5 A oT? Pr, ei ) | ae sol ae (ieee a Pi i ae wi 世界 农业 丛刊 生物 固氮 译 丛 〈 三 ) RRA 主编 * * * BEB 李 永 庆 $ 农业 出 版 社 出 版 〈 北 京 朝 阳 区 更 营 路 ) HEB EIR ATM AT 、 北京 市 密云 县 印刷 厂 印 刷 rex 1092 83K 16 开 本 8 印张 198 千 字 1988 年 2 月 第 1 版 1988 年 2 月 北京 第 1 次 印刷 印 数 1 一 1,200 册 定价 2.00 元 ISBN 7-109-00120-2/S + 85 国 气 的 生物 化 学 0 W. G. Zumft (1) 固氮 细菌 中 Nz 和 NH4+ 同 化 的 调节 和 途径 aa D, Kleiner (9) ATP 在 固氮 酶 机 理 中 的 作用 证 据 : 关于 金属 与 核 苷 酸 络 合 MoFe 和 蛋白 的 质子 核磁 共振 弛 豫 效 应 的 研究 人 seoee ween cee cee cone sees cece cone cece Ss. Ne Kimber 等 (15) FE) aU EE 9 LE (TE EG vee ence eens ceee cane ene aden case nnn enne acne cnen enne sens cuen cues eens aan even ones W. J. Brill (26) 人 和 A. A, Bacs% (36) TEP AE iy Fg UR UL, FB Diy Ce Sad Fh oneness sone snes eave sven ene anen etee sees snes T. V. Bhuvaneswari (46) BPEL AE Py BEB Ag BULB ves cote coee ence eves ence cone oven even sven snes cues suse ause sees sees aeee H., J. Evans (57) 细菌 与 热带 禾 本 科 植 物 根 联合 国 所 作用 的 评价 ………e nnn P.Van。Berkum 等 〈67) 水 稻 土 中 的 蜡 养 国 扎 作用 和 ee 工 。 Yoshida 等 (87) 异型 胞 中 的 国 所 作用 … 人 计生 -PP Fay(100) 直接 测定 圆 褐 固氮 菌 (Azotobacter ghroococeum) 的 呼吸 作用 、 wit pts SO By =p 14] Mogd Jae Pe scm wren zac ents non ener soss onve ane anne onny onssienes P, A, Lespinat (118) 固氮 巴西 螺 菌 〈4zoszpiri11uza brasilense sp. 7) 培养 中 体内 固氮 酶 和 和气 酶 活性 -的 质谱 动力 学 研究 …………。 et Y。M。Berlier 等 (120) ve euen? a " chat im Py 7 二 让 3 ‘ ‘ > 7 ry q ©) he 7 i ‘ f ~ Ta i x» Alp J é 二 . a Le 多 bes - ye ae ar rr ¥- . én wt a ‘ , aa he ¥. a. ean ‘ ‘ elas ak J bearoe see a i. ' ‘ud i PE ry us 4: ; te A ‘a , 5 bg A em ae 4! i, vi 固 拓 的 生物 化 学 W.G.Zumft Poe 关于 Nz 还 原 代 谢 途 径 的 生化 研究 已 获得 了 大 量 的 资料 。 在 此 ， 仅 提出 有 关 酶 本 身 研 究 的 近期 结果 。 作 者 在 1975 年 和 1976 年 对 这 一 问题 已 作 了 两 次 详尽 的 讨论 ， 至 于 与 许多 权威 性 评述 相同 的 内 容 ， 此 文 拟 不 再 痪 述 。 两 年 一 次 的 固氮 会 议 文献 汇编 是 重要 的 资料 来 源 。 此 外 ， 还 有 三 本 专著 提供 了 酶 在 化 学 和 物理 化 学 领域 外 的 较 全 面 的 信息 。 节 近 关 于 钼 是 所 还 原 作用 中 的 重要 微量 金属 元 素 的 化 学 问题 亦 已 汇编 成 册 ， 在 许多 个 人 的 评述 中 也 包含 了 这 方面 的 内 容 。 2 . 酶 及 其 它 组 分 固氮 酶 曾 被 酶 学 委员 会 看 作为 还 原 的 铁 氧 还 蛋白 : 固氮 氧化 还 原 酶 〈ATP 一 一 水 解 作 FAD CE. Cy. 1.18.2, 1 ] 现 在 已 分 离 得 到 。 固 氛 酶 的 两 个 组 分 现在 称 为 固氮 酶 还 原 酶 〈 通 常 称 为 铁 蛋 白 ) 和 固氮 酶 〈 通 常 称 为 铀 铁 蛋 白 )。 这 一 命名 将 在 催化 作用 一 节 中 论 及 。 最 近 补 充 描述 了 有 关 固 氮 酶 组 分 的 特性 ， 即 有 关 圆 褐 固氮 菌 〈-4zotobacter chroococ- cum) 、 多 粘 人 芽孢 杆菌 (Bacillus pol ymyxa). 8 HE 状 杆 菌 〈(Xantpobacter autotrophi- cus) 的 固氮 酶 组 分 的 特性 ， 首 次 鉴定 了 蓝 细菌 柱 胞 鱼 腥 藻 酶 的 主要 特性 ， 证 实 了 有 关 酶 的 高 度 保守 性 。 到 目前 为 止 ， 对 固氮 酶 的 修饰 仅 包 括 了 三 种 光合 细菌 和 非 光 合 细菌 中 产 脂 螺 菌 (Spirillum lipoferum) [ 见 后 ]。 在 生态 学 上 从 栏 木 根瘤 菌 中 得 到 无 细胞 固氮 酶 的 活性 是 一 个 突破 。 这 种 根瘤 是 由 Frankia 类 型 的 放 线 菌 引起 的 。 其 它 被 认为 具有 生化 影响 的 主要 菌 种 ， 是 甲烷 氧化 细菌 和 杆菌 属 中 单一 的 固氮 菌 种 硫 杆菌 “〈T 让 obacillus ferrooxidans) ， 这 些 菌 至 今 尚 未 进行 无 细胞 系统 的 研究 。 在 以 前 认为 不 能 固氮 的 假 单 胞 菌 属 中 ， 也 报道 了 其 中 一 种 能 够 固氮 。 生 长 在 温泉 中 的 绿 菠 也 有 类 似 现 象 。 