中 国 科学 院 教材 建设 专家 委员 会 规划 教材 ee = 2 ee ol, cee FT Fh) Tiro~ —— —T) 4tt (Ze = 4 — FE | J\ 1 cr All RIT &~ Ae 4c5 EB 7 ee ee ee eee, 8S 孙 汶 生 - BR SE Fe 马 春 红 EP 分 ok as www. eae com NE AN Aa ky Ve) \ ,7 ' 上 M5. [LIU 2 217 / 中 国 科 学 院 教材 建设 专家 委员 会 规划 教材 供 医 学 七 年 制 \ 八 年 制 \ 研 究 生 使 用 基因 工程 学 + 编 Mitt SKK 副 主编 刘 素 侠 MR 编 ”者 (以 姓氏 笔画 排序 ) 于 学 慧 ， 马 春 红 BRE RER 马 春 红 王晓燕 x) RAK wm OA 曹 英 林 } 内 容 简 介 本 书 是 山东 大 学 医学 院 免疫 学 研究 所 和 兄弟 院 校 的 第 一 线 教 师 根据 多 年 的 教学 和 科研 实践 ,充分 考虑 基因 工程 学 及 分 子 生 物 学 在 21 世纪 生命 科 学 中 的 重要 地 位 和 新 时 期 医学 院 校 培养 目标 ,坚持 理论 联系 实际 的 原则 编 写 而 成 。 本 书 围绕 基因 工程 学 的 基本 理论 、 基 本 技术 及 基因 工程 学 在 医学 中 的 应 用 ,系统 阐述 了 基因 克隆 基因 表达 及 多 种 常用 基因 工程 学 技术 的 原 理 及 方法 。 具 有 简明 扼要 、 可 操作 性 强 等 特点 。 本 书 适合 医学 院 7 年 制 .8 年 制 学 生 ,临床 和 基础 各 科研 究 生 ,以 及 综合 大 学 相关 专业 研究 生 ,也 可 作 为 本 科 生 选修 课 及 青年 医师 进修 .自学 用 书 。 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 基因 工程 学 / 孙 汶 生 等 主编 .一 北京 :科学 出 版 社 ,2004.8 中 国 科 学 院 教材 建设 专家 委员 会 规划 教材 ISBN 7-03-013199-1 1.#: II.@O 孙 … OF: OF: 下 .基因 -遗传 工程 -医学 院 校 一 教材 W.Q78 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2004) 第 037982 号 责任 印 制 : 刘 士 平 /封面 设计 : 卢 秋 红 mek BR 出 版 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 http://www. sciencep.com EPR AT 印刷 科学 出 版 社 发 行 各 地 新 华 书店 经 销 2004 年 8 月 第 一 版 开本 :787x1092 1/16 2004 年 8 月 第 一 次 印刷 ”印张 :21 172 印 数 : 1 一 4 000 字数 :500 000 定价 : 32.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 ,我 社 负责 调 换 《 环 伟 ?) 山 BY 基因 工程 技术 自 20 世纪 70 年 代 诞 生 以 来 ,发展 异常 迅速 ,从 简单 的 基因 体 外 “拼接 ” ,逐步 形成 了 关于 基因 结构 、 功 能 研究 的 一 整 喜 理论 和 方法 。 目前 ,基因 工程 技术 已 广泛 应 用 于 人 类 基因 组 学 、 生 物 学 .遗传 学 .肿瘤 学 、 传染 病 学 等 与 基础 医学 和 临床 医学 有 关 的 各 个 研究 领域 ,并 大 大 加 快 了 这 些 领 域 的 发 展 , 作 为 21 世纪 的 医学 生 和 医学 工作 者 应 该 了 解 、 掌 握 和 运用 基因 工程 的 相关 理论 和 技术 。 为 此 ,我 们 感到 应 该 为 他 们 提供 一 本 简明 扼要 介绍 该 领域 基本 理论 和 相关 技术 的 教材 或 参考 书 。 山东 大 学 医学 院 免 疫 学 研究 所 自 20 世纪 80 年 代 开 始 为 研究 生 开设 基因 工 程 学 课程 ,致力 于 开拓 学 生 科研 思路 ,培养 研究 生 科 学 思维 和 训练 学 生 实验 技 能 , 深 受 广大 学 生 的 好 评 。 此 次 ,我 们 在 总 结 20 年 教学 经 验 的 基础 上 ,吸收 基因 工程 学 最 新 研究 成 果 和 技术 ,编写 此 书 。 本 书 是 山东 大 学 医学 院 免疫 研究 所 全 体 教师 和 研究 生 共同 努力 的 成 果 , 其 主要 使 用 对 象 是 医学 院 临 床 和 基础 各 科研 究 生 ,以 及 综合 大 学 相关 专业 研究 生 ,也 可 作为 本 科 生 选修 课 及 青年 医师 进修 、 BAS. ; 基因 工程 学 涉及 遗传 学 生物 化 学 分 子 生 物 学 及 微生物 学 ,属于 多 学 科 交 叉 的 边缘 学 科 。 为 了 避免 与 其 他 学 科 的 重复 ,本 书 在 编写 过 程 中 以 基因 工程 技 术 为 主线 ,围绕 基因 克隆 、 体 外 重组 、 基 因 表 达 及 基因 工程 学 在 医学 中 的 应 用 ， 重点 介绍 相关 技术 的 原理 技术 和 最 新 发 展 , 突 出 实用 性 ,注重 理论 与 实验 相 结 ES 全 书 共 分 为 四 篇 。 第 一 篇 包括 第 一 至 第 三 章 ,概括 介绍 基因 工程 学 发 展 动 态 及 相关 基本 理论 ,包括 DNA 大 分 子 的 结构 特性、 功能 及 基因 工程 的 基本 过 程 ,力图 对 基因 工程 学 的 基本 内 容 和 新 进展 作 一 个 框架 式 的 介绍 ,其 内 容 也 涉 及 了 当前 许多 崭新 的 研究 领域 ,如 基因 组 学 功能 基因 组 学 等 。 第 二 篇 基因 工 程 学 基本 理论 与 技术 ,包括 第 四 章 至 第 十 二 章 , 主 要 介绍 基因 工程 常用 技术 及 相关 理论 ,通过 这 部 分 的 讲述 ,读者 可 以 了 解 有 关 基 因 克 隆基 因 表 达 的 基本 策 RUE ,以 及 基因 工程 学 中 常用 的 工具 酶 .载体 的 概念 \ 种 类 和 当前 基因 工程 - 中 广泛 应 用 的 PCR 测序 及 芯片 技术 。 第 三 篇 基因 工程 在 医学 中 的 应 用 ,包括 第 十 三 章 至 第 十 九 章 , 主要 介绍 目前 基因 工程 学 在 医学 中 应 用 后 产生 的 新 技 术 、 新 发 展 , 如 基因 工程 抗体 基因 表 达 调 控 研 究 、 功 能 基因 簿 选 、 基 因 治疗 及 利 用 基因 工程 技术 制备 新 型 实验 动物 模型 等 。 第 四 篇 是 基因 工程 学 实验 技术 ,该 1 = ‘i+ 基因 工程 学 部 分 内 容 主要 是 结合 前 面 介 绍 的 理论 ,以 基因 克隆 、 基 因 表 达 为 主线 设计 实验 ， 力图 通过 这 些 买 验 使 读者 掌握 基因 工程 的 基本 技术 和 技能 。 书 后 编写 了 七 项 附录 ,提供 了 一 些 章 用 培养 基 试剂 的 配制 、 基 因 工 程 铅 用 数据 等 , 供 研究 者 方 便 应 用 。 为 帮助 读者 能 够 更 好 地 阅读 、 理 解 相 关外 文 原著 ,本 书 收录 了 基因 工 程 冲 用 词汇 及 名 词 解释 以 供 参考 。 本 书 编 号 中 , 山 乐 省 医学 科学 院 韩 金 祥 院 长 给 予 了 大 力 冯 持 并 撰写 "生物 蕊 片 的 技术 原理 与 应 用 "一 章 , 泰 山 医 学 院 魏 然 教 授 也 为 本 书 的 出 版 给 予 了 大 力 支 持 , 住 此 一 并 表示 致谢 。 基因 工程 学 是 一 门 《 速 发 展 的 交叉 学 科 , 本 书 力图 做 到 实用 性 和 准 人 稍 性 ， 并 尽量 将 基因 工程 学 的 最 新 成 果 纳 入 编写 内 容 ,然而 ,由 于 学 科 上 友 展 迅 狐 、 编 写 时 间 仓 佐久 编者 水 平 所 限 ,可 能 企 内 容 、 又 字 、 编 排 及 图 表 方 面 存在 下 漏 和 不 足 之 处 , 层 切 希 黑 恋 者 和 同道 们 指正 。 孙 汶 生 2004 年 3 月 于 济南 ”人 BS AT DNA 的 结构 与 性 能 RN (4) 二 、DNA 的 分 子 结构 pp (6) 第 二 章 ae (19) 第 一 节 ， 基 因 工 程 的 基本 概念 . re 第 二 BA Ay BEAL GRE FRE i cre eae ee oe eg ee rea pre Cee map ng enenanetpesevs- (20) Oe SR ea ba Lek ee EO Tere ke Ca. ence kp [| 二 4 | > A EB lil tl ‘iv: 基因 工程 学 He | | | aA Bl Ii eae 第 一 节 | + HB lll fl | a4 Hil {i | 2 | oH |W | | H# oF A ltl [I 第 五 基因 工程 的 发 展 与 应 用 - ISL a Oe a ee x 人 类 后 基因 组 计划 ao 第 二 篇 ”基因 工程 学 的 基本 理论 与 技术 ne MAT RL RAMRE WA hic. BAR ee i a) PEs YY NE os eee ne. Rl ee Me eed. dR: Oke aw Re om 、 限 制 性 核酸 内 切 酶 的 分 类 . 人 "TL a SS RP «eee eres. Ge A 20 BREA - we dee dee'éa's'ee'dws ob a “ 恨 制 性 核酸 内 切 酶 在 基因 工程 审 的 应 用 cr ee TITTTPTICT ICTS RTT eee er (50) DONA FEE BE AP EDR epee sss cee ate acento cen aaa ceeae: vis sct222 . -连接 酶 从 化 :DNXA EBB RY A, Bl) 2s se 8a aba es os coe Ges as. A Smee ena - Su sb cas casase ccs .. SUN GRE ae Cee ne DNA ESE BE TE EA TB a ss set te eee seat aac 22 a oe :区 每 二 二 了 水 相似 GR … (53) 453) DNA 连接 酶 … KF RAE * ARO HOHE + wes eee 、 反 转录 酶 催化 DNA 合成 的 分 子 机 制 … Tee ey eer BEG TE EME TP PL Ae estes ee A : setting DNA #4 Af 1 BoA: eid bee abe dpe dee ofeich bo QUbep Ram 、 大 肠 杆 菌 DNA 3 ABB ET BY Klenow KC BERR ce cee eee cee eee eee cee cee eeeeeeeenaes ia 、T4 DNA 聚合 酶 及 TI7 DNA 聚合 酶 wee cre cee cee ee eee eee ee eee eee tenner cee eee eee eee RRR. CR Pr pr eB. (33) Yt shizes st (CSA) . pene ES ose was des oo esi (38) = (38) (34) ss (34) (35) (36) (37) (38) (39) (43) (43) (43) … (44) (45) (48) (49) (50) (51) * (358) (52) (54) (54) (55) 30) (56) (56) (57) 第 七 节 … 末 端 脱氧 核 背 酸 转移 酶 pe = 每 仇 端 转移 酶 在 基因 了 开 程 中 的 应 用 1 第 五 章 ”基因 工程 的 克隆 载体 第 一 节 “概论 …… Se AM aot RE Bc ore woo coe nae ver one dos nae say voduse dedven encrdaste soit Shea «th —. MERA Sh RRL …: —. BATHE - =. RABE - B >k dt | See 3:55; a oF AY Il Ih # ay | 、 基 本 特性 - 辅助 病毒 .M13K07-………… eee eres B lil [i SKB BARE - 、 未 知 基因 的 获得 . M13mp18/19 viata eat ae ap ETS EA a 28 RS ols a hdd ASB... ty , MEF RR pUC118 和 pUC119 的 主要 特性 PP . WE PAR BRA pUCI18/119 的 优 题 cre eter eee ee eee eee eee eee ee eee nee ene eee eee eee eee "vi' 基因 工程 学 | aH A lil [I a [il [1 第 四 | s+ A BS Ill Ih ‘ 同 聚 物 加 尾 法 cee cec cance ces cance ces coe seence cue cobislosMoslslisilns Sepals Silehifluiniiss «ssa Cea Oe 2). ces oo ; 根据 重组 载体 的 标志 作 第 和 dae ecanacensacelcnecacuse ses dec annL 二 和 下 让 半生 生生 … (95) 第 七 章 ”原核 细胞 表达 系统 - | er se Teal Pl 人 < 、 外 源 基 因 在 原核 细胞 中 的 表达 .…… CR sea 、 影 响 外 源 基 因 在 原核 细胞 中 表达 效率 的 主要 因素 nee ee cee cee tee ete cee une eee ees .原核 细胞 表达 载体 的 条 件 及 特点 pp FEA BER BI nce tence esncen ene cncene enn enncencee cone still ebcitla cille Sebisishe enalpes AE PRA UPR BRK one eeeer rene ene connnerdvinidtedlsnitae viiidai deielssnlsh od ded «big 、 分 泌 型 表达 载体 … 、 表 达 产 物 的 检测 - a no» see ohh “d) odie ehh 原核 生物 表达 系统 的 应 用 措施 及 其 局 限 性 有 pp ae | -- (106) 第 八 章 ” 真 核 生物 表达 系统 … 第 一 节 | i aH (il [I | # [1 |! | Wl [1 第 四 节 真 核 生 物 表 达 系 统 概述 … 、 真 核 生 物 表 达 系 统 的 优势 及 必要 性 … a. 、 真 核 生 物 基 因 结 构 及 表达 调控 特点 … Ss , BRAEMRKAR- ds dh Os) doo he tb TTR Tey 酵母 表达 系统 … 、 酵 母 载体 … ais ov 二 eight 二 ` 外 源 基因 在 酵母 中 的 表达 策略 … 哺乳 动物 细胞 表达 系统 … 、 哺 乳 动 物 细 胞 表达 系统 中 的 常用 遗传 标记 … 有 、 哺 乳 动物 细胞 表达 载体 … a See eee ee 三 、 哺 乳 动物 细胞 基因 转移 方式 … 昆虫 杆 状 病毒 表达 系统 … (89) (89) (90) (91) (91) (92) (92) (92) (93) (93) … (94) … (94) (94) (94) “at @5) (97) (98) (99) sse« (100) = (10%) “* (103) (104) ** (106) *- (106) (106) -- (110) … (110) … (110) ++ (112) … (115) (115) (116) (120) » (122) | {Ih [| 第 九 章 聚合 酶 链 反 应 .… 第 第 8 + Hi | cr Sk A OB il II 一 一 一 一 -一 … . PCR 的 基本 原理 -… -PCR Batis 不 对 称 PCR 、PCR 在 分 子 生物 学 中 的 应 用 … 、PCR 技术 在 临床 医学 中 的 应 用 … 第 十 章 “ 核酸 杂交 … 第 一 节 | oem Ll ot a i tl dH lil [I | DNA agepogo 和 (123) (124) (125) e WOVITerrerrerrerrerr Terre eee reer ee ai (126) - (126) * (126) … (130) PCR SE 5B DU [BB Fy cre eee ete te eee eee ene eee eee cee ne eee cee ene en eee ens \、 反 转录 PCR \、 定 量 PCR 、 实 时 荧光 定量 PCR 、 重 组 PCR \、 反 向 PCR . 2H PCR . KEE PCR Ay =F (126) (131) (131) ff (13h) … (132) “= (133) *» (135) … (135) seer (136) * (136) a + (136) *» (137) ** (138) nunennnnnnenateneecenereneennesse cerosilodele teindeoe ses. (140) Pi Oy EAS ELPA ae ene tee een eee ee nnnnnnters? na 全 ho REE HD FPS Be LIER cen ce ctee ce eee cen ene tenner ene ebitie calorie lee wle cial daieaialeeeeee ene TAR I BT FR nnn nnn nen ecnene cen cnnenn arn ccer te eile he aoeleterdga op ging ep oe eee ile acre Tid BE shah « wave ns ccs nrncssccsaccnacnnenuuacnaacacunsaacs scughhenetckd aia ee ai De a eC GE Oy. CeCe eee eee eC oe nee eee eT ERE Eee eeeR eee Steet eenen ta! er trite «RED APFs BE TST oo teen cen erncenceeeneccncen ene nre edition aie tke side wale wale dp tho vee NE CE. Coe | ee so oa IE is te cto cs escerservecs ersevanenevenycr sas an (137) (140) (140) (142) (144) (148) (148) (150) (153) . Sanger RUBE AL SER AL Be es eeecseser anaes sen agent eneennnd pie einai eatentsiadis ates anipes (153) (154) (154) (154) (155) (155) * viii ° ‘AB + #8 #8 lt It 第 十 三 证 ez | 4k tot OS Il [I AH ltl {1 [th [4 | & mH BE a | | 基因 工程 学 -Maxam-Gilbert (63232 WE DNA 序列 2 f 其 他 的 DNA 测 序 方 法 有 DNA SH FR AY 2 aR eee cee ccc cacces seuss cesses sas coveee see WP HOE Mi stelscsccceiees ares. RE BRR BR 了 5 AEFI TBR FF A HBR Ae coe cee eee cee needed dbo abe bale coe coe cnn ced due cue cne cedesuaesesb aber ces 生物 芯片 的 分 类 -0 “年 笔划 片 的 基本 工作 原理 站 市 ARE Wy ROL AG IAT Fd se 280 sae ddasac see see cease ssndss coe. Sey SEE PE 5 存在 问题 及 :发展 前 景 呈 3 第 三 篇 ”基因 工程 学 的 应 用 FE A TFB ee ee ee cee cee ee eee cee cece eee cee eee cee eee eee cee cee eee cee eeeeeeseeeee cee 基因 工程 抗体 概述 :sr , A- BBR A Ft 和 全 生生 SIT PEM ac ee ae <- UHI Pe ee cee sas evecte a ceuvadadadte ciedes sts dee mae sed 281 21153 Dae iat 11 CE Ee Lee LEEPER ED oi . Fab 抗体 pp SAP ER Bie Ile ran cc cade 20 68 208 586885 806 68S SEERA AR Mp DE a PARA Phe dee ces con cba cansad detec seat BRT 08 hdd Ut Wei bet tes ies eh

(159) (161) (165) + ~€165 ) (166) (166) (166) (167) *- (172) (178) (183) (183) (184) (184) (185) (186) (187) (187) (188) (188) (188) (189) (189) (189) (190) (191) * CPE) (194) (194) (194) (195) (200) eg 转录 水 平 调 控 的 研究 方法 ORR TIMI IRR REE 5500 eee 证 上 a | | G ol > | ce de A lil [1 i dH iil [I | a i FH TS It I! | i | + HE fh | serine DNA 多 态 性 研究 概述 Ne \、 微 卫星 DNA pe 、SNP 作为 遗传 标记 的 优势 NU 、SNP 的 网 上 资源 :Nt SERWK FTE OE BED EME aed ces cceccc ese cee sess MGR AR RE RE AMG... . SEREX 技术 步骤 pp one 这 SEREX 方法 所 筛选 的 肿瘤 相关 抗原 基因 pp 基因 敲 除 与 转基因 技术 … . FEA ax BR ND A AE FE BAL rae DRS De FA Be EE HE SR 、 基 础 研究 … "xe 第 四 Bd 十 4 {ok i at 实验 一 实验 二 实验 三 实验 四 基因 工程 学 @ i i | oA | EM dH A OE lil Il DNA 疫苗 的 免疫 原理 与 应 用 | | 第 四 篇 ”基因 工程 实验 技术 碱 变性 法 提取 质粒 了 NA ee cc ee Dee Le See fo cee ee DNA BRB FTES RT | nnn nn nee he reese ede te oe DNA. BRISA AL, < EUS DFE I oe servis ence denise celeb edn slne eed alee olna eta CyWahaghlatdl one ah Ss CS | eee ter … (264) [1 实验 五 ”细胞 总 RNA 的 抽 提 - 实验 六 Eap 二 、RT-PCR( 反 转录 -聚合 酶 链 反 应 ) … 转基因 技术 的 基本 原理 .ppp oe cee cee cee cen ceeiees cus ceelees ces cee … (239) 、 构 建 DNA 疫苗 的 基本 条 件 ee -DBDNA 疲 黄 制 备 的 基本 步 颈 和 方法 .……… See 0 (232) (233) (233) (233) (236) (239) (241) (242) (243) (244) (245) (246) (251) (252) (252) (254) (256) (256) (257) (258) (258) (259) (262) … (269) … (269) … (270) (272) (272) (273) … (281) 、Northern 印迹 杂交 …… 1 虽 质 体 介 导 的 转 染 SSG CE OG 05 ARCISOO ROO CEC Sb 6 SEIS SEO O0O CRO HoC RDO OOE CE Tica COOE GEE CRe *» (294) 表达 谱 DNA 芯片 样品 的 标记 及 杂交 实验 方案 ee 实验 九 Mh | “实验 十 一 一 -一 人 实验 十 二 实验 十 三 实验 十 四 实验 十 五 实验 十 六 、Southern fei PCR-SSCP 技术 … 核酸 电镜 技术 … 附录 工 常用 玻璃 器 四 的 处 理 … 附录 V 专业 词汇 ( 英 中 对 照 ) BY oe VI BACAR eis (275) (275) (276) (278) (278) (282) (284) (286) (286) (287) (289) (292) (298) oo (302) NR CEE, 2+. s cclewasts De sabes vf LAOs Gataiive pone dos 2s«derjeneers aacines out pede. SiS gp eee IE ea eee SEV A SESE PA Se A BR -- eee ee eee cee cen crsees ces cneensceeceeene ences MEV SAS i See (RW) eatin ops Sieh Reais aes ona tee oo +. (328) (303) (305) (309) (315) (ato) dy PEE y AGOwee Fe Ht SS He MB BAT 一 ah if. (80S) ----iies. ee eee ne . aR Ni in OST a - CRBS) 人 tRees asinine srne ses peeharecamp nnn ons rnvoor GR (SR=) < ae teil | (48S ) Does fe a AVG PHRBAR 5 ow CORS) rs SR BN oF da OR Bg (ORS) + ee fo 有 : (yas) Fo oe Se HEB the fo Hh Hh te Bet aw -----.- tomer noo gepape RHEE F (eas) Pan RaW ine a + ay bb ke “Mss fo 1 (ge. 有 > 4 . 人 a (aGsae 99? -+° te Eee - oe Wy +o Sener wate nde wee meeens AS POOL eer «Pacer C0 O84 ,于 【SoS) n ae% AN; eae * FH ee “** SAA REA ORS OED Rt tet eet O80 8D wei me tie a KE 机 yee : Om Ss CON +s ERR ee Be PPB Ay 6a A ----- mn a w+ nee see ean ons eases emer g eo J i 7 ; (des) foe ve DA: 5a dead oe Re + ey im: ye wp re eee mae ae mend (BOS) sies+4 CoPioks AE 4 TE 5 A AR REE SE Sh OD A sna (S0E) 4 Ti 4) 5 O49 in TAT Bester me ee ax! 3) Tix tnaedy Aw ebi bur ene « i Ae eenee A india ida Laan ae F . _ pee: 2 (808 ) Pas One ban tee es bee cee wee ISP ER OPH OES oo moe 6» 4 wile'\Ae aanves teem ROE): se aE on —cengnye Pest EARN (ME) … a EN 的 四 屋 INT (O18) SE-B A Bm RE Cte IK ) ‘2 -. Ore + Bea 2 ee Ce nes | EP “het MAD BAB: 28 5 PIE nacre msi 9 ETS . .s * iw A ib Re fa a tacos wes a Temp 和 co 和 +8 " . oe 能 4\ ia 8 te mi aie dns sam toe a ; ia one 40° acne ~te te beoe te * eGR Ew os Seba: oprorme ‘* Se 和 viata « 7% <>< CR Tere it) tat a ; ae ’ 7 | a WE Ae aah Ure Bs whens 4o +094 nee 108 eee eee mee Get O98 Cem ? Bh, ths reg samme, pi ent Banonwan enn ans ivpnens sve 二 加 . 3 ea) ,' wy " biel LE RL REL ee Oe ee : — Tr. ry oa 4 六 it Part | . Conspectus ~ .. 2 evtoeqenod ， 第 一 章 “基因 与 基因 组 Chapter 1. Gene and Genome ST ”基因 的 概念 与 特性 基因 (gene) 最 初 是 遗传 学 概念 , 随 着 生物 学 科 的 不 断 发 展 及 生命 科学 理论 与 技术 研究 的 不 断 深入 与 完善 ,人 们 对 基因 本 质 的 认识 及 其 定义 也 在 不 断 深 化 。 一 、 基 因 的 概念 与 分 子 生 物 学 定义 1926 4F , Morgan 从 遗传 学 的 角度 提出 基因 是 位 于 染色 体 上 的 基本 遗传 单位 ,基因 既是 携带 遗传 信息 的 结构 单位 ,又 是 控制 遗传 性 状 的 功能 单位 。 早期 研究 曾 认 为 遗传 物质 是 蛋白 质 , 直 至 1944 年 Avery 等 从 肺炎 链球 菌 转 化 实验 的 研 究 首 次 证 明 ,控制 某 些 遗传 特性 的 物质 是 DNA, 而 不 是 蛋白 质 ( 见 图 1-1). —=— A B Cc D PP ly, nts oe: 6 UW 图 1-1 Avery 的 肺炎 链球 菌 转 化 实验 (1944 年 ) A. 注射 有 荧 膜 (S 型 ) 的 致 病 性 肺炎 链球 菌 SD PRETO OB. 注射 突变 的 (R 型 ) 非 致 病 性 肺炎 链球 菌 ,小 鼠 存活 C. 注射 加 热 杀 死 的 S 型 ,小 鼠 存 活 “D. 注射 活 的 R 型 与 加 热 杀 死 的 S 型 的 混合 物 , 小 鼠 死 亡 “ e 3 四 . 4 . 基因 工程 学 1953 年 Watson 和 Crick 提出 了 DNA 分 子 的 双 螺 旋 结 构 模 型 ,阐明 了 DNA 自我 复制 的 机 制 ,推测 DNA 分 子 中 的 碱 基 序 列 储存 了 遗传 信息 。1961 年 法 国 科 学 家 下 .Jacob Al J. Monod 以 及 其 他 科学 家 相继 发 表 了 他 们 对 调控 基因 的 研究 ,证 实 了 信使 RNA( mRNA) # ft 着 从 DNA 到 蛋白 质 合成 所 需要 的 信息 ;发现 了 遗传 密码 ,提出 了 遗传 信息 储存 于 核酸 之 中 ;DNA 通过 转录 和 翻译 控制 蛋白 质 合成 ,从 而 将 DNA 双 螺 旋 结 构 与 DNA 功能 联系 起 来 。 事实 上 ,并 不 是 所 有 的 基因 都 是 DNA。 有 些 基 因 还 包括 不 同类 型 的 RNA, 如 tRNA、 rRNA 等 。 编 码 蛋白 质 或 RNA 的 基因 均 称 为 结构 基因 。 此 外 ,DNA 还 含有 只 起 调节 功能 的 片段 或 序列 , 称 为 调节 序列 。 调 节 序 列 可 提供 信号 ,表示 结构 基因 的 开始 和 结束 ,或 参与 启动 或 关闭 结构 基因 的 转录 ,或 作为 复制 起 始点 起 作用 。 因此 ,基因 的 分 子 生 物 学 定义 是 :基因 是 编码 功能 性 蛋白 质 多 肽 链 或 RNA 所 必需 的 全 部 核酸 序列 (通常 是 DNA 序列 ) ,负载 特定 的 遗传 信息 并 在 一 定 条 件 下 调节 、 表 达 遗 传 信 息 ,指令 蛋白 质 合 成 。 根 据 此 定义 ,一 个 基因 应 包含 了 编码 蛋白 质 肽 链 或 RNA 的 序列 ,为 保证 转录 所 必需 的 调控 序列 内 含 子 以 及 相应 编码 区 上 游 $ 端 和 下 游 3 端的 非 编 码 序列 。 二 、 基 因 的 一 般 特 性 ， ”基因 有 三 个 基本 特性 :中 基因 可 自我 复制 ,通过 DNA 半 保 留 复 制 , 保 证 物种 的 遗传 稳 定性 ;外 基因 决定 生物 表 型 或 性 状 , 即 基因 通过 转录 和 翻译 决定 多 肽 的 氨基 酸 序列 ,由 此 确 定 某 种 酶 或 蛋白 质 的 性 质 , 表 达 某 一 特定 的 生物 性 状 ;@ 很 多 因素 可 导致 基因 突变 ,新 突变 的 等 位 基因 一 旦 形成 ,就 可 通过 自体 复制 ,在 其 后 的 细胞 分 裂 中 保留 下 来 传 给 子 代 ,产生 新 的 生物 性 状 。 基因 按 其 功能 主要 分 为 结构 基因 和 调控 基因 : 1. 结构 基因 ”结构 基因 (struicture gene) 是 能 决定 某 些 多 肽 链 (蛋白质 ) 或 酶 分 子 结构 的 基因 。 结 构 基 因 的 突变 可 导致 特定 蛋白 质 (或 酶 ) 一 级 结构 的 改变 。 2. 调控 基因 ”调控 基因 (regulator gene) 是 具有 调节 控制 结构 基因 表达 功能 的 基因 。 调 控 基 因 的 突变 可 以 影响 一 个 或 多 个 结构 基因 的 功能 ,导致 重 白质 (或 酶 ) 量 或 活性 的 改变 。 此 外 ,有 的 基因 只 转录 而 不 翻译 ,如 核糖 体 RNA (ribosomal RNA，rRNA) 基 因 ,其 功能 仅 是 转录 rRNA; 转 运 RNA(transfer RNA, tRNA) 基 因 ,其 功能 仅 是 转录 tRNA。 第 二 节 ”DNA 的 结构 与 性 能 核酸 (nucleic acid) 是 生物 的 遗传 物质 基础 ,也 是 基因 的 基本 结构 。 核 酸 的 化 学 组 成 、 分 子 结构 符合 遗传 物质 的 稳定 性 .连续 性 及 多 样 性 的 要 求 。 一 、 核 酸 的 化 学 组 成 核酸 结构 的 基本 单位 是 核 苷 酸 (nucleotide acid) ,每 个 核 苷 酸 由 工 个 磷酸 、! 个 五 碳 糖 和 1 个 碱 基 3 部 分 组 成 。 核 酸 有 两 类 :一 类 是 脱氧 核糖 核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA), 第 一 章 “基因 与 基因 组 -5- DNA 中 的 脱氧 核糖 核 苷 酸 主要 由 4 AP SE , BY AR RS (adenine, A) . RM (guanine, G), Af HB BE (cytosine, C) Al Hey AR EE (thymine, 工 ) 及 脱氧 核糖 (deoxyribose) 和 磷酸 构成 ; 另 一 类 是 核糖 核酸 (ribonucleic acid，RNA) ,RNA 分 子 中 的 核糖 核 苷 酸 主要 由 碱 基 A\G、C AR KE (uracil, U) KBB (ribose) Fl Be AR FA BK (LAN 1-2). am ARAN Sway ‘e NH, O O 3 ZC N73 CH NZ HN sad CH eee Oo" SN ces O H N H H Ss Fd aS Ie 尿 喀 喧 胸腺 喀 喧 : HOCH HOCH * Ko? SNOB al os On 4K y OHA! QKin Hi NERA: NS za OH H OH H BE ii FA BF NH, NH, HOCH) O HOCH, O HO OH OH H ARRAY (RAT ) HLA Ime Fb AF FGA EF) 图 1-2 ”核酸 的 化 学 组 成 DNA 分 子 中 含有 磷 ,故常 用 放射 性 核 素 ?2P 做 DNA 标记 。 6 . 基因 工程 学 =, DNA 的 分 子 结构 (一 ) DNA 的 一 级 结构 DNA 的 一 级 结构 是 指 4 种 核 苷 酸 的 连接 及 其 排列 顺序 。DNA 分 子 是 4 RARER 经 3 -5 磷酸 二 酯 键 聚 合 而 成 , 故 也 称 多 核 苷 酸 (polynucleotide ) 。 (二 ) DNA 的 二 级 结构 1953 年 ,Watson 和 Crick 提出 了 DNA 分 子 双 螺旋 结构 模型 ,其 要 点 是 :DNA 分 子 是 由 2 条 平行 的 多 核 苷 酸 链 围 绕 同一 中 心 轴 构 成 的 右手 双 螺旋 结构 。 多 核 苷 酸 的 方向 由 核 昔 酸 间 的 磷酸 二 酯 键 的 走向 决定 ,一 条 从 5$->3“, 另 一 条 从 3 一 5 ,两 条 链 旦 反 向 平行 排列 (an- tiparallel) ,彼此 由 氢 键 相连 ,G 55 C ACXT(G=C),AS T Bet (A=T), BR DNA 的 二 级 结 构 。 图 1-3 表明 DNA 的 分 子 骨架 。 双 螺 旋 结 构 图 1-3 DNA 双 螺 旋 结 构 及 碱 基 配 对 示意 图 (=) DNA 的 超 螺旋 结构 生物 体内 绝 大 多 数 的 DNA 是 以 超 螺旋 (supercoil，SC) 的 形式 存在 。 细 菌 及 质粒 DNA 均 为 共 价 闭环 (covalent close circle，CCC) 双 链 DNA, 4 ao 螺旋 卷曲 为 超 螺旋 结构 。 当 超 螺 旋 结 构 的 DNA 任 一 单 股 链 出 现 缺 口 时 ,螺旋 则 松 开 呈 环 状 , 称 为 开 环 (open circle，OC); 环 AR DNA 分 子 不 稳定 , 易 被 限制 性 内 切 酶 切断 ,形成 线 型 (linear，LC)DNA。 由 于 超 螺旋 第 一 章 “基因 与 基因 组 -7- DNA 有 较 大 的 密度 ,在 凝 胶 电泳 时 涌 动 速度 较 快 ,在 离心 场 中 的 移动 速度 也 较 线性 或 环 状 的 DNA 快 , 故 应 用 凝 胶 电泳 或 超速 离心 法 可 以 很 容易 的 将 超 螺 旋 DNA 分 开 ( 图 1-4)。 ee) al [= 单 链 切 割 || 连接 CXSOO A B 图 1-4 DNA 的 构 型 (A) 与 电泳 位 置 (B) 由 于 相对 分 子 质量 相同 而 构 型 不 同 的 DNA 在 电场 中 泳 动 速度 不 同 , 所 以 DNA 相对 分 子 质量 测定 时 均 需 采用 线 型 DNA。 =, DNA 的 功能 与 性 质 1. DNA 的 吸收 光谱 et DNA 分 子 的 吸收 光谱 高 峰 为 260nm, 紫 外 线 照射 可 引起 DNA 损伤 断裂 。 2. DNA 分 子 在 电场 中 的 迁移 “DNA 分 子 在 碱 性 条 件 下 带 负 电 , 凝 胶 电泳 中 向 正极 泳 动 。 分 子 大 小 及 构象 不 同 的 DNA 分 子 其 迁移 率 不 同 ,从 而 可 以 分 开 。 溴 化 乙 啶 (EB) 可 衣 A DNA 双 链 的 配对 碱 基 之 间 ,在 紫外 线 激发 下 呈现 橙 红 色 荧 光 , 可 用 于 DNA 分 析 及 相对 分 子 质量 测定 。 3. DNA 的 变性 ”在 一 定 物 理 或 化 学 因素 的 作用 下 ,DNA 的 双 链 间 的 氢 键 断裂 ,形成 单 链 的 过 程 ,叫做 DNA 的 变性 (denature)。 加 热 到 一 定 温度 ,DNA 双 链 分 开 , 称 热 变性 。 DNA 对 波长 为 260nm 的 紫外 线 具 有 吸收 作用 , 且 单 链 DNA 对 紫外 线 的 吸收 值 高 于 双 链 DNA。 由 于 DNA 变性 而 使 其 溶液 对 紫外 线 的 吸收 值 增加 的 现象 称 为 增色 效应 , 常 以 此 特 性 进行 DNA 观察 和 测定 。 使 一 半 的 螺旋 结构 解体 时 的 温度 被 定义 为 解 链 温度 (temperature melting,Tu)e Tu 对 DNA 的 PCR 扩 增 十 分 重要 ( 见 第 万 章 )。s 4. DNA 的 复 性 将 DNA 的 变性 因素 去 除 后 ,两 条 单 链 根据 碱 基 互 补 原则 ,恢复 成 双 链 的 过 程 , 称 为 DNA 的 复 性 (renature) 。 热 变性 后 慢 慢 冷却 ,两 条 单 链 恢复 成 双 链 螺 旋 结 构 的 过 程 , 称 为 退火 (annealing)。 来 源 不 同 的 两 条 核酸 单 链 , 根 据 碱 基 互补 的 原则 形成 双 链 的 ”8 . 基因 工程 学 过 程 , 称 为 杂交 (hybridization) 。 杂 交 可 发 生 在 DNA/DNA 之 间 ,也 可 发 生 在 DNA/RNA 之 间 。 核 酸 杂 交 的 种 类 很 多 ,如 Southern blot, Northern blot \ 原 位 杂交 (zi situ hybridization) 等 。 采 用 标记 DNA 探 针 进行 杂交 ,可 以 检测 特定 DNA 的 存在 情况 ( 见 第 十 章 )。 = DNA 的 复制 与 表达 一 、DNA 复制 DNA 复制 过 程 中 ,首先 碱 基 间 氢 键 断裂 , 双 螺 旋 解 旋 并 松 开 , 然 后 每 条 多 核 苷 酸 链 各 以 自己 为 模板 (template) 吸 收 游离 i 核 苷 酸 , 按 碱 基 互 补 原则 ,进行 氢 键 结合 。 在 聚合 酶 作用 下 , 合 成 新 的 互补 链 ,与 原来 的 模板 单 链 并 列 盘旋 ,形成 稳定 的 双 螺 全 = 旋 结 构 ( 图 1-3)。 由 此 新 形成 的 2 个 DNA 分 子 与 原来 DNA <= = 分 子 的 破 基 序列 完全 一 样 。 每 个 子 代 DNA 分 子 的 一 条 链 来 自 its 3 ARK DNA, A— ARE EH A BAY , Br Ae RP AS tll Fr RK HE ——" 保留 复制 (semi-conservative replication, Kl 1-5). ——— 天 二 、 基 - 因 * 表 达 图 1-5 Xie DNA 半 保留 复 制 过 程 基因 表达 (gene expression ) 是 指 细 胞 在 生命 过 程 中 ,把 依 存在 DNA 序列 中 的 遗传 信息 经 过 转录 和 翻译 ,转变 成 具有 生 物 活性 的 蛋白 质 分 子 。 生 物体 内 的 各 种 功能 蛋白 质 和 酶 都 是 由 相应 的 结构 基因 编码 的 (图 1-6)。 (一 ) 转录 过 程 在 RNA 聚合 酶 的 催化 下 ,以 DNA 为 模板 合成 mRNA 的 过 程 称 为 转录 (transcription ) 。 在 双 链 DNA 中 , 作为 转录 模板 的 链 称 为 模板 链 (template strand) ,或 反 义 链 (antisense strand) ; 另 一 条 链 称 为 编码 链 (coding strand) ,或 有 义 链 (sense strand) 。 编 码 链 与 其 转录 产 物 的 差异 仅 在 于 DNA 中 工 变 为 RNA 中 的 U。 在 含 许多 基因 的 DNA 双 链 中 ,每 个 基因 的 模板 链 并 不 总 是 在 同一 条 链 上 , 亦 即 一 条 链 可 作为 某 些 基 因 的 模板 链 ,也 可 是 另外 一 些 基 因 的 编码 链 。 转录 后 要 进行 加 工 ,转录 后 的 加 工 包 括 : 1. 剪接 一 个 基因 的 外 显 子 和 内 含 子 都 转录 在 一 条 原始 转录 物 RNA 分 子 中 , 称 为 前 mRNA(pre-mRNA) ,又 称 不 均一 核 RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)。 前 mRNA 分 子 既 有 外 显 子 序列 又 有 内 含 子 序 列 ,还 包括 编码 区 上 、 下 游 的 非 翻 译 序列 。 必 须 除 去 内 含 子 序 列 ,才能 产生 成 熟 的 ` 有 功能 的 mRNA 分 子 , 这 个 过 程 称 为 RNA 剪接 (RNA splicing) 。 剪 切 发 生 在 外 显 子 的 3 末端 的 GT 和 内 含 子 3 末端 与 下 一 个 外 显 子 交 界 的 AG 处 。 第 一 章 “基因 与 基因 组 -9- 编码 链 基因 57 Boer AG < GT AG ay rad bon 3 1 1 3, = 3 模板 链 [> I , GU__ AG GU AG / 转录 iv RNA 5 Cap 3 (per-RNA) Poly (A) 1. 加 帽 & FEAR RRL 2. RNA 加 工 和 剪 切 5' Cap AAA------ An3 ' {) 5' Cop me AA A------An3 | mRNA 细胞 核 细胞 质 翻译 延 仲 中 的 多 肽 链 5 完整 的 5 4 AAA 和 An3 ar 好 aa 一 核糖 体 图 1-6 真 核 生物 结构 基因 表达 (DNA->RNA-~ 和 蛋白 质 ) 流 程 图 2. 加 帽 “ 几 乎 全 部 的 真 核 mRNA 5 端 都 具 “ 帽 子 (cap) 结构。 虽然 真 核 生 物 的 mRNA 的 转录 以 味 叭 核 苷 酸 三 磷酸 (pppA 或 pppG) 领 头 , 但 在 $ 端的 一 个 核 苷 酸 总 是 7- 甲 基 鸟 核 苷 三 磷酸 (m7GpppAGpNPp)。mRNA 5 端的 这 种 结构 称 为 帽子 。 不 同 真 核 生物 的 mRNA 具 有 不 同 的 帽子 。 mRNA 帽子 结构 的 功能 :@ 能 被 核糖 体 小 亚 基 识别 ,促使 mRNA 和 核糖 体 的 结合 ; @Om7Gppp 结 构 能 有 效 地 封闭 RNA 5 末端 ,以 保护 mRNA 免 受 $ 核酸 外 切 酶 的 降解 ,增强 mRNA 的 稳定 性 。 3. 加 尾 大 多 数 真 核 生 物 的 mRNA 3“ 末 端 都 有 由 100 ~ 200 + ARES (A) AA polyA HE. polyA 尾 不 是 由 DNA 编码 的 ,而 是 转录 后 的 前 mRNA LA ATP 为 前 体 , 由 RNA 末端 腺 苷 酸 转移 酶 , 即 polyA 聚合 酶 催化 聚合 到 3 “末端 。 mRNA poly(A) 尾 的 功能 是 :四 有 助 于 mRNA 从 细胞 核 到 细胞 质 的 转运 ;@ 避 免 在 细胞 中 受到 核 酶 降解 ,增强 mRNA 的 稳定 性 。 (二 ) 翻译 过 程 真 核 细胞 的 转录 以 及 加 工 都 在 细胞 核 内 进行 ,但 翻译 过 程 则 在 细胞 质 中 进行 。 以 mRNA 作为 模板 ,tRNA 作为 运载 工具 ,在 有 关 酶 .辅助 因子 和 能 量 的 作用 下 ,将 活 化 的 氨基 酸 在 核糖 体 ( 亦 称 核 蛋 白 体 ) 上 装配 为 蛋白 质 多 肽 链 的 过 程 , 称 为 翻译 (transla- tion) ,这 一 过 程 大 致 可 分 为 肽 链 的 起 始 、 延 长 与 终止 3 个 阶段 (图 1-7)。 -10-: 基因 工程 学 多 个 核糖 体 (“ 装 配 机 ”) DNA( 遗 传 信息 ) DODODPADODOAIGDOODSOM Si pate mRNA ( “BUR” ) 多 个 5 tRNA (特异 转运 工具 ) — RAAF Cth ) 多 个 氨基 酸 ( 原 料 ) 图 1-7 真 核 细胞 的 翻译 过 程 从 核糖 体 上 释放 出 来 的 多 肽 需要 进一步 加 工 修饰 才能 形成 具有 生物 活性 的 蛋白 质 ,这 一 过 程 称 为 翻译 后 加 工 (posttranslational processing)。 翻 译 后 的 肽 链 加 工 包 括 肽 链 切 断 , 某 些 氨基 酸 的 羟基 化 、 磷 酸化 .乙酰 化 、 糖 基 化 等 。 真 核 生物 在 新 生 多 肽 链 翻 译 后 将 蛋氨酸 裂 解 掉 。 第 四 六 基 因 组 基因 组 (genome) 是 细胞 或 生物 体 的 全 套 遗 传 物质 , 载 有 遗传 信息 的 DNA 大 分 子 通常 组 装 成 染色 体 (原核 生 物 中 为 染色 质 ) ,每 条 染色 体 存在 成 千 上 万 个 不 同 的 基因 。 人 们 曾经 认为 每 个 基因 组 的 DNA 量 是 不 变 的 (包括 数目 位置 等 ) ,但 至 20 世纪 60 年 代 ,在 大 肠 杆菌 的 半 乳 糖 操 纵 子 的 研究 中 发 现 了 插 人 序列 以 及 可 转移 位 置 的 遗传 因子 后 , 才 认识 到 基因 组 的 某 些 成 分 的 位 置 并 非 一 成 不 变 。 尽 管 如 此 ,各 类 生物 的 基因 组 仍 有 其 基本 的 结构 特点 ,物种 不 同 ,染色 体 数目 不 同 , 其 基因 数量 不 等 , 少 至 几 个 ,多 则 5 万 一 10 万 个 。 不 同 物种 的 正常 染色 体 数 目 见 表 1-1。 表 1-1 不 同 生物 的 正常 染色 体 数 目 物种 染色 体 数 目 DNA 含 量 /bp A Wit HA {A (bacterial phage A) 1 5x 10° KF CE. coli ) 1 4.2x 10° 啤酒 酵母 (yeast) 34 1.410’ 果 蝇 (fruit fly) 8 1.4X108 小 鼠 (mouse) 40 4.7 10° it (frog) 26 4.5X 10° 人 (human) 46 3.2X10? 鸡 (chicken) 78 2. «10? 第 一 章 ”基因 与 基因 组 -11- 一 、 病 毒 基 因 组 病毒 不 能 单独 繁殖 ,只 能 在 宿主 细胞 内 进行 复制 。 完 整 的 病毒 颗粒 是 由 核酸 和 和 蛋 白质 组 成 的 ;其 核心 为 核酸 ,构成 病毒 的 基因 组 。 病 毒 基因 组 的 特点 使 其 可 以 通过 人 工 改 造成 为 基因 工程 中 良好 的 载体 。 (一 ) 病毒 基因 组 的 结构 病毒 的 基因 组 由 DNA 或 RNA 组 成 ,每 种 病毒 颗粒 只 含有 一 种 核酸 。 病 毒 基因 组 的 DNA 或 RNA 可 以 是 单 链 的 (single strand，SS) ,也 可 以 是 双 链 的 (double strand, DS) ;可 以 是 环 状 分 子 ,也 可 以 是 线性 分 子 。 多 数 DNA 病毒 的 基因 组 是 双 链 DNA 分 子 , 如 乙 型 肝炎 病毒 的 基因 组 是 双 链 环 状 DNA, 腺 病毒 ,疱疹 病毒 的 基因 组 为 双 链 线 状 DNA; 多 数 RNA 病 毒 的 基因 组 是 单 链 RNA 4) -F , UA KAR IE (二 ) 病毒 基因 组 的 特点 1. 病毒 基因 组 小 ,基因 数 少 。DNA 病毒 基因 组 的 大 小 差别 很 大 。 如 乙 型 肝炎 病毒 只 有 3.2kb, 只 能 编码 几 种 蛋 白 质 ;而 癌 病 毒 基 因 组 有 300kb, 可 以 编码 几 百 种 蛋白 质 。 2. #A BSAA, BI I—E DNA 片段 可 以 编码 2 一 3 种 蛋白 质 分 子 。 这 种 结构 可 使 较 小 的 基因 组 携带 更 多 的 遗传 信息 。 例 如 乙 型 肝炎 病毒 (HBV)( 图 1-8)。 虽 然 有 些 基 因 完 全 重 二 在 一 起 ,但 它们 的 开放 读 码 框架 (open reading frame，ORF) 不 同 ,因此 翻译 的 氨基 酸 序 列 及 表达 的 和 蛋白质 完 全 不 同 。 3. 鸣 菌 体 的 基因 是 连续 的 ,基因 组 中 无 内 含 子 。 感 染 真 核 细 胞 的 病毒 基因 是 不 连续 的 ,具有 内 含 子 。 4. 病毒 基因 组 大 部 分 为 编码 蛋白 质 的 结构 基因 ,一 小 部 分 序列 为 基因 之 间 的 间隔 区 和 基因 表达 的 调控 序列 。 5. 病毒 基因 组 DNA 序列 中 功能 相关 的 蛋白 质 基 因 或 rRNA 基因 常 集中 在 基因 组 的 一 个 或 几 个 特定 的 部 位 ,形成 一 个 功能 单位 或 转录 单元 。 6. 除 反 转录 病毒 基因 组 有 两 个 拷贝 外 ,其 他 病毒 基因 组 中 每 个 基因 只 有 一 个 拷贝 。 二 、 原 核 生 物 基 因 组 原核 生物 的 核 物质 分 散在 细胞 质 中 ,无 核 膜 包围 ,只 有 染色 质 ,不 形成 染色 体 。 通 常 多 数 为 双 链 环 状 结 构 ,少数 为 线 状 。 由 于 其 核 物 质 只 有 DNA 分 子 ,不 含 组 蛋白 ,没有 核 仁 ,不 形成 明显 的 细胞 核 ,无 核 膜 , 故 称 为 类 核 (nucleoid)。 例 如 大 肠 杆 菌 染 色 质 是 由 4.2x105bp 组 成 的 双 链 环 状 DNA 分 子 , 约 有 3 000 一 4 000 个 基因 ,目前 已 经 定位 的 基因 已 达 900 多 个 I~ o Pre S2 pre S} +/PreZenome 35 kb pre cl i oO SS @ xrar O Shimyr 国有 ”多 腺 苷 化 信和 号 me ORT] 前 S1 启 动 子 基本 核心 局 动 户 er § 直接 重复 序列 DRI 和 DR, 图 1-8 HBV 基因 组 结构 (一 ) 细菌 染色 质 基 因 组 的 结构 特点 1. 细菌 染色 质 基因 由 环 状 双 链 DNA ARM ABR RE ,形成 致密 的 类 核 。 类 核 中 央 部 分 由 RNA 和 支 架 蛋 白 组 成 ,外 围 是 双 链 闭环 的 DNA 超 螺旋 。DNA 链 上 与 复制 、 转 录 有 关 的 信号 区 域 优先 与 细胞 膜 结合 ,这 种 连接 有 助 于 细胞 膜 对 染色 质 的 固定 及 细胞 分 裂 时 染色 质 的 均匀 分 配 。 2. 功能 上 相关 的 几 个 结构 基因 往往 串联 排列 在 一 起 组 成 操纵 子 (operon) 结 构 , 受 上 游 调控 区 控制 。 转 录 时 , 几 个 基因 转录 在 一 条 mRNA 链 上 ,再 分 别 翻译 成 各 自 的 蛋白 质 。 3. 结构 基因 序列 是 连续 排列 的 ,无 内 含 子 ,在 转录 后 不 需要 加 工 修饰 。mRNA 在 DNA 链 上 合成 时 ,核糖 体 就 开始 将 mRNA 翻译 成 蛋白 质 , 即 边 转录 边 翻 译 , 翻 译 与 转录 偶 联 进 行 。 4. 细菌 的 DNA 绝 大 部 分 都 是 编码 蛋白 质 的 功能 基因 。 5. 细菌 基因 组 结构 基因 无 重 秋 现 象 。 6. 细菌 基因 组 中 结构 基因 多 为 单 拷贝 ,但 编码 rRNA 的 基因 通常 是 多 拷贝 的 ,以 适应 细菌 核糖 体 快速 组 装 及 蛋白 质 快 速 合成 。 第 一 章 “基因 与 基因 组 ， 13 . (二 ) 质粒 细菌 除了 在 类 核 中 含有 较 大 环 状 染 色 质 DNA, 胞 质 中 还 含有 小 的 双 链 环 状 DNA 分 子 结构 , 称 为 质粒 (plasmid)。 质 粒 是 细菌 的 特殊 结构 ,多 在 4x10" 一 100x10?bp 范围 内 ,具有 良好 的 自我 复制 和 调控 系统 。 质 粒 携带 的 遗传 信息 通过 复制 ,产生 子 代 质 粒 , 并 在 细胞 分 裂 时 进入 子 代 细胞 。 质 粒 广 泛 存 在 于 细菌 ,有些 酵母 菌 和 其 他 真菌 中 也 发 现 有 质粒 存在 。 大 肠 杆菌 质粒 结构 见 图 1-9。 环 状 质粒 分 子 FARA (4 Jk DNA “人 大肠 杆菌 细胞 抗生素 抗 性 基因 控制 质粒 DNA 转移 的 基因 图 1-9 大 肠 杆 菌 质粒 结构 示意 图 质粒 并 不 是 细菌 生命 活动 所 必需 的 ,但 其 编码 的 性 状 大 多 数 对 细 戎 起 保护 作用 ,使 细 革 获得 有 利于 其 生存 的 特性 。 质粒 携带 有 许多 基因 ,可 以 控制 许多 重要 的 生物 学 形状 。 例 如 携 珊 B- 内 酰胺 酶 的 质粒 使 笨 主 菌 对 B- 内 酰胺 类 抗生素 如 青霉素 和 氮 人 西林 产生 耐 受 性 。 质粒 可 以 从 一 个 细菌 转移 至 另 一 个 细菌 ,可 以 在 同 种 属 的 细菌 或 在 不 同 种 属 的 细菌 之 间 转 移 。 携 带 的 性 状 也 随 之 转移 。 质 粒 可 以 从 抗生素 耐 受 细菌 转 人 对 抗生素 敏感 的 细菌 ， 使 后 者 变 为 耐 药 菌 。 质 粒 在 致 病菌 中 播 散 ,形成 多 重 耐 药 菌株 。 某 些 质 粒 还 能 与 染色 质 整 合 , 其 复制 则 受 染 色 质 的 控制 。 把 所 需 目 的 基因 插 人 到 质粒 中 ,并 导入 受 体 细胞 ,通过 质粒 的 复制 及 转录 ,使 受 体 细胞 能 够 产生 由 外 源 基因 编码 的 蛋白 质 。 质 粒 的 特性 使 其 在 基因 工程 中 成 为 应 用 十 分 广泛 的 载 体 工 具 ( 见 第 五 章 )。 三 、 真 核 生 物 基 因 组 真 核 生 物 中 DNA 结构 复杂 ,表达 调控 多 样 。DNA 在 细胞 中 的 包装 是 一 种 独特 的 、 紧 凑 和 高 度 凝聚 的 结构 ,经 过 多 级 螺旋 盘 绕 压 缩 ,与 蛋白 质 结 合 形成 染色 体 。 整 个 基因 组 分 布 在 细胞 核 内 的 多 条 染色 体 中 ,外面 有 核 膜 包 庄 。 真 核 生 物 的 染色 体 在 细胞 周期 的 大 部 分 时 间 -4- 基因 工程 学 内 以 染色 质 (chromatin) 的 形式 存在 ,染色 质 的 基本 单位 是 核 小 体 (nucleosome)。 由 于 染色 体 DNA 存在 于 细胞 核 中 , 故 mRNA 在 细胞 核 内 合成 后 ,要 经 过 修饰 加工, 如 剪 切 、 加 多 聚 腺 苷 酸 (poly A) 尾 等 ,然后 运输 到 细胞 质 ,指导 蛋白 质 合 成 。 真 核 细 胞 除 细 胞 核 DNA 之 外 ,细胞 器 线粒体 也 含 极 少量 的 DNA( 不 到 细胞 全 部 DNA 的 1% )。 但 受精 和 分 型 的 卵细胞 中 线粒体 较 多 ,线粒体 DNA(mtDNA) 的 总 量 也 相应 的 多 一 些 。 线 粒 体 DNA 分 子 甚 小 ,全 长 约 有 14kb ,为 环 状 双 螺旋 结构 ,编码 线粒体 tRNA TRNA 和 少数 几 种 线粒体 蛋白 质 。95% 以 上 的 线粒体 蛋白 质 是 由 核 DNA 编码 的 。 当 细胞 分 裂 时 ,线粒体 DNA 亦 进 行 复制 ,并 进入 子 代 细胞 器 中 。 植 物 中 存在 叶绿体 DNA。 (一 ) 真 核 生 物 基 因 组 的 一 般 特 点 1. 真 核 生 物 的 基因 组 比较 庞大 ,例如 和 人 的 单 倍 体 基因 组 由 3.2x10?bp 组 成 ,含有 大 约 3 万 个 基因 。 具 有 许多 复制 起 始点 ,但 每 个 复制 子 的 长 度 较 小 。 2. 真 核 生物 基因 组 DNA 与 蛋白 质 结合 形成 染色 体 ,储存 于 细胞 核 内 , 除 配 子 细 胞 外 ， 体 细 胞 内 的 基因 是 双 倍 体 (diploid) , 即 有 两 份 同 源 的 基因 组 。 3. 真 核 细胞 基因 无 操纵 子 ,转录 产物 为 单 顺 反 子 ,一 个 结构 基因 经 过 转录 和 翻译 生成 一 个 mRNA 分 子 和 一 条 多 肽 链 。 4. 真 核 生 物 基 因 组 存在 大 量 重复 序列 ,重复 次 数 可 达 百 万 次 以 上 。 5. 真 核 生物 基 因 组 中 非 编码 区 域 多 于 编码 区 域 。 6. 真 核 生 物 大 部 分 基因 含有 内 含 子 ( 间 隔 序列 ) ,因此 结构 基因 是 不 连续 的 , 称 为 断裂 基因 (split gene) 。 7. 真 核 生物 基因 组 中 许多 来 源 相 同 .结构 相似 \ 功 能 相关 的 基因 在 染色 体 上 成 串 存 在 ,这 样 的 一 组 基因 称 为 基因 家 族 (gene family)。 多 基因 家 族 是 真 核 生物 基因 组 织 的 一 个 重要 特征 。 8. 真 核 生物 的 基因 大 小 差别 很 大 ,例如 ,人 类 血红 蛋白 的 基因 长 仅 约 1 700bp, 而 人 类 假 肥大 型 营养 不 良 症 (duchenne muscular dystrophy，DMD) 基 因 全 长 为 2 300kb。 (=) 真 核 生物 基因 组 的 CEFR 同一 物种 的 基因 组 DNA 含量 总 是 恒定 的 ,一 个 单 倍 体 基 因 组 中 的 全 部 DNA 量 称 为 该 物种 DNA 的 C 值 (CC value)。 一 般 来 说 , C 值 随 着 生物 的 复杂 性 的 增加 而 增加 。 结 构 和 功 能 越 复杂 ,需要 的 基因 越 多 ,其 C 值 越 大 。 但 某 些 植物 或 两 栖 类 ,它们 的 DNA 含量 比 人 类 高 出 几 十 倍 , 这 种 形态 学 复杂 程度 与 C 值 大 小 不 一 致 的 反常 现象 称 为 C 值 矛 盾 (C value paradox) ,其 机 制 和 意义 尚 不 明确 。 (三 ) 真 核 生 物 基 因 结 构 真 核 细胞 核 内 基因 的 DNA 序列 由 编码 序列 和 非 编 码 序列 两 部 分 构成 。 编 码 序列 被 非 编码 序列 隔 开 ,是 不 连续 的 。 基 因 结 构 包 括 4 个 区 域 :@O 编 码 区 ,包括 外 显 子 与 内 含 子 ;四 前 导 区 ,位 于 编码 区 上 游 ,相当 于 RNA 5 末端 非 编码 区 ( 非 翻 译 区 );@ 尾 部 区 ,位 于 RNA 3 编 码 区 下 游 ,相当 于 末端 非 编码 区 ( 非 翻 译 区 );@ 调 控 区 ,包括 启动 子 和 增强 子 等 。 基 因 编 码 区 的 两 侧 也 称 为 侧 夷 序列 。 第 一 章 ”基因 与 基因 组 .15 、 1. 外 显 子 和 内 含 子 “大 多 数 真 核 生物 的 基因 为 不 连续 基因 (interrupted or discontinu- ous gene) 。 所 谓 不 连续 基因 就 是 基因 的 编码 序列 在 DNA 分 子 上 是 不 连续 的 ,被 非 编码 序列 所 隔 开 。 编 码 的 序列 称 为 外 显 子 (exon) ,是 基因 编码 表达 多 肽 链 的 部 分 ; 非 编码 序列 称 为 内 含 子 (intron) , 又 称 插 和 人 序列 (intervening sequence，IVS)。 内 含 子 可 转录 ,但 在 前 mRNA (pre-mNRA) 时 被 前 切 掉 。 内 含 子 的 核 苷 酸 数量 可 比 外 显 子 多 许多 倍 。 如 果 一 个 基因 有 nn 个 内 含 子 ,一 般 基 因 的 外 显 子 被 分 隔 的 数目 为 浆 +1。 外 显 子 在 mRNA 转录 过 程 中 , 受 特 定 酶 的 作用 ,被 拼接 成 具有 表达 活性 的 完整 的 结构 基因 。 2. 外 显 子 - 内 含 子 接 头 “” 每 个 外 显 子 和 内 含 子 接头 区 都 有 一 段 高 度 保守 的 一 致 序列 (consensus sequence) , 即 由 内 含 子 5$ 末端 大 多 数 是 GT 开始 ,3 “末端 大 多 是 AG 结束 的 序列 , 称 为 GT-AG 法 则 ,是 普遍 存在 于 真 核 基因 中 RNA 剪接 的 识别 信号。 3. 侧翼 序列 ”在 第 一 个 外 显 子 的 上 游 和 最 未 一 个 外 显 子 的 下 游 是 一 段 不 被 翻译 的 非 编码 区 , 称 为 侧翼 序列 (flanking sequence). MFI GA EA va FF ,对 该 基因 的 活性 有 重要 影响 。 4. 启动 子 启动 子 (promoter) 具 有 促进 启动 转录 过 程 的 功能 ,与 基因 转录 的 起 始 、 调 节 及 转录 激活 功能 密切 相关 ( 详 见 第 七 章 )。 5. 增强 子 ”增强 子 (enhancer) 不 能 启动 基因 的 转录 ,但 有 增强 转录 的 作用 。 一 般 位 于 真 核 基因 转录 起 始点 的 上 游 或 下 游 。 增 强 子 序列 可 与 特异 性 细胞 因子 结合 从 而 促进 转录 的 进行 。 研 究 表明 ,增强 子 通常 有 组 织 特异 性 ,这 是 因为 不 同 细胞 核 有 不 同 的 特异 性 细胞 因子 与 增强 子 结合 ,从 而 对 基因 表达 有 组 织 、 器 官 . 时 相 与 强度 不 同 的 调节 作用 。 例如 人 类 单 拷贝 胰岛 素 基 因 $ 末端 上 游 约 230 bp 处 有 一 组 织 特 异性 增强 子 ,在 胰岛 B 细胞 中 有 一 特异 因子 可 作用 于 该 区 以 增强 胰岛 素 基 因 的 转录 和 翻译 ;其 他 组 织 中 无 此 因子 。 这 正 是 胰岛 素 基 因 只 有 在 胰岛 B 细 胞 中 才 得 以 很 好 表达 的 原因 。 6. 终止 子 终止 子 (terminator) 具 有 转录 终止 的 功能 。 终 止 子 是 在 转录 终止 点 之 前 的 一 段 回 文 序列 , 约 7 一 20bp。 回 文 序 列 的 对 称 轴 一 般 距 转录 终止 点 16 一 24bp( 图 1-10). an lah 3 ATT ARAGGCTOC} nT GAGCCTTT TTTTT bath ela A | 多 录 | 多 GCC #A/T 模板 链 5'AUU UUUUU3' Al 1-10 ”转录 终 止 子 序列 图 -16- 基因 工程 学 在 回 文 序 列 的 下 游 有 6 一 8 个 A 一 工 对 ,因此 ,这 段 终止 子 转录 后 形成 的 RNA 具有 发 夹 结构 ,并 具有 与 A 互补 的 一 串 U, 因 为 A 一 U 之 间 氢 键 结 合 较 弱 ,因而 RNA/DNA 杂交 部 分 易于 拆 开 ,这 样 对 转录 物 从 DNA 模板 上 释放 出 来 是 有 利 的 ,也 可 使 RNA 聚合 酶 从 DNA 上 解 离 下 来 ,实现 转录 的 终止 。 四 、 人 类 基因 组 人 类 基因 组 (human genomie) 包 括 细胞 核 内 的 基因 组 及 细胞 质 内 线粒体 基因 组 ,其 结构 不 同 , 各 有 特点 。 (一 ) 细胞 核 基因 组 人 类 细胞 的 全 部 遗传 信息 (基因 ) 都 编码 在 线 状 的 DNA 分 子 上 。 每 个 单 倍 体 基 因 组 约 含 3.2X10?bp。 人 类 基因 的 平均 长 度 为 1 一 1.5kb, 所 以 基因 组 足以 编码 1.5x105 种 蛋白 质 ,但 实际 上 编码 蛋白 质 的 结构 基因 只 不 过 3 万 个 , 仅 占 总 基因 组 的 2% 一 3%。 其 余 的 DNA 序 列 包 括 基 因 之 间 的 间隔 序列 、 基 因 内 插 和 人 序列 .重复 序列 等 。 研 究 证 实 , 其 中 二 些 有 着 特殊 的 功能 ,包括 调节 基因 的 表达 ,增强 同 源 染 色 体 之 间 的 配对 和 重组 ,维持 染色 体 结构 ， 调节 前 mRNA 的 加 工 以 及 参与 DNA 的 复制 等 。 但 绝 大 多 数 重 复 序列 的 功能 目前 尚 知 之 其 少 。 1 . 单一 序列 ( 单 拷贝 序列 ) “单一 序列 (unique sequence) 又 称 非 重 复 序列 , 约 占 基 因 组 的 60% 一 65% ,这 种 序列 在 一 个 基因 组 中 一 般 仅 有 单个 或 几 个 拷贝 ,大 多 数 编码 蛋 自 质 和 酶 基因 属于 此 类 。 单 一 序列 的 两 侧 往往 为 散在 分 布 的 重复 序列 。 因 为 大 多 数 结构 基因 是 单 拷贝 序列 ,所 以 结构 基因 的 突变 很 容易 造成 遗传 性 状 的 改变 或 产生 遗传 性 疾病 。 2. 重复 序列 ”重复 序列 (repetitive sequence) 是 指 在 一 个 基因 组 中 具有 很 多 拷贝 的 序 列 , 又 可 分 为 几 类 : (1) 高 度 重复 序列 (highly repetitive sequence) :高 度 重 复 序 列 一 般 不 能 转录 ,它们 参与 染色 体 结 构 的 维持 ,形成 结构 基因 间隔 ,可 能 与 减 数 分 裂 时 同 源 染 色 体 的 联 会 配对 有 关 。 其 长 度 可 能 2.4.6.8 等 几 个 bp, 较 长 的 序列 可 达 200bp, 但 其 重复 拷贝 数 可 多 达 10° 次 以 上 。 例如 端 粒 就 是 由 高 度 重 复 序列 的 卫星 DNA( satellite DNA) 构 成 。 (2) 中 度 重 复 序 列 (moderately repetitive sequence) :一 般 都 是 不 编码 的 序列 ,其 长 度 为 300~7 000bp。 大 多 数 与 单 拷贝 基因 间隔 排列 ,少数 在 基因 组 中 成 串 排 列 在 一 个 区 域 。 可 重复 数 十 至 数 万 (<10> ) 次 ,在 基因 调控 中 起 重要 作用 ,包括 开启 或 关闭 基因 、 促 进 或 终止 转 a DNA 复制 的 起 始 并 参与 前 mRNA 加 工 等 。 (3) 基因 家 族 和 基因 徐 : 真 核 基因 组 中 有 许多 来 源 相 同 、 结 构 相 似 、 功 能 相关 的 基因 ,这 组 基因 称 为 基因 家 族 (gene family)。 基 因 家 族 的 成 员 可 以 分 布 于 几 条 不 同 染 色 体 上 ,也 可 集中 于 一 条 染色 体 上 。 集 中 成 复 的 一 组 基因 称 为 基因 徐 (gene cluster)。 例 如 人 类 白细胞 抗 原 (HLA) 系 统 的 7 个 连锁 基因 座位 ,排列 成 A-C-B-D-DR-DQ-DP ,形成 一 个 基因 簇 。 有 些 基因 家 族 的 成 员 并 不 集中 排列 为 基因 徐 ,而 是 散布 在 基因 组 中 不 同 部 位 ,如 微 管 蛋 白 基 因 家 族 。 第 一 章 “基因 与 基因 组 - 17 - 3. 假 基因 “在 多 基因 家 族 中 的 某 些 成 员 并 不 产生 有 功能 的 基因 产物 , 称 为 假 基因 (pseudogene) ,如 WE. Va. VB 等 。 | 此 外 ,人 类 基因 组 中 还 有 一 些 特殊 的 短 序列 位 于 各 基因 的 侧翼 ,它们 是 起 到 调控 作用 的 | WET BF REE). AT BY A A PEE 10 A 9 JR BE ( proto-oncogene) & #4) : 成 了 多 样 性 的 人 类 基因 组 结构 。 (二 ) 线粒体 基因 组 人 类 线粒体 DNA(Cmitochondrial DNA, mtDNA) 是 独立 于 细胞 核 染 色 体 外 的 基因 组 ,能 自主 复制 ,由 16 569 个 碱 基 对 组 成 ,每 一 个 mtDNA 分 子 为 环 状 双 链 DNA 分 子 , 外 环 为 重 链 , 内 环 为 轻 链 (图 1-11)。 基 因 组 含有 37 个 基因 ,其 中 13 个 为 蛋白 质 基 因 ,主要 编码 与 细 胞 呼吸 链 代 谢 相 关 的 蛋白 质 或 酶 。 rRNA 基因 rRNA 基因 16S val RQ) 编码 蛋品 基因 23S TRNA H 4# ATPase 6 图 1-11 人 类 线粒体 基因 组 HH: 重 链 ;L: 轻 链 ;ND1 一 ND6: 基 因 编 码 NADH 脱氧 酶 亚 单位 ;COI 一 CO3 :基因 编码 细 胞 色素 c 氧化 酶 亚 单位 ;1 一 3CYB: 基 因 编 码 细胞 色素 0 人 类 线粒体 基因 组 具有 下 列 特点 : 1. 人 类 线粒体 的 基因 排列 的 非常 紧凑 , 除 与 mtDNA 复制 及 转录 有 关 的 一 小 段 区 域外 ， 无 内 含 子 序列 。 基 因 之 间 有 时 有 重 释 ,因此 ,mtDNA 的 任何 突变 都 会 累及 到 基因 组 中 一 个 -18:- 基因 工程 学 重要 功能 区 域 。 2. mtDNA 为 高 效 利 用 的 DNA。 有 5 个 阅读 框架 ,缺少 终止 密码 子 , 仅 以 后 或 "LUA 结 尾 。 3. mtDNA 的 突变 率 高 于 核 中 DNA, FAREED. 4. mtDNA 为 母系 遗传 。 5. 部 分 mtDNA 的 密码 子 不 同 于 核 内 DNA 的 密码 子 。 细 胞 核 内 所 列 的 密码 是 一 种 通 用 密码 ,但 是 真 核 生 物 线粒体 的 密码 却 有 若干 处 不 同 于 通用 密码 。 如 人 类 线粒体 UGA 不 是 终止 密码 子 ,而 是 色 氨 酸 的 密码 子 ;AGA、AGG 是 终止 密码 子 , 而 不 是 精 氢 酸 的 密码 子 。 这 样 ,加 上 通用 密码 中 的 UAA 和 UAG ,线粒体 共有 4 个 终止 密码 子 。 线粒体 的 密码 表 排 列 得 比较 整齐 ,各 种 氨基 酸 的 密码 子 以 及 起 始 和 终止 密码 子 的 数目 或 是 2 ,或 是 4, 或 是 6。 近年 发 现 ,有 些 遗 传 病 如 Leber (EE MH AI WLS a SS SEAR EA 关 , 因 而 线粒体 基因 结构 已 引起 普遍 关注 。 (3) EA) Fix 4) 第 二 章 ”基因 工程 的 基本 概念 、 过 程 及 研究 策略 Chapter 2. Basic Concept, Process and Research Strategy of Genetic Engineering 第 一 节 “基因 工程 的 基本 概念 基因 工程 是 生物 工程 体系 中 的 重要 组 成 部 分 。 现 代 生 物 工 程 体系 的 组 成 包括 :基因 工 程 、 细 胞 工程 酶 工程 、 蛋 白质 工程 微生物 发 酵 工 程 . 生 化 工程 .生物 传感器 等 。 基因 工程 (genetic engineering) ,又 称 重组 DNA 技术 (recombinant DNA technology) , 是 指 在 基因 水 平 上 ,根据 人 们 的 需要 以 人 工 的 方法 取得 供 体 DNA 上 某 个 或 某 些 有 用 的 基因 ， 在 体外 重组 于 载体 (质粒 、 喉 菌 体 .病毒 等 )DNA 分 子 上 ,然后 将 重组 DNA 转 人 受 体 细胞 进 行 无 性 繁殖 ( 称 之 为 “克隆 ”) 和 行使 正常 功能 ( 称 之 为 "表达 ”), 从 而 产生 人 类 所 需要 的 产物 或 创造 新 的 生物 类 型 的 生物 学 技术 。 基因 工程 的 核心 是 DNA 分 子 的 体外 重组 技术 。 外 源 DNA 插 和 人 载体 分 子 所 形成 的 杂 合 分 子 又 称 为 其 合 DNA 或 DNA AIK (DNA chimera) 。 经 重组 技术 而 获得 的 具有 新 功能 的 微生物 称 " 工 程 菌 "。 基 因 工 程 通 过 基因 重组 ,使 一 个 独特 的 DNA 顺序 在 细胞 内 复制 、 扩 增 , 该 过 程 也 称 为 分 子 克 隆 。 克隆 (clone) 源 于 希腊 文 “klone” ,原意 是 用 "“ 嫩 枝 " 或 “ 插 条 ”繁殖 。 在 基因 工程 中 克隆 是 指 生物 体 通 过 细胞 无 性 繁殖 形成 的 基因 型 完全 相同 的 后 代 个 体 组 成 的 群体 ,简称 为 无 性 繁 殖 "。 克 隆 技 术 (cloning) 则 指 通过 DNA 重组 和 克隆 扩 增 后 从 众多 的 基因 或 细胞 群体 中 获得 目的 基因 或 细胞 的 技术 操作 。 该 技术 反映 了 细胞 核 分 化 技术 、 细 胞 培养 和 控制 技术 的 发 展 ， 是 人 类 在 生物 科学 领域 取得 的 一 项 重大 技术 突破 。 克隆 可 根据 其 研究 或 操作 的 对 象 分 为 基因 克隆 、 细 胞 克隆 和 个 体 克 隆 三 大 类 。 基 因 克 隆 是 指 在 分 子 (ODNA) 水 平 上 开展 研究 ,以 获得 大 量 的 相同 基因 及 其 表达 产物 ;细胞 克隆 则 是 在 细胞 水 平 上 开展 研究 ,以 获得 大 量 相同 的 细胞 ;个 体 克 隆 则 是 经 过 一 系列 的 操作 产生 一 个 或 多 个 与 亲 代 完全 相同 的 个 体 ,如 克隆 羊 等 。 基因 工程 按 其 发 展 和 认识 过 程 经 历 了 以 下 几 种 术语 的 变化 , 即 : 中 基因 操作 (gene ma- nipulation ) ;@ 基 因 重 组 (gene recombination) ;@) 基 因 工 程 (genetic engineering) ;四 分 子 克 隆 (molecular cloning) ;@DNA 工程 (DNA engineering);@@ 基 因 克 隆 (gene cloning). - 20 . 基因 工程 学 第 二 ”基因 工程 的 基本 过 程 及 研究 策略 基因 工程 技术 的 基本 过 程 可 概括 为 六 大 步骤 (图 2-1)。 MEDI A na 酶 切 位 点 LLL 9 tll vs Y- [aaam CZs HASSE ST Be edsmae ms 将 重组 载体 导入 细菌 细胞 刀 并 了 代 细 胞 图 2-1 基因 工程 基本 过 程 示 意图 1. 人 工 合成 或 从 生物 基因 组 中 ,获得 带 有 目的 基因 的 DNA 片段 (donor DNA) ; 2. 选择 或 改造 作为 载体 的 DNA(vector DNA); 3. 将 带 有 目的 基因 的 外 源 DNA 片段 连接 到 能 够 自我 复制 的 并 具有 选择 标记 的 载体 分 子 上 ,形成 重组 DNA 分 子 , 即 DNA 重组 (DNA recombination) ; 4. 将 重组 DNA 分 子 引 入 受 体 细胞 即 转化 (transformation ) 或 转 染 (transfection ; 5. 从 大 量 的 细胞 繁殖 群体 中 ,筛选 出 获得 了 重组 DNA 分 子 的 受 体 细胞 (工程 菌 ) 并 扩 增 ,进一步 抽 提 、 纯 化 扩 增 的 目的 基因 (clone amplification) ; 6. 将 目的 基因 克隆 到 表达 载体 上 , 导 人 受 体 细胞 ,使 之 在 新 的 遗传 背景 下 实现 功能 表 达 ,产生 出 人 类 所 需要 的 物质 , 即 基 因 表 达 (gene expression) 。 第 二 章 “” 基因 工程 的 基本 概念 .过程 及 研究 策略 - 21- 一 、 目 的 DNA 的 制备 (一 ) 直接 分 离 DNA 适 于 遗传 背景 了 解 比较 清楚 的 细菌 染色 体 、 质 粒 及 病毒 DNA 的 提取 分 离 。 其 方法 是 将 提取 的 DNA 通过 组 建 几 种 限制 性 内 切 酶 (restriction enzyme，RE) 的 物理 图 谱 进 行 基因 定位 ,然后 通过 DNA 的 酶 切片 段 电 泳 分 离 DNA, 应 用 相应 DNA 探 针 确定 目的 DNA 后 ,从 制备 电泳 的 凝 胶 中 回收 所 需 DNA. (二 ) 鸟 枪法 克隆 目的 基因 在 不 了 解 DNA 的 遗传 背景 时 ,无 法 直接 分 离 目的 基因 ,可 采用 鸟 枪 法 (shotgun) 进 行 目 的 基因 的 克隆 。 岛 枪 法 的 基本 技术 是 用 限制 性 内 切 酶 消化 DNA, 由 此 得 到 很 多 DNA 的 随机 片段 ,将 这 些 DNA 片段 与 载体 连接 ,组 成 由 各 种 片段 DNA 构成 的 重组 DNA, 转 化 受 体 细胞 ,筛选 含有 插入 DNA 片段 的 重组 阳性 细胞 。 在 一 个 适当 的 表达 系统 中 ,让 所 有 重组 体 分 别 表 达 ( 建 立 基因 库 ) ,通过 探 针 杂交 表达 产 物 分析 或 基因 序列 分 析 , 选 出 正常 表达 目的 基因 的 重组 体 ， 然后 克隆 扩 增 该 重组 体 , 酶 切 回收 相应 片段 。 目前 ,以 鸟 枪法 已 建立 了 某 些 生 物 的 基因 库 ,为 研究 某 些 特定 DNA 片段 提供 了 方便 。 基因 库 (gene bank) 是 指 某 生物 细胞 内 所 存在 的 全 套 基 因 。 基 因 库 制备 是 将 一 种 生物 的 全 套 遗 传 物质 以 酶 消化 后 与 载体 DNA 重组 ,转化 受 体 细胞 ,并 克隆 扩 增 抽 提 制 备 DNA 或 采用 物理 方法 (如 超声 波 处 理 ) 制 备 DNA 片段 ,使 其 收集 到 上 百 万 的 叹 菌 体 颗粒 中 ,经 大 量 复制 而 形成 了 众多 储 有 该 细胞 各 个 DNA 片段 的 克隆 , 当 制 备 的 克隆 数目 多 到 可 以 把 整 个 生物 的 全 部 遗传 信息 都 包括 在 内 时 ,这 一 组 克隆 的 总 体 称 为 某 一 生物 的 基因 库 ,也 可 称 为 基因 文库 (gene library)( 见 第 六 章 )。 (=) 构建 cDNA 文库 ,筛选 目的 基因 真 核 细 胞 染色 体 DNA 很 大 ,特定 基因 只 占 染 色 体 很 小 的 部 分 (10 一 10 EL) ,如 人 染色 体 相 对 分 子 质量 可 达 10” ,又 因 真 核 细 胞 的 基因 内 存在 着 间隔 顺序 (内 含 子 ) ,所 以 ， 不 像 原 核 细 胞 DNA 分 离 那 样 易 得 。 基因 工程 中 制备 真 核 细 胞 基因 一 般 是 先 分 离 纯化 富 含 目 的 基因 的 mRNA, 再 反 转 录 为 互补 DNA(complementary DNA,cDNA) ,然后 进行 cDNA 的 克隆 扩 增 。 包 含有 细胞 mRNA 信息 的 全 部 cDNA 称 为 克隆 cDNA 文库 ,利用 基因 探 针 可 由 cDNA 文库 中 钓 取 相 应 的 目的 基因 。 建 立 cDNA 文库 ,筛选 目的 基因 是 真 核 细 胞 基因 工程 的 基本 策略 。 近年 ,大 规模 cDNA 测序 和 DNA 芯片 技术 ,为 快速 筛选 目的 基因 或 发 现 新 基因 提供 了 快速 而 准确 的 方法 。 (四 ) 酶 法 或 化 学 方法 人 工 合 成 基因 1. DNA 聚合 酶 链 反 应 (polymerase chain reaction, PCR) PCR 技术 可 用 于 制备 大 量 -22: 基因 工程 学 DNA 特异 片段 。 该 法 可 从 粗 制 品 及 降解 的 DNA 模板 中 专 一 性 大 量 扩 增 特异 DNA 片段 ， 是 DNA”* 体 外 克隆 "的 一 种 形式 ( 详 见 第 九 章 )。 2. DNA 合成 ”利用 DNA 合成 仪 可 合成 任何 已 知 序列 的 DNA 片段 或 人 为 设计 的 DNA 片段 。 目 前 ,全 自动 合成 仪 化 学 合成 DNA 采用 的 是 效率 极 高 的 亚 磷酸 三 酯 法 ( 详 见 第 WE)» (五 ) mRNA 差异 显示 技术 筛选 差异 表达 基因 差异 显示 是 利用 相应 的 一 对 组 织 ( 如 肝癌 组 织 与 正常 肝 组 织 ) 基 因 表 达 的 差异 ,筛选 出 在 某 种 组 织 中 受 某 种 因素 调控 的 一 eae ee (六 ) 差异 蛋白 质谱 表达 技术 筛选 功能 基因 差异 蛋白 质谱 表达 技术 是 利用 双向 蛋白 电泳 对 相关 细胞 中 和 蛋白 表达 的 差异 进行 直接 比 较 , 从 而 鉴定 相关 功能 蛋白 。 经 氨基 酸 序 列 分 析 , 发现 差异 表达 的 相关 功能 基因 ( 详 见 第 六 章 )。 此 外 ,重组 CDNA 表达 文库 的 血清 学 分 析 (serological analysis of recombinant cDNA ex- pression libraries，SEREX) 是 近年 发 展 的 一 种 功能 基因 的 筛选 方法 。 该 法 利用 针对 某 抗原 (如 肿瘤 抗原 ) 的 免疫 血清 筛选 该 抗原 的 CDNA 表达 文库 中 的 阳性 克隆 ,经 进一步 鉴定 可 获 得 编码 该 抗原 的 基因 ( 见 第 十 七 章 )。 二 、 载 体 DNA 及 其 改造 (一 ) 基因 工程 中 的 载体 载体 (vector) 是 指 一 个 能 够 进行 自我 复制 的 复制 子 , 它 必须 能 携带 外 来 DNA 进入 指定 的 受 体 细胞 并 在 受 体 细 胞 内 稳定 保存 复制 \. 扩 增 。 1. 常用 的 载体 及 其 特点 ”基因 工程 中 常用 的 载体 包括 :质粒 (plasmid) ` 噬 菌 体 (bacteri- al phage) 病毒 (virus ) \ 柯 斯 质粒 (cosmid) 等 ( 详 见 第 五 ,六 章 )。 常用 载体 的 大 小 、 结 构 、 复 制 功能 的 差别 很 大 ,但 其 共同 的 特点 为 : (1) 在 宿主 细胞 中 能 独立 的 自我 复制 。 (2) 很 容易 从 宿主 细胞 中 分 离 纯化。 (3) 载体 DNA 分 子 结构 中 有 一 段 不 影响 其 扩 增 的 非 必 需 区 域 , 插 和 人 外 源 DNA 片段 后 能 被 动 的 与 载体 一 起 复制 、 扩 增 。 2. 质粒 ”质粒 是 存在 于 细菌 染色 体 之 外 的 能 自我 复制 的 双 股 闭环 DNA (dsDNA), ,在 基因 工程 中 应 用 极 广 ,根据 在 细胞 内 拷贝 数 的 多 少 及 特点 ,可 将 质粒 分 为 两 类 : (1) 严 紧 型 质粒 (stringent plasmid) :多 为 具有 自身 传递 能 力 的 大 质粒 ,其 DNA 复制 与 宿主 染色 体 DNA 复制 密切 偶 联 ,拷贝 数 低 , 约 1 一 5 个 拷贝 /细胞 ,如 pPSC101。 所 谓 拷贝 一 般 是 指 细菌 内 某 一 基因 组 或 基因 的 复 本 ; 单 拷贝 (single copy) 是 指 单 倍 体 基 因 组 中 , 仅 出 现 一 次 的 基因 或 DNA 序列 。 — 第 二 章 “基因 工程 的 基本 概念 .过 程 及 研究 策略 - 23 - (2) 松弛 型 质粒 (relaxed plasmid) :多 为 相对 分 子 质量 小 \ 不 能 自动 传递 的 质粒 ,其 复制 在 宿主 细胞 的 松弛 控制 之 下 。 拷 贝 数 高 ,可 达 10 一 200 个 拷贝 /细胞 。 当 氨 基 酸 饥饿 或 加 入 蛋白 合成 抑制 剂 (如 氧 霉 素 ) 时 ,细胞 染色 体 DNA 和 严 紧 型 质粒 DNA 的 复制 停止 ,但 松弛 型 质粒 DNA 能 继续 复制 ,甚至 达到 数 千 个 拷贝 。 因 此 松弛 性 质粒 被 广泛 用 作 基 因 工 程 中 的 载体 。 (=) 作为 载体 DNA 必须 具备 的 条 件 1. 载体 DNA 必须 能 被 受 体 细胞 所 接受 ,进入 宿主 细胞 后 应 能 大 量 目 我 复制 (区 隆 载 体 ) ,作为 表达 载体 还 应 具有 促使 外 来 DNA 高 效 表达 的 调控 区 ,使 所 携带 的 外 来 DNA 能 在 其 内 忠实 复制 、 稳 定 表达 。 2. 有 适应 的 限制 性 酶 切 位 点 ,最 好 对 不 同 的 限制 酶 有 各 自 的 单一 切 点 ,能 散人 外 来 的 DNA。 3. 能 赋予 受 体 细胞 易于 检测 的 表 型 标志 ,以 作为 重组 体 的 选择 标记 。 4. 载体 DNA 相对 分 子 质量 要 相应 的 小 ,以 保证 外 来 DNA 片段 插入 后 构成 重组 体 的 稳 定性 。 载 体 应 易于 获得 、 易 于 改造 ,具有 多 拷贝 。 5. 携带 外 源 DNA 的 幅度 要 宽 ,要 非 自 我 转移 或 在 特定 宿主 细胞 之 外 不 能 生存 。 6. 从 生物 防护 的 角度 应 是 安全 的 。 (三 ) 载体 的 改造 由 于 作为 基因 工程 中 的 载体 应 具备 以 上 几 个 条 件 , 故 自 然 界 中 的 载体 多 需 一 定 改造 才 能 适 于 携带 目的 DNA 进入 受 体 细 胞 ,易于 筛选 并 能 充分 复制 和 表达 。 为 此 , 常 采 用 不 同 的 策略 进行 载体 改造 ,如 在 载体 上 引入 一 段 具有 多 种 限制 性 酶 切 位 点 的 人 工 合成 DNA 序列 ， 以 便 为 外 来 DNA 提供 插入 位 点 。 这 种 序列 通常 称 为 多 克隆 位 点 (multiple cloning sites, MCS) 序 列 。 另 外 ,也 可 在 质粒 中 引进 能 够 完善 载体 功能 的 辅助 序列 ,如 引入 可 供 克 隆 筛 选 的 含 抗 性 基因 的 片段 ,或 在 真 核 表 达 载 体 上 引入 病毒 启动 子 或 增强 子 等 元 件 。 现 以 大 肠 杆 菌 质粒 pBR322 为 例 说 明 ( 图 2-2)。 pBR322 是 由 具有 四 环 素 耐 药 基 因 (tet) 的 pMB, SRA AK BS MK it 4 EA Camp") 的 质粒 pPBSF2134 共 转 大 肠 杆菌 RRI 受 体 细 胞 后 经 历 一 系列 演化 .重组 改造 而 产生 的 很 有 应 用 价值 的 载体 颗粒 ( 详 见 第 五 章 )。 pBR322 相对 分 子 质 量 为 2.6Xx 105, 长 度 4.3kb, 具 有 毛茶 西林 及 四 环 素 两 个 耐 药 基 因 (tet',amp'), fe amp’ 上 有 限制 性 内 切 酶 Pst 工 的 单一 切 点 ,在 ter’ 区 域 存在 Hind I, Bam H1, Sal 工 的 单一 酶 切 点 , 当 外 源 DNA 整合 到 耐 药 基因 特定 位 点 时 ,可 导致 相应 耐 药 基 因 失 活 ,因此 可 依 表 型 Amp 及 Tet 作为 正 反 选择 标记 (Tet ,Amps BK Tet®, Amp’) Sifi ve HE 2H (4 随 着 基因 技术 的 发 展 , 目前 已 开发 出 各 种 不 同 的 .商品 化 的 载体 。 无 论 从 携带 外 源 DNA 的 大 小 .特点 ,还 是 限制 性 内 切 酶 位 点 的 选择 设 定 、 筛 选 标 记 , 都 有 精细 的 设计 。 因 此 ， 根据 设计 需要 可 以 很 方便 的 选择 合适 载体 ,进行 DNA 的 体外 重组 。 “24 . 基因 工程 学 Bsul51 23 _. |Hind IIL 29 EcoR\.xap\ 4359 FEco321 185 Aatll 4284 Nhe! 229 Ssp| 4168 BamH | 375 SgrAl 409 Pael 562 Xagl 622 Sal 1 651 Scal 3844 Pyul 3733 Pst 3607 Box! 712 Vsp| 3537. Eco3\1 3433 Eco521 939 Eam|\ 1051 3361 Bsp681 972 BspMI 1063 Mval2691 1353 Eco1301 1369 Cai 12884 “re Pe MIs Bpul01 1580 BsgI 1650 Aff Il, BspLUI11 2473 Kpn21 1664 Sap! 2350 Pyull 2064 BseJI 1668 Nde| 2295 Esp31 2122 Bstll071 2244 Psy] 2217 BsaAl 2225 图 2-2 ”载体 pBR322 示意 图 三 、 体 外 DNA 重组 (一 ) 重组 的 概念 DNA 重组 是 指 不 同 来 源 的 DNA 片段 共 价 连接 .通过 重新 组 合 ,构成 了 具有 两 个 DNA 分 子 遗 传 信 息 的 新 重组 体 DNA (recombinant DNA). DNA 重组 通常 是 指 外 来 DNA 片段 (目的 基因 ) 与 载体 (质粒 噬菌体 或 病毒 DNA) 的 共 价 连接 。 (二 ) 目的 DNA 与 载体 的 连接 目的 DNA PE DNA 经 限制 性 内 切 酶 水 解 后 ,可 通过 以 下 形式 进行 连接 : 1. 黏 末端 连接 BATHE AR Big (cohesive ends or stick ends) 是 指 ds DNA 分 子 经 酶 切割 后 所 产生 的 限制 性 片段 的 单 股 未 端 。“ 黏 性 ? 指 它 能 与 另 一 个 互补 的 单 股 未 端 配 对 结合 为 双 链 的 性 能 。 当 以 同一 种 工 型 限制 酶 切割 供 体 DNA 及 载体 DNA 时 ,可 产生 相同 的 单 股 黏 性 末 端 , 如 图 2-3 所 示 , 以 EcoR 工 酶 切 后 末端 都 可 为 TTAA。 这 样 , 供 体 与 载体 的 DNA 具有 相 同 的 互补 的 黏 性 末端 ,很 易 产 生 重 组 DNA 分 子 。 由 于 该 重组 DNA 上 保留 了 EcoRI] WR 别 序列 和 切 点 部 位 , 故 有 利于 质粒 扩 增 后 目的 基因 的 回收 。 另 外 , 当 单 股 黏 末 端 超过 4 个 碱 基 序 列 时 ,重组 可 仅 靠 互 补 的 黏 性 末端 碱 基 配 对 连接 ,可 不 需 连 接 酶 。 - 25 - 图 2-3 BR MmIER 两 个 DNA 分 子 经 同一 酶 切 所 形成 的 黏 末端 , 因 存 在 着 互补 的 碱 基 序列 可 互相 配对 而 结合 , 称 为 退火 (anneal) 。 当 一 个 DNA 分 子 片 段 足够 大 时 ,自身 也 可 退火 形成 环 状 (如 载体 DNA 与 载体 DNA 碱 基 配 对 而 形成 双 连 体重 组 分 子 ) 使 目的 DNA 不 易 插 入 ,形成 无 效 重组 at. 黏 末 端 连 接 主要 有 同 源 黏 末 端 连接 与 定向 克隆 两 种 方法 ( 详 见 第 六 章 )。 2. 同 聚 物 核 苷 酸 末 端 法 ”该 法 是 用 末端 核 苷 酸 转移 酶 在 DNA 片段 上 人 工 制 造 一 个 黏 末端 ,如 在 外 来 DNA 片段 5 及 3“ 末端 分 别 加 上 一 小 段 单 股 同 聚 物 尾 ( 即 一 连 串 相同 核 苷 酸 ) ,如 poly dA( 或 poly dG) ,在 载体 两 未 端 各 加 一 段 boly dT( 或 poly dC) ,这 样 两 个 DNA Fr Be BD ay Fl] FA AR ig AY poly dA:poly dT( 或 poly dG: poly dC) 形 成 碱 基 配 对 ,然后 以 连接 酶 结合 (图 2-4)。 若 互补 序列 较 长 ,可 不 需 连 接 酶 。 该 法 的 优点 为 不 会 发 生 自身 环 化 。 3. 平 齐 末 端 连接 法 T4 DNA 连接 酶 也 可 把 只 有 平 齐 示 端的 两 个 DNA 片段 共 价 连 成 新 的 DNA 分 子 , 但 其 效应 仅 为 黏 性 未 端 连接 效率 的 百 分 之 一 。RNA 连接 酶 能 提高 DNA 连接 酶 的 连接 效率 ,但 其 机 制 尚 不 清 。 4. 人 工 接头 连接 对 平 未 端的 DNA 或 没有 互补 黏 末 端的 DNA, 除 同 聚 物 加 尾 法 外 ， 也 可 先 连 上 人 工 设 计 合成 的 脱氧 赛 核 苷 酸 双 链接 头 , 使 DNA 末端 产生 新 的 限制 性 酶 切 位 点 ,经 内 切 酶 割 后 , 即 可 按 黏 性 末端 相连 。 5. T-A 克 隆 T-A 克 隆 是 用 来 直接 克隆 PCR 产物 的 简便 方法 ,也 可 连接 DNA 片段 用 于 直接 DNA 测序 ( 详 见 第 六 章 )。 四 、 重 组 DNA 的 转化 (一 ) 转化 把 以 质粒 为 载体 构建 的 重组 DNA ,在 一 定 条 件 下 引入 受 体 细 胞 的 过 程 称 转化 (trans- formation) 。 以 噬菌体 或 病毒 构建 的 重组 DNA 引入 受 体 细胞 的 过 程 称 转 染 (transfection)。 接受 了 重组 DNA 的 受 体 菌 称 为 转化 子 或 工程 菌 。 PIR) -=----------- 7 CS 未 端 转移 酶 aa aa } Ae | 4ouse em +acrP Ree FOCAGGGEE eece--—-52 cela GG6GACCTO 二 二 CT ——~—~“C~*=“‘é‘ oe 退火 ， 转 化 导入 已 co 后 修复 Pst UHL A G 图 2-4 RW RA SE RK (二 ) 感受 态 细 胞 及 其 特点 受 体 细胞 处 于 感受 态 是 转化 成 功 与 否 的 关键 之 一 。 感 受 态 (competent) 是 指 细胞 处 于 最 适 于 摄取 和 容忍 外 来 DNA 的 生理 状态 。 感 受 态 细胞 的 特点 为 : (1) 细胞 表面 暴露 出 一 些 可 接受 外 来 DNA 的 位 点 (以 溶菌 酶 处 理 , 可 促使 受 体 细胞 的 接受 位 点 充分 暴露 )。 (2) 细胞 膜 通 透 性 增加 (Ca 处理, 可 使 膜 通 透 性 增加 ,使 DNA 直接 穿 过 质 膜 进入 细胞 )。 (3) 受 体 细胞 的 修饰 酶 活性 应 表现 最 高 ,而 限制 酶 活性 最 低 , 使 转 和 人 的 DNA 分 子 不 易 被 切除 或 降解 。 (4) 受 体 细胞 本 身 应 处 于 非 生长 繁殖 阶段 ( 即 受 体 细 胞 染色 体 相 对 稳定 )。 基因 工程 中 多 采用 限制 酶 阴性 、 修 饰 酶 阳性 (r m-”) 的 大 肠 杆 菌 C600、HB101、JM109 等 作为 受 体 细胞 ,比较 容易 接受 重组 DNA 使 其 稳定 扩 增 或 表达 。 (三 ) 转化 方法 重组 DNA 转化 的 方法 很 多 ,列举 常用 的 钙 转化 法 及 电 转 化 法 如 下 : 1. 钙 转化 法 ”大肠 杆 菌 是 应 用 最 广 的 受 体 细 胞 之 一 。 转 化 过 程 中 受 体 细胞 在 AC 以 Mg 洗涤 ,然后 加 入 70~80mmol/L 的 Ca?* 处 理 的 受 体 细胞 , 随 之 加 入 重组 DNA, 以 42°C 瞬间 热 冲击 处 理 , 然 后 加 入 培养 基 ,经 培养 后 在 培养 板 上 筛选 出 相应 的 转化 子 。 第 二 章 ”基因 工程 的 基本 概念 .过程 及 研究 策略 - 27 - 氯 化 钙 转化 法 由 Cohen 等 人 首创 ,其 转化 率 一 般 为 10` 一 10? 转化 子 g DNA。 2. 电 转 化 法 “” 电 转化 法 由 Dower 等 人 于 1988 年 首次 取得 成 功 ,目前 DNA 电 转 化 仪 已 得 到 推广 应 用 。 该 法 以 高 压 脉冲 电击 细胞 ,使 细胞 摄取 外 源 DNA。 电 转化 法 不 需 制 备 感受 态 细菌 , 操 作 简 便 ,适用 于 各 种 细菌 .酵母 菌 以 及 真 核 细 胞 等 的 转化 ,其 转化 率 可 达 10? 一 102 转 化 子 / MDNA, 转 化 率 受 电场 强度 . 电 脉 冲 时 间 长 度 及 DNA 的 浓度 影响 。 该 法 的 缺点 是 转化 细胞 受 强 电场 作用 活性 受到 一 定 影响 。 由 于 电 转 化 法 转化 率 高 ;操作 方便 , 故 目 前 已 广泛 应 用 。 五 、 重 组 体 的 筛选 鉴定 与 克隆 扩 增 (一 ) 重组 体 的 筛选 鉴定 感受 态 的 受 体 细胞 经 体外 重组 DNA 转化 处 理 后 ,有 一 部 分 细胞 获得 了 重组 DNA 而 成 为 转化 细胞 (重组 体 ) ,但 在 整个 反应 体系 中 , 尚 存 在 着 大 量 未 转化 的 细胞 ,因此 ,进行 克隆 扩 增 前 需 设 法 将 含有 重组 DNA 分 子 的 重组 体 从 细胞 群 中 分 离 出 来 ,该 过 程 即 为 重组 体 的 筛选 。 不 同 的 克隆 载体 及 相应 的 受 体 细 胞 ,其 重组 体 的 筛选 ,鉴定 方法 不 同 。 常 用 筛选 重组 体 的 方法 有 :平板 筛选 ,电泳 筛选 、 原 位 杂交 筛选 等 ,对 重组 体 的 进一步 鉴定 常用 各 种 核酸 分 子 杂交 免疫 化 学 及 核酸 测序 等 方法 。 重组 DNA 转化 细胞 后 ,首先 进行 平板 筛选 ,确定 转化 效率 ,以 利于 进一步 鉴定 阳性 重 组 体 。 常 用 方法 介绍 如 下 : 1. 平板 筛选 ”平板 筛选 是 阳性 重组 体 进 行 初步 筛选 的 方法 ,简单 而 快速 。 筛 选 是 依据 载体 DNA 分 子 携 带 的 筛选 标记 所 赋予 受 体 细胞 在 平板 生长 的 表 型 特点 进行 的 , 供 筛选 用 的 载体 DNA 的 遗传 标志 ,在 最 初 的 设计 时 就 应 该 考虑 到 。 如 质粒 pPBR322 多 采用 抗生素 抗 性 基因 搬入 失 活 法 来 选择 转化 细胞 。 所 谓 插入 失 活 (insertional inactivation ) 是 在 载体 分 子 基因 编码 顺序 中 的 限制 性 内 切 酶 作用 位 点 上 , 插 人 外 源 性 DNA 后 ,其 编码 供 筛 选 的 标记 性 产物 或 功能 不 能 正常 表达 ,此 现象 常 作为 一 种 筛选 重组 体 的 方法 。 抗生素 平板 筛选 为 最 常用 的 平板 筛选 法 之 一 ,因为 多 数 克 隆 载体 常 有 抗生素 抗 性 基因 ， 如 抗 氨 茶 西林 基因 (axzzp5) , 抗 四 环 素 基 因 (tet) 等 。 载 体 pBR322 具备 amp' 及 tet’ H+ i 药 基因 ,当选 用 Hind 亚 酶 切 时 ,外 源 性 DNA 正好 插 人 到 cee’ 基因 的 位 置 ,结果 重 组 体 表现 AA tet’ ,而 amp" 不 受 影 响 。 上 述 pBR322 与 外 源 DNA 重组 后 转化 E.coli 时 ,利用 插入 失 活 、 双 抗生素 对 照 筛 选 十 分 方便 (图 2-5) 。 转 化 后 可 能 产生 以 下 三 种 细胞 ; (1) amp’, tets: 重 组 DNA 没有 进入 受 体 细 胞 SEA AE. coli ) 没 有 获得 抗 性 基因 , 故 不 能 在 Amp Tet 平板 生长 。 (2) amp", tet’: JRL pBR322 进入 了 受 体 细胞 ,但 质粒 中 没 插入 目的 基因 ( 即 重组 体 没 有 进入 受 体 细胞 ,进入 的 仅 有 载体 质粒 ) , 故 保 持 了 amp". tet". (3) amp*. tets: 重 组 质粒 进入 受 体 细胞 ,由 于 目的 基因 的 插 人 使 重组 质粒 pPBR322 的 tet" 受到 干扰 而 灭 活 ,表现 对 四 环 素 敏 感 ,但 因 保持 amp" 活性 , 仍 可 在 Amp 板 上 生长 , 故 只 有 此 组 细胞 是 含有 目的 基因 的 转化 子 , 应 从 平板 上 选择 出 来 进行 培养 扩 增 。 28 . 基因 工程 学 Bam HI BamHI Bam HI t > aoe amp' €/ Bam HI tet’ Ki 图 2-5 插入 灭 活 示意 图 平板 筛选 有 多 种 方法 ,包括 普通 抗生素 平板 法 , 插 人 失 活 抗生素 平板 法 、 择 和 人 表达 抗 生 素平 板 法 及 显 色 平 板 法 等 ( 详 见 第 六 FE). 2. DNA 限制 性 内 切 酶 图 谱 分 析 与 电泳 筛选 法 ”药物 平板 法 筛选 的 重组 体 常 有 假 阳性 转化 菌落 ,如 自我 连接 载体 ,缺失 连接 载体 等 , 仅 用 抗生素 平板 法 不 易 鉴 别 , 但 采用 电泳 法 可 将 这 些 假 阳 性 菌落 淘汰 。 电 泳 筛选 法 适用 于 插入 片段 与 载体 DNA 片段 相差 较 大 的 重组 子 的 初步 筛选 ,因为 由 这 些 转化 菌落 所 抽 提 的 重组 质粒 经 酶 切 后 产生 的 DNA 分 子 大 小 不 同 ， FL DNA 在 凝 胶 中 位 于 不 同 的 区 带 , 很 易 鉴 别 。 但 如 果 插 人 片段 是 与 目的 DNA 或 载体 DNA 大 小 相似 的 非 目的 DNA 片段 , 则 电泳 法 亦 不 能 鉴别 排除 。 这 时 可 采用 核酸 分 子 杂 交 方 法 ， 即 以 目的 基因 片段 制备 的 探 针 与 重组 DNA 杂交 ,才能 最 终 确定 真正 阳性 重组 体 。 3. PCR 筛选 重组 体 ”有些 载体 的 外 源 DNA 插入 位 点 两 侧 , 存 在 恒定 的 碱 基 序列 , 因 此 ,可 设计 与 插入 片段 两 侧 DNA 互补 的 引物 ,对 小 量 抽 提 的 重组 质粒 DNA 进行 PCR 产物 分 析 ,此 法 不 仅 能 迅速 扩 增 插入 片段 ,而且 还 可 以 进行 DNA 序列 分 析 。 如 为 PCR 筛选 测序 而 设计 的 T-A 克隆 载体 已 广泛 应 用 ( 见 第 九 章 ) 以 上 方法 仅 是 对 重组 体 的 初步 筛选 ,作为 重组 体 的 鉴定 则 要 求 以 更 准确 的 方法 直接 证 实 或 判断 目的 DNA 的 存在 ,如 DNA 测序 、 核 酸 分 子 杂 交 、 免 疫 检测 法 (以 单 殉 隆 抗体 对 表 达 产 物 的 检测 ) 核酸 电镜 技术 等 。 4. 核酸 分 子 杂 交 览 定 ”核酸 分 子 杂 交 (hybridization ) 是 指 两 个 不 同 来 源 的 含有 互补 核 第 二 章 “基因 工程 的 基本 概念 .过 程 及 研究 策略 - 29 - 苷 酸 序列 的 单 股 核酸 分 子 ,通过 碱 基 配 对 形成 一 个 新 的 、 稳 定 的 双 股 分 子 的 过 程 ,是 筛选 , 鉴 定 重 组 体 最 常 选 用 的 方法 之 一 ,按照 参与 杂交 的 核酸 分 子 的 不 同 ,可 分 别 形成 DNA-DNA, DNA-RNA RNA-RNA 分 子 杂 交 。 在 核酸 分 子 杂 交 鉴 定 重 组 体 时 必须 具有 相应 的 核酸 探 针 所 谓 核酸 探 针 是 指 以 放射 性 同位 素 或 非 放 射 性 标记 物 如 地 高 辛 、. 生 物 素 等 标记 的 一 段 特定 已 知 序 列 的 DNA 或 RNA 片段 ,用 于 核酸 杂交 技术 以 检测 出 与 其 互补 的 待 测 酸 分 子 。 根据 杂交 的 特点 ,分 子 杂 交叉 可 分 为 点 杂交 、 原 位 杂交 \、Southern 杂交 等 ( 见 第 十 章 )。 菌落 原 位 杂交 技术 是 将 带 有 重组 子 的 菌落 复印 在 硝酸 纤维 滤 膜 上 , 原 位 溶菌 后 ,经 DNA 变性 使 其 在 原 位 固定 于 滤 膜 上 ,然后 以 相应 的 DNA 探 针 通过 分 子 杂 交 鉴 定 阳性 重组 体 , 最 后 对 照 参 考 平 板 上 的 相对 位 置 ,选择 出 相应 的 菌落 。 5. DNA 测 序 “ 为 获得 有 高 效 表达 功能 蛋白 的 重组 体 ,检测 插入 片段 的 顺序 及 方向 的 正确 性 非常 必要 。 经 初步 筛选 后 ,一 般 需 进行 DNA 测序 。DNA 自动 测序 是 目前 已 公认 的 确定 重组 体 一 级 结构 最 可 靠 的 技术 。 (二 ) 重组 体 的 克隆 扩 增 从 转化 细菌 中 筛选 出 含有 阳性 重组 子 的 菌落 经 鉴定 其 正确 性 , 即 可 通过 细菌 培养 大 量 克隆 扩 增 ,以 获得 所 需 目的 基因 片段 的 大 量 拷贝 或 获得 相应 目的 基因 表达 产物 。 如 果实 验 设计 的 目的 是 制备 纯化 DNA 片段 (如 制备 探 针 所 需 DNA 片段 ) ,那么 收获 扩 增 后 的 细菌 (工程 菌 ) 经 质粒 抽 提 \ 酶 切 、 电 泳 即 可 回收 目的 DNA。 多 数 基因 工程 的 重要 目的 在 于 实现 目的 基因 的 表达 ,以 获得 功能 性 蛋白 产物 ,因此 ,目的 DNA 受 体 菌 的 表达 是 基因 工程 技术 中 最 后 也 是 十 分 关键 的 一 步 。 六 、 目 的 DNA 在 受 体 细胞 中 的 表达 为 使 克隆 的 外 源 基因 高 效 表 达 ,必须 有 一 个 合适 的 表达 系统 以 保证 基因 产物 高 效 表达 。 而 基因 表达 是 在 各 种 调控 因子 控制 之 下 实现 的 ,因此 ,必须 精心 设计 构建 高 效 表 达 载 体系 统 以 获得 具有 活性 的 蛋白 质 产物 ( 见 第 七 .十 四 章 )。 目的 DNA 能 和 否 高 效 表 达 , 除 与 表达 载体 自身 特点 及 诱导 条 件 有 关 , 如 温度 .pH 诱导 物 的 存在 等 ,还 取决 于 受 体 细胞 容许 目的 DNA 表达 的 多 个 层次 : 1. 转录 水 平 上 启动 子 与 受 体 细胞 RNA 多 聚 酶 的 统一 问题 。 2. 翻译 水 平 上 mRNA 的 核糖 体 结合 部 位 与 受 体 细 胞 核糖 体 的 统一 问题 。 3. 外 来 DNA 片段 插入 方向 对 表达 的 影响 。 4. 其 他 ,如 转录 后 修饰 .翻译 后 修饰 等 。 以 上 任何 一 个 过 程 均 能 直接 影响 到 目的 DNA 的 表达 。 基因 工程 中 目的 DNA 是 以 复制 子 作为 载体 ,所 以 转化 后 通过 复制 子 的 自主 复制 才能 扩 增 目的 DNA。 但 来 自 异种 个 体 的 DNA 能 否 在 受 体 细 胞 正确 表达 、 转 录 、 翻 译 出 活性 产 物 ,这 是 关系 到 整个 工程 是 否 真正 有 价值 的 关键 。 当 以 大 肠 杆菌 为 受 体 细胞 时 , 它 对 各 种 来 源 的 外 来 基因 的 容忍 力 均 较 强 。 枯 草 杆菌 , 葡 -30- 基因 工程 学 萄 球菌 质粒 均 可 以 在 大 肠 杆 菌 中 正常 表达 ,但 反之 却 不 行 。 另 外 ,外 来 基因 在 受 体 细胞 中 能 否 表达 也 与 供 体 - 受 体 的 亲缘 关系 有 一 定 的 相关 性 。 对 真 核 细胞 表达 载体 的 研究 进展 很 快 ,特别 是 腺 病毒 表达 载体 已 进入 临床 应 用 阶段 。 腺 相关 病毒 载体 \ 双 启动 子 酵母 表达 载体 能够 供 真 核 与 原核 共 表达 的 穿梭 载体 以 及 各 种 融 合 蛋白 表达 载体 的 使 用 ,比较 方便 地 实现 了 外 源 基 因 在 真 核 细胞 内 的 表达 ( 见 第 七 \ 八 章 )。 对 目的 DNA 的 表达 产物 尚 需 鉴定 其 产量 和 活性 。 表 达 产 物 的 检测 是 确定 整个 设计 是 否 达到 预期 目的 的 重要 步骤 ,包括 表达 产物 特异 性 及 表达 产物 生物 活性 两 方面 的 鉴定 。 特 异性 鉴定 可 采用 免疫 学 方法 ,如 免疫 荧光 素 标记 抗体 免疫 沉 演 免疫 印迹 (Western blot) 等 ;对 蛋白 质 表达 产物 生物 活性 的 鉴定 则 应 根据 其 特点 选择 相应 的 检测 指标 或 方法 。 基因 工程 的 流程 设计 参见 图 2-6。 组 织 、 器 官 、 细 胞 基因 fash ait I 细菌 质粒 噬菌体 、 病 表 86) 本 本 I on i ee oe 基因 文库 合成 文库 、 基 因 组 文库 、cDNA 文库 l | DNA 序列 筛选 1 目的 基因 转移 rete Soo hy 表达 | 人 rectrivormpduniagaumems 组 织 、 血 、 创造 恨 种、 着 治疗 人 类 遗 时 作物 良种 HY tin 节省 饲料 peli 图 2-6 基因 工程 的 流程 设计 图 ( 孙 汶 生 ) 第 三 章 “基因 工程 的 发 展 与 应 用 Chapter 3. Development and Application of Genetic Engineering 第 一 他 基因 工程 发 展 的 历史 背景 1953 年 ,Nature 上 发 表 了 伟大 的 科学 家 Crick 和 Watson 提出 的 DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 ， 揭 开 了 长 期 困惑 人 们 的 生命 之 迹 , 宣 告 了 分 子 生物 学 的 诞生 。 它 与 受 因 斯 坦 提 出 的 相对 论 及 海 森 堡 创立 的 量子 力学 .量子 场 论 共 同 被 誉 为 20 世纪 最 伟大 的 三 项 发 现 。 1990 年 ,由 美国 启动 的 人 类 基因 组 计划 (human genome project，HGP) 是 探讨 人 类 全 部 基因 遗传 信息 的 跨国 科学 工程 ,与 制造 原子 弹 的 曼哈顿 计划 、 阿 波 罗 登 月 空间 计划 共同 被 誉 为 20 世纪 最 伟大 的 三 项 科学 计划 。 基因 工程 学 问世 虽 仅 有 几 十 年 的 历史 ,但 很 多 先驱 科学 家 及 其 开创 性 的 科学 研究 为 基 因 工 程 的 发 展 建立 了 功 不 可 没 的 丰功伟绩 ( 表 3-1)。 基 因 工 程 学 为 完成 人 类 基因 组 计划 提 供 了 主要 的 技术 并 奠定 了 雄厚 的 理论 基础 ,已 成 为 生命 科学 的 重要 支柱 学 科 之 一 。 基因 工程 学 的 崛起 与 发 展 基于 该 学 科 在 理论 与 技术 上 的 三 大 重大 突破 。 表 3-1 基因 工程 发 展 的 百年 回顾 年 代 人 物 事件 1865 年 奥地利 学 者 G.Mendel 备 德 尔 遗 传 定律 ,遗传 因子 的 概念 1869 年 F. Miescher BUM SE el BE HF PD BB) DNA 1909 年 Ft# W. Johannsen 首次 提出 以 “gene" 这 一 名 词 表 达 备 德尔 的 遗传 因子 概念 1910 年 美国 遗传 学 家 Thomas Hunt Morgan 。” 遗传 学 规律 (基因 连锁 和 互 换 定律 ) ,首创 基因 学 说 1940 年 Beadle 和 Tatum 蛋白 质 由 基因 编码 1944 年 3 位 美国 科学 家 分 离 出 细菌 的 DNA, 发 现 DNA 是 携带 生命 遗传 物质 的 分 子 1951 年 Pauling 蛋白 质 的 "螺旋 ,蛋白质 的 二 级 结构 1953 年 J.D. Watson #1 F. H.C. Crick 在 英国 人 自然) 杂志 发 表 " 核 酸 的 分 子 结构 一 一 脱氧 核糖 核酸 的 一 个 结构 模型 ”, 标 志 着 DNA 双 螺 旋 结 构 的 建立 (1962 年 获 诺 贝 尔 生理 学 或 医学 奖 ) 1957 年 A.Kornberg MKD ARR DNA RAB I 1958 年 M. Meselson 和 下 . W. Stahl DNA 的 半 保 留 复 制 1961 年 Crick DNA RNA、 蛋 白质 的 中 心 法 则 | 32 基因 工程 学 入 1 全 1966 年 全 部 破译 64 个 遗传 密码 ,一 部 生物 学 的 无 字 天 书 一 一 密码 字典 1970 年 1972 年 1973 年 1976 年 1977 年 1977 年 1977 年 1978 年 1981 年 1982 年 1985 年 1985 年 1986 年 1987 年 1988 年 1989 年 1990 年 1990 年 1990 年 10 月 1994 年 1994 年 1995 年 1995 年 1996 年 1996 年 1996 年 1997 年 1997 年 1998 年 4 月 1998 年 1998 年 1998 年 人 BD M.W.Nirenberg 等 Tem 和 Baltimore P. Berg Cohen 和 H. Boyer W.Gilbert 和 A. Maxam Sanger Bergert Beyer Boyer 和 Itakura R.D. Palmiter 和 R. L. Brinster 美国 公司 Kary B. Mullis Robert Sinsheimer Muller Dhundale J.D. Watson Greider Levine Chittenden, Farrow 和 Klefer Morin Jacobson 英国 威 尔 姆 斯 (Weilmos) 美国 ONYX 公司 LRM SG 续 表 可 元 什 问世 ,揭示 了 生物 遗传 信息 的 传递 方式 和 规律 病毒 的 反 转 录 酶 ,修正 了 遗传 信息 流 的 中 心 法 则 划时代 的 第 一 次 DNA 重组 (SV40 + A me BTA) (1980 年 获 诺 贝尔 化 学 奖 ) 划时代 的 第 一 次 分 子 克 隆 ,宣告 了 基因 工程 的 诞生 化 学 直 读 法 测 DNA 序列 (1980 年 获 诺 贝 尔 化 学 奖 ) 双 脱 氧 链 终止 法 测定 DNA 序列 (1980 年 获 诺 贝 尔 化 学 奖 ) 发 现 断 裂 基 因 (interruption gene) jm SHKEA HM MRA, WU BRA mRNA 加 工 机 制 splicing 大 肠 杆菌 第 一 个 基因 工程 产品 一 一 人 生长 激素 释放 抑制 素 (so- matostatin) 大 肠 杆 菌 表达 人 生长 激素 基因 第 一 个 转基因 动物 “超级 老鼠 ” 第 一 个 基因 工程 胰岛 素 商品 化 (Humulin) 发 明 聚 合 酶 链 反 应 (PCR) 在 加 利 福 尼 亚 大 学 主持 会 议 讨 论 人 类 基因 组 测序 问题 端 粒 (telomere) RNA 和 DNA 杂 合 子 msRNA, 反 转录 单元 和 病毒 的 祖先 Retron， 再 次 揭示 生命 的 起 源 负责 举世 瞩目 的 人 类 基因 组 测序 工作 膜 虫 的 端 粒 酶 (telomerase) 明星 基因 一 一 抑 癌 基 因 p53 第 一 个 转基因 玉米 及 转基因 小 麦 植株 诞生 被 誉 为 生命 科学 “阿波 罗 登 月 计划 "的 国际 大 类 基因 组 计划 启动 提前 一 年 完成 人 类 基因 组 遗传 图 基因 工程 西红柿 在 美国 上 市 英国 《自然 } 杂 志 汇 集 发 表 了 人 基因 组 全 物理 图 抑 瘤 基因 bak Methanococcus jannaschii 基因 组 测序 完成 ,确定 地 球 上 存在 第 三 种 生命 类 型 DNA 芯片 人 HeLa 细胞 的 端 粒 酶 细胞 凋 亡 (apoptosis) 克隆 羊 多 利 (Dolly) HGP 完成 50% Bischoff 缺陷 型 腺 病毒 治疗 瘤 症 一 批 科学 家 在 美国 组 建 遗传 公司 ,与 HGP 展开 竞争 发 现 神经 性 耳 礁 基因 a _ 第 三 章 BALENALRSNA - 33 - 续 表 re HK 人 事件 1999 年 美国 普及 转基因 玉米 \ 大豆 和 棉花 ,种 植 面积 50% 1999 年 9 月 中 国 加 入 人 类 基因 组 计划 ,负责 测定 人 类 基因 组 全 部 序列 的 1% 1999 年 12 月 1 日 人 类 第 22 号 染色 体 测 序 完 成 2000 4F 4 月 中 国 科 学 家 按照 HGP 的 部 署 ,完成 了 1% 人 类 基因 组 的 工作 框架 图 2000 年 5 月 人 类 第 21 号 染色 体 测 序 完成 2000 44 6 A 26 A 科学 家 公布 人 类 基因 组 工作 草图 ,标志 着 人 类 在 解读 自身 “生命 之 书 " 的 道路 上 迈 出 了 重要 一 步 2001 年 2 月 12 日 R.A BK RS 6 国 科学 家 和 美国 塞 莱 拉 公司 联合 公布 人 类 基因 组 图 谱 及 初步 分 析 结果 2001 年 J.M. Claverie 提出 人 类 结构 基因 可 能 仅 有 30 000 个 的 推论 2001 年 12 月 人 类 第 20 号 染色 体 测 序 完成 2002 年 12 月 5 日 小 鼠 基因 组 序列 草图 完成 2003 年 1 月 人 类 第 14 号 染色 体 测 序 完成 2003 年 4 月 人 类 基因 组 计划 宣布 完成 一 、 基 因 工 程 发 展 的 关键 性 理论 1. 20 世纪 40 年 代 ,Avery 和 Griffith 报道 了 肺炎 链球 菌 的 转化 研究 ,首次 证 明了 生物 的 遗传 物质 是 DNA。 2. 20 世纪 50 年代, Watson 和 Crick 提出 了 DNA 结构 的 双 螺 旋 模 型 ,从 此 为 搞 清 生物 遗传 物质 的 分 子 机 制 奠 定 了 基础 。 3. 20 世纪 60 年 代 ,Nirenberg 等 确定 了 遗传 信息 的 传递 方式 , 即 DNA->RNA->~ 有 蛋白质 遗传 信息 流 的 中 心 法 则 ,全 部 破译 了 氨基 酸 的 64 个 遗传 密码 ,编排 了 一 本 震惊 世界 的 密码 字典 ,由 此 揭 开 了 生物 遗传 的 恋 底 ,为 基因 工程 学 的 诞生 黄 定 了 雄厚 的 理论 基础 。 二 、 基 因 工 程 的 重大 技术 发 明 基因 工程 三 大 技术 的 发 明 ,为 基因 工程 学 的 诞生 建立 了 功 不 可 没 的 丰功伟绩 ,提供 了 必 不 可 少 的 关键 性 技术 手段 。 1. 限制 性 内 切 酶 的 分 离 与 纯化 “1970 年 ,Smith 和 Wilcox 首次 从 嗜 血 流 感 杆菌 中 分 离 纯化 了 限制 性 内 切 酶 (restriction endonuclease，RE) Hind 下 ,由 此 ,为 基因 工程 制备 了 精密 的 基因 操作 "手术 刀 ”( 见 第 四 章 )。 2. 反 转 录 酶 的 发 现 1970 年 , Baltimore 和 Temin 同时 各 自发 现 了 反 转 录 酶 ,从 而 打破 、 了 传统 的 中 心 法 则 ,并 为 真 核 基因 的 制备 技术 黄 定 了 基础 。 3. 载体 技术 载体 (vector) 是 指 可 容忍 外 源 性 DNA 片段 插入 .可 在 细胞 间 转 移 并 能 在 细胞 内 自主 复制 的 DNA 分 子 。 细 菌 的 质粒 、 喉 菌 体 及 某 些 病毒 均 有 独立 复制 DNA 的 能 力 ,并 能 通过 一 定 方式 进入 细菌 或 受 体 细 胞 , 故 都 是 基因 工程 中 良好 的 载体 。Cohen 首次 将 . 34 . 基因 工程 学 质粒 作为 基因 工程 的 载体 ,为 实现 DNA 体外 重组 提供 了 关键 性 的 技术 方法 和 有 重要 价值 的 实验 材料 ,这 是 基因 工程 诞生 的 第 三 个 技术 准备 。 1972 年 ,美国 斯 坦 福 大 学 的 Berg 首次 实现 DNA 重组 。 其 后 ,Cohen 于 1973 年 进一步 实现 了 重组 DNA 的 转化 ,成 为 基因 工程 历史 上 第 一 个 成 功 实现 克隆 转化 的 创举 。 因 此 ， 1973 年 被 确定 为 基因 工程 诞生 的 元 年 ,Cohen 被 人 誉 为 基因 工程 的 创始 人 。20 世纪 70 EAR, 随 着 基因 工程 理论 的 突破 与 技术 的 发 展 ,基因 工程 学 水 到 渠 成 迅速 发 展 为 一 门 独立 的 工程 技术 学 。 第 二 ”基因 工程 的 发 展 与 应 用 基因 工程 的 诞生 ,重组 技术 的 兴起 ,开辟 了 按照 人 们 的 意愿 短期 内 定向 改造 生物 遗传 性 ,创造 新 生物 的 新 纪元 。 自 20 世纪 70 年 代 以 来 ,基因 工程 已 展现 了 惊人 的 发 展 实力 和 极 其 广阔 的 应 用 前 景 。 一 、 基 因 工程 疫苗 与 DNA 疫苗 (一 ) 基因 工程 疫苗 基因 工程 疫苗 是 指 利 用 基因 重组 技术 表达 的 重组 蛋白 作为 疫苗 ,又 称 重 组 抗原 疫苗 (recombinant antigen vaccine)。 制 备 基 因 工 程 疫苗 的 基本 过 程 是 将 编码 抗原 免疫 原 性 的 基 因 与 表达 载体 连接 , 导 和 人 细菌 .