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上 海 科学 技术 文献 出 版 社

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生物 大 分 子 印 渍 技术 和 应 用
范 培 昌 “编著
上 海 科学 技术 文献 出 版 社 出 版 发 行
(上 海 市 武康 路 2 号 )
天 壮志 让 经 销
昆山 亭 宁 印 刷 厂 印刷

开本 787X1092 1/32 ”印张 9.25 ”字数 223, 000
1989 年 6 月 第 1 版 “1989 年 6 91 KB
印 数 ，1 一 4, 000
ISBN 7-80513-333-6/Q.12
定 价 5.70 元
《科技 新 书目 ?> 185-256

编 者 的 话

新 技术 的 开发 和 应 用 促进 了 生命 科学 的 发 展 ， 这 是 从 事 生
_ 命 学 科 的 人 们 所 郊 知 的 真 席 。 近 十 年 来 ， 生命 科学 中 又 出 现
了 三 项 具 革命 性 的 新 技术 : DNA 序列 快速 分 析 术 , 单 克 隆 抗 体
生产 术 和 生物 大 分 子 印 渍 术 。 和 以 往 新 技术 出 现时 的 情景 不
同 ， 这 三 项 技术 诞生 后 仅 一 二 年 就 都 得 到 广泛 的 认可 。 报 道 之
多 , 应 用 面 之 广 , 都 是 以 往 所 不 及 。 今 天 , 它们 虽 在 理论 与 实践
两 方面 都 已 取得 丰硕 成 果 , 然 发 展 势头 却 有 增 无 减 。
生物 大 分 子 印 渍 术 简便 易 行 , 既 具 有 凝 胶 电泳 的 高 分 辩 率 、
生物 分 子 亲 和 技术 的 高 灵敏 度 ， 又 能 将 所 得 结果 长 期 保存 而 深
受 欢 迎 。 今 天 , 它 已 在 生物 化 学 、 分 子 生物 学 、 免 疫 学 、 医 学 、 细
胞 生物 学 .植物 生理 学 等 学 科 得 到 广泛 应 用 。 更 可 喜 的 是 , Net
术 已 进入 临床 检验 等 部 门 , 为 病原 诊断 作出 贡献 。 可 以 预言 , 随
着 本 技术 的 继续 发 展 ， 印 渍 术 必 会 成 为 生命 学 科 各 领域 实验 室
中 必 不 可 少 的 一 项 常规 技术 。
本 书 的 编写 将 以 方法 学 为 主线 ,希望 在 参阅 本 书后 能 使 读者
基本 上 理解 和 掌握 这 项 极为 有 用 的 新 技术 ， 希 望 本 书 能 解答 实
际 操作 中 所 遇 到 的 种 种 疑难 问题 。 全 书 共 分 六 章 ， 前 两 章 为 概
念 和 原理 ; 三 、 四 章 讨论 装置 与 操作 ; 最 后 两 章 介绍 发 展 和 应 用 。
限于 篇 幅 ,“ 应 用 "一 章 中 将 偏重 分 子 生 物 学 与 医学 , 有 关 其 它 方
面 的 应 用 将 以 实例 形式 穿 揪 于 各 章 间 。 自 认为 这 样 做 , 既 可 限制
住 篇 幅 , 又 可 反应 印 渍 术 应 用 的 广泛 性 。 鉴 于 编著 者 知识 浅薄 、
实践 又 少 , 错误 之 处 在 所 难免 , 欢迎 读者 批评 指正 ,共同 进步 。
范 培 昌 (华东 师范 大 学 生物 系 , 上 海 )
一 九 八 七 年 四 月

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目录
引言 co cncenceecencccceccercencersencencessecsectecsecsesce -++(1)
生物 大 分 子 印 渍 术 的 概念 pp (1)
生物 大 分 子 印 渍 术 的 演变 与 发 展 .pp (3)
印 渍 过 程 及 常用 术语 pe (9)
印 渍 术 的 评价 …………- ee A ie) ea oe (14)
印 续 采 的 应 用 与 前 时 六。 (17)
bib, 9) 6c 2-6-0 ee +++(25)
印 渍 效率 sees verceesesrenseeses oo .(25)
与 凝 胶 电 泳 有 关 的 印 渍 原理 pp (28)
与 固定 化 技术 有 关 的 印 渍 原理 .… 了 ++(44)
GER ABR AA WH PR Beever rete ws (59)
GFE WE 55 EGE: «oe cee ves cececec ae cnedtbeecsFesduent -- (73)
毛细 作用 印 渍 装置 与 操作 …… 和 74)
扩散 印 渍 装置 与 操作 …Pp 0 …(79)
电 印 渍 装置 与 操作 :pp 0 .(80)
其 它 辅助 装置 与 操作 -……… setteeeeeeessessesseeeeseeees (94)
SOSH AE cece een eeee 0 全 站 (106)
印 渍 模板 的 选择 与 加 工 pp (106)
印 渍 用 纸 的 选择 与 加 工 .pp (119)
了 (131)
EW ft eR Wy FETE BE cnn ece ccc ececccescctectereescoees (132)
EK BE KF AY EFE cece eeccecceceececeeseceseeeees (152)
印 渍 纸 染 色 方法 eee (158)

七 ” 印 渍 分 子 的 特异 性 检 出 一 一 印 盖 术 creeeeneeeeneee (169)
第 五 章 有关 印 渍 的 其 它 技术 ep (191)
一 点 印 渍 术 ee (191)
—e ) hk + Serco ger (202)
= AV FEAE ERE HER -eeeeevccceesvovennanes ceesssesee( B06)
四 生物 小 分 子 印 渍 术 creer: 0 (208)
五 ”测定 酶 活性 的 酶 印 渍 术 …………… aac conta (213).
A 印 渍 物 的 回收 技术 ee hier teens (221)
+ 在 印 渍 纸 上 使 用 非 放射 性 探 针 的 分 子 杂 交 术 …(225)》
第 六 章 “” 印 渍 术 在 分 子 生 物 学 与 医学 领域 的 应 用 …:……(232)
< 在 研究 生物 分 子 问 相 互 作用 牢 的 应 用 sess + (232)
= 在 基因 组 DNA 测序 及 基因 定位 中 的 应 用 oo (237)
三 在 基因 结 点 构 分 析 中 的 应 用 eee cccccccccccers : coccesce (247)
四 FEREN, LAW ARER TASH MHD R
as (253)》
五 在 送信 关 病 诊 断 和 治疗 让 的话 用 二 下 人 ar (257)
六 “在 免疫 学 与 自身 免疫 病 中 的 应 用 ee (265)
七 “在 单 克 隆 抗 体 生产 与 研究 中 的 应 用 ee (271)
八 _ 在 各 种 传染 病 病 理 研究 与 临床 诊断 中 的 应 用 --- (275)
本 书 所 用 缩写 和 简称 oo(287

第 全 证 :路 =

一 、 生 物 大 分 子 印 渍 术 的 概念

生物 大 分 子 印 渍 术 始 创 于 1975 年 ， 由 苏格兰 爱丁堡 大 学
E. M, Southern 首先 提出 ”…。 他 将 限制 性 内 切 酶 消化 后 的 DNA
片段 先进 行 琼脂 糖 凝 藤 电泳 ， 已 分 离 的 DNA 各 片段 就 在 凝 胶
上 用 气 氧 化 钠 处 理 使 之 变性 为 单 链 。 把 一 张 硝 酸 纤维 率 纸
(Nitrocellulose paper, 简称 NO) mee se RE, 利用 毛细 作用 原
FABER PR DNA FEBS) NCA EE ZA eH. UR,
ete SRY DNA 片段 经 得 起 任何 处 理 , 可 针对 所 需 DNA 片段
采用 经 放射 性 标记 的 RNA, 在 NO 上 进行 DNA-RNA 分 子 杂
交 。 最 后 经 放射 自 显影 ， 即 可 从 底片 上 显现 出 一 条 杂交 分 子 的
Rw, SUB AA 11 re.

由 于 这 种 技术 类 似 用 吸 墨 纸 去 吸 干 作品 上 的 墨迹 ， (HR

_ DNA ae Leta H
i ee hy 下 这 印 渍 后 之
al-] yea use| | 人 | Tesi
= ae NRE ry 4 :
放射 自 显影 谱 ne 演 涯 - ae
| 放射性 ge
RNA 探 针

Ali 检 出 某 种 B- 珠 蛋白 基因 的 DNA 印 次 术 全 过 程 示意 图
e 1 e

“Sa BL a+

B?
fo xg ae Eee ge

纸 染 上 墨 渍 而 被 称 为 Blottingc,2， 此 词 理应 译 为 印 渍 术 吧 或 印
迹 术 名 。 某 些 文献 把 它 译 为 “ 原 位 转移 加 ", I DA RR”
之 感 。

由 图 1-1 可 见 , 印 渍 术 实际 上 是 凝 胶 电 泳 技术 .固定 化 技术
及 分 子 亲 和 技术 三 者 融 为 一 体 的 综合 性 技术 。 其 核心 在 于 把 凝
胶 电 泳 已 分 离 的 区 带 转移 并 印 渍 于 固定 化 纸 上 使 之 固定 化 ， 并
处 于 薄 的 固定 化 纸 表面 ， 从 而 既 耐 其 后 用 分 子 亲 和 技术 检 出 所
需 特异 性 分 子 时 所 进行 的 种 种 处 理 ， 又 有 利于 亲 和 分 子 接近 而
提高 灵敏 度 。

众所周知 ， 各 种 凝 胶 电泳 是 当代 分 析 与 纯化 生物 大 分 子 最
有 效 的 技术 之 一 。 目 前 , 凝 胶 电泳 的 分 辩 率 已 达 惊 人 程度 。 如
O'Farrell 的 双 相 凝 胶 系统 ,一 次 电泳 就 能 分 辨 出 二 600 多 种 蛋
白质 虽 。 但 这 却 出 现 了 新 问题 : 要 想 毫 不 含糊 地 从 这 上 千 条 区
带 中 辨别 出 一 条 是 我 们 感 兴趣 的 功能 性 蛋白 质 ， 则 常 是 十 分 下
难 的 。 迄 今 , 虽 已 创立 了 能 灵敏 地 特异 性 检 出 酶 四、 抗原 四 、 糖
蛋白 c、 激 素 受 体 no, 或 其 它 DNA-RNAc .和 蛋白质 -DNAda、
蛋白 质 -DNA-DNAcs, 区 9、 蛋 白质 -蛋白 质 中 ,1 等 的 方法 和 技
术 , 但 是 若 把 这 类 方法 直接 用 于 凝 胶 电泳 后 的 分 离 区 带 ， 则 要
SR. (上 被 鉴定 的 生物 大 分 子 应 能 亲 和 结 合 于 一 种 容易 检 出 的 配
体 上 ; (2) 此 配 体 应 不 受 凝 胶 孔 径 的 限制 容易 进 六 凝 胶 ; (3) 电泳
期 间 生 秽 类 人 芬 子 的 活性 应 能 哥 持 一 至少 能 保留 住 其 和 特异 性 配
体 结合 的 亲 和 位 志 ; 或 者 (4) 电泳 时 有 昌 已 失 活 , 但 电泳 后 经 某 种
处 理 后 可 使 生物 大 分 子 恢复 活性 。 显然 , 要 做 到 上 述 各 项 势必
要 对 电泳 后 之 斤 胶 进行 各 种 处 理 ; 包括 保温 浸泡 .洗涤 、 平 衡 、
改 性 等 等 , 这 又 可 能 使 凝 胶 变 形 - 破 损 、 断 裂 , BSR,
何况 湿 的 凝 胶 难 以 贮存 , 必须 及 时 并 连续 地 处 理 ; 凝 胶 孔 径 限制
扩散 的 作用 , 又 迫使 采用 较 大 量 的 , 十 分 昂贵 又 供应 不 足 的 配 体 .

试剂 。 例 如 ， 通 常 直 接 检 出 琼脂 糖 凝 胶 上 已 分 离 的 限制 酶 切
DNA FEM, 每 一 区 带 约 需 1Ng 单 链 互补 DBNACODNA)。 事
实 士 “如 果 想 要 分 析 来 肯 一 复杂 机 体 的 特异 基因 结构 而 又 不
对 基因 预先 提纯 的 话 ， 那 来 将 必须 在 一 百 万 左右 其 它 DNA 类
Ura Be HE (10-8 g) 量 的 单 种 类 型 的 DNAT, 这 就 要 求 所
用 方法 必须 非常 灵敏 且 具 高 度 特异 性 ， 而 直接 使 用 凝 胶 来 检 出
-就 有 一 定 困难 。 相 反 , 印 渍 术 可 使 凝 胶 中 的 分 子 经 印 渍 而 浓 集 于
固定 化 材料 的 表面 , 故 能 达到 这 种 检 出 要 求 。 正 因为 印 涡 术 克服
了 直接 用 凝 胶 检 出 生物 大 分 子 时 带 来 的 种 种 困难 刀 所 以 其 一 出
: 现 就 被 三 泛 接受 ， 并 很 快 在 分 子 生 物 学 和 医学 领域 得 到 应 用 和
RR.

一 、 上 生物 大 分 子 印 HRA I 变 与 发 展

Southern 于 1975 年 开创 DNA 印 涡 术 后 不 到 一 年 ;法国
_ oy) Chambon 小 组 在 应 用 此 技术 研究 鸡 豚 卵 清 蛋 白 基 因 : 时 ，: 发
现 分 子 杂交 后 所 得 放射 自 显影 谱 显现 的 不 是 一 条 ， 而 是 多 条 区
- 带 。 这 一 偶然 发 现 ， 使 Ohambon 小 组 立即 意识 到 其 重大 意义 :
“ 真 核 生 物 基 因 具 有 不 编码 的 反 入 序列 于 8。 现在 已 经 肯定 这 一
结论 是 正确 的 ， 并 把 这 种 具有 不 编码 捅 入 序列 的 基因 称 为 断裂
基因 (〈$Split gene) , 其 中 编码 序列 称 为 外 显 子 (exon Bt extron),
不 编码 序列 称 为 内 含 子 Gntron), 这 一 -杰出 成 果 被 创立 DNA
双 螺 旋 模 型 的 Crick 誉 之 为 分 子 遗 传 学 中 的 一 次 “微型 革 命 ”%
也 使 印 渍 术 名 声 大 振 。 1977 年 ，Alwine 等 人 将 些 印 渍 术 应 用
FRNA 的 研究 上 , :并 首先 采用 重 氮 蔡 氧 甲 基 纤维 素 纸
(Diazobenzyl oxymethy! cellulose paper， 人 简称 DBM), Lite
- 被 印 渍 物 和 它 共 价 键 合 而 被 固定 化 ”…。 遗憾 的 是 ，Alwine 等

人 把 当时 人 们 以 发 明 人 姓氏 命名 的 Southern blotting,， 以 其 姓 :
氏 含 南部 之 意 来 称呼 ( 即 南 部 印 渍 术 ); 汉 而 把 他 们 的 改良 法 风趣
Hb PK A AL EH EN WEAR (Northern blotting), 1979 44, Towbin 等
AB FEE iA TS Re, FER He KE Ep Ut AK (Imamunob—-
lotting)"”, Towbin 等 人 另 一 功绩 是 , 他 们 首先 应 用 电 洗 脱 装 :
置 作为 印 涡 动 力 , 这 不 仅 能 真实 地 获得 凝 胶 分 离 区 带 的 复制 品 ，
MAST OO. AAT, FE AN ish WMT KER
广泛 应 用 的 一 种 ， 且 已 有 几 种 仍 不 太 理 想 的 电 印 溃 专 用 装 署 间
«Tt, eB Bio-Rad 公司 生产 的 Transblot cell; 我 国 江苏 兴 化
分 析 仪 器 厂 生 产 的 转移 电泳 槽 。 此 外 ， 大 们 也 常 把 用 电 帮 为 印
WT BY ED LAR By Ha ED Yet (EHlectroblotting) "| Ha %e BEI
(Electroelution)™@*)_ Hy #4 #% (Flectrotransfer)"”_ jk #%
移 (Bleotrophoretio, “transfer ) 41. 横 向 电泳 (ITransVersal
electrophoresis) 05 等 。 Towbin 等 人 创造 的 免疫 印 渍 术 是 当代
印 污 术 中 发 展 最 快 : 应 用 最 广 的 一 类 ,有 目前 已 有 不 少 用 于 临床 诊
斯 的 报道 ”2。 这 是 因为 抗体 也 是 大 分 子 ， 它 们 簿 易 渗 入 族
Wee, 用 凝 胶 直 接 检 出 将 有 一 定 困 难 , 印 渍 术 正 好 免 免 了 这 一 关键
fa] BO, 1981 4F Burnette 把 免疫 印 渍 术 谐 称 为 西部 印 涡 术 .
(Western blotting) °°”, 并 为 许多 人 所 接受 而 沿用 BS, BA
免疫 印 涡 术 的 同义词 “2。 和 蛋白 质 印 渍 术 最 初 系 由 Renart SA.
提出 的 221。1982 42, Reinhart 和 Malamud 将 等 电 点 聚焦 法
分 离 蛋 白质 的 凝 胶 作 为 印 渍 模板 ， 他 们 又 把 这 种 蛋白 质 印 涡 术
称 为 东部 印 涡 术 (了 astern blotting)”, 使 之 成 为 蛋白 质 印 di
术 的 同义词 。

综 上 所 述 ， 除 了 Southern blotting 系 取 发 明 人 姓氏 以 示 :
纪念 外 , 其 余 名 称 均 属 科 学 上 该 谐 之 称 ， 虽 说 别 有 风 趣 ,但 其 后 :
果 除 造成 名 称 的 混乱 外 ， 还 出 现 了 不 必要 的 政治 性 争论 o TF

Jz, Gershoni 和 Palade 在 1983 年 著 文 吁 号 改变 这 一 局 面 ,， 痉
建议 把 各 种 生物 大 分 子 众 凝 胶 转 移 到 一 种 固定 化 基质 上 的 过 程
- 称 为 印 渍 术 (blotting)， 这 一 术语 可 和 有 关 大 分 所 连 在 一 起 使
用 如 了 DNA El 7 (DNA blotting), RNA & fg 7 (RNA
blotting), 4 2£EN #78 (Immunoblotting), 7% A kit Al eA
(Protein blotting)", 就 目前 报道 的 文献 看 ，Gershoni 和
Palade 的 建议 已 为 大 多 数学 者 所 接受 ， 返 今 ， 除 了 Soutnern
blotting 和 Western blotting 外 ， 像 Eastern blotting 和
Northern blotting 等 以 地 区 性 命名 的 术语 已 基本 消失 。 但 是 ，
‘Gershoni 和 Palade 关于 Blotting 可 与 有 关 大 分 子 名 称 连 用 的
建议 , 又 引起 了 另 一 堆 和 名 词 。 如 大 分 子 印 涡 术 (MacromolecuJar
‘blottinh)™*)_ fg EN WAR (Enzyme blotting)56 、 脂 多 糖 印 渍 术
(“LPS” blotting) °"_ 配 体 印 渍 术 (Ligand Blotting)**_ 酶 联 免
疫 电 转移 印 溃 技术 (Enzyme-linked immunoelectrotransfer
‘blot techniques)" HK B&H A AR CWheat Germ
caggluinin blotting)“”, 4:EN 77 (Golden blotting) “4 过 氧
- 物 酶 免疫 印 涡 术 (Peroxidase immunoblotting)“ 等 等 。 显
然 , 除 了 前 三 个 词 符 合 Gershoni Fil Palade 的 建议 外 ， 其 余 名
: 称 实 属 印 汪 过程 中 用 于 检 出 所 使 用 的 配 体 或 染料 名 称 ， 非 并
Gershoni 和 了 alade 所 建议 的 ， RAGE TRB, 后 被 印 渍 于
固定 化 介质 上 和 欲 检测 的 生物 大 分 子 。 |
值得 提出 的 是 ,1979 4F Ronart | AY” EXE EE A Ne
研究 中 为 了 研究 印 渍 效率， 他 们 把 蛋白 质 纯 品 直接 点 于 固定 化
纸 上 ; 然 后 再 按 印 渍 术 的 其 后 步骤 予以 鉴定 。 同年 , Oleveland
等 人 ”把 疱疹 病毒 感染 的 细胞 直接 点 于 固 窟 化 材料 上 使 之 固
定 化 , 然后 进行 免疫 检 出 。 这 种 不 经 凝 胶 电 泳 分 离 ; 直接 把 样品
DNB A BEE LATTER Ca) ROT NEBL, 然后

e- 5

RAAT RAR RE TER RN A A A (Dot
blotting)“”, HED, A EDAR PRE MT BER HK,
FERN AED AA, FAP AEE, A EDERAL AR AAS.
技术 范畴 。 但 是 ,考虑 到 两 种 方法 具有 相辅相成 的 关系 ,作者 将 -
把 它 作 为 印 渍 术 的 一 项 分 支 来 讨论 。

点 印 涡 术 (Dot blotting) 是 在 1981 年 ， 因 Larsson 设计 了
一 种 纸 上 肽 抗原 的 多 点 测定 法 (Multi-spot test)“ 而 引起 人
们 注意 。 目 此 以 后 ， 点 印 涡 术 则 以 其 同时 可 检 出 数 十 样品 而 前
名 于 世 。 报 道 之 多 , 发 展 之 快 ,都 达到 惊人 的 程度 29, 各 种 点 印
涡 专 用 装置 也 相继 问世 。 Pim, Towbin 小 组 设计 了 一 种 可
注射 皮 克 量 的 样品 输送 器 ( 百 ami-Lton Microlad'M 型 )， 能 反
复 输送 0.1 ul 体积 的 样品 ， 并 使 其 自动 地 点 在 刻 有 格子 的 NO:
纸 上 。 又 如 Alric 等 人 5 设计 了 一 种 点 印 渍 槽 部 = 次 抬 作 可
上 样 600 个 。 当 然 , 也 像 其 它 新 技术 出 现时 的 情景 那样 ,点 印 溃 -
术 的 名 称 也 有 许多 同义词 ， 尤 其 是 因为 它 广泛 用 于 抗原 和 杂交
瘤 的 筛选 ， 故 常 冠 以 有 关 名 词 。 例 如 ， 点 免疫 结合 术 (Dot
immunobinding)"” $f 4 4% tH %& (Spot iminunodetec-
tion)? 点 印 涡 免疫 测定 (Dot blot immunoassay)“ _ HER RE
点 检 出 法 (Anfiger spot detection)“ 4x28 HE 4} HT (Aybridot.
analysis\°" 等 3 EEE Ae 点 .
ENTRAR, FAK HEA A Yet (Colony—blot)4Y, 9° |

图 1-2 列 出 了 Sa ERAN WERENT ii
不 难 判别 二 者 之 差异 。 图 中 ，A 为 限制 性 内 切 酶 降解 人 DNA.
所 得 片段 经 0.8% 了 琼脂 糖 凝 胶 电泳 后 , 凝 胶 的 放射 自 显 影 谱 人 (其 -
中 列 工 为 XDNA 的 分 子 量 标准 系列 ) 了 是 该 首 胶 经 用 NO 纸 :
Eli, 并 用 B 珠 蛋白 的 RNA 与 之 杂交 后 所 得 的 放射 目 显 影 谱 ;
O 是 以 圆 点 的 形式 直接 把 不 同 量 胸 背 酸 激酶 点 于 DE81 纸 上 =

- 6&6 «

| nd a 10 20 “150。 100-200 . 500 Nase
i 6 MRS ge et A ree Shey OSes Se SS See, Stee wen ee ade SESS Sea Ae EL

F1-2 ”以 凝 胶 为 模板 的 常规 印 涡 术 (A、B) ALA CO) AN Bis LER

A, RaW A DNA 的 电泳 凝 胶 之 放射 自 显 影 谱 ; B, 此 凝 胶

经 印 涡 , 并 用 分 子 杂交 检 出 专 一 性 区 带 的 放射 自 显影 谱 ;C, 直接

点 样 于 固定 化 纸 的 点 印 渍 谱 ， 数 字 示 点 样 和 5 ul RABAT S
+P i (BSA) REE.

an:

然后 用 IU 检 出 的 放射 自 显影 点 印 涡 谱 .

综 上 所 述 ， 作 者 按 Gershoni 和 Palade MB”, HAA
印 涡 术 归 类 如 图 1-3, iEM Gershoni 和 了 alade 提出 的 那样 ，
要 求 在 印 渍 术 前 只 冠 以 被 印 溃 的 生物 大 分 子 名 称 。 至 于 目前 常
见 的 在 印 渍 术 前 加 有 配 体 、 染 料 - 装 置 、 印 渍 动力 等 等 名 称 者 , 也
可 按照 被 印 涡 的 生物 大 分 子 , 在 图 1-3 中 找到 相应 的 位 置 。 例 如
Brada 和 Roth #2 t4 Hy & Aly (Golden blotting)“”, 金 溶 胶 只
是 作为 染色 方法 ， 实 质 上 是 把 SDS-PAGE HRMS ht +
NO 纸 上 ， 故 应 属于 免疫 印 涡 术 。 些 外， 图 1-3 也 把 点 印 溃 术
作为 印 涡 术 中 的 一 项 分 支 来 归 类 。 帮 者 也 同意 Gershoni 和
Palade 的 建议 , 除 Southern blotting 外 ,不 再 使 用 如 Eastern
blotting 等 这 类 易 使 人 误解 的 地 区 性 名 称 。 和

RAT
oe L RNAS A:
|
' _ 免疫 印 渍 术 |
SE a Sa Ce ee Lae
:

EDR

图 13， 作 者 建议 的 印 渍 术 分 类

(4 8 «

三 印 渍 过 程 及 常用 术语

要 熟悉 并 掌握 一 项 新 技术 ， 必 须 先 对 其 全 过 程 有 一 初步 了
解 ,以 便 在 此 基础 上 去 领会 其 有 关 理 论 。 图 于 工 曾 列 出 了 DNA
ENE 7R AY HEAR, 这 里 再 以 Gershoni 等 人 最 近 用 免疫 印 渍 术 特 蜡
检 出 人 红细胞 膜 中 副 流感 病毒 受 体 (sendqai virus receptors) 的
SWEAR FO, 并 同时 介绍 印 涡 过 程 中 常用 的 术语 。

图 1-4 A Gershoni 等 人 实验 步骤 的 方 框图 。 为 了 比较 检
出 效率 ， 他 们 同时 用 放射 标记 法 和 酶 联 免疫 检 出 法 进行 检 出 。
此 外 , 他 们 的 这 一 实验 比较 完整 ,在 引用 时 ， 因 不 同 的 实验 目的
可 以 删 减 。 但 图 中 标 有 数码 的 步 又， 除 狂 灭 项 外 通常 是 不 能 减
少 的 。

1. BER Bik |

印 渍 术 中 进行 的 凝 胶 电泳 与 常规 法 并 无 两 样 ， 但 因 印 渍 效
LA KERN FLAS REAR, 而 大 多 采用 板 型 凝 胶 。 即 使 采用 加
型 管 凝 胶 ， 也 往往 经 纵 切 后 取 中 间 片 条 进行 印 渍 。 为 了 使 大 分
子 容易 迁 出 凝 胶 ” 常 在 不 影响 分 辨 率 的 情况 下 尽 可 能 采用 大 筷
Be Wb, 在 一 些 研究 印 渍 机 理 及 其 影响 因素 的 印 渍 实验 中 ,为
使 结果 标准 化 ， 大 多 采用 著名 的 、 久 经 考验 而 公认 的 Laemml
电泳 系统 52] 。

在 图 :14 所 示 实 验 中 ，Gershoni 等 人 也 用 Iaemmli 系统
对 人 红细胞 影 淘 ( 影 泡 制 法 可 参考 文献 [43] 和 54] ) 进行 板 型 十
=e FE Wit RAR A ies BERK BER HK (SDS-PAGE), 污 样 晤 为
T0~100 ug ya), EB EH 10% , MEK O.3~+~1 mm, Bika
BRAMA=: 一 块 作 常 规 染色 ， 用 它 和 印 涡 后 的 考 贝 相对 照 ，
了 解 印 涡 区 带 数 是 否 和 原来 凝 胶 中 相同 ; 另 两 块 用 作 比 较 两 种

a -
fal
F
区
后 ，

酶 联 I 抗 反应 .
洗涤
和
图 44 用 免疫 印 渍 术 特 异性 检 出 人 红细胞 膜 中 副 谤
感 病毒 受 体 的 全 过 程 示意 图 (说 明 见 正文 )
检 出 方法 的 印 涡 模板 (Blot templet), MAT WCE FN et Re we MK
[15.6mMTris, 120mM 甘油 ,pH8.83; 加 (或 不 加 )20% 甲醇 ]
中 , 在 室温 下 浸泡 1~ 4 小时。 此 步 称 为 印 渍 前 平衡 ， 目 的 在 于
Oj i ee BE A Ka ESP AS, AR BERET
WERE AKERS, 致使 印 渍 谱 上 区 带 扭 曲 变形 造成 的 影响 。
2. 印 渍 ，
EN (Blot) 或 称 转移 (Tiansfer)， 实 质 上 是 把 凝 胶 电 泳 已
分 离 的 区 带 转 移 于 固定 化 纸 或 膜 使 之 固定 化 。 这 种 固定 化 作用
可 以 是 非 共和 价 结合 (如 用 NO 纸 )， 也 可 以 是 共 价 结合 (如 用 重

e 10 «

氨 化 纸 )5 印 涡 的 动力 既 可 用 电 , 也 可 利用 毛细 作用 , 接触 扩散 作
用 。 为 此 印 渍 术 中 又 可 按 印 溃 动 力 务 和
为 电 印 涡 术 (Electroblotting), 毛细
4E FR ED YE (capillary blotting) 和 接触
$° HW EN WH (contactdiffusion)"?, 所
用 印 溃 装置 一 般 由 实验 目 行 设计 ，
图 1-5 所 示 电 印 渍 装置 示意 图 是 比较
通用 的 。 也 就 是 说 ， 在 两 侧 装 有 网 板
形 正 、 负 电极 的 印 渍 槽 中 央 ， 放 入 印 溃
A. KKRERAS FLA RAK
TRB — BUR EK ARS -
所 组 成 。 因 将 在 第 三 章 中 ， 专 门 讨论 ，
这 里 不 再 详 述 。 | 1. MERCH: 2。 固定 化
在 Gershoni 等 人 的 实验 中 采用 纸 ; 8. 二 和 〇 通用 滤纸 ; 4.
Lanai, 与 图 工 5 类 人 的 电 四 该 这
eH, MRE NO, PEA TO~ “ 片 阴 电极 ; 7. 有 机 玻璃
90V; AMAA 3 之 6h。 所 用 印 渍 组 oi
神 液 和 士 述 平 衔 溶液 相同 ， 用 量 为 41 同时 预 冷 到 8~I10”0。
3. HK
#K (Quenching) VF 6H (Blocking), Hy AWARE
要 目的 在 于 检 出 某 种 已 分 离 的 功能 性 区 带 , 而 不 是 全 谱 的 检 出 ，
这 就 要 采用 生物 分 子 亲 和 技 术 。 也 即 利用 一 对 亲 和 物 中 的 甲 方
去 检 出 已 被 印 渍 于 固定 化 纸 ( 称 印 涡 纸 ) 土 的 乙方 。 由 于 甲 方 仍
是 生物 分 子 , 直接 用 它 去 处 理 已 印 涡 的 固定 化 纸 , 它 势 必 去 占领
印 涡 纸 上 各 区 带 间 所 剩余 的 活性 基 团 , 使 它 也 被 固定 化 , 从 而 使
欲 检 出 的 区 带 混淆 不 清 , 难以 辨认 。 为 此 必须 把 印 渍 纸 上 这 些 剩
余 的 活性 基 团 事先 封闭 再 行 检 出 。 印 涡 术 中 这 种 和 印 汪 纸 剩余

e 11 。

基 团 的 结合 称 为 非特 异性 背景 结合 (Nornspecife background
binding), 并 把 它 比 拟 为 "噪声 ” 而 把 亲 和 物 双方 在 印 渍 纸 上 的
结合 称 为 特异 性 等 合 (Specific binding), 又 比拟 为 “信和 号 入- 因
此 在 印 渍 术 中 常用 称 为 “信号 -噪声 比 (Signal-to-noisaTatio)”
NADL BABE LER RR, 并 把 检 出 前 预先 封闭
EN fot AK LE Fe) a SE A HY A RRA AK aK ST BA, 所 用 试剂 也 相应 地
称 为 狂 灭 剂 \Quencher) 或 封 阻 剂 (Blocking agent), 3

在 图 1-4 Stax Gershoni 4 A MSc PAA AI HAE A
(BSA) Fler Ae FL TE SS BAA. HEAT FS LER EN i AR EET
得 的 两 张 印 渍 纸 分 别 用 含 2% BSA 的 PBS( 硫 酸 盐 缓冲 的 生理
盐水 ， 即 140mMNaCl, 10mM BRYA, pHT.4AR, AE
3% BSA+10% 新 生 牛 血清 的 PB8 溶液 二 在 25°C FRAN
物 区 2h。 前 者 用 于 放射 性 检 出 , 后 者 用 于 酶 联 免疫 检 出 。

4. 印 盖 与 检 出

印 渍 于 固定 化 纸 上 的 生物 分 子 区 带 . 男 然 也 可 用 常规 染料 。
如 考 罗斯 亮 蓝 、 氮 基 黑 等 使 其 显现 全 谱 , 但 印 渍 术 的 主要 目的 还
在 于 利用 生物 分 子 的 亲 和 人 性 ,使 印 渍 纸 上 我 们 感 兴趣 的 某 种 或
某 些 区 带 特异 性 地 显现 出 来 。 这 种 利用 亲 和 分 子 偶 中 一 方 去 亲
和 结合 印 涡 纸 上 另 一 方 的 处 理 , EAR LMA Overlay, WT he
和 印 渍 术 这 一 名 词 相 呼应 ， 作 者 把 含有 有 覆盖 物 之 意 的 Overlay
译 为 “ 印 盖 ”。 印 涡 术 中 ， 人 们 常 按 所 用 配 体 的 类 别 冠 以 印 盖 名
称 , 如 抗体 印 盖 (Antibody overlay)5239; 处 源 凝 集 素 印 盖 (lectin
overlay), 32:64 (Virus overlay)", 钙 调 蛋白 印 盖
(Calmodulin overlay)” 4%,

EMS RMR, AMNBERAD TE PEARL
具 的 一 方 称 为 配 体 (Ligand)。 它 可 以 是 生物 大 分 子 , 如 RNA、
cDNA 、 和 蛋 昌 质 `、 抗 体 、 外 源 北 集 素 等 ; 也 可 以 是 小 分 子 ; 如 酶 的

e 12 。

: 旗 物 或 其 竞争 抑制 剂 等 。 在 印 渍 术 中 , 配 体 既 然 作 为 探测 工具 ，
它 必 须 在 和 其 亲 和 物 结合 后 能 显现 出 来 。 为 此 人 们 常用 化 学 修
饰 法 (如 用 间 位 素 . 荧 光 化 物 或 者 酶 联 ) 使 之 直接 或 间接 地 标记 。
;这 种 经 化 学 修饰 而 打上 标记 的 配 体 ， 印 渍 术 中 称 之 为 探 针
(Probe), 由 于 印 渍 术 中 可 以 选用 一 些 能 发 生 共 价 反应 指 固 征
AGFA AG (A Ba AR) HE EDGE, 所 以 凝 胶 电泳 分 离 的 大 分 子 区 带 在
印 涡 时 能 发 生 共 价 反应 而 牢固 地 结合 于 纸 上 。 又 由 于 用 探 针 的
印 盖 常 是 非 共 价 结合 , 因此 可 在 第 一 次 探测 并 照相 记录 后 , 又 可
通过 改变 p 陡 或 离子 强度 来 除去 探 针 ， 然 后 再 用 另 一 种 探 针 去
探查 另 一 些 印 渍 物 。 这 样 继续 下 去 ,就 可 在 一 张 印 渍 纸 上 实 现 多
PRM, 据 此 ， 印 渍 术 中 又 按 探 针 应 用 的 先后 顺序 ， 分 别称
为 第 一 换 针 <、 第 二 探 针 、 第 三 探 针 等 。 并 把 除去 前 面 探 针 的 步 又
称 为 抹 除 GErasing)。
“在 图 1- 生 所 示 实 验 中 ,Gershoni 等 人 ' 呈 采用 病毒 印 盖 。 为
了 比较 两 种 检 出 方法 ， 他 们 同时 采用 了 同位 素 标记 法 和 酶 联 免
疫 检 出 法 。 由 于 方法 不 同 ,反应 体系 也 不 相同 , ERG RI
始 就 分 别 进行 了 。 就 同位 素 标记 法 而 言 , 他 们 把 副 流感 病毒 按
Markwell #] Fox 法 5 ,使 用 Natl fez nih, RA BRKE
冲 液 ( 即 2% BSA fy PBS 缓冲 液 ) 配 成 内 含 25I- 标 记 副 流感 病
# 10~20 ug (24 F 5~10x 10° opm) Ky ENR, F 4°C 下 对 印
AE BRM 2, Bae AA LAS RES A
BEE. BEB, FAR SRT EE BY TF] PER BE 5B Ue, FEU
10 分 钟 。 印 渍 术 中 常 简略 写 为 洗 5X10”。 最 后 在 专用 装置 中
F— 70°C 下 进行 放射 自 显影 12…96 小 时 .所 得 放射 自 显影 谱 表
明 ， 仅 有 红细胞 膜 中 所 含 的 血型 糖 蛋白 AkGlycophorin A) 和
副 流感 病毒 亲 和 结 合 ,， 由 此 得 出 结论 :“ 它 是 红细胞 膜 上 该 病毒
的 唯一 受 体 和 蛋白”5

«13 5

关于 酶 联 抗体 检 出 法 ，Gershoni 等 人 系 采 用 双 抗 体 间 接 免
疫 显 色 的 方法 (图 1-4). AEH 150 ue 的 副 流感 病毒 悬浮 于
15 ml FER Rip BIE 3% BSA 和 10 多 .新生 牛 血 清 的 PBS 组
MEHR) A, FA PENA, 并 于 25°C 下 振 播 2 洒 时， 此 即 病 毒
印 盖 步 又 5 然后 用 PBS Rpm YE EN EAR 5 Ue, HM 二 分 钟 ;以
除去 未 结合 之 病毒 。 用 重组 病毒 被 膜 注射 兔子 得 到 的 免 抗 副 流
感 病毒 抗体 “作为 工 抗 。 此 时 ，150Ag 工 抗 用 15 ml fy 50mM
Tris-Hel(pH 7.6), 0.05% Tween 20 #13% BSA 组 成 的 工 抗
反应 液 浸 泡 上 述 经 印 盖 的 印 溃 纸 工 小 时 ， 然 后 用 不 含 工 抗 的 同
种 缓冲 液 洗 4 次 ,每 次 15 分 钟 以 除去 未 结合 之 工 抗 。 其 后 再 用
已 经 偶 联 着 辣 根 过 氧 物 酶 的 羊 抗 免 IgG 这 种 市 售 商品 作为 开
抗 。 此 时 先 把 I HLL 1:1000 稀释 度 混入 15ml, A 3% BSA
的 PBS Bie +, HAE RMA LRM ERA I
NEY. FAAS EF IL Ste Fe PPP BE 4 Ue, BER 15 4) Pb PRE FE
友 应 IL St. HA AT A Bet a RD A Se £4 A, BD
FAA 25mg — Ask IK AE HK Al 0.003 % H.20a(v/v) fy 50 ml,
50mMTris-HCl(pH 8.6) 的 缓冲 液 使 印 渍 物 保温 显 - 色 。 结果 :
表明 wise BAA 或 KOR
体 结合 。 -5

比较 图 +2 和 图 It. 的 印 渍 过 程 ; 我 们 不 难看 出 ， 生物 大 分
子 印 渍 术 均 包含 有 凝 腕 电泳 . 印 渍 `. 钴 灭 . 印 盖 和 检 红 这 五 大 步骤 :
由 于 各 步骤 的 反应 体系 不 同 ， 步 又 之 Wakeis aggre

程 。

Sp Re
Towbin 和 Gordon 指出 ,生物 大 分 子 印 演 术 使 高 分 辩 率 的

e 14 。

效 胶 电泳 和 高 灵敏 度 的 固 相 检 出 法 结合 起 来 ,不 但 使 操作 简化 、
省 时 ; 租 能 达到 更 高 的 灵敏 度 ” Flanagan fil Yost 比较 了 用
” 敢 胶 直接 印 盖 检 出 和 用 印 渍 术 检 出 钙 调 蛋 自 结合 蛋 和 白质
(Calmodulin-binding proteins) Gi H°", FRE RS BK
带 难 以 扩散 迁 出 , HC ee BE Be eth, Pie 2~3 Ky BAM BE
Wc Lb Se WBE TE Mb BR HB AY AE Ht BN A we aia FAT, 相反 用 印 渍 术 检 出 ，
全 程 仅 需 16 iy, TA} BESS Al ae AB EE AB A EC BEY ae HK
同 。 送 今 , 许 多 实验 都 证 明 印 渍 术 有 许多 优点 ;归纳 起 来 至 少 有
GQ) 湿 的 固定 化 用 纸 是 柔韧 的 , 容易 操纵 和 控制 。 它 经 得 起
反复 处 理 和 连续 分 析 , 决 不 会 像 凝 胶 那 样 容 易 破损 .断裂 和 变形 。
《2) 被 固定 于 固定 化 纸 表面 的 生物 大 分 子 ， 可 以 均一 地 和
各 种 配 体 起 反应 导 它 不 会 像 凝 胶 那 样 因 孔 径 位 盟 而 妨碍 配 体 分
子 和 其 亲 和 物 接近 。
(3) 印 渍 法 使 生物 大 分 子 浓 集 于 固定 化 纸 表 面 ， 不 但 使 其
” 检 出 所 用 配 体 的 用 量 减 少 ,而 且 改 善 了 依据 生物 活性 或 抗原 - 抗
体 反 应 性 的 检 出 灵敏 度 。 检 出 时 间 也 大 为 缩短 。
(去 除 变性 剂 也 比 直接 使 用 凝 胶 容 易 且 彻底 ， 能 使 生物
大 分 子 较 完 全 地 恢复 到 天 然 态 。
全 ) 对 免疫 印 渍 术 而 言 , 由 于 抗原 已 被 固定 化 于 印 渍 纸 上 ，
故 可 检 出 那些 不 会 产生 沉淀 反应 的 抗原 -抗体 反应 。
(6) 现在 已 能 做 到 一 次 印 渍 可 得 多 张 复制 品 ,例如 Manabe
等 大 的 装置 能 在 二 小 时 内 对 一 块 凝 胶 模 板 印 渍 就 可 以 获得 20°
Tk WOM, 这 样 就 能 做 多 种 鉴定 与 分 析 。
(7) 用 共 价 键 侣 法 固定 的 生物 分 子 ， 其 探 针 可 像 录 音 磁 带 :
那样 被 抹 除 , 然后 再 用 第 二 、 第 三 探 针 先 后 探查 , 这 就 可 以 回答
某 一 区 带 是 否 具 有 多 功能 ; 某 种 抽 提 物 有 几 种 功能 性 生物 分 于

e 15 &

等 问题 。

(8) 生物 分 子 被 固定 化 后 增加 了 稳定 性 ， 印 涡 区 带 不 会 再
扩散 , 容易 贮藏 。 不必 像 凝 胶 直 接 印 善 那样 必须 马上 连续 不 断
地 进行 分 析 。 tis

(9) 对 同位 素 检 出 法 而 言 , 由 于 固定 化 纸 很 薄 , 可 以 提高 放
射 自 显影 的 效率 ; 尤其 是 低能 量 射 线 , 也 能 通过 印 渍 术 而 获得 较
满意 的 结果 。

(10) - 印 渍 术 所 用 设备 简单 ,可 以 自制 。 :

印 渍 术 仅 有 十 二 年 历史 ， 但 已 显露 出 众多 的 优点 ， 而 且 还
在 不 断 地 表现 出 来 。 例如 Thompson 等 人 利用 印 渍 术 同 时 测
ERT HBR ES, Parekh 等 人 指出 印 涡 于 NO 纸 上
的 蛋白 质 可 以 回收 52 等 等 。 当然 ， 印 涡 术 也 存在 一 定 问 题 , 例
如 生物 分 子 所 以 能 印 渍 于 NO 纸 的 分 子 机 制 尚 不 十 分 清楚 志 ””
DNA 印 渍 时 必需 使 之 变性 为 单 链 , 电 印 渍 时 最 好 采用 和 板 型 冀
胶 同 样 大 小 的 整 片 状 铂 电 极 , 这 是 十 分 虹 贵 的 , 现 有 的 各 种 电极
代用 品 都 存在 许多 问题 ,难以 获得 均一 电场 ; ARH HR
尚 局 限于 采用 低 灵 敏 度 的 染料 ， 如 氨基 黑 10B、 考 马 斯 亮 蓝 卫
250, 至 于 高 灵敏 度 的 银 染 料 。 印度 墨水 等 还 存在 着 高 背景 的 问
题 ; 由 于 各 分 离 区 带 在 同一 条 件 王 印 渍 , 在 各 种 因素 影响 下 常 难
以 全 部 百分之百 地 转移 于 印 渍 纸 ， 因 此 定量 检 赃 的 可 行 性 尚 视
所 需 分 离 物 的 印 渍 性 质 而 定 。 尽 管 如 此 , 这 些 还 都 是 印 渍 术 发 展
道路 上 出 现 的 问题 ， 不 是 技术 本 身 所 存在 的 不 可 逾越 的 因 有 障
碍 。 事 实 上 许多 问题 已 在 解决 之 中 ,例如 Taylor BHT He
双 链 DNA WIT; Svoboda 等 人 采用 氢化 亚 锡 表 面 导 电 彼
璃 作为 阳极 ， 以 不 锈 钢板 作为 阴极 ， 创造 了 既 能 获得 均一 电场 ，
又 防 阳极 玫 面 氧化 的 电极 系统 25， Brada 和 Roth 用 爹 深 胶 使
印 涡 纸 染色 ， 获 得 了 低 背 景 高 灵敏 度 的 染色 谱 [ 名 。 BHM

« 16 e

量 的 改进 方案 更 是 层出不穷 , 除 提出 定量 的 实验 依据 外 XE
创造 了 弱 激 光 印 渍 纸 定量 扫描 仪 ” “和 电视 -微机 定量 系统 …。
FY DAA AS, 随 着 印 渍 术 的 高 速 发 展 必 会 不 断 完善 ,最 终 将 成 为 生
命 学科 许 多 领域 中 的 常规 技术 。

A, PRY SAT

就 目前 已 报道 过 的 资料 看 ， 印 涡 术 已 在 分 子 生物 学 和 医学
领域 得 到 最 多 的 应 用 ,本 书 也 将 以 一 章 篇 幅 予 以 较 详 细 的 曾 述 。
为 了 能 对 印 涡 术 的 应 用 有 一 较 全 面 的 了 解 ， 这 里 将 简要 地 介绍
印 渍 术 应 用 的 各 方面 。

1. 在 免疫 学 中 的 应 用

印 涡 术 是 一 种 快速 和 灵敏 的 筛选 抗原 和 抗 血清 的 技术 。 和
其 它 类 似 技术 相 比 ; 它 不 需要 对 抗原 或 抗体 进行 预先 提纯 , 也 不
一 定 对 它们 进行 预先 标记 ， 可 以 直接 用 稀释 过 的 抗 血清 得 到 免

疫 复合 物 。 因此 免疫 印 渍 术 常 被 用 来 作为 抗原 特性 的 描述 ; 用
“于 血清 学 上 桔 别 目的 2o; 鉴定 抗体 特异 性 ; 制备 表 位 谱 (Epitope
mapping; Epitope 一 词 常 译 为 抗原 决定 篮 ), 分 析 非 抗体 配 体 类
(Non-antibody ligands) 对 其 受 体 的 特异 性 结合 。 印 渍 术 还 能
分 析 那 些 溶解 度 差 的 ， 在 其 它 抗 原 - 抗 体 沉 淀 反应 中 常 以 污染
物 出 现 的 那些 抗原 。 值得 注意 的 是 ,免疫 印 渍 术 在 鉴定 肿瘤 相
关 抗 原 (Tumor-associated antigen) 中 已 证 明 是 有 效 的 5%4。
Rittenhouse 等 人 证 明 ， 广 泛 用 于 癌 诊 断 和 治疗 中 的 癌 胚 抗原
(Carcinoembryonic amitigen), 只 能 用 免疫 印 涡 术 才 能 看 出 65
此 外 ， 免 疫 印 渍 术 也 被 用 来 检 出 免疫 学 上 起 交叉 反应 的 蛋白 质
的 电泳 变异 型 (Electrophoreic variant), 包括 补体 Clg”, 次
HRCRRERE BR, REYARQREZRE RH, USAR

17 we

98 RENE AKO, |

2. EESRAHANA

印 渍 术 可 为 诊断 、 治 疗 和 了 解 疾病 的 病理 ,尤其 是 免疫 病
HB, 提供 有 力 的 工具 。 现在 已 使 用 印 渍 抗原 来 测定 各 种 病 头 的
抗体 谱 ; 已 有 可 能 直接 用 免疫 印 渍 术 作 为 临床 检验 的 手段 。
Kettis A #9 iE AA 52 Be Ep tot AR AE XS HAL BE BY AK EB (Entamoeba
histolytica) 作出 血清 学 上 的 应 答 ， 认 为 他 能 作为 肠 外 传染 病
的 血清 诊断 “ "Towbin 等 人 曾 用 印 渍 术 筛 选 自 碳 免 疫 疾 病
的 抗 血 清 ”"。 有 关 蠕 虫 传染 的 免疫 应 答 ， 因 其 复杂 性 和 难以
获取 增 溶 了 的 抗原 制剂 ,对 它 的 研究 过 去 是 相当 困难 的; 现 在 ，
Tsang 等 人 已 用 印 渍 术 克 服 了 这 些 问题 ， 为 这 类 传染 病 的 早期
诊断 制备 了 抗原 或 特异 性 抗体 2 -Partanen 等 人 "和
Sharma 等 人 ”都 系统 研究 过 弓形 体 病 (Toxoplasmosig) 免 疫 应
答 中 的 血清 学 图 谱 ，， 认为 印 渍 术 所 显示 的 这 些 肽 类 的 免疫 应 答
WAKES BANC HT. Wise 和 Watson 开发 了 一 类 用 于 支
JR AIR FF IST A AE ELAR, Barbour 等 人 用 免疫
EYER DS BH ee CE RL) BR Te 14 12 Se a ED HB, 因
Fa PEACE HAG BR AZ) HH Be 2 TB
—tE" | Melcion 等 人 在 单 克 隆 伽 吗 疗法 (Monoclonal gamma-—
pathy) 中 , 应 用 印 渍 术 鉴 定 尿 中 未 提纯 的 骨 链 瘤 蛋 白质 还 有
许多 有 关 印 溃 术 在 医学 领域 的 应 用 ， 将 在 后 面 专 章 介绍 。

3. 在 分 子 生物 学 领域 的 应 用

Southern 初创 印 渍 术 时 ， 了 就 是 为 了 研究 核 粳 体 RNA
人 TRNA) 的 基因 编码 中 。 Chambon 小 组 用 互补 DNA (cDNA)
探查 小 鸡 卵 清 蛋白 基因 结构 时 发 现 ， 当 小 鸡 基 因 组 DNA & fR
iil META CIF EN iT NC 纸 ， 再 用 卵 清 蛋白 cDNA 探 针 与 印 渍 纸
冲 区 带 杂 交 时 ,放射 自 显影 谱 上 显现 出 几 条 区 带 。 他 们 立即 意

= 18 «

识 到 卵 清 蛋白 基因 必定 是 被 另 一 些 DNA 序列 间隔 开 来 ， 这 种
间 码 序 列 不 被 转录 为 卵 清 蛋 自 的 mRNArs， 这 就 动摇 了 原来
认为 :“ 核 苷 酸 的 线性 序列 直接 相应 于 蛋白 质 中 氨基 酸 的 线性 序
列 ” 这 一 概念 。 也 就 是 说 ,“ 同 线性 原则 ”并 不 存在 于 真 核 生物 中 。
攻 印 涡 玉 得 到 的 这 二 重大 发 现 ,也 使 它 成 为 当今 研究 基因 结 检
与 帮 达 的 重要 工具 之 一 : 现在 常用 印 汪 术 来 探测 某 种 基因 是 否
属 断 裂 基因 , 这 种 断裂 基因 含 多 少 内 含 子 等 。

印 渍 术 在 分 析 DNA 甲 基 化 对 基因 表达 有 何 作用 中 也 提供
了 三 种 有 用 的 信息 。 在 高 等 真 核 生 物 的 DNA 中 ,部 分 胞 音 残
基 已 被 甲 基 化 ,基因 中 的 甲 基 化 程度 可 用 印 渍 术 来 分 析 。 因为
限制 性 内 切 酶 WspI 和 五 pcII 的 切 点 均 在 OOGG 序 列 处 ,如果
此 序列 中 胞 昔 被 甲 基 化 ， 即 OmsOGG 时 ， 五 pcII 就 不 能 识别 ，
而 WMspI 仍 能 切割 。 因 此 对 同 种 基因 的 五 pcII 和 -MspI 酶 切 印
溃 谱 进行 比较 就 能 反映 出 该 基因 的 甲 基 化 程度 。 现 已 确定 ， 基 .
因 指 甲 基 化 程度 与 其 转录 活性 成 反比 "es

印 渍 未 又 可 用 于 基因 活 楷 的 研究 。 已 经 知道 , 在 某 种 特定
组 织 申 被 转录 的 基因 要 比 不 活动 的 基因 能 更 快 地 被 DNase BE
fe. DER BP RSE EA EPR TE TRA a
胞 核 用 DNaseI 消 化 ， 然 后 抽 提 出 DNA, 经 限制 性 内 切 酶 消化
后 进行 电泳 ,再 印 渍 于 NO 纸 ， 并 用 特定 基因 探 儿 检测 。 因为
含有 该 探 针 特 异性 的 限制 酶 切片 段 可 被 DNaseI 预 先 降解 而 消
失 , 故此 实验 就 能 反映 该 基因 对 此 酶 的 敏感 程度 "9 显然 ， 这
种 印 渍 检验 可 用 于 机 体 不 同 组 织 或 不 同 发 育 阶段 某 些 基因 的 活
PELL BE, :

CNW AR BED PR Be Sh AMA IE (Malfunc—
tioning gene) 的 分 析 。 WAR He AS LE A RIE 2 An HB
都 曾 用 印 渍 术 分 析 过 。 在 患 有 B- 地 中 海 贫血 症 的 病人 中 , 6- 珠 :

sg 19 e«-

蛋白 链 的 合成 下 降 , 但 B- 珠 蛋白 基因 的 限制 酶 切 图 谱 显示 的 基
央 结 构 几 乎 总 是 完整 的 ; 相反， 在 “地 中 海 贫血 症 中 通 各 检 出
的 则 是 o- BRE

4. 印 渍 术 在 生物 化 学 领域 的 应 用

印 渍 术 被 广泛 用 于 各 种 生物 分 子 间 的 相互 作用 。 例如

Bowen 4 A" 和 Hoch i Ep yt oR BEE at DNA=E SI A

RNA- 蛋 白质 的 相互 作用 ; Bowen A" RMA He,
百 3 和 H4 之 间 的 相互 作用 Fernandez-Pol'"s 用 表皮 生长 因子
激素 鉴定 出 印 渍 谱 凸 的 表皮 生长 因子 受 体 。 Gershoni 等 人 用
o- 金 环 蛇 考 印 盖 电 鳗 电 器 官 膜 的 印 渍 谱 ， 发现 此 毒素 只 和 乙酰
胆 碱 受 体 的 oT Bi He, Bell 和 Engvall 用 印 渍 术 找 到 了
胶原 和 纤维 粘连 蛋白 (Fibronetin) 的 结合 片段 ea。 Erlich 等
人 用 印 渍 术 分 析 了 外 源 凝 集 素 与 糖 蛋白 之 间 的 相互 :作用 p2.
Gorelick 等 人 则 用 印 渍 术 查证 了 钙 调 蛋白 与 其 结合 蛋白 间 的 缔
合 sa。 此 外 ， 印 溃 术 也 在 酶 亚 单位 的 鉴定 中 发 挥 作 用 ca 甚至
有 人 用 印 渍 术 来 测定 酶 活性 。 近 来 ,Thompson 等 人 提出 了 测
定 大 批 样品 中 谷 氨 酸 合成 酶 (BEOIH:4.7.1) 和 谷 氨 酰胺 酶 (BO
-3.5.1.2) 酶 活性 的 印 渍 方法 sc?2。 Kuonen 等 人 也 创造 子 用 印
渍 术 测 定 牛 心 线粒体 内 膜 中 琥珀 酸 脱氧 酶 的 酶 活性 2 印 涡 术
还 能 鉴定 质 膜 的 表面 成 分 及 其 拓扑 学 ce; 分 析 同 工 酶 cm] 等。

5.，- 印 渍 术 在 生命 学 科 其 它 领 域 中 的 应 用

印 渍 术 已 在 细胞 生物 学 中 开始 应 用 , 例如 也 azman 等 人 ce
将 人 血清 进行 凝 胶 电 泳 并 印 渍 于 NO 4ES, FB TE Ae BPE
(NRK 细胞 株 ) 一 起 保温 , 发 现 印 渍 纸 上 某 些 区 带 能 和 NRK 细
胞 亲 和 结 合 。 经 染色 ， 发 现 正常 的 NRK 细胞 被 定位 于 纤维 粘
连 蛋 白 (Fibronectin) 和 一 种 新 发 现 的 分 子 量 为 70000 道 尔 顿
葛 多 肽 上 。 这 一 工作 开创 了 用 印 渍 术 研 究 蛋 白质 与 细胞 间 相 互

« 20 。

作用 的 新 领域 。 印 渍 未 也 在 植物 生理 学 方面 开始 应 用 。 Steup-
和 Gerbling FH EN WEARS HT THESE ABE OT HE HRM OE BE Kk
解 酶 类 的 多 态 性 cs1。 在 生物 物理 学 方面 ，Eriokson $A
现 把 :CO- 或 58S- HIS AMEE TAME AL, 能 增 大 用
族 射 人 性 育 显 涡 检 出 的 效率 ， 认 为 这 是 由 于 缩短 了 放射 性 同位 素 -
和 照片 乳胶 表面 之 间 的 距离 而 引起 的 ， 也 因为 干 的 印 渍 纸 比 湿
的 凝 胶片 对 同位 素 显 影 有 更 大 的 灵敏 度 所 致 。

印 渍 术 已 证 明 是 一 种 具有 广泛 应 用 的 优良 技术 ， 新 的 应
用 还 在 不 断 开 发 。 例如 已 有 研究 表明 ， 印 渍 纸 上 的 固定 化 生物 -
分 子 在 原 位 被 修饰 是 可 能 的 。 把 印 污 纸 用 唾液 酸 酶 保温 可 以 从
REAR ERE MORE, MRR LMT WEA mts.
可 以 用 碱 性 磷酸 酶 进行 原 位 去 磷酸 化 。 显然 , 这 种 原 位 修饰 对
研究 生物 分 子 识别 则 是 重要 的 。 印 渍 纸 上 的 生物 分 子 也 容易 复
性 ， 这 种 复 性 阴 固 定 化 区 带 用 来 充当 活体 外 重组 研究 中 成 核 -
现象 的 位 点 也 许 是 有 可 能 的 。

参考 文献

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me 24 9

第 二 章 “ 印 渍 术 原理 及 其 影响 因素

第 一 章 引 言 已 说 明 , 生物 大 分 子 印 渍 术 实 由 效 胶 电泳 、 生 物

分 子 固 定 化 ， 以 及 生物 分 子 原 位 亲 和 结 合 三 项 技术 组 合 而 成 的

综合 性 新 技术 。 就 印 溃 术 的 基本 原理 而 论 ， 它 必然 以 此 三 项 技

术 为 依据 ;同时 又 因 它 们 的 组 合 而 显现 出 特殊 性 , 还 有 需要 探讨

的 原理 ;限于 篇 幅 , 本章 将 只 讨论 与 印 渍 术 有 关 的 基本 原理 , 至
于 组 成 印 渍 术 的 这 三 类 技术 ， 它 们 的 原理 和 方法 可 参阅 有 关 专
ce

需要 提出 的 是 ; 生物 大 分 子 印 渍 术 仅 有 十 二 年 历史 。 RE
它 新 技术 出 现时 的 情景 那样 ， 报 道 大 多 集中 在 改进 方法 和 应 用

开发 等 方面 , 有 关 技 术 原 理 的 探讨 还 处 在 初始 阶段 ; 某 些 现象 沿

TOR ERE. 这 也 许 就 是 目前 国内 、 外 仅 有 数 篇 综述 文章 ”>
尚 无 专著 问世 的 原因 所 在 。 尽 管 如 此 , 为 了 促进 本 技术 的 发 展 ，
看 者 还 是 力图 从 如 象 潮水 般 涌 来 的 有 关 印 渍 术 的 文献 中 ， 搜 集
并 小 结 出 某 些 理 论 。 一 些 实 难 定论 的 现象 也 将 以 影响 因素 予以
FAB.

一 、 印 渍 效率

前 已 提 及 ， 印 渍 术 首 先是 把 生物 大 分 子 从 凝 胶 中 转移 到 转
定 化 纸 或 膜 上 使 之 固定 化 , 然后 就 在 固定 化 纸 上 上 进行 固 相 检测 。
这 样 做 不 仅 使 印 渍 术 获 得 了 凝 胶 电泳 所 具有 的 高 分 辨 率 ， 也 获

e 25 «

得 了 固 相 检 出 技术 所 具有 的 简化 性 和 高 灵敏 度 ”"。 显然 ， 人 位
必然 要 求 在 印 渍 过 程 中 所 有 已 被 电泳 分 离 的 生物 分 子 ， 都 能 训
不 保留 地 全 部 迁 出 凝 胶 , 并 毫 无 损失 地 印 渍 于 固定 化 纸 上 。 只
有 这 样 , 印 渍 不 才 符 合 定量 的 要 求 。 然 而 这 只 是 理想 状态 , 事实
上 存在 着 许多 限制 因素 ( 详 见 后 述 ) 而 难以 达到 。 为 此 JUNI
入 了 称 为 印 渍 效率 (Blotted efficiency), Bk My HB MR
(Efficiency of transfer) 这 一 概念 。 其 含义 是 ， 印 溃 后 印 渍 纸
上 所 得 各 复制 区 带 的 量 ( 浓 度 ) TRAE EN DT A 相应 区 带 量
《浓度 ) 的 百分数 。

Bilin, Stott 等 人 中 为 了 确定 印 渍 效率 做 了 两 项 实验 。 第 一
项 实验 要 求 回答 蛋白 质 能 否 从 凝 胶 中 均一 地 转移 到 人 GO 纸 上 。
为 此 他 们 把 牛 血清 白 蛋 白 以 200 pog/om? 板 状 凝 胶 量 ; FEE EE
合 前 就 均匀 地 参 入 于 丙烯 酰胺 溶液 中 。 MIRA, BAM
泳 就 直接 用 电 印 渍 法 把 蛋白 质 印 涡 于 XO 纸 。 最 后 用 氮 基 黑 把
EBA NO 纸 分 别 染 色 ， 并 用 反射 式 光 密 度 计 对 NO 纸 在 Lom
间隔 距离 下 扫描 , 结果 得 图 2-1 扫描 谱 。 他 们 计算 了 切 次 扫描
的 平均 误差 ,证明 除 去 边缘 效应 (Edge effect) 外 , 每 次 扫描 的 最
大 平均 误差 是 士 7.2 多 ,整个 面积 的 最 大 误差 少 于 9 多 。 此 后 ，
他 们 再 把 这 种 已 染色 的 NO 纸 和 凝 胶 ， 分 别 切 成 2xX2om 的 平
方 小 块 ， 用 甲醇 : HO: 氨水 (比重 0.880) =66:84:1(v/v/v)
于 60°C 下 保温 4 小 时 ， 再 在 室温 下 放 三 天 , 务 使 洗 脱 完全 。 然
后 在 610nm 波长 下 测定 洗 脱 液 的 OD( 光 密度 ) 值 。 与 此 同时 ，
本 一 系列 浓度 的 牛 血清 白 蛋 白 标 准 溶液 分 别 直 接点 在 NO 上 ，
干燥 后 用 上 述 同样 方式 染色 和 洗 脱 。 测定 表明 , 该 标准 溶液 的
Keio FE 10~ 100 ng 蛋白 质量 范围 内 旦 线性 ; 印 渍 过 的 族 胶 中 还
残留 有 血清 白 蛋 白 58 色 ， 而 转移 于 印 渍 纸 上 的 印 渍 效率 为 429a
他 们 认为 ， 如 此 低 的 印 渍 效率 可 能 是 由 于 凝 胶 中 残留 有 难以 迁

距离 (cm

21 AAEM ENC SRR RGR
扫描 间 陋 1om; BEZIER 0 050D, .

Hs WE REA Be Aaa. a EA mK, as-
第 二 项 实验 要 求 回答 经 电泳 分 离 后 的 印 渍 效率 。 此 时 , 他 .
们 把 牛 季 清白 蛋白 和 患 骨髓 瘤 病 类 的 血清 混合 进行 凝 胶 电 聚 插
HKD EH, RBM NOS 北 胶 和 NO 纸 分 别 染 色 后 ; HI
下 各 分 离 区 带 ”: 最 后 再 按 第 一 项 实验 所 述 方法 洗 脱 并 测 Esso,
结果 表明 牛 和 大 的 血清 白 蛋 白 :平均 印 渍 效率 分 别 为 90 和 和
82% 5 RIGA ULE HY EDP TE 73 ~ 100% 之 间 ; 不 同 分 离
区 带 并 不 相同 ,平均 为 .89 多 。 由 此 得 出 结论 认为 :不 同 蛋 白质
的 印 渍 效率 是 不 一 样 的 下 2
ERS, 印 渍 效率 是 本 技术 的 一 项 重要 参数 -.。 万 其
是 想 用 印 污 术 进 和 4 了 定量 分 析 时 ， 更 需要 设法 使 印 渍 效率 尽 可 能
达到 100% ,起 码 应 使 所 需要 的 那 条 区 带 达 到 近似 100% 的 印
HAE, 现在 已 经 知道 ， 影响 印 渍 效率 的 因素 很 多 必须 对 它们
充分 理解 才能 获得 优良 的 印 渍 效率 。 - 这

e 27 a

=, SRR RRAR HP HR

io Fl A RSL CRA, | LSP GAY BRK BE IB we DK IS BE
HS EMIT WEP WEL, Andrews 曾 列 出 当代 所 用 凝 腕 电泳 的 主
要 类 型 及 其 在 蛋白 质 和 核酸 研究 中 的 应 用 一 览 表 ( 表 2-1) ™,
其 中 除 制 备 电 泳 (Prep. PAGE) sp, 其 它 各 类 均 已 用 作 印 渍 模板
(Blotted templet), 而 且 ， 表 中 所 列 各 类 凝 胶 电泳 在 分 离 分 析

中 的 各 项 应 用 ;现在 也 罗 乎 全 由 印 读 术 来 担任 。 大 量 的 印 渍 实
Bee BH, 由 凝 胶 电泳 分 离 的 各 区 带 分子 量 、 凝 胶 孔 径 、 所 用 凝 胶

类 型 , 以 及 上 样 量 都 会 影响 印 渍 效率 。

工分 子 量 与 印 渍 效率 |

WT UDA, 凝 胶 电泳 后 因 各 生物 大 分 子 被 限制 在 凝 胶 内 ， 分
子 量 越 大 就 越 难 扩散 出 凝 胶 ， 因 此 印 渍 效率 也 较 低 。Bittner
等 人 ”用 Hae IIT 限制 性 内 切 酶 ,把 %X 174 DNA 切 成 长 度 为
72 到 | 1342 碱 基 对 (bp) 的 片段 ， 并 用 MP 予以 放射 性 标记 ， 在
5% 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 (PAGD 和 0.5% 琼脂 糖 (Ag.) 中 进行 组 合 电
KABA, FEF BRAK A A AE HK A (Diazobenzyl
oxymethy] cellulose paper, fj #K DBM 纸 ) 上 。 最 后 分 别 对 族 胶
和 印 涡 纸 进行 放射 自 显影 ， 拍 照 存 底 后 再 切 下 各 区 带 进行 放射

性 计数 , 结果 如 表 2-2 所 示 。 可 见 : (了 在 一 定 的 凝 胶 孔 径 下 , 分-

子 量 越 大 印 渍 效率 越 差 ，(2) 分 子 量 越 小 越 易 扩散 山北 胶 ， 因此
残留 在 凝 胶 中 的 量 极 少 ( 如 表 2-2 中 72 RBA), (AIL EN BE
效率 并 不 理想 ， 表 明 部 分 小 分 子 会 穿 透 固定 化 纸 进 六 印 渍 缓冲
WP MZ iE); (3) 印 涡 后 把 转移 于 固定 化 纸 上 的 量 和 残
留 在 凝 胶 内 的 量 相 加 , 其 和 常常 不 能 得 到 100%, 说 明 除外 分 隆
穿 透 NO 纸 外 , 印 渍 后 处 理 也 会 造成 一 些 损失 。

#286

Vaessen 等 大 所 用 1335 开标 记 了 了 酵母 线粒体 的 细胞 色素 bex
BE, BZSDS~11% PAG 板 形 电泳 后 用 电 印 渍 把 分 离 区 带
印 渍 于 两 张 登 放 着 的 NO 纸 上 ( 印 渍 2 小 时 )。 最 后 分 别 对 凝 胶
BRAK NO 纸 进 行 放射 自 显影 , 所 得 显影 谱 分 别 在 550nm
波长 下 用 光 密 度 计 扫描 , 并 计算 所 得 各 亚 单位 区 带 之 量 , 结果 如
表 2-8 所 示 。 可 见 , 有 些 蛋白 质 确 会 在 印 渍 时 穿 透 第 一 张 固定 化
纸 而 印 渍 于 第 二 张 固定 化 纸 上 ， 匹 其 是 低 分 子 量 ( 二 25000 Mr,
Mr 为 表 观 分 子 量 ) 的 蛋白 质 。 其 次 , 表 2-8 也 表明 , 在 此 实验 条
HEF ED ERE HET 100% . 但 也 不 能 绝对 地 认为 分 子 量 越 大 印
涡 效 率 越 差 , 例如 表 2_8 所 列 40000 Mr 亚 单位 却 是 印 涡 效 率 最
高 的 , 说 明 印 涡 效 率 还 和 和 蛋白质 性 质 有 关 。
Manabe 等 人 959 为 了 验证 :“ 一 定 凝 胶 孔 径 下 分 子 量 越 大 的
生物 分 子 印 渍 效率 越 差 > 这 一 概念 , 进行 了 一 项 很 有 说 服 力 的 实

验 。 他 们 把 人 血清 进行 二 元 电泳 , 即 先进 行 圆 管 形 凝 胶 电 聚 焦 ，

然后 把 凝 胶 纵 切 ， 取 中 间 的 胶片 条 放 于 线性 浓度 梯度 板 形 凝 胶
(Hy 4~17% 丙烯 酰 腕 和 0.2~0.85.% 甲 又 双 丙 烯 酰胺 聚合 而
成 ) 顶 部 进行 电泳 。Manabe 等 人 设想 ， 采 用 梯度 凝 胶 将 使 不 同
分 子 量 的 蛋白 质 都 能 处 于 与 其 大 小 相当 的 凝 胶 孔 径 中 ”理应 全
部 能 有 效 地 被 印 渍 .Manabe 等 人 又 考虑 到 印 渍 时 间 可 能 引起 误

差 于 是 在 电 印 渍 时 ， 除 了 控制 恒 电 流 为 150mA( 起 始 电压 为
12V/em) 外 , 每 10 分 钟 换 一 张 新 的 NC 纸 , 直到 100 分 钟 ， 共
得 10 张 考 贝 。 图 2-2 系 用 考 马 斯 亮 蓝 R-250 对 印 渍 前 所 用 凝
胶 模 板 (A)， 以 及 印 渍 后 所 得 第 5(B) 和 第 10(O) 张 NO 纸 的 染
色谱 。 可 见 ， 使 用 梯度 凝 胶 可 使 各 种 分 子 量 的 蛋白 质 包括
5 万 ~100 万 在 内 的 所 有 有 蛋白质 ， 同 时 迁 出 凝 胶 并 印 渍 于 NG
纸 。 但 是 , 较 大 分 子 量 的 蛋白 质 (分 子 量 之 170000) 需 要 更 长 的 印
渍 时 间 ( 见 图 2-2 之 O)。 为 了 能 定量 地 说 明 问 题 , Manabe 等 人

e 29 e>

表 2 工 RRC TS |

物质 | Asya Te

未 知 混合 物 的 分 析

未 知 物 与 已 知 物 之 比较

复杂 混合 样品 (如 血 * 尿 、 AS a
液 ) 组 分 比较 =

PRES AE AD HT
组 蛋白 BK. i

REA

均 质 性 (即将 度 ) 验证 ，

ef ENE, Riba hp FO

某 提 纯 法 各 步 产 率 与 纯度 之 检验 | . + _ |

作为 进一步 提纯 之 指示 ‘

HSA ERIL A >
PWR HE mAh AS |. …:
ERZR ~

ats ond

vhs Ae Set cloak Meta ae

构象 异 构 体 、 三 级 结构 分 析
— ARR
配 体 结合 检验
上 亚 单位 结构 分 析
-分 竹 量 测定
-二 Bat
He 等 电 点 测定
ia HAMMSDPWEAD EE
‘RBA ¥
>. (LR ANRS WaT TD
- 核 | -构象 物 分 离
~ SIG RPRA ES *
| See SPRATT
“类 aH ae + a a ;
3 ele: ae | .
说 明 :PAGE HB, 使 用 均 质 受 冲 液 的 PAGH, PAGE MPB PDT
”梯度 凝 胶 电 泳 ; Trans PGGE, 横向 梯度 凝 胶 电 泳 ; 2D-PAGE， 双 相
:电泳 5Immuno, 免疫 电泳 ; THF dens. grad, 在 具有 密度 梯度 自由 溶液
“pk; IEF gran. bed; 在 水 平 式 粒 状 凝 胶 中 的 电 聚 焦 ; SGE, ee RS
异 源 凝集 素 存在 下 或 用 标记 异 源 凝集 素 检 出 。- 4

| aoe.

|

其 在 蛋白 质 与 核酸 研究 中 之 应 用 : :
EF

Trans | 2D- | Prep,| Ag.& Imm- PAG-| NEP | ~~
| PSE PAGEIPAGHI comp.| uno ohare IF | HGE gran. SCE aie AFE

re | | 一 一 | 一 |

1
=
RS 3 Ee
BYVOL

SS |S RE
一 一 一

| 一 | 一 |

一 -一 -一 一 | 一
一 一 一 一 一
一 -一 一 一 一 一
_

一 -一 一 一
一 -一 一 一 一
一 一 一 一 一 -一

-一 -一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 一
4h) PAGE; SDS-PAGE， 在 SDS 存在 下 的 PAGE; PGG 了 ， 聚 丙烯 酰 胶 浓 度
‘PAGE; Prep. PAGE, aA PAGE; Ag.& comp. | EAR RRA
hz ee; PAG-IF,, ZR He; NEPHGE, :不 均 质 pH Rw
ws FE, RES ree lg TRANG, ARTO Rl b, ce

UTR SRA EA EOS ENS ae : 要 é TN i “4 ie | t — wt

aks

表 2-2 不 同 长 度 DNA 片段 的 印 渍 效率 二

片段 长 度 电 印 mt 90min 后

(BRB) FNMA (Yo) BEBE RES (%) Mit (Go)
1342 17 79 96
1078 21 76 97

872 31 70 101

606 « 50 44 94

210, 278, 271 62 未 -一 一 78
234 69 15 84
194 72 15 87
118 59 31 90

72 56 2 oe

R23 细胞 色素 be: LAEMVSLSUAPAT AKERS

NC 纸 上 的 印 渍 效率
lm wm B (%)
亚 单 位 一 -一
第 一 张 NO 纸 1 一 第 二 张 NC 佐
44000 Mr 65 ~~
40000 Mr 70 10
30000 Mr (Cyt b-+c) 65 12
25000 Mr (FeS 蛋白 质 ) 23 9
17000, 14000, 11000 Mr 21 22

又 用 混合 有 抗 -Ig G、 抗 - 铁 传 递 蛋 白 ( 简 HK TH Mpi-Go RAZA
(简称 Ge) 的 免 抗 血清 混合 物 ， 对 土 述 10 张 印 渍 纸 分 别 进行 处

理 ,然后 再 用 过 氧 物 酶 联 羊 抗 兔 世 G 与 之 反应 ,最 后 在 二 氨基 联
苯胺 和 互 *0。 底 液 中 显 色 。 由 这 种 特异 性 免疫 检 出 得 到 的 10 张
印 渍 谱 中 的 3 张 示 于 图 2-3。 仍然 证 明 使 用 梯度 凝 胶 可 使 分 子
量 超过 17 万 的 区 G 和 分 子 量 仅 了 万 左右 的 Go 球 蛋白 同时 迁
出 凝 胶 ， 但 是 Ge 在 印 渍 50 分 钟 后 ( 即 第 5 张 印 渍 纸 后 ) 逐 渐 江

a aa

图 2_2; FAN 1796 BRERA (EBRD ETI
A， 印 涡 前 的 凝 胶 染 色谱 ;-B， 第 5 张 NO 纸 染 色谱 ;
C, 105. NC 纸 染色 谱 。

Icm 7 e 5

B23 人 血清 凝 胶 分 离 物 经 特异 性 免疫 检 出 所 得 印 渍 谱
A, 第 虐 张 印 渍 纸 ; B, 5 5 KEN, C, 5810 张 印 渍 纸 。

符号 说 明 见 正文 。
RT, ot IgG 在 印 渍 100 分 钟 处 还 有 大 量 被 印 渍 。 为 了 获得 印
污 时 间 和 印 渍 效率 之 间 的 关系 ，Manabe | AS 又 用 他 们 自制
AY ok DLR EONS BT AS 10 Gey DL EN EAR LAS BE BET
BA, RBA 2-4 所 示 曲 线 。 分 子 较 小 的 Ge 在 第 6 张 印
种 纸 上 降 为 零 。Tf 的 分 子 量 约 9 万 ， 它 在 第 5 张 印 渍 纸 上 出 现
高 峰 , 而 在 第 10 张 印 涡 纸 上 消 失 。 分 子 量 最 大 的 IgG 在 第 6 张
EN Ye AR tH BM epee, 但 在 第 :19 张 印 涡 纸 上 其 强度 几 和 第 工 张 印

e 33 。

20t Gc Tf
ome T.s Ts 8 9 10

} 印证 纸 号

A24 对 图 2-3 各 印 渍 谱 定量 测定 的 结果
印 渍 纸 号 系 每 印 渍 10 min 后 换 一 张 新 NC 纸 的 顺序 号 。
图 中 符号 说 明 见 正文 。 . .-

渍 纸 相同 。 由 此 可 以 得 出 结论 ， 在 这 种 条 件 下 人 丰 清 所 窗 蛋白
质 大 多 数 在 50 分 钟 时 间 内 可 全 部 转移 ， 但 低 分 子 量 的 蛋 白质 只
有 较 高 的 转移 速率 。 也 就 是 说 ， 在 电 印 渍 过 程 中 各 种 蛋白 质 在
各 种 时 间 的 转移 速度 并 不 相同 , 各 呈 明 显 的 峰 曲线 。

