 蛋白 质 才能 成 疑 胶 而 被 除去 ， 卉 且 为 了 种 使 解 离 ,需要 有 高 江 度 的 氛 化 钠 溶液, 可 能 同时 还 需要 用 乙醇 来 —— me es 沉淀 核 蛋白 糙 合 物 。 DT ELMS STORING, AIOE 胶 中 含有 核酸 。 用 阴离子 型 去 活 剂 的 提取 方法 将 50g 新 鲜 的 小 牛 胸腺 切 往 ,在 高 速 绞 碎 器 (Waring 攒 拌 器 ) 中 与 200ml 多 准 的 含有 0.01W 柠檬 酸 钢 的 0.9% 氧化 钢 洲 液 共同 搬 拌 工分 钟 使 成 匀 浆 (Kay, Simmons 和 Dounce!) HEHE HEHE 3 分 钟 ,但 为 了 避 如 降解 , 提 拌 的 时 ” 立 应 尽量 竹 短 )。 将 匀 浆 在 0"C 下 ,以 2500 转 / 分 的 转速 转 离 30 分 钟 ， 弃 去 LEK. BUM Sate RRA Roa, AVS Dp he 离 , FOREARM EA. VERRY A 1 Stk AY 0.9% SE SPA YC TE SERS PIT 1 Ph, POURRA KEE FEMA 90 ml 去 污 剂 RE Gy: 100 ml 45% AE SOAR AREA Oe), NIM DIEEE. A TAE RR HR ERE RSA He R 15 ee * a 六 se is +. , rae = ' car as 16 第 二 章 核酸 的 提取 a SUE EESET FIZURE 3 小 时 。 ZEREPRREEH, RE AON | TREK. 加 氢化 钠 55 g GEYEIE Th SUSAR BEZEY 1M, BORE OPAIIORG BE 著 下 降 。 ARSUYE 5~10 分 钟 以 保证 氧化 钠 完全 洲 解 。 ULSAN EAT 超过 这 个 限度 , AAR S ER GAT H 将 溶液 在 室温 下 以 2500 转 / 分 的 转速 转 离 (或 在 更 高 的 转速 下 使 产生 更 “ 澄清 的 上 层 液 ) 以 除去 蛋白 质 沉 降 物 。 加 乙醇 (95%) 于 上 层 清 液 中 并 同时 加 “ 以 撑 拌 。 这 样 就 生成 一 种 高 度 凝 胶 状 的 沉淀 , 这 个 沉 兴 逐渐 失 水 变 成 白色 的 ， FEM, CTU, 挤 去 包含 在 沉 尘 中 的 上 层 液体 ， 然后 用 95% 乙醇 将 沉 洽 洗 潍 三 区 , 再 用 丙酮 洗 潍 , 直 至 洗 滩 液 不 呈 混 波 为 止 。 “ 将 粗 制 品 在 空气 中 于 燥 ,产量 狗 2g。 粗 制 品 中 含有 少量 蛋白 质 素 质 。 在 室温 下 将 此 粗 制 品 悬 学 于 700 ml 燕 馈 水 中 并 快速 揽 拌 GS-2 小 时 ) 使 3. 其 溶解 。 当 溶解 完全 后 ,加 去 污 剂 洲 液 63ml, HARE Lat. SILA 45 g GEYSHRANSU CSIR BESS y TI 然后 以 13000 转 / 分 的 转速 转 离 至 少 工 小 时 。 取 出 上 层 清 液 , 加 太 等 体积 的 95% 乙醇 使 腕 氧 戊 糖 权 酸 盐 析 出 ， 并 将 其 洗涤 如 前 。 将 产物 放 在 700ml 燕 馆 水 中 ,在 室温 下 搬 择 工 小 时 使 再 游 解 。 加 SALSA 6.3 g 使 游 液 的 氧化 钠 省 度 变 为 0.9% 。 在 这 个 溃 度 下 制备 物 下 的 任 ， (PERNA RAMS ED BEARER. HRW Ze ST FL) 13000 i/ RS Tobey, MRUMbSA35s, BERRA REE ERA) LM 再 在 提 拌 下 小 心 加 太 95% ZEEE ARERR TL 出 。 所 产生 的 纤 礁 状 产 物 如 前 法 用 乙 栈 洗浴 ADP, 直到 琴 羡 洗 液 ” TATSA Ik, AURTEZE AUR TIRE 1.3~1.4 克 )。 5 — Fi BE Dy IE EME ANIL PAB J EEE PIR ARCS RD A oe BRERA 9% CERAKLEH, SUED bE. A PARR A SSE ITS RH HP Le HES IR ERT AR FEM LM 所 化 绍 洲 液 中 沉 演 出 时 , 则 这 种 沉 演 方 法 显得 特别 有 价值 。 下 列 方 法 最 初 是 由 Gulland、jJordan 和 Threlfall'®” 在 极 2 x Bue PREAH (rH 54.5 kg 小 牛 胸腺 开始 ) 。 因 为 这 样 规模 的 制备 ARGS, MATIC, RULE ALP ey 法 。 这 个 方法 和 Chargaff” prong HAs 用 湾 氧 化 纳 盗 波 提 取 的 方 革 ; 用 所 仿 - 凝 胶 方 革除 去 看 白质 加 - 整个 操作 过 程 都 要 在 4°C 冷 室 中 进行 。 将 250g 新 鲜 小 牛 胸腺 切 碎 ,并 ce. ae beat 和 与 500 ml 含有 0.1X 氢化 钠 溶 液 和 0.057 perf et a PERRIER PEHE 1 Sp ShH MEV. VER KAY PH 必须 调节 到 6.8 与 7.0 之 % “Hf. Ze 2500 转 / 分 的 转速 转 离 下 所 成 的 沉降 物 用 拨 化 纳 - 梯 榜 酸 纳 溶液 通 过 ， 制 成 匀 浆 的 方法 洗 潍 两 次 将 这样 处 理 的 组 织 有 尖 在 1250 ml 10% SU LSA ， 液 中 制 成 匀 浆 ,这 时 溶液 的 粘度 显著 增加 。 在 提取 48 小 时 后 , 将 溶液 用 粗布 4 =| 质 co， 54,65] F750 ¢ 小 千 胸腺 切 隆 ,并 与 1.5 升 含有 0.101 siCeaneiieRn 005m pe 汪 RRBRSIEC MLE UH AB TEREDERE HIT LAIR. 将 用 2500 转 / 分 的 转速 转 离 HIE , F-7E Sharples 离心 机 中 以 20000 转 / 分 的 转速 转 离 ,使 溶液 澄清 。 将 澄 清洲 液 加 入 到 工 .5 倍 体积 的 乙醇 中 , 使 杷 蛋白 烙 合 物 沈 出 。 沉 浣 用 转 离 证 法 或 将 其 邦 粒 在 插 棒 上 收集 起 来 ,然后 再 依次 用 70% 和 95% CEB, Hos ”在 芙 空中 干燥 。 将 楼 蛋白 用 快速 携 拌 使 其 悬 活 于 2 Ft 10% BA L 钠 涛 波 中 。 NRA US SABER, By VBE Ae APPR RA 将 等 体积 的 毛 仿 - eR Ak (He 3:1 YEAS) Jn A BULA HELE RSE RS BPE 30 秒 钟 ， ”使 成 匀 浆 ,再 用 2500 转 / 分 的 转速 转 离 。 MO LK, 重复 进行 此 项 去 除 有 蛋白质 的 手续 ， 每 次 减少 氮 仿 -成 醇 混 合 液 的 用 量 ， 直到 在 水 -氯仿 的 界面 层 申 波 有 凝 胶 为 止 。 这 样 的 操作 通常 需要 进行 8 一 12 次 。 将 上 层 清 液 加 到 两 AEA 95% 乙醇 中 , 收集 所 得 的 沉淀 挤 去 水 分 , 然后 依次 用 70% , 90% 乙醇 和 无 水 乙醇 洗 次 。 最 后 在 项 空 或 空气 中 干燥 。 用 姬 氧化 铅 座 六 提取 的 方法 ; 用 氧化 纳 使 从 该 全 和 以 除去 看 ， 所 得 的 沉降 物 以 同样 的 方法 用 氧化 纳 - 榨 榜 酸 纳 溶液 再 洗 潍 两 次 。 将 这 样 处 。 理 的 租 粹 悬 兆 在 2 升 10% 氨 化 钠 深 波 中 ,放置 48 TFA DE. HE ARTEL TREE A 10 倍 体积 的 水 中 ,并 在 离心 机 中 转 离 以 分 出 况 泛 。 将 。 所 得 的 模 蛋 白 湾 解 于 5 Ft 10% 氮 化 钠 溶液 中 ,加 拨 化 纳 使 其 他 和 , 并 油 整 潜 液 的 体积 使 达到 6 升 ,并 在 0°C “FRE 了 2~14 天 。 Hye 1.5 升 含有 500g Celite 545" Ay RPP HpAy HAN LEAVE I A BIE DREAM, BEET, GEVTVEZE Hyflo-supercel** 的 帮助 下 用 燃 烙 玻 璃 漏斗 ( 孔 达 No. 4) 吸 洪 。 将 站 液 透析 ,使 所 化 钠 的 溃 度 降低 到 I Ze 右 ， 然 后 将 其 加 到 两 倍 体积 的 乙醇 中 以 沉 演 腊 氧 成 糖 楼 酸 俩 。 收 集 沉淀 ， He # 一 种 硅胶 助 焉 剂 ( 译 者 注 ) ** 一 种 助 滤 剂 ( 译 者 注 ) 18 第 二 章 核酸 的 提取 * 水 分 ,用 T0% ZIM EHUCK AE IRR INTNE FEB ZPFIR. WHT BBE SUE REA DWP EK, 24 bat NRE DIES ER Ae a, BURR Ze 1.8 FHKE + RSX, 并 在 0°C FRB, STEROL PS. ZEEE TSB LEB PMA 20% SULEAK oul, HBB, AAS 心 方法 将 其 集 取 , 用 1% BULORATAVENE DTI IK, FFG 500 ml 10% SU bsy VARA RS. IBS AMA, FPR AABN 5 TAOS 溶液 中 。 在 0"C FBHE 3 天 后 , HITE Ay At ze Hyflo-supercel 的 帮助 下 用 燃 千 玻璃 漏 污 ( 孔 率 No. 4) 如 前 法 吸 滤 。 FA URSA SATE ITT 5 FA BULA IEDs Bg ”将 500 g SRR) FOP, REE. “ARERR ATR PF 3 Ft 0.14 氧化 钠 洲 液 中 ， 并 在 高 速 粹 碎 器 中 携 拌 30 Poel a IR, 静 置 过 夜 后 将 此 混和 物 以 2200 转 / 分 的 转速 转 离 40 分 钟 。 弃 去 上 层 清 液 。 将 PRS RET 1 Ft 0.14 SCS PT RAK, FD SLE RTE PRET, SEAT ASIN TH RAG 90 分 钟 。 将 沉淀 在 1.5 升 0.14 ASR PEER AR. FECES Fm - 20% RALSVAE 1.5 Ft, BBN, 将 溶液 的 pH 调节 到 7 了 .4~7.8, 然 后 以 24 小 时 的 间隔 分 两 次 加 胰 乳 蛋白 酶 200 me, ZIMA 100mg, HV 液 在 室温 下 静 置 过 夜 ， 然 后 用 粗布 过 滤 。 滤液 加 70% CE 9 i Se 核酸 钠 沉 出 , 井 用 70% 乙醇 洗涤 。 ULE TAS 3 升 蒸 馆 水 中 。 在 5*C 下 对 水 透析 一 星期 ， 每 天 换 水 一 Ko WEN PAG LATS RPP, ERAGE ae JL. Ky HAG IS BAM Celite CE REMETE. ZEAE THEA dn aan ESP i 40 ml, 再 加 等 体积 的 98% ZARA. STS HERTIE AE 10% CBRNE 3K, AKC 2K, MVE 2K, RRR BAC GREIF IR. Hh ARH Be , 虽然 上 述 几 种 方法 只 需 稍 加 修改 或 不 加 修改 序 能 用 于 从 大 多 数 哺乳 类 动物 组 役 中 提取 觅 氧 友 糖 核酸 钠 , 但 是 要 从 其 他 来 源 中 ， 特别 是 从 微生物 、 病 毒 、 植 愧 胡 积 及 精子 等 提取 核酸 盐 时 , 就 需要 a a w w td ee Beer 胶 氧 友 糖 核酸 钠 的 提取 19 ”特别 设计 的 技术 操作 。 最 初 使 用 避 腕 使 制备 物 降解 的 方法 从 微生物 中 提取 出 来 的 肌 SCS, i JR ER UH vp Ly Ek (ET PE I eH PRO, 5k LOIRE Ne MAS REY HE AE PRN HY LE FARIS VA TRA IE SHE He, A -RERHERE 质 , 最 后 使 其 成 钙 盐 沉 出 。 还 有 斑 个 相似 的 方法 60 和 用 阴离子 型 去 活 剂 吗 的 提取 方法 均 便 应 用 于 从 Hemophilus influenzae 中 提取 出 具有 和 址 传 转移 活性 的 腊 氧 友 糖 核酸 。 ”虽然 在 这 些 方法 中 都 是 用 温和 的 洲 菌 方法 来 裂解 秋 胞 ， 但 大 — 多数 微 生物 都 需要 与 玻璃 粉 共同 研磨 或 用 研磨 机 处 理 作为 提取 前 TEAR, RAUL, 就 可 以 用 上 济 方法 中 的 一 种 ”或 将 上 迹 方法 稍 加 修改 后 来 进行 提取 @soro0。 一 个 满意 的 从 酵母 条 胞 中 提取 肌 氧 友 糖 核酸 的 方法 就 是 这 样 做 的 cm。 噬菌体 ， 特 别 是 以 偶数 衙 号 的 下 MIA, Se 的 良好 来 源 。 它 可 用 提纯 的 噬菌体 来 制 取 "9。 提 纯 的 方法 是 将 噬 ” 昔 体 在 95% 乙醇 中 沉淀 后 ,重新 悬 尝 于 0.2M 氧化 钠 溶液 中 , 用 ” 氛 仿 -乳化 法 除去 变性 的 蛋白 质 。 最 初 三 次 乳化 时 用 纯净 的 氧 仿 ， 随后 用 9:1 的 氛 优 - 辛 醇 混 和 物 作 为 乳化 剂 。 但 是 , 这 个 方法 除 用 “于 从 噬菌体 中 提取 脱氧 成 糖 核酸 外 ， 很 少 用 于 从 病毒 中 提取 脱氧 ” 友 糖 核酸 。 ag SAAD PPE EE BR A He 9 Sz BEB EP HH PRAISE; 这 种 污染 在 提取 纯粹 的 核酸 的 工作 中 至 今 还 是 一 个 不 可 克服 的 困难 。 虽 然 从 刍 和 海胆 精子 和 言 丸 中 提取 腊 氧 友 糙 核酸 可 以 按照 标准 的 方法 进行 ， 但 从 哺乳 类 动物 的 精子 中 ” 制 取 腊 氧 友 糖 核酸 时 却 遇 到 意外 的 困难 。 除 非 先 进行 某 些 降解 处 理 ,否则 就 不 可 能 用 湾 盐 溶液 从 哺乳 类 动物 精子 中 提取 出 核 蛋 和 白 。 例如 ,要 从 人 类 精子 中 制 取 一 个 合 人 满意 的 高 聚 核酸 ,就 只 有 上 先 将 腊 脂 的 人 类 精子 用 胰 蛋 白 酶 "9 (不 含 肌 氧 核糖 核酸 酶 ) 处 理 才能 得 到 。 但 是 ,从 公牛 的 精子 中 制 取 高 聚 核酸 还 必须 先 用 能 使 核酸 发 竺 降解 作用 的 毛 氧 化 钙 作 初步 提取 "9 。 cee ae 20 7 ats 核酸 的 提取 各 种 脱氧 戌 糖 极 酸 钠 制 备 方 法 的 比较 只 有 对 各 种 制备 物 溶液 的 性 质 进 行 条 车 的 物理 化 学 的 研究 之 后 才 有 可 能 对 各 种 制备 方法 的 产品 作出 适当 的 比较 。 这 样 客 整 的 3 ”研究 还 没有 人 做 过 。 但 是 还 是 可 以 找到 一 些 有 关 前 三 种 制备 方法 Ay Loe as MFRS, «Frick! 代用 Hammarsten 的 方法 ，Gul- land. Jordan 和 Threlfall WAH De Kay, Simmons 和 Dounce x FS Fa a ll BT 7S AP HBP SS REE SPE et oA SEPA, TIE 些 制备 方法 只 做 过 定性 的 研究 ， 而 且 这 些 方法 的 价值 只 从 其 产量 ， Ai. Bin lk, Frick 还 是 断定 用 Hammarsten 的 方法 通常 会 产生 一 种 混 有 有 蛋白质 的 制品 .从 Doty 和 Bunce” % Reichmann, _ Rice, Thomas 和 Doty"? 的 光 散 射 的 和 沉降 的 研究 ,以 及 Shooter — 和 Butlerral 的 离心 分 级 研究 都 可 以 得 到 比较 有 用 的 和 定量 的 报 道 。 用 氧 仿 - 凝 胶 方法 所 得 的 制品 其 分 子 量 比 用 上 gner(Haimnmar- sten) 或 Kay, Simmons 及 Dounce 的 方法 所 得 的 制品 的 分 子 量 都 低 。 因 此 这 好 象 在 生成 凝 胶 时 发 生 了 一 些 降解 作用 。 用 8gner 的 方法 与 用 Kay. Simmons 和 Dounce 的 方法 所 得 的 制品 其 分 子 ” 量 很 相近 。 从 Shooter 和 Butler 的 分 级 太 宪 发 现 用 氯仿 - 凝 胶 方 、 4 法 会 产生 显著 的 分 级 ， 而 用 ay、Simmons 和 Dounce 阴离子 型 ， 去 污 剂 的 方法 则 得 到 一 种 具有 和 核 蛋 白 性 质 相似 的 脱 氟 友 糖 核 酸 。 因此 可 以 断定 现在 最 好 的 制备 方法 是 Kay Simmons 4 Do- unce Pr B MHS FA BAS Fe 15 HIRD BS YR A He, ae 然 还 应 该 指出 ,到 目前 为 止 所 得 到 的 最 好 的 和 -射线 衍射 图 象 却 是 用 Signer 方法 所 得 的 制品 。 ey | FESR He th EY RY ET ER 质 。 这 种 沉淀 的 纤 锥 状态 通常 被 认为 是 制品 性 质 良 好 的 一 种 极 向 ;入 的 标志 ,因为 降解 了 的 制品 一 定 是 粉末 。 但 是 纤 蕉 状 的 制品 车 反 复 用 燕 饮水 溶解 ,然后 再 用 乙醇 沉淀 ,也 可 使 其 转变 为 粉 未 cm。 当 Tae ea ee ay Le CT ee ORS eT ARTE ” a yal hi DERE WIRE 21 ee eanio aE 核酸 就 变 为 可 以 溶解 在 乙醇 中 ,而 车 在 75"0 下 小 心 加 大 氧化 钠 于 它 的 异 丙 醇 溶液 中 , 则 可 使 核酸 成 粉 ， ”未 状态 沉 出 。 这 时 产物 仍 具有 很 高 的 聚合 程度 ， 虽 然 仍 有 可 能 产 年 一 些 如 Thomassa 所 述 的 那 种 类 型 的 不 可 着 转变 ， 因 为 它 全 猎 ”和 容 溶 解 在 低 于 10-3M 毛 化 钠 的 水 洲 液 中 。 用 上 述 各 种 方法 制 得 的 脱氧 友 糖 核酸 钠 中 最 可 能 存在 的 杂质 ”是 友 糖 核酸 和 蛋白 质 。 在 这 些 杂 质 中 , 戊 糖 核酸 的 去 除 较 为 麻烦 。 。 如 果 还 有 蛋白 质 存在 只 要 反复 采用 适当 的 去 除 蛋白 质 的 方法 序 ”可 将 其 除去 。 在 许多 动物 棚 答 中 , 友 糖 核酸 可 以 在 用 生理 盐水 作 初 ， es iret, HR IERT, Bilin WBA | Be 中 提取 核酸 时 , SESE AL AE” 中 提取 核酸 时 ,这 种 方法 就 | 次 有 效果 ， 井 且 提 取出 来 的 制品 是 一 个 腹 氧 友 糖 核酸 和 友 糖 核酸 ”的 混合 物 , 因此 必须 采用 其 他 的 方法 来 分 离 它们 。 到 目前 为 止 还 没有 闹 计 出 一 个 真正 完善 的 方法 ， 这 可 从 过 去 所 尝试 的 许多 方法 ” 中 看 出 。 它们 包括 : 用 冰 栈 酸 将 银 盐 分 级 沉 出 外; 将 钙 盐 分 级 沉 7 Hy (71,81) « FE Yak {48> ,67， Ti). FFA SAY ee ,8i] 或 对 碱 透 析 5 ,83] 除去 ”核糖 核酸 ; 车 是 分 子 量 较 低 的 友 糖 核酸 ， 则 用 活性 炭 吸 收 人 s' 归 ; 以 BARE PA ASHE TES 等 。 这 些 方法 很 少 不 受 到 批 | 永 的 :分 级 方法 不 能 做 到 良好 的 分 离 ; 电 泳 法 很 费力 而 且 分 离 不 完 是 人 至; 利用 核糖 核酸 酶 的 作用 会 产生 一 些 抗 酶 级 分 和 一 些 核糖 核 背 ” 酸 ,而 碱 会 使 腕 氧 成 糖 核酸 降解 到 某 种 程度 ,同时 会 使 皮 糖 核酸 水 。 解 成 核 背 酸 。 最 后 两 种 方法 似乎 比较 最 为 满意 。 成 糖 极 蛋 百 的 提取 成 糖 核酸 比 脱 氧 友 糖 核酸 对 酸 、 碱 的 作用 更 不 稳定 ,因此 在 提 “ 取 戊 糖 核酸 及 其 核 蛋 白 的 方法 中 都 同样 必须 只 能 采用 温和 的 起 剂 。 过 去 所 采用 的 利用 酸 、 硕 的 方法 会 生成 降解 斑 物 ， 因此 将 不 再 诗 论 。 友 糖 核酸 在 和 胞 中 所 分 布 的 区 域 比 胸 氧 成 糙 核 酸 广 。 虽 然后 _—s eee 2 22 第 二 章 核酸 的 提取 者 几乎 只 能 在 壮 胞 核 中 找到 而 前 者 则 在 灿 胞 质 和 锈 胞 核 内 都 有 。 翔 胞 核 中 的 戊 糖 核酸 鸥 占 竹 胞 内 核酸 总 量 的 十 分 之 一 ea gg 中 大 部 分 的 成 糖 核酸 是 以 核酸 - 脂 蛋 自 复 合 物 的 形式 存在 于 显 往 必 物质 的 部 分 中 ,虽然 在 其 中 也 有 一部分 是 可 洲 人 性 友 糖 核 蛋 白 。 PERL By LS HFT DLA ll We A HALAS HP Fe HS op 的 方法 分 出 。 用 分 航 离 心 方法 分 离 粗 菱 匀 浆 时 会 产生 核酸 - HERA, PORDAS Tt FT DURE ALA AEB ED KGET, BRAG HE Iya 有 可 溶性 核 蛋 白 和 颗粒 状 物质 的 混合 物 。 ais ¥ HAAR EOE ERR, ADE ELH 70a Be FY LSD Ap es th BER SS OLY Ti EL. | 要 将 所 有 用 于 提取 友 糖 核 蛋白 的 方法 一 一 加 以 叙述 是 不 切实 际 的 。 象 提取 股 氧 友 糖 核 蛋 日 一 样 , 没有 一 种 是 广泛 适用 的 方法 。 因此 选 择 了 几 个 典型 的 制备 方法 叙述 如 下 : ”用 0.14M StL NPAs ede ax By Ty JOT sa ee sn #5 900.8 AERO TIBE, PPLE 1.6 Ft 0.140 Sessa, Hofer EERE ET BD ASHI AMEE EE ILS, 然后 在 离心 机 中 转 离 .在 所 得 到 的 租 带 凶 白色 的 上 层 清 液 中 加 10% REDE DH 至 4.2， 这 时 有 大 量 沉 活 出 现 。 将 沉降 物 用 离心 方法 分 出 ,并 用 0.5 RLSM He, 继 用 水 尝 ， 起色 洗 液 中 不 含有 氧 离子 为 止 。 再 将 沉降 物 悬 将 于 水 中 , 小 心 加 入 0.50 ge PRESSES. HTT TL AMEN ABLE 500 ml, 所 得 洲 液 在 离心 宙 中 以 10000 转 / 分 的 转速 转 离 使 其 漆 清 ， 再 在 pH 4.2 -FpeyrpERe HS. 重复 这 种 手 SAK. 将 最 后 所 得 的 溶液 对 水 进行 透析 ， 并 使 核 蛋 白 在 pH 4.9 下 沉 出 。 所 得 沉淀 依次 用 70% CEMAKC NE, RE RARAS Pie, 用 0.5 M 氯 化 钠 洲 液 洗 潍 的 目的 是 要 除去 含 在 第 一 次 沉 洗 中 的 脱氧 友 HERA. Kerr 和 Seraidariantss) 指出 ， 若 使 这 些 腺 体 不 是 在 高 速 蒋 碎 器 PIT RAD, Ti PEE PBL ep, ERS TETE FSU ESRI HE rR Spy RARE, UR AME PERT BS, 这 样 从 碳酸 氨 钠 洲 液 中 重 BITES E BURA MDBE. 