生物 化 学 实验 技术 从 书 Faas 学分 析 技 术 ‘ 同心 ) hes ; wee we f | 生物 化 学 实验 技术 丛书 离心 沉降 分 析 技 术 本 党 TAO AS hie ya x 7 fe > . -= 4 F AS RES Bh ISSN fy > 本 用 b [ “ a, ' he Pee ff ee A Sr ee AS witli 44+ 2x B® 去 加 9 8.3% 1 天 f° 234934 A fF fi tt 全息 离心 [ 降 分 析 是 一 门 测定 生物 高 分 子 分 子 最 和 其 值 物理 HY ae SURAT AUIS IED Me, A EMT a 只 作 简略 的 说 明 。 RAGS TURE TRIN MA A A Selig dapetanlemp named. i wy rcchebalaaies Solin Se'Gipipiplals sis) ‘ WRG T Hi AR BOR AOE BIT tk, PLB PEA PRO, Ba « BANTER ET He 本 书 可 供 生物 化 学 、 生物 物理 工作 者 以 及 有 关 大 学 的 教师 本 和 ,大 | FES , ttt iy - cai Bt al 8 ey! ete ~ i sei 生物 化 学 实验 技术 从 书 igh 离心 沉降 分 析 技 术 oth, ae RE 编著 由 责任 编辑 Raw ee mn ne By 北京 朝阳 门 内 大 街 37 号 ， ¥FQaE Ke aly EDR 新 华 书 店 北 京 发 行 所 发 行 各 地 新 华 书店 经 售 1983 年 10 月 第 一 版 开本 : 787x1092 1/16 1983 年 10 月 第 一 次 印刷 印张 :6 1/4 E53 50 SF: Hi,000 $9 . Sago 书号 ?13031 ie L x ; 本 村 书号 : 3272 + 13—10 SBS pide 定价 :ou 元 OPP eee eee eee Pee eee ee ee eee ee eee PE reeset eee eee eee eet eee eee ante ea eee nena cares seeeeaeneresuneteanes 1 第 二 章 超 离 心 分 析 技 术 概 述 … 和 pp 2 第 三 章 ”仪器 .pp 7 分 析 超 高 心机 ae 7 三 、 分 析 转 并. 7 FV FBT BED secre ece cee eee cee cence scence reeceneeerenracsenseesasserseeceesassessansensessannes 8 四 、 光 学 检测 方法 pe 1l 第 四 章 ”实验 的 一 般 考虑 和 注意 .pp 16 至 、 样 品 制备 16 二 、 离 心机 的 使 用 及 转 头 、 离 心 池 的 选择 .pp 16 Be EAE BE WERE - +++ ee 17 DO, CBE EROS By -eo-eecceeceresccnecccenrceeseccecceeeceuseesescseesersereneseceeseeenesesens 18 Fry 离心 分 析 实 验 应 考虑 的 现象 尼 pee 23 第 五 章 ”沉降 速度 的 测定 .pe 28 三 、 移 动 界面 法 测定 沉降 系数 .peeeeoeoeeee eee 28 二 、 特 殊 情 况 沉 降 系数 的 测定 pp 34 =, 样品 均一 性 的 鉴定 和 不 均一 性 的 分 析 oooooooovoovosoooooooovoooooeooooooioioooosoeoooo。 36 DO, 区 带 沉 降 法 .ee 38 Fix WUE FRAG) FF Bh nee o eect enecce cen eneccsesecnesccenscetecaenscsecetresccesasceuvessescerees 39 六 、 从 沉降 系数 计算 DNA 4) corre tect eee e eee e etree eee ten tee eee eee eeteeneee tetera seats 39 第 六 章 ”沉降 -扩散 法 测定 分 子 量 pp 5 Litas 过、 沉降 -扩散 法 原理 pp 43 BME PA PTE WAGE Sh” BL FDL 00 soe c ones cascade coe pseu dba asVecceceacatecescseaes ee 44 第 七 章 ”沉降 平衡 法 pp 47 一 、 低 速 沉 降 平 衡 法 测定 分 子 量 和 ppp 47 A BER TUE GEE HUGE AYE Bh oo eee cee cence ccc eecreeccnccecsneecenscneserescaeseereeren ces 59 Hy FRE ESE GRRE (i PE) GES FB nee ee cee eee c ce eeececeetetceneceeeneeenenees 66 四 、 有 关 用 特殊 溶剂 做 的 实验 .pe 68. 第 八 章 Archibald 方法 pe 69 SFL BE BEE RR ES SEI Bh ee nee nee ee eee cece ee ewe ceec en ccecserenecercnseeseeteeensecnces 72 第 十 章 “离心 分 析 技 术 必 须 的 辅助 测定 .pp 79 一 、 密 度 .ev 79 二 、 和 粘度 .pe 81 三 、 偏 徽 比 容 ，eeeoeeeeee9e 82 if 3 附录 制备 超 离心 技术 Nak aed s0GheGAwhcae ccc an cences cedsduceccanenes abenn vies cup cee oeaine kei ann 86 一 、 分 级 离心 法 .ee99eoeee 86 本 Md J w= 7 ee x @zRe x rxs tetas ae Dll 第 一 章 引 _1924 年 Svedberg 和 Rinde 首先 设计 制造 了 超 ( 速 ) 离 心机 ,实现 了 在 强大 离心 力作 用 下 沉降 微小 颗粒 。 他 们 开始 设计 的 目的 是 研究 金属 胶体 粒子 ， 但 是 很 快 发 现 这 是 研究 高 分 子 化 合 物 的 重要 工具 。 用 超 离 心机 研究 的 第 一 个 高 分 子 化 合 物 是 蛋白 质 。 1926 年 Svedberg 和 Fahraus 测定 了 马 血 红 蛋 白 的 分 子 量 ， 为 68,000。 以 后 不 断 地 对 各 种 蛋 香 质 进行 分 子 量 测定 ,结果 得 到 重复 的 高 分 子 量 , 因 此 证 实 了 和 蛋白质 确实 是 一 个 真正 的 高 分 子 化 合 物 ,而 不 是 一 些 低 分 子 单元 的 任意 排列 或 聚合 以 后 超 离心 机 有 了 改进 ， 特别 是 五 十 年 代 市 上 出 售 的 商品 超 离 让 机 性 能 有 了 很 大 提 高 ,与 此 同时 发 展 了 各 种 超 离心 分 析 技术 。 现 在 超 离心 机 玫 了 乎 已 成 为 实验 室 ， 克基 是 蛋白 质 研究 实验 室 不 可 缺少 的 重要 工具 。 ，” 超 离 心 沉降 分 析 作为 一 种 研究 手段 , 它 具 有 许多 优点 。 例 如 可 在 低温 下 进行 测定 ;并 且 相 当 快 速 ， 这 就 比较 适宜 研究 娇嫩 的 和 不 稳定 产物 的 纯度 和 均匀 度 。 另 一 优点 是 样品 需要 量 很 少 。 离 心地 的 容量 不 到 一 毫升 ,还 可 采用 浓度 较 稀 的 样品 ,从 而 避免 了 对 溢 液 的 非 理想 性 作 校 正 ， 用 折射 率 方法 检测 时 约 需 一 一 毫克 样品 ,而 用 光 吸 收 法 检测 时 ， 消光 系数 天 的 样品 检测 极限 在 微克 水 平 。 ， 从 超 离 心 沉 降 实验 结果 很 容易 计算 沉降 系数 S、 分 子 量 MP RRR 六 和 沉降 几 质 的 波 度 .同时 也 可 观察 到 溶液 中 是 否 存在 几 种 不 同 的 组 分 :还 可 以 研究 沉降 物质 的 不 均一 性 ; 。 息 离 心 沉降 分 析 最 重要 的 应 用 当然 是 分 子 量 测定 。 值 得 指出 的 是 ， 现 在 超 离心 沉降 分 析 测 定 的 分 子 量 范 围 已 从 数 百 直 至 几 百 万 ， 仅 有 百 分 之 几 的 误差 。 研 究 多 组 分 体系 或 不 均一 物质 时 , 视 样品 的 性 质 可 以 有 相当 高 的 精确 度 。 对 一 个 典型 蛋白 质 来 讲 , 如 果 含 有 百 分 之 几 杂质 并 且 杂 质 的 大 小 相当 于 该 蛋白 质 分 子 大 小 的 一 半 左右 ， 则 一 般 要 检 出 这 个 杂质 是 不 困难 的 。 由 于 存在 Johnston-Ogston 效应 , 检 出 和 蛋白 质 相对 来 讲 分 子 量 较 小 的 杂质 是 容易 的 。 对 于 分 子 量 广泛 分 布 的 样品 ,虽然 结果 处 理 有 些 困 难 , 但 是 把 沉降 曲线 经 过 一 系列 数学 分 析 ,得 到 相当 满意 的 关于 非 均一 度 的 信息 喇 “ 现在 超 离心 分 析 技 术 已 能 够 测定 样品 之 间 非 常 小 的 密度 差 和 沉降 系数 差 (0.005$)。 和 已 知 的 典型 流体 力学 模型 一 如 栅 球 等 的 相应 有 关 数 据 比 较 ，S、M DHEA 以 提供 样品 分 子 大 小 和 形状 的 信息 。 通 常 所 得 结果 是 半 定 量 的 ， 并 且 需 要 知道 不 同 模型 的 大 量 参数 才能 区 别 。 为 此 ,应 该 和 其 他 由 分 子 形状 决定 的 物理 量 , 如 粘度 、 光 散射 、 流 动 双 折 射 等 进行 比较 。 通 过 这 种 方法 可 以 发 现 非 常 水 的 流体 力学 行为 上 的 差别 。 不 过 和 不 同 的 分 子 形状 联系 常常 是 很 困难 的 。 沉降 平衡 离心 可 以 得 到 热力 学 数据 ,因此 ,这 个 方法 也 是 详细 研究 高 分 子 溶液 性 质 的 一 个 有 力 工 具 。 在 这 里 要 全 面 概括 目前 超 离心 技术 所 能 解决 的 问题 显然 是 不 现实 的 。 早 期 超 离 心 沉 降 分 析 所 做 的 工作 (1940 年 以 前 ) Svedberg 和 Pederson 已 作 了 全 面 总 结 。 在 此 以 后 也 曾 有 过 很 好 的 综述 和 评论 ca。 本 书 仅 就 超 离心 技术 最 基本 的 实验 方法 作 一 介绍 , 读者 如 需 进 一 步 了 解 超 离 心 沉降 分 析 技术 ,请 参阅 有 关 著 作 。 第 二 章 ” 超 离心 分 析 技 术 概述 当 一 个 悬 间 液 放 置 时 ,由 于 重力 场 的 作用 ,可 以 看 到 悬浮 的 粒子 逐渐 沉降 。 从 沉降 的 速度 可 以 计算 悬浮 粒子 的 质量 。 高 分 子 溶液 里 的 分 散 质 点 (高 分 子 ) 的 质量 很 小 , 所 以 要 用 超 离 心机 ， STEAAUN ANRET RR ATEN ROL. FYE ® 1000 KUL ,产生 几 十 万 倍 于 重力 的 离心 力 。 ee 在 分 析 超 离心 机 中 进行 沉降 分 析 , 利 用 超 离心 机 高 速 运转 产生 的 强大 离心 力 * 用 光学 检测 装置 检测 溶液 中 溶质 的 移动 速度 ;或 者 在 较 低 转 速 使 高 分 子 溶质 在 较 小 离心 力 场 内 沉降 (产生 浓度 梯度 ) 和 扩散 ( 减 小 浓度 梯度 ), 这 两 种 相反 的 作用 经 过 一 段 时 间 达 到 平衡 ， 测量 溶质 在 离心 池 中 的 分 布 。 在 超 离心 沉降 分 析 技术 中 ,前 者 称 为 沉降 速率 法 ;后 者 称 为 沉降 平衡 法 。 | 分 析 超 离心 机 的 标准 离心 池 如 图 2-1, ECR HA cco SB 形 。 离 心 池 放 大 分 析 转 头 (图 2-2) HUFL ARORA HY a ee Hd FT HE Ge 转 时 离心 池内 溶液 对 流 。 离 心 池上 下 分 别 安装 一 块 石英 窗 (图 2-1W), 允许 光线 通过 ; 运 转 过 程 中 可 以 利用 光学 方法 检测 。 转 头 旋转 产生 离心 力 ， 样 品 溶液 中 溶质 比重 大 于 溶剂 时 ,溶质 从 流 面 沿 着 旋转 半径 向 转 头 边缘 沉降 下 去 。 反 之 若 溶 质 轻 于 溶剂 , 则 出 现 溶质 “上 浮 " 现 象 。 离 心 池内 溶液 槽 扇形 狭 的 一 边 叫 池 项 , 另 一 边 叫 池 底 。 转 头 上 上 距 旋转 轴 的 距 离 以 > 表示 , 液 面 的 位 置 是 rw， 液 底 的 位 置 是 rso , 因此 溶液 的 液 柱 高 上 一 一 rwe 离 心 池 的 厚度 世 是 指 离心 池 溶液 槽 楼 柱 的 高 度 , 也 就 是 两 片 石英 窗 之 间 的 距离 。,， 超 离 心 沉降 分 析 的 分 辩 能 力 正比 于 液 柱 高 度 4 和 离心 力 or ， 其 中 心 是 角速度 。 从 图 2-1: 分 析 离 心地 。 COMB; BHI; “W 一 石英 窗 ; S 一 池 世 * 中 有 一 四 棱柱 液 机 2-2 分 析 转 头 实验 和 理论 的 角度 来 考虑 ,r 约 为 7em 和 公约 为 2ctm 最 为 合适 P。 离心 过 程 中 离心 池内 样品 溶液 浓度 《<) 的 变化 用 光学 方法 限 距 ， 或 者 测定 深 液 的 折 射 率 (z); 或 者 测定 溶液 的 光 吸 收 值 。 用 ,Sehlieren 光学 方法 得 到 的 是 折射 率 梯 度 (dn /dr) WHER DPBS Cr) 的 曲线 (图 2-3B)。 王 和 涉 光 方法 得 到 的 是 折射 率 (>) 作为 距 轴 心 距离 (7 的 函数 (图 2-3A)。 在 通常 实验 样品 浓度 范围 内 折射 率 和 浓度 成 正比 ， 因 此 得 到 的 曲线 图 分 别 对 应 于 dc/d 和 Ar 或 <、， 其 中 < 是 浓度 用 光 吸 收 法 检测 时 , 光 密 度 和 浓度 成 正比 ,得 到 的 是 cr》 类 型 的 曲线 (图 2-3A)。 目前 使 用 的 分 析 超 离心 机 几乎 都 是 现成 定 型 的 产品 ,比较 容易 操纵 ,相对 来 讲 运转 费用 也 比较 低 。 一 沉降 速率 法 实验 时 ， 超 离心 机 内 转 头 以 高 “， 速 运转 ， 如 果 溶 液 中 只 有 一 种 溶质 组 分 在 离心 力作 用 下 沉降 7 可 以 观察 到 原先 在 离心 池 中 均 ， 匀 分 布 的 溶质 分 子 以 一 定 速度 向 转 头 边缘 移 去 ， 经 过 一 定时 间 离 心 池 中 形成 一 个 纯 溶 剂 的 “ 区 域 和 一 个 浓度 均一 的 区 域 (图 2-3A)c 这 个 浓度 均一 区 域 称 为 坪 区 。 坪 区 和 溶剂 区 之 闻 出 现 一 个 界面 ,通常 界面 是 很 陡峭 的 ,这 是 因为 界 面 后 半 部 由 扩散 而 尾随 的 溶质 分 子 是 在 较 低 的 浓度 中 沉降 ;具有 较 高 的 沉降 速度 ,从 而 赶 上 前 面 的 分 子 s: 坪 区 浓度 随 界 面 外 移 而 连续 地 逐步 距 液 面 距离 (cm) 起 始 浓度 (%) 浓度 撞 度 - 距 轴 心 距离 (cm) -图 2-3 沉降 速率 法 实验 时 ?浓度 (A) 和 浓度 樟 BE (B) 与 离心 池 距 离 的 函数 关系 示意 图 。 变 黎 ,这 是 因为 离心 池 中 溶液 槽 的 端面 是 扇形 ， 溶 液 不 断 稀释 ,浓度 减 小。 从 界面 移动 速 度 可 以 计算 沉降 系数 。 沉 降 系 数 和 沉降 粒子 的 大 小 和 形状 有 关 。 沉降 系数 结合 另外 一 些 独立 测定 的 数据 可 以 计算 沉降 分 子 的 分 子 量 。 图 2-3 是 沉降 速率 法 示意 图 ,图 2-3A 有 是 不 有 同时 间 ¢ 对 > 作 图 ,图 2-3B 是 不 同时 间 dc/dr 对 ~ 作 图 。 至 于 那些 比重 较 溶 剂 小 的 溶质 分 子 , 如 浓 盐 溶液 中 的 脂 蛋 白 ,离心 过 程 中 溶质 不 是 下 沉 而 是 上 浮 。 经 过 一 段 时 间 ， 离 心 池 底 部 形成 一 纯 溶 剂 区 ， 这 时 沉降 系数 是 负 值 。 浓 度 梯 度 ( 也 即 折射 率 梯 度 》 on 跨越 界面 时 也 是 负 值 ,沉降 图 谱 上 峰 形 是 倒 的 。 Bik qa) 离心 力 场 如 果 溶 液 中 存在 两 种 沉降 分 子 ， 它 们 的 沉降 系数 不 同 ， 则 会 形成 两 个 界面 。 其 一 位 于 溶剂 和 较 慢 移动 组 分 间 ， 另 一 位 于 较 慢 组 分 和 溶液 (含有 两 种 组 分 ) 间 。 结 果 得 到 如 图 2-4 的 图 形 , 有 两 个 峰 和 两 个 阶梯 。 一 个 待 分 析 系统 如 含有 多 个 可 沉降 组 分 , 依 此 类 推 , 每 一 新 组 分 产生 (GC) ”一 个 界面 ， 从 这 些 界面 移动 的 速度 分 别 计算 各 个 组 分 的 沉降 系数 。 如 果 系 统 中 包含 有 一 大 批 不 同 的 分 子 ， 它 科 不 同 的 沉降 系数 在 界面 上 形成 连续 的 分 布 ; 可 以 计算 沉降 系数 co) 。 的 分 布 函数 ,当然 也 可 以 计算 分 子 量 的 分 布 函数 5 FE J\ 八 溶液 在 相对 较 低 转速 时 离心 沉降 【 警 吉 说 分 子 量 为 | 60,000 HE AMZ 8,000rpm (44/5) Ba), 这 时 的 情况 | 和 上 述 沉 降 速率 法 很 不 一 样 。 离 心 开始 阶段 液 面 处 浓度 7 下 降 ,离心 池 底 部 浓度 增高 。 由 于 扩散 作用 ; 离 忌 池内 不 像 沉 降 速 率 法 会 形成 一 个 无 溶质 区 ,相反 液 面 处 始终 存在 溶质 ,即使 浓度 是 很 低 的 5 离心 池 中 间 有 一 浓度 不 变 的 区 域 , 叫做 坪 区 (图 2-5)。 je 随 着 实验 的 进行 ,这 个 坪 区 消失 ,最 后 沉降 速度 完 ah 全 被 扩散 抵消 两 者 达成 平衡 ， 离 心 池 中 没有 一 处 WE 有 物质 的 纯 转 移 ， 浓 度 不 再 随时 间 而 变化 。 沉降 平衡 实验 在 还 没有 建立 平衡 以 前 ， 不 同时 间 的 距 轴 心 距离 和 浓度 的 变化 见 图 2-6A， 相 应 的 浓度 梯度 变化 见 图 2-6B8。 实 验 时 每 一 点 的 浓度 利用 ，“ 光学 方法 测定 。 和 沉降 速率 法 不 同 ,测定 离心 池 中 的 浓度 分 布 可 以 直接 计算 沉降 分 子 的 分 子 量 (沉降 速率 法 和 沉降 平衡 法 计算 中 都 需要 知道 沉 BEAL AoA LEA) 除去 这 一 明显 的 优点 外 , 沉 re m4 oat 降 平衡 理论 基础 也 比较 扎实 。 它 的 缺点 是 达到 平 .图 2-5“ 沅 降 平 衡 离心 图 。 Dat 衡 需 要 很 长 时 间 ，, 往往 要 按 天 计 , 许 多 样品 , 例如 在 ?表示 尚未 到 达 平衡 5 蛋白 质 ， 不 能 耐 受 如 此 长 久 的 离心 。 不 过 目前 超 离心 机 已 经 能 够 使 转 头 在 低温 下 长 时 期 运转 ;并且 从 理论 士 证 明 ，, 在 实验 操作 上 了 予以 变通 可 以 大 大 缩短 达到 平衡 所 需 的 时 间 5 ， 另 一 种 不 同 的 方法 , 即 等 密度 梯度 沉降 法 ,是 让 溶质 在 一 密度 梯度 介质 中 沉降 ， 直 至 周围 介质 的 密度 和 溶质 密度 相等 时 为 止 。 从 溶质 停留 在 离心 池 中 的 位 置 来 计算 分 子 量 。 总 之 , 几 种 超 离 心 分 析 技术 的 区 别 主 要 是 从 操作 的 观点 着 眼 , 很 难 铺 楚 地 说 明 它 们 之 间 的 截然 不 同 界限 。 事 实 上 有 可 能 仔细 选择 实验 条 件 ， 从 一 个 实验 的 数据 按照 这 些 技 术 * 4 «@ 不 同 的 要 求 进行 处 理 。 不 同 的 超 离 心 分 析 技术 可 以 进一步 用 热力 学 方程 式 统一 起 来 。 玫 乎 所 有 超 离 心 分 析 技术 实验 的 数学 基础 是 Lamm 导出 的 微分 方程 %。 试 考虑 旋转 的 扇形 离 心 池 中 一 个 装 位 四 棱柱 体积 (图 2-7)， 它 的 两 个 ， 面 分 别 距 轴 心 "和 * + d7s， 一 个 面 上 通过 的 沉 降 粒子 数量 /.(r，, 2) 取决 于 该 面 上 的 溶液 浓度 <、 面积 、 粒 子 沉 降 速度 。 由 于 沉降 速度 可 以 用 单位 离心 力 场 沉降 速度 ( 即 沉降 系数 S) 和 离心 力 or 的 乘积 来 表示 ,因此 ， Jr, 1) = crisis (2-1) * Sith @ EIA ME WIAs 1 是 光 径 ， 即 离心 洱 溶液 槽 楼 柱 的 高 度 ; > 是 距 轴 心 的 距离 ; dr 是 柱 面积 ; 是 离心 池 的 角速度 (弧度 / 秒 )， 5 是 沉降 系数 、 pers (2-2) 其 中 是 时 间 。 沉 降 系数 s 单位 的 因 次 是 em/ 秒 / 达 因 / 亮 ,现在 定 为 Svedberg (S)。18 = 10- 秒 。 由 于 存在 扩散 作用 ， 粒 子 也 有 反 向 流动 。 根 据 Fick 第 一 定律 ， 向 轴 心 运动 的 粒子 数量 Jp(r， 妆 。 起 始 浓度 (95) 浓度 梯度 Jp(Cryi) 一 一 Déorl 86. Or -” 距 被 面 离 距 (cm) 6.4 6.8 距 轴 心 距离 (cm) 226 2-7 其 中 也 是 扩散 系数 ， = 是 距 轴 心 > 处 一 个 面 的 浓度 梯度 。 因此 在 此 > 面 上 沉降 粒子 的 净 转 移 数量 J(r , 1) 为 上 述 两 项 之 和 I(r, n= Irs t) #Jp(r, t) = orl | sor saad oe.) 过 > 十 dr 面 的 粒子 转移 数量 也 可 写成 类 似 的 式 子 。 加 粒子 的 数量 是 [J(Cr,z) 一 Jr 十 dryti)]dzt 一 一 OJ (rs t) Or drdz 7.2 (2-3) (2-4) fedrt WIA, r Mr 十 dr 之 间 增 (2-5) 5 se 这 相等 于 相应 的 浓度 增加 (6c/6i)dz RUKR oridrs Att As = = 2a |(z — csr ) | | ob Gis MDS r EMX O-6) 可 写成 | coils = =D E = = al _ so"|， = 本 2e| hei 必须 强调 式 2-7 LURE DA 8 均 与 浓度 无 关 的 条 统 。 实际 上 许多 系统 并 不 符 从 这 个 息 Ro | Fujita BTS 与 浓度 成 线性 关系 的 系统 作 了 详细 的 讨论 。 ,在 这 里 所 以 要 推导 式 2-7。 因 为 这 是 超 离心 分 析 技术 的 基础 。 例 如 沉降 速率 法 液 面 附近 粒子 浓度 基本 上 等 于 零 , 将 式 (2-7) 解 微分 方程 说 明了 所 形成 界面 的 姓 状 。。 Xe RARER ASPEN Beit 0c/Or = 0,25 一 0， RAK C7), fF | Bed mT 2Swc | co) Di ADP DK Pk BE is Se HE FT TT PE AR OT EE BET 2c /Oz=0 RAK (2- 7) 得 到 Svedberg 方程 式 , 反 应 了 沉降 系数 和 扩散 系数 与 分 子 量 的 关系 。 Bee 8 @ 一 、 分 析 超 离心 机 超 离心 机 和 普通 离心 机 的 差别 是 超 离心 机 的 转速 高 得 多 。 超 离心 机 分 为 分 析 超 离心 机 和 制备 超 离 心机 ,前 者 能 精确 控制 离心 力 , 并 且 用 照相 方法 或 者 电子 技术 记录 沉降 粒子 在 离心 过 程 中 的 行为 。 对 这 些 记录 进行 分 析 可 以 测定 粒子 的 物理 性 质 。 虽然 1924 年 开始 出 现 了 超 离 心 分 析 技术 ,但 是 直到 五 十 年 代 电 动 超 离 心机 成 为 商品 出 售 以 后 , 才 促 使 超 离心 分 析 技术 迅速 发 展 。 有 意思 的 是 ,尽管 分 析 超 离心 机 外 形 、 驱 动 部 件 ,控制 部 件 等 有 所 不 同 ， 但 是 和 离心 分 析 实 验 直 接 有 关 的 部 件 ， 如 转 头 \ 离 心 池 等 的 基 本 设计 更 动 极 少 ,甚至 如 离心 池 中 心 至 轴 心 的 距离 (65.0mmj 也 保持 不 变 。 分 析 超 离心 机 应 该 具有 下 列 功能 : (1) 高 速 旋 转 ; (2) 速度 的 选择 和 控制 ; (3) 温度 的 选择 和 控制 ; (4) 离心 过 程 中 检测 (光学 摄影 或 扫描 )。 现在 世界 上 各 实验 室 装备 的 分 析 超 离心 机 大 多 数 是 美国 Beckman 公司 出 品 的 _Spinco E 型 分 析 超 离心 机 。 它 用 电动 机 经 齿轮 变速 带动 转 关 旋转。 新 的 机 型 最 高 转速 为 80,000 rpm， 但 是 由 于 离心 池上 透 光 材 料 石英 窗 强度 的 限制 ， 实 际 上 只 用 到 60,000rpm (HAR 离心 池 为 68,000rpm); 平均 转速 恒定 在 40.15% 以 内 。 温度 维持 在 +0.1°C 内 ,读数 精 确 至 002*%C。 机 内 装 有 光学 系统 和 自动 摄影 ;摄影 间隔 自 2 分 至 12 小 时 48 分 。 分 白 昌 离心 机 的 结构 和 操作 具体 部 分 因 机 而 异 ,请 参阅 有 关 仪器 的 说 明 书 。 =. BH RK 分 析 超 离心 机 的 分 析 转 头 如 图 3-1 RAR ESAT PP AOE 5 EARS PaO 定 因素 之 一 5 现在 主要 用 钻 合金 或 钛 合金 来 制造 转 头 。 分 析 转 头 有 双 孔 、 四 孔 、 六 筷 之 分 ;分 别 可 放大 相应 数量 的 离 记 池 。 最 高 转速 较 高 的 转 头 外 形 鱼 成 卵 形 ,以 免 应 力 集 中 于 图 3-1 分 析 转 头 % 3-1 Beckman Spinco E 型 分 析 超 离心 机 中 使 用 的 各 种 分 析 转 头 的 特性 离心 池 中 心 最 高 转速 ‘Ff, | 同时 可 放 离 (rpm) sie ae 力 心 池 数量 主 EAS 60,000 261,000 2 基本 转 头 沉降 速率 法 ， 68,000 336,000 最 高 转速 转 头 ,小 分 子 测定 ,高 温 测定 a a ow 52,000 196,500 Mik ap 规 52,000 196,500 60,000 261,000 最 高 转速 多 孔 转 头 44,000 140,600 ZS un 赂 18,000 23,500 基本 低速 转 头 lee g 40,000 116,300 干涉 光学 系统 平衡 实验 48,000 170,000 两 孔 处 。 根 据 不 同 的 实验 目的 设计 了 各 种 转 头 ;它们 的 特性 和 用 途 见 表 3-1. = aDRreB Dw 分 析 离心 池 的 结构 见 图 3-2。 各 种 分 析 离心 池 的 差别 主要 在 盛 放样 品 溶液 的 池 芒 。 <2 。 螺丝 图 pig 33-2 池 芯 的 性 能 ew tae 充填 环 氧 树脂 = pH 使 用 范围 pH7 pHI—10 2 oq 00 Se pea . | emer“ oe ; 化 学 性 能 不 能 用 于 腐蚀 性 | ， 在 下 列 试剂 中 溶 胀 或 | ， 下 列 溶 剂 中 略为 < 一 > PGR, SRR. | 溶解 : 冰 乙 酸 ， 氢 氧化 | 肿胀 不 能 长 时 间 一 BOR FD | ee nae ee | Taw ow 酯 , 甲 基 或 乙 基 醚 ? 甲 基 或 乙 基 两 顽 ff, Freon 113, %& 哺 , 三 氧 乙烯 对 有 机 溶剂 抗 性 ai abi te 强 ? 机 械 性 能 好 。 mS …， 最 高 转速 单 模 : 转 头 最 高 | ， 单 模 ， 转 头 最 高 转速 | ” 单 槽 :埋头 最 高 转速 ; AM: 转 头 | Wh: 50,000rpm 转速 ; 双 槽 :60,000 rpm 最 高 操作 温度 40% 3-2 分 析 离 心 池 池 芯 两 端 分 别 由 置 于 窗 座 中 的 “ 窗 ” 封 闭 。 池 芯 ,“ 窗 "“ 窗 座 ” 等 装 在 池 者 内 ， 将 螺丝 圈 近 紧 后 放 人 转 头 的 孔 中 。 * 8 « > 分 析 离 心 池 的 池 芯 由 不 同 的 材料 制造 。 设 计 成 不 同 的 形式 以 满足 不 同 的 实验 县 的 和 要 求 。 制 作 池 芯 的 材料 有 龟 合 金 . 铝 粉 或 矶 粉 填充 的 环 氧 树 腊 或 三 氟 氧 乙烯 树脂 (KelF)， 此 外 也 有 用 聚 酰胺 的 。 各 种 材料 池 世 的 性 能 见 表 3-2。 在 实验 中 根据 允许 使 用 的 最 高 转 速 、 化 学 稳定 性 (不 为 溶剂 溶解 或 腐蚀 )、 样 品 的 浓度 等 来 选择 合适 的 池 芯 os AT 脂 池 芯 ,高 温 测定 或 特种 溶剂 时 用 铅 合金 或 铝 粉 充填 树脂 池 芯 。 ”各 种 不 同 的 分 析 离心 池 世 的 构造 和 用 途 分 述 于 下 : (—) 单 槽 池 适用 于 一 般 沉 降 实验 。 池 芯 形状 见 图 3-3。 池 芯 中 有 一 扇形 端面 四 棱柱 槽 。 扇 形 角 度 有 2。 和 4。 两 种 。 扇 形 角度 愈 小 ， 离 心 池 放 人 和 人 转 头 时 愈 要 仔细 ， 务 使 针对 轴 心 。 此 外 还 要 增加 摄影 时 曝光 时 间 ， 不 过 需要 的 样品 数量 少 并 且 界 面 、 液 面 更 近似 直线 。 池 芯 厚度 最 小 1.5mm, 最 大 30mm， 以 厚 12mm 者 最 为 常用 。 池 蕊 2) 的 厚度 和 样品 的 浓度 两 者 的 乘积 决定 mp ie Schlieren 光学 系统 所 得 图 象 内 峰 的 面积 或 者 干涉 光学 系统 所 得 图 象 的 干涉 条 纹 的 位 移 。 例 如 用 30mm BHA, Schlieren 光学 系统 所 得 图 象 内 峰 的 面积 , 较 用 12mm 厚 池 芒 时 天 2.5 倍 。 因此 选择 不 同 厚度 的 池 世 和 样品 溶液 浓度 组 合 ， 将 允许 有 一 相当 大 的 样品 浓度 测定 范围。 3-3 池 世 (=i 双 楂 池 用 于 沉降 速率 法 、 沉降 平衡 法 测定 。 池 世 的 形状 见 图 3-3。 池 芯 上 有 两 个 扇形 端面 四 棱柱 槽 ,扇形 角度 均 为 2.5"。 通 常 一 槽 置 溶剂 , 另 一 槽 置 溶液 。 用 双 槽 池 得 到 的 Schlieren 图 形 中 峰 的 下 面 有 基线 ， 可 以 校正 由 于 离心 池 变 形 、 介 质 中 盐 类 化 合 物 或 其 他 物质 部 分 沉降 引起 的 浓度 梯度 。 干涉 光学 系统 或 光电 扫描 系统 检测 必须 用 双 槽 池 。 池 世 厚度 有 表 3-3 WG (12mm MS, 2.5?) 每 一 模 的 容量 REE BE (cm) 容量 (ml) 1.00 “0.35 0.90 0.32 0.80 0.29 0.70 es 0.25 0.60 0.22 0.50 0.18 0.40 | 0.15 0.30 0.11 0.20 0.07 0.10 0.04 0 CR) 0 至 轴 心 距离 (cm) 6.20 6.30 6.40 6.50 6.60 6.70 6.80 6.90 7.00 7.10 7.20 12mm, 18mm #1 30mm 三 种 。 表 3-3 SE 12mm BS Di (2.5?) 每 一 模 中 不 同 高 度 液体 的 客 积 。 (=) 合成 界面 离心 池 分 单 槽 ( 浆 型 .毛细 管 型 ) 和 双 槽 (毛细 管 型 ) 三 种 (图 3- -4)o igh io! AN Fe 合成 界面 单 槽 毛细 管 型 合成 界面 ? 国 型 合成 界面 双 槽 毛细 管 型 长 疫 柱 平衡 字 芯 Hoe. (hui cen Oa ee BB S74 RY) Lol 2 SG SS ee aes EES RT EC 合成 界面 离心 池 可 用 来 测定 样品 的 起 始 浓度 或 者 界面 移动 非常 慢 ， ie tem ae PRI 物质 ;例如 蔗糖 的 沉降 系数 。 