VUCN lp ZO REVISTA DE LA ACADEMIA CANARIA DE CIENCIAS Folia Canariensis Academiae Scientiarum | Volumen V, Num. 4 (1993) REVISTA DE LA ACADEMIA CANARIA DE CIENCIAS MCzZ -IBRARY FEB 14 2013 HARVARD Seccion UNIVERSITy BIOLOGIA Folia Canariensis Academiae Scientiarum Volumen V - Nim. 4 (1993) REVISTA DE LA ACADEMIA CANARIA DE CIENCIAS Folia Canariensis Academiae Scientiarum Director - Editor Nacere Hayek Calil Secretario José Breton Funes Comité Editorial Francisco Sanchez Martinez Francisco Garcia Montelongo José Manuel Méndez Pérez Juan José Bacallado Aranega Publica: Academia Canaria de Ciencias, con la colaboracién de Gobierno Aut6nomo Canario, Cabildo Insular de Tenerife y CajaCanarias. ISSN: 1130-4723 Depdésito Legal: 212-1990 Imprime: Grafican, S. L. Graciliano Afonso, n°. 3 - Tfno. 22 77 33 Santa Cruz de Tenerife PRESENTACION El presente volumen V se ha desglosado en tres fasciculos numerados de la forma siguiente: NGm. 1 — MATEMATICAS, Noms. 2 y 3 - FISICA Y QUIMICA, y NGm. 4 - BIOLOGIA. Un texto fnico relativo al apartado " Vida Académica ", figura en los tres fasciculos mencionados. El correspondiente a MATEMATICAS contiene ademas trabajos pertenecientes a la Sec- ci6én destinada a HISTORIA Y FILOSOFIA DE LA CIENCIA. Por otra parte, una semblanza redactada por quien esto escribe, del Aca- démico Correspondiente Dr. D. Antonio de Castro Brzezicki, fa- llecido en el filtimo dia de Diciembre de 1993, aparece también en este fasciculo; en ella destacamos la gran dimensidén humana, cientifica y profesional de este ilustre Profesor. Se integran asimismo en el presente volumen algunos discur- sos preceptivos de ingreso de Académicos—Electos, asi como las respectivas contestaciones a cargo de Académicos Numerarios. Aparecen, como siempre, publicados en el fasciculo que corres- ponde a la especialidad del nuevo miembro. Una vez mas, expresamos nuestro agradecimiento a los auto- res que nos han enviado sus trabajos, y a las corporaciones e instituciones que hacen posible la publicacién de esta Revista, muy en especial al Cabildo Insular de Tenerife, Caja General de Ahorros de Canarias y Gobierno Aut6nomo Canario. El Director Nacere Hayek ~ eepA sb ,esditoaes oasee 0+ yp 9m sgtiazoabes, ssneldise emu : 2 ~5? 1ipts9=28 o1jtes> bisidheedds was. <0 osnerbnogasr109 & ABLdinst S>osege \ fer CERAM PM RAaPS Bb omtsID Lo ns gis ; ae ante ndtanemib cbhawosquaheterUEes as jolustosa’ oge8 oust aS GH LMAntELONgD 5 iS eroxg % solnbsn Pet: 2 loné Manual Méndez Pérez ~) a -awoath sonupla nweassoy PAPUA Rei A> inne invessal 92. zal ommv lee ,aotuelt-sopimibsok wb Cesapnt eb sovisquoesg a y Bolte eau 2eaim@becd #b Op1eo & asn0lostae7f9e esvisoeqsees ~ fens -ee T1002 eup ofypltoeae? [9 ns eabsaaildyg .eiqmsie OMoD ,aeo vudmsim ovewt Ieb Sabilsetoeqse ef 8 . 4 i] » Ce. = -ojug 201 8 odasimiosbetes Orseeun sotsessqxe ,28m sev) sau - , Ss #enninparmqrom tel « ¥ ,@ofedetd 206 vbsivas cued eon sup ee2 = ; 4 ~acedvee® ager ob ahiscesi (dug af sidleog nevad aup- esnctousitent © 7 iw eh i[svenstD efe> ,etiseanT. ab saélventI-oblidsd is faioogen: as 7 ey lees | epee anes onxetdon ¥Y BeivensS sb eax70dA > the be etabrmendatde 5 | | ie (yetenne \aldnonee Canario, bs ; visita tnaowlar de lenarte?7 to im tnjet sntrias teysH e1aobu rs tL MES? 23 Dendaite Legals 2123090 har aie: ruf-can, ‘ i, . ay Crain A TOON), oy, 5. ifne, pee gi Le - Sufts { ruiz cl ionocrnes —_ : - 3 ‘ OF ; aa SECCION BIOLOGIA b i ee ae a es || ee Wr ue : Se » ViQIIT82 Rev.Acad.Canar.Cienc., V (Nim. 4), 9-23 (1993) DIMORFISMO Y VIRULENCIA DE HONGOS PATOGENOS PARA HUMANOS: ALGUNOS ASPECTOS BIOQUIMICOS(#) Gioconda San-Blas Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC), Centro de Microbiologia y Biologia Celular, Apartado 21827, Caracas 1020A, VENEZUELA . ABSTRACT Some biochemical mechanisms (sulphydryl groups, hormonal receptors, proteinases) involved in the processes of virulence and dimorphism in fungi pathogenic for humans are reviewed. KEY WORDS: Pathogenic fungi, dimorphism, pathogenicity. RESUMEN Se revisan diversos mecanismos bioquimicos (grupos sulfidrilos, receptores hormonales, proteinasas) involucrados en el control de la virulencia y el dimorfismo de hongos patdogenos para Rumanos. PALABRAS CLAVES: Hongos patdgenos, dimorfismo, patogenicidad 1. INTRODUCCION Muchos hongos zoopatogénicos crecen en mas de una morfologia, con una fase saprofitica usalmente consistente en hifas, y una fase parasitaria, frecuentemente expresada como levadura. Esta dualidad fenotipica se ha llamado dimorfismo [14]. £1 dimorfismo es un modelo wei para examinar las bases de la morfogénesis y la diferenciacisn celular en euceariotes y su explicacidn podria ser util para entender los mecanismos de control de un grupo importante de micosis que (*)Este trabajo es un resumen del material presentado como Conferencia Inaugural gel Primer Congreso Nacional de Micologia, realizado en Tenerife, en julio de 1992. afligen al hombre y a los animales. La temperatura, o factores nutricionales, oO ambos, son generalmente los agentes que accionan los mecanismos conducentes al cambio en la morfologia fungica. Si bien los estudios bioquimicos de regulacién de la patogenicidad y del dimorfismo todavia no se conocen en profundidad, la literatura actual sobre el tema indica que hay algunos ejemplos ilustrativos sobre estos fendmenos. 2. GRUPOS SULFIDRILOS 2-1. Histoplasma capsulatum H.. capsulatum es un hongo patdégeno dimérfico causante de la histoplasmosis. En su estadio saprofitico, el hongo esta bajo la forma filamentosa o micelial (M) pero en el huésped existe como levadura (L) gemante. En el laboratorio, la fase M puede convertirse a ia E .cambiando la) temperetuna, Gen 2 RneUubactontGe 2] Garay ont embargo, Para que este cambio se manifieste, es indispensable que el medio de cultive contenga, ,orupes Ssulfidarnitos- Garrison yy assole demostraron que la cisteina y la cistina eran transportadas en forma activa en la levadura por una permeasa dependiente de ATP y que ellas estimulaban la respiracidn fungica al incorporarse al ciclo de Krebs como acido pirdtvico. También demostraron que los efectos en la respiracién eran una buena medida de 1a incorporacién de estos compuestos. Maresca y col. [11] retomaron estos estudios y compro- baron que las levaduras incubadas a 37°C tenian un nivel mas alto de respiracion que los micelios incubados a 25°C (6,6 y 2,8 nmol Q por 10 min por mg peso seco, respectivamente). Al llevar la levadura a 25°C. la respiracién Caia a niveles caracteristicos' del micelio: y viceversa. La adicién de cisteina o cistina al medio estimuld la respiracién de la levadura pero no la de micelio. El estudio dela respiracidn en la transformacié6én M+ L reveld la existencia de tres ‘estadios £10] durante las primeras 24 a 48 horas del aumento de temperatura se produce una disminucidn progresiva enla rata de respiracidén yen la concentracioén intracelular de cisteina; como segundo estadio ocurre una suspensidédn total de la respiracién ala vez que el nivel de cisteina cae a sue mas bajo valor. Para pasar al estadio tercero, después de 4a65 dias, se requiere de la adicidn exdgena de cisteina que provoca la activacién de la respiracidn mitocondrial y conduce a la culminaci6oén de la transicién morfoldgica. En ese momento, la rata de respiracidén se restaura y se aumentan los niveles de cisteina a los valores iniciales. Debido a que los cambios de morfologia estan relacionados con la vVirulencia, cualquier bloqueo genético o fisioldédgico en la transfor- macidn M+ L tiene especial interés como posible arma terapéutica. A tal efecto, Medoff y col. £123 estudiaron el efecto del acido p- Cloromercurifenilsulfénico (PCMS), un agente bloqueador de grupos - SH, en la transformacién M+ L con el fin de verificar la hipdtesis de que el estado redox de algunos grupos -SH podia controlar el dimorfismo. Cuando los micelios fueron expuestos a PCMS 100 pM por 24 horas, crecieron normalmente a 25°C aunque al ser transferidos a 37°C no fueron capaces de transformar, efecto que resultdé irreversible aun 11 después de multiples pasajes en medio sin PCMS. Aunque se desconoce la razé6n de este efecto, se ha sugerido que el PCMS podria curar la célula de algun plasmido o inhibir alguna translocacién cromosdémica, quizas similar al efecto observado en los tipos sexuales en levaduras OF ae Este micelio bloqueado en su ee eee es a levadura es suficiente para provocar una respuesta inmune protectora en animales y por lo tanto tiene un interés terapéutico potencial. De hecho, Medoff y col.f£12]3] demostraron que a pesar de no existir diferencias en la virulencia de levadura normales o tratadas con PCMS en ratones CD-1, los micelios de H. capsulatum tratados con PCMS no fueron Capaces de transformar a levaduras en esos mismos ratones. Mas aun, al aumentar la concentracion je micelios tratados con PCMS se aumento en forma e jaqbeueaievS la sobrevivencia de ratones luego de La) tA SCE2.6N6eClOD cepas virulentas de levaduras, Ssiendo esta supervivencia proporcional a la dosis de indéculo inmunizador. Este enfoque experimental esta resultando de interés en la posible preparacidon de vacunas experimentales contra la histoplasmosis. 2.2. Paracoccidioides brasiliensis En el modelo de dimorfismo de P. brasiliensis presentado por Kanetsuna y col. (€8] y complementado por San-Blas y San-Blas (14], se enfatiza el Bees de los grupos sulfidrilos de las proteinas de pared celular en el dimorfismo de este hongo. Al igual que en H. capsula- ewin, (ee brasiliensis presenta dimorfismo térmico, produciéndose una fase Ma 23°C y una L a 37°C, efecto que es reversible y dependiente unicamente de la temperatura [8]. Resultados experimentales [8] 12 indican que la fase L tiene una actividad de 5 a 8 a ere de la enzima proteina disulfuro reductasa (PDR) que la fase M, actividad que provoce el rompimiento de los grupos disulfuros en las proteinas de la pared celular y que genera proteinas de cadena mas corta en la levadura que en el micelio, propiciando de esta manera el estableci- miento de una forma redondeada en la fase L Con mayor actividad de PDR y de proteinas largas en el micelio, en armonia con la configura- cién de las hifas. Esta hipdétesis permite suponer que cualquier efecto que perturbe la actividad de PDR en P. brasiliensis conducird a modificaciones en el proceso de transformacién M+ L. Con este enfoque experimental se han comenzado estudios para precisar el efecto de derivados de ajo (Allium sativum) sobre P. brasiliensis. Se ha reportado que los extractos acuosos de ajo tiene un efecto antifungico sobre Candida albicans habiéndose propuesto varios sitios de accidén, particularmente como : Hackiaeane ae de tioles esenciales (€2,3,5)3. El ajoene es un derivado quimico de la alicina del ajo y ha sido introducido hace algunos anos como inhibidor de la agregacién plaquetaria [1]. Su accidn como posible agente antifungico fue reportado por primera vez en Aspergillus niger y C. albicans por Yoshida y col. [9] quienes sSugirieron que el ajoene bloqueaba algun paso de sintesis de la pared celular. Trabajos ulteriores [£19] indicaron que el crecimiento de P.brasiliensis era inhibido por el ajoene, siendo la fase L mas sensible que la Mala accién de este agente. Si bien el mecanismo de accidn no fue elucidado, los datos provenientes de microscopia electrdanica 13 sugirieron que ta interferencia primaria estaba a nivel de la membrana citoplasmdatica, con un efecto secundario eventual sobre la pared celular. Mas aun, el efecto inhibitorio del ajoene sobre la fase L (no asSi sobre la fase M) es revertido con la adicién de compuestos protectores de grupos sulfidrilos tales como cisteina o mercaptoetanol. Ademas, el proceso de transformacién M+ L (pero no el reverso) es bloqueado en presencia de ajoene [16]. Como quiera que la estructura quimica del ajoene contiene un puente disulfuro, es probable que compuestos protectores de los grupos sulfidrilos sean Ccapaces de revertir la acciédn del ajoene precisamente através de esos puentes disulfuros, quizas porque el ajoene estaria funcionando como un competidor de las proteinas contentivas de disulfuros, haciendo que tla enzima PDR actue en el ajoene y no hacia su blanco natural. De esta manera, las proteinasS no pueden acortarse a las cadenas mas pequenasS caracteristicas de la fasel, con lo que se fuerza al hongo a mantenerse bajo la fase M. 3. RECEPTORES HORMONALES Los receptores de hormonas esteroideas han tenido interes para los estudiosos de la paracoccidioidomicosis debido 2a que s1 bien el contacto con P. brasiliensis es igualmente frecuente en hombres y mujeres, la enfermedad es de 13 a 87 veces mas frecuente en hombres C133 lo cual sugiere algun efecto hormonal en la diseminacidégn de la infeccidédn. Estudios realizados al efecto (13] indican que el citosal de P. brasiliensis eS capaz de enlazar 17 ®-estradiol en forma 14 especifica, efecto que no se observé con testosterona, 17 a-estradiol o corticosterona, y s6élo parcialmente (25%) con estrona, estriol y progesterona. La anulaci6én del efecto con la adicioén de tripsina y N-etilmaleimida sugirié la naturaleza proteica del receptor y lea necesidad de grupos disulfuros como elementos activos del proceso de recepcién [9]. Mas aun, el estradiol fue capaz de iinhibir la trans- formacién M+ L en FP. brasiliensis, paso indispensable en el proceso de infeccion. De alli que los autores sugieran que los’ estrégenos enddédgenos del huesped actuen a través de la proteina receptora del hongo, inhibiendo la transformaci6én M+ L, 10 cual explicaria la resistencia de las mujeres a la paracoccidioidomicosis (13]. El efecto del estradiol en la morfogénesis de P. brasiliensis pudo ser observado en la expresién de proteinas (4]. El analisis electroforético de proteinas citosdédlicas por SDS-PAGE reveld la existencia de 12 bandas asociadas al micelio (entre los Hanges de 30 a 140 kDa) y 18 bandas asociadas a la fase levaduriforme (entre 22 y fer kDa). En c@lulas que transformaban del micelio a levadura se observ6é una progresioén hacia el perfil de proteinas de levadureas ala vez que se produjeron 5S bandas nuevas (23 a SO kDa), bandas que eran transitorias durante el proceso de transformacion. £1 tratamiento de micelios con estradiol alterdéd los perfiles observados en condiciones normales: 4 de 12 bandas asociadas al micelio se mantuvieron mientras que la aparicién de las 5 bandas de transicion y 9 de las 18 bandas asociadas a la levadura fueron bloqueadas o demoradas. Estos resulta- dos apoyan la hipdétesis de que en analogia a la accidén de receptores 15 hormonales en mamiferos, la respuesta funcional de P. brasiliensis a estradiol esta relacionada con la regulacién dela expresién de proteinas, mediada a través de un complejo proteina receptora ligando que repercute directamente en la expresiédn de la virulencia del hongo. 4. PROTEINASAS 4.1. Coccidioides immitis El ciclo parasitario de C. immitis, es iniciado por la transfor- macion de la artroconidia infecciosa presente en el aire en una esférula multinucleada que se aloja en el tracto respiratorio: y alcanza los alvéolos. El contenido de las esférulas es convertido eventualmente en una multitud de pequenas endosporas uninucleadas que al diseminarse provocan la enfermedad (20]. Esta transformacidn es de primordial importancia en la patogenia de la enfermedad, razon por la cual se han comenzado estudio que permitan elucidar los mecanismos bioquimicos que lea regulan. Yuan ¥s Lobe YVi2o, 203 estudiaroan macromoléculas solubles en agua provenientes de paredes celulares de conidias (SCWF), demostrando que entre ellas existia una proteinasa Capaz de digerir elastina,_ y coldageno, importantes proteinas estructurales de los pulmones, asi como también sIgA, inmunoglobulina que provee anticuerpos 2 las superficies de mucosas. La electro- foresis en SDS-PAGE indicéd que esta proteinasa correspondia a une molécula de peso molecular 36.000 kDa, tenia un pH dptimo de 8,90 y una temperatura dadptima de 35°%a 40°C. Los substratos preferidos fueron 16 colageno, elastina, themoglobina, IgG, sIgA y caseina. Como = inhi- bidores actuaban disopropilfosfofluoridato, TPCK, a«x-1 antitripsina, PMSF y quimostatina, todo lo cual la caracteriza como una serina proteinasa del tipo quimotripsina. La enzima se encontraba mas concentrada en la pared del aparato de segmentacién de las esférulas momentos antes de comenzar el proceso de diferenciacién de endosporas C22). Asi mismo, la presencia de un inhibidor de la proteinasa fue detectada del citosol y de la pared celular del hongo (21). Con todos estos datos, los autores sugieren que la proteinasa podria ser una enzima alostérica bajo el control del modul ador inhibitorio que dejaria de ejercer su efecto en el momento en que la esférula debe pasar ala fase final indispensable del proceso invasivo como es la produccién de las endosporas. 4.2. Paracoccidiobides brasiliensis En el modelo de dimorfismo deP. brasiliensis presentado por Kanetsuna y col. C8] y luego complementado por San-Blas” y San-Blas C14], el Principal elemento de consideracidédn en el control de la regulacién de la transformacién radica enla presencia de «- 1,3- Qlucan en la fase L del hongo y su) sustitucién por @ -1,3-glucan en la fase M. Estudios in vitro sobre la sintesis de @ -qglucan en P.brasiliensis [£15] indican que la UDP-glucosa actUua como nucledtido preferencial con la participacidén de la enzima glucan sintetasa que se encuentra particulada en las membranas y que es mas activa a 23°C que a 37°C. Curiosamente, tanto la enzima proveniente de levadura como de micelio provocan la sintesis de @ -glucan y en ningun caso de 17 « =G1.4ueE4n.. Considerando que la levadura sdlo contiene trazas de 8 -Qglucan, se ha postulado la hipdétesis de que proteinasas presentes en el citoplasma podrian regular el control de la sintesis del poli- sacarido a fin de que é¢ste se produzca mayormente durante el creci- miento micelial y se restrinja durante la formacidon de levaduras C18]. Resultados inéditos (San-Blas’ y colaboradores) sugieren que este es en realidad el caso. Se ha encontrado que existe una pro- teinasa neutra intracelular, con caracteristicas de serina proteinasa que permanece activa durante el crecimiento de micelio y en la trans- Formac 20M, b-- MM. AL com tisatr do. la actividad decrece durante el creci- miento levaduriforme y en la transformacién M=+L .Estos datos apoyan la hipétesis planteada por San-Blas y col. C18] en cuanto a la parti- Cipacion de proteinasa en el control de la sintesis de ~ -glucan y por ende, en la regqulacién del dimorfismo de P. brasiliensis, siendo este proceso indispensable para el establecimiento de la infeccidn. 9. CONCLUSIONES Los ejemplos arriba senalados permiten establecer la existencia de controles bigqquimicos de la patogenicidad y el dimorfismo en ciertos hongos. Sin embargo, con ellos s6lo estamos comenzando- un estudio que tiene mucho que ofrecer en cuanto a las posibilidades de conocer reguladores bioldgicos para el tratamiento de algunas micosis que afligen ala humanidad. Al mismo tiempo, estos estudios revelan la existencia todavia no comprobada de otros eventos que van desde la activacién de genes hasta el cambio morfoldédgico, algunos de los 18 cuales serian los verdaderos causantes de las regulaciones bioquimi-— cas aqui senaladas. Es de esperarse, por lo tanto, que las investiga- ciones continuen en estas lineas a fin de entender con propiedad estos fendémenos: y aplicarlos en el control de las enfermedades micdéticas. AGRADECIMIENTOS: Al Comité Organizador del I Congreso Nacional de Micologia por su invitacién a dictar la Conferencia Inaugural de ese evento, y a la Academia Canaria de Ciencias por financiar los gastos de traslado a Tenerife. 19 EZ3 O39 C4] 6. BIBLIOGRAFIA AP ITZ-CASTRO Rin) JoEDEZMA, ~ (E24: ESCALANTE se ches, © sLORQUERA fies PInATE. sre MORENO—-REA,.id.- .CARRIELO,. Gap (HEAL psOe, ».and JAN, MawK., (1988), Ateene ») 646,72 )—-4,5,.9-tr pthiaadedeca—-1,6,1.1-tnhi enea7— oxidejJ, reversibly prevents platelet activation in dogs under extracorporeal circulation. Arzneim. Forsch. Drug. Res. 38, 901- 904. 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Abstract The results obtained indicate that the building of the subaerial stage of construction of Lanzarote began during the Miocene and is characterized by the formation of two main basaltic "island-edifices": Los Ajaches, built in a relatively short and continued period of about 1 Ma of reversed polarity in the Middle Miocene, and Famara, constructed in three progressively shorter late Miocene-Pliocene eruptive phases corresponding respectively to Epoch 9 of normal polarity at about 10.2 to 8.7 Ma, Epoch 6 of reversed polarity (6.5 to 5.7 Ma) and the Cochity normal polarity event (3.9 to 3.8 Ma) in the Gilbert Epoch. After a prolonged period of eruptive repose of about 2 Ma, eruptive activity resumed in the island in the middle Matuyama reverse polarity Epoch, with basaltic magmas and fissure eruptions that continued until quite recently (1824), with an eruptive episode of an anomalously high magnitude between 1730 and 1736. The evolutive trends of the related magmas show the presence of a complete evolutive magmatic cycle in the old edifice of Los Ajaches, with magmas evolving by crystal fractionation from alkali basalts to trachytes. In Famara and Tias edifices, magmas are mainly primitive basanites generated by partial melting processes. In the Quaternary volcanism, partial melting-generated basanite-alkali basalt magmas are also predominant, with some superimposed components of crystal fractionation. A significant exception is the 1730 eruption, where the evolution of magmas is completely anomalous in the recent magmatic history of the Archipelago, from basanites to olivine tholeiites, probably in relation with the mixing of magmas from two different magmatic sources. 25 Introduccion La combinacion de la datacion por métodos’ radiométricos y la magnetoestratigrafia con inversiones del campo magnético terrestre (CGT) es una técnica habitual en terrenos volcanicos que mejora considerablemente la precision en la definicion de la duracion de las diferentes fases eruptivas en relacion con los métodos puramente radiometricos. La aplicacion de esta tecnica en las Islas Canarias (Abdel-Monem et al. 1971, 1972; Watkins, 1974; Carracedo, 1974a,b; Fuster y Carracedo, 1979; Carracedo y Soler, 1992, 1994) y en las Islas Hawaii (Holcomb et al. 1993) ha puesto de manifiesto que la edad de las formaciones volcanicas obtenida empleando unicamente dataciones K-Ar, tienden a reducirse considerablemente cuando se las circunscribe en las correspondientes unidades de polaridad de la escala de inversiones del CGT. En este trabajo, se aplica la magnetoestratigrafia a la reconstruccion de la evolucion geologica de Lanzarote, una isla de reducidas dimensiones (860 Km’), de historia geologica relativamente sencilla) y con un numero considerable de dataciones radioméetricas (47 edades K-Ar). La estratigrafia magnética de las series volcanicas subaéreas de Lanzarote se han definido a partir del analisis de la inclinacion geomagneética (polaridad) del CGT impresa en las lavas al enfriarse por debajo de la temperatura de bloqueo de sus componentes ferromagnesianos. Este analisis se ha realizado no solo en las formaciones que afloran hoy en la isla, sino asimismo en los testigos recuperados en los numerosos sondeos realizados en el Programa SPA-15 de la UNESCO (SPA-15, 1972; Custodio, 1974). Con la ayuda de esta técnica, de gran utilidad en la correlacion estratigrafica, y las numerosas dataciones radiometricas publicadas (Abdel Monem et al., 1971; Coello et al., 1992: Meco y Stearns, 1981) se han reconstruido los principales edificios volcanicos, sus fases de actividad y la extension de sus productos. De esta forma, aportamos un esquema tentativo de la evolucion general de la isla en su parte emergida. Paralelamente, la revision petrogenetica que se presenta, hecha a partir de datos geoquimicos —incluyendo algunos nuevos— y mineralogicos de los edificios y ciclos volcanicos cuya localizacién estratigrafica se conoce gracias a la aplicacion de las técnicas mencionadas, ha permitido definir las pautas principales de evolucion geoquimica de los magmas a traves de la historia geologica de la isla, 26 presentandose un modelo de los procesos magmaticos responsables de los diferentes episodios eruptivos. Metodologia Las determinaciones paleomagnéeticas fueron realizadas en su mayoria directamente en el campo con magnetometros portatiles del tipo “flux-gate”. Para comprobar la fiabilidad de las determinaciones de campo, se recogieron muestras de todas las unidades determinadas, siguiendo tecnicas estandar (orientacion con brujula solar, perforacion con brocas de diamante, etc.). Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Paleomagnetismo de la Estacion Volcanologica de Canarias, sometiéndolas a desmagnetizacion progresiva tanto en campos alternantes (AF) de hasta 50 mT como a temperaturas de hasta 600 °C. En ningun caso se observo la presencia de componentes magneticos secundarios de importancia y, en todo caso, la polaridad definida en el campo era sistematicamente consistente con la determinada en laboratorio. - | En los sondeos del SPA-15 se siguieron criterios de definicion de la polaridad de perforacion de los testigos. Se determinaron en laboratorio las variaciones de la inclinaci6n geomagnética colada a colada (Carracedo y Soler, 1992, 1994). Los datos geoquimicos de elementos mayores se obtuvieron mediante analisis por fluorescencia de Rayos X segun el metodo de De Jongh (1981). Los elementos traza, por el procedimiento de Leoni y Saitta (1976). Los analisis mineralogicos se efectuaron con microsonda y corregidos por el metodo empirico de Bence y Albee (1968). Los analisis quimicos del volcanismo historico utilizados en este trabajo han sido publicados anteriormente (Carracedo et al. 1990). Datos geoquimicos adicionales proceden de Rodriguez Badiola, Carracedo y Sigmarsson, en publicacion. Etapas en el desarrollo de Lanzarote. Definicion y descripcion de los principales edificios volcanicos. EI edificio Miocénico (“shield volcano”) de Los Ajaches El grueso de la isla de Lanzarote esta formada en su parte emergida por dos edificios antiguos independientes (Fig. 1): el de Los Ajaches, situado en el extremo 27 meridional de la isla y activo en el Mioceno medio, y el de Famara, situado en la parte septentrional y construido en varias etapas entre el Mioceno superior y el Plioceno. El edificio volcanico antiguo de Los Ajaches parece haberse construido, al menos en la mayor parte de su volumen emergido, en un unico episodio de duracion relativamente corta, entre los 14.5 y 13.5 Ma. Las edades radiometricas publicadas quedan incluidas en este intervalo de tiempo, salvo una edad de Abdel Monem et al. (1971) de 19.5 Ma, al parecer discutible, y otra de 12.3 Ma de Coello et al. (1992). Nos hemos inclinado por acortar ei periodo de actividad de este edificio en relacion con estas edades extremas respecto al conjunto (ver Fig. 6 en Coello et al., 1992) por nuestras observaciones de campo. Esta formacion no presenta discordancias de importancia (angulares, paleosuelos, etc.) en los 300 m visibles de escarpe en Pico Redondo y porque la formacion presenta en su totalidad una unica polaridad invertida (R) respecto a la del CGT actual o normal (N) (Fig. 2), incluso en las tobas submarinas de la base del edificio detectadas en sondeos del SPA-15 (Fig. 3). Prolongar otro millon de anos la edad de esta formacion —como seria el caso de incluir la edad de 12.3 Ma— parece discrepar con la ausencia de una clara discordancia erosiva y con la presencia de una unica unidad de polaridad, ya que la escala de inversiones geomagneticas presenta en ese periodo unidades de polaridad siempre inferiores al millon de anos (Tarling, 1983; Jacobs, 1984). | EI edificio volcanico del Mioceno tardio de Tias Los escasos afloramientos correspondientes a este edificio volcanico se distribuyen fundamentalmente alrededor del pueblo del mismo nombre, entre los edificios antiguos de Los Ajaches y Famara. Son restos muy erosionados de lavas y pitones basalticos, aislados entre si por las lavas recientes. Los centros de emision de la zona de Tias son de polaridad negativa, con una edad radiometrica de 6.1 Ma (Coello et al., 1992). En la zona mas proxima al edificio de Los Ajaches tanto los pitones como las lavas son de polaridad normal. Estas lavas de polaridad normal y edad de 6.6 Ma (Coello et al., 1992) contornean el edificio de Los Ajaches por el norte, llegando hasta la zona del Janubio, donde afloran en discordancia erosiva sobre las lavas de Los Ajaches (de edad 14.1 Ma, Coello et al., 1992). Es muy 28 posible, pues, que la actividad volcanica de este edificio se ubicara en el transito de la Epoca 7 de polaridad normal (aproximadamente entre 6.5 y 8.0 Ma, McDougall et al., 1977), a la que podria corresponder la actividad inicial de este edificio, a la Epoca 6 de polaridad inversa (6.5 a 5.7 Ma, McDougall et al., 1977). El sondeo S- 10 (Fig. 3), situado al norte de Los Ajaches, muestra claramente las relaciones estratigraficas apuntadas. EI edificio voleanico Mio-pliocénico de Famara El edificio Famara se ha construido en tres etapas discontinuas separadas por discordancias muy evidentes, al quedar marcadas por almagres (paleosuelos cocidos por coladas o “backed contacts”). Estas etapas presentan volumenes progresivamente-decrecientes, entre si y con relacion al edificio de Los Ajaches, lo que parece indicar una disminucion progresiva de la actividad magmatica tanto en Famara como en la isla en su conjunto. La unidad inferior de Famara esta formada principalmente por coladas basalticas, algunas de considerable potencia y extension superficial. En la unidad intermedia son frecuentes los conos y mantos de piroclastos basalticos, con algunos almagres intraformacionales. Unas pocas coladas, asimismo basalticas, forman la unidad superior. Esta coladas superiores son particularmente potentes, indicando muy posiblemente el relleno de barrancos excavados al finalizar la emision de la unidad intermedia. Las tres unidades estratigraficas mencionadas se corresponden- con tres unidades magnetoestratigraficas de diferente polaridad (Fig. 4), un hecho puesto ya de manifiesto en un trabajo anterior (Fuster y Carracedo, 1979). La unidad inferior, de polaridad normal, se habria emitido entre 10,2 y 8,3 Ma (Coello et al., 1992), periodo correlacionable en efecto con la Epoca 9 de polaridad N, aproximadamente de 10.2 a 8.7 Ma (McDougall, 1979; Tarling, 1983). Las unidades intermedia y superior, de polaridad R y N respectivamente, se pueden asimismo correlacionar con los intervalos de edad propuestos por Coello et al. (1992) de6.7a53y39a 3.8 Ma. Esas edades y sus polaridades respectivas pueden encajarse en la Epoca 6 de polaridad inversa (6.5 a 5.7 Ma, McDougall et al., 1977) y en el Evento Cochiti de polaridad N (3.9 a 3.8 Ma, Mankinen y Dalrymple, 1979). Estas unidades han 29 sido definidas en Famara no solo en afloramiento (Fig. 4), sino también en testigos de sondeos del SPA-15 (Fig. 5). Una interesante derivaciOn de este trabajo es la comprobacion de como la magnetoestratigrafia puede ayudar a_ incrementar la precision de las dataciones radiometricas, encajando estas en las unidades de polaridad de la escala de inversiones geomagneticas establecida. Esta escala ha sido determinada a partir de la suma de numerosos datos radiometricos y de polaridad en los mas diversos escenarios y materiales de todo ei planeta. La determinacion de la polaridad geomagnéetica es, por otra parte, una tecnica sencilla en comparacion con la datacion radiomeétrica. En el primer caso se trata de un proceso fisico, la fijacion del vector del CMT en el momento de enfriamiento de la roca, de dificil variacion por procesos naturales post-deposicionales (alteracion, recalentamiento suave, etc.), en todo caso, facilmente detectables en el laboratorio. Las dataciones radiométricas constituyen, en cambio, un método geoquimico mas complejo, en que la precision depende muchas veces de factores de dificil reconocimiento. En el edificio Famara, donde la actividad eruptiva seria practicamente continuada si nos atenemos a las edades radiométricas publicadas, esta queda claramente circunscrita a tres etapas muy separadas en el tiempo cuando se aplica la magnetoestratigrafia (Fig. 6). El hecho de que las dataciones radiométricas tienden a exagerar los intervalos eruptivos, al menos en la zona de Canarias, ha sido puesto mas 0 menos claramente de manifiesto por diversos autores (McDougall y Schmincke, 1977; Carracedo, 1979). En efecto, mientras que la informacion radiométrica tiende a adjudicar periodos de varios millones de anos para la mayoria de los edificios insulares de las denominadas Series | de las islas (Fuster et al, 1968), nuestras observaciones indican que estos intervalos pueden estar artificialmente exagerados, al no corresponderse con la presencia de unos pocos cambios de polaridad geomagneética, frecuentemente uno o dos, sin que sean evidentes interrupciones importantes de la actividad eruptiva. No suelen apreciares discordancias erosivaS que _ podrian corresponderse con_ discordancias magnetoestratigraficas, por lo que las unidades de polaridad geomagnetica (generalmente de duracion inferior a 1 Ma) son, en la mayoria de los casos, consecutivas (Carracedo, 1975, 1979; Carracedo y Soler, 1992, 1994). 30 Si tenemos en cuenta que en todo este edificio volcanico solo se han encontrado tres unidades de polaridad (Fig. 6), podemos asumir que las edades radiometricas deberian encajar en el periodo de duracion establecido para ellas. De la observacion de la figura se desprende que, en este caso, esto es asi para la mayor parte de las edades, y que las que quedan fuera de los intervalos de tiempo correspondiente podrian, por su misma polaridad y similar posicion estratigrafica, encajarse con el resto de las edades de cada unidad de polaridad. Esta tecnica permitiria, en el caso de Famara, definir con bastante mayor precision la duracion de los intervalos de actividad eruptiva, que quedan considerablemente reducidos. Seria aun mucho mas interesante la extrapolacion de este método a casos en que las edades radiometricas disponibles son mucho menos coherentes que en Famara. La facilidad con que se determinan las polaridades geomagnéticas, incluso directamente en afloramiento con magnetometros del tipo “flux-gate”, hace dificilmente explicable el uso de métodos radiométricos sin el apoyo simultaneo de la escala de inversiones geomagneticas. El voicanismo fisural cuaternario La actividad volcanica se reanudo en la isla después de un periodo de reposo de unos 2.5 Ma., iniciandose con centros de emision frecuentemente periféricos a los edificios antiguos de Los Ajaches (Mna. Roja y el grupo de volcanes de Caldera Riscada) y Famara (grupo de volcanes de Teguise), todos ellos correspondientes a la €poca de polaridad inversa Matuyama. Una edad de 2.7 Ma para Mna. Roja (Coello et al., 1992) es muy discutible, tanto por el estado de conservacion del edificio como por la existencia de otra datacion para el mismo centro eruptivo de 0.8 Ma (Meco y Stearns, 1981). Mas adelante, en la epoca de polaridad normal Brunhes (a partir de 0.7 Ma) se refuerza el caracter fisural del volcanismo de la isla, con alineaciones de conos volcanicos que la recorren en direccion NE-SO, preferentemente entre los dos edificios-isla antiguos. Esta actividad fisural se mantiene hasta fechas historicas (erupciones de 1730 y 1824). 