这 种 省 略 是 有 利 的 ， 因 为 在 这 个 操作 过 程 直 TIME PEA ey pp es | Stanley's"! 原先 是 用 盐分 级 的 方法 提取 烟草 花 叶 病毒， 这 个 方法 便 成 功 地 应 用 于 好 几 种 病毒 核 蛋 白 的 制 到 。 虽然 Hamoir 全 : PRET A EI : 23 RE HFG A 0 UL Ue BD ULER EA, ARE EPEAT IE PE HEI, MA BP EH — | ANA PI Markham 和 Smith” fy ers se Hote ME HE ”了 到。 这 种 病毒 特别 合 人 感到 兴趣 , 因为 当 用 乙醇 使 蛋白 质变 性 时 就 很 容易 得 到 其 中 所 含 的 友 糖 核酸， 并 且 还 因为 在 这 种 病毒 中 仿 ABATED AR (22%) 。 | , SOWEE-FEA NHL PHI T SE, LOH IEE fb Brassica carinata A Pp bE Fh RR RE HE, AiR RE SOA EF EN — AE HL I, “通常 ,从 老 的 或 “ 硬 ， 的 植物 制 取 病 毒 比 从 正在 很 快 生长 的 ' 软 ?的 “ ”和 精 虱 制 取 病 毒 可 以 得 到 更 高 的 产量 。 全 从 生长 于 露天 中 而 发 育 补 阻 的 敬 戎 类 植物 中 制 取 病毒 ,每 升 计 液 中 病毒 的 产量 高 于 1g, 但 从 花房 中 的 植物 制 取 病 毒 通常 产 棕 都 在 每 升 200~500 mg 之 问 。 二 Ba ART PEAS ERATE IE ISLS RTS AC Hy EE PIE HE. A Fi FASE FAIRER, UGE 7K FPL HERB HE HH pH se HTE 5.7. ZEEE FRSSITHK 300 ml AYE PIPES AN 95% 乙醇 于 着 液 申 使 其 澄清 。 所 加 大 乙醇 的 量 差不多 达到 临界 值 ， 因 此 必须 小 心 量 取 。 这 时 所 形成 的 大 量 沉 尘 应 立 序 放 在 离心 机 中 用 低速 (3500 转 / 分 ) 转 离 15 分 钟 。 取 相当 于 澄清 汁液 一 个 体积 的 包 和 硫酸 钞 洲 液 加 到 上 层 清 液 中 将 其 BE, 最 好 过 夜 。 几 小 时 后 在 溶液 中 就 出 现 大 量 的 租 小 的 八 面体 精 晶 ,并且 ATE MA; 同时 还 可 以 看 到 许多 具有 高 度 折 光 能 力 的 双 折 射 唱 ” 体 。 这 些 晶体 是 无 机 盐 , 随 后 应 将 其 除去 。 用 离心 方法 以 3500 转 / 分 的 转速 转 离 30 分 钟 ,收集 精 晶 沉淀 , 但 上 层 清 液 在 肯 置 一 两 天 后 往往 会 析出 第 二 批 千 唱 ， 因 此 应 将 其 保存 。 此 外 ,要 将 所 有 的 四 小 烙 晶 都 用 离心 方法 分 离 极为 困难 , 因为 这 些 直 小 的 精 唱 在 溶液 中 不 很 紧密 , 因而 析出 很 慢 。 将 含有 病毒 和 许多 不 溶解 物质 的 车 晶 沉 演 再 悬 海 在 少量 的 水 中 ( 原 汗 液体 积 的 TV/10 至 也 多 或 柳 冲 溶液 中 ,然后 再 放 在 离心 机 中 塌 离 以 除去 不 溶解 物质 。 这 种 使 病毒 沉 屿 、 继 以 重新 将 车 唱 溶解 、 然 后 再 放 在 离心 机 中 转 离 以 除去 四 胞 碎片 的 手续 需要 反复 进行 儿 次 。 在 顺利 的 情况 下 ， 在 这 个 阶段 所 制备 的 病毒 已 相当 炖 次 。 24 第 二 章 核酸 的 提取 有 好 几 种 方法 可 以 用 于 进一步 的 存 化 。 现 在 所 用 的 方法 是 用 胰 蛋 白 酶 将 病毒 消化 ,然后 用 市 售 的 胰 诅 出 液 (10 mg/ml) 处 理 , 再 加 几 消 毛 仿 作 防 腐 Fl, 在 保温 箱 中 保温 几 小 时 , 即 可 将 一 些 杂 质 除 去 。 将 病毒 重 知 撮 儿 次 后 可 将 所 含 的 酶 除去 。. 提 炖 的 病毒 常 合 有 棕色 色素 ， 这 可 以 在 病毒 在 稀 乙 醇 深 液 中 糙 品 时 除 去 。 将 含有 锡 5 mgyml 的 病毒 和 痕 量 毛 化 钠 的 游 液 渝 却 到 O°C, AEE TR IMA 0.25~0.30 体积 的 无 水 乙醇 。 当 乏 清 加 入 由 20 ml 无 水 乙醇， 10 ml | 冰 醋 酸 然后 用 水 稀释 至 100 ml 配 成 的 游 波 时 ， 病 毒 洲 液 即 变 为 混浊 。 车 使 ， 将 此 溶液 加 热 ， 混浊 即行 消失 。 若 使 将 此 洲 液 在 0°C 下 甫 置 儿 小 时 ， 则 病毒 成 粗 小 的 、. 具 有 双 折射 的 针 状 精 唱 析出 。 在 冷却 下 用 离心 方法 将 这 些 精 晶 分 “ 出 (这 些 灶 晶 在 初生 成 时 ,可 以 在 室温 下 洲 解 )。 也 可 以 将 溢 液 在 1*C 下 孝 置 几 天 ; 此 时 郎 可 看 到 大 量 精 日 附着 在 容器 底部 , 于 是 母液 可 以 很 窜 易 地 倾 出 。 将 所 得 辕 晶 溶解 在 0.1M 磷酸 级 二 钠 深 液 或 中 性 番 冲 液 中 ， 因为 车 用 清水 洲 解 会 产生 混 直 的 悬 郊 流 。 此 时 含有 不 洲 解 的 带 有 色素 的 物质 ， 可 以 用 离心 广 法 以 5000 转 / 分 的 转速 转 离 除去 。 SB tk TAAL A RR BO, AEE op HE, BRENT TE ee eee ee ee We Hata 并 将 其 在 一 12"C Fk. MWILA TORE. PRT 3% 重 量 的 磷酸 氮 二 钙 配 成 省 度 为 5095 HAE SIH REA. QS 从 这 个 痊 却 的 \ 但 已 充分 融化 的 浆 块 中 梯 出 汁液 。 将 汁液 用 Celite SHIRDIEE 、 去 粗 红 粒 的 生 色色 素 和 外 来 杂质 , 并 在 离心 机 中 以 20000 ~ 30000 i /4p Aye 速 转 离 30 分 钟 。 这 时 病毒 形成 小 团 块 沉 出 。 蛮 去 实际 上 已 不 含 病毒 的 王 层 清 液 。 将 小 团 块 病毒 洲 于 少量 燕 馆 水 中 。 合 并 病毒 小 团 块 溶液 , 在 角 式 离心 机 中 以 3000 转 /分 的 转速 转 离 30 分钟 以 除去 炮 色 色素 和 不 溶性 胶体 物质 。 将 此 售 “ | ARNE RM AES DAWEH. =e BIB AE SAI HT RK, ARASH F, RBS ee Oe 离 所 得 的 病毒 小 团 块 游 于 0.1 调节 至 pH 7 ABREU BS 燕 馆 水 溶解 后 两 欢 用 高 速 转 离 所 得 的 病毒 小 团 基 ,可 以 使 病毒 中 的 炮 色 色素 愤 好 地 得 到 分 离 。 所 有 用 作 元 素 分 析 的 制品 都 应 当 对 流动 的 燕 馆 水 透析 48 小 时 ,以 进行 进一步 的 提 钝 。 每 升 着 液 中 的 纯化 病毒 小 团 块 产量 为 0.1~0.4gs De REA ER ANS He AR 25 Dee AR HY be HR AREA DE HT ER TBO A Ze _L U | HORS FRET BER DARED, WHS ASE IA Ae 核酸 特别 丰富 的 酵母 中 制 取 。 但 是 ， 要 提取 友 糖 核酸 必须 先 使 酵 ， 。 母 的 竹 胞 壁 破裂 。 在 过 去 一 般 所 用 的 方法 中 常 采用 碱 溶液 , 因此 无怪 所 得 的 制品 通常 都 具 低 的 分 子 量 。 近 来 便 发展 了 几 种 温和 的 “入 法 以 制 取 聚 合 度 较 高 的 核酸 。 但 是 , 戊 糖 核酸 的 解 聚 不 仅 可 以 ， 在 用 化 学 哉 剂 提取 过 程 中 产生 ， 同 时 也 可 在 用 酶 提取 的 过 程 中 产 ， 下 ， 因 为 解 聚 酶 一 “核糖 核酸 酶 通常 总 是 和 核酸 共同 存在 的 。 在 。 用 温和 的 步 又 代替 剧烈 的 化 学 方法 时 ， 必 须 注意 到 酶 降解 的 机 会 下 会 增加。 Bacher 和 Allen ”全 确切 地 疙 明 过 在 皮 粮 核酸 的 提 取 过 程 中 会 发 生 酶 降解 。 Olarke 和 8Schryverc9l ja 3¢ By FH Hy DL 10% Pea 溶液 在 es - 60~ 80°C F 42 I OF RE A IE NS EA HP A De RT _ Davidson 和 Waymouth"” ”应 用 以 提取 羊 肝 中 的 友 糖 核酸 。 以 后 。 Oharga 人 及 其 同 工 者 ”修改 了 这 个 方法 并 用 以 提取 各 种 动物 的 夺 ” 中 及 面包 酵母 中 的 戊 糖 核酸 。 Volsn 和 Carter” 叙述 了 从 动物 粗 积 中 制 取 戊 糖 核酸 的 一 1 般 方法 。 在 这 个 方法 中 利用 了 蛋白 质 可 以 溶解 在 2M 盐酸 有 溶液 ， 让 而 友 糖 核酸 则 在 准时 从 这 个 洲 液 中 沉 出 的 性 质 。 Grinnan 和 Niosherdoo 双 改 进 了 他 们 的 方法 。 已 沟 成 功 地 用 作 股 氧 友 糖 核酸 ”的 制备 的 阴离子 型 去 污 剂 沉淀 核 蛋白 溶液 中 的 蛋 自 质 的 方法 便 “ 航 Kay 和 Dounce™™ 上 发展 为 从 动物 钥 稚 中 制 取 戊 糖 核酸 的 通用 ”证 法 。 从 酵母 提取 友 糖 核酸 从 有 困难 ， 因 为 要 提取 这 个 核酸 必须 Se Ae AM ETE, Orestfield, Smith 和 Allendoa DUG Davis 和 A]lenttoal BY 3+ T —T HE DORN HUE, TEE HARUN VA Oe, FS SURE RSA, | 应 用 这 个 方法 提取 时 ， 则 生成 一 种 表面 上 看 来 是 高 分 子 量 的 白色 而 坚 人 ree 第 一 章 核酸 的 提取 韧 的 纤 礁 状 物质 , 它 的 产 率 相当 于 酵母 中 友 粳 核酸 的 60~70 % 最 近 信 有 人 报道 一 个 用 葵 酚 溶液 从 粗 徐 和 烟草 花 叶 病毒 中 提 取 友 糖 核酸 的 新 方法 ol 。 这 个 方法 似乎 具有 能 够 抑制 核糖 核 “ ′ 酸 酶 作用 的 优点 ,因而 产生 了 高 聚合 度 的 产物 ,同时 也 具有 能 够 在 提取 过 程 中 使 蛋白 质 和 觅 氧 成 糖 核酸 完全 除去 的 优点 。 应 用 这 个 方法 所 遇 到 的 唯一 困难 似乎 在 于 多 糖 的 完全 除去 。 信纸 用 过 各 种 各 样 的 方法 从 植物 病毒 中 提取 友 粳 核酸。 从 某 几 种 病毒 中 分 离 蛋 白质 似乎 比 从 其 他 病毒 中 容易 。 Cohen 和 Stan- ley 在 研究 烟草 花 叶 病毒 的 核酸 时 ， 用 加 热 的 方法 使 蛋 自 质变 性 ,因而 使 其 变 为 不 溶解 。Dorner 和 Knight 入 对 各 种 共 植 物 病毒 中 制 取 友 糖 核酸 的 方法 进行 了 系统 的 研究 。 对 番茄 铸 从 病毒 所 试用 过 的 方法 中 包括 酸 、 碱 、 醇 、 去 污 剂 、 蛋 自 水 解 酶 、 声波 振 动 .加 热 和 冷却 、. 盐 、 丁 醇和 和 氧 仿 、 盐 酸 有 以 及 在 低温 下 的 痊 凝 气体 等 处 理 的 办 法 。 只 有 两 种 方法 能 得 到 合理 的 产量 。 一 种 是 反复 冷 冻 和 融化 60 次 ， 继 用 盐 析 方 法 使 蛋白 质 沉 出 。 另 一 种 是 在 100"0 _ 下 用 硫酸 十 二 酯 钠 (Duponol O) 处 理 ， 然 后 再 用 盐 析 使 蛋 自 质 沉 出 。 冷冻 后 继 以 融化 的 方法 所 生成 的 产物 非常 不 均一 , Bi 不 用 。 用 硫酸 十 二 酯 钠 的 方法 所 得 的 糙 果 相当 满意 。 Dorner 和 Knight 认为 Bawden 和 Pirie” 所 令 述 的 一 种 相似 的 、 但 条 用 低 温 的 方法 并 不 适用 。 在 室温 下 加 乙醇 使 溶液 浸 度 达到 83% 可 以 PEACE RACE SESE! POL Te WITT TE. TA OAL HR TEC EE AR PIE AS REAR. ie Be BH Ne MAY We IES REI Aw eos TASTY eS Oe ac HE WL ML ARH EA J RDI NBL Sa Ae NRA RA AME PRP PEI DORR AE: CL) 将 脱氧 成 糖 配 酸 以 核酸 - 蛋白 质 复 合 物 的 形式 除去 ，(2) 从 2M Hh WR ON Ye Hb OE RAR TH, 而 大 量 的 蛋白 质 仍 洲 解 在 此 溶液 中 ，(3) FSR OG REG ade — 2 BE BR ~~ i aa ae, 成 糖 核酸 钠 的 提取 Ey: SRT) HT, DU EELAUH 3 倍 体积 调整 到 DH 6.8 的 0.15M 毛 化 绩 -0.02M 磷酸 盐 枫 冲 溶液 与 之 混和 ， 井 在 高 速 绞 碎 器 中 攒 拌 6 一 8 分 钟 制 成 匀 浆 。 同时 加 辛 醇 数 消 以 减少 泡沫 的 生成 。 所 成 的 匀 浆 放 在 离心 机 中 在 3000 g FREES 30 分 钟 。 此 时 实际 上 所 有 的 腕 氧 戌 糖 酌 酸 都 以 不 湾 解 的 核酸 -蛋白 质 复合 物 形式 除去 。 在 迅速 摄 拌 下 将 固体 盐酸 肽 加 到 上 层 清 液 中 , 使 旗 度 变 为 2 。 所 得 的 洲 液 在 38"C 下 都 置 30 分 钟 ,然后 在 OCC 下 冷却 工 小 时 。 在 这 些 条 件 下 , 粗 楼 提取 液 中 大 部 分 的 蛋白 质 仍 溶解 在 溶液 中 ,同时 有 胶 状 帝 演 生成 ,其 中 含有 成 糖 杷 酸 和 少量 蛋白 质 。 HUE pH6.8 yee 的 2M 盐酸 有 冷 溶液 洗 洒 两 次 。 这 样 可 除去 存留 在 省 盐酸 甩 溶 液 中 的 任何 胸 | BUR. 将 沉 演 悬 兆 在 2M 盐酸 有 洲 液 中 (每 克 原 粗 积 用 工 体积 )， 然 后 用 氧 仿 - 尘 醇 (5:1) # Sevag, Lackman 和 Smolens 的 方法 95 提取 以 除去 ”和 蛋 自 质 杂 质 。 将 着 活 在 盐酸 肌 洲 液 中 的 桶 酸 加 到 等 体积 的 氯仿 - 辛 醇 混 合 液 中 加热 到 40"C, 并 用 机 械 接 振 30 分 钟 ,然后 将 其 放 在 离心 机 中 转 离 。 分 出 含有 杷 酸 的 上 层 水 溶液 。 再 用 新 鲜 的 氯仿 - 辛 醇 混 合 液 提 取 两 次 。 这 些 提取 手 炉 必须 在 40°C 下 进行 ， 因 为 在 冷却 的 情况 下 或 在 毛 化 钠 溶 液 申 或 水 洲 液 中 提取 时 , 杷 酸 和 蛋白 质 的 分 离 都 不 完全 。 用 醋酸 调节 溶液 的 pH 至 4.2~4.5 后 再 加 两 倍 体积 的 冷 乙醇 就 可 以 使 杷 酸 从 冷 的 盐酸 有 洲 WORTH. 将 沉 出 的 白色 架 状 戊 糖 棚 酸 在 离心 机 中 圭 离 ， 并 用 70% 乙醇 洗 ” 潍 两 次 ， 然 后 再 将 此 沉 演 游 解 在 水 中 ， 小 心 用 氢 氧 化 钠 稀 洲 液 泣 节 pH 至 6.8, 再 用 转 离 方法 除去 任何 不 溶解 的 变性 蛋白 质 。 为 提 炖 核酸 ,可 以 加 工 了 氧化 绩 游 液 使 最 后 的 氧化 钠 猎 度 变 为 0.05M， 再 加 两 体积 乙醇 使 成 糖 核酸 SAYIN. HAST DIA 70% 乙醇 洗 滩 两 次 。 另 一 个 可 以 阻止 任何 核酸 酶 作用 的 方法 是 按 每 克 钥 织 以 3 倍 体积 的 2.5M he Maar SRA, FED RS. DURAN BH BN Be ah WHT. MARA ER RAR SES ey OM MAYS WME , DURA UE AIR EAI : Kay 和 Dounce™™ 批判 了 Volkin 和 Carter®” 的 方法 。 因 为 在 这 个 方法 中 虽然 用 盐酸 股 分 离 了 核酸 和 和 蛋白质 ， 仍 需 再 用 氧 优 = 凝 胶 方 法 作 进 一 步 的 提纯 。 因 此 他 们 设计 了 下 述 方法 ,他们 认 为 用 这 个 方 法 可 以 得 到 不 含有 可 检 出 的 蛋白 质 的 高 聚合 度 的 友 糖 核酸 。 ’ + Uwe yr om» i | Pa ae WA oo a 3 gs ee ora Ae a 28 ”第 二 章 核酸 的 提取 . 用 硫酸 十 二 酯 仙人 从 哺乳 类 动物 的 组 积 中 提取 忆 糖 护 酸 俩 ” 将 50 g 新 鲜 冷 冻 的 组 织 切 成 小 块 ,用 200ml1 含 有 0.9% 毛 化 绩 和 0.1 樟 榜 酸 钠 的 混合 冷 洲 液 将 其 混和 ， 并 在 高 速 蒋 碎 器 (Waring 拌和 器 ) 中 在 0~3°C 下 攒 择 5 分 钟 制 成 匀 浆 。 将 匀 浆 放 在 离心 机 内 在 0~3"C 下 以 2500 — 转 / 分 的 转速 转 离 30 分 钟 ， DURST OR Ee, 再 在 冷却 下 以 2500 转 / 分 的 转速 转 离 , 以 便 进一步 除去 任何 剩余 的 脱氧 成 糖 核 蛋白 。 将 上 层 清 液 借 出 ,在 冷却 和 攒 拌 下 加 大足 量 的 LN 盐酸 , CEPR pH 降 至 4.5。 PRA RADE ELBE LEMS HT FDI 2500 转 / 分 的 转速 转 高 全 分 钟 。 奔 LBA. THES RELAY 0.9% 氯 化 钢 洲 液 混和 使 总 体积 达到 100 ml, ZEMEE Fim A 9 ml 5% 炖 次 硫酸 十 二 酯 钠 的 乙醇 (人 5%) EIR. 10% 氛 氧 化 钠 深 波 小 心 绥 纵 加 到 此 混合 液 中 以 提高 其 pH 到 7 然后 继续 揽 拌 3 小 时 。 再 加 大足 量 的 固体 所 化 钠 使 洲 液 的 氯 化 钠 滤 度 变 为 TY 。 将 所 成 的 略 带 粘 稠 的 洲 波 在 Servall 离心 机 中 以 14000 转 / 分 的 转速 转 离 -30 分 钟 。 倾 出 上 层 清 液 ,加 太 两 倍 体 积 的 95% 乙醇 使 核酸 沉 出 。 将 生成 的 白色 架 状 沉 演 在 离心 机 中 转 离 ,会 欢 用 乙醇 和 丙酮 洗 潍 , 并 在 空气 中 于 燥 。 将 此 干燥 物质 游 解 于 100 ml 水 中 ， 在 括 拌 下 加 大 9 ml 硫酸 十 二 酯 钠 溶 i, 井 在 室温 下 括 拌 2 小 时 。 加 入 足 量 的 固体 拨 化 纳 使 洲 液 的 氧化 锁 溃 度 达 Si) 1M, 将 此 游 液 以 14000 转 / 分 的 转速 转 离 30 分 钟 。 倾 出 上 层 清 液 , 然 后 加 APR RUZ EE BE. CHAT RAS GRR BEE BH b> BL HB GS kA, FESR PPR 将 上 面 所 得 白色 粉 未 游 解 在 30 ml 水 中 ,并 次 却 到 OCC 左右 。 加 大 固体 ” 毛 化 钠 使 游 液 变 为 0.9% 。 小 心 加 入 0.1N 盐酸 使 PH EB) 4.5, ZEAE HEV) 14000 转 / 分 的 转速 转 离 上 小 时 。 倾 上 层 清 液 于 一 烧杯 中 , 杯 中 含 足 RAIA See SLE EE RIM, SULA Ea 溶液 仍 渝 时， 小 心 加 入 0.1N 氮 氧 化 钠 溶液 使 PE HSE 7.0, IBIS RR 的 95% 乙醇 使 核酸 以 钠 盐 的 形式 沉 壮 出 来 。 用 离心 人 cota 23 PARA CAPAC BOREL AFR. 最 后 所 得 的 产物 为 白色 粉末 , 容易 溶解 在 水 中 生成 澄清 洲 液 。 用 此 法 从 850 g《〈 湿 重 ) 鼠 肝 中 所 得 的 产物 多 为 200 mg (FE), 相当 于 粗 积 中 成 糖 权 酸 含量 的 50% 。 用 苯酚 从 哺乳 类 动物 的 组 积 中 提取 戊 糖 护 酸 钠 ”o9 Bae hc. FEST AUER BCR EP EEE 60 秒 钟 制 成 匀 浆 。 所 得 与 浆 用 布 拱 ， 成 糖 核酸 锅 的 提取 29 ”漏斗 过 污 以 除去 纤 厅 状 粗 秩 。 在 搅拌 下 迅速 加 入 等 体积 的 90% SEMIS 液 (W/V) 。 继 绫 括 拌 工 小 时 ， 然 后 在 0°C 下 以 1750 转 / 分 的 转速 转 宛 工 小 时。 此 时 离心 管 中 的 液体 分 为 两 层 。 上 层 水 洲 液 含 全 部 的 成 糖 权 酸 和 多 糖 ， 下层 酚 液 含 腕 氧 戊 糖 核酸 和 和 蛋白质。 不 溶解 的 蛋白 质 留 在 酚 - 水 闻 的 分 界 层 feo HUME, KREG, ISTEP RPGRANUE BE 2%, FEANPG ABN. OR EBERT RAY PETERS DBL DL 1750 we /Sp HHS 20 分 钟 ， 用 乙醇 -水 (3: 了 洗 潍 一 卖 , 然 后 将 其 洲 解 在 25~ 100 ml 水 中 。 所 含 的 乙醇 可 以 在 旋转 蒸发 器 中 蒸发 除去 或 用 乙醚 洗 潍 ,然后 用 氮气 流 驱 除 水 中 梨 余 的 乙醚 。 将 此 澄清 溶液 与 等 体积 的 2.5 磷酸 氨 二 钾 (KsHPO)， 0.05 体积 的 83.3% 磷酸 和 工 体积 的 2- 甲 氧 基 乙醇 ( 重 燕 馆 过 的 ) 相 混和 。 BSED 和 机 中 畏 离 使 下 层 该 体 速 同 任何 不 洲 解 的 物质 和 上 层 分 开 。 将 下 层 液 体 用 从 ”和 四 和 氧 基 乙醇 -水 -2.51 GREG & — GA-33.3e 磷酸 (HE 1:1:1:0.05 体积 比 例 ) 混 和 所 成 的 上 层 液 洗 潍 一 次 。 合 并 的 上 层 液体 中 含有 所 有 的 戊 糖 核酸 。 如 遇 有 任何 不 溶解 物质 ， 可 在 用 聚 乙烯 (Polythene) 制 成 的 离心 管 中 以 10000g 塌 离 工 小 时 。 将 上 层 清 液 合并 ,加 甲 基数 滴 , 并 对 水 (2 升 ) 透 析 。 透 析 时 至 少 ” 换 水 四 区 。 必 要 时 可 将 透析 袋 内 的 内 容 物 在 离心 机 中 转 离 。 加 醋酸 钙 使 栈 酸 钙 的 江 庆 达到 2%%， 再 加 两 倍 体积 的 乙醇 使 友 糖 核酸 沉 壮 出来， 并 放 在 离 臣 机 中 畦 离 以 收集 所 生成 的 沉 演 。 用 乙醇 -水 (3: 卫 洗涤 2 一 3 区 ， 在 贰 空中 FRR AUCIOEF IR. 产物 含水 网 12% 。 产 量 为 40~650 mg/100 g RIF. 