综 上 所 述 , 在 一 定 凝 胶 孔 径 下 ， 由 于 凝 胶 孔 各 位 阻 的 存在 ，
高 分 子 量 的 生物 大 分 子 通 常 难以 迁 出 凝 胶 被 印 渍 ， 虽说 在 某 些
尚 不 清楚 的 原因 下 ， 少 数 高 分 子 量 生 物 分 子 也 能 有 效 转 移 。 根
据 这 一 结论 , 人 们 提出 了 下 述 种 种 解决 方案 ，(J) 使 用 可 逆 的 凝
胶 交 联 剂 代替 甲 叉 双 丙烯 酰 腕 ;以 便 在 印 渍 前 先 将 凝 胶 裂
fe + ?; (2) 印 渍 前 凝 胶 内 的 蛋白 医 先 用 蛋白 酶 消化 使 之 水 解
Ayer ERS ED EO; (3) 对 上 万 碱 基 组 成 的 DNA 片段 可 引入
YI (nick) Kee, PURER ARR EPIRA
染色 的 DNA 来 引入 切口 "9 MAA DNase A Pik Ab FS Ate
切 吾 于 双 链 了 DDNA 片段 中 再 电泳 ,此 后 的 印 渍 效率 可 达 93 7%
(4) x} RNA Agi a, 可 用 稀 碱 溶液 与 之 短 时 间 保 温 使 之 分 取

se 34 «

WN; 〈5) 在 印 渍 缓冲 液 中 加 去 污 剂 \《 如 0.1 和 8SDS8) 也 能 有
效 地 提高 高 分 子 量 蛋 白质 的 印 渍 效率 ”…; 〈6) 采 用 聚 丙烯 酰胺
与 琼脂 糖 组 成 的 组 合 凝 胶 ， 且 认为 琼脂 糖 的 加 入 不 会 影响 电泳
分 辩 率 ;〈7) 采 用 线性 浓度 梯度 凝 胶 ” 等。 有 关 这 类 处 理 的 具体
操作 将 在 第 四 章 讨论 。

2、 上 样 量 与 印 渍 效率

常规 凝 胶 电 泳 实践 表明 ; “上 样 量 越 大 , 凝 胶 电 泳 分 辩 的 区
带 数 目 越 多 , 区 带 强 度 也 随 之 增加 ” 生物 大 分 子 印 渍 术 是 以 电
泳 后 之 凝 胶 为 模板 , 是 否 也 符合 这 一 原则 呢 ? Howe 和 Hershey
在 用 印 渍 术 测 定 大 肠 杆菌 ( 卫 . coli MRE 600 株 ) 溶 胞 物 中 蛋白
质 合 成 起 始 因子 (Protein synthesis initiation factor) i, i
验 了 电 印 渍 时 间 及 电泳 上 样 量 对 印 渍 效率 之 影响 ”5 关于 前
者 , 我 们 将 在 下 节 讨 论 。 关 于 后 者 ，Howe 和 Hershey 实验 了 不
同上 样 量 的 大 肠 杆菌 粗 溶 胞 物 和 提纯 了 的 起 始 因子 2a(IEF 2a),
电泳 采用 著名 的 Laemmli jy SDS-PAGE AS, Palit Be Me
Ey 10%, MBB 10x 140m, 印 渍 用 电 作 动力 ， 电
压 20V,， 电流 300mA,， 印 渍 6 NA, WT BILE ii A wy
穿 透 固定 化 纸 , 也 象 Vaessen ME, SHMPTK NO 纸 。 结 果 如
图 2-5 的 B-E Pras, 其 中 也 和 QQ 图 示 电 泳 时 加 E. coli Hay
10.40 Fi 100 ug A AE ER HE, BAAS
的 两 张 NCO ARH A Wa EIB HY 8 — 5k Ile LAR, C 图 为 第 二 张 NO
纸 印 渍 谱 。 AL, E10 ug 时 所 有 蛋白 区 带 虽 都 被 国定 在 第
—iK NO 纸 二 ,但 因 上 样 太 低 ， 虽 然 直接 看 印 渍 纸 尚 能 分 辨 ,经
拍照 后 照片 荆 就 看 不 见 了 。 ER 40ue ih, BH NOR ER
Te ts Mh, pt Fe BEBE NEE A fi (10000~20000 Mr) 则 穿 透 第 一 张
NO 纸 被 固定 在 第 二 张 NO 纸 土 (照片 也 难看 出 )。 上 上 样 1001g
时 大 大 超过 了 第 一 张 NO 纸 之 容量 , 各 区 带 大 都 能 在 第 二 张 NO

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图 2 性 5 ATED RT la] (A) Ale Hk EBC B-E)
对 印 总 效率 之 影响 (说 明 见 正文 )

纸 上 显 现 (照片 上 也 难 分 辨 )。 图 2-5 中 的 卫 是 提纯 了 的 IE 2a,
经 425I- 抗 IE'2a 特异 性 免疫 检 出 的 放射 自 显影 谱 ,，D 图 顶部 所
列 数字 系 电 泳 时 加 IE 2a 的 ng 量 。 图 2-5 中 的 卫 是 由 各 种 处 理
组 成 的 印 渍 谱 , 顶部 数字 1~38 列 是 分 别 加 卫 . coli 溶 胞 物 5.10 ，
Al20 ug 蛋白 质量 进行 电泳 , 经 印 渍 后 再 用 :2I- 抗 IE'2a 免疫 检
出 的 放射 自 显影 谱 。 4 和 55 列 系 上 卫 . Coli sei 40ue Ba
量 进行 电泳 , 然后 印 渍 并 分 别 用 稀释 度 为 1:100 的 抗 - 起 始 因子
S(IF 3) 和 稀释 度 为 1:25 的 抗 -起 始 因子 1GIF1) 反应 ， 最 后
用 3sI-A 蛋白 显现 放射 自 显影 谱 ( 图 2-5 右 侧 拟 列 IEF'2a，
IF2b, IE3 和 了 JEL 是 起 始 因子 标准 品 的 电泳 迁移 率 )。 这 些 实
验 表 明 , 随 着 电泳 上 样 量 的 增加 , 区 带 被 印 渍 的 强度 和 数目 也 随
之 增加 。 但 是 ， 正 如 .D 图 中 上 样 量 达 300ng IF 2a 时 显现 的 印
Bie BE, 它 出 现 了 众多 的 区 带 , 似乎 35I- 抗 IE 2a 与 之 特异 性
结合 能 力 丧 失 了 。 这 种 现象 的 原因 虽 不 清楚 ， 然 而 说 明 印 渍 时
必须 控制 上 样 量 ; 过 少 难以 检 出 ， 过 多 不 但 超过 固定 化 纸 的 结
合 容量 从 而 穿 透 固定 化 纸 造 成 损失 ， 还 会 产生 矫 作 物 。 据 此 ，
Howe 和 Hershey? 提出 了 各 起 始 因子 在 300 ng 范围 内
呈 线 性 关系 的 定量 依据 ， 这 是 用 伽 玛 计数 器 或 扫描 斑点 面积 求 ，

aa

扫描 面积 (Abmm》 、
放射 性 X103(cpm) °

ie 20 80°
E.Coli 溶 胞 物 上 样 最])
2-6 -用 免疫 印 渍 术 定量 分 析 LE. colt
溶 胞 物 中 各 起 始 因子 的 结果
a, IF1; b，IE2a;i c, IF2b; d, IF3
得 的 。 由 此 标准 曲线 求 得 的 . 卫 . coli 溶 胞 物 ,各 上 样 量 在 一 定 范
围 内 也 旦 线性 关系 (图 2-6),
Vaessen 等 人 9 也 证 明 ， 若 要 用 印 渍 本 定量 必须 控制 电泳
上 样 量 在 一 定 范围 内 。 他 们 用 酵母 溶 胞 物 作为 电泳 样品 ,分 别
W1~2o pe SARE LF 11% 的 聚 丙烯 酰胺 板 凝 胶 ， 然 后
进行 SDS-PAGB。 电 泳 结束 后 电 印 渍 于 NO 纸 ， 电 压 为 60V，
印 渍 2 小时。 印 渍 后 用 针对 细胞 色素 os 复合 物 的 40000Mr
亚 单位 的 抗 血 清 保温 ， 其 后 再 用 33I-A 蛋白 与 其 反应 ， 所 得 放
射 自 显影 印 渍 谱 示 于 图 2-7 A。 为 了 定量 ， 这 种 放射 自 显影 谱
或 用 密度 计 于 550nm 波长 下 扫描 (图 2-7B 虚线 曲线 ), 或 剪 下
FRA WM Bit Ses we BONE, 实验 结果 表明 , 两 种 定量 方
法 都 得 到 区 带 强度 随 上 样 量 之 增 大 近 线 性 地 增加 。 计 算 证 BA,
本 法 最 少 可 检 出 0.1ng 的 抗原 ， 但 若 用 伽 玛 计数 定量 法 ， 最 大
检 出 值 不 会 超过 20 we 蛋白 质 浓度 的 上 样 量 . 这 一 实验 再 次 证
明 , 用 印 渍 术 定量 必须 控制 上 样 量 在 一 定 范围 内 , 此 值 因 实验 对
象 、 印 渍 时 间 和 凝 胶 孔 径 等 差异 而 有 变化 。

eres SR

~

我

人 ; $25

in:

kw 蛋白 质 (wg)
2-7 “免疫 定量 检 出 酵母 溶 胞 液 中 Cytbe
复合 物 之 40000 Mr 亚 单位 E

A, 不 同上 样 量 (wg 蛋白 质 ) 的 印 渍 谱 ; B, FAL
定量 曲线 。 说 明 见 正文 。

JIE, Ohlsson 等 人 用 市 售 胰 蛋 白 酶 商品 ， 以 051. 0.8,
1.0,.5.0, 10.0, 50.0 ug LE RENEE 1% 琼脂 精 凝 胶 电泳 二 其
后 用 毛细 作用 印 渍 法 把 区 带 转移 于 NO 纸 ， 并 用 专 一 性 酶 活性
染色 法 显现 红色 区 带 .也 发 现 上 样 量 在 0.1~10.0pg 范围 内 该
老区 带 难以 显现 ， AM VCR DA AE EMEA EH
度 ; Ha BD Do GB IB KA ERE 二 EU 潮

3. EAR SABRE |

前 面 提 及 ,在 一 定 凝 胶 孔 径 下 印 渍 效率 与 生物 大 分 子 的 分
子 量 呈 反比 。 那 末 ,延长 印 渍 时 间 能 否 使 高 分 子 量 物质 完全 转
移 并 印 渍 于 固定 化 纸 呢 ? 对 此 问题 ,人 们 作 过 一 些 研究 。
Bittner 等 大 co 用 0.6 多 琼脂 糖 北 胶 分 离 经 限制 性 内 切
酶 BeoRI 消 化 的 经 放射 性 标记 的 ADNA 片段 。 电 泳 后 把 板 形
BRAM 2om 宽 的 胶 条 ; 其 中 一 条 经 干燥 后 直接 进行 放射 自
显影 作为 对 照 ， 其 余 胶 条 经 碱 处 理 使 DNA 分 解 为 单 链 后 ， 在
25mM BERRA SE Hh YK (pH 6.5) A HEN WEF DBM 纸 。 此 时 电 印
WET He) ZY Hl He 80,60 Fi 90 4} PH, AME HAGE 2A, 电压 为
271Vc: 印 溃 后 各 凝 胶 和 印 涡 纸 分 别 进 行 放射 自 显影 ， 并 对 各 区
带 进行 放射 性 计数 。 结 时 如 表 2-4 所 示 , 其 中 印 渍 效率 按 下 式
UH DNA 的 百分数 来 表示 ;

DBM 2 寸 性 一 子 中
DNA (96) = Seah cal BLAH HB Ma, x 100
RA FARMAN RAM DNA 片段 转移 于
DBM 纸 的 印 渍 效率 的 影响

Fo oe ENR 120min AMR 印 渍 不 同时 间 后 结合 于 DBM 纸 上 的 DNA %

(kb) ， 留 在 凝 胶 中 的 DNA % 30 min 60 min 120 min
21.2 22 51 65 61
7.8 | 19 38 63 58
5.7, 5.4 15 46 61 62
4.6 "98 43 63 58
3.3 : 25 29 48 49

由 表 2-4 ym, (DH Ny DNA. 片段 在 电 印 渍 60 分 钟 时
印 溃 效 这 最 高 ，( 纪 过 长 的 印 渍 时 间 ( 见 420 分 钟 项 )， 印 渍 效率
反而 有 所 下 降 ,这 可 能 是 由 于 物质 穿 透 DBM 纸 的 缘故 ; (3) 本 实

e 39 B

验 的 印 渍 效率 并 不 遵守 与 分 子 量 成 反比 的 关系 ， 相 反 二 者 呈正
比 关系 ( 试 与 表 2-2 比较 为 这 并 不 奇怪 , 因为 这 里 采用 了 大 和 扎 的
0.75 % 琼脂 糖 凝 胶 。

Howe 和 Herskey 也 做 过 印 渍 时 间 和 印 渍 效率 之 间 的 关 :
A, 他 们 的 实验 表明 ( 见 图 2-5A)， 小 分 子 量 蛋 白质 (如
IF 1, IF38) 的 电 印 渍 速率 要 比 大 分 子 的 蛋白 质 (如 TF 2a, TF 2b)
快 得 多 , 仅 需 印 渍 工 小 时 就 能 使 印 渍 效率 达 最 高 水 平 * 而 后 者 震
4 小 时 。 另外 ,他 们 对 印 渍 6 小 时 后 的 凝 胶 模板 用 高 灵敏 度 的
银 染 料 检 查 ， 已 没有 任何 残留 的 蛋 自 质 区 带 存在 靖 但 和 小 时 的 :
印 渍 效率 并 不 比 本 小 时 高 也 认为 是 物质 穿 透 印 渍 拨 的 原因 。-

最 近 Svoboda 等 大 研究 了 土 样 量 , EVAL, SK) Ar
印 渍 效率 之 间 的 相互 关系 后 。 此 时 , HEIR A 80 x80 x07 mm:
的 微型 板 胶 进 行 不 连续 凝 胶 电 泳 。 演 缩 胶 的 演 产 为 59%7 分离
胶 为 12.5 狗 。 电 泳 样品 为 Phamacia 生产 的 估 分 子 量 标准 蛋白
质 系 列 。 电 泳 后 用 他 们 独创 的 电 印 渍 装置 ( 详 见 第 三 章 ) 印 渍 于
NC 纸 , 每 芋 分 钟 换 一 张 新 的 NO 纸 ,， 直 到 :90 分 钟 。 由 于 样品
已 用 xsT 标记 ， 故 用 密度 计 扫描 放射 自 显 影 谱 来 定量 。 结果 如
图 2-8 所 示 ， 其 中 人 图 表明 ， 较 小 分 子 量 的 14kDa 和 20kDa.
He EU 巧 分 钟 后 即 达 最 天 印 渍 效率 (>90 多 ); 中 等 分 子 量 的
80kDa Fj] 45 kDa ZE 30 4} $PRTARRK; 高 分 子 量 的 67KDa 和
94kDa 需 60 分 钟 才 能 接近 最 大 值 。 此 结果 充分 表明 ， 在 一 定
BERFLE PF, 分 子 量 越 大 越 需 延长 印 涡 时 间 , 但 过 长 又 将 因 物 质 -
穿 透 印 渍 纸 而 使 印 涡 效率 下 降 。 据 此 , 应 该 根据 所 需 检 出 物质
的 分 子 量 来 确定 合适 的 印 渍 时 间 。 图 2-8 中 的 了 是 不 同 量 的 牛
血清 白 蛋 白 (BSA) 经 电泳 后 电 印 渍 于 NO AR FS AY fa] PERE EP
果 表 明 , 不 同上 样 量 的 BSA 其 时 间 进 程 相同 , 均 在 45 FBP ADT
最 大 值 。 综 合 上 两 项 实验 结果 不 难得 出 下 述 结 论 : 不 同 分 子 量 的

er 40 。

100 He
这
bo a
pe 上 样 的 蛋白 质量
i = 50 3548g/cm |
呈 RS
A
eh = 15 30 45 60 90
> 100;
S 上 样 有 最 (wxg 蛋 白质 /cmy)
o—e3.5
$x 50 e—e].0
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4 一 40. 10
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0 fai
i 0) 4S 80. 9B
印 渍 时 间 (min)

图 2-8“ 上 样 量 . 分 子 大 小 、 印 渍 时 间 和 印 渍 效率 的 关系
A. 掉 自 质 分 子 量 标 准 系列 经 不 同 印 计时 间 的 印 读 效率 。 图 中 上 Da
1 “表示 和 干道 尔 顿 。 94 上 Da 为 磷酸 化 酶 b; 67 kDa AFI I Ee A;
45 kDa 为 卵 清 重 日 ; 30 kDa 为 磷酸 本 本 ; 20 kDa 为 大 豆 胰 蛋白酶
抑制 章 ;-14kDa 为 o- 乳 清 蛋白 ” -

1 了 .不 同上 样 量 的 后 惫 铺 清 蛋白 在 不 同 印 渍 时 间 的 印 总 效率 。
生物 大 分 子 , 在 一 定 凝 对 孔径 下 具有 不 同 的 时 间 进 程 , 但 同 种 分
了 竹 虽 上 上 样 量 不 同 , 其 时 间 进 程 也 相同 。 值 得 提出 的 是 , 图 2-8 所
得 印 渍 效率 几 近 100%, XB IRA Svoboda 等 人 所 设计 的 电 印
溃 装 置 有 关 ， 值得 重视 。 关于 这 种 装置 作者 将 在 后 面 集 中 介 ra,

e° 410

phased ell iho te te ake
它 与 凝 胶 电泳 有 关 的 因素

LaLa ni he A. BE
胶 电泳 有 关 的 因素 ;

C1) 凝 胶 厚 度 “” 一 般 认为 同 孔 径 的 圆 管 型 凝 胶 比 板 型 凝 胶
更 难 印 渍 2， 也 就 是 说 在 一 定 凝 胶 孔 径 下 ， 印 渍 时 间 取 次 于 凝
胶 模 板 之 厚度 吧 。 这 是 不 难 理解 的 ， 因 为 圆 管 型 凝 胶 直径 通常
为 5~7mm, 而 常规 板 型 凝 胶 通常 仅 序 2~ 4mm。 印 渍 过 程
中 , 不 论 是 单方 向 印 渍 还 是 双方 向 印 渍 , 凝 胶 中 的 物质 必须 从 一
侧 迁 到 另 一 侧 ( 决 不 能 只 从 胶 中 心算 起 )， 迁移 路 程 越 长 所 需 印
TINE BACKS 有 况 凝 胶 孔 径 不 是 均一 的 (习惯 上 采用 平均
孔径 )， 孔道 也 总 是 弯 弯 曲 曲 。 这 些 都 将 加 大 位 阻 ,使 物质 较 难
扩散 迁 出 凝 胶 转 移 于 印 渍 纸 。 根据 这 一 原理 ， 印 渍 术 中 常 把 圆
管 型 凝 胶 纵 切 成 若干 长 薄 和 二， 再 取 其 中 心 片 条 用 作 印 渍 模

~ tid

BP, 即使 采用 板 型 凝 胶 来 印 渍 ， 也 常 改 用 厚 1mm 的 薄 胶 ，
RO, 甚至 用 O.7 mm HERERO, SR AR 1.5~3mm ©

厚 的 常规 板 胶 ， ee
等 措施 来 补偿 一 。

(2). 板 型 凝 胶 的 边缘 效应 如 所 周知 在 板 型 凝 胶 上 加 样
有 两 种 基本 方式 : 一 种 是 采用 样品 槽 模板 来 制 胶 , 使 凝 胶 项 部 形 .
成 一 个 个 相互 隔 开 的 加 样 凹 梢 。 另 一 种 是 直接 加 样 于 板 胶 顶
部 , 使 样品 成 连续 的 横 条 , 此 时 上 样 量 大 有 利于 其 后 的 检 出 或
用 于 小 规模 制备 目的 。 人 得 是 后 一 种 方法 因 电 泳 时 存在 着 边缘 效
应 区 带 呈 中 央 下 四 的 弧 线 (网 图 2-9)”。 当 用 这 类 板 胶 纵 切
为 几 等 分 作为 印 渍 模板 ， 并 用 于 茶 种 比较 实验 目的 时 二 两 侧 胶

片 和 中 心 胶片 无 论 在 区 带 迁 移 率 或 区 带 强 度 方面 ;都 会 产生 一

定 误 差 。 事 实 上 这 是 凝 胶 电 泳 引 起 的 ， 和 印 渍 处 理 无 关 5 Stott
2 42 。

&,
2 TE HERS: 2
. 其 > .
Tye ee ES

#2 ; ee eae
et ‘ ONS. SS

ss ae ate 一 一 a7 ;
A29 经 用 了 coRE 消 化 并 用 °P wick ADNA HE,
在 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 后 转移 于 DBM 纸 所 得 印 渍 谱
0.75% 甫 脂 糖 板 型 凝 胶 尺 寸 为 13x15X0.3cmo 采用 条 状 加 样 方式 。

等 大 外 对 此 曾 有 详细 的 定量 论证 〈 兄 图 2-1) ， 认 为 印 渍 中 必须
-排除 边缘 效应 产生 的 误差 。

(3) 凝 胶 的 皱 缩 与 膨胀 :

Gershoni 和 Palade 指出 "2 由 于 北 胶 电泳 所 用 缓冲 液 和
苑 涡 时 所 用 印 渍 缓冲 液 的 盐 浓 度 不 同 ， 因 此 在 电泳 和 印 渍 之 间
稀 要 增加 平衡 步骤 。 AIM, 印 渍 过 程 中 因 盐 浓度 的 改变 会 使 交

和 43 和

胶 发 生 皱 六 或 膨胀 ， 从 而 使 印 渍 区 带 扭曲 变形 。 通 常 ， 正 录 ，
Bittner 等 人 指出 的 ”"， 电 印 渍 时 要 求 电 洗 脱 系统 具有 较 低 的
电阻 抗 , 因此 印 渍 缓冲 液 常 采用 低 离子 强度 ,如 25mM; pH6.5.
的 磷酸 缓冲 液 0 7.5mM Tris-1.2mM iimik (pH 8.9
we), Be 15.6mM Tris-120mM 甘氨酸 (pH8.8) 缓 冲 液 c2o 这
样 一 来 ， 凝 胶 会 在 印 渍 期 间 发 生 膨 胀 ; 使 印 渍 区 带 畸 变 。 为 此 ，
BE BCS Ze ED it aT EA ED RE, 使 凝 胶 充分 赔 胀 后 再
印 渍 。 但 是 ,平衡 处 理 实际 上 是 用 印 渍 缓冲 液 浸泡 1~2 小 时 ，
此 时 又 可 能 使 凝 胶 中 已 分 离 区 带 扩散 出 凝 胶 进 入 平衡 缓冲 液 而
造成 损失 一 。 据 此 , 人 们 又 省 去 平衡 步骤 , MEDAN MA 20%
的 甲醇 来 防止 凝 胶 膨 胀 光 ,所 。 然 而 甲醇 既 会 降低 蛋白 质 从 .
SDS-PAG 迁 出 的 速率 ,又 会 延长 印 涡 时 间 宇 5 最近 Szewozyk- |
和 玫 ozlo 他 证 明 凝 胶 的 皱 缩 常 发 生 在 低 浓 度 凝 胶 ， 若 丙烯 酰胺
we MEY BE FE 12% WER, REA RACE LAT RAB, HE
ELAN SS FE Et BRA

除 上 述 外 ， 尚 有 一 些 与 凝 胶 电 泳 有 关 的 会 影响 印 溃 效 率 的
其 它 因 素 。 例 如 ,用 等 电 点 聚焦 电泳 分 离 的 区 带 , 因 各 物质 已 处
于 等 点 电 状 态 , 净 电荷 为 零 , 印 汪 这 类 凝 胶 时 显然 不 能 采用 电 印
Wk, 而 需 改 用 毛细 作用 印 渍 法 或 接 钥 扩 散 印 渍 法 。 有 时 , 虽 没
有 采用 电 聚 焦 的 凝 胶 作 模板 ， 在 电 印 渍 过 程 中 也 会 出 现 某 些 中 :
等 或 小 分 子 量 的 蛋白 质 ， 任 你 如 何 加 长 印 溃 时 间 也 不 会 使 之 迁
出 凝 胺 。 这 是 由 于 印 渍 体系 的 条 件 恰好 等 于 该 蛋白 质 达 等 电 点
状态 的 缘故 50。 此 时 应 该 改变 印 涡 体 系 ， 或 者 改变 印 汗 方式 。

三 、 与 国定 化 技术 有 关 的 印 渍 原理 一
将 生物 分 子 、 细 胞 器 或 细胞 , 通过 适当 的 物理 或 化 学 方法 处 |

@ 44 6

型; 使 它们 束缚 在 特定 的 支持 物 上 , 成 为 较 稳 定 的 、 不 溶 于 水 、 又
能 保持 一 定 生物 活性 , 这 种 方法 称 为 固定 化 技术 志 2。 被 固定 的
酶 称 为 固定 化 酶 ; 被 固定 的 细胞 称 为 固定 化 细胞 。 生物 材料 被
适当 的 固定 化 以 后 虽说 已 被 修饰 成 为 衍生 物 , 但 常 能 保持 一 定
的 生物 活性 。 例如 ， 一 类 固定 化 组 胞 当 供给 它们 生长 培养 基
尘 还 能 用 来 生产 代谢 物 ， 从 而 被 称 为 生长 着 的 固定 化 级 胞
{Growing immobilized -cells)， 或 称 为 固定 化 活 细胞
(Immobilized live cells)92。 生 物 大 分 子 印 渍 术 的 重要 步 了 又
-之 一 ” 就 是 把 凝 胶 电 泳 已 分 离 的 大 分 子 区 带 转移 并 固定 于 固定
-化 载体 上 ,使 之 形成 稳定 的 水 不 溶 的 、 经 得 起 各 种 处 理 的 、 浓 集
于 固定 化 载体 表面 从 而 能 容易 和 各 自 特异 性 配 体 亲 和 结合 的 固
“年 化 生物 分 子 “…”"。 显 然 , 有 关 固 定 化 技术 的 种 种 原理 也 必然 成
为 印 渍 术 的 重要 依据 。 但 限于 篇 幅 ,， 本 节 将 只 讨论 固定 化 技术
-应 用 于 印 涡 术 中 出 现 的 特殊 性 。
工 _ 印 渍 术 中 所 用 固定 化 材料 的 作用 机 理
就 目前 印 涡 术 中 所 用 固定 化 材料 而 言 , 主要 有 三 种 : 酸 基 纤
MERA (A NO 纸 和 乙酸 纤维 素 纸 ) 化 学 活化 纸 ( 如 DBM 纸 ) 和
尼龙 衬 底 的 膜 ( 如 商品 名 Zetabind 的 固定 化 膜 ， 简 称 ZB 膜 )。
HP, TU NO 纸 应 用 最 为 广泛 。 有 关 印 涡 术 所 用 各 种 固定 化
- 材料 的 结构 、 制 造 、 选 择 和 应 用 等 将 在 后 面 专 节 讨 论 , 这 里 只 涉
_ 及 主要 固定 化 材料 和 生物 分 子 的 作用 机 理 。
(硝酸 纤维 素 (NO) 纸 “关于 NO 纸 和 生物 分 子 的 作用
-机理 , BAM ASS IH”. Gooderham 认为 ，NO 纸 所 以 能
- 使 生物 分 子 固定 化 是 由 许多 作用 的 综合 结果 , BRK
了 手 作 用 以 及 和 氢 键 之 形成 ”…"。Wallis 等 人 的 实验 表明 ,在 p 互 8.0
HMA, 蛋白 质 较 雁 易 被 吸附 于 NO 纸 上 , 认为 在 此 条
- 件 下 NGC 纸 带 有 负电 故 以 静电 引力 吸附 蛋白 Ro, Farrah 等

e 45 e

A TWEE HS, AE ROAR RSS BEZE Hs HERR BREE F A NO RATES a
主要 是 朴 水 作用 ， 因 为 这 种 结合 不 能 用 减 极 盐 类 -;(Chaotropic-

salts) #6, Schneider 实验 证 明 ?6, 非 离子 型 去 污 剂 下 riton
-100 能 促进 蛋 和 白质 从 NOC' 纸 上 上 洗 脱 下 来 ; 故 认为 蛋白 质 和 NO
AM Ai cr aE eit AK EA. Flanagan 和 -了 ost 则 认为 BAK
在 NO ARE HY DHE eS RAO, Aled Tweemi20 38 iy
iS 7H A BE IB HES HP — he

定 化 蛋白 质 的 可 塑性 ;从 而 增加 了 蛋白 质 的 印 盖 能 力 ; 使 原来 未

Be he Hy HY 6100Mz 的 镍 调 蛋 白 的 结合 蛋白 活性 显现 出 来 2

Parekh 等 人 最 近 详细 比较 了 各 种 洗 脱 液 组 成 对 洗 脱 NO 纸 上

国定 化 蛋白 质 的 能 力 ”。 此 时 % 他 们 把 购 自 了 Pharmagia 的 标准
蛋白 质 分 子 量 系列 《和 图 2-8A 所 用 相同 ) 用 PL tpi, a BE
43 SDS-10% PAGE FPRFNCKE, 经 放射 自 显影 对 各 区
带 定 位 后 把 印 渍 纸 纵 切 成 1 等 分 》 等 等 分 再 个 细 地 切 下 各 区

ti, 然后 用 图 2-10 说 明 中 的 各 系统 分 别 洗 脱 5 洗 脱 液 种 100009-

下 离 必 5 分钟; 再 分 别 取 上 清和 NO 纸 用 伽 玛 光谱 计 测 放射 性 。

图 2-10 表明 , 各 种 蛋白 质 区 带 均 可 被 内 含 50 禾 吡啶 或 和 入 五 .

Ra Hy O.1M CRRA th (pH 8.9) A wc Hb Be bi Ch AK 7 Al 8).
又 表明 , 离子 型 或 非 离子 型 去 污 剂 , A Rw BAT eA
质 增 溶 ， 但 若 把 它们 单独 用 于 洗 脱 NO 纸 王 的 固定 化 蛋 自 质 常
是 无 效 的 \ 曲 线 1 一 多， 即使 把 它们 组 合 起 来 洗 脱 也 只 部 分 有 效
(曲线 6)。 这 些 结果 使 他 们 得 出 结论 说 :“NG 纸 和 和 蛋白 质 的 初

级 结合 是 芷 水 性 质 的 ”因为 用 非 极 性 的 有 机 溶剂 处 理 有 着 最 高

VERO,
需要 指出 的 是 ，DNA 印 涡 中 双 链 DNA 7 fie oi 4 NO AE,
为 此 电泳 后 需 用 碱 处 理 凝 胶 使 之 解 为 单 链 DNA, JA BBC REZ

能 和 NO Aa. Bee DNA 和 NO 纸 的 作用 机 理 还 很 少 报 _

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0 20 30 40 50 60 70 80 90 io0
~ SS. .. 生息 质 分 于 是 xd403 3
» A210 洛 种 洗 陪 系统 洗 陪 印 渍 纸 上 标 准
一 蛋白 质 分 子 量 系 列 的 效率 比较

1, O1MZMRBMR, pH8.9, 100°C 保温 5 min; 2, AS
1% Triton 和 -100 或 脱氧 胆 酸 钠 的 0.1M OBR wR, pHs.9,
100°C 保温 5min; 3， 内 含 6M KR IMBRMNHOIMCR
ere rh ye, pHs8.9, 100°C 保温 5min; 4， 内 含 19%6SDS 的 0.1M
CRRA YR, pH8.9, 100°C 保温 5min; 5, 50% 甲酸 溶液 ，
60°C =k 100°C 下 3h; 6, AZ 0.1% SDS, 0.5% 脱氧 胆 酸 钠 ， 和
0.5% Triton X-100 的 0.1M ZMH, pH8.9, 100°C F
fim Smin; 7, A 40% ZieHj0.1M CRBRRMH MR, pH8.9,
60°C Rig 3h; 8, AA 50% 吡啶 的 0.1M 乙酸 铵 缓冲 液 ，p 互
8.9,60" 保温 3h。 实 验 重复 三 次 ,各 次 洗 脱 效率 的 变化 均 少 于 69pe

道 。- Nathew 指出 这 种 结合 会 因 温度 升 高 而 减弱 ;; 因 盐 浓度 增
Inia se". lke DNA 印 涡 时 常 采用 很 高 盐 浓 度 的 印 渍 缓冲
液 ， 如 50mM Tris-HCl &% pH8.3 2mM EDTA-50mM Wim
ae an

2) FRRKR KEBREKMEDKSD TWEE
BOWSER. ISN EG HT AT AT

e 47 »

Ft FF oR: AE (Aminobenzy] oxymethy] cellulose paper, {fj 称
ABM 纸 ), 是 在 临 用 时 才 用 亚 硝酸 处 理 使 成 重 氨 衍 生物 , 然后 再
AFB, 使 其 和 生物 大 分 子 共 价 偶 联 吧 ，

NHe

(ABM 纸 )
HOl | NaNO,
=| N=N
O
oy tee 全
(DBM 纸 )
| com
[sexes |-N-N
纤
H,—O—CH,—#é
素
( 共 价 偶 联 的 生物 大 分 子 印 渍 物 )

FEU RP, ABM 纸 经 重 氮 化 生成 的 了 衍生 物 称 为 重 氮 蔡 氧 甲
基 纤 维 素 纸 (Diazobenzyl oxymethyl cellulose paper), {ij PK
DBM 纸 。 在 印 溃 术 文献 中 总 是 称呼 DBM 纸 而 不 提 及 市 售 商
tn ABM 纸 。

Alwine 等 人 指出 ca, 单 链 核酸 和 DBM 纸 的 共 价 偶 联 是 通
UR PS PRA PRE 2 HARA 5 位 来 实现 的 。
APRA A DBM 纸 反应 则 要 慢 得 多 。 用 人 工 合成 区 多 到

« 48 «

胞 华 或 多 聚 脱 氧 乃 苷 ， 以 及 多 聚 腺 昔 或 多 聚 脱氧 腺 苷 都 不 能 和
”了 BM 纸 反应 。 最 近 又 证 明 多 核 肌 苷 也 能 和 DBM Ay, Bt
可 能 是 通过 肌 苷 残 基 的 2 位 与 之 偶 联 的 。Alwine 等 人 认为 , 带
负电 的 了 NA 可 能 首先 通过 离子 作用 与 DBM 4 Re
氨基 团 连 接 、 接 着 再 发 生 缓 慢 的 共 价 键 合 , 最 终 纸 上 的 阳 电 荷 可
以 通过 水 解 而 逐渐 消失 "。 因 此 其 后 只 有 少量 的 阳 电荷 会 和
探 针 发 生 非特 异性 结合 。 这 一 特性 使 DBM 纸 在 印 渍 并 检 出 时
具有 高 灵敏 度 和 低 背 景 。 至 于 双 链 DNA， 是 不 能 直接 和 DBM
纸 偶 联 的 , 也 必须 在 电泳 后 用 碱 处 理 使 之 解 为 单 链 才能 用 DBM
A EN iii.

蛋白 质 和 DBM 纸 相互 作 用 也 有 类 似 情况 ， 即 带 负电 的 和 蛋
白质 先 和 带 阳 电 的 重 氮 基 团 发 生 静 电 吸 引 然后 完成 不 可 逆 的
EBA HEATER, BAR PAM DBM 纸 发 生 共 价
BEG HY Bese Tyr, His, Lys, Arg, 也 可 能 还 有 半 胱 氢 酸
残 基 。f8tellwag 和 了 Dahlberg 指出 , 甘氨酸 也 会 和 DBM 纸 发 生
重 氮 反应 , 因此 使 用 DBM eS RA Tris-H AREA
iA

由 于 DBM 纸 是 和 生物 大 分 子 共 价 连接 的 ， 因 此 容许 被 固
定 的 分 子 经 受 住 严 厉 条 件 下 的 种 种 处 理 。 也 容许 印 渍 纸 反 复 使
用 ， 让 多 种 探 针 先 后 检 出 多 种 区 带 近 。 但 是 DBM 纸 内 部 比较
粗糙 ,， 印 渍 中 常会 降低 凝 胶 中 原 有 区 带 之 分 辨 率 。 使 用 时 要 加
L, KA NO 纸 那 么 方便 。

(3) BAAKR(ZBR) 这 是 一 类 用 称 为 尼龙 66 HRS
三 酰 己 二 胺 作为 材料 , 在 加 工时 被 导入 众多 的 叔 胺 基 使 之 修饰 。
AKA NA ai NC 纸 那样 薄 而 光滑 的 表面 ; 其 机 械 强 度 更 大
而 耐用 。 这 类 尼龙 衬 底 膜 具有 众多 的 阳离子 ,因此 它 和 生物 大
分 手 的 结合 ,公认 为 是 和 多 阴离子 生物 分 子 发 生 可 逆 性 静电 作

e 49 e

用 的 结果 1]。Gershoniji 和 Palade 指出 ， 以 SDS-PAG 为 模板
印 渍 蛋白 质 时 ，ZB 膜 比 NO 纸 能 得 到 更 好 的 结果 ， 认 六 这 种 效
应 也 是 由 于 ZB 膜 众多 的 阳 电 荷 引 起 印 渍 系统 的 处 电压 差 而 产
FE AS. 如 果 用 毛细 作用 或 接触 扩散 作用 印 渍 时 ， 这 种 电位 类
可 能 起 着 独立 的 .内 在 的 电 迁 移 力 的 帮 用 。

前 已 提 及 , 双 链 DNA 不 能 和 NO 纸 或 DBM 4E4EA. fA
Taylor 34 1H", 天 然 态 双 链 DNA 可 不 经 任何 处 理 就 能 成 功 趣
印 渍 于 尼龙 膜 ， 虽 说 其 结合 容量 比 变性 DNA pT B~10 Fe,

Flanagan 和 Yost iEH]"", 蛋白 质 和 尼 萎 膜 也 如 NO 纸 那
样 , 是 多 点 结合 的 ,因为 Tween 20 也 能 促使 蛋白 质 从 尼龙 膜 上
之 洗 脱 。

尼龙 膜 具 有 众多 阳离子 的 特性 也 带 来 二 些 问题 ， 例 如 它 也
月 和 探 针 牢 固 结合 从 而 产生 非特 异性 结合 的 高 背景 2 DAU
合适 的 狂 灭 方法 封 阻尼 龙 膜 上 剩余 的 结合 位 点 四 号 KZ ple Ie
联 的 阳 电 荷 既 排斥 阳离子 染料 使 之 无 法 染色 ;又 过 量 的 结 舍 阴
离子 染料 ， 使 染色 谱 具 高 背景 而 难以 显现 区 带 。 至 今 还 没有 将
适 的 用 于 尼龙 膜 上 全 谱 检 出 的 染料 。

2， 印 渍 用 纸 的 结合 容量 与 孔径

Priel ie it (Binding eapacity) 是 指 每 平方 厘米 固定 化
PE PTR AEWA F KBR, Hil NO KA 80 ne B
日 质 / em 的 结合 容量 ; 而 ZB 膜 具 有 高 达 480 we BE it /om?
的 结合 容量 ”“。 因 此 ZB 膜 有 着 更 高 的 印 渍 灵敏 度 . 不 同 制 造 厂
家 的 同 种 产品 ,其 结合 容量 也 不 相当 。 例如 Bedford 4: 7* Hy py
品名 为 Milipore NG 的 硝酸 纤维 素 纸 , 由 于 其 内 含有 众多 的 酯
其 结合 容量 仅 为 5wg 蛋白 质 /emsc9。 就 印 渍 未 而 言 ， 为 了 获

得 态 的 印 溃 效 率 ,使 用 结合 容量 大 的 固定 化 材料 将 更 好 些 ; pg
为 高 结合 容量 的 材料 可 以 容纳 更 多 的 生物 分 子 ， 不 会 因 超 载 而

« SO «

使 印 渍 区 带 穿 过 固定 化 纸 进入 印 渍 缓冲 液 中 造成 损 失 。 当 然 ，
选择 优良 的 固定 化 材料 不 仅 要 考虑 结合 容量 ， 还 要 考虑 诸如 电
性 5 FLSA, 例如 ，Schaltman 和 Pongs 就 兽 用 低 容量 的
乙酸 纤维 素 纸 成 功 地 印 渍 过 蛋白 质 “?。
NO 纸 是 印 渍 术 中 目前 应 用 最 为 广泛 的 固定 化 材料 ， 它 原
先 用 于 分 离 细 菌 等 之 超 滤 膜 , 即 对 颗粒 作 机 械 得 分 用 。 得 分 时 ，
因 它 能 使 颗粒 停留 在 NO 纸 表面 , 故 也 称 为 “表面 滤纸 (Surpace
filter)”, RAT MAS HANH BURL, BNC 纸 有 各 种 孔径 规
格 。 :现在 ， NC 纸 被 用 作 印 渍 用 纸 , 因 被 印 渍 的 大 分 子 是 通过 和

NO 纸 的 化 学 吸附 作用 而 被 固定 化 , 故 称 其 为 “深度 滤纸 \Dpepath

flter)2m。 其 实 ， 二 者 在 性 质 上 并 无 差异 。 WERK, Sw
小 分子 量 的 生物 分 子 容易 穿 透 NO 纸 进 入 深 液 造成 损失 ， 因 此
DOBRA ELBA NOR, 就 目前 而 言 ， 大 都 选用 孔径 为
0.45 wm, 和 孔 分 布 的 平均 密度 为 40X 10°/om? 的 :NO 纸 作为 印
BAO. 对 低 分 子 量 的 生物 分 子 而 言 ， 则 采用 平均 孔径 为
0.2jum fy NC 449, gb ZR JA O.15 wm FL ty NO Ae"),
或 者 把 NO 纸 进 行 共 价 交 联 以 消除 孔径 效应 el。 除 此 , 有 人 提
出 采用 纯 的 汉 O 纸 比 混 有 忒 酸 纤维 素 的 NOQ 纸 (如 商品 Milipore
NO) 能 更 有 效 地 印 渍 DNA, 至 于 重 氮 纸 和 溴 化 氰 活化 纸 因
和 生物 分 子 共 价 键 合 , 常 不 考虑 孔径 效应 。
3. 去 污 剂 的 作用

;去 污 剂 对 印 渍 有 一 定 作用 是 肯定 的 ， 但 究竟 对 印 渍 有 利 还
是 不 利 则 尚 有 争论 5 大 多 数学 者 认为 ， 当 生物 大 分 子 用 8SDS-
«PAGES Bint, HE ED WERT BRS SDS, 这 也 是 印 渍 前 进行 平衡
处 理 的 目的 之 二 So, 到 哇 。 因 为 , 除去 SDS 可 使 多 肽 在 印 渍 前 复
#e°", ot By IE SDS 和 DBM 纸 上 的 重 氮 基 团 发 生 作 用 。
Towbin 和 Gorduon 指出 , 在 8D8 存在 下 蛋白 质 在 pH8.0 下 被

e 51 e

吸附 于 NO 纸 上 的 效率 很 差 ， 因 为 8DS8- 蛋 白质 复合 物 带 负 奸
难以 和 pH8.0 下 具 负 电 性 的 NORWAY, De Blas 和

Oherwinki 用 免疫 印 渍 术 研究 单 克隆 抗体 时 发 现 ，SDS AIBA

乙醇 的 存在 会 使 抗原 决定 秘 的 构象 发 生 改 变 。 ALAR NO
纸 后 因 不 能 恢复 原来 构象 ， 而 使 具 这 种 抗原 决定 答 的 抗原 不 能
和 其 单 克 隆 抗 体 相 结合 “。 为 此 ，Bowen 等 人 建议 用 0.5 和 (Y/
v) Triton X-100 和 4M ARK SDS, 并 帮助 蛋 自 质 复 性 9。
| fizz, Kuonen 等 人 最 近 证 明 ， 采 用 内 含 不 变性 去 污 剂 Triton
和 -100 梯度 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 分 离 牛 心 亚 线粒体 内 膜 的 膜 蛋 和 白 ，
并 印 渍 于 NGC 纸 时 ， 若 印 渍 液 中 含有 Triton X-100 Hs + Hi
IRE AA NO 纸 的 结合 。

以 上 意见 表明 ， 印 涡 前 除去 去 污 剂 是 必要 欧 。 但 是 ，
Johnson 等 人 的 看 法 并 不 如 此 “， 他 们 指出 ， 除 了 糖 蛋 白 和 脂
蛋白 外 , 大 多 数 蛋 白质 在 SDS 存在 下 形成 具有 均一 负电 和 荷 的
SDS- 和 蛋白 质 复合 物 ， 因 此 对 这 种 全 带 负 电 的 复合 物 进行 电 印 溃
时 将 可 以 实现 单方 向 印 渍 。 相 反 ， 用 其 它 凝 胶 系 统 分 离 的 蛋白
质 则 显示 出 广 范围 的 pKa 值 , 使 各 蛋白 质 显 出 不 同 的 电化 学 性
质 。 对 它们 进行 电 印 渍 时 只 能 是 双方 向 的 。 即 在 凝 胶 的 两 侧 都
放 上 印 渍 纸 , 且 需 在 凝 胶 的 阴极 侧 放 负 性 固定 化 纸 《 如 世 O 纸 )

而 在 凝 胶 的 阳极 侧 放 正 性 固定 化 纸 ( 如 2B, 膜 )5 其 有 这 样 才能

在 电 印 渍 后 得 到 两 张 互 补 的 , FE ORES
i, Johnson 等 大 建议 利用 8SD8 fi4E SDS-PAGE ASF ik
中 实现 单方 向 印 渍 s9。 他 们 的 做 法 是 ,把 OL ie a SRE
的 蛋白 质 用 内 含 乙 酸 - 脲 的 PAG 了 分离， 然后 把 凝 胶 浸 六
100ml 内 含 SDS fy BrP (2.3g¢ SDS, 8m] 甘油 20.75g Tris,
0.5ml B-3i tt ZB, 90 ml 蒸 馅 水 ,用 HCl 调 pH6.8), ee
温 下 摇 80 分 钟 , 然后 在 24mM Tris, 192mM 甘氨酸 , 20% 是

CO 六

有

AAA SDS 处 理 对 印 渍 的 影响 (说 明 见 正文 )

醇 (p 也 8:3) 的 印 渍 缓冲 液 中 电 印 渍 ,所 得 各 放射 自 显影 谱 如 图
2-11 im, 其 中 图 A 是 工 标记 多 瘤 病 毒 (VP) 蛋 白质 从 凝
胶 转 移 于 NO 纸 的 放射 自 显影 谱 。 a 列 是 印 渍 中 把 NC 纸 放 在
SERA ARM; b 列 是 把 NC 纸 放 凝 胶 的 阴极 侧 ; e 列 和 d 列
4} 5) Al a, b 列 相同 , 但 印 渍 前 均 未 用 SDS 处 理 。 由 此 可 见 ,只
A ENISHI SDS 处 理 ， 且 把 NO 纸 放 在 凝 胶 阳 极 侧 者 才 被 印
i. 图 了 是 凝 胶 的 放射 自 显 影 谱 ， 其 中 a 列 为 ”“ 工 标记 多 瘤
病毒 标准 蛋白 质 在 乙酸 - 脲 凝 搁 中 分 离 所 得 放射 自 显影 谱 ; b 列
是 经 SDS Ah FFA NC 后 ， 残 留 溪 胶 模 板 的 放射 自 显 影 谱
(HRA 2-114 Za Fl), wl ERENT, 并 无 区 带
BF BE © 列 是 未 用 8DS Wh BE ry ENR EE A 2-11 A
之 6 列 六 可 网 它 全 然 不 能 被 印 渍 。jJohnson 等 人 的 这 一 实验 结
果 证 明子 8DS 能 促进 蛋白 质 印 渍 于 NCA, 似乎 和 上 述 大 多 数

e 53 &

研究 者 的 结论 相反 。 事 实 上 对 Johnson 等 人 的 实验 进行 仔细
分 析 后 不 难看 出 ， 他 们 的 实验 还 不 能 动摇 上 述 大 多 数学 者 的 两
Hie, (), ， 负 性 的 SDS A HEF UF fa HE WY NO 纸 ;
(2); SDS 使 蛋白 质 失 活 难以 用 功能 性 分 子 亲 和 法 检 出 时 因为 ，
Wallis 等 人 认为 常用 的 偏 碱 性 (pH8.0 左 右 ) 印 渍 缓冲 液 使 NO
Ri, 象 这 样 的 印 渍 条 件 ， 自 然 难 以 使 带 锡 的 SDS
白质 复合 物 和 带 负电 的 NO 纸 结合 。 现在 , Johnson 等 人 改 用
pH 6.8 的 印 渍 缓冲 液 ， 此 时 NO 纸 是 否 仍 带 负电 尚 无 见 有 报
道 , 但 既然 它 能 和 带 负 电 的 SDS- 蛋 白质 复合 物 相 结合 说 明 在
此 条 件 下 NO 纸 很 可 能 示 显 负电 性 。 sb, Johnson 等 人 是 用
放射 自 显影 检 出 全 谱 , 没有 采用 功能 性 分 子 亲 和 检 出 法 ;所以 也
不 能 说 明 SDS 处 理 是 否 还 能 使 蛋白 质 印 渍 物 存在 亲 和 活 性 ;
值得 提出 的 是 ，Johnson 等 人 用 上 述 同 种 方法 成 功 地 电 印
渍 了 用 凝 胶 等 电 点 聚焦 分 离 的 多 瘤 病 毒 蛋 白质 。 WEIR, sb
于 等 电 点 状态 的 蛋白 质 难 以 使 用 电 印 渍 法 使 之 迁 出 电 聚 焦 凝 胶
被 印 渍 于 NO 纸 。 但 Johnson 在 电 聚 焦 后 把 凝 胶 用 SDS8 深 液
浸泡 , 使 各 处 于 等 电 点 状态 的 蛋白 质 和 8SDS 形成 带 负电 的 复合
物 ， 然 后 再 在 GDH6.8 的 条 件 下 使 它们 电 印 渍 于 NOL 图
2-12 即 是 Johnson 等 人 用 8SDS8 处 理 使 荆 I 标记 多 瘤 病毒 蛋 白
质 从 等 电 点 (IEE) 凝 胶 中 电 印 渍 于 :XO 纸 的 放射 自 显影 谱 5 其
中 ，a 列 为 印 渍 时 NO 纸 放 在 TEF BeBe hy FARM; b F)2% NO
纸 放 在 该 凝 胶 之 阴极 侧 ; e 和 d 列 分 别 和 a. bp 相 同 汪 但 印 渍
前 未 用 8DS 处 理 ; FHT, JP SDS 处 理 且 把 NO 纸 放 于 小
胶 阳极 侧 时 具有 高 的 印 渍 效率 。 未 用 SDS 处 理 的 了 ER 凝 胶 也
能 印 渍 ,， 但 效率 低 ， 尤 其 是 处 于 等 电 点 的 酸性 蛋 ' 白 质 难 世 印
RO, 在 此 实验 中 Johnson 等 人 还 试验 了 用 'SDS 处 理 过 的
IEF 凝 胶 是 否 还 具 抗 原 活 性 。 此 时 他 们 使 用 针对 多 瘤 病 毒 蛋 自

* 54 «

从 电 聚 焦 凝 胶印 渍 5T 标 记 多 瘤 病 毒 蛋白 质 于 NC
“ ， 纸 的 放射 自 显影 谱 ( 说 明 见 正文 )

质 的 抗 自 清 进行 免疫 印 渍 ， 结 果 示 于 图 2-13。 这 一 实验 似乎 又
说 明 SDS 处 理 并 没有 使 印 渍 纸 上 的 抗原 活性 丧失 ; BPS
病毒 的 蛋白 质 是 这 样 。 |

至 于 使 用 化 学 活化 纸 印 渍 蛋白 质 时 ; 由 于 二 者 系 共 价 键 合 ，
因此 去 污 剂 常 能 在 印 渍 中 使 用 而 不 必 耽 心 它 会 使 蛋白 质 丧 失 活
性 四 。 Ericksn 等 人 也 认为 ， 印 渍 缓冲 液 中 加 入 低 浓度 的 SDS.
能 改善 蛋白 质 的 印 渍 8sls 但 是 Lin 和 Kassamatsu #74",
污 剂 Nonidet P-40 的 存在 将 使 蛋白 质 从 NO 纸 上 解 脱 而 造成
损失 。

和 4 甲醇 的 作用

. 印 渍 缓冲 液 中 加 入 甲醇 是 由 Towbin 等 人 首先 提出 的 ea
其 目的 在 于 梅 定 凝 胶 模板 的 几何 形状 ;使 凝 胶 不 会 在 印 渍 过 程
中 发 生 胀 或 缩 。 以 后 不 少 学 者 指出 甲醇 能 增加 NO 纸 对 蛋白 质
的 结合 容量 =e,4e,s6s 但 是 甲醇 又 会 降低 蛋白 质 从 SDS- 聚 丙烯.

e 55 e-

图 2- 雪 IEF RRA SDS 处 理 的 免疫 印 渍 谱 (b) 和 直接 用
放射 自 显影 显现 的 全 谱 (a) 比 较
酰胺 凝 胶 中 洗 脱 的 效率 29。 它 的 存在 需 延 长 电 印 涡 的 时 间
(>12 小 时 )， 才 能 使 高 分 子 量 蛋 白质 (>100 万 Mrz) 有 效 地 印
yi 4°?

Ii, Szewozyk 和 Kozloff AB IE T FAREED FY HE
AS, 此 时 ， 他 们 采用 美国 马里 兰州 BRL Aa A me
分 子 量 蛋 白质 标准 系列 ， 因 为 该 系列 的 六 种 蛋白 质 组 分 中 有 两
种 是 强 碱 性 的 ， 即 溶菌 酶 的 等 电 点 为 pH 11.0(pI=11.0) A+
胰 和 蛋白 酶 抑制 剂 的 PI=10.5。 再 者 ， 该 系列 已 经 预 染 ， 不 需 再
加 染料 就 能 在 NC 纸 显 现 斑 点 ， 有 利于 计算 印 渍 效率 。 Be,
Szowezyk 和 Kozlotf 总 共 试 验 了 六 种 印 渍 缓冲 系统 ， 其 中 再 分
AIMRA IN 20% 甲醇 。 实 验 表明 ( 见 表 2-8) 9”, ENDWAR

« 56 e

\

2-5 甲醇 对 各 种 蛋白 质 从 SDS-P 了 AG 转移 于 NC 纸 的 影响 、

piggies 二 洗 赔 效 - NOE
了 BOM acy) 酸性 和 中 ， 强 碱 饥 酸 性 和 中 “ 强 磊 人
HEAR 有 蛋白. 质 性 蛋白 质 和 蛋白质

1, 25mM Tris/192mM (a) G P G G
HER, pH8.3 20 (b) G M G G
2, 25mM Tris/192mM (a) G > M P P
甘氨酸 ，DH8.3 Ain (by @ M P P

3, 0.7% 乙酸 (a) P P M M
不 加 (b)P aa M

4, 25mM AMPSO, (a) G ML G G
pH 9.5 20 (b) G G @ @
.5, 25mM CAPSO, . (a@ M G G
pH10.0 20 (b) G G G G
6, 25mM 7,88 F/R (a) G M G G
BR, pH9.5 20 (b) G G G G

说 明 : AMPSO, 3-N-(1, IT 二 甲 基 产 乙 基 )- 氨 基 -2_ 羟 基 丙 磺 酸 ; OAPSO，
3-N- 环 已 氨基 -2- 羟基 两 磺 酸 ; (a), KERR URN OOS ED Us
(b) ,省略 平衡 步骤 ; G, 表示 好 ; M, 表示 中 等 ; 表示 差 。

[的 Tris HARA RPI 20% 甲 醉 有 利于 酸性 和 中 性 蛋白

质 从 凝 腕 中 洗 脱 , 并 有 效 地 结合 于 NG 纸 , 但 是 甲醇 并 不 促进 碱
性 蛋 自 质 的 洗 脱 。 经 扫描 定量 表明 , 甲醇 存在 时 碱 性 蛋白 质 的
洗 脱 效率 仅 为 10% 左右 ， 虽 说 这 .10% 全 能 结合 于 NO 纸 。 省 |
去 甲醇 , 略 能 提高 碱 性 蛋白 质 的 洗 脱 效率 , 但 又 降低 了 和 NO 纸

之 结合 , 包括 酸性 和 中 性 的 蛋白 质 世 是 如 此 > 这 一 结果 表明 , 省

去 里 醇 不 会 导致 碱 性 蛋白 质 印 渍 效率 的 增加 ， 但 甲醇 能 改善 酸
性 及 中 性 蛋白 质 和 NO 纸 的 结合 。 这 是 因为 甲醇 能 从 8SDS-PEAG
HPS} HERE SDS, Mitte SDS- 蛋 白质 复 合 物 的 负 性 减弱 。 与
此 相反 ,8SDS- 碱 性 蛋白 质 在 除去 部 分 8DS 后 仍 有 强 的 负电 性 ，
因此 难 和 带 负电 的 NC 纸 结合 。8Szewozyk 和 Kozloff Hw RH 、

e 57 e-

推断 ， 碱 性 蛋白 质 将 能 在 较 碱 性 的 印 渍 缓冲 液 中 转移 sa5 正如
表 2-5 所 示 ， 使 用 三 种 p 也 9.5 左 右 的 印 涡 缓 冲 液 时 都 得 到 了
令 人 满意 的 结果 , 而 用 0.7% 乙酸 缓冲 液 时 无 论 洗 脱 效率 , 还 是
_ 和 NO 纸 的 结合 程度 都 很 差 。
但 是 ， 几 乎 和 上 述 工作 同时 发 表 的 Svoboda 等 人 的 论文
中 20， 对 甲醇 的 作用 提出 了 又 一 观点 。 他 们 设计 了 一 种 能 使 阴
极 和 阳极 溶液 分 开 的 属 电泳 类 的 电 印 涡 装 置 。 他 们 发 现 ， 若 阴
极 溶液 和 阳极 溶液 均 由 内 含 20% 甲醇 的 25mM Tris-192 mM
HARA KAY, M SDS-12.5% PAGE 分 离 的 , Pharmacia 公司
生产 的 低 分 子 量 标准 蛋白 系列 , 各 组 分 的 印 渍 效率 相差 很 大 , 万
其 是 分 子 量 较 大 的 磷酸 化 酶 b(94000Mr) 的 印 渍 效率 水 于 40 多
《图 2-14) 。 实 验 又 证 明 , 车 用 0.1% SDS 蔡 代 阴极 缓冲 液 中 之
甲醇 , 那 末 各 蛋白 质 印 渍 于 NO 纸 的 效率 都 大 为 提高 ;分 予 量 较
天 的 磷酸 化 酶 卫 的 印 渍 效率 也 将 提高 到 70 匈 。 而 且 , 各 种 蛋白
质 穿 透 NO 纸 的 损失 也 不 会 大 于 10% (WB 2- 人 去 说 明 及 尼龙
. 膜 印 渍 值 )。Svoboda 等 人 为 了 解释 这 一 机 理 , 他 们 在 效 胶 两 侧
各 放 七 张 NO 纸 ， 经 830V 下 电 印 渍 工 小 时 后 测 价 NO 纸 的 PH
值 , 结果 在 阳极 和 雍 胶 间 的 七 张 NO 纸 的 pH (A 4p BE 2 4B,
攻 .6.6.7， 而 放 在 凝 胶 和 阴极 间 的 七 张 NC 纸 分 别 是 .8.9.9.10、
10、 革 、 志 。 由 此 他 们 认为 印 渍 不 仅 取决 于 蛋白 质 所 带电 荷 北
胶 的 分 子 得 效应 ,而且 也 取决 于 电压 梯度 。 在 阴极 侧 存在 20%
围 醇 促进 了 SD8- 蛋 白质 复合 物 的 分 解 和 蛋白 质 和 NO 纸 前 侍
合 (这 和 上 述 Szewezyk 和 Kozlo 作 的 观点 丰 同 ca) ”而 在 阴极
侧 存在 0.19% SDS 时 可 增加 阳离子 的 和 (或 ) 站 水 性 蛋 自 质 的 印
渍 效率 ， 因 为 SDS 使 它们 也 带 负电 ， 致 使 体系 中 具有 凝 胶 的 分
子 筛 效应 影响 转移 速率 。 相 反 , 若 阴极 缓冲 液 中 存在 甲醇 , 将 使
SDS- 蛋 白质 复合 物 负 性 减弱 , 自然 难以 有 效 转移 了 江

-« 58 e

、 BBR ee mh
/-MEOH(20%y 下 @ S

— SDSO,174) 0 0 +.
也 60% int A F ¢ a 1

转移 于 NC 纸 i

—
S
oS

ay
NS ; Cn Oo
一 一 oO >

全 30V 下 电 印 溃 1 小 时 后 之 放射 性 强度 (cpm86) 一

转移 于 尼龙 膜

一 oo =
94 67 45 30 20 14 94 67 45 30. 20 14 94 67 45 30 20 14

2414 Ame IRS AB OMEOH) sk SDS i,
确 分 子 量 蛋白 质 标准 系列 各 组 分 印 涡 于 NOC 纸 、 尼 龙
i, 以 及 印 渍 后 凝 胶 模板 中 还 残留 的 区 带 所 含 放射 性
低 分 子 量 蛋 和 白质 标准 系列 经 用 1 id. Nia, NOAM 尼龙

膜 释 放 在 三 起 ,以便 用 尼龙 膜 计 算 物 质 穿 透 XC 纸 的 量 。
底部 数字 指出 组 成 低 分 子 量 蛋白 质 标准 系列 六 种 成 分 的 Mr(x
10-3), 因 胰 蛋白 酶 抑制 剂 (20000) 和 o- 乳 清 蛋 白 (14000) 两 区 带

赤 接 近 ， 难 以 准确 切 下 , 故 一 并 计数 (20/J4)。

四 、 与 分 子 亲 和 技术 有 关 的 印 渍 原理

印 渍 术 的 重要 目的 在 于 从 众多 的 被 印 渍 区 带 中 检 出 少数 郊
种 我 们 感 兴趣 的 区 带 ; 而 不 是 全 谱 的 检 出 , 为 此 需要 依靠 分 子 亲

e 59 eb

和 技术 进行 专 一 性 检 出 。 对 核酸 印 溃 术 而 言 ， 党 利用 RNA-
DNA 和 DNA-DNA 22% 2 WY, ik 4 Schleif 和 Wensink 所
言 ”分 子 杂 交 一 词 容 易 使 大 误解 ; 但 它 已 成 为 习惯 用 词 。 事
实 上 , 分 子 杂交 也 是 利用 生物 分 子 的 可 亲 和 性 ,理应 归于 分 子 亲
和 技术 。 至 于 免疫 印 渍 术 ， 则 是 利用 抗原 -抗体 的 亲 和 性 ， 也 就
是 说 抗体 对 其 相应 抗原 具有 独特 的 特异 性 和 高 度 的 亲和力 ， 其
解 离 常 数 为 10-4 习 10-%M。 结 合 和 运载 蛋白 的 特点 之 一 是 与
其 互补 的 维生素 或 激素 有 高 度 的 亲 和 性 ， 其 解 离 常数 为 10 ~
10-3M。 膜 结合 受 体 蛋白 与 其 互补 的 激素 之 间 的 相互 作用 也 是
BREA AR EM RAE, HBB 10°~10-°M, HF
蛋白 能 和 其 特异 性 外 源 凝 集 素 (Lectin) 亲 和 结合 ， 其 解 离 常 数
最 大 ,在 10°~10° M 之 间 。 酶 与 其 底 物 或 竞争 性 抑制 剂 的 亲 和
结合 特性 更 是 早 为 人 知 。 此 外 , 细胞 表面 有 众多 的 生物 分 子 , Bl
此 也 能 和 其 亲 和 物 特异 性 亲 和 结 合 ， 而 成 为 亲 和 技 术 中 检 出 病
毒 受 体 ， 细 胞 亚 群 等 的 一 亚 类 。 就 目前 已 报道 过 的 有 关 印 涡 文
献 看 ， 上 述 各 种 亲 和 技 术 都 被 应 用 于 印 渍 术 中 的 检 出 。 又 由 于
这 种 检 出 是 在 固定 化 纸 上 进 行 , Towbin #1 Gordon 称 之 固 相
检 出 技术 (Solidq-phase detection techniques)™,

1. 分 子 杂交 的 一 般 原 理

溶液 中 双 链 DNA 经 高 温 或 高 pH 处 理 即 变性 为 两 条 互 补
的 单 链 。 逐 渐 恢复 溶液 的 温度 或 p 互 值 时 ， 根 据 碱 基 配 对 的 原
则 ,分开 的 两 条 单 链 会 自动 复 性 成 原来 的 双 链 结构 。 如 果 两 条
单 链 核 酸 分 子 来 自 不同 的 物种 或 品系 ， 只 要 它们 的 碱 基 序列 是
同 源 的 或 部 分 地 同 源 ; 那 末 也 能 发 生 全 部 或 部 分 的 复 性 ,这 就 称
HERE RAHI SSE ARE, AF ZRBC PETTY RAL GE DNA 与 DNA 之 间 ，
也 可 发 生 在 DNA 与 RNA 之 间 。 FELNMEARH, BAB FALIH
已 被 印 涡 于 园 定 化 纸 ， 另 一 分 子 则 常常 预先 用 放射 性 同位 素 标

-» GD 5

” 记 ， 并 称 其 为 探 针 。 用 此 探 针 来 识别 或 “ 钓 出 ” 印 渍 纸 上 众 多 区 -

带 中 能 与 其 同 源 的 亲 和 核 酸 分 子 ， 即 是 印 渍 术 的 重要 目的 。 由
于 探 针 具 放射 性 , 因此 放射 自 显影 谱 上 只 有 杂交 分 子 显现 区 带 ，
非 杂 交 分 子 则 不 显现 ， 据 此 就 可 识别 出 所 需 核 酸 分 子 。 这 类 探
针 的 标记 方法 有 许多 , 印 渍 术 中 常用 离 体 (in vitro) 标 记 法 。 其
中 又 可 区 分 为 如 平 三 种 方法 :

GQ) 用 反 转 录 法 标记 互补 DNACDNA) 此 时 以 RNA( 如 :

mRNA) 为 模板 ， 通 过 反 转 录 酶 合成 cDNA。 假如 加 入 反应 系 .

统 的 DNA 前 体 物 是 放射 性 的 , 则 合成 的 cDNA 便 可 用 作 探 针 。
(2) 切 日 移 位 人 (Niek-translation) 反 应 -这 是 目前 最 普遍
采用 的 标记 了 NA 的 方法 。 甚 原理 是 ,在 大 肠 杆菌 的 DNA 2
fig I(DNApolymerase IT) 参 与 下 ， 使 反应 系统 中 的 四 种 脱氧 核
背 三 磷酸 (其 市 至 少 一 种 是 用 放射 性 PP ak 标记 的 ) 摊 入 待
标记 的 DNA BF, 这 里 的 关键 是 DNA SRG LESS
能 的 酶 ， 与 本 反应 直接 有 关 的 是 它 所 具 ->3' 外 切 酶 功能 和
DNA 聚合 酶 功能 。 如 图 2-15 HA. (a) 加 入 微量 的 DNA 酶 工
(DNase I; 或 称 牛 胰 DNA 酶 )， 使 待 标记 的 ,DNA 分 子 链 上 形
M—P WA (nick), WM & 8-OH FH He MI D'-P HEH; (b)
DNA 多 聚 酶 工 附着 在 切口 上 ( 它 不 能 附着 在 无 切口 的 完整 双 链
1!) © HF DNA SRB I 58 外 切 酶 活性 ， 它 可 以 从 切
口 开始 沿 忆 ->3' 方 向 逐个 切除 脱氧 核 昔 酸 盖 同 时 又 由 于 它 具 有
DNA 聚合 酶 的 功能 , 能 以 切口 83-O 互 末端 为 引子 ,用 对 应 的 一 :
条 单 链 为 模板 把 反应 系统 中 游离 的 四 种 脱氧 核 背 酸 逐 个 地 接 到
PAY 8’-OH FAD; (A) 随 着 上 述 两 个 反应 不 断 进 行 , 图 中 的 :
切 百 就 不 断 向 移 动 ， 同 时 切口 左 侧 的 新 合成 的 DNA 链 不 断
EK, 每 一 个 切口 可 以 使 其 延伸 约 400 个 核 苷 酸 , 而 且 每 个 :
DNA 分 子 的 两 条 链 又 各 可 以 用 DNase 工 造成 许多 个 切口 。 区 U:

e 61, 全

(a)
‘.

i
N

tt

2b WoeURNAe
箭头 示 切 口 位 置 ; 虚线 的 椭圆 形 代 表 DNA 2 eahs 1; 短 粗 杆 线 表示 四
种 脱氧 核 昔 三 磷酸 ; 粗 线 表示 新 合成 的 - DNA 链 。
为 折 入 反应 系统 的 四 种 脱氧 核 昔 三 磷酸 中 有 _ 或 丙种 是 用 =P
aH 标记 的 , 所 以 由 此 切口 移 位 而 新 合成 的 DNA 链 便 是 放射
性 的 了 。 -又 因 其 碱 基 序 列 仍 与 反应 前 的 卫 NA: 分 子 完全 一 样 ，
所 以 它 可 用 作 杂 交 探 针 。
(3) 未 端 标记 法 “上 述 两 法 均 不 能 标记 RNA YF, HU
4 DL RNA 为 探 针 或 者 当 探 针 DNA 是 只 有 用 十 个 核 彰 酸 对 的
小 分 子 时 ,可 用 来 端 标记 法 。 其 原理 如 图 2-16 所 示 : 先 用 碱 性
磷酸 酶 切 去 待 标记 核酸 片段 的 5 端的 磷酸 后 产生 5-O 也 末 六 ，
接着 在 多 核 苷 酸 激酶 的 催化 下 把 ATP 中 六 位 的 磷酸 加 到 豆

>
aie
UT

A216 :未 端 标记 法 图 解
P* 表示 放射 性 的 PP,

Wit. ft A 则 核酸 片段 的 5 末端
EB iid ET |

2.: .核酸 印 渍 术 中 有 关 分 于 杂交 的 改良

过 去 ， 经 电泳 分 离 的 限制 酶 切 DNA 片段 需 在 印 渍 前 先 变
性 使 祥 解 为 单 链 上 因为 双 链 DNA 不 能 和 NO 纸 结 合 。 最 近
Taylor 提出 ”其 有 较 大 强度 和 抗 筑 能 力 的 尼龙 膜 可 结合 双 链
DNA“), 此 时 ， 印 渍 后 的 尼龙 膜 可 浸 于 2.5M NaCl 和 0.5M
NaOH BAM 15 He DNA 变性 ， 再 在 pH5.5 i) 3M 乙酸
钠 中 中 和 15 PSMA MOB KBB CDNA 探 针 进行 分
FRE, 晶 说 此 法 的 灵敏 度 较 差 ， 但 为 印 溃 天然 DNA 开创 了
先例 。

Amasino #it# ii A RAE (PEG) SREB A R iv
er I FEAR (Dex 804) ， 认 为 它 会 增 大 核酸 分 子
杂交 作用 的 速率 吧 :。 例 如 不 加 多 聚 物 的 反应 液 中 ， 即 使 含有 探
Brie EIA 1 x10°cepm/ml, 反应 仍 需 经 24 小 时 才能 勉强 检测。
如 果 反 应 液 中 含 10% Dex SOs, 482 4) NRA HAA
DNA,， 随 着 杂交 时 间 延 长 到 12 小 时 后 可 以 获得 较 强 信号 。 但

e G3 。

反应 液 中 若 含 10% PEG wt, 少 于 和 小 时 就 可 检 出 结合 的 DNA，
8~12 小 时 就 能 杂交 完全 ， 并 获得 比 Dex SO, 更 强 的 信号 。 又
证 明 ， 加 10% PEG JER ET RRR AY we > BY) 2 x 10 cpm/m1™,
这 比 常规 核酸 杂交 中 所 用 1 x 10° opm/mal 的 浓度 可 少 用 2~ 10
倍 。Amasin6 认为 ， 反 应 体系 中 多 聚 物 的 存在 使 探 针 分 子 被 排
挤 而 浓 集 在 一 起 , 从 而 加 速 了 杂交 反应 的 进行 sm。

Radford 在 进行 DNA 印 渍 时 , 比较 了 切 互 移 位 法 制备 探 针
中 用 ss9- 和 3P- 标记 DNA 的 效果 cl。 过去, 常规 切口 移 位 法
中 经 常用 szP 标记 , 因为 @P 可 以 得 到 高 的 比 放 射 性 ，B- 粒 子 的
高 能 量 又 可 以 保证 放射 自 显影 较 快 显现 (和 用 宇 或 4O 相 比
较 )。: 但 是 ， 目 前 已 有 一 种 市 售 高 放射 性 的 sg- RRR
品 , 称 为 脱氧 腺 苷 -5 [or- 硫 代 -9] 三 磷酸 盐 [(o-*8) dATP],
Radford 的 实验 证 明 s9, FF (aS) dATP By A Be PE A.
(Het ?中 具有 更 长 的 半衰期 OS HW 8T.1LR ii OP W 14.2
F), As BRI Ae eR, 2) °P 具有 高 的 比
POE, KMS A BBE LECBRAMR, M
而 掩盖 掉 邻 近 较 弱 的 区 带 。 BOS ht, BIBRA BON TE

可 使 此 问题 减 到 最 小 程度 ; 《3) 可 以 利用 “3 和 ”PR 放射 的 B 粒

子 能 量 差 ， 使 用 同一 张 印 渍 纸 进 行 两 种 探测 而 不 需 抹 掉 第 一 探
针 。 此 时 先 用 °S wid DNA 进行 探 测 “然后 再 用 PP te id
DNA 探测 。 后 者 探测 时 在 印 渍 纸 和 和光 底 片 间 加 一 层 塑 料 纸 ，
PEA A MP 才能 透 过 塑料 纸 达到 底片 上 。
3. 免疫 亲 和 结 合 的 一 般 原 理
所 有 高 等 动物 都 有 识别 异体 分 子 和 进入 其 机 体 潜伏 起 来 的
有 害 分 子 的 能 力 ， 我 们 把 这 套 针 对 侵入 物质 的 主要 防御 机 构 称
之 为 免疫 系统 。- 凡 能 刺激 免疫 系统 反应 的 物质 统称 为 抗原 而
把 为 了 识别 抗原 由 免疫 系统 产生 反应 而 制造 出 的 蛋 和 白质 称 为 抗

二 64 ¢

eS ee ee

R26 免疫 球 蛋 白 的 五 种 基本 类 型

sR: | 链 | 分 FRO) FREE (90)
igG % L - 150, 000 75
IgM p 900, 000 8
IgA Q 160, 000 16
Ig D 5 180, 000 <1
Ig E € 180, 000 <1:

体 。 事 实 上 , 抗体 与 抗原 的 识别 是 通过 一 系列 的 化 学 键 , 虽说 这

些 键 的 每 一 个 都 很 弱 , 都 不 是 共 价 键 , 但 它们 加 在 一 起 就 变 得 很
WR Sikora 和 Smedley 曾 形象 地 描述 过 抗体 和 抗原 间 的 亲 和 结
合 : 抗体 和 其 抗原 的 紧密 衔接 有 些 象 两 大 块 拼 板 玩具 的 那 种 衔
接 ““。 抗 体 可 在 血液 的 球 蛋白 分 部 中 找到 ， 故 称 为 免疫 球 蛋
Fj (Immunoglobulins), RHE MMA ST BM KAD A TH
本 类 型 ( 表 2-6)。 所 有 的 免疫 球 蛋 白 分 子 都 有 类 似 的 基本 结构 ，
都 由 两 条 重 链 和 两 条 轻 链 所 组 成 ， 并 由 二 硫 键 把 它们 结合 在 一

(Fab) > fh Fe

—_—o)| ye a

wR 垣 定 区
210 1TgG 的 结 梅
可 变 区 和 结合 抗原 的 部 位 在 肽 链 的 六 -末端 处 。

起 。 在 抗体 的 重 链 和 轻 链 中 有 一 些 区 域 称 为 可 变 区 (图 2-17)，
其 氨基 酸 序列 因 不 同 抗体 而 不 同 , 这 种 变化 都 发 生 在 肽 链 的 站-
末 病 处 。 由 此 可 以 想象 ,由 每 一 种 抗原 所 出 现 的 每 一 种 可 能 形
状 都 可 为 某 种 抗体 所 衔接 。 BR, 较 大 和 较 复 杂 的 抗原 分 子 可
能 有 几 个 不 同 的 区 域 , 每 一 区 域 都 能 衔接 一 种 抗体 , 抗原 上 的 这
种 区 域 通 称 为 抗原 决定 得 (Antigenic determinant) ,图 2-18.
下 一 抗原 决定 族 结 合 于 一 抗体 分 本 六 -末端 处 的 情景 。 前 已 提 :

抗原 汪汪 >
有 TS =

芒 原 决定 部 位

EL va CrTs—CS Er ee ee es ee =

aT Ol

C C

218 HRRERASTIART N-AmMHABA

及 , 免疫 印 渍 时 抗原 决定 篮 的 构象 会 因 SDS MBE CBE
而 改变 , 从 而 导致 用 其 单 克隆 抗体 检 出 的 效率 降低 …。

在 免疫 印 渍 术 中 免疫 检 出 常 采用 双 抗 体 间接 免疫 检 出 法 。
这 是 因为 直接 用 一 种 抗体 来 检 出 抗原 时 , 抗体 一 方面 要 用 酶 , 或
用 荧光 染料 ， 或 用 工 标记 的 葡萄 球菌 A 蛋白 (以 后 简称 A Be

白 ) 进 行 标记 ， 另 一 方面 又 要 保持 住 和 抗原 结合 的 亲 和 部 位 ， 这
是 很 复杂 的 工作 。 更 由 于 这 类 探 针 的 一 部 分 会 因 化 学 修饰 而 影
响 和 抗原 的 亲 和 结 合 , 检 出 时 常常 需要 加 大 探 针 用 量 , 也 为 此 和 常
改 用 间接 法 。 各 种 标记 的 间接 免疫 检 出 法 的 原理 示 于 图 2-19。
即 , 固定 化 的 抗原 首先 和 它 的 免疫 球 蛋 和 白 \ 常 称 为 工 抗 ) 结 合 , 然
后 再 用 带 有 各 种 标记 《〈 酶 标 、 荧 光标 记 、”IA 蛋白 标记 等 ) 的
抗 免疫 球 蛋 白 抗 体 ( 常 称 I 工 抗 ) 反 应 而 检 出 。

se 2 teas HELI

长 外 光 灯 DAB 0 wee

{
1
RIK ro i AERA

NCH NE

A219 免疫 印 渍 术 中 常用 的 三 种 间接 免疫 检 出 原理 图
I, 荧光 标记 ; TL, wee; III， 放 射 性 标记 。
最 近 Immle 等 人 在 用 免疫 印 渍 术 检 出 血液 凝固 因子
AUP. ID 中 发 现 ， 上 述 间接 免疫 检 出 法 在 检 出 卫 . KIL 中
存在 三 个 问题 首先， 放射 标 记 了 的 ILA A IgG 起 交 又

e 67 »