酵母 或 真 核 细胞 中 ,表达 相应 的 蛋白 质 ,接种 给 人 体 后 可 刺激 机 体 产 生 有 效 的 免疫 应 答 。 此 类 疫苗 安全 有 效 ` 成 本 低廉 ,已 广泛 应 用 于 疾病 预防 。 (=) DNA 疫苗 DNA 疫苗 ,也 称 核酸 疫苗 (nucleic acid vaccine，NAV) ,是 指 直 接 把 带 有 目的 抗原 基因 (免疫 原 性 基因 ,例如 病原 体 的 一 个 抗原 编码 基因 ) 插 人 表达 载体 ,通过 注射 或 粒子 麦 击 等 途 径 将 重组 DNA 导入 动物 细胞 或 人 体 ,使 之 在 活体 细胞 内 持续 表达 出 天 然 的 抗原 物质 一 一 目的 蛋白 质 , 这 些 目的 蛋白 质 经 正确 的 糖 基 化 修饰 等 加 工 处 理 后 ,与 MHC 抗原 形成 复合 物 并 被 递 呈 到 细胞 表面 一 一 能 诱导 产生 特异 性 细胞 免疫 (CMI) 及 体液 免疫 (HI) 的 物质 。 最 近 研 究 的 较为 深入 的 免疫 刺激 DNA 序列 (immunostimulatory DNA sequence, ISS) 、 重 组 病 毒 载体 疫苗 (RVVV) 等 均 属 于 DNA 疫苗 ( 见 第 十 九 章 )。 二 、 基 因 诊 断 基因 诊断 也 叫 DNA 诊断 、 分 子 诊断 ,是 通过 从 患者 体内 提取 样本 用 基因 检测 方法 来 判 断 患者 是 否 有 基因 异常 或 携带 病原 微生物 。 目 前 ,基因 诊断 检测 的 疾病 主要 有 三 大 类 :感染 性 疾病 的 病原 诊断 各 种 肿瘤 的 生物 学 特性 的 判断 .遗传 病 的 基因 异常 分 析 。 一 般 情 况 下 ， 对 感染 性 疾病 的 诊断 相对 容易 ,制备 相应 的 探 针 即 能 达到 准确 诊断 ;但 对 肿瘤 及 遗传 病 进行 第 三 章 ”基因 工程 的 发 展 与 应 用 - 35 - 基因 诊断 时 应 考虑 到 疾病 的 病理 生理 的 复杂 性 (如 基因 的 多 功能 性 、 多 种 功能 调节 与 相互 作 用 ) 及 人 类 遗传 的 多 样 性 (如 表 型 所 反映 的 基因 型 往往 是 通过 极其 多 样 的 环境 基础 和 其 他 重 要 方式 诱导 或 起 作用 的 ) , 故 目 前 大 多 只 能 以 排除 法 对 疾病 进行 诊断 ,例如 对 一 种 遗传 性 神 经 系统 错乱 症 一 一 享 廷 顿 病 , 若 基因 检测 结果 为 阴性 , 则 可 排除 此 病 。 或 通过 对 某 些 有 遗传 病危 险 倾向 的 人 的 预测 .评估 (如 癌症 、 糖 尿 病 .心脏 病 \ 高 血压 等 ) ,使 其 通过 采取 相应 措施 而 预防 或 减少 病情 发 生 。 人 类 基因 组 计划 为 正常 的 人 类 基因 组 的 研究 提供 了 一 个 序列 参考 ,在 后 基因 组 研究 中 ,将 不 断 发 现 新 基因 ` 致 病 基 因 及 变异 基因 。 有 的 是 引起 某 些 疾病 或 其 他 异常 的 原因 ,如 编码 某 种 酶 、 蛋 白质 因子 等 的 基因 缺失 或 异常 ;有 的 虽然 与 这 些 疾 病 有 关 , 但 不 是 其 发 生 的 直接 原因 ， 如 某 些 疾病 与 HLA 相关 联 。 当 深入 了 解 了 人 类 基因 的 缺失 或 异常 相关 性 时 ,通过 检测 有 关 疾 病 的 发 病 基因 ,就 可 以 诊断 和 预测 疾病 的 发 生 。 如 253 基因 与 近 一 半 肿 瘤 的 发 生 有 关 。 基因 诊断 制剂 和 技术 方法 也 将 更 加 专 一 和 快速 、 准 确 。 未 来 10 年 中 ,基因 诊断 将 从 目 前 占 现代 疾病 检测 中 的 0.5% 扩 大 到 占 全 部 诊断 检测 的 8% 一 10% 。 =. 2 Alia or (一 ) 基因 治疗 发 展 的 三 个 阶段 从 20 世纪 80 年 代 至 20 世纪 末 ,基因 治疗 的 发 展 经 历 了 三 个 阶段 : 1. 20 世纪 80 FRM EAA IT A “PEAT IR” ARABIA OR ERS A ,对 基 因 治 疗 存在 很 大 争议 。 直 到 1989 年 ,美国 FDA 才 同 意 将 载体 导 和 人 作为 “基因 标记 ”的 临床 试验 ,科学 家 们 在 临床 前 研究 方面 进行 了 大 量 工 作 和 舆论 准备 。 2. 1990 年 之 后 ,基因 治疗 进入 临床 试验 , 短 短 数 年 之 内 就 有 上 百 个 临床 方案 , 带 来 了 医学 生物 学 领域 的 一 片 狂热 ,使 人 们 感到 基因 治疗 即将 成 为 临床 治疗 的 一 种 成 熟 的 方法 ,使 一 些 尚未 成 熟 的 方案 过 早 的 进入 了 临床 试验 ,给 基因 治疗 的 应 用 带 来 了 一 些 不 良 影响 。 3. 1995 年 ,美国 NIH 主持 了 对 基因 治疗 临床 试验 的 初步 评估 ,使 基因 治疗 从 狂热 转 人 理性 化 的 正常 轨道 。1999 年 ,以 电 脉冲 DNA 导入 为 代表 的 新 技术 的 问世 ,标志 着 基因 导 和 人 系统 的 重大 突破 ,为 基因 治疗 的 应 用 开创 了 新 的 契机 。 (二 ) 基因 治疗 研究 现状 将 正常 的 治疗 性 基因 导 人 人 体 ,替换 或 矫正 有 害 基因 , 即 可 达到 基因 治疗 的 目的 。 基 因 治疗 最 明显 的 应 用 是 治疗 遗传 性 基因 疾病 。1990 年 ,美国 国立 卫生 研究 所 (NIH) 首 次 对 一 名 患 有 腺 苷 脱 氮 酶 (ADA) 缺 乏 症 的 4 岁 女 孩 进行 了 基因 治疗 ,并 获得 了 肯定 的 疗效 ,其 工 淋巴 细胞 半衰期 从 30 一 35 天 延长 为 3 一 5 个 月 ,由 此 标志 着 人 类 基因 治疗 正式 开始 。 目 前 CA 300 多 家 基因 治疗 公司 ,已 有 900 多 种 临床 方案 正在 研究 ,基因 治疗 的 疾病 已 涉及 各 种 恶性 肿瘤 ` 心 血管 病 、 代 谢 病 .感染 性 疾病 .遗传 性 疾病 和 艾滋 病 等 。 近年 基因 治疗 发 展 平稳 。 截 至 2004 年 1 月 ,全 世界 已 有 918 个 方案 进入 临床 试验 ,其 中 恶性 肿瘤 治疗 方案 居 首 位 ,为 608 个 ;几乎 大 多 数 恶性 肿瘤 都 有 基因 治疗 方案 ,如 神经 、 妇 -36- 基因 工程 学 BL 消化 道 Ati. BER .头颈 部 以 及 造血 系统 恶性 肿瘤 等 。 其 次 为 单 基因 遗传 病 ,方案 90 个 。 我 国 现 有 基因 治疗 方案 3 个 :复旦 大 学 节 京 伦 实 验 室 于 1991 年 12 月 2 日 首次 进入 临床 试 验 的 血 友 病 了 基因 治疗 方案 ; 反 转 录 病 毒 载体 导入 IL-2 基因 治疗 非 小 细胞 肺癌 的 方案 ; 腺 病毒 介 导 的 p53 基因 转移 结合 放射 线 治 疗 头颈 部 肿瘤 。 (三 ) 基因 治疗 的 相关 技术 1. 目前 基因 治疗 中 临床 试验 所 用 的 载体 系统 以 反 转 录 病 毒 居 首 位 ,其 次 是 腺 病毒 、 裸 DNA 脂 质 体 cs Joa BE: .病毒 疫苗 .单纯 疱疹 病毒 `, 腺 相关 病毒 方案 ,以 及 RNA 转移 等 。 2. 进行 基因 治疗 用 的 基因 按 所 占 比 例 大 小 有 细胞 因子 .抗原 、. 抑 癌 基 因 、 自 杀 基 因 、 缺 陷 基 因 、 耐 药 基因 、 受 体 以 及 其 他 基因 。 3. 基因 治疗 必须 解决 三 个 关键 问题 基因 导 和 人 系统 .基因 表达 的 可 控 性 及 筛选 更 多 更 好 的 治疗 基因 。 (1) 高 效 的 、 靶 向 性 基因 导入 系统 :基因 治疗 的 关键 是 靶 向 性 问题 ,只 有 将 治疗 基因 输 送 并 进入 特定 的 靶 细 胞 ,才能 在 该 细胞 中 得 到 高 效 表 达 。 如 果 治 疗 基因 不 能 导 和 大 多 数 肿 瘤 细 胞 ,至 少 要 求 尽 可 能 不 进入 或 较 少 进入 正常 细胞 。 迄 今 使 用 的 病毒 性 载体 中 ,如 反 转 录 病毒 、 腺 病毒 在 体内 肿瘤 基因 治疗 时 , 除 直 接 注射 人 瘤 体 外 , 若 用 全 身 给 药 ,很 难 达 到 期 望 治 疗 的 作用 。 对 恶性 肿瘤 的 体内 形式 的 基因 治疗 ,当务之急 是 建立 靶 向 性 强 的 载体 系统 。 体 外 曾 有 过 许多 尝试 ,尤其 是 受 体 靶 向 的 非 病 毒 载体 系统 ,如 上 海 肿 瘤 研 究 所 顾 建 仁 院士 创立 的 四 元 复合 体 导 入 系统 。 (2) 外 源 基因 表达 的 可 控 性 :最近 电 脉冲 介 导 的 DNA 转化 技术 的 改进 使 许多 基因 ,如 分 泌 性 蛋白 的 基因 可 导入 肌肉 ,维持 相当 时 间 的 表达 ,其 量 有 可 能 达到 发 挥 药 效 的 水 平 。 最 理想 的 可 控 性 是 模拟 人 体内 基因 本 身 的 调控 形式 ,但 其 难度 极 大 ,对 于 导 人 基因 的 载 体系 统 提 出 了 严峻 的 挑战 。 长 片段 DNA 进入 细胞 及 其 整合 ,涉及 整合 的 位 点 ,最 终 的 理想 Fe SER FE FAY “knock in”. (3) 筛选 有 治疗 价值 的 基因 :临床 试验 的 治疗 基因 集中 于 少数 基因 ,对 极 大 部 分 多 基因 疾病 (如 恶性 肿瘤 .高 血压 糖尿病 等 ) 的 致 病 基 因 还 有 待 阐 明 。 这 将 有 赖 于 人 类 基因 组 计 划 ,尤其 是 功能 基因 组 学 的 发 展 , 包 括 目前 已 知 和 未 知 功能 的 基因 的 表达 调控 序列 的 确定 ， 以 及 相互 作用 规律 的 阐明 。 四 、 基 因 工 程 药 物 以 基因 工程 技术 制备 药物 将 成 为 今后 医药 发 展 的 主流 。 基 因 工 程 药物 主要 有 以 下 几 个 方面 的 研究 与 开发 。 1. 基因 重组 药物 “基因 重组 药物 是 以 人 工 重 组 DNA 表达 产物 作为 治疗 性 药物 ,其 表 达 / 生 产 系 统 为 各 种 细胞 ,如 大 肠 杆菌 .酵母 细胞 ,或 哺乳 动物 细胞 。 自 1982 年 世界 上 第 一 个 基因 重组 药物 ”人 胰岛 素 " 在 美国 上 市 以 来 ,至 今 已 有 上 百 种 产品 问世 , 另 有 300 多 个 品 处 于 临床 试验 阶段 。 全 世界 基因 重组 药物 的 使 用 以 16% 的 速度 增长 。 各 国 纷纷 加 大 对 该 领域 的 投资 ,加 强 对 其 源头 .生长 点 .制高点 一 一 功能 基因 的 研究 ,并 开始 利用 蛋白 质 工 程 技 第 三 章 ”基因 工程 的 发 展 与 应 用 37 AR ,对 现 有 的 重组 药物 进行 分 子 改造 (如 构建 融合 蛋白 )。 随 着 后 基因 组 研究 的 推进 ,有 望 开 发 出 更 多 的 基因 重组 药物 。 广义 的 基因 重组 药物 (生物 技术 药物 ) 还 包括 重组 疫苗 和 诊断 或 治疗 用 的 单 克 隆 抗 体 。 2. 植物 基因 工程 药物 ”植物 基因 工程 药物 即 利用 转基因 植物 技术 ,在 植物 细胞 中 表达 特定 基因 药物 。 将 一 些 病 毒 或 细菌 的 有 用 基因 转 人 马铃薯 等 植物 中 ,可 大 量 . 低 成 本 地 生产 出 疫苗 ,或 通过 直接 食用 该 转基因 植物 而 获得 免疫 力 , 如 HBV 转 植 物 基 因 口 服 疫苗 的 研 制 。 我 国 中 药 的 一 些 有 效 成 分 的 开发 是 一 个 很 广阔 的 基因 药物 研究 空间 ,可 通过 关键 酶 对 其 代谢 途径 进行 遗传 操作 ,有 目的 地 获得 大 量 有 效 成 分 ,去除 或 减少 有 毒 成 分 。 3. 动物 基因 工程 药物 “动物 基因 工程 药物 指 利 用 转基因 动物 生产 基因 药物 。 用 于 分 泌 相 应 基因 的 蛋 白 质 产 物 的 动物 器 官 (如 乳腺 ) 称 为 生物 反应 器 。 如 用 转基因 绵羊 生产 蛋白 质 酶 抑制 剂 ATT, 其 产 率 达到 每 升 奶 3Sg, 可 大 量 生产 ,用 于 治疗 肺 气 肿 ,目前 已 进入 焉 期 临 床 试验 。 4. 基因 组 药物 ”基因 组 药物 是 沿 着 从 基因 序列 一 和 蛋白质- 功能 一 药物 的 途径 研制 新 药 。 基 因 组 和 后 基因 组 学 提供 了 庞大 的 信息 资源 和 结果 ,为 新 药 的 开发 提供 了 优化 条 件 ,前 景 广阔 。 五 、 基 因 工 程 新 技术 的 开发 与 应 用 (一 ) SNP PARK AR & AE (single nucleotide polymorphisms，SNP) 是 近年 研究 和 发 现 新 基因 的 新 思路 .新 方法 。SNP 是 人 和 群 中 的 某 种 单 碱 基 差 异 , 在 人 和 群 或 其 他 动物 种 群 中 的 遗传 变异 中 占有 很 高 的 比重 。 据 估计 ,在 人 类 基因 组 上 平均 每 Lb 就 有 一 个 SNP 存在 。 SNP 作为 一 种 数量 多 、 分 布 广 的 遗传 标记 ,在 疾病 的 研究 过 程 中 能 够 更 好 地 帮助 我 们 找到 新 的 基因 和 阐明 其 机 制 。 几 乎 每 个 基因 中 或 者 和 其 邻近 的 区 域 都 有 相关 的 SNP 分 布 ， 并 且 能 够 和 这 些 基因 一 起 稳定 地 遗传 下 去 。 所 以 ,通过 比较 正常 人 和 病人 的 SNP 的 分 布 方 式 和 频率 ,就 可 以 确定 哪些 SNP 与 疾病 相关 联 。 这 种 研究 方法 在 多 基因 控制 的 复杂 疾病 ， 如 癌症 \ 心 血管 疾病 糖尿病 及 一 些 较为 少见 的 简单 疾病 中 都 是 很 有 效 的 。SNP 研究 还 可 以 发 现 新 的 药物 作用 的 靶 基因 ,用 于 遗传 性 疾病 的 产 前 诊断 以 及 在 临床 上 根据 病人 个 体 的 SNP 差异 进行 个 体 化 用 药 ( 详 见 第 十 六 章 )。 (二 ) 生物 芯片 技术 生物 芯片 包括 DNA 芯片 .抗原 芯片 抗体 芯片 、 细 胞 芯片 和 组 织 芯 片 等 。 狭 义 上 讲 生 物 芯片 是 DNA 芯片 的 代名词 ,其 中 的 DNA 微 点 阵 (DNA 有 序 排列 ) 包 括 直径 为 200xm BK 更 小 的 数 百 至 数 千 个 点 。 目 前 研究 和 应 用 最 多 的 生物 芯片 是 DNA 芯片 ,抗体 等 芯片 仍 在 发 展 之 中 。 生 物 芯 片 即 缩小 了 的 生化 分 析 器 ,通过 芯片 上 微 加 工 获 得 的 微米 结构 与 生化 处 理 相 结合 ,将 成 千 上 万 个 与 生命 相关 的 信息 集成 在 一 块 厘米 见方 的 氧化 硅 、 玻 璃 或 塑料 等 材 料 上 而 制 成 。 -38- 基因 工程 学 20 世纪 90 年 代 初 开始 进行 研制 ,芯片 技术 得 到 了 迅速 发 展 。 发 展 的 趋势 是 研制 出 高 度 集成 化 的 集 样 品 制 备 .基因 扩 增 、 核 酸 标记 及 检测 为 一 体 的 便携 式 生 物 分 析 系 统 , 即 所 谓 的 “微缩 实验 室 芯 片 (Lab-on-chip)”, 使 现 有 的 许多 烦琐 、 费 时 、 不 连续 、 不 精确 和 难以 重复 的 生物 分 析 过 程 自动 化 .连续 化 和 微缩 化 , 既 可 用 于 基础 研究 (如 上 文 所 述 ,进行 方便 快捷 的 基 因 分 析 药物 筛 选 等 ) ,又 具有 巨大 的 应 用 价值 (如 疾病 诊断 等 ) 和 经 济 效益 ( 见 第 十 三 章 )。 (=) 基因 敲 除 与 转基因 动物 模型 的 建立 与 应 用 = AY ax BR (gene knockout) 是 以 基因 工程 的 方法 造成 动物 某 一 有 功能 的 特定 基因 的 缺 失 ,以 研究 该 基因 的 功能 活性 。 而 转基因 动物 (transgenic animal) 是 将 某 一 生物 特定 的 基因 转 和 人 另 一 生物 体 ,以 获得 该 基因 在 受 体 动物 中 的 稳定 复制 与 表达 ,利于 研究 该 基因 的 功能 。 如 HBV 转基因 鼠 使 宿主 特异 性 (人 ) 的 HBV 在 小 鼠 体内 复制 .表达 ,为 HBV 生物 活性 、 致 病 机 制 及 抗 HBV 药物 筛选 提供 了 不 可 缺少 的 实验 动物 材料 。 基 因 痪 除 与 转基因 技术 详 见 第 十 八 章 。 第 三 节 “人 类 基因 组 计划 与 后 基因 组 时 代 一 、 人 类 基因 组 计划 1990 年 ,在 美国 正式 启动 路 世纪 的 人 类 基因 组 计划 (human genome project, HGP), 以 期 破译 人 类 自身 遗传 秘密 。2000 F 6A 26 日 ,参加 人 类 基因 组 计划 国际 协作 组 的 各 个 国 家 同时 宣布 ,人 类 基因 组 核 背 酸 序列 的 “工作 框图 "已 完成 。 这 是 生命 科学 的 里 程 碑 ,也 昭示 着 人 类 已 从 基因 组 时 代 开 始 步 人 后 基因 组 时 代 。 人 类 基因 组 是 指 传递 人 类 遗传 信息 的 23 对 染色 体 (22 对 常 染 色 体 +XX 或 XY 染色 体 ) 及 其 所 携带 的 全 部 基因 。 基 因 是 染色 体 上 特定 的 DNA 片段 。 人 类 基因 组 包括 细胞 核 基因 组 与 线粒体 基因 组 ,其 结构 框架 如 图 3-1 所 示 。 人 类 基因 组 约 含 3 万 个 基因 ,由 约 30 亿 对 碱 基 组 成 。 人 类 基因 组 计划 的 目的 就 是 找 出 30 亿 对 碱 基 在 染色 体 上 准确 的 位 置 排序 。 这 项 工作 分 两 步 实 施 :中 绘制 人 基因 组 的 全 部 基 因 连 锁 图 谱 ,也 称 染 色 体 图 或 遗传 图 ,该 图 早 在 1992 年 已 完成 ;@ 基 因 的 DNA 序列 ( 碱 基 对 ) 测 定 , 由 此 完成 人 类 遗传 密码 的 基本 数据 ,已 于 2000 年 6 月 26 日 按期 完成 。 二 、 模 式 生 物 的 基因 组 计划 在 人 类 基因 组 计划 的 影响 下 ,发 展 出 模式 生物 的 基因 组 计划 。 模 式 生物 是 分 子 遗 传 学 家 用 于 研究 生命 奥秘 的 基本 工具 。 模 式 生物 基因 组 计划 将 为 后 基因 组 时 代 人 类 基因 功能 的 阐释 提供 很 好 的 参照 系统 ,加快 和 加 深 对 人 类 基因 功能 的 理解 与 运用 。 1995 年 ,第 一 个 细菌 基因 组 一 一 流感 嗜 血 杆 菌 的 全 基因 组 序列 发 表 , 其 后 陆续 完成 了 11 种 与 人 类 疾病 相关 的 病原 菌 和 $ 种 与 工业 、 基 础 研究 有 关 的 细菌 的 基因 组 全 序列 分 析 。 1996 年 4 月 , 真 核 单 细 胞 酵母 的 基因 全 序列 完成 ;1998 年 12 月 ,第 一 个 多 细胞 真 核 生物 的 第 三 章 “基因 工程 的 发 展 与 应 用 - 39- 人 类 基因 组 细胞 核 基 因 纪 线粒体 基因 组 =2000Mb =16.6kb ~20% ~80% 基因 和 基因 基因 外 24 rRNA 224 tRNA 3480 有 关 序 刻 DNA ”基因 基 内 iy FFE [A] 单一 或 中 等 重复 70%~80% 20%~30% <10% >90% 编码 非 编 码 下 see 135 eos ee Re 4S PER ~60% ~40% 假 基 内 DNA Aat He BK Be 8 eH / ICE a 片段 非 翻 译 序 刻 AN fide Ht SS FF FI) 序 刻 图 3-1 人 类 基因 组 框架 示意 图 基因 组 一 “线虫 的 基因 组 序列 发 表 。 果 蝇 基 因 组 计划 水 稻 基 因 组 计划 正在 进行 之 中 ,计划 将 于 2004 年 完成 模式 植物 拟 南 芥菜 于 2005 年 完成 模式 动物 小 鼠 的 基因 组 计划 。 三 、 人 类 后 基因 组 计划 人 类 后 基因 组 计划 是 由 序列 (结构 ) 基 因 组 学 向 功能 基因 组 学 的 转移 , 即 在 基因 组 静态 的 碱 基 序 列 逐 步 搞 清 楚 后 , 转 而 对 基因 组 进行 动态 的 生物 学 功能 的 研究 。 因 为 找 出 人 类 基 因 字 母 表 的 顺序 仅仅 是 迈 出 了 一 小 步 , 就 DNA 序列 信息 本 身 而 言 ,并 不 能 提供 特定 基因 功 能 的 确定 信息 。 例 如 ,一 个 给 定 的 基因 在 什么 确切 位 点 表达 的 时 空调 节 及 该 期 的 确切 功能 如 何 ? 在 这 些 海量 的 序列 信息 基础 上 ,就 可 以 在 分 子 层面 上 探索 人 类 健康 和 疾病 的 奥秘 。. 基因 是 一 种 人 类 共有 的 有 限 的 资源 ,基因 产业 能 够 创造 巨大 的 商业 价值 ,并 将 使 人 类 生存 的 质量 和 境况 发 生 革 命 性 的 飞 妈 。 随 着 后 基因 组 计划 的 进行 ,近年 来 已 衍生 出 许多 新 的 分 支 学 科 , 包 括 功能 基因 组 学 、 结 构 基 因 组 学 .生物 信息 学 .比较 基因 组 学 .蛋白质 组 学 .整体 生物 学 及 药物 基因 组 学 等 。 -40- BALES 未 来 的 基因 组 和 后 基因 组 学 研究 将 为 医疗 保健 带 来 新 的 模式 , EE aT IT AR ;将 产生 一 个 以 特异 的 分 子 病理 学 为 诊断 依据 ,以 患 病 前 个 人 基因 档案 预测 资料 为 依据 的 疾病 预防 式 治 疗 模式 。 (ER) FA) 第 二 篇 基因 工程 学 的 基本 理论 与 技术 Part Il. Basic Principles and Techniques of Genetic Engineering 5 Cae Sk A ie KARETRBA eglqionin4 ojesd . 3 I : 中 51jeneb to zeupinrlo: hip on a A dies oe as 第 四 章 ” 基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 Chapter 4. Restricted Enzyme and Its Application 在 基因 工程 中 ,无 论 是 在 特定 部 位 准确 切割 DNA 以 获得 所 需 的 目的 基因 ,还 是 将 目的 DNA 连接 于 载体 进行 DNA 分 子 重组 ,都 离 不 开 分 子 水 平 的 精密 “手术 刀 "””“ 缝 幼 针 "一 一 基 因 工 程 工具 酶 。 基 因 工 程 中 的 工具 酶 是 基因 工程 研究 的 技术 工具 ,主要 来 源 于 细菌 及 真菌 ， 种 类 繁多 ,功能 各 异 。 目 前 ,分 离 并 纯化 的 基因 工程 工具 酶 已 超过 400 余 种 。 其 中 较为 重要 的 有 十 几 种 。 本 章 将 介绍 几 种 常用 的 工具 酶 。 第 一 全 ”限制 性 核酸 内 切 酶 宿主 细胞 中 均 存 在 着 一 对 功能 相反 的 酶 一 一 限制 性 核酸 内 切 酶 (restriction endonucle- ase，RE) 和 DNA 甲 基 化 酶 或 称 修饰 性 核酸 酶 (modification nuclease) ,限制 性 核酸 内 切 酶 与 其 对 应 的 甲 基 化 酶 对 DNA 底 物 有 相同 的 识别 顺序 ,但 生物 学 功能 是 相反 的 。 限制 性 核酸 内 切 酶 简称 限制 酶 ,是 一 类 能 够 识别 dsDNA 分 子 中 的 某 特 定 核 苷 酸 序列 ， 并 由 此 切割 DNA 双 链 结构 的 核酸 内 切 酶 ,具有 切除 和 降解 无 关外 来 DNA 的 作用 ,参与 构 成 宿主 抵抗 外 源 DNA 人 侵 的 防御 机 制 。 限 制 性 核酸 酶 内 切 DNA 形成 的 片段 ,5 端 为 P,3” 端 为 OH。 修饰 性 核酸 酶 简称 修饰 酶 或 甲 基 化 酶 ,可 对 宿主 本 身 的 DNA 进行 限制 性 修饰 ,防止 DNA 被 降解 。 一 、 限 制 性 核酸 内 切 酶 的 命名 原则 由 于 限制 性 核酸 酶 的 数目 非常 庞大 ,需要 有 一 个 统一 的 命名 法 则 。 现 介绍 已 得 到 认同 的 由 H. O. Smith 和 D. Nathans 于 1973 年 提出 的 命名 法 。 该 规则 以 内 切 酶 来 源 的 微生物 学 名 进行 命名 ,具体 法 则 如 下 : 1. 用 产生 酶 的 微生物 “ 属 " 名 的 第 一 个 字母 (大 写 ) 及 “种 "名 的 前 两 个 字母 (小 写 ) ,表示 宿主 菌 的 名 称 。 如 , 埃 希 氏 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) FA Eco 表示 , 嗜 血性 流感 菌 (Haemophilus influenzae) FA Hin 表示 。 . 2. 知 微 生物 有 不 同 变种 和 品系 , 则 需 用 变种 或 品系 的 第 一 个 字母 (大 写 ) 代 表 。 如 ,大 肠 杆 菌 ( Escherichia coli )R 株 分 离 的 酶 用 EcoR 表示 。 3. 同一 微生物 产生 的 几 种 限制 酶 , 则 根据 其 发 现 和 分 离 的 先后 顺序 用 罗马 数字 表示 。 如 大 肠 杆菌 ( Escherichia coli )R 株 分 离 的 第 一 种 及 第 二 种 酶 分 别 命名 为 EcoR 工 及 EcoRI。 a -44- 基因 工程 学 二 、 限 制 性 核酸 内 切 酶 的 分 类 根据 酶 的 识别 序列 及 切割 位 点 \ 催 化 条 件 及 是 否 具 有 修饰 酶 活性 ,可 将 限制 酶 分 为 工 、 [ 、 亚 型 。 这 三 种 不 同类 型 的 限制 酶 具有 不 同 的 特性 , 见 表 4-1。 表 4-1 限制 性 核酸 内 切 酶 的 类 型 及 其 特性 特 点 I #® I 型 i # 限制 和 修饰 活性 多 功能 酶 分 开 的 核酸 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 “ 双 功 能 酶 限制 作用 所 需 的 辅助 因 了 于 ATP. Mg?* 、S- 腺 苷 蛋 所 “Mg ATP .Mg’* 、S- 腺 苷 蛋氨酸 酸 识别 序列 EcoB: TGA(N)gTGCT 旋转 对 称 EcoP1: AGACC 切割 位 点 在 距 识别 序列 至 少 1000bp 位 于 识别 位 点 或 其 附近 距 识别 序列 3 端 25bp 处 处 随机 切割 酶 催 转 换 不 能 能 能 甲 基 化 作用 的 位 点 识别 序列 识别 序列 识别 序列 序列 特异 性 切割 不 是 是 是 在 基因 克隆 中 的 作用 无 用 非常 有 用 用 处 不 大 注 :N 代表 任何 一 种 核 苷 酸 。 I 型 限制 酶 : 属 复合 功能 酶 , 兼 具 限制 修饰 两 种 功能 ,具有 核酸 内 切 酶 . 甲 基 化 酶 .ATP 酶 和 DNA 解 旋 酶 四 种 活性 。 工 型 限制 酶 的 活性 发 挥 与 DNA 的 甲 基 化 程度 有 关 , 若 识别 位 点 上 两 条 DNA 链 均 未 甲 基 化 ,就 行使 内 切 酶 功能 ,并 在 切割 DNA 的 同时 或 以 后 转变 为 ATP 酶 ; 若 位 点 上 只 有 一 条 链 甲 基 化 , 则 发 挥 修饰 作用 ,使 另 一 条 链 也 甲 基 化 ; 若 位 点 上 两 条 链 均 已 甲 基 化 , 则 与 位 点 解 离 。 工 型 限制 酶 的 显著 特点 是 在 DNA 链 上 的 识别 序列 与 切 割 位 点 不 同 ,一 般 在 离 识 别 位 点 1kb 至 几 个 kb 的 部 位 随机 切割 DNA ,需要 ATP 的 水 解 作 用 提供 能 量 。 工 型 酶 无 固定 切 点 ,不 产生 特异 性 DNA 片段 。 如 EcoB 、FcoK。 开 型 限制 酶 : 即 通常 所 说 的 限制 酶 。 具 有 这 类 酶 的 微生物 其 限制 、 修 饰 系统 分 别 由 两 种 不 同 的 酶 完成 , 即 限制 性 内 切 酶 和 修饰 性 甲 基 化 酶 。 开 型 限制 酶 的 特点 是 相对 分 子 质量 小 ， 仅 需 Mg 作为 催化 反应 的 辅助 因子 ,能 识别 并 切割 DNA 链 上 的 特异 性 核 苷 酸 顺 序 ,产生 特异 性 DNA 片段 ,因此 ,在 基因 工程 中 开 型 限制 酶 的 应 用 非常 广泛 。 常用 的 工 型 限制 酶 及 其 识别 序列 与 切割 位 点 , 见 表 4-2。 焉 型 限制 酶 :与 工 型 限制 酶 相似 ,但 其 不 同 点 是 亚 型 限制 酶 的 切割 位 点 在 识别 序列 的 一 侧 约 25bp 处 的 核 苷 酸 位 置 上 单 链 切割 DNA 分 子 , 有 特异 性 的 切割 位 点 。 此 类 酶 数量 相当 4 EcoP I . LTT 2 BRS all AE RT EP) AY EAS, ASH BE SP TTY BR ol 酶 名 称 Ava | BamH | Bel Il Bel I BstEI BstZ 1 Dpn I EcoR I EcoRV Hindll Hincll Hinf I Hpa I Hpa I KpnI Mbo I Neo I Pst I Pvu I Sac I Sal I Sau3A I Sma | Sst I Tag I Xba | Xho I Xma | Xma I 识别 序列 Cy PyCGPuG G¥ GATCC Ay GATCT Ty GATCA G ¥ GTNACC C ¥ GGCCG Gy ATC Gy AATTC GAT ¥ ATC Ay AGCTT GTPy ¥ PuAC Gy ANTC GTT ¥ AAC Cy CGG GGTACY C ¥ GATC Cy CATGG CTCGAY G CAG ¥ CTG GAGCT ¥ C G¥ TCGAC 4 GATC CCC ¥ “GGG GAGCT ¥C T¥CGA T¥ CTAGA C¥ TCGAG CCC ¥ GGG CTCGA)G S0S ”基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 - 45 . 表 4-2 部 分 开 型 限制 酶 的 性 质 及 酶 切 位 点 缓冲 液 = aE ZC 异 源 同 工 酶 可 互相 连接 的 酶 M 37 Sal 工 或 Sml I K 30 Bel I , Bgl Il , Moo I , Xho Il L 37 Xho Il , BamHI M 60 BamHI , Xho I] M 60 H 50 M 37 Sau3A I Blunt M/H 37 H 37 M 37~55 M 37 任何 平头 末端 酶 M 37 L 37 任何 平头 末端 酶 L 37 Taq I ,Cla I 3 37 M 37 Sau3A I Xho 1 , BamHI H 37 M 21~37 M 37 任何 平头 末端 酶 L 37 Sst | M/H 37 Ava I ,Xhol M 37 BamH1 , Bgl Il K4 37 Xma I 任何 平头 末端 酶 37 Sac I i 65 Hpa I] , Asu II , Cla I , Msp I H 37 H 37 Aval, SalI e 37 Sma I 某 些 Ava I M Si) Pst I 注 :识别 序列 用 一 条 链 按 5 一 3 方向 表述 ,箭头 所 指 系 酶 切 位 点 ;Py 代表 喀 啶 碱 基 CoB T, Pu (RS SE A BR OG; 星 号 ( * ) 代 表 该 碱 基 被 特定 的 甲 基 化 酶 所 修饰 ;L\M\H 分别 代表 该 酶 的 缓冲 液 为 低 盐 、. 中 盐 ,高 盐 缓冲 液 。 (一 ) 开 限 制 酶 的 识别 与 切割 特点 三 、 开 型 限制 酶 的 识别 与 切割 序列 1. 下 型 限制 酶 具有 特定 的 识别 顺序 核 苷 酸 组 成 的 特定 核 苷 酸 序列 , 即 识别 序列 , I 型 限制 酶 在 其 识别 序列 内 切割 DNA 分 子 ， 绝 大 多 数 的 开 型 限制 酶 ,都 能 够 识别 由 4 一 8 个 ” 46 基因 工程 学 因此 ,识别 序列 又 称 为 开 型 限制 酶 的 切割 位 点 或 壮 序列 。 [型 限制 酶 识别 靶 序 列 的 大 小 决定 着 产生 特定 DNA 片段 的 大 小 。 如 果 DNA 的 碱 基 组 成 是 均一 的 ,限制 酶 位 点 在 DNA 链 上 的 分 布 是 随机 的 , 则 要 求 识 别 4 个 核 苷 酸 靶 序列 的 酶 (如 Hpa Il 、Mzpo 工 等 ) ,在 一 个 庞大 的 DNA 链 上 ,平均 每 44 个 核 苷 酸 即 可 遇 到 一 个 靶 序 Fl (1/44 = 1/256) ;而 对 要 求 识 别 6 个 核 苷 酸 靶 序列 的 酶 (如 BaxzHI 、EcoRI、Ps I #), 则 平均 每 6° 个 核 苷 酸 才能 遇 到 一 个 特异 的 识别 序列 ( 即 1: 6° = 1/4096). 2. 工 型 限制 酶 的 识别 序列 具有 180 度 的 旋转 对 称 性 工 型 限制 酶 的 识别 序列 呈 完 全 回 文 结 构 。 所 谓 回 文 结构 指 的 是 形似 回 文 的 一 段 DNA 序列 ,其 特点 有 二 : (1) 以 某 一 对 核 苷 酸 为 中 轴 ,左右 同 数目 的 核 苷 酸 彼 此 呈 碱 基 互 补 ; (2) 这 两 股 DNA 链 若 按 同方 向 阅读 (如 $ 一 3 或 3 一 5 ) ,其 核 苷 酸 顺 序 相 同 。 如 : 5’---GTATCC } GGATAC =" 3“ 3’---CATAGG | CCTATG … 5 ’ 对 称 轴 3. 开 型 限制 酶 对 dsDNA 切割 时 ,可 产生 两 种 不 同 的 切口 (末端 ) (1) 平 齐 末端 (flush 或 blunt end) : 开 型 限制 酶 在 其 识别 序列 的 对 称 轴 上 对 dsDNA 的 两 条 链 同 时 切割 ,两 条 链 的 断裂 位 置 处 在 对 称 轴 上 ,形成 双 股 平 齐 末端 。 如 Sma 工 等 。 + 3G GA <3" 5 和 证 有 他 CS BS GRR 3/---AT CY =. 5° AT 5 CT =< A 具 平 齐 末 端的 DNA 片段 不 易于 重新 环 化 。 (2) BRAM (cohesive end) :大 部 分 的 开 型 限制 酶 (如 BamHI .EcoRI #)WMWOEH 点 具 180 "旋转 对 称 性 ,形成 黏 性 末端 。 该 末端 在 双 股 DNA 断口 处 ,各 产生 一 小 股 互补 的 核 苷 酸 单 股 区 , 若 此 单 股 区 有 四 个 以 上 核 苷 酸 序列 ,就 可 产生 稳定 的 碱 基 配 对 。 两 个 不 同 的 DNA 分 子 , 经 同一 个 限制 酶 切割 所 形成 的 黏 末 端 是 相同 的 ,经 互补 的 碱 基 配 对 很 容易 退火 而 组 合成 新 的 DNA 分 子 。 重 组 的 DNA 分 子 仍 保留 了 原来 的 酶 切 序列 ,这 对 重组 DNA 分 子 中 目的 DNA 的 回收 十 分 重要 。 由 于 黏 末 端 具有 180` 旋 转 对 称 性 , 故 经 酶 切 的 DNA 分 子 , 也 可 自身 重新 环 化 。 黏 性 未 端 又 有 5 - 黏 末 端 与 3 - 黏 末 端 之 分 : 1) $ - 黏 性 末端 :该 类 酶 在 其 识别 序列 的 对 称 轴 两 侧 , 从 5 -P 末端 切 割 dsDNA 的 两 条 链 ,产生 S’-P 单 链 延 伸 的 黏 性 末端 。 如 EcoR 工 酶 切 后 形成 的 黏 末 端 : y 5’--G AATT C3 ”EeeRI 2G 3 4.5. AAT Tee 3°-C TTAA C5’ CTTAA 5’ 3°Ge A 2) 3 - 黏 性 末端 :该 类 酶 在 其 识别 序列 的 对 称 轴 两 侧 , 从 3 -OH 末端 切割 dsDNA 的 两 条 链 ,产生 具有 3 -OH 单 链 延 伸 的 黏 性 末端 。 如 Psz 工 酶 切 后 形成 的 黏 末 端 : BUS “基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 -47- ， 5{ # CTGCAGs*3* Pst I +- CRGCA 3° 党 和/ et Br eGl ACETIC? 75’ GD" 3° ACGTC 云 个 (=) 有 特殊 性 质 或 相互 间 有 一 定 关系 的 开 型 限制 酶 1. 异 源 同 工 酶 (isoschizomers) ”也 称 为 同 裂 酶 , 指 来 源 不 同 识别 序 列 相 同 的 酶 。 该 类 酶 切割 DNA 的 位 点 或 方式 可 相同 , 亦 可 不 同 。 如 Sma 工 与 Xma 工 , 这 两 种 酶 识别 序列 相 同 ,但 酶 切 位 点 不 同 : y Smal CCC GGG Xa T GCM CCGSE 个 又 如 ,Hpae 工 与 Msp 工 ,它们 的 识别 与 切割 序列 均 相 同 (Cy CGG) ,但 Msp 工 还 可 以 识 别 切 割 已 甲 基 化 的 序列 ,如 GG y mCC。 2. 同 尾 酶 (isocaudarner) ”识别 序列 与 切割 位 点 相互 有 关 的 一 类 酶 。 它 们 来 源 各 蜡 ， 识别 序列 也 各 不 相同 ,但 都 可 以 产生 出 相同 的 黏 性 末端 。 如 : y Hpall CC GG Smal CCC GGG A Sza 工 所 识别 的 6 SBRARRPA SP, ASA Hoa LSI 4 SREB, BL, 瓦工 能 识别 并 切割 Sma 工 的 核 苷 酸 序列 ,但 反之 则 不 行 。 又 如 : : Mbo | GATC Bel |). T °GATCA BamHI G GATCC Bgl ih AN WGATCT ‘ A 上 述 四 个 酶 的 识别 序列 中 都 有 GATC, 酶 切 后 均 产 生 相 同 的 黏 性 末端 一 -GATC。 但 {LA Mbo 工 能 识别 并 切割 其 他 三 个 酶 的 识别 序列 ,而 其 他 三 个 酶 之 间 却 不 能 互相 识别 其 核 苷 酸 序列 。 同 尾 酶 产生 的 DNA 片段 ,由 于 具有 相同 的 黏 性 未 端 ,因而 ,能 够 通过 黏 性 末端 之 间 的 碱 基 互 补 而 彼此 连接 ,形成 的 位 点 称 之 为 “杂种 位 点 "(hybrid site) 。 但 此 类 杂种 位 点 不 能 够 再 被 原来 的 任何 一 种 同 尾 酶 识别 切割 。 异 源 同 工 酶 与 同 尾 酶 在 基因 工程 中 有 一 定 的 作用 。 由 于 消化 条 件 和 来 源 的 限制 ,不 能 用 一 种 酶 消化 某 类 底 物 时 , 则 可 用 以 上 两 种 酶 代替 。 3. iC EE BS 38 fF AH (distant cleavage) ”此 类 酶 在 DNA 链 上 的 识别 序列 与 切割 位 点 是 不 geal 核 苷 酸 区 域 与 识别 序列 结合 ,然后 滑行 到 识别 序列 以 外 的 另 一 个 位 点 进 行 切 割 ,这 一 点 与 工 型 酶 相似 ,但 不 同 的 是 其 切 点 与 识别 位 点 的 距离 是 一 定 的 ,而 且 不 像 -48- BALES 型 酶 那么 遥远 ,一 般 为 10 SPR SEA A. UM: Mbo I| GAAGANNNNNNNN (N 代表 任何 一 种 碱 基 ) , 切 点 与 识别 位 点 相隔 8 个 碱 基 ; Hga | GACGCNNNNN y , 切 点 与 识别 位 点 相隔 5 个 碱 基 。 此 类 酶 在 基因 工程 中 具有 一 定 的 应 用 价值 。 4. 可 变 酶 ”此 类 酶 是 匡 型 酶 中 的 特例 ,其 识别 序列 中 的 一 个 或 几 个 核 苷 酸 是 可 变 的 ， 该 识别 序列 往往 超过 6 个 核 苷 酸 。 如 : BstpIT:GGTNACC ,识别 7 个 核 苷 酸 序列 ,其 中 1 个 碱 基 可 变 。 Bgl I :GCC(N),NGGC, iS 11 个 核 苷 酸 序列 ,其 中 5 个 碱 基 可 变 。 、 影 响 工 型 限制 酶 作用 的 因素 除 DNA 本 身 的 因素 外 ,反应 混合 液 中 的 离子 强度 .酸碱度 .试剂 (甘油 `.DMSO) 及 酶 浓 度 等 因素 ,对 酶 的 专 一 性 和 反应 速度 均 有 影响 。 (—) DNA 对 酶 切 反应 的 影响 1. DNA 的 纯度 ”限制 性 核酸 内 切 酶 消化 DNA 的 反应 效率 ,在 很 大 程度 上 取决 于 所 使 用 DNA 本 身 的 纯度 。 若 DNA 纯化 过 程 中 污染 了 某 些 制剂 ON A. CTE 以 及 高 浓 度 的 盐 离子 等 ,都 有 可 能 抑制 核酸 内 切 酶 的 活性 。 应 用 碱 变性 法 小 量 碱 法 抽 提 的 DNA, 7 常 含 有 这 类 杂质 ,一 如 采 用 包 下 己 和 方 汉 " 对 抱 寺 六 下 内 雪 除 对 佐 环 大于 各 和 和 和 (1) 增加 核酸 内 切 酶 的 用 量 ,平均 每 微克 底 物 DNA 可 加 入 S~ 10 单位 酶 。 (2) 扩大 酶 切 反应 的 体积 ,使 潜在 的 抑制 因素 被 相应 的 稀释 。 (3) 延长 酶 切 反 应 的 时 间 ,可 延长 为 3 一 4h。 2. DNA 的 甲 基 化 程度 ”识别 序列 中 特定 核 苷 酸 的 甲 基 化 修饰 ,会 强烈 地 影响 限制 性 核酸 内 切 酶 的 活性 ,导致 局 部 消化 ,甚至 完全 不 被 消化 。 在 基因 克隆 中 ,使 用 失去 了 甲 基 化 酶 的 大 肠 杆 菌 菌 株 制备 质粒 DNA, 可 避免 产生 此 类 问题 。 (=) 反应 缓冲 液 对 酶 切 效率 的 影响 1. 离子 强度 pH 的 影响 ”限制 性 内 切 酶 在 非 标准 反应 条 件 下 ,能 够 切割 一 些 与 其 特异 识别 序列 类 似 的 序列 ,这 种 现象 称 " 星 号 活性 ”(star activity)。 星 号 活性 一 般 在 相应 限制 酶 的 名 称 右 上 角 加 一 个 星 号 (* ) 表 示 。 例 如 , 当 缓 冲 液 中 的 离子 强度 保持 低 水 平时 ,如 MgCl, 浓度 由 Smmol/L 降 至 2mmol/L(pH8.5) Ht, EcoR 工 对 底 物 专 一 性 识别 能 力 降 低 , 其 识别 序 列 可 从 正常 的 6 核 苷 酸 (GAATTC) 减 到 4 核 苷 酸 (NAATTN) ,识别 的 特异 性 发 生 * 松 动 ”， 可 从 其 "正确 ”识别 序列 以 外 的 其 他 位 点 切割 DNA 分 子 。EcoR 工 的 这 种 星 号 活性 ,以 EcoR “表示 5 有 几 种 二 价 金属 离子 能 使 限制 性 EcoR I BH EcoR 工 ,从 高 到 低 依次 为 :Mn 、 Mg? *) Zn? CH 缓冲 液 为 高 pH、 低 离子 强度 时 较 易 诱发 酶 的 星 号 活力 出 现 。 BOS “基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 49 2. 某 些 试剂 可 改变 酶 的 专 一 性 ”实验 证 明 ,NaCl 能 稳定 Bsv 工 对 其 识别 序列 GGCC 的 专 一 性 。 但 当 降低 NaCl 总 浓度 和 (或 ) 增 加 pH 时 ,也 能 促进 EcoR 工 的 活性 。 另外 ,当下 水 试剂 如 甘油 含量 过 高 (> 10% ,VXV) 或 二 甲 基 亚 硕 等 存在 时 ,使 Baxz HI 的 识别 与 切割 专 一 性 发 生 改 变 , 导 致 不 能 识别 自己 的 正确 序列 。 (=) 酶 对 消化 效率 的 影响 内 切 酶 的 量 对 酶 切 反 应 的 影响 较 大 。 一 般 是 Leg 底 物 (ADNA) ,在 S0 则 终 反 应 体系 中 ， 在 推荐 的 反应 缓冲 液 和 温度 下 反应 1h, 达 到 完全 酶 解 所 用 的 酶 量 为 1U。 若 酶 解 lvg JD, 按 此 标准 ,1U 的 内 切 酶 可 达到 完全 消化 。 酶 解 lpg 以 上 的 DNA, 可 按 此 标准 体系 的 比例 进 行 放 大 。 但 在 实际 应 用 中 ,一 般 要 用 稍 过 量 的 酶 (lwg 加 2 一 5 单位 酶 ) 反 应 较 长 的 时 间 , 才 能 够 达到 完全 酶 解 。 但 是 ,不 能 过 分 加 大 酶 的 用 量 。 酶 量 过 大 对 酶 切 反应 的 影响 包括 两 个 方面 :其 一 , 酶 过 量 ( 一 般 为 >100UAg DNA) & 影响 酶 识别 序列 的 正确 性 ,如 BaxzHI 的 正常 识别 序列 为 Gy GATCC, , 当 酶 过 量 时 ,其 识别 序列 变 为 NGATCN , 称 为 BamHI ;其 二 , 酶 制剂 含 甘油 成 分 , 酶 过 量 , 会 因为 甘油 量 大 而 影响 其 识别 的 专 一 性 ,诱发 星 号 活力 。 (四 ) 酶 切 反应 的 温度 消化 反应 的 温度 ,是 影响 限制 酶 活性 的 另 一 个 重要 因素 。 不 同 的 限制 性 核酸 内 切 酶 , 具 有 不 同 的 最 适 反 应 温度 。 大 多 数 限制 性 核酸 内 切 酶 的 标准 反应 温度 都 是 37C ,但 个 别 酶 要 AE 37°C 以 外 的 反应 温度 ( 表 4-2)。 酶 切 反应 的 温度 高 于 或 低 于 最 适 温度 ,都 会 影响 核酸 内 切 酶 的 活性 ,甚至 最 终 导 致 酶 完全 失 活 。 (五 ) 酶 解 时 间 酶 解 时 间 可 以 通过 加 大 酶 量 而 缩短 ,反之 , 酶 量 较 少时 可 以 通过 延长 酶 解 时 间 以 达到 完 全 酶 解 的 目的 。 不 同 的 DNA 底 物 在 一 定 酶 量 和 一 定时 间 内 ,其 酶 解 效 率 不同 , 可 以 根据 DNA 撒 物 上 酶 切 位 点 的 多 少 , 与 MADNA 存在 位 点 的 数目 进行 比较 后 ,再 决定 酶 量 和 酶 解 时 间 。 五 、 限 制 性 核酸 内 切 酶 在 基因 工程 中 的 应 用 DNA 分 子 的 完全 与 正确 酶 解 ,对 于 DNA 连接 .基因 克隆 分 子 筛选 和 鉴定 .DNA 序列 测 定 以 及 构建 基因 组 文库 意义 重大 。 1. 局 部 酶 切 消 化 作用 “用 于 DNA 物理 图 谱 的 绘制 。 理论 上 ,限制 性 核酸 酶 对 DNA 分 子 的 切割 反应 ,应 为 完全 酶 切 消 化 作用 (complete di- gestion) 。 但 实际 上 ,由 于 组 成 DNA 分 子 的 4 种 核 苷 酸 的 含量 不 是 等 量 的 ,其 排列 顺序 也 不 是 随机 的 ,因此 ,限制 性 核酸 酶 对 DNA 分 子 的 实际 消化 作用 要 低 于 完全 消化 的 频率 ,此 类 不 完全 的 限制 酶 消化 反应 , 称 之 为 局 部 酶 切 消 化 (partial digestion) 。 如 果 通 过 缩短 酶 切 反 应 的 时 间 ,或 降低 反应 的 温度 以 约束 酶 的 活性 ,就 可 以 达到 局 部 消化 的 目的 ,可 用 于 绘制 DNA ”50 . 基因 工程 学 的 物理 图 谱 。 2. 对 基因 组 DNA 的 切割 构建 基因 组 文库 ”基因 组 文库 (genomic library) 是 含有 某 种 生物 体 全 部 基因 的 随机 片段 的 重组 DNA 克隆 群体 。 构 建 基因 组 文库 时 ,由 于 提纯 的 原核 或 真 核 细 胞 染色 体 DNA 相对 分 子 质量 均 较 大 (在 100kb 以 上 ) ,需要 限制 性 内 切 酶 使 之 消化 为 一 定 大 小 的 片段 ,再 与 相应 载体 连接 ,构建 文库 ( 详 见 第 六 章 )。 3. 重组 子 的 筛选 鉴定 ”对 于 抗生素 平板 初步 筛选 具有 重组 子 的 菌落 ,小 量 培养 后 ,分 离 出 重组 质粒 DNA, 用 相应 的 内 切 酶 消化 重组 子 释放 出 插入 片段 ,然后 凝 胶 电泳 检测 插 人 片段 和 载体 的 大 小 。 对 于 可 能 存在 双向 插入 的 重组 子 , 还 可 以 用 内 切 酶 消化 鉴定 插 人 方向 ( 详 见 第 六 章 )。 此 外 ,利用 限制 酶 对 DNA 片段 的 完全 消化 作用 ,可 用 于 DNA 序列 测定 。 两 个 不 同 的 DNA 分 子 ,经 同一 个 限制 酶 切割 后 ,可 用 于 DNA 重组 克隆 及 亚 克 隆 ( 详 见 第 六 章 )。 第 二 节 “DNA 连接 酶 DNA 重组 技术 的 核心 步骤 是 DNA 片段 的 体外 连接 。DNA 连接 的 本 质 是 一 个 由 连接 酶 催化 的 生物 化 学 过 程 。 在 这 个 过 程 中 ,连接 酶 (ligase) 的 活性 对 连接 产物 的 形成 其 为 关 键 , 因 此 ,DNA 连接 酶 是 体外 重组 DNA 分 子 必 不 可 少 的 基本 工具 酶 之 一 。 限 制 性 核酸 内 切 a DNA 分 子 切 割 成 不 同 大 小 的 片段 ,而 连接 酶 将 不 同 来 源 的 DNA 片段 组 成 新 的 杂种 DNA 分 子 ,并 把 他 们 彼此 连接 并 封闭 起 来 。 一 、DNA 连接 酶 的 分 类 及 特性 (一 ) T4 DNA 连接 酶 T4 DNA 3£ #2 AB HAA (E. coli )T4 噬菌体 DNA30 编码 的 产物 ,最 早 是 从 T4 鸣 菌 体 感染 的 大 肠 杆菌 中 分 离 纯化 的 ,相对 分 子 质量 为 68 x 10” ,是 一 种 单 链 多 肽 酶 ,能 催化 两 个 DNA 片段 的 3 -OH 末端 与 S -P 末端 形成 磷酸 二 酯 键 , 需 要 ATP 作为 辅助 因子 并 由 ATP 提供 能 量 。T4 MRK DNA30 现 已 被 克隆 ,并 可 在 大 肠 杆菌 中 大 量 表 达 , 因 此 T4 DNA 连接 酶 比较 容易 制备 。T4 DNA 连接 酶 可 高 效 催化 dsDNA 片段 间 黏 末端 的 连接 ,并 可 催化 平 末端 DNA 片段 的 连接 ,因此 ,在 分 子 生 物 学 研究 和 基因 克隆 中 应 用 非常 广泛 。 (=) 大 肠 杆 菌 DNA ZEB MPA E.coli DNA 连接 酶 ,是 由 大 肠 杆菌 染色 体 基 因 组 中 Lig 基因 编码 的 ,相对 分 子 质量 为 75 10°. lig 基因 已 经 被 克隆 ,并 能 在 相应 大 肠 杆 菌 细胞 中 大 量 表达 。 此 连接 酶 不 能 催化 平 末端 DNA 分 子 之 间 的 连接 ,其 底 物 只 能 是 带 缺 口 的 双 链 DNA 分 子 和 具有 同 源 互 补 黏 末端 的 不 同 DNA 分 子 ,并 以 NAD 作为 辅助 因子 。 第 四 章 “” 基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 51 . 二 、 连 接 酶 催化 DNA 连接 的 机 制 DNA 连接 酶 可 催化 两 相 邻 的 DNA 链 中 的 一 条 链 3 -OH 端 与 另 一 条 链 $ -P 末端 形成 磷酸 二 酯 键 ,这 个 过 程 是 一 种 耗 能 反应 。 大 肠 杆 菌 DNA 连接 酶 是 在 大 肠 杆菌 及 其 他 细菌 中 催化 DNA 分 子 的 连接 反应 ,利用 NAD-”( 烟 酰胺 腺 味 叭 二 核 苷 酸 ,nicotinamide adenine dinucleotide) 作 为 能 源 ;而 T4 DNA 连接 酶 则 在 动物 细胞 及 喉 菌 体 中 催化 DNA 分 子 的 连接 反应 ,利用 ATP( 腺 苷 三 磷酸 ,adenosine triphosphate) 作 能 源 。 二 者 除了 能 源 辅 助 因 子 不 同 之 外 ,其 他 的 作用 机 制 并 无 差别 。 下 面 以 T4 DNA 连接 酶 为 例 ,简单 讨论 连接 酶 催化 连接 的 分 子 机 制 。 T4 DNA 连接 酶 催化 DNA 连接 的 反应 分 为 三 步 ( 图 4-1) :ATP 与 T4 DNA 连接 酶 形成 复合 物 ,通过 ATP 中 的 磷酸 与 T4 DNA 连接 酶 中 的 亮 氢 酸 的 氨基 ,形成 磷酸 -氨基 键 而 连 接 , 即 形成 酶 -ATP 复合 物 (T4 DNA 连接 酶 - 亮 氨 酸 -N- 核 糖 - 腺 味 叭 ) ; 酶 -ATP 复合 物 活化 DNA 链 55 端 的 磷酸 基 团 ,形成 磷酸 -磷酸 键 ;DNA 链 3 端的 凑 基 活化 并 取代 ATP ,与 $" 端 磷 酸根 形成 磷酸 二 酯 键 , 并 释放 出 AMP ,完成 DNA 链 之 间 的 连接 。 O I 5’ Pp H_3'+0 — P —0S’——— OH 3’ | Or- sl NAD* 5k ATP DNA 连接 酶 AMP+NMN 或 PPi 5 PP 一 yb — p—_ 9 ——____ 0H 3” | fod NAD* NMN 5! 3’ ATP AMP+PPi Sy 3 7/ Se TH Be oh 5 A! 5" 图 4-1 T4 DNA 连 接 酶 催化 DNA 连接 的 分 子 机 制 三 、 影 响 连 接 效 率 的 因素 1986 年 ,V. King 和 W. Blakeskey 提出 ,以 连接 反应 产物 转化 感受 态 细胞 的 能 力 ,作为 判断 连接 效率 的 标准 。 连 接 反应 中 的 ATP 浓度 .连接 酶 浓度 .连接 反应 时 间 、 连 接 反 应 温 。 52 . 基因 工程 学 度 . 插 人 片段 与 载体 分 子 的 摩尔 比值 等 参数 , 均 可 影响 连接 反应 产物 的 转化 效率 。 1. 连接 反应 的 温度 ”是 影响 转化 效率 的 最 重要 参数 之 一 。 连 接 酶 连接 缺口 DNA 的 最 佳 反 应 温度 是 37°C ,但 在 此 温度 下 , 黏 性 末端 之 间 的 氢 键 结合 不 稳定 。 因 此 ,连接 黏 性 末端 的 最 佳 温度 ,应 该 保证 黏 性 未 端 退 火 及 连接 酶 活性 反应 速率 之 间 的 平衡 ,一 般 以 4 一 15ST 为 最 佳 。 黏 性 末端 中 G+ C 含量 多 时 ,其 连接 反应 温度 可 以 增高 。 2. 连接 酶 的 浓度 ”在 平 末端 DNA 的 连接 反应 中 ,最 适 的 反应 酶 量 大 约 为 1 一 2U; 而 对 于 黏 性 末端 ( 如 EcoRI) 间 的 连接 ,在 同样 条 件 下 , 酶 浓度 仅 为 0.1U , 便 能 达到 最 佳 转化 效 率 。 在 不 同 生 产 厂家 ,由 于 其 所 规定 的 连接 酶 的 活性 定义 单位 不 同 , 因 此 ,T4 DNA 连接 酶 活性 可 相差 几 十 倍 ,甚至 上 百倍 。 在 实际 应 用 中 ,应 参照 说 明 书 确定 使 用 酶 量 。 3. ATP 浓度 ”反应 浓度 变动 范围 一 般 应 保持 在 10pmol~ 1mmol 之 间 。 4. 连接 反应 时 间 “ 当 连接 反应 温度 为 12 一 307 之 间 时 ,连接 反应 时 间 约 为 1 一 16h。 若 连接 温度 更 低 ( 如 4°C ) ,连接 时 间 应 适当 延长 至 24 一 48h。 5. 插入 片段 与 载体 分 子 的 摩尔 比值 插入 片段 与 载体 分 子 以 2-3:1 的 比例 最 为 合 pigs PU. DNA 连接 酶 在 基因 工程 中 的 应 用 1. XP TR) UR AGAR ig DNA 分 子 的 连接 同 源 黏 末 端 包括 相同 一 种 内 切 酶 产生 的 黏 性 末端 和 不 同 的 内 切 酶 产生 的 互补 黏 性 未 端 ,后 者 连接 成 的 DNA 顺序 不 能 再 被 原 切 割 内 切 酶 识 别 切割 。 此 种 连接 反应 的 产物 中 ,存在 一 定数 量 的 载体 自身 环 化 分 子 ,使 转化 菌 中 出 现 较 高 的 假 阳 性 克隆 。 在 连接 前 将 线性 DNA 分 子 进 行 5 端 脱 磷酸 处 理 , 可 避免 假 阳性 克隆 的 出 现 。 2. 对 平 末 端 DNA 分 子 的 连接 大 肠 杆 菌 DNA 连接 酶 不 能 催化 平 未 端 DNA 片段 的 连 接 , 平 末端 DNA 分 子 之 间 的 连接 ,需要 T4 DNA 连接 酶 催化 。 此 种 连接 方式 , 既 可 以 恢复 原始 的 酶 切 位 点 ,又 可 以 创建 一 个 新 的 酶 切 位 点 ,使 某 些 重组 子 的 筛选 鉴定 大 大 简化 。 平 末 端 DNA 分 子 连 接 的 效率 较 黏 末端 低 ,加 入 适量 的 PEG 能 促进 平 末端 的 连接 。 BAT Ie He ae ie 反 转 录 酶 即 依赖 于 RNA 的 DNA 聚合 酶 ,是 Temin 等 于 1970 年 在 致癌 RNA 病毒 中 发 现 的 一 种 特殊 的 DNA 聚合 酶 ,该 酶 以 RNA 为 模板 ,根据 碱 基 配 对 原则 ,按照 RNA WOKE 酸 顺 序 ( 其 中 避 与 A 配 对 ) 合 成 DNA。 这 一 过 程 与 一 般 遗 传 信息 流转 录 的 方向 相反 , 故 称 为 反 转 录 , 催 化 此 过 程 的 DNA 聚合 酶 叫做 反 转 录 酶 (reverse transcriptase) ,也 称 之 为 逆转 录 酶 。 后 来 发 现 反 转录 酶 不 仅 普遍 存在 于 RNA 病毒 中 ,哺乳 动物 的 胚胎 细胞 和 正在 分 裂 的 淋巴 细胞 中 也 有 反 转 录 酶 。 目 前 ,已 经 从 多 种 RNA 肿瘤 病毒 中 分 离 到 这 种 酶 ,但 最 普遍 使 用 的 是 来 源 于 鸟 类 骨髓 母 细 胞 瘤 病 毒 (avian myeloblastosis virus，AMV ) 的 反 转 录 酶 及 来 源 于 莫 洛 尼 鼠 白血病 病毒 (Moloney murine leukemia virus，M-MLV) 的 反 转 录 酶 。 SUS “基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 - 53 - AMV 的 生化 特性 AMV 由 aa 和 8 两 条 多 肽 链 组 成 ,其 相对 分 子 质量 分 别 为 65x10” #95 X 10°. a HAA 反 转 录 酶 活性 和 RNaseH 活性 ,RNaseH 活性 是 一 种 核糖 核酸 外 切 酶 活性 ,能 以 5$ 一 3 或 3 一 5 方向 特异 地 降解 RNA-DNA 杂交 分 子 中 的 RNA 链 ,继而 作为 引物 或 被 反 转 录 成 小 片 段 的 DNA ,干扰 全 长 EDNA 的 合成 ,因而 在 反应 中 起 副作用 ,应 尽量 去 除 它 的 活性 。B 链 具 有 以 RNA-DNA 杂交 分 子 为 底 物 的 $ 一 3 "脱氧 核酸 外 切 酶 活性 。 反 转 录 酶 是 一 个 具有 多 功能 的 酶 ,此 外 , 尚 有 DNA 依赖 的 DNA 聚合 酶 活性 DNA 解放 酶 活性 。 二 、 反 转录 酶 催化 DNA 合成 的 分 子 机 制 反 转 录 酶 具有 5 一 3 方向 的 聚合 活性 。 该 酶 能 利用 具有 3 端 poly(A) 的 mRNA AK 板 ,在 引物 oligo(dT), (FEF Abi Al AG Hie ER) A SIS ,合成 与 mRNA 互补 的 DNA 链 (Bf cDNA,complementary DNA), ,此 cDNA 称 为 第 一 链 cDNA。 该 反应 的 产物 是 一 种 RNA- DNA 杂 交 分 子 ,通过 碱 处 理 去 处 mRNA 模板 ,再 以 第 一 链 CDNA 为 模板 ,在 特异 性 引物 指 引 下 ,由 大 肠 杆 菌 聚 合 酶 工 (或 Tag DNA 聚合 酶 ) 催 化 合成 第 二 链 cDNA( 图 4-2)。 由 于 单 链 cDNA 3“ 末 端 易 于 自身 环 化 ,形成 发 夹 结构 ,因此 需 用 S1 核酸 酶 降解 发 夹 结构 。 此 种 体 外 以 RNA 为 模板 合成 DNA 大 量 进 行 扩 并 的 方法 又 叫做 反 转 录 PCR (RT-PCR, reverse transcript polymerase chain reaction ) 。 Pe aie: SEG pee Ae 3+ f 5' Wy | KH 5 LoL bP abt Le PELL ee a 5’ cDNA | S1 核酸 酶 5。 -LTEURILEOEREEEED ae 5! cDNA | RNase H 9 Tee ee eG DNA | DNA 聚合 酶 yf ELE RET TEE CEP CE Le) ier 3! 5' DNA 图 4-2 RSPR AB HELL DNA 合成 的 分 子 机 制 -54- 基因 工程 学 三 、 反 转录 酶 在 基因 工程 中 的 应 用 真 核 生物 基因 组 DNA 十 分 庞大 , 且 含 有 大 量 的 重复 序列 。 无 论 是 采用 电泳 分 离 技术 还 是 通过 杂交 的 方法 , 均 不 能 直接 分 离 到 目的 基因 片段 。 反 转录 酶 的 发 现 和 应 用 ,使 通过 mRNA 得 到 DNA 进行 克隆 成 为 现实 。 1. 构建 cDNA 基因 文库 在 基因 工程 中 , 反 转 录 酶 的 主要 用 途 是 转录 mRNA 为 cDNA, 制 备 基 因 片 段 , 从 而 构建 CDNA 基因 文库 ( 详 见 第 六 章 )。 2. Li ssDNA RNA 为 模板 制备 核酸 探 针 以 poly(A)mRNA 为 模板 ,在 引物 oligo (dT), 的 引导 下 , 当 存 在 四 种 dNTP 时 , 反 转 录 酶 可 催化 cDNA 的 合成 , 若 在 dNTP 中 加 入 ao”P 标记 的 dNTP(a-*P-dNTP) At , 则 新 合成 的 EDNA 就 成 为 放射 性 核 素 标记 的 DNA 链 ， 通过 纯化 ,就 可 以 获得 单 链 ”P 标记 的 cDNA 探 针 。 反 转录 酶 的 引物 也 可 以 是 特异 的 赛 核 苷 酸 引 物 ,还 可 以 采用 随机 朝 核 苷 酸 作为 引物 ( 详 见 第 十 章 )。 Ss)qi DNA 聚合 酶 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 大肠 杆菌 DNA 聚合 酶 工 的 KKlenow KF Ef (Klenow 酶 )、T4 DNA 聚合 酶 \T7 DNA 聚合 酶 \ 反 转录 酶 及 Taq DNA 聚合 酶 等 ( 表 4-3) 均 是 基因 工程 中 常 用 的 DNA 聚合 酶 ,其 共同 特点 是 ,能 够 把 脱氧 核糖 核 苷 酸 连续 地 加 到 dsDNA 分 子 引 物 链 的 3 -OH 端 ,催化 DNA 分 子 聚 合 ,而 引物 不 从 DNA 模板 上 解 离 。 表 4-3 DNA 聚合 酶 特性 聚合 酶 名 称 来 源 3 一 5 外 切 活性 ”5 一 3 外 切 活 性 ”聚合 反应 速率 持续 合成 能 力 E.coli DNA 聚合 酶 大 肠 杆菌 低 有 中 低 Klenow 大 片段 酶 大 肠 杆菌 低 无 中 低 T4 DNA RAB T4 Wit BB 1K 高 无 中 低 T7 DNA RAB T7 Wie BR 高 无 快 高 反 转 录 酶 肿瘤 病毒 无 无 低 中 Taq DNA 聚合 酶 fA AK AE 无 有 快 高 一 、 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 工 及 应 用 大 肠 杆 菌 DNA #4 if (E.coli DNA polymerase) 有 三 种 不 同 的 类 型 , 即 DNA A A I DNA 聚合 酶 IDNA 聚合 酶 焉 ,分 别 简称 为 polI pol ll M polll. poll M pol I HEB 功能 是 参与 DNA MERWE, poll lh] DNA 的 复制 有 关 。 在 基因 工程 中 ,pol 工 与 分 子 克 隆 的 关系 最 为 密切 。 ————— SOS BALELTRBRANA - 55 - (—) DNA 聚合 酶 工 的 特性 DNA 聚合 酶 工 是 1957 年 由 Arthur Kornberg 首先 发 现 的 DNA 聚合 酶 ,又 称 Kornberg 酶 。 此 酶 研究 的 最 清楚 而 且 代 表 了 其 他 DNA 聚合 酶 的 基本 特点 。 1. DNA 聚合 酶 工 的 生物 学 特性 ”由 大 肠 杆菌 pIA 基因 编码 ,是 一 种 单 链 多 肽 蛋白 质 , 相 对 分 子 质量 为 109 x 10" 。 此 酶 是 一 个 多 功能 酶 ,具有 S 一 3 的 聚合 酶 活性 、$ 一 3“ 核 酸 外 切 酶 活性 及 3 一 $ 核酸 外 切 酶 活性 。 酶 的 活性 发 挥 需要 Zn ,在 BTC AEE ,每 个 酶 分 子 每 分 钟 能 催化 667 TK RB ATE EXE DNA 链 中 。 2. DNA 聚合 酶 工 的 聚合 反应 特点 (1) DNA 聚合 酶 工 必 须 在 具有 全 部 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 dNTPs(dATP .dGTP 、dCTP、 dTTP) 和 Mg 存在 时 ,才能 催化 合成 DNA 的 互补 链 。 (2) 催化 DNA EN A RAE $ 一 3 方向 生长 的 , 即 在 生长 链 的 3-OH 末端 挫 和 人 新 的 核 FR XR BOK S| WHE A 3 -OH。 (3) 模板 可 以 是 dsSDNA, 也 可 以 是 ssDNA. 3. DNA 聚合 酶 工 的 $ ~ 一 3“ 核酸 外 切 酶 活性 一 一 切除 修复 作用 5 一 3 外 切 酶 活性 就 是 从 $ 一 3 人 方 向 水 解 DNA 生长 链 前 方 的 DNA 链 , 即 从 游离 的 $-P 末端 水 解 DNA 分 子 , 释 放 的 产物 主要 是 S -磷酸 核 苷 ,也 可 以 有 少量 较 大 的 核 苷 酸 片段 。 这 种 酶 活性 只 对 DNA 上 配对 部 分 ( 双 链 ) 的 磷酸 二 酯 键 有 切割 作用 ,每 次 能 切除 10 个 核 苷 酸 ,在 DNA 损伤 的 修复 中 可 能 起 着 重要 作用 。 4. DNA 聚合 酶 工 的 3 一 5 核酸 外 切 酶 活性 一 一 校对 作用 从 DNA 链 的 3 -OH 末端 开始 向 $ 的 方向 水 解 DNA 分 子 ,主要 功能 是 识别 和 切除 不 配对 的 DNA 生长 链 末 端的 核 苷 酸 , 对 维持 DNA 复制 的 真实 性 十 分 重要 。 当 反应 体系 中 没有 反应 底 物 dNTP 时 ,由 于 没有 聚合 作用 而 出 现 暂时 的 游离 现象 ,从 而 被 3 一 $ 外 切 酶 活性 所 降解 。 若 加 入 的 核 苷 酸 与 模 板 不 互补 而 游离 时 则 被 3 一 $ 外 切 酶 切除 ,以 便 重 新 在 这 个 位 置 上 聚合 对 应 的 核 苷 酸 。 只 有 在 加 入 与 模板 互补 的 核 背 酸 时 , 才 会 使 外 切 酶 活性 受到 抑制 ,并 继续 进行 DNA 的 合成 。 因此 ,3 一 5$ 外 切 酶 活性 的 主要 功能 是 校对 作用 。 (二 ) DNA 聚合 酶 工 在 基因 工程 中 的 应 用 DNA pol 工 的 DNA 聚合 酶 活性 和 5 一 3 外 切 酶 活性 协同 作用 ,可 以 使 DNA 链 上 的 切 日 向 前 推进 , 即 没有 新 的 DNA 合成 ,只 有 核 苷 酸 的 交换 。 这 种 反应 叫 缺 口 平 移 (nick trans- lation)。 当 双 链 DNA 上 某 个 磷酸 二 酯 键 断 裂 产生 切口 时 ,DNA pol 工 能 从 切口 开始 合成 新 的 DNA 链 ,同时 切除 原来 的 旧 链 。 这 样 , 从 切口 开始 合成 了 一 条 与 被 取代 的 旧 链 完全 相同 的 新 链 。 如 果 新 挫 和 的 脱氧 核 苷 三 磷酸 为 2P-dNTP, 则 重新 合成 的 新 链 即 为 带 有 放射 性 核 素 标记 的 DNA 分 子 ,可 以 制备 探 针 进行 分 子 杂 交 实 验 ( 详 见 第 十 章 )。 =. Kitt fw DNA 聚合 酶 1 AY Klenow 大 片段 酶 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 [全 酶 ,经 舒 替 兰 酶 (枯草 杆菌 蛋白 酶 ) 分 解 后 ,形成 两 个 片段 ， -56- BALES — Hr Ba FH 36x 10 ,具有 5 一 3 方向 的 核酸 外 切 酶 活性 ; 另 一 个 是 相对 分 子 质量 为 76x 103 的 大 片段 ,具有 5 一 ~3“ 聚 合 酶 与 3 一 5 方向 的 核酸 外 切 酶 活性 。 此 大 片段 叫 做 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 工 的 Klenow Fr £&( E.coli DNA pol] Klenow fragment) ,又 称 之 为 Klenow 聚合 酶 或 Klenow 大 片段 酶 。 在 基因 工程 中 ,Klenow 大 片段 酶 的 主要 用 途 有 : (1) 修补 经 限制 性 内 切 酶 消化 DNA 所 形成 的 3 隐蔽 末端 ; (2) 标记 DNA 片段 的 末端 ; (3) cDNA 克隆 中 第 二 链 cDNA 的 合成 ; (4) DNA 序列 测定 ; (5) 随机 引物 末端 标记 法 标记 DNA 的 3 末端 ,以 制备 基因 探 针 ( 详 见 第 十 章 )。 =. WA DNA ZB it DNA 多 聚 酶 又 叫 Tag DNA 聚合 酶 (Ta DNA polymerase) ,最 初 由 百 A Erlich 于 1969 年 从 栖 生 水 热 菌 (Thermzzxs aquaticus)YT-1 菌株 中 分 离 纯 化 出 。 此 菌 生活 在 70 一 75ST 的 环境 中 ,在 嗜 热 脂 肪 芽孢 杆菌 及 其 他 哮 热 菌 中 也 得 到 类 似 的 耐 热 DNA 聚合 酶 。 Taq DNA 聚合 酶 基因 全 长 2496 个 碱 基 ,编码 832 个 氨基 酸 ,相对 分 子 质量 为 94 又 10”。 该 酶 最 为 突出 的 特点 是 具有 良好 的 热 稳定 性 。9ST 保温 2 小 时 , 酶 的 活性 仍 保持 良好 。 该 酶 在 70~7SYC 时 具有 最 高 的 生物 学 活性 ,能 以 从 高 温 变性 的 靶 DNA 分 子 中 分 离 出 的 ssSDNA 为 模板 ,从 分 别 结合 在 扩 增 区 段 两 端的 引物 为 起 点 , 按 $ 一 3 方向 合成 互补 DNA 的 新 生 链 。75 一 80 条 件 下 ,每 一 个 酶 分 子 每 秒 可 延伸 约 150 个 核 苷 酸 ,温度 降低 时 , Tag DNA 聚合 酶 催化 新 生 链 延伸 的 速度 明显 下 降 。 该 酶 是 PCR 反应 中 重要 的 酶 ,PCR 过 程 中 ， 解 链 温度 多 采用 94 .30 BEA A 30~35 次 ,Tad 酶 完全 能 保证 PCR 反应 的 正常 进行 而 自身 不 会 因 高温 而 失 活 ( 详 见 第 九 章 )。Tac DNA 聚合 酶 的 发 现 , 使 PCR 技术 得 到 迅速 发 展 和 广泛 应 用 。 Taq DNA 聚合 酶 除 具 有 5 一 3 RAMEE, MAA 5 3 外 切 酶 活性 ,但 缺乏 3 一 5 外 切 酶 活性 。 因 而 ,在 PCR 反应 中 如 果 发 生 单 核 苷 酸 的 错 配 ,不 能 够 及 时 校正 ,一 般 情 况 下 出 现 碱 基 错 配 的 几率 为 2.1x10-4。Tag DNA 聚合 酶 活性 发 挥 对 Mg2+ 浓度 非常 敏感 。 Mg? * Ye JE ea AY , 酶 活性 易 受 到 抑制 ,一 般 在 不 同 的 反应 体系 中 应 适当 进行 调整 。 四 、 反 转录 酶 为 基因 工程 中 最 重要 的 核酸 酶 之 一 ( 详 见 本 章 第 三 节 )。 五 、T4 DNA RABR T7 DNAR AH T4 DNA 聚合 酶 (T4 DNA pol) SE T4 Wi Ba ARBRE AK i FFE RRA AG, HH PASE 43 编码 ,为 单 链 多 肽 酶 ,具有 S$ 一 3 聚合 酶 与 3 一 5 方向 的 核酸 外 切 酶 活 第 四 章 “基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 57 - 性 。 在 催化 DNA 合成 时 ,可 以 单 链 DNA 作 模 板 ,也 可 以 有 缺口 的 双 链 DNA 作 模 板 , 但 后 者 需要 有 基因 32 蛋白 的 辅助 。 利 用 单 链 DNA 为 模板 进行 扩 增 ,可 同时 利用 它 作为 引物 ， 即 此 单 链 DNA 的 3 端 能 环绕 其 本 身 的 某 一 顺序 形成 氢 键 配对 ,3 端的 未 杂交 部 分 即 被 T4 DNA 聚合 酶 的 3’ 外 切 酶 活性 切 去 ,然后 在 其 作用 下 从 3 -OH 端 开 始 聚 合 , 合 成 该 模板 DNA 的 互补 链 , 再 以 互补 链 为 模板 合成 原来 的 单 链 DNA。 此 酶 的 功能 是 可 用 以 催化 标记 DNA 平 未 端 或 隐蔽 的 3 末端 。 T7 DNA 聚合 酶 是 从 T7 叭 菌 体 感染 的 大 肠 杆菌 宿主 细胞 中 纯化 出 的 一 种 核酸 酶 。 具 A DNA 聚合 酶 活性 及 3 5 方向 的 核酸 外 切 酶 活性 。 六 、 真 核 生 物 的 DNA 聚合 酶 真 核 生物 中 也 具有 DNA 聚合 酶 ,但 这 些 聚 合 酶 多 数 都 没有 3 一 5 或 5 一 3 外 切 酶 活 性 。 其 聚合 反应 机 制 与 原核 生物 的 聚合 一 样 。 主 要 有 :DDNA 聚合 酶 , 占 酶 总 量 的 80% ~90% ,相对 分 子 质 量 为 300x103 ,含有 4 个 或 5 个 亚 基 , 主 要 负责 染色 体 DNA 的 复 fil, QDNARA AS B.A FIRB 45x10 , 仅 含 有 一 条 链 ,主要 作用 是 修复 核 内 DNA. @DNA 聚合 酶 Y, 相 对 分 子 质量 为 140 x 103 ,存在 于 线粒体 内 ,负责 催化 线粒体 DNA 的 复 制 。 最 近 从 免 的 骨 亿 细 胞 质 中 分 离 到 一 种 新 的 DNA 聚合 酶 ,这 种 酶 与 上 述 真 核 生物 的 DNA 聚合 酶 不 同 ,而 与 原核 生物 的 聚合 酶 类 似 , 具 有 3 一 5 核酸 外 切 酶 活性 , 称 为 DNA 到 合 酶 $。 另 外 ,从 酵母 原虫 等 低 等 真 核 生 物 中 分 离 到 一 些 DNA 聚合 酶 。 一 般 来 说 ,这 些 低 等 生物 都 没有 相对 分 子 质量 低 的 DNA RAR B, 而 且 与 原核 生物 的 DNA 聚合 酶 相似 ,有 3 一 $ 外 切 酶 活性 。 第 五 节 ” 碱 性 磁 酸 酶 有 两 种 不 同 来 源 的 碱 性 磷酸 酶 ,一 种 是 从 大 肠 杆 菌 中 分 离 纯化 出 的 ,叫做 细菌 碱 性 磷酸 酶 (bacterial alkaline phosphatase, BAP) ; 另 一 种 是 从 小 牛 肠 中 分 离 纯化 出 的 ,叫做 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酶 (calf intestinal alkaline phosphatase,CAP)。 其 共同 特性 是 ,特异 性 切 去 DNA 或 RNA 分 子 的 $ -P, 从 而 使 DNA 或 RNA 分 子 的 $-P 未 端 转 换 为 $ -OH 末端, 即 所 谓 的 核酸 分 子 脱 磷酸 作用 。 碱 性 磷酸 酶 的 底 物 可 以 是 ssDNA 或 dsDNA 或 RNA, 也 可 以 是 核糖 或 脱 氧 核糖 核 苷 二 磷酸 。 BAP 5 P-DNA SOH-DNA+Pi BAP 5’P-RNA 5’OH-RNA + Pi CAP 和 BAP 在 理化 特性 上 稍 有 不 同 ,CAP 的 活性 比 BAP & 10~20 4%, A CAP 对 热 较 ~ 不 稳定 ,在 SDS 中 加 热 到 68°C 即 可 完全 失 活 ,而 BAP 具有 热 抗 性 ,终止 它 的 作用 较为 困难 ， 需要 酚 / 氯 仿 反复 抽 提 多 次 ,因而 BAP 不 如 CAP 应 用 广泛 。 碱 性 磷酸 酶 在 基因 工程 中 的 应 用 主要 有 : 1. 制备 $ 末端 标记 的 核酸 探 针 ， 碱 性 磷酸 酶 脱 磷酸 作用 的 产物 是 具有 5 -OH 末端 的 -58- 基因 工程 学 核酸 分 子 , 有 底 物 [7y-2P]ATP 存在 的 条 件 下 ,在 T4 多 核 苷 酸 激酶 催化 下 ,将 ATP 分 子 上 的 7-2P 基 团 转移 到 DNA 或 RNA 分 子 的 $ -OH 上 ,就 可 以 获得 5 末端 标记 的 核酸 探 针 ( 详 见 第 十 章 )s 2. 防止 DNA 重组 中 载体 的 自身 环 化 ”在 体外 DNA 的 重组 中 ,为 防止 线性 化 的 载体 分 子 自我 环 化 或 自身 连接 ,在 连接 反应 之 前 ,用 碱 性 磷酸 酶 处 理 载体 分 子 , 除 去 5$-P 基 团 , 加 入 目的 DNA 进行 重组 ,再 对 此 反应 混合 物 进 行 热处理 , 则 没有 与 目的 DNA 重组 的 载体 分 子 解 链 ,恢复 为 线性 构 型 ,这 样 就 不 能 够 形成 转化 子 克 隆 ,而 只 有 载体 分 子 与 目的 DNA 形 成 的 重组 体 才 可 以 在 受 体 细胞 内 形成 阳性 克隆 ,从 而 很 容易 筛选 出 来 。 SIN TT 单 链 核酸 内 切 酶 一 一 S1 核酸 酶 Sl 核酸 酶 是 一 种 从 稻谷 曲霉 (Aspergillus oryzae ) 中 分 离 纯化 出 的 高 度 单 链 特异 的 核 酸 内 切 酶 ,其 主要 的 功能 是 降解 sDNA 或 RNA, 形 成 具有 5 -P KWH HRHRMNABHR 片段 。 Sl 核酸 酶 活性 的 发 挥 需 要 Zn 作 辅 助 因 子 , 最 适 pH WH 4.0~4.5, 4% pH 上升 到 4.9 时 ,降解 速率 则 会 下 降 50% 。 对 NaCl 的 浓度 要 求 的 范围 可 以 变动 较 大 ,为 10 一 300 mmol/L, 但 最 佳 浓 度 为 100 mmol/L. EDTA. tH mR ERE RPK SDS 等 ,都 可 以 抑制 S1 核酸 酶 的 活性 。 Sl 核酸 酶 在 基因 工程 中 的 应 用 主要 包括 : 1. RNA 分 子 定位 “给 RNA 分 子 定位 是 Sl 核酸 酶 在 分 子 生 物 学 研究 中 的 一 个 最 主要 的 功能 。 一 个 RNA 分 子 是 由 其 DNA 模板 的 一 定 的 核 苷 酸 序列 编码 的 , 若 这 个 RNA 分 子 同 包 括 该 模板 的 DNA 分 子 ( 碱 基 组 成 多 于 该 模板 ) 杂 交 , 则 形成 具有 单 核 苷 酸 链 的 RNA- DNA 杂种 双 链 分 子 ,利用 S1 核酸 酶 去 除 单 链 尾巴 ,回收 双 链 分 子 , 碱 变性 后 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 或 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ,就 可 以 测 出 RNA-DNA 杂种 分 子 中 的 DNA 片段 的 大 小 ,从 而 对 RNA 分 子 进 行 定位 。 2. 测定 真 核 基 因 中 内 含 子 的 位 置 ”由 两 外 显 子 拼接 的 mRNA 与 模板 DNA( 由 两 个 外 显 子 和 外 显 子 之 间 的 内 含 子 组 成 ) 杂 交 , 形 成 三 种 RNA-DNA 杂种 分 子 : 一 种 是 组 成 的 RNA-DNA 杂种 分 子 在 两 外 显 子 之 间 形 成 一 个 单 链 DNA 环 ,利用 S1 核酸 酶 降解 掉 单 链 DNA 环 和 两 端的 单 链 DNA 尾巴 ,可 获得 两 外 显 子 全 长 的 DNA 分 子 ; 另 两 种 是 各 由 一 个 外 显 子 DNA 与 RNA 组 成 的 RNA-DNA 杂种 分 子 ,S1 核酸 酶 降解 掉 多 余 的 内 信子 和 两 端的 单 链 DNA 尾巴 ,可 获得 与 每 个 外 显 子 相 对 应 的 DNA 分 子 。 通 过 琼脂 糖 凝 胶 电泳 ,可 得 到 各 4 DNA 的 相应 谱 带 ,从 而 确定 内 含 子 的 位 置 。 此 外 ,S1l 核酸 酶 可 以 消化 限制 性 核酸 酶 产生 的 黏 末 端 , 形 成平 齐 末端 ,降解 CDNA 合成 过 程 中 形成 的 发 卡 环 结构 ,在 质粒 组 建 和 基因 重组 中 被 广泛 应 用 。 HTT | AS Mia A EP RRS BS AR ita Abt, A YF BR FG % WE (terminal deoxynucleotidyl transferase) ,简称 末端 转移 酶 (termi- Sse ”基因 工程 工具 酶 及 其 应 用 - 59- nal transferase) ,是 从 小 牛 胸腺 中 纯化 出 的 一 种 相对 分 子 质量 较 小 (34 x 10” ) 的 碱 性 蛋白 酶 。 一 、 末 端 转 移 酶 的 生物 学 功能 催化 5 脱氧 核 苷 三 磷酸 转移 到 另 一 个 DNA 分 子 的 3-OH 末端 , 即 进行 $ 一 3“ 方 向 聚 合作 用 。 与 DNA 聚合 酶 不 同 ,末端 转移 酶 不 需要 模板 的 存在 ,就 可 以 催化 DNA 分 子 聚合 。 未 端 转移 酶 的 模板 是 具有 3 -OH 末端 的 ssDNA 或 具有 延伸 3 -OH 末端 的 dsDNA. 二 、 末 端 转 移 酶 在 基因 工程 中 的 应 用 1. 给 DNA 片 段 3-OH 末 端 加 尾 末端 转移 酶 是 一 种 非特 异性 酶 , 当 反 应 混合 物 中 只 有 一 种 dNTP 时 ,形成 只 有 一 种 核 苷 酸 组 成 的 3 尾巴, 称 之 为 同 聚 物 尾 巴 (homopolymetric tail) 。 在 基因 工程 中 ,利用 末端 转移 酶 分 别 给 载体 分 子 和 外 源 DNA 片段 加 上 互补 的 同 聚 物 尾巴 MATA An, AFI DNA 重组 ( 详 见 第 六 章 ) 。 2. 催化 DNA 片段 的 3 -OH 末端 标记 ,用 于 DNA 序列 分 析 在 DNA RI PR 端 转 移 酶 催化 [a-32?P]-3“ 脱 氧 核 苷 酸 加 入 到 DNA 分 子 的 3 末端 ,使 该 DNA 不 再 具有 游离 的 3 -OH 末端 ,可 终止 单 核 苷 酸 的 挫 人 作用 ,通过 凝 胶 电泳 后 的 放射 自 显影 ,就 可 以 读 出 DNA 的 序列 。 3. 制备 3 末端 标记 的 DNA 探 针 “末端 转移 酶 可 催化 标记 的 dNTP BA Bl DNA 片段 的 3 -OH 末端 ,制备 3 末端 标记 的 探 针 ( 详 见 第 十 章 )。 表 4-4 总 结 了 几 种 重要 工具 酶 的 酶 学 性 质 及 其 应 用 RES. 表 4-4 几 种 重要 工具 酶 的 酶 学 性 质 及 其 应 用 酶 来 Wi 活性 kK 物 辅助 因子 特 点 基因 工程 中 的 主要 用 途 Bie sl (TL) 微生物 AY dsDNA Mg2+ 特异 性 识别 与 切割 ， @ 基 因 重 组 产生 平 齐 或 黏 末端 ”@ 组 建物 理 图 谱 图 制备 探 针 @DNA Wi FF 连接 酶 E.coli 连接 两 DNA 的 dsDNA Mg2+ ”对 黏 末 端的 连接 效率 @DNA 重 组 T4 Me BR HA 3’-OH4; 5’-P ATP 高 于 平 末端 @ 构 建新 质粒 5'>3' RE ssDNA DNA pol I E.coli 5 一 3 外 切 dsDNA Mg?* XtdsDNA 的 外 切 被 四 制备 探 针 3 一 5 外 切 dsDNA 5 一 3 聚合 活性 抑 ODNA Wl 制 反 转 录 酶 RNA 肿瘤 RNA->DNA 合 成 ssRNA Mg2+ RNAS Oil @ cDNA, H# 病毒 DNA-~RNA 合成 ssDNA DNA 指导 基因 文库 RNaseH RNA-DNA RNA-DNA 杂交 链 @ 制 备 探 针 解 旋 cccDNA 解 超 螺旋 - 60 - ag S1 核酸 酶 末端 转移 酶 Bal31 BAP CAP 基因 工程 学 来 ” 源 稻米 曲霉 小 牛 胸腺 乳白 短 杆菌 细菌 小 牛 肠 iG (tt 降解 单 链 核酸 在 3 末端 挫 人 核 苷 酸 外 切 DE 5 磷酸 jx DB ssRNA ssDNA ssDNA dsDNA ds/ssDNA 续 表 辅助 因子 特 点 基因 工程 中 的 主要 用 途 Zn? * ORNA 定位 QW < [el BaF 图 构建 新 质粒 Mg** Co?* 存在 时 ,可 用 @3 MRR dsDNA 为 模板 QALRA ht 加 构建 新 质粒 Ca?* 5 3 两 端 同时 等 速 测定 DNA 中 限制 外 切 酶 识别 位 点 Mg** OBE tk RR HB 自身 环 化 Ar (+) HR) 第 五 章 ” 基因 工程 的 克隆 载体 Chapter 5. Genetic Cloning Vector ei Mm OB 基因 工程 的 目的 和 基本 手段 ,是 选用 合适 的 载体 把 供 体 DNA( 外 源 基因 ) 运 载 到 相应 的 受 体 细 胞 内 ,从 而 复制 、. 扩 增 出 大 量 的 目的 DNA 分 子 或 者 转录 表达 为 相应 产物 ,所 有 这 些 都 必须 选择 合适 的 载体 。 :基因 工程 中 所 使 用 的 载体 可 分 为 :克隆 载体 (cloning vector)、 转 录 载 体 (transcription vector) 和 表达 载体 (expression vector) 。 克 隆 载体 是 指 可 以 携带 外 源 基 因 或 DNA 片段 进入 受 体 细 胞 并 使 外 源 DNA 大 量 扩 增 的 复制 单元 ,适用 于 复制 扩 增 外 源 DNA。 转 录 载 体 是 以 DNA 为 模板 .用 RNA 聚合 酶 开 合成 RNA 的 过 程 ,多 采用 体外 转录 体系 。 表 达 载 体 是 用 于 表达 原核 或 真 核 细胞 中 某 个 特定 基因 所 编码 的 蛋白 质 产物 的 载体 ,其 克隆 位 点 的 上 游 含有 强 启动 子 \ 下游 含有 转录 终止 序列 ,适用 于 表达 某 特定 蛋白 质 。 克 隆 .表达 的 基本 流程 是 : 克隆 载体 转录 载体 DNA _ DNA RNA 蛋白 质 xz KK QR 原核 与 真 核 细胞 的 基因 结构 及 其 表达 、 调 控 有 不 同 的 特点 。 原 核 细 胞 基因 组 的 主要 特 点 是 :中 染色 质 为 环 状 双 股 DNA 分 子 , 外 无 核 膜 与 胞 质 隔 开 , 使 转录 与 翻译 偶 联 .连续 进 行 ; 包 具有 操纵 子 结构 ,多 个 基因 共 受 同一 调节 基因 调控 ,这 能 使 插入 到 该 多 顺 反 子 区 域 的 外 源 DNA 同样 被 复制 ;@ 结 构 基 因 多 为 单 拷贝 ( 即 基因 不 重复 );@ 田 特定 区 域 分 布 着 特异 性 的 DNA 顺序 (元 件 ) :如 调节 基因 控制 单元 和 结构 基因 ,转录 的 起 动 区 .终止 区 等 。 这 些 特 异 的 DNA 元 件 能 精确 高 效 地 调控 着 DNA 的 复制 .RNA 的 转录 (图 5-1)。 原 核 细 胞 基因 组 的 这 些 特 点 足以 把 一 个 外 源 DNA 分 子 连接 插入 到 原核 细胞 DNA 复制 体系 的 特定 区 段 而 被 扩 增 ;同样 , 亦 能 把 DNA 复制 体系 中 的 某 结 构 元 件 进行 改造 ,引入 到 其 他 载体 系统 中 ， 构建 成 新 的 载体 。 基因 工程 中 的 克隆 载体 应 具有 如 下 特性 (图 S-2) :具有 复制 子 ,能 在 宿主 细胞 内 自主 地 复制 ,并 携带 重组 DNA 分 子 一 同 扩 增 ;@ 有 单一 限制 性 内 切 酶 的 酶 切 位 点 或 多 克隆 位 点 (multiple cloning site,MCS) ,MCS 是 人 工 合成 的 一 段 含有 多 个 不 同 的 单一 限制 性 内 切 酶 切 点 的 DNA 序列 , 它 有 利于 外 源 基 因 插 入 该 区 域 ;@ 有 选择 性 遗传 标记 ,如 抗 药 基 因 、 酶 基 因 营养 缺陷 体 及 喉 菌 斑 形 成 能 力 等 ,便于 筛选 出 阳性 重组 体 ;@ 田 拷贝 数 高 (10 一 200 个 /每 个 细胞 ) ,易于 分 离 ;@ 生 物 安全 性 好 。 es @i = 调节 基因 操纵 子 1 Zz y a PG) 基因 Po 基因 基因 基因 80 1045 80 35 3510 780 825 LAC (Bia B--) FL B---FLR Be FLBR EE BYES CRE BM S-1 原核 细胞 基因 组 的 结构 特征 一 一 Lac 操纵 子 结构 模型 图 5-2 ”克隆 载体 模式 图 目前 所 使 用 的 载体 , 按 其 特性 可 分 为 六 类 :中 质粒 (plasmid); 加 入 叭 菌 体 (bacteriophagea) ; @ Ri tt Jt AL (cosmid) ;@ M13 Me FA 1K ( phage M13) ; © H FF ( yeast) HA; @ 真 核 细 胞 病毒 载体 (eukaryotic virus vector ) 。 前 四 类 克隆 载体 用 于 原核 细胞 中 ;酵母 和 病 毒 载体 则 属于 真 核 细 胞 克隆 或 表达 载体 。 第 一 节 ”细菌 质粒 的 生物 学 特性 一 、 质 粒 的 定 文 质粒 是 存在 于 细菌 等 微生物 细胞 染色 质 以 外 的 共 价 闭环 的 双 股 DNA 分 子 , 具 有 独立 自主 复制 和 调控 的 能 力 ,可 赋予 宿主 细胞 一 定 的 生物 学 性 状 。 一 、 质 粒 的 生物 学 特性 1. 大 小 ”根据 质粒 的 大 小 ,分 为 2 型 :@O 小 型 质粒 : 约 1.5 一 15kb 长 ,易于 转化 , 因 不 带 可 传递 基因 (tra ) , 故 不 能 接合 传递 ;@ 大 型 质粒 : 约 60~120kb, HA tra 基因 ,能 接合 传 递 。 因 太 大 ,不易 转 化 。 2. 复制 类 型 ”根据 质粒 的 复制 型 式 ,分 2 类 :@ 严 紧 型 质粒 (strengent plasmid) :大 型 质 SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 - 63- 粒 多 属 之 , 它 拷贝 数 少 (1 一 2 个 /每 个 细胞 ), 具 自身 传递 能 力 。 其 DNA 复制 依赖 宿主 细胞 i) DNA 聚合 酶 亚 及 蛋白 质 合 成 体系 ( 即 酶 系统 两 者 相同 ) ,与 宿主 细胞 染色 体 DNA 的 复制 相 偶 联 且 呈 双 向 复制 , 故 复制 受 宿主 细胞 的 严格 控制 ;@ 松 弛 型 质粒 (relaxed plasmid) :多 半 为 小 型 质粒 ,拷贝 数 多 (10 一 200 个 /每 个 细胞 )。 其 DNA 复制 是 在 宿主 细胞 松弛 控制 下 进 行 的 ,只 需 DNA 聚合 酶 工 参与 ,与 染色 体 复 制 不 同步 ,适用 于 基因 工程 中 做 质粒 载体 。 用 氧 霉 素 可 扩 增 松弛 型 质粒 DNA, 因 和 毛 霉 素 可 与 细菌 的 S0S 核糖 体 亚 基 结 合 ,抑制 肽 基 转 移 酶 活性 ,从 而 抑制 DNA 聚合 酶 、 蛋 白质 的 合成 ,使 细菌 DNA 和 严 紧 型 质粒 DNA 的 复制 停止 。 松 弛 型 质粒 的 DNA 复制 可 依然 进行 ,拷贝 数 大 量 扩 增 (1000 一 3000 个 ) ,因此 用 氧 霉 素 可 大 量 扩 增 质粒 DNA。 3. 拷贝 数 ”拷贝 数 是 指 在 宿主 细胞 分 裂 前 质粒 DNA 自我 复制 的 份 数 。 小 型 质粒 拷贝 数 多 , 易 改 造 为 克隆 载体 ;大 型 质粒 拷贝 数 少 ,不 易 改 造 。 4. DNA 构 型 电镜 下 观察 DNA 有 3 种 构 型 :中 超 螺旋 型 (I 型 即 CCC 型 covalently closed circle DNA 或 SC 型 ,supercoiled circle) : 因 分 子 结构 为 共 价 闭环 的 双 股 DNA 分 子 , 呈 超 螺 旋 结 构 。@ 开 环 型 (T 型 即 OC 型 ,open circle): MAK DNA 有 一 股 断 开 ,形成 “缺口 ”。 图 线 型 ( 亚 型 即 LC 型 linear circle) :DNA 双 股 在 某 处 完全 断 开 。 5. 电泳 特点 “上述 3 种 构 型 的 DNA 分 子 ,在 琼脂 糖 凝 胶 中 有 不 同 的 泳 动 速度 ,其 泳 动 速度 主要 取决 于 凝 胶 的 浓度 ,也 受 电流 、 组 冲 液 .离子 强度 和 省 化 乙 锭 (EB) 的 浓度 影响 。 电 泳 迁移 率 的 大 小 一 般 是 :CCC 型 >LC 型 >OC 型 , 借 此 可 分 析 DNA 分 子 的 构 型 , 同 在 LC 型 条 件 下 可 测量 DNA 分 子 的 大 小 。 6. 不 相 容 性 ”利用 同一 复制 系统 的 不 同 质 粒 不 能 稳定 地 共存 同一 宿主 细胞 , 称 为 不 相 容 性 (incompatibility) ,如 pPBR322( 图 5-3, 5-4) pUC 系列 , 4 pMB1 复制 子 而 彼此 不 相 容 ,但 可 与 带 pSC101 质粒 的 细胞 相 容 。 带 有 不 可 互 换 成 分 的 复制 子 的 质粒 可 共存 同一 细胞 , 称 之 为 相 容 性 (compatibility) ,基因 操作 应 考虑 到 复制 子 等 因素 是 否 具 相 容 性 。 三 、 质 粒 的 分 类 1. 按 复 制 型 式 ”分 为 严 紧 型 和 松弛 型 复制 。 2. 按 基因 转移 性 分 两 类 :@ 传 递 性 质粒 : 常 为 大 型 ` 严 紧 型 质粒 ;@ 非 传递 性 质粒 :多 为 小 型 松弛 型 质粒 。 3. 按 遗 传 性 状 产物 分 类 ”中 抗 生 素 抗 性 :如 氨 葵 西林 、 氯 霉 素 抗 性 。@ 限 制 酶 -修饰 酶 (R-M) 系 统 : 如 hsdR 菌株 可 使 DNA 甲 基 化 ,但 不 限制 外 源 DNA, BA (r,-m,+) shsd~ 菌株 为 限制 和 甲 基 化 双 缺 陷 型 (r - m,,- ) 0 第 三 站 质粒 载体 一 、 概 一 一 偿 天 然 的 细菌 质粒 并 不 能 完全 满足 基因 工程 所 要 求 的 条 件 ,必须 经 过 改造 才能 成 为 理想 、 -64- 基因 工程 学 实用 的 载体 。 改 造 的 方法 是 基因 突变 修饰. 重 排 \ 重 组 等 。 改造 载体 的 目的 是 调整 载体 的 结构 .提高 转化 率 。 载 体 改 造 的 常用 手段 包括 :@ 减 小 相对 分 子 质量 。 一 般 载 体 越 小 ,转化 率 愈 高 。@ 在 载体 上 引入 "多 克隆 位 点 "(MCS,multiple cloning site) ， 便 于 外 源 DNA 片段 插入 该 区 。@ 在 质粒 中 引入 特定 用 途 的 辅助 序列 ,使 载体 功能 更 加 完善 和 专业 化 。 例 如 :引入 lacZ’ 基因 用 于 蓝 和 白斑 筛选 ;加 入 病毒 启动 子 和 其 他 元 件 在 真 核 细 胞 表达 ;加 入 真 核 和 原核 表达 元 件 ,可 做 成 穿梭 质粒 载体 或 者 真 核 细胞 的 克隆 表达 载体 。 4363/1 EcoR | 来 自 pPSE2124 vag pSC101 的 区 段 fi) DNA KBr bor 3147 KF pMBI 的 DNA KX FR 1763 Al 5-3 pBR322 质粒 载体 的 结构 来 源 图 4363/0 EcoR || Hina lll DNA Eag I (4363bp) Pyu Il 图 5-4 pBR322 物理 图 谱 — 站 — SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 - 65 - 二 、 和 常用 的 质粒 克隆 载体 1. pBR322 质粒 (1) pBR322 质粒 的 构建 :pBR322 来 源 于 三 个 天 然 质粒 pSC101 \ColE1 (47 pMB1 复制 子 ) 和 pbSFE2124( 表 5-1) ,经 过 融合 一 转 位 一 重 排 一 缺失 ,最 终 组 建成 质粒 pbPBR322( 图 $S-3、4)。 #5-1 三 个 天 然 质 粒 的 基本 特性 质粒 复制 型 相对 分 子 质量 /( x 105) 单一 酶 切 点 选择 标记 pSC101 严 紧 型 5.8 EcoRI Te: ColE1 松弛 型 4.2 EcoRI Coli™™ pSF2124 松弛 型 7.4 EcoRI、BamHI Ap’ (2) pBR322 的 物理 图 谱 与 识 读 (Bolivar et al. 1977): DNA 物理 图 谱 (physical map) , 是 指 在 DNA 分 子 上 标明 限制 性 内 切 酶 存在 的 位 点 数目 排列 顺序 及 特征 性 功能 标记 的 图 形 , OF PK BR il El i (restriction map). 物理 图 谱 的 表现 形式 分 为 三 类 :中 环形 ;@ 线 形 ( 含 DNA 一 级 序列 );@ 复 合 型 (环形 与 线形 相 结合 )。 pBR322 物理 图 谱 见 图 5-4, 识 读 该 图 可 获得 如 下 信息 :@DNA 大 小 (4363bp， 2.6X10'");@ 零 点 (环形 图 谱 的 起 止 点 );@o”~ (复制 起 始点 ,箭头 示 复 制 方向 );@ 图 选择 标记 (两 个 抗 性 标记 :Ap Tet5; 箭 头 表 示 转 录 方 向 );@ 重 要 的 单一 酶 切 点 (分 别 密集 分 布 在 Ap" KK. Tet 区 ,提供 了 插入 灭 活 和 选择 标记 );@ 内 切 酶 旁 的 数码 ,表示 该 酶 的 切口 位 置 。 (3) pBR322 的 应 用 :@ 和 常规 的 原核 细胞 克隆 载体 (用 于 扩 增 、 保 存 DNA, 片 段 的 长 度 多 小 于 2kb), 应 用 最 广 。@@ 改 造成 了 衡 化 质粒 ,如 pPBR325、pBR327、plink322 等 。@@ 利 用 pBR322 构建 原核 表达 载体 ,包括 非 融合 性 表达 载体 PKK223-3、 分 这 型 表达 载体 pIN 焉 系 统 、 及 融合 表达 载体 pGEX 系统 。 (4) pBR322 的 宿主 细胞 :包括 HB101.JM107.JM109,LE392 等 。 这 些 宿主 细胞 的 共同 特征 主要 是 :其 F' 因 子 上 的 /acfe、zacAMI15 基因 经 过 修饰 , 致 - 肽 表达 缺陷 。 (S) 基因 克隆 选择 受 体 细胞 的 原则 :中 与 所 选择 载体 相 匹 配 。@ 载 体 - 受 体 细胞 之 间 是 否 存 在 lacZ 表达 -缺陷 互补 药物 抗 性 标志 ,便于 筛选 。@@ 宿 主 细胞 相 容 性 好 。 2. pUC 载体 (1) pUC 载体 系列 :包括 pUC8/9, pUC12/13 Al pUC18X19 ,成 对 排列 ,为 Mssin 等 人 1983、1985 年 先后 构建 。 (2) pUC18/19 的 特点 (图 5-SA 限制 图 谱 ):pUC18/19 是 由 pPBR322 和 M13 ME aA HY 建 的 双 链 DNA 质粒 载体 ,长 2.69kb。 含 有 pBR322 的 复制 起 始点 ` 大肠 杆 菌 LacZ’ 基因 、 Ap’ 抗 性 基因 ;含有 M13 的 MCS( 置 于 LacZ’) ,便于 插入 目的 DNA。pUC 质粒 系列 是 应 用 较 普 遍 的 质粒 载体 。 PUC 质粒 常 是 成 对 的 ,成 对 载体 的 其 他 特性 完全 相同 ,只 是 MCCS 的 排列 方向 互 为 相反 (Al 5-5B). -66: 基因 工程 学 Ndel, HgiEll185 2622 Aatll Eco01092674/ Nar 297。， 2501 Sspl pane 259 一 Pvul 280 Sbob Wey SS” 309 2180 Scal \ sissies 2070 Pvul 2060 Avall pUC18 / pUC19 — (2.69 kb) 2000 1922 Mstl 1838 Avall 1820 Bell ~ HegiEll 1387 FA 5-5A pUC18/19 克隆 载体 限制 图 谱 Hincll Xmal Accl Sma\ Asp718 Hind Sohil Psdl Sall 2aJ BamHI Kpnl SacI ”EcoRI 5'- GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC ~-3' pUCI9 Xmal Hincll Asp718 Smal : Accl EcoRI — Sacl Kpn| BamH| Xbal Sall Pt Shi Hind ll 5'- GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC -3' pUCI8 Lacz’ Al 5-5B pUC18 和 pUC19 载体 中 的 多 克隆 位 点 示意 图 pUC 质粒 呈 多 拷贝 (500 一 700 个 /每 个 细胞 ) 对 数 生长 A ABR HH. (3) LacZ'“ 基 因 与 蓝 白 斑 筛 选 :;ac2Z “基因 是 大 肠 杆菌 lacZ 操纵 子 的 DNA 片段 , 它 编码 B- 半 乳糖 苷 酶 氨基 端的 146 个 氨基 酸 形成 w- 肽 ,该 w- 肽 与 宿主 细胞 中 下 因子 上 的 lacZ’ AM15 基因 (ao- 肽 缺陷 型 ) 的 产物 互补 ,产生 完整 \ 有 活性 的 B- 半 乳糖 苷 酶 。 这 种 酶 分 解 生 色 底 物 (X-gal, 5- 澳 -4- 毛 -3- 叫 吹 -B-D- 半 乳糖 苷 ) ,形成 蓝 色 菌 落 ; 当 外 源 基 因 插 和 人 MCS Je, lacZ’ o- 肽 基因 的 读 码 框架 被 破坏 ,不 能 合成 完整 的 B- 半 乳糖 苷 酶 分 解 底 物 X-gal, 菌 落 呈 白 色 。 用 这 种 方法 可 筛选 阳性 重组 子 ,并 称 为 “ 蓝 白斑 ”筛选 。“ 蓝 白斑 "筛选 法 应 用 十 分 广泛 。 (4) 受 体 细胞 :包括 JM101,.JM105.JM107 和 JM109 菌株 等 。 这 些 菌株 都 是 带 琥珀 突 变 载体 的 允许 细胞 , 虽 经 甲 基 化 修饰 但 并 不 限制 转 染 的 DNA, 可 进行 B- 半 乳糖 苷 酶 的 w- 肽 ee NC BLS ”基因 工程 的 克隆 载体 .67 . 互补 。 (5) pUC 质粒 载体 的 优点 :四 相对 分 子 质量 小 ( 约 2.7kb) BURMA. ORAS ety 点 ,方便 于 克隆 转移. 测序 等 。@@ 可 进行 蓝 白斑 筛选 ,用 组 织 化 学 法 检测 重组 体 。 3. TA 克隆 载体 ( 引 自 invitrogen Clark,J M 1988;Mead,D et al.1991 ) (1) 原理 : TA 克隆 技术 是 为 了 克隆 PCR 产物 而 设计 的 , 它 利 用 Tag 聚合 酶 (和 某 些 聚 合 酶 的 混合 物 ) 具 有 末端 转移 酶 活性 的 特点 ,能 把 PCR 产物 的 3 末端 加 上 一 个 非 模 板 依 赖 的 A, 所 用 工 载体 是 带 有 3° 突出 端的 载体 ,在 连接 酶 作用 下 可 以 高 效 (4 小 时 内 )、 一 步 到 位 地 把 PCR 产物 直接 插入 到 该 工 载 体 中 。 目前 TA 克隆 载体 已 系列 化 专业 化 商品 化 ,试剂 品质 优良 应 用 效果 也 好 。TA 载体 的 突出 特点 是 获取 .连接 外 源 DNA 不 受 酶 切 点 的 限制 ,能 直接 克隆 PCR 产物 ,TA 克隆 技 术 大 大 提高 了 DNA 克隆 的 效率 。 近 几 年 国内 已 广泛 应 用 。 (2) 载体 PCR2.1 的 主要 特点 (图 5-6): O3'-T 突出 端 能 直接 与 Taq 聚合 酶 扩 增 的 PCR 产物 相连 接 ;@ 体 外 RNA 转录 时 选择 T7 启动 子 ;@ 通 用 的 polylinkerT 接头 两 侧 有 EcoRI 酶 切 位 点 ,使 容易 切取 插 人 子 ; 四 有 Kan' 和 Amp 抗 性 选择 标志 ;@ 可 用 蓝 / 白 菌落 facZa ATG CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTC CTT TGT CGA TAC T TAC TAA TGC GGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT BsiX| EcoR | Ecor | GTA ACG GCC GCC AGT GTC CTC GAA TTC GCC CITEMAENIMBAc ccc GAA TTC TGC CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAC CTT AAG CGG G TTC CCG CTT AAG ACG 二 BsKX1 Not | mi Nsi | Xba | Apa | AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG |CCC TAT TCT ATA GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC |GGG ATA ry T? Promoter M13 Forward (-20} Primer AGT GAG TCG TAT T. AAT TCA/CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC TCA CTC AGC ATA ATG TTA AGT/GAC CGG CAG CAA AAT GTT GCA GCA CTG ACC CTT TTG pCR®, RE 3.9 kb 图 5-6 pCR2.1 克隆 载体 -68: 基因 工程 学 筛选 ;@OM13 提供 了 测序 的 正 向 和 反 向 引物 结合 位 点 。 (3) TA 克隆 方法 的 优点 :@ 合 成 引物 不 必 含有 限制 内 切 酶 位 点 ;@ 不 需 用 PCR 修饰 | 图 减少 PCR 产物 的 纯化 过 程 ;@ 田 不 需要 连接 的 接头 。 (4) 受 体 细 胞 的 选择 :为 确保 结果 可 靠 应 选择 :JavaF E.coli (#4 HA :F endAl recAl hsdR17(rke,mrke”) supE44 thi-1 gyrA96 relA1®80 lacZAM15(lacZYA-argF)Ul169)。 TKS PR — 7 em FO J, Se RETO EE: OE Bae EH 带 B- 半 乳糖 苷 酶 ( lacZAM15) AY - 肽 的 重组 克隆 ;@ 能 减少 转化 质粒 的 同 源 重 组 (recA ) ; 图 可 提高 DNA 复制 水 平 ;四 研究 来 自 载体 中 携 有 fl 复制 起 始点 的 单 股 DNA。 (5) 应 用 :TA 载 体 为 一 克隆 载体 。 主 要 应 用 于 克隆 DNA, 也 可 用 于 转录 。 4. 其 他 质粒 载体 从 pUC 系列 派生 了 许多 能 在 体外 转录 和 克隆 基因 的 载体 ,它们 的 共同 特点 是 都 带 有 喉 菌 体 (T3 `T7 或 SP6) 编 码 的 依赖 DNA BY RNA 聚合 酶 转录 单位 的 启 BAF ,使 载体 能 体外 转录 揪 入 的 外 源 DNA JHE EM RAARA. BIM:pGEM34: ERA SP6.T7 启动 子 和 MCS ,便于 揪 和 人 人、 克隆 外 源 DNA。 pGEM-3Z/4Z: 它 比 pGEM-3/4 长 出 一 段 LacZ’ 序列 ,用 蓝 白 斑 筛 选 重组 体 ( 图 5-7)。 Ssp 1 21424ar IT 2260 Xmn 工 1937 P- pGEM®-3Z lacZ plasmid (2743 bp) 15-7 pGEM-3Z/4Z 的 物理 图 谱 图 pGEM-3Zf( + /—): 这 是 一 对 带 有 fl MERA DNA 复制 起 点 的 载体 ,在 该 起 点 是 以 互 为 相反 的 方向 在 体内 产生 单 链 DNA 或 者 在 体外 产生 RNA, 这 些 产物 能 与 插入 多 克隆 位 点 的 外 源 DNA 双 链 中 任意 一 条 链 互 补 ( 图 S-8). pGEM-5Zf( + /— ) 和 pGEM-7Zf( + 7- ) 与 pGEM-3Zf( + /— ) 的 不 同 ,是 多 克隆 位 点 内 限制 性 内 切 酶 的 数量 和 组 成 有 所 不 同 。 SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 *。， 69 ， Aat ll Nde I 2260 2509 pGEM ®-3Z,(+) vector (3199bp) Aat Il Nae | 2260 2509 ~=— Nae Il 2691 Xmn | 1937 Sca 1 1818 Amp’ pGEM ®-3Zf{-) vector (3199bp) lacZ 图 5-8 pGEM-3Zf(+/- ) 的 物理 图 谱 BVT A 鸣 菌 体 载体 —.) WE FA TK (一 ) 入 噬菌体 的 基本 特性 入 只 菌 体 是 大 肠 杆 菌 的 温和 型 DNA 只 菌 体 , 属 长 尾 噬菌体 科 。 能 自主 复制 , 靠 长 尾 末 端 吸附 宿主 细胞 壁 而 感染 。 进入 细胞 内 生长 有 两 种 形式 :溶菌 型 (lytical pathway ) Aly Jk 70 . 基因 工程 学 (lysogenic pathway 或 整合 型 ) 。 深 菌 生长 时 形成 清亮 的 吻 菌 斑 , 易 被 识别 , 溶 原生 长 时 鸣 斑 浑浊 。 和 鸣 菌 体 基 因 组 DNA if $0kb ,中 段 有 约 20kb MK EMME RAMA AERA DG 的 ,因此 能 被 外 源 DNA 取代 ,这 种 重组 的 DNA 可 被 包装 成 具有 感染 性 的 噬菌体 。 在 该 DNA 分 子 的 两 端 各 有 12 个 碱 基 互 补 的 5 端 单 链 , 形 成 黏 性 末端 位 点 (cos, cohensive-end site) ,cos 位 点 的 黏合 、 环 化 与 DNA 复制 、 转 录 以 及 感染 有 关 。 在 感染 早期 环形 XDNA 按 6 形式 双向 复制 ,感染 晚期 则 以 滚 环 方式 复制 出 线性 排列 的 多 基因 组 连 体 的 DNA 分 子 ,经 切 2 cos Hb. 包装 成 熟 。 (二 ) 入 史 菌 体 基 因 组 和 转录 1. 入 喉 菌 体 基 因 组 入 鸣 菌 体 基因 组 全 长 48 S02bp ,为 两 端 不 闭合 的 线性 双 螺 旋 DNA, 由 左右 两 臂 组 成 ,编码 66 个 基因 ,其 中 46 个 读 框 已 经 确定 (图 5-9 )。 图 5-9 入 鸣 菌 体 的 遗传 和 分 子 图 谱 互补 DNA 末 段 用 3 和 5 表示 ,基因 用 字母 表示 。att :噬菌体 附着 到 宿主 的 位 点 ;DNA 链 向 左 转录 (六 时 针 方 向 ) ,其 左 黏 性 末端 (m) 为 $“G, 两 个 操纵 子 分 别 用 工 ; 和 工 ; 表示 ;DNA 链 向 右 转录 ( 顺 时 针 方向 ) ,其 右 黏 性 末端 (m) 为 5 Ai 两 个 操纵 子 用 R, AR, 表示 。 特 别 重要 的 基因 :c 工 : 阻 巡 蛋白 基因 ,OR:Ri 转录 的 操纵 基因 ,Or:L;: 转录 的 操纵 基 A ,cro :第 二 个 阻 过 蛋白 基因 , 它 阻 过 LL. MR, 的 转录 ;免疫 区 :c 工 .cro、\OR MO, MF; N: BA cro 终止 的 调 节 基 因 ;J~ U 编码 尾 蛋白 的 基因 ;Z 一 A 编码 头 蛋白 基因 入 喉 菌 体 的 基因 可 分 为 控制 复制 的 和 转录 调控 的 两 类 基因 : (1) 控制 复制 的 基因 及 其 功能 简介 1) 头 部 基因 :由 4A, 妈 ,B,C,D, 下 ,下 等 7 个 基因 组 成 ,负责 编码 和 噬菌体 头 部 蛋白 质 和 具 包 装 功能 的 蛋白 质 。 ————— ee SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 - 71 - 2) 尾部 基因 :由 Z,U,V,G,T, 瑟 ,M, 工 ,KK,T,J 等 11 个 基因 ,编码 尾部 蛋白 质 。 3) 重组 基因 :行使 整合 、 重 组 和 切割 功能 。 含 有 ;zt ,zis,ezo,red,ga7z 基因 及 at 识 别 位 点 。(int 蛋白 能 使 IDNA 整合 到 细菌 染色 体 上 ;xis 蛋白 是 一 种 酶 ,能 把 原 唆 菌 体 从 宿 主 染 色 体 上 切割 下 来 ;int 和 xis 蛋白 都 能 识别 att PA; red 基因 可 促进 重组 )。 4) 正 调 控 基 因 : 包 括 N,Q 两 个 基因 。N 蛋白 是 早期 正 调 控 因 子 ,能 持 抗 宿主 的 转录 终止 子 (o) ,能 促进 O ,P,Q,red ,zis, 和 int 基因 的 转录 。 5) Ria AEA :包括 cT,cIT,cIT,cro 等 重要 基因 。(c 工 蛋白 与 O; ,DO, 结合 ,终止 入 鸣 菌 体 全 部 的 基因 转录 ,促进 进入 溶 原 途 径 及 维持 溶 原状 态 。cI,c 亚 维持 免疫 性 ,阻止 裂解 基因 S$,R 的 转录 ,促进 cI WHR. cro, red 能 部 分 抑制 cJ,N,redg Maris WHR. tof (Hcl 基因 关闭 ,使 和 Wa BR PR EA 6) DNA 合成 基因 :包括 O ,P 基因 。 7) 裂解 基因 :包括 S,R 基因 控制 溶菌 作用 ;R 基因 编码 溶菌 酶 。 (2) 负责 转录 调控 及 识别 位 点 :OU,OR: 左 向 \ 右 向 操纵 子 。Pi , PR: 左 向 、 右 向 启动 子 。 Pru: a WAS. Pre: 阻 遏 物 建 立 启 动 子 。at: 整合 与 切 离 识别 位 点 。 刀 : 左 向 终止 子 。zRi,tRz : 右 向 终止 子 1.2。PR: 右 向 晚期 启动 子 。cosL ,cosR: 左 端 、 右 端 黏 性 末 端 。 2. 入 喉 菌 体 的 转录 入 喉 菌 体 的 转录 过 程 分 为 三 个 阶段 (图 5-10) :早期 转录 (early stage) ,迟早 期 转录 (delayed early stage) 和 晚期 转录 (late stage). 5-10 A WRB DNA 的 转录 示意 图 1. 早期 转录 本 ; 1. PRERA; 1. 晚期 转录 本 . 箭头 表示 转录 方向 (1) 早期 转录 :从 PL 和 PR 启动 子 起 始 , 早 期 RNA 的 转录 分 别 在 N 基因 和 cro RAK HA 2, 和 如 1 位 点 终止 。 转 录 产 生 的 N 蛋白 可 中 和 宿主 p 转录 中 止 因子 ,使 转录 越过 万 ， tei A 如 ?进入 迟早 期 转录 。 早 期 转录 产物 cro 蛋白 的 积累 ,导致 P 和 Pr 启动 子 关闭 。 (2) 后 早期 转录 :主要 进行 DNA 复制 和 重组 。 当 MO ,P 基因 的 产物 合成 后 , 环 状 ， ADNA 开始 复制 。 复 制 分 为 两 个 阶段 :早期 为 6 复制 ,晚期 为 滚 环 复制 。 早 期 6 复制 增加 了 转录 和 复制 的 模板 数 ;而 滚 环 复制 扩 增 了 大 量子 代 噬 菌 体 DNA。 进 入 生活 周期 的 循环 时 ,6 复制 停止 , 滚 简 复 制 则 成 为 主要 的 方式 。 .72 . 基因 工程 学 入 噬菌体 DNA 重组 的 特征 是 位 点 特异 性 重组 ,这 与 入 噬菌体 DNA 的 整合 (int) 和 切 离 (xis) 相 关 。 (3) 晚期 转录 :晚期 基因 区 包括 与 唆 菌 体 头 `. 尾 组 装 和 有 裂解 有 关 的 许多 基因 。Q 蛋白 的 合成 会 导致 晚期 转录 的 开始 ,PA 启动 子 的 启动 将 转录 与 鸣 菌 体 的 头 ` 尾 组 装 和 裂解 有 关 的 基因 。 然 后 包装 MA. ADNA 转录 的 特点 是 在 生命 周期 的 早期 阶段 进行 的 , 呈 左 向 ` 右 向 双向 转录 ,分 别 转译 、 合成 相应 的 酶 和 蛋白质 ,基因 调控 机 制 也 基本 明了 ,其 转录 调控 研究 更 为 彻底 。 其 功能 性 基 因 大 多 聚 在 一 起 ,编码 调控 蛋白 质 的 基因 与 被 调控 靶 位 点 极其 靠近 ,终止 位 点 与 起 始 位 点 相 HE. 50% BK 60% 的 基因 对 鸣 菌 体 的 生长 和 鸣 斑 形成 是 必需 的 ,但 在 J~ N 之 间 173 的 基 因 不 是 必需 的 ,利用 后 者 的 这 一 特性 可 构建 成 不 同 的 克隆 载体 。 .3. 溶 原 、 裂解 周期 的 基因 调控 入 喉 菌 体感 染 大 肠 杆菌 宿主 后 ,要 选择 溶 原 或 裂解 发 育 途径 。 溶 原状 态 需 要 入 DNA 整合 进 宿 主 的 细胞 DNA 中 。 由 溶 原状 态 进 入 有 裂解 生长 需要 ADNA 从 宿主 DNA EWR FR. AMY BS ABA Ae A Ae PK DNA 的 特定 位 点 经 过 特 异性 重组 实现 的 。 入 只 菌 体 的 溶 原 和 裂解 循环 主要 是 后 早期 基因 ( 即 调节 基因 ) 编 码 功 能 的 表现 ,只 有 它 们 的 功能 表达 后 ,使 周期 循环 发 生 分 歧 , 才 显现 出 溶 原 或 裂解 途径 。c 工 基因 是 影响 溶 原 和 裂解 的 关键 ,cI 活 化 使 阻 遏 蛋白 启动 子 合 成 有 效 , 则 阻 遏 蛋白 结合 操纵 基因 ; 若 cll AI 化 , 阻 遏 蛋白 不 能 形成 ,Cro 则 结合 操纵 基因 。Cro 蛋白 和 阻 巡 蛋白 相互 后 抗 ,Cro 蛋白 合成 可 间接 阻止 c 工 转录 ,而 不 进入 溶 原 。 阻 过 蛋白 的 合成 可 阻止 早期 基因 的 转录 ,关闭 Cro & 白 的 合成 ,使 进入 裂解 周期 。 和 只 菌 体 DNA 是 否 进 入 溶 原 或 者 裂解 途径 ,取决 于 阻 遏 蛋白 和 Cro 蛋白 两 者 作用 的 效力 与 时 间 。 二 、 和 鸣 菌 体 载 体 (一 ) 基本 特性 根据 入 叭 菌 体 的 基因 组 特点 ,利用 碱 基 突 变 的 方法 ,把 入 只 菌 体 基 因 组 中 J~- N 之 间 ( 约 占 全 基因 组 143 长 度 ,是 裂解 生长 非 必须 区 ) 的 DNA 序列 ,用 内 切 酶 修饰 切 点 从 而 将 野 生 型 入 喉 菌 体 改 造成 入 吻 菌 体 突 变 株 (Murray，Rambach，Thomas 等 ,1974)。 后 又 改造 成 两 种 入 鸣 菌 体 克 隆 载 体 : 插 和 人 型 载体 (insersion vector) 和 替换 型 载体 (substitution or replace vector) (Williams 和 Blattner,1980) 。 和 噬菌体 是 最 早 使 用 的 载体 ,以 溶菌 状态 生长 。 其 突出 优点 是 :四 包装 容量 大 (可 达 20kb)。@ 体 外 包装 反应 效力 高 ( 比 质粒 载体 克隆 效率 高 100 倍 ) , 故 适 用 于 构建 cDNA 文库 和 基因 文库 。 构建 入 鸣 菌 体 载体 的 基本 条 件 ,是 确保 其 具有 感染 性 和 增殖 性 。 要 求 入 喉 菌 体 基 因 组 的 长 度 适 宜 ,不 能 过 长 .过 短 ,否则 不 能 有 效 包 人 外 壳 形 成 有 感染 性 的 唆 菌 体 ,一 般 为 基因 组 的 75% 一 105% 之 间 ( 即 38 一 52kb)。 这 对 于 插入 型 载体 和 替换 型 载体 各 有 特定 的 要 求 。 入 噬菌体 载体 的 主要 优点 是 体外 包装 反应 非常 有 效 , 它 比 质粒 载体 克隆 效力 可 高 100 倍 。 ADS ”基因 工程 的 克隆 载体 .73 . (二 ) 常用 的 入 鸣 菌 体 载体 入 喉 菌 体 载体 是 载体 系列 中 最 为 庞大 和 应 用 很 广 的 殉 隆 载体 。 常 用 的 有 :和 gt、 Charon、 XEMBL 和 和 ZAP。 按 其 特点 和 用 途 分 为 两 类 :插入 型 载体 和 替换 型 载体 。 1. 入 搬入 型 载体 含 一 个 或 多 个 单一 酶 切 位 点 ,只 容许 小 于 10kb 的 DNA 插入 ,用 插 大 灭 活 等 检测 重组 体 。 根 据 插 和 人 失 活 的 特异 性 又 分 为 :中 功能 失 活 : 当 c 工 区 编码 的 阻 抑 物 活性 被 破坏 ,不 能 溶 原 。 如 AZAP 载体 。@8B- 半 乳糖 苷 酶 失 活 一 一 如 pBluescript M13. 具 代 表 性 的 插入 型 载体 有 :和 gtl0(Huynh 等 ,198$)( 图 5-11 上 )、XgtLl1(Young 和 Davis, 1983)( 图 5-11 下 ) ,及 其 具有 体内 删除 作用 的 入 鸣 菌 体 载体 一 一 XZAP。 EcoRT(32.71kb) | | Left end(0.0 kb) BamHI Sam I (= i nd) ~ Sam | Bamuil Hind Ill |__| Right end(43, 34 kb) 一 | Se im, So % = & S = &§ 站 as = os (a5) 4 S = 2 ea) é 己 们 oO VS a — Lal 一 3 = z Ree Spee $F om, © = 5 S 了 = B SS SS = SN £ & 2 rea Sa g 人 OF ) 图 5-11 AgtlO(_E) \Agtl1( F BAR (1) Agtl0:i DNA K 43.3kb, ,能 克隆 小 于 6kb 的 EcoR 工 片段 。 它 的 EcoR 工 单一 切 点 位 于 c 工 基因 内 ,该 位 点 插入 外 源 片 段 会 使 < 工 失 活 ,重组 喉 菌 体 则 形成 清亮 的 只 斑 ;而 未 揪 入 者 则 形成 浑浊 的 噬 菌 斑 。 和 gtl0 的 宿主 菌 是 :C600( 扩 增 时 用 );C600 hf1A( 筛 选 重组 体 用 )。 (2) 和 Xgtl1l :长 度 为 43.7kb ,可 克隆 小 于 7.2kb 的 EcoRI HB. ERA BO FL BE AT AGE 因 N 端 片段 ,惟一 的 EcoR 工 切 点 在 lacZ’ 基因 的 羧基 端 。 在 gal 大 肠 杆菌 宿主 中 ,重组 鸣 ATE X-gal 平板 上 形成 无 色 的 叭 菌 斑 , 非 重组 叭 菌 体 则 形成 蓝 色 喉 菌 斑 。Xgtll 用 于 构建 cDNA 文库, 若 插 和 人 方向 正确 . 读 码 框架 正确 则 可 表达 融合 蛋白 (可 具有 抗原 性 )。 -74- 基因 工程 学 和 Xgtll 的 宿主 菌 为 :Y1090hsdR . (3) 和 XZAPI 载 体 与 pbBluescript M13- 喉 菌 粒 : 1) AZAP IT 载体 基因 组 的 基本 构成 (Short，1988. 图 5-12):XZAPI 载 体 基 因 组 为 40.82kb ,由 左 至 右 依次 为 :cos Kit, A-J K,pBluescriptSK WH #L( A lacZ’ 基因 ) 和 MCS 序列 ,c1857 及 att ~ cos 末端 ;在 pBluescriptSK MEA ALAA :O fl(=- ) 起 点 和 起 始 子 、 终止 子 :fL(- ) 起 点 区 的 起 始 子 ( 工 信 号 ) 可 被 辅助 病毒 Ml3 的 反 式 作用 蛋白 识别 ,启动 切割 DNA. @MCS: MCS JP SF lacZ’ 下 游 ,其 两 端 有 T3 和 T7 叭 菌 体 启动 子 , 外 源 DNA 插 入 MCS WBURA RIERA RHA BA. OCIE1: WARM BHF. OAmp: AK 林 抗 性 基因 ,提供 筛选 标记 。 cos 本 A ZAP RE (I) Lae =7T7 . , 3 A ZAP RK cos Ih (il ) pBluescript sk Ili By AZ (3.0kb) 图 5-12 AZAP 载体 与 pBluescript M13 的 形成 过 程 2) pBluescript M13 噬 菌 粒 的 形成 过 程 ( 图 5-12) :AZAP Il 载体 是 一 个 带 有 LacZ-a 互补 肽 (AZAP,LacZ-u complementation peptide) ,并 可 形成 Lac WERE AY ta A AY A We Be TA aR TR, LacZ 启动 子 上 游 EcoR 工 位 点 插入 了 一 个 多 克隆 位 点 ,在 该 位 点 能 克隆 10kb 的 CDNA. AZAP 有 6 个 限制 酶 单 切 点 (Kpa 1 ,Apal , Xbo 1, Hin] ,Acc 1 ,Sal Il , BV K~S7), 可 用 于 直接 克隆 cDNA; 在 邻近 多 克隆 位 点 处 有 T3 和 T4 启动 子 , 利 用 这 两 个 启动 子 可 合 成 与 克隆 cDNA 互补 的 链 特异 性 RNA( 探 针 ); 另外 ,该 载体 内 有 一 个 在 体内 可 删除 的 叹 菌 粒 载 体 pBluescript SK(M13 - )(Short 4 1988). f1 序列 能 在 体内 将 插入 的 DNA MA A We Be SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 . 75 - 体 载 体 转 换 到 Bluescript 质粒 ,经 体内 删除 ,包装 成 单 链 ( + )DNA 叭 菌 体 颗粒 一 一 pBluess- criptM13 喉 菌 粒 。 最 后 ,用 单 链 (+ )DNA 的 pBluesscriptM13 叭 菌 粒 感染 下 大 肠 杆 菌 , 以 Co 正 1 #5 ori 起 点 复制 、 合 成 了 双 股 DNA. 环 状 双 链 DNA 的 pBluescript M13( — ) 用 辅助 病毒 转 染 生成 sDNA, 利 用 此 特性 能 容 易 地 把 插入 的 外 源 DNA 测序 、 位 点 定向 诱 变 、 非 定向 删除 等 。XZAP 人 AR Al AZAP/L 的 其 他 特性 完全 一 样 ,只 是 多 克隆 酶 切 位 点 的 方向 相反 ,以 备 选 择 。 其 受 菌 体 是 商品 化 的 XL1- BLue MRF 菌株 。 3) AZAP 载体 的 用 途 : 中 克隆 cDNA,DNA 长 度 约 10kb。@ 有 体内 删除 特性 ,可 直接 完 成 目的 DNA 的 亚 克 隆 。@@ 具 有 多 克隆 位 点 和 lacZ 插 人 灭 活 特性 。 轩 可 表达 融合 蛋白 ,用 其 抗体 筛选 。G@pBluescript M13 能 转录 mRNA, 可 制备 外 源 DNA 的 mRNA 转录 本 ,而 制备 RNA Rt. AZAP 是 新 一 代 载 体 , 它 增加 了 克隆 位 点 和 表达 cDNA 的 范围 ,因而 用 途 广 ,有 可 能 替代 Agt10 和 Ngtl1l。 4) 应 用 于 :ODNA、RNA 测序 ,RNA 探 针 制备 。@@ 作 单 向 缺失 定点 诱 变 、 表 达 融 合 蛋 白 及 制备 RNA 转录 物 。 2. 入 蔡 换 型 载体 也 称 为 取代 型 载体 ,在 其 中 央 有 多 个 限制 酶 切 点 ,可 被 外 源 DNA 所 取代 。 能 克隆 长 达 9~22kb DNA 片段 ,多 用 于 构建 真 核 细 胞 基因 组 文库 ,目前 常用 的 该 类 载体 有 :Charon 40 和 EMBL4。 (1) Charon 40 :Charon 系列 最 早 由 Blattner 等 人 构建 ,Charon 40 是 近年 构建 的 入 置换 型 载体 (图 5-13). Charon 40 {KK 41.9kb, FF 19.2kb. AE 9.6kb, EP RA SRE 段 的 两 侧 各 有 一 对 方向 互 为 相反 的 16 个 内 切 酶 的 多 克隆 位 点 ,便于 克隆 操作 。 可 容纳 9.4~24.2kb 的 外 源 DNA 片段 。 在 它 可 置换 的 片段 是 由 多 节 段 区 (polystuffer 一 一 由 80 个 头 尾 相 接 的 DNA 短片 段 组 成 ) ,两 短片 段 之 间 的 连接 可 被 Noe 工 识别 而 切断 成 小 碎片 EB 清除 小 碎片 ,确保 大 部 分 鸣 菌 体 获得 含 外 源 片 段 的 两 臂 。 该 重组 子 是 gam* ,可 在 recA 大 肠 杆菌 中 增殖 。 宿 主 菌 为 LE392。 ¥ 804% Ul (Lac 操 纵 基因 + 腺 病毒 DNA235bp 重 复 序列 ) 左 臂 19.2kb 右 臂 9.6kb 和 E BamHI = | 三 | 三 | 一 | 一 = — 二 一 | at eT te Sot Ss=sc BS SS s S_- E8SQucsS tees 8 S 5 £5 SS Se = 8, ~ 35 = = = US S > SASARRSESARTGRS T= SS TRFSEKESERSRESKSS << = 图 5-13 Charon40 载体 - (2) EMBL4:EMBL4 #2 2 58 RE (745 BY A SE BAS Be BRA (I 5-14). EE (20kb), AG (9kb) 中央 区 (14kb) 三 部 分 组 成 。 在 可 置换 的 中 间 片 段 ,两 端 有 两 个 切 点 相同 .方向 相 反 的 Sal] .BamH I fl EcoRI 多 克隆 位 点 , 适 于 克隆 Sau3A 或 Mbo I 部 分 消化 的 DNA 片段 。 被 置换 的 DNA 序列 能 抑制 和 叭 菌 体 的 溶 原 性 生长 ,一旦 此 片 取 被 外 源 DNA 替代 ， 。" 76 . 基因 工程 学 BASS Spi 基因 型 ,能 在 P2 溶 原 化 的 大 肠 杆菌 菌株 中 生长 良好 ,产生 叭 菌 斑 ,利用 此 Spi 优势 筛选 可 获得 重组 叭 菌 体 。 用 EMBL 系列 载体 克隆 重组 子 ,为 提高 其 转 染 率 , 转 染 前 需 进 行 体 外 包装 。 包 装 的 鸣 菌 体 颗粒 比 未 包装 的 转 染 率 高 100 一 1000 475 (10° 喉 斑 数 / 每 mg 重组 DNA). EMBL4 的 受 体 菌 :LE392。 PREC) | AAR | | EMBL 4 vecter 5’... GGATC TGGGT CGACG GATCC GGGGA ATTCC CAGAT CC ...3' i ds Le nde) WE Sall\ BamHI EcoRI Al 5-14 EMBL4 载体 (3) XGEMI11 :来 源 于 和 XEMBL3 ,中 间 可 取代 区 的 两 侧 各 有 6 个 内 切 酶 识别 位 点 (Sac 工 、 Xho | .BamH I .Avr I .EcoRI .Xba 1), MAA SF 疡 工 切 点 (识别 顺序 不 对 称 ) 和 方向 相对 的 SP6.T7 RNA 的 启动 子 。 其 切割 、 沉淀、 连接 、 克 隆 过 程 与 XEMBL3 相同 。 因 其 插入 容量 大 (24kb) , 尤 适宜 建 基 因 组 文库 。 用 Spi 筛选 , 非 重 组 背景 稍 高 。 上 述 替 代 型 入 喉 菌 体 载体 , 因 可 容纳 20kb 的 DNA, 故 较 适 用 于 建立 基因 组 文库 。 应 根 据 实 验 条 件 选择 合适 的 入 鸣 菌 体 克 隆 载体 。 第 五 Bi Be —. FE AS RF ME FAL ,也 称 柯 斯 质粒 (cosmid, 来 自 cos site-carring plasmid) , 最初 由 Collins 和 Hohn, 1978 年 以 质粒 和 入 叭 菌 体 cos 黏 末 端 序列 改建 而 成 。20 世纪 80 年 代 后 有 许多 改进 ,扩大 了 应 用 范围 。 黏 粒 的 基本 特性 : 四 质粒 的 特性 :有 复制 起 始点 ,限制 酶 切 点 1 一 2 个 , 耐 药 性 标记 ;GO 喉 菌 体 特性 : 含 cos 末 瑞 序列 ,基因 组 长 4 一 6kb,29 一 4$kb 的 目的 DNA 可 置 于 两 cos 之 间 。 @ 克 隆 容 量 大 (31 一 4$kb)。 田 能 与 同 源 序列 的 质粒 进行 重组 形成 共 合体 ,利用 这 一 特性 可 把 两 个 盘 选 标记 不 同 的 共 合 体 分 子 选择 出 来 。 把 柯 斯 质粒 载体 c2XB 为 其 中 之 一 ,如 图 5-15. 黏 粒 的 优势 : 既 具 有 细菌 质粒 自主 复制 的 特点 ,又 能 包容 大 片段 DNA( 小 于 45kb) ,经 体外 包装 ,感染 宿主 菌 ,再 复制 出 大 量 DNA 或 表达 产物 ,易于 鉴定 。 BAS ”基因 工程 的 克隆 载体 .77 - Amp' c2XB (6.8kb) 基因 纽 配 DNA | (Gas a Wb Smal < 一 BamHI BamHI < 一 Smal COS cos Amp'rep it | (1)Sau3A 局 部 消化 (2) eR | Sau3A Sau3A + 30~45kb | ,, Smal 二 三 et. Small 7 全 ER Amp' rep 30~52kb 只 有 可 包装 的 分 子 体外 包装 图 5-1$ Bafes-Swift 柯 斯 克隆 步骤 一 技术 :改进 原始 的 黏 粒 克隆 方法 ,繁琐 、 阳 性 重组 率 低 、 易 丢失 。 为 克隆 真 核 细 胞 DNA, 后 来 的 技 术 改 进 主 要 是 : 1. ERR EMBARK: ORE A ABT cos 位 点 ,便于 克隆 。 如 c2RB 载体 。@ 加 入 原核 细胞 的 复制 子 , 易 在 细菌 中 复制 。@ 四 加 入 特异 性 启动 子 :T3、T7、SP6， 利于 双向 转录 。 如 pPWE15。 四 含 真 核 细 胞 复制 起 始 位 点 (SV4 复 制 位 点 ) ,如 pMCS. OFM 入 选择 标志 (zeo 抗 性 ) ,利于 真 核 细 胞 中 的 转 染 、 筛 选 。 2. 筛选 技术 ”筛选 技术 主要 为 :@O 菌 落 原 位 杂交 (大 量 筛选 )。@ 和 蛋白 质 表 达 ( 抗 原 性 、 (73: 基因 工程 学 生物 活性 检测 )。@@ 药 物 抗 性 筛选 。 3. 柯 斯 克隆 方法 Bates-Swift 法 (1983) 应 用 黏 粒 载体 在 大 肠 杆菌 中 克隆 真 核 细 胞 基因 组 大 片段 DNA, 称 为 柯 斯 克隆 。 以 Bates-Swift 柯 斯 克隆 法 为 例 (P. F. Bates 和 R. A. Swift,1983) ,其 基本 步骤 如 图 5-15. (1) 黏 粒 克隆 的 基本 步骤 (以 c2XB 为 例 , 图 $-15):DNA 用 BamHI #l Sa 工 消化 后 ， 与 经 Sau3A 局 部 消化 和 碱 性 磷酸 酶 处 理 的 真 核 DNA 片段 重组 ,此 重组 分 子 即 作 为 被 包装 的 底 物 。 包 装 的 噬 菌 颗粒 导 和 人 大 肠 杆菌 recA -细胞 中 ,以 质粒 形式 复制 ,并 提供 氨 葵 西林 抗 性 筛选 标记 。 (2) c2XB 黏 粒 的 主要 特性 :c2XB 黏 粒 的 特性 主要 是 :0D6.8kb 大 小 ,具有 Baxz HTI 单 一 位 点 ,两 个 cos PLR AR Swa 1 (CRA Sin BE) PIF. OA Tt tH 3E A ( Amp", Kam"; Kam" 在 两 个 cos 位 点 之 间 。@@ 用 Ba HI , Sma | WPA UA AIA ETE HAS Sau3A 酶 切 (与 BaxzHI 是 同 尾 酶 ) 的 真 核 DNA 连接 ,获得 中 间 为 真 核 DNA 片段 .两 端 分 别 为 c2XB 的 BAKA. ORAM AE ,感染 。 (3) 应 用 :中 克隆 容量 大 (47kb)。@ 适 用 于 建立 真 核 基因 文库 或 者 分 离 大 型 基因 (大 于 ， 10.0kb). 第 六 节 “MI13 喉 菌 体 载 体 一 、 野 生 型 M13 喉 菌 体 的 生物 学 特性 野生 型 M13 是 一 种 丝 状 的 大 肠 杆菌 吻 菌 体 , 基 因 组 为 (+ ) 单 链 闭 环 DNA 分 子 ,6407 bp。 它 只 感染 具有 下 ”性 菌 毛 的 大 肠 杆菌 ,在 宿主 细胞 内 形成 双 链 、 环 状 的 复制 型 DNA(RF DNA, replication form), RF DNA 分 子 以 滚 环 复 制 累 积 拷贝 。 它 感染 宿主 细菌 而 不 裂解 宿 主 菌 ,但 可 释放 到 培养 基 中 ,可 从 培养 基 中 收获 该 噬菌体 。 在 平板 固体 培养 基 上 因 使 细菌 生 长 减 慢 ,形成 浑浊 的 叭 菌 斑 。 M13 鸣 菌 体 基 因 组 中 ,在 I 一 基因 之 间 有 S$0bp 的 间隔 顺序 (IS,intergenic sequence) , 它 不 编码 蛋白 ,但 与 DNA 复制 .转录 和 包装 有 关 , 外 源 DNA 插 和 人 该 区 不 影响 其 复制 ,其 他 区 的 基因 为 复制 所 必需 (图 $-16)。 =~ AE HY M13 鸣 菌 体 的 改造 把 野生 型 的 M13 i a A (A 5-16) 改 造成 为 M13mp 克隆 载体 ,主要 集中 在 IS 区: 1. 插入 选择 标记 “将 大 肠 杆菌 lac 操纵 子 和 编码 lacZ’ 区 (表达 B- 半 乳糖 苷 酶 氨基 末端 146 个 氨基 酸 , 即 c- 肽 ) 能 与 受 体 细 胞 (缺失 ac2Z “基因 的 )F 因子 附加 体 互 补 ,形成 有 活性 的 半 乳糖 苷 酶 ,可 借 蓝 白斑 筛选 。 2. MCS 插入 w- 肽 N 端的 编码 部 分 ”如果 在 MCS 插入 u- 肽 N 端的 编码 部 分 可 得 到 不 同 的 M13mp 系列 。 如 :M13mp8/9、M13mpl0ZL1、M13mp18/19( 图 5-17 ) 。 a ra) Oe” > aa SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 - 79 - 三 、M13 载体 系列 的 优 缺 点 1. 主要 优点 ”中 使 克隆 操作 简便 。 因 有 一 段 密集 的 序列 ,插入 到 修饰 改变 的 B- 半 乳糖 苷 MEA EP (Hind THR). OH F M13mp 系列 是 成 对 地 构建 的 ,可 有 效 克隆 ds DNA 中 每 bass 一 条 链 。@M13mp 载 体 独一无二 的 特点 是 产生 ss DNA, iX#£ DNA ill FF . ffi] 4 ssDNA 标记 探 针 中 得 以 广泛 应 用 。 目 前 以 Ml3mp18/19 最 党 用 。 人 2. 缺点 ”克隆 能 力 受 限 , 克 隆 的 DNA 片 段 不 长 于 1500bp. FS] 野生 型 M13 Wa Be 5-16 BAH M13 Me ia Ai Multi cloning site M13mp18/mp19 (7, 249 bp) 1 6230 AEE A 6286 5 '— GAATTCGAGC TCGGTA CCCGGGGATCCTCTAGAGT CGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG C - 3 ' EcoRI act Kpnl 575 BamHl ya 7 = rc Pstl J Sphi Hind ll eral fa) Sse83871 Hincll mpl9 6233 lacZ 6289 5 GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTC T AGAGGAT CCCCGGGTACCGAGCTOGAATTC 一 3 7/ Hind lll JIL Pd 一 SalI Xbal BamH ‘Smal Kpnl sac EcoRl Sse83871 gcey Xmal Hincll 图 5-17 M13mp18/19 fa tii) BS ie Al $e RE 7 PY. M13mp18/19 AY Bf sil ZA af A oo ME i ee 1. Ml3mp 18/19 两 者 是 一 对 常用 的 M13 AA Ea Ba a aR A SETA 7.25kb. ARIA AY 。 80 . 基因 工程 学 是 两 者 /ac2Z 区 MCS 顺序 相反 ,便于 两 个 方向 插 和 人 ,获得 互 为 相反 的 两 条 链 。 2. 用 1lacZ“a- 肽 互补 选择 重组 体 , 即 蓝 白 斑 筛 选 。 3. 有 一 段 MCS 序列 , 供 选 择 RE 位 点 。 Ti, 78 ws 主要 应 用 :ODNA 测序 ,如 M13 双 脱 氧 酶 促 法 ;@O 制 备 单 链 DNA; Oil GBH DNA 探 针 。 受 体 细菌 株 为 :JM103.JM107 和 JM109。 BE MnP hee pUC118/119 —\. cE AS FFE Wa: Bal VLR AR RR J A BG Me Ba SR AY) 0 BG ORT 9) AY BT A RR , 称 为 WE FA AL BK (AK ( phagemid BK vector). 噬 菌 粒 载体 的 相对 分 子 质量 比 M13 小 , 约 为 3000bp, 既 有 质粒 的 复制 起 点 ,也 有 鸣 菌 体 的 复制 起 点 。 它 在 大 肠 杆菌 内 可 按 正常 双 链 DNA 分 子 的 复制 方式 形成 双 链 DNA, BA 常规 质粒 的 特性 ; 当 在 辅助 噬菌体 (基因 下蛋 白质 ) 的 协助 下 , 它 又 可 同 M13 载体 一 样 按 滚 环 模 型 复制 出 单 链 的 DNA, 经 包装 成 喉 菌 体 颗粒 后 被 挤 压 出 宿主 细胞 。 利 用 后 者 的 这 一 特 性 ,可 直接 把 克隆 的 DNA 片段 测序 。 例 如 pUC118/119 是 较 常 用 的 噬 菌 粒 克隆 载体 。 二 、 鸣 菌 体 载 体 pUC118 和 pUC119 的 主要 特性 Wat BA AS RAE pUC118/119( Al 5-18) ,是 一 对 分 别 由 pUC18 和 pUC19 质粒 与 野生 型 Ml13 喉 菌 体 在 基因 间隔 区 (IG,intergenic region) 重 组 构建 的 。 IG 区 长 度 为 476bp, 含 M13 的 复 制 起 点 , 它 插入 到 pUC18 Al pUC19 质粒 的 Ndel 位 点 上 。 两 者 的 MCS 序列 正 相 反 ,其 他 分 子 结构 完全 相同 。 如 果 某 一 DNA 分 子 插 和 人 这 一 对 鸣 菌 体 载体 多 克隆 位 点 的 同一 限制 性 内 切 酶 位 点 上 ,将 形成 的 两 个 重组 载体 ,一 个 会 转录 克隆 基因 的 正 链 DNA, 另 一 个 则 转录 克隆 基因 的 负 链 。 因 此 ,应 用 pUC118 和 pUC119 噬 菌 粒 载体 ,能 将 克隆 的 DNA 两 条 链 都 能 有 效 地 合成 出 来 ,可 广泛 用 于 DNA 测序 及 体外 定点 诱 变 等 。 但 是 ,要 制备 单 链 DNA, 需 要 让 该 噬菌体 进行 滚 环 复 制 , 所 产生 的 单 链 载体 DNA 必须 由 辅助 病毒 提供 外 壳 蛋 白 包装 ,形成 鸣 菌 体 颗粒 再 被 挤 出 宿主 细胞 ,分 布 在 培养 基 中 。 从 该 培养 基 中 可 获得 大 量 噬菌体 颗粒 。 SHS ”基因 工程 的 克隆 载体 - 81 . pUC118/pUC119 (3.2kb) ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CATGCA AGC TTG GCA A) pUCII8 & ye BEAT EcoRI Sacl Kpnl Paes BamHI — Xhal pre Pst Sphl Hindlll ma Hinc Il B) pUC1I19 & se BEALS ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC GGG GTA CCG AGC TCG AAT TCA CTG Hindi “Sap Pt 到 Wel Tea) Ge at! Boo Acc Hinc Il 图 5-18 pUC118 和 pUC119 Mi FAA RRA 、 辅 助 病毒 M13K07 | pUC118 和 pUC119 Wa Fa ARE fa AA a, RA BEAR RR itil , A AE AH CE 放 。 而 要 进入 该 途径 必须 有 辅助 病毒 协助 才 行 。pPUC118 和 pUC119 Mi FA TK AY a Bh a Be M13K07 菌株 ,其 基本 构成 是 含有 :@M13mpl MMA Sle A (ERE), ASH DNA 不 能 有 效 复制 ,但 可 在 宿主 细胞 内 合成 供 包 装 用 的 外 壳 蛋 白质 。@D 有 plsaA 质粒 的 复制 起 点 , 它 控制 辅助 病毒 DNA 复制 。@G)Tn903 的 卡 那 霉 素 抗 性 基因 。@ 四 MI13 的 IG 区 EMA 一 个 Ava 1 WA ,M1i3mpl 突变 的 复制 起 点 就 插 在 此 区 。 DU. Wik Ba AR ARS pUC118/119 的 优点 1. RA pUC 质粒 的 特性 ,可 用 于 常规 质粒 的 克隆 。 2. 本 身 相 对 分 子 质量 小 . 共 价 闭合 ,可 克隆 10kb 外 源 DNA 分 子 ,容易 分 离 和 操作 。 3. 有 amp 抗 性 基因 选择 标记 ,便于 筛选 .初步 鉴定 。 4. 拷贝 数量 高 (可 达 500 个 /每 个 细胞 ) ，DNA 制备 效率 高 ， - 82: 基因 工程 学 5. 有 多 克隆 位 点 序列 ,便于 选择 外 源 DNA 与 克隆 。 6. 载体 有 lacZ’ 基因 编码 区 , lacZ’ 基因 置 于 /cc 启动 子 控制 之 下 ,可 用 Xgal- IPTG 组 织 化 学 显 色 反应 筛选 重组 子 。 7. 用 辅助 病毒 超 感染 形成 DNA; 能 制备 单 链 模板 和 DNA 探 针 , 作 定 点 诱 变 分 析 等 。 本 章 内 容 主要 讲述 了 基因 工程 技术 中 常 表 5-2。 质粒 a+ 和 Wi Ba 50 3h BL (cosmid) 2~4 M13 6.4 pYAC 11.4 SV go BLE Nae? RNA 肿瘤 病毒 8 一 10 ( fel FR RA ) 乳头 瘤 病 毒 ( 穿 8+ 梭 载 体 ) Bi 200 表 5-2 宿主 细胞 E.coli E.coli E.coli E.coli 细菌 ,酵母 猴 肾 细胞 鼠 细 胞 真 核 : 鼠 细 fd, JR 核 : E.coli 敏感 细胞 昆虫 杆 状 病毒 80 一 200 昆虫 细胞 (BRE) 常用 的 基因 工程 载体 的 主要 特点 应 用 基 DNA 最 大 负荷 / kb <10 筛选 标记 耐 药 性 琥珀 ,lac 颜色 耐 药性 lac 颜色 耐 药 性 ,基因 突变 抑 制 敏感 细胞 敏感 细胞 敏感 细胞 , 耐 药 性 蚀 斑 筛 选 本 十 序 列 oa bt yt a 用 克隆 载体 的 主要 特性 与 应 用 , 现 归纳 如 主要 特点 插 和 人 失 活 ,插入 表达 ,体外 体 内 重组 相 结合 体外 包装 X-cos 尾巴 ,体外 包 装 像 和 -噬菌体 ,体内 复制 . 像 质粒 。 HARE 穿梭 质粒 ,容量 大 早晚 期 区 域 取代 ,增强 子 LTR ,cDNA 整合 , 原 病毒 像 质粒 一 样 的 附加 体 宿主 范围 广 ,构建 多 价 疫苗 强 启动 子 , 体 外 体内 重组 相 结合 (PRA AER) ; ¢ 1 ; : | 第 和 信 章 A ie le Chapter 6. Gene Cloning 基因 克隆 (gene clonging) 是 通过 分 子 生 物 学 技术 获得 一 段 基因 或 DNA 片段 的 大 量 拷 贝 ;, 从 而 对 该 基因 进行 研究 或 应 用 的 过 程 和 技术 ,又 称 为 DNA 克隆 。 基 因 克 隆 是 研究 基因 组 成 ,结构 、 功 能 与 调控 ,以 及 从 分 子 水 平 研究 各 种 生命 现象 ,包括 生长 发 育 、. 遗 传 . 进 化 及 疾 病 等 ;从 而 成 为 改造 细胞 或 个 体 遗 传 性 状 造福 于 人 类 的 基础 。 基 因 克 隆 中 所 扩 增 的 基因 称 为 目的 基因 。 由 于 基因 克隆 时 必须 将 目的 基因 重组 至 载体 中 ,并 导入 受 体 细胞 复制 ,因而 目 的 基因 又 称 为 外 源 基 因 (foreign DNA)。 基因 克隆 是 分 子 生 物 学 的 核心 ,其 关键 技术 是 DNA BARA. DNA #44 (DNA re- combination) 即 用 酶 学 的 方法 ,在 体外 将 不 同 来 源 的 DNA 进行 特异 性 切割 ,并 重新 连接 ,组 合成 一 个 新 的 杂 合 DNA 分 子 的 过 程 。 第 一 节目 的 基因 的 获得 基因 克隆 的 第 一 步 即 获得 目的 基因 。 根 据 研 究 对 象 和 目的 的 不 同 ,目的 基因 可 来 自 原 核 细胞 或 真 核 细 胞 。 原 核 细胞 基因 组 比较 简单 ,其 基因 定位 相对 容易 ,一 般 可 直接 分 离 基因 组 DNA, 酶 切 后 ,以 相应 探 针 调 取 目 的 基因 。 真 核 细胞 基因 组 相对 复杂 ,多 含有 庞大 数目 的 基因 ,其 基因 定位 困难 , 真 核 基 因 的 克隆 多 通过 构建 基因 组 文库 进行 。 根据 人 们 对 目的 基因 序列 的 认识 情况 ,可 采用 不 同 的 基因 克隆 策略 。 一 、 已 知 基 因 的 获得 已 知 基 因 即 序列 已 被 克隆 测序 ,并 做 到 资源 共享 的 基因 。 随 着 分 子 生 物 学 技术 的 发 展 和 大 类 基因 组 计划 的 实施 与 完成 ,人 们 对 基因 的 认识 正在 以 前 所 未 有 的 速度 发 展 ,已 知 基 因 越 来 越 多 。 由 于 已 知 基因 的 一 级 序列 清楚 ,其 基因 的 获得 相对 容易 ,通常 可 采用 化 学 合成 法 和 PCR 扩 增 法 获得 。 (一 ) 化 学 合成 法 该 法 是 Khorana 于 1967 年 首先 发 明 的 一 种 利用 化 学 反应 合成 朝 核 苷 酸 链 的 方法 。 随 痢 化 学 合成 基因 技术 的 日 益 完善 和 自动 化 ,合成 基因 的 周期 越 来 越 短 , 合 成 的 基因 越 来 越 Ko A 20 世纪 80 年 代 以 来 ,DNA 化 学 合成 方面 取得 了 突破 性 的 进展 。 经 过 几 十 年 的 发 83 。 .84 . 基因 工程 学 展 , 已 从 费时 .费力 ,又 难 掌握 的 液 相合 成 法 发 展 为 自动 化 的 DNA 合成 仪 ,现在 计算 机 控制 的 全 自动 核酸 合成 仪 已 被 广泛 应 用 ,可 按 人 们 设计 好 的 序列 一 次 合成 100 ~ 200bp 长 的 DNA 片段 ,这 使 得 DNA 来 源 不 再 受 限 制 , 极 大 地 促进 了 分 子 生 物 学 的 发 展 , 迄 今 已 有 100 多 种 合成 基因 ,如 胰岛 素 .c- 干 扰 素 、 尿 激酶 基因 等 。 目前 ,全 自动 合成 仪 化 学 合成 DNA 采用 的 是 效率 极 高 的 固 相 亚 磷酸 三 酯 法 。 固 相 亚 磷 酰 胺 三 酯 法 是 将 DNA 固定 在 固 相 载体 上 完成 DNA 的 链 合成 ,其 合成 方向 是 由 合成 引物 的 3 端 向 $ 端 合 成 , 相 邻 核 苷 酸 通 过 3 一 $ 磷酸 二 酯 键 连接 。 其 基本 过 程 包括 : 第 一 步 ,将 预先 连接 在 固 相 载体 上 的 活性 基 团 被 保护 的 核 苷 酸 与 三 氯 乙酸 反应 , 脱 去 其 5 -羟基 的 保护 基 团 Dmt, 获 得 游离 的 $ -羟基 ;第 二 步 , 合 成 DNA 的 原料 ( 亚 磷 酰胺 保护 的 核 苷 酸 单 体 ) 与 活化 剂 四 氮 唑 混合 ,得 到 反应 活性 很 高 的 核 苷 亚 磷 酸 活化 中 间 体 (其 3? 端 被 活化 ,5 -羟基 仍然 被 Dmt 保护 ) ,与 溶液 中 游离 的 $ -羟基 发 生 缩合 反应 ;第 三 步 是 带 帽 (cap- ping) 反 应 ,缩合 反应 中 可 能 有 极 少 数 $ -羟基 没有 参加 反应 , 带 帽 反应 中 使 用 乙酸 酥 和 1- 甲 基 咪 唑 使 这 些 核 背 $ -羟基 反应 形成 酰 ,终止 其 继续 发 生 反应 而 成 为 短片 段 , 这 种 短片 段 可 以 在 纯化 时 分 离 掉 ;第 四 步 ,缩合 后 在 氧化 剂 碘 的 作用 下 , 亚 磷 酰 形式 转变 为 更 稳定 的 磷酸 三 酯 。 经 过 以 上 四 个 步骤 ,一 个 脱氧 核 背 酸 被 连接 到 固 相 载体 的 核 苷 酸 上 。 再 以 三 氯 乙酸 脱 去 它 的 $ -羟基 上 的 保护 基 团 Dmt, 重 复 以 上 步骤 ,直到 所 有 要 求 合成 的 碱 基 被 接 上 去 。 以 上 合成 的 粗 产 物 ,使 用 浓 氮 水 在 SSC ,8 一 10h 脱 去 碱 基 环 上 的 保护 基 团 ,再 使 用 各 种 纯化 方式 去 除 合成 过 程 中 形成 的 短片 段 ,得 到 合乎 要 求 的 DNA 片段 。 DNA 化 学 合成 常用 来 合成 PCR 引物 .DNA 探 针 测序 引物 及 目的 基因 合成 等 ,几乎 涉 及 整个 生命 科学 领域 。 化 学 合成 法 的 准确 性 极 高 ,合成 速度 较 快 ,是 一 个 十 分 有 用 的 手段 , 它 不 仅 可 直接 合成 基因 ,还 能 改造 基因 结构 ER RIA SEAM EKER DNA 片段 可 作为 探 针 引物 和 人 工 接头 ,在 基因 工程 研究 中 具有 重要 的 作用 。 但 化 学 合成 价格 昂贵 ,所 以 目前 很 少 全 部 用 化 学 方法 去 合成 大 片段 基因 。 (=) PCR 扩 增 对 于 已 部 分 了 解 或 完全 清楚 的 基因 ,可 以 通过 PCR 反应 直接 从 染色 体 DNA 或 cDNA 上 高 效 快速 地 扩 增 出 目的 片段 ;只 要 了 解 基因 两 侧 的 DNA 顺序 ,并 分 别 在 5 端 和 3 端 设计 引物 ,以 含有 微量 目的 基因 的 样品 为 模板 ,利用 DNA 聚合 酶 ,根据 DNA 复制 的 碱 基 配 对 原 则 ,可 在 体外 按 2” 指数 扩 增 ,获得 所 需 基 因 。PCR 的 原理 及 技术 参见 第 九 章 。 另 外 ,最 近 几 年 发 展 起 来 的 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT- PCR) 已 成 为 克隆 真 核 基因 常用 的 有 效 方法 。 该 法 省 去 了 cDNA 文库 的 构建 和 筛选 等 操作 , 可 用 于 基因 转录 产物 分 析 .cDNA 克隆 .cDNA 探 针 制备 和 RNA 高 效 转录 系统 的 构建 。 PCR 可 以 扩 增 各 种 材料 的 DNA ,而 不 必 分 离 目的 基因 ,其 成 功 的 关键 在 于 引物 的 设计 。 PCR 具有 简便 .快速 的 特点 ,目前 除 用 做 扩 增 已 知 基因 外 ,已 成 为 检测 特定 基因 进行 基 因 突变 分 析 的 重要 方法 。 然而 ,由 于 PCR 每 轮 扩 增 的 产物 是 下 一 轮 复制 的 模板 , 随 着 快速 复制 次 数 的 增加 ,其 错 误 几 率 也 越 来 越 大 ,实验 统计 表明 ,35 轮 复制 后 的 错误 几率 约 为 0.25% ,而 且 由 于 较 小 的 第 六 章 基因 克隆 - 85. DNA 片段 容易 扩 增 而 优先 聚集 ,所 以 PCR 法 不 适 于 扩 增 基因 用 于 研究 其 精确 结构 .调节 控 制 位 点 。 AAA A AY aR TS 尽管 人 类 基因 组 计划 已 完成 ,但 真 核 生物 众 多 , 真 核 基 因 组 信息 繁杂 ,尤其 是 各 种 功能 基因 仍 不 为 人 所 知 ,因而 尚 有 许多 目的 基因 序列 未 知 。 对 于 未 知 基因 的 获得 ,可 以 采用 下 列 方法 : (一 ) 构建 基因 组 文库 ,筛选 目的 基因 基因 组 DNA 文库 (genomic DNA library) 理 论 上 包含 某 一 生物 基因 组 DNA 的 全 部 序列 。 构建 基因 组 文库 的 基本 方法 是 :从 生物 组 织 细胞 中 提取 出 全 部 DNA, 用 物理 方法 (超声 波 搅拌 剪 力 等 ) 或 酶 法 将 DNA 降解 成 预期 大 小 的 片段 ,然后 将 这 些 片段 与 适当 的 载体 ( 鸣 菌 体 BAL BK YAC、BAC 载体 ) 连 接 , 转 人 受 体 细菌 或 细胞 ,这 样 每 一 个 细胞 接受 了 含有 一 个 基因 组 DNA 片段 与 载体 连接 的 重组 DNA 分 子 ,而 且 可 以 复制 扩 增 ,许多 细胞 一 起 组 成 一 个 含有 基因 组 各 DNA 片段 克隆 的 集合 体 ( 图 6-1) 。 Sia AE DNA 真 核 基因 组 DNA BarmHI nen ea oe the = 右 臂 BamHI cos L | a R_ cos MDoT 部 分 酶 切 消化 中 加 片段 | SF, ee te cos, al R= cos -一 一 一 一 一 一 Sen = 45 约 20kb 人 小 的 DNA 片段 Res cos EEL —20kb R *cos¥ ae 92% ® OOO Y anew | 感染 E.coli q 构建 基因 组 文库 图 6-1 基因 组 文库 构建 流程 示意 图 -86- 基因 工程 学 从 文库 中 利用 杂 交 或 PCR 方法 能 钓 取 该 生物 的 全 部 基因 或 DNA 序列 。 构建 基因 组 文库 ,再 用 分 子 杂 交 等 技术 去 钓 取 基因 克隆 的 方法 , 称 为 鸟 枪 法 。 当 生物 基 因 组 比较 小 时 ,此 法 较 易 成 功 ; 当 生 物 基因 组 很 大 时 ,构建 完整 的 基因 组 文库 和 从 庞大 的 文 库 中 克隆 目的 基因 具有 一 定 难 度 , 因 而 限制 了 其 应 用 。 (二 ) 构建 cDNA 文库 ,筛选 目的 基因 cDNA 是 指 以 mRNA 为 模板 ,在 反 转 录 酶 的 作用 下 形成 的 互补 DNA( 简 称 CDNA). cDNA 文库 (cDNA library) 即 包含 着 细胞 全 部 mRNA 信息 的 cDNA 克隆 的 集合 ,其 基本 构 建 过 程 为 :提取 组 织 细胞 的 全 部 mRNA, 在 体外 反 转 录 成 cDNA, 与 适当 的 载体 连接 后 转化 受 体 菌 , 则 每 个 细菌 含有 一 段 cDNA, 并 能 繁殖 扩 增 ,这 些 细菌 的 集合 构成 该 组 织 细胞 的 cDNA 文库 。 基因 组 含有 的 基因 在 特定 的 组 织 细 胞 中 只 有 一 部 分 表达 ,而且 处 在 不 同 环境 条 件 、 不 同 分 化 时 期 的 细胞 其 基因 表达 的 种 类 和 强度 也 不 尽 相 同 ,所 以 cDNA 文库 具有 组 织 细胞 特异 性 - 而 且 cDNA 文库 去 除了 不 编码 的 非 结 构 基 因 ( 如 内 含 子 .启动 子 ) , 比 基 因 组 DNA 文库 小 得 多 ,能 够 比较 容易 地 从 中 筛选 出 克隆 细胞 特异 表达 的 基因 ,是 发 现 新 基因 和 研究 基因 功 能 的 基础 工具 。 建立 cDNA 文库 后 ,如 何 有 效 地 获取 或 筛选 到 目的 基因 ,可 根据 基因 而 采取 不 同 的 方 法 。 若 对 目的 基因 序列 有 所 了 解 ,筛选 的 最 直接 方法 是 用 核酸 探 针 进行 杂交 ,或 设计 引物 进 行 PCR 扩 增 。 若 目的 基因 序列 不 清楚 ,而 基因 产物 的 部 分 氨基 酸 序列 已 知 时 ,可 利用 氢 基 酸 序列 指导 合成 核 苷 酸 探 针 获 得 目的 基因 。 此 外 ,也 可 利用 差异 显示 技术 筛选 组 织 特 异性 表达 的 功能 基因 。 (=) mRNA 差异 显示 技术 筛选 差异 表达 基因 通过 建 库 的 方法 筛选 目的 基因 工作 量 大 ,成 功率 低 ,尤其 是 随 着 人 类 基因 组 计划 的 实施 与 完成 , 越 来 越 多 的 基因 序列 被 人 们 发 现 和 认识 ,通过 建 库 的 方法 寻找 新 基因 ,几率 越 来 越 ys 差异 显示 是 利用 一 对 组 织 基因 表达 的 差异 ,筛选 出 在 某 种 组 织 中 受 某 因 素 调控 的 一 个 或 一 组 差异 表达 基因 的 常用 方法 。 差异 显示 技术 进展 迅速 ,其 中 mRNA 差异 显示 是 筛选 差异 表达 基因 的 最 有 效 方法 之 一 。 mRNA 差异 显示 又 称 为 差异 显示 反 转 录 PCR (differential display RT-PCR, DDRT- PCR) ,由 哈佛 大 学 医学 院 Peng Liang 和 Arthar B. Pardee 博士 于 1992 年 发 明 建立 ,至 1996 年 发 展 成 熟 。 差异 显示 技术 的 基本 原理 和 过 程 是 :建立 一 组 具有 可 比 性 的 细胞 (如 肿瘤 组 织 和 正常 组 织 ) , 抽 提 其 在 某 一 条 件 下 表达 的 所 有 mRNA, 构 建 cDNA 文库 ;同时 以 实验 组 (肿瘤 细胞 ) 和 对 照 组 (正常 细胞 )mRNA 为 模板 ,经 RT-PCR 制备 放射 性 cDNA 探 针 ,并 分 别 与 上 述 实 验 组 cDNA 文库 进行 杂交 ;然后 用 变性 聚 丙烯 酰胺 测序 胶 分 析 其 差别 ,将 有 差别 的 基因 克隆 化 ,进一步 分 析 其 结构 与 功能 (图 6-2)。 . ae 第 六 章 BARE 87. 肿瘤 组 织 细胞 IER AAA He Pe | 分 离 poly(A)mRNA [> poly(A)mRNA # 肿 AAAAA ik JH AAAAA AAAAA 外 AAAAA AAAAAS 25 a eee > Si 证 AAA oligo(dT) | Pace oligo(dT) Kae RIG 构建 CDNA XCF Be 32p_ dNTPs tt. E.coli 2P_dNTPs ?2P 标 记 的 CDNA PRET (SN = ?2P 标 记 的 CDNA 换 旬 | 杂交 | 杂交 母 板 复制 到 硝酸 纤维 素 腊 上 | an eM a | i we At yay 4a Hse tO CDNA 所 在 的 we KE H ti cDNA 克隆 Af < ‘= ps X ENF 图 6-2 FA Be Fe Se A ASR Ise AP HF Se He A BY 差异 显示 技术 可 以 筛选 同一 种 细胞 在 不 同 条 件 下 表达 的 基因 (包括 组 织 特异 性 表达 ,组 织 发 育 或 细胞 周期 的 某 一 阶段 表达 的 已 知 或 未 知 基 因 ) ,也 可 以 筛选 受 某 一 刺激 因素 或 病理 因素 调控 表达 的 基因 。 差 异 显示 主要 用 于 肿瘤 等 多 种 疾病 的 分 子 遗传 学 研究 ,可 有 效 筛 选 获得 疾病 相关 分 子 ,也 可 用 于 对 不 同类 型 ,不 同时 期 细胞 的 基因 或 基因 表达 情况 进行 比较 ， 以 获取 对 整个 细胞 生命 过 程 的 有 用 信息 。 差异 显示 的 优点 在 于 :@ 简 单 , 仅 需要 PCR 及 DNA 测序 胶 电 泳 ,可 在 大 多 数 实 验 室 开 展 ;多 灵敏 性 高 , 仅 需 0.2ug RNA 作为 起 始 材 料 ;@ 可 同时 分 析 多 组 样品 ;由 重复 性 好 ,90% 的 条 带 可 重 现 ;@ 快 速 ,2 天 内 可 获得 cDNA 谱 带 ,一 周 内 可 进行 探 针 的 扩 增 及 杂交 筛选 。 由 于 上 述 优 点 ,差异 显示 广泛 应 用 。 但 差异 显示 技术 也 存在 不 少 问题 ,概括 起 来 有 两 方面 : 一 是 假 阳 性 多 ( 约 50% ~70% ) ,二 是 得 到 的 有 差异 CDNA 片段 短 ( 约 110 一 500bp)。 (四 ) 差异 蛋白 质谱 表达 技术 筛选 功能 基因 差异 蛋白 质谱 表达 技术 是 利用 双向 蛋白 电泳 对 相关 细胞 中 蛋白 表达 的 差异 进行 直接 比 - 较 ,克隆 ,从 而 鉴定 相关 功能 蛋白 的 方法 。 由 于 差异 蛋白 质谱 表达 技术 直接 分 析 蛋 白 表达 的 差异 ,能 够 最 大 限度 地 减少 假 阳性 率 , 提高 工作 效率 , 较 mRNA 差异 显示 技术 更 为 简便 、 有 效 , 是 功能 基因 组 学 研究 中 兴起 的 新 技术 。 差异 蛋 日 质谱 表达 技术 的 基本 过 程 包括 :@ 建 立 具 有 可 比 性 的 细胞 在 某 一 条 件 下 的 表达 -88: BALES ee A Joa ies , BN fre Bee a AP Bk a At: 9 A ed Peas 9 A, 8 XD] Ba Bk ,将 各 种 蛋白 按 相对 分 子 质量 和 带电 荷 情况 完全 分 开 ;@O 比 较 两 种 细胞 中 和 蛋白 表达 的 差异 ,通过 图 像 分 析 和 软 件 处 理 ,发 现 表 达 有 差异 的 蛋白 质 ;@ 克 隆 差异 表达 基因 。 切 下 差异 表达 的 相应 胶带 ,进行 氨 基 酸 测序 ,获得 新 基因 的 部 分 序列 ; 据 此 合成 探 针 , 即 可 从 相应 文库 中 获取 、 克 隆 全 基因 。 第 二 T 基因 重组 将 目的 基因 插入 载体 的 过 程 , 即 基因 重组 (gene recombination) ,其 基本 过 程 包括 :首先 在 目的 基因 和 载体 两 端 造成 切口 ,然后 依赖 双 链 DNA 黏 末 端 单 链 序列 的 互补 结合 和 DNA 连接 酶 将 切口 补 上 。 这 一 步 的 实质 就 是 将 两 种 DNA 在 体外 进行 酶 促 连接 ,最 终 获 得 一 个 重组 子 。 正 确 的 克隆 需要 有 正确 纯净 的 DNA 片段 .相对 应 的 末端 浓度 和 适宜 的 连接 物 ( 载 体 ) 分 子 构 型 。 一 般 连 接 反 应 中 外 源 DNA 与 载体 的 比例 采用 3:1,4:1 或 5:1。 不 同 来 源 .性质 的 外 源 片 段 采 用 的 连接 方法 不 同 。 常 采用 的 连接 方法 有 : 黏 末 端 连接 法 . 平 端 连接 法 人 工 接头 法 和 同 聚 物 接 尾 法 。 一 、 熏 末端 连接 1. 全 同 源 黏 末端 连接 ”如果 目的 序列 两 端 有 与 载体 上 相同 的 限制 性 核酸 内 切 酶 位 点 ， 则 同一 限制 性 核酸 内 切 酶 酶 切 后 在 目的 基因 与 载体 的 两 端 产生 完全 同 源 的 黏 末 端 ,在 降低 温度 退火 时 ,能 重新 互补 结合 ,在 DNA 连接 酶 催化 下 ,目的 序列 与 载体 DNA 连接 ,实现 基 因 重 组 , 称 为 全 同 源 黏 末 端 连 接 ( 图 6-3 ) 。 不 同 的 限制 性 内 切 酶 酶 切 , 如 果 产 生 的 DNA 黏 末 端 相同 ,也 同样 可 用 此 法 连接 ,如 识 别 6bp 序列 的 BamH I 和 识别 4bp 序列 的 Mobo 工 切 割 DNA 后 ,都 产生 $ 突出 黏 性 末端 GATC, 可 以 互补 结合 连接 。 全 同 源 黏 末端 连接 是 最 方便 的 克隆 方法 ,其 连接 效率 高 ,一 般 可 采用 低 浓 度 连 接 酶 在 低 温 ( 低 于 16°C ) 高 浓度 ATP 的 情况 下 进行 连接 。 全 同 源 黏 末 端 连接 的 缺点 是 :容易 出 现 载体 自身 环 化 、 双 向 插 人 ( 即 目的 基因 以 两 种 方 向 插入 载体 ) 和 多 拷贝 插 和 人 的 现象 ,从 而 在 转化 后 出 现 高 背景 ,使 得 筛选 更 为 困难 。 双 向 揪 和 人 尽管 对 基因 克隆 无 影响 , 却 会 影响 基因 的 表达 。 采 用 碱 性 磷酸 酶 事先 对 载体 DNA 进行 去 磷酸 化 处 理 , 可 有 效 避 免 载 体 的 自身 环 化 现象 ;建立 连接 体系 时 , 若 将 目的 基因 和 载体 DNA 的 摩尔 数控 制 在 2 一 3:1, 则 可 有 效 减 少 多 拷贝 插入 的 问题 。 2. 定向 克隆 使 目的 基因 按 一 定 方向 插 和 人 载体 的 克隆 方案 称 为 定向 克隆 。 最 常用 的 定向 克隆 方案 是 用 两 种 限制 性 核酸 内 切 酶 切割 载体 和 目的 基因 ,从 而 在 载体 和 目的 基因 两 端 产生 非 同 源 互补 的 两 个 黏 末端 ( 黏 - 黏 连接 )。 定 向 克隆 也 可 以 通过 在 一 端 造成 平 端 , 另 一 端 产生 同 源 黏 末端 实现 黏 - 平 连接 。 定向 克隆 有 效 地 限制 了 载体 的 自身 环 化 ,并 且 实 现 了 目的 基因 的 定向 插入 ,在 基因 克 隆 ,尤其 是 表达 某 一 基因 时 ,极为 有 用 。 定 向 克隆 的 连接 体系 与 相应 的 黏 末端 连接 或 平 端 连 接 相同 。 a Ne: ee ~ EcoRI] EcoRI | 质粒 Ce i 图 6-3 全 同 源 黏 末端 连接 二 、 平 端 连接 T4DNA 连接 酶 能 催化 限制 性 内 切 酶 切割 产生 的 DNA 平 末 端 进行 连接 。 如 果 目 的 序 列 和 载体 上 没有 相同 的 限制 性 内 切 酶 位 点 可 供 使 用 ,用 不 同 的 限制 性 内 切 酶 切割 后 的 黏 性 末端 不 能 互补 结合 , 则 可 用 适当 的 酶 将 DNA 突出 的 末端 削 平 或 补 齐 成 平 未 端 ,再 用 T4DNA 连接 酶 连接 。 平 端 连接 比 黏 末端 连接 的 效率 低 很 多 ,但 具有 普 适 性 ,可 适用 于 任何 DNA 片段 间 的 连 接 , 是 非常 有 用 的 基因 克隆 策略 。 另 外 , 平 端 连接 还 常用 于 将 人 工 合成 的 人 工 接头 连接 到 DNA 末 端 ,为 进一步 的 克隆 奠定 基础 。 平 端 连 接 的 主要 缺点 是 连接 效率 低 和 存在 多 拷贝 插入 ,为 此 ,在 平 端 连接 时 , 需 采 用 高 浓度 的 DNA 和 连接 酶 ,同时 ,在 连接 体系 中 加 入 低 浓 度 的 聚 乙 二 醇 类 物质 ,也 可 有 效 提高 连接 效率 。 多 拷贝 插入 的 缺点 ,可 通过 控制 插入 片段 与 载体 的 摩尔 比 解决 。 三 、 同 聚 物 加 尾 法 如 果 连 接 的 两 个 DNA 片 段 没有 能 互补 的 黏 末 端 ,可 通过 同 聚 物 加 尾 法 在 其 末端 引入 . 90 . 基因 工程 学 互补 黏 末 端 , 即 用 末端 核 苷 酸 转移 酶 催化 脱氧 单 核 苷 酸 添加 至 DNA 的 3 末端 ,例如 一 股 DNA 的 3 端 加 上 polyG, 另 一 股 DNA AY 3 端 加 上 polyC( 图 6-4) ,这 样 就 可 人 工 在 DNA 两 庙 做 出 能 互补 的 核 苷 酸 多 聚 物 黏 性 末端 ,退火 后 结合 连接 ,这 样 的 方法 称 为 同 聚 物 加 尾 法 。 ie zy i 5" 3% : 5 Ul 3 ' 5 载体 DNA 目的 DNA 一 dGTP dCTP 上 本 剖 脱 气 术 有 本 村 移 酶 -于 全 让: ae polyG polyG — polyC polyC polyG 图 6-4 同 聚 物 加 尾 法 连接 原理 示意 图 四 、 人 工 接头 连接 对 平 末端 的 DNA 或 没有 互补 黏 末 端的 DNA, 除 同 聚 物 加 尾 法 外 ,也 可 先 连 上 人 工 设计 合成 的 脱氧 守 核 苷 酸 双 链 接头 ,使 DNA 末端 产 生 新 的 限制 性 内 切 酶 位 点 ,经 内 切 酶 切割 后 , 即 可 按 黏 性 末端 相连 。 人 工 接头 是 人 工 合成 的 短 DNA 序列 ,可 用 于 DNA 的 连接 ,人 工 接头 有 两 种 :连接 子 和 普 适 子 。 1. 连接 子 (linker) 连接 子 是 一 段 人 工 合成 的 短 DNA 序列 ,其 中 含有 一 或 多 个 限制 性 核酸 内 切 酶 位 点 , 含 多 个 限制 性 核酸 内 切 酶 位 点 的 连接 子 称 为 多 聚 连接 子 (polylinker)。 连 接 子 两 端 均 为 平 末端 ,可 与 目的 DNA 通过 平 端 连接 ,经 合适 的 酶 切 后 可 在 目的 基因 与 载体 间 人 为 引入 黏 末端 ,提高 连接 效率 。 连接 子 适 用 于 对 DNA 平 末端 的 改造 和 连接 。 除 此 之 外 ,在 构建 基因 组 文库 时 ,需要 对 内 切 酶 消化 后 的 DNA 片段 进行 PCR 克隆 、 扩 增 , 这 时 可 首先 将 带 有 黏 末 端的 DNA 片段 补 平 ,再 与 连接 子 连接 ,这 样 就 在 所 有 DNA 片段 的 末端 引入 了 一 段 共有 序列 ,其 中 包含 了 一 个 相同 的 内 切 酶 位 点 。 对 这 样 的 DNA 群 , 只 用 一 种 引物 (与 相应 连接 子 互补 ) 即 可 对 所 有 DNA 片段 进行 扩 增 , 扩 增 产物 经 相应 的 酶 切 后 ,可 以 非常 方便 的 进行 克隆 。 2. 普 适 子 (adaptor) 普 适 子 是 一 段 人 工 合成 的 一 端 或 两 端 为 黏 末端 的 DNA 序列 ,其 中 包含 一 至 多 个 限制 性 核酸 内 切 酶 位 点 。 普 适 子 克 服 了 连接 子 仅 适 用 于 对 平 端 进行 改造 的 ANS 基因 克隆 -91- 缺点 ,可 以 平 端 与 目的 基因 连接 ,也 可 以 黏 末 端 与 目的 基因 连接 而 改变 其 酶 切 位 点 。 使 得 殉 隆 方 案 有 更 多 的 选择 。 如 : 平 未 端 /EcoR 工 黏 末 端 : 5’ AGCGGCCGCG 3 3’ TCGCCGGCGCTTAA © 5’ BamHI /Pas | Fi YH: 5’ GATCCGGCAACGAAGGTACCACTGCA 3’ 3’ GCCGTTGCTTCCATGGT 5’ HY. TAKE 随 着 PCR 及 其 相关 技术 的 不 断 发 展 和 完善 ,其 应 用 范围 日 益 广泛 ,如 何方 便 、 快 捷 和 高 效 地 克隆 PCR 产物 越 来 越 成 为 众多 研究 者 关注 的 焦点 。 克 隆 PCR 产物 有 若干 好 处 ,一 是 有 利于 测序 ,二 是 方便 产物 的 大 量 制备 ,从 而 满足 进一步 研究 的 需求 ,如 探 针 标记 杂交 等 。 目前 ,T-A 克隆 是 用 来 直接 克隆 PCR 产物 的 方便 方法 。 其 基本 原理 是 :由 于 TagDNA 聚合 酶 在 扩 增 目的 基因 的 同时 ,可 以 不 依赖 模板 而 在 产物 的 两 端 加 上 两 个 游离 的 ”A” ,因而 只 要 载体 切口 处 人 工 加 上 游离 的 “T” ,PCR 产物 即 可 与 载体 连接 。T-A 克隆 载体 已 被 广泛 应 用 ,并 已 成 为 商品 化 的 载体 。 图 6-5 是 pGEM-T 载体 的 物理 图 谱 。 Aat I Nde 2260 2509 Xmn] 1937 Scal 1010 6-5 是 pGEM-T 载体 的 物理 图 谱 第 三 节 BATRA Shea 目的 基因 与 载体 连接 后 ,要 导入 细胞 中 才能 复制 扩 增 ,再 经 筛选 ,才能 获得 重组 DNA 的 分 子 克 隆 。 不 同 的 载体 在 不 同 的 宿主 细胞 中 复制 ,导入 细胞 的 方法 也 不 相同 。 -92- 基因 工程 学 3 等 加 上 "人 转化 (transformation) 是 指 将 质粒 DNA 或 以 质粒 为 载体 构建 的 重组 子 导 和 人 细胞 的 方 ie. 早 在 1943 年 Avery 等 就 发 现 有 毒 肺炎 链球 菌 的 DNA 与 无 毒 肺炎 链球 菌 共 培养 后 产 生 有 毒性 的 肺炎 链球 菌 后 代 的 转化 现象 ,证 明 质 粒 DNA 具有 进入 细胞 的 能 力 , 但 DNA 自 然 进 入 细胞 的 效率 很 低 。 在 分 子 生 物 学 和 基因 工程 工作 中 常 采 取 一 些 方法 处 理 细胞 ,使 之 容易 接受 外 界 DNA， 处 于 这 种 状态 的 细菌 即 称 为 感受 态 (competent cell) 。 将 感受 态 细 菌 与 外 源 DNA 接触 ,可 大 大 提高 转化 效率 。 最 常用 的 转化 方法 是 CaCl 法 ,其 基本 过 程 包括 :首先 将 大 肠 杆菌 经 冰冷 CaCl, 的 处 理 ,成 为 感受 态 细菌 ,然后 加 入 重组 质粒 并 迅速 由 4 人 转 和 人 42 尼 做 短 时 间 处 理 ( 热 RSE) ,质粒 DNA 就 能 进入 细菌 。 此 外 ,用 高 电压 脉冲 短暂 作用 于 细菌 也 能 显著 提高 转化 效率 , 即 电 穿孔 (electroporation ) 转 化 法 。 ar 染 一 从 JN 噬菌体 进入 宿主 细菌 或 病毒 进入 宿主 细胞 中 复制 的 天 然 过 程 就 是 感染 (infection)。 以 经 人 工 改造 的 叭 菌 体 或 病毒 做 载体 时 ,以 其 DNA 与 目的 序列 重组 后 , 需 经 体外 包装 形成 有 活力 的 吻 菌 体 或 病毒 颗粒 ,模仿 天 然 过 程 ,借用 叹 菌 体 或 病毒 的 外 碗 蛋白 将 重组 DNA 注入 细菌 或 细胞 ,使 目的 序列 得 以 复制 繁殖 ,这 一 过 程 亦 称 感染 。 感 染 的 效率 很 高 ,但 DNA 包装 成 噬菌体 或 病毒 的 操作 较 繁琐 。 Sa Fe okt EE BA AS Jog BE BK A Hy RAR AY EZ DNA 导入 细胞 的 过 程 , 称 为 转 染 (transfection ) 。 转 染 不 同 于 感染 之 处 在 于 , 转 染 时 勿 需 体 外 包装 形成 病毒 颗粒 ,而 是 先 经 过 CaCl, 、 电 穿孔 等 处 理 宿主 菌 ,使 之 成 为 感受 态 ,然后 ,重组 的 鸣 菌 体 或 病毒 DNA 也 可 以 质粒 DNA 的 方式 进入 宿主 菌 ,并 复制 扩 增 。 最 经 典 的 转 染 方 法 是 1973 年 建立 的 磷酸 钙 法 ,其 基本 原理 是 :将 DNA 与 磷酸 钙 混合 ， 制备 磷酸 钙 -DNA 共 沉 淀 物 ,此 时 ,培养 细胞 摄取 DNA 的 效率 会 显著 提高 。 此 外 ,用 电 穿 孔 法 处 理 培养 的 哺乳 类 细胞 也 能 提高 细胞 摄取 DNA 的 能 力 , 但 所 用 外 加 电场 强度 . 电 脉 冲 时 间 等 条 和 件 均 与 处 理 细 菌 不 同 。 脂 质 体 (liposome) 转 染 法 用 人 工 脂 质 膜 包 庄 DNA, 通 过 胞 腊 融合 将 DNA 导入 细胞 ,方法 简单 有 效 ,近年 来 使 用 日 益 广 泛 。 第 四 节目 的 基因 序列 死 隆 的 筛选 与 鉴定 目的 序列 与 载体 DNA 正确 连接 ,并 重组 导 和 人 细胞 的 频率 极 低 。 一 般 一 个 载体 只 携 融 \ BANS 基因 克隆 - 93- 革 一 段 外 源 DNA ,一 个 细胞 只 接受 一 个 重组 DNA 49 -F, PR Sif UE ( screening) 3k A 92 BE AY 重要 步骤 。 盘 选 目 的 基因 就 是 挑选 出 含有 目的 序列 的 重组 体 (recombinant ) 。 以 下 就 常用 技术 的 基本 原理 加 以 介绍 。 ry Hee He Ba ZA a AS AY toy PE iE 克隆 载体 中 都 带 有 用 于 筛选 的 标志 基因 ,利用 这 些 标志 可 以 筛选 获得 阳性 重组 子 。 克 隆 载体 携带 的 最 常见 标志 是 耐 药 性 标志 ,如 抗 氨 革 西林 (az5) LAKE ( tet") 、 抗 卡 那 霉 素 (kezo) 等 。 若 外 源 基 因 插 入 在 抗 性 基因 外 部 ,在 含有 抗生素 的 培养 基 中 ,只 有 携带 相应 耐 药性 基因 载体 的 细胞 (阳性 重组 子 ) 才 能 生存 繁 Met WA ,而 未 能 接受 载体 DNAS 4 EGS) 4 BB BE SBE (or \ 掉 。 如 果 外 源 目 的 基因 插入 在 载体 的 而 药性 基 | 转化 pBR322 外 源 DNA 因 内 部 ,该 耐 药 性 基因 被 插入 灭 活 , 则 含有 目的 oe | psTI ¥ PSTI 基因 的 阳性 重组 子 就 会 丢掉 此 种 抗 性 。 例 如 质 + PSTI SN eer ce a oes 粒 pBR322 3% amp! 和 res 两 个 抗 药 基因 ,车 espe SF sae 将 目的 序列 插入 tec’ 基因 序列 中 ,转化 大 肠 杆 EE amp ae A ,让 细菌 在 含 氨 葵 西林 或 四 环 素 培 养 基 中 增 any Peed 殖 , 凡 未 接受 质粒 DNA 的 细胞 都 不 能 生长 ; 凡 i 在 含 氨 革 西林 和 四 环 素 的 培养 基 中 都 能 生长 的 2 tate | 细菌 是 含有 质粒 pBR322 的 ,但 其 pBR322 未 插 ei pM amp FAK SELES 大 目的 序列 ; 凡 在 含 氨 蔡 西林 的 培养 基 中 能 生 G5 长 而 在 含 四 环 素 的 培养 基 中 不 能 生长 的 细菌 就 很 可 能 是 含有 目的 序列 的 重组 质粒 (图 6-6). lacZ’ 基因 是 克隆 载体 中 的 另 一 类 重要 标志 基因 ,利用 lacZ 设计 的 蓝 白 斑 筛 选 法 (原理 见 第 五 章 ) ,近年 被 广泛 应 用 。 例 如 将 目的 序列 插入 质粒 pUC19 的 多 克隆 位 点 ,转化 大 肠 杆 菌 后 ,在 含 氨 茶 西林 IPTG、X-gal 的 培养 基 中 培养 ,由 于 lacZ 基因 被 插入 灭 活 ,含有 插 人 目 的 序列 的 重组 质粒 不 能 产生 B 半 乳糖 苷 酶 , 呈 白 色 菌 落 ,这 样 就 很 容易 获得 含有 目的 序列 的 克隆 。 根据 重组 载体 的 标志 来 筛选 ,可 以 去 除 大 量 的 非 目 的 重组 体 , 但 只 是 粗 得 ,在 某 些 情况 会 出 现 假 阳 性 (例如 细菌 可 能 发 生变 异 而 引起 耐 药 性 的 改变 , 却 并 不 代表 目的 序列 的 插入 )， 所 以 需要 做 进一步 的 鉴定 。 图 6-6， 双 抗生素 对 照 .插入 失 活 实验 二 、DNA 限制 性 内 切 酶 图 谱 分 析 这 是 在 上 述 筛 选 后 的 进一步 分 析 。 目 的 序列 插入 载体 会 使 载体 DNA 限制 性 酶 图 谱 (restriction map) 发 生变 化 。 利 用 这 种 变化 可 以 鉴定 插入 序列 的 大 小 和 方向 。 最 常用 的 方 法 就 是 利用 重组 时 的 酶 切割 重组 子 DNA, 若 获得 与 目的 基因 一 致 的 片段 即 证 明 重 组 子 中 含 -94- 基因 工程 学 有 揪 和 人 序列。 || 利用 标记 的 核酸 做 探 针 与 转化 细胞 的 DNA 进行 分 子 杂 交 , 可 以 直接 筛选 和 鉴定 含 目 的 基因 的 阳性 克隆 。 常 用 的 杂交 方法 包括 菌落 原 位 杂交 、Southern 杂交 。 其 中 菌落 原 位 杂 交 直 接 将 转化 后 生长 的 菌落 复印 到 硝酸 纤维 素 膜 上 ,经 碱 裂 解 后 ,将 菌落 释放 的 DNA 原 位 吸附 在 膜 上 ,再 与 标记 的 核酸 探 针 温 育 杂 交 ,核酸 探 针 就 结合 在 含有 目的 基因 的 菌落 DNA 上 而 不 被 洗 脱 , 待 显 色 后 就 可 以 将 含有 目的 序列 的 菌落 挑选 出 来 。 四 、PCR 法 PCR 技术 的 出 现 给 克隆 的 筛选 增加 了 一 个 新 手段 。 如 果 已 知 目的 序列 的 长 度 和 两 端 的 序列 ,设计 合成 一 对 引物 ,以 转化 生长 的 细菌 质粒 DNA 为 模板 进行 扩 增 ,挑选 出 PCR 产 物 与 预期 长 度 相 符 的 克隆 ,可 能 就 是 含有 目的 序列 的 重组 子 。 五 、 免 疫 学 方法 此 法 不 是 直接 筛选 目的 基因 ,而 是 通过 特定 的 标记 抗体 与 基因 表达 产物 的 反应 指示 含 有 目的 基因 的 转化 细胞 ,因而 要 求 目 的 基因 进入 受 体 细胞 后 能 够 表达 。 常 用 来 标记 抗体 的 酶 包括 过 氧化 物 酶 、 碱 性 磷酸 酶 等 。 利 用 酶 可 催化 特定 的 底 物 反应 而 呈现 颜色 变化 ,可 以 指 示 出 含有 目的 基因 的 克隆 位 置 。 免疫 学 方法 特异 性 强 灵敏度 高 ,适用 于 从 大 量 转 化 细胞 集合 体 中 筛选 很 少 几 个 含 目的 基因 的 细胞 克隆 。 六 、 核 苷 酸 序 列 测 定 经 上 述 方法 筛选 鉴定 的 克隆 ,都 要 用 核酸 序列 测定 进行 最 后 鉴定 。 通 过 测序 可 以 确证 已 知 基因 的 克隆 准确 无 误 ; 如 果 克 隆 序列 未 知 ,通过 测序 才能 确 知 其 结构 ,推测 其 功能 ,用 于 进一步 的 研究 。 因 此 核酸 序列 测定 是 分 子 克隆 中 必 不 可 少 的 鉴定 步 又。 核酸 序列 测定 的 原 理 和 方法 详 见 第 十 一 章 。 (4A) Bos “原核 细胞 表达 系统 Chapter 7. Prokaryotic Expression System 基因 工程 的 一 个 重要 目的 就 是 获得 有 功能 的 蛋白 质 产品 。 这 一 目的 的 实现 ,包括 目的 基因 的 克隆 复制 转录、 翻译 \ 加 工分 离 纯化 等 一 系列 复杂 过 程 。 其 中 ,基因 的 克隆 、 复 制 、 转录 及 翻译 需要 在 一 个 合适 的 系统 中 完成 , 即 基 因 表 达 系统 。 根 据 受 体 细胞 的 不 同 ,表达 系 统 分 为 原核 表达 系统 和 真 核 表 达 系 统 ,本 章 主要 介绍 原核 表达 系统 。 所 谓 原 核 细 胞 表达 系统 (gene expression in prokaryotic cells) 就 是 将 克隆 的 外 源 基因 导 大 原核 细胞 ,并 使 其 在 原核 细胞 中 以 发 酵 的 方式 快速 高 效 地 表达 、 合 成 基因 产物 。 原 核 细 胞 表达 系统 中 用 于 基因 克隆 的 载体 主要 是 质粒 和 鸣 菌 体 载 体 ( 详 见 前 述 ) ,外 源 基 因 通 过 转 化 或 转 染 的 方式 进入 受 体 细胞 ,并 在 其 中 表达 。 受 体 细胞 是 外 源 基 因 最 终 表达 的 场所 ,在 原 核 细 胞 表达 系统 中 主要 指 大 肠 杆 菌 、 链 霉菌 和 枯草 杆菌 。 本 章 主 要 讲述 如 何 将 克隆 的 外 源 基 因 导 入 原核 细胞 并 得 到 高 效 表 达 。 一 、 外 源 基 因 在 原核 细胞 中 的 表达 外 源 基 因 必 须 在 宿主 细胞 调节 元 件 控制 下 才能 正确 表达 并 获得 有 效 数 量 的 功能 蛋白 质 。 原 核 细 胞 结构 简单 、 表 达 调 控 方 式 单一 ,基因 工程 中 很 多 复杂 的 基因 ,尤其 是 真 核 生 物 基因 要 在 其 中 表达 存在 一 定 难 度 ,因而 有 必要 首先 讨论 一 下 原核 生物 的 基因 结构 和 表达 特 点 。 (一 ) 原核 生物 基因 结构 和 表达 特点 1. 基因 结构 同 真 核 生物 相 比 ,原核 细胞 没有 核 膜 ,基因 结构 简单 。 原 核 基因 是 连续 的 ,其 基因 表达 以 操纵 子 为 单位 。 操 纵 子 是 一 些 功能 相关 的 结构 基因 串联 在 一 起 ,前面 结合 有 调控 区 控制 结构 基因 的 表达 ,这 些 结构 基因 和 调控 基因 共同 组 成 一 个 完整 的 转录 单位 ( 操 纵 子 ) ,完成 一 定 的 功能 。 2. 表达 特点 ”原核 生物 基因 的 转录 和 翻译 是 偶 联 的 、 连 续 进 行 的 ,mRNA 在 合成 过 程 中 可 和 多 个 核糖 体 结合 , 同 时 开始 翻译 多 条 肽 链 , 即 可 形成 多 顺 反 子 mRNA。 原 核 细胞 中 缺乏 转录 后 加 工 系 统 , 不 能 识别 内 含 子 , 同 时 也 缺乏 真 核 细胞 中 的 翻译 后 加 工 修饰 系统 。 原核 生物 中 基因 的 表达 , 同 其 他 生物 一 样 包括 基因 的 有 效 转录 和 mRNA 的 正确 翻译 。 (1) 基因 的 有 效 转录 :原核 生物 中 惟一 的 RNA 聚合 酶 在 转录 过 程 中 识别 并 与 DNA 启 动 子 结合 ,启动 DNA 的 转录 。 启 动 子 是 一 段 DNA 序列 ,是 RNA 聚合 酶 识别 并 结合 的 部 位 ,对 起 始 mRNA 的 合成 必 不 可 少 。 原 核 细 胞 中 各 种 不 同 启动 子 都 含有 两 处 高 度 保守 区 : - O5 - 。 96 . 基因 工程 学 一 是 在 转录 起 始点 上 游 大 约 10bp 处 , 称 为 Pribnow box ,是 一 段 富 含 AT 碱 基 组 成 的 序列 ， 称 为 -10 区 ,或 TATA box; 另 一 处 是 位 于 转录 起 始点 上 游 大 约 35bp 处 ,一段 由 10 个 碱 基 组 成 的 序列 , 称 为 -35 区 。 不 同 启动 子 的 效率 不 同 :RNA 聚合 酶 很 容易 识别 强 启 动 子 ,从 而 产生 较 多 的 mRNA, 弱 的 则 相反 。= 10 区 和 一 35 区 是 决定 启动 子 强 弱 的 重要 因素 ,二 者 间隔 的 碱 基 并 不 十 分 重要 ,但 二 者 间 的 距离 ( 核 苷 酸 数目 ) 却 是 影响 启动 子 强 弱 的 重要 因素 。 原核 生物 中 基因 转录 的 终止 是 以 终止 子 (terminator) 来 完成 的 。 终 止 子 是 位 于 基因 或 操纵 子 3 末端 转录 终止 点 之 前 的 一 段 长 约 7 一 20bp 的 特殊 序列 ,由 一 个 富 含 AX 民 的 区 域 — 4S & G/C 的 回 文 对 称 序列 构成 , 回 文 对 称 结构 的 中 轴 距 转录 终止 点 16 一 24bp。 终 止 子 转录 后 的 mRNA 有 葵 环 结构 ,并 具有 与 AT 区 对 应 的 一 串 UCR 1-10), HFAUZ 间 氢 键 结合 较 弱 ,因而 RNA/DNA 杂交 部 分 易于 分 开 , 从 而 有 利于 转录 产物 从 DNA 模板 上 释放 ,并 使 RNA 聚合 酶 脱离 DNA, 转 录 终 止 。 (2) 基因 表达 的 正确 翻译 :原核 生物 中 转录 与 翻译 是 偶 联 进行 的 。 在 RNA 的 合成 过 程 中 核糖 体 即 可 结合 于 mRNA 上 ,启动 翻译 过 程 。 原 核 生 物 中 mRNA 的 核糖 体 结合 位 点 包 括 翻 译 的 起 始 密码 子 (AUG) 及 SD 序列 。SD 序列 (Shine-Dalgarno 序列 ) 是 1974 年 由 Shine 和 Dalgarno 首先 发 现 的 ,是 细菌 核糖 体 有 效 结合 于 mRNA 和 翻译 起 始 所 必需 的 核 苷 酸 序 列 , 由 AUG 上 游 3 一 10bp 处 的 一 段 3 一 9bp 长 的 富 含 味 叭 核 苷 酸 的 序列 组 成 ,该 序列 刚好 与 16S rRNA 5 末端 的 富 含 喀 啶 的 序列 互补 (图 7-1)。 16SrRNA G 5 端 序 记 A 0 U C U CCUCCA 5’ GAUUCCUAGGAGGUUUGACCUAUGCGAGCUUUUAGU 3! mRNA Al7-1 SD 序列 的 位 置 另外 ,在 大 肠 杆 菌 中 凡 发 生 了 无 义 突变 的 基因 ,其 编码 的 蛋白 质 短 肽 都 被 迅速 降解 ,而 野生 型 蛋 白 质 则 非常 稳定 。 7 WR SS pe er Se RY BE Be oN es 基因 的 表达 才能 最 终 完成 。 (二 ) 外 源 基 因 表 达 的 必要 条 件 综 上 所 述 ,克隆 基因 要 在 原核 细胞 中 获得 有 效 表达 ,必须 具备 下 列 条 件 : 1. 外 源 基 因 的 编码 区 不 能 被 内 含 子 分 隔 , 真 核 基因 的 $ 非 编码 区 必须 被 删除 。 2. 外 源 基 因 必 须 置 于 原核 细胞 的 强 启动 子 和 SD 序列 等 调控 元 件 控制 下 ,启动 子 必须 被 RNA 多 聚 酶 识别 。 3. 外 源 基因 在 载体 中 必须 有 正确 的 开放 阅读 框架 (open reading frame,ORF) 4. 外 源 基 因 mRNA 必须 相对 稳定 和 有 效 地 翻译 ,形成 的 蛋白 质 不 易 被 降解 。 | | 四 RE BCS ”原核 细胞 表达 系统 - 97 - 二 、 影 响 外 源 基因 在 原核 细胞 中 表达 效率 的 主要 因素 外 源 基 因 能 和 否 在 原核 细胞 高 效 表达 决定 于 原核 细胞 启动 子 强 弱 .拷贝 数 高 低 及 核糖 体 结合 位 点 等 因素 。 (—) BAF 基因 高 效 表达 ,必须 选择 强 启动 子 ,常用 的 启动 子 有 : 1. ac 启动 子 来 自 大 肠 杆菌 的 乳糖 操纵 子 (Jacob & Monod,1961)。 乳 糖 操纵 子 的 组 成 包括 :阻碍 蛋白 基因 (7T) .启动 基因 (已 )、 操 纵 基 因 (O) 和 结构 基因 (Z、Y、A, 分 别 编码 候 半 乳糖 苷 酶 .渗透 酶 .乙酰 化 酶 )。 己 是 RNA 聚 合 酶 结合 的 部 位 ,用 于 起 始 转录 ; 工 基因 编 码 阻 遏 蛋白 。 阻 巡 蛋 白 与 操纵 基因 O 结合 后 ,阻止 结构 基因 的 转录 (图 7-2A); 若 诱导 物 与 阻 遏 蛋白 结合 , 阻 遏 蛋白 不 能 与 操纵 基因 结合 ,转录 可 正常 进行 ,结构 基因 表达 (图 7-2B)。 异 两 基 -B-D- 硫 代 半 乳糖 苷 (isopropyl-B-D-thiogalactoside,IPTG) 是 B- 半 乳糖 苷 酶 的 底 物 类 似 物 ; 有 很 强 的 诱导 能 力 , 可 与 阻 遏 蛋白 结合 ,促进 转录 (可 提高 真 核 基 因 表 达 量 50 倍 )。 2. zz 启动 手 “ 从 大 肠 杆 菌 色 氨 酸 操 纵 子 中 分 离 , 受 两 种 调控 :一 种 相当 于 lac 启动 子 的 负 调 控 : 阻 过 基因 编码 的 阻 遏 蛋白 与 色 氮 酸 结合 后 被 活化 ,封闭 操纵 基因 ,使 转录 不 能 进 行 ; 色 氨 酸 缺乏 时 , 阻 遏 蛋白 不 能 与 操纵 基因 结合 ,转录 被 启动 。 另 一 种 调控 通过 衰减 子 完 成 : 色 氨 酸 丰 富 时 ,转录 进行 到 启动 基因 和 操纵 基因 的 衰减 子 停 止 ,而 色 氢 酸 缺 乏 时 ,转录 可 以 通过 衰减 子 ,进行 到 结构 基因 。B- 呀 唆 丙 烯 酸 是 色 氢 酸 竞争 性 抑制 剂 ,可 以 竞争 性 抑制 色 氨 酸 与 阻 遏 蛋白 的 结合 ,促进 转录 。 A 操纵 基因 (O) 结构 基因 启动 了 (P) af i y apt pie 3 @ ide aad leer h ta Cec Pe ae a2 结合 位 点 发 生 改变 es ©. p= mRNA 7-2 乳糖 操纵 子 的 调控 模式 3. Tac AMF f—4 lac Mitrp BAFARCHAAR AT (A trp 启动 子 的 -35 区 和 lac 启动 子 的 =10 KAMA LARA DNA 及 lac 操纵 基因 组 成 )。 启 动能 力 非 常 强 , 受 lac -98- 基因 工程 学 阻 遏 蛋白 的 负 调 节 ,并 被 IPTG HS. 4. PL 和 PR 启动 子 PA MARE RAR MARAT. Kh lac 启动 子 活 性 强 8 一 10 fi. SAMBA C 工 基因 负 调 控 ,C 工 基因 编码 温度 敏感 蛋白 ,其 作用 类 似 于 ac 启动 子 的 阻 遇 蛋白 ,28 一 32 记 时 ,C 工 基因 产生 正常 的 有 功能 蛋白 ,抑制 转录 进行 ,温度 升 高 至 420 时 ,C 工 被 破坏 (可 逆 过 程 ) ,操纵 基因 解除 封闭 ,转录 开始 。 强 启 动 子 可 以 起 始 高 水 平 转录 ,容易 导致 质粒 的 不 稳定 性 ,在 强 启动 子 下 游 安 置 一 终止 子 , 可 以 增强 质粒 的 稳定 性 。 (二 ) 基因 剂量 一 般 来 说 ,细菌 内 基因 拷贝 数 越 多 ,基因 表达 量 越 高 ,因而 可 以 通过 提高 基因 拷贝 数 来 增加 表达 量 。 比 如 ,可 以 采用 温度 诱 生性 载体 ,这 类 载体 在 低温 时 拷贝 数 较 低 ,温度 升 高 后 拷贝 数 大 量 增 加 ,表达 量 升 高 。 (三 ) 核糖 体 结合 位 点 翻译 效率 受 下 列 因 素 影响 :QOSD 序列 与 16S rRNA 3’ 未 端的 互补 程度 ;@SD 序列 的 核 苷 酸 组 成 及 其 与 AUG 之 间 的 距离 ;@AUG 两 侧 位 于 - 20 至 +13 之 间 的 核 苷 酸 组 成 。 三 、 原 核 细 胞 表达 载体 的 条 件 及 特点 一 段 删 除 内 含 子 和 $ 非 编 码 区 的 外 源 基因 经 酶 切 .连接 、 克 隆 成 功 后 ,要 在 原核 细胞 中 表达 ,必须 借助 于 合适 的 表达 载体 。 表 达 载 体 (expression vector) 不 同 于 克隆 载体 ,前 者 是 适 用 于 受 体 细 胞 中 表达 外 源 基因 的 载体 ;而 后 者 是 适用 于 受 体 细胞 中 复制 、. 扩 增 外 源 基 因 的 载 体 。 二 者 的 功能 不 同 ,其 构成 也 不 同 。 根 据 外 源 基 因 在 原核 细胞 中 表达 所 需 的 必要 条 件 和 影响 表达 量 的 因素 ,一 个 成 功 的 原核 表达 载体 必须 具备 下 列 元 件 : > 1. 强 启动 子 ”产生 大 量 与 克隆 基因 1 原核 操纵 了 互补 的 mRNA。 | EU 融合 基因 2. SD 顺序 ”提供 合适 的 核糖 体 结合 0 位 点 ,启动 正确 高 效 的 翻译 过 程 。 site Le 3. 筛选 标志 基因 和 其 他 一 些 调控 基 saa RS ae sor sees mee PL 7S RDB 0 HA BAST = A AS 同 的 基因 产物 。 le Pe et (1) 融合 型 表达 载体 产生 融合 蛋白 ， 信号 肽 | 融合 蛋白 的 一 部 分 (N 端 ) 是 由 载体 编码 oe ’ 的 原核 多 肽 ,而 另 一 部 分 是 一 段 维 持 正 确 的 ORF 的 外 源 基 因 编 码 的 外 源 蛋 白 ,可 通过 4 一 mm 一 化 学 降解 法 或 酶 解法 切除 融合 蛋白 中 的 + A FEY ZW) < 四 ee eg RE Oh EY A7-3 原核 基因 表达 示意 图 (2) 非 融合 型 表达 载体 可 产生 天 然 完 Le ACS ”原核 细胞 表达 系统 - 99 ， 整 的 外 源 蛋 白 , 其 中 不 含 任 何 原核 序列 。 (3) 分 泌 型 表达 载体 可 将 表达 的 蛋白 由 细胞 质 跨 膜 分 泌 到 胞 周 间 辽 ,成 为 分 刻 型 蛋白 ， 分 泌 型 蛋白 可 以 是 融合 蛋白 ,也 可 以 是 非 融合 蛋白 ,三 种 载体 的 表达 原理 见 图 7-3。 四 、 融 合 型 表达 载体 融合 型 表达 载体 可 以 将 外 源 基因 插 人 至 一 段 原核 序列 3 端 ,最 终 产生 和 原核 蛋白 融合 的 外 源 蛋 白 。 (一 ) 主要 组 成 元 件 融合 型 表达 载体 主要 由 下 列 元 件 组 成 :中 原核 强 启动 子 和 SD 顺序 ;@ 多 克隆 位 点 位 于 一 段 原 核 基 因 的 3 端 ,并 使 外 源 基因 的 ORF 保持 不 变 。 (二 ) 构建 方法 构建 融合 型 表达 载体 的 关键 是 将 外 源 基 因 插 和 人 原核 序列 近 3” 端 ,并 保持 正确 阅读 框 架 , 常 采用 以 下 方法 达到 这 一 目的 : 1. 若 外 源 基因 和 原核 基因 序列 都 清楚 时 ,可 选择 合适 酶 切 位 点 ,使 框架 正确 ; 2. 在 将 外 源 基因 和 原核 序列 连接 时 ,分 别 将 二 者 末端 接 上 不 同 长 度 的 相互 匹配 的 人 工 嘉 核 苷 酸 链 (dC-dG/dA-dT) 形 成 三 种 不 同 阅读 框架 的 重组 体 , 其 中 之 一 具有 正确 阅读 框 架 ; 3. 在 外 源 基因 和 原核 序列 之 间 加 上 合适 的 人 工 合 成 的 DNA 接头 ,使 得 阅读 框架 正确 ; 4. 同时 构建 具有 三 种 阅读 框架 的 一 系列 载体 (位 相 载体 J。 在 这 些 载体 中 具有 相同 的 fa AF SD 顺序 和 一 段 相 同 的 原核 多 肽 序列 ,在 此 序列 下 游 接 有 一 限制 性 酶 切 位 点 , 供 外 源 BARA ,此 位 点 距 AUG ZW RE—-AWMRAP SA. ROR A 切 位 点 后 ,总 有 一 个 具备 正确 阅读 框架 的 表达 载体 ,可 以 表达 外 源 基因 。 (三 ) 融合 型 表达 载体 的 特点 目前 已 构建 了 大 量 融合 表达 载体 ,很 多 已 商品 化 ,它们 具有 明显 的 优越 性 : 1. 表达 效率 高 ”因为 外 源 基因 转录 和 翻译 的 起 始 均 由 正常 原核 序列 控制 , 故 可 产生 高 表达 ,外 源 蛋 白 可 通过 化 学 或 酶 促 加 工 切 割 得 到 ; 2. 产生 的 融合 蛋白 比 天 然 蛋 白质 更 稳定 ,融合 蛋白 是 避免 细菌 蛋白 酶 降解 的 最 好 措 施 ; 3. 产生 的 蛋白 质 易于 鉴定 、 纯 化 ”融合 蛋白 相对 分 子 质量 大 于 菌 体 蛋白 ,电泳 即 可 鉴 定 ` 分 离 ; 另 外 ,有 些 融合 蛋白 带 有 特殊 功能 多 肽 片段 ,易于 纯化 ,例如 pGEX #4 A 4 Ht H Ak Sit Fe 4 % MF ( glutanthione S:transferase,GST) 基 因 ,可 利用 该 酶 进行 纯化 (图 7-4)。 (四 ) 融合 型 表达 载体 举例 pGEX 系统 (图 7-4) 包括 3 种 载体 pGEX-1T.pGEX-2T. pGEX-3X 和 1 种 用 于 纯化 表 和 -100- 基因 工程 学 918 | Thrombin PE yd 962 | ] | CIG GTTCCG CGT GGA TCC CCG GAATIC AIC GTIGACTGACTGACGA BamHI EcoRI Stop codons — Thrombin pGEX-2T 962 | CIG GIT CCG CGT GGA ICC CCG GGA _AITCAT CGLGAC IGA CIG ACG BamHl SoalT EcoRl Stop codons 5 921 Factor X “ pGEX-3X ATC GAA GGTCGT GGG ATT CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG ACTGAC BamHI Small EcoRI TthTIl (1-1114,2-1115,3-1119) Aat II (1-1219,2-1220,3-1224) Ptac pGEX -lyT4947bp Pst | (1-1896, BspM(63) -2T4948bp 2-1897, -3X4952bp 3-1901) AlwN(1-2616. 2-2617 3-2621) 7-4 pGEX 载体 达 蛋 白质 的 亲 和 层 析 介 质 Glutathione Sepharose 4B. RAP AAO tac 启动 子 : 可 诱导 高 表 达 ;@ 含 有 LacIa HEA, SAA SBR Hl | OSD 顺序 下 游 为 谷 胱 甘 肽 琉 基 转移 酶 (GST) 基 因 ，， 外 源 基 因 与 GST 基因 相连 ,因而 产生 的 是 GST 与 外 源 基 因 的 融合 蛋白 ,易于 纯化 (可 利用 亲 和 层 析 介 质 Glutathione Sepharose 4B 纯化 ); 四 多 克隆 位 点 上 游 含有 凝血 酶 (thrombin) (pGEX-1T ,pGEX-2T) 8K Xa 因子 (pPGEX-3X) 的 特异 性 位 点 ,因而 用 凝血 酶 或 Xa 因 于 即 可 获得 外 源 蛋 白 , 对 外 源 蛋 和 白 的 抗原 性 和 功能 影响 不 大 。 五 、 非 融合 型 表达 载体 (一 上 主要 元 件 非 融合 型 表达 载体 中 外 源 基 因 从 ATG 开始 直接 在 原核 调控 元 件 控制 之 下 ,可 产生 天 然 完整 蛋白 。 其 载体 的 基本 结构 包括 :原核 启动 子 ,SD 序列 ,ATG ,外 源 基因 和 终止 密码 子 。 (=) 非 融 合 型 表达 载体 的 特点 非 融合 蛋白 在 胞 内 表达 时 ,往往 会 形成 包涵 体 。 包 涵 体 的 形成 是 外 源 蛋白 高 效 表 达 时 ee _ ACS “原核 细胞 表达 系统 - 101 - 的 普遍 现象 ,其 形成 与 多 种 因素 有 关 , 如 :蛋白 质 的 性 质 、 宿 主 细胞 类 型 .培养 温度 及 营养 条 件 等 。 尽 管 包涵 体形 成 有 利于 产物 的 纯化 ,但 包涵 体 的 后 续 处 理 过 程 十 分 复杂 ,包括 :以 强 变性 剂 变性 溶解 包涵 体 ,然后 经 复 性 获得 有 正确 折 县 的 和 蛋白质。 包涵 体 的 复 性 效率 往往 较 低 。 (=) 非 融合 型 表达 载体 举例 PKK233-3( 图 7-5) :可 在 含 /cc 工 基 因 的 宿主 菌 (JM105 ) 中 有 效 表 达 大 量 外 源 蛋 白 ,并 可 被 IPTG 诱导 表达 。 含 强 iac 启动 子 , 其 下 游 为 一 多 克隆 位 点 ,为 稳定 载体 ,在 多 克隆 位 点 下 游 还 含有 一 个 很 强 的 终止 子 rrzB ,载体 的 其 余部 分 为 pDBR322。 IAGGARACAGAATICCCGGGGATCCGTCGACCIGCAGCCAAGCTT EcoRI Sam | BamHI* sqjt* Pstl Hind Ill Xma | Acc 1* Hinc I* Hinc Il (66)* BamHI(256)* *Site not unique pBR322 ri Accl(2127)* Pyu Il (1947) 图 7-5 pKK233-3 载体 TN. PU RIK BK 分 泌 型 表达 载体 将 蛋白 分 泌 出 胞 膜 ,避免 被 宿主 细胞 的 蛋白 酶 降解 ,是 一 种 十 分 有 用 的 载体 。 (一 ) 主要 元 件 1. 启动 子 和 核糖 体 结合 位 点 ; 2. 信号 肽 序列 ”为 使 蛋白 质 跨 过 细胞 膜 分 沁 至 胞 周 间 隙 ,分泌 型 表达 载体 在 SD 顺序 下 游 装 有 一 段 信 号 肽 序列 。 信 号 肽 是 一 段 15 一 30 个 氮 基 酸 的 多 肽 ,具有 一 个 高 度 疏 水 核 - 102: 基因 工程 学 心 , 可 以 引导 和 蛋白质 穿 过 细胞 膜 , 自身 被 信号 肽 酶 水 解 ,释放 出 功能 蛋白 ,由 于 真 核 生物 和 原 核 生 物 的 信号 肽 十 分 相似 ,因而 分 泌 型 表达 载体 中 的 信号 肽 序列 可 取 自 不 同 生 物 细胞 。 (二 ) 分 泌 型 表达 载体 特点 分 泌 型 表达 载体 产生 的 蛋白 质 可 分 泌 至 胞 周 间 除 (很 少 排出 细胞 ,进入 培养 液 ) ,可 避免 细胞 蛋白 酶 的 降解 ,并 利于 纯化 。 因 为 除 具 备 信 号 肽 外 ,蛋白 质 内 部 必须 有 相应 的 与 分 谈 有 关 的 氮 基 酸 序列 ,而 宿主 细胞 又 具有 相应 的 转运 机 制 ,能 识别 并 正确 切割 信号 肽 ,才能 获得 蛋白 质 的 分 泌 表 达 , 所 以 并 非 所 有 蛋白质 都 可 以 插入 此 种 载体 在 原核 细胞 中 得 到 分 刻 表 达 。 一 般 来 说 , 真 核 生 物 和 原核 生物 中 的 分 泌 蛋 白 以 及 一 些小 分 子 多 肽 能 在 原核 细胞 中 分 泌 表 TS ,但 一 些 非 分 泌 的 天 然 蛋 白 则 很 难 分 认 表 达 。 (=) 分 泌 型 表达 载体 举例 1. pIN 亚 系统 (图 7-6) 包括 3 种 载体 :pIN-ompAl,pIN-ompA2 和 pIN-ompA3。 如 图 746 所 示 , 三 种 载体 均 带 有 大 肠 杆 菌 最 强 启动 子 工 2p( 脂 蛋白 基因 ), 启 动 子 下 游 装 有 lacUV-5 的 启动 子 及 其 操纵 子 。 为 调节 基因 的 表达 ,在 该 质粒 上 克隆 有 ec 工 基 因 ,为 达到 高 效 表达 的 目的 ,质粒 中 带 有 人 工 合成 的 高 效 翻 译 起 始 顺序 (SD 顺序 及 ATG)。 信 和 号 肽 序 列 取 自 于 大 肠 杆 菌 分 刻 蛋 白 :opxza( 外 膜 蛋 白 ) 基 因 ,信号 肽 序列 下 游 紧 接着 是 一 个 人 工 合 成 的 多 克隆 位 点 (EcoRI Hizd 开 和 BamH 1 ), 为 使 各 种 目的 基因 插 人 多 克隆 位 点 后 都 能 保持 正确 框架 ,三 种 载体 的 多 克隆 位 点 片段 长 度 不 同 ,可 分 别 适 合 于 所 有 三 种 密码 子 阅 读 框架 。 pIN-Ill -ompA1 Pst ] 7.4kb 图 7-6 pIND RZ 2. pEZZ18 如 图 7-7 ,载体 带 有 lac 启动 子 , 启 动 子 下游 装 有 葡萄 球菌 A 蛋白 的 信和 号 肽 序列 和 两 个 结构 基因 ZZ ,2Z2Z 基因 的 下 游 紧 连 着 一 段 取 自 pPUC18 的 多 克隆 位 点 。 因 此 ， pEZZ18 产生 与 A 蛋白 ZZ 段 融合 的 蛋白 ,并 可 将 此 融合 蛋白 分 沁 至 胞 周 间 除 。 因 为 ZZ 段 第 七 章 “” 原核 细胞 表达 系统 - 103 - 是 A 蛋 自 与 IgG 结合 的 区 段 ,所 以 该 融合 蛋白 可 直接 通过 亲 和 层 析 进 一 步 纯 化 (以 IgG Sepharose 6FF 为 配 体 )。 另 外 ,由 于 14kD 的 ZZ 段 构 型 独特 ,可 减少 外 源 蛋白 由 融合 状态 恢 复 为 天 然 状 态 时 受到 的 影响 。 2912 2971 GCG AAT TCGAGC _ ICG GIA CCC GGG GAT CCILCIAGAG TCG ACC_ TGC AGG CATGCAAGC TIG EcoRI — Sacl KpnI! Small BamH1 Xbal — Sall PstI Sphl “Hind I PUCI8 Synthetic gene EZZ 18 Notl(2238) 有 CjaI(3982) 7-7 pEZZ18 七 、 表 达 产 物 的 检测 克隆 基因 插 和 人 适当 表达 载体 ,构建 表达 性 重组 体 ,转化 受 体 菌 , 经 诱导 表达 才能 获得 表 KEA ,对 其 表达 产物 还 需 进 一 步 检测 验证 ,进而 分 离 纯 化 。 对 于 非 分 沁 蛋 白 来 说 ,所 得 蛋白 质 在 胞 质 内 ,因而 检测 的 第 一 步 就 是 破碎 细胞 ; 对 于 分 泌 蛋 白 来 说 ,蛋白 质 也 仅 分 泌 至 胞 周 间隙 ,同样 要 经 破碎 后 才能 进行 检测 ,裂解 原核 细胞 的 方法 主要 有 超声 破碎 法 \ 酶 解法 和 化 学 法 。 细胞 破碎 后 ,要 对 蛋白 表达 产物 进行 特异 性 鉴定 和 生物 学 活性 鉴定 。 特 异性 鉴定 的 方 法 常用 的 有 免疫 沉淀 法 免疫 荧光 素 标记 抗体 法 、 蛋 白质 印迹 法 和 ELISA。 (一 ) 免疫 荧光 素 标记 抗体 法 该 法 简单 快速 ,适宜 于 定性 检测 。 将 表达 产物 的 受 体 细胞 固定 于 干净 玻 片 上 ,然后 与 目的 蛋白 的 多 抗 或 单 抗 37Y 充分 反 应 ,洗涤 后 再 加 荧光 标记 的 第 二 抗体 反应 ,第 二 抗体 可 用 荧光 标记 的 葡萄 球菌 A 蛋白 或 羊 抗 鼠 / 免 IgG, 充 分 洗涤 后 立即 用 荧光 显微镜 观察 。 -104- 基因 工程 学 (二 ) 免疫 沉淀 法 可 检测 并 定量 分 析 存 在 于 多 种 蛋白 质 复 合 物 中 的 微量 抗原 ,敏感 度 极 高 ,可 检测 到 100pg 的 放射 性 标记 蛋白。 首先 以 35SS-Met 和 35S-Cys 标记 受 体 细 胞 中 的 蛋白 质 ; 然 后 将 受 体 细胞 裂解 , 取 有 裂解 液 ( 含 目 的 蛋白 ) 与 靶 蛋 白 抗 体 反 应 ,形成 抗原 -抗体 复合 物 ,用 偶 联 的 蛋白 A 和 Sepharose RK 活 固定 的 金 葡 菌 (S .axrexs ) 吸 附 抗原 -抗体 复合 物 ,也 可 以 用 抗 被 检 蛋 白 抗 体 的 抗体 进行 吸 附 ,吸附 后 离心 沉淀 抗原 -抗体 复合 物 ;最 后 将 沉淀 的 复合 物 进 行 SDS-PAGE 电泳 ,使 得 各 和 蛋 白质 按 相对 分 子 质 量 大 小 分 开 ,进行 放射 自 显影 ,分析 蛋白 表达 情况 。 (=) 免疫 印迹 (Western blot) Western blot 是 20 世纪 70 年 代 末 80 年 代 初 发 展 起 来 的 一 种 结合 了 和 蛋白质 凝 胶 电泳 和 固 相 免疫 的 蛋白 质 分 析 技 术 ,兼备 了 凝 胶 电 泳 的 高 分 辨 为 和 固 相 免疫 的 特异 敏感 等 特点 ， 无 需 对 蛋白 质 进行 放射 性 标记 , 即 可 从 混杂 抗原 中 检测 出 微量 特定 抗原 。 其 敏感 度 高 ,可 检 测 出 1 一 Sng 的 蛋白 质 , 即 被 检 有 蛋白 占 总 蛋白 的 1Z10 即 可 检 出 。 免疫 印迹 技术 包括 三 个 步 又: 1. SDS-PAGE 电泳 ”裂解 细胞 ,进行 蛋白 质 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ,使 蛋白 质 按 相 对 分 子 质 量 大 小 分 开 ; 2. 电 转 移 “将 凝 胶 上 的 蛋白 质 条 带 在 电场 力作 用 下 转移 至 硝酸 纤维 素 膜 上 ; 3. 免疫 显 色 ”在 硝酸 纤维 素 膜 上 进行 显 色 。 先 与 一 抗 反应 后 再 与 相应 酶 标 二 抗 反应 并 进行 显 色 。 (PQ) ELISA( 酶 联 免疫 吸附 法 ) ELISA 可 用 于 抗原 的 定量 分 析 。 经 上 述 特异 性 鉴定 后 ,还 应 鉴定 表达 产物 是 否 具 有 生 物 学 活性 及 其 活性 高 低 ,以 判断 是 否 具有 实用 价值 。 各 种 目的 产物 的 性 质 不 同 ,其 生物 学 活 性 的 鉴定 方法 也 不 同 。 如 :肿瘤 坏死 因子 (TNFa) 可 通过 测定 其 对 小 鼠 L929 细胞 株 的 杀 伤 力 来 鉴定 其 活性 ;干扰 素 -a(IFNa) 则 通过 测定 其 对 人 上 皮 细 胞 Wish 细胞 株 的 保护 力 来 确 定 其 活性 。 八 、 原 核 生物 表达 系统 的 应 用 措施 及 其 局 限 性 (一 ) 外 源 基 因 在 原核 细胞 中 表达 的 应 用 措施 提高 外 源 基因 表达 效率 ,可 以 从 以 下 方面 考虑 : 1. 提高 翻译 水 平 ”构建 载体 时 ,调整 SD 顺序 与 ATG 之 间 的 距离 ,或 改变 ATG 与 SD 附近 几 个 核 苷 酸 ,以 消除 可 能 出 现 的 二 级 结构 ,提高 翻译 水 平 ;也 可 以 在 DNA FP iit ffi A— 转录 终止 子 以 稳定 mRNA ,提高 翻译 效能 。 2. 选择 合适 宿主 不 同 菌株 表达 水 平 不 同 ,不 同 载体 适用 于 不 同和 宿主 。 第 七 章 ”原核 细胞 表达 系统 - 105 - 3. 减轻 宿主 细胞 代谢 负荷 ,提高 外 源 基 因 的 表达 水 平 ”可 以 将 宿主 菌 的 生长 和 外 源 基 因 的 表达 分 开 ( 用 PL 启动 子 的 温度 诱导 和 lac 启动 子 的 化 学 诱导 ) ;也 可 以 将 宿主 菌 的 生长 和 表达 质粒 的 复制 分 开 ( 质 粒 PCI101 转化 宿主 菌 ,在 257 时 宿主 菌 中 质粒 拷贝 数 仅 10 个 ， 宿主 大 量 生长 ,温度 升 至 37 人 时 ,质粒 大 量 复 制 )。 这 一 方法 是 基因 诱导 表达 的 常用 方法 。 4. 提高 表达 蛋白 稳定 性 ,防止 被 宿主 降解 ”产生 融合 蛋 白 或 分 刻 和 蛋 和 白 均 可 达到 此 目 的 。 另 外 ,有 些 细菌 突变 株 ,失去 或 降低 了 蛋白酶 的 降解 能 力 , 可 以 用 做 受 体 :如 Lon- 缺 陷 型 菌株 ,缺乏 合成 蛋白 酶 所 必须 的 肌 苷 (Lon) ;再 者 ,T4 ERA AY Pin 基因 产物 是 细菌 蛋白 酶 的 抑制 剂 ,将 其 克隆 人 载体 可 稳定 基因 产物 。 (二 ) 原核 表达 系统 的 局 限 性 1. 原核 细胞 中 缺乏 翻译 后 加 工 修饰 系统 ,所 产生 的 多 肽 不 能 进一步 加 工 , 比 如 糖 基 化 、 磷酸 化 ,以 及 无 法 形成 正确 的 蛋白 质 高 级 空间 结构 等 ,因而 原核 系统 对 很 多 真 核 蛋 白 都 无 法 实现 功能 表达 。 2. 原核 表达 外 源 蛋 白 常 以 包涵 体形 式 存在 ,必须 经 过 变性 ` 复 性 处 理 , 才 能 获得 有 生物 学 活性 的 蛋白 ,而 复 性 的 处 理 过 程 复 杂 ,对 相对 分 子 质量 大 ,尤其 是 分 子 内 二 硫 键 多 的 蛋白 质 ,其 表达 效率 非常 低 。 3. 在 原核 细胞 中 进行 分 记 表 达 , 大 多 是 将 产物 分 记 至 胞 周 间隙 ,很 难 实现 真 正 的 分 弯 出 胞 ,其 产量 很 低 ,而 且 容易 出 现 信号 肽 不 被 切割 ,或 不 在 特异 位 置 上 切割 等 问题 。 4. 在 原核 细胞 中 表达 的 真 核 蛋白 不 稳定 , 易 被 细菌 蛋白 酶 降解 。 5. 原核 细胞 没有 转录 后 加 工 系统 ,无 法 识别 内 含 子 , 故 原 核 细 胞 无 法 表达 真 核 基因 组 DNA。 6. 重组 原核 细胞 在 培养 过 程 中 产生 的 内 毒素 难以 排除 ,污染 表达 产物 ,影响 产品 纯度 。 ( 马 春 红 ) 第 八 章 ， 真 核 生物 表达 系统 Chapter 8. Eukaryotic Expression System 真 核 生物 基因 表达 系统 (gene expression in eukaryotic cells) 是 指 在 真 核 细 胞 中 表达 外 源 基因 的 体系 。 真 核 细 胞 ,不 论 是 其 基因 结构 ,还 是 其 表达 调控 都 十 分 复杂 ,许多 问题 大 们 至 今 仍 处 在 探讨 之 中 。 真 核 细 胞 基因 工程 (体外 表达 真 核 基因 ) 起 步 较 晚 ,1978 年 ,Berg SRK 用 SV40 病毒 做 载体 ,在 非洲 绿 猴 肾 组 织 培养 细胞 中 成 功 表 达 了 免 血 红 和 蛋白 B 多 肽 链 ,这 是 应 用 DNA 体外 重组 技术 ,第 一 次 成 功 地 在 真 核 细胞 中 表达 另 一 真 核 基因 ,这 在 基因 工程 的 理论 和 应 用 上 都 有 重大 意义 。 随 着 技术 方法 的 突破 ,现在 人 类 克隆 成 功 的 真 核 DNA 数目 、 种 类 都 已 极为 繁复 ,而 真 核 细 胞 表达 系统 的 受 体 也 已 发 展 成 为 包括 酵母 .昆虫 细胞 、 哺 乳 动 物 细胞 等 的 一 个 大 家 族 , 真 核 细胞 基因 工程 技术 日 趋 成 熟 。 关 于 真 核 基 因 在 原核 细胞 中 的 表达 ,已 在 第 七 章 中 讨论 ,本 章 仅 介 绍 基 因 在 真 核 细 胞 中 表达 。 第 一 他，” 真 核 生 物 表 达 系 统 概述 \、 真 核 生 物 表 达 系 统 的 优势 及 必要 性 真 核 生物 表达 系统 由 于 真 核 细胞 的 基因 结构 及 基因 表达 方面 的 特点 而 具有 优越 性 : 1. 真 核 生物 系统 具有 转录 后 加 工 系统 ,可 识别 并 删除 基因 中 的 内 含 子 ,前 切 加 工 为 成 熟 mRNA; 2. 具备 完善 的 翻译 后 加 工 系统 ,可 进行 糖 基 化 、 乙 酰 化 、 磷 酸化 等 修饰 ,使 蛋白 质 形 成 正确 的 天 然 构 型 ,因而 真 核 生 物 表 达 系 统 产 生 的 蛋白 质 更 接近 天 然 状 态 , 有 利于 对 其 功能 、 生物 学 活性 的 研究 ,也 更 具有 价值 ; 3. 某 些 真 核 细 胞 可 将 基因 表达 产物 直接 分 刻 至 细胞 培养 液 中 ,简化 了 纯化 工艺 ,降低 了 生产 成 本 。 另外 ,由 于 真 核 细 胞 中 基因 表达 的 调控 方式 极其 复杂 , 真 核 生 物 表 达 系 统 的 研究 有 助 于 我 们 深入 了 解 基 因 调 控 的 机 制 。 二 、 真 核 生物 基因 结构 及 表达 调控 特点 (一 ) 真 核 生 物 基因 结构 特点 1. 真 核 生 物 中 DNA 极其 丰富 “， 真 核 细 胞 DNA 是 大 肠 杆菌 DNA 含量 的 数 千 倍 (大 肠 杆菌 基因 组 约 4x10*bp ,哺乳 类 基因 组 在 10?bp 数量 级 ) ,这 些 DNA 组 成 了 真 核 生 物 的 基因 - 106 。 Www wa ec 人 人 第 八 章 “” 真 核 生 物 表 达 系 统 - 107 - 组 。 要 从 如 此 丰富 的 基因 组 中 克隆 筛选 出 某 一 目的 基因 就 比较 困难 。 克 隆 真 核 基因 常用 的 方法 是 从 细胞 mRNA 反 转 录 合 成 相应 的 CDNA. DNA 含量 高 .种 类 多 ,形成 的 mRNA 也 多 ,而 相应 的 某 一 目的 基因 mRNA 含量 相对 较 少 ,考虑 到 真 核 生物 各 种 组 织 细 胞 含有 种 类 、 数目 完全 相同 的 基因 ,但 在 各 分 化 不 同 的 细胞 中 表达 不 同 的 蛋白 质 , 其 mRNA 转录 有 所 不 A ,因而 真 核 基因 工程 的 第 一 个 问题 就 是 要 选择 易 取 材 、 易 培养 且 含 目的 基因 mRNA 较 丰 富 的 细胞 或 组 织 作为 目的 基因 的 材料 来 源 。 2. 真 核 基 因 的 不 连续 性 ” 真 核 生 物 基 因 的 不 连续 性 是 真 核 生物 基因 结构 上 最 重要 的 特点 , 即 一 个 基因 的 编码 序列 (外 显 子 ,exon) 被 一 个 或 几 个 非 编 码 序 列 ( 内 含 子 ,intron) 所 分 隔 。 由 基因 转录 形成 的 mRNA 前 体 必 须 经 过 前 切 (splicing)、 加工 、 切 除 内 含 子 , 才 成 为 成 熟 的 mRNA, 并 由 细胞 核 进入 细胞 质 ,这 就 增加 了 基因 表达 调控 的 环节 。 3. 真 核 生物 mRNA 5 端 具有 帽子 结构 ,3 MAA polyA 尾巴 ” 真 核 细 胞 mRNA 5 dig 含有 帽子 结构 :7m GPPNimN2m::-,3’ 3c —-MA AIL T+ 2B 200 个 左右 的 多 聚 腺 苷 酸 (polyA) 尾 巴 ( 组 蛋白 除外 ) ,原核 细胞 中 没有 这 种 结构 。 这 种 差别 导致 了 真 核 细 胞 mRNA 半衰期 较 长 ,可 达 数 小 时 甚至 更 长 ,因此 可 有 足够 时 间 提 取 mRNA 并 反 转 录 合 成 cDNA, 使 真 核 生 物 基 因 工 程 成 为 可 能 。 4. 真 核 生物 基因 组 中 含有 大 量 重 复 序列 ”重复 序列 (repetitive sequences) 即 在 基因 组 申 多 次 重复 出 现 的 DNA 序 列 。 用 复 性 动力 学 等 实验 表明 有 三 类 重复 序列 :中 高 度 重 复 序 列 (high repetitive sequences) 这 类 序列 一 般 较 短 ,长 10 一 300bp ,在 哺乳 类 基因 组 中 重复 108 次 左右 , 占 基 因 组 DNA 序列 总 量 的 10% 一 60% ,人 的 基因 组 中 这 类 序列 约 占 20% 。 四 中 度 重复 序列 (moderate repetitive sequences) ,这 类 序列 多 数 长 100~S00bp, BR 10~10° 次 , 占 基因 组 的 10% 一 40% 。 例 如 哺乳 类 中 含量 最 多 的 一 种 称 为 Alu 的 序列 ,长 约 300bp ,在 哺乳 类 不 同 种 属 间 相似 ,在 基因 组 中 重复 3 一 $x 10; 次 ,在 人 的 基因 组 中 约 占 7%。 在 人 的 基因 #0 A 18S/28S rRNA 基因 重复 280 *K,5S rRNA 基因 重复 2000 次 ,tRNA 基因 重复 1300 次 ， 5 种 组 蛋白 的 基因 串 连 成 得 重复 30 一 40 次 ,这些 基因 都 可 归 人 中 度 重 复 序列 范围 。@ 单 拷 ” 贝 序列 (single copy sequences) ,这 类 序列 基本 上 不 重复 , 占 哺乳 类 基因 组 的 50% 一 80% ,在 大 基因 组 中 约 占 65% 。 绝 大 多 数 真 核 生 物 为 蛋白 质 编码 的 基因 在 单 倍 体 基 因 组 中 都 不 重 复 ,是 单 拷贝 的 基因 。 重 复 序列 在 真 核 细 胞 中 行使 各 种 功能 :@ 四 编码 一 些 功能 十 分 重要 、 需 要 量 极 大 的 产物 ,如 组 蛋白 rRNA tRNA 及 某 些 糖 代 谢 酶 类 等 。 这 些 重复 序列 满足 了 细胞 的 需要 。@ 重 复 序列 中 含有 特殊 结构 ,参与 基因 表达 调控 :如 AT 含量 丰富 , 易 解 链 , 有 利于 与 调控 基因 复制 的 蛋白 质 因 子 结合 ,或 者 含有 末端 反 向 重复 序列 ,可 形成 葵 环 结构 。G@) 与 染 色 体 构象 .着 丝 点 形成 有 关 。 (二 ) 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 的 特点 1. 真 核 生物 基因 表达 的 调控 是 多 方面 多 层次 的 。 真 核 生 物 中 DNA 多 与 组 蛋白 结合 形成 复杂 的 高 级 结构 ,被 包 庄 在 核 膜 内 , 核 外 还 有 遗传 成 分 (如 线粒体 DNA 等 ) ,这 就 增加 了 基因 表达 调控 的 层次 和 复杂 性 。DNA 在 核 内 转录 后 ,经 加 工 、 切 除 , 运 输 到 核 外 才 成 为 成 熟 的 mRNA,mRNA 在 细胞 质 中 与 核糖 体 结合 开始 翻译 。 这 一 过 程 的 每 一 步 都 影响 基因 的 表达 。 - 108 - BALES 2. 一 条 成 熟 mRNA 只 能 翻译 出 一 条 单一 肽 链 ,而 不 能 形成 原核 生物 的 多 顺 反 子 mRNA. 3. 真 核 生 物 中 转录 和 翻译 在 时 间 上 .空间 上 都 是 完全 分 开 的 ,其 功能 相关 基因 分 开 , 分 BN DEFT FER ,而 没有 操纵 子 式 结构 。 (三 ) 真 核 生 物 基 因 表 达 的 调控 模式 真 核 生物 中 基因 表达 的 调控 是 十 分 复杂 的 ,可 以 在 转录 前 转录、 转录 后 、 翻 译 和 翻译 后 五 个 水 平 进 行 调 控 , 其 中 转录 水 平 的 调控 是 最 重要 的 一 步 。 1. 转录 前 (基因 组 水 平 ) 的 调控 即 基 因 结 构 上 的 改变 , 较 稳 定 长 久 ,包括 基因 丢失 、 基 因 重 组 .基因 扩 增 , 甲 基 化 修饰 和 染色 质 结构 改变 。 2. 转录 水 平 的 调控 ”主要 涉及 三 种 因素 : (1) RNA 聚合 酶 : 真 核 生 物 共 有 三 种 RNA 聚合 酶 ,分 别 合成 不 同类 型 的 RNA, 其 中 RNA 聚合 酶 开 转 录 合成 mRNA。 (2) 顺 式 调 控 因 子 (cis-acting factor) : 顺 式 调控 因子 是 与 结构 基因 串联 的 特定 DNA 序 列 ,对 基因 转录 的 精确 起 始 和 转录 活性 有 重要 作用 。 主 要 包括 起 正 性 调控 作用 的 顺 式 作用 Tuff | Ja 3 F (promoter ) , $4 5% F (enhancer ) | 和 起 负 性 调控 作用 的 元 件 一 一 沉寂 子 (si- lencer) 加 尾 及 转录 终止 信号 。 1) 启动 子 (promoter) : 真 核 生 物 中 的 启动 子 (promoter) 是 位 于 基因 5 末端 与 转录 起 始 有 关 的 核 苷 酸 序列 。 其 作用 特点 为 近 距 离 (100bp) 作 用 .具有 方向 性 、` 空 间 位 置 较 恒 定 。 与 原核 生物 相 比 , 真 核 生 物 启动 子 更 复杂 .序列 也 更 长 。 真 核 生 物 启 动 子 间 没 有 明显 共同 一 致 的 序列 ,上 且 真 核 生 物 启动 基因 转录 需要 多 种 蛋白 质 因 子 的 相互 协调 作用 ,不同 蛋 白质 因子 又 能 与 不 同 DNA 序列 相互 作用 ,不 同 基 因 转 录 起 始 及 其 调控 所 需 的 蛋白 因子 不 同 , 因 而 不 同 启动 子 序列 也 大 不 相同 。 真 核 生物 启 动 子 一 般 包 括 转 录 起 始点 及 其 上 游 约 100 一 200bp FF 列 , 包 含有 若干 具有 独立 功能 的 DNA 序列 元 件 ,每 个 元 件 约 长 7~30bp。 最 常见 的 哺乳 类 RNA 聚合 酶 开启 动 子 中 的 元 件 序列 见 表 8-1。 表 8-1 哺乳 类 RNA 聚合 酶 开启 动 子 中 常见 的 元 件 结合 的 蛋白 因子 元 件 名 称 共同 序列 名 称 相对 分 子 质量 结合 DNA 长 度 TATA box TATAAAA TBP 30 000 一 10bp GC box GGGCGG SP-1 105 000 一 20bp CAAT box GGCCAATCT CTF/NFI 60 000 一 22bp octamer ATTTGCAT Oct-1 76 000 ~ 20bp Oct-2 53 000 ~23bp KB GGGACTTTCC NF-«B 44 000 一 10bp ATF GTGACGT AFT ? 20bp 真 核 生 物 启 动 子 中 的 元 件 可 以 分 为 两 种 :四 核心 启动 子 元件 (core promoter elements ) 指 RNA 聚合 酶 起 始 转录 所 必需 的 最 小 的 DNA 序列 ,包括 转录 起 始点 及 其 上 游 -= 257 -30bp 处 的 TATA 盒 。 核 心 元 件 单 独 起 作用 时 只 能 确定 转录 起 始 位 点 和 产生 基础 水 平 的 eg 第 八 章 “” 真 核 生物 表达 系统 - 109 . 转录 。@O 上 游 启 动 子 元 件 (upstream promoter elements) 包括 通常 位 于 -70bp 附近 的 CAAT 盒 和 GC 盒 \ 以 及 距 转录 起 始点 更 远 的 上 游 元 件 (图 8-1)。 这 些 元 件 与 相应 的 蛋白 因子 结合 能 提高 或 改变 转录 效率 。 不 同 基因 由 不 同 的 上 游 启 动 子 元 件 组 成 ,其 位 置 也 不 相同 ,就 使 得 不 同 的 基因 表达 分 别 有 不 同 的 调控 。 DNA mRNA A8-1 真 核 基因 启动 子 结构 模式 图 2) 增强 子 (enhancer) :增强 子 (enhancer) 是 一 类 能 促进 转录 活性 的 顺 式 调控 元 件 , 但 它 本 身 并 不 具备 启动 子 活性 。 增强 子 最 早 是 在 SV40 病毒 中 发 现 的 长 约 200bp 的 一 段 DNA, 可 使 旁 侧 的 基因 转录 提 高 100 倍 , 其 后 在 多 种 真 核 生物 .甚至 在 原核 生物 中 都 发 现 了 增强 子 。 增 强 子 通常 由 若干 组 件 构成 ,长 100 一 200bp ,其 核心 组 件 常 为 8 一 12bp, 可 以 单 拷贝 或 多 拷贝 串 连 形式 存在 。 增强 子 作 用 有 以 下 特点 :无 方向 性 、 远 臣 离 作用 、 位 置 不 恒定 但 有 相位 性 (只 有 在 DNA 双 螺 旋 的 某 一 相位 ,活性 较 强 ) 无 基因 特异 性 ` 有 组 织 特异 性 。 首先 ,增强 子 可 以 在 任 一 位 置 提 高 同一 条 DNA 链 上 基因 的 转录 效率 ,可 以 远 距 离 起 作 用 ,通常 可 距离 1 一 4kb ,而 且 在 基因 的 上 游 或 下 游 都 能 起 作用 。 其 次 ,无 方向 性 。 增 强 子 的 作用 与 其 序列 的 正 反方 向 无 关 , 将 增强 子 方向 倒置 依然 能 起 作用 。 第 三 ,增强 子 发 挥 作 用 依赖 启动 子 的 存在 。 没 有 启动 子 ,增强 子 不 能 表现 活性 。 但 增强 子 对 启动 子 没 有 严格 的 专 一 性 ,同一 增强 子 可 以 影响 不 同类 型 启动 子 的 转录 。 例 如 , 当 含有 增强 子 的 病毒 基因 组 整合 人 宿主 细胞 基因 组 时 ,能 增强 整合 区 附近 宿主 某 些 基因 的 转录 ; 当 增强 子 随 某 些 染色 体 段 落 移 位 时 ,也 能 提高 移 到 的 新 位 置 周 围 基 因 的 转录 。 最 后 ,增强 子 具 有 组 织 特异 性 。 增 强 子 的 作用 机 制 虽然 还 不 明确 ,但 与 其 他 顺 式 调 控 元 件 一 样 ,必须 与 特定 的 蛋白 质 因 子 结合 后 才能 发 挥 增强 转录 的 作用 。 许 多 增强 子 只 在 某 些 细胞 或 组 织 中 表现 活性 ,这 种 组 织 或 细胞 特异 性 是 由 这 些 细 胞 或 组 织 中 具有 特异 性 蛋白 质 因子 所 决定 的 。 3) 衰减 子 (dehancer) :衰减 子 (dehancer) 或 称 沉 农 子 (silencer) 是 一 类 抑制 基因 转录 的 顺 式 调控 因子 ,其 作用 方式 与 增强 子 相 同 :其 作用 可 不 受 序列 方向 的 影响 ,也 能 远 距 离 发 挥 作 用 ,并 可 对 异 源 基 因 的 表达 起 作用 。 4) 转录 终止 信号 :转录 终止 信号 控制 基因 转录 的 结束 。 大 多 数 真 核 基 因 其 mRNA 3’ 端 具 polyA 尾 , 其 上 游 10 一 20bp 处 具有 加 尾 信号 (AATAA) ,ployA 尾 下 游 有 G/T fe. HN 信号 和 G/T 徐 共 同 构成 这 些 基因 的 转录 终止 信号 。 组 蛋白 和 少数 不 具备 polyA 尾 的 基因 的 转录 终止 信号 是 一 段 能 形成 发 夹 结 构 的 反 向 重复 序列 。 (3) Bost fe AAA (trans-acting factor) :是 由 位 于 不 同 或 相同 染色 体 上 相距 较 远 的 基因 -110- 基因 工程 学 所 编码 的 蛋白 质 因子 ,通过 与 顺 式 调控 元 件 和 RNA 聚合 酶 的 相互 作用 而 调节 基因 转录 活 性 。 反 式 作 用 因子 结构 上 包含 一 个 与 DNA 结合 的 结构 域 和 一 个 转录 活化 结构 域 ,;DNA 结合 域 靠 它 特有 的 结构 与 相应 的 DNA 序 列 结合 后 ,激活 转录 活化 结构 域 , 参 与 基因 表达 调控 。 3. 转录 后 修饰 包括 前 体 mRNA 的 前 切 ,内 含 子 的 去 除 ,外 显 子 拼接 及 mRNA HME 和 戴 帽 。 加 尾 和 戴 帽 均 可 增强 mRNA 稳定 性 ,延长 其 寿命 ;另外 ,加 尾 帮 助 mRNA HAA 胞 质 , 戴 帽 则 是 核糖 体 结 合 和 翻译 起 始 所 必需 的 。 4. 翻译 水 平 的 调控 ”主要 涉及 mRNA tRNA 核糖 体 和 可 溶性 蛋白 因子 。 其 中 反 义 RNA/DNA 技术 是 目前 使 用 较 多 的 翻译 水 平 调控 措施 。 反 义 RNA(antisense RNA) 是 一 段 含有 与 目的 基因 产生 的 mRNA 碱 基 序 列 互补 的 小 分 子 RNA。 反 义 RNA 可 通过 与 mRNA 的 结合 ,形成 双 链 结构 ,影响 mRNA 的 翻译 。 反 义 RNA 对 转录 也 有 影响 。 天 然 反 义 RNA 最 初 发 现 于 原核 生物 ,后 来 在 真 核 生物 中 也 有 发 现 。 目 前 人 们 在 真 核 生 物 中 模拟 原核 生物 反 义 RNAZLDNA 作用 机 制 ,应 用 于 抗 病毒 、 抗 寄生 虫 、. 抑 制 癌 基 因 等 研究 ,已 取得 很 大 进展 。 5. 翻译 后 水 平 调 控 ”蛋白 质 合 成 后 ,还 必须 经 过 一 系列 加 工 过 程 才能 成 为 有 生物 活性 的 功能 蛋白 质 ,包括 切除 信号 肽 序列 ,进行 磷酸 化 .乙酰 化 、 糖 基 化 等 化 学 修饰 等 。 三 、 真 核 生 物 表 达 系 统 真 核 生物 表达 系统 中 根据 受 体 细 胞 的 不 同 , 其 所 应 用 的 载体 和 表达 策略 各 有 不 同 , 据 此 ,可 将 真 核 生物 表达 系统 分 为 三 类 : 1. 酵母 表达 系统 ”利用 酵母 表达 载体 ,将 外 源 基 因 在 酵母 细胞 中 表达 ; 2. 哺乳 动物 细胞 表达 系统 ”利用 重组 病毒 载体 ,在 哺乳 动物 细胞 中 表达 外 源 基 因 ; 3. 昆虫 细胞 表达 系统 ”利用 昆虫 杆 状 病毒 表达 载体 ,在 昆虫 细胞 中 表达 外 源 基因 。 HW ERE BIL ARSE 酵母 表达 系统 中 以 酵母 为 受 体 细 胞 。 酵 母 是 单 细 胞 真 核 生 物 ,其 遗传 背景 清楚 ,具有 真 核 细 胞 的 特点 :可 以 识别 内 含 子 ,对 蛋白 质 进行 多 种 翻译 后 修饰 ,有 分 这 功能 ,可 对 多 种 蛋白 质 进 行 胞 外 分 泌 表 达 ,而 其 本 身 的 分 泌 蛋 白 很 少 ,因而 纯化 较 方 便 。 同 时 ,酵母 又 具有 原核 细胞 培养 简单 .生长 周期 短 ` 容 易 操作 的 特点 。 此 外 ,酵母 具有 较 高 的 安全 性 ,已 被 美国 食品 和 医药 管理 局 (FEDA) 确 认为 一 种 安全 的 生物 。 因 而 酵母 是 一 种 理想 的 基因 工程 受 体 细 胞 ， 酵母 表达 系统 是 一 种 很 好 的 真 核 基因 表达 系统 ,有 着 广阔 的 发 展 前 景 。 已 有 多 种 蛋白 质 在 酵母 细胞 中 成 功 表达 ,如 人 乙肝 病毒 表面 抗原 、 核 心 抗原 .干扰 素 \ 人 表皮 生长 因子 和 胰岛 素 前 体 等 。 一 、 酵 母 载 体 (一 ) 酵母 载体 的 组 成 与 特点 酵母 载体 适用 于 在 酵母 细胞 中 复制 . 扩 增 和 表达 基因 ,分 为 克隆 载体 和 表达 载体 ,其 主 -一 第 八 章 ” 真 核 生 物 表 达 系 统 + 111 要 组 成 元 件 包 括 : 1. 遗传 标记 ”所 有 酵母 载体 中 都 必须 含有 一 定 的 遗传 标记 ,以 利于 重组 子 的 筛选 、 鉴 定 。 酵 母 细 胞 虽 可 表达 细菌 抗生素 ,但 却 对 大 多 数 抗生素 不 敏感 ,因而 多 数 细菌 抗生素 基因 不 能 作为 酵母 细胞 的 遗传 标记 。 酵 母 中 常 含 有 一 些 能 与 特定 大 肠 杆 菌 变 异 株 功能 互补 的 一 些 基 因 , 即 这 些 基因 相当 于 大 肠 杆菌 的 特定 功能 基因 ,这 些 基因 常用 作 外 源 基 因 转 化 酵母 时 的 遗传 标记 。 2. 用 于 酵母 载体 中 的 调控 序列 (1) ARS(auto replication sequence) :酵母 的 自主 复制 序列 ,相当 于 复制 起 始 区 (点 ) ,可 启动 基因 在 酵母 中 的 复制 。 (2) 2pm 质粒 :酵母 细胞 中 存在 许多 不 同类 型 的 内 源 性 质粒 ,其 中 一 种 称 为 2xm 质粒 ， 它 以 高 拷贝 数 存在 于 细胞 核 外 ,为 小 的 环 状 DNA, 长 约 2pm, 可 以 独立 复制 并 转录 。 (3) 酵母 启动 子 :在 酵母 表达 载体 中 必须 含有 酵母 启动 子 , 以 启动 外 源 基 因 在 酵母 细胞 中 的 表达 。 常 用 酵母 启动 子 有 :AD 瑟 ( 醇 脱氧 酶 ) 基 因 、PGK (磷酸 甘油 激酶 ) 基 因 、PHO5 (酸性 磷酸 酶 ) 基 因 、GAP(3- 磷 酸 甘油 醛 脱 氢 酶 ) 基 因 、SUC 蔗糖 酶 基因 等 。 其 中 ,磷酸 甘油 激酶 (PGK ) 和 磷酸 甘油 醛 脱 氢 酶 (GAP) 在 细胞 内 各 占 总 蛋白 的 5% 左 右 , 属 于 高 含量 蛋白 质 ,因此 ,它们 的 启动 子 为 强 启动 子 。 (4) 酵母 着 丝 粒 区 段 (CEN ) :增加 转化 子 稳定 性 。 3. 酵母 载体 均 是 由 细菌 质粒 DNA 与 酵母 DNA 重组 的 穿梭 质粒 (shuttle vector) , 既 可 以 在 原核 生物 中 复制 增殖 ,又 可 在 真 核 酵母 中 复制 和 表达 。 (二 ) 酵母 载体 的 分 类 酵母 载体 可 分 为 五 类 ,其 结构 和 构建 过 程 如 图 8-2。 pBR ori 酵母 基因 | 图 8-2 ”酵母 载体 的 种 类 和 构建 过 程 -112- BALES 1. 酵母 整合 型 质粒 (YIp,yeast integrating plasmid) 在 细菌 质粒 中 引入 酵母 的 遗传 标 记 基 因 , 即 成 为 YIp。YIp 中 不 含 酵母 复制 起 始 位 点 ,而 是 通过 同 源 重 组 ,整合 人 酵母 染色 体 ,形成 稳定 的 转化 子 , 并 随 染 色 体 复制 而 复制 。YIp 转化 率 极 低 (1 一 10 Rte Fg DNA). 2. 酵母 复制 型 质粒 (YRp,yeast replicating plasmid) 由 细菌 质粒 和 带 有 复制 子 (ARS1 基因 ) 及 遗传 标记 的 酵母 基因 组 成 ,可 在 酵母 细胞 中 自主 复制 ,其 转化 频率 比 YIp 高 100 FF 以 上 ,拷贝 数 也 多 ,但 YRp 不 稳定 ,即使 在 有 选择 压力 下 也 容易 丢失 。 3. 酵母 附加 子 型 载体 (YEp,yeast episomal plasmid) 由 细菌 质粒 DNA. 酵母 标 记 基 因 和 酵母 2um DNA 组 成 。 酵 母 2xm DNA 是 酵母 中 类 似 于 质粒 的 一 种 游离 于 核 外 的 DNA， 可 独立 复制 。 因 而 由 2pm DNA 组 成 的 YEp 型 载体 可 以 在 核 外 存在 并 独立 复制 ,其 转化 频 率 拷贝 数 及 稳定 性 与 YRp 相似 。 上 述 三 种 酵母 载体 均 不 含 酵 母 启 动 子 ,其 中 的 原核 启动 子 没 有 能 力 启 动 真 核 基 因 在 酵 母 中 的 表达 ,因而 不 适用 于 在 酵母 中 表达 外 源 基 因 。 4. 酵母 表达 质粒 “在 上 述 酵 母 穿 梭 质 粒 基础 上 添加 酵母 启动 子 , 即 可 在 酵母 中 表达 基 因 。 若 在 酵母 表达 型 质粒 中 加 入 信号 肽 序列 , 则 可 以 实现 外 源 基 因 的 分 刻 表 达 。 5. 酵母 人 工 染 色 体 (yeast artificial chromosome, YAC) 由 酵母 染色 体 和 2um DNA 的 复制 起 始 区 .着 丝 粒 序列 和 四 膜 虫 端 粒 DNA 组 成 。YAC 在 细胞 有 丝 分 裂 和 减 数 分 裂 中 具 有 和 天然 染 色 体 的 稳定 性 。YAC 人 允许 插入 300kb 的 外 源 片 段 , 甚 至 长 达 1000kb 以 上 的 片段 也 能 插入 并 稳定 转化 ,有 利于 对 大 片段 克隆 DNA 的 表达 及 和 蛋白 功能 进行 研究 ,也 使 建立 基 因 组 文库 的 工作 量 减 少 。 图 8-3 显示 了 以 YAC 克隆 基因 的 基本 过 程 。 2um 质粒 ,后 来 研究 人 员 相 继 又 构建 了 一 系列 酵母 的 克隆 载体 和 表达 载体 。 另 外 , 啤 酒 酵母 具有 较 高 的 安全 性 ,已 被 FDA 确认 为 一 种 安全 的 生物 ,以 其 为 受 体 表 达 的 产品 不 需 要 进行 大 量 的 宿主 安全 性 实验 。 利用 啤酒 酵母 已 成 功 表 达 了 多 种 和 蛋白质, 但 是 啤酒 酵母 作为 受 体 细胞 ,有 不 可 避免 的 缺 点 :表达 量 较 低 ,大 量 表 达 时 , 易 发 生 质粒 的 丢失 ;重组 蛋白 经 常 出 现 过 量 糖 基 化 ;分 泌 表 达 时 ,有 时 会 将 产物 留 在 壁 膜 间 院 中 。 