31 La cartografia de inversiones geomagneticas de Lanzarote (Fig. 7), muestra las diferentes formaciones y edificios volcanicos en relacion con las correspondientes unidades de esta escala de inversiones. Caracteristicas y pautas evolutivas de los magmas La primera descripcion petrografica y geoquimica detallada de los materiales volcanicos de los diferentes episodios/ciclos eruptivos de Lanzarote fue presentada por Fuster et al. (1968), trabajo de sintesis en el que se recogian y ampliaban datos de trabajos anteriores (Fernandez Navarro, 1919; Hausen, 1959; Ibarrola y Lopez Ruiz, 1967). El estudio detallado de la variabilidad y evolucion de los magmas correspondientes fue realizado por Ibarrola (1969, 1970) y Fuster (1975). Mas recientemente, se aportan nuevos datos petrologicos y geoquimicos en numerosos trabajos, entre los que destacan los de Schmincke (1976, 1982), Armienti et al. (1989,1990) y Carracedo et al. (1989,1990). Se abordan en este trabajo los problemas que se plantean en relacion con la diversidad volcanologica y el origen y posible evolucion de los magmas. La revision petrogenética se basa en nuevos datos geoquimicos y mineralogicos obtenidos para las_ diferentes unidades_' volcano-estratigraficas establecidas mediante la magnetoestratigrafia. Esto permite una definicion, identificacion y ordenacion de los procesos magmaticos y volcanologicos responsables de los diferentes episodios eruptivos que no seria facil abordar con los métodos anteriormente aplicados. Composicion quimica y mineraldgica de los magmas EI edificio miocénico (“shield volcano”) de Los Ajaches La actividad volcanica de los Ajaches ha originado una gran diversidad de tipologias, como se observa en la Fig. 8a, con variacion desde basanitas a traquitas. Los términos mas basicos de la serie (basanitas-basaltos) se localizan preferentemente en la zona basal de la serie de los Ajaches (Juan Perdomo y Los Dises), los términos intermedios (basalticos-traquibasalticos) en la secuencia estratigrafica de Pico Partido y los terminos mas diferenciados (traquitas maficas y 32 traquitas) se localizan en los diques de la zona de Janubio y pitones de Papagayo. Mineralogicamente, los términos basaniticos y basalticos estan constituidos por fenocristales de olivino forsteritico (Fig. 9a), con Fo 84 %, o 2.62. Estos minerales estan ausentes en los terminos mas evolucionados, en los que predominan los minerales feldespaticos con un amplio rango de variacion, desde bytownita- labradorita a oligoclasa-anorthoclasa en los términos traquiticos (Fig. 9b). El resto de la mineralogia se reduce a la presencia de clinopiroxenos de tipo diopsido y oxidos de la serie magnetita-ulvospinela (Fig. 9c y 9d). La identificacion del proceso evolutivo se ha efectuado mediante la utilizacion cualitativa del comportamiento de elementos traza, C” , C“ vs. C”. Los resultados indican (Fig. 10a) que las variaciones composicionales observadas en el volcanismo de los Ajaches —suponiendo que la serie volcanica esté geneéticamente relacionada— estarian producidas predominantemente por procesos de cristalizacion fraccionada, sin que se evidencien otros mecanismos superpuestos significativos, como fusion parcial, mezcla o asimilacion. La estimacion de los parametros del proceso petrogenéetico se aborda en otro trabajo (Rodriguez Badiola, Veintemillas y Carracedo, en preparacion). Edificios volcanicos de Tias (Mioceno superior) y Famara (Mioceno-Plioceno) El edificio basaltico de Famara presenta pocas variaciones petrograficas, aspecto indicado ya por Fuster y colaboradores (1968). En el diagrama TAS de la Fig. 8b se evidencia que la practica totalidad de las muestras analizadas (correspondientes a la secuencia de Orzola, acantilado de Famara y Tabayesco) corresponden a términos basaniticos con muy poca dispersion de valores. El comportamiento de las lavas es muy similar en el edificio Tias (Fig. 8c). La mineralogia dominante en Famara (Fig. 9a) es de fenocristales de olivino forsteritico con poca dispersion de valores (en promedio, Fo 87 %, o 0.83). Enel edificio Tias los valores son similares (Fo 85.9 %, co 1.8). Predominan los minerales feldespaticos con un estrecho rango de variacion, desde bytownita a labradorita (Fig. 9b). La confrontacion de elementos traza (Fig. 10b) indica que las variaciones observadas en las series volcanicas de Famara y Tias estarian fundamentalmente 33 relacionadas con procesos de fusion parcial, sobre los que se superponen algunos procesos de fraccionacion. EI volcanismo fisural cuaternario Los centros de emision correspondientes al inicio del ciclo de actividad cuaternaria (Serie Il) muestran limitadas variaciones en su composicion, desde basaltos a basanitas (Fig. 8d). E! grupo de volcanes de la zona de Teguise y el centro eruptivo de Montana Roja, en el sur de la isla, presentan composiciones basalticas que difieren de los materiales basaniticos emitidos por los centros eruptivos de Playa Quemada y Montana Bermeja, al este de Los Ajaches. Esto es, en parte, debido al elevado contenido de fenocristales de olivino (Fo 84 %) y/o xenocristales de -olivino forsteritico (Fo 87 %), que aparecen en concentraciones superiores a las determinadas en la zona de Teguise (Fo 83 %). Los materiales de la serie lil muestran un claro caracter basaltico alcalino con valores muy uniformes (Fig. 8e) y una mineralogia (Fig. 9a) constituida por olivino forsteritico (en promedio, Fo 83 %, o 1.42), feldespatos labradoriticos (Fig. 9b), y clinopiroxenos augitico-diopsidicos (Fig. 9c). En cambio, las _ erupciones subhistoricas (Serie IV) del grupo volcanico de La Quemada-Los Helechos-Corona presentan una mayor dispersion composicional respecto a la Serie Ill, con una continua variacion desde basanitas a basaltos alcalinos (Fig. 8f). La mineralogia esta caracterizada por la presencia de fenocristales de olivino (en promedio, Fo 85 %, o 0.72) (Fig. 9a), feldespatos de tipo labradorita-andesina (Fig. 9b), y minerales de Fe-Ti (Fig. 9d). La confrontacién de elementos traza C” , C“ vs. C" (Fig. 10c) separa claramente los materiales de la Serie Il, de composicion basanitica, que quedan claramente individualizados. En los restantes materiales de composicion basaltica de esta Serie y en las Series Ill y IV, las variaciones geoquimicas estarian fundamentalmente relacionadas con cambios en el grado de fusion, aun cuando los procesos de cristalizacion fraccionada estén asimismo presentes. Las erupciones historicas (1730 y 1824) presentan una interesante diversidad composicional. y en ambas erupciones son frecuentes la presencia de xenolitos ultramaficos. En las lavas de la erupcion de 1730-36 (Fig. 8g) se evidencia una 34 clara evolucion desde basanitas a basaltos alcalinos en el inicio de la erupcion (Caldera de los Cuervos y Pico Partido), que prosigue hacia basaltos olivinicos y toleitas olivinicas en las siguientes fases eruptivas. Esta peculiar caracteristica de la erupcion de 1730 fue ya destacado por Carracedo et al. (1989). Por el contrario, los materiales emitidos durante la erupcion de 1824 corresponden a basanitas con un rango composicional bastante restringido (Fig. 8g). Mineralogicamente, las lavas de la erupcion de 1730 se caracterizan por la presencia dominante de fenocristales de olivino con valores medios Fo 86%, o 2.79 (Fig. 9a), mientras que estos valores cambian a promedios de Fo 85%, o 3.27 en las lavas de la erupcion de 1824. El resto de la mineralogia de las lavas de 1730 esta constituida fundamentalmente por microcristales de feldespato de composicion labradoritica (Fig. 9b), clinopiroxenos augitico-diopsidicos (Fig. 9c), y oxidos de Fe-Ti (Fig. 9d). La confrontacién de elementos traza C” , C“ vs. C” separa claramente ambas erupciones historicas (Fig. 10d). En efecto, en los materiales correspondientes a la erupcion de 1730 se observa una marcada divergencia entre las tendencias correspondientes a la primera fase eruptiva, con evidentes indicios de procesos de fraccionacion y/o acumulacion de cristales de olivino (algunos de los cuales presentan caracter xenolitico), y las fases sucesivas, en las que parecen dominar los procesos de fusion parcial (Carracedo et al., 1990). Las lavas correspondientes a la erupcion de 1824 se situan por encima de la linea teorica FC, pero con aproximacion a los terminos mas basaniticos de la erupcion de 1730 (Fig. 10d). Evolucion general del magmatismo en Lanzarote La continuidad temporal en la actividad volcanica del edificio de Los Ajaches podria explicarse mediante un modelo petrogenetico relativamente simple, basado en varios aspectos: a) actividad volcanica con altas tasas eruptivas, y consiguientemente, construccion en un tiempo relativamente corto de un voluminosos_ edificio volcanico; b) persistencia de diferentes procesos de cristalizacion fraccionada; c) amplia diversidad composicional y mineralogica, en particular de los feldespatos como se ha indicado anteriormente. Esta diversidad composicional del edificio volcanico de Los Ajaches contrasta con la monotonia de los edificios de Famara y Tias, caracterizados por materiales 35 de caracter primitivo, originados en procesos de fusion parcial, tal como sugieren Armienti el al. (1990). Las importantes interrupciones de la actividad volcanica en Famara no tienen reflejo aparente en la composicion de los magmas, ya que esta se reanuda después de cada _ interrupcion con _ caracteristicas genéticas y composicionales semejantes, sin que se hagan patentes procesos de diferenciacion importantes. Después del prolongado periodo de inactividad general en la isla, que se inicia al terminar el volcanismo pliocénico de Famara, la actividad volcanica cuaternaria se va a caracterizar por un marcado caracter alcalino, en particular en la zona de Playa Quemada y Montana Bermeja, erupciones que arrastran enclaves duniticos (Sagredo, 1969). Posteriormente, los magmas evolucionan hacia _ términos basalticos, con una ligera disminucion de la alcalinidad (Fuster et al. 1968; Fuster 1975), evidenciandose procesos de fusion parcial y fraccionacion superpuestos. La erupcion historica de 1730 supone una clara anomalia dentro de las tendencias geoquimicas de los magmas basalticos de las Islas Canarias, dado su caracter transicional entre basaltos alcalinos a toleiticos (Carracedo et al., 1989; 1990; Carracedo y Rodriguez Badiola, 1991). Los trabajos de Armienti et al. (1989) senalaron que los materiales de la erupcion de 1730 incluian términos basalticos alcalinos y basaltos olivinicos, variaciones que son controladas por un regimen tectonico transpresivo y distensivo. Por el mismo tiempo, Carracedo et al. (1989; 1990) establecian que las primeras fases de la erupcion de 1730 presentan, en efecto, un marcado caracter alcalino, con basanitas y basaltos alcalinos, pero que a partir de la segunda fase de la erupcion, se hace patente una derivacion hacia el campo de los basaltos olivinicos y toleitas olivinicas, que se repite en las sucesivas fases eruptivas. Segun estos ultimos autores, estas particulares diferencias composicionales responderian a variaciones del grado de fusion parcial, con bajas tasas para los magmas con Ne y mayores en los magmas con Hy. Las variaciones observadas estarian a su vez relacionadas con la profundidad de generacion de los magmas, que migrarian de alguna forma desde un "frente” profundo a otro de profundidad intermedia asociado a una larga fractura (Carracedo et al., 1992). Las peculiares variaciones composicionales del estadio fisural de la erupcion, unicas en la historia reciente de Canarias, podrian explicarse por la mezcla de los magmas 36 generados en estos dos ambientes de diferente profundidad y, posiblemente, régimen tectonico. Ridley y Perfit (1991) indican en un estudio comparativo de la erupcion de 1730 y 1824, que las lavas de 1824 presentan mayor enriquecimiento en elementos traza incompatibles y mayor enriquecimiento en LREE (Ce,/Yby= 17-21) en relacion con las lavas de 1730 (Ce,/Yby=7-9), diferencias que se originarian por cambios en el grado de fusion parcial. Sin embargo, los resultados obtenidos nos sugieren una matizacion de estos datos, ya que las lavas correspondientes a la primera fase (pre- fisural) de la erupcion de 1730 presentan asimismo un evidente enriquecimiento en elementos incompatible y en LREE (Ce,/Yby= 17-23) respecto a los valores que presentan las fases eruptivas (fisurales) siguientes (Ce,/Yby= 6-9). Esto apoyaria un modelo de cambio composicional en funcion de las variaciones del grado de fusion parcial aun dentro de la misma erupcion de 1730. Los valores bajos de fusion se corresponderian con fuertes enriquecimiento en LREE y viceversa, observacion que ya fue apuntada por Armienti et al. (1990) para explicar las variaciones composicionales de las lavas de naturaleza mas primitiva de Lanzarote. Mas recientemente, Sigmarsson et al. (1992) indican, en base a las variaciones de la relacion *“Th/**Th en lavas toleiticas de la erupcion de 1730, que los magmas proceden, por diferentes grados de fusion parcial, de fuentes isotopicamente diferenciadas, observacion en concordancia con la heterogeneidad isotopica senalada por Armienti et al. (1990) y Ridley y Perfit (1991). Un modelo evolutivo general del desarrollo de la isla de Lanzarote Los datos geocronologicos y petrologicos expuestos nos permiten abordar, al menos de forma aproximada, la elaboracion de un modelo actualizado de la evolucion general de la isla de Lanzarote, de sus diferentes etapas de consiruccion y de la generacion y evolucion de los magmas asociados. La isla de Lanzarote es probablemente la de geologia mas simple y mejor conocida del Archipiélago. Un sondeo de 2700 m perforado para explorar las posibilidades de explotacion de energia geotérmica en la zona de Timanfaya atraviesa todo el edificio insular, hasta alcanzar el basamento oceanico con fauna del Paleoceno inferior y medio, mientras que los primeros estadios de construccion 37 volcanica submarina de la isla se efectuarian en el Oligoceno medio y superior (Sanchez Guzman y Abad, 1986). Informacion adicional aportada por sondeos situados en el sur de Lanzarote — . realizados para investigar los recursos hidricos de la isla (SPA-15, 1972; Custodio, 1974)— parecen apoyar que el nucleo submarino principal de la isla estaba situado en la parte sur de la isla actual (Fig. 11-1). Coello y colaboradores (1992) relacionan este edificio con el edificio antiguo del norte de Fuerteventura basandose en que los periodos de actividad definidos para ambos a partir de dataciones radiométricas se solapan. Sin embargo, esto parece cuestionable, por las consideraciones expuestas y por la polaridad normal de este edificio antiguo del norte de Fuerteventura (Carracedo, sin publicar), que no se correlaciona con la polaridad inversa de Los Ajaches. Las primeras emisiones subaéreas en Los Ajaches podrian haberse localizado alrededor de los 14, 5 Ma. Este estadio inicial se caracterizO por una intensa actividad eruptiva, con volumenes y tasas de emision elevados que conformaron un edificio (el edificio-isla de Los Ajaches) de gran desarrollo y de rapida construcci6n (posiblemente inferior a 1 Ma), aspectos tipicos de los primeros ciclos volcanicos subaéreos de las Islas (Carracedo, 1979; Arana y Carracedo, 1978; Schmincke, 1982) (Fig. 11-2). En relativa concordancia con estos aspectos, las variaciones composicionales observadas en el volcanismo de los Ajaches parecen indicar la presencia de magmas que han experimentado un ciclo de variacion a través de procesos de cristalizacion fraccionada. La actividad eruptiva termino definitivamente en este edificio-isla alrededor de los 13,5 Ma. Aunque posiblemente alcanzo una extension muy superior a la actual, como evidencia el que lavas de este edificio son interceptadas por los sondeos S-08 y S-10, separados mas de 14 Km (ver Figs. 1 y 11), asi como una altitud mucho mayor (maxima altura actual, 560 m), el largo periodo transcurrido sin nuevas emisiones (hasta los centros eruptivos recientes de Atalaya de Femés, Caldera Riscada, etc.) permitio que la erosion lo desmantelara profundamente. Después de un periodo de reposo general de unos 2-2,5 Ma en que los Ajaches funciono como una isla la actividad volcanica se inicio en la parte norte de la actual Lanzarote (Fig. 11-3). El nuevo “edificio-isla” que se forma en esa zona lo hace en tres etapas sucesivas. La primera etapa (3 a 5 in Fig. 11), en la que se construye la 38 formacién Famara inferior (ver Figs. 4, 5 y 7), se corresponde con la Epoca 9 de polaridad N (aproximadamente entre 10,2 a 8,7 Ma, McDougall, 1979), equivalente a la anomalia 5 (Blakely, 1974). La siguiente fase (Famara media en Figs. 4, 5 y 7) se produce aproximadamente entre 6,5 y 5,7 Ma, probablemente la Epoca 6 de polaridad inversa (McDougall et al., 1977). La etapa final (Famara superior) de construccion de Famara ocurre en un periodo muy corto (0.1 Ma), que coincide con. el evento Cochiti de polaridad normal (3.9 a 3.8 Ma) dentro de la época Gilbert de polaridad inversa (Mankinen y Dalrymple, 1979). Es interesante observar que la duracion de estas tres etapas parece disminuir de forma progresiva (aproximadamente 2,1 Ma para Famara inferior, y 1,4 Ma y 0,1 Ma para Famara media y superior). Esta disminucion progresiva podria ser paralela a la atenuacion de los procesos de generacion de magma, que como hemos visto, parecen corresponder a pulsos sucesivos de un mismo foco magmatico. En efecto, las variaciones en la composicion geoquimica observadas en las series volcanicas de Famara y Tias estarian fundamentalmente relacionadas con procesos de fusion parcial, sobre los que se superponen algunos procesos menos significativos de fraccionacion. Las importantes interrupciones de la actividad volcanica en Famara descritas no parecen influir en la composicion de los magmas, que mantienen en todo el edificio volcanico caracteristicas genéticas y composicionales semejantes, sin que se aprecien procesos de diferenciacion significativos. Coincidiendo aproximadamente con la actividad de la fase intermedia de Famara se forma un edificio volcanico en lo que seria la costa NE de Los Ajaches (Fig. 11- 4), rellenando buena parte del vacio existente entre las “islas” de Famara y Los Ajaches. En la zona mas proxima a este ultimo edificio tanto los pitones como las lavas son de polaridad normal y edad de 6.6 Ma (Coello et al., 1992), muy probablemente correspondiendo a la parte final de la Epoca 7 de polaridad normal (aproximadamente entre 6.5 y 8.0 Ma, McDougall et al., 1977), a la que podria corresponder la actividad inicial de este edificio. El sondeo S-10 (Fig. 3), situado 2 Km al norte de Yaiza alcanza tobas submarinas a 23 m bajo el nivel actual del mar. Sobre estas tobas se apoyan coladas miocenicas de Los Ajaches, con una rasa marina a +3 m. Las coladas procedentes del edificio Tias se apoyan a su vez sobre una rasa (+15 m) con cantos redondeados de playa y arenas eolicas (jable), facies caracteristica de las costas de barlovento en las series antiguas. Parece, pues, que 39 las coladas iniciales del edificio Tias contornearon el de Los Ajaches alcanzando la costa por la zona del Janubio (Fig. 11-4), donde afloran hoy en una sucesion estratigrafica muy similar a la hallada en el sondeo S-10. La actividad en el edificio Tias continu6 entrada la Epoca 6 de polaridad inversa (6.5 a 5.7 Ma, McDougall et al., 1977), posiblemente con centros de emisioOn mas cercanos a Famara. Una vez que la actividad eruptiva ceso en Famara hace unos 3,8 Ma, se inicia un largo periodo (unos 2-2.5 Ma) de reposo general en la isla. Cuando la actividad se reanuda ya en el Cuaternario, el aspecto de la isla era el tipico de los edificios volcanicos afectados por un largo intervalo de erosion: un edificio en forma de arco abierto hacia barlovento, con una extensa plataforma marina de abrasion y acantilados subverticales cubiertos en la base por una facies tipica de playa, dunas y piedemonte (Fig. 11-6). La reactivacion del volcanismo ocurre en el Cuaternario, posiblemente en el Matuyama_ post-Olduvai (limite superior del evento Olduvai, 1.67 Ma, Mankinen y Dalrymple, 1979). La polaridad de las fases iniciales de este volcanismo cuaternario, lo que se conoce generalmente como Serie II (Fuster et al., 1968), son invariablemente de polaridad inversa y parecen corresponderse con el tramo de la epoca de polaridad inversa Matuyama situado entre el limite superior del evento Olduvai (1.67 Ma, Mankinen y Dalrymple, 1979).) y el inferior del evento Jaramillo (0.97 Ma, Mankinen y Dalrymple, 1979). El inicio del volcanismo cuaternario de Lanzarote se caracteriza por la actividad de unos pocos centros de emisién, sin evidencia de una pauta fisural definida. Mas bien se agrupan estos centros eruptivos de la Serie Il en la periferia de los edificios antiguos: el grupo de volcanes de Teguise, Mala y Arrieta, en el borde del edificio Famara, y los centros eruptivos de Mna. Roja y el grupo de Mnha. Riscada, en los bordes del edificio de Los Ajaches (Fig. 11-7). Mas recientemente, dentro ya de la época de polaridad N Brunhes (0,78 Ma _ a la actualidad, Tauxe et al., 1992), el volcanismo cambia a mecanismos tipicamente fisurales, originandose alineaciones de volcanes que recorren la isla en direccion NE-SO y_ preferentemente entre los edificios antiguos de Famara y Los Ajaches (Fig. 11-7). Se origina asi un rift que se caracteriza por sus tasas eruptivas relativamente altas y baja frecuencia de emisiones, configurando una “dorsal” de muy baja relacion de aspecto (Carracedo y Rodriguez Badiola, 1992; Carracedo et 40 al., 1992; Carracedo, 1994). A partir de la configuracion del rift, la actividad eruptiva se concentra en su ambito; las emisiones rellenan totalmente la parte central de la isla, parcialmente los edificios antiguos y la rasa marina que existia en la costa de barlovento, donde la _ isla incrementa su _ superficie considerablemente. Precisamente la ubicacion de buena parte de los centros eruptivos sobre esta plataforma erosiva de baja cota explica la abundancia de aparatos volcanicos freatomagmaticos, al haberse producido interacciones magma-aguas marinas o freaticas en la mayoria de estas erupciones recientes. En este volcanismo las variaciones geoquimicas estarian fundamentalmente relacionadas con magmas sujetos a cambios en el grado de fusion parcial, con indicios de procesos menos importantes de cristalizacion . En 1730 se produce una erupcion de magnitud y caracteristicas geoquimicas anomalas en el volcanismo reciente de Canarias (Fig. 11-8). Su duracion (2.054 dias), extension (unos 200 Km’), volumen de emisiones (3-5 Km’) y la evolucion de los magmas hacia el campo de las toleitas olivinicas supone un caso unico en el volcanismo de Canarias y, aparentemente, en el volcanismo basaltico fisural del planeta. Un modelo que podria explicar estas peculiaridades se basaria en la presencia de dos fuentes (“frentes”) de generacion de los magmas en dos ambientes de diferente profundidad y, posiblemente, regimen tectonico. Las peculiares variaciones composicionales podrian explicarse por la mezcla de los distintos magmas generados. La erupcion de 1824, en la que se producen tres centros eruptivos alineados concordantemente con el rift descrito, cierra por el momento el registro de la actividad eruptiva en la isla de Lanzarote. Las caracteristicas composicionales de las lavas indican que se ha recobrado la pauta normal, al no existir indicios de mezcla de magmas como en la erupcion de 1730. Agradecimientos Este trabajo se ha financiado con el Proyecto de investigacion de la CICYT PB 92-0119. Queremos expresar nuestro agradecimiento al Servicio Geoldgico de Obras Publicas del Gobierno de Canarias por las facilidades prestadas para el estudio de los sondeos del SPA-15. 41 References Abdel-Monem, A., Watkins, N.D. y Gast P.W., 1971. K-Ar ages; volcanic stratigraphy and geomagnetic polarity history of Lanzarote, Fuerteventura, Gran Canaria and Gomera. Am. J. Sci. 271 490-5271. Abdel-Monem, A., Watkins, N.D. y Gast P.W. 1972. 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Geophys.J.R.Astr.Soc. 32: 249-267. 45 Pié de Figuras Fig. 1.- Mapa de Lanzarote donde se indican los principales edificios volcanicos Se indican los sondeos estudiados (indicados con una S) y las localidades donde se ha analizado la polaridad magnética en laboratorio. Fig. 2.- Estratigrafia geomagneética del escarpe de Pico Redondo, en el edificio antiguo de Los Ajaches. Fig. 3.- del sondeo S-10 (ver Fig. 1). Fig. 4.- Estratigrafia geomagneética de las secciones del acantilado de Famara y la pista de Tabayesco. Se propone una correlacion de las tres unidades que componen el edificio Famara. Fig. 5.- Estratigrafia geomagnética y correlaciones en los sondeos del SPA-15 en Famara. Las tres unidades propuestas quedan claramente de manifiesto tanto en afloramiento (Fig. anterior) como en el subsuelo. Fig. 6.- Modelo que acorta la duracion propuesta para las distintas fases volcanicas de los edificios de Famara y Tias a partir de dataciones radiometricas, mediante el uso de las polaridades geomagneticas. Circulos vacios: polaridad negativa o inversa; idem llenos: polaridad positiva o normal. Explicacion en el texto. Fig. 7.- Mapa de inversiones geomagneéeticas de Lanzarote. Esta tecnica permite adjudicar un intervalo de edad bastante definido en funcion de la polaridad magnetica a todas las formaciones volcanicas de la isla. Fig. 8.- Diagramas alcalis vs. silice para los distintos edificios y formaciones volcanicas de Lanzarote. Los campos (Le Bas et al., 1986) corresponden a: PB (Picro-Basaltos), B (Basaltos), BS (Basanitas), TB (Traquibasaltos), MT (Traquitas maficas), T (Traquitas). La linea de trazos marca la division de Macdonald y Katsura(1964) que separa los campos alcalino y toleitico. Fig 9.- Diagramas que ilustran la composicion de las formaciones subaéreas de Lanzarote. a) Variacion composicional del olivino (Fo %). El contenido promedio esta indicado por la barra vertical. b) Diagrama Ab:An:Or que indica la composicion de las plagioclasas y feldespatos alcalinos en las series volcanicas de Lanzarote. c) Rango de variacion de los clinopiroxenos Ca-Mg-Fe. d) Diagrama de variacion FeO-Fe20;3-TiO»2 de los oxidos ulvospinela-magnetita e ilmenita. 46 Fig. 10.- Diagrama de identificacion de procesos magmaticos de Allegre y Minster (1978). Se comparan elementos muy incompatibles CH (Ce) frente a elementos ligeramente CM (Zr) vs. CH (Ce). BPM y FC indican “batch partial melting” (fusion parcial) y “fractional crystallization” (cristalizacion fraccionada) respectivamente. Fig 11.- Esquema que ilustra de forma simplificada la evolucion general de la isla de Lanzarote. Explicacion en el texto. 47 Lanzarote e “a C ANARY ISLANDS V 2 SS QUATERNARY San Bartolome QUATERNARY ARRECIFE y pees <2 ] MIOCENE ie Playa Blanca wist ew rv aa| 6-e sampling site S13 @ borehole PLIO-QUATERNARY Je 13° 30! t= EEG 48 Pico Redondo Los Ajaches Volcanic Edifice TTS AA MIDDLE | | ies "t nies: = a Pig Bea: TTT) ) : MIOCENE — FEMES SCARPMENT Fre. 2 VOLCANIC ERUPTION PRE-17307 Pi. a ee SERIES IV SERIES lll | SERIES Il ae MATUYAMA Tias Volcanic Edifice SERIES |! Volcanic Edifice 50 FAMARA CLIFF (Pefias del Chache) m.a.s.1 > _— ie =If +39 Cochiti normal polarity event ( 3,9-3,8 my.) = ll PE a SOO) Ba ee a Epoch 6, reverse polarity 6,5-5,7 my. ) 300 At Epoch 9 of normal : polarity 10,2-8,7 Ma 200 abe *8,3 - x ) 100 \ pd \ NIIMMIIIII|) Present sea level | es pe FIG. 51 TABAYESCO TRACK (Filo del Cuchillo) *6,2 A LATE FAMARA PLIOCENE | MIDDLE FAMARA . UPPER MIOCENE EARLY FAMARA m.a.s.b AS 500 Cochiti 3 normal N- ol polarity a event 400 ry ated i = = Epoch 6 R. - of reverse w polarity = «oe ee 300 a 17 N +e cuuseesuae <= 200 , > E ~ Epoch 9 sf normal saesssaeeeee S polarity = Ve nITtT iii 100 present sea level 52 m.y. Z FAMARA 3,4 3,9 4 Wien 9 Nunivak 4 wee —4,32 Sidufjall a7 GAUSS (N) GILBERT (R) EPOCH 5 (N) EPOCH 6 (R) EPOCH 7 (N) EPOCH 8 EPOCH 9 (N) EPOCH 10 (R) Historic eruptions (<500 y) Brunhes (Normal polarity: <0.78 m.y.) Upper Matuyama (Reversed polanity: 0.7-1.6 m.y.) <<< << «<< << == general period of volcanic repose (~ 3 m.y.) Upper Famara Formation (Cochiti Event of Normal polarity: 3.9-3.8 m.y.) Lower Tias formation ? (Epoch 7 of predominantly Normal polanty: aprox. 6.5-8.0 m.y.) Middle Famara Formation and Tias Formation Hiii:| (Epoch 6 of predominantly Reversed polarity: 6,5-5,7 m.y.) Ss Lower Famara Formation SS (Epoch 9 of predominantly Normal polarity: 10,2-8,7 my.) <<< <<< << general period of volcanic repose (~ 3.0 m.y.) Ajaches Formation _ (Reversed polanty: ~ 14.5-13.5 my.) FRGG) 7 54 LANZAROTE 3 J 7G oS g p Canary Islands _ Africa Alk. Alk. 1730-36 SERIES IV HISTORIC VOLCANISM Alk. d Alk. | SERIES Il ra SERIES Ill / ‘ : . ‘ ~~ 5 : \ vw * B ! " B e al \ \ - * \ Ss 1 O 2 Y | \ A) y LOWER-MIDDLE PLEISTOCENE (UPPER MATUYAMA) UPPER PLEISTOCENE (BRUNHES) FIG. 8 55 Ca-Mg-Fe clinopyroxenes 1824 1730-36 Series IV Series Ill Famara Los Ajaches UMMM AM, Mio-PLIOCENE Plagioclase and high-T alkali feldspars QUATERNARY WM, HISTORICAL UMM. 56 Ce/Zr Ce/Zr 1824 4 2 0.0 3 Ce(pmm) 0.0 0 1 MIO-PLIOCENE VOLCANISM a: (FAMARA-TIAS) 1 8 FAMARA Gi ae : oe 4 pee N 6 . FC 5 2 b we he BAS 4 | BMP 0.0 2- 100 200 Ce (pmm) 0.0 FIG HISTORIC VOLCANISM (<500 yr.) a 57 % BMP QUATERNARY VOLCANISM SERIES IIT 100 200 Ce (pmm) MIOCENE VOLCANISM (LOS AJACHES) 300 300 Corona-Los Helechos volcanic group (subhistoric) Teguise volcanic group (Middle Matuyama) .¢)* d >a ona Recent (Brunhes) to subhistoric volcanic lineaments and lava fields ‘ai * pee at gee Pe 4 baat ae + ar tS —— ‘ ¢ _ : P=! Caldera Riscada volc. group emty a (Upper Matuyama) rosion \ Historic volcanism (< 500 y.b.p.) OLD FAMARA EDIFICE central lowland eee Miia. Roja Volcano Periodof scarp Recent and subhistoric ~((j per Mae) cL nee volcanic activity nal repose a erosion ~1,6 m.y. to 500 y.b.p. ———— Final volcanic stage at Famara => sand covered lowland? marine-cut shallow coast shelf Intermediate eruptive stage at Famara 6.5-5.7 m.y. AS = a MWY, 6.7-5.7 my. Eruptive activity at Tias voicanic edifice 10,2-8,7 Ma First subaerial volcanic activity at Famara Final eruptive building stage at Los Ajaches First sub aerial volcanic activity at Lanzarote Rev.Acad.Canar.Cienc., V (Num. 4), 59-115 (1993) LA FIJACION SIMBIOTICA DEL DINITROGENO UNA REVISION GENERAL ( * ) A.M. Gutiérrez-Navarro(1) , M.A. Leén-Barrios (1) y J. Corzo (2) Departamentos de Microbiologfa y Biologfa Celular(1) y de Bioquimica y Biologia Molecular (2). Universidad de La Laguna. La Laguna. 38206 Tenerife El nitrégeno es el elemento mds abundante de la biosfera y constituye una parte importante (entre el 8 y el 10 por ciento) de la materia viva. En los suelos se encuentra en forma combinada y con frecuencia es el factor limitante para el crecimiento de los vegetales y, por consiguiente, para la productividad de los ecosistemas. Por el contrario, en el estado de dinitrégeno es extremadamente abundante en la atméstfera terrestre (constituye el 76 por ciento en peso del aire) por lo que podria ser considerado a@ priori como una fuente prdcticamente inagotable de este elemento. Ahora bien, debido a la estructura de su molécula, se trata de un gas extraordinariamente inerte y, por ello, no es utilizable por los seres vivos con la Unica excepcidn de un conjunto de procariotas capaces de fijarlo, es decir, de transtormarlo hasta una forma metabolizable por otros organismos. _ Microorganismos fijadores de nitrégeno La actividad fijadora de nitrégeno consiste en la reduccidn del dinitrégeno de la atmédsfera hasta amoniaco: El amoniaco producido es luego incorporado a esqueletos carbonados para la sintesis de aminodcidos y otros compuestos nitrogenados, y ello hace que los organismos capaces de efectuar esta actividad puedan vivir en ausencia de nitrégeno combinado y sintetizar sus materiales nitrogenados a expensas, exclusivamente, del nitrégeno que hay en la atmosfera. Es una actividad que estd catalizada por un sistema enzimatico, el complejo nitrogenasa, que solamente se encuentra en un grupo de seres vivos, (*). Dada la categoria y profundidad con que ha sido tratado el tema de esta revisidédn, el Comité Editorial ha considerado de gran interés incluir este trabajo en esta Secci6dn. 59 todos ellos procaridticos, que reciben el nombre de diazotrofos y que cada vez se va viendo mds ampliado. En la actualidad se conocen 80 géneros de eubacterias (Tabla 1) y 6 de arqueobacterias (Tabla 2) que incluyen una o mds especies diazotrofas. Tabla 1 Clasificacién de las eubacterias diazotrotas. Grupos fisioldgicos Géneros y numero (entre paréntesis) de especies diazotrofas Heterotrofas Aerobias Azotobacteriaceae Azotobacter(6), Azomonas(3), Beijerinckia(4), Derxia(1), Xantho- bacter(3) Acetobacteriaceae Acetobacter(2) Pseudomonadaceae Pseudomonas (6) Methylomonadaceae Methylosinus(2), Methylocystis(1), Methylococcus(4), Methylobac- ter(1), Methylomonas(2), Microcyclus(4), Renobacter(1). Rhizobiaceae Rhizobium(S), Bradyrhizobium(1), Azorhizobium(1), Photorhi- zobium(1), Agrobacterium(1) Spirillaceae Azospirillum(S), Herbaspirillum(1), Aquaspirillum(4), Campylobac- ter(1) Beggiatoaceae Beggiatoa(1) Actinomycetes Frankia(1) Afiliacion dudosa Alcaligenes(3), Thiobacillus(1) Anaerobias facultativas Enterobacteriaceae Citrobacter(2), Klebsiella(4), Enterobacter(3), Erwinia(1) Vibrionaceae Vibrio(4) Bacillaceae Bacillus(3) Afiliacion dudosa Mycoplana(2) Anaerobias Bacillaceae Clostridium(12), Desulfotomaculum(3) Afiliacion dudosa Desulfovibrio(7), Desulfobacter(4) Fototrofas Anoxigeénicas Rhodospirillaceae Rhodobacter(5), Rhodopseudomonas(7), Rhodospirillum(5), Rhodopila(1), Rhodomicrobium(1), Rhodocyclus(2) Chromatiaceae Chromatium(7), Lamprobacter(1), Thiocystis(1), Thiocapsa(2), Amoebobacter(1) Ectothiorhodospiraceae Ectothiorhodospira(2) Chlorobiaceae Chlorobium(4), Chloroherpeton(1), Pelodyction(1), Prostheco- chloris(1) Chloroflexaceae Chloroflexus(1) Afiliaciodn dudosa Heliobactzrium(1) Oxigénicas Chroococcaceae Gloeothece(1) Nostocaceae Anabaena(12) Anabaenopsis(1) Aphanizomenon(1),Aulorisa(1), Chlorogloea(1), Cylindrospermum(4), Gloeotrichia(1), Nodularia(1),Nostoc(8), Trichodesmium(1) Rivulariaceae Calothrix(5) Scytonemataceae Scytonema(2), Tolypothrix(1) Oscillatoriaceae Oscillatoria(1), Plectonema(1), Schizothrix(1) Stigonemataceae Fischerella(2), Hapolosiphon(1), Mastigocladus(1), Stigonema(1), Westelliopsis(1) Tabla 2 Clasificacién de las arqueobacterias diazotrotas Grupos fisiolégicos Géneros y numero (entre paréntesis) de especies diazotrofas Metanégenas Methanococcales Methanococcus(5) Methanobacteriales Methanobacterium(3) Methanomicrobiales Methanolobus(1), Methanosarcina(1) Methanothermaceae Methanothermus(2) Hal6filas : Halobacteriaceae Halobacterium(1) Algunos diazotrofos solamente pueden fijar el nitrégeno atmostérico en simbiosis con plantas perte- necientes a varias familias vegetales. Son los denominados fijadores simbidticos del nitrégeno, que se agrupan fundamentalmente en cuatro géneros: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Frankia. Las restantes bacterias diazotrofas se denominan fijadores libres del nitrégeno y son de fisiologia diversa. Entre ellas, las hay fototrotas oxigénicas (algunos gémeros de cianobacterias) y anoxigénicas como algunas especies de Rhodopseudomonas, Rhodobacter 0 Chromatium. Entre las organotrotas las hay anaerobias _ facultativas (pertenecen a este grupo, por ejemplo, algunas especies de los géneros Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Erwinia, Vibrio 0 Bacillus), anaerobias estrictas, como las pertenecientes al género Clos- tridium, y aerobias estrictas, como las de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia y Derxia, asi como algunas estirpes de Pseudomonas y de metilobacterias. También hay arqueobacterias diazotrotas como las metanégenas y Halobacterium halobium (Tabla 2), lo que sugiere que estamos ante una actividad metabélica de origen evolutivo muy antiguo, quiz4s mds que la propia fotosintesis, y ello podria explicar también la extrema sensibilidad al oxfgeno que presenta la nitrogenasa. La principal limitacién que tiene la fijaci6n libre del nitré6geno se deriva del hecho comentado de que el complejo nitrogenasa no es activo en condiciones aerobias y solamente funciona cuando esté debidamente protegido del oxigeno gaseoso; asi se explica que las bacterias facultativas fijen el nitrégeno atmostérico sdlo cuando son cultivadas en anaerobiosis. En el caso de los diazotrofos aerobios la proteccién de la nitrogenasa se logra, entre otros mecanismos, mediante una intensa actividad respiratoria que impide el acceso del oxigeno a los lugares en los que radica el complejo enzimatico. Pero ello exige el consumo de ingentes cantidades de materia orgdnica que ha de ser utilizada como sustrato respirable para llevar a cabo dicha protecci6n de la nitrogenasa. Ademés, el proceso fijador del nitrégeno es muy endergénico y, en consecuencia, para que tenga lugar, son necesarias grandes cantidades de ATP que se obtienen también mediante la respiracién de materia orgdnica: se calcula que la reduccién de un mol de dinitr6geno consume, como minimo, 16 moles de ATP. De esta pequefia discusién cabe deducir que es poco probable la existencia en los suelos de semejantes cantidades de materia orgdnica, lo que limita considerablemente el papel de la fijacién libre del nitrégeno, al menos en los suelos de climas templados (mayor importancia 61 puede tener en las zonas tropicales, en las que los aportes de residuos vegetales a los suelos son mayores). Por otra parte, el complejo nitrogenasa se inhibe por el amonio, producto de su actividad catalftica sobre la molécula de dinitré6geno y, por esta razén, es poco probable que las bacterias fijadoras libres puedan acumular en su citoplasma cantidades de amonio suficientes como para Ser excretadas al suelo, lo que indica que el posible nitrégeno liberado como consecuencia de la fijacién libre lo serfa casi exclusivamente en forma orgdnica, no asimilable directamente por los vegetales, que, como es sabido, asimilan el nitrégeno en las formas am@nica y nitrica. Por ello, ha de sufrir varias transtormaciones, también efectuadas por bacterias: en primer lugar, la mineralizacidn libera amonio que es oxidado, primero a nitritos y después a nitratos. En todos estos procesos se produce la inmovilizacién del nitr6geno, ya que la microflora que lo transforma también lo utiliza como nutriente para su propio crecimiento. 2 Fijacién simbidética del nitrégeno: introduccién Todos los problemas senalados se soslayan en el caso de la fijacién simbictica del dinitrégeno: en primer lugar, el aporte de materia orgdnica lo etectua la propia planta hospedadora, mediante su actividad fotosintética; el fotosintato es transportado hasta el sitio de fijacién y alli oxidado por la bacteria para obtener el ATP necesario para el funcionamiento del complejo nitrogenasa. Ademds, el amonfaco producido en el proceso tijador es rdpidamente incorporado en los esqueletos carbonados, también suministrados por la actividad fotosintética del hospedador, lo que impide la inhibicidn de la nitrogenasa a que antes aludfamos. Por ultimo, el producto final de la fijacién del nitrégeno (generalmente, amidas, ureidos o aminodcidos) es utilizado directamente por la planta. Esto justifica el hecho de que, desde el punto de vista cuantitativo, la fijacidn simbidtica dei nitré6geno tenga mayor importancia que la fijacién libre. Asf, segun datos de Mishustin y Shil’nikova [240], la fijacién libre efectuada por las ciauobacterias supone una cantidad de 22 kilogramos de nitrégeno por hectdrea y afio; a Azotobacter son atribuibles 0,26 kilogramos por hectérea y aio y a Clostridium, 0,22. Sin embargo, una hectdrea de terreno bien abonado en el que se cultiva alfalfa en simbiosis con bacterias del género Rhizobium tija cada ano una cantidad de nitrégeno equivalente a mds de 264 kilogramos; en el caso del trébol, se fijan en las mismas condiciones unos 220 kilogramos y en el del altramuz, unos 132 kilogramos. No es extrafio, pues, que la mayor parte de los trabajos publicados en relacidn con la fijacién del nitré6geno atmostérico se refieran a los procesos de tijacidn simbistica. Hace unos 2.000 afios en la época de la Roma antigua, era conocido y se utilizaba el hecho de que las leguminosas contribuyen a mantener la fertilidad de los suelos. Por ello, se convirtid en una prdctica agricola habitual la rotacidn de cultivos de leguminosas y trigo. Como tantas otras cosas, esta practica cay6 62 en el olvido en la oscura Edad Media y no fue redescubierta hasta mediados del siglo XVIII en el condado de Nortolk (Inglaterra) porque como sefalaba Sir Humprey Davey en 1.813 “Los guisantes y las judfas parecen especialmente adaptados para preparar los suelos para el cultivo del trigo”. Este sistema rotacional de cultivos se extendiéd pronto al Continente y permitié la estabilizacién agricola y la liberacién de mano de obra del campo, que, junto con las teorfas econdmicas de Malthus, hicieron posible la revolucién industrial acaecida en el siglo XIX en la Europa Occidental. Sin embargo, esta capacidad de las leguminosas no se relacioné con la presencia de ndédulos en las rafces de estas plantas, que habfa sido ya descrita en 1.675 por Malpighi, hasta que en 1.838 Boussingault demostr6 de una manera clara que las leguminosas fijaban el nitrégeno de la atmésfera y, cincuenta anos mds tarde, Hellriegel y Wilfart demostraron que sélo pueden hacerlo las que poseen ndédulos radicales. El aislamiento del primer diazotroto simbidtico fue realizado en 1.888 por Beijerinck. Hasta entonces se crefa que la fijacién del nitrégeno en los nédulos de las leguminosas se efectuaba en unos orgdnulos, denominados "bacteroides" que, supuestamente, se formaban de novo en las células del nédulo. Beijefinck demostr6 que, en realidad, dichos bacteroides son consecuencia de una serie de cambios que experimenta una bacteria del suelo que infecta la raiz, a la que denomin6 Bacillus radicicola y actualmente es conocida como Rhizobium leguminosarum. Desde entonces se han ido aislando nuevos diazotrotos simbidticos, la mayorfa de los cuales lo son con leguminosas, lo que confiere a esta simbiosis su importancia cuantitativa. En efecto, debe tenerse en cuenta que el de las leguminosas (Familia Fabaceae) es uno de los grupos vegetales mds numerosos, formado por unos 700 géneros y 14.000 especies. De ellas, hay unas cien de importancia agricola que se cultivan en una superficie total de 250 millones de hectdreas y Suponiendo una fijaciédn media de 140 kg de nitrégeno por hectdrea y afo, se puede calcular que la simbiosis permite una entrada a los suelos de 35 millones de toneladas de nitrégeno al afo en todo el Planeta. Como queda dicho, las bacterias que etectuian una fijacidn simbistica del nitr6geno se agrupan en s6lo cuatro géneros: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Frankia. Este ultimo es simbidtico con plantas de diversas familias, pero los tres primeros s6lo pueden establecer la simbiosis con leguminosas (la nica planta perteneciente a otra familia que puede establecer simbiosis con un miembro de las Rhizobiaceae es Parasponia, planta lefiosa de la familia Ulmaceae, que es intectada por Bradyrhizobium). Dado que la distincidn’entre Rhizobium y Bradyrhizobium data de hace unos doce anos [179] y que el aislamiento de Azorhizobium es aun mas reciente [124], los primeros trabajos que hacen relaci6n a ellos se retieren solamente al género Rhizobium y en lo que sigue, cuando se utilice el término "rizobio” estard reterido indistintamente a uno u otro género. 