下 面 所 述 的 是 .Orestfield、 Smith 和 Allen™! 专 为 在 提取 过 程 中 避免 酶 降解 而 襄 计 的 方法 。 他 们 认为 提取 所 得 的 产物 和 其 他 “ 粹 品 有 显著 的 差别 ,而 且 看 来 比 它 们 优越 。 从 酵母 中 制 取 核 糖 核酸 9o2 取 一 容量 为 4 升 的 有 盖 炒 杯 , HE LAP, A IRE HBL 拌 器 的 斤 棒 。 将 500 ml 含 29 硫酸 十 二 酯 钠 、4.5% 乙醇 、0.01253 磷酸 二 氧 俩 和 0.01252 磷酸 氨 二 人 钠 的 混合 液 (pH 6.5~6.7) 放 在 烧杯 中 ， 在 斤 拌 PRA. BME, TERT TH 150 g 切 成 极 小 块 的 酵母 加 到 此 沸 脆 的 溶液 中 , 立即 加 盖 以 防止 水 分 燕 发 。 在 酵母 加 太后 光 液 的 温度 狗 为 83~87°C, ABNER: 工分 钟 ， 然 后 将 烧杯 及 其 内 容 物 移 到 沸水 浴 中 放 置 2 分 钟 以 防止 生成 过 多 的 泡 计 。 洲 液 在 移 到 水 浴 中 时 ， 其 温度 为 92~ 94°C 。 在 水 浴 中 加 热 2 分 钟 后 , 将 烧杯 内 容 物 倾 丰 一 浸 在 于 冰 - 湾 纤 剂 (Cel- TO 30 S-Ee 核酸 的 提取 losolve) 冷冻 混合 剂 中 的 2 升 烧 杯 中 ， 用 手 搬 拌 4~8 分 钟 , 直 到 温度 降低 到 434°C 时 为 止 。 将 杯 中 混合 物 放 在 离心 机 中 在 00 下 以 2000 转 / 分 的 转速 GIES 30 分 钟 。 在 揽 择 下 将 上 层 清流 倾 入 两 倍 体积 的 沦 乙 醇 中 , 并 在 举 却 下 在 离心 机 中 以 2000 转 / 分 的 转速 转 离 网 巧 分 钟 ,收集 沉 省 。 沉 尘 用 准 却 的 67 允 乙醇 洗 WTI, HATH 150 ml, ZEB, BSUS, HI 入 洗 液 ， 同 时 加 入 2N SULSAMSIE 5~10 FEDERER, PAPER 需 在 2000 转 / 分 的 转速 下 转 离 15~20 分 钟 。 将 所 得 粗 制 的 杷 酸 悬 兆 于 80% 乙醇 中 ,并 在 冷却 下 都 置 过 夜 以 促 成 蛋白 质 的 除 尽 。 HRT pe 中 所 含 的 核糖 核酸 的 80% 以 上 。 将 粗 制 的 杷 酸 用 离心 方法 收集 , 然后 游 解 在 130~180 ml ke, BRE 波 呈 混浊 状态 , 其 pH (ae 8 左右 。 立即 小 心 加 大 LN 醋酸 将 溢 液 中 和 到 pH7.0。 在 0°C 下 以 20000 转 / 分 的 转速 转 离 30 分 钟 (Spineo 工 型 制备 用 的 离心 机 ) 使 不 再 混 池 。 此 时 有 些 漂 兆 物质 不 能 被 除去 。 加 固体 氧化 钠 于 上 层 清 液 中 使 洲 液 氧化 钠 的 溃 度 变 为 1 。 游 液 在 0"C FIRE, RE ae 增加 ;而 粘度 的 增加 旭 较 显著 。 狗 在 30 分 钟 内 有 凝 胶 分 离 出 来 。 将 含有 少量 泛 游 杂质 的 黄色 上 层 液 以 20000 转 / 分 的 转速 转 离 工 小 时 以 分 离 凝 胶 。 FRE 上 层 清 液 。 用 67% CARRERE, BAA 150 ml, 其 中 加 有 工 ml 2M 氯 化 钙 溢 液 。 在 连续 搬 拌 下 友 码 加 水 于 洗 后 的 沉 尘 使 其 深 解 。 这 时 洲 液 的 p 互 值 为 7.0。 在 4"C 下 对 烃 常 更 换 的 燕 馆 水 透析 36 小 时 。 先 用 Celite _ 过滤, 然后 用 石棉 垫 过 小 以 除去 混浊 物 。 将 澄清 无 色 的 洲 液 渝 丈 干 燥 以 产生 白色 固体 。 产 量 1.4.g， YTS HRA BEER 60~70% , { FIG Dorner 和 Knight™” grgzsit ity FH DLA Bie AEE (BS) . Haya AGM (SBM) 40 NS SSA AEX (PX) HILDE 糖 核酸 的 方法 。 从 植物 病毒 中 制 取 六 糖 核酸 Gag 加 硫酸 十 二 酯 纳 (Duponol O) 浴 液 于 病毒 游 液 中 ,使 每 ml 反应 混合 胸中 分 别 含 10 mg 硫酸 十 二 酯 纳 和 15 mg BS, 16 mg 硫酸 十 二 酯 绩 和 7mg SBM 及 2.5 mg 硫酸 十 二 酯 策 和 1.5 mg PX 。 每 种 混合 物 以 40 ml 为 一 批 , 在 高 心 管 中 用 沸水 浴 加 热 4 分 钟 ,再 在 冰 浴 中 冷却 , 然后 对 燕 饮水 透析 4.5 小 时 。 BRM BARK. IME OM 毛 化 钠 溶液 于 透析 后 的 制备 物 中 ， GEIS WBE) 127， 并 在 100°C 下 加 热 3 分钟 。 在 冰 浴 中 准 却 后 ,将 沉 出 的 蛋 自 — ee sk ae a. A £. 上 贿 考 文献 31 “ 质 放 在 离心 机 中 畦 离 使 其 分 出 井 用 热 的 1 SLSR. SHEE 层 清 液 和 洗 液 ,对 蒸馏水 透析 巧 ~24 小 时 。 肖 析 时 换 水 数 欢 。 对 含有 SBM 和 了 X 的 反应 混合 物 必须 在 省 烽 到 30 ml 左右 后 用 1M 氯 化 钠 溶液 使 蛋白 质 再 行 沉淀 一 次 ， 并 透析 15~24 小 时 。 在 上 面 三 种 情况 下 所 得 的 透析 液 均 放 在 火 棉 胶 袋 内 用 吹风 方法 蒸发 ， 使 溃 编 至 20~70 分 之 一 。 泪 编 液 以 40000 塌 / 分 的 转速 (Spineo 工 型 制备 用 离心 机 ) 转 离 工 小 时 。 此 时 通常 会 得 到 变性 蛋白 质 的 小 团 块 。 将 上 层 清 液 倾 出 ,溶液 进行 冷 丈 于 燥 即 可 得 到 配 酸 。 Volkin 和 Oarter'” Fj $i me VEE Ie eH Ti He Kay 和 Dounce?™ 用 硫酸 十 二 酯 钠 提 取 成 糖 核酸 的 方法 是 唯一 可 效 比 较 的 两 种 方法 。 才 没 有 系统 地 研究 过 从 这 些 方法 提取 所 得 产物 的 物 理化 学 性 质 ,但 是 鉴于 用 氯仿- 凝 胶 方法 以 除去 腊 氧 成 糖 枝 酸 中 的 蛋 自 质 时 所 受到 的 分 级 作用 "。 (当然 这 个 方法 也 可 以 应 用 于 成 糖 核酸 ) , 则 后 一 方法 似乎 更 为 可 取 。 〈 郑 景 略 ” 通 ) BA LMR [1] Miescher, F. Med.-chem. Unters. 1871, 4, p. 441; Die histochemischen und | physiologischen Arbeiten von Friedrich Miescher 2 vols: F. O. W. Vogel, . Leipzig, 1897 [2] Altmann, R. Arch. Anat. Physiol., Lpz. 1889, p. 524 [3] Kossel, A. and Neumann, A. Ber. dtsch. chem. Ges. 1894, 27, p. 2215 [4] Neumann, A. Arch. Anat. Physiol., Lpz. 1899, Supplement, p. 552 [5] See for example: "Levene, P. A. Hoppe-Seyl. Z. 1905, 45, p. 370; J. biol. Chem. 1921, 48, p. 117; 1922, 53, p. 441 : Levene, P. A. and La Forge, F. B. Ber. disch. chem. Ges. 1910, 43, p. 3164 Feulgen, R. Hoppe-Seyl. Z. 1914, 90, p. 261 Johnson, T. B. and Brown, E. B: J. biol. Chem. 1922, 54, p. 721 Baumann, E. J. J. biol. Chem. 1924, 61, p. 1 Johnson, T. B. and Harkins, H. H. J. Amer. chem. Soc. 1929, 51, p.1779 Ooghill, R. D. J. biol. Chem. 1931, 90, p. 57 [6] Levene, P. A. and Bass, L. W. Nucleic Acids: Chemical Oatalog Com- pany, New York, 1931, p. 261 [7] Mirsky, A. E. and Pollister, A. W. Proc. nat. Acad, Sci., Wash. 1942, | 4 ; 32 [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] 17] [18] [19] [20] _ (21) [22] [23] [24] [26] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] (34) 第 二 章 核酸 的 提取 - 28, p. 344; Genetics 1943, 28, p. 82; Trans. N. Y. Acad. Sci. 1943, imi iont Biol. Symp. 1943, 10, p. 247; J. gen. Physiol. 1946, 30, p. 117 Pollister, A. W. and Mirsky, A. E. Genetics 1942, 27, p. 150; J. gen. Physiol. 1946, 30, p. 101 Levene, P. A. and Jorpes, E. J. biol. Chem. 1930, 86, p. 389 Lilienfeld, L. Z. physiol. Chem. 1894, 18, p. 473 Hammarsten, O. Z. physiol. Chem. 1894, 19, p. 19 Wohlgemuth, J. Hoppe-Seyl. Z. 1903, 37, p. 475 Bang, I. Beitr. chem. Physiol. Path. 1903, 4, pp. 115, 331 and 362 Huiskamp, W. Hoppe-Seyl. Z. 1901, $2, p. 145 Jones, W. and Whipple, G. H. Amer. J. Physiol. 1902, 7, p. 423 Sevag, M. G., Lackman, D. B. and Smolens, J. J. biol. Chem. 1938, 124, p. 425 Kelley, E. G. J. biol. Chem. 1939, 127, p. 55 — Seibert, F. B. and Watson, D. W. J. biol. Chem. 1941, 149, p. 55 Stern, K. G., Goldstein, G., Wagman, J. and Schryver, J. Fed. Proc. 1947, 6, p. 296 Stern, K. G. and Davis, S. Fed. Proc. 1946, 5, p. 156 Orgel, G. and Stern, K. G. Fed. Proc. 1950, 9, p. 211 Gajdusek, D. C. Biochim. biophys. Acta 1950, 5, p. 397 Stern, K. G., Goldstein, G. and Albaum, H. G. J. biol. Chem. 1961, 188, p. 273 Steiner, R. F. Trans. Faraday Soc. 1952, 48, p. 1185 ~ Shooter, K. V., Davison, P. F. and Butler, J. A. V. Biochim. biophys. Acta 1954, 13, p. 192 Butler, J. A. V., Davison, P. F., James, D. W. F. and Shooter, K. ee: Biochim. biophys. Acta 1954, 13, p. 224 Orampton, OC. F., Lipshitz, R. and Chargaff, E. J. biol. Chem. 1964, 206, p. 499 Doty, P. and Zubay, G. J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, p. 6207 este eer vere ee ee ee eee ae ee ee: Dounce, A. L. and O/Connell, M: J. Amer. chem. Soc. 1958, 80, p. 2013 Clarke, G. and Schryver, S. B. Biochem. J. 1917, 11, p. 319 Cardin A. and Pinotti O. Boll. Soc. ital. Biol. sper. 1936, 11, p. 752 Thompson, R. H.’S. and Dubois, R. J. J. biol. Chem. 1938, 125, p. 65 Watanabe, I. and Suzuki, K. J. chem. Soc. Japan (pure chemistry section) 1951, 72, pp. 578, 580 and 604; Chem. Abstr. 1952, 46, Pp. 3666 von Euler, H. and Hahn, L. Arkiv. Kemi Min. Geol. 1946, 22A, No. 17; 1946, 23A, No. 5 Petermann, M. L. and Lamb, O. M, J. biol. Chem. 1948, 176, p. 685 0 BEAR 33 Gulland, J. M., Jordan, D. O. and Threlfall, C. J. J. chem. Soc. 1947, p. 1129 Frick, G. Biochim. biophys. Acta 1949, 3, p. 103 Fleming, M. and Jordan, D. O. Disc. Faraday Soc. 1953, No. 13, p. 217° Ambrose, E. J. and Butler, J. A. V. Disc. Faraday Soc. 1953, No. 13, p. 261 Luck, J. M., Kupke, D. W., Rhein, A. and Hurd, M. J. biol. Chem. 1953, 205, p. 235 Hammarsten, E. Biochem. Z. 1924, 144, p. 383 Cohen, S. 8. J. biol. Chem. 1945, 158, p. 255 Bernstein, M. H. and Mazia, D. Biochim. biophys. Acta 1953, 11, p. 59 Ohargaff, E. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Ohargaff and J. N. David- son): Academic Press, New York, 1955, p. 323 Felix, K. and Hartenech, A. Hoppe-Seyl. Z. 1926, 157, p. 26 Maver, M. E. and Greco, A. E. J. biol. Chem. 1949, 181, p. 8 Fenstein, R. N. and Butler, C. L. Proc. Soc. exp. Biol., N. Y. 1961, 79, p. 179 . ! Davison, P. F., Conway, B. E.and Butler, J. A. V. Progr. Biophys. 1954, 4, p. 148 Chargaff, E. and Saidel, H. F. J. biol. Chem. 1949, 177, p. 417 Dounce, A. L. and Monty, K. J. J. biophys. biochem. Cytol. 1955, 1, p. 155 Monty, K. J. and Dounce, A. L. J. gen. Physiol. 1958, 41, p. 595 Mirsky, A. E. and Ris, H. J. gen. Physiol. 1947, 31, p. 7; 1951, 34, p. 475 Peacocke, A. R. Biochim. biophys. Acta 1954, 14, p. 157 Thomas, R. Bull. Soc. Chim. biol., Paris 1953, 35, p. 609; Biochim. biophys. Acta 1954, 14, p. 231 Ohargaff, E. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff and J. N. David- son): Academic Press, New York, 1955, p. 322 Signer, R. and Schwander, H. Helv. chim. acta 1949, 32, p. 853 Schwander, H. and Signer, R. Helv. chim. acta 1950, 33, p..1521 Sevag, M. G. Biochem. Z. 1934, 273, p.419 Sreenivasaya, M. and Pirie, N. W. Biochem. J. 1938, 32, p. 1707 Bawden, F. O. and Pirie, N. W. Biochem. J. 1940, 34, p. 1278 Marko, A. M. and Butler, G. O. J. biol. Chem. 1951, 190, p. 165 Dounce, A. L., Simmons, N. 8. and Kay, E. R. M. Fed. Proc. 1951, 10, p. 177 Kay, E. R. M., Simmons, N. 8. and Dounce, A. L. J. Amer. chem. Soe. 1952, 74, p. 1724 Simmons, N. S., Ohavos, S. and Orbach, H. K. Fed. Proc. 1952, 11, p.390 34 [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] (75) [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] Pe ee 第 二 章 核酸 的 提取 Chargaff, E., Lipshitz, R.and Green, O. J. biol. Chem. 1952, 195, p. 155 Butler, J. A. V., Conway, B. E. and James, D. W. F. Trans. Faraday Soc. 1954, 50, p. 612 Chargaff, E. The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff and J. N. Davidson): Academic Press, New York, 1955, p. 324 Cosgrove, D. J. and Jordan, D. O.—unpublished results McCarty, M. and Avery, O. T. J. exp. Med. 1946, 83, pp. 89 and 97 Zamenhof, 8., Leidy, G., Alexander, H. E., Fitz Gerald, P. L. and Ch- argaff, E. Arch. Biochem. Biophys. 1952, 40, p. 50 Zamenhof, 8., Alexander, H. E. and Leidy, G. J. exp. Med. 1953, 98, p. 373 | See for example: Gandelman, B., Zamenhof, 8. and Chargaff, BE. Biochim. biophys. Acta 1952, 9, p. 399 Ohargaff, E., Zamenhof, 8S., Brawerman, G. and Kerin, L. J. Amer. chem. Soc. 1950, 72, p. 3825 Zamenhof, 8., Brawerman, G. and Chargaff, E. Biochim. eae: Acta 1952, 9, p. 402 Snellman, O. and Widstrém, G. ay kiv. Kemi Min. Geol. 1945, 19A, No. 31 Jones, A. S. Biochim. biophys. Acta 1953, 10, p. 607 Chargaff, E. and Zamenhof, 8S. J. biol. Chem. 1948, 173, p. 327 Brown, G. L. and Martin, A. V. Naiure, Lond. 1955, 176, p. 971 Zamenhof, 8., Shettles, L. B. and Ohargaff, E. Nature, Lond. 1950, 165, p. 756 Wyatt, G. R. Biochem. J. 1951, 48, p. 584 Mann, T. The Biochemistry and Fertilization of the Gametes (Biochem. Soc. Symposia No. 7): Cambridge University Press, London, 1951, p. 11 Frick, G. Biochim. biophys. Acta 1954, 13, p. 374 Doty, P. and Bunce, B. H. J. Amer. chem. Soc. 1952, 74, p. 5029 Reichmann, M. E., Rice, 8. A., Thomas, O. A. and Doty, P. J. Amer. chem. Soc. 1954, 76, p. 3047 Shooter, K. V. and Butler, J. A. V. J. Polym. Sci. 1957, 23, p. 705 Vendrely, R., Vendrely, C. and Sadron, O. C. R. Acad. Sci., Paris 1957, 244, p. 676 Laland, 8. G., Overend, W. G. and Webb, M. J. chem. Soe. 1952, p. 3224 McOarty, M. and Avery, O. T. J. exp. Med. 1946, 83, p. 97 Ohargaff, E., Zamenhof, §., Brawerman, G. and Kerin, L. J. Amer. chem. Soc. 1950, 72, p. 3825 % ’ —- - 4 站 Bm Fe RR 35 Zamenhof, 8. and Chargaff, E. Nature, Lond. 1951, 168, p. 604 ‘ Dutta, 8. K., Jones, A. 8. and Stacey, M. Biochim. biophys. Acta 1953, 10, p. 613 F See Levene, P. A. and Bass, L. W. Nucleic Acids: Chemical Oatalog — Company, New York, 1931, p. 299 Schneider, W. O. J. biol. Chem. 1946, 165, p. 585 Mirsky, A. E. and Pollister, A. W. J. gen. Physiol. 