RM; 其 次 ,尽管 工 抗 已 用 缺失 下. XI] mR, 但 还 有
某 些 污染 抗体 存在 ; 再 者 ,放射 自 显影 谱 廿 出现 了 两 条 和 和 卫 . 和 II
无 关 的 较 弱 的 区 带 。 为 了 克服 这 些 问 题 ，] 项 mmale 等 人 采用
了 一 种 新 的 免疫 检 出 法 "“”, 其 原理 如 图 2-20 所 示 。 简 言 之 , A
re TE DRA (NO A) 上 的 抗原 和 抗体 中 的 一 部 分 结合 后 ， 再 和
经 提纯 的 已 用 一 工 标记 了 抗原 反应 而 检 出 -他 们 的 实验 表明 用
此 新 法 灵敏 度 极 高 , 可 检 出 0.8ng RUA BP, XI, wi
晰 无 污染 区 带 , 也 几 无 背景 。

2-20 Immli 等 人 创造 的 新 法 \B) 和
原 法 (A) 不 同 点 的 原理 示意 图
人 代表 针对 卫 . XITM IgG nk; @ Ral Hida Fe |

4. EK ,

用 一 种 非特 异性 的 , ARH ENC H F, 封印
渍 纸 上 未 结合 位 点 从 而 消除 背景 的 处 理 谓 之 狂 灭 中 。 也 就 是 说 ，
不 管 想 试验 什么 ， 印 渍 后 印 渍 纸 上 不 曾 印 渍 着 分 子 的 滤纸 部 分
会 在 印 盖 时 非特 异性 地 吸附 探 针 , 并 因此 产生 二 种 过 高 的 背景 。
为 此 必须 在 印 渍 后 , 也 即 印 盖 前 ， 先 狂 灭 滤纸 上 这 种 剩余 部 位 。
苦 灭 处 理 通常 是 把 已 印 渍 了 的 滤纸 用 高 浓度 的 牛 血 清白 蛋白
(BSA)aa'lo,4 或 血红 蛋白 (Hb)ee2， 于 95-~60°C 下 保温 1~
125 来 达到 。 白明 胶 sm、 各 种 动物 血清 we 等 都 曾 用 作 和 蛋白 质
CSUR. 对 DNA 印 汪 而 言 ， 除 使 用 25% BSA 4h, Wi
用 Denhardt 试剂 9 作为 狂 灭 剂 co。

| OSE S a

"fortum og Mtr 9 WIGS Yoo tik mre ogxy AW — DH ie Fld “WAS WE wom, (org) Afod ‘TOKO TO
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- 就 目前 已 报道 过 的 印 渍 术 文 献 看 , 有 两 种 主要 的 狂 灭 方式 ，
BE KARAETRRERE RO, BAW T RRMA L
ARR SHER A. PER RIAA EEF US RY
液 或 洗涤 液 中 2?， 这 是 因为 某 些 学 者 认为 狂 灭 剂 还 能 增强 其 后
AY EN BORO, 或 者 能 促进 抗原 决定 篮 构 象 的 复 性 所, 如 果 儿 灭
剂 选择 适当 的 话 。 例 如 Bartles 和 Hubbard 指出 ，BSA =? Hb
作为 狂 灭 剂 时 会 抑制 :IT- 麦 胚 凝 集 素 结合 其 糖 蛋白 受 体 ， 如果
改 用 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (Polyvinylpyrrolidone; 简称 PP; 平均
Mr = 40000) 作为 狂 灭 剂 , ARAL AT ABER DA LARA
位 点 , 1 HS TRE ABU, 这 是 因为 了 PP 中 绝对 不
会 含有 象 BSA 试剂 中 所 含 的 糖 蛋白 杂质 的 缘故 2

值得 提出 的 是 ， Flanagan 和 Yost 曾 系统 研究 过 各 种 狂
灭 剂 以 及 上 述 两 种 狂 灭 方式 的 效率 吗 ?)， 结 果 如 表 2-7 所 示 。 他
们 得 出 结论 说 ,用 Tween 20 fey RERH, PRT MER NO RE
非特 异性 结合 有 用 外 ， 还 提高 了 钙 调 蛋白 (CalM) 和 已 印 渍 于
NO 纸 上 它 的 结合 蛋白 的 印 盖 效 率 ， 尤 其 是 表 观 分 子 量 (Mr ) 为
61000 的 脑 蛋白 。 其 最 小 检 出 值 为 0.62wg, 这 比 所 试验 的 其 它 ”
方法 , 灵敏 度 要 提高 7 全 60 倍 = BRL, 表 2-7 也 表明 ; FE BEBE
直接 印 盖 需 2 到 3 天 , 而 用 方法 工 印 盖 检 出 时 , 包括 电 印 渍 步 又
在 内 仅 需 16 小 时 。 Flanagan 和 Yost RH, ABRAM
迎 灭 剂 的 又 一 优点 是 ， 所 得 印 渍 谱 可 用 氨基 黑 染 色 而 不 会 产生
AP. Tween 20 所 以 能 提高 印 渍 效率 在 于 它 使 多 点 结合 于 :
NO 纸 上 的 蛋白 质 消 除了 部 分 结合 点 ， 这 对 恢复 钙 调 蛋白 的 结
合 蛋 白 的 活性 部 位 将 起 一 定 作 用 5。

参 考 文 献
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‘Bae EN You 3 与 操作

sey 5p ECARD MKS wee Atl, RWB
4, ATRPRADAH=R™. 毛细 作用 印 渍 (Capillary
blotting) .扩散 印 溃 (Difttusion Blotting) Fi # Aly (Electro-
blotting)。 各 类 印 涡 装 置 在 设计 上 各 不 相同 。 目前 以 电 印
渍 法 应 用 最 为 广泛 , 已 有 儿 种 电 印 渍 槽 商品 供应 , 例如 我 国 江苏
兴 化 分 析 仪 器 厂 生 产 的 转移 电泳 仪 、 瑞 典 LEKB 公司 生产 的
Transphor' Gell 呈 一 美国 生产 的 Trans-Blot Oell(Bio-Rad
Laboratories, Richmond, Calif.) 41 HoeferTE42 型 转移 槽
(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Oalif.)"’,
th, Bio-Rad Laboratories 还 生产 有 专 供电 印 渍 用 的 高 电流
:1 低 电 压 的 电 印 渍 醒 电 源 (2.5 人 A/250V) 一 。 就 目前 而 言 ,这 些 电
印 溃 商品 还 存在 各 种 问题 “…… 因此 新 的 构思 和 设计 不 时 有 所 报
ja 9,

需要 指出 的 是 ， 上 述 电 印 溃 商 品 以 及 所 有 有 关 电 印 汗 的 报
道 ; 所 用 装置 实 可 分 为 两 类 : 电 洗 脱 装置 和 电泳 装置 。 前 者 ， 两
HRA MK BAS 同一 槽 中 , 同时 被 同 种 溶液 所 浸没 1。 后
者 , 两 电极 被 印 渍 夹层 分 隔 开 , 各 被 电极 溶液 所 饱和 的 滤纸 所 浸
润 。 这 些 滤 纸 相当 于 和 常规 电泳 仪 中 彼此 分 开 的 两 个 电极 槽 ,， 因
此 滤纸 上 被 饱和 的 两 电极 溶液 可 以 相同 ， 也 可 以 不 同 。 这 里 所
以 如 此 强调 两 类 电 印 渎 装置 的 差异 ， 是 因为 采用 电 洗 脱 装置 进
行 电 印 渍 时 ， 需 采用 低 电 压 、 高 电流 电源 ( 约 -50V,，5A)sa。 不
广 意 这 一 点 , 误 将 常规 的 常 压 电泳 仪 的 电源 ( 约 500V，500mA)
来 替代 , 其 结局 将 烧 筑 电流 表 。

6 732e

一 、 所 细作 用 印 渍 装置 与 操作

Southern 开创 本 技术 时 即 采 用 这 种 方式 sa 他 设计 的 两
种 毛细 作用 印 渍 装置 示 于 图 3-1 和 3-2。 经 琼脂 糖 板 形 或 圆 管
形 凝 胶 电 泳 分 离 的 DNA 限制 酶 切片 段 ， 用 0.5Ug/ml 药 省 乙
Be, PATE 254nm 波长 的 紫外 光 下 加 红色 滤 光 片 进行 拍
照 。 所 得 照片 可 以 作为 DNA 片段 的 全 谱 检 出 ,- 以 及 其 后 用 分 -
子 杂交 法 检 出 特异 性 区 带 时 用 作 定位 的 对 照 谱 ; 用 一 把 在 火焰

图 3 用 于 板 形 ee ys
(a) ~ (a), TERA. VALE OMES

主 烧 过 的 刀片 将 玫 胶 纵 切 成 宽 0.5cm 到 tem 的 凝 胶 条 。 把
Ay He He 3) BIA th 1.5 MNaCl 和 0.5MNaO 互 组 成 的 溶液 中
15 4) 9, HE DNA 疗 段 变性 解 为 单 链 。 再 把 凝 胶 转 入 3M NaCl
和 0.5M Tris-HOLCDH 7.0 组 成 的 缓冲 液 中 洗涤 , 以 便 将 碱 中
-和 掉 。 经 上 述 处 理 过 的 凝 胶 条 即 可 作为 印 渍 模板 。 印 渍 时 ， 先
-把 一 张 厚 的 普通 滤纸 裁 成 20eomxl18cm, 在 20 倍 由 0.15M
NaCl 和 0.015M 柠檬 酸 钠 组 成 的 溶液 (简称 20 x SSC) PRE,
然后 取出 铺 于 玻璃 台 板 上 。 如 图 3-1a 那样 把 凝 胶 条 放 于 湿 滤
KEE PME, LPM SHR Fem x 20 cm 的 有 机 玻璃 板 或
普通 玻璃 板 , MAR RAE 2~3 mm, 且 厚 度 相同 (3mm) 。
取 一 张 硝酸 纤维 素 纸 ( 即 NO 纸 ) 裁 成 2.26m x18cm, HLA 2x
:SSO 溶液 中 浸 湿 后 铺 于 胶 条 上 ， 其 两 侧 边缘 刚好 搭 在 胶 条 两 侧
所 放 的 有 机 玻璃 板 上 (图 3-lb) 。 以 上 操作 需 注意 两 点 ， 其 一 ，
NO 纸 有 正 反面 ,正面 常 称 为 NO 表面 ， 较 光滑 ， 此 面 应 朝向 凝
胶 ; 其 二 ; NO 纸 和 凝 胶 间 , 凝 胶 和 湿 滤纸 之 间 必 需 严 防 气泡 。 因
为 气泡 会 产生 高 阻抗 点 , 形成 低 效 印 渍 区 。 这 在 印 渍 术 中 称 为
“Ht (Bald spots)” AHHH, VARS BMS ERM
平整 。 取 两 张 厚 的 普通 滤纸 裁 成 2cmx 180m Ky), FE 2x SSO
WP BG A 3-1e 那样 分 放 于 NO 纸 两 侧 的 上 方 。 此 两 张
滤纸 条 的 间距 刚好 等 于 凝 胶 条 的 宽度 ， 即 5mm 左右 。 最 后 把
5 9k 100m x 18 om 的 干 滤纸 (普通 滤纸 、 控 手纸 等 均 可 ) 又 放 在
最 上 层 ( 图 3-1d), 夹层 即 告 装配 完成 。
对 圆 管 形 凝 胶 柱 而 言 , 层 间 排 列 与 上 类 似 。 如 图 3-2 所 示 ，
MBH 9mm, 长 12 或 24cm。 据 此 用 有 机 玻璃 粘 制 成
6 列 尺 寸 与 胶 柱 相当 的 印 渍 槽 。 凝 胶 柱 的 处 理 和 板 形 凝 胶 相同 ，
但 各 步 时 间 需 延长 一 些 。 凝 胶 放 入 印 渍 槽 后 ， 把 已 用 2X8SSO
| RE NO 纸 放 入 胶 柱 顶部 , 其 上 再 放 5 张 干 滤纸 即 可 。

es 75e

a. vv —————————LL—<_—————————— TN

图 3-2 AR iV li

HH EIRP APSE AREA, EBM (SSO), 不 论 是 处 于 湿 滤 :
纸 中 还 是 处 于 凝 胶 中 , 系 由 顶部 的 干 滤纸 吸引 通过 毛细 作用 把 : j
Jez he ts By DK A ED A FE ar
涡 时 间 , 正如 原理 一 章 所 述 , RFRA, RDB THK
小 和 性 质 等 。 在 Southern 从 2% FIRMA BE We 3mm)”
转移 E.coli DNA fv BER al RES ED BE BY SK Hs EE STE,
(1A, SA 9 JE BEE) BL DNA HY BB Hl PB, 区
Bi 20 小 时 后 仍 不 能 完全 转移 一。

1979 年 ，Southern 又 把 毛细 作用 印 下 装置 修改 — 3-3"
所 示 结 构 呈 LIE ES SE PI
用 装置 。 eh Shas tH

24 (EA PREWRKE AE: 5 WR eR, TE
便 , FRAKD, GLB, Fa
和 印 溃 动力 较 弱 而 难以 迁 出 凝 胶 。 为 此 AME A— BRR
印 涡 法 进行 改良 的 报道 , 如 Schaltmann #1 Pongs™? 在 进行 果 ，
蝇 组 织 培养 细胞 蛋白 质 分 析 中 ， 虽 也 采用 了 如 图 3 的 类 似 装 二
置 , 但 他 们 把 此 装置 整套 放 人 加 有 盖 的 、 高 为 2 灾 38omi 的 玻璃 盒 ，
HH, 以 便 印 涡 体系 在 长 时 间 印 涡 后 还 能 保持 一 定 湿度 只 Miskin2
和 Soreq 不 但 把 毛细 作用 装置 进一步 简化 BRP |S

* 76%

EE ee 7

图 3-3 用 于 琼脂 糖 板 形 凝 胶 的 毛细 作用 印 渍 装置
a. —B FR; b. NCH; co. 由 一 圈 塑 料 条 围 住 的 凝 胶 ;
d. 两 侧 下 弯 并 浸入 溶液 的 厚 滤纸 e， 玻璃 板 ;i 节 印 渍 缓冲 液 槽 。

BO HANES FEB BBE ED BE» HAN FEI NO 纸 用 OAM Tris

OL (pH8.1) fy 5 28 np yy 3 36, 取出 沥 干 水 滴 后 夹 于 两 张 普
MERA AS. 平 铺 于 盘 中 ， 再 把 凝 胶 放 在 NO 纸
二 面 , 连 盘 放 进 恒 湿 箱 中 , 87°C Fen a 2 小 时 即 告 完成 Ohlsson
等 人 ”以 及 Yan den Bergco 则 在 毛细 作用 印 渍 夹层 的 顶部 放
ELA TH BO, 以 便 保 证 各 晨 间 度 好 接触 Peferoey 等 人 则
把 整 个 装配 件 放 入 大 型 真空 二 召 器 中 ， 利 用 减 压 真空 来 缩短 钙
CUNT, SUE, 毛细 枚 用 印 沪 法 最 应 用 不 多 , (KGL 的 琼脂
BE GIB BSP EE Bh ay ED 还 时 有 报
道 “ …。 因 为 这 类 大 孔 凝 胶 一 般 均 能 在 23 小 时 内 完成 印 渍 ，
强 和 的 条 件 又 有 利于 用 印 污 术 分 析 酶 活力 aa。

基 近 ,下 hompson 等 人 提出 了 一 种 很 有 启迪 任 的 毛细 作用

«77 #

I S'SSSE'ESE TE PN AE, A

印 涡 方法 ， 并 成 功 地 定量 分 析 了 玉米 苗 龄 为 3 星期 的 叶子 粗 提
液 中 谷 酰胺 酶 ( 卫 O 3, 5.1, 2) 活力 GD. 他 们 先 把 含 谷 酰胺 酶 的

品 在 12% (w/v) te BY AIG EE (12 x15 x1. 2cm)J 中 电泳 ， 电
泳 后 的 凝 胶 横 切 成 2mm 厚 的 薄片 作为 印 渍 粳 板 二 -再 按 图 3 4

所 示 招 凝 胶 赤 于 滤纸 和 成 像 胶 (Image gel) Zia]. 基体 做 法 是 ，
先 在 台 画 上 铺 二 块 塑 料 布 ， 其 上 放 两 张 干 的 普通 滤纸 ， 由 它们
吸引 其 上 各 种 凝 胶 层 的 水 分 。 滤 纸 上 放 一 块 厚 4maas 内 会 离子 -
交换 树脂 (Dowex AG 1—X8, ZB, 200~4008; RAH
Dowex AG 50W—X8, H* #4, 200~400 目 ) 的 琼脂 糖 (0. 75%): 3 习
蜂胶 片 。Tiompson Fit HRI RIBS, FAIS Tag /ml
AG 1—X8 树脂 ) 或 49mg/ml( 指 AG50W= 8 树 脂 ) 量 的 湿 树
脂 混 入 融化 了 的 琼脂 糖 , 然后 灌 入 厚 4mm 的 框架 申 铸造 ;冷却
后 即 是 。 成 像 胶 上 面 安放 电泳 凝 胶 , 其 上 再 放 浸 透 底 物 溶液 (25-
mM LI- 谷 酰胺 、100mM- 乙酸 钠 ，pH4.9) 的 普通 滤纸 。 各 层 安 :
放 完 成 后 , 提起 下 层 塑料 布 的 四 角 ; 把 整个 顽 层 外事 起 来 以 防水 、
we, BEATA, 在 夹层 最 下 面 的 两 张 干 滤纸 的 吸引 下 BE
层 的 滤纸 中 所 含 底 物 将 被 吸引 进入 电泳 凝 胶 中 统 并 在 其 中 和 富 - ，
谷 酰胺 酶 的 区 带 发 生 酶 促 反应 。 酶 反应 产生 的 产物 众 氨 酸 ) 又-
HHOARA ROR Te

图 3-4 测定 谷 酰胺 酶 活力 的 毛细 作用 印 渍 夹层 装配 图
ss 78 。

所 用 条 件 又 只 能 使 谷 氨 酸 吸着 ; 故 能 不 受 其 它 杂 质 干 扰 地 .有 选
择 性 地 检 出 谷 氨 酸 并 予以 定量 为 此 ,了 Hompson 等 人 称 此 为
产物 选择 性 印 溃 (Product-Selective Blot)", fi wil,
室温 十 印 渍 工 小 时 反应 即 能 完全 。 为 了 使 产物 全 能 进入 成 像 胶
ij 中, 他 们 在 印 渍 后 ,仔细 地 除去 电泳 凝 胶 和 成 像 胶 的 上 、 下 层 滤
纸 ,， 再 把 这 两 块 胶 ( 切 缴 移动 位 置 ) 放 在 凝 胶 真 空 干燥 器 中 。 此
时 成 像 胶 朝 向 真 室 源 ， 在 不 加 热 的 情况 下 抽 真 空 20 分 钟 ,使 酶
到 应 产物 全 部 进入 成 像 胶 中 。 人 除去 电泳 凝 胶 ， 再 把 成 像 胶 用
500ml 水 在 轻 轻 播 动 下 洗涤 。 共 洗 8 次 , 每 次 15 分钟， 以 便 除
去 除 谷 氨 酸 以 外 的 任何 杂质 。 洗 涤 后 成 像 胶 用 Davies 和 Miflin
斯 创 酚 本 试剂 使 谷 氨 酸 显 色 。 通常 在 10~30 分 钟 内 即 能 得 到
很 好 的 荧光 显 色谱 , 可 在 长 波长 紫外 灯 下 拍照 , 然后 用 密度 扫描
计 在 465mnm 波长 下 进行 定量 。

如 所 周知 ， 在 不 变性 电泳 凝 胶 中 原 位 检 出 酶 活性 有 许多 困
难 ， 因 为 很 难 在 凝 胶 中 把 底 物 和 酶 反应 后 产生 的 产物 分 开 。 迄
今 常 用 的 在 不 变性 凝 胶 电 泳 后 的 酶 活性 定位 法 ， 又 只 限于 少数
能 生成 可 着 色 物 质 的 酶 类 ,如 屯 酸 脱 氢 酶 的 同 工 酶 等 。 现在
Thompson 等 大 所 创 产 物 选 择 性 印 渍 法 是 把 产物 特异 性 地 结合
于 成 像 胶 中 的 固定 化 材料 (树脂 ) 内 ， 这 就 解决 了 酶 反应 中 产物
和 底 物 难以 分 开 这 二 问题。 此 外 ，Thompson 的 实验 开创 了 印
HAW AFH, 其 意义 是 重大 的 。

= 二、 扩散 印 渍 装置 与 操作

HK EN PE fT Be OED TH (Contact-diffusion blott—
ing), #4 (Diffusion transfer)°", 或 间接 扩散 转移
(Diffusion—mediated transfer)”,

e793 e

扩散 印 溃 装 置 类 型 不 多 ， 大 都 按 图 3-5 所 示 夹 层 装配 ， 然
后 把 整个 夹层 放 入 大 容量 的 玻璃 拭 内 即 可 。 图 3-5 实 际 目 是
Bowen 等 人 用 扩散 印 渍 法 检 出 海 拉 (HeLa) 细胞 核 中 结合 DNA
的 蛋白 质 时 所 创 装置 22。 AACR, WR ae NO 纸 需 用 印
渍 缓冲 液 (他 们 采用 0.05M NaCl、2mM Na=EDITA、0.lmnM
DTT_10mM Tris-HOl, pH7.0 洲 液 ) 浸 湿 。 于 因为 市 上告 泡 沫 塑
料 垫 内 常 混 有 去 污 剂 , 用 前 需 先 用 大 量 水 清洗 除去 六 NAM
塑料 多 孔 ， 内 藏 大 量 气泡 , 必须 把 它 放 在 印 溃 缓冲 液 中 用 手 ( 戴
手套 ) 按 压 除 气 后 使 用 。 NO 纸 浸 泡 时 要 分 两 步 进行 六 先 把 NO
纸 潭 浮 在 印 渍 缓冲 液 上 一 段 时 间 ， 再 把 它 浸没 于 溶液 中 。 这 样
做 可 以 防止 NO 纸 表面 残留 气泡 。 装 配 时 ， 先 把 不 锈 钢 筛 板 放
A ALES, 放 土 一 块 泡沫 塑料 垫 (用 数 张 已 用 印 渍 缓冲 液 浸
湿 过 的 普通 滤纸 替代 也 可 ), 其 上 放 一 张 NO A, RR. 此
后 再 顺 次 放 NO 纸 、 泡 沫 塑料 垫 和 不 锈 钢筋 板 。 显 然 , 夹层 的 各
层 尺 十 要 相当 ; 层 间 务必 无 气泡 。 装配 好 夹层 后 徐徐 倒 六 印 渍
Bry, Bowen 等 人 的 实验 采用 2L 印 渍 液 ， who 36~ 48
小 时 , 并 在 12 Jef Kh e— UB EY EEE ES

由 上 可 知 , va EA Bik He Se EE FG SKE ae REE

Ey DX APH BAD HCE FE Ae ESE BEI PFD ERE
点 是 可 同时 获得 两 张 相 同 的 印 渍 考 贝 ,: BR SY ETB Fe
右 。 缺 点 是 印 渍 时 间 比 毛细 作用 印 涡 法 还 要 长 昼 直 于 扩散 印 汪
装置 至 今 无 多 大 改进 ， 这 里 不 再 讨论 。

a Urs ey Te

Ha EY) Pe (Electroblotting) (83 又 称 电 转 移 aastr5Ega
sfer) ”、 电 洗 脱 (Electroelution)c9 横向 电泳 (Transv6rsal —

7 80;

TR HA

II — **2**
Ee Se

NCH

:
CF a = 二 一
IT EE)

35 .扩散 印 渍 法 所 用 夹层 装配 图
electrophoresis)™_ #3 4 # EN ¥# (Electrotransfer blot)c57.
FH KAS B ( Electrophoretic transfer)°@ 等 。 电 印 渍 首先 由
Towbin 提出 ”由 于 此 法 印 渍 时 间 短 ， 印 渍 条 件 容 易 控制 ， 重
PATER, 印 渍 效率 高 等 特点 , 是 目前 最 广泛 采用 的 印 渍 方式 。

”地 印 渍 装置 各 式 各 样 ， 而 且 新 的 设计 还 在 不 断 涌现 中 。 作
者 认为 ， 种 类 昌 多 ， 但 可 按 电 印 渍 装置 的 形状 分 为 水 平 式 (如 图
3-8) 和 直立 式 \ 图 二 5 两 类 。 车 按 原理 ， 又 可 分 为 电 洗 脱 类 型
和 电泳 类 型 。 前 者 (图 二 5) ,两 电极 处 于 同一 槽 内 , 同时 被 浸没 ，
于 大 体积 的 同 种 溶液 中 ;后 者 大 多 属 水 平 式 ， 两 电极 分 占 夹层
的 上 、 下 两 端 (如 图 3-9);7 它 虽 无 常规 电泳 仪 那 种 分 放 两 电极 的
电泳 槽 , 但 因 两 电 汲 各 处 于 由 相同 或 不 相 同 溶液 浸透 的 滤纸 上
方 或 下 方 , 故 实际 上 和 电泳 装置 并 无 两 样 。

(直立 式 电 印 渍 装置 ， 在 第 一 章 中 绘 出 的 直立 式 电 印 汪

装置 (图 1-5) Aw Stellwag 和 Dahlberg 设计 的 ”"。 与 此 类 似
的 装置 曾 有 许多 报道 ， 例 如 Reiser 和 Wardale Kit hy HAN it
装置 (如 图 3-6 所 示 )。 夹 层 是 在 槽 外 装配 起 来 的 。 此 时 , 先 把
ADRK PME RM EL, BREE AE it Bt ym (pH9.2，
50mM HRA RR THRE (Omm 厚 )， 其 上 再 放 已
用 印 涡 缓冲 液 平衡 过 的 凝 胶 。 铺 上 一 张 新 制 备 的 重 氮 葵 硫 醚 纤
HERA (DPT 纸 ) 后 ; 再 放 一 张 浸 过 印 涡 组 冲 液 的 普通 滤纸 (如

Whatman No. 50), 最 后 再 放 上 第 二 块 5mm JE, JHA
Ew KORA, 以 及 第 二 块 多 孔 有 机 玻璃 板 。 装配 时 各
2), 尤其 是 凝 胶 和 DPT 纸 之 间 ， 务 必 不 能 夹 有 任何 气泡 。 装
配 结束 后 用 两 根 橡皮 筋 圈 在 夹层 之 两 端 , 使 各 层 紧 贴 在 一 起 , 这
样 就 可 以 把 整个 夹层 竖 放 入 印 渍 槽 内 。 印 渍 槽 是 用 厚 0.6cm
的 有 机 玻璃 粘 制 而 成 ， 内 部 尺寸 为 19.7Xx20.4X23.2cm。 杆
两 侧 粘 有 两 块 圆 形 板 , 其 四 周 绕 有 铂 丝 , MAAR.
电极 相距 12.50m, 夹层 则 放 在 两 电极 中 心 位 置 处 。 在 Stellwag
和 Dahlberg 采用 这 一 装置 印 渍 猿 猴 病 毒 40(SV40) 的 蛋白 质
时 ， 电 压 控 制 在 400V， 约 300~400mA， 即 电压 梯度 为 32V/
com, 印 涡 工 小 时 ， 槽 内 溶液 温度 由 原来 的 1020C 升温 到 20°C,
印 涡 效率 在 52~60% 之 间 , AF IK A
Bittner 等 人 设计 的 电 印 渍 装置 也 属 此 类 ， 而 且 现 有 Fa EN iit
商品 大 都 以 此 设计 为 基础 。 该 装置 结构 示 于 图 3-7co， 系 由 来
层 和 缓冲 液 槽 两 部 分 组 成 。 其 中 电极 框 较为 复杂 (图 3-7A)，

(3)¢5) (7) (3)

= (4) (6) (4)

图 3-6 直立 式 电 印 渍 装置 示 辣 图
(1) 电极 ; (2) WM; 〈3) 多 孔 有 机 玻璃 板 ; (4) WPM;
(5) 普通 滤纸 ; (6) DPT 纸 ; (7) WEB

*.82 。

© (FTL) fel oy S89 MA oh AGEL CRIT) BELG “eq SO" 9TX6X8 KC AD RAB “BAIRD SN “V
Bat Wa HOH % tum «2-8 国

(Shh)
WIG "FZ

AND)

(AHI) UOT

VE AG a GF

e 83 je

这 是 由 厚 1.27om 的 有 机 玻璃 粘 制 成 内 尺寸 为 2X9X1558om
的 电极 框架 。Bittner 等 人 的 实验 证 明 板 形 凝 胶 的 印 渍 最
好 把 它 放 在 平行 的 金属 电极 板 之 间 ， 因 为 和 组 症 靶 比 堵 赴 灯 全
属 板 电 极 将 有 小 的 阻抗 ， 任 何 电压 上 于 这 类 电 航 都 将 殉 福 地 分
布 于 整个 电极 表面 ， 从 而 提供 均一 电场 使 板 形 凝 胶 中 和 处 区 带
能 均匀 地 转移 。 铀 电极 是 较 理 想 的 , 它 不 容易 因 惠 解 而 损耗 ?但
是 即使 最 匣 的 铂 片 都 是 极其 昂贵 的 ， 为 此 他 们 用 实验 证 明 用 销
丝 按 一 定 距离 排 布 (如 他 们 用 .5.5em 间距 ) 也 能 产生 均匀 分 布
的 电场 。 此 外 , 他 们 为 了 保护 铂 丝 电极 , 在 负极 框 肉 辅 主 二 张 透
析 膜 , 此 膜 和 铀 丝 相距 1.5cm。 铂 丝 接 于 伟 出 电极 短 顶 的 香 若
插座 上 , 以 便 和 外 电源 接 通 。 为 了 使 赤 层 夹 紧 , 电极 框 顶部 和 下
部 附 有 三 个 螺旋 插 孔 。 正 电极 框 结构 与 此 类 似 , ATS,
三 个 螺旋 孔 内 有 螺纹 ， 以 便 尼龙 制 成 的 螺栓 可 通过 负极 框 的 三
个 孔 旋 入 正极 框 相应 孔 的 螺纹 内 使 夹层 紧 固 。 电 极 框 有 2om 高
的 肢 支 撑 , 目的 是 使 夹层 底部 可 放电 磁 搅 拌 棒 ， 以 便 使 整个 体系
温度 恒定 。

缓冲 液 模 也 由 有 机 玻璃 粘 制 而 成 内 尺寸 为 xx 葬 . gx
24.5cm( 图 3-7B) 。 槽 两 侧 各 粘 有 两 根 有 机 息 璃 条 -间距
4.5ocm， 夹 层 装 配 好 后 可 插入 其 间 使 之 固定 在 槽 中 心 位 置 ， se
层 装配 和 前 述 装置 差不多 , IAM TE. BBR AE —
张 普通 滤纸 、 凝 胶 .NO 纸 (或 DBM 纸 )、 一 张 车 通 滤纸 、 正 极 框
的 顺序 排列 。 印 渍 时 , 用 印 渍 缓冲 液 浸没 夹层 , 电流 控制 在 2A。|
因 有 搅拌 装置 , 印 渍 二 小 时 后 升温 -5 AS

由 图 3-6 和 图 3-_7 可 知 , EAE REM, AE II
围 溶液 。 换 句 话说 , RAMA JESTER, BOS AO
3 ae |

(2) 水 平 式 电 印 渍 装置 “图 3.8 是 Gibson 设计 的 水 平 式 -

0 64 。

$8 水平 式 电 印 读 夹 层 装配 图
1. FABRE; 2. ATOR, 3. 三 张 浸透 印 涡 缓
冲 液 的 普通 滤纸 ; 4. NCAR; 5. HR; 6. 三 张 浸透 内 含
链 霉 蛋白 酶 的 电极 缓冲 液 的 普通 滤纸 。

WARE, 他 为 了 提高 高 分 子 量 蛋 白质 的 印 渍 效率 , 在 阴
极 侧 的 电极 缓冲 液 中 加 有 有 蛋白酶 ， 使 凝 胶 中 高 分 子 量 蛋白 质 先
源 蛋 白 酶 原 位 温和 水 解 为 较 小 片 侦 ， 然 后 转移 并 印 渍 于 阳极 侧
Wy NO ARE, 具体 做 法 是 , 先 在 绝缘 台 板 上 放 上 一 块 重 1.7kg，
尺寸 为 309X16X2em 的 石墨 板 作为 阴极 ; 其 上 覆 以 氧 丁 二 烯 橡
Bes MEK TAA 25 或 75wg/ml 链 霉 蛋白 酶 的 电极 组
Th (0.1%SDS, 25mM Tris, 192mM 甘氨酸 ) 的 普通 滤纸
(Whatman 3MMD 把 它们 放 在 橡胶 垫上 。 被 巨细 胞 病毒
(COylomegalovirus) 感 染 的 人 包皮 成 纤维 细胞 , 取 其 细胞 核 粗 提
”省 , 经 0 标记 后 于 14% 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 中 电泳 。 电 泳 后 的 北
‘(180 x 180 x 0.75 mm) 纵 切 为 村 作 各 种 试验 5 其 中 一 块 (4.5
xlgem) 经 同 种 电极 缓冲 液 ( 不 含 蛋白 酶 ) 平 衡 后 放 在 上 述 三 张
滤纸 面 上 。 取 NO 纸 切 成 凝 胶 同 样 大 小 ， 并 在 印 渍 缓冲 液
(25mM Tris, 192mM- 4AM, 20% FARE) HP BEME, WET BE BEND
ETSI, = SK FA LAE Die a RB SR HH Ze NC
上 , BRBVUALRRRANARERK, 整个 夹层 的 装配 要
求 迅速 , 避免 凝 胶 脱水 , 又 要 快 中 求 稳 , 以 防 气泡 混入 夹层 内 。 在
Gibson 的 这 一 实验 中 ,采用 12V 电池 充电 器 作为 电源 ， 起 始 电

2 85 。.

=“ mmol

~

Hy 1.5A, EN 2 小 时 。 结 果 表 明 , 分 子 量 高 达 145000 AYE
MA PT, 印 涡 效 率 小 于 507%, 而 加 酶 印 涡 时 印 Ios
效率 高 达 98 % 。 这 是 因为 印 渍 过 程 中 ， 阴极 侧 三 张 滤纸 中 的 链
霉 蛋白 酶 在 电 驱动 下 进入 凝 胶 ， Ea AE”, MA AL
出 凝 胶 。 由 上 了 可知, 电流 只 穿 过 凝 胶 ， 两 电极 虽 没 有 分 装 两 模 ，
但 各 以 三 张 滤纸 吸 满 电极 浴 液 ， Pei 2. clei. yon A
Hee Ah re EE SO
Vaessen 等 人 设计 的 水 平 式 “a CUES be gO,
Abi 148 Rf Wy 150 x 200 x 1mm KAR EE BR, IO
于 扁平 的 盘 中 (图 3-9). Pk LKR 0.57SDS 的 普通
滤纸 。 纸 上 放 凝 胶 后 覆 以 一 张 NO, HERR IMWIDK
印 涡 绥 冲 液 (192mM 甘氨酸 , 25mM ‘Tris, 20% FARE, PH8.3) 浸
湿 的 普通 滤纸 。 另 一 块 和 阴极 同样 大 小 的 不 锈 钢板 放 在 这 鸽 滤
纸 上 作 为 阳极 。 3 一 5 张 也 浸透 印 渍 缓冲 液 的 普通 滤纸 放 在 阳
极 上 , 然后 压 上 1.5kg 的 重 物 使 各 层 间 平整 ( 重 牺 可 用 瓶 内 装 永
替代 )。 最 后 在 盘 内 仔细 地 灌 入 印 渍 缓冲 液 直到 刚好 淹没 阴极
时 为 止 。Vaessen essay 11% 聚 丙烯 酰胺 板 形 凝 胶

rey oeeee ri) 5
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‘oie =f mi 465. OR SBR DELS
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2 Ys Ot pith Mews)

ANE semen

图 3-9 OER RE RE iF
1. 阴极 ; 2. 一 张 普 通 滤纸 ; 3. HERE; 4. NO 纸 ; 5. 10~15
AMMO tk; 6. BRB; 7. 3~5 张 普通 滤纸 ) 8. 1.5kg A.

- 0
3 oe wa . cee

中 ,转移 酵母 线粒体 细胞 色素 be: 复合 物 的 亚 单位 于 NCA 上。
印 涡 在 堂 温 下 进行 。 印 渍 中 逐渐 增 大 电压 (直到 60V)， 以 保证
电流 不 超过 250mA。 印 渍 共 2 小 时 。 由 此 装置 中 两 电极 被 分
开 的 情况 看 , 它 也 属 电泳 装置 。

(3) 电 印 渍 装置 的 近代 改良 ， 自 984 年 以来 ， 随 着 生物
大 分 子 印 渍 术 的 莲 勃 发 展 ， 人 们 越 来 越 理 解 到 现 有 电 印 渍 商品
中 存在 的 许多 问题 ， 于 是 纷纷 提出 新 的 设计 。 这 里 选择 其 中 的
三 种 , 它们 似 能 启发 出 更 新 的 构思 , 也 同时 能 反映 出 原 有 电 印 渍
装置 所 存在 的 一 些 关键 性 问题 。

人 多 考 贝 电 印 渍 装置 : 1982 年 , Manabe 等 人 开发 了 一 种
微型 多 样品 双 相 凝 胶 电 泳 技术 sa。 这 是 8 抉 38x38xlmm 板
形 凝 胶 并 联 于 同一 架 微型 板 电 泳 槽 中 进行 电泳 的 新 技术 OO,
当时 , Legooki 和 Verma 已 经 提出 在 一 块 凝 胶 模板 上 印 渍 数 份
考 贝 的 印 渍 方法 s9。Manabe 等 人 立即 意识 到 这 种 多 考 贝 印 汪
术 可 用 于 他 们 多 样品 微型 凝 胶 电 泳 的 印 渍 ， 于 是 设计 出 如 图
3-10 所 未 的 多 考 贝 电 印 渍 装置 四。 这 是 由 可 开关 的 活动 盖 板 和
印 渍 缓冲 液 槽 两 部 分 所 组 成 。 盖 的 主板 (A) 由 有 机 玻璃 板 制 得 ，
尺寸 为 190x80X5mms 主板 下 粘 有 一 块 有 机 玻璃 制 成 的 凸 出
物 (B); 借助 它 的 重 方 以 及 能 扣 住 主板 的 目 槽 , 使 盖 板 可 以 灵活
地 开 和 关 。 主 盖 下 面 凸 出 物 前 方 还 用 两 块 有 机 玻璃 板 桥接 着 一
H43x170mm 的 有 机 玻璃 板 ( 芒 ， 用 它 作为 电极 等 的 支持 板 。
二 根 粗 0.3mm，, K2) 720mm 的 铂 丝 , 横向 弯曲 成 板块 状 作为
阴极 (0)。 其 下 二 块 硬 质 泡沫 垫 (可 用 防震 用 包装 填料 板 代替 )
PI 43x 170mm 大 小 (D), 用 有 机 玻璃 制 成 的 长 螺丝 (K) 把 此

. 驳 沫 肆 (D) 连 同 铁丝 电极 一 起 固定 在 支持 板 ( 芒 上 。 印 渍 槽 外
形 如 图 3-10 中 互 . 工 荆 等 所 示 ， 也 全 由 有 机 玻璃 粘 制 而 成 。 整
全 装置 是 借 斜 着 的 , 以 便 印 渍 时 电极 发 生 的 气泡 能 沿 斜坡 逸 出 。

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图 3-10 “多 考 贝 电 印 渍 装置 结构 图 2 下.
右 侧 为 正视 装配 图 ; 左 侧 为 侧 视图 ， 图 中 符号 说 有 明 见 正文 , 教 字 单 位 为 mm,
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MLE — HALF RA AR RRO) ri
上 再 放 上 一 块 硬 质 泡沫 垫 (D') RBM SMG 只
电 印 涡 时 ， 先 把 印 渍 缓冲 液 (0:25M Tris, O.39MEE ICR,
pH8.3) HA ENEMY HH, BERL AUGER Ha YE ACD) A
100ml), W—- IK YF sWUAC RM 40 x 168 mm (G) jie FE Ha VE
(D') 表 面 。 由 微型 板 凝 胶 电 泳 分 离 了 大 血清 的 凝 胶 》 .用 三 把 不

锈 钢 制 成 的 铲 斗 (35x80x0.3mm) 铲 起 , 并 放 在 滤纸 (GD)JE5 因 |

每 块 凝 胶 尺 寸 仅 为 38x38mm， 故 滤纸 上 共 可 并 行 放 辕 汉 块 凝
胶 , 胶 间 相距 5mm 左右 (E)5 BNO AR RM 40x40mm Zp
(GE)， 经 印 渍 缓冲 液 浸 湿 后 用 小 锰 子 把 它们 仔细 地 分 放 在 法 热
凝 胶 上 (务必 和 要 夹 有 气泡 ) 5NO CE Ee

于 更 换 新 的 NG 纸 ,以 达到 多 次 印 溃 得 多 考 幢 的 目的 。 正 因为
这 样 , NO AAU Ay LA ay, 并 搭 在 槽 前 端 所 附 可 上 下 活动
的 栅 客 上 ， 印 渍 一 次 后 只 要 向 上 提 栅 格 就 能 把 4 张 NO 纸 同时
He, 俩 之 脱离 凝 胶 利 于 换 新 的 NO 纸 再 次 印 渍 。 和 印 渍 开始 时 ，
因 盖 子 放下 后 盖 下 所 连 凸 出 物 (B) 进入 印 渍 缓冲 液 ， 使 印 渍 组
冲 液 向 王 提 升 达到 阴极 表面 而 使 电路 接 通 。Manabe 等 人 在 其
天 血清 蛋白 质 的 印 渍 中 使 用 重 电 流 为 150mA( 起 始 电压 梯度 为
12V/om), 4 EN Yt 10 DB HH IK NO OH ATED 5 Ue, 共 得 20
bac & 3

nay 使 用 表面 时 HABE nb UR, Svoboda:
等 人 提出 吧 , 为 了 保证 电 印 渍 快速 而 又 可 重 现 地 进行 , RAT
胶 的 电场 必须 是 均匀 的 ; 在 不 产生 过 激 状态 下 电压 梯度 尽 可 能
高 。 前 者 决定 了 区 带 转移 的 一 致 性 , 后 者 决定 着 电 印 渍 速度 前
面 所 提 及 的 种 种 装置 中 ， 以 采用 铂 丝 编 织 成 相距 一 定 间隔 的 电
极 组 件 ( 如 图 3-7 和 3-10 所 示 ) 为 最 佳 *= 目 前 国内 外 电 印 渍 商
品 大 多 为 这 种 电极 , AP HABE BE, 丙 极 间 的 电压 梯度 约 在
10V/em 左右 。 但 是 所 用 铀 丝 很 长 (每 极 需 .5m, 共 3m), 再 加
ERORE, ORES REN, 为 此 有 人 改 用 石墨 板 或 不 锈
钢板 (如 图 3-8 和 图 3-9) 。 它 们 价格 便宜 , 如 果 两 极 间距 离 短 一
些 也 能 产生 均匀 电场 。 但 也 有 一 些 问题 ， 例 如 石墨 电极 机 械 抗
性 差 , 易 发 生 电 损伤 ;不锈钢 电极 则 不 能 抗 阳 极 ' 氧 化。 据 此 ，
Svoboda 等 人 设计 了 以 不 锈 钢 板 作 阴极 , 以 抗 氧 化 的 、 在 玻璃 表
HA 20~30nm 厚 的 仕 属 氧化 物 (大 多 数 是 氧化 亚 锡 ) A
层 的 导电 和 玻璃 板 作 阳极 。 此 外 ,他 们 根据 两 板 状 电极 间距 离 越
短 电场 越 均匀 、 电 压 梯 度 也 越 大 的 原理 , 把 两 极 间 的 距离 缩短 到
不 大 于 1om。 这 样 一 来 , 尽管 所 上 功率 不 大 于 0.1W/em2, 而
电压 梯度 可 高 达 80~40V /om, 这 就 缩短 了 印 渍 时 间 。 相 反 , 如

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图 3-6 所 示 装 置 , 由 于 极 间距 离 长 , 即使 加 压 到 200 叉 也 刚 能 达
到 10V /om 的 电压 梯度 。 而 且 体系 因此 发 热 而 需 附 加 致 冷 系
统 。 | 4th “1 HBeyr
Svoboda 等 人 设计 的 电 印 渍 装置 示 于 图 3-llc5 -阴极 KG)
系 将 厚 1mm 的 不 锈 钢 板 边 缘 一 侧 弯 曲 , 并 在 其 土 焊接 导线 (1
所 构成 。 该 电极 平面 部 分 尺寸 为 10x 15em。 作为 阴极 的 氧化
亚 锡 表 面 导电 玻璃 ( 蕊 各 国 均 有 市 售 商 品 ,Svyobod 等 天 则 是 购
自 比 利 时 布鲁塞尔 的 Qlaverbel 公司 。 购 来 后 为 了 加 接 导 线 可
在 其 四 周 涂 上 一 周 宽 0.5cm 的 胶 态 铜 ( 即 印 刷 线 路 板 的 钢印
Bi), 其 上 焊 导 线 (g 以 接 电 源 。 为 了 了 屏蔽, 此 印刷 圈 可 用 一 个 由

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BY127 经 @® 40cm ; : x <P odie 号 wx

a 接 阳极 ， . kites a
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LED, BAR oR LEDOL
A311 应 用 表面 导电 玻璃 作为 阳极 的 水 平
式 电 印 渍 装置 结构 示意 图

LED 为 发 光 二 极 管 。 国 中 数字 说 明 见 正文
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聚 毛 乙 烯 制造 的 , IE 3mm . 宽 Lom 的 隔离 框 (5) 封闭 。 此 框 可 计
氟 压 酸 酮 粘 胶 粘 牢 于 印刷 铜 圈 上 。 印 渍 槽 用 有 机 茅 璃 粘 制 成 盒
状 , KH 8.9xX16.7X11.7om, HFA GRE S BRB.
板 电极 可 抗 阴 极 氧 纶 ; 但 不 抗 阴 极 的 还 原作 用 , 因此 电源 的 正 负
极 不 能 接 错 。 为 防 错 接 引 起 不 必要 的 损失 , 他 们 用 一 上 只 BYLT
二 极 管 来 保护 ， 反 接 时 则 电路 不 通 。 又 为 了 使 电路 有 良好 的 接
通通 路 ， 在 正 、 负 极 间 并 联 了 串 有 5.6kg 电阻 的 发 光 二 极 管
(LED) 线 路 。 此 电器 元 件 焊接 在 一 块 板 上 (9)， 装 于 印 渍 槽 一-
侧 。 为 了 方便 , 电极 插座 (8) 也 可 安装 其 上 。

印 渍 夹层 的 自 下 向 上 的 排列 顺序 为 阴极 板 、 七 张 浸 透 阳极 ，
绥 冲 液 (25mM Tris-192mM Aw, pH8.3, 内 含 20% 甲醇 )
的 滤纸 ` NO 纸 ( 也 用 阳极 缓冲 液 浸 湿 )、 凝 胶 、 七 张 以 上 浸透 阴
极 缓冲 液 ( 内 含 0.19%8DS、pH8.3,， 25mM Tris-192mM 4.
酸 ) 的 普通 滤纸 阴极。 最 后 在 不 锈 钢 阴极 板 上 压 上 0.3kg 的 重
物 。, 恒 电 还 控制 在 30V 时 起 始 电流 为 0.3A， 印 渍 工 小 时 就 能
印 渍 完全 , 此 时 电流 减 半 。

8Svoboda 等 人 指出 , 他 们 用 此 装置 每 周 实验 一 次 , 共 达 两 年
未 见 电极 有 何 损耗 或 变质 中 。 印 渍 时 , 由 于 所 用 功率 很 小 , 没有 -
看 到 电极 有 气泡 发 生 。

由 圭 装 置 可 见 ， 两 电极 分 放 于 浸透 不 相同 电极 缓冲 液 的 滤
纸 上 , 实 为 电泳 装置 。

(iii) 两 用 式 电 印 汗 槽 :以 上 介绍 的 电 印 渍 装置 或 为 水 平 -
式 , 或 为 直立 式 。 最 近 , Stott 等 人 设计 了 一 种 既 可 用 于 水 平 式 ，
也 可 用 于 直立 式 的 两 用 电 印 渍 槽 9。 如 图 3-12 所 示 ， 印 渍 模
旺 立 方 体 (26oms), 系 用 5mm 厚 的 有 机 玻璃 制 成 。 底 部 两 侧 各
粘 一 块 9x26X0.5om 的 长 方形 有 机 玻璃 板 ， 使 槽 底 中 央 形 成
一 条 深 5mm. 宽 8om 的 沟 ( 图 3-12d)， 以 便 印 渍 夹层 直立 地 插

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/ 22, 5cm X 22. 5cm se 4 6: 3 FAL ai
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图 3-12 ARAL A EM £8 kt dk

(a) 槽 (数字 为 内 部 尺寸 ); (b) HE; (Cc) 固定 架 ( 共 么 块 ); atk
(2) HE; (¢) RABE; (2) RR.

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入 此 沟 内 。 槽 盖 上 粘 有 柄 , 四 周 外 有 九 孔 ,用 于 散热 。 其 中 两 孔 .
ER (A 3-12b) 电极 接线 柱 可 从 此 和 孔 伸 出 。 盖 的 四 角 粘 有-
三 角 块 ,使 槽 盖 放 在 槽 上 时 不 会 移动 。 电极 采用 了 22 .5Xx 22.5
xd.3cm 的 石墨 板 , RA TIA 3-12e 所 示 揪 入 一 个 中 空
的 不 锈 钢 圆 往 体 (长 2om; 直径 0.9om); 用 它 作为 电源 输出 线
接头 。 再 用 有 机 玻璃 按 图 3-124 HMMS, BARREN
它 揪 在 石墨 电极 和 泡沫 塑料 垫 之 间 ， 以 便 通电 后 产生 的 气泡 可
以 由 此 放出 。 为 此 , 概 格 的 三 边 粘 有 世 形 边 框 , 另 一 边 的 中 部 粘
两 块 侄 三 角 块 。 把 此 栅 格 紧 贴 石墨 电极 时 ， 电 极 产生 的 气泡 即
FY EMH Ha De AA PLB IA hl to A 3-12e 所 示 的 固定 架 四
块 ,用 作 直立 式 印 渍 时 的 固定 支架 。 2
印 渍 夹层 的 装配 如 图 3-18a 所 示 。- 先 把 阴极 板 放 入 槽 底 、

然后 按 次 放 入 电极 栅 格 - 泡 泊 塑 料 整 .一 张 普通 滤纸 、 凝 胶 、NO
纸 、 一 张 普通 滤纸 .泡沫 邓 料 垫 .阳极 顶 格 和 阳极 板 。 槽 内 放 入 部
分 印 渍 缓冲 液 (0.025MITris; 0.072M 甘氨酸 -pH8.8)， 戴 上 手
套 有 力 地 压 阳 极 板 ,使 层 间 和 泡沫 塑料 垫 中 空气 挤 出 。 若 作为
KER, 此 时 只 需 在 阳极 板 上 压 一 重 物 , 接 通 电源 即 可 。 若
AHURA, 只 需 用 手 抓 住 夹 层 的 两 边 , 并 滑动 其 底 缘 使 其 .
RARE, 上 缘 用 四 块 固 定 架 ( 即 图 3-12o) 使 夹层 直立 :
于 槽 中 央 。 加 盖 后 补 加 印 涡 缓冲 液 使 充满 整个 印 渍 槽 ， 此 时 即
WBE BRI A. Stott 等 人 在 从 SDS-PAG 转移 核 蛋 白
于 NO 纸 时 采用 2A: 电 流 ,上 时 电压 梯度 在 4~5V/om A, ED
站 2 小 时 后 续 束 ， 液 温 最 多 只 升 到 °C, 凝 胶 表面 温度 也 为
25°C, EVAR AIA 70~100%"", Stott SAUNA BRE
极 价 格 便宜 ; 又 能 保证 获得 均等 电场 , 所 设计 的 印 渍 槽 能 维持 一 :
种 陡 的 电压 梯度 , 这 就 保证 能 在 2 水 时 内 转移 完全 。 他 们 又 认 -
HOY BRR ESR AGAR IER, (eR HS

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图 3-13 BIA

装配 (a) 和 直立 式 安装 示意 图 (切中 fo gee eo

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他 们 也 认为 夹层 外 的 致 冷 循 环 圈 不 是 必须 的 。 Mr ete AT
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四 、 Le ere Sten al

; JIN Ba aS
1) SFR ERM EDR Fg
特异 性 核酸 片段 。 通常 ， 分 子 杂交 反应 是 在 可 胃 热 封口 的 市 售 1
食品 塑料 袋 内 进行 5 。 此 时 ; 一 张 17 x 120m NO 467g Jn 15m
alata ilies 4 PTAC AT RCRD 7 Bi

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加 之 杂交 反应 要 求 较 高 浓度 (103~.104cpmy/ml), 因此 设法 减少
探 针 用量 又 不 降 底 检 出 灵敏 度 是 核酸 印 渍 术 中 人 们 关心 的 问
题 。Southern 开创 印 渍 术 时 设计 了 一 种 专用 于 分 子 杂 交 的 狭
Ho", HORM 3- 考 所 示 。 它 很 容易 用 有 机 玻璃 粘 制 。 其
ARH: & 20m, 宽 8mm, 长 则 比 所 用 印 渍 纸 条 (Southern 的
RAH 1x180em™) 稍 长 1em。 装置 的 顶板 上 开 一 狭 槽 ，
以 便 捅 入 印 渍 纸 。 采 用 这 种 装置 , 对 工 x 18cm 的 印 渍 纸 而 言 只
需 1ml 杂交 溶液 。
2) $#eLA “免疫 印 渍 术 中 重要 的 应 用 之 一 是 筛选 大
量 样品 中 抗体 -抗原 复合 物 se。 近代 在 单 克隆 抗体 生产 中 ， 也
要 求 能 快速 地 从 众多 的 杂种 瘤 克 隆 中 筛选 出 某 种 特异 性 搞
AEE, 此 外 ， 同 种 抗原 制剂 印 渍 后 常 需 用 各 种 病人 的 血清 去 探
测 ， 以 了 解 何 种 病人 的 血清 识别 了 何 种 抗原 。 有 时 人 们 在 这 类
实验 中 还 要 比较 各 种 稀释 度 抗体 检 出 同 种 抗原 制剂 的 灵敏 度 ，
这 样 将 需 同 时 处 理 更 大 批 的 印 渍 纸 。Victor 等 人 为 此 设计 了
二 种 多 槽 检 出 盘 ( 图 3-15)s9。 它 是 用 有 机 玻璃 粘 制 而 成 , 共有
-25 条 狭 槽 , 每 狭 槽 的 尺寸 为 40x22X228mm。 应 用 时 , 先 把 印
渍 了 抗原 的 NC 纸 纵 切 成 0.5~0.8cm 宽 、 如 图 3-16 记 示 的 狭
条 , 并 分 放 于 多 槽 检 出 盘 的 狭 槽 中 , 分 别 加 入 不 同 稀释 度 的 抗体
溶液 6 病人 血清 或 单 克隆 抗体 ) 10 ml, 然后 把 检 出 盘 放 于 旋转 式
- 摇 床 土 摇动 工 小 时 使 之 反应 。 其 后 洗涤 、 酶 联 第 二 抗体 等 反应
均 在 此 检 出 盘 中 进行 。 这 种 检 出 盘 的 狭 槽 数 ， 尺 寸 大 小 可 按 不
FISH BORE BR.

图 3-14 FARA RKE

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8-16， 印 渍 有 抗原 的 NC 印 涡 纸 纵 切记 条 的 情景

(3) 常规 印 渍 与 志 印 渍 两 用 检 出 装置 ”在 第 一 章 中 曾经 提
及 一 种 直接 把 抗原 点 在 NO 纸 上 , 然后 采用 常规 印 渍 术 处 理 NG
纸 使 之 免疫 检 出 的 方法 点 印 渍 法 (Dot blotting), 由 于 常

关 印 渍 术 常 需 预先 摸索 欲 检 测 生物 大 分 子 的 最 佳 试验 条 件 ， 例

如 确定 抗原 或 工 抗 、 开 抗 的 浓度 、 选 择 合适 的 狂 灭 条 件 和 染色
WAS. 为 了 处 理 大 批 样品 ， 人 们 常 采用 点 印 渍 术 作 为 先行 步
Wg), 除 此 /二 些 不 要 求 电泳 分 辨 的 大 量 样品 的 抗原 或 抗体 阔
选 ， 也 往往 采用 点 印 渍 术 co。 点 印 渍 时 ， 通 常用 微量 吸管 直接
HR ge 5 ~ 2200] 量 点 于 固定 化 纸 上 ( 见 图 革 2c) 。 通 常 ;
一 张 9x 9em 见方 的 固定 化 纸 大 致 可 以 点 上 4 忆 5 行 ; 每 行 8 个
FRA. WAZA MBH 0.5om, 斑点 直径 0.6 忆 1.0cm, 行
$EY 1.5om, 因此 共 可 点 样 82~404"", But Alric 等 人 为 了
使 点 印 渍 能 容纳 更 多 的 样品 , 能 使 上 样 更 省 时 省 力 ; 同时 又 能 用
于 常规 印 渍 ”设计 了 一 种 可 以 常规 印 渍 和 点 印 渍 两 用 的 检 盟 装
置 am。 如 图 3-1 im, 全 装置 由 工 ~IV 共 四 部 分 组 成 。 图 中 ，

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I 为 盖子 ,两 侧 装 有 螺丝 孔 ， 能 使 各 组 件 在 装配 后 紧 固 成 一 体 =
开 是 具 垂 直 坑 的 板 ,， 坑 深
10mm, 宽 2 或 3mm， 长
80mm。JIIHI 是 具有 水 平
坑 的 板 , 坑 的 尺寸 为 10X
2( 或 3)xX1l20mm。.IV 为
底盘 , 内 粘 有 工 ~ III 部 分
WAR. 4A FRED
涡 检 出 时 采用 该 装置 工
II, IV 部 分 组 装 。 此 时 ，
提纯 了 的 线 料 体内 膜 经 板
形 SDS-PAGE 分 离 ， 并
Ha El ti FF NO“ (9x 13
BE bac om) ° NO RARER Je #8
图 9 计生 本 区 和 二 于 装置 的 底盘 AIVY) 中 , 其
OE 上 放 三 张 经 同 种 缓冲 液 浸
I. #; IL 具 垂 直 坑 的 板 ， 湿 的 普通 滤纸 。 把 具有 垂
Ill. 具 水 平 坑 的 板 ; 工 V: 底盘 。 HSM ACD HATES
插 圈 中 ,两 侧 用 钢 夹 使 之 与 底盘 紧 贴 在 一 起 。 各 坑 自 左 向 右 用
a~w 予以 编号 在 坑 中 分 别 加 入 不 同 种 或 量 的 免疫 迎 清 ， 坑 、
i~w 中 分 别 加 或 不 加 各 种 稀释 度 的 单 克隆 抗体 :天 置 490 分钟，
后 , 取 走 钢 夹 , 加 上 盖 板 (IT), 用 两 侧 螺旋 拧紧 于 底盘 出 20°C
保温 2 小 时 。 反 应 完毕 后 除去 工 和 II AWM PRO
NO 纸 ,把 ai 部 分 的 NO RAMA MLA BAe, 其
它 NO 纸 则 在 :IT- 羊 抗 小 鼠 免疫 球 蛋白 中 保温 已 :所 得 放射 自
显影 谱 如 图 3-18 所 示 。 使 用 免疫 血清 的 坑 显 示 了 大 量 的 民 带 -
使 用 单 克 隆 抗 体 的 坑 只 显 一 或 数 条 带 ， 不 辐 纯度 会 有 一 些 差异 &

B18 使 用 两 用 检 出 装置 所 得 检 出 谱
a~b, 使 用 线粒体 免疫 的 羊 血 清 ,a REE 1:3, b 为 1:30; c~wd, 使 用 细
胞 色素 氧化 梅 免疫 的 羊 血清 ,c 的 称 释 度 为 1:3;d 1:30;0~8, AAT
杆菌 DNA 结合 蛋白 质 免 疫 的 兔 血清 ,e AMEE 1:50, f FH 1:200;g~h,
用 wHM 酵母 蛋白 质 免 疫 过 的 免 血 清 ,g A FEED 1250, by 1:200, 8
克隆 抗体 实验 有 : 来 自 初级 杂种 瘤 培养 之 上 清 液 (1-0, 稀释 度 为 1:1) 和 克
隆 和 杂种 瘤 培养 上 清 液 (pq、u, 稀释 度 为 1:1)。 IT~t， 来 自 未 提纯 腹水 上
清 液 , 稀释 度 均 为 :100;vY 和 浆 来 自 经 提纯 腹水 之 土 清 滚 , 稀释 度 分 别 为
1:10 9 1:100,i,j,k Kis
此 外 , 使 用 这 种 装置 不 会 产生 坑 间 的 扩散 污染 ,如 图 3-18 中
ij 上 坑 未 加 血清 , 均 未 见 其 邻近 坑 有 任何 血清 渗入 。
在 点 印 渍 时 ， 先 把 三 张 用 印 汪 绥 冲 液 浸 湿 的 普通 滤纸 放 入
底盘 (IV), 其 上 放 上 也 用 同 种 缓冲 滚 浸 湿 的 NCR, RASH
II 或 JII( 视 抗原 和 检验 的 抗体 数 而 定 ， 抗 原样 品 数 多 则 用 盘
JI 反之 用 盘 JID) 捅 入 底盘 的 捅 入 圈 中 。 把 各 种 抗原 样品 分 别 衣
浴 各 坑 中 。 当 NO 纸 稍 千 后 用 水 洗 除 未 结合 抗原 ， 再 用 狂 灭 剂 “
封 阻 NO 纸 上 未 结合 位 点 。 用 另 一 块 具 坑 盘 UI RUG AA
开 时 后 者 用 III; 前 者 用 II 时 后 者 用 IT) 替代 前 一 抉 板 ) 紧 固
后 即 可 在 各 坑内 加 六 各 种 抗体 制剂 。 这 种 方法 的 检 出 图 谱 如 图
3-19 ia. WL, —3K 9x 180m 的 NO 纸 上 可 同时 检 出 600 &
站 次 点 ,这 比 常 规 点 印 渍 的 斑点 数 多 出 10 多 倍 。 更 重要 的 是 不

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图 3-19 ”使 用 两 用 检 出 装置 进行 点 印 涡 时 的 检 册 谱
需 乏 滴 加 样 , 而 是 可 以 逐 行 地 加 , 这 就 省 时 省 力 许多 .由 于 这 种
装置 的 高 效率 ,国外 已 有 和 相应 产品 问世 ， 如 法 国生 产 的 M70 型
Altuglass(SEBIA, Issy Les Moulineaux, 9 ,其 结构 和
图 3-18 出 示 的 并 无 两 样 。 okt

(4) 印 渍 区 带 定 量 使 用 的 电视 摄像 -微机 系统 常规 凝 胶
电泳 技术 中 , 因 凝 胶 透 明 , 电泳 分 离 后 凝 胶 中 的 区 带 经 染色 就 可
在 专用 密度 计 中 扫描 定量 。 现在 ,， 凝 胶 中 的 区 带 转 移 手 固定 化
纸 上 , 由 于 各 种 固定 化 纸 均 不 透明 , 就 不 能 用 这 类 密度 计 扫 描 定
MY. 就 目前 所 报道 的 有 关 印 渍 术 定 量 的 文献 看 记 大 都 采用 放
射 性 标记 , 得 到 放射 自 显影 底片 后 再 对 此 底 具 用 密 疼 计 拍
Sy ”… … “。 或 者 从 固定 化 纸 上 剪 下 放射 性 攻 带 再 用 2- 计 数
共计 数 而 定量 ”入 。 少 数 报道 则 是 采用 弱 激 光 密 度 计 (Sott
Jaser densitometer) ,对 免疫 染色 了 的 NO 纸 直 接 扫描 定量 所 :。
显然 , 这 些 条 件 限制 了 印 渍 纸 上 区 带 的 定量 检 出 。 t 3

1983 年 日 本 京都 大 学 Manabe 和 Okuyama 设 计 了 一 种 电
视 摄 像 - 微 机 系统 (TV camera—microcomputer system)“,
FY Si FRSC IAM a SE AT PA ES Ay BS A THF) AN Se
密度 计 ( 约 生 千 美元 )。 重 要 的 是 它 既 可 以 用 于 常规 凝 胶 中 区 带

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的 定量 ” ， 也 能 用 于 固定 化 纸 上 区 带 的 定量 ""。 最 小 检 出 值
达 0.05wg 蛋白 质 , 灵敏 度 是 相当 高 的 。 考 虑 到 这 种 系统 很 可 能
成 为 现 有 凝 胶 密 度 计 的 换代 产品 , 这 里 予以 简单 介绍 。

电视 摄像 -微机 系统 的 组 装 如 图 3-20 所 示 。 一 块 染 了 色 的
凝 胶片 或 NO 纸 被 夹 在 两 块 玻璃 板 之 间 , 放 在 一 个 荧光 灯箱 的 光
源 板 上 。 一 织 黑 白 电 视 摄像 机 固定 在 支架 上 。 装 有 ft 一 16mm
“镜头 和 了 -2 滤 色 片 的 镜头 对 准 凝 胶 或 NO 片 。 摄 像 机 的 放大
率 可 通过 改变 连接 于 镜头 的 延伸 管 长 度 来 调节 。 例 如 长 15mm
的 延伸 管 就 可 将 8x6mm 的 NO 片上 图 象 全 部 投影 于 电视 显示
屏 上 。 视 频 信号 由 一 架 数 字 转 换 器 使 之 转化 为 数字 , 并 和 一 架 微
机 联系 起 来 。 数 字 转 换 器 可 把 视频 图 像 分 成 256 x 256 .个 点 ,每
| 点 又 设计 成 么 种 水 平 的 灰 度 。 转 为 数字 的 图 象 可 在 触动 开关 后
以 了 60 秘 的 速度 从 数字 转换 句 中 取得 , 并 由 一 架 电视 显示 器 监
视 ( 称 为 数据 监视 器 )。 显 示 的 图 像 可 被 存 贮 于 5 英寸 (12.7cm)
REA, 磁盘 驱动 器 用 两 个 , 其 一 驱动 存 贮 微机 程序 的 磁盘 , 以

数据 监视 机 程序 监视 器

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和

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i WKAR, 另 一 驱动 器 存 贮 数字 化 图 象 的 磁盘 。 一 张 吉 英寸

Tom) 磁盘 可 以 存 贮 七 个 数字 化 图 像 。 控 制 本 系统 的 程

| 征 机 所 附 显示 屏 ( 称 程序 监视 器 ) 来 选择 5 党 想 江 了 起 打 旨
pci: 2 .

本 系统 所 用 合 机 程序 软件 包 己 有 商品 市 售 。 该 软件 是 为 操
作 员 和 微机 、 微 机 和 外 部 接口 装置 对 话 而 用 Basie BASH, se ;
由 下 列子 程序 所 组 成 : (1)“%oeep”， 系 为 了 选择 其 后 子 程序 所 编 ，
的 引导 程序 ; (2)“save”, 读数 字 转 换 器 中 已 数字 化 图 像 的 数据 ，，
并 把 它们 贮存 于 一 张 磁 盘 档 案 中 ; (8)“load”’, RE PHAR
数字 ， 并 把 它们 存 贮 于 数字 转换 器 的 春 贮 器 中 (的 "aata ，
match”, 对 数字 转换 器 中 数字 化 图 象 和 任何 已 存 贮 手 盘 磁 中 的 ，
这 类 图 像 作出 比较 ， 包 括 和 电视 显示 屏 二 未 配 以 点 位 置 的 显示
图 像 进行 比较 ; (5) “demo”, 允许 操作 人 员 使 用 一 种 游标 来 选择
已 数字 化 图 像 的 任何 矩形 面积 ， 即 在 所 选 面积 中 ， 用 四 种 灰 宏
一 一 白色 、 浅 灰色 、 暗 灰色 和 黑色 一 一 计算 吉 的 数目 汪 (6)5paco=
kageIIT”, 令 点 阵 式 打印 机 打出 数字 转换 器 中 已 数字 兹 的 图 像 。

Manabe 和 Okuyama 对 此 软件 包 商品 作 了 少量 修改 , BNE
“demo” 程 序 中 加 入 两 项 功能 ，(H) 在 点 阵 计数 后 计数 区 带班 点
的 密度 积分 ; 并 打印 出 来 ; OE ee 从 被 研究 的
所 保留 的 四 种 灰 度 面积 中 判别 出 所 选 面积 。

区 度 标准 是 用 市 售 密度 标准 卡 来 清 定 的 ， 这 种 村 度 标准 上
是 一 种 照相 底片 ， 上 面 有 十 三 种 密度 渐 降 的 影 象 。 把 这 种 标准 。
卡 放 在 本 系统 的 荧 光 灯箱 上 ， 卡 上 的 图 像 即 可 经 数字 化 显示 在
电视 显示 屏 。 通过 调节 数字 转换 器 上 两 个 可 变 电 阻 ， 就 可 使 四 ，
种 灰 度 水 平 ， 即 白色 、 浅 灰色 、 暗 灰色 和 黑色 ， 转 楷 为 0.04.
0.25、0.67 和 工 .32 的 密度 值 。 因为 白色 相当 于 INQ 纸 或 凝 胶
的 曰 色 背 景 , 所 以 其 它 灰 度 水 平 的 密度 值 应 减 去 0.04。 这 样 一

* 102+

ee

本

SS WRAY

A nnn SSS

A321 双 相 凝 胶 区 带 经 灰 度 计数 等 最 后 得
ae 到 的 微机 打印 出 来 的 图 谱
, 用 电视 摄像- -微机 系统 对 NO 纸 或 凝 胶 上 的 区 带 进行 定量 测
定时 ， 微机 点 阵 打 印 机 打出 的 图 像 将 如 图 3-21 那样 ,每 一 区 带
的 量 则 用 密度 积分 ( Integrated density) 来 表示 。 所 谓 密 度 积

分 是 指 任 一 区 带 中 各 灰 度 乘 其 点 计数 的 总 计 值 , 即 ，

ea 103 e

I.D. =0.24L+0.63D+1.28B >
str, 1.D. 为 密度 积分 , LD BAW RRAK GRAB B=: |
FH RRA 。

综 上 所 述 , 印 渍 术 所 用 装置 形似 简单 ， 然 其 中 含有 深奥 的 到 只
论 , 不 理解 它们 就 难以 设计 出 既 合 理 又 便宜 的 印 涡 装 置 。 尽管
如 此 ， 从 迄今 已 报道 过 的 文献 看 , 人 们 已 体会 到 电极 材料 、 装 置 ，
的 形式 .电压 梯度 的 控制 、 操 作 上 的 简便 性 等 都 必须 加 以 改进 。
可 以 预言 ， 一 种 如 像 印刷 机 那样 ， 真 正 符 合 印 渍 这 一 名 称 的 级
涡 装 置 必 将 在 短期 内 出 现 。 它 将 类 似 于 电泳 装置 (不 是 电 洗 脱 :
式 )， 有 着 如 Svoboda 设计 的 那 种 便宜 又 抗 氧 化 的 导电 玻璃 作 |
PR; 有 着 如 Manabe “A MARA DL Gp ye WI ED Mal BL?
FEO; BG AE Bi 1k Ha GUT HAE Ag, 又 能 省 去 致 冷 设 备 ;
印 渍 全 程 将 不 超过 工 小 时 。 此 外 ，- 一 整套 印 渍 有 关 的 设备 也 必
相继 出 现 ， 包括 印 渍 纸 切割 机 (免疫 印 渍 时 常 需 将 一 张 印 渍 纸 一
次 切 成 如 图 3-16 那样 十 数 条 0.5cm wee IL), 洗涤 反应 盘 、 |
定量 扫描 仪 等 。

参 考 xX MR,

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e 1056

第 四 章 实验 技 和
不 论 核酸 印 渍 还 是 蛋白 质 印 涡 ， OLSEN 二
它 实验 步骤 和 技巧 都 大 同 小 异 。 因此 , 本 章 在 较 具 体 介绍 各 种
印 污 物 检 出 方法 的 同时 ， 将 原则 性 地 讨论 检 出 前 各 步 的 实验 技 和
术 。 印 渍 术 发 展 极为 迅速 ,已 有 大 量 文 献 报道 , 大 中 不 难 找到 所
需 研 究 的 生物 分 子 的 印 汪 条 件 。 为 了 读者 方便 ARATE
格 形式 列 出 近 百 种 生物 大 分 子 的 印 渍 条 件 供 参考 * BPA
步骤 的 影响 因素 , 有 一 些 已 在 原理 一 章 中 讨论 过 ,为 省 篇 幅 , A
已 提 过 的 本 章 不 再 论 及 。 Si
SIRO RAR TRS OWEN, Ha
: DDK A fy eA a EA 3 A EEA
: BPR SREP KSB, ARTE Ee
BUEN LBC EF RECA, eB LOR, BONE |
胶 电 泳 后 再 印 渍 , 虽 增 加 了 数 小 时 的 印 渍 步 又 ， 但 其 后 仅 需 10°
|
.

分 钟 的 染色 和 脱色 步骤 ;全程 不 到 一 天 。 据 此 ,本 章 还 将 介绍 印 慎
涡 纸 上 全 谱 检 出 的 染色 技巧 。 过 Kian

一 、 印 渍 模板 的 选择 与 帮工 于

除 点 印 渍 外 ， 常 规 印 污 术 几乎 都 是 用 各 种 凝 膀 电 瀛 后 所
凝 胶 作 为 印 渍 模板 (Blotted template), ANBAR, BeBe HTK
已 经 成 为 当代 鉴定 各 种 生物 大 分 子 特性 及 其 纯度 的 主要 工具 <
它 的 高 分 辩 率 , 以 及 既 能 用 于 分 析 又 能 用 于 制备 ,设备 可 简 可 繁 恒

* 106+

四

等 实用 性 ,使 它 的 发 展 至 今 不 误 。 从 某 种 意义 上 说 ,生物 大 分 子
印 污 术 实 是 凝 胶 电泳 发 展 至 今 的 又 一 产物 。 所 以 , 要 想 完善 地
掌握 印 渍 术 的 实验 技巧 ,首先 应 该 掌握 凝 腕 电泳 技术 。 EPR
胶 电 泳 已 有 许多 专著 ore， 这 里 只 讨论 如 何 获取 作为 印 渍 模板
有 鹊 凝 胶 , 以 及 如 何 处 理 使 之 达 最 大 印 渍 效率 。

从 第 二 章 中 可 知 : 印 渍 效率 和 凝 胶 的 厚度 和 孔径 有 关 ; 和 电
泳 分 离 分 子 的 性 质 . 大 小 和 上 样 量 有 关 ; 也 和 电泳 时 所 用 样品 的
增 溶剂 . 变 性 剂 等 有 关 。 KWL, 目前 似 能 小 结 出 如 下 几 点 : (JT)
板 形 凝 胶 比 圆 管 形 凝 胶 更 易 印 渍 oo3; (2) 即使 采用 板 形 凝 胶 ,， 也
是 胶片 越 薄 越 易 印 渍 93; (3) 处 于 等 电 点 状态 的 生物 分 子 难以
用 电 印 渍 法 印 渍 922; (4) 在 一 定 凝 胶 孔 径 和 印 涡 时 间 下 , 分子 量
越 大 的 分 子 越 难 印 渍 完全 3 (区 在 过 长 印 渍 时 间 下 ,， 较 小 分 子
量 的 物质 将 穿 透 固定 化 纸 造成 损失 而 得 低 印 渍 效率 ”3; (6) 电泳
上 样 量 必须 适当 , 过 多 将 因 超 过 固定 化 纸 结 合 容量 而 损失 , 过 低
又 将 使 印 溃 纸 上 区 带 微弱 55; (7) 凝 胶 中 存在 增 溶剂 等 会 影响
ENE, A SDS 有 利于 电 印 渍 效率 1481.6M 脲 能 改善 大 分
FREAK RRO, AER Cooralen) Lea
DNA 片段 的 印 渍 效率 2 等 。

要 想 获得 优良 的 印 渍 模板 ， 上 述 各 项 必须 认真 考虑 ， 但 其 中
.不乏 矛盾 之 处 。 例 如 , 凝 胶 孔 径 越 大 越 易 印 涡 , 若 据 此 而 任意 加
大 凝 胶 孔 径 势 必 形 失 凝 胶 电 泳 厌 有 的 高 分 辩 率 。 又 如 ,分子量
越 大 的 分 子 越 难 迁 出 北 胶 ,于 是 加 长 印 渍 时 间 , 此 时 处 于 同 片 北
胶 中 的 水 分 子 物质 必 将 因此 穿 透 印 溃 纸 而 损失 一 大 部 分 。 凡 此
种 种 都 说 明 吉 用 辩证 法 则 ， 灵 活 地 使 用 各 种 技巧 来 获取 最 佳 状
: 埠 的 印 渍 模板 。 下 列 各 项 建议 和 实验 也 许 能 给 我 们 许多 启迪 。

1. 按照 印 汪 目 的 制 取 印 渍 模板

一 般 说 来 生物 大 分 子 印 溃 术 的 检 出 目标 可 归 为 下 列 三 类 ，

° 107

各 类 对 印 渍 模板 的 要 求 也 有 差异 s 人 BEE:
C1) SRE HERE iy VOM EE TEE TI ET EDD
能 分 子 。 fain, Gershon: AO TRIE A A AA HE Fe |
AM AREM LEA, 他 们 用 SDS-10%PAGE 分 离 人 红 -
细胞 膜 蛋白 ， 并 用 此 板 形 凝 胶 作为 印 渍 模板 ， 电 印 渍 于 NO AR.
时 把 印 渍 纸 一 分 为 二 ; 一 份 用 考 马 斯 亮 蓝 染 色 显 现 全 谱 ; 另 一
份 用 235T 标记 的 仙台 病毒 作 探 针 与 之 印 盖 ， 结 果 放 射 让 显影 语 ，
下 只 显 二 条 区 带 。 和 全 谱 对 照 , 此 区 带 是 血型 糖 蛋 自 赤 CGlyeo
phorin A), 为 了 进一步 验证 ， 他 们 再 用 麦 胚 凝集 素 杀 和 柱 刘 -
sie SURE Fa A, PUR ESE RS AES” BRI 2
i 1h FLA ME RON BE 2 dD
Heit HL BRA, CREE. BA Te
Aly 2 ips Re fe A SOULE SP AS ET
哈 才 明 它 是 定性 检 出 ， 可 以 不 考虑 印 污 效 率 ,也 不 考虑 较 小 分 。
子 量 的 物质 是 否 会 穿 透 NO 纸 而 造成 的 部 分 损失 二 对 于 这 种 定
性 目的 而 言 , 印 涡 模 板 要 求 不 严格 ,只 要 凝 胶 中 的 区 带 数 能 一 个
- RWS NO 纸 就 算 达 到 目的 ;至 于 转移 予 多 少量 可 以 不
管 。 为 此 ,任何 凝 胶 均 可 作为 印 渍 模板 (但 活 胶 电 育 此 的 凝 胶 不
可 用 电 印 渍 ) ,重要 的 是 控制 印 污 时 间 ， 租 常 以 最 天 耸 拖 量 区 市
能 转移 50% 左右 的 时 间 为 好 。 } MSBEZS A
(2) SARK OCR RES.
iit, Bartles 和 Hubpbaracs] 在 定量 检 出 血清 粘 蛋 Are Zee
WEI AMG AHMET AN SER, SERRE SDS-T PAGE Fe
离 , 电 印 污 于 NO 纸 。 为 了 确定 分 子 量 , COP SP BT
26~220 千 道 尔 顿 (gDa) 的 蛋白 质 标准 分 子 量 系列 。 印 渍 纸 经
PK Jes FTF EEE LA. CAT a HE
Hoofor GS 300 219 8 j| 41485 Hk o 24 58 Be BI4E 43000 和 940005

ee eee

«108-6

Da GPRM) ADA PAR KA, AFA IM FH) Ab BY LEB AR BE
wy N-CR ARORA, B-RAE MRA E
A, 前 者 含量 比 后 者 大 3.2 倍 22。 由 此 实验 可 知 ， 其 实验 目的
不 在 于 全 谱 检 出 , 虽 要 求 定量 ,但 区 带 数 不 多 。 而 且 ， 在 整个 26
~220 kDa. 范围 内 欲 检 出 的 两 条 区 带 集中 在 40~…94kDa 区 域 ，

- 据 此 所 选 印 渍 模板 及 印 渍 条 件 应 能 保证 这 两 条 区 带 达 到 最 大 印
污 效 率 (90 和 以上) 至 于 在 此 条 件 下 , 较 高 和 较 低 分 子 量 的 区 带
能 否 转 移 或 有 和 否 损失 等 都 不 必 考 虑 。 为 了 做 到 这 一 点 ， 必 须 进
行 一 些 预 备 实验 ; 首先 , 用 上 述 第 (了 项 办 法 定性 地 确定 检 出 区
带 在 何 位 置 ? HU, 在 尽 可 能 不 下 降 电 泳 分 辩 率 的 前 提 下 , 加 大
这 两 条 区 带 的 凝 胶 孔 径 ; 第 三 , 确定 能 达 最 大 印 渍 效率 的 印 渍 时
间 和 条 件 ; 第 四 , 验证 印 渍 效率 是 否 确实 达到 最 大 值 , 此 时 需 对
印 涡 后 的 凝 胶 用 高 灵敏 度 染料 (如 银 染 料 ) 染色 ， 看 此 两 条 区 带
是 否 还 有 残留 。 还 必须 在 印 渍 时 玖 效 儿 张 印 渍 纸 ， 并 在 印 渍 后
分 别 染 色 。 看 看 这 两 条 区 带 是 否 只 印 渍 在 第 一 张 XGO 纸 上 , 还
是 尚 有 部 分 穿 透 并 印 渍 于 第 二 、 甚 至 第 三 张 印 涡 纸 上 , 若 有 , 定
量 时 也 可 补 入 此 数 。

(3) 全 谱 定 量 检 出 。 例 如 Loeb2s 为 了 探测 划 兰 氏 阴性 菌
露 于 细胞 表面 的 成 分 ， 把 流感 嗜 血 杆 菌 b(Gcemopji1us
onfluenzae b) Kag 株 的 外 膜 ， 用 SDS-PAGE 分 离 后 电 印 渍 于
NO 纸 。 把 XO KAW RM O.50m 宽 的 10 等 分 条 。 其 中 两 侧 的
条 (图 410) 和 印 渍 前 (A) 及 印 渍 后 (B) 的 凝 胶 ， 同 时 用 考 马 斯
亮 蓝 染 色 。 可 见 凝 胶 (A) 上 的 区 带 至 少 有 10 条 (用 英文 字母 玫
示 ， 其 中 1 为 脂 多 糖 ) , 它们 全 被 印 渍 于 NO 纸 (O), NBR AS

胶 (B) 没有 显现 任何 区 带 也 说 明 印 涡 是 完全 的 。 另 外 8 ZNO
纸 经 狂 灭 步骤 后 , 用 各 种 变 株 吸附 过 的 Eag 株 全 细胞 抗 血清 免
BA, BA 3%I-A 蛋白 与 之 反应 。 在 放射 自 显影 后 用 LKB

¢ 109 »

Sei , 4 rad :
a LS
”

4-1 流感 哮 血 村 菌 b 型 Hag 株 外 膜 上 露 于 细胞 表面 成 分 的 定量 印
A~C, GE

CPT Re iM 5 1~8, ARE ee eee LA TA
白 免 疫 检 出 的 放射 自 显 影 谱 。 说 明 见 正文

要
-人 ’ ~

. 2c 本 ya ss
= &

i.

