Tho ANN \ 北京 师范 大 学 生物 系 生物 化 学 教研 室 编 书馆 All Ul 高 等 学 校 试 用 教材 基础 生物 化 学 实验 三 北京 师范 大 学 生物 系 生物 化 学 教研 室 编 Ak tea « ARH. 新 华 书 店 北京 发 行 所 发 行 Ak da « mae ERIS BE * 开本 8501168 1/32 印张 8.25 字数 190,000 1982 年 10 月 第 1 版 1983 年 3 月 第 工 次 印刷 印 数 00, 001—14, 8100 书号 13012-0804 Ht 0.75 元 +AU 1980 秆 教育 部 制定 的 师范 院 以 教学 大 钢 编写 而 成， 增加 了 一 些 实验 以 供 选 用 。 可 与 6 生物 化 学 简明 教程 ?配合 Ho SHRA=AR- as 第 一 篇 选取 了 若干 与 所 编写 实验 有 关 的 技术 理论 和 应 用 ， 使 学 扩大 这 方面 的 知识 。 共 分 八 章 ， 包 括 实验 的 准确 性 透析 法 、 析 法 、 电 泳 法 、 分 光 光 度 法 、 同 位 素 技术 等 。 Ge: 第 二 三 篇 中 共 编 写 了 四 十 组 学 生 实验 (每 组 用 3 一 4 学 时 ， 1 询 实 验 用 6 一 8 学 时 ) 和 演示 实验 其 中 多 数 是 我 们 在 历年 教学 中 HH; 少数 是 从 国内 外 参考 书 上 选取 , 经 过 我 们 试 作 , 认为 适合 本 一 般 师 范 院 校 实验 ee eh FReNAERNR TST ROR 为 学 生 实验 。 。 出 于 我 们 的 经 验 不 足 ， 理 论 水 平 有 限 ， 书 中 的 错误 和 不 足 之 RHA RAH RRFRAP LO RAM REROR ; | 1982 485 fA ‘és 4 : 7 Rie Sada de eg. Sy. eee eae BES ee Mie te Libs zor ROA, “nc peeing 3 J Ns F ESA. 请 bie ‘k 4 os 3 | GE OF ee aac oe Aa Ske, i: % : } ke: “> es = Reh < we eid a pe se re " Seg aie Rees it yet oF Ue 天 | ere ’ ML c n at 4 rae si a” eal - . x ae 人 & & *s Aad ‘+ 4 ; z S 3 % * “a # x a % ; ee Meet Se oo BENS a oe ae «3 x 4 #36 f rn Te HR ott Se . rd he . - - ~ | * gf a” , 4 Chis # ; 四 和 a , a . Ew - - a 4 . al ‘ s 加 > 而 > . 本 * suonne PORT IMTTeTICTIeTICTT ETI eT eect etre rier etter rere | 4 和 ee eee is (=) Abt Rtn enema eo im AABN R Sonaseibye wow'aih one sed nn'sed.apsicnwese nas aneune abe sonconase sansna conden can E a = oor O00 00s 608 Boe O88 88 Ee EOS Fe HEE OES HOS OES OHS Oe O08 OOS He OEe OSs BEe OES OD ell ty \ i ert Oe 和 si ~ i? oA St Ne Re ale rey TS eee ei Rete ; “第 二 章 透析 WOR STRRGEAAG sreah ene so io sertansseage gn edsvns sages as ee ¥ : 三 章 Esk 0 ZF en 2392 0 1: kees, a 6, eee ce) — oa | a "2 eT 2 ett ee (—) 408 2 ee 000 000 eeeee 606 000 ce esp oks cce oes ne she 0460 sbs CERES ane ane aeRERee =) TES T-ASE Be EH ove ore ene eve cee cee eee one cee cee one cee ene cvs cns one cen one sen ees ons aus eee one nee (=) AY BEL BT ore ore wee eee cee cee nee nee cee cee es sone eee eee wae wee wee gee wee one oes eee eee Os Bae one (四 ) wee seeeseseesssoessssesooseeosoossos sosee osssnessn (五 ) 凝 胶 层 析 .ee 第 四 章 ”电泳 技术 -pp 一 、 电泳 技术 基本 原理 … ee ee ne eee eee ee wee eee eee oes eee own new oes eee Bee Ee a 37 人 +9943 (—) 电场 强度 ( 电势 梯度 ) PISTINTINTI STIS eT eT e Teter Tiere et 人 二 (二 ) 溶液 的 pH 值 wv cer ere eee eee ne ene cen ene nen one ene one ene one ene ene gas ane ene gen ene aes ene oes (三 ) 溶液 的 离子 强度 ， eve ene coe coe ene ee ee CUED). a BE a woe ona nos ere son beeiere ons ove cos one ans son cop ove an DU, Bar I WEE VBE HE Bk vee eee cee cee cee eee nee ceeeee ooeooerosoe ae oe FL, BR A TAS ETH BR BS HE Bic ooo eee eee eee cee cee cee ne cee enn ene ces sae cen see eee see ens 第 五 章 分 光 光度 法 “… 一 、 原理 ……: (一 ) 光源 … (=) Ba (三 ) 吸收 池 coe cee cee coe nee cee eee cee ces ene cee rescue sue cee sue ees cee sue nas aee ous ous wen eae ne eee aes (四 ) RET By ove vee cee cee cee cee cee cee cee nee ene ces cee ces see eee ene ans ene cue sun een ene ous eee see one one (五 ) 测量 装置 … 兰 : 元 种 国产 分 光 开 并 计 的 齐 绍 5 sce cnc ons ocak ca (一 ) 72 型 分 光 光 度 计 … =) TRY 型 分 光 光 度 计 TITTIRNUIRTIETINITR ULI (=) 751 G FY SY IE IE BE ib vee coe cee eee eee eee eee 00 000 000 000 000 008 c00 050 068 856 seus ee nde label 、 基 本 知识 … (一 ) 同位 素 :。 co) Bt LR AS PED wee eee eee eee cee ee TISTINIIETIOCIRIIRTIOTIOTINTIOTIO‘VIET CTI OT TTS T Try itt TT (=) 放射 性 衰变 的 规律 pe Werereoaroey eT Ti ety ee oe 50 ea eee ces coe ces ces see 6() 4 / eevee 00 60 二 、 分 光 光 度 计 的 基本 部 件 … a fr 69 eee eee eee eee eee see eeeses 00072 ives 7? 72 eee eee eeeeee 74 了 eee eee ee eee eee 135 - pe A oo a ee =. at oo BARE =. seme act bupieatn ae () REBAR CE) 反应 瓶 体积 的 测定 … sigh BNE REHM IG - be a " 、 组 织 样 品 … ae 第 二 篇 ”学 生 实 验 。 第 九 章 蛋白 质 的 化 学 2 SW — AS RA mee —BL Re I S g8- mxmnonee—nene-- SRO) Ee ty He ae (=) — A a ls fe: RULE RB RA MEAWHA 实验 七 甲醛 滴定 法 测定 氨基 氮 … RMA RG Ce - TG \ a ahaa wets Pye we te ean dae Sue wen te ete eas aun aie cen enn sue gen eed ene ens ens 7 射线 的 探测 … Bike) 盖 划 计数 器 … gan gd sew gab eph.dedadpinns enust dug petievbidad dations edu cmwotabdaee I ie meatier tess tt nance Ste is ad dada oo RRR nae rrcreraeno a 蛋白 质 的 性 质 实验 (一 ) 一 一 蛋白 质 及 氨基 酸 的 呈 色 反应 ……' 实验 五 ”血清 蛋白 的 栈 酸 纤维 薄膜 电 旋 -……: 本 “实验 九 菜花 (花椰菜 ) 中 核酸 的 分 离 和 鉴定 .pp bid ee Ea ge eee Oe, eee eee :站 小 op | < . a a 知 * a - , 实验 十 一 第 十 一 章 a 实验 十 三 实验 十 四 \ 实验 十 五 实验 十 六 第 十 二 章 实验 十 七 实验 十 八 实验 十 九 - 实验 二 十 it RB rie Bs AMP, ADP 和 ATP ni 酶 的 特性 060 068-056 600 bee 556 0b Gol ii 人 si 全 和 枯草 杆菌 蛋白 酶 活力 测定 … 底 物 浓度 对 酶 促 反 应 速度 的 影 常数 的 测定 … see 酶 浓度 对 酶 促 反 应 速度 的 影响 测定 碱 性 磷酸 酶 活性 … 胰 凝 乳 和 蛋白酶 的 制备 及 活力 测定 … + see cee eee nee sen ce 组 织 代谢 … 肌 糖 原 的 酵 解 作用 … 小 麦 萌 发 前 后 淀粉 酶 活力 的 比较 … 血糖 的 定量 测定 一 Hagedorn-Jensen — © 胰岛 素 对 血糖 浓度 的 影响 … 实验 二 十 一 ”发 酵 过 程 中 无 机 磷 的 利用 … \v 实 验 二 十 二 ”脂肪酸 的 B- 氧 化 … 实验 二 十 三 “ 精 氨 酸 酶 的 作用 … eed 实验 二 十 四 氨基 移 换 反应 (一 ) 一 血液 中 转氨酶 活力 的 测定 (分 光 光 度 法 )… 实验 二 十 五 ” 氢 基 移 换 反 应 (二 ) 一 一 谷 丙 转氨酶 活性 的 测定 第 十 三 章 实验 二 十 七 ” 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 盘 状 电泳 (血清 蛋白 的 分 离 ) oo ene ene (AE BIE) ee - ee ee 实验 二 十 六 “用 阳离子 交换 树脂 摄取 氯 化 钠 名 pe 第 三 篇 ”演示 实验 实验 二 十 八 、 离 子 交 换 柱 层 析 法 分 离 氨基酸 …" WS AS BE IBETE VE PGE BE RY ik oe ons see eee cee ene ene tee coe cnsens sf £0. BE 1 BD TG PEAR BBS vee eve eve ene een eee ene sen ene ene ees ene cn een ene 实验 三 十 一 “紫外 分 光 光 度 法 测定 核酸 的 含量 :pe ene vee cee ene nee eee eee one 实验 三 十 二 透析 实验 (一 ) 蛋 自 质 的 透析 ee 实验 三 十 - 4 +0152 188 i ! PEGA Sg ie push TO Ga vs MURA ; é 5 he FB BT YG (—) RAE HOSE one one coe roe eae one one ate eo one one one eee 205 十 四 AE FE FE WT BE BE AY BRIS coe ce ene ere cee cee ene ene cen cee ene ene one 006207 - 十 五 用 铂 和 血液 过 氧化 氢 酶 分 解 过 AER shang seem scent ope 207 S+x : 肝 组 织 耗 氧 量 的 测定 …… Nias b 6 walhsunje ad Gey beLeA ann abe beh sou cae SDE 三 十 七 - 用 碳酸 钙 分 离 菠菜 的 色素 … aac peapiainennanals tates 6 Soares eck ae =+/A Be BE IE BE SY BBS THF CER oon tee eee cee eee cee cnecee enn 9213 e=+IL 用 32p SPS LOS eS vec ccccce se ce 0 215 — BASE a wre cee ee cre cen ees ete ee teens te ne ne te ee 21” opt Clem. a ee / P| < ot : . a sae PT. Cae nf wae pula : 三 利生 ~ Sa. Wate Fo “"} 放生 4 村 CE ete Se ee gt eee oe AN ie - SPR a tt Ae hike . < 5 oe > > ee ie nae et" FE ee ee ae a 下 eee eee C00 COs Fee SOs Fee eee eee Fee Oee ees eco SOC SEO SES SET SER SES EES ESSE SEH AEE eee #9219 ee = SMe aE RE Be aaa icncnca kaw sees nash arwabe van eaves oka eun saetin eee 000220 上 we BAIA OL I~ oo see nee cae oes nee eee cee ces cee cus cne cee senses eeee DDD 本 (大 ) 江 拓 六 和 但 温和 销 让 的 站 生计 全 全 ver nas. ockai sine gine 2 x (HL) 酸度 计 … ea is van hires Se aester ioe coo sais Sapemn Wie pesiehilecs gekg SaE a 四 、 常用 缓冲 溶 容 液 的 配制 … sai aonidneevinae Dagdawais sondanadanns se ines Be (—) 磷酸 氢 二 钠 - 柠 榜 酸 缓冲 液 4 = 醋酸 -醋酸 钠 缓冲 液 enn coe eee eos cos eee coe cnn ee ene cnn ane eee cen ae aede ene cnn sue eee oo 40243 CFL) PVE Se Pi ER RE TG one cae nee ene cee sen ence cen cnn cne aes ensue sen cue ene see ene eneee ee QA CPS) Tris Fe MR «++ 000 se cee son css nue coe cus on nes see ong coe eve one con nce ens cae ove nee cen QA oo) ee) ee ee > aie - eon. AH so eee eee eee een ene ene eee cee coe cae ene see cesses see ene2A6 ‘ 人 Ts Fe FAG WIR AOE RL se eee eee eee see seeese cee senses cescee aes cesses eee QA7 wi, 4 + _ rac se! De oe $ Tee i a Z a “ EL ae 2 bea 上 上 ea Se Oey es | Ol nell ante: ry No CD ~~] 四 ees: 3 y “BR ARE MRI HAR Tg nee one ose one DN, FERRI FAR BE ee ere coe cee cee tee eee ene Dy Sone 二 . = ee 天 ’ ; 5 ge? =: 好 - baal, Pid ! ont. <= RNS eats eS ae Pe. oy, sete « t@ Va. ni rhe ia vt “en | % med oave 7 f Pe » eee a bei s ae > ? ‘- ” “is ‘- ye - + . . é Oe), 7 . . in) 4. _*> 4 Se Y ~ : ‘ 2 2 4 让 本， . a renews as ti Grr oer . ee | ‘ 4 he wh . a bat = c = >€ 7 ms ers es ° = . \ = 2 “ey , - ~~ a } ' —~ * 2 站 et. Pig vse a -4 pee: ~ Vv, — - a > “ha? as 4 2 4 . a 9 att es ¥ rr, “ae - iatg 7 3 : % ‘ A 7 0 eae onl ee 各 “7.74 7 WE Pe 4 Set ela Son BART Senet © dhol? . es w id ‘3 o> ste et ee ; on ie she teeew , a . 7 . 7 , a é + es + ow re. an ees ess - +. < A! ie 2 ~ 本 oJ 中 oe 7 *; % => ei ee Phe es bey 7t ae * : we 站 人 ay 4 t V4 7 > . ae -s 。 fe . . te thw Ghee -” 2 - 4 my “ . “ . 2 有 fn ve . > | : 上 . AY fe Mie ; : 和 AWAY Le wo od 全 #“ 4s a Ta. a 有 © +-8y = a i oo “ i Pa | z > fe" »’ a p 4, 人 机 oo 这 和 ake ~ RY his Se Wi a By alt -, hg 1s + ive oS bag * : : ~ Pt ™ . tak ‘ ae 和 -* - ae" are eG 44 *- “ie Le ey 5 . meu .*: ee ors ma’ FS oe ‘ . stg ~~ tse a a ~ 四 be * . : y 四 «a ke r if P ey » 9 - * , _ ib a8 ~ tes aha, EE ~% * 4 和 ‘Fa : . y yo ; SA vv 和 . & ; - me 7 1 : *’°6 / AY « > 而 本 a 常用 生物 化 学 实验 技术 及 原理 第 一 章 “实验 的 准确 性 准确 性 可 以 定义 为 与 真实 性 一 致 的 程度 。 因 此 ， 科 学 家 们 除 en ” 验 : eer errren oe 在 生物 化 学 实验 中 带 用 的 单位 和 量 。 、 单 位 和 量 未 书 所 使 用 的 单位 是 SI 单位 (国际 单位 制 )， 是 以 米 制 为 基础 the SI PA DLA TF AY BLES Be Se Bt 普遍 接受 。1981 年 8 AZ a 布 的 中 华人 民 共 和 国 计 量 单位 名 称 与 符号 方案 亦 妇 国际 单位 制 基 a ee. i | : vs oo. SALT 种 基本 单位 , 均 列 在 表 1-1 中 。 7% e ] . ° N% 注 : 表 中 单位 名 称 , 去 掉 方 括号 时 为 单位 名 称 的 全 称 ， 去 掉 方 括号 及 其 中 的 字 即 成 为 单位 名 称 的 简称 ; 无 方 括号 的 单位 名 称 ， 简 称 与 全 称 同 。 圆 括号 中 的 名 称 与 它 前 面 的 名 称 是 同义词 。 下 同 。 表 1-1 基本 单位 8 最 | 单 位 名 称 | ee oS Coe nape i Q 长 度 米 m zi 和 质量 千克 , (公斤 ) kg : 时 间 种 a 电流 - 安 [ 培 ] — “4 热力 学 温度 开 [ 尔 文 ] K 物质 的 量 摩 [ 尔 ] | 发 光 强度 坎 [ 德 拉 ] 《二 ) 导 出 单位 除 以 上 基本 单位 外 ， 还 有 一些 因 适当 组 合 这 些 基本 单位 而 得 到 的 导出 单位 。 为 了 方便 起 见 , 这 些 导出 单位 都 给 以 专门 名 称 ,在 生物 化 学 工作 中 常 遇 到 的 导出 单位 列 在 表 1-2 中 。 #1-2 ” 某 些 具有 专门 名 称 的 导出 单位 ener 4 is ee eee a 量 单 位 名 称 单位 符号 频率 赫 [ 冀 ] Hz a 力 牛 [ 顿 ] N a 压强 , (压力 ), 应 力 帕 [ 斯 卡 ] = Pa 能 , 功 ,热量 焦 [ 耳 ] J 功率 , 辐 [ 射 ] 通 量 瓦 [ 特 ] W 电量 , 电荷 EL] C 7 电位 ,电压 ,电动 势 ,电势 RLF] V 电容 法 [ 拉 ] 下 电阻 欧 [ 姆 ] Q 3 a 6} 摄氏 温度 摄氏 度 “St 2 ‘ uf said | wtih i Ms aks Pgh haem Ney, ne wir J he Oe 从 > 和 Oy chin re is Pi a | gas 了 六 ey * 4 eg ah $ me ef a ae - 六 和 > 说 Ue ‘i iy * ‘ ‘ : mane i " <2) > 4 rf? ~ 2 “i : eS 有 册 音 位 大 大 或 大小 此 时 ， Se 可 在 单位 % 13 rage Bes AS RC ia 原文 (法 ) Ge aed | mega . kilo deci 3 aig “ centi milli micro a 和 pe te) ae te - nano yp Koh a hor = pico | 。 词 头 和 符号 组 合成 为 一 个 新 符号 .例如 mms 的 意思 是 (10 -sm 不 是 10-*m。 因此 在 书写 时 ， 词 头 和 符号 之 间 不 应 留 有 空格 或 ES ee H, RZ, 在 导出 单位 中 , 符号 之 间 则 应 留 有 空格 ， 或 者 为 四 ,加 上 一 个 点 。 例 如 : Bo ms 三 毫秒 , 即 10-ss ig m-s=3 x Fb, wi Saha 四) 与 SI LeRHM fest BLM eH EAR Me 位 有 时 与 SI 单位 并 用 。 = 1. 升 (D) 在 生物 化 学 工作 中 用 升 作为 体积 基本 单位 。 一 升 | 准确 等 于 一 立方 分 米 。 eee ”1000 Ft =1 立方 米 一 ms 1 升 (D) =1dm*=10-*m* 1 毫升 (ml =1cm*=107*m? z 1 微 升 (AH =1mm*=10-*m® 2. 克 (g) 在 生物 化 学 中 用 克 作 为 质量 的 基本 单位 。 克 有 时 和 词 头 合用 , 如 千克 (kg), SIE (meg), 微克 (Ag) 等 。 3. 秒 (s) ”时 间 的 基本 SI 单位 为 秒 , 但 是 通用 的 时 间 单 位 [ 即 分 (min)、 小 时 (h) .日 (d)] 在 方便 时 也 可 以 用 。 (五 ) 摩 尔 和 浓度 1， 摩 尔 (mol): 摩尔 是 “物质 的 量 ; 的 单位 。 当 物 质 含有 6x 10" 个 微粒 时 ,这 种 微粒 的 物质 的 量 称 为 1 摩尔 。 微 粒 可 以 是 原子 , 分子、 离子 以 及 其 它 粒 子 。1 摩尔 任何 物质 的 质量 称 为 该 物质 的 摩尔 质量 。 某 物 质 的 摩尔 质量 就 等 于 该 物质 的 分 子 量 以 克 为 单位 。 例 如 葡萄 糖分 子 的 摩尔 质量 (分 子 量 180) 是 180g, ee or a. 清 蛋白 分 子 的 摩尔 质量 (分 子 量 6 8,000) J 68, 000g 或 68kg。 ， 2， 摩 尔 浓 度 ( 摩 尔 / 升 或 mol/D: 单位 体积 溶液 中 溶质 的 量 叫做 溶质 的 浓度 。 在 生物 化 学 工作 中 量 的 单位 是 摩尔 ， 体 积 的 单位 是 升 。1 摩尔 浓度 因此 定义 为 每 升 溶液 中 含 溶质 1 摩尔 。 1mol/1= 每 升 溶液 中 含 溶质 的 分 子 量 以 克 为 单位 摩尔 浓度 过 去 的 符号 是 M (0.15MNaCl)， i riealatadt sina 议 用 mol /1ft # (0. Egg 3. 重量 浓度 : 有 时 待 测 的 物质 组 分 不 明 ， 如 某 种 抽 提 液 中 的 蛋白 质 或 核 醇 的 浓度 , 在 这 种 情况 下 , 用 单位 体积 的 重量 而 不 是 用 摩尔 来 表示 浓 度 。 在 生物 活性 物质 的 分 子 量 还 未 查 明 的 时 候 ， 如 维生素 Bis 或 ‘a oe ; | oe EERE, 也 可 以 这 样 用 。 体 积 的 单位 还 是 升 ,因此 所 有 的 i FE MBUAFH TG ARELA 100m] 为 基础 (g/1 mg/1, we/1, 等 )。 仍 然 使 用 多 这 个 术语 ， 但 必需 意义 明确 ( 写 信 下列 括 号 中 的 意义 )。 例 刀 BAAN THEIR ee hs 每 100g 水 中 含 Danie W/W) Eee ”每 100ml 水 中 含 2am (W/V) = HBA 每 100ml 7k Hh 4 2ml HERB (V/V) 4, 从 摩尔 浓 庆 换算 为 每 毫升 的 摩尔 数 : * 在 许多 生物 化 学 反应 中 需要 知道 试管 中 物质 的 摩尔 数 ， 它 可 从 溶液 的 摩尔 浓度 和 其 体积 来 计算 。 首 先 需 计算 Iml 溶液 中 物 。 质 的 摩尔 数 , 然后 乘 以 试管 中 溶液 的 体积 。 如 每 次 将 摩尔 数 和 体积 各 缩小 10° 倍 , 绝对 数 就 不 变 ; 这 种 关系 在 实际 中 很 有 用 。 Bs : 1 摩尔 浓度 溶液 =1mol/1 ; 省 et =1mmol/ml =1lymol/ nl ARE, Lame ten ik =1mmol/1 =1lymol/ml 二 .准确 测量 | ER ’ 所 有 实验 室 工 作 都 包 售 革 些 形式 的 测量 。 由 于 所 有 的 测量 都 ”可 能 有 误差, 故 应 懂得 这 些 误差 的 可 能 来 源 。 DL. 个 人 误差 :这 可 能 来 源 于 一 个 设计 不 好 的 实验 ， 其 中 的 控 “和 制 实验 不 够 。 例 如 在 许多 生物 实验 中 环境 的 温度 和 光照 可 能 对 所 eR RAGE. Aine 需 小 心地 控制 。 设 计 实 验 时 每 总 ec 次 应 只 引入 一 个 变量 而 其 他 所 有 能 影响 实验 的 因素 都 保持 恒定 。 个 人 误差 还 常 贡 来 源 于 由 视差 引起 的 不 正确 读数 。 因 此 ， 在 许多 仪器 上 , 都 在 指针 的 背面 装 一 面 镜子 , 这 样 当 指针 和 其 镜 影 重 合 时 就 可 得 到 真实 的 读数 。 在 某 些 仪器 上 则 使 用 数字 计数 来 代替 刻度 的 反射 。 但 是 吸管 刻度 目前 还 只 能 用 肉眼 观察 ， 而 不 正确 地 在 吸管 中 液体 的 弯 月 面 上 读数 可 能 是 生物 化 学 实验 中 误差 最 大 的 来 源 之 一 (图 1-1)。 这 类 的 个 人 误差 可 以 通过 仔细 的 王 作 加 以 纪 正 或 消除 。 如 吸管 读数 为 3.5ml, 只 有 位 置 (b) 给 出 正确 读数 图 1-1 避免 由 于 视差 引起 的 错误 Pay, 2， 仪 器 的 局 限 : 一 种 特殊 装置 的 准确 度 的 局 限 通 稼 是 已 知 - 的 ， 在 选择 仪器 时 应 考虑 在 内 。 例 如 10ml 分 度 吸管 的 误差 是 0.2 多 ,这 种 吸管 可 以 相当 准确 地 转移 较 大 量 的 液体 , 如 9.2ml， 但 要 转移 0.1ml， 其 误差 则 可 高 达 20 多 。 因 此 应 根据 实验 的 要 求 选 择 合适 的 量 器 , 天 平等 。 Se oe es eo ee ee ee en ht ee a v7 q Fn ” ; 四 标准 物 和 空白 实验 为 了 在 测量 时 尽 可 能 得 到 准确 的 数值 ,， 必需 使 误差 减 至 最 小 。 。 机 通过 仔细 的 工作 和 使 用 标准 溶液 做 到 这 一 点 .在 任何 实验 中 SEEM ice ia apm, A PA i ARE EOE Me A Re, A 。 所 得 的 数据 必需 落 在 真 值 范围 之 内 。 标 准 溶液 应 与 所 研究 的 溶液 RAR AOR, 此 时 可 以 画 出 一 条 能 指示 用 浓度 测量 物 质量 变 的 标准 曲线 。 从 待 测 液 得 到 的 数值 应 落 在 标准 曲线 范围 之 。 两 ,然后 读 出 实验 数值 。 通 常 在 容量 测定 时 只 有 一 种 标准 物 , 可 以 ”预先 画 好 标准 曲线 。 3 在 任何 测量 实验 中 都 应 包括 有 空白 溶液 。 用 同体 积 的 蒸馏 水 ”代替 待 测 液 并 严格 按照 待 测 液 和 标准 液 那样 的 方法 处 理 ， 即 得 所 a RG Tae, 当然 , 在 最 终 计算 时 , 应 从 实验 值 和 标准 值 中 减 去 从 空白 溶液 中 得 到 的 任何 数值 ， 因 为 空白 值 是 所 用 的 试剂 而 不 是 。 待 测 物 ( 所 研究 的 物质 ) 所 造成 的 。 在 本 书 众多 的 比 色 测定 中 对 空 。 特 和 标准 溶液 的 实际 应 用 有 很 好 的 阐述 。 在 酶 的 工作 中 常 需 用 几 个 空白 或 对 照 溶液。 4, 偶然 误差 ， 还 有 一 种 无 法 预料 的 偶然 误 差 。 同 一 个 实验 i 者 在 同样 条 件 下 进行 一 系列 测定 时 ， 每 一 次 测量 的 结果 都 略 有 不 同 ， 这 就 是 偶然 误差 所 造成 的 。 进 行 大 量 的 测定 并 计算 平均 值 | RADU RNR MR. RE RAS LO, 两 次 测定 就 够 了 ， 而 这 通常 是 在 制定 标准 曲线 时 的 情况 。 重 复 实 ， 。 验 间 的 一 致 程度 叫做 精密 度 。 精 密度 和 准确 度 不 是 一 个 概念 。 因 于 为 测量 可 以 高 度 精密 但 由 于 仪器 或 技术 的 误差 而 并 不 准确 。 在 许多 情况 下 , 精确 度 并 不 像 例 子 ( 表 1-4) 中 那样 高 ,实验 结 *REDKHS. Alt, 测量 一 下 所 得 数据 的 分 布 是 有 益 的 。 为 此 ， |， 应 介绍 统计 学 的 一 些 概念 。 表 1-4 血清 中 氯 离子 的 测定 所 化 物 《mmol/D 测 定 次 数 实验 值 ¥ % 值 1 102 102 2 104 103 3 106 ”104 ; 4 104 104 5 103 104 6 105 104 以 下 从 统计 学 原理 所 引出 的 方程 式 是 作为 工具 使 用 的 、 公 式 的 推导 已 略 去 。 (二 ) 正 态 分 布 曲 线 如 果 得 到 某 种 量 (z) 的 一 大 批 数 据 , 就 可 画 出 一 个 表示 数据 的 数目 与 z 值 关 系 的 曲线 (图 1-2)。 这 种 实验 结果 的 正 态 或 Gaus- ian 分 布 曲 线 有 一 些 特征 , 即 所 有 数据 的 65% 图 1-2 数据 的 正 态 或 Gaussian 分 布 D 曲线 是 对 称 的 ， 其 最 大 值 为 平均 值 5 SH iia Ces | ee ey 0, us Diner) Senge hes bis a te me We Si @ Ds E+ 和 Fo, PRAM 68% 落 在 图 中 交叉 he es 95 % set EA Et 20 Wy, 99% de ff EL80 范围 内 。 Le 1) 标 准 偏差 (SD): o AE FAME ME. EIEN EL RE 能 7 sates ryt,), SRIRAM A (n) AEA os 全 和 te Mae ZX / 2, AL ch HA SHEE, : d,=2,;—X do=%o.—2 Eins oe d,, 一 ° 7 as mia 离 差 除 以 样本 数 (由 得 到 方差 (rc 本 2 CO *=(di td; + d? eee eeeaes «+d2)/n. wi \ t “标准 偏差 tc) 是 方差 的 平方 根 。 除 非 进行 无 限 次 数 的 测量 , 平 sth 2 & 与 标 准 偏差 (c) 就 不 能 精确 得 知 。 在 实践 中 只 可 能 进行 有 二 但 能 从 有 限 数量 的 数据 除 以 自由 度 (a-1) 而 不 是 样 re ”本 数 (四 来 算出 总 体 方差 的 近似 值 。 。 计算 单个 数据 与 平均 值 的 偏差 太 繁 琐 ， 但 可 用 以 下 的 实验 式 从 x 的 和 (Y。) 及 2 的 和 (So) 来 确定 标准 偏 闪 。 时 2 一 (2z)2/a S ges n—1 | 2) 均值 标准 误差 (SEM): 通常 平均 值 是 从 单个 数据 得 到 的 ， | 得 是 知道 此 值 与 总 体 的 未 知 平均 值 偏离 多 少 比 知道 实验 结果 的 分 。 布 情况 更 重要 。 均值 标准 误差 (cm) 估 量 所 测定 的 有 限 数量 样本 与 总 体 平 均值 的 可 能 误差 。 0 II/ 。 从 上 式 可 以 看 出 : 样本 的 数量 越 多 , SEM 越 小 ,也 越 接近 无 限 数据 的 “真实 ?平均 值 。 (三 ) 生 物 材 料 中 数据 的 变化 一 个 物理 量 ,如 一 种 纯 液 体 的 密度 或 粘度 ,能 在 实验 室 中 测定 ，” 并 可 将 所 获得 的 数据 与 正确 的 数据 相 比较 。 一 些 随机 的 变化 也 可 以 观察 到 。 如 小 心 从事 ， 这 些 变 化 可 以 很 小 ; 因而 只 需 测定 少数 几 次 , 便 可 计算 出 平均 值 。 生 物 学 中 的 许多 测定 则 不 是 这 种 情形 。 生 物 学 中 往往 没有 单个 的 “真实 ? 值 , 而 只 有 一 定 范围 的 “正常 > 值 。 许 多 测量 遵循 一 个 对 称 的 “ 正 态 ?分布 ， 因 而 可 以 应 用 简单 的 统计 学 方法 。 此 时 , 正常 值 通常 从 (Z 一 2c) 开 始 , 延伸 到 (2 十 20) 为 正 , 包 括 所 有 数据 的 95 多 (图 1-2)。 1 布 , 则 需要 更 复杂 的 数学 处 理 。 在 一 些 生 物化 学 实验 中 要 知道 一 个 实验 是 否 引起 一 个 测定 量 的 显著 变化 或 者 所 得 数据 是 否 来 自 偶然 的 机 会 是 很 重要 的 。 一 位 - 英国 的 统计 学 家 , 他 自称 "学生 "， 发 明 一 种 简单 的 试验 ; 用 实验 数 据 的 分 散 情况 来 确定 一 个 样本 是 否 属于 一 个 已 知 总 体 的 几 事 。 这 种 试验 叫做 “学 生 ”t 试验 。 Be EMBER, MN IEM SI, ESD (EL ARRAY RRR E (Hoy) RITE LIE & MR a AST 平均 值 (m) 和 真实 平均 值 的 关系 是 : M=Ett-Om 或 m=E+t-o//n 式 中 o (REE 8) EAH RMSE me ELMS 可 利用 自由 度 (z 一 1) 从 统计 学 表格 中 查 出 二 的 几率 ( 严 值 ) “几率 为 0.05 意味 着 样本 和 总 体 相 同 的 机 会 是 5 名 。 如 果 世 值 下 降 了 ‘eee > ee al en ee re Otel ae Vita Ans 6 ef *' ta. .% ities Bat Pe Re an ee ie tee Ns : . > SULA 0.01 以 下 Lee A ts KOLAR AL, ”这 两 种 水 平 通常 是 生物 学 中 的 “置信 限度 "。 几 素 在 0.05 水 平 的 Es 验 结 果 被 视 为 “显著 ", 几率 在 0.01 水 平 则 为 “非常 显著 "。 ”进行 有 限 次 数 测定 的 两 种 试 样 可 以 直接 对 比 ， 利 用 下 列 方程 RE 4 Pi ED ad Ny +Ne—2 Ns SRR Be CA = mo), 则 上 式 可 简化 为 : t= (@r—)/ {Coit oD (a)! — menuane ea be 严格 认真 地 清洗 和 正确 使 用 容 量 玻璃 仪 器 ， 对 于 实验 室 工作 。 的 谁 确 也 是 十 分 重要 的 , 其 具体 操作 方法 见 附录 。 Ee ; 实验 报告 . 仙人: 实验 室 工 作 的 目 的 是 用 一 种 明白 易 懂 的 方式 向 他 人 传播 实验 结果 和 所 引出 的 概 和 (一 ) 结 果 的 记录 1 实验 本 : 最 好 用 大 的 硬 皮 本 写实 验 报 告 。 用 讲义 夹 和 单 篇 。 的 地 和 纸 也 可 以 SEARLE i A, sR i 应 把 课程 和 实验 名 称 、 姓 名. 日 期 和 页 数 写 在 实验 报告 上 。 课 程 完成 后 还 可 编 一 个 目录 。 ae 可 以 用 不 同 的 方式 书写 实验 报告 。 下 列 各 标题 是 在 大 多 数 生 用 化 学 研究 论文 中 所 使 用 的 。 在 一 些 实验 中 也 可 以 把 两 部 分 合并 ， « J] « ee As * +? 俗名 。 4， 实 验 或 方法 : 要 描述 按 操作 顺序 所 进行 的 实际 做 甘 ， 不 能 “ 为 一 个 标题 , 如 “方法 和 结果 ?或 “结果 与 讨论 ”， 将 依 不 os 容 而 定 。 2 题目 和 引言 :所 有 的 实验 都 有 -个 题目 ， 它 应 读 写 在 实验 和 报告 的 顶端 ,与 日 期 并 列 在 一 起 。 实 验 题目 应 该 简洁 而 明确 ,使 实 验 的 目的 一 目 了 然 。 学 生 应 明确 实验 的 上 且 的 ， 如 能 对 在 实验 中 试图 证 明 的 内 容 有 一 个 粗略 的 描述 就 更 好 。 3， 材 料 和 仪器 : 应 列 出 所 用 的 试 寞 和 装置 ， 特殊 的 仪器 要 有 合适 的 图 解 ， 说 明 化 学 试剂 时 要 避免 未 被 普遍 接受 的 商品 名 或 照抄 实验 书 或 实验 讲义 。 实 验 描述 要 简洁 , 但 要 写 得 明白, 以 便 他 gc 结果 : 常 希望 能 重复 以 前 的 某 些 实验 结果 ， 或 此 次 的 结果 ee 因此 应 记录 实际 观察 到 的 实验 现象 而 不 是 照抄 实 验 书 所 列 应 观 完 到 的 实验 结果 。 应 记录 实验 现象 的 所 有 细节 。 如 只 报告 在 一 个 特殊 实验 中 生成 一 种 黄色 沉淀 是 不 够 的 。 沉 淀 的 真 实 颜 色 是 什么 , 亮 黄 , 桔 黄 或 其 他 ? 沉淀 是 多 , 是 少 , 是 胶 状 还 是 颗 粒状 7 什么 时 候 形成 沉淀 ， 立 即 生成 .缓慢 生成 , 扰 时 生成 还 是 冷 - 却 时 生成 ? 所 有 这 些 似乎 都 是 显而易见 的 ， 但 常常 被 忽视 。 报 告 > ‘ a ie = ee Le Mb FEE NE EE EDIE ERE 学 研究 中 仔细 观察 , 特别 注意 未 预期 的 实验 现象 是 十 分 重要 的 , 这 些 观察 常委 引 起 意外 的 发 现 ， 而 且 为 了 重复 工作 也 需要 准确 的 实 验 报告 。 在 实验 报告 中 只 写 “处 死 大 鼠 并 取 肝 ?是 十 分 不 合适 的 ， 给 出 鼠 的 品种 、 性别. 年 龄 和 体重 。 鼠 是 饥 俄 的 还 是 饮食 的 ，， 是 否 用 某 种 方式 处 理 过 ? 是 如 何 处 死 它 的 ? ss an = - , 5 1 Tle 竺 ”4 上 述 各 种 因素 可 能 十 分 重要 , 因此 必须 记录 。 ee 论 中 能 对 此 问题 回答 到 什么 程度 。 “应 有 一 简短 而 中 上 肯 的 结论 。 = =) Pack st 最 好 用 图 表 的 形式 概括 实验 的 结果 ， 根据 所 记录 数 aks ducusendiancuen, “有 时 还 需要 紧 接 在 标题 下 面 有 一 详细 的 说 明 。 在 每 一 纵 行 数据 结 村 的 顶端 注 明 所 使 用 的 单位 而 不 要 在 表格 的 每 一 行 中 都 重复 地 书 。 写 数据 的 单位 。 表 格 中 的 数据 应 有 合适 的 位 数 。 可 适当 调整 数据 ft 9 单位 做 到 此 点。 例如 浓度 0.0072mol/1 最 好 在 浓度 (mmol/D | 的 栏 下 表示 为 7.2 或 在 10-4 x He JB (mol/1) 的 栏 下 表示 为 72。 2. 图 解 常常 在 实验 报告 中 画 上 专门 仪器 的 粗略 草图。 此 SE. ccncosenanuecntncme 上 比 宛 长 的 描述 更 清楚 。 一 般 说 ， 当 所 观察 记录 的 数据 较 多 时 用 图 。 组 比 用 表格 好 。 从 图 中 吸取 结果 也 比 从 表 中 来 得 容易 。 而 且 观 察 ， 各 点 是 否 能 画 成 一 个 光滑 的 曲线 还 能 给 出 实验 中 偶然 误差 的 某 些 概念。 此外， 图 能 清楚 地 指出 测量 的 中 断 而 从 数字 表格 中 则 不 容 二 易 看 出 来 。 ;93。， 直 线 图 in y Hx WHAM FAH BRI: _ _y=mzt+e ; “2, Dh y 对 z 作 图 就 得 到 一 条 直线 。 直线 的 侍 束 是 m, 它 与 了 轴 相 交 于 c( 图 1-3)。 时 。 在 许多 情况 下 ,y- 和 :z 并 不 是 线性 关系 ,但 对 数据 进行 基 种 处 。 再 ， 仍 可 得 到 一 条 直线 。 本 书 中 有 这 样 处 理 数据 以 获得 直线 的 例 1 ， ieee ae yo es —c/m 图 1-3 HR&Ay=mz+e) 子 ， 如 Beer-Lambert 定 律 和 酶 动力 学 4 怎样 画图 “在 许多 实验 中 ， 都 有 一个 量 , Sate pH stil & 度 , 在 系统 地 变化 着 , EM A, ELA 做 自 变量 , 未 知 量 或 待 测量 叫做 应 变量 。 画 图 时 , 习惯 把 自 变量 画 在 横 轴 (z 轴 ) 上 而 把 应 变量 画 在 纵 轴 (y 轴 ) 上 。 下 面 列举 一 些 作 ” .图 的 提示 : 和 (1) 为 了 清楚 起 见 , 调整 标 度 使 斜 度 在 45° FEE (2) 图 应 有 明白 简洁 的 标题 清楚 地 标明 两 个 轴 的 计量 单位 。 (3) 最 好 用 简单 数字 标明 轴 上 的 标 度 (如 使 用 10mmol/1 REEL 0.01mol/1 或 10,000wmol/1 要 好 ) 。 (4) 欲 表 示 实 验 中 所 测定 点 的 位 置 应 用 清楚 设计 的 符号 (o， e@ ,De,^A, ^,) 而 不 用 x, 十 ,或 一 个 小 点 。 4 (3) ETH RC, 78 Et Arte — Rea 它们 之 间 的 距离 太 大 。 (6) 根据 不 同 的 实验 用 光滑 的 连续 的 曲线 或 用 直线 连接 各 : 点 。 (7) 符号 的 大 小 应 能 指示 各 值 的 可 能 误差 iff AL, Tea Es ae ; 常常 知道 得 很 准确 ， 有 时 也 可 以 把 结果 表示 为 重 直 的 线 或 村 其 长 + 14 « CE “ ‘o> Se 2oao ooo doe "$006 底 物 (umol/1) AChE 活性 一 个 错误 的 曲线 图 2000 3000 “oo «=. $998 加 底 物 (hmol/1) SO AChE 活性 () 图 1-5 图 1-4 的 错误 图 1-4 的 错误 : (1) 标题 不 明确 。 不 能 使 用 未 加 说 明 的 缩写 。 (2) 活性 没有 单位 。 (3) 底 物 是 什么 ? (4) 横 轴 的 数字 太 大 , 单位 应 用 mmol/1, (5) 纵 轴 的 数字 太 多 。 (6) 两 条 曲线 使 用 相同 的 符号 。 (7) 各 点 大 小 不 均匀 , 圆圈 不 整齐 。 (8) 应 用 光滑 的 曲线 , 而 不 是 用 一 系列 的 直线 连接 各 点 。 CO) 曲线 应 该 通过 各 实验 点。 (10) 曲线 不 应 超越 最 后 一 个 实 验 点 。 C11) 线 不 应 罕 过 符号 。 (12) 是 实验 点 还 是 污点 ? (13) 应 用 工具 画 一 个 光 请 曲线 而 不 是 用 手 制图 。 (14) 刻度 标号 应 画 在 图 内 。 (15) 没有 刻度 标记 。 (16) 两 条 曲线 表示 什么 ? ee ae ee eee vee er 第 二 章 £ tf 。 透析 是 利用 小 分 子 能 通过 ， 而 大 分 子 不 能 通过 半 延 膜 的 原理 。 把 它们 分 开 的 一 种 重要 手段 。 通 常 的 做 法 是 将 小 分 子 和 大 分 子 的 。 混合 物 放 进 用 半 透 膜 制 成 的 透析 袋 里 并 沉没 在 大 量 的 水 中 。 袋 内 。 的 小 分 子 就 不 断 通过 膜 进入 外 部 溶剂 中 待 达到 平衡 为 止 (图 2-D。， 如 果 对 流水 透析 或 不 断 更 换 透 析 袋 外 的 溶剂 可 以 做 到 袋 内 的 混合 。 物 几乎 不 含 小 分 子 。 透 析 的 速度 受 一 些 因素 的 影响 。 下 面 就 粗略 讨论 这 上 因素 cee (AP MURAI NUE ATS, RIUM 已 作 成 商品 出 售 。 也 可 用 玻璃 纸 代 替 火 棉 胶 。， 人 筷 ) 摧 备 先 将 一 适当 大 小 和 长 度 的 透析 管 放 在 碱 性 EDTA 溶 液 _ (Na,CO, 10 克 / 升 EDTA 1 毫 摩尔 / 升 ) 中 沸腾 30 分 钟 以 避免 F PEROALMAI:. RR, PRUETT. SETLIEH elated 究 的 材料 充满 透析 管 ( 袋 ), 然后 结扎 顶部 。 透 析 最 好 “在 新 制备 的 管 中 进 行 , 因为 温 的 透析 袋 非常 容易 受 微生物 感染 。 如 。 果 放 须 保存 透析 袋 , 则 应 在 溶液 中 加 入 痕 量 的 们 甲酸 。 ， (三 ) 通 透 性 ”透析 袋 的 通 透 性 因 袋 的 大 小 和 预 处 理 的 方法 不 同 而 ， 蜡 。 但 透析 过 夜 时 ， 半 透 膜 大 体 可 以 允许 分 子 量 30,000 以 下 的 化 4 POG. LRKLRAP ROAR, BoM A aT Sieh WR, A Ae A a AaB a a HH 。 透 范围 可 做 精细 分 离 之 用 。 a: SF 本 dus c} Pe ss 5 剂 ~ (一 ) 水 溶液 “一 般 说 , 透析 的 速度 在 蒸馏 水 中 最 大 , 虽然 通常 需要 特定 的 pH 和 离子 强度 的 水 溶液 来 稳定 所 研究 的 分 子 。 (二 ) 大 分 子 溶液 ”透析 时 水 将 进入 透析 袋 ， 因 此 总 是 将 透析 袋 装 满 以 避免 透析 的 材料 过 于 稀释 。 如 果 用 一 种 不 活泼 的 高 分 子 化 合 | 物 代 替 通 常 使 用 的 水 溶液 作为 溶剂 ， 则 透析 时 水 就 会 由 透析 袋 中 渗 出 , 用 这 种 方法 透析 过 夜 , 可 将 200 毫升 溶液 浓缩 至 几 毫 升 。 ， ” 三 、 物 理 条 件 (一 ) 温 度 ” 透 析 速 度 也 受 温 度 的 影响 , 温度 越 高 透析 速度 越 快 。 提 高 温度 时 , 溶剂 的 粘度 降低 而 扩散 速度 增加 。 此 外 , 许多 大 分 子 对 温度 很 敏感 , 因此 蛋白 质 等 的 透析 通常 在 冷 的 条 件 下 进行 。 (二 ) 压 力 大 分 子 .和 小 分 子 的 分 离 也 受 通过 膜 时 的 压力 梯度 影 ” 响 。 可 将 透析 袋 放 在 真空 中 (而 不 放 在 溶液 中 ), 并 敞开 透析 袋 的 一 端 。 此 时 水 和 小 分 子 会 渗 出 透析 袋 形成 超 滤液 而 留 在 透析 袋 中 的 大 分 子 被 浓缩 。 这 个 过 程 叫做 超 滤 。 区 ~ PY. Donnan 膜 平 ff 当 大 分 子 ( 如 蛋白 质 ) 的 盐 溶 液 透析 时 ， 带 电 的 蛋白 质 不 能 透 过 膜 而 它 的 反 离 子 则 趋向 于 透 过， 这 就 导致 离子 在 膜 两 边 不 均匀 分 布 并 产生 pH 的 变化 , 这 种 现象 叫做 Donnan 效应 , 常 发 生 在 对 燕 馏 水 透析 的 时 候 。 如 带 负电 荷 的 蛋白 质 盐 溶 液 对 水 透 亲 是; 蛋 白质 不 能 透 过 透析 袋 , 而 它 的 反 离子 (Na+) 可 以 通过 , 结果 造成 环 ， * 18 « ee on * ae — 待 分 离 的 混合 物 人 (水 或 稀 缓 冲 液 ) 图 ant SPEAK OAD DAY FAI WH ET PE Sele ATR an a Se BAR Nas '_.Nat 0 pa ee H+ +OH- ma 7K See le Nat : 1 pH 降低 | PHAGES -图 2-2 蛋白 质 的 盐 溶 溶液 对 燕 饮水 透析 时 所 观察 到 的 Donnan 效应 。 (Pr 代表 蛋白 质 阴 离子 ) NRE. 为 了 保持 中 性 , 水 就 分 解 出 所 离子 移 进 透析 —& 蛋白 质 部 分 的 p 也 因此 下 降 而 水 部 分 的 pH 上升 (图 2-2)。 反 = 如 蛋 自 质 带 正 电 , 则 pH 的 变化 相反 。Donnan 效应 可 以 导致 | 蛋 自 质 沉 汪 或 变性 因而 是 不 可 取 的 。 为 了 减少 Donnan 效应 , 透 。 本 通 党 对 具有 BE RR NCE e 19 e % 第 三 章 层 析 法 层 析 法 也 叫 色 谱 法 ， 是 一 种 物理 的 分 离 方 法 。 它 是 利用 混合 物 中 各 组 分 的 物理 化 学 性 质 的 差别 ， 使 各 组 分 以 不 同 程度 分 布 在 两 个 相 中 , 其 中 一 个 相 为 固定 的 ( 称 为 固定 相 ), 另 一 个 相 则 流 过 此 固定 相 ( 称 为 流动 相 ) 并 使 各 组 分 以 不 同 速度 移动 , 从 而 达到 分 离 。 层 析 法 是 近代 生物 化 学 最 常用 的 分 析 方法 之 一 ， 运 用 这 种 方 法 可 以 分 离 性 质 极为 相似 ， 而 用 一 般 化 学 方法 难以 分 离 的 各 种 化 合 物 , 如 各 种 氨基 酸 、 核 苷 酸 , 糖 .蛋白质 等 。 层 析 法 有 许多 种 类 ， 可 以 根据 所 用 两 个 相 的 状态 和 操作 方式 不 同 进行 分 类 如 下 ; % 3-1 层 析 法 的 一 般 分 类 固 定 相 流 动 相 | 操作 方式 名 称 mit ae 离子 交换 齐 离子 交换 层 析 此 外 , 还 有 凝 胶 层 析 ， 亲 和 层 析 和 高 压 液 相 层 析 党 方法 。 在 讨论 几 种 常用 的 层 析 法 之 前 ， 先 介绍 一 下 柱 层 析 法 的 一 般 技术 。 : | 4 | | iS eo 20° ¢ : | % : a7 \ ‘ 保持 恒 压 的 溶剂 池 层 析 法 的 一 般 技术 ’ \ 形 滤纸 Se PAL Ae 尼龙 格 栅 、 烧 结 玻 片 或 玻璃 棉 作 8 为 支持 板 ( 物 ) RARE AS “FEUER” LA 避免 分 离 后 组 分 的 再 混合 4 图 3-1 和 柱 层 析 装 置 a. bite aie i AL He i A AE A 3 3-1, (二 ) 层 析 材 料 的 准备 许多 材料 都 可 在 层 析 法 中 使 用 ， 在 装 柱 前 这 些 材料 要 用 溶剂 平衡 ， 另 外 还 需 作 一 些 预 处 理 , 例如 凝 腕 层 析 材料 需要 溶 胀 ,吸附 剂 需要 加 热 或 酸 处 理 来 活化 ， 离 子 交 换 树脂 需要 用 酸 碱 处 理 来 得 到 所 需 的 电离 形式 。 在 用 溶剂 平衡 时 ， 先 使 材料 沉淀 ， 用 倾注 法 除去 悬浮 的 细 颗 粒 , 否则 由 于 细 颗 粒 的 堵塞 , 溶剂 的 流速 将 显著 降低 (图 3-2) 浆 =1 体积 湿 沉 淀 十 0.5 体积 溶剂 玻 棒 防止 产生 气泡 细 颗 粒 用 用 溶剂 稀释 的 悬浮 液 倾泻 法 除去 a ne 2 轻 轻 邑 柱 以 便 填 装 SO) By BEE a 填 装 的 材料 | 沉淀 颗粒 再 用 0.5 们 、 ] 体积 溶剂 悬浮 以 便 支持 板 装 柱 Lf ; 稍微 打开 旋塞 以 | 材料 沉淀 b- 图 3-2” 层 析 柱 的 制备 \ (三 ) 装 柱 层 析 柱 的 填 装 是 先 关闭 出 口 , 用 溶剂 灌注 至 1/3 体 积 ， 并 使 支 持 板 下 的 ` 死 体积 "不 在 有 气泡 , 再 慢 慢 地 向 溶剂 中 加 浆 状 物 , 要 小 ， 22 。 ” 恋 地 沿 着 玻 棒 倾注 以 防止 气泡 存留 在 柱 内 。 让 悬浮 液 沉 省， 并 放 出 过 多 的 溶剂 ,为 了 避免 分 层 , 最 好 一 次 装 完 , 如 需 分 几 次 填 装 , 则 ”在 三 次 填 装 前 应 先 在 已 经 沉淀 的 表面 用 玻 棒 搅拌 然后 再 倾注 ， 重 ， 复 这 个 过 程 , 直至 装 到 需要 的 高 度 。 用 溶剂 彻底 洗涤 层 析 柱 后 使 液 ， 面 降 到 比 层 析 床 表面 略 高 一 点 。 最 后 复 盖 一 张 圆 形 滤纸 或 尼龙 布 ， ”以免 加 样 时 扰乱 床 表面 (图 3-1)。 (四 ) 加 样 EBERT, 先 将 样品 溶解 在 溶 溶剂 里 或 对 洗 脱 液 透析 , 样品 溶液 的 ， 小 度 应 该 尽 可 能 高 些 , 以 减少 样品 溶液 体积 , 使 区 带 狭窄 。 将 样品 ， 仔细 加 到 层 析 床 的 表面 , 打开 旋塞 至 液 面 与 床 面 齐 , 然后 连接 溶剂 ， 池 , 保持 一 定 高 度 的 液 面 。 五 ) 洗 脱 bt 下 一 步 是 用 适当 的 洗 脱 液 把 各 组 分 依次 从 柱 上 洗 脱 下 来 。 在 取代 扩展 法 中 ， 溶 剂 与 层 析 材 料 的 相互 作用 比 柱 上 的 物质 “与 层 析 材 料 的 相互 作用 要 强 ， 于 是 与 柱 结合 的 分 子 被 取代 。 每 一 “个 桩 能 绪 合 多 少 物质 都 有 一 个 限度 ( 即 总 柱 容量 )。 在 取代 扩展 的 ”情况 下 , 样品 上 柱 量 差不多 达到 总 柱 容量 的 50 多 ， 一 般 尚 能 完全 分 离 。 但 是 为 了 得 到 更 好 的 分 辨 力 ， 洗 脱 法 更 为 可 取 。 ae 洗 脱 法 是 最 常用 的 方法 。 使 用 洗 脱 法 ， 上 柱 量 不 超过 总 柱 容 量 的 10 多 , 溶剂 与 柱 的 相互 作用 比 溶质 与 柱 的 相互 作用 能 , 溶剂 越 。 过 结合 的 分 子 ， 逐 渐 地 将 它们 从 桩 上 冲洗 下 来 。 在 冲洗 过 程 中 各 。 组 分 因为 吸附 力 不 同 而 逐渐 分 离 。 在 一 个 组 分 被 洗 脱 后 可 以 更 换 。 洗 脱 液 , 这 就 是 所 谓 的 分 步 洗 脱 。 另 外 , 还 有 一 个 可 行 的 方法 是 逐 ， 渐 改 变 溶剂 的 性 质 ， 形 成 一 个 离子 强度 .pH 或 极 性 的 递增 梯度 从 。 而 使 各 组 分 依次 被 洗 脱 , 这 种 方法 叫 梯度 洗 脱 , 它 的 优点 之 一 是 能 。 够 减少 拖 尾 现象 。 (六 ) 部 分 收集 及 分 析 ee ~~ i 往 的 流出 液 可 以 用 人 工 的 方法 收集 到 一 系列 试管 中 或 使 用 部 分 收集 器 。 这 种 装置 能 使 每 一 管 按 预 定 的 时 间或 滴 数 收集 流出 液 ， 然后 自动 移 位 ， 下 一 管 再 继续 收集 。 洗 脱 完毕 将 已 收集 的 许多 部 分 流出 液 即 可 选用 各 种 适宜 的 方法 进行 定量 分 析 ， 并 画 出 洗 脱 物 的 量 对 流出 液体 积 的 洗 脱 曲线 。 每 一 部 分 的 蛋 自 质 或 核酸 的 含量 可 以 让 流出 液 通过 一 个 流动 小 室 测定 其 280nm 或 260nm 的 光 吸 收 来 进行 连续 监测 。 二 、 几 种 常用 的 层 析 法 : (一 ) 吸 附 层 析 这 是 首次 由 Tswett 用 来 分 离 色素 的 层 析 方法 。 吸 附 剂 的 经 典 含义 可 以 说 成 是 一 种 表面 具有 吸附 分 子 的 特性 的 固体 (特别 是 ， 当 它 是 多 孔 的 和 分 得 很 细 的 时 候 )。 如 氧化 铝 、 硅 胶 、 活 性 淡 等 固体 物质 都 具有 吸附 性 能 , 可 以 将 一 些 物 质 自 溶 液 中 吸附 到 它 的 表面 。: 它 和 离子 交换 树脂 不 同 ， 吸 附 剂 表面 和 分 子 的 吸引 力 理论 上 不 含 有 静电 力 。 吸 附 可 以 是 非常 特异 的 ， 以 致 于 可 以 从 一 个 混合 物 中 选择 性 地 吸附 一 种 物质 。 用 这 种 方法 进行 各 种 成 分 的 分 离 是 由 它 、 们 被 吸附 剂 所 吸附 的 程度 , 以 及 它们 在 分 离 用 的 溶剂 中 的 溶解 度 ， 这 两 个 方面 的 差异 所 决定 的 。 当 然 这 些 特点 是 由 化 合 物 的 分 子 结 构 所 决定 的 。 例如 在 柱 吸附 县 析 中 ， 混 合 物 的 分 离 是 在 装 有 适当 吸附 剂 的 玻璃 管 的 柱 中 进行 的 。 混 合 物 加 到 柱 上 ， 然 后 用 一 个 适当 的 溶剂 (或 是 混合 溶剂 ) 通 过 这 个 柱 。 