1946, 30, p. 117 Kerr, 8. E. and Seraidarian, K.J. biol. Chem. 1949, 180, p. 1203 Stanley, W. M. Science 1935, 81, p. 644 Hamoir, G. Biochem. J. 1951, 48, p. 146 Markham, R. and Smith, K. M. Parasitology 1949, 39, p. 330 Hogeboom, G. H. and Schneider, W. O. The Nucleic Acids Vol. 2 (Ed. E. Ohargaff and J. N. Davidson): Academic Press, New York, 1955, p. 205 Knight, OC. A. and Stanley, W. M. J, biol. Chem. 1941 141, p.29 Knight, C. A. J. biol. Chem. 1947, 171, p. 297 Knight, ©. A. J. biol. Chem. 1952, 197, p. 241 - Bacher, J. E. and Allen, F. W. J. biol. Chem. 1950, 183, p. 641 Davidson, J. N. and Waymouth, O. Biochem. J. 1944, 38, p. 375 Chargaff, E., Magasanik, B., Vischer, E., Green, O., Doniger, R. and Elson, D. J. biol. Chem. 1950, 186, p. 51 Volkin, E. and Carter, O. E. J. Amer. chem. Soc. 1951, 73, p. 1516 Grinnan, E. L. and Mosher, W. A. J. biol. Chem. 1951, 191, p. 719 Kay, E. R. M. and Dounce, A. L. J. Amer. chem. Soc. 1953, 75, p. 4041 Orestfield, A. M., Smith, K. O. and Allen, F. W. J. biol. Chem. 1955, 216, p. 185 Davis, F. F. and Allen, F. W. J. biol. Chem. 1957, 227, p. 907 Gierer, A. and Schramm, G. Nature, Lond. 1956, 177, p. 702 Gierer, A. and Schramm, G. Z. Nature, 1956, 11b, p. 138 Kirby, K. 8. Biochem. J. 1966, 64, p. 405 Ootter, J. 8. and Brown, R. A. Science 1956, 124, p. 1077 Schuster, H., Schramm, G. and Zillig, W. Z. Nature, 1956, 11h, p. 339 Cohen, S. 8. and Stanley, W. M. J. biol. Chem. 1942, 144, p. 589 Dorner, R. W. and Knight, 0. A. J. biol. Chem. 1958, 205, p. 959 Bawden, F. O. and Pirie, N. W. Biochem. J. 1940, 34, p. 1258 = > PE ee ee a J BHR MIRNA 5 | AEA AMIR ME AMA PRS SE. SERA 活性 部 分 与 腊 氧 友 糖 核酸 问 的 同一 性 是 正确 的 话 ， 那 么 就 必须 假 CMSA CERES AeA BER RA SE WWE, RESHMA we EMM eR A DEES, Wid — RENEE KF BS 域 四 。 究 葛 这 两 者 之 问 ,何者 更 符合 事实 , 我 们 还 不 知道 。 也 许 是 这 两 种 方式 均 用 于 形成 遗传 密码 。 但 是 不 论 用 何 种 方式 ,从 一 个 UNF ERS eI AE RTE FE Se -物理 的 不 均一 性 。 在 成 糖 核酸 中 也 能 预料 到 不 均一 性 。 目 前 已 积累 了 大 量 的 证 。 据 , 表 明 友 糖 核酸 与 蛋白 质 的 合成 有 着 紧密 的 联系 。 假 使 这 样 的 关 ”和 桑 的 确 是 存在 的 话 ， 那 么 单一 关 胞 合成 多 种 蛋 和 白质 的 已 知事 实 必 然 表 明和 胞 中 的 戊 糖 核酸 具有 不 均一 性 。 因 此 ,和 腊 氧 戊 糟 核 酸 一 样 ， 从 一 个 壮 胞 中 提取 出 来 的 全 部 友 糖 核酸 也 很 可 能 胡 现 着 物理 的 和 化 学 的 不 均一 性 。 用 化 学 或 物理 方法 将 核酸 样品 进行 分 级 分 Dll 离 , 现 在 必须 看 作 是 任何 详尽 研究 核酸 结构 的 初步 工作 ;显然 这 种 分 级 分 离 必 须 先 于 任何 企图 去 确定 多 核 苷 酸 链 中 的 核 音 酸 坎 序 。 到 目前 为 止 已 进行 的 不 均一 性 和 分 级 分 离 的 大 部 分 研究 工作 72 SRA RRR AK, 而 与 成 糖 核酸 无 关 。 这 反映 出 目前 的 看 法 , 即 锈 胞 内 的 遗传 功能 是 受 狂 胞 核 的 脱氧 友 糖 核酸 所 控制 ,而 竹 胞 质 内 的 友 糖 核酸 的 作用 则 比较 不 明显 。 并 且 , 腊 氧 友 糖 核酸 的 闯 训 的 和 可 靠 的 制备 方法 较 之 友 糖 核酸 的 制备 方法 则 更 早 有 所 Wik. 脱氧 友 糖 核酸 的 物理 不 均一 性 、 37 脱氧 友 糖 杷 酸 的 物理 不 均一 性 虽然 仅 在 最 近 才 得 到 直接 的 定量 论据 ， 但 是 次 液 中 的 肌 氧 友 糖 核酸 盐 离子 的 不 均一 分 散 性 质 早 就 意料 到 。 只 有 用 Schlieren (Philpott-Svensson) 56°42 Abi, FARMER EEK 5 x 10™* g/ml 的 核酸 的 沉降 作用 。 FEIX-NRET EIA, VOREI—-7+B HES 聚 电解 质 溢 液 中 所 观察 到 的 超 清 晰 (hypersharp) 的 Schlieren 界 区 。 BRAK HAY Schlieren FRH RAMA, (Se ”无 疑问 ,这 个 界 区 的 形状 与 核酸 样品 的 沉降 系数 的 分 布 无 关 。 1.0 总 省 度 的 分 数 S. ol 0 10 20 30 40 50 So,w 图 1 在 -0.2M SAE SPT HH AR Dal UR ER IR OT A SS (K. V. Shooter #1 J. A. V. Butler: Trans. Faraday Soc. 1956, 52, 739 页 ) Bi FAROE RR, PREVA AE LT RA ROC HY Din OLA FH , Pal iii PEPYS BE 3S 107° g/ml BAAR 度 的 沉降 系数 可 加 以 测定 。 利 用 这 个 方法 ,8Shooter 和 Butler! 从 紫外 吸收 的 改变 ， 测 定 了 越过 沉降 界 区 的 脱氧 成 糖 核酸 钠 咨 液 的 沉降 系数 的 分 布 , 并 由 此 测定 了 核酸 盐 的 淡 度 。 图 工 表示 随 着 核酸 盐 省 度 所 发 生 的 沉降 系数 分 布 的 变化 情况 。 图 中 曲 共 关 明 ， 具有 低沉 降 系数 值 的 物质 其 沉降 系数 对 湾 度 的 依 顿 关系 小 ， 但 具 38 第 三 章 ” 核酸 的 不 均一 性 和 从 级 苍 离 “有 更 高 沉降 系数 值 的 物质 则 其 沉降 系数 对 尖 度 的 依 膨 关系 大 。 但 是 ， 重 要 的 关系 是 在 溃 度 为 雳 时 ( 按 Oth 和 Desreux™ 的 方法 计 算 ) ,此 时 显示 出 沉降 系数 分 布 的 实 驳 。 腊 氧 友 糖 核酸 与 其 母体 核 蛋 日 的 沉降 系数 分 布 ”的 比较 表 明 当 应 用 阴离子 型 去 污 剂 法 以 提取 核酸 时 (ay、Simmons 和 Dounce 法 , 参看 第 二 章 , 参 考 文 献 60)， 在 去 除 蛋白 质 过 程 中 , 沉 降 系数 分 布 没 有 改变 ,分 毅 也 没有 发 生 。 但 是 ,用 氧 仿 - 凝 胶 法 以 去 除 蛋白 质 时 (Sevag, Lackman 和 Smolens #, BAEBr—z, FS A OCRK 15) ， 则 产生 一 种 核酸 , 它 具 有 一 个 显然 不 同 于 原来 的 核 蛋 白 的 沉降 系数 分 布 曲 比 。 这 表明 在 去 除 蛋 白质 过 程 中 , BAS 核酸 的 分 级 已 沟 发 生 ( 图 2)。 原来 的 核 蛋白 一 一 一 去 污 剂 法 = i ENCE 酸 钠 制 自 总 省 度 的 分 数 0 10 20 30 40 50 So, w 图 2 AD este RA BRAY EY HOTS ts (K. V. Shooter #1 J. A. V. Butler: J. Polym. Sci. 1957, 23, 707 页 ) 从 脱氧 成 糖 核酸 钠 溶液 中 用 沉降 方法 所 观察 到 的 这 样 明显 的 不 均一 性 使 人 “有些 惊奇 , 因为 鉴于 对 一 个 具有 恒定 截面 (constant cross-section) 的 坚实 棒状 系 入 来 讲 ， 沉 降 系数 应 该 与 棒 的 长 度 兄 FER. K Shooter 和 Butler 观察 到 的 显著 不 均一 性 侣 人 推 测 : 可 能 由 于 聚集 的 作用 , 肌 氧 成 糖 核酸 盐 离 子 若 使 不 是 揉 曲 到 基 种 程度 , 就 是 它们 的 直径 是 可 变 的 。 为 了 要 清楚 地 诈 明 所 观察 到 FRE IIR HARE EDAD 39 ”的 不 均一 性 井 不 是 由 于 聚集 作用 所 引起 ，Shooter 和 Butler" 全 ”将 膀 氧 皮 糖 核酸 盐 放 在 握 开 式 具 套 管 的 畦 头 (swing bucket rotor) 让 在 Spinco 卫 型 超速 离心 机 中 以 39000 转 / 分 的 转速 转 离 4.5 小 时 加 以 分 级 分 离 ,并 使 沉降 继续 进行 至 溶液 汉 度 由 最 初 的 7X10 gj/ml 变 为 1x10-5g/ml。 具 有 沉降 系数 大 于 20 的 所 有 物质 都 被 沉降 到 管 的 底部 。 TENG, 从 沉降 的 测定 井 没有 发 现 这 个 溶液 中 有 聚集 作用 。 这 个 级 分 的 沉降 系数 分 布 与 原来 的 股 氧 皮 糖 核酸 盐 沉 降 系 数 分 布 的 比较 见 图 83。 虽然 这 个 级 分 仍 有 一 个 一 定 的 沉 降 柔 数 范围 ,但 已 明显 地 比 原来 的 物质 的 为 小 。 1.0 ig 10 20 30 40 50 S20, w 图 3 胶 氧 皮 糖 核酸 钠 的 沉降 系数 分 布 曲线 ,表示 延长 离心 后 所 得 的 分 级 分 离 A. FORA; B. 离心 后 所 得 到 的 级 分 (K. V. Shooter #71 J. A. V. Butler: J. Polym. Sci. 1957, 23, 706 页 ) Te NR iE PRR CA] — EAM RD BS FERRE EELS A A ALAR I SE LTS PE FES AWA BAA. RV OUR Ae Bee Fy DL) BS 意见 大 概 是 由 Mirsky 和 Ris 提出 的 。 他 们 观察 到 当 提 取出 来 的 染色 体 的 大 部 分 腹 氧 皮 糖 核酸 洲 解 于 1 毛 化 钠 溶液 中 时 , 少 量 的 核酸 仍 可 以 从 不 溶 于 这 个 溶液 的 残余 染色 体 中 检 出 。 这 部 分 残余 核酸 最 初 彼 认为 是 一 种 杂质 ， 但 也 完全 可 能 基于 股 氧 友 糖 核 Sete 1M 氛 化 钠 中 的 不 同 溶解 度 而 发 生 了 分 级 分 离 。 上 述 的 可 —- 3 Ves hs Ae oe eee. * -一 “* > 4 -了 40 第 三 章 “被 酸 的 不 均一 性 和 分 航务 离 能 性 也 适用 于 一 个 午间 的 报道 sa 所 述 的 肝 丰 胞 核 中 的 鹏 轰 友 糖 AYU A EBB Sy HAYA FRE EE PE RP | Bendich"" 与 Bendich. Russell 和 Brown”! BS I TE 。 BRRFIBI NOS TE 0.87% ALS OAR PRI IE AL DORR LAB. ATRIAL ALBRECHT DLS Ay Bia SABBD WPA Be; ATE Pre HRI PITY, EBA See gy OM 人 中 的 程度 是 不 相同 的 。 “二 Chargaff, Crampton 和 Lipshitz"! 从 分 离 七 个 级 分 的 精 果 ， 介 烙 了 一 个 比较 群 尽 的 步 又 。 他 们 从 小 牛 胸腺 中 提取 出 核 蛋 自 后 ， 在 高 速 混 和 货 中 将 核 蛋 白水 沙 液 用 氧 仿 - 正 辛 醇 混 和 液 处 理 ， 使 其 成 凝 胶 析出 ,然后 将 凝 胶 逐 步 用 省 度 递增 的 氧化 钠 溶液 提取 ， 再 用 乙醇 使 核 蛋白 沉 出 ， 而 脱氧 成 糖 核酸 则 用 氧 仿 - 凝 胶 法 提取 。 提取 出 的 级 分 均 进 行 了 分 析 研 究 。 所 得 的 最 重要 的 观察 为 : 用 省 度 递增 的 氧化 钠 咨 液 提取 时 则 得 到 一 系列 含有 矢 味 喻 和 胞 喀 啶 站 度 递 降 而 腺 呀 喻 和 胸腺 喀 呢 淡 度 递 升 的 核酸 和 级 分 。 但 是 , 各 对 碱 ” 基 仍 尽 等 克 分 子 的 比例 存在 于 各 靓 分 中 。 这 种 分 级 分 离 方法 可 能 是 以 核酸 与 蛋白 质问 键 的 稳定 性 的 差别 为 根据 的 ， 而 上 述 这 些 作 者 "2 在 作 更 广泛 的 研究 时 , 人 对 用 人 造 蛋 和 白质- 核酸 盐 为 对 象 , 并 把 这 种 研究 推广 到 不 同 棚 积 的 觅 氧 成 糖 核酸 的 研究 中 去 。 Lucy 和 Butler“ 重复 了 Ohargaff、Orampton 和 Lipshitz 的 工作 。 当 他 们 一 般 地 确定 了 分 毅 分 离 的 方法 时 , HPI CS 果 表 明 在 用 氧化 钠 溶液 作 凝 胶 的 提取 中 ， 主 要 的 可 变 因 素 不 是 氧 化 钠 的 省 度 ， 因 为 类 位 的 分 级 分 离 也 可 以 将 凝 胶 用 同 尖 的 氧化 SVS WK IC THE WT AS BUSS 3 , Al FA AEG HR PAS AR TR YS ERE , ROE AP eA ee NPBA LS RR, NAEP SSI, 一 在 87°C 下 易 洲 在 LM Sesh, I BRIER AE FORE FE Hg & BEES 0 SREB AMIRAEIY 5 es REDG ey A LD EA SEH Wa 4] HABE (260 my) ON Se a Ee Se eee 0.5 0.55 0.60 0.65 0.70 0.80 1.0 BEARD RL ee RAFI 4 )\ MBA BRE BLE LARA IED + RRA PETIT ASAE ; (G. L. Brown 和 M. Watson: Nature, Lond. 1953, 172, 340 页 ) 分 级 分 离 的 一 个 重要 进展 是 用 层 桥 法 进行 核酸 分 级 分 离 的 党 献 。 鉴 于 核酸 对 碱 性 蛋白 质 具 有 亲和力 以 及 核酸 分 子 问 在 化 学 车 构 上 的 差别 有 可 能 影响 到 它们 与 蛋 自 质问 糙 合 的 键 的 强度 ， _ Brown 和 Watson” 应 用 了 层 析 柱 ,在 柱 内 将 从 小 牛 胸腺 制备 的 RAE a Bl ae FEE Bee Ek. RAK PE BEE CE 、 0.4.M RtLSAVEHRE , Aa — ei AE RR NE 胸腺 ) 溶液 从 层 析 柱 的 顶部 加 入 。 在 压力 下 这 些 溶液 冲洗 大 柱 内 ， 于 是 核酸 则 和 被 吸附 在 柱 上 。 然 后 将 明 附 的 核酸 用 逐 段 递增 或 回炉 递增 淡 度 的 较 放 的 氧化 钠 溶液 加 以 洗 胸 。 图 4 是 一 个 典型 的 逐 段 洗 腊 图 计 。 这 个 图 鲜明 显 地 表示 出 随 着 每 一 氧化 钠 溶液 治 度 的 二 加 ,一 个 肯定 的 觅 氧 核糖 核酸 级 分 被 清 楚 地 洗 有 下 求 ,这 个 级 分 在 BTR ME DIM. AUP SRR BMA ETE, HEMT IX Mila ERIS W, 分 分 析 指 出 在 核酸 级 分 中 腺 嘎 哈 与 饲 嘎 喻 的 比例 和 胸腺 喀 啶 与 胞 喀 啶 的 比例 是 随 着 氧化 钠 洗 腊 液 淡 度 的 增 大 而 递 二 的 。 这 样 就 - ae Set eee wee AES rs algae com 42 Bae ”核酸 的 不 均一 性 和 分 毅 分 离 证 实 了 Chargaff, Orampton 和 Lipshitz"* 过 去 工作 的 糙 果 。 Brown 和 Watson 更 能 证 明 不 同 来 源 的 核酸 具有 显著 不 同 的 洗 腊 ak Brown 和 Martin"® 采用 了 按 Hoffpauir #0 Guthrie?” FF | ES HOLT MES REED LE BPEL, FE | HLS RCE PS BA SE BETO OOS, 其 PATA EAE AD LS a EI TEE OE J a te FE, WERE AY ROBE AEE BLD PE, RE 制备 噬菌体 核酸 的 方法 如 何 ， 都 可 进行 这 种 分 级 分 离 ， 而 这 两 个 ， 级 分 中 的 腺 嘎 界 与 饲 味 哈 的 比值 完全 不 同 。Lermanca 应 用 了 类 位 以 上 的 层 析 法 售 将 肺炎 球菌 中 的 遗传 转移 物质 进行 分 级 分 离 。 Main 和 Cole? 及 Semenza”?! 应 用 了 公 沟 满意 地 用 于 层 析 蛋白 质 2a 和 酶 的 磷酸 钙 凝 胶 对 觅 氧 友 糖 核酸 进行 分 级 分 离 。 这 种 层 析 柱 的 制备 已 由 Tiselius 及 其 同 工 者 叙述 过 吕 aa。 他 们 将 FERRER EHR Py ARYA RR BE VERE Bh FAS BA RE VE HE LEI OLVERE. Semenza #MWKA=T A ABBA RABE i, 但 是 Main 和 Cole 没有 得 到 多 于 一 个 的 洗 腹 峰 ,， 工 且 也 没有 观察 到 有 明显 的 分 级 。 发 展 到 现在 为 止 , Bendich RE lA) LH" 的 分 级 分 离 技 术 可 算是 最 合 人 满意 的 。 由 于 脱氧 友 糖 核酸 含有 可 电离 的 磷酸 基 图 并 能 成 为 带 有 一 个 次 怖 电荷 (等 电 点 低 于 p 瑞 力 的 离子 ,因此 他 们 将 核酸 当 作 一 个 多 聚 阴 离子 的 混合 物 来 处 理 ， 因 而 采用 了 阴 离 子 交 换 层 析 法 。 但 是 选择 一 个 适宜 的 交换 剂 是 不 易 的 , 他 个 在 得 到 一 个 满意 的 分 级 分 离 之 前 代沟 试用 过 几 种 交换 剂 四 。 已 知 对 分 级 分 离 核 苷 酸 (参看 第 四 章 ) 有 效 的 强 碱 型 树脂 , Dowex-1, 对 于 股 氧 友 糖 核酸 则 表现 着 低 的 吸收 容量 ， 井 且 吸 丰 到 这 种 树脂 中 的 那 一 航 分 的 核酸 由 于 结合 得 如 此 微弱 ,以 致 不 能 用 于 层 析 。 应 用 能 碱 型 树脂 Amberlite ITR4B 人 沟 得 到 比较 满意 的 千 果 。 用 离子 强 度 递 增 的 氯 化 钠 溶液 作为 洗 腊 液 可 使 大 量 吸 大 柱 中 的 核酸 从 这 个 交换 剂 成 为 许多 洗 腊 航 分 而 获得 回收 (在 不 同 试验 中 ， 公 观察 到 ees | 四 胶 氧 皮 糖 核酸 的 化 学 不 均一 性 和 分 级 分 部 48 A 16~200 个 洗 腹 峰 ) 。 但 是 , Amberlite 树脂 在 其 他 方面 的 应 用 则 不 大 理想 ,因为 所 得 到 的 车 果 不 能 重复 ,而 且 有 大 量 的 树脂 杂质 BARE FASE Le Ay EE ESE AT A VE ZEA GE A BR SE BY BB 果 。 这 些 交 换 剂 是 由 Peterson 和 Sober™2~*) 为 了 蛋白 质 和 肽 的 分 级 分 离 而 发 展 起 来 的 。 在 各 种 被 坪 过 的 交换 剂 中 , RE 分 离 最 有 希望 的 是 由 Peterson 和 Sober 称 之 为 卫 OTEOLA-SF 的 纤 礁 素 。 这 种 交换 剂 虽然 对 蛋白 质 和 肽 的 层 析 没 有 多 大 用 处 ,但 用 于 腊 氧 友 糖 核酸 的 分 级 分 离 则 非常 满意 山 ?v~a3680。 EOTEOLA-SE 交换 剂 是 从 高 纯度 的 木 纤 蕉 素 (Peterson 和 Sober DE Bendich 及 其 同 工 者 使 用 的 是 一 种 称 为 Solka-Floc 的 制备 物 ) A= CRIA PIL—B=E (epichlorohydrin) wT LG 法 处 理 而 制 成 的 。 将 150 ml 含有 60 g 氨 氧 化 钠 的 光 液 在 揽 拌 下 加 到 60 g Solka-Floe 中 ， 并 在 冰 让 冷却 30 分 钟 ， 然 后 将 35 ml 三 郑 乙 胶 和 60 ml 氯 甲 基 一 氧 三 圆 的 ADS ILE MA. 在 充分 混和 后 , 将 混和 物 在 油 浴 中 于 75~80°C 间 加 热 30 分 钟 ,并 不 时 加 以 斤 拌 。 浸 大 油 浴 鸥 10 分 钟 后 ， 发 生 放 热 反 应 ,并 ARATE, 在 加 热 时 间 欧 止 时 ,将 所 成 的 下 珀 色 胶 状 物 在 冰 浴 中 只 却 ,并 将 250 ml 2M 氯 化 钠 溢 液 在 括 拌 下 分 几 部 分 加 太 其 中 , 使 成 一 匀 和 的 晤 活 液 。 