=.

2202 型 激光 密度 计 扫描 定量 ， 可 得 图 4 1 中 妆 8 的 结果 。 卖
明 Eag 株 抗 血清 除 b/c 区 带 外 ,能 和 所 有 的 外 膜 蛋 白质 和 脂 多
RAS (B41 217, RS A WLR), HSE a x 和
了 区 带 ( 难 以 用 考 马 斯 亮 蓝 显 现 ， 见 A 列 ) Be Ne Ie AER
烈 结 合 而 显现 G1). 如 果 这 种 Bag 株 抗 血清 先 里 生活 为 卫 ag
菌株 吸附 ;再 去 免疫 印 盖 外 膜 蛋 自 印 溃 谱 (图 4-1 2H 2), MBAR
钙 渍 谱 芋 的 去 条 王 区 带 消失 了 , 这 就 证 明 这 两 种 成 分 一 mn 蛋 白
和 脂 多 烽 是 露 在 胞 外 的 成 分 宇 量 测定 又 表明 泛 带 上 含量 下
降 ( 比 较 列 工 和 27， 说 明 抗 血清 中 有 部 分 针对 上 蛋白 的 抗体 被
了 Bag 生活 株 吸 附 陈 去 了 。 列 3 是 用 缺失 被 膜 的 Eag 变 粕 和
b-S2 株 吸附 过 的 Hag 抗 血清 去 免疫 印 盖 外 膜 蛋白 印 涡 谱 的 结
果 。 此 谱 和 列 2 几乎 相同 ;这 就 证 实 了 上 述 结论 。 列 48 是 分
别 用 Bag 株 的 另 一些 变 株 一 G5、0O47、054， 以 及 大 肠 杆菌 也
和 KL16 吸附 过 的 Hag 抗 血清 去 印 盖 同 种 印 渍 谱 所 得 结果 。 其
中 除 GS 除去 了 抗 赴 清 中 的 脂 多 糖 外 ( 列 邹 ，Q47 和 O54 (HS
和 6) ARAMA NEA, 这 又 表明 ， 了 Hag 株 中 脂 多 HA nS
白露 出 胞 外 的 区 域 ， 只 和 某 些 流感 嗜 血 菌 的 b 型 株 起 交叉 反 -
应 。 两 株 未 加 工 过 的 大 肠 杆 菌 没 有 吸附 去 Hag Sie
区 带 ( 列 了 和 8)， 说 明 大 肠 杆菌 露 于 表面 的 决定 焦 不 和 流感 哮
MFR URW,

上 上 述 实验 要 求 能 定量 地 检 出 印 涡 全 谱 ， 这 是 比较 困难 的 。
Loch KRU, 上 述 实验 重复 过 12 次 ,所 得 各 区 带 的 定量 数据 有 一
些 变化 , 也 承认 小 分 子 的 脂 多 糖 因 穿 透 NO 纸 造 成 部 分 损失 cs。
显然 ， 要 想 使 几 十 万 分 子 量 和 不 满 一 万 分 子 量 的 分 子 在 一 种 凝
胶 孔 径 下 同时 完全 转移 而 又 不 会 损失 , 这 是 很 难 做 到 的 。 最 好 的
亦 法 是 改 用 忽 度 梯度 凝 胶 作为 印 渍 模板 。 Manabe 等 人 在 印 溃
天 血清 蛋白 质 时 采用 了 双 相 电泳 29， 第 一 相 用 pH4~”8 的 凝 胶

e111

HE Ae (PAGEF), 第 二 相 用 4~17 多 的 聚 丙烯 酰胺 梯度 凝 胶 电
泳 (PGGE), 在 电 印 溃 时 以 梯度 凝 胶 为 模板 。 因 各 种 大 小 的 分 子
均 处 于 其 相应 大 小 孔径 的 凝 胶 区 域 中 , 故 电 印 涡 仅 荆 小 时 ,就 使
28 种 血清 蛋白 质 完全 转移 ， 这 就 克服 了 分 子 大 小 对 印 渍 速率 造
成 的 影响 22。 当 然 , 在 非 梯度 凝 胶 作 模板 的 印 渍 申 计 也 可 在 印
WER BK ALAR, 然后 以 最 高 分 子 完 全 转移 作为 印 渍 条 件 家
印 溃 后 总 计 各 印 渍 纸 上 区 带 量 也 能 达到 精确 定量 的 目的 二 但
是 这 种 办 法 没有 采用 梯度 凝 胶 那样 方便 写 印 渍 时 间 也 将 增加 许
多 。 值 得 提出 的 是 ,正如 Manabe 等 人 所 指出 的 “用 梯度 凝
胶 作 印 涡 模 板 时 ， 较 小 分 子 量 的 蛋白 质 尽 管 处 于 小 我 径 凝 胶 区
段 ,但 迁移 仍 较 快 ( 见 图 2-4), 各 种 分 子 量 蛋 白质 迁 出 梯度 凝 胶
的 峰 曲 线 也 有 差异 (图 2-4)。 为 此 ， 要 想 精 确定 量 最 好 在 采用
梯度 凝 胶 作 为 印 涡 模 板 的 同时 ， 再 琶 放 数 张 印 渍 纸 。 也 就 是 说
把 上 述 两 法 组 合 起 来 。 此 外 ,， Elkon SAFO, 加 有 琼脂 糖
的 常规 凝 胶 , 既 能 改善 凝 胶 的 机 械 性 能 、 提 高 印 渍 效率 , 汉 不 会
影响 原 有 电 注 分 辨 率 。 但 是 ,了 kon 天 光 全 相生 个 几
大 和 孔 凝 胶 作 为 印 溃 模 板 而 言 的 。
2， 印 渍 模板 的 解 聚
为 了 克服 高 分 子 量 生物 分 子 因 闫 胶 孔 径 位 国难 区 还 出 基 胶

而 宛 全 印 溃 的 困难 ,人 们 想 出 了 许多 办 法 , 其 中 之 三 是 在 印 渍 前
先 把 凝 胶 解 聚 2。 常规 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 铸造 是 采 玫 甲
SUMP MEE (WV, N’-Methylenehisacrylamide, {j# MBA)
作为 交 联 剂 ; fe ei
care -am -om am 本 本 we
0 O a ARR

MBA 只 能 在 非常 苛刻 的 条 件 下 , 例如 在 50° 或 80°C 下 用 30%
HsOs 才能 洲 解 2…， 显 然 这 是 生物 分 子 经 受 不 了 的 5 RSs, 曾

“112-6

有 人 建议 改 用 二 丙烯 酸 乙 酯 (Ethylene diacrylate, fhj ff
EDA)? 4il— Wi ARK(N, N’-Diallyltartardiamide,
简称 了 DATD)2”, 二 者 结构 式 如 下 :
Ca 人 (HDA)
O O
CH,—CH—CH;—NH—C—CH—CH—-C—NH—CH,—CH=CH, (DATD)
O OH OH O

EDA 中 的 酯 键 可 被 强 碱 水 解 ; DATD Si 1, 2- 乙 二 醇 结构 可
被 过 和 碘 酸 氧化 裂解 。 前 者 对 生物 分 子 不 合适 ,后 者 尚 可 。 因 此 印
HAR PAAR DATD 作为 交 联 剂 ,并 在 印 渍 前 用 过 碘 酸 处 理
v 北 胶 ;使 凝 胶 解 聚 释放 出 高 分 子 量 的 区 带 。 七 十 年 代 中 期 , 有 人
又 提出 了 两 种 交 联 剂 一 一 双 丙 烯 酰 光 腕 (Bisacrylyloystamine,
fi #KBAO)*” 和 二 产 乙 撑 双 丙烯 酰胺 [CN, 一 (2-Dihydro=~
xyethylene) bisacrylamide; 简称 DHEBA] 2

C singe fh “50 H—CH,—0H,;—S—S—O0H,;—0H,—N Pas eras

O
(BAC)

Syn 2 ae A gia (DHEBA)
O OH OH é
BAC 市 含有 二 硫 键 MTR CH; DHEBA 中 既 含 有 对 过
碘 酸 敏感 的 二 ，2- 乙 二 醇 基 团 ， 又 含有 碱 可 裂解 的 酰胺 羟 甲 基
键 。 由 于 这 两 种 交 联 剂 能 在 大 多 数 生 物 分 子 经 受 得 住 的 条 件 下
裂 解 而 被 应 用 于 印 训 术 。 两 种 可 被 过 碘 酸 裂解 的 交 联 剂 一 一
DATD fii DHEBA 的 具体 操作 可 参看 Tas SAI. fay
言 之 “ 当 用 这 两 种 交 联 剂 分 别 和 丙烯 酰胺 制 成 的 凝 胶 作 为 印 渍
模板 时 , 可 在 印 渍 前 用 10mM 过 碘 酸 (20ml/4em2 胶片 ) 浸泡 凝
JE 4 AY TA] (AA) , 再 用 水 漂洗 一 下 即 可 印 渍 。
3. 印 渍 模板 的 酶 解

ee 113。

使 印 溃 模 板 中 所 合 高 分 子 量 生物 分 子 经 水 解 酶 类 有 限 水 解 加 |
为 较 小 分 子 , 也 是 加 速 大 分 子 迁 出 凝 胶 而 印 渍 的 办 法 之 一 。
Gibson 在 印 溃 被 巨细 胞 病毒 (ytomegalovirus) 感 染 的 人 7
包皮 成 纤维 细胞 核 分 部 所 含 蛋白 质 的 实验 中 co, 用 链 霉 蛋 白 酶 时
有 限 水 解 了 印 渍 模板 上 的 蛋白 质 。 具体 做 法 是 ,蛋白 质 样品 经
14%PAGE 分 离 ;, 取 下 凝 胶 放 入 如 图 3-8 RAR DWE ee me
胶 的 阴极 侧 放 三 张 事先 用 内 含 25~…70jg/aml eae ae SB hy BD
污 绥 冲 液 (0.1%8S8DS825mMTris.192mM HAR) wy Hs
滤纸 。 电 印 渍 时 ,滤纸 上 的 蛋白 酶 在 电动 力 下 迁 关 凝 胶 中 ,使 其
中 蛋白 质 有 限 水 解 后 再 转移 到 NC HEE, Gilbsoa py3xk— Seay
证 明 ,145kDa 的 蛋白 质 区 带 在 25wg/ml 酶 量 作用 下 | Beas
要 比 无 酶 处 理 对 照 提 高 10 倍 。 若 酶 量 增 大 到 95/ 志 /al 时 印
渍 效率 更 比 对 照 增 大 到 .23 倍 。 他 还 指出 ; EES ee
效果 , 但 链 霉 蛋白 酶 抗 去 污 剂 如 SDS). 分子 较 水 易 进 义 凝 胶 二
以 及 价格 也 较 便宜 , 这些 优点 是 其 它 蛋白 酶 难以 比拟 的 ae
Bittner 等 人 在 印 渍 XDNA 的 EcoRI 限制 酶 切片 段 中 也
应 用 了 酶 消化 ”他 们 把 ?标记 的 XDXA(2-33wg) 加 到 .35x
的 酶 液 中 , 此 液 内 含 40 ng/ml 牛 胰 DNase I ASEH HooR I, 条
用 100mM Tris~HCl(pH7.8). 10 mMMgOls #il1mM EGTA, ©
配制 ， 反 应 在 37°C 下 进行 巧 分 钟 此 时 HeoR I 2 ADNA
成 片段 , DNasel 使 双 链 片段 产生 切 日 ;加 六 20 到 下 性 酚 并 在
旋涡 混合 器 上 混合 使 反应 终止 。 处 理 后 的 样品 佐 0.15% 琼脂
各 电 泳 ， 然 后 把 凝 胶 用 碱 处 理 使 双 链 DNA fils, bee ER
DBM 纸 。 实 验 结果 表明 ,用 DNase 处 理 过 的 高 分 子 量 DNA 片
段 印 渍 效率 达 改名 ,而 未 用 酶 处 理 的 对 照 仅 为 36 和 pas 二
和 4， 印 渍 模板 的 理化 修饰 与 平衡 处 理 dO miRae
AACE TE 2 Fi USCA DE SE et

* 114.6

;

高 印 渍 效率 。 例 如 , 通常 认为 用 等 电 点 聚焦 电泳 分 离 的 蛋白 质 ，
将 在 凝 胶 中 均 处 于 等 电 点 状态 。 用 这 种 凝 胶 作为 印 渍 模板 时 ，
著 用 电 印 渍 法 ， 就 具有 那些 因 印 渍 缓冲 液 pH 影响 使 之 脱离 等
电 点 态 的 鼻 白 质 可 以 转移 外 ， 仍 处 于 等 电 点 态 以 及 在 等 电 点 处
已 沉积 的 蛋白 质 则 不 能 转移 2。Johnson 等 人 用 pHT~9 HR
胶 电 聚 焦 分 离 了 Wl 标记 的 多 瘤 病 毒 的 蛋白 质 Gs。 考 虑 到 党
需 的 凝 胶 电 聚焦 所 用 凝 胶 网 孔 还 不 够 大 ， 可 能 会 影响 电 印 渍 效
率 ， 于 是 他 们 在 凝 胶 中 加 入 0.1% 的 琼脂 糖 来 增 大 网 孔 。 但
是 他 们 的 实验 结果 表明 ,用 此 凝 胶 在 PH6.8 的 印 渍 缓冲 液 中 进
行 电 印 渍 , 印 渍 效率 仍 很 差 ,尤其 是 在 此 条 件 干 仍 处 于 等 电 点 态
的 酸性 蛋白 质 。 为 此 ， 他 们 把 此 凝 胶 浸 入 100ml SDS 缓冲 液 |
(2.3gSDS, 0.75¢Tris, 8ml 甘油 ,0.5ml8- 琉 基 乙 醇 ,90ml KR
饮水 ,用 HO1 i PH6.8), 并 在 室温 下 播 蕊 30 分 钟 ,然后 在 标准
印 渍 缓冲 液 (24mM Tris, 192mM HAM, 20% FB, pH8.3)F
HED NC 纸 。 结 果 表 明 经 SDS 处 理 后 的 凝 胶 中 所 有 多 瘤
病毒 的 结构 蛋白 质 全 被 完全 转移 了 (SA A 2-12 和 2-13),
且 证 明 ,: 这 些 蛋 白质 虽 经 SDS 处 理 ， 却 仍 保持 着 抗原 活性 (图
213)。 他 们 认为 二 用 SDS 修饰 印 渍 模板 使 原来 处 于 等 电 点 态
的 蛋白 质 都 形成 了 带 负 电 的 SDS- 蛋 白质 复合 物 , 从 而 能 在 p 也
8.3 的 条 件 下 单方 向 地 电 印 渍 于 放 在 凝 胶 阳 极 侧 的 NO 纸 上 。
为 了 进一步 验证 这 一 结论 ， Johnson 等 人 又 用 0:9M 乙酸 -
6.25M R15 %PAGE 分 离 35I 标 记 的 多 瘤 病 毒 蛋 自 质 , 然后 以
琵 凝 胶 作为 印 渍 模板 进行 电 印 渍 。 由 于 这 种 乙酸 - 甩 凝 胶 分 离
的 蛋白 质 在 PH6.8 印 渍 缓冲 液 中 各 具 不 同 的 pK 值 ,因此 电 印
涡 时 有 的 迁 向 阴极 ; 有 的 迁 向 阳极 。 也 就 是 说 需 在 凝 胶 的 两 侧
各 放 一 张 印 渍 纸 。 电 印 渍 的 结果 产生 了 两 张 互 补 的 印 渍 谱 ， 故
谓 之 双方 向 印 渍 (Bidqireetional blotting)。 为 了 使 乙酸 - 脲 凝 胶

©1156

这 类 印 汪 模 板 能 实现 单方 向 印 渍 ，Johnson HEUER 四
SDS 修饰 , 使 所 有 蛋白 质 和 SDS 形成 复合 物 而 带 负 电 。 此 时 再
在 pH3.3 EF LED, UB A A A
He Be BA A Md A NO 4E ETS,

补 骨 脂 素 (Psoralen 7 _E JEFF GAR HE Be Be we
沉着 的 皮肤 疾病 。 它 象 其 它 多 环 芳香 烃 化 合 物 CU Me AZ.
bie WRIA AS) ABR, ZMH AY RA DNA, SRO
(~360nm) 照 射 下 激发 并 共 价 结合 于 DNA ASEBEDR, AMEE

素 不 仅 能 和 双 链 DNA 形成 复合 物 , ABA BE DNA 或 RNA |

FERAL Ay, PE Rb IS DR HCE AE Dy BEI HE BR 8,
质 结构 的 光化学 探 针 sa, 以 及 测定 DNAR RNA Wy Rear
力学 em。Frossard 等 人 委 据 补 骨 脂 素 上 述 征 质 ， 犯 其 衍生

物 一 4， 5 8-= FUE AMAR CUM) im BEE, 从 而 提高 “
TK HE 50~500bp 的 DNA J BE Ay EURO, AAT a A

法 是 ， 在 铸造 7% 聚 丙烯 酰胺 板 形 凝 胶 中 ， 加 入 适量 的 了 TMP-

乙醇 溶液 (120wg/ml) ,再 用 这 种 凝 胶 分 离 经 五 05TIT 根 制 村 内 。
切 酶 消化 的 PBR 322 质粒 DNA HBL, HKG, BERBERA

0.5M NaOH-1.5M NaCl ye yer 30 分 钟 ,使 双 链 DNA HBL
为 单 链 。 FRE ROS A 1M Tris-HOl, 3MNaOl (pH. 4) PM

中 30 分 钟 使 碱 中 和 。 以 上 步骤 均 在 暗中 进行 。 FPA BER ZE
EI ARIE FUR IESO~60 秒 : 用 它 伤 邯 渍 覃 入 于 50mMTris-
EOL 50mM 硼酸 盐 、.2mM EDTA (pH8. 3) 印 渍 绥 症 液 中 ,30V
下 对 NO 纸 电 印 渍 3 小 时 。 EINE 4-2 Bea, AI TMP AR
照 (A 列 ) 中 124bp 长 的 DNA 片段 印 涡 很 差 , 被 印 污 的 区 ee
也 很 少 。 然 而 加 有 250 wge/100 mIPAG 量 TMP Hy BEBE CB 列 )， 4

89~124bp 长 的 DNA ARAB BUR, 而 是 随 着 TMP ve Be 23

加 ,最 小 的 长 6tbp 的 DNA 片段 也 能 显现 出 来 ， 区 带 数 目 也 增 ，

* 116 。

||

|

\

A422 TMP 对 长 度 为 50~500bp DNA FRAN aa ez
A, Aj TMP; BD, 分 别 在 100m] 丙烯 酰胺
溶液 中 加 250g, 400 ug 71 1000 ug,

加 许多 (@, D Fil)", Frossard 等 人 认为 ，TMP 所 以 能 提高
50~500bp 这 么 小 的 DNA 片段 之 印 渍 ， 是 由 于 TMP 使 DNA
小 片段 交 联 成 较 大 网 络 而 不 致 穿 透 NO 纸 。 他 们 用 更 高 浓度 的
TMP 实验 证 明 ， 同 样 大 小 的 DNA 片段 在 此 条 件 下 又 难 转移
了 ， 认 为 高 浓 放 的 .了 MP 导致 小 片段 交 联 成 更 大 网 络 而 难 迁 出
BRO, : :

Bittner 等 人 在 印 渍 47 kb(F-MAE) Ki) DNA 实验 中 , 也
做 过 类 似 上 述 的 工作 ca， 但 他 们 是 用 溴 乙 锭 。 因为 凝 胶 中 的
DNA 经 省 乙 锭 染色 后 若 用 紫外 光照 射 , DNA 将 被 引入 切口 ca
从 而 提高 DNA 大 片段 的 转移 。 “Bittner 等 人 根据 这 一 设想 ,把
a2P 标记 的 XDNA(47kb) 片 段 经 0.75% 琼脂 糖 诈 胶 电泳 , 电泳

17。

后 的 凝 胶 切 成 2om 宽 的 条 ,其 中 之 一 放 在 滤纸 上 直接 吸 于 其 它
5 条 用 0.51wg/ml 省 乙 锭 染色 。 各 染色 胶 条 分 别 在 254mm 紫外
光 下 曝光 0.1.2.5.10 分 钟 后 , 用 碱 处 理 使 DNA eRe Ft Ha ENE
于 NO 纸 。 结 果 如 表 41 所 示 , 以 未 印 渍 的 王 凝 胶 为 100%， 贴
未 照 光 的 (0 It) DWT 22%, 经 紫外 光照 , 印 渍 有 所 增加 ， 且 .
以 照 光 5 分 钟 处 为 最 高 ， 但 也 只 比 未 照 光 对 照 增 加 14%, A
64% ARB, Bittner 等 人 认为 省 乙 锭 经 紫外 光照 后 增加 了
DNA 中 切口 数 , 有 利于 印 渍 , 但 此 条 和 件 又 使 DNA 和 琼脂 糖 发
生 交 联 ,致使 DNA 难以 迁 出 凝 胶 , 短 成 实验 失败 9。 了
表 4-L 紫外 光照 不 同时 间 对 溴 乙 锭 染

色 的 47kbDNA 印 渍 效率 之 影响
紫外 光照 时 间 (min) RAT 二 于 _ 补 印证 的 DNA%9

综 上 所 述 ， AE ASR IR
LRM RS —, WS ERS :
各 种 加 工 ， cee A RE, ST
预先 用 印 涡 缓冲 液 浸 泡 凝 胶 的 步骤 在 内 ， 统 称 为 印 溃 模 板
衡 处 理 。 这 类 平衡 处 理 常 因 印 渍 目的 而 有 不 同 te
材料 不 同 而 有 差异 。 例 如 有 人 为 防 SDS8 和 DBMI 纸 _E Wy HS.
基 团 发 生 作 用 ， 平 衡 处 理 时 就 要 除去 SDS-PAGE 后 凝 胶 中 的
SDS), SANA TC ma
CLAP YSMSDS, —HEwWF ES, ARAAFH. ?

* 118-6

充分 表明 必需 按 需 要 灵活 应 用 , 切 不 可 死 搬 硬 套 , 也 只 有 这 样本
能 获得 最 大 成 功 。

=. Pin AR ES eT

迄今 已 有 多 种 印 污 用 纸 被 用 来 成 功 地 印 渍 各 类 生物 大 分
译 让 优良 的 印 渍 用 纸 应 具有 下 述 性 质 ;() 对 生物 大 分 子 具 有 较
大 的 结合 容量 ; (2) 和 生物 大 分 子 结合 证 固 , 不 会 因 各 种 保温 . 洗
涤 等 处 理 而 使 大 分 子 脱 落 ; (3) AF MA EEK FB
因 印 渍 而 失 活 ; 应 能 保持 大 分 子 原 有 的 可 杂交 性 - 移 疫 反应 性 或
分 子 间 可 作用 性 ; (ARIE, 能 使 液 流 或 电子 流通 过 以 实
现 印 渍 ; 全 ) 理 .化 性 质 稳定 ,不 因 各 种 酸碱度 缓冲 液 的 处 理 而 熙
解 ; (6) 上 一定 的 机 械 强度 ,经 得 起 加 热 、 振 萝 等 处 理 ; (7) 可 长 时
MAM: @) BER; () 能 印 污 各 种 生物 分 子 ;10) 价
格 便宜 ,使 用 方便 。

显然 ;要 使 某 种 印 渍 用 纸 集 上 述 性 质 于 一 身 , 就 目前 的 技术
条 件 而 言 还 难 达到 。 例 如 ,NO 纸 价格 便宜 使 用 方便 , 具 一 定 的 机
械 强度 ,理化 性 质 也 较 稳定 ,是 印 渍 术 中 应 用 最 广泛 的 固定 化 材
料 。 但 其 结合 容量 (80r 必 蛋白 质 /om?) 比 不 上 ZB A (480g Be
自 质 /ema)。 就 DNA 印 渍 术 而 言 它 只 能 印 渍 单 链 DNA, 而 不 能
像 ZB 膜 那 衬 还 可 印 渍 双 链 DNAc9。 再 说 , NO 纸 是 和 生物 分
子 非 共 价 结合 ， 它 也 没有 那些 能 和 生物 分 子 共 价 结合 的 重 氮 化
纸 (如 DBM 纸 ) 那样 牢固 结合 生物 分 子 。ZB 膜 和 DBM 纸 也
有 自身 的 弱点 ， 前 者 具有 众多 的 阳离子 只 适 于 印 溃 带 阴离子 的
生物 分 子 ; 后 者 使 用 前 要 重 氮 化 , 没有 NO 纸 那么 方便 。 凡 此 种
种 ;都 说 明 必须 按 印 渍 目的 选择 合适 的 印 渍 用 纸 ,才能 达到 最 佳
BUR. :

e119 ¢

需要 提出 的 是 ， 印 渍 用 纸 的 选择 也 和 所 选用 的 印 渍 方式 有 yy
关 。 例 如 ,采用 毛细 作用 或 扩散 作用 印 渍 方式 , 宣 选 用 闭 天 孔 各 Ty
的 印 渍 纸 ( 如 平均 孔径 为 0.45 pum 的 NO AR), 这 样 可 加 快 印 渍 国
速率 。 如 果 选 用 申 印 涡 方式 , 则 宣 采 用 较 小 孔径 的 印 渍 纸 ( 如 平 ”“ 肝 |
均 孔 径 为 0.1wm 的 NO 纸 )“o。 因 为 这 种 小 孔径 并 不 影响 电 ” 国 |
子 流 的 盘 过 ， 却 能 防止 小 分 子 量 生物 分 子 因 穿 透 印 涡 纸 而 造成
的 损失 。 这 也 说 明 ; 生物 大 分 子 印 渍 术 中 除了 按 印 渍 用 纸 所 只
性 质 选 用 外 , BYMS SAH DARKS
1. 硝酸 纤维 素 纸 S) Sl“ Ee om SAS HE
硝酸 纤维 素 纸 (NO 纸 ) EMA, BO
BELT MARA. ERAS CECE
或 乙酸 -丙酮 ) 中 增 溶 , A RARER oe
燥 过 程 的 条 件 控制 ,如 温度 、 时 间 等 ,就 决定 了 HG a BAS
之 大 小 。 在 印 渍 术 中 ，N9O 纸 的 孔径 是 一 重要 参数 。 所 指 孔 径 “
是 指 横越 NO 纸 的 , 弯 弯 曲 曲 不 规则 长 通道 的 平均 有 效 和 孔径 . 例
in 0.45 wm 的 NO 纸 ,所 具 和 孔 的 平均 密度 达 ,450 又 10s/Gaas。 也
就 是 说 , 孔 的 总 面积 约 占 NO 纸 总 面积 的 80 多 Fees NO 纸 最
初 被 用 作 超 滤 膜 , 用 来 机 械 得 分 大 小 如 细菌 之 类 的 颗粒 二 于
这 类 利 分 是 使 颗粒 停留 在 NO 纸 的 表面 或 近 表 面 处 二 获 在 超 波
的 术语 中 被 称 为 表面 滤纸 (Surface filter)”, WE=F ENE
生物 大 分 子 是 通过 疏水 力 等 非 共 OME PRT FAL NO 48 He HE
用 ( 详 见 第 二 章 原 理 部 分 ) ,生物 大 分 子 既 在 表面 被 吸附 BE
中部, 故 被 称 为 “深度 滤纸 (Depth filter)’, TRL, FRR
2 人才 站 和 材料， 只 是 前 者 常 制 成 四 片 状 ， 后 者 党 制 成 西方
NO 级 已 有 众多 的 商品 市 售 ( 表 4-2) , 通 澡 可 在 4°O RRA
一 于。 Nathew 指出 “2， 不 同 牌号 NO 商品 的 印 渍 效果 者 三 定 国

saA120。

#42 RARER NC 纸 商品

名 称 或 代号 em pr 8 | RORY fo scm
硝酸 纤维 素 纸 浙江 黄岩 人 民 化 工厂 ;上海 医 工 院 0.22 [44]
BA 85 Schleicher & Schtiell Inc., Dassel, 0.45 4 [45~48]
West Gremany . 0.30 [40]
0.20 [11]
0.10 [20]
BA 83 同上 0.20 | [33]
Millipore NC |Millipore Ltd., Mississauge, |} 0.45 [40, 48]

25HAWP | Ontario, Canade

Bio-Rad No. |Bio-Rad Laboratories, Richmond, 0.45 [49]
162-0115 California, USA

差异 。 他 在 DNA EYE BW, Schleicher & Schiiell (S&S) Ay
产品 比 :Millipore py [ASF hy Be HH AE JL OY HE a 5 HBL BE
Faub 4 A xt Was A AR“. Towbin 3 A By St Me #2 HH,
Millipore NO 纸 的 结合 容量 仅 有 5/g 蛋白 质 /em” ,而 纯净
的 NO 纸 应 有 80 ug 蛋白 质 /cm2 HAA AB. Gershone and
Palade 总 结 性 地 指出 ″，NXNO 纸 中 混 有 乙酸 纤维 素 时 结合 容量
下 降 , Millipore 产 品 正 是 因为 它 的 存在 而 影响 了 印 渍 效果 。 朱
运 松 等 人 比较 了 上 海 医药 工业 研究 院 生产 的 NO 纸 和 8SK&8 产
品 , 认为 二 者 具有 相同 的 印 渍 效率 和 检 出 灵敏 度 “。

NO 纸 使 用 航 为 方便 ， 印 渍 时 只 需 将 NO 商品 裁 成 印 渍 模
板 同样 尺寸 ， 经 印 渍 缓冲 液 浸 湿 即 可 装 入 印 渍 夹层 中 。NO 纸
29,44, 并 有 正 : 反 两 面 , 正面 光滑 , 反面 较 粗糙 。 浸 泡 时 ,应
把 正面 对 着 液 面 , 先 任 其 漂浮 于 液 面 短 时 间 , 然后 再 把 它 浸 没 于
溶液 中 。 印 渍 时 也 应 把 NO 纸 的 正面 紧 贴 于 凝 胶 , 层 间 严 防 光 有
“Vd. 7 SDS-PAGE (FRA BA, NO 纸 若 处 在 PH8.0

e121¢

以 上 缓冲 液 中 也 带 负电 ,应 把 它 放 在 冀 胶 的 阳极 侧 cm
Lin 和 Kasamatsu 曾 研 究 过 不 同 孔 径 NO 纸 的 印 渍 效
FOC. 他 们 把 3sI 标记 的 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 (MEI4 Bw
'68kD, 共 六 种 ) 用 SDS-15%PAGDE 分 离 ,然后 把 凝 胶 一 分 为 五
Hori See CTA Gk NO 纸 进 行 电 印 渍 (250 瑟 帮 : 汉 小 时 关 “ 紧 贴
凝 胶 的 第 一 张 NO 纸 分 别 采用 0.45、0.3.、0:2.0.17 二 四 种 筷
- 径 ， 并 取 名 为 NH 其 后 登 放 的 另 一 张 NG 纸 均 用 0:467 3,
- 径 , 并 取 名 为 N2。 印 溃 后 各 组 N1 和 N2 分 别 进行 放射 自 显影 ，
并 用 ?7 计数 器 求 得 各 印 渍 区 带 的 放射 性 。 正 如 玫 二 3 所 示 ，，
68kD AYA MMELLIE HH MERE, ThA SSE Hh O.45 om FB 的 NO
纸 。30~40kDa 的 多 肽 印 渍 效率 有 所 提高 ， EAN Be SE a 0.45
um dL NO Ai A RES O.3umNO 4, AF 2OkDa Wa
NG AT Be, (Hh 35 8 0.45 pummNO 纸 5 ZEA IR 4 2h
BY, 18-4 A 17.DkDa ih 2 Bh See T 20% ees, So Fa
0-2 um 孔径 的 NO AEN BEE MIA TR AES 3 IN fy 1473 Da
FAKES 0-45 um NO HEN i, 损失 高 达 40%. EB I 0.3 Be
Bo MNO HULK 20% 和 11%, ATRIA Oot jam ALB
NO 纸 才能 达到 95 多 左右 的 印 渍 效率 。 从 表 和 3 的 实验 结果 不
难看 出 ; 在 分 子 量 为 14.3~68KDa 范围 内 , 若 采 用 电 印 污 法 , 则
AHA 0.1 wm fy NO 纸 较 好 。 TT SHAS ARS s
ACUI BHR, AY PBT NO Be aes ,
Bo 如 果 想 使 生物 大 分 子 和 NO At ihe aS ae ges |
能 交 联 剂 。Kakita 等 人 曾 采 用 N- S53 58 HEE BE ita
BP REL RAH TMT HE BOR, ee 4 INO 纸 共 价 交
KAP, Kay EIU HS BLO Ae st] — pe — age Se
rt NOYE, ‘lt PRS. oe ae ae
一 人 仍然 认为 ， RNA 不 能 和 NO 纸 相 结合 cai 因此 商 采

22 。

和 Re pee iS

R43 各 种 孔径 NC 纸 印 渍 各 种 分 子 量 蛋 白质 的 效率 ( 私 )

NC 纸 孔 径 (pm)
0.3 0.2 0.1

蛋白 质
的 Mr a:
(x10-2) |G N1N2 (T)| G N1N2 (T)| G N1 N2 (7) |G N1N2 (TD:

rr 一 ogg | 一 | erreeeeeieereerrerreererirrrr

68 73 27 0(100)| 64 36 0(100)| 62 38 0 (100)} 69 31 0 (100)
40 62 37 1(100)| 57 43 0(100)| 52 48 0 (100)| 57 43 0 (100)
30 28 71 1(400)| 28 72 0(100)| 27 73 0 (100)| 30 70 0 (100)
18.4/17.5| 7 67 6 (80)| 12 86 2(100)} 5 95 .0 (100)} 991 0 (100)
14.3 351 5 (59)| 375 2 (80)| 485 <i (89)| 4 94 <1 (98)-

G Fy EN ae Be A AY EB Ke, N1 和 N2 为 释放 的 两 张 NC ARE.
PN T RHE 7; (T) 4 G-+N1+N2 总 和 。

TL NC 纸 印 渍 RNA 的 报道 。

2 化 学 活化 纸

生物 大 分 子 印 渍 术 中 也 可 采用 枇 学 活 楷 纸 作为 印 渍 用 纸 ，
如 所 周知 ， 琼 脂 糖 在 大 性 条 件 下 用 省 化 氰 处 理 可 以 引入 活泼 的
“ 亚 氨 基 碳 酸 盐 ”， 从 而 使 得 琼脂 糖 具有 能 和 生物 分 子 发 生 共 价 -
键 合 反应 的 功能 团 。 :这 种 反应 称 为 从 学 活化 ,被 活化 的 琼脂 糖 -
称 为 活化 型 琼脂 糖 。 同 桩 原理 ， 把 纤维 素 滤纸 用 化 学 处 理 引 入 -
活泼 的 功能 团 ， 使 之 能 在 印 渍 中 和 生物 大 分 子 共 价 键 合 的 印 渍 .
用 纸 ， 称 为 化 学 活化 纸 COhemically activated papers)527。 就
目前 已 报道 过 的 印 渍 用 纸 中 属于 化 学 活化 纸 的 有 两 类 : BAL.
纸 和 省 化 氰 活化 纸 。

(1) € KK (Diazo paper) ， 又 可 分 为 重 氮 蔡 氧 甲 基 纤 -
维 素 纸 C(DBM 纸 ) 和 重 氮 苯 硫 醚 纤维 素 纸 (Diazophenylthioe--
ther cellulose paper; 简称 DPT 纸 ) 两 种 。 由 于 重 氮 纸 上 的 重
氨基 团 非常 活泼 不 稳定 ， 因 此 作为 商品 只 能 制 成 它们 的 非 活化 -
型 中 间 体 , 临 用 时 由 用 户 自己 活化 。 例 如 DBM 纸 的 商品 ,或 为 -
硝 基 革 氧 甲 基 纤 维 素 纸 ( 简 称 NBM 纸 ， 如 Pierce 4h), ste

°123 和

REE AUP EE He eH (简称 ABM 纸 )。DPT 纸 亦 然 ,商品 实
为 氨基 苯 硫 醚 纤维 素 纸 (简称 APT 纸 , 系 8 点 8 Inc. jfk). 可
见 ， 这 些 产 品 均 未 重 氮 化 ， 需 要 用 户 在 临 用 时 自己 把 它们 重 氢
化 。 此 外 ,也 由 于 重 氮 基 团 不 稳定 , 印 渍 中 只 能 采用 仅 需 较 短 时
间 的 电 印 渍 法 ， 不 宜 采 用 需 长 时 间 印 渍 的 毛细 作用 法 或 扼 散 印 ，
渍 法 。 时
重 所 化 纸 容易 自制 ， 如 下 列 反应 式 是 DBM 纸 合 成 的 全 过
程 ， 以 及 此 产物 (DBM 纸 ) 经 重 氮 化 后 印 渍 核酸 时 的 共 价 键 合
反应 ( 兄 最 后 反应 式 )。 式 中 ， 硝 基 革 氧 甲 基 氧 化 吡啶 (NBPO)、
NBM 和 ABM 434 4 iti & fi dh Cn British Drug Houseg
Pierce Chemical Company; Schleiche & Schuell Inc, 等 均 有
生产 ), 因此 手头 只 要 有 任 一 种 商品 都 可 按 玉 式 合成 到 DBM 纸 。
具体 操作 是 :把 干 的 氯化氢 气 通 入 含有 :58g 多 到 甲 醛
[Paraformaldehyde;- (CH.O),] 和 200g = 硝 基 革 乙 醇 《2 一
Nitrobenzyl alcohol) fy 1L 苯 溶 液 中 ， Sik FREAK BE,
使 有 机 相 和 水 相 分 开 ,除去 上 层 有 机 相 。 水 相 中 加 六 150g 无 水
NaSO, 后 过 滤 。 装 入 旋转 蒸发 器 中 在 减 压 幸 除 葵 , 然后 在 减 压
下 蒸馏 残留 下 的 黄色 溶液 ,并 收集 压力 达 .5mm FRE A EE
150°C 和 154°C 之 间 的 分 部 。 此 步 务 要 当心 ! 因为 蒸 馅 近 于 燥
时 将 可 能 爆炸 。 通 常 可 以 得 到 216g 黄色 液体 , 把 它 慢 慢 加 六 到
750 mal 搅拌 着 的 、 冰 冷 的 吡啶 溶液 中 , 静 置 一 夜 使 吡啶 盐 结 晶 出
来 。 用 浇 结 玻璃 漏斗 收集 结晶 , 先 用 吡啶 洗 一 次 , 再 用 石油 醚 洗
几 次 。 在 减 压 下 干燥 , 此 即 NBPO。 通 常 可 得 267gNBPO; 产 率
y 73% , #8, NBPO 放 入 干燥 器 中 贮 于 一 20"0 fen wet
下 面 反应 将 在 通风 橱 中 进行 ， 以 除 吡 啶 雾气 用 来 反应 的
滤纸 应 有 良好 的 机 械 强度 和 对 化 学 试剂 的 抗 性 导 通 常 认为
Whatman 540 滤纸 是 合适 的 。 反 应 可 在 长 方形 的 扩 瓷 盘 : 玻 璃

- 124-6

人 CE- cH.ocn. a

CHzOH

bs
+ NCI eo eee
NOz NaN 核酸
hai oe ts
a OCH
oe DBM [Est] 一 CH -
No”
- : Ce + HNO:
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| +e x REN ABMiR — CH.OCH:
7 NO < NHe-
2s "gf NazS20< ia
CHOCH: 一 人 ENBM 纸

盘 或 不 锈 钢 盘 内 进行 ,大 小 应 和 印 渍 模板 相当 或 成 倍数 扩大 ,以
便 裁 前 时 不 会 浪费 。 首 先 把 欲 反应 的 滤纸 裁 成 和 上 述 瓷 盘 相同
大 小 , 放 在 次 盘 底 部 ,并 把 次 盘 浮 在 60°C 水 洽 上 。 按 每 平方 厘米
滤纸 需 用 28.5 忆 ,内 含 2.3mgNBPO(8.14Umol,MW =280.7)
和 0.7mg 三 水 酷 酸 钠 的 水 溶液 计算 , 准备 好 反应 液 。 每 次 每 盘
只 放 一 张 滤 纸 导 之 反应 。 把 反应 液 均匀 地 倒 在 纸 上 ,， 用 戴 橡 皮
手套 的 手 赶 走 纸 面 上 气泡 并 不 断 而 又 均匀 地 用 手 晃 动 纸 面 溶液
直到 纸 呈 微 于 状态 。 把 纸 连 盘 放 入 60°C 烘箱 中 干燥 了 分 钟 。

。 125 >

把 纸 翻 过 来 使 纸 背 向 上 。 调 节 人 烘箱 ,升温 到 135°C, 并 保温 30 一
40 分 钟 。 这 步 很 重要 ,如 果 温 度 达 不 到 135"0， 反 应 将 不 完全 。
经 验证 明 ， 具 有 空气 循环 的 烘箱 能 得 到 最 好 的 反应 效果 刘 经 烘 。
烤 的 滤纸 用 水 洗 几 次 ， 共 20 分 钟 。 再 用 丙 责 洗 8 次 ， 共 20 分
钟 。 最 后 空气 干 爆 , 即 得 NBM 4g, Scie, NBM 纸 最 稳定 可，
在 汪 箱 中 贮存 数 月 , 故 某 些 厂家 只 出 售 这 类 NBM 纸 ， 因 就 在
于 其 稳定 性 好 。 其 后 则 由 用 户 完 成 下 述 步骤; aoe |
i NBM 4 Ail 150m] 20% (w/v) #=— 亚硫酸钠 深 液 ， 60°C © :
反应 30 分 钟 。 反 应 在 通风 橱 中 进行 以 除去 SO 反应 期 间 E
Maat an peo 反应 结束 得 到 的 即 是 ABM 3, FR
AYLI, HU3I~5 4b, METFHREBA ASR ABM
纸 也 较 稳 定 ， 可 在 真空 下 , 4°C 保存 达 革 年 之 久 。 也 有
商品 出 售 ,用 户 在 印 渍 时 可 按 下 述 方法 使 之 重 氮 化 心
14Xxl4cm ff} ABM 纸 至 少 用 100ml 1. 2MHO1 me Lak, ;
hg) BART HHA 0. 3ml/om®? ky fy 1.2 MIO] 中 。 取
HOF RC Hil HY 1% NaNO. HFK 2.7 ml, 混入 100ml 冰冷 的 工 2M
HOI 中 ， 在 冰 浴 干 把 ABM 所 放 入 此 法 波 中 ， 并 不 时 地 衣 划 -
下 。 反 应 30 分 钟 后 取 一 清 深 液 ,加 于 淀粉 砚 化 物 试 奶 下 测试 一
而 酸 ， 此 时 溶液 应 仍 是 阳性 反应 (黑色 ) 。 把 这 种 已 重 拨 化 了 的
ABM 纸 \ 即 DBM 纸 )， 仍 保存 在 这 种 冰冷 的 酸 溶液 中 计 直 到 和 欲 “
印 溃 的 凝 胶 准备 好 时 取出 。 用 冰冷 的 水 快速 地 洗 两 次 避 再 用 冰
次 的 印 泪 缓 冲 液 洗 两 次 ， 全 部 洗涤 总 时 间 不 应 超过 2 志 8 分 钟 C
立即 把 DBM 4c BE we Re eligi SA
快 越 好 。
DBM 纸 显然 没有 NO 纸 方便 ， Sik FA, eat ’
时 常会 降低 凝 胶原 有 的 分 辩 率 。 但 它 它 能 印 渍 NO 纸 不 能 印 渍 的
BNA RR DNA 小 片段 9; 它 和 生物 大 分 子 是 其 价 连 接 Bem 了

= 126.

vv 征 , 印 渍 后 的 种 种 处 理 不 会 使 生物 分 子 脱落 ; 它 因此 能 在 探 针 印
”关中 像 录 音 带 那样 ;在 抹 去 探 针 后 重复 使 用 多 次 , 这 样 就 能 顺 次
， 策 用 多 种 探 针 以 便 对 同一 印 渍 纸 进行 多 种 探测 。
RF DPT 纸 ， 亦 如 上 述 DBM AA, 市 售 商品 系 未 活
”化 的 氨基 葵 硫 醚 纤维 素 纸 (Aminophenyjthioether cellulose
paper; 简称 APT 纸 ) 。 临 用 时 由 用 户 自 己 用 酸性 硝酸 钠 使 APT
RBA. APT Riba Bil, TH ABM 纸 简便 而 安全 , 具体
取 几 张 各 为 414x25cm Ky Whatman 50 滤 纸 ; HARA Uk
箱 所 用 保鲜 纸袋 中 = 加 入 70ml 含有 2mgy/ml 氧 硼 化 钠 的 0.5M
ASA, BA 380ml 1, 生 丁 二 醇 缩 水 二 甘油 醚 (]。4-
Butanediol diglycidyl ether), 把 保鲜 袋 口 用 电 烙 铁 加 热 封
A, ESRPPRERUR IC), HFRABKRMK, Hin

—— 10m 12-4 set A 40m] 丙酮 混合 液 , HERO A, 又 垂直

旋转 10 小 时 。 反 应 结束 后 剪 开 袋 口 倒 去 溶液 取出 滤纸 , 顺 次 用
丙酮 洗 两 次 50.1NHO] 洗 两 次 HiO 洗 几 次 0.1NHO] 再 洗 两 次 。
最 后 ,用 水 洗 光 次 后 空气 干燥 即 是 APT 纸 。 上 述 第 一 次 水 洗 以
前 所 有 步骤 , 宜 在 通风 橱 中 进行 。 空 气 干燥 后 的 APT 纸 可 贮 于
装 有 硅胶 的 干燥 器 中 ， 放 入 ACU. BRU, APTA 比
ABM 纸 更 稳定 59。 |

APT 纸 的 重 所 化 步骤 和 前 述 ABM 纸 的 活化 步骤 完全 相
同 。Reiser 和 Wardale 曾 用 DPT 纸 成 功 地 印 渍 过 非洲 绿 猴 肾
细胞 全 细胞 抽 提 液 ， 以 及 猿 猴 病 毒 40(SV 40) SpA RO,
他 们 还 比较 了 DPT 纸 及 其 前 体 的 印 渍 效率 5?。 因 为 ,Stellwag
和 Dahlberg 在 使 用 DBM AEA RNA DNA 和 和 蛋白质 的 实验
High, BRAEMAR, DBM 纸 还 能 以 非 共 价 方式 结合 部
分 RNA 或 DNA5C5 ik, Reiser 和 Wardale 也 想 证 明 DPT

e127 。

表 4-4 DPT 及 其 前 体 纸 印 渍 蛋白 质 的 效率 与 稳定 性
结合 “TI-IgG 重 链 之

纸 的 -类 型
纸 的 -类
I 新 活化 的 DET 纸 70
TI MATA 0.1 MTris-HCl(pH9)-10 % 乙 醇 胺 - 10
0.25% 白明 胶 处 理 二 小 时 使 重 氨基 失 活 的 DPT
III APT 纸 15

IV whatman 50 滤纸
V whatman 540 滤纸

纸 是 否 也 有 类 似 现象 。 于 是 他 们 把 TI RIK Fe IgG fA SDS—
PGGE(7~20%) 进 行 分 离 , RG A Bob mw (10mM pH

9.2 硼酸 钠 缓冲 液 )5 分 钟 的 DPT RACH AR, 4} Gl FE 400V

(300~400mA) 下 电 印 渍 工 小 时 。 印 涡 后 , AB a BBA,
切 下 各 组 IgG HERTHA. WT REE A RA
DPT 及 其 前 体 纸 结合 的 牢固 程度 ,各 组 印 渍 后 各 一 分 为 二 。 二
组 用 含 0.1M BRAY (pH7.5),0.5 MNaCl #1 2%S8SDS BAR,
在 室温 下 洗 60 分 钟 后 计数 ; AAR, ARI 4e4, AT
见 , 失 活 了 的 DPT 纸 确 能 非 共 价 地 结合 蛋白 质 ， 租 其 量 仅 为 活
化 DPT 纸 的 一 半 , 而 且 容易 被 洗 掉 (80%) 。 环 重 拓 从 的 区 P 下
纸 也 能 非 共 价 结合 蛋白 质 ， 且 结合 量 高 达 15%, PERSE
“0 的 溶液 洗 去 80% 。 常规 滤纸 则 不 能 和 蛋白 质 结 个 5 直上 上
实验 可 知 , DPT 纸 能 牢固 地 共 价 键 合 蛋白 质 ， BA SDS HIGH
洗涤 仍 能 保留 70%。 HF SCI IEA FE BH 3 Be Je fy 30% FE Ye
附 的 游离 放射 性 (若是 , 则 70% 即 是 DPT ACSIA EAA EE),
还 是 去 污 剂 使 共 价 键 解 离 的 部 分 ( 似 不 可 能 ) RE 2
们 所 说 的 :蛋白质 有 部 分 和 DPT Ye ny ah Se A ase Bee 0080

(2) RM RIEMHK 生物 大 分 子 印 涡 术 中 被 采用 的 另 一 种

s128 。

a ee
= - 4 v . , a 本 所 ~ 本

.化 学 活化 纸 是 溴 化 氰 活化 纸 (ONBr-aetivated paper, 简称 OBA

纸 ) ”oOCBA 纸 也 容易 按 Taylor 改进 的 qlark 等 人 的 方法 上 自
制 “ 守 具体 步 又 如 下 :到 :20 张 直径 为 9cm 的 Whatman 40 [hl

; 形 滤纸 ; 放 入 1000ml 烧杯 中 加 入 400ml, 0.1 MNaHOO; 洗涤

15 分钟 5 洗涤 时 用 手 捧 住 烧杯 作 圆周 式 晃 动 , WO AREA,
以 免 损伤 滤纸 (下 同 )5 再 换 400ml 水 同样 晃动 下 洗涤 15 分 钟 。

“以 下 步 又 均 在 通风 橱 内 进行 。 把 洗 过 的 20 张 滤纸 放 入 2000ml

装 有 ONBr 溶液 (12g ONBr-F480mI HO) 的 烧杯 中 ， 用 QN
NaOH 调 溶液 酸碱度 达 pHll。 此 时 活化 反应 开始 ,用 手 捧 住 侥

杯 不 时 晃动 ) 又 同时 滴 加 2N NaOH 使 溶液 恒定 在 pH11 处 。 反

by 8 分 钟 后 倾 去 ONBr 溶液 使 反应 终止 。 留 下 的 滤纸 用 500ml
0.1MNaHLCOs 洗 ， 共 两 次 。 然 后 按 5 张 滤纸 一 组 ， 顺 次 用
250ml; 0.1M NaHOO。 250mlHs0; 200 ml 50% 丙酮 (用 水 配
Hl) SBE LK. PUR AAS TR, 放 入 装 有 干燥 剂 的 干燥 器 中
针 于 4C 忆 冰箱 。 这 种 经 处 理 的 CBA 纸 较 稳 定 , 通 常人 CO 下 贮藏
数 月 仍 能 保持 活性 。

Bhullar 等 人 曾 用 CBA 纸 成 功 地 印 渍 过 抗 Te 血清 的 特异
人 性 抗原 。 印 渍 时 ;他 们 先 把 OBA 纸 用 印 渍 缓冲 液 (pH6.5，
0.1M 磷酸 钠 缓冲 液 ) Rik, ia BEBE (SDS-15 PAG) 上 ，
用 毛细 作用 印 渍 法 印 渍 SR, lit Ja, OBA 纸 放 入 100ml
狂 灭 缓冲 液 40.1MIJTrig, 1% 甘氨酸 .0.1% MRABA,10%
乙醇 胺 为 于 37 C 下 保温 工 小 时 ,以 封 阻 OBA 纸 上 那 些 未 共 价
结合 生物 分 子 的 剩余 区 域 。 然 后 再 用 抗 血清 、”I-A 蛋白 先后
Ab FBT Ro MIA Ay CBA 纸 印 渍 蛋白 质 是 很 有 效 的 , 被 印 渍

”区 带 虽 经 共 价 键 合 但 还 保持 着 抗原 活性 。

商品 溴 化 氰 是 一 种 白色 结晶 ， 室 温 下 易 挥发 而 产生 有 刺激
性 的 剧 毒 蒸气 。 因 而 OBA 纸 制备 时 务必 在 良好 的 通风 橱 中 进

ee 129。

行 。 反 应 后 的 ONBr 废 液 不 能 随便 丢弃 ,应 与 碱 性 三 惟 亚 铁 相 ”
混合 , 使 其 破解 为 无 毒 而 又 易于 随意 处 理 的 亚 铁 握 化 物 5 |

3. ex RM(Nylon-based membrane) RHE

尼龙 衬 底 异 是 一 种 俗称 尼龙 66 HECCR CCR, S
导入 众多 的 叔 胺 基 后 被 修饰 成 带 阳 电 的 膜 。 最 初 这 各 膜 材料
被 用 于 液体 和 气体 的 过 滤 。 由 于 它 具 有 如 NC 纸 那 料 薄 而 光滑 “
的 表面 ,更 大 的 机 械 强 度 , AE AAS OE Pe
静电 作用 ， 以 及 具有 结合 蛋白 质 的 高 容量 4807iEX6 画 区 而 被 应
AT AMR. Tae

CRHKRECHASH RTS, BESMHRREH
Zetabind, % AMF Cuno Divison, Meriden, Conn. fy Filj*
品 , Pt EVE SC mR HP AS HS Je ey HA RY ZB, HSL, Bio-
Rad Laboratories(Richmond, Oalif. ) 生 产 的 Zetaprobe, 以 及
AMF/OUNO 生产 的 Zetapor， 均 和 Zetabind 属于 同 稳产 品 ，
它们 的 理 、 化 性 质 并 无 重大 差异 csl。 因 为 这 类 商户 络 称 欧 有
2eta 字 首 ， 因 此 可 以 把 ZB fei Bs, Be Se Zeta Me (Zota
membranes) 的 缩写 符号 ， 而 不 是 专 指 Zetabind 商品 522

ZB JA fa ih WY DAA EF ED eT OEE A Im ZB RRR
O55 25 WF A PS SRY Flee, ALE NE EI
其 非特 异性 结合 探 针 部 位 的 步骤 。2ZB 膜 印 渍 谱 不 能 用 常规 的
FN HE AS ee FASE fe, BOR IE ER A .
决 的 问题 之 一 。 在 印 渍 术 中 ZB 膜 是 仅 次 于 NO AMR ER :
用 的 印 读 纸 , 曾 成 功 地 印 渍 过 单 链 DNA IRE DNAS Bae
PE HOP, 但 是 ， Hossenlopp “§ \ HEIR TAR TE
剂 对 ZB OY LAE Je ENE PIR BS ARG em, Ad 1%BSA.1%
APR. 1% Polypep 和 工 % 4th 277 0S wae a
NAIC ES AAA, ZB Bae Be

* 130+ oa

高 ol。 用 牛 血 红 蛋 白 狂 灭 ,背景 昌 有 下 降 , 但 区 带 也 不 清晰 "so。

ZB 膜 尽 管 有 许多 优点 , 得 若 不 解决 这 些 问题 必 将 限制 它 的 进 一

步 应 用 。

在 印 渍 未 中 还 有 --: 印 涡 用 纸 曾 被 报道 过 。 例 如 , van den

"Borg 用 离子 交换 纤维 素 纸 Whatman DE 81 jit 3h 4h G0

台

了 2% 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 的 细菌 胸 昔 激酶 50。 他 采用 50mM
Tris—-Z,@ (pH7.5), 0.5mM Mg-ATP, 1mM 斑 基 乙醇 帮 为 印
MAM, FEAR ARF °C FRI RK, Bays PL
brid ht ARS FE TR ET ft, van den Berg 指出 , 在 这 种 条

件 下 印 渍 后 仍 能 保持 酶 活性 。

前 面 讨论 NO 纸 时 提 及 , NO 纸 中 混 有 乙酸 纤维 素 时 结合 容
FR“. 和 但 是 Seohaltman 和 Pongs 却 用 乙酸 纤维 素 膜 (8 &
8 CA 25010) 成 功 地 从 SDS-10% PAG 上 印 渍 了 果 蝇 组 织 培养
‘SA His JP Ee BY A

三 、 印 渍 缓冲 液 的 选择

生物 大 分 于 印 渍 术 发 展 至 今 仅 十 二 年 历史 ， 有 关 印 涡 缓 冲
液 的 选择 尚 无 可 循 规 律 。 就 目前 已 知 印 渍 原理 和 大 量 实践 经
B®, KARE DADB HAE RM: GQ) 所 选 印 涡 缓冲 液 的 组 分 和
PH, 应 能 使 所 需 印 渍 的 大 分 子 具 有 最 大 浴 解 度 ， 使 之 容易 迁 出
BERT LEP BE. (2 所 选 缓冲 液 应 能 保持 被 印 涡 大 分 子 仍 具
最 大 的 分 子 亲 和 性 , 如 像 分 子 可 杂交 性 、 免 疫 活 性 或 各 类 分 子 间
的 相互 作用 力 等 ， 以 利于 其 后 的 专 一 ' 性 检 出 “”。 (3) 所 选 印 渍
APM REIL ERS RAIS. 例如 ,采用 重 氮 化 纸 的 蛋
上 目 质 印 渍 术 中 ,- 若 用 Tris- 甘 氨 酸 缓冲 液 时 , 甘氨酸 也 能 和 重 氮

其 团 反 应 , 既 降 低 了 生物 分 子 的 印 渍 效率 , 又 将 使 其 后 用 蛋白 质

。 131。

~

染料 的 检 出 产生 高 背景 am。 (A) 所 选 印 渍 缓冲 液 应 能 防止 凝 胶
在 印 渍 中 发 生 胀 或 缩 等 变形 ， 为 此 大 们 常 加 抗 变 剂 k 如 20% FA
醇 ) 于 印 溃 缓 冲 液 中 cl。(5) 采用 电 脱 色 槽 类 型 的 电 印 渍 术 : 启
选 印 涡 缓冲 液 应 有 利于 体系 产生 高 电流 ， Ness nate
就 是 说 印 渍 绥 冲 液 应 是 低 离 子 强度 的 。 *
表 45 列 出 了 印 渍 各 种 生物 大 分 子 站 采用 过 的 各 种 印 汪 组
MRE EMA HS, 蛋白 质 印 渍 术 中 最 常 采用 药 两 种 印
WB MIE, Towbin 等 人 提出 的 pH.8.3,25mM Tris-i92mM
甘氨酸 -20% 甲醇 溶液 "9， 以 及 Bittner 等 人 建立 的 pH5:5
25mM 磷酸 钠 缓冲 液 2。 它 们 常 被 称 为 标准 印 渍 组 种 液 ; 关于
印 涡 缓 冲 液 中 添加 甲醇 、 去 污 剂 、 有 机 溶剂 等 的 利和 害 , 忆 在 印
涡 原 理 一 章 中 阐述 , 这 里 不 再 重复 。 关 于 核酸 印 渍 术 8 最 常 池 用
i) ED WE BEM WE Southern 建立 的 SSC Srey, Zee 0. 15M
NaCl-0.015M FRR FAR. Md 4-5 AEB, BRA ah
外 ,大 多 是 上 述 三 种 印 渍 液 的 变 体 , 而 且 只 是 在 缓冲 液 组 成 的 摩
尔 浓度 上 有 所 变化 。 当然 , 采用 毛细 作用 或 扩散 大 用 印 渍 方式
BY, 因 不 存在 让 印 渍 体系 产生 高 电流 的 问题 ,所 需 绥 冲 液 常 常 就
是 样品 的 电泳 缓冲 液 ， tttesiesses |

+ 《

yy, 7 ee :

1. REA ts =
印 渍 ， 虽 说 是 印 渍 术 中 又 一 关键 步骤， 人

如 果 只 想 了 解 凝 胶 电 泳 分 离 的 蛋白 质 混合 物 中 存在 多 少 区
并 想 用 印 渍 纸 把 全 谱 长 期 保存 下 来 ， 那 么 印 涡 是 非常 容易 实 :

的 。 此 时 ,只 需 把 电泳 后 的 凝 胶 放 在 玻璃 板 上 ; 其 引 放 一 张
A 册 放 上 三 张 普通 干涉 纸 , 压 上 一 本 书 , 任 其 在 室温 下 放 一 夜

*132-6

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平整 地 贴 在 一 起 。

次 日 ;了 到 出 NO HEHE A 0.1% 氨基 黑 -45% 甲醇 7% 乙酸 溶液
中 染色 5 分钟 ， 再 放 入 70% 甲醇 -7.% 乙酸 中 脱色 15 分钟 ， 即
可 看 到 NO 纸 上 , 如 凝 胶 中 那样 的 蛋白 质 区 带 。 如 果 长 期 保存 ，
只 需 将 染 了 色 的 NC 纸 用 水 漂洗 后 烘 干 (风干 也 行 ) 即 可 。

当然 ， 印 渍 术 的 重要 目的 在 于 感 兴 趣 的 某 些 分 子 特 异性 地
定量 检 出 ; 因此 印 渍 操作 就 有 一 定 要求 。 前 已 提 及 , 印 渍 术 中 按
印 渍 动力 可 人 芝 毛 细作 用 力 :扩散 力 和 电动 力 三 类 ; 若 按 印 渍 方向
Sy, 则 可 分 为 单方 向 和 双方 向 印 渍 两 类 ; 再 按 印 渍 方式 ,又 可 分
为 单 拷贝 和 多 拷贝 两 类 ; 根据 这 些 印 渍 类 型 ,， 印 渍 操作 要 掌握
三 大 要 点 s

首先 ; 不 论 何 种 印 渍 类 型 ， SABER BBS EW,
尤其 是 凝 胶 和 印 渍 纸 之 间 ， 要 绝对 避
免 混 有 气泡 。 因为 ， 气泡 会 产生 高 阻
抗 点 从 而 形成 低 效 印 渍 区 (图 4-3)。
这 在 印 渍 术语 中 称 之 为 “ 秃 斑 (Bald
spot)”; 同样 理由 ;各 层 间 务 要 紧密 、

其 次 ; 不 论 何 种 类 型 印 渍 ， 需 要
控制 好 印 渍 时 间 ( 详 兄 第 二 章 印 渍 原
理 )， 尽 可 能 使 所 需 区 带 达 到 95% 以 “~ 一
EW ARR, RYU pas ANCE Re
来 取得 经 验 。 工 气泡 后 形成 的 “ 秃 班 尺 箭头 )

第 三 ;注意 印 渍 纸 放 置 方向 5 :关于 此 项 ; 则 因 不 同 印 渍 动力
等 而 不 同 5 汪 对 毛细 作用 印 渍 而 言 ， 印 渍 纸 应 放 在 液 流 穿 过 凝 胶
方向 的 前 方 二 如 图 8-1, 3-2, 3-3 所 示 ; 印 渍 缓冲 液 是 伴 项 部 干
滤纸 吸引 向 世故 印 渍 纸 理应 放 在 凝 胶 的 上 面 。 就 扩散 印 渍 法

言 二 不 论 印 溃 夹 层 (图 3-5) BEY, 还 是 平 卧 于 大 容量 印 渍

ea。 147。

og, ye pe 3, 因 泊 胶 中 区 带 会 同时 向 两 侧 扩散 ; 改 印 溃 纸 应 在 凝 胶
两 侧 各 放 一 张 ,使 之 形成 双方 向 印 汪 。 EN AK
上 相应 区 带 的 浓度 才 是 真实 的 印 渍 效率 上 BT, a
WATE, REAM MR RE
SDS-PAG, IR SDS-25 4 i Ay MB HH, RE EE
移 ， 因 此 印 渍 纸 应 放 在 凝 胶 的 阳极 侧 。 EERE} Bs Se
HH, 或 带 正 电 , 或 带 负电 , 或 者 净 电 荷 为 零 ; 对 这 种 印 渍 模板 来
说 , 需 视 所 需 分 子 在 所 选 平衡 缓冲 液 pH AREF BRET Eo
若 现 负 电 , 印 渍 纸 应 放 凝 胶 阳 极 侧 ; LZ, MR
检 出 ， 那 末 必 须 在 凝 胶 的 两 侧 各 放 一 张 印 渍 纸 ， 进 生 双 方向 证
BE, 印 渍 结果 将 得 到 两 张 互 补 的 印 渍 谱 。 王 外 ?还 要 看 印 渍 纸 是
何 种 材料 。2ZB 膜 带 众多 的 阳 电 荷 , CRRA RS KS
子 , 因此 采用 ZB WEY a ED, 必须 把 它 放 在 疾 胶 的 阳极 侧 才 有
效 。 活 化 纸 系 共 价 结合 大 分 子 : 未 身 就 不 存在 方向 性 问题 志 比
时 完全 取决 于 凝 胶 中 分 子 所 荷 电 性 来 决定 把 它 放 在 凝 胶 药 哪 三
侧 。NO 纸 是 通过 多 种 作用 力 与 大 分 子 结合 的 2s1 未 身 也 应 不 存
在 方向 性 。 但 Wallis 等 人 认为 ,NO 纸 在 PHS. OM ENE M
带 负电 , 此 时 应 把 它 放 在 凝 胶 的 阴极 侧 S2. AE DNA 印 涡 坟 中 ，
由 于 DNA 是 多 阴离子 生物 大 分 子 ， 电 印 淡 时 意 是 把 印 演 纸 放
在 凝 胶 的 阳极 侧 。 过 兴工 ae:

2. 多 拷贝 印 渍 SO WHEL,

SL erLRB NG meee
PIE VL, EWA AT B Ep hil BSE A — Be AE
的 复制 品 , 所 得 每 一 拷贝 又 都 能 单独 地 用 于 和 分析 和 检验 ;了 这 就
使 得 原来 只 能 用 于 二 种 目的 之 凝 胶 ， 可 以 通过 印 渍 来 用 于 乡 种 -
Flt) KES, RABE Hy DETR BRT TT DE ET
TE AO, ERR RE, eR IR:

«1486

登 放 式 和 印刷 式 。

(1) 梧 族 式 多 拷贝 电 印 渍 法 ”这 是 在 凝 胶 一 侧 同 时 麦 放 数
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3-8)F¢ TOP IBS, —K PIR BBC 2 ~3 TK EM BEAL °°,
但 Gershoni 和 Palade 8@— yr yA 10 KN", PO, eT
把 *°I 标记 牛 血清 白 蛋 白 GBSA) 用 SDS-10% PAGE 分 离 , 然
后 用 它 作 模板 ;在 其 阳极 侧 登 放 切 张 NO 纸 或 2B 纸 , 并 在
30V FH LNA. Elita} AW Ee KN Gi A BSA 区
带 的 放射 性 , BRIM 4-4 Pras. WIL, ZBRRAR ANAS
容量 , 因此 在 第 十 2 张 ZB 膜 上 大 量 结合 PL-BSA fa, RAD
量 被 结合 于 第 3~8HK ZBR EL. NCKARABERE RIK,
但 是 在 又 放 着 的 各 层 滤 纸 上 都 结合 了 一 定量 的 “TIBSA, HE
几 和 印 渍 纸 数 呈 平 缓 的 直线 下 降 。 MEK, KYM
贝 数 越 多 则 凝 胶 电 泳 的 上 样 量 应 越 大 。 例 如 上 述 实验 , **°I-BSA
的 上 样 量 高 达 1400ng 一 ,这 比 常 规 上 样 200ng 左右 要 高 7 倍 。
上 述 实 验 也 表明 , 这 类 多 拷贝 印 渍 采用 NC 纸 比 2B IRE; 记得
10 张 拷贝 NO 纸 上 的 印 渍 物 浓度 则 随 登 放 纸 号 而 递减 。

(2 印刷 式 多 拷贝 电 印 渍 法 “此 法 是 在 电 印 渍 时 , 每 隔 一
定时 间 换 一 张 新 的 印 渍 纸 , 借 此 来 获得 多 拷贝 。 例 如 , Svoboda
等 人 在 研究 印 渍 速率 的 时 间 进 程 ( 见 图 2-8) 时 "每 隔 15min 换
一 张 NO 纸 , 共 电 印 渍 90min, 故 得 6 张 印 渍 拷贝 ca。 Legocki
和 Verma 曾 用 图 解 ( 图 4-5) 来 说 明 多 拷贝 电 印 渍 谱 免 疫 检 出 的
实用 性 ;并 通过 条 件 试验 确定 了 多 拷贝 电 印 渍 所 需 最 佳 印 渍 时
lal HT FB AI Ee (Rhizobium japonicum 61A76 和 61A24 株 )
总 蛋白 抽 提 液 ; 以 200 ye 蛋白 质 浓度 上 样 于 双 相 凝 胶 ， 共 分 离
出 '350 尽 450 条 主要 区 带 。 用 这 种 凝 胶 作 模板 ,平衡 后 在 其 阳极
MKE—K NOR, RE KR BRA 25mM Tris-192mM 甘

2149.6

10°

104

"1— BSA STH (cpm)

10%

12345 67 8 9 10 =:
登 放 的 滤纸 号 ae

图 4 和 多 拷贝 电 印 渍 所 得 8 或 10 张 ZB RRCO-O)R
NC 纸 (O-O 〇 ) 拷 贝 上 335T-BSA 的 放射 性

箭头 工 指出 8 张 ZB BAR ER; HH 2 #810 NO

NDS e hee oan jp eh ees
氨 酸 (pH8.0)-20% HARKEN BE SE aR yA, 800mA FEY Lh
HY. 取出 夹层 再 换 一 张 新 的 NO 4S ENE OR, 如 此 操作
共 3 次 。 所 得 各 拷贝 按 图 45 安排 , 其 中 二 张 经 狂 灭 浆 理 后 用
免 抗 根瘤 菌 蛋白 抗体 保温 , 再 用 I-A 蛋 下 最 放射 性 谱 g4 混
然 , 上 述 换 NO 纸 的 过 程 较为 麻烦 , 必须 把 紧 因 好 的 温 淋 淋 的 夹
层 松 开 。 为 此 ，Manabe 等 人 专门 为 多 拷贝 电 印 渍 变 评 了 三 种
颅 为 合理 的 装置 ( 见 图 3-10)eo。 它 象 油印 机 那 冬 ! 欢 纸 时 员 需
把 夹层 上 半 部 提起 即 可 。 他 们 的 装置 可 以 同时 放 革 获 微 型 疑 胶

* 150 。

ys EDM 多 拷贝 免疫 检 出
2). ———Oeeeaaeeeeeeeee

十 AbX + AbY. +AbZ

MEGAFTS—2RERY

RE “”
”图 45 多 拷贝 电 印 渍 在 免疫 检 出 中 的 应 用 示意 图
AbX, AbY, AbZ 表示 一 张 印 渍 纸 土 至 少 可 用 三 种 抗 血清 处 理 。
《 详 见 第 三 章 ) 又 由 于 电极 之 间距 离 仅 是 夹层 的 厚度 , BO aT
PAS AR, 10 分 钟 即 可 换 一 张 印 渍 纸 ,， 共 -50 分钟 , 履 可 得 20

KB MO,

3. 印 渍 电源
在 第 三 章 中 已 经 论 及 ， 电 印 渍 槽 实 可 分 为 电 洗 脱 槽 和 电泳 -
槽 两 类 , 后 者 系 1983 年 后 才 开 始 在 一 些 实验 室 试制 的 目 用 装置 。
因此 目前 国内 外 市 场 上 供应 的 电 印 涡 槽 都 属 电 洗 脱 槽 类 。 从 原 ，
理 土 讲 ; 这 类 印 训 槽 都 需要 高 电流 、. 低 电压 的 直流 稳 压 电源 ， 如
BA, 100V. FAK, 常规 电泳 仪 的 直流 稳 压 电源 则 是 低 电 流 、 高 -
电压 ， 如 300~500mA, 500V。 因此 市 售 印 渍 槽 (通常 不 附 电 .
VW), 若 用 常规 电泳 仪 电源 替代 ,操作 时 必须 小 心 , 以 防 烧 筑 电流 ，
Be AUT FAA, 电 洗 脱 是 两 电极 间 放 于 无 分 隅 的 同 种 溶液 内 , 这
相当 于 把 插 在 市 电 中 的 两 根 电线 ， 直 接 放 入 一 盆 冷 水 中 使 之 如，
«PAS Te: 低 电 阻 引起 了 高 电流 。 其 次 , 电 印 渍 最 好 采用 铀 片 电
极 ; 这 样 可 使 整 块 凝 胶 上 任 一 点 都 具有 相同 的 电场 , 从 而 使 任何
区 带 能 均匀 地 转移 。 然 而 即 梧 很 薄 的 、 仅 需 10Xx 巧 cm 的 铀 片 ，

se 151=

其 价格 都 将 是 极其 昂贵 的 ,因此 市 售 商品 常用 铂 丝 (两 电极 共 需 ，
2m K) 25 HAL MRE, 大 的 电极 面积 又 增加 了 筷 流 量 第
三 ,正如 电 洗 脱 进程 那样, 电解 质 也 将 从 凝 胶 息 洗 陪 出 来 进入 印
汪 缓 冲 液 中 增加 溶液 的 导电 性 , 也 就 是 说 溶液 更 阻 将 逐步 下 降 ，
导致 外 电场 电流 进一步 加 大 。 HEAR, RA PRE
渍 槽 的 电源 应 是 高 电流 电源 , 最 好 采用 人 恒 电流 式 的 高 电流 电源 。
否则 在 操作 过 程 中 , BRAM LA, BAER. HEL,
这 类 印 渍 槽 最 好 采用 高 电流 的 12V ila wh = cy 电瓶 ) 来
作为 电源 。

由 上 也 可 了 解 到 , 电 印 渍 所 用 高 电流 必然 使 体系 发 热 , 这 是
电 洗 脱 不 可 避免 的 现象 ， 因 此 市 售 印 渍 槽 商品 天 多 附 有 冷却 水
循环 装置 。 此 外 ， 印 渍 时 间 又 取决 于 两 电极 间 的 距离 过 因 为 印
渍 速率 又 取决 于 电压 梯度 (V/em) ;距离 越 远 六 HR RRB
小 。 鉴 于 上 述 情况 , 我们 在 借用 他 人 印 渍 经 验 时 ( 玫 4-8), ;必须
了 解 其 印 渍 装置 的 情况 ， 尤 其 是 许多 实验 室 系 采用 自制 的 电 印
Wit, 式样 虽 类 同 , 但 大 小 。 TERS RRR RE eA
献 中 又 常常 不 具体 说 明 。

总 之 ， 印 渍 术 历史 不 长 ， Sts Cu eH a LAER DR, 价
格 昂贵 , 印 渍 时 间 长 ， 耗 电 , 不 能 多 拷贝 印 涡 等 等 吻 端 。 可 以 预
料 , 新 一 FRR Th MR 8 I Ai

et eet ees on

除了 印 涡 们 品 已 用 放射 性 标记 ， 或 只 想 把 印 涡 谱 用 常规 染
色 法 检 出 全 谱 外 , 凡 印 渍 谱 需 用 分 子 亲 和 技术 特异 性 检 击 者 ) 印

溃 后 的 印 渍 纸 都 要 先 经 狂 灭 步骤 才能 用 探 针 检 出 5UE 节 在 第 二
章 中 所 讨论 的 , 印 渍 后 ， TL ES ef

* 152.

| 阻 。 化 学 活化 纸 则 需 在 印 涡 后 熏 之 失 活 。 只 有 这 样 ， 才 能 在 其
后 用 探 针 印 盖 时 ， 不 会 使 探 针 (它们 往往 也 是 生物 大 分 子 ) 因 被
”这 些 剩余 活性 或 区 域 非特 异 结合 而 形成 高 背景 。 在 实际 操作
”中 , 狂 灭 步骤 常 不 只 是 单纯 为 了 封 阻 印 渍 纸 上 剩 余 作 用 力 ,也 常
伴 有 生物 分 子 印 渍 后 的 复 性 等 目的 ， 巨 其 在 免疫 印 渍 时 更 是 姑
此。 例如 Petit 等 人 提出 ,从 SDS 变性 凝 胶 上 印 渍 而 来 的 抗体 ，

”可 在 锤 灭 溶液 中 加 入 Nonidet P-40 来 促进 抗体 所 具有 的 抗原
SE, Towbin 和 Gordon 也 指出 , 有 时 只 需 简 单 地 把 狂 -
灭 反 应 时 间 ， 从 原来 的 工 小 时 增 到 2 小时， 同时 提高 反应 温度

3) 40°C, 就 能 改善 印 渍 纸 上 核 糖 体 蛋白 质 的 检 出 信号 52。

镑 灭 剂 的 种 类 很 多 , 大 多 仍 是 蛋白 质 , 如 牛 血 清白 蛋白 、 血
TEA. REA. 白明 胶 、 各 种 动物 全 血清 等 。 表 4 5 中 已 列
”出 了 各 种 生物 分 子 印 渍 中 所 用 狂 灭 剂 ,可 作 人 参考 。 |

BK Rh FR eae A, A a
EIS DH BL FPL Be APB IC HA EL LA ER SE A, 于 25~ 60°C"

”下 保温 1 一 12 小 时 即 可 。 但 是 ,正如 原理 一 章 所 述 , 狂 灭 步骤 既 可

用 蛋白质 类 作为 狂 灭 剂 , 也 可 用 非 蛋白 质 类, 如 像 了 ween 20re91、

” 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVPO)22 和 聚 蔗糖 (商品 名 Ficoll)? 等 。 此

Sh 狂 灭 时 也 可 二 步 完 成 ， 也 可 分 多 步 完 成 。 例如 Hossenlopp:

”等 大 在 印 涡 血 清 中 类 胰岛 素 生 长 因子 的 结合 蛋白 质 时 ， 狂 灭 步

又 共 分 四 步 : 先 把 印 渍 好 的 印 渍 纸 经 空气 干燥 ; 再 用 3% NP40-

TBS(0.9% NaCl-50mM NaH2PO,) F 4°C Fiz 30 分 钟 ; 然后

| +e FA 1% BSA-TBS $ 4°O #32 2 小 时 ; 最 后 改 用 0.1%Tween
20-TBS YK 1045 90°", BR, H=PREKHEBLR,

第 四 步 被 认为 Tween 4 FF a HY ED 3 Al By EK FH) (BSA) BE

98), MEE RT SB AE RAE EY AY AE, FE 4-6 HET 1B

项 较为 典型 的 狂 灭 实例 供 人 参考 。

表 4-6 常用 首 灭 缓冲 液 及 狂 灭 条 件 、 -

被 印 涡 分 子 FET Bh RR FER RE

麦 粒 抽 提 物 中 过 敏 原 蛋白 质 196BSA-PBS(pH6:8)。 或 者 :
0.05%BSA-0.5%Tween 20-
PBS(pH7.4)

[66]

SV404#F4BAABAM 10.25% 白明 胶 =<0.1MTris=HOE 本:
10% 乙醇 胺 (PH9.0); 20°C,15min

酵母 线粒体 复合 物 III ”|8%BSA-150mM NaC+lOmM »
NaHPO,(pH7.2); 40°O; 30、 }

60min

人 血清 蛋白 质 3% BSA-0.9% NaCl-0.1% | +
NaN3-10mM Tris-HCl (pH7.4);}
中 ee
血浆 抗 胰 蛋白 酶 aa (1) 5% BSA-PBS(100mM ~

NaCl-38mMNagHPO;- ，

12.5mMNaH,PO,-3mM __

NaNsi pH7.4);4°C 1
(2) 0.5%T ween MParne

30min

E Coli 溶 胞 物 中 蛋白 质 合
成 起 始 因子

(1) 3% BSA-0.9% 2
Tris-HCl (pH7.4); 37°C, Uh} -
(2) 0.5% BSA-0. 5% Triton x
100-0.2% SD8-0.01% "~~
NaN3-0.9% NaCl; RH ZR OY

染色 质 非 组 蛋白 类 蛋白 质
PV3 结构 多 肽

NaOl-50mM ‘Tris-HCl(pHT hit 本
37"C，1h

* 54 。

(5)

其 后 反应
一 一 gens Kamm | 讼 中 是 否 | 文献
剂 ?
一 于 来 花 肥 病毒 和 届 音 花 吓 山 3 双 BSAL0.39gTween 20-PBS | + | [116].
一 毒 的 壳 包 蛋白 质 (pH7.4); 15min —
-- 鼠 脑 突 触 体 膜 蛋 白 0.05% Tween 20-PBS(pH7.2); 二 [99]
22°C, 3X5min
_ HeLa 细胞 的 DNA 结合 蛋 |0.03%PVPO- 0.02% Ficoll- " [65]
白 ( 各 种 DNA 印 涡 术 也 常 |0.02%BSA-ImM Na-EDTA-
— FATE KF) 10mM Tris—HCl(pH7.0);15~
west 36min
_ 鼠 肝 细 胞 质 膜 糖 蛋白 和 血清 |255 PVPO-0.8% NaCl-0.02g |、 + [22]
类 粘 蛋 白 KCL0.015g NasHPO4-0.02g
us KH2PO,(pH7.4); 30 min
血清 中 类 胰岛 素 生长 因子 的 |G) DRREBEAT IE + (4) [60]
Bee. (2) 3%NP 40-TBS; 4°C, 30min

(3) 1%BSA-TBS; 4°C, 2h
(4) 0.1% Tween 20-T'BS; 10min

BSA, + fi#4 4; PBS, 0.9%NaCl-50mM NaH.POQy; PVPO, 38Z, 40th.
i bel; TBS, 0.15MNaCl-0.01MTris-HCOI(pH7.4)。 一 ,不 存在 ; 十 ,存在
十 (2) ,存在 第 二 种 狂 灭 液 。 狂 灭 条 件 中 未 列 反应 温度 者 为 室温 。

目前 认为 ,使 用 非 蛋 白质 类 的 Tween 20 FARK, AIK
有 利于 其 后 用 蛋白 质 染 料 染 出 NO 纸 上 全 部 蛋白 质 区 带 , 还 有 利
于 特异 性 免疫 检 出 的 免疫 反应 性 ""…”…”。Batteiger 等 人 曾
对 使 用 工 ween 20 作为 薄 灭 剂 作 过 详细 的 比较 实验 “， 他 们 用
12.5%P AGE 4433 TU ABR Rik (Chlamydia trachomatis Le/
434/Bu 株 ; 简称 LAV 434) SF Ali, 然后 电 印 渍 于 NO AR, 再 按 :
He 4-1 HH 1224 Xf 4A] FPNC 印 渍 纸 进行 免疫 检 出 。 具 体 做 法 是 :

e155 &

R47 Betteiger FLESFRM 比较 实验 中 所 用 实验 组 全

—— —w ee

抗 血清 稀释 液 洗涤 液 &

NC
PBS-TW PBS-TW | - Re
2 PPBS_TW PBS_TW PBS-TW 对 照 组
(月 Gabe = 一 一、 一 一 一 一 一 一 — rae

PBS_-TW PBS-TW

TSGAN-1% a
PBS-8%BSA |PBS-8%BSA [Ee Txiton a etal

TS-3%BSA |150mM NaCl |

TS-3%BSA
TS-TW 150mM NaCl -

343 免 TS-3%0BSA |TS-TW 150mM NaCl

血清

TSGA 150mM NaCl
TS-TW TS-TW

TSGA-TW “|TSGAETW 二

PBS-TW —«|[PBS-S Talkow 法 am

PBS; 4mMKH2PO4，16mMNasHPOW 115mM NaCl, pH7.3; TW: 0.05%
Tween 20; TSGAN: 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.25% BAR, 0.15%
NaNs, 0.1% Nonidet P40, pH7.5; TS: 10mM
DH7.4;TSGA: 同 TSGIAN, 但 无 Nonidet P-40; :8S: 0. ES!