13 - 3: El proceso de infeccién de las leguminosas por los rizobios El establecimiento de la simbiosis es un proceso complicado que implica la interaccién entre ambos simbiontes. De torma esquematica puede ser representado como en la Figura |. La relacién simbiotica comienza cuando los rizobios son atraidos quimiotdcticamente por los exudados radicales de la planta hospedadora [82,123,137] y, como consecuencia de ello, proliferan abundantemente en su rizostera. Cuando estan préximos a la raiz, los rizobios se unen a las células supertficiales (pelo radical y células epidérmicas) por peeanInACs no bien conocidos, aunque posiblemente impliquen la interaccidén de macromoléculas complementarias. Asf las lectinas presentes en la rafz de la leguminosa podrfan unirse a componentes especfficos de la superficie del rizobio. Las fibrillas de celulosa producidas por Rhizobium pueden ayudar a esta unidn al tavorecer que la bacteria quede atrapada en la superficie de la rafiz [193]. Por otra parte, esta unidn podria favorecerse por las ricadesinas (proteinas que ligan Ca** especiticas de las Rhizobiaceas). Si bien hay consenso sobre el papel de las lectinas en esta unién, mayor controversia existe sobre el componente polisacaridico superticial del rizobio que las reconoce [26,68]. Asi, para algunos autores son las propias fibrillas de celulosa [193]; para otros, los polisacdridos extracelulares o capsulares [66,67] y para otros, en fin, los lipopolisacdridos de la pared [188,220,384]. Nosotros disponemos de una coleccién de rizobios aislados de leguminosas endémicas del Archipiélago Canario, que, pese a tener la misma gama de hospedadores, muestran polisacdridos extracelulares de diferente composicién qufmica [208,209]. De cualquier forma, sean 0 no responsables del reconocimiento inicial, los componentes superticiales del rizobio parecen desempenar una importante funcidn en la simbiosis y son numerosos los trabajos que aportan datos que avalan esta afirmaci6n y las descripciones de mutantes no intectivos, cuyos polisacdridos no difieren de los de la estirpe parental intectiva [17,249,315]. También se ha observado que las mutaciones que afectan a cualquiera de los componentes polisacarfdicos superticiales de los rizobios pueden alterar su fenotipo simbistico. Asf, los mutantes eps (incapaces de sintetizar polisacdridos normales) ditieren en sus capacidades simbisticas con diferentes plantas: una misma mutaci6n induce un tenotipo Nod o Inf en plantas de Pisum, Medicago y Leucaena, pero no atecta al fenotipo simbidtico sobre Figura 1. Estadios en la infeccidn de la raiz de una leguminosa por diazotrofos simbiontes. A. La bacteria es atraida mediante quimiotaxis a la rizosfera del vegetal y prolifera en ella. B. Se produce una adsorcién especifica de la bacteria al pelo radical de la planta. C. El pelo sufre una incurvacion caracteristica quedando algunas bacterias atrapadas en la zona incurvada. D. Se produce una invaginacion de la pared y la membrana del pelo radical, para formar el tubo de infeccidn que avanza a través de las células corticales del vegetal (E), ramuficdndose. Simultadneamente se induce un foco de proliferacién celular formandose el primordio del nédulo. F. Representaci6n esquematica de un corte de un nédulo maduro. |. Célula no infectada, atravesada por el tubo de infecci6n que contiene bacterias indiferenciadas; 2. Proceso de infecci6n de la célula vegetal por liberacién de vesiculas por invaginacion de la membrana citoplasmatica y tusidn con vesiculas procedentes del aparato de Golgi, del reticulo endoplasmico o de ambos; los rizobios se diferencian al estado de bacteroide; 3. Célula infectada que contiene los bacteroides alojados en simbiosomas, limitados por la membrana peribacteroidea. B union polar especifica receptor superficial v union al azar * = receptor del pelo pared celular UO © zona de mitosis oO ma pared — > infeccion bi 4 (Brady)Rhizobium 3 +d . 4 NV ‘ membrana (a x &> bacteroide eg — membrana s peribacteroidea vesiculas RE/Golgi 65 Phaseolus, Glycine y Lotus {164a]. Por otro lado, los mutantes en los lipopolisacdridos tienen un tenotipo Fix en Phaseolus y Glycine (282a] y sin embargo, mutaciones en los lipopolisacdridos de R. meliloti pueden o no afectar al tenotipo simbidtico con alfalta [106,205]. La respuesta inicial del pelo radical a la presencia de Rhizobium consiste en un incurvamiento para adoptar la forma de un cayado de pastor. El extremo incurvado engloba una 0 mds bacterias que invadirdn el pelo radical. La infeccidn comienza con la formacién de un tubo de infeccién que se inicia por la disolucién enzimatica de la pared del pelo radical [13,48] y la invaginacién de la membrana citoplasmatica de dicho pelo, a cuyo alrededor se depositan nuevos materiales idénticos a los de la pared celular [192,283] que aislan al rizobio infectante. Se calcula que el tubo, que avanza por la célula precedido por el nticleo celular [218], alcanza la base del pelo radical al cabo de unas 48 horas [267]. Luego el tubo de infeccién se ramitica y avanza por las células del tejido cortical de la raiz hasta que alcanza un foco celular en "estado hipersensible" [156]. Recientes estudios permiten sugerir que estas células hipersensibles estén localizadas en el cértex medio de la raiz y contienen concentraciones anormalmente altas de glicoproteinas ricas en prolina y de las enzimas fenilalanina amonjaco liasa y chalcona sintetasa, dos enzimas claves de la via de biosintesis de los fenilpropanoides, en la que se producen las titoalexinas [156]. Por otra parte, también se ha observado que las células en las que termina el crecimiento del tubo de infeccién y las adyacentes contienen compuestos fenélicos en sus paredes celulares [282], lo que sugiere que los sintomas del estado hipersensible son la ligniticacién de la pared y la acumulaci6n de fitoalexinas. Las bacterias que han sido conducidas por el tubo de infeccién hasta las células corticales del vegetal proliferan en él y son liberadas al citoplasma de la célula por un proceso endocitico (Figura 1), como consecuencia del cual quedan rodeadas por una membrana de origen vegetal que establece un compartimento, denominauo simbiosoma, en cuyo interior la célula se divide, pierde su forma bacilar y se hace mazuda y pleomorfica; entonces aparece el sistema nitrogenasa y otros complejos enziméaticos necesarios para la fijacién del nitrégeno. En este estado, la bacteria recibe el nombre de bacteroide, conservando la primitiva denominacién de los supuestos orgdnulos fijadores de nitr6geno que se habfan descrito en las células de los nédulos radicales de las leguminosas. En una leguminosa que fija activamente nitr6geno pueden encontrarse hasta 10.000 bacteroides por nddulo, que est4é compuesto de partes aproximadamente iguales de tejido vegetal y de bacterias [267]. Por otra parte, aunque el bacteroide requiere oxfgeno para la produccidn de los altos niveles de ATP necesarios para el funcionamiento de la nitrogenasa, ésta, como queda dicho, es extremadamente sensible al oxfgeno, cuyo nivel en el interior del nédulo se controla por una hemoproteina, similar a la hemoglobina de la sangre de los vertebrados que recibe, por ello, el nombre de leghemoglobina. La formacién del nédulo radical exige que las células corticales de la raiz se dividan, pero, a diferencia de las implicadas en la formacién de las rafces laterales, estas divisiones son anticlinales; por otra parte, no se inician en las células por las que avanza el tubo de infeccién, sino que tienen comienzo en células que estan separadas por varias de ellas del extremo del tubo en progresién. La localizacién de las divisiones celulares iniciales presagia el tipo de nddulo que se va a formar y, a Su vez, esto depende de la planta y no del rizobio [61,250]. Cuando las divisiones celulares se inician en una zona interna del cértex del vegetal, como ocurre en la mayor parte de las leguminosas de climas templados, como el guisante, la veza, el trébol o la alfalfa, se forman nédulos que reciben el nombre de indeterminados porque crecen indefinidamente y tienen forma alargada, mazuda [212,251]. Por el contrario, cuando las divisiones celulares se inician en la zona externa del c6rtex se originan nddulos determinados, de mortologia esférica, que son caracteristicos de leguminosas como la soja, la judfa comin o diversas especies de Lotus [251,303]. La diferencia citol6gica fundamental entre ambos tipos de ndédulos radica en la existencia en los indeterminados de un meristemo persistente que se localiza en el extremo apical y hace que el ndédulo crezca fundamentalmente por divisidn y posterior diferenciacién de las células. La forma alargada se debe a que se van afadiendo permanentemente nuevas células en el extremo del nédulo en el que se localiza el meristemo. Por otra parte, dado que en el nddulo indeterminado existe un gradiente en la edad de las células desde el extremo apical hasta la base proximal por la que se une a la raiz, en él se encuentran representados todos los estadios del desarrollo nodular (Figura 2). En el caso de los nédulos determinados no existe meristemo y, por consiguiente, el crecimiento del nddulo se debe mds al aumento en tamano de las células que a su divisi6n; por ello, se trata de nédulos de morfologfa esférica. Ambos tipos de nédulos se diferencian también en los compuestos nitrogenados que Se sintetizan en ellos y son transportados a otras partes de la planta: en los indeterminados se forman amidas; en los determinados. ureidos [156]. El modelo general que acabamos de describir tiene algunas excepciones. Asf en algunos casos, las bacterias no son liberadas del tubo de infeccidn al interior del citoplasma. Tal es el caso, por ejemplo, de mutantes auxotrofos para la leucina de Rhizobium meliloti simbiontes con alfalfa [357], y el de rizobios silvestres que infectan a Parasponia [280] o a algunas leguminosas arb6reas [101,103]. En estos casos las células del nédulo se ven atravesadas por tubos ramiticados que contienen los bacteroides, y a los que en ocasiones se ha denominado tubos de fijacidén [102]. El nédulo radical, cualquiera que sea su clase es el nicho microaeréfilo en el que tiene lugar la fijacidn de nitrégeno. Ya se ha indicado que los rizobios son bacterias aerobias obligadas y que la fijacién del nitrégeno es un proceso endergdnico, sensible al oxigeno: estas dos caracteristicas, aparentemente irreconciliables se armonizan en el interior del nédulo radical, cuyos tejidos centrales infectados tienen tensiones de oxigeno muy bajas que facilitan la actividad fijadora del bacteroide. En efecto, cerca de la 67 Indeterminado Determinado Figura 2. Organizacién citolégica de los nédulos determinados e indeterminados descritos en las leguminosas. HV, haz vascular; M, meristemo; S, zona de senescencia; ZFN, zona fijadora de nitré6geno; ZST, zona simbiotica temprana; ZTI, zona temprana de infeccion. periteria del nédulo existe una capa continua de células vegetales no infectadas que restringe y regula la ditusidn del oxfgeno gaseoso hacia las zonas internas, que se mantienen, por ello, con unas tensiones de oxfgeno disuelto, aproximadamente cien veces menores que las atmostéricas (0,2 por ciento), valor suficientemente bajo como para que la nitrogenasa pueda efectuar su acci6n catalitica. Ademds, como una adaptaciGn adicional para la creacién de un ambiente microaer6filo para los rizobios, las células intectadas que se localizan en los tejidos internos, contienen grandes cantidades de leghemoglobina, cuya funcidn es tacilitar la difusidn del oxfgeno a bajas concentraciones por el citoplasma de la célula vegetal infectada, aportando al rizobio un flujo de oxfgeno suficiente para llevar a cabo la respiracién y la fosforilacién Oxidativa [38]. 4, Bioquimica y genética de la nitrogenasa 4.1. | Componentes del sistema nitrogenasa El mecanismo de fijacidn del nitr6geno parece muy similar en la mayor parte de los organismos diazotrofos. Un avance importante en el conocimiento del proceso fijador se produjo cuando se demostré que la reduccidn del nitrégeno hasta amoniaco podia ser etectuada in vitro, en presencia de piruvato, utilizando extractos libres de células de Clostridium pasteurianum [51]. Posteriormente se comprob6 que 68 el proceso reductor dependiente de piruvato podfa ser separado en dos componentes: uno de ellos era un sistema fosforocldstico en el que el piruvato es oxidado para producir ATP y poder reductor; el otro, al que se le dio el nombre de nitrogenasa, reducia el nitrégeno utilizando para ello el ATP y el poder reductor generados. El sistema nitrogenasa ha sido aislado y en muchos casos purificado a partir de muchos diazotrofos, tanto de vida libre como simbidticos y en todos ellos tiene una estructura similar. En el aislamiento, se separa en dos componentes [243]. El primero de ellos se denomina ferro-proteina, nitrogenasa-reductasa, azoferredoxina, 0 componente II; contiene cuatro 4tomos de hierro y cuatro 4tomos de azufre ldbiles, que constituyen un centro 4Fe-4§S [125,258], al que se unen de forma simétrica dos subunidades polipeptidicas idénticas, de peso molecular variable entre 29.000 y 36.500 y de secuencias de aminodcidos muy conservadas, como se deduce de la alta homologia del gen nifH que codifica para la ferro-proteina de Klebsiella pneumoniae y de Rhizobium meliloti. La tuncién de esta ferro-proteina es la de actuar como reductor especffico para el segundo componente de la nitrogenasa [333,334]. El otro componente, denominado ferromolibdo-proteina, dinitrogenasa, azofermo 0 componente I, es un tetramero de estructura a-,. La subunidad @ tiene un peso molecular aproximado de 56.000 [244] y esta codificada por el gen nifD, mientras que la subunidad 8 es algo mayor (peso molecular, 60.000, [244] y esta codificada por el gen nifK. Como en el caso de la ferro-protefna, las secuencias de aminodcidos de estas cadenas polipeptidicas estén muy conservadas. El andlisis elemental demuestra que contiene 2 dtomos de molibdeno y entre 24 y 32 dtomos de hierro [258,392]. Dado que el nimero de 4tomos de azufre labiles es el mismo que el de 4tomos de hierro, se puede admitir que ambos se encuentran formando centros Fe-S. De hecho, parecen existir seis de estos centros metdlicos, dos de ellos del tipo 4Fe-4S, que se denominan centros P y dos del tipo 6Fe-8Mo-6S, denominados centros M o cofactores de hierro y molibdeno, FeMo-co [88,331]. Existen otras nitrogenasas, denominadas alternativas, por lo que la dependiente de molibdeno, cuya estructura acabamos de comentar, recibe el nombre de nitrogenasa 1. En etecto, desde antiguo venia siendo conocido que algunos diazotrofos pueden fijar el nitré6geno en ausencia de molibdeno, por lo que se postulaba la existencia en ellos de una dinitrogenasa diferente que no requiriera este metal. El problema fue resuelto cuando se determin6 la existencia de una nitrogenasa 2, cuyo componente I utiliza vanadio en lugar de molibdeno y es denominada VaFe protefna [23,90,323]. Posteriormente, se ha aislado un tercer tipo de nitrogenasa, denominada nitrogenasa 3, que posee una Fe-Fe proteina [59]. Todas las nitrogenasas tienen en comun estar formadas por dos componentes metaloproteicos, el componente I, o dinitrogenasa, que contiene el sitio activo de la enzima, y que puede llevar un cofactor FeMo-co, 0 FeVa-co, 0 FeFe-co, y el componente II, o nitrogenasa reductasa, que reduce especfficamente al componente I. Este segundo 69 componente es siempre una ferro-protefna con un centro metdlico del tipo 4Fe-4S. 4.2 Funcion catalitica de las nitrogenasas Al parecer, el tuncionamiento de los tres tipos de nitrogenasa tiene los mismos requerimientos: son necesarios, ademds de los dos componentes del sistema y de magnesio, un reductor de bajo potencial, ATP y condiciones microaer6filas [59]. Dado que el primer sistema nitrogenasa descrito fue el dependiente de molibdeno, es el mds estudiado y del que se posee un mayor cuerpo de conocimientos. Ademds de su sustrato natural, el dinitrégeno, la Mo-nitrogenasa puede reducir a otros sustratos diferentes (azida, cianuro acetileno y protones, entre otros), que se comportan como inhibidores de la fijacién del nitrégeno [41]. Un sustrato alternativo de la nitrogenasa que tiene gran interés es el acetileno. En efecto, la reducci6n de acetileno a etileno por la nitrogenasa es muy eficaz: la Km de la enzima para este sustrato es 0,1 mM, similar ala que tiene para el N, y el producto, el etileno puede ser facilmente detectado por cromatografia de gases. Por ello, la actividad in vivo de la nitrogenasa se ensaya utilizando acetileno como sustrato en lugar de nitré6geno molecular. Dado que la reduccién del acetileno requiere sé6lo dos electrones, en lugar de los seis necesarios para la reduccién del dinitrégeno hasta amoniaco, cabe esperar que la relacién N, tijado/etileno producido sea de 1:3. Sin embargo, los valores reales obtenidos ditieren de este valor tedrico, en tunci6n del sistema experimental empleado, del material biolégico utilizado y en el caso de los nédulos radicales, de la presencia en ellos de etileno que, como es sabido, es una hormona vegetal. Esto limita en gran medida la utilizaci6n del test de reduccidén del acetileno para estudios cuantitativos, aunque sigue siendo de gran utilidad, por su sencillez y sensibilidad, para estudios cualitativos. Otra aplicaci6n de este procedimiento deriva del hecho de que la nitrogenasa dependiente de vanadio también puede reducir el acetileno, pero produciendo, ademéds de etileno, etano [72]. Dado que la nitrogenasa dependiente de molibdeno no forma etano como producto de reducci6n del acetileno, el ensayo de dichos productos permite detectar el funcionamiento in vivo de nitrogenasas alternativas. La velocidad del flujo de los electrones hacia la nitrogenasa es independiente del sustrato e, incluso en condiciones Optimas para la reduccién del dinitr6geno, aproximadamente el 25 por ciento de los electrones suministrados al sistema son utilizados para la reducci6n de protones: N, + 16Mg-ATP + 8e + 8H* ----- —> 2NH, + H, + 16Mg-ADP + 16P, Esta produccidén de hidrdégeno se cree debida a que la unién del N, a la nitrogenasa requiere la existencia de un sitio reducido en la enzima y que la unin del dinitrégeno al mismo desplaza H, [58]. En etecto, como se puede deducir del mecanismo de funcionamiento de la enzima, expuesto en el esquema de la tigura 3, el reductor inmediato del sistema, que en Rhizobium es la ferredoxina (Fd) reducida [52] y en 70 n electrones (n entre O y 7) FeMoP n+7 electrones Figura 3. Mecanismo de accién de la nitrogenasa, A. Reduccién de la nitrogenasa (FeMoP) por la nitrogenasa - reductasa (FeP). B. Ciclo de reduccidn del nitrégeno por la nitrogenasa. Cana incorporaci6on de un electrén implica un ciclo completo como el representado en A. 71 Klebsiella pneumoniae, \a flavodoxina reducida [326], transtiere los electrones a la ferroprotefna, que en presencia de MgATP altera su conformacién y se convierte en un componente de bajo potencial. En este estado la terro-proteina se combina con la nitrogenasa, hidrolizdndose el ATP, y le transfiere un electron. Simultdneamente, el FeMo-co toma un protén del medio. Cada vez que tiene lugar la transferencia de un electron, la ferroprotefna se combina y se disocia del otro componente y tiene lugar la hidrdlisis de dos moléculas de MgATP [42]. Como consecuencia de esta transterencia de electrones, se forma un trihidruro de la enzima [216,352] al que se une la molécula de dinitré6geno desplazando dos a4tomos de hidrégeno [58]. A partir de este momento, son necesarios cinco electrones adicionales para tormar las dos moléculas de amonfaco. De estas consideraciones sobre el mecanismo de accién de la nitrogenasa cabe deducir que la produccién de hidrégeno es un aspecto esencial e inevitable del propio funcionamiento de la enzima. Aunque la nitrogenasa dependiente de vanadio tiene la misma afinidad por el N, que la dependiente de molibdeno, cataliza la reduccién de protones a H, en mayor medida y se estima que en este caso al menos el 50 por ciento de los electrones son empleados para esta funcidn [90]. El aparentemente inutil consumo de ATP para la produccién de hidrégeno es compensado en muchos diazotrofos aerobios, tanto simbidticos como de vida libre, por la accidn de una hidrogenasa (sistema Hup, de Hydrogen uptake protein) muy activa que permite reciclar el hidrégeno producido. Su actividad tiene como resultado la generacién de ATP y una mejora de la eticacia metabdlica del organismo [100], hasta el punto de que en Bradyrhizobium japonicum permite, bajo ciertas condiciones un crecimiento quimiolitotrofo utilizando H, y CO, como tinicas fuentes de energfa y carbono, respectivamente [145,210]. 4.3 Genética de la fijacién del nitr6égeno El estudio de la genética de la fijacién de nitrégeno se inicié en Klebsiella pneumoniae, en la que se han identiticado al menos 21 genes nif que controlan el proceso. Estos genes estan organizados en ocho regiones de transcripcién comprendidas en una porcién del cromosoma de 23 kb [50]. Los polipéptidos estructurales de la nitrogenasa estén coditicados por el operén nifHDK [294,296], mientras que otros operones regulan funciones diversas: la biosintesis de FeMo-co est4 controlada por los operones nifBQ, nifEN y nifX [172,296,325], la moditicacién post-traduccional de los componentes de la nitrogenasa es llevada a cabo por proteinas codificadas en el operén nifUSVM [294-296] y las proteinas transportadoras de electrones estén codificadas en los operones nifF y nifJ [154,296,337]. Por ultimo, el operén nifAL regula la transcripcidn del conjunto de genes nif [91]. Cuando los genes nif de K. pneumoniae son transteridos a otras bacterias como Escherichia coli [77], Salmonella typhimurium [278], Agrobacterium tumefaciens [74,75] 0 mutantes Nif de Azotobacter vinelandii [49] 0 de Rhizobium [75], la bacteria 72 receptora se hace diazotrota y la expresidn de los genes nif esté sometida a represidn por el nitrégeno fijado 0 por el oxfgeno. Cuando se logré la clonacién de los genes nif de K. pneumoniae en plasmidos, se abrié la posibilidad de investigar la presencia de genes similares en otros diazotrotos, mediante técnicas de hibridacién de ADN que han puesto de manifiesto la existencia de genes nif altamente conservados en todos los diazotrofos investigados hasta ahora, sobre todo en los que se retiere al operén nifHDK, lo que indica un notable grado de conservacién en la estructura de la nitrogenasa, pese a que los diazotrofos son un conjunto filogenético diverso de bacterias [224,308]. En algunos, los genes nif son de localizacién cromosémica, pero en otros, como Rhizobium, Lignobacter 0 Enterobacter agglomerans, se encuentran en plasmidos [252]. Algunos autores encuentran la explicacién del alto grado de conservacién de los genes de la nitrogenasa precisamente en esta localizacién plasmidica de los genes nif. Para ellos, en muchos diazotrotos la capacidad fijadora serfa de adquisicién reciente mediante una transferencia horizontal de genes. Sin embargo, si ello hubiera sido asi, también cabria esperar un alto grado de homologia en genes nif diferentes de los estructurales de la nitrogenasa y, como queda dicho, el mayor grado de homologia se encuentra en el operén nifHDK. En nuestra opinion, cabe una explicacién alternativa: la fijacién del dinitrégeno debe ser una actividad de aparicién temprana en el curso de la evolucidén, como lo sugiere la existencia de arqueobacterias diazotrofas y la extremada sensibilidad al oxfgeno de la nitrogenasa. Quizds la actividad de la enzima sea muy dependiente de las estructuras secundaria y terciaria de sus componentes y. por ello, sean permisibles muy pocos cambios en la secuencia de aminodcidos [39]. Dado que la nitrogenasa es uno de los principales constituyentes celulares de los diazotrotos (puede llegar a suponer el quince por ciento de la protefna celular soluble) y que su actividad catalftica es extremadamente costosa en términos de ATP consumido, no resulta extrafo que en todos los sistemas fijadores de nitrégeno la funcidn de los genes nif esté sometida a una estricta regulacién para evitar que, por un exceso en el medio de nitrégeno combinado o de oxigeno, el proceso se haga supertluo por la falta de eficacia 0 por inactivacién de la nitrogenasa [257]. Asf, en presencia de oxfgeno o de una fuente de nitrégeno combinado abundante se reprime la sintesis de la enzima [89,361]. En K. pneumoniae los diferentes operones nif constituyen un regulén, sujeto a control positivo (activacién) y negativo (represi6én). Ambos tipos de control se ejercen a dos niveles jerérquicos diferentes. El primero de ellos est4 ejercido por el sistema Ntr niliacite general del metabolismo del nitré6geno) que afecta no sélo a los genes nif, sino también a otros operones del metabolismo del nitrégeno, como los de la utilizacién de la arginina, la histidina o la prolina [219] y el otro, a cargo del operén nifLA, es especifico para los operones nif. El sistema Ntr est4 tormado por tres genes: ntrA que codifica un factor sigma (o~), diferente del factor 0” convencional, que es necesario para la transcripcidn especifica de los operones sometidos a 73 control por Ntr; la sintesis de esta protefna es constitutiva y no se atecta por la tuente de nitrégeno ni por la presencia de oxfgeno [157,238]. El gen mrB codifica para una protein-quinasa que tosforila de manera especitica al producto de nirC y este gen codifica una proteina que activa al promotor del operén nifLA. La activaciOn de los genes nif de K. pneumoniae tiene lugar en cascada, como se expone en la figura 4. ntrA ginB ginD J Oo T Peeical siren) genes nif uridilada ——— ee TS O Sen tad | oie pica : ie Terie ees t ort D owt BRS 4 —+ » ginA * ntrB ntrc ‘ a ot ee ee Oe ee ee nifA nifL Figura 4. Regulacién de los genes nif en K. pneumoniae. Los promotores dependientes de o” se representan con trama oscura y los dependientes de o™ (proteina del gen nrrA), rayados. Los cuadrados representan las formas inactivas de las proteinas y los circulos, las formas activas. La linea gruesa de trazo continuo indica inducci6n; la punteada, represion; la linea de trazo discontinuo, catdlisis. En condiciones limitantes de nitr6geno combinado, cuando la relacién a@-cetoglutarato/glutamina alcanza un valor critico, el producto del gen g/nD activa por uridilacién al producto del gen g/nB y este producto activa NtrC mediante la quinasa NtrB. La protefna NtrC fostorilada, en conjuncién con la protefna NtrA, activa al gen estructural de la glutamin-sintetasa (g/A) y al oper6n nifLA. Ademds, como glnA, ntrB y ntrC constituyen un Unico oper6n, aumentan las concentraciones de NtrB y NtrC. El producto del gen nifA, junto con NtrA activa la transcripcidn de los restantes genes nif. En presencia de nitrégeno fijado no hay activacién de la protefna GlnB y, por consiguiente, tampoco de NtrB ni de NtrC. Estos productos génicos inactivos reprimen la expresidn de sus propios genes a partir del promotor de g/nA [257]. La represiOn por el oxigeno se etecttia por un mecanismo diferente, que no depende del sistema rr, ya que algunos de los operones regulados por este sistema han de expresarse en condiciones de aerobiosis [76,89]. 74 En este caso la represidn depende exclusivamente del producto NifL que, en presencia de altas tensiones de oxfgeno se modifica e inactiva al producto NifA [155,238]. En el caso de los rizobios, la organizacién de los genes nif y su regulacidn son diferentes. Por ejemplo, los genes estructurales de la nitrogenasa, nifHDK, torman un solo oper6n, localizado en el plasmido pSym, en R. meliloti y R. leguminosarum, pero en B. japonicum estan separados en dos operones diferentes, nifH y nifDK, de localizaciédn cromosémica [214]. Por otra parte, en estos diazotrofos simbidticos se han encontrado otros genes para la fijacién del dinitrégeno, que no son homdlogos con los de K. pneumoniae y que reciben el nombre de genes fix. Aunque en la mayor parte de los casos no se ha identificado aun la funci6n bioquimica exacta de los genes fix, las secuencias de nucledtidos de algunos de ellos guardan homologia con las de los genes de las ferredoxinas bacterianas y otras metaloprotefnas [136,92,93,152,195,247]. La regulacién de los genes de la fijacién también es diferente en los rizobios: el gen nifA es activado a través de una cascada que se desencadena cuando los niveles de oxigeno del medio caen por debajo de cierto umbral. En estas condiciones, la proteina FixL, localizada en la membrana actua como sensor de oxfgeno, se autofosforila y transtiere el grupo fosfato a una proteina reguladora, Fix J [62,274]. La proteina FixJ fostorilada induce la transcripcién de nifA y de fixK. El producto NifA, junto con el factor sigma NtrA, enciende los restantes genes nif y fix. Por otra parte, la propia proteina NifA es sensible al oxigeno [22] y representa por ello un segundo nivel de regulacidn de los genes nif y fix. 3. Fisiologia del nédulo radical | Intercambio gaseoso Para que en el nddulo radical, una vez formado, se Ileve a cabo una fijacidn de nitr6geno eticaz es mecesario que se cumplan una serie de condiciones, que han sido revisadas [382,383] y que se pueden resumir en las tres siguientes: a) debe existir una barrera de difusidn para el oxigeno que equilibre su entrada con el consumo en el interior del nédulo. b) una tasa respiratoria relativamente alta en la célula intectada a fin de que se produzca una caida relativamente rdpida en la concentracién de oxfgeno disuelto. c) una red de espacios aéreos interconectados entre las células intectadas. Como el oxfgeno difunde una diez mil veces mejor en el aire que en medio acuoso, la presencia de estos espacios permite un rdpido movimiento del gas por la zona infectada, de tal forma que solo penetra en la célula una pequefa tracci6n. De no existir estos espacios, el centro del ndédulo serfa absolutamente anaerobio. La leghemoglobina i a existente en el citosol de la célula infectada completa el flujo del oxfgeno hasta la superticie del bacteroide. Estos mecanismos protectores no deben impedir ni la entrada de nitrégeno ni la salida de CO,, procedente de la actividad respiratoria, 0 de H,, procedente de la actividad nitrogenasa. El aporie de nitrégeno se asegura merced a su elevada concentracién en el aire atmostérico y a la gran capacidad del bacteroide para reducirlo hasta NH;, lo que permite la formacién de un gradiente de concentracién Suficiente para que pueda difundir hasta el interior del tejido nodular [16]. Por el contrario, la difusién hacia el exterior del CO, y del H, es mds compleja, ya que en ambos casos se deben establecer gradientes lo suficientemente amplios como para permitir que estos gases difundan hacia fuera con la misma velocidad en que son generados como consecuencia de la actividad metabolica de la célula infectada. El CO, se encuentra en equilibrio con su forma hidratada, el ion HCO,, que difunde en medio acuoso mucho més rdpidamente que el CO., aunque a través de las membranas lo haga mds lentamente, debido a la existencia de una carga negativa. En medio acuoso, la reaccién de hidratacién del CO, es lenta, pero en los nédulos existe la enzima anhidrasa carbénica, que cataliza la formacién de HCO, y hace que la velocidad de difusidn del CO, no se vea limitada por la de su hidrataci6n, sino por la magnitud del gradiente de HCO, tormado. Por otra parte, al evitarse la acumulacidn de CO,, se tavorece el funcionamiento de la leghemoglobina, ya que la atinidad de esta protefna por el oxfgeno disminuye en presencia de CO, [16]. En lo referente al H,, su velocidad de ditusi6n es mucho mayor que la del oxfgeno y, por ello, aunque no se establezcan grandes gradientes, es posible que difunda hacia fuera sin que Ilegue a acumularse en el nédulo a concentraciones que inhiban a la nitrogenasa. Ademds, debe recordarse la existencia en los bacteroides de muchos rizobios del sistema Hup que reciclaria el hidrégeno haciendo innecesaria su salida al exterior nodular. 52 Metabolismo del carbono Debido a la mayor facilidad para su aislamiento, los simbiosomas del sistema Bradyrhizobium Japonicum-soja han sido los més estudiados desde este punto de vista y, por ello, la discusi6n que sigue estard centrada fundamentalmente en él, aunque, cuando se disponga de datos sobre otras simbiosis, se hard mencidn de ellos. Ya se ha indicado que el funcionamiento de la nitrogenasa requiere electrones y energia. Se admite que la fuente principal de ambos requerimientos es el fotosintato de la planta, ya que la falta de fotosintato, impuesta experimentalmente cultivando a la planta en oscuridad, tiene como consecuencia una disminucidn en la tasa de fijacién de nitrégeno [372]. El fotosintato es metabolizado en las células del nédulo para producir el poder reductor necesario para reducir a la ferredoxina, reductor inmediato de la nitrogenasa reductasa, y el ATP necesario para la accidén de esta ultima. También se ha indicado que la 76 célula infectada est4 compartimentada y que el bacteroide se encuentra (solo o formando grupos en numero variable) en el interior del simbiosoma, orgdnulo delimitado por una membrana que recibe el nombre de membrana peribacteroidea. Por consiguiente, la discusién del metabolismo del carbono debe hacerse teniendo en cuenta esta compartimentacién de la célula. 5.2.1. Metabolismo en el citosol El principal producto de la fotosintesis translocado al nédulo es la sacarosa [288] pero no es probable que actuie como fuente primaria de energia para los bacteroides, ya que la velocidad de entrada a través de su membrana es muy baja [127] y no se ha detectado en ellos invertasa, enzima que cataliza la hidr6lisis de la sacarosa en glucosa y fructosa [222,341]. Por otra parte, aunque en el citosol de la planta intectada existe invertasa [341], la entrada de glucosa en el bacteroide se inhibe por la presencia de dcidos dicarboxilicos como el succinato o el malato que también se detectan en el citosol [314,342]. Por consiguiente, los hidratos de carbono han de ser metabolizados en el citosol para rendir compuestos que puedan atravesar la membrana peribacteroidea y la del bacteroide. Gran parte de la sacarosa que llega al nddulo es almacenada en el citosol de las células infectadas en forma de almidén [164,375], lo que refleja un exceso de aporte de sacarosa para suplir los requerimientos de la fijaci6n del nitr6geno, ya que la acumulacién de almid6n es considerada generalmente como consecuencia de un exceso de carbohidratos. En cualquier caso, parte de la sacarosa importada al ndédulo es hidrolizada por la invertasa del citosol en glucosa y fructosa, que son metabolizadas por la glucolisis o mediante la via de las pentosas fostato [16]. Es casi un paradigma, derivado de los estudios con células animales, que la glucolisis rinde piruvato que luego es importado a la mitocondria donde es convertido en acetil-CoA y metabolizado a través del ciclo de los 4cidos tricarboxilicos (TCA). Sin embargo, en las células infectadas el nimero de mitocondrias es muy pequefo en relacidén con el de bacteroides, por lo que no parece probable que la actividad mitocondrial sea suficiente como para suministrar todo el ATP necesario para la actividad de la nitrogenasa. Por otra parte, debe ser tenido en cuenta que en las condiciones microer6filas del nddulo es posible que el ciclo TCA mitocondrial no actue ya que algunas de sus enzimas, como la citrato sintasa, la NADP-isocitrato dehidrogenasa y la a- cetoglutarato dehidrogenasa, se inhiben o se reprimen en estas condiciones [226]. Por consiguiente, debe ser considerada otra via alternativa en la que la glucolisis rinde malato y que en las células vegetales en general puede tener una importancia cuantitativa, al menos, similar a la considerada "cldsica", es decir, glucolisis, ciclo TCA, cadena respiratoria [63,202]. En estas células existen dos enzimas, la fosfoenolpiru- vato carboxilasa y la malato dehidrogenasa que catalizan la conversi6n del oxalacetato en malato [202]. La 77 enzima mdlica, también presente en el citosol producirfa piruvato a partir del malato, lo que, a su vez, constituye una fuente adicional de piruvato y CO,, sustratos de la fostoenolpiruvato carboxilasa. Por otra parte, es también posible que el malato no sea el tinico compuesto dcido producido en el citosol, ya que en condiciones de baja tensi6n de oxigeno se producen también dcidos dicarboxilicos C,, como el succinato 0 el fumarato [63,139,203]. El andlisis de los dcidos org4nicos presentes en los nédulos, tanto determinados como indeterminados, parece indicar la existencia en las células infectadas de una via reductora para la sfntesis de dicarboxilatos C, [371]. En cualquier caso, los dicarboxilatos mds abundantes en el néddulo son el malato y el succinato. Por otra parte, los andlisis de actividades enzimaticas en el citosol, demuestran cantidades muy elevadas de proteinas y de actividades fosfoenolpiruvato carboxilasa, malato dehidrogenasa y aspartato aminotransterasa [54,85 ,96,120,200,344,376] que son las enzima claves para dirigir el flujo del carbono hacia la produccién de malato [139,231,369]. Por otra parte, en nédulos ineficaces o de plantas sometidas a determinados tratamientos, como la adicién de nitratos, la eliminacién de los retonos o en presencia de inhibidores, se produce una cafda paralela en la concentracioén de 4cidos orgdnicos, en las actividades de estas tres enzimas y en la actividad nitrogenasa [96,320,370]. Lo que permite sugerir que es el malato el compuesto carbonado que, principalmente soporta la actividad de la nitrogenasa. 