实际 上 所 有 固有 气 酶 的 分 离 过 程 与 常用 的 方法 相似 ， 只 是 在 氧 的 作用 下 因 蛋 白 极 不 稳定 而 遭 到 破坏 。 节 近 为 了 试图 减轻 这 种 氧 的 危害 ， 在 乙 二 醇 存 在 和 零下 低温 时 ， 采 用 免疫 吸附 层 析 法 ， 使 固氮 酶 的 纯化 方法 得 到 进一步 发 展 。 但 是 这 种 方法 还 有 待 于 其 它 实 验 室 的 确认 。 专 性 好 气 的 棕色 固氮 菌 的 酶 复合 体 在 与 低 分 子 量 的 铁 硫 蛋白 结合 时 ， 有 具有 “和 氧 稳定 ”的 特性 《在 空气 中 tt/* > AR) 。 不 同 有 机 体 固 氨 酶 组 分 的 体外 重组 形成 了 异种 互补 。Emerich 和 了 Burris (1978) 进行 了 广泛 的 酶 巨 补 的 研究 。 用 8 种 纯化 的 或 接近 均一 的 固氮 酶 组 分 进行 了 55 个 组 合 的 〈 可 能 是 56 SAG) 种 间 互 补 ， 并 分 析 了 酶 的 活性 。 发 现在 49 个 组 合 中 两 组 分 形成 了 复合 体 ， 其 中 45 个 组 合共 有 全 部 或 部 分 的 酶 活性 。 这 些 互 补 中 有 专 性 好 气 的 和 专 性 厌 气 的 、 光 合 的 和 共生 的 细 site 菌 ， 以 及 微 好 气 的 和 兼 性 厌 气 的 ， 它 们 都 显示 出 酶 在 进化 过 程 中 具有 高 度 稳定 性 。 在 无 活 性 的 互补 中 总 是 含有 巴 氏 梭 菌 的 一 个 组 分 ， 说 明了 它 的 固氮 酶 在 体内 必定 具有 不 同 的 结合 特 性 。 然 而 巴 氏 梭 菌 和 柱 孢 鱼 腥 蔬 、 巴 氏 梭 菌 和 肺炎 克 氏 杆菌 间 的 互补 反应 具有 催化 活性 。 旱 种 复合 体 的 活性 依赖 于 pH、 组 分 比 、 和 蛋白 浓度 ， 这 些 因素 在 同 种 固氮 酶 重组 中 也 具有 一 定 的 作用 。 这 些 异 种 互补 即使 无 活性 也 同样 提供 了 有 关 因 氨 酶 的 准 计 量 、 电 子 传 递 体 的 性 质 、 限 速 步骤 、ATP 作 用 等 方面 的 资料 。 他 们 对 肺炎 克 氏 杆菌 和 圆 褐 固氮 菌 、 肺 炎 克 氏 杆 菌 与 巴 氏 梭 菌 之 间 的 互补 以 及 棕色 国 氮 菌 与 巴 氏 梭 菌 间 所 形成 的 无 催化 活性 的 复合 体 也 都 进行 了 机 理 方面 的 研究 。 铁 蛋 白 的 分 子 量 约 为 60000[ 包 括 辅 基 在 内 的 梭 菌 铁 蛋白 氨基 酸 组 分 计算 为 57674]， 即 约 为 钼 铁 蛋 白 的 1/4。 在 溶液 中 两 个 相同 的 亚 基 紧密 地 结合 在 一 起 构 或 蛋白 质 单 体 。 已 经 确 定 了 铁 蛋白 亚 基 的 一 级 结构 ， 其 具有 273 个 氨基酸 残 基 。 但 尚未 揭示 其 与 细菌 铁 氧 还 蛋白 间 的 联系 “〈 现 已 不 使 用 固 氨 铁 氧 还 蛋白 的 名 称 了 ) 。 分 子 中 含有 6 个 半 胱 氨 酸 残 基 ， 它 们 随机 分 布 在 氨基 酸 链 中 ， 而 与 铁 硫 答 相 结合 的 半 胱 氨 酸 残 基 的 位 置 保持 一 定 。 蛋 白 中 也 有 许多 二 次 或 三 次 重复 的 氨基 酸 顺 序 。 钼 铁 蛋白 的 分 子 量 略 高 于 200000， 它 是 由 4 个 亚 基 聚 集 而 成 的 。 通 过 肽 谱 和 未 端 顺 序 法 确定 了 肺炎 克 氏 杆菌 、 棕 色 固 气 菌 、 巴 氏 梭 菌 中 钥 铁 蛋白 的 组 分 ， 其 分 子 结构 为 uzB2 仅 用 SDS 电 泡 得 到 的 结论 是 不 足以 确定 钥 铁 蛋 白 的 4 级 结构 的 。 通 过 电泳 或 先进 行 预 处 理 再 经 离子 交换 层 析 可 以 大 量 地 分 离 亚 基 。 梭 菌 中 o 亚 基 尽 管 仅 含有 3 个 色 氨 酸 残 基 ， 但 仍 能 通过 光谱 ， 很 容易 地 与 较 小 的 B 亚 基 BEER) 区 别 开 来 。 3. ey” 铁 蛋 白 的 化 学 分 析 与 光谱 研究 能 够 提供 令 人 信服 的 有 关 辅 基 中 铁 一 硫 特性 的 证 据 。 每 个 铁 蛋 白 二 聚 体 都 个 有 4 个 铁 原 子 和 等 量 的 无 机 硫 。 确 定 铁 一 硫 结构 的 好 方法 是 铁 硫 禾 置 换 或 挤 出 法 。 用 硫 醇 置换 铁 硫 中 心 并 用 已 知 徐 和 挤 出 物 进行 光谱 比较 ， 证 明了 可 以 从 蛋 白质 中 挤 出 接近 全 部 的 铁 ， 以 及 铁 蛋 白 中 存在 的 一 个 Fe4S4 答 。 由 于 铁 蛋 白 的 两 条 多 肽 链 是 相同 的 ， 因 此 除非 铁 硫 徐 在 生物 合成 代 入 中 一 开始 就 是 不 对 称 的 以 外 ， 铁 硫 符 总 是 等 量 的 与 两 条 链 结合 ， 并 保持 分 子 的 对 称 性 。 从 结构 和 准 计 量 上 看 ， 梭 菌 铁 蛋 白 是 一 个 单 电子 载体 ， 如 果 与 梭 菌 氧 还 蛋白 相 比 较 ， 后 者 在 结构 上 是 一 个 单 电子 载体 ， 但 总 共 传 递 两 个 电子 。 Orme-Johnson 对 来 自 不 同 种 的 铁 蛋 白 的 EPR 谱 的 低 积分 〈0.2 一 0.45 自 旋 / 毫 升 ) 已 作 了 详尽 地 讨论 ， 他 特别 指出 了 第 二 个 顺 磁 中 心 。 肺 炎 克 氏 杆 菌 EPR 谱 的 计算 机 模拟 预示 了 存在 另 一 个 中 心 ， 如 果 确 实 的 话 ， 它 的 性 质 尚 有 待 确定 。 Thorneley (1976) 发 现 圆 褐 固氮 菌 在 动力 学 反应 阶段 中 有 第 二 个 电子 运输 给 铁 蛋 和 白 ， 然 而 解释 它 并 非 是 一 个 物理 过 程 。 亲 和 法 〈 如 核 背 酸 、 染 料 配 位 体 或 铁 氧 还 蛋白 的 基 质 ) 已 应 用 于 铁 蛋 白 的 纯化 ， 用 以 获得 全 部 金属 中 心 。 