(1) SHIRA 47 所 列 狂 灭 剂 ， 分 别 把 本 G AF 87°C FRM 1
小 时 。(2) 再 分 别 换 用 超 免疫 抗 工 GV-343; 锡 血清 于 370 下 反
应 2 小时。 所 谓 超 免疫 抗 血 清 (Hyperimmune antiserum) , #2
指 血清 中 含有 极 丰 富 的 特异 性 抗体 , 借 此 获得 高 检 出 率 s 此 时 ，
1 和 2 试验 组 作为 对 照 , 分 别 用 PBS 和 免疫 前 的 免 血 清 替 代 超
免疫 兔 血 清 。 此 外 ,各 组 超 免疫 免 血 清 分 别 用 表 47 所 列 稀释 液 ，
但 稀释 度 均 为 1:256。(3) 分 别 用 表 4-7 所 列 洗涤 液 在 室温 下
UE 全 分 钟 。(4) FA I-A Ey CH Ta ®

«156-6

j

87°C 下 保温 工 小 时 。 (5) 分 别 用 表 生 7 所 列 洗涤 液 洗 5 次 ， 共
30 分 钟 。 在 除去 过 量 的 A 蛋白 后 把 NO 纸 空气 干燥 , 最 后 用 柯 -
i& X-Qmat AR 底片 于 一 70?0 下 放射 自 显影 。 结 果 如 图 46:
所 示 , 作为 对 照 的 革 和 2 组 ,看 不 到 任何 放射 性 区 带 。 说 明 固 定
于 NO 纸 上 的 衣原体 蛋白 质 没 有 和 A 蛋白 发 生 非 特异 性 结合

也 说 明 免 疫 前 的 免 血 清 中 不 含有 IgG， 或 其 它 可 以 结合 此 抗原
或 A 蛋白 造成 假 阳性 的 血清 因子 ( 见 图 4-6 之 2 号 NO 纸 )。 图 -
4-6 中 ， 第 3 一 12 号 NO 纸 均 是 用 超 免疫 免 血 清 检 出 的 放射 自

显影 谱 ， 其 中 第 5 号 处 理 ( 表 生 7) 实 属 Vaessen 等 人 曾 采 用 过
的 方法 99, 洗涤 液 中 含有 非 离子 型 去 污 剂 Triton X-100, 其 结
果 比 用 其 它 去 污 剂 的 NO #8 8, 4.7.8, 10, 11 5) BLA

图 4 6 Batteiger 2 \ Zea a TCH ALL

较 实 验 中 所 得 放射 自 显影 谱
ERR A NC 纸 试验 号 ， 它 们 和 表 4-7 所 列 相对 应 ; 左 侧 数 字
为 分 子 量 (KD 入 TD HERR. KEBLE,

数 要 少 ,区 带 强度 也 较 弱 。 而 且 ，Triton X-100 处 理 ( 第 5 号 )
和 用 Nonidet P40(4 号 ) 或 Sarkosyl(12 号 ) 这 两 种 卖 污 剂 处 理
WHR, MART RAE RH EB DA
区 带 ( 见 图 4 -6)。 这 条 区 带 用 Tween 20 PEAT FE AY BEY
弱 区 带 (第 3、7、8、10 和 代号 ) WARM My Bw
为 强 区 带 (第 6 和 9 号 )。 后 来 用 气 基 黑 10B 直 接 涡 这 些 用 PEBSL
Tween 20 KRW NCA, HRABDRX- Key,
而 认为 它 可 能 不 是 多 肽 。 从 图 4-6 RRB, TOE 8%
BSA(6 号 )， 还 是 用 Tween 20(3.7 和 1043), 都 能 有 效 地 狗 丈
NC 纸 上 的 未 印 涡 区 。 相反 ， 用 上 白 明胶 帮 为 其 灭 剂 时 就 难以 多
天 了 (9 号 )。 此 外 ,在 使 用 Tvween 20 作为 狗 灭 剂 的 处 理 中 :元
论 使 用 磅 酸 缓冲 液 (3 号 ) ， 还 是 采用 Tris Bry, 其 结果 并 无
BREF ae

从 Batteiger 等 人 所 得 上 述 结果 表明 , 除 白明 胶 外 ， 如 果 用
BSA 作为 其 灭 剂 , 其 效果 和 用 了 een 20 Hey RIF Hy HY,
可 以 获得 可 以 接受 的 背景 值 。 但 是 ， 使 用 灾 ween 20 作为 迎 灭
剂 时 ， 因 它 不 是 蛋白 质 ， 故 容许 NG 纸 上 印 渍 物 经 特异 性 免疫
检 出 后 ,再 用 氨基 黑 10B 对 此 NO 纸 进行 全 谱 染色 ， 这 是 蛋
多 质 类 狂 灭 剂 所 做 不 到 的 。

六 、 印 渍 纸 染 色 方法

ARUN 2H, APA ADARENEREE
检 出 所 需 生 物 大 分 子 。 但 随 着 本 技术 的 发 展 , 人 们 也 希望 能 像 凝
队 染 色 那 样 ,用 常规 染色 法 使 印 渍 纸 显现 全 谱 。 究 其 原因 有 四 ”
\) 全 谱 的 显现 有 利于 欲 检 出 分 子 的 定位 ， (2) 有 利于 用 常规 分

二 量 祭 准 系列 来 确定 欲 检 出 分 子 的 分 子 量 jX3) 企 图 在 常规 妆 色 是

* 158-

显现 全 谱 后 ,就 在 此 染色 谱 上 再 作 特异 性 检 出 , 起 到 “一 箭 双 雕 ”
HEH; (4) 了 解 印 渍 后 的 区 带 数 是 否 和 原 有 凝 胶 中 区 带 数 相
当 ,也 即 确定 印 渍 的 真实 性 实践 证 明 , 印 渍 纸 上 蛋 白质 区 带 也 可
以 用 常规 染料 染色 ,而 且 染 色 和 脱色 总 时 间 通 常 都 只 需 数 分 钟 。
”有 前 ， 有 关 印 渍 纸 的 全 谱 染 色 法 大 都 集中 于 NO 纸 上 蛋 白质 区
a BBL, 这 固然 是 因为 NO 纸 应 用 最 广 ( 见 表 45), 但 也 因为
其 它 印 渍 纸 的 染色 还 存在 一 些 问题 。 例 如 ZB 膜 带 阳 电 , 而 大 多
数 用 于 蛋白 质 的 常规 染料 属 阴离子 ， 它 们 强烈 地 被 ZB 膜 吸 附
而 使 之 显 高 背景 。 此 外 ， 低 浓度 的 去 污 剂 ， 如 0.1%SDS_ +=
。” 烷 基 三 甲 基 省 化 镑 , 或 Triton X-100 等 ， 因 能 从 ZB 膜 上 除去
”染料 而 使 蛋白 质 区 带 脱 色 ca9。 也 曾 试验 过 用 阳离子 染料 来 染
2B 膜 上 印 渍 的 蛋白 质 ， 其 结果 是 既 不 能 染 2B 膜 ， 也 不 能 染 其
Et。 EZ A, hit, Gershoni 和 Palade 提出 了 一 种 预 处 理
ZB 膜 使 之 染色 的 方法 中 2， 把 印 渍 了 蛋白质 的 ZB 风 一 先 用
25% 异 两 醇 -10% 乙酸 短 时 洗 一 下 , 再 用 大 量 水 洗 多 次 , 把 ZB
膜 放 入 0.19%(w/v) 氧 化 铁水 溶液 中 保温 0:5 天 工分 钟 ， 经 水 洗
| 后 再 放 入 0.1(w/v) 丹 宁 酸 水 溶液 中 保温 ,直到 2B 膜 上 显现 紫
上 红色 蛋白 谱 为 止 。 此 法 总 算 使 ZB 膜 染 色 获 得 成 功 ,但 染色 强
度 通 常 较 弱 ,方法 尚 需 改善 。
基于 上 述 原因 ， 本 节 将 仅 介绍 有 关 NO 纸 上 和 蛋白 质 区 带 的
全 谱 染色 法 。
1. 常规 蛋白 质 染料 染色 法
NO 纸 上 蛋 白质 印 渍 区 带 可 用 氨基 黑 10B、 考 马 斯 亮 蓝 R-
250 快 绿 利 印 度 墨 水 等 染色 而 显现 全 谱 。 各 种 染色 步骤 示 于 表
由 4-8。 其 中 , 尤 以 氨基 黑 10B 应 用 最 多 ,各 种 配方 仅 在 甲醇 和 忆
。 酸 浓度 上 略 有 变化 。 图 4-7 是 Towbin 等 人 用 NO 纸 印 渍 分 离
上 ”五 eof 核糖 体 总 蛋白 质 的 电泳 凝 胶 时 ,采用 考 马 斯 亮 蓝 了 -

159

表 4_8 BHRRNSW NC 纸 上 蛋 白质 区 带 全 谱 的 操作 步骤

ECR

兴 PBS-TW, fi pH7.2, 0.01iMNagHPO,-NaH PO, 缓冲 液 配制 的 0239%
Tween 20 溶液 ;

250, 染 并 行 实验 所 得 又 未 印 渍 过 的 凝 胶 (A) 和 用 所 基 票 10B ye
印 渍 纸 (B) 所 得 到 的 结果 "1。 可 见 , 二 者 区 带 数 相等 , 目 氨基 黑
染色 后 的 背景 并 不 比 凝 胶 上 的 高 xs。 更 重要 的 是 ， 凝 胶 的 染色
和 脱色 要 费时 数 天 ;相反 ,NO 纸 上 因 区 带 已 处 在 纸 表面, 染色
加 脱色 全 过 程 仅 需 20 分 钟 ( 过 长 的 染色 时 间 反而 产生 高 背景 ) 。
Flanagan 和 Yost 也 曾 用 实验 证 明 , 2 Tween 20 浸泡 过 的 NO
印 读 纸 ， 再 用 氨基 黑 染 色 时 就 不 会 产生 高 背景 ci AE,
多 数学 者 认为 氨基 黑 、 考 马 斯 亮 蓝 、 快 绿 和 茶 膀 蓝 黑 的 染色 灵敏
HEAR Bp 46, 00, 59, 1147 例如 Wojtkowiak a 3 on, 用 氨基
黑 染 色 , 当 被 染 的 蛋白 质量 少 于 12 Bug ARE

«160+

ey RRR COMER)
的 比较 (说 明 见 正文 )

pw

94-8 用 印度 墨水 染 NC 纸 印 渍 所 得 蛋白
质 区 带 的 染色 谱 ( 说 明 见 正文 )

2 8 所 列 桨 色 剂 中 公认 印度 墨水 (即墨 汗 ) 的 灵敏 度 最
Pio Hancock 和 Tsang 曾 对 印度 墨水 染 NO 纸 上 和 蛋白 质 区 带
作 过 详细 研究 cae， 认 为 印度 墨水 的 最 适 浓度 是 Iml PBS-TW
中 含 1u1。 低 于 此 浓度 就 不 能 有 效 地 染 出 蛋白 质 区 带 ， 高 于 此
浓度 则 引起 高 背景 。 他 们 又 指出 ， 印 度 墨 水 染色 液 中 含 Tween
20 时 可 以 防止 背景 的 增 大 ,其 浓度 在 0.05~5.0% 范围 内 都 合
适 。 染 色 时 间 最 好 为 2 小时, 洲 染 一 夜 则 更 可 取 。 染 好 色 的 NG
纸 能 在 4e0 下 至 少 保存 一 月 。 图 生 8 即 是 他 们 用 NO 纸 印 渍 贾
SWE, wh (Gléardéa Lamblia) 全 细胞 SDS 增 深 分 部 所 含 蛋白 质
药 印 度 墨 水 染色 谱 , 此 时 背景 呈 灰 黄色 , 区 带 显 亮 灰 色 ， 即使 少
于 80mg 量 的 蛋白 质 都 能 检 出 。 虽说 印度 墨水 染色 的 灵敏 度 很
高 ,但 不 少 学 者 指出 此 法 具有 高 背景 , 其 灵敏 度 因 蛋白 质 不 同 而
A—FE. bln Falk 和 Elliott TEI”, 用 印度 墨水 染 大 豆 胰 蛋
白 酶 抑制 剂 和 玉米 去 蔡 病 毒 (MstpV) 的 外 壳 蛋 白质 时 效率 极

© 161。

差 , 而 染 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 和 烟草 花 叶 病毒 (TMV) 的 共 壳
和 蛋白质 时 效果 极 好 , 从 而 指出 用 印度 墨水 染色 具有 选择 性 Go。
值得 提出 的 是 ， 全 谱 染 色 的 重要 目的 之 一 在 于 特异 性 区 带
出 的 定位 。 为 此 ， 一 种 实验 常 需 做 三 套 样品 ， 即 凝 胶 染色
i, PwC AMARA LRA RE, BE
较 不 方便 的 。1982 年 Towbin 等 人 设计 出 二 种 可 逆 染 色 法
(Reversible staining method)", 也 就 是 说 用 染色 剂 显现
NO 纸 上 全 谱 后 作 好 标记 〈 如 用 墨汁 刺 点 的 方法 ) Rave
料 再 进行 特异 性 免疫 检 出 。 他 们 的 具体 做 法 是 二 经 双 相 凝 胶 电
泳 分 离 的 鸡 肝 细 胞 核糖 体 蛋 白质 被 电 印 渍 于 NG 纸 把 印 渍 纸
用 水 短 乔 洗 涤 后 浸入 用 IOmM 乙酸 钠 - 2.2 (DH 5) S27 He
的 ,浓度 为 100 ug/ml 的 肝素 洲 液 中共 3 次 ， 每 次 3 分 钟 。 再
把 印 渍 纸 浸泡 于 用 同 种 缓冲 液 配制 的 浓度 为 200 we /ml fy A
葵 胶 蓝 (Toluidene blue) 染 色 液 中 染 3 次 ,每 次 3 分 钟 。 用 未 洗
去 过 量 的 染料 后 , 显现 的 蛋白 质 区 带 用 墨汁 作 好 玫 记 , BIB
BZD 50%CH,OH-T.5% 乙酸 中 工 小 时 。 此 时 各 蛋白 质 区 带
的 染料 被 除去 ， NO 纸 上 的 全 谱 消 失 ， 留 下 的 只 是 墨江 表 记 点 。
此 种 印 涡 纸 即 可 再 用 于 特异 性 免疫 检 出 ， 所 显现 的 特异 性 区 带
很 容易 从 印 渍 纸 上 的 墨汁 表 记 辨 认 出 它 是 全 谱 中 和 何 条 区 带 Go5
最 近 Towbin 等 人 又 创造 了 另 两 种 可 逆 染 多 法 。 酌 们 拒 印
焉 纸 用 6M RAT 50mg /L 酚 红 ( 用 -ImM HOT 小 配制 ) 保 源 天
用 1mM HO] 液 洗涤 短 时 间 。 EE 带 被 染 成 黄 色 ，
可 在 蓝 色 滤 光 片 下 清楚 看 到 。 或 者 ， 把 此 印 渍 纸 空气 干燥 ，
1 使 蛋白 质 区 带 显 红 色 。 用 墨汁 作 好 标记 后 用
a 7k — 10 FB SE bt We (PBS) Ye Fe Ye tat 再 进行 特异 性 免疫 检
-
呈 一 类 具有 同等 效果 的 方法 是 全 谱 染 各 前 过 巴特 丰 性 击 能

* 162.

RW ITI, KH Batteiger 等 大 创造 的 "”"。 他 们 在 印 汪 后
的 所 有 步骤 中 ,都 加 有 0.05%Tween 20/447), 它 的 存在 ，
容许 印 渍 纸 在 免疫 检 出 后 再 用 氨基 黑 :10B BMS. AKU
法 的 具体 操作 和 原理 已 在 前 面 狂 灭 一 节 中 提 及 ,这 里 不 再 重复 。
2.. 铁 . 银 、 金 染 色 法 ; :
由 于 上 述 常用 蛋白 质 染色 剂 的 灵敏 度 较 关 高 灵敏 度 的 印
度 墨水 染色 法 又 具 高 彰 景 和 选择 性 ， 因此 大 们 一 直 在 寻求 印 渍
纸 全 谱 染色 的 最 佳 方案 。 下 述 诸 法 即 是 近年 来 已 报道 过 的 全 诺
RA 0
(1) ARR Bi 198642 Moeromans 等 人 介绍 ee 各
可 在 ZB PLA NO 纸 上 染 蛋白 质 区 带 的 铁 溶胶 染色 法 ca。 他 们
指出 , 带 阳 电 的 ZB 膜 若 用 于 印 渍 SDS-PAGE 时 , 因 蛋 白质 均
带 负 电 ， 故 有 着 比 NO 纸 大 得 多 的 结合 容量 。 但 因 蛋 白质 染料
大 多 是 阴离子 , 难以 使 阳性 2B, 膜 上 所 结合 的 负 性 和 蛋白质 染色 ，
更 何况 阳性 .QUB 膜 会 强烈 结合 阴离子 染料 而 显 高 背景 。 但 是 ，
带 负 电 的 SDS= 蛋 白质 复合 物 和 阳离子 ZB 膜 结合 后 ,该 3SDSr-
蛋白 质 复合 物 剩 余 的 负 性 可 和 阳 : 离 子 的 卡 可 基 酸 铁 胶 体
(Cacodylate iron colloid) 相 结合 , 却 又 和 2B 膜 上 未 印 渍 区 的
阳离子 相 排斥 。 因 此 当 用 酸性 亚 铁 氰 化 钊 和 卡 可 基 酸 铁 发 生 显
|， 色 反 应 时 , 就 能 达到 ZB 膜 上 低 背 景 的 蛋白 质 全 谱 显 现 289。 具
”体操 作 如 下 :
中 Tween 20- 阳 离子 卡 可 基 酸 铁 胶体 染 料 ( 简 称 Ferri Dye)
| BY il 47: He 10m10.5MEegls.6HsO， 在 搅拌 下 逐 滴 加 入 到 沸腾
的 60ml AIK 冷 到 室温 ， 把 溶液 加 到 :9 体积 0.1M 卡 可
基 钠 (Sodium cacodylate) 2th Wi (pH 7.0):3, Wl] 460 nm bys
| WEE, SE ES RAB O. Digoom=0.5. 卡 可
BWLZO— PPR, 有毒， 操作 时 要 戴 手 套 。 加 入 了 ween 20

e 163 。

使 其 终 浓度 为 0， 2%, WE) Ferri Dye, © :

染色 方法 : 取 印 渍 后 的 ZB rrr. ST # 每 次 10 分
bh, Fk 200ml, 把 ZB 膜 放 入 上 述 制备 好 前 了 erri Dye
(3mm 宽 的 ZB 膜 用 5ml) 中 ， 室 温 下 保温 工 水 时 (最 好 在 带 塞
试管 中 进行 ,操作 时 戴 手 套 )。 此 时 ZB it Ea Ew
的 黄 神色， 玫 无 背景 或 有 轻微 的 背景 (图 AOA) Bee ewe,
用 200m! 车 偏 水 洗 3x2 分 钟 ， 加 入 新 本 前 显 色 剂 二 酸性 亚 、
Be UL BRS CE 100 ml, 则 为 40ml {'N HO1+40 mi H.0 +
20ml10.05MK4Fe(ON)e]， 反 应 工分 钟 。 Ho A
ti ta, 2 Se AE RR (9B), ER, 此 反应 会
POE ABE BULA, DR ey DPT 反应 结束 ， |
ZB 膜 用 大 量 水 冲洗 , 然后 千 燥 拍照。 L

Moeremans 等 人 认为 , Ferri Dye ridene mm 9A
KL 4-9), 他们 试验 本 OF Decoom=0-05~1.50 fy
整个 范围 ， 认 为 0. Decom—0.4~0.6 HRPM. 此 法
Hk NOAA LEAR HS, RHE ng KF, 但 他 们
RVIE RIE SNE 8. TA, ZB RMA, R
适 于 染 SDS-PAG 作为 印 渍 模板 的 、 带 负电 的 三 DS- 蛋 白质 复 侣
物 , 或 者 桨 未 用 阳离子 修饰 过 的 尼龙 膜 上 的 印 污 谱 *“““

(2) Rk B 4k K (Silver-staining technique) aw 1979
年 Swanstro 在 凝 胶 电泳 染色 技术 中 引进 银 盐 染色 著 宁 Ga 让
来 ， 规 已 一 致 公认 此 法 灵敏 记 要 比 常规 考 蕊 斯 亮 蓝 宇 2250 高
100 倍 cem。 人 们 当然 希望 能 把 这 种 染色 找 采 引 六 印 溃 纸 的 全
谱 染 色 中 ，Yuen 等 人 即 是 这 样 做 的 。 ARE T RAS a
的 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 ， 被 印 汪 于 NO AUG Hy BRE Be 4 Re
JA008) 2h €e Fy Be IK. 1) ER ey NO SEPT pHy.4, 0. 01M

Tris-HOI Bhs 1 Be RIG ATP VERA, BU OE

* 1646

ys}

49 蛋白 质 分 子 量 宗 准 系列 印 溃 于 2B 膜 的 铁 溶 胶 染 色谱
“全 为 了 erriDye 染色 谱 ; 3 为 A 谱 再 用 显 色 剂 强化 的 显 色 谱 。
AAI BAN ZB RX 3mm KA 8 条 ,并 分 别 试验 制备
FerriDye RY AT EX O. Digonm 值 。 即 自 id 向 右 O. Dégonm
~ FTF 71.481 .05,0.85,0.64,0.41.0.20,0.10, #1-0.05,

2) 48 NO 432 X 100ml, 0.5% 铁 氰 化 钾 溶 液 中 ,在 灯箱 上 摇动
5 分 钟 后 换 用 无 离子 水 短暂 洗 一 下 ;3) 把 NO 纸 放 入 100ml, A
0.2g 硝酸 银 和 .0.2g 硝酸 匀 揭 水 溶液 中 (其 中 还 含 0.5ml 37%
FRSA), 在 灯箱 上 播 20 分 钟 ; 委 委 弃 硝酸 银 溶 液 , 把 NO 纸
在 蒸 饮水 中 浸 两 次 ,每 次 40 秒 钟 ， 再 用 刚 蒸 人 馅 的 蒸 饮水 洗 3 分
S's 98 NO 纸 转 入 100ml 内 含 39% 碳酸 销 和 0.25m137% 甲醛
的 溶液 中 摇 士 夜 ， 相 用 燕 饮水 洗 O 纸 两 次 , 共 佑 分 钟 。 然 后
把 它 放 入 100ml A 1.4ml NH4OH.0.07g NaOH 和 :0.2g 磁
酸 银 的 溶液 中 反应 巧 分 钝 ， 接 着 用 蒸 饮水 短暂 洗 两 次 ; 6) 加 入

©1658

100m] pj ¢ 0.005 % # BAGH 0.019 匈 甲醛 的 溶液 ,此 时 和 蛋白质
将 二 镑 暗 的 黄 褐色 背景 上 显现 为 亮 银 包 带 。 把 NO 染色 纸 马上
放 在 水 中 贮存 。

Yuen 等 人 在 上 述 实验 中 指出 ， 4 EU MR SDS 的 蛋白 质
区 带 时 , 银 染料 则 使 蛋白 质 染 成 可 和 背景 区 别 的 亮 黄 褐 色 。 他
们 认为 ,8DS 的 存在 可 以 防止 银 在 蛋白 质证 沉积 ,因此 用 银 染 料

染 NO 纸 上 印 渍 8DS- 和 蛋白 质 的 区 带 最 为 有 效 尖 *。 又 指出 ,用

银 染 NO 印 渍 纸 比 染 凝 胶 更 有 利 ， 因 为 染 O 纸 时 不 需要 像 染
凝 胶 那样 ,用 大 量 水 多 次 地 洗涤 以 除去 过 量 的 SDS。 Hk, NO
纸 染 色 时 , 可 在 同一 溶液 中 同时 染 数 张 , 这 就 节省 了 硝酸 银 。 第
三 , 染 好 的 NO 纸 可 以 无 限期 地 贮 于 水 中 。 第 四 ,用 银 染 了 色 的

NO 纸 上 , 蛋白 质 区 带 还 保留 有 抗原 活性 ;因此 继 染 色 后 还 能 用 “
免疫 检 出 法 检 出 特异 性 区 带 。 最 后 ,灵敏 度 极 高 ， 可 染 ng 量 的 -

蛋白 质 。 但 是 , 许多 工作 表明 , 银 染 色 虽 具 高 的 灵敏 度 , 但 其 背
景 较 高 ,所 得 染色 谱 常 难以 被 接受 Fe。 一， 一

(3) 金 米色 (Gold staining) 1985 年 Bhat oe ns AFF
4) T FARE AS: (Colloidal gold) 3% NO 纸 上 蛋 白质 印 渍 区 带 的
新 方法 so1。 经 和 其 它 染色 方法 相 比较 ， 认为 金 染 色 的 灵敏 度 最
高 , 具有 优良 的 对 比 度 和 低 背 景 。 他 们 采用 Bio-Rad 公司 出 品
的 蛋白 质 高 分 子 量 标准 系列 作为 样品 ， BEF SDS-7.5%PAGE
分 离 后 , ENF NO AIF ARASH. 县 体操 作 如 平 : -2 1

胶 态 金 深 胶 的 制备 (全 部 用 重 蒸 饮水 ): 250ml 0.01% —

HAUO]s 溶液 , 放 入 一 架 经 仔细 清洗 过 的 . 配 有 通 流 冷凝 管 的 锥
形 烧 瓶 中 。 搅 拌 , 并 在 沸腾 下 连 流 。: 快 速 加 入 了 :5ml 经 0521m
微 孔 滤 膜 过 滤 的 1% 柠檬 酸 钠 溶液 。 再 过 流 30 分 钟 后 让 爹 深
Lee, 并 贮 于 无 菌 瓶 中 (43C)。 实验 证明 , Bee

SS1T66。w

和 答 要 了 销 加 量 有 关 ,上述 换 作 可 得 平均 直径 为 159m 的 会 济

SS eS ee

BH. HHH 200m 或 4 nm 直径 者 , 上述 柠檬 酸 钠 溶液 分 别 改
用 3.75 和 3ml 即 可 。

染色 步骤 ， PRT HK NO 纸 用 大 量 含 0.3% Tween 20 的
了 BS(pHY7.2) 溶 液 , 于 87°C 下 充分 洗涤 30 分 钟 ， 然后 再 在 室温
下 洗 3x 了 分钟, 以便 彻 底 洗 去 凝 胶 上 的 杂质 和 残留 的 SDS。NO
ASDA RIERA YE 3 分 钟 。 取 平均 直径 为 15~30nm 的 金
溶胶 95ml; 加 入 Bal, 2% Tween 20 水 溶液 , 充分 混合 后 加 入
20ml pH 的 50mM FRE. HLA NOM, 于 室温 下
保温 对 小 时 。 通 常 ,每 平方 厘米 印 渍 纸 约 用 此 溶液 0.2ml 左右
即 可 。 由 于 背景 仅 因 蛋 白质 样 杂质 存在 而 发 生 , 故 经 充分 洗涤 过
WH) NO 纸 , 即使 用 金 深 胶 长 时 间 染 色 也 不 会 产生 高 背景 。 因 此 ，
为 了 使 蛋白 质 区 带 和 人 金 洲 胶 完全 结合 ,尤其 是 为 了 定量 目的 ,上
述 反应 时 间 至 少 和 小 时 , 越 长 越 好 。 染 色 完成 后 ,蛋白 质 区 带 显
We, 空气 干燥 后 可 保存 之 。 需 要 注意 的 是 , 若 发 现 上 述 染色
液 在 染色 时 转 为 蓝 色 就 必须 更 换 ， 这 是 印 渍 纸 上 有 和 蛋白质 被 洗
下 与 之 反应 的 结果 。 |

Moeremans 等 人 在 此 实验 中 ; 对 各 种 染色 剂 的 染色 效果 作
THERE 4-10), 估 们 采用 公认 为 灵敏 度 最 高 的 银 染 料 ,对 作
Hy ED VERE ERE DYER (图 4-10F), 由 图 可 知 ，
考 马 斯 亮 蓝 、 氨基 黑 和 快 绿 的 染色 效果 相似 , 但 灵敏 度 都 较 差
每 种 蛋白 质 区 带 都 需 在 30ng 量 时 才能 显 色 。 印度 墨水 染色 比
较 灵 敏 ， 各 蛋白 质 区 带 量 在 Og 时 即 可 染 出 。 胶 态 金 染色 的
灵敏 度 最 高 ， 约 每 区 带 在 3ng 时 即 可 染 出 。 由 图 也 可 知 ;

Bio-Rad 公司 出 品 的 高 分 子 量 蛋白 质 标 准 系列 虽 标 明 由 肌 球

& A @00kDa)_ BFR 16H b(92.5kDa). 牛 血 清白 蛋白
《66:2kDa)、 旷 清 蛋白 (和 zkDa) 等 五 种 成 分 所 组 成 ， 但 用 高 灵
考 度 的 金 染 料 ( 包 括 印度 墨水 亦 然 ) 染 色 时 , 则 显现 出 众多 的 杂

e 167 。 ;

图 和 410 各 种 染色 剂 染 NC REO T ORR
标准 系列 所 显 染色 谱 比较 - ， te
- 考 马 斯 亮 蓝 R-250; B. 氨基 黑 10B; C. RAR; D. HS

TFT ct darn FB’. 银 染 凝 胶 ( 对 照 )。 if 10% EDDC, E aS
左 向 右 由 1000~3, Ong 递减 oh S) ety oS we” bs 3

Te A eS? ,

F pH. 2 RR th,
溶胶 颗粒 直径 的 影响 较 小 ; 最 佳 在 155 30n ee eae

* 168.

AAU, 金 溶胶 带 负 电 具 梳 水 性 ;因此 能 和 和 蛋白 质 上 阳性 基
团 和 琉 水 基 团 很 好 结合 co Sk ARE RT, 灵敏 度 高 值得
Me

Seika koa w FE kop AR

ZR sma ca MAR, 其 土 被 印 渍 分 子 可 用 探 针 特异
性 徐 嚼 ;这 在 印 汪 术 中 称 为 印 盖 (Overlay)5 通 常 ,在 和 探 针 反应
HUET AR PARRA A FE, DAES Hy RB DPR ET A EN TR
纸 的 非特 异性 结合 。 前 已 提 及 , 这 类 特异 性 检 出 主要 是 依据 生
物 分 也 间 特 有 的 亲 和 人 性 ， 因 此 不 同 实验 目的 所 用 探 针 ( 或 配 体 )

”分 子 截然 不 同 。- 就 当代 印 站 术 而 言 大 多 数 工 作 集中 在 核酸 和

蛋白 质 这 两 天 类 物质 。 有 关 宅 们 的 特异 性 检测 ,前 者 常用 分 子 杂
交 法 ,后 者 大 多 利用 免疫 反应 性 ( 见 表 入 5) 。 至 于 其 它 ， 例 如 脂
多 糖 、 酶 与 底 物 的 相互 作用 等 ， 虽 说 所 用 配 体 不 同 ,但 探测 步骤
大 同 小 异 ,也 无 非 基 保湿、 洗涤 等 手法 。 为 此 本 节 将 只 讨论 有 代
表 性 的 核酸 分 子 杂 交 法 和 和 蛋白质 免疫 印 盖 术 。

1) 印 渍 纸 土 核酸 分 子 杂 交 法

核酸 印 渍 未 中 除 常用 放射 性 标记 酶 切片 眉 ; 或 用 溴 乙 锭 染
色 显 现 荧光 全 谱 外 ， 常 采用 放射 性 标记 核酸 作 探 针 进行 特异 性
检 出 , 即 用 放射 性 标记 单 链 核酸 探 针 去 寻找 印 渍 纸 上 某 种 能 与
其 碱 基 序 列 全 部 或 部 分 配对 的 单 链 核酸 ， 从 而 使 之 以 放射 性 谱
显现 出 来 。 这 种 用 单 链 核酸 探 针 去 亲 和 结 合 另 一 单 链 核酸 的 方
法 俗称 分 子 杂交 ( 详 妮 原理 三 章 )。 RRP Pw wR at
有 :PP-oODNAS 或 2 标记 的 用 切口 移 位 技术 制备 的
DNA 2) 用 末端 标记 法 制备 的 PP-RNA、 连 靶 着 放射 性
zB tRNA, 用 ak PP HT AAA ICH RNA, UR

169 es

1 标记 的 RNAS? 等 。 鉴 于 DNA 或 了 NA 在 活体 处 进行 放
射 性 同位 素 标 记 的 方法 国内 已 有 译 著 出 版 办”， 这 里 不 再 重复
值得 指出 的 是 , 八 十 年 代 始 , 出 现 了 一 类 非 放 射 性 核酸 探 针 和 三
类 RNA Ff (Riboprobe)——SP6 +2.
*itie, 关于 后 者 , BRE BPA SS ，

只 往 大 们 在 核酸 分 子 杂 交 广 法 中 最 常 使用 的 是 用 切口 移
位 技术 制备 的 DNA 探 针 , AIRED RNA RRP RET KR:
期 以 来 找 不 到 一 个 理想 的 系统 ， 能 方便 地 用 号 制 答 二 定量 标记
hy RNA, AAR, KBB RNA 探 针 SP6) 系 统 载体 和 丰 应
的 RNA 聚合 酶 的 问世 , CHAAR, BR eT
MILA) RNA 片段 。 研究 表明 呈 当 噬菌体 SPOR MAU
1) RPA (Salmonella typhimurium) a, ABT PP aE a A Se
码 的 , 对 SPE6 Wit Aa oh A ER Se ER RNA Fe is
酶 是 单条 肽 链 , 分 子 量 96, 000, 385) We SM id SE 4 SE 5 BE
化 后 的 酶 ,在 体外 相当 稳定 ， 具 很 高 活力 * Eee ER, te
DNA 模板 , 以 Mg” 作 辅 助 因子 ”容易 被 华 面 清 自 和 蛋 自 及 亚 精
胺 激活 。 在 离 体 条 件 下 它 仍 能 保持 对 SP6 Ja oF BY ee BEA
TE, 因此 能 把 特异 性 载体 (PSPee 和 pSP6 坟 中 计 紧 播 在 SP6 启动
FP ui) CE KR HK, SPC 转录 产物 的 制备 过程 比 较 -
简单 ， 如 图 4-11 Bras, 538 PE AE BK pSPo 或
PSPos 的 多 联结 子 (polylinker) 中 载体 pPSPes 和 DSPes 的 差
FILET 其 多 联结 子 的 克隆 位 点 顺序 六 站 相 友 会 即 节 SP 大 为
Hind IT, Psi TScl 1, Ace 1, Hine Il Xbalj Bam Hy Awa I,
Smv I Sac 工 Heo RI; pSPes EAR, Bl HooRTy Sacl. Sma I,
Ava l, Bam HI, Xba l, Hine I. Ace I, Sac Il, Pst I,
Homa, JA Pitt YEAH) a RA Re RS ERA FE SPS
RNA 聚合 酶 催化 下 可 转录 出 均一 的 单 链 了 NA GRC ee

sa37o。

- SPERNARAM ESF Pgs

_ 3HMEDNA |
may -—-—— PSP64(65>)

‘ 揪 入 多 联结 子

RRB

x

{
SPERNAR SM : f
tNTPs sy

RNA 转 录 产 物
图 生 坟 -SP6. 系 统 转录 -RNA 产 物 生 产 示意 图

质粒 DNA 为 模板 ,至 少 可 转录 得 到 10/ 妈 了 上 的 RNA。1984
年 以 来 ， 已 有 不 少 应 用 这 种 了 NA 探 针 在 印 渍 纸 上 进 行 核酸 分
子 杂 交 的 报道 。 且 认为 ; 与 有 着 类 似 大 小 和 比 活 的 DNA 探 针 相
‘He, 这 种 RNA 探 针 的 灵敏 度 更 高 10 倍 。 用 此 , RNA 探 针 和 印
涡 纸 上 :RNA 进行 分 子 杂 交 时 , 经 4 小 时 上 曝光, 即 可 检测 出 Spe
3) RNA, #2, 0.5pg ASE mRNA, ,也 可 在 48~72
-小 时 曝光 后 检 出 。
有 关 印 渍 纸 土 进行 分 子 杂 交 的 操作 也 很 简单 : ED HE DNA
后 取 下 印 涡 纸 , 用 圆珠笔 在 印 渍 纸 上 标 上 凝 胶 药 位 置 和 大 小 ; 放
X SSC(0.15 MNaCl-0.015 M 柠檬 酸 钠 液 , W HCl 调 pH7.0)
中 漂洗 后 80"0 下 减 压 干燥 各 小 时 。: 抵 此 处 理 的 印 渍 纸 BE Ie:

， 存 数 月 仍 可 用 于 分 子 杂 交 ， 这 是 直接 用 凝 胶 来 杂交 所 不 能 比

| 拟 的 65 如同 蛋 自 质 印 渍 那样 ， 特 异性 检 出 核酸 时 ， 也 需 对 印 渍 :
， : 纸 预 先 镁 灭 。 FEDNA 印 渍 中 常用 Denhardt 试 剂 作为 狂 灭
F9, 这 是 一 种 大 分 子 混合 物 ， 系 用 3X8SSG 配 制 的 ， 由 商
_ li % Ficoll fy FE We (MW =400, 000). FE Z. Jat mi Ie HE

171 ‘o>

(Polyvinylpyrollidone; 简称 - PVPO; MW= 330. , 000) Fl + iit
清白 蛋白 (BSA) =H HRAM, BE SBE 0.02% (w/v)o #
灭 时 ， Mee Vere st carer oe Le 65°C 下 保温 几 小
时 。 把 事先 制备 好 的 炉 酸 探 针 洲 于 同 种 狂 灭 液 , 稚 后 加 六 8D&
使 其 终 浓度 达 0.2%。 探 针 菊 度 全 般 以 放射 性 计 ， 常 规 核 酸 分
子 杂交 中 , 一 般 采用 1x10scpmy/rmnl, 但 因 实 验 目的 和 采用 的 方
EAR [a], 可 在 2x104~1xX:d0sopm/ml FFA AAAI. RFA
Ze PTA, AAR AER SEH TE ME
Fk EN WARE GTS FALE LPT: 。，
CD ENUEREILA— Hae, ARIES Te
的 试管 中 , BERET ASH A REISE EN ORE HG ER BLED AT
(2) HLEDIRARA ARE, TAMER PE
呈 单 层 ( 印 涡 面 朝向 试管 中 心 ) IA TEER Ae ae
A, 把 试管 横 放 于 一 架 专用 滚 简 器 上 ， 此 时 厅 交 滚 刚好 能 以 条 :
TRMEVE— BEI} EW WEARS BAPTA AY EERO HE A
3h, APE KES ZI. SRS RR
8 BE EL PE EAR A RS 于 讨
(3) FEN WEAR BASE ZS 4S (SCA Uk A
薄型 塑料 盒 ， 加 入 浸没 印 污 纸 表面 量 的 杂交 液 后 ?用 烙铁 把 腿 品
SE, BOOK HES UO SO
(4) 把 印 渍 纸 用 杂交 溶液 浸 湿 ! Re eR Re
EMT SL, RO IE eee, 及 司 涡 古 习
在 装置 一 章 中 所 介绍 的 杂交 狭 AC 3-14) A ASC)
类 , CHARRETTE Be HHhRK, RARE
于 用 最 小 的 体积 去 覆盖 住 整 片 印 渍 纸 。 ER,
产生 高 背景 , 印 溃 纸 还 是 应 该 用 足够 量 的 反应 液 覆盖 住 ; 千 万 别 :
让 印 涡 纸 上 有 某 些 区 域 处 于 干燥 状态 ; ie

es 72。

-一

OY I OP Ts a

Peo BEB, 杂交 液 中 若 有 甲 酰胺 存在 , 将 能 得 低 背 景 。
但 此 溶剂 会 降低 杂交 反应 速率 又 会 使 印 渍 纸 上 的 DNA 部 分 赔
BATT RRA, 另外 半 杂 交 反 应 液 中 存在 空气 时 将 引起 高 背景
点 ,因此 反应 液 在 使 用 前 需 减 压 除 气 。 汗水 能 引起 探 针 的 吸附
AE FA, 所 以 印 渍 纸 别 用 赤裸 的 手指 去 操作 。
杂交 反应 的 时 间 取 决 于 所 用 欣 针 浓度 和 核酸 序列 的 复杂
-性 。 目 前 核酸 杂交 反应 大 多 在 iad ii ll-F 2~6 xSSO 缓冲
BOP RW 1~48 小 时 。
在 杂交 反应 之 后 ， NO 纸 用 大 量 稀 盐 溶液 在 高 温 下 洗 工 小
和 时 以 上 。: 厌 多数 实 验 室 则 采用 大 量 0.1~2 xSS 溶液 ,于 ,60~
710°C FRE LANES. 充分 洗涤 有 利于 减低 探 针 对 印 渍 纸 刺 非特
-有恒 性 结合 区 结合 所 形成 的 高 背景 ; 有 利于 减少 探 针对 非 同 源 核
: 酸 序列 的 结合 。 op “Bp ay xX BY
-进行 放射 自 显影 。
印 涡 纸 的 放射 自 显影 方 法 和 通 带 在 板 形 紫 胶 上 所 进行 的 广
VAT. 如 所 周知 ; 胶着 的 感光 和 乳剂 不 仅 对 光子 敏感 :而且
对 电离 畏 射 也 很 敏感 加 因 示 能 检 浊 印 渍 纸 或 凝 胶片 士 的 " 丽 、

MOS AP Al Le 核酸 匣子 杂交 实验 中 人 科 常 采用 MP 来

标记 探 针 ， 因 此 常用 间接 放射 自 显影 术 来 增强 P By PPT Ae
变 敏 感性 。 此 时 , 常 把 印 渍 纸 用 两 张 塑料 薄膜 夹 住 (如 有 果 湿 前 印
中 纸 更 需 如 此 jj K-mMm— Kk xX HAI A (a Kodak XAR
OX BA), BERS) FS aS BS SS ad A SER
34798 BF Cintensification screen; 4j;Dupont Cronex XG@ 型 增强
屏 ) 的 瞳 盒 。 把 此 夹层 两 侧 , 用 2mm JE A FAI AE, BLA — 70°C
冰箱 中 。 打 开 增 强 屏 瞳 盒 亡 附 1 W AT (ay) Kodak GBX 型 安
Sky) HEF ERIE 4~ 18>) RBA ARKEW ARS 在 于
SLA AA BARS, I BAY fe RS AP

*e17F-

纸 拉 触 良好 。 由 上 可 知 ,所 谓 间 接 放射 自 显影 , 只是 在 灯 源 和 胶
片 间 增 加 了 一 个 增强 屏 。 当 它 的 一 个 草 体 被 光源 电 施 神 击 | 时，
它 能 释放 出 许多 光子 ， 这 些 光 子 又 使 感光 乳剂 内 的 许 允 草 体 敏 -
感化 从 而 达到 增强 的 目的 。 BOR BCH Re OP By ee BE

增 大 10 倍 左右 ; 使 75 的 检 出 灵敏 度 约 提高 pipet

2

(1) GLUE; eR RACH a
时 , 层 间 要 避免 气泡 。 否 则 , Bt Bee
旁 皱 纹 那样 的 图 形 。 失 此 操作 时 ， 常 把 湿 的 印 渍 纸 平 铺 在 一 块 :
SHWE, 其 上 放 一 张 滤纸 , QGP,
按压 推 平 ,以 减少 层 间 气泡 产生 > 去 和 全 人 Md DT OOF

(2) 增强 屏 也 能 产生 磁 光 ， 在 组 装 夹层 时 布 能 使 宅 饥 汉

(3) 为 了 增强 微弱 区 带 的 敏感 度 放 可 以 化 腕 :此 预 六 站 :
(Preflash) 。 这 可 在 放射 自 显影 前 ,用 一 张 放 大 丰 纸 具 交 胶 并 来
实现 。 最 好 的 预 曝 光 能 和 赁 经 验 测定 ， 而 县 显影 胶 洲 的 站 密度 :
(OD) fA % 0.1 2) 0.2 之 间 5 测定 OD 值 时 , 5 AER BE
片 放 在 分 光 光 度 计 中 于 660 nm PK FE WEA Z eM Se

(g) :斯 得 放射 自 显影 谱 可 用 密度 计 进 行 全 谱 定 量 持 撒 只 或 :
者 , TG WG EHH Fs ik hE ae SO Py
Bis :ciaae oh Coe eee SUSE aa en

(5) XH RNS ENT A, AR 六 用
PAE Ac iil A 2072, 5-—= ze WM 0 ie ce
Alo Pia FU, ik AAR, a ee
水 的 印 读 纸 , LAT READ HICH BB To) i. Se 盒 剧 届

2. DRL AMT MR MRI ese ,

HERS Hi 法 是 近代 印 渍 术 中 特异 性 检 出 蛋白 质 分 予 最 常用 -

的 方法 。 在 免疫 检 出 中 又 以 间接 法 应 用 最 户 ( 详 见 第 三 章 ); 训

4

sa

此 常用 双 抗 体 。 所 用 探 针 ,或 用 茨 光 素 标记 :或 用 同位 素 或 酶 标
(i. Aa, 后 两 种 标记 应 用 最 广 , 且 已 有 成 套 试剂 市 售 。 免 疫 检
出 《 印 渍 术 中 称 为 免疫 印 盖 ) 具 有 高 灵敏 度 ， 常 能 检 出 细胞 或 体
HR 1pg~1ng 量 的 病毒 抗原 。: 印 盖 期 间 所 用 抗体 稀释 度 和 反
应 条 件 变化 很 大 ,取决 于 印 渍 纸 上 抗 原 量 和 所 用 抗体 性 质 。 对
高 亲 合 力 (Avidity)ass 抗 体 而 言 ， 可 以 采用 高 稀释 度 和 长 时 间
保温 ,以 便 节 约 昂贵 的 抗 血 清 ( 如 抗 激素 血清 价格 极 高 )。 相 反 ，
对 半 寿 期 仅 3 小 时 的 低 亲 合力 抗体 而 言 ， 最 好 使 用 高 抗体 浓度
和 短 时 间 的 反应 条 件 ， 因 为 较 长 的 反应 时 间 将 导致 抗体 溶解 。
Towbin 和 ;Gordon 曾 用 高 亲 合 性 的 单 克 隆 抗体 进行 实验 并 计
St, UA 10-°M (对 IgG 类 而 言 约 等 于 .0; 基 ug/ml) 的 抗
体 深度, 印 盖 工 小 时 左右 ,通常 就 能 有 效 地 检 出 as 他 们 认为，
在 间接 法 检 出 中 ， 结合 于 抗原 的 工 抗 , 常 在 免疫 固定 过 程 中 因
采用 也 工 抗 而 使 之 稳定 下 来 52。

-放射 免疫 印 盖 中 ,最 常 采用 OL 标记 的 葡萄 球菌 A 蛋白 作
为 探 针 ; ;此 时 ,不 可 用 全 血清 作为 印 渍 纸 的 狂 灭 剂 ， 以 防 血 清 .
RAMA 蛋白 结合 造成 假象 。 A 蛋白 的 结合 因 种 属 和 同型 物
( 即 由 间 一 种 属 产生 的 三 或 多 种 抗体 之 一 ) 的 现象 而 有 很 大 差
HM, 现在 认为 , 免 抗 体 和 :A 蛋白 结合 最 好 ca PP

Stee eo re) eon
HEDEBNE, WALT. SEbR LICHT BOE eRe Ue
WMT. I RE PO 的 免 抗 免疫 球 蛋 白 试剂 , 检
出 的 限度 约 在 .0,lng 到 :tmol( 飞 摩尔 ,10-35g) 免 疫 球 蛋 白 范围
内 。 但 用 它 检 出 印 渍 纸 上 抗 原 时 , 此 法 是 否 能 达到 这 种 灵敏 度 ，
SET BL SL He RR fe IBLE AT, SREY
WS Ta) AEA EOS

“近年 来 还 报道 过 许 允 新 的 免疫 aah eR in Howe 和

©175e

Hershey ft) @ Sin FF (Immunogold reagen 切 55 py 及 Brower
罕 人 的 链 霉 抗生素 -酸性 磷酸 酶 复合 物 ra 等 Pee Hee
件 的 可 变性 ， ee
有 关 各 种 抗原 所 用 免疫 检 出 方法 ; 可 查 表 4B
1) 325T-A 雪白 的 免疫 检 出 法 这 里 举 Loeb Sa HH
感 嗜 血 杆 菌 (Haemophilus influenzae) REA Re,
体操 作 如 下 : 经 分 离 的 外 膜 制 剂 用 SDS-PAGE 3} 23, SHED
UF NO He. PARSE AEF TSE SB Pl POP EE
质 , ALS FE A PE Pk Se SRO ES RE FS i, EAS YFP
和 印 渍 纸 上 的 外 膜 成 份 进行 免疫 印 盖 。 WT RMA MA,
一 张 印 渍 好 的 NO 纸 , BRIE 0.5em RRA, WEAR AE
种 抗 血清 印 盖 。 印 盖 前 , NO 条 用 10m1, A SSBSA,'0.0015M
PACHA 0.05% Tween 80 的 PBS Bury, SI FH (6Or/
min) 90 分 钟 , RR NO A RNR. RIE ARE
为 13100 Wy St MLS FH 90 Fh, Bed NO 4A, FA
40m1PBS 洗 2x15 4}4h, FEAR 0.05% Tween 80) PBS ye
2x15 4}$h, JL NO AA He A 10m! FY 030i 14d By
(New England Nuclear 产品 ， ‘Ee RORY HE Dy "70% 1000i/28)
的 上 述 同 种 狂 灭 缓冲 液 中 FE SF He 90 Uap Fe NO.
纸 如 抗体 反应 后 的 洗涤 步骤 那样 清洗 。 把,WO 琳 项 时 清 主 水 ，
夹 在 两 块 塑 料 薄膜 之 间 , 用 手 按压 除 寺 过 分 前 翻 癌 读 王 过 离 品
放 上 一 张 Kodak X-Omat AR 胶片 S¢ZE Wee ee
曝光 。 所 得 放射 自 显影 底 ‘i fa 1 LKB 2202: Uo Bea WE
度 计 扫描 定量。 工 术 着 也 出 订 避 读 到 内 忆
(2) PRERILR RK be Talia a Rae
术 免 疫 检 出 TD. cols Bow LT 和 TiS A RPE
TODEEM AE TL St. AMA Ye FR Ee ee PD EA2p

#1766
vt

ZHEAEEM HB. cole {REE 50s WM HPA LT Al L12 BA,
BAS Rseee Al (Freund complete adjuvant) F744, Vw
250ug BARBRTPENT USILPRRW BRK. Bat
$38, 79 .和 1t0: 天 再 次 注射 说 最 后 在 第 OT Kt Hp Bai, 所
得 抗 血清 ( 抗 < 工 7X 划 2: 和 三 清 ) 帮 为 下 抗 3 E.coli RAE UB
含 3M 腺 -189%PAGB 进行 分 高 站 FRA ONO 纸 C 电 压 梯度
6V/com; 二 本 时 旋 印 渍 纸 用 内 谷 引 MBSA fy 0.9% NaOl-10 mM
Tris-HO@l (pH7.4) RwpywyF 40°C 十 保温 二 入 时 ,2 以便 狂 灭 印
蓝 纸 上 剩余 结合 部 位 。 再 把 N9 纸 转 入 用 上 述 同 种 狂 灭 缓冲 液
W110 se Ahi LT/L12 血清 (每 毫升 滴 度 为 340pmiol) 溶液
FCI SR). SPREAD. 反应 结束 后 用 狂 KR Rip
RUS ky HK 30 分 钟 。 FANC KRHA BRARELAY AAD
= IgG(Nordie Laboratories, Tilbarg, Netherlands 产 品 ) 液
中 5 KARA LRA XA, MEH W150, HAS
10% hs, WT HRW SE PH 30 DSK BRR
RiP 5 MK, FE30 FH, 经 上 述 处 理 后 得 到 的 印 渍 纸 * 即 可
在 加 有 黄色 滤 光 虞 的 ;长 波长 紫外 灯 上 看 到 荧光 谱 ( 图 412B)。

(C) FARLAMBRARE BH Towbin “9 A
| ERR RIHKRERHH A, VAR a eRe
抗 -山羊 IgG( 求 自 上 述 同一 厂家 的 商品 ) 作 了 比较 实验 。 由 于
Towbin 等 人 的 工作 较 早 进行 (1979 年 )， 被 视 为 当代 印 渍 术 免 疫
检 出 的 经 典 方法 。 以 后 的 许多 工作 常 沿用 此 法 或 在 此 基础 上 稍
加 修改 22， 故 值得 重视 。Towbin 等 人 酶 联 免 疫 检 出 的 工 抗 反
应 步 又 和 上 述 荧光 法 相同 。 即 在 工 抗 反应 并 用 狂 灭 液 洗涤 巨 次
后 , 把 NO 纸 转 入 用 迎 灭 缓冲 液 稀释 为 1:2000 WRB A
联 免 抗 -山羊 IgG AF 10% 免 血 清 的 溶液 电 , 在 室温 下 保温 2
小 时 。 反 应 结束 , ARK MR Ok, H 30: 分 钟 。 把 NC 纸 浸入

e777

Al & 25 ug/ml SUER AT # He (O-dianisidine) A 0.01% H,0,
的 10mM, pH7.4Tris-HOl 缓冲 液 中 ， 室温 下 反 应 20~ 30 分
钟 后 ，NO 纸 用 水 洗 来 终止 反应 。 此 底 物 旺 名 混 谷 流 必 须 用 时
新 配 , 可 采用 1% SIR DTS FH HE AI 0.3% HO, fey me
波 来 配制 。 用 水 洗 过 的 NO AR Ry SCZ PGK SEI we BE fay ae > Se
to “PRRGH) NO 纸 , 其 背景 颜色 有 颇 大 下 降 , BR ERS.
i 4-12 R Towbin 等 人 用 酶 联 (A) 和 荧光 素 偶 联 (B) 名
疫 检 出 E. coli 核糖 体 L7 和 Li2 EA Aye ME, BL
PLAS 蛋白 仅 在 氨基 末端 处 有 些 差异 ， 三 者 韦 沪 迁移 率 极 钵
近 。 从 图 4 12 可 见 , NO 上 只 显 工 7 Al L12 Pe eee EF
的 椭圆 形 斑点 是 污染 物 )。 其 实 前 面 所 列 图 和 7 即 是 本 实验 的
对 照 详 , 可 以 看 出 核糖 体 总 蛋白 具有 众多 的 成 范 ; Bee ee we
检 出 后 其 它 区 带 就 不 能 显现 ， 这 充分 证 明 免疫 检 出 法 的 高 度 特 “
异性 。 由 图 4-9 也 可 看 出 ， 酶 联 免 疫 检 出 的 灵 续 度 高 手 菊 部
So WA, AE RPE, DEAREST RE 一 步 降低 所 用
1:2000 这 一 稀释 度 (荧光 素 偶 联 剂 所 用 稀释 度 为 到 50 包 此 外 ，
SAC EN BEA AAV BER J DB i Eo ee er J pa, 主
是 避免 放射 性 污染 ; 二 是 灵敏 度 颇 高 ; 三 是 直接 看 到 区 带 显 色 ;

人 ez -oo yw

7 . - Ses %
ek Cake cs ;
1 站

AA? BK CA) SSE SEB) Se HE, ool
核糖 体 7 和 L12 蛋白 的 比较 OL a

* 1786

加 是 利于 保存 。

有 关 过 氧 物 酶 联 免疫 检 出 的 显 色 剂 ， 在 印 溃 术 中 应 应 用 的 已
有 许多 ;如 邻 葵 -二 腕 (O-Phenylenediamine7 和 4-4 1-3 i}
(4-Chloro-1—naphthol)*°. jE 4% — #¥ (Orthophenylenedi—
amine)" 3, 3'- AAR (3, 3’-Diaminobenzidine)“™.
SBIR AS i HR (O-Dianisidine)“*, ARRKAROAALD
(3, 3’+Diaminobenzidine tetrahydrochloride) "48, A@2iw
氧 物 酶 联 抗体 也 有 许多 种 , BREATS HH. 全 如 已 用 于 印
涡 术 的 有 偶 联 着 态 蛋 帕 的 辣 根 过 氧 物 酶 抗体 "…、 偶 联 抗 生 物 素
蛋 蝗 人 4AVidin) 的 辣 根 过 氧 物 酶 抗体 5“%"、 过 氧 物 酶 - 抗 过 氧 物 酶
RAO SS. PREZ, 但 具体 操作 步骤 也 不 过 和 上 述 实例
KEAN

(4) MIR RB RK Rieke WAH Blake 等 人 引
AER THAR REE HE Se BE eT, HK JR Ze O’ Connor 和
Ashman 为 检测 组 织 切 片 土 微量 碱 性 磷酸 酶 而 创立 的 组 织 化 学
BRAM, 但 原 法 中 使 用 了 3- 羟 基 -2- 蔡 酸 -2, 4 二 甲 基 栈 替
漂 胺 磷酸 作为 底 物 。 由 于 它 在 水 溶液 中 不 稳定 ，Biaie 等 人 在
引 六 印 溃 术 时 ，. 改 用 了 6 省 -4 氧 加 羟 磅 酸 (5-Bromo-4-
Chloroindoxyl phosphate; 简称 BOP)”。 由 于 他 们 的 目的 在
于 检 出 淋 球 菌 (CWeisseria gonorrhoeae) sR Ah IA, 为
此 他 们 用 提纯 了 的 工 蛋白 作 免 疫 原 ,以 100uwg/ml 工 蛋白 的 浓度
和 弗 氏 完全 佐 剂 等 体积 混合 :然后 注射 入 白 免 的 肩 腥 下 。 三 星
期 后 ”用 相同 剂量 工 蛋白 液 和 弗 氏 不 完全 佐 剂 等 体积 混合 的 乳
剂 ,以 同样 方式 再 次 注射 。 此 后 ,动物 被 用 100ug 剂量 静脉 注
射 来 增加 免疫 力 。 所 得 抗 血 清 滴 度 约 2ug/ml,

> WR BESS SDS-PAGE 分 离 ;, 并 在 1A HF
— PF NO RCL). FA HAR A F 0.5% Tween 20 fy

°179¢

PBS 缓冲 液 中 狂 灭 30 分 钟 ， 换 用 新 的 狐 灭 液 再 保 S8G FF oh
把 NG 纸 转 入 用 同 种 狂 灭 液 ; 以 120;000 备 释 度 配 制药 工 绰 白
抗 航 清 深 液 中 ,室温 播 动 下 反应 3 小 时 FEE RES x
5 分钟: NO HEAR RR EH ER
溶液 中 , SYR PL QA, ERROR S KOA RO
换 用 二 乙 基 巴 比 妥 酸 -乙酸 缓冲 液 (0.15M; pH9:6) Hes SF Fa
洗 过 的 :NO 纸 转 入 底 物 溶液 些 时 ?用工 甲 基 甲 酰 腕 配制 的 HE
BREW tne) ‘mal ft shcilelnbigignieed ABI ARE HS BR

A413 ERIM I
AE RRR
BE HS HY CBE AL TE 3Z)

乙酸 盐 组 冲 液 配 制 的 二 mgAa 硝 基 :
1 Po we (NBT), WLR 2MMgOls 作为 -
FE, FX Ze REE hl AO es
4a in F AA 5}; 204] MgCle, 1ml 034% ~
NBT, 0.1 m1 WHER eH, 9ml — 乙
ALA RM- CME RM NO Ac
在 底 物 溶液 中 ， 37°C FEE
实验 结果 如 图 13 mR
a FMR Se he 4 SDS->
PAGE 分 离 后 ， 用 考 马 斯 亮 蓝 染色 的 -
RM; b 列 为 提纯 了 的 外 膜 工 蛋白-
如 a 列 同样 处 理 所 得 凝 胶 谱 ; 0 列 是
以 a 列 为 模板 印 涡 于 NOR, 然后 用
抗 I 蛋 白 的 免 血 清 代 抗 ) 和 碱 性 碍 酸 :
酶 联 抗 -抗体 (II 抗 ) 特 异性 免疫 检 上 出 :

谱 。 不 难看 出 。 列 至 少 有 四 条 区 带 ，Blake 等 人 认为 这 是 内 源 :
性 酶 使 I 蛋 白 部 分 降解 而 引起 的 。 他 们 又 指出 , RRA
碱 性 磷酸 酶 反应 时 , 底 物 被 裂解 为 磷酸 和 吗 产 基 , MRR HIS

«180+

¢

通过 互 变异 构 形成 一 种 酮 化 物 ， 并 在 碱 性 条 件 下 发 生 二 聚 作用
形成 三 种 脱 氨 靛蓝， 在 这 种 二 聚 作用 过 程 中 释放 出 的 了 t+: 使 硝
SEMA Me, 形成 了 一 种 强 蓝 色 的 二 甲 膳 。 他 们 认为
BMRA NBT 在 水 溶液 中 更 稳定 ， 因此 只 会 产生 极 少 的 非
PEI, BR AA LER, 区 带 也 不 扩散 ,， 这些 优点
有 利于 定量 检 出 。 HD, 本 法 染色 谱 不 禄 色 利 于 保存 , 灵敏度 较
高 , pg 量 抗原 即 能 检 出 。
3. 免疫 印 盖 术 的 新 方法
5 由 于 免疫 印 泪 未 应 用 最 为 广泛 ， 因 此 新 方法 层 出 不 益 。 例
如 使 用 免疫 釜 试 剂 的 免疫 印 盖 法 ceo; “用 链 堆 抗 生 物 素 蛋白 - 酸
EDIRNE Gy RI KO, 先 经 免疫 沉淀 来 浓缩 抗原 再 行
He BEEN WE A EEN SE, 以 提高 抗原 检 出 灵敏 度 的 增强 方法 Se8]
用 过 氧 物 酶 联 和 碱 性 磷酸 酶 联 II 抗 ; 在 同 张 印 渍 纸 上 先 后 检 出
两 种 抗 源 的 连续 免疫 锥 出 法 583 先 用 小 分 子 化 合 物 修饰 印 渍 纸
上 抗原 , 再 用 常规 双 抗体 免疫 检 出 法 检 出 特异 性 抗原 593; 等 。 此
外 于 目前 已 经 有 环 少 采用 单 克隆 抗体 作为 工 抗 的 免疫 检 出 报
SE 他 梢 都 夕 汶 使 用 单 克 隆 抗体 要 比 常规 双 抗 体检 出 法 更 灵
49 10 FES 限于 篇 幅 ; 末节 只 能 选用 一 些 比较 重要 的 方法 予以 具
KIB 在 王 有
GQ) 友 流 爹 这 剂 验 出 法 此 法 实质 上 是 把 全 PAE (il HE OL
i WS) BREF USE, Pl RF IgG te SH
SeGegsey”, KFBRFALZABRMS ABABA
997 Brada- Fil Roth 424 2 A BRR, Fe /
REPRE POWWEB RARE ER
Bei, RAT SA AHI] Sie OO) 具体 做 法 是 , 刷
RWI FAIZ SDS-PAGE 4} Be Sw NC aS FA
0.5% BSA fy PBS4S rp yk (pHT .4) 于 20°C FRR 2 -\ Hy,

181%

再 用 内 合 26ug 针对 蔗糖 酶 亚 单位 的 单 克 隆 抗 体 的 状 天 组 冲
液 , 于 20°C 下 保温 2 AMY AKER RE 30 RAS
的 工 抗 后 , 把 NO ARBAB ARE 14ug/ml, BRK
免 抗 小 鼠 IgG 抗体 ， 在 20°C 下 保温 2 小 时 5 BSAA
灭 液 洗 30 分 钟 除 去 。 取 金 溶 胶 -A ZARFAWBM, A PBS we
液 稀 释 到 ODssmm=0.44。 把 4 体积 这 种 溶液 和 二 体 积 胎 后 多
清 混 匀 , 放 入 上 述 洗 好 的 NO 纸 ， 于 20°C FAR La. a
用 PBS 溶 流 洗 2x5 分 钟 , HA 1% Triton X-100 Ay PBS wx
洗 10 分 钟 ， 再 在 PBS Pye 2x5 4}oh, RAPE Brada 和
Roth 指出 , 此 法 可 检 出 :50ng 的 酶 量 , Tha: ER PIA
蛋白 时 的 放射 性 处 理 ; (ii) et es Ga) Be a ey Gv) 各
区 带 强度 均一 ,不 会 造成 假象 ; (v) 虽 说 是 采用 金 深 有 it 契 价格 并 :
不 贵 , 容易 在 各 实验 室 中 实现 5 P+ a awe Eh
(2) 抗原 修饰 后 的 免疫 检 出 法 HEHE P MS IRE
不 困难 但 费时 颇 多 , 尤其 制备 单 克隆 抗体 时 不 仅 费 时 西 较 麻烦
因此 设想 先 用 5- 磷 酸 吡 哆 醛 人 GPLP) 和 和 氢 硼 化 钠 (SBj) 来 修饰 已
UTA ELERLMEAR, +e a 5B (PPxy)
蛋白 质 , 然后 具 需 制备 直接 针对 PPxy Se AT, BAL
任何 抗原 都 可 用 这 种 单 克隆 抗体 作为 工 抗 来 检 出 局 也 只 胡 这 样
才能 使 此 单 克 隆 抗 体 成 为 通用 商品 lo 下 titler 等 大 的 实验 证 .
明 此 设想 是 可 行 的， 具体 做 法 如 下 :7 鼠 肝 细胞 抽 提 液 经 8DS-
PAGE 分 离 ， 然 后 电 印 渍 于 NO 4k ZB ER, ART NC HE
或 ZB 膜 用 pH8.0 的 PBS 缓冲 液 洗 去 印 渍 液 寺 把 印 污 纸 革 六 .
新 配 并 充 氮气 的 内 含 0,.3MPLP 的 卫 BS 液 中 号 室温 下 揪 29 苍
钟 。 反 冰 后 的 印 渍 纸 用 了 BS weve BRA RO, SEDGE PS
含 300mg/mi 氢 硼 化 钠 的 PBS 溶液 中 ; SR 205) obs
NAUK ESTAR AK ee ei Rm PPxy-Kamee wo

* 1626

经 上 上 述 处 理 过 的 印 渍 纸 仍 可 以 用 氨基 黑 '10B 等 常规 染料 染 笃
显现 全 谱 ;[ 也 可 进行 免疫 检 出 。: 后 者 检 出 步骤 和 常规 法 并 无 两
样 ， 即 仍然 先 做 狂 灭 处 理 。 此 时 ,把 修饰 过 的 印 渍 纸 用 含 10%
BSA #,2.5% 人 血浆 的 PBSCPH7:3) 深 液 , 于 45°C THER 12
小 时 ; 再 用 PBS(p 了 7.3) 冲 洗 印 渍 纸 3x5 分 钟 。 此 后 即 可 用 单
克隆 抗 -PPxy 抗体 作为 工 抗 :商品 阁 根 过 氧 物 酶 联 羊 抗 -小 鼠
F(ab’): 作为 IEG, URN AERA A BOs 作为 酶 底 物
和 显 色 剂 , 按 前 述 常规 步骤 进行 免疫 检 出 。Kittler 等 人 的 实验
指出 ; 此 法 可 检 出 mg 量 的 蛋白 质 ， 而 且 能 使 目前 还 难 染 色 的
ZB RR

事实 上 ,用 了 LP 修饰 非 印 渍 纸 上 的 蛋白 质 早 有 报道 ,例如 ,
斧 曾 修饰 过 果糖 : 瑟 6 三 磷酸 酶 529、 ARRARE ee
AERO H colt. kee A LAL A 延伸 因子 GO 等
等 。 有 关 PLP 和 重 癌 质 的 结合 部 位 ， 已 知 是 PLP 和 和 蛋白质 中
PAM REN REM. A, MRS TRS PR
酸 较 少 或 缺失 时 , PLP EMA RRL, 或 不 能 修饰 。 Kittler:
等 人 的 实验 也 证 明 ， 用 此 法 荣 印 演 纸 上 低 分 子 量 多 肽 时 红色 效
果 较 差 。

(3) x II RERL RE bit 1986 年 Theisen 等 人 报道 -
了 用 偶 联 着 过 氧 物 酶 和 碱 性 莲 酸 酶 的 第 开 抗体 , 连续 检 出 免疫
印 渍 中 两 种 不 同 抗原 的 方法 94 他 们 的 具体 操作 如 下 : RA
单 核 白细胞 系 U9 志 的 二 苦 离 心 沉降 分 部 (内 含 包 池 素 和 氨基 已
SHITE), JA SDS-PAGE 4 AH ENT: NO AR, BIRR Bap
液 (内 含 3%BSA hy PBS Yi, pHT.4) de 3 IE BRIS HSH TF RK
一 夜 后 , NO 纸 和 工 抗 反 应 。 些 工 抗 是 用 免疫 亲 和 法 提纯 了 的 人
包涵 素 (Olathrin) 去 免疫 白 兔 而 获得 的 se 将 这 种 免 抗 人 包涵 素 ，
FPR Ze iG AE BSR PR BE Wy gug/ml, 放 入 印 渍 纸 ,于 87°C

©1834

下 保温 2.5 小 时 。 把 NOAA KARTS, HAE
钴 灭 液 稀释 工 万 倍 的 碱 性 裤 酸 酶 联 羊 抗 移 TG Hp, =F 20~22°C
保温 2.5 AANA ea FLW SES WR A PM
a ( 见 本 章 七 ,2. (4) )。 此 时 , EN BEAL — AeA} -F Hh 180, 000
的 蓝 色 区 带 (图 414)， 此 即 是 包涵 素 。 把 此 染色 了 的 NO 纸 用 ，
hy 4 0.5% Tween 20 的 PBS(pH7.4), 2a FRE DXB 44h,
Fy & 0.5% Tween 20 的 0.1M AMIR SXOASH, WS
0.5% ‘Tween 20 hy PBS Wx 5x5 4}eh, BH AW = 3%
BSA ft) PBS(@# 0.01% NaNs) 中 , SR FRE LR, KAR
可 进行 第 二 种 抗原 的 检 出 。 此 时 , ARF 1 Se SR EE
的 大 胎盘 'B- 氨 基 已 糖苷 酶 B (6-Hexosaminidase B) 4% 4%
而 制 得 。 把 此 工 抗 用 没有 NaN, fy PBS 该 稀释 到 娘 终 流 度 为

“2 ie Gt {
bug APARS Hwa
ill ROL Ae —

, nissdalD) 26 0
“6414 II Shel ina ak FFL
(U Fil) rh Ne me Ae .