毕 赤 酵母 系统 是 最 近 发 展 起 来 的 新 型 表达 系统 ,与 啤酒 酵母 比较 ,具有 下 列 优点 : (1) 表达 量 高 :利用 强 启动 子 ( 如 : 醇 氧化 酶 AOX 基因 的 启动 子 ) ,表达 量 较 其 他 表达 系统 高 10 倍 至 100 们 以上。 以 毕 赤 酵 母 表达 的 破 伤 风 毒 素 C, 其 表达 量 可 达 12g/L. (2) 稳定 性 好 : 毕 赤 酵母 的 表达 载体 为 整合 型 载体 ,可 通过 同 源 重组 整合 至 酵母 染色 体 中 ,形成 稳定 的 转化 子 。 (3) 高 分 泌 : 以 啤酒 酵母 的 因子 信号 肽 引入 毕 赤 酵母 表达 载体 ,可 获得 很 好 的 分 沁 效 果 , 人 人 血 白 蛋 白 分 泌 表 达 可 达 10g7ZL_。 二 、 外 源 基 因 在 酵母 中 的 表达 策略 1. 酵母 的 偏 受 密码 子 ”不同 生 物 中 密码 子 的 使 用 频率 不 同 ,同一 种 生物 细胞 对 同一 氢 基 酸 的 不 同 密码 子 使 用 频率 也 不 相同 。 在 酵母 中 表达 外 源 基 因 ,自然 要 选用 酵母 偶 受 的 密 第 八 章 “” 真 核 生 物 表 达 系 统 - 113 - 染色 体 DNA EcoRI - 6 A CEN a—< EcoR| B ori TEL TEL BamHI EcoRI EcoRI EcoRI #478 Siti + Bam HI DNA 片段 Lig Dai, y, - EcoR | #4 AR iti i i ori A a TEL ~cmnetgieeniganinipeeen 及 CEN 8B TEL A = ~ reo oo TEL ort A = # GEN” 'B eae Bam HI BAAR Sita T4 连 接 酶 体外 重组 TEL ori A > CEN B TEL _———— ee | We AY, PRE WS Ba 一 一 一 a See eee, see a) . et ee 图 8-3 YAC 克隆 基因 的 流程 码 子 ,但 同时 要 考虑 基因 转录 产物 mRNA 的 二 级 结构 对 表达 蛋白 的 影响 。 2. 外 源 基 因 的 表达 形式 “外 源 基因 在 酵母 中 有 两 种 表达 形式 : (1) 直接 表达 外 源 基因 :即将 外 源 蛋 白 表达 在 细胞 质 中 ,而 不 分 刻 出 胞 。 酵 母 菌 表达 外 源 基 因 ,多 为 胞 内 表达 ,其 中 ,乙肝 病毒 表面 抗原 在 酵母 菌 中 的 表达 就 是 一 个 成 功 的 例子 (图 8-4). (2) FEW Bead s Th Wh Bei A VA ae Ss 7° oy Be Be APE, Va ET Ay A EB HE Bo BE 糖 基 化 修饰 ,是 一 种 很 好 的 表达 形式 。 在 酵母 细胞 中 利用 外 源 性 的 信号 肽 很 难 分 沁 表 达 。 然而 利用 酵母 细胞 中 天 然 存 在 的 分 泌 型 蛋白 质 的 信号 肽 ,可 以 构建 酵母 分 沁 型 表达 载体 , 实 - 现 外 源 基 因 的 分 泌 表 达 。 最 常用 的 酵母 分 泌 信 号 肽 序列 是 啤酒 酵母 因子 的 信号 肽 。 pGAPZa( 图 8-5) 是 利用 oe 因子 进行 分 刻 表 达 的 一 种 新 型 毕 赤 酵母 表达 载体 。 影 响 酵母 细胞 分 泌 表 达 的 因素 除 信号 肽 外 ,还 有 许多 其 他 因素 ,比如 :基因 剂量 .营养 型 及 表达 产物 的 产量 等 。 3. 表达 策略 ”为 实现 外 源 基 因 在 酵母 中 的 高 效 表达 ,可 采取 如 下 措施 : 分 离 的 编码 HBVsAg 序 列 — 酵母 表达 载体 7 BEAL J 一 细菌 复制 起 点 amp’ | evar @ Gam d pe | FARR i AR FEE ie PEL BR AY Be BF 发 酵 装 置 中 提纯 得 到 培养 细胞 HBsAg 物 质 图 8-4 酵母 细胞 表达 乙肝 病毒 表面 抗原 流程 图 pPGAPZQA,B:C 3.1 kb 图 8-5 pGAPZa 物理 图 谱 第 八 章 “” 真 核 生物 表达 系统 .115 (1) 利用 诱导 型 强 启动 子 : 毕 赤 酵 母 表达 载体 中 常用 的 醇 氧化 酶 AOX 启动 子 是 一 种 甲醇 诱导 型 启动 子 , 可 利用 甲醇 诱导 外 源 基因 的 表达 。 (2) 提高 整合 型 表达 载体 在 细胞 中 的 整合 拷贝 数 : sign 记 , 以 抗生素 加 压 筛 选 含 有 多 拷贝 的 转化 子 。 (3) 控制 蛋白 酶 降解 活性 :采用 和 蛋白酶 缺陷 型 宿主 菌 ,降低 发 酵 培 养 基 的 pH, 或 在 培养 基 中 补 加 氨基 酸 或 多 肽 , 均 可 避免 产物 被 降解 。 此 外 ,分 沙 表 达 也 是 一 种 避免 产物 被 降解 的 良好 策略 。 第 三 节 ”哺乳 动物 细胞 表达 系统 哺乳 动物 细胞 表达 系统 是 指 在 哺乳 动物 细胞 中 表达 目的 基因 ,或 采用 茶 种 方式 ,将 目的 基因 导入 哺乳 动物 细胞 ,改变 受 体 细胞 的 某 种 状态 。 哺乳 动物 细胞 是 自然 界 中 最 高 级 的 真 核 细胞 ,以 其 为 受 体 细胞 进行 基因 表达 ,可 对 表达 产物 进行 完全 的 翻译 后 修饰 ,包括 二 硫 键 形 成 、 糖 基 化 、 磷 酸化 . 寡 聚 体形 成 及 和 蛋白酶 对 蛋白 质 的 特定 切割 。 哺 乳 动物 细胞 还 可 表达 有 功能 的 膜 蛋白 受 体 细胞 ,这 为 研究 多 种 膜 受 体 的 生物 学 功能 提供 了 必要 工具 。 此 外 ,哺乳 动物 细胞 表达 系统 是 进行 基因 治疗 的 惟一 受 体系 统 。 因 而 ,哺乳 动物 细胞 表达 系统 有 着 其 他 表达 系统 不 可 替代 的 作用 。 一 、 哺 乳 动 物 细胞 表达 系统 中 的 常用 遗传 标记 1. 胸 苷 激酶 ( 芯 ) 基 因 一 一 HAT 选 择 法 ”正常 细胞 中 二 氢 叶 酸 还 原 酶 将 二 氧 叶酸 还 原 为 四 氢 叶 酸 ,参与 合成 dTTP .4dATP .dCTP。 当 培养 基 中 加 入 二 氢 叶 酸 类 似 物 氮 基 蝶 叭 时 ， 二 氢 叶 酸 还 原 酶 失 活 ,上述 途 径 受 阻 。 由 于 正常 细胞 中 含有 ck BA, ch 基因 可 将 胸 苷 转化 为 胸 苷 一 磷酸 ,进而 继续 合成 dTTP ,满足 细胞 需求 ; 若 同时 在 培养 基 补 加 次 黄 味 叭 作为 dATP.dCTP 合成 的 蔡 补 途径 , 则 细胞 可 以 生存 。 因 而 在 HAT 培养 基 ( 正 常 培养 基 中 添加 BA TEMES Ue BRS BEF) Pot? 细胞 可 以 存活 ,而 tk- 细胞 因为 缺乏 ck 基因, 不 能 合成 dTTP, ARETE HAT 培养 中 生存 。 因此 ,以 让 -细胞 株 为 受 体 细 胞 ,以 含 次 黄 味 叭 (hypoxanthine)、 氮 基 蝶 叭 (aminopterin ) Ail HF (thymidine) A) HAT 选择 培养 基 进 行 选择 培养 ,可 筛选 重组 有 ck SEA tk” A. 2. =A RIA RB (dihydrofolate reductase，dhfr) 基 因 dhfr 是 真 核 细 胞 合成 胸腺 喀 了 啶 过程 中 重要 的 酶 ,可 催化 二 氧 叶 酸 还 原 为 四 氢 叶 酸 ,后 者 为 合成 胸腺 喀 啶 提供 甲 基 。 这 一 1 FE BY BK HY BRE {Dy BBE HH MS Fa AA aE FS ( methotrexate, MTX) 3e FEA ii], dhfr” 4a Al 普通 培养 基 中 无 法 成 活 ,但 转 和 人 dhfr 基因 后 可 生存 。 因 而 ,以 dhfr” MASA, Be 转 和 人 dh fr 基因 的 细胞 。 dhfr 为 选择 标记 对 受 体 细胞 有 严格 的 限制 ,但 该 选择 系统 的 优点 是 : 若 培 养 基 中 加 入 甲 氨 蝶 叭 (MTX) ,并 逐渐 增加 浓度 ,使 细胞 逐渐 产生 抗 性 ,可 以 使 转 人 的 dh fr 基因 和 外 源 基 因明 显 扩 增 ,外 源 基 因 表 达 量 增加 。 3. 新 霉 素 抗 性 基因 (zeo) 此 标记 基因 适合 在 含有 新 霉 素 类 似 物 G418(gentamycin ) 的 。 116 .基因 工程 学 选择 培养 基 中 选择 neo 的 细胞 。 其 原理 为 :虽然 新 霉 素 只 对 原核 细胞 有 毒性 而 对 真 核 细胞 无 毒性 ,但 其 类 似 物 G418 却 对 真 核 .原核 细胞 均 有 毒性 , 故 一 般 真 核 细胞 在 含 G418 培养 基 HAE. neo 基因 编码 的 磷酸 转移 酶 可 以 使 G418 失 活 AMAR KAPHA neo 基因 后 可 以 在 含 G418 的 培养 基 中 生长 。 以 新 霉 素 抗 性 基因 为 选择 标记 适用 于 所 有 真 核 细 胞 ,对 受 体 细胞 无 特殊 要 求 ,是 一 种 应 用 极为 广泛 的 真 核 标记 基因 。 转化 后 的 重组 子 经 上 述 筛选 标志 初 选 后 ,还 应 进行 特异 性 筛选 :可 进行 原 位 杂交 或 提取 重组 子 核 酸 进行 酶 切 电泳 分 析 , 有 必要 时 可 进行 核酸 序列 分 析 和 表达 产物 检测 。 二 、 哺 乳 动物 细胞 表达 载体 在 哺乳 动物 细胞 中 表达 外 源 基因 , 真 核 载体 是 必 不 可 少 的 工具 ,也 是 成 功 的 关键 。 所 谓 真 核 细 胞 载体 即 可 携带 外 源 基 因 进 入 真 核 细 胞 ,并 在 其 中 复制 增殖 表达 的 工具 。 根 据 功 能 ,可 以 分 为 真 核 细胞 克隆 载体 和 真 核 细胞 表达 载体 。 真 核 细 胞 克隆 载体 指 适 用 于 外 源 基 因 在 真 核 细胞 中 扩 增 的 载体 工具 。 因 为 在 真 核 细胞 中 扩 增 操作 复杂 、\ 周 期 长 成 本 高 ,所 以 一 般 都 在 真 核 细 胞 克隆 载体 的 基础 上 进一步 加 工 ,加 入 真 核 启动 子 ,增强 子 等 元 件 ,使 外 源 基因 可 以 在 真 核 细胞 中 表达 ,这 就 是 真 核 表 达 载 体 (适用 于 外 源 基 因 在 真 核 细胞 中 的 表达 )。 另外 , 受 体 细胞 不 同 ,适用 的 载体 也 不 同 ,这 些 载体 又 有 一 些 特殊 名 称 , 其 中 ,适用 于 哺乳 动 物 细 胞 的 载体 统称 为 哺乳 动物 细胞 表达 载体 。 (一 ) 哺乳 动物 细胞 表达 载体 的 主要 组 成 元 件 现在 经 常 应 用 的 哺乳 动物 表达 载体 均 为 穿梭 载体 , 既 包 含 原 核 序 列 ,以 利于 在 原核 细胞 中 扩 增 ,又 包含 能 在 真 核 细 胞 中 表达 的 转录 单位 (由 非 编 码 序列 及 选择 标志 组 成 , 常 将 已 清 楚 的 几 种 不 同 病 毒 及 哺乳 动物 基因 融合 在 一 起 ) 。 哺 乳 动物 表达 载体 主要 包括 以 下 元 件 : 1. 启动 子 启动 子 的 转录 效率 因 细 胞 而 异 ,因此 要 根据 宿主 细胞 的 类 型 选择 不 同 的 启 动 子 。 真 核 表 达 载 体 中 常用 的 启动 子 包 括 病毒 来 源 的 启动 子 ( 如 : 绿 猴 空 泡 病毒 40, simian vacuolating virus40, SV40) Ja a) . B 4H Ad jm & (cytomegalovirus, CMV) JA WT. AR (Rous sarcoma virus, RSV) Ja BF 2 #% SRI BE AK OR Sita BE AZ FF 9] (long terminal repeat, LTR) 等 ) 和 细胞 来 源 的 启动 子 [ 如 热 休 克 和 蛋白 (heat shock protein, HSP) Ja HF . WLR HE MCK 启动 子 等 ]。 大 多 数 真 核 启 动 子 .增强 子 具 有 较 强 特异 性 , 故 应 根据 宿主 加 以 选择 ;但 有 些 来 自 于 病毒 的 增强 子 宿 主 范围 较 广 泛 ,如 SV40 早期 增强 子 , 可 对 多 种 哺乳 动物 型 别 细胞 启动 子 有 作用 。 2. 增强 子 ”许多 来 源 于 病毒 的 增强 子 具 有 广泛 的 宿主 范围 ,在 不 同 种 属 细胞 中 都 有 极 强 的 促进 转录 能 力 ,这些 序 列 已 被 广泛 用 于 真 核 表 达 载 体 中 ,常用 的 有 SV40、RSV CMV、 LTR 增强 子 。 3. 筛选 标记 “克隆 在 真 核 载体 中 的 重组 子 , 由 于 真 核 基因 一 般 没 有 特殊 标志 , 故 必 须 在 真 核 载体 中 填 加 筛选 标志 。 常 用 的 标志 基因 详 见 前 述 。 4. 转录 终止 信号 和 多 聚 腺 苷 酸化 信号 ”为 使 转录 后 的 mRNA 能 有 效 进行 切割 和 多 聚 \ 第 八 章 “” 真 核 生 物 表 达 系 统 .117 . ARE RL ,在 真 核 表 达 载 体 中 必须 含有 转录 终止 信号 和 多 聚 腺 苷 酸化 信号 ,最 常用 的 polyA 信号 是 来 自 SV40 的 一 段 237bp 的 BamH I-Bel 工 限制 性 酶 切片 段 。 另 外 , 真 核 基 因 3“ 非 编 码 区 的 一 些 序列 可 影响 mRNA 稳定 性 , 故 有 必要 切除 。 5. 剪接 信号 ”并 非 所 有 cDNA 都 需要 剪接 信号 ,但 一 般 来 说 ,内 含 子 不 会 降低 而 是 提 高 表达 效率 , 故 可 采取 在 哺乳 动物 基因 转录 单位 中 带 有 剪接 供 体 和 受 体 位 点 的 载体 。 6. 复制 元 件 ”载体 中 的 复制 元 件 可 提高 外 源 基 因 表 达 水 平 。 如 SV40 复制 子 , 可 使 载 体 在 相应 宿主 中 大 量 复 制 , 达 极 高 拷贝 数 (3 一 4 天 后 达 104/ 细 胞 ) ,用 于 瞬时 而 大 量 表达 蛋 A. 7. 原核 序列 ”为 了 能 方便 地 获得 大 量 的 重组 DNA, 哺 乳 动 物 表 达 载 体 通常 含有 一 段 原核 序列 ,其 中 包括 :能 在 大 肠 杆 菌 中 复制 的 复制 子 、 便 于 在 原核 细胞 中 筛选 重组 子 的 抗 性 基因 和 多 克隆 位 点 。 (二 ) 哺乳 动物 细胞 表达 载体 的 种 类 哺乳 动物 表达 载体 分 为 病毒 型 载体 和 非 病 毒 型 载体 两 大 类 。 1. 病毒 型 载体 ”病毒 是 在 漫长 的 自然 进化 过 程 中 存活 下 来 的 没有 细胞 结构 的 最 小 、 最 简单 的 生命 寄生 形式 。 它 们 通常 可 以 高 效率 地 进入 特定 类 型 的 细胞 ,表达 自身 蛋白 并 产生 新 的 病毒 粒子 。 因 此 ,病毒 是 首先 被 改造 作为 真 核 表 达 的 载体 。 原 则 上 讲 , 所 有 的 病毒 通过 一 系列 的 处 理 ( 如 删除 与 致癌 、 致 毒 和 复制 相关 的 基因 片段 ,在 合适 的 位 置 插 人 外 源 基 因 )， 均 可 改造 成 为 基因 传递 的 工具 。 目前 常用 的 病毒 载体 分 为 两 类 :整合 型 和 游离 型 。 其 中 整合 型 载体 整合 人 染色 体 ,并 随 染色 体 复制 而 复制 ,可 持续 表达 外 源 基因 ,但 存在 插入 诱 变 的 危险 ,主要 包括 SV40 载体 、 反 转录 病毒 载体 。 游 离 型 载体 不 整合 人 染色 体 ,而 是 游离 于 染色 体外 ,以 病毒 颗粒 的 形式 独立 复制 ,或 在 辅助 病毒 的 帮助 下 复制 ,没有 插入 诱 变 的 危险 ,安全 性 高 ,但 一 般 为 瞬时 表达 。 主 要 包括 : 腺 病毒 载体 、 冶 苗 病毒 载体 等 。 (1) SV40 病毒 载体 :SV40 DNA 是 一 个 小 的 、 共 价 闭合 双 链 DNA, 长 约 5.2kb, 其 序列 及 物理 图 谱 和 各 功能 区 段 已 清楚 。SV40 基因 组 分 早期 区 和 晚期 区 ,早期 区 基因 是 病毒 溶 源 生 长 所 必需 ,可 产生 tt 抗原 和 工 抗原 ,晚期 区 则 产生 病毒 衣 壳 蛋白 ,是 包装 病毒 颗粒 所 必 需 的 。 SV40 病毒 载体 是 发 展 最 早 的 经 典 的 病毒 载体 ,其 构建 方法 有 两 种 :一 种 是 将 外 源 基 因 取代 早期 区 或 晚期 区 ,然后 与 辅助 病毒 (只 包含 早期 区 或 晚期 区 ) 共 同感 染 宿主 , 即 可 获得 含 外 源 基因 的 子 代 病毒 颗粒 , 另 一 种 是 仅 保 存 病毒 基因 组 中 与 复制 相关 的 序列 ,并 与 质粒 DNA 重组 ,构建 穿梭 载体 。 pSVK, 质粒 (图 8-6) 是 广泛 适用 于 多 种 哺乳 动物 细胞 的 多 功能 表达 载体 。 由 以 下 元 件 构成 :四 质粒 复制 起 始点 CoUET :质粒 可 在 细菌 中 复制 扩 增 ;@ 丝 状 噬 菌 体 复制 起 始点 Fl1: 在 辅助 噬菌体 M3 KO, 帮助 下 可 产生 单 链 喉 菌 体 ;@SV40 的 复制 起 始点 .早期 启动 子 、 mRNA 拼接 信号 和 接 尾 信号 :质粒 可 在 真 核 细 胞 中 复制 并 表达 基因 ;四 多 克隆 位 点 ; GOT7RNA 聚 合 酶 启动 子 :可 在 体外 转录 插入 片段 的 DNA。 (2) 反 转 录 病 毒 (RV) 载 体 : 反 转 录 病 毒 属 于 正 链 RNA 病毒 ,可 高 效 地 感染 许多 类 型 的 352 AATACGACTCAT IAIAGGGAGATCGAATTCGAGCTCGGTACC T7 Promoter EcoR| Sacl* Kpn1 395 CGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGGGCCCTCGAGCTC Smal Tgamul* Xbal Sal Pst] Xhol Sacl* Apal Bgl (271) SV40 Early Promoter | SV40 Small T antigen SV40 ori an 5 人 3Splice site Pyull(3917) Ssp 1(983)* ae Polyadenylation pSVK3 3919bp pBluescript Il KS+ 4 Ssp 1(1913)* *Site not unique Ssp 1(2044)* Bgl 1(2727)* —Pyull(2479)* 图 8-6 pSVK; 质粒 宿主 细胞 ,并 稳定 整合 到 宿主 细胞 基因 组 中 。 它 是 最 先 被 改造 且 应 用 最 为 广泛 的 基因 治疗 载体 。 反 转 录 病 毒 基 因 组 大 约 10kb, 含 有 三 个 最 重要 的 基因 :gag( 编 码 核心 蛋白 )、zo!( 编 码 反 转 录 酶 ) 和 ezw( 编 码 病毒 外 膜 蛋 白 ) 。 两 端 存在 长 末端 重复 区 (LTRS) 用 于 介 导 病毒 的 整 Bo env 基因 中 含有 病毒 包装 所 必需 的 序列 (包装 信和 号 )。 常用 的 反 转 录 病 毒 载 体 多 由 Moloney 鼠 白血病 病毒 (MoMuLVI) 改 造 而 来 。 此 类 病毒 为 嗜 双 性 病毒 , 既 可 感染 鼠 细胞 亦 可 感染 人 细胞 。 反 转录 病毒 载体 的 基本 成 分 包括 :必需 的 病毒 基因 组 分 (如 LTRS、 病 毒 的 包装 识别 信和 号、 翻译 所 需 的 前 接 识 别 位 点 及 poly A 尾 等 )、 标记 基因 和 其 他 质粒 必要 成 分 。 反 转 录 病 毒 载体 均 为 复制 缺陷 型 反 转 录 病 毒 载体 ,其 中 缺失 反 转 录 病 毒 的 gag, pol 和 env 等 基因 ,因而 不 能 形成 病毒 颗粒 ,必须 借助 包装 细胞 提供 病毒 蛋白 ,才能 包装 产生 子 代 重组 病毒 。 这 种 子 代 重 组 病毒 也 仅仅 具备 一 次 感染 性 ,从 而 避免 了 在 人 体 细胞 间 的 扩散 感 染 ,也 大 大 降低 了 病毒 本 身 的 致癌 性 与 致 病 性 。 所 谓 包 装 细胞 即将 缺失 包装 信号 的 反 转 录 病毒 DNA 导入 细胞 即 构建 成 包装 细胞 系 ,可 为 反 转 录 病 毒 载体 提供 结构 蛋 白 ,使 之 包装 形 第 八 章 ” 真 核 生 物 表 达 系 统 - 119 - 成 子 代 病毒 颗粒 。 其 中 包装 细胞 含有 反 转 录 病 毒 的 包装 蛋白 (满足 穿梭 载体 需求 ) ,但 缺失 包装 信号 等 调控 元 件 ,同样 不 能 独自 产生 完整 病毒 颗粒 。 病 毒 载体 转 染 进入 包装 细胞 后 , 载 体 与 包装 细胞 作用 互补 共同 完成 病毒 包装 ,形成 的 病毒 颗粒 感染 目的 细胞 后 ,由 于 目的 细胞 不 含有 编码 病毒 蛋白 的 基因 ,病毒 DNA 不 能 包装 形成 完整 病毒 颗粒 ,避免 了 扩散 。 基于 上 述 设想 ,人 们 建立 了 第 一 代 包 装 细 胞 系 2, 2 是 单 向 性 包装 细胞 ,包装 形成 的 病毒 颗粒 仅 感染 吵 齿 类 动物 。 由 于 虽 2 缺失 包装 信和 号 ,其 反 转 录 与 整合 信号 完整 ,因而 当 载 体 转 入 后 , 易 产 生 辅 助 病毒 。 辅 助 病毒 是 为 缺陷 型 病毒 提供 包装 所 必需 基因 的 病毒 。 若 畏 助 病毒 的 基因 组 一 起 被 包装 , 则 产生 的 病毒 颗粒 进入 受 体 细 胞 后 仍 可 进一步 感染 其 他 细胞 。 第 二 代 包 装 细胞 的 代表 PA317 是 双向 性 包装 ( 子 代 颗粒 除 感染 嘴 齿 类 动物 外 ,还 可 感染 灵 长 类 动物 )。PA317 中 除 缺 乏 包 装 信号 ,还 有 S LTR 端的 缺失 ,上 且 其 3” LTR 被 SV40 的 多 聚 腺 苷 酸 位 点 取代 ,因而 其 产生 辅助 病毒 的 可 能 性 大 大 减少 。 第 三 代 包 装 细胞 (@GCRE、 ECRIP) 进 一 步 在 结构 基因 内 引入 突变 与 缺失 ,使 得 产生 辅助 病毒 的 可 能 性 进一步 降低 。 反 转 录 表 达 载 体 作为 基因 载体 具有 明显 优势 :宿主 范围 广泛 ,存在 于 几乎 所 有 的 人 类 细 胞 上 ,因而 对 细胞 的 感染 谱 广 ,特别 是 对 分 裂 细 胞 感染 效率 较 高 ;可 主动 感染 分 裂 细 胞 ; 可 整 合 到 宿主 染色 体 中 ,在 细胞 内 长 期 存在 而 不 杀 死 宿主 细胞 ,表达 时 间 较 长 ,是 当今 基因 治疗 中 常用 载体 。 但 反 转 录 病 毒 载体 也 存在 不 可 克服 的 缺点 : 仅 整合 到 处 于 增殖 状态 的 细胞 ,对 静止 细胞 无 感染 能 力 ; 人 允许 插入 的 外 源 基 因 有 严格 的 限制 ,一 般 小 于 8kb; 携 带 外 源 基 因 随 机 整合 和 人 人体 组 织 细 胞 ,有 诱 变 危险 , 且 组 织 或 细胞 选择 性 不 高 。 (3) 腺 病毒 (AdV ) 载 体 : 腺 病毒 是 无 包 膜 的 线性 双 链 DNA 病毒 ,在 自然 界 分 布 广泛 ,其 基因 组 长 约 36kb ,两 端 各 有 一 个 反 向 末端 重复 区 (ITR) ,ITR 内 侧 为 病毒 包装 信号 。 基 因 组 于 分布 着 四 个 早期 转录 单位 (E1、E2、E3、 下 4) 承 担 调节 功能 ,和 一 个 晚期 转录 单位 ,负责 结 构 蛋 白 的 编码 。 第 一 代 腺 病毒 载体 中 腺 病毒 基因 组 上 的 E1A 和 El1B 基因 已 被 目的 基因 所 取代 ,因而 在 普通 体内 缺乏 复制 能 力 , 仅 在 染色 体 上 已 整合 有 E1A MELB 的 包装 细胞 (如 293 细胞 ) 中 复制 ,缺陷 型 的 重组 腺 病毒 才能 包装 成 完整 的 腺 病毒 颗粒 ,具有 较 好 的 安全 性 。 但 此 类 型 载体 可 引发 机 体 产生 强烈 的 炎症 反应 和 免疫 反应 , 且 表 达 外 源 基因 时 间 短 。 第 二 代 腺 病毒 载体 在 第 一 代 载 体 的 基础 上 ,缺失 E2A 或 下 4 基因 ,产生 较 弱 的 免疫 反应 ,其 载体 容量 和 安 全 性 方面 较 第 一 代 载 体 改 进 许多 。 第 三 代 腺 病毒 载体 缺失 了 全 部 的 (无 病毒 载体 , gutless vector) 或 大 部 分 腺 病毒 基因 (微型 腺 病毒 载体 ,mini-Ad) , 仅 保 留 ITR 和 包装 信号 序列 。 第 三 代 腺 病毒 载体 最 大 可 插 和 人 35kb 的 基因 ,病毒 蛋白 表达 引起 的 细胞 免疫 反应 进一步 减少 ; 载体 中 引入 核 基质 附着 区 基因 可 使 得 外 源 基 因 保 持 长 期 表达 ,并 增加 了 载体 的 稳定 性 。 腺 病毒 载体 其 生物 学 特性 有 :不 整合 到 染色 体 中 ;外 源 基因 表达 水 平 高 ;表达 时 间 较 短 ; 免疫 原 性 强 。 与 反 转 录 病 毒 载体 相 比 , 腺 病毒 载体 具有 显著 优点 :@ 四 基因 组 大 ,因而 可 插 人 大 片段 外 源 基因 (最 多 可 达 35Skb);@ 可 高 效 地 转 染 不 同类 型 的 人 体 组 织 细胞 (体外 实验 通常 接近 100% 转 染 效 率 ) ;@ 可 感染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ;@@ 病 毒 滴 度 高 ,可 达 10!" pfu/ml; © FT Ja fin wR 染 组 织 ,如 肺 等 ;@ 进 入 细胞 内 并 不 整合 到 宿主 细胞 基因 组 , 仅 瞬 间 表 达 , 因 而 安全 性 较 高 。 腺 病毒 载体 的 缺点 主要 表现 为 :免疫 原 性 强 , 可 刺激 机 体 产 生 免 疫 反应 ;重组 、 纯 化 费时 ; 几 - 1200: 基因 工程 学 乎 可 以 感染 所 有 细胞 ,而 缺乏 特异 性 。 (4) 腺 相关 病毒 (AAV) 载 体 : 腺 相关 病毒 属于 非 致 病 的 微小 病毒 科 家 族 的 成 员 。 只 有 依赖 于 辅助 病毒 (如 腺 病毒 ) 才 能 增殖 。 此 类 病毒 基因 组 很 小 ,如 开 型 腺 相关 病毒 是 由 4681 个 核 苷 酸 组 成 的 单 链 DNA; 包 含 两 个 基因 : rep 基因 (编码 负责 调节 病毒 复制 .结构 基因 表 达 和 整合 到 宿主 基因 组 中 的 蛋白 ); cap 基因 (编码 衣 壳 结构 蛋白 ) ,基因 组 的 一 个 末端 存在 一 个 145bp 的 末端 重复 区 (terminal repeat). AAV 是 目前 基因 治疗 载体 系统 研究 的 热点 之 一 。 其 生物 学 特点 有 :基因 组 小 而 易于 操 VE ;可 感染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ; 当 辅 助 病毒 不 存在 时 ,AAYV 能 整合 到 宿主 细胞 基因 组 的 特定 区 域 ( 如 人 的 第 19 号 染色 体 短 臂 上 ) ,但 构建 的 载体 实际 应 用 时 则 很 难 达 到 定向 整合 ;无 致 病 性 .安全 性 好 ;免疫 原 性 弱 ,实验 证 明 其 可 以 有 效 地 转 染 脑 ` 骨骼 肌 、 肝 脏 等 许多 类 型 的 细 胞 。 缺 点 是 装载 外 源 基 因 容 量 有 限 ( 不 超过 4.9kb) ,缺少 高 效 的 包装 细胞 ,制备 过 程 复杂 ， 制备 滴 度 低 (< 10* 病毒 颗粒 /ml) ,可 能 出 现 免 疫 排斥 反应 。 (5) 冶 苗 病毒 载体 : 首 苗 病毒 是 动物 病毒 中 最 大 的 一 种 ,其 基因 组 也 非常 大 , 且 与 天 花 病毒 有 密切 亲缘 关系 ,长 期 以 来 被 用 做 预防 天 花 的 疫苗 。 癌 苗 病毒 的 庞大 基因 组 中 含有 一 个 大 的 复制 非 必需 区 ,可 供 外 源 基 因 插 和。 痘 苗 病 毒 载体 一 般 包 括 : 冶 苗 病毒 调控 顺序 .外 源 基因 插入 位 点 和 选择 标记 。 因 为 总 苗 病毒 复制 非 必 需 区 很 大 ,因而 可 能 允许 同时 插 和 人 几 种 基因 ,构建 多 价 疫苗 。 2. 非 病 毒 载体 虽然 病毒 载体 作为 基因 传递 的 工具 广泛 被 采纳 ,但 它们 仍 存 在 着 不 少 的 局 限 性 :病毒 性 载体 均 可 以 诱导 机 体 产 生 某 种 程度 的 免疫 反应 ;存在 着 插 和 人 突变 的 风险 ; 载体 容量 有 限 ;制备 过 程 复杂 等 。 非 病 毒 载体 中 含有 原核 组 成 元 件 和 真 核 启 动 子 元 件 ,因而 是 一 类 穿梭 载体 , 既 可 以 在 原 核 细 胞 中 复制 增殖 ,又 可 以 在 真 核 细胞 中 转录 表达 。 非 病毒 载体 不 具备 形成 病毒 颗粒 的 能 力 , 不 能 通过 包装 ,形成 有 感染 性 的 活 病毒 主动 感染 受 体 细 胞 , 而 是 需要 借助 一 定 的 手段 进 入 细胞。 与 病毒 载体 相 比 , 非 病 毒 载体 则 具有 无 传染 性 不 限制 载体 容量 ,可 大 量 制 备 等 优点 。 pCDNA3 (图 8-7) 是 目前 常用 的 非 病 毒 型 表达 载体 ,其 主要 组 成 元 件 包 括 :CMYVY 启动 子 、 多 克隆 位 点 .azzz 抗 性 基因 和 新 霉 素 抗 性 基因 .大肠 杆菌 复制 子 Fl 丝 状 叭 菌 体 复制 起 始点 `SV40 启动 子 .增强 子 和 polyA 加 尾 信号。 三 、 哺 乳 动 物 细胞 基因 转移 方式 成 功 构建 含有 目的 基因 的 重组 表达 载体 后 ,必须 要 将 重组 子 导入 到 受 体 细 胞 。 哺 乳 动 物 细 胞 基因 转移 方法 较 多 ,可 分 为 物理 .化 学 和 生物 三 大 类 。 前 两 种 是 非 病毒 方法 ,包括 磷 酸 钙 沉 淀 法 `.DEAE-Dextran 法 微量 注射 法 ,此 外 还 有 电 穿 孔 法 .裸露 DNA 直接 注射 \ 脂 质 体 共 转化 和 受 体 介 导 的 基因 转移 等 。 第 三 种 方法 为 病毒 方法 , 指 病毒 载体 重组 后 ,通过 体外 包装 ,形成 携带 目的 基因 的 病毒 颗粒 ,主动 感染 靶 细 胞 并 表达 出 目的 基因 的 方法 。 1. 磷酸 钙 沉 淀 法 ”首先 由 Granhan 和 Vander EB 建立 ,主要 用 于 贴 壁 和 悬浮 细胞 的 转 染 。 磷 酸 钙 沉 淀 法 的 关键 是 以 CaCl, 和 磷酸 盐 形成 合适 颗粒 的 磷酸 钙 沉 淀 ,沉淀 形成 后 将 第 八 章 “” 真 核 生 物 表达 系统 - 121 - Apal989 bGH pCDNA3 5446 bp my ori SV40 ColE| polyA neo’ 图 8-7 pCDNA3 物理 图 谱 DNA 与 沉淀 混合 并 加 入 对 数 生 长 期 细胞 ,由 于 磷酸 钙 沉 淀 使 细胞 通 透 性 增高 ,DNA 随 之 进 入 细胞 。 2. DEAE-dextran 法 ”最早 由 Pagano 建立 于 1969 年 , 现 已 广泛 用 于 转 染 技术 ,尤为 暂 时 表达 。 该 法 主要 是 应 用 DEAE-dextran 对 细胞 的 毒性 作用 ,将 DNA 和 DEAE-dextran 无 血清 培养 基 一 起 加 到 受 体 细胞 上 ,在 DEAE-dextran 的 作用 下 ,DNA 导入 受 体 细 胞 。 特 点 是 :DNA 用 量 少 .简便 快速 ,影响 因素 少 ; 同时 使 用 二 磷酸 氯 唑 处 理 细胞 ,可 防止 转 人 的 DNA 被 降解 ,大 大 提高 了 转 染 效率 。 3. 电 穿孔 法 “根据 细胞 暴露 于 高 电压 时 ,细胞 膜 可 被 电 脉冲 瞬间 穿孔 ,从 而 使 存在 于 细胞 悬 液 中 的 外 源 DNA 进入 细胞 设计 的 高 效 基因 转移 方法 。 电 穿孔 法 转 当 效 率 很 高 ,但 细胞 受 损 严重 。 4. 裸 DNA 注 射 即 把 携带 外 源 基 因 的 质粒 直接 注射 或 通过 基因 枪 导 人 到 组 织 细 胞 中 ,此 方法 主要 应 用 于 DNA 疫苗 (外 源 基因 为 病原 体 的 有 功能 的 基因 片段 ) ,可 激发 机 体 的 细胞 免疫 和 体液 免疫 。 5. 脂 质 体 法 “” 脂 质 体 (liposome) 是 由 脂 质 双 分 子 层 组 成 的 颗粒 ,可 介 导 基因 穿 过 细胞 膜 。 最 常用 的 脂 质 体 为 阳离子 脂 质 体 (或 称 阳 性 脂 质 体 ) ,主要 由 带 正 电荷 的 脂 类 和 中 性 辅 助 脂 类 等 摩尔 混合 。 带 阳性 电荷 的 脂 质 体 与 带 阴 性 电荷 的 DNA 之 间 可 以 有 效 地 形成 复合 物 ,此 复合 物 通过 内 吞 作 用 可 进入 细胞 中 。 其 作用 机 制 如 图 8-8 所 示 。 旨 质 体 介 导 的 基因 转 染 有 以 下 特点 :中 脂 质 体 与 基因 的 复合 过 程 比 较 容 易 ;@ 脂 质 体 与 细胞 膜 融合 将 目的 基因 导入 细胞 后 , 脂 质 体 即 被 降解 ,无 毒 ,无 免疫 原 性 ;QODNA 或 RNA 可 得 到 保护 ,不 至 于 灭 活 或 被 核酸 酶 降解 ;四 转 染 过 程 方便 易 行 , 重 现 性 好 。 脂 质 体 介 导 的 基因 转移 方法 具有 简便 、 安 全 、 可 携带 较 大 DNA 分 子 等 优点 ,已 在 多 种 基因 治疗 实验 中 成 功 应 用 ,是 目前 基因 治疗 临床 研究 方案 中 , 除 反 转 录 病 毒 载体 以 外 应 用 最 - 122: 基因 工程 学 阳 离 了 脂 质 体 了 aa 四 + 人 + Pe = 口 Veo + we AMY: : pos Dies 2 tye 全 su se Ak a A AAd ; ONO pee ht ORG ROARS—. Rae 哺乳 动物 细胞 生生 gor eceeP@asevn,, st *. se 了 + *s « ° A 全 图 8-8 阳离子 脂 质 体 基因 转移 作用 机 制 多 的 基因 传递 方法 (>20% )。 但 脂 质 体 介 导 的 转 染 效 率 低 ,尤其 是 无 法 解决 细胞 特异 性 导 入 问题。 6. 受 体 介 导 的 基因 转移 受 体 介 导 的 基因 转移 是 近年 发 展 的 新 技术 , 它 利 用 细胞 表面 存在 的 特异 性 受 体 介 导 的 内 吞 作用 ,将 偶 联 了 受 体 特异 性 配 体 的 DNA 结合 分 子 ( 如 多 聚 赖 氨 酸 ) 与 DNA 结 合 , 形 成 可 溶性 复合 物 ,通过 内 在 化 实现 基因 定向 转移 。 受 体 介 导 的 基因 转移 系统 中 ,外 源 基 因 被 内 吞 后 ,形成 吞 鸣 溶 酶 体 , 常 导 致 部 分 外 源 基 因 及 其 表达 产物 被 降解 而 影响 表达 率 。 如 何 使 得 外 源 基 因 稳 定 地 从 吞噬 溶 酶 体 中 释放 ,是 提高 受 体 介 导 基因 转移 系统 转移 效率 的 关键 。1998 年 , 顾 建 人 、 田 培 坤 等 利用 流感 病毒 部 分 功能 域 可 使 内 吞 小 体 释 放 其 内 吞 物 , 从 而 逃避 溶 酶 体 降解 的 特点 SE A AE ZS RE 肽 的 新 型 细胞 受 体 为 靶 向 的 基因 导 和 人 系统 ,显示 了 其 在 基因 治疗 中 的 优势 和 潜在 应 用 价值 。 除 细胞 表面 存在 的 特异 性 受 体 介 导 外 ,也 可 以 将 DNA 与 单 克 隆 抗体 或 病毒 胞 膜 蛋 白 共 价 结合 ,而 介 导 外 源 基 因 导 和 人 到 某 一 类 型 的 细胞 中 。 第 四 节 ”昆虫 杆 状 病毒 表达 系统 杆 状 病毒 (Baculovirus) 是 许多 农林 业 昆 虫 的 天 敌 , 可 作为 微生物 杀 虫 剂 服务 于 人 类 。 以 杆 状 病毒 作为 外 源 基 因 表达 载体 ,具有 极其 广泛 的 应 用 。1987 年 统计 ,国际 上 已 有 超过 150 所 大 学 研究 机 构 或 公司 的 实验 室 从 事 这 一 研究 ,而 且 已 表达 几 十 种 真 核 基 因 。 其 中 ， 第 一 个 为 美国 食品 和 药物 管理 局 批准 上 人 体 试验 , 拟 用 于 预防 艾滋 病 的 基因 工程 疫苗 ,就 是 应 用 杆 状 病毒 表达 载体 系统 表达 生产 的 。 第 八 章 ， 真 核 生 物 表 达 系 统 + 123 - 一 、 昆 虫 杆 状 病毒 载体 (一 ) 杆 状 病毒 基因 组 特点 杆 状 病毒 基因 组 庞大 , 约 100 一 150kb, 其 中 包含 一 些 与 病毒 复制 无 关 的 非 必 需 区 。 最 时 发 现 ,也 是 应 用 最 多 的 一 个 病毒 复制 非 必 需 区 是 病毒 的 多 角 体 编码 基因 (Ocx )。 多 角 体 蛋白 是 病毒 复制 晚期 用 来 包 埋 病毒 粒子 的 蛋白 质 成 分 ,在 光 镜 下 明显 可 见 ,其 基因 启动 子 强 大 ,可 以 启动 外 源 基因 高 效 表 达 。 另 外 ,后 来 发 现 病 毒 复制 最 晚期 表达 一 种 10kD 的 蛋白 质 , 也 是 复制 非 必需 区 ,其 P10 启动 子 也 逐渐 应 用 于 杆 状 病毒 载体 。 (二 ) 转移 载体 由 于 杆 状 病毒 基因 组 庞大 ,难以 在 体外 拼接 ,必须 借助 转移 载体 进行 体外 基因 操作 。 1. 转移 载体 (transfer vector) 指 同 时 含有 原核 序列 (复制 起 始 信号 抗 性 基因 ) 和 病毒 基因 组 序列 的 载体 , 除 可 携带 外 源 基 因 在 原核 中 复制 、 扩 增 外 ,还 可 通过 细胞 内 同 源 重组 ,将 外 源 基因 插 人 病毒 基因 组 ,构建 重组 病毒 。 2. 转移 载体 的 基本 元 件 (图 8-9) (1) 原核 序列 :包括 复制 起 始点 (如 大 肠 杆菌 Ecoll 复制 起 始点 )、 抗 性 基因 (如 氨 苯 抗 性 基因 ) 及 多 克隆 位 点 。 (2) 杆 状 病毒 启动 子 : 常 用 的 有 P10 启动 子 和 多 角 体 启动 子 (PP 媚 )。 有 些 转 移 载体 中 可 同时 携带 两 个 甚至 多 个 杆 状 病毒 启动 子 , 以 启动 多 种 外 源 基 因 的 同时 表达 。 (3) 杆 状 病毒 复制 非 必 需 区 :多 采用 多 角 体 蛋白 的 侧 愤 序列 ,提供 转移 载体 与 杆 状 病毒 胞 内 同 源 重组 的 位 点 。 (4) 昆虫 细胞 加 尾 信号。 P10 局 动 了 多 角 体 局 动手 OY 加 尾 信号 % fv \ =) RPS ea $f HAW RUE Ecol\ 图 8-9 杆 状 病毒 转移 载体 物理 图 谱 因为 杆 状 病毒 基因 组 庞大 ,难以 在 体外 拼接 。 首 先 必 须 将 病毒 DNA 有 关 片 段 克 隆 于 质粒 DNA 并 做 精细 加 工 , 切 除 多 角 体 编码 区 ,并 保留 其 两 端 片段 , 接 上 多 克隆 位 点 ,构建 成 转移 载体 质粒 (transfer vector plasmid) ; 随后 ,在 体外 拼接 上 外 源 基 因 ,并 利用 共 转 染 的 方法 ,将 野生 型 病毒 基因 和 含有 外 源 基 因 的 重组 转移 载体 质粒 DNA 同时 导入 细胞 ,由 于 两 种 基因 都 具有 多 角 体 编码 区 两 端 片段 ,二 者 在 细胞 内 进行 等 位 基因 交换 ,外 源 基 因 捅 人 到 杆 状 病毒 基因 组 ,而 将 多 角 体 蛋白 基因 灭 活 ( 图 8-10) 。 目的 基因 nee 重组 转移 载体 BEAR MY be PARI 124 基因 工程 学 (三 ) 杆 状 病毒 载体 构建 建立 杆 状 病毒 载体 必须 将 外 源 基 因 插 人 病毒 基因 组 特定 区 域 ,通常 是 多 角 体 编码 区 。 昆虫 虫 体 体内 同 | 涉 重 组 i — | iti | 重组 杆 状 病毒 昆虫 绸 胞 8-10 以 杆 状 病毒 为 载体 表达 目的 基因 的 流程 图 二 、 在 昆虫 细胞 中 表达 外 源 基 因 杆 状 病毒 载体 系统 的 受 体 是 昆虫 细胞 ,目前 这 一 表达 系统 已 日 益 成 熟 ,成 为 一 种 恨 好 的 在 昆虫 细胞 中 表达 外 源 基因 ,首先 必须 构建 一 个 合适 转移 载体 (图 8-10)。 第 八 章 ， 真 核 生物 表达 系统 - 125- 1. 转移 载体 质粒 ”此 质粒 中 不 含 昆虫 基因 启动 子 , 只 是 起 转移 作用 ,通过 共 转 染 与 野 生 型 病毒 共同 进入 宿主 ,并 在 宿主 内 与 野生 病毒 DNA 发 生 同 源 交 换 , 最 终 将 外 源 基 因 插 人 野生 型 病毒 基因 组 中 。 2. 共 转 染 同时 将 病毒 DNA 和 质粒 DNA 导入 细胞 的 方法 , 称 为 共 转 染 (co-transfec- tion)。 常 用 共 转 染 的 方法 有 磷酸 钙 沉 淀 法 和 脂 质 体 技术 微量 注射 技术 。 其 中 磷酸 钙 沈 演 法 简便 易 行 ,转化 效率 较 高 ,应 用 最 广泛 。 3. 重组 病毒 的 筛选 ”由 于 重组 病毒 中 外 源 基因 插 和 人 多角 体 基因 而 使 重组 病毒 表现 为 多 角 体 阴性 (Ocu -) 与 野生 病毒 的 多 角 体 阳性 (Ocu- ) 区 别 明 显 。 因 而 在 培养 的 单 层 细胞 上 铺盖 低 融 点 琼脂 糖 ,并 在 显微镜 下 挑选 Ocu 空 斑 , 即 可 获得 纯化 的 重组 病毒 。 基因 产物 的 表达 :以 纯化 重组 病毒 感染 昆虫 细胞 或 活体 昆虫 , 即 可 在 细胞 培养 上 清 中 或 细胞 质 内 获得 表达 产物 。 三 、 杆 状 病毒 载体 系统 优势 杆 状 病毒 载体 系统 比 其 他 原核 或 真 核 表 达 系 统 具 有 明显 优势 1. 容量 大 杆 状 病毒 不 但 自身 基因 组 大 ,其 复制 非 必 需 区 也 较 大 ,可 以 允许 两 种 外 源 基因 插入 ; 2. 具有 强 启动 子 ”多角 体 蛋 白 启动 子 启 动能 力 极 强 , 其 启动 合成 的 多 角 体 蛋白 占 细 胞 BEAN 50%WE; 3. 有 易 识 别 标记 “野生 型 病毒 表达 多 角 体 蛋白 (Ocu ) ,在 显微镜 下 明显 可 见 ,重组 病 毒 中 外 源 基 因 的 择 人 使 多 角 体 蛋白 基因 失 活 ,不 再 产生 多 角 体 (Ocu ) ,这 一 标志 非常 明显 ， 有 利于 阳性 重组 子 的 筛选 ; 4. 具有 良好 的 后 修饰 作用 ,可 使 表达 产物 进行 磷酸 化 、 糖 基 化 、 切 除 信号 肽 等 。 5. 安全 杆 状 病毒 只 感染 昆虫 细胞 ,对 人 畜 无 害 , 具 有 可 靠 的 安全 性 。 ( 马 春 红 “” 韩 丽 辉 ) 第 九 章 “” 聚合 酶 链 反 应 Chapter 9. Polymerase Chain Reaction 聚合 酶 链 反 应 (polymerase chain reaction ,PCR) 是 一 种 在 体外 扩 增 特定 基因 或 DNA 序 列 的 方法 ,又 称 基因 体外 扩 增 法 ,具有 特异 性 高 效 性 和 高 度 准确 性 三 大 特点 。 它 为 基因 的 分 析 与 研究 提供 了 一 种 强 有 力 的 手段 ,对 现代 分 子 生 物 学 ,万 至 整个 生命 科学 的 研究 与 发 展 都 有 着 深远 的 影响 。PCR 技术 自 1983 年 由 美国 PE-Cetus 公司 的 Mullis 等 人 发 明 至 今 , 已 被 广泛 应 用 于 分 子 克 隆 .序列 分 析 .基因 突变 、 遗 传 病 、 传 染病 .性 传播 性 疾病 及 法 医 判 定 和 考古 研究 等 领域 ,具有 广阔 的 应 用 前 景 。 第 一 节 PCR 的 基本 原理 和 影响 因素 一 、PCR 的 基本 原理 PCR 技术 实际 上 是 在 模板 DNA` 引 物 和 四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 存在 的 条 件 下 依赖 于 DNA 育 合 酶 的 酶 促 合 成 反应 。 具 有 特异 高度 敏 感 、 快 速 、 无 放射 性 及 操作 简单 等 特点 。 特异 性 依赖 于 与 靶 序 列 两 端 互补 的 寡 核 苷 酸 引 物 。 PCR 由 变性 一 退火 一 延伸 三 个 基本 反应 步骤 构成 :四 模板 DNA 的 变性 :反应 物 加 热 至 92~96C ,使 模板 DNA RA PCR 扩 增 形成 的 DNA 双 螺 旋 解 离 ,成 为 单 链 ;@ 模 板 DNA 与 引物 的 退火 ( 复 性 ) :模板 DNA 经 加 热 变性 成 单 链 后 ,温度 降低 使 引物 与 模板 DNA 单 链 的 互补 序列 配对 结合 ,此 步 温 度 变 化 范围 比较 大 (具体 温度 从 37 ~ OSC BA), SIS 列 的 同 源 程度 和 朝 核 苷 酸 的 碱 基 组 成 决定 ;四 引物 的 延伸 :DNA 模板 -引物 结合 物 在 TagDNA 聚合 酶 的 作用 下 ,以 dNTP 为 反应 原料 ,以 靶 序 列 为 模板 , 按 碱 基 配 对 与 半 保 留 复 制 原理 ,合成 一 条 新 的 与 模板 DNA 链 互 补 的 半 保 留 复 制 链 ,重复 变性 一 退火 一 延伸 三 过 程 ,就 可 获得 更 多 的 " 半 保 留 复制 链 ” ,而 且 这 种 新 链 又 可 成 为 下 次 循环 的 模板 (图 9-1)。 每 完成 一 个 循环 需 2 一 4min,2 一 3h 就 能 将 待 扩 目的 基因 扩 增 放大 几 百 万 倍 。 二 、PCR 反应 的 基本 条 件 及 其 对 PCR 的 影响 (一 ) 模板 PCR LA DNA BR RNA 为 模板 进行 核酸 的 体外 扩 增 。 不 过 RNA 的 扩 增 需 首 先 反 转 录 成 cDNA, 然 后 才能 进入 PCR 循环 。 标 准 分 子 生 物 学 方法 制备 的 样品 DNA(RNA) RARE 以 用 于 PCR , 且 不 需要 另外 的 纯化 步 又。 模板 若 为 哺乳 动物 基因 组 DNA, 则 每 次 PCR 需 模 - 126 。 ANS ROBERN .127 - nb 3 ,模板 DNA [= 3 Side oa! 3 5! 端 引物 | 3x 3 号 ae | se 3/ 端 引物 人 / / - DAs eee) see 5 环 底 物 变性 、 退 火 / = 1 3 3 ph. es] ofp = LE I (3 RNA #2: HU) ie Wd on DAAAMAA —— a —— AAAAAA 一 一 AAAAAA 反 转 录 合 成 cDNA 基因 特 关 性 引物 HEHE AT 引物 BEBLZN EE S| YD SSS Se cA AANA 一 -一 一 一 一 -一 AAAAAA “Sa. a tari ae

3 / 5 F 图 9-5 重组 PCR 导致 特定 碱 基 蔡 换 示 意图 五 、 反 加 下 CR 反 疝 PCR(inverse PCR ,IP-CR) 是 对 一 个 已 知 的 DNA 片段 核心 序列 两 侧 的 未 知 序列 进 行 扩 增 和 研究 的 技术 。 选 择 已 知 序 列 内 部 没有 切 点 的 限制 酶 对 此 段 DNA 进行 酶 切 ,利用 连接 酶 使 之 形成 环 状 DNA 分 子 , 具 已 知 序列 设计 合成 合适 的 3 端 和 5 和 端 引 物 扩 增 未 知 序 列 ( 图 9-6)。 | <—DNA—> 一 NA | | | | 用 限制 性 内 切 酶 消化 DNA 用 单一 内 切 酶 消化 核心 区 ， 然 后 进行 PCR 5' 3 人 限制 覆 识 刊 位 点 Sse 上游 扩 增 区 ees Al9-6 反 向 PCR 的 原理 示意 图 7\. 2H PCR 多 重 PCR(multiplex PCR) 即 在 同一 反应 体系 中 加 入 多 对 引物 , 扩 增 同一 模板 的 几 个 区 域 。 如 果 基 因 的 某 一 区 段 缺失 , 则 相应 的 电泳 图 谱 也 缺失 ,多 重 PCR 和 Southern blotting 一 样 可 靠 ,但 操作 简单 得 多 。 多 重 PCR 可 同时 检测 多 个 突变 位 点 或 病原 生物 ,有 利于 遗传 病 和 感染 性 疾病 的 诊断 。 +t. KER PCR 一 般 情 况 下 ,正常 PCR 使 用 的 DNA RAMRAA S$ 一 3 聚合 活性 ,而 无 3 一 5 校正 活 性 ,这样 就 限制 了 PCR 扩 增 片段 的 长 度 。 长 距离 PCR(long PCR ) 使 用 了 两 种 DNA 聚合 酶 ， 一 种 聚合 酶 无 校正 活性 , 另 一 种 聚合 酶 具有 3 一 方向 校正 活性 , 且 其 浓度 较 低 ,这 样 使 PCR 扩 增 片段 长 度 大 为 增加 。 天、 下 对 称 PCR 不 对 称 PCR(asymmetric PCR) ) 即 在 扩 增 体系 中 加 入 不 同 浓度 的 3 端 和 5 引物 ,而 得 到 单 链 DNA 产物 。 一 般 两 条 引物 的 浓度 采用 SO~ 100:1 的 比例 。 在 最 初 10 一 15 个 循环 中 主 要 产物 还 是 双 链 DNA, 但 当 低 浓 度 引 物 被 耗 尽 后 ,高 浓度 引物 介 导 的 PCR 反应 会 产生 大 量 i) 84 DNA(ssDNA) ,纯化 单 链 DNA 即 可 进行 其 他 试验 。 ANS “聚合 酶 链 反 应 .137 . 第 三 节 PCR 的 应 用 PCR 技术 自从 建立 以 来 ,由 于 其 敏感 高效、 操作 简便 ,在 分 子 生 物 学 研究 和 临床 医学 中 得 到 广泛 应 用 。 一 、PCR 在 分 子 生 物 学 中 的 应 用 (一 ) 制备 cDNA 文库 与 筛选 用 传统 方法 构建 cDNA 文库 与 筛选 , 既 费 钱 费 时 ,又 需要 较 多 的 组 织 。 但 如 果 用 PCR 方法 ,只 用 很 少 组 织 其 至 几 个 细胞 就 可 以 构建 cDNA 文库 ,并且 大 大 提高 了 工作 效率 。 (=) DNA 测序 PCR 技术 使 DNA 测序 大 为 简化 ,因此 ,现在 几乎 都 采用 PCR 法 进行 DNA 序列 测定 。 测序 时 ,PCR 产物 既 可 以 克隆 到 测序 载体 中 ,也 可 以 不 克隆 直接 测序 。 直 接 测序 方便 可 靠 ， 且 可 标准 化 和 自动 化 ,所 以 直接 测序 更 普遍 。 自动 化 测序 仪器 ,大 都 使 用 荧光 或 放射 性 标记 的 核 苷 酸 挫 人 法 ,然后 进行 电泳 与 自动 化 记录 结果 ,自动 测序 中 常用 的 反应 是 不 对 称 PCR. (三 ) 检测 突变 碱 基 DNA 碱 基 突 变 可 引起 肿瘤 .遗传 病 .免疫 性 疾病 等 ,因此 ,检测 DNA 突变 分 子 对 临床 诊 断 与 研究 有 重大 意义 。 突 变 分 子 的 检测 有 多 种 方法 ,如 赛 核 苷 酸 探 针 (ASO) 限制 性 内 切 酶 片段 长 度 多 态 性 (RFLP) 变性 凝 胶 电 泳 (DGCE) 及 其 他 方法 ,但 是 以 上 各 种 方法 A OR 合 酶 链 反 应 - 单 链 构 象 多 态 性 (single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products,PCR-SSCP ) 分 析 技 术 简 便 快速、 经 济 。 PCR-SSCP 技术 的 原理 是 :在 非 变性 条 件 下 ,DNA 单 链 在 凝 胶 电 泳 中 的 迁移 率 与 其 相 对 分 子 质 量 和 空间 构象 有 关 。DNA 分 子 中 碱 基 突 变 ( 即 使 只 有 一 个 碱 基 ) 可 导致 空间 构象 的 改变 ,影响 DNA 的 泳 动 速度 ,从 而 将 变异 的 DNA 与 非 变异 DNA 区 分 开 来 。 由 于 PCR-SSCP 技术 是 检测 单 链 DNA 的 ,因此 可 应 用 不 对 称 PCR ,将 PCR 产物 进行 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ,此 时 双 链 DNA 泳 动 速度 最 快 ,其 次 是 正常 的 单 链 DNA 分 子 , 最 后 是 突 AES} Fo (四 ) 基因 重组 与 融合 在 分 子 生物 学 研究 中 常常 需要 将 两 个 不 同 的 基因 融合 在 一 起 ,通过 PCR 反应 可 以 比较 容易 地 实现 这 一 目的 。 在 两 个 PCR 扩 增 体系 中 ,两 对 引物 分 别 由 其 中 一 对 的 5 末端 引物 和 万 一 对 的 3 末端 引物 带 上 一 段 互补 的 序列 。 混 合 两 种 PCR 扩 增 产物 ,在 连接 酶 的 作用 下 于 互补 端 发 生 粘 连 ,得 到 包含 两 个 不 同 基因 的 DNA 片段 IST rn ee - 138: 基因 工程 学 (五 ) 用 简 并 引物 法 扩 增 未 知 序列 简 并 引物 是 指 按照 氨基 酸 密码 子 简 并 性 而 合成 的 一 套 不 同 碱 基 序列 。 最 常 使 用 的 情况 有 : 当 某 一 基因 的 序列 不 明 ,但 其 表达 的 蛋白 质 已 纯化 ,并 已 对 氨基 末端 的 氨基 酸 测序 ,知道 了 几 个 所 基 酸 序列 (通常 为 5 个 或 以 上 氮 基 末端 氨基 酸 序列 ) 时 ;或 者 是 为 寻找 某 一 基因 家 族 未 知 成 员 时 ;或 对 某 一 基因 家 族 分 型 鉴定 时 。 使 用 简 并 引物 的 PCR 反应 ,最 适 条 件 往往 要 赁 经 验 确 定 ,尤其 是 选 定 复 性 温度 ,以 避免 引物 与 模板 之 间 发 生 错 配 , 有 的 学 者 认为 用 热 启动 法 能 够 有 效 地 克服 错 配 现象 。 (六 ) 其 他 PCR 技术 在 其 他 很 多 方面 都 得 到 了 应 用 ,如 基因 定量 ,鉴定 与 调控 蛋 自 结合 的 DNA 序 列 ; 检 测 基因 修饰 ,还 可 制备 DNA 探 针 、 构 建 克 隆 或 表达 载体 等 。 二 、PCR 技术 在 临床 医学 中 的 应 用 (一 ) 病原 体 诊断 利用 PCR 可 以 检测 标本 中 的 病毒 、 细 菌 \ 真 菌 .支原体 , 直 圣 寄生 虫 等 病原 生物 ,标本 可 以 是 组 织 .细胞 .血液 分泌 物 或 排泄 物 等 。 对 于 某 些 病毒 或 细菌 ,如 肝炎 病毒 等 还 可 以 分 型 。 诊 断 的 关键 是 要 正确 设计 引物 ,通常 应 设置 阳性 对 照 与 阴性 对 照 ,以 防止 出 现 假 阴 性 或 者 假 阳 性 结果 。 如 果 模 板 DNA SBA, A Wty SR PCR, HH PCR 反应 的 敏感 性 、 特 异性 和 检测 的 准确 性 。 (二 ) 遗传 病 基 因 的 诊断 遗传 病 一 旦 发 病 ,往往 难 以 治愈 ,终生 伴随 ,甚至 夺 去 病人 的 生命 ,所 以 及 早 发 现 尤为 重 要 。 用 PCR 进行 诊断 ,由 于 其 成 本 低 .快速 和 对 样品 质量 和 数量 要 求 不 高 等 特点 ,可 在 妊 垦 早期 取得 少量 样品 (如 羊水 ) 进 行 操作 ,发 现 异 常 胎儿 可 早期 终止 妊娠 。 (=) 组 织 器 官 移植 的 配 型 选择 we BBE A MBE ,对 某 些 疾病 的 治疗 具有 独特 的 作用 。 同 基因 移植 不 发 生 免 疫 排斥 ,而 异 基因 移植 时 ,会 发 生 移植 排斥 反应 。 避 免 移植 排斥 反应 ,需要 找到 与 受 者 主要 组 织 相 容 性 抗原 (HLA) 相 适应 的 个 体 。HLA 经 典 的 配 型 方法 是 通过 血清 学 或 混合 淋巴 细胞 培养 方法 分 析 HLA 的 基因 表 型 ,操作 费时 又 不 方便 。 使 用 PCR 配 型 时 ,可 使 用 有 关 HLA 基因 引物 ,对 HLA 进行 扩 增 ,并 利用 寡 核 苷 酸 探 针 进 行 杂交 ,可 方便 精确 地 选择 出 配 型 合 适 的 供 体 。 (四 ) 肿瘤 的 诊断 、 转 移 的 确定 根据 各 种 肿瘤 细胞 内 基因 突变 的 情况 设计 引物 ,进行 PCR, 同 时 据 正常 基因 设计 引物 第 九 章 ”聚合 酶 链 反应 - 139 - 进行 PCR ,比较 二 者 PCR 产物 琼脂 糖 凝 胶 电泳 结果 , 即 可 判断 是 否 为 肿瘤 。 若 为 血液 标本 、 淋巴 结 或 肿瘤 临近 组 织 即 可 活检 , 亦 可 有 助 于 确定 是 否 有 肿瘤 转移 ,由 于 PCR 高 度 敏 感 , 只 需 少 量 肿 瘤 细 胞 即 可 获得 阳性 结果 ,有 利于 早期 诊断 。 (五 ) 法 医学 法 医学 应 用 DNA 分 析 的 目的 包括 个 人 识别 和 亲子 鉴定 。PCR 技术 的 应 用 和 发 展 , 有 效 地 解决 了 法 医学 上 取证 遇 到 的 困难 。 随 着 新 的 PCR 技术 的 建立 , 必 将 促进 法 医学 更 快 的 发 展 。 (六 ) 其 他 领域 PCR 技术 在 动 植物 学 研究 领域 组织 和 群体 生物 学 及 古生物 学 等 领域 已 得 到 广泛 的 应 用 。 ( 朱 法 良 ) 第 十 章 核酸 杂交 Chapter10. Nucleic Acid Hybridization 核酸 分 子 杂 交 技 术 Nucleic Acid Hybridization 是 现代 分 子 生 物 学 领域 最 常用 的 基本 技 术 方 法 之 一 。 其 基本 原理 是 具有 一 定 同 源 性 的 两 条 核酸 单 链 在 一 定 的 条 件 下 (适宜 的 温度 和 离子 强度 ) , 按 碱 基 互 补 原则 退火 形成 双 链 。 由 于 核酸 分 子 杂 交 的 高 度 特异 性 及 检测 方法 的 高 度 灵 人 敏 性 ,使 核酸 分 子 杂 交 技 术 在 分 子 生物 学 领域 中 被 广泛 应 用 ,如 基因 克隆 的 筛选 和 酶 切 图 谱 制 作 .基因 组 中 特定 基因 序列 的 定量 和 定性 检测 .基因 突变 分 析 以 及 疾病 的 诊断 等 。 核 酸 杂 交 的 应 用 大 大 推进 了 分 子 生 物 学 的 迅 狐 发 展 。 第 一 人 ”核酸 分 子 探 针 的 标记 一 、 探 针 的 种 类 及 其 选择 核酸 分 子 杂 交 是 利用 已 知 探 针 检 测 待 测 核酸 序列 。 其 中 待 测 核酸 序列 可 以 是 克隆 的 基 因 片段 ,也 可 以 是 未 克隆 的 基因 组 DNA 或 细胞 总 RNA。 核 酸 分 子 探 针 则 是 用 放射 性 核 素 或 其 他 标记 物 标 记 的 、 能 与 特定 的 靶 分 子 发 生 特 异性 结合 的 DNA 或 RNA 片段 。 根据 核酸 分 子 探 针 的 来 源 和 性 质 可 分 为 基因 组 DNA 探 针 .cDNA FR Et RNA 探 针 及 人 工 合成 的 寡 核 苷 酸 探 针 等 几 类 。 根 据 目的 要 求 的 不 同 ,可 以 采用 不 同类 型 的 核酸 探 针 。 值 得 注意 的 是 ,并 不 是 任意 一 段 核酸 片段 均 可 作为 控 针 。 探 针 选 择 的 最 基本 原则 是 探 针 必 须 具有 高 度 的 特异 性 ,另外 还 要 考虑 来 源 是 否 方便 等 其 他 因素 。 (一 ) 基因 组 DNA 探 针 以 基因 组 DNA 作为 探 针 在 目前 应 用 最 为 广泛 。 基 因 组 是 某 一 生物 细胞 全 套 基 因 的 组 合 , 几 乎 所 有 的 基因 片段 都 可 被 克隆 到 质粒 或 噬菌体 中 ,这 为 获得 大 量 高 纯度 的 基因 组 DNA 探 针 提供 了 非常 方便 的 来 源 。 近 年 来 发 展 起 来 的 多 聚 酶 链 反 应 (PCR ) 为 基因 组 DNA 探 针 的 制备 提供 了 另 一 方便 的 来 源 。 但 在 选择 此 类 探 针 时 ,要 特别 注意 真 核 生 物 基 因 组 中 存在 的 高 度 重 复 序 列 ( 如 人 类 基因 组 中 的 Ale 序列 )。 要 尽 可 能 使 用 基因 的 编码 序列 (外 显 子 ) 作 为 探 针 ,而 避免 使 用 内 含 子 及 其 他 非 编码 序列 ,否则 探 针 可 能 因 高 度 重复 序列 存在 引 起 非特 异性 杂交 而 出 现 假 阳性 结果 。 - 140 - a 第 十 章 核酸 杂交 - 141- (二 ) cDNA 探 针 cDNA 也 可 作为 探 针 。cDNA 是 以 mRNA 为 模板 ,在 反 转 录 酶 的 作用 下 形成 的 互补 DNA(complementary DNA, 简称 cDNA)。 由 于 cDNA 不 存在 内 含 子 及 其 他 高 度 重 复 序列 ， 因此 是 一 种 较为 理想 的 核酸 探 针 。 但 因 cDNA 探 针 不 易 获 得 ,从 而 限制 了 它 的 广泛 应 用 。 另外 ,以 cDNA 为 探 针 还 必须 注意 poly(dT) 产 生 的 非特 异性 杂交 问题 。 (三 ) RNA 探 针 mRNA 作为 核酸 分 子 杂 交 的 探 针 具有 以 下 优点 : 1. RNA/RNA #1 RNA/DNA 杂交 体 的 稳定 性 较 DNA/DNA 杂 交 体 的 稳定 性 高 ,因此 杂交 反应 可 在 更 为 严格 的 条 件 下 进行 (杂交 温度 可 提高 LOT 左右 ) ,因而 杂交 的 特异 性 更 高 。 2. 由 于 单 链 RNA 分 子 不 存在 互补 双 链 的 竞争 性 结合 ,其 与 待 测 的 核酸 序列 杂交 的 效 率 更 高 。 3. RNA 不 存在 高 度 重复 序列 ,因此 非特 异性 杂交 较 少 。 4. 杂交 后 可 用 RNase 将 未 杂交 的 探 针 分 子 消化 掉 ,从 而 使 本 底 降 低 。 但 是 ,大 多 数 mRNA 存在 一 多 聚 腺 苷 酸 尾 , 有 时 也 会 影响 其 杂交 的 特异 性 。 此 缺点 可 通过 在 杂交 液 中 加 入 poly(A) 将 待 测 核酸 序列 中 可 能 存在 的 poly(dT) 或 poly(U) 封 闭 而 加 以 克服 。 另 外 ,RNA 极 易 被 环境 中 大 量 存在 的 核酸 酶 降解 ,因此 不 易 操 作 ,这 也 是 限制 其 广 泛 应 用 的 重要 原因 之 一 。 (四 ) BRR “近年 来 , 随 着 DNA 合成 仪 的 问世 及 使 用 的 逐步 推广 ,人 工 合成 的 寡 核 苷 酸 探 针 的 应 用 越 来 越 广泛 。 其 优点 是 : 1. 可 根据 需要 合成 相应 序列 ,避免 了 天 然 核 酸 探 针 中 存在 的 高 度 重复 序列 带 来 的 不 良 影响 。 2. 特别 适合 于 基因 点 突变 分 析 , 因 为 大 多 数 寡 核 苷 酸 探 针 长 度 只 有 15 一 30bp ,其 中 只 有 一 个 碱 基 不 配对 也 会 显著 影响 其 T, {A (melting temperatute, 解 链 温 度 , 即 DNA 溶液 一 半 的 双 链 DNA 已 解 离 为 单 链 的 温度 )。 3. HRM EH BERT GE A ,序列 的 复杂 性 低 ,相对 分 子 质 量 小 ,因此 杂交 所 需 时 间 也 较 短 。 但 是 ,需要 注意 的 是 , 短 刘 核 苷 酸 探 针 所 带 的 标记 物 较 少 , 特 别 是 非 放 射 性 标记 时 ,其 灵 敏 度 较 低 。 i FS LIT SEK RR ET TIE A : 1. RHECANRRMFNKHTERARRE Be AB AAT IY SC ht Asc a, BB 已 有 大 量 的 基因 被 克隆 并 进行 了 序列 测定 。 因 此 ,对 相当 多 的 基因 而 言 ,可 通过 查阅 基因 库 (gene bank) KAM -RERBARPI, HWE: (1) 一 般 要 求 探 针 长 度 为 10 一 5S0bp。 过 短 会 导致 特异 性 降低 ,过 长 则 不 仅 合 成 较 困 难 ， -142- 基因 工程 学 而 且 杂 交 时 间 也 会 延长 。 (2) G:C 含量 应 为 40% 一 60% ,超出 此 范围 会 增加 非特 异性 杂交 。 (3) 不 应 有 大 于 4bp 的 碱 基 反 向 互补 配对 ,和 否则 探 针 内 部 会 形成 “发 夹 样 > 结 构 。 (4) 避免 有 同一 碱 基 的 连续 出 现 ( 如 一 G-G-G-G 一 ) 。 (5) 最 好 在 计算 机 中 与 已 知 的 各 种 基因 序列 进行 同 源 性 比较 ,如 赛 核 苷 酸 探 针 序列 与 非 靶 基 因 序列 有 70% 以 上 的 同 源 性 或 连续 有 8 个 以 上 的 碱 基 序列 相同 , 则 最 好 不 用 ;重新 设计 。 2. 从 蛋白 质 多 肽 序列 推测 寡 核 苷 酸 序列 “对 于 一 些 尚未 克隆 的 基因 ,可 根据 其 蛋白 质 氨基 酸 序列 合成 相应 的 寡 核 苷 酸 序 列 作为 探 针 。 由 于 氨基 酸 密码 的 简 并 性 ,有 些 氨基 酸 可 由 多 种 密 码 子 编码 ,这 使 我 们 根据 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 来 推测 其 基因 的 碱 基 顺 序 的 工作 变 得 甚 为 困难 。 要 完全 准确 地 将 其 基因 顺序 推测 出 来 几乎 是 不 可 能 的 。 但 有 以 下 几 个 原则 可 供 参考 : (1) 尽量 选择 那些 只 含有 一 种 密码 子 编码 的 氨基 酸 (如 色 所 酸 和 蛋氨酸 ) 的 多 肽 作为 合 REC BHS IR (2) 尽管 某 些 氨基 酸 可 由 多 种 密码 子 编码 ,但 其 使 用 频率 是 不 一 样 的 ,因此 应 优先 考虑 使 用 频率 最 高 的 密码 子 。 (3) 真 核 基 因 中 极 少 有 CG 序列 ,因而 ,密码 子 内 部 凡是 存在 CG 顺序 的 密码 使 用 率 极 低 。 另外 , 当 两 个 相 邻 的 氨基 酸 的 最 高 频率 密码 子 相 连 导致 CG 顺序 出 现时 ,应 将 其 中 一 个 氨基 酸 密码 换 为 次 高 频密 码 子 。 通 常 将 前 一 个 密码 子 NNC 换 成 NNT, 甘 氨 酸 、 苏 氨 酸 除外 。 (4) 参考 同一 基因 家 族 的 基因 顺序 ,对 于 密码 子 的 正确 选择 也 是 有 所 帮助 的 。 (5) 采用 上 述 原则 合成 的 赛 核 苷 酸 探 针 一 般 错 配 率 较 低 ,选择 合适 的 杂交 条 件 (如 适当 降低 杂交 温度 等 ) ,可 基本 满足 克隆 筛选 等 工作 的 需要 。 为 了 尽 可 能 减少 假 阴性 结果 ,也 可 合成 各 种 可 能 的 寡 核 苷 酸 探 针 分 别 或 混合 进行 探测 。 当 混合 进行 杂交 探测 时 ,由 于 各 探 针 的 (G+ C)% 含 量 不 同 , 因 此 需 分 别 在 不 同 的 温度 下 进行 探测 或 采用 适当 的 方法 使 其 T。 值 基本 趋 于 相同 。 二 、 各 种 标记 物 及 其 选择 一 种 理想 的 探 针 标记 物 ,应 具备 以 下 几 种 特性 :中 高 度 灵 人 敏 性 ;@ 标 记 物 与 核酸 探 针 分 子 的 结合 ,应 绝对 不 能 影响 其 碱 基 配 对 特异 性 ;@ 不 影响 探 针 分 子 的 主要 理化 特性 ,特别 是 杂交 特异 性 和 稳定 性 ,杂交 体 的 解 链 温 度 (T。) 应 无 较 大 改变 ;四 不 影响 Ag-Ab 或 酶 和 底 物 的 反应 ;@ 标 记 及 检测 方法 简单 .保存 时 间 长 ;@ 对 环境 无 污染 ,对 人 体 无 损伤 ,价格 低廉 。 可 用 于 核酸 探 针 的 标记 物 主要 有 两 大 类 , 即 放射 性 标记 物 和 非 放 射 性 标记 物 。 (一 ) 放射 性 标记 物 放射 性 核 素 的 灵敏 度 极 高 ,可 检测 到 0.01pg 甚至 更 微量 的 核酸 分 子 。 其 最 大 的 优点 是 放射 性 核 素 与 相应 的 元 素 具有 相同 的 化 学 性 质 。 由 于 放射 性 核 素 与 相应 元 素 的 差别 只 在 中 子 数目 上 ,质子 和 电子 数 完全 一 致 ,而 元 素 的 化 学 性 质 是 由 其 核 外 电子 决定 的 ,因此 放射 性 核 素 对 各 种 酶 促 反应 无 任何 影响 ,也 不 会 影响 碱 基 配对 的 特异 性 与 稳定 性 及 杂交 性 质 。 改 外 ,放射 性 核 素 的 检测 具有 极 高 的 特异 性 ,少数 假 阳 性 结果 的 出 现 , 极 少 是 由 于 放射 性 核 素 了 第 十 章 核酸 杂交 - 143 ， 引起 的 ,而 主要 是 由 杂交 过 程 本 身 导 致 的 。 因 此 若 严 格 按 规 程 操 作 ( 主 要 是 预 杂交 和 洗 膜 )， 则 假 阴 性 率 极 低 。 放 射 性 核 素 的 主要 缺点 是 易 造 成 放射 性 污染 。 另 外 ,多 数 放射 性 核 素 的 半衰期 都 较 短 ,因此 必须 随 用 随 标 ,标记 后 立即 使 用 ,不 能 长 期 存放 。 常用 于 标记 核酸 探 针 的 放射 性 核 索 有 ”P、S、H, 下 面 简要 介绍 这 几 种 放射 性 核 素 : 1. °P 能 产生 穿 透 力 极 强 的 B 射线, 因此 放射 自 显影 所 需 时 间 短 , 灵 人 敏 度 高 ,分辩 率 高 ,是 最 常用 的 放射 性 标记 物 .2P 常 以 ”P-dNTP 或 "PNTP 的 形式 提供 ,标记 部 位 有 v iy 位 标记 。 前 者 常用 于 切口 平移 法 ,随机 引物 法 等 标记 法 ,后 者 用 于 多 核 苷 酸 激酶 末端 转移 法 的 标记 。P 的 缺点 是 半衰期 短 ( 约 14d) ,射线 散射 严重 ,导致 X 线 片上 带 形 轮廓 不 清 , 有 时 影响 结果 的 分 析 , 特 别 是 当 要 求 高 分 辩 率 时 (如 DNA 序 列 测定 和 细胞 原 位 杂交 时 )。 2.°S S 原子 可 以 取代 磷酸 分 子 上 的 一 个 氧 原子 ,从 而 形成 ”S 标记 的 核 苷 酸 分 子 。 分 子 结构 的 这 种 改变 对 大 多 数 核酸 修饰 酶 (DNA 和 RNA 聚合 酶 、 激 酶 和 磷酸 酶 等 ) 的 活性 没有 太 大 的 影响 ,因此 可 替代 ”*P 标记 的 核 苷 酸 用 于 探 针 标记 。 另 外 , 因 ”*S 射线 的 散射 作 用 较 弱 ,在线 胶片 上 成 影 分 辨 率 较 高 , 且 半 衰 期 长 ( 约 87d) ,故常 用 于 核酸 序列 测定 及 细 胞 原 位 杂交 。 但 因 ”*S PERL BOL AE BEAR ,粒子 穿 透 力 极 弱 ,检测 的 灵敏 度 较 “P 稍 弱 。 3. °H “”H 释 放 的 B 粒 子 能 量 极 低 ,散射 极 少 ,因此 在 感光 乳胶 上 的 成 影 分 辩 率 高 ,本 底 较 低 ,最 适用 于 细胞 原 位 杂交 。 且 其 半衰期 长 ,标记 的 探 针 可 存放 较 长 时 间 反 复 使 用 。 但 因 放 射 自 显影 所 需 时 间 较 长 ,其 应 用 受到 限制 。 (=) 非 放 射 性 标记 物 近 几 年 来 , 随 着 非 放 射 性 标记 物 和 标记 技术 的 发 展 , 非 放 射 性 标记 物 标 记 探 针 的 敏感 度 接近 放射 性 核 素 标记 探 针 的 敏感 度 ,并 且 具 有 操作 简便 ,获得 结果 快 , 无 放射 性 污染 ,稳定 性 较 好 ,可 以 长 时 间 存 放 的 优点 ,目前 广泛 应 用 于 基础 和 临床 研究 ,有 和 逐渐 取代 放射 性 核 素 标 记 探 针 的 趋势 。 根 据 检 测 方法 的 不 同 , 非 放 射 性 标记 物 可 分 为 以 下 几 类 : 1. 半 抗 原 目前 常用 的 非 放 射 性 标记 物 有 生物 素 和 地 高 辛 ,它们 都 是 半 抗 原 , 可 以 利 用 这 些 半 抗原 的 抗体 进行 免疫 检测 。 (1) 生物 素 标 记 探 针 是 通过 一 个 长 臂 ( 核 苷 酸 与 生物 素 之 间 的 长 链 ) 使 生物 素 连 接 到 核 苷 酸 喀 啶 环 的 C-5 或 叮 叭 的 N-6 位 上 , 制 成 生物 素 化 的 核 苷 酸 , 然 后 以 一 定 方法 使 标记 的 核 苷 酸 失 和 人 到 探 针 中 去 ,而 不 影响 杂交 过 程 中 的 碱 基 配 对 ,杂交 后 加 入 酶 标的 抗 生 物 素 蛋 白 ， 酶 分 解 底 物 出 现 有 色 反 应 而 检测 。 即 生物 素 化 核 苷 酸 一 挫 人 到 DNA 中 去 制 成 探 针 一 杂交 一 加 入 酶 标 抗 生物 素 蛋白 一 加 酶 底 物 一 显 色 。 生 物 素 与 核 苷 酸 间 的 长 臂 的 作用 是 避免 生物 素 分 子 与 核酸 分 子 结 合 后 因 空间 障碍 影响 与 抗 生 物 素 蛋白 的 结合 ,灵敏 度 检测 结果 表明 臂 长 与 灵敏 度 有 一 定 关 系 , 其 中 以 Bio-16 或 11-dUTP 标记 的 DNA 探 针 的 敏感 度 最 高 ,可 达 1 一 2pg。 利 用 生物 素 标记 的 探 针 优点 是 无 放射 性 ,操作 简便 ,但 缺点 是 敏感 性 低 , 原 位 杂交 时 因 组 织 细 胞 存在 有 内 源 性 生物 素 , 易 出 现 假 阳性 结果 。 (2) 地 高 辛 ,是 一 种 类 固 醇 半 抗原 , 像 生 物 素 一 样 ,可 通过 一 长 臂 人 工 结合 于 dUTP 上 ， 然后 以 一 定 方 法 使 标记 的 dUTP BAF DNA 中 去 ,得 到 地 高 辛 标记 的 核酸 探 针 , 探 针 与 样 品 中 核酸 杂交 后 加 入 酶 - 抗 地 高 辛 抗 体 复合 物 ,最 后 通过 酶 使 底 物 显 色 而 检测 。 其 优点 是 无 放射 性 ,操作 简便 安全 ,灵敏度 接 近 同 位 素 标记 ( 达 0.1pg) ,特异 性 较 高 , 因 组织 细 胞 内 无 内 -144- 基因 工程 学 源 性 地 高 辛 ,所 以 原 位 杂交 时 ,不 易 出 现 假 阳 性 。 2. 配 体 生物 素 还 是 一 种 抗 生 物 素 蛋 白 ( 卵 白 素 ,avidin) 和 链 霉 素 抗 生 物 素 蛋 自 (streptavidin) 的 配 体 , 可 以 用 亲 和 法 进行 检测 。 3. 荧光 素 ， 如 FITC、 罗 丹 明 类 ,可 以 被 紫外 线 激发 出 效 光 进行 观察 ,主要 适用 于 细胞 原 位 杂交 。 4. 光 密 度 或 电子 密度 标记 物 ”如 金 、 银 等 ,适用 于 细胞 原 位 杂交 ,可 以 在 光 镜 下 或 电镜 下 进行 观察 。 5. 还 有 一 些 标记 物 可 与 另 一 些 物质 反应 而 产生 化 学 发 光 现 象 ,可 以 像 放 射 性 核 素 一 样 直接 对 X 线 胶片 进行 曝光 。 如 Promega 公司 生产 的 LightsmithIMII Luminescence Engineer- ing System 及 Amersham 公司 的 ECL 等 。 这 类 标记 物 可 能 是 今后 研究 主流 。 三 、 探 针 标 记 方 法 探 针 的 标记 方法 可 分 为 体内 标记 法 和 体外 标记 法 。 体 内 标记 法 是 将 放射 性 标记 的 化 合 物 作为 代谢 底 物 加 到 活 细胞 中 ,经 细胞 的 代谢 处 理 而 将 生物 大 分 子 加 以 标记 。 例 如 将 "HL- 胸 苷 加 入 到 活 细胞 培养 基 中 ,可 标记 DNA; 而 "H- 尿 苷 则 可 标记 RNA. PRA id RAM FB 踪 某 些 分 子 在 细胞 中 的 代谢 途径 是 极其 有 效 的 手段 。 但 由 于 此 方法 受到 多 种 因素 的 限制 ， 使 标记 化 合 物 的 比 放 射 活性 不 高 。 另 外 ,不 同 生物 细胞 的 代谢 途径 不 一 样 ,要 选择 不 同 的 标 记 底 物 才 能 得 到 有 效 的 标记 。 因 而 ,在 分 子 生 物 学 领域 中 普遍 使 用 的 核酸 分 子 探 针 几乎 都 是 用 体外 标记 法 标记 的 。 体 外 标记 法 有 两 种 : (一 ) 化 学 标记 法 化 学 标记 法 是 利用 标记 物 分 子 上 的 活性 基 团 与 探 针 分 子 上 的 基 团 (磷酸 基 团 ) 发 生 的 化 学 反应 而 将 标记 物 直 接 结 合 到 探 针 分 子 上 ,如 光敏 生物 素 的 标记 。 光 敏 生 物 素 是 指 将 生物 素 与 另 一 类 化 学 性 质 较 活 泼 的 基 团 ( 释 氮 基 或 补 骨 脂 ) 相 连 。 光 敏 生 物 素 与 核酸 探 针 混合 后 ,在 强 可 见 光 ( 未 灯 或 钨 灯 ) 照 射 下 (10 一 20min) ,光敏 生物 素 中 的 活泼 基 团 与 核酸 共 价 相 连 ,成 为 生物 素 标记 的 核酸 探 针 。 (二 ) 酶 促 标记 法 酶 促 标记 法 是 将 标记 物 预 先 标 记 到 核 苷 酸 分 子 上 ,然后 利用 酶 促 方 法 将 核 苷 酸 分 子 挫 人 到 探 针 分 子 中 ,或 将 核 苷 酸 分 子 上 的 标记 基 团 交换 到 探 针 分 子 上 。 此 法 适用 于 所 有 放射 性 核 素 对 核 苷 酸 的 标记 ,部 分 非 放 射 性 标记 的 核 苷 酸 分 子 也 可 用 此 法 进行 标记 ,如 生物 素 、 地 高 辛 标记 的 核 苷 酸 。 下 面 介 绍 几 种 常用 的 酶 促 标记 法 : 1. 缺口 翻译 法 或 切口 平移 法 “切口 平移 法 是 实验 室 中 最 常用 的 一 种 脱氧 核糖 核酸 探 针 标 记 法 。 它 利用 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 工 的 多 种 酶 促 活 性 将 标记 的 dNTP 挫 人 到 新 形成 的 DNA 链 中 ,从 而 合成 高 比 活性 的 均匀 标记 的 DNA 探 针 。 线 状 . 超 螺旋 及 带 缺 口 的 环 状 WHE DNA 均 可 作为 切口 平移 法 的 模板 。 — Soe yee ne 第 十 章 核酸 杂交 - 145- 其 基本 原理 是 以 极 微量 的 DNA 酶 I(DNase TI) 在 Mg: 的 存在 下 ,在 待 标记 的 双 股 DNA 的 每 一 条 链 上 产生 若干 单 链 缺口 ,再 利用 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 工 的 5 一 3 “核酸 外 切 酶 活性 及 5 一 3 聚合 酶 活性 ,在 缺口 处 $ 末端 每 切除 一 个 核 苷 酸 , 则 在 3 末端 添加 一 个 核 苷 酸 ,以 修补 缺口 , 随 着 缺口 在 DNA 上 的 移动 ,标记 的 核 苷 酸 就 挫 人 到 新 合成 的 DNA 链 中 (图 10-1) 。 5 一 3:' 双 链 DNA g” 5 |] evn Mg y + ef 二 = 一 一 3 ' 带 切 口 的 3 一 一 一双 链 DNA t I mans Mi I [o-P]-dNTP* y + + 于 一 -二 一 > 一 一 一 > 一 3 er hon <> 5’ t I] = —= st to eee = a DNA 探 针 图 10-1 切口 平移 法 原理 示意 图 注 : 所 “22P 标记 的 DNA 此 方法 的 特点 是 快速 \ 简便、 标记 探 针 均匀 ,特异 性 高 ,最 常用 于 标记 双 股 DNA 探 针 。 BBE DNA 或 RNA 及 小 片段 (100 一 200bp) 双 链 DNA 不 能 用 此 法 标记 。 需 注 意 的 是 ,DNA 多 聚 酶 必须 是 大 肠 杆菌 DNA 多 聚 酶 全 酶 ,此 酶 的 Klenow 大 片段 不 具有 5 一 3 外 切 酶 的 活性 ,所 以 不 能 替代 。 再 者 ,DNase 工 的 浓度 一 定 要 适当 。DNase I 度 过 大 ,将 导致 DNA 链 上 形成 的 切口 过 多 ,从 而 使 探 针 长 度 过 得 ,影响 杂交 反应 的 效率 ; DNase 工 的 浓度 过 低 , 则 不 足以 形成 足 量 的 切口 ,将 会 使 标记 效率 下 降 。 理 想 的 结果 应 使 30% ~ 60% AY KH RB A BI DNA 中 ,最 后 形成 的 单 链 DNA 探 针 的 理想 长 度 为 400 一 800bp。 2. 随机 引物 法 “随机 引物 法 是 近年 来 发 展 起 来 的 一 种 较 理想 的 核酸 探 针 标记 方法 ,目前 大 有 取代 缺口 平移 法 而 作为 实验 室 中 DNA 探 针 标记 常规 方法 的 趋势 。 其 基本 原理 是 利用 随机 守 核 苷 酸 引物 和 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 [的 Klenow 片段 来 标记 DNA。 所 谓 随 机 引物 是 含有 各 种 可 能 排列 顺序 的 窒 核 苷 酸 片段 的 混合 物 , 它 可 以 与 任意 核 苷 酸 序列 杂交 ,起 到 聚合 酶 反应 引物 的 作 用 。 随 机 引物 可 用 DNase ] 降 解 小 牛 胸腺 DNA 获得 (6 一 8 个 核 苷 酸 ) ,或 用 人 工 合成 方法 获得 (6 ， 146 .基因 工程 学 个 核 苷 酸 )。 当 待 标记 的 DNA 探 针 变性 后 与 随机 引物 一 起 杂交 时 ,随机 引物 按 碱 基 互 补 配对 原 则 各 自 与 模板 上 的 不 同 区 段 结合 ,Klenow 片段 即 从 引物 3-OH 端 开 始 合成 互补 DNA 链 ,反应 中 若 加 入 修饰 的 dNTP 即 可 获得 标记 的 DNA 探 针 (图 10-2)。 人 3 ”一 _ 3 | 变性 随机 虽 物 O LJ OC KlenowDNA 聚合 酶 [o-2P]-dNTP"” es 口 * 口 #82 标记 的 单 链 DNA 探 针 pth. ANE 图 10-2 “随机 引物 标记 法 原理 示意 图 注 : O 随机 引物 一 ~” >:P 标 记 的 DNA 此 方法 的 特点 是 :@ 不 但 可 以 用 于 双 链 DNA 标记 ,而 且 可 用 于 单 链 DNA 或 RNA 探 针 的 标记 ; @O 操 作 方 便 , 避 免 了 用 DNase { 处 理 时 , 酶 浓度 掌握 不 当 所 带 来 的 一 系列 问题 ;G) 标 记 效 率 高 ,3h 内 可 使 40% 一 60% 以 上 甚至 90% 的 修饰 DNA BA BIERET DNA 中 去 。@ 田 因 核 苷 酸 挫 人 率 极 高 BARE 可 不 经 Sephadex-50 纯化 即 可 用 于 杂交 ,还 可 直接 在 低 熔点 琼脂 糖 溶 液 中 进行 标记 。@@ 由 于 反应 条 件 控制 在 pH 6.6, 可 抑制 KlenowDNA RA HE 3 一 "外 切 酶 活性 ,延长 反应 时 间 也 不 会 造成 DNA 的 降解 。 必 要 时 可 将 反应 时 间 延 长 到 12 ~ 16h, fH ESHA REA ZB DNA 中 ,从 而 提高 标记 活性 。 3. ERA RRAHMAMHIC AAT, LARNER EAR EEA FACIE A #2 5S SATA. A FE RR Et AT A RE ESR RE. PRK 苷 酸 探 针 标 记 的 方法 有 很 多 ,在 此 仅 介绍 常用 的 三 种 : (1) 末端 脱氧 核 苷 酰 转 移 酶 法 (简称 末端 转移 酶 法 ) :末端 转移 酶 可 催化 [2 P]-dNTP 在 单 链 DNA 3 末端 的 多 聚 化 ( 详 见 第 四 章 )。 此 方法 标记 活性 高 ,适用 于 克隆 筛选 点 突变 分 析 及 细胞 原 位 杂交 等 ,缺点 是 不 能 控制 增 加 的 核 苷 酸 的 数量 ,使 得 到 的 标记 产物 长 短 不 一 ,但 可 加 入 标记 的 [c-?”P]-ddNTP 而 控制 。 (2)T4 多 核 苷 酸 激酶 法 : 先 用 碱 性 磷酸 酶 将 $ 端 P 去 掉 或 加 入 过 量 ADP 接受 $-P 形 成 AIP ,而 暴露 3$-OH。 再 利用 T4 多 核 苷 酸 激酶 的 作用 催化 ATP 分 子 上 的 六 磷酸 基因 转移 到 DNA 或 RNA 分 子 的 $S-OH 上 ,采用 72P-AIP 为 底 物 , 即 可 将 DNA 样品 $ 末 端 标记 ( 详 见 第 四 章 )。 BTS 核酸 杂交 .147 . 此 方法 的 缺点 是 在 每 个 探 针 的 5 末端 多 加 了 一 个 磷酸 ,理论 上 ,这 会 影响 其 与 DNA 的 杂交 。 再 者 , 因 生 物 素 等 标记 物 是 连 在 碱 基 上 ,而 不 是 磅 酸 基 团 ,因此 T4 多 核 苷 酸 激酶 法 不 可 用 于 生物 素 等 的 末端 标记 。 (3) Klenow DNA 多 聚 酶 标记 法 :对 于 带 黏 性 末端 的 双 链 寡 核 苷 酸 可 利用 Klenow DNA 4 38 酶 的 填充 反应 进行 末端 标记 。 而 对 于 单 链 寡 核 苷 酸 , 则 可 预先 合成 一 小 段 与 此 探 针 互补 的 寡 核 HARE ANSI ,然后 利用 Klenow DNA 多 聚 酶 的 链 延 伸 反 应 获得 标记 的 寡 核 苷 酸 探 针 。 此 法 的 特 点 是 模板 DNA 与 标记 的 DNA 探 针 长 度 不 相同 。 如 果 需 要 ,可 采用 电泳 方法 将 它们 分 离开 来 。 5 一 一 AAAAAAIAAAAA 3' poly(A) mRNA ER (dT) a PAAR AAR ARAN A 3! Trier ll 反 转 录 栈 dNTP( 其 中 一 种 为 [o-?2P]-dNTP) 5 一 AAAAAAHAAAAA 3 . Trier 5' RNA/DNA 杂交 体 由 碱 变性 SephadexG-50 柱 层 析 x gv 3P 标 记 的 单 链 CDNA FREI 图 10-3 :2P 标记 的 单 链 cDNA 探 针 的 制备 注 : *< 32P 标记 的 DNA spo hiay BAIN 多 接头 DNA 片段 克隆 SS 几 NEY) 《 线性 化 SP6RNA 聚合 酶 \| NTP [o—P]-UTP -二 3 标记 的 RNA 转录 产物 10-4 采用 SP6DNA 载体 体外 转录 体系 合成 2P 标记 的 RNA Ft 。 148 . 基因 工程 学 4. cDNA 的 标记 BW mRNA HER, WER dT 为 引物 BHAA REA BS oy oN Wi IL SE A EF PR AS | i FE Dz PR EY VEC, DET i Ee, RE EE BA 4 RNA/DNA 杂交 双 链 经 碱 变性 后 ,RNA 单 链 可 被 迅速 降解 成 小 片段 ,经 SephadexG-50 柱 层 析 , 即 可 获 得 单 链 cDNA 探 针 (图 10-3 ) 。 5. RNA 探 针 的 标记 “常用 体外 转录 的 方法 制备 RNA 探 针 。 利 用 SPORNA BAMA 系 ,首先 将 感 兴 趣 的 基因 序列 克隆 到 SPO 表达 载体 的 SP6 启动 子 下游 的 多 克隆 位 点 下 ,用 适当 的 限制 性 内 切 酶 在 插入 序列 的 下 游 将 质粒 线性 化 。SP6 MIRA) RNA 聚合 酶 对 SP6 启动 子 序 列 具 有 高 度 的 亲 和 人 性 ,从 而 启动 其 下 游 序 列 的 转录 (图 10-4)。 因 此 ,如 果 在 4 种 NTP( 其 中 一 种 用 ?2P 标记 ) 的 存在 下 ,利用 SP6RNA 聚合 酶 的 Run-off 转录 活性 , 即 可 获得 高 放射 活性 的 RNA 探 针 ,最 后 DNA 模板 可 用 无 RNase 污 染 的 DNase 处 理 而 清除 掉 。 第 二 节 ”核酸 分 子 杂 交 的 技术 一 、 核 酸 分 子 杂 交 的 类 型 核酸 分 子 杂 交 可 分 为 液 相 杂 交 和 固 相 杂交 两 种 。 液 相 杂 交 是 在 液体 中 进行 的 杂交 方 法 ,杂交 速度 快 , 常 与 核酸 电镜 技术 结合 在 一 起 ,研究 不 同 DNA 的 同 源 性 及 mRNA 与 染色 体 DNA 间 的 关系 等 。 液 相 杂 交 最 大 缺点 是 不 能 区 分 探 针 DNA 与 目的 DNA, 给 常规 应 用 带 来 困难 。 固 相 杂 交 是 在 一 定 支 持 物 上 进行 的 杂交 反应 ,其 优点 是 检测 方便 ,因而 应 用 广泛 。 它 包括 膜 固 相 印迹 杂交 和 原 位 杂交 两 种 。 (一 ) 膜 固 相 印迹 杂交 膜 固 相 印迹 杂交 是 指 将 待 测 核酸 序列 结合 到 一 定 的 固 相 支持 物 上 ,然后 与 存在 于 液 相 中 的 标记 核酸 探 针 进行 杂交 的 过 程 , 是 目前 最 常用 的 一 种 核酸 分 子 杂 交 方 法 。 选 择 良 好 的 固 相 支 持 物 与 有 效 的 转移 方法 是 此 项 技术 成 败 的 关键 。 下 面 介 绍 固 相 支持 物 的 选择 及 常用 的 膜 固 相 印 迹 杂 交 类 型 。 1. 固 相 支 持 物 的 选择 (1) 硝酸 纤维 素 滤 膜 : 硝 酸 纤维 素 滤 膜 具有 较 强 的 吸附 单 链 DNA 和 RNA 的 能 力 ,特别 是 在 高 盐 浓度 下 ,其 结合 能 力 可 达 80 一 100ng/cm 。 吸 附 的 单 链 DNA 或 RNA 经 真空 烘 烤 后 ,依靠 疏水 性 相互 作用 而 结合 在 硝酸 纤维 素 膜 上 。 另 外 ,硝酸 纤维 素 膜 还 具有 杂交 信和 号 本 底 较 低 的 优点 ,因此 被 广泛 应 用 于 Southern , Northern 斑点 印迹 及 克隆 得 选中。 硝酸 纤维 素 膜 非 特异 性 吸附 蛋白 质 的 作用 较 弱 ,特别 适合 于 那些 涉及 和 蛋白质 作 用 (如 抗体 和 酶 等 ) 的 非 放 射 性 换 针 标记 的 杂交 体系 。 硝酸 纤维 素 滤 膜 是 应 用 最 广泛 的 一 种 固 相 支持 物 , 但 并 不 十 分 理想 。 因 为 硝酸 纤维 素 膜 是 依靠 疏水 性 相互 作用 结合 DNA 的 ,这 种 结合 并 不 十 分 牢固 , 随 着 杂交 及 洗 膜 的 进程 ， DNA 会 慢 慢 脱离 硝酸 纤维 素 膜 , 特 别 是 高 温情 况 下 ,从 而 使 杂交 效率 下 降 。 因 此 ,不 太 适 宜 于 同一 膜 上 重复 进行 杂交 。 再 者 ,硝酸 纤维 素 膜 质地 较 脆 ,特别 是 经 烘 烤 后 ,操作 不 方便 , 须 特别 小 心 。 硝 酸 纤 维 素 膜 与 核酸 的 结合 有 赖 于 高 盐 浓 度 ( >10 x SSC) ,在 低 盐 浓度 时 ,结合 | 第 十 章 核酸 杂交 .149 . DNA 的 效果 不 佳 ,因此 不 适宜 于 电 转移 印 迹 法 。 另 外 ;硝酸 纤维 素 膜 对 于 相对 分 子 质量 小 的 DNA 片段 (特别 是 小 于 200bp 的 DNA 片段 ) 结 合 能 力 不 强 。 因 此 ,现在 更 多 的 人 倾向 于 使 用 尼龙 膜 。 (2) 尼 龙 膜 :尼龙 膜 是 目前 较 理想 的 一 种 核酸 固 相 支持 物 , 它 有 多 种 类 型 , 除 网 眼 大 小 不 二 样 外 ,有 的 尼龙 膜 未 经 特殊 处 理 , 有 些 则 是 经 过 了 正 电 荷 基 团 的 修饰 ,这 种 修饰 的 尼龙 膜 结合 核酸 的 能 力 更 强 。 尼龙 膜 结合 单 链 及 双 链 DNA 和 RNA 的 能 力 较 硝酸 纤维 素 膜 更 强 , 可 达 350 一 500pg/ cm 。 而 且 经 烘 烤 或 紫外 线 照 射 后 ,核酸 可 牢固 地 结合 在 尼龙 膜 上 ,这 种 结合 较 硝 酸 纤维 素 膜 强 ,特别 是 用 短波 紫外 线 照 射 后 ,核酸 中 的 部 分 喀 啶 碱 基 可 与 膜 上 的 带 正 电荷 的 氮 基 相互 交 联 ,从 而 使 结合 更 为 牢固 。 碱 处 理 也 可 使 DNA 牢固 地 结合 在 尼龙 膜 上 ,因此 使 DNA 的 变性 \ 吸 印 和 固定 可 以 一 步 完 成 。 有 报道 微波 处 理 也 可 使 DNA 结合 在 尼龙 膜 上 ,此 方法 特 别 适 合 于 菌落 原 位 吸 印 法 ,使 细菌 的 裂解 .DNA 变性 与 固定 可 一 步 完成 (注意 :硝酸 纤维 素 膜 不 能 用 微波 处 理 ,否则 会 引起 燃烧 )。 另 外 , 它 的 韧性 较 强 ,操作 较 方便 ;对 于 相对 分 子 质 量 小 的 核酸 片段 亦 有 较 强 的 结合 能 力 ,甚至 短 至 10bp 的 核酸 片段 也 能 结合 ;在 低 离子 强度 条 件 下 也 可 较 好 地 结合 DNA, 因 此 比较 适合 于 电 转 印迹 法 ;再 者 ,尼龙 膜 可 重复 用 于 杂交 ， 一 次 杂交 后 , 探 针 分 子 可 经 碱 变 性 而 被 洗 脱 下 来 ,从 而 可 用 于 与 第 二 个 探 针 进行 杂交 。 其 缺 点 是 杂交 本 底 较 高 ,可 以 用 加 大 预 杂 交 液 中 的 非特 异性 封闭 试剂 的 方法 克服 。 2. 固 相 印迹 杂交 的 类 型 (1) 斑点 及 狭 颖 印迹 法 (dot or slot blot) :将 RNA 和 DNA 变性 后 直接 点 于 硝酸 纤维 素 膜 上 ,用 于 基因 组 中 特定 基因 及 其 表达 的 定性 及 半 定 量 研究 , 称 为 斑点 印迹 。 它 是 实验 室 常 用 技术 之 一 。 与 Southern 及 Northern 印迹 法 相 比 ,其 优点 是 简单 .迅速 ,可 在 同一 张 膜 上 同 时 进行 多 个 样品 的 检测 ;对 于 核酸 粗 提 样品 的 检测 效果 也 较 好 。 缺 点 是 不 能 鉴定 所 测 基 因 的 相对 分 子 质量 ,不 能 确定 外 源 DNA 在 细胞 染色 体 中 的 整合 情况 ,而 且 特 异性 不 高 ,有 一 定 比 例 的 假 阳性 。 (2) Southern 印迹 (Southern blot) :Southern 印迹 是 指 将 电泳 分 离 的 DNA Fr Be Me Re 中 转移 到 一 定 的 固 相 支持 物 上 进行 杂交 的 过 程 。 该 转 印 技术 是 1975 年 Southern 建立 的 ， 故 称 为 Southern 印迹 法 。 DNA 分 子 经 限制 性 内 切 酶 酶 切 后 ,再 经 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 将 所 得 DNA 片段 按 相 对 分 子 质量 大 小 分 离 成 不 同 区 带 , 然 后 将 含 DNA 片段 的 琼脂 糖 凝 胶 变 性 ,并 将 其 中 的 单 链 DNA 片段 转移 到 硝酸 纤维 素 膜 或 其 他 固 相 支持 物 上 ,而 各 DNA 片段 的 相对 位 置 保持 不 变 。 这 种 膜 即 可 用 于 下 一 步 的 杂交 反应 。Southern 转 印 过 程 可 利用 毛细 管 虹 吸 作 用 由 转移 缓冲 液 带动 核酸 分 子 转移 到 固 相 支持 物 上 ;也 可 利用 电场 作用 进行 电 转 ;还 可 利用 真空 抽 滤 作用 进 行 真空 转移 。 利用 Southern 印迹 法 可 进行 克隆 基因 的 酶 切 图 谱 分 析 、 基因组 基因 的 定性 及 定量 分 析 、 基 因 突 变 分 析 及 限制 性 片段 长 度 多 态 分 析 (RFLP) ,外 源 基因 的 整合 等 。 (3) Northern 印迹 (Northern blot) :Northern 印迹 是 指 将 RNA 变性 及 电泳 分 离 后 转移 到 固 相 支 持 物 上 进行 杂交 的 过 程 ,转移 后 的 支持 物 可 用 于 杂交 反应 以 鉴定 其 中 特定 mRNA 分 子 的 量 及 大 小 。 此 转 印 技术 是 1977 年 由 G.R.Stark 建立 的 。 - 150: 基因 工程 学 Northern 印迹 的 基本 原理 及 过 程 与 Southern 印迹 相同 ,前 面 提 到 的 毛细 管 虹 吸 法 、 电 转 法 及 真空 转移 法 也 同样 适用 于 RNA 的 转移 。 只 是 RNA 变性 方法 与 DNA 不 同 , 因 为 碱 会 导致 RNA 的 水 解 , 故 不 能 用 碱 变性 RNA. RNA 变性 常用 甲醛 或 聚 乙 二 醛 或 甲 基 氢 氧化 汞 。RNA 变性 后 有 利于 在 转 印 过 程 中 与 硝酸 纤维 素 膜 结合 , 它 同 样 可 在 高 盐 中 进行 转 印 ， 但 在 烘 烤 前 与 膜 结合 并 不 牢固 ,所 以 在 转 印 后 不 能 用 低 盐 缓冲 液 洗 膜 ,否则 RNA 会 被 洗 脱 。 在 凝 胶 中 不 能 加 EB, 因 为 它 会 影响 RNA 与 硝酸 纤维 素 膜 的 结合 ,为 了 测定 片段 大 小 ， 可 在 同一 凝 胶 上 加 标记 物 一 同 电泳 ,之 后 将 标记 物 胶 切 下 .染色 ,照相 , 含 样品 的 凝 胶 进 行 Northern 转 印 。 (=) 原 位 杂交 原 位 杂交 属于 固 相 分 子 杂交 的 范畴 , 它 是 用 标记 的 DNA 或 RNA 探 针 ,在 原 位 检测 组 织 或 细胞 内 特定 核酸 序列 的 方法 。 包 括 组 织 细胞 原 位 杂交 、 菌 落 原 位 杂交 。 1. 组 织 细胞 原 位 杂交 组织 细胞 原 位 杂交 是 在 细胞 保持 基本 形态 的 情况 下 RAT HEA 细胞 内 与 RNA 或 DNA 杂交 。 此 杂交 过 程 主 要 是 在 载 玻 片 上 进行 的 。 根 据 其 所 用 探 针 及 所 要 检测 的 核酸 不 同 ,可 分 为 DNA-DNA、RNA-DNA 及 RNA-RNA 杂交 。 由 于 原 位 杂交 能 在 成 分 复杂 的 组 织 中 进行 单一 细胞 的 研究 而 不 受 同 一 组 织 中 其 他 成 分 的 影响 ,因此 对 于 那 些 数量 少 上 且 散 在 于 其 他 组 织 中 的 细胞 内 DNA 或 RNA 的 研究 更 为 方便 ;同时 由 于 原 位 杂交 不 需要 从 组 织 中 提取 核酸 ,对 于 组 织 中 含量 极 低 的 靶 序 列 有 极 高 的 敏感 性 ,并 可 完整 地 保持 组 织 与 细胞 的 形态 ,更 能 准确 地 反映 出 组 织 细 胞 间 的 相互 关系 及 功能 状态 。 2. 菌落 原 位 杂交 菌落 原 位 杂交 是 将 待 检测 的 菌落 转移 到 硝酸 纤维 素 膜 , 然 后 再 利用 探 针 检测 细菌 菌落 或 噬 菌 斑 中 特异 的 DNA 序列 或 基因 , 这 在 筛选 重组 DNA 文库 时 尤为 有 用 。 其 基本 过 程 是 先 将 要 筛选 的 细菌 菌落 从 琼脂 平板 上 原封 不 动 地 转移 到 硝酸 纤维 素 腊 上 ,注意 转移 菌落 时 在 琼脂 平板 和 硝酸 纤维 素 膜 上 的 相应 位 置 都 要 做 标记 ,便于 以 后 辨认 原 始 菌落 。 膜 上 的 菌 经 原 位 裂解 、 变 性、 固定 、 烤 膜 后 ,DNA 就 固定 在 膜 上 ,经 杂交 后 确定 含 特 异性 基因 的 菌落 。 | 二 、 核 酸 分 子 杂 交 的 基本 过 程 核酸 分 子 杂 交 实 质 上 是 双 链 DNA 的 变性 和 具有 同 源 序列 的 两 条 单 链 的 复 性 过 程 , 其 基本 过 程 包括 变性 TARR ARS \ 洗 膜 及 检测 。 ed BE 3 维系 DNA MeN HES EAB MRA AERA. DNA 的 变性 是 指 用 加 热 或 强 碱 使 WAL DNA 之 间 的 氢 键 打开 形成 单 链 的 过 程 。 此 时 ,DNA 的 二 级 结构 发 生 破 坏 ,但 未 破坏 其 一 级 结构 。 热 变性 通常 采用 95$ 一 100 和 他 加 热 $ 一 10min; 碱 变性 采用 OO. Smol/L NaOH 作用 30 一 60min。 第 十 章 核酸 杂交 : 151. (二 ) 预 杂 交 预 杂 交 的 目的 是 用 非特 异性 DNA 22 (EA DNA 或 小 牛 胸腺 DNA) 及 其 他 高 分 子 化 合 物 (Denharht 溶液 ) 将 待 测 核酸 分 子 中 的 非特 异性 位 点 封闭 ,否则 这 些 非特 异性 位 点 会 在 杂交 时 与 探 针 非特 异性 结合 。 (=) RE 指 待 测 DNA 样品 中 若 存在 与 加 入 的 DNA 探 针 同 源 的 互补 顺序 ,在 一 定 的 条 件 下 , 即 可 退火 而 形成 异 源 DNA 双 链 , 即 DNA 杂交 体 。 其 实质 上 是 DNA 的 复 性 过 程 。 复 性 是 指 变性 的 两 条 单 链 DNA 按 碱 基 互 补 配 对 原则 ,在 适当 条 件 下 重新 缔 合 形成 双 链 的 过 程 。 复 性 并 不 是 变性 反应 的 简单 逆 反应 过 程 。 变 性 可 以 在 一 个 极 短 的 时 间 内 迅速 完成 ,而 复 性 则 需 相 对 较 长 时 间 才 能 完成 。 如 果 使 热 变 性 的 DNA 溶液 迅速 冷却 , 则 只 能 形成 一 些 不 规则 的 碱 基 对 ,而 不 会 恢复 DNA 双 链 结构 。 而 将 此 变性 溶液 在 低 于 T。 值 25°C 的 温度 下 维持 相当 长 的 时 间 (24h 左右 ) , 则 可 使 之 回复 至 天 然 的 双 链 结构 状态 。 复 性 时 的 第 一 步 是 两 条 DNA 单 链 随机 碰撞 形成 局 部 双 链 的 过 程 ,这 种 随机 碰撞 形成 的 局 部 双 链 是 暂时 的 ,如果 局 部 双 链 周围 的 碱 基 不 配对 , 则 重新 解 离 。 一 旦 找到 正确 的 互补 区 ,首先 形成 的 局 部 双 链 就 形成 核心 ,核心 两 侧 的 碱 基 顺 序 迅 速配 对 ,形成 完整 的 双 链 分 子 。 杂交 体系 的 建立 应 考虑 以 下 因素 : 1. 离子 强度 ”通常 采用 5$x 或 6xSSC(1xSSC 为 0.1$molL NaCl,0.015SmolALL ty & 酸 钠 ) ,离子 强度 过 高 或 过 低 可 能 影响 杂交 的 特异 性 。 2. DNAKE DNAKE RMA , 复 性 速度 您 快 。 为 保证 足够 的 DNA 浓度 , 除 应 加 入 足 够 的 DNA 量 以 外 ,还 应 尽量 减少 杂交 体积 ,一 般 每 平方 厘米 滤 膜 面积 加 50 一 100A 杂交 液 为 宜 。 3. DNA 探 针 的 长 度 ” 探 针 片 段 越 大 ,其 扩散 的 速度 越 慢 ,因此 复 性 的 速度 越 慢 。 4. 杂交 温度 ”选择 适当 的 杂交 和 洗 膜 温度 是 核酸 分 子 杂 交 成 败 最 关键 的 因素 之 一 。 通常 杂交 反应 在 低 于 Tu 值 15 一 25 立 温度 下 进行 。T。 值 除 受 (G+C) 含 量 影响 外 ,还 与 杂 交 体 中 离子 的 强度 , 探 针 的 复杂 性 (长 度 ) ,是 否 含 有 甲 酰 胺 等 多 种 因素 有 关 。 如 果 一 长 度 为 5$00bp 的 探 针 , (G + C) 含 量 为 S0% ,杂交 体系 中 含 5 x SSC, 不 含 甲 酰胺 , 则 Ta AA 93.40, BAHAI (Thyb) DLW 93.4-25=68.4C ; 若 含 有 50% 甲 酰胺 , 则 T,, AW 68.4C 。 那 么 其 杂交 温度 (Thybg ) 应 为 68.4-25=43.4T 。 一 般 情 况 下 ,在 不 含 变性 剂 甲 酰胺 时 ,大 多 数 杂 交 反 应 在 68 HET, 4A 50% 甲 酰胺 时 ,在 42Y 进行 。 5. 提高 杂交 效率 ”在 杂交 液 中 加 入 硫酸 葡 聚 糖 ,可 促进 链 间 的 缔 合 。 同 时 ,由 于 本 身 的 微粒 结构 可 吸附 探 针 分 子 ,从 而 使 接触 面积 增加 ,使 杂交 效率 提高 10 一 100 倍 ;缺点 是 使 “ 杂交 背景 加 深 。 也 有 人 使 用 聚 乙 二 醇 (PEG, 相 对 分 子 质 量 为 6000 一 8000) 和 聚 丙 烯 酸 ( 相 对 分 子 质 量 为 90 000) ,此 两 者 的 优点 是 黏稠 度 较 硫 酸 葡 聚 糖 低 。 (四 ) 洗 腊 洗 膜 是 在 一 定 离 子 强度 和 适当 温度 下 , 洗 去 非特 异性 吸附 在 支持 物 上 的 DNA 探 针 的 - 152: 基因 工程 学 过 程 。 洗 膜 温 度 的 高 低 直接 影响 杂交 的 背景 和 敏感 度 ,温度 过 高 可 能 使 特异 性 结合 的 探 针 脱落 ,而 洗 膜 温度 过 低 , 则 不 能 将 非特 异性 吸附 的 探 针 洗 掉 。 一 般 最 终 洗 膜 浓 度 应 在 低 于 Tm (2 5~12C FHT. PUN, PRET SOObp, (G+ C) RHA 42% ,离子 强度 为 0.1XSSC ,不 & FA PERK. T, HN 67°C , 则 洗 膜 温度 为 55 一 627 ,对 多 数 杂 交 体 系 而 言 , 最 典型 的 终 洗 膜 浓度 为 0.1 x SSC , 洗 膜 浓 度 为 SSY 。 (五 ) 杂交 信号 的 检测 杂交 信号 的 检测 方法 因 探 针 上 的 标记 物 不 同 而 异 。 通 常 分 为 以 下 两 类 ; 1. 放射 性 核 素 探 针 的 检测 “采用 放射 自 显影 的 方法 检测 , 即 利 用 放射 性 核 素 产生 的 射 线 (B 或 7) 使 X 线 片 感光 而 检测 。 其 方法 是 将 杂交 膜 用 保鲜 膜 包 好 ,在 暗室 中 ,与 X 线 片 压 在 一 起 , 置 于 暗盒 中 ,于 - 70 冰箱 中 曝光 适当 时 间 后 ,在 暗室 中 取出 X 线 片 ,经 显影 ew 后 即 可 观察 结果 。 2. 非 放射 性 核 素 探 针 的 检测 (1) 地 高 辛 标记 探 针 的 检测 :地 高 辛 是 一 种 半 抗 原 , 可 通过 抗原 -抗体 反应 和 酶 显 色 体系 偶 联 而 检测 。 例 如 ,杂交 后 ,地 高 辛 标 记 的 探 针 即 特 异性 结合 在 硝酸 纤维 膜 上 ,检测 时 加 入 地 高 辛 抗体 - 碱 性 磷酸 酶 复合 物 ,抗体 与 地 高 辛 抗原 结合 , 当 加 入 碱 性 磷酸 酶 的 底 物 (NBT 和 X- 磷 酸 盐 ) 时 , 酶 则 分 解 底 物产 生 蓝 紫色 不 溶性 反应 物 。 (2) 生 物 素 标记 探 针 的 检测 :生物 素 (biotin) 是 抗 生 物 素 蛋白 (avidin) 的 配 体 。 抗 生物 素 蛋白 是 一 种 糖 蛋白 ,其 分 子 中 有 4 个 与 生物 素 结合 的 位 点 ,与 生物 素 的 亲和力 极 高 ,生物 素 探 针 常 通过 亲 和 法 进行 检测 。 酶 常用 辣 根 过 氧化 物 酶 ,其 底 物 为 二 氨基 联 苯胺 (DAB) ,在 H,O, 存在 的 情况 下 , 辣 根 过 氧化 物 酶 分 解 DAB 产生 红 棕 色 沉 淀 物 。 (王晓燕 ) —_ eee =a St—S DNA NE Chapter11: DNA sequencing DNA 测序 (DNA sequencing) ,就 是 确定 组 成 DNA( 脱 氧 核糖 核酸 ) 的 四 种 化 学 碱 基 的 确 切 顺 序 ( 即 核酸 一 级 结构 的 测定 ) ,是 现代 分 子 生 物 学 中 的 一 项 重要 技术 。 和 常规 测序 方法 的 基本 过 程 包 括 : 第 一 ,把 待 测序 的 DNA 分 子 进行 处 理 , 得 到 只 差 1 个 核 苷 酸 的 一 系列 逐步 缩短 的 DNA 分 子 混合 物 ; 第 二 ,通过 凝 胶 电 泳 把 这 些 DNA 分 子 分 离开 来 ,形成 阶梯 状 排列 的 条 带 ,然后 逐个 读 出 DNA 的 碱 基 序列 。 目前 主要 应 用 两 种 快速 序列 测定 技术 :1977 AE OP. Sanger 等 提出 的 双 脱 氧 链 终止 法 和 1977 年 由 Maxam 与 Gilbert 提出 的 化 学 降解 法 ,其 中 双 脱 氧 链 终止 法 是 目前 应 用 最 多 的 技术 。 近 几 年 ,由 于 DNA 测 序 策略 的 日 趋 成 熟 , 以 及 自动 测序 仪 的 改进 ,序列 测定 速度 和 准确 率 大 为 提高 。 第 一 节 DNA 序列 测定 的 策略 DNA 序 列 测定 简便 快速 ,但 由 于 受到 电泳 凝 胶 分辩 率 的 限制 ,一 般 每 次 测序 只 能 测 出 500 一 600 个 核 背 酸 ,因此 对 更 长 DNA 分 子 的 测定 必须 考虑 到 策略 问题 ,以 确保 DNA 序列 分 析 简 捷 .快速 准确。 一 、 从 遗传 图 谱 物理 图 谱 到 基因 组 序列 图 谐 以 DNA 测 序 为 基础 的 基因 组 学 研究 主要 包括 遗传 图 谱 、 物 理 图 谱 的 绘制 和 基因 组 序 列 的 测定 ,以 及 解读 .注释 分 析 基 因 组 序列 等 四 个 方面 的 内 容 。 遗 传 图 谱 , 即 通过 亲本 的 杂 交 ,分 析 后 代 的 基因 或 其 他 特异 分 子 标 记 物 间 重 组 率 ,并 用 重组 率 来 表示 两 个 基因 之 间距 离 的 线性 连锁 图 谱 。 物 理 图 谱 是 以 大 片段 的 基因 组 DNA 分 子 为 基本 单位 ,以 连续 的 重 雪 群 为 基本 框架 ,通过 遗传 标记 将 重 礁 群 或 基因 组 DNA 分 子 排列 于 染色 体 上 ,描绘 DNA 上 可 以 识别 的 标记 的 位 置 和 相互 之 间 的 距离 (以 碱 基 对 的 数目 为 衡量 单位 ) ,这 些 可 以 识别 的 标 记 包 括 限制 性 内 切 酶 的 酶 切 位 点 、 基 因 等 。 对 于 人 类 基因 组 来 说 ,最 粗 的 物理 图 谱 是 染色 体 的 条 带 染 色 模 式 ,最 精细 的 图 谱 是 测 出 DNA 的 完整 碱 基 序 列 。 基 因 组 序列 是 分 辩 率 为 单 个 碱 基 的 物理 图 ,也 是 最 终 基 因 图 的 主要 结构 基础 。 在 基因 组 测序 中 ,存在 着 两 种 不 同 的 战略 , 即 全 基因 组 随机 测序 战略 和 以 物理 图 为 基础 的 以 大 片段 克隆 为 单位 的 定向 测序 战略 。 两 者 的 最 大 区 别 在 于 是 否 依赖 基因 组 作 图 。 把 每 条 染色 体 分 成 平均 长 度 为 400 kb 的 片段 ,每 段 克 隆 到 一 个 酵母 菌 人 工 合成 染色 体 (yeast = see -154- 基因 工程 学 artificial chromosome,YAC) 上 ,所 有 YAC 克隆 都 按照 其 在 染色 体 上 的 实际 位 置 进行 排序 ， 可 得 到 一 个 能 够 覆盖 整个 染色 体 的 YAC 文库 。 把 每 一 个 YAC 克隆 携带 的 染色 体 片 段 经 部 分 酶 切 形成 一 系列 有 重 友 区域 的 40 kb 左右 的 片段 克隆 到 黏 粒 上 ERIE. BTR 粒 上 的 染色 体 片 段 再 经 酶 切 形成 4 kb 左右 的 片段 克隆 到 测序 专用 的 质粒 载体 上 。 测 序 质 粒 上 携带 的 4 kb 片段 就 可 以 用 现在 常规 测序 的 方法 进行 测序 了 。 把 所 有 质粒 殉 隆 的 DNA 片段 序列 读 出 ,再 按照 各 个 片段 在 染色 体 上 的 实际 位 置 进行 排列 ,最 后 就 可 以 得 到 染色 体 的 全 部 核 苷 酸 碱 基 对 序列 。 LE 全 基因 组 随机 测序 战略 主要 采用 鸟 枪 法 (shotgun) ,也 俗称 “ 零 弹 法 ", 是 随机 先 将 整个 基因 组 打 碎 成 小 片段 进行 测序 ,最 终 利 用 计算 机 根据 序列 之 间 的 重 枚 关系 进行 排序 和 组 装 , 并 确定 它们 在 基因 组 中 的 正确 位 置 。 采用 超声 波 处 理 或 酶 解 的 方法 ,将 待 测 的 DNA 片段 随机 地 切 成 大 小 不 同 的 小 片段 并 WE. AAW ERE RPM a ,通过 计算 机 处 理 各 片段 核 苷 酸 序列 的 资料 RARE S 的 序列 连 成 待 测 DNA 的 全 长 序列 。 全 基因 组 鸟 枪 法 测序 的 主要 步骤 是 :第 一 ,建立 高 度 随 机 、 插 和 人 片段 大 小 为 kb 左右 的 基因 组 文库 。 克 隆 数 要 达到 一 定数 量 , 即 经 末端 测序 的 克 隆 片 段 的 碱 基 总 数 应 达到 基因 组 5 倍 以 上 。 第 二 ,高效 大 规模 的 末端 测序 。 第 三 ,序列 集 合 。 第 四 ,填补 缺口 。 有 两 种 待 填补 的 缺口 ,一 是 没有 相应 模板 DNA 的 物理 缺口 ,二 是 有 模板 DNA 但 未 测序 的 序列 缺口 。 “ 鸟 枪法 "优点 是 速度 快 , 好 像 树林 里 停 了 一 大 群 鸟 ,很 多 人 乱 枪 射击 ,在 很 短 的 时 间 内 ， 就 可 以 将 林子 中 的 大 部 分 鸟 打 中 ,而 且 简 单 易 行 ,成 本 较 低 ,可 以 在 较 短 的 时 间 内 通过 集中 机 器 和 人 力 的 方法 获得 大 量 的 基因 片段 。 但 是 用 它 来 测序 ,最终 排 序 结果 的 拼接 组 装 比较 困难 ,尤其 在 部 分 重复 序列 较 高 的 地 方 难度 较 大 。 此 外 ,有 许多 序列 片段 难以 定位 在 确切 的 染色 体 上 ,成 为 游离 片段 ;同时 又 会 有 许多 地 方 由 于 没有 足够 的 覆盖 率 而 形成 空缺 。 这 些 缺 陷 最 终 导致 整个 基因 图 会 留 下 大 量 的 空洞 (gap) ,也 影响 其 准确 度 。 三 、 引 物 延 伸 法 引物 延伸 法 (primer walking) 是 利用 通用 引物 确定 待 测 DNA 片段 两 端的 序列 以 后 , 根 据 测 出 片段 的 一 端 序列 ,设计 新 的 引物 再 向 前 测序 ,以 此 方式 不 断 向 前 测序 ,直到 获得 待 测 片段 的 全 长 序列 。 四 、 套 式 缺 失 法 套 式 缺失 法 ( 即 限制 性 酶 切 - 亚 克 隆 法 ) 是 采用 核酸 外 切 酶 从 待 测 DNA 片段 的 一 端 逐 个 降解 核 苷 酸 , 通 过 选择 不 同 的 降解 时 间 ,可 以 获得 一 套 长 短 不 同 的 单 向 缺失 的 突变 株 。 突 变 株 亚 克 降 后 分 别 进行 序列 测定 ,然后 将 这 一 整套 单 向 缺失 突变 株 的 核 苷 酸 序 列 拼 接 起 来 , 即 —_ 第 十 一 章 DN WM 序 .155 . 可 获得 待 测 DNA 片段 的 序列 。 第 二 节 ”常用 的 DNA 测序 方法 Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法 和 Maxam-Gilbert 化 学 修饰 法 是 目前 公认 的 两 种 最 常用 .最 有 效 的 DNA 序列 手工 分 析 法 。 但 目前 利用 现代 精密 仪器 和 机 器 人 技术 实现 了 DNA 测序 的 高 度 自 动 化 ,市 场 上 已 经 有 各 种 型 号 的 DNA 自动 测序 仪 可 供 选 购 。 一 、Sanger 双 脱 氧 链 终止 法 英国 剑桥 大 学 分 子 生 物 学 实验 室 的 F. Sanger 等 人 于 1977 年 发 明了 利用 DNA 聚合 酶 的 双 脱 氧 链 终 止 原理 测定 核 苷 酸 序列 的 方法 。 由 于 这 种 方法 要 求 使 用 一 种 单 链 DNA 模板 和 一 种 适当 的 DNA 引 物 ,因此 有 时 也 称 为 引物 合成 法 。 它 利用 了 DNA 聚合 酶 所 具有 的 两 种 酶 催化 反应 特性 :第 一 ,DNA 聚合 酶 能 够 利用 单 链 DNA 作 模 板 ,合成 出 准确 的 DNA 互补 链 ; 第 二 ,DNA 聚合 酶 能 够 利用 2 3 - 双 脱 氧 核 苷 三 磷酸 作 底 物 ,将 其 挫 人 到 寡 核 苷 酸 链 的 3 末端 ,从 而 终止 DNA 链 的 延伸 。 (一 )Sanger 双 脱 氧 链 终止 法 原理 通常 DNA 复制 所 需要 的 组 分 包括 :DNA RAM BRE DNA 模板 . 带 有 3'- 羟 基 末 端的 单 链 寡 核 苷 酸 引物 .4 种 UNTP(dATP.dGTP.dTTP 和 dCTP)。 以 DNA 单 链 为 模板 ,在 特 定 条 件 下 ,用 特异 的 引物 在 DNA 聚合 酶 的 作用 下 ,根据 碱 基 互 补 配 对 的 原则 ,不 断 将 4 种 脱氧 核糖 核 苷 酸 (dNTP) 加 到 引物 的 3- 羟基 末端 并 使 引物 链 得 到 延伸 ,合成 出 新 的 互补 DNA 链 。 这 种 链 的 延伸 是 通过 引物 的 3 - 产 基 和 脱氧 核糖 核 苷 酸 底 物 的 5 -磷酸 基 团 形成 磷酸 二 酯 键 来 完成 的 。 如 果 这 种 反应 体系 中 加 入 双 脱 氧 核糖 核 苷 酸 (ddNTP) ,这 种 2 3-- ddNTP 的 5 -磷酸 基 团 是 正常 的 ,而 3 位置 缺少 羟基 ,因此 在 DNA 聚合 酶 的 作用 下 ,仍然 可 以 通过 5 -磷酸 基 团 与 引物 链 的 3 -羟基 反应 挫 人 到 引物 链 中 ,但 是 由 于 ddNTP 没有 3'-# 基 ,不 能 继续 与 下 一 个 $ -磷酸 基 团 形成 磷酸 二 酯 键 而 导致 引物 链 延 伸 的 终止 。 例 如 ,存在 ddCTP.dCTP 和 三 种 其 他 dNTP( 其 中 一 种 为 -2P 标记 ) 的 情况 下 ,将 引物 、 模 板 和 DNA 聚 合 酶 一 起 保温 , 即 可 形成 一 种 全 部 具有 相同 $ 引物 端 和 以 ddC 残 基 为 3 端 结尾 的 一 系列 长 短 不 一 的 片段 混合 物 。 这 样 ,在 测序 反应 体系 中 ,DNA 引物 链 不 断 合 成 与 偶然 终止 ,产生 一 系列 的 长 短 不 等 的 核 苷 酸 链 。 然 后 将 这 些 测序 反应 产物 经 变性 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 ,分离 制 得 的 放射 性 自 显影 区 带 图 谱 将 为 新 合成 的 不 同 长 度 DNA 链 中 C 的 分 布 提供 准确 信息 ， 从 而 将 全 部 C 的 位 置 确 定 下 来 。 采 用 类 似 的 方法 ,在 ddATP .ddGTP 和 ddTTP 存在 的 条 件 下 ,可 同时 制 得 分 别 以 ddA .ddG 和 ddT 残 基 为 3" 端 结尾 的 三 组 长 短 不 一 的 一 系列 核 苷 酸 链 片段 ,其 长 度 取决 于 以 起 始 DNA 合成 引物 末端 到 出 现 过 早 链 终止 位 置 之 间 的 距离 ,结果 将 产生 4 类 寡 核 苷 酸 , 它 们 分 别 终 止 于 模板 链 的 每 一 个 A\C\G 或 工 的 位 置 上 。 将 制 得 的 四 组 混合 物 全 部 平行 地 分 别 点 加 在 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 板 上 进行 电泳 ,每 组 制品 中 的 各 个 组 分 将 按 其 链 长 的 不 同 得 到 分 离 ,从 而 制 得 相应 的 放射 性 自 显影 图 谱 ,根据 自 显影 图 谱 ， ” 156 . 基因 工程 学 从 4 组 泳 道上 按 终止 反应 时 所 形成 不 同 长 度 DNA 的 区 带 位 置 依次 读 出 从 3 到 3 的 碱 基 序 列 ( 图 11-1)。 该 过 程 可 由 计算 机 读 写 ,也 可 人 工分 析 。 @ 99° Op Ojo Me 000 SE: eon erga L_1_ 不 能 与 下 一 个 ANTP HE RK me fo Pas — AE Bt ; TTAGACCCGATAAGCCCGCA Hx ae DNA & ei | 标记 的 引物 +4dNTP+ddNTP nn eee TTAGAC CCGATAMNGE OCG GA oa ATTCGGGCGT - | H7 | 一 H_ATCTGGGCTATTCGGGCGT H 一 yw. AATCTGGGCTATTCGGGCGT H (b) Er 站 | DNA 多 有 聚 酶 |)