用 向 非 罗 啉 磺 酸 盐 除 去 梭 菌 中 具 较 高 催化 活性 的 铁 蛋 白 〈1.7umol/ 分 钟 / 毫 克 蛋 白 ) 中 的 铁 ， 证 明了 只 有 略 超过 一 半 的 蛋 自 是 呈 活性 态 的 ， 尽管 对 于 这 种 极 不 稳定 的 铁 硫 蛋白 〈 梭 菌 铁 蛋 白 在 空气 中 的 fy， ~20%) 的 低 积 分 值 和 可 运输 电子 的 总 数 《〈 最 终 与 铁 有 关 ) 的 数据 分 析 还 存在 某 些 不 同 看 法 ， 但 是 现在 仍然 将 铁 蛋 白 作为 单 电 子 传递 体 .其 具有 一 个 Fe4S4 复 、 可 能 在 〈Fe4S,)2 和 (Fe,Si)* a. AB ‘Qe MgATP? 结合 部 位 、 准 计量 为 每 水 解 2 摩尔 ATP 传 递 1 摩尔 电子 等 等 ， 这 些 现象 都 综合 在 当前 对 固氮 酶 催化 的 知识 中 。 钼 铁 蛋 白 铁 硫 中 心 的 性 质 则 更 为 复杂 。 特 别 是 这 个 组 分 中 包含 有 混合 的 铁 钼 中 心 。 在 用 定量 称 斯 饮 尔 谱 进 行 的 对 生物 结构 的 研究 中 ， 钼 铁 和 蛋白 是 一 个 好 例子 。 用 这 一 方法 来 确定 铁 的 环境 要 精确 2 2% 以 上 。 在 光谱 上 有 区 别 的 四 个 组 分 中 有 三 个 在 物理 学 上 作为 可 分 离 的 铁 硫 Hi, EAM AP FesSii RAPHE) ， 两 个 属于 混合 型 徐 〈 称 为 M 和 化) ， 较 小 的 上 个 称 为 S | 徐 。 这 些 工 作 提供 了 侈 间 的 证 据 ， 证 明了 钥 铁 蛋白 中 铁 原 子 的 数量 为 30 土 2 。Fe4S4 禾 中 铁 原子 有 具有 两 种 类 型 的 光谱 ， 比 例 为 1 ;: 3， 而 且 在 电 性 方面 与 细菌 铁 氧 还 蛋白 的 Fe4S4 徐 略 有 区 别 。 这 在 圆 二 色散 特征 谱 上 也 是 明显 的 。 尽 管 P 徐 为 蛋白 环境 所 修饰 ， 但 仍然 能 够 用 硫 玲 将 它 挤 出 ， 并 证 明 是 Fe4S, 徐 结构 。 一 种 可 行 的 方法 是 用 o- 二 甲苯 -a，a“- 硫 醇 将 往 挤 出 ， 随 后 用 P- 三 氟 茉 甲 基 硫 醇 配 位 置换 ， 再 与 合成 的 标准 模型 物 的 *FNMR 谱 的 化 学 位 移 相 比较 确定 往 为 FetSi。 十 分 有 趣 的 是 不 能 通过 硫 醇 将 钼 铁 蛋 白 中 的 钥 铁 硫 复 合 物 MIR ) 挤 出 。 除 了 称 斯 鲍 尔 谱 对 铁 硫 复 的 证 明 以 外 ， 在 CO 抑制 固氮 酶 的 瞬间 态 中 也 能 观察 到 EPR 信号 ， 这 与 低 分 子 量 的 铁 硫 蛋白 的 EPR 信 号 相似 ， 并 且 很 有 可 能 这 个 信号 并 非 由 M 禾 所 引 起 。 A . 铁 钼 辅 因 于 可 以 用 酸 处 理 钼 铁 蛋 白 将 其 中 低 分 子 量化 合 物 中 的 钥 提 取出 来 。 由 于 这 个 领域 的 研究 进 展 在 早期 有 关 梭 菌 中 钥 铁 蛋白 中 四 组 分 的 分 离 的 论文 中 已 有 论述 ， 所 以 尽管 它 实际 上 可 能 是 辅 基 部 分 ， 但 还 是 把 固氮 酶 中 含 钼 部 分 叫做 辅 因子 。 在 所 有 含 钼 酶 中 关于 钼 辅 因子 的 可 互 换 性 假说 没有 相反 的 实验 证 据 ， 并 已 将 固氮 酶 和 其 它 含 钼 酶 区 别 开 来 。 不 能 合成 含 钥 辅 因子 的 钼 铁 蛋 白 的 钼 化 合 物 缺 陷 型 的 突变 种 已 经 分 离 出 来 ， 它 可 用 于 溶剂 提取 低 分 子 量 钼 辅 因子 的 试验 系 禾 ， 而 且 可 以 预计 到 它 在 生物 无 机 化 学 这 一 领域 中 迅速 发 展 的 重要 性 。 连 二 亚 硫 酸 盐 还 原 的 钼 铁 蛋 白 的 EPR 特 征 信号 《〈 用 这 种 谱 甚 至 可 以 鉴定 在 整体 细胞 内 的 HAM) 是 S =3/2 系 统 ， 这 是 铁 钥 辅 因子 引起 的 。 钼 铁 和 蛋白 含有 两 个 这 样 的 辅 因子 ， 假 设 它 的 中 心 组 成 为 MoFeseSes 〈 光 谱 和 分 析 数 据 与 这 并 不 一 致 ) 。 铁 铀 辅 因 子 至 少 包含 了 30 个 铁 原 子 中 的 12 个 ， 并 且 代 表 了 一 种 新 的 结合 的 钥 一 铁 一 硫 复 。 从 酸 碱 处 理 的 梭 菌 钥 铁 和 蛋白 中 已 分 离 得 到 有 具 高 度 特征 光谱 的 钥 化 合 物 ， 最 近 确 定 为 钥 的 4 -或 3 - 硫 醇 复合 物 。 这 些 化 合 物 的 分 离 条 件 不 允许 天 然 蛋白 的 残 基 再 合成 ， 从 而 得 到 结 论 ， 钼 铁 蛋 白 含 有 一 个 与 铁 硫 徐 结合 的 钼 的 4- 硫 醇化 合 物 。 剧 烈 的 分 离 步骤 仅 留 下 钼 周围 的 核心 结构 ， 没 有 完整 的 铁 硫 组 分 ， 这 导致 了 在 突变 种 试验 中 重组 能 力 的 丧失 和 乙 抉 还 原 活 性 的 丧失 。 用 硼 气 化 合 物 不 能 使 铁 钥 辅 因子 在 原 位 上 还 原 乙 烽 〈 已 证 明 单 独 的 钥 铁 蛋白 没有 活性 ) ， 然 而 一 旦 从 蛋白 中 分 离 出 来 ， 其 产生 的 活性 为 完全 固氮 酶 系统 的 8%…( 按 Mo 计 算 ) 。 与 固 气 酶 不 同 ， 应 用 BH4 铁 钼 辅 因子 也 能 还 原 环 丙 烯 ， 但 只 能 形成 环 丙 烷 而 没有 两 Iii 0 随 着 X 射 线 吸 收 光谱 在 实验 和 理论 中 的 发 展 ， 钥 铁 蛋 白 成 为 第 一 个 金属 蛋白 予以 检 测 。 钼 的 吸收 边 能 约 为 2.015V， 尤 其 是 扩 延 吸收 边 精 细 结 构 CEXAFS) 可 以 提供 有关 吸 收 原 子 、 数 量 以 及 在 吸收 剂 第 一 配 位 体内 的 原子 距离 等 信息 。 可 是 这 种 方法 不 能 提供 有 关 空间 排 列 和 略 超出 第 一 配 位 体 范 围 的 信息 。 这 是 一 种 迁 回 的 方法 ， 在 试图 设计 模型 或 在 用 蛋白 质 来 es8e 与 模型 化 合 物 相 比较 时 ， 必 须 记 住 这 一 点 。 