eat. side cave | si 下 eer 四 (a) 多 村 离心 池 hi i 20a 因为 沉降 平衡 时 间 和 溶液 液 柱 高 度 成 反比 5 SS BSS SE 有 足够 地 方 控 几 个 槽 ， 同时 进行 几 个 样品 的 沉降 平 衔 分 析 ， 节约 了 时 间 、 费 用 ,并 且 条 件 一 致 便于 比较 。 一 种 六 槽 池 蕊 见 图 - -4。 ~ A A EE 它 的 池 世 装 有 隔离 片 ,分 固定 隔离 片 和 移动 隔离 片 两 种 (图 3-5)， 用 于 分 离 样品 中 两 个 不 同 的 沉降 组 分 。 配 合 某 种 专 一 的 分 析 方法 ,例如 酶 分 析 ， 可 以 在 极 粗 的 制剂 中 测定 访 酶 的 沉降 速度 。， (六 ) 区 带 沉降 离心 池 离心 过 程 中 密度 较 小 的 样品 溶液 借助 于 离心 力 铺 在 密度 较 大 的 深 溶液 液 面 上 ， 形成 一 薄 层 。 样 品 以 区 带 形式 沉降 。 有 三 种 形状 的 池 芯 (图 3-5)。 专用 于 分 析 有 紫外 吸收 的 巨 大 高 分 子 样品 ,如 脱氧 核糖 核酸 (DNA)。 *10 « 机 械 分 离 离心 ' 闻 区 带 池 芯 册 型 ,图 3-5 池 芯 分 析 离心 池 池 窗 的 材料 有 两 种 : 石英 和 兰 宝石 (天 然 氧化 铝 ), 常用 的 是 石英 。 高 速 运转 时 (> 40.000rpm)， 使 用 干涉 光学 系统 或 光电 扫描 装置 检测 时 应 该 用 兰 宝石 窗 的 离 心 池 。 凶 窗 的 两 个 面 是 平行 的 ,也 有 磨 成 一 面 倾斜 、 成 橡 形 的 %。 使 用 槐 形 窗 的 主要 目的 是 运转 一 次 可 同时 分 析 两 个 或 两 个 以 上 样品 ,但 是 精度 较 差 ? 有 时 也 用 于 补偿 密度 梯度 介 质 引起 的 光 偏 折 。、 为 了 舍 旋 转 辐 转 头 平衡 / BIR POD ALE 在 转 头 另 一 全 与 分 析 离 记 池 对 称 的 孔 中 还 要 放 人 抗 重 离 心 池 。 抗 重 离心 池 不 仅 乎 衡 分 析 离 心 池 的 重量 ， 也 作为 光学 检测 装置 所 得 图 象 计算 离心 池 中 距 轴 心 距离 的 基准 。 有 两 种 类 型 的 抗 重 离心 地: 一 种 用 于 Schlieren 光学 系统 和 光 吸 收 法 检测 装置 , 另 一 ARTF ORE RAE MET 后 者 也 可 用 于 Schlieren 光学 系统 。、 四 光学 检测 方法 ge ware 分 析 超 离心 机 主要 装备 有 三 种 光学 系统 ， 用 来 答 测 离心 过 程 中 高 下 泪 中 样品 的 浓度 及 其 变化 。 它们 是 Schlieren 法 、 Rayleigh 干涉 光 法 和 光 吸 收 法 。 前 两 种 方 靶 检测 原理 基 于 溶质 和 介质 对 光线 有 不 同 的 折射 这 一 性 质 ， 第 三 yy 根据 记录 方法 又 可 分 为 摄影 法 和 光电 扫描 法 两 种 。 (—) Schlieren aera ae ae yo at = a Schlieren 光学 系统 的 检测 原理 是 基于 十 万世 纪 法 国 物理 学 家 5 eae 发 现 的 光 学 效应 。 Schlieren 是 一 个 德 文 单词 ， 其 含义 是 条 纹 与 阴影 。 超 离心 机 上 安装 的 主要 是 Philpot 和 Svensson 设计 的 光学 系统 “ 9 ,用 摄影 方法 记录 由 界面 产生 的 光 偏 折 。 Schlieren 光学 系统 的 基本 装置 由 下 列 部 件 组 成 : 光源 , 两 个 Schlieren BH: 准 直 镜 和 聚焦 镜 ， 一 个 光 装 和 成 像 屏 〈 照 相 底片 )。 其 中 光 益 可 以 是 - - 根 杆 子 、 一 条 狭 颖 或 相差 片 。 Schlieren # {1 二 BWA TB¥AN wouoyeg 9-¢ Hh = — ©12e¢ 光学 系统 的 排列 见 图 3-6, 伦 的 工作 原理 简 述 于 下 。 在 图 3-6 上 光源 狭 锋 中 任 一 点 射出 的 光 通 过 准 直 镜 后 平行 , 聚焦 镜 又 把 光线 聚焦 ,成 像 于 照相 镜 之 前 。 通 过 光 阑 上 小 孔 A, B, C) 的 光线 ,在 照相 筑 的 屏 上 成 清晰 的 图 像 (A', B', C`)。 同 理 , 经 过 狭 锋 的 光线 仍 和 光 ARAL. MRA ARAB lin REBUT at OTR) » 仍 会 会 聚 FR A’, 因为 透镜 的 设计 已 考虑 这 一 情况 。 经 过 其 他 点 的 光线 也 已 作 同样 考虑 。 在 图 3-6b 中 加 进 了 一 垂直 光 轴 的 柱 形 镜 。 这 个 透镜 的 作用 是 使 光线 提前 会 聚 ,因而 再 度 发 散 ， 在 屏 上 形成 一 直线 像 A;, AD AD 而 不 是 一 点 像 。 它 的 位 置 使 垂直 方向 的 像 在 屏 上 依然 聚 焦 很 好 。 像 的 垂直 位 置 不 为 柱 形 镜 改 变 , 向 下 偏 折 的 A 线 (折线 ) 也 不 会 改变 线 像 的 位 置 。 现在 在 垂直 平面 上 插入 一 带 有 斜 狭 颖 的 光 阑 ， 斜 狭 笑 的 中 心 在 光 轴 上 。 因 此 通过 A 没 有 偏 折 的 光 , 只 有 在 中 心 线 ( 粗 黑 线 ) 可 以 通过 后 面 的 透镜 到 达 角 上 ,这 时 它 的 位 置 是 A:， 和 原先 水 平 线 A"、B'、C' AR. 不 偏 折 的 光线 通过 A、B 和 C 会 聚 成 一 像 (在 第 二 光 阐 处 )， 它们 也 能 出 现在 屏 上 。 透 过 物体 的 光 没有 偏 折 时 ,B; 和 C; 沿 着 垂直 轴 前 进 。 如 果 从 A 出 发 的 光线 向 下 偏 折 离 开 原 先 位 置 (折射 ) , 那 未 只 有 和 光 闭 斜 狭 颖 相交 的 那 一 点 光线 ( 粗 折 线 ) 可 通过 后 面 的 透镜 ， 与 A 相 应 的 像 将 在 屏 上 AH. KAM AQ CAKE 距离 与 光线 在 物体 中 的 偏 折 成 正比 。 从 B 和 C 来 的 光线 无 影响 。 因 而 这 个 系统 可 以 使 一 个 垂直 偏 折 的 光 转 换 成 光线 在 屏 上 (或 底片 上 ) 水 平 的 位 移 , 却 不 改变 光 点 的 垂直 高 度 ,而 这 垂直 高 度 本 身 相 应 于 物体 一 定位 置 ( 像 图 上 所 示 垂 直 孔 的 位 置 )。 按照 上 述 安排 ,用 一 水 平 狭 锋 代替 孔 A、B 和 C 可 增加 光 强 度 和 屏 上 的 分 辩 率 。 每 一 光 点 A、B 和 C 由 一 光平 面 代替 。 任 一 与 此 狭 矣 相应 的 光线 通过 斜 颖 的 光 更 多 ,发 散 后 走 向 照相 镜 , 然 而 在 屏 上 聚焦 。 因 为 柱 形 镜 已 被 安排 产生 这 个 效应 5 现在 假定 如 图 3-7c 的 情况 号 在 光 盖 位置 放 一 透明 的 平行 壁 离心 地。 具有 最 大 折 射 率 樟 度 的 沉降 括 面 的 趾 心 位 于 下 处 因此 相应 的 像 B' 将 在 屏 上 有 最 大 的 位 移 。 OCR eT CAREER DR bo 田 面 出 发 的 连续 各 点 光线 的 位 移 是 和 相应 的 折射 率 梯度 成 比例 ， 结 果 在 屏 亚 画 出 二 条 光滑 的 连续 曲线 。 对 于 单 分 散 体系 来 讲 , 这 条 微分 曲线 近似 对 称 , 峰 尖 代表 界面 位 置 。 Be REARS HSUPA: A PIES PRA 成 比例 。 ( 二 ) Rayleigh 干涉 光 系统 “单一 狭 颖 光 的 衍射 图 象 是 一 中 间 有 一 相当 宽 的 明亮 条 纹 和 膨 围 亮度 渐 弱 的 条 纹 组 成 六 愈 向 外 亮度 愈 暑 。 条 纹 的 宽度 与 光 的 波长 成 正比 ， 而 与 光 益 狭 多 的 宽度 成 反比 。 如 果 有 两 条 狭 儿 ;明亮 条 纹 中 有 细微 结构 ,这 是 因为 光线 通过 两 狭 锋 到 达 屏 十 距离 不 同 ， 显 然 它们 将 在 中 心 明亮 条 纹 水 平 不 同位 置 产生 于 站 ， 相 互 加 强 或 狐 销 。 条 纹 不 像 单 光 隙 条 纹 是 连续 的 ,而 是 明暗 交替 的 状态 ,就 是 所 谓 干涉 条 纹 。 为 了 在 超 离心 机 上 应 用 干涉 光 方 法 检测 样品 沉降 ;有 必要 强调 指出 干涉 条 纹 间 的 空间 与 波长 成 正比 ， gsj PERU Ze PRK 超 离心 机 上 安装 的 Rayleigh 于 涉 光学 系统 装置 是 那 种 可 以 和 Schlieren 光学 系统 合 用 的 装置 ， 只 要 改变 Schlieren 光学 系统 光源 狭 锋 的 方位 ( 转 90")。 因此 即使 在 离 忆 过 程 串 砚 者 也 可 轮番 使 用 ,分 别 获 得 各 自 的 图 象 。 ¢ 48 。 em QT 3-7 Rayleigh 二 光学 系统 示意 图 » A 3-7 & Rayleigh 于 水 光学 系统 的 示意 图 。 从 过 打发 出 的 光 经 过 光 障 (a) 通过 二 千 涉 滤 色 片 (图 上 未 画 出 )， EHS (b) 成 平行 光 。 :平行 光 在 一 对 顽 于 离心 池 下 窗 座 里 的 FER IE BR (c) (0.5mm 宽 ) 处 分 成 两 束 分 别 透 过 离心 池 的 两 个 液 槽 ,再 穿 过 另 一 对 颂 隙 较 宽 的 狭 锋 Xe) 经 聚焦 镜 (人 聚焦 于 (h) 处 。 这 两 对 狭 颖 是 平行 的 ,并 不 沿 着 沉降 的 途径 ， SHREVE: 使 得 只 有 溶液 槽 直接 在 轴 的 直径 方向 时 才 有 形成 干涉 的 条 件 。 诗 就 是 Schlieren ;光学 系统 放 Schlieren 光 阑 (相差 片 、 小 杆 等 ) 的 地 方 。 以 后 千 涉 光 经 照相 $i i) 和 柱 形 镜 (j) 至 屏 ( 底 片 记录 )。 Schlieren 光学 系统 与 Rayleigh 干涉 光学 系统 变换 时 ,只 有 两 处 要 变动 一 下 , 即 光源 光 隙 要 转 90?〈 互 成 直角 )， pe Schlieren TEE BT 光学 系统 检测 时 要 避 开 。 如 果 离 心 池 两 槽 中 的 液体 是 一 样 的 ,例如 都 是 溶剂 ,条 纹 是 直 的 。 正 中 的 条 纹 相当 于 缝隙 成 像 的 中 心 ;光线 具有 相同 的 光 径 长 度 。 设 此 中 心 条 纹 为 零 条 纹 ,两 侧 的 第 一 条 纹 与 中 心 条 纹 相 差 一 企 波长 ?两 侧 的 第 二 条 纹 相差 二 个 波长 ,以 此 类 推 。 silanes so Ro ADRSB ARE. HA-TAR ,看 不 出 有 任何 变化 。 之 所 以 会 产生 条 纹 移 位 ;是 因为 通过 一 个 槽 的 光 因 液体 折射 率 变化 改变 子 光 程 ， wie FEB MTF » EBA FESS AA — FB AS JL A. A ARERR TEAR 变 ， 中 心 条 纹 和 其 他 条 纹 移 至 与 折射 率 改变 有 关 的 位 置 。 如 果 垂 直方 向 溶液 不 均一 而 是 存在 一 个 界面 ;分 成 溶液 和 溶剂 两 个 区 域 , 那 末 条 纹 将 有 平 直 的 部 分 ， 相 当 于 离心 池 项 部 和 底部 ,中 间 为 一 组 相当 于 界面 的 曲线 条 纹 相 隔 开 。 事 实 上 ,每 一 条 将 表示 一 条 折射 率 对 距离 的 曲线 。 由 于 中 心 衍 射 条 纹 宽度 的 限制 ， 超 离心 沉降 分 析 的 干冰 光 检测 图 谱 止 天 约 © 14 ， 溶剂 13-94 只 可 看 到 七 条 条 纹 。 因 此 不 可 能 跟踪 一 条 条 纹 走 过 全 部 图 象 ， 除 非 界面 上 折射 率 变化 非 BD, 界面 条 纹 的 移 位 可 以 直接 用 条 纹 数 代表 而 不 用 条 纹 间距 (图 3-8) , 这 样 即使 没有 二 个 完整 的 图 象 ， 从 跨越 界面 的 条 纹 数 也 可 以 测量 得 很 准确 。 即 使 条 纹 移 位 直至 与 条 纹 垂直 , 沿 着 某 一 条 特定 条 纹 计 算 跨 越界 面 的 条 纹 数 ,很 容易 测定 条 纹 数目 所 表示 的 横向 位 Bo 条 纹 数 /、 离心 池 光 径 的 厚度 « 和 单 色光 波长 1, 界面 处 折射 率 变化 Az， 有 下 列 关 Fa An = ue | | (3- 1) 在 许多 实验 中 ,跨越 界面 约 有 二 十 条 条 级 ， ree rr RAL» AEF 涉 光学 系统 检测 灵敏 度 较 Sehlieren 光学 系统 为 高 。 (S) 光 吸 收 法 ， 光 吸 收 法 检测 的 二 个 前 提 是 溶液 与 溶剂 必须 有 光 吸 收 的 差别 ， 也 就 是 说 沉降 组 分 尽 须 有 光 吸 收 。 所 有 用 于 分 析 超 离心 机 的 光学 检测 系统 中 光 吸 收 法 是 最 简单 的 二 种 过 这 地 就 不 难 理解 为 什么 一 开始 分 析 超 离心 机 就 采用 这 个 光学 系统 。 光 吸 收 法 系统 中 由 光源 、 滤 色 片 产 生 某 - 一 波长 一 定 强度 的 光 ， 经 一 对 透镜 使 平行 光 通过 离心 池 后 在 光 轴 上 某 处 聚 焦 ;最 后 经 照相 镜 在 底片 上 感光 成 像 。 如 果 离 心 池 装 满 溶液 ,此 溶液 吸收 90 % 透 过 的 光 ， 那 必 到 达 底 片 的 光 是 很 少 的 ,几乎 不 使 底片 感光 。 当 粒子 向 离心 池 底部 沉降 时 , 液 柱 顶部 会 出 现 一 个 透明 区 (溶剂 区 ) ， 透 过 这 一 部 分 的 光 使 底片 感 ete 光 。 在 界面 处 由 于 浓度 变化 ,吸收 程度 也 不 同 , 底 片上 感光 的 黑 度 也 不 同 ( 图 3-9)。 控制 摄影 条 件 ， 照 相 底片 的 黑 度 和 沉降 物质 的 浓度 成 比例 ， 因 此 沉降 物质 的 流 度 是 照相 底 片 离 轴 心 距离 的 函数 。 和 干涉 光学 系统 检测 一 样 ， 光 吸 收 法 得 到 的 也 是 浓度 对 距离 作 的 曲线 图 ,而 不 像 Schlieren 法 是 浓度 梯度 对 距离 的 曲线 。 光 吸 收 法 装置 是 简单 的 ,但 是 实验 操作 却 比 较 麻 烦 , 需 要 严格 控制 条 件 。 因 为 底片 上 的 黑 度 受 许 多 因素 影响 ,如 曝光 时 间 、 显 影 、 定 影 条 件 、 温 度 等 ， 其 中 最 大 的 困难 是 掌握 底 片 曝 光 。 底 片 的 光 强 度 对 数 和 黑 度 的 关系 是 $ 形 曲线 ， 要 求 曝 光 的 光 强 度 处 在 S 形 曲线 中 间 成 比 千 部 分 ,才能 有 正确 的 结果 。 和 否则 ; MER ERA AOE, 曝光 过 度 黑 度 与 曝光 时 间 无 关 。 为 了 克服 上 述 缺 点 ,现在 利用 光电 扫描 记录 沉降 过 程 , 但 是 这 样 一 来 装备 就 不 再 简单 而 变 得 复杂 了 。 | 3-9 第 四 章 “ 实 验 的 一 般 考虑 和 注意 —. om tl 备 AVM COTTE OHA RAUBER, 这 里 只 LEARN Fy ta 果 样 品 是 纯 的 ;处 在 干燥 状态 ,一 般 可 称 量 后 真 接 溶 于 合适 的 溶剂 中 应 用 。。 BOE 数量 溶剂 ,以 备 双 槽 离心 池 或 合成 界面 离心 池 用 。 溶 该 必须 清晰 或 者 近乎 无 色 。 超 离心 分 析 技术 一 般 来 讲 是 以 不 带电 粒子 作 模 型 ， 而 大 部 分 生物 样品 在 水 溶 波 处 于 离子 状 套 ; 琴 此 有 必要 在 溶剂 中 添加 小 分 子 无 机 盐 类 化 合 物 ， 减 弱 蛋白 质 或 核酸 等 生物 高 分 子 帘子 的 电荷 效应 。 溶 剂 的 离子 强度 为 0.1 至 0.2 已 足够 抑制 电荷 效应 。 一 般 在 溢 剂 中 加 人 让 性 大, 如 氧化 钠 ， 维 持 0.1 至 0.2 克 分 子 浓度 。 以 混合 溶剂 溶解 样品 ,样品 必须 对 溶剂 透析 ， 特别 是 样品 不 纯 或 者 样品 不 是 干粉 时 ， 透 析 更 为 必要 。 这 时 外 透 液 就 作为 双 槽 离心 池 或 合成 界面 离心 池 的 对 照 。 透析 处 理 还 可 减少 样品 中 小 分 子 量化 合 物 的 浓度 。 这 些小 分 子 量化 合 物 在 离心 力 场 中 会 重新 分 布 , 浓度 过 高 时 ， 它 们 的 分 布 情况 会 在 Schlieren BRS 干涉 光 图 象 中 显示 出 来 ,干扰 高 分 子 化 合 物 浓度 的 准确 测定 。 此 外 ,透析 也 克服 蚤 理论 二 处 理 三 元 体系 中 沉降 的 困难 口 。 真正 的 二 二 雪人 六 沪 体 系 基 全 人 的 多 本 化 全 起 省 BEARERS OA AT EH fete nike 3 离心 机 的 使 用 及 转 头 、 离心 池 的 选择 离心 机 应 根据 使 用 说 明 书 进行 操作 ， 要 强调 的 是 必须 仔细 阅读 ， mm 行 工作 。 1 允 于 一 特定 实验 来 讲 ,离心 池 、 离心 池 组 件 和 转 头 有 最 住 配合 时 转 头 的 选择 取决 于 分 析 样 品 所 需 的 转速 、 CO Ae 及 操作 温度 。 Beckman 公司 出 品 的 Spinco E 型 分 析 超 离心 机 各 种 转 头 的 特 狂 和 用 由 表 3-1。 最 常用 的 是 标准 型 An-D 转 头 或 AnrH 转 头 ,样品 溶液 多时 ,用 An-E 转 头 做 沉降 平衡 分 析 可 以 用 An-G 转 头 ,同一 时 间 内 分 析 几 个 样品 ,比较 方便 。 、，- 离心 池 的 选择 首先 决定 于 光学 检测 系统 。 干 涉 光 系统 和 光电 扫描 系统 必须 用 双重 心 池 5 Schlieren 光学 系统 也 常常 用 双 覃 离心 池 , 以 便 同 时 得 出 基线 。 不 过 双 覃 离心 池 的 最 高 允许 转速 较 单 槽 离心 池 低 。 离 心 池 池 芯 的 选择 取决 于 最 高 允许 转速 \ 化 学 稳定 性 、 构 造 和 厚度 5 池 芯 材料 和 厚度 ( 见 第 三 章 第 3 节 ) 的 选择 取决 于 待 分 析 的 样品 溶液 。 馈 合金 制 池 芯 虽 已 使 用 多 年 ,但 化 学 稳定 性 不 佳 ,现在 正 逐 步 被 塑料 制 池 世 取 代 。 只 是 在 高 温 或 在 某 些 特殊 溶剂 中 进行 超 离 心 沉降 分 析 时 才 使 用 铝 合金 池 世 。 水 溶液 样品 最 好 选用 铝 粉 填充 的 树脂 池 世 。 如 有 需要 绝对 避免 和 钻 接触 ， 可 选用 碳 粉 充填 的 环 氧 树脂 或 KelF 池 雯 。 池 芯 标准 厚度 是 12mm。 因 为 Schlieren 光学 系统 得 到 的 曲线 中 的 峰 高 以 及 证 涉 光 系 统 让 _ 得 到 的 图 象 中 干涉 条 纹 的 移 位 都 与 光 径 ( 池 世 厚度) 和 溶液 浓度 成 比例 ， 选 择 不 同 的 凶 芯 “. w 16 - 厚度 可 以 扩展 待 测 样品 深 液 浓度 范围 。 例如 用 30mm 厚 池 芯 摄 得 的 Schlieren 峰 面积 为 12mm 厚 池 芯 摄 得 的 峰 面 积 的 2.5 倍 。 反之 ， 用 1.5mm 厚 池 志 世 则 仅 为 了 mm 厚 池 世 的 1/89 各 种 池 芯 需要 的 样品 数量 见 表 4-1。 Ran ty & & (mh ty th BE (mm) BR GWA TA, 但 是 用 光电 扫 揪 装置 检测 或 者 转速 大 于 40.000rbm 下 用 于 涉 兆 系统 检 测 时 。 宣 用 蓝宝石 窗 。 用 横 形 池 窗 虽 可 同时 分 析 一 个 以 上 祥 品 , 不 过 ， 如 果 要 求实 验 结 果 精 确 ,必须 用 平面 池 窗 。 ARM OUEA PE, CERT OR RRO TER OE AT Schlicren EER 统 和 光 吸 收 法 。 三 、 光 学 系统 的 选择 REE, PRO ERM AR. 242 是 分 析 直 离心 机 meee coe R42 各 种 光学 检测 系统 的 特征 Schlieren 光学 系统 光 吸 收 光学 系统 | 紫外 摄影 法 光电 扫描 装置 ” Rayleigh. 干涉 光学 系统 SER 沉降 速率 法 沉降 平衡 法 、 沉降 速率 法 测定 低 UR ARI CURR 鉴定 纯度 测定 样品 浓度 | 浓度 样品 度 样品 ) 外 区 带 沉 降 速率 法 密 Hea “ 度 梯度 沉降 平衡 法 “| 度 样品 ) ! . 密度 梯度 沉降 平衡 本 法 YE : 其 他 用 途 沉降 平衡 法 测定 扩散 系数 差分 沉降 速率 法 测定 样品 浓度 沉降 速率 法 a 常规 测定 浓度 范围 1.0 一 10mg/ml 0.5—5 mg/ml 蛋白 质 0.1—1mg/ml 蛋白 质 (i2mm 池 蕊 》 核酸 0.01—0. 1mg/ml 0.05—1.0mg/ml 核酸 0.01 一 0.lmg/ml ta 一 一 个 一 直接 观察 离 忌 过程 十 一 直接 观察 离心 过 程 | wees. | “可 测 低 浓度 样品 ， 直接 测定 浓度 梯度 观 | 直接 测定 相对 浓度 高 pte} aa ae 直接 观察 离心 过 程 ABUTS 《改变 | 相差 片 角度 OMFS KEE REIN | 要 得 到 浓度 梯度 需 | 不 能 观察 离心 过 程 | ; 3 学 系统 对 油污 和 : 可 能 干扰 要 微分 PR SR 定量 测定 样品 浓度 要 积分 才能 得 到 浓 | ”离心 池 的 位 置 非常 | 困难 度 感 ， 位 置 不 正 有 很 光学 系统 对 油污 和 | 精度 较 低 灰尘 很 敏感 ERED SAIS ASHE ES iy a} 除了 光电 扫描 装置 用 记录 仪 记录 实验 结果 外 ,其 余 的 检测 方法 都 用 摄影 方法 来 记录 由 于 光线 较 弱 ,摄影 用 的 底片 宜 用 感光 度 高 的 。 曝 光 时 间 需 由 实验 基体 情况 决定 5 一 般 都 比较 长 。 用 Schlieren 光学 系统 和 . Raylcigh 于 涉 光学 系统 要 选择 获得 的 图 谱 有 最 大 反差 的 曝光 时 间 ; 以 方便 以 后 的 读 片 * -底片 的 显影 ; 定 影 等 无 特殊 要 求 ; 不 过 光 吸 收 摄影 法 检 测 时 要 特别 小 心 ,至 少 要 让 冲洗 出 来 的 底片 上 黑 度 和 离心 池 中 光 密 度 有 半 定 量 关 系 5 这 就 要 求 各 项 操作 条 件 尽 可 能 保持 一 致 ,以 便 获 得 重复 结果 。 四 、 沉 降 图 谱 的 分 析 应 该 用 微 比 长 仪 阅读 底片 。 Schlieren 图 谱 也 可 用 优良 的 放大 机 阅读 。 微 比 长 仪 应 能 阅读 长 、 宽 各 5cm 的 底片 , 精度 为 1 一 2k。 由 于 放大 ,图 谱 中 的 线条 都 有 一 定 宽度 ， 通 常 以 线 的 中 心 位 置 来 计算 。 至 于 界面 位 置 的 精确 测定 , 尚 有 一 些 争议 ,一 般 以 界面 宽度 的 中 心 作为 界面 位 置 。 (—) Schlieren 图 谱 阅 读 法 图 4-1 是 典型 的 Schlieren 沉降 图 谱 , 各 部 分 的 名 称 见 图 注 。 Schlieren 图 谱 是 dn/dr 对 > 作 图 (其 中 ”是 折射 率 , > 是 距 轴 心 的 距离 )。 在 实验 允许 的 准确 度 范 围 内 ,溶液 折射 率 的 变化 dn 和 样品 浓度 的 变化 de 成 正比 ,因此 Schlieren 图 谱 可 以 看 成 是 dc/ar 对 了 作 表 4-3 角 的 正切 BRO tan 8 咨 液 -空气 液 面 咨 剂 -空气 液 面 eo 30° 0.57735 ie te a 35° 0.70021 jy AG 0.83910 45" 1.0000 © 50° 1.1918 55° 1.4281 60° 1.7321 65° 2.1445 ty 70S 2.7475 ABS Th BH 75° 3.7321, < 80° 5.6713 hg 85° 11.430 图 4-1 Schlieren 图 象 图 。 Schlieren 图 谱 中 的 峰 表示 界面 区 域 ， 峰 的 最 高 点 所 在 的 位 置 一 般 就 作为 界面 的 位 Bo 基线 和 峰之 间 的 面积 和 浓度 成 正比 。 不 过 dn/dr 的 值 和 - Schlieren 光学 系统 中 的 相 差 片 角度 6 有 关 , 因 此 用 峰 的 面积 来 表示 浓度 时 ， 这 个 6 角度 要 一 定 。 否 则 , 要 把 an/dr 的 值 乘 以 相差 片 角 召 的 正切 (tan 6) ( 表 4-3)， 才 能 把 不 同 的 6 拍 的 Schlieren 图 谱 进 行 比较 。 1. 放大 倍数 沉降 分 析 计 算 中 都 是 以 沉降 粒子 径 向 外 移 的 距离 来 计算 ， 所 以 底片 o 18 。 ERIK ss ie A EB SRA 5 BRE BEE HVE PY KF BL X AT Tas BID BES ah VBE BS AA BA PE 5 Gt BS EBS A PN 基准 线 之 间 的 距离 和 实际 的 抗 重 离心 池 的 内 侧 基准 线 和 外 侧 基准 线 之 间距 离 之 比 来 实现 的 。 也 可 用 一 一 校正 离心 池 来 计算 。 所 谓 校正 离心 池 系 在 离心 池 中 以 一 有 精确 刻度 平行 线 的 镜片 代替 池 世 。 从 底片 上 精确 测量 各 平行 线 间 的 中 离 ， 然后 除 以 镜片 上 各 平行 线 的 实 际 距 离 ,计算 放大 倍数 5 底片 上 的 Y 轴 方向 即 区 RYE RR ACRE AX Schlieren 图 谱 中 垂直 方向 的 位 置 是 表示 离心 池 中 溶液 浓度 梯度 引起 的 光 的 折射， 沉降 分 析 中 常用 相对 值 计算 , 故 不 必 作 放 头 倍数 的 校正 。 2. 离 轴 心 距离 的 测定 ““ 置 底片 于 微 比 长 仪 下 ， 沿 底片 的 基线 ， 准确 读 出 各 有 关 部 分 的 读数 ,准确 到 10ze [ 例 ] Schlieren 图 谱 如 图 4-1o。 内 侧 基准 线 | 波 面 外 侧 基准 线 一 -| 一 -| 一 -| 一 9.575 6.050 9.655> 9° 615 38.855 微 比 长 仪 读数 (mm) (3.8855 一 0.6050) _ A F= Date oaks 2.05 其 中 7. 305 5. 0 分 别 是 抗 重 离心 池 外 侧 基 准 线 和 内 侧 基 准 线 在 转 头 中 距 轴 心 的 实际 距离 。 液 面 至 轴 心 的 距离 tm = 7.30 一 (2.9955 — 09619) = 5.87cm “界面 至 轴 心 的 距离 += 7.30— (3.8853 = 1.6913) dn: 6:2 Rom PA SHI RREENAHE ERRAMEAD 伸展 的 程度 随 转速 、 转 头 使 用 次 数 不 同 而 不 同 ， 很 难 准确 测定 , 好 在 此 值 不 大 (60,000rpm 时 约 伸展 0.02 一 0. 04cm)， 除非 特 萄 要 求 ,通常 测定 时 均 忽 略 不 计 。 3. 峰 下 面积 的 测定 ”一 种 方法 如 图 4-2 所 示 ,把 峰 分 割 成 二 系列 小 块 ,每 二 小 块 近 似 作 为 梯形 计算 面积 。 例如 ABCD 的 面积 是 4 位 置 上 峰 的 高 度 乘 以 水 平方 向 增 量 CD。 整个 峰 的 面积 近似 于 各 梯形 面积 之 和 。 具体 计算 时 , 沿 底 线 每 隔 微 比 长 仪 上 读数 0.lcm 为 一 间隔 。 从 原点 开始 , 沿 底线 移动 0.05cm ( 微 比 长 仪 读数 )， 读 出 该 点 峰 高 (dc/dzr)，, 作为 第 一 个 峰 高 值 。 以 后 每 次 移动 0.1cm ( 微 比 长 仪 读数 ), 读 一 次 峰 高 。 如 是 循序 前 进 , 直至 读 完整 个 峰 。 通 常 峰 宽 不 是 间隔 的 整数 倍 ， 但 是 由 于 尾数 引起 的 误差 极 微 ， 可 以 忽略 不 计 。 峰 面积 相当 于 Ot D (de/dr), 其 中 下 是 水 平方 向 放大 倍数 。 这 个 值 的 单位 是 cm’, TA FS RR EE 2 Schlieren 光学 系统 检测 的 超 离心 沉降 分 析 实 验 , 有 关 浓 度 的 计算 通常 可 以 直接 将 此 值 代 进去 ,而 不 需要 转换 成 绝对 浓度 单位 。 另外 一 种 计算 峰 面 积 的 方法 是 把 底片 放 在 照相 放大 机 下 放大 10 倍 , 投 影 在 方 格 计算 纸 上 计 算 峰 下 的 面积 。 注意 ， 假 如 采用 微 比 长 仪 得 到 的 水 平方 向 的 放大 倍数 是 R, 那 末 这 里 计算 时 放大 倍数 应 是 己 和 放大 机 放大 倍数 之 和 。 当然 用 电子 求 积 仪 测量 峰 面 积 就 更 19 * 方便 了 。 (=) Rayleigh 干涉 图 形 的 读 法 图 4-3 是 典型 的 干涉 条 纹 图 。 每 一 条 纹 表示 离心 池 中 溶液 银 度 和 上 距离 的 关系 ， 也 就 是 浓度 C 对 距离 ”* 作 的 图 当然 这 里 有 一 个 前 提 ， 就 是 浓度 C 和 折射 率 宛 旦 线性 关系 5 图 上 条 纹 垂 直方 向 移 位 表示 两 部 分 液体 之 间 溶 质 浓 度 的 变化 。 条 纹 位 移 值 A 代表 浓度 单位 是 条 纹 数 ， 或 者 移动 距离 km 或 cm。 这 个 单位 可 以 保留 代 人 浓度 项 直接 进行 计算 。 两 个 条 纹 平 坦 部 分 条 纹 在 垂直 方向 移动 距离 ,或 者 跨越 界面 的 总 条 纹 数 J， 表示 界面 的 浓 度 变 化 。 因 此 ， 溶 液 相 和 溶剂 相 平坦 部 分 条 纹 在 垂直 方向 的 移 位 也 就 代表 离 居 池 齐 坪 区 的 浓度 。 对 蛋白 质 来 讲 , 使 用 12mm 厚 池 世 离心 地， 一 条 条 纹 移 位 ( 约 300w) HATA 浓度 0.025mg/ml。 i 界面 位 置 的 决定 ,最 简单 的 方法 是 取 浓 度 变 化 一 半 时 的 位 置 > 作 界 面 位 置 ,也 就 是 条 纹 垂直 位 移 的 中 点 。 底 片 在 比 长 仪 下 阅读 时 ， 应 保持 抗 重 离心 池 两 参考 孔 的 同一 条 纹 在 Pe Fpl 界面 坪 区 ag fl - 3 AH Bi 0.0 | 6 夜 = 空气 界面 OTe ee Ae eo OT 图 4-3 Rayleigh 干涉 图 形 * 20 。 Se ee eee 一 直线 上 。 必 须 注 意 , 抗 重 离 必 池 两 参考 孔 中 的 条 纹 数 并 不 一 样 。 和 Schlicren 图 谱 不 一 样 ,放大 倍数 不 是 用 抗 重 离 心 池 两 参考 孔 来 计算 ,而 是 用 抗 重 离心 池 外 参考 孔 的 外 侧 基准 RAMSAR ORTH. 两 者 (外 侧 基 谁 线 和 参考 线 中 心 ) 的 距离 为 1.67cmo 底片 上 各 点 的 相应 离心 地 位 置 的 计算 和 Schlieren 图 谱 一 样 , 不 过 是 从 抗 重 离心 池 的 参考 线 中 心算 起 。 Pe RS Stitt 底片 在 水 平方 问 读 数 应 准确 至 10w， 不 足 一 条 纹 时 应 读 2 lpo a ts LARA KEW . 邻近 两 条 条 纹 间 垂 直方 向 的 间 卫 是 一 个 重要 的 常数 ， 决定 于 光源 波长 \ 底 片 至 离心 池 的 距离 等 因素 。 每 一 架 超 离心 机 有 一 定 值 ,也 就 是 说 每 一 架 离心 机 此 值 要 分 别 测定 。 