产 物 过 滤 后 ,用 乙醇 洗 潍 三 次 ,并 在 芙 空中 干燥 。 这 样 制 成 的 交换 剂 在 0.531 毛 化 钠 溶液 中 的 碱 度 (PK0%) 为 7.5, 而 且 非 常 可 能 含有 含 氮 的 交 联 (eross-linkages) 。 车 小 心 罚 FARR, 交换 剂 的 制备 是 可 以 合理 地 加 以 重复 的 叫 。 具 有 不 同 吸附 特性 的 交换 剂 可 以 从 不 同比 例 的 三 产 乙 腕 和 毛 甲 基 一 氧 = Bf. Bendich, Pahl, Korngold, Rosenkranz 和 Fresco®! @3:4m 报道 了 EOTEOLA-SF RSS he. BRC RAE TR BAT HAE BG 3 REA) SOT SEA, eA By I BT EBS Ig F_E al 备 的 交换 剂 的 8~10mg/g, FLEE SHE Hy LOT RF EAE, AE B= FEU BB SE SAS AAS Ig A A WT CT Gl 44 Soe PRR 4 RUDE AR So Hl PART HU, DACA aH 3} 级 分 离 。 ECTEOLA 柱 最 好 是 制备 在 一 个 2x10 em 的 管 中 ， FREI 。 «AYRE Pyrex 玻璃 漏斗 (内 径 0.8 cm, 高 12em)， 而 管 项 则 燃 接 一 标准 的 麻 砂 口 玻璃 座 (glass socket)。 将 0.5g ECTEOLA fn #%j 20 ml pH 7.0 Ay ; 0.01M 磷酸 盐 授 冲 液 制 成 稀 浆 注入 柱 内 。 稀 浆 的 流速 用 一 螺旋 夹 和 附 于 柱 底 的 橡皮 管 加 以 控制 。 然 后 用 0.5 N 氨 氧 化 钠 洲 液 以 每 小 时 欧 5~10ml Ay 流速 洗 潍 交 换 剂 ,直到 流出 液 在 260 mu 处 显示 出 一 个 可 忽 秽 的 光 密 刻 值 (小 于 0.015) 时 为 止 。 过 多 的 洗涤 似乎 对 交换 剂 无 害 , 因此 常 推荐 用 磊 液 延续 洗 WES 至 4 天 。 在 碱 液 洗 潍 后 ,继续 用 pH7.0 的 0.01 了 x 磷酸 盐 艾 冲 液 以 同样 的 流速 洗 潍 3 至 4 天。 然后 将 每 毫升 舍 有 工 g 脱氧 戊 糖 杷 酸 的 pH7.0 BoB 酸 楼 冲 液 或 0.001 M 氧化 钠 溶液 加 到 交换 剂 中 。 将 此 游 液 , 1~3 ml, 用 吸管 徐徐 加 至 蜀 洗 过 的 交换 草 上 面 的 洲 液 中 。 在 重力 下 , 让 游 液 以 每 小 时 不 超过 2~4 ml 的 速度 从 交换 剂 滤 过 。 当 柱 上 的 溶液 全 部 流 过 而 只 剩 下 0.5iml 时 ， 柱 壁 用 数 毫 升 的 磷酸 盐 徐 冲 液 或 毛 化 钠 洲 液 洗 淋 ， 使 液 流 继续 进行 , 直至 交 换 剂 上 留 有 0.5 ml 时 为 止 。 此 时 已 有 数 百 毫 升 的 磷酸 盐 盘 冲 液 以 每 小 时 3 ml 的 速度 通过 交换 剂 (已 载 积 有 礁 栈 )， 直 至 流出 液 的 光 密 度 值 驻 小 于 0.015 时 为 止 。 此 时 配 酸 被 全 固 地 附着 在 交换 剂 上 ， 虽 用 磷酸 盐 艇 冲 液 元 分 洗涤 亦 不 能 把 它 除 去 。 EOTEOLA- 核 酸 柱 的 洗 腊 可 用 间断 洗 胸 法 或 梯度 洗 腊 法 加 以 完成 。 在 前 一 个 方法 中 氛 化 钠 的 澡 度 是 从 0.05 M 到 0.1, 0.2 等 等 逐步 增高 , 直到 2M 时 为 止 , 流 速 和 维持 在 每 小 时 5~6 ml 。 然 后 测定 最 大 吸收 区 域 ( 从 240~~ 290 mu) 中 洗 腊 液 的 紫外 吸收 达 ， Mbipsiiedieieree BE, SIGE VERE rh 48 — 7M Se EEE BET HE. ce Bendich,Fresco,Rosenkranz 和 Boiser” 9-44.24 alah ; Di BESS BB ZB AS ROLE A (AD) , 这 个 外 形 图 显示 出 在 0.2 ” ”和 0.4 氧化 钠 问 有 两 大 般 分 。( 层 析 计 外 形 图 是 将 在 260mr 处 的 光 密 度 值 乘 以 级 分 的 毫升 数 所 得 的 积 对 管 数 及 洗 腊 液 下 度 作 图 而 得 到 的 。) 一 般 来 讲 , 榜 度 洗 胸 法 是 一 个 比较 满意 的 技术 ,可 是 Bendic、 Fresco, Rosenkranz 和 Beiser®” 在 和 采用 单 混 和 室 的 梯度 洗 腊 和 柔 RAGA 5 中 所 示 的 那 两 个 大 般 分 分 开 。 但 是 , 当 使 用 了 和 ov 2 nil See 和 ws sw < , 本 ae Oe Bee eg” ee ee ER a ae 二 天 “脱氧 皮 糖 核酸 的 化 学 不 均一 性 和 分 级 从 离 46 WERMZARH, 却 能 得 到 更 好 的 分 开 。 MAINE ARYA 的 是 使 江 度 的 范围 极 生 地 上 升 。 这 种 如 Bendich, Pahl, Korngold, Rosenkranz 和 Fresco®! 所 描述 的 系 芒 见 图 6 。 —| ‘ee | 天 ie 1.8 : 5.30 中 1.6 ys 1.4 长 pe 1.2 F 1.0 = . gS 0.8 ~ 6 RO. $0.4 0.2 上 ea 寺 0 20 40 60 80 100 120 210 270. 290 325 NaCl osu | oi | 0.2M | 04m osuas-20 0.5M 0.5M |0.5N NaOH 本 pH #7 一 一 一 一 一 PH6.6 pHapH8 pHs. 图 5 BOTEOLA- 纤 厅 柱 上 小 牛 胸 腺 脱氧 核糖 核酸 的 不 连续 洗 股 (3.6 mg 股 氧 核糖 核酸 在 0.5 克 EOTEOLA- 纤 厅 素 上 ) (A. Bendich, J. R. Fresco, H. S. Rosenkranz #1 S. M. Beiser: J. Amer. Chem. Soc. 1955, 77, 3672 页 ) LE 0.5 RY RULSAPAWERNEE YZ pH 7 的 0.01 MX BRAG Hh BE UE RCRA OIR Th, AOSV ASEAE 150-ml SERA 100~ 125 ml PREREEUE AEH , I RPE RE. LL NAB SSS — RASA AMR MS, IES PIERRE RL PeeRH, eR ARNEL, VELEN StiME, 其 氧化 钠 省 度 均 可 从 下 式 求 得 [20: [NaCl Jaenie= [NaCl Joye [NaCl Jpyarme + * ESRC LESSEE Hh UE RE PE RA REE, PE 2 mm 的 厚 壁 长 毛细 管 (4~5 om) TRERANEA, BERBReANRER Oy dg) 时 2~5 ml, 每 隔 2 小 时 将 其 收集 在 自动 航 分 收集 器 中 。 46 第 三 章 ， 核 酸 的 不 均一 性 和 分 级 分 离 0.5 M NaCl 0.01 M 磷酸 盐 和 缓冲 液 图 6 具有 双 混 和 室 的 用 作 梯 度 洗 腊 法 的 装置 (A. Bendich, H. B. Pahl, G. O. Korngold, H. S. Rosenkranz 和 J. R. Fresco: J. Amer. Chem. Soc. 1958, 80, 3952 5) 0.5 M Absa RIRIR RES UR, AeA LSANIR ees) 2.0 M, AUS A-PDF Ko a EFA AACR GE pH fE4EHN, A RAM B MSA. 但 是 ， 7a BER ACSA BEA DH 值 同 时 提高 , AUER RRR. BEART FE, BVT DEA CSAAIRBEM 0.5 M 提高 到 2.0 歼 而 p 孔 从 7.0 提 高 到 11.0 的 情况 下 继 秆 进行 。 若 将 层 析 柱 最 后 用 0.5 N 氨 氧 化 钠 溶液 洗 潍 ， 则 可 以 回收 到 几乎 全 部 的 核酸 5 , 层 析 谐 外 形 的 可 再 现 程 度 见 图 7。 此 图 是 从 部 分 肝 切除 术 2 | 股 氧 友 糖 核酸 的 化 学 不 均一 性 和 分 级 从 离 47 周 和 4 周 后 的 鼠 肝 和 胞 核 用 阴离子 型 去 污 剂 法 提取 出 来 的 腹 氧 皮 pepe Wy thir BR. FAT 中 的 大 部 分 的 洗 腊 峰 基本 上 是 重 迭 的 。 旋 个 的 分 开 只 有 在 每 小 时 流速 不 超过 3 至 ml 时 才能 获得 。 。 洗 胸 速度 的 些微 十 加 将 导致 分 开 能 力 的 下 降 。 0.32 2 周 0.24 光 密 度 (260 my) oO bo 0.5M NaOH 梯度 至 0. pote aaiie 至 1.0M NH; 一 一 一 0.01M Jo. OM NaC] 2， OM NaCl 图 7 MERA APRA 2 周 和 4 周 后 的 再 生 和 县 肝 脱氧 友 糖 核酸 在 EOTEOLA 柱 上 的 层 术 (A. Bendich, H. B. Pahl, G. C. Korngold, H. 8. Rosenkranz 和 J. R. Fresco: J. Amer. Chem. Soc. 1958, 80, 3954 页 ) FRR SUE WY EA CE A YB a WEI. 每 一 来 源 的 核酸 表 现 其 特有 的 典型 层 析 谱 。.Bendqich、Pahl 和 Beiser’ 已 能 对 下 烈 来 源 的 腹 氧 友 糖 核酸 的 层 析 计 加 以 区 别 : 小 牛 胸腺 ,人 类 白血病 的 白血球 ,大肠 杆 菌 ， 了 .ceyres， 肺 类 球菌 , T6r 噬菌体 , 工 6r 十 噬 菌 体 以 及 大 鼠 的 脾 、 肠 、 诊 和 脑 。 用 上 壕 方 法 也 便 对 们 的 制备 方 法 作 过 上 比较 ea 。 图 8 表示 出 人 体 粒 条 胞 的 股 氧 成 糖 核酸 的 两 个 样 品 的 县 析 计 。 其 中 一 个 样品 是 用 阴离子 型 去 污 剂 法 制 得 的 ， 而 另 i 48 JERR BE (260 my) x 体积 (m]) 第 三 章 VBR’ -ENARSS ae ¥ 0.5M NaCl ; O.AMNH #88653 0.1 = 1.0M NH | | I 0.12 0.220.300.33 0.36 |2.0m] 2.0m NaCl NaOH RAFRE NaCl 0.01M SRBREExbig, pH 7 图 8 从 相同 起 始 物 质 按 两 种 不 同方 法 制备 的 人 体 粒 和 胞 中 的 股 氧 皮 糖 核酸 的 两 个 样品 在 EOTEOLA 柱 上 的 层 析 。 上 上 面 的 层 煌 计 所 表示 的 样品 是 条 用 Kay, Simmons 和 Dounce 法 制 得 的 。 下 潭 的 层 析 谱 所 表示 的 样品 是 用 毛 化 钠 提 取 后 再 用 氯仿 - 锋 胶 法 除 去 蛋白 质 制 得 的 ( 贿 看 第 二 章 ) (A. Bendich, H. B. Pahl 和 8. M. Beiser: Cold Spr. Harb. Symp. quant. Biol. 1956, 21, 34 页 ) SUE RA ERE 7 49 PE RUE FE FS CSE WJ SR SS 屋 析 名 的 彼此 相似 合 人 推 想到 这 两 种 方法 与 Shooter 和 Butler’ 的 发 现 相 比 较 时 ,产生 了 几乎 相同 的 产物 。Shooter 和 Butler™ 从 沉降 作用 的 研究 断定 氧 仿 - 凝 胶 法 在 提取 时 引起 了 分 航 分 离 ( 参 看 ， 38 页 ) 。 重要 的 是 在 上 OTEOLA 柱 上 多 核 苷 酸 层 析 分 离 的 基础 必须 加 以 建立 。Bendich KH |r] TAs?” 便 就 这 个 问题 从 两 个 观点 作 了 和 研究: 1) 柱 的 不 同 级 分 中 味 哈 和 喀 啶 的 组 成 碟 分 , (2) BE 析 计 处 形 的 形状 作为 腊 氧 友 糖 核酸 样品 的 分 子 大 小 的 函数 。 从 小 和 牛 胸 腺 腊 氧 核糖 核酸 航 分 的 分 析 结 果 ( 表 1) 可 以 看 出 味 哈 和 喀 于 喧 的 成 分 是 有 显著 的 不 同 忆 ' 吕 。 由 此 可 见 ， 阴 离子 交换 法 对 于 具 | 有 不 同 成 分 的 脱氧 核糖 核酸 的 全 部 样品 的 航 分 人 完 成 了 分 离 。 检 查 表 工 中 碱 基 成 分 的 克 分 子 数值 表明 在 般 分 的 分 析 车 果 中 没有 什 .将 特 征 , 这 和 Chargaff, Crampton 和 Lipshitz" 以 及 Brown 和 Watson 的 观察 相反 , 他 们 发 现 腺 味 哈 对 篇 嘎 喻 和 胸腺 喀 啶 对 ， 胞 喀 啶 的 比例 是 随 着 洗 腊 液 的 氯 化 钠 滤 度 的 增加 而 增 大 的 。 分 析 数 据 (Be 4 的 可 能 有 意义 的 特点 是 腺 呀 哈 对 胸腺 喀 喧 和 高 顺 喻 对 胞 喀 啶 的 比例 不 等 于 1。 象 将 在 后 面 (第 九 章 ) 所 讨论 的 ， Watson-Orick 的 脱氧 友 糖 核酸 模型 的 重要 特点 就 是 这 两 个 硕 | ， 基 对 之 问 的 特殊 氨 键 ， 以 及 渤 今 为 止 所 有 肌 氧 友 糖 核酸 的 分 析 都 证 明 碱 基 对 的 比例 非常 接近 于 1 (第 四 章 ) 。 由 此 可 见 ， 阴 离子 型 交换 法 与 其 他 方法 在 分 离 方面 具有 不 同 的 根据 ， 这 些 方法 都 能 产 GS, TOT MIEN HORDES 1, 了 解 到 底 多 核 背 酸 在 阴离子 型 交换 剂 上 的 这 样 结 合 会 不 会 对 Watson-Orick 模型 中 的 特殊 氮 键 造 茅 断裂 以 致 产生 单独 的 多 核 苷 酸 链 将 是 有 趣 的 。 著 是 如 此 , 则 特殊 碱 基 对 的 比值 偏离 于 工 的 原因 就 能 够 得 到 v 解释。 但 是 , 有 力 的 证 据 证 明 核 酸 在 EQOTEOLA 柱 上 的 吸附 卉 示 对 核酸 的 精 构 发 生 重大 的 改变 。 柱 遂 分 的 再 层 析 产 生 一 个 层 析 嘲 , 其 中 某 一 级 分 的 大 部 分 , 如 在 原 分 圾 分 离 中 的 一 样 , 出 现在 洗 肌 层 析 讲 外 形 的 相同 位 置 处 。 核酸 千 构 的 一 定 改变 , 例如 受热 处 章 ”核酸 的 不 均一 性 和 分 级 分 离 第 三 50 (9968 'd ‘0g “896T “909 \ vor © S10) eS SS ao OF Oo 2 er ri Nw Oe © OH SORA Aa S > o Hooeocone 89 Oo He AD 十 入 HT AO+av 96°0 b ee Gy 一 samen | tania er | 劲 贡 名 加 3 ieee "WaYyo “Mau “f ;008eIJ “WY 中 Uk zUeIyUSSOY “g “A ‘pjosuz0y O°) Tqed “@ “H ‘qorpuog -y) W100 ° Mesto ey FERS (FE BE) = § O0OT Xx | EPR Guo Ge eh Gh YL LY MBE Special — * By Geshe Gilt & AE Ye Bae Gch TOT ~ OPT GP A ch FS Bet alters 9 LL |b ee EA Oth UA Oh Set ET LE GT YL ys Ye Oe cha CEN) BEEN BWI RE 19 oO oot os oot et tl) OS eee 06'0 | 98°0 | #6 8270 | 82°0 | 86 cL°0 | 89°0 | 96 7L°0 | 890 | 86 6L°0 | g2°0 | TO v0 | 79°0 | 96 70 | 19°0 | 88 88.0 | e2'0 | 26 58'0 | TO | 46 58'0 | F9°0 | 88 Ts°0 | 19°70 | Te EO: AR en de 4 (00° T= Samanrey) AY FE WE Le BY SoS 0 S'S Oo 1) S/o & €3°0 0°% aP*0 0°S 98'0 0°% 350 0% OL*0 0°% OL'O 0°% 0T'0 0°S § 9°6 Hd ‘six, 0°% 68°0~FE'0 1g°0~6z"0 62°0~02°0 SON A EY Gi AR WW Ae ECT Be GH eh BGA BRAL PA WS PO des” 2 T's PPS 6°9 SPS pg 685 8 8 LEZ~9ES t's TlZ@~902 9°g 002 ~66T 8 8 L6T 5'8 T9L~9FT 9°S r9~69 o's | /9~99 9"8 上 3 人 89 ‘Te~0g 0° 00T Le Y x% 肯 女 EM Le | KE uy 5 ” 脱氧 皮 糖 核酸 的 化 学 不 均一 性 和 分 级 分 离 51 理 时 , WS SBE pra IE AY bb eee (A 9c), 更 重要 的 可 能 证 . 据 是 对 肺炎 球菌 的 具有 转移 活性 的 腹 氧 成 糖 核酸 进行 分 级 分 离 时 ， 从 层 析 柱 上 获得 的 合并 级 分 几乎 具有 和 原 物 质 相 同 的 生物 活 HE (80, 38] ss AFAEF FEAT RAEI HS DLE iB EBSD 析 , 但 是 Bendich, Pahl, Rosenkranz 和 Rosoff®? @x}/h4F aR RAAB AFR OEE IHU ME HH Be Hh VES Jeo 7)F I RAIN Ta LA 9c， 而 图 92 是 两 个 级 分 和 原来 的 核酸 对 比 时 的 沉降 系数 分 布 , 这 两 个 级 分 是 用 (1)0.16~0.24.M 氧化 钠 深 液 和 (2) 0.25~0.84.M 氧化 钠 溶液 在 区 域 I (图 9c) UE BRA, 这 些 航 分 表示 出 更 小 的 重量 平均 沉降 系数 , 其 数值 随 洗 用 ” 洲 江 度 的 增加 而 增 天 ,并 且 和 以 前 所 得 的 结果 相符 合 aa4m ,同时 也 呈现 出 沉降 系数 的 更 狂 险 的 分 布 。 a 直接 涉及 层 析 计 上 狼 分 位 置 和 分 子 大 小 间 相 互 关系 的 有 价值 的 报道 是 从 研究 受热 处 理 的 有 氧 核糖 核酸 溶液 而 来 。 在 低 离 子 强 度 时 对 腊 氧 核糖 核酸 洲 液 (参看 十 一 章 , 261 页 ) 的 加 热 会 使 沉降 系数 和 粘度 降低 ;如 果 延 长 加 热 ， 则 导致 分 子 量 的 降低 。 受 热 处 岂 理 脱 氧 核糖 核酸 洲 液 的 层 析 计 和 未 受热 处 理 的 样品 的 层 析 计 均 见 图 95。 受 热处理 的 溶液 的 层 析 必 显然 与 那些 未 沟 处 理 的 核酸 的 层 析 计 不同 , 因为 在 水 中 加 热 的 核酸 的 大 部 分 都 在 区 域 工 回收 ; 可 是 在 pH7.0 的 0.01 M 磷酸 盐 授 冲 液 中 加 热 时 会 生成 一 种 产 ， 有 物 ， 这 个 产物 在 层 析 上 几乎 难以 显 出 象 未 烃 加 热处理 的 核酸 所 特 有 的 第 一 个 寅 峰 。 因 为 从 每 一 个 层 桥 柱 上 所 收集 的 核酸 的 量 是 与 曲线 下 (图 90) 的 面积 成 正比 ,因此 可 以 看 出 将 核酸 在 0.01 MBE 酸 盐 焰 冲 液 中 加 热 会 使 第 一 个 高 峰 几 乎 完全 消失 ,同时 在 区 域 II ， 中 的 核酸 亦 大 量 消失 ( 朗 在 0.1~1.03f 所 和 2M ASN YE PS). RAH MS BATE Kime IL, 这 大 概 与 通常 在 此 区 域内 所 洗 腊 的 物质 在 一 起 。 因 为 未 沟 加 热处理 的 物质 的 层 析 计 显 示 出 的 最 大 量 的 核酸 是 在 区 域 III 内 ， 因 此 可 以 预料 到 这 个 区 域内 含有 多 量 的 分 子 量 较 大 的 物质 ,这 些 电 质 在 水 中 加 热 时 几乎 完全 消失 ,而 . roe oe . ~ 9 52 第 三 章 ，” 核酸 的 不 均一 性 和 分 级 分 离 随后 可 以 在 第 一 高 峰 处 , 即 区 域 TAP, ARR BS 酸 会 减 小 其 分 子 的 大 小 ， 由 此 亦 可 推 知 区 域 工 内 的 洗 腊 级 分 亦 是 小 分 子 的 。 这 样 层 析 分 极 分 离 承 显 出 与 分 子 的 大 小 有 关 , 如 同 与 粗 成 有 关 一 样 。 I II TIT: iv. 在 水 中 加 技 在 pH7 的 0.01 M 磅 酸 盐 绥 串 液 中 加 热 ‘BES ies ; 05M l0.1mu | NaCl NH, NaOH 2M NaCl 0.01 M 磷酸 盐 缕 冲 液 图 9 加 热 对 小 牛 胸腺 脱氧 核糖 核酸 层 析 谱 的 影响 (A. Bendich, H. B. Pahl, H. S. Rosenkranz 和 M. Rosoff: Symp. Soc. exp. Biol. 1958, 12, 38 页 ) DEAR BE (260 mu) X 体积 (ml) 脱氧 皮 糖 核酸 的 化 学 不 均一 性 和 分 级 分 离 53 1.0F 3 ae ol "eee / 0.8 | . / : he. 4 0.6 ‘Gis a Rit Pr) 0.4 o 7+ 1 1 @ 42 4 未 分 级 分 离 的 0.2 | / 0 2 f 5 1 S20, w 图 9% 在 区 域 工 (图 9c) HORM RARER ERA ( 般 分 1 是 用 0.16~0.242 所 化 钠 洗 脱 的 ; 级 分 2 是 用 0.25~0.34 M Rte Sve MEH) (Symp. Soc. exp. Biol. 1958, 12, 36 页 ) | AGLI TASES BOB, HAE HE ABA EE SEL WR I IAI HH He 唯一 制备 出 来 的 具有 生物 功能 的 脱氧 友 糖 核酸 是 从 肺炎 球菌 中 获 得 的 具有 转移 活性 的 腊 氧 成 糖 核酸 ， 而 这 种 核酸 已 成 为 层 析 研究 的 主题 。 在 这 些 研究 中 ,各 个 级 分 的 转移 活性 也 便 丢 检查 过 ” 。 肺 类 球菌 中 具有 转移 活性 的 脱氧 成 糖 核酸 本 来 就 具有 四 种 可 证 明 的 遗传 特性 ,这 些 特性 包括 对 青 夫 素 、 链 霉 素 和 磺 胸 的 抵抗 作用 的 改变 ， 以 及 对 甘露 醇 利用 的 改变 。 从 发 生 于 某 一 单 株 的 细菌 分 离 出 来 的 核酸 制备 物 根本 是 以 单独 无 关 的 动因 随便 艺 导 出 这 些 遗 传 转变 作用 ， 虽 然 相 当 数目 的 变种 竹 胞 都 显示 出 丙种 性 质 ， 即 甘露 醇 的 利用 和 对 链 霉 素 的 抵抗 作用 。 这 两 种 性 质 彼 认为 是 相关 的 或 联系 的 事件 。 