5.2.2. Transporte a través de la membrana peribacteroidea Como ya se ha indicado, los bacteroides se encuentran encerrados en orgdnulos especificos, los simbiosomas, que estan delimitados por una membrana que recibe el nombre de membrana peribacteroi- dea. Cada vez son mds abundantes los datos que sugieren que la formaci6n de la membrana peribacteroidea no eS una mera consecuencia de la internalizacién de la membrana citoplasmatica de la célula infectada. Asi, se ha comprobado que se trata de una membrana con una alta proporcidn lipidos:proteinas [300] y que contiene fostatidilcolina, que es sintetizada en el reticulo endopla4smico y transportada por el sistema de Golgi de la célula infectada [234]. De igual forma, contiene glicoproteinas especiticas que son procesadas en el retfculo endoplasmico y en el sistema de Golgi 0 en ambos compartimentos [377,378]. Por otra parte, las comparaciones de los pertiles proteicos obtenidos por electroforesis en geles de poliacrialmida y por inmunoelectroforesis demuestran la falta de identidad entre la membrana peribacteroidea y la citoplasmatica [236]. Por ultimo, la membrana peribacteroidea posee una ATPasa [25,81] que puede generar un potencial de membrana en el simbiosoma intacto [363]. Entre las proteinas que forman parte de la membrana peribacteroidea se encuentran las que regulan el paso de metabolitos entre el citosol de la célula infectada y el bacteroide. Ademds de la ATPasa que hemos mencionado, contiene una protefn-quinasa dependiente de iones calcio, que interviene en la 78 regulaciOn del transporte de metabolitos, ya que se admite que la fosforilacién de protefnas estimula la tasa de transporte de malato a través de la membrana peribacteroidea, representando un importante mecanismo regulador durante la fijaci6n del nitré6geno [260]. Por consiguiente, la membrana peribacteroidea no es sdélo un sistema de aislamiento del bacteroide y del citosol celular, sino que se trata de un centro metabdélico muy activo que controla el tuncionamiento de la simbiosis. De los compuestos carbonados que se encuentran en el citosol de la célula infectada, los mds abundantes son los carbohidratos, los dcidos dicarboxilicos y el glutamato [73,181]. De ellos, la sacarosa, la glucosa y la fructosa no pueden atravesar la membrana peribacteroidea [65,316]. En realidad, se detecta una cierto paso de glucosa y de tructosa a través de dicha membrana, pero su velocidad es muy lenta [362] y no muestra saturacién por sustrato [365], lo que sugiere que se trata de un proceso de difusidn pasiva y no de un transporte mediado por transportador [65]. Un disacérido que se encuentra en grandes cantidades en el simbiosoma y también en el citosol de la célula intectada es la trehalosa. Como se acaba de comentar, la membrana peribacteroidea carece de transportadores para la glucosa, pero sf puede transportar UDP-glucosa [313], que puede provenir de la sacarosa presente en el citosol mediante la reaccidn reversible de la sacarosa sintetasa, enzima muy abundante en las células del nddulo [242]. Dado que el bacteroide contiene enzimas fosforilantes de la glucosa y de la fructosa, se puede sintetizar en él la trehalosa, que luego se puede hidrolizar por una trehalasa presente tanto en el citosol de la célula infectada como en el espacio peribacteroideo (232]. Ademds, los bacteroides de B. japonicum contienen dos enzimas capaces de hidrolizar la trehalosa: la tosfotrehalasa, que produce glucosa-6-fostato y glucosa, y la trehalosa fostorilasa, que rinde glucosa-1-fostato y glucosa [311]. El resultado final de este sistema serfa el transporte de glucosa a través de una membrana inicialmente impermeable a ella [55]. Todavia no se dispone de intormaci6n suficiente acerca de alguin otro papel que la trehalosa pudiera desempenar en el funcionamiento de la simbiosis. De cualquier torma, los carbohidratos deben ser poco relevantes para el mantenimiento de la actividad fijadora de nitrégeno y no constituyen una fuente de energfa directa para el bacteroide, como lo Sugiere el hecho de que las enzimas claves de la via de Embden-Meyerhof (la fostotructoquinasa), de la via oxidativa de las pentosas fosfato (la 6-fosfogluconato dehidrogenasa) 0 de Entner-Doudorofft (la glucosa- 6-fostato dehidrogenasa) no se detecten en el bacteroide, o bien sus actividades sean minimas y desde luego mucho menores que las que presenta la bacteria en vida libre [173,316,317]. Por otra parte, mutantes de Rhizobium deticientes en algunas de las enzimas del metabolismo de la hexosas, como la glucoquinasa, la tostogluco-isomerasa, la fructoquinasa o la piruvato dehidrogenasa, forman nédulos eticaces (capaces de fijar el nitré6geno) en la leguminosa hospedadora especifica [16]. La hip6tesis de que el glutamato serfa un sustrato carbonado ideal durante la fijacién del nitr6geno 79 [181] hizo centrar la atencidn en el transporte de este aminodcido a través de la membrana peribacteroidea. Sin embargo, se demostr6 que, si bien los bacteroides aislados captan el aminodcido por un mecanismo mediado por transportador que, ademds es dependiente de la fuerza proténmotriz del bacteroide, la -membrana peribacteroidea es impermeable a él [367], por lo que tampoco debe ser relevante en el funcionamiento de la actividad fijadora de nitrégeno en el nédulo. Por el contrario, el transporte de dcidos orgdnicos, especialmente malato y succinato, es muy rapido, tanto por los bacteroides como a través de la membrana peribacteroidea, se inhibe por agentes desacoplantes y por inhibidores de la respiracién, y muestra cinética de saturacién [367]. Ademas, los sistemas de transporte a través de la membrana peribacteroidea y de entrada en el bacteroide deben ser diferentes, ya que el primero es sensible a los dcidos ttalénico y cianocinémico, mientras que el segundo, no [366]. El de la membrana peribacteroidea tiene menor atinidad por el malato y el succinato que el del bacteroide, pero las V,,,, de ambos sistemas son similares. El primero es unico y cataliza el transporte de una gama relativamente amplia de dicarboxilatos y tiene mayor atinidad por el succinato y el malato. Ademiés, el transporte de estos dcidos se inhibe por la carbonilcianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP), un agente desacoplante y por el KCN, un inhibidor del transporte de electrones respiratorio y se estimula por el ATP [259], lo que demuestra que es dependiente de un estado energético de la membrana peribacteroi- dea. Probablemente, este transportador de dicarboxilatos existente en la membrana peribacteroidea sea una nica molécula de proteina, la denominada nodulina 26 [260]. Parece probado, pues, que los unicos sustratos carbonados que atraviesan la membrana peribacteroidea a una tasa suticiente como para soportar la actividad de la nitrogenasa son los dicarboxilatos, especialmente el succinato y el malato. 5.2.3. Metabolismo en el bacteroide El hecho de que el malato sea el dicarboxilato mds abundante en el citosol de la célula infectada y de que pueda atravesar rdpida y eticazmente la membrana peribacteroidea, asf como la inexistencia en los bacteroides de las enzimas claves del metabolismo de las hexosas, convirtieron a este compuesto en el metabolito clave en el interior del bacteroide. Para su metabolismo es necesaria la presencia de un ciclo TCA eficaz, como lo prueban el hecho de que los rizobios mutantes en el transporte de dicarboxilatos torman ndédulos ineticaces [6,34,107,126,253,304] al igual que las estirpes mutantes defectivas en alguna enzima del ciclo TCA [87,122]. Por otra parte, en todos los casos estudiados hasta ahora las actividades especiticas de las enzimas del ciclo TCA son mucho més elevadas que las de las restantes enzimas del metabolismo del carbono, tanto en el estado de bacteroide [173] como de célula vegetativa [173,208]. 80 La entrada de los dicarboxilatos en el bacteroide se efectuia a través de un transportador (el sistema dtc) que se ha descrito tanto en Rhizobium [34,107,304] como en Bradyrhizobium [168]. Kahn y col. [181] Sugirieron que la entrada de malato se verfa favorecida, ademas, por la denominada lanzadera malato- aspartato. De acuerdo con estos autores, el malato importado por los bacteroides serfa oxidado hasta oxalacetato por la malato dehidrogenasa y luego transaminado hasta aspartato por una aspartato aminotransferasa dependiente de glutamato, rindiendo aspartato y a-cetoglutarato que serfan exportados al citosol de la célula infectada. Esta afirmacién estaba basada en el hecho de que en los bacteroides de B. japonicum existen cantidades importantes de la aspartato aminotransferasa [200,309]. La salida de a- cetoglutarato del bacteroide hacia el citosol celular mantendria el potencial electroquimico a través de la membrana del bacteroide a fin de compensar en parte la captacién de malato. En apoyo adicional de esta interpretaciOn est4 el hecho de que cuando los bacteroides de soja aislados son incubados en presencia de glutamato marcado con “C y malato frio, en la mezcla de reaccién se acumula a-cetoglutarato marcado con “C. [343]. Ahora bien, para que continue el flujo de compuestos carbonados entre el citosol celular y el bacteroide serfa necesario que en el citosol el a-cetoglutarato fuera transaminado con aspartato por acci6n de la aspartato aminotransferasa del vegetal, para producir glutamato y oxalacetato. Este ultimo serfa reducido luego a malato por la mdlico dehidrogenasa y podrfa entrar de nuevo en el simbiosoma. Pero el funcionamiento de la lanzadera exige la entrada de glutamato que donarfa los grupos amino para la transaminaciOn inicial del oxalacetato por la aspartato aminotransferasa del bacteroide. Esta entrada de glutamato es posible a través de la membrana del bacteroide [21,312,367], pero ya hemos visto cémo la membrana peribacteroidea es una barrera de permeabilidad para el glutamato [367], por lo que esta lanzadera no parece estar implicada en el intercambio de metabolitos entre el citosol y el bacteroide. Una vez en el interior del bacteroide, el malato es metabolizado mediante un complejo sistema que implica al ciclo TCA, al ciclo de los 4cidos dicarboxflicos (DCA), la sintesis de poli-B-hidroxibutirato y, en cierta medida, la fermentaci6n del piruvato. A continuacién veremos cada una de estas vias metabdlicas: 5.2.3.1. El ciclo TCA Dado el significado metabélico del ciclo TCA en los bacteroides, se hace necesario comentar su funcién y los mecanismos de regulacién del mismo que operan en la simbiosis. Como en otros organismos heterotrofos las funciones bdsicas del ciclo TCA son suministrar precursores biosintéticos y, acoplado con la cadena respiratoria, generar la mayor parte del ATP necesarios para el crecimiento o para las reacciones enderg6nicas que tienen lugar en el bacteroide. También como en los restantes organismos, el ciclo es cebado con acetil-CoA que se combina con el oxalacetato para formar citrato, compuesto de seis 4tomos 81 de carbono que experimenta cuatro reacciones de oxidacién, dos de las cuales (las catalizadas por la isocitrato dehidrogenasa y por la a-cetoglutarato dehidrogenasa) son también reacciones de descarboxila- cidn, de tal forma que se eliminan los dos 4tomos de carbono correspondientes al acetil-CoA y se regenera el aceptor de cuatro carbonos, el oxalacetato. Los dos compuestos iniciadores del ciclo, el oxalacetato y el acetil-CoA, provienen del malato importado desde el citosol celular. El oxalacetato puede ser formado por la reaccidn catalizada por la mdlico dehidrogenasa y el acetil-CoA se formarfa a partir del oxalacetato por una Serie de reacciones anapler6ticas, cuya naturaleza exacta aun no es clara, ya que, en realidad, son posibles varias rutas. En los bacteroides de B. japonicum no parece existir la fosfoenolpiruvato carboxilasa [344], que es la enzima que cataliza la carboxilacién del fosfoenolpiruvato, un intermediario de la glucolisis, hasta oxalacetato, pero son posibles otras vias alternativas. Una de ellas implicarfa la reduccié6n del malato hasta oxalacetato por la mélico dehidrogenasa, seguida por la reaccidn catalizada por la tosfoenolpiruvato carboxiquinasa que descarboxila el oxalacetato hasta fosfoenolpiruvico y que ha sido detectada en los bacteroides, pero parece no ser esencial para el funcionamiento del nddulo [227]. La conversi6n del fosfoenolpiruvato hasta piruvato estarfa catalizada por la piruvatoquinasa, enzima que también ha sido detectada en los bacteroides [200]. Otra alternativa implica a la enzima mdlica (malato dehidrogenasa descarboxilante) que rinde piruvato y CO,. Esta enzima ha sido detectada en los bacteroides de B. japonicum [199] y parece desempefnar un significativo papel en la oxidacidn de los 4cidos dicarboxflicos [228]. Vemos, pues, que cualquiera de las vfas posibles utiliza como intermediario al piruvato que luego serfa descarboxilado hasta acetil-CoA, que tendrfa diversos destinos: cebar al ciclo TCA, entrar en el ciclo DCA, ser usado en la produccién de PHB o reducirse hasta etanol via acetaldehido [226]. Con respecto a la regulacidn del ciclo TCA en los bacteroides de los rizobios se dispone de poca informacién, ya que han sido pocas las enzimas aisladas y caracterizadas. Waters y col. [376] aislaron la mdlico dehidrogenasa de B. japonicum que es sensible a varios metabolitos efectores, entre los que se encuentra el NADPH [98]. La isocitrico dehidrogenasa de R. meliloti es sensible al ATP y en menor medida al ADP y al AMP [57]. En rizobios infectivos en Lotus se encuentra una isocitrico dehidrogenasa dependiente de NAD que en la bacteria en forma libre es sensible al ATP, mientras que en el bacteroide no responde a los nucleétidos de adenina [246], lo que sugiere que esta actividad radica en enzimas diferentes en la bacteria en forma libre y en el bacteroide. Recientemente [221] se ha descrito que en Bradyrhizobium (Lupinus) \a actividad mélico dehidrogenasa radica en una enzima en la forma libre de la bacteria y en dos, en el bacteroide. En B. japonicum la piruvato dehidrogenasa se inhibe por el NADH [97]. Un hecho que debe ser tenido en cuenta es que el ciclo TCA se encuentra, en la mayorfa de los organismos, regulado por el oxfgeno. Asf, la isocitrato dehidrogenasa y la a-cetoglutarato dehidrogenasa, 82 las dos enzimas descarboxilantes del ciclo, asf como la citrato sintasa, suelen ser sensibles al NAD(P)H y su expresiOn y actividad se inhiben en condiciones anaerobias en las que se produce una elevacidén de la proporcién NADH/NAD [174,323]. Dado que en el nédulo existe un ambiente microaer6filo se ha cuestionado si la rama descarboxilante del ciclo TCA desempefia realmente un papel importante en el metabolismo del bacteroide y en la fijacién del nitrégeno [226]. Recientemente se han aislados mutantes de R. meliloti carentes del gen estructural de la isocftrico dehidrogenasa (idc). Estos mutantes forman el mismo numero de ndédulos que la estirpe silvestre y con forma y tamafo normales, pero ineficaces y, ademéas, carentes de leghemoglobina. A partir de estos mutantes fueron aislados pseudorevertientes, carentes de actividad citrato sintasa, que s6lo formaban nédulos rudimentarios [180]. Estos resultados sugieren que las enzimas del ciclo TCA pueden intervenir no sélo en la funcién del nédulo, sino también en su morfogénesis [180]. 5.2.3.2. El ciclo DCA De todas formas, la rama descarboxilante del ciclo TCA tampoco resulta imprescindible, en términos metabdélicos, para el funcionamiento del ndédulo, ya que la regeneracién del oxalacetato puede producirse mediante la operacién del ciclo de los dcidos dicarboxflicos (DCA). Este es un ciclo que tiene dos enzimas clave: la isocitrato liasa, que cataliza la escisidn del isocitrato en succinato y glioxilato, y la malato sintasa, que cataliza la condensacién del glioxilato con el acetil-CoA para dar malato. Ambas enzimas han sido detectadas en los bacteroides de B. japonicum [313]. 5.2.3.3. El ciclo del dcido z-aminobutirico (GABA) Otra via que obvia una de las reacciones descarboxilantes del ciclo TCA es la via del GABA, que partiendo del a-cetoglutarato rinde succinato, a través de la produccién de glutamato, GABA y succinato semialdehido. Para el funcionamiento de esta via es necesaria, primero, la aminacién de a-cetoglutarato hasta glutamato. Salminen y Streeter [312] han demostrado que una parte significativa del carbono que entra en el ciclo TCA es convertido en glutamato y Fottrell y Mooney [112] demostraron que el amonio y el a@- cetoglutarato inducen muy eficazmente la cetoglutarato dehidrogenasa y la aspartato aminotransferasa. En los bacteroides el amonio debe ser abundante debido a la accién de la nitrogenasa y, si debido al ambiente microaer6filo, se inhibe o se reprime la a-cetoglutarato dehidrogenasa, podrfa producirse también una acumulaci6n del cetodcido, por lo que es posible la formacién de glutamato por aminacién del a- cetoglutarato. El glutamato formado podrfa cumplir una primera funcién consistente en donar los grupos 83 amino para el funcionamiento de la lanzadera malato-aspartato, ya comentada, pero también podrfa ser descarboxilado para formar GABA que se produce muy abundantemente en el nédulo [45,203] y que luego serfa desaminado y oxidado hasta succinato [181,226]. Esta via serfa un procedimiento para retirar a- cetoglutarato del ciclo TCA obviando la accidn de la a-cetoglutarato dehidrogenasa, pero eliminando una cantidad equivalente de CO, y rindiendo succinato, otro intermediario del ciclo. Para que la vfa opere es necesaria, como queda dicho, la aminacién del a-cetoglutarato hasta glutamato, que puede estar catalizada por dos sistemas enzimaticos diferentes, la glutamato dehidrogenasa o la glutamina:2-oxoglutarato aminotransferasa (GOGAT) y ambas han sido detectadas en los bacteroides de B. japonicum [40,86], por lo que resulta muy probable la existencia de esta via. Es mds, se ha sugerido que en los bacteroides de B. japonicum puede ser la principal via catab6lica para el glutamato [199] y se han aislado mutantes de R. meliloti defectivos en esta via, que si bien forman ndédulos de apariencia normal tienen menor actividad nitrogenasa [111]. 5.2.3.4. Metabolismo del piruvato Ya hemos visto cémo el piruvato sirve de metabolito cebador de los ciclos TCA y DCA mediante su descarboxilacién a acetil-CoA. Sin embargo, en las condiciones microaer6filas del nédulo son posibles vias fermentativas para la transtormacidén de este metabolito. Una de ellas serfa su conversi6n en alanina por la alanina dehidrogenasa [16], aunque esta enzima no se encuentra en los nédulos de alfalfa y las altas concentraciones de este aminodcido existentes en los bacteroides debe ser atribuida a la actividad de la glutamato:piruvato aminotransterasa [85]. Existe también la posibilidad de que el piruvato sea reducido a lactato por la lactato dehidrogenasa, ya que esta enzima ha sido detectada en los nédulos de alfalta [85] y los bacteroides de soja incubados en condiciones microaer6filas acumulan lactato [346]. En los bacteroides de B. japonicum se han detectado las actividades aldehido dehidrogenasa [344] y alcohol dehidrogenasa [313]; ademas, en condiciones anaerobias la alcohol dehidrogenasa procedente de extractos de bacteroide favorece la producci6n de etanol [347] y, dado que los bacteroides forman acetato cuando se incuban en anaerobiosis y en ellos no existe piruvato descarboxilasa [347], se puede postular que el piruvato es descarboxilado a acetil-CoA, que posteriormente se transforma en acetato por la acetil-CoA sintasa [279]. A continuacién la acetaldehido dehidrogenasa convertiria el acetato en acetaldehido y la alcohol dehidrogenasa completaria la reduccidn hasta etanol. 84 Los bacteroides de B. japonicum y de R. leguminosarum bv. phaseoli acumulan grandes cantidades de poli-8-hidroxibutirato que pueden suponer hasta el 50 por ciento del peso seco y que se pueden poner de manifiesto mediante microscopia electrénica [385]. La s{ntesis de este polf{mero que comienza cuando se establecen las condiciones microaer6filas en el nédulo, se inicia por la condensacién de dos unidades de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, que se reduce a §-hidroxibutiril-CoA, cuya polimerizacién da lugar al PHB. se trata, pues, de un proceso reductor. Ahora bien, dado que en condiciones de microaerofilia la nitrogenasa consume grandes cantidades de energfa y de electrones, es razonable preguntarse qué funcidn cumple en el bacteroide la s{ntesis de PHB. McDermott y col. [226] especulan que en las condiciones microaer6filas del néddulo se acumularfa reductor, es decir, habrfa una alta relacién NAD(P)H/NAD(P), que inhibirfa o reprimirfa a enzimas tales como la isocitrato dehidrogenasa, la cetoglutarato dehidrogenasa o la citrato sintasa, lo que provocarfa una acumulacién de acetil-CoA que se derivarfa a la sfntesis de PHB; el proceso, restablecerfa, asfmismo, una relaci6n NADH/NAD favorable para el funcionamiento de las mencionadas enzimas, que, como ya se ha indicado, resultan clave para la actividad y el desarrollo del nédulo (apartado 5.2.3.1). En efecto, coincidiendo con la sintesis de PHB se observa una cafda, aproximadamente del 25 por ciento, en la actividad de NADP-isocitrato dehidrogenasa [187,344]. | Coincidiendo con el inicio de la sintesis de PHB se han detectado incrementos de la actividad B- hidroxibutirato dehidrogenasa [186,385] y, dado que esta enzima suele intervenir en la degradacién del polfmero, su actividad implicarfa un recambio constante de PHB, pero con una acumulaci6n neta del polimero [226]. Hemos de mencionar que no en todas las simbiosis se produce una acumulacién de PHB. Si bien ésta tiene lugar de forma general en los bacteroides de Bradyrhizobium, los de Rhizobium, con la unica excepcidn ya citada de R. /eguminosarum by phaseoli, no acumulan tal polimero o lo hacen en menor grado que los bradirizobios. Esto no es mds que una comprobaci6n adicional de las profundas diferencias metab6licas que existen entre los dos géneros. 5.3. Metabolismo nitrogenado Como en el caso del metabolismo del carbono, conviene recordar aqui que las células infectadas que ftorman parte del nédulo radical se encuentran compartimentadas y que las diversas transformaciones que llevan a cabo sobre el nitrégeno tienen lugar en diferentes compartimentos: en el bacteroide tiene lugar 85 la produccién de amonio, como consecuencia de la actividad catalitica de la nitrogenasa sobre la molécula de dinitr6geno. Sin embargo, no es ésta la unica fuente de amonio en el ndédulo, sino que en éste tienen lugar otros procesos productores de amonio. En primer lugar, puede proceder de los nitratos, que llegan al nddulo directamente desde el suelo por absorciOn a través de la superficie o desde el xilema de la raiz a través de conexiones con el sistema vascular del nédulos [213]. Estos nitratos son reducidos en el néddulo hasta amonio por acci6n de dos enzimas, la nitrato reductasa y la nitrito reductasa que se encuentran tanto en el citosol de la célula infectada como en el bacteroide. Por otra parte, en el metabolismo intermediario del nédulo se producen reacciones de desaminaci6n, de hidrdlisis y otras, que acaban rindiendo amonio, que, junto con el procedente de la reduccién de los nitratos, sirve para aumentar el contenido de amonio del ndédulo radical. Desde hace tiempo es conocido el hecho de que la mayor parte del amonio producido en los bacteroides pasa al citosol de la célula intectada, donde es asimilado por enzimas del vegetal porque, aunque los bacteroides tienen las enzimas neceSarias para la asimilacién del amonio, éstas se encuentran reprimidas 0 en muy baja actividad [24,40,165], por lo que el amonio debe ser excretado rdpidamente. En efecto, desde hace unos veinticinco afios se sabe que los bacteroides aislados que reducen '*N, liberan al medio la mayor parte del [‘"NJamonio liberado [19] y, de forma similar, los rizobios que, en vida libre, son inducidos a fijar activamente el nitr6geno in vitro, también pierden amonio al medio extracelular [20,254,360]. Por el contrario, las enzimas equivalentes de la fraccién vegetal del nédulo se inducen paralelamente a la actividad de la nitrogenasa y asimilan activamente el amonio producido por ésta (289133298). Los rizobios y otras muchas bacterias diazotrotas poseen transportadores de amonio que solo se expresan en condiciones limitantes de nitrégeno [128,129,166,177,254,263]. Sin embargo, ni en las membranas de los bacteroides ni en la membrana peribacteroidea, se expresan tales transportadores y, por ello, el amonio atraviesa ambas membranas por difusidn simple [166,177,254,364], que viene favorecida por la alta tasa de su asimilaciOn en el citosol de la célula intectada. Como consecuencia de esta asimilacién, se torman en las células del ndédulo una serie de compuestos nitrogenados que son exportados por el xilema [265,266] hasta las partes aéreas de la planta, donde son utilizados como donadores de nitrogeno reducido para la sintesis de los compuestos nitrogenados necesarios para el crecimiento. Como ya se ha indicado, las leguminosas pueden ser divididas en dos grupos segun el tipo de nddulos que presentan y el tipo predominante de compuestos que transportan a través del xilema: las exportadores de amidas, que forman noédulos indeterminados y transportan asparragina, glutamina o metilén-glutamina, y las exportadores de ureidos, que forman nddulos determinados y transportan alantofna, Acido alantoico o citrulina [320]. Ahora bien, cualquiera que sea el tipo de moléculas que se transporten, antes tiene lugar una asimilacidn primaria del amonio, que rinde 86 glutamina, por accién de la glutamina sintetasa (GS) y la glutamina 2:oxoglutarato aminotransterasa (GOGAT), también denominada glutamato sintasa [28,40]. El amonio es incorporado al carbono gamma del dcido glutamico, formdndose la amida correspondiente, la glutamina, en una reaccién dependiente de ATP y catalizada por la glutamina sintetasa: GS glutamato + NH*, + ATP --— glutamina + ADP + P, En apoyo de la intervencién de esta enzima estan los hechos siguientes: 1) utilizando ‘*N y °N, se ha demostrado que el amonio se incorpora rd4pidamente en forma de glutamina [230], y 2) esta incorporaci6n es bloqueada por un inhibidor especffico de la glutamina sintetasa, la metionina sulfomixina (MSO), que provoca un répido incremento en la concentracién de *NH,* en el nédulo [230]. El nitrégeno incorporado como grupo amida en la glutamina es seguidamente transferido al carbono 2 del Acido oxoglutdrico, para formar glutamato. Esta reaccién, dependiente de nucledtidos de piridina reducidos, es catalizada por la GOGAT [230]: GOGAT 2-oxoglutarato + glutamina + NAD(P)H + H* ------ — 2 glutamato + NAD(P)* La intervencién de esta enzima también se ha puesto de manifiesto mediante el empleo de “N y de inhibidores, en este caso, la azaserina que es un inhibidor de la reacciones de transferencia de grupos amida [255,368]. Las dos enzimas necesarias para esta asimilaci6n primaria del amonio han sido aisladas y purificadas del nédulo [27,56,134,229]. La GS se localiza exclusivamente en el citosol, mientras que la GOGAT estd tanto en el citosol como en plastos [11,30,328,329]. Ambas se inducen durante el desarrollo del néddulo [10,29,135,298,299,319]. Aunque la glutamina, el primer producto de la asimilacién del amenio, se encuentra normalmente en los exudados del xilema de las leguminosas productoras de amidas, no es, ni mucho menos, el compuesto mayoritario. Lo es la asparragina (4,190,204,340,385], compuesto mas soluble y metabdlica- mente menos activo que la glutamina. De las diversas vias metabélicas que existen en los vegetales Superiores para la sintesis de asparragina, se ha demostrado que la que opera en el ndédulo radical es la reacci6n catalizada por la asparragina sintetasa (AS), enzima que ha sido aislada y purificada de los extractos de nddulos de soja [167], requiere ATP y cataliza la siguiente reaccién [117]: AS glutamina + aspartato + ATP ----— asparragina + glutamato + AMP + PP. El Acido asp4rtico necesario para la anterior reaccién es generado por accién de la aspartato 87 aminotransferasa (AAT), que como se ha indicado se encuentra ampliamente distribuida en los nédulos radicales de las leguminosas [104.105] y cataliza la siguiente reacci6n reversible: AAT aspartato + 2-oxoglutarato <---> glutamato + oxalacetato En la leguminosa tropical Arachis hypogaea, se ha encontrado un aminodcido no proteico, la amida 4-metilénglutamina, que puede llegar a suponer hasta el 90 por ciento de los exudados del xilema [113,114]. El mecanismo de sfntesis de esta amida no esta claro, porque, si bien se ha aislado de los cotiledones de cacahuete una metilénglutamina sintetasa especffica [381], que cataliza una reacci6n similar a la de la glutamina sintétasa, pero utilizando metilénglutamina como aceptor y formando AMP y PP’; sin embargo, hasta ahora no ha sido posible aislar esta enzima de los nédulos de esta planta. En el otro grupo de leguminosas, los productos mayoritarios obtenidos como consecuencia de la actividad fijadora de dinitr6geno no son aminas, sino ureidos. Asf, en las especies de Alnus [239] y de Casuarina [374] el compuesto nitrogenado mds abundante en los ndédulos, en las raices, en los tallos, en las hojas y en el exudado del xilema es la cirulina, cuya procedencia del amonio asimilado en el proceso tijador se ha demostrado mediante la utilizacidn de °N y “CO,, que demuestran que ambos marcadores se incorporan rd4pidamente en citrulina, a una tasa muy similar a la de la fijacidn del dinitrégeno [118,225]. Se sabe muy poco sobre la sintesis de citrulina en los nédulos, pero en otros tejidos vegetales este ureido se forma normalmente mediante una reaccién entre el carbamil fosfato y la ornitina, que est4 catalizada por la ornitin carbamil transferasa (OCT): OCT carbamil tosfato + ornitina ----— citrulina + P; Ahora bien, como la ornitina se produce a partir del glutamato [351], la sfntesis de citrulina requiere un mecanismo anaplerotico que produzca a-cetoglutarato para la sintesis de glutamato. Esta via es la asimilacién del CO, por la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que produce oxalacetato. Este cetodcido entrarfa en el ciclo TCA-y produciria el cetoglutarato [225]. Por su parte, el carbamil fosfato se forma por accién de la carbamil fosfato sintetasa (CPS), que cataliza una reaccidn de asimilacién de CO,, que requiere ATP y glutamina como donador de nitrégeno, que en este caso procede del grupo amida [225]: CPS glutamina + ATP + CO, + H,O --— carbamil fosfato + glutamato + 2ADP + P, 88 Los otros dos ureidos detectados en el floema del segundo grupo de leguminosas, la alantofna y el Acido alantoico, son compuestos estructuralmente relacionados y se forman en una misma vfa bioqu{mica. Mothes [245] y Reinbothe y Mothes [289] propusieron que estos ureidos podrfan formarse por cualquiera de las dos vfas siguientes: 1) condensacién entre la urea y un compuesto de dos carbonos como el glioxilato o la glicina, y 2) catabolismo oxidativo de las purinas. Aunque el ultimo de estos autores sostenfa que la segunda de las vfas era altamente improbable, en Ia actualidad se tiene la certeza de que es precisamente éste el mecanismo de formaci6n de alantofna y 4cido alantoico en el nddulo radical, como consecuencia de las siguientes observaciones: 1) las enzimas del catabolismo de purinas (xantina dehidrogenasa, uricasa y alatoinasa) se encuentran en niveles muy elevados en los nédulos de Vigna unguiculata [7,8,10], Glycine max [115,116,319,348] y Phaseolus vulgaris (290,292,349 ,350], que son leguminosas transportadoras de ureidos; 2) normalmente, los niveles de estas enzimas son bajos en leguminosas exportadoras de amidas, como Lupinus luteus [290,292] y Pisum sativum [60]; 3) los niveles de estas enzimas aumentan cuando se dispara la fijacién as N,, la actividad asimilatoria de amonio y la exportacién de ureidos en el ndédulo [7,8, 10,292,319]; 4) la adicién de alopurinol, inhibidor irreversible de la xantina dehidrogenasa, tiene como consecuencias una disminucidén en los niveles de ureidos en el néddulo y en la salida de estos compuestos al xilema, asf como un incremento en los niveles nodulares de xantina [7,8,115,354], y 5) los extractos libres de células obtenidos a partir de nédulos convierten en ureidos intermediarios como la inosina monofostato (IMP), la xantina monofosfato (XMP), la xantina y la hipoxantina y también en este caso, el alopurinol inhibe esta conversién [354,386,387]. Aunque las purinas que dan lugar a los ureidos pueden proceder de la degradacién del ADN y el ARN, en los nédulos se sintetizan de novo en una vfa que implica la intervencién del fosforibosilpirofosfato (PRPP), la glutamina, el Acido aspartico, CO,, glicina, metenil tetrahidrofolato y formil tetrahidrofolato [9,10,290,292,321], dando como primer producto la inosina monofosfato, a partir de la cual se forman la alantoina y el Acido alantoico. La inosina monofosfato es convertida en xantina monofosfato por una reacci6n catalizada por la inosina monofosfato dehidrogenasa (IMPDH) [31,291]: IMPDH inosina monofosfato + NAD + H,O ----— xantina monofosfato + NADH + H~ Esta enzima ha sido aislada y purificada de los néddulos de Vigna unguiculata y tiene localizacién citosélica, si bien en los nédulos de Glycine max se encuentra en plastos [32]. A continuaci6n, la xantina monofosfato es convertida en xantosina por accién de una 5’ nucleotidasa y en xantina por accién de una nucleosidasa [32] y el siguiente paso es la oxidacién de la xantina hasta 89 Acido urico, por accién de la xantina dehidrogenasa (XDH), que también puede catalizar la oxidacién de la hipoxantina, intermediario en el catabolismo oxidativo de las purinas [144]: XDH hipoxantina + NAD + H,O ---— xantina + NADH + H* XDH xantina + NAD + H,O ---— 4cido trico + NADH + H* Por ultimo, el dcido urico es convertido en alantofna por la uricasa y ésta en Acido alantoico por la alantoinasa [144]: uricasa Acido urico + O, + H,O ----------- — alantofna + H,O, + CO, alantoinasa alantoina + H, --------- — 4cido alantoico. 6. El simbiosoma como organulo litico. ~Una funcién para el acido indol acético?. Para completar la visidn sobre el funcionamiento del ndédulo radical conviene reparar en la naturaleza del simbiosoma. Como es sabido, la endocitosis de bacterias Gram negativas por células eucaridticas suele terminar con la fusién el fagosoma y los lisosomas y la digestién de la bacteria. Ahora bien, se ha propuesto que cuando el fagosoma carece de receptores para el lisosoma se produce una endosimbiosis [53], que podria haber sido el punto de arranque del proceso endosimbidtico que condujo a la adquisicidn de las mitocondrias y los cloroplastos [53,379]. En el caso de la endosimbiosis fijadora de nitrégeno, ya se ha indicado que los bacteroides se encuentran encerrados en orgdnulos, simbiosomas, rodeados por una membrana cuya naturaleza no esta, en absoluto clara. Para algunos autores, la membrana peribacteroidea procede de la invaginacidn de la membrana citoplasmatica [18] con varias nodulinas ancladas a ella [272], pero para otros, esta interpretaciOn es discutible. Asi, Mellor y Werner [237] consideran al simbiosoma como un orgénulo temporal e independiente, recogiendo y ampliando la anterior sugerencia de Truchet y Coulomb [356] para los que los bacteroides habitan "fitolisosomas". Después de eso, se ha ido acumulando evidencia bioquimica que apoya la idea de que el simbiosoma es un orgd4nulo muy semejante a los lisosomas y, por consiguiente, con una funcidn Iftica. Las principales pruebas que apoyan esta idea son las derivadas de la comparacién de las protefnas peribacteroideas y las de los lisosomas. En el espacio peribacteroideo de diversas leguminosas existen a-manosidasa [235], enzima que suele ser considerada como un marcador vacuolar 90 [33], asf como proteasa 4cida [235], trealasa [189,232,241,311]. De estos datos se concluye que el simbiosoma y el lisosoma son orgdnulos similares [233]. Ahora bien, esta interpretacién plantea el problema de cémo el bacteroide resiste la accién de las enzimas Ifticas existentes en el simbiosoma y cémo la entrada del endosimbionte en el simbiosoma no termina con su digestidn como ocurre en el caso de otras bacterias Gram negativas cuando se encuentran en el tagolisosoma. En el caso de algunas estirpes, sobre todo mutantes fix, la microscopia electrénica revela que los bacteroides sufren una digestidn muy rdpida [15,378], lo que prueba que, para el establecimiento de una simbiosis estable, deben existir mecanismos para proteger a los bacteroides de los efectos del compartimento lftico en que se encuentran. Uno de ellos puede ser la existencia de inhibidores de proteasa, que son moléculas que controlan la proteolisis [201]. En los vegetales los inhibidores de proteasa se encuentran en vacuolas [373] 0 en determinados tipos de lisosomas como los cuerpos proteicos [161]. En el caso de los néddulos de soja se ha encontrado una protefna de 18-20 kDa que es inhibidor de la termolisina, una proteasa [121] y, dado que en los cotiledones se encuentra una proteina similar [121], no debe tratarse de una nodulina. Una caracterfstica que tienen los lisosomas es su acidez y también en esto, el simbiosoma y el lisosoma se asemejan. La acidez del primero es debida a varios factores. En primer lugar, al transporte de dcidos dicarboxflicos [388] y, en segundo lugar, por la accién de una ATPasa existente en la membrana peribacteroidea que provoca la entrada de protones hacia el simbiosoma [363]. Por otra parte, es sabido que los rizobios son bacterias muy poco tolerantes a la acidez [131,191,248]. Por consiguiente, los bacteroides han de poseer también mecanismos que contrarresten esta acidificaci6n continua del simbiosoma y que eviten que éste Ilegue a convertirse en un compartimento netamente litico [183]; uno puede ser el consumo de dicarboxilatos para la respiracién [35] y el otro, la excrecién de amonio procedente de la actividad de la nitrogenasa [36]. Es interesante detenerse un poco a considerar la funcidn de la ATPasa existente en la membrana peribacteroidea. Se trata de una enzima similar a la existente en la membrana citoplasmatica de las células del vegetal y su funcidn es la creacién de un gradiente de protones, importdndolos al simbiosoma con consumo de ATP, a tin de mantener a la membrana peribacteroidea en un estado energético que permita el paso de solutos a través de ella. Una funcién adicional serfa mantener la electroneutralidad durante el transporte de aniones comio el malato [363]. Si ello es asf la actividad de esta ATPasa puede resultar imprescindible para el mantenimiento de la simbiosis eficaz, y en ello podrfa resultar util la produccién de auxinas vegetales por parte del microsimbionte. Desde hace tiempo se sabe gue los rizobios producen simbidticamente dcido indol acético (AIA) y que éste se acumula en el ndédulo que tiene concentraciones de la auxina superiores a las detectables en 91 el resto de los tejidos [171]. Asfmismo, se ha comprobado que la produccién de AIA por los rizobios responde a los mismos inductores que los genes nod, responsables de la nodulacién [281]. Sin embargo, su papel en el establecimiento y funcionamiento de la simbiosis es incierto. Kaneshiro y Kwolek [182] aislaron mutantes de Bradyrhizobium hiperproductores de AIA que producen mayor numero de ndédulos que la estirpe silvestre y también se ha propuesto que la auxina revierte la acci6n inhibitoria de los nitratos sobre el crecimiento y la funcidn del ndédulo [330]. Nosotros planteamos una hipotesis alternativa, que est4 basada en la capacidad del AIA para provocar la excrecién de protones a través de las membranas de las células vegetales activando las ATPasas existentes en ellas [142,284,285] que ha dado origen a la denominada teorfa del crecimiento dcido [286]. El papel de la auxina en el funcionamiento de la simbiosis podrfa consistir en la activacién de la ATPasa de la membrana peribacteroidea para mantener el gradiente de protones a su través y la acidificacién del simbiosoma. En apoyo de esta idea est4 su capacidad para revertir la inhibici6n por nitratos, ya que éstos desacoplan la actividad de la mencionada ATPasa y el transporte de metabolitos al simbiosoma y por, ello, inhiben la fijacidn del nitr6geno [363]. La acidez del simbiosoma servirfa, a su vez, para mantener un gradiente de protones entre éste y el bacteroide incrementando la fuerza protén-motriz necesaria para la sintesis del ATP que soporta la actividad de la nitrogenasa. Sin embargo, para tener evidencia directa del papel del AIA en éste y otros aspectos de la simbiosis es imprescindible la obtencién de mutantes incapaces de producir la enzima, a fin de ensayar su comportamiento simbidtico. Estos mutantes son dificiles de obtener, debido a la via de produccidén de la auxina. En etecto, el AIA se produce como consecuencia de la oxidacién espontdnea del dcido indol piruvico producido en la desaminacién del triptéfano por accién de aminotransterasas especificas para aminodcidos aromaticos [269]. Por consiguiente, cualquier estrategia para obtener estos mutantes exige la obtencidn de estirpes carentes de estas transaminasas y ello se ve dificultado por el hecho de que, generalmente, los rizobios contienen mds de una de tales enzimas [194,269,270]. Nosotros disponemos de una estirpe de Bradyrhizobium (Chamaecytisus) que s6lo tiene una de estas transaminasas [138] y que, por ello, resulta muy apropiado para la obtencién de los mencionados mutantes AIA’. D. i.Por qué soélo las leguminosas? Como ya se ha indicado, los rizobios s6lo infectan a las leguminosas y cada estirpe bacteriana concreta lo hace a una gama también concreta de leguminosas hospedadoras, existiendo estirpes de gama amplia de hospedadores (pueden infectar a muchas plantas diferentes), o de gama estrecha (por el contrario, infectan un conjunto reducido de leguminosas) [389]. Durante mucho tiempo se ha especulado sobre las 92 bases moleculares de esta especificidad y pronto se supuso que era consecuencia de un intercambio de sefiales entre ambos miembros de la asociaci6n simbidtica. Sin embargo, hasta que no ha sido posible la manipulacién genética de los dos, no se ha podido tener una visi6n mds 0 menos clara de la secuencia de eventos iniciales que conducen a la infeccién [215] y actualmente se sabe que en este intercambio de sefales se encuentra la base de la especificidad, que est4 controlado por genes, tanto de la bacteria como de la leguminosa hospedadora. Esta libera una serie de compuestos que actian como sefiales para inducir la expresi6n coordinada de los genes bacterianos necesarios para la nodulacién. Estos genes, de los que se han identificado mds de cuarenta [338], reciben el nombre de genes nod y, como su numero es mayor que el de letras del alfabeto, reciben también el nombre de genes nol [310]. Estos genes codifican las enzimas necesarias para la sfntesis de los denominados factores Nod, que son oligosacdridos sustitufdos que provocan cambios morfoldgicos en la rafz de la planta y actian también como determinantes de la gama de hospedadores de un estirpe concreta de rizobio. En todas las especies de Rhizobium estudiadas hasta ahora, los genes nod se encuentran localizados en los plaésmidos simbidticos, mientras que en Bradyrhizobium y Azorhizobium, son de localizacién cromos6émica y en los tres casos, se encuentran agrupados en diferentes operones y se regulan de forma coordinada por el regulén nod [262]. El andlisis genético ha permitido dividirlos en tres _ genes nod comunes, genes nod especificos del hospedador (Asn), y genes nod especfficos del cultivar o del genotipo (CSN o GSN) [355]. 