混 合 物 就 随 着 溶剂 的 流动 而 逐渐 分 开 。 在 最 初 , 溶液 刚 倒 在 吸附 柱 上 时 , 混合 物 全 锌 吸附 剂 吸附 在 桩 的 上 层 , 在 继续 加 入 溶剂 冲洗 时 , 千 中 就 会 连续 不 断 地 发 生 混合 物 « 24 « . Oe i i si a + al ie oe =a > ae < Fer ~~ J 站 《 ae RE, 容 解 ， 再 吸附 的 反复 交替 过 程 。 如 被 吸 二 附 的 某 物质 被 溶剂 溶解 出 来 (解吸 作用 ), 就 随 着 向 下 面 流动 , 但 又 — aro UBER 又 把 它 从 溶剂 中 吸附 出 来 ,后面 继续 流下 来 的 新 溶剂 又 再 把 它 溶 解 出 来 并 被 带 着 往 下 移动 , 又 再 被 吸附 。 就 这 下 物 中 各 物质 都 会 从 柱 顶 向 下 移动 一 段 距离 ， 但 是 由 于 各 物质 被 吸附 剂 吸附 的 程度 以 及 它们 被 溶剂 溶 ” 解 的 能 力 不 同 而 向 下 移动 的 距离 不 同 因此 彼此 分 离 。 吸 附 性 弱 的 ， “就 比较 容易 被 溶剂 溶出 , 又 因为 它 再 被 吸附 的 力量 比较 弱 , 所 以 在 > 桩 中 移动 的 距离 就 大 些 。 经 过 适当 的 时 间 后 ， 混 合 物 中 各 物质 就 Bs “可 以 完全 分 开 。 = 它们 被 分 离 以 后 ， 现 在 一 般 最 常 采用 的 方法 是 让 杜 继续 展 . Fe, 用 溶剂 把 被 吸附 的 物质 由 吸附 柱 上 冲洗 出 来 , 从 柱 上 流出 的 洗 ， 脱 液 必 须 分 部 地 收集 , 随后 进行 分 析 。 对 任何 一 种 特殊 的 吸附 剂 和 溶剂 洗 脱 系统 的 选择 由 所 要 完成 palatal ”在 分 离 时 可 引起 某 些 化 合 物 的 降解 。 吸附 层 析 的 操作 方式 有 柱 型 和 薄 层 两 种 。 具 体操 作 技术 请 见 本 章 。 一 、 杜 层 析 的 操作 和 (五 ) 薄 层 层 析 两 部 分 。 (一 /离子 交换 层 析 离子 交换 层 析 利用 含有 能 跟 周 围 介质 进行 离子 交换 的 不 稳定 离子 的 不 溶性 基质 来 分 离 物 质 。 _ 1、 离子 交换 基质 Adams #1 Holmes 在 1935 年 通过 酚 、 甲 醛 和 矿 酸 缩聚 成 不 ， 洲 性 树脂 ， 制 成 了 第 一 个 人 工 合成 的 离子 交换 材料 。 从 此 以 后 ， 电大 工 合成 的 离子 交换 树脂 日 见 增多 〈 多 数 是 从 芳香 族 化 合 物 合成 © 25 e Fi - CH=CH, CH=CH, =~ am p 的 ), 由 葵 乙 烯 | eo 及 交 联 剂 二 乙烯 茶 | | 聚合 得 到 CH=CH, . 的 物质 是 一 种 和 常用 的 树脂 基质 : a ae CH,— car CH,— rie CH,—CH—CH,—CH—CH, — | OO 0, Ogi —CH—CH,— CH CH,— fee sie CH,—CH—CH, — | ea SOA 联 度 一 般 为 4 一 14 多 。 树 脂 的 交 联 度 小 时 , 则 水 溶性 强 ， 加 水 后 树 脂 的 膨胀 性 大 , 网 状 结构 的 网 眼 大 , 交换 反应 快 , 交换 选择 性 低 。. 相 - 反 , 树脂 的 交 联 度 大 时 , 则 水 溶性 弱 , 加 水 后 树脂 的 膨胀 性 小 , 网 眼 ”小 , 交换 慢 , 具有 一 定 的 选择 性 。 hi 离子 交换 树脂 适合 分 离 小 分 子 物 质 如 氨基 酸 ， 但 对 于 天 分 子 ”如 绰 自 质 是 不 适合 的 ， 因 为 大 分 子 不 能 进入 树脂 紧密 交 联 结构 的 内 部 。 为 此 大 分 子 可 以 用 取代 的 纤维 素 和 葡 聚 糖 来 分 离 ， 这 些 物 。。 、 质 的 分 子 是 纤维 状 的 , 它们 的 大 部 分 功能 基 团 在 其 表面 。 2 可 电离 基 团 Pe: 离子 交换 树脂 按照 它们 对 阴离子 或 阳离子 的 亲 合 力 的 特性 可 以 分 为 阴离子 交换 树脂 和 阳离子 交换 料 脂 。 例 如 阳离子 交换 树脂 ie 交换 周围 介质 的 阳离子 ， 也 就 是 说 ， 决 定 树脂 究竟 是 阴离子 的 还 © 26 ¢. ” ey ee PS He gee rs, att 办 和 苯 乙 焕 的 相对 含量 决定 了 聚 葵 乙 烯 链 之 间 的 交 联 度 。 交 联 度 是 “ 指 这 种 树脂 骨架 中 ， 含 有 二 乙烯 苯 的 重量 百分率 。 国 产 树 脂 的 交 ™~ . 阴离子 交换 齐 阳离子 交换 剂 固定 离子 十 固定 离子 一 可 交换 离子 C) 可 交换 离子 多 : 图 3-3 ”阴离子 和 阳离子 交换 剂 | 这 两 种 类 型 又 可 进一步 分 成 含有 强 电离 基 团 的 如 一 SOsH CB 一 酸 型 ) 和 一 NR。 ( 强 碱 型 ) 及 弱电 离 基 团 的 如 一 COOH， 一 OH( 弱 “a + << mA = va a 9 二 。 也 形式 存在 (在 极端 pH 值 时 例外 ) a | —S0,H=-=—SO," +H* = 2 NR. OH=—-——NR,OH- 4 wrest 所 含 基 团 的 电离 程度 依 pH 而 定 ， SLL — 7H fy pH 范围 有 最 大 交换 容量 时 方 能 使 用 。 、 —COOH=—COO- +H* q —NH; eee NE +H* c - Wor HA pH 6 左右 有 最 天 容量 , 而 带 有 氨基 的 那些 树脂 在 pH 低 于 6 时 才 有 效 。 离子 交换 纤维 素 含 有 取代 了 纤维 素 一 OH 的 弱电 离 基 团 , 3 ， 。 基 团 的 密度 比较 低 , 因为 取代 太 多 时 就 会 使 纤维 素 变 得 可 溶 。 常 见 a 的 林 电 商 基 轩 有 见 下 表 RD) AINE. ( 弱 碱 型 )。 强 离子 交换 树脂 是 完全 电离 的 , 并 以 带 表 3-2 “一些 取 代 纤维 素 的 可 电离 基 团 可 电离 基 团 阳离子 交换 剂 一 CH: 一 SO:H RAB FP HE SM 2.5 一 CH: 一 COOH 羧 甲 基 CM 3.5 一 PO:H， 磷酸 基 P 6.0 阴 高 子 交 换 剂 C:H; —CH: —CH, —NC 二 乙 基 胺 乙 基 DEAE 9.5 C.Hs m C.H; —CH, —-CH.—N—C.Hs | 三 乙 基 腕 乙 基 TEAE -10.0 Nc.Hs LS 在 高 PH 时 不 带电 Qu 2 PHETAN AAA 较 低 的 pPHCPH< 6) 各 在 低 的 pH 值 时 充满 电荷 ， 与 Zi OH- TEA BF NOW BAS Jl ha 53 3S BX 及 Y- 的 混合 物 给 six 结合 活动 的 离子 X- 比 Y -多 | 用 Cl- 洗 脱 Ee yA o es . - Zpnsscr X -被 所 用 高 盐 溶液 的 CI 取代 | 用 碱 再 生 从 saior 树脂 用 碱 再 生 图 3-4 阴离子 交换 层 析 的 各 阶段 + 28 本 让] re se Bales Eugene. RIAA, OME A MLE 6, paella | 38. HOF 典型 的 离子 交换 反应 过 程 可 用 下 面 的 例子 加 以 说 明 ， 在 这 里 用 含有 饥 基 的 阴 敲 子 交 换 树脂 分 离 两 个 负电 性 离子 X- 和 芯 - 树脂 的 可 电离 基 团 的 浓度 几乎 可 以 达到 .6 一 10 摩 尔 / 升 ， 因 此 “有 很 高 的 交换 容量 。 虽然 一 般 以 为 离子 交换 树脂 的 作用 仅仅 是 通过 离子 交换 过 程 E RPKOR, WAR LOTRR ERRAND TRIER. et 合 离子 可 以 通过 改变 缓冲 液 的 pH 来 洗 脱 。 例 如 当 pH 4 E. am 这 种 看 白质 分 子 的 净 电 荷 就 减 少 , 与 树 脂 的 结合 就 减弱 而 被 洗 脱 , 别 的 带电 的 蛋白 质 仍然 结合 在 柱 上 , 这 | 样 就 达到 了 分 离 的 目的 。 另 外 溶剂 中 的 离子 要 与 结合 离子 对 离子 pi 结合 离子 ， 所 以 增加 离子 强度 也 可 将 结合 离子 洗 脱 。 se “用 前 面 介绍 的 梯度 方法 逐渐 地 改变 。 离子 与 树脂 的 结合 是 种 动态 平衡 ， 其 结合 程度 取 奖 于 树脂 的 性 质 、 温 度 、 离 子 强度 和 溶剂 成 分 ， 同 时 还 与 树脂 的 电离 度 和 被 分 离 的 物质 有 关 。 高 价 离子 最 容易 结合 而 不 易 洗 脱 ， 对 于 典型 的 强酸 性 阳离子 交换 树脂 来 说 H+ 一 Na+ 一 Mg2+ < 一 Als+ 一 Th4+, 所 以 在 用 一 种 高 价 离 子 取代 结合 离子 时 应 使 用 稀 溶 液 ， 而 如 果 要 导入 一 种 低 价 离子 则 需 用 浓 溶 液 。 5 离子 交换 材料 的 准备 树脂 和 取代 多 糙 ( 取 代 纤维 素 、 取 代 葡 聚 糖 ) 首 先 要 在 蒸馏 水 中 吸 涨 ， 并 去 掉 过 细 的 颗粒 。 商 品 树脂 ， 特 别 是 阳离子 交换 剂 会 o ag i Fi E an Eee 有 4 FF TN = 8! ne eee i tery aa ee ON i pte oo ee Cee PERE Ee iS ald “含有 铁 或 其 它 重 金属 , 可 以 用 2 一 4 摩尔 / 升 的 盐酸 洗涤 加 以 去 除 。 通过 用 适当 的 溶液 洗涤 可 获得 所 需要 的 离子 形式 的 离子 交换 材料 。 例如 氨 型 的 阳离子 交换 树脂 是 先 用 盐酸 洗涤 , 然后 用 水 洗涤 直至 流出 液 呈 中 性 为 止 ， 同 样 制备 钠 型 是 用 氯 化 钠 或 氧 氧化 钠 溶 液 洗涤 树脂 ， 再 用 水 洗涤 至 中 性 。 SENN SAREE ee 必须 是 不 跟 树 脂 结合 6. paigieeletieriarren er 生生 和 间 EA 离子 交换 柱 层 析 法 分 离 氨基 酸 。 (三 ) 分 配 层 析 易 深 于 有 机 溶剂 而 难 溶 于 水 的 混合 物 的 分 离 常用 吸附 层 析 法 。 可 电离 的 水 溶性 混合 物 最 适宜 用 离子 交换 层 析 法 分 离 。 分 配 层 析 法 是 界 于 这 二 者 之 间 ， 在 水 和 有 机 溶剂 中 都 可 溶 的 混合 物 用 分 配 层 析 法 易 分 离 。 当 把 一 种 物质 在 两 种 不 混 溶 的 溶剂 中 振荡 时 ， 它 将 在 这 两 相 中 不 均匀 的 分 配 。 达 到 平衡 时 ， 这 种 物质 在 两 种 深 剂 中 的 浓度 之 比 是 一 个 常数 ， 也 就 是 所 谓 的 分 配 系 数 (a)。 _ 物质 在 溶剂 T Fh Ay oe ie ”物质 在 溶剂 工 中 的 浓度 分 配 层 析 法 实际 上 是 一 种 连续 抽 提 法 。 在 这 里 ， 二 种 溶剂 通 。 常 是 被 结合 在 固定 的 情 性 支持 物 ( 柱 或 膜 ) 上 的 水 ， 另 外 一 相 由 流 动 的 被 水 饱和 的 有 机 溶剂 构成 ， 它 流 过 固定 相 ， 如 果 某 一 混 含 物 的 各 组 分 在 这 两 相 中 的 分 配 系 数 有 足够 的 差异 ， 它 们 就 可 以 被 FT 各 机 了 人 ai 纸 层 析 的 理论 Consden, Gordon 和 Martin 首先 用 滤纸 作 支 持 物 并 以 草 三 酮 为 灵敏 显 色 剂 ， 建 立 了 微量 而 简便 的 分 离 重 « 30 « . tt ae BHT) ~p yn 《〈 亲 水 溶剂 的 吸附 层 ) . Bess ye 图 3-5 - 液 - 液 分 配 层 析 的 原理 白质 水 解 液 中 氨基 酸 的 方法 。 不 久 又 发 现 除了 氨基 酸 外 ， 糖 、 述 | 苷 酸 。 人 省 休 激素、 维生素 抗生素 等 很 多 物质 都 能 用 纸 上 层 析 法 分 离 , 因而 纸 层 析 成 为 生化 工作 中 一 种 常用 的 分 离 分 析 方法 。 4 滤纸 是 理想 的 支持 介质 ， 在 纸 上 ， 水 被 吸附 在 纤维 素 的 纤维 之 间 形 成 固定 相 。 由 于 纤维 素 上 的 羟基 具有 亲 水 性 ， 和 水 以 氢 键 ， 相连 , 使 这 部 分 水 不 易 扩 散 , 所 以 能 与 跟 水 混合 的 溶剂 仍然 形成 类 ” 似 不 相 混合 的 两 相 。 当 有 机 相沿 纸 流动 经 过 层 析 点 时 ， 层 析 点 上 溶质 就 在 水 相 和 有 机 相 之 间 进行 分 配 ， 有 一 部 分 溶质 离开 原点 随 有 机 相 移动 而 进入 无 溶质 的 区 域 ， 这 时 又 重新 进行 分 配 ， 一 部 分 溶质 从 有 机 相 进 入 水 相 。 当 有 机 相 不 断 流动 时 ， 溶 质 就 治 着 有 机 相 流 动 的 方向 移动 ， 不 断 进行 分 配 。 溶 质 中 各 组 分 的 分 配 系数 不 同 ， 移 动 速率 也 不 同 ， 因而 可 以 彼此 分 开 。 , ，， ， 纸 上层 析 法 的 一 般 操 作 是 将 混合 物 点 到 纸 上 ， 千 后 让 溶剂 从 “有 样品 的 一 端 经 毛细 作用 流 到 纸 的 另 一 端 。 等 纸 干 后 ， 可 用 适当 的 显 色 方 法 使 混合 物 中 各 组 分 在 纸 上 的 位 置 显示 出 来 ， 物 质 移动 e 3] a ss .+ .~“2. EF. we eerrm TEA 号 > 大 —_ . ’ = “| - - : 区 he ta) Re ee eee eS © ha a een aah eR ates 4 4, FURR, 展 层 方式 、 温 度 .pH 等 条 件 下 的 Ry 值 基本 上 是 不 党 i ® 32 e 的 距离 与 溶剂 移动 距离 之 比 就 是 By 值 。 某 一 种 物质 在 特定 的 深 数 (图 3-6) o 溶剂 前 沿 原点 R+ 值 跟 分 配 系 数 有 关 3-6 RE Ry 值 的 意义 Ry 与 % 的 关系 如 下 式 : Ai: 流动 相 的 横 截面 积 A: 国定 相 的 横 截 面积 RAEN AME, BARRE, LAME 用 和 可 能 的 离子 交换 ， 这 个 等 式 就 会 有 例外 。 2， 样 品 的 制备 和 点 样 在 研究 生物 材料 时 ， 做 层 析 以 前 样品 要 脱盐 (用 离子 交换 或 Behr), AWA MET RAR, 值 的 改变 ， 同 时 还 会 影 响 辨 认 分 离 组 分 的 化 学 反应 。 在 层 析 前 还 可 用 超 滤 或 葡 聚 糖 来 除 掉 蛋 白质 。 然 后 用 微量 点 样 管 将 样品 溶液 (2 一 20 微 升 ) 点 于 纸 上 ， 点 的 直径 不 超过 0.3~0.5 厘米 , 如 样品 太 稀 , 需 重复 点 几 次 时 每 次 点 之 前 均 应 吹 干 , 点 间距 离 约 2 一 3 厘米 。 3， 纸 的 选择 a alli gli eg a RAPT ATR BT 1 号 滤纸 (或 Whatman 1 号 ), 若 有 较 多 的 和 人 二 搞 雹 则 亲 用 新 华 3 号 (起 Whatman 3-3) 纸 较 合适 ， 可 是 其 分 辩 力 比 1 号 差 。 。 溶剂 顺 着 纸 的 纹 道 扩 展 速 度 快 ， 横 纹 则 速度 慢 。 必要 时 ， 使 用 前 可 将 尖 纸 用 缓冲 液 淄 泡 或 经 乙酰 化 作用 进行 。 化 学 修饰 。 4。 溶 剂 的 选择 溶剂 的 选择 跟 纸 的 选择 一 样 , 主要 是 根据 经 验 , 同时 也 取决 于 。 所 要 分 析 的 物质 。 如 果 在 溶剂 A 中 样品 物质 移动 离 溶剂 A 的 前 沿 上 近 ， 那 就 是 溶解 度 太 大 ; 如 果 在 溶剂 了 中 它们 靠近 原点 周围 ， 那 | 就 是 溶解 度 不 够 大 ， 因 而 合适 的 深 齐 应 该 是 人 和 了 的 适当 的 混合 Dy, 以 使 样品 各 组 分 的 Rs 值 能 在 整个 纸 的 长 度 上 散布 开 。 在 某 些 | 分 离 中 pH 是 一 个 重要 因素 ， 很 多 溶剂 含有 乙酸 或 氨 以 形成 一 个 ” 酸性 或 碱 性 的 环境 。 3 5. RE | 4 虽然 展 层 方式 可 以 不 同 ， 但 其 共同 点 都 是 将 点 好 样品 的 滤纸 国定 , 使 其 一 边 与 溶剂 槽 接触 , 让 溶剂 扩展 ， 整 个 装置 扣 在 密闭 的 把 滤纸 卷 成 圆 简 状 双向 层 析 装 置 图 3-7 LTB 容器 内 ， 槽 壁 衬 热 浸透 溶剂 的 滤纸 以 保持 恒定 的 蒸气 压 并 且 放 在 恒温 室 里 ， 温 度 的 波动 会 使 溶剂 走 得 不 均匀 ， 并 改变 Ry 值 。 展 层 方式 有 上 行 、 下 行 和 环行 。 上 行 层 析 见 上 图 于 上 行 层 析 是 比较 常用 的 方法 ， 它 的 优点 是 可 以 在 两 个 方向 上 进行 ( 即 双 向 层 析 ) 图 (3-8)。 混 合 物 在 第 一 种 溶剂 中 被 分 离 (溶剂 “ 溶剂 1 溶剂 2 —— , 转 90" 裁 去 溶 最 终 分 离 剂 前 沿 部 分 图 3-8 用 双向 纸 层 析 分 离 混 合 物 应 是 挥发 性 的 )， 干燥 后 将 纸 转 90°, 再 在 第 二 种 溶剂 中 进行 。 显 色 或 用 其 它 方法 定位 后 得 到 的 层 析 图 详 跟 在 相同 条 件 下 已 知 物 的 层 析 图 谱 比 较 就 能 故 定 寓 合 物 的 各 组 分 。 下 行 层 析 适 用 于 一 些 鼠 y 值 接近 的 混合 物 ( 图 3-9)。 图 3-9 下 行 野 析 e 34 。 bf Be ”因为 溶剂 泣 离 纸 的 底部 ， 这 就 能 使 两 组 分 较 充分 地 分 离 。 当 。 然 在 这 种 情况 下 不 能 测定 By 值 ， 而 只 能 与 标准 参考 物 如 葡萄 精 。 相 比 较 ， 就 糖 来 说 : me te pp _ Ae a HBR AG SBE BD FBS 大 部 分 化 合 物 是 无 色 的 ， 可 以 用 特殊 的 显 色 剂 使 其 显 色 ， 配 | 制 显 色 剂 时 最 好 使 用 与 水 不 混 溶 且 挥发 性 较 大 的 溶剂 。 显 色 剂 可 用 喷雾 器 喷雾 或 迅速 将 纸 在 显 色 剂 中 浸渍 。 如 果 被 分 离 物质 本 身 具 有 紫外 吸收 性 质 ， 可 在 紫外 线 照 射 下 © 与 纸 的 荧光 背景 对 照 显 出 暗 的 班 点 。 另 外 有 些 化 合 物 在 紫外 线 下 。 发 出 特殊 的 荧光 。 。 (四 ) 薄 层 层 析 ”swaimroB 和 了 JIlpaf6ep 在 1938 年 叙述 了 植物 位 取 物 在 氧化 _ 。 铀 薄 层 上 的 分 离 , 但 是 直到 1956 年 以 后 落 层 层 析 才 逐渐 引起 各 广 面 的 注意 和 重视 。 薄 层 层 析 法 是 将 支持 物 在 玻璃 板 上 均匀 地 铺 成 薄 层 ， 把 待 分 析 的 混合 物 加 到 藩 层 上 , 然后 选择 合适 的 溶剂 进行 展开 , 而 达到 分 离 鉴定 的 目的 。 薄 层 层 析 兼 有 柱 层 析 和 纸 层 析 的 优点 。 它 操作 方 便 , 设备 简单 , 展开 时 间 短 ， 一 般 只 需 几 分 钟 到 几 十 分 钟 。 它 灵敏 度 高 , 适用 于 微量 样 唱 的 分 析 ( 小 到 0.01/ 毫 克 ), 但 是 加 大 薄 层 的 厚 度 则 又 能 分 离 较 多 (大 到 500 毫 克 ) 的 样品 。 涨 层 层 析 还 有 一 个 优点 是 除了 可 用 一 般 显 色 剂 外 , 对 某 些 薄 层 材 料 还 可 用 腐蚀 性 显 色 剂 ， 另外 ， 还 可 以 在 支持 物 中 加 蒙 光 染料 以 有 助 于 点 的 鉴别 。 薄野 层 析 法 分 离 物质 的 原理 依 所 用 不 同 支 持 物 的 性 质 而 不 同 ， 可 以 是 吸附 层 析 、 离 子 交换 层 析 、 分 配 层 析 或 是 凝 胶 过 泪 。 “7%. 9 n 1 薄野 的 制作 in 在 玻璃 板 上 涂 铺 一 层 薄 层 ， 最 简单 的 方法 是 在 一 根 玻 棒 的 两 端 绕 几 围 胶布 ; 用 玻 棒 压 在 玻 板 上 ,， 把 支持 物 向 一 个 方向 推动 ， 即 WIE. 图 3-10 ”用 玻 棒 涂 铺 薄 层 有 时 用 上 述 方法 制 得 的 薄 层 不 太 均 匀 ， 可 以 用 有 机 玻璃 自制 一 个 涂 铺 器 即 能 取得 满意 的 结 采 。 图 3-11 自制 薄 层 涂 销 器 及 其 使 用 藩 层 厚度 小 于 200 微米 时 ， 影 响 Rr 值 ， 一 般 情况 下 厚度 为 250 微米 比较 合适 。 可 做 薄 层 材料 的 物质 很 多 ， 例 如 硅胶 ， 和 氧化 铝 、 纤 维 素 粉 、 DEAE 纤维 素 、 葡 聚 糖 等 ,具体 选择 哪 一 种 依 所 研究 的 问题 而 定 。 硅胶 对 大 多 数 的 物质 分 离 都 是 适宜 的 。 有 时 在 硅胶 中 加 入 烛 石 膏 作 为 粘 合 剂 。 这 时 一 且 与 水 调 合 就 需 快 速 操 作 。 2. RIF « 36 。 eas 2 eee ee, ae eats Fee HREM sR ERIEAMI, w ROMER CERIO MLM, AAD MA, PULA CER PAL BE T ee 剂 的 滤纸 条 。 薄 层 层 析 的 展开 方式 跟 纸 层 析 一 样 , 可 以 是 上 行 . 下 ， 行 、 昔 向 或 双向 。 下 图 是 上 行 法 的 一 种 方式 。 3. et RAR 样 ， 可 用 适当 的 显 色 剂 喷雾 或 根据 组 分 的 紫外 吸 ea EN at hades q amen | } RMR Er A eh EAR ASA A ee ke ts — 和 便 有 效 的 生物 化 学 分 离 分 析 方法 。 这 种 方法 的 基本 原理 是 用 一 般 上 的 柱 层 析 方法 使 分 子 量 不 同 的 溶质 通过 具有 分 子 得 性质 的 固定 相 RIE), ATE Ra | FPR BEBE RATS Pl, ne EAGT NE BH BE, BRS Aa ， 凝 胶 ` 聚 苯 乙 烯 和 多 孔 玻璃 珠 等 。 现 以 利用 交 联 葡 聚 糖 , 2 。 和 测定 分 子 量 为 例 说 明 凝 胶 层 析 法 的 基本 原理 和 应 用 。 。 ， 。 交 联 葡 聚 糖 (商品 名 Sephadex) 是 由 细菌 葡 聚 糖 (以 右 旋 葡 萄 ， 粳 为 残 基 的 多 糖 ) 用 交 联 剂 环 氧 毛 丙 烷 交 联 形成 的 具有 三 空间 的 ， 网 状 结构 物 。 控 制 葡 聚 糖 和 交 联 剂 的 配 比 及 反应 条 件 就 可 决定 其 ， 交 联 度 的 大 小 ( 交 联 度 大 “网 腿 ? 就 小 ), 从 而 得 到 各 种 规格 的 交 联 MRE, 即 不 同型 号 的 凝 胶 。“G?” 表 示 交 联 度 ，G 越 小 , 交 联 度 越 ， 夫 ， 吸 水 量 也 就 越 小 。( 见 表 3-3), ‘57. 7g ees ~ : , — 四 oe. ae Tire (uM .W.) 本 bans oe rect 多 Bi | 肽 与 蛋白 质 \(e/eFR) |(ml/g 干 胶 ) 2 温 Ub KE G10 <700 一 700 {1,040.1} 2—8- 3 1 G15 <1500 <1500 | 1.5+0.2 | 2.6—-3.6) poem 1. G25 | 700—5000 |1000—5000 | 2.5+0.2| 4-6 6 2 G50 | 500—10000 |1500—30000 | 5.0+0.3| 9—11 6 2 G75 |1000—50000 |3000—70000 | 7.5+0.5} 12—15 24 3 G100 |1000—100000/4000—150000|10.0+1.0 |. 15—20 48 5 G150 |1000—150000|5000— 400000] 15+1.5| 20—30 72 5 G200 |1000—200000|5000—800000| 20+2.0 | 30—40 72 5 把 经 过 充分 溶 胀 的 凝 胶 装 入 层 析 柱 中 , 在 加 入 样品 以 后 , 由 于 交 联 葡 聚 糖 的 三 维 空间 网 状 结构 , 小 分 子 能 够 进入 凝 胶 , 比较 大 的 分 子 则 被 排 阻 在 交 联 网 状 物 之 外 ， 因 此 各 组 分 在 层 析 床 中 移动 的 | | O | rs ---—— 0 ——CH; CHOH H CH 各 O.H 2 OH H O CH, 2 O { H OH H 及 WA re) CHOH gee ro i ’ H H . bun fi I OH H o-—--- oO O 1 H OH eS CH: CH, H H HOH HH 0 一 一 cH, 人 H OH HZ H O / i HO OH- H Oo H2 H OH H OH H ") eee OH 图 3-13 ” 交 联 葡 聚 糖 的 化 学 结构 ie 4 ees MIE BLA) FA NTE ANT (PA 8-13), 29 FEA HS Ho IY BESTEL HS ALBA TE DD, 其 流程 短 , 移动 速度 快 ， 先 流出 层 析 。 床 。 分 子 量 小 的 物质 可 以 透 和 人 凝 胶 颗 粒 , 流程 长, 移动 速度 慢 , 比分 | 子 量 大 的 物质 迟 流出 层 析 柱 。 经 过 分 部 收集 流出 液 , 分 子 量 不 同 的 | 物质 便 互相 分 离 (Al 3-14) Sephadex G10 到 G50 通常 用 于 分 离 。 肽 或 脱盐 。G75 到 G200 可 用 于 分 离 分 子 量 大 于 10000 的 蛋白 质 。 eo RAR BORLEN 交 联 网 状 物 SEA 一 大 分 子 不 能 进入 ”图 3-14 凝 胶 过 让 的 原理 图 3-15 BERRA Re a he Saiahci TS et Ce \ i 交 联 葡 聚 糖分 子 含有 大 量 的 羟基 , 极 性 很 强 , Dork, PDE BB: 用 前 必须 用 水 充分 溶 胀 。1 克 干 重 凝 胶 充分 溶 胀 时 所 需 的 水 量 ( 毫 升 ) 叫 做 凝 胶 的 得 水 值 ( 丈 ,), 因为 得 水 值 不 易 测 定 ， 故 常用 溶 胀 度 | 即 床 体积 来 表示 凝 胶 的 得 水 性 ， 其 定义 是 每 克 语 重 凝 胶 颗 粒 在 水 了 中 充分 溶 胀 后 所 具有 的 凝 胶 总 体积 。 2， 凝 胶 柱 的 总 体积 (总 床 体积 )F, 是 干 胶体 积 Y 在 凝 胶 颗 粒 内 部 的 水 的 体积 F, 及 凝 胶 颗 粒 外 部 的 水 的 体积 了 之 和 。 V,=VotVitVy QQO™P 5 QOQ © QQ ‘ : 2O@ : * = Q = Oo VotVi , i 图 3-16 Vo. Vy, Vi Vs 之 间 的 关系 示意 图 , ALMA PAK VAT REAL GET I Sea 2 Vo 也 叫 外 水 体积 。 党 常用 洗 脱 一 个 已 知 完全 被 排 阻 的 物质 人 (如 蓝 葡 聚 糖 2000) 的 方法 来 测定 , 此 时 甚 洗 脱 体积 就 等 于 Fe。 ao V7, MU DAD AB ER BAB PN RPS BL, FT CISA De EE (BS) 和 得 水 , fi W, 计算 : | i V;=mg-W, | 也 可 以 从 洗 脱 一 个 小 于 凝 胶 工 作 范 围 下 限 的 小 分 子 化 合 上 » 40 ， bit ieee | V ne Kav, a _ke ea 2 的 分 配 比例 (分 本 系数) #8 Ve—Vo_ wor. V; mg:W, 4 Ait WEB, WGK Ka 一 1, 7. 一 mr 十 Fi。 在 通常 的 工作 范围 内 Ke ee Oe RATT mene Te 对 溶质 的 吸附 。 。 溶质 的 洗 脱 特征 的 有 关 参 数 (V/V, Fe/PF, Ke Kav) 都 与 4 ALS 5.0 - 5.6408M 图 3-17 洗 脱 特征 与 分 子 量 的 关系 DMEM ARSENE, HI, 所 造成 的 偏差 不 大 ， SoM PRM aie MAYHEM Kav 表示 a Ve—Vo Ta Vi-Vo e。 44 « ervesvey. 则 天 0 一 0，F. 一 mo。 如 果 分 子 可 以 完 ne ae Cu x} logM ides nena Fama ww a Boe me 电泳 技术 带电 质点 在 电场 中 移动 的 现象 称 为 电 瀛 。 电 泳 现象 早 在 十 九 世纪 初期 就 被 人 们 发 现 了 , 并 用 于 胶体 化 学 中 , 但 是 电泳 技 术 的 广 泛 应 用 则 在 二 十 世纪 四 十 年 代 左 右 。 近 年 来 各 种 类 型 的 电泳 技 将 支持 物 做 成 薄膜 或 薄 层 的 ， 也 有 平板 的 或 柱状 的 。 由 于 与 光学 FGA DA ABMS SE A, 又 组 成 了 等 电 聚焦 仪 , 等 速 电泳 仪 等 等 , 大 大 地 发 展 和 扩大 了 电泳 技术 的 应 用 范围 。 | 各 种 类 型 的 电 泡 技术 概括 如 下 表 : 表 4-1 电泳 技术 的 种 类 区 ae eats ee ee . Tiselleus 式微 量 电 泳 。 显 微 电 泳 .等 电 聚 焦 电 泳 技术 、 。 等 速 电泳 技术 。 密 度 梯度 电泳 ， 纸 上 电泳 醋酸 纤维 薄膜 电 记 ， 薄 层 电泳 ， 非 凝 胶 支持 物 区 带电 沪 | 水 平 式 或 重 直 式 ”用 支持 物 的 支持 物 有 : 淀粉 .纤维 素 粉 ,玻璃 粉 、| (平板 法 ,柱状 法 及 线 丝 法 ) 电泳 技术 硅胶 , 合成 树脂 粉末 . WERE HE Wx Hi ik (1) 淀粉 凝 胶 rca rey = 省 冲 ao fF oO NY 4,45 Fi Fe, teh He Ha ok 《水 平 式 或 垂直 式 ) 和 &. Oo 全 jee =H] (2) 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 1) 圆 盘 电 泳 法 垂直 式 (柱状 法 ) AxKut 2) 平板 电泳 法 垂直 式 或 水 平 式 hte 3) SDS- 圆 形 电泳 法 垂直 式 ( 测 分 子 量 ) (3) BRAG PEE tk : (4) 琼脂 凝 胶 电 泳 平板 法 或 柱状 法 (hn Se BE Ha Hk) 。 双 向 电泳 。 电泳 - 层 析 相 结合 技术 ， 交叉 电 泳 法 。 连 续 纸 电泳 ， ~ wo WO abe RIGA HE 任何 一 种 物质 的 质点 ， 由 于 其 本 身 在 溶液 中 的 解 离 或 由 于 其 ” 表面 对 其 他 带电 质点 的 吸附 ， 会 在 电场 中 向 一 定 的 电极 移动 。 例 如 氨基 酸 ,蛋白 质 酶 .激素 ,核酸 及 其 衍生 物 等 物质 都 具有 许多 可 “ 解 离 的 酸性 和 碱 性 基 团 。 它 们 在 溶液 中 会 解 离 而 带电 。 一 般 说 ” 来 , 在 碱 性 溶液 中 〈 即 溶液 的 pH 值 大 于 等 电 点 PD, AFA He 荷 , 在 电场 中 向 正极 移动 。 而 在 酸性 溶液 中 , 分 子 带 正 电荷 ， 在 电 ” 场 中 向 负极 移动 。 移 动 的 速度 取决 于 带电 的 多 少 和 分 子 的 大 小 。 不 同 的 质点 在 同一 电场 中 泳 动 速 度 不 同 , 常用 泳 动 度 ( 或 迁移 HR) 来 表示 。 泳 动 度 的 定义 是 带电 质点 在 单位 电场 强度 下 的 泳 动 ， 速度 。 即 : a OE OR? RF BRAY) Serb: bik ah IE UB? RE BAY) 、 | 44 ”2 为 质点 的 泳 动 速度 (厘米 / 秒 或 分 ) 了 为 电场 强度 (伏特 /厘米 ) d 为 质点 泳 动 距离 (厘米 ) “并 为 支持 物 的 有 效 长 度 ( 厘 米 ) ， YV 为 加 在 支持 物 两 端的 实际 电压 (伏特 ) ” t 为 通电 时 间 ( 秒 或 分 ) AW Vit 便 可 计算 出 质点 的 泳 动 度 。 ee Claes Cec Lee 即 质点 所 带 净 电 荷 的 量 ， ， 质点 的 大 小 和 质点 的 形状 。 一 般 来 说 ,质点 所 带 净 电荷 越 多 ,质点 直 | Bi), 越 接近 于 球形 , 则 在 电场 中 的 泳 动 速度 越 快 ; 反之 则 越 慢 。 。 泳 动 度 除 受 质点 本 身 性 质 的 影响 外 , 还 受 其 他 外 界 因素 的 影响 ,如 溢 液 的 粘 产 等 。 影 响 泳 动 速度 的 主要 外 界 因素 还 有 下 列 几 种 : (一 )、. 电 场 强度 (电势 梯度 ) “电场 强度 是 指 每 1 厘米 的 电压 降 ， 它 对 泳 动 速度 起 着 十 分 重 上 要 的 作用 。 例 如 , 纸 上 电光 的 支持 物 滤纸 两 端 相距 20 厘米 ， 如 电 上 硅 降 为 200 伏特 , 则 电场 强度 为 200 伏特 /20 厘 米 一 10 伏 特 / 厘 米 。 电场 强度 越 高 , 带电 质点 移动 速度 越 快 。 根 据 电场 强度 的 大 小 ,可 ， 将 电泳 分 为 常 压 (100~500 4K) Hes Bk Allies FE (500 ~10,0004K) Hea Bk; ae EH Dk i es $y 9 BE — BBE 2—10 ARF / BK, Wk SL BR Ke, 需要 几 小 时 到 儿 天 ; 高 压 电泳 的 电场 强度 为 20~200 伏特 / 悍 ， 米 ,电泳 分 离 时 间 比 较 短 , 有 时 仅 需 几 分 钟 。 常 压 电 泳 多 用 于 分 离 上 蛋白 质 等 大 分 子 物 质 ， 而 高 压 电泳 则 用 来 分 离 气 基 酸 、 小 肽 、 核 苷 酸 等 小 分 子 物 质 。 在 生产 中 有 时 需要 进行 快速 的 中 间 分 析 ， 如 果 | RAMI, 可 以 把 常 压 电 泳 小 型 化 , 缩短 滤纸 两 端 距离 ， 达到 高 压 快速 的 目的 。 如 将 原来 两 端 相距 20 厘米 的 滤纸 改 为 5 厘 米 , 外 加 电压 仍 为 200 伏特 ,电场 强度 则 变 为 40 伏特 /厘米 ， 这 样 。45 。 就 加 快 了 电泳 速度 。 (=), 溶液 的 pH 值 溶液 的 pH 值 决定 带电 质点 解 离 的 程度 ， 也 决定 物质 质点 ， 所 带 净 电荷 的 多 少 。 对 蛋白 质 ,氨基酸 等 两 性 电解 质 而 言 ，pH 值 距 等 电 点 越 远 , 质点 所 带 净 电 荷 越 多 , 泳 动 速度 也 越 快 ; RS, 慢 。 因 此 , 当 分 离 某 一 蛋白 质 混合 物 时 , 应 选择 一 个 合适 的 PH 值 ，， ”使 各 种 蛋白 质 所 带 净 电荷 的 量 差异 较 大 ， 以 利于 分 离 。 为 了 使 电 泳 过 程 中 溶液 的 pH 值 恒定 , 必须 采用 缓冲 溶液 。 (三 ), 溶 液 的 离子 强度 离子 强度 代表 所 有 类 型 的 离子 所 产生 的 静电 力 ， 也 就 是 全 部 “ 的 离子 效应 , 它 取决 于 离子 电荷 的 总 数 , 而 与 溶液 中 盐 类 的 性 质 无 关 。 溶 液 的 离子 强度 越 高 , 带电 质点 的 泡 动 速度 越 慢 ; 离子 强度 越 低 ， 质 点 汇 动 的 速度 越 快 。 一 般 最 适合 的 离子 强度 在 0.02~0.2 之 间 。 在 稀 溶 液 中 , 离子 强度 的 计算 方法 , 是 将 每 一 离子 浓度 乘 以 其 价 数 的 平方 ,再 将 所 有 乘积 相 加 ,以 2 除 其 和 。 计 算 公式 如 十: 离子 强度 (D = 5 SCZ 式 中 : C 为 离子 的 摩尔 浓度 (摩尔 / 升 ) Z 为 离子 的 价 数 | 例如 : 求 0.015 摩尔 / 升 Na.SO, 溶液 的 离子 强度 , Ml: 离子 强度 (D) = 5 (0.015 x 2x 12+0.015 x 22) = 0.045 根据 离子 强度 (TD) 的 计算 公式 单单 价 化 合 物 的 离子 强度 等 于 其 浓度 ; 双双 价 化 合 物 的 离子 强度 等 于 其 浓度 的 四 倍 ; 单 双 价 ( 或 双 单 价 ) 的 离子 化 合 物 的 离子 强度 等 于 其 浓度 的 三 倍 。 。 46 ， a ew - — wae * e 四 ), 电 滩 现 和 个 固体 支持 攀 的 相对 秘 动 称 为 电 渗 现 象 (图 4-1)。 例 如 在 纸 电 访 时 , 由 于 纸 上 带 有 负电 荷 ， 而 与 纸 接触 一 一 一 一 一 一 一 十 一 一 一 十 + 二 ++ 二 二 , 电 渗 方 向 图 4-1 电 渗 示意 图 的 水 湾流 因为 静电 感应 带 有 正 电荷， 在 电场 的 作用 下 溶液 便 向 负 ， 极 移动 并 带动 着 质点 向 负极 移动 。 假 如 这 时 进行 电 头 ， 则 质点 移 phate Fi SRR FS 3a PRE AN eb EAS YB a Fe A HB HE EWA, PEI AR RHE ii HAG , 则 其 表面 速度 比 电泳 速度 快 。 。 着 质点 原来 向 正极 移动 则 其 表面 速度 比 电 谍 速 度 慢 。 因 此 , 在 电 ， 泳 时 应 尽量 避免 使 用 具有 高 电 渗 作 用 的 支持 物 。 a cae A : 7 Hla Bic AUR AR YE HNO TREE AR, “adr ok HA PLT AY, HL DCH WE ATH Dic HERE, 其 中 包括 电极 、 缓 冲 液 a HYD TT J BY 3e FR A BAL Se i Hk PSK CI ° 47 e 4-2) Fge4esk (图 4-3) 等 。 电 泳 仪 是 提供 直流 电源 的 装置 ， 它 能 控制 电压 和 电流 的 输出 。 纸 电 读 可 分 为 低压 电泳 和 高 压 电 访 两 ER Ht fi SS aX N N NY N N N N N S S S Lf WRRARALSSRESEREELEEEN NS N N a 滤纸 条 NNNSNNNSRRRRRR SSS SSS ca TT. 图 4-2 KPA eA 图 4-3 ARK 类， 低压 电光 仪 的 电压 一 般 为 100 一 500 伏特 ， 电 流 为 0 一 150 毫 安 。 高 压 电 泡 仪 的 电压 为 ”500 一 10000 (RAF, HAHA 50 一 400 毫 Be FEL Di ASIDE AE i EH A FY HL FS, 又 能 输出 稳定 的 电 访 。 纸 电泳 的 设备 简单 , 应 用 广泛 ,是 最 早 使 用 的 一 种 电泳 技术 。 在 早期 的 生物 化 学 研究 中 , 曾 发 挥 重 要 作用 。 由 于 纸 电泳 时 间 长 ，。 分 辩 率 较 差 , 近年 来 逐渐 为 其 他 快速 、 简便、 分辩 率 高 的 电 永 技 术 所 代替 。 =. AMET AE VE IH ok Re FEL PREF 2A FE WM Hy SF yD Dk Pa Ps, AR 膜 电 访 。 醋 酸 纤维 素 是 纤维 素 的 羟基 乙酰 化 所 形成 的 纤维 素 醋酸 酯 。 将 它 深 于 有 机 溶剂 (如 丙酮 . 氛 仿 、 氛 乙烯 ,乙酸 乙 酯 等 ) 后 , 涂 * 抹 成 均匀 的 薄膜 ， 干 燥 后 就 成 为 醋酸 纤维 薄膜 。 现 有 国产 醋酸 纤 维 薄膜 成 品 出 售 。 醋 酸 纤维 薄膜 具有 泡沫 状 的 结构 ， 厚 度 约 为 120 微米 , 有 很 强 的 通 透 性 , 对 分 子 移动 阻力 很 小 醋酸 纤维 薄膜 电 恋 是 近年 来 推广 的 一 种 新 技术 。 目 前 已 广泛 应 用 于 科学 实验 ,生化 产品 分 析 和 临床 化 验 , 如 血清 蛋白 、 血 红 蛋 白 、 球 蛋白 , 脂 蛋白 、 糖 蛋白 、 甲 胎 蛋 白 , 类固醇 , 同 功 酶 等 的 分 离 和 es 48 « } 鉴定 Poser rs Hilt AE REA SER > BEARIRIOE, BL ie (EF AIR AE EE. ENE BR LOR Lt A MRE IEE Mer Die, ALI eC ESR SLL CE A 本 BREF Ae EN Dic Pe RACH ic CLP BR ASS Se LH = A HELI) ae PU, cH WBE Bes Dk 。 在 凝 胶 电泳 中 ， 琼 脂 凝 胶 电 泡 是 最 早 得 到 广泛 应 用 的 。 因 为 ee @@ 在 琼脂 凝 胶 中 含有 琼脂 1 一 1.5 多 ， 其 余 都 是 。 在 这 种 凝 胶 中 电泳 ,近似 自由 界面 电 汪 , 可 是 样品 扩散 又 比 自 ar, 四 琼脂 凝 胶 电 泳 ， 支 持 物 均匀 , APSE, oP - PR, 重复 性 好 。 轩 液 相 与 固 相 界面 无 明显 界限 , 电 访 速 度 快 。 | 因 琼 脂 凝 胶 透明 而 不 吸收 紫外 线 , 可 以 直接 用 紫外 检测 仪 测 定 。@ | DAA Bee, 样品 容易 洗 脱 , 利于 制备 。@ 干 膜 可 以 长 期 保存 3 除 以 上 的 优点 外 , BRAS HE Berks dic th 2 NORE hh, 因为 琼脂 ”是 一 种 强酸 性 物质 ， 能 造成 严重 的 电 渗 现象 影响 电泳 的 速度 ， 而 ， 且 琼 脂 中 所 含 可 溶性 杂质 难于 除去 。 | 二 琼脂 凝 胶 电 泳 有 平板 式 和 柱 式 两 种 , 一 般 采 用 平板 式 为 多 。 其 = 实验 步骤 如 下 : 二 1 配制 缓冲 溶液: 琼脂 凝 胶 电泳 常用 缓冲 溶液 的 pH 值 多 在 6 一 9 之 间 , 离子 强度 为 0.02 一 0.05。 离 子 强度 过 高 时 , 由 于 大 量 电 | 瀛 通 过 琼脂 板 将 产生 热量 , 使 板 中 水 分 大 量 蒸发 而 析出 盐 的 结晶 ， 甚至 使 琼脂 板 断 裂 , 电 流 中 断 。 常 用 的 缓冲 溶液 , 有 磺 酸 盐 缓冲 液 _ err. a 2， 制 板 : 制 板 常用 的 琼脂 浓度 为 1—1.5.% . PA ik PPE 时 成 的 凝 胶 富 有 弹性 , 坚固 不 脆 。 将 一 定量 的 琼脂 用 水 浴 加 热 溶化 ， a » 49 « ay ‘ si hi ites gi ete cl ae acca te, i = a - he al . Se ec Alt) el eee Se as ror, 4 1.” / CASS AR A 60°C 的 缓冲 液 混合 ， 使 其 浓度 为 1—1.5%, 继续 加 热 至 表面 无 气泡 , 迅速 将 凝 胶 倒 在 水 平 玻璃 板 上 , 使 其 厚度 约 为 3 EK, 冷却 后 即 成 防 脂 板 (注意 这 里 所 用 缓冲 液 的 离子 强度 必须 比 电 访 时 的 离子 强度 高 一 倍 )。 3. FARE: 加 样 方法 有 二 : 一 是 挖 槽 法 , 在 琼脂 板 的 中 央 挖 一 KTH, 将 在 水 浴 上 熔化 至 42 一 45*C 的 琼脂 与 样品 等 量 混合 ， 倒 入 小 槽 中 , 也 可 直接 将 样品 倒 入 小 槽 中 。 另 一 种 是 滤纸 播 和 法 ， 在 斑 脂 板 上 适当 的 位 置 用 刀片 切 一 Rise, TARA FE iin DEAR Fr, AR HY Wa Be E55 BB I BEB, RR PR EAR, 4—5 % ‘Fe 4 电泳 :加 样 完毕 后 , HDR NS BS PO ACHE Hk A FEL 层 滤纸 与 电极 槽 缓冲 液 连接 。 接 通电 源 ， 调 节 电 压 。 一 般 电场 强 度 为 6 伏特 /厘米 。 5 固定 和 染色 : 将 电泳 后 的 琼脂 板 浸 入 用 70 多 酒精 配制 的 2 多 醋酸 溶液 中 15~20 分 钟 进行 固定 。 固 定 后 的 琼脂 板 , 需 用 自 来 水 漂洗 数 次 ， 然 后 放 在 40°C Ze hs Ha DEAR EA, ES 水 膜 , 附 于 玻璃 板 上 , 再 以 适当 的 显 色 剂 显 色 。 Fi, FR Mas POC IC TSE We Hk i I ee i ALA BG) A AS ABI FAD TARA A, 在 电场 的 作用 下 ， 产 生 不 同 的 移动 速度 而 分 离 的 方法 。 它 具有 电汇 和 分 子 得 的 双重 作用 。 (一 ) 聚 丙烯 酰胺 的 聚合 丙烯 酰胺 单 体 和 交 联 剂 N\N'- 甲 又 双 丙烯 酰胺 在 催化 剂 的 作 用 下 聚合 成 含有 酰胺 基 侧 链 的 脂肪 族长 链 。 相 邻 的 两 个 链 通过 甲 又 桥 交 联 起 来 就 形成 三 维 网 状 结构 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 。 mY O , PR ai Pe Me: CH,—CcH—C—NH, (简称 为 Acr) es 50 « , FAM ILM AMEN: (简称 为 Bis) ‘ Ra gO eis i __ CH,=CH—C—NH—CH,—NH— C —CH=CH, 3 CH, OST at ae RO i de ; oe et oe ae ete ae -CH,— pei c—0 c=0 - > NEH， NH NH, ee CH,— 7 (全 一 | C=0 ee C=O -C=0. . c=o : fae i NH Oa a 2 一 CH， H-£CH,—CH},-CH,—CH-ECH,—C Hi, .CH 一 Ar cy Cx0 | idee) 3 aii, Fey I Te ao A, 常用 的 催化 剂 (包括 催化 剂 和 加 速 剂 ) 有 以 下 两 种 : ” 1， 过 硫酸 铵 -TEMED (四 甲 基 乙 二 胺 ) 系统 : 当 Aer A Bis 的 溶液 中 放 入 这 个 催化 系统 后 , 过 硫酸 镶 [(NHJDa3:O 司 产生 出 游 离 氧 原子 使 单 体 成 为 具有 游离 基 的 状态 , 从 而 发 生 聚 合作 用 <。 聚合 的 初速 度 和 过 硫酸 铵 浓度 的 平方 根 成 正比 。 这 种 催化 系统 需要 在 碱 性 条 件 下 进行 , 例如 , 在 pH8.8 条 件 下 7 多 的 丙烯 酰胺 溶液 30 分 钟 就 能 聚合 完毕 。 在 pH4.3 时 聚合 很 慑 , 要 90 分 钟 才能 完成 。 温 ， 度 与 聚合 的 快慢 成 正比 。 通 常 在 室温 下 就 很 快 聚合 , 温度 升 高 聚合 更 快 。 如 将 混合 后 的 凝 胶 溶液 放 在 近 0"C 的 地 方 ， 就 能 延缓 聚合 。 一 般 来 讲 温度 过 低 ， 有 和 氧 分 子 或 不 纯 物质 存在 时 都 能 延缓 凝 胶 的 聚合 。 为 了 防止 溶液 中 气泡 含有 氧 分 子 而 妨碍 聚合 ， 在 聚合 前 须 将 溶液 分 别 抽 气 , 然后 再 混合 。 | ¢ 2， 核 黄 素 -TEMED 系统 : 这 是 一 个 光 激 发 的 催化 反应 。 核 “ 黄 素 在 光照 下 分 解 , 黄 素 被 还 原 成 无 色 型 , 但 在 有 氧 条 件 下 ， 无 色 时 型 又 被 氧化 成 有 游离 基 的 黄 素 环 ， 使 聚合 作用 开始 。 核 黄 素 催化 系统 的 优点 是 : @ 用 量 极 少 (1 毫克 /100 毫升 )， 对 所 分 析 的 样品 没有 任何 影响 。@@ 聚 合作 用 所 需 用 的 时 间 可 以 自由 控制 ， 变 化 光 照 时 间 、 强 度 ， 可 使 聚合 延缓 或 加 速 。 而 过 硫酸 饺 -TEMED 系统 ， 的 聚合 作用 所 需 的 时 间 除 了 取决 于 温度 、pH 值 及 有 氧 分 子 或 不 纯 物 质 的 存在 外 ， 还 取决 于 它们 的 浓 冻 。 为 了 使 分 析 的 结果 重复 性 高 , 核 黄 素 催化 系统 的 光照 时 间 和 强度 最 好 标准 化 。 凝 胶 的 机 械 强度 和 弹性 是 很 重要 的 。 凝 胶 的 软 硬 、 透 明度 、 粘 着 度 都 会 直接 影响 分 离 的 效果 。 凝 胶 的 机 械 性 能 ,弹性 ,透明 度 和 粘着 度 都 取决 于 凝 胶 总 浓度 和 Ar 与 Bis 两 者 之 比 。 UE T (Acr Fil Bis 总 浓度 ) =*?.100(%) C ( 交 联 剂 百分比 ) =? -100(%) 证 ,人 Be a= Act HM, b= Bis 克 数 m= Baws REI. | 其 中 :0(w/w) 是 很 关键 的 。 当 a:b <10 It, ERE Me, BAL G4; :b>100 tH}, 5% 的 凝 胶 呈 糊 状 , 也 易 断 裂 。 欲 制备 完全 透明 而 又 有 弹性 的 凝 胶 应 控制 :2= 30 左右 。 不 同 浓度 的 单 体 对 RTA, 发 现 Act 低 于 2%, Bis 在 0.5% 以 下 就 不 能 RAT. itn Acr 浓度 时 要 适当 降低 Bis WIRE, MET 25% I, a:b=20#F #; T%5—10%, a:b= 40 fe His TA | 15—20% iH, a: b= 125—200 左右 。 ”用 于 研究 大 分 子 核酸 的 凝 胶 多 为 卫 = 2.4% 的 大 孔径 凝 胶 , 因 ， 为 太 软 不 易 操作 , 最 好 加 入 0.5% 琼脂 糖 。 有 的 在 3 多 凝 胶 中 加 入 20% 基业 也 可 增加 其 机 械 强度 而 不 影响 其 孔径 大 小 。 至 于 粘着 ERA AAR ARETE, 单 体 浓度 适中 ， 凝 胶 与 器 壁 粘着 情况 令 人 满意 ， 不 会 出 现 样品 渗 漏 。 新 制备 的 凝 胶 与 器 壁 附着 力 BEA, 随 存放 时 间 的 延长 附着 力 降 低 ， 有 时 在 电泳 结 束 时 一 部 分 胶 柱 就 可 能 从 管 壁 上 滑脱 出 来 。 化 )、 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 孔径 ，”。 聚 再 烯 酰胺 凝 胶 在 电 水 中 不 仅 有 防止 对 流 , 减低 扩散 的 能 力 ， | 而 且 还 具有 分 子 筛 的 作用 ， 这 是 因为 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 是 一 个 三 维 下 空间 网 状 结构 。 某 一 个 分 子 通过 这 种 网 孔 的 能 力 显然 取决 于 凝 胶 和 孔 共 的 大 小 和 形状 , 也 取决 于 被 分 离 物质 的 大 小 和 形状 。 因 此 , 当 所 分 离 的 物质 不 变 时 , BEY, 孔径 越 小 ， 所 受阻 力也 就 越 大 。 推算 蜂胶 孔径 的 几 种 方法 : 五 为 孔径 的 平均 直径 ; c 为 多 聚 体 浓 度 : 4 为 多 聚 体 分 子 直径 , 若 不 是 卷曲 的 分 子 应 为 5A; ， 五 为 常数 ， 取 决 于 凝 胶 的 几何 构 型 。 假 车 多 聚 体 的 链 是 以 近 。 直角 交 联 的 , 则 约 为 1.5。 Pa 以 5 匈 凝 胶 为 例 可 计算 出 其 孔径 平均 直径 为 38A。 这 样 的 计 “ 算是 粗略 的 , 与 实际 情况 尚 有 一 定 的 距离 。 | 2， 有 人 计算 TS % BEML CIDP IY 直径 为 50A; 80% 的 为 而 q 3. 有 人 利用 颗粒 状 聚 丙烯 栈 胺 蜂胶 做 色 层 分 析 , 测定 了 总 浓 度 ( 卫 ) 为 6.5 一 20% 的 丙烯 酰胺 凝 胶 液 在 六 种 不 同比 例 的 双 丙 烯 “ 酰胺 存在 时 聚合 后 的 孔径 大 小 ,结果 见 图 4-4, 从 图 上 可 以 看 出 ， 孔径 的 大 小 在 很 大 程度 上 取决 于 两 者 的 总 浓度 (TP), THK, 孔径 相应 变 小 ,机 械 强度 增强 。 值 得 注意 的 是 当 印 值 不 变 时 ，Bis " 2 ing * = 20 q =>, . 7 有 fs ~ ie j ij 15 ; , es ‘ : Es 2) : \ Ce m 10 ie ad 3 ASE Aes Bs EET bee be | ny ou net ae? 人 ef BREE .¥ py 5 e 4 . * | 1 2 3 二 Ro.s (厘米 X10-?7) 图 4-4 Rs( 凝 胶体 积 中 可 利用 的 50 匈 分子 的 半径 ) 在 丙烯 酰胺 总 下 浓度 6.5—20% 范围 内 与 Bis 百分率 的 关系 。 外 a Bl; 24 Bis 浓度 在 5% 以 上 或 以 下 时 ， 尽 管 PABA, 但 却 比 罗 值 小 而 Bis 为 5% 时 的 孔径 要 大 。 ， 分离 蛋白 质 的 实践 证 明 ， 胶 的 孔径 大 约 是 蛋白 质 分 子平 均 大 ae 例如 肌 红 蛋白 和 细胞 色素 分 子 的 半径 上 为 2 毫 微米 ,那么 可 选择 平均 胶 孔 半 径 为 1 毫 微米 的 凝 胶 浓度 (可 | BES), Ak, 在 实用 中 常 按 样品 的 分 子 量 大 小 来 选择 适宜 HUERTA. te 4-1, 4-1 不 同 分 子 量 范围 所 选用 的 凝 胶 浓度 百分率 we FF EB : 范 适用 的 凝 胶 浓度 多 <104 20—30 蛋 1 一 4X104 ， 、 50 一 20 白 4X104—1X105 10-15 质 1—5X105 5—10 >5xX105 2 一 5 核 本 15 一 20 酸 104 一 10s 5 一 10 (RNA) 105 一 2X104 2 一 2.6 上 丙 的 蛋白 质 在 此 胶 中 电泳 都 能 得 到 满意 的 结果 。 当 分 析 一 个 未 知 样品 时 ,常常 先 用 7.5 儿 的 标准 苦 胶 或 用 4 一 10 多 (AE BER EER 。 测 , 选 出 适宜 的 凝 胶 浓度 。 (三 )、 缓 冲 系统 的 选择 在 选择 缓冲 系统 时 主要 从 以 下 两 方面 来 考虑 : 1，pH 范围 ,离子 种 类 和 离子 强度 对 蛋白 质 来 说 ， 选 择 的 pH 值 应 能 使 样品 中 各 种 蛋白 质 分 子 ， 泳 动 率 的 差别 最 大 。 酸 性 蛋白 质 在 高 pH 条 件 下 ， 碱 性 蛋白 质 在 es 55 。 ”常用 的 所 谓 标准 胶 是 指 浓度 为 7.5% 的 凝 胶 ， 大 多 数 生物 体 bi ae, ”人 ve le 和 ee 至 be i acne a i a a a ol hm lle - _ eR en antigen es ae pee Seer 孔径 。 多 用 于 分 析 浓 度 较 稀 的 样 er saan a x ¢ » . ’ i TR ra 3 : : ie ss cs ~~ . . CA) oF. e er a 1K PH AEP AE FEB BRE AY SR MN EA sth 3H Dk 离 后 , 还 希望 测定 其 生物 活性 , 则 缓冲 系统 的 PH 值 不 应 过 大 或 过 小 (大 于 pH9 或 小 于 PH4), 否则 会 ?| 起 蛋白 质 话 性 的 钝 化 。 目 前 RAW BRR Oh AS A ei PH (pH9 左右 ), 1K PH (pH4 7 A) 中 性 三 大 类 。 此 外 , Hi se FBS FS BE AR DR VARI (.01—0.1. 摩尔 / 升 )。 因 为 离子 强度 低 ,电导 就 低 。 电 导 低 的 优点 是 能 产生 高 电压 梯度 , HEL Dk a) BE PEA, 产生 的 热量 也 较 小 , 分 离 效果 好 。 2. 连续 和 不 连续 系统 SRR AIR Mh pH MSN | 同 ， 不 连续 系统 是 槽 中 与 凝 胶 中 的 缓冲 系统 和 PH IAA, AE 续 系统 的 分 辩 率 较 高 。 (四 ) 不 连续 盘 状 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 电泳 不 连续 盘 状 电泳 往往 包含 两 种 以 上 的 缓冲 溶液 , pH 值 和 凝 胶 品 。 一 般 是 在 内 径 为 0.7 厘米 ， 长 10 厘米 的 小 玻璃 管内 , 把 三 种 性 质 不 完全 一 样 的 聚 丙烯 酰 胺 凝 We BABA, 如 图 4-5 所 示 , 图 中 加 为 样品 胶 ( 其 中 含有 样品 ) ，@@ AS 不 连续 凝 胶 电 沪 示 意图 为 浓缩 胶 ( 又 名 成 层 胶 ), 这 两 种 胶 的 缓冲 液 ,pH 值 和 和 孔径 大 小 完 全 一 样 。@@ 是 分 离 腕 (又 叫 电泳 胶 ) ， 其 孔径 一 般 比 沙 缩 胶 小 pH 值 也 不 同 。 样 品 腕 和 浓缩 腕 是 了 =3%，C=20 多 的 单 体 溶液 在 Tris-HCI 缓冲 液 中 由 核 黄 素 催化 合成 的 大 孔 胶 ，pH6.7。 而 分 离 胶 是 由 了 =7 匈 ,C=2.5 多 的 单 体 溶液 在 Tris-HCl 2 ih yy (pH8.9) 中 通过 过 硫酸 铵 催化 聚合 成 的 小 孔 胶 。 将 含有 这 三 种 凝 胶 的 玻璃 管 放 在 含有 Tris- 甘 氨 酸 (PH8.3) 缓 冲 液 的 电泳 槽 内 进行 电 藉 ， 就“ * 56 * 是 不 连续 的 盘 状 聚 丙烯 酰胺 疑 胶 电 访 。 它 之 所 以 有 很 高 的 分 辩 力 | 是 因为 有 三 种 效应 : 即 浓缩 效应 , 电荷 效应 和 分 子 得 效应 。 | RAR: PARIS BRA RR EME, HE ， 至 有 的 能 浓缩 几 百 倍 。 为 什么 样品 会 在 浓缩 胶 中 被 压 挤 成 层 呢 ? 和 泳 时 , 由 于 CI 解 离 度 大 , 几乎 全 部 释放 出 C1-; 而 在 电泳 槽 中 的 | Tris- 甘氨酸 缓冲 液 是 pH8.3， 因 为 甘氨酸 等 电 点 为 6.0， 在 电 访 上 过 程 中 , 它 上 只 有 极 少数 分 子 (1 一 0.1 多 ) 解 离 成 HN-CH-COO-。 |， 一般 酸 性 蛋白 质 在 此 pH 值 下 也 解 离 为 带 负 电荷 的 离子 , 但 其 解 离 | 度 比 HCI 小 , 比 甘 氛 酸 大 。 这 三 种 离子 带 有 同性 电荷 , 在 一 定 的 电 ， 场 作用 下 ， 它 们 的 泳 动 率 是 不 一 样 的 。 而 且 它们 的 有 效 泳 动 率 是 — 按 下 列 次 序 排列 的 。 即 : Me i@qi> My Ay > My Gy mA BAR, a 为 解 离 度 , ma 为 有 效 泳 动 率 。 根据 有 效 泳 动 率 的 大 小 , 最 大 的 称 为 快 离子 (或 先行 离子 ， 这 。 里 是 CL-)， 最 小 的 称 为 慢 离子 (或 随后 离子 , 这 里 是 HIN 一 CH: 一 COo-)。 电 泳 开 始 时 三 种 凝 胶 中 都 含有 快 离子 ,只 有 电 泡 槽 中 的 二 缓冲 液 舍 有 慢 离子 。 电 访 开 始 后 ， 由 于 快 离子 的 泳 动 率 最 大 在 快 离子 后 边 就 形成 一 个 离子 浓度 低 的 区 域 ， 即 低 电导 区 。 电 导 与 电 压 梯 度 是 成 反比 的 : | he sealed EB; 电压 梯度 工 : 电流 密度 7: 电导 率 。 所 以 低 电 导 区 就 产生 了 较 高 的 电压 梯度 。 这 种 高 电压 梯度 使 蛋白 质 和 慢 离子 在 快 离子 后 面 加 速 移动 。 因 而 在 高 电压 梯度 区 和 低 电压 梯度 区 之 间 形 成 一 个 迅速 移动 的 界面 。( 如 图 4-6) 。 由 于 样品 中 蛋白 质 的 有 效 泳 动 率 恰好 介 于 快 、 慢 离子 之 间 ， 所 以 也 就 聚集 在 这 个 移动 的 界面 附近 , 被 浓缩 成 一 狭小 的 样品 薄 层 。 «37. % ER oe ee Mey ee pe eee ee Pe | ”这 是 因为 样品 胶 和 浓缩 胶 是 用 PH6.7 的 Tris-HC1 缓 冲 液 制 成 ; 电 这 ”种蛋 白质 就 以 一 定 的 顺序 排列 成 电荷 效应 ， 蛋 白质 混合 物 在 界面 处 被 高 度 浓缩 ， 堆 积 成 层 ， AN 形成 一 狭小 的 高 浓度 的 蛋白 质 区 区 不 断 移动 RON 带 ， 但 由 于 每 种 蛋白 质 分 子 所 带 的 电荷 不 同 , 因而 泳 动 率 不 同 ,各 低 电 讨 EN 一 个 一 个 的 圆 盘 状 蛋白 质 区 带 。 分 子 算 效应 : 当 和 蛋白 质 通过 ESN eat 浓缩 胶 进 入 分 离 胶 时 , 由 于 pH 值 KIN nae 和 凝 胶 孔 径 突然 改变 ， (选择 分 离 胶 的 PH 为 8.9, 电泳 时 经 实际 测 图 4-6 不 连续 电泳 浓缩 效应 示意 图 量 为 pH9.5)， 使 甘氨酸 的 解 离 度 增 大 ， 因 而 它 的 有 效 泳 动 率 也 增 加 , 此 时 甘氨酸 很 快 就 赶 上 并 超过 了 蛋白 质 分 子 , 这 样 高 电压 梯度 不 存在 了 ， 使 蛋白 质 样品 进入 一 个 均一 的 电压 梯度 和 pH AR AE RY 分 离 胶 中 。 分 离 胶 的 孔径 较 小 ， 分 子 量 或 构 型 不 同 的 蛋白 质 通 过 ， 分 离 胶 , 所 受 摩擦 力 不 同 , 受阻 汪 的 程度 不 同 ， 因 此 表现 出 不 同 的 泳 动 率 , 即 所 谓 的 分 子 筛 作用。 即使 净 电 荷 相似 , 泳 动 率 相等 的 蛋 白质 分 子 , 也 会 由 于 分 子 筛 效应 在 分 离 胶 中 被 分 开 。 具体 操作 请 参阅 本 书 第 三 篇 )。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 除 具 有 分 子 筛 作用 以 外 ， 还 具有 下 面 一 些 优点 ; eu: 1 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 是 人 工 合成 的 凝 胶 ， 可 以 通过 调节 控制 音 体 浓度 或 单 体 和 交 联 剂 的 比例 ， 形 成 不 同 程度 的 交 联 结构 。 很 容 易 得 到 孔径 大 小 .范围 广泛 的 凝 胶 , 所 以 实验 重复 性 很 高 。 2， 聚 丙烯 酰 胺 形成 的 凝 胶 , 机 械 强 度 好 , 弹性 大 ; 便于 电泳 后 的 一 切 处 理 。 3， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 是 碳 - 碳 的 多 聚 体 ， 只 带 有 不 活泼 的 酰胺 e S28 *e = « ' a ee gk Pe eee et, ee Soe ee Se See ERS ee eee ty ar ie : ae lh FERS) = < RE 并 oe SEE, UNA, a. ; nS 目前 广泛 应 用 于 分 子 生物 学 ,生物 化 学 .细胞 学 微生物 学 ,村 掀 学 ,动物 学 ,免疫 学 酶 学 等 学 科 的 研究 以 及 临床 化 验 。 9 59 。， 第 五 章 “分 光 光 度 法 分 光 光 度 法 是 利用 物质 所 特有 的 吸收 光谱 来 鉴别 物质 或 测定 “ 其 含量 的 技术 。 因 为 分 光 光 度 法 极为 灵敏 、 精确 ,快速 和 简便 ; 在 复杂 组 分 的 系统 中 , 不 需要 分 离 , 即 能 检测 出 其 中 所 含 的 极 少量 物 。 质 ， 因 此 分 光 光 度 法 目前 已 成 为 生物 化 学 研究 中 广泛 使 用 的 方法 之 一 。 一 ， 原 - “ 理 如 果 用 加 热 , 放 电 、 射 线 照射 等 方法 来 激发 物质 ， 可 使 物质 发 光 。 物 质 所 发 射 的 光 是 具有 电磁 本 质 的 物质 , 它 既 有 波动 性 , 又 有 微粒 性 。 cls 光波 和 其 它 波 一 样 , 具有 一 定 的 频率 (>")。 不 同 单 色光 的 颜色 ” 不 同 ， 就 是 因为 其 频率 不 同 。 但 不 同 频率 的 光 在 真空 中 的 传播 速 度 (c) 相同 , 都 是 3x 10° 米 / 秒 。 根 据 光 的 速度 (c) 和 频率 (2) 可 计 算出 它 的 波长 (4)。 if gee 六 »y 人 眼 可 见 的 光 只 占 电 磁 波 谱 的 很 小 一 部 分 (400 一 760nm) 。 它 是 一 种 频率 较 大 的 电磁 波 。 电磁 波 按 频 率 大 小 , 从 频率 最 小 的 无 线 电 波 到 频率 最 大 的 ?- 射线 , 排 成 一 列 , 即 组 成 电磁 波 的 波谱 , 如 图 5-1 所 示 。 我 们 所 讨论 的 光谱 范围 ， 包 括 波 长 范围 为 400 一 760nm 的 可 . 见 光 区 和 波长 范围 为 200 一 400nm 的 紫外 光 区 。 钨 灯光 源 所 发 的 光 通过 三 棱镜 折射 后 ， 在 另 一 侧面 的 屏 上 可 ”60 ， 能 量 渐 增 一 > 分 子 旋转 eae 价 电子 跃迁 Pay Jee Fe We BS 2 子 跃迁 | 400um 25um 2.5 hm ]/ 0.04cm . 400nm 800nm 200nm 0.8um Se 图 S—1 ise a SF AAS HET HE BER BE, RE. UT ES ， 灯 的 发 射 光 谱 。 各 种 不 同 的 光源 都 有 其 特有 的 发 射 光谱 。 因 此 可 。 采用 不 同 的 发 光 体 作为 仪器 的 光源 。 如 铝 灯 能 发 出 400—760nm ， 波长 的 光谱 , 可 作为 可 见 光 分 光 光 度 计 的 光源 。 氨 灯 能 发 出 185 一 400nm 波长 的 光谱 , 可 作为 紫外 分 光 光 度 计 的 光源 。 如 果 在 光源 和 棱镜 之 间 放 上 某 种 物质 的 溶液 ， 此 时 在 屏 上 所 上 显示 的 光谱 已 不 再 是 光源 的 光谱 ， 它 出 现 了 几 条 暗 线 。 即 光源 发 ， 射 光 谱 中 某 些 波长 的 光 因 溶 液 吸收 而 消失 。 这 种 被 溶液 吸收 后 的 | 光谱 称 为 该 溶液 的 吸收 光谱 。 不 同 物质 的 吸收 光谱 是 不 同 的 。 因 。 此 根据 吸收 光谱 , 可 以 鉴别 溶液 中 所 含 的 物质 。 分 子 中 的 每 一 个 电子 往往 处 于 基态 , 但 在 一 定 条 件 下 , 它们 可 以 获得 能 量 , 上 升 为 激发 态 。 为 了 使 它们 从 基态 跃迁 到 激发 态 , 必 。 须 吸 收 一 个 恰好 等 于 跃迁 所 需 能 量 的 量子 来 增加 电子 的 能 量 。 所 以 当 光 线 穿 过 这 一 物质 时 , 某 些 量子 化 的 能 即 传递 给 这 物质 , 使 它 的 电子 提升 到 较 高 的 能 级 状态 。 同 样 ， 当 激发 态 的 电子 回 到 基态 dH, 它 发 射出 特征 波长 的 辐射 。 能 量 与 频率 的 关系 式 如 下 : E=E,—E,=hv Soe B= 4) F-We ewe Ht AB HE 已 = 电子 在 起 始 能 级 的 能 量 已 = 电子 在 最 终 能 级 的 能 量 人 e 6] e i < 二 FE ae eS a 中 ee —t ad — . - * Ses = et oe cae eS eel, 4 7 ee ee ee ee Se - = 、 了 Ts Pre | 2 : 4 2 = ae ge. . ‘ < AW, ae 3h a > = 4 ‘ j ’ - 号 Se, « - . i 和 4 h = 2 A ee Be = 6.63 x 10-2" ARH | 4 HERA RM, Bet Ie ER. 有 一 部 分 光 在 溶液 的 表面 反射 或 分 散 ， 一 部 分 光 被 组 成 此 溶液 的 “ 物质 所 吸收 , 只 有 一 部 分 光 可 透 过 溶液 。 入 射 光 = 反射 光 十 分 散光 十 吸收 光 十 透 过 光 dn SR: BRAVE FR ABB 7k (或 组 成 此 溶液 的 溶剂 ) 作为 “ 空 自 ?去 校正 反射 ， 分 散 等 因素 造成 的 入 射 光 的 损失 , 则 入 射 光 = 吸收 光 十 透 过 光 7 = 经 过 空白 校正 后 入 射 光 的 强度 7 = 透 过 光 的 强度 根据 实验 得 知 Pi, - 167" Sh, ¢ AVP I MERI ME, 1 表示 吸收 物质 的 光 径 ， AKA, ¢ 表示 吸收 物质 的 摩尔 消光 系数 。 它 表示 物质 对 光 的 吸收 特性 , 不 同 物质 的 。 数值 不 同 。 I 所 以 Fic 7 2 | a ecl 47 GEIR) =F ae P= 1079 若 以 卫 对 吸收 物质 的 浓度 作 图 ， 则 得 图 5_2 ROPE, the 式 可 得 业 liga ecl lg 十 称 为 物质 的 消光 值 ( 杷 或 吸收 值 CA) E=ecl 若 以 至 对 物质 的 浓度 作 图 , 则 得 图 5-3 中 的 直线 。 « 62 。 fakes REE nie 图 5-2” 透 光 率 与 物质 浓度 的 关系 图 5-3 ”吸收 与 物质 浓度 的 关系 q 上 起 说 明了 物质 的 光 吸收 与 吸收 物质 的 浓度 和 液 层 的 厚度 成 ‘EL. 这 就 是 Beer-Lambert 定律 。 ra- 二 、 分 光 光 度 计 的 基本 部 件 上。 分光 光 诬 计 根据 使 用 的 波长 范围 不 同 可 分 为 紫外 光 区 、 可 见 于 光 区 和 红外 光 区 分 光 光度 计 。 无 论 哪 一 类 分 光 光 度 计 都 包括 五 个 。 基本 部 件 :光源 ,音色 器 .吸收 池 、 检 测 器 和 测量 仪表 。 分 光 光 度 。 计 各 部 件 的 次 序 如 下 图 所 示 : 1 光源 = 单 色 器 吸收 池 ”检测 器 测量 仪表 Cam) BD (em) (光电 池 ) Reem 图 5-4 分 光 光 度 计 基 本 结构 示意 图 (一 ) 光 源 | 分 光 光 度 计 上 常用 的 光源 有 两 种 , $22 TAIT 在 可 见 光 区 、 近 紫外 光 区 和 近 红外 光 区 常用 钨 丝 灯 作为 光源 ， 其 工作 温度 约 为 2870"K。 多 经 灯 的 灯 经 为 紧密 泥 旋 形 , 若 将 灯 经 (ere 对 准 仪器 光学 装置 的 轴线 时 ， 能 在 出 光 狭 锋 的 平面 上 投射 光亮 均 匀 的 直线 影 象 。 钨 丝 灯 的 缺点 是 在 短波 长 (二 350nm) 处 辐射 强度 小 , 而 且 必 须 小 心地 控制 流 至 灯 上 的 电流 才能 维特 恒定 的 强度 。 在 紫外 光 区 多 使 用 氢 弧 灯 。 氢 灯 内 充 有 低压 氨 气 ， 在 两 极 间 施 以 一 定 电压 来 激发 所 分 子 可 发 出 紫外 光 。 因 玻璃 吸收 紫外 线 ( 光 学 玻璃 的 透射 范围 为 340 一 1000nm)， 所 以 氢 灯 的 泡 壳 用 石英 制 成 (石英 的 透射 范围 为 185 一 3500nm)， 或 在 灯泡 的 发 光 处 开 一 厂 英 窗 。 若 用 气 灯 代替 氢 灯 , 虽 发 射 的 波长 范围 相同 , 但 在 紫外 光 区 的 发 射 强度 可 增加 三 倍 之 多 。 因 和 气 灯 价格 昂贵 , 一 般 很 少 使 用 。 (二 ) 单 色 器 音色 器 是 把 混合 光波 分 解 为 单一 波长 光 的 装置 。 在 分 光 光 度 计 中 多 用 棱镜 或 光栅 作为 色散 元 件 。 1. 棱镜 光波 通过 棱镜 时 , 不 同 波长 的 光 折射 率 不 同 。 波 长 愈 短 , 传播 速度 愈 慢 , 折射 率 也 愈 大 ; 反之 , 波长 愈 长 , 传播 速度 愈 快 ， 折 射 率 则 念 小 。 因 而 能 将 不 同 波长 的 光 分 开 。 因 为 玻璃 对 紫外 线 的 吸收 力 强 ， 故 玻璃 棱镜 多 用 于 可 见 光 分 光 光 度 计 。 石 英和 熔 凝 石英 (fused silica) 棱镜 可 在 整个 紫外 光 区 传播 光 , METER PIED FEE 度 计 中 广 为 应 用 。 熔 凝 石英 虽 比 石英 在 短波 长 方面 更 易 传 播 光 ， 但 因 价格 昂贵 , 仅 在 需要 高 强度 辐射 时 , 才 被 使 用 。 2 衍射 光栅 在 石英 或 玻璃 的 表面 上 刻 划 许多 平行 线 〈 每 英寸 约 刻 15,000 一 30,000 条 )。 由 于 刻 线 处 不 透 光 , 通过 光 的 干涉 和 衍射 使 较 长 的 光波 偏 折 角 度 大 , 较 短 的 光波 偏 折 角 度 小 , 因而 形成 光谱 。 在 光源 照 到 棱镜 (或 光栅 ) 以 前 , 一 般 先 要 经 过 一 个 人 射 狭 颖 ， ° 64% ; ”再 通 过 平行 光 镜 使 成 为 平行 光束 投 到 棱镜 上 。 透 过 楼 镜 的 光 再 经 ， 另 一 聚 光 镜 ， 在 此 聚 光 镜 的 焦 面 内 可 得 一 清楚 的 光谱 图 。 如 在 焦 。 线 处 放 一 出 射 狭 缝 , 转动 棱镜 使 光谱 移动 , 就 可 以 从 出 射 狭 锋 射 出 。 所 需要 的 单 色光 。 整个 装置 称 为 “音色 器 ”。 准 直 透 镜 会聚 透镜 ES pa os 焦点 曲线 Ne ne et, a fis Ci ere is Coe) See iar OPTS = ¢ 17 AST RE rae = ; 图 5-5 eM eR & o> 吸收 池 ( 比 色 杯 、 bE O11, te Bab) fi HIS, 石英 和 熔 凝 石英 制 成 , 用 来 盛 被 测 的 溶液 。 在 低 ， 于 350nm 的 紫外 光 区 工作 时 , 必须 采用 石英 池 或 熔 凝 石英 地。 ， ， 当 光 透 过 吸收 地 时 ， 有 一 部 分 光 因 空气 和 玻璃 接触 面 的 反射 ”而 损失 , 其 数值 约 为 4 多。 为 了 减少 这 种 反射 损失 ,吸收 地 必须 与 光束 方向 垂直 。 此 外 在 制造 吸收 地 时 ， 也 应 尽 可 能 使 每 套 池子 完 全 相同 (如 玻璃 的 质料 .厚度 等 ), 以 免 产 生 误差。 。 。“ 遇 收 地 上 的 指纹 、 油 污 或 璧 上 一 些 沉积 物 都 会 显著 地 影响 其 Fete, 因此 在 使 用 前 务必 彻底 清洗 。 a ame “ (四 ) 检测 器 常用 的 检测 器 有 三 种 : 光电 池 、 光 电 管 和 光电 倍增 管 。 1， 光 电池 光电 池 是 由 三 层 物质 组 成 的 圆 形 或 长 方形 薄片 ， 装 在 一 个 特 时 制 的 匣子 里 面 。 第 一 层 是 一 种 导电 性 良好 的 金属 (如 银 )， 这 是 光 电池 的 负极 。 中 间 极 薄 的 一 层 是 半导体 硒 ” 第 三 层 是 铁 ， 这 是 光 ， 志 池 的 正极 。 当 光电 池 受 光照 射 以 后 , 半导体 硒 的 表面 逸 出 电子 ， 上 这 些 电 子 只 向 负极 方向 移动 , 而 不 向 正极 移动 , 因此 在 上 下 两 金属 ° 63 e [一 w: . SQOANAAAANAAEE LLL ALLL LLL LL LY “ULI ra ee : . , SSSSS 2. 光电 管 光电 管 是 由 封装 在 真空 透明 封套 里 的 一 个 半圆 柱 型 阴极 和 一 个 丝 阳极 组 成 。 阴 极 的 凹面 上 有 一 层 光电 发 射 材料 ， 此 种 物质 经 光照 射 可 发 射电 子 。 当 在 两 极 间 加 有 电位 时 ， 发 射出 来 的 电子 就 流向 丝 阳极 而 产生 光电 流 。 对 于 相同 的 辐射 强度 ， 它 所 产生 的 电 流 约 为 光电 池 所 产生 电流 的 1174。 由 于 光电 管 具有 很 高 的 电阻 所 以 产生 的 电流 容易 放大 。 ; 3. HH ee i >: 光电 倍增 管 远 比 普通 的 光电 管 优越 ， 它 可 将 第 一 次 发 射出 的 电子 数目 放大 到 数 百 万 倍 。 图 5-8 为 光电 倍增 管 的 示意 图 。 和 光电 管 相 似 ， 光 电 倍 增 管 的 阴极 表面 在 光 的 照射 下 可 发 身 图 5-8 光电 倍增 管 ， 电子 。 电 子 被 带 有 正 电 的 兼 性 阳极 (dynode) 所 吸引 ,并 向 着 它 加 。 速 运动 。 当 电子 打 在 兼 性 阳极 上 时 ， 能 引起 更 多 的 电子 自 表 面 和 。 出 。 这 些 射出 的 电子 又 被 第 二 个 兼 性 阳极 所 吸引 ， 同 样 再 产生 更 是 多 的 电子 。 这 样 的 过 程 重复 9 次 后 ， 每 个 光子 可 形成 10% 一 107 个 | 电子 。 这 些 电子 最 后 被 收集 在 阳极 上 。 所 得 到 的 倍增 电流 可 进 一 步 加 以 放大 和 测量 ; | , 。 五) 测量 装置 电流 表 、 记 录 器 和 数字 示 值 读数 单元 。 现 代 的 仪器 常 附 有 自动 记 录 器 ， 可 自动 描 出 吸收 曲线 。 | 三 、 几 种 国产 分 光 光 度 计 的 介绍 (一 ) 72 型 分 光 光 度 计 本 仪器 是 上 海 分 析 仪器 厂 生 产 的 一 种 可 见 光 分 光 光 度 计 ， 波 | 长 范围 为 420 一 700nm。 它 由 稳 压 器 ,. 单 色光 器 和 微 电 计 三 部 分 所 | 组成。 其 光学 系统 如 图 5-9 所 示 : 仪器 的 光源 是 一 个 10V, 7.5A 的 钨 丝 灯 泡 ， 由 一 个 磁 饱 和 稳 上 压 器 向 它 提供 低压 电源 。 钨 丝 灯 发 出 的 光 经 过 进 光 狭 儿 ， 反 射 镜 | 和 透镜 后 , 成 为 平行 光 进 入 棱镜, 色散 后 的 各 种 波长 的 单 色 光 被 钱 上 铝 反 射 镜 反射 , 经 过 另 一 块 透 镜 , 再 聚 光 于 出 光 狭 锋 上 。 在 出 光 狭 上 经 的 后 部 为 比 色 亚 定位 装置 。 单 色光 通过 盛 有 被 测 溶液 的 比 色 亚 Jas 再 射 到 三 光电 凶 上 。 根 据 比 耳 定律 , 溶液 的 浓度 愈 大 或 液 层 愈 FF, 则 透 过 光线 的 强度 愈 低 。 根 据 透 过 溶液 后 的 光线 强度 , 在 半 导 。 体 硒 光电 池上 产生 相应 的 光电 访 , 因而 在 微 电 计 的 标尺 上 , 可 读 出 。 相应 的 吸收 值 或 透 光度 的 读数 。 © 67 « 一 般 常用 的 紫外 光 和 可 见 光 分 光 光度 计 有 三 种 测量 装置 ， 即 1 一 光源 ”2 一 进 光 犹 怒 3 二 反射 镜 “4 二 透镜 2h 5 一 棱镜 ”6 一 反射 镜 7 一 透镜 8 一 出 光 狭 链 78 9—fb fl 10 一 光量 调节 器 11 一 光电 地 “12 一 微 电 计 5 rr 图 5-9 72 型 分 光 光 度 计 的 光学 系统 7 “人 全) 721 型 分 光 光度 计 其 oe ‘ 721 AYA, ICSE A Lie A =A aE) 7 tho SRA EK Be 光路 , 单 光 束 方法 。 其 波长 范围 为 360— 二 用 钨 丝 白 炽 灯 泡 汉 于 2 | ‘. LSE Be 9 1011 12 43 7 i 上 ait oer NI, 四 光源 灯 12V, 25W ip er 图 色 散 棱镜 四 准 直 镜 @@ 保 护 玻璃 Oke @ 反 射 镜 ”@@ 光 栏 四 聚 光 透 镜 OneaAm Det] ”四 保护 玻璃 四 光电 管 图 5-10 721 型 分 光 光 度 计 的 光学 系统 e 68 « 为 光源 。 其 光学 系统 如 上 简 图 所 示 : 。 由 灯泡 发 出 的 连续 辐射 光线 , 经 过 聚 光 透 镜 会 聚 后 , 再 经 过 平 ， BERG 90° 角 。 光 线 反射 后 ， 经 和 人 射 狭 儿 而 入 射 到 单 色 器 内 。 狭 ”人 钴 正 好 位 于 球面 准 直 物镜 的 焦 面 上 。 当 入 射 光 线 经 过 准 直 镜 反 身 Wa 就 以 一 东平 行 光 射 向 棱镜 (该 棱镜 背面 双 铝 ) ， 并 在 其 中 色散 。 入 射 角 在 最 小 偏向 角 , 入 射 光 在 铝 面 上 依 原 路 反射 回来 , 再 经 过 准 | 直 物 镜 反射 ， 而 会 聚 在 出 光 狭 丝 上 。 由 狭 颖 出 来 的 光 通 过 被 测 的 - 溶液 , 再 射 到 GD-7 型 光电 管 上 。GD-7 Wie BB He. BR | 钠 阴 极 面 对 整个 可 见 光 区 都 较 灵 敏 (光谱 灵敏 范围 350 一 850nm) 。 光电 管 受 光 后 所 产生 的 光电 流 ， 经 过 一 组 高 值 电 阻 (50M.500M、 «1K MQ), 在 电阻 两 端 形 成 一 个 电压 降 ， 通 过 电压 降 的 测定 来 间接 ”地 测量 光电 流 的 变化 。 (=) 751G 型 分 光 光度 计 751G 型 分 光 光 度 计 是 上 海 分 析 仪器 厂 制造 的 一 种 紫外 分 光 光度 计 。 它 能 测定 物质 在 紫外 光 区 、 可 见 光 区 和 近 红 外 光 区 的 吸 收 光谱 ,波长 范围 为 200 一 1000nm。 本 仪器 是 根据 相对 测量 的 原理 而 设计 的 。 测 定时 先 选 定 某 一 是 ”溶剂 (或 空气 ) 作为 标准 , 并 认为 它 的 透 光 率 为 100%。 而 被 测 样 唱 的 透 光 率 是 相对 于 标准 而 言 。 也 就 是 说 ， 被 测 样品 在 一 定 波长 下 的 透 光 度 就 是 由 出 射 狭 缝 射出 的 单 色 光 分 别 通过 被 测 样品 和 标 准 溶液 , 这 两 个 能 量 的 比值 。 仪 恬 的 方块 图 如 上 : 751G 型 分 光 光 度 计 采用 单 光 束 自 准 式 光 路 ， 其 波长 范围 为 200 一 1000nm。 在 波长 320 一 1000nm 范围 内 ， 用 钨 丝 白 炽 灯 汽 ， -在 波长 200 一 320nm 范围 内 ， 用 气 弧 灯 作 为 光源 。 其 光学 系统 如 下 立体 图 所 示 : ——_ 图 5-12 751 分 光 光 度 计 光 学 系统 立体 图 OAR 思 四 面 反光 镜 图 钨 丝 灯 “四 平面 反光 镜 ” 回 石英 窗 OM thks QHEHR OARRHR OAREZH 四 Meh 架 OEM OKEMHRNH Ob OR 光电 管 ” 四 红 敏 光电 管 ”四 光电 管 滑动 架 OBAMAS FH EURO MO) 发 出 的 连续 辐射 光线 , 射 到 聚 光 四 面 镜 包 上 ，: 再 被 反射 到 平面 镜 由 ， 然 后 再 反射 至 人 射 狭 颖 %,， 它 正好 位 于 球 面 准 直 物 镜 @ 的 焦 面 上 。 因 此 入 射 光 线 到 达 物 镜 @ 并 经 反射 后 ， 就 以 一 束 平行 光 射 癌 棱 镜 (@)( 该 棱镜 背面 镀 铝 )。 光 线 以 最 小 偏 问 角 射 入 棱镜 , 为 棱镜 底面 所 反射 , 重 又 穿 过 棱镜。 经 过 棱镜 的 色散 作用 ， 分 开光 谱 带 。 从 棱镜 色散 后 出 来 的 光线 经 准 直 物 镜 加 反射 70 人 7 rr ? thew 人 人 ek ae Tl Ge goss . a 4 | FG SIRES, ELLA AAR JeMEHD, ‘TAU ; oer 与 出 射 狂 缝 安 置 在 同一 狭 名 机 构 上 , 同时 开 闲 。 为 了 消除 © 杂 散 光 对 于 测量 结果 的 影响 ,在 出 射 狂 颖 后 装 有 滤 光 片 @ 365nm | 及 580nm 各 一 块 。 此 外 还 有 一 装 滤 光 片 的 孔 ， 可 根据 需要 放 入 其 中 它 滤 光 片 (也 可 不 放任 何 泪 光 片 )。 光 线 通 过 滤 光 片 后 ， 进 入 样 咒 于 宣 .在 比 色 四 托 架 上 可 放 四 支 比 色 下 @@.。 根 据 波段 需要 可 以 采用 玻 |。 璃 或 石英 的 比 色 则 ,为 了 使 光线 能 够 集中 地 照射 到 光电 管 阴极 上 ， TE AE EAI HO. | 本 仪器 采用 真空 光电 管 紫 敏 GD-5 和 红 敏 GD- _6 作为 接收 | Fee, 用 以 将 光 能 转换 为 电能 其 中 GD-5 为 锦 饮 阴极 面 ， 对 紫光 上 灵敏 , 使 用 波长 为 200-625nm。GD-6 HARM HPI, 对 红 光 灵 fc, 使 用 波长 为 625-1000nm。 透 过 被 测 样品 的 光线 照 到 光电 管 上 ， 发 生 光 电 效 应 产生 光电 i, 再 流 过 一 个 高 值 电阻 (2KMO) ,在 电阻 两 半 形 成 电压 降 。 本 公 | 器 就 是 通过 测定 电压 降 来 间接 地 测定 所 产生 的 光电 流 。 es 第 六 章 “ 放 射 性 同位 素 技术 放射 性 同位 素 技术 利用 同位 素 和 普通 原子 在 化 学 性 质 上 的 ， 相似 (因而 生物 体 不 能 区 别 它 们 ) 来 研究 物质 的 代谢 变化 ; 又 利用 它们 在 物理 性 质 上 的 不 同 ， 使 用 探测 仪器 测量 和 追踪 。 这 种 技术 解决 了 很 多 以 前 无 法 解决 的 问题 ,是 一 种 非常 有 效 的 研究 工具 , 在 生物 化 学 应 用 中 有 重要 价值 。 | — EA A (一 ) 同位 素 原子 由 一 个 带 正 电 荷 的 核 和 围绕 着 核 的 带 负电 荷 的 电子 云 组 成 。 原 子 的 质量 集中 在 核 上 。 原子 核 含 质子 和 中 子 两 种 主要 成 分 。 质子 是 带 正 电 荷 的 粒子 , 其 质量 大 约 是 电子 的 1850 倍 。 原 子 不 带 电 ， 其 核 中 的 质子 数 等 于 轨道 中 的 电子 数 。 这 个 数 叫 做 原子 序数 (Z)。 中 子 是 不 带电 的 粒子 ， 其 质量 大 约 等 于 一 个 质子 。 原 子 核 中 质子 数 和 中 子 数 的 总 和 叫做 质量 数 (A)。 B.. A=Z+N: N=eeh.. oe 由 于 中 子 数 与 原子 序数 无 关 , 所 以 它 不 影响 原子 的 化 学 性 质 。 一 种 元 素 的 原子 不 一 定 含 有 相同 的 中 子 数 。 原 子 序数 (质子 数 ) 相 同 而 质量 数 不 同 的 元 素 叫做 同位 素 。 See, 同位 素 的 表示 方法 一 般 是 将 原子 序数 标记 在 元 素 符号 的 左下 Hi, 质量 数 标记 在 它 的 左上 方 ,如 : YC 和 HC, YO MEO, 每 一 种 元 素 的 同位 素数 目 是 不 同 的 。 最 先 发 现 的 是 氛 的 同位 « 72 « 1 即 各 Ne 全 Ne 和 强 Ne。 同位 素 可 分 为 稳定 性 同位 素 和 不 稳定 性 同位 素 两 类 。 wi Be gti, 7 FR ese aL CR 不 稳定 性 是 同位 素 又 称 放射 性 同位 素 ,其 不 稳定 的 原子 核 会 自发 误 变 , 以 一 种 ， 国有 的 速度 放 田 -射线 (o- 误 变 ) 或 8- 射线 (6- 误 变 )， 或 ?射线 《?- 误 变 ) 原子 核 本 身 也 转变 为 稳定 性 元 素 。 以 氢 元 素 为 例 ， 氢 有 上 三 种 同位 素 YH TH, 9H, 前 两 种 是 稳定 性 同位 素 , 3H( 氧 ) 是 放射 性 | 同位 素 。 气 能 自发 误 变 , 产生 B- 射 线 , 变 为 3He( 氨 )。 放 射 性 同位 | 素 主 要 是 由 人 工 生产 的 。 稳定 性 同位 素 在 使 用 上 不 如 放射 性 同位 素 方便 ， 它 的 灵敏 度 和 不如 放射 性 同位 素 高 ， 而 且 探 测 也 困难 得 多 。 本 章 简略 介绍 有 关 放射 性 同位 素 的 知识 。 (=) 射线 的 性 质 1. ax- 射线 的 性 质 : aaa 。 原子 核发 生 w- 衰 变 时 失去 两 个 质子 和 两 个 中 子 同 时 放出 w 粒 ” 子 ， 即 新 形成 的 核 和 原来 相 比 ， 质 量 减 少 4, 原子 序数 减少 2。 可 见 ,a- 粒 子 实 际 上 是 两 个 质子 和 两 个 中 子 组 成 的 所 原子 核 . 它 们 从 核 中 以 每 秒 2x 104 公 里 的 速度 放射 出 来 ， 其 能 量 一 般 是 几 个 兆 电 子 伏特 〈 一 个 电子 伏特 是 一 个 电子 在 1 伏特 的 电位 差 中 加 速 通过 时 所 获得 的 能 量 ， 等 于 1.6 x 10-? 焦耳 ) 。 由 于 -wx- 粒 子 在 很 短 的 路 程 上 就 能 把 大 量 的 能 量 用 于 电离 ,所 以 当 进 入 生物 体 中 时 , 对 生物 有 较 大 的 损害 。 然 而 , -射线 对 生物 的 外 照射 效应 非常 小 , 用 一 层 纸 就 能 挡住 & 粒子 。 在 生物 化 学 实验 工作 中 不 常 遇 到 w- 误 变 的 同位 素 。 2，p- 射 线 的 性 质 : 原子 核发 生 8- 误 变 时 , 一 个 中 子 通过 发 射 一 个 带 负电 背 的 | 粒子 而 转变 为 一 个 质子 。 结 果 核 失去 了 一 个 中 子 得 到 一 个 质子 ,其 « 73 e — 原子 序数 增加 1, 质量 数 保持 不 变 。 如 在 生物 化 学 中 和 党 使 用 的 “C 的 - 误 变 可 表示 为 站 CC 一 7 NT+A-。p- 射 线 是 电子 流 、 速 度 为 每 _ 秒 2x10* 公 里 ， 接 近 于 光速 。B- 射 线 的 电离 作用 比 & 粒 子 小 ,但 Ey BRE DHL -射线 大 许多 倍 。 | 各 种 放射 性 元 素 所 放出 的 有 粒子 的 能 量 不 同 ， 能 量 最 小 的 是 了 fil GHD 的 及 粒子, 它 的 能 量 是 0.018 兆 电子 伏特 。 强 P 的 站 射 性 较 强 。 它 的 有 粒子 的 能 量 是 1.71 兆 电子 伏特 。 “外 的 8- 射 线 在 空气 中 的 射程 不 到 0.5 厘米 ， 在 组 织 中 的 射程 更 小 , 只 有 6 微米 。 一 般 来 讲 B- 射 线 可 以 用 工 厘 米 厚 的 有 机 臻 玉 屏 挡住 , 所 以 8- 射 线 的 外 照射 问题 不 太 大 。 但 是 , 在 任何 情况 下 都 不 能 忽视 这 种 防护 , 因为 A- 射 线 有 可 能 在 机 体 的 表面 上 被 完全 中 收 和 而 引起 很 大 的 破坏 作用 。 3，7? -射线 的 性 质 . 》- 射 线 是 一 种 光子 流 , 以 光速 (在 真空 中 每 秒 3x 105 公 里 ) 运 动 , 其 能 量 大 约 在 几 十 万 电子 伏特 以 上 。 光 子 不 带电 荷 所 以 7- 射 ， 线 不 能 直接 使 遇 到 的 物质 电离 。y- 误 变 本 身 并 不 引起 原子 序数 或 质量 的 变化 。 但 它 经 常 同时 伴随 着 w 或 有 粒子 的 发 射 。 4 PHARM KARR), 而 振动 频率 很 大 , 穿 透 力 又 强 ， 所 以 要 用 密度 较 大 的 物质 (如 铅 ) 来 进行 防护 。 (|) 放射 性 误 变 的 规律 原子核 的 放射 性 衰变 以 放射 性 元 素 所 特有 的 固定 速度 进行 ， 始终 遵循 着 一 个 规律 ,不 受 外 界 条 件 的 影响 ; 即 单位 时 间 内 衰变 的 原子 数 与 现存 的 放射 性 原子 数 No 成 比例 。 假 如 某 一 种 放射 性 原 子 现在 有 No 个 , 那么 经 过 时 间 上 后 ， CRM ET NTRS, N 和 Nn 的 关系 如 下 式 : N=Noe7 hia? + 74 « ”起 中 ;的 时 间 单位 与 Ti 的 时 间 单位 一 致 。 是 自 状 常数 ,为 2718。 村 其。 需要 的 时 间 。 它 对 于 一 定 的 放射 性 元 素 是 个 常数 ( 表 6-D 。 是 ”和 如: Co 放射 源 出 厂 时 的 放射 性 强度 为 10,000 居 里 , 则 半年 后 剩 下 的 放射 性 强度 应 按 以 下 的 方法 计算 。 已 知 No=10,000 ft, t=0.5 年 ，Ti =5.26 年 代入 公式 后 全 二 10000e-(0.693/5.26)x0-5 Cal 一 10000e-0'06598 E = 10000 x 0.9363 = 9363 (iG A) . De See ees ese em gee dave deo 衰 期 。 ; 表 6-1 生物 化 学 研究 中 使 用 的 一 些 同位 素 4 4 同 位 素 射线 “HM, a sH B- 12. 2646 3 eee B- 573048 3 “ 2p B-,y 14.30% | 36S er 87.90K = eK B-,Y 12.40 小 时 Co B-,Y 5. 2646 45Ca B- 165K 59Fe B-,y 45K es. B-.Yv 8.05% 氮 和 和 氧 的 放射 性 同位 素 的 半衰期 太 短 《8O 的 半衰期 是 2.03 分 , 3N 的 半衰期 是 10.00 分 ), 在 研究 工作 中 不 便 使 用 ， 故 未 列 在 ， 表 中 。 通 常 使 用 这 两 种 元 素 的 稳定 性 同位 素 3SN 和 180。 0。 半 之 期 是 放射 性 元 素 的 原子 核 因 嘉 变 而 减少 到 原来 的 一 半 所 % (OQ) 放射 性 强度 的 单位 : 放射 性 强度 的 基本 单位 是 居 里 。 每 秒 放射 37x108 粒 子 的 ， 任何 同位 素 的 量 为 1 居 里 。 在 生物 学 中 ,通常 使 用 毫 居 里 \ 微 居 ， 里 、 毫 微 居 里 这 些 更 小 的 单位 。 必 须 注意 , 居 里 指 的 是 样品 中 直 正 ” Be He WSEAS Be 〈 即 误 变 / 秒 )， 而 不 是 用 探测 器 所 探测 到 的 衰变 数 ( 即 计数 / 秒 )。 在 实际 应 用 中 后 者 也 可 当做 放射 性 强度 的 单位 。 1 居 里 (c) ——3.7 x 10" pe RR REAE |B 1 毫 居 里 (mc) —3.7 x 107 次 核 衰变 / 秒 1 (UB HL (uc) ——3.7 x 104 次 核 衰变 /种 1 0% (nc) 一 一 3.7X10 次 核 衰变 / 秒 使 用 任何 一 种 放射 性 探测 仪 必须 从 误 变 数 中 减 去 “本 底 ?。“ 本 底 ? 是 宇宙 线 、 仪器 本 身 放 射 性 (如 污染 ) 和 电子 线路 噪声 等 所 造成 _ 误 变 数 的 总 和 。 - 在 进行 具有 放射 性 同位 素 的 实验 中 常 加 入 该 种 元 素 的 稳定 性 是 同位 素 作为 载体 。 故 应 使 用 放射 性 比 强度 来 表示 放射 性 强度 。 放 射 性 比 强度 通常 指 单位 质量 ( 克 ) 或 体积 (毫升 ) 内 的 放射 性 误 变 数 (或 计数 ) 。 ar 单位 时 间 内 的 误 变 数 (或 计数 ) 比 放射 性 一 样品 的 重量 (或 体积 ) 二 、 射 线 的 探测 射线 通过 物质 时 与 物质 发 生 相 互 作用 而 产生 一 些 特殊 的 效应 (如 电离 )， 探 测 射线 产生 这 些 特 殊 效 应 的 能 力 的 仪器 叫做 射线 探 测 器 。 射 线 探测 器 的 种 类 很 多 ， 在 生物 学 研究 中 常用 的 有 如 下 两 种 : «76 9 Tea ee PO Re Ye te OP ae ed ee 。 (一 ) 盖 革 计数 器 盖 革 计数 器 适用 于 测量 ”P、"I、”"C1 等 高 能 及 粒子 的 放射 性 ，，， 盖 革 计 数 器 包括 三 个 部 分 : 盖 革 管 .高压 电路 及 机 械 记录 器 。 。 常见 的 盖 革 计 数 管 有 圆柱 形 计数 管 及 钟 畦 形 计数 管 两 种 ， 它 们 的 上 结构 基本 相同 。 即 在 密闭 外 壳 内 安置 两 个 电极 ; 中 央 的 细 钨 丝 为 阳极 ， 管 内 壁 的 金属 圆 简 为 阴极 。 抽 去 管内 空气 后 放 进 一 些 惰性 ， 气体 ( 氨 、 氛 、 氨 等 ) 和 少量 猴 灭 气体 (乙醇 甲烷 等 )。 ”用 盖 革 管 探测 射线 的 基本 原理 如 图 6-1 十 高 压 低压 阴极 ea 定 标 器 输出 管 或 计数 仪 图 6-1 G-M 管 探测 大 方块 图 ， 。。 当 射 线 进 人 管内 冲击 惨 性 气体 并 使 之 电离 时 ， 两 极 间 产生 电 «Ae, 射线 能 变 成 电能 , 并 以 脉冲 的 形式 , 转 入 定 标 器 。 液体 闪烁 测量 方法 是 近 二 十 年 出 现 的 -种 测量 放射 性 的 新 技 A, 它 适用 于 测量 "HAC、ssS 等 低能 B 放射 性 强度 ， 在 生物 化 学 、 放射 医学 有 机 化 学 和 生物 物理 学 等 方面 都 得 到 广泛 的 应 用 。 此 法 。 具有 灵敏 度 高 , 测量 时 间 短 ,便于 重复 测量 等 优点 。 r ’ 本 =) wasnt 司 9 77 ，。 液体 闪烁 测量 的 基本 原理 是 ; 闪烁 液 能 吸收 辐射 能 量 , 并 且 再 以 光 能 的 形式 发 射出 来 ”产生 贡 光 。 荧 光 光 子 经 过 一 汽 的 光 收 集 系统 , 打 在 光电 倍增 管 的 光阴 极 上 转换 为 电 脉冲 , 最 后 为 定 标 器 记 录 。 最 简单 的 液体 闪烁 计数 器 是 单 管 液体 闪烁 计数 器 ， 它 由 光电 倍增 管 .前 置 放 大 器 主 放 大 器 ; 脉冲 高 度 标 别 器 和 定 标 器 组 成 。 液体 闪烁 计数 器 的 基本 结构 如 图 6-2。 负 高 压 射线 前 大 二 甄别 器 及 定 标 器 图 6-2 ”内 烁 计数 粥 方块 图 三 、 放 射 目 显影 术 放射 性 同位 素 发 射 的 射线 ， 能 使 照相 胶片 感光 ， 如 将 感光 胶 片 附着 于 含有 放射 性 的 标本 或 组 织 切片 上 ， 经 过 曝光 , 显影 、 定 影 等 步 又 ,在 胶片 上 相当 于 标本 或 组 织 上 含有 放射 性 的 部 位 、 就 出 现 黑色 的 颗粒 。 这 种 技术 叫做 放射 自 显影 术 。 所 得 到 的 影像 、 称 为 放射 自 显影 谱 。 利 用 放射 自 显影 术 能 在 细胞 结构 完整 的 情况 下 ， 研究 某 些 生物 大 分 子 ( 如 核酸 , 蛋白质. 脂肪 和 酶 等 ) 在 生物 合成 过 Se 程 中 的 精细 定位 。 E 这 种 测量 方法 不 需要 复杂 贵重 的 仪器 ， 又 有 其 它 方法 所 不 能 赫 代 的 实用 价值 , 是 一 种 很 有 发 展 前 途 的 研究 手段 。 es Je * 四 、 放 射 性 同位 素 法 的 优 缺 点 放射 性 同位 素 法 的 灵敏 度 非常 高 ， 最 灵敏 的 光谱 分 析 法 可 以 鉴定 10-" 克 的 物质 而 10 一 10-! 克 的 放射 性 物质 就 可 以 相当 准 © 确 地 被 测 出 。 放 射 性 同位 素 实 验 可 在 生理 条 件 下 进行 ， 如 将 代谢 物 、 药物 等 用 同位 素 标记 后 投入 生物 体内 , 可 以 不 经 过 提取 或 提纯 ， 的 手续 便 可 追踪 这 些 物 质 在 生理 条 件 下 的 代谢 转变 。 L “ 近 十 年 来 ， 由 于 同位 素 法 与 其 他 技术 相 结合 又 发 展 了 它 的 应 用 范围 。 如 “放射 免疫 法 ”， 利 用 放射 性 底 物 进行 酶 活力 的 测定 方 法 等 可 以 测定 极 微量 的 活性 物质 。 同 位 素 技 术 和 层 析 ， 电 菊 等 方 法 相 结合 也 广泛 用 于 核酸 和 和 蛋白 质 等 物质 的 分 离 和 结构 测定 。 ”同位 素 示 踪 法 简便 易 行 。 能 够 揭示 其 他 方法 目前 还 不 能 发 现 的 事实 。 生 物化 学 近年 来 在 各 个 领域 中 所 取得 的 成 就 都 与 这 种 技 | 术 的 应 用 分 不 开 。 ea : | 0 放射 性 同位 素 的 应 用 虽然 有 上 述 的 许多 优点 ， 但 在 使 用 上 也 上 存在 一 些 缺点 和 限制 。 如 目前 许多 放射 性 物质 还 不 易 得 到 ， 也 比 — 较 昂 贵 。 放 射 性 同位 素 的 最 大 缺点 是 有 损伤 性 。 在 使 用 放射 性 同 上 位 素 时 ， 必 须 防止 射线 对 于 人 体 的 伤害 。 因 此 工作 人 员 应 具有 一 。 定 的 防护 知识 和 熟练 的 操作 技能 。 要 严格 防止 放射 性 物质 由 呼吸 | 道 ， 口 腔 及 皮肤 各 渠道 进入 体内 。 应 尽量 减少 身体 接受 外 照射 的 剂量 (可 从 使 用 屏障 物 , 进行 远 距离 操作 或 缩短 操作 时 间 等 采取 多 方面 措施 ), 同时 要 避免 污染 工作 环境 。 te pate > TE Same EH Warburg 氏 呼吸 计 测 压 法 基本 原理 在 温度 固定 和 体积 不 变 的 条 件 下 反应 系统 中 某 气体 量 的 变化 可 以 从 其 所 表现 的 压力 的 变化 测量 出 来 。Warburg 氏 呼 吸 计 就 是 根据 这 个 熟知 的 气体 定律 设计 出 来 的 。 此 法 操作 简便 ， 所 需 材 料 微 少 ， 比 较 精 确 。 常 用 来 测定 一 些 吸 收 气体 或 释放 气体 的 生物 “ 化 学 反应 。 如 琥 珀 酸 的 测定 〈 琥 珀 酸 在 琥珀 酸 氧化 酶 作用 下 吸收 氧气 产生 丁 烯 二 酸 )， 谷 氨 酸 和 丙酮 酸 的 测定 ( 谷 氨 酸 和 两 酮 酸 在 相应 的 脱羧 酶 的 作用 下 产生 二 氧化 碳 ), 组 织 或 细胞 的 呼吸 《吸收 氧气 放出 二 氧化 碳 ) 等 。 二 、 仪 并 的 构造 Warburg 氏 呼吸 计 有 恒温 水 槽 和 压力 计 . (及 反应 瓶 ) 两 部 分 (Al 7-1). fe im. 7k #4 Hp He AP A, IE 温度 变化 不 超过 + 0.05°C, 7k AY Py tu Ze 38 A Hs tre, JAG 达 带 动 , 可 以 往复 播 摆 。 压力 计 由 反应 瓶 下 、 反 应 瓶 WS, 压力 计 M, 三 通 活 塞 工 及 7-1 压力 计 结构 « 80 «¢ pike enim. 反应 瓶 以 麻 口 与 压力 计 相 接 ， 它 的 底部 有 ”一 个 中 央 小 杯 , 压力 计 为 粗细 均匀 的 U 形 毛 细 玻 璃 管 , 二 辟 具 有 同 。 冬 的 刻度 (由 下 而 上 ， 刻 度 由 0 到 300 毫米 )。 其 中 一 臂 与 大 气相 。 通称 为 开车, 另 一 臂 通 过 支管 连接 反应 瓶 , 其 上 端 具有 一 个 三 通 活 。 塞 T。 当 三 通 活塞 关闭 时 , 这 一 璧 不 与 外 界 相通 ， 因 此 称 为 闭 臂 。 | 在 U 形 管 底部 了 处 连接 一 段 乳 胶管 , 管 的 下 口 用 玻璃 棒 塞 住 , 管内 Fei Brodie YAIR 〈 此 溶液 比重 为 1.033， 配 制 方法 见 实验 三 十 A), 利用 压 在 乳胶 管 上 的 带 螺旋 的 板 , 可 调节 压力 计 内 液 柱 高 低 。 三、 仪器 使 用 的 理论 和 操作 要 点 (一 ) 操作 要 点 和 计算 方法 Warburg 氏 呼 吸 计 常 被 用 来 测定 一 个 反应 中 氧 气 的 吸收 量 。 。 此 时 在 反应 瓶 中 所 装 物质 的 反应 是 吸收 氧气 的 ， 如 在 反应 前 使 闫 。 内 充满 氧气 (有 时 亦 可 以 使 用 空气 )， 氧 气 的 吸收 量 就 可 以 从 反应 瓶 中 气体 压力 的 减少 计算 出 来 。 如 果 在 反应 过 程 中 同时 有 二 氧化 夸 产 生 , 就 在 反应 瓶 中 央 小 杯 中 放 人 少量 浓 氨 氧化 钾 将 它 吸收 。 测 ， 定时 先 将 反应 瓶 上 活塞 和 与 压力 计 连 通 的 部 位 严密 封 闲 ， 然 后 将 整个 压力 计 浸 在 预先 调 好 温度 的 恒温 水 槽 中 并 使 其 与 水 槽 中 温度 达到 平衡 。 反 应 开始 时 调节 压力 计 U 形 管 闭 臂 的 液 面 使 达到 零点 ( 测 气体 的 吸收 时 ， 零 点 一 般 定 在 250 毫米 或 150 毫米 处 ) 。 记 录 开辟 处 液 面 的 高 度 , 然后 再 关闭 三 通 活塞 , 使 压力 计 往复 摆动 。 以 后 每 次 读数 时 都 要 先 将 闭 璧 液 面 升 到 零点 , 再 记录 开辟 的 读数 。 反 | 应 终了 时 开辟 液 面 总 的 降低 量 就 代表 反应 时 间 内 氧气 被 吸收 的 总 ” 量 (详细 操作 步 又 见 实验 三 十 六 )。 设 气 体 消耗 量 为 ,反应 后 压力 计 上 读 出 的 压力 变化 为 及 , 则 wh = oe 74 5 8] « a= Kh, KER PR Bl. V2 +098 Pp. 式 中 三 反应 瓶 中 气体 体积 7 反应 瓶 中 小 体 体积 a%= 被 吸收 气体 在 温度 工 及 一 个 大 气压 时 的 溶解 度 、 2=760x13.60/ 压 力 计 中 液体 的 比重 若 在 30"C, LA Brodie 溶液 作 压 力 计 中 溶液 以 测定 氧 的 吸收 , 则 13.6 33 = 10,000 毫米 T =273+30=303°C oj= 0.0261 (30°C I-A TE He of SARE) 了 一 反 应 时 加 入 反应 瓶 中 液体 的 体积 也 = 反应 瓶 体积 一 反应 瓶 内 液体 体积 (有 Po. T.do,.V 5 均 为 常数 , 反应 瓶 体积 可 以 预先 测定 《每 一 支 压 P,=760~x itty REA BBA) MB LETRA RPE K, WK Abe 4B tt h By 以 推算 出 气体 的 吸收 量 zx 。 (=) 温 压 计 压力 计 中 压力 的 改变 还 受 室 内 大 气压 力 和 水 槽 温度 变化 的 影 响 , 所 以 实验 时 必须 同时 用 一 支 压 力 计 校正 温度 和 压力 的 变化 , 其 反应 瓶 内 加 入 与 反应 液 相等 体积 的 水 或 缓冲 液 。 这 支 压力 计 叫 做 温 压 计 。 反 应 后 温 压 计 液 柱 面 上 升 即 表 示 在 反应 过 程 中 大 气压 力 下 降 或 水 覃 温 度 升 高 。 如 果 测 定 氧 的 吸收 ， 在 有 样品 的 压力 计 中 Pe EL Bee, 则 观察 数值 比 实际 数值 下 降 的 要 小 , 所 以 应 该 将 温 压 计 © 82 6 - a Se - Set. fe. ee ee ie ee ~ » + + a> .! m4 ia Key we Ries ., ie AB 6 aS at ” \f hos s + . 与 大 oe Pe ee ar HLTH RR GA Bee Le oh Ws (FA 7-2). ~ i = 249 250 250 220 开始 时 10774 ss, 7 IZ BHR 250 250 sai 950 x 开始 时 10 分 钟 后 温 压 计 图 7-2， 反 应 瓶 和 温 压 计 上 的 压力 改变 ©) 反应 瓶 体积 的 测定 反应 瓶 体积 测定 一 般 采用 较 精确 的 汞 称 重 法 AAT SY ILS ES ee 仪器 洗涤 : 测 体积 时 , RE HE AUR RL EMI ”压力 计 U 形 玻璃 管 下 口 连 一 小 段 橡皮 管 ， 然 后 将 压力 计 开 臂 上 端 «SARA. 打开 活塞 , 将 压力 计 磨 口 接头 浸入 钞 酸 洗 液 中 , 用 水 。 丢 将 洗 液 抽 入 压力 计 中 ， 浸 泡 过 夜 后 用 水 冲 净 。 再 依次 抽 入 燕 包 4 e 83 。 水 .乙醇 和 乙醚 。 在 磨 口 接头 处 放 一 小 块 棉花 , 然后 抽 人 入 空气， 用 气流 将 压力 计 吹 干 。 用 软 纸 或 棉花 芒 些 煤油 控 去 反应 瓶 口 及 侧 蔷 玻璃 塞 等 处 的 油脂 后 ， 放 入 铭 酸 洗 液 中 浸泡 过 夜 。 然 后 依次 用 自 来 水 ,蒸馏 水 冲 净 。 在 60°C 干燥 箱 内 干燥 。 2， 冬 的 清洁 : 将 干净 的 橡皮 管 一 端 连接 小 漏斗 ; 另 一 端 连 接 一 小 段 毛 细 玻 璃 管 (可 用 破损 的 温度 计 )， 使 汞 从 漏斗 中 通过 毛细 管 逐 滴 滴 入 30% 硝酸 溶液 中 。 然 后 将 硝酸 倾 出 , FA kK BERR Be 洗 液 不 再 显 酸性 为 止 。 用 滤纸 吸 去 汞 表面 的 水 份 ， 再 用 干 涯 纸 过 滤 , 过 滤 时 需 将 小 纸 底部 用 针 刺 一 小 孔 。 3， 反 应 瓶 体积 测定 在 反应 瓶 内 装 满 纯净 的 汞 ， 用 头 部 弯曲 的 小 玻璃 棒 赶 去 附 在 反应 瓶 内 壁 的 气泡 。 把 装 有 冬 的 反应 瓶 接 上 压力 计 , 调整 汞 量 , 使 示 达 到 压力 计 磨 口 接 头 上 高 约 一 厘米 处 , 在 冬 柱 液 面 处 画 一 记号 ， 用 毛笔 刷 去 反应 瓶 外 部 附着 的 汞 , 取 下 压力 计 , 立即 将 温度 计 插入 BORO MURR TRE. PERSE ER, Sm HAL PA FAC (9 Hk HE HE: LIE. 取 一 段 橡皮 管 ， 一 端 连 接 漏斗 , S3— EE PL, 从 漏斗 中 倒 入 汞 ， 用 手 自 下 而 上 捏 橡皮 管 以 除去 冬 中 的 气泡 。 打 开 压力 计 活 塞 , 让 汞 流入 压力 计 中 , 调节 压力 计 的 倾斜 度 ， 使 汞 的 一 端 达到 零点 (250 毫米 或 150 毫米 处 )， 另 一 端 达 到 磨 口 接头 上 高 约 一 厘米 所 画 记 号 处 (图 7-3) 。 关 闭 活塞 ， 倾 斜 压力 计 使 其 中 图 7-3 反应 瓶 体积 的 测定 8 了 « SAR AU 形 管 下 口 流 至 已 知 重量 的 称 量 瓶 中 。 合 并 反应 瓶 内 HOR, 称 重 。 如 此 重复 3 次 , 取 平 均值 。 从 表 7-1 中 该 温度 时 冬 的 密度 计算 体积 。 平 行 测定 的 误差 不 应 超过 0.1%. ，。。 秒 是 毒品 ， 凡 涉及 和 汞 的 操作 均 应 放 在 大 磁盘 中 进行 以 避免 和 二 落 在 桌 上 或 地 上 。 如 果 不 慎 将 秒 落 在 地 上 无 法 收集 时 , 可 撤 一 些 硫 视 粉 在 汞 上 。 压 力 计 的 刀 形 管 和 支管 部 分 均 易 折断 或 碰 碎 ， 操 作 “时 应 十 分 讶 慎 。 一 表 7-1 计算 反应 瓶 常数 所 用 的 数据 ia BECO) 25 30 | 35 | 37 | 40 ‘ | ey Re 13.5462 = 13.5340 | 13.5217 13.5095 | 13.5046 13.4973 0.0310 | 0.0283 | 0.0261 | 0.0244 | 0.0239 | 0.0231 SF mh ct 的 二 氧化 碳 的 测定 可 以 同时 用 两 套 压 力 计 , 在 一 个 反应 瓶 中 加 浓 碱 溶 洲 , 另 一 个 瓶 中 不 放 浓 碱 ， 从 二 个 压 力 计 读数 的 差 就 可 以 计算 出 呼吸 过 程 中 二 氧化 碳 的 放出 量 。 其 细 节 可 参考 有 关 书 籍 。 & aco, a 0.878 | 0.759 | 0.665 | 0.592 | 0.567 | 0.530 | . a @ i ; 3 第 八 章 ”实验 样品 的 制备 在 基础 生化 实验 中 最 常用 的 实验 样品 是 组 织 样品 ， 血 样品 或 尿 样品 。 组 织 样品 常 采用 动物 的 肝 、 肾 、 胰 或 肌肉 组 织 ; 植物 的 叶 、 SUE; 微生物 中 的 酵母 或 培养 的 微生物 , 如 大 肠 杆菌 等 。 人 或 动物 的 血样 品 常 采用 全 血 、 血 浆 ,血清 或 血 滤液 。 现 将 这 些 样品 的 制备 方法 摘要 介绍 如 下 : —. RB 如 生物 组 织 离 体 过 久 ， 其 所 含 物质 的 含量 和 生物 活性 都 将 发 生变 化 。 因 此 , 当 利用 离 体 组 织 作为 提取 材料 或 代谢 研究 材料 时 应 在 冰冷 条 件 下 尽快 处 理 。 一 般 采 用 断 头 法 杀 死 动物 ， 立 即 取出 胜 器 或 组 织 ， 除 去 外 层 脂肪 及 结缔 组 织 并 用 冰冷 的 生理 盐水 洗 去 血液 后 , 再 用 滤纸 吸 干 。 迅 速 称 重 后 ， 根 据 实 验 的 不 同 要 求 , RU 下 方法 制 成 实验 样品 。 1. 组 织 糜 ” 将 动物 组 织 用 剪刀 或 绞 肉 机 迅速 前 成 糜 状 。 2. 组 织 匀 浆 ， 向 剪 碎 的 动物 组 织 中 加 入 适量 冰冷 的 匀 浆 制 备 液 ， 用 高 速 电动 匀 浆 器 或 玻璃 勾 浆 器 制 成 匀 浆 。 常 用 的 玻璃 匀 浆 器 有 5 毫升 和 10 毫升 两 种 , 由 一 个 磨砂 玻璃 套 管 和 一 个 带 有 磨 砂 玻璃 杆 头 的 杆 组 成 。 玻 璃 杆 的 外 壁 必 须 紧 舍 玻 BABE EN ABE. 用 时 , 将 套 管 放 入 冰 浴 中 ， 将 玻璃 杆 与 调 速 马达 连接 , 待 将 剪 碎 的 “ 组 织 悬 浮 于 匀 浆 制备 液 中 并 倾 入 套 管 中 后 , 把 杆 再 插 人 套 管 中 。 开 动 马达 并 调节 村 的 转速 。 用 手 扶 住 套 管 口 部 , 不 断 上 下 移动 ( 肝 组 织 约 8 一 15 次 ), 直至 组 织 碎 块 磨 成 匀 浆 为 止 ( 见 图 8-D。 © 86 ¢ 图 8-1 组 织 匀 浆 制 备 匀 浆 制备 液 通常 用 生理 盐 水 、0.25 摩尔 / 升 芒 糖 或 适当 的 组 3. 组 织 浸出 液 “组织 匀 浆 离 心 后 所 得 的 上 清 液 即 组 织 温 植物 的 新 鲜 组 织 常 在 称 重 后 置 于 研 钵 中 ， 再 加 少量 的 介质 和 清洁 的 细 砂 研 麻 成 匀 浆 ， 最 后 稀释 到 需要 的 浓度 。 测 定植 物种 子 - 中 不 易 变化 的 成 分 时 , 常用 烘 干 的 粉末 作为 样品 。 了 oa EN x =, fm KR ih 收集 动物 或 人 的 血液 时 应 使 用 干燥 的 器 严 , 以 防止 溶血 。 1. 全 血 : 取出 血液 后 , 迅速 盛 于 含有 抗 凝 剂 的 于 燥 试 管内 混 . 匀 ( 注 意 避 免 激烈 振荡 ), 即 得 全 血 。 常用 的 抗 凝 剂 有 草酸 盐 、 柠 檬 酸 盐 , 氟 化 钠 ,. 肝 素 等 , 根据 实验 的 要 求 而 定 ， 一 般 情 况 下 使 用 廉价 的 草酸 盐 。 抗 凝 剂 的 使 用 量 不 宜 过 多 ， 通 常 每 毫升 血液 加 1 一 2 毫克 草酸 盐 ，5 SR MER 一 10 毫克 所 化 钠 或 0.01 一 0.2 毫克 肝素 。 可 将 抗 凝 剂 配 成 适当 浓 度 的 水 溶液 ， 然 后 取 0.5 毫升 放 在 收集 血 的 小 试 FE IE BEE TF (用 肝素 为 抗 凝 剂 时, 燕 干 温度 不 应 超过 CO AH 2. 血浆， 全 备 离心 后 的 上 清 液 即 为 血浆 。 3. 血清 “不 加 抗 凝 剂 的 血液 在 室温 下 自行 凝固 后 约 需 3 小 时 可 分 离 出 血清 ， 也 可 离心 分 离 以 缩短 时 间 。 应 及 早 分 离 血 清 以 避免 溶血 。 4. 无 蛋白 血 滤液 “分 析 血 液 中 某 些 成 分 时 , 要 避免 蛋白 质 的 Fit, 故 需 预 先 除去 血 中 的 蛋白 质 成 分 , 制 成 无 蛋白 滤液 。 可 以 根 据 实验 的 特殊 要 求 选用 不 同 的 蛋白 沉降 剂 。 常 用 的 蛋白 沉降 剂 有 MR, = ACM MARIE. | 三 、 尿 液 样品 一 般 定性 实验 使 用 随时 收集 的 尿 液 样 品 ， 但 一 天 之 中 各 次 排 “ 出 的 尿 滚 成 分 因 饮 食 状况 和 生理 条 件 的 不 同 有 很 大 的 差异 。 