测定 的 方法 很 简单 :一 选择 底片 土 条 纹 呈 水 平 的 地 方 的 一 条 明亮 条 纹 ,测量 此 明亮 条 纹 中 心 至 下 一 条 明亮 条 纹 中 心 之 间距 离 ,此 距离 就 是 条 纹 间 宽度 。 为 了 增加 准确 度 ,应 该 测量 几 条 清楚 的 条 纹 间 的 距离 ,然后 以 此 条 纹 数 除 之 ， 取 其 平均 值 。 一 Pry sis lesa ET tO os. | = ar Petes. | — qa == ara A | | hes 沿 此 线 计算 0 12345678 yy, YI ri 1 Y ifthe | 分 数 部 分 = 了 4-4 Rayleigh 图 形 读数 法 作为 界面 位 置 沉降 方向 一 一 一 ， | | | 4 Sm 全 ~ oe a 线 线 ee 21 。 Se rr ee ng ~~ 区 Rt ase eek eS OE on oe see ee. 般 约 为 300z， 读数 误差 应 小 于 So PERG UENO SERRE TE FR =~ 数 。 it 2 条 纹 移 位 距离 的 测定 ，， 以 前 已 经 提 到 ,干涉 条 纹 的 垂直 方向 位 移 代 表 浓 度 , 具 条 读 片 方法 如 下 (图 4- 和。 在 干涉 光 图 谱 上 条 纹 平坦 部 分 选择 二 条 清晰 的 明亮 条 八 〗 BE 中 心 线 ; 定 为 Wi。 在 比 长 仪 下 平行 于 该 条 纹 移 动 ,计算 与 之 相交 的 明亮 条 纹 数 ,直译 代表 坪 区 的 条 纹 处 止 。 整 数 条 纹 之 外 的 不 足 一 条 条 纹 的 分 数 条 纹 移 位 的 读 法 如 下 。 这 时 不 再 水 平移 动 而 是 垂直 移动 测量 至 该 明亮 条 纹 中 心 线 ， 记 下 此 数 Zy， 然 后 以 条 纹 间 宽度 Y。 (测量 方法 见 上 面 1) 除 之 ， 得 到 条 纹 移 位 的 分 数 部 分 。 将 此 分 数 加 于 整数 部 分 即 为 整 不 内 参考 线 记录 纸 项 。 a J 池 顶 "| 溶液 -空气 界面 {! J \! i 浓度 曲线 1 1 徽 分 曲线 本 I! | nL ‘ I I i tit : i f 外 参考 线 | 外 1 沉降 方向 | ‘| ee re tel Zcro O.D, bs (ho os nea os 0.40.D, - | 0,20.D, 条 纹 移 位 数 。 Boo oase BORE RR ERAN DPLN ETE: 变通 的 方法 是 把 条 纹 移 位 对 距离 > 作 图 ,外 延至 液 面 和 液 底 。 液 面 处 的 条 纹 一 般 不 太 陡 峭 , 外 延 没 有 什么 ”困难 5 六 底 处 即使 用 了 垫底 液 ( 氟 油 ) 仍 非常 陡峭 ”"， A 目测 法 处 延 已 能 满足 要 求 。 (=) AR BEBE 光 吸 收 法 检测 有 两 种 记录 方式 。 摄 影 记 录 ， 底 片 的 黑 度 要 用 光 密 度 计 阅 读 。 图 人 -5 是 光 密 度 计 扫 描 得 到 的 图 谱 。 由 于 大 部 分 实验 结果 计算 只 需要 知道 图 谱 上 一 些 特定 部 位 距 轴 心 的 距离 (如 液 面 ,界面 中 心 等 )， 这 些 部 位 的 测量 方法 基本 土 同 Schlieren 图 谱 和 于 eRe, 不 过 记录 纸 上 是 以 cm 为 单位 ， 放 大 倍数 是 光学 系统 放大 倍数 和 光 密 度 计 放 大 信 数 的 乘积 ， 数 值 是 记录 纸 上 抗 重 离心 池 两 基准 线 问 的 距离 和 离心 池 池 两 参考 孔 实际 长 RE (1.60cm) 之 商 。 界面 位 置 通常 取 溶 剂 相 区 和 坪 区 的 中 值 和 曲线 相交 处 (移动 界面 沉降 法 ) ,区 带 沉降 法 则 取 峰 的 最 大 值 处 。 这 种 用 摄影 方法 记录 的 光 吸 收 法 对 摄影 条 件 要 求 严 格 控制 ,操作 手续 麻烦 ,并 且 缺 乏 足够 的 精度 。 光 琢 收 法 检测 的 另 一 种 记录 方式 是 光电 扫描 ， 在 离心 过 程 中 直接 记录 离心 池 中 液体 的 光 密 度 。 记 录 纸 上 的 图 谱 如 图 4-6 所 示 。 阅 读 的 方法 和 上 面 所 述 一 样 。 Bobi 的 光 密 度 值 应 和 记录 仪 上 记录 笔 的 移动 距离 成 正比 ,如果 不 成 线性 关系 , 那 末 要 作 一 校正 曲线 (图 4-7)。 20 sie ati 图 4-7 校正 曲线 EEE SEcEEPSeLae wv 五 、 离 心 分 析 实验 应 考虑 的 现象 (一 ) 浓度 依存 性 高 分 子 溶液 在 超 离心 机 中 的 流体 力学 性 质 是 浓度 的 函数 。 样 品 溶液 在 某 一 浓度 沉降 分 析 得 到 的 数据 只 是 表示 该 浓度 观察 到 的 数值 ， 应 该 在 报告 中 将 浓度 一 并 报告 。 对 浓度 » 23 。 的 依存 程度 ,不 同 的 物质 是 不 一 样 的 。 一 般 讲 来 ,球状 蛋白 质 比较 小 。 纤 维 状 蛋白 质 或 老 核酸 等 就 非常 大 ,必须 在 可 以 检测 的 浓度 范围 内 进行 一 系列 实验 ,然后 外 延至 无 限 稀释 处 (溶质 浓度 沪 零 时 )。 通 常 高 分 子 的 沉降 系数 在 浓度 高 时 变 小 。 如 果 相 反 ， 在 高 浓 庆 时 锅 降 系 数 增 大 ,可 以 考虑 溶质 分 子 相互 作用 成 为 聚合 物 的 可 能 ,也 可 能 在 低 浓 度 时 溶质 分 子 解 聚 成 亚 基 。 沉 降 平 衡 法 测定 分 子 量 ,溶液 在 非 理想 状态 时 观察 到 的 值 小 于 真实 值 。 (=) 平方 根 稀释 定 则 因为 池 芯 中 盛 放样 品 溶液 的 槽 的 截面 是 扇形 ， 离 心 过 程 中 界面 下 的 挟 区 浓度 将 会 降 低 ;* 反 映 在 'Schlieren 图 谱 上 峰 变 小 ， 干 涉 条 纹 移 位 减少 。 从 式 2- 号 坪 区 浓度 随时 间 的 变化 将 是 Oc seo" i 3 aa bo 2sw?C a 8) AA FE TM FRAY FE _un a a ie w’r dt . ke GO) RAK (2-8) 得 | ere a) 其 中 > 一 *(z) ,是 界面 的 位 置 。 积 分 之 ,时 间 # 的 浓度 C, MORE Ce 的 关系 a (a) 号 其 中 六 是 时 间 为 0 时 界面 距 轴 心 的 臣 离 ， 通 常 即 液 面 rw;” 是 时 间 界 面 距 轴 心 的 距 离 。 (=) 电荷 效应 ( 盐 效应 ) 蛋白 质 \ 核 酸 等 许多 生物 高 分 子 是 高 分 子 电解 质 ,在 水 溶 臣 中 解 离 成 离子 。 沉 降 过 程 中 ,由 于 正 \ 负 离子 沉降 速度 不 同 , 在 离心 池 中 形成 一 电位 梯度 。 根 据 电 中 性 原则 ,带电 荷 粒子 在 离心 力 场 中 的 分 布 和 不 带电 的 中 性 粒子 的 分 布 就 不 一 样 。 电 和 荷 效应 不 论 是 帝 降 速 率 法 还 是 沉降 平衡 法 都 会 带 来 很 大 影响 。 这 种 高 分 子 离子 之 闻 的 电荷 效应 叫 第 一 电荷 效 应 。 为 了 降低 这 个 效应 ， 可 以 在 溶液 中 加 入 适量 中 性 盐 ( 如 氧化 钠 等 )。 不 过 加 和 人 的 小 分 子 支 持 电解 质 的 正 离子 和 负离子 沉降 速度 不 同时 (如 氧化 钨 、 碘 化 锂 等 ) ,也 会 影响 高 分 子 离子 的 沉降 速度 (第 二 电荷 效应 ) ,因此 要 有 区 别 地 选择 支持 电解 质 ,这 一 点 是 很 重要 的 。 根据 高 分 子 的 离子 化 程度 ,一 般 加 大 正 \ 负离子 沉降 速度 几乎 相同 的 中 性 盐 ( 如 氧化 钠 ) ,维持 0.1 至 0.2 离子 强度 ,高 分 子 离子 影响 最 小 。 至 于 因 加 入 其 他 盐 类 改变 了 溶剂 的 粘度 和 密度 ， 可 以 观察 到 沉降 系数 的 变化 ,为 此 沉降 系数 必须 换算 成 标准 状态 : 20%C 纯 水 中 的 值 。 《 四 ) Johnston-Ogston 效应 如 果 样 品 溶 臣 中 有 不 止 一 个 组 分 沉降 , 会 产生 另 一 种 浓度 依存 关系 * 即 所 谓 可 ohastom- * 24% Ogston Mo SATAATMLEH, AUR AIA DAI RS A 样 ,而 且 Schlieren ALM HE FAM RA RAD SS RE 可 观察 到 ,总 的 峰 面积 中 沉降 慢 的 组 分 所 占 比 例 减少 ,而 沉降 快 的 组 分 增加 。 这 个 效应 在 低 浓 度 时 可 忽略 , 浓度 越 高 越 显 著 。 Johnston-Ogston 指出 ， 这 个 不 正常 现象 的 出 现 是 由 沉降 物质 的 特性 所 决定 。 一 企 二 组 分 混合 体系 沉降 分 析 时 会 看 到 两 个 界面 ， 在 快 组 分 沉降 时 也 夹杂 着 慢 组 分 的 沉降 ， 不 过 这 部 分 慢 组 分 和 快 组 分 后 面 的 那 部 分 旬 组 分 有 不 同 的 沉降 系数 《5) (图 4-8)o。。 因 此 这 里 有 三 个 * 值 ， 这 些 * 值 之 间 的 相对 值 影响 混合 物 离 dx } 图 4-8 心 沉降 的 结果 。 经 时 间 离心 ,离心 池 中 有 三 个 相 : (1l) c 相 ， 由 纯 溶 剂 组 成 ; (2) eA, 含有 慢 组 分 ,其 浓度 为 C2; (3) > 相 , 具 有 两 种 组 分 , 慢 组 分 和 快 组 分 ,它们 的 浓度 相应 为 cz 和 Clo 假定 这 些 相 之 间 界 面 都 是 无 限 陡 峭 ， 分 别称 为 cg 界面 和 py 界面 。 7, 处 界 Hof AWA ,7z 处 界面 py 有 一 沉降 系数 88g。 因为 > 相 中 浓度 较 高 ， 而 沉降 系数 依存 于 浓度 ，S7 将 小 于 SP. 要 慢 组 分 在 XX. 之 间 不 堆积 ,必须 在 py 界面 两 侧 校 正 慢 组 分 的 浓度 来 补偿 沉降 系数 差 。 慢 组 分 和 快 组 分 的 相对 移动 可 写成 SY —S,, 4% 增加 为 零 时 C?(CSr = 5?) = crCeer 一 37) (4-3) 实验 中 观察 到 的 慢 组 分 浓度 (用 op 界面 峰 的 面积 计算 ) C4 一 C2™ (obs HAW), KR 池 底 部 分 的 慢 组 分 真实 浓度 为 大 〈Cy 作 扇 形 梳 面 稀释 校正 ) ,其 值 决定 于 三 个 沉降 系数 。 如 果 ST 一 8 即 在 快 组 分 的 稀 溶 液 申 实验 观察 到 的 相对 浓度 是 正确 的 。 另 一 方面 ， 在 快 组 分 蒿 浓度 的 溶液 中 ， 特 别 是 那些 快 组 分 沉降 系数 浓度 依存 性 大 的 ,57 « Sf 和 CP > Cryo。. 洲 度 依存 性 小 的 球形 分 子 ，Johnston-Ogston 效应 天 致 可 以 忽略 。 但 是 一 些 非 对 称 大 分 子 * 特 别 是 沉降 系数 接近 的 混合 组 分 影响 就 大 了 ,不 能 忽视 ( 表 4-4)。 因此 ， 对 于 未 知 的 混合 驳 样 品 , 贡 要 知道 它 行 相互 过 间 沾 度 之 比 时 要 作 校 正 7 校正 方法 之 二 ;是 测 定 一 系列 样品 浓度 沉降 图 谱 上 两 组 分 的 显示 相对 浓度 ， 然 后 外 延至 零 浓度 s; 组 分 间 相 对 "25 « 快 组 分 对 不 同 慢 组 分 的 效应 c: +e LE 快 A A> 48 #8 4 Lita 4 re ik 5 度 Y Ti (g/100ml) CS) 物质 uC et a 要 4 烟草 花 叶 病毒 1.0 137 MER , 烟草 花 叶 病毒 1.0 117 纤维 蛋白 原 1.0 纤维 蛋白 原 2.0 5.4 牛 血 请 白 蛋 白 25.05 te 2.0 5.3 WRB at 4S RE (O.3mg/ml) (1844})- BREN RR (0.2—1.0mg/ml) ( 快 组 分 ) 混 合 物 的 Johnston-Ogston 效应 (S? /S2 = 0.700) 底片 编号 (7 5/7m)?Co°* es", o™ 0.3—0.2mg/ml 混合 物 | 5 62.0 47.6 0.713 6 60.6 46.5 0.721 7 61.5 48.3 0.716 8 60.1 46.4 0.721 9 58.9 45.4 0.724 10 58.9 45.5 0.726 0.3—0.4mg/ml BAD 4 87.9 49.0 0.706 5 87.1 49.2 0.705 6 84.7 47.5 0.715 7 82.1 50.2 0.699 0.3—0.6mg/ml 混合 物 5 114.8 53.1 0.682 6 108.6 50.9 0.695 7 107.8 52.7 0.684 8 102.1 49.7 0.702 as 9 98.9 48.6 0.704 10 % 94.2 46.4 0.721 0.3—0.8mg/ml 混合 物 6 157.4 48.6 0.708 ‘iad 145.4 54.1 0.680 gy 147.9 50.1 0.700 9 137.6 48.7 0.704 niten 10 131.4 48.5 0.709 11 _ 126.0 47.6 0.714 0.3—1.0mg/ml 混合 物 8 201.0 51.3 0.692 9 199.8 - 54.4 0.676 J 10 191.9 51.4 0.692 11 174.5 49.5 0.703 12 174.4 51.1 0.694 by 13 182.4 50.2 0.698 “*T o = S?/S¢(=0.700) FAR (4-4) RAE. 82 RE RAMRE C? 计算 值 。 6 显示 浓度 的 测量 ， 应 使 界面 沉降 至 相近 部 位 进行 ， 以 避免 由 于 径 向 稀释 引起 另 一 种 复杂 Ho 这 个 方法 不 适合 用 于 稀释 过 程 中 组 分 之 间 存 在 可 逆 平 衡 体系 。 可 以 用 Trautman 等 四 的 近似 处 理 计算 某 一 浓度 混合 组 分 样品 内 组 分 浓度 比 Co- 一 (72/1 mY? obs Sy it B& : Pa Cre" /sare x 1 Co aa | 0 其 中 一 | re/ 5 实际 求 相对 浓度 C2 时 ,可 以 近似 o = 52/52, 8° So 是 极限 TEAR. 吕 是 把 各 浓度 宴 组 分 的 显示 沉降 系数 对 各 显示 浓度 作 本 ,外 延至 零 浓度 时 之 fi, St 是 快 组 分 的 显示 沉降 系数 对 各 显示 浓度 或 总 浓度 作 图 ， 外 延至 零 深度 取 值 j 表 4-5 是 Trautman 等 用 已 知 混合 组 分 样 蝇 做 的 实验 的 结果 。 e 27 e HER TOME 分 析 超 离心 机 最 大 的 用 途 之 一 就 是 测定 沉降 速度 。 理 由 很 清楚 ， 因 为 一 次 实验 只 要 上 少量 样品 ( 几 豪 克 以 下 )， ERENT (一 个 少时 或 稍 多 一 些 ) 就 能 得 到 几 个 重要 的 信息 。 首先 可 确证 是 否 存在 高 分 子 , 它 的 含量 大 概 是 多 少 。 其 次 可 以 计算 沉降 系数 ,结合 界面 扩 散 的 形状 估计 高 分 子 大 小 ， 检 测 分 子 不 均一 性 以 及 混合 物 中 各 组 分 之 间 的 比例 》 不 过 从， 一 次 离心 实验 就 对 沉降 粒子 的 物理 性 状 下 结论 是 非常 危险 的 ， 如 有 可 能 应 和 其 他 分 析 技 术 平行 测定 。 FORE 一 、 移 动 界 面 法 测定 沉降 系数 溶质 分 子 在 单位 离心 力 场 中 的 沉降 速度 称 为 沉降 系数 ,以 S 表示 : 9 三 | (2-2) 其 中 * 是 距 轴 心 距离 , : 是 时 间 ,w 是 角速度 。 单 位 是 Svedberg (IBA S, 10°" B)o 通 常 报 道 的 沉降 系数 Sww 是 指 溶质 在 20%C， 和 水 密度 、 粘 度 一 样 的 溶剂 中 的 沉降 速度 。 要 换算 成 这 个 状态 必须 知道 实验 温度 时 溶液 的 密度 和 粘度 ， 以 及 溶质 的 偏 微 比 容 。 在 接近 20°C 测定 稀 溶 液 的 沉降 系数 ,所 得 $ 值 一 般 可 直接 应 用 不 需 作 校正 。 沉降 系数 是 浓度 的 函数 ， 无 限 稀 释 时 溶质 的 沉降 系数 Show 是 测定 一 系列 浓度 的 So,w， 外 延至 和 雪 浓 度 的 值 。 外 延 不 一 定 是 直线 (图 5-1), 因此 实验 时 样品 浓度 应 尽 可 能 低 , 以 缩短 外 延 距离 。 SEE ia | 沉降 系数 [5] 浓度 (mg/ml) 图 5-1 移动 界面 法 是 测定 沉降 系数 最 常用 的 方法 。 从 界面 移动 求 粒子 沉降 系数 误差 一 般 在 +2% EA. 操作 上 可 以 引起 误差 的 主要 因素 有 三 个 : 〈1) 温度 测量 不 准 ; (2) 转 头 转 TRA Fa; (3) Schlieren 峰 的 位 置 没 有 定 准 。 ee 达成 平衡 ,转速 保持 在 指定 转速 ，Schlieren 图 谱 上 峰 尖 一 些 。 « 28 « (一 ) 实验 方法 3 Luts 1. 样品 配制 ”样品 事先 应 尽 可 能 纯化 ,准确 测定 溶质 浓度 溶剂 的 盐 浓度 。 深 质 浓 度 随 溶质 分 子 形状 不 同 而 不 同 。 Schlieren 图 谱 中 峰 的 扩散 和 溶质 分 子 的 扩 数 系数 成 比 例 , 因 此 扩散 系数 大 的 球状 分 子 要 在 比较 高 的 浓度 (12mm 池 芯 2 一 10 mg/ml) 进行 测定 ， 而 像 胶 原 之 类 棒状 分 子 可 在 较 低 浓 度 (O.2—1.0mg/ml) 测定 。 用 紫外 吸收 光学 系统 检测 时 ， 由 于 核酸 在 260nm 波长 处 有 很 强 的 吸收 ，12mm 池 世 离心 池 关 样品 浓度 只 要 .0.2 一 1.00.D./mlo 多 数 生物 高 分 子 样品 溶液 的 溶剂 , 为 了 抑止 电荷 效应 ， 选 在 溶质 等 电 点 附 近 的 PE， 并 且 加 氧化 钠 等 中 性 盐 至 讽 子 强度 0.1 一 0.2。12mm 池 芯 的 离心 池 每 次 实验 液 体 用 量 如 下 : ,二 BACB A) 溶液 -08ml we (扇形 角 2?) 溶液 ”0.4ml tet 双 槽 池 ( 扇 形 角 2.5°) 溶液 ”0.5ml ， 溶剂 ”0.5ml (外 透 液 ) 合成 界面 单 槽 池 ( 扁 形 角 4?) «Hw 0.45mi 溶剂 “0.1ml( 外 透 液 ) 2. LBA . | 3 (1) 离心 池 : PI 3- 7 Sauk Sse HEB Fes meta 芯 可 参考 平 列 情 况 选择 : “q ay 单 槽 池 : BPEL, SERADGRRGF S > 2) WBE: PSF AS St RE BBE K CR BE ERA MR» REL TR ah YR ) be as 不 均一 样品 的 组 成 分 析 8 合成 界面 单 槽 池 : 样品 值 小 -一 一 一 一 一 溶 州 林 身 浓 度 梯度 大 (溶剂 本 身 的 浓度 梯度 掩盖 界面 位 置 ) 一 ©) x. 转速 决定 于 界面 移动 的 速度 ， 太 快 太 慢 都 不 好 。 一 般 转速 选 在 运转 一 小 和 具体 数值 参考 表 5- Tlo 表 5-1 沉降 系 效 和 转速 沉降 系数 SX 10 (Hb) 转速 . (rpm) ， <5 转 头 允许 最 高 转速 10 $0,000 20 ; | 35,000 = 30 "285000" 40 25,000. 50 22,000 100 15,000 离心 加 速 过 程 中 要 随时 观察 离心 池 是 否 存在 滩 漏 ， 以 及 样品 溶液 中 是 否 存在 低速 能 帝 降 的 组 分 。 (3) BY: 两 次 摄影 的 间隔 时 间 一 一 般 选 在 界面 汽 降 至 离心 池 液 柱 让 部 这 一 段 时 间 内 摄影 十 次 ,曝光 时 间 随 光源 、 底 片 而 异 , 曝 光 时 间 短 于 :20 秒 可 得 良好 的 照片 。 a 29 。 分 别 正 确 记 下 离心 开始 时 间 、` 到 达 指 定 速度 的 时 间 \ 每 一 Gingiaigik barely i Schlieren 光学 系统 时 还 要 记 下 每 一 RE 3. 沉降 系数 的 计算 、 和 根据 沉降 系数 的 定义 , 式 (2-2) 改写 成 : S 2. 2.303 dlogr 1.367 16000 2.807 1.367 _ 1700 3.168 1.212 17000 3.168 1.21201 SAMO | 3.553 1.080 18000 3.553 1.080 2000 4.387 - ~ 8.749x10-7 ff 20000 4.387 8.709% 10-8 2200 5.308 ‘7.231 22000 5.308 7.231 2400 6.317 6.076 24000 6.317 } 6.076 2600 7.411 5.179 26000 er a 5.179" 2800 4.598 4.464 28000 8.598 4.464. | 3000 9.870 3.889 30000 9.870 1. ' 3.889 3200 1.123% 10? 3.418 32000 1.123107 © 3.418 3400 1.268 3.027 34000 1.268 3.027 3600 1.421 2.701’ 36000 1.421 2: 90P ec 4000 1.755 2.189 40000 1.755 2.187 4400 2.123 1.808 44000. “2,123 1.808 4800 2.527 1.519 48000 2.527 1.519 5200 2.965 1.295 52000 2.965 By (om) 5600 3.439 1.116 56000 3.439 1.116 6000 | 3.948 - 9.722% 1078 . 60000 3.948 - 9.722 10-1 (6400 | | 4.490 8.545 64000 4.490 本 -800 5.671 7,569 “63000 - | 5.671 7.569 27200 5.685 Ht OhreeT his, 72000 5688 6.752" (4. 55 50 45 沉降 系数 [5] 40 沉降 系数 S:o,v[s] 0 : 1.0 2.0 35 浓度 Ce/100m1) 30 : BUS. WETS C20) 254) 304535 a 浓度 (pgyal) 图 5-3 和 牛 血清 白 蛋白 So 对 浓度 © 作 图 图 5-4 PL mirabilis DNA 沉降 系数 的 浓度 依存 性 « 33 浓度 依存 性 小 的 样品 也 可 用 下 式 表示 : S.= 5 人 1- 一 天 re) (5-7) 其 中 Se， S° 分 别 为 浓度 “ 和 无 限 稀 释 时 的 沉降 系数 , 玉 s 是 常数 。 M,, X 10° 聚 。 0. 0.05 0.1 0.150.20.30.4 0.5 KEE C mg/ml) A5-5 血红 和 蛋白 沉降 系数 对 浓度 作 图 图 5-3 是 牛 血清 白 蛋 白 Sow 对 浓度 < 作 Al, 外 延至 < 一 0 求 极 限 沉 降 系 数 3 的 例子 。 图 5-4 & P. mirabilis DNA 沉降 系数 的 浓度 依存 性 可 以 看 出 , 像 DNA 或 病毒 这 类 样品 的 $ 值 非常 大 ， 它 们 的 浓度 依存 性 也 非 常 大 。 如 果 只 在 高 浓度 测定 ， 将 得 出 错误 的 结果 。 因 此 ， 在 这 种 场合 最 好 采用 紫外 吸收 法 检测 ， 尽 可 能 在 低 浓度 测定 。 如 有 可 能 的 话 , 用 30mm 池 芯 ， 浓 度 可 降 至 0.050.D./ml — 以 下 ,相当 于 .DNA 浓度 0.0025mg/ml 或 者 蛋 白质 浓度 0.05mg/ml。 如 用 光电 扫描 记录 ， 浓度 还 有 可 能 进一步 降低 。 S 值 在 高 浓度 范围 内 不 变化 而 在 低 浓度 范围 内 降低 ， 溶 质 是 一 个 解 离 聚 合体 系 的 可 能 性 很 大 。 图 5-5 是 血红 蛋白 沉降 系数 对 浓度 作 的 图 ， 显 示 了 血红 蛋白 在 低 浓 度 时 解 二 、 特 殊 情况 沉降 系数 的 测定 (—) 小 S 值 低 浓 度 , 小 S 值 (Ss 一 1S), 高 扩散 系数 的 溶质 ， 离心 时 界面 刚 离开 该 面 时 即 扩散 ， 很 难 读 出 峰 的 最 高 值 的 位 置 。 这 时 可 用 合成 界面 离心 池 做 实验 ， 在 离心 过 程 中 溶剂 流向 溢 入 表 面 , 人 为 地 形成 界面 ,按照 上 述 同样 方法 从 界面 移动 的 速度 求 3 值 ， 不 过 溶剂 必须 是 样品 透析 平衡 的 外 透 液 。 ~ ) ws 不 能 透析 的 小 分 子 , 可 根据 Baldwin 的 处 理 吃 用 下 式 计 算 : Coz2 = 72 | coexp(=25u**) 一 (ac/ar)ar| + ba r?(dc/dr)dr (5-8) 为 便于 数字 积分 , 令 壮 一 (4. — rm) 十 .2rm(r 一 rm) + 25 AB: Sep? 1 is 2dc¢ is dc 一 一 一 Cr — rm)? — dr 十 -27m (r — rm) — dr¢| (5-9) Tun d Tm dr (=) 溶剂 本 身 浓 度 梯 度 很 大 的 情况 溶剂 本 身 浓 度 梯度 很 大 时 ,离心 过 程 中 会 和 溶质 的 浓度 梯度 重合 ,因此 无 法 判断 溶质 最 高 峰值 的 位 置 (图 5-6)。 这 时 应 该 用 双 槽 离心 池 用 浓度 分 布 的 二 次 和 矩 的 平方 根来 求 $ 值 。 另 一 个 方法 是 用 合成 界面 离心 池 ( 图 5-7), 调节 溶剂 数量 使 合成 的 界面 位 于 相对 来 讲 浓度 梯度 不 大 的 离心 池 中 央 部 位 。 mr 34 « ae alli ee ay anes ce le 图 5 -6 用 标准 池 芯 的 情况 5-7 用 合成 界面 池 的 情况 (=) 大 分 子 DNA 的 沉降 系数 Rosenbloom 等 a9 报 道 了 从 吃 菌 体 T3; T4,T5, T7 制备 的 DNA 沉降 系数 为 30 一 50S， 分 子 量 范围 2 一 8X 107。 沉 降 过 程 中 一 部 分 似 聚合 ,余下 部 分 的 单 体 浓度 决定 于 分 子 的 大 小 和 转速 (图 5-8)。 因此 应 在 不 引起 聚合 的 低 浓 度 和 低 转 速 进 行 测 定 。 《1/cX 10?/ml/r) 人 X 10-*(rad?/s X ¢7) 图 5-8 DNA 单 体 浓 度 和 转速 的 关系 。 T7DNA (4}-¥ 4 25000000, 31S), TSDNA (分 子 fit 84000000, 48.58), T4DNA 〈 半 分子量 )( 分 子 量 65000000,41.5S), | 7 0.05M 磷酸 组 种 浪 ，pH7 .2， 0.2MNaCl。 35 :。 (QO) 差别 沉降 法 把 两 个 样品 分 装 于 两 个 离心 池内 ,其 中 之 一 用 槐 形 窗 ,离心 过 程 中 同时 摄影 ， 测 定 8 值 , 这 个 方法 叫 示 差 沉降 法 。 这 里 讲 的 差别 沉降 法 ,是 指 测定 同一 样品 由 于 环境 变化 引起 结构 改变 产生 的 极 微小 的 $ 值 变化 。 把 两 部 分 样品 分 放 在 双 槽 离心 池 的 两 个 槽 中 ， 用 干 水 光学 系统 观察 它们 之 间 S 值 存在 的 微小 差别 。 Kirschner 等 9 用 差 刚 沉降 法 观察 天 冬 SARS A EERE (ATCase) 的 催化 亚 基 的 结果 , 见 图 5-9。 + 1.5 1.0 45/S[%] 5 0.5 0.02 0 10-° 10+ 10-3 10-7 10-1 5-9 差别 沉降 法 观察 天 冬 氨 酸 转 氨 甲 酰 酶 (ATCase) 催化 亚 基 的 结果 。 Hi 1: ATCase 催 化 亚 基 2X 10-°M 氨 甲 酰 磷酸 锂 十 琥珀 酸 盐 ; ” 槽 2: ATCase 催化 亚 基 2X10”M 磷酸 钾 十 成 二 酸 。 三 :样品 均一 性 的 鉴定 和 不 均一 性 的 分 析 沉降 速率 法 实验 的 目的 之 一 是 研究 样品 的 均一 性 。 在 Schlieren 图 谱 上 , 理论 上 讲 均 一 的 物质 应 是 单一 对 称 的 峰 。 但 是 影响 峰 形 的 因素 很 多 ,样品 不 均一 性 会 使 界面 变 宽 , 8 的 浓度 依存 性 产生 界面 陡峭 效应 ,溶质 的 扩散 、Johnston-Ogston 效应 均 影响 峰 形 。 如 果 说 溶质 均一 是 单一 峰 , 那 未 单一 峰 不 一 定 均一 , 非 对 称 峰 也 不 过 定 不 均一 < 简单 的 扶 Schlieren 峰 的 对 称 性 判断 溶质 是 否 均一 是 危险 的 。 配 合 其 他 分 析 方法 ， 如 沉降 平衡 、 凝 胶 过 小 、 盘 状 电泳 SDS- 丙 烯 酰胺 雍 胶 电泳 等 平行 实验 来 判断 比较 好 。 (—) 多 分 散 体系 的 分 析 对 于 一 些 系统 , 超 离心 机 的 分 辩 能 力 不 足 以 分 离 各 侠 单个 组 分 ,结果 得 到 一 系列 连续 分 布 的 沉降 系数 。 从 不 同 的 起 始 浓度 样品 咨 该 得 到 的 沉降 图 谱 可 以 计算 沉降 系数 的 分 布 函数 g(S)o 沉降 系数 Sy 的 分 布 常用 其 重量 闫 率 函 数 表 示 : BCSDE CI 。 5 (5-10) 其 中 op EERE 假定 界面 变 宽 完 全 是 由 于 So aa 〈 无 扩散 , 无 浓度 效应 ，3 一 Su)， 则 : ui J de/dSo= oir He (5-11) r Acne MATE ( dey — (£) ae) A g(So) = (+) (=) wrt 2 | (5-12) .© 36.0 实际 上 扩散 是 不 可 避免 的 ,所 以 上 述 gi(S) 只 是 显示 的 频率 函数 , 定 为 g*(S)， s= (2)9(=)> 这 里 ,S 只 是 表示 离心 池 中 一 个 位 置 ， 而 不 是 样品 中 某 一 组 分 的 沉降 系数 。 因 此 用 8. 表 示 而 不 用 S 来 表示 。 Te of 由 于 扩散 使 界面 变 宽 , 是 与 夺 成 比例 ,而 沉降 系数 不 均一 使 界面 变 宽 与 站 成 比例 ;外 延至 + 0 时 将 可 去 除 扩散 的 影响 。 做 完 一 次 实验 后 ,在 不 同时 间 * 计算 g*(S) HHA. 后 将 这 一 组 曲线 以 g*(S) BE [g*(S) 17? Xt 1/2 作 图 ,外 延至 零 时 ,得 到 一 系列 S (Ho «BA gS) 曲线 要 校正 的 是 Johnston-Ogston 效应 。 最 方便 的 方法 是 在 稀 深 液 进行 实验 ,这 时 Johnston-Ogston 效应 可 以 忽略 。 用 高 灵敏 度 的 光 吸 收 法 或 干涉 光 系 统 来 做 实验 是 完全 可 以 做 到 的 。 对 于 巨大 分 子 扩散 也 可 忽略 ， 则 可 直接 用 式 (5-12) 计算 (图 5-10)。 为 了 简化 起 见 , 离 心 池 中 粘度 、 密 度 和 压力 均 未 校正 ,如 有 必要 的 话 , 可 按 常 规 方法 进行 。 (=) 多 组 分 体系 的 分 析 ， 多 组 分 体系 在 Schlieren 图 谱 上 出 现 二 个 以 上 的 峰 。 各 组 分 之 间 如 有 相互 作用 将 使 情况 复杂 化 。 体系 中 “ 组 分 的 沉降 系数 Se 不 仅 取决 组 分 “的 浓度 ,还 取决 于 P，7…: 等 组 分 。 相互 作用 使 得 这 个 系统 很 难 进 行 数学 处 理 。 有 实际 意义 的 就 是 前 面 提 到 的 Johnston-Ogston 效应 。 单 用 平方 根 稀 杰 定 则 校正 ， 峰 面 积 之 比 仍 不 能 正确 代表 各 组 分 浓 (b) PA 5-10 (a) JERR DNA 的 光 吸 收 沉降 曲线 (0.004% 在 0.2M NaCl, pH7 中 )， 57980rpm。 = (b) DNA 样品 的 沉降 系数 分 布 〈 不 同时 间 ) 84.7 分 ; A 10.7 分 ; 416.744, (c)DNA 样品 的 沉降 系数 分 布 〈 不 同 转速 ) ©59780; A 42040; 020410, [Schumaker,V. N 和 H. K. Schachman (1957) Biochim Biophys. Asta 23 _ 628—6391, 37 « 度 之 比 , 慢 组 分 的 可 以 出 现 应 有 面积 的 3 一 4 倍 , 必 须 予 以 注意 。 (=) 解 离 聚合 体系 Gilbert” 给 出 了 同一 分 子 解 离 聚合 体系 和 不 同 分 子 解 离 聚合 体系 形成 界面 的 形 状 。 可 逆 解 离 聚 合体 系 中 ,如 果 反 应 速度 很 快 ,多 聚 体 少时 将 观察 不 到 这 个 峰 。 例如 血红 蛋白 在 0.002mg/ml 浓度 时 S FE 2.05 (图 5-5)。 大 于 这 个 浓度 , 沉降 速度 变 大 ，0.25mg/ml 时 ,3S 是 4.6S。 在 这 两 个 浓度 范围 内 ,界面 呈现 一 平均 的 沉降 常数 。 多 聚 体 多 时 ， 将 可 观 察 到 单 体 和 多 聚 体 各 自 的 界面 。 但 是 单 体 和 多 聚 体 之 间 平 衡 常数 因 压力 而 变化 , 图 于 1 是 肌 球 肝 的 单 体 (S%,w 一 6.5S) 和 多 聚 体 (S%,w = 1508) 之 间 平 衡 与 压力 的 关系 Pae 油 BR wie 空气 lia a b 图 5-11 四 、 区 带 沉 降 法 和 沉降 速率 法 不 同 ,区 带 沉降 法 中 样品 不 是 溶解 在 溶剂 内 ;而 是 铺 在 密度 较 样品 溶液 密度 大 的 溶剂 上 面 ， 样 品 成 区 带 状 沉降 。 溶 剂 中 溶 人 小 分 子 物 质 使 溶剂 具有 “自生 ”密度 梯度 性 质 。 小 量 样品 溶液 铺 在 溶剂 上 面 ， 交 界 处 由 于 扩散 很 快 在 样品 区 带 前 面 形成 一 密 度 增加 区 。 只 要 条 件 选 择 合适 ,在 样品 区 带 前 始终 保持 一 密度 梯度 ,沉降 物质 以 基本 不 变 的 组 成 呈 区 带 沉 降 。 沉 降 系数 可 以 从 区 带 中 心 移 动 的 速度 来 计算 ， 和 移动 界面 法 类 似 。 和 移动 界面 法 相 比 ,区 带 沉降 法 的 优点 是 : 〈1) 样品 需要 量 少 ; (2) AR 8 的 组 分 可 以 完全 分 开 ,没有 Johnston-Ogston 效应 ,各 组 分 间 相 对 浓度 完全 可 以 测定 ; (3) 样品 不 需 要 透析 (事实 上 也 不 允许 透析 )。 因此 要 研究 不 同 沉降 介质 的 影响 ， 璧 如 说 研究 pH 的 影 ， 响 , 只 要 改变 溶剂 的 pH 就 可 以 了 。 不 过 溶质 用 量 很 少 ,一般 检 测 用 的 折射 率 法 灵敏 度 不 够 ,需要 用 光 吸 收 法 检测 ,这 就 带 来 了 一 定 的 局 限 性 。 另 外 ;操作 也 需要 一 些 技巧 ,特别 是 不 知道 样品 密度 和 沉降 系数 时 。 如 果 沉 降 溶 剂 和 样品 薄 层 之 间 的 密度 差 不 足 时 ,扩散 梯度 sa 38 。 不 足以 支撑 样品 溶质 ,产生 混和 ;如 果 密 度 差 过 分 大 ,将 观察 不 到 样品 区 带 , 因 为 过 分 陡峭 的 扩散 梯度 使 光 偏 离 光 学 系统 。 样 品 区 带 沉降 过 快 ,会 走出 扩散 梯度 区 进入 纯 溶 剂 区 ,这 时 区 带 不 稳定 而 与 溶剂 混和 。 区 带 沉 降 法 适宜 于 做 扩散 慢 的 分 子 ， 如 核酸 和 病毒 等 的 工 作 。 大 分 子 量 蛋 白质 测定 效果 不 及 它们 好 ， 罗 入 耳光 全 人 (一 ) 样品 实验 条 件 样品 浓度 : ”天然 DNA、 病 毒 粒 子 等 为 0.05 一 0: ited: 扩散 快 的 样品 浓度 要 更 高 一 些 。 区 带 中 心 浓度 保持 在 0.5. O. D.， 样 品 溶液 用 量 10 一 20wl。 沉降 溶剂 : 在 0.5 一 4M NaCl 或 CsCl 中 选用 ,通常 用 0.5M KCl, 1.0M NaCl, 低 离子 强度 实验 可 改 用 50 一 90%DiO 或 蔗糖 溶液 。 不 过 蔗糖 溶液 的 扩散 系数 较 其 他 盐 溶液 为 小 ,由 扩散 产生 密度 梯度 比较 难 。 离心 池 :根据 实验 目的 选用 区 带 沉 降 离心 池 工 型 、II 型 或 III 型 (图 3-6)。 如 果 没 有 这 些 特殊 规格 池 芯 ,也 可 用 合成 界面 离心 池 。 运转 条 件 : 一 般 选 30,000rpm， 20° 进行 实验 。 紫 外 摄影 两 次 间隔 8 分 钟 ,直至 全 部 区 人 带 沉降 到 离心 池 底 为 止 。 离 心 开始 时 如 在 样品 区 带 部 位 有 一 暗 区 ， 表 明 盐 梯度 足够 陡 峭 ,使 光 偏 离 光 学 系统 。 如 果 这 个 暗 区 在 以 后 几 张 底片 中 不 消失 ,实验 应 重 做 ， 选 一 密度 较 低 的 沉降 溶剂 或 者 在 样品 溶液 中 加 盐 。 如 既 不 出 现 样 品 区 带 也 不 出 现 暗 区 ， 则 应 改 用 更 高 密度 的 沉降 溶剂 (更 浓 的 NaCl 或 者 加 CsCl、 芒 糖 )。 如 果 离 心 开 始 时 有 样品 区 带 ; 以 后 消失 ， 那 就 要 降低 转速 。 快 速 扩散 的 区 带 表 示 样 品 可 能 是 多 分 散 体系 ;不 对 称 区 带 可 能 是 多 分 散 体系 ,也 可 能 是 存在 浓度 依存 关系 。 判 别 的 方法 是 用 更 低 浓 度 再 试 一 次 ,如 果 区 带 变 得 对 称 起 来 ,是 浓度 依存 关系 。 (=) 沉降 速度 的 计算 在 光电 扫描 记录 的 图 谱 或 光 密 度 计 扫描 底片 的 图 谱 上 ， 选择 区 带 的 最 高 点 测量 区 各 至 轴 心 的 距离 ro 和 和 常规 方法 一 样 , 以 log 对 时 间 上 作 图 ,计算 沉降 系数 San, RAK 准 状态 So,we 再 从 一 系列 浓度 测定 的 Soow 值 对 浓度 ¢ 作 图 , 外 延至 < 一 0 得 S%,we 样 品 中 如 有 几 个 组 分 ， 可 以 分 别 测定 每 一 峰 下 的 面积 和 最 高 点 的 位 置 。 从 峰 的 面积 可 计算 各 组 分 的 浓度 (假定 各 组 分 消光 系数 是 一 样 的 )o 如 果 各 组 分 消光 系数 不 同 但 均 已 知 ,可 把 各 峰 的 面积 以 各 自 的 消光 系数 除 之 计算 各 组 分 的 浓度 。 :从 各 峰 的 最 高 点 可 计算 各 组 分 的 沉 降 系数 。 Vinograd 等 2 用 本 法 和 常用 的 移动 界面 法 测定 沉降 系数 比较 ,所 得 结果 基本 一 Bo 五 沉降 系数 和 分 子 量 一 部 分 实际 测定 的 沉 部 降 系数 和 分 子 量 分 子 形状 之 间 的 关系 见 表 5-40 六 、 从 沉降 系数 计算 DNA 分 子 量 . 超 离心 分 析 测 定 分 子 量 的 范围 很 广 (10 一 109，, 但 是 对 某 些 巨大 分 子 , 如 DNA 的 分 39 四 5-4 沉降 系数 和 分 子 量 ft fh S¥o,w X 10°(#) i 形 RK PRES 核糖 核酸 酶 1.64 13,680 . 溶菌 栈 1.87 14,100 靡 蛋白 了 酶 原 2.54 23,200. 1 ; ae j 6- 乳 球 蛋 白 2.83 35,000 | ASA 3.55 45,000 $e 血清 白 蛋 白 4.31 65,000 ; 2 血红 蛋白 4.54 68,000 : Tatas 11.3 250,000 PRES 18.6 480,000 Ham r 纤维 状 、 棒 状 蛋 白质 BEE BE it "0.71 6,830 ) EM 细胞 色素 b， 1.31 14,750 | 4 EMER it 2.59 72,000 204 x4904 胶原 3.0 280;000 $154 x30004 DER it 5.5 596 ,000 204 x 1500A ve SF iit 22.3 1,200,000 纤维 蛋白 项 7.63 339,700 i CARAE AR | ; | ‘ aan 核糖 核酸 酶 1,36 13,680 a ae 血红 蛋白 1.04 15,500 MELB | 1.06 17,200 6-9REA 1.40 18, 400 psig | RE AMR 1.5 25,700 醛 缩 酶 1.7 40,000 免疫 球 蛋 白 1.7 40,000 P 血清 白 蛋白 2.4 69;000 WR 4.3 197,000 * BAD FMAK> WE Wt fd 40 11.8% 108 $504 x76004 BiANRE 132 10.6x 10° 烟草 花 叶 病毒 185 31.3% 10° 170A x2800A T7 叹 菌 体 487 37.5% 10° % p4704 x4204 fe p100A x 1504 : *' C. Tanford Physical Chemistry of Mac-omolecules. Wiley, N. Y. 1971, *? 7 6M HEM, O.1M 68- 纺 基 乙 醇 中 测定 [C. Tanford, K. Kawahara & S. Lapanje J. Am. Chem. Soc. 89, 729 1967], 子 量 测定 仍 有 困难 。 然 而 帝 降 系数 与 分 子 量 有 关 ，, 对 同一 构 型 的 DNA 可 通过 经 验 式 由 议 降 系 数 来 计算 分 子 量 。 Oo 线 型 双 链 DNA (NaDNA) 最 佳 经 验 式 是 Suw 一 2.8 + 0.00834M*” (M > 10°) (5-13) 根据 式 (5-137) 计算 的 DNA 分 子 量 列表 5-5 中 。 RSS ROR DNA 的 沉降 系数 和 分 子 量 DNA 来 源 沉降 系数 《Sio,w) Mx 10 xX 174 RF Il 14.3 3.4 17 32.0 25.2 T5+ 51.8 67.9 T4 61.8 108 分 子 量 小 于 10°.My 可 按 下 式 计算 。 由 于 没有 比较 好 的 标准 DNA 样品 ，Sy%,w 与 -M 的 关系 式 (5-14) Aan (5-13) 那样 精确 。 jae Sow = 0.116M°*> (3 X 10°< M <4 X 10°) (5-14) (=) 2144 DNA (NaDNA) ee Bet DNA 的 可 弯曲 度 甚 高 ， 分 子 的 沉降 系数 对 pH, BT REL BESARANK 存 性 5 另外， 分 子 内 形成 氢 键 ， 分 子 的 碱 基 组 成 和 碱 基 顺 序 的 特异 性 也 可 能 影响 沉降 系 数 。 因 此 在 碱 性 pH 溶液 中 测定 较 好 。 如 果 在 中 性 pH 附近 测定 ,样品 溶 流 测定 前 要 加 热 处 理 (90%c, 5 分钟 ), 急 冷 备 用 。 分 子 量 > 10°, 按 下 式 计 算 : Siw = 0.0461M°*® (M > 10°) | (5-15) ( 碱 性 DNA, 0.9M NaCl, 0.1M NaOH, R = 1.160, T = 20—25°c) uf FSi] (1 = [和 : . he le Si,w = 0.00929M°” (M > 10°) (5-16) (中 性 DNA, 1.0M NaCl, 0.01M Tris-HCl 缓冲 液 , pH8, R = 1.144, T = 20—25%) RS-6 线 型 单 链 DNA 的 沉降 系数 和 分 子 量 Mx10-° Sto,W DNA 来 源 TO 单 链 双 链 双 链 单 链 ( 碱 性 ) 单 链 (中 性 ) 中 X714 1.70 . _ — 16.1 27.6 fd 1.90*! — = 17.0*? — Ad. g (半分 子 ) 9.0 (18.0) 27.7 30.7 64.7 7G 12.6 25.2 32.0 37.2 84.8 Adg (全 分 子 ) 15.5 (31.0) 35.1 40.1 95.8 TZ 58 (116) 63.5 123 208 括号 内 的 分 子 量 是 以 双 链 DNA Sw 值 , 由 式 (5-13) 计算 。 ™ S。A. Berkowitz & L. A. Day Biochemistry 22, 4825 (1974). *? Y. Ikchara, Y. Obata, H. Utiyama & M. Kurata Bull. Ind. Chem. Res. Kyoto, Univ. 51, 140 (1973). Als 用 Studier BY S%,w 数据 co, 按 式 (5-16), (5-17) PDH AN RT 果 见 表 5-6. oT aba 分 子 量 < 10° 的 单 链 线 型 DNA 分 子 量 的 计算 ， 和 上 上述 双 链 DNA 情况 相似 ， 也 是 没 有 合适 的 单 分 散 样品 , 较 好 的 经 验 式 如 下 : ne ee Sow == 0.056My (M = 10°) : (5-17) ig (=) 环 状 双 链 DNA 体内 环 状 双 链 DNA 螺旋 之 间 间 距 较 线 型 双 链 DNA 为 长 ， 因为 在 水 深 液 中 曹 积 内 能 。 为 了 减少 这 种 倾斜 ， 双 链 间 形成 超 螺旋 结构 , 这 种 DNA 叫 工 型 。 TRADE DNA Bi 有 一 条 链 断 开 ， 螺 距 回 到 正常 值 ; 分 子 整体 来 讲 不 倾斜 ; 称 佑 工 型 。 I 型 .II 型 环 状 DNA 分 子 量 和 沉降 系数 的 关系 如 下 : r Sw = 0.0139M°™ (I @ DNA) ~ (5-18) = 2.97 + 0.00947M°*? (II 型 DNA) Me FAX. (5-18) (5-19) 计算 的 一 些 DNA 3 FSU 5-7", 表 5-7 环 状 NsDNA 的 沉降 系数 和 分 子 重 | S3o DNA 来 源 本 Mx 10-¢ | I 型 II 型 线 型 dil 型 ) 让 ar SV40 21.0 16.0 14.0 3.40 中 XI174RF 21.0 16.3 14.3 3.59 20.3 15:8 14.4 3.66 8:3 20.2 18.0 6.43. 线粒体 人 39. 2 24.0 12.9 线粒体 38.9 27.6 2459. °' 13.8 细胞 内 Ach 265 53.7 35.8 47 24.6 细胞 内 P22 40 35.2 ; II 4 DNA 分 子 量 是 按 式 (5-137) 计算 。 % ‘42 = 第 六 章 “ 沉 降 - 扩 散 法 测定 分 子 量 高 分 子 的 研究 首先 遇 到 分 子 量 测定 问题 ,分 析 超 离心 机 使 用 方便 ,对 分 子 量 测 定 特别 有 用 s 沉降 分 析 测定 分 子 量 范围 很 广 ,小 自 蔗糖 , 大 至 粒子 量 为 50 X105 的 病毒 ; 多 分 散 体系 可 以 得 到 平均 分 子 量 ， 分 子 量 分 布 。 沉 降 分 析 测 定时 不 需要 知道 溶质 的 形状 和 溶剂 化 情况 。 得 到 的 分 子 量 是 “绝对 "的 ,不 需要 用 已 知 分 子 量 的 标准 物质 来 校正 。 沉降 -扩散 法 和 沉降 平衡 法 是 最 常用 的 两 种 沉降 分 析 测 定 分 子 量 方法 。 过 去 大 量 应 用 沉降 -扩散 法 测定 分 子 量 ,现在 虽然 比较 少 用 ,但 仍 不 失 其 应 用 价值 。 和 沉降 平衡 法 ( 见 第 七 章 ) 比 较 ; 林 法 的 优点 是 ， 对 寡 组 分 体系 样品 可 区 利 用 各 组 分 沉降 速度 不 同 而 相互 分 离 ; 分 别 测 定 它们 的 分 子 量 ( 如 有 扩散 的 数据 提供 )。 在 某 些 特殊 情况 下 ， 分 子 大 小 相似 ， 形状 不 同 ,或 者 形状 相同 ,大 小 不 一 ,只 要 能 利用 沉降 速度 不 同 而 分 开 ,也 可 以 分 别 测定 分 子 量 。 一 些 分 子 量 很 大 的 分 子 , 如 .DNA,，, 不 适用 沉降 平衡 法 测定 ,沉降 -扩散 法 可 以 测定 。 这 类 分 子 通常 也 基于 沉降 系数 来 计算 分 子 量 (第 五 章 第 6 节 )s 一 、 沉 降 -扩散 法 原理 . 当 离心 力 很 大 时 ， 高 分 子 溶质 沉降 。 高 分 子 溶质 受 两 个 力作 用 :: 离心 力 和 移动 时 溶 剂 的 阻力 。 当 这 两 种 力 平衡 时 ， ay dr /4 满足 下 式 : M(1—Vp)wr =f: _ : (6-1) APMED FTE, 了 是 溶质 的 偏 微 比 容 ，2 是 溶液 的 密度 ， oo 是 角速度 ，” 是 距 轴 心 的 距 Bf 是 阻力 系数 。 f 随 高 分 子 的 形状 和 大 小 溶剂 的 粘度 、 高 分 子 与 溶剂 分 子 间 的 相互 YEA Fo 俊 定 高 分 子 在 溶液 里 沉降 所 受到 溶剂 分 子 的 阻力 和 高 分 子 在 溶液 里 扩散 时 所 受到 的 阻力 相同 ; 那 末 RT : 5 ae 0 t 万 a (6 2) HODED RAM, R ERK, TEANEBE. 单位 离心 力 场 下 的 沉降 速度 即 沉降 系数 LF ae 和 ote be tore | A a (2-2) 所 以 RTs: . . M = DU Ve) a (6-3) 这 就 是 Svedberg 方程 式 。 在 相同 的 实验 条 件 下 测定 沉降 系数 ( 苑 第 五 章 ) 和 扩散 系数 ， 以 及 溶质 偏 微 比 容 和 深 RABE MATE). 从 一 个 浓度 测定 的 沉降 系数 s 和 扩散 系数 忆 ， 代 人 式 (6-3)， 计 ”43 % 算 的 结果 是 显示 分 子 量 。 当 然 在 测定 SHDN REMRESLRERFE-R KAR 《6-3) 中 的 温度 和 溶液 密度 就 是 实验 时 的 温度 和 溶 芒 密度 。 用 So,w 和 Da,w 来 计算 时 ， 式 (6-3) 中 的 温度 是 293.2"K， 密 度 是 20*c 时 该 样品 实 际 浓度 的 水 溶 小 的 密度 ,不 过 绝 大 多 数 情 况 下 ,此 值 用 水 的 密度 代替 ,已 足够 准确 。 最 好 是 做 一 系列 浓度 的 测定 (同一 溶剂 ,同一 温度 为 得 到 的 'S 和 忆 值 外 延至 无 限 稀释 (c>0)o #S° Ml D° (ABEABRIEF 20C, 水 ) 以 及 溶剂 密度 ,实验 时 的 温度 代 人 式 (6- 3) 计 算 分 子 量 。 如 果 计 算 中 采用 溶质 偏 微 比 容 了 是 非 溶 剂 化 的 值 ， BAK se 3) 计算 的 分 子 量 就 不 是 溶剂 化 分 子 的 分 子 量 。 二 、 离 心 池 中 测定 扩散 系数 ”有 许多 方法 测定 扩散 系数 ,以 Tiselius 电泳 池 自由 界面 实验 得 到 的 结果 最 好 ,数据 精 确 并 且 重 复 。 但 是 使 用 不 是 很 方便 ,而 且 需 要 较 多 的 样品 。 另 一 方面 ;生物 桩 疮 例如 蛋 自 质 并 不 是 绝对 均一 ,用 的 溶剂 是 缓冲 液 或 者 含 盐 溶液 可 能 存在 一 些 影 响 * 实 际 上 也 限制 了 扩散 系数 的 准确 性 。 因 此 利用 合成 界面 离心 池 来 测定 扩散 系数 同 祥 是 可 行 的 。 在 合成 界 面 离心 池内 测定 扩散 系数 桩 品 需要 量 很 少 ， 离 心 池 液 槽 的 扇形 以 及 离心 时 产生 的 略 有 杰 曲 的 液 面 所 引起 的 误差 可 以 忽略 不 计 。 超 离 心机 内 测定 扩散 系数 的 方法 很 简单 。 用 合成 界面 离心 池 合成 一 个 陡峭 界面 ， 界 面 随时 间 扩 散 ,测定 其 扩散 系数 。 通 常 在 低速 旋转 ,使 粒子 基本 上 不 沉降 。 不 过 即使 粒子 沉降 ,本 法 仍 可 应 用 。 如 果 粒 子 的 扩 敬 有 显著 的 浓度 依存 ， FES hee 这 样 就 要 做 一 系列 不 同 浓度 的 实验 ,外 推出 Ds。 实验 方法 用 相对 来 讲 浓度 比较 高 的 蛋白 质 深 1 HACE ANE on BH EOSRAM A DMARD, BMH HSRC 20°), 转 头 加 速 到 6,000rpm， 12 FMBAA MMA AOA. ESM BK, 000rpm 后 降 低 电 压 ， 但 不 停机 ， 使 转 头 目 由 地 慢 慢 降 速 。 温度 控制 在 测定 沉降 速度 时 同 祥 的 温度 。 在 1 一 3 小 时 内 ， 开 始 时 每 隔 2 分 钟 摄 一 张 Schlieren 图 谱 ， 以 后 可 隔 4 分钟 、8 分 钟 、16 分 钟 等 拍摄 一 张 。 (=) 结果 计算 ES) 心机 中 测定 扩散 系数 , 用 en 光学 系统 检测 ， 可 用 抛 点 法 ， 也 可 用 高 -面积 法 计算 。 扩散 界面 和 折射 率 梯 度 的 关系 是 : On An apr ; —_ | = ex : } - 6-4) vy. inl, Dy ' i : KRhseBiHS.DET RAM, Ze, * ZIBB. 7x = ON, 0n/6x 有 最 大 值 sa 44 « (#) 二 一人 2 ERASE Meg . NOx DBE 2 Af eDt HeRIB AMY fA 只 要 使 (22) 一 0 期 可 ,因此 二 at | x} = 2Dt 4 (6-6) 其 中 脚注 i 表示 拐点 。 结 合式 (6-4); (6-5), (6-6) 得 : Rin Mash sk i (#)- (3 hai an 只 其 请 6=72 用 Schlieren 光学 系统 检测 ,底片 上 的 图 形 纵 轴 以 了 表示 ;横生 以 叉 表 示 : 则 ” On _ ‘ a KY (6 8) Ri tha An= = \" Yds 上 (6-9) 其 中 天 是 仪器 常数 , 忆 是 X 轴 的 放大 倍数 , 4 是 峰 下 的 面积 。 将 式 (6-5) SH (6-8), (6- 9) 结合 2 SS 和 六 Ant ue 结合 式 (6-7), (6-8), (6-9) | Yi; = Yaxexp (6-11) 由 式 (6-11) 可 从 曲线 求 得 两 个 Xi 值 , 结 合式 (6-6) 得 : + [XV 2 p-+ |%| 7 (6-12) XK (6-10) 是 高 -面积 法 计算 的 根据 ,而 式 (6-12) SHAREWARE [ 例 ] 酵 母 醛 缩 酶 扩散 系数 测定 (拐点 法 ) 呈 。 ec 一 12.84mg/ml。 LU xi 对 时 间 ( 以 种 为 编号 | 时 间 ( 分 7 了 最 大 F xi(X107) | x#(< 10°) 1 4 1.695 2.1733 3.68 1.35 3 8 1.725 2.1733 3.91 1.53 5 12 1.625 2.1733 4.40 1.62 7 16 1.510 2.1733 4.67 2.18 9 20 1.385 2.1733 4.72 2.23 il 24 1.300 2.1733 4,90 2.40 13 28 1.235 2.1733 5.52 3.05 5 : 32 1.210 2.1733 5.64 3.18 17 36 1.150 2.1733 5.87 3.45 19 40 1.112 2.1733 6.18 3.82 21. 44 1.067 2.1733 6.33 4.00 23 48) 1.035 2.1733 6.59 4.34 单位 ) 作 图 ,用 最 小 二 乘法 得 x? = 11.6040.27 X 10-72 十 0.94 士 0.05 X 107? Dax = 5.80+0.13 X 10-7cmz2/ 秒 mw 45 « 高 -面积 法 的 计算 : “测量 Schlieren 峰 下 的 面积 4， 峰 高 (Yax)， 以 42/Y3xr 对 时 间 z(〈 单 位 : 秒 ) 作 图 ,所 得 直线 的 斜率 除 以 12.566〈4x)， 得 到 显示 扩散 系数 。 如 要 测定 无 限 稀释 时 溶 流 的 扩散 系数 Do， 可 做 一 系列 不 同 浓度 的 实验 ,外 延至 零 浓 度 。 测 定 Diw> 可 利用 下 式 293.2 t Daw 一 Dax( 227) (22) (Ras) : bag AEE SAER TAD RAL TOLARAA REE Be YA REA AE 状 是 Gaussian 分 布 。 低 浓度 样品 可 用 光 吸 收 法 测定 。 t ti « 46 « | ”第 七 音 . 7 ) tera cHE, 在 较 小 离心 力 场 由 由 于 高 分 子 的 离心 沉降 (产生 小 度 梯度 ) 和 扩散 (了 减 小 浓度 宰 度 ) 两 种 相反 的 作用 达成 平衡 ， 离 转轴 不 同 距 离 处 的 浓度 分 布 就 达到 一 恒 稳 值 ， 不 再 改变 (图 2-6)。 沉降 平衡 法 就 是 利用 沉降 平衡 时 离心 地 中 溶质 的 浓度 分 布 来 计 算 溶 质 的 分 子 量 。 在 超 离心 沉降 分 析 发 展 的 历史 过 程 中 ,最 先 应 用 的 技术 就 是 沉降 平衡 法 。 限 于 早期 实验 条 件 的 困难 , 不 久 就 很 少 应 用 , 有 一 段 时 间 几 乎 完全 为 沉降 -扩散 法 取 代 而 不 再 应 用 。 以 后 由 于 超 离 心机 性 能 改进 ,特别 是 光学 检测 系统 的 改进 ,沉降 平衡 实验 变 得 好 做 了 ,加 上 理论 基础 比较 完善 ,实验 方法 的 发 展 ,测定 的 分 子 量 数据 比较 正确 ,因此 近年 来 沉降 平衡 法 测定 分 子 量 又 再 度 岂 起 , 占 子 绝对 优势 。 沉降 平衡 法 测定 分 子 量 有 两 种 主要 的 实验 方法 ， 即 低速 沉降 平衡 法 和 高 速 沉 降 平 衡 法 。 它 们 的 优 缺 点 见 表 7-1。 另 外 还 有 超 短 液 柱 沉降 平衡 法 , 它 可 缩短 离心 时 间 。 表 7-1 低速 沉降 平衡 法 和 高 速 沉 降 平 衡 法 的 比较 了 “低速 平衡 法 高 速 平衡 法 液 底 浓 度 和 流 面 浓度 之 比 ，Cs/ Cn 35710 oa : 1000—20,000 起 始 浓度 2—20mg/ml 3 “* 0.1—2mg/ml WERK Lv. 要 saad A? Ke | 到达 平 衡 需 要 的 时 间 5 O&K 短 离心 池 液 槽 形状 2 扇形 不 是 扇形 亦 可 数据 精确 度 ; 高 低 : 允许 测定 的 浓度 范围 狭 宽 由 浓度 分 布 得 到 的 分 子 量 My ,Mz* Mn, Mw, Mz* * My, My, Mz 分 别 是 数 均 分 子 量 ) 重 均 分 子 量 ,Z 均 分 子 量 , 即 | > 号 n;M; 这 C M, = = é rer >» 2: 23 C;/M ee Seam 27M “Dean ) aks iho deat Ms REM; Hi aDFOAF Ed 一 、 低 速 沉 降 平衡 法 测定 分 子 量 [所 谓 低速 沉降 平衡 法 的 “低速 "是 和 高 速 沉降 平衡 法 相对 而 言 的 。 低 速 沉 i Ya 是 传统 的 碗 降 平衡 法 。 理想 盗 被 或 近似 理想 咨 液 达 到 沉降 平衡 状态 时 ， 上 距 转 轴 轴 心 + 处 所 有 分 子 的 总 浓度 “47, 和 重 均 分 子 量 Mw(r) 有 下 列 关 系 : 机 《9 bay 和 dlnC C1. Vp duo? ar’ 其 中 了 是 溶质 的 偏 微 比 容 Gy; p 是 溶液 的 密度 ; ;在 稀 深 液 时 以 溶剂 的 密度 po 代 之 ; R 是 气体 常数 〈8.313X 10" 尔格 / 度 ， 克 分 子 ); 工 是 绝对 温度 〈"K); @ 2 REE COMBE / BD), 即 转速 (rpm) x 2 50。 因此 在 计算 分 子 量 时 ， 要 知道 沉降 平衡 时 离心 池 中 各 处 的 溶质 WEE HERE IRB. lami Aas ese. | RRM F Oe HR AR EAE AS RAE Sie 和 质 小 度 的 分 布 再 要 用 其 他 方法 测定 起 始 浓度 ci， 然后 用 十 列 条 件 式 计算 i r+ Cdr as Ge 5 At — 7) ) | (7-2) (7-1) Hy, r, 分 别 是 轴 心 至 液 面 和 流 底 的 距离 (一 ) 实验 方法 LEBER ”沉降 平衡 实验 每 次 测定 时 间 很 长 ,费用 也 较 贵 ,因此 样品 最 好 用 其 他 方法 测定 其 均一 性 ,并 且 初 步 估算 它 的 分 子 量 。 样品 对 溶剂 充分 透析 (过 长 或 更 长 时 间 ); 如 有 杂质 先 用 制备 超 离心 机 离心 除去 s 溶质 浓度 : 在 0.5 一 5.0mg/ml 浓度 范围 内 测定 三 个 浓度 。 如 用 光电 扫描 装置 检测 ， 蛋白 质 浓 度 为 0.05 一 1.0mg/ml, 核酸 浓度 为 0.01 一 0.1mg/ml。 溶剂 ， 同 沉降 速率 法 实验 ,务必 使 电荷 效应 减 至 最 少 。 oa oh te FRE 0 10.2 Silo ETE RAE ERE REAR 2. 光学 系统 ”如 果 用 光电 扫描 装置 ， 离心 池 中 深 质 的 绝对 浓度 可 以 直接 测定 ,不 需 要 另外 再 测定 起 始 浓度 。 所 得 分 子 量 精确 度 甚 高 ， 只 是 目前 这 不 装置 还 不 普遍 用 摄影 记录 光 吸 收 法 ,虽然 早年 Svedberg 曾 应 用 过 ;但 是 定量 困难 ， 一般 不 能 满足 要 求 ;实际 上 时 已 停 用 。 最 常用 的 是 干涉 光学 系统 。 干 涉 光学 系统 虽然 两 点 间 浓 度 差 测定 误差 可 小 于 1 9 ， 但 是 要 另 做 实验 测定 起 始 浓度 ,并 且 液 面 和 液 底 的 浓度 读数 困难 , 容易 引进 误差 。 sdhlieren 光学 系统 精度 较 低 ,但 是 比 起 干涉 光学 系统 , 它 不 需要 作 浓 度 校 正 。 有 些 计算 方法 不 需要 另 做 实验 测定 起 始 浓度 ， 不 需要 测量 液 柱 两 端的 图 象 。 特 别 是 它 可 以 在 较 高 样品 浓度 和 较 高 盐 浓 度 下 测定 ， 可 用 于 高 浓度 的 盐酸 肌 和 BRIA Wer MUSH PS EOS FLOM, 3, 离心 池 选用 双 槽 离心 池 。 转 速 在 20,000rpm 以 上 时 ;用 石英 窗 光 线 会 产生 偏 折 , 宜 用 宝石 窗 。 离 心 Ne meme HIRI Cink 7-1 所 示 ) 一 仙 装 咨 波 ， 一 便装 湾 刘 ， 有 固定 位 置 不 能 搞 错 | 至 于 哪 二 侧 液 槽 盛 溶液 中 哪 一 aa 侧 液 槽 盛 溶 剂 , 请 参阅 离心 机 说 明 书 。 Beckman AR] Spinco E 型 分 析 超 离心 机 是 堪 侧 为 溶液 覃 )。 为 了 使 液 底 明 显 ,在 溶液 槽 中 另 加 密度 较 样 9 48 ° 样品 品 溶液 密度 高 但 和 样品 盗 液 不 互 溶 的 号 液 。 MARR A PC43 ( 气 油 )， 硅 狂 或 四 氧化 Bk 2 ERO ASE TROT, — OE 液 用 量 为 : ea 0lol | Iw 0.01—0.02ml | ，， IH 外 透 液 0.13—0.14ml (mbt eB) 4B OARTEUESE, 转 头 的 振动 将 影响 靖 度 。 12000rpm UL FA An-J #34, Be 时 用 An-H 或 An-D 转 六 | | : S.#R | MRO, 液 面 利 液 底 浓度 差 越 大 ， 分 子 量 测定 精度 越 高 。 转 速 过 分 高 将 使 液 底 的 浓度 变化 (aC/dr) 变 得 很 大 ,以致 光线 偏离 光 轴 。 通常 取 ciyca = 3, 这 时 FEE HAIG (Cs, Cm 分 别 是 液 底 和 液 面 的 浓度 )。 | Co! Cn REMIX AINE A 这 是 将 式 省 1) A te ro 积分 : G MOA @ : 2 1 o( 2) - MGR aay o- FAX. (7-3) 计算 3mm 液 柱 时 ， 各 C3/Ch (5) FRAO AOE 7-211, ET = 283°K, V = 0.73(ml/g) p= = 1.00g/ml; rp = 7.2m, tm = 6.9m, # 7-2 ae 值 和 分 子 量 与 转速 的 关系 .; 转 iit pm) . 9.0 wee Hs Ad St 72cm; tre = 69cm; T= 283°K; V = 0.73ml/g; o = 1.00g/ml, | ERE TE MEN ARATE RT 中 。 9] 7-2 3mm 液 柱 时 分 子 量 、 沉降 系数 与 转速 的 图 解 。 如 果 不 知 道 天 约 的 分 子 量 风 可 先进 行 一 沉降 速度 实验 ; 头 致知 算 一 下 沉降 系数 ;然后 利用 图 (7-2) 选择 转速 。 6. 到 达 平 衡 时 间 的 推算 ”离心 开始 时 离心 池 中 溶液 是 均一 一 的 到 达 嘉 下 平衡 时 间 误差 小 于 0.1% 的 离心 时 间 zw HE FRITS: toon = 0.67(7 — 1m)?/D = 0,67( rs. = tm)?M (1 — Vp) /SRT (®) (7-4) 7. 缩 短 到 达 平衡 的 时 间 ”从 式 (7-4) 可 以 看 出 ， 第 一 项 (>* 一 re) BN, 到 和 大平 衡 的 时 间 越 短 。 但 是 * 一 rw 代表 液 柱 的 高 KREBS. OF RRA, WEBER. BI 如 Smg/ml 蛋白 质 深 液 液 柱 3mm 时 ,分 子 量 误差 小于 目 %; 而 液 柱 Lam Hy 到 达 平 衡 时 « 49 « 7-3 Rit 3mm, G/CC, 一 3 时 合适 的 实验 条 件 %& 质 分 子 量 Dy,w X 107 w(rpm) to.ooi(Chr) e’(hr) WUE bt 570000 MRIS 10,700,000 和 烟草 花 叶 病毒 50000000 2800 15.3 660 ili 330 核糖 核酸 酶 12400 11.9 19000 1.3 7A BS 14100 10.4 17000 1.5 BEE 5 Ag 23200 9.5 14000 1.6 6-7LREA 35000 a; 12000 2.0 SAA 45000 2 I0000 2.0 血红 蛋白 > 60,000 6. 9100 2.2 血清 白 蛋白 66009 5. 8300 2.6 过 氧化 氢 酶 250,000 4. 4300 3.8 纤维 蛋白 原 330000 2 3500 9.7 aes 480000 3. 3100 45 a 1 . 0.: 近似 沉降 系数 = =] ma BE OB, Sl SY i 已 8 at ¥ & x10” 7-2 间 缩 短 9/10 (也 就 是 说 只 需要 原先 时 间 的 1/10), HOFRREAID™, 显然 必须 有 一 定 高 度 的 液 柱 才能 进行 浓度 分 布 分 析 。 缩短 到 达 平 衡 时 间 的 一 个 主要 方法 ， 是 离心 开始 时 以 高 于 平衡 实验 所 需 的 转速 o ite e— EM’, RABEL OLB w。 Herner 等 "实测 的 结果 见 表 7-4。 Richards 等 吧 把 提高 的 转速 w' 和 在 这 个 转速 旋转 的 时 间 二 用 式 〈7-5) 表示 ; Ca/cu 一 1 一 In(CCcs/Cn) (7-5) MAri'— in(C;/C,) hy, #ihA= Oa teer * 是 实验 条 件 下 的 沉降 系数 。 - ARGEXR (7-5) > LABIA Co/ Cm MRA, Co/ Cm — 1 in (C6/Ca)- 和 (cu/ca) 的 关系 见 图 7-3。 具体 的 实验 步骤 如 下 : C1) Ra’ = didi, 用 式 7-5) 计算 二 实际 旋转 时 间 再 加 10%; * 50. 2w*st’ PP 表 7-4 缩短 到 达 沉 降 平衡 的 时 间 # Cit) t (小 时 7 Te (小 时 ) 核糖 核酸 酶 13,690 | 13,000 14 2.2 14 RK 5,800 14,400 15.2 - 16.0 76 14,750 12,900 4.1 4.8 ae xz 采用 本 法 达到 沉降 平衡 的 时 间 。 ， ze 用 选 定 转速 达到 沉降 平衡 的 时 间 。 Ce/Cr 1 2 3 4 5678910 0.9 0.6 7.0 5 0.7 é 0.4 5.0 2 0.5 g S 0.3 0 he 2 3.0 & 0.1 00.2 os Lo 44 Th, 2.2 1.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 — O 0.3 0.5 0.7 0.9 InC/Cm 8 图 7-3 Cs/Cm A Cs/Cm — 1 — In Cy/Cy 图 7-4 C,/C, 5BWKR (Cs/Ca) InC/C。 的 关系 (2) 立即 减速 至 0.7o" ,旋转 5%* 时 间 ; (3) 尽快 加 速 至 选 定 的 沉降 平衡 转速 w。 一 些 蛋白 质 样品 溶液 , 液 柱 3mm，Cs/ Cn 一 3 时 的 o, wo’, 2’ WR 7-3. 其 中 沉降 系 数 . 扩 散 系 数 均 用 该 浓度 测定 值 代替 Sow 和 Dg,r， V 设 为 0.73。 另 一 个 缩短 到 达 平 衡 时 间 的 方法 ,是 借助 于 合成 界面 离心 池 ,使 离心 开始 时 离心 池 中 “样品 溶液 不 均一 。 Pasternak 等 2 用 合成 界面 离心 池 使 样品 溶液 在 离心 开始 时 呈 阶 梯 式 浓度 曲线 ,可 缩短 3/4 的 时 间 达 到 平衡 。 这 种 阶梯 浓度 曲线 的 选择 ,取决 于 最 终 希 望 得 到 的 浓度 分 布 曲线 、 离 心 池 中 阶梯 位 置 的 选择 、8 以 及 样品 溶液 原先 的 浓度 比 CCi。 图 (7-4) 表示 了 Cs/ Cn 一 3.3 时 ， Ca/ C: 与 8 的 国 数 关系 ， 可 以 看 出 曲线 有 一 段 是 很 平 的 ， 因 此 实验 时 加 入 离心 池 中 的 溶液 量 不 那么 严 格 。 Griffich2” 用 了 一 个 改进 的 池 芯 (图 7-5)。 离心 开始 时 ,浓度 分 布 曲线 有 四 个 阶梯 ,在 同样 AU HEE RET , 结 合 上 述 提 高 转速 的 方法 ， 平衡 CF TAU EEE ay Teo ee 到 达 时 间 还 可 缩短 2/3, Griffich 测定 核糖 核 图 7-5 池 芯 kena fa 135004150, 与 根据 氨基 酸 组 成 计算 的 结果 13683 完全 一 致 ， 员 用 了 48 分 钟 (20410rpm)。 8. 运转 实验 开始 前 , 调节 离心 转 头 腔 的 温度 在 15 一 20% ,之 间 ， 待 转 头 温度 接近 实验 温度 ,精确 测定 平衡 到 达 时 的 转 头 温度 。 为 了 校正 离心 池 窗 的 折光 ,确认 让 面 和 液 底 的 位 置 ,在 溶质 分 布 尚未 形成 前 ， 各 摄 一 - Sl ~ Wi 26 Ais A Schlieren Hive 加 速 到 预定 的 平衡 转速 的 工 5 CAKE AERIAL), 用 Schlieren 光学 系统 "相差 片 月 度 60°, 不 时 观察 图 象 。 这 时 Schlieren 图 象 应 像 图 六 4 这样 变 化 。 如 果 不 是 这 样 的 话 ; 可 以 随时 更 换 速度 。 当 拍 下 图 7-6e 这样 的 图 象 时 ( 约 为 估算 的 平衡 时 间 的 115), 降 速 到 预先 选 定 的 平衡 转 速 ,保持 此 转速 直至 计算 所 需 的 平衡 时 间 ， 或 者 在 观察 屏 上 观察 到 如 图 区 7 这 样 的 图 象 。 每 隔 1 一 2 小 时 拍摄 一 次 ， 将 3 一 5 小 时 内 拍 的 图 象 选 择 坏 定 长 度 (Ar) 测 定 干涉 条 纹 的 变 位 。 如 果 小 于 0.03 条 纹 (90n), TUHEAE Ms WRAL, Wee 旋转 ,直到 满足 下 列 要 求 ， 凡 离心 时 间 在 24 小 时 内 ,应 在 3 小 时 内 底片 上 没有 变化 离心 时 间 超 过 :24 小 时 ,应 在 5 小 时 内 底片 无 变化 。 如 转速 选择 赂 为 高 高 一 些 ， 液 底部 分 条 纹 难 CAR WUE 10% RRA EB | 二 图 77 | 到 达 平 衔 后 ， ae DURTER A ROHN 然后 改 用 Schlieren 光学 系统 ， 不 同 相差 片 角度 拍摄 。' 记 录 下 转 头 的 温度 ， PREM T 训令 全 t¥ 全 部 底片 冲洗 出 来 并 得 到 满意 的 照片 后 ,停机 。 (=) 起 始 浓度 的 测定 为 了 计算 分 子 量 , 必 须知 道 起 始 浓度 。 并 不 需要 知道 尖 质 的 绝对 起 抒 浓 度 只 要 才 达 起 始 浓度 的 单位 和 平衡 实验 时 浓度 单位 相 一 致 ,也 就 是 说 平衡 实验 如 用 干涉 光 检 测 ?浓度 以 条 纹 数 或 条 纹 移 位 (An) 表示 ，Schlieren 光学 系统 以 峰 下 面积 表示 Com?) 5 紫外 吸收 光 FRR TE ICH Eo T¢ « 52. 用 合成 界面 离心 池 进 行 起 始 浓度 的 测定 ， 方 便 而 且 正确 (图 7-8) 干涉 光学 系统 测 定 界 面 处 条 纹 移 位 ，Schlieren 光 en , 学 系统 测定 峰 下 的 面积 代表 洲 质 | Lb. ORE. HERSKA lle na im 测定 起 始 浓度 ， 有 时 也 会 在 沉降 FT = 差 ， 其 原因 可 能 是 (1) 合成 界面 离心 池 中 溶液 和 沉降 平衡 实验 的 | 溶液 不 完全 相同 ， 例 如 沉 降 平衡 FP 实验 时 可 能 样品 产生 不 可 逆 解 离 聚合 ， 离 心 池 底 部 产生 沉降 以 及 池 壁 吸附 等 情况 。 或 者 扇形 端面 有 些 渗 漏 ,界面 过 旱 合 成 ,液体 对 — a. 流 扰 动 梯度 等 。 (2) 透析 如 不 充 | ois 分 ,浓度 也 测 不 准 。 溶 液 中 盐 浓度 高 时 ; 盐 浓 度 会 使 测定 产生 误差 5 盐 浓度 稍 高 时 ,将 会 观察 到 峰 不 扩散 。 因 此 ,实验 过 程 中 应 很 好 监视 界面 的 情况 ,如 有 反常 ， 应 重新 把 样品 透 折 平 衡 后 再 做 。 a | 1. 样品 溶液 ,溶剂 ”样品 的 溶液 和 溶剂 应 和 沉降 平衡 实验 用 同一 个 ,因此 平衡 实验 用 剩 的 部 分 样品 溶液 和 溶剂 应 密闭 保存 ,使 溶质 和 盐 浓度 保持 不 变 。 2. 离心 池 ， 用 毛细 管 型 双 槽 合成 界面 离心 地 《沉降 平衡 实验 最 好 也 用 同一 离心 池 进行 )。 PR REHTMPAIE 0.15ml, oS EN Dea Weal 加 该 时 注意 ， 务 必 在 离心 池 直 立 时 ,毛细 管内 无 液体 。 如 果 沉降 平衡 实验 用 同一 毛细 管 型 双 槽 合成 界面 离心 池 ， 也 可 以 这 样 操作 。 平 衡 实 验 结 束 后 ,取出 离 忘 池 ; 轻 轻 地 来 回 倾倒 几 次 ， 使 样品 溶液 再 度 均 一 。 然 后 把 离心 池 的 样 曲 注 人 和 孔 朝 上 ,注意 勿 使 毛细 入 接触 液体 。 打 开 溶剂 模 的 关 > 加 入 同样 的 溶剂 使 满 ; 加 民 盖子 密闭 ,准备 离心 。 Ad 3. 运 转 离心 池 放 人 转 头 内 , 待 温度 充分 平衡 后 ,开始 离心 , 慢 慢 加 速 , 选 择 和 沉降 平衡 实验 相同 的 温度 和 转速 。 加 速 至 8000ipm At, WHR AMM ARM ARES 正常 。 一 是 两 槽 液 面相 等 , 拍 下 第 盖 张 焉 片 ;并 记 下 时 间 。 以 后 隔 一 定时 间 摄 影 。 记 下 各 次 摄影 时 间 。 FA Schlieren 光学 系统 时 ， 相差 片 角度 应 当 和 平衡 实验 时 Fo GS Ss BE sere (=) 分 子 量 计 算 [ 例 ] 1. 起 始 浓度 计算 . 取 几 张 用 合成 界面 离心 池 做 实验 拍摄 的 底片 ， 测定 界面 位 置 处 的 干涉 条 纹 移 位 (第 四 章 第 4 节 ) 或 Schliera 峰 下 的 面积 。 如 果 界 面 移动 , 取 原先 界面 刚 合成 时 的 位 置 作为 r， 对 每 一 张 底片 的 条 纹 移 位 或 峰 面 积 乘 以 (rzi 作 校正 。 AUR 释 校正 后 浓度 仍 随时 间 而 减少 时 , 则 需 进 一 步 外 延至 上- 0 取 值 ii 设 本 例 用 干涉 光学 系统 合成 界面 离心 池 摄 得 底片 条 纹 移 位 fo = 28 X 150pnm: 士 32pm = 42324m = 4.232mm = 0/4232cm, eo BS 6 DARE ELEREAPREAEAW © PBA Schligen AM =, gr, } Se aS aa eee ry 5.6 + A 4 其 中 刁 是 和 轴 放 大 倍数 。 «Ol Fisa 2 .05。 外 延 值 35.029mm x I fas ; Rit, G 38.285mm es 和 ae » = > Pe Faas sK tah 2B 38.2 38.4 38.6 38.8 39.0 ~ 40.6 40.8 41.0 41.2 41.4 比 长 仪 了 轴 读 数 Cmm) 7-9 RARE * 值 的 测定 3. 平衡 图 谱 条 纹 移 位 的 测定 ”阅读 干冰 条 纹 要 很 当心 ,底片 在 比 长 仪 下 图 象 的 X 轴 必 须 和 比 长 仪 的 科 轴 平行 干涉 条 纹 移 位 有 两 种 读 法 。 一 种 方法 是 选择 适当 的 在 了 轴 方 向 上 某 -一 位 置 ， 然后 沿 区 轴 移 动 ， 顺 次 阅读 明 线 或 暗 线 中 心 的 入 轴 坐 标 位 置 。 另 一 种 方法 是 选 定 某 一 明 线 或 瞳 线 , 在 和 X 轴 上 等 间隔 阅读 该 条 纹 的 Y 轴 值 。 后 面 这 种 方法 在 作 流 面 浓度 计算 时 较 复 杂 , 不 : 过 条 纹 倾 斜 不 大 时 ( 即 起 始 浓度 低 , 转 速 小 时 ), 不 得 不 用 这 个 方法 。 下 面 是 这 种 方法 的 读 Bo ) 为 了 取 读 数 的 平均 值 ,至 少 需 读 5 条 条 纹 。 从 波 面 开始 沿 X 轴 作 等 距离 移动 至 液 底 ， 每 隔 0.1—0.2mm 读 一 个 并 值 。 条 纹 移 位 过 大 ， 以 致 于 不 能 阅读 ,可 以 加 上 下 一 条 新 条 纹 。 以 条 纹 半 宽 (150um) 的 5 fF BN 750um 加 到 新 读 出 的 条 纹 值 来 表示 。 沪 面 和 该 底 的 Y 轴 读数 , 系 以 了 值 对 和 作 图 ,外 延至 X。 FX, 来 计算 ( 见 图 7-9)。 至 轴 心 的 距离 ALY 轴 读 数 的 平均 值 Y,(mm) 列 于 表 7-5 中 。 4. 液 面 浓度 Cn 的 测定 (7-2) 可 改写 成 : | fr (C+Cy)r .ar 一 = (C; = Cn) Or? — 72) (7-6) 进一步 按 下 式 用 条 纹 移 位 计算 : | Ge fade dr = 2 hy ta — 72) (7-7) 式 (7-7) 左边 从 表 (7-5) 中 (太一 加)r 项 内 数值 积分 来 求 : © 54 。 | (二 加 Si 8400 一 3.8285272， 05 Xx 0 ‘4a + 0.02/2. 05. {0541/2 + (1. 534i 2.45 Lobes: 1+ .16.445) (ay ' | a * +. 17.915/2}. ite a. 1509 <4. -1400)/2. 05 x ge 915 + 18. hae? wi ae aS 7 235(mm.- eat) “a ) RTS 低速 沉降 法 测定 > 和 站 轴 读 数 的 平均 值 ; 2 (y 一 ey) * ag BD eT 1 r 条 纹 移 位 (mm Xcm) * i 1 . HEE AN Y 4h 人 r= Ya) Bp 3% | Yahav Fe i G. he fm) (nm) r rem). , 0. 898 基准 ) ary | 3.8285 (xm) | 7.050 (rm): | -49.717，| 32.430( 外 完 | 二 0 0.491 3.8400 7.054 49.759 | 32.507 0.077 0.502 "3.8600: °° «| “7.064 = |} 49.000 | 32.644 0.214 0.520 3.8800 7.074" |- 50.041 |322777 0.34% ii * 0.537 3.9000 7.084 50.183 | 32.89). 0.461, 0.551 3.9200 7.093 50.311 | 33.031 0.601 0.568 3.9400 7.103 50.453 | 33.172 0.742 0.584 3.9600 7.113 50.595 | 33.317 0.887 0.601. 3.9800 7.123 50.737 .| 33.469 1.039 0.617 4.0000 7.132 50.865 | 33.635 1.205 | 0.634 4.0200 7.142 51.008 | 33.798 .. 1.368 0.650 4.0400 7.152 51.151 | 33.963 me 0.666 4.0600 7.162 51.294 -| 34.135 1.705 0.682 4.0800 7.171 51.423 | 34.318. 1.887 _ 0.698 4.1000 7.181 51.567. | 34.513 2.083 0.714 4.0200 7.191 51.710 | 34.717 2.287 0.731 4.0400 7.201 51.854 | 34.918 2.488 0.747 4.1509(xp) 7.205 (45) 51.898 | 35.029( 外 延 ) | __ 2.599... 0.756 其 中 2.05 是 放大 倍数 。 式 〈7-7) 右边 的 思 是 用 合成 界面 法 求 得 的 起 始 浓度 ,在 这 里 fo = 4.232mm, (+? — ¥2,) = 51.898 — 49.717 = 2.181(cm’), | 1.335 = (4.232 oh KC ISL fm = 3.099mm 5. log 轧 对 产 作 图 以 求 得 的 如 代入 表 (7-5) HG, — fe) Hit fo Wlogf, 二 作 图 (图 7-10)， 取 其 斜率 。 因 为 jos C.， 所 以 斜率 dlogf,/dr? = dlog C-/djz LAK 《7-1) 计算 分 子 量 。 本 例 赤 一 0.744mlyg p = 1.003(0.1MKCI) R = 8.313 X 107 尔格 / 度 . aE T = 297.0°K a = Gic6' x == ot 6.43 x 10? 弧度 /各 ‘ Nye ES (1=Vp)w, 2r2 号 55 * [ 例 ] 1. 起 始 浓度 测定 ”测定 每 一 张 合 成 界面 离心 池 实验 的 底片 上 界面 处 总 的 条 纹 移 位 log, ofr dlog /dr* = 0.117 50.0 50.5 51.0 51.5 r°(cm’) 图 7-10 ,log 轧 对 靖 作 图 中 心 , 同 样 记 下 和 轴 的 标尺 读数 (第 1.5 条 纹 ), 如 此 重复 ,直至 读 完全 片 。 最 后 记 和 最 未 uae. daiemacall Reaiahed ite moa iieabebiiiibe es: # (7-6) 中 。 J, 对 时 间 * 上 作 图 ,外 延至 :一 0, Hh J 相当 于 起 始 浓度 Co, 本 例 为 7.23 条 纹 。 2. 测定 每 一 条 条 纹 中 心 至 轴 心 的 距 离 ， ”选择 一 张 最 完好 的 底片 ， 放 在 比 长 仪 下 。 HK MBAR iF RK 面 ， 沿 Y 轴 移动 使 与 图 谱 中 间 的 一 条 暗 条 纹 的 中 心 相交 ， 记 下 和 轴 标 妆 读数 。 开始 沿 义 轴 移 动 至 第 一 条 明 线 的 中 心 ， 记 下 和 轴 标 尺 读 数 (第 0:5 BB) 继续 沿 和 X 轴 移动 直至 下 一 条 (第 二 条 明 线 ) 的 BRE Cu 的 测定 ，， 液 面 浓度 C。 由 下 式 计算 ri(c, — C3) — \"-Pae Ci = eee r} Te 12 ai “el £CCy — Cu) — AGE, r? t. WH 7-6 的 数据 Aj2?1r? = {46.408 + 47 = 544.545 条 纹 编号 sia Res 0 (isi) 14.196 0.5 14.268 1.5 i) 297 ZeD 14.457 3.5 14.531 4.5 14.581 = 14.639 6.5 14.681 全 二 14.726 8.5 14.759 9.5 14.796 10.5 14.824 11.15 CRI) 14.850 ee 9 了 2 #°50.311} x 1+ 50. 311 二 50: al 0.15. ial 表 7-6 -低速 沉降 法 测定 分 子 量 的 数据 r(cm) 6.792 6,827 6.879 6.917, 6.953 6.979 7.004 7.026 7.046 7.062 7.079, . |. 7.093 7 +105 最 后 暗 条 纹 是 第 11 RAL RAM = 0-15, | » 56 » | C( 条 纹 数 ) 0.480 0.547 0.655 “0.742 0.814 © "0.876 | 0.930 0.979 1.001 1.061 1.098 1.131 1.151 loge y? 7-11 logC Hr “ER Aj28 和 2 BAWABA Y HRA A XR AE r= ”wm Rr =r, ZARA ARE ATH. RAK (7-8) | are 50.481(11.15—0)—544.545 50.481 二 46.131 4. log C Xr? FA - 离 轴 心 不 同 距离 的 条 纹 数 是 把 该 位 置 的 条 纹 移 位 加 上 液 面 浓 - 度 的 条 纹 数 ( 表 7-6)。 以 log C Xf 7? FCA 7-11); 斜率 dlog C/dr? = 0.1565。 已 知 (1 — Vp) = 0,277 “转速 = 15.000rpm i Cn 22 = = 3.02) 温度 = 12.4°%C 因此 - 7 下 My = —2RT__. din€ _ 2 X 8.313 X 107 X 285.6 x 72303 x 9.1565 ae ~ ar? 0.277 X 2.467 x 10° = 2.504 X 10 (四 ) 样品 溶液 的 不 均一 性 和 非 理想 性 (1) Togic 对 尹 作 图 ,其 斜率 与 分 子 量 成 正比 。 均一 的 理想 溶液 下 此 线 是 一 直线 ,从 斜率 可 计算 分 子 量 。 如 果 是 曲线 ， 则 曲线 上 每 一 点 的 切线 和 该 点 的 显示 分 子 量 成 正 化。 曲线 向 下 弯 ( 即 浓度 增加 斜率 变 小 ) ,一 般 说 来 样品 是 非 理 想 溶液 :相反 ,曲线 向 上 凸 起 , 表 示 溶 质 不 均一 曲线 上 各 点 切线 的 斜率 与 混合 物 的 重 均 分 子 量 成 正比 。 要 指出 的 是 半 有 时 不 均一 的 非 理想 溶液 , 由 于 曲率 相互 抵 销 ,Jog C 对 疡 作 图 仍然 得 到 二 条 直线 。 因 册 从 一 个 浓度 测定 的 结果 来 对 该 溶液 的 理想 性 和 均一 性 下 结论 是 不 够 的 ， 必 须 变换 起 始 浓度 和 转速 进行 实验 。 浓 度 高 对 非 理想 性 影响 大 ,高 转速 对 不 均一 性 影响 大 ,这 是 很 清楚 的 。 (2) 如 果 经 其 他 方法 确证 样品 是 均一 的 ; MRE log CH 产 虱 图 得 到 向 址 弯 的 曲 线 , 那 未 各 点 切线 的 斜率 用 最 小 二 乘法 隶 出 可 计算 显示 分 子 量 芷 大吉 (7)]y 而 神通- i 1 ~Mapo(r) na Me 其 中 也 是 常数 。 以 Mave(r) A C(r) Be f(r) HER SHE C0, AR M? 变更 起 始 浓度 ,在 较 广 的 浓度 范围 内 作 图 更 好 。 ' 3) AB-KkKARHRLSAMOTRERARLM. RANKER Oe 中 样品 的 显示 重 均 分 子 量 Mwapp， 将 其 倒数 对 (Cs + Cu) /2 作 图 ， 外 延至 (Cs 士 Ca)/ 2 一 0, 可 求 得 M%。 十 Chee Clr) +4 O-) aa gegen SMS (7-10) (1 — Vp)w*( 73 — 77,) Co i 8 Bs LAVA Tad 2” pu 5 Sete ae C-D 这 里 得 到 的 是 重 均 分 子 量 。 由 式 (7-12) 可 求 忆 均 分 子 量 : ea MwysCs — My.m> Cm =| M zapp Gy a7 Gs (7 2) 其 中 Mws 和 Mam 分 别 是 液 底 和 液 面 的 重 均 分 子 量 。 (五 ) 光电 扫描 装置 的 应 用 | 应 用 光电 扫描 装置 的 优点 是 沉降 平衡 测定 时 溶质 浓度 非常 低 ， 因 此 可 以 更 准确 地 外 延至 无 限 稀释 。 从 记录 纸 上 直接 得 到 浓度 ,不 需要 再 用 合成 界面 离心 池 做 一 次 实验 。 实验 的 准备 和 离心 池 的 安装 ， 充 填 如 上 所 述 。 样品 起 始 浓度 的 光 吸 收 选 在 0.5 JER 度 或 更 低 一 些 。 选 择 一 个 光 吸 收 和 浓度 成 比例 的 波长 ， 通 常 样 品 的 最 大 吸收 波长 可 满足 这 个 条 件 。 离 心 时 同样 采用 提高 转速 的 方法 以 缩短 到 达 平 衡 的 时 间 。 不 时 扫描 图 象 ， 当 记录 纸 上 代表 靠近 离心 池 顶 那 一 半 部 分 液体 的 浓度 分 布 呈 直线 时 , 降 速 至 平衡 实验 速度 。 到 达 平 衡 前 后 , 隔 一 定时 间 扫描 ,要 求 凡 离心 时 间 在 24 小 时 ,应 在 3 小 时 内 扫描 图 谱 无 变 化 ,离心 时 间 超过 24 小 时 ,应 在 5 小 时 内 扫描 图 谱 不 变 。 确 证 已 达到 平衡 ,用 最 慢 的 扫描 速度 .最低 噪 音 扫描 几 张 图 谱 。 | 在 记录 纸 上 读 出 离 轴 心 距离 * 与 相应 的 光 密度 值 。 一 般 > 取 15 一 20 点 。 光 密 度 (O. D) 如 果 和 浓度 成 正比 ， 则 不 需 再 换算 成 浓度 ,直接 以 log(9. D) Xt 7? (FA, MER 斜率 代入 式 (7-1) 计算 分 子 量 。 本 法 计算 分 子 量 的 准确 度 ， 在 很 大 程度 上 取决 于 记录 纸 上 基线 取得 是 否 正确 。 用 下 列 方法 操作 可 以 减少 可 能 产生 的 误差 。 当 平衡 实验 已 经 做 完 ， 浓 度 分 布 曲线 已 经 记录 下 来 * 这 时 不 停机 ,相反 把 转速 提高 到 转 头 允许 的 最 高 转速 ,连续 转 几 小 时 ,此 时 离心 池 的 二 半 部 分 将 为 纯 溶 剂 区 ,因为 大 分 子 溶质 已 沉降 。 然 后 迅速 降 至 原先 平衡 实验 时 的 转速 , 立 即 扫描 几 张 图 谱 。 以 离心 池内 溶剂 区 曲线 的 平均 位 置 作为 基线 ， 从 这 个 位 置 来 计算 平衡 曲线 上 浓度 的 分 布 。 (A) 不 需要 知道 起 始 浓度 的 计算 法 上 述 应 用 光电 扫描 装置 当然 不 需要 知道 起 始 浓度 就 可 以 计算 分 子 量 ， 不 过 这 里 主要 是 指 用 其 他 光学 方法 得 到 的 数据 ,不 用 起 始 浓 度 计算 分 子 量 的 方法 。 e 58 ¢ 09 Schlieren’ JOM Fe BASE Lain) 最 时 提出 这 个 方法 ,但 是 没有 被 广泛 应 Flo 本 法 的 缺点 是 应 用 . Schlieren 光学 系统 灵敏 度 较 低 并 且 对 是 否 真正 平衡 的 反应 敏 Ko 不 过 可 应 用 相差 片 提高 灵敏 度 汪 借助 于 干涉 光学 系统 来 检测 是 否 达到 平衡 4 RTE 述 这 二 点 外 ，: 林 法 计算 的 结果 是 准确 的 。: 它 的 优点 是 不 需要 再 用 合成 界面 离心 池 做 一 次 实验 ， ARE BORER 不 要 换算 溶质 量 , 计 算 也 非常 简单 对 多 分 散 体系 计算 结果 是 己 均 分 子 量 。 实验 完全 和 目 述 一 样 ， 在 Slice UPA La — 系列 + 处 的 海员 tt 以 tog [+ 对 己 作 疼 , 取 其 得 率 ioe | 区 [dP 人 K 人 下 式 计算 分 子 量 2.303dlog a L «| 2RT dr ere ae hie 2) | (1 — Vp)? dr’ ; 2. 于 涉 光 图 谱 计 算 Nazarian” 提出 只 \ 需 要 测定 干涉 光 图 谱 的 条 纹 移 位 ， 用 相 对 浓度 计算 分 子 量 的 方法 。 对 均一 的 溶质 来 讲 ， Booths, 和 rs* 处 (2 一 六 一 常数 2) 之 癌 的 于 涉 条 纹 移 位 AoJ 相当 于 它 们 之 间 的 浓度 差 。 代入 下 式 计算 分 子 量 Hei mT aA Oh ae ad 其 中 4 4 一 D> Ao] = yey + -9) Vo ) riety 3 每 一 对 测量 位 置 (g,, 4 = on FO) 要 换算 成 离心 池 中 的 真实 位 置 (7。 一 gv, = Qn? )o 表 (7-6) 列举 了 液 柱 高 3mm 左右 的 每 一 对 测量 条 纹 移 位 离 轴 心 距离 。 这 些 距离 可 以 通过 放大 倍数 刁 计 算 相应 的 图 片上 的 位 置 (R=(r—1n)F), 以 这 上 坚 对 位 置 的 条 纹 移 位 的 对 数 对 + "EA, 从 斜率 求 分 子 量 。 M = Gos) 表 7-6 3mm 液 柱 适 宜 测量 条 纹 移 位 的 每 一 对 距 轴 心 的 距离 7wi(cma) ey 7.0569 7.0711 7.0852 7.0993 Tetist 7.1274 7.1414 7.1454 7.1554 7.1694 7.196 CoN ON NM Se WwW NH oc = = TL EIU DT MTL NE AR Yphantis 法 ， 因 为 1964 年 Yphantis 首先 应 用 本 法 测定 分 子 量 ”。 高 速 沉 降 平衡 法 测定 分 子 量 的 原理 和 低速 沉降 平衡 法 测定 分 子 量 的 原理 相同 ， 它 ea 59 。 们 之 间 的 区 别 在 于 前 者 转速 高 , 约 2 一 3 倍 于 低速 沉降 平衡 , 液 面 附 近 的 溶质 浓度 事实 上 等 于 零 , 所 以 称 之 为 高 速 涡 降 平 衡 法 。 和 低速 沉降 平衡 法 相 比 较 , 高 速 沉 降 平衡 法 的 优点 是 : 〈1) 离心 结束 时 ,知道 离心 池 中 溶液 的 绝对 浓度 ,不 需要 再 用 合成 界面 离心 池 做 实验 测定 起 始 浓度 ;〈2) 可 以 在 更 低 的 浓度 测定 ， 因 此 一 些 难 溶 样品 也 有 可 能 测定 ;3〈3) 计算 简单 , RIERA APRN ERIE, 做 一 次 实验 就 可 以 得 到 无 限 稀释 时 的 分 子 量 ; 《4) 平衡 到 达 时 间 较 短 〈 不 超过 24 IY); (5) 低速 沉降 平衡 法 不 能 测定 的 大 分 子 量 《104 数量 级 ) 溶 质 也 可 能 测定 。 它 的 缺点 是 : 〈1) 因为 液 面 附近 溶质 浓度 实际 上 为 零 ,所 以 不 能 测定 分 子 量 低 于 lO 的 物质 ， 样 品 中 如 混 有 较 低 分 子 量 的 物质 , 则 不 可 能 测定 分 子 量 ; 《2) 溶 质 在 离心 池 底 部 沉积 ,不 可 能 分 析 溶 质 总 的 分 子 量 分 布 ; (3) 转速 较 高 ,离心 池 窗 光 Na TA; (4) 精度 较 低 。 (一 ) 实验 方法 7 1. 