近 来 确定 的 黄 嗓 叭 氧化 酶 和 其 它 含 钼 酶 的 钥 辅 因 子 为 喉 啶 衍生 物 就 是 一 个 显著 的 例子 。 对 巴 氏 梭 菌 和 棕色 固氮 菌 的 钼 铁 蛋 白 及 其 分 离 出 的 铁 钥 辅 因 子 进行 了 X 射 线 吸收 谱 的 分 析 ， 三 种 物质 的 光谱 极为 相似 ， 并 得 出 如 下 结论 ;， 钥 与 3 个 或 4 个 硫 原子 相配 位 ， 其 间距 为 2.35A， 有 :11 个 或 2 个 硫 原子 相距 略 远 些 ，2 个 或 3 个 铁 原子 距离 为 2.73 全 。 已 分 离 出 来 的 铁 钼 辅 因 子 具 有 氧化 还 原 活 性 ， 它 可 被 染料 氧化 ， 并 且 也 能 被 连 二 亚 硫 酸 盐 所 还 原 。 假 设 通过 光 还 原 反应 可 获得 全 还 原 态 ， 即 EPR 一 静止 态 〈 也 称 为 超 还 原 ) ， 但 至 今 尚 不 能 做 和 到， 相反 在 光 反 应 系统 中 用 EDTA 作 为 还 原 剂 则 呈 EPR 一 静止 态 。 向 已 分 离 的 铁 铀 辅 因子 中 加 入 苯 硫 酸 ， 它 的 EPR 信 号 峰 变 陡 ， 与 天 然 的 钥 铁 蛋白 谱 更 为 相似 。 ([Mo2FesS, (SC2H;)sJ° Be CMozFeeSe(SPh),J* 是 合成 的 类 似 于 铁 铀 辅 因子 结构 的 立方 烷 铁 硫 徐 。 和 上 面 模型 物 一样 ， 在 这 些 复合 物 中 一 个 钼 原子 在 得 的 角 上 取代 了 一 个 铁 原 子 ， 并 且 通 过 3 个 外 加 的 硫 配 位 体 桥 联 到 第 二 个 相同 的 化 上 。 这 些 复合 物 的 EXAFS 数 据 与 天 然 钥 铁 蛋 白 的 数据 极为 相似 。 开 放 式 模型 (上 右 ) 也 已 合成 ， 它 呈 〈Ph4D)zCCLHFeSzMo SFeClz] 复 合 物 形式 。 另 一 种 只 含有 MoS4 核 心 的 较 小 单元 , 与 一 个 FeSz 基 因 相连 C(Ss)EeS” MoS?]:-， 它 与 酸 / 碱 处 理 的 梭 菌 钼 铁 蛋 白 在 光谱 分 析 上 极为 相似 。 从 这 种 复合 物 中 可 获得 硫 醇 复合 物 。 另 一 个 尝试 是 把 目前 可 利用 的 数据 汇集 在 一 起 构成 一 个 适宜 的 模型 ， 所 以 提出 这 样 一 个 结构 ， 它 通过 钼 的 4 - 硫 醇 单元 与 Fe4S4 钞 相 接 。 5 . 众 化 作用 固 氛 酶 底 物 的 多 样 性 有 利于 对 这 种 酶 进行 全 面 的 实际 的 研究 。 可 选择 的 底 物 主要 发 现在 六 十 年 代 中 期 。 其 中 乙 块 更 为 有 用 ， 这 是 由 于 它 很 容易 被 固氮 酶 还 原 并 且 容 易 分 析 。 除 了 母 ite Usb, TH. HMA DH GT AR RIERA, ESR MER 速率 相 比 要 低 几 个 数量 级 。 两 烯 仍 能 还 原 ， 但 丙烷 则 不 能 被 还 原 活 性 部 位 所 接受 。 环 丙烯 是 最 近 新 补充 的 固氮 酶 底 物 。 提 纯 后 的 酶 、 整 体 细 胞 以 及 分 离 出 的 铁 钼 辅 因子 都 能 迅速 地 将 环 丙烯 还 原 。 由 于 人 们 对 还 原作 用 的 立体 化 学 感 兴趣 ， 所 以 它 还 可 以 用 作为 固 气 酶 和 铁 钼 辅 因 子 活性 部 位 的 探 针 。 在 :HzO 中 ， 多 于 90% 的 环 丙 烯 形成 [上 顺 式 -1,2-?Hz]， 如 果 可 能 的 话 ， 反 式 异 物体 将 少 于 5 一 10% 。 但 是 丙烷 的 形成 则 不 能 说 明 具 有 这 种 高 度 的 立 体 选 择 性 ， 因 为 所 得 到 的 [ 反 式 -1,3- Hz] 丙烷, 〔 顺 式 -1,3-?H?] 丙 烷 和 [2,3- :Hz] 两 烷 的 比例 为 2:1:1. 曾 一 再 提出 ， 二 气 杂 葵 和 脐 在 氨 还 原作 用 中 ， 是 作为 与 酶 结合 的 中 间 产 物 。 用 对 二 甲 基 氨基 葵 醛 反应 鉴定 了 在 氮气 下 “〈 而 不 是 在 毛 气 下 或 用 氰 化 物 作为 底 物 时 ) 完整 的 固 气 酶 系统 中 加 入 酸 或 碱 可 形成 脖 。 初 期 酶 结合 的 中 间 产 物 幸 要 还 是 肝 ， 它 是 在 水 解 过 程 中 形成 的 。 这 一 发 现 启示 了 有 可 能 存在 二 氨 一 氢化 合 物 作为 中 间 产 物 。 随 着 氨 还 原作 用 中 二 所 杂 洽 一 肝 途 径 的 进一步 证 明 ， 将 证 实 Bulen 发 现 的 肝 是 固氮 酶 的 底 物 。 通 过 对 固 氨 酶 形成 的 HED 的 详尽 研 究 提 出 了 在 二 氛 杂 苯 水 平 上 存在 中 间 产 物 的 间接 证 据 。 午 清 固 氨 酶 催化 “交换 ”反应 的 关键 是 HD 的 形成 需要 电子 这 一 事实 。 流 经 氮 〈 固 氮 条 件 下 ) 、 氨 〈 放 氧 条 件 下 ) 以 及 所 加 氢 ( 固 所 但 抑制 所 的 条 件 ) 中 全 部 电子 均 保 持 恒 定 。 在 D: 存 在 时 ， 可 用 形成 的 产物 来 说 明 全 部 电 子 流 ， 电 子 流 的 恒定 性 仅 能 从 一 个 电子 分 配给 另 一 个 形成 HD 分 子 的 事实 来 加 以 证 实 。 从 机 理 上 看 ， 电 子 的 分 配 是 根据 下 面 设 想 的 二 气 杂 茶 为 中 间 产 物 的 方程 提出 来 的 。 e Ae E+N2 +2H* + 2e ———E-N2Ha E- N2H2 +Dz2———-E+N2+2HD 2H*+2e +D,z—-—2HD 存在 一 个 耗 能 的 和 消耗 还 原 物 的 无 效 循 环 过 程 是 这 一 机 制 的 特征 。 如 果 存 在 这 种 无 效 循 环 ， 那 末 对 于 在 所 和 有 气 中 自 养 生长 的 氢 细 菌 将 会 产生 明显 的 影响 。 一 般 由 有 机 体 提 供 一 个 分 子 来 抑制 这 个 反应 是 不 可 能 的 。 氮 的 还 原 与 氨 的 形成 之 间 的 普遍 联系 都 说 明 与 此 相反 。 固 所 酶 的 活性 部 位 由 于 产生 氢 阱 而 起 到 了 间接 的 保护 作用 ， 这 是 由 氢 酶 在 能 量 代谢 和 氢 的 再 循环 作用 外 提供 的 。 