因 此 ， 肌 氧 成 糖 核酸 的 制备 物 似乎 至 少 包含 有 五 个 航 分 ,它们 都 可 以 核 分子 的 形式 鉴定 出 来 ,而 其 中 的 四 个 级 分 中 的 Nr. ee Ek eS ee ee | A im ' : r , Py ae Noa 54 每 一 个 都 只 与 一 个 可 鉴定 的 遗传 性 质 有 关 。 FEAR, 上 述 的 这 两 种 性 质 伺 乎 联系 在 一 起 。 具 有 转移 活性 的 脱氧 友 糖 核酸 的 层 析 谐 见 图 10。 某 些 级 分 对 链 老 素 的 转移 活性 则 列 在 胡 2。 狗 “分 的 相对 活性 相差 甚大 , 某 些 级 分 具有 至 少 80 倍 于 其 他 迁 分 的 活 性 。 最 活 泪 的 级 分 的 活性 锡 为 原 求 物 质 的 活性 的 五 倍 。 这 些 玫 分 就 是 与 交换 剂 (BOTEOLA) 精 合 得 最 牢固 的 航 分 在 一 起 的 ， 寿 且 是 在 硕 性 范围 内 被 洗 腊 下 来 的 。 用 碱 处 理 很 可 能 会 破坏 一 些 活 性 ,因此 这 些 航 分 事实 上 原来 就 具有 上 比 所 观察 到 的 更 大 的 活性 。 第 三 章 ”核酸 的 不 均一 性 和 分 航 分 离 Ephrussi-Taylor™” 应 用 硅 营 士 -组 蛋白 柱 以 及 Lermanc2 应 用 甲 基 化 的 牛 血 清 蛋 和 白 所 进行 的 同位 素 标 记 的 具有 转移 活性 的 腊 氧 光 密 度 (260 mu) X8 -一 一 一 一 二 一 一 2.0 HH oO pert 之 已 | 0 20 50 80 梯度 至 O.5M NaCl 0.0 = 0.1M NH; 0.141.0M NH, | at FUE: NHs oboe | 0.052 0.18 0.56 reo iC yet FUR: NaCl 7, = cq °o | 0.04 | 0.28 0.2 0.35 0.026 0.1M sthth tha pH 7 0.5M NaCl 图 10 在 了 EOTEOLA # EAB IE PEN Be RS ree (A. Bendich, H. B. Pahl #1 8. M. Beiser: Cold Spr. Harb. Symp. quant. Biol. 1956, 21, 34 页 ) OS MNaOH i) ve =) . ”脱氧 皮 糖 核酸 的 化 学 不 均一 性 和 分 级 苍 离 55 核糖 核酸 的 分 级 分 离 ,都 获得 了 类 似 的 结 果 。 Be 2 所 记载 的 数据 可 以 明显 地 看 出 使 受 体 翻 胞 转变 为 对 鱼 霉 素 有 抵抗 作用 的 竹 胞 是 与 许多 级 分 有 关 。 前 面 的 级 分 (no. 25) 和 后 面 的 级 分 (no. 260) 一 样 , 均 具 有 转移 活性 。 有 许多 解释 都 可 。 以 用 来 遂 明 这 种 变化 。 一 个 可 能 性 是 分 子 大 小 的 不 均一 性 的 影响 天 于 生物 学 的 (化 学 的 ) 不 均一 性 的 影响 ,而 前 面 的 级 分 ,虽然 所 含 。 的 分 子 的 大 小 比较 小 ,但 仍 含有 特殊 有 关 的 转移 烙 构 ; 另 一 可 能 性 是 在 每 个 分 子 中 含有 一 个 以 上 的 活性 部 位 ， 而 这 些 活 性 部 位 在 所 ， 有 分 子 中 可 能 不 是 都 位 于 同一 相应 的 位 置 上 。 不 论 惧 正 的 解释 应 ERE, BIRD OD EEA BEE 。 特异 的 和 遗传 活性 的 级 分 。 才 2 肺炎 球菌 腕 氧 戊 糖 核酸 层 析 航 分 的 链 霉 素 转移 活性 BE HE HE KF NaOl we, | REE | a ot a om tt PEAS FUE EB FAME 。 DART NASI pe a stat ; Rem wea: 列 在 三 个 栏 中 的 活性 数值 是 在 不 同日 期 测 定 的 (A. Bendich, H. B. Pahl 和 8. M. Beiser: Cold Spr. Harb. Symp. quant. Biol. 1956, 21, 42 页 ) 56 C= MRK REPAY — PE Chantrenne"” 在 友 糖 核酸 的 不 同 金属 盐 的 洲 解 度 的 基础 上 ， 首先 提出 了 从 用 胞 中 提取 的 全 部 成 糖 核酸 样品 是 不 均一 的 见解 。 Ohantrenne 分 离 出 两 个 级 分 ,随后 Ghuysen” 双 对 这 两 个 圾 分 “ 的 均一 性 重新 进行 了 研究 。Bacher 和 Allen) 亦 在 溶解 度 测 定 的 — 基础 上 检查 了 一 些 友 糖 核酸 的 不 均一 性 。 但 是 ,这 些 分 级 分 离 方 法 一 般 都 不 能 得 到 多 于 两 个 以 上 的 狼 分 ,其 中 一 个 具有 低 的 洲 解 度 ， 而 另 一 个 则 具有 高 的 洲 解 度 。Ghuysen 和 Desreux “入 在 pH3.5 和 5.5 时 用 分 级 提取 方法 井 且 用 醋酸 -丙酮 -水 的 混和 物 或 甲醇 - 氧化 钠 -醋酸 盐 的 权 冲 混和 物 作 分 段 制备 ,分 毅 分 离 了 酵母 的 核糖 核酸 。 用 这 个 分 般 分 离 方 法 获得 了 二 个 航 分 ， 它 个 都 具有 相同 的 昧 喻 - 喀 喧 比例。 这 些 级 分 中 有 许多 含有 相同 的 分 子 量 但 具有 不 TH AYRE} Sti ES CA ERE SY Be Trio Lo 意 使 用 ， Miura 和 Suzuki“? 与 Bradley 和 Rich” 应 用 了 这 个 技术 作成 糖 核酸 的 分 级 分 离 。 前 两 个 研究 者 应 用 Dowex-2 ( 氧 型 , 交 联 度 10%) 作 交 换 剂 ， 而 后 两 个 研究 者 则 应 用 Peterson 和 Sober 所 制 备 的 EOTEOLA 柱 作 为 交换 剂 。 将 .Dowez- 230 EERE DR 先 用 酸 、 碱 和 水 选 , 然 后 再 用 工 到 See IFAT, 直至 洗 液 不 再 含有 紫外 吸收 物质 时 为 止 。 烦 脂 的 吸附 量 攻 为 每 10 ml 树脂 3.5 mg 成 糖 柜 酸 ， 而 流速 则 杀 持 在 0.2 毫升 /平方 厘米 /分 。 将 核酸 洲 于 0.2 M SUS, RATER ULL. US FRI BEEP Fan HSA LEAK OM 0.5 M 到 5M) RRRAMDLBEI, Bene 核酸 的 省 度 则 由 在 260 mu 处 测量 的 光 吸 收 来 决定 。 —F> SFE Wy VEN the LP 11, Pe ea HE RE 大 个 级 分 。 如 再 层 析 所 示 的 , APHEW ERE, MF 的 分 子 量 是 用 表面 槽 攻 (surface trough) 法 测定 的 。 这 个 方法 相 ” 当 便 利 , 因为 需要 核酸 的 量 极 少 ,但 测定 烙 果 未 甚 准确 。 般 分 的 分 eee ee 57 SF-RAeRLIL REA MEER (CORNEA TNA, BOIS WEA FS TT RS eB EY IS ED A A EH 45 Ghuysen 和 Desreux* *” 的 观察 相符 合 SENT Bo # 100 200 300 400 500 600 700 800 a 流出 液 量 ml id BALL 从 Dowex-2 i FUR A O7uPAS Me De RO ETE (K. Miura 和 K. Suzuki: Biochim. biophys. Acta 1966, 22, 566 A) SES DUMRERIN EIST ERH (Bx 1048) «BERRY NaCl | . A B N C yee Ae 酵 Ay FF 肌 B Be 母 xR BH | 0.92 | 2.24 | 3.89 | 6.91 FSF Rk FF B HW 0.11 a Sat oe 0.29 nt a: ick 0.95 0.86 Aes ee 1.76 2.39 2.97 4.41 a4 3.76 4.47 6.28 一 ale 4,21 5.80 一 shy 4.82 ( 搞 自卫. F. Bradley 和 A. Rich: J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, 5901 页 ) 58 Bae ”核酸 的 不 均一 性 和 分 级 芬 离 村 每 个 级 分 洗 脱 的 百分率 -° 8 to oO 0 0.10 0.20 0.30 0.40 0.901.0 ee ae NaOH ERRHW RDF 图 12 #2 EOTEOLA #: LAR eRe Bree (D. F. Bradley 和 A. Rich: J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, 5899 页 ) Bradley 和 Rich”) 的 实验 主要 涉及 在 了 OTEOLA #: EES 般 分 离 后 从 各 种 友 糖 核酸 所 得 烽 分 的 沉降 常数 的 改变 。 他 个 所 应 用 的 实验 技术 与 前 述 Bendich 及 其 同 工 者 所 用 的 技术 极 相 业 M24, A 12 烈 出 了 七 种 不 同 戊 糖 核酸 样品 的 层 析 计 和 未 被 分 般 分 离 的 核酸 的 平均 沉降 系数 (S$) 。 当 沉降 系数 增 大 时 , 洗 腹 层 析 训 BAEK ee WLR ZI 并 且 这 种 影响 显然 会 掩蔽 了 化 学 个 均一 性 的 影响 。 A es \. eT — wae 59 ee 图 42(e) 是 烟草 花 叶 病毒 的 成 糖 核酸 的 洗 胸 层 析 计 外 形 , 对 于 这 种 核酸 Bradley 和 Rich 全 加 以 研 帘 ， 其 目的 是 希望 它 能 够 较 租 胞 的 核酸 更 为 均一 。 但 事实 并 非 如 此 , 它 的 一 部 分 不 均一 性 可 能 是 由 提取 时 所 发 生 。 表 3 A TK 糖 核酸 的 不 同 航 分 的 平均 沉降 系数 ,其 数值 大 部 分 与 Miura 和 Suzuki ”的 分 子 量 测定 的 烙 果 相符 合 ”。 在 他 们 所 得 的 结 采 中 ， 沉降 党 数 是 随 着 氧化 钠 洗 股 液 YS BE HOSA DUTTA AY — REA FEE a TT EEE BFK 小 对 于 不 均一 性 影响 的 重要 性 。 这 种 影响 的 重要 性 亦 在 分 级 分 离 GER Fr) BAT 献 [1] Bendich, A. Essays in Biochemistry (Ed. 8. Graff): John Wiley, New York, 1956, p. 14 [2] Shooter, K. V. and Butler, J. A. V. Nature, Lond. 1955, 175, p. 500 [3] Shooter, K. V. and Butler, J. A. V. Trans. Faraday Soc. 1956, 52, p. 734 [4] Oth, J. and Desreux, V. J.U.P.A.C. Symposium on Macromolecular Chemistry: Ric. Sci. Mem. 1955, Supplement A, p. 447 [5] Shooter, K. V. and Butler, J. A. V. Nature, Lond. 1956, 177, p. 1033 £6] Shooter, K. V. and Butler, J. A. V. J. Polym. Sci. 1957, 23, p. 705 _ [7] Peacocke, A. R. and Schachman, H. K. Biochim. biophys. Acta 1954, 15, p. 198 [8] Butler, J. A. V. and Shooter, K. V. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity (Ed. W. D. McElroy and B. Glass): Johns Hopkins Press, Baltimore, 1957, p. 540 { [9] Mirsky, A. E. and Ris, H. J. gen. Physiol. 1947, 31, p. 7 [10] Schneider, W. C. and Hogeboom, G. H. Cancer Res. 1951, 11, p. 1 [11] Bendich, A. Fap. Cell Res. 1952, 3, Supplement 2, p. 181 [12] Bendich, A., Russell, P. J. and Brown, G. B. J. biol. Chem. 1953, 203, p. 305 [13] Ohargaff, E., Crampton, O. F. and Lipshitz, R. Nature, Lond. 1953, 172, p. 289 第 三 章 ”核酸 的 不 均一 性 和 分 和 级 分 离 Crampton, O. F., Lipshitz, R. and Chargaff, E. J. biol. Chem. 1954, (211, p. 125 Lucy, J. A. and Butler, J. A. V. NV ature, Lond. 1954, 174, p. 32 Sherrat, H. 8. A. and Thomas, A. J. J. gen. Microbiol. 1953, 8, p- 217 Brown, G. L. and Watson, M. Nature, Lond. 1953, 172, p. 339 Brown, G. L. and Martin, A. V. Nature, Lond. 1955, 176, p. 971 Hoffpauir, C. L. and Guthrie, J. D. Text. Res. (J.) 1950, 20, p. 617 Campbell, D. H., Leuscher, E. and Lerman, L. 8. Proc. nat. Acad. Sci., Wash. 1951, 37, p. 575 See also Brown, G. L. and Brown, A. V. Symp. Soc. exp. Biol. 1958, 12, p. 6 : Lerman, L. 8. Biochim. biophys. Acta 1955, 18, p. 182 Tiselius, A., Hiertén, 8. and Levin, O. Arch. Biochem. Biophys. 1956, 65, p. 132 Main, R. K. and Oole, L. J. ae ch. Biochem. Biophys. 1957, 68, p. 186 Semenza, G. Ark. Kemi 1957, 11, p. 89 Tiselius, A. Ark. Kemi 1954, 7, p. 443 Bendich, A., Fresco, J : R., Rosenkranz, H. 8. and Beiser, S. M. J. Amer. chem. Soc. 1955, 77, p. 3671 Bendich, A., Pahl, H. B. and wre S. M. Cold Spr. Harb. Symp. quant. Biol. ‘1956, 21, p. 31 Bendich, A., Pahl, H. B. and Brown, G. B. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity (Ed. W. D. McElroy and B. Glass): Johns peviss Press, Baltimore, 1957, p. 378 Bendich, A., Pahl, H. B., Rosenkranz, H. 8S. and Rosoff, M. Symp. Soc. exp. Biol. 1958, 12, p. 31 Bendich, A., Pahl, H. B., Korngold, G. C., Rosenkranz, H. 8. and Fresco, J. R. J. Amer. chem. Soc. 1958, 80, p. 3949 | . Sober, H. A. and Peterson, E. A: J. Amer. chem. Soc. 1954, 76, p. 1711 Sober, H. A. and Peterson, E. A. Ion Exchangers in Organic and Biochemistry (Ed. C. Colman and T. R. E. Kressman): Interscience, New York, 1957, p. 318 Peterson, E. A. and Sober, H. A. J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, p. 751 Sober, H. A., Gutter, F. J., Wyckoff, M. M. and Peterson, E. A. J. Amer. chem. Soc. 1956, 78, p. 756 Friedkin, M. and Wood, H. J. biol. Chem. 1956, 220, p. 639 Osawa, 8. and Sakaki, T. Biochim. biophys. Acta 1957, 25, p. 195 Pahl, H. B., Beisor, 8. M. and Bendich, A. Fed. Proce. 1957, 16, p. 230 Bendich, A., Beiser, 8S. M., Fresco, J. R. and Hotchkiss, R. D.— ” elise, gh 二 F. W. J. biol. Olem。 1950, 184, p. 511 J Ghuysen, J.-M. and Desreux, V. Bull. Soc. chim. Belg. 1951, 60, p. 410 _ Ghuysen, J.-M. and Desreux, V. Bull. Soc. chim. Belg. 1952, 61, P- 181 Es and Suzuki, K. Biochim. biophys. Acta 1956, 22, p. 565° ) D. F. and Rich, A. J. Amer. chem. Soc. 1956, Mi p. 5898 : PR ee Suk. i & date P gtd ry, ay in ‘ pees :. WAS Pu = ba * Geoeg ee SO LUE AP UTE AK AL LIS He RINE TAR BEEF EE BEI 核酸 的 水 解 腊 氧 皮 糖 核酸 和 友 糖 核酸 的 水 解 可 产生 各 种 不 同 的 产物 。 这 ， 些 产 物 包括 味 哈 大 和 喀 啶 碱 , 依 照 核酸 类 型 的 友 糖 和 腊 氧 成 糖 , 相 ， 应 的 磷酸 化 糖 类 , BAS, MBSR UDF RMSE 音 酸 ) 以 及 由 这 些 物 质 进 一 步 破坏 而 成 的 各 种 降解 产物 。 核 酸 的 - 类 型 和 水 解 剂 的 本 性 对 确定 降解 的 进行 非常 重要 。 用 碱 水 解 时 ， 这 两 类 核酸 表现 出 全 然 不 同 的 性 质 ， 其 原因 将 在 第 八 章 中 讨论 。 友 糖 核酸 在 室温 下 用 1 碱 液 处 理 时 立即 水 解 成 单 核 昔 酸 , TIE 氧 皮 糖 核酸 在 这 些 条 件 下 很 少 受到 类 似 水 解 的 破坏 。 要 使 腹 氧 友 糖 核酸 变 为 可 溶 于 酸 的 寡 核 背 酸 凸 必 须 将 其 在 100?0 FFE 1M 碱 液 中 处 理 和 小时。 ABODE, OA FO mE A DOE EERE Ee PAS I AT MED 2. LE PRN EEE, WG Sebi TA Fj SER SSF SUE SRE i Oe Se aac EHS ae 糖 所 成 的 昔 的 键 对 酸 更 为 不 稳定 。 因 此 当 这 两 类 核酸 用 酸 水 解 时 、 就 立刻 生成 嘎 哈 碱 一 一 腺 嘎 哈 和 篇 味 哈 ， 而 在 成 糖 核酸 中 的 哮 啶 ， 碱 则 倾向 于 以 单 核 背 酸 的 状态 存在 ,若是 胎 氧 友 糖 核酸 的 吵 啶 碱 ， 则 尽 核 苷 二 磷酸 的 状态 存在 。 只 有 在 剧烈 的 条 件 下 核酸 才能 彼 水 解 成 游离 的 喀 啶 碱 一 胞 喀 啶 、 尿 喀 喧 或 胸腺 喀 啶 。 水 解 到 嘎 叭 碱 和 喀 啶 碱 | FAA Pea ii. 0 1 OR IC SPE AY AIRS, Hah DA DR Ae FS A fa Bs, AT tie? "Mt Ay Bas, Beene FW Eh wm?) DKA O.4N 至 6Ne Hy KU EA eRe AUR KR #£ 100 ~120°C FAbBE 1 = Q-hAy, FERRE, 尤其 是 将 其 NH me A FES AS TR) 63 FFAS BRS, FSB WE LEAL ES WE RR HARB LRA ARATE. MINER RETE 120°O 下 用 0.5X 盐酸 将 核酸 处 理 2 水 时 是 否 会 使 味 啥 碱 全 部 释 出 &%9。 但 用 轿 层 析 法 四 以 及 生成 银 起 沉淀 的 方法 四 从 相应 的 核 音 酸 回收 的 腺 味 哈 和 饲 嘎 哈 的 量 来 断 , 在 100°O 下 用 LV 酸 处 理工 小 时 已 能 够 相当 满意 地 使 顺 哈 碱 APR. 这 些 条 件 也 全 应 用 于 友 糖 核酸 的 分 析 , A 分 如 已 芍 知 的 嘎 哈 和 喀 啶 衍生 物 几乎 全 部 回收 中。 但 是 ,测定 嘎 哈 淡 度 的 同位 素 稀释 法 全 指出 , 用 这 种 方法 处 理 时 移 有 7 多 的 嗓 险 FY fe RAR TT BDI BRA ESOT Yk DOR AR ey PR A EO, ELEM EBL KS DURE HY THIER Pk, Be EM WOE COMBAT AREAL. RRIALEE a, BNL Be AL SOTA HR, BAD AE RE, 但 为 了 分 BRA, HS BTS 2 BD A OO YR 8 iis FA DAR Se OIE PP DA) i: BI — 5G 善 方 法 的 困难 性 。 胞 喀 喧 和 尿 喀 啶 可 用 25% 的 硫酸 在 175°C 下 水 解 酵母 核 精 核 酸 2 小 时 而 制 得 吧 。 但 是 ,在 这 些 条 件 下 , 胞 喀 喧 会 腊 氨 而 变 成 尿 喀 啶 。 其 他 全 被 采用 过 的 南齐 包括 在 120?Q 时 的 —0.4~0.6N 盐酸 外 175°O 时 的 98~100% 的 甲酸 包 、175?g 时 fy 20% 的 盐酸 外、12 W EO DLR =I TE 155°O 下 水 解 工 小 时 中。 用 0.4~0.6 WV 盐酸 在 120?"0 "Pok ARNE Rem 当 酸 的 淡 度 增加 时 , 喀 喧 碱 的 释 出 量 亦 增加 ; 可 是 , 胞 喀 啶 的 产量 “对 尿 喀 啶 来 讲 是 低 了 , RAPE Le eA, 用 省 的 甲酸 可 防止 胞 喀 啶 的 觅 氨 作 用 ,可 是 沟 这 样 处 理 后 ,所 得 的 尿 喀 啶 的 量 极 低 ， 而 且 这 种 方法 全 被 发 现 不 适宜 用 作 尿 喀 啶 核 背 酸 的 定量 水 解 吧 。 