* 184%

2ue/ml Re. RERUN RA NO, JAMA NaN, Ky PBS
YE XG 4 Sh, WA TSA RF 87°C FR 2.57, NO
纸 经 同 种 无 NaN, 的 PBS 液 洗 许 后 , BAM PBS WHR STH
Rit RE Gi IgG 溶液 中 ， 于 20~22°C 下 反应 2.5 小
”时 。 此 后 所 用 -3, 3- 二 氮 基 联 苯 胶 和 百 :0。 的 显 色 法 如 前 述 常
规 方法 。 此 时 即 可 看 到 NO 纸 上 另 三 条 显 褐色 的 区 带 ， 这 是 所
OB BAY BE PAA 4-14 Zz UD), ae T

图 4-14 2 Theisen 等 人 的 实验 结果 之 一 上 部 的 数字 示

所 用 抗原 的 ng 数 , U 代表 U937 Ai. PLL, BRU WIS, HS
均 是 经 提纯 了 的 包涵 素 ( 左 侧 ) 或 胎盘 6- 氨 基 已 糖 彰 酶 的 免疫 -
印 渍 对 照 谱 。 图 下 的 十 、 一 导 玫 示 记 用 五 开 抗 的 情况 ,十 号 为
使 用 过 ;一 号 则 没有 使 用 ”图 右 列 数字 是 用 蛋 自 质 标准 品 所 定
分 子 量 数据 。 正 如 Theisen 所 言 "9, 人 的 B- 氨 基 已 糖苷 酶 由 三
Ft AD, BP A, BAS 所 组 成 ;其 亚 单位 组 合 为 w8.BB 和 aa,
来 自 胎盘 的 B- 链 主要 显现 为 分 子 量 约 为 29;000 的 一 群 区 带 ,而

在 U937 细胞 中 则 显现 为 分 子 量 分 别 为 多 ,000, 50, O0OFI5S1, 000

三 条 相关 的 区 带 ， 用 同位 素 法 已 证 明 它 们 是 B- 链 的 中 间 加 工
yo, Theiseh 等 人 得 出 结论 说 ， 先 后 用 碱 性 磷酸 酶 联 和 过 氧
物 酶 联 开 抗 , 可 以 毫 不 含糊 地 顺 次 检 出 两 种 抗原 ， 这 是 因为 两

种 开 抗 检 出 的 产物 颜色 不 同 ， ,前 者 显 蓝 色 ， 后 者 为 神色 , ER

易 辩 别 c9。

综 上 所 述 ,免疫 检 出 方法 虽 多 但 其 操作 步 又 无 非 均 是 保温 -

洗涤 之 类 ,只 要 掌握 并 选择 好 所 用 试剂 和 反应 条 件 ,就 不 难 获得
食 好 结果 s- 值 得 提出 的 是 ,近年 来 已 有 一 批 蛋白 质 分 子 量 款 准
系列 商品 市 售 。 其 中 适 于 免疫 原 分 子 量 测定 的 已 有 许多 报道 , 例
如 预 染 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 ”53; 联接 有 蜡 硫 握 酸 盐 荧 光 化 物
的 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 9883; 用 常规 莉 尽 质 分 子 量 标准 系列 免

e-185

庶 白 兔 制 成 的 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 免疫 笋 血清 呈 偶 联 生物 ，

素 的 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 ”2 等 。 这 种 情况 充分 表明 3; EDK

分 子 印 涡 术 已 经 处 在 整体 配套 、 窟 来 越 完 兰 多 内 用 Si In) 28 3

tie SPER 下 Be Eta
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~- 1906

.第 五 章 “有关 印 污 的 其 它 技术

"yk AaF EO Boh Be AL Sh, 除 所 用 装置 日 趋 完善 和
配套 成 龙 外 ,在 方法 学 和 印 渍 类 型 诸 方 面 都 有 很 大 发 展 。 例 如 ，
在 方法 学 方面 ;- 发 展 出 点 印 渍 术 (Dot blotting)™; 印 渍 纸 上
EDD FH RA ip RO, “ 抹 去 (Erased)> 印 i AR LER, 使 同
张 印 渍 纸 能 用 多 种 探 针 连续 探测 的 “ 抹 除 术 ( Erasing)”, 把 探
针 先 结合 于 整 张 印 渍 纸 ， 再 印 渍 检 出 凝 胶 上 探 针 识别 的 生物 分
子 的 强化 主动 转移 (Facilitated active transfer)? 等 。 目前 ，
印 渍 术 也 开始 进入 制备 目的 ， 提 出 ST MERA EERE A RY
FEMBE. FED Hh, 已 经 伏 核 酸 和 蛋白 质 两 大 类
坟 展 到 细胞 和 其 它 生物 分 子 ( 包 括 小 分 子 量 的 生物 分 子 ) 例如
Aaa Be ww (LPS blotting). 细胞 印 %t (Cell blotting) 7.
配 体 印 涡 CLigand blotting)", 产物 选 择 性 印 渍 (Produci-
selective blotting)", BR, 限于 篇 幅 ,本章 不 可 能 全 面 而 详
细 地 介绍 这 些 极为 有 前 途 的 方法 。 然而 作者 希望 地 过 本 音 所 选
狗 容 ,能 使 读者 了 解 到 印 渍 术 的 发 展 趋势 。

Re 来

点 印 渍 术 有 许多 同义词 ( 详 兄 第 一 章 )， 但 不 难 从 各 种 名 称
Pixs Dot 或 Spot 一 词 , 以 及 出 示 的 小 圆 点 或 小 方块 图 谱 《如 图
T2o 图 83418 和 图 3-19) 辨 认 出 它 属 常规 印 渍 术 还 是 点 印 渍 。 例
如 文献 (10) 廊 指 “一 种 快速 鉴定 NG 纸 上 蛋 白质 的 简便 方法 ”>

es 191。

实 为 点 印 溃 术 ; 而 文献 [11]， 题 目 虽 为 “ 圆 点 滤 膜 杂 交 法 ” 其 内
既 有 常规 印 羔 术 图 谱 也 有 点 印 渍 图 谱 ， 实 是 两 种 方法 的 比较 实
验 。 当 然 ,点 的 几何 形状 可 以 是 圆 点 ,也 可 以 是 小 方块 点 【图 3-
18 和 3-1 印 ;因此 Dot 2k Spot 二 词 译 为 “点 "将 更 灵活 些 。
Towbin 和 Gordon 指出 ， 印 涡 术 中 如 果 电 泳 分 辩 率 不 是 :
必须 的 , 那 未 就 可 把 样品 直接 以 任何 所 希望 的 郊 何 形 痪 ;起 于 国
定 化 纸 进行 固 相 检测 , 以 此 达到 多 样品 同时 检 出 :高 身 克 壶 条 操
作 简 化 的 目的 OP, EAT, A EDUCA ATE BLED AR HO BEE
IEF MERA UMM, A, PRSOUE, RE
KARR UR AYES, (LP eR SED, MZ
BENE He OW NEL TOWER EH EU ARB SF THD BON BE
RNA EL) RHEE BMT
1 点 印 渍 的 操作 要 点 hit ARR AGES
点 印 渍 术 是 把 一 系列 样品 直接 点 于 固定 化 纸 ; 通常 是 用 0 二
BY 1 wl 体积 的 微量 输液 器 ; 把 样品 重复 点 在 印 渍 纸 上 。 Towbin
|v 441 04 (de et — BT DE Ah BEE (pe) a BY oh 3B (Hamilton
Microlab M 型 ) 点 样 , 能 反复 输送 0-1 el RARE I
了 点 样 速度 和 增加 了 点 样 数 目 sa。 RE, BARRE
一 项 费时 又 麻烦 的 操作 , 点 间距 离 也 难 控 制 (Towbi 等 人 则 在
AL LM ERE), Bo Rep MR Alrio BAF 1986
年 设计 的 一 种 点 印 渍 装置 (图 8-17)", 他 们 以 条 式 点 样 ， 同 时
能 检 出 600 余 点 而 值得 重视 .从 理 论 上 讲 , 所 有 印 渍 用 纸 都 能 用
FAW, 但 目前 大 多 应 用 NO 纸 co>lal。 而 且 认 为 ， 把 样品
让 接点 于 干 的 NO 纸 ,斑点 不 易 扩散 ， 相 邻 班 点 不 会 因 互 相 街 接
mrt. jg (00 Tit
AMAR STR ea Me |
He BL DWAR DB PEPE HE ENE ETE RET RAN DHE

«1926

BRA BMRB. RU, SER
MSR REET OOS 胎 牛 血清 的 狂 灭 效率 差 ; 且 较 昂贵 ，
.不宜 使 用 吧 。 当 用 免疫 检 出 法 测定 核酸 时 , 因 全 血清 中 存在 核
BB, 常 改 用 抗 -DNA 抗体 的 血清 as Towbin SAMAK
RD AMBRE RAP, RA 1mg/nil BSA #1 0.1%
Nonidet. P-40 混合 物 作为 猴 灭 剂 呈 二 点 印 渍 的 狂 灭 步骤 和 党
- 规 印 渍 术 相同 , 只 需 将 点 样 后 的 印 渍 纸 ; 溉 入 镁 灭 缓 六 液 中 保温
:一 段 时 间 即 可 。i 其 后 检 出 步骤 中 ; PER BILE, AE BE
景 达 最 小 值 。 =

FEUER VRE Fr ERB OOS) MAS AER
Ri. MEBKWATFRE™, 抗原 类 的 免疫 亲 和 检 出 等 。- 后
者 也 包括 过 氧 物 酶 标 981.433TI-A 蛋白 标记 3 等 等 ; 具体 操作 也
;如 常规 印 渍 术 。 此 外 ,也 常 采用 单 克 隆 抗体 作为 工 抗 9。
点 印 渍 昌 是 一 种 有 效 的 定性 方法 ;但 它 也 用 作 定 量 检 出 。 此
寺 , 或 用 反射 式 密 度 计 定量 扫描 斑点 的 酶 联 染色 物 99, 或 通过 放
射 自 显影 检 出 一 工 标记 探 针 -5 了 awkes 兽 指出 ,NO 纸 王 结合
免疫 球 蛋 白 的 量 和 光 密 度 之 闻 ; 当 使 用 已 知 量 点 印 渍 的 免疫 球
蛋 自 作 标 准 曲 线 时 ; 有 如 下 定量 关系 式 2o.;;

Y = Alog («+ B)
HY Boe 度 值 ; © 是 结合 免疫 球 蛋 自 的 量 AR BEL
常数 。 后 来 ,此 式 被 修改 为 :
AYE A/a2+ B/a? +0

sy CAKES MED, HE ATM 8 100 pg/ml BA He
Towbin. 小 组 还 为 这 种 用 反射 式 密度 计 的 定量 测定 编写 了 原始
数据 处 理 的 计算 机 程序 ae。

2. 点 印 渍 操作 实例 ，

; X BY Sternberg 和 Jeppesen 用 AERC RIAZE FE jg se

e 1936

fon ip eR eC AE OE ET IO, 来 说 明
点 印 溃 操 作 全 过 程 。 如 所 周知 ， 单 克 隆 抗体 生产 中 最 关键 的 因
素 之 一， 是 从 众多 的 培养 上 清 液 中 筛选 身 相 关 抗 体 。 有 过 要 这 类 :
筛选 是 在 微量 滴定 塑料 板 上 进行 ， 此 法 的 成 功率 取 次 于 摔 原 结
合 于 塑料 才 面 的 能 力 aa SERIA RVR, SORA
微粒 抗原 都 容易 和 NO 纸 结合 。 而 县 ， 用 SDS 增 深 的 抗原 也 可
与 之 直接 结合 。 Sternberg 和 Jeppesen 3 We fy FL Pk HR fe tar
下 as, Mra FED RR Don K2 4) Bf SR Be Pa A ee,
浮 于 样品 缓冲 液 (L%8SDS, 50mM DTT, 6.25mM Tris HCl,
pH6.8), H-#RMEASRRAR, DORIA ARE
式 ,点 样 于 直径 为 92 mm 的 圆 形 NOE, HF NO 纸 事 党 已
划 成 5mzms 的 方 格 网 , ARE, PE A RE SE SL
ff A PEMABUA 0.5 yl, XY OAL Ope BARE, 响
样 毕 ;， NO ARIA & 5% BSA fy TN YR (0.9 % Nal, omM
Tris- 责 01，pHT7. 公 中， 在 室温 下 保湿 BOS} IER, | HE
NO 纸 放 在 同样 大 小 的 一 张 普通 滤纸 上 , 此 滤纸 事先 用 同 种 儿
MALL, 然后 一 起 放 在 一 只 90 mm RSA MI I 9
的 盖 中 。 单 克隆 抗体 4G8 和 206 Se UREN Ee a de PB
NS1-Ag4-1， 和 用 8SD8S WHA RAKED EA (Chromosome:
core protein) 4 hy. 7)\f BALB/O 株 的 牌 细胞 亏 融 合 物 ， 所 :
Ll, RUTTER ECP, SOR ey Ee, DL
11 等 分 的 量 点 在 上 述 已 狂 灭 过 的 NO FEE ( 即 也 点 在 网 格 的
交叉 点 处 )。 此 步 实 为 常规 印 渍 术 的 印 盖 (OVSRS7) 轩 培养 物 上 上
UWE T Hi. FL FEMI, FAD AIR, “BAF 804
钟 后 取出 NO 纸 ， 用 100ml TN ys THRE, i X 100 m1
TN 液 中 浸 10 分 钟 。 再 转 入 内 含 0.05% NP AO Wy 100 ml TN
ae (210 分 钟 , 最 后 又 转 入 100ml TN WRF YE 10 4} eb.” pee

«1946

主要 除去 工 抗 ，NP 40 则 是 为 了 减低 背景 。 把 洗 好 的 NO 纸
BAW & 5x 10° cpm/ml I-trid F(ab). Mbt) KM IgG 和
5% BSA 的 20ml TN 液 中 , 于 室温 摇动 下 反应 45 分 钟 , RG HE
工 抗 反应 后 的 洗涤 步骤 洗涤 。 洗 涤 结 束 , 把 NO 纸 在 真空 下 干燥
并 进行 放射 自 显影 。 由 此 流程 可 知 , 点 印 渍 术 除 直接 点 样 于 NO
纸 外 , 其 它 操作 都 和 常规 印 渍 术 相 类 同 。

图 5-1 4 Sternberg 和 Jeppesen 的 实验 结果 之 一 。 此 时 ，
他 科 把 一 系列 的 抗原 按 纵 列 点 在 NO 纸 上 。 其 中 ，a 列 为 对 照 ，
系 采 用 低 分 子 量 蛋白 质 标准 系列 b Ale 列 为 染色 体 ; e AHH
色 体 核 忆 蛋 和 白 ， d4 和 hh 列 为 细胞 核 ; e 列 是 用 2M NaCl 和
DNaseI 处 理 过 的 细胞 核 ; 了 列 为 微 管 蛋白 (Tubulin) 和 肌 动 蛋
白 。a~ 列 的 抗原 样品 学 中 加 有 8SDS,g 和 卫 列 未 加 。 两 种 单
克 降 抗体 印 盖 行 如 图 箭头 所 示 。 此 结果 表明 ， 点 印 渍 术 对 抗体 -
特异 性 的 初步 分 析 是 非常 有 用 的 。 图 5 指出 , 单 克隆 抗体 4G8-
能 和 8DS 变性 了 的 染色 体 和 细胞 核 结合 , 却 不 能 和 未 变性 的 这
两 种 抗原 制剂 结合 ; 单 克 隆 抗 体 206 则 全 能 结合 。

Aol 单 克 隆 抗体 4G8 和 206 对 不 同 抗原 反应 性 的 点 印
渍 分 析 ( 说 明 见 正文 )

2195 7

3. 点 印 渍 应 用 概述
点 印 涡 术 虽说 历史 不 足 十 冬 ， 但 其 应 月 已 经 非常 广泛 。 由
” 于 点 印 渍 是 把 样品 直接 点 于 固定 化 纸 ( 样 品 未 经 电泳 共 离 )， 因
此 大 多 应 用 于 欲 筛 选 和 比较 大 量 实验 样品 的 研究 目的 中 5

(在 分 子 生物 学 领域 的 应 用 “大 多 应 用 于 核酸 分 子 交
RV WARE MELE oO, ply, Amasino AT RAR ACM
(PEG) 是 否 会 比 常规 所 用 的 核酸 分 子 杂 交 的 加 速 剂 一 一 葡 聚 糖
硫酸 酯 (Dex8O4) 更 有 效 , 就 采用 点 印 涡 术 来 做 比较 实验 ”= 他
先 把 A6Ti 质粒 放 入 100mM NaOH 中 煮沸 5 AH, MMA
链 。 加 入 1/2 体积 1M Tris-HOl 缓冲 液 (PH7.0), 再 用 水 稀
释 到 DNA 浓度 为 20pg/Al。 然 后 ， 按 每 点 吾 册 直接 点 于 于 的
2Z83 膜 上 , 共 12 列 , 每 列 3 点 。 ARB, 80°C FHF 2 in t=
DNA 牢固 结合 于 2B 膜 。 杂 交 时 ， 把 2Z2B 膜 按 列 裁 开 HA
三 组 ,每 组 4 列 ， 分 放 于 ， 一 组 ， 不 加 ; OA, mA 10%PEG
(Mrz=6~7.5x10); 三 组 ， 加 10% DexSO, (Mr=5 xl105) 的
杂交 反应 液 (pH7.2，0.25 M NaHsPO 0.25 MNaCl, 7%
SDS, 1mM EDTA, 1x 10° cpm/ml1 [**P]GTP-% RNA) #,
于 42°C ish FHETRAE RM, SAAR 4.8, 12 M247
处 取出 一 条 ,用 2x SSC 液 在 室温 下 洗涤 5 分 钟 使 反应 终止 。 转 ”
入 0.25MNaH.PO,-2% SDS-1mM EDTA 溶 液 中 于 65°C
洗 两 次 ,每 次 20 分 钟 。 取 出 ZB 膜 , 用 普通 滤纸 按压 使 于 ， 封 入
”塑料 袋 后 进行 放射 自 显影 。 结 果 如 图 2 所 示 , 不 加 加 速 剂 者 ，
IRE 24 小 时 后 才能 勉强 检 出 。 Dex8SO, 能 加 速 杂 交 速 率 ， 4 小
时 后 即 可 检 出 ， 随 着 杂交 时 间 的 延长 ， 信 号 逐渐 加 强 。 然 而
PEG 效果 最 佳 ,8~~12 小 时 即 能 杂交 完全 ， 比 DexSO, 提高 2~
10 倍 。

由 上 实验 可 知 点 印 涡 术 在 选择 最 佳 实验 条 件 中 ; 是 十 分 有

[sa496。 /

= 杂交 反应 时 间 (h)
aii atte, re Yas 24 }

不 如
10% Des, ®@ @ © @ )

see @ 和 @ 大
5-2 加 速 剂 DexSO, #1 PEG 对 核酸 分 子 杂 交 速 率 的 影响

用 又 简便 易 行 的 技术 。 Taylor 在 研究 双 链 DNA FEAR Al it
于 2QB 膜 的 研究 中 , 也 是 采用 点 印 涡 作 为 先行 步骤 ,以便 在 大 量
条 件 试验 中 选 出 最 佳 方案 拓 。 此 外 , 点 印 涡 术 也 可 作为 基因 调
控 的 研究 工具 。 例 如 甲 胎 蛋 白 和 白 蛋 白 已 被 用 于 肝癌 发 病 机 理
和 治疗 ， 以 及 真 核 细 胞 基因 表达 的 研究 指标 2e， 于 是 有 人 用
点 印 渍 术 和 定量 测定 大 鼠 甲 胎 蛋 白 和 白 蛋 白 基 因 转 录 产 物 一 一
mRNAs 和 mRNAan， 借 此 研究 基因 调控 ， 寻 找 肝 瘤 发 病 机
53: ee

2) 在 医学 中 应 用 “点 印 渍 术 在 医学 中 的 应 用 报道 最
多 一 。 对 临床 诊断 而 言 , 点 印 涡 术 具有 很 大 吸引 力 。 因 为 , EF
许 在 一 张 固定 化 纸 上 实 现 几 十 个 ,乃至 几 百 个 后 分析 , 若 采 用 免
疫 印 盖 又 将 能 以 高 灵敏 度 检 出 抗体 。 现 已 证 明 ， 点 印 涡 能 容易
地 完成 免疫 球 蛋 白 类 型 的 特异 性 分 析 ， 这 是 临床 诊断 最 为 需要
Kj. Hawkes 等 人 就 曾 为 此 目的 ,利用 现 有 市 售 配套 抗原 ,用 点
印 渍 术 进 行 了 这 类 血清 学 筛选 试验 ”“。 现 在 ,国外 己 有 一 套 标
准 补体 (Complemen 切 系列 ,可 用 于 点 印 渍 术 诊 断 呼 吸 道 感染 疾
is, 包括 腺 病毒 .衣原体 、 流 感 、 流 行 性 腮腺 炎 、 支 原 体 、.Q 热 等
02), Walsh 等 人 更 用 此 系列 检验 Ig 卫 和 两 种 过 敏 原 一 一 侍

e 197。

wh 有 蜜 峰 毒液 22。 他 们 指出 ,该 系统 是 对 IgE Seen, FEM
清 检验 中 有 着 足够 的 灵敏 度 、 可 以 重 现 ， 变化 系数 只 在 3~6%
之 间
Gordon 和 Rosenthal 曾 为 结缔 组 织 疾病 建立 了 一 套 自身
免疫 图 谱 , 用 来 测定 抗 -DNA 抗体 .风湿 病因 子 ; 以 及 测定 HeLa
细胞 亚 细 胞 分 部 的 抗体 ca。 他 们 指出 ; 此 法 可 和 常规 测定 风湿
病因 子 和 抗 细胞 核 因子 (Anti-nuclear factor) 检验 法 相关 联 ;
并 用 于 临床 诊断 。 目 前 此 法 已 用 国际 参 比 血清 使 之 标准 化 。
Pappas 等 人 应 用 点 印 渍 诊断 内 脏 利 什 曼 病 2。 枉 们 指出 ，
KGAA eR RED A Ss ae 本 于 全 于 二 汪
球 蝎 病 和 球 孢 子 菌 病 的 诊断 。
(3) 在 生物 化 学 等 领域 的 应 用 “va Hi Borg 创造 了 用
点 渍 术 测定 胸 苷 激酶 (简称 TK; 02.7121) Wg aE
法 29。 他 不 但 用 点 印 渍 详细 研究 了 测 些 酶 活性 的 基 佳 谎 案 ) 也
-用 点 印 渍 比较 了 各 种 类 型 造血 细胞 的 共 K 活 福 5 We a
是 ,TK 的 等 电 点 在 pH5.6~5.8 处 , 高 于 此 值 带 负 电 s 时 把

它 点 在 带 阳 电 的 离子 交换 纤维 素 纸 DES 上 ; 再 用 放射 性 确

的 底 物 , 如 22°F Ae a EF (dC) aR 2° 1B RF dU) |e RR
i, AE AMMO GAR eT eee SF DESI At,
如 果 没 有 酶 活性 , 这 类 底 物 因 无 这 种 强 负 电 性 , 将 被 友 应 后 的 洗
涤 步 骤 除 去 。 通 过 放射 自 显影 ， 凡 显 放射 性 的 班 点 即 才 明基 酶
活性 。 放 射 性 强度 和 酶 的 比 活力 呈 线 性 关系 MR
A. FA B-3 是 van der Berg 用 各 种 物种 的 细胞 质 提 液 所 测
TK MRAM NCU. Hb, a 行 用 IaU fey; b FF Td
作 底 物 。 FA, MC-6 和 KY893 分 别 是 被 单纯 性 瘤 疮 病毒
‘(Herpes Simplex Virus; 简称 HSV) 转化 的 病 成 纤维 细胞 汲
MARA, —~ HIYA TK. WEHI-3, OEM-4, MOLT-4UR&
s 198. ’

MSE © yeas oc) RTA hs RBM yy, 3 LEM Re - MOLT- . SSE oe 5
dase Ta” HHSY Tk’) | te

53 Aaya TK RAW SRM
— Be es CAA LEZ)
_HSB-2 均 为 淋巴 样 细胞 系 * 其 中 ; HSB-2 是 TK she, He
5-8 可 知 ,各 细胞 株 含 不 同 水 平 的 TK 活性 ,缺失 TK 的 变 株 不
-能 在 图 谱 中 看 到 任何 斑点 痕迹 ; 而 KY 893- 和 小 鼠 骨 艇 的 细胞
抽 提 液 中 含有 最 高 PK 活性 。 最 有 意义 的 是 ，MO-6 株 分 别 用
了 IUD 和 Iag 作为 底 物 (比较 图 5-8 第 一 列 ) 时 ，TK 活性 相差 很
ke 早 有 报道 ，IdU 是 TK 同 工 酶 的 特异 性 底 物 。 由 此 可 以 扒
论 , 本 法 尚 能 用 于 同 工 酶 之 检 出 。
Gershoni 等 人 在 进行 细胞 印 渍 的 实验 中 用 点 印 渍 法 作 了
试探 性 实验 ; 最 后 又 用 点 印 渍 作 了 验证 实验 so。 他 们 设想 ,病毒
苔 染 正常 生活 细胞 必 先 对 细胞 进行 选择 性 结合 ; 也 就 是 说 正常
细胞 凸 有 病毒 的 受 体 蛋白 ， 且 很 可 能 是 具 糖 链 的 糖 蛋白 。 为 了
论证 这 一 设想 ,他们 把 红细胞 膜 影 泡 ) 按 0.7 ng 的 蛋白 质量 点
于 NO 纸 , BRK WR, 或 用 42 开标 记 付 流感 病毒 ; 或 用 12T
标记 的 从 副 流感 病毒 外 壳 提 纯 的 糖 蛋 白 作为 探 针 进行 印 盖 ; 结
果 如 图 54。 图 中 a 列 为 红细胞 膜 样品 ; b 列 为 红细胞 样品 点 于
NG 纸 后 用 120 ug 未 标记 的 活 的 付 流 感 病毒 于 4° 下 保温 工 小
sf; 0 Fd b 列 ,但 再 用 120 ng 二 硫 苏 粳 醇 (DTT) 处 理 使 活 病
HAE; AWM a 列 ， 但 点 样 后 用 1U/ml fy me Be BE CE DHL
5.5 乙酸 缓冲 液 中 ) 浸泡 NO 纸 工 小 时 (37*C), 然 后 用 PBS HERS

* 199 =

5-4 用 点 印 渍 术 探测 付 流感 病毒 及 其 外 壳 糖 蛋 自 对 各
种 处 理 红细胞 膜 之 结合 (说 明 见 正文 )

次 。 上 述 各 列 处 理 完 成 后 ， 再 按 行 用 六 TI 标记 探 针 印 盖 。 其，
HSV 行 系 用 碘 标 记 副 流感 病毒 (SV) 印 盖 ; HN AF FAA
用 碘 标 记 的 , 从 付 流感 病毒 外 壳 提 纯 的 血细胞 凝集 素 / 唾 液 酸 酶 ”
糖 蛋 白 (Hemagglutinin/Neuraminidqase glyoo=protein; 简称
HN), 以 及 融合 因子 一 一 卫 糖 蛋白 (FF) 印 盖 。 由 图 54 可 知 ， 副 ，
流感 病毒 是 能 和 红细胞 膜 结合 的 (SV/a 点 ); 这 种 绪 合 是 通过
病毒 外 壳 的 HN 粮 蛋 白 (HN/a 点 )， 而 不 是 卫 糖 蛋 自 (EXa A)
来 实现 的 。 图 5-4 也 证 明 ， 红 细胞 膜 中 和 副 流 感 病毒 相 结合 的 ，
分 于 ,是 末端 具 唾 液 酸 残 基 的 糖 蛋白 类 。 因为 ;用 唾液 酸 酶 处 理
过 的 红细胞 膜 , 就 不 能 结合 病毒 了 CL SV/d il HN/d 点 )。 KH
实验 再 表明 , 点 印 渍 术 也 可 用 于 竞争 性 实验 。 图 5 中 ，SV/b 本
氮 系 在 红细胞 膜 点 样 后 用 未 标记 活 的 副 流 感 病毒 与 之 结合 二 然
BAA ML ice, 由 于 结合 位 点 已 被 前 者 右 用 ，
后 者 就 不 能 再 与 之 结合 , 故 不 能 显现 放射 性 斑点 。 然 而 ,如果 用
DTD 这 类 还 床 剂 使 前 者 失 活 , 则 碘 标 记 病 毒 又 能 和 红细胞 膜 结
合 了 (看 SV/e 和 HN/e 点 )。 这 一 实验 启示 ， 点 印 污 术 是 初探
生物 分 子 间 、 细 胞 与 生物 分 子 间 相 互 作用 分 子 机 理 的 良好 而 负

ea200。

快速 的 方法 。
.点 印 渍 术 也 已 步 入 定量 阶段 。 Domin 等 人 在 研究 免 肝 微粒
体 悬 液 中 细胞 色素 P-450 (Cyt P-450) 同 工 酶 的 工作 中 ,用 点 印
Bie MA Cyt P-450 II 型 9。 图 5 5 是 他 们 用 不 同 浓度 、
经 提纯 的 细胞 色素 P-450 II 型 所 得 的 标准 曲线 。 此 时 ,他 们 招 .
提纯 的 OytP-450 II 按 图 所 列 8 种 浓度 点 于 NO 纸 ， 然 后 用 过
“ 氧 物 酶 联 免疫 方法 使 之 显 色 , 最 后 用 弱 激 光 扫 描 仪 扫描 。 所 得
娃 果 用 矩形 坐标 计算 ， 证 明峰 高 和 Cyt P-450 II 8 ye BF RUE
A |
e@eee @ 8 ee

二 ghia

一 一 一 一 一
0.01 0.02 0.03 0.04 .0.05 0.06 0 0,10
本 Cyt P—450'l 4 (pmol)

HER (cm) 8

0,02 0,04 0.06 0.08 0,10
Cyt P—450 Il 4!(pmol)

BS 经 提纯 的 CytP-450II 型 的 点 印 渍 定量 分 析
A. 不 同 浓度 (其 量 和 也 谱 相 对 应 ) 的 CytP—450 II 型 点 印 渍 酶 联 免 疫 检
出 谱 ; B, A 的 弱 激 光 扫描 谱 ;Q 为 Cyt P-450 II 浓度 和 峰
高 作 图 所 得 标准 曲线 。
201 e.

比 。 图 中 标准 曲线 起 始点 未 通过 零点 是 由 斑点 背景 式 图 5-5 中
A 行 之 7) 所 引起 。 由 此 可 见 ， 点 印 渍 定量 分 析 是 可 行 的 就 ，
Oyt P-4r1II 型 而 言 ， 最 小 检 出 值 为 0.0fpmol 有 是 相当 灵敏
当然 , 弱 激光 扫描 仪 极为 昂贵 , 设计 出 更 方便 、 价 廉 ; 适用 于

透明 固定 化 纸 扫描 定量 的 装置 ， J ACETATE SER
Hieioraiete

— mht pz

迄今 , 有 关 这 方面 的 报道 仅 数 篇, (EL BNR BB —
发 展 方向 ,值得 重视 。 所 谓 细 胞 印 盖 (Cell ovezlay)， 是 指 常规
印 渍 术 中 使 用 完整 细胞 .病毒 等 作为 探 针 , 借 此 研究 细胞 和 生物
分 子 间 的 相互 作用 。 现 已 知道 ,许多 重要 的 生物 学 现象 , 如 象 负
胞 的 形态 发 生 、 伤 口 愈合 .肿瘤 转移 ,病毒 感染 等 等 都 与 细胞 和
外 界 物质 、 细 胞 和 细胞 之 间 的 相互 粘着 有 关 。 这 种 粘着 有 选择
性 ,是 由 双方 的 生物 分 子 所 决定 的 。

Hayman 等 人 指出 ,人 血清 中 含有 许 允 能 和 细胞 绪 谷 揭 蛋
白质 , 其 中 经 很 好 鉴定 过 的 是 纤 连 蛋白 (Fibromectin)jrm。 为 了
了 解 人 血浆 或 血清 中 还 存在 哪些 这 类 可 以 结 谷 细 胸 的 蛋 百 质 ，
他 们 用 细胞 印 盖 术 进行 了 探测 。 具 体 做 法 是 ; ASE
Jil SDS-7 % PAGE 进行 蛋白 质 电 瀛 分离 。 为 了 使 面 浆 中 所 含
较 少 蛋白 质 能 充分 显现 ， 在 电泳 前 他 们 用 Affi-gel Blue #1 A
蛋白 -Sepharose 柱 ， 亲 和 层 析 除 去 大 部 分 血浆 中 所 舍 最 大量 的 :
蛋白 质 成 份 一 清 蛋白 和 IgG, 电泳 后 把 凝 胶 三 分 为 二 ”二 份
用 考 马 斯 亮 蓝 R-250 染色 显现 全 谱 ， 另 一 份 作为 印 渍 模 冰 电 纯
Vit NO 纸 。 印 渍 后 把 NO 纸 浸 入 500ml, 内 个 5img/mlIBSA
的 PBS Web HK 16 小 时 。 经 PBS 液 洗涤 后 ， 碟 NO ARIA ML

4 202 ，

ve

mee, IO Fee ONS
A56 上 鼠 肾 细胞 印 盖 人 血浆 蛋白 质 印 渍 谱 的 显现

a, SOMMER Dee; b, REMY NG 纸 上 人 血浆 蛋白 的 鼠 肾

细胞 印 盖 谱 ;e~e, 从 b 谱 上 所 示 相 应 位 置 小 方块 处 取样 ,用 光学 显微镜 (X

66 倍 ) 观 察 所 得 显 微 照 片 。

“ 痛 单 细胞 悬 液 (107 细胞 /50 ml)， 于 87°C 下 保温 工 小 时 。 反 应
毕 , 取 出 印 渍 纸 用 PBS 洗涤 ,然后 放 入 3% 多 聚 甲醛 (Parafor-
maldehyde) 中 国定 ， 再 用 含 0.1% 氨基 黑 10B fy 45.7% 甲醇 -
10% TK R45 % 无 离子 水 溶液 染色 1~2 分 钟 , 在 909% 甲醇 -

2% 乙酸 溶液 中 脱色 到 区 带 清晰 。 此 时 细胞 结合 的 区 带 在 苍

蓝 色 的 背景 上 显 瞳 蓝 色 。 图 5-6 系 上 述 主要 步骤 所 得 结果 。 其
Ht, 图 ce Ak M EL NO 纸 上 取 样 ,用 显微镜 观察 和 摄影 的 显 微

”照片 。 可见 , 显 区 带 的 e 和 处 有 大 量 细胞 粘 结 ， 而 无 区 带 的 d

- 处 只 有 几 个 未 洗 净 的 细胞 残留 着 。 经 用 蛋白 质 分 子 量 标准 系列

"203。

检 杏 ( 见 图 5-6 左 侧 所 列 千 道 尔 顿 值 )， 和 细胞 结合 的 这 两 条 区 -
带 , 分子量 分 别 为 220,000 和 70, 000 左右 。 经 验证 ， 前 者 即 纤 -
连 蛋 白 ,后 者 是 血清 的 扩散 因子 (Spreading factor),

显然 , Hayman 等 人 的 上 述 实验 具有 重大 意义 ,他 们 开创 了 - -
用 印 涡 术 方便 地 从 分 子 水 平 上 得 到 细胞 间 相 互 作 用 的 先例 。 回
顾 过 去 的 常规 方法 ， 为 了 鉴定 细菌 细胞 或 病毒 感染 正常 细胞 的
分 子 基 础 , 必须 设法 先 从 正常 细胞 中 逐个 除去 膜 成 分 , 然后 用 病 -

毒 或 细菌 和 此 放空 了 某 成 份 的 细胞 相 结 合 。 当 发 现 此 病毒 不 能 - ，

再 结 合 时 , 则 初步 证 明 此 物质 是 该 病毒 受 体 .在 此 基础 上 ,再 把 提
外 了 的 这 种 物质 插入 到 上 述 放空 了 此 成 分 的 细 克 二 再 和 病毒
反应 。 如 果 病 毒 又 能 结合 , 则 证 明 此 物质 确 系 该 病毒 受 体 cxs2。 ，
由 上 可 知 ,过 去 的 实验 方法 难度 极 大 。 尤 其 是 ， eee Tt 者
入 膜 的 糖 蛋 往 时 , 由 于 提纯 困难 而 难以 实施 。 因 而 , 就 病毒 受 体
而 言 ， 迄 今 为 止 已 确证 的 仅 数 种 。 如 磷 酯 酰 丝氨酸 已 证 明 是 交
BYE RIB; (Vesicular stomatitis virus) seh; 尼克 酰 -- :
乙酰 胆 碱 受 体 也 可 能 是 狂犬 病毒 (Rahies virus) Hye Ao" 等 。

为 了 说 明 印 渍 术 用 于 鉴定 病毒 受 体 的 优越 性 ,这 星 再 举 -
Gershoni 等 人 最 近 用 印 渍 术 中 的 细胞 印 盖 法 , 鉴别 由 人 红细胞
膜 的 血型 糖 蛋白 是 副 流感 病毒 受 体 这 一 例子 co 在 前 面 虚 印 渍
一 节 中 已 经 提 及 , RATE AS ED RT SRE, FEDER
再 用 常规 印 渍 术 作 了 论证 。 具 体 做 法 是 ,他 们 先 把 人 红细胞 影 泡 -
用 8SD8-10% PAGE 分 离 , 电 印 渍 于 NO 纸 , 然后 用 环 玉 标记 或
藻 根 过 氧 物 酶 联 副 流感 病毒 进行 印 盖 , 结果 只 显 出 二 条 区 带 , 和
全 谱 对 照 此 区 带 是 含 唾液 酸 的 血型 糖 蛋白 及 。 据 此 ， 全 们 提纯
了 血型 糖 蛋白 A, 并 重复 上 述 电泳 - 印 渍 - 印 盖 诸 步骤 5 aR,
所 显 区 带 位 置 和 全 膜 制 剂 的 实验 结果 完全 一 致 。 为 了 亲 慎 起 、
见 , 他 们 在 印 溃 后 又 用 吐 波 酸 酶 处 理 印 汗 纸 。 当 降解 除去 唾液 酸 :

* 204.6

15-7 副 流感 病毒 和 人 红细胞 膜 成 分 的 结合
左 列 为 蛋白 质 分 子 量 标准 系列 ,数字 以 干道 尔 顿 计 。asb, 分 别 为 红细胞 膜
及 提纯 的 血型 糖 蛋 白 A 凝 胶 的 考 马 斯 蓝 染 色谱 ;c\d, Bl a 和 SRA
FAS RAN eZ HB; ef, Bcd 印 涡 纸 经 唾液 酸 酶 处 理 后 再 用
” 病毒 印 盖 之 检 出 谱 。

葛 糖 蛋白 区 带 并 再 和 病毒 印 盖 时 , 就 不 能 检 出 了 GEILE 5-7),
由 此 完全 肯定 ， 人 红细胞 膜 上 具有 唾 液 酸 末 端 糖 链 的 血型 糖 蛋
白人 A 是 副 流感 病毒 的 受 体 。 唾液 酸 是 否 是 该 病毒 识别 所 必须
的 ? 因为 已 知人 红细胞 膜 上 具有 呈 液 酸 未 端 糖 链 的 ,不 只 是 血型
糖 蛋 白 A。 由 此 设想 两 种 可 能 : 一 是 其 它 唾液 酸 糖 蛋白 在 膜 中
含量 极 少 不 能 检 出 ; 二 是 由 于 病毒 识别 的 结构 除 唾 液 酸 外 尚 有
其 它 部 分 。

Gershoni 等 人 根据 上 述 实验 结果 指出 ， 生物 颗粒 材料 ， 如
具 外 壳 的 动物 病毒 或 重组 病毒 外 过 ， 都 可 以 充当 蛋白 质 印 渍 术
中 印 盖 的 探 针 。 这 种 病毒 印 盖 法 ， 为 筛选 各 种 细胞 和 组 织 申 潜
在 的 病毒 受 体 提 供 了 一 种 简便 有 效 的 方法 。 也 为 检验 不 同 群 落

«205 ¢

病毒 间 的 结合 作用 ， 以 及 它们 和 各 种 细胞 膜 多 肽 进行 竞争 性 续 ”
合 的 研究 ,提供 了 一 种 全 新 的 方式 -6

三 、 印 渍 纸 上 原 位 修饰 术

被 印 渍 在 固定 化 纸 上 的 生物 大 分 子 ， 可 通过 种 种 酶 处 理 使
之 磷酸 化 .去 糖 链 等 。 这 即 是 印 渍 术 中 又 二 发 展 方向 , Gershoni —
和 Palade 称 为 印 渍 纸 上 原 位 修饰 法 65 BR, RRR
将 在 生物 分 子 相互 作用 中 用 来 研究 修饰 物 对 此 作用 的 功用 。

上 节 所 举 Gershoni 等 人 的 病毒 印 盖 点 印 渍 实验 中 , 他 们 采 :
用 唾液 酸 酶 来 处 理 印 渍 了 人 红细胞 膜 蛋白 质 的 印 渍 纸 ， 使 印 渍 ”
纸 上 含 唾液 酸 的 血型 糖 蛋白 A 失去 唾液 酸 而 不 能 和 副 流感 病
毒 相 结合 cm。 这 种 实验 可 作为 印 渍 纸 上 原 位 修饰 的 实例 之 二 。
从 中 也 不 难 领 会 到 这 种 原 位 修饰 的 重要 意义 JE
Dion 和 Poment 用 蛋白 酶 处 理 印 涡 纸 二 的 糖 蛋白 , 导 -
致 糖 肽 的 迅速 释放 ”"。 他 们 的 做 法 是 ， 先 把 鼠 乳 房 肿瘤 病毒
(Murine mammary tumor virus; {ij # MuMTV) f #8 & 4
1.5mg 深 于 0.5ml PBS, jm AG BLA YB) 2 mM, 40°C FAME
30 分 钟 。 40,000r/min FRAUD HOMME, FART a
(*H) NaBH, (10mOi/ml) fy 0.5 ml PBS +, 4 27E 3a FSi.

化 30 分 钟 。 FILE, IMA pRIA NaBH, 3) 1mg/20p1 He HE,
继续 在 宝 温 下 保温 15 分 钟 ,以 使 反应 完全 。 再 如 王 述 离 站 条件
HUME W, I HF O.1ml PBS fh, ge BD SAR.
MuMT'V 糖 蛋白 制剂 。 在 4M 脲 存在 下 对 它 进 行 箔 形 8DS-9 钨
PAGE 分离。 电泳 后 把 凝 胶 一 分 为 二 ， 一 份 直接 进行 放射 自 显
影 显现 全 谱 ( 图 5~8A), 另 一 份 用 扩散 作用 双方 向 印 涡 于 两 张
NO 纸 上 。 具体 做 法 是 ， 把 凝 胶 浸 入 内 含 50mMNaCU 2mM.

# 2O6 ，

Am

EDTA, 0.1mMDTT 和 4M RW 10mMTirs—-HOl(pH 7.05
Sur, 室温 下 反应 3 At, LIBRE BE AY SDS, He
RESIEF AIK NC 纸 间 ， 并 按 常规 法 装配 好 夹层 ( 兄 第 四 章 ), 浸入
2 工 上 述 同 种 缓冲 液 中 印 渍 40~ 48 小 时 , 其 间 换 新 鲜 缓 冲 液 工
次 。 按 照 儿 胶 放射 自 显影 谱 ( 即 图 5 -8A) 各 区 带 位 置 ,分别 前
下 NO 纸 上 相 当 于 分 子 量 为 三 ,000 和 34,000 的 糖 蛋白 (gp
55 和 gp3g 区 带 ， 分 别 放 入 试管 。 各 加 入 0.5ml 内 含 0.4 多
fe & & Aw, 10mMCaCl, A 0.2mM NaN; fy 0.1 MTris~
HCl(pH8.0) Bp, F 50°C 下 进行 酶 解 反 应 。 反 应 期 间 ， 每
隔 和 小 时 各 取 一 等 分 酶 解 液 ， 用 液 闪 仪 测定 这 种 下 NO 纸 上
gp 55 或 gp34 因 被 蛋白 酶 解 而 释放 于 溶液 的 3H- 标 记 糖 肽 放射
性 。 为 了 保持 酶 量 , 反应 进行 到 蕊 和 2 小 时 处 ， 各 补 加 50 pl
内 含 链 才 蛋白 蓝 的 同 种 酶 解 反应 液 工 次 。 图 5-SB 即 是 所 测 结
果 。 其 中 , (e) 为 gp55 的 酶 解 进 程 ;(-) 为 gp 34 的 酶 解 过 程 ;

” 挫 gp55 释 放 的 放射 性 百分数 (26) ) ，

is ' da ro ol- .
<0 5° 1 15 20. 25 30.
时 间 (hy B

A5-8 MuMIY HEARD BPN Bei (A), UR 4
gD55 和 gp34 区 带 经 印 渍 后 酶 解 而 释放 PA ic AW AS
进程 图 4B)《 说 明 见 正文 ):

°207-¢

箭头 示 加 酶 处 。 可 见 酶 解 4 小 时 后 , 无论 是 gp55 还 是 gp 84,

都 已 释放 了 大 于 90% HK. RE FAINT RR, Fewest
性 释放 入 溶液 。 此 实验 充分 证 明 ， 糖 蛋白 被 牢固 地 固定 于 NO
可 用 蛋白 酶 对 NO 纸 进行 有 效 的 原 位 修饰 5 就 本 实验 条
件 而 言 ,4 小 时 即 可 完成 反应 。Dion 和 Pomenti 认为 这 种 印
溃 纸 上 原 位 酶 解 方法 可 用 于 糖 蛋白 所 含 糖 链 的 糖 残 基 涪 列 分
析 , 此 时 只 需 用 各 种 外 切 或 内 切 糖 苷 酶 消化 印 渍 物 , 然后 分 析 所
释放 的 糖 残 基 即 可 ce)。
有 关 印 渍 纸 上 被 印 渍 的 磷酸 化 蛋白 质 ， 通 过 碱 性 磷酸 酶 原 .
位 处 理 使 之 去 磷酸 的 工作 也 已 开始 95 可 以 相信 , 印 渍 物 的 原 位
修饰 必 是 印 涡 术 发 展 的 主要 方向 之 一 。 因 为 ， 印 渍 使 得 生物 分
子 固定 化 ,使 生物 分 子 具 有 相当 好 的 稳定 性 ， 经 得 起 种 种 处 理 ;
也 经 得 起 原 位 修饰 。 事 实 上 ， 在 印 溃 纸 上 进行 Ope, HE
FFE HGRA MOMS, MAM MA EAA

子 的 原 位 修饰 。 由 此 也 可 设想 ， 印 渍 纸 的 原 位 修饰 必 能 顺利 发 ，

展 , 并 不 存在 难以 逾越 的 技术 障碍 。

四 、 生 物 小 分 子 印 渍 术

虽说 生物 大 分 子 印 渍 术 是 当代 印 渍 术 的 主流 ， 但 除 核酸 与
和 蛋 日 质 两 大 类 物质 外 ， 其 它 生 物 小 分 子 的 印 渍 也 时 有 报道 。 它
们 的 印 溃 方 式 有 时 偏离 常规 方法 , 种 类 也 还 局 限 在 很 小 范围 ,但
却 给 我 们 许多 启迪 。 据 此 暇 想 出 它们 很 可 能 是 印 涡 术 今后 发 展
的 又 一 方向 ， 并 可 能 在 工业 (如 味精 制造 业 ) 中 得 到 应 用 而 值得
重视 。

需要 说 明 的 是 有些 报道 冠 以 me Hk ED AR (Ligand
blotting)” 的 名 称 se?, 配 体 一 词 习惯 上 常 把 它 视 为 枚 的 底 物 、 区

«206 «

_—s

=

a
‘
4
a

争 抑制 剂 等 之 类 的 小 分 子 化 合 物 C。 其 实在 生物 化 学 中 , 配 体
系 指 生物 分 子 亲 和 偶 中 一 方 而 言 , 当 甲 方 被 固定 于 柱 (如 琼脂 粮
«FE RAC NC 纸 ), 则 乙方 被 称 为 配 体 ; 反之 ， 乙 方 被 固定 时 ，
甲 方 也 转 称 为 配 体 。 配 体 既 可 是 小 分 子 , 也 可 以 是 大 分 子 , 必须
视 报 道内 容 来 了 解 。 例如 Cardin 等 人 所 述 配 体 印 渍 术 ， 实 际
上 是 用 125I- 肝 素 ( 粘 多 糖 ,， 属 大 分 子 ) 作为 探 针 ， 检 出 印 渍 纸 上
人 血浆 乳 麻 粒 的 低 密 度 脂 蛋 白 忆 1。 按 类 ( 见 第 一 章 ), EME
白质 印 渍 术 。 甚 目的 ,在 于 探讨 大 链 浆 中 可 和 肝素 (这 里 由 它 为
配 体 ) 结 合 的 蛋白 质 , 故 不 属 生物 小 分 子 印 渍 术 的 范畴 。

1985 年 ，Thompson 等 人 提出 了 一 种 他 们 称 为 “产物 选择
性 印 渍 术 (Product-selective blotting) 2 的 小 分 子 印 涡 术 喇 。 他
们 把 谷 酰胺 溶液 浸透 的 滤纸 ;覆盖 在 经 电泳 分 离 .内 合 谷 酰胺 酶
的 琼脂 凝 胶 上 。 凝 胶 下 ， 放 一 块 含 有 离子 交换 树脂 的 凝 胶 作 为
印 渍 胶 , 利用 其 下 干 的 普通 滤纸 的 吸水 作用 ,把 最 上 层 滤纸 中 的
谷 酰胺 吸入 含 谷 酰胺 酶 的 凝 胶 中 ,使 之 发 生 酶 促 反 应 。 所 产生 的
产物 一 一 谷 氨 酸 和 未 反应 完 的 底 物 一 谷 酰胺 ， 仍 因 最 下 层 干
滤纸 的 吸引 而 被 迁 入 印 渍 胶 中 (人 参见 图 3-4) 。 由 于 印 渍 胶 中 含
有 离子 交换 树脂 ， 其 条 件 又 控制 在 只 和 谷 氨 酸 发 生 交换 的 最 适
条 件 下 进行 。 因 此 这 种 印 涡 的 结果 ,使 得 只 有 和 谷 氨 酸 被 固定 ,其
它 物 质 ， 包 括 谷 酰胺 、 谷 酰胺 酶 及 样品 中 其 它 成 分 , 或 穿 透 印 渍
胶 而 流失 ， 或 在 印 渍 后 的 洗涤 步骤 中 被 除去 。 最 后 所 得 谷 氨 酸
印 渍 胶 用 酚 酌 试剂 染色 10~30 分 钟 (有 关 谷 氨 酸 酚 本 染色 可 参
看 文献 [40] ) , 然后 在 长 波 紫 外 光 下 拍摄 荧光 谱 , 再 用 密度 计 于
465 nm 波长 下 扫描 定量 .Thompson 等 人 曾 对 提纯 的 谷 酰 胶 酶
用 一 系列 浓度 进行 平行 实验 ， 又 在 同 块 凝 胶 上 直接 点 上 一 系列
浓度 的 谷 氨 酸 , 经 染色 和 定量 扫描 , 绘制 出 标准 曲线 。 图 5 9 Bp
是 实验 结果 。 图 中 ,上 排 班 点 是 直接 点 样 的 谷 氨 酸 标准 品 , 自 左

e209 。

.100 100 ” 50 ohh. 30 2) 18
oF AR aha t EY ftemUd : - te
; 4. N28, 125. oe AO. 18 ili ae, ion ic

fap aah 5 LIA nmal) S bed: ct ee

pane ae

5-9 poner FS AIRED GRIURIESO.
向 右 浓 上 度 分 别 为 :200.100 和 50 nmol。 下 排 是 谷 酰胺 酶 反应 后
所 得 谷 氨 酸 印 法 谱 。 图 下 数字 注 明 了 上 样 的 酶 单位 《〈 相 邻 两

斑点 为 一 组 ) 和 记 测 谷 氮 酸 量 。 可 见 二 者 呈 线 性 关系 :、。 了 此外;
Thompson 等 人 也 曾 用 此 法 和 常规 放射 性 测定 法 作 正 比较 寺 结
果 如 表 O-1 Pras, 可 见 二 者 结果 相似 7 说 明 此 法 可 和 常规 放射 性
WWE. Thompson 等 人 认为 ,这 种 印 渍 法 共有 及 泛 用 途 ，
不 限于 检 出 谷 酰 胶 酶 和 谷 氮 酸 合成 诲 的 活性 和 检 出 谷 氮 酸 量 。
印 污 所 用 固定 化 材料 也 不 限于 离子 交换 树脂 ，， 例 如 连 有 各 种 配
体 的 珀 脂 糖 凝 胶 之 类 ， 也 能 起 到 选择 性 吸附 的 作用 as 此 外 他们
还 认为 检 出 小 分 子 丰 选 择 性 可 通过 改变 印 渍 条 件 来 获得 s 如 改
BE pH, 离子 强度 和 竞争 性 底 物 等 "5

脂 多 糖 (LES) 构 成 了 革 兰 氏 阴 性 菌 体 细胞 的 9) 抗原 ， 它

大 多 由 20 个 左右 的 糖 残 基 连 于 一 分 子 类 脂 所 组 成 中 也 可 算是
EVN FRAGT. Bradbury 等 人 在 研究 革 兰 氏 阴 性 菌 的

*210¢

R51 谷 氨 酸 印 渍 法 与 常规 放射 性 测定 法 比较

上 样 的 谷 酰胺 酶 活力 单位 到 应 时 间 检 出 的 谷 氨 酸 (nmol)
(mU) (min) Ene 常规 法
80 TO 856 813
40. . 10 316 . 444
40 20 705 未 测
rt ee 10° - 471 444
=) 40° 5 105 未 测

LPS 抗原 特性 中 来 用 了 印 渍 术 , 并 称 之 为 LPS ARO, 由 于
这 是 除 核酸 和 和 蛋白质 外 的 又 一 种 重要 的 生物 分 子 的 印 渍 报道 ，
这 里 将 较 详 细 地 介绍 如 下 ;
Bradbury 等 人 实验 所 用 材料 为 大 肠 杆菌 (CE. cols 0:111:
-了 B4)、 奇 异 变形 杆菌 (Protews mirabilis 0:3; 简称 P. mir0:3) 和
-普罗 维 登 斯 杆菌 (Provédencia stuartés 0: 酉 简称 P. stu 0:4), _
他 们 一 方面 用 这 些 细菌 悬 液 分 别 注射 白 免 ,获取 各 自 的 抗 血清 ，
“ 另 一 方面 用 它们 制备 各 自 的 开 PS。 在 提纯 工 PS 时 ， 他 们 把 50
个 培养 四 的 培养 细菌 ， 以 每 培养 亚 3ml 的 体积 悬浮 于 0.85 多
-生理 盐水 中 。 经 离心 .洗涤 和 再 离心 后 , 取 细 胞 沉淀 物 称 重 ， 并
“HED 45% 酚 溶液 。 冰 浴 下 充分 混合 5 分 钟 , 加 热 到 65°C, FEE
拜 10 分 钟 。 冰 浴 冷 却 到 4°C, 1,0009 下 离心 30 分 钟 ， 除 去 上
层 酚 相 溶液 。 下 层 溶液 对 流动 的 自来水 透析 48 ~72 小 时 ,透析
SSA BV LPS. UK FRE FR
LPS 的 电泳 分 离 是 用 14% PAGE 完成 的 。 电 泳 共 作 4 套 ，
其 中 一 卖 电泳 凝 胶 进 行 银 染色 ， 另 三 块 分 别 用 三 种 菌株 的 抗 血
“ 清 进行 转移 后 的 免疫 印 盖 。 此 间 , 先 把 凝 胶 作 模板 ， 于 60V
下 电 印 渍 于 NO 纸 。 所 用 印 渍 缓冲 液 和 常规 印 渍 并 无 两 样 ， 即
20mM Tris-HC]l-150 mM HARA 20% FAR, El, Bk

e211e

NO 纸 浸 于 200 ml, 内 含 0.9%_NaCl 0.25% 白明 胶 的 10mM
Tris-HOl (pH7.4) 溶液 中 ， 于 40°C FR RIANA, NO
纸 分 别 转 入 100 ml, 内 含 1:400 稀释 度 的 各 菌株 的 免 抗 血清 和
0.25% 白明 胶 的 10mM Tris-HCl (pH7.IRRMR, Be
动 下 反应 16 小 时 。 取 出 NC A, AAA 0.9% NaCl fy 10mM ©
Tris-HCl (pH7.4) 洗 两 次 ， 共 二 小 时 。 BAA & 0.056%
Nonidet P40 和 0.97% NaOl 的 10mM Iris-HOIpPHY7.4 溶 液
洗 两 次 ， 共 工 小 时 。 把 NO 纸 转 入 含有 瑟 X1056pm /ml “I-A
AEM $i fe IgG Al 0.25 % 1459 Be AY 10mM Tris-HOl (pH
7.4)II 抗 反 应 液 中 ,反应 工 5 小 时 。 反 应 完成 后 ,如 工 抗 反应 的 :
洗涤 步骤 彻底 清洗 ,把 NC 9 级 干 燥 后 进行 放射 自 显 影 。-

谱 。 由 于 已 知 脂 多 糖 系 由 外

图 5 .10 是 华 兰 氏 并 人 性
层 专 一 性 低 聚 糖 链 . 中 心 多

ify LPS 印 渍 谱 。 其 中 工
3 和 5 列 是 各 菌株 LPS 经 电
泳 分离 后 ， 凝 胶 直 接 用 银 染 、
料 染色 的 对 照 谱 ; 2.4 和 6
列 则 是 各 菌株 LPS BE BE
因 5-40 三 种 草 兰 氏 阴 性 菌株 的 糖 链 和 脂 质 三 部 分 组 成 ， 且
LPS Epi GHAR LIE) 近代 已 知 属 中 心 多 糖 链 的 部
分 在 电泳 中 迁移 最 快 ,而 含 0 抗原 的 外 层 DLPS 迁移 居中 ca, 故
不 难 从 图 5 ~ 10 分 辨 出 。 用 五， cola 0: 111 Al P. mér 0: 8 $i Ii
消 印 盖 的 LPS EN wei (Bl 2 A 6 A), —B Raa

印 渍 ， 并 用 各 自 抗 血 清 免疫
印 盖 所 得 leat Bw

AV 0 抗原 的 外 层 LPS, 它们 和 中 心 多 糖 链 部 分 的 反应 较

sP12。

差 ,尤其 是 P. mir0:3(6 列 )。 和 它 俩 不 同 , P. stu0:4 的 抗 血清
中 则 既 含 针对 外 层 ， 也 含 针 对 中 心 部 分 PS 的 抗体 (4 列 )c。

Bradbury 等 人 的 上 述 工作 ,开创 了 印 渍 脂 多 糖 的 先例 ， 为
印 涡 术 的 应 用 增添 了 又 一 方向 。 (AEM, Bradbury 等
人 一 方面 同意 Gershoni 和 Plade 的 建议 °, Wee He MARR
印 渍 术 之 类 的 地 区 性 术语 来 称呼 印 渍 术 ， 故 采用 了 “LPS Ep ve
术 ” 这 一 正确 名 称 。 但 是 ,他 们 却 同 时 又 提议 ,是 否 把 东部 印 渍 术
(Eastern blotting) 改 用 在 非 蛋白 质 和 核酸 类 的 生物 分 子 印 渍
术 上 ， 而 把 西部 印 渍 术 (Western blotting) 一 词 从 免疫 印 渍 扩
大 到 和 蛋白质 和 结合 蛋白 质 ( 即 糖 蛋白 、 脂 蛋白 等 )]。 显然 这 是
不 能 同意 的 ， 因 为 Gershoni 和 Palade 关于 取消 地 区 人 性 命名 法
的 目的 ， 不 只 是 为 了 纠正 西部 印 渍 术 和 东部 印 渍 术 都 指 蛋白 质
印 渍 术 的 这 一 重 迭 而 引起 的 混乱 ， 更 主要 的 是 防止 这 类 地 区 性
名 称 延 续 下 去 ， 将 不 可 避免 地 会 出 现 如 像 “中 东 印 渍 术 (Mid-
Eastern blotting)” 之 类 ， 会 引起 不 必要 政治 纠纷 的 名 称 之 缘
故 25。

五 测定 酶 活性 的 酶 印 渍 术

近年 来 已 有 儿 项 用 印 渍 术 测 定 酶 活性 的 实例 。 前 节 所 提
Thompson 等 人 的 产物 选择 性 印 渍 术 ， 测 定 了 玉米 苗 叶 所 含 谷
氨 酸 合成 酶 的 活力 ”…， 它 可 算是 这 方面 的 实例 之 一 。 如 果 认 为
Thompson. 等 人 的 印 渍 方法 已 偏离 常规 印 渍 术 还 难以 令 人 信服
Wid, BAP Aras Oblsson 等 人 的 例子 则 是 完全 按 标准 印 渍
方法 来 测 酶 活性 的 。 他 们 不 仅 测 定 了 几 种 蛋白 酶 的 活性 ， 还 测
定 了 酶 原 。

Ohlsson 等 人 称 他 们 的 方法 为 酶 印 涡 术 (Enzymoblott-

es213。

ing)， 目 的 在 于 开发 一 种 特异 性 检 出 生物 体液 和 组 织 朱 提 液 店 ，
蛋白 酶 类 及 其 酶 原 的 方法 2。 为 了 说 明 他 们 这 种 酶 印 渍 法 的 :
实用 性 , 他 们 除 试验 了 市 售 猪 的 胰 蛋 白 酶 〈EO Ss Od) HA
漳 人 性 蛋白 酶 (EO3.4.22.11) 和 和 牛 的 胰 凝 乃 蛋 白 酶 (也 03 4.21.1).
外 ,还 试验 了 猪 胰 匀 浆 物 中 这 些 蛋 白 酶 及 其 酶 厌 记 大体 向 法 是 )
猪 胰 组 织 绞 碎 后 加 入 4 倍 体积 预 冷 到 220 的 员 05MOa0B 二
0.2MTirs-HOl(pH 8.3) 溶 液 ,在 一 支 玻璃 / 特 氟 隆 浆 器 中 每
BIR, 40, 30,000g 下 离心 工 小 时 ， 王 清 即 是 待 测 猪 胰 色 浆
液 。 为 了 试验 蛋白 酶 原 , 部 分 匀 浆 液 在 电泳 前 加 1/4
生理 盐水 配制 成 Img/ ml AK SE FF HE 87°C 下
保温 80 分 钟 ,以 使 与 浆液 中 蛋白 酶 原 活 兹 有 导 辐 不同 3

上 述 各 种 蛋白 酶 样品 ， 分 别 区 10 pl Ear 1% —
糖 凝 胶 电 泳 ,电泳 严格 控制 在 10~ 12°C_6 V/om HA ER PEE F 2E-
行 30 分 钟 ,以 保证 酶 不 失 活 。 电 泳 结束 , 各 板 形 凝 胶 二 芬 为 二 六
一 份 直接 用 银 染料 染色 作 全 谱 显现 ， 另 一 份 用 毛细 帮 用 印 渍 法 :
印 渍 于 NO 纸 。 因 是 大 和 孔 琼 脂 糖 胶 为 模板 ， 印 渍 只 需 30 分 钟
印 渍 后 取 下 NO 纸 进行 空气 干燥 。 为 了 试验 印 渍 纸 上 原 位 检 出
蛋白 酶 原 的 可 能 性 ， 在 上 述 印 渍 前 ，NO 纸 先 用 泪 度 为 王 0 或 :
0.1mg/ml, 用 0.05M Ca0l.-0.2M Tris-HOl(pH 7.8) rh yk
Ac iil FY) Ja Kk EA, ZEA Ra LN

印 渍 并 干燥 了 的 NO 纸 分 别 在 各 和 蛋白酶 的 对 硝 基 酰 替 苯 胶
底 物 溶液 中 保温 工 小 时 ,以 进行 原 位 酶 反应 。 此 时 , 炊 出 胰 和 蛋白酶
FY Jy J IV oc FF P-L PS SE EE Beh ER CRT
称 Bz-Arg-pNA), JAIN HY 25 mg FF 95°C FR 560ml, 0.2M
Tris-HOl(pH 7.8) hy 22 we, WHERE BT Jae
FET LAE PY RAI BE BEAR AE (Suc-Phe-pNA), FART HR
25mg He 2m) — AW, HR a NE AS pe

«214°

氨 酸 -对 硝 基 栈 替 葵 腕 (Bz-Tyr-pNA) 替 代 ， 用 时 也 取 25 mg,
AF 12ml 二 甲 亚 硕 中 。 检 出 弹性 蛋白 酶 的 底 物 是 W- 丝
34 Bt-L-Pi AB-L-W AB-L-W ARNT TE BE AE HE (Suc~
(Ala)s-pNA) ,用 时 取 25mg 溶 于 10ml 二 甲 亚 硕 中 。

上 述 蛋 白 酶 解 反 应 产生 的 对 硝 基 葵 胺 ,可 用 Y-( 二 蔡 基 ) 乙
二 胺 使 之 重 氮 化 而 产生 红色 偶 氮 染 料 。 为 此 ， 把 上 述 已 和 底 物
反应 的 NO 纸 放 入 内 含 0.1% 亚 硝酸 钠 的 1M HC! 中 反应 5 分
钟 ,再 转 入 内 含 0.5% AGRE 1M HO! 中 反应 5 分 钟 , 最
后 转 入 内 含 0.05% N-(1- 蔡 基 ) 乙 二 胶 的 47.5% 乙醇 溶液 中 。
当 RNU 纸 上 显 出 红色 区 带 ， 上 且 达 最 大 强度 时 (通常 在 1~5 分钟
后 ) 才 取出 NO 纸 ,并 直接 封 入 两 张 透明 塑料 纸 之 间 。 装配 时 当
Dy AR TH, 把 四 周 粘土 后 凡 于 一 和

由 上 操作 可 见 ,Dhlsson
等 人 是 把 有 活性 的 蛋白 柄 印
WNC 纸 , 再 用 特异 性 底 物
与 之 原 位 反应 而 检 出 ， 因 此
称 为 酶 印 涡 术 是 有 根据 的 ，
确 是 始终 保持 着 酶 活性 。 他
们 的 这 一 实验 得 到 了 两 项 贤 -” : , ee ee a ee
有 价值 的 结果 ; 图 5-1L ARBORAMWERSA.

(关于 活性 蛋白 酶 的 酶 活性 的 印 污 详 (说 明 见 正文 )
检 出 _ 当 用 Bz-Arg-pNA 检 出 胰 蛋 白 酶 时 , 有 四 条 迁 向 阳极 的
区 带 显现 (图 5-1L 和 5-12A)5 Al 5-11 还 出 示 了 上 样 50、10、
5.1.0.5 和 0.1Ag( 自 左 向 右 ) 市 售 胰 蛋 白 酶 所 显 酶 印 渍 谱 , 由 此 .
证 明 此 法 最 小 检 出 值 为 0.5wg 酶 量 。 用 各 种 特异 性 底 物 , Dae
渍 法 检测 胰 蛋 白 酶 . 胰 凝 乳 蛋白 酶 和 弹性 蛋白 酶 ,以 及 它们 的 酶 -
原 的 印 渍 谱 如 图 5-12 所 示 。 DR BLE FB A, RE AA:

e215 e-

AO AMAA
A, Bz-Arg-pNA 为 底 物 测 胰 蛋 白 酶 活性 (a，b) 和 其 酶 原 。 其 中 , a 为
上 样 10 ug 的 市 售 胰 蛋 白 酶 制剂 ;b 为 用 肠 肽 酶 活化 过 的 猪 膜 匀 浆 物 为

RY Ky BRIG DRA BKB NC 纸 上 , 所 显现 的 酶 原 活 化 谱 。
Bf OC, 系 分 别 以 Bz-Tyr-pNA 和 RSuc-Phe-pPNA 为 底 物 , 测定 胰 凝 乳 蛋 王 :
白 酶 活性 (d\e) 及 其 酶 原名 。 其 中 ,d ALY 100ug 的 市 售 胰 凝 乳 蛋白 酶
商品 ;e 为 用 胰 蛋 白梅 活化 过 的 猪 胰 匀 浆 物 ;为 胰 匀 浆 物 电泳 后 印 涡 于 含
胰 蛋 白 酶 的 NO 上 ,所 显现 的 酶 原 活 化 谱 。

D， 以 Suc-(Ala)s-pPNA 为 底 物 测 弹 性 蛋 和 白梅 活性 (g、]) ALG.

其 中 ，g ALF 100 ug BOTH BEE BS Pa h fi 的 处 理 分 别 和 e,f

相同 。
物 ,市 售 酶 制剂 (图 5-12 Ba 和 Cd) 和 用 肠 肽 酶 活 纶 了 酶 原 的 猪
胰 匀 浆 物 (图 512Be 和 Co) ,都 在 阴极 区 显 出 两 条 较 弱 的 区 带 。
经 一 系列 酶 浓度 印 渍 比较 ， 检 出 限度 是 5Ag( 用 Bu-Tyr-pNA
为 底 物 ) 和 10 we (用 Suc-Phe-pNA 为 底 物 )。 BEE Mee
性 印 渍 时 , 也 在 阴极 区 显现 两 条 区 带 (图 扩 位 Dg)， 检 出 限度 为
Bug. {AANA PT (Be 2 EEE 还 在 阳
极 区 显现 一 条 弱 的 区 带 (图 5-12Dh)。

(2) 关于 酶 原 的 原 位 检 出 ” 当 从 猪 胰 匀 浆 液 电泳 分 离 出 蛋

白 酶 原 , 并 印 渍 于 NO 纸 时 ， 使 用 任何 底 物 都 不 能 检 油 和 企 何 区
带 。 但 用 肠 肽 酶 或 胰 蛋 白 预 处 理 NO 纸 , 再 进行 同 种 印 渍 时 , 酶

esP16。

—

原则 因 进 入 NO 纸 而 被 纸 上 存 在 的 肠 肽 酶 或 胰 蛋 白 酶 原 位 活 -
化 ;致使 区 带 显 现 。 由 于 酶 原 比 其 相应 的 蛋白 酶 分 子 量 大 , 因此
这 种 原 位 活化 的 酶 原 所 显现 的 区 带 数 和 迁移 率 都 和 其 相应 的 蛋
白 酶 不 一 样 ( 试 比 较 图 5-12 各 列 )。

Ohlsson 等 人 也 研究 过 这 种 酶 印 渍 的 印 渍 效率 ,证 明 0.1~
10 ug 之 间 的 OP 上 样 量 ; 几乎 能 达到 100% 的 印 渍 效率 。 超过
10 wg 就 难以 完全 印 渍 。 在 酶 原 原 位 活化 中 ,NO 纸 用 肠 肽 酶 预 保
温 的 浓度 也 有 影响 。 当 使 用 10mgy/ml 浓度 时 , 用 Bz-Arg-
pNA 作 底 物 可 得 三 条 区 带 。 若 肠 肽 酶 浓度 降 为 0.1mg/ml 或
更 低 时 ,使 用 同 种 底 物 也 只 能 在 阴极 处 显现 一 条 区 带 。 又 证 明 ，
ENA ABR NO 纸 虽 经 在 480 和 25°C 下 贮藏 66 天， 份
能 得 到 与 未 贮藏 的 相同 结果 。 如 果 把 经 酶 活性 染色 了 的 印 渍
纸 , 放 入 密封 塑料 袋 中 贮 于 二 18*C 下 , 虽 经 16 个 月 ， 酶 反应 的
区 带 强 度 或 分 辩 率 都 不 会 发 生变 化 2。 但 若 湿 放 室温 或 如 C
时 ,在 几 天 内 区 带 就 逐渐 变 弱 并 最 后 消失 。 此 外 ,Ohlsson 等 人
也 指出 ;样品 中 不 需要 很 高 的 酶 活性 , 因为 印 渍 后 酶 处 于 NO 纸
表面 ; 易 和 底 物 接近 而 反应 。 酶 促 反 应 的 产物 又 被 结合 于 XGO
纸 上 , 因此 增 大 了 灵敏 度 和 分 辩 率 。 相 反 , 如 果 酶 活性 过 高 ， 就
可 能 产生 多 于 NG 纸 结 合 容量 的 产物 ， 致 使 这 些 多 出 来 的 产物
进入 底 物 溶 浪 中 使 之 成 为 黄色 ， 结 果 会 在 重 氮 化 后 使 NO 纸 出
PAL FR, 区 带 则 变 为 暗 红色 ra。Ohlsson 等 人 预言 ,这 种
酶 印 涡 适 用 于 一 切 其 底 物 可 用 B- 硝 基 栈 替 苯 胺 基 团 修饰 的 酶
类 。 用 其 它 生 色 团 修饰 的 底 物 ; 如 B- 蔡 酚 基 团 修 饰 的 底 物 ， 也
可 能 采用 酶 印 渍 术 检 出 其 活性 c2。

其 实 , Reinhart 和 Malamud- 早 在 1982 ARE Se RGA
散 印 溃 法 印 渍 天 然 酶 来 检 出 其 活性 ， 只 是 由 于 扩散 印 渍 需 长
时 间 ,， 酶 活性 有 所 下 降 而 效果 不 够 理想 se。 次 年 ，Sleup 和

ee217 e

Gorbling 把 扩散 印 渍 改 为 电 印 渍 , AM Dy He TES
草 豆 叶 中 的 淀粉 酶 活性 ， 而 且 还 能 用 这 种 酶 印 泪 本 分 析 淀 粉 酶
的 多 态 型 c9。 由 于 Sleup 和 Gerbling 这 一 酶 印 涡 中 采用 的 不
是 常规 印 渍 用 纸 ,而 是 聚 再 烯 酰胺 凝 胶 , 因此 作为 印 涡 术 审 所 用
固定 化 材料 的 又 一 范例 , 值得 作 较 详细 的 介绍 。

Sleup 和 Gerbling [ty Mg Ep jt FA HERE (Spinacta oleracea)
Ail Bi (Pisum sativum) i} HERA MB, W120 pe BREA
质 含量 的 上 祥 量 ， 进 行 板 形 8.5% 了 PAGE。 为 了 和 原 有 用 订 和
电泳 分 析 淀粉 酶 多 态 型 的 技术 相 比较 ， 有 些 凝 胶 中 迭 关 了 直 链
淀粉 。 电 泳 结 束 后 把 凝 胶 取 出 ， 放 在 另 二 抉 内 合 0. 汪 久 B
链 淀 粉 的 板 形 8.5% PAG 之 左 侧 ， 再 用 两 张 已 用 印 汪 组 神 液
(37.4mM Tris -288mM 甘氨酸 pH8.6) 32% WY 58 HA.
FEA} OU 0 Ff FH EW BB PE, FA BA SLA RH.
把 装配 件 放 入 电 印 渍 槽 , 在 350~470 V (20~18 mA) FH
5 小 时 。 一 种 简化 了 的 示意 图 如 图 5-13A; 两 电极 距离 为 fomy
FP 表示 普通 滤纸 ,8 是 用 作 印 涡 模 板 的 凝 胶 ,，A 为 内 含 直 链 淀粉
的 印 法 凝 胶 。 为 了 和 扩散 印 渍 法 的 ) 相 比较 ， 有些 作为 模板 的 凝
胶 进 行 了 扩散 印 渍 。 此 时 印 渍 液 采 用 5mM CaClz-50 mM Mes
(pp 也 6.6) 绥 冲 液 ,扩散 印 渍 系 在 室温 下 进行 哇 小 时 赤 印 涡 完 成
后 , 模板 凝 胶 和 未 印 渍 的 电泳 凝 胶 均 用 考 马 斯 蓝 GE250 染 名 。 印
渍 凝 胶 则 用 碘 处 理 进 行 负 染色 。 此 时 , 把 印 涡 凝 胶 用 未 洗 两 次
KA 10mM KI-14mM la 溶液 中 直到 深蓝 色 背 景 王 出 现 匹 名 区
带 为 止 。 此 染色 凝 胶 可 保存 于 30% 甲醇 -5 儿 WRB.