因 此 ， 定量 测定 尿 液 中 各 种 成 分 时 应 收集 24 小 时 的 尿 液 ， 混 合 后 再 取 ” 样 。 人 通常 在 早晨 一 定 的 时 间 排 尿 ， 弃 去 尿 液 。 将 以 后 每 次 排出 « 88 « 本 4 ~ ~ ‘mRNA Ee 包括 第 二 天 早晨 同一 时 间 排 出 的 尿 液 . 把 收 ， 集 的 24 小 时 尿 液 刘 分 混合 后 测量 其 总 体积 , 然后 取样 分 析 。 收 集 een 最 好 立即 进行 实验 。 也 可 在 收集 尿 的 瓶 a etal lili ta 酸 。 收 集 实验 动物 的 尿 液 时 , 可 将 动物 放 在 代谢 笼 中 , RL 站 洁 通 过 笔下 的 漏斗 收集 动物 24 小 时 的 尿 液 。 « 89 « 人 tae We aan 第 二 篇 “学 入 em 本 书 采 用 国际 单位 (SD 制 。 摩 尔 浓 度 用 摩尔 / 升 ( 相 当 于 也 ) 表示 ; 当量 浓度 用 当量 / 升 (相当 于 N) 表 示 ( 参 见 第 一 章 ) 。 在 每 个 学 生 实验 的 试剂 和 材料 一 项 中 都 列 出 了 每 20 个 学 生 (一 般 1 人 1 组 ) 所 需 用 的 量 。 我 们 在 估计 试剂 用 量 时 考虑 了 : 1， 实 验 指导 上 各 操作 步 又 需要 量 。 ‘; 2. SWS TSE AY AT AE HEB EE Ue Be ip 3， 润 洗 实验 容器 及 分 装 损失 量 。 4 4， 学 生 操作 水 平 。 5. 配制 的 方便 。 ‘a 凡 我 们 在 教学 中 采用 过 的 实验 的 试剂 用 量 已 按 历年 实际 用 量 建立 一 套 卡片 , 除 记 录 本 实验 所 需 物品 及 试剂 配制 方法 外 , 并 详细 记载 历年 药品 器 材 实际 需 用量 ， 教 学 组 织 和 效果 ， 学 生 测定 的 数 据 , 实验 中 易 出 现 的 疑问 和 蜡 常情 况 以 及 解决 办 法 , 参考 文献 等 以 积累 自己 的 教学 经 验 。 | 加 以 调整 , 可 供 参考 。 我 们 建议 各 新 校 建立 实验 档案 , 即 每 个 实验 一 te, en 是 LA a a Oe ated ee rw 了 ho = 5.2 . a. ens _ t wiih 2 Aa"t 6 ‘a . Se SARs 实验 一 ”总 气量 的 测定 ” 咒 氏 (Micro-Kjeldahl) 定 氮 法 一 、 BB: ” 学 习 山 氏 定 氛 法 的 原理 和 操作 技术 。 二、 原理: eee Tere ts 核酸 及 氨基酸 等 ) 的 含 气量 。 : int RK, i eet ae er a . a . lad oy . yy 严 ee 3. co 9 BP or 3 二 eo mT = . ' 8 > 4 ia ’ = : é 二 氧化 矶 和 水 ， 而 氨 则 转变 成 氨 ， 并 进 一 - 步 与 硫酸 作用 生成 硫酸 , Be. 此 过 程 通常 称 之 为 “消化 ”。 ”和 但 是 , 这 个 反应 进行 得 比较 缓慢 , 通常 需要 加 入 硫酸 钾 或 硫酸 。 销 以 提高 反应 液 的 沸点 , 并 加 入 硫酸 铜 作为 催化 剂 ， 以 促进 反应 的 。 进行 。 甘 氨 酸 的 消化 过 程 可 表示 如 下 : ___CH,NH,COOH + 3H,SO,—>2CO, + 3SO, + 4H,O+ NH, ; 2NH, + H,SO,—> (NH,),SO, PBR Bist PY (ET HE Be PY nc PS PR IE, US MS, 借 水 蒸汽 将 产生 FR RAR) — a, 一 定 浓 度 的 硼酸 溶液 中 , 硼酸 吸收 氨 后 使 溶液 中 氢 离 子 浓度 降低 , 然后 用 标准 无 机 酸 滴 定 , 直至 恢复 溶液 中 原来 © 气 离 子 浓度 为 止 ,最 后 根据 所 用 标准 酸 的 当量 数 ( 相 当 于 待 测 物 中 。 氨 的 当量 数 ) 计 算出 待 测 物 中 的 总 气量 。 1 =, eh: ; . ° 91 。 ss, Ar ALB 5 YR EME Ht, 其 中 的 矶 ， imcveeure | ST nae as Nil PALS eer ees ee | bare An I he ne ' 2 WA oo | vy Aptis — < DO 不 an ee 1. 100 毫升 凯 氏 烧瓶 。 2. DLE EAA BH 3. 50MI-ARI, 4. 3 毫升 微量 滴定 管 。 5. 分 析 天 平 。 6. 烘箱 。 7. 电炉 。 8. 1000 毫升 蒸 馆 烧 瓶 。 9. 小 玻璃 珠 。 四 、 试 剂 : or ee 1 化 学 纯 浓 硫酸 200 2 Ff 2. 粉 未 硫酸 钾 -硫酸 铜 混合 物 rae) 16 克 K,SO, 与 CuSO,-5H,O 以 3:1 配 比 研磨 混合 。 3. 30 狗 所 氧化 钠 溶 液 ”1000 毫升 4. 2 多 硼酸 溶液 500 毫升 5. 标准 盐酸 溶液 ( 约 0.01 当量 / 升 ) 600 毫升 6. HAART ( 田 氏 指示 剂 ) 50 毫升 由 50 毫升 0.1 多 甲 烯 蓝 乙 醇 溶液 与 200 毫升 0.1 多 甲 基 红 乙 _ 醇 溶 液 混 合 配 成 ， 贮 于 棕色 瓶 中 备用 。 这 种 指示 剂 酸性 时 为 紫红 色 , 碱 性 时 为 绿色 。 变 色 范 围 很 窗 且 灵敏 。 7. 市 售 标准 面粉 和 富强 粉 O See 五 、 操 作 方 法 : 1. 凯 氏 定 氮 仪 的 构造 和 安装 : 凯 氏 定 氨 仪 由 蒸汽 发 生 器 ， 反 应 管 及 冷凝 器 三 部 分 组 成 。 见 图 。 ® 进行 实验 时 可 让 部 分 同学 用 标准 面粉 , 部 分 同学 用 富强 粉 进行 测定 ， : © 92 9 nn i mo ’ i ’ weer ee eg eee ee ae yee 号 下 ae a ws 水 be 多 微量 凯 氏 蒸 馆 装置 蒸气 发 生 恬 包括 电炉 及 一 个 1 一 2 升 容积 的 烧瓶 〈 图 中 二 2) 。 ， 素 气 发 生 器 借 橡 皮 管 (图 中 3) 与 反应 管 相连 ， 反 应 管 上 端 有 一 个 _ 百 璃 杯 (图 中 鸭 , 样 唱和 碱 液 可 由 此 加 入 到 反应 室 ( 图 中 5) 中 , 反应 。” 室 中 心 有 二 长 玻璃 管 ， 其 上 端 通过 反应 室 外 层 ( 图 中 6) 与 蒸汽 发 生 器 相连 , 下 端 靠近 反应 室 的 底部 。 反 应 室外 层 下 端 有 一 开口 , 上 有 一 皮 管 夹 ( 见 图 中 7), 由 此 可 放出 冷凝 水 及 反应 废 液 。 反 应 产生 的 氮 可 通过 反应 室 上 端 细 管 及 冷凝 器 (图 中 8) 通 到 吸收 瓶 (图 中 9) 中 ; 反应 管 及 冷凝 器 之 间 借 磨 口 (图 中 10) 连 接 起 来 ,防止 漏 气 。 ”安装 仪器 时 , 先 将 冷凝 器 垂直 地 固定 在 铁 支 台 上 , 冷凝 器 下 端 不 要 距离 实验 台 太 近 ， 瓜 免 放 不 下 吸收 沽 。 然 后 将 反应 管 通过 磨 e 93 。， 口 连接 (图 中 10) 与 冷凝 器 相连 ， 根 据 仪器 本 身 的 角度 将 反应 管 固 定 在 另 一 铁 支 台 上 。 这 一 点 务 须 注意 ， 否 则 容易 引起 所 的 散失 及 | _ 反 应 室 上 端 弯 管 折断 。 然 后 将 蒸汽 发 生 器 放 在 电炉 上 ， 并 用 橡皮 管 把 燕 汽 发 生 器 与 反应 管 连接 起 来 ， 安 装 完毕 后 , 不 得 轻易 移动 ，， 以 免 仪 器 损坏 。 2， 样 品 处 理 : 某 一 固体 样品 中 的 含 气量 是 用 100 克 读 物质 ( 干 重 ) 中 所 含 所 的 克 数 来 表示 (多 )。 因 此 在 定 氨 前 ， 应 先 将 固体 样品 中 的 水 份 除 掉 。 一 般 样品 烘 干 的 温度 都 采用 108°C, 因为 非 游离 的 水 ,都 不 能 在 100"C 以 下 烘 干 。 在 称 量 瓶 中 称 入 一 定量 麻 细 的 样品 ， 然 后 置 于 105*C 的 烘箱 内 干燥 4 小时。 用 霸 塌 错 将 称 量 瓶 放 入 干燥 疾 内 ， 待 降 至 室 名 后 称 重 , 按 上 述 操作 继续 烘 于 样品 。 每 干燥 1 工 小 时 后 , 称 重 一 次 ， 直 到 两 次 称 量 数值 不 变 , WAT 若 样品 为 液体 (如 血清 等 ), 可 取 一 定 体积 样品 直接 消化 测定 。 精确 称 取 0.1 克 左 右 的 干燥 面粉 作为 本 实验 的 样品 。 3. 消化: 取 四 个 100 毫升 凯 氏 烧瓶 并 标号 。 各 加 1 颗 玻 璃 珠 ， 在 1 及 2 号 瓶 中 各 加 样品 0.1 克 ， 催 化 剂 200 毫克 ， 浓 硫酸 5 毫升 ,注意 加 样品 时 应 直接 送 入 瓶 底 ; 而 不 要 沾 在 瓶 口 和 瓶颈 上 。 在 3 及 4 号 瓶 中 各 加 0.1 毫升 蒸馏 水 和 与 1 及 2 号 瓶 相同 量 的 催化 FH Pee 硫酸 , 作为 对 照 , 用 以 测定 试剂 中 可 能 含有 的 微量 含 气 物质 。 每 个 瓶 口 放 一 漏斗 , 在 通风 橱 内 的 电炉 上 消化 @。 在 消化 开始 时 应 控制 火力 ， 不 要 使 液体 冲 到 瓶颈 。 待 瓶 内 水 PUREE, 硫酸 开始 分 解 并 放出 SO, 白 烟 后 , 适当 加 强 火 力 ， 继 续 消 DQ 也 可 在 “ 远 红 外 消 者 炉 " 内 进行 消化 。 es 94 « YY SE _ - hae ag : Foe ~ RUE, Ime Rk 10 ET CEREAL I, 随 加 随 摇 ) 。 冷 却 后 将 瓶 内 容 物 HA 50 毫升 的 容量 瓶 中 , 并 以 蒸馏 水 洗 烧瓶 数 次 ， 将 洗 液 并 入 量 。 瓶 。 用 水 稀释 到 刻度 , 混 匀 备用 @。 4. 2818: 1) RRR eR: ARPA BER La eR HE 饮水 .关闭 皮 管 夹 7, 将 蒸汽 发 生 器 中 的 水 烧 开 , 让 燕 汽 通过 整个 仪 RR, 7 15 分 钟 后 ,在 冷凝 器 下 端 放 一 个 盛 有 5 毫升 2 多 硼酸 溶液 和 1 一 2 滴 指 示 剂 混合 液 的 锥 形 瓶 。 位 置 倾斜 如 图 , 冷凝 器 下 端 应 | 完全 浸没 在 液体 中 , 继续 蒸汽 洗涤 1 一 2 分 钟 ， 观 察 锥 形 瓶 内 的 溶 ， 法 是 否 变色 ， 如 不 变色 则 证 明 燕 馏 装置 内 部 已 洗涤 干 淘 。 向 下 移 ， 动 锥 形 瓶 ， 使 硼酸 液 面 离开 冷凝 管 口 约 1 厘米 ， 继 续 通 蒸汽 工分 SRA UE, 压力 减低 ， 反 应 室内 凝结 的 水 可 自动 吸出 进入 6， 。 打开 皮 夹 7, 将 废水 排出 。 2) FRR HL 50 毫升 锥 形 瓶 数 个 , 各 加 5 毫升 硼酸 和 1 一 2 i 指示 剂 , 溶液 呈 紫 色 , 用 表面 严复 盖 备 用 。 是 “用 吸管 取 10 毫升 消化 液 ， 细 心地 由 车 馏 器 小 玻 杯 注入 反应 和 室 ， 塞 紧 玻 棒 玻 塞 。 将 一 个 含有 硼酸 和 指示 剂 的 锥 形 瓶 放 在 冷凝 | 器 下 , 使 冷凝 器 下 端 浸 没 在 液体 内 。 FAVELA 30 多 的 氧 氧化 钠 溶液 10 毫升 放 人 小 玻璃 杯 (图 中 国 ”4), 轻 提 棒状 玻璃 塞 使 之 流入 反应 室 (为 了 防止 冷凝 管 倒 吸 ， 液 体 中 并 非 所 有 样品 消化 液 透明 时 消化 作用 即 已 完成 。 另 外 消化 液 的 颜色 亦 常 因 样品 成 份 的 不 同 而 异 。 因 此 ， 每 测 一 新 样品 时 , 最 好 先 试验 一 下 需 多 少时 间 才 能 使 样 ， 唱 中 的 有 机 氨 全 部 变 成 无 机 气 。 以 后 即 以 此 时 间 为 标准 。 本 实验 至 消化 液 呈 透明 淡 。 绿色 时 即 消化 完全 , 约 需 2 一 3 小 时 。 QD 本 实验 可 分 两 次 完成 , 第 一 次 进行 消化 , 第 二 次 进行 蒸 馅 。 \ — ° 95 ， He 直至 消化 液 时 透明 淡 绿色 为 止 D。 消 化 完毕 ， 等 烧瓶 内 容 物 冷 ， ， 钟 。 最 后 用 水 冲洗 冷凝 管 口 , 然后 用 手 捏 紧 橡 皮 管 3， 由 于 反应 室 wet SS. Ge ee BE NERC alas. cpa tae tay 流入 反应 室 必须 缓慢 ) 。 尚 未 完全 流入 时 ， 将 玻璃 塞 盖 紧 , [ey wR 杯 中 加 入 蒸馏 水 约 5 毫升 。 再 轻 提 和 玻璃 塞 ， 使 一 半 蒸 馏 水 慢 慢 流 入 反应 室 , 一 半 留 在 玻璃 杯 中 作 水 封 。 加 热 水 蒸汽 发 生 器 , 沸腾 后 夹 紧 夹子 7 开始 蒸馏 。 此 时 锥 形 瓶 中 的 酸 溶液 由 紫色 变 成 绿色 。 自 变色 时 起 记 时 ， 燕 馏 3 一 5 分 钟 。 移 动 锥 形 瓶 , 使 硼酸 液 面 离开 冷凝 管 约 1 厘米 ， 并 用 少量 蒸馏 水 洗涤 冷凝 管 口外 面 。 继 续 蒸 馅 “ 1 分 钟 , 移 开 锥 形 瓶 ,用 表面 严复 盖 锥 形 瓶 。 蒸馏 完毕 后 ， 须 将 反应 室 洗涤 干净 。 在 小 玻璃 杯 中 倒 入 蒸 饮 水 , 待 蒸气 很 足 , 反 应 室外 壳 6 温度 很 高 时 ， 一 手轻 提 棒 状 玻璃 塞 使 冷水 流入 反应 室 ， 同 时 立即 用 另 一 只 手 捏 紧 橡 皮 管 3, 则 6 Pare 气 冷 缩 , 可 将 5 中 残 液 自动 吸出 ,再 用 蒸馏 水 自 4 倒 入 5， 重 复 上 述 操作 。 如 此 冲洗 几 次 后 , 将 7 打开 , 将 6 中 废 流 排 出。 再 继续 下 一 个 蒸馏 操作 。 待 样品 和 空白 消化 液 均 蒸馏 完毕 后 , 同时 进行 滴定 。 (3) 滴定 :全 部 蒸馏 完毕 后 , 用 标准 盐酸 溶液 滴定 各 锥 形 瓶 中 收集 的 氨 量 ， 并 酸 指示 剂 溶液 由 绿 变 淡 紫 色 为 注定 终点 。 (4) 计算 : ama Vi ee 消化 液 总 量 (毫升 。 op “测定 时 消化 液 用 量 ( 毫 开 ) 六: 标准 盐酸 溶液 当量 浓度 。 Vis 滴定 样品 用 去 的 盐酸 溶液 平均 车 升 数 。 人 Ww; 样品 重量 GE) 14; AMRF ik, 若 测 定 的 样品 含 氮 部 分 只 是 蛋白 质 , 则 ， / 样品 中 蛋白 质 含量 (多 ) = 总 氮 量 x6.25 ~ 9 96 ， ;样品 中 除 有 蛋白 质 外 , 尚 有 其 它 Ea RR, 则 需 向 样品 中 加 入 三 。 和气 乙 酸 ， 然 后 测定 未 加 三 氧 乙酸 的 样品 及 加 入 三 氧 乙酸 后 样品 上 J 清 液 中 的 含 气量 得 出 非 蛋白 氮 及 总 气量 ， 从 而 计算 出 蛋 自 气 ,再 进一步 算出 蛋白 质 含量 。 4 EN: A = BR AREA 7 蛋白 质 含量 ( 克 %) = BAR x 6.25 en 氨基 酸 的 分 离 鉴 定 一 纸 层 析 法 ， ; 目的: 通过 氨基 本 的 分 离 ， 学 习 纸 层 析 法 的 基本 原理 及 操作 方法 。 二 、 原 理 : 纸 层 析 法 是 用 沪 纸 作为 情 性 支持 物 的 分 配 层 析 法 。 层 析 溶剂 由 有 机 溶剂 和 水 组 溶剂 前 沿 。 ”物质 被 分 离 后 在 纸 层 析 图 谱 层 析 点 上 的 位 置 是 用 Pi 值 ( 比 移 ) 来 表 ， 示 的 : 原点 到 层 析 点 中 心 的 距离 3 Bees | LN EEA ET AMY Ry BM. By 值 的 大 小 与 物 | RE, HEIR A UTE A Ny A A i ESA HK AAA TE A IER +5, BH: | 1. BTL; Q FRBHAARMTMA AAW RETR. HEN BT HL, 滤纸 平衡 后 ’ BARA AE ERB DIL MAD RF. ¢ 97 e -* oo 毛细 管 ; 喷雾 器 ; 培养 四 ; ， 层 析 滤 纸 (新 华 一 号 ) 。 四 、 试 剂 : 1. 扩展 剂 : 650 毫升 是 4 份 水 也 和 的 正 丁 醇和 1 份 醋酸 的 混合 物 。 将 20 毫升 正 丁 醇和 5 毫升 冰 醋 酸 放 入 分 液 漏 斗 中 , 与 15 毫升 水 混合 , 充分 振荡 ， 静 置 后 分 层 ， 放 出 下 层 水 层 。 取 漏斗 内 的 扩展 剂 约 5 毫升 置 于 小 烧杯 中 做 平衡 溶剂 , 其 余 的 倒 入 培养 四 中 备用 。 2. 氨基 酸 溶液 :0.5 的 赖 氨 酸 、 且 氨 酸 、 妥 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、 亮 氨 酸 溶液 及 它们 的 混合 液 (各 组 份 浓度 均 为 0.5 驳 ) 各 5 毫升 3. 显 色 剂 50 一 100 2 F+ 0.1% kA B= AMIE T BAM. 五 、 操 作 方法 : 1， 将 盛 有 平衡 溶剂 的 小 烧杯 置 于 密 闵 的 野 析 缸 中 。 2， 取 层 析 滤纸 (长 22 厘米 , 宽 14 厘米 ) 一 张 。 在 纸 的 一 端 距 边缘 2 一 3 厘米 处 用 铅笔 划一 条 直线 ， 在 此 直线 上 每 间隔 2 厘米 作 一 记号 。 3. 点 样 : 用 毛细 管 将 各 氨基 酸 样品 分 别 点 在 这 六 个 位 置 上 ; 王后 再 点 一 次 。 每 点 在 纸 上 扩 散 的 直径 最 大 不 超过 3 BK, 1 2 3 和 4. 扩展 : 用 线 将 滤纸 颖 成 简 状 ， 纸 的 两 边 不 能 接触 。 将 盛 有 Hy 20 毫升 扩展 剂 的 培养 亚 迅 速 置 于 密闭 的 层 析 缸 中 , 并 将 小 纸 直 4 « d 7 So nnn » aoe ee ws eae. ee, DR. ) 待 溶剂 上 升 15—20 厘米 时 即 取 出 滤纸 , 用 铅笔 描 出 溶剂 前 aE, 自然 干燥 或 用 2 —-----—----—-4 溶剂 前 沿 OS. ES: 用 喷雾 器 均匀 喷 上 0.1 多 前 三 酮 正 丁 醇 溶液; 然后 置 。 然 箱 中 烘 烤 5 分 钟 (100"C) 或 用 热风 吹 干 即 可 显 出 各 层 析 班 点 。 6. 计算 各 种 氨基 酸 的 Ry 值 。 实验 三 ”蛋白质 的 性 质 实验 (一 ) 一 一 蛋白 质 及 氨基 酸 的 呈 色 反应 一 、 目 的 : .了 解构 成 蛋白 质 的 基本 结构 单位 及 主要 联接 方式 。 了解 蛋白 质 和 某 些 氨基 酸 的 呈 色 反应 原理 。 3 学 习 几 种 常用 的 鉴定 蛋白 质 和 氨基 酸 的 方法 。 =, BERR: (—) 双 缩 脲 反应 : 1. JR: 尿素 加 热 至 180"C 左 右 ， 生 成 双 缩 RIFF. WR « 99 » noe. SEHR IML, CORREO ONZE, PRIA OER EERE 7 RE Bik HER BE Hp AE SG Cu2+ 结 合生 成 紫红 色 化 合 物 ， 此 反应 称 为 双 缩 有 反 应 。 蛋 白质 分 子 中 有 肽 键 , 其 结构 与 双 缩 逐 相 似 , 也 能 发 生 此 反应 。 可 用 于 蛋白 质 的 定性 或 定量 测定 。 反应 式 如 下 : a NH ANHn ; C8 C—O \NH; 180° ‘NH +NH,; * NA ry C=O C 一 0 q \NH, \NH, pe : NH, je CG. CN. eee 和 Cu SNH ese \ein 证 ie [| saa 紫红 色 化 合 物 A 4 3 ; * : ” 双 缩 脲 反应 不 仅 为 含有 两 个 以 上 肽 键 的 物质 所 有 。 含 有 一 个 肽 键 和 一 个 一 CS 一 NH, —CH,—NH», —CRH—NH,, —CH,— NH —CHNH,—CH,OH s%—CHOHCH,NH, 等 基 团 的 物质 以 NH, NH, | RZ M— B(O—¢-—C=0) Syme HER NH, th PIE A NH, 与 Cu2+ 可 生成 暗 蓝 色 的 络 离子 Cu(NHs) .2*, 因此 , 一 切 蛋白 质 或 二 肽 以 上 的 多 肽 都 有 双 缩 脲 反 应 ， (8A 反应 的 物质 不 一 定 都 是 蛋白 质 或 多 肽 。 2 试剂 : (1) RE: 10% es 100 « een a ae 50 ag (3) 1% REAR FAIA ”60 毫升 (4) 2 驳 卵 清 蛋白 溶液 - 80 毫升 ， 3， 操作 方 法 : 取 少量 尿素 结晶 , 放 在 干燥 试管 中 。 用 微 火 加 热 使 尿素 熔化 。 4 熔化 的 尿素 开始 硬化 时 ， 停止 加 热 , 尿素 放出 氨 , BRM. & JB, 加 10 多 氧 氧化 钠 溶液 约 1 毫升 , 振荡 混 匀 ， 再 加 RRR RE 1, 再 振荡 。 观 察 出 现 的 粉红 颜色 。 避 免 添 加 过 量 硫酸 铜 , 否 WU, 生成 的 蓝 色 气 氧 化 铜 能 掩盖 粉红 色 。 < 疝 易 二 试管 加 卯 清 蛋 白 溶液 约 毫升 和 10% 氨 氧化 钠 溶 波 | 约 2 毫升 ， 摇 匀 , 再 加 1 多 硫酸 铜 溶液 两 滴 ， 随 加 随 播 。 WH Be «BA BL — () HER; 1 原理 : | RRMA SEPSIS AVE =F BE yD, PEA FRR — OE JB A FP PE IR ss B-ARRMR, RMFS-RRPBER MM RA BRM, 二 酮 吡 嗪 和 肽 键 上 的 亚 氨基 不 呈现 此 反应 。 因 此 ， 虽 然 蛋 白质 ”和 氨基 酸 均 有 前 三 酮 反 应 ， 但 能 与 茄 三 酮 呈 阳 性 反应 的 不 一 ， 定 就 是 蛋白 质 或 气 基 酸 。 在 定性 定量 测定 中 ， 应 严防 干扰 物 存 EAE. a 访 反 应 十 分 灵敏 ，1:1.500.000 浓度 的 氨基 酸 水 溶液 即 能 给 出 反应 , 是 一 种 常用 的 氨基 酸 定量 测定 方法 。 BSR PASS, 第 一 步 是 氨基 酸 被 氧化 形成 CO,、NHs ARE, rk ABS ALE DRI =; 第 二 步 是 所 形成 的 还 原 MSM Bk APE MT Ra ERA 反应 机 理 如 下 ; 2 101 。 oe ss Seb eS phy” Lo Ae ee ee 再 》 心 +H,N—C—COOH —~> PRS, sie i Cy € +NH, +c0,+ R-C€ NC oun © Oe 蓝 紫色 此 反应 的 适宜 pH 为 5 一 7， 同 一 .浓度 的 蛋白 质 或 氨基 酸 在 不 “ 同 pH 条件 下 的 颜色 深浅 不 同 , 酸度 过 大 时 甚至 不 显 色 。 2， 试 剂 : GeO 4 (1)- 蛋 白质 溶液 “ 100 毫升 _ : 102 . | ”2 多 卵 清 蛋白 或 新 鲜 鸡 蛋清 溶液 (蛋清 :水 =1:9)， (1) 取 2 支 试 管 分 别 加 入 蛋白 质 溶液 和 甘氨酸 溶 i 1 毫升 “再 各 加 0.5 毫升 0.1% 曹 三 酮 水 溶液 ， 混 名， 在 沸水 浴 中 加 执 i—2 分 钟 , 观察 颜色 由 粉色 变 紫 红色 再 变 蓝 。 (2) 在 一 小 块 滤纸 上 滴 上 一 滴 0.5 多 的 甘氨酸 溶 该 ， 风干 后 再 在 原 处 滴 上 一 滴 0.1 多 的 曹 三 酮 乙醇 溶液 ， 在 微 火 旁 性 干 显 色 ， 观察 紫红 色 柬 点 的 出 现 。 (三 ) 黄色 反应 : 1. 原理 :含有 共 环 结构 的 氨基 酸 , 如 栈 氨 酸 和 色 氨 酸 , 遇 硝 酸 后 , 可 被 硝化 成 黄色 物质 , 该 化 合 物 在 碱 性 溶液 中 进一步 形成 深 栓 色 的 硝 醒 酸 钠 。 反 应 式 如 下 : Ho—( 》 +HNO,—>HO— (\— o=(") | | O, 硝 基 酚 (黄色 ) I = al O 413 HH ARE A BA CHE SR) 多 数 蛋 白质 分 子 含有 带 葵 环 的 氨基 酸 , 所 以 有 黄色 反应 , BAAR 不 易 硝 化 , 需 加 入 少量 浓 硫 酸 才 有 黄色 反应 。 2. 试剂 : (1) 鸡蛋 清 溶液 100 毫升 将 新 鲜 鸡 蛋 的 蛋清 与 水 按 1: 20 混 匀 ， 然 后 用 六 层 纱布 过 滤 。 (2) 大 豆 提取 液 100 毫升 将 大 豆 浸泡 充分 吸 胀 后 研磨 成 浆 状 用 纱布 过 滤 。 TO03 。 (2) 0.5% HRA : 80 毫升 ” (3) 0.1% Bi = Rak Im 50 毫升 - (4) 0.1% B= MI- ZB AK 20 毫升 “ 3. 操作 方法 : (3) 头发 (4) 指甲 “ (5) 0.5% 亲 酚 溶液 50 毫 并 (6) 浓 硝 酸 200 毫升 〈7) 0.3% 色 氨 酸 溶液 10 毫升 (8) 0.3% 酯 氨 酸 溶液 10 毫升 ” (9) 10% 氨 氧 化 钠 溶液 100 毫升 3. 操作 方法 : - 向 7 个 试管 中 分 别 按 下 表 加 入 试剂 , 观察 各 管 出 现 的 现象 , 有 的 试管 反应 慢 可 略 放置 或 用 微 火 加 热 。 待 各 管 出 现 黄色 后 ， 于 室 温 下 逐 滴 加 入 10 匈 氨 氧 化 钠 溶 液 至 碱 性 , 观察 颜色 变化 。 管 + 1 2 3 4 | 5 6 7 材 料 | 鸡蛋 清 | 大 豆 | 指甲 | axe | 0.5% | 0.3% | 0.3% mie. | 提取 液 ny | 色 氨 酸 | RASC ( 滴 ) 4 4 | 少许 | 少许 | 4 4 4 浓 硝 酸 ( 滴 ) | 2 4 | 40 “40 4 | 4 | 4 as |.) «| he rr (PY) HRARM: 1. 原理: “£4 NH, yore (fae ¢—NH Nee NH . —_OH NH > / + geo = ia +NH CH, ee » CH CH, CH, | ) | CH, CH, CH—NH, cae COO H COOH 红色 e。 104° RUB AES MLR iy FER CER YE Uk LR AN 溶液 中 ”发 生 反 应 , PALER. Sees 5 i (2) 2NH,;+3NaBrO—N, * +3H,O+3NaBr , 精 氨 酸 是 唯一 呈正 反应 的 氨基 酸 , 反应 极为 灵敏 , 此 反应 可 用 | 于 定性 鉴定 含有 精 氨 酸 的 蛋白 质 和 定量 测定 精 氨 酸 。 2 | (1) 0.3 匈 精 氨 酸 溶液 10 毫升 (2) 蛋白 质 溶液 、 100 毫升 鸡蛋 清 :水 =1:20; 配 法 见 “ 黄 色 反 应 ”。 SR (3) 20% RA RIA 100 毫升 (4) 1% 0-320) CBP IA | 20 EF} I FE (5) 次 溴 酸 钠 溶液 10 毫升 ， ， 2 克 溴 溶 于 100 毫升 5 多 氨 氧 化 钠 溶液 中 。 置 棕色 瓶 中 , 可 在 ， 冷 蜡 处 保存 二 周 。 8. BRET BE: Tele AE Pa DP Ze INA RH, 记录 出 现 的 现象 。 | 5 5 3 | 1 aa ae ges area 3 5 | 一 | 一 | 5 | 3 | 1 -本 实验 十 分 灵敏 。a- 蔡 酚 要 过 量 。 次 省 酸 钠 、 精 氨 酸 及 蛋白 | 质 均 不 可 过 多 , 过 多 的 次 省 酸 钠 可 继续 氧化 有 色 产 物 使 颜色 消失 。 于) 乙 醛 酸 反应 ; ° 105 。 1. 原理 : 在 浓 硫 酸 存在 下 , 色 氨 酸 与 乙 醛 酸 反 应 生成 紫色 物质 反应 机 理 疝 不 清楚 ， 可 能 是 一 分 子 乙 醛 酸 与 两 分 子 色 氮 酸 脱水 缩合 形成 与 靛蓝 相似 的 物质 。 NH2 NA2 ¢ yy * “含有 色 氨 酸 的 蛋白 质 也 有 此 反应 。 2. iA: (1) 蛋白质 溶 液 100 毫升 鸡蛋 清 :水 =1:20 (2) 0.03% f ARIAM SS CAO MES (3) okBRRR© 200 2 F+ (4) 浓 硫 酸 ( 分 析 纯 ) _100 毫升 3. 操作 方法 : “ 取 3 支 试 管 。 编号。 分 别 按 上 表 加 入 蛋白 质 溶液 、 色 氨 酸 溶 液 和 水 , 然后 各 加 入 冰 醋 酸 2 毫升 。 混 匀 后 倾斜 试管, 沿 管 壁 分 别 ， D ” 冰 醋 酸 一 般 都 含有 乙 醋酸 杂质 , 故 可 用 冰 栈 酸 代替 乙 醛 酸 。 + 106° : — 缓 缓 加 入 浓 硫 酸 约 1 毫升 , 静 置 。 观 察 各 管 液 面 间 紫 色 环 的 出 现 。 。 车 不 明显 , 可 于 水 浴 中 微 热 @。 CN) BARE: ; 1. 原理; 偶 氨 化 合 物 与 酚 核 或 咪唑 环 结合 产生 有 色 物 质 。 它 与 酷 氨 酸 。 和 组 氨 酸 反应 的 产物 分 别 为 红色 和 樱桃 红色 。 偶 氮 苯 磺 酸 与 酷 氨 酸 和 组 氨 酸 反应 的 产物 如 下 : a af Vn | HOSS ( \ N=N, Ho—{_)}—cH,—cH—cooH . Hos—(_\—N= hye. NH, Ho,s—(- \—N=N—C=C—CH,—CH—COOH | ae, ioe | HN N NH, “fF | ‘ N=N—( \—soO,H ss (_)-So, & a A OE AC TE AV 2. itl: : — C) eae 8 30 毫升 (2) 0.3 多 组 氨 酸 溶液 10 毫升 (3) 0.3 匈 栈 氨 酸 溶液 10 毫升 (A) 20% 氨 氧化 钠 溶液 ， 20 毫升 (5) 重 氨 试 齐 50 毫升 溶液 A: 5 克 亚 硝酸 钠 溶 于 1000 毫升 水 中 。 溶液 B:5 JER IEA TMB IA TF 1000 毫升 水 中 ， 溶 解 后 , in QD 本 实验 极为 灵敏 ， 色 毛 酸 和 蛋白 质 的 量 不 可 过 多 。 Q 稀释 的 鸡蛋 清 效果 不 好 。 和 入 5 毫升 浓 硫 酸 。 A,、B 液 分 别 保存 在 密闭 瓶 中 , 用 时 以 等 体积 混合 。 3， 操 作 方 法 : | 7 取 3 支 试管 , 编号 。 按 下 表 所 示 顺 序 和 剂量 加 大 试剂 , 并 观察 有 色 产 物 的 形成 。 eo 0.3% | 0.3% 20 7% AAR | MAR | 鸡蛋 清 | 重 氨 试剂 | AA 现象 管 号 溶液 | 溶液 溶液 (七 ) 醋酸 铅 反应 及 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 反 应 : 1 原理: 蛋白 质 分 子 中 常 含有 半 胱 气 酸 和 胱 氨 酸 ， 含 硫 蛋 白质 在 强 碱 条 件 下 ， 可 分 解 形 成 硫化 钠 。 硫 化 钠 与 醋酸 铅 反 应 生成 黑色 的 硫 化 铅 沉淀 。 若 加 入 浓 盐 酸 , 就 生成 有 臭 味 的 硫化 氢气 体 ( 蛋 气 酸 对 强 碱 稳定 , 不 发 生 此 反应 )。 反 应 式 如 下 : R—SH 3 2NaOH—>R—OH-+ Na,S+H,0 Na,S-++Pb*?—>PbS ) +2Nat PbS + 2HCI—~> PbCl1, + H.S + 含有 一 SH fy-F Ea bcdestechiie eo 成 玫瑰 色 物 质 。 反 应 式 如 下 : [Fe(CN),NO]-:+SH- 一 >[Fe(CN) .NOSHJj-= [Fe(CNJJNOSH]-* 一 工 > [Fe(CN),NOS]-*+H,0 2. RF: « 108 + OO ae ae 0 耽误 SI ye -大 硬 Po) = ee Te > 一 Ww t 3 > - : ve es - = a Se > ‘ > el i ee : a aber oe J Sa a 关 相 们 Bea: oe. ore a) 蛋白 质 溶液 一 鸡蛋 请: 水 =1:1 (3) 10 多 氢 氧 化 钠 溶液 (4) 浓 盐 本 ”5) 0.5 多 醋酸 铅 溶液 3， 操作 方法 : (2) 0.3% ERE RIE (6) 57% WARE RIC ATA CA et ) 《7) AREAS: 用 10% RR A TOCA A 50 毫升 5 Ft 100 2Ft 100 毫升 50 Ft 5 毫升 (1) 向 试管 中 加 入 0.5 多 醋酸 铅 溶液 1 毫升 ， 再 加 10% 氧 氧 化 销 溶液 至 产生 的 沉 汪 完全 溶解 为 止 。 播 匀 。 加 入 被 水 稀释 一 倍 的 鸡蛋 清 0.4 毫升 。 混 匀 ， 小 心 加 热 ， 至 溶液 变 黑 后 ， MAREE | 数 滴 , 嗅 其 味 , 并 将 湿润 栈 酸 铅 试纸 置 于 管 口 , 观察 其 颜色 的 变化 。 (2) 将 一 消 0.3 多 半 胱 氨 酸 溶液 滴 在 白 次 盘 的 思 穴 中 ,加 10 多 “的 氢 氧 化 钠 三 滴 ， 再 滴 一 滴 5 多 亚 硝 基 铁 所 化 钠 溶液, 观察 玫瑰 红 - 颜色 的 生成 (此 颜色 不 稳定 , 很 快 消失 )。 L 实验 四 “蛋白 质 的 性 质 实验 (二 ) 一 一 蛋白 质 的 等 电 点 测定 和 沉 证 反应 一 、 蛋 白质 等 电 点 的 测定 : 1. AR: CL) TSE 9 EE fs EI (2) 学 习 测 定 蛋白 质 等 电 点 的 一 种 方法 。 2. JR: 香 晶 质 是 两 性 电解 质 。 在 蛋白 质 溶液 中 存在 下 列 平衡 : e 109 。 pH>pl pH=plI pH Bem 1.2.3, 448 pH {A Rik H 5.9, 5.3, 4.7, 3.5, sie SRR. RE 10 分 钟 语 ,再 观察 其 混 油 度 .最 混浊 的 一 管 的 pH Sn ani eo 在 测定 等 电 点 的 实验 中 , 要 求 各 种 试剂 的 浓度 和 加 入 量 相当 准确 。 e。 TIIT。 二 、 蛋 白质 的 沉淀 及 变性 : 1， 目 的 : (1) 加 深 对 蛋白 质 胶体 溶液 稳定 因素 的 认识 。 (2) 了 解 沉淀 蛋白 质 的 几 种 方法 及 其 实用 意义 。 (3) 了 解 蛋白 质变 性 与 沉淀 的 关系 。 2 原理: 在 水 溶液 中 的 蛋白 质 分 子 由 于 表面 生成 水 化 层 和 双 电 层 而 成 为 稳定 的 亲 水 胶体 颗粒 , 在 一 定 的 理化 因素 影响 下 , 蛋白 质 颗粒 可 因 失 去 电荷 和 脱水 而 沉淀。 蛋白 质 的 沉淀 反应 可 分 为 两 类 。 2 (1) 可 逆 的 沉淀 反应 : “此 时 蛋 睛 质 分 子 的 结构 尚未 发 生 显著 变化 ， 除 去 引起 沉淀 的 因素 后 , 蛋白 质 的 沉淀 仍 能 溶解 于 原来 的 溶剂 中 , 并 保持 其 天 然 性 质 而 不 变性 。 如 大 多 数 蛋白 质 的 盐 析 作用 或 在 低温 下 用 乙醇 (或 丙 ADAM EATER, RAE RM, 常 利用 此 类 反应 。 (2) 不 可 逆 沉 淀 反 应 :- 此 时 蛋白 质 分 子 内 部 结构 发 生 重大 改变 ， 蛋 白质 常 变性 而 沉 ” bi, 不 再 深 于 原来 溶剂 中 。 加 热 引 起 的 蛋白 质 沉淀 与 凝固 , 蛋白 质 与 重金 属 离子 或 某 些 有 机 酸 的 反应 都 属于 此 类 。 蛋白 质变 性 后 , 有 时 由 于 维持 溶液 稳定 的 条 件 仍然 存在 (如 电 FT) 并 不 析出 。 因 此 变性 蛋白 质 并 不 一 定 都 表现 为 沉淀 ， 而 沉淀 的 蛋白 质 也 未 必 都 已 变性 。 3， 试 剂 与 材料 : (1) 蛋白 质 溶液 500 REF} 5 多 WH HS A EE Hee TOR Be He ET AY 7k SH } (新 鲜 鸡 蛋清 :水 =1:9) (2) pH4.7 醋酸 -醋酸 钠 的 缓冲 溶液 100 毫升 e 了 JI2 。 as 3 he oon pa om ET ie +B a = > ee ee se ee + eS ¥. wes Went s a a werd 可 (3) 3% 硝酸 银 溶液 1065+ (4) 5% =ACRIAR 50 毫升 (5) 95% BE 250 毫升 (6) Fa Fn aR EAI 一 250 毫升 BRR 1000 3% (8) 0.1 当 量 / 升 盐酸 溶液 3 300 毫升 (9) 0.1 当量 / 升 气 氧 化 钠 溶液 100 毫升 (10) 0.1 当量 / 升 碳酸 钠 溶液 eet oe 11) 0.1 4k / FR 100 毫升 (12) 甲 基 红 溶液 20 毫升 (13) 2% Ae Mia 150 毫升 ‘4. 操作 方法 : (1) 蛋白 质 的 盐 析 。 TERE RAR Fe, 硫酸 钠 、 毛 化 钠 等 ) 浓 溶 液 能 析出 蛋白 质 。 盐 ”的 浓度 不 同 , 析出 的 蛋白 质 也 不 辣 。 “如 球 蛋 自 可 在 半 饱 和 硫酸 欠 溶 液 中 析出 ， 而 清 蛋白 则 在 饱和 - ”硫酸 馆 溶 液 中 才能 析出 。 由 盐 析 获得 的 蛋白 质 沉 证 ， 当 降低 其 盐 类 浓度 时 ， 又 能 再 溶 。 解 , 故 蛋白 质 的 盐 析 作用 是 可 逆 过 程 。 ”如 5 多 卵 清 蛋白 溶液 5 毫升 于 试管 中 ， 再 加 等 量 的 饱和 硫酸 。 较 溶液 ， 混 匀 后 静 置 数 分 钟 则 析出 球 蛋白 的 沉淀 。 倒 出 少量 混浊 | 沉淀 ,加 少量 水 , 是 否 溶解, 为 什么 ? 将 管内 容 物 过 滤 , 向 滤液 中 添 加 硫酸 贸 粉 未 到 不 再 溶解 为 止 , 此 时 析出 的 沉淀 为 清 蛋白 。 ”取出 部 分 清 蛋 白 ,加 少量 蒸馏 水 , 观察 沉淀 的 再 溶解 。 (2) 重金 属 离子 沉淀 蛋白 质 : 重金 属 离子 与 蛋白 质 结合 成 不 溶 于 水 的 复合 物 。 — 取 一 支 试 管 , 加 入 蛋白 质 溶液 2 Str, 再 加 3% 硝酸 银 溶液 1 3 e []3« -一 2 滴 , 振 震 试管 , 有 沉淀 发 生 。 放 置 片 刻 ; 倾 出 上 清 液 ,向 沉淀 中 加 入 少量 的 水 , 沉淀 是 否 溶 解 ? 为 什么 ? (3) 某 些 有 机 酸 沉淀 蛋白 质 : 取 一 支 试管 , 加 入 蛋白 质 溶液 2 毫升 , MA 1 SHS HA 乙酸 溶液 , 振荡 试管 , 观察 沉淀 的 生成 。 放 置 片刻 , 倾 出 上 清 液 ,向 沉淀 中 加 入 少量 水 , 观察 沉淀 是 否 溶解 。 (4) 有 机 溶剂 沉淀 蛋白 质 。 、 取 -_ 支 试管 :加 入 2 RIVE AMMEN, FMA 2H 95% Z RE. HA), 观察 沉淀 的 生成 。 (5) 乙醇 引起 的 变性 与 沉淀 。 取 3 支 试管 , 编号 。 依 下 表 顺 序 加 入 试剂 : 试剂 5% ise A 管 号 二 溶液 溶液 振 播 混 匀 后 ， 观 察 各 管 有 何 变化 。 放 置 片刻 。 向 各 管内 加 水 “ ”8 毫升， 然后 在 第 2、3 号 管 中 各 加 一 滴 甲 基 红 ， 再 分 别 用 01 当量 / 升 醋酸 溶液 及 0.1 当量 / 升 碳酸 钠 溶液 中 和 之 。 观 察 各 管 颜 ， 色 的 变化 和 沉淀 的 生成 。 每 管 再 加 0.1 当量 / 升 盐酸 溶液 数 滴 , 观 察 沉淀 的 再 溶解 ,解释 各 管 发 生 的 全 部 现象 。 三 、 尿 蛋白 定性 检验 : 1. AW; 了 解 蛋白 质 沉淀 反应 及 变性 的 实践 意义 ， 掌 担 临床 常规 定性 检验 尿 蛋白 的 方法 。 。 114+ 2. ABE: ye . | REA DR OH IR, 不 能 用 临床 常规 方法 测定 出 来 。 。 用 临床 常规 方法 能 检查 出 蛋白 质 的 尿 叫做 蛋白 尿 。 患 肾 委 脏 病 的 人 BE DRER, GRR) 往往 有 蛋白 尿 , 因而 尿 中 和 蛋白质 的 检 。 查 在 临床 上 具有 重要 的 诊 上 断 意义 。 8 试剂 : (1) 2% 醋酸 溶液 BOREFh (2) 20% 磺 酸 水 杨 酸 溶液 50 毫升 (3) pH 蛋白 试纸 _ 4。 操作 方法 : (1D 加 热 醋酸 法 : 。 。 尿 中 的 蛋白 质 加 热 变性 后 溶解 度 降 低 , 因此 可 以 被 沉淀 出 来 ， 。 加 入 醋酸 使 尿 液 呈 弱酸 性 后 , 蛋白 质 仍 不 易 溶解 , 但 因 加 热 引起 的 ”磷酸 盐 混浊 则 在 加 入 醋酸 后 消失 , 故 二 者 可 以 区 别 。 RIS 毫升 置 于 试管 中 ， 加 热 至 沸腾 《试管 应 在 火焰 上 移 Bh, 严防 尿 液 喷 出 )。 观察 有 无 沉淀 产生 。 若 产生 沉淀 , 则 加 入 2% RRM AH, 然后 观察 沉 汪 情 况 。 按 下 表 记 录 结 果 。 观 察 eB HR 记录 附 号 | © Reb ERATE ”有 混浊 或 混浊 在 加 入 醋酸 后 消失 | _ 极 轻微 混 池 , 对 着 黑 背 影 才 看 到 | 内 | 0.01 驳 以 上 | 混浊 明显 , 但 尚 无 颗粒 状 或 架 状 物产 生 | Si | 0.01—0.05% | 颗粒 状 自 色 混 池 , 但 尚 无 架 状 物产 生 =| +4 | 0.05—0.2% 混浊 浓厚 , WHE i HAR | oe A | 0.2—0.3% ae 阴性 (2) 矿 酸 水 杨 酸 法 : 利用 有 机 酸 沉淀 蛋白 质 , 是 临床 常用 的 方 = PEP BE “PR” AR th, RP TE IR HE 0.0015 % e 115 » 即 可 检 出 。 @ WR) 3 毫升 加 入 试管 中 。 @ 加 入 20% 磺 酸 水 杨 酸 8 一 10 滴 , 如 出 现 沉淀 , ARPA RAMEE. BEE, 按 沉淀 多 少 记录 结果 。 : (3) RAR: RS APL Cn) 的 离子 结合 , 可 改 ， 变 染 料 的 颜色 。 使 上 述 染 料 附着 在 滤纸 上 面 制 成 蛋白 试纸 。 当 它 接触 含有 和 蛋白质 的 溶液 时 , 因 蛋 白质 含量 不 同 , 试纸 可 以 由 黄色 变 成 黄 绿色 、 绿 色 或 篮 绿色 , 可 根据 颜色 估计 蛋白 质 的 量 。 ® 本 试纸 供 检 查 尿 pH 值 及 蛋白 定性 和 半 定 量 之 用 。 其 淡 黄色 部 分 供 检 查 pH 值 用 。 ® 将 水 试纸 浸入 被 检 尿 中 后 立即 取出 。 约 10 PER, ZEA 然 光 或 白光 下 , 将 所 呈现 的 颜色 和 色 版 比较 判定 。 本 © 强 碱 性 尿 的 pH 值 在 8 以 上 者 , 尿 蛋白 呈 假 阳性 反应 。 可 滴 加 稀 栈 酸 校正 后 再 测定 。 @ 黄 胆 尿 , 浓缩 尿 , 血尿 等 异常 着 色 的 标本 , 可 影响 判定 。 © 蛋白 试纸 应 存 于 阴凉 干燥 处 。 其 带 色 部 分 不 可 用 手 接触 。 实验 五 “血清 蛋白 ee | 一 、 目 的 : oe eee TAPE HE OK BR AR AY — BAL, 、 原理 : “IEF EEDA NNR a a MR YE Ay Se FF Dy AY HB 方法 。 es: | 醋酸 纤维 薄膜 由 二 乙酸 纤维 素 制 成 ， 它 具有 均一 的 泡沫 样 的 “ 结构 , 厚度 仅 120 微米 , 有 强 渗透 性 , 对 分 子 移动 无 阻力 作为 区 带 ， 电泳 的 支持 物 进行 蛋白 电 坊 有 简便 , 快速 ,样品 用 量 少 ， 应 用 范围 ° 116 ¢ 广 , 分 离 清晰 ， 没 有 吸附 现象 等 优点 。 上 月 前 已 广泛 用 于 血清 蛋白 、 | 脂 蛋白 、 血红 蛋白 , 糖 蛋白 和 、 同 功 酶 的 分 离 及 用 在 免疫 电 永 中 。 ent: 醋酸 纤维 薄膜 (2 x 8 厘米 )。 常 压 电泳 仪 。 : 点 样 器 (市 售 或 自制 )O。 培养 严 ( 染 色 及 漂洗 用 )。 粗 滤 纸 。 玻璃 板 。 hE. .和 白 磁 反应 板 。 、 试 剂 : 1. 巴 比 妥 缓 冲 液 (pH8.6, 离子 强度 0.07) 1000 毫 升 ELLE 2.76 克 , 巴 比 妥 钠 15.45 克 , 加 水 至 1000 毫升 。 2. eta | 300% Ft 2; RIE 10B0.25 5%, 甲醇 50 毫升 , 冰 醋 酸 10 毫升 , 水 40 这 ” 升 ( 可 重复 使 用 )。 3 漂洗 液 2000 Ft 含 甲醇 或 乙醇 45 毫升 , 冰 醋 酸 5 毫升 ,水 50 EFF, 4. EBAY 300 毫升 含 无 水 乙醇 ? 份 , 冰 栈 酸 3 份 。 五 、 操 作 : 1. 浸泡 : 用 狠 子 取 醋 酸 纤维 薄膜 1 张 (识别 出 光泽 面 与 无 光 _ Pim, 并 在 角 上 用 笔 做 上 记号 ) 放 在 缓冲 液 中 浸泡 20 分 钟 。 2. 点 样 : 把 膜 条 从 缓冲 液 中 取出 ， 夹 在 两 层 粗 滤纸 内 吸 干 多 SNOT AR YY S AES a 4 @ 点 样 器 可 用 两 个 塑料 薄片 ,中 间 夹 一 0.8 厘米 宽 的 盖 玻 片 用 粘 合剂 粘 合 制 成 。 e J17 ， 盖 玻 片 样品 a 余 的 液体 , Rae al TE RF CIE PE LE), 将 点 样 器 先 在 放 置 在 白 磁 反应 板 上 的 血清 中 沾 一 下 , 再 在 膜 条 一 端 2 一 3 厘米 处 轻 ， 轻 地 水 平地 落下 并 随即 提起 ， 这 样 即 在 膜 条 上 点 上 了 细 条 状 的 血 inten. © | 3. HL GK: 在 电泳 槽 内 加 入 缓冲 液 ， 使 两 个 电极 槽 内 的 液 面 等 高 , 将 膜 条 平 悬 于 电泳 槽 支架 的 滤纸 桥 上 。〈 先 剪裁 凡 寸 合适 的 滤 纸 条 , 取 双 层 滤 纸 条 附着 在 电 访 槽 的 支架 上 , 使 它 的 一 问 与 支架 的 前 沿 对 齐 ， 而 另 一 端 淄 和 电极 槽 的 缓冲 液 内 。 用 缓冲 滚 将 滤纸 全 部 润 湿 并 驱除 气泡 , 使 滤纸 紧 贴 在 支架 上 ， 即 为 滤纸 桥 ( 它 是 联系 醋酸 纤维 薄膜 和 两 极 缓冲 芒 之 间 的 “桥梁 ")。 膜 条 上 点 样 的 一 站 靠近 负极 。 盖 严 电 访 室 。 通 电 。 调 节 电 压 至 160V， 电 流 强 度 0.4 一 0.7 8 / ARIE HE, 电 访 时 间 约 为 25 分 钟 。 滤纸 桥 酷 酸 纤维 素 菏 腊 滤纸 桥 醋酸 纤维 素 薄膜 电泳 装置 示意 图 4. Hef: 电 访 完 毕 后 将 膜 条 取 下 并 放 在 染色 液 中 浸泡 10 分 钟 。 5， 深 洗 : 将 膜 条 从 染色 液 中 取出 后 移 置 到 漆 洗 液 中 深 洗 数 次 至 无 蛋白 区 底 色 脱 净 为 止 , 可 得 色 珊 清晰 的 电 访 图 谐 。 Q 点 样 好 坏 是 电泳 图 谱 是 否 清晰 的 关键 ,可 让 学 生 先 在 让 纸 上 练习 。 5 人 ET 全 ”醋酸 纤维 薄膜 血清 蛋白 电泳 图 谱 从 左 至 右 , 依次 为 : 血清 清 蛋 白 ci REA oo REAP 球 蛋白 y REA 定量 测定 时 可 将 膜 条 用 滤纸 压 平 吸 干 , 按 区 带 分 段 剪 开 ,分别 淄 在 体积 0.4 当量 / 升 氢 氧化 钠 溶液 中 , 并 剪 取 相同 大 小 的 无 色 带 膜 条 作 空白 对 照 ， 进 行 比 色 。 或 者 将 干燥 的 电泳 图 谱 膜 条 放 入 透 : 明 液 中 浸泡 2 一 3 分 钟 后 取出 贴 于 洁净 玻璃 板 上 , 干 后 即 为 透明 的 薄膜 图 谱 , 可 用 光 密 度 计 直 接 测定 。 实验 六 ” 酯 蛋 白 的 制备 SN 目的 : 学 习 从 牛乳 中 制备 酪 蛋白 的 原理 和 方法 。 一 、 原理 : 牛乳 中 主要 的 蛋白 质 是 酪 蛋白， 含量 约 为 35 克 / 升 。 栈 蛋白 是 一 些 含 磷 蛋 白质 的 混合 物 , 等 电 点 为 4.7。 利 用 等 电 点 时 溶解 度 ”最 低 的 原理 ， 将 牛乳 的 pH 调 至 4.7 时 ， 栈 蛋白 就 沉淀 出 来 。 用 乙 ” 醇 洗 涤 沉 证 物 , 除去 脂 类 杂质 后 便 可 得 到 纯 的 酪 蛋白。 =, est: 3 1， 离 心机 。 2. FhpE He Bo 3. 精密 pH WARE 4, Hay, 5. EPR. © 119 + 6. 温度 计 。 四 、 试 剂 与 材料 : 1， 和 牛奶 2,500 2 F+ 2. 95% 乙醇 1,200 毫升 3. 无 水 乙醚 1,200 毫升 4. 0.2 摩尔 / 升 pH 4.7 醋酸 - 酷 酸 钠 组 名 液 3,000 毫升 FcR Hill A eG BRK. A i: 0.2 摩尔 / 升 酷 酸 钠 溶液 称 NaAC-3H,054.44 th, 定 容 至 2000 毫升。 B 液 : 0.2 摩尔 / 升 醋酸 溶液 称 优 级 纯 醋 酸 (含量 大 于 99.8 匈 )12.0 克 定 容 至 1,000 毫升 。 取 和 A 液 1770 毫升 Bik 1230 毫升 混合 即 得 PH4.7 的 醋酸 - 醋酸 钠 缓冲 液 3,000 毫升 。 5. 乙醇 -乙醚 混合 溢 2,000 毫升 乙醇 :乙醚 =1:1(GZ/TP) A. RAE: .将 100 毫 升 牛奶 加 热 到 40"C。 在 搅拌 下 慢 慢 加 入 予 热 到 40°C, pH4.7 的 醋酸 缓冲 液 100 毫升 。 用 精密 pH 试纸 或 酸度 计 调 pH # 4.7, | 将 上 述 悬 浮 液 冷 至 室温 。 离 心 15 分 钟 (3000 转 / 分 )。 弃 去 清 液 , 得 酪 蛋白 粗 制 品 。 2 用 水 洗 沉淀 三 次 ， 离 心 10 分 钟 (3,000 转 /分 六 FEB LE 3. 在 沉淀 中 加 入 30 毫升 乙醇 , 搅拌 片刻 , 将 全 部 悬 间 液 转移 至 布 氏 漏斗 中 抽 滤 。 用 乙醇 -乙醚 混合 液 洗 沉淀 二 次 。 最 后 用 乙 Rk VED BE Pi vk, HF 4. 将 沉淀 摊 开 在 表面 中 上 , 风干 ; AR AE A Alt © 120+ | lt 5。 准确 称 重 , 计算 含量 和 得 率 。 含量 : 酷 蛋 白 “ 克 /100 毫升 牛乳 Gl) mv. 测 得 含量 得 率 : 理论 含量 x 100% 式 中 理论 含量 为 3.5 克 /100 毫升 牛乳 。 实验 七 “甲醛 滴定 法 测定 氨基 氨 2 ee =| 的 : 初步 掌握 甲醛 镁 定 法 测定 氮 基 酸 含量 的 原理 和 操作 要 点 。 =, RE: 氨基 酸 是 两 性 电解 质 , 在 水 溶液 中 有 如 下 平衡 1 ee +H*, —NH,# NH, NH; : 弱酸 , 完全 解 离 时 pH 为 11—12 或 更 高 ， 若 用 碱 滴 定 一 NH。 pr 放 的 H+ 来 测量 氨基 酸 , 一 般 指示 剂 变色 域 小 于 10, 很 难 准确 指示 终点 。 常温 下 ,甲醛 能 迅速 与 氨基 酸 的 氨基 结合 ,生成 羧 甲 基 化 合 物 ， 使 上 述 平衡 右 移 ,促使 ~-NH。 释放 H*+, 使 溶液 的 酸度 增加 ， 滴 定 Fe 0 BCH C00" 站 NH, HCHO © R—CH—COO- NH, | NHCH,OH HCHO R—CH—COO- | N(CH.OH), e 12] « 终点 移 至 酚 配 的 变色 域内 (pH9.0 左 右 )。 因 此 , BT FAR BA ES AFA, 用 标准 氨 氧 化 钠 溶液 滴定 。 反应 式 见 121 页 。 如 样品 为 一 种 已 知 的 氟 基 酸 ， 从 甲醛 滴定 的 结果 可 算出 氨基 绿 的 含量 由 如 样品 是 多 种 氨基 酸 的 混合 物 如 和 蛋白 水 解 液 , 则 滴定 结果 不 能 作为 妥 基 酸 的 定量 依据 。 但 此 法 简便 快速 , Ae a ae 白质 的 水 解 程 度 , 随 水 解 程度 的 增加 滴定 值 也 增加 , aR ee LAS FE HS 加 时 , 表示 水 解 作用 已 完全 。 =, et: 1. 25 SF HIGH. 2. 3 ST hh ie F. 3. 吸管 。 四 、 试 剂 : 1. 0.1 当量 / 升 标准 甘氨酸 溶液 300 毫升 准确 称 取 750 25 5 H SAR, 溶解 后 定 容 至 100 SEF. 2. 0.1 当量 / 升 标准 氢 氧化 钠 溶 液 包 500 毫升 3， 酚 栈 指 示 剂 20 毫升 0.5% 酚 本 的 50% 乙醇 溶液 | 4。 中 性 甲醛 溶液 400 毫升 在 50 毫升 36—37% 分 析 纯 甲醛 溶液 PIMA 1 EF 0.1% 酚 栈 乙 醇 水 溶液 , 用 0.1 当量 / 升 的 氨 氧 化 钠 溶液 滴定 到 微 红 ， 贮 于 密闭 的 玻璃 瓶 中 , 此 试剂 在 临 用 前 配制 。 如 已 放置 一 段 时 间 , 则 使 用 前 需 重 新 中 和 。 CD 膊 氨 酸 与 甲醛 作用 生成 不 稳定 的 化 合 物 , 使 滴定 毫升 数 偏 低 。 酷 氨 酸 的 毫升 数 结果 偏 高 。 Q@， 标准 气 氧化 钠 溶 液 应 在 使 用 前 标定 , 并 在 密闭 瓶 中 保存 。 不 可 使 用 隔日 贮 在 微量 滴定 管 中 的 剩余 氨 氧 化 钠 。 5 $ 五 、 操 作 方 法 : 1. 取 3 个 25 毫升 的 锥 形 瓶 ， 编 号 。 回 1 2 号 瓶 内 各 加 入 0.1 当量 / 升 的 标准 甘氨酸 溶液 2 SET AK SET, HE. IA 3 号 HLA MA 7 芝 升 水 。 然 后 向 三 个 瓶 中 各 加 入 5 滴 酚 栈 指 示 剂 ， 混 匀 后 各 加 2 EFL EG TEL, Jy IFA 0.1 当量 / 升 标准 所 氧化 。 钠 溶液 滴定 至 溶液 显 微 红 色 。 重复 以 上 实验 2 次 ， 记 录 每 次 每 瓶 消耗 标准 氨 氧 化 钠 溶 流 的 EFT. WISE, 计算 甘氨酸 氨基 氨 的 回收 率 。 5 ig 实际 测 得 量 甘 氮 酸 氨基 所 回收 率 多 == 加 入 理论 量 X 100 公式 中 实际 测 得 量 为 滴定 第 1 一 2 号 瓶 耗 用 的 标准 氢 氧 化 钠 溶液 毫升 数 的 平均 值 与 第 3 号 瓶 耗 用 的 标准 氨 氧 化 钠 溶液 毫升 数 之 差 乘 以 标准 氨 氧 化 钠 的 当量 浓度 , 再 乘 以 14.008。 2 毫升 乘 以 标准 甘氨酸 的 当量 浓度 再 乘 以 75。 即 为 加 入 理论 量 的 毫克 数 。 2， 取 未 知 浓度 的 甘氨酸 溶液 2 毫升 ， 依 上 述 方法 进行 测定 ， 平行 做 几 份 ， 取 平均 值 。 计 算 每 毫升 甘氨酸 溶液 中 含有 氨基 氨 的 毫克 数 。 氨基 氨 (毫克 /毫升 ) = 公式 中 了 为 滴定 待 测 液 耗 用 标准 氨 氧 化 钠 溶液 的 平均 毫升 (Ve—Vix) x Nyaou x 14.008 2 Be Vn AE MAR (3 号 瓶 ) 耗 用 标准 氢 氧 化 钠 溶液 WP ee Ft. Nyon 为 标准 氨 氧 化 钠 溶 液 的 真实 当量 浓度 .由 中 ”本 实验 为 定量 实验 , 甘氨酸 和 和 氢 氧 化 钠 的 浓度 要 严格 标定 , 加 量 要 准确 , 全 部 操作 要 按 分 析 化 学 要 求 进 行 。 * B22 Ste BRS 实验 八 _ 醇 母 核糖 核酸 的 分 离 及 组 分 鉴定 一 、 目 的 : 了 解 核酸 的 组 分 , 并 掌握 鉴定 核酸 组 分 的 方法 。 二 、 原 理 : 酵母 核酸 中 RNA 含量 较 多 。RNA 可 溶 于 碱 性 溶液 ， 在 碱 提取 液 中 加 入 酸性 乙醇 溶液 可 以 使 解 聚 的 核糖 核酸 沉淀 ， 由 此 即 得 到 RNA 的 粗 制 品 。 核糖 核酸 含有 核糖 、 嗓 叭 碱 , 喀 喧 碱 和 磷酸 各 组 分 。 加 硫酸 者 沸 可 使 其 水 解 , 从 水 解 流 中 可 以 测 出 上 述 组 分 的 存在 。 =. Bat: FL. - 150 毫升 锥 形 瓶 。 水 浴 。 量 简 。 ， 布 氏 漏斗 及 抽 滤 瓶 。 吸管 。 ii ， 试 管 及 试管 架 。 烧 怀 。 ， 离 心机 。 .124 。 er 、 试 剂 和 材料 : 1. 0.04 摩尔 / 升 所 氧化 钠 溶 液 1,000 毫升 2 酸性 乙醇 溶 流 500 毫升 将 0.3 毫升 浓 盐 酸 加 入 30 毫升 乙醇 中 。 3. 95% Coke 1,000 2F+ 4. 乙醚 500 毫升 5. 3 当量 / 升 硫酸 200 毫升 6. 演 氨水 50 毫升 7.0.1 摩 尔 / 升 硝酸 银 溶 液 50 毫升 8. 三 毛 化 铁 浓 盐酸 溶液 80 毫升 将 2 毫升 10% 三 毛 化 铁 溶 液 ( 用 FeCl,.6H:O 配制 ) 加 入 到 400 毫升 浓 盐 酸 中 。 9.， 昔 黑 酚 乙 醇 溶液 10 毫升 溶解 6 克 苦 黑 酚 于 100 毫升 95% 乙醇 中 (可 在 冰箱 中 保存 1 个 月 )。 10， 定 磷 试 剂 50 毫升 (1) 17% 硫酸 : 将 17 毫升 浓 硫 酸 (比重 1.84) 缓 缓 加 入 到 83 毫升 水 中 。 (2) 2.5% FARR FERIA: 2.5 eo FARR RIA F 100 SEFt 7k Hh, (3) 10% 抗坏血酸 溶液 : 10 克 抗 坏 血 酸 溶 于 100 Ft 7k, 贮 棕色 瓶 保 在 。 