用 12X(70~72 匈 ) 过 氧 酸 在 100°O 下 水 解 工 小 时 几乎 可 以 全 部 得 到 所 有 的 碱 基 "9 ,虽然 喀 啶 碱 没 有 全 部 彼 回 收 。 但 是 这 个 方 法 ， 以 及 较 少 使 用 的 甲酸 方法 四， 便 彼 广 泛 地 应 用 于 核酸 的 分 析 。 近来 , Dutta、Jones 和 Stacey" 4p HBR = Hel CLR FE 155°O 下 水 解 80 分 钟 ; AAT eA 1 UR A ERB BIER A FF 2 cS ! ee “a aie ‘ a ~" 64 第 四 章 ”核酸 组 分 的 提取 和 核酸 的 组 成 还 有 一 个 优点 , 即 著 用 和 狂 层 析 法 进行 分 析 时 ,将 不 会 使 滤 狐 焦化 。 用 上 比较 温和 的 方法 处 理 腊 氧 友 糖 核酸 时 可 以 很 容易 地 使 其 中 的 腺 味 叭 和 岛 味 吟 涤 出 。 最 早 的 方法 是 采用 29 的 酸 在 1002O 下 水 解 10 分 钟 。 所 得 的 产物 除 味 叭 大 外 , 还 有 一 种 高 分 子 量 的 、 不 易 规 别 的 艾 余 物 ， 这 种 残余 物 称 为 胸腺 酸 中 ， 因 为 它 只 含有 胸腺 喀 啶 ; 但 天后 发 现 它 还 含有 胞 喀 喧 ,了 0 。 用 控制 更 严格 的 制备 方 229 Bde 87°C 下 、pH1.6 时 水 解 路 小 时 或 在 100°O FF, pH 2.8 时 水 解 工 小 时 ,可 得 到 一 个 更 易于 重复 产生 的 靶 称 为 去 味 ， 哈 酸 的 物质 。 盐 酸 醇 溶液 合用 于 嗓 叭 碱 的 定量 测定 外 细 。 当 用 更 强 的 酸 时 ， 则 含有 喀 啶 碱 的 多 核 背 酸 玛 基 可 进一步 被 降 解 成 胸腺 喀 喧 和 胞 喀 啶 腹 氧 友 糖 二 磷酸 以 及 相应 的 单 核 背 酸 。 用 盐酸 、 过 氧 酸 、 甲 酸 和 三 氟 乙 酸 进行 水 解 的 方法 介 秆 用 作 噶 喻 碱 和 喀 啶 碱 的 定量 测定 ， 其 所 用 的 条 件 和 水 解 皮 糖 核酸 时 所 用 的 条 件 颇 为 相似 。 在 120°C 下 用 盐酸 (6 W) 水 解 2 小 时 可 以 得 到 ABATE, (EL al UI Se Be ROA YR BE 7.5N 或 12 fost me" 在 100°C 下 水 解 工 小 时 可 以 得 到 更 好 的 结果。 当 用 12 过 氧 酸 水解 时 ， 则 将 损失 少量 的 胸腺 喀 啶 ， 但 是 这 种 损失 可 由 对 每 毫克 膀 氧 友 糖 核酸 使 用 不 超过 15 pl 的 过 氧 酸 而 减低 。 使 用 甲酸 作 水 解 剂 时 入 得到 最 满意 的 车 果 , 其 所 用 的 条 件 是 加 ,在 175"0 FH 98~ 100% 的 甲酸 水 解 2 小 时 ,但 也 可 用 更 短 的 加 热 时 间 '2s' 2 。 使 用 更 弱 的 甲酸 (88% ) 在 175°O 下 水 解 30 分 钟 亦 舍得 到 良好 的 车 果 'o。 (ER ae RE at, 筷 嘎 只 和 郑 甲 基 胞 喀 喧 的 回收 量 都 可 以 由 使 用 比较 大 一 些 的 酸 对 核酸 的 比例 (500 wl/mg) 和 和 避 有 驶 在 氧化 气氛 中 进行 水 解 而 得 到 坪 加 。 近 来 发 现 用 三 氟 乙 酸 在 155?0 下 水 解 工 小 时 可 以 得 到 非常 满 . 意 的 定量 和 结果” 。 AAG ROL EMA EY , OBER RAS DBR TK SE Be BA EEE, Zk fe 可 以 在 室温 下 用 1 aisha 1 盐酸 来 完成 。 但 是 后 一 方法 较 不 适宜 ,因为 友 糖 与 顺 哈 所 成 的 苷 的 键 有 被 断 裂 的 危险 呈 ,3239 。 Wa Be MG MB, AEE AA ES A HBR 65 SEF IX BAKE, HABER WE CEP DY ILE 3 7k PE me EE A IE WR. FEAT EP ,似乎 满意 的 是 : 在 80°C 下 及 pH 18~14 时 水 解 42 Ait ste)", FO. 氮 氧 化 钠 在 20~ 22°C 下 水 解 18 小 时 ,用 江 的 氨 氧 化 按 在 45°O 下 水 解 8 KS) (在 其 他 条 件 “ 下 用 氨水 解 会 产生 核 苷 ) 和 用 0.3X 氨 氧 化 钠 或 握 氧 化 钾 在 87°C 下 水 解 18 小 时 8s5*sn (更 高 的 碱 江 度 , 例如 1 氨 氧 化 钾 , 会 引起 FDIS WEE AK EF BE ER.) 。 用 这 些 方 法 所 得 到 的 核 背 酸 均 为 核 背 -2- 和 -3 磷酸 的 混合 物 (BF F320). 直 于 顺 哈 觅 氧 友 糖 核 音 酸 的 音 键 对 酸 不 稳定 以 及 这 种 核酸 对 敌 未 解 的 抵抗 作用 ， 因 此 化 学 水 解 井 不 是 一 个 从 脱氧 友 糖 核酸 制 备 单 核 背 酸 的 满意 方法 。 在 产生 碱 水 解 的 条 件 下 ,例如 用 1 毛 氧 化 钠 在 100°O 下 进行 水 解 4 小 时 , Se jE EER DL OS 和 胞 喀 啶 几乎 完全 觅 氨 巴 。 但 是 ,温和 的 酸 水 解 将 产生 喀 啶 -5'- 磷 酸 和 喀 啶 -3', 世 -二 磷酸 的 混合 物 Bs~ 扫 。 - 核酸 的 酶 促 水 解 亦 可 用 于 核 背 酸 的 制备 。 但 是 ,用 核糖 核酸 酶 使 皮 糖 核酸 水 解 ， 其 作用 不 能 完全 器 。 这 是 因为 核糖 核酸 酶 不 能 水 解 皮 糖 核酸 中 所 有 核 背 酸 间 的 键 , 而 只 有 那些 3'- 喀 啶 核 苷 磷 酸 基 团 与 相 邻 的 味 哈 或 喀 啶 核 苷 酸 问 的 下- 羟基 问 的 键 彼 水 解 的 糙 故 只 ~ 和 霹 。 因 此 相 邻 的 味 哈 核 昔 酸 问 的 键 以 及 在 一 个 下 =- 喀 啶 核 背 磷 酸 基 团 * 和 一 个 相 邻 的 味 叭 或 喀 啶 核 背 酸 的 3'- 产 基 问 的 鱼 SIAN BAK IE it DAG BE AE OBR BET FE Te RS PE 3'— PRE ET ” 酸 和 3'- 胞 喀 啶 核 苷 酸 以 及 寡 核 苷 酸 的 混合 物 。 核 背 -5 -磷酸 也 可 以 从 成 糖 核酸 制 得 ， 但 是 这 些 核 苷 酸 不 能 借 化 学 鼓 剂 的 水 解 而 获 得 ,其 原因 将 在 第 作 章 中 寻 论 。 可 是 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 , 当 除 去 台 - 单 酯 酶 的 活力 后 能 产生 一 个 含有 四 种 Bf- 核 背 酸 、 喀 啶 -2 , BA bz—8! , WR ME TR DL UMA BAF By UL A a, GAD 混合 物 中 可 用 离子 交换 层 析 法 将 BEB BS HK 脱氧 友 糖 核 苷 酸 也 可 以 用 酶 促 水 解 来 制备 。 在 用 小 牛 胰腺 的 脱氧 核糖 核酸 酶 将 肌 氧 友 糖 核 配 消 化 后 ， 用 离子 交换 层 析 法 可 以 ~ ® JRSCRL, Bekie (BARE) : 66 re WARE R Ay HS HH Pe RA 8 TR, UREA ARS 应 用 从 Micrococcus pyogenes’ Hao MAR IRB 8” Ha 5p Bie HH a 5) EAS, BS AK BSA Hill 4 EC AK F-8' RFR AK RENE 友 糖 核 普 可 以 从 友 糖 核酸 用 较 那 些 用 于 核 普 酸 制备 的 更 剧烈 的 水 解 条件 来 制备 。Levene 和 Jacobs?" 应 用 了 溃 的 氧 氧化 锭 在 175~180”g 及 加 压 下 进行 水 解 8.5 小 时 ,而 Bredereck, Martini 和 Richter?” 则 使 用 吡啶 的 水 洲 液 。 为 了 增加 产量 ,对 这 两 个 方 EARS EMER! 。 应 用 上 壕 两 种 化 学 水 解 中 的 任何 一 种 ; 核 $F ta FY DLA AS A FBP FRO, FER PSR, | DUI We 7A SE SE a HY A , ZS HR FE Te BA He PRR RB ee RA eee +P EWA BEE HE DEK ED EES FAS BE De FA. Hath ZA FAME ZK ER Hl BAZ =F, Anderson, Dekker #1 Todd’) 介 叙述 了 一 个 方法 , 先 将 腊 氧 成 糖 核酸 用 觅 氧 核糖 核酸 酶 水 解 ,水 解 后 不 立即 进行 分 离 ， 而 在 银 离 子 的 存在 下 使 腺 味 喻 腊 氧 友 糖 背 腊 氮 酶 的 作用 受到 抑制 ,然后 用 肠 磷 酸 酶 水 解 ,将 胸 氧 友 糖 核 苷 酸 中 的 磷酸 除去 。 水 解 产物 的 离子 交换 层 析 分 高 用 离子 交换 层 析 法 尽 分 离 从 核酸 水 解 所 得 的 嘎 吟 硕 、 喀 啶 碱 、 核 背 和 核 音 酸 的 方法 不 仅 可 作为 分 析 的 方法 ， 而 且 也 可 用 于 制备 这 些 化 合 物 。 近 年 来 这 个 方法 介 彼 相当 广泛 地 用 于 制备 不 能 用 其 . 他 方法 制备 的 核 苷 和 核 音 酸 。 这 个 方法 的 最 大 成 就 之 一 就 是 能 名 分 离 出 磷酸 基 团 在 友 糖 的 2%- 和 3'- 位 置 上 的 成 糖 核 昔 酸 的 带 构 HK, Oobn 及 其 同 工 者 se 咖 全 大 大 地 发 展 了 这 个 方法 。 其 他 文献 59 佛 广泛 地 叙述 了 离子 交换 层 析 的 一 般 方 法 。 苇 酸 降解 产物 的 分 离 则 往往 使 用 标准 的 技术 。 通 常 是 测定 沙 液 在 260 my. 处 的 光 吸 收 程度 作为 洗 腹 液 的 分 析 。 最 常用 的 离子 交换 树脂 为 ;: 强 碱 型 阴离子 交换 剂 Dowex-1, Dowex-2 和 Amberlite- PP WETS Ti, ORE Hi, AEF AA EY PRY HE AR 67 IRA-400; 强酸 型 阳离子 交换 剂 Dowex-50 Fi Amberlite—IR-120 以 及 弱酸 型 阳离子 交换 剂 Amberlite-IRO-50。 游离 的 哄 喻 碱 和 喀 啶 碱 以 及 核 背 可 以 含有 各 种 可 电离 的 基 Al, 如 果 不 考 虑 只 在 强 碱 中 才 电 离 的 糖 状 基 , 则 这 些 可 电离 的 基 团 为 : 腺 顺 哈 、 饥 呀 哈 和 胞 喀 啶 中 的 氨基 以 及 篇 味 哈 、 尿 喀 啶 和 胸 腺 喀 啶 中 的 一 NH 一 00 一 的 解 离 。 这 两 类 电离 基 团 的 PKG fi ( 参 看 第 七 章 ) 分 别 在 3.2~4.5 和 9.5~10.0 RA, RAR 一 个 弱酸 的 解 离 , 其 PK, 值 为 9.8。 这 个 数值 极 可 能 代表 咪 唑 环 rh —NH— 到 —N— 的 解 离 。 ”” 斑 于 核 背 酸 , 除 上 述 的 解 离 外 ,还 存在 着 磷酸 的 一 级 和 二 狼 解 BS, 它们 的 pK 值 狗 分 别 为 1.0 和 6.5 。 因 为 这 些 带电 的 基 团 不 同 , 因 此 洗 脱 可 以 用 二 加 竞 等 离子 的 省 度 并 蕉 持 沙 液 pH 不 变 , 因 而 使 离子 上 的 电荷 恒定 的 古 法 来 进行 ， 或 更 通常 地 用 坪 加 竞 委 离 FHA pH, 使 被 吸附 的 离子 上 的 电荷 减少 或 增加 的 方法 来 进行 。 核 背 酸 中 磷酸 基 团 的 存在 使 核 苷 酸 的 离子 交换 行为 与 味 叭 ” 碱 . 喀 啶 碱 和 核 背 类 的 离子 交换 行为 有 明显 的 不 同 , 因 此 这 两 类 有 物 质 的 离子 交换 行为 将 分 别 予 以 讨论 。 “在 酸性 溶液 中 , 饲 味 哈 、 腺 嘎 哈 和 胞 喀 啶 的 氨基 以 及 相应 核 昔 的 氨基 均 解 离 为 阳离子 ,其 pK 值 按 所 壕 砍 序 而 二 加 (参看 表 8 ”和 9，, 第 七 章 )。 尿 喀 啶 和 胸腺 喀 喧 以 及 相应 的 核 苷 没有 氨基 , 因 而 不 被 气 型 阳离子 交换 剂 吸附 到 任何 可 以 觉察 的 程度 。 图 18 表 示 出 人 工 襄 和 的 酵母 核糖 核酸 的 四 个 碱 基 在 Dowex-50 (H* 型 ) # 上 用 阳离子 交换 的 分 离 。 洗 腹 是 在 提高 竞 等 离子 的 省 度 而 不 改变 其 电荷 的 情况 下 进行 哇 瑟 加。 在 这 个 交换 系统 中 胸腺 喀 啶 犹如 胸 RR WE ARE AL RM DE BEE RE, ARABS BRE IE, AD EAR BES, LIAR BRIDE. UIE AEE eames eB A Td B— 基 胞 喀 啶 则 紧 随 之 ca 。 增 高 溶液 的 pH DUVET YEMEN REHEAT 用 于 分 离 嘎 哈 碱 和 喀 喧 碱 的 混合 物 , 虽 然 Reichard 和 Estbornsel 代用 这 个 方法 以 分 离 同 位 素 标 刀 的 腹 氧 成 糟 核 苷 。 但 是 一 般 来 68 Sz PARMA A DE EA TEA BEE (EE 9 HS, EE Oe Ais 5, DABS PE TF TERE _L AEB i 4 3.0 PDR El | Rem mE HX 5 ia) 2.0 = § a 44 1.0 0 ZZ: — 100 200 300 400 500 600 2N HCl 的 体积 ml 13 FARA RSF 28 hE: (Dowex-50-H*) Bre ry Heng FS . ALN EA EU A HIS (W. E. Cohn: Science 1949, 109, 377 页 ) —NH—OO— #5 SES FS, I oR ED Ba ROE ET AS BASE. FERRIS Hp, PRU RAY DOES , 1H ER mL EEE HB, HHP PETE EE EE RSS, ROR (SEAS LNA aL UE A EAS fg ESOP. FA 14 Se EL a Gi UME We TR BS HS BEEF 9 VEE A 15 pas BAF SMO MIEN EEE. RAT AMI 5 BF I ORMEER IS HER PE EEE , LH Wy Ae EFS LIS ie AZ EF ALE ee LS AL ZEA, BRT BE 它们 分 开 (\ 图 15， 。 但 是 , Anderson, Dekker fn Todd" 采用 了 一 个 适合 于 大 规模 制备 腊 氧 友 糖 核 苷 的 方法 ， 便 成 功 地 分 离 出 腺 嗓 喻 和 胞 喀 啶 的 脱氧 成 糖 核 苷 。 他 们 用 甲酸 包 稻 冲 液 (pH9.8) Be BRR Fa RUIN ae RA OA ka A. Dowex-2 HEE VEER, BR JRE A WR SE CY EEE a He, EF 99 2 PE SE ENR HL 69 交换 剂 Amberlite-IRO-50 +§_ ET RARC. TREE T HELE EAE « 4.0 Re 3.0 Fa 胞 路 啶 sa PROG OE & QQ 2.0 六 g 3 cq Dn re paren 吕 昌 | 1.0F | | 1 | 0 — 0 1400 200 300 400 500 600 700 800 NH,OH-NH,Cl #eubygny BR ml 图 14 ARAB 2HRE: (Dowex-1-Kte) SEN SIT Be, ME ad ROE AL HG ND, 89 ZS (W. E. Cohn: Science 1949, 109, 377 页 ) HIBPRAALECKAAHRBEA, A eMMme+ BE Bh RS PA: ERAS a Me ah FPA EF BY SC ee PEA A I] BR Wie AK EF | i SAY Er FS SB As A RSE , 因 ”此 在 低 到 相当 低 的 pH 值 时 仍 保 留 其 阴离子 性 质 。 这 些 两 性 电解 质 的 等 电 点 是 在 pH 和 2 之 间 。 如 图 16 所 示 , 在 pH5.5~2.0 范 园 内 , 当 pH 因 氮 基 的 电离 而 减 小 时 , RA pA, AAA 为 氨基 在 不 同 的 核 昔 酸 中 具有 不 同 的 PKG 值 , 因 此 在 基 一 答 定 的 TH 时 ,个 别 核 昔 酸 上 的 奖 电 荷 就 不 相同 。 交 电荷 的 不 相同 就 构成 了 离子 交换 分 离 的 基础 。 尿 喀 喧 核 音 酸 Cig BR AE ME WG: SL wR BE AK 昔 酸 亦 然 ) 没有 氨基, 因而 不 带 正 电荷 。 图 16 所 示 的 在 pH 2.0 以 下 的 和 盈 电荷 的 改变 是 由 于 离子 化 的 一 航 磷 酸 解 离 的 泣 定 BX & if 70 Uae RRA TH RE RAR A ~] oO C+ AR ma EEE] of FAS Ig 在 265 mw 处 的 光 密 度 oO 局 2.5 800 ml 0 通过 柱 的 体积 图 15 用 阴离子 交换 方法 (Dowex-] 二 -甲酸 盐 ) 所 作 的 呆 喻 碱 \ 路 喧 碱 、- BAERS (W. E. Cohn: J. Amer. chem. Soc. 1950, 72, 1474 BH) “HEAE PATHS ES BLA DR AB IL TO BA RB Fy, lita WB Ha A He HET HH HO VE PE Dee, ” WAT Be HA FMLA BI AY 45 BS te Se (PA 17) , 必须 假定 交换 剂 吸附 味 ， 啥 碱 的 能 力 狗 三 倍 于 吸附 喀 啶 碱 的 能 力 eo 。 Oohn 和 Khym"” 便 群 甸 令 述 了 四 个 友 糖 核 苷 酸 的 分 离 ( 混 pte 8 Ae). 图 1 ee 人 下 全 全 村 和 PE VENT AE 阴离子 交换 树脂 (Dowex-l sy -2, Amberlite-IRA-400 sk -410, 200~ 400 PHAR, 8~10% WA) EVRA. FE ATER AY BEF DL RIE A El — SBE DAS BO, ZEEE By We Ble A Hi, AES AA PR Hz MR 71 +0.6 +0.4 +0.2 eM AY AY -3' He RRM AZ AL—5’ ER 0.0 胞 路 啶 核 蔡 酸 PROB MERLE RR pH 图 16 每 个 核糖 核 昔 酸 分子 上 的 电荷 与 pH 的 关系 (W. E. Cohn: J. cell. comp. Physiol. 1951, 38 补充 本 了 24 FH) 1} RE MIGGHR ART GR Biss Pine Oe ASR 0.04 0.07 0.1 0.2 0:4 0.7 1.0 2.0 4.0 相对 分 配 系 数 图 17 核糖 核 昔 酸 的 相对 分 配 柔 数 ( 洗 膀 峰 的 位 置 ) 的 观察 值 与 p 瑞 的 关 肤 (W. E. Cohn: The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff #1 J. N. Davidson): Academic Press, New York 1955, 223 页 ] — i. we 在 260 my 处 的 光 密度 72 第 四 章 “核酸 组 分 的 提取 和 核酸 的 组 成 3.5 z 5 2.0400 1} ID i - H Tt peamigmiceaFB (11 mg) 。 t t pH fal 上 】| 腺 顺 哈 核 昔 酸 ) RM ERASER BREE 1.07 WY ao me) (15 mg) ‘Mire |e ! #8 or HH RE iz we P=00 < £9 iS -D 280 P=100 1 wad ! O.D 20 Oa: 下 HOCO1L 的 体积 (由 pH 校正 的 ) 图 18 用 阴离子 交换 (Dowex-2- 氧 化物) 分 离 核 糖 核 昔 酸 Se Ae TRS AY i HE (W. E. Cohn: J. Amer. chem. Soc. 1950, 72, 1476 Fy) 低 高 度 应 为 10 em， 而 所 含 树脂 的 最 小 体积 应 该 是 : BEARER A 20 ml, — BSP BAKA RAH BIB, PATER TE BY 速度 。 树 脂 的 制备 是 将 10 个 柱 容量 (CV) 的 IN SSSA, 274 CV AD 1M ACB AMR, 10 个 CV By IN 盐酸 洲 液 和 2 个 CV Rizk COE Dit HA He BY pH AF 3) EIS. “GOERS ERO AS (BB LD , WR 酸 - 聚 共 乙烯 离子 交换 剂 (Dowex-50 BK Amberlite—IR-120) (631 #§ 5238 pH5, 而 交换 剂 则 借 过 滤 或 倾 出 的 方法 除去 。 将 交换 剂 洗 次, 洗 液 并 入 滤波 中 ,然后 ”加 所 使 滤液 的 pH 提高 到 8 以 上 。 再 将 滤液 稀释 ,使 总 阴离子 (包括 核 苷 酸 ) BYIRBESSA 0.01M, 然后 将 其 以 不 大 于 3 毫升 /平方 厘米 /分 的 流速 流 过 交换 剂 , 使 了 明 离 子 吸附 在 交换 剂 上 。 交 换 柱 用 2 CV 的 水 和 10~20 CV py 0.01 7 毛 化 急 洲 液 洗 次 (下 到 流出 液 的 DH Kez 7 DIF) DABRSS BP a BE 碱 。 若 水 解 产 物 中 有 无 机 磷酸 盐 存 在 , 则 应 该 先 用 0.04 M Stik ok vs HR (10 WO ie a WO AES AES PRY HE AK 73 “CV)， 继 之 用 3CV 7kvEHEE 。 | FARRER (0.002 N) Bee, 其 洗 腕 过 程 可 用 分 光 光 度 法 测定 洗 腕 液 在 260 mw AAVEBOHORIE RR. Hee IRE AY 10 CV 内 被 除去 ， Se > Fl Hepes WS pete Bt i (yt 30 CV 内 出 现 )。 当 洗 腊 波 的 光 窗 度 值 重 新 降 至 低 于 0.01 时 ， 用 狗 100 CV 的 0.C05 N FRE ROR ERAS VHRR AU. 核 芽 酸 的 分 离 也 可 以 在 甲酸 盐 交 换 柱 (在 开始 时 的 - 几 个 步 屋 中 用 甲酸 盐 代 替 毛 化物 ) 上 用 0.12 甲酸 来 进行 或 在 乙酸 盐 交 换 柱 ( 在 开始 时 的 几 个 步 屋 中 用 乙酸 盐 代 替 毛 化物 ) 上 用 0.3W 乙酸 来 进行 652]。 