7.1. Genes nod comunes Los genes comunes de la nodulacién son un conjunto de genes nod que se encuentran estructural y funcionalmente muy conservados en la mayor parte de los rizobios estudiados, como se deduce de los estudios de secuenciacién de ADN [94,305,353], de mutagénesis con el trasposén TnS [80], andlisis de complementaci6n [69,110,163,175] y el andlisis de los productos génicos [84,94,318]. Estos estudios han permitido identiticar en Rhizobium, que es el género mejor estudiado en este sentido, tres conjuntos de estos genes comunes: los genes nodABC, que son esenciales para la curvatura del pelo radical y el comienzo de las divisiones celulares, los genes nod/J, que estan situados direccién abajo del gen nodC, y el gen regulador nodD, que precede a los anteriores y se transcribe en direccién opuesta a éstos [47]. Las mutaciones de los genes nodABC bloquean por completo la nodulacién y todas producen un fenotipo similar: las bacterias mutadas en cualquiera de estos genes casi no promueven curvatura del pelo radical (fenotipo Hac’) ni divisiones celulares [214]. Por su parte, las mutaciones en nodD dan el mismo fenotipo, pero ello se explica por la funcién reguladora que, como se vera, ejerce nodD sobre nodABC. Este papel 93 regulador del gen nodD se ve apoyado por el hecho de que a partir de su secuencia de nuclesdtidos se puede deducir que su producto en R. leguminosarum tiene homologfa con el dominio de unién al ADN de la protefna reguladora araC de E. coli [327]. Como han sugerido Wijffelman y col. [380], es probable que se trate de un "filtro molecular" que reconoce concentraciones de compuestos reguladores (activadores e inhibidores) liberados por una leguminosa concreta. El gen nodC codifica una protefna hidréfoba que, segtin se desprende de datos inmunolégicos y bioqufmicos, debe ser una protefna integral de la membrana implicada en el reconocimiento de sefiales en la misma [178]. La protefna NodA también debe localizarse en la membrana y se produce en pequenas cantidades en las células de R. meliloti [95]. Las mutaciones.en los genes nodlJ s6lo producen defectos marginales en el fenotipo de la nodulacién, que en R. trifolii pueden traducirse en un ligero retraso en la aparicién del ndédulo [262], una curvatura exagerada del pelo radical (fenotipo Hac+ +) [80] y en ocasiones a la formacién de tubos de infeccién cortos y abortivos [80]. En R. meliloti \as mutaciones en nodlJ provocan una proporcién anormalmente alta de pelos radicales curvados e infectados, que no afectan al numero de ndédulos; es mds, se ha comprobado que estas mutaciones retrasan la nodulacién [262]. El andlisis de la secuencia de ADN demuestra que la protefna del gen nod/ guarda una homologfa significativa con una familia de protefnas que ligan ATP e intervienen en diversos procesos de la biologfa de muchas bacterias [153], la mayor parte de las cuales se encuentran localizadas en la membrana citoplasmatica de Salmonella typhimurium y Escherichia coli y normalmente intervienen en el transporte activo de compuestos de bajo peso molecular como histidina, maltosa, oligopéptidos, fosfato y ribosa [153]. Por su parte, el producto del gen nodJ es una protefna hidrdéfoba y forma parte integral de la membrana [99]. 7.2. Genes nod especificos del hospedador Los genes nod que controlan la especificidad por el hospedador (antes denominados genes /sn) son los que controlan la especificidad de una bacteria por una leguminosa concreta. Estos genes se han identificado siguiendo dos criterios: por un lado, se trata de los genes que hay que introducir en una especie concreta de rizobio para hacerla infectiva en leguminosas que, normalmente, son infectadas sdlo por el rizobio donador y, por otro, son genes cuyas mutaciones alteran la gama de hospedadores de un rizobio y no pueden ser complementadas introduciendo los genes correspondientes (y, en ocasiones, con un alto grado de homologfa) procedentes de otra especie [78]. Con estos criterios se han caracterizado con detalle los genes nodFEGH de R. meliloti y nodFE de R. leguminosarum y R. trifolii. As{, por ejemplo, en R. trifolii las mutaciones en los genes nodFE tienen como consecuencia una alteracién de la gama de hospedadores: mientras que la estirpe silvestre infecta rapidamente diversas razas de trébol, los mutantes 94 nodFE nodulan muy débilmente al trébol blanco y al rojo [80] y, en contraste con la estirpe parental, infectan guisantes; aunque provocan la formacién de tubos de infeccién en el trébol subterrdneo, la infecci6n no culmina con la formacién de nédulos. Estos resultados indican que los genes nodFE controlan la especiticidad por el hospedador y son dominantes sobre otros genes nod especificos de hospedador. Demuestran, asimismo, que las plantas de trébol blanco impiden la nodulacién por los mutantes, y las de guisante impiden la infeccién por las estirpes silvestres (pero no por las mutantes) de R. trifolii. 7.3. Productos de los genes nod Los genes nod, tanto comunes como especfficos de hospedador, controlan la produccién de un tactor (denominado factor Nod) de naturaleza glicolipfdica que provoca la deformacidén del pelo radical y las divisiones celulares de la leguminosa compatible. El primero que se identificé fue el denominado factor NodRm-1! [211], que es un factor Nod producido por R. meliloti. Se trata de un tetrasacdrido de residuos de D-glucosamina unidas por enlace 8 (1-4), que estd sulfatado y tiene acetilados tres de los grupos amino. El extremo no reductor de la molécula contiene un dcido graso no saturado de 16 dtomos de carbono, y el extremo reductor, un grupo sulfato. Posteriormente, se han aislado otros toads factores Nod producidos por R. meliloti y otras especies de Rhizobium y Bradyrhizobium y se ha propuesto una nomenclatura uniforme para ellos [301]. Por ejemplo, el factor NodRm-1 ahora se denomina NodRm-IV(S). - Rm significa R. meliloti, 1V indica los cuatro residuos de glucosamina y S, el grupo sulfato localizado en el extremo reductor de la molécula. Los factores Nod de R./eguminosarum by viciae pueden ser tetra 0 penta glucosaminas, estdn acetilados y carecen de grupos sulfato; se designan como Rlv-IV(Ac) o Rlv- V(Ac). En R. meliloti se han detectado varios factores Nod; todos tienen una estructura bdsica similar a la de NodRm-1, pero algunos carecen de grupo sulfato [211], otros estén formados por cinco residuos de glucosamina [322] y otros por s6lo tres de estos residuos [322]. Al menos existen cinco factores Nod producidos por R. /eguminosarum y |a diferencia mds evidente con respecto a los producidos por R. meliloti es la carencia de grupos sulfato; los de R. /eguminosarum bv. viciae difieren de NodRm-1, ademas, en la longitud de la cadena carbonada existente en el extremo no reductor de la molécula: en este caso se trata de una cadena de 18 dtomos de carbono y contiene cuatro dobles enlaces [335]; ademas, en el extremo no reductor existe un grupo O-acetilo [335]. Las estirpes de Bradyrhizobium también segregan tactores Nod formados bdsicamente por glucosamina, pero que difieren de los de Rhizobium en la naturaleza de los Sustituyentes; por ejemplo, en el extremo reductor hay un residuo de S-o-metil-fucosa [156]. 95 Figura 5. Estructura general de un factor Nod.n representa el numero de residuos de glucosamina. El lipido localizado en el extremo de la molécula es tipico de los tactores Nod segregados por R. meliloti. Las flechas indican los papeles propuestos para cada gen nod. La sintesis de estos factores Nod est4 controlada por los genes nod. En la figura 5 se expone la estructura general de los factores Nod conocidos hasta ahora y el presunto papel de los diversos genes nod en su sintesis. Por ejemplo, nodC que, al parecer, tiene una secuencia similar a la del gen de la quitin sintasa de levaduras [156], controlarfa la unién por enlace 8(1-~4) entre los residuos de glucosamina, sintetizados bajo el control de nodM, cuya secuencia es homéloga con la del gen glmS de E. coli, que codifica la D-glucosamina sintetasa [12]. El producto de nodL acetilaria los residuos de glucosamina [83] y los genes nodEF controlarian la sintesis de dcido graso [162,327]. Cuando se tratan las raices de alfalfa con una preparacién purificada de cualquier factor NodRm provoca la deformacién de los pelos radicales a la concentracién 107'M, mientras que a una concentracién 10°’M estimula la divisién de las células corticales [358]. Sin embargo, las rafces de leguminosas que no son hospedadoras de R. meliloti como la arveja (Vicia sativa), no responden a la adicién de NodRm-1 a esas concentraciones, aunque sus pelos radicales se detorman cuando son tratadas con factores Nod de R. meliloti que carecen de grupo sulfato, como NodRm-2 [211], o con factores Nod de pentaglucosamina a la concentracién de 10° 0 10°M [322], lo que, a nuestro juicio, demuestra que los factores Nod tienen la capacidad de disparar de manera especitica los primeros estadios del proceso de nodulacién y que esta especificidad depende de la estructura y composicién quimica de cada factor. 96 7.4. Regulacién de los genes nod El unico gen nod que se expresa de manera constitutiva es nodD, que se encuentra en todos los rizobios investigados hasta ahora. En muchos casos existe una sola copia de este gen, pero en otros constituyen una familia multigénica [3,64,159]. Dado que los genes nodD de las diferentes especies de Rhizobium se diferencian en su respuesta a los exudados de los diversos hospedadores y se manifiestan de una manera especffica de especie [162,158] es probable que la presencia de diversos alelos nodD en una misma bacteria permita a ésta responder a los diversos inductores producidos por sus diversos hospedadores, haciendo de esta forma Optima su respuesta simbidtica [150,140,159]. Los demas genes nod s6lo se expresan en presencia de la leguminosa compatible o de sus exudados radicales, lo que indica que la planta produce moléculas que actian como sefnales para la induccidn de estos genes. La mayor parte de los operones nod inducibles estén precedidos por unas secuencias consenso de 47 pares de bases, altamente conservadas, que se denominan cajas nod [306] o cajas de nodulacién y son secuencias reguladoras en cis que coordinan la expresién de los operones nod. La protefna NodD se une, incluso en ausencia del inductor producido por la planta, a dos regiones de estas cajas nod [109] por medio del extremo amino terminal de la molécula, que est4é mucho mds conservada que la mitad carboxilo terminal [162,307], lo que implica que esta mitad desempefia funciones diversas, como, por ejemplo, el reconocimiento de inductores diferentes [43,44,162], mientras que la mitad amino terminal sirve para la uni6n al ADN [327]. Sin embargo, este resultado est4 sometido a controversia porque algunos trabajos con mutantes dobles [44] y con genes nodD quiméricos [336] sugieren que la parte carboxilo terminal también se une al ADN y que NodD no consta de dos dominios separados. La protefna se encuentra localizada en la membrana y ello sugiere que su extremo carboxilo terminal mira hacia la parte externa de la célula a fin de reconocer los inductores, mientras que el extremo amino tienen una !ocalizacién hacia el citoplasma y se encuentra unido a la caja nod. En R. meliloti se ha encontrado una protefna represora que acttia en trans, uniéndose a los promotores de nodD y disminuyendo de esta forma la cantidad de la protefna NoD disponible. De esta forma, en R. meliloti la transcripcién de los operones nod inducibles se encuentra sometida, tanto a control positivo, ejercido por inductores secretados por la leguminosa hospedadora, y negativo, ejercido por la proteina represora. En otras especies de Rhizobium o Bradyrhizobium no se han encontrado protefnas de este tipo. Con los datos que acabamos de describir, se han elaborado diversos modelos de regulacién de la expresi6n de los operones nod: la protefna NodD se une a la caja nod incluso en ausencia del inductor (esta unidn he sido demostrada in vitro pero atin no ha sido confirmada in vivo) y, después de unirse al inductor 97 producido por la leguminosa hospedadora, experimenta un cambio conformacional [79,196] que le permite activar la transcripcién. En el caso de R. meliloti esta activacién debe impedir la unidn de la proteina represora y promover el comienzo de la transcripcién coordinada del regulén nod por medio de la ARN polimerasa [196,306]. Sin embargo, queda pendiente la respuesta a varias Pee como, por ejemplo, mediante qué mecanismos se unen los inductores a NodD y cuales son las modificaciones estructurales que ello provoca, cémo es la unidn de NodD a la ARN polimerasa de la bacteria, 0 la posible funcién de NodD en estadios posteriores del desarrollo del nédulo. 7.5. Moléculas inductoras producidas por la planta hospedadora Como queda dicho, los genes nod inducibles s6lo se expresan en presencia de exudados radicales de la leguminosa compatible [70,215,389]. La ultima década ha estado dedicada, en parte, a la identificacién de los componentes de los exudados que ejercen esta acci6n inductora, para lo que ha sido de gran utilidad la utilizacidn de estirpes bacterianas que llevan la fusi6n nod-lacZ [79, 130,272,287]. Estos trabajos recibieron un fuerte impulso cuando se demostré que algunos compuestos fendlicos sencillos liberados por tejidos vegetales heridos inducen la expresi6n de los genes vir de Agrobacterium spp. [339]; por otra parte, desde antiguo es conocido que las rafces de los vegetales exudan flavonoides [217], pero este hecho habia pasado inadvertido porque no se concebia el modo en los microorganismos del suelo pudieran utilizar metabolitos producidos por otros seres vivos en cantidades traza [277]. Estos trabajos han conducido al descubrimiento de ciertos compuestos de los exudados radicales como inductores de los genes nod. En las simbiosis de climas templados, como alfalfa/R. meliloti, guisante/R. leguminosarum y trébol/R. trifolii, los inductores son flavonas, flavonoles y flavanonas sustituidas [108,271,287], asf como chalconas [276], y en la simbiosis entre soja y Bradyrhizobium, isoflavonas sustituidas [197]. A trate ce an OO OO lsoflavonas Flavonas Flavanonas 98 El hecho de que estos compuestos puedan ser aislados a partir de las semillas, pldntulas en cultivo axénico 0 rafces indica que no es necesaria una sefial bacteriana para la induccidén de la produccidn de tlavonas 0 isoflavonas. De hecho, estos compuestos se sintetizan como productos de la via central de los tenilpropanoides existente en las plantas [146], son liberados al medio independientemente de su capacidad inductora de los genes nod de la estirpe de rizobio especffica, y su naturaleza y la cantidad en que son producidos depende de la planta [141,271,275,302,390] y de su estado de desarrollo [148]. En los casos de la alfalfa, la judfa o la soja, la gama de flavonoides exudados por las rafces es diferente de la de los que son producidos por las semillas [132,149,150,169,170,271]. Los flavonoides son liberados por la planta en torma de agliconas o de derivados glicosilados de baja actividad pero muy solubles [150,223] que son convertidos en la forma activa por accién de glicosidasas bacterianas [71]. Las sustancias inductoras son muy potentes y ejercen su acci6n a concentraciones del orden nanomolar y se consigue una induccién total a concentraciones comprendidas entre 10° y 5x10°M [391]. Con fines comparativos, se puede citar que los inductores de los operones del metabolismo de la lactosa y de la arabinosa actuan a concentraciones superiores en tres a cinco 6rdenes de magnitud [262]. Los diversos flavonoides producidos por la planta ejercen diferentes acciones sobre los genes nod. Asf, en algunos casos, flavonoides que carecen de actividad inductora son inhibidores de la senuaciiel por parte de inductores eficaces [79,108,141,198,272]. Por regla general, los anti-inductores tienen la misma estructura que los inductores y la inhibicidn puede compensarse mediante la adicién de concentraciones crecientes de éstos [272], por lo que pueden ser considerados con inhibidores competitivos [71], algunos de los cuales son también especificos y s6lo actuian sobre estirpes bacterianas que son activadas por inductores producidos por leguminosas pertenecientes al mismo grupo de inoculacién cruzada [198]. Por contra, también se ha detectado un efecto sinérgico entre flavonoides producidos por la misma planta [148,149,150] pero ello puede ser explicado teniendo en cuenta que en algunas especies existen varios alelos del gen nodD, de torma que un conjunto de varios de estos genes interactuando con diferentes inductores, tendrfa mayor actividad que uno solo [71]. Hasta hace relativamente poco tiempo, s6lo se habfa podido detectar la capacidad de las plantulas (o las semillas) de las leguminosas para producir los flavonoides inductores o antiinductores bajo condiciones controladas del laboratorio, pero no se habfa detectado su presencia real en los ecosistemas naturales donde se supone que deben actuar. Recientemente, uno de nosotros [206] ha podido aislar de la rizostera de altalfa la formononetina-7-O-glucésido, que activa las proteinas NodD1 y NodD2 de R. meliloti. Los tlavonoides también pueden influir en los rizobios del suelo por mecanismos diferentes de la activacién de los operones nod. As{f, aunque Rhizobium y Bradyrhizobium son atrafdos por compuestos 99 tendlicos que son nutrientes potenciales para estas bacterias [264,273], esta atraccién también la ejercen, a muy baja concentracién, compuestos como los flavonoides que pueden no tener valor como nutrientes [1,5,46,185]. En el caso de R. meliloti, 1a capacidad quimiotdctica de los tlavonoides est4 estrechamente relacionada con su capacidad inductora y requiere la existencia de los genes nodD y nodABC activos [46]; por su parte, en R. leguminosarum y R. phaseoli esta correlacién es menos evidente y la quimiotaxis es independiente de los genes nod [1,5]. Un hecho interesante es que el crecimiento de R. meliloti en medios minimos se estimula fuertemente (el tiempo de duplicacién se reduce a la quinta parte) cuando se afaden al medio a concentraciones micromolares luteolina u otros flavonoides producidos por el hospedador, con independencia de que sean o no inductores de los operones nod [148]. El mecanismo de esta estimulacién del crecimiento es desconocido, pero, junto con la respuesta quimiotdctica puede contribuir a mantener una poblacidn elevada de la bacteria especifica en la rizosfera de la leguminosa. 8. Aplicaciones agricolas Siendo las leguminosas uno de los grupos vegetales que contiene un mayor numero de especies de interés para la nutricién humana y animal, no es de extrafiar que, coincidiendo con el creciente interés cientftico por la fijacién simbictica del nitrégeno, se haya centrado la atenci6n en los aspectos aplicados de la simbiosis entre estas plantas y las bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium. Ya hemos indicado cémo el empleo de leguminosas, junto con el de los cereales, en agricultura se remonta a los tiempos mds antiguos y cémo desde hace mucho tiempo se tiene conciencia del efecto beneticioso de la rotaci6n de cultivos para el rendimiento de las cosechas. Por ello, esta prdctica se ha extendido y en la actualidad puede ser considerada como habitual en la agricultura de la mayor parte de los pafses. Se tienen la tendencia a considerar a las leguminosas exclusivamente como fuente de alimentos. Si bien es verdad que son aprovechadas como forrajeras, y para la obtencién de aceites y de granos para la alimentacién humana y animal, no debe olvidarse que también son utiles para otros fines. Asi, pueden ser utilizadas para la tertilizacién de pastizales, como abono verde, como plantas madereras y en silvicultura. El] denominado abono verde es la torma de utilizacién que, en teorfa, produce mas beneficios para el terreno. Consiste en enterrar el cultivo de leguminosa al final de su ciclo de crecimiento y se trata de una técnica de abonado muy frecuente en los pafses tropicales y subtropicales, en los que la posibilidad de cultivar plantas en cualquier época del ano facilita la introduccién de abonos verdes en el intervalo que media entre los cultivos mds importantes, como el arroz, la cafia de azticar y otros [324]. Las leguminosas arbéreas, como, por ejemplo, las del género Acacia, son utilizadas para la obtencién de madera y, en silvicultura, también se ha demostrado la conveniencia de introducir leguminosas en las plantaciones de otros 4rboles. Por ejemplo, 100 Haynes y col., [151] describen un experimento muy interesante que consistié en introducir diversas especies de los géneros Trifolium y Vicia en plantaciones de Platanus occidentalis de tres afios de edad. Cinco afos después, la altura, el didmetro y el {ndice volumétrico de los a4rboles eran significativamente mayores que los de plantaciones control en las que no se habfan introducido leguminosas. En el caso de los 4rboles cultivados conjuntamente con Trifolium subterraneum, el indice volumétrico quintuplicaba al de los 4rboles control. En Nueva Zelanda se ha introducido Lupinus arboreus en plantaciones de pino Monterey que se localizan en terrenos arenosos y muy improductivos; con ello se ha logrado disminuir la dependencia de estas plantaciones de abonos artificiales [119]. Ahora bien, aunque en condiciones naturales, las leguminosas pueden estar bien noduladas por estirpes de rizobios existentes en los suelos, las prdcticas agrfcolas tales como la introduccién de monocultivos 0 la aplicacién incontrolada de fertilizantes, de herbicidas y de pesticidas, pueden alterar la composicidn de la biota del suelo y provocar una pérdida de infectividad de los mismos. Por ello, salvo que se conozca la existencia previa de la estirpe de rizobio adecuada para la leguminosa que se desea cultivar, suele ser necesario introducir en el suelo la estirpe bacteriana especifica, no sdlo la primera vez, sino en ocasiones durante varios anos, a fin de lograr que se estabilice una poblacién adecuada de la misma. Esta introduccién puede hacerse inoculando directamente el suelo, o bien, inoculando las iscaisation antes de la siembra. generalmente, resulta mds facil y es mds eficaz inocular las semillas, lo que suele hacerse bandndolas en una suspensiOn del indculo (aproximadamente, 4 g por kg de semillas) en algun Ifquido adhesivo, como, por ejemplo, goma ardbiga. Una vez secas, se puede proceder a la siembra. En muchos casos esta técnica es util no s6lo porque asegura una inoculacién uniforme de cada semilla, sino porque al humedecerla, favorece la germinacién. Sin embargo, en otros casos puede no ser de tanta utilidad: en ocasiones las semillas deben ser tratadas con fungicidas que resultan t6xicos para la bacteria; en otras veces, la semilla puede ser demasiado frdgil (como la del cacahuete) para soportar el tratamiento o de tamafo demasiado pequenio (como en muchas especies de Trifolium) para conseguir en cada una de ellas un nimero de bacterias suticiente para asegurar una nodulaci6n eticaz, y a veces, como en los casos de la soja y el altramuz, la envoltura de la semilla se separa de ésta en una etapa muy temprana de la germinacién reduciendo la probabilidad de contacto de la bacteria con la nueva raiz. En estos casos puede ser mas util introducir el inoculante directamente en el suelo, inoculando una zona htimeda interna, que est4 por debajo de la superficie seca sobre la que se dispone la semilla. Cuando ésta germina, la rafz entra en contacto con la zona densamente poblada por los rizobios introducidos en las capas inferiores del suelo. Es evidente que debe hacerse una cuidadosa seleccién de la estirpe de rizobio que se utiliza como inoculante. Es claro que esta estirpe debe ser capaz de infectar a la leguminosa en cuesti6n, pero, como regla general, debe hacerlo bajo una amplia gama de condiciones ambientales (acidez, salinidad, carencia 101 de agua, presencia de pesticidas, etcétera). Pero, ademas, debe ser capaz de competir con otras estirpes de Rhizobium o Bradyrhizobium que pudieran existir en el suelo y limitar la nodulacién por la estirpe utilizada como inoculante. También son importantes factores bioldgicos del suelo, como la presencia de otros microorganismos, especialmente las micorrizas, ya que se ha demostrado que la simbiosis triple leguminosa- ° rizobio-micorriza aumenta la nodulacion y la tasa de fijaci6n de nitrégeno, sobre todo en suelos pobres en tésforo [14]. En general, se recomienda aumentar el cultivo de leguminosas con el fin de disponer de un adecuado suministro de alimentos proteicos. En efecto, aunque no hay una consenso general sobre la cantidad de proteina adecuada en la dieta humana, se estime que debe rondar los 70 gramos diarios, pero, lamentablemente, una parte importante de la poblacidn est4é muy por debajo de este consumo diario e, incluso, por debajo de los 36 g diarios que recomendaron en 1.973 la FAO y la OMS como mfnimo absoluto para una persona de 65 kg de peso [119]. Admitiendo que la poblacién mundial actual est4 en torno a 5.200 millones (datos de 1.990), la produccién global de proteina debe ser de 1,3 x 10* toneladas al ano. Esta cantidad se supera cada ano [268], lo que sugiere que, en teoria, se produce suficiente protefna para alimentar a la poblacién mundial. El problema, por un lado, radica en el reparto desigual de esta produccién. Asf, mientras en los paises industrializados de Europa Occidental y Norteamérica hay una superproduccién de alimentos proteicos, en los pafses subdesarrollados un elevado porcentaje de la poblacién pasa hambre. Otro problema es que el mero dato de consumo de proteina por habitante no es Suficiente, ya que no tiene en cuenta la composicién en aminodcidos de las diferentes protefnas. Asf, por ejemplo, la protefna de trigo es deficiente en lisina, mientras que la de las leguminosas lo es en metionina. Por consiguiente, las necesidades nutricionales del hombre se satisfacen mejor con una dieta proteica compuesta por una mezcla de cereales y leguminosas que por cualquiera de los dos tipos de vegetales. Teniendo en cuenta éstas y otras consideraciones, Hardy [147] ha propuesto duplicar hasta 2,6 x 10° toneladas al afio la produccién de cereales y cuadruplicar hasta 50 x 10° toneladas la de leguminosas. Sin embargo, el incremento del cultivo de leguminosas y su introduccién en nuevos paises tropieza con algunos obstaculos. Algunos de ellos son de naturaleza cultural. Muchas sociedades no tienen el hdbito de cultivar y de consumir leguminosas y se resisten a adoptarlas como alimento bdsico. La idea, muy extendida en la sociedad occidental, de que las leguminosas son un alimento reservado a los menos pudientes ha determinado en gran medida la preferencia por la carne o el pescado como suplemento proteico a la dieta bdsica de cereales. El otro problema es de fndole prdctica y econémica y deriva del hecho de que un aumento en la tasa de fijaci6n de nitrégeno en un suelo lleva aparejado un incremento en el consumo de otros elementos como potasio, fésforo, calcio y azutre que hay que aportar si no se encuentran en cantidad suticiente para un rendimiento 6ptimo de las cosechas. También pueden convertirse en factores limitantes 102 el molibdeno, como parte constitutiva de la nitrogenasa, y el cobalto, constituyente de la leghemoglobina. En determinados suelos deficientes en estos elementos habr4 de contemplarse la necesidad de su adicién. La clave para un uso mas eficaz de las leguminosas es la formacién del agricultor, que incluye una explicaci6n racional de las ventajas de la rotacién de cultivos, la inconveniencia de un aporte excesivo de abonos nitrogenados, la necesidad de lograr una infeccién eficaz, lo que implica introducir bacterias (la estirpe de Rhizobium o de Bradyrhizobium adecuada) en el suelo, bien directamente, bien inoculando las semillas y, por supuesto, sobre una adecuada comercializacién de sus cosechas [119]. Ahora bien, debe tenerse en cuenta que las finalidades del aumento de produccién de las cosechas son diferentes segun el drea geogrdtica que se considere. En los paises avanzados, en los que el problema es de superproduccidén de alimentos, la explotaci6n de la fijacién de nitrégeno servirfa, si acaso, para disminuir los costos de las cosechas. Sin embargo, en los pafses en vias de desarrollo 0 sub-desarrollados la situacién econdémica es muy diferente: existe en ellos un claro déficit en alimentos proteicos y la utilizacién de abonos nitrogenados eficaces es diffcil porque en muchos de ellos no existe una industria quimica local y la importacién de abonos es tan dificil y tan cara como la de alimentos. En esta situaci6n, la explotacién de plantas fijadoras de nitrégeno puede ser una necesidad imperiosa, pero teniendo en cuenta, como senala Halliday [143], que el uso de las leguminosas debe llegar a ser um complemento a la utilizacién de abonos nitrogenados para el cultivo de cereales, pero nunca llegar a sustituirla por completo. 2. Consideraciones finales y perspectivas La simbiosis entre los rizobios y las leguminosas se ha convertido en el paradigma de las interacciones entre los microorganismos y las plantas, debido sobre todo al enorme esfuerzo investigador que ha concitado, desde las investigaciones agronémicas hasta la biologia molecular y se trata de un drea de en la que coinciden como en pocas los aspectos de investigacién llamada b4sica y aplicada. Una de las cuestiones mds interesantes que pueden ser abordadas es la relativa al significado de la simbiosis. Suele considerarse como evidente que la simbiosis entre los rizobios y las leguminosas es una relacidn mutualista en la que ambos elementos obtienen beneficio. En el caso de la leguminosa hospedadora el beneticio es claro: tiene un aporte directo de nitrégeno que le permite vivir en suelos deficiente en formas combinadas de este elemento. Sin embargo, en el caso del elemento bacteriano de la asociacidn el beneticio es notablemente mds dudoso. En efecto, como queda dicho, los rizobios se diferencian a bacteroides para lograr una simbiosis eficaz y ésta es una forma bacteriana que puede ser considerada “a término". Realmente, est4 sometido a controversia si la diferenciacién a bacteroide es o no reversible [2,359], pero parece confirmarse que séla es posible en medios especificos [345,359] y, por ello, resulta 103 improbable que sea signiticativa en los ambientes naturales y es mds probable que sean destruidos durante la senescencia del ndédulo [261], cuando el simbiosoma adquiere su cardcter Iftico. Por consiguiente, se plantea la aparente paradoja de que en el curso de la evolucién se haya mantenido un genotipo (el que determina la capacidad para infectar a las leguminosas) que resulta letal para la bacteria, ya que los bacteroides no contribuyen a las generaciones posteriores. ~Cudl es, entonces, el beneficio que obtiene la bacteria al establecer la relacidn simbidtica?. Crecientemente va avanzando la idea de que se trata de un caso de “altruismo" en el que los bacteroides se sacrifican durante la degradacién del nédulo, pero bacterias iguales, que permanecen sin diferenciar en el interior del nddulo o en el tubo de infeccidn encuentran un habitat en el que se aseguran un aporte de nutrientes superior al existente en la rizostera a la que son liberadas cuando termina la vida del nddulo, asegurando de esta manera la pervivencia de la estirpe en un suelo determinado [176]. En los ultimos anos ha avanzado considerablemente nuestro conocimiento sobre los aspectos bdsicos de la simbiosis, pero aun quedan muchas cuestiones por resolver, casi todas relacionadas con el intercambios de senales, es decir, la "conversacién inteligente" [256] que mantienen la bacteria y la planta hospedadora. Por citar algunas, las mds importantes serfan: 1) ¢Cudl es el mecanismo de activacién de la protefna NodD que, a su vez, activa la transcripci6n de los operones nod?. 2) ¢Cémo interactua la protefna Nod moditicada con la ARN polimerasa de la bacteria. a fin de lograr dicha activacién?. 3) ~Mediante qué mecanismos el factor Nod especifico desencadena tres procesos morfogenéticos (curvatura del pelo radical, crecimiento del tubo de infeccidn e induccidn de la divisidn celular) aparentemente diferentes?. 4) ;Son necesarias otras moléculas sefial, ademas de los factores Nod, para culminar el proceso de diferenciacién del néddulo?. 5) (Es el dcido indo] _ eels 7 gt te pay en eel alas Pues tops le ee ey Sewer "ss «£2 Seiten DLA anaien ae hirenap hal (eB - oemmninarae A. §., RUA, 2 TAA mets AMA, YAMAMOTO. oer | THOMAS, 2% PTE DI AR NL: ot Alig Lane Lehn & WOM AS. rs DSRaLPrn' Le To 1, (aplemineiiay, 20, h-aT7 ve } 14 f =) > a THORN LE Re te Le , J | a 7021. on ‘Mottatere, tat eT o ee a a! Ai oat. a's Bea. @ Pa a PORK... CONDOR t,- 4TiecowtEn 9 poeta j y KENDRA stecatil ROK? By i4, er | a i lé iw TRPLETY. £.W., EVs, 0.7.4 RANDALS, 0.0. AOR), ee ee ee rae .* FIVTLTT TW. FEACDOWSRY, M = (t 999)) ceed Ree Mincten ,. O6 anes, * e f » rH MED, #. (tL S284; bh: Wires, Bie oh; 04-97 irowy LOoPQuicr. *. V¥ew 1, CAML ira 6 WLI ‘ff , Peek, AP : ” 1, Raye. 1S) ple aD 2 '¢ - 4 3 LATS ¢. ; 4 $y 7) . i _ oryt Wa wedabt 4, eiuasa > _ ‘ uJ fie AT). «tim 1. €3 3a 05 Ten; re) Lon, “i @ wl * ih) } , ‘ ween 4 & 2 Wi ; o£; Gis re “ral bd nvr? Aes wa Heely, be é ‘ ‘ se ‘eit r ) Ge ve rer A y a4 ‘ eo, bef 1% i @. are? , , . ‘ ° a sae g : 7 'e TY arf 94, 72h _ har. 14°)) 00 ape ee aa cc? if HAYS i. pee HONS Lat by 15 DAS rv ") Mak en)-e4 nda ate ’ ot ae ee. "~ ee ts he irhe’ry!. Povevée (7 &. eri ¢S.8) Cam, 7 ¢ ht a bY ’ j ; tin BPM AMES : 1 GOS. oi “i io j beta ox tL we vei Win). Oe: 43: S73. & ean wu _t. Se ee b, Pigesi Pipers mm, Ore el. = DT PR Gi); Paes Jist.. Ot, hi =. : ere Lae : atl Hives et. i. 37.344 > Se | | mh ai, t ‘ 1 on», bia nay. oa TY te ‘ A F} : Cr CASA AG. 4:4 ACEC Lm eet am. PLS : i 7 at. 5 arsii ca Gh eo UAT? Wan, ¢ “) @Ods ie 1S + ra = mFRaL A i Pent i Tracie, 2h NO al beARe cucwe!gur ties tages. of ata whe Be nahrwts ity ba se Actos ce la Beal Bor i extact Boontmlca Be apres foi- Pals a =" ad : 6 ian; Oecacce dé Yacultéded UWiverattatias, Wirectores + tas EG; Beadbiemerte cadiso por zu Oireuesr, Presides «| Eyres. Or. tert NGcaca Nagek. Cali), aceagasted’ oe b>e- - ay ’ Profeéalonales + pareondlidades de atreaes Coccer® 7, = h - % i ’ ? pecteas por ©) lind. -Gr\ Secretaciz tir. Breese Pvess Meise Corrésghondienté si aso 1943, ef \f* Delel hiiva, ibeeA ick Gite te mM Ew A ) ree) srieo: Bt: : ) ; ols ay ANAC ‘5 Ve OT ‘¢ » + 2 ice Ge ben 7 (an a 7 ar 8 ecadar sti Ch i Ge Les Paine« cs ‘ : reeasicente ca a > « - es \ ; Atsad Retjtor ¢e ia ‘ read ‘ fT s aad We iz Wenta tie %oe+ecs ic a Are J . Sa Uvieron preaantas auses a ~ o | a he F< > is = Ae =| oy NIM RD H as i? b 1 Las actividades de la Academia comenzaron con la solemne apertura de curso que tuvo lugar el aia uno de Febrero en el Sal6én de Actos de la Real Sociedad Econémica de Amigos del Pais de Tenerife, amablemente cedido por su Director. Presidi6é el acto el Excmo. Sr. Don Nadcere Hayek Calil, acompanado de Pre- sidentes, Decanos de Facultades Universitarias, Directores de Colegios Profesionales y personalidades de otras Corporaciones. Tras la lectura por el Ilmo. Sr. Secretario Dr. Bret6én Funes, de la Memoria correspondiente al ano 1992, el Excmo. Sr. Don Julio Pérez Silva, Catedrdatico Emérito de la Universidad de Sevilla y Premio Canarias de Investigacién, pronuncié la confe- rencia inaugural titulada Enigmas en la evolucién del hombre ". Aparte de la leccién antes citada, los Ilmos. Sres. Aca- démicos Don Angel Gutiérrez Navarro y Don Manuel Vazquez Abe- ledo, impartieron sendas conferencias tituladas " La fijaci6én Simbiédtica del nitrdégeno: un modelo de investigaci6n pura y a- plicada " (octubre de 1993), y " Variaciones de la luminosidad solar " (noviembre de 1993), respectivamente. La Academia se vi6é enriquecida con la incorporacidén de tres nuevos académicos numerarios, los Dres. Don Bonifacio Ni- colas Diaz Chico, Don Juan Ortega Saavedra y Don José Regidor Garcia. Las solemnes sesiones académicas que tuvieron lugar en la ciudad de Las Palmas de Gran. Canaria, fueron presididas por el Excmo. Sr. Presidente de la Academia acompafiado por el Excmo. y Magfco. Sr. Rector de la Universidad de Las Palmas, y con la asistencia de la Junta de Gobierno de la Academia desplazada a tal evento. Estuvieron presentes numerosas personalidades de la 119 cultura, docencia e investigacidn. La sesi6én correspondiente a la toma de posesi6én del Dr. Diaz Chico, catedratico de la Universidad de Las Palmas, tuvo lugar en el Saldén de Actos de la Casa de Col6én el 30 de Junio de 1993. En su discurso de ingreso desarrolldé el tema Regula- cién multihormonal de proteinas hepaticas ". Fué contestado por el Académico de N&imero Don Angel Gutiérrez Navarro. Las de los Dres. Don Juan Ortega y Don José Regidor, cate- draticos de la Universidad de Las Palmas, tuvieron lugar el 14 y 15 de Diciembre de 1993, respectivamente, y se celebraron en el Salén de Actos de la Real Sociedad Econémica de Amigos del Pais de Las Palmas. El Dr. Ortega expuso el tema " Estudios b4asi- cos sobre fluidos y mezclas fluidas a bajas presiones ", y fué replicado por el Académico Dr. Don Francisco Garcia Montelongo. El Dr. Regidor en su conferencia de ingreso desarroll6é el tema titulado " La década del cerebro ", respondiéndole el Académico Don Juan José Bacallado Aranega. La Academia Canaria de Ciencias hizo constar su agradecimiento a las autoridades de las que de- penden los salones de actos utilizados en las sesiones académi- cas anteriormente mencionadas. También, y previos los tramites estatutarios pertinentes, la Junta General de la Academia tom6é el acuerdo de nombrar Acadé- micos Correspondientes a los Excmos. Sres. Don Julio Pérez Silva, Premio Canarias de Investigaci6én, y Don Luis A. Santal6é y-Sors (residente en Buenos Aires), Premio Principe de Asturias de In- vestigacién, en atencién a los relevantes méritos que en ellos concurren. 