溶 液 呈 淡 黄 色 时 可 用 , 如 呈 次 黄 或 棕色 则 失效 , 需 纯化 抗坏血酸 。 临 用 时 将 上 述 三 种 溶液 与 水 按 如 下 比例 混合 。 17% BERR: 2.5% FARR PRIA WE: 10% 抗坏血酸 溶液 :水 =1:1: 1:2(V/V), 11， 酵 母 粉 200 克 i ie Ay REDE: 将 15 克 酵 母 悬 浮 于 90 SEF} 0.04 摩尔 / 升 氨 氧化 钠 溶 液 中 ， 并 在 乳 钵 中 研磨 均匀 。 将 悬浮 液 转 移 至 150 毫升 锥 形 瓶 中 。 在 沸 水 浴 上 加 热 30 分 钟 后 ， 冷 却 。 离 心 (3, 000 转 / 分 )15 分 钟 将 上 清 液 缓 缓 倾 入 30 党 升 酸性 乙醇 溶液 中 。 注意 要 一 边 搅 拌 一 边 缓 组 倾 入 。 待 核糖 核酸 沉淀 完全 后 ， 离 心 (3, 000 转 / 分 )3 分 钟 。 弃 去 清 液 。 用 95% 乙醇 洗涤 沉淀 两 次 , 乙醚 洗涤 沉淀 一 次 后 ， 再 用 乙 醚 将 沉淀 转移 至 布 氏 漏斗 中 抽 滤 。 沉 淀 可 在 空气 中 干燥 。 取 200 克 提 取 的 核酸 , 加 入 3 当量 / 升 硫酸 10 毫升 ; 在 沸水 浴 中 加 热 10 分 钟 制 成 水 解 液 并 进行 组 分 的 鉴定 。 1. WES Gi: 取水 解 液 1 毫升 加 入 过 量 浓 所 水 ， 然 后 加 入 约 1 毫升 0.1 摩尔 / 升 硝酸 银 溶 液 , 观察 有 无 味 叭 碱 的 银 化 合 物 沉淀。 2. 核糖 : 取 一 支 试 管 加 入 水 解 液 1 EF, SACRE IR 液 2 ZIMA CAA 0.2 毫升 。 放 沸水 浴 中 10 分 钟 。 注意 溶液 是 否 变 成 绿色 , 说 明 核 糖 的 存在 。 3， 磷 酸 : 取 一 支 试 管 , 加 入 水 解 液 1 毫升 和 定 磷 试剂 1 毫升 。 在 水 浴 中 加 热 , 观察 溶液 是 否 变 成 蓝 色 , 说 明 磷酸 是 否 存在 。 实验 九 RE GEM) PR .o Pie AY TS A EE —, BM: 初步 掌握 从 菜花 中 分 离 核 酸 的 方法 ,和 RNAJ、DNA 的 定性 检定 。 D 从 酵母 中 提取 核酸 部 分 可 由 两 个 学 生 共 做 一 份 。 水 解 及 组 分 鉴定 部 分 由 每 个 学 生 独 立 操作 。 * 126° 、 原理 : 和 氨 乙 酸 或 稀 高 毛 酸 溶液 在 低温 下 抽 提 菜花 匀 。 浆 ， 以 除去 酸 溶性 小 分 子 物质 ; 再 用 有 机 溶剂 ， 如 乙醇 乙醚 等 抽 sR, APART VEN DRIES OR. BUA PRERIAIR (10% AULA HR) AN 0.5 当量 / 升 高 毛 酸 (70"C) 分 别提 取 DNA fl RNA, 再 进行 定性 检定 。 由 于 核糖 和 脱氧 核 精 有 特殊 的 颜色 反应 ， 经 显 色 后 所 呈现 的 颜色 深 屋 在 一 定 范围 内 和 样品 中 所 含 的 核糖 和 脱氧 核糖 的 量 成 正 比 , 因此 可 用 定 糖 法 来 定性 定量 测定 核酸 。 1. 核糖 的 测定 : 测定 核糖 的 常用 方法 是 若 黑 酚 ( 即 3.5- 二 PAIGE) Pe: (Orcinol 反应 ) 。 当 含有 核糖 的 RNA 与 浓 盐 酸 及 3,5 -三 产 甲 全 在 沸水 浴 中 加 热 10 一 20 分 钟 后 , 有 绿色 物产 生 , 这 是 因 为 RNA 脱 哇 队 后 的 核糖 与 酸 作用 生成 入 栈 ， 后 者 再 与 35- 二 多 FE fe AE aR CH; | 100°C oe o—\ Jon rat FeCl; 绿色 复合 物 。 DNA.、 重 白质 和 粘 多 糖 等 物质 对 测定 有 干扰 作用 。 2， 脱氧 核 糖 的 测定 : 测定 脱氧 核糖 的 常用 方法 是 二 苯胺 法 。 含有 脱氧 核糖 的 DNA 在 酸性 条 件 下 和 二 苯胺 在 沸水 浴 中 共 热 10 分 钟 后 ， 产 生 蓝 色 。. 这 是 因为 DNA 嗓 叭 核 苷 酸 上 的 脱氧 核糖 遇 酸 生成 @- 羟 基 -6- 酮 基 戊 醛 ， 它 再 和 二 苯胺 作用 产生 蓝 色 物 质 。 冰 栈 酸 PN ea DNA+ > H.SO,+f [NEO ( [ey Si \/ > i277 > 此 法 易 受 多 种 糖 类 及 其 衍生 物 和 和 蛋白质 的 干扰 。 上 述 两 种 定 糖 的 方法 准确 性 较 差 , 但 快速 简便 , 能 鉴别 DNA - 与 RNA, 是 检定 核酸 , 核 苷 酸 的 常用 方法 。 三 、 器 材 : 1. 人 重 温 水 浴 。 2. 电炉。 3 离心 机 。 4， 布 氏 漏斗 装置 。 5. 吸管 。 6. KER. 7. 量 简 。 8. BT). 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 新 鲜 菜花 。 2. 95% 乙醇 ; 600 训 升 3. 丙酮 400 毫升 A. 5 多 高 毛 酸 溶液 ”200 毫升 5. 0.5 当量 / 升 高 气 酸 溶液 200 毫升 6. 10% RIERA ， 400 毫升 7. 标准 RNA 溶液 (5 2 we /100 毫升 ) 50 毫升 8 标准 DNA 溶液 (15 毫 克 /100 毫升 ) 50 毫 升 ， 9. 粗毛 化 钠 250 克 - 省 10. HER 5 11. 二 苯胺 试剂 60 毫升 将 1 克 二 苯胺 溶 于 100 毫升 冰 栈 酸 中 , 再 加 入 2.75 毫升 浓 硫 酸 ( 置 冰箱 中 可 保存 6 个 月 。 使 用 前 , 在 室温 下 摇 匀 )。- | 12. 三 氧化 铁 浓 盐 酸 溶液 25 毫 升 * 128 « 配 法 见 实验 八 。 13. SBM CBA 200 毫升 ” 配 法 见 实验 八 。 五 、 操 作 步 骤 : 1， 核 酸 的 分 离 。C (1) 取 菜 花 的 花冠 20 克 ， 剪 碎 后 置 于 研 钵 中 。 加 入 20 毫升 95% CRIA 400 毫克 海 沙 , 研磨 成 匀 浆 。 然 后 用 布 氏 漏斗 抽 滤 , 弃 去 滤液 。 ear | (2) dew A 20 毫升 丙酮 ， 搅 拌 均匀 , 抽 滤 ， 弃 去 滤液 。 (3) 再 向 滤 酒 中 加 入 20 毫升 丙酮 ， 搅 拌 5 分 钟 后 抽 王 (用 力 FRI, RE AM) 。 (4) 在 冰 盐 浴 中 ， Hg RTE AE HS 20 毫升 5% ii MARIS eh, BPE, HAVE, 弃 去 滤液 。 (5) 将 滤 河 悬浮 于 20 毫升 95% 乙醇 中 , 抽 滤 , 弃 去 滤液 。 (6) 滤 漂 中 加 入 20 毫升 丙酮 , PE Bh, HBA, AD | RIBAS PRE (7) APR BMA TE 40 SH 10% RH WAR. 在 沸水 浴 中 加 热 15 分 钟 。 放 置 , 冷却 , HIE, 留 滤液 。 并 将 此 操作 重复 进行 一 次 。 将 两 次 滤液 合并 , 为 提取 物 一 。 (8) 将 滤 河 重新 悬浮 在 20 毫升 0.5 当量 / 升 高 毛 酸 溶液 中 。 加 热 到 70*C。 保 温 20 分 钟 (恒温 水 浴 ) Ja THUR. WIR (提取 物 二 )。 2. RNA,DNA 的 定性 检定 : (1) 二 苯胺 反应 : 一 @ 两 个 学 生 为 一 组 , 做 核酸 的 提取 实验 。 e 129 。 a | 提取 物 一 (毫升 ) | - 提取 物 二 (毫升 ) | 一 二 苯胺 试剂 (毫升 ) | 2 | 县 | 2 | 2 | 2 放 沸 水 浴 中 10 分 钟 后 的 现象 | | | | | (2) SGRORM: WRB GET) | 31. | =) =o DNA 溶液 (毫升 ) ) — | 4 oe x 3 | | 管 号 1 2 3 4 5 RNA 溶液 (毫升 ) | Bi as | 1 | et | 下 提取 物 一 (毫升 ) 提取 物 二 (毫升 ) 三 毛 化 铁 浓 盐酸 溶液 (毫升 ) a i x2 | ae En | 2 SBM CMA (SF) | 0.2 | 0.2 0.2 0.2 0.2 放 沸 水 浴 中 10 一 20 分 钟 后 的 现象 | | | | | 根据 现象 分 析 提 取 物 一 和 提取 物 二 主要 含有 什么 物质 ? See PBR ET BPE Ter MR HEL Dik o> TA A AT —, BM: 2s SY BN BZ BRT IS J SEAL Ta 25 2 PR 19 BR RT 2 Yah Age HE ik FY Dik BAM 7 12g - 1306 二 RNA 在 稀 碱 条 件 下 水 解 , 先 形成 中 间 物 2 , 3’ - 环 状 核 苷 酸 ， 进一步 水 解 得 到 2” 和 3' - 核 苷 酸 的 混合 物 。 .在 pH3.5 时 ， 各 核 苷 酸 的 第 一 磷酸 基 (pK0.7—1.0) 完全 解 离 , 第 二 磷酸 基 (pK6.0) 和 烯 醇 基 (p 天 9.5 以 上 ) 不 解 离 ,而 含 氨 环 的 解 离 程度 差别 很 大 。( 见 附 表 ) 因此 在 pH3.5 条 件 下 进行 电泳 可 将 这 四 种 核 苷 酸 分 开 。 四 种 核 苷 酸 在 pH3 .5 时 的 离子 化 程度 Bt 酸 RAN PK 值 离子 化 程度 净 负 电荷 AMP 3.70 0.54 0. 46 GMP 2.30 0.05 0.95 CMP 4,24 0.84 0.16 UMP = 1.00 本 实验 先 用 稀 氢 氧化 钾 溶 液 将 RNA 水 解 ， 再 加 高 毛 酸 将 水 解 液 调 至 pH3.5, 同时 生成 高 氯酸钾 沉淀 以 除去 玉 *， 然 后 用 电泳 法 分 离 水 解 液 中 各 核 苷 酸 ， 并 在 紫外 分 析 灯 下 确定 RNA 碱 水 解 HR BD He ok LTE =, 287: 1. 电热 恒温 水 浴 。 2. 紫外 分 析 灯 (波长 为 254nmy)。 3. FARR aE. 4 5 » HDD, HOKE ， 离心 机 。 四 、 试 剂 和 材料 : - 0.3 摩尔/ 升 气 氧 化 钾 溶 液 1003 F} 2. 200 bil / Ft ies A ARTS HR 40 2 Ft 3. 核糖 核酸 (粉末 ) 4 we - 131+ —_ 4. 0.02 摩尔 / 升 pH3.5 柠 榜 酸 缓冲 液 1000 毫升 5.， 了 醋酸 纤维 济 膜 (2x8 厘米 ) 五 、 操 作 方 法 : 1. RNA 的 碱 水 解 : 称 取 0.2 殉 RNA， 深 于 5 毫升 0.3 摩尔 / 升 氢 氧 化 钾 溶 液 中 ， 使 RNA 的 浓度 达到 20—30 毫 死 /毫升 。 在 37°C 下 保温 18 小 时 (或 沸水 浴 30 分 钟 )。 然后 将 水 解 液 转移 到 锥 形 瓶 内 。 在 冰 浴 中 用 高 氛 酸 溶液 滴定 到 水 解 液 的 pH 为 3.5。2000 1 SENS 分 钟 。 除 去 沉淀 , LAREN AAR. 2. FF: 将 酷 酸 纤维 素 薄 膜 在 pH3.5, 0.02 HEAR / Fer RRR PR iia, 用 滤 试 吸 去 多 余 的 缓冲 液 。 然 后 将 膜 条 无 光泽 面 癌 上 平 铺 在 玻璃 板 上 , 用 点 样 问 在 距 膜 条 一 端 2 一 3 厘米 处 点 样 。 3. HAdK: | Ea PE a AY ve He A Hk A, ERR RE 靠近 负极 。 调 节 电 压 至 160V， 电 流 强 度 为 0.4 ee / BK. HK 25 分 钟 。 | Hoa, 将 膜 条 放 在 滤纸 上 , 于 紫外 分 析 灯 下 观 赛 ， 用 铅笔 将 吸收 紫外 光 的 暗 斑 圈 出 。 在 记录 本 上 绘 出 RNA 水 解 液 的 醋酸 纤 2 7G Hee HL ok ETE, FERRER 2e PROBE 57 RE BE ek LE BF BR. 实验 十 一 “” 王 层 层 析 法 分 离 AMP、ADP #l ATP 一 、 目 的 : 1. 学 习 泗 层 层 析 法 的 基本 原理 及 操作 方法 。 2. 应 用 DEAE- 纤 维 素 薄 层 层 析 分 离 鉴 定 核 苷 酸 。 © 1326 一 、 原理 : 二 乙 氨基 乙 基 纤维 素 : CH 一 CH N—CH,—CH,—#f 维 素 ， 简 称 DEAE-2F CH: 一 CH， 。 素 , 是 弱 碱 性 阴离子 交换 剂 , 在 pH3.5 左右 > fe at DN fe ET, HE ye AMORA AT TT ee LA. AIA 的 结构 不 同 , 因而 和 DEAE- 纤 维 素 亲和力 的 大 小 不 同 , 来 达到 分 离 的 目的 。 三 、 器 材 : | ERR: 4.5 厘米 x 20 厘米 。 布 氏 漏斗 或 离心 机 。 。 涂 布 器 O ( 薄 层 厚度 : 0.6 Be). 毛细 管 。 吹风 机 。 恒温 箱 。 托盘 天 平 。 » 紫外 分 析 灯 (波长 254 毫 微米 )。 、 试 剂 : 1. 1 当量 / 升 盐酸 溶液 | 200 毫升 2. pH3.5 0.05 摩尔 / 升 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓冲 液 “1000 BEF} 称 取 柠檬 酸 .2H:O16.20 克 , 柠檬 酸 钠 .2HO6.70 克 ， TA fe FE 2,000 毫升 水 中 , 调 pH 至 3.5, 3。 标准 核 苷 酸 各 5 BEF Bike Boas io OQ 涂 布 器 可 以 用 有 机 玻璃 自制 : 用 有 机 玻璃 粘 成 长 方形 框 ， 其 中 一 面 与 底面 有 空隙 , 空 阶 大 小 决定 薄 层 的 厚度 。 本 实验 薄 层 厚度 为 0.6 毫米 。 e 133.6 10 2 be / Ft ty AMP, ADP fi] ATP 溶液 4. RA RAT 5 毫升 AMP+ADP+ ATP (4% 10 58 /2Fh) 5. DEAE-474:% 40 克 A. RA: 1. DEAE- 纤 维 素 的 予 处 理 : 用 4 倍 体积 的 水 将 DEAE- 纤 维 素 浸 钨 过 夜 ， 离 心 或 抽 王 。 再 用 1 当量 / 升 的 盐酸 溶 沪 浸泡 4 小 时 (或 搅拌 1.5 小 时 )。 用 水 洗 至 中 性 或 在 60°C 以 下 烘 干 备用 。 2. Bik: © 用 水 把 经 过 予 处 理 的 DEAE- 纤 维 素 在 烧杯 里 调 成 糊 状 ， 立 即 倒 入 干净 的 玻璃 板 上 。 轻 轻 揪 动 玻璃 板 ， dsrasinebib st Ye Js 或 将 糊 状 物 倒 至 涂 布 器 的 槽 内 , Fi A ES OB 0.6 诸 米 ) 。 将 玻璃 板 先 放 在 水 平 桌 面 上 静 置 片刻 ， 再 放 和 人 60°C 烘箱 内 烘 干 备用 。 涂 布 器 的 制作 及 铺 板 方法 参见 第 三 章 图 3-11, 3. FARE: 在 距 DEAE- 纤 维 素 板 一 端 2 厘米 处 用 铅笔 轻 轻 划一 横 线 ， 在 横 线 中 央 用 毛细 管 点 样 ( 见 图 )。 eR eee 样品 点 2 一 3 次 。 4。 展 层 ; 四 每 个 学 生 用 1 克 予 处 理 过 的 DEAE- 纤 维 素 ， 加 水 8 一 9 毫升 , 可 铺 4.5 厘 米 关 20 厘米 的 板 二 块 。 - 1346 FE 250 毫升 烧杯 内 倒 进 约 1 厘米 深 的 pH3.5 的 柠檬 酸 缓冲 We ( 约 30 毫升 )。 把 点 过 样 的 薄板 倾斜 插入 此 烧杯 内 (点 样 端 在 下 ) 溶 液 由 下 而 上 流动 ， 当 溶剂 前 沿 到 达 距 薄板 上 端 约 工 厘米 处 时 (25 分 钟 左右 ), 取出 薄板 , 用 热风 吹 干 , 用 波长 254 毫 微米 的 紫 Spe HA St DEAE-2F 38/2, BAFARSEA WINK. DEAE-2F 4 素 可 回收 , 经 再 处 理 可 反复 使 用 。O 此 法 具有 快速 灵敏 的 特点 。 @ 再 处 理 方法 : 将 DEAE- 纤 维 素 从 玻璃 板 上 刮 下 , 用 水 洗 后 , 在 1 当量 / 升 的 氢 氧化 钠 溶 液 中 涯 泡 2 小 时 , 用 水 洗 至 中 性 (或 水 的 pPH)， 再 用 1 当量 / 升 的 盐酸 溶液 浸 泡 2 小 时 。 再 用 水 洗 至 中 性 或 在 60"C 烘箱 中 烘 干 备用 。 学 生 从 铺 板 开始 做 实验 ， 2.5 一 3 小 时 可 全 部 完成 。DEAE- 纤 维 素 的 予 处 理 和 再 处 理 均 由 教师 完成 。 。 1356 Ste & 实验 十 二 酶 的 特性 一 、 目 的 : 加 次 对 酶 的 性 质 的 认识 。 二 、 内 容 : 本 实验 由 温度 对 酶 活力 的 影响 ; pH 对 酶 活力 的 影响 ; 酶 的 激 活 剂 及 抑制 剂 ; 酶 的 专 一 性 四 组 实验 组 成 。 (一 ) 温度 对 酶 活力 的 影响 1. 原理 : 酶 的 催化 作用 受 温 度 的 影响 , 在 最 适 温度 下 , 酶 的 反应 速度 最 高 。 大 多 数 动物 酶 的 最 适 温度 为 37 一 40 C,， 植 物 酶 的 最 适 温 度 为 50—60°C, 酶 对 温度 的 稳定 性 与 其 存在 形式 有 关 。 有 些 酶 的 干燥 制剂 ， 虽 加 热 到 100°C, 其 活性 并 无 明显 改变 ,但 在 100°C 的 溶液 中 却 很 快 地 完全 失去 活性 。 低温 能 降低 或 抑制 酶 的 活性 , 但 不 能 使 酶 失 活 。 2. att: (1) 试管 及 试管 架 。 (2) 恒温 水 浴 。 (3) vif. (4) 沸水 洽 。 ° 136° 3 试剂 和 材料 : (1) 0.2 驳 淀粉 的 0.3% A(t Mia 150 F} 需 新 鲜 配 制 。 (2) 稀释 200 倍 的 唾液 50 毫升 tC AR RK, LAR i, 再 含 一 口 蒸馏 水 ， 半 分 钟 后 | 使 其 流入 量 简 并 稀释 200 倍 , (稀释 倍数 可 根据 各 人 唾液 淀粉 酶 活 性 调整 ) 混 匀 备 用 。 (3) 碘化钾 - 碘 溶液 50 Ft 将 碘化钾 20 克 及 碘 10 克 溶 于 100 EFt 7k oh. EFA BT 10 fs 4. BRET: MAE EME ne. WHOS WA, ioe WEEE, RA ET OS, HT B,D BL WAS te, PEAR LE, tae Be Re ek 9, ”可 由 水 解 混合 物 遇 碘 呈 现 的 颜色 来 判断 。 取 3 支 试管 , 编号 后 按 下 表 加 入 试剂 : | a ee 淀粉 溶液 (毫升 ) | 1.5 | 1.5 稀释 唾液 (毫升 ) | 1 | 1 AULA REM ea IH)| ais | a | 1 NR HLS, 8 号 两 试管 放 和 人 37°C 恒温 水 洽 中 ，2 号 试管 | 放 入 冰 水 中 。10 分 钟 后 取出 ，( 将 2 号 管内 液体 分 为 两 半 ) 用 碘 化 | 钾 - 碘 溶液 来 检验 1, 2,3 管内 淀粉 被 茬 液 淀粉 酶 水 解 的 程度 。 记 ， 录 并 解释 结果 , 将 二 号 管 剩 下 的 一 半 溶 液 放 入 37°C 水 浴 中 继续 保 | Hi 10 分 钟 后 , 再 用 碘 液 实验 , 结果 如 何 ? 了 2 » (=) pH 对 酶 活性 的 影响 1. Je SH: | 酶 的 活力 受 环境 pH (ty REMI GEE, AN LARS pH 不 同 。 本 实验 观察 pH 对 唑 液 淀 粉 酶 活性 的 影响 ， 唾 液 淀粉 酶 的 最 适 pH 约 为 6.8。 2. 器材 : (1) 试管 及 试管 架 。 (2) 吸管 。 (3) ie. (4) 50 毫升 锥 形 瓶 。 (5) 恒温 水 浴 。 3. 试剂 和 材料 : (1) 新 配制 的 溶 于 0.3 多 氧化 钠 的 0.5% 淀粉 溶液 250 毫升 (2) 稀释 200 倍 的 新 鲜 唾 液 100 毫升 (3) 0.2 摩尔 / 升 磷酸 所 二 钠 溶液 600 毫升 (4) 0.1 摩尔 / 升 柠檬 酸 溶液 _ 400 毫升 (5) 碘化钾 - 碘 溶液 50 毫升 (6) pH 试纸 : pH=5,.pH=5.8.pH=6.8.pH=8 四 种 4 操作 方法 : 取 4 个 标 有 号 码 的 50 毫升 锥 形 瓶 。 用 吸管 按 下 表 添 加 0.2 1 | | 5.15 | 4.85 | 5.0 2 6.05 83.95 | 5.8 5, | eiz | 2.28 | 6.8 4 9.72 0.28 8.0 138 li Tae eh oto Aa. Ma, ¥ EAR / Ft RNG PAA EA 0.1 摩尔 / 升 柠檬 酸 溶液 以 制备 pH5.0 一 8.0 的 四 种 缓冲 液 。 从 四 个 锥 形 瓶 中 各 取 缓 冲 液 3 毫升 ， 分 别 注 入 4 支 带 有 号 码 的 试管 中 ， 随 后 于 每 个 试管 中 添加 0.5% 淀粉 溶液 2 毫升 和 稀释 ”200 倍 的 唾液 2 毫升 向 各 试管 中 加 入 稀释 唾液 的 时 间 间 隔 各 为 1 分钟。 将 各 试管 内 容 物 混 匀 , 并 依次 置 于 37°C 恒温 水 浴 中 保温 。 POEM A I 2 分 钟 后 ， 每 隔 1 分 钟 由 第 3 管 取出 一 滴 混 i, 置 于 白 姿 板 上 , 加 1 小 滴 碘 化 钾 - 碘 溶 液 , 检验 淀粉 的 水 解 程 度 。 待 混合 液 变 为 棕 黄色 时 , 向 所 有 试管 依次 添加 1 一 2 滴 碘 化 钾 - PAI. AR veil PY ee NL TAL ALB, 从 第 一 管 起 ， 亦 均 为 1 分 钟 。 | : ”观察 各 试管 内 容 物 呈 现 的 颜色 ， 分 析 pH 对 唾液 淀粉 酶 活性 ”的 影响 。 (三 ) 唾液 淀粉 酶 的 活化 和 抑制 1. JR BE: 酶 的 活性 受 活 化 剂 或 抑制 剂 的 影响 。 所 离子 为 唾液 淀粉 酶 的 “活化 剂 , 铀 离子 为 其 抑制 剂 。 2. arth: (1) 恒温 水 浴 。 (2) 试管 及 试 答 架 。 3， 试 剂 和 材料 : (1) 0.1% 淀粉 溶液 150 训 升 (2) 稀释 200 倍 的 新 鲜 唾 液 150 毫升 (3) 1% 氯 化 钠 溶液 50 毫升 (4) 1% 硫酸 铜 溶液 50 Ft (5) 1% 硫酸 钠 溶液 50 4 Ft ° 139 。 (6) 础 化 钊 - 础 溶液 - 100 毫升 4， 操 作 方 法 : 管 号 1 2 3 4 | 0.1% tie BIS HK (ETE) | 1.5 | 1.5 | 1.5 1.5 稀释 唾液 (毫升 ) | | | 0.5 | 0.5 1 乡 硫 酸 铜 溶液 (毫升 ) | 0.5 | = us | re “1 多 氧化 钠 溶液 (毫升 ) | | 5, it | eS 1 ERO TEETH) | | os | ee He 7k (ETL) | | | | 0.5 37° Ott it 7K. PRI 10 4 Bh 注 “保温 时 间 可 根据 各 人 唾液 淀粉 酶 活力 调整 。 解释 结果 , 说 明 本 实验 第 3 管 的 意义 。 (四 ) 酶 的 专 一 性 1. 原理 : 酶 具有 高 度 的 专 一 性 。 本 实验 以 唾液 淀粉 酶 和 姑 糖 酶 对 淀粉 和 荐 糖 的 作用 为 例 , 来 说 明 酶 的 专 一 性 。 证 粉 和 蔗糖 无 还 原 性 ， 唾 液 淀 粉 酶 水 解 证 粉 生成 有 还 原 性 的 Bee BE, AN FE HE (CEE BE YS I SE. RE a TV HE ACR BB ik SEP AE 原 性 葡萄 糖 和 果糖 , 但 不 能 催化 淀粉 的 水 解 。 JA Benedict AA 查 糖 的 还 原 性 。 2. abt: (1) fain 7K 4. (2) brie. (3) 试管 及 试管 架 。 3 试剂 和 材料 : 。140 。 (1) 2 多 蔗糖 溶液 150 26 Ft (2) ZF 03% 氯 化 钠 的 1 多 twewRR 150 SF BREE Hill) (3) 稀释 200 FFF Fo ir ee MER ”100 4 F¢ (4) 芒 糖 酶 溶液 100 Ft 将 啤酒 厂 的 鲜 酵 母 用 水 洗涤 2 一 3 次 (离心 法 ), PR CE NEA 上 自然 干燥 。 取 干 酵 且 100 克 , 置 于 乳 钵 内 , 添加 适量 蒸馏 水 及 少 量 细 沙 , 用 力 研磨, 提取 约 1 小 时 ， 再 加 燕 馏 水 使 总 体积 约 为 原 体 BRM 10 倍 。 离 心 , 将 上 清 液 保存 于 冰箱 中 备用 。 (5) Benedict 氏 试剂 ”200 训 逢 无 水 硫酸 铜 1.74 克 溶 于 100 毫升 热 水 中 ， 冷 却 后 稀释 至 150 毫升 。 取 柠檬 酸 钠 173 克 , 无 水 碳酸 钠 100 克 和 600 毫升 水 共 热 ， PARI SO nk 3 850 毫升。 再 将 冷却 的 150 AETHER 倾 入 。 本 试剂 可 长 久保 存 。 4 操作 方法 : (1) 淀粉 酶 的 专 一 性: | 2% ie BIS Hk (iH) | 稀释 唾液 (毫升 ) | Fe | a : | ; | ae eS 考 沸 过 的 称 释 吗 波 ( 毫 和 | — | — | — | — | FRB CEI) Se tds be eee | 37"O 人 恒温 水 浴 15 57h Benedict 试剂 (毫升 ) | 141° 解释 实验 结果 (提示 : ME BR DR te BD Bik Sb a8 A AD ke 糖 酶 ) 。 (2) 蔗糖 酶 的 专 一 性 : mee wm | 4 | — [,4 [-= | | | 2% 蔗糖 溶液 ( 滴 ) | j “i 4 | y | 4 erm) | 一 | 一 | FU ik fo He BRR TS ee | ms | (毫升 ) 蒸馏 水 (毫升 ) [二 37°C 人 恒 强 水浴.5 分 钟 Benedict 氏 试剂 (毫升 )| 1 1 加 1 1 1 1 沸 水 % 2-3 分 4h 现 象 | Kiet ART ae AA A OE 一 、 目 的 : 1， 学习 测 定 和 蛋白 酶 活力 的 方法 。 2. te: 72 型 或 721 型 分 光 光 度 计 的 原理 和 使 用 方法 。 3. 学 习 绘 制 标 准 曲线 的 方法 。 9 = apa RAL A Folin 试剂 , A: WEES Ae Fn APRN AD, 它 在 碱 性 条 件 下 极 不 稳定 , 可 被 酚 类 化 合 物 还 原 产生 蓝 色 ( 钼 蓝 和 钨 蓝 的 混合 物 ) 。 酪 蛋白 经 蛋白 酶 作用 后 产生 的 酷 友 酸 可 与 酚 试 剂 反应 ， 所 生 .142 。 ] 成 的 蓝 色 化 合 物 可 用 分 光 光度 法 测定 。 9 =, 器 材 : 5. 72 型 (或 721 型 ) 分 光 光 度 计 。 四 、 试 剂 : 1. Binh 400 毫升 于 2,000 毫升 磨 口 近 流 装 置 内 加 入 钨 酸 钠 (Na,WO,-2H,0) 100 5, 钼 酸 钠 (NasMoO,.2H,O)25 Ft, 7k 700 BF, 85% 磷酸 ”50 毫升 ， 浓 盐酸 100 毫升 。 微 火 近 流 10 小 时 后 加 入 硫酸 锂 150 | 克 , 蒸馏 水 50 AFL ANIA THE. AVY 15 分 钟 , 以 驱逐 残 溴 , 溶 液 呈 黄色 。 冷 却 后 定 容 到 1,000 SF, UE, 置 于 棕色 瓶 中 保存 。 使 用 前 用 氢 氧 化 钠 标 定 , 加 水 稀释 至 1 当量 / 升 ( 约 加 1 倍 水 )。 2. 0.55 摩尔 / 升 碳酸 钠 溶 液 2,000 毫升 3. 10% =ACRIRK 150 训 升 4. 0.5% REE AIA 100 Ft : 称 取 栈 蛋白 2.5 克 ， 用 0.5 当量 / 升 的 氢 氧 化 钠 溶液 4 毫升 泣 iid, 加 0.02 摩尔 / 升 pH7.5 磷酸 缓冲 液 少 许 ， 在 水 浴 中 加 热 溶解 。 | 冷却 后 ,用 上 述 缓冲 液 定 容 至 500 毫升 。 此 试剂 临 用 时 配制 。 5. 0.02 摩尔 / 升 pH7.5 磷酸 缓冲 液 。 200 Ft PUL RR Sl — 钠 (Na,HPO,-12H,0)71.64 %, JAKEAB 1,000 毫升 为 A 液 。 称 取 磷 酸 二 氢 钠 (NaH,PO,-2H,0) 31.21 3%, | 用 水 定 容 至 1,000 毫升 为 B 液 取 A 液 840 毫升 , B 液 160 毫升 , 混 合 后 即 成 0.2 摩尔 / 升 (pH 7.5) BEARS Mee, hn FAI ARE 10 倍 。 6. 100 微克 /毫升 Me ARIA 200 毫升 ° 143° 精确 称 取 烘 干 的 酷 氨 酸 100 毫克 , 用 0.2 当量 / 升 盐酸 溶液 溶 解 , 定 容 至 100 毫升 , 临 用 时 用 水 稀释 10 倍 , 再 分 别 配 制 成 几 种 10 一 60 微克 /毫升 浓度 的 酷 氨 酸 溶液 。 7. Wisi 100 毫升 称 取 1 克 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 的 酶 粉 ， 用 少量 0.02 摩尔 / 升 pH 7.5 的 磷酸 缓冲 液 溶解 , 然后 用 同一 缓冲 液 定 容 至 100 毫升 。 振 播 约 15 分 钟 , 使 其 充分 溶解 , RAFAL. MAIER 5 BT, 稀释 至 适当 倍数 (如 20 倍 , 30 倍 , 40 倍 ) 供 测 定 用 。@ 此 酶 液 可 在 冰箱 中 保存 一 周 。 A. REA: @ 1. 绘制 标准 曲线 : 取 不 同 浓度 (10 一 60 微克 /毫升 ) 酷 氛 酸 溶液 各 1 毫升 ， 分 别 加 入 0.55 摩尔 / 升 碳酸 钠 溶液 5 毫升 , 酚 试剂 1 毫升 。 置 30"C 恒温 水 浴 中 显 色 15 分 钟 ， 用 分 光 光 度 计 在 680 毫 微米 处 测 光 吸收 值 ， 用 空白 管 ( 只 加 水 、 碳 酸 钠 溶液 和 酚 试 剂 ) 作对 照 , 以 光 吸 收 值 为 纵 坐标 , 以 酷 握 酸 的 微克 数 为 横 坐 标 , 绘制 标准 曲线 。 2。 酶 活力 测定 : 吸取 0.5 6 RR AK 2 毫升 置 于 试管 中 ， 在 30°C 水 浴 中 了 予 热 五 分 钟 后 加 入 予 热 (30"C，5 分 钟 ) 的 酶 液 1 毫升 , 立即 计时 。 反 应 10 分 钟 后 , 由 水 浴 取 出 , 并 立即 加 入 10 多 三 氯 乙酸 溶 液 3 毫升 ， 放置 15 分 钟 后 , 用 滤纸 过 滤 。 同时 另 作 一 对 照管 , 即 取 酶 液 1 毫升 先 加 入 3 EFF 10% 的 三 ACARI, 然后 再 加 入 0.5% MRAM 2 毫升 ，30*C 保温 10 分 钟 , 放置 15 分 钟 , 过 滤 。 DQ 一 般 将 1 克 酶 粉 稀释 2,000 倍 , 若 酶 活力 很 高 , 可 酌情 再 稀释 - 四 “本 实验 分 两 次 完成 ， 第 一 次 绘制 标准 曲线 , 第 二 次 测 酶 活力 。 酶 液 的 提取 及 稀释 由 教师 课 前 准备 好 。 。14 了 。 取 3 支 试 管 , 编号 。 分 别 加 入 样品 滤液 ,对照 滤液 和 水 各 1S ” 升 。 然 后 各 加 入 0.55 摩尔 / 升 的 碳酸 钠 溶液 5 毫升 ， 混 匀 后 再 各 加 入 酚 试剂 1 毫升 。 立 即 混 鱼 ， 在 30"C 显 色 15 分 钟 。 以 加 水 的 ”一 管 作 空白 , 在 680 训 微 米 处 测 对 照 及 样品 的 光 吸收 值 。 OE TG: | Mie te 30'C、pH7.5 的 条 件 下， 水 解除 蛋白 每 分 名 产生 本 所 酸 1 微克 为 一 个 酶 活力 单位 。 则 1 克 枯 章 杆菌 蛋白 酶 在 30°C, pH7.5 的 条 件 下 所 具有 的 活 力 单位 为 : (Ay-Ay) ‘Keo 式 中 : Aq: 样品 液 光 吸收 值 。 Ay: 对 照 液 光 吸收 值 。 K; 标准 曲线 上 光 吸 收 为 1 时 的 酷 氨 酸 微克 数 。 t: 酶 促 反 应 的 时 间 (分 ), 本 实验 上 =10。 V 酶 促 反应 管 的 总 体积 , (毫升 数 ), ARH V=6, ON: BUENO RE RE RER, 本 实验 W= 2,000。 SE TV 底 物 浓度 对 酶 促 反 应 速度 的 影响 一 一 米 氏 负数 的 测定 一、 目的 : 1， 了 解 底 物 浓度 对 酶 促 反应 速度 的 影响 。 2 学 习 测 定 米 氏 常 数 (Km) 的 原理 和 方法 。 二 、 原 理 : 早 在 1913 年 Michaelis 和 Menten 首先 提出 了 酶 促 反 应 速 ” 度 和 底 物 浓度 的 关系 式 。 即 米 氏 方程 式 : 。145 。 oe 和 本 % pe ES Kat+{83 式 中 : 2 Ayre Ma RE, V 为 最 大 反应 速度 , LS] 为 底 物 浓度 ， Km AKG HBL, 其 单位 为 摩尔 浓度 。 ” 玫 m 值 是 酶 的 一 个 特征 性 常数 ， 一 般 说 来 , Km 可 以 近似 地 表 示 酶 与 底 物 的 亲 合 力 。 测 定 Kin 值 是 酶 学 研究 中 的 一 个 重要 方法 。 Lineweaver-Burk 作 图 法 是 用 实验 方法 测定 En 值 的 最 常 用 的 比较 方便 的 方法 。 Lineweaver 和 Burk 将 米 氏 方程 改写 成 倒数 形式 : ee eee ee nV Isp oR 实验 时 选择 不 同 的 LS], 测定 相对 应 的 ”。 求 出 两 者 的 倒数 ， 以 对 TS 作 图 ， 则 得 到 一 个 斜率 为 Ka/F 的 直线 。 将 直线 外 推 与 横 轴 相交 , 其 横 轴 截 矩 为 一 -5T 一 去 -， 由 此 求 出 玫 。 值 。 这 个 [S] 方法 比较 简便 。 本 实验 以 胰 和 蛋白 酶 消化 酪 蛋白 为 例 采用 Lineweaver-Burk 双 倒 数 作 图 法 测定 Km 值 。 胰 和 蛋白 酶 是 胰 液 中 的 一 个 酶 , 它 催化 蛋白 质 中 碱 性 氨基 酸 (L- 精 氮 酸 和 工 - 赖 氨 酸 ) 的 羧基 所 形成 的 肽 键 水 解 。 水 解 时 生成 自 由 氮 基 ， 因 此 可 以 用 甲醛 滴定 法 由 判 断 自由 氛 基 增加 的 数量 来 起 踪 反 应 。 =, 87 1. 50 毫升 及 150 EF HEIR. 2. 25 SEF Way EE, 滴定 台 、 蝴 蝶 夹 。 3. 10 毫升 及 5 BHM. Q 甲醛 滴定 法 原理 参见 本 书 第 九 章 实验 七 。 146 - 4. 100 毫升 量 简 。 5. 恒温 水 浴 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 40 克 / 升 酷 蛋 白 溶 液 (pH8.5) 10,000 毫升 AO 克 栈 蛋白 溶解 在 大 约 900 毫升 水 中 , 再 加 20 毫升 1 摩尔 / Ft NaOH, 连续 振荡 此 悬浮 液 ， 微 热 直 至 溶解 , 最 后 用 1 摩尔 / 升 HCl ag 1 BEAR /F+}NaOH 调 到 pH8.5, 并 用 水 稀释 至 1 升 。 2， 胰 蛋白 酶 溶液 (40 52 /Fh) 2000 毫升 可 用 由 胰 脏 制备 的 粗 胰 和 蛋白酶 制剂 配制 并 放 人 冰箱 内 保 存 。 | 3. FAME We (400 ge / Ft) 500 毫升 4. WRK (2.5 克 / 升 乙醇 ) 200 毫升 5. tei: NaOH (#9 0.1 摩尔 / 升 ) 溶液 4,000 Ft 五 、 操 作 : 分 别 向 6 个 小 锥 形 瓶 中 加 入 5 毫升 甲醛 溶液 和 1 滴 酚 栈 并 滴 加 0.1 摩尔 / 升 标准 氨 氧 化 钠 溶液 直至 混合 物 呈 微粉 红色 。 所 有 锥 形 瓶 中 的 颜色 应 当 一 致 。 量 取 100 毫升 酷 蛋 白 溶液 , 加 到 一 锥 形 瓶 中 ， 在 37*C 水 浴 中 保温 10 分 钟 。 将 胰 蛋 白 酶 液 也 在 37°C 水 浴 中 保温 10 分 钟 。 然 后 精确 地 量 取 10 毫升 酶 液 加 到 酷 蛋 白 溶 液 中 (同时 记 时 ! ) 。 充 分 混合 后 , 随即 取出 10 毫升 反应 混合 物 (作为 零 时 的 样品 ) 吹 至 一 含 甲醛 的 锥 形 瓶 中 。 向 所 取 的 反应 混合 物 中 加 入 酚 本 (每 毫升 混合 物 加 入 1 滴 酚 栈 ), 用 0.1 摩尔 / 升 NaOH 滴定 直至 呈 微 弱 但 持续 的 粉红 色 , 在 接近 到 达 终 点 之 前 ， 再 加 入 指示 剂 每 毫升 氨 氧 化 钠 溶 INA 1 滴 酚 栈 )。 然 后 , 继续 滴 至 终点 ， 记 下 所 用 0.1 摩尔 / 升 氨 氧化 钠 溶 液 的 毫升 数 。 在 2、4、6、8 和 10 分 钟 时 , 分 别 取 出 10 毫升 消化 样品 , 准确 e。 147 。 地 照 上 法 操作 。 在 每 个 样品 中 滴定 终点 的 颜色 应 当 是 一 致 的 。 用 增加 的 滴定 度 对 时 间作 图 ， 测 定 初速 度 。 配制 不 同 浓度 的 酷 蛋 白 溶液 (7.5.10.15.20,30 克 / 升 ) 测 定 不 同 底 物 浓度 时 的 活力 。 用 实验 测 得 的 结果 , 以 二 对 F- 5- 作 图 , 求 出 忆 和 Km 的 数值 。 [Ss] 实验 十 五 “ 酶 浓度 对 酶 促 反 应 速度 的 a 用 分 光 光 度 法 测 定 碱 性 磷酸 酶 活性 一 、 目 的 : 1 学 习 制 作 酶 浓度 与 酶 促 反 应 速度 关系 曲线 。 2， 学 习 用 连续 法 测定 碱 性 磷酸 酶 活力 的 原理 和 方法 。 二 、 原 理 : 1， 酶 促 反 应 的 反应 速度 与 酶 浓度 成 正比 。 根 据 米 氏 公 式 人 “4 LSI>LEIN, WLEJ=(ES)], RAR PRE Knt+[8]’? = V=k, [EF]. _ LEIS] & ES] —KOFIS) Kat fal 当 [S] 保 持 不 变 时 ,了 cc[Z]。 2， 碱 性 磷酸 酶 (简写 AKP) ERE PA Ta RP. Ee 的 最 适 PH 在 9~10 之 间 ， 其 数值 随 酶 的 来 源 、 绥 冲 液 种 类 、 磷 酸 基 团 受 体 、 同 功 酶 组 成 . 底 物 浓度 等 因素 而 有 所 不 同 。 骨 骼 系统 和 肝胆 患 有 疾病 时 , 血清 AKP 增高 。AKP 作用 于 磷酸 酯 , 释放 无 机 磷酸 。 OH OH | AKP | R-O—P=O +H,0—>R-OH +HO—P=0 | | OH OH ° 148° | AKP 除 以 有 机 正 磷酸 酯 为 底 物 外 , 还 可 以 焦 磷 酸 酯 ， 偏 磷酸 ” 酯 为 底 物 。 常 用 产物 无 机 磷酸 或 R.OH 的 量 来 表示 AKP 的 活性 。 ”在 低温 下 AKP 比较 稳定 。 本 实验 采用 对 硝 基 酚 矶 酸 酯 (简写 PNPP) 为 底 物 。 在 碱 性 条 ，” 件 下 ,PNPP 经 AKP 水 解 所 产生 的 对 硝 基 酚 固 3 为 黄色 ; 在 420 Be ”微米 处 有 光 吸 收 峰 , 所 以 可 用 分 光 光 度 计 直 接 跟 踪 对 硝 基 酚 ,来 了 “ 。” 解 酶 促 反 应 的 进程 。 =, ae: 分析 天 平 。 ， 布 氏 漏斗 抽 滤 瓶 。 玻璃 水 泵 。 .分 光 光 度 计 (每 份 备 比 色 杯 [ 光 径 Icm]4~-6 A), 秒表 。 ， 加 样 器 (可 用 代用 器 具 )。 x é-pl tH. q 烘箱 。 ” LO. fib Be HE (Hevesi I Ca #9)» 11. pH 7A, 四、 试剂 和 材料 : a 1. 0.1 摩尔 / 升 pH10.0 碳酸 钠 -碳酸 氨 钠 缓冲 液 ”1500 毫 升 2. 50 微 摩 尔 / 升 对 硝 基 酚 标准 液 50 毫升 AHIR 69.5 毫克 对 硝 基 酚 ， 深 于 100 毫升 01 摩尔 / 升 ,pHI10.0 矶 酸 盐 缓冲 液 中 , 再 用 缓冲 液 稀 释 100 fF 3， 对 硝 基 酚 斐 酸 钠 C(PNPP 钠 盐 ) 溶液 250 ¥EFt D 对 硝 基 酚 在 酸性 条 件 下 无 色 , 在 碱 性 条 件 下 为 黄色 。 。149 。 (1) 对 硝 基 磷酸 钢 的 制备 : 称 取 13.9 克 对 硝 基 酚 , 溶 于 50 毫升 吡啶 中 。 另 取 9.7 毫升 三 SAAC (POCIs, IK PRAM ICE ME. CMRI, Rae 保存 , 不 宜 使 用 已 吸 潮 的 POCl。) 置 500 毫升 烧杯 中 , 逐 滴 加 入 ( 速 度 不 宜 过 慢 ) 对 硝 基 酚 吡啶 液 。 此 反应 有 刺激 性 烟雾 生成 , 应 在 通 | 风 橱 中 操作 。 边 加 边 用 玻 棒 搅 拌 。 抽 滤 去 吡啶 氯 化 物 (白色 固体 或 粘 稠 状 物 ) 后 , 向 反应 液 中 逐 滴 加 水 直至 无 发 热 反 应 为 止 ， 然 后 用 蒸馏 水 稀释 至 150 毫升 , 加 沸 热 氢 氧 化 饥 饱 和 液 至 反应 为 碱 性 (使 酚 栈 变 红 )。 此 时 已 有 沉淀 析出 。 加 等 体积 99 狗 乙醇 后 ， 置 冰箱 中 。 待 沉淀 完全 后 用 布 氏 漏斗 抽 滤 , 再 以 少量 (以 恰好 复 盖 沉淀 为 度 )50% 酒精 洗 沉 淀 一 次 。 最 后 再 以 无 水 乙醇 和 乙醚 各 洗 一 次 。 所 得 淡 黄色 沉淀 即 PNPP th (CeH,OsNPBa.2HO， 分 子 量 =390.4) 。 在 50°C 干燥 后 , 放 棕色 瓶 中 保存 。 (2) 5 毫 摩尔 / 升 PNPP 钠 盐 溶液 制备 : 称 取 98 毫克 PNPP Mth, 溶 于 约 25 毫升 蒸馏 水 中 ，( 可 加 数 滴 1 当量 / 升 HCI BY), MAL 1.1 毫升 1 当量 / 升 硫酸 溶液 以 沉 淀 Ba2+。 用 1 当量 / 升 氢 氧 化 钠 溶液 调 pH 至 3 一 3.5, 使 BaSO, 沉 淀 完 全 。 将 沉淀 液 在 冰箱 静 置 片刻 ， 过 滤 以 除去 硫酸 钢 。 向 滤液 Fp niki 1 当量 / 升 硫 酸 溶液 以 检查 Ba2+ 是 否 沉淀 完全 ， 然 后 用 少量 1 当量 / 升 氢 氧 化 钠 溶液 调 pH 至 7, 用 0.1 摩尔 / 升 pH10.0 碳 酸 盐 缓 冲 液 定 容 到 100 毫升 , 放 棕 色 瓶 中 保存 。 A, 3.3 单位 /毫升 碱 性 磷酸 酶 液 40 毫升 称 取 一 定量 碱 性 磷酸 酶 (1,100 单位 / 克 )， 用 0.1 摩 尔 / 升 pH 10.0 碳酸 盐 缓 冲 液 配 成 3.3 单位 /毫升 。 混 匀 ， 溶解 ( 勿 猛烈 振荡 ， 为 什么 ?), °C 保存 可 用 一 周 。 五 、 操 作 方法 : 1， 标 准 曲线 的 制作 : 用 50 微 摩尔 / 升 对 硝 基 酚 标准 液 ， 在 ° 150+ | 1 = ; 医 2.5 一 25 微 摩尔 / 升 范围 内 ,配制 一 系列 不 同 浓度 的 标准 液 (不 少 于 AH). 。 测 420 毫 微米 处 光 吸 收 值 。 以 光 吸 收 值 为 纵 坐 标 ， 对 ” 硝 基 酚 标准 液 浓 度 ( 微 摩尔 / 升 ) 为 横 坐 标 作 图 , 绘制 对 硝 基 酚 标准 | 曲线 。 2， 测 定 不 同 酶 浓度 时 的 反应 速度 。 (1) 取 比 色 杯 ( 光 径 1 厘米 )4 一 5 只 , 用 铅笔 在 毛 玻璃 面 标号 。 各 加 入 5 训 摩 尔 / 升 对 硝 基 酚 磷酸 钠 溶液 2 毫升 再 依次 向 各 杯 中 — IMA 0.1 摩尔 / 升 pH10.0 we mRER A HAR 1.9.1.8、1.7、1.6、1.5 和 1.4 毫升 ， 并 分 别 用 扁 头 玻 棒 上 下 搅拌 混 匀 (注意 ! 切 鼠 用 玻璃 棒 触 及 比 色 杯 的 透 光 面 )。 随 后 将 各 杯 放置 在 分 光 光 度 计 的 比 色 杯 架 上 ， 在 420 毫 微米 波长 下 调 定 堆 点, ( 即 加 酶 液 前 的 底 物 空白 ), 用 加 样 -器 (或 代用 器 具 ) 分 别 依 次 加 入 0.1.0.2.0.3.0.4 和 0.5 SFE 3.3 单 位 /毫升 的 AKP 液 , 在 加 酶 液 的 同时 , 开动 秒表 计时 ， 并 立即 用 扁 。 头 玻璃 棒 将 杯 中 溶液 混 匀 (这 步 操作 越 快 越 好 ， 每 次 的 搅拌 方式 ”也 应 保持 一 致 ) 。 每 隔 15 秒 记 录 一 次 光 吸 收 数值 ， 共 记录 三 分 钟 (如 仪器 不 稳 ; 第 一 次 读数 可 由 半分 钟 开 始 ) 并 记录 室温 。 (2) 以 各 杯 所 测 得 的 光 吸 收 值 为 纵 坐 标 , 以 时 间 为 横 坐 标 , 作 图 〈 是 否 都 为 通过 原点 的 直线 ? 为 什么 ?)。 利 用 对 硝 基 酚 标准 曲 线 求 出 每 条 直线 段 的 斜率 ， 即 在 相同 条 件 下 不 同 酶 浓度 反应 的 初 速度 (以 微 摩 尔 / 升 /分 表示 )。 (3) 用 不 同 酶 浓度 反应 的 初速 度 (用 光 吸 收 值 / 分 表示 ) 为 纵 坐标 ， 以 酶 浓度 (用 酶 溶液 的 毫升 数 表示 ) 为 横 坐标 作 图 。 将 所 给 。 制 的 曲线 与 前 图 比较 。 e 151° Soe NEALE A Bi AY itll A 及 活力 测定 一 、 目 的 : 学 习 胰 凝 乳 和 蛋白酶 (又 称 胰 糜 和 蛋 白 酶 ) 的 制备 和 活力 测定 的 原 理 及 方法 。 =, Re: 到 目前 为 止 ,已 知 的 酶 都 是 蛋白 质 , 因此 一 般 提纯 蛋白 质 的 方 法 也 适用 于 酶 的 提纯 ， 所 不 同 的 是 在 提纯 酶 的 过 程 中 要 不 断 地 进 行 酶 活力 的 检测 。 比 活力 是 指 单位 重量 的 蛋白 质 样 品 中 所 含 酶 活力 的 单位 数 。 随 着 酶 被 逐步 地 纯化 , 其 比 活力 也 逐步 地 提高 , 因此 ， 通 常 采用 测 定 酶 的 比 活力 的 方法 来 鉴定 酶 被 逐步 纯化 的 程度 。 本 实验 从 猪 胰 脏 中 提取 、 分 离 、 纯 化 胰 凝 乳 蛋 白 酶 。 采 用 酶 活 力 单位 数 /毫克 蛋白 质 样品 表示 酶 的 比 活力 。 用 福 林 (EFolin) 酚 试 剂 法 测定 样品 中 的 蛋白 质 含量 。 把 在 pH7.4， 温 度 25"C 时 ， 保 温 10 分 钟 能 使 底 物 酷 蛋 白水 解 出 10- 毫克 当量 酷 氨 酸 的 胰 凝 乳 蛋 白 酶 规定 为 工 个 活力 单位 。 栈 氨 酸 与 酚 试剂 作用 产生 蓝 色 ， 其 深 浅 与 酷 氨 酸 量 成 正比 ， 故 用 胰 凝 乳 蛋白 酶 催化 栈 蛋 白水 解 所 得 产 物 酷 氨 酸 的 多 少 来 判定 样品 中 胰 凝 乳 蛋白 酶 的 活力 单位 数 。 三 、 器 材 : 1 高速 组 织 的 碎 机 。 2. WEI), BET. BIT). 3. ER (50 毫升 和 100 SE Ft). 4, Bb, 5 毫升 刻度 离心 管 。 5 漏斗 。 。152 ， 6. 纱布、 棉线 。 7. Weis (10,5, 2.1.0.5 BF). 8. 玻 棒 及 滴 管 。 9. 透析 袋 。 10. BER. ll. 人 台秤、 分析 天 平 。 12. 离心 机。 13， 人 恒温 水 浴 。 14. 显微镜 载 玻 片 . 盖 玻 片 。 15. 分 光 光 度 计 。 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 新 鲜 猪 胰 脏 1-2 个 2. 0.25 当量 / 升 H.SO, 溶液 1,000 毫升 取 蒸 馏 水 200 SEF+, HA Me H.SO,7.0 毫升 , 然后 加 蒸 馅 水 至 1,000 毫升 。 3. 固体 (NH4) :SO， 40 4. 1%BaCl, wm 25 BEF} 5. 12M AIA 100 毫升 ; . 3 " ge es i 4 ff 二 eS - . i “ty - + 4 ne ‘ a PE ed oa s $ > a a as : ¥ Rate eae SY ee nn ae ples cel ° : nd ras “ ~ f ee. ag Fm, op a ge hg i agg i SE ee he Se se ae > sf = yng: eon 0 和 ot 所 Sate of > 二 BRERA 1.0 52, A pH8.0, 0.1 摩尔 / 升 磷酸 盐 缓 冲 液 100 3 Ft, 在 沸水 中 者 5 分 钟 使 之 溶解 ,冰箱 中 保存 。 6， 磷 酸 盐 缓冲 液 (0.1 摩 尔 / 升 , PH7.4) ”1500 毫升 ; 7. 10O%= MCB. 300 毫升 ， 8. 0.1 当量 / 升 NaOH 溶液 2,500 毫升 | 9， 碱 性 铜 溶液 1,500 3851 ; 甲 液 : 20 克 矶 酸 钠 、 4 克 氢 氧化 钠 和 0.1 克 酒 石 酸 钾 共 溶 于 ; 1,000 毫升 水 中 。 | a 乙 液 : 0.5 克 CuSO,-5H,O HF 100 毫升 水 中 。 o F553 。 临 用 前 按 甲 液 50 毫升 和 乙 液 1 训 升 比例 混合 。 此 溶液 可 用 一 日 。 10. 酚 试剂 1,500 Ft 见 本 书 第 十 一 章 实验 十 三 枯草 杆菌 蛋白 酶 活力 的 测定 。 11， 标 准 母 液 : 称 干燥 酷 氨 酸 115.9 毫克 溶 于 0.2 当 量 / 升 HC11,000 毫升 中 , 此 溶液 相当 于 40 单位 / 训 升 的 胰 凝 乳 蛋白 酶 溶 Ko 15 tas HE BE i BAN PA FEO: vy, | HU EOE LE a Me | 的 活力 数 配制 , 方 走 了 | (活力 单位 /2 毫升 ) 0 | 8 | 标准 母液 10 It + (0.2 当量 / 升 )HCL 90 毫 和 @ | 6 | DBM 20 BIt+ © SAMA 20 毫升 @ | 4 | © 3m FR 20 毫升 +(0.2 当量 / 升 )HCI 20 毫 天 @ | 2 | @@ 号 稀释 液 20 毫升 二 (0.2 当量 / 升 )JHCI 20 毫 和 @ | 1 | 加 号 稀释 液 20 毫升 十 (0. 2 当量 / 升 JHC1 20 毫 升 A. RFR: 1， 胰 凝 乳 蛋白 酶 的 提纯 : 整个 操作 过 程 在 O° —5°C 条 件 下 进 行 ， CD 提取 : 取 新 鲜 猪 胰 脏 ， 放 在 盛 有 冰冷 0.25 当量 / 升 H,SO, 的 容器 中 ， 保 存在 冰箱 中 待 用 。 去 除 胰 胜 表面 的 脂肪 和 结缔 组 织 - 后 , 称 重 。 用 组 织 的 碎 机 绞 碎 @。 然 后 混 悬 于 两 倍 体积 的 冰冷 0.25 当量 / 升 HSO, +, 放 冰箱 内 过 夜 . 将 上 述 混 悬 液 离心 10 分 钟 , 上 层 液 经 两 层 纱布 过 滤 至 烧杯 中 ; 将 沉淀 再 混 悬 于 等 体积 的 冰冷 标准 母液 由 准备 室 配制 , 母液 稀释 由 学 生 自 己 操作 。 Q 本 实验 共 分 两 次 做 。 第 一 次 做 胰 凝 乳 蛋白 酶 提纯 , 第 二 次 做 胰 凝 乳 蛋白 酶 比 活力 的 测定 。 CO) 此 步 允 可 根据 具体 情况 由 准备 室 做 或 由 学 生 分 组 做 。 。154 。 和 从 .... an 1 | wii ere, a me ee —. Son Je wh? ae _ 留 样 测 蛋白 质 和 酶 活力 。 Q ae: 提取 液 10 SH 加 固体 (NH4):SO41.14 克 , 达 0.2 饱和 度 , 放置 10 分 钟 , 离心 (3, 000 转 /分 ) 10 分 钟 。 | | 弃 去 沉淀 ”保留 上 层 液 取 7 毫升 , 加 入 固体 (NH):SO41. 323 克 , 达 0.5 饱和 度 ， 放 置 10 分 钟 , 离心 (3, 000 转 / 分 )10 分 钟 。 ee LI mite 溶解 于 3 倍 体积 的 水 中 ， 装 入 半 透 膜 透析 袋 , 对 pH5. 0, 0.1 摩尔 / 升 醋酸 缓冲 液 透析 两 天 (用 1 和 BaCl;, 检查 已 无 白色 BaSO, 沉淀 产生 ), 离心 5 分 钟 (3, 000 转 /分 )。 | 弃 去 沉淀 ”保留 清 滚 《变性 的 酶 蛋白 ) “| 加 (NH,);SO,(3.9 均 /10 毫 升 ) 达 0.6 饱和 度 , 放置 10 分 钟 , 离心 10 分 钟 (3, 000 转 / 分 )。 este fa CH ERE LAR aH @ 结晶 : 取 分 离 所 得 的 胰 凝 乳 蛋白 酶 溶 于 3 倍 体积 的 水 中 ， 取 0.5 毫 升 留 样 测 蛋 白质 和 酶 话 力 。 然 后 加 (NH4) SO4(1.44 克 / 10 毫升 ) 至 胰 凝 乳 蛋 和 白 酶 溶液 达 0.25 饱和 度 ， 用 0.1 当 量 / 升 NaOH 调节 pH 至 6.0, 在 室温 (25 一 30*C) 放置 12 小 时 即 可 出 现 结 晶 。 在 显微镜 下 观察 结晶 形状 。 2， 胰 凝 乳 蛋白 酶 比 活力 的 测定 。 © 样品 蛋白 质 含量 的 测定 。 (1) 蛋白 质 标准 曲线 的 制备 @ 准确 量 取 一 定量 的 人 血清 或 牛 血清 清 蛋白 用 凯 氏 定 氛 法 测定 其 蛋白 质 实际 含量 。 中 蛋白 质 标准 曲线 可 由 准备 室 提 供 。 ° 155° 0.25 当量 / 升 HSO, 中 ,再 离心 ， 将 两 次 上 层 液 合并 , 即 为 提取 液 。 q @ : 1 ; : ; 4 ; eee | ues | — 4 4 f 另 准确 取 10 se A fn tes BO AL A, FS Rk Yee i, 定 容 到 10 SEF. PEARSE PAC iil A hh PRK. 蛋白 质 原液 (毫升 ) | 蒸馏 水 (毫升 ) (1) 液 0.4 9.6 (2) wi 0.5 9.5 (3) 流 0.6 9.4 (4) 液 0.8 9.2 (5) i 1.0 9.0 取 试 管 6 支 , 编号 , 按 下 表 操 作 : yy | 1 2 3 | 4 | 5 6 标准 样品 (毫升 ) GD 液 2.o|(2) 液 2.o|(3) 液 2.o|(4) 液 2.0|(5) 液 2.0| — 蒸馏 水 (毫升 ) | ss | ve | ms £ 这 2.0 碱 性 铀 溶液 (毫升 ) | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 Zon tTt 2 im + kh H 20D Brin Hl (EFT) | 0.2 | 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混 匀 各 管 , 30 分 钟 后 ， 以 第 六 管 为 空白 管 ( 光 径 为 0.5 厘米 )， 在 波长 680nm 处 读 取 光 吸收 值 。 按 凯 氏 定 氮 法 测 得 的 蛋白 质 含量 , 算出 各 管 的 蛋白 质 浓度 , 以 此 为 横 坐 标 , 各 管 的 光 吸 收 值 为 纵 坐 标 作 图 , 得 标准 曲线 。 (2) 测定 样品 蛋白 质 含量 “1 We HE FL A A He HH A, 0.6 te AE (NH,) SO, 制 得 的 胰 凝 乳 和 蛋白 酶 B、 胰 蛋白酶 结晶 溶液 C、 分 别 用 pH7.4 0.1 摩尔 / 升 磷 酸 盐 缓 冲 液 黎 释 适当 倍数 中 QD 根据 经 验 提 供 以 下 稀释 倍数 仅 供 参考 A, B, C 分 别 稀释 200 倍 。 e。 156° 取 4 支 试管 , 编号 , 按 下 表 操 作 : we ee : Te [ms 样品 (毫升 ) = | oe, ee Ss WERK EF) | | | | mmm) | 20 | 20 | | 混 On F # @ + hk B 20 分钟 酚 试剂 (毫升 ) | 0.2 | 0.2 | 0.2 0.2 2.0 2.0 TAME, 放置 30 分 钟 , 测定 680nm 波 长 的 光 吸 收 值 (以 蒸 馅 水 调 零点 ， 光 径 为 0.5 厘米 )。 用 A、B 、C 各 管 的 光 吸 收 值 、 分 别 减 去 对 照 的 光 吸 收 值 , 然后 查 蛋白 质 标 准 曲线 , 得 出 每 毫升 稀释 样 _ 蝇 的 蛋白 质 含量 ， 再 计算 出 A.B、C 三 种 制剂 每 毫升 中 蛋白 质 的 含量 。 @ 样品 中 胰 凝 乳 蛋白 酶 活力 的 测定 ; C1) 制备 标准 曲线 @ 按 下 表 加 液 。 (4) 流 2.0 (2) 液 2.0|(3) 液 2.0 (1) 滚 2.0 0.1 当量 / 升 NaOH( 毫 升 ) | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 碱 性 铀 溶液 (毫升 ) | 2.0 2.0 | 2.0 | 2.0. | 2.0. | 2.0 酚 试 剂 ( 毫 升 ) 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 J, 放置 30 分 钟 , 测 680nm 光 吸 收 值 。 