C 反 应 ,在 A>C 列 中 出 现 比较 深 的 带 时 ,可 以 帮助 确定 其 为 A 碱 基 。 (四 ) 化 学 测序 法 的 特点 化 学 法 测序 通常 都 用 ”“P 标记 的 DNA, SAIS 标记 的 末端 终止 法 比较 , 它 显 出 的 条 带 比较 宽 且 有 扩散 ,这 就 限制 了 化 学 法 对 较 大 片段 条 带 的 分 辨 能 力 ,一 般 在 一 块 电泳 胶 上 最 多 能 读 出 200 一 500 个 核 苷 酸 序列 。 另 外 ,化 学 法 对 标记 探 针 及 电泳 回收 DNA 片段 的 纯度 有 比较 高 的 要 求 。 化 学 测序 法 已 不 常用 。 三 、DNA 序列 分 析 的 目 动 化 Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法 和 Maxam-Gilbert 化 学 修饰 法 都 需要 使 用 放射 性 核 素 作为 标记 物 ,对 操作 人 员 有 辐射 危害 ,而且 放射 性 材料 在 保藏 .处 理 和 运输 方面 也 相当 麻烦 。 此 外 ,这 两 种 DNA 序列 分 析 法 还 存在 操作 步骤 繁琐 、 效 率 低 、 速 度 慢 等 缺点 ,特别 是 判断 测序 结果 的 读 片 过 程 , 既 花 时 间 又 乏味 。 因 此 , 自 DNA 序列 分 析 技 术 问 世 不 久 ,就 有 许多 科学 家 开 始 致力 于 DNA 分 析 自 动 化 方面 的 研究 。 (一 ) DNA 自动 测序 的 基本 原理 自动 获 光 序列 测定 是 用 染料 标记 的 双 脱 氧 核 苷 酸 作 为 DNA 延伸 的 终止 物 。DNA 序列 - 160 ， 基因 工程 学 分 析 自 动 化 包括 两 个 方面 :一 是 “分 析 反 应 ”的 自动 化 , 另 一 方面 则 是 “ 读 片 过 程 “ 的 自动 化 。 现在 大 多 采用 四 甲 基 若 丹 明 (tetramethylrhodamine) 作 为 发 光 剂 ,预先 标记 引物 DNA. HA | 这 种 引物 的 DNA 片段 能 在 激光 诱导 下 发 出 荧光 ,从 而 取代 放射 性 核 素 标记 。 如 图 11-3 所 AS ,由 激光 发 射 器 产生 的 激光 束 , 通 过 精密 的 光学 系统 后 被 导向 凝 胶 表面 的 检测 区 垂直 射 向 KER , 遇 到 经 过 检测 孔 的 DNA 片段 后 激发 荧光 发 色 基 团 发 射出 具 特 定 波长 的 荧光 。 这 些 荧光 通过 聚焦 透镜 集中 后 传 给 滤 光 镜 / 棱 镜 组 件 , 区 分 四 种 碱 基 产 生 的 不 同 波长 ,经 成 像 透 镜 后 由 高 灵敏 度 的 (CCD) 相 机 分 段 收 集 信 和 号 ,传送 到 计算 机 上 进行 分 析 处 理 。 &. =? porn [|< 高 灵敏 度 (CCD) 的 相机 MARIE > TD AD < 滤 光 片 /棱镜 纽 件 样 tt i BOL A Al 11-3 高 速 自动 DNA 测 序 仪 的 结构 及 工作 原理 (=) DNA 自动 测序 的 步骤 按照 标准 的 双 脱 氧 链 终止 法 进行 测序 反应 ,用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 做 电泳 分 离 ,在 电泳 凝 胶 的 侧面 ,固定 上 一 个 激光 通道 小 孔 ,在 凝 胶 板 的 上 面 装 上 一 套 菊 光 信 号 接收 器 。 电 泳 过 程 中 , 当 DNA 条 带 在 电场 的 作用 下 ,经 过 激光 通道 小 孔 时 , 带 有 荧光 剂 标记 的 DNA 在 激光 的 激发 下 便 产 生 了 荧光 。 菊 光 感 受 器 收 到 这 种 荧光 信号 后 ,通过 信号 转换 器 转换 为 电信 和 号 ,再 输入 到 数据 处 理 系统 ,最 后 把 所 测 得 的 序列 直接 打印 出 来 (图 11-4)。 ene Cc sc aailentes TCAC piel ata SAARC AGC OSU TAC COREG GAT CCT en 本 图 11-4 自动 测序 仪 利 用 荧光 染料 获得 的 图 谱 (N 代表 未 测 出 的 碱 基 ) 第 十 一 章 DNA WMS .161. (三 ) DNA 自动 测序 的 优点 用 染料 标记 的 终止 物 代 替 正 常 ddNTP 和 放射 性 标记 的 dNTP 有 三 个 优点 :第 一 ,避免 使 用 放射 性 物质 ,加 速 测 序 反 应 ;第 二 ,所 有 四 种 终止 反应 可 使 用 四 种 不 同 的 染料 在 同一 管 中 进行 ,一 种 颜色 代表 一 种 ddNTP ,减少 了 试管 和 吸 头 的 用 量 ; 第 三 ,用 不 同 的 染料 ,所 有 的 反应 可 在 一 个 泳 道上 进行 凝 胶 电 泳 ,条 带 通过 它们 对 扫描 仪 上 不 同 波长 光 的 吸收 能 力 不 同 而 识别 。 新 式 测 序 仪 结合 了 Taq DNA 聚合 酶 测序 法 和 染料 标记 ddNTP 的 优点 ,是 新 式 自 动 序 列 测定 的 基础 。 四 、 其 他 的 DNA 测序 方法 随 着 分 子 生物 学 的 飞速 发 展 , 尤 其 是 近年 来 人 类 基因 组 计划 (HGP) 及 后 基因 组 研究 的 提出 ,人们 需要 更 加 高 效 而 快速 的 核酸 序列 分 析 手 段 。 自 从 20 世纪 70 年 代 末 期 DNA 测序 技术 问世 以 来 ,人 们 已 经 做 了 大 量 重要 的 改进 ,但 从 根本 原理 上 创新 的 则 只 有 杂交 测序 法 (sequencing by hybridization ,SBH) 一 种 。 (一 ) 杂交 测序 近年 来 ,一 种 全 新 的 DNA 测 序 方法 一 一 杂交 测序 (sequencing by hybridization, SBH) 及 基于 SBH 发 展 起 来 的 DNA 芯片 (DNA chips) 或 叫 基因 芯片 (gene chips) 的 技术 应 运 而 生 。 SBH 最 初 是 由 英国 .前 南斯拉夫 和 俄罗斯 的 四 个 科学 家 小 组 于 20 世纪 90 年 代 初 同时 提出 来 的 , 它 是 利用 一 组 已 知 序 列 的 寡 核 苷 酸 短 序列 做 探 针 , 同 某 一 特定 的 较 长 靶 DNA 分 子 进 行 杂 交 ,通过 计算 机 分 析 从 而 测定 其 核 苷 酸 序列 。DNA 芯片 是 一 种 通过 杂交 测定 未 知 DNA 序列 的 新 技术 。 1. 杂交 测序 的 原理 在 一 个 玻璃 或 硅 片 上 合成 大 量 已 知 序 列 的 守 聚 核 苷 酸 片段 (作为 PRET) ,这 些 探 针 一 端 固定 在 固体 基质 上 ,另外 一 端 是 游离 的 。 它 们 在 硅 片 上 有 规律 地 排列 着 ,每 个 特定 位 置 上 探 针 的 序列 都 是 已 知 的 。 假 如 有 一 个 DNA 片段 需要 测序 ,我 们 可 以 把 它 的 单 链 形式 用 荧光 进行 标记 ,然后 与 硅 片 上 的 6 万 多 种 探 针 进行 分 子 杂 交 ,在 荧光 显微镜 下 观察 杂交 结果 。 如 果 某 个 探 针 与 待 测 DNA 某 个 部 分 的 序列 是 完全 互补 的 , 待 测 DNA 分 子 就 被 结合 到 硅 片 上 ,这 个 探 针 所 在 的 位 置 就 会 发 出 荧光 。 如 果 一 段 较 短 的 DNA Ft BE’ 够 同 较 长 的 靶 DNA 片段 杂交 ,并 形成 完全 的 双 链 结构 ,我 们 便 据 此 推断 在 靶 DNA 上 存在 着 相应 的 互补 序列 。 如 果 将 一 种 核 苷 酸 顺 序 为 $-AGCCTAGCTGAA-3 的 12-mer AY #2 DNA, 与 一 组 完全 随机 的 8-mer FER RR ELIE BRC ,在 总 数 为 43 = 65 536 种 的 8-mer 探 针 群 体 中 , 仅 有 5 种 会 与 靶 DNA 形成 完全 互补 的 双 链 分 子 。 根 据 这 $ 种 发 生 了 完全 杂交 作 用 的 8-mer 5£ KF PR TR FL ls) BE PP A AR EK , (8 OT HE th 3 BZ 12-mer 的 靶 DNA 分 F AA PB IL FF (PE 11-5). 2. DNA 杂交 测序 的 步骤 DNA 杂交 测序 实质 上 包括 两 个 主要 的 步骤 ,首先 是 将 测定 A982 DNA 分 子 同 一 组 已 知 其 核 苷 酸 顺 序 的 寡 核 苷 酸 探 针 进行 杂交 ,然后 与 那些 能 够 同 部 DNA 形成 完全 的 双 链 杂 合 分 子 的 窒 核 苷 酸 探 针 做 比较 分 析 ,并 据 此 推算 出 靶 DNA 的 核 苷 -162- BALES 酸 序列 。 (1) DNA 测 序 芯 片 的 制备 :根据 待 测 DNA 片段 的 长 度 选择 寡 核 苷 酸 探 针 长 度 ,将 该 长 度 所 有 排列 组 合 的 守 核 苷 酸 固定 在 芯片 载体 上 。 一 种 方法 是 在 芯片 载体 上 直接 原 位 合成 ， 另 一 种 方法 是 将 事先 合成 好 的 探 针 通过 喷射 或 直接 接触 固定 在 带 有 特定 活化 基 团 的 芯片 载 体 上 。 (2) 将 待 测定 的 靶 DNA 分 子 进 行 菊 光标 记 。 (3) 将 带 有 荧光 标记 的 靶 DNA 分 子 与 DNA 测序 芯片 上 的 探 针 进行 杂交 ,杂交 后 进行 (4) 使 用 激光 共聚 焦 扫 描 仪 对 结果 进行 获 光 检测 ,得 到 杂交 结果 图 。 根 据 能 够 同 靶 DNA 完全 杂交 的 寡 核 苷 酸 探 针 之 间 的 碱 基 重 琶 关 系 ,通过 专门 的 计算 机 分 析 软 件 处 理 得 出 待 测 DNA 分 子 的 核 背 酸 序 列 。 五 种 完全 杂交 的 核 苷 酸 序列 3° -T-C-G-G-A-T-CG-5’ C-G-G-A-T-C-G-A G-G-A-T-C-G-A-C G-A-T-C-G-A-C-T A-T-C-G-A-C-T-T 推算 出 的 靶 分 子 序列 3” -T-C-G-G-A-T-C-G-A-C-T-T-5’ 5’ -A-G-C-C-T-A-G-C-T-G-A-A-5' 图 11-5 最 简单 的 杂交 测序 原理 3. 杂交 测序 的 特点 (1) DNA 杂交 测序 法 不 仅 避 免 了 传统 测序 法 必 不 可 少 的 操作 繁琐 的 凝 胶 电 泳 ,而 且 既 不 需要 使 用 价格 昂贵 的 核酸 酶 ,也 不 需要 进行 复杂 的 化 学 反应 ,被 公认 为 是 一 种 有 发 展 潜力 的 适合 于 大 规模 DNA 测序 工作 的 新 方法 ,特别 适用 于 DNA 自动 测序 。 (2) 由 于 杂交 反应 的 平行 性 使 得 它 能 在 一 次 实验 中 自动 同时、 快速 、 AB Hh 条 序列 ,而 且 获 得 的 序列 信息 高 度 特异 .稳定 , 它 被 誉 为 遗传 信息 分 析 方 面 革命 性 的 里 程 碑 ， 该 技术 在 病原 检测 方面 也 将 得 到 广泛 应 用 。 (3) SBH 技术 的 效率 随 着 微 阵 列 中 朝 核 苷 酸 数量 与 长 度 的 增加 而 提高 ,但 微 阵列 中 者 核 苷 酸 数 量 与 长 度 的 增加 则 提高 了 微 阵 的 复杂 性 ,降低 了 杂交 准确 性 。 邻 堆 杂 交 技 术 (con- tiguous stacking hybridization ,CSH) 弥 补 了 SBH 技术 存在 的 弊端 ,CSH 技术 的 应 用 增加 了 微 阵 列 中 赛 核 苷 酸 的 有 效 长 度 ,加强 了 序列 准确 性 ,可 进行 较 长 的 DNA 测序 。 (二 ) PCR 测序 PCR 测序 有 以 下 优点 :OO 模板 需要 量 小 ;@ 方 法 简便 ,操作 易于 标准 化 .自动化 ;加 测序 效率 高 ,准确 ,在 短 时 间 内 即 可 完成 。 1. PCR 直接 测序 (direct sequencing, DS) PCR 直接 测序 是 指 对 PCR 产物 进行 的 直接 序列 分 析 , 而 不 需要 先 将 DNA 待 测 片段 克隆 于 测序 载体 上 ,这 不 仅 大 大 地 简化 了 操作 步 又 ,节省 大 量 的 人 力 和 物力 ,而 且 可 实现 自动 化 操作 ,加 之 新 的 荧光 检测 技术 的 应 用 ,使 测序 的 效率 大 大 提高 。 ae ES 第 十 一 章 DN WM SE .163 . 采用 PCR 循环 直接 测序 时 ,应 首先 将 扩 增 产物 转化 为 单 链 测 序 模板 ,目前 常用 的 转化 方法 为 不 对 称 PCR(asymmetric,PCR); 此 外 ,还 有 磁 珠 俘获 法 、 外 切 酶 消化 法 和 基因 组 扩 增 转录 同步 测序 法 (genomic amplification with transcript sequeucing,GAWTS)。PCR 直接 测序 的 最 新 进展 是 将 双 脱 氧 链 终止 法 与 PCR 技术 相 结合 进行 测序 ,在 PCR 反应 体系 中 同时 将 ddNTP tA ,并 利用 放射 性 核 素 或 荧光 素 标记 的 引物 引导 扩 增 后 ,将 模板 的 扩 增 与 测序 同 时 进行 ,其 使 用 的 模板 量 小 且 不 需 分 离 单 链 。 2. PCR-SE& HBR Et BER ARAE(PCR-ASb) 如 果 一 个 基因 的 突变 部 位 、 性 质 经 测序 分 析 已 经 阐明 , 即 可 用 该 方法 直接 检测 突变 。 该 方法 的 原理 即 利 用 人 工 合成 的 寡 核 苷 酸 片 段 作为 探 针 ,与 经 PCR 扩 增 获得 的 靶 DNA 进行 杂交 ,在 严格 控制 杂交 条 件 的 前 提 下 ,通过 斑 点 杂交 或 其 他 类 型 的 杂交 来 检测 PCR 产物 中 有 无 相应 突变 , 即 探 针 与 靶 DNA 片段 之 间 只 要 有 一 个 碱 基 不 配对 或 错 配 ,就 能 检 出 。 (1) 探 针 : 探 针 一 般 合 成 两 个 ,一 个 为 正常 序列 , 另 一 含有 突变 位 点 ,前 者 与 正常 靶 DNA 完全 互补 ,后 者 只 与 突变 DNA 互补 ,一 般 长 度 为 19 bp BRHAKZA SURFER 针 (allele specific oligo nucleotide probe, ASO 探 针 ) 。 (2) 探 针 的 标记 :最 先 应 用 的 标记 物 为 放射 性 物质 如 ”P、S, 但 由 于 其 来 源 . 半 衰 期 及 放射 性 危害 而 不 能 普遍 应 用 。 利 用 PCR 技术 可 获得 足够 量 的 靶 DNA 片段 ,因此 非 放 射 性 核 素 标记 的 探 针 亦 可 获得 非常 满意 的 结果 ,使 ASO 探 针 使 用 起 来 更 加 简便 ,而且 无 放射 性 核 素 半衰期 的 限制 ,操作 亦 更 安全 ,适合 于 临床 应 用 。 目 前 已 用 于 PRU 8 地 中 海 贫血 的 基 因 突 变 检测 。 (3) 杂交 类 型 :PCR 技术 的 出 现 , 从 根本 上 解决 了 靶 DNA 的 来 源 问题 ,使 人 们 能 在 很 得 的 时 间 内 获得 足够 量 的 靶 DNA, 传 统 的 PCR-ASO 技术 主要 是 将 PCR 产物 固定 于 杂交 膜 上 ,然后 用 不 同 的 标记 探 针 检测 ,也 可 将 已 标记 好 的 探 针 预先 固定 于 杂交 膜 上 ,再 使 之 与 PCR 产物 结合 ,检测 有 无 完全 互补 的 DNA 产物 。 3. 测序 引物 设计 与 要 求 ”由 于 在 测序 PCR 扩 增 反应 中 ,所 设计 的 引物 对 测序 PCR 的 结果 影响 比较 大 ,因此 ,提出 一 些 设 计 引 物 的 原则 ,以 供 参 考 。 (1) S| WRE:>18/20 bp. (2) 引物 应 避免 3 个 或 3 个 以 上 相同 碱 基 重 复 序 列 的 出 现 , 特 别 是 要 避免 3 个 或 3 个 以 上 的 连续 Gs。 (3) 在 测序 PCR 反应 中 ,Tu B55 CHSIMRAREERFAA RIE T,, 值 的 引 物 。 (4) GC 含量 :40% 一 60% 。GC 含量 低 的 引物 , 则 有 必要 将 引物 序列 延长 到 18 个 碱 基 以 上 ,以 确保 T。 值 高 于 所 推荐 的 低 限 值 3S5 CT. (5) 引物 自身 不 具有 回 文 结 构 , 以 避免 引物 自身 形成 发 夹 结构 。 如 果 引 物 中 存在 回 文 结构 , 则 有 可 能 引起 测序 PCR 的 无 效 引发 ,从 而 影响 测序 PCR 结果 。 (6) 引物 设计 应 避免 引物 自身 二 聚 体 或 引物 间 二 聚 体 的 形成 。 (7) 尽 可 能 通过 计算 机 证 实 对 于 载体 和 插入 DNA 片段 与 所 设计 的 引物 的 结合 位 点 是 惟一 的 ,特别 是 在 3 末端 的 8 一 10 bp. (8) 不 能 设计 简 并 性 引物 。 在 测序 PCR 中 , 简 并 性 引物 只 能 导致 测序 PCR 失败 。. 。 164 . 基因 工程 学 (9) 由 于 对 多 聚 核 苷 酸 和 短 串 联 重复 序列 的 测序 比较 困难 ,因此 ,设计 引物 时 还 要 尽量 避免 与 此 区 域 接近 或 可 与 之 发 生 退 火 反 应 的 引物 。 (=) 单 分 子 荧光 测序 单 分 子 荧光 测序 是 一 种 快速 DNA 测序 法 ,是 利用 单 分 子 操作 技 术 直 接 读 取 DNA 碱 基 序列 的 方法 ,与 传统 的 荧光 测序 法 相 比 ,这 种 方法 可 大 大 提高 速度 。 目 前 , 单 分 子 菊 光 测 序 技术 还 没有 完全 成 熟 ,主要 问题 是 用 于 识别 单个 碱 基 的 单 分 子 光谱 技术 还 没有 过 关 ,利用 隧 道 扫 描 显 微 镜 和 原子 力 显 微 镜 直 接 读 取 DNA 分 子 碱 基 序 列 的 研究 正在 进行 之 中 ,近期 内 有 可 能 取得 突破 。 单 分 子 荧光 测序 的 主要 过 程 如 下 :第 一 步 , 取 一 条 大 约 有 5 万 个 碱 基 的 单 链 DNA 分 子 , 把 它 的 一 端 用 化 学 方法 连接 在 一 个 非常 微小 的 塑料 球 上 ,DNA 分 子 就 会 强 绕 在 塑料 球 上 。 第 二 步 ,在 一 张 类 似 激光 唱片 的 圆 盘 上 铺 一 层 很 薄 的 液体 薄膜 ,然后 用 激光 光 钳 把 塑料 球 放 在 这 张 光盘 的 液体 膜 上 进行 移动 ,DNA 分 子 就 会 在 后 面 被 拖 着 展开 ,就 好 像 一 只 船 拖 着 一 条 绳子 快速 前 进 ,把 绳子 拉 展 一 样 。 第 三 步 , 让 拉 展 的 DNA 分 子 与 一 种 核酸 外 切 酶 结 合 ,这 种 核酸 外 切 酶 可 以 和 DNA 的 游离 末端 结合 ,然后 逐个 把 DNA 的 碱 基 切 割 下 来 。 第 四 步 ,用 单 分 子 光谱 技术 逐个 识别 并 且 读 出 碱 基 即 达到 了 测序 的 目的 。 (四 ) 流 式 细胞 仪 测序 其 原理 是 以 DNA 单 链 为 模板 ,合成 互补 链 时 的 核 苷 酸 分 别 用 不 同 的 荧光 染料 标记 , 然 后 连同 核酸 外 切 酶 置 于 石英 毛细 管内 。 被 酶 切 而 分 解 下 来 的 核 背 酸 一 个 一 个 地 通过 流 式 细 胞 仪 的 检测 系统 ,借助 于 不 同 的 荧光 而 直接 读 出 核 苷 酸 的 序列 。 (五 ) 扫描 隧道 显 微 术 (scanning tunneling microscopy,STM) 这 项 技术 的 基本 原理 是 利用 量子 隧道 效应 ,将 原子 线 度 的 极 细 针 尖 在 接近 样品 的 表面 处 扫描 ,通过 监测 样品 与 针尖 间 隧 道 电源 随 距 离 的 变化 而 得 到 样品 表面 的 形象 ,对 DNA FF 品 则 可 区 分 出 DNA 糖 -磷酸 骨架 上 4 种 碱 基 的 差别 。 现 在 最 新 的 一 种 称 为 分 子 激 发 显 微 术 ,扫描 针尖 与 样品 之 间 的 能 量 交换 与 调制 的 灵敏 度 ,在 分 析 DNA 时 ,如 标记 上 可 以 区 别 的 金属 , 则 可 进一步 提高 不 同 碱 基 的 分 辩 率 。 (六 ) 和 射线 成 像 术 积极 发 展 强烈 的 激光 X 射线 源 和 高 质量 的 X 射线 光学 仪器 ,使 X 射线 的 成 像 能 力 足 以 在 空间 上 分 辨 不 同 的 碱 基 。 在 发 展 该 项 技术 时 ,要 考虑 消除 与 防止 射线 对 DNA 的 损伤 效 应 。 另 一 项 技术 称 为 准 唱 体 成 像 术 , 它 是 在 用 PCR 技术 扩 增 一 段 DNA 分 子 时 ,以 重金 属 离 子 标 记 一 种 碱 基 ,只 要 1000 万 个 标记 的 、 完 全 伸展 的 DNA 分 子 就 可 作为 分 析 样 品 。 当 用 激光 X 射线 作 分 析 时 ,金属 标记 物 在 DNA 片段 中 的 位 置 可 从 散射 数据 中 加 以 确定 。 每 一 DNA 片段 只 需 测 定 ALT. GLC 四 种 标记 物 的 位 置 后 加 以 汇总 , 便 可 获得 核 背 酸 的 排列 次 序 。 PA ar, PF prs 第 十 一 章 DN 测 序 .165 ， 第 三 节 DNA 测序 中 的 笛 见 问题 无 论 手 工 测 序 还 是 测序 仪 自动 测序 ,都 存在 下 列 问题 : (一 ) 测序 结果 信号 弱 ,无 法 正确 读 取 序 列 常见 原因 是 模板 量 不够 ,测序 模板 量 主要 取决 于 模板 长 度 和 种 类 。 若 为 PCR 产物 测 序 ,一 般 要 求 100 ngykb ,而 质粒 DNA 可 稍 多 ,为 100 一 200 ng/kb. (=) 测序 信号 模糊 , 信 噪 比 显著 升 高 可 能 是 模板 DNA 污染 ,比如 PEG、EDTA RNA 或 其 他 DNA 导致 酶 活性 受 抑 制 。 (=) 测序 信号 提前 共同 终止 ,测序 反应 无 法 继续 进行 当 模 板 DNA 中 有 二 级 结构 形成 .4dNTP 浓度 不 当 或 模板 浓度 过 大 时 ,可 导致 测序 反应 提前 终止 。 (四 ) 无 正常 测序 信号 常见 原因 是 引物 设计 不 当 或 模板 G-C 含量 过 高 。 第 四 节 ”测序 的 意义 人 类 基因 组 计划 (HGP) 的 最 终 目 的 是 要 了 解 人 类 染色 体 10 万 多 种 基因 的 调控 机 制 ,从 而 进一步 阐明 人 类 的 整个 生命 活动 。 因 此 ,对 基因 密码 的 测序 分 析 是 一 项 十 分 重要 的 内 容 。 生物 体内 不 同 的 基因 密码 顺序 是 区 分 不 同 生物 种 类 的 依据 ,疾病 的 发 生 亦 将 导致 生物 体内 基因 密码 顺序 发 生 改 变 。 应 用 各 种 突变 检测 技术 检测 到 的 基因 突变 ,最 后 都 需 用 序列 分 析 才能 确定 突变 类 型 及 突变 位 置 ,其 效率 可 以 达到 100% 。 因 此 ,DNA 序列 分 析 是 检测 基因 突变 最 直接 、 最 可 信 的 方法 , 它 不 仅 可 确定 突变 的 部 位 ,而且 还 可 确定 突变 的 性 质 , 现 已 广泛 用 于 基因 突变 检测 .遗传 性 疾病 诊断 . 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP) 研 究 、 基 因 组 重叠 序列 群 (con- ting) 之 间 的 间隙 填补 ( 补 洞 ) 等 方面 。 (高 立 芬 ) 第 十 二 章 FMMARA Chapter12. Technique of Biochip 生物 芯片 技术 是 20 世纪 90 年 代 中 期 以 来 影响 最 深远 的 重大 科技 进展 之 一 ,是 融 微 电 子 学 .生物 学 物理 学、 化 学 .计算 机 科学 为 一 体 的 高 度 交 叉 的 新 技术 。 通 过 设计 不 同 的 探 针 阵列 .使 用 特定 的 分 析 方 法 可 使 该 技术 具有 多 种 不 同 的 应 用 价值 ,如 基因 表达 谱 测 定 突变 检测 、 多 态 性 分 析 、 基 因 组 文库 作 图 及 杂交 测序 (sequencing by hybridization，SBHJ) 等 ,为 后 基因 组 计划 时 期 基因 功能 的 研究 及 现代 医学 科学 及 医学 诊断 学 的 发 展 提供 了 强 有 力 的 工 具 , 将 会 在 新 基因 的 发 现 、 基 因 诊 断 药物 筛选 给 药 个 性 化 等 方面 取得 重大 突破 ,为 整个 人 类 社会 带 来 深刻 广泛 的 变革 。 该 技术 被 评 为 1998 年 度 世 界 十 大 科技 进展 之 一 。 一 、 生 物 芯片 的 概念 生物 芯片 (biochip) 是 指 采用 光 导 原 位 合成 或 微量 点 样 等 方法 ,将 大 量 生物 大 分 子 比 如 核酸 片段 .多肽 分 子 甚至 组 织 切片 、 细 胞 等 生物 样品 有 序 地 固化 于 支持 物 ( 如 玻 片 . 硅 片 、 聚 两 炳 酰胺 凝 胶 、 尼 龙 膜 等 载体 ) 的 表面 ,组 成 密集 二 维 分 子 排列 ,然后 与 已 标记 的 待 测 生 物 样 ， 品 中 的 靶 分 子 杂交 ,通过 特定 的 仪器 如 激光 共聚 焦 扫 描 或 电荷 偶 联 摄影 像 机 (CCD) 对 杂交 信和 号 的 强度 进行 快速 .并行 \ 高 效 地 检测 分 析 , 从 而 判断 样品 中 靶 分 子 的 数量 。 由 于 常用 玻 片 [ 硅 片 作为 固 相 支持 物 , 且 在 制备 过 程 模拟 计算 机 芯片 的 制备 技术 ,所 以 称 之 为 生物 芯片 技术 。 二 、 生 物 蔚 片 的 分 类 生物 芯片 根据 点 在 芯片 上 的 探 针 的 不 同 分 为 基因 芯片 、 蛋 白质 芯片 、 糖 芯片 细胞 及 组 织 芯 片 \ 芯 片 实验 室 。 1. 基因 芯片 (Gene chip) 又 称 DNA ith (DNA chip) , 它 是 在 基因 探 针 的 基础 上 研制 出 的 , 它 将 大 量 DNA 探 针 分 子 固定 于 支持 物 上 ,然后 与 标记 的 样品 进行 杂交 ,通过 检测 杂 交 信 和 号 的 强度 及 分 布 来 进行 分 析 。 2. 蛋白 质 芯片 ”与 基因 芯片 的 基本 原理 相同 ,但 它 利 用 的 不 是 碱 基 配 对 而 是 抗体 与 抗 原 结 合 的 特异 性 即 免疫 反 应 来 检测 。 蛋 白质 芯片 构建 的 简化 模型 为 :选择 一 种 固 相 载体 ,能 够 牢固 地 结合 蛋白 质 分 子 (抗原 或 抗体 ) ,这 样 形成 蛋白 质 的 微 阵 列 , 即 蛋白 质 芯片 。 3. 糖 芯片 ”DN Wang 为 研究 糖 基 介 导 的 分 子 识 别 及 抗 感染 反应 在 生物 医学 研究 领域 - 166 。 第 十 二 章 ”生物 芯片 技术 - 167 - 中 的 作用 ,研制 了 以 微生物 多 糖 为 靶 点 的 糖 芯片 ,将 微生物 多 糖 以 非 化 学 结合 方式 固定 到 表 面 修饰 的 玻璃 片上 ,一 张 玻 片上 可 固定 大 量 的 微生物 抗原 (20 000 个 点 )。 不 同 糖 结构 结合 的 糖 结合 物 均 可 用 于 微 阵 列 的 制造 。 经 空气 干燥 的 微 阵列 可 以 稳定 的 长 期 保 在 。 这 种 糖 芯 片 可 同时 检测 大 量 的 抗体 且 只 需 几 微 升 的 血清 样本 。 4, 细胞 和 组 织 芯片 ”是 通过 微细 加 工 技术 将 细胞 或 组 织 制备 在 同一 张 芯片 上 ,用 于 药 物 的 筛选 或 组 织 基 因 表 达 或 其 他 分 析 用 。 5. 芯片 实验 室 ， 为 高 度 集成 化 的 集 样 品 制 备 . 基 因 扩 增 、 核 酸 标记 及 检测 为 一 体 的 便 携 式 生物 分 析 系 统 。 它 最 终 的 目的 是 实现 生化 分 析 全 过 程 全 部 集成 在 一 片 芯 片上 完成 ,从 而 使 现 有 的 许多 繁琐 、 费 时 、 不 连续 、\ 不 精确 和 难以 重复 的 生物 分 析 过 程 自动 化 ` 连 续 化 和 微 缩 化 , 属 未 来 生物 芯片 的 发 展 方向 。 另外 ,根据 原理 不 同 ,生物 芯片 可 分 为 元 件 型 微 阵列 芯片 .通道 型 微 阵 列 必 片 . 生 物 传 感 芯片 等 新 型 生物 芯片 。 | 三 、 生 物 芯片 的 基本 工作 原理 生物 芯片 的 工作 原理 包括 芯片 的 制备 .样品 的 制备 与 标记 、\ 杂 交 图像 的 采集 和 分 析 。 (一 ) 芯片 的 制备 制备 芯片 方法 也 不 尽 相 同 , 以 DNA 芯片 为 例 ,基本 上 可 分 为 两 大 类 :一 类 是 原 位 合 ( 即 在 支持 物 表 面 原 位 合成 守 核 苷 酸 探 针 ) ,适用 于 宴 核 苷 酸 ; 一 类 是 预 合 成 后 直接 点 样 ,多 FAFA A B DNA, ANAS, EB mRNA. 1 原 位 合成 ”有 两 种 途径 ,一 是 原 位 光 刻 合成 (Affymerix 公司 专利 技术 ) ,该 方法 的 主 要 优点 是 可 以 用 很 少 的 步骤 合成 极其 大 量 的 探 针 阵列 。 某 一 含 N 个 核 苷 酸 的 春 聚 核 苷 酸 ， 通过 4x N 个 化 学 步骤 能 合成 出 4> 个 可 能 结构 。 例 如 想 要 合成 8 核 苷 酸 探 针 ,通过 32 个 化 学 步骤 ,8 个 小 时 可 合成 65 536 个 探 针 。 而 如 果 寺 传统 方法 合成 后 点 样 ,那么 工作 量 之 大 将 是 不 可 思议 的 。 同 时 ,用 该 方法 合成 的 探 针 阵列 密度 可 高 达到 10°/cm?. 另 一 种 原 位 合成 是 压 电 打印 法 (piezoelectric printing) ,原理 与 普通 的 彩色 喷 墨 打印 机 相 似 , 所 用 技术 也 是 常规 的 固 相合 成 方法 。 不 过 芯片 喷 印 头 和 墨盒 有 多 个 ,墨盒 中 装 的 是 四 种 碱 基 合 成 试剂 。 喷 印 头 可 在 整个 芯片 上 移动 。 支 持 物 经 过 包 被 后 ,根据 芯片 上 不 同位 点 探 针 的 序列 需要 将 特定 的 碱 基 喷 印 在 芯片 上 特定 位 置 。 冲 洗 .去 保护 、 偶 联 等 则 与 一 般 的 固 相 合成 技术 相同 。 该 技术 采用 的 化 学 原理 与 传统 的 DNA 固 相合 成 一 致 ,因此 不 需要 特殊 制 备 的 化 学 试剂 。 每 步 产 率 可 达到 99% 以 上 ,可 以 合成 出 长 度 为 40~ 50 个 碱 基 的 探 针 。 目 前 除了 Affymetrix 等 公司 使 用 该 技术 合成 探 针 外 ,其 他 中 小 型 公司 大 多 使 用 合成 点 样 法 。 2. 点 样 法 ”是 将 预先 通过 液 相 化 学 合成 好 的 探 针 ,或 PCR 技术 扩 增 cDNA 或 基因 组 DNA 经 纯化 .定量 分 析 后 ,通过 由 阵列 复制 器 (arraying and replicating device ARD ) 或 阵列 点 样机 (arrayer) 及 电脑 控制 的 机 器 人 ,准确 .快速 地 将 不 同 探 针 样 品 定量 点 样 于 带 正 电荷 的 尼龙 膜 或 硅 片 等 相应 位 置 上 (支持 物 应 事先 进行 特定 处 理 ,例如 包 被 以 带 正 电 荷 的 多 聚 赖 氨 酸 或 氨基 硅烷 ) ,再 经 紫外 线 交 联 固定 后 即 得 到 DNA 微 阵列 或 芯片 。 -168- BATES 点 样 的 方式 分 两 种 ,其 一 为 接触 式 点 样 ( 即 打印 法 ), 即 点 样 针 直 接 与 固 相 支持 物 表 面 接 触 ,将 DNA 样品 留 在 固 相 支 持 物 上 ;打印 法 的 优点 是 探 针 密度 高 ,通常 lcm 可 打印 2 500 个 探 针 ;缺点 是 定量 准确 性 及 重 现 性 不 好 ,打印 针 易 堵塞 且 使 用 寿命 有 限 ; 其 二 为 非 接 触 式 点 样 , 即 喷 点 , 它 是 以 压 电 原理 将 DNA 样品 通过 毛细 管 直 接 暑 至 固 相 支持 物 表 面 。 喷 印 法 的 优点 是 定量 准确 、 重 现 性 好 、 使 用 寿命 长 ;缺点 是 喷 印 的 斑点 大 ,因此 探 针 密度 低 ,通常 crm 只 有 400 点 。 点 样机 器 人 有 一 套 计算 机 控制 三 维 移动 装置 .多 个 打印 / 哮 印 头 ` 一 个 减 震 底 座 , 上 面 可 放 内 盛 探 针 的 多 孔 板 和 多 个 芯片 。 此 外 ,还 可 以 有 温度 和 湿度 控制 装置 、. 针 洗涤 装置 。 打 印 /时 印 针 将 探 针 从 多 孔 板 取出 直接 打印 或 喷 印 于 芯片 上 。 检 验 点 样 仪 优 劣 的 指 标 包括 点 样 精度 ` 点 样 速度 .一 次 点 样 的 芯片 容量 ` 样 点 的 均一 性 .样品 是 否 有 交叉 污染 及 设 备 操作 的 灵活 性 ` 简 便 性 等 。 (二 ) 样品 的 制备 lL 核酸 样品 的 制备 ”根据 样品 来 源 、 基 因 含 量 .检测 方法 和 分 析 目 的 不 同 ,采用 的 基因 TE . 扩 增 及 标记 方法 各 异 。 为 了 获得 基因 的 杂交 信和 号 必须 对 目的 基因 进行 标记 。 标 记 方 法 有 荧光 标记 法 .生物 素 标记 法 、 放 射 性 核 素 标记 法 等 。 目 前 采用 的 最 普遍 的 荧光 标记 方法 与 传统 方法 如 体外 转录 、 PCR \ 反 转录 等 原理 上 并 无 多 大 差异 ,只 是 采用 的 荧光 素 种 类 更 多 ， 这 可 以 满足 不 同 来 源 样品 的 平行 分 析 。 RNA 样品 通常 需要 首先 反 转 录 成 cDNA 并 进行 标记 后 才 可 进行 检测 (图 12-1,A)。 目 前 标记 的 方法 有 多 种 , 均 可 实现 对 基因 表达 的 检测 ,其 中 间接 法 (图 12-1,B、C) 大 大 提高 了 标记 效率 ,而 Affymetrix 公司 等 采用 的 体外 转录 方法 可 使 检测 的 灵敏 度 明 显 提高 ,增加 了 低 丰 度 表达 基因 的 检 出 率 ( 图 12-1,D)。 由 于 检测 灵敏 度 所 限 , 尚 难 以 普通 探 针 对 极 少 量 的 核 酸 分 子 进 行 杂交 和 检测 ,所 以 需要 对 样品 或 后 续 测 试 信号 进行 适当 的 放大 。 多 数 方法 需要 在 标记 和 分 析 前 ,对 样品 进行 适当 程度 的 扩 增 ,例如 通过 PCR 方法 ,以 使 样品 核酸 的 拷贝 数 有 所 提高 ,达到 检测 的 灵敏 度 。 除了 检测 前 对 样品 分 子 的 放大 外 ,通常 仍 需要 有 高 灵敏 度 的 检测 设备 来 采集 、 处理 和 解 析 生 物 信 息 。 但 亦 有 不 经 过 对 样品 的 扩 增 和 放大 而 直接 应 用 特殊 处 理 的 探 针 ,例如 分 支 探 针 技 术 ,可 达到 较 高 的 检测 灵敏 度 水 平 。 这 种 方法 的 原理 是 ,设计 具有 庞大 分 支 结 构 的 分 支 PA BERET ,分 支 末 端 以 酶 标记 。 这 样 ,经 过 分 支 核 苷 酸 与 酶 的 双重 放大 作用 而 将 标本 杂交 时 极 弱 的 信号 转换 为 较 强 的 化 学 信号 。 它 的 最 大 优点 在 于 其 操作 简便 ,具有 较 高 的 灵敏 度 ， 同时 也 可 以 保证 检测 结果 的 特异 性 。 当 然 , 由 于 不 同 检 测 方式 的 灵敏 度 不 同 ,对 于 样品 的 处 理 和 扩 增 情况 的 要 求 亦 有 所 不 同 ,具体 的 处 理 和 放大 方法 仍 需 根据 实际 情况 进行 选择 。 2. 和 蛋白质 及 其 他 生物 样品 的 制备 ”蛋白质 芯 片 在 进行 检测 和 分 析 时 ,可 以 将 待 分 析 的 蛋白 质 样 品 用 荧光 素 或 其 他 物质 进行 标记 ,然后 与 生物 芯片 上 的 生物 大 分 子 进 行 相互 作用 ， 最 后 依据 标记 物质 的 不 同 ,采取 相应 的 检测 方式 采集 和 分 析 样 品 和 芯片 上 生物 大 分 子 相 互 作用 的 结果 。 对 于 非 核酸 类 的 生物 大 分 子 ,存在 的 问题 是 有 时 不 便于 对 其 进行 扩 增 和 放大 ， 因为 其 他 生物 大 分 子 的 结构 相对 比较 复杂 不 能 进行 简便 的 克隆 或 扩 增 。 所 以 ,这 就 向 检测 的 灵敏 度 提 出 了 更 高 的 要 求 。 其 他 生物 大 分 子 的 检测 和 分 析 类 似 于 蛋白 质 分 子 。 例 如 核酸 与 蛋白 质 的 相互 作用 配 体 间 的 相互 作用 等 。 第 十 二 章 ”生物 芯片 技术 169 . A B 直接 标记 法 aadUTP 间接 标记 法 TAU TU RNA RNA Cy3/Cys 标 记 的 dCITP Behe RE pe KHER dTTP.dGTP.dATP dTTP.dGTP.dCTP YYW Cy3 标 记 的 cDNA POI sve sv ad I I I = =O: 7O- NH, NH, NH, nnn Cy5 标 记 的 cDNA ae ~ T ’ Al = @: -@: -@: 偶 联 反应 N- FRESE TAAL 活化 的 荧 认 次 料 降解 RNA ete ial 2a Bolle oe Oe Sa! . ¢ ~~ Fg sae sur, ar, “8: -@: -@: ©. @- 局 - LL aa T T T -@: -@: -@: goes he Fhe @ wy A -@- -@- -@- Cc D 体外 转录 方法 Genesphere 3DNA 方法 Sam ple AS 2 “Sample B ee) — 分 离 RNA wee a a ) = be ci Co a ei ee ay ee one mation 3 A Pe MIROW0) Epithelial) i908 is - + pagel 站 全 ca FH 1.28 Sn 1 on: oy "| oe i Fit OSU BRCA! Ocoee me omic —s bp OR, teas ane aie ,; Bho RSE ® X20 MR PM GE Pig ‘2? SACK rANRNNEE SH HaMRyt sa |Salad i 4 ‘ut 4 i : yw Hw jo cs lal ws . * PA PEAR et oot heee Ree Oe 7 sf “ae vale RUA A ARE E S25] Be ee nae. To ee YR. FU, Bens eee a< esc = Pw 第 三 起 BADR BALA Part Ill. Application of Genetic Engineering mea 8 ak To noitsoilqgA . i “pniteenigna sitet ne 第 十 三 章 ， 基因 工程 抗体 Chapter13. Genetic Engineering Antibody 自 1984 46 5% —4> ik PLB it AR—— A Bait i BF al) BO DAK, oir AY EA EDA AS 断 出 现 , 如 人 源 化 抗体 ` 小 分 子 抗体 和 抗体 融合 蛋白 (Fab ` 单 链 抗体 、 双 链 抗体 、 双 特异 抗体 ) 等 。 另 外 , 鸣 菌 体 抗体 库 与 核糖 体 展示 文库 技术 的 出 现 ,使 不 经 免疫 即 可 获得 包括 人 在 内 的 任何 一 种 动物 的 特异 性 抗体 成 为 可 能 。 第 一 节 ”基因 工程 抗体 概述 抗体 作为 疾病 预防 、. 诊 断 和 治疗 的 制剂 已 有 上 百年 的 发 展 历史 。 其 制备 方法 经 历 了 多 克隆 抗体 单 克 隆 抗体 , 现 已 发 展 至 第 三 代 的 基因 工程 抗体 。 多 克隆 抗体 (多 抗 ,PcAb,polyclonal antibody) 是 人 类 有 目的 的 利用 抗体 的 第 一 步 , 其 制备 方法 是 将 天 然 抗 原 经 免疫 动物 而 获得 。 多 抗 的 不 均一 性 ,限制 了 对 抗体 结构 和 功能 的 进一步 研究 和 应 用 。1975 4F Kohler 和 Milstein 首次 用 杂交 瘤 技术 制备 出 具有 高 度 均 一 性 的 单 克 隆 抗体 ( 单 抗 ， McAb, monoclonal antibody) 这 是 抗体 工程 发 展 的 第 一 次 质 的 飞 牙 ,也 是 现代 生物 技术 发 展 的 一 个 里 程 碑 。 单 克隆 抗体 因 其 均一 性 高 、 纯 度 大 而 在 疾病 诊断 、 治 疗 和 科学 研究 中 得 到 了 广泛 的 应 用 。 单 克隆 抗体 具有 上 鼠 源 性 ,进入 人 体会 引起 机 体 产 生 人 抗 鼠 抗体 (human anti-mouse antibody, HAMA) ,导致 排斥 反应 ;同时 , 单 抗 是 完整 的 抗体 分 子 ,其 相对 分 子 质量 较 大 ,在 体内 穿 透 血管 的 能 力 差 ;生产 成 本 高 ,不 适合 大 规模 工业 化 生产 。20 世纪 80 年 代 , 随 着 分 子 生 物 学 、 分子 免 疫 学 的 发 展 ,抗体 基因 结构 和 功能 的 研究 成 果 与 重组 DNA 技术 相 结 合 ,产生 了 基因 工程 抗体 技术 。 基因 工程 抗体 (genetic engineering antibody) 指 利用 重组 DNA 技术 和 和 蛋白 质 工 程 技术 ， 将 抗体 基因 按 不 同 需要 进行 加 工 \ 改造 和 重新 装配 ,然后 经 转 染 导入 适当 的 受 体 细 胞 中 表达 的 抗体 分 子 。 与 单 克 降 抗体 相 比 ,基因 工程 抗体 具有 如 下 优点 : 1. 降低 免疫 原 性 ”通过 基因 工程 技术 的 改造 ,可 以 降低 甚至 消除 人 体 对 抗体 的 排斥 反应 。 2. 改善 抗体 药物 动力 学 ”基因 工程 抗体 的 相对 分 子 质 量 较 小 ,可 以 部 分 降低 抗体 的 鼠 源 性 ,更 有 利于 穿 透 血管 壁 ,进入 病灶 的 核心 部 位 。 3. 可 根据 治疗 的 需要 ,制备 新 型 抗体 。 4. 生产 简单 ,价格 低廉 “可 以 采用 原核 细胞 真 核 细胞 和 植物 等 多 种 表达 方式 ,大 量 表 达 抗 体 分 子 ,大 大 降低 生产 成 本 。 基因 工程 抗体 的 发 展 经 历 了 一 个 长 期 的 过 程 :最 初 的 基因 工程 抗体 主要 是 利用 分 子 生 物 学 技术 ,对 单 克 隆 抗体 进行 人 源 化 改造 。 由 于 人 源 化 抗体 结构 复杂 、 相 对 分 子 质量 大 ,无 法 改善 抗体 的 亲和力 ,这 些 缺 点 限制 了 其 更 为 广泛 的 应 用 。 小 分 子 抗体 的 出 现 , 大 大 改善 了 SS -1834- 基因 工程 学 药 代 动 力学 ,在 诊断 和 治疗 领域 得 到 了 广泛 应 用 。 组 合 化 学 方法 在 抗体 工程 领域 中 应 用 , 诞 生 了 抗体 库 技 术 。 吹 菌 体 抗体 库 是 目前 应 用 最 为 普遍 的 抗体 库 技 术 。 采 用 鸣 菌 体 抗 体 库 技 术 筛 选 抗体 避免 了 动物 免疫 、 细 胞 融合 及 克隆 筛选 的 长 期 .复杂 过 程 , 易 于 制备 稀有 抗原 的 抗体 ,并 使 制备 完全 人 源 化 的 高 亲和力 抗体 成 为 可 能 = 在 叹 菌 体 抗体 库 基础 上 , 近 几 年 又 发 展 了 核糖 体 展示 抗体 库 技 术 。 核 糖 体 展示 抗体 库 技 术 的 整个 过 程 均 在 体外 进行 ,可 以 构建 高 容量 ,高 质量 的 抗体 库 ,代表 了 抗体 工程 的 未 来 发 展 趋势 。 Bo 人 源 化 抗体 人 源 化 抗体 (humanized antibody) ,是 为 了 克服 鼠 源 性 单 克 隆 抗 体 的 免疫 原 性 ,而 通过 AFR ,将 其 进行 人 源 化 改造 后 获得 的 抗体 ,其 目的 是 使 之 和 人 体 自 身 的 抗体 分 子 具 有 极 其 相似 的 轮廓 ,从 而 降低 免疫 原 性 ,逃避 人 免疫 系统 识别 ,避免 HAMA 产生 。 抗体 人 源 化 改造 ,主要 基于 对 抗体 本 身 结构 的 认识 。 根 据 氨基 酸 变 化 程度 ,抗体 的 肽 链 可 以 分 为 可 变 区 (V 区 ) 和 不 变 区 (C 区 ) 两 部 分 ,其 中 ,可 变 区 包含 了 与 抗原 结合 的 位 点 ,其 免疫 原 性 较 小 ,而 不 变 区 与 抗原 结合 功能 无 关 , 有 较 强 的 免疫 原 性 。 因 而 ,人 源 化 抗体 主要 是 对 可 变 区 或 不 变 区 的 改造 。 抗体 的 人 源 化 主要 有 两 个 基本 原则 :一 是 保持 或 提高 抗体 的 亲和力 和 特异 性 ;二 是 降低 或 基本 消除 抗体 的 免疫 原 性 。 不 管 在 人 源 化 中 采用 何 种 方案 进行 ,都 必须 遵循 这 两 点 ,尤其 不 能 丧失 抗体 特异 结合 抗原 的 能 力 。 一 、 人 - 鼠 艇 合 抗体 由 于 不 变 区 与 抗体 的 抗原 结合 功能 无 关 ,而且 90% 的 HAMA 是 针对 不 变 区 的 ,因而 第 一 代 的 人 源 化 抗体 设计 用 人 的 C 区 蔡 代 鼠 的 C 区 , 即 保留 鼠 McAb 的 可 变 区 ,并 使 之 与 人 抗体 的 恒定 区 重组 ,成 为 租 合 抗体 (图 13-1). =~ if] 鼠 搞 体 | 1 See Cen Bees ea Al 13-1 人 源 化 抗体 第 十 三 章 “基因 工程 抗体 . 185 - 骨 合 抗体 的 基本 原理 及 过 程 : 1. V 区 基因 的 克隆 尽管 IJgV 区 基因 具有 复杂 的 多 样 性 ,但 le 重 链 和 轻 链 V 区 基因 5 及 3' 端 (骨架 区 及 前 导 肽 序列 ) 相 对 保守 ,因而 可 以 设计 相应 的 引物 通过 反 转 录 PCR 从 分 泌 某 种 鼠 单 抗 的 杂交 瘤 细 胞 中 扩 增 重 链 及 轻 链 的 相应 功能 区 。 2. 表达 载体 构建 ”将 克隆 的 鼠 单 抗 功 能 性 V 区 基因 ,与 人 抗体 C 区 基因 按 一 定 方式 重组 ,克隆 到 表达 载体 中 , 即 可 构建 鼠 -人 嵌 合 的 轻重 链 基 因 表 达 载 体 。 然 后 将 艇 合 抗体 的 DNA 重组 子 导 入 受 体 细 胞 。 3. 符合 抗体 的 表达 ”由 于 艇 合 抗体 是 完整 的 抗体 分 子 ,其 恒定 区 必须 经 糖 基 化 才能 发 挥 功能 。 因 此 ,大肠 杆 菌 . 吻 菌 体 一 般 不 能 作为 宿主 细胞 。 酵 母 菌 因为 存在 糖 基 化 错误 的 可 能 性 HA tI AF RIA RA HA. COS 细胞 是 短暂 表达 艇 合 抗体 较为 理想 的 细胞 ,一 般 在 几 天 内 即 可 装配 成 功 ,从 而 为 快速 分 析 艇 合 抗体 提供 了 可 能 。 骨 艇 瘤 细胞 是 表达 角 合 抗体 最 主要 的 宿主 细胞 ,其 中 又 以 SP2/0 细胞 为 主 。 此 外 ,中 国 仓鼠 卵巢 瘤 (CHO) 细 胞 和 肿瘤 浸润 性 工 淋巴 细胞 等 都 可 以 用 来 表达 舱 合 抗体 。 4. 岩 合 抗体 表达 产物 的 检测 ELISA 法 、`Western 印迹 法 、RIA 以 及 间接 荧光 免疫 分 析 法 等 均 可 用 来 检测 符合 抗体 。 人 鼠 艇 合 抗体 用 人 的 C 区 取代 鼠 的 C 区 ,最 大 限度 地 保留 了 鼠 单 抗 的 特异 性 和 亲 和 力 , 较 好 地 解决 了 鼠 源 性 单 抗 诱 发 的 HAMA 等 不 良 反应 ,并 可 延长 半 寿 期 ,改善 药 动 学 。 此 外 , 角 合 抗体 含有 人 抗体 的 Fc 段 ,能 有 效 地 与 靶 细 胞 上 的 Fe 受 体 结合 ,诱导 细胞 毒性 效应 。 1998 年 ,美国 FDA 批 准 抗 TNF-a 人 鼠 符 合 抗体 用 于 炎症 性 肠 病 , 开 辟 了 舱 合 抗体 用 于 人 体 治疗 的 先河 。 目 前 , 嵌 合 抗体 已 经 用 于 肿瘤 ,感染 自身 免疫 病 等 疾病 的 治疗 ,并 显示 出 良好 的 治疗 效果 。 但 是 , 花 合 抗体 中 保留 了 完整 鼠 抗 体 的 V 区 结构 ,使 其 仍 有 较 强 的 异 源 性 。 而 且 , 肉 合 抗体 是 完整 的 抗体 分 子 ,相对 分 子 质量 较 大 ,对 肿瘤 组 织 的 穿 透 能 力 较 差 ,清除 也 较 慢 ,因而 在 导向 诊断 和 治疗 等 方面 的 应 用 受到 限制 。 —. Be H Ht Fy st — AE Wh > a ES aT AE BS BR HE), AR AR HG it PE te i A AY EE aE — 步 将 鼠 单 抗 可 变 区 中 相对 保守 的 骨架 区 (framework region, FR) FHMMAA FR , 仅 保 留 与 抗原 结合 的 CDR (complementary determinant region) 部 位 , 称 为 改 型 抗体 (reshaped anti- body，RAb)。 换 言 之 ,RAb 是 指 利 用 基因 工程 技术 ,将 人 抗体 V 区 中 的 CDR 序列 改换 成 鼠 单 抗 的 CDR 序列 后 重 构成 的 一 种 新 的 基因 工程 抗体 ,又 称 为 重 构 型 抗体 。 因 RAb 主要 涉 及 CDR 的 "移植 , 故 又 称 作 CDR 移植 抗体 (CDR grafting antibody)( 图 13-1). RAb 的 构建 基于 对 抗体 分 子 结构 的 进一步 认识 。 基 因 序 列 及 X 线 晶体 衍射 法 的 分 析 显示 ,抗体 分 子 的 V 区 是 由 CDR Al FR 两 部 分 构成 。Va 和 Vi 上 的 6 个 CDR 折 和 大 成 环 状 ， 并 向 外 突出 形成 抗原 结合 位 点 ,从 而 决定 了 抗体 的 特异 性 和 亲和力 。V 区 中 的 FR 序列 基 本 保守 , 且 在 不 同 的 抗体 间 有 较 高 同 源 性 ,同一 抗体 的 FR 可 适用 于 不 同 抗原 结合 位 点 的 移 植 。 抗 体 分 子 的 这 种 结构 特性 ,提供 了 设计 和 构建 RAb 的 物质 基础 。 -186- 基因 工程 学 RAb 的 发 展 经 历 了 两 个 阶段 : 1. 第 一 代 改 型 抗体 ”第 一 代 RAb 是 以 人 骨 人 瘤 蛋白 的 已 知 唱 体 结构 为 根据 ,选择 序 列 已 知 .并 与 鼠 源 性 单 抗 有 较 高 同 源 性 的 人 FR 作为 框架 ,并 移植 人 鼠 单 抗 的 CDR: 制备 除 CDR 序列 不 同 外 ,其 他 结构 几乎 完全 相同 的 治疗 用 抗体 。 为 保证 RAb 的 亲和力 ,可 改变 个 别 氮 基 酸 残 基 的 组 成 。 第 一 代 改 型 抗体 仅 通 过 简单 的 移植 ,将 鼠 单 抗 的 CDR 与 人 抗体 进行 重 构 ,虽然 最 大 限度 地 减少 了 异 源 性 序列 ,但 却 极 有 可 能 降低 抗体 的 亲和力 。 2. 第 二 代 改 型 抗体 ”为 获得 具有 高 亲和力 的 治疗 性 抗体 ,第 二 代 RAb 的 构建 应 用 了 人 抗体 基因 库 ,引进 计算 机 技术 模拟 抗体 分 子 的 立体 结构 (分 子 模拟 法 ) IPT ARR A FR。 其 基本 过 程 为 :首先 构建 人 抗体 基因 上 库 ,根据 同 源 性 原理 选择 出 与 鼠 单 抗 高 度 同 源 的 AFR 序列 ,并 通过 分 子 模 拟 法 鉴别 出 与 抗原 结合 位 点 关系 密切 的 鼠 单 抗 FR 上 的 氨基 酸 残 基 ,在 构建 V 区 时 把 这 些 关键 FR RAEN CDR 重组 并 移植 到 所 选取 的 人 FR 上 ,形成 鼠 人 fA FR ,其 亲 水 性 残 基 来 自 人 抗体 序列 ,而 功能 区 内 的 残 基 及 连接 CDR 的 残 基 则 来 自 鼠 源 抗体 序列 ,从 而 在 保证 抗体 特异 性 的 同时 ,获得 了 高 亲和力 的 RAb。 RAb 中 由 于 保留 了 鼠 单 抗 与 抗原 结 合 的 最 小 单位 (CDR 序列 ) 而 保持 了 原 有 单 抗 的 特 异性 ,并 最 大 限度 地 减少 了 鼠 源 性 。RAb 的 产生 与 发 展 ,使 多 种 特异 的 鼠 源 单 抗 有 可 能 应 用 于 临床 治疗 ,其 中 包括 通过 人 体 免 疫 应 答 难 以 诱 生 的 特异 性 抗 人 抗原 的 抗体 ,因而 具有 广 泛 的 应 用 前 景 。 第 三 节 ”小 分 子 抗体 人 源 化 抗体 具有 完整 的 抗体 结构 ,相对 分 子 质 量 较 大 ,难以 穿 过 血管 壁 ,影响 靶 部 位 对 其 的 摄取 。 特 别 是 肿瘤 组 织 的 血 供 本 身 就 不 丰富 ,对 抗体 的 摄取 量 就 更 少 。 通 过 基因 重组 技术 ,在 保持 原 有 抗原 结合 活性 的 基础 上 ,把 完整 的 抗体 分 子 改造 成 小 分 子 抗体 ,可 改善 抗 体 的 药 动 学 特性 ,并 适合 于 临床 的 应 用 。 小 分 子 抗 体 根 据 构 建 的 方法 不 同 , 可 分 为 Fab 抗 体 . 单 链 抗体 . 单 域 抗体 和 双 特 异性 抗体 (图 13-2)。 双 特 异性 抗体 图 13-2 “小 分 子 抗 体 结构 示意 图 第 十 三 章 ”基因 工程 抗体 ， 187 - 一 、Fab ft 体 抗体 的 Fab 段 只 有 完整 IgG 的 1/3 ,由 重 链 V 区 及 Chl 功能 区 与 轻 链 间 以 二 硫 键 形式 连接 而 成 ,具有 与 完整 抗体 完全 相同 的 抗原 结合 能 力 。 采 用 基因 工程 手段 构建 Fab 抗体 的 原理 ,是 把 抗体 分 子 的 Va 区 和 Cyl 功能 区 的 cDNA 与 轻 链 完整 的 CDNA 序列 重组 并 克隆 到 适当 的 表达 载体 中 ,然后 在 大 肠 杆 菌 等 宿主 细胞 中 表达 。 由 于 Fab 抗体 不 具有 Fe 段 ,不 需要 翻译 后 的 糖 基 化 修饰 ,因而 多 采用 大 肠 杆 菌 来 表达 。 此 外 ,Fab 抗体 也 可 在 植物 细胞 及 尾 虫 细胞 内 表达 ,但 不 同 的 表达 类 型 其 表达 量 有 明显 的 不 同 。 Fab 抗体 的 相对 分 子 质 量 较 小 , 约 为 S0 kD 左右 ,体内 应 用 具有 较 好 的 渗透 性 和 药 动 学 特征 ,已 被 用 于 多 种 疾病 的 诊断 和 治疗 。 但 多 数 Fab 抗体 具有 较 大 的 鼠 源 性 ,人 体内 反复 使 用 易 引 起 HAMA 反应 。 近 年 ,用 鸣 菌 体 抗体 库 技术 来 制备 完全 人 源 的 Fab 抗体 ,有 望 解决 这 个 问题 。 二 、 单 链 抗 体 单 链 抗体 (single chain of Fv, ScFv) EH Vy 和 Vi 通过 连接 肽 重组 并 表达 的 一 种 小 分 子 抗体 ,具有 抗原 结合 能 力 良 好 、 相 对 分 子 质 量 小 、 穿 透 力 强 、 体 内 循环 半衰期 短 及 免疫 原 性 低 等 特性 。 在 此 基础 上 ,可 与 其 他 效应 分 子 构建 成 多 种 具有 新 功能 的 抗体 分 子 ,是 构建 免疫 毒素 和 双 特 异 抗体 等 的 理想 而 基本 的 元 件 。 因 此 , 单 链 抗体 在 基因 工程 抗体 的 研究 中 占有 重要 的 地 位 。 单 链 抗 体 基 因 的 构建 一 般 采 用 从 杂交 瘤 细 胞 提取 mRNA, 反 转录 成 cDNA, 通 过 PCR THER V, 及 Vy 基因 ,再 用 人 工 合成 的 寡 核 苷 酸 序列 ( 即 接头 ) 把 V_ 的 C 端 与 Va 的 N Sin 或 Va 的 C 端 与 Vi 的 N 端 连 接 , 即 成 为 单 链 抗体 基因 。 近 年 来 ,将 吹 菌 体 表面 呈现 技术 (phage display) 应 用 于 单 链 抗体 筛选 ,可 从 人 外 周 血 淋巴 细胞 直接 提取 mRNA, 绕 过 免疫 和 细胞 杂交 融合 的 过 程 , 从 而 直接 可 以 构建 和 筛选 单 链 抗体 基因 。 设计 理想 的 接头 (linker) 序 列 是 构建 单 链 抗体 的 关键 。 理 想 的 接头 需 保 证 Va 和 Vi 在 表达 系统 中 能 等 摩尔 地 产生 ,不 干扰 Va 和 Vi 的 自由 折 和 到 , 并 使 抗原 结合 位 点 处 于 适当 构 型 ,不 引起 分 子 动力 学 改变 , 尽 可 能 减少 蛋白 酶 攻击 及 防止 单 链 抗体 的 聚集 等 。 目 前 最 常用 的 接头 序列 是 具 刚 性 结构 的 15 肽 序列 (Gly4Ser)3。 此 外 ,还 可 从 已 知 三 级 结构 的 天 然 蛋白 质 获得 合适 的 序列 ,如 轻 链 的 elbow region 序列 ,藻类 蛋白 序列 等 作为 接头 序列 。 单 链 抗体 虽然 较 好 地 保持 了 抗体 的 特异 性 ,但 当 抗原 含 重复 抗原 决定 复 时 ,其 亲 和 活 性 可 降低 8 倍 以 上 。 通 过 构建 双 价 SecFv, 可 改善 ScFv 的 亲 和 活 性 。 将 噬菌体 表面 呈现 技术 应 用 于 ScFrv 的 筛选 ,可 筛选 出 高 亲和力 和 特异 性 更 强 的 SFv。 通 过 C 末端 连接 另 一 单 链 抗体 基因 ,可 构建 和 表达 出 双 特 异 单 链 抗体 ,应 用 于 肿瘤 的 诊断 和 治疗 。 也 可 与 IL-2 IFN 等 细胞 因子 基因 连接 ,使 细胞 因子 特异 性 杀伤 肿瘤 细胞 ,增强 抗 肿瘤 活性 ,降低 其 毒 副作用 。 随 着 有 关 研 究 的 不 断 深入 ,ScFv 应 用 也 会 日 趋 广泛 。 - 188 .基因 工程 学 = A bh it 只 含 V 区 基因 片段 的 小 分 子 抗体 ,就 称 为 单 域 抗体 ,其 相对 分 子 质 量 仅 为 整个 Ig 分 子 的 1Z12 , 故 也 称 之 为 小 抗体 。 单 域 抗体 只 有 Vy 或 Vi 一 个 功能 结构 域 制备 相当 简单 ;而 且 可 以 在 大 肠 杆菌 等 宿主 中 表达 出 有 活性 的 抗体 片段 。 单 域 抗体 突出 的 特点 是 分 子 小 ,因此 其 抗原 性 很 弱 , 较 适 合 于 体内 的 应 用 。 由 于 其 分 子 小 ,因而 易于 穿 透 组 织 ,可 用 来 快速 清除 组 织 内 的 毒素 ,并 可 渗透 到 完整 McAb 分 子 不 能 达 到 的 部 位 ,从 而 提高 对 肿瘤 等 的 治疗 效果 。 与 完整 McAb 相 比 , 单 域 抗 体 的 亲和力 较 低 ,而 且 相 对 的 较 有 黏 性 。 单 域 抗 体 最 大 的 缺 陷 是 不 含 Fc 段 ,因此 无 固定 补体 及 介 导 ADCC 的 作用 。 这 将 影响 其 实用 价值 。 然 而 ,通过 不 同 的 Va 基因 以 及 其 他 功能 分 子 的 重组 等 ,可 能 获得 双 特 异性 ,甚至 多 特异 性 以 及 具有 其 他 功能 活性 的 单 域 抗体 ,但 要 进行 这 些 改造 还 需 很 多 的 研究 。 第 四 厂 ” 双 特异 性 抗体 一 、 双 特异 性 抗体 的 发 展 天 然 Ig 是 由 两 个 完全 相同 的 Vi 和 Va 区 域 构成 ,该 区 域 是 特异 性 识别 并 结合 抗原 的 关键 部 位 。 而 经 人 工 设 计 构 建 的 双 特 异性 抗体 (bispecific antibody,BsAb) 则 由 两 个 不 同 的 抗原 结合 位 点 组 成 ,可 同时 与 两 种 不 同 的 抗原 决定 簇 结 合 , 并 可 将 其 耦 联 的 药物 、 酶 或 放射 性 核 素 等 导向 到 靶 部 位 ,这 种 具有 双 价 双 特 异性 的 抗体 又 称 为 双 功 能 抗体 (bifunctional anti- body , BfAb) 。 二 、BsAb 的 制备 与 构建 BsAb 的 制备 方法 包括 化 学 耦 联 法 、 杂 交 - 杂 交 瘤 法 和 基因 工程 方法 。 现 介绍 基因 工程 疗法 。 目前 ,一 般 采 用 与 抗原 结合 的 抗体 片段 ,如 Fab. Fv 或 ScFv 为 构件 设计 制备 BsAb。 这 种 BsAb 具有 相对 分 子 质 量 小 ,组 织 穿 透 力 强 , 易 于 清除 的 特点 ,并 由 于 其 中 缺乏 恒定 区 ,不 会 引起 全 抗体 的 生物 学 效应 ,减少 了 与 表达 Fe 受 体 的 细胞 发 生 非 特异 性 结合 的 机 会 。 制备 bisFv 的 关键 问题 是 如 何 使 两 个 单一 的 蛋白 融合 成 具有 双 功 能 性 的 蛋白 质 , 这 与 天 然 蛋白 质 中 两 个 或 多 个 亚 基 装 配 成 功能 性 聚集 体 相 类 似 。 目 前 ,至 少 有 3 种 比较 系统 的 方案 用 来 制备 bisFvs: 中 借助 一 种 能 提供 蛋白 质 间 相互 作用 的 “二 聚 化 结构 域 ”, 如 双 歧 性 的 螺旋 结构 . 亮 氨 酸 拉链 等 ,来 充当 抗体 恒定 区 ,从 而 实现 单 体 向 二 聚 体 的 转化 ,这 种 双 价 体 称 为 “ 微 抗 体 "(miniantibodies) 。 微 抗体 与 完整 抗体 有 相同 的 抗原 特异 性 和 相近 的 亲和力 ， 其 稳定 性 则 高 于 单价 的 SFv。@ 以 接头 直接 融合 两 种 SFv。 四 将 连接 肽 缩短 (0 一 15 氨基 第 十 三 章 ”基因 工程 抗体 - 189 - WB) ,制备 出 名 为 “ 双 体 ”(diabodies) 的 双 价 双 特异 性 SeFv。 将 A 抗 体 的 重 链 V 区 (VHA) 与 也 抗体 的 轻 链 V 区 (VB) 通 过 上 述 短 肽 连接 ,构成 杂 合 ScFv , 同 理 再 以 VIA 和 VHB 构建 另 一 RE SeFv。 当 二 者 同时 表达 时 ,由 于 短 接头 的 限制 ,位 于 同一 SecFv 链 的 V 区 之 间 难 以 匹 fic ,被 迫 与 另 一 SeFv 的 、 但 实际 是 来 源 相 同 的 V 区 相 匹配 ,巧妙 地 形成 有 两 个 抗原 结合 位 点 的 二 聚 体 。 第 五 他 唑 基体 抗体 Met Pa AS it HA FE (phage antibody library) 技 术 是 通过 PCR 将 全 套 人 抗体 重 链 和 轻 链 V 区 基因 克隆 出 来 ,并 在 叭 菌 体 表面 表达 、 分 记 ,经 筛 选 后 获得 特异 性 抗体 。 所 构建 的 抗体 的 集 合 称 为 抗体 库 (antibody repertoire) 或 组 合 抗体 库 (combinatorial antibody library) ,从 中 筛选 得 到 的 抗体 称 为 噬菌体 抗体 。 一 、 基 本 原理 该 技术 以 噬菌体 为 载体 ,将 抗体 基因 (Fa2 或 ScFu 基因 等 ) 与 鸣 菌 体 编码 的 外 元 和 蛋白 基 因 焉 (czp 亚 ) 或 立 亚 (coV 亚 ) 相 连 , 在 噬菌体 表面 以 抗体 -外 壳 蛋 白 融 合 蛋白 的 形式 表达 。 经 辅助 病毒 感染 后 ,携带 有 表达 载体 的 宿主 菌 就 会 释放 出 带 有 抗体 片段 的 叭 菌 体 颗 粒 。 这 种 喉 菌 体 抗 体 可 以 特异 识别 抗原 ,又 能 感染 宿主 菌 进 行 再 扩 增 ,因此 可 以 采用 类 似 于 亲 和 层 析 的 原理 从 鸣 菌 体 抗体 库 中 筛选 出 特异 性 抗体 。 鸣 菌 体 抗体 库 技术 的 产生 依赖 于 三 项 实验 技术 的 发 展 : 1. PCR 技术 的 发 展 使 得 利用 一 组 引物 克隆 出 全 套 Ig 可 变 区 基因 成 为 可 能 。 目 前 扩 增 Vu 和 Vi 基因 的 引物 主要 根据 FR 区 .前 导 肽 区 或 保守 序列 设计 FF AE S| 地 扩 增 多 样 化 的 可 变 区 基因 。 为 便于 克隆 , 常 在 引物 的 两 端 分 别 设 计 合适 的 酶 切 位 点 。 2. 基因 工程 表达 技术 的 发 展 与 成 熟 使 得 在 大 肠 杆菌 中 分 记 有 结合 功能 的 Ig 分 子 片段 获得 成 功 。 抗 体 与 抗原 结合 的 部 位 是 由 两 条 肽 链 (Vr 和 Vi ) 通 过 复杂 的 空间 折 有 登 形成 的 立 体 结构 ,维持 这 一 结构 对 抗体 的 功能 至 关 重 要 。 在 Ig 可 变 区 基因 5 加 入 细菌 的 信号 肽 序 列 ,Ig 可 变 区 即 可 分 这 到 胞 周 间隙 ,并 在 那里 完成 立体 折 琶 ,成 为 有 功能 的 蛋白 质 分 子 , 还 可 形成 链 间 二 硫 键 ,产生 二 聚 体 。 这 一 成 功 说 明了 用 抗体 库 在 原核 细胞 筛选 特异 性 抗体 的 可 行 性 。 3. 有 效 的 筛选 系统 ( 叭 菌 体 表面 呈现 技术 ) 的 建立 ”将 肽 链 通 过 与 单 链 吹 菌 体外 壳 和 蛋 自 (p 亚 或 pV 亚 ) 融 合 表达 在 丝 状 噬菌体 的 表面 ,利用 其 可 以 再 扩 增 的 特性 ,将 靶 分 子 固定 化 ,通过 亲 和 筛 选 - 洗 脱 - 扩 增 ,可 筛选 到 靶 分 子 的 配 体 肽 链 或 Fab Be. 二 、 吹 大 体 抗体 库 的 分 类 按 抗 体 基 因 的 来 源 ,噬菌体 抗体 库 分 为 : 1. 天 然 抗 体 库 (native antibody library) “以 淋巴 细胞 为 抗体 Vi 和 Vi 的 基因 来 源 所 构 ” 190 . 基因 工程 学 建 的 抗体 库 成 为 天 然 抗 体 库 。 2. 免疫 抗体 库 ”这 是 相对 于 天 然 抗 体 库 而 言 的 ,是 指 利 用 从 特定 抗原 免疫 的 动物 或 人 体 获 取 的 淋巴 细胞 为 材料 所 构建 的 抗体 库 。 此 种 抗体 库 的 库容 大 多 为 104 一 108 ,从 这 种 抗 体 库 中 比较 容易 筛选 出 高 亲和力 的 抗体 。 免 疫 抗体 库 对 于 筛选 特定 抗原 的 抗体 是 非常 合适 的 。 3. 半 合 成 抗体 库 ”CDR 决定 了 抗原 -抗体 结合 的 特异 性 ,其 中 重 链 CDRL、CDR2 只 能 组 成 7 种 立体 环 状 结构 。 而 CDR3 则 由 于 有 30 种 D 片段 .6 种 本 片段 ,以 及 N 区 的 重 排 组 于 & ,显示 出 长 度 序列 .和 空间 结构 的 高 度 可 变性 ,具有 比 其 他 任何 一 个 CDR 更 重要 的 作用 ， 是 抗原 结合 的 活性 中 心 。 这 种 CDR 结构 的 特异 性 是 半 合 成 抗体 库 的 基础 。 根据 CDR3 的 结构 特点 ,人 工 合成 长 度 为 5 个 或 7 个 氨基 酸 的 CDR3 随机 序列 ,通过 PCR 法 与 胚 系 (germline) 的 Vy 基因 重组 ,利用 这 种 形式 获得 的 抗体 基因 所 构成 的 抗体 库 称 为 半 合 成 抗体 库 。 4. 全 合成 抗体 库 “” 抗 体 可 变 区 基因 中 CDR 序列 完全 是 随机 合成 的 ,利用 这 种 形式 获 得 的 抗体 基因 所 构成 的 抗体 库 称 为 全 合成 抗体 库 。 在 全 合成 抗体 库 中 ,选择 抗体 可 变 区 模 板 的 依据 是 其 在 大 肠 杆 菌 中 的 表达 能 力 , 这 样 可 以 确保 它们 能 呈现 在 鸣 菌 体 表 面 ,而 且 可 借 助 可 溶性 片段 的 形式 大 量 生产 。 三 、 鸣 瑚 体 抗体 的 克隆 和 表达 (一 ) 抗体 可 变 区 基因 获得 实验 表明 ,杂交 瘤 细 胞 .免疫 脾 细胞 淋巴结 细胞 、 外周 血 淋巴 细胞 ,甚至 体外 免疫 的 细 胞 都 可 以 作为 克隆 B 细胞 全 套 可 变 区 基因 的 建 库 来 源 。 有 的 研究 提示 ,在 这 些 细胞 中 ,以 选用 淋巴 结 细胞 建 库 为 最 好 。 因 为 这 种 细胞 有 利于 筛选 到 高 亲和力 和 特异 性 的 抗体 。 目前 ,获得 可 变 区 基因 的 途径 主要 有 两 种 ,一 是 从 基因 文库 中 获取 可 变 区 基因 ,二 是 用 PCR 法 扩 增 Ig HK) Vy AV, 基因。 其 中 ,PCR 是 目前 在 构建 噬菌体 抗体 库 时 最 常用 的 一 种 方法 。 模 板 的 完整 性 及 其 浓度 的 高 低 , 引 物 的 设计 ,退火 温度 和 时 间 的 选择 ,循环 次 数 的 多 少 等 , 均 可 能 影响 PCR 的 结果 ,其 中 引物 的 设计 尤为 关键 。 (二 ) 表达 载体 喉 菌 体 抗体 库 的 表达 载体 可 分 为 入 噬菌体 (phage A ) , 54 $8 22 1K ME FA PK (filamentous phage) 及 只 菌 粒 (phagemid) 三 种 系统 ,这 三 种 系统 各 有 其 利弊 。 和 》 叹 菌 体 表 达 系 统 可 通过 菌 斑 印 迹 (plaque lift) 筛 选 克隆 ,但 外 源 性 片段 不 能 太 大 ,其 库容 较 小 (10")。 丝 状 叭 菌 体 主要 为 Winter 实验 室 所 采用 ,目前 已 构建 了 fd CATI 及 fd DOG1 ,并 已 制备 SecFv; 此 载体 中 又 包括 单价 及 多 价 两 个 子 系统 ,可 筛选 出 高 亲和力 抗体 。 喉 菌 粒 是 应 用 最 多 的 表达 载体 ,也 是 简便 高 效 模拟 B 细胞 产生 抗体 的 原核 表达 系统 。 目 前 对 此 系统 已 改建 的 主要 表达 载体 包 括 : VA pBluescript 构建 的 pComb3 ,pComb8 ,PCBAK8; LA pUC 构建 的 PHEN1 及 pCANTAB; 以 pDS31-1 构建 的 PSEX; 以 pPUC、PGC1 构建 的 pTac cp; 以 pSW1 构建 的 PEXmide 3 等 。 LA 第 十 三 章 “基因 工程 抗体 191 - 这 些 表 达 系 统 在 表达 抗体 时 ,一般 都 较 质 粒 表 达 系 统 的 产量 高 、 活 性 强 、 特 异性 好 ,易于 筛 选 ,其 本 身 也 可 与 质粒 联合 应 用 ,易于 构建 抗体 可 变 区 基因 文库 。 其 中 的 丝 状 鸣 菌 体 及 鸣 菌 粒 还 可 作为 寡 核 苷 酸 定位 诱 变 的 中 间 载 体 , 同 时 具有 诱 变 及 表达 功能 ,这 为 模拟 体 细胞 的 突 变 提供 了 前 所 未 有 的 工具 。 (=) 抗体 库 的 构建 在 构建 表达 Fab 段 的 抗体 库 时 ,可 把 Fab 的 一 条 链 (Fd) 在 叭 菌 体 表面 呈现 , 另 一 条 链 (k 或 入 轻 链 ) 克 隆 到 pASK22 类 型 的 载体 内 ,二 者 转 染 同一 大 肠 杆 菌 ,分 记 到 胞 周 间隙 中 的 一 条 链 与 噬菌体 表面 的 另 一 条 链 相 匹配 并 联合 成 为 在 噬菌体 表面 呈现 的 功能 性 Fab 抗体 。 在 构建 表达 ScFv 的 抗体 库 时 ,其 方法 有 多 种 ,如 将 Va 和 Vi 基因 分 别克 隆 到 不 同 噬 菌 体 载 体 上 再 将 两 载体 在 体内 或 体外 重组 ,或 将 Va 和 Vr 依次 克隆 到 同一 噬菌体 载体 上 ,也 可 用 细胞 内 PCR 装配 技术 在 淋巴 细胞 内 将 Va 和 Vir 基因 连接 ,再 克隆 到 噬菌体 载体 上 ,还 可 将 Vy 基因 库 与 单一 Vi 基因 组 合 等 等 。 此 外 ,在 抗体 基因 与 cb3 之 间 插 人 一 个 琥珀 (am- ber) 中 止 密码 子 , 当 此 密码 受 抑制 时 抗体 则 分 泌 表 达 。 因 此 当 重 组 鸣 菌 体 生长 在 抑制 型 或 非 抑制 型 大 肠 杆菌 时 就 可 分 别 模拟 B 细胞 和 浆 细胞 功能 。 (四 ) 转化 大 肠 杆 菌 喉 菌 体 抗体 库 的 大 小 与 大 肠 杆 菌 转 化 率 明 显 相 关 。400hml 感受 态 的 大 肠 杆 菌 经 电 穿孔 转化 ,至 少 有 10" 个 细菌 可 被 鸣 菌 粒 载体 转 染 ,这 与 体内 抗体 库 独 特 型 数目 一 致 。 如 果 鸣 菌 粒 在 体外 包装 , 则 还 可 以 明显 增加 转 染 大 肠 杆菌 的 数量 ,因此 电 穿孔 是 一 种 理想 而 有 效 的 增 加 大 肠 杆菌 抗体 库 数 量 的 手段 。 (五 ) 噬菌体 抗体 的 筛选 和 富 集 从 吹 菌 体 抗体 库 中 筛选 表达 特异 性 抗体 的 经 典 方法 主要 有 两 种 :@ 将 纯 抗原 包 被 在 固 相 介质 上 ,如 酶 标 板 免疫 试 管 或 亲 和 层 析 柱 ,然后 加 入 待 筛选 的 噬菌体 , 洗 去 非 亲 和 性 或 低 亲 和 性 结合 的 鸣 菌 体 ,回收 高 亲 稍 性 的 鸣 菌 体 ;@ 将 抗原 与 生物 素 基 团 相 连 , 再 将 其 固定 在 包 被 有 链 霉 素 抗 生物 素 (streptavidin) 的 磁 珠 上 对 鸣 菌 体 进行 筛选 。 四 、 鸣 菌 体 抗体 的 应 用 近年 来 ,噬菌体 抗体 已 成 为 基因 工程 抗体 研究 的 热点 之 一 ,并 被 广泛 应 用 于 生命 科学 的 各 个 领域 。 (一 ) 基础 研究 许多 自身 免疫 性 疾病 的 发 生 是 由 于 机 体 产 生 的 高 亲和力 自身 抗体 借助 ADCC 作用 和 (或 ) 激 活 补体 系统 等 机 制 引 起 的 组 织 病变 。 目 前 ,用 于 研究 自身 抗体 的 方法 有 杂交 瘤 技 术 、 EBV 转化 B 细胞 和 鸣 菌 体 抗体 库 技 术 。 其 中 ,由 于 种 属 间 的 差异 限制 了 鼠 单 抗 的 应 用 价 值 ,而 人 杂交 瘤 和 EBV 转化 B 细胞 技术 制备 的 单 抗 多 为 IgEM( 疾 病 相 关 的 器 官 特异 性 血清 -192- 基因 工程 学 中 自身 抗体 主要 为 IgG)。 相 比 之 下 , 叭 菌 体 抗体 库 技术 易于 操作 ,而 且 能 够 同时 获得 大 量 自身 抗体 。 据 统计 ,1993 一 1995 年 间 文 献 报道 的 IgG 类 自身 抗体 有 64 种 ,其 中 49 种 是 通 过 喉 菌 体 抗体 库 技 术 得 到 的 。199%6 年 ,Meclntosh 等 人 从 抗体 库 中 一 次 性 得 到 19 种 抗 甲 状 球 蛋白 的 人 单 抗 。 近 年 来 ,以 鸣 菌 体 抗体 库 技 术 为 工具 对 各 种 自身 免疫 性 疾病 的 研究 报道 有 :器 官 特异 性 自身 免疫 性 疾病 ( 桥 本 甲状 腺 Grave 病 .溃疡 型 结肠 炎 、 舍 格 伦 综合 征 、 重 症 肌 无 力 \ 原 发 性 胆汁 硬化 症 ) 以 及 系统 性 自身 免疫 性 疾病 (系统 性 红斑 狼 郊 、. 魏 格 纳 肉 芽 肿 )。 可 以 预见 ,利用 噬菌体 抗体 有 可 能 搞 清楚 自身 抗体 以 及 B 细胞 在 提 呈 自身 抗原 方面 的 作用 机 制 ,最 终 可 能 借助 X 射线 晶 体 学 解析 出 自身 抗体 所 识别 的 抗原 表达 。 (二 ) 诊断 和 治疗 叭 菌 体 抗 体 库 技 术 与 单 抗 技术 相 比 ,其 优势 在 于 可 不 经 免疫 制备 抗体 ,能 够 制备 大 单 抗 ,从 而 避免 了 鼠 单 抗 应 用 于 人 体 时 发 生 的 免疫 反应 。 而 且 ,通过 体外 亲和力 成 熟 技术 和 动 力学 常数 筛选 技术 ,能够 对 有 关 抗 体 进 行 改造 ,从 中 得 到 特异 性 和 动力 学 特性 均 较 好 的 抗 体 。 例 如 ,体内 影像 诊断 用 的 抗体 应 具有 高 亲和力 、 快 的 解 离 率 及 短 的 半衰期 ,而 靶 向 治疗 抗体 则 需要 慢 的 解 离 率 和 长 的 半衰期 。 叭 菌 体 抗体 库 技 术 则 可 根据 需要 把 有 关 的 抗体 改造 成 诊断 试剂 或 者 治疗 药物 。 利用 噬菌体 抗体 库 技术 已 经 获得 了 大 量 针对 病原 微生物 的 抗体 ,如 HAV、HBV、HCV、 HIV, VZV (varicella zoster virus), RSV (Rous sarcoma virus), Kl B iG #. CMV (cy- tomegalovirus) .HSV 流感 嗜 血 杆 菌 和 破 伤风 毒素 等 。 这 些 叭 菌 体 抗体 中 ,许多 具有 临床 诊 断 和 治疗 的 应 用 前 景 。 iif 噬菌体 抗体 库 技 术 模拟 生物 体内 B 细胞 的 有 关 特 性 一 一 识别 与 扩 增 的 统一 ,是 一 种 极 为 高 效 的 表达 、 筛 选 抗体 的 体系 。 而 且 , 该 技术 使 不 经 免疫 而 直接 利用 抗原 从 抗体 库 中 筛选 特异 性 的 抗体 变 为 现实 ,可 绕 过 免疫 制备 全 人 源 性 抗体 ,避免 了 鼠 源 性 抗体 在 人 体 应 用 时 诱 发 的 HAMA 等 不 良 反应 。 解 决 了 人 杂交 瘤 系 统 低 效 性 的 难题 ,使 人 单 克 隆 抗 体 的 制备 有 了 突破 。 这 是 基因 工程 技术 的 重大 发 展 。 因 此 , 叹 菌 体 抗 体 库 技术 的 出 现 及 叭 菌 体 抗体 的 研 制 成 功 已 成 为 生命 科学 研究 的 突破 性 进展 之 一 , 必 将 为 生物 技术 领域 的 发 展 带 来 巨大 的 推 动 。 但 是 ,目前 的 抗体 库 技术 仍 有 许多 问题 尚 需 进 一 步 解 决 。 首 先 ,以 丝 状 噬菌体 表面 呈现 系统 作为 筛选 手段 的 抗体 库 技术 ,其 前 提 是 文库 中 的 抗体 片段 在 大 肠 杆菌 中 必须 获得 分 这 性 表达 。 已 有 的 研究 表明 ,并 非 所 有 的 抗体 片段 都 能 在 大 肠 杆 菌 中 进行 分 记性 表达 。 如 何 将 抗体 库 储 存 的 信息 通过 原核 系统 完整 地 再 现 出 来 , 尚 需 进 一 步 的 探讨 。 其 次 ,由 于 道德 、 伦理 方面 的 制约 ,不 能 免疫 人 而 产生 较 高 特异 性 的 人 单 抗 。 虽 然 通过 构建 足够 多 样 性 的 天 然 抗体 库 ,同时 结合 体外 亲和力 成 熟 等 方法 可 以 产生 较 高 亲和力 的 抗体 ,但 其 库容 总 量 、 多 态 性 及 筛选 等 技术 环节 尚 待 深 入 研究 。 再 则 ,这 种 基因 工程 抗体 都 是 在 下 .co 中 表达 的 Fab 片段 或 单 链 抗体 ,其 表达 量 都 很 低 ,难以 用 于 实践 。 因 此 ,建立 高 效 表达 系统 有 助 于 此 第 十 三 章 ”基因 工程 抗体 . 193 . 问题 的 解决 。 随 着 该 项 技术 的 发 展 和 完善 ,人 们 可 以 在 更 大 的 程度 上 根据 需要 而 改造 和 制备 有 关 的 抗体 。 可 以 预见 ,一 个 随意 和 定向 地 制造 抗体 的 时 代 已 为 期 不 远 。 (242 Hm 4) 第 十 四 章 ” 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 Chapter14. Regulation of Eukaryotic Gene Expression 第 一 广 ” 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 的 基本 理论 一 、 真 核 生物 基 因 的 结构 功能 特点 真 核 生 物 在 基因 结构 上 与 原核 生物 有 相当 大 的 差异 ,其 特点 如 下 : (一 ) 真 核 生 物 的 DNA 含量 大 ,具有 复杂 的 高 级 结构 真 核 生 物 的 DNA 含量 约 为 大 肠 杆 菌 DNA 含量 的 数 百 至 数 和 干 倍 ,与 裸露 状态 的 原核 生 物 DNA 不 同 , 真 核 生 物 DNA 大 多 与 蛋白 质 结 合 ,形成 复杂 而 又 有 序 的 高 级 结构 即 染色 质 或 染色 体 ,并 由 核 膜 包 衷 起 来 ,形成 细胞 核 ( 线 粒 体 与 叶绿体 DNA 除外 )。 这 就 决定 了 真 核 生物 基因 表达 必然 受到 其 高 级 结构 的 影响 ,并且 转 录 与 翻译 过 程 不 能 同步 进行 ,从 而 可 以 在 更 多 的 水 平 上 进行 调节 控制 。 (二 ) 真 核 生 物 的 编码 基因 大 多 是 不 连续 的 绝 大 多 数 真 核 生物 (特别 是 高 等 脊椎 动物 ) 的 基因 是 由 外 显 子 与 内 含 子 镶 骨 排列 而 成 的 。 所 谓 外 显 子 (exon) 是 指 为 蛋白 质 氨 基 酸 序列 编码 的 那 部 分 DNA 序列 ;而 内 含 子 (intro) 则 是 指 那些 插入 到 编码 序列 之 中 的 非 编码 序列 。 基 因 转 录 产 生 的 初级 转录 产物 必须 经 过 一 ERD LE ,将 插入 的 内 含 子 序 列 切除 ,才能 形成 成 熟 的 mRNA 分 子 。 这 些 内 含 子 的 功 能 现在 仍 不 清楚 , 据 推测 可 能 有 如 下 几 种 作用 :中 某 些 内 含 子 中 含有 基因 表达 的 调控 序列 ， 参与 表达 的 调控 ;@ 不 同 的 剪 切 方 式 可 产生 不 同 的 基因 表达 产物 ;@@ 提 供 遗传 变异 机 会 , 专 生物 进化 有 关 。 (=) 真 核 生 物 的 DNA 中 含有 大 量 重 复 序 列 所 谓 重 复 序列 是 指 在 基因 组 中 多 次 反复 出 现 的 DNA 序列 。 这 些 重 复 序列 按 其 出 现 的 频率 可 分 为 低 度 .中 度 和 高 度 重复 序列 。 各 种 重复 序列 的 长 度 .序列 及 重复 次 数 不 同 ,其 功 能 亦 有 极 大 差别 。 有 些 重复 序列 是 为 蛋白 质 编 码 的 ,有 些 则 不 是 编码 序列 。 其 功能 可 能 大 BAW FLA: 1. 某 些 基因 产物 的 生物 学 功能 极为 重要 , 且 需 要 量 极 大 ,如 组 蛋白 rRNA tRNA, 及 某 些 糖 代谢 酶 类 等 ,因此 ,为 这 些 分 子 编码 的 基因 以 多 拷贝 形式 存在 ,可 充分 满足 细胞 的 需要 。， 194 - 第 十 四 章 ，” 真 核 生 物 基因 表达 调控 - 195 - 量 。 这 也 是 表达 调控 的 一 种 有 效 方式 。 2. 某 些 重复 序列 与 染色 质 构 象 .着 丝 点 的 形成 有 关 。 3. 参与 基因 复制 及 表达 的 调控 : 某 些 高 度 重复 序列 中 AT 含量 丰富 , 易 解 链 , 有 利于 与 调控 基因 复制 和 表达 的 蛋白 质 因子 结合 ;另外 ,许多 重复 序列 结构 中 含有 末端 反 向 重复 序 列 ,可 形成 蕉 环 状 结构 ,这 种 高 级 结构 参与 基因 表达 调控 ,也 可 能 与 基因 的 转 位 有 关 。 (四 ) 功能 性 基因 和 假 基因 某 些 有 一 定 同 源 性 而 又 不 完全 相同 的 基因 簇 , 组 成 一 个 基因 家 族 , 如 珠 蛋 白 基 因 ras 基因 家 族 等 。 它 们 分 工行 使 不 同 的 生物 学 功能 , 称 为 功能 性 基因 。 还 有 一 些 则 根本 不 具有 功能 , 称 为 假 基因 (pseudogene) ,它们 可 能 只 是 进化 的 痕迹 ,也 可 能 为 今后 的 进化 提供 物质 基础 。 例 如 ,多 种 蛋白 质 水 解 酶 都 具有 相似 的 活性 中 心 ,可 以 推断 ,它们 都 是 由 同一 种 原始 蛋白 水 解 酶 进化 而 来 的 。 这 种 原始 酶 基因 通过 扩 增 形成 多 拷贝 基因 ,然后 通过 突变 自然 选 择 而 进化 为 各 种 不 同 功能 的 蛋白 水 解 酶 。 (五 ) 真 核 生 物 基因 组 中 无 “ 超 基因 " 式 的 操纵 子 结构 真 核 生 物 基 因 组 中 不 存在 像 原 核 细 胞 " 超 基因 " 式 的 操纵 子 结构 ,功能 相关 的 基因 大 多 分 散在 不 同 的 染色 体 上 ,即使 位 置 相近 ,也 是 分 别 进行 转录 的 ,而 不 产生 多 顺 反 子 mRNA。 (六 ) 真 核 生物 基因 组 与 生长 有 关 基 因 的 调控 相对 较为 简单 ,而 与 分 化 有 关 基 因 的 调控 则 较为 复杂 原核 生物 生存 的 惟一 目的 就 是 无 限 生 长 繁殖 ,因此 其 基因 表达 调控 系统 的 作用 就 是 在 一 个 特定 环境 中 为 细胞 提供 最 大 的 生长 速度 ,即将 酶 活性 控制 在 最 大 速度 所 要 求 的 点 上 ,并 使 细胞 尽快 地 适应 变化 着 的 环境 。 而 真 核 生 物 ,特别 是 多 细胞 高 等 生物 , 则 除了 生长 繁殖 外 ,更 重要 的 是 要 进行 分 化 。 由 于 高 等 动物 的 血液 循环 系统 为 细胞 提供 了 一 个 较 稳 定 的 环 境 ,因此 生长 的 调控 相对 较为 简单 ,而 分 化 的 调控 则 复杂 得 多 。 高 度 分 化 的 组 织 细胞 中 ,只 AKA 10% 的 基因 不 同 程度 地 表达 ,大 多 数 基 因 被 关闭 ,如 何 调节 各 种 基因 的 表达 活性 ,其 复杂 程度 是 可 想 而 知 的 。 而 原核 生物 中 一 般 有 40% 一 50% 的 基因 处 于 活性 状态 。 二 、 真 核 生 物 基因 表达 调控 的 策略 如 上 所 述 , 真 核 生 物 基因 的 表达 是 一 个 多 阶段 过 程 , 因 此 ,其 表达 的 调控 也 是 在 多 阶段 水 平 来 实现 的 , 即 转录 前 转录、 转录 后 、 翻 译 和 翻译 后 等 五 个 水 平 。 (一 ) 转录 前 的 表达 调控 转录 前 的 调控 是 指 发 生 在 基因 组 水 平 上 的 基因 结构 的 改变 ,包括 基因 丢失 、 基 因 扩 增 、 基因 重 排 . 甲 基 化 修饰 及 染色 质 结构 改变 等 。 这 种 调控 方式 较 稳 定 持久 ,甚至 有 些 是 不 可 道 的 ,主要 见于 机 体 发 育 过 程 中 的 体 细胞 分 化 。 显 然 , 这 种 调控 方式 未 免 缺 乏 灵活 性 ,不 适 于 对 生长 因子 等 刺激 的 应 答 反 应 。 - 196 . 基因 工程 学 1. 基因 丢失 ” 体 细 胞 分 化 过 程 中 ,必须 将 某 些 基因 永久 性 关闭 。 显 然 达 到 此 目的 的 最 简单 有 效 的 方式 就 是 将 这 些 基 因 丢 失掉 。 在 一 些 低 等 真 核 生 物 ( 如 线虫 .原生 动物 和 昆虫 等 ) 的 体 细 胞 发 育 过 程 中 确实 发 现 了 染色 体 丢 失 现 象 。 如 原生 动物 尖 毛 虫 细胞 中 有 大 、 小 两 个 细胞 核 。 小 核 中 DNA 是 完整 的 ,不 具有 转录 活性 ,起 维持 种 系 的 作用 ;而 大 核 中 只 保留 了 部 分 DNA, 但 具有 转录 活性 。 这 种 基因 丢失 现象 并 非 普 遍 存 在 。 2. 基因 扩 增 ”基因 扩 增 或 基因 放大 (gene amplification) ) 是 指 基 因 拷 贝 数 的 增加 ,是 基 因 表达 活性 调节 的 有 效 方式 之 一 。 当 发 育 分 化 或 环境 条 件 的 改变 使 机 体 对 某 种 基因 产生 的 需要 量 剧 增 ,而 单纯 靠 调节 其 表达 活性 不 足以 满足 需要 时 , 则 需要 增加 这 种 基因 的 拷贝 数 。 扩 增 的 基因 可 游离 存在 ,也 可 整合 和 人 染色体, 有 些 生物 中 可 形成 多 条 染色 体 。 值 得 注意 的 是 ,不 适当 的 基因 扩 增 可 导致 某 些 疾病 的 发 生 。 如 某 些 癌 基 因 (c-xzyc 、c-ki-ras) 的 扩 增 可 能 与 某 些 肿瘤 的 发 生 有 关 。 3. 基因 重 排 ” 基 因 重 排 是 指 某 些 基 因 片 段 改变 原来 存在 的 顺序 而 重新 排列 组 合 。 重 排 可 以 仅仅 是 空间 位 置 或 方向 的 不 同 ,也 可 同时 伴 有 某 些 基因 片段 的 扩 增 或 丢失 。 基 因 重 排 方式 是 基因 表达 的 转录 前 调控 的 较 重 要 方式 之 一 。 广 义 的 基因 重 排 有 多 种 方式 :@ 类 似 于 mRNA 加 工 的 “ 剪 切 "方式 ;@ 转 座 子 方式 ;@ 染 色 体 转 位 方式 ;四 外 源 基 因 序 列 ( 如 反 转 录 病 毒 长 未 端 重复 序列 ,LTR ) 的 插入 激活 方式 等 。 (1)“ 剪 切 "方式 :哺乳 动物 中 免疫 球 和 蛋白 (Ig) 的 产生 是 此 种 方式 的 代表 。 机 体 可 产生 上 百 万 种 不 同 的 Ifg，Ig 的 这 种 多 样 性 是 通过 基因 重 排 实现 的 。 虽 然 编码 Ie 的 基因 数量 不 多 (不 足 500 个 ) , 却 可 通过 不 同 的 重 排 方 式 产生 多 种 多 样 的 抗体 。k 基因 通过 重 排 产 生 4Xx200=800 种 不 同 的 轻 链 ,而 AH SER AT = AE 200x10Xx4=8000 种 不 同 的 VD 三 连接 可 能 性 。 这 样 ,不 考虑 恒定 区 的 不 同 ,总 共有 800 x 8000 = 6 400 000 种 不 同 抗体 。 这 种 重 排 方式 是 极为 经 济 的 ,节省 了 大 量 的 基因 组 空间 。 (2) 转 座 子 方式 : 转 座 子 (Tn) 是 基因 组 上 可 移动 的 遗传 因子 。 当 转 座 子 插 人 到 染色 体 上 的 某 些 地 方 时 ,就 可 控制 此 基因 的 表达 ,这 种 基因 转移 方式 称 转 座 子 方式 。 转 座 子 将 一 些 原来 在 染色 体 上 相距 甚 远 的 基因 连接 到 一 起 ,从 而 产生 一 些 新 的 蛋白 质 分 子 或 新 的 表达 调 控 方 式 。 如 图 14-1 所 示 ,Tn 由 5 个 部 分 组 成 :四 反 向 末端 重复 序列 (IR) :这 是 转 座 酶 识别 位 点 ,通过 酶 切 .复制 后 再 插 和 人 到 其 他 位 置 ;@O 转 座 酶 基因 :编码 转 座 酶 , 转 座 酶 可 识别 插 和 人 顺序 ,并 在 DNA 上 切割 ;@ 阻 过 蛋白 基因 :编码 阻 过 蛋白 ,对 转 座 起 负 调 控 作 用 ;外 调控 区 : 为 调控 蛋白 的 结合 位 点 ;@ 附 加 基因 :与 转 座 无 关 ,如 Tn3 带 有 青霉素 抗 性 基因 一 一 B- 内 酰 胺 酶 基因 。 转 座 子 在 进化 中 的 重要 作用 是 无 疑 的 ,但 其 对 于 真 核 生 物 基因 表达 的 调控 作用 ， 仍 有 待 进一步 研究 。 IR IR —__ 一 -一 一 一 转 座 酶 基因 (SAL 36S B- Ay Ne 口 基 央 | 酶 某 因 (附加 基因 ) Fl 14-1 转 座 子 Tn3 结构 示意 图 第 十 四 章 ， 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 - 197 - (3) 染色 体 转 位 方式 (chromosome translocation) :严格 来 说 ,染色 体 转 位 方式 并 不 是 基 因 表 达 的 正常 调控 方式 ,而 是 一 种 病理 现象 ,但 确实 可 以 导致 某 些 基因 的 表达 改变 。 此 方式 常见 于 一 些 癌 基 因 的 活化 过 程 。 如 人 Burkitt 淋巴 瘤 中 党 可 见 t8;14) 染 色 体 易 位 ,导致 原 来 不 具 转 录 活 性 的 c-myc 癌 基 因 转 位 到 Ig 重 链 基因 的 强大 增强 子 作 用 之 下 ,从 而 被 激活 转 Ro (4) 外 源 基 因 插 和 人 激活 方式 :类 似 于 转 座 子 方式 ,但 可 能 并 无 转 座 子 的 参与 。 主 要 见于 反 转 录 病 毒 的 长 未 端 重复 序列 (long terminal repeat sequence,LTR) 的 插入 引起 的 细胞 癌 基 因 的 激活 。LTR 可 能 具有 增强 子 作 用 。 也 有 人 认为 有 一 些 ( 也 可 能 是 全 部 )RNA 肿瘤 病毒 本 身 就 是 转 座 子 。 4. 甲 基 化 修饰 ， 某 些 高 等 生物 ,尤其 是 兰 椎 动物 中 ,DNA 上 特定 的 CpG 序列 (转录 起 始 区 ) 处 的 胞 旷 啶 可 发 生 甲 基 化 修饰 (SmC) ,这 种 甲 基 化 修饰 可 以 阻止 某 些 基因 的 转录 ,并 且 能 遗传 到 子 细 胞 中 去 。 研 究 表明 ,转录 活跃 的 基因 是 低 甲 基 化 或 不 甲 基 化 的 ,而 不 表达 基 因 则 高 度 甲 基 化 。 如 珠 蛋 白 基 因 在 红 系 细胞 中 是 低 甲 基 化 的 ,而 在 不 表达 珠 蛋 白 的 细胞 中 则 高 度 甲 基 化 。 持 续 表 达 的 看 家 基因 (house-keeping gene) 的 转录 起 始 区 极 少 发 生 甲 基 化 (所 谓 看 家 基因 是 那些 维持 细胞 正常 功能 所 必需 的 持续 表达 的 基因 )。 有 人 认为 X 染 色 体 的 失 活 也 是 DNA 甲 基 化 的 结果 。 在 兰 椎 动物 中 ,DNA 甲 基 化 是 普遍 现象 (AE CHS HE 中 则 较 少 ,而 在 昆虫 中 则 根本 没有 。 5. 染色 质 结 构 对 基因 表达 的 调控 作用 真 核 生 物 基 因 组 的 最 重要 特征 之 一 就 是 DNA 与 组 蛋白 . 非 组 蛋白 等 多 种 蛋白 质 和 少量 RNA 及 其 他 物质 结合 ,形成 染色 质 (chromatin ) 或 染色 体 (chromosome) 结 构 。 含 大 量 碱 性 氨基 酸 ( 约 25% ) 的 组 蛋白 与 DNA 紧密 结合 ,可 保护 DNA 免 受 损伤 ,维持 基因 组 的 稳定 性 ,并 抑制 基因 的 表达 。 去 除 组 蛋白 则 基因 转录 活性 增高 。 这 种 组 蛋白 的 结 合 与 解 离 是 真 核 生 物 基因 表达 调控 的 重要 机 制 之 一 。 机 体 可 通过 磷酸 化 乙酰 化 . 甲 基 化 等 机 制 将 碱 性 组 蛋白 修饰 ,从 而 减少 正 电 荷 ,减弱 与 DNA 的 结合 能 力 。 染色 质 有 结构 紧密 的 超 卷 曲 状态 和 结构 松散 的 伸展 状态 及 多 种 中 间 状 态 。 这 两 种 状态 的 转换 主要 与 组 蛋白 HI 有 关 ,Hl 与 伸展 状态 的 核 小 体 结合 形成 螺旋 管 结 构 。 结 构 紧 密 的 染色 质 为 异 染色 质 ;结构 松散 的 染色 质 为 常 染 色 质 。 转 录 活 性 较 高 的 基因 都 位 于 结构 较 松 散 的 常 染 色 质 中 ,而 位 于 结构 紧密 的 异 染色 质 中 的 基因 则 大 多 不 具 转 录 活 性 。 转录 活 牙 的 基因 位 于 异 染 色 质 区 域 , 由 于 结构 松散 ,去 除了 组 蛋白 的 保护 作用 ,因此 对 于 核酸 内 切 酶 I(DNaseI) 水 解 作 用 较 敏 感 , 称 为 DNase 工 敏感 区 。 而 结构 紧密 的 常 活性 染 色 质 则 对 DNase 工 不 敏感 。 因 此 常 将 DNase 工 敏感 性 作为 该 基因 的 转录 活性 的 标志 。 另 外 ,在 活性 染色 质 中 还 存在 一 些 对 DNase 工 特别 敏感 的 区 域 , 称 为 DNase 工 超 敏 感 (DNAase I hypersensitive site) 。DNase 工 超 敏 感 区 一 般 位 于 活性 基因 的 S 端 ,可 能 反映 了 基因 转录 的 起 始 位 点 。 (二 ) 转录 水 平 的 调控 转录 水 平 的 调控 是 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 中 最 重要 的 一 步 ,主要 涉及 以 下 三 种 因素 的 组 互 作 用 :一 是 RNA 聚合 酶 (RNA ploymerase, RNA pol) 的 调节 ;二 是 顺 式 调 控 元 件 (cis- - 198 . 基因 工程 学 acting element) ;第 三 是 反 式 作用 因子 (tirazxs-acting factor). 1. RNA 聚合 酶 ”与 原核 生物 单一 的 RNA 聚合 酶 不 同 , 真 核 生 物 的 RNA 聚合 酶 有 三 种 :RNA RAMI LOM. RNA 聚合 酶 工 存在 于 核 仁 中 ,其 转录 产生 TRNA( 5.8S,18S 和 28Sr RNA), Xt o-3§ BA EMH. RNA 聚合 酶 I 存 在 于 核 质 中 ,其 转录 产物 为 mRNA 及 其 他 一 些 功 能 不 明 的 相对 分 子 质量 小 的 RNA, 如 U,~6 RNA, Xt u- 牲 草 碱 十 分 敏 感 , 与 细胞 生长 分 化 直接 相关 ,其 表达 调控 最 为 复杂 。RNA 聚合 酶 亚 存 在 于 核 质 中 ,其 转 录 产 物 为 SS rRNA 和 tRNA; 对 w- 鹅 草 碱 的 敏感 性 介 于 上 述 两 者 之 间 。 2. 顺 式 调控 元 件 “是 与 结构 基因 串联 \ 对 基因 转录 的 精确 起 始 和 活性 起 重要 调节 作用 的 RE DNA 序列 。 真 核 生物 中 ,不同 的 顺 式 调控 元 件 按 不 同 的 数量 .类别 及 空间 位 置 串联 排列 ， 组 成 了 各 基因 表达 的 调控 区 域 ,它们 的 协同 作用 决定 了 基因 转录 的 精确 起 始 与 转录 效率 。 (1) 启动 子 (promoter) :启动 子 是 与 启动 基因 转录 有 关 的 核酸 序列 ,位 于 基因 转录 起 始 位 点 5 端 ,只 能 在 近 距 离 起 作用 (一 般 在 100bp ZA) ,有 方向 性 ,空间 位 置 较 恒 定 。 它 是 转 录 的 最 基本 信和 号 结构 ( 详 见 第 八 章 )。 (2) 增强 子 (enhancer) :增强 子 是 一 类 能 促进 基因 转录 活性 的 顺 式 调控 元 件 , 但 它 本 身 不 具备 启动 子 的 活性 。 其 特点 是 :@ 无 方向 性 ; 包 远 距离 作用 , 距 有 基因 可 近 可 远 ,甚至 远 至 ， 几 十 个 kb 也 同样 能 发 挥 作 用 ,可 位 于 基因 的 上 游 . 下游 或 内 部 ;@@ 无 基因 特异 性 ,对 各 种 基 因 启 动 子 均 有 增强 作用 ;四 具有 组 织 特异 性 ;@ 具 有 相位 性 , 它 的 作用 虽然 与 距离 无 关 ,但 只 有 当 它 位 于 DNA 双 螺 旋 的 某 一 相位 时 , 才 具 有 较 强 活性 。 典 型 的 增强 子 是 SV40 早期 基因 中 的 72bp 重复 序列 ,其 中 有 由 特定 核 苷 酸 组 成 的 核心 序列 (core sequence, module, motif) . (3) 加 尾 信 和 号 及 转录 终止 信号 :在 加 polyA 尾 位 点 的 上 游 10 一 20bp 处 ,常见 一 保守 的 AATAA 序列 ,如 去 除 此 序列 ,基因 会 连续 转录 下 去 而 不 终止 ,被 认为 是 加 尾 信 号 ,但 与 转录 终止 的 关系 仍 不 能 肯定 。 3. 反 式 作用 因子 反 式 作用 因子 (又 称 为 反 式 作用 转录 因子 ) 是 由 位 于 不 同 染 色 体 址 同一 染色 体 相 距 较 远 的 基因 编码 的 蛋白 质 因 子 , 通 过 与 顺 式 调控 元 件 和 RNA 聚合 酶 的 相 互 作用 而 调节 基因 转录 的 活性 ( 详 见 第 八 章 )。 (三 ) 转 录 后 水 平 的 调控 从 原始 mRNA 到 成 熟 mRNA 的 调节 ,是 表达 调控 的 一 个 重要 内 容 。 1. 戴 “ 帽 ”"(capping) mRNA 转录 后 不 久 即 在 其 $ 末 端 加 上 m’GpppN 的 “帽子 "。 其 作用 是 ; 四 防止 mRNA 的 降解 ,延长 寿命 ;@ 与 核糖 体 小 亚 基 结合 ;@ 被 翻译 起 始 因子 所 识别 。 2. 加 " 尾 "(tailing) 除 组 蛋白 mRNA 外 , 真 核 生 物 mRNA 的 3 末端 均 有 一 poly A 序列 。 加 尾 信 号 是 AAUAAA, 由 核酸 内 切 酶 切 开 RNA3“ 末 端 ( 常 在 GC 序列 之 后 ) ,然后 加 上 polyA. polyA 的 功能 是 :OO 是 mRNA 进入 细胞 质 所 必需 ;@ 保 持 mRNA 稳定 性 ,延长 寿命 。 3. 甲 基 化 修饰 ”主要 是 形成 6- 甲 基 腺 味 叭 (6mA) ,其 意义 不 明 。 4. 拼接 (splicing) “将 hnRNA( 不 均一 核 RNA) 中 的 内 含 子 序列 切除 ,外 显 子 部 分 连接 起 来 , 称 为 RNA 拼接 。 在 拼接 位 点 上 常 有 一 些 保守 序列 ,在 其 3 端 多 为 AG, 在 其 5 端 多 为 GU, 它 们 是 指导 正确 拼接 的 信号 。 拼 接 过 程 有 核酸 内 切 酶 的 参与 ,有 些 RNA 则 可 自身 催 化 自发 拼接 ,一 些小 分 子 RNA, 如 snRNA, 也 参与 mRNA 的 拼接 过 程 。 YA Re ee Re ee 第 十 四 章 ，” 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 - 199 - 大 多 数 基因 的 mRNA 加 工 较 简单 ,只 产生 一 种 成 熟 的 mRNA, 指导 合成 一 种 蛋白 质 分 子 。 但 有 些 基 因 的 mRNA 可 有 不 同 的 加 工 方式 ,产生 不 同 的 蛋白 质 。 这 对 于 细胞 的 功能 分 化 有 一 定 的 作用 。 如 某 些 基因 有 多 个 加 polyA 位 点 ,通过 不 同 的 拼接 方式 产生 两 种 不 同 的 蛋 自 质 ,如 IgM\D、E、G 重 链 基因 \ 大 鼠 降 钙 素 基 因 、 人 血 纤 维 蛋 白 原 基 因 等 。Ignw 链 基因 有 两 个 poly A 位 点 ,通过 不 同 的 拼接 方式 产生 两 种 不 同 的 蛋白 质 , 较 短 的 ws FA FE 型 可 溶性 蛋白 ,而 较 大 的 pm 型 蛋白 则 结合 于 细胞 膜 上 。 (四 ) 翻译 水 平 的 调控 ”翻译 过 程 主要 涉及 mRNA tRNA、 核 糖 体 和 可 溶性 蛋白 因子 四 大 类 装置 。 对 于 翻译 水 平 调控 的 机 制 目前 了 解 不 多 ,可 能 有 以 下 几 个 方面 : 1. 对 可 溶性 蛋白 质 因子 的 修饰 ” 肽 链 起 始 因子 eIF-2 在 激酶 的 作用 下 磷 酶 化 后 ,可 抑 制 蛋白 质 的 合成 。 这 可 能 是 因为 磷酸 化 的 eIF-2 与 eIF-2B 结合 后 不 能 解 离 ,从 而 影响 eIF-2 的 再 循环 利用 。 2. 对 mRNA 稳定 性 的 调节 ”虽然 机 制 还 不 清楚 ,但 细胞 确实 可 以 调节 各 种 不 同 mRNA 的 寿命 。 起 重要 作用 的 mRNA 的 寿命 比 其 他 mRNA 的 寿命 长 。 如 等 晴 羽 化 成 蛾 后 ,需要 大 量 的 蛋 自 水 解 酶 溶解 看 丝 蛋白 ,此 时 蚕丝 蛋白 水 解 酶 mRNA 的 半衰期 长 达 100 小 时 ,而 其 他 的 mRNA 半衰期 具有 2.5 小 时 。 催 乳 激素 可 使 乳腺 组 织 中 的 酷 蛋 白 mRNA 的 半衰期 提高 20 倍 。 3. 反 义 RNA 对 翻译 的 调控 作用 ”所谓 反 义 RNA(anti-sense RNA) 是 一 段 与 mRNA 互 补 的 碱 基 序列 。 因 此 , 反 义 RNA 通过 碱 基 配 对 与 相应 的 mRNA 结合 ,形成 的 双 链 RNA 影 响 mRNA 的 模板 效率 ,抑制 翻译 。 此 外 , 反 义 RNA 也 可 能 会 抑制 基因 的 转录 ,有 些 反 义 RNA 可 能 参与 抑制 mRNA 的 拼接 过 程 。 天 然 反 义 RNA 首先 在 原核 生物 中 发 现 , 如 Tnl0 编码 的 转 座 酶 基因 就 受到 反 义 RNA 的 调控 ,使 得 转 座 速 度 不 会 受到 转 座 酶 基因 拷贝 数 的 影响 。 近 年 来 ,在 真 核 生物 中 也 发 现 了 一 些 可 能 的 天 然 反 义 RNA。 如 禽类 c-myc 基因 可 反 向 不 连续 转录 出 3 个 反 义 RNA, 分 别 位 于 第 1 个 外 显 子 上 游 . 第 1 个 内 含 子 及 第 2 个 内 含 子 和 第 3 个 外 显 子 。 推 测 它 与 mRNA 拼接 、 翻 译 及 转录 调控 有 关 。 总 之 ,在 翻译 过 程 中 ,确实 存在 一 系列 的 调控 机 制 , 有 些 是 非特 异性 的 ,有 些 是 特异 性 的 针对 某 特 定 基因 的 。 这 方面 仍 有 很 多 的 课题 有 待 进一步 研究 。 (五 ) 翻 译 后 水 平 的 调控 蛋白 质 合成 后 ,还 须 经 一 系列 的 加 工 过 程 才 能 成 为 有 活性 的 功能 蛋白 质 。 1. 切割 “分 记 型 蛋白 质 必须 切除 疏水 性 信号 肽 。 多 种 酶 是 以 酶 原形 式 存在 的 ,如 胰 蛋 白 酶 原 ,必须 经 酶 解 才能 成 为 活性 蛋白 。 2. 化 学 修饰 ”，@ 磷 酸化 :磷酸 化 -去 磷 化 作用 是 机 体 调节 酶 活性 的 最 常见 方式 。 磷 酸 化 位 点 有 丝氨酸 、 苏 氨 酸 和 酷 氨 酸 ;@ 糖 基 化 : 糖 基 化 位 点 多 为 天 冬 氨 酸 丝氨酸 和 苏 氨 酸 ; @ 乙 酰 化 :主要 是 N 未 端 及 赖 氨 酸 。 3. 连接 有 些 蛋 白质 经 切割 成 小 肽 后 ,还 必须 以 一 定 的 方式 连接 起 来 。 如 红细胞 凝集 素 、 外 源 凝 集 素 及 刀 豆 球 蛋白 等 。 因 此 ,推测 细胞 中 可 能 存在 一 类 多 肽 连接 酶 。 -200- 基因 工程 学 第 二 节 基因 表达 调控 的 研 完 方 法 基因 表达 调控 研究 已 成 为 当代 分 子 生 物 学 中 的 重要 课题 。 技 术 的 进步 促进 了 调控 研究 的 逐步 深入 ,而 研究 的 深入 又 产生 了 对 新 技术 的 需求 ,因而 新 方法 新 技术 层出不穷 ,种 类 繁 多 ,本 书 仅 择 其 重要 者 进行 介绍 。 一 、 转 录 前 表达 调控 的 研究 方法 (—) DNase 工 超 敏 感 分 析 (DNase 工 hyperseneitivity assay) 活跃 转录 的 基因 存在 于 结构 松散 的 常 染 色 质 上 , 较 少 受到 和 蛋白质 的 保护 ,因而 易 受 核酸 内 切 酶 DNase 工 的 攻击 ,特别 是 基因 转录 调控 位 点 。 这 种 对 DNase 工 的 高 度 敏 感性 即 称 DNase 工 超 敏 感性 。 此 方法 基本 步骤 是 分 离 细 胞 核 ,与 一 定量 的 DNase 工 反 应 后 提取 DNA, HK 4) Ja, 行 Southern 杂交 分 析 ,根据 片段 的 大 小 ,鉴定 超 敏 感 位 点 。DNase 工 超人 敏感 区 一 般 位 于 活 性 基因 的 3 端 ,可 能 反映 了 基因 转录 的 起 始 位 点 。 (=) DNA 甲 基 化 分 析 在 哺乳 动物 细胞 DNA 中 ,CpG 核 苷 酸 序列 出 现 的 频率 较 低 ,只 有 预计 频率 的 1/5 左右 ,尽管 只 有 一 部 分 CpG 核 苷 酸 被 甲 基 化 ,但 这 种 甲 基 化 具有 高 度 的 细胞 特异 性 。DNA 上 特定 的 CpG 序 列 处 的 胞 喀 啶 甲 基 化 修饰 对 基因 的 表达 有 抑制 作用 。 检 测 DNA 的 甲 基 化 状态 有 助 于 了 解 该 基 因 的 转录 活性 。 甲 基 化 分 析 的 方法 有 多 种 ,最 简单 有 效 的 方法 是 利用 限制 性 内 切 酶 对 甲 基 化 的 敏感 性 不 同 进行 测定 。 对 CpG 序列 甲 基 化 作用 敏感 性 不 同 的 限制 性 内 切 酶 见 表 14-1。 表 14-1 对 CpG 序列 甲 基 化 作用 敏感 性 不 同 的 限制 性 内 切 酶 限制 性 内 切 酶 可 切割 序列 不 可 切割 序列 Hpa Il CCGG C,,CGG Msp I CCGG,C,,CGG mCCGG - Cfo I , Hha I GCGC G,. CGC Waser. Sma | CCCGGG CGJCGGG Xma | CCCGGG mCCCGGG CC,,CGGG Acc I] , BsuE I CGCG mCGCG Bstu | CGCG mCG_CG Fnuu II CGCG mCGCG, GG,,CG Tha | CGCG mCGCG, ,CG,CG Xho | CTCGAG CT,,CGAG Ava | CP,CGP,G CP,.,CGP,G Sal | GTCGAC GT,,CGAC Taq | TCGA,T,,CGA TCG,,A Aos {| , Aha {I GP (CGP C GP, ,CGP,C 第 十 四 章 “” 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 - 201 - 续 表 限制 性 内 切 酶 可 切割 序列 不 可 切割 序列 Cla I ATCGAT AT,,CGAT Hae II , Ngo I P,GCGCP, P,G,,CGCP, : Nar I GGCGCC GGiLEGEC GGOGC,C Mlu I ACGCGT A,,CGCG1 Mee Il ACGT ACCT 二 、 转 录 水 平 调控 的 研究 方法 转录 水 平 调控 的 研究 方法 很 多 ,包括 转录 起 始 位 点 的 测定 、 进 行 中 的 核 转录 分 析 、 不 同 细胞 间 表 达 水 平 的 差异 文库 分 析 .调控 元 件 研 究 的 报告 基因 法 。 (一 ) 转录 起 始 位 点 的 测定 精确 测定 基因 的 转录 起 始 位 点 ,对 于 进一步 研究 其 基因 表达 调控 机 制 具 有 极 重 要 的 作 用 。 和 常用 的 转录 起 始 位 点 测定 方法 有 三 种 :核酸 酶 S1 作 图 法 (SL-mapping)、RNase 作 图 法 (RNase mapping; 或 RNase 抗 性 分 析 法 ,RN-resistance assay) 和 引物 延伸 法 等 。 Sl 及 RNase 作 图 法 的 基本 原理 如 图 14-2 所 示 ,5 末端 标记 的 单 链 DNA 或 RNA 探 针 可 与 相 应 的 mRNA 互补 链 杂 交 , 用 核酸 酶 S1 BK RNase 消化 未 杂交 的 单 链 部 分 ,测序 胶 电 泳 分 离 ,放射 自 显影 测定 DNA 片段 的 长 度 ,估计 5 标记 末端 与 mRNA 5 末端 的 距离 , 即 可 判断 出 转录 起 始 位 点 。 EIA DNA 可 二 转录 eM mRNA 前 切 | 与 探 针 杂 交 5' Kin + | S1 核酸 酶 标记 的 探 针 YY 或 RNase 消 化 fe yh 电泳 、 放 射 日 显影 图 14-2 ” S1(RNase) 作 图 法 原理 示意 图 - 202: 基因 工程 学 引物 延伸 法 的 原理 是 : 待 检 基 因 mRNA 与 过 量 $ 末端 标记 的 单 链 DNA 引物 杂交 ,利用 反 转 录 酶 进行 延伸 反应 合成 CDNA, Sa, WE A RAY CDNA 产物 的 长 度 , 即 可 判断 出 引物 5 末端 与 mRNA 5 末端 ( 即 转录 起 始 位 点 ) 的 距离 。 (二 ) 进行 中 的 核 转录 分 析 进行 中 的 核 转录 分 析 (nuclear run on transcription) , 即 在 细胞 核 提 取 物 中 加 人 放射 性 核 “ Zeid BH = RB ERB ABE HEN mRNA 分 子 中 。 通 过 核酸 分 子 杂 交 方 法 , 即 “ 可 鉴定 出 多 种 基因 是 否 转录 及 其 转录 的 量 。 这 是 测定 基因 转录 活性 的 较为 可 靠 的 方法 , 排 除了 Northern 杂交 等 方法 中 mRNA 半衰期 对 实验 结果 的 影响 。 可 同时 分 析 多 种 基因 的 转 TG CE ,也 是 此 法 的 一 大 优点 。 (=) 不 同 组 织 细胞 或 同一 细胞 不 同 状态 基因 转录 的 差异 分 析 ( 差 示 文 库 ) 差 示 文 库 (differential library) 又 称 扣 除 文库 (subtracted library) ,是 反映 不 同 组 织 细胞 或 同一 种 细胞 处 于 不 同 功能 状态 下 的 基因 表达 差别 的 cDNA 文库 。 这 对 于 研究 细胞 发 育 分 化 、 细 胞 分 裂 周 期 细胞 对 药物 和 生长 因子 的 诱导 反应 及 肿瘤 等 疾病 的 分 子 基础 都 有 极 大 的 帮助 。 建立 差 示 文 库 的 基本 流程 是 :分 别提 取 不 同 细胞 的 mRNA, 将 其 中 一 种 mRNA 反 转 录 成 cDNA, 然 后 与 过 量 的 另 一 种 细胞 mRNA 进行 杂交 ,羟基 础 灰 石 柱 层 析 分 离 纯 化 未 形成 杂交 体 的 单 链 cDNA, 它 反映 此 细胞 中 特异 性 表达 的 基因 。 以 所 得 到 的 单 链 cDNA 为 模板 ， 合成 第 二 链 ,以 此 双 链 cDNA 建立 cDNA 文库 , 即 为 差 示 文库 。 (四 ) 启动 子 活性 的 研究 (报告 "基因 方法 ) 对 假定 顺 式 调控 序列 的 启动 子 活性 的 测定 , 常 采用 "报告 "基因 (reporter gene) Wi. Bil 通过 基因 重组 方法 将 待 测 DNA 序列 与 一 特异 的 “报告 "基因 相连 ,然后 导 和 人 细胞 中 进行 表 达 。 通 过 测定 表达 出 的 “报告 ?基因 产物 的 量 , 即 可 推断 出 此 DNA 序列 是 否 具 有 启动 子 活 性 。 报 告 基因 为 鉴定 和 分 析 基 因 的 调控 元 件 提 供 了 便利 的 方法 。 作为 "报告 "基因 必须 满足 下 列 条 件 :中 此 基因 所 编码 的 酶 活性 必须 易于 同 受 体 细 胞 内 相似 的 酶 活性 相 区 别 ;@ 不 会 受 细胞 内 其 他 酶 活性 的 干扰 ;@ 测 定 方 法 简单 .快速 .灵敏度 高 、 特 异性 高 。 目 前 有 三 种 基因 较为 理想 : 氯 霉 素 乙 酰 转移 酶 (CAT) 基 因 、B- 半 乳糖 苷 酶 基 因 和 荧光 素 酶 基因 。 1ABACHHRBEMEA 和 氯 霉 素 乙 酰 转移 酶 (chloramphenicol acetyltransferase, CAT) 基 因 最 初 来 自 细菌 转 座 子 Tn9 ,其 产物 CAT 可 产生 氯 霉 素 抗 性 。 其 催化 的 反应 如 下 : MEK + 乙酰 CoA BRCM OM oi EK + CoA RGR 2 He BM 3-CL RE R— —=1-C MAB RK 1-CRABR + 乙酰 CoA ae SCENER .3- 二 乙酰 氨 霉 素 + CoA ge ee 第 十 四 章 ， 真 核 生物 基因 表达 调控 .203 - 因此 ,可 用 :14C 标记 的 氧 霉 素 或 :C 标记 的 乙酰 辅酶 A 方 便 地 进行 CAT 活性 的 检测 。 2. R.- 半 弛 糖 苷 酶 基因 “有 R. 半 乳糖 童 酶 可 作用 于 底 物 ONPG( 邻 硝 基 苯 -B-D- 半 乳 吡 喃 业 音 ) 或 Xgal(5- 溴 -4- 氧 -3- 呵 唆 -B-D- 半 乳糖 ) 产 生 淡 黄 色 或 蓝 色 反应 产物 。B_ 半 乳糖 苷 酶 基因 党 作为 CAT 活性 测定 的 内 对 照 基因 ,以 排除 转 染 及 蛋白 质 提取 等 过 程 中 的 误差 对 实验 结果 的 干扰 。 CAT FinadJIT 图 14-3 pSVoCAT 载体 如 图 14-3 所 示 : 切除 SV40 启动 子 ,将 外 源 启动 子 DNA 片段 插入 ,在 大 肠 杆菌 中 扩 增 。 然后 与 阳性 对 照 ( 含 SV40 启动 子 ) 阴 性 对 照 ( 不 含 启 动 子 ) 分 别 导 入 哺乳 动物 细胞 中 进行 瞬时 表达 。 可 同时 将 B- 半 乳糖 苷 酶 基因 共 转 染 入 细胞 中 ,作为 CAT 测定 的 内 标 。 提 取 全 细 胞 蛋白 提取 物 ,与 氯 霉 素 和 乙酰 CoA 一 起 保温 ,用 薄 层 层 析 等 方法 测定 乙酰 化 的 氯 霉 素 的 量 , 即 可 判断 DNA 序 列 的 启动 子 活 性 。 3. RHABAA 获 光 素 酶 基因 是 近 几 年 发 现 的 一 种 新 方法 ,是 用 于 哺乳 动物 细胞 的 非 放 射 性 核 素 遗传 报告 系统 。 荧 光 素 酶 催化 的 生物 发 光 反 应 需要 获 光 素 作 底 物 ,以 及 ATP、Mg 及 分 子 所 。 将 这 些 试剂 与 含有 荧光 素 酶 的 细胞 裂解 液 混合 即 会 产生 一 种 迅速 误 减 (在 1 秒 内 ) 的 闪光 。 这 种 光 信 号 可 用 一 种 配备 了 便于 迅速 混合 反应 物 的 自动 注射 装置 的 获 光 检测 仪 进行 检测 。 发 光量 的 总 值 与 样品 的 荧光 素 酶 活性 成 正比 ,因而 可 对 荧光 素 酶 报 告 基因 的 转录 进行 间接 估计 。 荧 光 素 酶 易 被 蛋白 酶 降解 ,因而 在 转 染 的 哺乳 动物 细胞 中 的 半衰期 约 为 3h。 荧 光 素 酶 的 这 种 迅速 更 新 的 性 质 ,使 之 成 为 研究 可 诱导 系统 的 一 种 理想 的 候选 报告 蛋白 。 荧光 素 酶 作为 报告 基因 具有 很 多 优点 :中 荧光 素 酶 的 测定 比 毛 霉 素 酰基 转移 酶 (chlo- ramphenicol acetyltransferase,CAT) 或 其 他 常用 的 报告 基因 更 为 灵敏 。 荧 光 素 酶 分 析 独 有 的 高 灵敏 度 使 它 可 用 于 分 析 弱 启动 子 及 允许 在 转 染 实验 中 使 用 少量 的 DNA PIAA. QU xe 荧光 素 酶 不 需要 用 放射 性 物质 。@@ 菊 光 素 酶 在 哺乳 细胞 中 的 半衰期 为 3 小 时 ,在 植物 中 的 半衰期 为 3.5 小 时 。 由 于 半衰期 短 , 故 启动 子 活 力 的 改变 会 即时 导致 荧光 素 酶 活性 的 改变 ， 而 荧光 素 酶 不 会 积累 。 相 反 ,CAT 在 哺乳 细胞 中 的 半衰期 为 $0 小 时 ,在 转录 减弱 后 , 酶 的 全 部 活性 还 能 维持 比较 长 的 时 间 。 四 荧光 素 酶 浓度 在 10 mol/L (10pg/L) 3) 10° Smol/L (lmg/L) 范 围 内 ,荧光 信号 强度 与 酶 浓度 成 正比 。 在 理想 条 件 下 ,可 检测 到 10 mol /L 的 ss Re ru tea ee emai ee te -204- 基因 工程 学 菊 光 素 酶 ,因此 小 量 转 染 细胞 裂解 物 就 可 以 测定 酶 活性 。 为 了 排除 转 染 及 蛋白 质 提 取 等 过 程 中 的 误差 对 实验 结果 的 干扰 , 目前, 常 采用 双 荧 光 素 酶 报告 基因 测试 系统 。 双 荧光 素 酶 报告 基因 测试 系统 (DLR) 灵 敏 .方便 ,在 一 个 系统 中 用 于 测量 两 个 单独 的 荧光 素 酶 报告 基因 : 曹 火 虫 区 光 素 酶 和 海 骨 荧光 素 酶 。 将 董 火 虫 荧光 素 酶 作为 实验 报告 基因 , 海 骨 菊 光 素 酶 作为 对 照 报告 基因 。 虱 火 虫 和 海 骨 荧光 素 酶 都 具有 生物 发 光 报 告 基因 的 卓越 的 测试 特点 ,但 它们 在 进化 上 的 起 源 不 同 , 因 此 ,具有 不 同 的 酶 学 结构 与 底 物 要 求 。1986 年 , 董 火 虫 区 光 素 酶 基因 被 用 作 测 定 基因 表达 的 报告 基因 ,在 此 之 后 获 得 了 广泛 的 应 用 。 董 火 虫 荧光 素 酶 是 一 个 61 000 单 亚 基 蛋白 质 , 酶 活力 不 需要 翻译 后 修 饰 ,在 翻译 后 即 可 作为 遗传 报告 基因 。 在 ATP、Mg- 和 O, 的 存在 下 ,通过 萤火虫 荧光 素 的 氧化 反应 而 发 光 。 海 肾 荧光 素 酶 ,一 个 36 000 WEE A, AE A AAA Renilla reni- formis ,含有 3% 的 糖 类 ,但 是 和 莉 火 虫 荧 光 素 酶 一 样 , 酶 活力 不 需要 翻译 后 修饰 ,在 翻译 后 即 可 作为 遗传 报告 基因 。 在 海 骨 荧光 素 酶 的 催化 下 , 海 旨 奖 光 素 被 氧化 并 释放 光子 ,可 用 奖 FEAT UM MOT Fe TE VE RE BE HE (五 ) DNA 与 蛋白 结合 的 研究 1. BeBe RAYE (gel retardation assasy) “又 称 迁 移 改变 法 (mobility shift assasy) ,是 检测 DNA 结合 蛋白 的 一 种 简单 迅速 而 又 灵敏 可 靠 的 实验 方法 。 凝 胶 滞留 法 的 基本 原理 是 : 当 DNA 结合 蛋白 与 相应 的 DNA 片段 或 寡 核 背 酸 结合 而 形成 DNA- 有 蛋白 质 复 合 物 后 ,使 DNA 片段 的 相对 分 子 质量 及 电荷 发 生 改 变 , 因 而 在 聚 两 烯 酰胺 凝 胶 电泳 中 迁移 率 发 生 改 变 ,通常 Be UF SY) DNA 片段 的 泳 动 速率 慢 得 多 ,在 放射 自 显影 X 线 胶片 上 形成 一 较 游 离 DNA 片段 滞后 的 带 型 。 此 方法 与 其 他 实验 方法 相 比 ,不 但 简单 迅速 ,而 且 灵 敏 度 高 ,可 以 检测 出 fmol (10 摩尔) 量 的 DNA 结合 蛋白 。 不 同 种 类 的 DNA 结合 蛋白 导致 不 同 的 迁移 率 , 因 此 可 以 将 与 同一 DNA 片段 结合 的 不 同 蛋白 质 分 离开 来 。 采 用 此 方法 可 以 鉴定 特定 基因 调控 序列 中 是 否 存在 特定 DNA 结合 蛋白 的 结合 位 点 ,也 可 以 用 来 鉴定 特定 细胞 核 蛋白 中 是 否 存 在 某 种 基因 的 DNA 结合 蛋白 ,常用 作为 基因 转录 调控 因子 的 初步 筛选 ,是 研究 序列 特异 性 DNA 结合 蛋白 的 最 常用 方法 。 2. Southwestern 印迹 Southwestern 印迹 是 结合 了 Western 印迹 及 Southern 印迹 两 种 - 试验 方法 特点 而 设计 的 一 种 检测 序列 特异 性 DNA 结合 蛋白 的 试验 方法 。 其 基本 原理 是 ， 细胞 核 蛋 白 提 取 物 经 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 后 ,采用 Western 印迹 方法 将 核 蛋 白条 带 转 移 到 硝酸 纤维 膜 上 ,然后 与 2”P- 示 端 标记 的 DNA 片段 人 杂交。 如 果 此 核 蛋白 提取 物 中 含有 此 种 DNA 片段 特异 结合 的 序列 特异 性 DNA 结合 蛋白 , 则 会 在 相应 的 蛋白 质 条 带 区 域 形成 DNA- 和 蛋白 质 复合 物 ,并 可 被 放射 自 显影 检测 到 。 此 方法 的 优点 是 可 以 测定 到 DNA 结合 蛋 白 的 相对 分 子 质 量 ,因而 为 随后 的 蛋白 质 提 取 与 纯化 创造 了 条 件 。 3. 足 纹 法 “ 足 纹 法 是 近年 来 发 展 起 来 的 一 种 测定 DNA 结合 蛋白 在 DNA 上 的 精确 结 合 位 点 的 实验 方法 事实 上 , 足 纹 法 的 起 源 可 以 追溯 到 20 世纪 60 年 代 末 到 70 年 代 初 。 当 人 们 用 小 球菌 核酸 酶 轻微 作用 染色 质 后 得 到 了 长 度 均 为 约 200bp 或 其 倍数 的 DNA 片段 ， 这 是 由 于 DNA 受到 非特 异性 DNA 结合 蛋白 -组 蛋白 的 保护 的 结果 。 据 此 提出 了 核 小 体 模 型 。 这 是 DNA 酶 解 足 纹 法 的 最 早 雏形 。 随 后 这 一 方法 也 应 用 到 了 序列 特异 性 DNA 结合 第 十 四 章 ， 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 - 205 - 蛋白 的 结合 位 点 鉴定 上 ,Gilbert 等 发 现 lac 抑制 子 的 结合 可 保护 lec 启动 子 免 受 甲 基 化 试 剂 (DMS) 的 攻击 ,这 是 化 学 足 纹 法 的 雏形 。 早 期 的 足 纹 法 大 多 是 将 蛋白 -DNA RAMEE 酶 解 ,回收 受到 保护 的 DNA 小 片段 ,进而 测定 其 序列 ,这 种 方法 耗 时 又 费力 ,直到 1978 年 ， Galas 等 才 以 全 新 的 方法 发 展 了 足 纹 技术 ,并 正式 提出 了 ”" 足 纹 法 ”概念 ,他 们 发 明 的 DNase 工 足 纹 法 直至 现在 仍然 是 最 常用 的 足 纹 法 。 (KAT LZ FF) 第 十 五 章 ”人 关 基 因 诊 断 与 治疗 Chapter 15. Human Gene Diagnosis and Therapy BT 基因 诊断 所 谓 基 因 诊 断 , 原 指 基 因 水 平 上 诊断 遗传 性 疾病 。 这 种 技术 后 来 也 被 用 于 诊断 其 他 疾 病 。 因 此 ,基因 诊断 是 从 分 子 水 平 上 对 疾病 进行 的 诊断 。 一 、 基 因 诊 断 的 方法 基因 诊断 的 方法 主要 有 PCR 法 DNA 探 针 (probe) 法 和 基因 序列 测定 等 ,这 些 方法 经 常 结合 起 来 使 用 以 方便 对 疾病 的 诊断 。 (一 ) PCR (polymerase chain reacion ) 法 PCR 法 就 是 多 聚 酶 链 式 反应 法 。 