120 La Junta General Ordinaria se reuni6é una vez en el trans- curso del ano, conforme a lo dispuesto en los Estatutos de la A- cademia, mientras que la de Gobierno lo hizo dos veces. Se tra- taron diversos asuntos. Conviene destacar el concerniente a la confeccién de un pergamino alusivo a la conmemoraci6én del segun- do bicentenario de la fundacién de la Universidad de La Laguna, que fué entregado por una Comisi6én de la Junta de Gobierno a la Magfca. y Excma. Sra. Rectora en su despacho. En relaci6én con el premio anual de investigaci6én cientifica que concede la Academia, se acord6 modificar las bases por las que se rige, con el objeto de hacerlo mas flexible, asi como también aumentar su cuantia has- ta 500.000,- pesetas. El correspondiente al ano que comentamos, disciplina de Fisica, fué declarado desierto. Aparte de los actos que se han indicado, la Academia ha par- ticipado en la organizaci6én de los siguientes: Congreso de la Sociedad Espanola de Fijacién del Nitrdégeno, celebrado en colaboraci6én con el Departamento de Microbiologia y Biologia Celular de la Universidad de La Laguna. Mayo de 1993 en Santa Cruz de Tenerife. Congreso Nacional de Enologia, patrocinado por la Asocia- ci6n Canaria de Enélogos. Junio de 1993 en Los Realejos (Tenerife). XXXV Simposium organizado por la International Asociation for Vegetation Science - Isla Alta y Montafhias, Biodiversidad, Bioclima y Conservaci6én -, en colaboraci6n con el Departamento de Biologia Vegetal (Botanica) de la Universidad de La Laguna. Abril de 1993 en Santa Cruz de Tenerife. Simposium de Botanica CriptogAmica, organizado por el Depar- 121 tamento de Biologia Vegetal (Botanica). Septiembre de 1993 en Santa Cruz de Tenerife. Seminario de Analisis Matematico, impartido por el Profesor H. M. Srivastava, Profesor de la Universidad de Victoria (Cana- d&) y organizado por el Departamento de Analisis Matem&tico de la Universidad de La Laguna. Febrero de 1993 en La Laguna. V Congreso de la Asociaci6én Espafiola de investigaci6én sobre el cancer, organizado por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Septiembre de 1993 en Las Palmas. Conferencia del Profesor Alain Verschoren de la Universidad de Amberes sobre Algoritmos genéticos y Arboles. Facultad de Ma- tematicas de la Universidad de La Laguna. Noviembre de 1993. Conferencia del Profesor Sheiam Abyankar de la Universidad de Purdue (U.S.A.) ‘sobre A glance of algebraic geometry. Depar- tamento de Matematica Fundamental de la Universidad de La Lagu- na. Mayo de 1993. Conferencia del Profesor Oleg Milstein de la Universidad de G6ttingen (Alemania Federal) titulada Aepe ede ieee of lignin biodegradation for technological purpose. Departamento de Micro- biologia y Biologia Celular de la Universidad de La Laguna. Di- Cciembre de 1993. Ha aparecido, a su debido tiempo, el volumen IV de la Revis- ta de la Academia Canaria de Ciencias que en este ano consta de dos fasciculos dedicados a las sesiones de MatemAticas y Fisica, el primero, y a las de Quimica y Biologia, el segundo. Ya se ha- lla distribuido en gran parte. Contintia manteniendo su gran cali- dad. 122 En otro orden de actividades, el Excmo. Sr. Presidente de la Academia represent6é a esta Corporaci6én en el ya mencionado V Congreso de la Asociaci6én Espanola de investigaci6én sobre el cancer, celebrado en el pasado mes de Septiembre en la ciudad de Las Palmas. Asimismo fué invitado a una reuni6én organizada por el Instituto de Espana, celebrada en Madrid en el mes de diciembre de 1993, a la que asistieron todos los presidentes de Academias Asociadas al mencionado Instituto. En ella present6 una Memoria relacionada con las actividades de nuestra Corpora- ci6dén. 123 “1 Shnsah er ees 7 iserc se. BePulgary = Ms ioes on LA% Rilnee - oe a” - * 1" xy : —— i \Forencia. du! Mufaede’ Ala ty: Wersoh ehoten: ee 8 ia) wDaEres 3 ¢ Aigots tava’ genbtiods ¥ eh dey Poidales n= Ce ° ,Ver~g24ag ce La’ USiruna. = renbeg oe ia ‘dul Profeaor-Shavaii novia’ rm is Pe i ; 7 j +? = > i £ AACea “af @ ie aabts a : eeenbetel e ey. y ” . emitica Fundamental én ta ieee Rida de a Ta f res os ie 7 | age = r i” sack! OleeMiletein de ia oni ecate aa ie : ‘ ; Tederca) ticuvieads Noelia at Lens of a L ‘ é l plrpace. Departemeses Ze. - Tor a id Ge a. 4 unas \e a PP 4 exide tseung rlwian ae det os es. ; encias wie e& u ote ‘fia eal: ¢o é ‘ ~~ a a = <= 2 = pelts ria, ¥ Pt -de Witales ¢ Atoiegia, @i eepunda. see 43 sf mean. patte. Ci -‘ » is > - ; < , Ep. : O unl wey Acad .CanarJC1enes asc vi tne 649 28 25-152 (1993) LUGARES DE UNION DE BAJA AFINIDAD PARA GLUCOCORTICOIDES: UN MODELO PARA EL ESTUDIO DE LA REGULACION MULTIHORMONAL DE PROTEINAS MICROSOMALES HEPATICAS Discurso leido por el Académico-Electo Ilmo Sr. Dr. BONIFACIO NICOLAS DIAZ CHICO en el acto de su recepci6n el dia 30 de Junio de 1993 DISCURSO DE CONTESTACION por el Académico Numerario Ilmo Sr. Dr. ANGEL GUTIERREZ NAVARRO @HCIODL me | aa ciieenee ASAT € ad IJAMOMAOHITIUM: 2A TATE 2ALAMO2OSOIM oteelt-coimbbaod fo s0q obial oral, . es OOIMD SAIG ZA1O91 OMATIMO Ad 2 Gl” FOV! 5b oinul ob OF 2th [9 NGOG9997 Oe ae G : OASAVAY SHARAITYD JAOMA 20 wom LUGARES DE UNION DE BAJA AFINIDAD PARA GLUCOCORTICOIDES: UN MODELO PARA EL ESTUDIO DE LA REGULACION MULTIHORMONAL DE PROTEINAS MICROSOMALES HEPATICAS Discurso de ingreso en la Academia del DR. BONIFACIO NICOLAS DIAZ CHICO RESUMEN Muchas proteinas hepdaticas estan sometidas a control multihormonal. Esto crea grandes dificultades a la hora de comprender la importancia relativa de cada hormona -y de cada mediador intracelular de su accidn- en la activaciédn de los genes que codifican estas proteinas. En los Ultimos afos, nuestro laboratorio ha estudiado una proteina microsomal hepatica capaz de unirse a varias hormonas esteroideas con una afinidad inferior a la de los receptores cldsicos, y que hemos denominado LAGS (de Low Affinity Glucocorticoid- binding Sites). Los LAGS estan regulados por un sistema multihormonal complejo. En primer lugar, los LAGS son especificos del sexo masculino y tienen una ontogenia realmente peculiar. Ademds desaparecen tras la hipofisectomia y casi desaparecen durante el hipotiroidismo. Disminuyen su concentracién tras adrenalectomfa, y la orquidectomia, practicada antes de la pubertad, hace que su concentraciédn aumente. Estudios sobre cada hormona individual permiten concluir que existe una regulacién sinérgica de los LAGS por glucocorticoides, hormona de crecimiento y hormonas tiroideas. Por tanto, los LAGS proporcionan un modelo reproducible y relativamente sencillo para el estudio de la regulacién multihormonal de proteinas microsomales hepaticas. SUMMARY Many liver proteins are under endocrine regulation by various hormones. We have extensively studied the binding properties and the endocrine regulation of the liver microsomal Low-Affinity Glucocortioid-binding Sites (LAGS). These proteins bind glucocorticoids such as cortisol, corticosterone and dexamethasone, but not tnamcinolone acetonide. The LAGS are male specific, and undergo a peculiar ontogeny. They dissapear after hypophysectomy, and adrenalectomy (ADX) and hypothyroidism (TX) provoke an important decrease in their concentratration. Orchiectomy performed before the puberty causes an increase in the LAGS concentration, that is abolished by testostercne propionate treatment. Both thyroid Hormones (T;/T,) and Growth Hormone (GH) are able to induce the LAGS. Glucocorticoids are ineffective when injected alone, but potentiate the effects of both GH and thyroid hormones. We conclude that glucocorticoids, GH and thyroid hormones act synergistically on the LAGS regulation. Texto del discurso pronunciado por el Dr. D. Bonifacio Nicolas Diaz Chico en Las Palmas de Gran Canaria (30-6-93) 127 1. INTRODUCCION La regulacién hormonal de proteinas hepaticas estaé sujeta a multiples controversias, principalmente porque muchas de ellas son controladas por varias hormonas. Entre las proteinas hepaticas mejor conocidas que se encuentran sometidas al control de varias hormonas simultdneamente se encuenta la proteina de secrecién a),-globulina [1], y la proteina intracelular conocida como receptor de estrdgenos (RE) [2,3]. Por otra parte, no se han desarrollado modelos sencillos para abordar con eficacia los sistemas de regulacién multihormonal de proteinas hepaticas. El] higado contiene una gran variedad de proteinas microsomales, entre ellas los enzimas de la familia de los p450, que participan en los procesos de oxidativos que sufren las hormonas esteroideas, medicamentos y productos tdxicos a su paso por el higado. Poco se sabe sobre la regulacidn de los genes que codifican para estas proteinas microsomales, salvo que algunos de ellos estan sometidas a control multihormonal, y que parte de ellos sdlo se expresan en uno de los dos sexos [4,5]. En los ultimos 5 anos, nuestro laboratorio ha estudiado una proteina microsomal hepatica, presente en las ratas macho, que hemos denominado LAGS (de Low Affinity Glucocorticoid-binding Sites). Los LAGS presentan un interesante perfil farmacoldégico de capacidad de unidn a diversas hormonas esteroideas [5-11], y se encuentran regulados al menos por tres hormonas [12-14]. Debido a que los LAGS son abundantes y faciles de medir, ademas de experimentar cambios de concentraci6n muy amplios debido a manipulaciones hormonales diversas, consideramos que pueden cosntituir un buen modelo para estudiar la regulacién multihormonal de proteinas microsomales hepaticas. Z. METODOLOGIA GENERAL PARA LA DETERMINACION DE LAGS 2.1 Animales 128 Ratas macho intactas e hipofisectomizadas (HYPOX) de la cepa Sprague-Dawley, y ratas macho de la cepa Lewis fueron adquiridos en la empresa Mollegaard (Dinamarca). Ratas enanas derivadas de la cepa Lewis fueron adquiridas al National Institute for Medical Research (Mill Hill, London, U.K.). Las ratas fueron hechas hipotiroideas mediante la administraci6n de Propiltiouracilo al 0.05% en el agua de bebida, y dejdndolos en ese tratamiento al menos 21 dias. 2.2. Preparacion de membranas microsomales Todos los pasos que se mencionan a continuacién fueron llevados a cabo a 0-4°C. Las muestras de higado fueron homogeneizadas en un homogenizador Potter de tefldén-cristal (B.Braun, Melsungen, Alemania) en tamp6n TMMDS (50 mM Tris-HCl, 10 mM molibdato sddico, 5 mM cloruro magnésico, 2 mM ditiotreitol, y 0.25 M de sacarosa, pH 7.5). Los homogenados fueron centrifugados a 17,000 x g for 15 min para separar las fracciones nuclear y mitocondrial. El sobrenadante fué centrifugado de nuevo a 105.000 x g para obtener el citosol, que a veces se usé para medir la concentracién de receptores de glucocorticoides. El precipitado de 105.000 x g fue resuspendido en TMMDS y usado como suspensi6n microsomal (2-3 mg proteina/ml) para ensayos de captacién hormonal. Las proteinas fueron medidas segtin descripcidn de Lowry et.al. [15], usando seroalbumina bovina como estandar. 2.3. + Anialisis de captacién de [/H]Dexametasona por LAGS Los LAGS fueron medidos mediante incubacioén de alicuotas de suspensidn microsomal con 10 nM a 500 nM de [*H]dexametasona ((7H]DEX, concentracién final), con o sin un exceso de 200 veces de DEX no radiactiva. La incubacidn se prolongaba al menos 18 horas a 0-4 °C. Luego se anadia una suspensién de dextrano-carbén activo (DCC), se agitaban las muestras, se incubaban por 10 min y se centrifugaban. La radiactividad era medida en el sobrenadante mezclando una alicuota con liquido de centelleo. El contaje de radiactividad se convertia en pmol [*H]DEX/mg proteina microsomal. Cuando los resultados se representaban en funcién de la concentracién de [*H]DEX< inicial se obtiene una curva de saturaci6n tipica (Fig. 1A). 129 El programa de ajuste de curvas LIGAND-PC [16] fué utilizado para determinar los tipos de constantes de disociacién (K,) el ndmero maximo de lugares de unién [*H]DEX-LAGS (B,,a,). La recta obtenida de la representacidén de la ecuacién de Scatchard (Fig.1B) indica que los LAGS constituyen una publacién homogénea de lugares de unidn microsomales para CPH]DEX. 3. PERFIL DE CAPTACION DE ESTEROIDES POR LOS LAGS Varias hormonas esteroideas son capaces de competir con la [7H]DEX por unirse a los LAGS. Este es el caso de corticosterona, cortisol, prednisolona y otros glucocorticoides. La progesterona, y en menor extension el progestageno sintético promegestone (R5020) también compiten con [‘H]DEX por unirse a los LAGS. Es interesante que la triamcinolona acetdnido, el mejor ligando para receptores de glucocorticoides, no se una a los LAGS (Tabla 1). Los LAGS también captan algunos androgenos sintéticos (estanozolol y danazol) y estrogenos sintéticos (etinil-estradiol y mestranol), pero no las hormonas naturales respectivas [6.12.13]. La capacidad de los LAGS de unirse a DEX pero no a triamcinolona acetdnido les hace diferentes de otras proteinas hepaticas solubles [10,17], como el propio GR. A pesar de que la capacidad de los microsomas hepaticos de unirse a los esteroides es conocida desde hace mds de 20 anos, poco es lo que se sabe respecto a su posible funcién intracelular. Como hipotesis de trabajo, otros autores han avanzado dos posibilidades: 1) podria tratarse de un transportador membranal de hormonas esteroides; 0, 2) podria ser un enzima capaz de modificar la actividad hormonal, que actuara modulando su actividad o como una barrera para su accion. En este caso podria tratarse de un enzima metabolizador de esteroides. Es importante constatar que las propiedades de los LAGS en cuanto a captadores de hormonas esteroideas hace que puedan estar semisaturados a las concentraciones de progesterona que se encuentran el plasma durante el embarazo, o de cortisol durante situaciones de estrés. Recientemente hemos podido demostrar que existen proteinas microsomales capaces de captar estanozolol o etinil estradiol en tejidos humanos, y, en 130 particular en el cancer de mama, lo que abre interesantes perspectivas sobre la comprensién de sus funciones [6]. 4. ONTOGENIA DE LOS LAGS El primer aspecto importante respecto a una posible regulacién hormonal de los LAGS es su especificidad de género, pues sdlo estan presentes en ratas macho. En efecto, las ratas hembras de la cepa Lewis no expresan LAGS en ningtin momento de su vida. Los LAGS tienen una interesante ontogenia [13,18], siendo indetectables hasta la 4* semana de vida, aumentando abruptamente durante la pubertad, para alcanzar el maximo nivel hacia los 3 meses y decreciendo paulatinamente a lo largo de la vida adulta (Fig.2). La ontogenia de los LAGS contrasta con la del RG, que estan presentes desde la vida intrauterina con una concentracion bastante estable a Jo largo de la vida ( 0.2 a 0.3 pmol/mg proteina). Recientemente hemos obtenido evidencia de que el aumento con la edad en la concentracién de LAGS coincide con un aumento en el umbral de respuesta a los glucocorticoides, en términos de sintesis del enzima tirosin-amino-transferasa (TAT). Este hecho es compatible con la hipétesis de que los LAGS puedan constituir alguna clase de barrera intracelular en el mecanismo de accion intracelualer de los glucocorticoides en el higado [19,20]. 5. EFECTO DE LA ORQIDECTOMIA SOBRE LOS LAGS Dado que los LAGS aumentan bruscamente durante la pubertad [12], y que son especificos del sexo masculino, intentamos encontrar si los andrégenos estan involucrados en la regulaci6n de su ontogénesis, tal como ocurre en oiras proteinas hepaticas como la a,,- globulina [21]. Las ratas macho fueron orquidectomizadas 0 seudooperadas cuando tenian 25 dias de edad. Inmediatamente recibieron el implante de una capsula de silastic conteniendo testosterona disuelta en aceite, o aceite sdlo, como control. Los resultados (Fig. 3) muestran que la orquidectomia elevé los niveles de LAGS significativamente respecto de las pseudooperadas, 131 y que el implante con testosterona rebajaba los niveles de LAGS a su situacién normal. Estos datos prueban que la testosterona juega un papel negativo en la regulacién de los LAGS, si bien su papel es moderado en comparacién con otras hormonas. El efecto de la testosterona sobre los LAGS es exactamente opuesto al que juega en el caso de la a,,-globulina [21]. 6. EFECTO DE LA ADRENALECTOMIA SOBRE LOS LAGS Dado que los LAGS captan glucocorticoides, tratamos de encontrar si la adrenalectomia afecta la concentracién de LAGS. Para ello, ratas macho de tres meses de edad fueron sometidas a adrenalectomia o seudoperadas, y al cabo de tres dias inyectadas con el 1 mg/dia de acetato de corticosterona disuelto en aceite, o con aceite sdlo como control. Los resultados (Fig. 4) muestran que la adrenalectomia rebaja los niveles de LAGS al 50% del control, y que el tratamiento con acetato de corticosterona restaura los niveles normales de LAGS. Estos datos permiten concluir que los glucocorticoides son las hormonas adrenales implicadas en la regulacién de los LAGS, y que juegan un papel positivo en su regulacion. 7. EFECTO DE LA HIPOFISECTOMIA SOBRE LOS LAGS Dado que tanto las homonas testiculares como las adrenales estan reguladas por la adenohipofisis, no propusimos explorar a continuacién el efecto de la hipofisectomia sobre los LAGS. Para ello utilizamos ratas macho de tres meses, que habian sido hipofisectomizadas una semana antes. Los resultados (Fig. 5) muestran que la hipofisectomia disminuye drdsticamente los niveles de LAGS, hasta hacerlos prdcticamente indetectables. Por lo tanto, bien las hormonas hipofisarias directamente, o bien las hormonas controladas desde la hipdfisis indirectamente, son absolutamente necesarias para la iniciacidn y mantenimiento de la expresién de los LAGS. Este resultado claramente contrasta con el incremento de receptores de glucocorticoides medido en las mismas muestras de higado, que es debido a la acumulacion de receptores por falta de utilizacién de los mismos a causa de la disminucion de secrecidn de glucocorticoides por las adrenales de los animales hipofisectomizados. 132 Por otra parte, y dado que el efecto de la hipofisectomia sobre los LAGS es mucho mas fuerte que la debida a la adrenalectomia, es preciso concluir que existen otras hormonas relacionadas con la hipdfisis, ademas de los glucocorticoides, implicadas en la regulacién de los LAGS. En un intento de clarificar este extremo se inyectaron diversas hormonas hipofisarias a las ratas hipofisectomizadas. La Fig. 6 muestra que el tratamiento sustitutivo de la hipofisectomia con diversas hormonas hipofisarias fué bastante inefectivo, salvo en el caso de la hormona de crecimiento humana (hGH) que fué capaz de una restauracidn parcial del nivel de LAGS. Es interesante destacar que el efecto de la hGH fue mas pronunciado cuando se inyecté tres veces al dia que cuando se la suminitr6 de forma continuada mediante una bomba osm6otica (resultados no incluidos). Este dato es interpretable en el sentido de qiue la imitacién de los picos de secreci6n fisiol6gicos de GH en el macho mediante tres inyecciones al dia de hGH [22,23] puede tener relevancia para obtener un respuesta mejor de induccién de LAGS. 8. TRATAMIENTO CON hGH A RATAS ENANAS Las ratas hipofisectomizadas tienen todo el sistema endocrino dramaticamente alterado. Por ello, el efecto de la hGH encontrado en las ratas hipofisectomizadas debia ser comprobado en otros modelos animales. Asi, se adquirieron ratas macho enanas, derivadas de la cepa Lewis, que son especificamente deficientes en GH. En el resto de los parametros endocrinos estas ratas se encuentran dentro del rango de la normalidad [24]. © Las ratas enanas tienen una concentracidn de LAGS que representa el 33% de las ratas normales de la misma edad. Cuando se administré hGH a las ratas enanas se obtuvo una perfecta curva dosis-respuesta (Fig.7), sin llegar a alcanzar el nivel de LAGS de las ratas normales, debido seguramente a las dosis usadas y el modo de administrarla. Estos resultados permiten asignar a la GH un papel estimulante de la produccién de LAGS, que es cuantitativamente relevante. 133 9. EFECTO DEL HIPOTIROIDISMO Ninguno de los tratamientos vistos hasta ahora permiten asegurar que determinada hormona mantiene bajo control a los LAGS completamente. En la siguiente etapa tratamos de demostrar si las hormonas tiroideas, también dependientes de la hip6fisis, juegan algtin papel en la regulacién de los LAGS. Con este propdsito producimos ratas hipotiroideas por el procedimiento de administrar PTU (Propiltiouracilo) en el agua de bebida [25]. La Fig. 8(A) muestra que tras 21 dias de tratamiento se consigue un efecto casi tan pronuniado como en el caso de la hipofisectomia. Cuando el tratamiento con PTU es suprimido, los LAGS retornan al nivel normal en dos semanas. El tratamiento con T; a ratas todavia bajo el efecto del PTU hace reversible el efecto del hipotiroidismo, aumentando los LAGS al nivel normal (Fig. 8(B)). Estos datos prueban que las hormonas tiroideas tienen un papel determinante en la regulacidn de la expresi6n de LAGS en la rata macho. 10. EFECTOS COMBINADOS DE GLUCOCORTICOIDES Y T, Desde hace algunos anos se sabe que la sintesis y secerecidn de GH en la rata es dependiente de las hormonas tiroideas, y, en menor medida, de los glucocorticoides [26,28]. Por lo tanto, el potente efecto descrito del hipotiroidismo sobre el nivel de LAGS pudo ser debido a un efecto indirecto de la falta de hormonas tiroideas sobre la secrecién de GH. Para descartar esa posibilidad utilizamos ratas hipofisectomizadas, en las que si es posible demostrar la existencia de acciones directas de las hormonas tiroideas y de los glucocortcoides sobre los niveles de LAGS. La Fig. 9 muestra que tanto la corticosterona como la T; son poco efectivas al inyectarlas por separado en ratas hipofisectomizadas. Sin embargo, cuando fueron inyectadas conjuntamente su efecto fué realmente importante. Estos resultados demuestran que el efecto de las hormonas tiroideas sobre el higado es directo y no necesariamente mediatizado por la GH. También ilustran que glucocorticoides y hormonas tiroideas actuian sinérgicamente sobre el higado para alcanzar una induccion Optima de los LAGS. 134 11. EFECTOS COMBINADOS DE GLUCOCORTICOIDES, T, Y GH A continuacién tratamos de comprender qué clase de interrelaciones se establecen entre GH, hormonas tiroideas y glucocorticoides sobre la regulacién de los LAGS. El unico modelo posible para estudiar estas interrelaciones es la rata hipofisectomizada. En estas ratas encontramos, en primer lugar, que los glucocorticoides potencian el efecto de la GH, de manera andloga a lo que hacen con la T, (Fig.10). Este hecho clarifica el efecto permisivo de los glucocorticoides sobre los LAGS: son poco efectivos actuando por si solos, pero tienen un efecto sinérgico importante al actuar bien con la GH bien con la T;. El paso siguiente fué estudiar las interrelaciones de las tres hormonas actuando simultaneamente. Sorprendentemente, la T, y la GH parecian antagonizarse una a la otra, tanto en presencia de glucocorticoides como en su ausencia (Fig. 10). Pensando en la posibilidad de que el aparente efecto antagdnico de la T; y la GH pudiera ser debido a las altas dosis de T; usadas, disenamos un experimento para explorar un amplo rango de dosis de la hormona tiroidea. Partimos de 50 ratas hipofisectomizadas, todas ellas tratadas con glucocorticoides a lo largo del experimento. Este grupo se dividié en dos mitades: a 25 ratas se les inyect6 100 yg hGH/dia (Grupo GH+), divididas en tres inyecciones diarias y las otras 25 ratas recibieron suero salino con la misma regularidad (Grupo GH-). De cada uno de los grupos GH+ y GH- se tomaron subgrupos de 5 ratas, que recibieron el tratamiento de T; siguiendo un patrén de dosis-respuesta de 0, 0.1, 0.5,1, y 2.5 yg T3/100g de peso, administradas con la primera dosis del dia de GH. Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 11. En susencia de GH (grup GH-), el efecto inductor de la T; no fué evidente hasta que se alcanzaron los 0.5 ug/100 g de peso, a partir del cual su efecto es muy potente. En presencia de GH (grupo GH +) dosis de T; tan bajas como 0.1 yug/100 g son capaces de producir induccién maxima de LAGS. Dosis superiores a ésta realmente causan inhibicion de la sintesis de LAGS. Este experimento dejé claro que las tres hormonas acttian sinérgicamente en presencia de bajas dosis de T;, pero sus efectos se interfieren a dosis mds altas. El estudio de los mecanismos moleculares que participan en una regulacidn de esa complejidad promete aportar informacién de una gran una caliadad para la comprensién de mecanismos de regulaci6n hormonal de proteinas hepaticas. 135 Puesto que la T, tiene una vida media corta y es dificil establecer cuando se esta inyectando en dosis fisioldgicas, se repitid el experimento inyectando T,, cuya vida media es mds larga y permite establecer niveles fisdl6gicos de hormonas tiroideas [29]. Los resultados mostraron que la inducci6n maxima de LAGS se consigue con una dosis de T, de 1.5 wg/100 g de peso, la cual esta considerada como fisioldgica. Este experimento permite asegurar que las hormonas tiroideas, la GH y los glucocorticoides actuan sinérgicamente a niveles fisiolégicos en la regulacion de la concentracién de LAGS. 12. AUSENCIA DE EFECTO DE LA DIABETES SOBRE LOS LAGS Algunas proteinas hepaticas como la a,,-globulina y el IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) son inducidos por la insulina [30]. A su vez, la mayoria de las acciones de la GH son mediatizadas por el IGF-1. En un intento de dilucidar si el IGF-1 esta involucrado en la regulacién de los LAGS, estudiamos el efecto del ayuno y la diabetes sobre los LAGS, puesto que la insulina es necesaria para la producci6n hepatica de IGF-1 y el ayuno causa una importante caida en los niveles de IGF-1 [31]. La diabetes estudiada fué la inducida por estreptozotocina. En estas ratas se encontr6é que ni la diabetes inducida, tanto si estaba tratada con insulina como si no lo estaba, ni tampoco el ayuno tenian efecto alguno sobre los niveles de LAGS. Este experimento demuestra que los LAGS no estan regulados por la insulina y también que su concentracion no es influida por la ingesta de alimento. No obstante, ni este eyperimento ni los restantes descritos hasta ahora excluyen la posibilidad de que los factores paracrinos como el propio IGF-1 u otros, que se encuentran bajo regulacién hormonal y son producidos por el propio hepatocito, participen de modo directo en la regulacidn de los LAGS. 136 13. REGULACION MULTIHORMONAL DE RE, a@,,-GLOBULINA Y LAGS Los hechos conocidos sobre la regulaciédn endocrina de las tres protefnas hepdticas mejor estudiadas desde este punto de vista -el receptor de estrégenos (RE), la a,-globulina y los LAGS- se encuentran resumidos en la Tabla 2 [2,3,30]. Cada una de estas protefnas tiene sus propias peculiaridades en términos de regulacién hormonal, y los LAGS difieren bastante de ambas, en particular en lo que se refiere a la participacion de la insulina y las hormonas sexuales. La Fig. 12 resume todo el conocimiento actual sobre la regulacién endocrina de los LAGS. Estos hechos permiten concluir que los LAGS estan regulados sinérgicamente por las hormonas tiroideas, la GH y los glucocorticoides a niveles fisioldgicos, con una influencia negativa, alin sin evaluar, de la testosterona. El papel de todas estas hormonas sobre la ontogenia de los LAGS, y las razones de tipo ontoldgico o endocrino acerca de su falta de expresidn en la rata Lewis hembra son cuestiones todavia abiertas. El higado contiene numerosas proteinas miscrosomales, entre ellas la familia de los enzimas P450, que juegan papeles fundamentales en el metabolismo de diversas sustancias naturales, como las hormonas esteroideas, o xenobidticas, como farmacos y sustancias tdxicas [32,33]. Recientemente hemos podido demostrar que proteinas microsomales capaces de captar hormonas esteroideas -LAGS o proteinas capaces de interactuar con los LAGS- existen en numerosos tejidos animales y humanos, notablemente en el cancer de mama [6 y resultados no publicados]. Los LAGS son actualmente la proteina microsomal cuya regulaci6n endocrina ha sido mas extensamente estudiada. Es probable que las peculiaridades de la regulacidén hormonal de los LAGS aqui descritas abran el camino para la comprension de la regulacién de las otras proteinas microsomales captadoras de hormonas esteroideas, cuyas funciones podrian verse alteradas bajo situaciones naturales o artificiales de modificacién de los pardmetros hormonales que las regulan. 137 AGRADECIMIENTOS Las investigaciones reumidas en este trabajo han sido realizadas a lo largo de cuatro afios de colaboracién con los investigadores Ricardo Chirino, Leandro Fernandez, Antonio Lépez, Luis D. Boada, Domingo Navarro, Juan F. Rivero y Juan C. Diaz Chico, quienes merecen mi mds profundo agradecimiento. Estas investigaciones han sido sufragadas mediante proyectos de investigacién financiados por la Consejeria de Educacién, Cultura y Deportes del Gobierno de Canarias, la Direccicé6n General de Investigacidn Cientifica y Técnica (Proyectos PA86-0474 y PM89-0218) y la Fundacién Universitaria de Las Palmas de Gran Canaria REFERENCIAS i Chatterjee B, Demyan WF, Roy AK 1982 Interacting role of thyroxine and Growth Hormone in the Hepatic synthesis of a,-globulin and its messenger RNA. J Biol Chem 258:688-692. 2. Shapiro LE 1983 Regulation of a thyroid hormone-dependent protein by growth hormone: the induction of hepatic a,,-globulin and its messenger ribonucleic acid in adult male hypothyroid rats. Endocrinology 113:1280-1286. a Norstedt G, Wrange I, Gustafsson J-A 1981 Multihormonal regulation of the estrogen receptor in rat liver. Endocrinology 108:1190-1196. 4. 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VWOlsIDadS3 70’ WU OOL mere X "hipaa! deka Vell 4/8 W.L0l ‘NOIOWLd WD QHYVHOLVOS 30d VLOSY a NOIDVYNLVS 30 VAYND ‘V SOdedey SPWOSOIDIW & PUOSP}AWEXAQG-H; ap UOIUA -| bi 14] Fig. 2.- Ontogenia de LAGS y RG en rata macho 0 LAGS A RG 12 pmol 3? HDEX 0.4 / mg prot pmol *HDEX 10 /mg prot 0.3 8 0.2 4 : 0.1 0 7H00 0 a2 24) 30 "25 6 16 142 .3.. Efecto dela orquidectomia (ORX Fi Fig. 4.- Efecto de la_adrenalectomia (ADX) ADX+ AC A oe ee 2 Z ADX ADX - AC AC = Acetato de corticosterona Oo 3 DIAS 10 144 Fig. 5.- Efectos de la _ hipofisectomia (HIPOX Fig. 6.- Efecto de _ las hormonas hipofisarias 14 pmol *H-DEX /mg prot 12 RATAS HIPOX HIPOX 146 Fig. 7.- Efecto dela hGHen ratas enanas LAGS i6 pMol *H-DEX / mg prot i4 12 10 : : 8 0 50 100 150 Lig hGH/100 g peso 147 LAGS (pmol/mg protein) Fig. 8.- Efecto del hipotiroidismo 1 A. Efecto del PTU -PTU \ K +PTU —™=6 os 21 24 28 DIAS DE TRATAMIENTO inducido por PTU B. Efecto de la qT, Ratas + PTU ae a, SS: Se DIAS DE TRATAMIENTO 148 Fig. 9 .- Efectos de T, y Corticosterona 5 RATAS HIPOX LAGS Ts ls Vor os fee CL+WO+ mE 0 o =X\Y XOdIH SVLVUY HOU BUCISJSOIIPOD A EL HOY ep SO}2fF ~ Ol © (Ma 6ooT/BnN) FL SA ESBSe dO GeDpvCEe HSU - a SHDEX BOUND (pmol/mg protein) XOdIH SVLVUY 151 Fig. 12.- Requlacion endocrina de los LAGS TESTICULOS TESTOSTERONA ADRENALES GLUCOCORTICOIDES TIROIDES TT, EXPRESION DE LAGS ) 52 Rev.Acad.Canar.Cienc., V (NUM. 4), 153-166 (1993) CONTESTACION AL DISCURSO DE INGRESO DEL ACADEMICO-ELECTO DR. D. BONIFACIO NICOLAS DIAZ CHICO POR EL ACADEMICO DE NUMERO DR. D. ANGEL GUTIERREZ NAVARRO Exmo. Sr. Presidente de la Academia, Exmo. Sr. Rector Magnifico de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Ilmos. Senores companeros de Corporacion. Senoras y Senores: En cumplimiento de un acuerdo de la Academia, me cabe el honor y la satisfaccion de representarla en esta primera sesion que celebra en las Palmas de Gran Canaria, para dar la bienvenida a la Corpora- cion a un nuevo académico, el Dr. D. Bonifacio Nicolas Diaz Chico. Es costumbre en este tipo de sesiones hacer una semblanza de la trayectoria personal y profesional del académico electo y contestar a su discurso de ingreso. No romperé esta linea ya cldasica en nuestras academias y comenzaré presentando el perfil biogrdfico del Bey *Diaz Chico. Nacio Diaz Chico, hace 43 anos, en el seno de una familia de agricultores, en la Isla de Tenerife, en Fasnia, pueblo que, como él Suele decir es "exportador de papas, tomates y maestros", y curs6 sus estudios de bachillerato en el Instituto de La Laguna. Guarda un grato cecuerdo de muchos de sus profesores, pero en especial, de D. Pedro Gili y de nuestro companero el académico Alfredo Mederos, a la sazon Profesor ‘e Fisica y Quimica del mencionado Instituto. 153 Al término de sus estudios universitarios ingresa en la Universidad de La Laguna, en cuya Facultad de Ciencias obtiene la Licenciatura en la seccidén de Bioldgicas con la calificacidon de sobresaliente y Premio extraordinario en el curso 1.971-72. Su tesis de Licenciatura se titulo "Efecto de las cumarinas sobre el consumo de oxigeno y el transporte activo de galactosa por el intestino de rata in vitro". Tres anos después alcanza el Grado de Doctor por esa Universidad con la Tesis titulada "Efecto en hipdofisis de rata de productos con actividad FSH-RH y LH-RH sobre la sintesis de protei- nas, ARN “y, AMP ciclico".) Esta "tesis,..mereci6o la- calificacion= de Sobresaliente cum laude, y también en este caso recibe el Premio Extraordinario. De esta etapa de formacion recuerda con especial carino, y me lo ha repetido varias veces, a los profesores Matilde Gonzalez Garcia-Estrada y Fernando Lozano Cabo, tristemente desapare- cidos, a los Profesores Prevosti y Lacadena y, sobre todo, al que considera su maestro, el Prof. Jordana. Al término de sus estudios de Licenciatura inicia su trayectoria docente, en la que ha ocupado practicamente todos los puestos de la carrera. Asi, tras dos anos contratado por la Universidad de La Laguna para impartir Biologia en la Facultad de Medicina, se traslada en el curso 1.974-75 a Las Palmas de Gran Canaria, en cuyo Colegio Universitario se hace cargo de las ensenanzas de Fisiologia y durante tres anos largos, dirige el vepartamento de Fisiologia y Bioquimica. Interrumpe su actividad en Las Palmas, para completar su 154 formacion en la Division de Oncologia del Departamento de Medicina del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, donde permanece durante casi dos anos y, a su regreso, es de nuevo contratado como Profesor Titular de Fisiologia en el Colegio Universitario de Las Palmas. El 27 de septiembre de 1.987 toma posesion de su plaza de Profesor Titular Numerario de Fisiologia y en diciembre de 1.992, accede a la Catedra de dicha especialidad en la Universidad Las Palmas de Gran Canaria. Ha desempenado diversos cargos de gestién y de _ gobierno universitarios, como la direccio6n de Departamento a que antes me referia, Secretario General, primero, y Director, después, del Colegio Universitario de Las Palmas y, al crearse esta Universidad, accede a su equipo de gobierno como Vicerrector de Investigacidén y Tercer Ciclo, y luego pasa a ocupar el Vicerrectorado de Ordenacion Académica que actualmente desempena. Su actividad investigadora ha sido ciertamente fecunda: Desde 1986 viene siendo financiado por diversos organismos nacionales y regionales, como la extinta Comision Asesora de _ Investigacion Cientifica y Técnica, el Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social, la Comision Interministerial de Ciencia y Tecnolo- gia, el Consejo Superior de Deportes, o la Direccidn General de Universidades e Investigacion del Gobierno de Canarias, que han aportado para sus investigaciones una cantidad global superior a los 36 millones de pesetas, es decir una media de cinco millones y medio de pesetas al ano, que no son pocas, pero que, en absoluto, pueden ser consideradas como una inversion baldia, ya que el Dr. Diaz Chico 155 es autor de 45 Comunicaciones y 3 ponencias a Congresos Nacionales e Internacionales, director we seis Tesis Doctorales y ha publicado 36 trabajos de investigacido6n, alguiios en revistas de tan alto impacto como Endocrinology que, si nos dejamos guiar por los indices de impacto del Journal Citation Reports (y no conozco otro indice mas fiable), esta a la cabeza de su especialidad. Todos sus trabajos y comunicaciones, desde la ya lejana fecha de su Tesis de Licenciatura, versan sobre temas de endocrinologia, lo que nos dice que estamos ante un caso de continuidad y unidad curricular ciertamente notable. Para terminar esta breve semblanza de la personalidad de Diaz Chico, destacaré un hecho que no quisiera que pasara inadvertido: Sus mejores trabajos (o al menos, los publicados en revistas de mayor impacto) estan realizados después de su estancia en Estados Unidos y por un equipo de trabajo formado aqui, en la Universidad de Las Palmas. Ello indica que no estamos ante un caso, desgraciadamente tan frecuente en el campo de Biologia Molecular y que quiero denunciar de esta tribuna, de personas que salen a un centro de investigacion pionero en su campo de investigacioén y realizan un trabajo meritorio, pero a su regreso se muestran incapaces de continuarlo y de aplicar aqui lo que aprendieron fuera, lo que significa que la inversion publica destinada a sufragar sus estancias resulta de indudable utilidad para el interesado, pero de escasa rentabilidad para la institucion en que presta sus servicios. ES mas, en ocasiones, la continuidad en el curriculum de tales personas sd6lo se logra a base de continuas y frecuentes salidas que impiden una labor continuada de formacion de nuevos investigadores en nuestras universidades. 