以 光 吸 收 值 为 纵 坐 标 ， 酶 活性 单位 为 横 坐 标 ， 绘制 标准 曲线 。 (2) 样品 中 胰 凝 乳 蛋 白 酶 活力 测定 : 中 可 由 准备 室 提供 。 ° 157" 将 上 述 三 种 制剂 (A、B、C) 分 别 用 pH7.4, 0.1 摩尔 / 升 磷酸 盐 缓冲 液 稀释 适当 倍数 中 。 取 试 管 四 支 , 编号 , 按 下 表 操 作 : 管 号 A B C | 对 照 1% Ree A (EFL) 1.0 1.0 1.0 一 pH7. 4, 0.1 摩尔 / 升 磷酸 盐 缓 冲 液 (毫升 ) | Weert weer oer 摇 4, it A 25°C 水 浴 中 10 4 样品 (毫升 ) | 1.0 | 1.0 1.0 1.0 摇 4), HR BE TR fk 10 4 BH 10% = RGR SEFt) 2.0 2.0 2.0 2.0 放置 10 eh ee. 取 试 管 4 支 , 编号 , 按 下 表 操 作 : 管 全 A B Cc 对 照 iE ( SEF) | 2.0 | 2.0 | 2.0 2.0 0.1 当量 / 升 NaOH 溶液 (毫升 ) 2.0 | 2.0 - 2.0 2.0 碱 性 铀 溶液 (毫升 ) | 2.0 | 2.0 2.0 | 2.0 酚 试剂 (毫升 ) | 0.2 0.2 0.2 0.2 7), 放置 30 分 钟 后 分 别 测 定 680nm HK ERM AA 馏 水 调 零点 )。 将 各 管 的 光 吸 收 值 分 别 减 去 对 照管 的 光 吸 收 值 , 然 后 查 标 准 曲线 ， 算 出 每 毫升 胰 凝 乳 和 蛋白 酶 稀释 液 的 活力 单位 数 。 由 计算 : 比 活力 三 胰 凝 乳 蛋白 酶 活力 单位 数 /蛋白 质 诸 殉 数 DQ 根据 经 验 提供 以 下 稀释 倍数 , 仅 供 参考 。A FE 400 倍 。B 稀释 800 倍 。C Mh FE 2,000 倍 。 以 上 稀释 倍数 可 根据 实验 具体 情况 确定 。 临 测定 前 再 稀释 。 * 158° 第 十 二 章 组 织 代谢 实验 十 七 ”“ 肌 糖 原 的 酵 解 作用 一 、 目 的 : 学 习 检定 糖 醇 解 作用 的 原理 和 方法 ， 了 解 糖 酵 解 作 用 在 糖 代 谢 过 程 中 的 地 位 及 生理 意义 。 ns Me | 肌 糖 原 的 酵 解 作用 , BULB ER ARE, 经 过 一 系列 的 酶 促 反 应 ， 最 后 转变 成 乳酸 的 过 程 。 它 是 糖 类 供给 组 织 能 量 的 一 种 方式 。 可 用 下 列 反应 式 表示 酵 解 作用 的 总 过 程 。 过 (CoHiO,+HO 一 >2CHCHOHCOOH 糖 原 FL — Abt FAIUL ps Be aL Pa He Bi ee Ey DE ESE HE. FAL 肉麻 时 , 实验 必须 在 无 氧 条 件 下 进行 ; FAL HEE, 则 可 在 有 氧 条 件 下 进行 。 因 为 催化 酵 解 作用 的 酶 系 全 部 存在 于 肌肉 提取 液 中 ， 而 三 羧 酸 循环 和 呼吸 链 的 酶 系统 则 集中 在 线粒体 中 。 糖 原 可 用 淀粉 代替 。 本 实验 用 乳酸 的 生成 来 检查 糖 原 或 淀粉 的 酵 解 作用 。 糖 类 和 蛋白 质 王 扰 乳酸 的 测定 。 在 除去 蛋白 质 与 糖 后 ， 乳 酸 可 与 硫酸 共 热 产生 乙 醛 , 后 者 再 与 对 羟基 联 苯 反 应 产生 紫红 色 物 质 。 此 法 比较 灵敏 , 每 毫升 溶液 含 1 一 5 微克 乳酸 即 可 检 出 O。 申 测定 时 所 用 的 仪器 应 严格 地 洗涤 干净 。 ° 159 « 人 ; va £ 。 Bit > i 14. i fej (LOE Fh) 、 试 剂 和 材料 - KAR . 0.5% 糖 原 溶液 (或 0.5% 淀粉 溶液 ) 80 毫升 液体 石 腊 ”100 SF} . 15% 偏 磷酸 溶液 80 毫升 ， 氢 氧化 钙 (粉末 ) 20 * ， 浓 硫酸 100 Ft . 饱和 硫酸 铜 溶液 50 26 Ft. 硫酸 铜 溶 解 度 为 20.7 Fe (20°C) 8，1/15 BE A / Ft BENGE ohne 200 EFF (1) 1/15 摩尔 / 升 磷酸 二 氧 钾 溶 液 : 称 量 9.07852 K HPO, ] 于 蒸馏 水 中 , 于 1000 毫升 容量 瓶 中 稀释 到 刻度 。 (2) 1/15 摩尔 / 升 磷酸 所 二 钠 溶液 : 称 量 11.876 eh ss 160 。 Ee i peer AO ie Ep: INS) peek NazHPO,.2H2O (或 23.894 克 Na,HPO,-12H,O) 溶 于 蒸馏 水 中 ， 于 1000 毫升 容量 瓶 中 定 容 到 刻度 。 1/15 摩尔 / 升 磷酸 缓冲 液 (PH7.4): 将 上 述 (1) 液 与 (2) 液 按 1: 4 的 体积 比 混合 , 即 成 为 pH7.4 的 缓冲 掖 。 9. 1.5% 对 羟基 联 茶 试剂 20 SEF: 称 取 对 羟基 联 茶 1.5 Su, 溶 于 100 毫升 0.5 多 氢 氧 化 钠 溶液 中 , AC LO DIA. AM 。 ” 基 联 汪 颜 色 较 深 ， 应 用 丙酮 或 无 水 乙醇 重 结晶 。 此 试剂 放置 时 间 。 长 久 后 , 会 出 现 针 状 结晶 , 应 播 匀 后 使 用 。 五 、 操 作 方法 : 1. ALA BER HI: 鼠 被 处 死 后 ， 放 血 。 立 即 割 取 死 鼠 背部 和 腿 部 的 肌肉 。 在 低 温 条 件 下 用 剪刀 把 肌肉 剪 碎 制 成 肌肉 麻 , 低温 保存 备用 (应 在 临 用 前 制备 ) 。 2. JUL PN BE AS Be FA (1) M4 ERE, WE. AMA 3 毫升 pH7.4 OEMS hy All 1 SEF} 0.5 GPE AI 或 0.5 匈 淀粉 溶液 )。 1 和 2 号 管 为 试验 管 ， 3 和 4 号 管 为 对 照管 。 向 对 照管 内 加 入 15% HORM AIR 2 Be 升 , 以 沉淀 蛋白 质 和 终止 酶 的 反应 。 然 后 在 每 支 试 管 中 加 入 新 鲜 肌 BE 0.5 克 , 用 玻璃 棒 将 肌肉 碎 块 打 散 , 挠 义 ， 再 分 别 加 入 一 藩 层 液体 石 腊 ( 约 1 毫升 / 管 ) 以 隔绝 空气 。 将 4 支 试管 同时 放 入 37°C 恒温 水 浴 中 保 齐 。 (2) 1 一 1.5 小 时 后 取出 试管 , 立即 向 试管 内 加 入 15% 偏 磷酸 溶液 2 毫升 并 混 匀 。 将 各 试管 内 容 物 分 别 过 滤 ， 弃 去 沉淀 。 量 取 每 个 样品 的 滤液 4 毫升 , 分 别 加 入 已 编号 的 试管 中 , 然后 向 每 管内 加 入 饱和 硫酸 铜 溶液 1 毫升 , HRD, 再 加 入 0.4 克 氢 氧化 钙 粉 末 , HE 上 橡皮 塞 后 用 力 振荡 。 因 皮肤 上 有 乳酸 勿 与 手指 接触 .放置 30 分 钟 , 并 不 时 振荡 , 使 糖 沉 淀 完 全 。 将 每 个 样品 分 别 过 滤 , 弃 去 沉淀 。 © 161° ae 3. FLAME HYD WN Ze : 取 4 支 洁净 、 干 燥 的 试管 , Fs AR ERR 1.5 SEAL AN 2 一 和 滴 对 羟基 联 茉 试剂 ， 混 匀 后 放 入 冰 浴 中 冷却 。 将 每 个 样品 的 滤液 0.25 毫升 逐 滴 加 入 到 已 冷却 的 上 述 硫 酸 与 对 羟基 联 雁 混合 液 中 , 随 加 随 播 动 冰 浴 中 的 试管 , 注意 冷却 。 将 各 试管 混合 均匀 , 放 入 沸腾 的 水 浴 锅 中 待 显 色 后 即 取出 , 比 较 和 记录 各 管 溶液 的 颜色 次 浅 , 并 加 以 解释 。 SEO NEHA Aa te BY 酶 活力 的 比较 : 一 、 目 的 : 1. 学习 分 光 光 度 计 的 原理 和 使 用 方法 。 2， 学 习 测 定 淀粉 酶 活力 的 方法 。 3， 了 解 小 麦 萌 发 前 后 淀粉 酶 活力 的 变化 。 =, RE: APT PETRA WOK IL A EEL TERETE. TERRE 使 淀粉 分 解 为 麦芽 糖 。 2(CeHioOa) , +nH,O—>nC,,.H2.01, SE HERE ATU YE, HELE 3,5-— Ek OREM tt) 3-2 基 5- 硝 基 水 扬 酸 。 后 者 可 用 分 光 光度 计 法 测定 。 COOH COOH | | —OH 还 原 一 OH | er; av, \ A SN ON NO， ON NH, 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 3- 氨 基 5- 硝 基 水 杨 酸 ( 棕 色 ) 休眠 种 子 的 淀粉 酶 活力 很 弱 , 种 子 吸 胀 萌动 后 , 酶 活力 逐渐 增 强 ， 并 随 着 发 匠 天 数 的 增长 而 增加 。 ° 162° > 和 观察 小 麦 种 子 十 发 前 后 后 汗 粉 酶 活力 的 变化 。 1, 25 毫升 刻度 试管。 2 吸管 。 3. $19k. 4. BoE. 5. 分 光 光 度 计 。 6. BED PL. 7. 人 恒温 水 浴 。 四 、 试 剂 : 1. 0.1 % bat EERE ATK 20 毫升 : 精确 称 量 100 BEE EME, 用 少量 水 溶解 后 , BEA 100 毫升 容量 瓶 中 , 加 蒸馏 水 至 刻度 。 2，pH6.9, 0.02 RE AR/ Ft BERR oye 100 毫升 : 0.2 摩尔 / 升 磷酸 二 所 钾 67.5 BFt +s 0.2 BEAR / Ft RRMA BF 82.5 毫升 混合 , 稀释 10 倍 。 3. 1% EBA 100 毫升 : 1 克 可 溶性 淀粉 深 于 100 毫 升 0.02 摩尔 / 升 磷酸 缓冲 液 中 , 其 中 含有 0.0067 摩尔 / 升 气 化 钠 。 4. 1%3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 200 毫升 : 1 克 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 溶 于 20 毫升 2 当量 / 升 的 氨 氧 化 钠 溶液 和 50 毫升 水 中 ; 再 加 入 30 克 酒 石 酸 钾 钠 , 定 容 至 100 毫升 。 若 溶液 混浊 , 可 过 滤 。 5. 1 多 氯 化 钠 溶液 300 毫升 6. 海 砂 5 克 | A, RS R: | 1. APSR HF: 小 麦 种 子 浸泡 2.5 小 时 后 ， 放 入 25°C 恒温 条 内 或 在 室温 下 用 HO, @ 小 麦 萌 发 所 需要 的 时 间 与 品种 有 关 , SRO, TE4EKRRAMAMR TAL. ‘ es。 163 ° 2， 酶 液 提取 Bu Ye Bes = Fea AVY AY Sh AE 15 株 , A FLEAS, 加 海 砂 200 毫克 , 加 1 RUE AAVA I 10 毫升 ,用 力 磨 碎 。 在 室温 下 放置 20 分 钟 ， 搅 拌 几 次 。 然 后 将 提取 液 离 心 (1.500 转 /分 )6 一 7 分 钟 。 将 上 清 液 倒 人 量 简 , 测定 酶 提取 液 的 总 体积 。 进 行 酶 活力 测定 时 , 将 酶 提 取 液 稀释 10 (8, 取 干 燥 种 子 或 浸泡 2.5 小 时 后 的 种 子 15 粒 作为 对 照 (提取 步 Walt). 3. RTE A WU: (1) 取 25 毫升 刻度 试管 4 支 。 编 号 。 按 下 表 要 求 加 大 各 试 剂 (各 试剂 须 在 25°C 预 热 10 分 钟 )。 1 | 2 3 | 4 干燥 种 子 ( 或 浸 | RFEKRY 泡 2. 5 小 时 后 ) | 天 幼苗 的 酶 提 | 标准 管 空白 管 FS Big HE He | 取 滚 酶 液 ( 毫 升 ) | 0.5 | 0.5 | 一 | 一 标准 麦芽 糖 溶液 (毫升 ) | ss ese | 05 | 一 1% tEW WIR SFr) | 1 | 1 , | 1 | 1 水 (毫升 ) | i - | - 0.5 将 各 管 混 匀 , 放 在 25°C 水 浴 中 , 保温 3 分 钟 后 , 立即 向 各 管 中 加 入 10 多 3.5- 二 硝 基 水 杨 酸 溶液 2 毫升 。 (2) 取出 各 试管 , 放 入 沸水 浴 中 加 热 5 Bh ABB ia, 加 水 稀释 至 25 Ett. HARTA. 1. FRR | 2. 发 芽 三 、 四 天 幼 的 酶 提取 液 Bay FD Pi BE He 500nm Ie lc tii | | | | - 164° | (3) 用 空白 管 作对 照 ; 在 500 毫 微米 处 @ 测 定 各 管 的 光 吸 收 值 , 将 读数 填 人 上 表 。 计算 根据 溶液 的 浓度 与 光 吸 收 值 成 正比 的 关系 , 即 : 全 一 ee 则 C( 酶 液 管 浓度 ) = Am Sen, “ 式 中 C 代表 浓度 ; A 为 光 吸收 值 。 | 本 实验 规定 : 25°C 时 3 分 钟 内 水 解 省 粉 释放 1 Ee BE OE 需 的 酶 量 为 1 个 酶 活力 单位 。 则 15 株 种 子 或 15 株 幼苗 的 总 活力 MA ft =Cy Xx ty X Vig ¢ Cog = BBB I TR BE Thy = BE TDR Pit EAS BC Va=te RR BAR. 实验 十 九 血糖 的 定量 出 十 Hagedorn-Jensen 二 氏 定 糖 法 一 、- 目 的 : 学 习 用 Hagedorn-Jensen 二 氏 微 量 滴 定 法 测定 血糖 含量 。 二 、 原 理 : 动物 血液 中 的 糖 主要 是 葡萄 糖 ， 其 含量 较 恒 定 。 健 康 家 免 的 ”血糖 水 平 为 80 一 120 毫克 多 。 用 硫酸 锌 和 和 氢 氧化 钠 除去 被 检 血 中 的 蛋白 质 制 成 无 蛋白 血 滤液 。 当 将 血 滤 液 与 标准 铁 氨 化 钾 溶 液 共 热 时 , 一 部 分 铁 握 化 钾 还 原 成 亚 铁 氰 化 钾 , 并 与 锌 离子 生成 不 溶性 化合物。 向 混合 波 中 加 入 磺 化 物 后 ， 用 硫 代 硫 酸 钠 溶液 滴定 所 释放 的 E 碘 。 即 可 知 剩 余 的 铁 氰 化 钾 量 。 血 糖 越 多 , 剩余 的 铁 氰 化 钾 越 少 , 所 ”加 如 用 光电 比 色 计 , 使 用 绿色 滤 光 板 。 * 165° 消耗 的 硫 代 硫 酸 钠 也 越 少 。 硫 代 硫 酸 钠 溶液 用 量 与 血糖 浓度 的 交 系 可 以 由 经 验 确定 下 来 的 数字 表 查 出 。 此 过 程 可 用 反应 式 表示 如 下 : 1. 还 原 反 应 : KsFe(CN)e+ 糖 一 >K,Fe(CN)e 十 糖 的 氧化 产物 。 2K,Fe(CN),.+3ZnSO,—~>K,Zn,|[ Fe(CN),]. ) 十 3K, SO， 由 于 产生 不 溶性 化 合 物 , 糖 的 还 原 反 应 进行 得 比较 完全 。 2， 用 碘 量 法 测定 剩余 的 标准 KsFe(CN) es 溶液: 2K,Fe(CN),+2KI+8CH,COOH—~> 2H,Fe(CN),+1, +8CH,COOK 2Na,8,0, + 1,—>2NalI+ Na.S8,0O, , Bat: 1. HEE. 2. 0.1 毫升 微量 吸血 管 。 3. PAB. 4A. 50x90 毫米 大 试管 。 四 、 试 剂 与 材料 : 1. 0.45 狗 硫酸 锌 溶液 (新 鲜 配 制 ) 250 毫升 2，0.1 摩 尔 / 升 所 氧化 钠 溶液 (新 鲜 配制 ) 50 毫升 3. 0.005 当量 / 升 铁 握 化 钾 碱 性 溶液 100 毫升 用 分 析 天 平 称 化 学 纯 铁 氰 化 钾 165 克 、 溶 解 后 加 入 预先 准备 好 的 烛 制 无 水 碳酸 钠 10.6 克 , 定 容 到 1 升 。 将 溶液 放 在 棕色 瓶 内 ， 于 阴暗 处 保存 。 | 4. Sh - FE sT Re : 200 毫升 取 硫 酸 和 50 克 及 纯 毛 化 钠 250 克 , 定 容 到 1 Ft, 作为 母液 。 临 用 前 根据 所 需 用 的 试剂 量 加 入 碘化钾 ， 使 它 在 混合 液 中 的 浓度 为 25 克 / 升 。 了 66 5， 标准 0.005 当量 / 升 硫 代 硫酸 钠 溶液 360 毫升 临 用 时 由 标准 0.1 当量 / 升 硫 代 硫酸 钠 溶液 稀有 释 。 6.3 狗 醋酸 溶液 (不 应 含 铁 ) 100 毫 升 7. 1 多 可 溶性 淀粉 溶液 20 毫升 1 克 可 溶性 淀粉 溶 于 10 毫升 沸水 中 ， 然 后 加 入 到 90 毫升 饱 ”和 和 氧化 钠 溶液 中 。 此 溶液 可 作为 大 多 数 硝 量 法 滴定 的 指示 剂 ， 可 | 长 期 保存 。 mm 8. &. Ay RAH: 1. MORE, AMMA 0.45% 硫酸 锌 5 毫升 及 0.1 摩尔 / 升 ，” 氢 氧 化 钠 溶液 1 毫升 , 此 时 产生 氨 氧 化 锌 胶 状 沉淀 。 2. 将 兔 耳 去 毛 后 ,用 二 甲苯 捧 拭 使 之 充血 。 用 棉 球 撩 干 ， 用 | 针头 刺 破 耳 静脉 并 迅速 用 微量 吸管 精确 地 吸取 血液 0.1 BETES HR 去 吸管 尖端 周围 的 血 。 将 血 吸 入 一 个 装 有 氢 氧 化 锌 的 试管 中 , 并 仔 细 地 用 吸入 和 放出 溶 沪 的 方法 洗 微 量 吸管 三 次 。 另 一 试管 中 加 入 0.1 著 升 蒸馏 水 为 对 照管 。 3. 将 两 个 试管 同时 放 入 沸 水 浴 中 。 准 确 老 沸 四 分 钟 后 将 二 试 管 的 内 容 物 用 滤纸 分 别 过 滤 到 两 个 大 试管 内 ， 用 共 馅 水 冲洗 沉 省 和 原来 的 试管 两 次 , 每 次 都 用 水 3 SEF. RRA UR IF TE— iz. 4， 问 每 个 试管 内 用 吸管 精确 地 加 入 标准 铁 氰 化 钾 碱 性 溶液 2 Ft, 一同 放 入 沸水 浴 中 煮沸 15 分 钟 员 。 5. 冷却 后 分 别 加 入 氯 - 锌 - 础 溶液 3 毫升 及 3 多 醋酸 2 Ft, 混 匀 。 各 加 淀粉 液 两 泣 。 用 标准 硫 代 硫 酸 钠 溶液 泣 定 至 蓝 色 消 失 为 止 。 六 、 血 糖 含 量 的 计算 : 中 ”如 无 大 试管 , 在 此 步骤 中 可 将 溶液 定量 转移 至 50 毫升 锥 形 瓶 中 再 滴定 。 2 oA Ea eS ee ee ee ee a =. = 根据 血糖 换算 表 将 样品 滴定 值 和 对 照 滴定 值 折 合成 糖 值 。 将 ” 此 两 糖 值 的 差 乘 以 1000， 即 为 100 es Ft in ey i Bid Be SE et BK 下 表 列 出 0.005 当量 / 升 硫 代 硫 酸 钠 溶液 的 用 量 ( 毫 升 ) 和 血糖 | 含量 (毫克 /区 升 ) 的 换算 关系 。 表 中 最 左边 纵 行 中 的 数字 是 滴定 时 消耗 .005 当量 / 升 硫 代 ， 硫酸 钠 溶液 的 毫升 数 的 整数 及 小 数 后 第 一 位 。 表 中 最 上 的 横行 代 、 表 其 小 数 后 第 二 位 数字 ， 表 中 交叉 点 的 数字 为 0.1 莹 升 血 液 中 所 OF Hil Hd BE HE be BL 0.06 | 0.07 | 0.08 | 0.09 0.0 0.385} 0.382 | 0.379 | 0.376 | 0.373 | 0.370 | 0.367 | 0. 364 | 0.361 | 0.358 0.1 0.355] 0.352 | 0.350 | 0.348 | 0.345 | 0.343 | 0.341 | 0.338 | 0.336 | 0.333 0.2 0.331) 0.329 | 0.327 | 0.325] 0.323 | 0.321] 0.318 | 0.316/ 0.314 | 0.312 0.3 0.310 | 0.308] 0.306] 0.304; 0.302 | 0.300 | 0.298 | 0.296 | 0.294 | 0.292 0.4 0.290 | 0.288] 0.286 | 0. 284 | 0. 282 | 0.280 | 0. 278 | 0. 276 | 0. 274 | 0.272 0.5 0.270 | 0. 268 | 0. 266 | 0. 264 | 0.262 | 0. 260 | 0. 259 | 0. 257 | 0. 255 | 0. 253 0.6 0.251] 0.249| 0.247 | 0.245] 0.243] 0.241 | 0.240 | 0.238 | 0. 236 | 0.234 0.7 0.232] 0.230] 0.228 | 0.226] 0.224 | 0.222/ 0.221] 0.219) 0.217) 0.215 0.8 0.213] 0.211] 0.209 | 0.208 | 0.206 | 0.204 | 0.202 | 0.200 | 0.199 | 0.197 0.9 0.195] 0.193 0.191] 0.190] 0.188] 0.186) 0.184] 0.182/ 0.181) 0.179 1.0 0.177) 0.175 0 173 | 0.172] 0.170 | 0.168] 0.166} 0.164} 0.163 | 0.161 1.1 Hh ene 0.154] 0.152] 0.150] 0.148] 0.146] 0.145] 0.143 1.2 0.141] 0.139] 0.138] 0.136] 0.134] 0.132] 0.131] 0.129] 0.127/| 0.125 1.3 0.124] 0.122] 0.120] 0.119] 0.117] 0.115] 0.113) 0.111 | 0.110 | 0.108 1.4 0.106] 0.104] 0.102} 0.101] 0.099 | 0.097 | 0.095 | 0.093 | 0.092 | 0.090 1.5 0.088] 0.086 | 0.084! 0.083) 0.081 | 0.079 | 0.077 | 0.075 | 0.074} 0.072 1.6 0.070 | 0.068 | 0 06 | 0.08 0.063] 0.061 | 0.059 | 0.057 | 0.056 | 0.054 1.7 0.052] 0.050 | 0.048! 0.047 |] 0.045] 0.043! 0.041 | 0.039 | 0.038 | 0.036 1.8 0.034 | 0.032 | 0.031 | 0.029 | 0.027 | 0.025] 0.024] 0.022 | 0.020) 0.019 1.9 0.017 | 0.015] 0.014] 0.012] 0.010 | 0.008 | 0.007 | 0.005 | 0.003 | 0.002 ¢ 168° rd —e ss eS Oe ee _ ~ 实验 二 十 ”胰岛素 对 血糖 浓度 的 影响 一 、 目 的 : 通过 观察家 免 注射 胰岛 素 前 后 的 血糖 浓度 变化 ， 了 解 胰岛 素 ”对 动物 血糖 含量 的 调 证 作用 。 =, RB: 人 和 动物 的 血糖 浓度 受 各 种 激素 的 调节 。 胰 岛 素 能 加 速 血糖 的 氧化 和 促进 糖 原 的 合成 。 皮 下 或 静脉 注射 胰岛 素 可 中 | 起 血糖 q 降低 。 5, 4H: y.. Ab ive 2. 了 吸管 。 3. AMAR. 4. 01 训 升 吸血 管 。 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 家 免 。 2. 市 售 胰 间 素 制剂 Clue 20 或 40 单位 )。 3. 1 单位 /毫升 胰岛 素 溶 该 . 12 38%t (FASS Se all Fis PE TT XC) | : 4, 二 甲 茶 溶液 20 Ft . 0.45% 硫酸 锌 溶液 (新 鲜 配 制 ) 500 毫升 .0.1 摩尔 / 升 所 氧化 钠 溶液 (新 鲜 配 制 ) 100 毫升 . 40 多 葡萄 糖 溶液 50 Ft . Hagedorn-Jensen 二 氏 定 糖 法 全 部 试剂 (其 量 为 实验 十 九 试剂 用 量 的 2 倍 )。 五 、 操 作 方 法 : GD aa O°. - Ea ° 169 » 1. 准备 已 饥饿 16 一 24 小 时 的 家 免 一 只 , 体重 为 2 一 3 公斤 。 2. 取 3 支 试管 ， 各 加 入 0.45 儿 硫酸 锌 溶液 5 毫升 和 0.1 摩 尔 / 升 氢 氧 化 钠 溶液 1 EFT, 混 匀 备 用 。 3. 回 第 1 支 试 管 中 精 确 加 入 兔 血 0.1 SH. 第 2 支 试 管 为 对 照管 ， 其 中 不 加 血液 ， 而 加 0.1 毫升 水 。 按 Hagedorn-Jensen 二 氏 定 糖 法 ( 见 实验 十 九 ) 测 定 血 糖 。 4. 按 每 公斤 体重 1 单位 胰岛 素 剂量 给 家 免 皮 下 注射 胰岛 素 。 1 小 时 后 ， 再 由 耳 静 脉 取 血 。 癌 第 3 支 试 管 中 加 入 0.1 SH Ki, 用 同 靶 测定 血糖 , 不 用 再 做 对 照 。 取 血 后 , 立即 癌 晶 腔 或 皮下 注射 25 % Fil a) PRK 10 毫升 ,以免 家 免 发 生 胰 岛 素性 休克 而 死亡 。 5. 比较 两 次 测定 的 数据 ， 计 算 注 射 胰岛 素 后 血糖 降低 的 百 分 率 。 实验 二 十 一 “发酵 过 程 中 无 机 磷 的 利用 一 、 目 的 : 1. 掌握 定 磅 法 的 原理 和 操作 技术 。 2. FAR RW EHP EBL BE MY TEAL =, RE: WE AL AE GE AE RAG SH HE Ee CR. REE 用 和 酵 解 作用 的 中 间 步 又 基 本 相同 。 在 酵母 体内 蔗糖 先 经 蔗糖 酶 水 解 为 葡萄 糖 和 果糖 ， 葡 萄 糖 和 果糖 在 发 酵 过 程 中 再 经 磅 酸化 作 用 和 其 他 反应 生成 各 种 磷酸 酯 。 AH Ye Fil FH FEL HS FANG TE es we PAR He A My BE We IT x-1, 2, 4~ SA: 2S Fy BR A BP De Fy De A ae eB ELA PoP FCB RA OL, FA Be eB LBP EL RA TE. =, aH: . * 170° .试管 及 试管 架 。 乳 钵 。 吸管 。 。 小 漏斗 。 滤纸 。 恒温 水 浴 。 分 光 光 度 计 。 锥 形 瓶 。 试剂 与 材料 : 新 鲜 啤 酒 酵母 500 克 蔗糖 50 克 . RRB 200 2 Ft sft Na, HPO, 12H,0120.7 克 ( 或 Na ,HPO,:+2H,O 60 克 ) 和 KKH.PO,20 克 溶 解 于 蒸馏 水 中 , EAE 1000 毫升 ， 在 冰箱 中 贮存 备用。 临 用 时 稀释 1 一 5 倍 。 4. 标准 磷酸 盐 溶液 500 Ft 将 磷酸 二 氧 钾 (KH,PO4) 在 110°C HE 2 小时， 在 干燥 器 中 冷 却 后 , 准确 称 取 0.1098 克 , 用 蒸馏 水 溶解 , 定 容 到 1000 EF, MA 每 毫升 溶液 含 25 微克 无 机 磷 的 标准 态 酸 盐 溶 该 。 全 FE) ¢ Go. BO ee 5. 5% 三 氯 乙酸 溶液 500 训 升 6. 6 当量 / 升 硫酸 和 2.5 狗 钥 酸 铵 等 体积 混合 液 “ 1000 毫升 a-1, Zs 4-B FLA ARTA 100 毫升 将 0.25 Fe ou-1, 2, 4- 氛 基 蔡 酚 磺 酸 , 15 克 亚 硫酸 氢 钠 及 0.5 Be 亚硫酸钠 溶 于 100 毫升 蒸馏 水 中 。 使 用 前 , 加 水 3 份 混合 均匀 。 五 、 操 作 方 法 : 1. 标准 曲线 的 制定 : 按 下 表 次 序 在 各 管内 加 入 不 同 量 的 标准 磷酸 盐 溶液 和 试剂 ， © 171° 充分 播 匀 后 于 37°C 水 浴 中 保温 10 分 钟 。 冷 后 ， 在 660 毫 微米 波 长 下 测定 光 吸 收 值 , 以 含 磷 总 量 为 横 坐标 , 光 吸 收 值 为 纵 坐 标 ， 绘 ， 制 标准 曲线 。 应 注意 , 不 可 待 各 管 都 加 完 -1, 2, 4- 氨基 蔡 酚 磺 酸 钠 溶液 以 后 再 同时 混 匀 。 应 加 一 管 , ROE, 保温 一 管 , 力求 各 管 的 无 机 磷 与 还 原 剂 反 应 的 时 间 严 格 一 致 。 标准 磷酸 盐 | 含 磷 量 | 蒸馏 水 | AMR HERR | a -1, 2, 4-2 溶液 2. BERL AH: 称 取 2 一 4 克 新 鲜 啤 酒 酵母 0 和 1 TERE RR, 放 入 研 钵 内 仔细 研 碎 。 加 入 5 毫升 蒸馏 水 和 5 SET ORMRER UTI. HIRE 移 至 50 毫升 锥 形 瓶 中 并 立即 取出 0.5 毫升 均匀 的 悬浮 液 ， 加 入 到 已 盛 有 3.5 毫升 三 氯 乙酸 溶液 的 试管 中 , HE, 作为 试 样 1。 将 锥 形 WEA 37°C 恒温 水 浴 中 , 每 隔 30 分 钟 取出 0.5 毫升 悬浮 液 , 立即 加 入 到 已 盛 有 3.5 毫升 三 氯 乙酸 溶液 的 试管 中 ， 播 匀 。 共 取 三 次 ”作为 试 样 2，3，4。 将 每 个 试 样 静 置 10 分 钟 后 用 干 滤纸 过 滤 以 分 别 取得 各 试 样 的 无 蛋白 滤液 。 注 意 在 每 次 吸取 悬浮 液 前 ， 将 锥 形 @ 在 本 实验 的 予 备 试验 中 , 应 首先 摸索 酵母 的 用 量 及 磷酸 盐 的 稀 酸 倍数 .这 取决 于 酵母 的 新 鲜 程 度 及 原 发 酵 液 中 无 机 磷 的 基础 含 磷 量 。 可 先 依 上 述 操作 做 一 试 样 1， 测 其 光 吸 收 值 ， 变 更 酵母 用 量 和 磷酸 盐 的 稀释 倍数 使 试 样 1 的 光 吸 收 值 在 0.5 左右 ， 如 此 测定 效果 明显 , 目测 也 可 分 辨 各 试 样 的 颜色 梯度 。 。1I72 。 . i | 瓶 中 的 混合 物 充分 摇 匀 。 3. 无 机 磷 的 测定 : We 5 支 洁净 干燥 的 试管 。 编 号 后 按 下 表 加 入 各 种 溶液 并 按 标 准 曲线 制 定 的 同样 方法 操作 ， 分 别 测定 各 管 660nm 的 光 吸 收 值 ， 各 管 均 应 作 一 平行 管 , 取 其 光 吸 收 的 平均 值 , 从 标准 曲线 上 查 出 各 试 样 的 无 机 磷 含 量 , 以 试 样 1 的 无 机 磷 含 量 为 100%， 计 算 酵 母 发 酵 30.60 和 90 分 钟 后 消耗 无 机 磷 的 相对 百分数 。 | 发 酵 时 间 | 无 蛋白 滤液 | 蒸馏 水 | HAMMER a -1, 2, 4- 氨 | 。 | 660nm 管 号 溶液 see at 37°C (分 ) | 《毫升 ) | (毫升 ) | cam | (毫升 ) | | emu 1 | 0 | oa( 斌 样 1) | 2.9 | | 0.5 es 2 a 0 fon 1( 试 样 2) | 7 ee | elles 3 | 60 | 0.1( 试 样 3) | 2-9 | | PS i 4 | 90 | o.1catea) | 2.9 | ea # 5 os = 3.0 2.5 | 0.5 实验 二 十 二 “脂肪酸 的 8- 氧 化 一 目的 : 了 解 脂 肪 酸 的 8- 氧化 作用 。 =, “RE: FESTIVE, 脂肪 酸 经 6- 氧化 作用 生成 乙酰 辅酶 A。 两 分 子 乙 «RR A 可 缩合 生成 乙酰 乙酸 。 乙 酰 乙 酸 可 脱羧 生成 丙酮 , 也 可 还 原生 成 B-FET RR. CAREC, P-PET RAIA LE BR 本 实验 用 新 鲜 肝 糜 与 丁 酸 保温 , 生成 的 丙酮 在 碱 性 条 件 下 , 与 碘 生 成 碘 仿 。 反 应 式 如 下 : 2NaOH+I1, —— NaOI+NalI+H,O ° 173° SS Ps ee”, nes Lee ae 2 eee CH,COCH,+3NaOI = 一 CHI, +CH,;COONa + 2NaOH 碘 仿 剩余 的 碘 , 可 用 标准 硫 代 硫 酸 钠 溶液 滴定 。 NaOI+ Nal+2HCl = — I,+2NaCl+H,O I,+2Na,S,0, —— Na,S,0O,+2Nal 根据 滴定 样品 与 滴定 对 照 所 消耗 的 硫 代 硫酸 钠 溶液 体积 之 “ 可 以 计算 由 丁 酸 氧化 生成 丙酮 的 量 。 三 、 器 材 : 1. 5 毫升 微量 滴定 管 。 2、 人 恒温 水 浴 。 。 3. 吸管 。 4. RET. 5. 50 毫升 锥 形 瓶 。 6. isk. 7. 试管 及 试管 架 。 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 大 白鼠 2.0.1 儿 淀粉 溶液 20 Ft 3. 0.9% 氯 化 钠 溶液 200 毫升 4, 0.5 当量 / 升 丁 酸 溶液 150 毫升 取 5 毫升 丁 酸 溶 于 100 毫升 0.5 当量 / 升 氢 氧 化 钠 溶液 中 。 5. 15% 三 毛 乙 酸 溶液 200 毫升 6. 10% 氢 氧 化 钠 溶液 150 毫升 7. 10% 盐酸 溶液 150 毫升 8. 0.1 当量 / 升 碘 溶液 200 毫升 ah 称 取 12.7 克 碘 和 约 25 WEAN L ARVAE 7k oh, ARPES) 1000 升 , 混 匀 ,用 标准 0.1 当量 / 升 硫 代 硫酸 钠 溶液 标定 。 © 174° G n. - ft eat ee OT ai ia ae 9. 标准 0.02 当量 / 升 硫 代 硫 酸 钠 溶液 500 毫升 临 用 时 将 已 标定 的 1 当量 / 升 硫 代 硫酸 钠 溶液 稀释 成 0.02 ) 当量 / 升 。 10. 1/15 摩尔 / 升 pH7.6 磷酸 盐 缓冲 液 200 毫 升 二 摩尔 / 升 磷酸 氢 钠 86.8 毫 Ft 5 REAR / FE RRR 二 氨 钠 13.2 | SHEA. 五 、 操 作 方 法 : 1. 肝 麻 制备， 将 大 鼠 颈 部 放血 处 死 , 取出 肝 胜 。 用 0.9% 毛 化 钠 溶液 学 去 污 血 。 用 滤纸 吸 去 表面 的 水 分 。 称 取 肝 组 织 5 克 置 | 研 钵 中 。 加 少量 0.9 匈 毛 化 钠 溶液 ， 研 磨 成 细 浆 。 再 加 0.9% AE 钠 溶 小 至 总 体积 为 10 Ft. 2. He 2 个 50 毫升 锥 形 瓶 ,各 加 入 3 毫升 115 摩尔/ 升 pH7.6 的 磷酸 盐 缓 冲 液 。 向 一 个 锥 形 瓶 中 加 入 2 ESET Rs 另 一 个 锥 形 瓶 作为 对 照 , 不 加 正 丁 醇 。 然 后 各 加 入 2 毫升 肝 组 织 糜 。 混 多 ， BF 43°C 恒温 水 浴 内 保温 。 3. 沉淀 蛋白 质 : 保温 1.5 小 时 后 , 取出 锥 形 瓶 ， 各 加 入 3 训 升 15% 三 氯 乙酸 溶液 , 在 对 照 瓶 内 追加 2 毫升 正 丁 酸 , RO, BE 15 分 钟 后 过 滤 。 将 小 液 分 别 收集 在 2 支 试 管 中 。 4. 酮 体 的 测定 :吸取 两 种 滤液 各 5 毫升 分 别 放 入 另外 两 个 锥 形 瓶 中 , 再 各 加 3 毫升 0.1 当量 / 升 碘 溶 液 和 3 AE FL 10% SUE ARR. TRA, 静 置 10 分 钟 。 加 入 3 SET 10 多 盐酸 溶液 中 和 。 | 然后 用 0.02 当量 / 升 标准 硫 代 硫 酸 钠 溶液 滴定 剩余 的 碘 。 滴 至 浅 ”黄色 时 , 加 入 3 滴 淀 粉 溶液 作 指示 剂 。 摇 勺 , 并 继续 滴 到 蓝 色 消失 。 记录 滴定 样品 与 对 照 所 用 的 硫 代 硫 酸 钠 溶液 的 毫升 数 ， 并 按 下 式 计算 样品 中 丙酮 含量 。 5. HR: © 175 ee. CEs ee. ee 肝脏 的 丙酮 含量 ( 毫 摩尔 / 克 ) = (4 一 B) x N w4,8,0,% A 在 上 式 中 为 镁 定 对 照 所 消耗 的 0.02 当量 / 升 硫 代 硫 酸 钠 溶 TRH EFT RK. . B 为 滴定 样品 所 消耗 的 0.02 4a / Ft ie RE PTA SET 数 。 Ns,8,0, 为 标准 硫 代 硫酸 钠 溶液 浓度 (当量 / 升 )。 实验 二 十 三 “” 精 氨 酸 酶 的 作用 is 目的 : 观察 肝 组 织 的 精 氨 酸 酶 活性 。 = 原理 : 精 氨 酸 酶 催化 精 氨 酸 的 水 解 , 生成 鸟 氛 酸 和 尿素 。 如 借 脲 酶 的 作用 , 使 尿素 分 解 成 二 氧化 矶 和 氮 ， 再 用 纳 氏 试剂 检定 生成 的 所 ， 可 间接 得 知 精 气 酸 酶 的 活性 。 NH, NH, | ret C 一 NH NH, (CH,) 3 精 氨 酸 酶 | NH +H,O C=O0O+HCNH, / (CH,) ‘ NH, COOH HCNH, 尿素 鸟 氨 酸 \ COOH WRB NH, | c=0+H,0 2 onu,+co, NH, 2NH,+-H,SO, —> (NH,).SO, : aA AH AT SAA RIE NMR DR, HA AAR AAR ER, HRP: Hg NH, + 2(K1) Hel, -+3NaOH—> 256 SNH hE AHA Be a +3Nal +-4KI+2H,O Hei AR MG He PH % 9.9, 但 在 生理 环境 pH 2 7.4 WY, 仍 有 很 强 的 活性 , 而 脲酶 的 最 适 pH 为 7.0， 所 以 本 实验 在 pH7.4 的 组 Thee EAT. : =, eM: 1. Conway KP axl. 2. 剪子 及 狠 子 。 3. ZR ae MUTE) 。 4 四 、 试 剂 和 材料 : l. KAR 2. 0.1 摩 尔 / 升 PH7.4 DEMS EEE hy 250 毫升 3. 0.02 当量 / 升 硫酸 溶液 80 毫升 4. 1% ARIBU 100 毫升 5. AR mie Hill 7 80 Ft 1 Seth MKB T 100 2 Ff} 0.1 BE AR / FE PH 7.4 we Re th B® ah WR, 放 冰 箱 保 存 。 6. 饱和 碳酸 钠 溶液 (20°C 时 碳酸 钠 的 溶解 度 为 17.8 克 ) 50 毫升 7。 纳 氏 (Nessler's) iA FIO 80 毫升 DQ 纳 氏 试剂 是 具有 腐蚀 性 的 有 毒 试 剂 ， 因 而 应 严格 遵守 有 关 毒 品 的 操作 规程 。 实验 后 应 充分 洗 净 它 所 沾 污 的 一 切 器 亚 。 ae ee 7 : 7 ‘ P “4 A . ? . . ’ 4 fea ‘ : vy 了 he eta Cr 称 取 5.8 Sea AR An 4 克 碘 化 钾 溶 于 25 毫升 水 中 , 再 加 入 25 毫升 6 当量 / 升 的 氢 氧 化 钠 溶液 。 如 产生 沉淀 . 静 置 片刻 后 将 上 部 清 液 倒 人 具有 橡皮 塞 的 棕色 瓶 中 , 贮 于 暗 处 备用 。 “ Ay REA: 1. 肝 匀 浆 的 制备 ， 称 取 大 白鼠 鲜 肝 组 织 1 克 ， 加 0.1 摩 尔 / 升 pH7.4 wERGHL AE whim 2 毫升 , 在 玻璃 勾 浆 器 内 打 成 匀 浆 ,再 用 缓冲 液 稀 释 至 30 毫升 (或 将 称 取 的 肝 组 织 置 于 洁净 研 钵 中 , 加 少量 0.1 HEAR / Ft pH7. AiR RR ERE Mee EE LAR, 再 用 缓冲 液 稀 有 释 至 30 BE Ft). HE, 用 纱布 过 滤 , 收集 滤液 。 | 取 肝 匀 浆 1 毫升 置 于 试管 中 , 者 沸 后 冷却 备用 。 2. Fp HM O2 只 , 做 好 标记 , 在 内 室 和 外 室 按 下 表 先 后 加 入 os 测 TT + Mf wz | 外 室 | | 外 宣 0.02 当 量 / 升 硫酸 (毫升 ) | 1 | pH7. 4 缓冲 液 (毫升 ) | se SN | = | 1 1 乡 精 氨 酸 (毫升 ) | | as BD EF) poe ee | 2 mo | 一 | — | 一 | 1 脲酶 溶液 (毫升 ) Pate te 1 Bese 1 @ Conway 氏 扩 散 亚 由 内 外 二 室 组 成 , 内 室 上 沿 较 外 室 略 低 ( 见 图 )。 实 验 时 在 外 室 中 加 入 饱和 碳酸 钾 ( 或 碳酸 钠 ) 溶 液 后 保温 ， 使 其 中 的 铵 盐 变 成 氨 气 逸 出 , 在 一 定 时 间 内 所 扩散 的 氨 可 全 部 被 内 室 所 放置 的 酸 液 吸收 。 NHz 十 HCO 一 > NHs 人 十 HzCOs © 178 « 攻 各 试剂 ( 勿 使 内 室 和 外 室 试 剂 相 混 ! ) 。 星 在 扩散 严 的 外 室 边沿 涂 上 凡士林 。 盖 好 磨砂 玻璃 盖 (磨砂 面 朝 下 ), 使 其 密封 。 将 扩散 四 放 在 桌面 上 并 轻 轻 转动 数 次 ， 使 外 室 内 容 物 混 匀 。 然 后 放 在 37°C 温 箱 中 保温 。 半 小 时 后 取出 。 将 盖 移 开 一 小 角 , 将 饱和 碳酸 钠 1 毫升 加 入 外 室 中 , 立即 加 盖 密 封 ， 轻 轻 在 桌面 上 转动 数 次 , 混 匀 。 再 置 于 37°C 温 箱 中 保温 ，20 分 钟 后 取 ， 出 ,各 加 纳 氏 试剂 1 毫升 于 内 室 中 , 比较 测定 亚 及 对 照 严 的 颜色 。 实验 二 十 四 ”氨基 移 换 反应 (一 ) 一 一 血液 中 转氨酶 活力 的 测定 (分 光 光 度 法 ) 一 、 目 的 : 了 解 转 氨 酶 在 代谢 过 程 中 的 重要 作用 及 其 在 临床 诊断 中 的 意 x, oF >) PETG DM ae AY Ee BE UH, © =, RB: 生物 体内 广泛 存在 的 氨基 移 换 酶 也 称 转氨酶 , 能 催化 %- BAPE «BRAY x- 氮 基 与 %- 酮 基 酸 的 ax- 酮 基 互 换 ， 在 氨基 酸 的 合成 和 分 解 尿素 和 嗓 叭 的 合成 等 中 间 代谢 过 程 中 有 重要 作用 。 转 氨 酶 的 最 适 pH 接近 7.4, 它 的 种 类 甚 多 , 其 中 以 谷 氮 酸 - 草 酰 乙酸 转氨酶 (简称 谷 草 转氨酶 ) 和 谷 氨 酸 -丙酮 酸 转 氨 酶 (简称 谷 丙 转 氨 酶 ) 的 活力 最 COOH COOH | COOH COOH — CH, | (GOT) CH, CH, 谷 草 转 氨 酶 CH, CH, + pe ey. ae H—C—NH, | C=O C=O H—C—NHs: | COOH | COOH COOH COOH ac- 酮 戊 二 酸 门 冬 氨 酸 谷 氨 酸 草 酰 乙酸 中 本 实验 分 两 次 完成 。 第 一 次 制作 标准 曲线 , 第 二 次 测 酶 活力 和 总 结 。 ° 179 e COOH 。 c- 酮 戊 二 酸 AAR 强 。 它 们 催化 的 反应 如 上 。 正常 人 血清 中 只 含有 少量 转氨酶 。 当 发 生 肝炎 ， 心 肌 梗 死 等 病 患 时 , 血清 中 转氨酶 活力 常 显著 增加 , 所 以 在 临床 诊断 上 转氨酶 是 活力 的 测定 有 重要 意义 。 测定 转氨酶 活力 的 方法 很 多 ， 本 实验 采用 分 光 光度 法 。 谷 两 转氨酶 作用 于 丙 氛 酸 和 wx- 酮 戊 二 酸 后 ， 生 成 的 丙酮 酸 与 2，4- 二 硝 基 茶 肝 作 用 生成 丙酮 酸 2, 4-— EE. COOH | EN 一 NH 一 A ) 1 XA : CH; ON NO, cool ci) Me a ESM peas | +H,0. CHs ON NO, 丙酮 酸 2, 4-— ASE AE Ihe tit Ab Pa Bea, BT AEE RES 测定 。 从 丙酮 酸 2, 4- ASE AN TREAY HE We ek, 可 以 计算 酶 的 活力 。 三 、 器 材 : 1. 试管 及 试管 架 。 2. 吸管 。 3. 人 恒温 水 浴 。 * 180。 4. 分 光 光 度 计 。 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 0.1 摩尔 / 升 磷酸 组 名 液 (PH7.4) ”250 EFF 2. 2.0 微 摩尔 /毫升 丙酮 酸 钠 标准 深入 40—5028 Ft 取 分 析 纯 丙酮 酸 钠 11 Se TA 50 oe Ft AR eR (4 日 配制 ) 。 3. 谷 两 转氨酶 底 物 15028 Ft | Reaper eti w- 酮 成 二 酸 29.2 毫克 ，DIL- 丙 氨 酸 1.78 克 置 于 小 性 烧杯 内 ， 加 :1 当量 / 升 气 氧化 钠 溶液 约 10 毫升 使 完全 溶解 。 用 1 攻 当量 / 升 所 氧化 钠 溶液 或 1 当量 / 升 盐酸 调整 pH 至 7.4 后 , 加 磷酸 | 缓冲 液 至 100 毫升 。 然 后 加 氧 仿 数 滴 防 腐 。 此 溶液 每 毫升 含 - 。 酮 戊 三 酸 2.0 微 摩 尔 , 丙 氨 酸 200 微 摩尔 。 在 冰箱 内 可 保存 一 周 。 A, 2.4-— Ae AE WEVA I 150 毫升 在 200 毫升 锥 形 瓶 内 放 人 和 人 分析 纯 2.4- 二 硝 基 苯 肝 19.8 毫克 ， 各 100 毫升 1 当量 / 升 盐酸 。 把 锥 形 瓶 放 在 瞳 处 并 不 时 摇动 ， 待 ” 2,4- 二 硝 基 茉 肝 全 部 溶解 后 , 滤 和 人 棕色 玻璃 瓶 内 ， 置 冰箱 内 保存 。 Be 0.4 当量 / 升 气 氧化 钠 溶液 1,200 Ft 6. 人 血清 五 、 操 作 方法 : 1 标准 曲线 的 绘制 : 取 6 支 试管 ， 分 别 标 上 0, 1, 2, 3, 4 5 六 个 号 。 按 下 表 所 列 的 次 序 添 加 各 试剂。 9 丙 南 酸 钠 标准 液 | 一 谷 丙 转氨酶 底 物 | 9.50 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 0.25 | 0. 45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 | 0.25 } 磷酸 缓冲 液 (0. 1 摩尔 / 升 ， pH7. 4) 2,4- 二 硝 基 葵 肝 可 与 有 酮 基 的 化 合 物 作 用 形成 苯 脉 。 底 物 中 。 的 w- 酮 戊 二 酸 与 2,4- 二 硝 基 茶 腓 反应 , 生成 Ae SE. 此 , 在 制作 标准 曲线 时 ， 须 加 入 一 定量 的 底 物 ( 内 含 o- MRA) 以 抵消 由 w- 酮 戊 二 酸 产 生 的 消光 影响 。 先 将 试管 置 于 37°C 恒温 水 浴 中 保温 10 分 钟 以 平衡 内 外 温 度 。 向 各 管内 加 入 0.5 毫升 2, 4- 二 硝 基 葵 腹 溶液 后 再 保温 20 分 钟 ， 最 后 , 分 别 向 各 管内 加 入 0.4 当量 / 升 氨 氧 化 钠 溶液 5 毫升 .在 局 室温 下 静 置 30 分 钟 , 以 0 号 管 作 空白 ， 测 定 520 训 微 米 的 光 吸 收 旺 值 。 用 丙酮 酸 的 微 摩 尔 数 为 横 坐 标 , 光 吸 收 值 为 维 坐 标 , 画 出 标准 ， 曲线 。 2， 酶 活力 的 测定 : 取 2 支 试管 并 标号 , 用 第 1 号 试管 做 为 未 知 管 , 第 2 号 试管 做 为 空白 对 照管 。 各 加 入 谷 丙 转 氨 酶 底 物 0.5 毫 Ft, BF 37°C 水 浴 内 10 分 钟 , 使 管内 外 温度 平衡 。 取 血清 0.1 毫 三 升 加 到 第 1 号 试管 内 , 继续 保 刘 60 分 钟 。 到 60 分 钟 时 , 向 两 支 试 管内 各 加 入 2, 4- 二 硝 基 葵 肝 试 剂 0.5 毫升 ， 然 后 再 向 第 2 号 试管 中 加 入 0.4 当量 / 升 氨 氧化 钠 溶液 SH. TES i PAE 30 分 钟 “ 后 , 测定 未 知 管 的 520 毫 微米 波长 光 吸 收 值 ( 显 色 后 30 分 钟 至 2 小 、 时 内 其 色 度 稳 定 )。 在 标准 曲线 上 查 出 丙酮 酸 的 微 摩尔 数 。 CA 微 摩尔 丙酮 酸 代表 1.0 单位 酶 活力 )。 计 算 每 100 毫 升 血清 中 转 氨 酶 的 活力 单位 数 。 实验 二 十 五 ”所 基 移 换 反 应 (二 ) 一 一 谷 琴 转氨酶 活性 的 测定 ( 纸 层 析 法 ) —, Bey: 学 习 应 用 纸 层 析 法 鉴定 氨基 移 换 反应 。 iS 一 、 原理 : * 182° “未 卖 验 观 察 肌 内 廉 中 谷 丙 转 氧 酶 所 催化 的 氨基 移 换 反 应 。 在 反应 后 异 纸 层 析 法 检查 底 物 谷 氨 酸 的 碱 少 和 产物 丙 氨 酸 的 生成 。 为 了 防止 丙酮 酸 被 肌 内 糜 中 其 它 的 酶 所 氧化 或 还 原 ， 在 反应 系统 中 加 入 了 抑制 剂 省 乙酸 。 三 、 器 材 : fie al 7). BY. BF 试管 及 试管 如。 吸管 。 oe ra : “2 离心 管 。 5: 7 Fe Mt: 8. 9: 离心 机 。 Se Fe UML. 毛细 管 。 Mit F air IG IEA (AE 13 厘米 )。 ， 了 吹风 机 。 aes 、 试 剂 : 1. aha nen 1% BANC A BP AD) 50 Ft 2. 1% PABRMe BAYA C1 % SUA IC BIA BCP A) 50 毫升 3. A. 0.025% — VCR (ACR) PA 25 Ft 0.1% 碳酸 氢 钾 溶液 。 25 毫升 CH 1% SAIL EA RP AD) 2 % Wits AS YAS RR 20 毫升 . 0.9% sa tt PAYA 100 Ft . 扩展 剂 一 一 酚 的 饱和 水 溶液 1000 毫升 将 2 份 酚 和 1 工 份 水 ( 按 重量 计算 ) 混合 后 , 放 人 入 分 液 池 斗 中 。 据 Me Hak 24 小 时 以 后 分 层 ， 将 下 部 酚 层 放 到 瓶 中 备用 (可 重复 用 。 183° PTY Pee eS ee ee Ae er a ee re = sa aad 4 wk), | 8， 显 色 剂 100 毫升 0.1% 7k 2 BH = RAND TE T BETA. JH Load 9. Fit FMB IAI (0.1%) 5 毫升 10， 标 准 丙 氨 酸 溶液 (0.1 狗 ) 5 Ft 11. 1 匈 氢 氧化 钾 溶 液 100 毫升 12. 海 砂 5 克 习 五 、 操 作 方 法 : 1. WARE HAs 大 白鼠 肌肉 1 HE 加 入 0.9 匈 氯 化 钠 溶 液 3 毫 “ Ft, 再 加 海 砂 200 毫克 。 在 低温 下 研磨 成 细 浆 ， 离心 (3000 转 /分 ，， 5 分 钟 ) 弃 去 沉淀 , 得 肌肉 糜 提 取 液 。 | 2. 向 两 个 试管 中 各 加 入 0.5 BH 1S RM IBM, 0.5 毫升 1% 丙酮 酸 钠 溶液 ，0.5 毫升 0.1 多 碳酸 氢 钾 溶液 和 0.25 毫升 0.025% 一 省 乙酸 溶液 , 混 匀 。 然 后 分 别 加 入 肌肉 糜 提 取 液 0.5 毫 ” 升 ， 混 匀 ， 立 刻 将 第 二 支 试管 在 沸水 浴 中 加 热 2 一 3 分钟 做 为 对 用 塞 子 塞 住 这 两 支 试 管 ， 同 置 45"C 温 箱 中 。 保温 1.5 小 时 ， 并 时 时 振荡 内 容 物 。 | 3. 保温 完毕 后 ,取出 试管 。 各 加 2 多 醋酸 溶液 4 滴 ， 放 沸水 浴 中 2 分 钟 使 蛋白 质 完全 沉 下 。 过 滤 试 管内 容 物 , 收集 滤液 , 留待 Bs 4. ACER: 取 培 养 耿 一个, 加 入 酚 水 饱和 液 约 工 厘米 (小 心 ! ” 酚 有 腐蚀 性 )。 取 圆 形 滤纸 一 张 , 在 滤纸 中 心 剪 一 小 孔 (直径 约 1] 一 2 ， 毫米 ) 并 以 圆心 为 中 心 约 1 厘米 为 半径 划一 圆 做 为 底线 。 在 此 底 线 上 ， 用 铅笔 点 4 个 原点 (等 距离 )。 标 明 1、2、3、4( 见 图 )。 用 新 配制 的 酚 扩展 剂 可 以 反复 使 用 一 周 。 + 184+ 莉 四 根 毛细 玻璃 管 分 别 吸取 以 上 两 种 滤液 和 标准 的 谷 氨 酸 和 丙 氨 酸 溶液, 依次 点 在 滤纸 上 标明 号 码 的 原点 处 , 用 吹风 机 吹 干 后 ， 再 重 复 点 样 2 一 4 次 。 注 意 四 点 的 大 小 应 尽量 一 致 , 其 直径 不 应 大 于 3 毫米 。 然 后 将 滤纸 平 放 在 含有 饱和 酚 液 的 培养 阵 上 。 另 取 一 滤纸 小 条 卷 成 简 状 , 直径 约 为 1 一 2 毫米 , 将 其 下 端 剪 成 刷 状 。 将 此 小 简 播 入 尖 纸 中 心 小 孔 ( 不 要 突出 于 纸 面 上 )， 使 滤纸 通过 此 小 简 与 酚 溶液 相连 。( 注 意 勿 使 滤纸 的 其 它 部 份 与 酚 溶液 接触 ) 用 大 小 相同 — 当 酚 溶液 扩展 到 距离 纸 边缘 约 1.5 厘米 时 ( 约 需 40 一 50 分 钟 )， 取 上 出 滤纸 。 用 锁 笔 划 下 酚 溶液 扩展 之 边缘 ， 并 用 热风 吹 干 。 用 喷雾 | 器 喷 上 小 合 草 三 酮 溶液 , 再 用 热风 吹 干 。 用 铅笔 圈 下 各 显 色 点 。 测 ， 定 各 显 色 点 的 Ry 值 , 由 各 点 的 Ry 值 分 析 实验 结果 。 。185 。 的 培养 亚 盖 在 滤纸 上 , 此 时 酚 溶液 即 由 滤纸 中 心 孔 向 四 周 扩展 。 lL eit ie ee i ers ) * eM eee Ee ee ee oe _ ”第 十 三 章 ， 柱 层 析 法 的 基本 训练 实验 二 十 六 “用 阳离子 交换 树脂 摄取 氧化 销 一 、 目 的 : 通过 用 用 离子 交换 树 此 摄取 所 化 销 的 实验 ， 学 习 离 子 交换 有 析 法 的 原理 和 基本 操作 技术 。 二 、 原 理 : ”离子 交换 层 析 法 是 利用 各 种 离子 对 交换 剂 的 亲 合 力 程度 不 同 “， ”而 达到 分 离 的 方法 。 本 实 SAU A HR CANE, tb 的 基本 训练。 三 、 器 材 : 1. 25 毫升 碱 滴定 管 。 2， 层 析 管 (1 厘米 x 20 厘米 )。 3. 1,000 毫升 恒 压 洗 脱 瓶 (可 用 分 液 漏 斗 或 下 口 瓶 代 用 。 人 参见“ 第 三 章 图 3 一 1)。 1 4， 锥 形 瓶 。 5. 烧杯 。 6， 玻 璃 棒 。 7. 吸管。 四 、 试 剂 和 材料 : 1， 强 酸 型 阳离子 交换 树脂 ; 磺 酸 型 各 200 3 ¢ 186° Ge ST EST vs -弱酸 型 阳离子 交换 树脂 (酚醛 型 )@ .10 毫克 /毫升 所 化 钠 溶液 240.38 Ft ， 标准 氨 氧 化 钠 溶液 (浓度 约 为 0.1 当量 / 升 ) 500 毫升 ， 酚 栈 指 示 齐 30 3571 5. 2 当量 / 升 盐酸 溶液 ee ee ee . 2244 / Ft SRL aN : 2000 2& Ft 五、 操作 方法 : (参见 第 三 章 ) ”将 干 的 强酸 型 树脂 水 浸 过 夜 或 挠 拌 2 小 时 ， 使 充分 溶 胀 ， 再 用 4 倍 体积 的 2 当量 / 升 的 盐酸 浸泡 1 小 时 或 搅拌 半 小 时 , 倾 去 清 液 ， 洗 至 中 性 , 再 用 2 当量 / 升 的 氨 氧 化 钠 溶液 处 理 , 作法 同上 , 最 后 用 2 当量 / 升 的 盐酸 如 上 法 处 理 , 使 成 为 氢 型 , 洗 至 中 性 待 用 。 将 氢 型 树脂 装 柱 , 当 柱 的 顶部 快 干 的 时 候 ， 加 入 10 训 升 10 克 / 升 的 .氧化 钠 溶液 , 使 流入 柱 内 。 待 溶液 的 弯 月 面 正 好 在 树脂 的 顶端 时 ， 用 水 洗 脱 。 收 集 40 毫升 洗 脱 液 。 用 0.1 摩尔 / 升 标准 氢 氧 化 钠 滴 _ 定 收集 的 洗 脱 液 。 计 算 钠 离子 的 交换 率 。 “Nas fein OV) ne 585609, N = 标准 氧 氧 化 钠 溶液 的 当量 浓度 。 F= 滴 定时 所 消耗 标准 氨 氧 化 钠 溶液 的 毫升 数 。 用 弱酸 型 阳离子 交换 树脂 重复 以 上 实验 ， 并 讨论 实验 结果 。 @ 也 可 以 让 二 半 学 生 使 用 强酸 型 离子 交换 树脂 , 另 一 半 学 生 使 用 弱酸 型 离子 交 换 树 脂 , 然后 比较 实验 结果 。 ”87 ， eee A en Pe BE Je HEL TRH CL 2 HY 328) 一 、 目 的 : 了 解 聚 丙烯 酰胺 盘 状 电泳 的 基本 原理 和 操作 技术 。 =, RB: SRA IEEE WE — BAT BIBS, A 和 少量 交 联 剂 在 催化 剂 和 加 速 剂 的 作用 下 发 生 聚 合 反 应 而 制 得 的 。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 具 有 网 状 结构 ， 其 网 眼 的 孔径 可 用 改变 凝 胶 液 中 单 体 的 浓度 来 加 以 控制 一般 分 离 蛋白 质 选用 7.5 多 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 , 分 离 比 较 大 的 分 子 , VBE AR PRT JL 2.5 多 凝 胶 。 凝 胶 电 泳 分 辨 力 较 高 。 “= 三 、 器 材 : -车 1， 电泳 仪 (600V) Be BEAR HL Dik He Dk A 2. LK BERS CAPER IR MODINE), At 5 一 7 Bk, K 80—100 4, - 3. 