首 先 针对 所 要 检查 基因 的 DNA 序列 ,设计 并 合成 出 两 端的 引物 (primer) ,再 遵循 PCR 实验 的 步骤 进行 实验 操作 ,从 而 扩 增 分 离 出 特定 的 DNA 片段 , 继 之 对 扩 增 DNA 片段 进行 电泳 ,从 电泳 所 获得 的 不 同 带 型 ,可 以 了 解 到 该 片段 的 异 常情 况 ,进行 疾病 诊断 。 由 于 PCR 方法 的 成 本 低 、 快 速 和 对 样品 质量 和 数量 要 求 不 高 等 特 点 ,已 开始 用 于 多 种 遗传 病 的 产 前 诊断 (地 中 海 贫 血 和 血 友 病 等 )、 传 染病 (如 艾滋 病 ) 等 。 例 如 , 血 友 病 A(HA) 是 一 种 常见 的 X 连 锁 隐 性 遗传 性 出 血性 疾病 ,女性 为 携带 者 ,男性 发 病 ， 是 由 于 下 骨 基 因 22 密码 子 倒 位 造成 的 ,用 长 距离 PCR 的 方法 可 检测 出 下 出 基因 倒 位 的 胎 儿 , 以 便 进 行 产 前 诊断 。 首 先 设 计 合 成 三 对 特异 性 引物 ,PCR 扩 增 后 ,进行 琼脂 糖 凝 胶 电泳 , 根据 电泳 条 带 的 大 小 和 相对 分 子 质量 的 大 小 综合 判定 患者 是 否 存在 下 仙 基 因 内 含 子 22 倒 位 。 若 只 出 现 12kb 带 , 判 为 野生 型 ( 非 倒 位 ); 若 只 出 现 1lkb 带 , 判 为 倒 位 患者 ; 若 出 现 12kb 和 11kb 两 条 带 , 判 为 倒 位 的 携带 者 。 (=) RFLP(restrictive enzyme fragment long polymorphogenesis) 分 析 法 RELP 分 析 法 即 限制 性 酶 片段 长 度 多 态 性 分 析 法 。 在 非 缺 陷 型 疾病 中 ,突变 常常 会 产 生 新 的 或 消除 原 有 酶 切 位 点 ,因此 ,可 根据 DNA 限制 性 片段 长 度 多 态 性 不 同 进 行 基因 变异 分 析 ,对 疾病 做 出 诊断 。 首 先 设 计 适当 的 引物 ,使 扩 增 片段 包含 某 一 个 或 数 个 多 态 性 的 限制 性 内 切 酶 位 点 ,用 PCR 的 方法 对 目的 基因 进行 扩 增 后 ,用 限制 性 内 切 酶 对 PCR 产物 进行 消 化 ,电泳 后 ,根据 正常 人 与 病人 这 一 等 位 基因 酶 切片 段 长 度 上 的 不 同 ,再 结合 基因 连锁 分 析 ， 206 ， 第 十 五 章 “ 人 类 基因 诊断 与 治疗 ，207 ， 可 以 了 解 某 一 特定 基因 上 的 变化 。 这 一 方法 已 在 部 分 突变 所 致 - 地 中 海 贫血 ` 血 友 病 等 疾 病 的 诊断 得 到 广泛 的 应 用 。 (三 ) DNA 探 针 法 DNA 探 针 是 指 用 核 素 、 酶 荧光 分 子 或 化 学 催化 剂 等 标记 特定 DNA。 利 用 制备 的 特异 DNA 探 针 与 标本 进行 杂交 ,通过 杂交 结果 可 确定 检测 标本 中 有 无 同 源 互补 序列 ,从 而 检 出 所 要 查 明 的 DNA 或 基因 上 的 变化 。 (四 ) 基因 序列 分 析 法 不 管 是 RFLP 法 \DNA 探 针 法 , 还 是 PCR 法 ,如 要 彻底 了 解 相关 基 因 的 变化 情况 , 均 要 对 之 进行 DNA 序列 分 析 。 其 结果 将 清楚 而 明确 地 表明 基因 上 的 哪 一 个 或 哪 几 个 碱 基 发 生 了 突变 。 二 、 基 因 诊 断 的 疾病 当前 ,运用 上 述 技术 方 法 对 遗传 性 疾病 已 能 明确 诊断 (包括 产 前 诊断 ) 的 有 镰刀 性 贫血 HE .B- Hh A ME FX I. Duchenne 肌 营养 不 良 症 等 110 多 种 。 能 明确 诊断 的 病毒 、 细 菌 、 真菌 及 寄 生 虫 引起 的 感染 性 疾病 有 腹泻 病原 菌 、 性 病 病 原 体 巨 细胞 病毒 `. 乙 型 肝炎 病毒 ,疱疹 病毒 、 艾滋 病毒 (HIV) 等 约 40 种 。 应 用 抑 癌 基因 p16. 753 及 基因 重 排 分 析 等 ,可 对 某 些 白血病 及 恶性 肿瘤 进行 基因 诊断 或 产 前 诊断 。 对 某 些 动脉 粥 样 硬化 易 感 性 `. 职 业 病 \ 中 枢 神 经 系统 的 疾病 ,也 可 进行 基因 诊断 。 第 二 节 基因 治疗 所 谓 基 因 治 疗 (gene therapy) 是 指 将 正常 的 外 源 基 因 导 和 人 生物 体 或 人 体 细 胞 内 ,以 弥补 所 缺失 的 基因 或 关闭 、 降 低 异 常 表达 的 基因 ,达到 治疗 疾病 的 目的 。 简 言 之 ,用 基因 治 病 的 方法 就 叫做 基因 治疗 。 “世界 上 第 一 次 真正 在 临床 上 进行 基因 治疗 的 是 美国 加 州 大 学 的 一 位 科学 家 。 他 试图 用 基因 治 病 的 想法 在 当时 几乎 成 了 天 方 夜 谭 。 他 给 两 名 晚期 B- 地 中 海 贫血 的 病人 导 人 了 相关 的 基因 ,进行 基因 治疗 ,但 最 终 失 败 。 他 因 事 先 未 履行 必要 的 审批 手续 而 给 自己 带 来 了 很 大 的 麻烦 ,但 许多 人 称赞 他 是 一 位 勇敢 的 开拓 者 。 世 界 上 第 二 次 真正 在 临床 上 进行 基因 治疗 的 是 美国 国立 卫生 研究 院 (NIH) 的 Blaese 和 Anderson。 他 们 在 1990 年 9 月 用 重组 反 转 录 病毒 表达 腺 苷 酸 脱 氨 酶 (ADA ) 基 因 ,将 之 导入 一 名 ADA 基因 缺陷 症 女孩 的 工 淋 巴 细 胞 ，- 之 后 分 批 回 注 该 重组 淋巴 细胞 到 患者 血液 中 。3 个 月 后 , 回 注 体 内 的 携带 重组 基因 的 淋巴 细胞 分 帮 了 ADA 酶 ,使 这 名 患者 先天 缺损 的 免疫 系统 趋 于 正常 。 这 是 世界 上 基因 治疗 成 功 的 第 一 个 事例 。 之 后 又 以 基本 相同 的 办 法 治疗 了 几 位 病人 。 这 一 成 功 事 例 激励 了 全 世界 的 医学 科学 家 , 自 此 全 世界 风起云涌 ,掀起 了 基因 研究 治疗 的 狂澜 。 人 类 基因 治疗 最 早 着 眼 于 遗传 病 ,现在 基因 治疗 除 用 于 多 种 遗传 病 的 治疗 外 ,也 用 于 治疗 恶性 肿瘤 和 其 他 疾病 。 随 - 208 . 基因 工程 学 着 基因 治疗 基础 研究 的 不 断 突破 ,今后 临床 基因 治疗 的 疾病 范围 可 望 进一步 扩大 。 一 、 基 因 治 疗 的 类 型 根据 受 体 细 胞 的 不 同 ,当代 的 基因 治疗 研究 可 分 为 性 细胞 (germ cells) 基 因 治 疗 和 体 细 胞 (somatic cells) 基 因 治 疗 。 (一 ) 性 细胞 基因 治疗 顾名思义 ,性 细胞 基因 治疗 是 通过 基因 治疗 使 非 正 常 (缺损 失 活 或 过 量 表达 某 个 或 某 些 基因 ) 的 性 细胞 恢复 正常 ,不 仅 治 愈 被 治疗 的 病人 ,而 且 可 纠正 其 错误 的 遗传 背景 ,使 其 子孙 后 代 不 再 肉 患 这 一 疾病 。 这 是 一 个 根治 遗传 性 疾病 的 策略 。 主 要 是 应 用 同 源 重 组 或 基因 打 靶 的 方法 ,以 实现 目的 基因 对 细胞 染色 体 的 定位 整合 或 定点 修复 或 定点 突变 ,克服 了 盲目 性 , 且 可 以 遗传 给 后 代 子 孙 。 但 其 效率 很 低 ,技术 难度 较 大 ,以 至 当前 还 未 能 进入 临床 实验 。 (二 ) 体 细 胞 基因 治疗 体 细 胞 基因 治疗 是 针对 具体 患者 所 存在 的 基因 人 缺损, 失 活 或 基因 过 量 表达 的 实际 情况 ， 把 相应 的 正常 基因 导入 患者 的 体 细胞 ,以 治愈 被 治疗 的 具体 患者 ,但 不 能 纠正 其 错误 的 遗传 背景 。 故 这 个 疗法 被 认为 是 一 个 “ 治 表 而 不 治本 "的 疗法 。 如 ,导入 ADA 基因 可 以 使 ADA 基因 缺陷 的 患者 获得 足够 的 ADA 酶 而 痊愈 ;但 这 一 患者 所 缺损 的 ADA 基因 并 未 得 到 修 复 ,这 样 ATM SR PIAA AER ADA 基因 缺陷 症 。 然 而 , 体 细 胞 基因 治疗 的 优越 性 是 不 可 否认 的 。 首 先 , 他 使 一 向 认为 不 可 治愈 的 遗传 性 疾病 变 成 可 以 治愈 的 疾病 ,这 是 一 个 历史 性 的 突破 。 其 次 ,即使 是 每 3 个 月 治疗 一 次 ,也 比 天 天 打针 吃 药 的 传统 办 法 简便 ,经 济 得 多 ,更 主要 的 是 方便 了 病人 ,应 当 认 为 这 是 临床 医学 上 的 一 大 进步 。 二 、 基 因 转 移 系 统 目前 已 有 多 种 基因 转移 方法 可 将 目的 基因 导入 受 体 细胞 ,对 基因 治疗 较 有 意义 的 载体 有 反 转 录 病 毒 (RV) 、 腺 病毒 (Ad) 、 腺 病毒 伴随 病毒 (AAV) .单纯 疱疹 病毒 (HSV)、 脂 质 体 与 受 体 介 导 的 蛋白 (RMP)。 在 迄今 进行 的 临床 基因 治疗 中 ,大 部 分 采用 反 转 录 病 毒 载体 介 导 的 基因 转移 。 (一 ) 反 转 录 病 毒 反 转 录 病 毒 被 选 作 体 细 胞 基因 治疗 的 载体 ,是 因为 反 转 录 病 毒 可 进入 细胞 并 整合 到 染 色 体 上 ,病毒 基因 在 宿主 细胞 内 可 适宜 表达 但 不 影响 病毒 生活 周期 ,但 从 受 体 细胞 出 芽 的 病 毒 粒 子 给 基因 治疗 带 来 安全 性 问题 。 不 具 包 装 功能 的 病毒 载体 与 包装 细胞 系 的 应 用 ,使 病 毒 出 芽 的 可 能 性 极 大 地 降低 。 RV 前 病毒 DNA 可 分 成 两 部 分 , 即 顺 式 作 用 与 反 式 作用 序列 (图 15-1) 。 顺 式 作 用 序列 包括 两 端 长 未 端 重 复 序列 (long terminal repeat sequence, LTR). 包装 信号 VMAS, Wie 第 十 五 章 ” 人 类 基因 诊断 与 治疗 - 209 . 复制 的 必需 调控 区 ; 反 式 作用 序列 编码 包装 蛋白 gag pol 与 env。 构 建 载体 时 去 除 反 式 作用 序列 , 插 和 人 外 源 基因 ,再 与 质粒 重组 以 利 扩 增 。 重 组 的 病毒 基因 组 是 复制 缺陷 型 的 ,只 能 产 生病 毒 RNA, 不 编码 病毒 的 结构 蛋 日 。 72 72 ”CAATTATA Ltt gag/pol mRNA poly(A) a TAR ae ra eee TS Soe 图 15-1 PRS A I ee Se EA BE DNA 结构 | 下 ,增强 子 ;P, 启 动 子 ;I, 病 毒 RNA 合成 起 始 部 位 ;D, 给 位 裂解 部 位 ;r , 副 链 DNA 复制 起 始 部 位 ; 下 , 包 装 信号 ;A, 主 要 受 体 裂解 部 位 ;r+ , 正 链 DNA 自制 起 始 部 位 ;T, 病 毒 RNA 合成 中 3 SRR MR 加 成 部 位 ;LTR ,长 未 端 重复 ;Us Us 、R, 长 未 端 重复 的 部 分 ;gag, 病 毒 核心 特异 抗原 ;pol, 依 赖 RNA 的 DNA 聚合 酶 ( 反 转 录 酶 ) ;env, 外 壳 蛋 白 。72.72,72kb 重复 ;CAAT TATA ABT RK RFS 1. 载体 的 种 类 ”重组 的 反 转 录 病 毒 载体 大 致 可 分 为 四 类 :第 一 类 是 双 表 达 型 载体 , 含 两 种 外 源 基因 ,分 别 取 代 gag/pol FH BAS env 基因 , 双 表 达 载 体 的 特点 是 病毒 基因 的 调控 区 与 外 源 基 因 的 表达 密切 相关 ;第 二 类 是 内 部 含 启 动 子 的 病毒 载体 ,筛选 基因 紧 接 长 未 端 重复 序列 后 面 , 其 表达 受 5SLTR 局 动 子 控制 ,目的 基因 前 附 有 一 个 外 加 启动 子 , 其 选用 由 目的 基 因 与 靶 细胞 而 定 ,与 双 表 达 载 体 相 比 有 较 大 的 自由 度 ,不 足 之 处 是 内 部 启动 子 的 存在 可 能 会 影响 病毒 的 效 价 ;第 三 类 是 自身 灭 活 载体 ,3”LTR 缺失 一 段 序 列 ,由 于 3'LTR 是 两 端 LTR 的 模板 ,病毒 复制 时 其 缺失 ,这样 病 毒 顺 式 结构 不 会 干扰 外 源 基因 的 表达 ,减少 了 LTR 激活 相 邻 癌 基 因 的 可 能 性 。 其 缺点 是 病毒 滴 度 特别 低 。 第 四 类 是 双 拷 贝 载体 ,其 主要 特点 是 外 源 基 因 捅 入 3LTR 的 Us 区 ,在 转 当 细胞 内 基因 被 复制 并 转 到 $ LTR。 外 源 基 因 的 新 位 置 处 于 反 转 录 单 位 之 外 ,减少 了 该 转录 单位 对 外 源 基因 表达 的 负 影 响 ,使 插入 基因 的 调控 序列 较 正 常 地 发 挥 作 用 。 体 细胞 基因 治疗 多 采用 内 部 含 启 动 子 的 病毒 载体 。 2. 包装 细胞 上 述 4 种 缺失 编码 包装 蛋白 序列 的 病毒 载体 ,必须 提供 包装 蛋白 以 完成 病毒 包装 。 将 缺失 包装 信号 亚 序 列 的 反 转 录 病 毒 DNA 导 人 细胞 系 即 构建 成 包装 细胞 系 ， 这 种 细胞 产生 包装 和 蛋白, 因 自身 缺失 包装 信号 不 能 包装 。 病 毒 载体 导 和 人 细胞 后 ,含有 包装 信 号 的 载体 与 包装 细胞 作用 互补 共同 完成 病毒 包装 。 出 芽 的 病毒 粒子 转 染 目的 细胞 后 , 因 目 的 细胞 不 含 编码 包装 蛋白 的 序列 ,病毒 DNA 不 能 包装 出 芽 ,从 而 避免 了 扩散 。 (1) 第 一 代 包 装 细 胞 系 : WY, 是 单 向 性 包装 细胞 系 , 此 类 出 芽 的 病毒 粒子 只 能 感染 嘴 齿 人 - 210: 基因 工程 学 类 动物 ,这 种 属 特异 性 是 由 病毒 粒子 表面 的 糖 蛋白 类 型 所 决定 。 这 种 包装 细胞 系 的 缺点 是 易 产 生 辅 助 病毒 ,因为 反 转 录 与 整合 的 信号 是 完整 的 , 当 导 人 的 反 转 录 病 毒 载体 与 缺失 的 3 “末端 有 交 联 时 ,可 产生 辅助 病毒 , 受 感染 细胞 的 内 源 序列 亦 可 修复 病毒 的 基因 组 缺陷 。 如 辅助 病毒 的 基因 组 同时 被 包装 ,病毒 粒子 进入 受 体 细 胞 后 可 进一步 感染 其 他 细胞 , 即 包 装 信 号 的 去 除 仅 能 降低 但 不 能 排除 辅助 病毒 的 产生 。 (2) 第 二 代 包 装 细 胞 系 : 以 PA317 为 代表 ,PA317 细胞 株 是 双向 性 包装 细胞 系 ,由 PA317 出 芽 的 病毒 粒子 ,不仅 可 感染 路 齿 类 细胞 ,也 可 感染 包括 人 类 在 内 的 灵 长 类 细胞 。 它 不 仅 缺 失 包 装 信 和 号 更 序列 ,还 缺失 S LTR 的 S 末端 ,同时 3’ LTR 与 负 链 的 起 点 位 点 被 SV40 的 聚 腺 苷 位 点 取代 。 经 过 如 此 处 理 , 即 使 这 一 结构 的 RNA 也 被 包装 , 仍 不 能 反 转 录 。 比 起 单纯 缺失 更 序列 的 包装 细胞 系 ,PA317 产生 辅助 病毒 的 几率 要 低 得 多 。 (3) 第 三 代 包 装 细胞 系 : 将 gag/pol DNA 片段 与 env DNA 片段 分 离 并 引入 突变 与 缺 失 , 于 gag Menv 两 个 区 域 的 转录 位 点 分 别 插 人 连接 子 (linker) 以 产生 突变 ,大 部 分 分 离 的 转录 单位 的 LTR 被 SV40 的 聚 腺 苷 信号 取代 ,由 此 构建 单 向 性 包装 细胞 系 WCRE 与 双向 性 包装 细胞 系 亚 CRIP ,这 两 个 细胞 株 可 看 成 第 三 代 包 装 细胞 系 。 在 包装 细胞 的 两 个 转录 单位 与 载体 或 内 源 成 分 共 3 个 DNA 重组 才能 产生 辅助 病毒 ,但 因 突 变 位 于 转录 单位 ,可 能 仅 需 两 种 重组 事件 发 生 即 可 产生 辅助 病毒 。 重 组 发 生 于 包装 细胞 内 的 病毒 序列 与 反 转 录 病 毒 载 体 或 内 源 成 分 的 反 转 录 样 结构 。 实 验证 明 当 采用 特定 的 载体 时 , 平 CRE 与 WCRIP 细胞 系 产生 辅助 病毒 的 倾向 小 于 PA317 细胞 。 (二 ) 腺 病毒 腺 病毒 (Ad) 的 病毒 粒子 无 包 膜 ,二 十 面体 对 称 ,基因 组 为 线 状 双 链 DNA。 腺 病毒 易于 培养 和 纯化 ,基因 组 的 复制 与 转录 依赖 于 细胞 的 聚合 酶 ,因此 病毒 基因 的 表达 调控 可 以 模拟 宿主 细胞 的 基因 表达 机 制 , 允 许 插 人 载体 的 外 源 基因 长 度 可 达 36kb , 病毒 滴 度 较 高 (102 pfuMml) 。 能 感染 非 分 化 细胞 ,可 原 位 感染 组 织 ,尤其 是 肺 。 其 主要 缺点 是 目前 所 用 的 载体 含 较 多 的 腺 病毒 序列 ,可 能 刺激 免疫 反应 或 有 其 他 副作用 。 此 外 , 因 病 毒 载体 未 整合 在 染色 体 DNA 上 ,基因 表达 可 能 不 稳定 。 (三 ) 腺 病毒 伴随 病毒 腺 病毒 伴随 病毒 (AAV) 亦 称 依 赖 性 病毒 (dependovirus) , 它 的 繁殖 依赖 于 辅助 病毒 ,后 SAR AEM BBR. AAV 成 熟 病毒 粒子 内 MAA IE DNA, 来 自 不同 病 毒 粒子 的 正 负 链 DNA 在 试管 内 可 形成 双 链 DNA 结构 。AAV 与 Ad 的 混合 感染 可 以 明显 地 抑制 Ad 的 复制 。 在 这 种 溶 细 胞 性 感染 中 ,复制 需要 Ad 或 HSV 的 共同 感染 。 当 缺乏 辅助 病毒 时 ， AAV 感染 导致 其 基因 组 整合 到 宿主 细胞 染色 体 基 因 组 上 ,形成 潜伏 感染 状态 ,然后 当 有 畏 助 病毒 感染 同一 细胞 时 ,AAV 基因 组 DNA 将 复制 。 取 自 潜 伏 感染 细胞 的 染色 体 与 AAV DNA 的 原 位 杂交 证 实 ,AAV 基因 组 整合 的 位 点 在 19 点 染色 体 qd13.4。 数 个 独立 的 整合 位 点 的 顺序 分 析 显 示 ,断裂 点 均 位 于 宿主 细胞 DNA 上 100bp 内 ,将 基因 组 DNA 特异 地 整合 到 宿主 细胞 染色 体 上 单一 位 点 以 形成 病毒 潜伏 感染 。 在 迄今 所 见 的 病毒 DNA 整合 中 ， AAV 的 这 种 位 点 特异 性 整合 是 仅 有 的 。 wa peso oe 第 十 五 章 ” 人 类 基因 诊断 与 治疗 - 211 - (四 ) 单纯 疱疹 病毒 HSV 病毒 是 有 包 膜 的 双 链 DNA 病毒 ,线形 DNA 链 中 有 末端 重复 序列 和 内 部 重复 序 列 , 链 中 有 缺口 。HSV 基因 组 中 有 许多 基因 在 细胞 培养 中 对 病毒 生长 是 非 必 需 的 ,所 以 ， HSV 载体 可 导入 大 片段 基因 以 至 多 个 基因 ,构建 HSV 载体 期 望 得 到 有 组 织 特异 性 的 、 稳 定 、 适 宜 的 表达 。 (五 ) 脂 质 体 用 一 定 比 例 的 磷脂 酰 胆 碱 与 磷脂 酰 丝氨酸 共 溶 于 氯仿 ,制备 有 双 层 磷脂 膜 的 脂 质 体 。 将 待 转移 的 DNA 分 子 包 人 脂 质 体 中 , 受 体 细 胞 可 吞噬 这 种 含 外 源 基 因 的 脂 质 体 ,以 此 达到 基因 转移 的 目的 。 脂 质 体 已 用 于 直接 体内 基因 转移 。 将 对 靶 细 胞 特异 的 单 克 隆 抗 体 包 埋 于 脂 质 体 的 脂 质 双 层 ,用 超声 处 理 将 目的 基因 DNA 包 人 这 种 “免疫 脂 质 体 "中 。DNA 免疫 脂 质 体 的 腹腔 注射 使 基因 特异 性 转移 至 胞 膜 对 单 克隆 抗体 产生 免疫 反应 的 细胞 。 (六 ) 受 体 介 导 的 蛋白 受 体 介 导 的 蛋白 质 研究 较 多 的 是 唾液 酸 糖 蛋白 与 转 铁 蛋 白 。 转 铁 蛋 白 受 体 介 导 的 基因 转移 已 成 功 地 将 DNA 转移 至 多 种 离 体 细胞 ,唾液 酸 糖 蛋白 受 体 介 导 的 基因 转移 对 肝 细 胞 高 度 特异 ,体外 与 体内 实验 均 已 将 DNA 转移 至 肝 细 胞 。 蛋 白质 与 多 聚 赖 氨 酸 或 其 他 阳 离 子 化 合 物 偶 联 , 所 带 正 电 荷 有 利于 形成 DNA/ 蛋 白 复合 物 ,复合 物 经 静脉 注射 后 , 受 体 所 在 的 部 位 将 决定 其 细胞 特异 性 ,影响 核 内 体 / 溶 酶 体 旁 路 的 药物 (如 氯 唑 ) 增 加 基因 转移 的 效 率 。 和 蛋白 受 体 介 导 的 基因 转移 属 直接 体内 的 方法 ,这 一 方法 已 显示 出 对 肝 细 胞 的 突出 优点 ， 不 仅 是 唾液 酸 糖 蛋白 介 导 的 基因 转移 对 肝 细 胞 高 度 特异 ,而且 不 像 反 转录 病毒 载体 那样 需 要 做 肝 部 分 切除 才能 实现 高 效 转移 。 受 体 介 导 的 蛋白 质 携带 反 义 DNA, 可 显著 抑制 肝炎 病 毒 基因 的 复制 与 表达 。 三 、 受 体 细 胞 不 管 是 直接 体内 还 是 间接 体内 基因 转移 ,选择 目的 基因 表达 的 组 织 细 胞 最 好 是 组 织 特 异性 细胞 ,在 一 种 组 织 细 胞 中 表达 后 可 分 泌 或 以 其 他 方式 进入 靶 细 胞 的 也 可 应 用 。 对 于 间 接 法 基因 转移 ,还 应 考虑 :@ 细 胞 较 易 从 体内 取出 且 有 增殖 优势 ,最 好 生命 周期 较 长 ;@ 离 体 细胞 较 易 受 外 源 遗 传 物质 转化 ;@ 细 胞 经 转化 和 一 定时 间 培 养 后 再 输 回 体内 仍 能 成 活 。 (一 ) 造血 细胞 造血 细胞 种 类 多 样 且 在 体内 多 处 分 布 ,有 多 种 疾病 累及 造血 细胞 ,造血 细胞 较 符 合 间接 体内 基因 治疗 应 考虑 的 因素 ,因此 造血 细胞 作为 基因 转移 的 受 体 细 胞 研究 较 多 ,其 中 骨髓 最 受 重 视 。 因 骨 介 含 多 种 造血 细胞 且 处 于 不 同 发 育 阶 段 ,如 基因 转移 至 分 化 细胞 , 则 转移 基因 只 能 在 这 种 特定 细胞 的 生命 周期 内 表达 。 只 有 将 基因 转移 至 骨 找 多 能 干细胞 ,才能 使 转移 基因 终生 存在 于 所 有 造血 细胞 内 。 目 前 主要 采用 反 转 录 病 毒 载体 介 导 的 基因 转移 ,通过 包 - 212: BALES 装 细胞 包装 出 重组 病毒 ,在 转 染 造血 细胞 后 ,进行 短期 培养 ,再 输 回 动物 体内 。 这 种 方法 类 似 自 体 组织 移 植 ,其 主要 区 别 是 移植 细胞 受到 反 转 录 病 毒 的 转 染 。 主 要 问题 是 转移 系统 的 安全 性 与 有 效 性 ,转移 基因 在 受 体 细 胞 表达 的 适宜 性 。 在 转 染 目的 细胞 之 前 ,对 导 和 人 外 源 基 因 的 双向 性 包装 细胞 系 克 隆 作 系 统 筛 选 ,是 为 了 最 大 限度 地 殉 服 由 反 转 录 病 毒 载体 的 不 稳定 性 所 造成 的 基因 缺失 、 重 排 和 病毒 滴 度 低 等 缺点 。 检测 受 转 染 动物 外 源 基 因 的 整合 与 表达 ,并 用 非常 敏感 的 方法 检测 有 和 否 辅助 病毒 的 产生 ,并 从 整体 水 平 上 考虑 安全 性 与 有 效 性 。 反 转录 病毒 载体 仅 介 导 外 源 基因 转移 处 于 分 裂 状态 的 细胞 。 因 此 这 种 方法 适合 于 分 裂 较 快 的 血细胞 ,也 可 用 于 皮肤 成 纤维 细胞 、. 肝 细胞 等 ;不 适 合 于 增殖 较 慢 甚至 不 分 裂 的 细胞 ,尤其 是 肌肉 细胞 与 脑 细胞 。 已 有 许多 实验 室 可 分 离 鼠 骨 押 干 细胞 及 人 类 与 其 他 高 等 动物 的 骨 侯 干细胞 。 如 转移 后 4 A RE Ee (或 ) 淋 巴 组 织 内 检测 到 转移 基因 的 表达 , 即 认 为 转移 基因 已 整合 于 造血 和 干细胞。 应 用 这 种 方法 ,已 在 鼠 体 内 得 到 腺 苷 脱 氨 酶 基因 的 长 期 表达 ,二 氧 叶 酸 还 原 酶 突变 株 基因 已 在 鼠 体内 表达 并 显示 对 转 染 细胞 的 选择 优势 。 反 转录 病毒 DNA 在 转移 细胞 染色 体 基 因 组 上 随机 高 效 整合 ,但 重建 的 动物 造血 组 织 细 胞 的 基因 及 DNA 中 反 转 录 病 毒 的 不 同 整 合 位 点 数 较 少 ， 说 明 只 有 少数 受 感 染 细胞 在 骨 角 细 胞 内 成 活 。 转 染 及 筛选 过 程 使 骨髓 增殖 能 力 降低 ,可 能 是 丢失 干细胞 或 对 干细胞 转 染 不 足 的 原因 。 对 人 类 基因 治疗 需要 高 效 基因 转移 。 骨 艇 细胞 培养 .造血 干细胞 的 纯化 ,在 细胞 培养 中 使 用 多 种 生 血 因子 联合 应 用 ,可 望 增加 基因 转移 效 率 。 (二 ) 肌肉 细胞 反 转 录 病 毒 载体 介 导 的 基因 转移 对 骨骼 肌 细 胞 几乎 无 效 。 骨 骼 肌 细 胞 的 突出 特点 是 可 采用 直接 体内 基因 转移 ,即将 DNA 直接 注射 人 骨骼 肌 细 胞 。 用 含 B- 半 乳糖 背 酶 基因 的 质 粒 直接 注射 人 小 鼠 骨 骼 肌 细 胞 ,在 注射 区 域 的 肌 细胞 检测 到 该 基因 的 表达 。 用 同样 的 方法 注射 含 荧 光 酶 基因 的 质粒 ,在 2 个 月 的 检测 中 荧光 酶 基因 以 较 稳定 的 水 平 表 达 ,提示 其 表达 持续 时 间 会 更 长 。 用 金 粒 子 携带 B- 半 乳糖 苷 酶 基因 和 麦 击 鼠 体内 肌肉 细胞 ,在 麦 击 后 2 个 月 内 鼠 肌 肉 内 有 该 基因 的 存在 与 表达 。 直 接 注 射 与 篆 击 后 外 源 DNA 似乎 以 未 整合 的 染色 体 状态 存在 ,直接 注射 法 仅 对 骨骼 肌 细 胞 有 效 ,而 麦 击 适 用 于 多 种 细胞 。 血管 平滑 肌 细 胞 可 以 培养 ,经 遗传 操作 后 再 送 回血 管 。 反 转录 病毒 载体 携带 人 ADA 基因 与 细菌 NEO 基因 转 染 培养 的 免 平 滑 肌 细 胞 ,用 特制 的 球形 导管 剥 去 内 皮 细 胞 后 ,将 受 转 染 的 免 平滑 肌 细 胞 送 回 动脉 壁 。 人 ADA 基因 在 兔 血 管 壁 上 以 和 内 源 ADA 相近 的 水 平 持续 表达 半年 以 上 。 (三 ) 成 纤维 细胞 用 携带 目的 基因 的 反 转 录 病 毒 载体 转 染 成 纤维 细胞 ,已 表达 具有 生物 活性 的 ADA、 葡 萄 糖 脑 苷 酯 酶 . 味 叭 核 苷 磷酸 化 酶 . 低 密 度 脂 蛋白 受 体 与 凝血 因子 区 等 。 经 过 遗传 操作 的 成 纤维 细胞 的 胶原 基质 可 分 刻 因 子 区 ,将 这 种 基质 移植 到 动物 皮下 检测 到 因子 区 的 表达 。 这 一 方法 已 用 于 临床 治疗 B 型 血 友 病 。 经 遗传 操作 的 成 纤维 细胞 株 ,能 在 受 体 细胞 形成 肿瘤 。 生 长 激素 表达 随时 间 推 移 而 增加 ,说 第 十 五 章 ”人 类 基因 诊断 与 治疗 - 213 . 明 移 植 细胞 持续 增殖 。 正 常 成 纤维 细胞 行为 完全 不 同 ,移植 后 能 阻 遇 转移 基因 的 表达 ,值得 探讨 的 是 ,正常 成 纤维 细胞 能 否 在 移植 后 持续 表达 一 定 水 平 的 外 源 基因 及 对 大 动物 是 否 有 效 。 (四 ) 肝 细 胞 肝脏 是 重要 的 代谢 器 官 ,有 多 种 遗传 病 由 肝脏 特异 的 基因 产物 缺陷 引起 , 且 肝 脏 是 肿瘤 的 高 发 部 位 ,因此 肝 细 胞 成 为 基因 治疗 研究 的 重要 目的 细胞 。 外 源 基因 转移 至 体内 肝脏 的 方法 有 两 种 ,直接 体内 基因 转移 法 和 间接 基因 体内 转移 法 。 间 接 基 因 体 内 转移 是 由 反 转 录 病 毒 载 体 介 导 将 外 源 基因 转移 至 离 体 细胞 ,然后 做 自体 组 织 移 植 。 动 物 实验 证 明 , 转 基因 鼠 的 肝 细 胞 经 同 种 异体 移植 可 以 成 活 并 继续 发 挥 肝 细 胞 的 功能 。 直 接 体内 基因 转移 是 通过 受 体 介 导 使 重 组 病毒 载体 直接 导 和 人 肝 细 胞 ,从 而 将 外 源 基因 转移 至 体内 肝脏 。 将 唾液 酸 糖 蛋白 与 多 聚 赖 氨 酸 偶 联 通过 与 肝 的 唾液 酸 糖 蛋白 受 体 相 结合 转移 大 肠 杆 菌 久 半 乳糖 苷 酶 基因 至 鼠 肝 细胞 , 约 有 0.1% 肝 细胞 被 转 染 并 检测 到 低 水 平 的 有 B 半 乳糖 苷 酶 。 这 种 受 体 介 导 的 基因 转移 系统 与 腺 病毒 的 核 内 溶 胞 能 力 相 结合 ,可 促进 DNA 转移 至 肝 细 胞 并 产生 高 水 平 基因 表达 。 (五 ) 其 他 细胞 用 反 转 录 病 毒 载体 介 导 的 基因 转移 至 离 体 的 猪 与 大 内 皮 细 胞 ,自体 内 皮 细 胞 移植 后 ,外 源 基 因 表 达 可 持续 1 一 2 个 月 。 内 上 色 细 胞 分 泌 抗 凝血 因子 以 抑制 所 在 部 位 血栓 形成 ,血管 内 皮 细 胞 只 有 一 层 , 广 泛 分 布 , 数 目 有 限 及 局 部 作用 的 特点 限制 了 这 一 实验 的 实用 性 。 肿瘤 浸润 的 淋巴 细胞 (TIL) 以 专门 攻击 肿瘤 为 其 突出 的 特点 。 在 体外 用 反 转 录 病 毒 载 体 转 染 TIL, 扩 增 后 再 输 回 患者 体内 , 受 转 染 的 TIL 在 患者 体内 尤其 是 肿瘤 部 位 持续 存在 ， 未 见 明 显 副 作用 。 细 胞 携带 肿瘤 坏死 因子 基因 ,分 泌 的 肿瘤 坏死 因子 可 杀伤 肿瘤 细胞 。 四 、 基 因 治 疗 的 应 用 在 ADA 基因 缺陷 病 基 因 治 疗 取得 成 功 的 激励 下 ,世界 各 国 迅速 开展 了 广泛 的 研究 。 下 面 是 当时 开展 研究 的 一 些 情 况 ( 表 15$-1、15-2)。 表 15-1 美国 基因 治疗 的 疾病 (29 种 ) 产品 名 公 可 适应 证 开发 阶段 AAVCFTR Targeted RE HEAT AE ARIE SER 工期 临床 AD-P53 Introgen 非 小 细胞 型 肺癌 工期 临床 Therapeutics 头颈 部 癌症 抗 HIVT 细胞 治疗 Cell Genesys HIV 感染 1/1 Sai CFTR 腺 病毒 载体 Genetics aE HE SFE AE YE T/T Si Be Therapy CFTR 基因 治疗 Genzyme 襄 性 纤维 变性 I 期 临床 bites FF ite Genetize 化 疗 癌症 患者 工期 临床 胞 喀 喧 脱 氨 酶 基 GenVce 结肠 瘤 工期 临床 因 - 酶 病毒 载体 DA/Hu(r). 15 转 导 自 体 肿瘤 细胞 ;ITAT Chiron Viagene 转移 性 凤 细 胞 瘤 I 期 临床 KH 产品 名 “Zw 适应 证 开发 阶段 DA/Hu(r). 15 转 导 自 Chiron 扩散 的 恶性 黑 工期 临床 体 肿瘤 细胞 ;ITAT Viagene few DA/Hu(r). 15 转 导 自 Chiron 扩散 的 恶性 黑 工期 临床 自体 肿瘤 细胞 和 表达 7 于 扰 素 的 ”Viagene 色素 瘤 自体 肿瘤 细胞 DA/XHu(r). 15 转 导 自体 肿瘤 细 Chiron 成 神经 细胞 瘤 工期 临床 胞 ;ITAT Viagene hIFN-g 反 转 录 病 Chiron BER AR 工期 临床 毒 载体 Viagene 葡 糖 脑 苷 酯 酶 基 Genetic Gaucher 病 工期 临床 因 一 反 转 录 酶 病 Therapy 毒 载 体 GV-10 GenVec REEF EH 1 aK HIV-IT I II B env/re Chiron 无 症状 HIV 感染 工期 临床 反 转 录 病 毒 载体 Viagene HIV-IT(V) Retro Chiron 无 症状 HIV 感染 工期 临床 VectorIM 转 导 的 自体 成 维 细胞 Viagene HIV-IT(TAF) Genetic 成 人 脑 瘤 1/0 /0 i HS-tk Therapy 儿童 脑 瘤 1/0 /期 临床 寄生 虫 病 工期 临床 IC-imm 反 转 录 Targeted HIV 感染 工期 临床 病毒 载体 Genetics IL-2 基因 修饰 的 肿瘤 RPR Gencell FL ARS 工期 临床 Lg-GC 反 转 录 病 毒 Targeted Gaucher 病 工期 临床 Genetics LN-CTL 反 转 录 病 毒 HIV 感染 工期 临床 MDR 反 转 录 病 毒 载体 Genetech Therapy FLARE 工期 临床 MDRxL™ Ingenex 保护 造血 干细胞 免 受 化 疗 毒性 工期 临床 携带 TNF 反 转 录 病 毒 载体 Chiron 黑色 素 瘤 工期 临床 RGG-0853, ELA Chiron 5D Se Al FL Be 工期 临床 ( 脂 复 合 物 ) RV-AS-KRAS Introgen 非 小 细胞 型 肺 冯 工期 临床 Therapeutics RV-p53 Introgen AE Ay 4 Hl 2 Bh 8 工期 临床 Therapeutics RPR Gencell tgAAVCF Targeted REED EEE 1/0 Se Genetics 表 15-2 ”美国 反 义 治 疗 产品 (6 种 ) 产品 名 称 公 司 适应 证 开发 阶段 GEM91 Hybridon HIV 感染 ,AIDS I] 3A its ISIS2302 Isis Pharmaceutical 炎症 性 疾病 T1335 is BK ISIS2922 Isis Pharmaceutical AIDS 患者 的 巨细 胞 病毒 焉 期 临床 (CMV) 视网膜 炎 hr, ottem 第 十 五 章 ” 人 类 基因 诊断 与 治疗 + 215- 续 表 产品 名 称 a FW 适应 证 开发 阶段 ISIS3521 - Isis Pharmaceutical 癌症 I 期 临床 ISIS5132 Isis Pharmaceutical 癌症 工期 临床 LR-3001 Lynx Therapeutics 慢性 骨 允 性 白血病 进展 期 工期 临床 (一 ) 遗传 性 疾病 的 基因 治疗 这 一 方面 的 研究 多 半 属 于 单 基 因 缺 陷 所 引起 疾病 的 基因 治疗 ,主要 有 中 血 友 病 : 骨 -C ( 促 凝 成 分 ) 和 因子 缺陷 症 ; 包 免疫 缺陷 病 : 腺 苷 酸 脱 氨 酶 (ADA) 缺 陷 症 、 嗓 叭 核 苷 磷酸 酶 (PNA) 缺 陷 症 ;@ 和 贫血 :8B- 地 中 海 贫血 、 镰 刀 型 红细胞 贫血 ;四 肺 气 肿 :m- 抗 胰 和 蛋白 酶 缺陷 症 ; 回 溶 酶 体 储 藏 障碍 :葡萄 糖苷 酯 酶 缺陷 症 (Ganoher 病 );@ 其 他 代谢 病 : 如 葵 丙 氨 酸 化 酶 (PAH) 缺 陷 症 、 次 黄 味 叭 乌 味 叭 磷酸 核糖 转移 酶 (HGP) 缺 陷 症 等 。 (二 ) 恶性 肿瘤 的 基因 治疗 在 美国 和 德国 科学 家 进行 了 大 量 的 预备 性 实验 后 ,美国 NIH 的 科学 家 进一步 构建 重组 的 TIL( 肿 瘤 浸 润 淋巴 细胞 ) ,它们 能 表达 100 倍 于 正常 水 平 的 TNF。1990 年 11 月 ,他 们 获 准 用 表达 TNF 和 TIL 治疗 黑色 素 瘤 ,临床 实验 的 人 数 由 开始 的 2 例 增 至 50 例 。 另 外 ,用 表达 IL-2`IFN-2a 和 IL-l 的 TIL 治疗 神经 细胞 瘤 及 白血病 等 的 工作 也 开展 了 起 来 。 美 国 还 应 用 反 转 录 病 毒 将 毒素 基因 ( 若 麻 毒素 和 骨 人 灰 质 炎 病毒 毒素 中 所 含 的 一 种 蛋白 酶 的 基 困 ) 导 入 癌 细 胞 内 ,在 靶 细胞 内 表达 毒素 并 挥发 杀伤 作用 ,但 对 其 他 细胞 毒性 较 低 。 而 且 这 类 载体 已 被 改造 成 只 攻击 带 有 特殊 标志 的 细胞 ,也 可 运送 常规 的 治疗 蛋白 。 该 研究 在 基因 治疗 上 发 挥 了 分 子 导 向 的 思想 ,给 人 以 启示 。 (=) 传染 病 的 基因 治疗 对 于 不 治之 症 艾 滋 病 ,美国 科学 家 用 重组 反 转 录 病 毒 将 CD4 分 子 导 人 人 上 皮 细 胞 及 小 鼠 成 纤维 细胞 使 之 表达 ,试图 抑制 艾滋 病 病 毒 HIV。 类 似 的 方法 还 被 用 于 治疗 人 乳头 瘤 病 毒 \ 巨 细胞 病毒 及 肝炎 病毒 的 感染 。 此 外 ,还 研究 了 一 种 药物 作用 系统 ,将 一 段 酶 序列 基因 插 人 受 感 Fe OH Hd ,所 表达 的 酶 可 催化 无 活性 的 药物 原 体 转化 为 有 毒性 作用 的 形式 ,从 而 有 选择 地 杀伤 受 感染 细胞 以 避免 毒性 对 全 身 的 作用 。 还 有 将 编码 可 使 艾滋 病毒 HIV RNA 降解 的 核 酶 基因 转 染 入 淋巴 细胞 ,从 而 抑制 HIV 的 传播 。 又 将 HIV LTR-2’,5 BARRA RMAA RA HH HeLa-T4* 细胞 ,结果 经 修饰 的 带 有 CD4 受 体 的 这 种 细胞 具有 抗 HIV 感染 的 作用 。 (四 ) 其 他 基因 治疗 在 糖尿 病 治疗 研究 中 ,日 本 科学 家 将 表达 人 胰岛 素 的 组 织 培养 细胞 植 人 患 糖尿 病 小 鼠 的 腹腔 内 ,结果 植 和 人 的 细胞 存活 并 分 记 胰 岛 素 ,使 小 鼠 血糖 水 平 明 显 下 降 。 用 基因 治疗 技术 治疗 肌 营 养 不 良 ` 骨 质 疏 松 、 类 风湿 关节 炎 及 中 枢 神 经 系统 疾病 等 研究 亦 在 进行 中 。 -216- 基因 工程 学 五 、 基 因 治 疗 的 现状 和 展望 多 年 来 的 探索 , 基因 治疗 取得 较为 满意 的 结果 ,除了 ADA 基因 缺陷 病 之 外 ,还 有 LDLR( 低 密度 脂 蛋 白 受 体 基 因 ) 缺 陷 症 `B 型 血 友 病 等 。 对 于 前 者 主要 办 法 是 导入 DLR 正常 基因 并 使 之 表达 ,弥补 该 受 体 的 缺 如 ,进而 使 LDL 经 受 体 结合 与 介 导 而 被 降解 。 对 于 后 者 ,主要 是 导入 病人 所 缺少 的 IX 因子 基因 并 使 之 表达 ,从 而 取得 疗效 。 应 用 TK 基因 直 接 导 入 脑 瘤 病 灶 , 也 有 较 好 的 效果 。 当前 普遍 认为 , 除 某 些 单 基因 遗传 病 的 基因 疗法 效果 较 好 外 ,其 他 基因 治疗 的 效果 不 佳 。 主 要 原因 是 对 于 有 关 疾 病 的 发 生机 制 了 解 尚 属 粗浅 ,治疗 方案 在 技术 上 也 竺 改进 。 据 认 为 ,原来 所 前 明 的 遗传 性 疾病 ,大 多 数 是 单 基 因 人 缺陷 的 疾病 。 原 以 为 与 遗传 基因 无 关 的 疾病 ,当前 认为 ,不 仅 与 一 个 基因 有 关 ,而 且 往往 同 多 个 基因 有 关 , 甚 至 同 某 一 个 或 某 几 个 基因 网 络 相关 ,并 被 称 为 多 基因 疾病 ,如 亚 性 肿瘤 ` 心 脑 血管 疾病 .自身 免疫 病 . 内 分 刻 疾 病 等 等 。 因 此 ， 在 考虑 基因 治疗 的 方案 时 ,事先 需要 考虑 的 问题 ,其 涉及 面 将 深 广 得 多 。 如 家 族 性 高 血压 ,当前 已 知 与 多 达 30 多 个 基因 有 关 。 而 且 , 有 的 与 肾 素 -血管 紧张 素 -醛固酮 代谢 系统 相关 ;有 的 则 与 糖 代谢 系统 相关 ,如 胰岛 素 受 体 缺陷 ,有 的 则 与 循环 系统 ,甚至 与 神经 系统 相关 。 在 大 约 6000 种 遗 传 性 疾病 中 , 单 基 因 疾 病 仅 占 70% 。 基 因 治 疗 是 一 种 基于 分 子 遗 传 学 的 生物 高 技术 ,对 于 相关 的 基础 理论 知识 如 果 掌 握 得 不 够 ,也 就 很 难 设计 出 可 以 达到 十 分 满意 疗效 的 技术 方案 。 对 亚 性 肿瘤 进行 基因 治疗 的 探索 最 为 广泛 ,总 的 看 来 ,疗效 不 能 令 人 满意 。 具 体 的 治疗 方 案 可 以 分 为 两 类 。 一 是 杀 灭 肿瘤 细胞 的 基因 疗法 。 采 取 这 一 疗法 时 ,一般 都 进行 基因 的 靶 向 性 设计 。 但 除了 导入 p53 抗 瘤 基 因 在 某 些 情 况 下 有 一 定 的 疗效 之 外 ,大 部 分 的 临床 实验 结果 不 理想 。 而 且 ,可 能 用 于 靶 向 性 设计 的 ,能 够 强烈 杀 灭 瘤 细胞 的 可 用 基因 并 不 多 。 男 一 种 办 法 是 把 可 提高 机 体 免 疫 力 的 基因 导入 体内 ,以 通过 提高 机 体 的 免疫 力 而 控制 肿瘤 的 发 展 或 逐步 缩小 肿瘤 。 但 往往 在 动物 模型 上 进行 的 试验 效果 较 好 ,同样 的 方案 用 于 肿瘤 病人 的 临床 试验 ， 则 效果 不 佳 。 可 能 是 因为 动物 实验 的 荷 瘤 动 物 ,其 免疫 系统 尚未 遭 到 严重 的 破坏 ,以 提高 免疫 力 为 目标 的 基因 疗法 能 够 得 到 较 好 的 结果 。 而 患 有 恶性 肿瘤 的 病人 ,往往 其 免疫 系统 已 经 遭 到 了 比较 严重 的 破坏 ,以 致 采取 提高 免疫 力 的 疗法 ,不 能 取 到 如 期 的 效果 。 因 此 ,有 人 主张 ,在 采用 这 一 疗法 之 前 ,要 首先 研究 具体 治疗 对 象 本 身 免 疫 系统 的 实际 状况 ,再 来 分 析 与 决定 采取 提高 免疫 力 的 基因 疗法 是 否 可 取 。 这 就 是 说 ,提高 免疫 力 的 基因 疗法 要 个 体 化 。 目前 ,已 应 用 的 基因 治疗 方案 ,在 理论 和 技术 上 还 存在 不 少 问题 。 为 了 推动 基因 疗法 的 发 展 ,强化 基础 理论 研究 与 改进 已 有 技术 的 研究 ,都 是 十 分 重要 的 。 为 此 ,在 大 力 推进 人 类 基因 组 的 研究 计划 中 ， 研究 疾病 ,特别 是 多 基因 疾病 与 相关 基因 的 关系 的 命题 悄然 兴起 ,而 且 研究 得 如 火 如 茶 。 在 技术 研究 方 面 ,已 经 发 展 出 多 种 目的 的 基因 载体 ,各 有 优 缺 点 。 而 且 , 着 力 发 展 非 病 毒 载体 的 基因 疗法 。 总 的 看 来 ,基因 治疗 的 探索 尚 处 在 初步 阶段 , 通 向 真正 成 功 的 道路 是 漫长 的 。 但 它 标志 着 临床 医学 的 一 次 历史 性 变革 。 人 们 预期 , 它 将 可 能 在 不 远 的 将 来 ,成 为 临床 医学 中 的 一 种 常规 疗法 ,前 景 光 明 ,道路 曲折 。 ee ee SB T+7\S DNA Sarit Chapter16. DNA Polymorphism 随 着 人 类 基因 组 计划 (human genome project,HGP) 的 实施 和 完成 ,人 类 DNA 序列 已 基 本 清楚 ,并 由 此 延伸 出 许多 新 的 研究 分 支 , 如 功能 基因 组 学 (functional genomics) 和 基因 组 序 列 变异 的 研究 。 基因 组 序列 出 现 变异 是 基因 组 在 遗传 学 上 的 基本 特征 之 一 , 它 是 人 类 进化 和 适应 环境 的 必然 结果 。 基 因 组 中 的 这 种 变异 ,赋予 生物 医学 家 以 靳 新 的 思想 ,从 而 从 这 些 差 异 中 发 现 了 人 类 之 中 各 种 生物 学 现象 的 奥秘 ,如 健康 状况 \、 对 疾病 的 易 感 性 .寿命 的 长 得 \ 人 类 的 起 源 等 等 。 这 些 对 于 人 类 认识 自己 的 遗传 背景 和 据 此 采取 保护 措施 具有 十 分 重要 的 意义 。 研究 基因 组 差异 如 果 直 接 从 大 规模 全 序列 比较 显然 难以 做 到 ,但 可 从 均匀 分 布 于 基因 组 的 具有 代表 性 差异 位 点 开始 ,密度 不 断 增加 ,最 终 找 到 存在 于 所 有 人 中 的 各 种 DNA 序列 差异 ,这 就 是 DNA 多 态 性 (DNA polymorphism) 。 DNA 多 态 性 的 研究 始 于 20 世纪 80 年 代 , 大 致 可 分 为 三 个 阶段 :限制 性 片段 长 度 多 态 性 、 微 卫星 DNA AMAR ERE SH. 第 一 节 DNA 多 态 性 研究 概述 一 、 限 制 性 片段 长 度 多 态 性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms) , 即 限制 性 片段 长 度 多 态 性 ,是 最 早 用 来 研究 DNA 多 态 性 的 方法 。 利 用 DNA 限制 性 片段 长 度 多 态 性 的 基因 连锁 分 析 , 主要 是 应 用 DNA 内 切 酶 对 不 同 DNA 样品 中 的 等 位 基因 进行 酶 切 分 析 , 不 同 个 体 之 间 等 位 基因 被 酶 切 的 结果 在 长 度 上 不 同 ,再 结合 基因 连锁 分 析 , 可 以 了 解 某 一 特定 基因 在 人 群 中 的 变化 。 1987 年 ,第 一 张 较 完整 的 人 基因 连锁 图 绘制 成 功 , 共 确定 了 500 多 个 RFLP 位 点 ,并 定位 了 Huntington 病 \、CF( 言 性 纤维 化 ) 和 多 个 癌 相 关 基 因 。 二 、 微 卫星 DNA 微 卫 星 DNA 是 广泛 存在 于 原核 及 真 核 生物 基因 组 中 的 一 种 串联 重复 序列 ,其 中 ,近年 发 现 的 短 串 联 重复 序列 (short tendem repeats) ,和 可 变数 目 串 联 重复 序列 (variable number tandem repeats ,VNTRs) ,已 发 展 为 一 种 新 型 的 DNA 高 度 多 态 性 遗传 标记 系统 。 STRs 和 VNTRs 的 共同 特征 是 :由 2 一 70bp 的 核心 序列 (基本 单位 ) 呈 串联 重复 多 次 ， oe - 218: 基因 工程 学 中 间 没 有 间隔 ,总 长 度 一 般 小 于 1kb。 但 二 者 的 核心 序列 长 度 不 同 。 STR ,又 称 为 微 卫星 DNA(mini-satellites DNA) ,其 基本 单位 是 1bp 一 8bp 的 串联 重复 ， 每 个 微 卫 星 DNA 的 核心 序列 结构 相同 ,重复 单位 数目 约 15$ 一 60 个 。 目 前 已 知 的 STR 有 8000 多 个 ,主要 形式 为 :(CA) mm (GA) n, (AA) 2, (GG) n, (CAA) n, (CGG) ,其 中 以 (CA)2,(GT)7 为 多 见 。STRs 广泛 存在 于 人 类 基因 组 , 约 占 5% ,其 多 态 性 主要 来 源 于 串联 数目 的 不 同 。1992 年 ,Welssenbanch 等 以 STR 为 标记 制作 第 二 代 连 锁 图 取代 了 RFLP 连锁 图 。 VNTR, XA) LB DNA(small-satellites DNA)。 每 个 VNTR 都 含有 10~ 15bp Ray — 序列 ,这 类 重复 可 能 来 源 于 减 数 分 裂 期 间 的 同 源 染 色 体 或 染色 体内 部 的 不 对 等 交换 。 VNTR 与 STR 比较 类 似 , 但 是 重复 顺序 更 长 ;多 态 性 及 分 布 方面 不 如 STR ,因而 VNTR 作 为 遗传 标记 只 是 一 种 过 渡 ,目前 已 较 少 使 用 ,但 是 ,VNTR 曾经 对 STR 的 基因 定位 运用 起 到 推动 作用 。 作为 一 种 新 型 的 DNA 多 态 性 遗传 标记 , 微 卫星 DNA 具有 种 类 多 、 分 布 广泛 \ 高 度 多 态 性 和 杂 合 性 高 .重组 频率 低 的 特点 ,有 高 度 的 个 体 特异 性 ,遵循 重 德尔 共 显 性 遗传 定律 , 随 着 它 的 广泛 发 现 和 应 用 ,使 得 人 们 加 快 了 疾病 相关 基因 定位 、 分 离 、 克 隆 和 筛选 的 研究 步伐 。 =. PRP RE SHE 5EAY FF IR & ASHE (single nucleotide polymorphism, SNP) # A 4& 30 亿 个 碱 基 对 在 排列 顺 序 中 出 现 的 个 体 差异 。 在 不 同人 的 同一 条 染色 体 和 同一 个 位 置 的 核 苷 酸 序列 中 ,可 能 绝 大 多 数 核 苷 酸 排列 序列 一 致 ,只 有 一 个 地 方 的 核 苷 酸 序列 不 同 , 这 种 现象 就 是 “ 单 核 苷 酸 多 态 TE”. 在 DNA 多 态 性 的 不 同 表现 形式 (如 点 突变 、 插 和 人、 缺失 和 不 同 数目 串联 重复 等 ) 中 ,以 单 核 苷 酸 多 态 性 发 生 频 率 最 高 , 它 是 人 类 可 遗传 的 变异 中 最 常见 的 一 种 , 占 所 有 已 知 多 态 性 的 90% 以 上 。1996 年 ,Lander 成 功 地 用 单 核 苷 酸 多 态 性 作为 遗传 标记 制备 第 三 代 遗 传 连 iF. 随 着 对 SNP 检测 和 分 析 技 术 的 进一步 发 展 ,尤其 是 与 DNA 芯片 等 技术 的 结合 COM 为 第 三 代 遗 传 标 记 ,SNP 的 深入 研究 可 以 为 新 的 诊断 方法 治疗 方法 提供 基础 ,同时 也 是 群 体 研 究 中 探索 及 说 明 新 基因 功能 的 一 个 极其 有 效 的 工具 。SNP 可 以 满足 对 疾病 相关 基因 定位 研究 的 需要 ,尤其 是 对 多 基因 焉 传 病 高 精度 基因 定位 的 要 求 , 并 将 最 终 取 代目 前 最 常用 的 微 卫星 标记 技术 进入 基因 应 用 研究 的 领域 ,对 药物 基因 组 学 ` 诊 断 学 和 生物 医学 领域 的 研 究 起 重要 作用 。 第 二 站 ” 单 核 苷 酸 多 态 性 、 单 核 苷 酸 多 态 性 的 概念 PR AT WRB ASE , 指 基 因 组 序列 中 的 由 单个 核 苷 酸 的 变异 所 引起 的 DNA 序列 多 态 性 。 | wp 第 十 六 章 ”DNA 多 态 性 .219 . 和 狗 如 一 个 SNP 可 能 把 DNA 的 序列 AAGGCTAA 改变 为 ATGGCTAA。 人 类 基因 组 的 30 亿 A AEH ,许多 SNP 不 影响 细胞 功能 ,但 科学 家 认为 有 些 可 能 会 使 人 易 患 病 或 影响 对 药物 的 敏感 性 。 SNP 所 表现 的 多 态 性 只 涉及 单个 碱 基 的 变异 ,一般 只 有 两 种 碱 基 组 成 ,所 以 SNP 是 一 种 二 态 的 标记 , 即 二 等 位 基因 (biallelie) ,又 称 为 SNP 的 二 态 性 。SNP 的 这 种 变异 多 由 单个 碱 基 的 转换 (transition ) 或 颠 换 (transversion) 引 起 ,其 中 转换 与 颠 换 之 比 大 约 2:1。SNP 在 GCG 序列 上 出 现 最 为 频繁 ,而 且 多 是 C->T, 原 因 是 CG 中 的 C 即 胞 喀 啶 常 甲 基 化 , 甲 基 化 的 胞 喀 啶 自发 脱 所 后 即 成 为 胸腺 喀 啶 。 在 基因 组 DNA 中 ,任何 碱 基 均 有 可 能 发 生变 异 , 因 此 SNP 既 有 可 能 在 基因 序列 内 ,也 有 可 能 在 基因 以 外 的 非 编 码 序列 上 。 位 于 编码 区 内 的 SNP, 称 为 编码 区 SNP(coding SNP, cSNP)。 尽 管 cSNP 比较 少 ,但 它 在 遗传 性 疾病 研究 中 却 具 有 重要 意义 。 eSNP 分 为 同 义 cSNP(synonymous cSNP) 和 非 同 义 cSNP (non-synonymous cSNP) 两 种 。 同 义 cSNP 中 发 生 无 意义 突变 , 即 突变 碱 基 与 未 突变 碱 基 的 含义 相同 ,因而 同 义 cSNP 突变 导致 的 编码 序列 的 改变 并 不 影响 其 所 翻译 的 和 蛋白质 的 氨基 酸 序列 。 非 同 义 cSNP 中 发 生 了 有 意义 碱 基 突 变 , 使 得 其 编码 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 发 生 改 变 , 从 而 影响 了 蛋白质 的 功 能 。 这 种 改变 常 是 导致 生物 性 状 改变 的 直接 原因 。cSNP 中 约 有 一 半 为 非 同 义 cSNP。 二 、SNP 作为 遗传 标记 的 优势 SNP 自身 的 特性 决定 了 它 比 RFLP 和 微 卫 星 多 态 性 标记 更 适合 于 对 复杂 性 状 与 疾病 的 遗传 解剖 以 及 基于 群体 的 基因 识别 等 方面 的 研究 ,SNP 的 应 用 对 群体 遗传 学 .制药 业 法 医学 癌症 及 遗传 性 疾病 甚至 进化 的 研究 都 将 产生 不 可 估量 的 影响 。 (1) SNP 数量 多 ,分布 广泛 。 据 估计 ,人 类 基因 组 中 每 1000 个 核 苷 酸 就 有 一 个 SNP, 人 类 30 亿 碱 基 中 共有 300 万 以 上 的 SNP. (2) SNP 易于 进行 自动 化 分 析 , 适 于 快速 规模 化 筛 查 ,缩短 了 研究 时 间 。 由 于 SNP 具 有 二 态 性 , 非 此 即 披 ,在 基因 组 筛选 中 SNP 往往 只 需 有 或 无 的 分 析 , 而 不 用 分 析 片 段 的 长 BE ,这 就 利于 发 展 自动 化 技术 筛选 或 检测 SNP. (3) SNP 具有 高 度 的 稳定 性 ,研究 表明 , 单 核 苷 酸 多 态 性 存在 于 生殖 细胞 中 ,并 可 以 全 部 从 上 一 代 传 给 子 代 ,因而 不 会 因 突 变 而 造成 对 人 群 遗 传 分析 的 困难 。 (4) 部 分 位 于 基因 内 部 的 SNP 可 能 会 直接 影响 产物 蛋白 质 的 结构 或 基因 表达 水 平 , 因 此 ,它们 本 身 可 能 就 是 疾病 遗传 机 制 的 候选 改变 位 点 。 SOR PRAY TF BR AS 性 的 研究 意 Bt ML 单 核 苷 酸 多 态 性 是 人 类 基因 组 DNA 序列 变异 的 主要 形式 ,在 人 类 基因 组 中 广泛 存在 ， 具有 很 高 的 信息 含量 ,与 人 类 性 格 .身高 .长 相等 个 体 差 异 有 关 , 是 决定 人 类 疾病 (尤其 是 多 基因 疾病 ) 易 感性 和 药物 反应 性 差异 的 核心 信息 ,同时 , 某 些 SNP 的 频率 在 不 同 民族 .人 和 群 有 明显 差异 ,甚至 部 分 SNP 显示 群体 专 一 性 。 这 就 使 得 SNP 对 生物 医学 研究 药物 开发 、 . - 2200: 基因 工程 学 ts 除了 基因 制药 ` 诊 断 .生物 医学 研究 方面 的 应 用 ,SNE 谱 还 有 望 被 用 来 识别 基因 组 上 成 千 上 万 个 附加 标记 ,以 简化 HGP 研究 者 绘制 的 很 大 的 基 本 (一 ) SNP 与 疾病 的 关系 基因 在 决定 个 体 的 正常 表 型 , 即 形态 、 代 谢 和 免疫 状态 等 方面 起 着 决定 性 的 作用 。 通 过 赋予 个 体 对 疾病 的 易 感 性 或 抵抗 力 , 以 及 影响 机 体 与 环境 因素 的 相互 作用 ， — 病 的 发 生发 展 起 着 重要 作用 。 复杂 的 多 基因 疾病 ,如 癌症 糖尿病、 血管 性 疾病 和 某 些 精神 性 疾病 ,很 难 用 传统 寻找 基 因 的 方法 来 确定 ,因为 仅仅 一 个 基因 的 改变 对 其 影响 不 大 。 随 着 SNP 的 不 断 发 现 和 大 类 第 三 代 遗 传 标记 图 的 绘制 ,现在 已 有 可 能 描绘 在 某 一 疾病 发 病 时 或 发 育 阶 段 中 多 个 基因 位 点 甚至 整个 基因 组 的 状态 ,从 而 对 复杂 的 多 基因 病 产 生 更 深 的 认识 。 目 前 利用 SNP 可 以 在 以 下 几 个 方面 发 挥 作用 : (1) 确定 疾病 相关 基因 :进行 简单 和 复杂 疾病 的 遗传 连锁 分 析 (linkage analysis) 及 关联 分 析 (association analysis) ,用 于 疾病 易 感 基因 定位 ;而 且 其 定位 的 精度 将 比 微 卫 星 标 记 精 细 得 多 ,可 直接 用 于 指导 易 感 基因 克隆 。 (2) 寻找 可 以 带 来 新 治疗 方案 的 靶 基因 。 (3) 发 现 预 测 治疗 效果 的 基因 。 (二 ) SNP 与 环境 的 关系 人 们 已 经 发 现 不 同 种 族 . 不 同人 群 对 外 界 环 境 因素 变化 的 反应 不 同 , 痔 明 这 一 现象 的 本 JA RIF XT SNP 的 研究 。 在 疾病 发 生 BE A at FBP SR a RE Ot BO A EY DE ii EA. 易 感 性 的 遗传 基础 是 基因 组 的 结构 差异 或 (和 ) 表 达 差 异 。 对 于 大 多 数 多 基因 疾病 ,一 些 基 因 的 基因 多 态 性 不 一 定 与 疾病 的 易 感 性 直接 有 关 。 但 是 疾病 一 旦 发 生 , 这 些 基 因 多 态 性 对 其 编码 蛋白 质 的 不 同 影 响 , 将 会 使 疾病 的 临床 表 型 在 不 同 基因 型 的 个 体 之 间 出 现 差 异 ， SNP 有 助 于 阐明 这 些 差异 。 人 类 的 易 感 性 也 并 不 完全 由 基因 决定 。 在 环境 致 病因 素 作 用 下 的 基因 表达 差异 起 着 更 为 重要 的 作用 。 随 着 DNA 芯片 在 基因 表达 研究 中 进一步 应 用 ,在 理论 上 只 需 很 少 的 个 体 或 标本 就 可 确定 环境 因素 对 基因 组 表达 的 影响 并 找 出 易 感 基因 。 (三 ) SNP 与 个 体 化 治疗 基因 多 态 性 造就 了 人 与 人 之 间 在 临床 表 型 (clinical phenotype) 上 的 个 体 差异 性 。 在 基 因 多 态 性 研究 的 引导 下 ,临床 医师 将 有 可 能 预测 不 同 的 个 体 在 同样 的 致 病 条 件 下 会 出 现 什 么 样 的 病理 反应 和 临床 表现 ,也 就 是 不 同 的 临床 表 型 ,不论 在 疾病 的 预防 和 治疗 上 都 能 采取 更 具 个 体 化 的 措施 。 因此 ,从 临床 研究 出 发 ,根据 疾病 病理 生理 特征 性 改变 ,选择 合适 的 候选 基因 分 析 其 多 态 性 与 临床 表 型 (症候 、 转 归 治疗 反应 ) 之 间 的 联系 ,将 为 临床 上 从 基因 水 平 认 识 多 基因 疾 ( j i | | | | Hs W. ts FAR eS A) AS Wo I Ay He PE HR AB Ta BE EE Th (四 ) SNP 与 药物 的 关系 同一 种 药物 用 于 同一 种 疾病 的 不 同 病 人 ,效果 不 同 ,造成 这 种 差异 的 原因 是 由 于 药物 本 身 在 不 同 个 体 体 内 活化 、 代 谢 、 清 除 方面 的 差异 所 决定 的 ,而 这 种 差异 本 质 是 基因 差异 。 SNP 能 充分 地 反映 个 体 间 的 遗传 差异 。 通 过 研究 遗传 多 态 性 与 个 体 对 药物 敏感 性 或 耐 受 性 的 相关 性 ,可 以 阐明 遗传 因素 对 药物 效用 的 影响 ,从 而 指导 医师 根据 个 人 的 基因 特征 来 选 择 药物 及 药物 剂量 ,也 即 真 正 做 到 用 药 个 体 化 。 将 药物 疗效 与 基因 多 态 性 结合 起 来 ,有 可 能 找 出 某 些 特殊 人 和 群 。 在 他 们 身上 那些 被 临 床 试验 证 明 是 “无 效 " 的 药物 仍 可 能 发 挥 作 用 ,并 可 从 中 排除 那些 会 出 现 不 良 反 应 的 患者 。 这 将 会 大 大 提高 药物 效果 ,同时 减少 药物 不 良 反 应 的 发 生 。 目前 ,正在 兴起 的 “药物 基因 组 学 "(pharmacogenomics) 研 究 中 ,可 通过 检测 SNP 的 遗传 多 态 性 标记 揭示 人 和 群 中 不 同 个 体 对 不 同 药物 的 敏感 性 差异 的 根本 原因 ,为 临床 有 针对 性 地 合理 用 药 和 根据 不 同 基 因 型 群体 对 药物 的 反应 来 改进 药物 设计 提供 了 理论 依据 。 这 是 当前 制药 行业 对 SNP 表现 出 空前 兴趣 的 原因 。 (五 ) SNP 与 其 他 SNP 也 可 用 于 法 医 研究 中 的 罪犯 身份 的 鉴别 .亲子 鉴定 等 ,此 外 在 器 官 移植 中 供 体 和 受 体 间 的 配对 选择 及 物种 进化 的 研究 中 都 将 具有 重要 意义 。 PY. SNP 检测 方法 SNP 本 质 上 是 DNA 序列 中 单个 碱 基 的 置换 ,理论 上 任何 用 于 检测 单 碱 基 突 变 或 多 态 性 的 技术 都 可 用 于 SNP 的 识别 或 检 出 。 目前 已 有 多 种 方法 可 用 于 SNP 检测 ,但 不 管 哪 一 种 方法 ,首先 必须 进行 靶 序 列 的 扩 增 ， 然后 才能 进行 其 他 检测 。 传统 的 SNP 检测 方法 是 采用 一 些 已 有 的 成 熟 技 术 , 如 DNA 测序 、 限 制 性 酶 切片 段 长 度 多 态 性 (RFLP) . 单 链 构 象 多 态 性 (SSCP) .等 位 基因 特异 的 寡 聚 核 苷 酸 杂 交 (ASO) 等 。 这 些 技术 虽然 在 某 种 程度 上 能 完成 对 SNP 的 检测 ,但 由 于 它们 必须 通过 凝 胶 电泳 进行 检测 , 因 此 , 距 快 速 ,高效 、 自 动 化 的 目标 还 相差 甚 远 。 传 统 的 RFLP 只 能 检测 到 SNP 的 一 部 分 , 测 序 技术 既 费 时 费力 ,又 不 易 实 现 自动 化 ,而 且 DNA 链 的 二 级 结构 还 容易 造成 人 工 假 相 ,使 测序 结果 出 现 偏差 ,不 适宜 SNP 的 检测 。 目前 ,利用 现 有 技术 进行 大 规模 、 大 范围 内 检测 SNP 还 有 一 定 难 度 。DNA 芯片 可 能 为 SNP 的 研究 带 来 光明 前 景 。 DNA i (DNA chip) 技 术 是 近年 来 新 开发 的 一 种 DNA 序列 变异 检测 工具 。 其 主要 原理 是 在 一 块 小 硅 片 上 进行 微 阵 列 分 析 , 让 目标 DNA 与 密集 的 多 重 寡 核 苷 酸 阵 列 进行 杂 交 ,进而 检 出 SNP 的 有 效 方法 。 目前 已 有 多 家 公司 开展 了 对 芯片 的 研究 ,例如 Research Genetics 公司 新 近 开 发 了 1 个 -222- 基因 工程 学 集成 有 1500 个 SNP 的 DNA 芯片 , 它 涵盖 了 人 类 基因 组 全 部 24 条 染色 体 ,所 提供 的 信息 量 ， 至 少 等 于 或 优 于 目前 常用 的 300 一 400 个 微 卫 星 标记 的 图 谱 , 检 测 时 只 需 0.5ng 的 DNA 样 ， 品 就 可 进行 1 次 全 基因 组 的 扫描 。 五 、SNP 的 网 上 资源 “4 加 目前 已 有 许多 生物 医学 网 站 开辟 了 专门 的 SNP 网 页 ,可 以 很 方便 地 在 这 些 网 站 上 查阅 有 关 的 SNP 信息 。 国 际 上 较 重 要 的 网 站 有 :@ dbSNP(http:// www. ncbi. nlm. nih. govX SNP/) :该 网 站 是 由 美国 的 NCBI 主办 的 。 它 除了 可 接受 各 地 发 来 的 SNP 申请 注册 外 ,也 向 公众 免费 提供 对 SNP AY # i]. @QHGBASE (http: //hgbase. interactiva. de) :该 网 站 建 在 德国 ,收集 基因 内 SNP, 研 究 者 可 通过 检测 出 的 序列 查询 SNP. @ MIT SNP 数据 库 (http: //www-genome. wi. mit.edu /SNP/human/ index. html) :该 网 站 是 由 美国 麻 省 理工 学 1 院 建 立 的 。 它 包括 数 千 条 已 经 定位 的 SNP, 可 以 通过 指定 染色 体 的 某 一 区 域 查询 SNP. 此 外 ,可 供 利用 的 公开 SNP 网 上 资源 还 有 : 由 美国 国立 卫生 研究 院 (National Institute of Health，NIH) 提 供 的 主要 是 与 癌症 和 肿瘤 | ; 相关 的 候选 SNP 数据 库 : http: //cgap. nci. nih. gov/GAI | 由 人 类 基因 组 组 织 机 构 (Human Genome Organization, HUGO) 48 4) 2 28 BE: http: //ariel. ucs. unimelb. edu. au/cotton/mdi. htm . 由 美国 白头 研究 所 (Whitehead Institute for Biomedical Research Genome Institute) # 的 人 类 SNP 数据 库 : http: //www-genome. wi. mit. edu/SNP/human/index. html 由 华盛顿 大 学 (Washington University ) 支 助 的 按 染 色 体 位 置 组 织 的 SNP 数据 库 : http: //www. ibe. wustl. edu/SNP 由 瑞典 卡尔 林 斯 卡 研 究 院 (Karolinska Institute of Sweden) 建立 的 HGBase 数据 库 : http: //hgbase. cgr. ki. se/ 由 国际 医药 与 信息 加 工 公司 联合 组 成 的 SNP 研究 联盟 (The SNP Consortium, TSC) # LAY SNP BH es http: //snp. cshl. org/db/snp/map 由 美国 国立 环境 健康 科学 研究 院 (National Institute of Environmental Health Science) ¥ 助 的 犹他 州 大 学 SNP 数据库 : http:/Awww. genome. utah. edu/genesnps/ ( 马 春 红 ) S+ttS SEREX 方法 筛选 功能 基因 Chapter17. Screening of Target Genes by SEREX 人 类 基因 组 计划 的 核心 工作 是 DNA 测 序 ,然而 完成 人 类 全 基因 组 DNA 序列 的 测定 只 是 解密 人 类 遗传 密码 的 基础 ,更 重要 的 和 更 大 量 的 工作 是 功能 基因 组 的 研究 。 因 为 人 类 最 想 知 道 的 是 ,这 些 线性 排列 的 核 苷 酸 序列 最 终 是 如 何 实现 其 功能 的 。 虽然 大 规模 cDNA 测序 和 DNA 芯片 技术 加 快 了 新 基因 发 现 的 速度 ,但 由 于 缺乏 功能 方面 的 联系 ,因而 有 一 定 的 局 限 性 。 因 此 ,通过 功能 筛选 来 寻找 新 基因 渐渐 成 为 一 个 新 的 趋 势 。 利 用 生物 学 功能 表现 型 差异 组织 特异 性 、 细 胞 耐 药 性 和 免疫 原 性 等 特点 进行 大 规模 功能 基因 的 筛选 的 方法 近 些 年 来 层出不穷 。 这 些 方法 的 优点 是 由 于 筛选 本 身 是 与 功能 联系 在 一 起 的 ,因此 初 选 的 基因 与 功能 有 一 定 联 系 ,这 样 就 大 大 缩小 了 与 功能 研究 目标 的 距离 ， 加 快 了 功能 研究 的 速度 。 基于 基因 工程 学 原理 的 重组 CDNA 表达 文库 的 血清 学 分 析 法 (serological analysis of re- combinant cDNA expression libraries ,SEREX) 就 是 一 种 功能 基因 的 盘 选 方法 ,该 方法 利用 自 身 抗原 或 肿瘤 抗原 的 免疫 原 性 来 筛选 与 自身 免疫 病 或 肿瘤 相关 的 抗原 基因 ,然后 进一步 研 究 这 些 基因 与 自身 免疫 病 或 肿瘤 发 生 .发展 的 关系 ,为 疾病 治疗 芮 定 基础 。 本 章 以 SEREX 方法 筛选 肿瘤 抗原 基因 为 例 ,简单 介绍 基因 工程 学 技术 在 功能 基因 筛 选中 的 应 用 。 第 一 节 SEEREX 方法 原理 与 技术 步 又 一 、SEREX 方法 原理 SEREX 方法 的 理论 基础 是 人 体 的 也 淋巴 细胞 可 以 识别 自身 肿瘤 抗原 ,因此 肿瘤 患者 血 清 中 可 能 含有 肿瘤 抗原 的 相应 抗体 。 建 立 肿瘤 cDNA 表达 文库 ,使 肿瘤 抗原 浓度 成 百倍 的 增加 ,然后 用 肿瘤 患者 血清 筛选 文库 。 阳 性 克隆 中 插 和 的 cDNA 被 认为 可 能 是 对 应 于 肿瘤 抗原 的 编码 基因 ,进一步 分 析 阳 性 克隆 ,鉴定 出 相对 特异 的 肿瘤 抗原 基因 。 二 、SEREX 技术 步骤 (一 ) 建 库 WE tal AE AZAP 在 大 肠 杆菌 lacZ 启动 子 下 游 有 一 个 多 克隆 位 点 ,外 源 性 CDNA 可 插 人 该 - 223 - - 224: 基因 工程 学 位 点 ,从 而 在 感染 菌 或 诱导 的 溶 源 体 中 进行 表达 。 提 取 病 人 肿瘤 组 织 的 RNA, 分 离 纯化 其 中 的 mRNA, 合 成 cDNA 片段 。 反 转录 时 所 用 Oligo(dT) 引 物 带 有 Xno 工 酶 切 位 点 ,然后 两 端 连接 EcoR | 适 配 子 ,最 后 再 经 Xho 工 酶 酶 切 ,这 时 的 cDNA 一 端 是 Xho | BKM, A 端 是 EcoR | Bi7R i, CFE, cDNA 就 可 与 XZAP ME A TA RIAA) DNA 重组 。 重 组 子 经 过 体外 包装 ,可 获得 大 约 1 一 2Xx10" PFU AY ME BA TA ,构成 CDNA 表达 文库 (图 17-1 郊 Oligo(dT)linker-primer TTTTTTITTTTTGAGCTC 5f 信使 RNA 模板 Sf mRNA AAAAAAAAAAAA 3’ Reverse transcriptase 5-methyl dCTP dATP,dGTP.dTTP CH, CH, CH. CH CH, Xho if cDNA # ESR ie PLIT ECT errata Sig 5! RNA AAAAAAAAAAAA x RNase H DNA polymerase I dNTPs CH; CH; CH, CH, CH; Xho I cDNA 第 一 链 合成 ay TITTETIT CITT GAGCTC = 5 和 国生 ^^^^A^AAAAAAACTCGAG 3! EcoR | adapters T4 DNA ligase Eco R I CH, CH, CH, CH, CH, Xho if EcoR if 连接 EcoRI i G... TTTTTTTTTTTTGAGCTC... CTTAA 5 5'\ AATTCS.: DNA AAAAAAAAAAAACTCGAG ... G ay | Xho | restriction enzyme Eco R ] CH, Bick CH, CH, CH, Xho I Xho | 酶 切 3,! Ce TTTTTTTTTTTTGAGCT 3 5' AATTC... DNA AAAAAAAAAAAAC gt Completed unidirectional cDNA 图 17-1 cDNA 合成 流程 (=) Si FU Bt 2H Wie Bd AS Pe SR a , Be a TB GEE, PS FET OL BEI a, OE OEP SA AEA A) a 5, FE PH BE FB BRP PE AR ,经 病人 血清 孵育 后 再 用 碱 性 磷酸 酶 标记 的 羊 抗 人 IgG 孵育 ,然后 通过 碱 性 磷酸 酶 催化 的 显 色 反应 观察 病人 血清 与 膜 上 的 蛋白 成 分 是 否 发 生 血 清 学 反应 ,从 而 对 所 建 cDNA 文库 进行 免疫 筛选 。 第 一 轮 筛 选 所 得 阳性 克隆 再 进行 第 二 轮 或 第 三 轮 筛 选 ,直至 得 到 阳性 单 克 隆 第 十 七 章 ”SEREX DAMRDREBA - 225 . (=) UF 用 含有 阳性 重组 DNA 的 XZAP Mt Ba 8 A TB aS (8G US) Pe a, EE 所 用 的 AZAP Wee Ba AR BK AK DNA "Ff 2 A ee Ba AS of We a AS) 22 Ell (a SA I fh BAW FS see iY a, CET) — fe SE Ba PB a AR of 所 产生 的 复制 相关 基因 产物 可 以 识别 这 些 信 号 ,首先 在 XZAP WERK DNA 链 的 起 始 信号 部 位 造成 切口 ,然后 合成 单 链 DNA 的 反应 越过 多 克隆 位 点 (及 任何 插入 的 CDNA 序列 ) 而 止 于 下 游 终 止 位 点 。 其 中 一 些 子 代 分 子 可 环 化 并 包装 人 fl 颗粒 ,然后 从 感染 细胞 中 分 泌 。 这 个 过 程 被 称 之 为 XZAP We 体 载 体 DNA 的 体内 剪 切 。 这 些 分 泌 颗 粒 再 次 感染 细菌 后 ,进入 细胞 的 单 链 DNA 转变 为 带 有 ColE1 复制 起 点 的 双 链 分 子 , RAZ AME A AL pBK-CMV, ,可 按 一 般 质 粒 的 方式 进行 复制 , 且 可 用 常规 方法 加 以 扩 增 和 纯化 。 然 后 提取 质粒 DNA, 酶 切 鉴 定 后 对 插入 的 DNA 进行 测序 (图 17-2)。 MCS rt lacZ” lacZ 图 17-2 上 : ， 建 库 所 用 载体 AZAP 表达 载体 下 :体内 剪 切 后 形成 的 叭 菌 粒 pBK-CMV 含有 lacZ pr 启动 子 和 acZ HEA; MCS 中 含有 EcoR 工 和 Xho 工 酶 切 位 点 ; BA fl 丝 状 叭 菌 体 复 制 起 始 信号 I 和 终止 信号 T; & AME RE pBK-CMV 序列 (四 ) 生物 信息 学 分 析 使 用 BLAST 工具 把 测 知 的 DNA 序列 与 GenBank 中 的 数据 相对 照 , 以 确定 该 序列 是 否 是 一 新 基因 。 肿瘤 相关 基因 被 筛 选 出 来 之 后 ,可 通过 RT-PCR 和 Northern blot 技术 进一步 分 析 其 表 达 谱 ,观察 该 基因 在 人 体 各 组 织 和 肿瘤 组 织 中 的 表达 情况 ,以 判断 其 肿瘤 特异 性 ;或 者 进 一 步 分 析 该 基因 的 功能 ,阐释 其 与 肿瘤 发 生发 展 的 关系 。 - 226: 基因 工程 学 SOF SEREX 方法 所 筛选 的 肿瘤 相关 抗原 基因 目前 ,SEREX 方法 已 用 于 多 种 肿瘤 的 研究 ,包括 黑色 素 瘤 .食管 癌 、 肺 癌 、 星 形 细 胞 瘤 ， 神经 角质 瘤 、 胰 腺 癌 .前 列 腺 癌 、. 乳 腺 癌 、 白 血 病 、 脑 膜 瘤 、 头 颈 部 肿瘤 .胃癌 、 亚 性 间 皮 瘤 \ 肝 癌 、 肾 细胞 癌 、 结 肠 癌 和 卵巢 癌 等 。 现 已 鉴定 出 多 种 肿瘤 相关 抗原 基因 ,这 些 基因 大 多 数 在 SEREX 网 站 (http:/[www.licr.org/SEREX. html) 都 有 登陆 ,可 被 归纳 为 以 下 几 类 :CO CT 抗原 (cancer-testis antigens): 一 类 仅 出 现 于 某 些 肿瘤 组 织 及 正常 摆 丸 组 织 中 的 肿瘤 抗原 。 @ 突 变 抗原 :一 类 由 于 肿瘤 组 织 基 因 突 变 所 导致 肿瘤 相关 抗原 。@ 过 表达 抗原 :在 肿瘤 组 织 中 过 量 表达 ,超出 维持 机 体 自身 耐 受 而 诱发 免疫 应 答 的 自身 抗原 。 外 分 化 抗原 :高 表达 于 特 定 组 织 肿瘤 ,在 其 相应 正常 组 织 中 低 表 达 ,在 其 他 正常 组 织 或 其 他 肿瘤 中 不 表达 。 加 剪 切 变 异 抗原 :在 肿瘤 细胞 中 常 有 正常 基因 不 同 mRNA 剪 切 体 产 生 ,所 编码 的 新 的 变异 体 蛋 白 导 致 免 疫 应 答 。 有 一 些 SEREX 方法 所 筛选 的 肿瘤 相关 抗原 基因 又 被 做 了 更 进一步 的 研究 ， 尤其 是 CT 抗原 基因 ,由 于 它们 的 表达 主要 局 限于 肿瘤 和 淡 丸 等 生殖 系统 的 一 些 组 织 ,而 其 他 正常 组 织 不 表达 ,所 以 是 肿瘤 免疫 治疗 的 理想 靶 位 ,其 中 一 些 在 多 种 肿瘤 中 广泛 表达 的 CT 抗原 ,如 NY-ESO-1 已 被 作为 肿瘤 疫苗 用 于 临床 试验 。 由 此 可 见 ,利用 基因 工程 学 原理 设计 适当 功能 基因 筛选 方法 , 先 初 步 筛选 出 与 功能 有 一 定 联系 的 基因 ,这 样 就 大 大 缩小 了 与 功能 研究 目标 的 距离 ,可 以 尽快 地 用 于 临床 实践 ,从 而 提高 了 研究 的 效率 。 同 时 ,由 于 SEREX 方法 还 是 一 种 规模 筛选 方法 ,每 次 筛选 都 可 能 有 一 批 与 目标 功能 有 关 的 基因 被 发 现 , 这 也 就 加 快 了 发 现 新 功能 基因 的 速度 。 可 以 相信 , 随 着 大 规模 功能 筛选 技术 和 方法 的 不 断 改进 与 完善 ,发 现 有 功能 的 新 基因 的 速度 会 越 来 越 快 。 〈 石 永 玉 ) 第 十 八 章 ， 基因 误 除 与 转基因 扩 术 Chapter18. Gene Knockout and Transgenic Technique Zz TA ak RE (gene knockout) 2 VE 10 年 来 在 转基因 技术 和 人 工 同 源 重 组 技术 的 基础 上 发 展 起 来 的 高 新 生物 技术 ,又 称 基 因 打 靶 (gene targeting)。 这 种 技术 是 通过 基因 工程 的 方法 将 一 个 结构 已 知 但 功能 未 知 的 基因 去 除 ,或 用 其 他 序列 相近 的 基因 取代 (又 称 为 基因 敲 人 ， gene knockin) ,然后 从 整体 观察 实验 动物 ,从 而 推测 相应 基因 的 功能 。 这 种 人 为 地 把 实验 动 物 某 一 种 有 功能 的 基因 完全 缺失 的 技术 称 为 基因 痪 除 技术 。 该 项 技术 是 Marrio Capecchi 于 20 世 纪 80 年 代 末 在 犹太 州 (Utah) 大 学 发 展 起 来 的 ,实验 用 的 动物 通常 是 小 鼠 。 这 种 被 融 除 了 某 种 功能 基因 的 小 鼠 称 为 基因 逆 除 小 鼠 (knockout mice) 。 所 谓 转 基因 技术 ,是 指 利用 物理 、 化 学 和 生物 学 的 方法 将 人 工分 离 和 修饰 过 的 基因 导 和 人 到 生物 体 基 因 组 中 ,由 于 导入 基因 的 表达 引起 生物 体 性 状 的 可 遗传 性 修饰 ,并 能 稳定 地 遗传 给 后 代 ,从 而 建立 转基因 种 系 或 转基因 群 。 通 过 实验 导入 的 方法 使 外 源 基 因 在 实验 动物 染 色 体 基因 组 内 稳定 整合 ,并 遗传 给 后 代 , 这 种 稳定 整合 了 外 源 基 因 的 动物 称 为 转基因 动物 (transgenic animals) 。 SW FEA BRAY Be 2& A ax RAE 20 世纪 80 年 代 后 半期 应 用 DNA 同 源 重组 原理 发 展 起 来 的 一 门 新 技术 ,是 同 源 重组 技术 的 形象 说 法 , 即 是 将 外 源 DNA 与 受 体 细胞 基因 组 上 的 同 源 序列 之 间 发 生 重 组 ,并 整合 到 预定 位 点 上 ,使 受 体 细胞 特定 的 内 源 性 基因 被 破坏 ,而 不 累及 其 他 基因 ,从 而 改 变 细胞 的 遗传 性 状 而 造成 其 相应 的 功能 丧失 ,这 与 早期 生理 学 研究 中 常用 的 切除 部 分 -观察 整体 -推测 功能 的 三 部 曲 思想 相似 。 基 因 殴 除 不 仅 可 中 止 某 一 基因 的 表达 ,还 可 引入 新 基因 及 引入 定点 突变 , 既 可 以 用 突变 基因 刻 除 其 相应 的 正常 基因 ,也 可 以 用 正常 基因 殴 除 相应 的 突变 基因 。 根据 重组 后 靶 基因 的 特征 ,基因 敲 除 大 致 可 分 为 两 种 类 型 :四 基因 破坏 或 剔除 :由 于 外 源 序 列 的 引入 或 部 分 取代 , 靶 基因 原 有 结构 被 破坏 ;@ 基 因 置 换 : 靶 基因 的 全 部 序列 被 新 的 基因 或 改造 后 的 基因 所 取代 。 BS FE Da BR YY HE 20 世纪 80 年 代 初 ,胚胎 干细胞 (embryonic stem cells, ES 细胞 ) 分 离 和 体外 培养 的 成 功 Bare TF SEPA ax BR AY TK AR SE A ; 1985 年 ,首次 证 实 的 哺乳 动物 细胞 中 同 源 重组 的 存在 奠定 了 a ee a ” 228: BALES FE A ax RE AY FH 6 SE a ; ZI) 1987 4E , Thompsson 首次 建立 了 完整 的 ES Aa AE a BR AY 7) BE A, Aa ae ae FA AY EA a Ze) BR ES 4. SEAR RE—-BARGRA, BEA 2H An fd oo PS Sa He CR EAS , SET aR TAR RF : (1) 构建 重组 基因 载体 ; (2) 用 电 穿 孔 、. 显 微 注射 等 方法 把 重组 DNA 转 和 人 受 体 细胞 核 内 ; (3) 用 选择 培养 基 筛 选 出 已 击 中 的 细胞 ; (4) Ki PARA BRE ,并 移植 回 假 孕 母 鼠 获得 生殖 系 通 合体 小 鼠 , 经 过 适当 交 ; 配 ,获得 源 于 ES 细胞 的 纯 系 小 鼠 ,进行 形态 学 观察 及 分 子 生 物 学 检测 。 一 、 基 因 效 除 载体 的 设计 DNA 间 发 生 同 源 重组 的 频率 是 很 低 的 (10 一 10“) ,所 以 在 设计 基因 效 除 载体 时 , 提 高 同 源 重 组 发 生 的 频率 和 引进 选择 系统 是 试验 成 功 与 否 的 关键 因素 。 应 用 同 源 基 因 DNA 片段 构建 载体 ,可 以 将 同 源 重 组 频率 提高 20 倍 , 随 着 同 源 臂 长 度 的 增加 ,重组 频率 也 增加 。 二 、 基 因 效 除 载 体 的 构建 构建 载体 时 ,首先 要 获得 与 ES 细胞 相同 品系 的 基因 片段 作为 同 源 片 段 插 入 载体 ,并 在 载体 上 插 和 人 筛选 标记 基因 。 构建 基因 获 除 载体 的 基本 过 程 如 下 (图 18-1): (1) 获得 目的 基因 ( 待 融 除 基因 ) 的 同 源 片 段 ,将 此 DNA 片段 克隆 到 一 般 的 质粒 载体 中 。 (2) 从 重组 质粒 中 切除 目的 基因 同 源 片 段 的 大 部 分 同 源 DNA 序列 ,只 留 部 分 序列 在 线 质粒 载体 的 两 端 。 (3) 将 新 霉 素 抗 性 基因 (neo ) 克 隆 到 带 有 目的 基因 同 源 序列 的 线性 质粒 中 ,位 于 残留 目 的 基因 同 源 序列 的 中 间 。 (4) 在 目的 基因 同 源 顺 序 的 外 侧线 性 化 重组 质粒 载体 ,将 疱疹 病毒 胸 苷 激酶 (HSV-tk) 基因 克隆 到 此 线性 载体 中 。 因此 ,基因 敲 除 载体 由 部 分 残留 的 待 融 除 基因 的 同 源 片段 .位 于 其 内 部 的 neo 0 基因 和 信 于 其 外 侧 的 HSV-ce 基因 共同 构成 。 = FEARS A ES 细胞 IRB HR FA Sb BE HT (a He BS BT) AG SE Be BR RA SA ES 细胞 中 ,通过 基因 Wk Po AS EL) Sak A) Vr] aI Se 66 eB) DR ED eA PR, WAR EY neo 基因 置换 ES 细胞 基因 组 中 的 目的 基因 ,从 而 得 到 了 丧失 目的 基因 功能 的 ES 细胞 , 即 基 因 第 十 八 章 “” 基因 敲 除 与 转基因 技术 - 229 - 线 忻 质粒 载体 同 源 基因 片段 — Cease <> 重组 质粒 ee GEE ，eo 共 内 CC mbit 同 源 基因 片段 之 间 HSV- 基 因 ET 可 ¢ ) Fi lak BRA |e ES 细胞 © 2900000002 ES 4a ee a A ee eet SIN Acc [ame =F do 9 Fe A ie BR 7 Ba 正常 小 鼠 图 18-1 基因 训 除 载体 的 构建 及 基因 刻 除 流程 图 正常 小 鼠 四 、 阳 性 细胞 的 筛选 与 鉴定 基因 效 除 的 技术 路 线 虽 不 复杂 ,但 由 于 高 等 真 核 细 胞 内 外 源 DNA 与 靶 细 胞 DNA 序列 自 然 发 生 同 源 重 组 的 几率 非常 低 , 约 为 百 万 分 之 一 ,要 把 基因 贡 除 成 功 的 细胞 筛选 出 来 是 一 件 非 第 困难 的 工作 。 因 此 , 同 源 重 组 的 盘 选 和 鉴定 就 成 了 基因 敲 除 技术 所 要 解决 的 关键 问题 。 -230- 基因 工程 学 目前 已 有 多 种 科 选 方法 ,包括 正 负 筛选 法 (positive and negative selection, PNS) 标记 基 因 的 特异 位 点 表达 法 及 PCR 法 ,其 中 PNS 法 适用 范围 广 且 效率 较 高 5 (一 ) PNS 法 基因 效 除 的 载体 含有 两 种 筛选 标志 ,在 同 源 序列 的 一 个 外 显 子 内 插 有 neo 作为 正 选 择 的 标志 ,在 同 源 序列 的 3 端 插 有 不 含 启 动 子 的 HSV- 砍 基因 作为 负 选 择 的 标志 ,HSV- 克 基因 由 临近 的 neo 基因 启动 子 调 节 。 在 选择 性 培养 基 中 需 加 入 新 霉 素 和 致死 核 苷 类 似 物 (GANC) , 4 外 源 DNA 序 列 未 能 整合 到 内 源 基因 组 上 时 ,野生 型 的 ES 细胞 中 没有 neo 或 HSV-tk 基因 的 表 TK ,选择 性 培养 基 中 的 新 霉 素 成 为 致死 物 ,细胞 不 能 存活 ; 当 外 源 DNA 随机 整合 至 基因 组 上 时 (通常 为 含 neo 基因 的 同 源 重组 序列 与 HSV- 克 基因 共同 整合 到 内 源 性 基因 组 中 ) , neo 基因 的 启动 子 同 时 启动 同 源 序列 中 的 neo 基因 及 同 源 序 列 之 外 的 HSV-tk 基因 ,HSV- 灰 基因 产物 可 使 致死 核 苷 类 似 物 变 成 致死 物 (图 18-2 A) ;而 发 生 同 源 重 组 时 则 只 是 同 源 序 列 (包括 neo 基 因 ) 整 合 至 基因 组 中 ,HSV- 克 基因 位 于 同 源 序列 之 外 而 不 能 发 生 同 源 重 组 ,因此 阳性 细胞 可 以 在 含 新 霉 素 和 致死 核 苷 类 似 物 的 培养 基 中 存活 (图 18-2 B)。 neo" HSV-tk A neo’ HSV-tk ves RG 8722.3 可 oes neo" neo'HS V-tk- (G418'GANC') 图 18-2 正 负 选 择 系统 用 以 筛选 含 定位 导 和 人 基因 的 ES 细胞 A: 随 机 整合 ;B: 同 源 重组 neo 为 新 霉 素 抗 性 基因 ;HSV- 鼠 为 疱 站 病 毒 胸 苷 激酶 基因 ;geneX 为 ES 细胞 内 源 性 基因 (与 导 人 基因 同 源 );G418 HE RK | GANC' 指 抗 致死 的 核 苷 类 似 物 GANC;GANC 指 核 苷 类 似 物 参 与 合成 ,细胞 致死 Oe ee a2tr/\S BARRSREBARA - 231- (=) 标记 基因 的 特异 位 点 表达 法 将 无 启动 子 和 起 始 密码 子 的 neo 基因 插 和 人 靶 载 体 中 。 当 该 靶 载 体 转化 ES 细胞 后 可 能 出 现 以 下 几 种 情况 :@ 未 整合 到 细胞 基因 组 而 随 传代 消失 ;@ 随 机 整合 ,但 整合 位 点 旁 侧 序 PEA AF, neo 基因 不 表达 ;@ 随 机 整合 , 且 整 合 位 点 附近 存在 其 基因 的 启动 子 ,启动 neo 基因 的 表达 ;@ 同 源 重 组 ,基因 可 借助 靶 序 列 中 自然 存在 的 启动 子 和 起 始 密码 子 而 活跃 表达 。 因 此 ,G418 抗 性 细胞 应 具有 后 两 种 整合 特性 。 根 据 它 们 所 产生 的 DNA 酶 切 图 谱 不 Tal, AY AY Southern 印迹 法 鉴定 。 此 法 较 简 单 ,对 ES 细胞 的 影响 较 小 ,但 只 适用 于 ES 细胞 中 能 良好 表达 的 基因 。 (三 ) PCR 法 PCR 法 是 通过 选择 性 扩 增 发 生 同 源 重组 的 DNA 片段 来 鉴定 重组 阳性 的 细胞 。 首 先 在 MBAR PHA neo 基因 使 其 突变 ,然后 合成 两 个 引物 ,它们 分 别 位 于 外 源 靶 载体 和 与 靶 载体 相 接 处 的 内 源 非 同 源 序列 上 ,将 G418 抗 性 细胞 克隆 分 别 进 行 PCR 鉴定 。 当 发 生 同 源 重 组 时 ,由 于 两 个 引物 分 别 从 相对 的 两 个 方向 同时 扩 增 ,结果 是 DNA 片段 的 拷贝 数 以 指数 增 加 ,得 到 已 知 长 度 的 DNA 双 链 片段 。 而 发 生 随 机 整合 时 ,由 于 只 有 一 个 引物 且 为 单方 向 ， 扩 增 的 片段 拷贝 数 呈 线性 比例 ,片段 为 单 链 , 长 度 不 定 。PCR 法 的 缺点 是 必须 对 每 个 细胞 克隆 分 别 进行 扩 增 ,费时 费力 。 五 、 基 因 效 除 动 物 的 产生 5 BE PA ax BE ES 细胞 注射 人 豚 泡 中 ,使 其 与 原 豚 泡 中 的 细胞 共同 组 成 豚 泡 的 内 细胞 团 ， 将 胚 泡 移植 到 假 孕 小 鼠 的 子宫 腔 或 输卵管 中 ,使 ES 细胞 发 育成 小 鼠 或 某 种 组 织 ,对 后 代 小 鼠 进 行 筛选 ,可 以 得 到 基因 刻 除 的 艇 合体 小 鼠 , 然 后 经 过 杂交 育种 , 按 备 德 尔 遗 传 规律 ,其 后 代 中 有 1/4 的 几率 为 纯 合 子 ,经 过 将 雄性 艇 合体 小 鼠 与 正常 内 性 小 鼠 进 行 交 配 ,就 可 得 到 基 因 殴 除 的 纯 系 小 鼠 , 即 基 因 敲 除 小 鼠 。 三 闻 ”基因 沿 除 的 应 用 及 研究 进展 ES 细胞 基因 效 除 首次 使 体外 精细 的 基因 操作 与 小 鼠 的 整个 生长 发 育 和 生命 过 程 得 到 了 直接 的 结合 ,为 探讨 高 等 动物 基因 组 结构 和 功能 提供 了 有 效 的 方法 ,尤其 对 于 继 人 类 基因 组 计划 之 后 正在 全 球 范 围 内 竞相 开展 的 功能 基因 组 学 研究 具有 极为 重要 的 意义 。 由 基因 贡 除 技术 产生 出 的 特殊 小 鼠 已 经 对 哺乳 类 生物 学 的 各 领域 ,包括 发 育 生物 学 ` 癌 生 物 学 免疫 学 .神经 生物 学 和 人 类 遗传 学 产生 了 极 大 影响 。 理 论 上 ,基因 效 除 可 适用 于 任何 能 产生 ES 细胞 的 物种 ,将 来 可 在 小 鼠 基因 敲 除 成 熟 的 基础 上 开展 其 他 实验 动物 的 基因 逆 除 工作 。 。 232 . 基因 工程 学 一 、 基 础 研究 1. 建立 人 类 疾病 的 动物 模型 ,治疗 遗传 病 基因 敲 除 小 鼠 是 研究 疾病 的 发 生机 制 、 分 子 基 础 及 诊断 治疗 的 重要 实验 材料 。 在 基因 组 的 特定 位 点 引入 所 设计 的 基因 突变 ,可 模拟 造成 人 类 遗传 性 疾病 的 基因 结构 或 基因 数量 的 异常 。1992 年 成 功 建立 了 囊 性 纤维 化 病 (CEF) 的 基因 敲 除 小 鼠 模型 ,为 CF 的 基因 治疗 提供 了 和 良好 动物 模型 ,并 于 1993 年 开始 临床 试验 。 最 近 将 S-HT(1A) 受 体 基 因 毅 除 建立 了 焦虑 的 小 鼠 模 型 。 通 过 去 除 多 余 基 因 或 修饰 改造 原 有 异常 基因 可 以 达到 治疗 遗传 病 的 目的 。 2. 改造 动物 基因 型 ,鉴定 新 基因 和 (或 ) 其 新 功能 ,研究 发 育 生物 学 ”目前 对 于 新 基因 功能 的 研究 ,多 采用 基因 敲 除法 在 小 鼠 上 观察 该 基因 缺失 引起 的 表 型 变化 。 通 过 分 析 特 定 基因 表达 产物 的 生物 学 功能 ,对 基因 结构 进行 修饰 ,在 动物 发 生发 育 的 全 过 程 中 分 析 基 因 修饰 与 动物 表 型 的 关系 ,从 而 揭示 基因 的 真实 功能 。 深 入 研究 基因 殴 除 小 鼠 在 胚胎 发 育 及 各 个 阶段 的 表现 ,可 以 得 到 详细 的 有 关 该 基因 在 生长 发 育 中 的 作用 。 3. 研究 基因 活动 的 调控 机 制 ” 利 用 基因 殴 除 小 鼠 能 够 人 为 地 控制 基因 逆 除 发 生 的 时 空 性 ,可 用 于 探讨 基因 活动 的 复杂 调控 机 制 。 5 Ft Bt FE 1. 建立 特殊 的 遗传 工程 小 鼠 品系 ,改造 生物 .培育 新 的 生物 品种 ”通过 基因 置换 可 以 得 到 能 够 直接 产生 人 源 性 单 克 隆 抗体 的 小 鼠 品 系 ,用 做 医药 研究 与 应 用 。 2. 药物 筛选 和 新 药 评价 体系 ”通过 基因 剔除 技术 可 以 得 到 特定 基因 缺陷 的 小 鼠 品系 ， 用 于 药物 有 效 性 评价 和 安全 性 评价 。 3. 研究 环境 诱 变 剂 的 作用 规律 ”将 所 引入 的 DNA 片段 作为 环境 诱 变 剂 作 用 的 部 DNA, 通 过 对 它 回收 后 进行 结构 分 析 ,研究 诱 变 剂 造成 DNA 损伤 和 诱发 基因 突变 的 规律 。 二 江村 先进 展 基因 获 除 技术 在 国外 已 是 成 熟 技术 ,国内 还 刚刚 开始 。 但 是 ,国内 已 有 几 家 单位 在 这 一 领域 开展 了 一 些 工 作 。 例 如 ,利用 基因 获 除 系统 ,研究 了 Smad3 基因 的 功能 ,鉴定 了 3 个 与 骨骼 发 育 有 关 的 新 基因 ,探讨 了 肿瘤 坏死 因子 受 体 开 在 郎 格 罕 细胞 迁移 中 的 作用 ,探讨 了 CD45 蛋 白 酷 氨 酸 磷酸 酶 与 小 鼠 表 皮 Y8T 细胞 发 育 的 关系 ,研究 了 极 低 密度 脂 蛋 白 和 中 间 密度 脂 蛋 白 与 动脉 硬化 的 关系 等 等 。 近 年 来 ,又 产生 了 条 件 性 基因 效 除 技术 , 即 对 某 一 特定 细胞 类 型 或 细胞 发 育 的 特定 阶段 某 一 特定 基因 的 敲 除 , 这 项 新 技术 在 基础 理论 研究 及 实际 应 用 中 都 将 有 着 极 广阔 的 应 用 前 景 。 另 外 ,RNA 于 预 技术 (RNA interference，RNAi) 在 线 虫 的 体内 外 试验 中 都 能 达到 基因 逆 除 的 目的 ,对 于 哺乳 动物 ,RNAi 能 在 体外 培养 的 细胞 中 i Bl) FE A Fak RY CF 第 十 八 章 “基因 敲 除 与 转基因 技术 - 233 - 第 四 节 转基因 技术 1974 年 ,Jaenisch 应 用 显 微 注 射 法 ,在 世界 上 首次 获得 了 SV40 病毒 DNA 转基因 的 小 鼠 。1982 年 ,Palmiter 等 将 克隆 的 生长 激素 基因 用 显 微 注 射 法 (microinjection ) 直接 导 和 人 小 鼠 受精 卵细胞 核 内 ,所 得 转基因 小 鼠 的 肝 、 肌 、 心 等 组 织 都 能 产生 生长 激素 ,小 鼠 比 原 个 体 大 几 倍 , 称 为 “ 巨 鼠 " ,使 人 们 意识 到 转基因 技术 的 巨大 潜力 及 其 在 遗传 育种 方面 的 划时代 意 义 , 将 分 子 、 细 胞 .整体 水 平 统一 起 来 。 一 、 转 基因 技术 的 基本 原理 转基因 技术 的 基本 原理 是 将 目的 基因 (或 基因 组 片段 ) 用 显 微 注 射 等 方法 注 人 实验 动物 的 受精 卵 或 ES 细胞 ,使 目的 基因 整合 到 基因 组 中 ,然后 将 此 受精 卵 或 ES 细胞 再 植 人 受 体 动物 的 输卵管 或 子宫 中 ,使 其 发 育成 携带 有 外 源 基因 的 转基因 动物 ,人 们 可 以 通过 分 析 转 基 因 和 动物 表 型 的 关系 ,揭示 外 源 基 因 的 功能 ,也 可 通过 转 和 人 外 源 基 因 培 育 优良 的 动物 品种 。 二 、 转 基因 技术 的 策略 传统 的 制备 转基因 动物 的 方法 是 将 外 源 基 因 导 入 胚胎 中 ,在 胚胎 细胞 染色 体 上 整合 ,成 为 细胞 基因 组 的 组 成 部 分 ,伴随 胚胎 发 育 ,使 整个 机 体 的 细胞 染色 体 上 均 带 有 外 源 基因 ,这 一 基因 的 正确 表达 和 稳定 遗传 标志 着 转基因 动物 个 体 的 建成 。 常用 的 制备 转基因 动物 的 步骤 是 :中 获得 和 改建 目的 基因 ;@ 将 目的 基因 向 生殖 细胞 高 . 效 转 移 ;@ 受 精 卵 或 豚 胎 组 织 在 合适 的 环境 中 发 育 ; 由 筛选 .鉴定 稳定 的 细胞 系 。 生 产 转 基 因 动 物 的 关键 主要 是 对 外 源 基因 的 分 离 重组、 载体 构建 ,导入 外 源 基因 胚胎 的 培养 .移植 ， 以 及 获得 新 生动 物 的 整合 和 表达 的 鉴定 技术 等 ,其 中 最 关键 的 一 环 是 外 源 基因 的 导入 。 目前 使 用 的 制备 转基因 动物 的 技术 有 显 微 注 射 法 、 反 转录 病毒 感染 法 .胚胎 干细胞 法 和 体 细胞 克隆 技术 等 。 (一 ) 显 微 注射 法 制备 有 良好 表达 活性 的 目的 基因 , 需 用 显 微 注射 装置 将 目的 基因 导 和 人 动物 的 受精 卵 雄 性 原核 ,将 含有 外 源 基因 的 受精 卵 移植 人 假 孕 动物 的 输卵管 ,经 过 妊娠 、 分 娩 , 使 之 发 育成 正 常 的 幼 仔 ,再 用 分 子 杂 交 或 PCR 法 ,筛选 出 有 外 源 基因 整合 的 幼 仔 , 得 到 转基因 个 体 (图 18-3)。 用 这 种 方法 生产 的 动物 约 有 十 分 之 一 是 整合 外 源 基 因 的 转基因 动物 ,是 目前 将 外 源 基因 导入 胚胎 应 用 最 广 的 方法 。 显 微 注 射 法 产生 最 早 使 用 最 广 ,优点 是 外 源 DNA 整合 率 高 ,可 导入 的 目的 基因 长 (可 达 100 kb) ,不 需要 载体 ,直接 转移 目的 基因 ,可 以 直接 获得 纯 系 动物 ,使 得 实验 周期 明显 缩 短 。 缺 点 是 操作 复杂 、 设 备 昂贵 ,不易 推广 .导入 目的 基因 的 整合 位 点 及 整合 的 拷贝 数 无 法 控制 , 易 引 起 整合 部 位 的 插入 突变 而 妨碍 基因 表达 ,或 造成 豚 胎 发 育 障 碍 , 重 则 致死 。 -234- BALTES (外 源 DNA 线性 化 ， 供 原核 注射 用 | —— PARTE FETED | fat 图 18-3 利用 显 微 注射 技术 建立 转基因 小 鼠 的 技术 路 线 (二 ) 反 转 录 病 毒 载体 法 将 目的 基因 重组 到 反 转 录 病 毒 载体 上 , 制 成 高 浓度 的 病毒 颗粒 ,人 为 地 感染 着 床 前 或 着 床 后 的 胚胎 ,也 可 以 直接 将 胚 胎 与 能 释放 反 转 录 病 毒 的 单 层 培养 细胞 共 孵 育 以 达到 感染 的 目的 ,通过 病毒 将 外 源 目的 基因 插 人 整合 到 宿主 基因 组 DNA 中 ,技术 路 线 见 图 18-4。 反 转 录 病 毒 载体 法 的 优点 是 不 需要 重 排 , 不 破坏 目的 基因 ,不易 发 生 大 的 突变 , 易 分 析 择 和 位 点 ,整合 率 高 ,整合 位 点 单一 ,多 为 单个 拷贝 。 缺 点 是 需要 构建 带 有 转基因 的 反 转 录 病毒 , 且 容 量 有 一 定 限 制 ,所 得 的 转基因 个 体 扔 合 性 很 高 ,需要 进行 广泛 的 杂交 筛选 ,实验 周 期 长 ,可 能 出 现 转 人 病毒 基因 的 复制 .表达 等 。 (=) ES 细胞 介 导 法 ES 细胞 来 源 于 胚胎 囊 胚 期 内 细胞 团 (inner cell masses) ,是 多 洪 能 细胞 , &% A HB Aa BEE 腔 时 ,可 随 胚胎 发 育 而 形成 谋 合 体 ,参与 各 组 织 器 官 ( 包 括 生 殖 腺 在 内 ) 的 分 化 ,同时 又 具有 体外 培养 细胞 的 所 有 特征 ,因此 是 构建 转基因 动物 .特别 是 基因 逆 除 动物 时 将 基因 导 人 胚胎 的 桥梁 ( 详 见 基因 痪 除 部 分 ) ,技术 路 线 见 图 18-5。 Atr/\S BARRSREARA - 235 - 具有 neo 基 因 的 SoG SI FE UT. 日 的 基因 rm 目的 基因 和 质粒 DNA 的 重组 DNA 导入 ES 细胞 Ca) ES 细 肥 (来 自 时 毛 小 也 ) [feat ee (KAGE) R ) AA AMIZEAL 色 皮 毛 和 白色 皮毛 xX FETA ERT Be | Kerk SH GKE > 图 18-4 反 转 录 病 毒 载体 法 建立 转基因 小 鼠 的 技术 路 线 含有 目的 基 因 的 小 鼠 ES 细胞 介 导 法 是 1989 年 意大利 学 者 首先 报道 的 ,他 用 精子 作为 载体 转移 目的 基因 ,成 功 地 获得 了 纯 系 转基因 小 鼠 。 该 方法 优点 是 稳定 传代 的 细胞 系 能 用 于 各 种 目的 基因 的 转 移 ,可 在 植 人 前 筛选 出 合适 的 细胞 ,能够 得 到 很 多 遗传 上 相同 的 转基因 动物 。 缺 点 是 ES 细 胞 系 的 建立 和 培养 技术 还 不 完善 , 需 经 符合 体 途 径 ( 许 多 舱 合 体 转基因 动物 的 生殖 细胞 内 不 含有 转基因 ) , 且 实 验 周 期 长 。 (四 ) 体 细 胞 基因 转移 和 克隆 先 在 体外 培养 的 哺乳 动物 体 细胞 中 进行 基因 导入 ,筛选 获得 带 有 转基因 的 细胞 。 然 后 ， 将 带 有 转基因 的 体 细胞 移植 到 去 掉 细 胞 核 的 卵细胞 中 ,生产 重 构 胚 胎 。 重 构 豚 胎 移 植 到 待 学 母体 中 ,获得 转基因 动物 殉 隆 个 体 ,产生 的 仔 畜 全 部 (100% ) 是 转基因 动物 。 体 细胞 克隆 技术 物种 适用 面 广 ,实验 周期 短 ,效率 高 ,能 够 培育 出 与 供 体 基 因 组 完全 相同 的 转基因 动物 ,在 基础 研究 和 应 用 研究 方面 具有 重大 意义 。 如 第 一 例 体 细胞 克隆 动物 “多利 羊 " 的 诞生 引起 了 世界 性 麦 动 。 但 是 ,在 基础 理论 和 实验 技术 上 体 细 胞 克隆 技术 尚 需 进一步 完善 。 -236- 基因 工程 学 [esizrpgaxagj ES 纪 隐 培养 全 —| 外 源 DNA 转 染 超 供 排 体 ? | sere | (收集 卵 了 了 ) FETED fit 图 18-5 ES 细胞 介 导 法 建立 转基因 小 鼠 的 技术 路 线 (五 ) 精子 介 导 法 将 成 熟 的 精子 细胞 (通常 是 灭 能 后 ,也 就 是 破坏 细胞 膜 ) 与 外 源 基 因 载 体 DNA 进行 共 培养 ,使 精子 有 能 力 携带 外 源 DNA 进入 卵细胞 中 ,受精 并 使 外 源 DNA BEA SBP. Sb, th 可 通过 电 穿 孔 、 脂 质 体 转 染 法 将 载体 DNA 导入 精子 。 将 受精 卵 移 人 假 孕 母体 输卵管 中 , 继 续 发 育 获 得 转基因 动物 个 体 。 精子 介 导 法 的 优点 是 简单 方便 ,依靠 生理 受精 过 程 ,避免 了 对 原核 的 损伤 ,动物 育种 不 ain ak ,实验 周期 短 ,对 于 大 家 畜 的 转基因 研究 具有 重要 意义 。 缺 点 是 目的 基因 随机 整 合 ,无 法 早期 验证 遗传 修饰 事件 。 三 、 转 基因 技术 的 应 用 自 1974 年 美国 学 者 Jaenisch 首次 应 用 显 微 注射 法 获得 转基因 小 鼠 以 来 ,转基因 动物 已 用 于 疾病 动物 模型 的 建立 , 药 用 蛋白 质 的 生产 、 转 基因 家 畜 的 生产 等 方面 。 目 前 转基因 技术 已 广泛 应 用 于 许多 领域 ,如 在 免疫 学 .病毒 学 .代谢 性 疾病 神经 生理 学 等 方面 的 应 用 ,在 遗 传 育种 上 也 取得 了 突破 性 进展 。 第 十 八 章 ”基因 闻 除 与 转基因 技术 .237 . (一 ) 转基因 植物 的 研究 与 产业 化 转基因 技术 用 于 育种 ,不仅 可 以 加 快 改良 遗传 性 状 的 进程 ,使 选择 的 效率 提高 ,改良 的 机 会 更 多 ,而 且 不 受 有 性 繁殖 的 局 限 。 与 传统 的 备 德 尔 遗传 规律 育种 比较 ,转基因 技术 显示 出 其 优越 性 和 更 大 的 潜力 ,目前 提高 光合 作用 、 扩 大 固氮 能 力 、 提 高 营养 价值 . 抗 虫 . 抗 病 、 抗 旱 等 转基因 植物 都 在 研究 之 中 。 将 人 的 基因 转 和 人 植物 还 可 能 获得 医学 上 具有 治疗 用 途 的 药 物 ,例如 将 人 抗体 基因 转 人 烟草 ,从 烟叶 中 就 能 提取 人 的 抗体 蛋白 ,这 为 医药 产业 开辟 了 一 个 革新 的 制药 途径 。 (二 ) 转基因 动物 的 研究 与 产业 化 1. 建立 疾病 动物 模型 ”利用 转基因 技术 可 建立 敏感 动物 品系 及 产生 与 人 类 疾病 相同 的 疾病 动物 模型 。 转 基因 动物 作为 疾病 模型 可 以 代替 传统 的 动物 模型 进行 药物 筛选 ,并 且 准确 、 经 济 .试验 次 数 少 .显著 缩短 试验 时 间 。 目 前 已 建立 的 疾病 模型 有 :癌症 动脉 粥 样 硬 化 、 镰 状 细胞 性 贫血 、 圳 状 纤维 化 红细胞 增多 症 、 免 疫 缺 陷 、 自 发 性 高 血压 等 。 2. 研究 疾病 的 发 病 机 制 ” 利 用 转基因 动物 还 可 用 于 疾病 发 病 机 制 的 研究 ,对 于 人 们 认 识 、 预 防 疾 病 和 测试 新 的 治疗 方法 提供 了 有 力 手段 。 例 如 用 导入 各 种 癌 基 因 \ 致 瘤 病 毒 基 因 或 其 调控 序列 等 的 转基因 小 鼠 ,可 以 观察 肿瘤 发 生 的 历程 和 影响 因素 ;用 肝炎 病毒 基因 的 转 基因 动物 可 以 研究 肝炎 病毒 基因 在 肝炎 中 的 作用 ,利用 导入 各 种 细胞 因子 基因 、 免 疫 功能 基 因 或 特定 核酸 序列 的 转基因 动物 ,可 以 从 整体 水 平 研究 细胞 因子 免疫 调控 基因 表达 调控 等 问题 。 3. 用 于 器 官 移植 ” 随 着 器 官 移植 手术 的 普及 , 供 体 缺 乏 成 为 困扰 器 官 移 植 界 的 世界 性 难题 。 就 某 些 器 官 来 说 ,转基因 动物 的 器 官 用 于 人 体 移 植 将 有 重大 价值 。 为 解决 供 体 来 源 少 `、 多 老化 、 质 量 不 佳 等 问题 ,人 们 设想 将 猪 等 动物 器 官 作 供 体 ,但 异种 动物 的 器 官 进 入 人 体 内 ,会 发 生 排斥 反应 ,使 移植 无 效 。 研 究 发 现 人 体 衰 败 加 速 因 子 (DAF) 的 基因 可 抑制 这 种 排 Fe , 若 将 人 的 DAF 转移 到 猪 身 上 ,再 将 猪 的 器 官 移植 到 人 体 ,会 大 大 减弱 排斥 作用 ,此 项 技 术 称 为 转基因 技术 移植 ,世界 上 首 例 转基因 移植 实施 于 1995 年 。 4. 生产 蛋白 质 药 物 ”用 转基因 动物 能 获得 治疗 人 类 疾病 的 重要 和 蛋白质 “生物 反应 器 ” 的 概念 也 由 此 产生 。 例 如 导入 了 凝血 因子 人 基因 的 转基因 绵羊 分 泌 的 乳汁 中 含有 丰富 的 凝 血 因 子 区 ,能 有 效 地 用 于 血 友 病 的 治疗 。 现 已 较 好 地 建立 了 动物 乳腺 生物 反应 器 和 体 细 胞 克隆 技术 平台 ,目前 已 在 下 列 动 物 的 乳汁 中 生产 出 一 些 人 类 蛋白质 药物 :中 牛 : 抗 凝血 酶 、 纤 维 蛋白 原 `\ 人 血 白 蛋 白 胶原 蛋 白 、 乳 铁 蛋 白 、 糖 基 转 移 酶 、 和 蛋白 C 等 ; 包 山 羊 : 抗 凝血 酶 原 、 抗 胰 蛋 白 酶 人 血 白 蛋白 .组 织 纤 溶 原 激 活 因子 . 单 殉 隆 抗体 等 ;G 绵 羊 : 抗 胰 和 蛋白酶 .凝血 因 TK AAC; O87 :凝血 因子 区 8 CAR AURA MASA. (=) 研究 进展 从 整体 水 平 看 ,我 国 在 转基因 作物 研究 技术 方面 的 进展 与 国际 上 基本 同步 ,在 发 展 中 国 家 中 居 领 先 地 位 。 目 前 我 国有 多 种 转基因 植物 被 批准 进入 商品 化 生产 ,包括 我 国 自 己 培 育 的 耐 储存 番茄 (1997) . 抗 虫 棉 (1997) We EL Py EE 4 (1997) . 抗 病毒 甜 椒 (1998) . 抗 病毒 番 ”238 . 基因 工程 学 茄 (1998) 。 但 是 近年 来 ,在 国际 上 (尤其 是 欧洲 ) 对 转基因 作物 的 安全 性 出 现 了 较 大 的 争议 ， 这 些 争议 在 一 定 程 度 上 影响 了 转基因 作物 的 研究 `. 开 发 和 产业 化 的 进程 。 近年 来 转基因 动物 技术 又 有 新 的 发 展 :ES 细胞 导 人 与 目的 基因 同 源 的 序列 , 则 在 体内 可 以 经 同 源 重组 使 目的 基因 发 生 突 变 ,这 样 成 长 起 来 的 动物 就 有 目的 基因 的 缺陷 , 即 基因 打 靶 技术 。 用 基因 打靶 可 以 在 整体 水 平 上 研究 基因 的 功能 ,并 能 制造 出 遗传 缺陷 的 疾病 模型 。 研究 功能 基因 组 学 (functional genomics) 是 21 世纪 全 人 类 的 一 项 既 伟 大 又 艰巨 的 工程 和 任务 , 既 能 造福 于 人 类 ,也 可 能 危害 人 类 ,甚至 带 来 灾难 。 转 基因 技术 可 以 用 于 生产 生化 武器 ,如 果 造 成 有 毒 基 因 的 扩散 ,可 以 使 某 个 区 域内 的 人 群 老 失 对 某 种 特定 病毒 的 免疫 力 ， 从 而 发 生 大 规模 的 传染 病 。 另 外 ,在 基因 治疗 中 ,由 于 目前 对 人 类 基因 图 谱 并 未 完全 破译 ， 也 可 能 会 发 生 一 些 副 作用 。 最 可 怕 的 是 基因 造 人 。 (HLF) OOS Soy sap 第 十 九 章 DNA £6 BB Chapter19. DNA Vaccines 第 一 他 概 述 ars Mix ie DNA 疫苗 ,是 指 用 含有 编码 抗原 蛋白 的 基因 或 重组 质粒 DNA 转 染 或 者 注射 到 动物 细 胞 内 ,使 之 持续 表达 出 有 生物 活性 的 物质 ,从 而 诱导 出 细胞 免疫 (CTL) 和 体液 免疫 (HI) 效 应 的 生物 工程 制品 。 简 言 之 ,DNA 疫苗 是 用 编码 病原 体 或 某 特定 抗原 蛋白 组 分 的 DNA( 或 基因 ) 诱 生 免 疫 应 答 的 生物 工程 制剂 。 FA DNA 疫苗 直接 免疫 ,叫做 基因 免疫 (gene immune) 或 者 DNA 免疫 (DNA immune). 它 所 诱发 的 不 是 机 体 对 核酸 分 子 本 身 的 免疫 反应 ,而 是 通过 疫苗 基因 DNA 所 表达 的 蛋白 质 抗原 诱导 免疫 系统 而 产生 的 免疫 应 答 。 根据 使 用 目的 把 DNA 疫苗 可 分 为 两 类 :一 类 是 预防 性 DNA 疫苗 ,主要 用 于 传染 病 的 预防 ; 另 一 类 是 治疗 性 DNA 疫苗 ,多 应 用 于 肿瘤 等 治疗 。 目 前 ,有 些 DNA 疫苗 兼 有 预防 和 治疗 作用 。 大 多 数 DNA 疫苗 现时 仍 处 于 临床 前 实验 阶段 ,尚未 进入 临床 应 用 。 二 、 构 建 DNA 疫苗 的 基本 条 件 构建 DNA 疫苗 的 基本 条 件 有 两 个 :目的 基因 和 质粒 表达 载体 。 (一 ) 目的 抗原 编码 基因 获得 目的 抗原 基因 有 许多 方法 ,原则 上 应 选择 核心 蛋白 基因 的 保守 DNA 序列 , 近 几 年 采 用 表达 文库 免疫 技术 (expression-library immunization，ELI) 可 获得 免疫 活性 基因 。ELI 是 根据 病原 体 的 所 有 抗原 均 由 其 DNA 编码 的 原理 , 先 把 病原 体 基 因 文 库 中 的 病原 体 DNA 片段 插入 到 特定 的 质粒 载体 中 ,再 利用 基因 免疫 的 方法 筛选 病原 体 基 因 组 中 具有 免疫 保护 功能 的 基因 片段 ,ELI 技术 提供 了 一 种 在 众多 已 知 或 未 知 病原 体 基 因 中 获得 免疫 活性 基因 的 系统 而 普遍 有 效 的 方法 , 它 对 于 具有 庞大 基因 组 的 寄生 虫 ` 细 菌 等 基因 疫苗 的 发 展 更 有 意义 。 (二 ) 质粒 表达 载体 选择 质粒 表达 载体 的 原则 是 既 能 长 期 .高效 表达 ,又 要 免疫 原 性 好 ,因此 选择 表达 载体 239 - - 240 .基因 工程 学 时 必须 考虑 下 列 组 成 元 件 : 复 制 子 启动 子 、 免 疫 激 活 增强 序列 及 其 增强 子 .终止 子 等 。 根 据 需要 可 选择 细菌 载体 (如 伤寒 沙门 菌 Ty21a ,卡介苗 ) 或 者 病毒 载体 (如 冶 苗 病毒 、 腺 病毒 . 单 纯 疱 疹 `HBVsAg 载体 等 )。 目 前 从 免疫 效果 看 ,基因 免疫 的 载体 用 反 转 录 病 毒 载体 仍 不 如 细菌 质粒 载体 ,如 pPUC19 质粒 及 其 衍生 质粒 。 但 是 从 抗 病毒 、 抗 肿瘤 、 防 治 恶性 疾患 的 长 期 战略 目标 出 发 ,用 病毒 类 载体 可 能 是 有 效 手 段 之 一 。 1. 具有 载体 的 复制 基因 为 保证 疫苗 DNA 的 有 效 扩 增 ,可 利用 原核 细胞 如 大 肠 杆菌 作为 受 体 菌 来 制备 DNA 疫苗 ,要 求 载体 中 必须 含有 大 肠 杆菌 的 ColEI 3% pMBI 基因 ,才能 在 大 肠 杆菌 中 扩 增 DNA。 为 确保 DNA 疫苗 的 安全 性 ,防止 病毒 DNA 在 宿主 细胞 内 复制 或 者 整合 到 染色 体 上 ,必须 去 除 载 体 中 的 病毒 复制 关键 基因 以 及 与 基因 整合 有 关 的 位 点 。 例 如 pcDNA3.1 载体 因 含 有 病毒 的 复制 基因 和 基因 整合 位 点 而 不 十 分 安全 , 故 多 用 于 动物 实 验 ( 图 19-1) ;而 pVAX 质粒 表达 载体 则 去 除了 上 述 相关 基因 ,有 良好 的 生物 安全 性 ,可 用 作 临 床 试验 。 Amp" Xhol 971 pceDNA3.1 5446bp fl ori ColE| sy eed NeoR polyA 19-1 pcDNA3.1 结构 示意 图 2. 具有 真 核 细胞 的 启动 子 由 于 DNA 疫苗 是 用 在 哺乳 动物 细胞 内 表达 目的 基因 , 必 须 使 用 能 在 真 核 细胞 启动 DNA 转录 的 启动 子 , 病 毒 的 启动 子 具 有 这 种 作用 。 应 用 最 广 的 病毒 启动 子 是 巨细 胞 病毒 (CMV) 、 猿 猴 病毒 (SV40) 和 呼吸 道 合 胞 病毒 (RSV) 的 启动 子 。 这 些 启动 子 均 能 在 真 核 细胞 中 表达 不 同 的 真 核 和 原核 细胞 的 基因 产物 ,其 中 CMV 启动 子 的 表达 效率 高 ,最 常用 。 3. 未 甲 基 化 CpG 核 苷 酸 序列 一 一 极 好 的 免疫 优 剂 ”未 甲 基 化 CpG 核 苷 酸 序列 源 自 细菌 DNA 中 一 段 由 6 个 核 苷 酸 分 子 组 成 的 特异 序列 一 XiX CpGY, Y> ,其 核心 是 未 甲 基 化 的 CpG 双 TE BBE BN), FL 5 端 为 两 个 味 叭 (XI 、X> ) ,3 端 是 两 个 喀 啶 (Yi\Yz )。 这 种 未 甲 基 化 序列 在 细菌 中 发 生 率 很 高 , 约 为 1/16。 但 在 真 核 细胞 DNA 中 此 序列 的 发 生 率 很 低 , 仅 是 细菌 的 1% ,这 或 第 十 九 章 DN 疫 苗 .241. 许 是 目前 用 细菌 质粒 作 DNA 疫苗 载体 的 实验 效果 优 于 病毒 载体 的 因素 之 一 。 未 甲 基 化 CpG 核 苷 酸 序 列 因 有 激活 多 种 免疫 细胞 的 免疫 佐 剂 作用 ,而 称 为 免疫 刺激 DNA 序列 (ISS，immunostimulatory DNA sequence) 。 这 种 具有 免疫 增强 作用 的 窒 核 苷 基 序 - 可 因 种 属 不 同 、 基 因 DNA 中 所 含 ISS 序列 和 数目 的 不 同 ,其 免疫 效果 也 有 明显 差别 ,因此 精 心 设 计 、 合 成 及 控制 不 同 DNA 疫苗 中 的 最 佳 ISS, 让 机 体 获得 最 佳 免 疫 反 应 与 有 效 的 保护 作用 是 至 关 重 要 的 。 ISS 的 作用 特点 是 : (1) 作用 细胞 的 广泛 性 : ISS 能 诱导 B 细 胞 增殖 和 分 泌 IgM. IL-6, HS CD4* T rw IFN-7; 产 生 Tal 型 细胞 因子 IL-12 IFN-a IFN-B、TNF-a 等 , 诱导 NK 细胞 活化 ,高 效 地 杀 伤 靶 细胞 ;同时 还 能 增强 M 摄取 、 递 旺 DNA 活 性。 总 之 , 非 甲 基 化 CpG 所 诱导 的 免疫 应 答 是 以 Tal 为 主 , 这 对 于 抗 肿瘤 . 抗 病毒 疫苗 的 研制 应 用 有 实际 意义 。 (2) 作用 强 : ISS 佐 剂 作用 显著 ,诱导 的 抗体 比 不 含 ISS 序列 的 DNA 高 9 倍 。 (3) Ame SEA: CAS BR EA, EF DNA ER RSE DNA 片段 ) 表 现 一 定 的 剂量 依赖 关系 。 4. 选择 标记 最 常用 的 是 氨 苯 西林 抗 性 基因 和 卡 那 霉 素 抗 性 基因 。 临 床 实验 用 DNA 疫苗 最 好 选用 卡 那 霉 素 抗 性 基因 , 因 不 易 产 生 过 敏 反 应 。 5. 其 他 ”所 用 表达 载体 的 增强 子 序列 最 佳 翻 译 起 始 序列 .mRNA 终止 信号 .mRNA 的 稳定 性 等 都 可 影响 基因 的 表达 效率 ;基因 产物 的 修饰 .polyA 加 尾 信号 序列 和 分 子 结构 状 态 、 分泌 活性 、 细 胞 内 定位 等 也 对 免疫 原 性 也 有 较 大 影响 。 =. DNA 疫苗 制备 的 基本 步骤 和 方法 (—)DNA 疫苗 制备 的 基本 过 程 免疫 原 性 基因 一 插入 表达 质粒 载体 一 转化 至 受 体 细 胞 . 扩 增 一 体外 纯化 质粒 DNA~~ 免疫 接种 一 表达 免疫 原 ( 图 19-2). 用 于 免疫 的 基因 polyA | 将 目的 基因 插入 表 达 载 体 将 重组 质粒 导入 工程 菌 细 胞 ， 增 菌 ， 提 取 质 粒 图 19-2 DNA 疫苗 制备 流程 -242- 基因 工程 学 (二 ) 主要 步骤 和 方法 归纳 如 表 19-1。 表 19-1 DNA 疫苗 的 主要 步骤 方法 和 注意 事项 HH A RM 方法 与 说 明 (1) 基 因 疫 苗 的 制备 A. 选 择 要 表达 的 基因 真 核 或 原核 细胞 的 基因 (要 求 基因 正确 ); 精心 设计 .选择 基因 密码 子 B. 载 体 的 选择 选择 合适 的 启动 子 `.CpG ,选择 标记 和 复制 子 C. 质 粒 抽 提 和 疫苗 制备 去 除 大 肠 杆 菌 内 毒素 (可 用 超 滤 方 法 ) (2) 免 疫 效 果 的 检测 A. 体 外 真 核 细 胞 的 转 染 免疫 印迹 证 明 B. 测 定 体内 的 抗体 反应 ELISA 检测 基因 表达 产物 C. 实 验 动物 模型 选用 小 鼠 豚鼠、 灵 长 类 动物 ; 检测 指标 用 中 和 抗体 .CTL 等 D. 免 疫 途 径 肌 内 、 皮 内 、 鼻 内 口服 和 基因 枪 乞 击 ; 免疫 途径 对 Tal,Ta2 反应 的 诱导 E. 免疫 程序 接种 剂量 间隔 和 次 数 (要 制订 方案 ) F. 攻 击 和 免疫 保护 力 鉴定 攻击 的 时 间 .途径 和 剂量 ; 死亡 率 .存活 时 间 、 体 重 ; 脏 器 中 细菌 数 和 组 织 病理 学 改变 G-. 保 护 力 的 相关 性 指标 IL-2, IL-4, IL-12, IFN-y 等 细胞 因子 (定性 .定量 活性 测定 ) (IgG1 和 IgG2a 水 平 以 及 两 者 比例 ) PU. He FAB DNA 疫苗 质粒 表达 载体 (一 ) DNA 疫苗 所 用 的 载体 基本 构成 如 图 19-3 : 编码 疫 荫 成 分 基因 纳 核 启动 子 图 19-3 DNA 疫苗 载体 模式 图 第 十 九 章 DNA 疫 苗 .243 . (二 ) 较 常 用 的 DNA 疫苗 表达 载体 根据 目的 要 求 选 择 合适 的 载体 质粒 , 较 常 用 的 DNA 疫苗 表达 载体 有 : 1. pRC/CMV-HBs(S) (4 19-4) 即 pCMV-S, 44 CMV 早期 启动 子 控制 下 表达 HBV-S 抗原 ,专用 于 DNA 免疫 ,不 用 于 基因 克隆 。 Nrul 206 CMV Jaa tf pRc/CMV-HBs(S) 5618bp Xho | 3438 BamHI 3425 BamHI 2184 BamH | 2779 BssHI 2852 119-4 pPC/CMV-HBs(S) 2. 其 他 载体 各 有 特点 ,要 选择 使 用 ,略为 介绍 ,例如 : (1) pcDNA3.1: 是 克隆 和 表达 载体 , 含 CMV 早期 启动 子 `MCS 和 牛 生长 激素 腺 苷 酸 位 点 ,在 真 核 细 胞 有 neo 抗 性 基因 。 (2) pPCMV-B- 半 乳糖 酶 : 用 于 基因 转 染 与 表达 ,此 半 乳 糖苷 酶 在 CMV 启动 子 控制 下 表 达 , 可 有 较 佳 的 抗体 反应 与 工 细 胞 效应 。 (3) pCI: 为 Promega 公司 构建 , 属 哺乳 动物 表达 载体 。 以 pPGEM(R) 为 骨架 , 含 CMV 增强 子 / 启 动 子 区 ,含有 赃 合 内 含 子 (B- 珠 蛋白 与 IgG 内 含 子 ) 及 SV, 晚期 多 腺 苷 酸 信和 号 。 (4) Vical 质粒 系列 : 如 VR1012、VR1223、VR1332、VR1412。 它 们 在 鼠 骨 骼 肌 、 肺 和 肿 瘤 细 胞 中 表达 良好 。VR1012 是 一 个 基础 质粒 载体 ,加 上 选择 标记 可 构建 成 带 有 报告 基因 的 质粒 表达 载体 。 如 果 加 上 荧光 素 酶 基因 , 称 为 VR1223; 加 上 CAT 则 为 VR1332; 含 有 lacZ 报告 基因 , 则 为 VR1412。 应 根据 需要 ,选用 合适 载体 。 FL. DNA 疫苗 的 接种 (一 ) 接种 原则 与 途径 1. 接种 原则 连续 注射 多 次 ,间隔 2 一 3 周 。 可 与 蛋白 质 疫苗 交替 使 用 ,效果 更 好 。 用 多 价 DNA 疫苗 , 优 于 单价 DNA 疫 苗 。 2. 接种 途径 与 受 体 细胞 (1) 接种 途径 :可 经 鼻腔 、 肠 道 黏膜 .皮肤 `. 肌 肉 等 途径 。1999 年 9 月 《自然 生物 技术 杂 。 244 .基因 工程 学 志 》 还 报道 ,用 皮肤 涂抹 法 (护肤 露 ) 接 种 。 (2) 接种 的 受 体 细胞 : DNA 疫苗 免疫 接种 的 受 体 细胞 包括 : 肌 细 胞 . 角 化 细胞 `MHC- [阴性 细胞 。 这 些 细胞 使 接种 方便 、 容 易 吸收 。 (二 ) 接种 方式 可 选择 肌肉 注射 .皮肤 转 和 人 及 黏膜 转 人 等 方式 。 1. 肌肉 注射 ”肌肉 注射 最 常用 方便 有 效 。 用 肌 细 胞 注射 DNA 很 方便 ,但 也 存在 一 定 问题 ,这 显然 与 肌 细 胞 的 特性 分 不 开 : OF 长 期 稳定 表达 ( 肌 细 胞 属 永久 性 分 裂 细 胞 ,分 裂 不 活 路 而 不 丢失 DNA, 能 稳定 表达 );Q@ODNA 摄取 效率 低 (可 让 肌 细 胞 变性 ,如 局 部 冷冻 .注射 麻 醇 药 或 蛇毒 等 ,使 组 织 处 于 再 生 状 态 ,以 提高 DNA 摄 人 率 );@ 分 记 不 活 九 (缺少 共 刺 激 分 子 B; ,不 易 活 化 ,MHC- 工 类 分 子 低 水 平 表 达 )。 四 通 常 注射 其 盐 溶液 ( 单 次 注射 S0 一 100wg) ,2 一 3 次 ,可 达 较 好 程度 ,以 后 再 加 强 免 疫 。@@ 基 因 免 疫 效 果 较 好 (抗体 效 价 能 维持 12 一 18 个 月 , 若 在 7 个 月 时 加 强 免 疫 ,抗体 滴 度 可 达 原 来 的 10 倍 ;基因 免疫 还 能 诱导 TH 细胞 参与 ,有 免疫 记忆 效应 )。 2. 皮肤 转 和 人 ”可 用 皮 内 注射 法 和 微粒 子 针 击 法 ,实验 研究 多 用 后 种 方法 。 (1) 皮 内 注射 法 (Raz 等 ) : 单 次 注射 3 一 100kg DNA, 可 分 布 于 表皮 真皮 细胞 ,诱导 出 CM1,AM1, (2) RLF SZ FHKE (particle bombardment) :这 种 技术 是 将 疫苗 DNA 包 被 在 重金 属 一 一 金 微 粒子 表面 ,用 基因 枪 将 金 微 粒子 加 速 ,把 DNA 分 子 带 入 靶 器 官 、 组 织 或 单 细 胞 内 。 该 种 方法 转 染 效率 高 ( 几 十 纳 克 ) ,缺点 是 制备 DNA 包 庄 颗粒 方法 复杂 ,有 特殊 设备 的 要 求 。 微粒 子 麦 击 法 是 利用 火花 放电 产生 高 压气 体 的 电 基因 枪 ,提供 转 染 动力 。 其 基本 方法 和 特点 是 直接 转 和 信人、 效率 高 \ 效 果 好 (可 诱导 出 AM1 `CMI1 )。 3. 黏膜 转 和 人 ”此 处 黏膜 系 指 黏膜 组 织 (包括 局 部 黏膜 .生殖 道 黏膜 、. 鼻 黏膜 等 ) 。 黏膜 转 人 的 方法 ,可 用 基因 枪 或 注射 法 。 多 用 于 动物 试验 ,人 类 应 用 少 。 (=) DNA 免疫 与 加 强 免疫 的 有 效 匹 配 DNA 免疫 接种 要 按 设计 方案 进行 。 一 般 接种 3 次 ,间隔 2 一 4 周 , 小 动物 ( 鼠 类 ) 每 次 100wg ,大 动物 或 人 每 次 S00 一 1000mg。 DNA 免疫 接种 ,要 注意 初次 免疫 .强化 免疫 和 抗原 的 特性 。 应 遵循 先 用 DNA 疫苗 ,后 用 其 他 技术 生产 的 同类 疫苗 ,例如 重组 的 DNA 冶 苗 病毒 疫苗 ,可 诱导 出 CTL 效应 ,具有 感 染 能 力 和 抗 病毒 作用 。 如 果 只 用 相应 蛋白 质 、 多 肽 抗原 和 佐 剂 , 仅 能 增高 抗体 水 平 。 第 二 节 DNA 疫 苗 的 免疫 原理 与 应 用 一 、DNA 疫苗 的 免疫 原理 DNA 疫苗 免疫 的 确切 原理 , 尚 无 定论 。 概 括 地 理解 DNA 疫苗 的 综合 作用 :一 是 通过 诱 导 表 达 的 蛋白 质 等 因子 的 作用 ;二 是 未 甲 基 化 CpG 刺激 顺序 (ISS) 的 刺激 诱导 作用 一 一 即 免疫 优 剂 作用 (图 19-5). 第 十 九 章 DN 疫 苗 .245. APCHA, RARAMHR, WE, Hs ® (辅助 ) {Te} {CTL 加 | apc 表达 的 蛋白 /活性 物质 分 泌 型 LgG2a | (HEIR) 胞 内 型 CTL ， 能 力 最 强 免疫 细胞 活化 ， 激活 NF-KB 分 泌 细胞 因子 免疫 佐 剂 作用 图 19-5_DNA 疫苗 免疫 的 初步 原理 DNA 疫苗 的 免疫 效果 与 许多 因素 有 关 ,在 加 强 免 疫 时 抗原 的 性 状 尤其 显著 。 当 初次 免 疫 用 DNA 疫苗 ,加 强 免 疫 时 用 细胞 内 抗原 ,可 提高 CTL 强度 10 一 30 倍 ;加 强 免 疫 若 用 完 整 的 可 溶性 抗原 , 则 以 体液 免疫 为 主 。 二 、DNA 疫苗 的 评价 与 优化 (一 ) 主要 优点 与 传统 疫苗 ,生物 工程 疫苗 相 比 ,DNA 疫苗 有 许多 优点 :@ 安 全 性 好 (无 感染 的 危险 )， 稳定 性 好 (室温 不 易 变性 ,活性 较 稳定 ,易于 保存 运输 )。@@ 具 有 预防 、 治 疗 的 双重 功能 。 图 能 诱发 针对 天 然 蛋白 质 表 位 的 抗体 (体液 免疫 ) 和 特异 性 CTL 免疫 反应 。@ 轿 组 织 细 胞 能 主动 表达 抗原 ,表达 水 平 低 ,免疫 反应 持续 时 间 长 (长 于 1 年 以 上 )。 回 便于 构建 多 价 疫苗 。 @ 生 产 工艺 技术 容易 控制 BRE ;容易 纯化 ,生产 成 本 低 。@@ 能 快速 利 选 有 免疫 保护 效果 HEA, OAKS THl 或 Ti2 为 主 的 免疫 反应 。 (二 ) 疫苗 应 用 中 的 有 关 问 题 目前 ,DNA 疫苗 应 用 中 的 常见 问题 是 : 中 接种 的 统一 性 和 标准 化 (接种 的 剂量 、 部 位 、 途径 次 数 间隔 等 )。@DNA 疫苗 生产 的 质量 标准 与 应 用 标准 化 。 包 有 致 免疫 耐 受 的 可 能 -246- 基因 工程 学 性 ( 因 长 期 低 水 平 表 达 外 源 抗 原 ,容易 诱导 机 体 免 疫 耐 受 ) ,或 者 诱导 抗 DNA 抗体 的 产生 ， RA SLE 或 其 他 自身 免疫 病 。 田 基因 整合 :DNA 疫苗 如 果 有 基因 整合 ,可 能 激活 致癌 基 因 , 抑 癌 基因 失 活 ;或 致 基因 突变 ,使 表达 异常 。 但 是 ,整合 往往 发 生 在 快速 分 裂 的 细胞 , 肌 细胞 是 分 裂 终 末 细 胞 ,因而 肌肉 注射 接种 较 安 全 。 另外 ,基因 免疫 的 实验 效果 ,小 动物 体内 效果 好 ,大 动物 效果 差 , 这 可 能 与 种 属 、. 进 化 或 机 体 的 免疫 机 能 有 关 。 (三 ) DNA 疫苗 的 优化 成 功 的 .能 普遍 应 用 的 疫苗 都 必须 经 过 优化 、 反 复 实验 ,才能 真正 像 接种 卡介苗 (BCG ) 那样 有 效 、 实 用 。 也 只 有 把 DNA 疫苗 分 子 的 分 子 结构 、 功 能 基 团 和 进入 体内 的 命运 在 体 内 对 免疫 分 子 和 对 机 体 的 作用 与 影响 等 研究 清楚 ,才能 从 作用 机 制 上 阑 明 。 从 目前 DNA 疫苗 的 研究 技术 和 研究 水 平 上 看 ,优化 DNA 疫苗 主要 是 从 以 下 方面 着 手 :@O 优 化 DNA 载 体 : 调 节 元 件 ( 包 括 : 使 用 高 表达 的 启动 子 CMV ,转录 终止 元 件 的 设计 和 利用 ,多 顺 反 子 载体 的 使 用 等 )。@ 添 加 甲 病毒 复制 子 以 增强 抗 病毒 作用 : 甲 病毒 寄主 范围 非常 广 , 是 一 类 通过 节肢 动物 传播 的 正 链 RNA 病毒 。 含 自身 RNA 复制 酶 ,能 独立 复制 而 不 需 利 用 宿主 细胞 的 转录 系统 ,其 双 链 RNA 能 激活 宿主 细胞 的 抗 病毒 机 制 :一 是 激活 蛋白 激酶 途径 ;二 是 激活 2 ,S$ - 窒 聚 腺 苷 酸 合成 酶 的 途径 , 终 致 细胞 凋 亡 。@ 优 化 CpG 序列 :寻求 适合 人 体 的 最 佳 刺 激 序列 ( 因 CpG 序列 可 刺激 多 种 免疫 细胞 ,产生 多 种 细胞 因子 )。 田 抗原 编码 序列 :不 同 物 种 中 密码 子 的 使 用 有 偏爱 性 (bias) ,特别 是 终止 密码 子 的 改变 对 蛋白 质 抗 原 翻译 有 影响 。 名 免疫 佐 剂 的 应 用 :基因 疫苗 本 身 在 体内 不 能 自我 复制 ,所 表达 微量 抗原 蛋白 而 诱导 的 免疫 反应 通常 是 弱 于 活 疫苗 。 用 GM-CSF IL-4、IL-6 、IL-12 等 细胞 因子 的 表达 质粒 与 疫苗 DNA 混合 注射 ,能够 提高 机 体 免 疫 应 答 的 水 平 。B7-17IL-12 可 协同 DNA 疫苗 而 增强 THl 样 免疫 应 答 ,这 在 抗 肿瘤 免疫 中 更 为 重要 。 另 外 ,有 人 试图 注射 CpG-ODN 诱导 THl 型 细胞 因子 释放 ,激活 多 种 免疫 细胞 ,以 协同 扩大 DNA 疫苗 的 免疫 应 答 水 平 。 三 、DNA 疫 雷 的 应 用 研究 (一 ) 实验 动物 实验 动物 以 小 鼠 最 常用 ,必需 时 再 选用 高 等 的 哺育 类 动物 。 (二 ) 目前 研制 的 DNA 疫苗 DNA 疫苗 研究 最 为 广泛 的 是 抗 病毒 (传染 病 ) 疫 苗 ,其 次 是 抗 胞 内 寄生 的 细菌 性 传染 病 (如 结核 病 .寄生 虫 病 ) .自身 免疫 病 和 肿瘤 的 DNA 疫苗 。 研 制 的 DNA 疫苗 主要 是 :乙肝 病 毒 DNA 疫苗 ,丙肝 病毒 DNA 疫苗 ,流感 病毒 DNA 疫苗 ,HIV 病毒 DNA 疫苗 ,结核 杆菌 DNA 疫苗 , JERE DNA 疫苗 和 肿瘤 DNA 疫苗 等 。 (=) 临床 试验 和 临床 应 用 1. 临床 试验 研究 ”1997 年底 ,FDA 已 经 批准 6 种 DNA 疫 苗 的 第 工期 或 第 工期 临床 试 第 十 九 章 DNA 疫 B .247 . 验 : 艾 滋 病 流感 .单纯 疱疹 、 乙 型 肝炎 、 疙 疾 和 癌 胚 抗原 DNA 疫苗 ,其 中 准 疾 DNA 疫苗 已 进入 第 焉 期 临床 实验 。 2003 年 传染 性 非典 型 性 肺炎 (SARS) 的 DNA BH IEW RAW REO RE. HERR 术 研 制 的 SARS 全 病毒 灭 活 疫 苗 已 于 2004 年 5 月 在 志愿 者 中 进行 工期 临床 试验 ,而 预防 SARS 的 DNA 疫苗 由 于 该 病毒 的 急剧 变异 ,其 DNA 疫苗 距 临床 应 用 尚 需 些 时 间 。 乙 型 肝 炎 病 毒 、 结 核 杆 菌 的 DNA 疫苗 可 能 在 2004 年 进入 临床 下 期 。AIDS 病毒 的 基因 重组 DNA 疫苗 虽 经 20 年 的 努力 ,至今 尚未 成 功 进 入 临床 。 上 述 这 些 疫 苗 大 多 处 于 第 工 、 开 期 临床 试验 ,以 证 明 其 安全 性 抗原 性 。 至 今 未 发 现 疫 Hi DNA 分 子 整合 到 人 体 染 色 体 中 或 诱发 出 自身 免疫 病 的 病例 。 疙 疾 DNA 疫苗 临床 试验 已 经 进入 第 亚 期 ,2005 年 可 能 作为 商品 供应 。 2. 临床 应 用 =~ DNA 疫苗 目前 主要 应 用 在 传统 疫苗 无 法 对 付 的 病毒 性 传染 病 和 某 些 亚 性 疾病 ,如 艾滋 病 ,癌症 等 疾病 的 预防 和 治疗 。 (1) 病毒 等 传染 病 DNA 疫苗 :世界 上 第 一 例 基 因 疫 苗 是 治疗 艾滋 病 的 HIV 疫苗 ,并 于 1996 年 批准 在 健康 人 体 上 工期 临床 试验 。1993 年 ,流感 病毒 的 不 同 株 间 的 保守 性 抗原 基因 疫苗 诞生 。 随 后 HIV\ HBV\ HCV HTLV-1、 HSV 支原体、 结核 杆菌 、. 半 原虫 等 基因 疫苗 相 继 产生 并 逐步 进入 临床 试验 ,可 至 今 仍 未 有 一 种 DNA 疫苗 真正 进入 临床 应 用 。 (2) 肿瘤 DNA 疫苗 :肿瘤 DNA 疫 苗 的 研究 目的 ,是 通过 宿主 体内 表达 肿瘤 特异 性 抗原 以 打破 机 体 对 肿瘤 抗原 的 免疫 耐 受 性 ,诱导 出 对 肿瘤 的 特异 性 免疫 应 答 。 如 用 癌 豚 抗原 基 因 疫 苗 诱 导 细 胞 毒 T 细胞 的 靶 细胞 杀伤 效应 。 用 MHC-I 抗 原 基 因 疫 苗 治 疗 乳 腺 癌 、 纤 维 肉瘤 也 诱导 出 对 肿瘤 的 细胞 毒 作 用 。 (3) 免疫 调节 疫苗 :在 应 用 基因 疫苗 的 同时 ,注射 某 些 细胞 因子 (如 GM-CSF, IL-4,IL-6,IL-12) 或 者 辅助 因子 的 基因 疫苗 ,来 增强 或 者 调节 免疫 应 答 的 方向 改变 免疫 应 答 的 类 型 。 如 对 某 些 自身 免疫 性 疾病 移植 排斥 反应 、 多 发 性 硬化 症 及 避孕 等 DNA 疫苗 已 有 肯定 的 调节 治疗 作用 。 DNA 疫苗 也 可 分 为 预防 性 和 治疗 性 DNA 疫苗 ,进入 20 世纪 90 年 代 后 ,治疗 性 DNA 疫 苗 呈 现 飞 速 发 展 , 它 的 每 一 个 进步 都 可 能 对 人 类 肿瘤 、 艾 滋 病 \ 肝 瘤 . 闪 疾 `、SARS, 上 自身 免疫 和 某 些 非 传染 性 疾病 产生 很 大 的 影响 。 相 信 近 10 年 内 DNA 治疗 疫苗 将 会 有 突破 性 的 成 就 。 研制 开发 疫苗 ,应 根据 传染 病 . 非 传染 病 以 至 恶性 肿瘤 的 病因 流行 病 学 ` 致 病 物质 、 致 FAW FOL il ,过程 与 转 归 ,不 仅 研 制 预防 性 疫苗 ,更 要 大 力 研发 治疗 性 疫苗 。 由 于 基因 疫 苗 制 备 的 技术 方法 成 熟 . 生 产 可 标准 化 、 研 制 周期 较 短 ,只 要 临床 试验 安全 有 效 ,就 能 进行 商 品 化 生产 和 成 为 常规 的 预防 和 治疗 手段 。 近 10 多 年 来 ,世界 许多 国家 尤其 是 发 达 国 家 对 基 因 疫 苗 研 发 的 资金 投入 很 大 ,尽管 目前 直接 应 用 的 DNA 疫苗 还 不 多 ,但 进展 极 快 。 在 我 国 ,虽然 已 经 开展 了 DNA 疫苗 的 研究 工作 ,取得 了 可 喜 的 成 果 , 可 研究 的 广度 .深度 力度 - 远 不 及 发 达 国 家 和 国际 领先 水 平 。 相 信 , 随 着 我 国 的 经 济 发 展 和 科技 的 进步 ,预防 和 治疗 性 疫苗 的 逐步 应 用 ,对 于 突 发 性 ,烈性 传染 病 疫苗 的 研制 与 应 用 ,也 将 为 人 类 社会 的 进步 和 我 国人 民 群 众 的 生命 安全 、 健 康 长 寿 做 出 贡献 。 (FRA BH 然 ) 一 HAE DS Pides Hw Hw 2 Ae OE q od 7 i a 3 tal we a a a4 ae ~ | ? 4 Sitka Ay SP St SE COOH a SRP + 9 AR ea Tig 1 iR- Chk ea wy Sth. 76 6 Hi mp A) de) Ag set PB wo inp aR she OH on | PN Pe Se eg Pet yur hin Riel I. oh nm He. 时 wa Hi nia Ad aah te Ae 从 amg 27d TA 43 i RhPr at ts TS Si heh, Oe RR CO Cd 人 eee AAAI GAT: ot Madea aha! Ot ORS Letts tp RS Re | nc Eh Ste Se fh CASPAR RE ECE ED 40 FY BY BAP SSR thet tLe 芝 但 基 天 动 萤 ae | Dee ae. hy te Te ee eo aoa tee Lo eT. DRANG BAD WIP Rh a A) Re actA ‘ nes hal FE wv AVC pe OP GEE OS A Tea AV T+ Tt AeOF aE RK he RRA 2112, Fm MAE A HE Fat ae TOS TS ST OT AME A On RE. CNA RU ae a RG Ras eee PRAT SV, PUNAGE Bs city SH Ww er i BE BAR He ein SHLAA Fase WES). OREM Te, SHIR ATT SS PE A Te, m4 a Te. SLE eee re 当中 内 Tt. | i a a4 和 rae a, Om 2A De SR Fat FRAN Part IV. Experiment Technology in Genetic Engineering 了 om a aft é Sk Bl & Res A RE GEE yoolonnostT a, eniisenions oifensr . 买 验 一 ” 碱 变性 法 提取 质粒 DNA Exp1. Extraction of Plasmid DNA using Alkylie Denaturing Method 【原理 】 从 大 肠 杆菌 中 提取 质粒 DNA 的 基本 原理 是 根据 细菌 的 染色 质 DNA 和 质粒 DNA 分 子 的 大 小 、 结 构 不 同 、 碱 基 组 成 的 差异 等 特点 来 进行 分 离 的 。 常 用 的 煮沸 法 、 碱 变性 法 `\SDS 法 均 可 获得 较 满 意 效果 。 碱 变性 法 是 最 常用 的 质粒 DNA 提取 方法 。 碱 变性 法 提取 质粒 DNA 是 根据 细菌 染色 质 DNA 和 质粒 DNA 分 子 的 大 小 、 结 构 及 变性 与 复 性 的 差异 而 达到 分 离 的 目的 。 细 菌 染 色 质 DNA 的 分 子 大 ,为 线性 的 双 螺旋 ,而 质粒 DNA 的 分 子 小 ,为 共 价 闭环 超 螺旋 。 在 pH12.0~12.6 的 碱 性 环境 中 ,染色 质 DNA 的 氢 键 断裂 , 双 螺 旋 结 构 解 开 而 变性 ;质粒 DNA 的 大 部 分 氢 键 也 断裂 ,但 共 价 闭 环 超 螺旋 结构 的 两 条 互补 链 不 完全 分 离 。 当 以 pH4.8 的 高 盐 缓冲 液 调节 pH 至 中 性 时 ,质粒 DNA 恢复 到 原来 的 状态 保留 在 溶液 中 ,但 染色 体 DNA 不 能 恢复 而 形成 羯 绕 的 网 状 结构 ,大 部 分 DNA 和 和 蛋白 质 在 SDS 的 作用 下 形成 沉淀 。 通 过 离心 ,染色 体 DNA 与 不 稳定 的 大 分 子 RNA、 蛋 白质 -SDS 复合 物 等 一 起 沉淀 下 来 而 被 除去 ,质粒 DNA 存在 于 上 清 中 ,用 酚 氯仿 抽 提 可 进一步 纯化 。 【试剂 】 大 肠 杆菌 JM109-pBR322-HBV STE : 0.1 mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl( pH8 .0) lmmol/L EDTA(pH8.0) 溶液 工 : 50mmol/L 葡萄 糖 25mmol/L Tris-Cl( pH8 .0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 该 溶液 配制 后 ,6.76 x 104Pa 消毒 15 min,4 CFF. YW Ml (pH12.6 )( 新 鲜 配 制 ): 0.2mol/L NaOH 1% SDS 溶液 亚 (pH4.8) ,100 ml 含 : Smol/L NaAc 60ml “Zak ™ - 252: 基因 工程 学 UK Ba A 11.5ml WL AR 7K 28.5ml TE(pH8.0) : 10mmol/L Tris-Cl( pH8 .0 ) lmmol/L EDTA(pH8.0) 溶菌 酶 (10mgyml) 13 (HAL) G/B (2421) ECS) 一 、 质 粒 DNA 的 小 量 制 备 (Fr) 1. 细菌 的 培养 及 质粒 扩 增 (1) 取 甘 油 保 存 的 工程 菌 JM109-pBR322-HBV , 涂 布 含 氨 葵 西林 (Amp) 的 LB 琼脂 平 板 ,37 过 夜 。 (2) 挑 取 培养 板 上 的 单个 菌落 ,接种 到 2 一 Sml 含 Amp 的 LB 液 体 培 养 基 中 ,37Y 强烈 $6 9H (220 r/min) wt K. 2. 细菌 的 收集 及 裂解 (1) 取 1.4ml 培养 液 移 至 1.5ml 的 Eppendorf 管 中 ,12 000r/min, 4 , (或 室温 ) 离 心 30s. (2) FEV. lml AM 1 BYALA 12 000r/min, BL 30s. (3) 弃 上 清 , 将 细菌 沉淀 悬浮 于 100n KMANMAM 1 PRR GIEN. (4) 加 入 200 岂 溶液 Tl ,颠倒 混 匀 5 次 (不 要 强烈 振荡 ) ,放置 冰 浴 中 3 一 Smin。 (5) 加 入 150 pl 溶液 亚 ,温和 混 匀 10s, 冰 浴 内 放置 3~S5min. 12 000r/min, 4T (KE 温 ) ,离心 Smin。 3. 质粒 DNA 的 分 离 与 纯化 (1) 取 上 清 移 至 1 个 新 的 1.Sml 的 Eppendorf 管 中 。 加 入 1/2 体积 饱和 酚 ,1Z2 KARA 仿 / 蜡 戊 醇 (24/1L) ,颠倒 混 匀 2min,12 000r/min ,4°C (或 室温 ) ,离心 Smin。 (2) 取 上 清 移 至 另 1 个 1.5 ml 的 Eppendorf 管 中 。 加 入 2 倍 体 积 100% KLE IED, 室温 放置 $ 一 30min。12 000r/min ,4 (或 室温 ) ,离心 Smin。 (3) FL MAM 70% CBE Iml, 颠 倒 漂 洗 ,12 000r/min ,47 (或 室温 ) ,离心 3min。 (4) 弃 上 清 , 将 Eppendorf 管 于 吸水 纸 上 倒 置 Imin, 室 温 放 置 10 ~ 15min, KAS Hh 2min。 加 20u1 TE(pH8.0, 含 无 DNA 酶 的 RNA 酶 20kxg:ml) ,溶解 DNA ,短暂 混 匀 ,室温 放 置 30min 以 消化 RNA。 取 2 岂可 用 于 电泳 内 切 酶 酶 切实 验 , 或 -20C 贮 存 。 二 、 质 粒 DNA 的 大 量 制 备 [方法 】 1. 细菌 的 培养 及 质粒 扩 增 (1) 挑 取 培养 板 上 的 单个 菌落 ,接种 到 2ml 含 Amp 的 LB 液 体 培 养 基 中 ,37?7 GR te GH FE 光电 实验 一 “” 碱 变性 法 提取 质粒 DNA - 253 - (220rZmin) 培 养 过 夜 ,再 取 0.Sml 接种 至 2Sml 含 Amp AY LB 培养 基 中 培养 至 ODos:*0.6。 (2) 取 24ml 培养 液 接 种 到 S00ml 含 Amp 的 LB 培养 基 中 ,377 强烈 振荡 4 一 6h。 加 入 ABA SAME 170pg/ml,37C 强烈 振 葛 培养 12 一 16h。 2. 细菌 的 收集 及 裂解 (1) 将 培养 液 移 入 离心 管内 ,4000r[min,4f ,离心 13min, 弃 上 清 , 用 100ml 冰 预 冷 的 STE 悬浮 细菌 ,再 离心 收集 菌 体 。 (2) 将 细菌 悬浮 于 10ml 冰 预 冷 的 溶液 工 中 ,强烈 振荡 混 匀 ,加 入 lml RRB. (10mg/ml IEA , 冰 浴 放置 Smin。 3. 质粒 DNA 的 分 离 与 纯化 (1) 加 入 20ml 溶液 工 ,颠倒 混 匀 S~7 次 (不 要 强烈 振 葛 ) ,放置 Smin。 (2) 加 入 15ml 冰 预 冷 的 溶液 亚 ,温和 凑 倒 混 匀 , 冰 浴 放置 10min,12 000r/min, 4 , 离 ity 20min. | (3) 将 上 清 通过 4 层 消 毒 纱 布 泪 入 1 个 新 的 离心 管 中 , 加 入 0.6 倍 体积 的 异 丙 醇 混 匀 ， 室温 放置 10min,12 000r/min, 2A BL 15min, (4) AF Eis, FA 70% 乙醇 溶液 室温 漂洗 1 次 ,12 000r/min 离心 Sming 7). FFE 清 , 倒 置 离心 管 在 滤纸 上 , 流 净 液体 ,或 用 消毒 滤纸 小 条 小 心 吸 尽 管 壁 上 的 乙醇 ,室温 (或 37C ) 放 置 10 一 1Smin。 (5) Hf 3ml TE(pH8.0) 74 f# DNA 。 进 一 步 纯化 可 根据 具体 条 件 选 用 超速 离心 法 、 层 析 过 柱 法 或 PEG 法 (参见 实验 四 DNA 的 纯化 )。 【注意 事项 】 1. 操作 时 应 戴 手 套 , 所 用 试剂 与 容器 均 需 高 压 , 以 避免 DNase 污染 。 2. 每 一 步 操作 中 ,加 入 溶液 后 均 需 充分 混 匀 。 3. 碱 变性 时 ,要 充分 混 匀 使 菌 体 完全 有 裂解, 一旦 裂解 ( 变 黏 稠 ) ,应 立即 加 入 酸 溶液 中 和 。 4. 菌 体 裂解 后 ,每 步 操 作 动 作 要 轻 ,不 要 强烈 振 功 ,以 防 损伤 DNA。 ( 宋 ##) 实验 二 DNA SpA ee be Bt BOK Exp2. Agarose Gel Electrophoresis 电泳 是 分 子 生 物 学 技术 中 分 离 .鉴定 和 提纯 DNA 的 重要 手段 。 核酸 分 子 是 两 性 解 离 分 子 , 在 pH W 8.0~8.3 的 电泳 场 中 , 碱 基 几 乎 不 解 离 , 磷 酸 全 部 解 离 ,核酸 分 子 带 负 电荷 ,向 正极 泳 动 。 带电 颗粒 在 电泳 场 中 的 泳 动 可 用 迁移 率 表 示 ,不 同 大 小 和 构象 的 核酸 分 子 通过 一 定 孔 径 的 支持 物 介 质 时 ,表现 出 不 同 的 迁移 率 ( 即 分 子 筛 效应) ,从 而 使 DNA 分 离开 来 。 电泳 中 常用 溴 酚 蓝 或 二 甲 茉 青 为 示 踪 染料 指示 样品 的 迁移 过 程 。 溴 酚 蓝 呈 蓝 紫 色 ,在 2% 琼 脂 糖 凝 胶 中 电泳 时 ,迁移 率 接近 0.15kb 的 双 链 线性 DNA。 根 据 分 离 样品 中 DNA 分 子 大 小 ,参照 省 酚 蓝 的 迁移 情况 尚 可 决定 是 否 停止 电泳 。 核酸 需 染 色 才 能 显 出 带 型 。 溴 化 乙 锭 (EB) 是 一 种 荧光 染料 ,其 扁平 分 子 可 能 人 核酸 双 链 的 配对 碱 基 之 间 ,在 紫外 线 激 发 下 发 出 橙 红色 荧光 。 因 其 染色 操作 简单 、 灵 人 敏 , 不 影响 DNA 功能 而 最 常 使 用 。EB 染色 一 般 是 在 凝 胶 中 加 入 终 浓度 为 0.5ng/ml 的 EB, 可 在 电泳 过 程 中 观察 核酸 的 迁移 情况 。 本 实验 仅 介 绍 DNA 的 普通 琼脂 糖 凝 胶 电泳 , 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 技术 参见 实验 十 二 、 +. 【原理 】 琼脂 糖 凝 胶 电泳 (agarose gel electrophoresis) 是 利用 琼脂 糖 凝 胶 的 分 子 筛 效应 和 赋 形 特 性 ,把 DNA 分 子 在 碱 性 缓冲 体系 的 凝 胶 中 泳 动 时 分 离开 来 。 琼 脂 糖 凝 胶 的 分 子 得 孔径 较 大 , 适 于 分 离 200bp 一 50kb 的 DNA 分 子 。 凝 胶 的 孔径 取决 于 琼脂 糖 的 浓度 。 琼脂 糖 的 浓度 与 适 于 分 离 的 DNA 大 小 有 反 平行 线性 关系 。 表 实验 2-1 显示 琼脂 糖 浓 度 表 实 验 2-1 琼脂 糖 凝 胶 浓 度 与 线形 DNA 分 离 范 围 。 琼脂 糖 凝 胶 的 浓度 /% | 线性 DNA 长 度 p | 0 与 分 离 的 线性 DNA 大 小 的 对 应 关系 ,应 根 0.7 800 ~ 12 000 据 所 分 离 DNA 分 子 的 大 小 范围 选择 适合 的 1.0 500 一 10 000 Bee Bee FE ae 4007000 琼脂 糖 凝 胶 电泳 操作 简单 .快速 ,分离 范 本 pilosa 围 广 , 实 验 成 本 低 , 是 基因 工程 中 最 常用 的 技 术 之 一 。 【材料 】 EB 贮存 液 :用 双 蒸 水 配 成 10mg/ml, 磁 力 搅 拌 使 EB 充分 溶解 ,47 避 光 保存 。 3 实验 二 ”DNA PRASHERER BK .255 . 琼脂 糖 凝 胶 : 根 据 待 测 DNA 分 子 大 小 ,选择 适当 浓度 凝 胶 , 用 电泳 缓冲 液 配 制 。 TBE 缓冲 液 (5x ) : Tris 碱 54.0g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20ml 加 双 蒸 水 至 1000ml, 使 用 时 1:5 稀释 。 上 样 缓冲 液 (6x ): 0.25% Ye Bh ik 40% (W/V) RE RE YF ACR. DNA 样品 :pBR322-HBV 质粒 。 (Fre) 1. 制备 1% 的 琼脂 糖 凝 胶 : 在 电子 天 平 秤 上 称 取 lg 琼脂 糖 ,加 入 100 ml 电泳 缓冲 液 ， 微波 炉 内 煮沸 83min, 44 = 50~60T MH, INA EB 8K Sul, BA. 2. 灌 胶 : 将 配制 好 的 琼脂 糖 凝 胶 加 热 熔化 , 冷 至 607 EARP , BOE 3.5~5mm, ff 人 样品 梳 , 待 胶 凝 固 后 小 心地 拔 掉 样品 梳 。 3. BRR ARIK OA TBE(1x ) ,使 液 面 稍 高 出 胶 面 1 一 2mm。 4. 上 样 : 取 10p1 DNA 样品 ,加 2 上 样 缓冲 液 ,混合 后 加 到 凝 胶 样 品 孔 中 。 5. 电泳 : 接 通电 源 ,加 样 侧 接 负 极 , 另 一 侧 接 正极 ,调整 电场 强度 不 超过 SV /em, HK A 2~3ho 6. SRM ERE PIE BA 2/73 BK 4/5 凝 胶 时 ,停止 电泳 ,紫外 分 析 仪 上 观察 电泳 后 的 带 型 。 【注意 事项 】 . 琼脂 糖 凝 胶 熔 化 要 均匀 , 灌 胶 时 避免 气泡 。 . 凝 胶 厚 度 3.5 一 Smm。 过 薄 则 加 样 量 小 、 样 品 孔 易 撕 裂 , 过 厚 则 紫外 线 不 易 穿 透 。 . 加 样 时 不 要 加 进 气泡 ,不 要 用 吸 头 磁 坏 凝 胶 孔 壁 。 . EB 是 强 诱 变 剂 ,应 带 手套 操作 , 勿 接触 皮肤 。 见 光 易 分 解 ,应 避 光 保存 。 . 电极 不 要 接 反 。 电 路 接 通 后 ,负极 电解 产 气泡 比 正极 多 。 aA & WO NO 实验 三 “DNA 酶 切 及 相对 分 子 质量 测定 Exp3. Use of Restriction Endonuclease and Identification of Relative Molecular Mass 一 、 质 粒 DNA 的 小 量 酶 切 反 应 【原理 】 不 同 的 开 型 限制 性 内 切 酶 能 特异 地 识别 双 链 DNA 特定 的 核 苷 酸 序列 ,并 切割 一 定 部 位 的 磷酸 二 酯 键 ,产生 特异 性 的 DNA 片段 。 酶 切 单位 (1 单位 ) 的 确定 : 在 进行 酶 切 反应 时 ,应 根据 DNA 的 量 确定 内 切 酶 的 使 用 单 位 。 标 准 的 酶 切 单 位 的 确定 方法 ,是 以 ADNA 作为 标准 ,能 将 lxgX DNA 在 50 由 反应 体积 内 ,37T BY 1h 完全 切 开 ,所 用 内 切 酶 的 量 即 为 1 个 酶 切 单位 。 酶 切实 用 单位 : 消化 lpg 样品 DNA 所 需 酶 的 量 (单位 ) = ( 待 酶 切 DNA 上 酶 切 位 点 数 Z ADNA 酶 切 位 点 数 ) x (ADNA 相对 分 子 质 量 / 待 酶 切 DNA 相对 分 子 质量 )。 但 在 实际 应 用 中 ,由 于 酶 在 运输 保存 过 程 中 活性 会 部 分 降低 ,实际 用 量 一 般 为 计算 量 的 5 一 10 倍 。 【材料 】 质粒 DNA。 限制 性 内 切 酶 。 10X 酶 切 缓冲 液 。 无 离子 水 。 【方法 】 1. 7£ 1.5ml &) Eppendorf 管内 依次 加 入 : 2. 混 匀 ,12 000r/min, #4 BL 30s, 8 377 KK 无 离子 水 111 2 一 3h。 10 x 酶 切 缓冲 液 2yl : 3. 取 $ 岂 ,电泳 观察 酶 切 反 应 的 程度 。 待 酶 切 反应 完全 后 ,65 尼 水浴 10 一 15min, 终 止 限制 性 内 切 酶 24l 本 机 nite ae ae we em 总 体积 20 pl 7 SR Mi 【注意 事项 】 1. 限制 性 内 切 酶 极 易 失 活 ,操作 应 在 冰 浴 中 进行 2. 奉 反 应 条 件 不 适合 ,如 内 切 酶 量 太 大 ,可 导致 酶 的 特异 性 切割 改变 ,出 现 * 星 星 " 活 性 。 .256 - 实验 三 “DNA 酶 切 及 相对 分 子 质量 测定 - 257- 二 、 相 对 分 子 质量 测定 【原理 ]】 不 同 大 小 和 构 型 的 DNA 在 琼脂 糖 凝 胶 上 电泳 时 ,有 不 同 的 迁移 率 , 对 于 线性 双 链 DNA 在 凝 胶 电 泳 中 ,相对 分 子 质量 的 常用 对 数值 与 泳 动 率 成 反比 。 据 此 可 采用 DNA 分 子 长 度 (bp) 的 负 对 数值 与 泳 动 距离 作 图 ,使 DNA 相对 分 子 质 量 的 测定 非常 方便 ,也 较 准 确 。 把 未 知 的 DNA 样品 与 已 知 相 对 分 子 质 量 的 标准 DNA, 在 相同 条 件 下 电泳 ,用 图 解法 或 计算 法 可 求 出 未 知 线性 DNA 的 相对 分 子 质量 。 (Fre) 1. DNA 的 酶 切 ,方法 同 前 。 2. 1% 普 通 琢 脂 糖 凝 胶 的 配制 ,方法 同 前 。 3. 取 10 凡 未 知 的 DNA 样品 (pPBR322-HBVVEcoR | ),5 2ul 上 样 缓冲 液 (6x ) 混 匀 后 ， 加 到 琼脂 糖 凝 胶 样 品 孔 中 。 同 时 取 10wl(lrg) 已 知 相 对 分 子 质量 的 标准 DNA(ADNA/Hind IIL ) ,加 到 琼脂 糖 凝 胶 另 一 样品 孔 中 。 4. 电泳 ,2 一 3h Ja, RP BER, A Spg/ml Y EB RR 30min. 5. 紫外 线 分 析 仪 下 观察 结果 。 6. 测量 方法 及 计算 结果 :用 分 割 规 或 透明 尺 测 量 出 未 知 的 DNA 样品 与 已 知 相 对 分 子 质量 的 标准 DNA 的 各 条 带 距 加 样 孔 前 缘 的 实际 距离 ,用 半 对 数 纸 作 图 ,以 泳 动 距离 (cm ) 为 横 坐 标 ,以 碱 基 对 (或 相对 分 子 质 量 ) 的 常用 对 数 为 纵 坐 标 , 求 出 待 测 DNA 的 相对 分 子 质量 ( 表 实 验 3-1)。 【注意 事项 】 测 相 对 分 子 质 量 时 酶 切 一 定 要 完全 ,否则 出 现 不 同 构 型 DNA, 使 测量 不 准确 。 表 实 验 3-1 ADNA/Hind 下 相对 分 子 质 量 标准 片段 序号 碱 基 对 /bp 相对 分 子 质量 (x10?) 1 23130 15.00 2 9416 6.12 3 6557 4.26 4 4361 2.84 5 2332 1.51 6 2027 1.32 7 564 0.37 8 125 0.083. (KR tH PRK) 实验 四 DNA 的 纯化 回收 及 定量 EXP4. Purification, Reclamation and Identification of DNA 一 、DNA 的 纯化 常规 方法 抽 提 的 DNA 不 经 纯化 ,也 可 用 于 酶 切 、. 连 接 及 克隆 化 , 若 标 记 探 针 、 测 序 、 转 染 哺乳 动物 细胞 .转基因 动物 操作 等 则 要 进行 纯化 。 高 纯度 的 DNA 不 仅 要 求 完全 去 除 细 菌 染 色 体 DNA、RNA 及 蛋白 质 ,而 且 还 要 求 选择 质粒 DNA 的 不 同 分 子 构 型 。 DNA 的 纯化 方法 有 : 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 、 精 胺 纯化 法 玻璃 粉 洗 脱 法 及 商业 化 层 析 柱 纯化 法 。 现 仅 介 绍 比 较 实 用 的 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 纯化 DNA。 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 纯化 DNA 本 方法 因 操作 简单 、 经 济 而 最 为 常用 。 纯 化 的 DNA A AFR ee oe RROD 细胞 ,尤其 对 碱 变 性 抽 提 的 质粒 ,纯化 效果 更 好 。 【材料 】 5mol/L LiCl, FAB. TER(TE, pH8.0,44 20ug/ml 36 DNase ff) RNase) 。 1.6mol/L NaCll A 13% (W/V) PEG 8000}. 10mol/L MRE, CE, A. 【方法 ]】 1. 将 碱 变性 法 大 量 抽 提 的 质粒 DNA 深 于 TE 中 ,移入 一 新 的 1Sml 的 离心 管内 ,加 入 等 体积 的 Smol/L LiCl 混 匀 ,10 000r/min,4°C ,离心 10min。 2. 取 上 清 移 入 另 一 个 im 离心 管内 ,加 入 等 体积 的 异 丙 醇 混 匀 ,室温 放置 2min， 10 000rvmin 于 室温 离心 10min。 3. 弃 上 清 ,70% 乙 醇 溶液 漂洗 沉淀 ,10 000r/min, FR RB Smin , 弃 乙 醇 并 将 离心 管 倒置 于 滤纸 上 ,室温 放置 $ 一 10min。 4. FA S00u] TER 溶解 沉淀 , 移 至 一 个 1.Sml Eppendorf 管内 ,室温 放置 30min。 5. 加 入 500 风 的 1.6mol/L NaCl( 含 13% 的 PEG 8000) , 混 匀 ,4Y ,12 000r/min 离心 Smin。 6. FL, A 400u) TE 溶解 沉淀 ,分 别 用 酚 . 酚 / 氯 仿 、 毛 仿 各 抽 提 !1 次 。 7. 上 清 移 至 另 一 个 1.5Sml 的 Eppendorf 管内 ,加 入 100J 的 10mol/L 醋酸 铵 ,2 倍 体积 无 水 乙醇 , 混 匀 ,室温 放置 10min,12 000r/min,4T ,离心 Smin。 . 258 . 实验 四 DNA 的 纯化 ` 回收 及 定量 259 . 8. 弃 上 清 , 用 2001 70% 冷 乙醇 溶液 漂洗 沉淀 ,12 000r/min 47 离心 2min。 9. 弃 上 清 , 将 离心 管 倒 置 于 滤纸 上 ,室温 放置 S~10min. 10. 加 入 500pl TE 溶解 质粒 DNA, 测 OD26 \OD ogo VA HARE DNA 的 浓度 及 纯度 。 =, DNA 的 回收 从 含有 各 种 不 同 大 小 的 DNA 混合 物 中 ,分离 纯 化 特定 相对 分 子 质 量 的 DNA 片段 ,是 基因 工程 的 基本 工作 。 实 验 室 中 最 常 采 用 的 是 以 琼脂 糖 凝 胶 为 介质 将 DNA 分 离 后 ,再 进 行 回 收 。 目 前 常用 的 回收 方法 有 DEAE 膜 ( 二 乙 基 氮 基 已 基 纤 维 素 ) 插 片 法 、 低 融 点 琼脂 糖 BEBE HA BEV PEG 法 及 商品 化 回收 试剂 盒 等 ,可 根据 条 件 和 习惯 选用 不 同方 法 ,如 低 融 点 琼脂 糖 凝 胶 法 操作 简便 ,回收 率 较 高 , 适 于 大 片段 DNA 的 回收 ;DEAE 膜 插 片 法 较 简 单 ， 适 于 回收 小 于 S$kb 的 DNA 片段 ,应 用 较 普 遍 , 而 PEG 法 可 直接 从 琼脂 糖 凝 胶 中 纯化 、 回 收 大 小 不 同 的 DNA 片段 。 不 同方 法 得 到 的 DNA 回收 液 ,一 般 均 可 采用 常规 酚 、 氯 仿 / 异 戊 醇 抽 提 以 去 除 杂 质 , 使 DNA 得 到 纯化 。 因 此 ,回收 DNA 也 是 使 DNA 得 到 纯化 的 过 程 。 本 实验 介绍 DEAE ARG HIE PEG 法 及 试剂 盒 法 。 (—) DEAE RR 【原理 】 由 Dretzen 于 1981 年 在 Girvitz 方法 基础 上 改进 而 成 。DEAE 膜 (diethylamenoethyl , 即 二 乙 基 氮 基 己基 纤维 素 膜 ,是 一 种 阴离子 交换 纤维 素 , 在 它 的 纤维 骨架 链 上 ,连接 有 阳 离 子 交 换 基 团 ,能 够 结合 带 阴 电荷 的 DNA 分 子 。 在 高 盐 的 环境 下 ,DNA 分 子 又 可 以 从 DEAE 膜 上 解 离 , 从 而 回收 DNA 片段 。 【材料 】 DNA 样品 。 DEAE fi , BR BL A 7) id Sk RF 电泳 缓冲 液 :TBE。 高 盐 洗 脱 液 :TENa,20mmolML Tris-HCl pH7.5;1lmmolML EDTA;1.5mol/L NaCl. 正 丁 醇 , 酚 、 氯 仿 ,3mol[L NaAc, 乙 醇 ,TE 等 。 【方法 】 1. DNA 样品 的 内 切 酶 酶 切 ( 见 实验 三 )。 2. DNA 的 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ( 见 实验 二 )。 在 紫外 灯 下 观察 到 目的 DNA 完全 分 离 ， 并 确定 位 置 。 3. DEAE 膜 的 预 处 理 (1) 剪 好 DEAE 膜 ,使 其 长 略 大 于 凝 胶 加 样 孔 的 长 度 , 宽 略 高 于 琼脂 糖 凝 胶 的 厚度 。 放 人 干净 带 盖 的 平 血 中 。 (2) 加 入 10mmol/L EDTA(pH8.0) 溶 液 ,浸泡 Smin, 再 用 0.5mol/L NaOH 溶液 浸泡 Smin。 (3) 取 出 DEAE 膜 ,用 无 菌 蒸馏 水 反复 冲洗 数 次 。 若 不 立即 用 ,可 放 于 47 OK - 260 . 基因 工程 学 4. DEAE 膜 插 片 (1) 紫外 灯 下 观察 到 DNA 完全 分 离 后 停止 电泳 ,用 眼科 医用 解剖 刀 在 所 需 DNA 带 前 沿 切 开 ,切口 应 略 长 于 DNA 带 。 (2) 用 扁 头 杀 子 取出 处 理 好 的 DEAE 膜 , 插 和 人 切口 内 ,小 心 挤 紧 凝 胶 , 使 切口 紧密 闭合 。 (3) 继续 电泳 ,在 紫外 灯 下 观察 到 DNA 全 部 迁移 到 DEAE 膜 上 ,停止 电泳 。 (4) 取出 DEAE 膜 , 浸 于 预 冷 双 蒸 水 中 数 分 钟 。 5. 洗 脱 DNA (1) 取出 DEAE 膜 , 用 干净 滤纸 吸 干 膜 上 的 水 滴 。 (2) 把 膜 放 入 1.5ml Eppendorf 管内 ,加 入 适量 的 高 盐 缓冲 液 (TENa) 浸 没 纸 片 ,37TC , 2h 不 断 振 功 。 (3) 10 000r:min ,离心 Smin, 取 上 清 放 于 另 一 1.Sml Eppendorf 管 中 。 (4) BR(2)~(3)4 1~2 次 ,直到 在 紫外 灯 下 观察 不 到 膜 上 有 含 EB 的 DNA。 将 上 清 液 合并 。 6. 浓缩 抽 提 (1) 若 所 得 的 容积 过 多 ,可 用 3x 体 积 的 正 丁 醇 抽 提 一 次 ,以 浓缩 溶液 并 去 除 EB, 吸 出 含 目 的 DNA 的 下 层 水 相 。 (2) 用 酚 / 氯 仿 / 异 成 醇 、 氯 仿 / 异 成 醇 各 抽 提 一 次 ,上 清 液 加 1/10 倍 体积 的 3molML NaAc,2 倍 体积 冷 100% 乙 醇 沉 淀 DNA, —-20CT HK. (3) 12 000r:min, 室 温 离心 20min, 弃 上 清 ,DNA 沉淀 用 70% 乙醇 溶液 漂洗 一 次 ,12 000 rmin, 室 温 离心 10min, 弃 乙醇 ,真空 干燥 2min,5~ 10pul TE 溶 解 DNA。 (4) RO.5pl 上 样 电泳 ,并 测 其 浓度 与 纯度 。 【注意 事项 ]】 1. 适 于 回收 Skb 以 下 的 DNA 片段 ,对 于 ssDNA 或 Skb 以 上 的 dsDNA 片段 的 回收 率 低 。 2. 在 整个 回收 过 程 中 ,不 要 让 DEAE 膜 干 燥 , 和 否则 会 导致 DNA 不 可 逆 地 结合 在 膜 上 而 洗 脱 不 下 来 ,影响 回收 率 。 (二 ) PEG 法 回收 DNA 【原理 ]】 PEG(polyethylenglycol, 聚 乙 二 醇 ) 可 沉淀 DNA。 一 定 浓度 的 PEG 可 将 核酸 因 相 对 分 子 质量 的 不 同 进行 分 离 ,在 琼脂 糖 凝 胶 中 电泳 时 形成 清晰 的 DNA 带 ,便于 直接 从 琼脂 糖 效 胶 中 纯化 、 回 收 不 同 大 小 的 DNA 片段 。 回 收 的 DNA 可 用 于 酶 切 及 基因 重组 。 【材料 】 DNA 样品 ,琼脂 糖 。 眼科 手术 刀 注射 用 针头 , 移 液 管 。 TAE 电 泳 缓冲 液 (50 x 贮存 液 ):242gTris; S7ml 冰 醋 酸 ;100ml 0.5mol/L EDTA, pH8.0 ,蒸馏 水 定 容 至 1000ml。 PEG( 相 对 分 子 质量 为 8000 ,Sigma 产品 )， 15% PEG/TAE 溶液 的 配制 :1Sg PEG, 加 TAE 至 100 ml, 高 压 灭 菌 , 灭 活 DNase, 4 实验 四 DNA 的 纯化 ` 回收 及 定量 261 . 放 备 用 。 酚 / 氯 仿 / 异 成 醇 (25:24:1) ,100% 、 70% 冷 乙醇 ,TE BRK. 【方法 】 1. DNA 样品 的 内 切 酶 酶 切 ( 见 实验 三 )。 2. DNA 的 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 :0.8% ~ 1.2% 普通 琼 脂 糖 凝 胶 , 含 EB 0.5pg/ml, * A TAE 缓冲 系统 。 3. DNA 片段 的 回收 (1) 竺 电泳 将 DNA 完全 分 离 后 ,停止 电泳。 (2) 在 紫外 灯 下 ,于 所 需 DNA 带 正 前 方 用 锐利 的 手术 刀 切 一 抑 形 槽 (边缘 稍 大 于 DNA 带 ) ,用 注射 用 针头 快速 挑 去 切 下 的 凝 胶 块 ,于 槽 内 加 入 15% PEG/TAE 溶液 。 (3) 继续 在 20~25V/em 的 电压 下 电泳 , 约 5 一 10min。 在 长 波 紫外 灯 下 观察 到 DNA 完 4 tk A. PEG/TAG 溶液 中 (不 能 泳 出 ) ,停止 电泳 。 (4) 用 移 液 管 把 含 目的 DNA 的 PEG/TAE 溶液 移入 1.$Sml Eppendorf 管 中 。 .4. DNA 片段 的 纯化 (PEG 的 去 除 ) 一 一 常规 酚 / 氧 仿 抽 提 法 (1) 上 述 溶液 用 酚 / 氯 仿 抽 提 一 次 , 取 上 清 于 另 一 1.$Sml Eppendorf 管内 ,加 1/10 体积 3mol/L NaAc 和 2 FR AR AY Fok CB IRA, -20 过 夜 。 (2) 12 000r/min, & t> 20min, , 倾 去 上 清 。 (3) 沉淀 用 70% 冷 乙醇 溶液 漂洗 ,12 000r/min, BL» 10min. (4) 所 得 DNA 沉淀 真空 干燥 ,TE BY. (5) HO. Spl ERE ELK ,并 测 其 浓度 与 纯度 。 5. 如 遇 到 下 述 情况 , 则 按 如 下 方法 : (1) 若 所 得 的 DNA 片段 需 连 接 于 一 个 克隆 载体 上 , 则 可 从 小 槽 中 DNA 浓度 最 大 的 地 方 取得 ,无 需 纯 化 , 因 PEG 的 存在 可 增加 连接 反应 的 效率 。 (2) 若 同时 回收 多 个 不 同 的 DNA 条 带 , 可 在 其 正 前 方 控 多 个 矩形 槽 。 【注意 事项 】 此 法 适 于 对 难以 获得 的 微量 DNA 的 制备 ,其 回收 DNA. 的 大 小 可 从 0.2 一 Skb, 大 至 50kb 的 DNA 片段 ,重复 步骤 也 可 回收 ,但 需 注意 : 1. 电泳 缓冲 液 一 定 不 能 高 过 琼脂 糖 凝 胶 表 面 。 2. 矩形 槽 的 形状 要 规则 , 切 下 的 琼脂 糖 凝 胶 要 去 除 彻底 。 3. HEA PEG/TAE 溶液 继续 电泳 时 , 需 在 长 波 紫外 灯 下 观察 DNA 的 泳 动情 况 。 长 时 间 的 紫外 线 照 射 , 可 造成 DNA 的 损伤 。 (=) 琼脂 糖 凝 胶 试 剂 盒 回收 法 目前 使 用 较 多 的 商品 化 试剂 使 有 上 海 生 物 工 程 公 司 出 品 的 UNIQ-10 柱 式 DNA 胶 回 收 试剂 盒 及 QIAGEN 公司 的 QIAquick Be BEL CERF A , 均 有 详细 的 说 明 专 , 现 就 回收 效率 较 高 的 QIAquick 试剂 盒 简 介 如 下 : 【原理 】 利用 硅胶 膜 选 择 性 吸附 的 特性 , 当 含 有 目的 DNA 的 凝 胶 溶液 ,经 过 装 有 硅胶 膜 的 收集 - 262: 基因 工程 学 柱 时 ,使 DNA 选择 性 吸附 于 硅胶 膜 上 ,再 利用 洗 脱 液 进行 洗 脱 , 收 集 洗 脱 液 , 即 为 含有 目的 DNA 的 溶液 。 【材料 】 Buffer QG, Buffer PE. Baffeg BB /1Oiimél Li THEICH: PHB. Se 5 A BE, 3mol/L NaAc, pHS.0. 【方法 】 1. DNA 的 酶 切 、 电泳 分 离 ,方法 同 前。 2. 紫外 灯 下 ,小 心切 下 带 有 DNA MBER ,并 称 重 。 3. 使 用 <2% 的 琼脂 糖 凝 胶 , 按 每 100mg Ih Ht Bt 300p1 Buffer QG 的 比例 ,加 入 Buffer QG, 50°C 7K A BRE RE 10min, 并 每 隔 2 一 3min, 在 旋涡 混 旋 器 上 振荡 30s, 使 胶 充 分 融化 混 匀 。 若 溶 液 颜色 为 紫色 或 橙色 ,加 入 101 3mol/L NaAc(pH5.0) ,直到 颜色 与 Buffer QG 相同 。 4. 若 回 收 DNA 片段 的 大 小 位 于 500bp 与 4kb 之 间 , 则 不 需 加 入 异 丙 醇 , 否 则 ,加 入 与 凝 胶 等 量 的 异 丙 醇 。 5. 混 匀 后 , 移 人 QIAquick 内 管内 , 管 的 最 大 容积 为 7530 岂 , 12 000r/min, 4 ,离心 2min, 弃 收集 管内 液体 。 重 复 此 步 , 直 到 含 DNA 的 胶 溶 液 完 全 离心 。 6. 在 QIAquick 内 管内 加 入 0.5 ml & Buffer QG, 室 温 放 置 3min,12 000r/min, 4T , 离 心 2min, 弃 收集 管内 液体 。 7. 在 QIAquick 内 管内 加 入 0.75 ml 的 Buffer PE ,室温 放置 Smin,12 000r/min, 4T B 心 2min, 弃 收集 管内 液体 。 再 次 离心 ,12 000r/min, 4 ,离心 2min。 8. 在 QIAquick 内 管内 加 入 10 一 50 岂 的 Buffer EB ,室温 放置 Smin。 取 一 个 新 的 1.$ml Eppendorf 管 ,将 QIAquick 内 管 放 置 其 上 ,12 000r/min,4T ,离心 Smin, Eppendorf 管内 的 液 体 即 为 回收 纯化 的 目的 DNA。 9. 测定 核酸 的 浓度 及 纯度 。 【注意 事项 】 此 试剂 盒 方法 回收 DNA 纯度 高 , 适 于 回收 7Obp ~ 10kb 的 DNA 片段 ,大 于 10kb 的 DNA 片段 , 则 需 选 择 相 应 的 试剂 盒 。 =. DNA 的 定量 及 纯度 测定 做 酶 切 .连接 .转化 及 标记 探 针 等 ,必须 测定 DNA 的 浓度 及 纯度 , 现 介绍 几 种 常用 的 测 定 方 法 。 (一 ) 紫外 分 光 光 度 计 法 组 成 核酸 分 子 的 碱 基 , 均 具有 一 定 的 吸收 紫外 线 特 性 ,最 大 吸收 波长 是 260nm, 吸 收 低 谷 是 230nm ,根据 这 个 特性 ,可 用 于 测定 核酸 的 浓度 。 1. DNA 浓 度 测 定 ”在 波长 260nm 的 紫外 线 下 ,1 个 OD 的 光 密 度 值 相当 于 双 链 DNA Ye HEN SOug/ml, 4 DNA 或 RNA 为 40wgAml, 单 链 窒 聚 核 苷 酸 为 20xg/ml, 可 根据 此 计算 实验 四 DNA 的 纯化 、 回 收 及 定量 - 263 - 核酸 的 浓度 。 (FH) (1) Rt Spl DNA 样品 或 4 由 RNA 样品 ,加 水 至 lml, 混 匀 , 转 入 分光 光 度 计 的 石英 比 色 杯 中 。 (2) 分 光 光 度 计 预先 用 lml 蒸馏 水 校正 零点 。 (3) 将 样品 杯 放 在 分 光 光 度 计 比 色 槽 内 。 分 别 在 260`280nm 处 读 出 光 密 度 值 (OD;6o、 ODy 99) ,根据 下 述 公 式 计 算 核酸 浓度 : DNA #F¥ ih AY BE = (OD 60 < TK AR Fh FEL < 50) 1000 ng /ul RNA 样品 的 浓度 = (OD 69 X RAR Bh EAB X 40) 1000ng MI 4 DNA 样品 的 稀释 倍数 为 20, 则 OD;eo 的 数值 则 是 所 测 得 的 浓度 ;RNA FF i BY i BE 数 为 25 时 ,OD2;so 的 数值 则 是 所 测 得 的 浓度 。 【注意 事项 】 此 法 仅 用 于 测定 大 于 0.2Swg]ml 的 核酸 溶液 。 2. DNA 纯度 测定 ”分光 光 度 法 可 通过 测量 260.280nm 处 的 吸光 值 的 比值 ,推算 核酸 的 纯度 , 即 OD. 69 /OD 2g). DNA 的 比值 为 1.8,RNA 的 比值 为 2.0。 若 DNA 的 比值 高 于 1.8, 则 说 明 尚 含有 RNA, 可 用 RNA 酶 进行 处 理 ; 若 比值 小 于 1.6, 说 明 蛋 白质 或 酚 等 杂质 在 其 中 ,应 再 用 酚 / 氯 仿 抽 提 ,乙醇 沉淀 纯化 。 若 RNA 样品 的 比值 小 于 2.0, 也 应 该 用 酚 / 氧 仿 抽 提 ,乙醇 沉淀 纯化 。 紫外 分 光 光 度 计 法 测定 DNA 时 ,有 两 个 缺点 :一 是 无 法 区 别 DNA/RNA 的 性 质 , 以 及 质粒 DNA 或 染色 体 DNA, 二 是 测定 用 量 偏 多 。 (=) 荧光 分 光 光 度 法 DNA RNA 本 身 不 能 产生 效 光 ,但 荧光 染料 溴 化 乙 锭 (ethidium bromide, EB) FJ LARA 核酸 双 链 的 配对 碱 基 之 间 ,在 紫外 线 激发 下 ,发 出 红色 荧光 ,其 荧光 强度 与 核酸 含量 呈正 比 。 使 用 已 知 的 不 同 浓度 的 标准 DNA 做 对 照 ,可 比较 出 待 测 DNA 的 浓度 。 此 法 可 检测 到 1 一 10ng 的 样品 ,但 是 ,所 测 的 浓度 是 与 标准 比较 而 估计 出 来 的 ,因而 不 是 精确 浓度 。 1. 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 一 一 EB 染色 ”该 法 因 其 简便 易 行 样品 用 量 少 而 常 使 用 。 不 同 大 小 的 线性 DNA 经 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 后 ,采用 EB 染色 , 因 其 相对 分 子 质量 不 同 而 出 现 电 泳 快 慢 行 为 的 差异 , 泳 出 多 条 带 型 。 用 肉眼 在 紫外 灯 下 观察 、. 拍 照 , 或 在 凝 胶 成 像 仪 下 拍照 记录 ,与 已 知 浓度 的 标准 DNA 相 比 较 , 便 可 做 定性 定量 。 采用 此 法 , PS BR WE BE BY AG Ul) 4} HEB 0.05 ~ 0.1 pg AY DNA; Be Be FH BR BY YS EHH 5 ~ 10ng 的 DNA. 2. GRAB PERE EB 平板 比较 法 ”用 含 EB 的 适当 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 灌 制 平 板 。 将 待 测 DNA 与 系列 稀释 的 标准 DNA 浴 液 各 1 岂 ,分别 点 至 凝 胶 平板 上 ,于 室温 下 放置 数 小 时 ,在 紫 外 灯 下 观察 比较 ,可 大 致 确定 核酸 含量 。 此 法 简便 易 行 ,但 不 能 鉴别 DNA.RNA & DNA 的 构 型 ,也 不 能 测定 相应 的 样品 的 纯度 。 ( 刘 素 侠 ) 实验 五 ”细胞 总 RNA 的 抽 提 Exp5. Extraction of Total RNA 【原理 】 研究 基因 的 表达 和 调控 时 ,需要 从 组 织 和 细胞 中 分 离 纯化 RNA。 哺 乳 动物 细胞 内 的 RNA 含量 非常 丰富 ,平均 每 个 细胞 内 大 约 含 有 10 Pug ,每 克 细 胞 大 约 相 当 于 10° 个 培养 细 胞 ,可 分 离 出 S 一 10mgRNA。 因 此 , 真 核 细 胞 总 .RNA 的 分 离 相 对 较为 容易 。 绝 大 多 数 mRNA 的 3 端 存在 20 一 250 个 多 聚 腺 苷 酸 (poly A) B, AI WAR (dT) RAR HAD 离 。 因 此 ,可 以 很 方便 地 得 到 高 质量 的 mRNA, 而 只 需要 制备 总 RNA. RNA 酶 (RNase) 是 导致 RNA 降解 的 最 主要 物质 ,在 自然 界 中 广泛 存在 , 且 非 常 稳 定 。 常规 的 高 压 蒸汽 灭 菌 方 法 和 和 蛋白酶 抑制 剂 并 不 能 使 所 有 的 RNase 完全 失 活 , 因 此 ,必须 使 用 RNase AY 5% 34M) til #1 ——DEPC (diethyl pyrocarbonate, 焦 碳酸 二 乙 酯 ) 处 理 RNA 抽 提 过 程 中 所 用 的 一 切 仪器 及 试剂 ,具体 事项 如 下 : 1. 在 玻璃 烧杯 中 注入 双 营 水 ,加 入 DEPC, (# HK EW 0.1% (V/V, DEPC-H,0O) 2. 使 用 的 试剂 必须 用 DEPC-H,O 配制 。 3. 所 用 塑料 制品 , 均 应 用 DEPC-H,O 浸泡 ,在 通风 柜 中 37C 或 室温 下 过 夜 ,再 高 温 高 EZRA KH B/D 30min, 80~90TC 高 温 下 烘 烤 ,干燥 。 4. 若 为 玻璃 制品 或 剪刀 、 杀 子 等 金属 制品 ,用 DEPC-H,O #23. He Ja, 150° HE 4h Bhs 5. 注意 :DEPC 为 活性 很 强 的 剧 毒物 质 ,操作 时 必须 戴 手 套 , 并 在 通风 橱 内 进行 。 下 面 介 绍 几 种 较为 常用 的 细胞 总 RNA 的 制备 方法 。 (一 ) Trizol 法 【原理 】 Trizol 是 一 种 新 型 总 RNA 抽 提 试剂 ,内 含 异 硫 氰 酸 股 等 物质 ,能 迅速 破碎 细胞 ,抑制 细 胞 释放 出 的 核酸 酶 。 整 个 反应 过 程 应 在 15 ~ 30 下 进行 。 【材料 】 Trizol。 氯仿 。 异 两 醇 。 75% 乙醇 溶液 (DEPC 处 理 ) RNase 水 溶液 [ 含 0.1% DEPC(V/V) ] “。 264 。 实验 五 ”细胞 总 RNA 的 抽 提 - 265 - 【方法 让 组 织 或 细胞 (1) 组 织 : 每 50 一 100mg 新 鲜 组 织 内 加 入 lml Trizol itl, A SR HEAT OR. HA 组 织 的 体积 不 应 超过 Trizol 试剂 体积 的 10% 。 (2) 单 层 生长 细胞 : 吸 去 上 清 , 以 每 10cm2 面积 的 细胞 加 入 lml Trizol 的 比例 ,向 培养 瓶 内 直接 加 入 Trizol 试剂 ,溶解 细胞 ,用 吸 液 管 吹 打 细胞 溶解 物 数 次 ,将 混合 物 移 至 新 的 1.5ml Eppendorf 管 。 (3) 悬浮 生长 的 细胞 :1000r[min,Smin ,离心 沉淀 细胞 ,洗涤 一 次 (可 避免 mRNA 的 降 解 ) ,加 入 Trizol 试剂 反复 吹 打 溶 解 细胞 。 每 S 一 10x 10° 动物 、 植 物 .酵母 菌 细 胞 ,每 1X10” 细菌 细胞 ,加 入 lml Trizol 试剂 。 2. 优化 步骤 (可 供 选 择 ) 对 于 富 含 蛋 白质 脂肪、 多 聚 糖 或 诸如 肌肉 、 脂 肪 组 织 等 细 胞 外 成 分 的 标本 ,需要 增加 该 分 离 步 又 。 用 Trizol 试剂 混 匀 组 织 后 ,12 000r/min 于 40 离 心 10min, 以 除去 不 溶性 成 分 。 离 心 后 的 上 清 中 含有 RNA, 形 成 的 沉淀 小 球 含 有 细胞 外 膜 、 多 聚 糖 及 相对 分 子 质量 高 的 DNA, 应 去 除 。 来 自 脂肪 组 织 的 标本 ,可 有 过 多 的 脂肪 ,在 最 上 层 形成 脂肪 层 ,应 该 吸 掉 该 层 。 将 离心 后 的 ( 即 上 清 细胞 溶解 液 ) 移 入 新 的 Eppendorf 管 , 继 续 下 一 步骤 。 3. 分 相 (1) 将 细胞 溶解 液 在 15 一 307 孵育 Smin ,使 核 蛋 白 复合 物 完 全 解 离 。 (2) 加 入 0.2ml 的 氯仿 和 ml Trizol 试剂 ,注意 盖 紧 盖子 ,用力 摇动 Eppendorf 管 1Ss ,并 在 15 一 307 孵育 2 一 3min。 (3) 4C 离心 1Smin ,离心 力 不 超过 12 000r/min. (4) 离心 后 ,混合 物 可 分 为 三 层 :底层 是 葵 酚 -氯仿 相 , 交 界 处 为 白色 云 状 物 , 上 层 无 色 水 相 中 含有 RNA。 水 相 的 体积 大 约 为 60% 的 Trizol 试剂 体积 。. 4. 沉淀 RNA (1) 吸取 上 层 水 相 至 另 一 个 新 的 1.5 ml Eppendorf 管内 。 (2) 加 入 0.5ml 异 丙 醇 /ml Trizol 试剂 ,15 一 307C HA 10min。 (3) 4 已 离心 10min ,离心 力 不 超 过 12 000r/mine 离心 后 ,于 Eppendorf 管 边缘 和 底部 形成 的 沉淀 即 为 所 制备 的 RNA。 5. 洗涤 RNA (1) FEW, ABD 1m) 75% 乙 醇 溶液 漂洗 RNA 沉淀 。 (2) 混 匀 样品 ,47 离心 Smin ,离心 力 不 超 过 7500r/min. 6. HY RNA (1) 弃 上 清 ,RNA 沉淀 于 空气 /真空 干燥 5 ~10 min ,注意 不 能 让 RNA 沉淀 完全 干燥 ， 否则 将 降低 其 溶解 度 。 (2) 溶解 RNA 沉淀 :加 入 SOul FE RNase 的 0.1%DEPC 水 溶液 ,于 55 ~ 60CT HA 10min。 (3) 上 述 样品 即 可 用 于 反 转 录 成 cDNA、Northern 印迹 及 杂交 分 析 等 实验 ,或 放 于 -80C KAA. - 266 .基因 工程 学 (二 ) 异 硫 和 氰 酸 肌 - 氯 化 鸳 超 速 离心 法 【原理 ]】 异 硫 氰 酸 肌 是 蛋白 质 强 变性 剂 , 可 有 效 抑制 RNA 酶 的 活性 。 细 胞 或 组 织 裂解 液 经 过 CsCl 为 介质 的 密度 梯度 超速 离心 ,DNA 与 组 织 蛋 白 悬 浮 于 上 清 液 中 ,RNA 沉淀 于 管 底 从 而 分 离 。 此 法 不 仅 能 得 到 高 质量 的 RNA, 而 且 能 同时 分 离 出 细胞 染色 体 DNA, 已 成 为 提取 哺 乳 动 物 细胞 RNA 的 常规 方法 。 但 其 操作 复杂 ,流程 较 长 , 适 于 冷冻 时 间 长 、 细 胞 质 和 细胞 核 不 易 分 离 的 组 织 标本 及 富 含 RNA 酶 的 组 织 细 胞 。 【材料 】 GIT( 异 硫 氰 酸 肌 义 浆 缓 冲 液 ) :4.0mol/L 异 硫 氰 酸 肛 ， 0.1mol/L Tris-Cl(pH7.5),1% B- 3 3 Z. BE 5.7 mol/L Ask 4 HK: 5.7mol/L CsCl,0.01mol/L,EDTA(pH7.5). TE(#% 0.1% SDS). TE(pH7.6). 3mol/L NaAc(pH5.2). 100% 、 70% 乙 醇 溶液 。 (Fre) 1. 标本 制备 (1) 组 织 标本 :新 鲜 组 织 称 重 后 , 剪 成 约 lcm? 的 组 织 块 ,不 需 漂洗 直接 加 入 匀 浆 液 提 取 RNA。 (2) 贴 壁 培养 细胞 : 胰 酶 消化 后 离心 收集 ,PBS 漂洗 1 次 ,再 离心 收集 细胞 ,加 入 lml 4 (3) 悬浮 培养 细胞 :离心 后 ,用 PBS 悬浮 漂洗 沉淀 再 离心 收集 ,加 入 匀 浆 液 匀 浆 。 上 述 标本 若 不 立即 提取 RNA, 则 可 经 液 氮 速 冻 后 转 至 -707 贮存 备用 。 2. RNA 的 提取 (1) 将 处 理 好 的 样品 移 人 匀 浆 器 ,加 入 S ~7 倍 于 样品 体积 的 GIT. (2) 高 速 匀 浆 1 一 2min, 加 入 十 二 烷 基 肌 氮 酸 钠 (SLS) 至 终 浓度 0.5% , 混 匀 后 ,5000g， 室温 离心 10min。 和 若是 培养 细胞 可 不 离心 。 (3) 在 Beckman 离心 机 SW 60 离心 管 中 , 先 加 入 3.1ml 的 CsCl 洲 液 ,然后 在 其 上 面 小 心 铺 加 组 织 细胞 匀 浆 液 或 步骤 (2) 的 上 清 液 1.2ml, 平 衡 离 心 对 称 管 ,40 000rZmin ,超速 离心 12h。 (4) FE 2/3GIT 溶液 ,下 13 的 溶液 为 含 DNA 的 液体 , 较 黏 稠 ,可 用 于 提取 染色 体 DNA, 管 底 的 胶 状 沉淀 即 是 总 RNA。 3. RNA 的 纯化 (1) 将 离心 管 倒置 倾斜 ,用 70% 乙醇 溶 液 先 清洗 管 壁 上 的 盐 类 和 蛋白质 ,然后 用 70% 乙醇 (室温 ) 洗 RNA 沉淀 2min, 弃 乙醇 ,倒置 离心 管 数 分 钟 。 (2) FA 300pu1 TE YF ff! RNA 沉淀 ,转移 至 1.5ml Eppendorf 管内 ,用 等 容积 酚 MA. 氯仿 各 抽 提 1 次 。 若 为 培养 细胞 ,可 省 去 酚 .氯仿 抽 提 . 本 [ar 本 实验 五 ”细胞 总 RNA 的 抽 提 - 267 - (3) 上 清 加 入 1/10 体积 3mol/L NaAc(pH5.2),2x 体 积 无 水 乙醇 混 匀 后 -70TC 放置 30min。 (4) 12 000r/min,4C 离心 10min, 弃 上 清 ,70% 乙 醇 溶 液 室温 漂洗 沉淀 ,2000rmmin 离心 Smin, # Lif, AHF 2min。 (5) 加 入 适量 DEPC Ab FB AY LAE KIA BH RNA, 测 定 0D;。 与 OD;s ,判断 RNA 的 纯度 和 KE. -70CKH. BENE REA RNA, 可 用 小 容积 水 悬浮 溶解 RNA 后 ,再 加 入 3 倍 体积 乙醇 , -707 保存 。 使 用 前 再 离心 回收 RNA, 溶 于 0.3molML NaAc (pH5.2) 中 。 【注意 事项 ]】 1. 本 法 仅 适 用 于 lg 组 织 或 108 个 细胞 RNA 的 提取 , 超 量 的 样品 会 影响 RNA 的 提取 产量 与 纯度 。 2. 70% 乙 醇 漂 洗 RNA 沉淀 时 ,不 要 让 RNA 沉淀 漂浮 。 3. 一 般 情 况 下 ,步骤 (4) 中 RNA 沉淀 为 半 透 明 的 或 看 不 见 的 , 若 沉 淀 为 白色 颗粒 大 团 ， 说 明 CsCl 已 析出 ,应 该 反复 用 70% 乙 醇 溶液 漂洗 或 反复 乙醇 沉淀 回收 RNA, 以 去 除 CsCl. (=) RBM—AMBAZ 【原理 】 由 Strohman 首创 ,经 MacDonald 于 1987 年 改进 而 来 ,适用 于 没有 超速 离心 机 的 情况 下 提取 细胞 总 RNA。 盐 酸 县 是 另 一 类 强力 的 蛋白 质变 性 剂 ,可 溶解 蛋白 质 ,并 使 蛋白 质 二 级 结构 消失 ,细胞 结构 降解 , 核 蛋 白 迅速 与 核酸 分 离 AMR NARA. AA BAM 抑制 RNA 酶 活性 ,组 织 细胞 匀 浆 裂解 后 ,有 机 溶剂 抽 提 去 除 蛋 白质 ,通过 选择 性 沉淀 使 RNA 分 离 。 本 法 提取 的 RNA 质量 较 好 ,但 操作 过 程 繁杂 费时 。 【材料 】 EPMA IRM I :8mol/L HMA, 0.1mol/L NaAc(pH5.2), Smmol/L 2-3 Zé ZB, 0.5% + — te 3 WLR AA (SLS) « Eb RAM FR WK I :8mol/L HRA, 0.1mol/L NaAc(pHS5.2), Immol/L 2- 琉 基 乙 醇 ， 20mmol/L EDTA(pH8.0). 乙醇 :100% .70% 。 氯仿 / 正 丁 醇 (4:1)。 4mol/L NaAc,pH7.0. 3mol/L NaAc, pH5.2. RNA 溶解 液 : 0.2% SDS. 0.05mol/L EDTA, pH8.0. 【方法 】 1. 标本 制备 ”样品 细胞 的 准备 同 异 硫 氰 酸 且 法 。 - 268: BALES 2. 抽 提 RNA (1) 将 处 理 好 的 样品 移 人 匀 浆 器 ,加 入 10 FA REE ARM RR LO EAR 1mins (2) 将 匀 浆 液 移 入 1 个 离心 管 ,5 000r/min 室温 离心 10min。 (3) 取 上 清 移 至 1 个 清洁 离心 管 中 , 加 入 1/10 voi 3mol/L NaAc(pH5.2), #84, 再 加 2.5 倍 体 积 预 冷 的 100% 乙 醇 充 分 混 匀 OC 放置 至 少 2 (4) 5 000r/min 0C 离心 atoning (5) 每 个 细胞 样品 中 加 入 10 ~ 15ml FEAR AMATI I, PEPE A A (6) MA 2.5 倍 体积 冰 预 冷 的 100% 乙 醇 ,立即 充分 混 匀 , -20C KAA” 2h, (7) 5 000r/min 0C 离心 10min, 去 上 清 , 室 温 放 置 数 分 钟 以 挥发 乙醇 。 (8) 重复 步骤 (6) (7) 两 次 ( 即 总 共用 2.5 倍 体 积 乙 醇 沉 淀 3 次 )。 (9) 按 每 克 组 织 细 胞 Sml 的 比例 ,加 0.02mol/L EDTA(pH8.0) 溶 解 核酸 。 步 又 如 下 : 先 加 1Z2 体积 EDTA 振荡 1 一 2min,3000g 离心 2min; 弃 上 清 , 再 加 入 1722 容积 EDTA 振荡 核酸 1 一 2min, 合 并 两 次 核酸 溶解 液 。 3. RNA 的 纯化 (1) 上 述 核酸 溶液 用 等 体积 氯仿 / 正 丁 醇 (4:1) 抽 提 一 次 ,5 000r/min 室温 离心 10min, 吸出 上 清 至 另 一 个 清洁 离心 管 中 。 (2) 加 3 倍 体积 4molML NaAc(pH7.0) 混 匀 ,=-207C 放置 1h 以 沉淀 RNA. (3) 5 000r/min OC 离心 20min,RNA 将 于 管 底 形成 沉淀 。 (4) 吸出 上 清 液 ( 内 含 DNA, 可 留 取 抽 提 DNA) ,用 4? HAA 3mol/L NaAc (pH7.0) 漂 YE RNA ve ,20T 5 000r/min 离心 20min。 (5S) 弃 上 清 , 按 每 克 组 织 细 胞 AL ml 的 比例 加 入 0. 2% SDS,0.05mol/L EDTA(pH8.0) 溶解 RNA 沉淀 。 (6) 加 入 2 倍 体积 冰 预 冷 100% 乙 醇 混 匀 OC 放置 至 少 2h,5 000r/min 4T 离心 10min。 弃 上 清 ,70% 乙 醇 漂 洗 RNA 沉淀 ,5 000r/min 4 和 离心 3min, 去 上 清 , 室 温和 干燥 数 分 钟 。 (7) 用 DEPC 处 理 的 小 体积 双 蒸 水 溶解 RNA 沉 淀 ,加 入 3 倍 体积 100% 乙 醇 ,-70C 保 存 备 用 。 若 需要 回收 RNA, 加 3mol/L NaAc(pH5.2) BAK HW 0.3mol/L, #4, 12 000 r/min 4C 离心 回收 RNA。 【注意 事项 】 1. 在 RNA 的 纯化 步骤 (5) 中 , 若 有 SDS 沉淀 析出 , 滴 加 O. 1mol/L NaOH RIA pH 至 TiS 2. 整个 过 程 均 应 在 无 RNase 的 环境 中 进行 。 (MAR wh FA) 买 验 入 ”聚合 梅 链 反应 Exp6. Polymerase Chain Reaction 【原理 】 PCR 是 利用 酶 促 合 成 特异 DNA 片段 的 原理 ,模拟 DNA 复制 过 程 的 核酸 体外 扩 增 技 A. AAA aS PS A A SERS WE DNA 聚合 酶 作用 下 ,指导 两 条 互补 链 上 DNA 合成 ,经 高 温 模板 变性 、 低 温 退 火 ` 适 温 延 伸 ,三 个 步骤 的 反应 为 一 个 周期 ,循环 进行 。 每 一 周期 所 产生 的 DNA 又 成 为 下 一 次 循环 的 模板 ,如 此 循环 使 PCR 产物 以 指数 方式 增长 。 当 扩 增 25 一 30 个 周期 后 ,可 使 目的 DNA 放大 100 FHF. PCR 的 特点 : (1) 省 时 ( 几 小 时 完成 ) ,自动 化 操作 简便 。 (2) 灵敏 度 高 :可 检测 pg 量 的 模板 DNA. (3) 扩 增 效率 高 [ 扩 增 倍数 为 (1+ X)”,X: 扩 增 效 率 ,” :循环 次 数 ]。 (4) 特异 性 较 高 (由 特异 性 引物 、 碱 基 互 补 、 聚合 酶 特性 决定 ) 。 (5) 可 人 允许 一 定 核 苷 酸 的 错误 失信。 一 、 HBV 基因 扩 增 试剂 盒 检测 标本 中 的 HBV DNA 【材料 】 试剂 盒 组 成 (20 人 份 ) (1) 裂解 液 ,500l,1 管 。 (2) PCR 反应 混合 液 ,200 由 ,1 管 。 临 用 时 分 装 于 0.2ml Eppendorf 管 。 (3) Tag 聚合 酶 存在 于 溴 酚 蓝 内 ,200 吕 ,1 管 , 临 用 时 分 装 。 (4) HBVDNA 阳性 对 照 血 清 ,20ml,1 管 。 (5) 琼脂 糖 1 支 。 (6) WHE ,1000p1,1 管 。 【方法 】 1. 待 检 血 清 DNA 的 提取 裂解 HBV 颗粒 : 取 患 者 血清 40 几 ,加 裂解 液 20wl, 混 匀 后 ， 100C 煮沸 10min,12 000r/min, BL 20min, 吸 上 清 10ml ,为 PCR 扩 增 的 模板 ,或 存放 于 4 备用 。 2. pBR322-HBV 转化 大 肠 杆菌 阳 性 克隆 的 鉴定 “pBR322-HBV 连接 后 转化 大 肠 杆 菌 DHSa , 涂 布 Amp 平板 ,此 平权 上 生长 的 菌落 有 两 种 情况 ,阳性 克隆 与 自身 环 化 载体 ,可 应 用 > 269 - - 270: BALES PCR 方法 鉴定 。 挑 取 单 个 克隆 ,加 入 20] B fH HK, 100 AM 10min, 12 000r/min 离心 20min, 取 上 清 10pl 即 为 PCR 扩 增 模板 。 3. 扩 增 方法 “取出 已 分 装 有 PCR 反应 混合 液 及 Taq 聚合 酶 的 0.2ml Eppendorf 管 ， 12 000r/min, ,离心 30s, 每 管 加 入 处 理 好 的 模板 10 由 ,阳性 对 照 可 直接 加 入 10) 阳性 对 照 血 清 , 阴 性 对 照 加 入 双 蒸 水 ,振荡 混 匀 ,12 000r/min, BL 30s, 4E PCR 仪 上 按 下 列 程 序 进 行 扩 增 :9ST 预 变 性 3min 后 , 按 下 列 步 又 循环 35 次 :四 变性 ;9$C , 30s; @iBK ,55T , 30s; @ 延 伸 ,72 ,60s; 最 后 于 72 忆 延伸 10min。 4. 扩 增 产物 的 检测 “应 用 2% 的 普通 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 : 取 了 CR 反应 产物 10 风 , 直 接 上 样 电 泳 ,20 一 30min 后 ,紫外 透射 仪 内 观察 。 用 DL2000 作为 相对 分 子 质 量 标志 ,观察 扩 增 片段 大 小 。 判断 标准 : 若 标本 扩 增 带 与 阳性 对 照 带 处 于 同一 位 置 ,判定 为 标本 阳性 ,和 否则 为 阴性 。 二 、RT-PCR( 反 转录 -聚合 酶 链 反应 ) 【原理 】 RT-PCR 是 以 RNA 为 模板 ,体外 扩 增 DNA 的 方法 。 其 基本 原理 是 ,第 一 步 以 与 mRNA 3 端 polyA 互补 的 oligo(dT)n 为 引物 ,以 mRNA 为 模板 ,在 反 转 录 酶 的 催化 下 ,合成 cDNA; 第 二 步 以 cDNA 为 模板 ,加 入 与 cDNA 互补 的 引物 ,在 DNA 聚合 酶 催化 下 ,PCR 大 量 扩 增 目的 基因 。 本 实验 以 有 B 肌 动 蛋 白 (B-actin) 的 检测 为 例 ,介绍 RT-PCR 的 过 程 。 肌 动 蛋白 表达 于 任何 生物 细胞 , 且 含 量 比较 稳定 。 通 过 检测 逆转 录 产 物 中 及 肌 动 蛋白 的 表达 情况 ,推测 反 转 录 过 程 的 成 败 , 因 此 ,B- 肌 动 蛋 白 也 叫做 内 参照 。 当 药物 不 影响 B- 肌 WRAAIAN ,也 可 根据 用 药 前 、 后 B- 肌 动 蛋白 的 表达 量 ,进行 目的 基因 的 半 定 量 检测 。 【材料 】 反 转 录 酶 。 反 转 录 引 物 :oligo(dT)n。 RNA 酶 抑制 剂 。 细胞 总 RNA。 PCR 特异 性 引物 :浓度 为 20nmol/L, 上 游 引 物 Cx1:5’ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG 3’, F ii#5|M Cx2:5’ATG AGT GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT 3’, Taq 酶 :低温 保存 于 甘油 内 。 Mg :1.5nmol/L. DEPC-H,0O. dNTP: 10nmol/L. 【方法 】 1 以 mRNA 制备 cDNA 取 二 4» 1.5ml Eppendorf 管 , 按 下 述 依次 加 样 : 实验 六 ”聚合 酶 链 反 应 .271 . DEPC 处 理 的 三 蒸 水 Sul oligo(dT) n Lyl ( 0.5pg) RNA Iyl (0.1~Syg) : 总 体积 Lipl 混 匀 ,于 70°C A Smin, HRB K EAE , ZE Eppendorf 管内 按 下 述 继续 加 样 : DEPC 处 理 的 三 蒸 水 1. Spl RNA 酶 抑制 剂 0.51 5 < Buffer 4ul 10nmol/L dNTP 2pl 总 体积 191 在 旋涡 混 旋 器 上 混 匀 30s, 12 000 r/min 离心 30s, 放 入 37C 水浴 Smin, Hl A JFK ae A (M-MLV) 1p1(200n) ,于 42 忆 反应 60min ,再 放 人 70 水 浴 灭 活 反 转录 酶 10min, 迅 速 置 人 冰 水 浴 中 冷却 。 此 反应 产物 即 为 反 转 录 的 cDNA, 可 取 ll WR RR WR RAE, 其 余 放 于 - 207 备用 。 2. 8B- 肌 动 蛋 白 的 PCR 扩 增 ，” 取 一 个 0.2ml Eppendorf 管 , 按 下 述 依次 加 入 : = RK 18.0pl Cx 0.5yl Cx 下 0.5yl 10 X Buffer 2.5yl dNTP 0.5yl Mg 1.5pl cDNA 1.0 pl Taq BY 0.5 pl 总 体积 25.0 yl 在 旋涡 混 旋 器 上 混 匀 30s,12 000 r/min BL 30s, HA PCR 仪 , 按 下 列 程序 进行 扩 增 : 95C 预 变性 3min 后 ,进行 如 下 循环 :四 9STC , 45s; @55T ,60s;@72T , 45s. HE 30 个 循环 ， FH 72 延伸 Smin。 3. 扩 增 产物 的 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 检测 ”制备 2% 的 普通 琼脂 糖 凝 胶 , 取 2 一 10wl PCR 扩 增产 物 ,加 入 2m416x 上 样 缓冲 液 , 混 匀 后 加 入 加 样 孔 内 ,40 一 80V 电压 进行 电泳 。 同 时 加 入 DNA Maker DL2000,30 ~ 60min 后 ,在 紫外 线 下 观察 结果 , 若 出 现 366bp DNA 带 , 则 为 阳 性 。 在 上 样 量 一 定时 ,可 根据 DNA 带 的 亮度 估计 反 转 录 的 效果 。 DL2000 电泳 后 的 DNA 47 :2000bp .1000bp .750bp .S00bp .250bp , 100bp. 有 关 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 的 详尽 方法 ,参阅 实验 二 。 【注意 事项 ]】 1. 血清 标本 ”应 使 用 一 次 性 试管 及 吸管 ,以 防 污染 标本 。 2. 微量 加 样 器 应 准确 , 酶 加 入 量 过 大 时 常常 造成 非特 异 产物 生成 ,引物 量 过 大 时 易 形 成 引物 二 聚 体 。 3. 全 部 操作 过 程 应 使 用 一 次 性 塑料 吸 头 ,以 防止 交叉 污染 。 4. 为 防止 Taq 酶 失 活 ,应 在 最 后 加 入 。 反 复 冻 融 易 致 Taq 酶 失 活 ,因此 加 样 时 最 好 不 要 让 Taq 酶 离开 冰柜 。 ( 刘 素 侠 ) 实验 七 DNA 的 连接 与 转化 Exp/. Ligation and Transformation of DNA <= ADNAL.- 2 hind 【原理 】 DNA 重组 技术 中 的 核心 步骤 之 一 是 目的 基因 与 载体 之 间 的 连接 。DNA 连接 本 质 上 是 一 个 酶 促 生物 化 学 过 程 , 即 在 一 定 条 件 下 ,由 DNA 连接 酶 催化 目的 基因 与 载体 相 邻 的 S Si 磷酸 与 3 端 羟 基 之 间 形 成 磷酸 二 酯 键 的 过 程 。 相同 或 不 同 限制 性 内 切 酶 产生 的 相同 黏 性 末端, 在 降 至 退火 温度 时 ,能 重新 互补 结合 ， 在 DNA 连接 酶 的 催化 下 ,目的 序列 就 与 载体 DNA 链 相 连接 。 【材料 】 酶 切线 性 化 载体 DNA: pBR322/EcoR 工 酶 切片 段 。 酶 切 处 理 的 目的 DNA:HBV DNA/EcoR I 2 T4-DNA 连接 酶 : 购 于 华美 生物 工程 公司 , -20T7 保存 。 T4 Buffer(10 x ):0.2mol/L Tris-HCl, pH7.6, 0.1lmol/L DTT, 0.1mol/L MgCl. ATP: 10mmol/L, FAK fa LAE 7K Bic tii] , — 207 保存 。 【方法 】 1. 取 一 个 1.Sml Eppendorf 管 , 按 下 述 加 样 : ——— SS 总 体积 为 20 岂 , 混 匀 ,12 000r/min, BY-Ly 30s. 4ul K Fi WL HK 7K 2. 置 12 人 CC 水浴, 反应 过 夜 。 2yl T4-Buffer(10 x ) 3. 65C KY Smin, KI T4- 连 接 酶 。 2ul 10mmol/L ATP 4. 可 直接 用 于 转化 试验 。 Sul 酶 切 处 理 的 pBR322 DNA cr ee 5. 评估 连接 结果 :可 取 Syl EE I pe : I oh 合 物 ,琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 , 结 果 在 载体 2ul T4-DNA 连接 酶 Se ae ee DNA 和 插入 DNA 条 带 之 后 有 若干 条 连续 的 微弱 融 型 (由 连接 环 化 DNA 的 不 同 构 型 所 致 ) ,表示 连接 有 望 。 【注意 事项 】 1. T4-DNA 连接 酶 活性 发 挥 需要 Mg * HB BD ,并 需 ATP 提供 能 量 。 2. 连接 反应 温度 应 视 所 用 的 内 切 酶 而 定 ,应 保证 黏 末 端 退火 及 酶 活性 ` 反 应 速率 之 间 的 平衡 。 .272 . 实验 七 ”DNA 的 连接 与 转化 .273 . 二 、 重 组 DNA 的 转化 【原理 】 转化 的 基本 原理 是 细菌 处 于 0C CaCl, 低 渗 溶液 中 ,细菌 膨胀 成 球形 ,转化 混合 物 中 的 DNA 形成 抗 DNase 的 羟基 - 钙 磷 酸 混合 物 粘 附 于 细胞 表面 ,经 42°C 短 时 间 热 冲击 处 理 , 促 进 细胞 吸收 DNA 复合 物 ,在 选择 性 培养 基 平板 上 培养 ,可 选 出 所 需 的 转化 子 。 【材料 】 pBR322 与 HBV 的 连接 产物 。 LB 培养 基 。 LA 培养 基 :LB 培养 基 中 加 入 终 浓 度 为 S0ngAml HAE PGK (Amp). LA 平板 :用 LB( 含 终 浓度 的 Amp 50pgAml) 配 成 。 100mmol/L CaCl, :用 双 蒸 水 配制 ,高 压 灭 菌 ,47 保存 。 JM109 受 体 菌 (F* , lacZAM 缺失 ) (FH) 1. 感受 态 细胞 的 制备 (1) 取 甘 油 保 存 的 JM109 划 线 接种 至 LB 琼脂 板 上 37 SHEFF 16 ~ 20h. (2) 挑 单 菌落 接种 至 2ml LB 液体 培养 基 中 ,37?7 振荡 ,培养 过 夜 。 (3) 取 0.Sml 培养 物 接种 至 100ml LB 培养 基 中 ,37? 剧烈 振荡 ,培养 4 一 6h 不 动 ,至 OAgo9 =0.4~0.5( AMAR REA 5 x 107 个 细胞 Aml)。 (4) 将 培养 物 置 冰 浴 2h, MK 1.4ml BA 1.5ml Eppendorf # A ,5000r/min, 4C ,离心 Smin。 | (5) 弃 上 清 , 倒 置 Eppendorf 管 使 残 液 流 尽 ,将 菌 体 重 悬 于 冰 预 冷 的 700p1 CaCl, 溶液 中 , 冰 浴 静 置 30min。 (6) 5000r/min,4C ,离心 Smin, 弃 尽 上 清 , 将 菌 体 悬浮 于 冰 预 冷 的 140ml CaCh 溶液 中 ， 冰 浴 放置 备用 。 2. 转化 (1) 取 140pl 感受 态 细菌 , 置 冰 上 。 (2) 加 入 20pl( BK 101) REP IRA , 冰 浴 放置 30min ,每 隔 Smin, 轻 轻 播 动 Eppendorf tx. (3) 42T , 热 休 克 1~2min, HRA LE, MA Imin。 (4) 加 入 lml LB 液体 培养 基 , 轻 轻 摇 匀 ,37Y 振 功 培养 1 一 2h ,使 细菌 恢复 正常 。 (5) 取 100 一 200 岂 菌 液 涂 布 于 LA 平板 上 ,37 培养 12 一 24h。 (6) 进一步 筛选 鉴定 。 【注意 事项 ]】 1. 试剂 纯度 ”试剂 纯度 影响 转化 效率 ,尤其 是 CaCl, ,甚至 同一 三 家 出 品 的 不 同 批号 产 品 ,转化 率 也 有 一 定 区 别 ,最 好 避 光 储存 于 4Y 冰箱 中 。 2. 细菌 的 生长 状态 ”应 收获 对 数 期 或 对 数 生长 前 期 的 细菌 用 于 感受 态 的 制备 。 -274- 基因 工程 学 3. #80 ”转化 实验 使 用 的 器 亚 如 玻璃 器 严 微量 吸 头 及 下 ppendorf 管 等 ,应 彻底 清洗 和 高 压 消 毒 ,表面 去 污 剂 及 其 他 化 学 试剂 污染 往往 大 幅度 降低 转化 率 。 4. 感受 态 细 菌 4Y 保存 12 一 24h, 可 提高 转化 率 。 (AER RRA) 实验 八 _ 重 组 子 的 筛选 与 奉 定 Exp8. Screening and Identification of Recombinants 如 何 从 转化 细菌 菌落 中 筛选 含有 阳性 重组 子 的 菌落 并 鉴定 重组 子 的 正确 性 ,是 基因 工 程 的 重要 工作 。 不 同 的 克隆 载体 及 相应 的 宿主 系统 ,其 重组 子 的 筛选 .鉴定 方法 不 尽 相 同 ， 概括 起 来 有 以 下 几 类 。 一 、 重 组 子 的 泣 选 法 重组 子 转化 宿主 细胞 后 ,载体 上 的 筛选 标志 基因 会 导致 细菌 某 些 表 型 的 改变 ,大 在 琼脂 平板 中 添加 相应 的 筛选 物质 ,可 以 直接 筛选 鉴别 含 阳 性 重组 子 的 菌落 , 常 是 筛选 阳性 重组 子 的 第 一 步 。 1. 抗生素 平板 盘 选 ”为 阳性 重组 子 的 初步 得 选 方法 。 对 带 有 抗生素 抗 性 基因 的 载体 ， 如 果 外 源 DNA 片段 插入 载体 的 位 点 在 抗 性 基因 之 外 , 抗 性 基因 仍 能 表达 ,这样 重组 子 转化 细胞 后 ,能 在 含有 相应 药物 的 琼脂 平板 上 生长 并 形成 菌落 的 ,是 含有 阳性 重组 子 的 宿主 菌 。 2. 插入 失 活 双 抗生素 对 照 盘 选 ”有 的 载体 含有 双 抗 性 基因 ,外 源 DNA 插入 后 使 其 中 一 个 抗 性 基因 失 活 , 则 可 用 两 个 分 别 含 不 同 药物 的 平板 对 照 筛 选 出 阳性 重组 子 。 3. 插入 表达 筛选 ”有 些 载体 的 筛选 标志 基因 前 面 存 在 一 段 负 控制 序列 , 当 择 和 人 失 活 该 负 调 控 序 列 时 ,筛选 标志 基因 才能 表达 ,为 插入 表达 筛选 。 4. B- 半 乳糖 苷 酶 筛选 ”对 携带 lacZ 基因 的 载体 ,可 以 利用 与 宿主 菌 的 w- 肽 互补 作用 进 FT Wi. lacZ 基因 编码 w- 肽 ,可 与 宿主 菌 形成 w- 肽 互补 作用 后 ,编码 有 活性 的 B 半 乳糖 苷 酶 ,通过 IPTG 诱导 ,分 解 底 物 X-gal 形成 蓝 色 吹 菌 斑 。 若 在 lacZ 基因 的 多 克隆 位 点 上 插入 外 源 基 因 ,可 使 lec2 基因 失 活 ,从 而 破坏 重组 子 与 宿主 菌 之 间 的 w- 肽 互补 作用 ,在 含有 X- gal 和 IPTG 的 平板 中 生长 时 形成 无 色 喉 菌 斑 或 菌落 ,而 载体 自身 环 化 后 转化 的 细菌 为 蓝 色 喉 菌 斑 或 菌落 。 此 法 筛选 出 阳性 重组 子 的 几率 比较 高 。 方 法 如 下 : (1) 制作 含 X-gal 的 琼脂 平板 : 含 1.5% 琼 脂 的 LB 固体 培养 基 融 化 后 ,冷却 至 407 ,加 和信 氮 直 青霉素 使 终 浓 度 为 S0ng/ml, 混 匀 后 铺 琼 脂 平板 , 待 凝固 后 ,再 在 平板 表面 均匀 涂 布 20u1 SOmg/ml AY X-gal 和 100u1 100mmol/L 的 IPTG, 使 其 终 浓 度 分 别 为 40xg]ml、 0.5mmol/L. (2) 取 适 量 的 转化 菌 SR i ERO AR 37 HE K 24h, WIE BY PAK. S. 快速 裂解 菌落 法 ”从 抗 性 平板 中 直接 挑 取 菌 落 裂 解 后 ,不 需要 内 切 酶 消化 ,直接 进 AT BE MBC HK ,与 载体 DNA 比较 迁移 率 , 初 步 判 断 是 否 有 插 人 片段 的 存在 ,适用 于 插 人 片段 二 7 - 276: 基因 工程 学 较 大 重组 子 的 初步 筛选 。 方 法 如 下 : (1) 用 消毒 牙签 从 菌落 上 挑 取 少 许 细 菌 接种 到 另 一 个 LB 琼脂 板 ,再 将 该 菌落 中 剩 下 的 细菌 全 部 取出 至 96 孔 培 养 板 中 ,加 入 裂解 液 ,用 牙签 打 散 菌 落 。 (2) #E 96 孔 板 的 盖 , 用 胶布 封 严 ,68Y 水 浴 保 温 45min. (3) EFLIM A 2.5] 25% 芒 糖 ,对 照 组 为 载体 DNA, 上 样 于 琼脂 糖 凝 胶 进 行 电泳 。 (4) 电泳 完毕 后 MERE AA 0.5pg/ml EB 的 溶液 中 染色 45min, 紫外 线 灯 下 观察 ,如 有 上 比 载体 DNA 迁移 慢 的 样品 , 则 根据 编号 ,从 储存 琼脂 板 上 , 挑 取 相应 的 菌落 ,小 量 培养 提 取 DNA ,进行 内 切 酶 消化 鉴定 。 二 、 重 组 子 的 鉴定 一 般 情 况 下 ,经 过 初步 筛选 的 重组 子 ,还 需 根 据 重 组 子 的 结构 特征 进行 酶 切 、 杂交 、PCR 扩 增 等 步骤 ,才能 鉴定 阳性 重组 子 。 1. 内 切 酶 图 谱 鉴 定 ” 对 于 初步 筛选 出 的 阳性 重组 子 ,应 用 相应 的 内 切 酶 切割 释放 出 目 的 基因 片段 ,然后 电泳 检测 插入 片段 和 载体 的 大 小 。 对 于 可 能 存在 双向 插 和 人 的 重组 子 ,还 可 以 用 内 切 酶 消化 后 鉴定 方向 。 2. Southern 印迹 杂交 为 进一步 确定 DNA 插入 片段 的 正确 性 ,在 内 切 酶 消化 重组 子 、 凝 胶 电 泳 后 ,通过 Southern 印迹 杂交 ,鉴定 重组 子 中 的 插入 片段 是 否 是 所 需 的 靶 基 因 片 段 。 具体 方法 参见 核酸 杂交 技术 。 3. PCR 筛选 重组 子 “ 利 用 载体 的 外 源 DNA 插入 位 点 两 侧 设 计 引 物 ,对 初步 筛选 的 阳 性 重组 子 进 行 PCR 分 析 ,不 但 可 迅速 扩 增 插入 片段 ,而且 可 以 鉴定 插 人 片段 的 序列 正确 性 ， 判断 连接 的 方向 。 4. 菌落 原 位 杂交 菌落 或 噬 菌 斑 原 位 杂交 技术 是 至 今 仍 通用 的 重组 子 筛选 技术 , 它 是 先 将 转化 菌 直接 铺 在 硝酸 纤维 素 膜 上 ,用 放射 性 核 素 或 地 高 辛 标记 的 特异 DNA 或 RNA 探 针 进 行 分 子 杂 交 , 然 后 挑选 出 阳性 克隆 菌落 的 方法 。 本 方法 能 进行 大 规模 操作 ,一 次 可 筛选 5 x 10°~5 x 10° 4 FAY BRE PAE ,对 于 从 基因 文库 中 挑选 目的 重组 子 ,是 一 项 首选 的 方法 。 (1) 抗 性 平板 的 制作 含 1.5% 琼 脂 的 LB 固体 培养 基 融 化 后 ,冷却 至 40 MAAK 西林 使 终 浓 度 为 S0wg/ml, 混 匀 后 铺 琼 脂 平板 。 (2) 取 两 块 含有 Amp 的 LB 琼脂 板 ,用 剪刀 剪 取 适当 大 小 (直径 小 于 平 亚 内 径 ) 的 硝酸 纤维 素 膜 , 光 面 向 上 铺 于 其 中 一 块 含 有 Amp 的 LB 琼脂 板 上 ,做 好 标记 , 待 硝酸 纤维 素 膜 湿 润 后 ,备用 。 (3) 用 消毒 牙签 从 抗 性 平板 上 挑 取 单 菌落 ,点 至 硝酸 纤维 素 膜 上 ,然后 再 用 此 牙签 将 该 菌落 接种 到 另 一 个 含有 Amp 的 LB 琼脂 板 的 相应 位 置 处 。 (4) 换 消毒 牙签 , 依 此 法 再 接种 其 他 的 单 菌落 。 (5) KEP RBA 37C 生长 24h, 取 下 硝酸 纤维 素 膜 ,并 保存 好 另 一 平板 。 将 硝酸 纤维 素 膜 经 过 变性 液 变 性 .中 和 液 中 和 后 ,80Y 真空 烤 干 膜 2h ,与 相应 的 DNA 或 RNA 探 针 杂交 ， 根据 杂交 结果 ,于 另 一 平板 中 挑 取 相 应 的 阳性 菌落 ,活化 后 抽 提 质粒 或 冻 存 菌 种 。 以 上 介绍 了 筛选 鉴定 阳性 重组 子 较为 常用 的 方法 ,在 具体 的 实验 操作 中 ,可 根据 所 用 的 实验 八重 组 子 的 筛选 与 鉴定 - 277- 质粒 类 型 .插入 片段 的 大 小 宿主 菌 的 特点 等 实际 情况 选用 合适 的 一 种 或 几 种 方法 。 ( 刘 素 侠 张 AK) 实验 九 ”DNA 探 针 标记 及 核酸 杂交 技术 Exp9. DNA Labeling Technology and Nucleic Acid Hybridigation —. DNA Ret pic SHAR (—) DNA 探 针 标记 【原理 】 随机 引物 法 是 一 种 较 理想 的 核酸 探 针 标记 方法 ,其 基本 原理 是 ,按照 碱 基 互 补 配对 原 则 ,随机 引物 (6 聚 核 苷 酸 引 物 ) 与 待 标记 的 DNA 片段 上 的 不 同 区 段 特 异性 结合 ,在 Klenow 大 片段 的 催化 下 , 即 从 引物 3’-OH 端 开 始 合成 互补 DNA 链 ,反应 中 若 加 入 Dig (digoxigenin, 地 高 辛 ) 标 记 的 脱氧 尿 喀 啶 三 磷酸 (Dig-dUTP) ,其 就 可 随机 挫 人 到 新 合成 的 DNA 链 中 , 即 可 获得 Dig 标记 的 探 针 。 本 法 的 优点 是 标记 速度 快 (1h) ;标记 量 宽 (10ng 一 3wg); 检 测 反应 灵敏 度 高 ;线性 DNA 标记 效率 高 ;没有 半衰期 ,安全 性 好 ;适用 范围 广 (各 种 杂交 )。 【材料 】 待 标记 HBV DNA. 6 聚 核 苷 酸 引 物 。 dNTP 标 记 混 合 液 :10 x dNTP 标记 混合 液 ( 含 有 dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Dig- dUTP, pH?23)% Klenow fi :2u/pl. TE %:10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA. (Wik) 以 HBV DNA-Dig 探 针 的 标记 为 例 ,方法 如 下 : 变性 HBV DNA Sul 1. 取 一 1.5ml Eppendorf #¥ , #1 A HBV 6 RBH RS 2yl DNA 2ng( 10p1) 。 10x dNTP(@ Dig-dUTP) yl ae rs. } t Klenow iif tl 2. 沸水 中 煮沸 1LOmin, LR HK A KK 灭 菌 双 蒸 水 10p1 中 冷却 10min. KAA: 20pl 3. 另 取 一 1.5ml Eppendorf 管 ,分 别 加 入 : 各 种 试剂 ( 见 上 表 )。 4. EVR ,12 000r/min 离心 10s,37 和 水 浴 过 夜 。 "278 ， 实验 九 ”DNA 探 针 标记 及 核酸 杂交 技术 - 279 - 5. MMA 0.2mol/L EDTA 2 则 终止 反应 ,再 加 入 2.51 的 3mol/L NaAc, 75yl 的 冷 无 水 乙醇 , 混 匀 ,=-20 过夜 。 6. 14 000r/min 4 离心 20min, 用 lml 预 冷 的 70% 乙 醇 溶液 洗 一 次 ,14 000r/min 4C 离心 20min。 7. 弃 上 清 ,室温 干燥 后 以 S0Ml TE BHA, BF -20C 保存 待 用 。 (王晓燕 Thi) (二 ) 斑点 杂交 (dot blot hybridization ) 【原理 ]】 将 待 测 DNA 样品 经 变性 后 ,点 样 于 硝酸 纤维 素 膜 上 ,用 Dig 标记 探 针 与 其 进行 杂交 。 若 待 测 样品 中 有 与 探 针 同 源 的 DNA 存在 ,标记 的 探 针 即 与 待 检 DNA 按 碱 基 配 对 原则 结 A ,再 与 碱 性 磷酸 酶 标记 的 Dig 抗体 结合 ,在 碱 性 磷酸 酶 底 物 存在 的 情况 下 ,可 显现 出 褐色 广 点 ,为 阳性 结果 。 I 工 . 探 针 灵 敏 度 的 检测 【材料 】 lpg HBV DNA 样品 .Dig-HBV 探 针 。 20XSSC:NaCl 175.3g; fA RREN 88 .2¢; WAR 7K 800ml, 用 NaOH 调 pH 至 7.0, 加 水 至 1000ml ,高 压 灭 菌 。 预 杂交 液 :53SxSSC;5% 封 阻 剂 ;30% 甲 酰胺 等 内 洗 膜 IC5x 贮 存 液 ):10xSSC;0.5%SDS( 使 用 时 稀释 )。 洗 膜 I(5x 贮 存 液 ):1xSSC;1%SDS( 使 用 时 稀释 )。 绥 冲 液 A(10x 贮 存 液 ) :100mmolL Tris-HCl;1.5mol/L NaCl 稀释 使 用 。 缓冲 液 B:0.5% 封 阻 剂 溶液 , - 20"C 贮存 。 缓冲 液 C:100mmol/L Tris-HCl; 100mmol/L NaCl;50mmol/L MgCl, ,pH9.5。 抗 -Dig-AP 结合 物 ; 显 色 剂 | -NBT; 2 78) 1 :X- 磷 酸 盐 。 BH BREF HE RAR AR AC SS (Fre) 1. 硝酸 纤维 素 膜 的 预 处理 ”将 适当 大 小 的 硝酸 纤维 素 膜 用 蒸馏水 浸透 ,然后 浸 于 20ml 10 x SSC 溶液 中 Smin 以 上 ,再 将 硝酸 纤维 素 膜 铺 于 9%6 孔 点 样 器 上 。 2. 样品 与 点 样 “ 用 灭 菌 双 蒸 水 将 lvg HBV DNA 样品 稀释 成 系列 梯度 ,使 每 个 梯度 HBV DNA 的 浓度 依次 为 10ng\、lng、100pg、10pg\1lpg.0.1pg.0.01pgZl0wl。 每 梯度 取 10yl, 100 煮沸 5 一 10min ,立即 放 入 冰 水 浴 中 冷却 Smin。 通 过 96 孔 点 样 器 吸 印 到 硝酸 纤维 素 膜 “ 上 ,真空 泵 负 压 抽 于 。 每 梯度 点 两 孔 , 如 下 图 : 3. KERR ” 取 下 硝酸 纤维 素 膜 放 在 滤纸 上 , 放 人 和 人 80°C 温 箱 , 烤 干 2h。 4. 预 杂 交 取出 膜 放 于 室温 ,将 膜 于 10 x SSC HRA, AWARD HMA, MA 2ml 预 杂 交 液 , 赶 出 气泡 封口 ,42 和 他 水 浴 摇 床 2 一 3h( 可 手动 翻动 几 次 )。 . 杂交 ” 倒 净 杂交 绕 中 的 溶液 ,加 lml 新 杂交 液 ,再 加 入 已 加 热 煮 沸 (100C 10min) 并 snag Sie Smin) Rt 10pl, 7) ke A RAR ARR, 42C KBR RE Hit PR (>20h). 6. 洗 膜 先 按 比例 称 释 好 洗 膜 工 和 洗 膜 和 下。 用 适量 1x 洗 膜 工 溶液 室温 下 振 摇 洗 2 次 ,每 次 Smin。 再 用 适量 x VER ARF 50~S55C 下 振 摇 洗 2 次 ,每 次 1Smin。 7. 显 色 反 应 | (1) FZ BK 10 PRR A, 膜 在 适量 1x 缓冲 液 A 中 短暂 洗涤 lmin。 (2) 膜 在 适量 缓冲 液 B 中 ,室温 摇动 30min。 (3) 再 用 适量 1x 缓冲 液 A 短暂 洗 膜 。 (4) 用 10ml 1x 缓 冲 液 A 稀释 100p] 酶 结合 物 (1:100 稀释 ) ,室温 摇动 30mins (5) 用 适量 1x 缓冲 液 A 摇动 洗 膜 (以 去 除 未 结合 的 抗 -Dig- 酶 结合 物 ) 室 温 1Smin, 洗 2 (6) 膜 在 适量 缓冲 液 C 中 平衡 2min 后 , 倒 净 溶液 。 (7) 在 10ml 缓冲 液 C 中 ,加 入 451 NBT 和 35pl X- 磷 酸 盐 溶液 , 混 匀 后 在 黑暗 下 显 色 ， 阳性 对 照应 在 30min 内 显 色 , 显 色 时 不 要 摇动 膜 。 (8) 在 显 色 适当 时 (一 般 Sh) ,取出 膜 用 TE 溶 液 终 止 显 色 反应 。 延 长 显 色 反应 的 时 间 可 提高 一 定 的 灵敏 度 。 8. 结果 判定 “一般 可 直接 检测 出 0.1pg 的 DNA 量 。 若 低 于 0.1pg 则 可 能 由 于 DNA 定量 不 准 或 试剂 盒 标记 效率 不 高 。 【注意 事项 ] 1. 标记 好 的 探 针 除 做 灵敏 度 鉴 定 外 ,同时 应 做 含有 阴性 、 阳 性 对 照 的 探 针 特异 性 检测 。 2. 可 直接 将 标记 好 的 探 针 系列 稀释 后 点 样 于 硝酸 纤维 素 膜 上 ,然后 直接 进行 显 色 反 应 ,这 样 可 省 去 前 面 预 杂 交 和 杂交 的 步骤 ,但 不 宜 定量 。 Tl. 检测 血清 标本 中 的 HBV DNA 【材料 】 A RG K 缓冲 液 :0.4molML NaCl; 100mmol/L Tris;lmmolMLEDTA;4%SDS。 & A K:20mg/ml. 饱和 酚 .氯仿 / 异 戊 醇 (24:1)。 【方法 】 1. 取 1.5ml Eppendorf 管 ,加 入 10ml 2 A i K.SOpl 蛋白 酶 K 缓冲 液 .50Ml 患者 血清 ， 37 水 浴 2h。 2. 加 110l 酚 :氯仿 / 蜡 戊 醇 (1:1) 混 合 液 于 上 述 离心 管 中 , 混 匀 Smin,12 000r/min 离 心 10min。 实验 九 DNA 探 针 标记 及 核酸 杂交 技术 281 . 3. 在 新 离心 管 中 加 入 3yl 1Smol/L NaCl, 吸 取 离 心 好 的 上 清 60 风 ,加 150p1 4 567K Z BM IES, -—20C mw WM 2h,12 000r/min 离心 10min , 沉 深 核酸 。 5. 弃 上 清 , 真 空 干燥 ( 约 1Smin)。 每 管 加 入 50pl TE RA FRR. 6. 点 样 :将 已 提取 好 的 血清 核酸 和 阳性 、 阴 性 对 照 各 5S0wl 于 100°C 煮沸 5 一 10min, 立 即 BLA UAE PY El Smin。 短 暂 离心 使 管 壁 的 溶液 离心 到 管 底 , 再 加 入 SOpl 的 10 x SSC 混 匀 后 , 取 100 岂 通过 96 孔 点 样 器 吸 印 到 硝酸 纤维 素 膜 上 ,真空 泵 负 压 抽 王 。 杂交 步骤 同 探 针 灵敏 度 的 检测 。 【注意 事项 ]】 1. 在 预 杂交 和 杂交 过 程 中 溶液 应 处 于 流动 状态 ,替换 杂交 时 膜 不 能 干燥 。 2. 杂交 后 , 含 探 针 的 杂交 液 应 回收 ,- 20C 保存 ,下 次 变性 后 可 以 重复 使 用 。 3. 膜 可 以 立即 用 于 显 色 ,或 放 在 干燥 的 环境 中 待 以 后 显 色 用 。 ( 王 晓 茂 ”高 立 芬 ) 二 Southern 印迹 杂交 【原理 】 Southern 印迹 杂交 (southern blot hybridization) 是 将 DNA 限制 性 内 切 酶 酶 切片 段 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 电泳 分 离 后 ,在 高 盐 条 件 下 通过 虹吸 作用 将 变性 的 DNA 片段 转 印 到 硝酸 纤维 素 膜 上 ,再 利用 特异 性 探 针 进行 杂交 。Southern 印迹 杂交 是 对 基因 或 DNA 片段 进行 定性 、 定量 突变 定位 及 定 长 的 常用 方法 。 在 遗传 病 \DNA 图 谱 分 析 、 基 因 突 变 、RFLP 及 PCR 产 物 分 析 方 面 都 有 重要 应 用 。 转移 DNA 除了 应 用 虹吸 作用 外 ,还 可 用 电 转 法 或 真空 转移 法 。 【材料 】 0.25mol/L HCl 变性 液 :0.$SmolML NaOH,1.5mol/L NaCl. HAY : mol/L Tris-HCI(PH8.0) ,3mol/L NaCl. 硝酸 纤维 素 膜 、 普 通 滤 纸 ` Whatman 3MM We ARR 7K AR BE BR , 500g FETS (KD), 其 他 试剂 同 斑点 杂交 。 (Fre) 1. ABD HY DNA 标本 在 琼脂 糖 凝 胶 中 电泳 后 ,EB 染色 ,在 紫外 光 下 摄影 ,电泳 时 ,应 有 一 孔 加 入 有 zzd 亚 酶 切 的 ADNA 作为 DNA 相对 分 子 质量 的 对 照 。 2. 将 凝 胶 置 一 大 平 血 中 , 切 去 无 用 区 域 ,并 在 胶 的 一 角 作 好 标记 。 3. 酸 处 理 : 在 转移 大 分 子 量 DNA(>1kb 时 ) 时 , 常 需 用 HCI Xb PH FT RE DNA, 加 入 0.25mol/L HCI 使 液 面 没 过 胶 面 , 置 室 温 处 理 10 一 20min , 轻 轻 摇动 数 次 , 倒 去 液体 ,用 蒸馏 水 洗 3 次。 4. 变性 :加 入 变性 液 置 室 温 30min ,使 双 链 DNA 间 的 氢 键 打开 , 轻 轻 摇 动 数 次 , 倒 去 液 体 ,用 蒸馏 水 洗 3 次 。 - 282: 基因 工程 学 5. 中 和 :加 入 中 和 液 置 室温 30min, 重复 一 次 。 6. 用 Whatman 3MM 滤纸 覆盖 在 玻璃 板 上 ,将 玻璃 板 置 一 个 小 瓷 盘 上 ,加 入 10 SSC, 用 玻璃 棒 赶 去 滤纸 与 玻璃 之 间 的 气泡 。 7. 将 凝 胶 轻 轻 倒置 于 滤纸 上 ,用 玻 棒 赶 尽 气 泡 。 8. 将 稍 小 于 凝 胶 大 小 的 硝酸 纤维 素 膜 在 2 x SSC 内 浸 湿 后 (Smin 以 上 ) ,覆盖 于 凝 胶 之 上 ,小 心 除去 滤 膜 与 凝 胶 之 间 的 气泡 ,在 凝 胶 周 围 包 上 一 层 保鲜 膜 ,防止 液体 流动 形成 短路 ， 然后 再 覆盖 同样 大 小 Whatman 滤纸 8 张 。 9. 将 吸水 纸 裁 成 与 凝 胶 相 当 大 小 , 置 于 滤纸 之 上 (5 一 8cm 高 )。 再 加 一 块 玻璃 板 ,玻璃 板 上 放 一 500g 重 的 夸 码 (或 其 他 重 物 ) ,液体 可 从 “ 族 胶 一 硝酸 纤维 素 膜 3MM 滤纸 "方向 流动 ,从 而 使 凝 胶 中 的 DNA 片段 转移 至 硝酸 纤维 素 膜 上 。 10. 转移 约 需 12 一 24h ,转移 期 间 , 当 吸 水 纸 潮湿 时 应 及 时 替换 。 11. 移 去 吸水 纸 , 取 下 硝酸 纤维 素 膜 , 置 2 x SSC 中 漂洗 后 取出 , 置 2 层 滤纸 中 ,80C 真 空 烘 干 2h。 置 干燥 缸 内 保存 , 待 杂交 。 12. 其 他 步骤 同 斑点 杂交 。 【注意 事项 ]】 1. 在 处 理 凝 胶 时 动作 要 轻 , 以 防 凝 胶 破 碎 。 2. 重 物 可 使 滤纸 片 . 吸 水 纸 之 间 有 较 好 的 接触 , 发 挥 毛细 虹吸 作用 。 但 注意 不 要 太 重 ,这样 会 影响 DNA 从 胶 中 向 上 转移 。 3. 转移 时 间 取 决 于 DNA 片段 的 大 小 。 若 片段 < 1kb 转移 1 一 2h 即 可 , 若 >15kb 需 转 移 1Sh 以 上 。 9 (LMR RR) =. Northern 印迹 杂交 【原理 】 Northern blot 印迹 杂交 (Northern blot hybridization) 与 Southern blot 杂交 基本 相同 。 所 不 同 之 处 在 于 ,RNA 不 如 DNA 稳定 , 易 被 RNA 酶 降解 ,而 RNA 酶 不 仅 广泛 存在 ,而 且 加 热 至 1007 也 不 能 使 其 灭 活 ,所 以 在 操作 RNA 时 ,所 用 的 一 切 器 血 和 溶液 都 必须 经 过 严格 的 消除 RNA 酶 的 处 理 。 另 外 ,RNA 的 电泳 必须 在 含 甲 醛 或 成 二 醛 变 性 凝 胶 中 进行 。 Northern blot 杂交 主要 应 用 于 检测 瘤 基因 或 其 他 肿瘤 相关 基因 的 过 度 表达 ,也 可 检测 抑 癌 基因 的 低 表 达 或 不 表达 。 【材料 】 10x MOPS 电泳 缓冲 液 :0.2mol/L MOPS(3-[ N-M5 PAK ] FT AR) (pH7.0) ,0.05mol/L 乙 酸 钠 , 0.01mol/L EDTA(pH8.0). 载 样 缓冲 液 ( 用 DEPC 预 处 理 ):$0% HH, Immol/L EDTA(pPH8.0),0.25% 溴 酚 蓝 ， 0.25% — HAF. PS HH SHAS BH ,37% 甲醛 , 甲 酰胺 。 LWT, DNA 探 针 标记 及 核酸 杂交 技术 ， 283 - 电泳 装置 ,相对 分 子 质量 标准 参照 物 ,其 他 试剂 同 斑点 杂交 。 (Fr) 1. 配制 1% 琼 脂 糖 变性 胶 : 10 x MOPS 电泳 缓冲 液 10ml 0.1% DEPC 水 90ml 普通 琼脂 糖 lg 将 胶 加 热 至 完全 熔化 后 , 在 室温 放置 冷却 至 OOT ,加 入 37% FR S.4ml BS. Ra 灌注 电泳 胶 , HMO ATS AVE Ft, 蒸馏 水 冲洗 , 乙醇 干燥 , 然后 用 3% 双 氧 水 处 理 10min, 最 后 用 DEPC 处 理 的 蒸馏 水 彻底 冲洗 。 2. 在 一 个 1.Sml Eppendorf 管 中 加 入 下 列 试 剂 并 混 匀 : RNA 4.5J 5X MOPS 电泳 缓冲 液 2.0 37% 甲醛 3.5yl 甲 酰胺 10.0 咯 # OSC 保温 1Smin,， 速 置 冰 浴 中 ,12 000r/m, BL 30s, MA 2 已 载 样 缓冲 液 , 混 匀 。 4. 上 样 前 预 电 泳 Smin ,将 RNA 样品 上 样 于 加 样 孔 中 , 同时 在 另 一 样品 孔 中 加 入 相对 分 子 质量 标准 参照 物 , TAR 33~4V /em 电泳 。 每 1 一 2h 将 阴阳 极 电泳 液 混 合 一 次 。 5. 电泳 结束 后 ， 切 下 部 分 相对 分 子 质量 标准 参照 物 带 , 溴 化 乙 锭 染色 ， 紫 外 线 下 照相 或 凝 胶 成 像 仪 下 拍照 ,记录 结果 。 6. 上 述 电泳 后 的 凝 胶 一 般 不 需 进 行 处 理 即 可 直接 进行 印迹 。 含 有 甲醛 的 凝 胶 可 用 DEPC 预 处 理 过 的 水 漂洗 以 去 除 所 含 的 甲醛 。 如 果 凝 胶 较 浓 (>1% ),， 较 厚 (>0.5$cmy) 或 待 测 RNA 片段 较 大 (>2.5kb)， 可 预先 将 凝 胶 置 0.0Smol[L NaOH 溶液 中 浸 20min， 再 用 DEPC 处 理 的 水 漂洗 , 最 后 用 20 x SSC 浸 4Smin。 转 移 方法 同 Southern 印迹 。 【注意 事项 】 所 用 的 器 严 及 试剂 均 必 须 经 过 DEPC 浸泡 ,再 高 压 后 高 温 烘 烤 。 (王晓燕 KH) 实验 十 “从 组 织 中 提取 人 基因 组 DNA Exp10. Extraction of Human Genome DNA From Tissue 【原理 ]】 在 进行 真 核 基 因 工 程 .Southern 杂交 或 PCR 时 , 需 从 组 织 或 细胞 中 获得 完整 的 基因 组 DNA, 因 而 真 核 生 物 的 组 织 或 细胞 (包括 培养 细胞 ) 常 成 为 制备 DNA 的 主要 材料 。 提取 基因 组 DNA 的 一 般 原 理 是 取 冰 冻 或 液 氮 冻结 的 组 织 ,经 剪 碎 、 匀 浆 器 研 碎 或 用 工 具 砸 碎 以 后 ,经 SDS 和 蛋白酶 K 作用 使 细胞 充分 裂解 释放 出 DNA, 然 后 用 饱和 酚 和 和 氯仿 / 异 戊 醇 去 除 蛋 白质 ,用 RNA 酶 去 除 RNA, 就 可 以 产生 100 一 200kb 左右 的 基因 组 DNA Fr 段 ,经 适当 剪 切 后 ,可 适用 于 以 入 叭 菌 体 作 为 载体 的 基因 组 文库 的 构建 。 【试剂 】 PBS。 匀 浆 缓冲 液 :0.2$SmolLL 蔗糖 ;2$Smmol[L Tris-HCl(pH7.5);25mmol/L NaCl;25mmol/ L MgCl. 细胞 裂解 缓冲 液 (TNE) :10mmol/L Tirs-HCl( pH7.4);10mmol/L NaCl; 10mmol/L ED- TAs 3 10% SDS; Proteinase K(10mg/ml) 。 饱和 酚 (pH8.0) , SA 15 /5# SRF (24:1). 3mol/L NaAc ,无 水 乙醇 等 。 【方法 】 1. 取 小 鼠 新 鲜 肝 组 织 ,在 电子 天 平 秤 上 称 取 0.1g, 放 置 于 青霉素 小 瓶 中 备用 或 =207 存放 。 2. 用 一 锐利 剪刀 将 组 织 前 成 尽 可 能 小 的 块 (处理 过 程 中 要 保持 组 织 的 潮湿 )。 加 入 lml PBS 混 匀 。 3. 将 剪 好 的 组 织 移 至 1.$Sml Eppendorf 管内 ,5000r:min ,离心 ,2min。 4. 弃 上 清 , 用 冷 匀 浆 缓冲 液 1Iml 悬浮 沉淀 ,转移 至 匀 浆 器 内 ,于 冰 上 研磨 15 一 20 次 (不 能 超过 30 次 ) 。 5. 再 将 研磨 好 的 组 织 移 至 新 的 1.Sml Eppendorf 管内 ,3$000r[min ,离心 ,2mins 6. 弃 上 清 , 用 1ml PBS 悬浮 沉淀 ,35000rymin ,离心 2min。 7. FF Lie AA Lil 细胞 裂解 缓冲 液 悬浮 沉淀 ,加 入 SOp1 10% SDS 使 终 浓 度 为 0.5% , 轻 轻 混 匀 后 ,加 入 20ul 10mg/ml 的 Proteinase K BAM HE WH 200ug/ml, ATI A © 8. 37C Ki Ra, at BW 1.5ml Eppendorf 管内 2 284 - 实验 十 “从 组 织 中 提取 人 基因 组 DNA - 285 - 9. 加 入 等 体积 酚 / 氯 仿 / 异 成 醇 (25:24:1) 混 合 , 抽 提 10min。 10. 12 000r/min, 0 1Smin ,吸出 水 相 至 另 一 新 1.5ml Eppendorf HP. MFP La 性 蛋白 层 较 厚 ,再 加 入 1/4 体积 的 细胞 裂解 缓冲 液 至 含 酚 和 中 间 层 的 管 中 , 如 上 步骤 再 提取 一 次 ,合并 两 次 的 水 相 。 11. 重复 第 9.10 步 。 12. 取 上 清 液 至 另 一 新 1.5ml Eppendorf 管 中 , 加 入 1/10 体积 3mol/L NaAc 和 2 倍 体 积 无 水 乙醇 , 混 匀 ,可 见 DNA 呈 絮 状 析出 ,此 时 可 用 玻璃 棒 将 DNA 绕 出 溶 于 TE 中 ,剩余 液 体 可 放置 - 20 2h 或 过 夜 。 13. 12 000r/min ,离心 10min 使 DNA 沉淀 ,沉淀 用 70% 乙 醇 漂洗 一 次 ,所 得 DNA 样品 YF 50ul TEP. 【注意 事项 】 1. 组 织 块 取 材 要 新 鲜 ,应 尽量 剪 碎 。 2. 所 用 匀 浆 器 须 配 套 适 中 ,过 大 过 小 均 不 利于 研磨 组 织 块 。 3. SDS 在 加 样 前 要 求 溶解 ,可 将 其 置 于 37C KA PRA. 4. 尽 可 能 使 用 新 鲜 配 制 的 蛋白 酶 K, 使 用 前 需 进行 预 试验 确定 其 活性 。 5. 加 入 等 体积 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 (25:24:1) 混 合 抽 提 时 应 颠倒 混 匀 ,要 轻柔 ,避免 剧烈 震 6. 苯酚 腐蚀 性 很 强 , 可 引起 严重 的 烧伤 ,注意 防护 。 (王晓燕 张 艳 ) 实验 十 一 ”基因 转 染 哺乳 动物 细胞 Exp11. Gene Transfection into Mammalian Cells tt Ye (transfection) #48 4 bk DNA BK RNA 导入 细胞 的 过 程 。 哺 乳 动物 细胞 常规 的 转 染 方法 有 两 种 :短暂 转 染 和 稳定 转 染 。 前 者 又 称 为 过 渡 性 转 染 、 瞬 时 转 染 ,是 将 DNA 送 入 活 细胞 内 ,但 DNA 不 会 谋 和 细胞 的 染色 体 中 ,可 在 2 一 3 天 内 通过 收集 被 转 染 的 细胞 进行 基因 表达 分 析 。 后 者 又 称 为 永久 性 转 染 ,是 将 目的 基因 传送 入 活 细胞 ,经 过 一 定时 间 选 择 标 记 的 筛选 ,使 目的 基因 整合 人 细胞 染色 体 中 或 者 成 为 基因 附 体 存 在 于 细胞 内 ,从 而 得 到 稳定 表达 目的 基因 的 细胞 系 。 