由 于 固 氨 酶 在 被 氨 抑 制 时 需要 电子 传递 和 ATP 水 解 ， 所 以 对 于 氢 分 压 (pHs? ) 改变 时 氧 细菌 会 有 什么 影响 方面 有 以 下 几 种 预想 较 高 氨 分 压 可 导致 氢 酶 水 平 或 活性 的 提 高 。 当 固氮 酶 反应 ATP/2e 比 例 下 降 时 ， 需 要 供给 细胞 更 多 的 能 量 。 为 了 补偿 能 量 增加 的 需 求 ， 氮 气 下 生长 的 自 养 菌 对 氧 的 消耗 也 随 着 较 高 的 pHs 而 增加 。 因 此 这 些 结果 可 简单 地 被 认 A: 一 旦 pH 提高 到 超过 这 些 菌 的 调节 能 力 ， 必 然 导 致 对 自 养 细菌 的 抑制 作用 ， 而 对 于 以 氨 作 为 氮 源 生长 的 细菌 则 没有 这 种 影响 。 尽 管 选 择 某 些 单 一 参数 来 解释 这 种 状况 是 可 能 的 ， 但 反应 仍 支持 以 上 在 细胞 水 平 上 对 于 氢 机 制 解释 的 论述 。 文 献 中 少量 零碎 的 数据 确实 可 用 来 作为 支持 这 一 想法 的 切 步 证 据 。 A MgATP 2MgATP TFe ; .MgATP MgATP Al 铁 蛋 和 白 的 起 始 反应 简 图 图 工 描述 了 固 氨 酶 伺 化 作用 的 起 始 部 位 在 铁 蛋白 上 。 通 过 凝 胶 过 让 和 EPR 证 实 了 在 铁 蛋 白 上 有 两 个 MgATP 的 结合 部 位 ， 铁 蛋白 构 型 的 变化 是 由 于 与 核 背 酸 结合 所 致 。 在 用 向 菲 罗 啉 磺 酸 盐 研 究 需 核 苷 酸 的 铁 丈 合 的 速度 时 ，Lijones 和 Burris 的 结论 提出 在 铁 蛋 白 构 型 变化 以 前 ， 两 个 ATP 结 合 部 位 必须 占 满 ， 并 且 两 个 结合 部 位 对 MgADP 具有 不 同 的 亲和力 。 用 质 子 NMR 已 证 明了 Mg ”有 4 个 相同 的 结合 部 位 (Ke =1.7 土 0.3mM) 以 及 可 以 形成 三 元 金属 蛋 自 核 背 酸 复合 物 。 由 于 这 一 结论 与 其 它 方法 所 证 明 的 两 个 结合 部 位 的 结论 相 了 矛盾 ， 所 以 提 出 了 结合 两 个 MgATP? 分 子 〈 每 个 亚 基 一 个 ) 时 ， 在 空间 上 将 掩盖 另外 两 个 与 金属 核 HR 复合 物 结合 的 部 位 。 | | 动力 学 研究 所 提供 的 证 据 表明 ,MgATP? 的 结合 是 在 铁 蛋白 还 原 之 前 。 在 没有 MgATP:- Ae felt,» FASO. 使 氧化 的 铁 蛋 白 还 原 的 速率 (K>10°M "> 比 在 固氮 酶 催化 期 间 利 用 SO 来 还 原 的 速率 (K=3.10“M : 秒 -:) 明显 大 得 多 。 反 之 MgADP- 通过 连 二 亚 硫 酸 盐 来 抑制 氧化 的 铁 蛋 白 的 还 原 。 不 同 的 速率 说 明 ， 在 铁 蛋 白 中 存在 限 速 的 构 型 变化 ， 尤 其 是 在 : 稳 态 期 间 当 大 量 的 氧化 态 存在 时 ， 快 速 还 原作 用 受到 了 限制 。 从 铁 蛋 白 到 钥 铁 蛋白 的 电子 传递 需要 先 形 成 复合 物 。 普 遍 的 看 法 是 ， 在 这 种 复合 物 中 电 子 传递 是 与 ATP 水 解 作 用 密切 相连 的 。 用 铁 蛋 白 滴 定 钥 铁 蛋白 或 反 过 来 滴定 ， 都 可 依据 结 Blois 1M2:1 REA/ AREAS) 的 稳定 的 和 瞬间 的 复合 物 来 加 以 阐明 。 试 验 数 据 与 假设 的 两 个 固氮 酶 组 分 的 瞬间 复合 物 是 相符 合 的 ， 具 有 1 : 和 2 : 1 两 种 有 活性 的 复 合 物 。 从 放 氢 所 显示 的 酶 变 率 延迟 期 这 一 事实 可 得 出 结论 ， 每 传递 一 个 电子 后 ， 这 种 复合 物 2 5 e 即 分 刘 ， 而 ATP 水 解 从 反应 开始 显 钱 性 。 发 现 这 一 延迟 期 的 出 现 ， 是 由 于 钼 铁 蛋 白 而 不 是 于 铁 重 白 。 在 这 一 延迟 期 中 , 钼 铁 蛋白 的 EPR 信 号 下 降 , 这 就 反 过 来 表明 在 形成 肥 间 复合 物 ” 丰 子 从 铁 重 白 随机 地 被 传递 给 钼 铁 蛋 白 分 子 的 库 中 。 根 据 这 一 委 念 ， 铁 蛋白 只 不 过 作为 杀人 量 折 的 还 原 酶 ， 而 钼 铁 蛋白 的 作用 是 底 物 的 还 原 。 这 一 争论 证 实 了 上 面 提 到 的 固 包 醒 组 分 新 命名 法 。 然 而 在 这 里 仍 延 用 习惯 命名 法 。 子 传递 与 ATP 水 解 的 直接 联系 已 从 预 稳 态 时 磅 酸 盐 释 放 与 铁 蛋 自 的 氧化 《在 420nmT 用 分 光 光 度 法 跟踪 ) 的 相同 速率 中 得 到 证 明 。 棕 色 固氮 菌 固氮 酶 每 传递 两 个 电子 ， 夺 人 AT 分 子 永 解 的 最 低 数量 为 4。 这 一 数值 也 为 肺炎 克 氏 杆菌 中 的 醒 所 证 实 。ATP/2e HHL Et 许 和 中 的 影响 很 大， 以 臻 在 低温 和 低 PH 条 件 下 电子 传递 与 ATP 水 解 不 偶 联 。ATE 是 固 握 村 电化 应 丰 可 悄 玖 ， 所 以 近 20 年 来 这 一 课题 一 直 吸引 了 许多 研究 人 员 。 一 度 曾 设想 出 各 种 各 入 前 机 理 ， 其 中 天 多 数 都 认为 通过 ATP 的 水 解 作用 负 自由 能 变化 的 积累 形成 了 一 种 高 和 还原、 赤 。 这 一 假说 近来 得 到 了 进一步 的 阐述 。 尽管 _ 直 鲜 少 可 利用 的 数据 ， 得 固 氨 酶 催化 部 位 肯定 是 可 以 从 电位 观点 来 加 以 理解 部 是 对 国 氨 酶 采取 严格 的 电位 观察 ， 那 么 无 论 什么 时 候 只 要 一 达到 酶 所 需要 的 低 电 位 氧化 下 哲 太 ， 则 都 会 使 底 物 还 原 。 在 这 -机制 中 ， 其 它 固 气 酶 反应 的 必需 物 〈 包 括 ATF 于 仅仅 是 为 了 获得 较 低 的 氧化 还 原 态 。 