玻璃 架 ( 制 胶 时 用 来 垂直 插 放 玻璃 管 )。 4. 微量 注射 器 或 微量 吸管。 5， 带 长 针头 的 注射 器 。 65 AER. 7， 带 有 玻璃 珠 或 玻璃 棒 的 一 小 段 乳 胶管 。 。 四、 试剂 和 材料 和 血清 。 2. 迪 : 液 和 工作 溶液 : TEP AAC iil, 贮 液 及 工作 溶液 的 配制 9 100 毫升 溶液 中 的 含量 pH 工作 溶液 混合 比 1 当量 / 升 盐酸 48.0 毫 升 小 孔 凝 胶 ( 分 离 胶 ) Tris 36. 63% 1 份 1 号 贮 液 - ”TEMED 0.23 毫 升 2 份 2 号 贮 液 Acr ‘ a om ae: 1 份 水 Bis 0.7533 | 43 Sim “3s | dame ue pHs. 9, HERE? BE 7% 人 | 了 当量 / 升 盐酸 约 48 毫 和 AUER RAUB RE) 1 份 4 号 贮 液 Acr 10.0 克 6.7) 2 份 5 号 贮 流 Bis 2.5 克 1 份 6 号 贮 液 6 | BRR 4.0 毫 升 4 份 7 号 贮 液 7 | et 40.03% pH6. 7, BEEP BE 2.5%. 电极 缓冲 液 Tris 6. 03% 3 | Faas 10 t% 中 贮 滚 放 冰箱 中 一 般 可 保存 1 一 2 月 ， 3 号 贮 液 只 能 保存 一 周 。 如 有 不 溶 物 要 wie. 表 中 试剂 : Acr 一 一 丙烯 酰胺 ; 7 Bis 一 一 甲 又 双 两 烯 酰胺 ; TEMED 一 一 四 甲 基 乙 二 腕 ; Tris 一 一 三 羟 甲 基 氨 基 乙 烷 。 e 了 89。 Ay. RAK: 3 一 般 先 制 分 离 胶 , 再 在 分 离 胶 上 面 制作 浓缩 胶 。 1， 分 离 胶 的 制备 将 贮 液 由 冰箱 取出 等 达到 室温 后 再 按 上 表 中 的 比例 配制 工 ” 作 溶液 。 先 将 分 离 胶 液 与 过 硫酸 铵 分 别 放 在 真空 干燥 器 中 。 待 抽 出 溶解 的 空气 后 取出 , 赶快 混 匀 ; 用 带 长 针头 的 注射 器 吸取 一 定量 的 胶 液 , 沿 着 管 壁 加 到 预先 准备 好 的 玻璃 管 中 (玻璃 管 的 一 端 用 带 “ 有 玻璃 珠 或 小 段 玻璃 棒 的 乳胶 管 塞 住 ， 在 乳胶 管 中 加 二 滴 40 多 芯 糖 后 插 在 玻璃 架 上 ), 灌 入 的 分 离 胶 液 高 约 6.5 厘米 ;然后 立即 用 。 带 弯 针头 的 小 注射 器 在 已 加 入 的 分 离 胶 液 面 上 , 距 胶 面 约 0.1 厘 米 ” 处 沿 管 壁 缓 缓 加 入 3 一 5 毫米 高 的 蒸馏 水 层 , 切忌 使 加 入 之 水 呈 滴 ” ARS A BE, 这 样 会 使 顶部 凝 胶 浓度 变 稀 , 改变 凝 胶 孔 径 。 水 层 放 好 后 , 静 置 胶 液 使 进行 聚合 反应 。 正 常情 况 下 10 分 钟 ， 开始 聚合 , 应 控制 在 30 分 钟 到 .1 小 时 内 完成 聚合 刚 加 水 时 看 出 有 界面 , 后 逐渐 消失 。 1 A 胶 已 经 聚合 , 再 静 置 30 分 钟 使 聚合 完全 。 2， 浓 缩 胶 的 制备 用 注射 器 吸 去 分 离 胶 上 的 水 层 , 用 滤纸 条 吸 去 残留 的 水 液 ( 滤 纸 不 要 接触 胶 面 )。 按 比例 混 匀 浓缩 胶 液 〈 也 预先 抽 气 ， 抽 气 时 不 要 与 核 黄 素 混 合 , 抽 完 气 后 再 混合 ), 先 用 这 种 胶 液 很 快 漂洗 一 下 分 离 胶 的 顶部 ， 恒 除去 漂洗 液 后 ， 按 上 法 加 入 浓缩 胶 液 约 0.5—1 厘米 高 ， 并 立即 仔 了 细 加 水 层 。 然 后 在 距 管 10 厘米 处 用 日 光 灯 照射 进行 光 育 合 。 正 导 常情 况 下 照射 6 一 7 分 钟 就 可 看 到 浓缩 腕 显 乳 白色 ， 表 明 聚 合 开 ， @ 演示 时 , 教师 可 事先 做 好 胶管 , 演示 上 样 , 电泳 , 剥 胶 , 固定 染色 。 * 190° 量 ” 始 。 继 续 照 半 小 时 , 使 聚合 完全 。 [PRS AR, 吸 干 后 用 上 电极 槽 缓冲 液 洗涤 , 再 将 这 种 缓冲 液 加 | 至 管 顶 , 在 室温 放置 0.5 一 1 小 时 就 可 使 用 。 -浓缩 胶 应 在 临 用 前 再 制备 。 3.， 加 样 RAR DAC ERE AR, 用 1 毫克 /毫升 浓度 的 样品 液 每 管 需 5 一 100 微 升 。 ee | 使 空气 进入 , 再 拔 下 来 , 防止 将 凝 胶 拉 坏 。 下 槽 中 放 满 缓冲 液 ， 把 | 管 固定 在 上 覃 的 洞 中 , 要 保证 凝 胶管 垂直 和 橡皮 塞 孔 密 封 不 漏 管 | 的 下 端 且 上 一 滴 缓 冲 液 ， 再 把 上 槽 放 在 下 槽 上 ， 吕 免 管 下 有 气泡 。 | 管 中 凝 胶 表面 上 部 及 上 槽 灌 满 电极 缓冲 液 。 将 4 号 贮 液 1 份 ,水 3 份 , 20 狗 蔗糖 溶液 4 份 , 混和 , 然后 取 血 ， | 清 3 微 升 ,加 上 述 混 合流 0.15 毫 升 , 混 匀 后 小 心地 加 在 浓缩 胶 与 电 | 极 缓冲 液 界面 处 , 因 样 品 液 比 重大 , 即 平 铺 在 凝 胶 表 面 。 指示 染料 一 般 用 省 酚 蓝 或 酚 红 , 通常 每 管 加 O. 1 多 的 染料 溶液 0.005 毫升 , 指示 染料 与 样品 混合 后 加 入 。 4. Hiv 4 加 完 料 后 接 通 电源 , 负极 在 上 , 正极 在 下 。 调 节 电流 ， 开 始 时 上 用 1 一 2 BR, dk 1 一 2 分 钟 , 再 升 高 电流 到 约 3 一 5 毫 安 / 管 上 不 要 一 开始 电流 很 高 。 电流 最 好 不 超过 5 BE Re, 以 免 产 热 过 多 , 必 要 时 应 进行 冷却 或 在 冷库 内 进行 。 当 指示 拧 料 迁 移 到 凝 胶 柱 的 下 端 附近 时 就 可 停止 电泳 ， 关 闭 = 电源 , 取出 玻 管 。 F 缓冲 液 可 再 行使 用 , (ELL HY eA IA, 因 下 槽 缓冲 液 中 已 混和 人 催化剂 及 氯 离子 ( 快 离子 )， 如 将 它 当 作 上 槽 液 就 要 影响 电泳 效果 。 。191 。 —E————_ ee) os 7s, orn? 5， 凝 胶 的 取出 将 一 针头 长 约 10 厘米 的 注射 器 吸 满 水 .将 针头 插入 凝 胶 与 管 ， 壁 之 间 , 并 紧 贴 管 壁 ,一面 注入 水 一 面 慢 慢 旋转 琉 管 并 推 针 前 进 , 靠 ， 水 流 压 力 和 润滑 作用 使 玻 管内 壁 与 凝 胶 分 开 ， 待 水 从 玻 管 一 端 流 出 时 , 再 慢 慢 将 针头 退出 。 然 后 去 掉 针 头 , 用 注射 器 向 玻 管 中 快速 时 注射 水 , 将 凝 胶 压 出 玻 管 。 如 凝 胶 浓度 较 高 , 取出 困难 ， 可 用 10% 的 甘油 水 溶液 代 蔡 水 注入 。 一 般 录 胶 方 向 是 从 浓缩 胶 喘 开始 6. le foe 为 防止 凝 胶 柱 内 已 分 离 成 分 的 扩散 , 需 进 行 固 定 。 方 法 是 :把 剥 出 的 凝 胶 柱 浸泡 在 7 多 乙酸 或 12.5%% 三 氯 乙酸 的 水 溶液 中 几 分 ” 钟 ; 或 浸泡 在 用 7% 乙 酸 或 12.5% 三 氯 乙酸 液 配制 的 染色 液 中 , 同 时 进行 固定 和 染色 。 7. 染色 染色 的 操作 过 程 见 下 表 。 蛋白 质 的 染色 法 万 法 |] 固 ” 尖 eo 染色 时 间 Be 甲醇 用 0.1 当 量 / 升 气 氧 | 5 分钟 (室温 ) | 5% ZAR 化 钠 配制 的 -1 黎 氨 RER | 。 7 多 乙酸 | 基 黑 2 小 时 (室温 ) | 7% ZAR 用 7 区 乙酸 配制 的 | 0.5—-1% REM 104) ph( 96°C) 20 %o WE TKH | 0.25% R250 水 液 | 5 分 钟 (室温 ) | THOM osteo GRE MM | 0.5 小 时 (室温 10 色 三 氧 忆 本 SOM | os re ts HE 19:1(V/V ) 5% =KCR 5% TR KH AR AN | 1 小 时 (室温 ) | 90% PR 1% R250 19:1 6% 乙酸 6% 乙酸 中 1%2 G250 考 马 斯 蓝 G250 12.5 幼 三 氛 乙 酸 30 分 钟 ( 室 温 ) 64:36:1 12. 加 乙酸 个 0.1%G 10 分 钟 (室温 ) | 甲醇 -水 - 浓 氛 水“ 量 续 OR 方 法 al 染色 时 间 | Bm - Fonceau 12. samzmt p.wNaonepr zn] 2 aha) 5% CBM Else eae toa 7 le el Pececoraa ee Uy “离子 交换 柱 层 析 法 分 离 氨基 酸 一 、- 目的 : 尝 习 用 阳离子 交换 树脂 柱 分 离 氨基 酸 的 操作 方法 和 基 本 。 原理 。 二 、 原 理 : ”各 种 氟 基 酸 分 子 的 结构 不 同 ， 在 同一 PH 时 与 离子 交换 树 脂 ， 的 亲和力 有 差异 ， 人 和 | 三 、 器 材 : . Bere: 20 厘米 xl1 厘米。 试管 。 吸管 。 .和 恒 压 洗 脱 瓶 。 ， 部 分 收集 器 。 塘 磁 杯 。 电炉 。 . DIKE. oN DMR OM Pp 四 、 试 剂 与 材料 : 1， 葵 乙烯 磺 酸 钠 型 树脂 (强酸 1x 8, 100 一 200 目 , 可 用 上 海 华东 化 工学 院 产品 )。 2. 2 当量 / 升 盐酸 溶液 。 3. 2 当量 / 升 氨 氧 化 钠 溶液 。 = 4， 标 准 氨基 酸 溶液 。 天 冬 氨 酸 ， 赖 氨 酸 和 组 所 酸 均 配制 成 ?毫克 /毫升 的 01 当 4 量 / 毫 升 盐酸 溶液 。 5， 混 合 氨基 酸 溶液 将 上 述 天 冬 氨 酸 、 赖 氨 酸 和 组 氨 酸 各 溶液 按 1:2.5:10 的 比例 BAO, 6， 柠 楼 酸 - 氧 氧化 钠 -盐酸 缓冲 液 (PHS.8, 钠 离子 浓度 0.45 当量 / 升 ); 取 柠 榜 酸 (CeO;Hs.H:O)14.25 克 ,、 氢 氧化 钠 9.30 克 和 浓 盐 酸 5.25 毫升 溶 于 少量 水 后 , 定 容 至 500 毫升 , 水箱 保存 。 7. 显 色 剂 2 HAE SMA FE 75 毫升 乙 二 醇 单 甲 醚 中 ， 加 水 至 100 © 毫升 。 ”8.50% 乙 醇 水 溶液 。 Ay RAE: 1， 层 析 柱 的 准备 : 将 强酸 型 阳离子 交换 树脂 用 氢 氧 化 钠 处 理 成 Nat 型 后 洗 至 中 。 性 (处 理 方法 见 实验 二 十 六 ); 培 搓 一 小 时 后 装 成 一 个 直径 工大 米 ， q 高 16—18 厘米 的 层 析 柱 。 2， 氨基 酸 的 洗 脱 : 用 pH5.8 的 柠檬 酸 缓冲 液 流 洗 平衡 交换 柱 (装置 如 i). i ® #16 ULE: FESR, BTL PR STA I % 作 样品 , 上 样 量 可 略微 增 大 。 ° 1946 | 池 流 速 为 -0.5 毫升 /分 , 流出 液 达 。 床 体积 的 四 倍 时 即 可 上 样 。 由 柱 。 上 端 仔细 加 入 氨基 酸 混合 液 0.25 ” 一 0.5 毫升 , 同时 开始 收集 流出 液 。 ，” 当 样 品 液 弯 月 面 靠近 树脂 顶端 fet, ANZA A. 0.5 SEILER RE BEARER. RoR tbe as 。 月 面 靠 近 树 脂 顶端 时 。 再 加 入 0.5 | - 童 升 缓冲 液 。 如 此 重复 二 次 , 然后 用 滴 管 小 心 注入 柠檬 酸 缓冲 液 RAR Fe ES EBL 和 部 分 收集 器 相连 。 开 始 用 试管 (1:2.5:10V/V)0.27 毫升 。 洗 脱 液 离子 交换 柱 层 析 分 离 气 基 酸 混合 氨基 酸 的 洗 脱 曲线 层 析 柱 高 18 厘米 , 操作 压 72 厘米 , 流速 0.5 毫升 / 升 ， 收 集 量 1 毫升 / 管 。 室 温 15°C, LHRH: 天 冬 氨 酸 0.04 毫克 ， 赖 氨 酸 0.1 毫克 ， 组 氨 酸 0.4 毫克 ， 即 取 混 合 氨 基 酸 © 195. ee. oe gees Oe ee ee re ee Oe ae, oe A, PER ON ae eS ee ee “收集 洗 脱 液 , 每 管 收集 1 毫升 , 共 收 集 80 AEA. 3， 氮 基 酸 的 鉴定 : 向 各 管 收集 液 中 加 1 毫升 水 合 茄 三 酮 显 色 剂 并 混 勺 ， 在 沸水 “， 浴 中 准确 加 热 15 分 钟 后 冷却 至 室温 , 再 加 1.5 毫升 的 50 匈 乙醇 溶 液 。 放 置 10 分 钟 。 以 收集 液 第 二 管 为 空白 ”测定 570 毫 微米 波长 时 的 光 吸 收 值 。 以 光 吸 收 值 为 纵 坐标 , 以 洗 脱 体积 为 横 坐 标 绘制 洗 脱 ， 曲线 。 以 已 知 三 种 氨基 酸 的 纯 溶 液 为 样品 ， 按 上 述 方法 和 条 件 分 。 别 操作 ; 将 得 到 的 洗 脱 曲 线 与 混合 氨基 酸 的 洗 脱 曲线 对 照 , 可 确定 三 个 巍 为 何 种 氨基 酸 。 实验 二 十 九 ” 凝 胶 过 滤 法 测定 蛋白 质 分 子 量 一 、 BR: 1， 学 习 凝 胶 过 让 法 的 工作 原理 和 基本 操作 技术 。 2， 学 习 用 凝 胶 过 滤 法 测定 蛋白 质 的 分 子 量 。 二 、 原 理 : 4 KER ASE GR, SE ES 分 析 的 有 效 方法 之 一 ， 它 是 以 被 分 离 物 质 的 分 子 量 差异 为 基础 的 一 种 层 析 方法 。 此 类 层 析 的 固 相 载体 是 具有 分 子 得 作用 的 凝 胶 。 目 前 使 用 较 多 的 是 具有 各 种 孔径 范围 的 区 聚 糖 凝 胶 (商品 名 为 Se- phadex), 其 它 还 有 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 ( 商 品名 为 Biogel) 以 及 琼脂 精 凝 胶 ( 商 品名 为 Sepharose) , 葡 聚 糖 凝 胶 是 由 一 定 平均 分 子 量 的 葡 聚 糖 ( 右 旋 糖 ) 和 甘油 基 以 栈桥 (一 0 一 CH: 一 CH 一 CH: 一 0 一 ) 形 式 相互 交 联 形 成 的 = sve : 4 维 空洞 网 状 结构 。 是 一 种 不 溶 于 水 的 物质 。 通过 控制 交 联 剂 环 氧 气 “ 丙烷 和 葡 聚 糖 的 配 比 以 及 交 联 时 的 反应 条 件 可 控制 交 联 度 而 获得 。 196° M 具有 不 同 “网 腿 ? 的 凝 胶 。“ 网 眼 * 的 大 小 决定 了 被 分 离 物 质 能 够 自 由 出 入 凝 胶 内 部 的 分 子 量 范 围 。 它 们 可 分 离 的 分 子 量 从 几 百 到 数 、 十 万 不 等 。 凝 胶 过 滤 法 测定 蛋白 质 分 子 量 的 原理 参见 第 三 章 (五 ) 。 ”三 .器材 : 1， 层 析 柱 : 直径 2 一 2.5 厘 米 , 长 5060 厘米 或 直径 0.9 一 1.2 厘米 长 .100 一 150 厘米 的 玻璃 管 , 要 求 内 水 体积 大 于 100 毫升 。 本 】 实验 采用 直径 1.5 厘米 长 65 厘米 的 玻璃 管 。 玻 管 下 端 有 一 合适 的 胶 塞 ， 胶 塞 中 央 插 一 输血 针头 ( 截 去 庞大 的 端 部 ) 。 胶 塞 上 置 一 与 柱 内 径 同样 大 小 的 人 造 丝 或 尼龙 丝 填 片 。2， 恒 压 瓶 。3， 部 分 收集 器 。4 和 紫外 及 可 见 光 分 光 光 度 计 。5. MKB. 6 HEB j Hii 7. 内 径 稍 小 于 层 析 柱 的 长 玻璃 管 。 四 、 试 剂 : iL 葡 聚 糖 凝 胶 G200 2， 0.9 匈 氯 化 钠 溶液 3. 蓝 葡 聚 糖 2000 ARBRE HL: 细胞 色素 c( 市 售 针 剂 亦 可 , 分 子 量 11, 700), 9D 清 蛋白 ( 分 子 量 43, 000) 牛 血清 清 蛋白 (分 子 量 68, 000),-7- 球 蛋 白 分子量 165,000), 5 未 知 样品 :核糖 核酸 栈 五 、 操 作 方法 : @ 1. 凝 胶 深 胀 : 根据 预计 的 总 床 体积 和 所 用 干 胶 的 床 体积 ， 称 出 所 需 干 凝 胶 , 放 入 250 毫升 锥 形 瓶 中 , 并 根据 其 得 水 值 加 入 适量 中。 本 实验 所 用 时 间 较 长 , 教师 可 事先 装 好 柱 ， 并 用 0.9 色 的 NaCl 进行 流 洗 平 衡 。 演 示 时 可 仅 演 示 本 实验 一 部 份 内 容 ， 如 先 上 样 [样品 可 用 蓝 葡 聚 糖 ( 蓝 色 ) 或 细胞 ”色素 c( 红 色 ) 这 样 学 生 便于 观察 ]， 再 讲解 原理 及 实验 过 程 ， 最 后 将 洗 脱 液 进行 比 色 ， 标 出 本 样品 的 洗 脱 体积 。 也 可 用 蓝 葡 聚 糖 (10 毫克 /毫升 ) 与 重 络 酸 钾 (20 毫克 /毫升 ) 混合 液 0.5 毫升 上 样 , 然后 观察 红色 区 带 与 黄色 区 带 的 分 离 。 从 而 了 解 葡 育 糖 凝 胶 对 大 小 不 同 分 子 的 分 离 作 用 。 +: E925 a ee eee ee eee ee 的 蒜 馏 水 (水 可 略 多 一 些 ), 然后 置 于 沸水 浴 中 老 沸 5 相 时 , 浴 芭 至 2， 装 柱 : 按照 下 图 安装 柱 、 人 恒 压 瓶 及 部 分 收集 器 (可 以 悬挂 “ 一 垂 线 来 检查 柱 是 否 垂直 )。 LT Oe Be ak Ee 装 柱 前 将 溶 胀 的 凝 胶 减 压 抽 气 10 分 钟 以 除 尽 气泡 。 在 柱 内 先 注入 1/5—1/4 的 水 ， 再 插入 一 根 直 径 稍 小 的 长 玻 管 , 一 直到 柱 的 底部 , 然后 轻 轻 搅动 凝 胶 ( 切 勿 搅动 太 快 , 以 免 空气 PEA), 使 形成 均一 的 薄 胶 浆 , FERC ANS Be EBA EAL ERE 胶 开 始 沉降 时 打开 出 口 , 并 缓 缓 提起 长 玻 管 。 以 后 一 边 灌 凝 胶 ) 一 边 提升 玻 管 〈 长 玻 管 的 作用 是 可 以 减少 器 璧 效应 以 使 柱 装 得 比较 “ 均匀 。), 直至 液体 充满 整个 柱 时 再 将 玻 管 抽 出 . 柱 要 一 次 装 完 , 不 “ © 198 « 能 间歇 。 如 抽出 玻 管 后 凝 胶 尚 未 倒 完 ， 则 不 待 凝 胶 完 全 沉降 形成 胶 面 时 就 吸出 上 部 清 液 ; 用 玻 棒 轻 轻 搅动 上 部 凝 胶 , 再 继续 加 入 凝 胶 , 如 此 重复 ， 直 至 完全 装 好 为 止 。 待 凝 胶 沉 降 后 放置 巧 一 20 分 Bh, SRA 0.9 匈 毛 化 钠 溶液 的 恒 压 洗 脱 瓶 连接 , 开始 流动 平衡 。 此 “时 流速 不 能 太 大 , 必须 低 于 层 析 时 所 需 的 速度 , 在 平衡 过 程 中 逐渐 增加 到 层 析 时 的 速度 。 一 般 用 3 一 5 RR ARR HR he EE 就 可 以 了 。 3. 桩 的 检验 及 测定 外 水 体积 ” 称 取 2 一 3 毫克 蓝 葡 聚 糖 2000 溶 于 0.4 毫 升 0.9 多 所 化 钠 溶液 中 。 ”将 凝 胶 床 面 上 的 流体 吸 掉 ， 面 上 留 下 一 些 液体 从 柱 的 出 口 六 出 。 等 到 凝 胶 床 面 上 的 液体 正好 流 干 时 ， 用 滴 管 将 蓝 葡 聚 糖 加 到 ” 凝 胶 床 面 上 , 注意 不 要 破坏 床 面 。 要 从 床 面 中 央 开 始 加 , 逐渐 转 到 外 围 ; 要 避免 沿 柱 壁 镁 加 ， 以 免 样品 从 柱 壁 滑 下 (加 完 后 如 不 够 均 _ 多, 可 用 玻 棒 浅 浅 地 、 缓 缓 地 拉动 床 面 )。 待 其 正好 流 干 时 再 加 少 量 0.9 多 毛 化 钠 溶液， 等 到 六 干 后 再 加 0.9 多 氛 化 钠 溶液 ， 使 床 面 -上 液体 高 度 不 小 于 5 厘米 。 这 样 帝 和 人 洗 脱 液 时 不 会 冲动 凝 胶 床 面 。 然后 接 上 洗 脱 瓶 进行 洗 脱 。 同 时 用 部 分 收集 恬 收 集 洗 脱 液 ( 上 完 样 后 立即 开始 收集 ),， 流 速 控制 在 1 毫升 /2 一 3 分 钟 。 注 意 观 察 蓝 色 ”区 带 向 下 移动 的 情况 , 如 前 治平 齐 , 区 带 均匀 , 说 明 柱 是 均匀 的 , 可 以 使 用 。 在 蓝 葡 聚 糖 全 部 流出 柱 后 ， 用 610 毫 微米 波长 测定 各 管 之 光 吸收 值 , 其 洗 脱 体积 (至 峰值 管 的 洗 脱 液体 积 ) 即 为 柱 的 外 水 体积 。 4 标准 曲线 的 制作 中 中 ”标准 曲线 的 测定 方法 有 两 种 。 一 种 是 上 柱 样 品 中 一 次 包括 几 个 标准 蛋白 质 ， 洗 脱 后 分 出 相应 的 几 个 峰 。 根 据 峰 顶端 的 洗 脱 体积 算出 各 标准 蛋白 质 的 Ve/V。 这 样 一 次 走 柱 就 能 测 出 一 条 标准 曲线 。 将 已 知 的 蛋白 质 走 完 后 , 再 在 混合 样 品 中 加 入 未 知 样品 , 走 柱 后 出 现 的 新 峰 就 属于 未 知 样品 。 这 种 方法 叫做 内 播 法 。 另 一 种 方法 是 走 柱 一 次 测定 一 个 标准 蛋白 质 , 经 几 次 走 柱 画 出 标准 曲线 ， 然 后 再 测 未 知 样品 。 这 种 方法 叫做 外 播 法 。 本 实验 采用 外 揪 法 。 人， 称 细胞 色素 c, 卵 清 蛋白 、. 牛 血清 清 蛋白 及 )- 球 蛋白 各 2 一 3 毫 oh, 分 别 溶 于 0.4 一 0.5 毫升 0.9 狗 氯 化 钠 溶液 中 ， 然 后 如 洗 脱 蓝 葡 聚 糖 那样 分 别 上 样 、 洗 脱 , 收 集 , 并 用 230 毫 微米 测定 (细胞 色素 c ” 也 可 用 410 毫 微米 测定 ) 。 求 出 V。 如 用 280 训 微 米 测 定 则 样品 应 为 5 毫克 。 画 出 洗 脱 曲 线 ， 算 出 每 一 种 蛋白 质 的 Ve/ Vo, PALA Ve/Vo 对 1gM 作 图 。 5， 未 知 样品 的 测定 | 3 称 取 未 知 样品 2 一 3 毫克 , 溶 于 0.4 一 0.5 BF 0.9% 所 化 钠 深 A 液 中 。 用 同样 方法 ， 测 出 其 V。 计算 V。/V。 再 在 图 上 找 出 对 应 的 18M 值 , 从 而 求 出 M。 实验 三 十 “血红 蛋白 的 两 性 解 离 一 、 目 的 : Se . RE: 蛋白 质 为 两 性 电解 质 。 ARS Oe 影响 。 可 以 通过 血红 蛋白 在 电场 中 的 行为 证 明 〈 血 红 和 蛋白 的 等 电 点 是 6)。 、 器 材 : l. 2 个 避 形 玻璃 管 (直径 1 a 2.0 厘米 ， 两 端 圆 心 距离 为 5 厘米 ) 。 2. 4 条 铂 丝 (直径 0.5 厘米 ， 长 12 一 13 厘米 , ) 其 涯 入 溶液 的 一 端 折 成 8 一 10 个 螺旋 共 约 工 厘米 长 。 3. 1 或 2 台 直 流 整流 器 。 4, 4 条 导线 (红色 2 条 , 黑色 两 条 )。 * 200。 5. 工人 个 铁 架 台 。 6. 2 个 铁 试 管 夹 。 7. 2 个 双 顶 丝 。 8. 1 块 白色 挡 板 。 四 、 试 剂 及 材料 : 1. 0.2 当量 / 升 盐酸 溶液 2. 0.2 当量 / 升 氢 氧化 钠 溶液 3， 全 血 ( 放 冰箱 中 可 保留 旧 )4.5 多 柠 楼 酸 钠 溶液 五 、 操 作 方法 : 1， 将 0.8 毫升 全 血 放 在 100 VIA, Serer y 升 。 混 匀 后 , 取 其 中 40 毫升 转移 至 另 一 量 简 中 。 向 两 个 量 简 中 分 别 加 入 0.75 毫升 0.2 当量 / 升 的 盐酸 溶液 及 0.2 当量 / 升 的 氨 氧 化 PIF. 2. HATS UBER CERRG LE. 把 酸化 的 血液 和 碱 化 的 备 液 分 别 转移 至 两 个 U 形 管 中 。 在 U 形 管 的 两 端 插入 FH th. 铂 电极 的 下 端 应 浸入 溶液 。 铂 电极 通过 导线 与 整流 器 相 接 。 联 接 方式 见 图 。- a, 3， 当 电压 为 250V Ha ity 20mA Pt, 29 104) Bh Fe Ain AR 在 电场 中 有 明显 的 流动 。 酸 管 阳 ( 正 ) 极端 的 血液 逐渐 明亮 起 来 ，” 另 一 极 出 现 棕色 沉淀 , 而 碱 管 发 亮 的 一 端 出 现在 阴 ( 负 ) 极 O， 这 说 明 血 红 蛋 白 在 酸性 条 件 下 解 离 成 阳离子 , 在 电场 中 移 向 阴极 ; 在 碱 性 条 件 下 解 离 成 阴离子 ， 在 电场 中 移 向 阳极 。 血 红 蛋 白 因 酸 碱 条 件 不 同 可 以 解 离 成 带 有 不 同 电荷 的 离子 因而 是 两 性 电解 质 。 实验 三 十 一 “紫外 分 光 光 度 法 测定 核酸 的 含量 一 、 目 的 : 1， 了 解 紫外 分 光 光 度 计 的 基本 原理 和 使 用 方法 。 2， 学 习 用 紫外 分 光 光度 法 测定 核酸 含量 的 原理 和 操作 方法 。 二 、 原 理 : 核酸 、 核 背 酸 及 其 衍生 物 都 具有 共 斩 双 键 系统 ， 能 吸收 紫外 光 。RNA #1 DNA 的 紫外 吸收 高 峰 在 260 毫 微米 波长 处 。 一 般 在 260 毫 微米 波长 下 ， 每 毫升 含 1 微克 DNA 溶液 的 光 吸 收 值 约 “ 为 0.020， 每 毫升 含 1 微克 RNA 溶液 的 光 吸 收 值 为 0.022。 故 测 RK HE RNA 或 DNA 溶液 260 毫 微米 的 光 吸 收 值 即 可 计算 、 “出 其 中 核酸 的 含量 。 此 法 操作 简便 ， 迅 速 。 若 样品 内 混杂 有 大 量 的 核 背 酸 或 蛋白 质 等 能 吸收 紫外 光 的 物质 , 则 测定 误差 较 大 , 故 应 设法 事先 除去 。 =, 2H: l. DRE, 2， 离 心机 。 中 “如 在 形 管 后 衬 白色 挡 板 则 观察 效果 更 为 明显 。 -¢@ 202 。 ” 3， 容量 瓶 。 4, 紫外 分 光 光 度 计 5 吸管 。 6， 冰 浴 或 冰箱 。 四 、 试 剂 : l. 5—6% Bk 2. FAM MRI (沉淀 剂 );， 如 配制 200 毫升 可 在 193 毫升 蒸馏 水 中 加 入 7 毫升 70 多 高 毛 酸 和 0.5 SE FANE ”五 、 操 作 方法 : 1， 用 分 析 天 秤 准确 称 取 待 测 的 核酸 样品 500 毫克 , 加 少量 蒸 馏 水 调 成 糊 状 ; 再 加 入 少量 的 水 稀释 。 然后 用 5 一 一 6 多 氨水 调 至 pH7, 定 容 到 50 毫升 。 wD. RAY ELD eS, AA 支管 内 加 入 2 毫升 样品 深 “ie fa 2% FARK; 向 第 二 支管 内 加 入 2 毫升 样品 溶液 和 2 毫升 沉淀 剂 , 以 除去 大 分 子 核酸 作为 对 照 。 混 匀 。 在 冰 浴 或 冰箱 中 放置 30 分 钟 后 离心 (3000 转 / 分 , 10 分 钟 ) 。 从 第 一 第 二 管 中 分 别 吸取 0.5 毫升 上 ，， 清 液 ， 用 蒸馏 水 定 容 到 50 毫升 。 用 光 程 为 1 厘米 的 石英 比 色 杯 ， | 于 260 毫 微米 波长 处 测 其 光 吸 收 值 (A, 和 Ae). 六 、 计 算 : Ai 一 A， Pea int Ws OG (Pe _ 0.020 (8% 0.022) x 100 DNA (RNA) 9 = ee GREED 一 (A 表示 光 吸 收 值 ) 样品 浓度 二 500 毫克 0.5 10° 微克 50x xt = ane . 10 毫升 | =50 meen AUR CAA 55 a ES Ae Sits AS > RTS EF RY 9 AER ¢ 203 « 多 核 苷 酸 ， 即 可 将 样品 配制 成 一 定 浓度 的 溶液 (20 一 50 微 克 / 毫 升 ) 在 紫外 分 光 光度 计 上 直接 测定 。 实验 三 十 二 ”透析 实验 (一 ) 一 蛋白质 的 透析 一 、 目 的 : 学 习 透 析 的 基本 原理 和 操作 。 二 、 原 理 : 蛋白 质 是 大 分 子 物 质 ， 不 能 透 过 透析 膜 而 小 分 子 物质 可 以 让 由 透 过 。 4 在 分 离 提纯 蛋白 质 的 过 程 中 ， 常 利用 透析 的 方法 使 委 自 质 与 其 中 夹杂 的 小 分 子 物质 分 开 。 三 、 器 材 : 1 透析 管 或 玻璃 纸 。 烧杯 。 玻璃 棒 。 电磁 搅拌 器 。 ， 试管 及 试管 架 。 四 、 试 剂 : 1， 蛋 白质 的 氯 化 钠 溶液 三 个 除去 卵黄 的 鸡 卵 蛋 清 与 700 毫升 水 及 300 BEF Ht Ange te 钠 溶液 混合 后 , 用 数 层 干 纱布 过 滤 。 2. 10% 硝酸 溶液 3. 1 多 硝酸 银 溶液 4，10 匈 所 氧化 钠 溶液 5. 1 多 硫酸 铜 溶液 五 、 操 作 方 法 : 。204 ， ow eo 1， 用 和 蛋白质 溶液 作 双 缩 脲 反应 ( 见 实验 2， 回 火 棉 胶 制 成 的 透析 管 中 装 入 10 一 15 毫升 看 白质 深 容 液 并 | RAZED IKE. (作法 见 第 三 章 , 或 用 玻璃 纸 装 入 和 蛋白 旺 “” 质 溶 湾 后 所 成 袋 形 , 系 于 一 横 放 在 烧杯 的 玻 稿 棒 上) 。 3. 约 1 小 时 后 , 自 烧 杯 中 取水 1 一 2 SFP, Jn 10% 硝酸 溶液 数 滴 使 成 酸性 ， 再 加 入 1 多 硝酸 银 溶 液 1 一 2 滴 , 检查 毛 离 子 的 存在 。 “” 4 从 烧杯 中 另 取 1 一 2 毫升 水 , MMAR RY, 检查 是 否 有 蛋 “白质 存在 : Payee a ee -实验 三 十 四 锂 盐 存 在 时 蔗糖 的 燃烧 一 、 目 的 : 直观 地 认识 一 般 催 化 剂 的 催化 作用 。 =, AE: Re AS he AE fee RE, AS Ee a RR AC AS 0 yO RE, BRI A PA Sa 的 物质 。 现 在 以 锂 盐 对 芒 糖 氧化 作用 的 影响 作为 催化 作用 的 一 个 实例 进行 演示 。 三 、 器 材 : 1， 霸 锅 钳 。 “2 酒精 灯 。 四 、 操 作 : 用 钳子 取 普 通 食用 的 蔗糖 块 , 放 在 酒精 灯火 焰 上 。 芒 糖 不 会 燃 烧 ， 只 是 逐渐 地 熔化 和 炭化 。 如 果 把 撒 上 碳酸 锂 的 蔗糖 块 放 在 酒 精 灯 焰 上 , 由 于 锂 盐 对 蔗糖 氧化 的 催化 作用 , 使 蔗糖 以 明显 的 红色 火焰 燃烧 。 实验 三 十 五 ”用 铂 和 血液 过 氧化 所 酶 ‘hg apmenen 、 目 的 : 比较 十 物 催化 剂 一 酶 与 无 机 催化 剂 的 活性 ， 直 观 地 认识 到 酶 的 催化 效率 极 高 。 want 原理 : “在 通常 温度 下 ， 过 氧化 所 分 解 成 水 和 氧气 的 反应 进行 得 很 组 * 207。 慢 。 但 是 , 在 少量 的 铂 黑 或 血 ( 含 过 氧化 氢 酶 ) 存 在 时 , 这 个 反应 就 “ 习 大 大 地 加 加 了 。 同 时 ， 可 以 看 出 了 的 公 化 活性 比 天 机 机 化 剂 上 后 催化 活性 还 要 高 出 很 多 倍 。 4 三 、 器 材 : 1，150 毫升 锥 形 瓶 。 50 毫升 量 简 。 试管。 0.5 毫升 吸管 。 解剖 刀 。 四 、 试 剂 和 材料 : 1， shy tik. 2. 10% MILA ee 3. FHS. 将 0.5 克 四 氯 化 铂 溶解 在 0.5 毫升 蒸馏 水 中 , FE ae eee He 入 0.7 毫升 40 多 甲醛 溶液 。 然 后 ， 在 冷却 条 件 下 逐渐 加 入 氢 氧 化 疆 ei a °- 钠 溶液 (0.5 克 氢 氧化 钠 溶解 在 毫升 蒸馏 水 中 ), 先 在 冷水 中 放置 “ 30 分 钟 ,再 在 55°C 水 浴 中 放置 15 分 钟 。 然 后 将 溶液 振 播 3 一 5 分 ， 钟 , 即 有 各 状 沉淀 产生 。 用 倾泻 法 倒 出 上 清 液 , OCH IMA > 的 水 和 醋酸 ， 直 到 有 强烈 的 栈 酸 味 为 止 。 沉 淀 被 溶解 后 又 重新 出 DQ, AMSA Lina, HARADA. HER PBFA, 用 滤纸 将 液体 尽量 吸 干 。 最 后 将 沉淀 真空 干燥 或 放 在 室温 下 逐渐 干 爆 。 五 、 操 作 : 量 取 40 一 50 毫升 10% 过 氧化 氨 溶 液 ， 分 别 加 到 两 个 150 毫 升 锥 形 瓶 中 ， 然 后 用 解剖 刀 尖 端 取 少 量 ( 约 0.2 毫克 ) 铂 黑 加 入 一 个 锥 形 瓶 中 , 向 另 一 个 瓶 中 加 入 0.5 毫升 血液 。 在 铀 黑 作 用 下 , 锥 形 瓶 中 的 过 氧化 氢 发 生 迅 速 的 分 解 , 出 现 天 “ as。 208 « , , - be SEACH, EDLC DRIP. SETA hte OSE ”氧化 氢 酶 的 作用 下 发 生 强烈 的 分 解 , 迅速 出 现 大 量 泡沫 , 而 且 白 色 泡沫 由 液 面 升 起 。 实验 三 十 六 mL SUE ALARM 、 目 的 : UF LIEB iB arbors FPG 和 操作 。 二 、 原 理 : 鼠 肝 组 织 在 呼吸 过 程 中 摄 和 氧气 放出 二 氧化 碳 。 将 肝 匀 浆 放 入 Warburg 氏 呼吸 计 的 反应 瓶 中 时 ， 如 使 放出 的 CO, mata tt 钾 溶液 吸收 ， 则 其 耗 氧 量 在 温度 和 体积 固定 的 条 件 下 表现 为 压力 的 变化 , 可 以 测定 (参见 第 七 章 )。 三 、 器 材 : 1. Warburg 氏 呼 吸 器 一 套 ( 包 括 反应 疾 体 积 已 知 的 压力 计 3 支 , 零点 定 在 250 BK), 2. 解剖 器 一 套 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 大 白鼠 2. 生理 盐 溶液 将 0.9 多 氯 化 钠 溶液 100 毫升 , 1.15 多 所 化 钾 溶 液 4 毫升 , 0.11 “摩尔 / 升 氧化 钙 溶液 3 毫升 ，0.154 摩尔 / 升 硫酸 镁 溶液 1 毫升 和 ， pH 7. 3, 0.1 摩尔 / 升 的 磷酸 盐 缓冲 液 21 毫升 混合 。 注 意 最 后 加 入 eth, 要 边 搅 拌 边 加 入 , 以 防止 局 部 过 浓 出 现 沉 证 。 溶 液 pH 也 要 准确 , 偏 碱 亦 会 发 生 沉淀。 3. 10 驳 气 氧化 钾 溶 液 。 209.。 Pee Pe Oe a ee ee ae ee eee eee a Se +8 . 4. 羊毛 脂 5. Brodie 溶剂 23 SERIE HA, 5 Fe NAR PA AD 100 2H BSCE eae 500 ie g 水 中 , 并 加 入 1 一 2 BE SE wa a. A RP, BT 在 冰箱 中 长 期 保存 。 五 、 操 作 方 法 : ， 向 Warburg 氏 呼 吸 计 的 水 槽 内 加 入 温水 并 调节 到 所 需 温 Le, C) 。 开 动 搅拌 器 , 检查 调 热 器 , 使 其 处 于 正常 运转 状态 。 2. 准备 已 知 反 应 瓶 体积 (零点 为 250 毫米 ) 的 干燥 洁净 的 压 力 计 三 支 ， 将 其 三 通 活塞 涂 好 羊毛 脂 后 固定 在 特殊 的 架子 上 。 放 松 螺旋 夹板 , 将 乳胶 管 中 装 满 Brodie 溶液 并 连接 在 压力 计 上 。 调 节 螺 旋 严 板 ， 使 压力 计 液 面 升 至 250 毫米 处 。 压 力 计 液体 中 不 应 ” 含有 气泡 。 3， 向 与 压力 计 配 套 的 二 个 反应 瓶 底部 分 别 加 大 2 毫升 生理 盐 溶 液 , 并 向 中 央 小 杯 内 各 加 入 0.2 毫升 10 多 氨 氧 化 钾 溶 液 @ 并 tH FEE WA A PRY 1.5—2 厘米 。 的 滤纸 1 小 张 以 扩大 - 二 氧化 碳 的 吸收 效率 。 注 意 切 勿 使 碱 液 沾 污 反应 瓶 的 其 他 部 分 。 滤纸 应 高 出 中 央 小 杯 上 沙 3 一 5 毫米 。 4. 用 断 头 法 处 死 大 白鼠 , 迅速 取出 肝脏， 吸 去 血液 后 在 冰冷 条 件 下 将 组 织 剪 成 廉 状 。 用 扭力 天 平 在 纸 碟 上 准确 称 取 200 毫克 左右 的 组 织 糜 二 份 ,记录 每 份 组 织 魔 的 重量 : 5， 用 狂 子 将 盛 有 肝 麻 的 纸 碟 小 心地 放 入 反应 瓶 底部 ， 切 入 使 组 织 粘 在 瓶 璧 上。 用 细 玻 璃 棒 搅 义 ， 不 要 触及 中 央 小 杯 中 的 ”滤纸 。 5、 在 第 三 支 压力 计 的 反应 凑 中 放 入 2 ACP LE 大 。 «210° Cov i BRA I > JSC, 2 oh RAs ¥ 4 Wy 1 —_——— ee a ee ee ee ee 7. 在 各 压力 计 连 接 反应 瓶 的 磨 口 处 和 反应 瓶 的 侧 管 塞 上 涂 | 抹 羊 毛 脂 ， 将 反应 瓶 加 在 压力 计 上 并 用 橡皮 筋 或 弹 先 固 定 。 轻 轻 。 转动 反应 瓶 , 使 麻 口 处 不 漏 气 。 转 动 三 通 活塞 使 闲 辟 与 空气 相通 。 。 塞 好 侧 管 上 的 塞 子 。 8 将 压力 计 分 别 装 在 水 槽 两 侧 的 架子 上 , 使 反应 瓶 及 其 与 压 。 力 计 的 连接 处 均 浸 在 水 里 。 待 压力 计 温 热 后 , 取出 压力 计 , 再 重新 | 转动 压力 计 与 反应 瓶 接口 处 和 反应 瓶 侧 璧 上 的 活塞 O， 当 确保 此 | 二 处 都 不 漏 气 后 , 再 将 压力 计 放 入 水 槽 中 。 开 动 马达 , 使 压力 计 以 120 次 /分 (振幅 2 一 3 厘米 ) 的 速度 往复 摆动 。 约 15 分 钟 后 , 各 瓶 内 。 外 温度 达到 平衡 .停止 摆动 , 将 各 压力 计 闭 璧 液 面 调整 到 250 BER Kh, 关闭 三 通 活塞 , 迅速 记录 各 压力 计 开 臂 读 数 。 9. 重新 摇动 压力 计 , 每 隔 10 一 20 分 钟 , 停止 播 动 ， 迅 速 将 各 4 压力 计 的 闲 璧 液 面 升 至 250 毫升 处 ， 记 录 其 开辟 读数 。 共 记录 一 小 时 。 10. 实验 完毕 后 ， 先 将 各 压力 计 上 的 三 通 活塞 打开 使 反应 瓶 与 外 界 相通 , 然后 将 压力 计 取出 恒温 水 槽 , 取 下 反应 瓶 及 其 侧 辟 的 玻璃 塞 , 用 汽油 的 净 羊 毛 脂 , 再 用 如 热 的 洗涤 剂 或 铬 酸 洗 液 浸泡 后 _ ll. 氧 的 吸收 可 参照 以 下 的 例子 记录 和 计算 。 天 为 在 本 实验 条 件 下 的 反应 瓶 常数 。 从 反应 瓶 体积 计算 反应 瓶 常 数 的 方法 参见 ERE, ao, (37°C) = 0.0239, 同时 测定 的 各 平行 结果 之 间 的 偏差 , 一 般 不 应 超过 5 % « 以 上 实验 结果 也 可 以 用 符号 Qo, GHD) 表示， 即 相当 于 单位 重量 组 织 每 小 时 所 消耗 氧气 的 微 升 数 , 反应 瓶 中 所 用 的 是 空气 。 如 PUNE A, 符号 可 简写 为 go., 此 时 应 将 几 份 已 称 重 的 肝 组 织 中 羊毛 脂 在 室温 下 不 易 融 化 , 但 在 温水 槽 密封 较 好 ， 如 用 凡士林 代替 羊毛 脂 时 可 省 略 这 一 步 。 人 ee wa ee eee 温度 : 37"C PR: AFB 第 二 号 瓶 Ko, 一 2.05 埋 im He it 第 一 号 瓶 Ko,=2.55 压力 计 | Aj | HAH 压力 计 和 : 8 ic Ah A | 12:05 250 250 251 a 12:25 251 |+1| 220 | 30 | 30+1=3]|], 219 | 32 |32+1=33 12:45 252 |+1] 195 | 25] 25+1=26 193 | 26 |26+1=27 | 13:05 249 |-3| 173 | 22 | 22 一 3=19| 169 | 24 |24—3=21 © =h( 2K) | | saa | f 1 | KX hCBOK) | | 194 | 203 4 WF Be 238) | | 耗 氧 量 ( 微 升 / 10028 52 HF / 小 时 ) 糜 分 别 装 入 已 知 重 量 的 称 量 瓶 中 , 在 100°C AR AR, I | 据 以 计算 出 肝 组 织 魔 的 含水 量 , 再 加 以 换算 。 如 反应 瓶 中 所 用 的 是 氧气 , 则 符号 改 为 &883。 100 _ 194 veer Se FAR Poy BEEN —, BR: : 学 习 吸 附 层 析 法 的 原理 。 =, Re: 吸附 层 析 法 的 原理 可 以 简单 地 用 碳酸 钙 分 离 植物 色素 来 证 明 。 用 有 机 溶剂 提取 菠菜 叶 ， 将 一 支 粉笔 竖立 在 含有 机 提取 液 的 “ 烧杯 中 , 由 于 毛细 管 作用 ， 液 体 沿 粉笔 上 升 并 表现 为 清楚 的 色 带 : ， 叶绿素 为 绿色 ， 叶 黄 素 为 黄色 , OY be HHH. =, BH: 9 212° 有 .白色 粉笔 。 . LARUE , 50 毫升 烧杯 。 五 、 操 作 方法 : 称 取 新 鲜 菠 菜 叶 10 Se, 用 剪刀 前 成 小 块 ， 放 在 乳 钵 中 。 加 入 丙酮 10 毫克 研磨 成 浆 状 。 将 提取 液 离 心 或 过 滤 除 去 酒 子 。 在 烧 标 中 放 入 5 毫升 提取 液 并 在 烧杯 的 中 心 垂直 竖立 一 支 白粉 笔 ， 竺 待 二 段 时 间 后 ， 菠 菜色 素 就 在 粉笔 上 分 离 。 可 从 带 的 颜色 鉴定 是 ”人 和 何 种 色素 。 实验 三 十 八 吸附 层 析 法 分 离 叶 子 色素 —, Bm: 学 习 用 吸附 层 析 法 分 离 叶 子 色素 的 基本 原理 和 操作 技术 。 、 原理: 吸附 层 析 法 是 利用 吸附 剂 表面 对 溶液 中 的 不 同 物质 所 具有 的 不 同 程度 的 吸附 作用 进行 分 离 。 用 适当 的 溶剂 如 石油 醚 .甲醇 丙酮. 葵 …… 等 , 可 将 绿叶 中 的 色素 (叶绿素 a PRS DL PRR PIR, Te jek RPE RIE HB HD PREETI PA RE Fs FE RR 5 A 化 铝 等 吸附 剂 作成 。 =, galt: ° 213° 4 E. 4 : | a4 | 1， 抽 滤 瓶 。 2. SL¢k, 研 杆 。 3， 带 托 的 玻璃 棒 。 4。 层 析 柱 (或 玻璃 管 )20 厘米 x 1 厘米 。 四 、 试 剂 和 材料 : 1. 40°C 烘 干 的 菠菜 叶 2， 石 油 醚 3. 甲醇 4, & 5. Fer wee BA 6， 细 粉 状 蔗糖 7. 无 水 碳酸 钙 2 8. Abas : SS igkg eee 9， 海 砂 _ 五、 操作 方法 : 1。 取 烘 干 的 菠菜 叶 1 克 置 于 乳 钵 中 , 加 少许 海 沙 研 碎 。 g 2. 浸入 含有 22.5 毫升 石油 栈 、2.5 AHEM 7.5 SPR 混合 溶剂 中 , 放置 约 1 小 时 。 3、 过 滤 。 将 滤液 置 于 分 液 漏斗 中 , 加 5 台 升 水 轻 轻 上 下 颠倒 数 次 , 然后 弃 去 水 层 ( 其 中 溶 有 甲醇 )。 应 避免 激烈 振荡 ， MBI : 成 乳 浊 液 。 a A. HRs Te A a iL AE A JC 7k ER OO SEAT SE it EB 去 水 分 , 即 得 到 色素 提取 液 (必要 时 可 在 通风 顶 中 小 心地 浓缩 成 数 Ft). q 5. WP RE— BNE, FTE Fae LYRE), He 细 粉 状 氧 化 铝 装 入 柱 中 ， 年 装 入 少许 ， 就 用 带 托 的 玻璃 棒 压 紧 ， 装 到 3 厘米 高 为 止 。 约 用 氧化 铝 2 克 。 ”2Tf。 rs 25H, Pe ADA ERE BD AC, 约 用 3.5 oe. Be CREE LK RAED PREE, 缓慢 抽 滤 。 柱 上 还 保留 一 些 混合 液 ) , 将 色素 “用 同样 的 方法 再 装 入 细 粉 状 碳酸 钙 ， 高 度 为 5 厘米 ， 约 用 然后 用 同样 方法 装 入 7 厘米 6. 将 做 好 的 吸附 柱 装 在 抽 vey _E. 7 7. 将 石油 醚 和 葵 的 混合 液 (4:1) 倒 在 管 的 上 部 , 使 其 通过 吸 8. 不 等 混合 液 渗 干 (在 吸附 提取 滚 倒 在 层 析 管 上 端 。 ” 9。 使 溶液 通过 吸附 柱 。 并 继续 加 入 石油 醚 和 太 AD ie (4:1) ERE, 至 能 区 分 开 柱 上 清晰 的 色 带 为 止 。 3 SHI AYP 测定 小 麦 幼苗 根部 的 吸收 功能 、 目 的 : 5-371 —sege MR HA ick 的 基本 知识 和 方法 。 二 、 原 理 : szP LMM PBEM, 它 在 核 误 变 过 程 中 , 放出 高 能 A 粒子 ， 通 过 测量 计数 装置 便 能 较 好 地 进行 测量 。 车 将 用 ??P 标记 的 化 合 物 , i KHPPO, 施 于 植物 根部 ， 很 快 就 会 被 吸收 并 转运 到 植物 各 部 , 选取 植物 的 不 同 部 位 作 样 品 , 测定 其 放射 性 强度 ， 便 可 。2T5 。 知道 很 的 吸收 性 能 , 物质 分 配 的 方向 , 部 位 ， 数量 等 。 sc 三 、 器 材 : a 1. 培养 下。 ee 2. HSE. | ac, 3. 注射 器 。 4. 397). 5. Tt. 6. 放射 性 测量 计数 装置 (如 FH-408 自动 定 标 器 和 FI367 通 用 闪烁 探头 )。 | 四 、 试 剂 和 材料 : 1. sh RAKE) BF 2. @P 标记 化 合 物 五 、 操 作 方法 : 1. EWR, 大 小 比较 一 致 ABFA DERI F 50 一 60 BL, FE SIRT 7 15—24 小 时 。 2、 在 一 个 直径 9 Iai Ay Be FEI A LARA, PREIS | ARIK PRT 39 RENAE, IESE tk. Mm EM. FE 15°—20°C Fie, HSE MBI 1 厘米 时 , SPM, 在 有 光 处 “ ”经 5 一 7 天 即 可 长 成 10 厘米 高 的 幼苗 。 (注意 每 天 加 水 、 保 持 水 “是 分 )。 3. 用 注射 器 抽取 含 15 一 20 微 居 里 的 s?P 标记 化 合 物 @。 de 心地 注入 到 两 个 培养 阵 中 。 不 可 污染 叶片 。 晃 动 培养 耿 使 “P 溶 、 液 均 匀 分 布 。 } 4、 继 续 在 光照 下 培养 ,在 半 小 时 .1 ERIN) II @ 使 用 放射 性 同位 素 , 必须 严格 注意 防护 。 要 穿 上 工作 服 ， 带 好 橡皮 手套 。 被 污染 的 用 具 、 需 经 冲洗 或 隔离 放置 , 直至 用 放射 性 测试 仪 测量 无 污染 时 才 可 再 用 。 有 ROR GSE, BRP ER, 到 指定 地 点 统一 深 埋 在 土 中 , 严禁 乱 扔 。 ° 216° 叶片 , 测定 叶片 的 放射 性 强度 , 观察 不 同时 间 有 无 变化 。 5. 取样 与 测量 : -~ C1) ARMY TM RRA Aye 3 一 4 ahr, 在 扭力 天 平 上 称 其 重量 (50 毫克 左右 )。 (2) 先 测 好 测量 碟 的 本 底 , 然后 将 称 好 的 叶片 剪 成 小 段 (长 度 不 要 超过 碟 的 直径 ) 并 均匀 放 在 碟 内 , 测量 放射 性 。 | (3) 记 下 脉冲 数 。 减 去 本 底 , 算出 每 毫克 样品 的 放射 性 强度 ， GS RRM RH, 脉冲 出 现 愈 早 , 说 明 吸 收 转运 速度 愈 快 。 脉冲 数 一 本 底 样品 重量 ( 训 克 ) — ith 25 CO 试 比较 不 同时 间或 不同 培养 条 件 下 根部 的 吸收 和 叶片 的 放射 性 分 布 情况 。 实验 四 十 “小 白鼠 氮 中 毒 一 、 目 的 : 观察 氨 对 动物 体 的 毒害 二 、 原 理 : 各 种 原因 导致 的 血 氨 升 高 能 引起 脑 功能 紊 乱 ， 主 要 产生 能 量 代谢 障碍 , 出 现 中 毒 征象 。 氨 对 脑 细胞 代谢 的 干扰 是 多 方面 的 , 如 大 量 的 所 和 o-M ROMA A RAAB, 可 使 三 羧 酸 循环 中 oH pe 二 酸 耗竭 , 从 而 使 三 羧 酸 循环 运转 发 生 障碍 , ATP 生成 减少 ; 所 和 BRIG A RAAB, 增加 ATP 的 消耗 等 。 本 实验 给 小 白鼠 腹腔 注射 氛 化 贸 ， 观 察 所 中 毒 及 其 导致 的 死 亡 现象 。 三 、 试 剂 和 材料 : 1. 小 白鼠 一 只 ( 约 重 20 克 ) e217» tt ee a Lac ©, wn > —. Ve sie % wt. £8” “News 6 me &’ - tit ee’ Saat we al, Ks Oa rh re gar , ya ” . 人 2.， 10 多毛 化 贸 溶 液 _ gs ae 四 、 器 材 : As a 1 EINER Ba ona 五 、 操 作 : 3 本 取 小 白鼠 一 只 , 腹腔 注射 10 多 所 化 铵 0.6 毫升 左右 ,二 三 分 钟 后 可 观察 到 小 白鼠 抽 扩 现 象 , 随即 发 生 小 鼠 四 肢 及 尾巴 强直 ,不 久 死亡 。 oe 73 以 f = _ 所 Ss . te 入 o Or P Fale > i ti) = © ~ 条 与 > ~ »~ 1 i < a : [ ° 218° ae Brey, a aw 时 ; 附 录 1 实验 前 认真 预习 实验 内 容 。 ” 2。 实验 时 自觉 遵守 课堂 纪律 , 严格 按 操作 规程 操作 ， 既 要 独 立 操作 又 要 与 其 他 同学 配合 。 3。 实验 数据 和 现象 应 随时 记录 在 实验 本 上 。 (不 要 记 在 纸 片 上 1 实验 结束 后 ， 实 验 记 录 必 须 送 辅导 教师 审阅 后 才能 写实 验 报 告 或 离开 实验 室 , 实验 报告 最 迟 于 下 次 实验 课时 交 给 辅导 教师 。 A 精心 爱护 各 种 仪器 。 实 验 所 需 的 一 般 仪 器 按 规定 借 领 , 归 还 。 完 成 实验 后 应 将 仪器 洗 净 倒置 在 实验 柜 中 并 排列 整齐 。 如 有 损坏 或 遗失 需要 说 明 原 因 , 经 辅导 老师 签名 后 方 可 补 领 ， Sg 赔偿 。 5. 精密 贵重 仪器 每 次 使 用 后 应 登记 姓名 并 记录 仪器 使 用 情 况 。 要 随时 保持 仪器 的 清洁 。 如 发 生 故 障 ， 应 立即 停止 使 用 并 报 “ 告 辅导 教师 。 6. 按 需 要 量 取 用 药品 及 蒸馏 水 等 各 种 物品 , 要 注意 节约 。 7. 公用 仪 愉 、 药 品 用 后 放 回 原 处 。 不 要 用 个 人 的 吸管 量 取 公 用 药品 ”多 余 的 药品 不 得 倾 入 原 试 剂 瓶 内 。 Pee 的 瓶 塞 要 随 开 随 盖 , AS ETE 0 8. 保存 在 冰箱 或 冷 室 中 的 任何 物品 都 应 加 盖 并 注 明 保存 者 的 姓名 ,班级 .日 期 和 内 容 物 。 9. 保持 人 台面、 地面 、 水 槽 及 室内 整洁 。 含 强酸 强 碱 的 废 液 应 ¢ 219 « =" Bod ie Bee i the a «ears > + - Se 倒 入 废 液 缸 中 。 将 书包 及 实验 不 需 衣物 放 在 规定 的 架 上 。 3 10. 不 得 将 含有 易 燃 溶剂 的 实验 接近 火焰 。 漏 电 的 设备 一 律 “ AME, TERRE. IFS Se RS Bek, 口 吸取 (或 用 皮肤 接触 ) 有 毒药 品 和 试剂 。 凡 发 生 烟 雾 、 有 毒气 体 “ 和 不 良 气味 的 实验 均 应 在 通风 橱 内 进行 。 通 风 橱 门 应 紧 闭 ， 非 必 国 要 时 勿 开 。 g 11， 由 学 生 轮流 值 A, 值 日 生 要 负责 当天 实验 室 的 卫生 ， 安全 国 和 服务 性 的 工作 。 g 二 、 实 验 室 基本 操作 (一 ) 玻璃 仪器 的 洗涤 al 将 新 购买 的 玻璃 仪器 用 自来水 冲洗 其 表面 的 泥 污 ， 然 后 浸泡 国 在 1—2% 盐酸 溶液 中 过 夜 。 待 用 自来水 冲 净 后 再 进一步 洗涤 。 “” 疆 使 用 过 的 玻璃 仪器 先 用 自来水 冲洗 ， 然 后 将 所 有 待 洗 的 玻璃 “ 国 仪器 放 在 含有 洗衣 粉 的 温水 中 细心 刷洗 。 待 用 自来水 充分 冲洗 后 “ 旱 用 少量 蒸馏 水 刷洗 数 次 。 凡 洗 净 的 玻璃 仪器 其 内 外 壁 上 都 不 应 带 “ 国 AAG, 否则 表示 未 洗 干 淘 。 仪 器 上 的 洗衣 粉 必 须 冲 净 , 因为 洗衣 粉 可 能 干扰 某 些 实验 。 比较 胜 的 器 亚 或 不 便 剧 洗 的 仪器 (如 吸管 ) 先 用 软 纸 毛 去 可 能 存在 的 凡士林 或 其 他 油污 ， 用 有 机 溶剂 ana, Me) ee, 再 用 自来水 冲洗 后 控 千 ， 放 入 铬 酸 洗 液 中 浸泡 过 夜 。 取 出 后 用 自来水 “ 国 反复 冲洗 直至 除去 痕 量 的 洗 液 。 最 后 用 蒜 馏 水 测 洗 数 次 。 ”普通 玻璃 仪器 可 在 烘箱 内 烘 干 , 但 定量 的 玻璃 仪器 不 能 加 热 ， 。 一 般 采 取 控 干 或 依次 用 少量 酒精 、 乙 栈 测 洗 后 用 温 热 的 气流 KF : 4 铬 酸 洗 液 的 配制 方法 有 多 种 , 现 介绍 常用 的 一 种 方法 : 小 心 加 “ * 220° 热 100 毫升 工业 用 浓 硫 酸 ， 同 时 缓慢 加 入 5 克 工 业 用 重 铬 酸 钾 粉 “来 。 边 加 边 搅拌 , 待 全 部 重 铬 酸 钾 溶 解 后 , PAS, EIA “ 塞 的 玻璃 器 血 中 ， 玻 璃 器 严 底 部 最 好 垫 有 玻璃 纤维 以 减少 仪器 破 损 。 此 洗 液 可 反复 使 用 多 次 ， 如 洗 液 变 为 绿色 或 过 于 稀释 则 失效 。 ” 病 画 .传染 病 患者 的 血清 等 沾 污 过 的 容器 , 应 先进 行 消毒 后 再 进行 清洗 。 盛 过 各 种 毒品 ， 特别 是 剧 毒药 品 和 放射 性 同位 素 物 质 的 容器 必须 经 过 专门 处 理 ， 确 知 没有 残余 毒物 存在 时 方 可 进行 清洗 。 (>) 搅拌 和 振荡 配制 溶液 时 ， 必 须 充分 抄 拌 或 振 淘 混 匀 。 和 用 的 溶液 混 包 方 ”法 有 以 下 三 种 : 1. 搅拌 式 : 适用 于 烧杯 内 溶液 的 混 匀 。 (1) 搅拌 使 用 的 玻璃 棒 必 须 两 头 都 烧 圆 滑 。 “2) 搅 棒 的 粗细 长 短 , 必须 与 容器 的 大 小 和 所 配制 的 溶液 的 多 少 呈 适当 比例 关系 。 (3) 搅拌 时 , 尽量 使 搅 棒 沿 着 器 壁 运 动 , HHA, ARH 液 飞 溅 。- (4) 倾 入 液体 时 ， 必 须 沿 器 壁 慢 慢 借 入 ， 以 免 有 大 量 空气 混 入 。 倾 倒 表面 张力 低 的 液体 (如 蛋白 质 溶液 ) 时 , 更 需 缓慢 仔 细 。 (5) 研磨 配制 胶体 溶液 时 ， 要 使 杆 棒 沿 着 研 钵 的 一 个 方向 进 行 , 不 要 来 回 研磨 。 2， 旋 转 式 : EATON, 大 试管 内 溶液 的 混 匀 。 sds 时 , 手提 往 容器 后 以 手腕 , 肘 或 肩 作 轴 旋 转 容 器 , 不 应 上 下 振荡 。 3， 弹 打 式 : 适用 于 离心 管 .小 试管 内 溶液 的 混 鱼 。 可 由 一 手 ” 持 管 的 上 端 用 另 一 手 的 手指 弹 动 离心 管 。 也 可 以 用 同一 手 的 大 担 ° 221° 指 和 食指 持 管 的 上 端 ， 用 其 余 三 个 手指 弹 动 离心 管 。 手 指 持 管 的 ERR HANA, EATER ER ASMA, Se yD ey FE LBL 3) ria 在 容量 瓶 中 混合 液体 时 , 应 倒 持 容量 瓶 摇动 ， 用 食指 或 手心 顶 3 FEHR SE, FEAR SEA AHL 在 分 液 漏 斗 中 振荡 液体 时 ， 应 用 一 手 在 适当 斜 度 下 倒 持 漏 斗 用 食指 或 手心 顶 住 瓶 塞 , 并 用 另 一 手 控制 漏斗 的 活塞 。 一 边 振荡 ， 一 边 开动 活塞 , 使 气体 可 以 随时 由 漏斗 泄 出 。 4 三 、 常 用 仪器 的 使 用 a (一 ) 容量 玻璃 仪器 的 使 用 方法 a ALVEAEEAAE PM A. MAE REARE FT 2, WEE. BREA SY HORE. 1. 吸管 : 4 We EE EAE Lee he Ae. BI, an 吸管 不 干燥 , 应 预先 用 所 吸取 的 溶液 将 吸管 润 洗 2 一 3 Ue, DAR 所 吸取 的 操作 溶液 浓度 不 变 。 