156 El caso de Diaz Chico es diferente. Las dotaciones dedicadas a su formacion por la Fundacion Robert Welch de la Uriversidad de Texas y por el Comité Conjunto Hispano Norteamericano para la Cooperacion Cientifica y Técnica no han resultado fallidas: El Prof. Diaz Chico se traslad6 a la Universidad de Texas el 15 de febrero de 1.985 y permanecio en ella hasta el 30 de noviembre de 1.986. En ese tiempo descubre un nuevo antigeno de 46 kd asociado con un receptor de estrogeno en el cancer de mama humano, y cuando vuelve, amplia su grupo de investigacion y aumenta notablemente la calidad de su produccion cientifica, efectuada, como digo, toda en la Universidad de Las Palmas y por un grupo que él sabe crear y mantener entusiasmado con las investigaciones que realiza. Esta labor se vio reconocida cuando en octubre de 1.989 fue designado miembro de Comité Editorial de Journal of Steroid Biochemistry y cuando se le encomienda la organizacion del IX Simposio Internacional an Hicaitad= ca de Esteroides. Se trata, pues, de un profesor universitario en toda la extension de la palabra, que ha sabido fraguar su historial académico a base de rigor, de voluntad y, sobre todo, de decisi¢n y perseveran- cia, llegando a convertirse en un auténtico ejemplo de como sin ayudas excepcionales ni protecciones excesivas, se puede, con trabajo y seriedad y sin complejos de inferioridad injustificados, alcanzar brillantemente los mas altos niveles académicos. Estas cualidades del Dr. Diaz Chico se ven reflejadas en el excelente discurso de ingreso que acabamos de oir y que me dispongo a glosar como segunda parte de mi intervencion en este acto. El nuevo 157 académico ha optado por un tema directamente vinculado con su especialidad, en el que nos ha descrito los ultimos avances de su grupo de investigaci6én sobre algunos aspectos de la accion de las hormonas glucocorticoides en el higado de rata. Ha comenzado describiendo el modo general de accidén de los glucocorticoides, su union a receptores del citosol de las células hepaticas y la accion inductora del complejo receptorcorticoide sobre el nucleo celular, y pasa a describirnos la existencia en la fracci6én microsémica de los LAGS ("sitios de unioén a glucocorticoides con baja afinidad"), término que su grupo de investigacion ha popularizado, y demuestra que se trata de moléculas diferentes de los receptores citosélicos y con ontogenia también diferente a la de éstos. Nos describe luego, con precisi6én y rigor, la regulaci6oén hormonal de los LAGS, demostrando su dependencia de las hormonas hipofisarias y tiroideas y, en menor medida, de las adrenales, describiendo el efecto sinérgico de la corticosterona y la hormona del crecimiento por un lado, y de las hormonas tiroideas, la triyodotironina (T3) y la tiroxina (T4), con la hormona del creci- miento, por otro. Ha terminado plantedandonos las perspectivas de trabajo en este campo, que resume en tres areas: 1) elucidacidén del papel de los LAGS en los mecanismos de accién hormonal en el higado (proteina transpor- tadora de membrana; enzima del metabolismo de esteroides o proteina reguladora de la accion de glucocorticoides), 2) estudio de su papel en la accion del estanozolol y sus efectos en atletas y fisiocultu- 158 ristas, 3) posibilidades de desarrollo de trabajos con aplicacion en el cancer de mama. Los resultados expuestos son tan claros y concluyentes, que no admiten discusidén, al menos por mi parte, especialista en el grupo procaridético de seres vivos, en los que estos mecanismos de regula- cién no tienen lugar. Por consiguiente, no entraré a enjuiciar una exposicion tan bien estructurada y presentada como la que acabamos de oir. Sin embargo, me centraré en la ultima frase de su discuso, segun la cual, el uso del estanozolol ha permitido demostrar la existencia de proteinas que ligan este esteroide en el cancer de mama, porque en esta parte su especialidad confluye con la mia, demostrandose una vez mas, hasta que punto pueden ser artificiales las barreras que hemos levantado entre las disciplinas cientificas. El Académico electo nos decia al principio de su disertacion que los complejos receptoresteroide son factores activadores positivos de la transcripci6n, poniendo como ejemplo la induccion de la tirosinaa- minotransferasa, que ha recibido especial atencidon porque se trata de una enzima que puede ser inducida en el higado intacto, en las células hepaticas en cultivo y en lineas celulares derivadas de hepatomas. Todas estas células responden al tratamiento con corticoi- des induciendo de forma rapida la sintesis de la enzima (que llega a aumentar de 5 a 15 veces al cabo de diez horas), pero afectando muy poco a la sintesis de otras proteinaas del hepatoma o del higado. Esta induccid6n es consecuencia de la activacion especifica de la sintesis de unos pocos mensajeros celulares, entre ellos, el que codifica para la tirosina aminotransferasa, lo que prueba que la 159 aplicaci6én de esteroides puede tener efectos espectaculares y selectivos en la transcripci6én génica. Al final de su disertaci6én nos ha dicho que en el cdncer de mama existen algunos receptores para esteroides. El cancer de mama, al menos en ratones, es de etiologia virica y esta producido por el virus del tumor mamario de los ratones (MMTV), que es un retrovirus que se produce en cantidades elevadas en las células en presencia de esteroides del tipo de la cortisona, es decir, de glucocorticoides. Es interesante hacer constar que en el genomio de otras especies animales como ratas, monos e, incluso, humanos, se han encontrado las secuencias de este virus, aunque defectivas. El grupo de Payvar publicdo en Science en 1.983 que la hormona actua incrementando la transcripcion del virus. Se ha obtenido en un clon gendémico el ADN del MMTV (la copia de ADN completa del ARN virico que esta inserta en uno de los cromosomas de la célula) y se detect6 el promotor por transcripcién in vitro y por el analisis de la secuencia del ADN. Cuando los plasmidos que contenian este promotor del virus eran introducidos en las células, los esteroides que se anadian daban lugar a un incremento en la transcripcioén del ADN plasmidico y la maxima actividad transcripcional de estos plas midos exigia la reer en el medio de cultivo de una hormona glucocorticoide. Mediante el empleo de mutantes por delecion se han ido identifi- 160 cando las secuencias necesarias para la maxima transcripcioén inducida por glucocorticoides y se ha visto que se localizan 305 nucledétidos en direccion 5’ antes del sitio de iniciacidén del ARN. Por microsco- pia electrdénica se ha podido comprobar que, en realidad, a esta region se une el receptor de glucocorticoides purificado, lo que sugiere que la activacion de la transcripcion mediada por esteroides exige, al menos en el caso del virus que nos ocupa, la entrada del esteroide en la célula infectada, su union al receptor especifico y la unioén del complejo esteroidereceptor al acido nucleico del virus. En primer lugar, esto sugiere la sorprendente unidad de los mecanismos de regulacion de los seres vivos, desde las formas vivientes mas sencillas, los virus, hasta las estructural y funcio- nalmente mas complejas, los primates. Pero, por otra parte, si los LAGS fueran, efectivamente, o bien metabolizadores de esteroides, o bien competidores de los receptores citosdlicos, podrian tener un Significado adicional: serian un mecanismo de defensa natural de las células frente a la transformacion por oncovirus y al desarrollo ulterior de tumores de esta etiologia. Para terminar, permitanseme unas consideraciones sobre el papel que las Academias de Ciencias, entre ellas la nuestra, pueden desempenar a las puertas del siglo XXI en que nos encontramos. Con frecuencia, estas instituciones son criticadas y consideradas anticuadas y poco apropiadas a las circunstancias actuales en las que la comunidad cientifica se ha visto impulsada a una veloz carrera tras el resultado rapido, la publicacion inmediata y el crecimiento de los curricula, favorecidos por el, a mi juicio, pésimo sistema 161 para la provisi6n de plazas de profesorado estable en nuestras universidades. La consecuencia es que la prisa prima sobre el reposo en el trabajo, sobre el rigor en el planteamiento de hipdétesis y sobre el debate sereno de los temas cientificos de actualidad. Seria interesante hacer un poco de memoria y ver en qué momento historico aparecen las Academias de Ciencias, denominadas antes Sociedades Cientificas. Entre las mas prestigiosas que perduraron figuran la Royal Society de Londres, fundada en 1.662, la Academie des Sciences, fundada en 1.666, la Societas Regia Scienciarum, luego Academia Prusiana, fundada en 1.700 y la Academia de San Petersburgo, fundada en 1.725. La espanola, denominada en un principio Academia Natural Curiosorum (luego Academia de Ciencias Naturales y, mas tarde, Real Academia de Ciencias Exactas, Fisicas y Naturales) fue fundada en 1.657. Es decir, las principales Academias cientificas aparecen en pleno siglo XVII y comienzos del XVIII en un momento en que las universidades europeas (con las notables excepciones de Padua, Cracovia y Oxford) estaban sumidas en una profunda crisis, que arranca de mucho mas atras, cuando en los siglos XIV y XV las univer- Sidades se van haciendo cada vez mas inflexibles, mas atadas a la tradicidon y mas impermeables a las nuevas necesidades sociales. Ante las tendencias en ascenso como el humanismo o la ciencia positiva, las universidades vuelven la espalda y permanecen aferradas al escolasticismo, que habia perdido buena parte de su vitalidad y su racionalismo constructivo anteriores para degenerar en los que se puede llamar un "delirio ldgico". En general, el pensamiento independiente y la libertad de indagacion no fueron considerados como finalidades principales de la ensenanza superior. La universidad 162 europea fallo6 en la asimilacioén de la gran corriente renacentista y, concretamente, del Humanismo; fall6 en su actitud frente a la nueva filosofia que vio la luz fuera de la instituci6n universitaria (ni Descartes, ni Leibnitz, ni Spinoza, por ejemplo, fueron profesores universitarios) y fallo al perder un tanto su caracter internacional y al sufrir una excesiva ingerencia del poder temporal (imperial, real o papal). Consuma definitivamente su decadencia en los siglos XVII y XVIII con la actitud que adopta frente a la ciencia experimen- tal que surgia entonces con enorme impetu. En este ambiente surgieron las Academias, que suministraron lugares para que las mentes mas preclaras del siglo XVII, el denomi- nado "siglo del genio", que frecuentemente eran autodidactas y trabajaban como estudiosos solitarios e independientes, se reunieran y cooperaran. Sirvieron para la diseminacion del saber, mediante la edicion de revistas (algunas de las cuales perviven en la actualidad) que hicieron mas facil que hasta entonces la comunicaci6on entre los que cultivaban la ciencia. Procuraron bibliotecas, laboratorios, estipendios, instrumentos costosos, colaboradores y _ publicos intersados y sirvieron, en fin, de camaras de compensacion tanto para el cientifico como para el aficionado. Afortunadamente, a comienzos del siglo XIX y gracias a la problematica despertada por Alexander von Humbodlt, a sus ideas sobre la unidad del saber, el arbol de la ciencia, la estrecha unidad y casi identidad entre ensenanza e investigacion y a los éxitos logrados por no pocos profesores universitarios en el terreno de la ciencia positiva, se produjo un renacer y nuevo florecimiento de la 163 universidad europea. Coincidiendo con ello, entra en declive la creaci6n de nuevas academias. Por fijarnos sd6lo en el caso espanol, tras la fundacion en 1.764 de la Real Academia de Ciencias y Artes de Barcelona, no se funda ninguna institucion similar hasta 1.910 en que inicia sus trabajos en Cdérdoba la Real Academia de Ciencias, Bellas Letras y Nobles Artes y en 1.916 en Zaragoza la de Ciencias Exactas, Fisicoquimicas y Naturales. Desde entonces y hasta fechas mucho mas recientes en que surgen Academias similares en otros puntos de la geografia espanola como Sevilla o nuestro Archipiélago, no se produce la fundacion de tales instituciones, quizas debido a que con sus rasgos fundacionales del siglo XVII se hicieron innecesarias, dado que las universidades asumieron durante el XIX y buena parte del XxX el papel impulsor de la ciencia y su difusidon que habia caracterizado a las primitivas Academias. Ahora bien, nos podemos preguntar si la Universidad espanola actual, definida por la Ley Organica de Reforma Universitaria, es como indica la propia Ley en su preambulo, "un marco para la renovacion de la vida académica" para convertir a la institucion universitaria en "un instrumento eficaz de transformacion social, al servicio de la libertad, la igualdad y el progreso social y para hacer posible una realizacion mas plena de la dignidad humana". Creo que, aunque la voluntad del legislador fue ésa, la materializacion en cada universidad de las ideas de la Ley deja mucho que desear. Asi, bajo el manto de una aparente organizacion democratica, los claustros no son el Organo de debate y discusidé6n en libertad de los temas relacionados con la vida académica; antes bien, dado el sistema de mayorias por el que se ha optado para su eleccidén y que es calcado 164 del que opera en la organizacion politica de la Nacion, los claustros se han convertido mas bien en un sistema de ocultamiento de los pareceres contrapuestos con la linea de pensamiento dominante en cada Universidad, cuando no en un sistema de apartamiento del disidente, lo que ha provocado que la contrastacio6n de ideas que fue la nota caracteristica de la Universidad desde sus comienzos, ha desaparecido o esta en trance de desaparecer en aras de una sumision intelectual a la autoridad académica, de la que proceden en cierta medida las posibilidades de financiacion y de dotacion de nuevas plazas. Por otra parte, el apego al pasado también me parece evidente. La reforma actualmente en curso de los planes de estudio es un ejemplo de ello. En las licenciaturas existentes se ha rehuido, al menos en los casos que conozco, una reforma que aproxime nuestras ensenanzas a las nuevas necesidades sociales; por el contrario, la reforma parece haberse basado en el principio de que nada cambie y se ha optado por la posicidén cdomoda de dejarlo todo como esta con inde- pendencia de que la sociedad demande a la Universidad una modifica- cion sustancial de sus planteamientos y de los contenidos cientificos que imparte. Ademas, el sistema de provision de plazas que venia funcionando antes de la reforma y también el puesto en marcha con ella ha propiciado que en muchas areas de conocimiento las catedras estén copadas en mas de un cincuenta por ciento por profesores de una misma escuela, lo que tiene como consecuencia, la exclusion de las aulas de mentes valiosas,.pero que, por disidentes con las ideas de la escuela dominadora, son excluidas de la docencia. Podria citar ejemplos de 165 bidlogos que se cuentan entre los mas valiosos que hay en Espana y por estas razones no son profesores universitarios. En contraposi- cidn, las universidades han entrado en una carrera por incluir en sus claustros, mediante la via del doctorado honoris causa, a personali- dades del mundo politico o econdémico, primando el poder y el dinero sobre los méritos docentes y de investigacioén. La prensa habla estos dias de casos que, por evidentes, no mencionaré. En resumen, parece que la Universidad esta mostrando alguno de los sintomas decadentes que describi como propios de la institucio6n del XVII. Seria mucho decir que las Academias han surgido como res- puesta a ello, pero creo que si podrian asumir la labor de regenera- cidn que ejercieron las primitivas sociedades cientificas fundadas en ese Siglo. Por ello, me congratulo de que nuestra institucion reciba hoy a un cientifico joven, con inquietudes por la ciencia y que, ademas, ostenta un relevante cargo de gobierno en la Universidad. Sepa, Dr. Diaz Chico, que en esta tarea esperamos mucho de usted. Yo sé que no nos defraudara y puedo asegurar que contara con mi apoyo y arropamiento personales y con el de todos los miembros de la Corpo- racion. Sea, pues, bienvenido a la Academia Canaria de Ciencias. He dicho. 166 Rev .Acad.Canar.Cienc., V (NGm. 4), 167-181 (1993) LA DECADA DEL CEREBRO Discurso leido por el Académico-Electo Ilmo Sr. Dr. JOSE REGIDOR GARCIA en el acto de su recepcion el dia 15 de Diciembre de 1993 DISCURSO DE CONTESTACION por el Académico Numerario Ilmo Sr. Dr. JUAN JOSE BACALLADO ARANEGA 167 ae 5 ‘= = - a ‘ \ r ; : a 7s ; ental a 5 : a. Ria — +e. : : “1. * * 9 F i est oan Sees: . : ye wa : rn teeuman) gern aise IS nnn seiad, ® yontreridin: a ig it o See a intcinin doanaantas ane ‘aeane lin chine: pigplen ta. in dna nat; a ol - a VEL owte rode Gudle mln: be honnewine: hen, vid hea a ip c —. .-ai ita wil lo, era cored qan ef priieaars actin be te ac : ri 7 7 - 8 OREM AF AGA CASED ALE oe tind, Tt. allo; @e coheratule de que, sMestre ‘omnia eee 4h hey! 4 2 me ifiae javeur, cen drag i wtudad’ por ia conn tanta uA. eaievante bergd,| dé aaniarne an Le nt thier onioe, we om #sutactapea unpdranck mp hes 24, wa judars ) tele (eaguree- que coward oh whe ronalen ¥ oor e)- te) tedas ies atebron im re wla-eotabaod to 10g objal ozmaiths <1» pe ager AMORAD HOGIOTA 3201 00 womb FQ@! ob sieemaiciCl th Bf itty Is ndtoqsoo7 v4 sb O89 long’ = %. 7 4 - 7 - i ; f J 2 _— 7 ~ a ge 2? - aalta af Cae HOL MM raxtvids ad oausieie aa oberseny onimbbeod fs 10g | a A . ANG VARA OGAL LADAR 201 ViAUL aa oe 7 LA DECADA DEL CEREBRO José Regidor Garcia Para disipar los terrores, esas tinieblas del espiritu, no se necesita de los rayos del sol ni de los trazos luminosos del dia, sino del estudio racional de la Naturaleza. LUCRECIO: De Rerum Natura, libro II. Uno de los hechos mds relevantes del ano 1.989 fue, sin duda, la decision del Congreso de los Estados Unidos de América de declarar la década de los noventa como la DECADA DEL CEREBRO (Decade of the Brain). Esta histérica resolucion fue la conclusidn de una campafia emprendida, hace ahora mas de cinco anos, por un grupo de neurocientificos norteamericanos, empenados en dar a conocer el cerebro y la importancia que para la humanidad tiene el profundizar en su conocimiento mediante la investigaci6n cientifica. En la Resolucidn del Congreso de los Estados Unidos, los legisladores plasmaron las razones que motivaron su decisidn que, entre otras, quedaron reflejadas en los siguientes considerandos que transcribimos en traduccion literal: Considerando que se estima que el tratamiento, rehabilitacién y costos relacionados con los trastornos, enfermedades e incapacidades que afectan al cerebro representan un monto anual de $350.000.000.000.- (japroximadamente 40 BILLONES de pesetas!) ... Considerando que los ciudadanos de la Nacién deben ser conscientes de los estimulantes avances de la investigaci6n sobre el cerebro y de la disponibilidad de tratamientos efectivos para las enfermedades e incapacidades que afectan al cerebro Texto del discurso pronunciado .por el Dr. D. José Regidor Gar- cia en Las Palmas de Gran Canaria (15-12-93). 169 Considerando que la comprensién de la realidad del Sistema Nervioso aguarda en la frontera de la innovaciodn tecnol6gica ... Considerando que el estudio del cerebro implica el esfuerzo multidisciplinario de~ cientificos procedentes de dreas tan diversas como la Fisiologia, Bioquimica, Psicologta, Psiquiatria, Biologia Molecular, Anatomia, Medicina, Genética, y muchos otros mas que estan trabajando para conseguir el objetivo comin de un mejor conocimiento de la estructura del cerebro y cémo influye en nuestro desarrollo, salud y comportamiento, ... Es importante destacar el claro objetivo propagandistico de la DECADA DEL CEREBRO. Se trata de dar a conocer a los ciudadanos lo que se sabe actualmente del cerebro, de su estructura y de cémo funciona y también, los conocimientos que actualmente se tienen de las causas de muchas de sus enfermedades y de los remedios de que se dispone para su recuperacion. Es, en todo caso, una decidida apuesta por la esperanza basada en la razon. jEs necesario a las puertas del siglo XXI dar a conocer el Sistema Nervioso?. Cuando en 1825 el célebre frendlogo Franz J. Gall sentencidé que: "El Sistema Nervioso se ha conocido con una lentitud que sélo se explica por las numerosas dificultades que siempre se han opuesto a su investigacién", no hacia mds que constatar las vicisitudes histéricas que ha sufrido el estudio del Sistema Nervioso. Remontdndonos en la historia de la humanidad, los primeros datos acerca del cerebro proceden del papiro Edwin Smith redactado hacia el afio 3000 a.C. En él aparece el jeroglifico que representa al cerebro y hace la primera descripcidén de Nils 170 cémo es el aspecto externo del cerebro cuando en su caso numero 6 dice: *... al saltar la caja craneana deja al descubierto unas arrugas semejantes a las que Se forman sobre el cobre en fusién ..."; pero ademas, queda manifiesta la sorpresa del autor al observar como lesiones en el craneo o en el cuello afectan al habla o al control del movimiento de las extremidades, como queda reflejado en el caso numero 8: *... el hombre tiene una herida en el cradneo, va acompafiada de una desviacion de los globos oculares y el enfermo camina arrastrando el pie ...”, y en el caso numero 31: ”... el enfermo tiene una dislocacién de las vértebras del cuello; esta inconsciente de los dos brazos y de las dos piernas, su falo esta en ereccién y orina y eyacula sin saberlo ..." A pesar de estas observaciones, tanto para los egipcios como para las otras grandes culturas de la época: la mesopotamica y la hebrea, es el corazon la fuente de la vida y el que entrana los sentimientos y la inteligencia. Son los griegos presocraticos y principalmente DEMOCRITO, quien considera que la sensacion y el pensamiento tienen una base material que depende de una variedad especial de atomos finos, pulidos y redondos. De forma notable DEMOCRITO situa el pensamiento en el cerebro y deja prefigurada en su concepcion la nocidn de actividad nerviosa. Mas tarde, Hipocrates y sus discfpulos consolidan y enriquecen la tesis de Democrito mediante la observacion clinica. La medicina hipocratica -que sin duda merece el calificativo de cientifica-, establece la distincion entre enfermedades neuroldgicas y enfermedades mentales, atribuyéndoles un origen cerebral. Su tratado "Sobre la enfermedad sagrada", nombre con el que era cenocida la epilepsia, es un claro ejemplo de los esfuerzos del sabio griego por desterrar la supersticion y el mito en el estudio de la enfermedad. De forma notable, Hipocrates sentenci0: " El hombre debe saber que del cerebro y sélo del cerebro, surgen nuestros placeres, alegrias, risas y bromas, ast como nuestras tristezas, dolores, penas y lagrimas. Gracias a él, nosotros pensamos, vemos, oimos y distinguimos lo feo de lo hermoso, lo malo de lo bueno, lo agradable de lo desagradable,... Pero, siempre que el cerebro esté sano, el hombre puede pensar correctamente.” 171 Platén, con su teoria de las tres partes del alma, continua y desarrolla las tesis presocraticas separando la parte intelectual que queda localizada en la cabeza, de la irascible y de la concupiscible. La tesis cefalocentrista segtin la cual el pensamiento se situa en el cerebro del hombre alcanza con los hipocrdaticos y con Platén su formulacion explicita. Aristoteles llega a conclusiones diferentes. Haciendo uso del método cientifico, pero careciendo de los medios para acceder a la correcta interpretacion de los hechos, no presta atencidn a la presencia de los nervios pero, observa la distribucidn de los vasos sanguineos en el organismo y su convergencia en el corazon por lo que reactualizando a los antiguos mesopotamicos, hebreos y griegos, asevera que el corazon es la sede de las sensaciones, las pasiones y la inteligencia. Su observacion de que "De todos los animales el hombre es el que tiene el cerebro mas grande en proporcion a su tamafio", no fue argumento suficiente mds que para considerar que el papel de ese 6rgano era primordialmente procurar la refrigeraci6n del cuerpo. Avalada por el enorme prestigio de Anistoteles, la tesis cardiocentrista gozo del favor de la mayoria de los pensadores y su influencia se extendid durante siglos a través de la Escoldstica cristiana. Sin embargo, la medicina griega siguid fiel a los postulados de Hipocrates y en Alejandria HEROFILO y ERASISTRATO inauguran la diseccién del cuerpo humano. Estudian cuidadosamente el cerebro, sus componentes principales, describen los ventriculos cerebrales y distinguen entre nervios motores y nervios sensitivos. ((HEMOS DE ESPERAR AL SIGLO XVII PARA RECUPERAR ESOS CONOCIMIENTOS!). Quinientos anos mas tarde, GALENO instaura la experimentacién en el estudio del cerebro. Desarrolla la nocién de "Pneuma Psiquico” que es producido y almacenado por los ventriculos cerebrales a los que considera el 6rgano del alma. 172 Este concepto es rescatado por los padres de la Iglesia, Nemesio y San Agustin, los cuales localizan en los ventriculos las facultades del alma: imaginacion, raz6n y memoria, estableciendo el primer mapa de localizaci6n topogrdafica de funciones cerebrales. Hemos de dar un increible salto en el tempo y esperar al siglo XVI, con el Renacimiento, para que los eruditos se vuelvan a interesar por el cerebro; aunque s6lo sea desde una perspectiva anatomica, como queda reflejado por ejemplo en las magnificas laminas de VESALIO. 173 La relacién entre estructura y funcidén cerebral fue retomada a principios del siglo XIX por el médico y anatomista GALL el cual, en el disefio de su Frenologia, intenta localizar 27 facultades animicas en otras tantas areas cerebrales que, segitin él, se reflejaban en el crdneo. Mas tarde, los estudios llevados a cabo por Fleurens, Broca y finalmente Brodman llevan al establecimiento de las 52 areas corticales que actualmente reconocemos. Si dificil ha sido para la humanidad asumir el reconocimiento del cerebro como el 6rgano del pensamiento, jqué decir de la dificultad para demostrar su organizacion celular?. En efecto, aunque los primeros microscopistas (Malpighi en 1685; van Leeuwenhoek en 1718 o Dutrochet en 1824), realizan descripciones de estructuras nerviosas, no es sino hasta 1865 cuando, gracias a Deiters, se propone la imagen que en la actualidad tenemos de la célula nerviosa (constituida por un cuerpo celular con el citoplasma y el nticleo del que surgen varias ramificaciones gruesas, las dendritas y una fina prolongacidn més larga: el cilindro-eje o ax6n). A pesar de ello, la teoria reticularista iniciada por Gerlach y seguida por Golgi que consideraba la constitucién del tejido nervioso como una red continua y unitaria, gozé durante un tiempo del favor de muchos investigadores. La 174 contestaciOn a esa concepcidn de la organizacién del tejido nervioso provino de dos suizos: el embridlogo His y el psiquiatra Forel, los cuales proponian que las células nerviosas, como el resto de las células del organismo, mantenian su integridad e individualidad. Ramon y Cajal rebate ardientemente la teoria de Gerlach y Golgi, demostrando de manera definitiva la existencia de la célula nerviosa, (para la que Waldeyer en 1890 acuno el término de “neurona”), como individualidades con entidad propia: "/ndividualidades en nimero inmenso, las neuronas, completamente independientes, simplemente en contacto las unas con las otras, constituyen el sistema nervioso.” Es en pleno siglo XX, con la publicacién en 1933 por Cajal de su libro "zNeuronismo o reticularismo?.", cuando la Teoria Celular enunciada casi un siglo antes por Schleiden y Schwann se podia extender a todos los tejidos incluyendo el nervioso. Si en la historia de la humanidad determinados descubrimientos fueron hitos fundamentales en el conocimiento humano, -recuérdese lo que significaron las aportaciones de Copernico, de Newton, de Mm. Curie, de Darwin o de Watson y Crick por citar algunos-, las aportaciones de Santiago Ramon y Cayal al estudio del Sistema Nervioso hay que encuadrarlas dentro de esa especial categoria. En efecto, fue a partir de Cajal cuando un "nuevo horizonte” se abrid ante los investigadores del sistema nervioso y los clinicos. En sintesis, a Ramon y Cajal debemos la confirmacio6n fundamental de la neurona como célula nerviosa, interrelacionada a través de los contactos sindpticos entre si, para constituir los diferentes centros nerviosos responsables de la actividad cerebral. La teoria neuronal proporcioné ademas, el substrato donde engarzar los conocimientos que, tras el descubrimiento de la "electricidad animal” por Galvani en 1786, supuso el nacimiento de la electrofisiologia, encargada de estudiar las corrientes nerviosas, impulsos eléctricos que circulan por los nervios, los cuales pueden ser registrados y medidos y que son una muestra de la actividad nerviosa. 175 Paralelamente, las hipétesis a favor de que algun tipo de mecanismo quimico debia estar relacionado con la actividad neuronal, se va abriendo paso progresivamente en el pensamiento cientifico. En este campo, las aportaciones de Claude Bernard fueron decisivas, pues con su andlisis experimental del modo de accién de las sustancias t6xicas y medicamentosas puso la base sobre la que se construy6 la moderna farmacologia, fructificando en 1904 con el descubrimiento por Elliot de la adrenalina que ”... podria ser el estimulante quimico segregado cada vez que el influjo nervioso llega a la periferia.”. La adrenalina y la acetilcolina descubierta poco después, fueron reconocidas como las primeras sustancias quimicas producidas por las neuronas: los neurotransmisores, gracias a las cuales es posible la comunicacion interneuronal. El enorme desarrollo de la neurofarmacologia, el progresivo descubrimiento de nuevas sustancias activas sintetizadas por las neuronas y de la forma como éstas actuan en el sistema nervioso, asi como el cada vez mds detallado conocimiento de su localizaci6n y de sus relaciones, hacen que los "espiritus animales” de los antiguos griegos se identifiquen con el movimiento de los atomos y moléculas; 6, que el "pneuma” de Galeno, se descomponga en flujo de iones o de segundos mensajeros, en la relaciédn de los neurotransmisores con sus receptores. De tal forma, que para la moderna Neurociencia, el sistema nervioso ya no es mas un terreno ignoto apto sdlo para la especulacion, sino el substrato organico donde la Biologia Celular y Molecular con sus poderosas herramientas experimentales estan actuando infatigablemente. Si las aportaciones de Ramon y Cajal fueron la piedra angular de los modernos estudios del cerebro, las de Hubel y Wiesel (Premio Nobel de Medicina en 1981) han sido ejemplo de las nuevas maneras de abordar el andlisis del Sistema Nervioso. Dejando a un lado sus precisas contribuciones al conocimiento del sistema visual y a la funcionalidad de las neuronas que lo componen, hemos de considerar a Hubel y Wiesel, en cierto sentido, entre los "responsables” de lo que en la actualidad conocemos como "NEUROCIENCIA". En pocas palabras, podemos definir la Neurociencia como el estudio interdisciplinario del Sistema Nervioso. Se trata, por tanto, de abordar cada uno de los problemas e incdgnitas que hay 176 planteados sobre el cerebro desde todos los puntos de vista posibles: anatémico, fisioldgico, farmacoldégico, funcional y clinico; en otras palabras, un abordamiento biolédgico integral. Se trata pues, de trabajar en equipos multidisciplinarios donde cada miembro aporte su visién al problema comin. E| salto cualitativo es de tal magnitud, que los resultados estan indicdndonos que es ahora cuando verdaderamente tenemos esperanza de comenzar a conocer el cerebro y como consecuencia de ello, la probable solucién a muchas de las enfermedades neuroldgicas y psiquidtricas que aquejan a la Humanidad. De entre la multitud de temas relacionados con el Sistema Nervioso, quisiera detenerme, aunque brevemente, en dos de ellos por los que estamos particularmente interesados y a los que dedicamos buena parte de nuestra tarea universitaria. El primero tiene que ver con el estudio de los procesos de envejecimiento cerebral en general y con la demencia senil o enfermedad de Alzheimer en particular. Hace ahora mds de 80 anos, el médico aleman Alois Alzheimer realizo la precisa descripcidén de los sintomas de la enfermedad que aquejaba a una de sus pacientes y que, progresivamente la conducia a la demencia. Alzheimer realizo un minucioso seguimiento de la enfermedad, lo que le Ilev6 incluso a estudiar el cerebro de la paciente tras su fallecimiento. Describid la atrofia cerebral caracteristica de estos enfermos y la presencia en el tejido nervioso de unos acumulos anormales a los que denomin6: “Placas seniles”. Hoy en dia, la importancia de la enfermedad de Alzheimer en la sociedad occidental es cada vez mayor, dado el favorable incremento en las espectativas de vida. Con ello, la incidencia de la enfermedad de Alzheimer se incrementa de forma tal que puede llegar a ser del 40-50% entre los individuos de mas de 90 anos. Sin saber todavia la etiologia de la enfermedad, conocemos, sin embargo, las areas cerebrales que quedan afectadas. Estas se caracterizan por la acumulacion en 177 ellas de una proteina particular denominada "beta-amiloide”, tanto en las placas seniles - alterando el normal funcionamiento cerebral, afectando a la memoria, etc.-, como en las paredes de los vasos sanguineos, afectando a la circulacién sanguinea cerebral. La proteina beta-amiloide es, en realidad, una parte de una proteina (la APP O proteina precursora del amiloide), producida regularmente por las neuronas y cuyo procesado normal por una proteasa -que deja un fragmento ligado a la membrana neuronal y otro libre en la matriz extracelular- es esencial para el buen funcionamiento nervioso. Sin embargo, por causas desconocidas esa proteina es procesada errédneamente en los enfermos de Alzheimer, en los que se produce una fragmentaci6n andmala, acumulandose entonces en el espacio extracelular el fragmento que conocemos como beta-amiloide. Aunque la acumulacidn de amiloide en el cerebro de los enfermos de Alzheimer es una nota destacada, existen dudas de que ello sea la causa fundamental de la enfermedad. No obstante, el recientisimo descubrimiento de que las personas que portan de manera homocigota el gen que codifica un tipo de apolipoproteina, la E4, tienen un riesgo incrementado de padecer Alzheimer y que ello se debe a que en esas personas la apolipoproteina E4 facilita o acelera la acumulacion del beta-amiloide, est4 aportando nuevos datos acerca de como se establece y desarrolla la enfermedad a nivel celular. Pero, al mismo tiempo ha suministrado una herramienta de extraordinario valor, dado que ha permitido por primera vez la aplicacién de una prueba fiable con valor prondéstico Por ultimo, no quisiera finalizar mi reflexidn sobre el sistema nervioso sin mencionar uno de los mas recientes descubrimientos biolédgicos. Nos estamos refiriendo a la acci6n que un gas, el 6xido nitrico (NO), realiza como mensajero celular. A finales de los anos ochenta, se descubn6 por Moncada y colaboradores, que el propuesto "Factor relajante derivado del endotelio", responsable de la vasodilatacion era, sorprendentemente, un gas: el NO, que producido por las células del endotelio vascular a partir de L-arginina (la ruta L-arginina-NO), difundia 178 libremente afectando a las células musculares adyacentes, induciendo su relajacién y, como consecuencia de ello, la vasodilatacion. Si sorprendente fue descubrir un mensajero celular gaseoso, mas lo fue el descubrir que la ruta L-arginina-NO estaba presente en toda la escala filogenética animal y que se encontraba ampliamente distribuida en el organismo, participando en diversos procesos celulares de gran importancia. Entre los tejidos donde se localiz6 la enzima que sintetiza al 6xido nitrico (la sintetasa del d6xido nitrico, NOS), figura el sistema nervioso tanto central como periférico. En el sistema nervioso central, la presencia de una molécula de las caracteristicas del NO, abrié un nuevo horizonte a la investigacio6n neurobioldgica. Por primera vez, se describe la accidn de un mensajero celular retrégrado que, producido por una neurona, difunde rapidamente afectando a las células del entorno, (tanto neuronas como glia), activando una guanilato ciclasa soluble asi como una ADP-ribosil transferasa, como queda indicado en el esquema siguiente: Neurona 4 a “N__ (Nos L-ARGININE 270i hase (Ras) 239 I> 0 L-CITRULINE NADPH NADP 179 Basado en estos datos y en nuestros propios resultados, hemos propuesto -en colaboracién con los doctores Divac, de la Universidad de Copenhague, y Edvinsson, de la Universidad sueca de Lund-, que ciertas neuronas corticales, productoras de NO, pueden jugar un importante papel en el control fino de la vasodilatacién cerebral. Musculo Liso Neurona Relajacién Debemos destacar aqui, que con el estudio del NO se describe por primera vez la accién de un mensajero celular retr6grado, que producido por la neurona postsindptica tras su activaci6n por la presinaptica, pueda ejercer su accidn sobre ésta ultima, modificando asi su actividad. jEste tipo de accidn fue propuesto por Hebb en 1949!. La actividad del NO en el cerebro esta siendo investigada intensamente, y su relaci6n con el glutamato, el neurotransmisor excitador mas abundante en el cerebro, junto a su actividad retrdgrada, hacen que se le considere implicado en fendédmenos de la trascendencia de la plasticidad neuronal, la memoria, asi como en 180 procesos de citotoxicidad tras episodios de hipoxia e isquemia. En tal sentido parece establecido, segtin los resultados obtenidos mediantes experimentos fisioldgicos, farmacolégicos y de comportamiento, que el NO esta efectivamente involucrado en los procesos de aprendizaje y de memoria. El hecho de que el drea cerebral directamente implicada en esos procesos, el hipocampo, presentara un bajo numero de neuronas productoras de NO, ha planteado un problema de interpretacién de esos resultados. No obstante, experimentos realizados por nuestro grupo estan poniendo de manifiesto la posibilidad de que sean las neuronas piramidales del asta de Ammon las encargadas de producir el NO, con la particularidad de que el enzima no se encuentre en esas células de modo constitutivo sino inducido. A pesar de los rapidos avances ocurridos en esta materia, nada sabemos atin del papel que el NO puede jugar presindpticamente. Finalmente, puesto que la mayoria de los pacientes afectados presentan altera- ciones que provocan algiin tipo de incapacidad fisica y/o mental con una notable incidencia personal y familiar, debemos recalcar que son, sobre todo, razones humanitarias las que justifican nuestra dedicacion al estudio del "Sistema Nervioso”. 181 TS - 7 > a a ae | lone Ee a Oe S0p Isles” oibures bs alias = =a ey ‘ a hemos dexacar agul,.onsé cog ¢l Granta. de} NO on tess po neta 3 cia fe un menmpero ceinise-retmderado. que orodieata aor ia me MER 5 ! oS oof la proeus aul bara Rs “jer Cer att aceite, sate, 7 Jo af ow activdad.. [Est tine co j = “~ ° A i 7 : 7 —_ Fee's ify i = NO en et corbroems senda unveatigeds Inq ee a OMA €. Ma Olam prgoF. “2Clinict as abundante. ext ed re “2 isu ictivudad retiygruts, hacen que se ie comaidese, amplicadey a, e {rascende RCN dc la pineticdad.nevronal, i menor, ast como ga ‘3 = © ¥ _ _ 7 ; iG Ae yy = é : et pe — eat . ; a a Lae 7 — - me 7 - = id a SS] - _—s ee aves lO 1 “4 a Rev.Acad.Canar.Cienc., V (Nim. 4), 183-196 (1993) CONSTESTACION AL DISCURSO DE INGRESO DEL ACADEMICO DE NUMERO DR. D. JOSE REGIDOR GARCIA POR EL ACADEMICO DE NUMERO DR. D. JUAN JOSE BACALLADO ARANEGA. Excmo. Sr. Presidente de la Academia Canaria de Ciencias, Excmo. y Magf. Sr. Rector de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Iltmos. Sres. Académicos, Sras. y Sres.: Cumpleme el honor de contestar y dar la bienvenida, al seno de la joven Academia Canaria de Ciencias, al nuevo Académico de numero Dr. D. José Regidor Garcia, segun acuerdo tomado en su dia por la Junta de Gobierno de la citada Institucion. Quisiera aclarar que quien les habla es un lego en la materia que nos ocupa, lo que el ilustre recipiendario titula como "La Década del Cerebro", y que tan magistralmente ha resumido para hacernos llegar a todos la enorme importancia y trascendencia de las investigaciones a nivel mundial sobre el Sistema Nervioso. El Dr. Regidor, a quien tuve como alumno en una €poca irrepetible y yo diria que épica por cuanto la Universidad de La Laguna vivia intensamente el despertar de las libertades, conoce mis inclinaciones por el naturalismo sensu lato y por el empeno en dar a conocer, catalogar e investigar en profundidad la fauna marina y terrestre del Archipiélago Canario, con la inestimable colaboracion de varios equipos cientificos Cuyos componentes ejercen hoy dia su magisterio con solvencia y autoridad en ambas universidades canarias, siempre con la finalidad, para nosotros esencial, de salvaguardar y conservar un Patrimonio Natural de primera magnitud que se encuentra seriamente amenazado. Asi pues, no seré tan osado de contestar en profundidad aspectos de la Ciencia que me son casi ajenos y a los que sdlo tengo acceso muy colateralmente y siempre en el campo de los invertebrados. Los veintitres aNos de docencia en la Universidad de La Laguna nos han ensenado que las disciplinas zooldgicas, desde nuestro punto de vista imprescindibles y fundamentales, siempre deben estudiarse a la luz de la anatomia comparada; asi, a pesar de la enorme diversidad que presenta el Reino Animal, es 183 dable comprobar que sus estructuras -aparentemente diferentes- podemos referirlas a unos pocos niveles de organizaci6n o arquetipos. Todos aquellos animales que responden a un mismo arquetipo constituyen un tipo taxondmico (lo que conocemos como tronco o filo). El nucleo basico de conocimientos necesarios en el estudio de los animales esta constituido por lo anatdémico, lo fisioldgico y lo ecoldgico, que muestran una gran variabilidad, la cual nos pone en contacto con el fenédmeno fundamental del Reino Animal, su gran diversidad. La Morfologia representa una ciencia abstracta que al interpretar y explicar la estructura y la organizaci6én en los animales, constituye -como senala GADEA (1976)"l- la columna basica de la Zoologia. Evidentemente se apoya en datos concretos procedentes de la anatomia comparada, la embriologia, la paleontologia y la teratogenia. La cabal comprensién de los animales es sin duda obra de un proceso de sintesis en el que debemos ser capaces de ensamblar toda una serie de conocimientos adquiridos en su estudio, tales como: anatémicos, fisioldgicos, ecoldgicos y etolégicos, convenientemente asistidos (Gadea, op. cit) por otras ramas bioldgicas, en especial por la genética y la bioquimica. Sin duda, la formaci6n académica del Dr. Regidor, al menos durante esos ilusionados anos de los comienzos en que nuestros esfuerzos se reparten en todas las direcciones cortacircuitando a las sufridas meuronas, propiciO muy tempranamente su dedicaci6n a una de las especialidades anatomo-fisioldgicas, pero sin olvidar nunca el trasfondo y el mensaje que la biodiversidad y la Naturaleza de nuestro Planeta encierran y nos trasmiten cada dia. De ahi que el nuevo acadeémico comience su disertacién sobre la "Década del Cerebro" con una cita de Lucrecio (De Rerum Natura, libro Il) que encierra una filosofia muy bien asumida por Regidor en su quehacer cientifico: "Para disipar los terrores, esas tinieblas del espiritu, no se necesita de los rayos del sol ni de los trazos luminosos del dia, sino del estudio racional de la Naturaleza". Como muy bien ha puesto de manifiesto el Dr. Regidor, la Federacién Mundial de Neurologia, con la colaboraci6én de la Organizacién Mundial de la Salud y, en general, con la de variadas instituciones, universidades y centros de investigacion 184 de reconocido prestigio, declararon la década de los aNos noventa como "Década del Cerebro" (Decade of the Brain), decisi6n asumida asimismo por el Congreso de los Estados Unidos. Desconozco como se ha desarrollado, el pasado mes de septiembre, el XV Congreso Mundial de Neurologia, pero, ano dudarlo, los avances obtenidos en este primer congreso de la ya mentada década, asi como sus conclusiones abriran una puerta a la esperanza para los miles de enfermos que padecen esta o aquella dolencia de tipo neurolégico. En palabras del neurdélogo canario Dr. Fernandez Martin®!: "La Década del Cerebro, como programa de estimulo, coordinacién y ayudas para la financiacién de proyectos de investigaci6n neurolégica, establecid, a titulo de orientacién, diez lineas de trabajo en otros tantos grupos de enfermedades, a saber: las neuro-musculares, los traumatismos craneo-encefalicos, la enfermedad de Parkinson y sindromes afines, los tumores cerebrales, las enfermedades desmielinizantes del grupo de la esclerosis multiple, la enfermedad de Alzheimer y otras demencias tardias, los trastornos del sueno, las migranas y otros dolores de cabeza y los trastornos ocasionados por la patologia de la circulaci6n cerebral". Ya el Dr. Regidor, en linea con los ultimos avances en la materia, nos ha ilustrado sobre las nuevas metodologias e instrumentos que la "NEUROCIENCIA" -que define como el estudio interdisciplinario del Sistema Nervioso- pone al servicio del diagndstico y tratamiento de las enfermedades cerebrales: angiografia digital, resonancia magnética nuclear y tomografia axial computerizada. Sobre esta ultima técnica destaca las nuevas perspectivas abiertas por los estudios informaticos relacionados con el analisis de redes de neuronas formales que con toda probabilidad -como asegura Crick- supondra un paso de gigante en lo que a la comprension de las propiedades computacionales del cerebro se refiere. Asimismo otros avances en neurobiologia podrian ser los trasplantes neuronales; las células muertas no son reemplazadas a menos que se realicen injertos con células tomadas de embriones, lo que podria ser un buen tratamiento para solventar -quizas en un futuro proximo- algunas lesiones cerebrales (Pérez Batista com. pers.). 