与 通常 认为 的 ATP 降 低 氧 化 还 原 电位 相反 ， 还 有 人 提出 它 的 作 族 在 于 相反 的 一 面 ， 即 提高 氧化 还 原 电位 到 不 太 低 的 负 值 以 克 许 电子 在 两 个 组 分 之 间 传 递 。 氢 化 的 和 还 原 的 假设 都 是 根据 能 量 转 换 的 氧化 还 原 系统 这 一 相同 的 概念 。 Stiefel (1977) 提出 的 还 原 态 具有 极 低 的 氧化 还 原 电 位 是 合理 的 。 他 确认 如 果 二 氮 杂 AE 是 固 氨 酶 还 原作 用 的 中 间 产 物 ， 那 么 电位 是 在 - 1.0V 附 近 。 铁 蛋白 氧化 还 原 电位 在 0.3V 附近 (其 ATP 复 合 物 形式 则 为 - 0.4V 一 一 这 一 变化 很 可 能 是 溶剂 对 氧化 还 原 基 团 的 影响 ， 也 许 这 并 不 是 所 有 铁 蛋 白 的 性 质 ) 。 它 不 会 还 原 氧化 还 原 电位 低 于 一 0.4VY 的 还 原 态 ， 很 了 能 存在 一 个 高 的 还 原 态 确实 是 固 气 酶 催化 的 部 分 ， 这 是 由 于 测量 到 的 临界 电位 约 ~ 0.4Y， 而 日 襄 寺 -0.4V 就 没有 固 氨 栈 活性。 然而， 尽管 铁 钼 辅 因子 的 氧化 还 原 电位 尚未 测 出 ”全 它 存 在 着 一 个 所 谓 “ 超 还 原 态 2”， 用 于 将 > ae 底 物 还 原 的 电子 分 配给 低 氧化 还 原 电位 的 MP 钥 铁 蛋白 中 的 氧化 态 和 还 原 态 〈 等 于 超 还 a -LE 和 2 有， 原 态 ) 〈 图 2 ) 。 由 于 我 们 还 不 知道 在 金 Ae _ 属 中 心 存在 的 氧化 平衡 是 哪 种 类 型 ， 所 以 ay 5) 有 意 地 回避 了 关于 电子 供 体 怎样 更 准确 的 四 分 配给 钥 铁 蛋 白 不 同 金属 基 困 中 哪 一 个 的 ee ee, Pa] SSC AIMS Hie SAE DRM A AS AEB 人 2MgATP' RE 近 铁 蛋 白 的 电子 供 体 的 ， 所 以 称 为 表 -03| 一 一 一 观 电子 接受 对 ”。 提 出 假设 的 主要 条 件 在 于 (图 2 )，ATP 给 氧化 态 的 钥 铁 蛋白 提供 图 2 ATP 在 固氮 酶 催化 作用 中 作用 的 模式 能 量 从 而 提高 氧化 还 原 电位 。 这 一 过 程 产 MoFeor: SREAMtA ”MoFered 钼 铁 蛋 白 还 原 态 村 了 有 效 的 电子 接受 对 ， 即 给 氧化 的 一 一 还 原 的 ( 超 还 原 的 ) 钼 铁 蛋 白 提 供 能 量 , 铁 蛋 白 提供 它 的 同 电位 电子 。 这 里 使 用 的 “氧化 的 钼 REA” ji) 5 WW RE HR AS CY I AS) RB A AS A SAY» 因为 这 一 概念 如 括 于 理 的 氧化 还 原 循 环 中 所 显示 的 两 种 形态 。 钼 铁 蛋白 的 能 量 供给 可 以 设想 为 朋 间 的 磷酸 4g 8 化 〈 通 过 钼 铁 蛋 白 磷 酸 交 换 至 ATP， 在 这 个 方面 是 十 分 有 趣 的 ， 还 有 在 摊 菌 的 钼 络 合 物 中 存 ZEBE) 作为 一 种 构象 变化 或 作为 两 种 结果 的 结合 。 由 于 所 提出 的 钼 铁 蛋 自 超 还 原 态 和 供 能 态 是 短 寿命 的 ， 所 以 研究 它 或 用 实验 证 明 这 个 还 原 的 假说 将 是 困难 的 。 更 多 的 有 关 在 钼 铁 蛋 白 上 ATP 的 相互 作用 的 证 据 将 进一步 在 探讨 ATP 作 用 后 才能 证 实 。 6 .光合 自 养 细 菌 的 固氮 酶 和 合 酰胺 合成 栈 由 于 光合 自 养 固氮 菌 的 固 氛 酶 在 获得 最 大 催化 活性 时 需要 一 个 活化 组 分 ， 所 以 给 予 单独 的 讨论 。 许 多 场合 中 都 将 这 一 附加 组 分 误 称 为 “第 三 固氮 酶 组 分 ”。 它 一 旦 完成 了 激活 作 用 ， 在 维持 国 氛 酶 催化 活性 中 就 不 需 这 一 组 分 的 作用 了 。 这 一 组 分 不 像 固 氨 酶 的 两 个 组 分 那 样 参与 酶 的 转换 ， 因 此 它 不 是 氨 还 原 所 必需 的 第 三 组 分 。 到 目前 为 止 仅 有 次 红 红 螺 菌 国 氮 酶 的 分 子 参数 可 以 利用 。 它 的 钼 铁 和 蛋白 分 子 为 四 聚 体 ,分 子 量 约 为 230000〈 用 凝 胶 过 滤 法 测定 ) ， 然 而 与 所 有 其 它 的 铁 蛋 白 不 同 ， 用 SDS 电泳 观察 到 两 个 亚 基 的 分 子 量 分 别 为 30000 和 31500。 无 活性 铁 蛋 白 的 紫外 吸收 光谱 除 蛋白 质 的 最 大 吸收 峰 外 ， 在 没有 氨基 酸 残 基 的 268nm 处 还 有 第 二 最 大 吸收 峰 。 最 时 观察 到 的 光合 自 养 细菌 固氮 酶 的 独特 性 质 是 它 的 非 线性 动力 学 反应 ， 并 且 还 证 明了 活性 需要 锰 。 在 光合 细菌 的 破碎 细胞 中 ， 固 氮 酶 多 数 处 于 无 活性 形式 。 用 盐 溶液 冲洗 色素 膜 ， 可 以 溶解 出 某 一 因子 ， 它 作用 于 铁 蛋 白 并 使 铁 蛋 白 转变 成 有 共有 催化 活性 的 形态 。 以 上 提 到 的 活化 组 分 也 在 沼泽 红 假 单 胞 菌 〈Rphodobpsexdorzonras palustris) 英 膜 红 假 单 胞 菌 “〈RA- odopseudomonas capsulata) MAE A A ACA. lipoferum) PRA EME. 活化 组 分 还 未 能 提纯 到 揭示 它 的 分 子 性 质 的 程度 ， 但 从 Ludden 和 Burris 的 工作 中 证 实 了 它 是 一 种 酶 ， 能 从 铁 蛋 白 中 移 走 一 种 类 似 腺 味 叭 的 分 子 。 激 活 过 程 需 要 ATP， 但 它 不 水 解 ， 仅 通过 构象 变化 将 它 移 出 ， 从 而 打开 修饰 基 团 的 部 位 。 磷 和 戊 糖 也 是 铁 和 蛋白 上 菲 蛋白 部 分 ， 可 是 它 构成 了 没有 AMP 和 ADP 的 残 基 。 