上 述 实 验 结果 示 于 图 5-13B,， 图 中 I~.III 号 凝 胶 都 是 用 矿
化 物 进 行 淀 粉 酶 特异 性 活性 染色 法 。 胶 工 未 印 渍 实 为 电泳 分
离 胶 , 因 未 发 生 任何 诲 反应 ， 用 碘 染 色 时 就 不 能 显现 荃 何 区 带
由 此 对 照 也 反映 出 实验 未 产生 在 何 污 染 。 胶 开 相 当 于 过 去 检

72186 :

ae
四

出 淀粉 酶 活性 时 所 用 亲 和 电 泳 法 ,也 即 在 电泳 前 , 凝 胶 中 预先 挫 :
入 了 直 链 淀粉 。 当 把 菠 革 叶 粗 提 液 上 样 于 这 种 凝 胶 并 电泳 时 ，
由 于 亡 含 淀粉 酶 在 电场 中 迁移 的 同时 发 生 着 酶 促 反 应 ， 因 此 胶 :
II 虽 未 经 印 渍 ,用 碘 也 能 染色 。 从 胶 BES, RRS AB,
这 充分 反映 出 淀粉 酶 在 迁移 过 程 中 发 生 酶 反应 的 情景 。 显 然 ，
亲 和 电 泳 过 程 中 , 由 于 发 生 着 底 物 - 酶 相互 作用 ， 致 使 酶 的 电泳 .
迁移 率 改 变 , 分辨 率 也 下 降 了 (区 带 数 不 多 ). 关 于 迁移 率 的 变化 .
不 难 用 标准 品 予 以 修正 , 但 分 辨 率 下 降 则 难以 挽救 , 使 成 为 亲 和
电泳 技术 的 限制 因素 。 胶 II 是 菠菜 叶 粗 提 液 经 电泳 分 离 、 电
印 渍 于 含有 直 链 淀粉 的 凝 胶 ， 再 用 特异 性 淀粉 酶 活性 夏 染 色 之
检测 谱 。 可 见 ,至 少 有 芭 条 代表 各 种 类 型 淀粉 酶 的 区 带 密集 于 阳
极 区 。 其 迁移 率 和 亲 和 电 泳 显现 的 区 带 大 不 相同 ， 区 带 数 也 多
《请 比较 胶 TT FA TIT), BERARDI PES, 但是, 胶 III 若
改 用 扩散 印 渍 法 , 则 无 区 带 显现 4 图谱 未 示 ), 这 可 能 是 由 于 长 时
间 印 渍 (24 小 时 ) 使 施 失 活 , 或 具有 少量 酶 被 转移 的 缘故 。 胶 工 y
和 分别 是 胶 TLL 印 污 前 和 后 所 用 印 渍 模板 凝 胶 的 考 马 斯 亮 蓝
染色 谱 。 它 们 都 未 能 在 相当 于 淀粉 性 多 态 型 各 区 带 位 置 处 显现 .

e219 e-

区 带 。 对 此 ， 胶 V 可 看 成 是 因 区 带 全 部 转移 于 印 渍 胶 之 结果 ，
RELV 则 只 能 解释 为 考 马 斯 亮 蓝 的 检 出 灵敏 度 较 差 ， 这 也 反 证
了 酶 印 涡 示 的 高 灵敏 度 。

Steup 和 Gerbling cnt Lk ee
酶 印 渍 中 , 印 涡 时 间 和 印 渍 效率 的 关系 。 正 如 图 5-14 Pm, RFA
Ze EN ie 60 分 钟 时 才能 得 到 5 种 酶 型 组 成 的 淀粉 酶 从 谱 (图 歼
14B 之 胶 I)， 过 得 或 过 长 的 印 渍 时 间 都 将 导致 部 分 酶 型 的 形

Li:
JO

5-14 2G HEBEL OPA SESE RLY DEE, 印
渍 模板 的 考 马 斯 亮 蓝 染色 谱 (A) 和 印 渍 胶 的 淀粉 -
酶 特异 性 碘 染 色谱
BE I-V 分 别 为 电 印 渍 0、.10.30、60 和 130 分钟。
由 上 诸 例 清楚 表明 ， 酶 印 渍 术 是 十 分 灵敏 而 简便 黎 行 的 坟
法 ,用 它 研究 酶 的 多 态 型 、 检 出 同 工 复 . 定 量 测定 酶 活性 等 都 具有
很 大 潜力 。 这 在 酶 制剂 工业 生产 的 产品 检验 临床 酶 法 诊 业 AE
化 酶 制剂 药物 的 药检 等 应 用 部 门 中 , 可 能 发 挥 重 要 作用 。 需 要 指
出 的 是 , 酶 印 泪 术 应 专 指 印 渍 后 仍 具 酶 活性 , 并 能 般 过 原 位 酶 反
应 而 检 出 的 一 类 印 溃 术 。 至 于 那些 印 渍 后 已 无 酶 活性 , REAM

* 220°

常规 染色 剂 子 以 定位 的 方法 , 还 是 归 入 蛋白 质 印 渍 术 为 好 。

去、 印 渍 物 的 回收 技术

常规 凝 胶 电 泳 分 离 的 生物 大 分 子 ， 可 以 通过 扩散 作用 或 电
洗 脱 予以 回收 ,从 而 达到 制备 生物 大 分 子 的 目的 。 对 凝 胶 上 已 分
离 区 带 进 行 切 片 并 匀 浆 ， 是 回收 生物 分 子 最 常用 的 办 法 。 但 它
的 洗 脱 回收 效率 较 差 ， 尤 其 是 分 子 量 大 的 蛋白 质 。 人 们 也 采用
可 逆 性 交 联 剂 来 铸 胶 , 以 便 电泳 后 用 化 学 试剂 使 凝 胶 解 聚 , 提高
蛋白 质 的 洗 脱 效率 ss。 但 解 聚 剂 又 常 使 蛋白 质 修饰 或 降解 。 近 ，
代 也 确实 创造 出 一 些 极 好 的 ， 用 电 洗 脱 的 方式 从 凝 胶 中 回收 蛋
白质 的 方法 sz, 馈 。 它 们 虽说 能 有 效 地 回收 生物 大 分 予 ， 但 需要
”结构 复杂 的 装置 和 熟练 的 操作 技巧 cal。

印 渍 术 使 生物 大 分 子 处 于 薄 的 印 渍 纸 上 ， 如 果 生 物 大 分 子
和 印 渍 纸 是 非 共 价 结合 (如 采用 NO 4R ZB AS), PAE Ma
胶 中 回收 生物 大 分 子 要 容易 并 有 效 得 多 。 因 此 从 印 渍 纸 上 回 收
蛋白 质 等 , 必 是 印 渍 术 的 又 一 发 展 方向 。

1985 年 ,Barekh 等 人 对 从 :NO 纸 上 洗 脱 蛋 白质 作 了 详细 研 .
究 ， 取 得 了 许多 值得 重视 的 结果 吐 。 他 们 把 市 售 蛋 白质 分 子 量
标准 系列 用 氯 胺 了 (Ohloramine-T) jk“ 使 之 435T- 标 记 ， 然 后
用 8SD8-10%PAGE 人 分离, 再 用 Burnette 法 印 渍 于 NO AO",
图 5 15 即 是 他 们 得 到 的 ,NO 纸 上 42TI- 标 记 蛋 白质 标准 品 的 放 :
射 自 显影 谱 。 左 列 数字 为 分 子 量 ( 千 道 尔 顿 )， 从 上 到 下 分 别 是
磷酸 化 酶 b, 牛 血 清白 蛋白 , 卵 清 蛋白 ， 碳 酸 酬 酶 和 大 豆 胰 蛋 白
酶 抑制 剂 。 由 图 可 见 , 除 .67kDa 和 48kDa 之 间 有 杂 蛋 白 外 ,各
区 带 迁 移 率 相 差 很 大 , 适 于 定量 分 析 。

为 了 研究 制备 回收 图 5-15 所 示 各 和 蛋白质 的 最 佳 洗 脱 条 件 ，

e221¢

94K - aa
”67K - Sa i ie : es r

2%
42K - +e renvaes 200

30K ~ &

OM gnee soe

R515 Ay NC HE» <T-_ 标 记 蛋 Fm

放射 自 显影 谱 (说 明 见 正文 )

Parekh 等 人 把 此 NO 纸 按 列 纵 切 成 条 ， 以 便 用 于 各 条 条 件 让
验 。 每 一 条 上 的 区 带 仔细 切 下 ; 分 别 放 六 嘿 玛 计数 器 中 测 放 射
性 , 然后 再 按 表 5 2 所 所 示 洗 脱落 、 保 温 温度 和 时 间 ， 分 别 洗 脱 。 此
时 每 平方 厘米 NO 纸 采 用 0.3m PERU, BRR SY. VERE
Jase NO 纸 ， 溶 液 在 10,000g 下 离心 5 苍 韩 以 除去 任何 不 溶
物 。 分 别 测 NO 纸 和 离心 上 清 液 之 放射 性 6 Highton
#(%)

从 表 5-2 所 列 结果 清楚 表明 : CL) 含有 hele sp8,
DOC Triton X-100) at A Bt MAH (3 M $b BM Be 6M BR) 的
pH8.9 Zmee ZEN ye (A-A), 7£100°CF YES 4} Fh, SEVERE AK
率 通 常 仅 在 B~ 10% 左右 ( 见 二 4 号 处 理 )， 昌 说 低 分 子 量 的 天
豆 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 洗 脱 效率 ， 在 19% SDS 中 处 理 时 效果 较 好
些 。(2) 把 各 种 去 污 剂 组 合 起 来 于 100°C 下 洗 脱 已 分钟 (6 号 如
各 蛋白 质 的 洗 脱 效率 在 25-~ 85 % 范围 内 , 随 分 子 量 的 增加 洗 脱
效率 下 降 。 显 然 ， 这 种 处 理 是 比较 有 效 的 ， 但 所 得 恤 特 质 应 是
— (3) JU AA PLIAT ( CAA BO BEA ZR Be BE Oh
i, F 60°C 下 洗 脱 3 小 时 , HART IE EVE BCR (7 AB BY,
on 最 蛋白 质 的 洗 脱 效率 上 升 到 60~ 90% WHI, BEARS}

«2226

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S81) SBM YE LT | Bl 4 A a BA eee "MIR i

(o) HEMI rie

Sees eee alee 6-9 %

量 者 几 近 100%, 单 用 甲酸 于 60°C 下 洗 脱 3 涉 时 得 到 了 中 间
产 率 , 即 在 85~75% 范围 内 全 号 )。 RPM, 通常 分 子
量 越 大 洗 脱 效率 越 差 从 上 述 结果 可 以 得 出 这 样 的 结论 , 有 机 溶
剂 具 有 最 好 的 洗 脱 效率 ， 说 明和 蛋白 质 和 NO REO KAS
为 主 。 分 子 量 越 大 越 难 洗 脱 , 说 明 蛋 白质 和 NG 纸 是 多 点 结合 。
即 分 子 量 越 大 结合 位 点 越 多 , Ve Bi ee HE, Parekh 等 人 认
为 ， 回 收 的 蛋白 质 中 所 含 吡 吁 和 乙 且 可 以 通过 把 蛋 自 质 冰 冻 干
PORE. Ws, SDS-PAGE 因 对 分 离 复杂 的 蛋白 质 混 合 物
具有 高 分 辩 率 而 被 广泛 采用 ，8SDS8 的 存在 将 干扰 蛋 自 质 进一步
的 生化 分 析 , 采用 挥发 性 溶剂 洗 脱 SDS8- 和 蛋白 质 复 合 物 有 利于 使
SDS 从 蛋白 质 中 分 离 出 来 而 除去 。

为 了 进一步 了 解 用 有 机 溶剂 制备 回收 O 纸 上 和 蛋白 质 的 最

佳 条 件 , Parekh 等 人 又 作 了 洗 脱 温度 和 时 间 的 系列 实验 ， 结 果
如 图 5-16 所 示 。 事 实 上 , 洗 脱 温度 越 接近 所 用 有 机 溶剂 的 沸点
则 洗 脱 效率 越 高 ,但 这 是 制备 蛋白 质 所 不 能 容许 的 。 从 图 5-16
A 所 示 结 果 看 ， 在 387°C 和 60°C 下 洗 脱 有 着 同等 的 效率 ， 者 在 “

cles. Cts ae ) Remar R.x10" i
PA 5-16 jj 50% niu -0.1MA-A(pH8.9) #e Rs NOSE LES
质 分 子 量 标准 系列 时 洗 脱 温度 (A) 和 时 间 (B) 的 影响
A: 中 O, 5"0; A, 37*0; x，60*0。B rh: A, 1h; x, 3h; @, 12h(397E 87°O F),
e224

BO 下 洗 脱 ， 则 是 它们 的 80~85% 左右 。 用 40% ZAHER ML
实验 也 得 类 似 结果 。 从 洗 脱 时 间 看 , 若 以 24 小 时 处 的 洗 脱 效率
为 100%，, 那 末 洗 脱 工 小 时 则 为 其 70~90, 洗 脱 3 小 时 则 为 其
80~ 100% (图 5-16B)， 因 此 使 用 这 些 有 机 溶剂 洗 赔 蛋白 质 时 ，
DI 87°C 下 保温 3 Abit HE.

七 、 在 印 渍 纸 上 使 用 非 放 射 性 ，
探 针 的 分 子 杂 交 术

八 十 年 代 初 ， 核 酸 分 子 杂交 技术 中 出 现 了 多 种 使 用 非 放 射
竹 探 针 进行 原 位 分 子 杂交 的 方法 。 如 所 周知 ， 研 究 核酸 所 用 方
法 ， 因 要 求 有 较 高 灵敏 度 而 离 不 开 使 用 放射 性 同位 素 。 就 最 党
使 用 的 °° 来 说 , 其 半 训 期 仅 14~15 天 , 属 不 稳定 同位 素 ,操作
者 也 难免 不 受 其 辐射 。 因 此 人 们 一 直 在 寻求 非 放射 性 核酸 探 针 。

Langer 等 人 二 :于 1981 年 首先 采用 Bioll-dUTP 作为 扒
入 物 ， 用 它 进行 DNA 的 切口 移 位 标记 获得 成 功 。 两 年 后 ，
Leary 等 人 629 改 进 了 它 的 显 色 反 应 系统 ， 并 使 这 种 检测 商品
化 。 他 们 的 作法 是 ， 把 生物 素 标记 的 探 针 与 印 渍 在 NO 纸 上 的
i DNA 杂交 , 再 用 链球 菌 抗 生物 素 蛋 白 (SA) 及 生物 素 联 酶 多
聚 体 (Poly AP) (Rik, MARAE a, HE DNA 序列 即 呈 蓝 色
的 斑点 或 区 带 显 现 出 来 。 其 后 一 系列 生物 素 标 的 寡 核 苷 酸 探 针
相继 问世 ,其 中 最 引 人 注 月 的 则 是 Forster 等 人 5 合成 的 光 化
生物 素 ， 它 很 有 希望 大 大 提高 现行 非 放 射 性 标记 和 检测 技术 的
灵敏 度 。

最 近 ， 荧 光 技 术 也 闻 入 了 DNA 的 双 脱 氧 测序 法 。 Smith
等 人 已 成 功 地 修饰 了 双 脱 氧 法 所 需 的 寡 核 苷 酸 引物 ， 形 成 特 强
的 荧光 衍生 物 59。 这 些 方法 都 因 避 兔子 放射 性 污染 而 受到 重

e225

ag 05,502, 这 里 将 以 Hopman 等 人 最 近 创 立 的 条 北 核 酸 探 针
(Morcurated nucleic acid probe) foe, 来 说 明 这 类 非 放
射 人性 探 针 的 制备 和 用 于 分 子 杂 交 的 原理 。 |

几乎 所 有 这 类 用 于 核酸 分 子 杂 交 的 非 放 射 性 探 针 ， 都 是 采
用 化 学 法 或 酶 促 合成 法 把 半 抗 原 ( 例 如 三 硝 基 茶 、 生物 素 、 荧光
素 .乙酰 胺 基 荧 烷 ) 连 接 于 核酸 分 子 ， 然 后 采用 酶 联 免 疫 楷 学 技
术 耶 以 酶 活 染色 或 荧光 谱 来 显现 区 带 。Hopinan 等 大 的 汞 北 核
酸 探 针 也 属 此 类 59， 只 是 用 冬 把 核酸 和 含有 斑 基 的 半 抗 原 桥 接
在 一 起 。 他 们 认为 这 样 做 要 比 其 它 方法 结合 更 牢固 ”用 于 分 子
杂交 时 更 稳定 ， 这 类 修饰 作用 不 会 影响 分 子 杂 交 的 性 质 等 等 。

Hopman 等 人 首先 按 图 O17 合成 含 琉 基 的 半 抗 原 。 图 中 ，
缩写 符号 所 代表 的 化 合 物 名 称 是 : Fmoe iy REBEL BE ise
Hi; Boe 4 J AHA; OP fp 4H AEB; DMA 为 二 甲 Ik; eAhx

为 6- 氨 基 已 酸 ; Tnp-SO,H 4 = WER; BiO-ONSu 2% 1-

琥珀 酰 亚 胺 基 生 物 素 酯 ; Flu-NOS 为 荧光 素 异 硫 氰 酸 盐 ; TFA
为 三 氟 乙 酸 ; DTT 为 二 硫 苏 糖 醇 。 RZ
号 ,中 央 竖 线 和 最 后 一 行 的 虚线 表示 为 : BO Se WaA Top-
SO,H 反应 则 得 9 号 化 合 物 ， 即 Tap-Tys 工 YSNH-(OH5)a-
8H( 图 左 侧 ); 若是 8 号 化 合 物 和 Tnp-8Os 也 反应 则 得 11 号 产
物 , 即 eAhx(Trp)-Lys—Lys-NH—(CH,)4-SH, 同 理 ， 可 分 别
得 9~…13 号 产物 。 图 中 ,TFA 是 为 了 除去 Boo 基 团 ; DTT 出 是
AT EIR S—S 键 。 文 献 [95] 中 列 出 了 整个 合成 步骤 的 细节 。 由
于 作为 原料 的 化 合 物 工 和 5 都 有 商品 市 售 ， 不 难 自行 制备 出 这
类 半 抗 原 。

核酸 的 汞 化 步骤 大 致 如 下 ;- 先 把 欲 作 为 探 针 的 TDNA 或
RNA ,超声 破解 为 300~500 核 苷 酸 长 度 ) 了 DAA PRL
合 物 的 形式 分 离 出 来 ?, RAP 5mM re 10mM ~

«226.

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CCT RH) ENS Hoe gee io bg e 3

e227 +

NaAc, pH5.5~6.0 的 反应 液 ,50*0 下 保温 工 夜 。 反应 是 通过
加 入 等 体积 内 含 120mMKON，40mM NaCl, 2p1MEDTA 的
20 mM Tris-HOl (pH7.2) 绥 冲 液 来 终 止 。 第 成 的 未 化 核酸 可
用 凝 胶 层 析 分 离 出 来 ， 此 时 可 采用 预先 由 内 含 工 MKON 的 ©
10mM 磷酸 钠 组 冲 液 (pH7T.2) 平衡 过 的 Sephadex G-25 655 (8
x0.50em),
Pe ET AY RP ALAR SO A BE: EE Os 位 。 A
FH Bh, ADA 5-17 HBR SRE ESP
基 起 反应 ,形成 核 酝 -Hg-S- 半 抗原 复合 物 。 较 早 ，Hopman 等
人 是 用 谷 胱 甘 肽 和 尘 抗原 相连 ， 由 胱 氨 酸 的 综 基 和 冬 化 核酸 的
REFER, RRO AB. I, SOK
中 的 羧基 会 和 核酸 链 上 的 磷酸 ， 因 同样 带 负 电 , — 者 互相 排
斥 ， 在 不 平衡 的 条 件 下 常 使 汞 一 琉 基 键 断裂 而 裂解 。 据 此 ，
Hopman 等 人 改 为 如 图 5-1 所 示 第 9~13 号 产物 ， 即 在 半 抗
原 和 琉 基 化 物 之 间接 上 两 个 赖 氨 酸 残 基 ,， 此 时 赖 氨 酸 上 es- 氨基
带 正 电 , 使 它 和 有 汞 化 核酸 链 上 的 磷酸 基 团 起 静电 吸引 作用 ; 这 就
是 Hopman 等 人 创造 的 这 类 非 放 射 性 核酸 探 针 , 比 其 它 人 的 非
放射 性 同类 探 针 稳定 得 多 的 原因 所 在 。 其 机理 如 图 5 18 所 示 ，
这 是 用 Tnp 作为 半 抗 原 的 例子 。
Hopman 等 人 使 用 BORE AGERE MELE EH 卫星 DNA
(Satellite DNA) 进 行 原 位 分 子 杂交 , 然后 采用 多 克 座 羊 抗 Taz
血清 作为 工 抗 与 之 反应 , 再 用 偶 联 着 过 氧化 物 酶 开 抗 哥 温 ,并 以
邻 葵 二 腕 和 互 20。 作为 底 物 ,使 杂交 分 子 显 色 而 检 出 ss 他们
点 印 涡 法 比较 了 目前 所 敲 采 用 非 放 射 性 核酸 分 子 杂交 探 针 的
AE, ESL AW AR CER TY RH AEF Vincent 等 人 的 三
EAR, KE METRE ERA MAEDA BS
TOO, 也 大 于 或 等 于 Tchen FAR AI CR

es228 。

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I H = S~(CHa)2-NH- C~cH-NH- C-CH-NH- -NO>:
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0 0

B18 未 化 核酸 和 Top—Lyss+Lys-NH-(CH2)2-SH
形成 稳定 复合 物 的 机 理
箭头 示 磷 酸 连 接 于 核酸 链 上 之 位 置 。

光 素 标记 核酸 探 针 s。

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第 六 章 “” 印 渍 术 在 分 子 生物 学 与
医学 领域 的 应 用

从 前 述 五 章 所 涉及 的 种 种 实例 不 难看 出 ， 印 渍 术 已 在 生命
学 科 各 领域 得 到 广泛 应 用 , 其 中 包括 : 生物 化 学 .分 子 生 物 学 . 生
物 工程 学 、 免 疫 学 、 医 学 、 细 胞 生物 学 、 微 生物 学 、 植 物 生 理学 、 动
物 生 理学 等 等 。 在 实际 应 用 方面 ,也 已 开始 作为 临床 检验 生物
化 学 制药 工业 和 酶 制剂 工业 产品 鉴定 的 方法 之 一 。 在 这 里 论 及 :
具体 应 用 时 ,我 们 不 可 能 面面俱到 ,只 想 就 印 涡 术 在 分 子 生物 学
与 医学 领域 的 应 用 作 一 简要 介绍 。 前 者 包括 生物 大 分 子 结构 功
能 、 分 子 遗传 学 和 生物 膜 学; 后 者 包括 免疫 学 、 病 理学 临床 医
学 、 病 毒 学 .寄生 虫 学 等 。

生命 学 科 各 领域 有 着 密切 的 联系 ， 例 如 对 各 种 遗传 疾病 中
功能 畸变 基因 的 剖析 , 既是 分 子 遗 传 学 的 研究 课题 , 也 是 医学 中
病理 学 探讨 的 目标 。 因 此 这 里 将 按 印 渍 术 应 用 于 分 子 生 物 学 和
医学 领域 中 所 取得 的 主要 成 果 予 以 阐述 , 而 不 以 具体 学 科 归 类 。
这 样 做 , 似 能 从 中 启发 更 多 的 潜在 应 用 ,而 不 会 把 思路 只 局 限 在

这 两 大 学 科 中 。

、 在 研究 生物 分 子 间 相 互
作用 中 的 应 用

生物 分 子 间 的 相互 作用 ， 一 直 是 分 子 生 物 学 和 医学 领域 研
究 的 重点 课题 ， 也 是 生命 学 科 其 它 领域 想 从 分 子 水 平 了 解 生 谷

«232+ <
“J

:现象 必须 研究 的 项 目 s 分 子 生 物 学 家 研究 生物 分 子 的 相互 作
用) 例如 研究 DNA-DNA，DNA-RNA，DNA- 和 蛋白 质 _RNA-
-和 蛋白质- 蛋白 质 -蛋白 质 等 的 相互 作用 ， 既 是 为 了 揭露 各 类 生物
:大 分 子 是 如 何 通过 相互 结合 ， 组 成 具 完整 而 统一 功能 的 超 分 子
结构 ; 也 是 为 了 利用 这 类 相互 作用 ， 采 用 诸如 分 子 杂交 等 手段
进行 基因 重组 等 工程 。 就 医学 家 来 说 ， 研 究 抗原 -抗体 的 相
互 作用 ， 揭 露 病毒 、 细 菌 、 寄 生 虫 和 其 受 体 的 相互 作用 ， 常 是
为 了 从 分 子 水 平 止 了 解 病因 ， 找 出 诊断 和 治疗 疾病 的 最 佳 方
案 。
” ”就 目前 而 言 ， 有 关 各 类 生物 分 子 间 的 相互 作用 还 没有 十 分
其 确 和 合理 的 归 类 法 则 ,尤其 是 蛋白 质 -蛋白 质 相互 作 用 的 含义
极为 混乱 。 例如 蛋白 质 类 的 酶 -蛋白 质 底 物 -. 蛋白 质 抗 原 -蛋白
质 抗体 蛋白质 - 受 体 蛋白 -蛋白 激素 - 受 体 蛋 白 、 糖 蛋白 -外 源 凝
集 素 、 生 长 因子 - 受 体 蛋白 等 都 属于 蛋白 质 -蛋白 质 相互 作用 ,但
大 们 又 往往 把 它们 分 别 纳 入 酶 - 底 物 、 抗 原 -抗体 、 激 素 - 受 体 等
类 别 。 如 果 想 把 这 些 类 别 归 为 蛋白 质 -蛋白 质 大 类 中 的 亚 类 , 则 -
又 因 酶 的 底 物 不 一 定 是 蛋白 质 ; 能 产生 抗体 的 抗原 也 不 一 定 是
蛋 自 质 等 而 使 人 无 所 适 从 。 在 印 渍 术 中 , 更 出 现 了 如 细胞 - 受 体 、
病毒 - 受 体 等 一 类 相互 作用 ， 其 中 有 一 些 属 蛋白 质 - 蛋 白质 相 互
E78, 有些 则 不 是 , 有 些 还 尚未 查 清 。 基 于 上 述 情况 ， 这 里 只 能
就 事 论 事 地 把 印 渍 术 已 应 用 于 生物 分 子 相互 作用 的 研究 归 为 表
6-1 RAR 15 种 类 别 。

印 渍 术 的 一 大 特点 ， 在 于 利用 生物 分 子 间 相 互 作用 而 予 特
腊 性 检 出 。 由 于 亲 和 的 甲 . 乙 双 方 中 , 甲 方 被 凝 胶 电 泳 分 离 已 有
TRAE, 再 经 印 渍 固定 化 , 又 使 它 获得 了 相对 稳定 性 。 印 渍 纸
(RM, 和 凝 胶 相 比 ; 甲 方 是 处 在 固定 化 介质 表面 ， 这 又 有 了 容易
和 乙方 亲近 的 机 会 。 因 为 生物 分 子 间 相 互 作用 具有 高 度 特异

e233 。

——————— CC

% 61 印 渍 术 在 各 类 生物 分 子 间 相 互 作 用 研究 方面 的 应 用

RNB F

baie 质粒 DNA 的 了 ae IIT pBR 322 质粒 DN Al [1]

DNA-DNA

mi 和 ADNA 的 BecoRI 酶 切片 段 | pata Rex why [2]

A. DNA 的 Hind III 酶 切片 段 | ADNA

SV 40 RNA 和 仓鼠 细胞 聚 (和 二 | i
mag AR(A*)|) gee DNA 一 习

pRAF 87 质粒 DNA SENET 组 织 LF [5]

RNA-DNA

ey Ts Se
2 aR) Dh 9 RNA Sucas Bar
RNA 结合 蛋白 te #4 eK 5 .

HeLa 细胞 核 的 DNA 结合 蛋 自 | HelaDNA. «.} [6]

RNA-S AA

DNA- SAI

蛙 病 毒 (FRV3) 的 DNA HABA) FVSDNA |) = 下

鼠 胰 线粒体 的 钙 调 蛋 白 结合 蛋白 | BAER FO x [8]
蛋白 质 -蛋白 质 | 组 蛋白 Hs Bs | 38 Bat 2b [6]
RTOS em eS | IB {C93
RAT RSA | zj 来 结合 蛋白 CURE apoB peg .. |.)
ee = BULD | fy
= 各 种 B- 硝 基 酰 替 葵 |
va FERRI yh A gS ROU - [12]
Ge, es FES
E. coli 的 谷 酰 胺 酶 和 玉 谷 a Sy
a mes pe ABS] Leeweme ] C13]
造血 细胞 胸 昔 激酶 脱氧 胞 兰 或 脱氧 尿 音 | [14
Os (ih fhe Tite ke 抗体 8-2 互 5，
pine | KOR oasbreas. 5)

Hh sh BER R(SCA) | SOARS ~ | 16}

*234¢

e (ER)
相互 作用 类 别 被 印 渍 分 子 - Fe tk | 文献

阿 米 巴 溶 酶 体 三 种 酶 类 (N- 乙 酰
RL NE MG; 8- 葡 糖 埋 酶 ; ao- 甘

各 酶 的 单 克隆 抗体 | [17]

抗原 -抗体 |B)
革 兰 氏 阴性 菌 外 膜 脂 多 糖 脂 多 糖 抗 血清 | 13)
小 鼠 癌 胚 抗原 (CBA) CEA 单 克隆 抗体 | [19]
ee rr
| .Pergeao RR CRERLS| secu wee | [2
了 C8 ops et
rae Ag SMR KF ES gp =
: 肝 细 胞 质 膜 生长 激素 受 体 蛋白 | “人 生长 激素 [ad4]
RR RE ERI Oe FERIR CR CTSED, a ot
ieee jp | RRR 伴 刀 豆 球 蛋 自生 | (26)
Maa eee Lie ZR [27]

细胞器 - 受 体 | ,中国 仓鼠 外 梨 细 胞 的 淋 球 菌 菌 毛 | ONBr 裂解 的 淋 球 姜 | [as

生活 副 流 感 病毒 [29]

| 生活 鼠 肾 细胞 [30]

性 , 当 用 乙方 与 之 作用 时 , 即使 乙方 处 在 其 它 分子 群 中 ， 也 能 识
- 别 出 甲 方 而 发 生 相 互 作用 , 这 就 具有 了 高 度 灵 人 敏 性 。 显 然 , 印 渍
- 术 记 体现 的 高 纯度 、 高 稳定 性 、 易 接近 性 和 高 灵敏 度 ， 再 加 上 操
: 帮 简 便 、 装 置 简单 以 及 多 考 贝 等 特点 , 使 它 成 为 探讨 生物 分 子 间

e235 。

相互 作用 的 优良 技术 。 事 实 上 , 除了 那些 用 常规 染色 剂 或 用 预 标 -
记 样 品 显现 现 侍 谱 的 少数 印 汪 实验 外 ， FEE KS ENRICH BT A
为 印 涡 术 应 用 于 生物 分 子 相互 作用 的 实例 。 为 了 便于 理解 这 方
面 应 用 的 广泛 性 , 表 6-I 列 出 了 匡 类 生物 分 子 相 互 作用 的 实例 。-
值得 重视 的 是 ， 利 用 生物 大 分 子 印 渍 术 来 探究 各 类 生物 分 -
子 作 用 于 细胞 的 分 子 机 理 ， 探 究 病 毒 、. 微 生物、 寄生 虫 等 感染 细
胞 的 分 子 基 础 , 常 是 最 方便 和 有 效 的 方法 之 一 。 前 面 ,作者 闸 歼
举 过 红细胞 膜 上 副 流感 病毒 受 体 分 子 的 检 出 2 人 血浆 中 上 鼠 肾 -
细胞 受 体 的 检 出 9 等 实例 ,都 能 反映 印 渍 术 在 此 领域 研究 中 的
优良 效果 。 最 近 潘 华 珍 等 人 也 用 印 渍 术 探 讨 了 补体 On, 520M
胞 膜 结合 部 位 与 结合 的 基 团 c0。 她 们 过 去 曾 证 明 , 阵 发 性 睡眠
性 血红 蛋白 尿 症 (PNH) 患 者 的 红细胞 对 补体 溶 和 所 敏感 22, 后 来
又 用 对 唾液 酸 专 一 结合 的 尝 血 凝集 素 处 理 PNH 红 细胞 ， 证 明
它 能 降低 补体 溶血 ， 间 接 证 明了 它 与 红细胞 膜 血 型 糖 蛋白 的 结 -
合 。 现 用 印 渍 术 , 即 先 将 红细胞 膜 用 SDS-PAGE 4} 25, HAAN
于 NO 纸 ， 再 用 关 根 过 氧化 物 酶 标 Oss OS, BRARHO, 只
和 红细胞 的 血型 糖 蛋白 A 结合 con。 由 此 可 见 印 渍 术 能 方便 而
容易 地 获得 生物 分 子 间 相互 作用 的 直接 证 据 ，: 欢 而 揭露 细胞 间 -
相互 识别 , 药物 对 细胞 作用 等 等 的 分 子 机 理 。 此 外 , EM ERE
所 言 ， 研 究 核酸 与 蛋白 质 相 互 作用 已 是 当代 务 子 生物 学 中 又 一 :
新 的 热点 加)， 正 在 迅速 发 展 。 HRSA EAHA BE
白 与 操纵 基因 、 工 型 限制 性 内 切 酶 与 接头 - 氨 酰 化 合成
MA tRNA 等 这 一 类 蛋白 质 -= 核酸 相互 作用 的 和 研究 汪 有
关 核 小 体 、 核 糖 体 等 庞大 的 蛋白 质 -核酸 复合 体系 的 控
讨 ， 也 在 不 同 程度 上 取得 了 重要 进展 ca BR, Hi
A A Lc A

=e

—, £@R 5) én DNA wae
定位 中 的 应 用

44, DNA Fr Fl il EBA Sanger 的 双 脱 氧 末 端 终止 法 ，
UR Maxam-Gilbert 的 化 学 裂解 法 “。 正 如 黄 承 汉 所 言 , 这 两
种 方法 测定 的 都 是 已 被 克隆 的 DNA, 虽说 所 测 DNA 与 其 母体
一 样 , 却 是 借 腹 怀胎 ”都 是 克隆 载体 和 转化 后 扩 增 的 产物 。
那 末 ; 能 否 直 接 窥视 未 克隆 的 DNA 序列 呢 ?Ohurch 和 Gilbert
提出 的 基因 组 DNA 测序 法 对 此 作出 了 肯定 的 回答 ”“"， 并 被 人
TSA BARS,

Church 和 Gilbert 所 创 基因 组 DNA 序列 直接 测定 法 系 由
珠 化 学 裂解 法 <" 和 DNA 印 渍 术 结 合 组 成 ,其 原理 如 图 6-1。 简
言 之 ;用 适当 的 限制 性 内 切 酶 水 解 细胞 总 DNA,， 再 进行 碱 基 的

FECOoRI' c ¢ EcoRI

a ere ee
, 3 5”

ll V
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-人 G R

Le 人 有
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AS ES allt 5
CCR

图 64 基因 组 DNA 序列 直接 测定 法 示意 图

一 示 探 针 ,C A HOE ME
全 .能 补 探 针 工 检 出 的 片段 ; 了 :不 能 破 探 针 工 检测 的 片段 。

ea D37。

部 分 裂解 (图 6-1 则 是 以 肝 解 胞 喀 院 为 例 )。 此 后 经 6W%PAG 变
性 电泳 , 把 各 单 链 DNA 片段 分 离 , 再 印 渍 于 尼龙 膜 ， 并 经 紫外
光照 射 使 之 固定 化 。 此 印 涡 纸 与 特异 性 3?P 标记 RNA RF
交 后 , 即 可 通过 放射 自 显影 直接 读 出 碱 基 顺 序 。 由 此 可 兄 ,本 法
HEBRAZ—-LILET OUR, WHARF, AB
EcoRI 消化 DNA, Alf EVER AS BWR, WAS o AO
KM, HAVA, VR EB RAS o RHE
与 探 针 工 杂交 ， 于 是 在 印 渍 纸 的 自 显影 图 上 上 六 WA
6-1 中 所 示 DNA 链 左 侧 Heo 切 点 到 每 二 胞 喀 哇 碱 基 之 间距
离 相当 的 DNA 片段 。 相 反 , 6 28H EAA TR, BAR
能 检 出 。 其 它 腺 嗓 叭 、 鸟 嘎 叭 和 胸腺 喀 啶 碱 基 的 序列 拒 如 此 铝
作 ， 组 合 四 组 结果 即 可 获得 DNA 全 部 序列 中 AFORE
大 特点 之 一 是 印 渍 纸 可 反复 使 用 ， 因 此 可 依次 与 图 GE 中 所 示 .
探 针 工 III( 与 DNA 下 链 互 补 )， 或 II TV( 瑟 IDNA 正 链 互 补 )
进行 杂交 , 故 能 方便 地 测 出 两 条 链 的 碱 基 序列 这 样 做 ,省 去 了
原 有 间接 法 所 需 克 隆 载 体 这 一 繁复 步 又， 使 DNA 测序 法 更 省 -
事 、 更 快速 。

值得 指出 的 是 ， 近 年 已 利用 DNA 测序 法 来 分 析 蛋 自 质 的
氨基 酸 序列 。 自 1983 年 以 来 , 每 年 用 DNA 测序 法 分 析出 氨基
酸 序列 的 蛋白 质数 ， 已 超过 直接 用 经 典 的 -Edman 法 测 蛋 和 白质，
序列 的 数目 ， 而 且 逐 年 增 大 着 二 者 的 差 中 eam。 目 前 ， 印 渍 术
也 已 参 入 到 这 种 用 DNA 测序 法 分 析 蛋 白质 序列 的 过 程 中 ， 其，
大 致 轮廓 如 下 ，(1) 选用 富 含 需 测 蛋 白质 的 组 织 ， 分 离 出 总 .
RNA, (2) 分 离 纯化 出 该 蛋白 质 指 MRNA, (3) 以 mRNA WBE
板 , 用 首 转 录 酶 催化 合成 第 一 cDNA Be, (4) 碱 降解 除去 RNA.
模板 ,利用 第 一 cDNA 链 的 3' AM RIMES, EWEN
或 (和 )DNA 聚合 酶 工作 用 下 ,合成 第 二 链 的 CDNA; (6) 用 核酸

23B 。

BGS, WF RHA, 7 RIL DNA, (6) 将 双 链 cDNA- 与 质粒 载
体 进行 克隆 } 产 生 CDNA 文库 ; (7) 筛选 阳性 菌落 ， 即 将 NO 纸
贴 在 培养 上 上述 含 有 重组 DNA 杂种 分 子 的 转化 大 肠 杆菌 的 琼脂
SER AL, 使 各 菌落 印 渍 于 NO 纸 形成 复 本 , 在 印 渍 纸 上 原 位 消
化 后 ,用 放射 性 标记 的 DNA 探 针 进行 分 子 杂 交 ， 根据 放射 自 显
影 谱 挑 选 出 阳性 菌落 ; (8) 自 母 板 上 挑 出 由 印 渍 纸 指示 的 相应
的 阳性 菌落 , 进行 扩 增 ; (9) 分 离 重组 质粒 DNA, 经 限制 性 内 切
酶 消化 后 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ; 再 印 渍 于 NO 纸 , 然后 用 放
射 性 标记 的 eDNA BEATA FA, Wiki AHAB hy DNA
Hy ER; (10) 该 DNA 片段 即 可 按 前 述 间接 法 或 直接 法 测 出
DNA 序列 ,车 用 后 者 则 又 将 用 到 印 渍 术 ; 21) 根据 三 联 密码 ，
从 测 得 之 DNA 序列 推测 出 目的 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 。 :

上 述 过 程 , 曾 三 次 用 到 印 渍 术 。 当 然 , 虽说 借助 DNA 测序
法 分 析 蛋 让 质 一 级 结 梅 已 形成 主流 ， 但 不 等 于 说 今后 就 不 会 再
采用 和 蛋白质 序列 直接 测定 法 了 。 事 实 上 新 法 也 有 局 限 性 ， 例 如
要 求 组 织 中 mRNA 具有 高 丰 度 的 目的 蛋白 质 否 则 较 难 实现 。
MATH DNA 序列 分 析出 的 蛋白 质 序列 常 是 蛋白 质 前 体 ; 也
不 可 能 反映 蛋白 质 合 成 后 的 修饰 情况 等 。 基 于 这 些 理由 ， 在 由
DNA 序列 耸 析出 的 蛋白 质 序列 前 面 ; 必须 冠 以 “推测 ”两 字 ， 借
此 说 明 本 蛋白 质 序列 可 能 和 其 实际 序列 有 某 种 可 能 存在 的 差
别 。 | |

印 渍 术 也 在 基因 定位 中 得 到 广泛 应 用 。 首创 印 渍 术 萝
Southern 曾 在 1982 年 所 写 的 一 篇 题 为 “DNA 分 析 在 绘制 人 类
基因 组 图 中 的 应 用 ”的 综述 中 强调 ,要 以 克隆 重组 DNA 技术 作
为 绘制 人 类 基因 组 图 的 新 策略 ， 并 配 以 最 有 效 的 DNA 测序 术 ，
使 之 尽快 绘制 出 一 张 能 帮助 人 们 把 DNA 结构 与 染色 体 功能 联
系 起 来 的 基因 图 29。 就 目前 而 言 ， 绘 制 基因 组 图 大 致 分 三 步 :

先 在 细菌 中 克隆 DNA 片段 ， 再 用 凝 胶 电泳 分 离 限制 酶 切片 段 寻
最 后 印 溃 并 在 印 渍 纸 上 进 行 分 子 杂 交 。 显 然 ; HOME DNA 序列 的 ，
主要 目的 在 于 把 大 的 基因 组 分 割 成 可 供 分 析 的 小 片段 ， 并 大 量
地 生产 纯化 了 的 堪 豚 ， 这 也 为 其 后 测 出 基因 组 中 特定 片段 所 采
用 的 生物 学 效应 之 类 的 方法 提供 材料 。 限制 酶 切 图 谱 的 绘制 主
要 在 于 了 解 限制 酶 沿 DNA 链 切割 的 位 置 ,这些 位 点 以 后 可 被
用 作 测量 沿 DNA 链 长 度 距离 的 参考 点 。 印 渍 纸 上 的 分 子 杂 交
则 是 为 了 对 限制 性 酶 切 图 谱 中 的 特定 序列 进行 定位 * 这 里 举 一
个 简单 的 例子 来 说 明 上 述 各 项 原则 。 假 设 我 们 有 一 个 短 而 纯 的
核酸 序列 , 比方 说 ， 一 个 人 类 和 蛋白质 的 mRNA。 用 目前 已 报道
过 的 大 量 方法 之 一 将 它 标 上 放射 性 。 此 时 守 它 就 可 用 帮 该 蛋白
质 基因 的 探 针 , 从 随机 修剪 的 人 类 DNA 文库 中 , 寻找 出 含有 该
蛋白 质 DNA 序列 的 克隆 。 如 果 用 这 种 操作 使 我 们 找到 了 两 个
克隆 , 那 末 就 说 明 已 鉴定 出 人 类 基因 组 内 两 个 重 迭 的 区 域 ,从 而
获得 了 绘制 两 个 克隆 所 共有 的 限制 性 酶 切 区 域 图 的 如 下 方法
从 两 个 克隆 所 得 的 DNA， 可 单独 地 和 组 合 地 被 限制 性 酶 切割 ;
并 用 凝 胶 电泳 分 离 ， 然 后 再 由 两 个 克隆 共同 的 片段 来 辨认 重 迭
区 域 。 重 迭 区 以 外 的 图 是 来 自 各 个 克隆 所 特有 的 片段 ， 通 过 把
该 片段 从 凝 胶印 渍 于 NO 纸 ; 并 用 分 子 杂交 检 FA, 就 可
以 确定 各 编码 列 序 的 位 点 cl。。

由 上 述 操作 所 能 测定 的 DNA 长 度 ， 取 决 于 克隆 片段 的 kK
短 。 通 常 , RKKETULREH RE. 实际 上 , 通常
可 以 利用 的 原核 生物 运载 体 的 最 大 插入 列 序 为 50kb, 理 论 上 最
长 距离 应 是 100 kb 左右 ， 这 个 路 高 相 当 于 一 个 小 红色 体 的 于 分
之 一 8

， 印 渍 术 用 于 基因 定位 的 又 一 项 例子 是 由 James 等 人 进行
gs 目前 认为 ,前 胰 高 血糖 素 原 在 胰 、 小 肠 合成 ; 可 能 还 在 脑 ，

- 2406

WSR. 它 在 胰 和 直肠 内 经 组 织 特异 性 的 转译 后 加 工 ， 会 产生
未 局 的 肽 。 这 些 由 前 胰 高 血糖 素 原 衍生 的 肽 类 中 ， 有 一 些 肽 的
功能 巳 经 清楚 。 例 如 糖尿 病 中 危害 最 大 的 是 由 胰 高 血糖 素 引起
的 高 血 粒 症 ， 因 尼 了 解 胰 高 血糖 素 基因 在 染色 体 中 的 位 置 ， 将
有 助 于 说 明 这 二 重要 激素 在 遗传 学 中 的 地 位 。 为 此 ，James 等
大 在 建立 了 人 = 水 鼠 体 细胞 杂交 克隆 基础 上 , BEAT TAC
糖 素 基因 定位 他们 把 杂交 克隆 细胞 株 DNA, 经 限制 性 内 切 酶
完全 消化 , 然后 进行 0.8% 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 再 印 渍 于 NO 纸 ，
并 用 舍 有 编码 前 胰 高 血糖 素 原 11 ~~ 65 序列 外 显 子 , 和 另 一 个 相
当 于 前 胰岛 素 原 66~,99 序列 外 显 子 的 限制 酶 切片 段 作 为 探 针 。
结果 表明 , 这 类 探 针 与 小 和 忌 和 人 的 DNA 杂交 ,分 别 产生 7.8kb
“Fl2.0kb 区 带 。 与 此 同时 ， 在 人 -小 鼠 杂 交 细 胞 中 凡 存 在 人 2
号 染色 体 的 平行 实验 中 ; 都 能 显现 出 2.0kb 区 带 ， 而 无 2 号 染
色 体 的 杂交 细胞 则 为 阴性 。 由 此 证 明 ， 估 的 胰 高 血糖 素 基因 应
定位 于 2 号 染色 体 ro。
GRAM 04, 02 及 了 因子 都 乱 由 MILO 的 基因 编码 的 , 同
属 GDA 的 第 三 组 抗原 cad。 其 中 , B 因子 为 单 链 的 血清 恒 白 , 分
FHA 95,000. BFE D 因子 的 作用 下 产生 两 个 片段: Ba
(Mr = 80, 000) 和 Bb(Mr=60,000)"", 有 关 也 因子 基 央 的 上
述 定位 及 其 基因 结构 分 析 也 是 采用 了 印 渍 术 。 例 如 ,Camphsll
等 人 利用 寡 核 霸 酸 法 盘 选 了 人 肝 cDNA SCE, RAT WHR BR
子 DNA 克隆 。 其 中 二 株 为 515bp， 定 位 于 B 因子 基因 的 Bb
Bi. JAE EERE SAO A DNA pea AE IER, 获得 了 4
。 株 平 均 大 小 为 40IEb 的 了 因子 基因 克隆 。 经 过 限制 酶 切 图 谱 分
新 ; 印 淡 纸 杂交 分 析 和 部 分 DNA sept RRB API
的 Bb 部 分 长 度 约 为 4kb。 在 一 段 3.38kb 的 B 因 子 DNA 中
《所 括 编码 Bb RAE 87~505 及 3' 非 转 译 区 ) 有 11 PBT.

9 2241 e

此 血清 蛋白 酶 的 功能 区 被 外 显 子 分 隔 在 不 同 的 内 含 子 内 “2 。

随 着 近年 来 分 子 生物 学 的 发 展 ， 人 们 花费 很 多 精力 试图 乔
清 基 因 表 达 及 其 调控 机 制 。 已 经 提出 了 许多 模型 ”殿中 最 著名
的 有 乳糖 操纵 子 模型 ， 色 氨 酸 操纵 子 模 型 和 核糖 体 蛋 自 质 基 因
的 自身 反馈 模型 等 。 最 近 ， 人 们 在 研究 五 .oz K-12 HK Hp M
Om2 OF ARMA BATH, 分 离 出 了 局 动 子 前 面 的 3800bp
长 度 的 DNA 片段 。 将 这 个 小 片段 导入 PDBRasss 质粒 ; 带 有 这 种
质粒 的 大 肠 杆菌 虽然 可 以 正常 地 产生 'Omzp O a, (AEB
外 膜 蛋白 质 一 一 Op 卫 和 蛋白 的 生产 儿 乎 完全 被 抽 制 对 此 最
简单 的 解释 是 ， 从 这 300 bp 里 可 产生 出 Oo F EAR id A
子 。 这 种 解释 很 容易 用 实验 来 验证 。 首 先 ， 攻 实验 确定 了 该 区
* 0 100 200 300 400 500 600 bp. AuUCRBA CX 2 Ka,

CX28 . 见 图 6-2) 的 DNA 序 列 , 再
Hpal Mspl ATG omc , (8 FAW ea ah FF BY a Hs,

DNA | 以 证 明 启动 子 的 存在 和 转录
二 2 区

6-2 Om2 C 基 因 前 方 的 基 IEW MOmp0H RHA
因 的 转录 向 转录 的 。 如 图 6-2 所 示 ，

其 转录 终止 部 位 在 五 pc I 和 Msp 工 两 个 限制 性 内 切 酶 的 切 点 之
间 。 此 外 ， 从 这 个 区 域 的 DNA 序列 中 可 以 看 出 典型 的 转录 终

止 信号 。 这 些 都 表明 OX 28 KALE NF RNA, 为 了

验证 这 种 推测 , 又 用 此 OX28 DNA 片 段 作 为 探 针 ,去 探测 印 渍 纸
上 细胞 抽 提 液 中 RNA 分 离 物 ， 结 果 检 出 了 OSRNA, 这 说 明
OX 28 区 可 转录 出 6S RNA, 这 种 低 分 子 量 RNA 在 基因 表达
调节 机 制 中 起 着 调节 因子 的 作用 。 这 一 结果 和 其 它 一 些 证 据 使
日 本 学 者 水 野 猛 提出 了 另 一 种 新 的 基因 表达 调节 机 制 一 -渗透
压 调节 机 制 “2。 这 一 实例 也 不 难看 出 印 渍 术 在 基因 定位 中 所 起 “
2 #425

鹊 作用 。

就 人 类 基因 定位 的 研究 而 言 ,1983 年 第 七 届 国 际 人 类 基因
定位 专题 讨论 会 上 统计 , 已 定位 的 人 类 基因 总 数 达 824 个 , 这 比
第 六 届 (81 年 ) 公 布 的 427 个 多 了 近 4004“, 取得 迅猛 发 展
的 种 种 原因 中 ，Deisseroth 等 人 首创 的 把 分 子 杂 交 技 术 应 用 于
基因 定位 中 的 策略 立 下 了 汗马功劳 咯 ,40]。DNA 印 渍 术 的 建立 ，
使 分 子 杂 交 能 在 稳定 的 印 渍 纸 上 进 行 ， 更 加 速 了 这 一 领域 的 发
展 。 现 将 印 渍 未 应 用 于 基因 和 定位 的 主要 步骤 归纳 如 下 59. (1) 用
适当 的 限制 性 内 切 酶 分 别 将 来 自 人 类 细胞 、 鼠 类 细胞 , 以 及 由 这
二 者 产生 的 杂种 细胞 DNA， 的 进行 酶 解 消化 ; (2) 通过 琼脂 糖
BEBE IKE, 获取 这 三 种 细胞 DNA 的 酶 解 图 谱 ; (3) 以 琼脂
糖 凝 胶 为 印 渍 模板 , 把 酶 切 区 带 印 涡 于 NO AR; (© 用 标记 好 的
cDNA 探 针 和 印 渍 纸 上 的 DNA 酶 切片 段 进行 杂交 ; (5) 通过 放
射 自 显影 技术 将 与 探 针 互补 结合 的 一 些 杂 交 区 带 显示 出 来 。

可 见 其 全 过 程 实 为 常规 印 渍 术 操作 方法 。 由 此 得 到 的 结果
如 何 分 析 呢 ? 因为 不 同 种 的 动物 中 , 大 多 数 基因 的 DNA 序列 保
留 的 情况 和 程度 是 不 同 的 ,所 以 由 适当 的 限制 酶 切 所 得 DNA 的
酶 切 图 谱 也 不 相同 ,具有 明显 的 种 属 特征 。 据 此 ; 我 们 可 从 图 谱
区 带 的 变化 了 解 到 与 探 针 互补 结合 的 DNA 序列 (基因 ) 在 杂种
细胞 DNA PRA, 把 此 结果 与 杂种 细胞 中 人 染色 体 的 丢
失 情 况 联 系 起 来 ,就 可 以 给 该 基因 定位 。 如 图 6-3 所 示 , 系 用 印
渍 纸 上 原 位 杂交 所 作 克 隆基 因 定 位 , 由 此 就 能 理解 这 种 分 析 。 图
中 表示 出 分 别 用 限制 性 内 切 酶 BeoRI 和 Wend II, 处理 大 (HD)、
中 国 仓 诺 (eh) 两 种 亲本 细胞 ， 以 及 这 两 种 细胞 融合 得 到 的 不 同
杂种 细胞 ， 分 别提 取 的 DNA 与 人 的 白 蛋 白 基 因 探 针 所 作 分 子
杂交 。 由 图 6-3 不 难看 出 ， 含 有 人 4 号 染色 体 的 杂种 细胞 (第
3.7 列 )， 能 显现 出 单 用 大 细胞 DNA 进行 分 子 杂 交 时 的 同 种 区

e。 243 6

kb

6,8 &

3,5

二 5 ae

2 3 es, accel
图 6-3 人 类 白 蛋 白 基因 探 针 与 来 自 人 类 (H)、 中 国 仓 服 外 革 Gch
细胞 , 以 及 以 它们 为 亲本 产生 的 杂种 细胞 (十 .一 ) 的 基因 组 总 DNA，
在 印 渍 纸 上 进 行 分 子 杂交 所 显示 的 放射 自 显影 谱
各 基因 组 DNA RASH Hind III 和 HooRl 两 种 限制 性 内 切 梅 消 ”
化 ,经 电泳 分 离 、 ENA hinged
“URE »
带 (比较 工 和 3 列 及 5 和 7 列 )。 相 反 ， 不 含 和 至 导 染色 体 的 杂种
细胞 (第 么 8 列 ) 则 无 此 区 带 。 这 就 表明 ; 人 类 白 蛋 自 基因 是 在
第 和 号 染色 体 士 。
用 印 溃 术 进行 基因 定位 的 优越 性 ， 还 在 地 可 以 用 蕊 络 基 困
组 中 一 切 结构 基因 定位 , 只 要 能 获得 它 的 CDNA RRA, TT
不 上 这 些 基因 在 细胞 杂种 中 是 否 得 到 表达 。 所 以 局 这 种 方法 在
全 那 些 为 组 织 专 一 性 功能 编码 的 基因 定位 中 特别 有 用 品 此 办 ”
这 种 印 渍 纸 上 分 子 杂交 法 所 用 的 基因 探 针 可 以 来 自在 何 物 种
只 要 这 些 物 种 的 基因 组 中 有 足够 的 可 与 大 类 基因 组 中 相应 的
基因 DNA 序列 发 生 交叉 杂交 的 类 似 物 即 可 ca
根据 上 述 原理 , 印 渍 术 也 能 应 用 于 染色 体 精细 结构 的 定位 ?

9244-6

‘Pou |

H64 WRAAALSREAWA/ MAA DNA 克隆 出 的
2.2kb AWESA TUTE (EEN pBR325 中 ), 及 这 一 重组 质粒 中
EcoRI, Pou II 两 种 内 切 酶 的 切 点

2»

A | es team sop

ats fH
图 6-5 以 人 的 2.2kbDNA 重复 序列 与 它 的 亚 片段 1.2 kb,
0.6kb K0.4kb 为 探 针 和 具有 人 类 完整 的 12 号 染色 体 (12A)
RAMA AIMRAN 12 号 染色 体 (12A-1)7 细 胞 杂种 的 DNA
杂交 所 得 的 带 型 图

oa 245e

这 类 工作 最 有 代表 性 的 可 推 Iavw 等 人 的 实验 cm。 他们 把 只 合 :
有 人 第 12 号 染色 体 的 人 - 鼠 杂 种 细胞 的 DNA, 用 限制 酶 切 成 许
多 片 朋 后 组 装 到 和 哈 菌 体 中 ， 并 从 这 些 重组 噬菌体 中 克隆 到 一
个 人 的 2.2khb 重复 序列 (图 6-4) ,并 用 这 个 序列 作 探 针 ,与 此 同
时 ,用 恨 制 性 内 切 酶 政 oRI 消化 原 杂 种 细胞 的 DNA， 经 电泳 分
离 并 印 涡 后 , 和 上 述 2.2khb 序 列 探 针 在 印 污 纸 上 进行 分 子 厅 交 ，
结果 显示 出 如 图 6-5 A 所 示 多 种 很 清楚 的 区 带 。 再 用 限制 性 内
切 酶 Pow II 消化 2.2kb 重复 序列 , 可 得 到 长 度 为 把 2Kb 0.6
kb, 0.4kb 三 个 亚 片段 。 把 它们 作为 探 针 分别 与 原 厅 种 细胞 ，
的 DNA 片段 杂交 ， 可 得 到 如 图 6-5 B, 及 .Q. 所 示 简 单 得 多 的 杂 :
交 区 带 。 用 这 三 个 探 针 进一步 与 具有 不 同 缺 失 部 分 DNA 序列
的 人 12 号 染色 体 的 人 - 鼠 细 胞 杂种 DNA 片段 杂交 ， 就 能 从 各
杂交 图 谱 综合 分 析 中 , 对 12 号 染色 体 的 精细 结 梅 进行 定位 。 合
如 图 6-5 中 ,各 列 凝 胶 谱 的 左 列 是 侧 失 短 辟 未 端的 12 号 染色 体
(12A-1), 右 列 则 具有 人 类 完整 的 地 号 染色 条 。 比较 和 种 探
针 所 得 印 渍 杂交 谱 ( 即 图 6-5 fy -A-D) 不 难得 出 如 图 6-6 所 示 .
结果 , 即 缺失 短 臂 末端 的 了 2 号 染色 体 12A=1 缺失 6.0kb 5.4
kb，5.0kb, 4.6kb #1 4.2kb 五 条 带 ， 它 们 被 定位 于 12 pter—
12p1205 区 域 ,而 2.2kb 则 定位 在 12q12-12qter 区 (图 6-6)。
印 渍 术 应 用 于 基因 定位 的 报道 还 有 许多 ,例如 Anurag 等 :
人 利用 人 Bs 干扰 素 的 互补 DNA 作为 探 针 ， 从 存在 于 兴 MT
Oharon 4A 中 的 基因 组 DNA 库 中 半分 到 了 两 外 大 的 基因 组 .
DNA 克隆 人 Bs Fl ABy, 并 用 它们 作 了 B 于 扰 素 的 基因 定位 2。
他 们 发 现 ABs 和 Bs 是 不 同 的 ，XBs 用 印 渍 杂交 法 可 以 转移 到
人 的 2 号 染色 体 上 , 而 AB, 却 不 能 转移 到 2. 反 9 和 12 Beate
上 。 更 深入 的 DNA 印 渍 实验 和 核 背 酸 序列 分 析 表 明 ,NB AR FF
在 于 2 号 .5 号 和 9 号 染色 体 上 so。 这 就 改正 了 过 去 认为 人 有

sh246。

x

Vet
zV09

T-VZT

pap 7z-vzi

kb

22+ 十 一 一
6.0 十 一

54. 一
SS

Se ea

42 十 -一

A6-6 根据 2.2zb 重复 序列 和 它 的 亚 片段 十 .2kb、0.6kb 及
0.4 kb 作 探 针 与 具有 完整 的 人 类 12 Ee Gath RAPID AH 12
号 染色 体 的 细胞 杂种 DNA 杂 s 交 显示 出 的 带 型 (十 :表示 有 , ¢
表示 缺失 ) 可 把 6.0kb、 5.4Kkb, 5.0kb, 4.6 kb 和 4.2kb5 BA
定位 于 ]12pter 一 12p1205 区 域 ,把 2.3kD 定位 在 12qf2 一 12qter

干扰 素 的 基因 存在 于 2.5.9 号 染色 体 的 结论 。

三 ,在 基因 结构 分 析 中 的 应 用

基因 结构 中 的 外 显 子 数 目 、 突变 、 甲 基 化 程度 等 都 可 用 印 汪
术 进 行 分 析 。

1. 探测 基因 结构 中 外 显 子 数目

在 Southern 创立 印 渍 术 后 不 到 两 年 ,法国 的 Chambon 研
究 小 组 在 用 印 渍 术 分 析 鸡 卵 清 蛋 白 基 因 时 ， 发 现 高 等 真 核 生物
的 基因 中 含有 不 编码 的 揪 入 顺序 ”…。 这 项 在 分 子 生 物 学 发 展

e。 247 +

中 具 深 远 意 义 的 辉煌 成 果 , 也 使 印 渍 术 名 声 大 振 , 并 很 快 得 到 推
广 和 应 用 。 当 时 ，Ohambon /) 44 LS NEE AB MRNA 为
模板 ， 经 反 转 录 后 得 eDNA。 用 此 作为 探 针 去 探测 印 渍 纸 上 小 ，
鸡 基 因 组 DNA 的 EcoRI 和 HindIII Rie HE, AAS
先 已 经 知道 这 种 CDNA 探 针 序列 中 没有 EoORI Fl Hind IIT 3x
两 种 限制 性 内 切 酶 的 切 点 ， 因 此 用 这 种 探 儿 去 和 印 渍 纸 上 直 这
两 种 酶 切片 段 形成 的 ` 其 中 包括 有 一 段 卵 清 蛋白 基因 的 序列 进
行 分 子 杂交 , 理应 只 显示 鸡 卵 清 蛋白 基因 的 章 二 区 带 》 但 是 ; 实 、
验 结果 却 获 得 了 好 几 条 区 带 。 这 只 能 解释 为 ， 鸡 卵 清 蛋 白 基 因
的 DNA 序列 是 被 一 些 不 能 转录 为 成 熟 卵 清 蛋 白 mRNA 的 序
列 所 分 审 ， 这 些 插入 序列 中 含有 BeoRI Al Hén d III 这 两 种 限
制 酶 切 点 ,致使 印 渍 谱 上 显现 出 几 条 区 带 。

现在 已 经 肯定 ， 基 因 内 存在 不 编码 播 入 序列 是 真 核 生物 基
因 中 存在 的 普遍 现象 , 并 因此 被 称 之 为 断裂 基因 (Spli gene), Ay
渍 术 也 就 成 为 探测 基因 内 有 和 否 内 含 子 . 有 多 少 肉 含 子 的 方法 之
一 。 例 如 , 属于 多 肽 类 激素 的 胃 沁 素 (Gastrin) 公 认 是 胃酸 分 沁
的 主要 调节 因子 , 有 关 胃 泌 素 基因 已 从 人 DNA 基因 文库 中 分
离 出 来 。Wiborg 对 携带 人 胃 沁 素 基因 组 的 噬菌体 基因 文库 进
iii, BAA WH cDNA 克隆 的 30 MERE, 经
纯化 分 离 得 到 的 DNA, 用 限制 性 内 切 酶 消化 并 用 核酸 印 渍 术 分
°°, GRR, AB WREAAA 4400bp BAAS
Fo ARF 1 448500 bp, SFR SBF ATA EM bp 的
5 端 非 编 码 区 内 。 内 含 子 II 有 129 bp, ERR Be ES
元 素 活性 部 分 的 区 域 , 与 编码 胃 刻 素 前 体 蛋 白质 主 链 SN 端 部 分
WRIA MIT, 这 是 内 含 子 分 隔 功 能 性 区 域 的 又 三 不 例子 cm。

微 管 对 细胞 形状 的 维持 、 细 胞 运动 和 细胞 内 物质 的 运输 闫
系 很 密切 。 微 管 是 由 分 子 量 约 5EDa ft) a AB BEE BG

- 24B< .*

(Tubulin) WR. RSH, o 和 及 两 微 管 蛋 白 亚 单位 形成 异 质 二
聚 体 ， 在 数量 上 两 亚 单位 大 致 相等 。 曲 在 1978 年 ， 英 国 剑 桥
天 学 的 Gowaa 小 组 吧 ] 从 鸡 中 分 离 出 编码 K& 和 司 微 管 蛋白 的
mRNA, 并 证 明 w 和 和 蛋白质 是 分 别 由 两 种 不 同 的 基因 , 即 a6
微 管 蛋 白 的 基因 编码 出 来 的 。 他 们 用 来 自 不 同 鸡 种 的 微 管 蛋 特
mRNA 构建 的 CDNA 作为 探 针 , 经 核酸 印 渍 术 分 析 ， 发 现 鸡 os
和 B 微 管 蛋白 基因 在 单 倍 体 基 因 组 中 都 分 别 含有 4 个 不 同 的 基
因 挝 贝 。 他 们 建议 在 < 和 B 右 下 角 标 号 ,如 oro, Br Bo 等 , 来
表示 不 同 的 拷贝 。 以 后 ,Oowan 等 人 用 鸡 B 征管 蛋白 基因 作 探
针 来 筛选 人 基因 文库 。 经 核酸 印 渍 术 分 析 , 发 现 含 65 微 管 蛋白
基因 的 6.8kb 片段 含有 三 个 非 编 码 区 及 三 个 播 入 重复 结构 。 又
揭示 , 微 管 蛋白 基因 组 内 存在 有 许多 功能 性 的 假 基因 59。 BB
假 基因 , 是 指 与 某 功能 性 基因 在 核 苷 酸 序列 上 有 了 明显 的 同 源 性 ，
但 又 由 于 各 种 各 样 的 突变 ， 使 其 不 能 正常 表达 的 一 段 DNA 片
EE,

Mk o RE SBE-PREY MYER. 它
经 被 动 扩散 进入 肺泡 结构 ， 能 与 多 核 白 细胞 的 弹性 蛋白 酶
(Elastase) 结 合生 成 酶 和 抑制 剂 的 等 摩尔 复合 物 , 使 肺 的 弹性 纤
维 免 遭 弹性 蛋白 酶 的 水 解 ， 从 而 保护 肺泡 结构 。 在 临床 上 有 先
天 性 必 - 抗 胰 蛋 白 酶 缺陷 的 病人 , 较 一 般 人 患 肺 气 肿 阻 塞 者 要 高
”20~80 倍 。Leicht 等 人 利用 狮 独 w- 抗 胰 蛋 白 酶 eDNA 克隆 作
为 杂交 探 针 , 从 人 体 基 因 组 DNA 库 中 筛选 出 2x108 个 鸣 菌 班 ，
并 获得 了 它们 的 分 离 物 。 经 过 DNA 印 渍 未 分 析 和 电镜 观察 证
明 ;wi- 抗 胰 蛋 白 酶 基因 位 于 人 体 基 因 组 经 BeoRIT 消化 所 得 9.6
kb DNA 片段 内 ,全 长 约 5 千 bp; 确定 了 该 基因 有 4 个 外 显 子 ，
TRESS FA 0.71, 0.33 .0.13 和 0.27kb，8 个 内 含 子 分 别 长
1.45,1.15 #1 0.8kb; 证 明了 人 体 ui- 抗 胰 蛋 白 酶 和 鸡 卵 清 蛋白

e249 «-.

分 子 间 存在 着 同系 顺序 ,二 者 属 同一 蛋白 质 亚 族 等 名 寺
2 探测 基因 结构 中 甲 基 化 程度
印 渍 术 在 分 析 DNA 序列 中 甲 基 化 程度 也 十 分 天 用 如 所
周知 ,在 哺乳 动物 细胞 的 DNA 序列 中 含有 一 种 下 甲 基 胞 喀 喧
(0)。 在 人 类 DNA 中 品 9 约 占 全 部 胞 喀 啶 碱 基 的 3.5~
4.4% 左右, 且 在 其 3 端 常 与 鸟 味 叭 碱 基 为 邻 寺 即 : 5-5"0G-3',
许多 实验 证 明 ，DNA fy SEE 5 RB, BRB 癌变 机
FA eA OO, Pin, Razin 等 人 认为 二 活动 着 的 基因
是 处 在 低 甲 基 化 状态 ， 而 不 活动 的 基因 是 高 度 甲 孝 化 的 宛 ?
Razin 证 明 ， 受 精 后 早期 豚 细 胞 DNA 是 比较 低 甲 基 化 的 ; 随 着
豚 胎 组 织 分 化 成 熟 就 逐渐 甲 基 化 5s; Groffen “SA CESS FF 3H
WPS EBA, SCTE Hs A SE A O-fes 的 活动 与 甲 基 化 程度 呈
THA, Feinberg 证 明 ,在 人 类 结肠 癌 和 肺癌 中 ,第 长 激素 基
因 、c- 珠 蛋白 与 ?- 珠 蛋白 基因 都 是 低 甲 基 化 的 ， 而 原 发 性 肝癌 则
更 低 “。 由 上 可 知 ， 深 入 研究 DNA 序列 甲 基 化 程度 具有 重要
的 生物 学 意义 ， MRP 25: Ne
极 佳 的 方法 。
基因 甲 基 化 的 水 平 可 通过 限制 性 内 切 酶 Mspi 知 Hpa II
分 别 消 化 欲 测 DNA， 再 经 凝 胶 电 泳 分 离 并 印 渍 于 固定 化 纸 后 ，
比较 这 两 种 酶 的 印 渍 谱 就 能 求 得 。 因 为 Msp La 2pa II fy YW
点 的 在 00GG hh, WRI AEF oh Fy OEE RAL, Bll, CaOGIG 时 ，
Hall 不 不 能 切割 了 ,而 Msp 工 仍 能 切 。 因此 ; 比较 同 种 基因
的 Apa 1] Fil Msp 1 4 4b Ene, OL BE Jz RH KE BY FS A BB
Eo Kunnath 等 人 就 是 这 样 做 的 5, 他 们 研究 了 大 白鼠 rRNA
基因 中 09QG 序列 的 甲 基 化 。 做 法 是 , 把 大 白鼠 PRA Aya
tA pall 和 MspI 消 化 , 所 得 产物 经 电泳 并 印 渍 于 NO 纸 ，
然后 用 卫 标 记 的 大 白鼠 rRNA 与 其 杂交 求 出 该 基因 上 两 种

* 2506

酶 的 切 点 数 与 甲 基 化 之 间 的 定量 关系 0。 他 们 发 现 , 妊娠 第 1 全
FA EER, FOP HE FRNA 基因 中 很 少 有 甲 基 化 。 到 了 第 ]9 K,
约 有 30 色 的 TRNA 基因 被 甲 基 化 ， 并 且 一 直 持 续 到 成 年 仍 保 :
持 着 这 一 水 平 。 但 是 到 了 成 年 ，DNA 甲 基 化 的 模式 发 生 了 改 -
变 ， 由 连续 甲 基 化 模式 变 为 不 连续 甲 基 化 模式 ”…。 前 者 是 指 -
COGG 序列 中 胞 喀 喧 全 被 甲 基 化 ; 后 者 是 指 该 序列 中 约 有 807%
的 胞 喀 啶 被 甲 基 化 ， 这 可 能 是 由 于 基因 中 含有 非 甲 基 化 区 域 的 -
RB 沽 R |
8. 分析 基因 突变

| 印 渍 术 也 被 用 于 基因 突变 的 研究 。 突 变 ， 即 是 基因 结构 的
改变 。 从 入 吹 菌 体 到 人 类 ， 突 变 是 一 种 普遍 存在 并 经 常 发 生 的 -
生物 学 现 复 。 它 既 可 能 使 一 个 群体 获得 有 利 的 适应 进化 的 生存 :
结构 ， :也 可 能 使 一 个 群体 从 此 蒙受 有 害 的 遗传 负担 。 分 析 与 检
测 这 些 突变 , 无 疑 是 分 子 遗 传 学 研究 的 重要 方面 之 一 。DNA 突
ARM ZEA TE AG ER A RAR RRA ARE
ARH mw, AREBA=HDPE™, WKF AiR SE
核 背 酸 杂 交 技 术 和 核酸 酶 裂解 的 变性 电泳 技术 。 其 中 ， 凡 导致
限制 性 内 切 酶 切 点 增加 或 丢失 的 单个 碱 基 置 换 ， 原 则 上 都 可 用
印 渍 术 直 接 检 出 ””。

基因 突变 的 结果 产生 了 DNA 的 多 态 性 。 记 谓 DNA BA

性 是 指 染 色 体 DNA 等 位 基因 中 核 背 酸 排列 顺序 的 差异 性 ”。
在 生物 进化 过 程 中 ， 由 于 种 种 原因 引起 的 基因 突变 和 IDNA 分
FAB. MAH DNA 分 子 内 核 苷 酸 排列 顺序 发 生 改 变 。 淄
这 种 改变 影响 到 编码 基因 或 非 编 码 基 因 中 限制 性 内 切 酶 识别 位 -
点 时 ; 利用 限制 性 酶 切 图 谱 分 析 , 就 可 以 检测 出 这 种 存在 于 群体 :
之 内 的 DNA 多 态 性 二 并 称 此 为 DNA .限制 性 片段 长 度 多 态 性
(DNA Restriction Fragment Length Polymorphisms, ij ff:

e251 «¢:

REILPs) 。 显 然 , 印 渍 术 既 然 能 用 于 基因 突变 的 测定 号 也 就 成 为
> J RELPs fy ERAT. Win, SARKRA FB (OTC)
是 肝脏 线粒体 中 的 一 种 酶 ， 它 的 缺失 将 产生 一 种 严重 的 性 连锁
的 先天 代谢 缺陷 。 症 状 为 所 中毒 、 蛋 白质 不 耐性 和 精神 迟缓 , 潜
是 男性 则 会 早期 天 亡 。 由 于 OTC 在 羊膜 细胞 中 未 能 表达 ,无 法
用 羊膜 穿刺 术 进 行 产 前 诊断 。 胎 儿 肝 脏 活 组 织 检查 法 因 有 危险
性 也 难 采 用 。Rozen 等 人 据 此 将 人 体外 周 撑 淋巴 细胞 或 培养 的
皮肤 成 纤维 细胞 中 的 DNA, 用 几 种 不 同 的 限制 性 内 切 酶 消化 ; 电
泳 分 离 后 印 涡 于 NO 纸 , 再 以 0T9O 的 cDNA ASR, AFH WAG
上 的 酶 切片 段 进行 分 子 杂 交 。 观 察 印 渍 纸 上 荣 交 谱 5 发现 其 放
射 性 强度 有 着 入 Ue a NY, FEA RAE KA
的 基因 片段 %9。 当 他 们 用 Msp 工 限 制 酶 消化 时 》 除 予 可 产生 学
个 国定 片段 :1 好 .5 5.4, 3.5, 2.0 AL 1.9kb+h; WRB PHA HT
aE, FARRAR RHERRRESAS. HH
的 可 变 片 段 为 6.6 和 6.2kb; H—-FPMI A O.1L AL 4 4kb, HE
他 们 按 四 种 类 型 进行 了 单 型 分 析 , 其 各 自 频 率 经 85 PIER AR
查分 别 为 : A (6.0+5.1kb) =0.45, B(6.64+4.4kb) = 0.16,
0(6.2+5.1kb) =0.28, D(6.2+4.4kb) =0.115 HEH
有 69% 女性 ， 其 两 条 X RAKBARAMAB, BRELP ZA
合 ”……。. 利 用 此 种 单 型 分 析 ， 可 对 OTO 家 族 中 下 FEP 杂 合 女性
提供 遗传 咨询 。 例 如 , 某 男 性 患 儿 OTO RR, JR A BW, TT
Fy ACW, MAE OTO 突变 必定 位 于 母亲 的 玉 型 己 染 名 体
上 。 其 儿子 中 属 A 型 者 为 患者 ， 属 9 WIE; RRB A BH
女儿 则 为 携带 者 。 如 果 患 儿 与 其 祖父 母 同 型 ， 则 可 和 刻 在 其 母亲
或 本 人 的 又 染色 体 上 新 发 生 了 自发 突变 ; 对 几 个 家 族 前 vies
RA, HS RT ae ee 4
BRIA JE — A SLI, 各 种 族人 群 的 发 病 率 均 在 12% #

- 252

右 ; 并 且 随 年 龄 增加 而 增加 , 65 岁 以 上 的 发 病 率 可 高 达 5% 。 糙 -
- 尿 病 有 胰 意 素 依赖 性 糖尿 病 和 非 胰岛 素 依 赖 性 糖尿 病 两 种 类

l, 后 者 一 般 在 40 岁 以 后 发 病 , 发 病 率 较 高 ; 占 糖 尿 病 患者 总
数 的 85~90%。 现在 认为 ， 非 胰岛 素 依 赖 性 糖尿 病 有 很 强 的 遗 -
传 现象 ,发病 原因 很 可 能 和 胰岛 素 基 因 5'- 端 的 调节 基因 区 段 上
出 现 异 常 序列 有 关 "e5。 为 此 研究 了 胰岛 素 基 因 :5- 端 邻近 区
的 多 态 性 。 方法 是 : 先 从 周围 血液 的 有 核 细 胞 分 离 出 染色 体 :
DNA, 用 限制 性 内 切 酶 消化 后 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 经 印 渍 于
固定 化 纸 , 再 用 3?P- 胰 岛 素 基因 作 探 针 进 行 分 子 杂 交 , 从 放射 自
显影 谱 上 检测 多 态 性 片段 61。 Rotwein 等 人 用 此 法 分 析 过 87
- 例 胰岛 素 基 因 吕 = 端 邻近 区 的 多 态 性 。 当 用 限制 酶 BglI 水 解 白
Hi Wd He tak DNA 时 , 印 渍 杂交 表明 ,多 态 型 中 具有 1.5kb HA.
序列 的 类 型 ， 在 非 胰岛 素 依赖 性 糖尿 病 患者 中 出 现 的 频率 高 达 .
65.7%, TIE AW 25.7%),

印 渍 未 在 基因 结构 分 析 中 的 应 用 相当 广泛 ， 尚 不 止 于 上 述

Wm, Bsc bk, 当 我 们 翻阅 近代 任 一 期 <Nducleie Acids Res.» 3X
类 杂志 时 就 会 看 到 ， 用 于 基因 结构 分 析 的 印 渍 术 , 每 期 至 少 有
2~8 篇 报道 。 例 如 该 杂志 14 卷 16 期 上 ， 就 有 urter 等 人 用
EN it 7A) TARTS Re TRp4 AO, WR Datton 等 人 分 析 鸡
组 蛋白 基因 “两 篇 论文 ， 而 该 期 上 发 表 的 与 印 渍 术 有 关 的 文章 :
共有 6 篇 之 多 去 充分 反映 了 印 渍 术 在 分 子 生 物 学 中 所 占 地 位 。

四 、 在 基因 表达 、 基 因 筛 选 及 基因
工程 村 万 面 的 应 用

“基因 表达 ,尤其 是 基因 表达 调控 机 理 的 研究 ,是 当代 分 子 生 -
物 学 中 又 一 重点 领域 。 通 常 ,可 把 基因 表达 归 为 两 类 : 一 是 通过

es 253。

基因 工程 ,把 目的 DNA 重组 入 革 种 载体 DNA 寺 然后 了 解读
目的 DNA 如 何 表 达 ; 二 是 研究 正常 和 异常 细胞 中 国 N 表达 有
何 差异 。 前 者 又 常 称 为 转移 基因 的 表达 。 如 螺 正 核 生物 基因 转
BRR, KOO RIA WER I ABE BOW BPE
BAWARNK, GR, BREE RWRMER, RY
Wt AK WR BAR A T i. BR ae
的 5 端 , VR ECERRE AE, BOT 是 责 核 生物
基因 的 一 般 结 构 ， 其 上 忆 前面 的 非 编 码 区 易 受 激素 5 浓 合 酶 帮
Hi, mRNA 的 转录 也 从 这 里 开始 ;在 其 前 面 SO MARA
—TATA 盒 ,估计 与 聚合 酶 有 关 。 BMH IPRA RE SHR
起 始 有 关 。 如 果 我 们 切 掉 基 因 结构 牛 前 面 指 序 列 太 基因 则 用 表 .
达 。 此 外 ,转移 基因 表达 是 否 理想 ,就 必须 进行 紧 定 刀 这 都 要 用
到 印 渍 术 。 例 如 , 黎 志 豪 co 把 鸡 卵 白 蛋白 (Ovalbumin) 基因 转
入 鼠 细 胞 后 , 就 是 用 DNA 印 渍 术 来 鉴定 该 基因 的 表达 情况 。 此
时 ,把 转 染 细胞 中 提取 的 DNA， 经 限制 性 内 声 酶 消 花 后 用 琼脂
糖 凝 胶 电泳 进行 分 离 , 再 印 渍 于 NOR, 用 切口 移 位 法 制 得 鸡
孵 白 蛋白 基因 的 @P-cDNA EHR, FELLA EAD FR ，
交 。 如 果 转 染 细胞 DNA PH Ay AAA, BAR
则 被 保留 下 来 , 放射 自 显影 谱 王 就 可 见 到 区 带 有 相反 ， 没有 杂交
上 的 探 针 则 被 冲洗 掉 co。 otha ES
He Ayah se FSM RPE 数 的 方法 : 提高 了 人

转录 起 始 转录 终止
上 上 游 调控 部 位 ”“TATAf 由 子 部 位 ) 切 恋 (AATAAA-TTTTi
5 en | ATG GT A TAK! FS *2 a

DS FE Ry ts At eas Oa

1 非 编 phat da 基因 | 非 编
码 区 (外 显 ( 内 含 ( 外 显 码 区
了 JR ROE 站 =

图 6-7 SOAR Manse aay) 重 一 三 年 半 于

-254。

oD 型 干 拢 素 基 因 在 大 肠 杆菌 中 的 囊 达 水 平 。 其 中 , 有 关 他 们 组
建 的 新 质粒 pPBV 181 的 DNA 分 析 ,就 是 采用 了 印 渍 术 。 他 们
指出 肖 基 因 工程 技术 在 大 肠 杆菌 中 生产 人 干扰 素 ; 需 要 组 建 高
效 表达 质料。 为 此 他 们 组 建 了 一 个 新 质粒 BV 181， 使 干扰 素
表达 水 平 提高 约 巨 倍 。