185 En Francia (Instituto Gustave Roussy de Villejuif) el Dr. Perricaudet y colaboradores han experimentado con éxito, por métodos de terapia genética, en cerebro de ratas. La estrategia consiste en transferir un gen "terapeutico" a una célula por medio de un adenovirus. Este equipo de cientificos ha demostrado que la tecnica funciona muy eficazmente en el caso de las neuronas. Los investigadores lo han probado con un gen "delator", que dirige la producci6n de una enzima, la B- galactosidasa. Si se inyecta localmente una suspension de virus en el cerebro de ratas, la mayoria de las neuronas de los alrededores integran este gen extrano de forma duradera. Este resultado permite considerar aplicaciones multiples en el tratamiento de las enfermedades neurovegetativas, en las que el gen "terapeutico" tendria la misiOn de paliar un déficit en un neurotransmisor, e incluso de producir un factor de crecimiento de las neuronas. Los injertos de células o transplantes neuronales a los que aludi con anterioridad, y que al parecer se estan experimentando en enfermos de Parkinson, podrian tener en la terapia genética un sustituto 0 una alternativa importante. Parafraseando lo que tan claramente ha expuesto el Dr. Regidor al comentar el papel y los avances de la NEUROCIENCIA: "El salto cualitativo es de tal magnitud que los resultados estan indicandonos que es ahora cuando verdaderamente tenemos esperanza de comenzar a conocer la probable solucion a muchas de las enfermedades neuroldégicas y psiquiatricas". A niveles populares, del hombre y mujer de la calle, del ciudadano de a pie, O por decirlo mas finamente del tejido social menos preparado, lo mas corriente que se oye y comenta sobre el cerebro suele ser la clasica frase: "el hombre no conoce Su propio cerebro, no utiliza mas que una minima parte del mismo, desconoce sus propias capacidades, etc., etc. El cerebro humano, sede de la inteligencia, creatividad y memoria, consta -al final de la adolescencia- de alrededor de un billon de células, de las cuales unos cien mil millones son neuronas, concatenadas en redes. Estas neuronas -cada una de las cuales puede recibir 10.000 informaciones distintas al tiempo- sdlo se multiplican durante la infancia y un poco en la adolescencia, para seguidamente pasar a sobrevivir. El eminente catedratico y director del departamento de neurobiologia de la 186 facultad de medicina de Harvard, doctor Gerald D. Fischbach®™), en la introduccién general de la monografia MENTE y CEREBRO publicada el presente ano por la conocida revista Investigacién y Ciencia (Edicidn espanola de Scientific American), realiza un certero comentario que nos ilustra a la perfeccién sobre el tema que hoy nos ocupa, y que no me sustraigo de resumir: "§De qué forma ejerce su influencia la mente inmaterial sobre el cerebro? 4Como actua éste sobre aquella?. Descartes, al abordar esta cuestiOn, hallabase en desventaja. Ignoraba que el cerebro es la estructura mas enrevesada del universo conocido, de complejidad suficiente para coordinar los dedos de un concertista O para crear un paisaje tridimensional a partir de la luz que incide en una retina bidimensional. No podia saber que la maquinaria del cerebro esta construida y mantenida conjuntamente por genes y experiencias. Y como es obvio, desconocia que la versi6n actual es fruto de millones de anos de evolucidn. El cerebro resulta dificil de comprender porque, a diferencia de un ordenador, su construcci6n no obedece a propdsitos especificos ni se atiene a principios concretos de diseno. La seleccioén natural, fuerza motriz de la evolucion, es responsable". "De haber sabido Descartes todas estas cosas hubiera podido preguntarse, al igual que lo hacen los neurdlogos modernos, si el cerebro posee complejidad suficiente para dar cuenta del misterio de la imaginaciOn humana, de la memoria y de los estados de animo. La indagacién filosofica ha de ser complementada por experimentos, que se cuentan hoy entre los mas urgentes, apasionantes y dificultosos de toda la ciencia. Nuestra supervivencia, y posiblemente la del Planeta, depende de que conozcamos mejor la mente humana". "Las caracteristicas mas llamativas del cerebro humano son los grandes hemisferios encefalicos, de manifiesta simetria, asentados a horcajadas sobre el nucleo central, que se extiende y desciende hasta la médula espinal. Estos hemisferios, de superficie rica en pliegues y circunvoluciones, se encuentran recubiertos por una corteza laminar de unos dos milimetros de espesor. La corteza cerebral se subdivide, atendiendo a criterios morfoldgicos y funcionales, en numerosas zonas de recepcion sensorial, en zonas de control de actividades 187 motoras y en zonas menos nitidamente definidas donde acontecen procesos asociativos". "Casi todos los fendmenos de pensamiento y percepcidn se traducen en impulsos eléctricos nerviosos, denominados potenciales de accién, que se mueven sobre la corteza y a través de ella. Algunas regiones cerebrales dotadas de funciones especializadas han sido estudiadas con detalle, como la corteza motora, la corteza somatosensorial y la via Optica". "De la actividad colectiva de todas las regiones cerebrales aflora la mente". Esa mente que aun hoy dia desconoce, como bien nos ha ilustrado el nuevo Académico, la etiologia de sus mas graves enfermedades: el Parkinson y la bautizada como "enfermedad del olvido" o de Alzheimer; de esta ultima hay en la actualidad -sdlo en Espana- unas 250.000 personas que la sufren, cifra que, con toda probabilidad, aumentara en el ano 2000 a mas de 400.000, debido al paulatino envejecimiento de la poblacién y a la mayor certeza de los diagndsticos. Un grupo de expertos internacionales han puesto de manifiesto en la llamada "Declaraci6n de Madrid" (Marzo de 1993) que la enfermedad de Alzheimer se ha convertido en el tercer problema de salud en los paises desarrollados. Es pues necesario una mayor atencién para todas estas enfermedades, estando mas que justificado un esfuerzo econdédmico de cara a una investigacién intensa y continuada, lo que parece se esta llevando a cabo dadas las graves consecuencias asistenciales y la enorme carga econdmica que acarrea esta patologia (San Luis, 1993)". Asimismo, el 60% de los enfermos de SIDA declarados padecen alguna forma de demencia. Incluso los comienzos de la enfermedad son detectados en muchos casos por pérdida de memoria, reflejos, y trastornos en el lenguaje. Por otra parte son muchos los secretos, aun no resueltos, de la comunicaci6n entre las células nerviosas, como por ejemplo la inactivacién de los mediadores quimicos que son responsables de esa comunicacion neuronal; o la investigaci6én sobre !os mecanismos moleculares que incluyen el cOmo una neurona decodifica el mensaje quimico que le llega proveniente de otra neurona. Llegado a este punto me detendré, al igual que lo ha hecho el profesor 188 Regidor, para analizar brevemente el interesante y sorpresivo descubrimiento del papel que el Oxido nitrico (NO) juega como regulador bioldgico universal, lo que le ha valido a este conocido gas de contaminacién ambiental el ser elegido molécula del ano. Efectivamente, en el ano 1987 el hondureno Salvador Moncada y colaboradores, investigadores del laboratorio Wellcome del Reino Unido, descubren que la referida molécula inorganica (NO) jugaba un papel critico no solo como reductor de la tension arterial y defensa contra la trombosis, sino como mediador importante en el proceso de formaciOn de la memoria y en el origen de la impotencia del varon. Ya en los inicios de la década de los 80 se conocia que el endotelio vascular -como ha resaltado el Dr. Regidor- producia una sustancia que se bautizo como "FACTOR RELAJANTE DERIVADO DEL ENDOTELIO" (EDRF), que parecia jugar un papel importante en la dilatacion permanente de las arterias y que resulto ser algo tan simple como el Oxido nitrico. Pero, en palabras del propio Dr. Moncada: "lo mas sorprendente ha sido el haber descubierto la existencia de este gas inorganico en el sistema nervioso central, actuando como molécula mensajera entre las neuronas del cerebro y los nervios perifericos distribuidos en todo el organismo. El estudio de este fenomeno dara lugar a grandes revelaciones en el campo de la biologia en los proximos anos". (Diario El Pais, 1993). El citado investigador destaca como muy novedoso el descubrimiento de una serie de nervios, que bautizaron como nervios nitrérgicos, ..." cuya principal caracteristica en que son capaces de producir oxido nitrico". "Estos nervios los hemos encontrado, sigue diciendo Moncada, en muchos lugares del cuerpo humano como, por ejemplo, el aparato respiratorio, en el estomago, en los bronquios, en el corazon,,, y en el pene. Hemos comprobado que los nervios responsables de la dilatacion peneana son nitrérgicos, lo que significa aue si no se produce suficiente cantidad de oxido nitrico (NO), el pene no se dilata y, por tanto, no hay ereccion produciendo en el paciente impotencia". (Barbera'!-Moncada™!, 1993). Llegado a este punto quiero resaltar que si bien se ha investigado y se conoce el sistema que controla el flujo sanguineo cerebral general, hasta el presente no se habia encontrado ningun otro que lo controlara a nivel local. Y aqui viene la gran 189 aportacion del Dr. Regidor y colaboradores, en una investigaciOn puntera llevada a cabo por el nuevo académico junto a los doctores Edvinson (Universidad de Lund, Suecia) y Divac (Universidad de Copenhagen), lo que supone para la Universidad de Las Palmas un orgullo y un éxito internacional. Dichos investigadores han demostrado que numerosas neuronas clasificadas como NADPH-diaforasas, que sintetizan el NO, se encuentran cerca de los puntos de ramificacion de las arteriolas que descienden a través de la corteza cerebral desde su superficie "pial". Esta relacion espacial sugiere la posibilidad de un control neural del flujo sSanguineo cortical por las mentadas neuronas, mediado - posiblemente- por la accion rapida del Ooxido nitrico. Hace tan solo unos meses la prestigiosa revista Brain Research ha aceptado un trabajo de Regidor y colaboradores donde proponen la participacio6n del NO en los procesos de Memoria, senalando las neuronas productoras de la referida molécula inorganica en las areas implicadas en dicho proceso. Sea como fuere parece incuestionable que el Oxido nitrico es una molécula mensajera nueva cuya importancia se revela como extraordinaria. Estos trabajos del profesor Regidor me dan pie para -en honor a la brevedad- entrar de lleno en una sencilla semblanza humana y curricular del companero Academico. José Regidor Garcia nace en Las Palmas de Gran Canaria en Septiembre de 1949 en el seno de una familia cuya dedicacion primordial es el comercio y la economia. Como el mismo me ha comentado: ..."desde el punto de vista profesional he sido el garbanzo negro de la familia, ya que no me interesaron los aspectos comerciales, aunque nunca me faltaron el apoyo, aliento y confianza de mis padres". Durante ei bachiller mostrO6 una gran predileccidn por las Ciencias Naturales y la Quimica, hasta el punto de haber montado un laboratorio muy completo en su propia casa, remarcando asi sus claras e innatas inclinaciones por el terreno experimental. Sus grandes recuerdos estan ligados a €pocas mas calmas y reposadas de dos ciudades que han caminado siempre hermanadas: Las Palmas, donde realiz6 Sus estudios primarios y de ensenanzas medias y La Laguna, en cuya Universidad 190 se licenciéd y doctor6. Segtin sus propias palabras: "no cambiaria por nada su estancia en la ciudad de los Adelantados de la que guarda un recuerdo imborrable". Muy pronto entr6 como alumno interno en el Departamento de Citologia e Histologia de la citada Universidad, donde, de la mano de los profesores Marin Girén y Lépez Garcia lleva a cabo una investigaci6n muy en la linea clasica mantenida por ese Departamento casi desde sus inicios, y que ha versado sobre la corteza cerebral de reptiles endémicos de Canarias, especialmente de lagartos del género Gallotia, que representan un claro ejemplo de evolucién y diversificacién insular. Su Tesina de Licenciatura leida en 1974, "Estudio morfoldgico y biométrito de las neuronas corticales de Lacerta (Gallotia) galloti", obtuvo la maxima calificacion. El Dr. Carlos Lopez Garcia se convierte en su tutor, orientandole en las investigaciones que le llevan a la elaboraci6n de su Tesis Doctoral: "Tipologia neuronal y organizacion de la corteza cerebral de Lacerta galloti. Estudio con los métodos de Golgi". La calificaci6n de Sobresaliente Cum Laude ante un cualificado tribunal y su posterior publicaci6n hablan de la bondad de la misma. Se trata de una investigaci6n profunda de las poblaciones celulares de la corteza cerebral del reptil Squamata, Gallotia galloti (Dum. et Bib), a través del analisis de los distintos tipos neuronales que componen dichas poblaciones, discutiendo la importancia de las técnicas de Golgi y contribuyendo a la elaboraci6n de un modelo de la organizaci6n estructural y funcional de la corteza cerebral de reptiles. Quien suscribe estas lineas pudo vivir los comienzos, gestacién y desarrollo del Departamento de Citologia e Histologia de la Universidad lagunera, desde los pioneros, Dra. Genicio y Dr. Vazquez, pasando por los catedraticos Marin Girén, Lopez Garcia y Fernandez Ruiz, hasta la consolidacién definitiva con el actual equipo que dirige el Dr. Pérez Batista. A pesar de las no muy largas estancias de algunos de ellos, puede afirmarse que la colaboraci6n e investigaci6n mantuvo una linea uniforme y equilibrada, en la que el Dr. Vazquez supo despertar vocaciones como la del Dr. Regidor, que luego se encargaria de acrecentar el Profesor Marin, verdadero aglutinador en unos anos de gran trabajo, movimiento e incluso legitimas discrepancias. 191 La verdadera gran preocupacién de José Regidor durante su carrera es y sigue siendo la interpretacién de los fendmenos fisiol6gicos, tomando como base el conocimiento profundo del sustrato anatémico en que se sustentan. Segun sus propias palabras: "Trabajo Anatomia porque me gusta la Fisiologia". Durante unos anos continua sus investigaciones en la misma linea y con las referidas tecnicas de Golgi, aunque con un cambio de escenario y de ambiente que, en principio, le Supuso un brusco replanteamiento de sus esquemas y !o que el mismo define como el encuentro con los médicos. Efectivamente, el mismo ano de la lectura de su Tesis -1976- ingresa como Profesor Adjunto contratado en el Departamento de Biologia, Divisidn de Medicina del Colegio Universitario de Las Palmas -donde conto con el apoyo del Dr. Luque y las Dras. Castellano y Palomino- iniciando asi Su experiencia docente, pasando por una serie de altibajos al carecer de un equipo de trabajo y encontrar serias dificultades para crearlo. Un tanto desilusionado de la Universidad -en la que también ejercio otras obligaciones: Director en funciones del Departamento de Biologia de CULP y Profesor de Citologia y Embriologia (Anatomia) de la Escuela Universitaria de Enfermeria de Las Palmas- encuentra como solucién mas idénea su marcha al extranjero en busca de una mas solida formaciOn y de apoyo para sus investigaciones. Asi, en 1979 le conceden una beca postdoctoral del Comite Conjunto Hispano-Norteamericano para la Cooperacion Cientifica y Tecnoldgica, desplazandose a Boston con la familia y la casa a cuestas. Con el apoyo incondicional de su esposa Angela y de sus dos hijas, Adriana y Leticia, inicia su experiencia americana que él mismo senala como extraordinaria desde el punto de vista cientifico y humano. El Departamento de Anatomia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Boston lo admite como Profesor Visitante, iniciando nuevos trabajos e investigaciones con el Dr. Alan Peters, de las que cabe destacar el analisis de las neuronas no piramidales de la corteza visual del gato. Tras esta fructifera etapa regresa a Las Palmas, donde tropieza con los mismo problemas ala hora de formar equipo. Al propio tiempo va abandonando su habitual linea de trabajo en reptiles para dedicarse a mamiferos, e inicia una nueva linea sobre histoquimica de enzimas. 192 Gana la plaza de Profesor Adjunto Numerario de Citologia e Histologia Vegetal y Animal de la Universidad de Granada, pero pasa a ejercer como Profesor Titular Supernumerario y Jefe del Departamento de Biologia del CULP, en uno de esos raros privilegios de que han disfrutado y a veces padecido las universidades periféricas. Continua como Director del Departamento de Biologia del CULP, hasta que en Diciembre de 1989 toma posesiOn como Director del Departamento de Morfologia de !a Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, haciéndose cargo asimismo del Programa de Doctorado del citado Departamento. Pero seria en 1985 Cuando inicia otra no menos fructifera etapa de investigaciOn, marchando a Copenhague para trabajar, junto al Dr. lvan Divac, en el Departamento de Neurofisiologia de aquella Universidad, manteniendo esa colaboracion hasta el dia de hoy con estancias de corta duracion, para lo cual recibe varias becas y ayudas entre las que destaca la otorgada por la Fundacion Europea de la Ciencia. Los proyectos abordados giran en torno al cerebro de mamiferos: a) Estudio comparado del talamo dorsal y corteza prefrontal en Monotremas (Echidna) y en Insectivoros; b) Origen de las proyecciones cortico-corticales y cortico subcorticales en la rata. En el primer caso un trabajo suyo aparece publicado en la prestigiosa revista Brain, Behavior and Evolution, donde aborda, junto al Dr. Divac, la arquitectura del equidna Tachyglossus aculeatus y |a compara con la de la rata, concluyendo tentativamente que esta estructura cerebral de los equidnas corresponde al nucleo medio dorsal en especies placentarias. Estos trabajos, desde mi punto de vista, resultar esenciales de cara al cabal conocimiento de aspectos evolutivos y filogeneticos que aun no estan completamente despejados. Téengase en cuenta que los Monotremas (Prototerios) poseen los caracteres basicos de los Mamiferos (pelo, glandulas mamarias, etc.) pero difieren claramente de los restantes Mamiferos (Terios: Marsupiales + Placentarios) y presentan muchos Caracteres reptilianos. Ponen huevos, que son incubados y eclosionan fuera del cuerpo de la madre. Aunque la regién del neopalio del telencéfalo esta mucho mas desarrollada que la de los Reptiles, no tienen cuerpo calloso de conexion entre ambos hemisferios cerebrales. AsSimismo hay semejanzas con los Reptiles en los 193 sistemas reproductor y excretor, como la presencia de cloaca (ano-genital), y un largo etcétera. En fin, que investigaciones como la que acabo de referir nos ilustran sobre la personalidad del Profesor Regidor y su forma de pensar, marcada sin duda por un sustrato biologico que lo guia y lo motiva. No en vano presiden su despacho las fotos de Charles Darwin, consolidando su concepto evolutivo bien arraigado; S. Ramon y Cajal, maestro y espejo para quien -sin tener una explicacién plausible- siente, desde el inicio de su carrera, verdadera pasion por el estudio del Sistema Nervioso; y por ultimo la de Severo Ochoa, que marca la pauta de la intimidad celular, el como funciona y trabaja la célula. El Dr. Regidor gana la Catedra en el ano de gracia de los grandes fastos del 92; es ahora cuando el esfuerzo sera mayor, pues su espiritu insatisfecho -propio del buen investigador- asi como su gran vocacion e infinita paciencia le llevaran a la consolidaciOn de un gran equipo investigador en la Universidad de Las Palinas de Gran Canaria. Ha publicado una treintena de trabajos de investigaciOn en revistas de gran impacto, entre las que destaco: Journal Neurosciencie Methods; Brain, Behavior and Evolution, Journal of Comparative Neurology, Trabajos del Instituto Cajal de Investigaciones Bioldgicas, Morfologia Normal y Patologica, Anatomy and Embryology, etc. Su asistencia a congresos nacionales e internacionales ha sido importante y continuada, habiendo presentado alos mismos una cincuentena de comunicaciones y ponencias de gran relevancia. Destacaria la presencia del Dr. Regidor en sucesivos encuentros de la Sociedad Europea de Neurociencia en Alemania, Holanda, Belgica, Francia, Italia, Suiza y Espana, asi como en los mundiales de Neurociencia de Alemania Federal, Hungria y Canada. Ha dirigido media docena de Tesis Doctorales, dictado numerosas conferencias y ha desarrollado varios proyectos de investigacion financiados por la Comunidad Autonoma de Canarias. Pertenece a varias sociedades_ cientificas: Asociaci6n Europea de 194 Neurociencia, International Brain Research Organization, Sociedad Espanola de Neurociencia, etc. Es socio fundador de la Sociedad Espanola de Histologia y de la Sociedad Canaria de Neurociencia. No quisiera terminar sin recordar, como tantas veces me repitio el Dr. Regidor en las conversaciones mantenidas previas al acto que hoy concita nuestra atencion, al maestro de los maestros: Santiago Ramon y Cajal. Los avances en estos ultimos anos han venido a resaltar el hecho de que Cajal fue un adelantado de su tiempo. Las técnicas por él empleadas en el estudio del Sistema Nervioso siguen siendo hoy una herramienta util y en muchos casos imprescindible para el conocimiento del mismo. Aplicacion de tecnicas combinadas neuroanatoémicas, neuroquimicas y de neurobiologia molecular, han venido a corroborar hechos que ya habian sido apuntados por Cajal usando otras mas rudimentarias y menos sofisticadas. La conocida obra de Cajal "Textura del Sistema Nervioso del hombre y de los vertebrados" (publicada en 1898) es considerada todavia como el trabajo unico mas importante en el campo de la neurobiologia. Desde esa €poca parece claro que para comprender el cerebro los neurobidlogos deben entender no solo como se hallan construidas las distintas subdivisiones del mismo, sino también su finalidad, aprendiendo en detalle como funcionan las estructuras individuales y como funcionan en grupo. Asi procede en su trabajo José Regidor, teniendo por delante un interesante Camino que, en estos anos, se vislumbra como muy prometedor y plagado de sorpresas. Es de esperar, que paralelamente a las intensas investigaciones sobre el cerebro en esta crucial década, la ética y la inteligencia del hombre puedan vencer nuestra capacidad de destrucci6n del Planeta, un fragil ecosistema cerrado que se nos escapa de las manos. En nombre de la Academia Canaria de Ciencias doy la bienvenida al Dr. Regidor, profesor y amigo, de cuyo trabajo esperamos mucho, pues sabemos que lo mejor esta aun por llegar. Su obra, su talante y su humanidad son una garantia. He dicho 195 . BARBERA, J.M., 1993. Entrevista a Salvador Moncada. Antena Semanal, n° 658. 1 de Agosto de 1993. Madrid-Barcelona. . FERNANDEZ MARTIN F., 1993. Década del Cerebro y estudios en epilepsia. Tribuna Libre: Diario Canarias 7. Miércoles 30 de Junio. p. 18. . FISCHBACH G.D., 1993. Introduccién general. In: Mente y Cerebro. Libros de Investigacién y Ciencia. Prensa Cientifica, S.A. Barcelona. . GADEA E., 1976. La base morfoldgica de la zoologia. Mem. de la Real Acad. de Ciencias y Artes de Barcelona. n° 781. Vol. XLIII (7): 195-274. . MONCADA, S., 1993. Sobre el Oxido Nitrico. Futuro: Medicina. Diario El Pais. Miércoles 14 de Abril. p. 3. Madrid. . SAN LUIS O.G., 1993. Alzheimer. Revista "TU SALUD" Septiembre, pp: 12-17. Madrid. 196 NORMAS PARA LA REDACCION Y ENVIO DE ORIGINALES 1. GENERALES ll. La Revista de la Academia Canaria de Ciencias publica articulos de investigaci6n que sean inéditos, sobre temas de Matematicas, Fisica, Quimica y Biologia. La Revista acepta también trabajos sobre " Historia y Filosofia de la Ciencia ", especialmente referidos a las materias citadas, si bien en esta Seccién sdlo aparecera un maximo de dos trabajos en cada uno de los numeros que se publiquen. 1.2. Dado que la Revista utiliza el sistema offset de edicidén, empleando como original el que facilitan los autores, se aconseja a éstos el maximo cuidado en su confecciOn, usando una maquina eléctrica con cinta plastica negra o cualquier sistema de tratamiento de texto con impresora laser, sobre papel blanco de buena calidad tamafio DIN A-4. 1.3. El texto de cada trabajo, redactado en espafiol o en inglés (o bien en cualquier otro idioma a juicio del Comité Editorial), no debera exceder de 16 paginas, aunque se recomienda una extension de 6 a 10 paginas como promedio. El limite maximo para los destinados a la Seccién de Historia y Filosofia de la Ciencia es el de 25 paginas. Se entienden, tanto en un caso como en el otro, incluidas Notas, Bibliografia y Tablas. 1.4. El envio de cualquier original (cuyas hojas deberan ser numeradas con lapiz en el margen superior izquierdo), ha de ir acompafiado de una copia, y se dirigira a: Director-Editor Profesor N. Hayek Revista de la Academia Canaria de Ciencias Facultad de Matematicas Universidad de La Laguna Tenerife, Islas Canarias (Espafia) 2. PRESENTACION DEL TRABAJO 2.1. La caja o espacio ocupado por el texto en cada pagina, ha de tener unas dimensiones de 17 cm de ancho por 25 cm de largo, dejando margenes de 2 cm a cada lado y a 2 cm del borde superior de la pagina. 2.2. Se escribira a doble espacio entre lineas. 2.3. La pagina de introduccidén debe comenzarse a 5 cm del borde superior de la misma y ha de incluir los siguientes datos: Titulo del trabajo (en letras mayusculas centrado); Autor (inicial del nombre y apellido del autor, y lo mismo caso de ser varios los autores); Centro donde se ha realizado, con direcci6n postal; Abstract en inglés (con una extension maxima de _ 150 palabras) y Resumen en espafiol (con tope de igual extension); Key words o Palabras clave. 2.4. El comienzo de los parrafos tendra una sangria de cinco espacios. 2.5. Los encabezamientos de cada seccién (INTRODUCCION, PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS, DISCUSION, etc ...) mumerados correlativamente, seran escritos con letras MAYUSCULAS sin subrayado y centrado en el texto. Los encabezamientos de subapartados o subsecciones, numerados en la forma 1.1, 1.2, ..., 2.1, 2.2, .., se escribiran con letras minusculas subrayadas al margen izquierdo. 197 2.6. Las notas o llamadas, escritas con letra mas pequefia(*) y con un espacio entre lineas, figuraran a pié de pagina, precedidas de un indicativo, por éjempla, (*), 17"); sete... 2.7. Las referencias bibliograficas, intercaladas en el texto, contendran los nombres de sus autores seguidos de un corchete de la forma [ ], en el que figurara el numero correspondiente de la Bibliograffa; por ejemplo, G. CANTERO [23] 6 sdlo apellido, CANTERO [23]. A veces (y esto se deja a criterio del autor), el texto quizads requiera poner simplemente sdlo el ntmero de la bibliografia, o sea [23], sin citar autor. 2.8. Las Tablas han de numerarse con numeros romanos. Las figuras y dibujos (en tinta china) o fotograffas (en blanco y negro y papel brillante) deberan ser numeradas consecutivamente y con numeros arabigos. Los Apéndices (si los hay), se incluiran al final del texto, antes de la Bibliografia. 2.9. BIBLIOGRAFIA: Toda la bibliografia debe ser escrita por orden alfabético de apellidos (por ejemplo, DAVIS, E.G.; GONZALEZ, E. Y PEREZ, J.; MANRIQUE, S.; ...). Las referencias bibliograficas de articulos deberadn contener: autor (en mayusculas), afio de publicacién, revista, volumen y paginas; por ejemplo, WATSON, G.N. (1948), J. Diff. Geom., 3, 141-149. En caso de libros ha de incluirse: autor (en mayusculas), afio de publicacién, titulo (a ser posible, en cursivas o itdalicas), editorial y lugar de publicacién; por ejemplo, ELLIS, A.J. and MAHON, W.A.J. (1977), Chemistry and Geothermal Systems, Academic Press, London. 2.10. AGRADECIMIENTOS: centrado y texto a un espacio. 2.11. Se recomienda a los autores que tengan en cuenta los Reglamentos Internacionales de Nomenclatura para cada materia de las citadas en el apartado 1.1, asi como los _usos_ internacionales referentes a _ simbolos, unidades y abreviaturas. _ 3s NOTAS. FINALES 3.1. Los articulos seran sometidos a estudio por el Comité Editorial el cual, asesorado por expertos, decidira si procede o no a su _ publicacion, o bien propondra a los autores que hagan las modificaciones convenientes. 3.2. Por cada trabajo publicado, se entregaran al autor o autores, un total de 30 separatas. 3.3. El texto, incluidas figuras, tablas, diagramas,; €tc =:.,- de “um” trabayo publicado en la Revista de la Academia Canaria de Ciencias no podra ser reproducido sin permiso de la Academia Canaria de Ciencias. Nacere Hayek Director-Editor (*) Por ejemplo, Courier de paso 12. 198 INSTRUCTIONS TO AUTHORS 1. GENERALS 1.1. The Revista de la Academia Canaria de Ciencias publishes unedited research works in Mathematics, Physics, Chemistry and Biology themes. The Journal also accepts papers about "History and Philosophy of the Science", specially referred to the aforementioned subjects, though this Section will not publish more than two works in each number. 1.2. The Journal makes use of offset edition system, employing like original the one sent by the author; it is advised to write up the articles with too much care, using electric typewriter with black plastic ribbon or whatever text processing system with laser printing on good quality white paper at DIN A-4 size. 1.3. The text of each paper, written either in Spanish or English language or whatever one, allowed by Editor Committee, will have no more than sixteen pages, though it is recommended not to exceed six to ten pages. The limit of pages for the History and Philosophy of the Sciences Section is twenty-five ones.In both cases this includes Notes, Bibliography and Tables. 1.4. The sending of all originals (which pages have to be numbered with pencil on the left upper corner), should be enclosed with a copy and be sent to: Director-Editor Profesor N. Hayek Revista de la Academia Canaria de Ciencias Facultad de Matematicas Universidad de La Laguna Tenerife, Canary Islands (Spain) 2. PRESENTATION OF THE WORK 2.1. The text layout in each page, hag to have the following dimensions: 17 cm in width, 25 cm in length, 2 cm in each margin and 2 cm from the upper edge. 2.2. It will be written in double-spaced. 2.3. The introduction page has to begin 5 cm from the upper edge with the following information: Tittle (centered capital letters); Author (first name initials and surname, the same in the case of several authors); Institution where it was maked with postal address; Abstract written in English (at most 15SO words) and a Spanish Summary (with the same extension); Key words. 2.4. Each paragraph will have a 5 spaces indentation. 2.5. The correctly mumbered headlines of each Section (INTRODUCTION, EXPERIMENTAL PART, RESULTS, DISCUSSION, etc, ...) should be written in CAPITALS not underlined and centered. The subheadings and_ subsections headlines, numbered like 1.1, 1.2, ..., 2.1, 2.2, ..., will be written in underlined lower-case letters at the left margin. 2.6. The annotates, written in smaller letters(*) and one space between lines, will appear at foot of the page, preceded by an _ indicative, for (*) For example, Courier 12. 199 example,” (*)})¢**); ete: 2.7. The bibliography cross-references in the text, will contain the authors names and surnames followed by brackets like this [ ], with its respective number; for example G. CANTERO [23] or only the surname CANTERO [23]. It is possible, if the text requires it and the author desires it, to write only the number without the author name like [23]. 2.8. The Tables have to be numbered in Roman numbers. The figures and drawings (in black ink) or photographs (in shining black and white paper) have to be consecutive numbered in Arabic. The Appendixes (if they were) will be included at the end of the text, before Bibliography. 2.9. BIBLIOGRAPHY: Bibliography has to be written in surname alphabetic order (for example, DAVIS, E. G.; GONZALEZ, E. and MANRIQUE, S.; ...). The articles bibliographic references have to contain: author (in capitals), publication year, Journal, volume and pages; for example, WATSON, G. N. (1948), J. Diff. Geom., 3, 141-149. When it is in books, it has to contain: Author (in capitals), publication year, Tittle (in Italics if it is possible),publishing house and publication place; for example, ELLIS, A. J. and MAHON, W. A. J. (1977), Chemistry and Geothermal Systems, Academic Press, London. 2.10. ACKNOWLEDGEMENTS: centered and one-spaced. 2.11. It is recommended the authogs followed Nomenclature International Rules for each aforementioned subject in 1.1, as well as the international uses relative to symbols, units and abbreviations. 3. FINA NOTES 3.1. The articles will be submitted for consideration by Editor Committee that, advised by referees, will decide if the publication proceeds or not, or it will be proposed the author for making appropriate modifications. 3.2. The author (or authors) receive a total of 30 free reprints. 3.3. Working texts, included figures, tables, diagrams, etc., published in Revista de la Academia Canaria de Ciencias must not be reproduced without Academia Canaria de Ciencias license. Nacere Hayek Director-—-Editor 200 REVISTA DE LA ACADEMIA CANARIA DE CIENCIAS Folia Canariensis Academiae Scientiarum Volumen V - Nim. 4 (1993) INDICE Pags eee ee as) ws) Oe ee we ae: oe ee 8 elle el =" SECCION BIOLOGIA GIOCONDA SAN-BLAS - Dimorfismo y virulencia de hongos patdégenos para humanos: algunos aspectos bioquimicos . J. C. CARRACEDO y E. RODRIGUEZ BADIOLA —- Evolucién geolégica y magmatica de la isla de Lanzarote (Islas rn ee eae eee ee ee ek ee eS 25 A. M. GUTIERREZ NAVARRO, M. A. LEON-BARRIOS y J. CORZO La fijaci6n simbidética del dinitrégeno. Una revisi6én Ee nn ane ere fa ae a ak we ee eh 59 VIDA ACADEMICA Ege ee i tah Xa wo: GAS 0a Wm eS we my an ee Discurso de ingreso del Académico Numerario Dr. D. BO- ern Mat As DIAZ CHICO © 2. oe we oe ee 125 Discurso de contestaci6n por el Académico Numerario et ists GUtetnhena NAVARRO . 2s «6 se es we we 153 Discurso de ingreso del Académico Numerario Dr. D. JO- ree eee re i a Gane os eS ws! neo el a ie wt Se 167 Discurso de contestacién por el Académico Numerario feo JUAN JOSE BACALLADO ARANEGA:.. . «© « «= = =» = «» s 183 NORMAS PARA LA REDACCION Y ENVIO DE ORIGINALES .... 197 er feo te the os se SS ee we Se ee ee ee = ~«CUTSS - eee em a i rear, Ava te Cedia., “is sQoraluppad : api tals}, ped ating ‘eer, * The * — + ecu Sane qutitoPlalicteghl Q8niies, AJLGUAGARMEA SON. 2 : (T37), Chentnle Usaacewned salt intro Rosey ACKAGWERNGEMESTY: ceniced “and coh-epited; ie ; (‘OSS Gore iene Aiba ienieeipeibch emcee for seach afiMameyietiit Hts egy per ttiy Clas fades Sak! : eiSGve a Lie is wes @e miro Metin . . sme 2 - * - * hd > ‘hd = L— ria ere 4 | —— = MAA MAB) articies. with: Se ..suhtodred = for erisiengon.:; ty Laned tha wivie:st t¢7 refeceee, Weill deckide - ‘ifs pub icasion rcs oe pot, ar. ad Bini: BD Soh sethagshencae Pte? ziehs08 Seectinweh Semon id 2S} ar “Tletedas Gtdr ae OS eee ere 7 - - » her <= iners *~g@ s . 242 prem EAD Gedy ee 54. on mes, NOpeESeeaI AND,, hori Met) oe ie -Apectemte "a é ’ — i a i = Ay Vv : : ’ J 7 z 7 - 7 : ‘3 7 2 ae - a - : . : ee , 7 a Vie : ee a 2 ed 7 7 all aa = > ais — 7 if EP vie os he = : ( i wa : 4 f : ~ ail 3 4, ‘ \L i — ‘ ) ) 1 om ‘e f ¥ } i q ) 2 i = in i - - INDICE PRESENTACTON. . ~ ss ko 60a eee SECCION BIOLOGIA GIOCONDA SAN-BLAS - Dimorfismo y virulencia de hongos pat6genos para humanos: algunos aspectos bioquimicos . J. C. CARRACEDO y E. RODRIGUEZ BADIOLA —- Evolucién geolégica y magmatica de la isla de Lanzarote (Islas Canatias).-« <« « «© )& «. «= Jee Wee ee ee A. M. GUTIERREZ NAVARRO, M. A. LEON-BARRIOS y J. CORZO La fijacién simbidtica del dinitrdégeno. Una revisién GOmGral. « «ue se et ew Le Be ee ee ee ee eee VIDA ACADEMICA Aetividaedes. << « 3 «ss &» @ & eos wS oe eee eee Discurso de ingreso del Académico Numerario Dr. D. BO- WIFACIO WICOLAS DIAZ‘ CHICO... « 2 a sos & ee ee eee Discurso de contestacién por el Académico Numerario | Dr. D. ANGEL GUTIERREZ NAVARRO ... +5 «© «© «© «© «© = « Discurso de ingreso del Académico Numerario Dr. D. JO- SE REGIDOR GARCIA. « « «© + 2 8 @ & & 6 —@ wee eee Discurso de contestacién por el Académico Numerario Dr. D. JUAN JOSE BACALLADO ARANEGA ....++«+ = « « .NORMAS PARA LA REDACCION Y ENVIO DE ORIGINALES ... . INSTRUCTIONS TO AUTHORS. . .°..-. «+ «7s 4 Sele eee 25 59 119 +23 153 167 183 197 199