这 无 疑 地 上 暗示 了 激活 组 分 的 相反 方面 是 将 修饰 eA 加 到 铁 蛋 白 上 而 使 其 钝 化 。 虽 然 还 不 存在 进一步 系统 的 物理 证 据 ， 但 这 一 假设 已 列 于 光合 细 菌 固氮 酶 调节 的 图 表 中 〈 图 3) 。 媒介 物 ? 固 所 酶 的 调节 作用 Oe GS 调 节 作用 Spe 光 ? 级 联 控制 seme | RESO eee ge 结合 的 酶 ER 营养 状态 | e— 钥 铁 蛋白 NH.>| GS | 一 > 会 氢 栈 腕 无 反馈 抑制 3 ”交合 细菌 固 气 酶 调节 的 假设 机 理 (GS 为 谷 酰胺 合成 酶 ) 固 氨 酶 活性 调节 因子 的 表达 既 没 有 完全 和 弄 清 也 没有 完全 确定 。 发 现 谷 氨 酸 中 生长 的 分 离 破碎 的 细胞 或 所 中 生长 的 细胞 内 都 没有 活性 。 相 反 “ 氮 饥 俄 细胞 ”《〈 即 解 阻 抑 国 气 酶 ， 但 不 能 固氮 和 同化 气 的 细胞 ， 除 内 部 所 能 转换 外 ) 具有 全 部 的 活性 ， 可 以 得 到 非 正 常 的 固 氛 酶 。 e & ¢ 无 座 是 间接 的 还 是 更 直接 的 通过 关闭 光合 作用 的 途径 ， 光 在 钝 化 作用 中 都 起 着 重要 的 作用 。 这 还 有 待 继续 研究 它 的 可 能 性 。 IRIE RV (” (M-nmol «min +mg-!) + ¢ x 107) FQ2 (a) 用 金属 络 合 部 位 对 Mn2#+ 浓 度 的 高 比率 时 的 数据 所 作 的 (时 一 1) 对 Kp1 浓 度 的 倒数 的 E- 图 。 (b) 修正 了 的 E- 图 。 其 中 以 同样 的 数据 对 〈Kpl 浓 度 X 比 活性 ) 的 倒数 作 图 。 实 线 表 示 最 小 平方 线性 符合 蛋白 比 活 性 ; - Mh; O 2017 活性 单位 。 582 活 性 单位 ; A T44 活 性 单位 ; MB 1063 活 性 单位 ; O 1674 活 性 将 Scatchard 法 应 用 于 所 有 的 质子 弛 鸳 增 长 效应 的 数据 ， 则 能 对 一 些 结论 进行 更 一 般 的 检验 ，sb 值 和 每 一 次 观测 到 的 弛 和 耶 增 长 的 值 也 都 用 来 计算 自由 金属 离子 浓度 CMf 和 络 合金 属 离子 浓度 CMb] 以 及 由 此 而 产生 的 络 合 度 R(R =[Mb]/CEtD) 。 这 样 ， 对 每 一 个 M- 滴 定 就 建立 了 一 个 经 验 的 Scatchard 图 ， 即 R/CMf 对 R 的 作 图 ， 并 在 各 种 情况 下 都 计算 了 最 小 平方 线性 回归 。 作 为 例子 ， 图 1(a) 和 (b) 的 M- 滴 定 的 Scatchard 图 分 别 示 于 图 1(c) 和 (d)。 这 六 种 蛋白 制剂 的 Scatchard 作 图 都 在 图 3 中 ， 后 者 仅 表示 计算 出 的 最 小 平方 线 。 为 清楚 起 见 ， 略 去 了 实验 点 。 这 些 线 的 最 显著 的 特点 是 在 实验 误差 内 它们 都 是 平行 的 。 这 又 一 次 说 明了 对 所 有 的 蛋白 制剂 来 说 ， 不 论 比 活性 大 小 ， 金 属 络 合 对 它们 有 同样 的 牢固 性 。 而 且 在 R © 轴 上 的 交叉 点 等 于 每 个 分 子 的 络 合 部 位 数 Cn) 的 平均 值 。 这 个 值 随 着 蛋白 比 活性 的 增加 而 / R 18 ”Me 16 ‘€X 10’) uM-) io 12 IN at 10 @ 8 图 3 六 种 不 同比 活 的 Kop1 制 剂 的 Scatchard 图 的 总 合 (1) 582 活 性 单位 ; (2) T44 活 性 单位 ; (3) 1063 活 性 单位 ; (4) 1421 活 性 单位 ; (5) 1674 活 性 单位 ，(〈6 ) 2117 活 性 单位 。 这 些 线 符合 各 实验 点 的 最 小 平方 。 «18° 1 2 > 3, 400 一 200 0 200， .400 [Mi] (uM) 图 4 FAMo** SRA A LA eG AY “高 金属 图 ” ( 玫 D1I 的 比 活性 为 582 活 性 单位 ) 。 有 规律 地 增加 。 由 图 3 中 得 到 的 各 个 Scatchard 图 的 数据 总 括 于 表 1 .由 斜率 (= -ka-:l) 算 tHMn?* -KKp1 络 合 物 的 解 离 常数 KZ。 综 合 这 些 数值 ， 得 到 了 Kc 最 佳 估 算 值 为 209 土 23RM。 所 以 这 种 络 合 比 过 去 所 报道 的 由 同样 方法 得 到 的 Mn * -Kp2 络 合 (Ka=350 土 508&M) 要 牢 固 得 多 。 这 种 实验 的 Scatchard 作 图 在 实验 误差 范围 内 是 线性 的 。 所 以 对 于 任意 络 合 位 置 来 说 ， 没 有 证 据 能 说 明 它 们 是 非 等 效 的 。 作为 上 述 参 数 的 又 一 核实 ， 图 4 说 明了 [Et2/ (8s+ -1) 对 CMf 所 作 的 “高 金属 ”图 ， 这 个 图 由 于 满足 了 条 件 (Mf 人 六 CMb]j， 以 致 至 少 有 90% 的 Mn 是 游离 的 ， 所 以 其 数据 是 有 限 的 。 在 这 些 条 件 下 ， 预 计 这 种 作 图 应 为 线性 ， 其 侠 率 为 Cn(sgb- 1)] ， 在 CMf)] 轴 上 的 截 距 为 Ka。 图 4 中 的 有 限 的 数据 指 的 是 最 低 的 比 活 性 〈582 活 性 单位 ) 的 蛋白 ， 其 斜率 (0.187) 与 nD 和 gb 的 最 适 值 一 致 。 截 距 (~ - 230uM) 也 与 由 上 面 数 据 更 准确 地 推导 出 来 的 数值 一 王佐 。 表 1 Kp 1 比 活性 蛋白 浓度 络 合 部 位 数 Ka/AMNM (nm CzHs2 还 原 / 分 钟 . 