尿 激酶 基因 工程 的 研究 中 也 采用 了 印 渍 术 。 美 国 Abbott
实验 室 的 也 atzkin 研究 小 组 报道 了 许多 有 关 人 尿 激酶 基因 克隆
的 玉 帮 "3 ?9。 在 鉴定 重组 质粒 时 ， 他 们 采用 了 省 化 氰 活化 纸 进
行 印 渍 ,并 用 放射 免疫 检 出 法 证 明 ， 五 . cold x-1776 # -pABB26
fil E. colé x-1776 株 - 质 粒 pABBIO 两 个 重组 子 能 表达 尿 激 酶
蛋 自 ;虽说 表达 水 平 还 比较 低 。

谷 淑 燕 等 人 在 把 EB 病毒 核酸 片段 重组 于 鸣 菌 体 Ml3mp8
的 研究 中 , 制备 了 敏感 的 核酸 杂交 实验 的 探 针 "4。 她 们 也 用 这
种 探 针 进 行 印 涡 纸 上 的 分 子 杂交 。 因 为 这 种 探 针 是 单 链 的 重组
鸣 菌 体 DNA， 杂 交 实 验 时 就 省 去 了 双 链 DNA 预先 变性 步 又 。
尺 因 其 不 会 在 杂交 过 程 中 发 生 自 身 退 火 现象 而 具 高 效率 。

有 关上 比较 正常 和 蜡 常 细胞 中 基因 表达 水 平 的 研究 中 ， 印 涡
术 也 发 挥 了 重要 作用 。 李 宝 奸 等 人 四 利用 DNA 点 印 渍 术 定 性.
ERIE TKAPADRE TD PREARA RAE AW
达 s 在 哺乳 动物 的 正常 发 育 中 , PRESB, 随后 由
胚 肝 合 成 。 它 的 含量 在 胎儿 血清 中 最 高 , 临近 出 生 时 开始 降低 ;
出 生 后 急剧 下 降 ， 很 快 即 达 很 低 水 平 。 与 此 同时 ,由 肝脏 谷 成 的
白 蛋 由 却 不 断 升 高 ;出 生 后 不 久 即 可 达 正 常 水 平 ， 并 保持 稳定 ，
三 者 互 为 消长 。 但 是 ， 当 成 年 动物 发 生 肝 癌 等 病变 时 ， 这 种 玫
达 关 系 将 发 生变 化 ， 人 血清 中 甲 胎 蛋 白 含 量 急 又 升 高 。 因 此 现在
常 将 血清 中 甲 胎 蛋白 和 白 蛋 白 含量 的 变化 ， 作 为 肝癌 早期 诊断
Hew. 许多 研究 工作 表明 * LPP REAM ABA

e255 。:

含量 恋 化 ， 主 要 是 由 于 基因 转录 或 转录 后 水 平 的 差别 叶 -
引起 ， 认 为 这 种 差别 可 以 用 来 研究 真 核 细 胞 基本 壹 达 "50 李
宝 奸 等 人 用 点 印 渍 术 能 很 方便 地 定量 检 出 甲 胎 和 蛋白 和 自 蛋 自 基
因 的 转录 产 = Wy —mRNA arp Al MRNAawo 此 时 ， 他 们 把 扩 雯
并 纯化 的 , 含 大 鼠 甲 胎 蛋 白 (AFP) 基 因 片 段 的 质粒 了 RARE87 和
pRAF 65， 以 及 含 大 鼠 白 蛋白 (Alb) 基 因 片 自 的 质粒 RSA 了 8
和 PpRSA57, 分 别 等 量 混合 , HRMREBHA 0.2 ug/wl hh 4x Sso
Wow, WSR owl RAF READ NOR, HOSE
质粒 PBR 322 EAM. HAUA, RARER, FM Ol
AMA AAA poly(A*)RNA 杂交 。 经 放射 自 显影 后 杂交
区 带 用 计数 器 定量 。 结 果 如 表 6-2 Pa, 全 和光 全 AFP 和
Alb 二 者 互 为 消长 的 规律 王 。
#62 大 鼠 不 同 组 织 中 MRNA, A MRNAay 的 相对 全

正常 成 年 大 鼠 肝
KAIER (16~18 天 ) 561
AALS HME (16~18 天 )

* Bm pBR222 对 照 点 的 背景 数 ; DISG HAMMAM EEBS.
多 种 急性 转化 性 闻 转 录 病 才能 销 吗 特异 性 的 咒 关 庆生 四
酶 ， 这 种 酶 在 结构 与 功能 上 与 某 些 细胞 表面 的 生长 因子 受 体 橙
似 。 其 中 ，Gardner Rosheed 猪肉 瘤 病 毒 (GR-EeSvw 的 致癌 基 :
Al for 就 能 编码 这 种 酶 。 与 此 致癌 基因 相当 的 天 原 瘤 基因 o-

Jgr 被 定位 于 人 1 号 染色 体 短 臂 上。 Oheah 等 人 用 RNA: 印 汗
术 研 究 了 这 种 原 癌 基 因 能 否 在 人 肿瘤 细胞 中 表达 这 二 重要 命
题 “。 他 们 首先 从 一 系列 不 同 的 人 肿瘤 细胞 中 提取 [RNAJ 通过
FEASTS AEE OT ie MRNA, SEB RNA 印 渍 术 栓 ;

ty c-for WISH MRNA, BRA, 来 自 骨 散 增 生性 或 淋巴
细胞 增生 性 疾病 芋 个 细胞 系 中 , 有 6 个 细胞 系 为 o-jgr mRNA
PARE, SF UU Hh formRNA 的 长 度 为 83kb。 证 明 原 癌 for-mRNA
在 淋巴 瘤 系 中 的 表达 与 EBV 感染 有 关 , 认为 EBV 感染 可 能 是
BURT cfoe WHR.
RB EEF SMA AY Bald/o 小 鼠 脾 细胞 免疫 BR
蛋白 轻 链 基因 的 表达 频率 中 ,， 也 采用 了 DNA ABR, 用 它 分
术 了 特异 性 免疫 球 蛋白 轻 链 基因 ， 证 明 提 供 重 链 的 细胞 株 融 合
要 比 提供 轻 链 的 细胞 株 融合 ,其 抗体 特异 性 频率 要 高 37 RE,
分 离 基 因 是 进行 基因 工程 ,研究 基因 结构 功能 的 首要 环节 ，
但 分 离 得 到 的 基因 是 否 是 目的 基因 呢 ? 这 就 需要 筛选 .甄别 。 目
前 已 有 许多 钴 选 基因 的 方法 , 但 大 都 以 核酸 杂交 为 基础 ,因此 印
涡 示 在 基因 筛选 中 就 扮演 了 重要 角色 。 有 关 印 渍 纸 上 进 行 核酸
分 子 杂交 ,已 在 前 面谈 过 许多 , 把 它 用 于 基因 筛选 ， 目 的 昌 有 不
同 ,得 方法 并 无 两 样 , 这 里 不 再 多 述 。 值 得 提出 的 是 ， 用 核酸 作
探 针 筛选 基因 的 方法 有 一 定局 限 性 ， 因 为 必须 对 目的 基因 记 编
码 蛋 白质 的 氨基 酸 序列 要 有 所 了 解 ， 至 少 要 已 知 部 分 氨基 酸 序
Bl), AAs HT EU EE AR ED SI RR ET. UL, 四 于 某 些
ALRERBWA=[VEA, ARHRRKERA RYE
合 物 ; 对 筛选 的 专 二 性 和 成 功率 就 有 所 影响 59。1983 年 美国 斯
JK Young 和 Divis 设计 了 用 蛋白 质 抗 体 直接 筛选 基因
芍 有 效 方法 , 并 用 此 法 筛选 得 到 了 酵母 RNA 38-4 IT ER,
端 转移 酶 基因 、 鼠 粘连 蛋白 基因 .人 崖 藻 糖苷 酶 基因 等 5s1。

五 、 在 遗传 疾病 诊断 和 治疗 中 的 应 用
迄今 导 对 遗传 疾病 的 诊断 主要 还 是 通过 表现 型 ， 即 临床 证

e257 。

状 或 某 种 酶 ， 以 及 遗传 规律 来 推测 其 基因 型 。 对 遗传 病 的 治疗
cA ei ptte 。 从 医学 角度 看 ， 基 因 定 位 和 和 研
基因 结 和 的 目的 ,是 实现 对 遗传 病 的 “ 逆 诊 断 “《 即 根据 基因 型
来 采 确 定 表现 型 ) 和 基因 党 疗 , 以 便 从 根本 上 提高 大 的 素质 。 现 在
已 有 一 些 办 法 进行 “ 道 诊断 ”。 前 已 提 及 ， 限 制 性 内 切 酶 是 基因
操作 的 主角 ,基因 组 中 的 一 个 点 突变 ， 或 一 个 片段 的 缺失 . 捅 入
或 易 位 ,都 可 能 会 产生 或 缺失 一 个 酶 切 点 ) 从 而 改变 原来 限制 酶
切片 段 长 度 。 测 定 这 种 限制 性 片段 长 度 多 态 性 寺 就 能 直观 地 显
示 基 因 组 的 改变 。 然 而 其 中 的 一 些 已 证 明 与 某 种 遗传 病 至 共 分
离 (Cosegregation)， 可 以 用 来 检 出 致 病 基因 字 尤 其 是 降 性 致 病
基因 的 携带 者 。“ 首 诊断 ”的 另 一 途径 是 遗传 病 的 特异 性 探 钙 。、
fi) iil DMX 染色 体 上 得 到 了 诊断 Duchenne MLE Ft AR B HE
的 特异 性 片段 ; 从 21 号 染色 体 上 得 到 了 Down Rage ae
异性 片段 ; 从 小 鼠 基 因 组 中 已 分 离 得 到 也 GPRTE 基 因 片 段 ,可塑
用 于 检 出 Lesch-Nyhan 氏 综 合 症 。 BREWER HWS
Mr 途径 都 有 印 渍 术 参 与 。 对 于 基因 治疗 也 有 新 的 设想 届 合 好
A WER MERA AK BREA, Hea
B*™*(AAG)> UAG 与 6S" (CAG) > UAG BRIA FE MEE
〈 琥 班 突变 ) 引 起 的 。 现 在 已 在 体外 用 “定点 诱 变 2 指 访 法 合成 对
能 携带 Lys， 而 反 密 码 子 却 与 UAC HA Wy “SEA EI
制 型 tRNA, 并 能 借助 爪 桨 卵 母 细胞 系统 ,使 BO PES
因 片 段 准 确 无 误 地 合成 正常 的 B 链 ,从 而 达到 治疗 目的 避 当 然 ，
印 渍 术 在 基因 治疗 中 是 不 能 直接 应 用 的 ， rng
定 分 析 中 起 着 一 定 作 用 。 :
Chang 等 人 曾 采 用 eu JL A A a

症 进行 产 前 诊断 "9; ABC RE, TBS Ya Me Ek
取 的 DNA， 并 用 限制 酶 Mst IT Wye, 1.2% BRIE PERE

258 。

泳 分 离 后 印 渍 于 NO 纸 , 再 用 正常 人 .8B- 珠 蛋白 基因 被 Mst 11 HF

-化 所 得 下 末端 的 1.15kb 片 段 为 探 针 , 并 进行 印 渍 纸 上 的 分 子 杂
交 。 因 为 已 知 镰 形 细胞 性 贫血 症 患者 的 B- 珠 蛋白 基因 有 一 点
突变 , 即 由 正常 人 的 COTGAGG 变 为 OOTGITGG。 前 者 正 是 限
制 酶 Msé II 的 识别 位 点 , 故 可 把 B- 珠 蛋白 基因 水 解 为 长 度 分 别
AAL1Gkb 和 0.2kpb 的 两 片段 ; 后 者 不 能 被 MsiII 识别 ， 故 只
产生 一 条 单一 的 长 1.35kp 片段 。 现 用 1.15kb 的 片段 作 探 针 ，
就 可 以 在 AA 基因 型 中 见 到 I.15kb 片段 ,在 SS 基因 型 中 见 到
1.35kb 段 ， 而 在 AS 基因 型 中 见 到 上 .15kb F11.35kb 的 两 条
片段 。Ohang 等 人 用 此 法 在 5 名 有 镰 形 细胞 性 贫血 危险 的 胎儿
中 ,检测 到 了 相同 的 胎儿 基因 型 : 计 有 2 名 AA B® AS 型 和
2 名 SS 型。 他 们 指出 ， 此 法 灵敏 度 极 高 ， 只 需 1wg 基因 组 的
DNA 即 能 得 到 可 检 出 的 杂交 信号 。 也 就 是 说 ， 只 需 孕期 15 周
到 16 周 孕 妇 的 羊水 8 毫升 ,直接 抽 提 其 DNA, 即 可 用 印 渍 术 检

-出 sisII 酶 切片 段 。 此 法 为 镁 形 细 胞 性 贫血 的 产 前 羊膜 穿刺 诊
断 , 提供 了 一 种 既 安 全 又 精确 的 方法 。 它 无 需 作 细胞 培养 , 因此
实验 时 间 从 原 需 5 周 缩短 到 两 周 ， 减 少 了 实验 的 复杂 性 和 成 本
费 。 他 们 又 认为 ， 此 法 尚 能 再 进一步 简化 ， 以 扩大 其 实用 价
值 rm。

Old 等 人 也 用 与 上 述 类 似 方法 进行 血红 蛋白 病 的 产 前 诊
断 吕 ?。 不 同 的 是 ,他 们 除了 用 DNA 印 渍 术 外 , 还 用 限制 性 片段
长 度 多 态 性 分 析 , 进行 直观 诊断 。 此 外 , 曾 溢 滔 等 也 用 点 印 渍 术
实现 了 血 友 病 了 的 产 前 诊断 cn。

非 缺失 型 o 地 中 海 贫血 的 概念 首先 由 an 等 人 采用 分 子
杂交 技术 而 提出 的 ,他 们 认为 这 种 w- 地 中 海 贫血 的 病因 并 非 a
基因 的 缺失 , 而 是 w- 基 因 功 能 的 缺陷 。 以 后 许多 学 者 先后 用 限制
性 内 切 酶 技术 予以 证 实 , 不 仅 绘制 了 人 or- 基 因 内 及 外 围 的 内 切

e 259 o

下

tes \ 是 采用 DNA 印 渍 术 . 即 ， se SA CHT REA
oc (4 HL 9 (DEL) A SUE SEI DNA， 用 限制 酶 消化 后 进
行 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 离 , 再 印 渍 于 NC 48, PRP dpi Ay o-
珠 蛋 白 基因 特异 性 探 针 进 行 分 子 杂交 ， 放 射 自 显影 鉴定 售 有 有 号
珠 蛋 白 基 因 的 DNA HB", 有 关 天 的 细节 可 参 间 朱 康
JL gE.

Franzén “HGH T eB BME ee DNA gai

seve", fA RESELL DNA (pRepHind),
IDS ERE, SRR Ay DNA Narn = 本
出 。 大 致 做 法 是 , SABO pl 被 检 者 血 中 提取 出 DNA ,变性 后 , 用
毛细 管 以 每 点 直径 2mm 的 小 圆 点 , AF NC 纸 上 ; BRE
把 印 溃 纸 浸入 含 sP-pRepHind 探 针 的 杂交 溶液 中 ，65*0 下 反
应 2 小 时 ,然后 进行 放射 自 显影 10 小 时 并 观察 结果 。 图 6-8 出
ART SHWE BE DNA Alle] BER DNA, Doe te
er ik (6 $F O) ALARA DNA (6 4 D) AR ED BEES. HAI
REDE TE RA, OYE HE Ke HE JR iE PR BE O. 001 % . 出 现
阳性 征象 所 需要 最 小 恶性 疙 原 正 DNA 药 量 为 5 pg. Franzén
等 人 用 此 法 试验 了 35 i HE HAE JES JB sha BR) RE OA
IRA, ERA, RT — fh RA SP AE
LPH ES 35 A PA a
的 血 标本 中 ,也 除 一 份 外 均 为 阴性 ,而 此 阳性 标本 被 认为 并 有 亚
HEIR, Franzin 等 人 组 建 的 这 种 PRep 百 记 d 探 针 似 有
种 特异 性 , 与 其 它 一 些 疙 原虫 DNA 及 人 类 DNA HELMS |
So MATA NHS FAB AB, IR A
量 较 少 的 标本 ; SST LFF PE a eS
Lau 等 人 创立 了 一 种 用 DNA AEC PME IL He |

- @2606

68 :恶性 疙 原虫 重复 DNA 探 针 用 于 洗 疾 诊断 的 点 印 涡 分 析 -

第 1 行

第 3 行

-二 第 3 行

第 4 行
第 5 行
第 6 行

恶性 疙 原虫 DNA: a: 250ng, b: 25ng, c:2.5ng, d: 250Dg，e: 25pg.
a,b: 0. 5%, 0. 576 Fa ADRs Cy = e: a: 5%,0.57%,0. 8% TEED
goes -

a, d, 86:05550\0.59%0.0.45%0 间 日 症 原 虫 ; b、c:1-690、0.990 ibe

Oo

a~e: 0. 7%. 7%,0. 7%.0. 191. 0% wes
a~e:0.1,0.5% 0.1% .1.0%,0.7% BERR.

a,b; 0.8%,2.8% HEE EUR; c: 50 ul 非 感染 红细胞 ;as250ng 人 胎
DNA,

BITTE", WATT VE A EE IR 8 4kb 重复 序列 中 , RK
了 到 了 三 种 男性 特异 的 DNA 杂交 探 针 , 并 取 名 为 了 -特异 3.4kb
WH. 它 能 与 HooR] 消化 的 男性 染色 条 DNA 杂交 ， 而 与 女性
DNA ERM. 后 来 证 明 , 该 探 针 与 男性 DNA 的 亲和力 较 女 性
DNAX 1000 倍 之 故 。 用 此 探 针 测定 脸 儿 性 别 的 大 致 步骤 如 下 :

取 0.3 了 1 羊水 ,离心 耸 离 细 胞 ， 将 细胞 勾 状 物 在 碱 性 淤 液 中 加
热 使 DNA 解 链 。 冷 至 室温 后 把 此 DNA 以 小 圆 点 点 于 O 纸 ,分
SF) YASS 3.4kb 探 针 和 Alu 重复 序列 探 针 进行 印 涡 纸 上 分

° 261°

ug Alu 重复 序列 探 针 与 男 、 女性 均 能 杂交 ,在 此 用 作对 照 。
因 探 针 均 用 放射 性 标记 ， 杂交 斑点 可 从 目 显影 谱 上 定量 求 得 。 凡
男性 者 ,其 DNA 与 Y- 特 异 3.4kb 探 针 和 Ala 重复 序列 探 针
均 能 杂交 ; 而 女性 DNA 仅 与 Alu 重复 序列 探 针 杂交 , 据 些 即 可
确定 胎儿 性 别 。Lanu 等 人 指出 ， WIEME 2~8 天 。 作 为 常规 检
测 时 ， 仅 需 羊水 200 xl, 且 不 必 提 取 DNA, 也 不 需要 规定 羊水 标 、
本 中 细胞 数 或 DNA 浓度 ， 因为 Alu 重复 序列 探 针 已 提供 了 存
在 的 DNA 量 的 对 照 ” 。

在 细胞 癌变 原理 的 研究 中， 致癌 基因 假说 已 经 成 为 当
代 分 子 生 物 学 和 医学 中 最 引 人 注 目的 学 说 之 一 。 致 癌 基 因
(Oncogene, 简称 onc) HY ARM, 被 称 为 分 子 肿 瘤 学 的 里 程 碑 。 运
今 ， 不 仅 发 现 了 20 RAB I RNA 病毒 的 病毒 致癌 基因
(Viral oncogene; v-onC)， ti Ht 7 45 HE oh AS ES 中 发
现 了 与 v-one 同 源 的 DNA 序列 一 一 细胞 癌 基 因 (Cellular
oncogene; o—onc) 8788, y—one 和 c-one 的 同 源 性 常 是 用 DNA
印 涡 术 分 析 得 到 的 。 例如 Goff 等 人 cao 将 Ablson 小 FA A i is
病毒 (A_MuLV) 的 DNA, 先 后 在 噬菌体 Charon 21A(Ch21A)
和 质粒 PBR 322 中 克隆 和 次 级 克隆 ,得 到 了 A-MuLV 的 onc
段 abl， 经 切口 移 位 法 制 得 长 度 为 2.3kb ty @P-abl 探 针 。 再
把 人 HeLa 细胞 经 EcoRI, Hind III 和 .了 ai 工 等 限制 性 内 切 酶
消化 ， 片 段 用 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 离 后 印 汗 于 NO 纸 ， 并 用 “有
abl 探 针 与 之 杂交 。 结 果 发 现 这 些 酶 切 产物 中 都 有 2~4 条 杂交
区 带 显 现 。 表明 人 体 细 胞 中 含有 abl, 且 由 于 这 些 杂 交 区 带 的
核 童 酸 长 度 比 abl 大 得 多 ， 因 此 Gof 等 人 认为 其 中 含有 插 六 序
列 ， 这 一 实验 充分 说 明 o-onc 的 存在 页 下

为 了 进一步 研究 人 体 细胞 中 e-one 的 组 成 及 其 序列 必须
得 到 足够 量 的 ec-one。 为 此 ,Favera 进行 了 从 人 DNA 中 分 离 完 整

262 ，

wt} c-one 片段 及 其 克隆 增殖 的 工作 。 他 用 “了 -9 60 作 探 针 ，
和 采用 点 印 渍 术 从 人 基因 库 中 筛选 出 含 e-sis 的 克隆 (MX-L83)。 把

”838 大 量 繁殖 后 抽 提 其 DNA, 经 限制 酶 切 消化 ,进行 DNA 印

渍 术 检 出 杂交 区 带 。 BRR, Eco RI 酶 切片 段 旦 一 条 14.8
kb 的 杂交 区 带 , 但 菲 啶 溴 红 染色 带 却 有 三 条 ， 分 别 为 14.8kb，
-20kb 和 10.5Kkb。 因 .BeoRI 能 将 Ch4A( 重 组 喉 菌 体 载 体 ) 的 双
臂 切 掉 ， 故 可 知 X-L83 中 14:8kb 片段 含有 -one 的 片段 。 为

了 验证 , 把 芭 .8kb 片段 再 用 Be HI A Bol II 酶 切 ， 经 印 渍
杂交 分 析 ， 所 得 片段 与 人 DNA 用 同样 方法 产生 的 杂交 片段 大
小 相同 ， 说 明 此 c-one 没有 任何 部 分 丢失 。 经 异 源 双 链 分 析
(Heteroduplex analysis) 表 明 A-L33 和 A-C60 的 同 源 区 域 长
fF 1.2~1.8kb,

显然 ， 象 上 述 分 析 致 癌 基 因 的 方法 也 可 以 用 于 了 解 正常 细

胞 和 肿瘤 细胞 之 间 基 因 组 上 的 差异 。 例如 Humphries 就 曾 这
样 做 过 re5， 他 用 于 寻找 基因 组 变异 的 DNA 探 针 是 从 人 胚 肝
DNA 制 得 的 。 .他 把 人 胚 肝 DNA 经 限制 酶 HooRI 4 4b JG He
14kb 及 50kb 片段 , 再 用 限制 酶 Sov 3A 消化 ， 然 后 与 PATias
质粒 重组 后 进行 无 性 繁殖 。 WYP wig ABA DNA 对
PAT iso 重组 体 克 隆 菌 落 进 行 原 位 杂交 。 取 无 信号 或 低 杂 交 信
号 者 合并 为 100 组 ,提取 重组 质粒 DNA， 经 蔗糖 梯度 离心 使 质
粒 DNA 进一步 纯 化 后 , 再 用 Hoo RI 和 Sau 38A 混 合 消化 。 取 些
BERL EDIE PE BEAK BS, 去 掉 大 分 子 PATissDNA 片段 ，
其 余 片 段 洗 脱 后 用 切 兽 移 位 法 进行 PP 标记 ， 此 即 用 作 肿 瘤 组
织 检查 的 探 针 。 从 感 刹 胃 肠 肉瘤 病人 的 肿瘤 组 织 及 其 周围 组 织
学 上 正常 的 肠 粘 膜 组 织 中 , 提取 肿瘤 DNA 及 正常 DNA。 分 别
¥ coRI 消 化 后 ,在 工 % 琼脂 糖 凝 胶 上 作 电 泳 分 离 。 以 此 为 印
秆 模板 印 渍 于 NO 纸 ， 然 后 用 上 述 探 针 在 印 渍 纸 上 进 行 分 子 杂

e263¢ .

交 , 从 所 得 放射 自 显影 谱 上 比较 正常 DNA 和 肿瘤 了 DN 太 杂交 区
带 的 差异 。 结 果 表 明 ， 五 个 病人 的 正常 DNA 的 了 ooRI 消 楷 谱
中 有 能 与 此 探 针 杂交 的 小 于 14 kb 的 区 带 ,而 在 肿瘤 DNA 中 消
次 了 。

从 以 上 种 种 实例 中 不 难看 出 ， 核 酸 印 渍 术 可 在 许多 疾病 条
病理 研究 中 应 用 ， 其 关键 在 于 获得 合适 的 杂交 探 针 。 值得 注意
的 是 ,近代 人 工 合成 脱氧 赛 核 苷 酸 的 技术 日 趋 完善 , 因此 采用 大
TAR SPP BRE KE Be ERB eS EOS
iy}, Conner 等 人 ca 根据 地 中 海 性 6° iE Re BRE
基因 序列 中 89 位 密码 子 发 生 了 无 意义 突变 这 一 原理 ;大 工 从 成
T MR 6-8 所 示 具 放射 性 标记 的 8* 和 Bo 两 种 探 针 寻 它们 是
包含 有 se 的 19 脱氧 寡 核 苷 酸 。 表 中 , 框 内 的 碱 基 烦 序 为 B* 和 和
Bei 的 脱氧 赛 核 苷 酸 探 针 。 待 检 个 体 白细胞 或 羊水 名 胞 中 DNA，
用 Bam HI 酶 解 后 电泳 并 印 渍 于 NO 纸 ， 经 用 B* AT A 探 针
A) URE, 放射 自 显影 检 出 。 正 常 者 ,在 工 .8KEb Ms BERET
杂交 ; 杂 合 子 者 ,在 于 8kp 处 与 6 和 Bota PRE MABE; BEA
子 者 , 工 .8kb 仅 和 of 探 针 杂交 ,不 与 A PRETARBEO 2
OK, or 抗 胰 蛋 白 酶 缺陷 病 可 引起 肺 气 用 3 LPR 4 os
抗 胰 蛋白 酶 系 由 894 个 氨基 酸 残 基 组 成 ,经 序列 分 析 蕊

# 6-8 A bRR AMIR oH 6" 两 种 探 外 的 序列 分 村， 4
35 36 37 38 39 . 40 . 41
Tyr Pro ‘rp Thr Gin Arg ~ Phe Pho a

Be

ga 5'-TAO |cor TGG Acc CAG AGG ， TTO 时
3-ATG GGA ACO GG emro TOO AAG: AAA-3! ‘
5-TAO OCT TGG ACC TAG AGG TTC. Trr-3
porh

s-aTG {GGA ACO TGG ATC TCO AAG ALAA

#2646

证 明 .342 位 土 谷 氨 酸 残 基 密 码 GAG 点 突变 为 AAG。 据 此 ，
“Kidd 等 人 89 用 玫 6-4 所 示人 工 合成 的 ， 正 常 的 和 含有 突变 位
“而 异常 的 19 脱氧 赛 核 昔 酸 为 探 针 。 实 验证 明 ) 使 用 这 两 种 探
针 能 方便 地 用 印 渍 术 检 出 od- 抗 胰 和 蛋白酶 缺陷 病 。
) ae ts 人 工 合成 抗 胰 蛋 白 酶 基因 探 针 中 正常 和 异常 序列 比较
343

Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu
_ 5-GOT G@TG OTO ACC ATC GAC GAG AAA GGG ACT CAA-3’

TE# 3-0GA OAC GAG| PTGG TAG GTG CTC TIT CCC 了 6AGTT-5/

异常 8-GOT GTG CTC | Aco ATO GAO AAG AAA GGG aor OAA-3/
3-OGA OAC GAG TGG TAG OTG TIO TTT COO TGA GTT-8
注 : 框 内 的 顺序 为 正常 及 异常 的 探 针

六 、 在 免疫 学 与 自身 免疫 病 中 的 应 用

当前 , 免疫 学 最 关心 的 问题 之 一 ,不 是 对 异 已 的 认识 而 是
SACRA, 免疫 学 是 在 抗 传染 病 的 实践 斗争 中 产生 的 ，
它 所 关 关 的 是 抗 传染 作用 。 因 些 , 防御 的 观点 ;一 开始 就 在 免疫
学 中 占据 支配 地 位 。 这 样 ， 自 然 就 把 免疫 的 发 生 完全 归 因 于 蜡
已 抗原 的 刺激 , 把 免疫 看 作 是 单纯 地 认识 并 排斥 异 已 的 反应 。 但
事实 并 非 如 此 。 首 先 , 自身 抗体 和 自身 免疫 病 的 出 现 , 就 足以 说
角 确 实 存在 能 认 误 由 己 的 细胞 ; 进而 , SPUR HERES (Lectin) ABH
发 产生 不 同 特异 性 抗体 这 一 事实 ， 表明 不 需要 异己 抗原 也 能 诱
发 免疫 应 答 。 近 后 年来; 随 着 免疫 生物 学 和 免疫 遗传 学 的 进展 ，
先后 发 现 了 独特 性 抗原 和 MBS 抗原 在 免疫 调节 中 的 重要 作
戎 。 这 不 仅 使 人 们 让 识 到 识别 自己 是 发 生 免疫 应 答 的 基础 y 而
组 找到 卫 自 我 识别 的 标志 。 免 疫 学 就 进入 了 以 识别 自己 为 基础

© 265:

~

的 网 络 学 说 时 代 ,而 免疫 印 羔 术 在 其 中 则 起 到 于 促进 作用 ——
sae we BNA, SAL a SAT Me A SA eT 淋 名 有
胞 ;并 称 之 为 自身 反应 性 了 细胞 (Auttoreactive T cell, fi}
Tanto), Tauto A if SIRE, SF RF a aE BR se Tt.
Tw AUER, TER SUS, 32 BO AE
[L-2 等 辅助 因子 。 现 已 证 明 ，IL-2 不 单纯 是 于 细胞 的 生长 因
子 它 还 能 诱导 活化 了 的 Ta 再 释放 其 它 辅助 因子 ， 以 扩大 其 辅
助 功能 eD。 为 此 ， 有 关 工 一 的 研究 就 成 为 揭露 自身 抗体 奥秘 -
和 防治 自身 免疫 病 的 关键 一 环 。 大 们 对 人 类 工 -2 的 基因 结构 、
表达 调控 及 临床 应 用 等 都 作 了 广泛 而 细致 的 研究 现在 已 用
基因 工程 技术 生产 出 大 量 高 纯度 的 重组 II-2; 为 全 面 揭露 J “
在 机 体 自身 免疫 调节 作用 中 的 作用 黄 定 了 基础 。 有 关 IIL-2 这 -
类 研究 工作 中 都 有 印 渍 术 的 参与 。 例如 Taniquehi 等 人 "9 和
Devos 等 人 coo， 从 各 自 建 立 的 CDNA 文库 中 获取 了 含 编 码 、
IL-2 的 基因 ,把 重组 质粒 DNA 经 限制 性 内 切 酶 消化 ,琼脂 糖 凝
peta ks} BS, 并 印 汪 于 NO 纸 ， 再 用 相应 细胞 mRNA 作为 配 体 -
Jc EDA EGE TR. WHA PAA EY mRNA 进行
制备 回收 ,并 注入 卵 母 细胞 中 检测 .IL-2 mRNA By Rae Eo
复 此 步骤 ， 即 可 筛选 出 插入 有 ILr-2 cDNA 的 克 粒 Maeda 等
ASR ALN, HEV NO 纸 上 的 质粒 DNA 的 限 :
制 酶 切片 段 与 相应 mRNA 杂交 。: 但 他 们 与 上 述 方法 相反 ,是 把
未 和 印 渍 纸 上 结 合 的 mRNA 注入 卵 母 细胞 5 因为 含有 IL-2
cDNA 序列 的 质粒 DNA 可 以 封闭 编码 IL-2 fy MRNA 的 体外
翻译 活性 ,所 以 能 选择 出 含 IL-2 cDNA 的 克隆 e 党 训 雪 半 3
现在 ,TIL 2 cDNA 核 苷 酸 序列 已 经 测定 ;类 类 IL-2 基因组
组 成 及 限制 酶 谱 如 图 6-9 所 示 。 在 这 方面 的 研究 中 , 印 渍 术 也 作 :
由 入 了 贡献 。 例 如 Fujita 等 人 9 以 下 了 olbrook 等 人 5 都

e2D66 。

me 1000 a te = c
LE ee RRR x Hoe 5

JE a

6-9 AX IL-2 基因 组 成 及 限制 性 内 切 酶 切 点

用 DNA 印 渍 术 分 析 了 人 脾脏 、 胎 盘 等 的 染色 体 DNA， 并 对 克
HEH) DNA 片段 也 进行 了 核 昔 酸 序列 分 析 。 证 明 IL-2 基 因 全
长 5040 不 碱 基 ， 包 含 在 两 个 了 BeoRI 片 段 内 。 与 其 它 真 核 细 胞
相同 ; 具有 不 编码 插入 序列 (内 含 子 )。 人 基因 组 IL-2 序列 有 4
个 外 显 子 (图 6-9)， 外 显 子 工 含有 5 端 不 翻译 区 ， 并 且 含 编码
‘TL-2 起 始 的 49 个 氨基 酸 , 其 中 20 个 构成 信号 肽 。 外 显 子 寺 后面
是 由 9tibp 组 成 的 内 含 子 A, 其 后 即 为 编码 20 个 氨基 酸 的 外 显
子 2。 随 后 依次 是 :2292 bp 的 长 间隔 顺序 (内 含 子 B)、 编 码 48
个 氨基 酸 的 外 显 子 3、1364 bp 组 成 的 内 含 子 Q, 以 及 编码 36 个
氨基 酸 的 外 显 子 4. poly A 信和 号 在 终止 密码 后 的 261 个 核 苷 酸
处 。 值 得 注意 的 是 , 印 渍 分 析 表 明 , 在 第 二 个 内 含 子 区 有 几 处 与
某 些 潜在 病毒 增强 子 核心 成 分 同 源 。 此 外 , Holbrook 等 人 的 印
涡 分 析 发 现 9o9,， 其 56- 末端 侧 有 4 个 区 与 开 细 胞 白血病 病毒 同
源 , 认为 这 些 区 与 二 者 基因 特异 性 活化 有 关 。

为 了 确定 正常 与 异常 组 织 中 IL-2 基因 是 否 一 致 , Qlark 等
AMF Holbrook 等 人 co3 曾 对 恶性 袜 和 了 细胞 淋巴 瘤 细 胞 :
胸腺 革 皮 瘤 细胞 、 正 细胞 白血病 病毒 感染 的 下 细胞 和 和 白血病 细
胞 等 ， 都 进行 过 DNA 印 渍 分 析 。 证 明 各 种 来 源 的 细胞 均 未 发
现 明显 的 基因 多 态 性 、 重 排 或 扩 增 。

在 IL-2 基因 表达 的 调控 研究 中 也 应 用 了 印 涡 术 ， 例 如
Hirano 等 人 人 96 用 RNA 印 渍 术 证 明 , 下 细胞 丝 裂 原 - 植 物 凝集
素 (PHA)、 刀 豆 球 蛋 白 A〈ConA) 等 能 诱导 下 淋巴 细胞 IL-2
mRNA 的 产生 ,而 了 细胞 丝 裂 原 - 碍 is Hit (LPS) 等 则 无 此 作用 5

e267¢

他 们 用 RNA 印 涡 定量 分 析 表 明 ， 由 佛 波 脂 类 促 癌 剂 TPA te
PHA 诱导 的 细胞 中 提取 的 -mRNA5 在 体外 翻译 Th? 的 活性 要
中 单 用 PHA 刺激 的 mRNA 至 少 高 30 售 (用 其 它 技术 分 析 时
为 8 倍 )。 他 们 庆 劣 TRA 与 丝 裂 原 在 刺激 TL 2 Peo AY UE -
作用 是 十 分 重要 的 ; 并 认为 TRA 在 某 种 程度 上 可 千代 第 二 仿
号 5 5 | Mi ot AT S63
上 面 费 了 许多 笔墨 , 无 非 因 为 印 渍 术 在 IL-2 基因 研究 中 表 ，
现 突出 ,几乎 每 二 关键 环节 都 有 它 的 参与 ,包括 JI 9 基因 重 租 、
oDNA 的 克隆 和 筛选 .序列 测定 * 基因 组 结构 分 汽 及 定位 基因
表达 和 调控 等 。 更 何况 ,IIr-2 RT ERS SE
地 位 外 ,也 是 目前 少数 艺 种 用 基因 工程 生产 的 重组 药物 之 一。
重组 II 2 药 正在 进行 亚 临床 研究 ， 已 初步 证 明 它 在 自身 免疫
病 _ 免疫 合 隐 证 ,以 及 抗 肿瘤 等 病症 中 有 疗效 was 瑟 二 于 人
将 椎 动物 可 以 产生 抗体 ,对 外 源 性 物质 进行 应 答 s. 这 种 应
答 是 由 抗原 特异 性 相同 而 效应 功能 不 同 的 ， 多 种 抗体 的 相继 六
生 完 成 的 。 抗 体 的 效应 部 位 或 种 类 由 其 重 链 恒定 区 QH 区 ) 决
定 。 在 小 鼠 , 已 发 现 有 8 种 免疫 球 蛋 自 "0n5 IgM, IgD, 1eGe,
IgG, IgGs», Igoa, Ig 和 IgA, 已 知 由 第 一 次 接触 一 种 抗原 而
引发 的 原 发 反应 可 产生 IgM， 而 对 于 相同 抗原 的 继 发 反应 则 引
起 其 它 抗 体 的 产生 ， 如 血清 中 的 IgG 以 及 粘膜 上 的 节 A 和
IgM。 因 此 ,在 原 发 和 继 发 应 答 中 可 以 建立 起 对 抗原 的 免疫 3 记 ，
i270, 抗体 是 由 也 细胞 产生 ,每 一 个 了 细胞 能 在 其 表面 形成
表达 抗原 特异 性 的 免疫 球 蛋白 。 每 种 免疫 球 蛋 白 又 可 以 丙种 型
式 存在 ; 结合 膜 型 (m) 和 分 泌 型 (8)。 它们 之 间 的 不 同 ， 在 于 各
自重 链 的 羧基 末端 的 差异 。 抗原 刺激 一 个 卫 细胞 的 结果 之 一
就 是 m 型 到 8 型 的 转变 。 在 此 过 程 中 ,抗体 没有 发 生 特异 性 芝
种 类 的 改变 。 因 此 ,表面 免疫 球 蛋白 实 是 作为 也 细胞 接受 刺激

268， uw

萄 产生 抗体 的 一 个 外 部 信号 som。 有 关 免 疫 球 蛋白 的 结构 与 WB
能 虽 已 或 得 了 许多 进展 , 但 仍 存 在 许多 未 知 数 。 例 如 ,ID WH
能 相对 于 上 述 体液 免疫 应 答 的 情况 来 说 还 不 清楚 ， 其 它 种 类 免
疫 球 蛋 白 也 处 在 一 知 半 解 的 状态 。 印 渍 术 在 这 种 对 外 来 抗原 进
行 应 答 的 机 理 研 究 ， 以 及 有 关 疾 病 临 床 诊断 中 也 得 到 了 广泛 应
用 。

对 脑 养 液 (COSE) 中 IgG 组 分 的 测定 ， 有 助 于 某 些 神经 系统
炎 性 感染 疾病 的 诊断 89。 近 年 又 证 明 , 多 发 性 硬化 和 亚 急 性 硬
化 性 全 脑 炎 等 病人 ， 其 QOSF 中 某 些 IgG 组 分 区 带 含 抗 病毒 抗
体 习 光 其 是 含有 抗 麻疹 病毒 抗体 5o9。 为 了 提高 OSF IgG 组
分 区 带 测定 的 特异 性 和 灵敏 度 ， 许 贤 豪 采用 了 免疫 印 渍 术 cao。
他 把 提纯 了 的 免 抗 人 节 G 吸收 多 发 性 硬化 病人 的 OQSE, 把 此 样
TUES ARR IEF), EW NO 纸 。 印 渍 纸 经 狂
亚 后 ,用 过 氧化 物 酶 联 免 抗 人 IgG 进行 免疫 印 盖 ， 最 后 在 偶 氮
联 苯胺 和 HO. 溶液 中 进行 酶 染色 而 检 出 。 他 在 这 类 免疫 印 渍
TERE HAR IgG 组 分 区 带 实验 中 ,在 印 渍 纸 上 试 验 了 各 种
免疫 过 氧化 物 酶 染色 法 和 常规 染色 法 。 结 果 表 明 , DIN EE
帮 素 -过 氧化 物 酶 复合 物 染 色 法 最 为 敏感 。 它 比 过 氧化 物 酶 搞
过 氧化 物 酶 染色 法 敏感 2 倍 ; 比 直 接 免疫 过 氧化 物 酶 染色 法 敏
BR 4 4; 比 银 染色 法 敏感 32 倍 ; 比 考 马 斯 兰 桨 色 法 敏感 4800~
6400 FF, 许 贤 豪 认 为 ， 这 种 免疫 印 渍 术 的 高 灵敏 度 和 特 晃
性 可 用 于 OSF 中 有 关 病 毒 的 抗体 和 抗原 的 测定 , 并 有 助 于 其 流
行 病 学 的 研究 。

Wood 等 人 在 研究 免疫 球 蛋 白 重 链 和 轻 链 的 合成 . 加 工 及
ADH, RAAT EMAAR, Lefranc 等 人 也 曾 用 DNA. 印
溃 术 研究 了 正常 人 体 免 疫 球 蛋 白 重 链 恒定 区 基因 的 遗传 性 缺
类 sa。 正常 成 年 人 有 五 类 免疫 球 蛋 白 : IgM IgG IgD IgE

«269

TeA 但 Lefrane 等 人 用 DNA 印 渍 杂交 却 发 现 一 名 健康 的 穴居:
Wy Ay se NERA 4 IgM IgD, pape sierra
种 异常 模式

许多 自身 免疫 疾病 , 如 风湿 病 、 +4 £0
等 ,病人 血清 中 常常 发 现 高 浓度 的 、 在 健康 人 血清 中 未 能 检 出 的 -
低 分 子 量 IgM。 所 谓 低 分 子 量 IgM, 实 是 五 聚 体 IgM Ag
单位 。 通 常 认 为 , 低 分 子 量 IgM 与 循环 免疫 复合 物 下 风湿 因子
(RF) 有关。 Koh 等 人 cs 用 免疫 印 渍 术 定 量 检测 了 6: 剑 亚 急
性 细菌 性 心 内 膜 炎 (SBE) 病 人 、2 PIA HERD POA, DRE
为 对 照 的 20 例 健康 人 中 的 低 分 子 量 Tes 二 此 同时 , 又 用 比 浊 .
法 等 测定 各 血清 样品 中 的 RE 等 。 结 果 表 明 导 苔 染 性 宇内 膜 炎
病人 存在 低 分 子 量 IGM, 也 观察 到 它 和 风湿 因子 有 密切 关 深 j 此 .
bh, iL BECUASE AR, CHIRAL RRS ey ET
IgM AISA IgM, VR E—AL IgM 多 聚 化 为 特征 的 ad
病 caa。 GER

由 上 可 知 ， 印 溃 术 在 免 冯 学 与 自身 免疫 类 病 方面 已 得 到 广
泛 应 用 。 事 实 上 , 首创 免疫 印 渍 术 的 Towbim AO) gee
免疫 印 渍 术 来 研究 抗原 特性 ， 以 及 筛选 自身 免疫 (结缔 组 织 ) 病 -
抗 血清 。 现 在 ， 许 多 相关 抗原 中 有 一 些 已 用 免疫 印 渍 未完 成 了
特性 鉴定 , 并 在 Towbin 各 Gordon 于 1984 年 发 表 的 免疫 印 吐 :
术 综述 文章 中 , 已 用 表格 的 形式 列 出 ( 见 文 献 [15] 之 表 VyD HE
中 的 一 些 是 令 人 鼓舞 的 。 例 如 ,组 蛋白 类 HI yy 2B BIR IE
全 身 性 红斑 狼疮 中 主要 的 全 身 抗原 cael; 来 自 心肌 细胞 的 于 两 种 -
分 子 量 分 别 为 88,000 和 48, 000 Ay AE a, AB ANAL ai Te
Fi WIZ", Web, Gordon 和 Roseuthal Ay A EVRA.
进行 研究 ,建立 了 一 套 自 身 免疫 图 谐 ， 用 来 测定 抗 DNA 抗体 、
风湿 病因 子 ， 以 及 针对 来 自 HeLa 细胞 亚 细 胞 分 部 的 抗体 ”ee

人 TO

此 种 点 印 渍 检验 法 已 用 于 临床 ， pai 血清 已 被 选用 为 国际 标

准 化 参 比 血清 。

七 、 在 单 克 隆 抗体 生产 与 研究 中 的 应 用

站 1975 年 Kéhlor 和 Milstein 创建 了 单 克隆 抗体 (以 下 简
称 单 抗 ) 无 限量 生产 末 以 来 ,使 得 免疫 学 的 理论 研究 与 实践 都 发
AT EKER, 现在 ， 单 抗 生 产 术 已 成 为 生命 科学 与 医学 许多
领域 必 不 可 少 的 重要 技术 ca9)。

研究 与 制备 单 抗 的 主要 目的 之 二 ， 在 于 临床 应 用 单 抗 诊 断

STARR. HAR, BRERA HARE AN BARC

技术 制备 的 鼠 单 抗 。 从 临床 角度 看 ， 人 单 抗 优 于 鼠 单 抗 。 因 为
患者 摄 入 鼠 单 抗 , 作为 一 种 异 已 蛋白质, 总 要 冒 过 敏 反应 及 发 生
免疫 复合 物 病 的 风险 。 人 何况， 人体 对 作为 异种 蛋白 质 的 鼠 单 抗
必然 具有 更 快 的 清除 速度 。 例如 ，Burton SAW RSA T A

网 单 抗 (OKTs) 治 疗 同 种 肾 移植 物 排斥 范 象 ， 姜 例 患 者 均 出 现

发 热 . 寒 额 . 皮疹 ， 尚 有 一 例 出 现 支气管 痉挛 。 WAL 例 患者
的 先后 出 现 抗 OK Ts 抗体 ， 此 时 即使 增加 OKTs 治 疗 量 也 无
效 -…。 由 此 可 知 , 生 产 人 单 抗 是 势 在 必 行 ， 但 因 人 骨髓 瘤 细 胞
的 培养 条 件 比较 苛刻 ,生长 速度 又 慢 , 尚 需 进行 研究 与 试验 。 就
目前 而 言 , 人 单 抗 的 研制 主要 有 两 种 方法 : A) 经 典 的 杂交 瘤 技
AR, 即 用 人 骨 散 瘤 细胞 系 或 淋巴 母 细 胞 系 (LOL) 与 人 免疫 也 细
胞 融合 的 人 关 人 杂交 瘤 技术 ; (2) 利用 EB 病毒 转化 技术 结合
细胞 克隆 化 技术 ;建立 分 泌 大 单 抗 的 永久 性 抗原 专 一 的 卫 细胞
系 。 显 然 , 生 物 大 分 子 印 渍 术 在 杂交 瘤 的 筛选 中 , 在 病毒 转化 的
鉴别 中 , 以 及 在 克隆 技术 的 甄别 中 都 将 是 一 项 有 效 的 技术 。
UEP, FED AP, 也 常 利 用 单 抗 作为 探 针 去 探测 其 相关 抗

e271。

原 。 这 类 方法 也 常 成 为 某 些 疾病 临床 诊断 的 手段 之 一 于 面 将
具体 列举 一 些 印 涡 术 应 用 于 单 抗 研究 与 实践 的 实例 a 于

制造 单 抗 时 最 重要 的 因素 之 一 ， 就 是 快速 地 筛选 出 杂交 瘤
培养 物 上 清 液 中 的 相应 单 抗 。 过 去 ， 这 种 筛选 是 把 抗原 结合 到
微量 滴定 板 上 ， 然 后 进行 放免 分 析 。 这 种 方法 的 成 功 与 否 往 往
与 抗原 能 否 吸 附 到 塑料 板 表 面 有 关 。 为 此 二 Sternberg 和

Jeppesen KAS APRRYY. 他 们 所 用 抗原 为 中 国 仓 鼠 染 色 -

体 、 染 色 体 核心 蛋白 和 细胞 核 等 ,对照 为 低 分 子 量 的 蛋白 质 标 准
系列 商品 。 操 作 时 , 把 上 述 各 抗原 均一 分 为 二 ,分别 用 下 CCM 组
冲 液 (120mM KOI, 20mM NaOl, 0.1% TritonX—100, 10 mM

Tris-HCl, pH8.0) 悬 浮 , 或 者 用 变性 缓冲 液 38D3; 50mM

DTT, 62.5mM Tris-HCl, pH6.8) 溶 解 ， 然 后 分 别 用 毛细 管
以 圆 点 的 形式 点 于 NO 纸 上 。 此 种 NO 印 渍 纸 旦 圆 形 元 直 各
92mm。 用 前 , 先 用 笔划 上 5mm 的 方 格 , 抗原 样品 即 点 在 各 方
格 之 交叉 点 处 。 每 点 用 量 约 0.511, H4F 0.1~1.0mg 蛋白
质 。 点 样 毕 ， 在 室温 下 用 50 ml. 内 含 5% 小 牛 血 清 的 Tris- 盐
水 (0.9% NaOl, 10mM Tris-HOL pH7 4) vi 30 4+ 4h, WE
KRNCOKELMRBAAD. R-AWA-EM, A — ke
Tris- 盐 水 浸 湿 的 普通 滤纸 ,把 上 述 洗 好 的 .NO 纸 放 在 普通 滤纸
上 , 再 把 杂交 瘤 各 培养 物 上 清 液 分 别 点 在 原来 点 有 抗原 的 班 点
hh (BDZ SUK), AGA Lull BES, 室温 下 静 置 30 分

钟 。 取 出 NO 纸 , 顺 次 用 100mlTris- 盐 水 .100ml py 0.05%

NP 40 的 Tris- 盐 水 ， 和 100 ml Tris- 盐 水 各 洗 10 分 钟 5 把
洗 过 的 NO 纸 放 入 内 含 5% BSA #1 5 x 10° cpm/m] 32T- 标 记
P(ab)s REM IgG 的 Tris- 盐 水 中 , 振荡 45 oh, Ba, 如
上 述 洗 涤 后 干燥 , 并 进行 放射 自 显影 。 显 然 ; 经 上 述 试验 后 盖 丸

能 和 总 的 染色 体 蛋 白质 以 及 染色 体 核心 蛋白 (Core protein) 起

2272

-5 应 的 培养 物 中 ,都 含有 针对 该 核心 蛋 睛 抚 原 的 单 充 隆 抗 体 ,并

;在 放 显 谱 士 显现 斑点 ; RZ, WEHtRe mMELAARA 92mm
FY NO 圆 片 土 : 一 次 可 筛选 杂交 瘤 培养 物 80 份 ; 而 县 还 能 指示
“抗体 特异 性 。 例如 土 述 实验 中 , 他 们 把 天 试 抗 藉 相应 的 单 抗 编 号
-为 468 和 206。 这 是 因为 ; 单 抗 4G8 能 结合 到 8DS 变性 的 染色
- 体 和 细胞 核 止 , 但 不 能 和 未 变性 状态 者 反应 。 单 抗 206 却 可 与
这 两 种 处 理 的 染色 体 和 细胞 核 都 发 生 反 应 富 ”。

_ Mathew 等 人 最 近 创 造 了 一 种 称 为 用 受 体 介 电 的 电 诱 发 细
胞 融合 技术 来 制备 单 克 隆 抗体 35 他们 用 免疫 印 渍 术 分 析 了
新 法 和 各 种 类 有 方法 的 特性 ,指出 新 法 所 得 单 抗 都 具有 高 度 的
特异 性 ;新 法 可 以 减少 免疫 次 数 ,节省 抗原 用 量 ， 大 大 减轻 了 得
KLE, 能 得 到 高 亲和力 的 单 克 隆 抗 体 。

在 利用 免疫 印 涡 术 和 点 印 渍 术科 选单 克 隐 抗体 的 7 作 中 ，
Towhin 等 大 的 下 作 尤 为 突出 5。 他 们 采用 了 如 表 6-5 所 列
各 种 和 划 选 方法 ， 从 杂交 瘤 培养 物 上 清 液 中 筛选 出 针对 鸡 核糖 体
蛋白 86.L7、 Li8a、P1/P2， 以 及 针对 核糖 体 ENA yA eat

6S 用 各 种 免疫 原 免 疫 小 鼠 后 , RRMA

ARMA Mime

融 名 称 注入
全 | 一 一 一 一 一 一 | 免疫 原 mee | 抗体 类 别 | EE
号 | 杂交 瘤 | “抗体 | BSe
1 | xp2 | #-L1ga | 408-+6098 RIA; ELISA IgGl k} —
2 | VA2 | 抗 -8S6 S6 ELISA; 免疫 印 涡 法 | IgGl, k =
+ Jemtes |d-86-+ 4 IgGl, 下 | -
3.| 11D4.. | 34-L7_ 608 | 二 印 渍 法 ; Ce IgM, k | —

TVAT | 抗 -RNA | ‘IgM, k | +
4} xpe | P< |. Peso | Renee ee eM, k | +e

RIA, Ca EWE ‘ELISA, BREN NUETE. 不 同 融合 号 的 融合 条
和 件 不 同 8E i

2786

笨 。 由 表 可 知 , 印 渍 术 是 主要 簿 选 方法 , RIA 和 ELISA 法 主要
用 来 比较 印 渍 术 的 灵敏 度 。 实 验 中 ; Towbin 5 eee Hi —
针对 位 于 核糖 体 大 亚 基 38kDa 蛋白 质 的 新 的 单 抗 ” 并 到 名 为

PO“, Ab PO 帮 为 探 针 , SA PRRRM TARR

糖 体 的 蛋白 质 。 证 明 ， 在 所 有 被 试 的 物种 中 都 存在 这 种 相关 抗
原 229。 值 得 提出 的 是 ，Towbin 等 人 在 此 工作 中 报道 了 可 逆 染
色 法 , 即 先 用 可 逆 性 染料 使 印 渍 纸 显现 全 谱 ,用 笔 作 好 标记 后 洗
去 染料 , 再 改 用 探 针 进行 免疫 检 出 ( 详 见 第 四 章 )。 这 样 做 ， 又 使
印 渍 术 进 一 步 简 化 , 节省 了 筛选 或 检 出 时 间 。

Hawkes 等 人 也 用 点 印 渍 术 从 超 免 疫 林 鼠 脾 细胞 和 和 oT
系 细胞 融合 的 杂交 瘤 培养 物 中 ， 筛 选 针 对 突 触 体质 膜 蛋 自 的 单
克隆 抗体 ce1。 他 们 指出 , 采用 点 印 涡 时 ; FY ES eRe Ae SED
的 上 清 液 进行 上 述 试验 ， 而 不 必 稀释 。 经 此 法 筛选 出 的 一 种 针
对 鼠 脑 抗原 MIT-28 的 单 克隆 抗体 , SOB HERR, FE FR Be
术 分 析 了 来 自 各 种 鼠 组 织 粗 匀 浆 物 , 以 了 解 其 组 织 分 布 ,结果 如
图 6-10 所 示 。 图 中 ,LO.FKT.S 和 互 分 别 代表 小 鼠 的 用 、
小 脑 . 前 脑 、 肾 、 胸 腺 ` 横 纹 肌 和 让 肌 。- 由 图 可 知 寺 MIT=23 只 存
在 于 小 脑 和 前 脑 中 , 其 它 被 试 组 织 中 均 不 存在 ce。

LCF eee
图 6-10 用 点 印 读 术 分 析 鼠 脑 MIT-23 的 组 织 分 布 ，

在 利用 免疫 印 涡 术 检 出 各 种 抗原 物质 的 研究 中 ， 使 用 单 搞
作为 探 针 的 例子 就 更 多 了 。 例 如 补体 第 三 成 分 (09) 是 补体 系统
的 关键 成 分 ,已 知人 Os 有 着 遗传 多 态 性 , 迄今 已 知 0s 的 等 位 基
WML 20 个 。 Koch 和 Behrendt 最 近 用 免疫 印 涡 采 ， LW OF
作 抗 原 ， 从 细胞 融合 培养 上 清 液 中 筛选 出 一 个 被 称 为 互 AV 址

» 274.

的 单 壳 隆 抗体 9 他 们 再 以 HAV4， 为 探 针 ; 用 免疫 印 溃 术 对
各 种 天 血浆 中 的 -Qs 衍生 物 进 行 检测 ， 发 现 单 抗 了 AVe;i 仅 同
OsF 而 不 与 0s8 反应 。 以 全 反应 性 人 Cs 特异 性 单 抗 HAVa_s
作为 对 照 ) 用 免疫 印 渍 术 检 测 了 208 个 人 的 血浆 样本 ， 结 果 发
PMRHAOCSHAS 了 AV4; 有 反应 ， 而 某 些 具 OoF 者 不 与
HAVa5 反应 局 其 中 ,0 人 HAVs ;+ ES 1.9%, TOF

OK HAV as HES 11.8%, 他 们 发 现 的 这 种 新 的 人 0Os

多 态 性 是 基于 小 鼠 单 抗 同 Cs 分 子 的 反应 性 而 不 是 基于 电 和 荷 差
异 。 目 前 尚 不 知 Os SUK (Co 或 B) 或 裂解 产物 中 ， 哪 一 部 分 携
带 此 决定 基 。

RSM Chwyzer 在 用 酶 切 图 谱 法 确定 猿 猴 病 毒 40(3SV40)

-大工 抗原 上 单 克 隆 抗 体 结合 位 置 时 ， 也 主要 采用 免疫 印 溃

术 一 。 在 她 们 的 实验 中 采用 了 单 抗 PAbse;PAbss 和 了 Abassi。

了 Ab 是 乳 多 空 病 毒 蛋 白质 抗体 人 apovavirus protein antibody)
的 缩写 实验 时 ， 她 们 把 SV 40 的 大 下 抗原 用 各 种 蛋白 酶 消

化 ,所 得 片段 经 SDS-12.5% 了 AGE 分 离 后 ,用 扩散 印 渍 法 ， 双
方向 印 涡 24~48 小 时 。 得 到 的 印 涡 纸 经 狂 灭 后 ， 用 l-trid
的 止 述 单 抗 作为 探 针 进 行 探测 。 最 后 放射 自 显影 并 分 析 得 到 各
单 抗 在 大 工 抗原 上 的 结合 位 置 ， 证 明 PAdes 结合 到 大 了 工 抗原

N Sap) 17kDa 片段 上 ; PAD 结合 到 大 工 抗原 OC 末端 所 得 到

的 几 个 重 可 片 眉 上 so。

入 、 在 各 种 传染 病 病 理 研究 与 临床
”和 诊断 中 的 应 用

从 上 述 各 节 已 不 难看 出 , 印 渍 术 在 遗传 病 、 自 身 免 疫病 、 瘤
和 等 病理 探讨 和 临床 诊断 中 已 有 一 定 应 用 。 就 目前 已 公布 的 资 -

。 2756"

料 着 ， 事 实 上 印 渍 术 已 在 众多 疾病 的 病理 学 研究 与 临床 诊断 中
发 挥 作用 。 例 如 在 传染 病 方 面 ， 印 渍 术 遍 及 各 大 类 ) 所 播 峰 鼎
类 原生 动物 类 支原体. 衣原体、 细菌 .病毒 等 等 5 .就 印 渍 末 被
应 用 的 情况 看 大 致 可 分 四 类 Si5，( 了 印 渍 抗原 以 测定 病 类 的 抗 )
体 谱 ; (2) 用 印 渍 术 鉴 定 包 括 单 抗 在 内 的 抗体 的 特异 性 号 以 俩 |
用 作 病 理学 抗原 检 出 的 免疫 学 探 针 ; (3) AUR ERR Ae) BE
确定 类 特异 性 (Class specificity) 和 (或 ) SAHA te (Oligo-
clonioity); 《4 直接 把 印 渍 术 用 于 临床 诊断 ; Ba, be)
类 应 用 最 多 ,第 ( 约 类 则 刚 开 始 。 现 把 各 种 印 渍 术 在 传染 病 类 的 !
应 用 介绍 于 后 。 + Sp et Sete
iG RK AE Yee EY BERS, AR a RARER
增 溶 抗原 制剂 等 原因 , 过 去 一 直 很 难 研究 上 Bite RR
术 , 这 些 困难 得 到 了 克服 。 例 如 :Tsang :等 大 用 印 渍 术 和 研究 了 是 :
吸虫 传染 的 抗体 特异 性 58; Weiss 等 大 920 和 江 acias 等 从 9 分
别 用 免疫 印 渍 术 测 定 了 妆 有 丝 虫 和 涤 虫 病人 的 抗体 谱 > 他 们 都
认为 ,通过 制备 抗原 或 特异 性 抗体 ;就 可 用 印 溃 示 为 这 些 传染 病 !
患者 进行 早期 诊断 Sevl。 Gottstein 指出 印 渍 术 可 以 改善 夭 :
同 涤 虫 传 染病 之 间 血 清 学 上 差异 的 甄别 sdjMiller 等 大 认为 站
Hs BE EN WARE REM PAA Ae BE SI Te EO,
44: He FE BI Rb as os ZS HRM Bd BE LH Hd RST BET a
Be MOAT YB Ae A HP BE a SL ARE Ey Bs
圆 点 的 形式 点 于 省 化 氰 活化 纸 上 ,， BRR, Boel RA
血清 或 10J 病人 脑 硝 液 加 到 印 涡 纸 的 抗原 斑点 诗风 二 室温 下
反应 18 小 时 。 RHPA, 洗涤 后 再 和 结合 有 IgGs IgGs Ar
IgG, 的 “1-A 蛋白 于 室温 下 反应 3 小 时 。 最 后 经 洗涤 。 干燥 ~
放射 自 显影 ,用 7- 计 数 器 定量 测定 放射 性 二 Ae
了 70 Pj A aL GS AA AF Ye A EB A RO, ASS RE pS Oe

©2766

例 ; DAE BE HI 15 例 ; 脑 实质 春 虫 病 1B 例 ; 神经 对 照 组 14 例 ;
FUSE BE LT 例 。 结 果 显 示 ， 脑 室 或 脑膜 圳 虫 病 组 病人 血
清和 脑 养 液 抗体 水 平 (63.9% FI 52%) 与 对 照 组 (81.8% FI
2.13 匈 ) 相 比 , 均 有 显著 差异 ,2<0.0005。 脑 实质 囊 虫 病 组 病人 -
拥 清 和 脑 硝 液 的 抗体 结合 率 ( 和 .7% 和 10.4 多 ) 与 对 照 组 相 比 ，
HARE EM (p<0.001 和 2<0.0005) 。 脑 室 、 脑 膜 圳 里
病 组 所 有 病人 撑 清 和 脑脊液 抗体 水 平 同时 明显 增高 。 脑 实质 事
HI 15 例 病 大 中 ，2 例 的 脑脊液 抗体 明显 增高 ，1L 例 血 清 或
《和 ) 脑 养 液 抗 体 水 平 中 等 增高 。 对 照 组 芭 例 中 , AL
等 水 平 增高 , 其 余 均 不 增高 。Miller 等 人 指出 ,点 印 渍 术 检 测 脑
室 、 脑 膜 囊 虫 病 敏 感性 为 400%， 脑 实质 囊 虫 病 敏 感性 为 86 多，
假 阳性 为 了 为 因此 认为 ， 用 点 印 渍 术 同 时 检测 血清 和 脑 状 液
抗 圳 虫 特异 性 抗体 , 可 提高 圳 虫 病 临床 诊断 的 准确 性 99。

原生 动物 侵入 人 体 也 引起 许多 疾病 。 开 ettis 等 人 证 明 ， 应
用 免疫 印 渍 术 能 对 痢疾 阿 米 巴 (Entamoeba histolytica) 作出 血
清 学 上 应 答 ， 因 此 可 作为 肠 外 传染 较 好 的 迎 清 诊断 (Serodiag-
nosis) "841, Partanen 4 \.°")_Erlich 4 \.5%), pl % Sharma
等 人 9 全 都 研究 过 弓形 体 病 (Toxoplasmosis) 免 疫 应 答 中 病人
的 血清 图 谱 , 免疫 印 渍 术 能 显示 出 这 类 肽 谱 的 免疫 应 答 , 故 可 用
ES BRN Bi. Ogata 等 人 co 曾 详细 介绍 了 用 单 克 隆
访 体 和 抗 生 物 素 -生物 素 联 抗体 等 作为 探 针 , 采 用 免疫 印 渍 术 检
测 弓 形体 膜 抗 原 的 具体 方法 。

在 原生 动物 门 中 最 受 人 注目 的 是 汪 原 虫 ， 因此 采用 印 涡 术
研究 和 诊断 痉 疾 已 有 许多 报道 。Anders 等 人 926 曾 从 血清 学 上
PRM AK, HOE HE HY, 认为 此 肽 可 能 就 是 使 宿
_ 主 免疫 系统 被 压抑 的 分 子 基 础 。 免 疫 印 渍 术 分 析 表 明 , 尘 原
虫 是 通过 其 高 度 的 遗传 变异 性 来 逃避 宿主 的 免疫 系统 。 例 妇

9277s。

Coppel 等 人 用 印 渍 术 分 析 发 现 28" 由 一 种 具 重 复 氨基 酸 序 允
的 肽 产生 的 抗体 ,能 和 半 原 虫 分 泌 的 220kDa HARB
来 , Holder 等 人 证 明 ， 针对 这 种 多 肽 生产 的 单 友 隆 抗体 是 种 特 :
异性 的 (Species-specifie), 而 一 种 多 克隆 抗体 则 能 起 种 间 交 叉 反
jv, Taphaisri 等 人 用 免疫 印 渍 术 研究 了 与 首 区 天 群 和 闪 疾
病人 血清 发 生 反应 的 恶性 并 的 子 孢 子 抗原 成 分 8eo5 AR
了 已 证 明 能 减弱 同 种 子 孢子 传染 性 的 抗 恶性 痉 (2A 10) 和 抗 间
日 洗 (2F2) 环 子 孢 子 蛋白 的 单 抗 。 受 试 3 组 血清 分 别 采 自居 住
在 首 区 的 10 例 健康 人 、:0 例 现 症 恶 性 半 患 者 (AM)5 #1 10 HI
脑 型 恶性 症 患 者 (OM) 。( 事 先 ， 经 用 间接 荧光 抗体 试验 和 环 子
孢子 沉淀 试验 ， 都 证 明 这 些 患者 具有 抗 恶 性 闪 和 间 肯 疙 子 孢 子
抗体 。 抗 原 为 感染 恶性 首 和 间 日 闺 原虫 的 巴 拉 巴 蚊 的 唾 腺 六 经
PABA MET MF. REPRE, Brags Binz
RO 2e/) SUL, SEAT ATE ASR REA
的 免疫 反应 。 与 特异 的 单 抗 2A10 相对 应 的 抗原 子 孢 子 蛋 白 比
较 , 证 明 这 是 含有 4 种 不 同 分 子 量 多 肽 成 分 的 蛋白 质 ; 即 67,000:
(Pf 67) _65,000(Pf65)_ 60,000(Pf 60) Fy 58,000(Pf58), 居

fE7ETE KAY 10 例 健康 人 中 发 现 有 抗 Pf 60 Fn PLS APA,

抗体 。 其 中 必 wl AH Pf 65 抗体 ,3 例 尚 有 抗 Pf 67 Silk, 10
例 AM 和 10 例 QOM 病人 均 有 抗 Pf65 . Pf 60 和 了 Pf58 抗体 。 此
bh, 印 渍 术 分 析 还 证 明 , 恶性 首 和 间 日 首 环 子 犯 子 蛋白 有 种 特异
性 和 期 特异 性 。 即 ,在 血 内 时 期 的 原虫 中 它们 并 不 存在 ;而 且 它
们 只 与 同 种 相应 抗体 发 生 反应 ; 恶性 半 子 孢子 抗原 既 不 和 单 搞
2F2 反应 ， 也 不 御用 间 日 省 子 孢 子 免疫 的 小 鼠 血 清 起 反应 。 相
反 ， 单 抗 2A10 和 间 日 半 环 子 孢 子 蛋白 也 不 发 生 反应 = 10 ITE
常人 血清 及 正常 蚊 的 唾 腺 在 上 述 印 渍 试验 中 均 阴 性 5 :由 此 证
明 ， 环 孢子 重 白 是 自然 感 娄 逐 性 疙 引起 抗体 应 答 的 主要 抗原

s27B，

成 分 。

关于 支原体 (Mycoplasma) 和 衣原体 (Chlamydia) 感染 的
印 渍 术 诊断 也 有 一 些 报道 。 例如 Wise 和 Watson 曾 开发 了 一 -
种 支原体 抗原 特异 的 -存在 于 感染 细胞 表面 表达 的 单 克隆 抗体 ，
用 它 作 探 针 即 可 用 免疫 印 渍 术 进 行 临床 诊断 #。 针对 衣原体
多 肽 的 免疫 应 答 ， 也 用 免疫 印 渍 术 分 析 过 被 衣原体 感染 的 病人
ij“, Matikainen 和 Terho 还 开发 了 特异 性 抗体 探 针 ， 认
为 它 在 衣原体 的 临床 诊断 中 可 用 作 印 渍 术 检 验 的 工具 9 。

由 细菌 引起 的 疾病 ,其 病理 研究 和 诊断 已 有 大 量 的 采用 和 印
渍 术 的 报道 。Swansson FHS MH A
作为 探 针 ,用 免疫 印 渍 术 研 究 过 淋病 奈 瑟 菌 (Neisseria gonorr-
hoeae) 的 外 膜 结 构 。。 Gubish 等 人 为 了 鉴定 淋 球 菌 菌 毛 的 受
体 ， 免 疫 印 渍 了 宿主 的 蛋白 质 2al。 过 去 一 直 认 为 密 螺 旋 体 属
(Treponema) 感 染 的 免 冯 应 答 相 当 复 杂 。 后 来 ，Hanff SAR
用 免疫 印 渍 术 测 定 了 梅毒 螺旋 体 (Treponema Pallidwm) 感染 -
BRIER WSR, 解答 了 梅毒 感染 中 循环 着 的 免疫 复合
物 是 否 含 自身 抗原 类 , 或 螺旋 体 抗原 类 的 问题 。 现 在 ，Baughn-
等 人 已 把 免疫 印 渍 术 用 于 鉴定 存在 于 这 种 免疫 复合 物 中 的 密 螺
旋 抗 原 8se。 俗称 壁 剧 的 蜂 对 螺旋 体 的 传染 负 有 责任 ， 这 一 结
论 也 是 用 免疫 印 渍 术 分 析 得 到 的 。Barbour A fii Tw A.
血清 和 一 种 单 抗 进行 免疫 印 渍 ， 发 现存 在 于 病人 的 抗原 和 从 壁 ，
乔 中 分 离 出 来 的 螺旋 体 之 间 显 示 出 抗原 同一 性 Sr,1sl。 和 霍乱 肠 .-
毒素 是 霍乱 的 重要 致 病因 素 ， 熊 凌 霜 各 马 清 钧 利用 大 肠 杆 菌 热
敏 肠 毒 素 LT 基因 作为 探 针 , 采 用 DNA 印 渍 术 对 霍乱 绝 菌 中 的
替 乱 扬 毒 素 基因 作 了 侦察 与 定位 8sl。 此 工作 为 进一步 研制 抗
夫 乱 遗传 工程 菌 疫 苗 提供 了 必需 的 资料 。 周 电 钟 等 人 采用 点 印
渍 术 ， 在 溴 化 氰 活化 印 渍 纸 上 检 出 肝炎 病人 血清 中 特异 性 蛋

e279 。.

AR, VHRR FA ILA tps JR A AS
WOO. PUB HEE, Be BAR Ta. Bl
iy) Chakrabarty %§ A 2 3] TJ BA} 3 FF (Mycobacterium
leprae) Ht JR, Miller 2) Wi Ase Hh — PRUE Be
它们 的 单 抗 特异 性 也 曾 用 免疫 印 渍 术 测 定 过 cs39 a
麻风 的 早期 论 人 断 和 有 关 流行 病 检 可 提供 了 移 六 的 诊断 斌 剂 。
免疫 印 渍 术 最 显著 的 应 用 之 一 是 在 病毒 感 桨 的 血清 学 分
析 。 病 毒 较 难 培养 , 抗原 又 极为 复杂 , 加 之 溶解 度 壮 , BRE
难 作出 正确 判断 。 相 反 , 免疫 印 渍 术 只 需 少量 样品 ,高 的 分 辩 率
和 灵敏 度 使 之 成 为 研究 病毒 感染 的 主要 方法 。Hall 和 和 Choppin
使 用 免疫 印 渍 术 检 出 时 指出 ， 在 患 有 亚 急性 重 兹 性 全 脑 炎 药 病
人 脑 中 , 缺失 一 种 麻疹 病毒 肽 上 中 5。 Dorries Fy Ter-Meulen ips
jie hi Fh EL Bet MY A BE Ap BE (Coxsackiovirus) MYL AH LAY KE
异性 肽 的 TeM 抗体 nse。 印 渍 术 也 已 被 用 于 研究 也 型 肝炎 中 抗
原 的 本 质 。MoeMichael 等 人 把 血清 中 互 Bs 抗原 在 电泳 时 函 现
的 迁移 率 的 变化 和 病情 的 发 展 联系 起 来 nsmn。 他 如 养 获 灰质 炎
FARES BE HEA REO ee ee
用 免疫 印 溃 术 分 析 过 。 顺便 提 一 下 , 农 、 收 业 的 一 些 病 毒 也 可 用
DORA BT AEE > Pin, O'Donnel 等 人 就 提 再 过 采用 免疫 印 污
术 检 定 来 源 于 野地 的 植物 病毒 抗原 的 趴 体操 作 GEo Ry ick:
and Wechmar 也 用 免疫 印 渍 术 分 析 植物 病毒 ae。Rose 吕 莹 天
用 免疫 印 渍 术 对 牛 病毒 的 研究 8ea, 有 可 能 开创 印 渍 术 在 普 医 学
方面 的 应 用 。 至 了 印 深 术 在 昆虫 病毒 抗原 类 的 研究 ， 已 有 不
报道 , 可 望 在 农业 害 果 的 控制 中 发 挥 作用 ces~165
SARS EULER SOROS MN FRR
ODORS, SURE PRE BRA 操作 容易 等 特
Re MERE EAA TUR A EBL, SRD

~ 280%

来 越 广泛 。 就 医学 领域 而 言 ， 除 了 印 渍 术 的 上 述 特点 外 ， 若 采 :
用 点 印 渍 术 ， 因 能 二 次 操作 完成 数 百 抗原 的 血清 学 分 析 而 更 为
人 们 所 瞩目 。 可 以 预料 , 印 渍 术 在 临床 检验 中 必 有 远大 前 程 ,并
可 能 蔡 代 许多 现 有 的 标准 检验 方法 。

印 渍 未 初创 至 今 仅 有 十 二 年 历史 ,方法 学 上 还 在 不 断 创新 与
发 展 , 作者 渴望 这 本 小 册子 能 为 她 繁花 似 锦 的 前 程 ,添上 一 片 小
绿叶 。 本 书 中 有 关 作 者 的 研究 工作 得 到 国家 自然 科学 基金 资助 。

参 考 xB

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本 书 所 用 缩写 或 简称

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a-f(o) etoprotein 甲 胎 和 蛋白
Albumin 白 和 蛋白
Aminophenylthioether cellulose RIE Fi HE
Bisacrylyleystamine MA MAREKR
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Biotin—labeled deoxyuridine triphosphate 生物 素 标 记
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Bovine serum albumin 和 牛 血 清白 蛋 白
N-a-—Benzoyl—DL-—arginine-p-nitroanilide hydroch«
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Calmodulin 钙 调 蛋白

Complementary DNA 互补 DNA
Concanavalin A( 伴 ) 刀 豆 球 和 蛋白 A

Cellular oncogene 细胞 ( 致 ) 癌 基因

N', N'-Diallyltartardiamide N, N'-—~AKE BARR
Diazobenzyl oxymethyl cellulose( paper) BAF 3 PE
纤维 素 ( 纸 )
Dextran sulfate 葡 聚 糖 硫 酸 酯

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Esptein—Barr virus EB 病毒 ; EH CRATE
Ethylene diacrylate 二 丙烯 酸 乙 酯

Anti-Ge giobulin 抗 Ge RBA

Glycoprotein 糖 蛋白

Hemoglobin 血红 蛋白

HL-A antigen HL-A 抗原 ; 有 核 细胞 表面 的 组 织 相 容 -
性 抗原
Herpes simplex virus 单纯 性 疱疹 病毒
125T_labeled deoxycytidine Fat; ic hi She FA
1257 labeled deoxyuridine RAE ICRA Se Tod

Isoelectric focusing 等 电 聚 焦

Immunoglobulin 免疫 球 蛋白 二 了
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Lipopolysaccharide 脂 多 糖 ©

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Murine mammary tumor virus ASL EAR “>
Nitrobenzyloxymethy] cellulose #4332 ARH
Nitrobenzyloxymethyl py chlorinate MASE.
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Nitroblue tetrazolium #41 DOM CA
Nitrocellulose (paper) 硝 酸 纤维 素 ( 纸 )
Nonidet P-40 一 种 去 污 剂 的 商品 名

Optical density 光 密 度

Oncogene 致癌 基因

Ornithine transcarbamylase 1 SF
Polyacrylamide gel 聚 丙 烯 酰 胶 凝 胶

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Polyacrylamide gel electrophoresis SAQA BERR ERE
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电 聚 焦

Phosphate—buffered saline 磷酸 盐 缓 冲 的 生理 盐水
Polyethyleneglycol 聚 乙 二 醇
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Phytoh (a) emagglutinin 植物 凝集 素

Pyridoxal phosphate BERRI BR

Hemoglobinuria 121A RIE

Polyvinylpyrrolidone 3 ZL G2 Ba

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Phosphopyridoxy] BBL ES
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Rheumatismal factor 风湿 因子
DNA restriction fragment length polymorphism DNA
限制 酶 切片 段 长 度 多 态 性

Streptococcus anti=biotin protein 链球 菌 抗 生 物 素 和 蛋白
Subacute bacterial endocarditis WARM DAR
炎

Simian virus 40 猿 猴 病毒 40
Tris-buffered saline Tris 缓冲 的 生理 盐水
Anti-transferrin FREER
Thymidine kinase iy SB

Trimethyl psoralen 三 甲 基 补 骨 陛 未
Tobaccomosaic virus 烟草 花 叶 病毒
10mM Tris-HCl/0.9% NaCl, pH 7.4
Tween 20 吐 温 20

Zetabind 用 于 印 渍 的 一 种 尼龙 衬 底 腊 之 商品 名 。

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海 锦 华 实验 器 械
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