样品 配制 、 光 学 系统 、 离 心 池 “样品 溶液 的 配制 同 低 速 平衡 实验 (第 48 页 )， 对 溶剂 宜 作 长 时 间 透 析 , 务必 使 透析 平衡 。 高 速 沉降 实验 不 用 Schlieren 光学 系统 ， 大 多 采 用 干涉 光学 系统 ,也 可 用 紫外 扫描 光学 系统 。 蛋 白质 禅 品 溶液 浓度 范围 为 0.1 一 2.0mg/ml， 一 般 艇 法 是 在 此 浓度 范围 内 取 三 个 值 进行 测定 。 离 心 池 窗 宜 用 宝石 窗 。 离 心 池 除 用 常规 的 双 模 离心 池 外 ,也 可 采用 有 六 个 槽 的 池 芯 (图 3-4, 第 10 页 ), 同时 进行 三 个 样品 分 析 。 和 低速 沉降 平衡 实验 一 样 , 样 品 溶液 和 溶剂 分 别 放 人 指定 的 离心 池 槽 内 。 溶液 槽 : 溶液 0.11ml 底 液 0.01 一 0.02ml 溶剂 槽 : 外 透 液 0.12 一 0.13ml (不 必 过 量 ) Pees eS 2.8 和 低速 沉降 平衡 一 样 , 从 大 致 已 知 分 子 量 的 情况 下 按 下 式 估算 : w’M(1—V w’*S o = ee = ir ein (7-15) 其 中 是 有 效 还 原 分 子 量 ,M 是 分 子 量 , 到 是 偏 微 比 容 , 2 是 溶液 密度 (可 用 溶剂 密度 代 刀 R 是 气体 常数 ，8.31X 10 尔格 / 度 . 克 分 子 ; 工 是 温度 (K); S、D 分 别 是 测定 浓度 的 沉降 系数 和 扩散 系数 ; «LHe (BEB; rpm x 28), Tell” 和 Yphantis™ 分 别 计算 的 分 子 量 和 转速 的 关系 列表 7-7 中 ,实际 实验 时 可 把 表 中 数值 作为 选择 转速 的 上 `、 下 限 。 更 方便 的 方法 是 用 图 7-2 (第 50 页 ) 来 估算 高 速 沉 降 平 衡 应 选 的 转速 。 如 果 不 知 道 分 子 量 近 似 值 (或 范围 )， 则 可 先 做 一 沉降 速率 实验 ， 粗 略 计算 一 下 沉降 系数 ， 然 后 用 图 7-2 计算 。 泊 | 实际 操作 时 转速 也 可 在 离心 过 程 中 确定 ， 因 为 改变 转速 后 平衡 很 快 又 会 建 Ye 可 选 择 液 柱 中 间 部 位 浓度 为 零 作 为 最 适 转速 。 _ . ot pa ae 3. 平衡 到 达 需 要 的 时 间 ，” 液 柱 为 3mm 时 , 液 底 浓度 Cs MIR IREE Cn ZH Co— Cw， 和 真正 达到 平衡 时 的 ;Cs 一 :Cn 之 值 误 差 小 于 0.1 多 所 需 的 时 间 ，, WAAR rm 沉降 至 液 底 ”所 需 时 间 记 的 二 倍 吗 。 设 溶质 的 沉降 系数 为 *， 则 六 以 下 式 表示 : t, = 2095 一 加 /02 + sCre + 1m) ' (7-16) 438% RUE POM BI PORES, BURRILL es 60 the 4 7-7 高 速 沉降 平衡 法 分 子 量 和 转速 的 关系 *， 转 i (cpm) aft 3h Teller. ?£*?) : Yphantis 法 #3? 22.0: 35,600 7" 44,770 3.0 b- 29,500 ‘2 37,020 , 4.0 | ‘ , 25,980 Ay 31,410 * 50 | 4500S 27,690 6.0 r B-\ 5 20,410 © : 25,980 氏 7.0 19,160 24,630 8.0 17RMTRRUR 8a 21,740 wr 9.07 17,250 ~ “20,410 10.0 16,200. , 16,200 : “15.0 13,410 era 20.0 11,272 ~ 12,590 25.0 10,589 11,270 30.0 9,341 10,589 35.0 8,766 9,945 40.0 8,225 9,341 45.0 7,928 8,766 50.0 7,447 es * T= 283°K, V =0.73ml/g, o=1.00g/ml, 0 =M(1 — Ve)w*/RT 转速 取 最 接近 的 Beckman Spinco ERE DP Rie ES ** 液 柱 2mm, 六 槽 池 蕊 的 中 央 计算 ， o? = 3.3(cm™) 4.G2 = 5.0cm™ 高 转速 来 缩短 到 达 平 衡 的 时 间 ,但 并 不 常用 。 离心 开始 后 ; 当 速 度 达 到 预选 的 平衡 速度 时 摄影 一 幅 。 接 近 平衡 时 ,图像 必须 象 图 7-12 一 样 。 以 后 每 隔 一 小 时 拍摄 一 次 ， 直 至 不 能 测 出 连续 拍 的 两 张 底片 上 的 差异 〈 小 于 0.03 条 纹 移 位 )。 平衡 时 条 纹 必须 在 离心 池 的 上 半 部 分 呈 直 线 状态 ;以 保证 液 面 浓度 为 零 。 如 果 条 纹 直 线 部 分 大 于 或 小 于 液 柱 半 高 , 则 改变 速度 再 度 平 衡 。 最 后 摄影 几 幅 ,以 保证 得 到 一 张 清晰 的 照片 。 图 7-12 © >» 61 (=) ie (1) KABMMRE: R-AK NRTA —RAM MRD ELKW 上 按 一 定 间隔 读 出 条 纹 的 y(r) 值 。 在 条 纹 平坦 部 分 每 隔 0.05cm 读 一 次 ， 条 纹 开始 上 挠 后 , 隔 0.01 一 0.02cm 读 一 次 ,直至 底片 上 离心 池 的 底部 , 或 者 条 纹 过 于 密集 以 至 无 法 阅读 为 止 。 如 果 所 选 条 纹 出 格 ， 则 向 底线 下 移 四 条 条 纹 再 继续 读数 ,所 得 读数 加 上 4 乘 条 纹 间 垂直 距离 y(r)。 共 读 5 条 条 纹 ; 在 每 一 > 处 取 其 平均 值 计算 。 表 7-8 是 读数 记录 的 一 例 。 表 7-8 高 速 沉降 平衡 法 计算 分 子 量 的 数据 Beit (cm) Cm) (em*) yoo en) al és logty(r) — Yo] +3 1( 液 面 ) 13.792 3.4192 2 13.842 3.4188 3 13.892 3.4193 平均 (yo) = 3.4192 4 13.942 3.4193 5 13.992 3.4193 6 14.042 3.4197 7 14.092 3.4197 8 14.142 3.4203 9 14.192 3.4207 10 14.242 3.4217 11 14.292 3.4244 12 14.312 6.848 46.892 3.4050 0.0058 0.763 13 14.332 6.857 47.014 3.4261 0.0069 0.839 14 14.352 6.867 47.156 3.4280 0.0088 0.944 15 14.372 6.877 .. 47.286 3.4310 0.0188 1.072 16 14.392 6.886 47.148 3.4351 0.0159 1.201, 17 14.412 6.896 47.551 3.4376 0.0184 1.265 18 14.432 6.905 47 .683 3.4439 0.0247 1.393 19 14.452 6.915 47.815 3.4499 0.0307 1.487 20 14.472 6.924 47.947 3.4556 0.0364 1.561 21 14.492 6.934 48.080 3.4656 0.0464 1.667 22 14.512 6.944 48.212 3.4754 0.0562 1.750 23 14.532 6.953 48.346 3.4881 0.0689 1.838 24 14.552 6.963 48.479 3.5042 0.0850 1.929 25 14.572 6.972 48.612 3.5216 0.1024 2.010 26 14.592 6.982 48.746 3.5466 0.1274 2.105 27 14.612 6.991 48.880 3.5740 0.1548 2.190 28 14.632 7.001 49.013 3.6100 0.1908 2.281 29 14.653 7.011 49.147 3.6543 0.2351 2.371 30( 液 底 ) 14.697 从 表 7-8， 取 底片 上 条 纹 直 线 部 分 为 %， 其 余 为 >)， 计 算 每 一 ”处 的 条 纹 移 位 lyr) —yolo 求 出 > 距 轴 心 的 实际 距离 ， 平 方 之 。 以 [y(r) 一 %] A’ WH log Ly(r) 一 yo] , 作 图 更 方便 , 所 以 [yCr) — yo] 项 最 好 乘 以 1000 HY F log 数字 加 3)， 如 表 7-8 所 示 。 那 些 条 纹 移 位 不 足 0.01lcem 的 点 ,不 够 可 靠 , 不 宜 采 用 。 因 为 [7) — wo] 与 溶质 浓度 成 正比 ，Jog ly(r) — yo] 对 半 作 图 所 得 曲线 的 斜率 和 低速 沉降 平衡 法 一 样 626% RAK (7-1); 测定 偏 微 比 容 和 溶液 的 密度 后 ,计算 分 子 量 。 (1 一 元 p) 一 0.262 转速 = 30,000r—pm. T = 16.8°C dog Ly(r) = Yo] = 0.659 4 hemi 28 dr? a 2RT _, 2.303(dlogC) _ 2 X 8.313 X r X 290.0 ag x 0.658 (1 — Vp)? dr? | 0.262 X 9.870 x 10° = 2.83 x 10! Nan Oe aay so 图 7-13 log [Y(r) — Yo] Wr FA. FH = 0.659 以 前 兽 提 及 ,在 一 个 浓度 ,离心 一 次 只 能 得 到 显示 分 子 量 。 不 过 在 高 速 沉降 平衡 实验 上 述 计 算 中 ， 接 近 液 面部 分 的 离心 池上 半 部 浓度 趋向 无 限 稀释 。 因 此 在 这 低 浓度 一 侧 的 log [y(r)—yo] 对 王 作 图 ,如 果 得 到 一 条 直线 的 话 , 可 以 认为 计算 值 与 浓度 无 关 , 即 可 以 认 为 是 无 限 稀释 时 的 分 子 量 。 当 然 这 可 以 通过 不 同 的 浓度 ,不 同 的 速度 所 做 的 实验 来 验证 。 (2) 和 低速 沉降 平衡 实验 结果 不 同 ， 所 得 图 象 与 离心 池上 半 部 相应 的 干涉 条 纹 必须 平 直 。 如 果 仅 仅 是 看 起 来 似乎 很 平 而 实际 并 不 和 轴 平 行 ， 那 未 计算 结果 就 不 准确 。 之 所 以 产生 这 种 现象 有 三 种 可 能 : @ 溶 液 起 始 浓度 太 大 ;@@ 转 速 过 低 ; 四 有 低 分 子 化 合 物 混 人 (包括 溶质 的 解 聚 )。 对 于 前 两 种 情况 ,实验 最 好 重 做 。 把 溶液 稀释 ,用 较 高 转速 。 第 三 种 情况 应 将 样品 再 次 透析 ,去 除 小 分 子 。 如 果 无 效 , 则 不 能 用 本 法 测定 分 子 量 。 (3) logly(r) — 和] 对 壮 作 图 ,得 到 的 不 是 直线 , 那 未 和 低速 沉降 平衡 法 一 样 ,反映 了 溶质 的 不 均一 性 或 溶液 是 非 理想 溶液 。 如 果 已 确证 样品 溶液 是 均一 的 非 理 想 溶液 ， 可 用 最 小 二 乘法 求 出 各 > 点 的 [alnfy( 六 一 yol/dr7], 计算 显示 分 子 量 。 * 63 « % 7-9 高 速 沉降 法 测定 非 理 想 溶液 的 例子 CBU» 0.3mg/ml, 0.1 FFARR AHIR, pPH3.7) 篇 = [XA LOREAL pace cgay, BH In DrGao = ¥0)] ay, mm) |, 读数 (mn) (cm) Yo 1( 基 准 线 ) | 18.147 2( 液 面 ) 40.840 | 3 41.000 |} °° . 36.638 2 41.250 | 36.640 5 41.500 36.640 | > 平均 y>=36.639mm int AT 6 41.750 36.639 7 42.000 J. D se dy 36,639" [7 < RS ies 8 43.000 36.646 9 43.300 | 6.824 46.567 | 36.707 140 2.146 10 43.400 |~ 6.828 | 46.622" | 136.779" 173 2.238 11 43.500 | 6.833 46.690 | 36.812 216 2.334 3.03 2.96% 10° 12 43.600 | 6.838 46.758 | 36.853 261 2.417 2.74 2.68 13 43.700 | 6.843 46.827. | 36.900 312 2.494 2.47 2.42 14 43.800 |. -6.848 46.895 | 36.943 359 2.555 2.34 2.29 15 43.900 | 6.853 46.964 | 36.998 420 2.623 2.28 2.23 16 44.000 6.858 47.032 | 37.059 491 2.691, 、 2.245" 2.19 17 44.100 | 6.863 473101 | 37.130 571 2.757 ae 2.11 18 44.200 6.868 47.169 | 37.210 650 2.813 2.05 2.00 19 44.300 6.872 47.224 | 37.289 752 2.876 1.83 1.79 20 44.400 | 6.877 47.293 | 37.391 849 2.929 1.64 1.60 21 44.500 6.882 47.362 | 37.488 922 2.965 1.50 1.47 22 44.600 6.887 47.431 | 37.561 | 1026 3.011 1.46 1.43 23 44.700 6.892 47.500 | 37.665 |. 1132 3.054 1.44 1.41 24 44.800 6.897 47.569 | 37.771 | 1249 |° 3.097 1.34 1.31 25 44.900 6.902 | 47.638 | 37.888 | 1355 3.132 1.23 1.20 26 45.000 6.906 47.693 | 38.094 | 1468 3.167 1.15 1.12 27 45.100 6.911 47.762. | 38.107 | 1582 3.199 Py | 1.09 28 45.200 6.916 47.831 | 38.221 | 1705 3.232 1.07 1.05 29 45.300 38.244 | 1825 3.261 30 45.400 38.464 | 1963 3.293 31 45.528 ah 38.602 32( 液 底 ) 表 7-9 是 用 高 速 沉降 平衡 法 测定 胶原 的 例子 。 log [y(>) 一 %m] 对 壮 作 图 是 一 条 向 下 梅 的 曲线 (图 7-14), 表示 是 非 理 想 溶液 。 各 点 显示 分 子 量 的 计算 如 下 : és) 到 任 一 点 作为 中 心 点 ;在 其 前 后 各 取 两 点 ,分 别 以 脚注 十 ， 十 1, 0， 一 1， 一 2 表 之 。 点 与 点 的 间隔 为 Axo 每 点 的 log [y(> ) Pit yo] 什 记 为 LU42，U+i， Uys U4 pa 从 这 5 ey 值 计算 0 点 的 ZU/dx。 (42) Ot. (2U 42 + Us, — U4 = 2U-) Gan 这 里 Az ELE X A i : {eee r) = yol fa 1 (2) F . ~ (7-18) dr? -. 2 Wad ea 64 。 其 中 环 是 和 轴 的 放大 倍数 。 计 算 举例 如 王 ( 数 据 见 表 :7-9)o [ 例 ] +? = 47.500cmz(7 = 6.892cm) »» ) (22) 二 OE r 一 6.892 gr \dx 0.04, i 1¢ aks i) x (2 X 3.132 +3.097—3.011—2 X 2.695) 天 = 4200, £ | Mh (7-18) eae 3. dinly(r) — yo] _ zing ee ten ar 6.892 一 144 es DL R~8.31x 107 尔格 / 度 . 克 分 子 , T= de w 一 12590rpm X 7 TE /B, V=0.695, p= 46.5: 47.0 47.5 r?(cm’) 图 7-14 高 速 沉 降 平 衡 法 。log [YCr) — Yo] “ 1.017 RAK tis + ed f - HLA 对 ” 作 图 PSE | RATT ATES cee) C1 — Vp)a’ ar “= 0.978 x 10° x 1.44 = 1.41 X 10° 在 二 系列 的 点 上 计算 M sop ( 琢 7-9)， 将 这 些 数值 的 倒数 对 浓度 [yer = yo] 作 图 ; ne | 至 ly) —») > 0 BARREN OSB M° (A 7-15). (44) 多 分 散 体系 也 可 用 上 述 最 小 二 乘法 计算 logly(r) 一 和] Wr HALE A PRA Fite 二 10.0 -— va ae aye “各 点 的 数 均 分 子 量 M。(P)、 重 均 分 子 量 x : Mw(r), Z 35 FH Mzr) 按 下 式 计算 : => 5.0 7. ea eas het AION ag isk ty /M° = 2.80 . M, 7 ” = ba 10? ; C1 — Ve)o’ \ C(r)dr 0 500 =: 1000 1500 ; i; (7-19) a r (um ; ‘ , 浓度 [yC ee um) Mw(r ) ss IRT ; cL 2 (7-10) 图 7-15 分 手 量 的 浓度 依存 性 (i = Vp) DE Bierce gr } cat . a(t ac) M2r) = 一 一 一- 一- 。 co -CU 之 (7) (1 — Vo)? dC(r) vam 高 速 沉降 平衡 法 测 定 分 子 量 的 二 ae dae ens ae 因此 式 〈7-19) 的 分 母 积分 就 可 计算 数 均 分 子 量 M，,。 至 于 Z 均 分 子 量 的 计算 , + oes =? (22), 先 按 式 (7-17) 以 一 定 间隔 用 最 小 二 乘法 计算 之 ,所 得 之 值 对 C 作 图 ,再 一 次 用 最 小 二 乘法 求 出 斜率 ,计算 分 子 量 。 在 液 面 浓度 等 于 零 的 条 件 下 ; 全 部 溶质 的 重 均 分 子 量 My. 295 Me AX (7-21), (7-22). i-# sy = MCs) (7-21) Mz=My(r,)> ° (7-22) ae @s AUVAER MERLARATR. AMEFERRE LOM RAE, BP] FANE 法 来 求 ,但 容易 带 来 很 大 误差 ,所 以 几乎 不 用 这 个 方法 计算 。 三 、 短 液 柱 沉降 平衡 法 (中 点 法 ) 测 定 分 子 量 ， ， 沉 降 平 衡 到 达 的 时 间 可 以 用 式 (7-4) 计算 ， 和 高 心地 中 流 往 高 度 的 平方 成 正比 ， 因此 液 柱 高 度 降低 ， 平衡 时 间 大 为 缩短 。 本 法 就 是 利用 短 液 柱 和 达到 沉降 平衡 后 浓度 相当 于 起 始 浓 度 Co BY ” 处 的 浓度 梯度 (2C/ar)” 来 计算 分 子 量 的 P 在 ” 处 的 显示 分 子 量 -Mass 是 : » awe RT 00.5 Mapp = Sho Tae Lea C7223 ; Coy? & ) (1 a Vp) : G J 3) 分 子 量 的 浓度 依存 性 用 下 式 表示 : | 0 可 | 本 1 1 V < Mapp raat + cot _/ 47-24) 本 法 的 优点 是 测定 分 子 量 所 需 时 间 非 常 短 ， 不 过 需要 另外 测定 起 始 浓 度 。 本 法 只 能 测定 离心 凶 中 一 点 的 分 子 量 , 因 此 ,对 样品 是 否 均一 、 是 理想 溶液 还 是 非 理 想 溶液 不 能 进 行 分 析 。: 不 过 比较 不 同 溶剂 对 样品 的 影响 ,或 者 同时 做 许多 样品 的 比较 ,应 用 本 法 是 很 广 便 的 。 (一 ) 实验 方法 1 社 品 配制 ， 光 学 系统 和 离心 池 了 310mg/m， alas 法 (第 48 页 )。 5 ; 光学 系统 : 只 用 Schlieren eR o 离心 池 : 用 双 槽 或 多 槽 离心 池 。: Pee AP Ls HT ls 于 于 和 inert 品 量 极 微 ( 表 7-10), 用 微量 注射 器 注入 。 表 7-10 短 液 柱 法 样品 用 量 RH it | & it 溶液 槽 ” 底 液 0.04ml 0.005ml 溶液 0.03ml 0.017ml 溶剂 醒 0.08ml 0.023ml 液 柱 高 & Bre Imm. 0.7mm 2. 转速 “van Holde 等 指出 名 ,沉降 平衡 到 达 后 ,如 果 液 柱 短 , 则 在 2 2 ha [ate Lm 2 〈 其 中 Toy Tm Ay Bl) Ho HO JES FHT») REAVER BE CCr’) 以 下 式 表 示 : C(r') = C,H/sinhH = C,/(1 + H’/6 + -+-) ich 25) 其 中 C, 是 起 始 浓度 ， H = w'M(1—Vp)(r3— 77,)/4RT. REIN, 7’ 可 看 作 滚 柱 的 7, 即 一 了 一 im (实际 情况 是 1Imm 液 柱 , F 一 r’ < 0.002mm)。 因 此 如 果 液 柱 短 ， « 66 。 HW CG) = Coo HB H < 0.25 来 选 转速 o, 其 时 液 柱 中 点 处 的 浓度 CO) Mie 始 浓度 之 差 不 大 于 1% 0 3. 运转 可 参照 低速 沉降 平衡 法 运转 一 节 〈 第 51 页 )。 因 为 流 柱 甚 短 ， 可 以 不 必 加 速 到 高 于 平衡 实验 所 需 的 转速 来 缩短 到 达 沉 降 平衡 的 时 间 8 到 达 预 定 速度 后 ， 观 察 液 柱 中 点 的 浓度 梯度 ，(dC/V4ar) 一 。 每 隔 30 分 钟 拍摄 一 次 。 直至 《4dC/azr) 一 : 的 变化 在 测 量 误 差 范 围 以 内 。 和 me 80°)» 摄影 用 帧 ， 保证 至 少 有 一 张 清晰 > 满意 的 底片 。 (二 ) 计算 are sive | 1. 起 始 浓度 的 测定 TUM eee ME CB 52D. BER 角度 要 和 平衡 实验 时 的 角度 相同 ,从 合成 界面 峰 的 面积 计算 起 始 浓度 s 2. 液 柱 中 皮 距 办 必 的 距离 和 和 谈 处 浓度 袖 度 的 测定 ”在 沪 柱 中 点 处 (一 Sette) 测定 Schlieren 曲线 (图 7-16) 线 沉 中 心 的 高 度 CAS es LoL 距离 ) ,代入 式 (7-26), 计算 显示 分 子 量 see M aPP»sroO - at eee fe ‘A M aPPor oe (42) _ wt — Pp) (7-26) 其 中 C, RAMEE MT A Re FAUT AL Re EW BR x BH HY Hee 大 倍数 CF = 2.05); ¥ BRACKET (dC/ dr ) 项 中 Y 轴 的 放大 倍数 正好 抵 消 ,用 六 考虑 ]; 7 ESRB (cm); 图 7-16 “中 点 超 离心 法 (22) 是 于 处 底片 上 Schlieren 曲线 的 高 度 Cem); R 是 气体 常数 (8. 313X 107 尔 格 / 度 。 克 分 子 ); 了 是 温度 (Ks 是 角 加 度 ( 红 度 / 秒 ,rpm x 2); 严 是 偏 第 比 容 , "是 溶液 密 度 ( 实 际 上 由 于 样品 浓度 很 稀 , 以 溶剂 密度 代 之 )。 计 算 结果 列 于 表 7-11 中 。 - 表 7-11 中 点 法 测定 分 子 量 的 例子 (图 7-16) 槽 号 起 始 浓度 (mg/ ml) CoX 10*(cm*) 7(cm) (dC/dr),_3X10(cm) Mupp,7% 10* 使 用 双 槽 离心 池 能 够 求 出 离心 池 中 溶质 含量 * 则 除 在 中 点 处 可 计算 分 子 量 外 ;还 可 求 全 部 溶质 的 显示 重 均 分 子 量 Mwaip ( 式 7-10)。 这 时 Cs — Cw 是 溶剂 基线 和 溶质 梯度 曲 线 在 Ts Al rm 之 间 所 包含 的 面积 (cm2)o 均一 体系 My.app = M,pp.r> 不 均一 体系 Mw,app > Mappizo « 67 « 用 中 点 法 测定 分 子 量 - 计算 Mops 同时 计算 My, app >° das 好 的 方法 。 四 、 有 关 用 特殊 溶剂 人 的 实验 (一 ) 高 浓度 县 盐 的 水 溶液 ， 研究 非 共 价 结合 的 蛋白 质 亚 基 结 构 ， 常 常 在 6M 或 更 高 浓度 的 盐酸 县 咨 液 中 进行 亚 基 总 数 和 分 子 量 测定 。 用 这 种 溶剂 作 沉 降 分 析 实 验 时 ， 有 几 点 要 注意 。 首 先是 盐酸 肌 的 纯度 。6M 盐酸 肌 溶 液 的 紫外 吸收 ,在 260nm Xb A < 0.053 在 240 一 400nm 内 ;也 之 0.00， 那 未 这 批 产品 是 纯 品 。 如 果 有 紫外 吸收 ,可 用 活性 炭 吸 附 并 过 滤 ,滤液 应 无 紫 处 吸收。 用 碳酸 且 来 合成 盐酸 有 或 者 进行 重 结晶 亦 不 失 为 一 个 方法 。 配 好 的 盐酸 且 溶 液 ， 蛋 白质 溶 和 后 需 充分 透析 ,一 般 至 少 二 天 。 中 间 如 果 换 透析 液 , 则 从 换 芒 之 日 起 再 透析 三 天 。 配制 不 同 浓度 的 样品 ,可 先 透 析 平 衡 一 较 浓 的 样品 储备 液 , 然 后 用 外 透 液 稀释 。 操 作 时 要 避免 统 体 蒸发 ,因此 在 冷 室 内 操作 较 好 。 用 低速 沉降 平衡 法 测定 分 子 量 , 应 先 做 合成 界面 实验 ,不 用 的 样品 溶液 应 放 在 上 部 空间 很 小 的 容器 内 密闭 保存 。 盐酸 胀 水 溶液 的 浓度 和 密度 的 关系 ，Kawahara 等 69 曾 详细 研究 过 ( 见 第 十 章 )o。 6M SERRE RAE o = 1.143。 由 于 偏 微 比 容 和 溶剂 密度 的 变化 ， Se Baa IF RE EK 时 的 1.3 ZEA. 离心 力 场 中 盐酸 胀 有 一 定 程 度 的 浓度 分 布 。 计算 结果 表明 盐酸 股 浓 度 为 6M , WE 高 3mm, 转速 30,000rpm 时 ， 液 面 和 该 底 密度 差 为 0.0023 ,转速 10,000rpm .时 为 0. 0002, 因此 在 沉降 平衡 实验 选用 的 低速 影响 不 大 。 最 重要 的 是 偏 微 比 容 的 测定 。 由 于 盐酸 县 和 和 蛋 白质 有 一 些 作 用 ， 实际 上 求 到 的 是 显 示 偏 微 比 容 7"。 计算 分 子 量 有 关 的 (1 — Vp) TA » 由 于 2 tteRK,V A 1 误差 ， 将 使 分 子 量 计算 产生 8% 误差 (二 ) 界面 活性 剂 水 溶液 界面 活性 剂 和 盐酸 肌 一 样 ， 在 求 蛋白 质 亚 基 数目 和 分 子 量 时 用 得 很 多 。 界 面 活性 齐 的 纯度 也 是 重要 的 。 最 常用 的 硫酸 十 二 烷 基 钠 《SDS) 市 售 商品 由 于 碳 氧 链 长 度 不 一 ， 永 溶液 常 呈 乳 浊 ,这 种 试剂 不 适用 于 沉降 平衡 分 析 。 如 果 不 能 得 到 纯 品 ,目前 最 好 还 是 目 己 BM ARDEA Emerson 等 四 的 文章 。 - 蛋白 质 样品 溶液 要 充分 透析 ;沉降 平衡 可 按 通 常 的 实验 方法 进行 。 沉降 平衡 实验 结果 分 析 , 和 上 述 盐酸 且 水 溶液 情况 一 样 ， ACR ais FABRE AMS RRS Bae &.V' RV 相差 很 大 。 (=) 有 机 溶剂 _ A woe tt 溶 于 有 机 溶剂 中 的 样品 ， 沉 降 分 析 实 验 时 离心 池 世 材料 必须 耐 该 溶剂 的 腐蚀 。 在 样 品 难于 透析 的 情况 下 ,样品 要 先进 行 去 离子 ,干燥 去 水 , 深 于 有 机 溶剂 的 实验 。 所 得 结果 的 分 析 ,仍然 要 注意 显示 偏 微 比 容 的 测定 。 此 外 ,在 无 盐 系统 或 者 离子 强度 很 低 时 ,还 要 验证 蛋白 质 的 电荷 效应 对 显示 分 子 量 的 影响 。 se。 68 。 第 八 章 Archibald 方法 离心 过 程 中 离心 池内 液 柱 两 端的 溶质 既 不 流出 也 没有 流入 , 净 流量 为 零 , 即 满足 沉降 平衡 的 条 件 。 Arehibald 方法 就 是 利用 这 一 点 0， 通 过 测定 溶质 浓度 和 液 杜 顶 部 的 浓 关 与 浓度 梯度 ， 或 液 柱 底部 的 浓度 与 浓度 梯度 来 计算 淤 质 分 子 的 分 子 量 。 它 们 之 间 的 关系 4 Pe Oe ear em Sas 内 (1 — vp)a’ abana oy A (8 ni 或 RT 1 dc : M = 一 一 一 . #5 ) ) ™ 8-2 (1 — ve)w? rye, \ dr i MED TE, R 是 气体 常数 , TEM, 0 BLA, 0 是 溶液 的 密度 ， w 是 角速度 ， r 是 距 轴 心 的 距离 , ¢ 是 浓度 , m、b 分 别 表示 洲 柱 顶部 和 底部 离心 池 中 存在 “ 坪 区 ”的 条 件 下 , cm 和 cs 可 用 下 式 表达 : Cm = oy — \ ” 9(de/dr)dr , (8-3) fm “Tm . ie cb = co + fe e r*(de/dr)dr (8-4) , Th Tr 。 其 中 ce。 是 起 给 浓度 。 Archibald 方法 测定 分 子 量 的 优点 是 离 忌 时 间 很 短 ,不 到 一 个 小 时 ， 计 算 根 据 沉 降 平 衡 同样 的 热力 学 方程 式 。 它 的 最 大 缺点 是 分 析 数 据 取 自 液 柱 的 两 端 ， 而 这 二 端的 有 关 信 息 最 难 测 准 。 WL Schlieren 图 象 线条 很 宽 , 计 算 时 需要 外 延 去 找 波 面 位 置 的 了 轴 截 距 。 如 果 流 面 位 置 外 延 选择 正确 的 话 ， 这 个 方法 的 结果 高 度 准确 。 反 之 ， 如 果 选 择 不 正确 的 话 ,将 会 产生 巨大 的 差错 。 另 一 缺点 是 需要 用 合成 界面 池 测定 起 始 浓度 ， at BAe A REE PE a RD PTO > aepeeratadolaligegtnaaioniaaaepelinei eas 等 ,并 且 不 随时 间 而 变化 。 如 果 不 是 这 样 , 那 是 由 于 样品 溶液 非 理 想 性 的 影响 。 通 常 只 ERED, 因为 可 以 避免 沉降 物质 堆积 引起 的 复杂 性 ， RELOAD ABE» eth Wo 对 于 多 分 散 体系 ; Archibald 方法 测定 的 分 子 量 是 重 均 分 子 量 ， 离心 池内 波 柱 顶部 和 底部 测 得 的 数值 不 同 ,并 且 随 时 间 而 变化 ， 因为 不 同 大 小 的 分 子 按 个 同 的 沉降 速度 重新 分 fio 实验 方法 (—) 样品 ,光学 系统 ,离心 池 Beanies Tie HR Bah A A ,浓度 5mg/ml。 采用 Schlieren EFAS MCAS * 69 « WE ih. WN FC-43( 氟 碳 油 ) 填 底 。 溶液 模 0.03ml FC-43 0.12ml 样品 溶液 YA Hl 0.17ml 外 透 液 低速 (12000rpm LAF) FA An-J 转 头 , 高 速 用 An-D 或 An-H 转 头 。 《二 ) 速度 选择 如 有 果 知 道 样品 分 子 量 的 范围 ， 可 参阅 图 7-2 选择 离心 速度 。 如 果 毫 无 信息 则 插 经 验 来 选择 速度 。 本 法 速度 不 那 未 严格 ,有 很 大 变动 范围 。 合 适 的 离心 速度 ,离心 过 程 中 有 很 长 一 段 时 间 保 持 坪 区 。 观 察 Schlieren 图 象 , 离心 池 底 部 曲线 过 于 陡峭 ， 以 至 于 高 过 底片 顶部 ,表示 转速 太 高 。 