吸 取 溶液 时 ， 一 般 用 右手 的 大 担 指 ” 和 中 指 拿 住 管 颈 刻度 线 上 方 , 把 管 尖 插 和 溶液 中 ; 左手 拿 洗 耳 球 ， 先 把 球 内 空气 压 出 , 然后 把 吸 耳 球 的 尖端 接 在 吸管 口 , 慢 慢 松 开 左 手指 , 使 溶液 吸入 管内 。 当 液 面 升 高 至 刻度 以 上 时 ，- 移 开 吸 耳 球 ， 立即 用 右手 的 食指 按 住 管 口 ， 大 拇指 和 中 指 拿 住 吸管 刻度 线 上 方 再 使 吸管 离开 液 面 , 此 时 管 的 末端 仍 靠 在 盛 溶液 器 亚 的 内 壁 上 。 略 ” 为 放松 食指 , 使 液 面 平稳 下 降 , 直到 溶液 的 弯 月 面 与 刻度 标 线 相 切 时 , 立即 用 食指 压 紧 管 口 , 取出 吸管 , 插入 接受 器 中 , 管 尖 仍 靠 在 接 、 受 器 内 壁 , 此 时 吸管 应 垂直 , 接受 器 约 呈 15" 夹 角 。 松 开 食指 让 管 内 溶液 自然 地 沿 器 壁 流下 。 遗 留 在 吸管 尖端 的 溶液 及 停留 的 时 间 。 222° a (1) 无 分 度 吸管 ( 单 刻度 吸管 , 移 液 管 ) 见 图 1。 使 用 普通 无 分 度 吸 管 印 量 时 ， 管 尖 所 遗留 的 少量 溶液 不 要 吹 出 , 停留 等 待 3 秒 钟 , 同时 转动 吸管 。 (2) 分 度 吸管 (多 刻度 吸管 . 直 管 吸管 ) “分 庆 吸 管 有 完全 流出 式 、 吹 出 式 和 不 完全 流出 式 等 多 种 型 式 。 “- @ 完全 流出 式 ( 图 中 2 和 3) 上 有 有 零 刻 度 , 下 无 总 量 刻度 的 ,或 上 有 总 量 刻度 ， 下 无 零 刻 度 的 为 完全 流出 式 。 这 种 吸管 又 分 为 慢 流速 、 快 流速 两 种 。 按 其 容 «= RARER, 慢 流速 吸管 又 分 为 A 级 与 B 级 ， 快 流速 吸管 只 一 Tv ys | 本 有 B 级 。 使 用 时 和 A 级 最 后 停留 15 秒 , B 级 停留 3 秒 ， 同时 转动 吸 管 , 尖端 遗留 液体 不 要 吹出 。 ps rq @ 吹出 式 : | 标 有 “ 吹 ” 字 的 为 吹出 式 ， Go 液体 。 tk : @ 不 完全 流出 式 (图 中 4). 有 和 去 刻 度 也 有 总 量 刻 度 的 为 不 完全 流出 式 。 使 用 时 会 束 小 央 本 至 相应 的 容量 标 刻 线 处 。 1 为 便于 准确 快速 地 选取 所 需 的 吸管 ， 国 际 标 准 化 组 织 统 一 规 ” 定 : 在 分 度 吸 管 的 上 方 印 上 各 种 彩色 环 , 其 容积 标志 如 下 表 : 05 1 2 色 标 betes tet eta ee 标注 方式 | 单 | 单 |- 双 | xo] a] m [a |e | me] me 不 完全 流出 式 在 单 环 或 双环 上 方 再 加 印 一 条 宽 1—1.5mm fy 同 颜色 彩 环 以 与 完全 流出 式 分 度 吸 管 相 区 别 。 使 用 注意 事项 : -= (1) 应 根据 不 同 的 需要 选用 大 小 合适 的 吸管 ， 如 欲 量 取 15 毫升 的 溶液 ， 显 然 选 用 2 毫升 吸管 要 比 选 用 1 毫升 或 5 毫升 吸管 误差 小 。 | ) (2) 吸取 溶 溶液 时 要 把 吸管 插入 溶液 深 处 ， ORAS CTI Ye PR DA _E vara Yin HH (3) WA Mh fs 1 J a IE SP RP, Att 放 液 。 a. CRE: 可 以 准确 量 取 不 固定 量 的 溶液 或 用 于 容量 分 析 。 常用 的 常量 “ 滴定 管 有 25 毫升 及 50 毫升 两 种 ,其 最 小 刻度 单位 是 0.1 SEF, ° 2246 . a 标 称 容量 (ml) aa 0.25 10 25 50 5 . + Fe E 区 a 证 后 读数 时 可 以 估计 到 小 数 点 后 两 位 数字 。 在 生物 化 学 工作 中 党 使 用 2 及 5 毫升 半 微 量 滴 定 管 。 这 种 滴定 管内 径 狭 窄 ， 尖 端 流 出 的 液 科 也 小 , 最 小 刻度 单位 是 0.01 毫升 至 0.02 毫升 ， 读 数 可 到 小 数 点 后 第 三 位 数字 。 在 读数 以 前 要 多 等 候 一 段 时 间 ， 以 便 让 溶液 缓慢 流下 。 3， 量 简 : 量 简 不 是 吸管 或 冯 定 管 的 代用 品 。 在 准确 度 要 求 不 高 的 情况 下 ， 用 来 量 取 相 对 大 量 的 液体 。 不 需 加 热 促 进 溶解 的 定性 试剂 可 直接 在 具有 玻璃 塞 的 量 简 中 配制 。 4. 容量 瓶 : 容量 狐 具 有 狭 窗 的 颈 部 和 环形 的 刻度 是 在 一 定 温度 下 (通常 为 20"C) 检 定 的 ,含有 准确 体积 的 容器 。 使 用 前 应 检查 容量 瓶 的 瓶 塞 是 否 漏水 , SHEN ATL, 不 得 任意 更 换 。 容 量 瓶 刻 度 以 上 的 内 壁挂 有 水 珠 会 影响 准确 度 ， 所 以 应 该 洗 得 很 干净 。 所 秤 量 的 任何 固体 物质 必须 先 在 小 烧杯 中 溶解 或 加 热 溶解 ， 冷 却 至 室温 后 才能 转移 到 容量 瓶 中 。 容 量 瓶 绝 不 应 加 热 或 烘 干 。 (©) 6F | 台秤 又 叫 药物 天 平 是 用 于 粗略 称 量 的 仪 妖 。 币 用 的 有 100 克 【 感 量 0.1 殉 )、200 de Cee et 0.2 克 )、500 克 ( 感 量 0.5 Fe) Fl 1000 克 ( 感 量 1 克 ) 四 种 。 其 使 用 方法 如 下 : 1. 根据 所 称 物品 的 重量 选择 合适 的 台秤 。 2. 将 游 码 移 至 标尺 “0? 处 ， 调 节 横梁 上 的 螺丝 使 指针 停止 在 刻度 中 央 或 使 其 左右 摆动 的 格 数 相等 。 3. i FSG RESALE M.S RAM ty 25 TR DCE ABE 的 器 亚 中 ) 放 在 左 盘 上 ， 硅 码 放 在 右 盘 上 。 使 指针 重新 平衡 摆动 ， 则 者 盘 上 的 硅 码 总 量 ( 包 括 游 码 代表 的 重量 ) 即 代表 左 盘 上 称 量 用 * 223。 He (BUR ML) Ay He, 记录 此 重重 。 cast 4. iene in Ane 达到 平衡 ， 将 所 得 硅 码 总 重 减 去 纸 或 容器 的 重量 即 得 所 称 物品 的 ” 重量 。 ， 5. 必须 用 银子 夹 取 硅 码 , 加 硅 码 的 顺序 是 从 大 到 小 : gq 6. WEE, HUME BO", He, ke | READ, gq (=) 光学 天 平 1 光学 天 平 的 使 用 方法 : 1、， 被 称 物 要 称 准 到 1 毫克 时 才 准 使 用 分 析 天 平 。 被 称 物 重 ， 量 不 得 超过 天 平 最 大 载荷 。 若 被 称 物 较 重 ， 应 先 在 粗 天 平 上 试 称 。 (2) :在 同一 次 实验 中 应 使 用 同一 台 天 平 相间 一 盒 硅 码 。 不 同 硅 码 组 内 之 硅 码 不 能 随意 调换 。 < 2) AANA MLA, PAGEL, 点 偏差 超过 1 毫克 时 , 需 调整 后 再 用 。 (4) 天 平 机 构 有 任何 损坏 或 其 使 用 不 正常 时 ， 在 未 消除 故障 ， 以 前 应 停止 使 用 。 4 (5) MEARE PE ERIE RRP IGM TIO, kT 应 缓慢 , 不 得 使 天 平 剧烈 振动 。 (6) 取 放 被 称 物 或 加 减 夺 码 都 必须 把 天 平 横 梁 托 起 (关闭 天 ” 平 ) 以免 损坏 刀口 。 < (7) 被 称 物 的 温度 必须 和 天 平 室 的 室温 一 致 (8) 被 称 物 须 盛 在 干净 的 容器 中 称 量 。 具 有 腐 乌 性 的 蒸气 或 吸湿 性 的 物质 必须 放 在 密闭 的 容器 内 称 量 。 is (9) Bh Bey AUT: WS BE WCE FOF EE A He 226° ——— ee soe on a0) 天 平 的 前 门 不 得 随意 打开 。 称 量 过 程 中 只 能 打开 左右 而 个 过门。 取 放 物品 或 加 减 硅 码 时 开关 门 要 轻 而 慢 。 称 量 时 天 平 “的 各 玻 现 门 要 紧 闭 。 > (C11) BAAS RITES, 严禁 用 手 拿 取 。 按 从 大 到 小 顺序 ”缓慢 增加 硅 码 。 加 环 码 时 要 注意 以 免 环 码 跳 落 或 变 位 ， 影 响 称 量 数据 。 (12) 使 用 完毕 后 必须 将 天 平 横梁 托 住 ( 将 开关 手柄 关闭 ， 最 好 取 下 )。 然 后 将 夸 码 放 回 原 位 (包括 盒 硅 码 和 环 硅 码 )。 清 洁 天 3B, 断 开 电 源 ， FICE Rae, JRL ER AT IER 2. 天 平 的 调整 : 较 大 的 调整 应 由 保管 天 平 的 专人 或 教师 进行 。 (1) - 调 水 平 : 用 天 平 前 位 两 个 底 脚 螺丝 调 正 水 准 器 。 气泡 在 水 难 器 正中 央 即 为 水 平 。 (2) 调 零 点 : 即使 微量 标尺 上 的 0 点 与 游标 ( 光 屏 ) 刻 线 完全 重合 。 较 大 的 零点 调整 。 可 移动 横梁 上 左右 平衡 螺丝 的 位 置 。 @) 较 小 的 零点 调整 。 即 微量 标尺 “0" 点 与 游标 ( 光 屏 ) 刻 线 相 ” 距 3 格 以 内 , 可 转动 底板 下 面 的 拨 杆 。 (3) 调 光学 系统 : 射影 颜色 : 若 灯 光 射 影 显示 骚扰 的 颜色 ， 明 瞳 不 一 可 转动 和 移动 聚 光 镜 的 位 置 。 Q 射影 不 正 : 如 光学 投影 上 的 刻度 偏 上 或 偏 下 ， 可 移动 一 次 反射 镜 的 角度 来 调整 。 @@ 射影 明晰 性 : 如 光学 投影 上 的 射影 不 清晰 或 重 线 , 可 调 放 大 镜 的 距离 。 (4) 调 感 量 : 用 重心 螺丝 调 感 量 。 重 心 螺 丝 癌 上 移动 时 感 量 。227，。 ie if f Es: ; x se 1 we Hk. IR Ba RR, WA MONA, BE 随意 自行 调整 感 量 。 ey (5) 调 秤 盘 麻 控 的 适度 : 当天 平 停止 使 用 时 ; PREM STE 面 的 托盘 轻微 接触 , 如 托盘 太 高 或 太 低 ,可 将 托盘 拨 下 ,调整 托盘 螺丝 的 长 短 使 其 磨擦 适度 。 sie (6) 当天 平 开动 后 ， 光 学 投影 在 停止 前 应 左右 摆动 自如 a 摆动 突然 停止 , 则 指针 阻尼 器 等 发 生 摩 氛 , 应 仔细 检查 各 部 分 安装 是 否 正确 然后 纠正 其 不 正确 处 , LEE AR, “ 国 3. 读数 方 法 : Spit a (1) 在 十 毫克 以 下 称 量 时 4.2 mg=0.0042g © (2). 在 十 毫克 以 上 +3 i tS De a al 14.2mg 一 0.0142g (3) 在 一 殉 以 上 +35 +4 +5 slate patil Saad 1814.2mg=1.8142g 4， 注 意 事项 : 天 平 应 固定 专人 管理 , 定期 复 检 、 ER es 228 » ae TRY ee a De vat . i . (1) 天 平 室 要 保持 高 度 清 洁 , 清扫 天 平 室 时 , 只 能 用 带 潮气 的 AK, 决 不 能 用 温 透 的 拖把 拖 地 。 潮 温 物 品 切 勿 带 入 室内 , 以 免 增加 湿度 。 “ (2) 应 随时 清洁 天 平 外 部 ， 至 少 一 周 清洁 一 次 。 一 般 可 用 软 毛 刷 , 绒布 或 麻 皮 拂 去 天 平 上 的 灰尘 , 清洁 时 注意 不 得 用 手 直接 接 触 天 平 零件 ， 以 免 水 份 遗留 在 零件 上 引起 金属 氧化 和 量变 。 因 此 应 戴 细 纱 手套 和 极 薄 的 胶皮 手套 , 并 顺 其 金属 光 面 条 纹 进行 , 以 锡 零件 光洁 度 受 损 。 为 避免 有 害 物 质 的 存留 , 在 每 次 衡量 完毕 后 , 应 立即 清洁 底 坐 。 横 梁 上 之 玛瑙 刀口 的 工作 楼 边 应 保持 高 度 清 洁 ， 常 使 用 魔 皮 顺 其 棱 边 前 后 滑动 , 用 慢 速 清洁 , 中 刀 承 和 边 刀 垫 之 玛 瑙 平面 及 各 部 之 玛瑙 轴承 也 用 魔 皮 清洁 。 阻 尼 器 的 壁 上 可 用 软 毛 刷 和 魔 皮 清 洁 后 ， 再 用 二 十 至 三 十 倍 放大 镜 观 察 是 否 仍 有 细小 物 质 的 存在 。 (3) 天 平 玻璃 框 内 需 放 防 调 剂 ， 最 好 用 变色 硅胶 ， 并 注意 更 换 。 (4) 带 有 该 天 平和 硅 码 实 差 的 检定 合格 证 书 应 放 在 该 天 平和 夸 码 附近 以 便 衡量 时 获得 难 确 的 必要 数据 。 (5) 抽动 天 平一 定 要 印 下 横 粱 、 吊 耳 和 秤 盘 。 远 距离 搬 动 还 要 和 包装 好 。 箱 外 应 标志 方向 和 易 损 符号 ， 并 注 有 精密 仪器 切 勿 倒 置 等 字样 。 (四 ) 分 光 光 度 计 1. 72 型 分 光 光 度 计 (1) 操作 方法 Q 根据 说 明 书 的 要 求 ,用 导线 把 租 电 计 、 稳 压 器 和 单 色光 器 正确 连接 好 。 @ 先 检查 电源 电压 与 仪器 所 标注 的 电压 是 否 相符 , 然后 再 插 © 229。 上 电源 。 ae @@ 把 单 色光 器 的 光路 闸门 拨 到 黑 点 位 置 ， 再 将 做 电 计 志 源 开 关 拨 到 * 开 * 处 ， 此 时 在 标尺 上 即 出 现 指示 光 点 。 用 零点 调节 器 把 指示 光 点 的 黑 线 准确 地 调 到 透 光 率 标尺 的 零 位 上 。 @ 打开 稳 压 器 的 电源 开关 和 单 色 光 器 的 电源 开关 ; ER 门 拨 到 红 点 位 置 上 . 再 以 顺 时 针 方向 旋光 量 调节 器 , 使 微 电 计 的 指 “ 国 示 光 点 达到 标尺 上 限 附 近 。 待 硒 光 电池 趋 于 稳定 后 ( 约 10 分 钟 )，“ 恒 再 使 用 仪器 。 4 © HALEN AE, MEM, OREM 只 装 入 空白 溶液 或 蒸馏 水 ， 其 余 三 只 装 入 未 知 溶液 。 把 装 有 空白 溶液 或 蒸馏 水 的 比 色 亚 放 在 架 的 第 一 格 内 ， 其 它 的 比 色 亚 依次 放 好 。 把 比 色 王 架 正确 地 放 于 暗 厢 内 的 定位 装置 上 , 将 暗 厢 盖 好 。 旋转 波长 调节 器 , 使 所 需 的 波长 对 准 红线 。 把 光路 闸门 拨 RAR 光 点 准确 地 位 于 透 光 率 “100? 的 位 置 。 3 @ 把 光路 闸门 重新 拨 到 黑 点 处 , Ha BEM RAE 点 于 零 位 。 立 即 把 光路 闸门 拨 到 红 点 处 ， 再 一 次 校正 微 电 计 的 指 示 光 点 对 准 透 光 率 “100? 的 位 置 上 。 © 把 比 色 朋 定位 装置 的 拉杆 轻 轻 地 拉 出 一 格 ,此 时 第 二 个 比 . CTL HY ACSIA TOE A JER, HEIN Oo Hae RE eR 该 溶液 的 光 吸 收 值 和 透 光 率 。 其 它 的 未 知 溶液 也 按 此 法 进行 测定 。 国 © 测定 完毕 , 应 立即 把 比 色 亚 用 自来水 冲洗 ， 并 用 蒸馏 水 洗 “ 国 净 , 然后 倒置 在 滤纸 上 晾 和 干 备用 。 | @ 把 仪器 的 旋钮 复原 , 关闭 开关 。 技 下 电源 ， 并 用 塑料 单 盖 “ 国 好 仪器 。 | (2) 注意 事项 a CD 9 he FAG TAA A J a KO * 230° = ES, ast ae 1 并 一 和 证 3 人 at ey, Sag pap oot i ‘et Bre S pa 小 时 ,才能 再 用 。 @ 务必 保持 比 色 亚 透 光 面 的 清洁 。 不 要 用 手 摸 比 色 阴 的 光 清 的 表面 , 更 不 要 用 毛 剧 刷洗 比 色 亚 , 以 免 影响 读数 的 准确 。 @ 脏 的 比 色 亚 可 浸泡 在 肥皂 水 中 , 然后 再 用 自来水 和 蒸馏 水 冲洗 干净 。 倒 置 晾 干 备用 。 ® 比 色 甫 外 按 沾 有 水 或 待 测 溶液 时 ， 可 先 用 滤纸 吸 干 , 再 用 镜头 纸 措 净 。 © FL UA Le MA, 要 注意 尽量 使 它们 的 位 置 前 后 一 致 。 © 测定 时 应 尽量 使 被 测 溶液 的 光 吸 收 值 在 0.1 一 0.65 范 转 内 。 9 仪 属 的 周围 应 干燥 。 仪 右 使 完 后 ， 应 该 用 塑料 套子 单 住 ， 并 在 套子 内 放 数 袋 防 湖 硅胶 。 经 党 注意 单 色 光 器 的 防潮 硅胶 是 否 受 前 ， 并 及 时 调换 或 烘 干 。 2. 721 型 分 光 光 度 计 (1) 操作 方法 © 在 接 通 电源 之 前 , 应 该 对 于 仪器 的 安全 性 进行 检查 ， 电 源 线 接 线 应 牢固 , 通 地 要 良好 , 各 个 调节 旋钮 的 起 始 位 置 应 该 正确 。 @) 电表 的 指针 必须 位 于 零 刻 线 上 。 若 指针 偏离 , 则 可 用 电表 下 的 校正 螺丝 进行 调节 。 @ 将 仪器 的 电源 接 通 , 打开 比 色 亚 有 瞳 厢 盖 ， 使 电表 指针 处 于 Shr, WR 20 分 钟 后 , 才能 使 用 。 ”图 调节 波长 旋钮 至 所 需 用 的 单 色 光波 长 , 选择 相应 的 放大 灵 敏 度 档 , 再 用 零 位 电位 器 校正 电表 指针 指 在 零 位 。 ©) 将 预先 装 好 空白 溶液 和 待 测 溶液 的 比 色 亚 依 次 放 入 瞳 厢 内 的 比 色 亚 架 上 。 此 时 空白 溶液 应 位 于 光路 上 。 盖 上 暗箱 ， 使 光 + 231° 7 ae | 4 gy PP ee J seh “7 . oats ‘ia a) 好 Fat] « hes! 电 管 见 光 , 旋转 光量 调节 器 ， fee LRA EO MIRNA hE Mik 100% , 接 上 述 方法 连续 几 次 调整 零 位 和 使 电表 指 针 指 在 100% 后 , 即 可 进行 测定 工作 。 a 加 在 最 后 一 次 调节 电表 指针 ， 使 它 指 在 透 光 率 100% JR, 拉 比 色 焉 定位 装置 的 拉杆 ， 使 待 测 溶液 进入 光路 。 此 时 由 标尺 上 可 直接 读 出 光 吸 收 值 和 透 光 率 的 读数 。 (2) 注意 事项 D 放大 器 灵敏 度 档 的 选择 是 根据 不 同 的 单 色光 波长 ， 光 能 一 量 不 一 致 时 分 别 选用 。 各 档 的 灵敏 度 范围 是 : 第 一 档 x1 倍 , 第 二 档 x10 倍 ， 第 三 档 x20 倍 。 原 则 是 能 使 空白 档 良 好 地 用 光量 调节 器 调整 于 100% 处 。 Q 仪器 底部 有 二 只 干燥 剂 简 , 以 保持 仪器 的 王 燥 ， 此 外 在 仪 器 停止 工作 期 间 , 在 比 色 亚 瞳 箱 内 , 塑料 仪器 套 内 都 应 放 防 潮 硅 胺 袋 。 @ 其 它 见 72 型 分 光 光 度 计 注意 事项 。 3. 751G 型 分 光 光度 计 、 | (C1) 操作 方法 ® 检查 电源 电压 是 否 与 仪器 所 要 求 的 电压 相符 , 然后 再 插 上 电源 插头 。 @ 根据 测定 所 要 求 的 波长 选择 光源 灯 。 在 波长 320_1.000 ， nm 范围 内 用 钨 灯 。 在 波长 200 一 320nm 范 围 内 ， 用 氢 弧 灯 作为 光 源 。 拨 动 光源 选择 杆 使 所 需要 的 光源 灯 进 入 光路 。 根 据 需要 可 以 把 滤 光 片 推 人 光路 , 以 减少 杂 散 光 , 但 通常 情况 下 没有 必要 。 把 波 长 刻度 旋 到 所 要 的 波长 上 。 3 @@ 检查 仪器 的 各 种 开关 和 旋钮 使 处 于 关闭 位 置 。 然 后 再 打 开 电 源 开关 , 使 仪器 预 热 20 分 钟 。 - © 232° + f @ EE KEE. MIRE NY BE -K Ze 200—625 nm 范围 内 , 用 紫 敏 光电 管 ， 此 时 应 将 手柄 推 人 。 如 测定 的 波长 在 625 一 1000nm 范围 , 用 红 敏 光电 管 , 应 将 手柄 拉 出 。 © 根据 波长 选择 比 色 亚 。 测 定 的 波长 在 350nm 以 上 时 ， 用 玻璃 比 色 亚 。 测 定 波长 在 350nm 以 下 时 , 则 需 用 石英 比 色 甫 。 在 比 色 亚 中 装 好 溶液 , 放 在 暗箱 内 的 托 架 上 , 然后 把 瞳 箱 盖 好 。 | © 把 选择 开关 拨 到 “校正 ”位置 上 。 调 节 瞳 电流 使 电表 指针 指 到 0 。 为 了 得 到 较 高 的 准确 度 , 每 测量 一 次 都 应 校正 一 次 瞳 电 流 。 G@) 在 一 般 情 况 下 , 旋转 灵敏 度 旋钮 从 左边 停止 位 置 顺 时 针 转 动 三 圈 左 右 。 @ 旋转 读数 钮 , 使 刻度 盘 位 于 透 光 率 100% 位 置 上 。 把 选择 开关 拨 到 “x 1? 处 , 然后 拉 开 了 暗 电流 闸门 , 使 单 色 光 进 入 光电 管 。 © AVR, 使 电表 指针 接近 到 零 位 。 而 后 再 用 灵敏 度 旋钮 细致 调节 , 使 电表 指针 正确 地 指 在 “0 上 。 © 把 比 色 亚 定 位 装置 的 拉杆 轻 轻 地 拉 出 一 格 (注意 滑板 是 否 处 在 定位 槽 中 ), 使 试 样 溶液 进入 光路 , 这 时 电表 指 偏离 零 位 。 ”@@ 转动 读数 电位 器 旋钮 , 重新 使 电表 指针 移 到 “0? 位 上 , 此 时 刻度 盘 上 的 读数 即 为 试 样 的 透 光 率 和 相应 的 光 吸 收 值 。 加 取得 读数 后 , 应 即时 将 暗 电流 闸门 重新 关上 ， 以 保护 光电 管 ; 防止 受 光 时 间 过 长 而 疲劳 。 @ 在 读 取 透 光 率 和 相应 消光 值 的 数值 时 ， 若 选择 开关 在 “x1? 处 , 透 光 率 范 围 为 0 一 100 多 ， 相 应 消光 值 范围 由 co 一 0。 妆 ICRF 10% 时 , 则 可 把 选择 开关 拨 到 “x 0.1? 位 置 ， 此 时 所 读 取 的 透 光 率 数值 , 应 以 10 除 之 。 而 所 读 出 的 消光 值 应 加 上 1.0。 加 用 同一 标准 溶液 需要 测定 几 个 样品 时 ， 可 重复 以 上 的 操作 。 © 233 。 曲 测定 完 后 ， 应 把 各 个 旋钮 和 开关 复原 和 关闭 ， 法 下 插销 ,并 把 仪器 罩 好 。 (2) 注意 事项 由 在 电压 变动 较 大 的 地 方 ， 应 使 用 稳 压 器 ， PRL 工作 。 @ 其 它 见 72 型 分 光 光 度 计 注 意 事项 。 - - a5 Pe. —_ (A) 电动 离心 机 离心 机 是 利用 离心 力 分 离 母 液 和 沉淀 的 一 种 仪器 。 根 据 离心 容量 的 不 同 可 将 电动 离心 机 分 为 大 ,中 ,小 三 种 类 型 。 这 三 种 类 型 离心 机 的 最 高 转速 通常 都 是 4000 转 / 分 。 生 物化 学 实验 室 稼 使 用 小 型 或 中 型 的 电动 离心 机 。 1 使 用 方法 (1) 检查 离心 机 调 速 旋钮 是 否 处 在 零 位 外 套 管 是 否 完整 无 Ti FE A RZ (2) 离心 前 ， Jett cI este 其 量 以 距离 心 管 口 1 一 2 厘米 为 宣 , 以 免 在 离心 时 甩 出 。 将 离心 管 放 人 外 套 管 中 , 在 外 套 管 与 离心 管 间 注入 缓冲 水 , 使 离心 管 不 易 破损 。 (3) 取 一 对 外 套 管 (内 已 有 离心 管 ) 放 在 台秤 上 平衡 。 如 不 平 衡 ， 可 调整 缓冲 用 水 或 离心 物质 的 量 。 将 平衡 好 的 套 管 放 在 离心 机 十 字 转 头 的 对 称 位 置 上 。 把 不 用 的 套 管 取出 ， 并 盖 好 离 让 : 机 盖 。 (4) 接 通电 源 , 开启 开关 。 (5) 平稳 、 缓 慢 地 移动 调 速 手柄 ( 约 需 1 一 2 分 钟 ) 至 所 需 转 国 速 , 待 转速 稳定 后 再 开始 计时 。 (6) 离心 完毕 ， 将 手柄 慢 慢 地 调 回 零 位 。 关 闭 开 关 。 切断 电 源 。 * 234° a4 a er 7 (7) 待 离心 机 自行 停止 转动 后 ， 才 可 打开 机 盖 ， 取 出 离心 样 Ls] HH o (8) Hebe. RRR IVET a, 倒置 干燥 备用 。 2. 注意 事项 : (1) 离心 机 要 放 在 平坦 和 结实 的 地 面 或 实验 台 上 ， 不 克 许 倾 (2) 离心 机 应 接地 线 , 以 确保 安全 。 (3) 离心 机 启动 后 , 如 有 不 正常 的 噪音 及 振动 时 , 可 能 离心 管 | 破 雁 或 相对 位 置 上 的 两 管 重量 不 平衡 , 应 立即 关机 处 理 。 GO) 须 平 稳 、 缓 慢 增 减 转速 。 关 闭 电 源 后 , 要 等 候 离 心机 自动 停止 。 不 人 允许 用 手 或 其 它 物 件 迫 使 离心 机 停 转 。 (5) 一 年 检查 一 次 电动 机 的 电 刷 及 轴承 磨损 情况 ， 必 要 时 更 换 电 刷 或 轴承 。 注 意 电 刷 型 号 必须 相同 。 更 换 时 要 清洗 刷 盒 及 整 流 子 表面 污 物 。 新 电 刷 要 自由 落 入 刷 盒 内 。 要 求 电 刷 与 整流 子 外 Awe. HR Ais wT, 应 清洗 加 油 , 轴承 采用 二 硫化 钼 锂 基 脂 润滑 。 加 量 一 般 为 轴承 空 阶 的 本。 (六 ) 干燥 箱 和 恒温 箱 干燥 箱 用 于 物品 的 王 燥 和 干 热 灭 菌 ， 恒 温 箱 用 于 微生物 和 生 移 材 料 的 培养 。 这 两 种 仪器 的 结构 和 使 用 方法 相似 ， 干 燥 箱 的 使 用 温度 范围 为 50 一 250"C， 常 用 鼓 风 式 电热 以 加 速 升温 。 人 恒温 箱 的 最 高 工作 温度 为 60"C。 1. 使 用 方法 (1) 将 温度 计 插入 座 内 (在 箱 顶 放 气 调节 器 中 部 )。 (2) 把 电源 插头 插入 电源 插座 。 (3) 将 电热 丝 分 组 开关 转 到 1 或 2 位 置 上 ( 视 所 需 温度 而 2 定 )， 此 时 可 开启 鼓风机 促使 热 宝 气 对 流 . IME STE Ja» 20 Bin ATT 5E. 4 (4) 注意 观察 温度 计 。 当 温度 计 温度 将 要 达到 需要 通 座 时 ， 3 调节 自动 控 温 旋钮 , 使 绿色 指示 灯 正 好 发 亮 , 十 分 钟 后 再 观察 温度 、 计 和 指示 灯 ， 如 果 温 度 计 上 所 指 温度 超过 需要 ， 而 红色 指示 灯 仍 亮 , 则 将 自动 控 温 旋钮 略 向 反 时 针 方向 旋转 , 直 调 到 温度 恒定 在 要 求 的 温度 上 ， 指 示 灯 轮番 显示 红色 和 绿色 为 止 。 自 动 恒温 器 旋钮 在 箱 体 正面 左上 方 。 它 的 刻度 板 不 能 做 为 温度 标准 指示 ， 只 能 做 为 调节 用 的 标记 。 a (5) 在 恒温 过 程 中 , 如 不 需要 三 组 电热 丝 同时 发 热 时 , TE 启 一 组 电热 丝 。 开 启 组 数 越 多 , 温 庆 上 升 越 快 。 (6) 工作 一 定时 间 后 ， 可 开启 顶部 中 央 的 气 调节 器 将 潮气 排 — tH, 也 可 以 开启 鼓风机 。 5 4 (7) 使 用 完毕 后 将 电热 丝 分 组 开关 全 部 关闭 ， 并 将 自动 恒温 器 的 旋钮 沿 反 时 针 方向 旋 至 零 位 。 = (8) 将 电源 插头 拔 下 。 2. 注意 事项 : (1) 使 用 前 检查 电源 , 要 有 良好 地 线 。 2 = (2) FRECKLE, DORADA RIERA 箱 内 加 热 。 箱 体 附 近 不 可 放置 易 燃 物 品 。 (3) 箱 内 应 保持 清洁 ， 放 物 网 不 得 有 锈 ， 否 则 影响 玻璃 器 严 洁 度 。 i C4) 使 用 时 应 定时 监 看 ， 以 免 温 度 升 降 影响 使 用 效果 或 发 生 事故 。 (5) 鼓风机 的 电动 机 轴承 应 每 半年 加 油 一 次 。 4 (6) Van $F ah Ri a ALR i A I A SE Me Ee 则 温度 不 稳定 。 * 236° wh eg * rat 全 证 ‘4 YA £7. hd, par Os * hy , Pi 人 ‘a Ned 把 C7) 检修 时 应 切断 电源 。 (七 ) 电热 恒温 水 浴 电热 恒温 水 浴 用 于 恒温 加 热 和 蒸发 ， 最 高 工作 温度 为 100"C， 此 仪器 利用 控 温 器 控制 温度 ， 所 以 工作 原理 和 使 用 方法 与 干燥 箱 相似 。 但 应 注意 使 用 前 在 水 洽 模 内 加 足 量 的 水 以 避免 电热 管 烧 坏 。 如 较 长 时 间 不 使 用 , 必须 放 尽 水 槽 内 的 全 部 水 。 CN) 电 冰 箱 。， 电 冰箱 是 一 种 小 型 制冷 设备 , 主要 用 于 药品 ,试剂 和 生物 材料 的 保存 。 根据 箱 内 容积 大 小 ， 目 前 有 70 升 .100 升 .160 升 和 200 升 等 规格 的 全 封 闲 型 电 冰 箱 。 制 冷 剂 一 般 用 二 毛 二 所 甲烷 CF Cl, (i 称 F-12)。 1. 电 冰 箱 的 使 用 (1) 冰箱 应 放 在 空气 流通 .干燥 、 不 受 阳 光 直 晒 , 不 靠近 热源 ”的 地 方 。 电 冰箱 箱 体 要 离 墙 10 厘米 以 上 , 便于 空气 流通 。 放 置 要 平稳 。 (2) 使 用 电源 要 符合 电 冰 箱 铭牌 规定 ， 电 源 用 线 在 5 安培 以 上 ,并 要 装 有 2 安培 额定 保险 线 。 要 有 良好 的 地 线 , 接地 电阻 不 大 于 5 欧姆 。 (3) 温度 控制 器 上 数字 , 是 调节 时 的 记号 , 不 是 箱 内 的 真实 温 度 , 故 应 在 箱 内 放置 温度 计 。 温 度 控 制 器 旋钮 上 的 数字 越 大 , 温度 就 越 低 。 旋 到 “ 停 ” 字 时 , 机 器 停车 。 调 节 温 度 时 , 箱 内 的 温度 是 逐 渐 下 降 和 升 高 的 , 每 调整 一 次 ， 必 须 经 过 多 次 自 停 . 自 开 后 温度 才 能 稳定 。 如 仍 达 不 到 要 求 , 可 做 二 次 或 三 次 调整 。 (4) 托 架 上 切 勿 摆 满 存放 物品 。 应 留 有 空 阶 , 以 便 空气 流通 ， © 237。 er Ps ae rae : ra % > - 人 7 保持 箱 内 温度 均匀 。 0 特殊 气味 的 物品 应 严 加 包装 , 以 防 污染 。 fed RE (5) 热 物 品 应 冷却 到 室温 后 再 放 入 箱 内 。: (6) 冰箱 上 部 温度 低 , 下 部 温度 高 , 让 和 物品 时 要 注意 根据 所 需 温度 存放 。 WA eH CH, RE A 以 免 因 结 冰冻 破 瓶子 。 (7) 所 存放 的 物品 必须 注 明 物品 名 称 ,存放 日 期 ,存放 人 人。 有， 2. 冰箱 的 维护 4 (1) 使 用 时 , 开 冰箱 门 的 次 数 要 尽量 少 ， 关门 要 全 要 ek 少 侵入 箱 内 的 热量 。 (2) 冰箱 内 不 宜 放 置 强酸 强 碱 和 其 它 腐蚀 性 物品 。 (3) 蒸发 器 上 的 冰霜 太 厚 时 (2 厘米 左右 ) 会 影响 制冷 效果 ， 此 时 应 化 霜 。 将 温度 控制 器 旋 至 “化 霜 " 点 即 可 化 霜 ， 霜 化 完 后 再 回复 到 原 位 。 切 总 用 金属 器 手 冰 或 殴打 , 化 霜 时 注意 接 霜 水 。 (4) 搬 动 电 冰 箱 时 要 轻 , 不 要 倾斜 , 不 要 倒置 。 4 (5) 应 保持 电 冰 箱 的 清洁 , 箱 内 外 每 月 要 用 肥皂 水 冲洗 一 次 。， 至 少 每 半年 彻底 清扫 一 次 箱 体 后 面 冷凝 器 上 的 灰 竺 。 因 灰 尘 太 厚 时 隔 热 , 会 使 冰箱 的 制冷 效率 降低 。 : (6) 要 定期 检查 启动 继电器 (一般 可 半年 检查 一 次 )。 因 启动 接点 一 天 开 几 十 次 (正常 时 每 小 时 开 停 6 次 )。 启 动 接点 的 开 停 会 产生 火花 , 使 得 接点 面 烧 成 凹凸 不 平 , 导致 启动 过 长 或 损坏 冰箱 。 “ 如 接点 有 损坏 , 用 零 零 号 细 砂 纸 磨 光 , 即 可 保证 接点 启动 良好 。 (7) 电 冰 箱 临时 不 用 时 , 不 用 技 下 电源 插头 ， 但 应 注意 检查 电 源 。 电 压 过 低 时 易 烧 坏 压 纵 机 。 (AL) 酸度 计 ian” 酸度 计 是 测量 pH 值 的 精密 仪器 , eT AK Me 4 ° 238 ° Se lie Aol ata? ea a = am A a wd 二 上 LA Wi tt" 1. 使 用 方法 (1) 安装 : © 电源 的 电压 与 频率 必须 符合 仪器 铭牌 上 所 指明 的 数据 , 同 。 时 必须 接地 良好 , 否则 在 测量 时 可 能 指针 不 稳 。 @) 仪器 配 有 玻璃 电极 和 甘 季 电极 。 将 玻璃 电极 的 胶木 帽 夹 “在 电极 夹 的 小 夹子 上 。 将 甘 孙 电极 的 金属 帽 夹 在 电极 夹 的 大 夹子 ”上 。 可 利用 电极 夹 上 的 支 头 螺丝 调节 两 个 电极 的 高 度 。 @@ 玻璃 电极 在 初次 使 用 前 ， 必 须 在 蒸馏 水 中 浸泡 24 小 时 以 上 。 平 常 不 用 时 也 应 浸泡 在 蒸馏 水 中 。 © 甘 示 电 极 在 初次 使 用 前 ， 应 浸泡 在 饱和 和 氧化 钾 溶 波 内 , 不 要 与 玻璃 电极 同 泡 在 蒸 饮 水 中 。 不 使 用 时 也 浸泡 在 侈 和 和 氧化 钊 溶 液 中 或 用 橡胶 帽 套 住 甘 冬 电 极 的 下 端 毛细 孔 。 (2) 校 整 将 "pH-my" 开 关 拨 到 pH 位 置 。 @) 打开 电源 开关 , 指示 灯亮 , 预 热 30 分 钟 。 图 取 下 放 蒸 馅 水 的 小 烧杯 , 并 用 滤纸 轻 轻 吸 去 玻璃 电极 上 的 多 余 水 珠 。 在 小 烧杯 内 放 入 选择 好 的 ， 已 知 pH 值 的 标准 缓冲 溶 液 。 将 电极 唐 入 。 注 意 应 使 玻璃 电极 端 部 小 球 和 甘 科 电极 的 毛细 和 孔 浸 在 溶液 中 。 轻 轻 摇动 小 烧杯 使 电极 所 接触 的 溶液 均匀 。 @ 根据 标准 缓 名 液 的 pH 值 , 将 量程 开关 拧 到 0 一 7 或 7 一 14 处 = © 调节 控 温 钮 , 使 旋钮 指示 的 温度 与 室温 同 。 © 调节 零点 , 使 指针 指 在 pH 7 处 。 @ 轻 轻 接 下 或 稍 许 转动 读数 开关 使 开关 卡 住 。 调 节 定 位 旋 AL, 使 指针 恰好 指 在 标准 缓冲 液 的 pH 数值 处 。 放 开 读 数 开关 , 重 复 操作 , 直至 数值 稳定 为 止 。 校 整 后 , 切 勿 再 旋 动 定位 旋钮 ， 否 则 需 重新 校 整 。 取 下 标 e。 239 。 准 滚 小 烧杯 , 用 蒸馏 水 冲洗 电极 。 (3) 测量 : D 将 电极 上 多 余 的 水 珠 吸 干 或 用 被 测 溶 液 冲 洗 二 次 ， 人 后 将 电极 浸入 被 测 溶液 中 , 并 轻 轻 转 动 或 摇动 小 烧杯 , 使 溶液 均匀 接触 “ 电极 。 4 @ 被 测 溶液 的 温度 应 与 标准 缓冲 溶液 的 温度 相同 。 4 @@ 校 整 零 位 ， 按 下 读数 开关 ， 指 针 所 指 的 数值 即 是 待 测 液 的 ， pH 值 。 若 在 量程 DH 0 一 7 下 将 量程 开关 置 于 pH 7 一 14 处 再 测量 。 | @ 测量 完毕 , 放 开 读数 开关 后 , 指针 必须 指 在 pH 7 hb, 否则 重新 调整 。 2 © 关闭 电源 , 冲洗 电极 ， Wenn oe 2. 注意 事项 : (1) 防止 仪器 与 潮湿 气体 接触 。 湖 气 的 浸入 会 降低 仅 器 的 绝 缘 性 , 使 其 灵敏 度 、 精确 度 、 稳 定性 都 降低 。 (2) ELAR ARN, AB OE, ES 4 接触 。 zh (3) FPR MRNA BA bnhes, MN PAIS TE 用 四 毛 化 碳 或 乙醚 冲洗 , 再 用 酒精 冲洗 , 最 后 用 蒸馏 水 洗 净 。 (4) 甘 灵 电极 的 氧化 钾 溶液 中 不 允许 有 气泡 存在 ， 其 中 有 极 少 结晶 ， 以 保持 饱和 状态 。 如 结晶 过 多 , 毛细 孔 堵塞 , 最 好 从 新 灌 入 新 的 饱和 和 氧化 钾 溶 液 。 (5) APR DELS EL EL a PL, 应 更 换 玻 璃 电极 * 3 标准 缓冲 液 的 配制 : 了 度 计 所 用 的 标准 缓冲 液 的 试剂 容易 提纯 也 比较 黎 定 。 党 用 ， 的 配制 方法 如 下 : (1) pH= 4.00 的 标准 缓冲 液 * 240。 J, FF x ? ae | © RCH 105°C R/O EES RSC 5.07 3, ITA ”饮水 溶解 , 并 定 容 至 500 毫升 。 (2) pH=6.88 的 标准 缓冲 液 称 取 在 130°C 干燥 二 小 时 的 磷酸 二 氢 钾 (KH,PO,) 3.401 克 ， ”磷酸 氢 二 钠 (NasHPO,.12H:O) 8.95 克 或 无 水 磷酸 所 二 钠 (Na, HPO,)3.549 克 , 加 重 蒸馏 水 溶解 并 定 容 至 500 毫升 。 (3) pH=9.18 的 标准 缓冲 液 称 取 Wl Be #4 (Na,B,O,;-10H,O) 3.8144 be eM 7c 7k WR A (Na2B,0;)2. 02 ki; 加 重 蒸 馅 水 次 容 解 并 定 容 至 100 毫升 。 四 、 常用 缓冲 溶液 的 配制 生物 实验 室 中 常用 的 某 些 缓冲 液 列 在 下 表 中 。 绝 大 多 数 缓冲 液 的 有 效 范 围 约 在 其 p 玉 。 值 左右 1 p 也 单位 。 酸 或 fm pKa, | pKa, | PKa, 磷酸 2.1 7.2 12.3 柠 样 酸 3.1 4.8 5.4 碳酸 6.4 10.3 一 Ai me 4.8 一 一 巴 比 妥 酸 3.4 a Tris( = 7% PAE FE) 8.3 一 一 选择 实验 的 缓冲 系统 时 ， 要 特别 慎重 。 因 为 影响 实验 结果 的 因素 有 时 并 不 是 缓冲 液 的 PH， 而 是 缓冲 液 中 的 某 种 离子 。 选用 下 列 缓 冲 系统 时 应 加 以 注意 。 1. 硼酸 盐 ”这 个 化 合 物 能 与 许多 化 合 物 (如 糖 ) 生 成 复合 物 。 2. 柠檬 酸 盐 ”柠檬 酸 离子 能 与 钙 离 子 结合 , 因此 不 能 在 Ca:2+ 存在 时 使 用 。 。24T 。 0 二 aS 二 3， 了 磷酸 盐 “” 它 可 能 在 一 些 实验 中 作为 酶 的 抑制 剂 甚至 AR 物 起 作用 。 重 金属 离子 能 与 此 溶液 生成 磅 酸 盐 沉淀 ,而且 它 在 pH7.5 以 上 的 缓冲 能 力 很 小 。 4. Tris “这 个 缓冲 液 能 在 重金 属 离子 存在 时 使 用 ， 但 也 可 能 在 一 些 系统 中 起 抑制 剂 的 作用 。 它 的 主要 缺点 是 温 庆 效应 (此 点 常 被 忽视 )。 室 温 时 pH 7.8 的 Tris 缓 冲 液 在 4C 时 的 pH 为 8.4 (ETC 时 为 7.4， 因 此 一 种 物质 在 人 C 制备 时 到 37"C 测 量 时 其 所 A 离子 浓度 可 增加 10 倍 之 多 。 Tris te pH7.5 ELF MS MMe 2 (R55. (一 ) 磷酸 氢 二 钠 - 柠 檬 酸 缓 冲 液 0.2 摩 东 / 升 -| 0.1 摩 尔 / 升 0. 288K /Ft | 0.1 摩 pH Na.HPO, 柠 样 酸 pH Na:HPO， ree Gest) | (毫升 Get) | Gab 2.2 0. 40 | 19. 60 5.2 10.72 | Spasiioaae 2.4 1.24 18.76 5.4 11.15 - 8. 85 2.6 2.18 17.82 5,6 11. 60 8. 40 2.8 3.17 16.83 5.8 12.09 7.91 3.0 4.11 15.89 6.0 12.63 - 7.37 3.2 4.94 15.06 6.2 13. 22 6.78 3.4 5.70 14. 30 6.4 13.85 6.15 3.6 6.44 13.56 6.6 14.55 5.45 3.8 7.10 12.90 6.8 15.45 4.55 4.0 7.71 12.29 7.0 16.47 | 3.53 4.2 8.28 11.72 7.2 17.39 | 2.61 4.4 8. 82 11.18 7.4 18.17 1.83 / 4.6 9.35 10.65 7.6 18.73 1.27 4.8 9. 86 10.14 7.8 19.15 0.85 5.0 | 10.30 9.70 8.0 19.45 | 0.55 ” Na,HPO,4)-F-4k = 141. 98; 0.2 摩尔 / 升 溶液 为 28.40 克 / 升 。 Na:HPO, .2H,O 分 子 量 =178. 05; 0.2 摩 尔 / 升 溶液 含 35.61 克 / 升 ; CsHsO,;.H;O 分 子 量 =210.14; 0,1 摩尔 / 升 溶液 为 21.01 H/F. 。242 。 0.1 摩 尔 / 升 柠檬 酸 钠 % 酸 a (BFt) A 3.0 y. VaS.6 ihe 5.0 8.2 11.8 . 3.2 iz: S 2.9 5.2 7.3 12.7 内 3.4 16.0 4.0 5.4 6.4 13.6 + 3.6 14.9 5.1 5.6 5.5 14.5 ae 3.8 14.0 6.0 5.8 4.7 15.3 pl 4.0 13.1 6.9 6.0 3.8 16.2 5 4.2 go73 7.7 6. 2 2.8 17.2 4.4 11.4 8.6 6.4 2.0 18.0 4.6 10.3 9.7 6.6 1.4 18.6 4.8 9.2 10.8 柠 榜 酸 CoHsO,- HO, 分 子 量 210.14; 0.1 摩尔 / 升 溶液 为 21.01 克 / 升 。 Fre Wh NasCcH;O,-2H.0, 分子量 一 294. 12; 0.1 摩 尔 / 升 溶液 为 29.41 克 / 升 ， “三 ) 醋酸 -醋酸 钠 缓冲 液 (0. 2 摩尔 / 升 ) 5 0.2 摩 尔 / 升 | 0.2 摩 尔 / 升 a Peon”) NaAC( 24) HACGEF) pH(18°C) 0.2 摩 尔 / 升 | 0.2 摩 尔 / 升 NaAC( 毫 升 )| HAC( 毫 升 ) & 3.6 0.75 9.25 4.8 5.90 4.10 3.8 1.20 8. 80 5.0 7.00 3.00 | 4.0 1. 80 8. 20 5.2 7.90 2.10 § 4.2 2.65 7.35 5.4 8. 60 1. 40 4.4 3.70 6. 30 5.6 9.10 0.90 “4 4.6 4. 90 5.10 5.8 9.40 0.60 NaAC.3H2O 分 子 量 =136.09; 0.2 摩 尔 / 升 溶 液 为 27.22 H/F. (四 ) 磷酸 盐 缓 冲 液 | 1. BERR — Hh WE RR — SU HAE hie (0.2 摩尔 / 升 ) x, 0.2 摩 尔 / 升 | 0.2 摩 尔 / 升 0.2 摩 尔 / 升 | 0.2 摩 尔 / 升 N Na.HPO, a 2PO, Ges) | (毫升 ) : 5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0 5.9 10.0 90.0 wat 67.0 33.0 er 72.0 28.0 6.0 12.3 87.7 。243 。 旋 0:2 靡 尔 / 升 | 0.2 摩 尔 / 升 0.2 靡 尔 / 升 | 0.2 摩 尔 es pH Na:HPO, | NaH.PO, ||- pH Na,HPO, | Nz aa (毫升 ) (毫升 ) (毫升 ) | ¢ i 6.1 15.0 85.0 7.3 77.0 Res 6.2 18.5 81.5 7.4 81.0 oC 6.3 22.5 77.5 7.5 84.0 a 6.4 26.5 73.5 7.6 87.0 6.5 31.5 68.5 7.7 89.5 6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 6.7 43.5 56.5 7.9 93.0 6.8" °° 49.0 51.0 ° 8.0 94.7 6.9 55.0 45.0 Na.HPO,:2H.0O 4) + =178. 05; 0.2 摩尔 / 升 溶液 为 35. 61 克 /) 升 二 Na:HPO4.12H:O 分 子 量 =358. 22; 0. 2 摩尔 / 升 溶液 为 71. 64 克 / 升 73 _ NaH,PO,-H.O 4>-f- ik = 138.01; 0.2 摩尔 / 升 溶液 为 27.6 克 / 升 i, NaH,PO,-2H:O 4}-¥ 4k = 156. 03; 0.2 摩尔 / 升 溶液 为 31. 21 ye/Ft j 2, BRR — BN RMR — SBT ER rhe (1/15 RE AR / FE) Sts (Ft) (毫升 ) 《毫升 ) 4.92 0.10 9.90 7.17 7.00 eid: 5.29 0.50 9.50 7.38 8.00 Ba 5.91. 1.00 9.00 7.73 9.00 i: 3 6.24 2.00 8.00 8.04 9.50 d 6. 47 3.00 7.00 8.34 9.75 ui : 6.64 4.00 6. 00 8. 67 9.90 2 6.81 5.00 5. 00 8.18 — 10.00 i 2 6.98 6. 00 4.00 ‘ Na,HPO,-2H.0 4} $-4it =178. 055 1/15 摩尔 / 升 溶液 为 11. 876 BIH ae KH:PO. 5) ¥-fit = 136.095 1/15 摩尔 / 升 溶液 为 9.078 克 / 升 。 ee 。244 。 ‘ ud ae = ee — < Fee GS we, ee CURD co 和 学 a Ne 2 7.6 je Sg 8.0 8.2 ; EERIE FH =206. 18; 0.04 摩尔 / 升 湾流 为 8.25 克 /和 (六 ) Tris -盐酸 缓冲 液 (25“C) ” 50 毫升 0.1 摩尔 / 升 三 羟 甲 基 氨 基 甲烷 0.1 摩尔 / 升 盐酸 刘 匀 后 , In 7k FE REE 100 毫升 。 | 0.04 BE AR / FE pHs | 巴 比 妥 钠 溶液 (2551) ~ 100 100 100 100 100 100 100 100 0. 218 As / Ft 0. 04M AR / Ft pH | 巴 比 妥 钠 溶液 盐酸 (毫升 ) - 《毫升 ) 18. 17. 16. 15. 13. 11. GE) Bibs aye eC) 100 100 0. 2H AR / Ft 盐酸 (毫升 ) .21 . 82 52 65 13° .70 .35 (Tris) WRG XSF R 7.10 45.7 8.10 26.2 0 44.7 8.20 22.9 7.30 43.4 8.30 19.9 7.40 42.0 8.40 17. 2 7.50 40.3 8.50 14.7 7. 60 38.5 8. 60 12h. iw P70 36.6 8.70 10.3 7. 80 34.5 8. 80 8.5 7.90 32.0 8. 90 7.0 8.00 29.2 = Fe Fe a HE A HE ( Tris) HOCH、 ~CH:OH 分 子 量 二 121. 14; HOCH.” “NH; 0.1 摩尔 / 升 溶液 为 12.114 H/F, Tris 溶液 可 从 空气 中 吸收 二 氧化 矶 ， 使 用 时 注意 将 瓶 盖 严 。 。245 。 sf” 本 a ae a. cont (七 ) 碳酸 钠 -碳酸 氢 钠 缓冲 液 (0. 1 摩尔 / 升 ) ， ee ， “Ca Mg? 存在 时 不 得 使 用 s Pes: > _ pH 0.1 摩 尔 / 升 上 20°C | 37°C NazCOs( 24) 9.16 8.77 1 < 3 9.40 9.12 2 Sous | ad 9.51 9.40 3 Te ey 9.78 9.50 4 oe Ants 9.90 9.72 5 5 10.14 9.90 6 4 10.28 10.08 一人 o5 10.53 10.28 x 2 10.83 10.57 9 1 Na.CO;:10H.O 分 子 量 =286.2; 0.1 摩 尔 / 升 溶液 为 28.62 H/F. NaHCO:。 分 子 量 =84. 0; 0.1 摩 尔 / 升 溶液 为 8.40 克 / 升 ， 五 、 和 常用 酸 碱 指示 剂 (一 ) 某 些 常用 指示 剂 : eat 7 和 es 4 百 里 酚 蓝 (Thymol blue) 0.1 克 溶 于 10.75 毫升 0.02 摩尔 / 升 | 1. Ta ( 酸 范 围 ) NaOH, 用 水 稀释 到 250 毫 升 es ie 溴 酚 蓝 0.1 克 溶 于 7.45 毫升 0.02 摩尔 / 升 | 3.0—4.6 4 NaOH, 用 水 稀释 到 250 毫升 aR - Gc (Bromophenol blue) 甲 基 红 (Methyl red) 0.1 克 溶 于 18.6 毫升 0.02 摩尔 / 升 站 4.4-6.2 NaOH, 用 水 稀释 到 250 毫升 红 : ee 0.1 克 溶 于 9.25 毫升 0.02 摩尔 / 升 NaOH, 用 水 稀释 到 250 毫升 酚 红 (Phenol red) 0.1 克 溶 于 14. 20 毫升 0.02 摩尔 / 升 | 6.8 一 8.0 NaOH, 用 水 稀释 到 250 毫升 7 ---gi4 0.19, 10.75 毫升 0.02 摩尔 / 升 | 8.0—9.6 a NaOH, 用 水 稀释 到 250 毫升 黄 am at. 0.1 克 溶 于 250 毫升 70% TM PRR (Bromocresol purple) 百 里 酚 蓝 (Thymol blue) ( 碱 范围 ) 酚 配 (Phenolphthalein) 7 pre hs 1 BRO. 1% FF AR TE ZL He fh) | SAREE, 5. GRRE i . pH=7.0 1% - | 保存 于 深 色 瓶 中 pH=8. 6 ?&# 9.0 紫色 七 、 标准 溶液 的 制备 和 标定 (一 ) 0.1 当量 / 升 揽 氧化 钠 ; 容 液 的 配制 和 标定 1. .0.1 当量 / 升 标准 邻 葵 二 甲酸 氢 钾 溶液 的 配制 Re) BF A, FF 100—125°C FAR fh OK — a _ CRHCH.O., 分 子 量 一 当量 一 2043) 基 准 试剂 约 102 克 (准确 到 。247 。 bey ae Me] 0.1 毫克 )。 用 水 溶解 后 按 定 量 分 析 操作 全 部 转移 到 500 EF me TICES. 1, SESE 瓶 中 。 计 算出 溶液 的 准确 当量 浓度 并 贴 好 标签 。 eo QL 0.1 Sa / FEAL Bes a A Hil pis. (1) 不 含 碳酸 钠 的 浓 氢 氧化 钠 的 制备 Rk 将 110 克 分 析 纯 氢 氧化 钠 固体 置 于 300 毫升 锥 形 瓶 中 ， jl00 毫升 水 ， 不 时 振荡 。 深 解 后 用 橡皮 守 塞 紧 并 表 置 雪 昌 直到 酉 酸 销 全 部 沉 于 底部 时 ， 倾 出 上 面 清 彻 液 备 用 。 100 RELIES BRIE 4 的 浓 深 液 约 含 NaOH75 i, (2) 0.1 当量 / 升 标准 氢 氧 化 钠 的 制备 meee te 液 5.5 毫升 , MAKB—Ft. 1, FAA BL RAI 4 (3) 标定 : 准确 量 取 20 毫升 0.1 4A / FLOAT 20 毫升 , 加 酚 本 指示 剂 3 一 4 WH, FAL 0.1 当量 / 升 所 氧化 销 溶液 浓 定 至 微 红色 , 记 下 氨 氧 化 钠 的 滴定 体积 。 重 复 做 三 份 。 | (4) 计算 W x 1000 : Neon oe C/I 式 中 W =KHC,H,O, fy he tt Ge) * F 三 标准 氨 氧 化 钠 溶液 滴定 体积 ( 芝 升 ) Naor 三 标准 氢 氧 化 钠 溶 液 准确 当量 浓度 (二 ) 0.1 当 量 / 升 标准 盐酸 的 配制 和 标定 吸取 分 析 纯 盐酸 ( 约 12 当量 / 升 )8.5 SEF In 7k B 1 Ft, 混 多 后 用 0.1 当量 / 升 标准 所 氧化 钠 溶 波 镁 定 ， ihe N NyaonV NaoH BCLW cg ot, HCl Nuci, Nyaon 分 别 为 盐酸 与 氨 氧 化 钠 的 准确 当量 浓度 。 。248 。 LL ‘ Vici. Vnaon 分 别 为 盐酸 与 氨 氧 化 钠 溶液 的 毫升 数 。 (三 ) 0.1 当 量 / 升 标准 硫 代 硫酸 钠 溶 液 的 制备 和 标定 称 50 克 硫 代 硫酸 钠 溶 在 老 沸 后 冷却 的 燕 馏 水 中 , 加 者 过 的 未 饱 水 到 2,000 毫升 。 用 标准 0.1 当 量 / 升 碘 酸 钾 溶 液 (0.3567 克 KKIO。 溶解 后 定 容 至 100 毫升 ) 标 定 , 标定 时 取 0.1 当量 / 升 KIOs 溶液 20 毫升 加 KI1 克 及 6 当量 / 升 HSO,5 毫升 , 用 所 配制 的 Naz$:Os 溶 流 滴 定 至 浅黄 色 后 ， 加 10 多 淀粉 指示 剂 3 滴 , 使 溶液 呈 蓝 色 ， 继 续 袜 定 至 蓝 色 消失 。 计 算 Na.S.0, 溶液 的 滴定 体积 和 准确 浓 度 。 5KI+ KIO, + 3H,SO,—~>3K,SO, + 3H,O-+ 31, 2Na.S,0, + I1,—Na,S,0, +-2Nal HL PS ER o> FHP BD TR a, 从 正 5 价 降 到 负 1 价 , 其 化 学 价 的 变动 为 6。 础 酸 钾 的 分 子 量 为 214.01， 所 以 矶 酸 钾 在 此 反应 中 的 氧化 还 原 当 量 为 214.01/6 三 35.67。 N “V Na,S,O, 溶液 当量 浓度 = 一 2 — 808 下 Na vs,o。 OER 20 2 Vna,8.0,; VNa.8.05 Vna,s,o, 为 NazSzOs aw ME AR (EFL). e 249 » 八 、 元 素 的 原子 量 表 ee 二 xe | 符号 | 原子 量 | 元 灯 | 符号 | mee 银 Ag 107. 868 ce Mo 95.94 a gn Al 26. 9815 所 N 14. 0067 ath As 74. 9216 钠 Na 22. 9898 & Au 196. 967 #e Nb 92. 906 a B 10.811 争 ”Ni 58.71 ei Ba 137.34 氧 O 15. 9994 Be Be 9.0122 RR Os 190.2 Sh Bi 208. 980 I P 30.9738. 省 Br 79.909 34 Pa 231.0 碳 G 12.01115 铅 Pb 207.19 钙 Ca 40.08 包 Pd 106.4 is Cd 112. 40 ae Pt - 195.09 i Ce 140.12 镭 Ra 226.0 ra Cl 35. 453 钢 Rb 85.47 a Co 58. 9332 pk Re 186.2 j 铬 Cr 51.996 ee Rh 102.905 fs Cs 132.905 可 Ru 101.07 铀 Cu 63.54 硫 Ss 32.064- 4h F 18. 9984 sy Sb 121.75 铁 Fe 55. 847 ay Sc 44. 956 % eg Ga 69.720 Wy Se 78.96 5b Ge 72.59 rk Si 28. 086 a H 1. 0079 锡 Sn 118.69 氨 He 4. 0026 fia Sr 87. 62 fee Hf 178.49 A Ta 180.948 RK Hg 200.59 a Te 127. 60 fh I 126. 9044 针 Th 232.038 锣 In 114. 82 钰 Ti 47.90 ‘eh Ir 192.2 Re Tl 204. 37 钾 K 39.102 ‘al U 238. 03 - 钒 V 50.942 ws pg? 钨 W 183.85 _ 和 包 Y 88.905 镁 Mg 24, 312 锌 Zn 65. 37 th Mn 54. 9381 fa Zr 91. 22 *。 250° En 九 ; 试管 ICH Re - 容量 瓶 量 简 量 杯 起 < | ‘ SHEA Hn TWF He JTL SLBA BB. (21) ® 150X 14mm 20x 漏斗 150X18mm 10 支 25ml 10 支 、 | AK 圆 底 , 10ml AX 500m! 上 个 250ml 1% 100ml 2% 50ml 2 个 IK 150ml 4 4 # i 90mm 50ml 4 个 45mm 10ml 4 支 白色 反应 盘 | 6 MW 5ml 4X 白 磁 板 2ml 4 支 培养 下 90mm iml 8x 120mm 0.5ml . 8 药 匀 0.2ml 4 支 PRI 0.1m AX 温度 计 酒精 0 一 100"GC 100ml 2% 滴 管 中 50ml 4 个 小 100ml 2 个 Ok Hs 大 、 中 、 小 50ml 2 个 药 用 天 平 10ml 1% 白 磁 盘 5ml 1% 电炉 500ml @ 个 别 实验 临时 补 发 的 仪器 未 列 人 上 表 。 。 251 °¢ : 符 昂 扬 封面 设计 TO 一 一