目前 ,基因 转 染 技术 常 被 用 于 基因 表达 的 分 析 研 究 上 ,常用 的 转 染 方法 有 :中 磷酸 钙 (calcium-phosphate) 转 染 法 ,ODEAE- 葡 聚 糖 转 染 法 (DEAE-dextran) ,@) 脂 质 体 (liposome) 介 导 的 转 染 法 ,四 电 穿 孔 法 (electroporation),@ 显 微 注射 法 (microinjection) , © js B Be ASP 的 转 染 法 ,OO 基因 枪 (gene gun ) 转 染 法 ,@ 受 体 介 导 的 基因 转 染 法 。 现 将 常用 的 几 种 转 染 方 法 介绍 如 下 。 —. Fa HF FL 【原理 ]】 细胞 暴露 于 高 电压 时 ,细胞 膜 可 被 电 脉冲 瞬 间 穿 孔 , 从 而 使 存在 于 细胞 悬 液 中 的 外 源 DNA 进入 细胞 。 【材料 】 待 转 染 的 哺乳 动物 细胞 。 不 含 及 含有 选择 剂 的 完全 培养 基 。 电 穿 孔 缓冲 液 ( 冰 冷 )。 纯化 的 DNA. Beckman JS-4.2 转子 或 相当 转子 。 电 穿孔 用 的 电极 池 及 电源 。 【方法 】 1. 在 完全 培养 液 中 培养 待 转 染 细胞 至 对 数 生长 期 ,4C ,640rvmin 离心 Smin 收集 细胞 。 2. 将 细胞 沉淀 用 其 半 量 体积 的 预 冷 电 穿孔 缓冲 液 重 悬 洗涤 ,4C , 640r/min 离心 Smin。 3. 对 于 稳定 转 染 ,将 细胞 以 1 107 Amol 的 密度 重 悬 于 0Y 的 电 穿孔 缓冲 液 中 ;对 于 短暂 表达 ,可 用 更 高 密度 的 细胞 (高 达 8x107?Mml)， . 286 . 实验 十 一 ”基因 转 染 哺乳 动物 细胞 - 287 - 4. 在 冰 上 放置 所 需 数量 的 电 穿 孔 用 的 电极 池 ,每 池 中 移入 0.5$ml 细胞 悬 液 。 5. DNA 加 入 冰 上 各 电极 池 的 细胞 悬 液 中 。 担 住 电极 池 两 侧 的 窗口 ,晃动 其 底部 以 混 匀 DNA/ 细 胞 悬 液 ,在 冰 上 放置 Smin。 6. 将 电极 池 放 入 电 穿 孔 装 置 的 架 上 (室温 ) ,用 所 设 定 的 电压 及 电容 值 电击 一 次 或 多 次 5 7. 将 电极 池 至 于 冰 上 10min。 8. 用 非 选择 性 完全 培养 液 20 倍 稀释 被 转 染 的 细胞 ,并 用 该 液 洗 电极 池 以 移出 所 有 的 被 转 染 细胞 。 9. 对 于 稳定 转 染 ,在 非 选 择 性 培养 液 中 培养 细胞 48h( 大 约 两 代 ) ,然后 转 入 含有 抗生素 的 培养 液 中 ;对 于 短暂 转 染 ,培养 细胞 50 ~ 60h 收集 细胞 进行 短暂 表达 分 析 。 【注意 事项 】 1. 电 穿 孔 法 受 DNA 浓度 影响 较 小 ,一 般 DNA 的 量 在 10~40pg/107 细胞 的 范围 内 效 果 好 ,并 且 在 DNA 用 量 与 援 人 量 之 间 有 好 的 线性 关系 。 2. 电 穿 孔 法 中 可 变 的 参数 是 电泳 冲 的 强度 和 长 度 。 操 作 中 最 好 能 找到 杀 死 20% ~ 60% 细 胞 的 电 脉冲 (一 般 是 1.SkV,2SwF)。 如 果 过 多 的 细胞 发 生死 亡 ,可 通过 调 低 电 容 来 降低 脉冲 的 长 度 。 二 、 脂 质 体 介 导 的 转 染 【原理 】 脂 质 体 (lipofectin) 是 一 种 人 工 制备 的 类 脂 质 小 球体 ,有 一 个 或 多 个 酷似 细胞 膜 的 类 脂 质 分 子 包 庄 着 水 相 介质 组 成 。 脂 质 体 主要 组 成 成 分 是 天 然 形成 的 磷酸 类 脂 。 构 成 双 分 子 层 的 类 脂 其 亲 水 性 的 首 基 部 分 形成 膜 的 内 外 表面 ,而 亲 脂 性 的 尾 端 部 分 位 于 膜 的 中 间 。 膜 壁 的 厚度 约 为 $ 一 7nm ,而 宫 的 直径 一 般 在 25~500nm 之 间 。 脂 质 体 的 这 种 结构 使 其 能 够 携 带 各 种 亲 水 的 ` 朴 水 的 及 两 亲 的 物质 ,它们 被 包 人 脂 质 体内 部 水 相 、 插 人 类 脂 双 分 子 层 或 吸 附 连接 在 脂 质 体 的 表面 。 按 荷 电 性 , 脂 质 体 可 分 为 中 性 脂 质 体 负电 性 脂 质 体 、 阳 离子 脂 质 体 。 阳离子 脂 质 体 ,又 称 阳性 脂 质 体 、 正 电荷 脂 质 体 ,是 目前 研究 较为 详尽 的 一 种 转 染 脂 质 体 。 大 多 数 阳离子 脂 质 体 是 由 一 种 中 性 磷脂 和 一 种 或 多 种 阳性 成 分 组 成 ,其 中 ,中 性 磷脂 起 到 稳定 双 层 膜 和 降低 阳性 成 分 毒性 的 作用 ,同时 提高 阳性 脂 质 的 细胞 渗透 功能 。 阳 性 成 分 是 具有 不 同化 学 结构 的 两 性 分 子 , 多 为 双 链 季 贸 盐 型 表面 活性 剂 ,为 整个 脂 质 体 提 供 正 电 和 荷 。 作 为 本 身 带 有 正 电 荷 的 脂 质 吉 泡 ,可 作为 荷 负电 物质 的 传递 载体 ,特别 是 适用 于 蛋白 质 、 多肽 和 寡 核 苷 酸 类 物质 (DNA 或 RNA)。 阳 离子 脂 质 成 分 与 带 负 电荷 的 DNA 相互 作 - 用 ,进而 将 DNA 缩合 成 致密 结构 ,形成 脂 质 -DNA 复合 物 。 阳 离子 脂 质 体 -DNA 复合 物 与 胞 质 膜 直接 融合 ,将 DNA 释放 到 胞 质 中 。 脂 质 体 介 导 的 基因 转 当 有 以 下 特点 :@ 脂 质 体 与 基因 的 复合 过 程 比较 容易 ;@O 脂 质 体 与 - 细胞 膜 融合 将 目的 基因 导入 细胞 后 , 脂 质 体 即 被 降解 ,无 毒 ,无 免疫 原 性 ;ODNA 或 RNA 可 得 到 保护 ,不 至 于 灭 活 或 被 核酸 酶 降解 ;@ 田 转 染 过 程 方便 易 行 , 重 现 性 好 。 - 288 - 基因 工程 学 【材料 】 指数 期 生长 的 HepG2 细胞 。 纯化 的 质粒 pcDNA-GFP。 DMEM 培养 基 ,不 含 血 清 。 含 10% 胎 牛 血 清 的 完全 培养 液 LDMEMVZ10% 胎 牛 血清 )。 & fit (AR MK ( LipofectAMINE!™2000 Reagent/LF2000) . 24 孔 细 胞 培养 板 。 5% CO, ,377 的 加 湿 培 养 箱 。 聚 葵 乙烯 管 (Falcon 或 Corning) 。 (FH) 1. EYL RI—K 4 1 x 10°~3 x 10° 细胞 /和 孔 的 量 在 24 孔 细 胞 培养 板 中 接种 指数 期 生长 的 细胞 ,在 5% CO, ,37C 的 加 湿 培 养 箱 中 培养 过 夜 ,直至 细胞 90% 一 95% 汇 片 。 2. 在 Eppendorf 管 中 配 制 DNA/ 脂 质 体 混合 物 : 对 于 每 孔 细 胞 ,将 0.8 ~ 1.0 质粒 以 无 血清 培养 基 稀 释 , 终 体积 为 S0m; 以 相同 无 血清 培养 基 稀 释 脂 质 体 悬 液 至 $0 岂 ,每 孔 细 胞 需 脂 质 体 1 一 3 局 ;将 两 管 稀释 液 在 室温 Smin 之 内 混 匀 至 一 管 中 , 混 匀 时 应 逐 批 进行 ,不断 吹 打 使 二 者 充分 融合 ,室温 放置 20min。 3. 取 前 一 日 接种 培养 板 , 移 去 旧 的 培养 液 ,将 DNA/LF 2000 混合 物 (100ml) 加 至 细胞 孔 的 中 央 ,并 同时 加 入 0.Sml 无 血清 培养 基 ,前 后 晃 动 培养 板 数 次 ,使 DNA/LF 2000 混合 物 均匀 分 布 至 细胞 表面 。5% CO, 37°C 的 加 湿 培 养 箱 中 培养 4 一 6h。 4. 4 一 6h 后 ,更 换 含 10% 胎 牛 血清 的 相应 培养 基 ,继续 培养 24 一 48h。 5. 若 原 细胞 培养 为 含 抗生素 的 培养 基 ,更 换 后 继续 培养 24h。 6. 若 为 短暂 转 染 , 转 染 后 72h 即 可 收集 细胞 用 于 表达 分 析 ; 若 为 稳定 转 染 , 则 需 在 恢复 培养 条 件 24h 后 , 按 1:10 的 比例 传代 细胞 ,并 更 换 选 择 培养 基 ,直至 得 到 阳性 细胞 克隆 。 【注意 事项 】 1. 脂 质 体 对 细胞 有 一 定 的 毒性 ,因此 转 染 时 对 细胞 的 浓度 要 求 较 高 ,而 且 不 同 的 细胞 敏感 性 不 同 ,可 通过 预 实验 优化 转 染 细胞 数量 。 2. 脂 质 体 悬 液 被 稀释 好 之 后 ,最 好 能 在 Smin 之 内 与 待 转 染 DNA 混合 ,不 宜 超 过 30min。 和 否则 脂 质 体 活力 会 大 大 降低 。 3. 为 使 待 转 染 DNA 与 脂 质 体 充分 混 匀 ,应 逐步 进行 ,如 每 次 取 10Ml。 4. 为 提高 脂 质 体 转 染 效率, 转 染 时 细胞 应 在 无 血清 、 无 抗生素 的 条 件 下 培养 ,警惕 细胞 污染 的 发 生 。 (54a RMA) ee Si +— SAME MRA Exp12. Western Blot Hybridization 1975 4F Southern 创建 了 DNA 印迹 技术 (Southern blot) ,在 此 基础 上 ,1979 年 和 1981 年 Towbin 和 Burnette 分 别 发 表 文 章 首次 建立 了 检测 和 蛋白质 的 免疫 印迹 技术 (Western blot). Western blot 具有 与 固 相 免疫 测定 相似 的 灵敏 度 和 特异 性 ,但 却 没 有 放射 免疫 测定 的 放射 性 污染 ,也 不 需要 像 免 疫 沉 淀 一 样 标记 划 蛋 白 。Western blot 可 检测 出 1 一 Sng WE 白质 。 是 从 混合 物 中 定向 、 定 量 检测 特异 蛋白 的 有 效 手 段 。 【原理 】 Western blot 由 SDS-PAGE 电泳 .蛋白质 转 印 和 固 相 免疫 测定 三 项 技术 结合 而 成 :首先 蛋白 质 经 SDS-PAGE 电泳 而 据 相 对 分 子 质 量 大 小 分 离 成 不 同 条 带 ; 分 离 蛋 白质 通过 电 转 移 /直接 印迹 方式 原 位 转移 至 固 相 支 持 物 上 ,并 保持 其 生物 学 活性 不 变 ; 在 固 相 支 持 物 上 让 相 应 抗体 与 被 分 离 和 蛋白 质 作 用 ,根据 抗原 抗体 结合 的 特异 性 检测 园 蛋白 。 (一 ) SDS-PAGE 电泳 SDS-PAGE 电泳 具有 三 种 物理 效应 :分 子 筛 效应 浓缩 效应 和 电荷 效应 ,可 使 蛋白 质 按 相 对 分 子 质量 大 小 精确 分 离 。 在 电泳 前 ,蛋白 质 样品 应 先 经 100C 煮沸 3min, 使 之 变性 ,防止 多 聚 体形 成 。 【材料 】 30% 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 贮备 液 : 温 热 去 离子 水 配制 成 含 29%(WAV) 丙 烯 酰胺 (Arc) 和 1% (WAV) 亚 甲 双 又 两 类 酰胺 (Bis) 的 凝 胶 贮存 液 LpH 和 7.0) ,室温 贮存 于 标 色 瓶 中 ,有 毒性 。 TEMED(N,N,N ,N -PO ABET, Mis — RR) :催化 作用 ,可 加 速 凝 胶 聚 合 。 10% 过 硫酸 贸 : 贮 存 于 47 ,在 一 周 内 使 用 ,可 加 速 Bis 和 Arc 聚合 。 Tris-Aly 电泳 缓冲 液 :2Smmol《MLTris,250mmolAL 甘氨酸 (pH8.3),0.1%SDS。 上 样 缓冲 液 :30mmolAL Tris(pH6.8), 100mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 (DTT),2%SDS,， 0.1% 省 酚 蓝 \ 10% 甘油 。 1.5mol/LTris 缓冲 液 (pH8.8) ,1.0molAL Tris 缓冲 液 (pH6.8) ,10%SDS。 (Fr) 1. 安装 垂直 电泳 槽 的 两 块 玻璃 板 。 表 实 验 12-1 丙烯 酰胺 浓度 与 蛋白 质 分 离 范 围 2. 根据 分 离 蛋 白质 相对 分 子 质量 大 小 ， AIRC 06 线性 分 高 范围 《xl10) 选择 适当 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 浓度 ( 表 实验 5 4 12-1), 并 据 表 实 验 12-2 数值 在 三 角 烧 瓶 中 7.4 aaa 按 所 需 凝 胶 浓度 配制 一 定 体积 的 分 离 胶 深 50 5-x2 这 8 本 - 290: 基因 工程 学 液 , 一 旦 加 入 TEMED, ,应 立即 混 匀 并 灌 胶 。 表 实 验 12-2 配制 Sm 各 种 浓度 丙烯 酰胺 所 需 各 成 分 的 体积 (ml) 溶液 成 分 凝 胶 浓 度 水 30% Arc 1.5mol/L_ Tris 10% SDS 10 % it Hi RK TEMED (pH8.8) 6% 7.9 3.0 3.8 0.15 0.175 0.056 8% 6.9 4.0 2.8 0.15 0.175 0.042 10% 5.9 5.0. 2.8 0.15 0.175 0.028 12% 4.9 6.0 3.8 0.15 0.175 0.028 15% 3.4 7.0 3.8 0.15 0.175 0.028 3. 迅速 在 玻璃 间 灌 胶 , 留 出 成 层 胶 空 间 ( 梳 子 齿 长 + lcm) ,小 心 在 分 离 胶 上 覆盖 一 层 无 离子 水 或 0.1%SDS ,室温 垂直 放置 2 一 3h。 4. 完全 聚合 后 , 倒 出 覆 层 液体 , 尽 可 能 排 去 液体 , 用 吸水 纸 吸 去 残留 液体 (不 可 触 破 胶 面 )。 5. 制备 成 层 胶 : 按 表 实 验 12-3 配制 成 层 胶 , 一 旦 加 入 TEMED, 应 立即 混 匀 并 灌 胶 5 表 实 验 12-3 配制 6ml 成 层 胶 所 需 各 成 分 的 体积 (ml) 水 30% 丙烯 酰胺 Imol/LTris( pH6 .8) 10% SDS 10% it RE TEMED 4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.012 6. 在 已 聚合 的 分 离 胶 上 直接 灌注 成 层 胶 , te BS A at Bit C/E PE)», FE 室温 放置 。 7. 聚合 时 ,将 样品 置 于 上 样 缓冲 液 中 ,100Y 3min 使 蛋白 质变 性 。 8. 聚合 后 , 小心 拔 出 梳子 ,将 电泳 槽 中 灌 满 Tris-Aly 电泳 缓冲 液 ,并 用 电泳 缓冲 液 冲 洗 样品 孔 。 9. 将 变性 后 的 样品 小 心 加 至 样品 孔 底 部 。 10. 接 电源 (正极 接 下 槽 ) ,小 电流 (1SmA) 使 染料 进入 分 离 胶 后 ,再 加 大 电流 至 20mA， 继续 电泳 至 溴 酚 蓝 到 达 分 离 胶 底部 , 关闭 电源 。 11. iF BFA, 小 心 取 出 凝 胶 。 (二 ) BARRA 通过 电 转 移 或 直接 印迹 法 将 蛋白 质 条 带 原 位 转移 至 固 相 支持 物 上 。 常 用 的 蛋白 质 转 印 方法 是 电 转 移 ， 即 通过 电泳 将 SDS-PAGE 凝 胶 上 的 蛋白 原 位 、 精 确 地 转移 至 固 相 支持 物 上 。 Western blot 中 作为 蛋白 质 的 固 相 支持 物 有 很 多 , 最 常用 的 是 硝酸 纤维 素 (NC) 膜 , 它 可 与 蛋白 质 非 共 价 结合 。 【材料 】 转移 液 :25SmmolvL Tirs(pH8.0), 192mmol/L Aly ,20% 甲醇。 0.5% BAER IKE MK. 10% ZR. HAM: F 3% + ABA, 0.5% Tween-20 的 PBS. Pea ear * 实验 十 二 “蛋白质 印迹 技术 - 291- 【方法 】 1. 电泳 后 将 凝 胶 放 至 转移 液 中 平衡 。 2.NC 膜 处 理 ” 双 蒸 水 中 漂洗 2h , 转 到 转移 液 中 4h。Whatman 滤纸 同 NC 膜 处 理 。 3. 转 膜 ” 在 海绵 夹 中 依次 放置 两 层 Whatman Ye AR BEE NC AR PE UE AR 正极 , 胶 向 阴极 置 于 转移 槽 中 ( 槽 中 注 满 转 移 液 ) ,100mA 转移 15 一 18h。 4. 转 膜 后 , 切 下 NC 膜 边 缘 的 对 照 蛋 白质 ,在 0.5% 和 氨基 黑 水 溶液 中 染色 3s,10% 乙 酸 脱色 , 若 NC 膜 上 有 和 蛋白质 带 , 证 明 转 膜 成 功 。 5. 转移 后 的 NC 膜 空气 中 干燥 0.5h 后 ， 置 于 封闭 液 中 4 封闭 7 一 8h。 (三 ) 免疫 印迹 在 固 相 支持 物 上 以 抗原 抗体 的 特异 性 反应 检测 混杂 和 蛋白质 中 的 特异 成 分 。 常 用 的 方法 有 放射 自 显影 、 酶 免疫 测定 及 免疫 荧光 法 等 , 其 中 以 酶 免疫 测定 法 最 常用 ， 目 前 多 以 酶 标 抗体 间接 染色 进行 检测 。 【材料 】 洗 膜 液 : 含 0.5%Tween-20 的 PBS. 第 一 抗体 浴 液 :用 封闭 液 稀 释 第 一 抗体 至 1:200 到 1:2000。 第 二 抗体 溶液 :用 封闭 液 将 酶 标 第 二 抗体 稀释 至 1:200 到 1:2000。 显 色 液 : 含 0.01% H,O, 和 0.05% 二 氢 基 联 葵 腕 (DAB) 的 25mmol/L Tris,0.14mol/L NaCl 缓冲 液 ( 现 配 现 用 ,放置 不 能 超过 2h) 。 (Fre) . 封闭 后 的 膜 用 含 0.5%Tween-20 的 PBS 洗 3 次 , 每 次 15min. .将 NC 膜 置 于 小 袋 中 , 加 入 稀释 的 第 一 抗体 ,浸没 NCR 40K. . 取出 膜 置 于 平 血 中 ,用 含 0.5%Tween-20 的 PBS 中 洗 3 次 , 每 次 15min. . 再 将 NC 膜 置 于 小 袋 中 , 加 入 稀释 的 酶 标 二 抗 浸没 NC 膜 ,室温 1 一 2h。 . RRB FOF LP ,用 含 0.$S%Tweesn-20 的 PBS 洗 3 次 , 每 次 15min. . 显 色 ”在 抗原 抗体 反应 过 程 中 ,配制 显 色 液 ,过 滤 后 备用 。 抗 原 抗体 反应 结束 后 ， 将 膜 置 于 显 色 液 中 显 色 ， 直至 显 色 效果 满意 为 止 。 7. 显 色 后 立即 将 膜 置 于 双 蒸 水 中 终止 反应 。 【注意 事项 】 1. 蛋白 质 条 带 从 凝 胶原 位 电 转 移 至 NC 膜 时 ,一定 要 将 NC 膜 一 方 接 正 极 ,否则 和 蛋白质 将 丢失 。 2. 电 转 移 时 间 视 蛋白 质 分 子 大 小 及 电荷 情况 而 不 同 , 需 预 先 摸索 。 3. 电 转 移 后 一 定 要 在 封闭 液 中 封闭 ,以 消除 背景 。 4. 免疫 印迹 过 程 中 抗体 一 定 要 浸没 膜 ,， 并 应 不 断 翻动 , 保证 反应 均匀 。 5. 显 色 液 一 定 要 现 配 现 用 , 显 色 时 间 因 抗体 滴 度 而 不 同 : 滴 度 低 时 间 长 ,反之 时 间 短 。 显 色 满 意 后 立即 将 膜 转 入 双 蒸 水 中 漂洗 终止 反应 。 anKk = wv = 实验 十 三 ER fl WR Exp13. In Situ Hybridization 【原理 ]】 原 位 杂交 技术 由 Gall 和 Pardue 及 John 等 于 1969 年 建立 ,其 基本 原理 是 利用 已 知 的 标 记 核 酸 探 针 ,通过 碱 基 配 对 的 原则 ,对 组 织 或 细胞 内 的 未 知 核酸 (DNA 或 RNA) 进 行 定性 定 位 的 方法 。 一 般 应 用 的 原 位 杂交 有 两 种 类 型 ,与 细胞 内 DNA 的 杂交 和 与 细胞 内 RNA 的 杂 交 。 这 两 种 类 型 都 是 将 标本 固定 在 显微镜 载 玻 片上 ,经 杂交 产生 杂交 信和 号 后 ,在 光学 显微镜 下 就 可 观察 到 结果 。 常用 的 原 位 杂交 技术 可 分 为 放射 性 核 素 原 位 杂交 技术 和 荧光 原 位 杂交 技术 (fluores- cence in situ hybridization，FISH) 。 它 不 仅 可 用 于 细胞 学 和 组 织 学 的 研究 ,而 且 在 研究 病毒 与 肿瘤 的 关系 上 有 具 重要 作用 。 近 几 年 来 ,由 于 染色 体 显 带 技 术 荧光 标记 技术 及 电镜 技术 的 发 展 和 完善 , 原 位 杂交 技术 在 生物 学 研究 上 展示 了 更 加 广阔 的 应 用 前 景 。 下 面 我 们 以 甲醛 固定 石蜡 包 埋 的 肝癌 组 织 ,地 高 辛 标记 的 HBV-DNA 探 针 为 例 ,简单 介绍 原 位 杂交 的 方法 。 【材料 】 0.1% BRMAR. 4% BF A Rwy A:0.1mol/L Tris-HCl;0.15mol/L NaCl(pH7.4). 封闭 缓冲 液 :2% 马 血清 ;0.2%Tween-20;0.1molML Tris-HC1;0.15mol/L NaCl, 抗体 缓冲 液 :1% 马 血清 ;0.3%Tween-20;0.1lmolML Tris-HCI1;0.15mol/L NaCl. 底 物 绥 冲 液 :100mmolLL Tirs-HCl;100mmol/L NaCl;50mmol/L MgCl, ,pH9.5. NBT 和 X-% AR EP i £4 Al . HBV-DNA 探 针 。 碱 性 磷酸 酶 标记 的 地 高 辛 (Dig) 抗 体 。 【方法 】 1. 载 玻 片 的 处 理 (1) 新 的 载 玻 片 放 人 硫酸 中 浸泡 24h, 水 冲洗 24h 后 ,用 单 蒸 水 浸泡 30min, 酒 精 浸 泡 30min ,自然 风干 。 (2) 用 0.1% 多 聚 赖 氨 酸 涂 布 载 玻 片上 ,室内 了 晾 干 备 用 。 2. 脱 晴 (1) oF 4~ 6pm 厚 的 肝癌 石蜡 切片 置 于 处 理 好 的 载 玻 片上 00 温 箱 过 夜 。 “202 。 实验 十 三 “” 原 位 杂交 - 293 . (2) 用 二 甲苯 37C 脱 螨 2 次 ,每 次 2min, 自 然 风 干 。 (3) 水 化 :将 玻 片 放 于 100% 、90% .70% 、50%、30% 的 系列 乙醇 中 各 3min,1 x PBS 洗 % Smin。 (4) 0.2mol/L HCI 室温 处 理 10 一 20min,1xPBS 洗 Smin, 自 然 风干 。 3. 杂交 前 预 处理 (1) 每 张 切 片 滴 加 5$0 一 100wl 20mg/ml 蛋白 酶 K (proteinase 民 ) , 置 湿 盒 内 37T 7k i 15min. (2) 滴 加 100u1 2mg/ml 甘氨酸 -PBS, 中 止 消化 Smin, 1 X PBS YE Smin。 (3) 4% & RHR (PEA) Al 5~ 10min, 1 X PBS #€ Smin. (4) 赔 水 :30% .50% .70% .90% .100 % 的 系列 乙醇 脱水 各 Imin, BARA. 4. 预 杂 交 和 杂交 (1) 每 张 切 片 滴 加 100pl 预 杂 交 液 , 置 湿 盒 内 42T KY th. (2) 倾 去 预 杂交 液 ,每 张 切 片 滴 加 10pl 地 高 辛 标记 的 HBV DNA 探 针 (500ng/ml) ,每 张 切 片 探 针 浓 度 为 Svg, 置 温 盒 内 96Y 变性 Smin ,然后 42C KBUK. 5 了 漂洗 (1) 2X SSC 室温 洗涤 10min。 (2) 0.1% SDS,0.1 x SSC F 37C MR 30min。 (3) 0.1 SSC F 37C HK 10min. (4) 缓冲 液 A 洗 lmin。 6. 显 色 (1) 每 张 切 片 滴 加 100 岂 封闭 缓冲 液 ,37C 30min。 (2) 除去 封闭 缓冲 液 ,每 张 切片 滴 加 30 ~ 50m! 酶 标记 抗体 (Surg/ml) 。 (3) 冲洗 :用 缓冲 液 A 于 室温 洗 2 次 ,每 次 Smin。 (4) 于 底 物 缓冲 液 中 平衡 2min。 (5) 每 张 切片 滴 加 100n1 新 配制 的 NBT 和 X- 磷 酸 盐 显 色 液 ,暗室 显 色 6 一 24h( 最 长 不 超过 24h) 。 (6) FTE 内 中 止 反应 Smin。 (7) 0.003 % WL WE FE KIA MK , 2 YE 1 一 2min。 (8) 30% .50% .70% .90% .100 % 的 系列 乙醇 脱水 ,各 lmin。 (9) — FR AE EAA PK, EK 1Imin ,树脂 封 片 , 光 镜 观察 拍照 。 【注意 事项 】 1. 所 用 的 载 玻 片 一 定 要 清洁 ,如 有 油污 , 则 易 导 致 杂交 过 程 中 组 织 标本 脱 片 。 2. BAT MIE HIE. (eR 王 群 ) 实验 十 四 “PCR-SSCP 技术 Exp 14. Single Strand Conformation Polymorphism 【原理 】 单 链 构象 多 态 性 (single strand conformation polymorphism, SSCP) 4} #f 4% A ,是 一 种 DNA 单 链 凝 胶 电 泳 技术 , 它 是 根据 形成 不 同 构象 的 等 长 DNA 单 链 ,在 中 性 非 变性 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 中 电泳 迁移 率 的 变化 ,以 检测 分 析 基 因 变 异 的 分 析 技 术 。 如 果 DNA 发 生 突变 , 则 单 链 构 象 改变 ,电泳 时 表现 出 不 同 的 带 型 ,从 而 鉴定 DNA 的 点 突变 。 聚 丙 烽 凝 胶 电 泳 的 凝 胶 介 质 分 辩 率 很 高 ,能 分 辨 因 点 突变 或 者 序列 的 变化 使 DNA 分 子 的 单 链 构象 所 发 生 的 改变 。 用 于 SSCP 分 析 的 核酸 片段 小 于 200bp ,检测 灵敏 度 为 70% 。 本 实验 利用 PCR-SSCP 技术 检测 不 同 HBV 感染 者 体内 HBV. 基 因 的 变异 情况 。 【材料 】 电泳 仪 . 垂 直 电 泳 槽 两 块 制 胶 玻 璃 板 、 玻 璃 板 夹 (夹层 厚度 lmm)、 梳 子 `.1% 普通 琼脂 糖 凝 胶 。 20 % 丙烯 酰胺 凝 胶 贮存 液 , 亚 甲 双 丙烯 酰胺 (Bis) :丙烯 酰胺 (Acr) = 1:19。 5SxTBE 浓 贮存 液 1L & :54g Tris.27.5g 硼酸 、 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0). 10% zt HR MB EK (AP). TEMED. 低 离 子 强度 (low ionic strength, LIS) vp: & 0.05% RBK 0.01% — RAF FF 和 10% 蔗糖 溶液 。 用 LIS 上 样 缓冲 液 处 理 的 样品 ,由 于 溶液 离子 强度 的 降低 可 使 核酸 分 子 的 解 链 温度 和 复 性 效率 降低 ,因而 能 够 提高 单 链 生 成 率 和 分 离 效 果 。 Al EK 210% CRE + 0.5% KAR. Ye (4, :0.2% AgNO; 溶液 。 fe. 4K 31.5% NaOH + 0.4% FR, # it YK :0.75% Na,CO;. HBV 病人 血清 标本 。 (Wri) 1. 目的 基因 片段 的 PCR 扩 增 ”利用 HBV 基因 扩 增 试剂 盒 ,对 不 同 来 源 的 血清 标本 进 行 PCR 扩 增 , 取 小 量 进行 普通 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 ,观察 产物 的 有 无 及 DNA 带 亮度 。 2. SSCP 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 液 的 配制 ”用 于 SSCP 分 析 的 凝 胶片 段 长 度 通常 在 500bp 以 "294 - Te 实验 十 四 “PCR-SSCP 技术 . 295 - 下 ,所 以 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 的 浓度 可 选 8% ,片段 较 小 时 选 12% 。 浓 度 为 8% 的 凝 胶 液 ,其 配 制 可 按 表 实验 14-1 进行 (所 配 液体 体积 可 据 玻 璃 板 大 小 而 定 。 以 玻璃 板 大 小 14cm x 11.5cm 为 例 , 凝 胶 厚 度 1mm ,安装 好 的 灌 胶 模 具 容 量 约 为 11ml, 所 以 所 配 凝 胶 液 的 量 可 按 12ml WY REM 14-1 SLRRPSRKAHAMS it 7A 20% BisAcr H,O 5X TBE 10% AP TEMED 添加 量 4.8 ml 4.8 ml 2.4 ml 84 pl 1.4 pl 3. 灌 胶 ”将 玻璃 板 装 人 橡胶 架 , 固 定 于 电泳 槽 中 , 插 人 合适 的 梳子 ,用 1% 琼 脂 糖 凝 胶 密封 两 侧 与 底部 。 将 凝 胶 溶 液 各 成 分 按照 表 实 验 14-1 中 的 顺序 加 入 小 烧杯 , 混 匀 后 抽 至 20ml 注射 器 中 , 带 针 头 贴 玻璃 板 内 壁 , 从 一 角 绥 慢 将 液体 注入 两 玻璃 板 空隙 ,以 防 气泡 产 生 。 室 温 聚 合 1h , 待 梳 齿 下 出 现 Schlieren 线 时 ,小心 拔 出 梳子 ,立即 用 水 冲洗 孔 格 。 在 电泳 槽 上 、 下 两 槽 中 灌 入 0.5xTBE AM, RB AAI. 4. 样品 处 理 RL 1~3yl PCR 产物 ( 取 量 视 产 物 浓 度 而 定 ) ,加 20mwl LIS- 缓 冲 液 ,98Y 放 置 Smin, 取 Spl EF. 5. 电泳 分 离 ”温度 SC (室温 较 高 时 ,可 用 冰袋 歼 于 电泳 槽 外 降温 ) ,电压 300V, 电 流 20mA, 电 泳 时 间 3h ,片段 较 长 时 ,可 适当 延长 电泳 时 间 。 6. 银 染 (1) Re FE REBAR ,DDW 水 洗 2 次 。 (2) 固定 液 固定 6min ,水 洗 2 次。 (3) 0.2% AgNO; 溶液 染色 10min ,水洗 3~5 次 。 (4) 显 色 液 显 色 7min。 注 意甲 醛 易 氧化 ,不 要 加 得 过 早 。 (5) MMA 0.75% Na,CO; 溶液 终止 显 色 。 【注意 事项 ]】 . 丙烯 酰胺 是 一 种 神经 毒剂 ,应 避免 通过 皮肤 吸收 。 . 玻璃 和 垫 条 要 彻底 清洗 干净 ,否则 影响 凝 胶 品 质 ,加 样 时 易 形 成 气泡 或 漏出 。 . 冲洗 凝 胶 孔 格 要 充分 ,以 免 导 致电 泳 带 型 不 整齐 。 . 凝 胶 和 电泳 贮 液 槽 中 使 用 的 TBE 应 是 同时 配制 的 ,否则 会 干扰 DNA 的 迁移 。 . 可 根据 电泳 板 的 大 小 ,配制 相应 体积 的 凝 胶 试 剂 。 6. PCR 产物 在 LIS 条 件 下 热 变性 ,样品 组 须 立 即 转 人 冰 浴 中 。 一 般 在 室温 条 件 下 , 保 存 4 一 5h 不 会 影响 分 析 结 果 。 aA & W NO = 买 验 十 五 ”核酸 电镜 捞 术 Exp15. Electron Microscopic Technology Applied in Nuclear Acids 【原理 】 许多 碱 性 球 和 蛋白 如 细胞 色素 c 在 低 盐 溶液 或 蒸馏 水 的 表面 容易 发 生变 性 形成 不 溶解 的 变性 薄膜 ,并 在 液 面 上 展开 。 如 果 所 处 的 液 面 大 小 合适 ,这 种 薄膜 即 可 扩展 成 单 分 子 层 而 形 成 由 伸展 的 肽 链 构成 的 蛋白 质 分 子 网 。 在 展 层 溶 液 内 ,细胞 色素 c 分 子 多 肽 链 上 的 大 量 氮 基 酸 碱 性 侧 链 基 团 ( 中 性 环境 中 细胞 色素 c 带 正 电荷 ) 与 核酸 分 子 链 上 的 酸性 基 团 (核酸 带 负电 和 荷 ) 以 水 合 链 结合 ( 或 靠 静 电 吸 引 ) ,核酸 分 子 就 相对 稳固 地 固着 在 细胞 色素 ec 的 周围 ， 在 展 层 时 , 随 着 细胞 色素 c 在 溶液 表面 展开 BRECK EST. ARRAY 网 膜 面 朝 下 在 溶液 表面 沾 一 下 ,核酸 即 可 吸附 到 碳 膜 上 (核酸 与 碳 膜 的 亲和力 比 核酸 与 下 相 液 的 亲和力 大 10 倍 ) ,转移 到 碳 膜 上 的 核酸 经 染色 ,金属 喷 镀 增加 反差 即 可 在 电镜 下 观察 。 所 用 的 碱 性 蛋白 除 细 胞 色素 c 外 ,还 有 廉 和 蛋白酶、 胰 和 蛋白 酶 、 核 酸 酶 .溶菌 酶 等 ,但 稳定 性 差 ， 效果 不 如 细胞 色素 co 【材料 】 上 相 液 ( 临 用 前 配制 ) : LO /mal 细胞 色素 c;1lxg/ml DNA;1lmolML NH4Ac。 “FP ABH :0~0.4mol/L NH4NC。 三 蒸 水 ;滑石 粉 ;滤纸 ; 碳 膜 ; 铜 网 ;90% 乙 醇 ;0.05mmolLL MR. 电子 显微镜 ; 载 玻 片 ;TEFLON( 聚 乙 所 乙烯 ) 盘 。 【方法 】 1. BE 将 下 相 液 倒 人 一 个 TEFLON( 聚 乙 氟 乙 烯 ) 盘 内 (或 者 塑料 培养 下 内 ) ,使 液 面 SMI. FA TEFLON 棒 清 洁 液 面 后 ,将 一 干净 载 玻 片 一 端 淄 人 下 液 相 内 ,一 端 搭 在 盘 壁 上 ， 形成 一 个 斜面 。 在 下 相 液 表 面 撒 上 一 薄 层 滑石 粉 ,用 吸管 吸取 SO pl 上 液 相 , 沿 距 下 液 相 表 面 1 cm 的 斜面 上 滴 下 ,如 展 层 良 好 ,会 看 到 形成 的 下 液 相 将 上 液 相 表面 滑石 粉 在 瞬间 内 推 向 四 周 。 待 液 面 稳定 后 ,用 附 有 支持 膜 的 铜 网 在 液 面 上 轻 轻 沾 一 下 ,用 滤纸 吸 去 多 余 的 液 体 。 2. 核酸 的 电子 染色 ”将 沾 有 核酸 的 铜 网 放 在 一 滴 0.05mmol/L Aa aR A AK i 色 30s, 然 后 在 90% 乙醇 液 滴 上 脱水 10s 之 后 用 滤纸 吸 干 ,自然 干燥 。 3. 金属 喷 镀 在 1x10*torrmmHg 的 条 件 下 ,以 6.5" 角 ,用 钨 丝 (或 色 - 久 合金 丝 ) 加 热 - 296 - 实验 十 五 ”核酸 电镜 技术 .297 . 喷 镀 ,样本 台 距 喷射 源 的 距离 为 4.$cm, 样 本 转动 速度 为 30r[/min。 【注意 事项 ]】 展 层 时 所 用 的 器 严 载 玻 片 要 绝对 干净 ,不 能 有 油脂 。 配 制 液体 所 用 的 水 必须 是 三 蒸 水 或 去 离子 水 。 ( 高 立 芬 ) 实验 十 六 “表达 谱 DNA 芯片 样品 的 标记 及 杂交 实验 方案 Exp16. Sample Labeling and Hybridization Protocol of Expression Profile By DNA Chip 【原理 】 目前 用 于 表达 谱 研 究 的 DNA 的 标记 方法 有 直接 标记 方法 .间接 标记 方法 及 体外 转录 的 方法 。 间 接 标 记 法 的 基本 原理 是 ,以 RNA 样品 为 模板 ,在 RNA 指导 DNA 多 聚 酶 ( 反 转 录 酶 ) 的 催化 下 ,以 oligo-dT 或 随机 引物 指导 ,经 反 转 录 合 成 cDNA, AER RA RIA 中 加 入 氮 基 酰 dUTP(aadUTP) ,由 于 其 结构 类 似 于 dTTP, 可 以 代替 dTTP BA Bl cDNA 第 一 链 中 。 挫 和 的 aadUTP 含有 游离 的 氮 基 ,可 通过 氨基 与 单 功能 的 Cy3 或 CyS 染料 进行 偶 联 ,从 而 对 cDNA 第 一 链 进 行 获 光标 记 。 与 直接 法 相 比 , 间 接 标记 法 大 大 提高 了 挫 入 的 效 率 ,减少 了 因 Cy3 和 Cys 挨 人 效率 的 不 同 对 结果 的 影响 。 效 光标 记 的 样品 \ 对照 的 cDNA 探 针 与 芯片 上 的 基因 片段 进行 竞争 性 杂交 , 探 针 的 浓度 越 高 ,与 芯片 上 的 基因 片段 杂交 的 比 例 越 高 ,经 过 激光 共聚 焦 扫 描 , 分 别 得 到 样品 与 对 照 的 荧光 强度 的 资料 及 比值 的 数据 ,经 过 进一步 分 析 , 即 可 得 到 样品 与 对 照 的 某 个 基因 的 表达 水 平 。 根 据 芯 片上 所 点 基因 的 不 同 ,可 得 到 不 同 数量 的 差异 表达 基因 ,是 一 种 高 通 量 的 检测 基因 表达 的 方法 。 可 用 于 比较 不 同 疾 病状 态 与 正常 的 基因 表达 差异 ,也 可 以 比较 不 同 处 理 之 间 的 基因 表达 的 差异 。 【材料 】 Microcon YM30 Centrifugal Filter Devices (Millipore ;Cat# 42410). QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen; Cat# 28106). Superscript [| RT (200U/ul) (Life Technologies Cat # 18064-014). dNTP sets( Promega) 。 5-(aminoallyl )-2’ deoxyuridine-5’ triphosphate (aadUTP ) ( Sigma; Cat # A0410), 50 x aadUTP: 100mmol/L dATP, dCTP, dGTP, 各 10pl, 100mmol/L dTTP6yl, 100mmol/L aadUTP 4yl, JRA - 20C 保存 。 Cy3 NHS -easter (Amersham Pharmacia Cat # Pa23001) 荧光 染料 。 Cy5NHS -easter (Amersham Pharmacia;Cat # PA 25001) IEA BI. DMSO( Sigma), Human cot-1 DNA, polydT (20mers) (2.5mg/ml), # f& ( hydroxy- lamine) 。 ‘“ae0 ° 实验 十 六 “表达 谱 DNA 芯片 样品 的 标记 及 杂交 实验 方案 - 299 - 预 杂 交 液 :20xSSC 2.5$ 岂 ,20%SDS 250 几 ,BSA 0.$g, 加 水 至 50ml, 过 滤 除 菌 , — 20T HR 存 。 杂交 液 :7.5 凡 甲 酰胺 ,3.7$nl 20 x SSC, 1.5p1H,0,0.75p1 2% SDS, 1.5p1 Img/ml hu- man cot-1DNA。 总 了 NA 或 mRNA( 要 求 OD;oo《OD;8o 比 值 在 1.8 一 2.0, 提 取 方 法 见 实 验 五 )。 PCR 仪 或 精密 水 浴 锅 ,扫描 仪 ,真空 浓缩 离心 机 ,普通 高 速 离心 机 ,芯片 杂交 盒 (Corn- ing) , 染 片 仙 ,其 他 实验 室 常用 试剂 及 耗材 。 Le) ’ 1. cDNA 第 一 链 的 合成 (1) M—451 Smal Eppendor! & FM: oligo-dT(2.5yg/pl) | 总 RNA(10 一 20pwg x pl 或 mRNA2pg) 0.05% DEPC-H,O tb 15. 5yl 总 体积 15.5yl AG .65C KIERME 10min, 4 FLA 10min. (2) 另 取 一 个 1.Sml Eppendorf 管 , 按 下 述 加 样 ; 5 x * Strand buffer byl 0.1mol/L DTT 3yl 50 X aadUTP mix 0. 6p 0.1% DEPC-H,0 2.41 总 体积 12pl 1B Sa 42° 预 热 4min。 (3) 将 RNA 转移 到 反 转 录 反 应 体系 中 ,再 加 入 Superscript [| RT RNase H(200U/ul) 2pl RNA 酶 抑制 剂 0.5pl 0.05% DEPC-H,0 适量 , {8 BAFALY 301. 42 CT 水 浴 内 反 转 录 2h, 即 可 得 到 aadUTP 标记 的 cDNA. 2. RNA 水 解 ”向 上 述 反应 体系 中 加 1.6pnl Smol/LNaOH (AME 0.25mol/L) & 20yl 0.5mol/L EDTA,6S 立 水 浴 放 置 15min, ,使 RNA 水 解 ,得 到 单 链 的 cDNA。 再 加 10 由 2mol/ L HEPES(pH 8.0) 中 和 反应 。 3. DNA 产物 的 纯化 ”以 Microcon YM30 纯化 cDNA 第 一 链 ,具体 步骤 如 下 ; 向 浓缩 柱 中 加 入 450Ml 灭 菌 HO 或 TE, 再 加 入 反 转 录 反 应 产物 ,12 000rMmin ,离心 6 一 10min, 弃 去 滤 过 产物 ,注意 不 要 使 柱 的 液体 离 干 ,重复 两 次 ,最 后 使 柱 中 的 液体 保持 在 5S01l 左右 。 掉 转 柱子 ,将 柱子 置 于 一 个 新 的 1.Sml EP 管 中 ,13 000r/min 离心 ,产物 经 真空 浓缩 离心 机 抽 于 。 4. 标记 的 cDNA 与 Cy5 或 Cy3 染料 的 偶 联 “以 4.$wl0.1lmolML Na,CO;(pH 9.0) 重 悬 cDNA, 以 4.51 DMSO 溶解 荧光 染料 (NHS-ester-Cy3 或 Cy5) (Img 荧光 染料 以 72nIDMSO -300- 基因 工程 学 溶解 ,分 装 16 个 小 管 ,-80TC 保存 ,2 周 内 使 用 或 真空 抽 王 后 47C 保存 ) 室 温 避 光 偶 联 1h, 加 A. 4.5pl 4mol/L #4 HE (0.289, 4 HF lml HO), Sik 15min, 终止 反应 。 5. 以 QIAQuick PCR Purification Kit 纯化 CyS/Cy3 标记 的 偶 联 产物 “将 样品 和 对 照 的 (Cy5 与 Cy3 标记 ) 偶 联 产物 合并 ,加 70 岂 于 O。 向 PCR 纯化 柱 中 加 5$00l buffer PB, 13 000 rmin ,离心 30 一 60s, 弃 去 滤 过 的 液体 ,加 750ul buffer PE( 应 用 液 ) ,13 000r/min, BL» 30 ~ 60s, 弃 去 滤 过 液体 ,重复 一 次 。13 200r/min 空 离 lmin, 干 燥 柱子 。 在 柱 中 央 加 30 则 buffer EB, ik lmin,13 000r/min 离心 1Imin。 重 复 洗 脱 一 次 。 洗 脱产 物 以 真空 浓缩 离心 机 抽 于 。 6. 微 阵列 预 处 理 (1) 湿 盒 水 合 ,80T 瞬间 干燥 30s。 (2) 紫外 交 联 ,能 量 190MJ。 (3) 0.1%SDS 浸泡 30s, 水 浸 30s。 (4) 沸水 中 变性 3min。 (5) 70% 乙 醇 浸 泡 1 一 2min。 (6) 500r/min 离心 Smin。 7. 微 阵 列 预 杂 交 处 理 (1) 加 入 预 杂 交 绥 冲 液 427 预 杂 交 45min. (2) 将 微 阵 列 置 于 室温 的 蒸 饮水 中 ,使 盖 玻 片 脱 落 。 (3) FARA RIAA), BSP PR. (4) 一 小 时 之 内 使 用 微 阵 列 。 8. 杂交 (1) 以 1$ 岂 杂交 液 重 悬 荧光 染料 标记 的 cDNA FR Ft, 100T 水 浴 变 性 2min, 室 温 冷 却 Smin。 (2) 将 盖 玻 片 盖 在 微 阵 列 上 ,从 盖 玻 片 的 侧 边 加 入 探 针 。 427 避 光 杂交 20 一 24h。 . 杂交 后 洗涤 ( 染 片 缸 中 进行 ,注意 避 光 ， 插 片 时 一 定 要 轻 ) a 2 x SSC 0.1% SDS HEX 3min。 (2) 1X SSC VER 2min。 (3) 0.2 x SSC HEH 1min. (4) 0.05 x SSC HU F 10s. (5) 500r/min 离心 3 一 4min 甩 于 ,3h 内 扫描 。 10. 扫描 ”杂交 后 芯片 的 扫描 ,根据 不 同 的 标记 方法 采用 不 同 的 扫描 仪 进 行 扫 描 。 艾 光标 记 的 探 针 采 用 激光 共聚 焦 扫 描 仪 扫描 。 扫 描 后 的 图 像 以 TIFF 格式 保存 ,然后 采用 Quantarray 进行 分 析 。 从 Quantarray 获得 的 数据 是 以 文本 格式 存储 的 文件 ,包括 Cy5/Cy3 的 比值 ,荧光 强度 及 其 他 参数 。 这 样 得 到 的 比值 资料 由 于 染料 之 间 标 记 效 率 的 不 同 还 需要 通过 Normalization 软件 进行 校对 ,最 终 获 得 的 CySXCy3 的 比值 才能 真正 反应 病理 组 织 与 正 常 组 织 中 基因 表达 的 差异 ,并 通过 聚 类 分 析 找 出 表达 差异 基因 之 间 的 相互 关系 ,从 而 阐明 从 因 的 表达 差异 与 疾病 的 发 病 机 制 之 间 的 关系 。 【注意 事项 ]】 实验 十 六 “表达 谱 { DNA 芯片 样品 的 标记 及 杂交 实验 方案 .301 . 1. RNA 的 提取 一 般 要 求 采 用 Trizol 试剂 提取 ,纯度 OD 469 /OD gp BRE 1.8~2.0Z 间 。 2. 荧光 染料 的 保存 很 重要 ,分 装 后 的 染料 应 尽快 的 使 用 。 3. 荧光 染料 标记 cDNA 后 ,后 续 的 操作 尽量 的 避 光 。 4. 应 对 染料 标记 效率 进行 计算 。 计 算 公 式 如 下 :采用 5$0ml 的 比 色 杯 , 将 标记 后 纯化 的 cDNA 产物 全 部 加 入 比 色 杯 中 ,分 别 在 SS0nm 及 650nm 波长 比 色 ,计算 各 自 的 标记 效率 。 _OD;soX 体 积 x37ng/lx 1000pg/ng pmol $f = 324. Spg/pmol _ ODs59 X EAA (ul) pmolCy3 = a = OD¢50 x fA FR (yl) pmolCy5 = ID gags a _ _pmolecDNA 核 音 酸 /染料 比值 = pmol Cy 染料 要 求 每 个 样品 染料 结合 率 大 于 200pmol, 核 苷 酸 / 染 料 比值 小 于 50 时 可 用 于 杂交 。 (Ae HEF) et Besse Ly FA CHA at UL AY Ah SH 1. 玻璃 器 严 的 处 理 ”新 购 进来 的 玻璃 器 严 应 先 用 肥皂 水 或 洗 洁 精 洗刷 ,后 用 自来水 冲 洗 ,再 用 1% 一 2% 盐 酸 水 溶液 浸泡 6 一 12h, 以 除去 游离 碱 , 用 自来水 冲洗 于 净 后 ,再 浸泡 于 硫酸 清洁 液 中 过 夜 ,最 后 用 自来水 冲洗 ,玻璃 上 瓶 等 器 亚 要 注 满 水 后 倒 出 ,如 此 反复 12 一 15 次 ,再 用 蒸 馅 水洗 1~3 KK, BRR FRAT. 培养 细胞 用 的 培养 瓶 .吸管 滴 管 等 对 清洁 要 求 更 高 ,用 蒸馏 水 冲洗 至 少 要 5 一 8 次 ,再 用 双 蒸 水 冲洗 SKE. HET ,包装 ,高压 , 烘 干 , 备 用 。 2. 硫酸 清洁 液 的 配制 与 注意 事项 (1) 硫酸 清洁 液 的 配方 如 下 : 成 分 配方 IT 配方 I (2) 硫酸 清洁 液 的 配制 与 注意 事项 : 重 铬 酸 钾 (g) 80 100 1) 配制 时 要 注意 安全 ,必要 时 戴 上 耐酸 自来水 (ml) 1 000 750 手套 、. 穿 上 耐酸 围裙 ,要 特别 注意 保护 面部 和 粗 浓 硫 酸 (ml, 工 业 用 ) 120 250 身体 裸露 的 部 位 。 2) 先 将 重 铬 酸 钾 溶 解 于 自来水 中 (可 稍微 加 热 ) , 待 冷 至 室温 后 徐徐 加 入 浓 硫 酸 ,不 然 容易 爆 沸 造成 意外 事故 。 3) 清洁 液 有 很 强 的 酸性 和 氧化 能 力 ,为 防止 器 严 内 残留 的 大 量 有 机 物 与 清洁 液 中 的 铬 酸 盐 结 合 而 迅速 破坏 失效 ,因此 要 求 各 类 器 严 需 先 用 肥皂 水 或 清洁 液 冲 洗 晾 干 后 ,再 放 人 清 洁 液 中 。 4) 若 玻 四 内 附 有 Hg? Pb” Ba 两 价 离子 时 ,要 先 用 稀 盐 酸 或 稀 硝 酸 处 理 后 再 浸 人 硫酸 清洁 液 。 5) 新 配制 的 清洁 液 为 红 褐 色 ,经 反复 使 用 会 变 成 绿色 ,表明 已 经 失效 ,应 奔 去 不 用 。 3. 玻璃 制品 和 塑料 制品 的 硅烷 化 处 理 (1) 把 待 硅烷 化 的 物品 放 和 人 一 较 大 清洁 的 玻璃 干燥 器 内 。 (2) 干燥 器 内 放置 一 个 小 烧杯 ,内 装 1ml 二 氯 二 甲 硅烷 。 注意 :二 氯 二 甲 硅烷 有 毒性 和 挥发 性 ,高度 易 燃 , 务 必 在 化 学 通风 橱 中 操作 。 (3) 通过 接 液 瓶 将 干燥 器 与 真空 泵 相连 ,开启 真空 系统 抽 气 至 二 氯 二 甲 硅烷 开始 沸腾 ， 立即 切断 真空 泵 与 干燥 器 之 间 的 连接 管道 ,关闭 真空 泵 。 干 燥 器 内 应 维持 真空 状态 ,一 且 二 氯 二 甲 硅 烷 开 始 沸腾 ,务必 马上 关闭 真空 泵 ,否则 挥发 剂 将 被 抽 和 人 真空泵 而 破坏 真空 密封 。 (4) 待 二 氯 二 甲 硅烷 挥发 至 尽 (1 一 2h) ,在 化 学 通风 橱 中 打开 干燥 器 。 让 二 氯 二 甲 硅 烷 烟雾 分 散 后 ,取出 玻璃 或 塑料 制品 ,玻璃 制品 和 玻璃 棉 使 用 前 应 于 180Y 烘 烤 2h。 塑 料 制品 不 应 高 压 灭 菌 ,但 使 用 前 须 用 水 彻底 冲洗 92 ， pi ae a aT -二 附 R + 303 - (5) 大 件 玻 璃 制品 的 硅烷 化 是 把 物品 用 氯仿 或 庚 烷 配制 的 5% 三 氯 工 甲 硅烷 浸泡 或 漂 洗 ,有 机 溶剂 挥发 时 ,二 氯 二 甲 硅烷 即 沉积 在 玻璃 制品 上 ,用 前 应 用 水 反复 冲洗 多 次 或 于 180°C 烘 烤 2 小 时 。 附录 工 ”第 用 培养 基 和 游 液 1. 常用 培养 基 溶液 (1) LB( Luria — Bertani) 4% # 4& : Bacto-tryptonel0g, Bacto-yeast extract 5g, NaCl 10g, # 于 800ml WH 7K A,AW NaOH #9 pH 27.5 定 容 至 1L, 分 装 高 压 灭 菌 。 (2) B 固体 培 养 基 : 按 琼 脂 :LB 液体 培养 基 (WZMV)=1.5% 一 2.0% 配 成 。 (3) 1lmol/L Tris: 溶 解 121.19g Tris 碱 , 于 800ml DDW 内 ,加 浓 盐 酸 调 所 需 pH. pH7.4 约 需 浓 HCl 70ml,pH7.6 约 需 浓 HCl 60ml,pH 7.4 Awe HCl 42ml, 在 最 终 调 pH 之 前 ,使 溶液 冷 至 室温 , 定 容 体 积 为 1L。 分 装 ,高 压 灭 菌 。 兰 溶液 呈 黄 色 时 , 弃 之 换 用 试 剂 纯 Tris 再 配制 新 溶液 。 (4) 0.5mol/L EDTA(pH8.0): 称 186.1gEDTA-Na .HEHO 溶 于 800mIDDW 中 ,振荡 混 匀 使 溶 ,用 NaOH(20gNaOH 颗粒 ) 调 pH 至 8.0。 调 体积 至 1L, 分 装 ,高 压 灭 菌 。 (5) Smol/L NaCl: 溶 解 292.2g NaCl 于 800mIDDW 中 , 调 体 积 至 1L ,分 装 ,高 压 灭 菌 。 (6) lmolML MgCl :溶解 203.3g MgCl,-6H,O 于 800mIDDW 中 , 调 体 积 1L ,分 装 ,高 压 灭 菌 。 (7) 3mol/L NaAC(pHS.2) :溶解 408.1g NaAC-3H,O (CHCONa:3HIO) 于 800ml DDW 中 ,用 冰 醋 酸 调 pH 至 5.2, 调 体积 至 IL, OH SEK. (8) lmol/L DTT :溶解 3.09g — Sit HHH (DTT) F 20ml0.molML NaAC(pH5.2) ,过 滤 除 菌 ,分 成 lml/#, —20C 保存 。DTT RS DIT 的 溶液 不 能 高 压 灭 菌 。 (9) EB 10mg/ml: Hl 1g 省 化 乙 锭 (EB) 到 100ml DDW 中 BE tit FEL) at DA i PR YE 溶解 AHA ba ER ICR. EB 是 一 种 强 锈 变 剂 ,操作 者 要 戴 手 套 注 意 防护 自身 ,更 应 注意 避免 污染 环境 。 (10) 10% SDS: 在 900ml 水 中 溶解 100g 电泳 级 SDS ,加 热 至 68Y HAE, ,加 入 几 滴 浓 盐 酸 调 pH 为 7.2, 加 水 定 容 至 1L, 分 装备 用 。SDS 洲 液 无 需 灭 菌 。 (11) 20xSSC: 在 800ml 水 中 溶解 173.5g NaCl 和 88.2g Fy RABE, MA BOR 10mol NaOH 溢 液 调 pH 至 7.0, 加 水 定 容 至 1L ,分 装 后 高 压 灭 菌 。 (12) X-gal: 用 二 甲 基 甲 酰胺 溶解 X-gal, 配 制 成 120mgml(W/V) 的 贮存 液 ,保存 于 一 玻璃 管 或 聚 两 烦 管 中 ,用 铝 稍 纸 封 庄 好 以 防 光 照 ,贮存 - 200. X-gal 溶液 无 须 过 滤 除 菌 。 2. 抗生素 溶液 的 配制 (1) 毛茶 西林 (AP) 保 存 液 : 25mg/ml (W/V) AE KABA, HER. PR, —20C RF. LER A 35~S50pg/ml. (2) ABA(CM) RAM: WA 34mg/ml (W/V) AY 100% 2 REAM, F-20C 保存 。 作 用 浓度 : 扩 增 质粒 为 170 ug/ml; fi VEST HE HAF 30 ug/ml. (3) TC 保存 液 : 为 12.Smg[ml(WXV) 盐 酸 四 环 素 的 乙醇 /水 (50% , V/V AMR. TEA - 304: 基因 工程 学 KEW 12.5ug/ml. TE: OHA MIE RUS WIE ADHA WARS PRR EBT ROMA 抗 剂 ,应 使 用 无 镁 盐 的 培养 基 ( 如 LB) 筛 选 四 环 素 抗 性 菌 。 3. 常用 电泳 缓冲 液 (1) TAE BMPR: 1) 工作 液 (1x ):0.04mol/L Tris-HAC, 0.001mol/L EDTA. 2) 浓缩 保存 液 (50 x ) :每 升 含 Tris 碱 242g, VK AGAR S57. 1ml,0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100ml。 (2) TPE 缓冲 液 : 1) 工作 液 (1x ):0.09mol/L Tris-H,PO,,0.002mol/L EDTA. 2) 浓缩 保存 液 (10 X ) :每 升 含 Tris 碱 108g ,85 % BERR (1.679mg/ml)15.1ml, 0.5mol/L EDTA(pH8.0)40ml. (3) TBE 缓冲 液 : 1) 工作 液 (1x ):0.045mol/L tris- 硼 酸 ,0.001molML EDTA. 2) 浓缩 保存 液 (5 x ) :每 升 含 Tris Bk 54g, DR 27.5g,0.05mol/L EDTA(pH8.0) 20ml。 (4) Tris- 甘 氨 酸 缓冲 液 : 1) 工作 液 (1x ): 25mmol/L Tris, 250mmol/L 甘氨酸 ,0.1%SDS。 2) 浓缩 保存 液 (5x ):15.1g Tris 碱 ,94g 甘氨酸 (电泳 级 ,pH8.3) ,50ml 10%SDS( 电 泳 级 )。 4. 凝 胶 加 样 缓冲 液 (1) I #6 x Bw wR:0.25 % YR BH KK (PBS) 0.25% — FB AA MB (xylene cyanol) ,40% (W/V) BEBE ,水 溶液 于 4 保存 。 (2) Tl AY 6x BwpwR 0.25% WRB IK (PBS) ,0.25 % — A EMME (xylene cyanol) ,0.25% Ficoll(type 400) ,水 溶液 于 室温 保存 。 (3) 2x SDS 凝 胶 加 样 缓冲 液 :100mmolvL Tris-HCl(6.8) ,200mmol/L DTT( 二 硫 苏 糖 BF) 4% 溴 酚 蓝 ,20% 甘油 。 注 :此 缓冲 液 为 不 含 二 硫 苏 糖 醇 的 2x SDS。 该 凝 胶 加 样 缓冲 液 可 保存 于 室温 , 临 用 前 取 lmol 的 二 硫 苏 糖 醇 储存 液 , 加 于 上 述 缓冲 液 中 。 5. 限制 性 内 切 酶 解 缓冲 液 缓冲 液 NaCl Tris-HCl MgCl, DTT BSA (mmol/L) (mmol/LpH7.5) (mmol/L) (mmol/L) (ng/ml) 低 盐 0 10 10 1 50 中 盐 50 10 10 1 50 高 盐 100 50 10 I 50 6. BER E DNA 的 分 离 范围 (1) 琼脂 糖 凝 胶 浓 度 与 线形 DNA 的 分 离 范 围 琼脂 糖 凝 胶 的 浓度 人 %) ”线形 DNA 长 度 人 (bp) 0.5 1000 ~ 30 000 0.7 800 ~ 12 000 LO 500 ~ 10 000 Lee 400 ~ 7000 ES) 200 ~ 3000 2.0 50 ~ 2000 (2) FSA Mais Bt HC Bae BS HE Tak OS BY Yd 丙烯 酰 铵 浓度 人 (% ) 分 离 核 苷 酸 的 范围 人 bp) 3.5 100 ~ 1 000 5.0 80 ~ 500 8.0 60 ~ 400 12.0 40 ~ 200 20.0 10~ 100 7 «AR Vel be SE BS A es PHB HE IBY) hl anitieg a 5.0 siaat sana 12 20 PY Has BE Be FE HK ( ml) 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6 10% 过 硫酸 胺 (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10 X TBE(ml) 10 10 10 10 10 总 体积 (ml) 100 100 100 100 100 附录 亚 ” 基 因 工 程 常 用 数据 和 换算 计算 公式 1. 基因 组 R17 MRK: 3.6kb, & 4 个 基因 (2000 年 )。 E. coli (PB51) Mt fi {& :250kb, & 240 多 个 基因 (2000 年 )。 E..coli(K-12 MG1655): 4.64Mb, & 4288 个 基因 ,其 中 1/3 基因 的 功能 尚 不 清楚 (2001 年 )。 结核 杆菌 :4.41Mb(2001 年 )。 酵母 :6000 个 基因 (2001 年 )。 果 蝇 :13000 个 基因 (2002 年 )。 线虫 :18999 个 基因 (2002 年 )。 拟 南 芥菜 :26000 个 基因 (2002 年 )。 人 :31000 个 基因 ,32 亿 对 碱 基 (2002 年 )。 -306- BALES 2. 常用 核酸 蛋白 换算 数据 (1) 重量 换算 : Ipg=10 °g | Ing=10 °g Ipg=10 'g lig=10°*g (2) 分 光 光 度 换算 : 1Ax69 DS DNA= 50pg/ml 1A2ioSS DNA = 33pg/ml 1A 69 DS RNA= 40pg/ml (3) DNA: pie CES age BAKA 650 道 尔 顿 摩尔 单 碱 基 对 平均 重 约 660g i. 道 尔 顿 的 双 链 DNA KA 0.5ym 长 10° 道 尔 顿 的 双 链 DNA 大 约 是 1.5kb (4) DNA 摩尔 换算 ; lpg 1000bpDNA=1.52pmol=3.03pmol 末端 浓度 lpg PBR322DNA=0.36pmolDNA 1pmol 1000bpDNA = 0. 66g 1pmol PBR322DNA = 2. 8p 1kb DS DNA( 4H Ek) = 6.6 10° 道 尔 顿 1kb SS DNA( 钠 盐 ) = 3.3 x 10° 道 尔 顿 1kb SS RNA( 4H #2) = 3.4 x 10° GEAR tH (5) Abe 5 5 HF ARR AY OF Sy HE XY OP FJ Bt = 330g /mol: kb DNA=330 个 氨基 酸 编码 容量 333 个 氨基 酸 =3.7X10* 道 尔 顿 (6) 蛋白 摩尔 换算 : 100pmol 分 子 量 100 000 有 蛋 白质 = 10rwg 100pmol 分 子 量 50 000 蛋白 质 =Sng 100pmol 分 子 量 10 000 4 A = Ing 氮 基 酸 的 平均 分 子 量 =126.7 道 尔 顿 (7) 蛋白 质 /DNA 换算 : 1000 分 子 量 蛋 白质 =270bp DNA 30 000 分 子 量 和 蛋白 质 =810bp DNA 50 000 分 子 量 蛋 白质 =1.35kp DNA 100 000 分 子 量 蛋 白质 =2.70kp DNA 注 :1kb DNA=333 个 氨基 酸 编码 容量 =3.7x10?4 道 尔 顿 蛋白 质 dA=dA 的 数目 ,dC= dC 的 数目 ,dG= dG 的 数目 ,dT=dT 的 数目 。 附 x - 307 - 3. 常用 的 计算 公式 : (1) DNA 的 摩尔 浓度 : 1) DNA 片段 的 分 子 量 克 / 摩 尔 DNA = 碱 基 对 数 x 单 碱 基 对 平均 重量 2) DNA 片段 $ -未 端 或 3 -末端 的 摩尔 浓度 = DNA 克 数 /DNA 分 子 量 = 摩 尔 浓度 x2 3) 环 状 DNA 分 子 被 限制 性 内 切 酶 切割 后 的 末端 摩尔 浓度 =DNA 摩尔 浓度 x 切 割 位 点 数 X2 4) 线性 DNA 分 子 被 限制 性 内 切 酶 切割 后 的 末端 摩尔 浓度 =DNA 摩尔 浓度 x 切割 位 点 数 X2+2 (2) 摩尔 浓度 和 当量 浓度 的 计算 1) 拳 尔 浓度 :是 1L 溶液 中 含 溶质 的 摩尔 数 ,或 lml 深 液 中 含 溶质 的 毫 摩尔 数 ,以 mol/L 表示 ,其 表达 式 为 :molIL= 寻 = 7 ml 式 中 :n, 溶 质 的 摩尔 数 ;mn, 溶 质 的 毫 摩尔 数 ;Vi ,溶质 的 体积 升 数 ;Vu ,溶液 的 体积 毫 升 数 。 BE an = EG W: 物 质 的 质量 ;fw:l 摩尔 质量 ;M: 分 子 量 。 2) 当量 浓度 :是 UL 溢 液 中 所 含 溶质 的 克 当 量 数 ,或 Im 溶液 中 所 含 溶质 的 毫克 当量 数 ,用 N 表示 ,其 表达 式 为 :N= 鼠 = Da poe 式 中 :n ,溶质 的 克 当 量 数 ;mn, 深 质 的 毫克 当量 数 ;V ,溶液 的 体积 升 数 ;Vw ,溶液 的 体 BEB n=) WW: 物 质 质量 下 : 克 当 量 4. 常用 的 DNA 碱 基 长 度 标准 参照 物 Gene Ruler 100bp ADNA/Hin d Ill ADNA/Hindlll + EcoR I pBR322/Bstn | ®y174 Hee lll DNA Ladder Plus 23130 21227 1375 1857 1353 194 3000 600 9416 5148 974 1060 1078 118 2000 500 6557 4973 831 929 872 1500 400 4361 4268 564 383 603 1200 300 2322 3530 125 121 310 1031 200 2027 2027 13 281 900 100 564 1904 271 800 125 1584 234 700 CO512—23.1 kb) (O,12—21 2 kb) (0.01~1.85 kb) (0.10~1.35 kb) (0.10~3.00 kb) 308 .基因 工程 学 5. 常用 蛋白 质 相 对 分 子 质量 标准 参照 物 蛋白 质 相对 分 子 质 量 肌 球 蛋白 212 000 高 B- 半 乳糖 苷 酶 116 000 分 磷酸 化 酶 B 97 000 ¥ + i AeA 66 200 量 过 氧化 氢 酶 57 000 醛 缩 酶 40 000 磷酸 化 酶 B 97 400 牛 血 白 蛋白 66 200 中 谷 氨 酸 脱 氢 酶 55 000 分 AeA 42 700 + AE 4a 40 000 量 碳酸 苷 酶 31 000 大 豆 抑 肽 酶 21 000 溶菌 酶 14 400 碳酸 苷 酶 31 000 AK GAM KG 21 000 低 马 心 肌 球 蛋白 16 900 at 溶菌 酶 14 400 oF 肌 球 蛋白 (Fl) 8 100 量 肌 球 蛋白 (F2) 6 200 肌 球 蛋白 (F3) 2 500 6. 同位 素 资料 : 放射 性 测量 单位 :伦琴 (r) 是 使 lg 空气 产生 1.61 x 102 离 子 对 的 X 或 y 射线 的 照射 剂量 。 R/0.87 = 1lrad 1Ci=3.7x 10° RF EB LpCi=3.7 x 10* KEE /s= 1.2 X 10° VK HB /min Bay (XK fin Fe 7 Be = 6 x 10°° 7. 典型 大 肠 杆 菌 的 重量 :10 2g/ 湿 重 / 细 胞 ;10 Pg 蛋白 质 / 细 胞 ;2x10 2 于 重 / 细 胞 。 1.0 x OD;; (Zeiss) KW = 1X 10° ?mole 8. 几 个 受 体 菌 的 表 型 : (1) C600(E . Coli): WF K12(E. Coli), AA Tai la RACF ) ,( 和 ), thr-1,leuB6, LacY1,tpnA21,supE44. AA BRS F AFA A Me A BY & BR OG (2) HB1O1(E. Coli) :来 源 于 下 .Coli, 是 F ,hsdS20,(rB MB ), supE44, recA13, are- 14 ,proA2 ,lacYl ,galK2 ,rpsL(Str)xyl-$,mlt-1,supE44, 和 ”的 菌株 。 (3) JM109(E. Coli) :recAl ,supE44 ,endAl ,hsdR17(rK ,mK* ),gyrA96,mtl-1, relAl, thiA(lac proAB) ,和 ,[F’traD36, proAB* ,lagl°ZAM15],y(DE3) Atk. (PRA K ti ® 春 ) 附 录 + 309- 附录 区 人 类 基因 组 测序 参加 单位 索引 (HGSI Participants) BCM-HGSC CMG-WCH GBF GENOSCOPE GTC HGGIGCAS IMBB/ FORTH Jena JGI Keio MD-ACC MMGC MOIMG-LH RIKEN-GSC Sanger SHGC TIGR UO-ACGT UTSW UWGC UW-MSG WshU WI/MIT YMGC Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center Dept. of Cytogenetics and Molecular Genetics at the Women’s And Children’s . Hospital GBF-Dept. of Genome Analysis, Braunschweig GENOSCOPE National Sequencing Center Genome Therapeutics Corp. Human Genome Center , Institute of Genetics , Chinese Acade- my of Sciences Institute of Molec. Biology & Biotechnology/Foundation for Research and Technology Hellas The Institute for Molecular Biology Jena Joint Genome Initiative (LBNL/LANL/LLNL) Keio University School of Medicine sequencing Team MD-Anderson Cancer Center Medical and Molecular Genetics Center Max-Planck-Institute for Molecular Genetics RIKEN Genomic Sciences Center (formerly Tokyo , JST-Ki- tasato/U. Tokyo Sequencing Team) The Sanger Center Stanford Human Genome Center The Institute for Genomic Research University of Oklahoma University of Texas Southwest University of Washington Genome Center University of Washington Multimegabase Sequencing Group Washington University School of Medicine Genome Sequencing Center Whitehead Institute “MIT Genome Sequencing Center National Yang Ming University Genome Research Center ( Fh ie US Australian Germany France US China Greece Germany US Japan US Spain Germany Japan UK US US US US US US US US Taiwan 刘 玉 刚 ) - 310 . 基因 工程 学 附录 V 专业 词汇 ( 英 中 对 照 ) anneal 退火 Aspergillus oryzae “稻谷 曲霉 普 适 子 anti-sense RNA Jz % RNA Ba FE HK IS asymmetric PCR 不 对 称 PCR allele specific oligo nucleotide probe ASO RET (SE LES EK EF BRR TF ) arraying and replicating device ,ARD 阵列 复制 项 arrayer adaptor aminopterin 阵列 点 样机 amber 3%3H association analysis ”关联 分 析 avian myeloblastosis virus, AMV 328448 母 细 胞 瘤 病 毒 bacterial alkaline phosphatase,BAP 细菌 碱 TE Be PR tt bacteriophageA A Mi FA 1K 杆 状 病毒 biochip 生物 芯片 bispecific antibody, BsAb 双 特 异性 抗体 bifunctional antibody, BfAb 双 功 能 抗体 临床 表 型 coding SNP,cSNP 编码 区 SNP chloramphenicol acetyltransferase, CAT 和 氧 霉 素 酰基 转移 酶 顺 式 调 控 因 子 相 容 性 C value paradox C 值 矛盾 细胞 基因 组 染色 质 染色 体 coding strand (sense strand ) 链 ) consensus sequence baculovirus clinical phenotype cis-acting factor compatibility cellular genome chromatin chromosome 编码 链 ( 有 义 一 致 序列 covalent close circle, CCC ， 共 价 闭环 clone “克隆 cohesive ends (stick ends) #& TEAR Sig competent 感受 态 complementary DNA,cDNA 互补 DNA complete digestion 完全 酶 切 消化 作用 calf intestinal alkaline phosphatase,CAP 小 牛 肠 碱 性 磷酸 酶 cloning vectors “克隆 载体 cosmid itt Ji Ai cohensive-end site COS 位 点 ， 黏 性 末端 位 capping 人 带 帽 cDNA library cDNA 文库 competent cell “感受 态 core promoter element 核心 启动 子 元 件 cytomegalo virus, CMV 巨细 胞 病毒 co-transfection 共 转 染 编码 偏爱 性 contiguous stacking hybridization ,CSH 4 堆 杂 交 技 术 cyclin-dependent kinas es, CDKs 赖 型 激酶 clustering analysis code bias Cyclin 依 聚 类 分 析 cyclone storage phosphor system “” 磷 感 屏 成 像 系统 charge-coupled devices ,CCD 电荷 偶合 装 置 chromosome translocation 染色体 转 位 方式 顺 式 调 控 元 件 core sequence,module,motif 核心 序列 CDR 移植 抗体 组 合 抗体 库 differential display RT-PCR , DDRT-PCR 差异 显示 反 转 录 PCR cis-acting element CDR grafting antibody combinatorial antibody library denature ”变性 DNA chimera DNA fe ATK DNA engineering DNA 工程 distant cleavage U0 FE BS 28 fi ie DNA recombination DNA 重组 DNA vaccine DNA 3 fi dehancer IK dihydrofolate reductase, dhfr = AM RA Jk dot or slot blot 斑点 及 狭 颖 印迹 法 DNA sequencing DNA ili FF direct sequencing,DS ”直接 测序 DNA chips DNA 芯片 DNase] MAY) AG I DNAase | hypersensitive site DNase | #8 i Je DNase | hyperseneitivity assay DNase | 超 敏 感 分 析 differential library ”差异 显示 文库 dependovirus ”依赖 性 病毒 diabodies ” 双 体 DNA polymorphism DNA 多 态 性 enhancer 增强 子 expression vector 表达 载体 euchromatin 常 染 色 质 expression-library immunization ,ELI 表达 文库 免疫 技术 E. coli DNA pol 工 Klenow fragment 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 I AY Klenow 片段 eukaryotic virus vector “， 真 核 细胞 病毒 载体 electroporation 电 穿 孔 expression vector 表达 载体 exon 外 显 子 etoposide KAW AH epithelial glycoprotein ”上皮 糖 蛋白 embryonic stem cells,ES 细胞 胚胎 干细胞 functional genomics ”功能 基因 组 学 filamentous phage f## 24 1K pa A 附 xR ,<39i framework region, FR 骨架 区 flanking sequence 侧翼 序列 flush(blunt) end 平 齐 末 端 foreign DNA 外 源 基因 genetic engineering antibody 基因 工程 抗 体 gene therapy 基因 治疗 gel retardation assasy Be vr AE gene amplification 基因 放大 gene chips “基因 芯片 gene bank 基因 库 gene 基因 gene immune 基因 免疫 gene expression 基因 表达 gene cloning 基因 克隆 gene library 基因 文库 gene manipulation 基因 操作 gene recombination ”基因 重组 genetic engineering 基因 工程 genomic library 基因 组 文库 genomic DNA library 基因 组 DNA 文库 gene expression in prokaryotic cells JR # 达 系 统 gene expression in eukaryotic cells 真 核 基 因 表 达 系 统 gutless vector 无 病毒 载体 genomic amplification with transcript se- queucing ,GAWTS 基因 组 扩 增 转录 同 步 测序 法 gene clustering EA R24 67 germ cells 性 细胞 germline LA gene knockout J&A mK PR gene targeting Jt AFT gene knockin J&A A human genome project, HGP “人 类 基因 组 计划 human anti-mouse antibody，HAMA “人 抗 -312- 基因 工程 学 鼠 抗体 humanized antibody 人 源 化 抗体 house-keeping gene 看 家 基因 hybrid clustering approach 混合 聚 类 法 heat shock protein, HSP AKA homopolymeric tail FI KF WBE high repetitive sequences 高度 重复 序列 hybridization 282% heterochromatin 538 4m heterogenuous nuclear RNA, hnRNA KA 异 质 RNA human genome hybrid site hypoxanthine 人 类 基因 组 杂种 位 点 UK By ERS 发 夹 结 构 内 细胞 团 isopropyl-B-D-thiogalactoside, IPTG FW 基 -B-D- 硫 代 半 乳糖 苷 incompatibility 不 相 容 性 immunostimulatory DNA sequence, ISS 4 疫 刺激 DNA 序列 isoschizomers “ 异 源 同 工 酶 lr] Fe immunostimulatory DNA sequence ,ISS 4 疫 刺激 DNA 序列 interrupted or discontinuous gene 因 intervening sequence, IVS ff ASF I iA KIS 间隔 顺序 hairpin structures inner cell masses isocaudamer 不 连续 基 insertional inactivation intergenic sequence, TIS Aa F infection ”感染 inverse PCR,IP-CR Ji |n] PCR linker 接头 long terminal repeat sequence ,LTR 长 末端 重复 序列 脂 质 体 连接 酶 Intron liposome ligase . nuclear run on transcription lytical pathway 溶菌 途径 lysogenic pathway ” 洲 源 途径 LacZ-a complementation peptide, ZAP | LacZ-a 互补 肽 连接 子 long PCR 长 距离 PCR 连锁 分 析 microinjection 显 微 注射 法 monoclonal antibody, McAb 单 克 隆 抗体 mobility shift assasy 迁移 改变 法 multiple cloning site, MCS 多 克隆 酶 切 位 点 linker linkage analysis Moloney murine leukemia virus, M-MLV 莫 洛 尼 鼠 白血病 病毒 mitochondrial DNA, mtDNA 线粒体 DNA molecular cloning 分子 克隆 multiple cloning sites, MCS 多 克隆 位 点 修饰 性 核酸 酶 中 度 重 复 序 modification nuclease moderate repetitive sequences 列 methotrexate, MTX FR gant mini-Ad 微型 腺 病毒 载体 multiplex PCR 多 重 PCR 微 抗体 微 卫 星 DNA Northern 印迹 nucleic acid vaccine, NAV ， 核酸 疫苗 nucleic acid ”核酸 nucleoid 24K 核 小 体 nucleotide acid HR 缺口 平移 nucleic Acid Hybridization miniantibodies mini-satellites northern blot nucleosome nick translation 核酸 杂交 neural network approach 神经 网 络 方法 normalization 标准 化 处 理 进行 中 的 核 转 录 分 析 native antibody library ”天然 抗 体 库 non-synonymous cSNP 非 同 义 cSNP open reading frame, ORF 开放 阅读 框架 open circle, OC FH open reading frame, ORF 开放 读 码 框架 osteoporosis ‘4 Jat Hii HATE osteoclasts 破 骨 细胞 polyclonal antibody，PcAb 多 克隆 抗体 polynucleotide 2K posttranslational processing 翻译 后 加 工 polymerase chain reaction, PCR 34 fi ## 反应 partial digestion 局 部 酶 切 消化 .phage M13 M13 WR TK particle bombardment #MALF RIE promoter 启动 子 physical map ”物理 图 谱 promoter for repressor establishment fH fi! 物 启 动 子 PRE polylinker 多 聚 连接 子 polymerase chain reaction, PCR ”聚合 酶 链 反应 primer dimer 引物 二 聚 体 或 引物 二 倍 体 primer walking 引物 延伸 法 pairwise average-linkage cluster analysis fd 对 平均 连锁 聚 类 分 析 piezoelectric printing He HF] ENE phage antibody library Me Fe AR Ht A JE phage 入 A We FATA phagemid We FA AL plaque lift PA BEEN wh phage display "at FA (A eT PL HK photomultiplier tube, PMT 光电 倍增 管 pharmacogenomics 药物 基因 组 学 positive and negative selection, PNS iE 筛选 法 quantitative PCR PCR 定量 reshaped antibody, RAb 改 型 抗体 restrictive enzyme fragment long polymor- 附 m) - 3185 phogenesis ,RFLP 限制 性 酶 片段 长 度 多 renature 42 VE repetitive sequence 重复 序列 RNA splicing RNA 剪接 recombinant DNA 重组 DNA restriction endonuclease, RE 限制 性 核酸 内 切 酶 relaxed plasmid 松弛 型 质粒 Ratio 分 析 reportor gene “报告 基因 restriction endonuclease igestion and sub- cloning 限制 性 酶 切 - 亚 克 隆 法 reverse transcriptase 反 转 录 酶 Ratio analysis revert transcript polymerase chain reaction ; RT-PCR J2#@ 3% PCR restriction enzyme, RE Pe dil HEAD Bt recombinant antigen vaccine 重组 抗原 疫苗 recombinant 重组 体 restriction map “限制 性 酶 图 谱 rous sarcoma virus, RSV 肉瘤 病毒 real-time quantitative PCR “实时 荧光 定量 PCR RNase RNA 酶 recombinant PCR,RP-CR 重组 PCR RNA ploymerase, RNA pol RNA #4 ii Rnase mapping RNase 作 图 法 repertoire antibody 抗体 库 restriction fragment length polymorphisms, RFLPs 限制 性 片段 长 度 多 态 性 RNA interference, RNAi RNA 干预 技术 short tandem repeats, STRs 短 串 联 重复 序 列 single chain of Fv, ScFv 单 链 抗体 somatic cells {4H Ad silencer 沉寂 子 splicing BY) sceening Wifi -314- 基因 工程 学 single nucleotide polymorphisms, SNP 单 BH RE SHE star activity 星 号 活性 stringent plasmid 严 紧 型 质粒 单 拷贝 序列 穿梭 质粒 single strand conformation polymorphism single copy sequences shuttle vector analysis of polymerase chain reaction prod- ucts, PCR-SSCP ”聚合 酶 链 反 应 — FA EE HY Southern blot Southern 印迹 shotgun sequencing “ 乌 枪 法 sequencing by hybridization, SBH 杂交 测 序 scanning tunneling microscopy,STM 扫描 sequencing by hybridization, SBH 7% 2 iil 序 Saccharomvces cerevisiae “酿酒 酵母 self organizing maps 9 AAA splicing 拼接 S,-mapping RBS, 作 图 法 subtracted library 扣除 文库 小 卫星 DNA synonymous cSNP_ 同 义 cSNP serological analysis of recombinant cDNA ex- pression libraries, SEREX 重组 cDNA 表 达 文 库 的 血清 学 分 析 法 simian vacuolating virus40, SV40 Rie 2 泡 病毒 semi-conservative replication 断裂 基因 结构 基因 supercoil, SC 超 螺旋 Sha. telomere 4 AZ small-satellites 半 保 留 复 制 split gene Structural gene telomerase 解 链 温度 temperature melting, T,, transformation 转化 transgenic animal 转基因 动物 template strand (antisense strand) 模板 链 ( 反 义 链 ) | Taq DNA 聚合 酶 terminal deoxynucleotidyl transferase “末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 Taq DNA polymerase terminal transferase 末端 转移 酶 transcription vector 转录 载体 transcription in early stage ”早期 转录 transcription in delayed early stage 迟早 期 转录 transcription in late stage 晚期 转录 transformation 转化 transfection 44% terminator 终止 子 thrombin € If trans-acting factor 反 式 作用 元 件 thymidine a # terminal repeat 末端 重复 区 transfer vector ”转移 载体 transfer vector plasmid 转移 载体 质粒 tetramethylrhodamine 四 甲 基 若 丹 明 trans-acting factor 反 式 作用 因子 transition 转换 transversion 颠 换 upstream promoter elements 上游 启动 子 元 件 unique sequence ”单一 序列 unsupervised Clustering 非 监 督 聚 类 法 variable number tandem repeats，VNTRs 可 变数 目 串联 重复 序列 vector 载体 western blot 免疫 印迹 yeast plasmid ”酵母 质粒 yeast inregrating plasmid，YIp 酵母 整合 yeast replicating plasmid, YRp 酵母 复制 型 质粒 附 R + 315° yeast episomal plasmid, YEp 酵母 附加 子 yeast artifical chromosome, YAC 酵母 人 型 载体 工 染 色 体 (38 春 ) 附录 人 和 常用 专业 名 词 与 解释 (英文 ) Adaptor A synthetic, double-stranded oligonucleotide used to attach sticky ends to a blunt- ended molecule. Adenovirus An animal virus, derivatives of which have been used to clone genes in mammalian cells. Affinity chromatography A chromatography method that makes use of a ligand that binds a specific protein and which can therefore be used to aid purification of that protein. Agrobacterium tumefaciens The soil bacterium which, when containing the Ti plasmid, is able to form crown galls on a number of dicotyledonous plant species. Ancient DNA Preserved DNA from an archaeological or fossil specimen. Annealing Attachment of an oligonucleotide to a single-stranded DNA molecule by hybridiza- tion. Antisense RNA An RNA molecule that is the reverse complement of a naturally occurring mRNA, and which can be used to prevent translation of that mRNA in a transformed cell. Antisense technology The use in genetic engineering of a gene coding for an antisense RNA. Autoradiography A method of detecing radioactively labelled molecules through exposure of an X-ray-sensitive photographic film. Auxotroph A mutant microorganism that grows only when supplied with a nutriend not re- quired by the wild-type. Avidin A protein that has a high affinity for biotin and is used in a detection system for bi- otinylated probes. Bacterial artificial chromosome (BAC) A cloning vector based on the F plasmid, used for cloning relatively large fragments of DNA in E. coli. Bacteriophage or phage A virus whose host is a bacterium. Bacteriophage DNA molecules are often used as cloning vectors. Baculovirus A virus that has been used as a cloning vector for the production of recombinant protein in insect cells. Batch culture Growth of bacteria in a fixed volume of liquid medium in a closed vessel, with no additions or removals made during the period of incubation. Bioinformatics The use of computer methods in studies of genomes. Biolistics A means of introducing DNA into cells that involves bombardment with high veloci- ty microprojectiles coated with DNA. Biological containment One of the precautionary measures taken to prevent the replication of 316 . 基因 工程 学 recombinant DNA molecules in microorganisms in the natural environment. Biological contain- ment involves the use of vectors and host organisms that have been modified so that they will not survive outside of the laboratory. Biotechnology The use of biological processes in industry and technology. Biotin A molecule that can be incorporate into dUTP and used as a non-radioactive label for a DNA probe. BLAST An algorithm frequently used in homology searching. Blunt end or flush end An end of a DNA molecule at which both strands terminate at the same nucleotide position with no single-stranded extension. Broad host range plasmid A plasmid that can replicate in a variety of host species. Broth culture Growth of microorganisms in a liquid medium. Buoyant density The density possessed by a molecule or particle when suspended in an aque- ous salt or sugar solution. Candidate gene A gene, identified by positional cloning, that might be a disease-causing gene. Capsid The protein coat that encloses the DNA or RNA molecule of a bacteriophage or virus. Cassette A DNA sequence consisting of promoter-ribosome binding site-unique restriction site- terminator (or for a eukaryotic host, promoter-unique restriction site-polyadenylation sequence) carried by certain types of expression vector. A foreign gene inserted into the unique restriction site is placed under control of the expression signals. Cauliflower mosaic virus (CaMV) _ The best studied of the caulimoviruses, used in the past as a cloning vector for some species of higher plant. Cauliflower mosaic virus is the source of strong promoters used in other types of plant cloning vector. Caulimoviruses One of the two groups of DNA viruses to infect plants,the members of which have potential as cloning vectors for some species of higher plant. Cell extract A preparation consisting of a large number of broken cells and their released con- tents. Cell-free translation system A cell extract containing all the components required for protein synthesis (i. e. ribosomal subunits, tRNAs, amino acids, enzymes and cofactors) and able to translate added mRNA molecules. Chimera (@ A recombinant DNA molecule made up of DNA fragments from more than one organism ,named after the mythological beast. @ The initial product of cloning using embryon- ic stem cells:an animal made up of a mixture of cells with different genotypes. Chromosome One of the DNA-protein structures that contains part of the nuclear genome of a eukaryote. Less accurately,the DNA molecule(s) that contains a prokaryotic genome. Chromosome walking A technique that can be used to construct a clone contig by identifying overlapping fragments of cloned DNA. Cleared lysate A cell extract that has been centrifuged to remove cell debris, subcellular parti- cles and possibly chromosomal DNA. 附 R + 317° Clone A population of identical cells, generally those containing identical recombinant DNA molecules. Clone contig approach A genome sequencing strategy in which the molecules to be sequenced are broken into manageable segments, each a few hundred kilobases or a few megabases in length, which are sequenced individually. Clone fingerprinting Any one of a variety of techniques that compares cloned DNA fragments in order to identify ones that overlap. Codon bias The fact that not all codons are used equally frequently in the genes of particular organism. Combinatorial screening A technique that reduces the number of PCRs or other analyses that must be performed by combining samples in an ordered fashion, so that a sample giving a partic- ular result can be identified even though that sample is not individually examined. Compatibility The ability of two different types of plasmid to coexist in the same cell. Competent A culture of bacteria that has been treated to enhance their ability to take up DNA molecules. Complementary Two polynucleotides that can base pair to form a double-stranded molecule. Complementary DNA (cDNA) cloning A cloning technique involving conversion of purified mRNA to DNA before insertion into a vector. Conformation The spatial organization of a molecule. linear and circular are two possible con- formations of a polynucleotide. Conjugation Physical contact between two bacteria, usually associated with transfer of DNA from one cell to the other. Consensus sequence A nucleotide sequence used to describe a large number of related though non-identical sequences. Each position of the consensus sequence represents the nucleotide most often found at that position in the real sequences. Contig A contiguous segment of DNA sequence obtained as part of a genome sequencing pro- ject. Continuous culture The culture of microorganisms in liquid medium under controlled condi- tions, with additions to and removals from the medium over a lengthy period of time. Contour clamped homogeneous electric fields(CHEF) An electrophoresis technique for the separation of large DNA molecules. Copy number The number of molecules of a plasmid contained in a single cell. Cosmid A cloning vector consisting of the A cos site inserted into a plasmid, used to clone DNA fragments up to 40kb in size. cos site One of the cohesive, single-stranded extensions present at the ends of the DNA molecules of certain strains of A phage. Covalently ‘closed-circular DNA (cccDNA) A completely double-stranded circular DNA molecule, with no nicks or discontinuities, usually with a supercoiled conformation. -318- 基因 工程 学 CpG island A GC-rich DNA region located upstream of approximately 56% of the genes in the human genome. Denfined medium A bacterial growth medium in which all the components are known. Deletion analysis The identification of control sequences for a gene by determining the effects on gene expression of specific deletions in the upstream region. Denaturation Of nucleic acid molecules: breakdown by chemical or physical means of the hy- drogen bonds involved in base pairing. Density gradient centrifugation Separation of molecules and particles on the basis of buoyant density, by centrifugation in a concentrated sucrose or caesium chloride solution. Deoxyribonuclease An enzyme that degrades DNA. Dideoxynucleotide A modified nucleotide that lacks the 3’ hydroxyl group and so prevents fur- ther chain elongation when incorporated into a growing polynucleotide. Direct gene transfer A cloning process that involves transfer of a gene into a chromosome without the use of a cloning vector able to replicate in the host organism. Disarmed plasmid A Ti plasmid that has had some or all of the T-DNA genes removed, so it is no longer able to promote cancerous growth of plant cells. DNA chip A wafer of silicon carrying a high density array of oligonucleotides used in tran- scriptome and other studies. DNA marker A DNA sequence that exists as two or more alleles and which can therefore be used in genetic mapping. DNA polymerase An enzyme that synthesizes DNA on a DNA or RNA template. DNA profiling A PCR technique that determines the alleles present at different STR loci within a genome in order to use DNA information to identify individuals. DNA sequencing Determination of the order of nucleotides in a DNA molecule. Double digestion Cleavage of a DNA molecule with two different restriction endonucleases, ei- ther concurrently or consecutively. Electrophoresis Separation of molecules on the basis of their charge-to-mass ratio. Electroporation A method for increasing DNA uptake by protoplasts through prior exposure to a high voltage, which results in the temporary formation of small pores in the cell membrane. Embryonic stem (ES) cell A totipotent cell from the embryo of a mouse or other organism, used in construction of a transgenic animal such as a knockout mouse. End filling Conversion of a sticky end to a blunt end by enzymatic synthesis of the comple- ment to the single-stranded extension. Endonuclease An enzyme that breaks phosphodiester bonds within a nucleic acid molecule. Episome A plasmid capable of integration into the host cell’s chromosome. Ethanol precipitation Precipitation of nucleic acid molecules by ethanol plus salt, used primar- ily as a means of concentrating DNA. Ethidium bromide A fluorescent chemical that intercalates between base pair in a double- 附 x + 319- stranded DNA molecule, used in the detection of DNA. Exonuclease An enzyme that sequentially removes nucleotide from the ends of a nucleic acid molecule. Expressed sequence tag (EST) A partial or complete cDNA sequence. Expression vector A cloning vector designed so that a foreign gene inserted into the vector is expressed in the host organism. Fermenter A vessel used for the large scale culture of microorganisms. Field inversion gel electrophoresis (FIGE) An electrophoresis technique for the separation of large DNA molecules. Fluorescence in situ hybridization (FISH) A hybridization technique that uses fluorochromes of different colours to enable two or more genes to be located within a chromosome preparation in a single im situ experiment. Footprinting The identification of a protein binding site on a DNA molecule by determining which phosphodiester bonds are protected from cleavage by DNase I. Functional genomics Studies aimed at identifying all the genes in a genome and determining their functions. Gel electrophoresis Electrophoresis performed in a gel matrix so that molecules of similar elec- tric charge can be separated on the basis of size. Gel retardation A technique that identifies a DNA fragment that has a bound protein by virtue of its decreased mobility during gel electrophoresis. Geminivirus One of the two groups of DNA viruses that infect plants, the members of which have potential as cloning vectors for some species of higher plants. Gene A segment of DNA that codes for an RNA and/or polypeptide molecule. Gene addition A genetic engineering strategy that involves the introduction of a new gene or group of genes into an organism. Gene cloning Insertion of a fragment of DNA, carrying a gene, into a cloning vector,and sub- sequent propagation of the recombinant DNA molecule in a host organism. Also used to describe those technique that achieve the same result without the use of a cloning vector(e. g. direct gene transfer). Gene knockout A technique that results in inactivation of a gene,as a means of determining the function of that gene. Gene mapping Determination of the relative positions of different genes on a DNA molecule. Gene subtraction A genetic engineering strategy that involves the inactivation of one or more of an organism’s genes. Gene therapy A clinical procedure in which a gene or other DNA sequence is used to treat a disease. Genetic engineering The use of experimental techniques to produce DNA molecules containing new genes or new combinations of genes. ” 320: 基因 工程 学 Genetic fingerprinting A hybridization technique that determines the genomic distribution of a hypervariable dispersed repetitive sequence and results in a banding pattern that is specific for each individual. Genetic map A genome map that has been obtained by analysing the results of genetic crosses. Genetics The branch of biology devoted to the study of genes. Genome The complete set of genes of an organism. Genomic library A collection of clones sufficient in number to include all the genes of a partic- ular organism. Genomics The study of a genome, in particular the complete sequencing of a genome. GM (genetically modified) crop 5. Kaneta Y, Kagami Y, Tsunoda T, Ohno R, Nakamura Y, Katagiri T. 2003. Genome-wide analysis of gene-expression profiles in chronic myeloid leukaemia cells using a cDNA mi- croarray. Int J Oncol,23(3) :681—691 6. R. Wold, S.B Primrose. 2001. Principles of Gene: Manipulation. 6th ed. Oxford: Blackwell Synergy Ltd 7. Wang DN,Liu SY, Trummer BJ et al. 2002. Carbohydrate microarrays for the detection of recognization of cross-reactive molecular markers of microbes and host cells. Nature Biotech- nology ,20:275—281 8. BP. 2001. HAA ae —— AEA AA Tt) Ae 2 A BE HL 9. 卢 圣 栋 .1999. 现 代 分 子 生 物 学 实验 技术 .第 2 版. 北京: 中国 协和 医科 大 学 出 版 社 10. RII KE. 2001. HEAT IRB. 2 版 .北京 :科学 出 版 社 书 价 23.22 单据 号 5V202( | or OT (R-1322.0101) 1 va i ISBN 7-03-013199-1 At Bok wm gh ESM ng E-mail: med_sp@sohu.com | | | | ISBN 7-03-013199-1 <= tH: 32.00 = 87030°13199