反 之 ,如 果 离 心 45 分 钟 以 后 才能 满足 下 述 摄影 要 求 , 则 转速 太 低 。 (=) 运转 ， 待 转 头 温度 达到 要 求 的 温度 (通常 在 15 一 20"c 内 ) 时 ， 开 始 离心 ， 加 速 至 所 选 速度 。 相差 片 角 70°, $F Schlieren 图 象 液 面 处 曲线 高 出 基线 2 一 3mm 时 拍 第 一 张 照片 。 这 个 高 度 可 以 用 Schlieren 图 象 上 液 柱 的 高 度 来 估算 《后 者 一 般 为 mm)。 以 后 每 隔 8 分 钟 拍摄 一 次 ,直到 中 间 的 坪 区 消失 为 止 。 (四 ) 起 始 浓度 测定 小 心 从 转 头 中 取出 上 述 离心 池 , 将 注入 孔 朝 上 ，, BR REE. BARRED. ERD 使 毛细 管 沾 上 液体 。 摇 匀 后 ， 把 溶剂 槽 灌 满 溶剂 (预先 平衡 至 实验 所 需 温 度 )o ;把 离心 池 放 入 转 头 内 ， 待 温度 平衡 , 开始 离心 。 加 速 至 8000 一 10;000rpm; 相差 片 角 同 平衡 实验 (70°), 拍摄 一 次 。 以 后 待 合成 的 _Schlieren 峰 扩 散 成 等 边 三 角形 时 再 拍 一 次 。 在 这 两 次 拍片 之 间 可 根据 上 述 平衡 实验 拍片 的 时 间 、 相 同 的 相差 片 角 ， 拍 摄 相应 的 Schlierea WEIR 片 。 (五 ) 计算 在 平衡 实验 照片 中 选 一 张 ， 合 成 界面 实验 中 也 选 二 张 相应 的 相片 ， 放 在 比 长 仪 下 计 、， | oe 测定 合成 界面 实验 Schlieren 峰 王 的 面积 (第 ,19 页 ), 此 值 相 当 于 coo 平衡 实验 相片 ,从 液 柱 顶部 开始 沿 水 平方 向 各 点 读 出 Schlieren 曲线 垂直 方向 的 读数 。 即 基 线 与 Schlieren 曲线 的 距离 (相当 于 dc/dr)o 开始 时 每 隔 0.01cm (X 轴 ) 读 一 次 ， 以 后 每 隅 0.02cm 读 一 次 ,直至 坪 区 。 结 果 如 表 8-1 所 示 。 面 部 分 的 最 早 几 个 读数 ， 由 于 ， Schlieren 曲线 并 未 伸 和 人 液 面 的 影子 中 ， 不 能 直接 读 出 。 所 以 在 计算 纸 上 以 de/ar 对 > 作 图 , 作 一 光滑 曲线 外 延至 液 面 的 位 置 。 [ 例 ] ”实验 数据 见 表 8-1。 (1 — vp) = 0.308 转速 = 20,000rpm 温度 =.19.2°C «70 。 8-1 Archibald 方法 测定 分 子 量 实验 数据 和 标尺 读数 (cm) ac/6r(cm) (dc /Or) 一 1( 液 面 7 13.975 6.687 ，44。716 0.2088* + 2 _ 13.985 6.691 44.769 0.1980* 8.864 3 14.005 6.701 44.903 0.1760* 7.903 aie 14.025 6.710 45.024 0.1556 7.006 rs 14.045 6.720 45.158 0.1338 | | 6.042 6 14.065 6.730 452293 7 Ps | en EL BLL ane 14.085 6.739 45.414 0.0897 sf. 44074 8 14.105 6.749 45.549 NG; O67)". 本 3.065 9 14.125 6.758 45.671 0.0520 2.375 16 ONS 14.145 6.768 "45.806 0.0351 1.608 ll 14.165 6.777 45.928 0.0231 1.061 12 14.185 6.787 46.063 0.0127 0.585 13 14.205 6.797 - 46.199 0.0051 “es Bogen 14 14.225 6.806 46.322 0.0012 0.056 15 14.245 9.816 + Spee 46.458 pes 0 Ot * Mac /ar xt r 作 图 上 测定 。 ”起 始 浓度 co = 0.713cmn? rm = 6.687 (8¢/Ar)m = 0.2088mm BK ER F = 2.095 sage : Ax = 0:020- 由 表 8-1 Zr72(9c/67) = 47.907 i 1 *P(#) 1 (人 r (2) = 65 — — )dr 一 co 一 二 | 一 一 | ere ie at te a: de Ks HS bide iF Arm! Or 1 (0.020 44.716 \2.095 fFRASK (8-3) = 0.0713 — ) X 47.907 = 00611 HAE (8-1) | Cn — (8.313 X 107) X.292.4 六 0.2088 .0.308 X (4.387 X .105) 6.687,X.0.0611 同 理 , 如 果 Schlieren 曲线 合适 的 话 , 可 用 式 (8-2)、 式 (8-4) 从 液 柱 底部 计算 分 子 量 。 = 9173. 10° «71. — BIL BRA 吉平 衡 法 测定 分 子 量 讽 前面 讲 过 的 方法 不 同 。; ee ee ee ee 一 密度 梯度 介质 中 。 离 心 池 底部 介质 密度 比 样品 密度 大 ， 离 心 一 段 时 间 后 样品 固定 在 和 它 本 身 密度 相等 的 地 方 ( 图 9-1)。 密度 梯度 超 离心 平衡 分 析 将 提供 高 分 子 的 浮力 密度 \ 溶 剂 化 、 结构 和 化 学 组 成 的 信息 。 密度 梯度 平衡 实验 开始 时 离心 池 装 满 样品 和 一 低 分 子 量 溶质 的 均匀 水 溶液 或 缓冲 液 。 这 个 低 分 子 量 溶质 即 梯度 物质 。 离 心机 以 相当 高 的 速度 运 转 24 一 48 小 时 直至 达到 平衡 。 离心 过 程 中 梯度 物质 重新 分 布 ， 在 离心 池 中 形成 一 密度 梯度 。 样 品 粒子 浓缩 成 一 条 或 几 条 区 带 ( 有 几 个 成 分 的 话 )， 它 ( 们 ) 的 位 置 是 梯度 中 相当 于 它们 的 密度 的 位 置 。 根据 沉降 -扩散 平衡 理 论 ， 梯 度 物质 在 离心 池 中 的 分 布 可 以 由 它 的 起 始 浓度 、 分 子 量 和 活 度 系数 来 决定 。 梯度 溶液 因 压缩 而 密度 增 加 ,通常 是 极 小 的 ,因此 得 到 的 是 大 气 Bee 压 下 大 分 子 的 浮力 密度 值 。 这 里 浮力 密度 是 指 溶剂 化 粒子 的 密度 ， 可 能 是 所 用 的 入 度 介质 的 一 个 特性 ”因此 在 丙种 不 同 的 介 质 中 测 到 的 密度 可 能 不 同 。 如 果 粒 子 具 有 淆 透 性 ， 则 不 同 浓度 时 即使 是 同一 一 介质 中 测 得 的 密度 也 会 不 同 。 样品 区 带 的 宽度 取决 于 几 个 因素 , 它 是 梯度 陡 度 的 一 个 函数 ,因而 也 就 是 取决 于 起 始 浓度 和 转速 以 及 大 分 子 的 物理 性 质 。 在 固定 实验 条 件 下 ， 区 带宽 度 取决 于 样品 粒子 密度 的 不 均一 度 和 它 的 扩散 速度 。 扩散 速度 和 粒子 的 大 小 成 反比 例 。 因此 样品 如 果 密 度 均 二 ;可 以 从 区 带宽 度 测定 分 子 量 。 事 实 上 用 这 个 方法 测定 核酸 或 病毒 的 分 子 量 带 有 一 定 风险 ， 因 为 不 容易 区 别 区 带宽 度 是 由 于 扩散 引起 还 是 不 均一 或 者 其 他 复杂 因素 引起 的 。 理论 上 测定 分 子 量 需要 知道 有效 的 ”密度 梯度 ， 这 个 量 既 考虑 了 溶剂 化 大 分 子 的 密度 变 化 ,也 考虑 了 密度 梯度 的 压缩 性 ,但 是 这 个 量 很 难 精确 赋值 。 下 面 只 介绍 一 种 最 简单 的 实 验 步 又 ,得 到 的 结果 是 一 个 很 好 的 大 分 子 分 子 量 近似 值 。 对 合适 的 梯度 物质 的 要 求 是 很 苛刻 的 ， 只 有 很 少 物 质 符合 生物 物质 测定 的 要 求 。 梯 度 物 质 必须 溶解 度 大 , 配 成 的 溶液 有 足够 高 的 密度 ,不 和 样品 起 反应 (不 包括 溶剂 化 )， 本 身 非常 稳定 ， 一 般 来 讲 在 紫外 区 应 无 吸收 。 有 时 还 要 求 梯度 物质 对 样品 不 能 有 不 良 的 次 透 压 效应 。 最 常用 的 两 种 梯度 物质 是 蔗糖 和 氧化 饮 。 芒 糖 价格 低廉 ,渗透 压 效应 小 ;缺点 e 272Z 。 EE (g/cm?) 0.9982 1.0021 1.0060 1.0099 1.0139 1.0179 1.0219 1.0259 1.0299 1.0340 1.0381 1.0423 1.0465 1.0507 1.0549 1.0592 1.0635 1.0678 1.0721 1.0765 1.0810 ‘1.0854 1.0899 1.0944 | 1.0990 1, 1036 1.1082 1.1128 1.1175 1.1222 1.1270 1.1318 1.1366 1.1415 1.1463 1.1513 1.1562 1.1612 1.1663 1.1713 1.1764 1.1816 1.1868 1.1920 1.1972 9-1 20°C REC FE 342) 的 密度 折射 率 和 浓度 数据 折射 率 ，zp 上 .3330 1.3344 » 1.3359 1.3374 1.3388 1.3403 1.3418 | 563433 1.3448 1.3464 1.3479 1.3494 1.3510 1.3526 153541 $9557 1.3573 1.3590 1. 3606 1.3622 1.3639 1.3655 1.3672 1.3689 _ 1.3706 1.3723 1.3740 1.3758 1.3775 1.3793 1.3811 1.3829 1.3847 1.3865 1, 3883 1.3902 1.3920 1.3939 1.3958 1.3978 1.3997 1.4016 1. 4036 1.4056 1.4076 wo on nV SB WN SS © jj 让 mwN 一 王 rm \D co wn WwW NNN N MP >» WN — © oR Ca en ide go I Got Guo uolsts Teh Ge Ww NEO a BO” RD AW NH OO CAF RUN” 25D N = OF COTO NT AU 量 百分比 (9) 二 | | | i | SK (mg/ml)* | | , 续 表 9-1 密度 (e/cm*) 折射 率 , mp 。 | 重量 百分比 (9)| 。 溶液 《mg/mD)* 克 分 子 浓度 1.2025 1.4096 0 45 541.1 1.582 1.2079 1.4117 1 46 555.6 ‘1.623 1.2132 - 104137 47 570.2 1.666 1.2186 . 1.4158 48 584.9 1.709 1.2241 : 1.4179 49 599.8 1.752 1.2296 1.4200 50 = IAS 1.796 1.2351 1.4221 51 629.9 1.840 1.2406 1.4242 52 645.1 1.885 1.2462 1.4264 53 660.5 1.930 1.2519 1.4285 54 676.0 1.975 1.2575 1.5307 55 691.6 2.020 1.2672 124329 56 707.4 2.067 1.2690 1.4351 57 727.3 2.113 1.2748 4373} 58 739.4 2.160 1.2806 1.4396 59 755.6 2.207 1.2865 1.4418 60 771.9 2.255 1.2924 404441 61 788.3 2.303 1.2983 ) 1.4464 62 804.9 2.351 1.3043 | 1.4486 63 821.7 2.401 1.3103 . 1.4509 64 Cm fea 2.450 1.3163 1.4532 65 855.6 2.500 1.3224 T4558 | 66 872.8 2.550 1.3286 1S456r >| 67 890.2 2.864 * 除 10 GARADRS (W/v), 是 密度 小 , REBERA 1.3g/cm’, 浓 溶 液 非 常 粘 。 由 于 蔗糖 的 粘度 特别 大 ,通常 预先 制 成 梯度 备用 。 氧化 钨 密度 可 高 达 1.9g/cms, 但 是 相当 贵 ,， 溶 液 对 铝 制 转 头 和 离心 池 有 腐 ， 蚀 。 用 于 核酸 测定 时 , 钢 离 子 代 替 了 常用 的 配对 离子 钠 离 子 ,因此 实际 研究 的 是 核酸 的 钨 盐 。 不 纯 的 氧化 钨 ， 溶 液 强烈 吸收 紫外 光 ， 所 以 只 有 经 过 精制 的 光学 级 的 氧化 钨 才 可 以 用 。 密度 梯度 溶液 可 以 称 重 配 制 ， 或 者 配 成 溶液 后 测定 它 的 折射 率 换 算 成 浓度 。 表 9-1 是 蔗糖 水 溶 冬 的 密度 、 折 射 率 和 浓度 之 间 的 关系 。 表 9-2 是 氧化 饮 溶 液 的 有 关 数 据 。 必 须 注意 在 文献 中 有 些 工作 者 用 重量 百分数 表示 浓度 ,而 另 一 些 工 作者 以 容量 百分数 表示 ， 从 表 9-1 FUR 9-2 可 以 看 出 ,这 两 种 方式 表达 溶液 浓度 时 ,它们 的 数值 差 是 不 可 忽略 的 。 用 氧化 钨 溶液 作 密 度 梯 度 实验 ， 温 度 常 选 25*c， 因为 这 个 盐 的 许多 物理 性 质数 据 都 是 在 这 个 温度 下 测定 的 。 密度 梯度 离心 技术 的 一 个 突出 优点 是 只 需要 很 少量 样品 。 例 如 只 要 几 个 微 死 的 核酸 就 可 测定 它 的 浮力 密度 。 密 度 梯度 离心 技术 主要 用 于 测定 非常 大 的 溶质 粒子 ， 例 如 核酸 和 病毒 的 分 子 量 ， 因 为 平衡 时 区 带宽 度 和 分 子 量 成 反比 。 例 如 在 56;,000rpm it, AEM (分 子 量 11700) 的 区 带宽 度 超 过 lcm ， 这 是 最 小 可 测 分 子 量 。 显然 有 几 个 组 分 并 存 时 ， 密度 梯度 离心 技术 的 分 辩 率 远 较 常规 的 方法 低 , 不 过 对 于 研究 蛋白 质 的 光 剂 化 ,这 个 技术 o fas 表 9-2 25°C MiLB FM 168.27) 的 密度 、 折 射 率 和 浓度 数据 ”密度 (¢/cm?) 重量 百分比 69)| WR (mg/ml) 1.0047 1 10.0 1.0125 2 20.2 1.0204 3 30.6 1.0284 4 41.1 1.0365 5 51.8 1.0447 6 62.8 1.0531 7 73.7 1.0615 8 84.9 1.0700 9 96.3 1.0788 10 107.9 1.0877 11 119.6 1.0967 12 131.6 1.1059 13 143.。8 1.1151 14 156.1 1.1245 15 168.7 1.1340 16 181.4 1.1437 17 194.4 1.1536 18 207.6 1, 1637 19 221.1 1.1739 20 234.8 让 hh 21 248.7 1.1948 22 262.9 1.2055 23 27753 1.2164 24 291.9 1.2275 25 306.9 1.2387 26 322.1 1.2502 27 337.6 Wo Set 28 353.3 . 1.2738 29 369.4 1.2858 30 385.7 1.298 31 402.4 1.311 32 419.5 1.324 33 436.9 1.336 34 454.2 1.3496 35 472.4 1.363 36 490.7 : 1.377 37 509.5 t 1.391 38 528.6 1.406 39 548.3 1.4196 40 567.8 t 1.435 41 588.4 , 1.450 42 609.0 5 1.465 43 630.0 ‘ 1.481 44 651.6 i 1.4969 45 673.6 + | 太一 二 nr Pr 续 表 9 -2 a 密度 (g/cm) 折射 率 ，” 若 | 重量 百分比 (96)| HK (mg/ml) WF UR 1.513 1.3822 46 696.0 4.134 1.529 1.3837 47 718.6 4,268 1.546 1.3852 48 742.1 4.408 1.564 1.3868 49 766.4 4.552 1.5825 1.3885 50 791.3 4.700 1.601 | 1.3903 51 816.5 4.849 1.619 1.3920 52 841.9 5.000 1.638 1.3937 53 868.1 5.156 1.658 1.3955 54 895.3 5.317 1.6778 1.3973 55 922.8 5.481 1.699 1.3992 { 56 951.4 5.651 1.720 1.4012 57 980.4 5.823 1.741 1.4032 58 1009.8 5.998 1.763 1.4052 59 1040.2 ) 6.178 1.7846 1.4072 60 1070.8 6.360 1.808 1.4093 61 1102.9 6.550 1.831 1.4115 62 1135.8 6.746 1.856 1.4137 63 1167.3 6.945 1.880 1.4160 64 1203.2 . 7.146 1.9052 1.4183 65 1238.4 | 7.355 * 密度 在 1.00 一 1.38 之 间 ， 按 下 列 关 系 式 计算 密度 : po” = 10.2402n% — 12.6483 密度 高 于 1.37, 按 下 式 计 算 密度 : pe” 一 10.8601m 答 一 13.4974 *#” 除 10.0 得 容量 百分数 922〈 王 /z)。 是 很 有 用 的 。 由 于 样品 溶液 浓度 非常 低 ,光学 系统 总 是 选择 紫外 光 吸 收 法 。 浓 盐 洛 液 ; 如 氧化 钨 浓 溶液 的 密度 梯度 ,类似 一 个 息 镜 , 会 使 透 过 离心 池 的 光线 偏 折 。 在 极端 的 场合 下 ， 甚 至 使 光 偏 出 照相 镜 , 因 此 一 部 分 甚至 整个 离心 池 不 在 底片 上 曝光 。 为 此 ,采用 负 1 或 2 OR 形 池 窗 予以 补偿 。 x 验方 法 (一 ) 样品 ,离心 池 ` 光 学 系统 采用 紫外 吸收 光学 系统 \ 双 槽 离心 池 、 碳 粉 充填 池 芯 , 下 池 窗 用 平面 石英 片 * 上 池 窗 用 fi 1? 模 形 石英 窗 。 Wi = 56D (W/W) 氯 化 钨 缓冲 溶剂 (5.65M CsCl, 比重 1.70g/cms3) 0.7ml Ei 5ug/ml DNA WIRCGAF ERA FA) 0.0—0.02 0.7ml (=) 运转 条 件 25°C, 44,000rpm 旋转 16 小 时 后 开始 记录 并 扫描 。 如 有 单 色 仪 波长 选用 265nmo « 7T6 。 一 -二 -一 Way if 2 MMA — Kk, 直至 峰 高 不 再 变化 为 止 ; 表示 已 经 达到 平衡 。 如 果 没 有 峰 出 现 , 表 示 样 品 溶液 浓度 不 够 ;或 者 没有 选 对 密度 梯度 范围 。 从 现在 选择 的 上 述 实 验 条 件 , 平 衡 时 “ 离心 池 顶 部 密度 为 1.65g/cm, 底部 密度 为 1.75g/emso, 因为 DNA 密度 在 1.7g/cm* 左右 ， 所 以 不 会 有 这 个 问题 。 至 于 未 知 样品 就 要 用 一 系列 不 同 浓度 的 氯 化 钨 溶液 来 做 实验 。 一 个 快速 选择 密度 梯度 的 方案 是 , 先 用 5 倍 上 述 样品 浓度 (0.0 一 0.1) 的 1.4g/ems MLA ”小 做 实验 , 离心 后 前 几 个 小 时 内 每 隔 16 分 钟 观 察 一 次 。 如 果 在 液 面 有 一 界面 沉降 ,同时 在 液 底 有 一 界面 上 浮 ， 表 示 离 心 池 中 密度 梯度 选 对 了 。 如 果 只 有 沉降 界面 ， 表 示 密 度 太 低 。 反 之 ,如 果 只 有 上 学界 面 , 表 示 密 度 太 高 。 如 是 反复 实验 可 以 找到 合适 的 密度 梯度 。 (三 ) 计算 浮力 密度 o, 按 式 (9-1) 计算 pha Oe Te (<2) (rs = re) E921) 其 中 pe 是 离心 池 中 的 等 浓度 点 , 即 这 re 点 处 梯度 的 浓度 等 于 起 始 浓度 , pe 一 poo 而 2 2 ‘i pa (9-2) 其 中 ry» ry 4) BIOWARE BSS 式 (9-1) 中 r, 为 样品 区 带 峰 项 距 轴 心 的 距离 , (42 ) 由 式 (9-3) 计算 。 do = wr. Ds a 8 32 (37) NA al & dina ~. 8 是 一 个 因子 , 它 的 定义 是 一 -工人 ™ SUL PS WER ANY © BOB LR (1 — vp)M \ dp 9-3, ZEABICH py = 1.70, HB = 1.19 x 10% 分 子 量 测 定 需 要 假定 大 分 子 区 带 呈 Gaussian 曲线 分 布 。 从 分 布 曲线 的 标准 偏差 c 来 表 9-3 25"C 下 不 同 密度 氯 化 德 溶液 的 8 值 BE (g/cm?) 8 1/8 1.15 2.491 10° 0.4014X10-° 1.20 1.984 0.5040 1.25 1.715 0.5831 1.30 1.546 0.6468 1.35 1.430 0.6993 1.40 1.346 0.7429 1.45 1.286 0.7776 1.50 1,245 0.8032 1.55 1.216 0.8224 1.60 1.197 0.8254 1.65 1.190 0.8403 1.70 1.190 0.8403 1.75 1.199 0.8340 1.80 t.215 0.8230 1.85 1.236 0.0891 te, bd al aes 计算 。 如 图 9-2: 所 示 , 画 一 条 基线 ; 测量 峰 高 。 tetas 0.607 处 测 和 . any Pea 相当 于 RUKH FS BERK OD: RRA TR Mo 4 fe he — 二 Ws . wre eins nee i: 学 mm "¢ « base oP, A ACL 4,0 Wee iat 本 ape ‘Ki Si , 六 YY 。 第 十 章 “离心 分 析 技术 必须 的 辅助 测定 几乎 所 有 的 离心 分 析 技术 都 需要 知道 离心 池 中 溶 洲 的 密度 p。 测定 分 子 量 时 要 使 测 定 值 误差 小 于 1 多 ， 样 品 密度 测定 值 必须 准确 至 0.3 多 以 内 。 密度 测定 虽然 可 以 用 密度 计 来 做 * 不 过 常用 的 还 是 .10 一 25ml KERN RO TRAM RE. BOT RA Sia vis HE Be» 因 溶 人 溶质 而 引起 的 密度 变化 非常 小 , 除 特 别 精确 测定 外 , 几乎 都 把 纯 溶剂 的 密度 代替 ,以 节约 样品 量 。 一 些 常用 的 溶剂 密度 见 表 10-1 MIA 10-1, 即使 要 精确 值 也 可 以 用 溶剂 的 密度 来 计算 溶液 的 密度 。 计 算 公式 见 式 (10-1), 一 些 计算 结果 见 表 10-2。 ioe Ousi ~'bun + Cl '—‘pendl) | (10-1) 其 中 < 是 流 度 ;7 是 溶质 的 偏 微 比 容 。 -- 表 10-1 水 的 密度 er. 和 盐 溶 液 的 Ap 与 /mv，P: 一 puv + Ap (a) 水 的 密度 本 : Puw(g/em?) 0.9978 0.9973 0.9968 : 0.9963 ; 0.9957 0.9954 0.9951 (RE A0 FIT Mow ; ; 3 = 克 分 子 浓度 Ao(g/cm ) 7! Neuw ] @ 20° 25° 30° 30° 40 R 有 GPRM) NaCl 0.10 0.0041 | 0.0041 | 0.0041 1.009° 1.010 0.20 0.0083 | 0.0082 | 0.0081 1.019 1.021 0.50 0.0204 | 0.0202 | 0.0200 1.049 1.054 ; 1.00 0.0403 | 0.0399 | 0.0395 1.101 1.111 : 2.00 0.0788 | 0.0780 | 0.0774 1.225 1.241 3.00 0.1160 | 0.1149 | 0.1140 1.382 1.397 KCl 0.1 0.0030 . 0.2 0.0079 KH,Po, 0.01 0.0010 0.10 0.0098 : 0.20 0.0193 ¢ 0.50 0.0469 «79 56 克 分 子 浓度 tht 盐 (M) Na, HPO, 0.01. 0.10 0.20 NaH,PO, 0.01 0.10 0.20 0.50 1.00 CH,COOH CH,COONa Na,CO, Na,B,O, RRA 溶质 的 7(cm?/g) 浓度 (mg/ml) 0.700 ; | 0.1 | | 1.0 . 3 wees 10.0 0.725 0.1 1.0 5.0 10.0 0.750 0.1 1.0 5.0 10.0 = 80 。 一 | 一 | 一 一 | 一 | 一 -一 密度 增 量 〈g/cm) 0.00003 0.0003 0.0015 0.0030 0.00003 0.0003 0.0014 0.0027 0.00003 0.0003 0.0013 0.0025 相对 密度 (212 my | TREE (mol/l) | 图 10-1 PROMEEC 可 在 15—30°C 范围 内 使 用 。 =<. 度 » 沉降 系数 、 扩散 系数 换算 成 标准 状态 。 必 须知 道 溶液 的 粘度 ， 和 密度 情况 一 样 ， 在 许 多 场合 , 特别 是 无 限 稀释 的 溶液 ， 以 溶剂 的 粘度 值 代替 溶液 的 粘度 ， 误差 极 小 , 可 忽略 不 计 。 粘 度 一 般 用 毛细 管 粘度 计 测 定 ,如 ,Ubbelohde 粘度 计 ( 图 10-2)。 因为 沉降 分 析 计算 中 只 需要 测定 咨 沪 对 水 的 相对 粘度 ， 因 此 只 要 知道 定量 溶 该 和 水 在 粘度 计 中 流 过 时 间 之 比 ， 些 值 直接 可 代 估 计算 。 一 些 浓度 不 同 的 盐 溶液 的 相对 粘度 见 表 10-1 和 图 10-3。 水 的 粘度 随 温 度 的 变化 很 大 ， i UBER 10-3) 浓度 (mol/1) 10-2 Ubbelohde Fl 10-3 BR tha LA At th 粘度 计 粘度 y/o, 25°C WEE » 8] 。 表 10-3 不 同 温度 水 的 粘度 和 20°C 水 粘度 的 比值 Cn:/ 20,7) 前 RR oN 1, 60 A UL we Ne Oo 16 Ww | | — | Ss J | —_qcr o“§m lume Se ee Cat +. nal el oe oe oo od NN UW 2 WN KY O&O NN Ne 王 局 KF OC WO CO Www wwwNnN WY YN DN N KN WA 上 ww 一 DO ON NH MU S&S W =. ta mk tk A 几乎 所 有 的 沉降 分 而 都 需要 用 到 偏 微 比 容 0 偏 微 比 容 的 定义 是 溶质 溶 于 溶剂 中 产 生 的 体积 变化 。 Og; T»Psf 由 于 溶质 的 流体 力学 性 质 取决 于 (1 — Go)» 偏 微 比 容 数 值 的 准确 性 有 可 能 对 沉降 分 析 结 se 82% 果 产 生 很 大 影响 。 例如 沉降 -扩散 法 测定 分 子 量 ;到 有 0.3 多 误差， 计算 结 果 误 差 为 1 多 (o ~ 1)。 决 定 偏 微 比 容 的 因素 有 温度 和 溶剂 化 作用 。 溶剂 化 作用 对 稀 溶液 中 的 绝 大 多 数 蛋 折 质 的 影响 很 小 。 但 是 在 某 些 溶液 ， 例 如 高 液 度 的 去 污 剂 或 氧化 饮 溶 液 作 用 非常 复 io Casassa 和 Eisenberg” 研究 了 多 组 分 体系 的 偏 徽 容 积 的 热力 学 性 质 ， 表 明 对 混合 深 液 透 折 乎 衡 的 多 组 分 溶液 可 以 得 到 显示 比 容 的 真实 值 。 沉降 平衡 实验 中 采用 这 些 显 示 值 , 可 避免 理论 上 溶剂 相互 作用 处 理 的 困难 而 得 到 正确 的 非 溶 剂 化 分 子 量 。 鉴于 偏 徽 比 容 的 重要 性 ,有 许多 方法 被 用 来 测定 这 个 数值 ,但 是 没有 一 个 方法 是 完全 令 人 满意 的 。 下 面 列举 了 一 些 方法 。 (一 ) 从 实验 结果 来 估算 绝 大 部 分 蛋白 质 的 偏 微 比 容 数 值 接近 ， 例 如 MecMeekin 和 Marshallea 测定 了 一 系 列 蛋 白质 的 偏 微 比 容 大 约 都 是 0.75。 因 此 可 以 假设 一 个 值 , 用 来 计算 分 子 量 。 这 时 报道 ”的 结果 应 列 出 分 子 量 与 浮力 因子 (1 — 90) BMA — 2), ey ee 的 > 是 一 个 假设 值 。 表 10-4 列 出 了 一 些 核 酸 的 偏 微 比 容 值 供 参考 。 % 10-4 DNA 和 RNA 的 偏 微 比 容 Kz eR. (ml/g) DNA*! : Cs DNA 0.479 gianni . Rb DNA ; 0.516 Na DNA 0.556 Li DNA | 0.561 K DNA 0.562 é NH, DNA 0.613 RNA Na RNA 0.57-£0.02*7 0.53*° *! Jj. E. Hearst, J. Mol. Biol. 4, 415 (1962). *2 P. Doty, H.\ Boedtkan, J. R. Fresco, R. Hoselkorn, M. ‘Litti, Proc. Nazi. Acad Sc# (USA) 45, 482 (1959). ** J. H. Strauss, R. L. Sinsheimer, J. Mol. Biol. 7, 43 (1963). (=) 根据 氨基 酸 分 析 知道 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 ， 可 以 根据 氨基 酸 的 偏 微 比 容 来 计算 蛋白 质 的 偏 微 比 容 。 Edsall 等 沁 测 定 的 氨基 酸 残 基 偏 微 比 容 见 表 10-5。 用 这 个 方法 计算 偏 微 比 容 较 上 述 (一 ) 法 为 佳 。 不 过 有 些 因素 如 蛋白 质 的 主体 结构 对 偏 微 比 容 的 影响 被 忽略 。 对 于 某 些 结构 蛋 白 计 算数 值 可 能 不 太 正 确 。 #105 AERREHKS . 核 糖 核 酸 . 酶 wa eR sg vj 伍 基 酸 残 基数 /分 子 | ssbb ei H AR : 0.64 3 1» | LoS. A 氨 酸 0.74 12 i ice 8 丝氨酸 0.63 15 9.44 KAR 一; 0.70 10 7.56 Gi 氨 酸 0.86 9 6s27…， 亮 氨 酸 0.90 2 1.74 RAR 0.90 3 2.30 ee 0.76 5 3.32 FAR - 0.68 . 一 as mae 0.75 4 Eg Bt 氨 酸 at ts FRA 8 5.95. & a 酸 + Me Bae iow 6.84 组 氨 酸 4 3.73 aw 4 4.43 hi 氨 酸 10 9.22 44 Kea 7 5.69 天 冬 酰胺 9 7.31 aA 酸 4 -363 ACA 7 = 谷 氨 酰胺 8 Teed. AAR 3 3.13 总 数 126 ZW; 98.82 ZoiW; 170.44 5 一 Ut = 0.713 ml/g (=) 用 比重 瓶 测定 这 是 最 常用 的 方法 。 秤 量 比重 瓶 中 溶液 的 质量 根据 式 (10-2) 计算 偏 微 比 容 fit gees 8 w)(= \(4) (10-2) 其 中 4 是 比重 瓶 中 溶 波 的 质量 ; 久 是 溶质 的 重量 百分数 ;，p 是 淤 液 的 密度 s “ 议 冯 对 厂 作 图 ， 斜 率 为 44/4aW。 