本 Hi | a et) 5 cs % 5.0 ae | A AM EL af RS RS 4.0 1] 在 260 my 处 的 光 密 度 Co 局 . nay AOE fm fe et BR beens 2.0 碱 基 5 if: 5 Se 1.0 = cn 人 j 0 500 1000 1500 2000 - 2500 ml 体积 (由 PH 平衡 而 来 ) 图 19 用 阴离子 交换 方法 (Dowex-1- 毛 化 物 ) 分 离 觅 氧 皮 糖 核 蔡 酸 (E. Volkin, J. X. Khym 和 W. E. Cohn: J. Amer. chem. Soc. 1951, 73, 1534 页 ) * asc, eck (A) hk aha -—o* 7 74 第 四 章 ， 核 酸 组 分 的 提取 和 核酸 的 钥 成 Volkin、Khym 和 Cohn! 首先 叙述 了 脱氧 友 糖 核酸 沟 酶 消 ， 化 后 所 产生 的 股 氧 友 糖 核 苷 酸 (-5'- 袜 酸 ) 的 分 离 。 其 典型 的 层 析 EL 19, 腊 氧 戊 糖 核 苷 酸 的 分 离 吧 ,saven gn eR RY 类 似 , 其 中 只 是 胸腺 喀 啶 腊 氧 成 糖 核 背 酸 (胸腺 喀 啶 核 蔡 酸 ) 代替 T Ree. Cohn, Volkin 和 Khym"™®! 对 这 个 方法 合作 了 全 面 的 描述 将 0.1~1.0% 的 腊 氧 戊 糖 权 酸 游 液 在 水 滩 上 在 100°C “F pnd 10 5 钟 ,以 除去 其 中 的 任何 磷酸 单 酯 酶 7， 然后 使 洲 液 中 硫酸 镁 (Mg : P=1:10) 的 省 度 达到 0.03 M DI Tekin ers ARR BSA ihe BE Ay 0.02% 1881, FE fe 37°C PeRio FERRI A Bs BA LSE PH 保持 在 6~8 Zi. ME 1~2 小 时 后 Eh A Bee — SO Ah Ha pH BS A9 Zs 间 。 水 解 作用 在 5~6 小 时 内 完成 。 在 水 解 过 程 中 将 游 液 用 稀 所 氧化 钠 游 液 沛 定 , 使 p 瓦 保持 不 变 。 水 解 完全 后 ,加 入 毛 氧 化 铁 使 洲 液 的 温度 变 为 0.127， 然后 将 溶液 稀释 ,使 总 的 阴离子 玫 度 (包括 核 芽 酸 ) 小 于 0.01 M, 并 使 其 在 交 ALLE. AUR DT IR PE, KB TE TEU CE LEAT. HE 在 柱 上 吸附 并 如 前 洗 潍 后 ， 用 狗 50 CV 的 0.001 N SEAR PE MERE Mame tes HER, FEA 40 CV 的 0.002 N REAR EY RHR. TRUER 酸 旭 用 30 CV 的 0.003 N ZkRRVENE, TBE SS ERA 0.005 N 的 盐 Be Gk) 70 CV) YEME. KANE ATLA DOE A Reha ZERO TEE. SURPRISE EE I RR 4f -2- 和 -3'— BER Ma Pils RELA FP BGO Be EE OIE AB HE ACEP AE TS BEEF —2'— 和 -3 HRS BBA De BE AK We FD PED). Bet DR AR Gk 7 PRL Hl WOE IS A KY FB By (BABA) 。 ELAR 7 LRM Be EER MRE oe EERE SH 的 解 离 常 数 (参看 第 七 章 , 表 9) , 其 氨基 的 pK! (AAI ES 的 PK4 值 依 5'-, 2'- 和 3'- 的 次 序 而 减 小 。 旗 然 在 必要 的 分 部 “ 条 件 下 , 异 构 体 在 洗 腹 时 呈现 这 样 的 次 序 , 这 似乎 是 , 因为 异 构 体 的 其 他 因素 几乎 不 变 , 那么 这 些 基 团 的 解 离 就 构成 了 分 离 的 原 “ 国 腺 嘎 喻 核 苷 -2 -磷酸 ( 腺 嗓 叭 核 音 酸 a) 和 腺 叶 喻 核 苷 -3'- 磷 酸 Pee ae oe oe eer eee se ee eee ‘ Wa i WR A AA ES Py 42 BK 75 (BN BEEF IR b) FY DL FAR") HELO 或 乙酸 盐 的 层 析 Fie DAFF (A 20) , PELE SAME ER RSE, 其 原 | 2h EBS pH 38~4 HI, 另 一 部 分 是 由 于 甲 RNA RM, (A, WOR IN AVERETT UE, HR FA Pr Eh ie BG Foie Hs AY BEA , TAT IEY FF Eh A Ze ERS CE 吸附 前 就 必须 加 以 稀释 "人 RE Te BD AT FS AE A DR A Er —« Webht EleI—AE LE, EFT TRB A Dk ray eek ze 2 meg, | RWIS (fade) 不 宜 大 于 0.01 1 。 将 层 析 柱 按 ”前 法 洗 泛 ,而 腺 叶 喻 核 音 酸 的 异 构 体 则 用 150 OV 的 0.02 NV 盐酸 Se x Dh DBE BE, PR -2' BRITE T 45 OV 后 出 现 ， 在 70 OV Fey Hiss FU TE ie, 1h BRM AK EP 3’ -磷酸 则 在 狗 120 OV AYIA aah 0.04 M FARREE-+0.004 Bf 甲酸 一 -| 18 FRM NE ER BMT ER ; 5! 2' 3! 5! 9! 3° HX #9 2. R = ~ 3 = et: O.D x O-D any Hi 1. | Dg Pe ake pee poten 0 O01 02 0.3 04 0.5 0.6 0.7 0.8 ; 通过 柱 的 体积 升 图 30 用 阴离子 交换 方法 (Dowex-1- 甲 酸 盐 ) 所 作 的 -2-、-3- 和 -5/- 核 糖 核 昔 酸 异 构 体 的 分 离 [W. E. Cohn: The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Chargaff #n J. N. Davidson): Academic Press, New York, 1955, 230 页 ] Sheep ee i e. al. ee ed Sy Weta f= 7) eer rs 2m" # i ; J 76 SUR ”核酸 组 分 的 提取 和 核酸 的 组成 到 顶峰 。 胞 喀 哇 核 苷 -2%- 和 -3/- 磷 酸 可 用 类 位 的 方法 用 0.001 M 盐酸 oa 或 一 个 甲酸 盐 或 乙酸 盐 系 业 四 ,路 电 和 加 以 分 离 ; RE 核 苷 -2- 和 -3'- 磷 酸 可 用 0.05 M A mege An 0.00125 M 甲酸 在 甲 Pee E47 Be 54, 60, 70] ; 篇 味 吟 核 苷 -2/- 和 -3'-- 磷 酸 则 用 0.005N , SLATER (LUTE: LIPO! 人 ra。 所 分 离 的 异 构 体 则 从 稀 溶液 中 在 更 小 的 柱 上 用 再 吸附 的 方法 进行 沽 ， 工 洗 腊 在 水量 的 0.1 广 盐酸 中 oa。 离子 交换 的 分 离 方 法 也 可 以 应 用 于 核 苷 二 磷酸 、 午 核 背 酸 以 ， 及 如 在 第 三 章 中 所 令 述 的 应 用 于 核酸 。 为 了 促进 分 离 , 亦 全 采用 KH). 在 这 些 烙 合剂 中 最 有 效 的 是 碘 酸 , 它 常 以 四 码 酸 盐 (和 KB.0;) 的 状态 存在 于 溶液 中 。 和 采用 硼酸 盐 系 竹 可 以 显著 地 坎 ™ o> + DVR RA) 。 核 苷 酸 以 及 核 苷 酸 异 构 体 的 分 离 也 可 以 在 _ 盔 酸 盐 系 巧 中 进行 而 得 到 一 些 分 离 上 的 改进 “”。 水 解 产物 的 约 层 析 分 离 自从 Vischer 和 Ohargaffrmn 以 及 Hotchkiss 第 一 次 证 实 可 用 纸 层 析 方 法 分 离 核酸 中 的 组 分 后 ,这 个 方法 进展 得 很 快 ,并 且 普 肖 用 作 定量 的 分 析 方法 。 这 个 方法 具有 上 比 离子 交换 方法 使 核酸 和 粗 分 分 离 得 更 快 的 优点 ,虽然 它 很 少 应 用 于 大 量 物质 的 分 离 。 已 多 诗 论 过 在 核酸 中 存在 着 酸 - 碱 基 团 的 组 分 ,这 些 硼 分 能 促进 它们 本 “ 身 的 吸附 。 应 用 狐 层 析 技 术 时 需要 克服 的 主要 实 芥 困难 是 在 颖 上 确定 斑点 的 位 置 ， 因 为 这 个 方法 的 完全 成 功 取决 于 用 灵敏 的 和 便 利 的 方法 来 作 斑点 的 鉴别 。 早先 的 方法 有 若 于 将 核酸 组 分 与 汞 构成 略 合 物 ， 然 后 将 其 中 的 汞 变 成 硫化 示 而 使 核酸 组 分 能 被 觉察 rm， HIT RSE 意 剪 开 ,， 借 洗 腊 作 用 以 及 洗 腹 液 的 分 光 光 度 测定 以 估 许 滤 度 外。 但 这 些 方法 都 不 十 分 合 人 满意 ,前 者 麻烦 而 且 相 当 不 灵敏 ,后 者 则 缺少 分 辨 能 力 。 随 着 在 核酸 组 分 的 最 大 吸收 范围 内 高 度 发 射 的 柴 外 灯 的 应 用 , 核酸 组 分 的 鉴别 有 了 显著 的 进展 。 于 是 在 滤 移 的 丽 、 HARE, 可 看 到 核酸 组 分 位 置 的 黑 虹 区域 %s*s0 。 在 进行 实 栓 时 ¢ OO EE IES AS RO HE fe 77 的 未 碳 灯 (能 发 射出 它 的 辐射 的 80 允 ,为 254mHw Skee) 和 一 块 石英 滤 光 片 。 另 外 一 个 比较 费力 但 能 供 欠 一 个 持 : 失 的 层 析 如 的 其 实 大 小 记录 的 方法 ， 就 是 在 紫外 光 下 作 一 个 层 析 讲 的 接触 照相 ss。 所 用 的 紫外 光 是 沟 过 滤 光 的 ， 外 和 争 的 硫酸 盐 溶 液 与 氧气 信用 求 分 离 从 高 压 示 灯 来 的 254 mm 和 265 mn FH BO), AA PRA GBILAT AY 257 mw 与 275 mm BERT DIGS 到 略 高 的 灵敏 度 B8l 。 在 显 过 影 的 片子 上 , DMEM 景 上 显 出 白色 的 斑点 ;这 些 斑 点 因而 可 以 自行 描绘 在 层 析 计 上 照相 的 方法 也 可 以 当 作 一 个 非常 灵敏 的 方法 用 以 检 出 象 骗 咕 附 及 其 衔 生物 一 样 的 物质 的 斑点 ， 这 些 物 质 在 某 种 情况 下 产生 束 。 光 号 。 这 个 方法 亦 全 被 用 以 检 出 从 用 8- 偶 氮 饲 味 哈 处 理 后 的 有 机 体 中 提取 出 来 的 成 糖 核酸 的 不 同样 品 中 存在 的 小 量 8-H ES. 嗓 啥 核 背 酸 吧 ,8 。 此 效应 可 以 在 层 析 计 与 照相 颖 之 间 嵌 大 一 张 纤 蕉 素 硝酸 酯 片子 以 照相 记录 。 适用 于 核 背 酸 以 及 其 他 磷酸 酯 的 其 他 检定 方法 是 用 酸性 钥 酸 盐 溶液 作 颖 层 析 计 的 喷洒 ， 用 热 、 光 或 酶 使 酷 发 生 局 部 水 解 以 及 ”使 所 生成 的 磷 钥 酸 攻 合 物 还 原 成 蓝 色 的 化 合 物 呈 叫 。 避 驳 需 要 ”使 核 昔 酸 水 解 的 方法 包括 用 铀 0 及 用 铁 离 子 嘱 的 固定 作用 。 亦 ”可 用 不 同 的 糖 基 久 检 出 核 苷 吗 。 用 过 丰 酸 盐 将 友 糖 氧化 成 二 醛 ， 然后 再 用 Schiff 南 剂 检 出 所 生成 的 二 醛 亦 能 检 出 成 糖 核 背 。 膀 氧 Bi | BRE ET A Dische —Alie ie yak A Feulgen 反应 来 检 出 。 Wyatt? Di & Markham” 4e Riki BHROBMATE, 然 上 行 层 析 法 对 取得 小 型 双向 层 析 计较 为 便利 ， 但 通常 所 用 的 是 下 行 层 析 法 , 这 样 溶剂 就 可 以 流出 滤 颖 之 外 。Whatman No. 1 je MATS tt AMMA, 但 应 用 于 制备 的 工作 , 则 更 厚 的 No. 3 MM 滤 和 狐 更 为 可 取 。 为 了 要 作 定 量 分 析 , 在 每 个 斑点 内 ,每 一 嘎 喻 或 每 一 喀 啶 的 含量 必须 锡 为 80 we 或 其 相当 的 量 ， 虽 然 更 小 的 量 也 人 成 功 地 秆 使 用 过 。 产 生 一 个 斑点 最 好 用 10. ~ 15 wl PA HR, 应 当 取 与 武 输 斑 点 在 同一 平面 上 的 平行 径路 作为 空白 。 在 用 分 光 光度 法 测定 省 度 以 前 ,空白 与 献 验 斑点 都 要 用 5 ml 的 0.1 W 盐酸 和 78 第 四 章 ”核酸 组 分 的 提取 和 核酸 的 组 成 MINH. | _ 虽然 溶剂 的 选择 还 略 受 这 样 的 事实 所 限制 ， 邵 在 紫外 光 下 有 吸收 的 物质 不 能 使 用 ， 但 在 狂 层 析 中 仍 售 沟 采用 过 许多 种 的 洲 剂 系 竹 。 但 是 大 多 数 溶剂 系 葬 都 是 以 脂肪 醇 为 基础 的 ,因为 它们 可 以 在 中 性、 酸性 或 破 狂 的 情况 下 使 用 。 一 个 重要 的 因素 是 洲 剂 中 存在 的 水 的 相对 量 ; 例如 , 改变 正 丙 醇 - 水 混合 物 的 水 含量 时 ,在 EE Bra EA RM A RRS RS CET BO, Fit kik, 必须 用 固定 的 水 汉 度 , 通常 是 恰 在 角 和 之 下 , 而 不 是 一 个 饱和 溶液 , 这 样 水 的 滤 度 就 与 温度 无 关 。 其 他 影响 分 离 的 因 。 素 是 pH 与 离子 强度 。 核 酸 组 分 的 电离 将 改变 分 配 的 情 沈 而 有 利 于 水 相 , 因此 pH 的 控制 是 重要 的 。 改变 盐 省 度 的 主要 影响 是 对 水 和 有 机 游 剂 的 互 洲 , 可 是 溶质 的 溶解 度 也 会 受到 影响 ,而 且 增加 了 溶质 的 吸附 。 含 氨 或 不 含 氨 的 正 丁 醇 水 溶液 是 最 初 用 以 分 离 核 酸 租 分 的 溶剂 中 的 一 个 中 吗 ， 井 且 仍 为 最 有 用 的 一 个 。 氨 最 好 加 入 到 槽 底 的 溶剂 中 , 因为 这 样 能 保持 更 恒定 的 状态 。 用 这 个 溶剂 系统 ,在 核酸 中 所 发 现 的 全部 嗓 吟 破 和 喀 啶 碱 均 能 彼此 分 离开 来 。 但 是 , 这 个 系 芒 对 饲 顺 哈 的 容量 则 低 。 对 含有 相当 高 骗 味 啥 汉 度 的 混合 物 宁 可 采用 酸 狂 系统 。 与 盐酸 在 一 起 的 相 丁 醇 四 或 异 丙 醇 29 都 可 应 用 。 下 面 烈 出 一 个 可 用 于 实现 大 多 数 分 离 的 溶剂 的 目录 509; test q 些 实例 中 , YAM MARTE ACR PPR, 因为 Markham™ 人 对 它们 作 了 修改 。 1. 正 丁 醇 (860 ml), 7K (140 ml) 84) 。 2. 157) 1 HA, AR (LEO. 880 的 氨水 的 体积 以 59 计 ) 加 于 槽 底 的 液体 中 。 3. 正 丁 醇 (770 ml), 水 (180 ml), 98~100% 的 甲酸 (100 ml) 82) 。 | 4. UT BE (700 ml, 在 26°O) , Wh ke Eh e (182 ml) ,在 20"0 下 加 水 到 1 FI-'6 12, 84, vey ak” 5， 5¢ AU BE (680 ml), eth (164 ml, 比重 1.19), 加 水 到 We We Ve AES: FIVE RY HEA 79 a3 ony 6. S¢IGRE (700 ml) , 水 (30 ml)， 另 加 比重 为 0.880 的 氨 深 液 (每 升 槽 容量 加 0.85 ml), 了. 饱和 硫酸 侯 水 溶液 (800 ml) , 1 M HERES (200 ml) , 异 两 B (20 ml)" , 前 三 个 溶剂 适用 于 顺 哈 碱 ， nee RAE 但 是 溶剂 2 不 适用 于 作 扁 顺 叭 的 定量 分 析 , 它 最 好 用 溶剂 3 或 5 进行 分 析 。 溶 剂 3 对 核 背 特别 有 用 。 核 苷 酸 在 所 有 前 三 个 溶剂 中 极 少 移动 而 仍 靠 近 原 Ko WA 4 适宜 于 研究 酸 水 解 产物 , BREE OS, OS, 酷 啶 核 苷 酸 和 尿 喀 啶 核 苷 酸 分 离 。 深 剂 5 便 彼 广 泛 应 用 于 核酸 的 ， 酸 水 解 产物 和 碱 水 解 产物 ,其 中 所 有 的 碱 基 都 可 彼 分 离 。 这 个 溶剂 特别 蕉 推荐 用 于 含有 高 波 度 饲 嘎 啥 的 混合 物 的 分 离 。 这 个 溶剂 亦 能 使 核 背 、 单 核 背 酸 以 及 小 的 寡 核 苷 酸 分 离 es'loovao。Laland、 Overend 和 Webb" ?* 应 用 了 一 种 类 似 的 酸 溶剂 ,但 使 用 了 正本 醇 ( 正 丁 醇 , 0.5 N 盐酸 , 2- 甲 氧 基 乙 醇 , 其 体积 之 比 为 80:17:10)。 溶剂 6 可 使 小 的 寡 核 背 酸 与 单 核 背 酸 分 离 , 它们 都 是 以 -2- 或 -8'— 的 形式 存在 。 洲 剂 6 TR MAP ERA De eg Sy $$ — BEE 5} BS? 21, Brown 和 Todd 及 其 同 工 者 亦 应 用 这 个 洲 剂 使 环 状 单 核 苷 酸 9 SRR SO, PAH TEE AE -2- 磷 酸 中 分 出 核 苷 -3'- 磷 酸 特别 重要 ; 只 要 顺 哈 或 喀 啶 带 有 一 个 氨基 , 这 种 分 离 就 能 完成 ( 尿 喀 啶 核 苷 酸 的 异 构 体 不 能 分 开 ) 。 这 ”不 溶剂 也 能 使 环 状 -2,，3'- 磷 酸 从 -2'- 或 -3'- 磷 酸 中 分 出 a2。 对 于 一 个 混合 物 用 单 向 层 析 法 分 离 感到 太 复 杂 时 ， 可 用 一 个 有 用 的 双向 层 析 系 入 ， 这 个 系 葡 系 由 异 丙 醇 -盐酸 溶剂 与 正 丁 醇 - 氨 洲 剂 或 与 异 丙 醇 - 氨 溶 剂 合 井 粗 成 而 加 以 使 用 。 应 用 溶剂 12,3 和 5%" 时 的 味 喻 碱 喀 喧 碱 和 核 苷 的 Re fit 色 带 的 移动 wR IE AN aE OS (Be = pe rar aeay ) UCR 4。 随 着 温度 的 改变 必须 预期 到 在 数值 上 有 革 些 差别 。 表 5 烈 出 核 苷 酸 在 溶剂 4, 5 和 7 中 的 Re ffi, Carter” 用 磷酸 钠 - 腊 成 醇 系 租 no. 8) 分 离 核 苷 酸 异 构 体 所 af a Ae 80 第 四 章 “核酸 组 分 的 提取 和 核酸 的 粗 成 #4 SREY Rp 值 RRs 0.38 0. Bey 0.15 0.11 0.13 0.22 REN 0.26 0.12 0.30 0.29 meat 0.18 0.05 0.24 0.21 尿 喀 啶 0.31 0.19 0.39 0.66 Phe FR 0.52 0.35 0.56 0.76 胞 喀 啶 0.22 0.24 0.26 0.44 5- 甲 基 胞 路 啶 0.29 0.27 一 0.52 5- Fea Scere 0.13 0.12 ae 0.44 RSID AE 0.20 0.22 0.12 0.34 Bist 0.15 0.03 0.17 0.30 RR AGE 一 0.03 =< 0.30 : 尿 哮 啶 核 昔 0.17 0.08 0.25 0.64 : 胞 喀 喧 核 昔 0.12 0.11 0.18 0.45 ty ea teas 0.35 ES 二 ie g FS RS BS 0.21 一 一 一 FENG RS Te ES 0.23 一 一 一 PRUE WE RES REE -0.38 一 — 一 Fed FR Op AS De HAS 0.51 ~ 0.40" 六 0.81 4 HOLME Me Re BEES 0.23 — 一 0.60 ss BALMER Ae | ， 0.35 一 一 一 (G. R. Wyatt: The Nucleic Acids Vol. 1 (Ed. E. Ohargafr #1 J. N. David- son): Academic Press, New York, 1955, 252 页 ; R. Markham, Brit. med. Bull. 1954, 10, 216 页 ] } 二 7 very 25 AERA Rp 值 i 剂 a ERG 2’ ee 腺 嘎 喻 核 苷 -3 一 磅 酸 筷 呀 喻 核 苷 -2 一 磋 酸 三 RM 过 =e Te ee, SK Ee r,s 0.26 0.16 0.50 0.40 0.73 0.73 3 Bt ra ae Rt SS 中 三 | || 胸腺 喀 啶 核 苷 酸 [摘自 G. R. Wyatt: The Nucleic Acids Vol. 1 (Rd. E. Ohargaff 和 于 N. Davidson): Academic Press, New York, 1955, 256 H) ma, 喀 啶 碱 \ 核 背 和 核 昔 酸 的 提取 81 和 酸 毛 二 钠 洲 液 。 在 这 个 系统 中 用 0.5 多 的 十 二 鹏 的 正 友 醇 溶 液 代 BHR EAA T RAR TR 。 水 解 产 物 的 电泳 分 离 核酸 以 及 核酸 租 分 中 的 可 电离 基 团 的 数目 和 种 类 已 痉 在 棕 涉 :和 到 它们 在 离子 交换 柱 上 和 和 力 上 的 吸附 时 论 及 。 FER hE PH AY, 和 狂 分 所 带 的 闪电 荷 不 同 使 组 分 在 电场 中 以 不 同 的 速度 移动 ， 因 此 硼 分 的 分 离 就 成 为 可 能 。 这 个 方法 的 重要 特点 在 于 , FEE pH BY, 可 以 相当 准确 地 推测 出 粗 分 的 相对 迁移 率 , 因而 就 能 够 鉴 ” 别 租 分 。 | Gordon ffi Reichardc4 首 先 尝 坪 用 电泳 分 离 由 酶 促 水 解 所 得 Markham 和 Smith®® +! 与 Orestfield 和 Allen™© 都 到 描述 过 a \ BAK BRT HA Sik EBC E A SLEEP 0 A EE RIAA 一 个 十 分 适用 的 物质 ,因而 以 后 所 有 的 工作 几乎 都 在 纸 上 进 行 。 电 ” 泳 分 离 法 不 象 猛 层 析 法 那样 彼 广 泛 地 应 用 。 尼 主要 用 于 核 苷 酸 、 小 的 寡 核 苷 酸 以 及 核 并 酸 异 构 体 的 分 离 。 电 泳 分 离 法 可 能 提供 了 在 ， 一头 实验 中 能 够 人 友 糖 核酸 中 分 离 4 个 碱 基 的 最 佳 方法 之 一 as 可 以 应 用 猛 电泳 的 标准 方法 来 分 离 核酸 的 水 解 产 物 。 但 是 专门 用 于 核酸 租 分 分 离 的 易 行 技术 。 对 电泳 分 离 具有 重要 意义 的 解 离 基 团 为 磷酸 的 一 级 和 二 级 解 离 基 轩 以 及 筷 顺 哈 、 腺 味 哈 和 胞 喀 喧 的 扰 基 。 分 离 极 少 能 在 使 一 NH 一 OO 一 Di BBE PSE ES Ye YA PE FT. UR Rp HK EE