二 随 浓度 变化 , WOR 24/dW 计算 1-zupo (po 是 溶剂 的 密 BE) MSR & 不 随 浓度 变化 , 则 可 用 显示 偏 微 比 容 丈 来 代替 fal we (10-3) 其 中 ” = = ERBRNLA, m= ait 是 溶剂 的 比 容 。 可 见 ， 见 ,， 只 要 在 一 父 溶 质 流 度 测 定 就 可 计算 7,0 在 式 (10-3) 中 sw tease ReRLICRER, 这 对 地 也 是 一 样 。 用 未 法 测定 偏 微 比 容 ,需要 相对 来 讲 大 量 的 样品 ,小波 密度 测定 必须 十 分 准确 。 对 蛋 白质 来 讲 ， 要 使 的 数值 正确 至 +0.002ml/g,1% 浓度 溶液 密度 必须 准确 至 小 数 点 后 第 五 位 上 土 2。 这 就 是 说 ， 用 10ml 比重 瓶 时 要 准确 秤 量 至 £0.2mg, 溶质 浓度 必须 准确 至 / +0.07mg/ml, (四 ) 沉降 平衡 法 测定 这 是 一 种 和 上 述 不 同 的 做 法 ， 是 在 一 系列 不 断 增加 密度 的 溶剂 中 进行 沉降 平衡 测定 分 子 量 , 得 到 M(1 一 zp), 同时 计算 M 和 zeo。 本 法 的 前 提 是 溶剂 和 溶质 的 相互 作用 不 因 密度 增加 而 增加 ;所 以 溶剂 局 限于 那些 含 H 和 QO 的 重 同位 素 的 水 。 :在 两 个 成 分 的 体系 中 (水 -蛋白 质 ,但 是 含有 不 和 蛋白 质 结合 的 盐 类 )， 溶剂 是 HiO 和 D;O。 根据 沉 降 平衡 法 Ms(1 pu) = 2RE (ding) EE NS Bee) us Sia) 2E aw 其 中 Ms* 是 蛋白 质 的 分 子 量 ， 《是 D 置 换 互 前 后 蛋 旦 质 分 子 量 之 比 。 MX (10-4) 和 式 (10-5) og ere. en . 二 a | (10-6) yar tay ppio — Pero. vt | wee 其 中 : SP, bred (dine/dr? Joie ~~. (dine /dr? et (10-7) 298 Tk SEARO HE Ca RD REL AO ELL Te TY， 半 胱 氨 酸 的 s 和 丝氨酸 的 O 上 结合 的 氢 均 被 气 置换 。 一 般 来 讲 ,& 值 与 蛋白 质 种 类 关系 不 天, 大致 有 一 定 值 : 1.0155, 至 于 溶剂 若 不 是 100% ? & 值 可 按 比例 折算 。 例如 等 量 混和 《(H20:D:;O 1:1), 水 四 7TRe ‘LB ALA REHO me | 实验 条 件 ， 莱 缩 酶 溶 于 0.1M 磷酸 钠 缓冲 液 ， z pH(pD) = 7, 20°; 起 始 浓度 0.2mg/ml, 转速 20,00drpm， 用 高 速 沉降 平 街 法 ， 记 录用 紫外 扫描 ， 测 量 280nm 吸收 。 结 果 如 图 10.4 所 示 ， 以 斜率 (dine/dr?) 代 人 式 (10-4) 和 式 (10-5) 得 : 人 56 二 总 M;(1 一 zomo) = 38200 +600 2 Ds 0 , v 图 10-4 In 2300 对 关 作 图 。0. kM (1 1 7 PD ay: = 2860024600 主语 @ pD7, areas 1 00o 一 1013，ppo = 1.118, k= 1.01555 Mkt (10-6) | v = 0.742+0.005 fA M = 154,000 +2000 这 和 其 他 方法 测定 的 数值 一 致 e 8S « 附录 ”制备 超 离心 技术 离心 机 是 一 种 把 溶液 中 的 粒子 分 离 出 来 的 仪器 。 制备 超 离心 技术 和 分 析 超 离心 技术 的 区 别 ,在 于 前 者 的 目的 是 分 离 出 一 些 “ 专 门 的 "粒子 ,后 者 还 包括 对 这 些 沉 降 粒 子 物 理性 质 的 测定 。 从 生物 学 方面 来 讲 ， 专 门 的 "粒子 通常 指 的 是 细胞 , 亚 细 了 胞 组 织 或 生物 高 分 子 。 制备 超 离心 技术 包括 两 种 方法 : 一 种 是 分 级 离心 法 , 另 一 种 是 密度 梯度 离心 法 。 了 分 级 离 心 法 一 个 非 均 一 的 粒子 悬浮 液 在 离心 机 中 离心 时 ， 各 种 粒子 以 各 自 的 沉降 速度 移 向 离心 管 底部 ， 逐 步 在 底部 形成 一 层 沉淀 物质 。 这 -县 沉淀 物质 含有 各 种 组 分 ， 但 是 最 多 的 是 那 些 沉降 最 快 的 组 分 ( 见 图 1)。 为 了 分 出 某 一 特定 组 分 ， 需 要 进行 一 系列 离心 。 通 常 先 选 择 一 个 离心 速度 和 离心 时 间 ， 第 一 次 离心 时 -把 大 部 分 不 需要 的 更 大 粒子 沉降 去 掉 。 这 时 所 需要 的 组 分 大 部 分 仍 留 在 上 清 溢 内 。 然 后 将 收集 到 的 上 清 液 用 更 高 的 转速 离心 ， 把 需 要 的 粒子 沉积 下 来 。 离 心 时 间 要 选择 得 当 , 使 大 部 分 不 需要 的 更 小 粒子 仍 留 在 上 清 液 中 。 接着 是 把 沉淀 悬浮 起 来 ， 再 一 次 用 较 低 转速 离心 。 如 此 反复 高 速 、 低 速 离心 ,直至 达到 所 需 粒子 的 纯度 为 止 。 这 种 基于 粒子 沉降 速度 不 同 而 分 离 的 方法 ,用 得 非常 普遍 ,对 病毒 和 亚 细 胞 组 分 的 浓缩 特别 有 用 。 但 是 用 它 得 不 到 一 个 纯 组 分 (那个 沉降 最 慢 的 组 分 除外 ), 不 过 即使 那个 最 慢 沉 降 组 分 , 它 的 得 率 也 是 很 低 的 。 KYO Ht =. 图 1 分 级 离心 法 二 、 密 度 梯度 离心 法 密度 梯度 离心 法 较 分 级 离心 法 复杂 ， 但 是 它 具 有 很 好 的 分 辨 能力。 密度 梯度 离心 可 以 同时 使 样品 中 几 个 或 全 部 组 分 分 离 ,这 是 分 级 离心 法 所 不 及 的 。 顾 名 思 义 ,这 个 方法 是 把 样品 粒子 在 一 个 密度 梯度 介质 中 离心 。 这 个 介质 由 一 合适 的 小 分 子 和 样品 粒子 可 在 其 中 悬浮 的 溶剂 组 成 。 离 心 时 ， 离 轴 心 愈 远 介质 密度 愈 大 。 密 度 梯 度 离心 法 又 可 分 为 两 种 操作 方法 : 速率 区 带 离心 技术 和 等 比重 技术 ,两 者 的 原理 是 不 同 的 。 (—) 速率 区 带 技术 用 速率 区 带 技 术 分 离 样品 依赖 于 样品 中 粒子 或 高 分 子 的 不 同 大 小 和 沉降 速度 。 如 图 es 86 。 a ee wk Th ; = ee eee 2 a> BAR TB EAST» Fed te HOE DT Re — 度 , 不 过 底部 存在 着 一 个 陡 的 正 梯度 ,防止 了 样品 的 过 早 沉 “ #0 om Mo 离心 力作 用 下 粒子 在 梯度 介质 中 呈 分 离 的 区 带 状 沉 iy ee 降 ， 每 一 条 区 带 粒 子 的 特征 是 具有 同一 沉降 速度 。 根 据 不 a 同 的 实验 目的 可 以 设计 不 同 的 梯度 ， 图 :是 几 种 党 用 的 衬 度 形式 。 要 使 速率 区 带 离 必 \ 得 到 成 功 ， peer te x “于 梯度 液 往 中 任 一 点 的 密度 ， 并 且 必 须 在 区 带 到 达 离心 管线 底部 以 前 停止 离心 。 表 1 列举 了 速率 区 带 法 典型 实验 运转 参数 。 | (=) 等 比重 技术 等 比重 技术 是 按 粒子 浮力 密度 分 离 的 方法 ， 为 此 要 选 择 介质 的 密度 梯度 ， 使 梯度 的 密度 范围 包括 所 有 待 分 离 粒 子 的 密度 。 样 品 可 以 铺 在 密度 梯度 液 柱 上 面 或 均匀 分 布 于 密度 梯度 介质 中 。 离 心 过 程 中 粒子 移 至 它 本 身 相同 密度 的 地 方形 成 区 带 ， 因 此 平衡 时 它们 的 分 离 完全 是 由 于 它们 之 间 密度 的 差异 ,和 时 间 无 关 ( 图 4)o ee, | 等 比重 梯度 实验 中 最 常用 的 介质 是 碱 金属 的 盐 溶液， 如 锁 盐 或 锣 盐 。 实 验 开始 时 往往 是 一 密度 均一 的 溶液 ,在 样品 区 带 等 速 型 KIO BE wR 1 2 3 图 2 在 水 平 式 转 头 中 进行 速率 区 带 分 离 。 1. 充满 密度 梯度 溶液 的 离 a; 2. 样 品 加 于 梯度 顶部 ;” 3. 离心 力作 用 下 粒子 按照 它们 的 质量 以 :不同 的 速度 移动 。 AS 几 种 梯度 形式 离心 过 程 中 自动 形成 梯度 。 这 个 过 程 称 做 “自生 梯度 "。 形 成 梯度 过 程 中 ， 原先 均匀 分 布 的 样品 粒子 也 下 沉 或 上 浮 至 其 等 比重 位 置 。 这 种 "自生 梯度 "技术 需要 长 时 间 离 心 ， 例 如 DNA 在 氧化 钨 梯度 中 形成 等 比重 区 带 需要 36 到 48 小 时 。 特 别 要 指出 是 ,离心 时 间 不 会 因 转 速 增加 而 减少 ,提高 转速 只 能 使 梯 训 物 质 重 新 分 布 , 区 带 位 置 有 所 改变 。 表 2 列举 了 等 比重 分 离 技术 的 典型 实验 和 运转 参数 。 许多 密度 梯度 实验 常常 把 速率 区 带 方法 和 等 比重 法 合并 应 用 。 例 如 选择 一 个 密度 梯 e 87 。 (Rl 速率 区 带 法 的 典型 实验 和 运转 参数 前 | Loe 血清 SW-60 5—20% 60,000 i} 血清 、 975 Sw-60 | 10—40% 60,000 5 烟草 花 叶 病毒 (TMV) sw40/41. | 10-40% 4 和 000 er eT 多 核糖 体 ( 鼠 肝 ) Z Sw40/41 10—40% 40000 5 多 核糖 体 ( 鼠 肝 ) y SW50.1 10—50% 50000 ts 核糖 体 亚 单位 SSW50T 10—40% 50000 tg 血清 Zane SW50.1 5—20% f 50000- Ss. 血清 457 Sw50.1 3—15% 50000 |. 6 ae 酶 (大 部 分 ) 52 8; SW60 10—40% 60060 te 亚 细 胞 组 分 (无 线粒体 ) SW-27 25135#3 27000 5 45 /55% rane he oe 核糖 体 RNA( 鼠 肝 ) ， , SW50.1 5—20% 50000 | * & fo 5 核糖 体 RNA (BF) sw60 10—40% 60000 ee DNA( 大 部 分 ) SwW60 pt: 10—40% | 55,000 | 5 | 5 * 这 是 Beckman 离心 机 的 转 头 型 号 ， 它 们 的 含义 以 SW50.1 为 例 ，SW 是 水 平 式 转 头 ，50 Sa HE 50000rpm (50x 1000), 最 后 数字 .T 是 型 号 。 又 如 SWw40/41 是 二 种 水 平 转 头 ， 最 高 转速 分 别 为 git tre 和 41000rpm, ~ 如 使 用 不 满 管 不 会 撕 裂 的 聚 碳酸 脂 , 离 心 管 中 液 体 用 量 少 一 半 ; 离 心 时 间 缩短 为 全 液 柱 时 的 112 或 114。 s 不 连续 梯度 。 a aL 力 场 | 图 4 “自生 ?梯度 等 比重 分 离 。1. 样 品 与 梯度 物质 混合 的 均匀 溶液 ; 2. BOAT BERET. 分 布 ? 样 品 区 带 保留 在 等 比重 处 < 表 2 等 比重 分 离 技术 的 典型 实验 和 运转 参数 gies | 转速 | 时 间 | 温度 i 转 离心 管材 料 | 沪 度 (zjcin5| Crpm) | 小 时 让 Co) DNA《【《 永 状 或 线 型 。B. Coli) | 1. SW50.1 | 育 碳 酸 酯 ( 半 满 ) : 20° DNA (HAR REB, E. Colt) Pe, Type50.2 | 聚 碳酸 酯 ( 半 满 ) 20° DNA (afi fk spo2) 2 Type50.70 | 聚 碳酸 酯 ( 半 满 ) : ‘| 20° DNA (Micrococcus luteus) : Type65 聚 碳酸 酯 ( 半 满 ) 20° *! SW 水 平 式 转 头 xy Type PARK RREMR 1 注 s « 88 。 度 使 得 样品 中 一 部 分 组 分 沉降 到 离心 管 底部 ,而 另 一 部 分 组 分 停留 在 它 的 等 比重 区 。 三 、 密 度 梯 度 分 离 法 的 实验 方法 《一 ) 梯度 形状 宰 度 形状 对 于 分 离 是 否 成 功 非 常 重要 ， 图 3 中 已 列举 了 常用 的 梯度 形状 。 最 常用 的 是 线性 密度 梯度 ， 分 离 蛋 白质 \ 酶 激素 核糖 体 亚 基 和 一 些 植物 病毒 有 良好 的 分 离 效果 。 向 下 中 的 梯度 适用 于 脂 蛋白 或 一 些 需要 上 浮 分 离 的 样品 。 不 连续 或 阶梯 式 梯度 最 适用 于 分 离 整个 细胞 ,植物 或 动物 组 织 匀 交 中 的 亚 细 胞 组 分 ,以 及 纯化 一 些 哺乳 动物 病毒 或 屁 虫 病毒 。 ， 等 速 梯度 是 指 这 样 一 种 梯度 ,其 中 粒子 的 沉降 速度 和 梯度 液 柱 的 长 度 无 关 各 区 带 沉 ” 降 速度 不 变 ,常用 的 5 一 20% 芒 糖 线性 梯度 就 是 这 样 一 种 梯度 。 巨大 分 子 如 核糖 体 亚 基 、 多 核糖 体 以 及 一 些 植物 病毒 ,需要 一 种 陡峭 的 梯度 以 及 长 液 柱 以 增进 分 离 能 力 。 .实验 操作 中 常常 在 离心 管 底部 加 瑟 层 高 密度 溶液 作为 " 垫 液 ”, 它 形成 一 个 阶梯 ,有 时 是 很 有 用 的 。 这 层 垫 液 的 存在 使 离心 后 沉降 物 容易 再 度 悬 浮 起 来 ， 防止 有 些 物 质 沉 降 后 变化 ， 特别 像 有 些 病 毒 沉 积 后 会 失去 活性 。 (=) 梯度 物质 梯度 物质 的 选择 原则 是 满足 分 离 方法 的 基本 要 求 , 除 此 之 外 尚 应 考虑 下 列 几 点 : C1) 它 的 密度 范围 既 能 满足 所 有 密度 梯度 技术 分 离 样品 的 要 求 , 又 不 能 使 转 头 受过 分 压力 ; (2) 对 样品 的 生物 活性 有 影响 ; (3) 对 一 些 敏 感 组 织 既 不 高 次 又 不 低 渗 ; (4) 不 干扰 分 析 技术 ; (5) 可 以 和 所 需 纯化 物 分 开 ; (6) 在 紫外 或 可 见 光 区 无 吸收 ; (7) 价格 不 贵 , 使 用 方便 ;如果 价格 帅 贵 必须 能 回收 再 用 ; (8) 可 以 灭 菌 ; (9) 不 腐蚀 转 头 ; (10) 不 燃 , 它 的 气 溶 胶 无 毒性 。 __ 到 现在 为 止 还 没有 一 种 完全 合乎 理想 的 梯度 物质 。 速 率 区 带 法 分 离 时 常用 蔗糖 作 梯 度 物质 ， 等 比重 法 分 离 最 常用 的 是 氯 化 钨 。 表 3 列举 了 一 些 普通 用 作 速 率 区 带 和 等 比重 梯度 物质 以 及 应 用 它们 分 离 的 对 象 。 (=) 梯度 溶液 的 准备 在 制备 梯度 液 柱 前 必须 先 配 好 所 需 浓 度 的 梯度 溶液 。 如 果 事先 配 好 储备 液 就 比较 方 便 。 Cline 和 Ryel 报道 了 莽 糖 配 成 66 多 储备 流 (室温 下 将 1710 SERIF 900ml 水 中 ,搅拌 至 溶 ) ,在 Sc 可 无 限期 放置 ,很 少 长 菌 。 图 5 和 图 6 KT TR « 89 -« PEPER) 1000ml FAHY 66% (W/W) 蔗糖 溶液 所 需 毫升 数 所 震波 度 (所 ) 5 es。 90 « ， 密度 梯度 物质 溶剂 ASA HzO Ae H,0 D,O Pre He H,0 HBR H,0 AeRRRF (CM. W.40,000) H,O0 Ficoll*! H,0 甘油 H2O Metrizamide*? H,0 GF H,O BARF H,O GUL FA H,O 蔗糖 (6692) H2O (65%) ; D,O 碘 化 钠 H2O JP oy arte o/s. Se [| el pale: el oe IK BE C20°C) | 35 91 98 -26 -30 -13 17 -26 - 46 37 221 *! 瑞典 pharmacia Hank RRA MN RLSM. *? [2-(3- 乙 酰胺 基 -5-N- 甲 基 乙酰 胺 基 =2，4，6- 三 碘 茶 甲 酰胺 基 -2- 脱 氧 -D- 葡 萄 糖 ]。 稀释 至 100ml FAG 66% (W/W) 蔗糖 毫升 数 3 名 从 表 9-2 查 到 此 蔗糖 溶液 为 40 多 w /W, HAGE 5 的 曲线 来 配制 这 个 浓度 ， 可 将 550ml 66% 蔗糖 储备 液 稀 释 至 1000mls 当然 也 可 按 比例 将 5.5ml 66 % 储备 液 稀释 至 10mlo。 同 理 , 从 表 9-3 查 到 密度 1.176g/cm’ 莽 糖 溶液 的 浓度 相当 于 1.375M, 根据 图 6 得 到 同样 结果 , 55ml 66 % FER a eK i ZB 100ml, 这 里 再 一 次 提请 特别 注意 ,为 了 重复 文献 报道 的 实验 结果 ,必须 搞 清 楚 表示 梯度 溶液 的 单位 ,是 本 /本 还 是 本 /7， 两 者 是 有 差别 的 。 例如 20%(W/W) ERR BEE 1.081g/cm*, 相当 于 21.5%W/V 蔗糖 溶液 的 密度 1.0748g/cm3s。 对 氧化 钨 溶液 来 讲 ， 这 个 ”差别 尤其 大 。 Hi 20% (W/W) 氯 化 钨 溶液 的 密度 是 1.758g/cms, 和 23.4 匈 柬 /F AAC 液 的 密度 一 样 ( 表 9-4)。 (四 ) 梯度 溶液 柱 的 制备 蔗糖 或 Ficoll 等 类 似 的 粘性 液体 的 梯度 液 柱 可 以 用 手工 或 梯度 仪 制备 。 了 引 手 工 制造 梯度 溶液 柱 的 方法 见 图 7。 在 一 注射 器 针 上 加 接 一 段 细 管 ， 其 长 度 要 够 插 人 离心 管 底部 。 如 要 在 15ml 离心 管 中 制备 5 一 20% 蔗糖 溶液 梯度 柱 ， 先 在 离 心 管 底部 放 3ml 5% 蔗糖 溶液 ， 把 管子 插 人 离心 管 底部 ， 然 后 用 注射 器 仔细 注 人 3ml 10% 莽 糖 溶液 , 注意 吉 免 气泡 产 生 。 保 持 管子 尖 仍 在 离心 管 底 ， 重 复 依 FRIEA 3m1 15% 和 3 ml 20% 蔗糖 溶液 ， 然后 沿 管 壁 小 心地 拔 出 针管 。 此 法 也 适 用 于 制造 盐 梯度 。 这 种 手工 制造 的 梯度 是 阶梯 式 梯度 ， 如 要 制造 光滑 的 线性 梯 。。 先 加 度 则 需 放 置 , 任 其 扩散 。 粘 度 您 大 ,扩散 愈 慢 ,放置 时 间 愈 长 。 一 一 各 种 市 售 或 自制 的 梯度 仪 均 可 用 来 制造 梯度 ， 和 手工 制造 梯度 比较 可 以 节 。 省 很 多 时 间 ， 并 且 容 易 变 换 梯度 的 形 最 后 如 式 。 一 一 一 TAN ii 实验 结果 证 明 ， 连 续 梯 度 柱 柱 面 浓 图 度 和 柱 底 浓度 之 比 以 1:4 为 好 ,特别 是 柱 面 浓度 小 于 10% (W/W) 时 有 较 高 的 分 关 率 。 “氧化 狗 这 类 盐 溶 液 用 来 作 等 比重 密度 梯度 介质 时 ， 离 心 过 程 中 会 自生” 梯度。 因此 很 容易 制作 ,只 要 计算 一 下 盐 溶液 浓度 ,使 它 在 离心 力作 用 下 重新 分 布 时 能 把 样品 的 密度 包含 在 内 。 梯 度 的 形式 ,陡峭 还 是 平坦 ,取决 于 转速 和 盐 溶液 的 浓度 。 “自生 -梯度 的 完成 需要 很 长 时 间 离 心 。 事 先 用 上 述 手工 铺 层 方法 制作 ， 可 以 缩短 离 心 时 间 ,或 者 像 沉 降 平衡 分 析 一 样 〈 第 49 页 ) 把 梯度 波 柱 缩短 。 不 过 这 样 做 的 话 ,样品 的 浓度 或 体积 也 要 相应 减少 ,并 且 要 选用 那些 允许 液体 只 装 部 分 而 不 要 装 满 的 那 种 离心 管 ， 如 育 碳 酸 酯 离心 管 。 否 则 的 话 ,必须 将 离心 答 上 部 空隙 用 低 密 度 液体 ,如 矿物 油 之 类 与 密 度 梯 度 溶液 不 互 溶 的 液体 充满 ,以 免 离心 过 程 中 离心 管 碎 裂 。 表 4 是 一 些 钨 盐 和 锦 盐 的 浓度 和 密度 换算 表 。 至 于 氯 化 钨 溶液 在 25°C 时 的 密度 、. 折 射 率 和 浓度 的 数据 列 在 表 9-2 中 。 es。 91 。 R44 —ESRDMRHR RE RER (20°) CsI w/w | CsCt | CsBr CsSO, | CsNO, | Rbcl | RbBr | UR6I | Rb,SO, | -RbNO, — 1 1.00593] 1.00612] 1.00608} 1.0061 |1.00566| 1.00561] 1.00593] 1.00591 1.0066° | 1.0053 2 1.01374] 1.01412] 1.01402} 10144 | 1.01319] 1.01307 | 1.01372|1.01370| - 1.0150 1.0125 - 4 1.02969] 1.03048} 1.03029] 1.0316 | 1.02859] 1.02825] 1.02965] 1.02963} 1.0322 | 1.0272 6 1.04609 | 1.04734] 1.04707] 1.0494 | 1.04443] 1.04379] 1.04604] 1.04604| 1.0499 1.0422 8 1.06297] 1.06472] 1.06438] 1.0676 |1.06072| 1.05917| 1.06291 | 1.06296]. 1.0680. |. 1.0575, 10 1.08036 | 1.08265] 1.08225] 1,0870 | 1.07745] 1.07604 | 1.08028] 1.08041] 1.0864 1.0731 12 | 1.09828] 1.10116/1:10071| 1.1071 | 1.09463] 1.09281] 1.09817|1.09842| 1.1052 | 1.0892 14 1.11676 | 1.12029) 1.11979] 1,1275 | 1541227] 1.11004] 1.11661]1.11701| 1.1246 || 1.1057 16 1, 13582| 1.14007| 1.13953] 1.1484 1.12775 | 1.13563|1.13621| 1.1446 1.1227. 18 1.15549] 1.16053] 1.15996] 1.1696 1.14596 | 1.15526] 1.15605| 1.1652 1.1401 20 1.17580] 1.18107] 1.18112] 1.1913 1.16469| 1.17554|1.17657| 1.1864 1.1580 22 1.19679] 1.20302] 1.20305] 1.2137 1.18396 | 1.19650] 1.19781]. 1.2083 1.1763 24 1.21849 | 1.22634| 1.22580} 1.2375 1.20379] 1.21817] 1.21980] 1.2309 1.1952 © 26 1.24093] 1.24990] 1.24942] 1.2643 1.22421} 1.24059] 1.24257] 1.2542 .| 1.2146 ， 28 = 1.26414} 4.27435 | 1.27395 1.24524 | 1.26380] 1.26616] 1.2782 | 1.2346 30 1.28817 | 1.29973] 1.29944 1.26691 | 1.28784] 1.29061] 1.3028 | 1.2552 35 1.35218| 1.36764 | 1.36776 1.32407 | 1.35191] 1.35598] 1.3281 1.2764 - 40 1.42245 45 1, 49993 50 1.58575 55 1.68137 60 1.78859 1.90966 1.44275 1.52626 1.61970 1.44354 1,52803 1.62278 1.38599 | 1.42233 1.45330 | 1.50010 1.52675 | 1.58639 1.68254 1.42806. 1.50792 1.59691 1.69667 1.80924 1.93722 1.72492 (五 ) 加 样 方法 究竟 在 一 密度 梯度 液 柱 士 可 加 多 少 样品 样品 的 浓度 多 大 ,这 都 需要 先行 测定 。 如 果 样品 浓度 过 大 ,会 产生 液 流 , 并 且 有 可 能 产生 沉淀 .即使 不 产生 沉淀 ， 过 分 高 的 样品 浓度 也 会 使 分 离 区 带 变 宽 而 丧失 分 辩 率 。 如 果 样 品 浓度 太 低 ， 那 未 分 离 区 带 难 于 鉴定 。 实 验 证 明 选 用 水 平 式 转 头 ,离心 管内 密度 梯度 液 柱 可 承担 样品 的 最 大 浓度 ,为 该 密度 梯度 液 柱 最 小 密度 的 浓度 的 1/10(W /W), 例如 6 一 20% 梯度 液 柱 可 支持 样品 的 浓度 为 0.6 铬 (于 / W)o > P #5 Beckman 制备 超 离心 机 水 平 转 头 一 般 上 样 量 Reem My ES Se ga ia tel BE (ml /#) Gin) (cm) SW65, 50.1, 50, 39 | 0:2 1/2 1.27(153) sw60 0.2 7/16 1.11.1) sw40, 41 0.5 | 9/16 1.42(1.4) $w27.1 ) 0.5 5/8 1.58(1.6) | Sw36 0.5 5/8 1.58(1.6) | SW27，25.1，25.2 9 1 2.54(2.5) | 样品 加 入 的 量 就 水 平 式 离心 转 头 来 讲 是 离心 管 截面 积 的 函数 。 上 样品 过 多 ,区 带 变 兰 , 多 组 分 体系 不 能 有 效 地 分 离 。 表 5 是 Beckman 制备 超速 离心 机 的 一 些 转 头 所 用 离心 管 常规 的 上 “和 料 量 ,其 他 规格 离心 管 可 参考 之 。 ,样品 铺 到 梯度 液 柱 土 去 可 按 图 8 的 方法 。 针 RAB WER 45—60° 角 ， 慢 慢 地 将 样品 沿 管 壁 MAME LE. RDNA 这 类 容易 断 开 的 脆弱 样 品 ， 应 该 用 孔径 较 大 的 移 液 管 代替 针头 以 减弱 剪 ， 力 的 作用 。 (六 ) 分 离 区 带 的 回收 一 一 有 许多 商品 生产 的 回收 区 带 仪器 ;用 手工 方 、 法 回收 也 很 方便 。 离 心 完毕 后 ,可 用 注射 器 或 滴 管 小 心地 按 层次 从 离心 管 上 部 移出 。 也 可 在 离心 管 底部 打 孔 ,分 步 收 集 流 出 液 , 不 过 要 控制 六 速 ,不 要 引起 扰动 。 如 果 样 品 区 带 是 有 颜色 的 或 者 可 以 用 方法 在 离心 管内 检测 ， POSTE oO PEA a 把 样品 抽出 。 四 、 实验 设计 的 一 些 参考 (1) 表 6 列举 了 用 超 离心 机 分 离 生物 物质 的 一 些 典型 分 离 步骤 ， 供 设计 实验 参考 。 0 十 细胞 色素 C 胶原 | ese RO 5 FSR A gwseas G a | 醛 缩 酶 触 酶 a,BREA 核糖 体 亚 单位 eB | Seti 微粒 体 1000 BARR 亚 细 胞 颗粒 10,000 PRL 100,000 CONnA: 2awne E. Coli rRNA 酵母 tRNA 核酸 0 牛 肝 DNA ~ REE T5.DNA _ Eguine sacgp tales Vesicular stomatitis 病毒 RNA 噬菌体 T AT, DNA Broad bean mottle Poltomyelilis TMV Feline leukemia : WE Be K T2 E | as 93 。 Q) 天 因子 和 天 因子: “离心 分 离 究 竟 要 旋转 多 长 时 间 ?| 这 是 经 常会 遇 到 的 一 个 问题 。 工 作者 往往 按照 文献 中 报道 的 离心 时 间 ， 或 者 就 任意 决定 一 个 离 忌 时 间 。 但 是 这 样 选 的 离心 时 间 通 常 长 于 粒子 分 离 真 正 需要 的 时 间 , 特 别 是 目前 用 了 高 速 转 头 更 是 如 此 。 这 样 既 浪 费 了 时 间 ， 也 多 耗 用 了 超 离 心机 ， 相 对 来 讲 缩短 了 仪器 使 用 寿命 。 因 此 要 正确 选择 和 高 效 利用 转 头 、 用 得 上 天 因子 和 天 ' At. K 因子 是 用 来 决定 已 知 沉降 系数 *( 单 位 S) 的 粒子 沉降 到 离心 管 底 所 需 的 时 间 ， 而 天 ' 因子 是 用 来 决定 已 知 * 值 (单位 S) 的 某 一 样品 区 带 ， 从 雯 糖 5 一 20 匈 密度 梯度 柱 ( 这 是 一 种 用 得 最 多 的 密度 梯度 液 柱 ) 顶 部 离心 沉降 到 离心 管 底部 的 时 间 它 们 和 离心 时 间 分 别 有 下 列 关系 : felt ae qd) Sx» WwW RE 离心 分 离 的 典型 分 离 步 标 待 分 离 物 质 分 离 步 R 细胞 组 织 一 > 分 散 细胞 一 > 速率 区 带 法 或 等 比重 离心 法 细胞 组 织 培养 液 RK ARTE 或 0 红血球 等 比重 离心 法 脂 蛋 白 血清 “| 天 > 分 级 离心 法 、 或 | 等 比重 离心 法 蛋白 质 “|- 一 > 速率 区 带 法 全 核酸 一 > 溶解 一 > 抽 提 一 > 速率 区 带 法 或 等 比重 离心 法 人 得 胸 和 二 肌 角 分 | 一 > 与 去 污 剂 研磨 一 > 等 比重 氧化 匈 离 心 一 > 碱 作 莽 糖 溶解 以 后 用 速率 区 带 法 RNA 细胞 , 亚 细 胞 级 分 一 > 溶解 一 > 抽 提 一 > 区 带 速率 法 病毒 细菌 H 沉淀 通过 CsCl 蛋白 质 细胞 一 一 匀 桨 一 “分 级 离心 一 洛 解 一 分 级 离心 一“ 速率 区 攻 样 度 离心 ~> 盐 沉 演 和 /或 柱 层 析 < 一 一 血清 或 血浆 一 > 区 带 速率 梯度 离心 亚 细 胞 颗粒 染色 质 NH 核 一 > 或 一 > 分 级 离心 法 一 > 区 带 速 率 法 或 等 比重 梯度 离心 抽 提 微粒 体 组 织 一 > 匀 浆 一 > 过 滤 一 > 分 级 离心 法 一 > 速率 区 带 法 或 等 比重 梯度 离心 线粒体 组 织 一 > 习 浆 一 > 过 滤 一 > 分 级 离心 法 一 > 速率 区 带 法 或 等 比重 梯度 离心 K 组 织 一 > 勺 浆 一 > 过 滤 一 > 分 级 离心 法 一 > 速率 区 带 法 或 等 比重 梯度 离心 原生 质 腊 组 织 一 > 匀 浆 一 > 过 滤 一 > 分 级 离心 法 一 > 速率 区 带 法 或 等 比重 梯度 离心 核糖 核 蛋 白 体 和 多 核糖 匀 奖 核 蛋 白 体 组 织 一 > 或 一 > 过 让 一 > 分 级 高 心 法 一 ”速率 区 带 法 溶解 Th MITRE eh EPS HLH — WT BR Si 细胞 一 > 匀 奖 一 > 分 级 离心 法 一 > 等 比重 梯度 离心 病毒 « 94% ”和 fri ks poe hae (2) fi S205 Ww -不同 的 转 头 具有 不 同 的 玉 (BRK) 值 ， 商 品 生产 的 制备 超 离心 机 转 头 一 般 都 提供 天 (和 K’) 的 数值 。 DAK AK 值 越 小 ， 转 头 效率 越 高 ,离心 时 间 越 短 。 用 式 (1) 和 式 (2) 计算 离心 时 间 需 要 知道 样品 的 沉降 系数 8, 一 般 生物 物质 的 沉降 系数 的 大 致 范围 见 图 9o e395 。 ae ra wl fi VL, 00 | 一 一 一 etaeecez 一 一 -一 一 -一 035047]G TEA pag tafe 0 Rol Svedberg, T. & H. 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