毫克 蛋白 ) (HM) (n) 582 73.0 1,02 219.3 582 54.8 1.08 222.7 582 36.5 1.12 219.6 740 140.4 1,28 234.8 744 70,2 1.18 216.6 1063 83.3 1.70 ; 184.8 1063 62.4 1.74 202.3 1421 69.7 2234r i” 239.6 1674 58.7 2.70 206.1 1674 35.2 2.64 183.3 1674 23.5 2.48 192.3 2117 35.0 -1 2.86 186.9 2117 17.5 2.86 175.5 综合 表 1 中 的 数据 和 适合 于 直线 的 最 小 平方 ， 并 示 于 图 5 中 。 可 清楚 地 表明 ，Kp1 和 蛋白 的 比 活性 在 实验 误差 范围 内 与 每 个 蛋白 分 子 对 于 Mn: 盖 的 络 合 部 位 数 的 平均 值 成 正比 。 曾 有 报道 ，Kpl 的 最 高 比 活性 为 2900 活 性 单位 ， 下 面 的 证 据 指 出 这 是 对 有 全 部 活性 的 蛋白 来 说 的 。 由 Kp1l 中 分 离 出 FeMoCo， 并 用 它 来 活化 从 肺炎 克 氏 杆菌 的 nifB 突 变种 中 的 Kpl 是 可 能 的 。 可 以 测 出 在 加 入 FeMeCo 后 ， 每 毫 微 殉 原 子 (ng atom) 钼 在 纯化 的 Kpl 中 产生 的 活 性 ， 并 用 它 计 算 分 子 量 为 218000， 每 个 分 子 中 含有 二 个 FeMoCo 中 心 的 Kp1 最 高 理论 比 活性 值 。 如 果 ， 这 个 值 大 约 为 2800 活 性 单位 ， 这 与 实验 值 很 相符 合 。 由 图 5 中 的 最 小 平方 线 外 推 得 到 的 比 活性 为 2900 活 力 单位 的 最 高 实验 值 ， 得 到 了 络 合 部 位 数 的 相应 值 ， 这 个 值 几 OF OG 地 等 于 整数 4。 所 以 我 们 得 出 结论 全 部 有 活性 的 KEp1 具 有 4 个 独立 的 Mn2 络 合 部 位 ,Kpl 的 比 活 性 与 络 合 部 位 数 成 正比 。 由 图 5 的 直线 外 推 得 到 的 活性 为 0 ， 则 指出 每 个 纯化 的 Kp1 分 子 上 残存 络 合 有 0.35 个 Mn:*。 这 一 点 的 重要 性 尚未 大 清 ， 但 可 能 说 明 随 着 第 一 个 Mn2 的 络 合 部 位 的 形成 ， 活 性 的 增加 比 在 图 中 所 展示 的 要 更 快 一 些 。 19 e 6 eT 0 1 : : 比 活 性 (nmoles /min-mg x 107") 图 5 AF KplHMe* 4S RMAC EZ AME 实 线 表示 实验 数据 的 最 小 线性 平方 ， 也 表示 了 最 小 活性 的 外 推 值 。 Kp1 的 比 活 D 582; 口 1063; MB 1421; A 1674; A 211T。 二 元 系统 ，Mg:* -Kpl 验证 固 气 酶 体内 活化 所 必需 的 离子 Ms:+ 的 抗 磁性 需要 不 同 的 实验 途径 。 Mg 和 Kpl 的 相互 作用 是 通过 比较 两 种 情况 下 MoFe 和 蛋白 所 诱导 的 质子 弛 移 增 强 效应 来 研究 的 。 在 第 一 种 情况 下 ，Kp1 溶 液 中 Mg 和 Mn2 都 存在 ，Mn2 对 Kp1 的 Tris 缓 冲 液 的 滴定 是 在 Kpl 溶 液 和 滴定 剂 中 的 Mg: + 浓度 恒定 的 情况 下 进行 的 。 这 种 滴定 用 不 同 的 Mg 所 浓度 〈10 一 50mM) 进 行 重复 。1/T 对 [Mn 的 M- 图 的 典型 结果 示 于 图 6 中 (图 6 略 ) 。 在 第 二 种 情况 下 ，Kp1 溶液 中 只 有 Mn 半 存 在，Mg 于 滴 入 含有 已 知 Mn? 浓度 的 Kp1 咨 液 。 在 两 种 实验 情况 下 ， 高 浓 度 的 Mg:+ 几 乎 完全 阻止 了 由 Mn - Kp1 络 合 物 引 起 的 弛 豫 增强 效应 。 此 外 在 包括 整个 有 效 比 活性 范围 内 的 三 种 蛋白 制剂 中 〈 其 比 活性 分 别 是 582、1063 和 2117 活 性 单位 》 也 观 Be 到 同样 的 行为 。 可 以 推测 ， 所 有 的 Mn 的 络 合 部 位 对 于 Mg 关 的 络 合 也 是 有 效 的， 而 且 后 者 在 足够 高 的 浓度 下 能 够 完全 取代 在 蛋白 上 络 合 的 Mn?*， 这 已 由 实验 滴定 曲线 与 根据 竞争 性 络 合 的 计算 之 间 的 一 致 性 而 得 到 了 定量 的 确证 。 对 于 这 三 种 蛋白 的 活性 ， 已 由 滴定 曲线 得 到 了 满意 的 重复 。 这 是 用 对 金属 (Mn 半 或 Mg2) 的 络 合 位 置 数 n 的 最 适 值 来 进行 重复 的。 已 经 测 出 了 Mn2 在 Mn2 -pl 中 的 Kx 值 。 而 对 于 Mg -KKpl 来 说 ，Mg 和 天 的 最 适 Kc 值 是 2.。2 -十 0.3mM， 所 以 可 以 确定 ，Mg 半 络 合 于 MnFe 蛋 白 上 ， 但 他 的 络 合 强度 比 Ma 半 要 水 一 个 数 量 级 。 “Kp1 和 其 它 金 属 离子 的 二 元 系统 - 已 经 发 现 有 显著 量 的 Cu、Ca 和 Zn 与 MoFe 蛋 白 相 结合 ， 一 种 可 能 的 解释 是 这 些 二 价 爹 属 离子 络 合 于 Mg 一 络 合 部 位 。 为 了 检查 其 它 抗 磁性 离子 是 否 有 取代 络 合 Mn2+ 的 作用 ”和 做 了 类 似 于 前 一 节 提 到 的 使 用 Mg2+ 的 一 系列 实验 。 自 从 最 近 制 备 了 MoFe 蛋 白 结晶 〈L。 王 .Mof- -tenson 个 人 通讯 )》 以便 进 行 X 射 线 研究 以 来 ， 已 经 考察 了 Ca2*、Zn2+ 和 Ba2+ 等 为 解决 相 的 问题 所 需 的 重金 属 的 衍生 物 。Zn:+ 的 应 用 由 于 生成 了 沉淀 而 未 得 成 功 。 而 在 用 Ca2* 和 Ba2+ 进行 的 实验 中 ， 由 于 使 用 了 它们 的 氯 化 物 ， 并 且 在 滴定 前 从 蛋白 溶液 中 去 除了 Na2Sz04 以 避 锡金 属 离子 生成 沉淀 ， 因 而 取得 了 成 功 。 将 Ca: 和 Ba2+ 依 次 滴 和 含有 Mn2* 的 Kp1 溶 液 中 《 比 活性 为 919 活 性 单位 ) ， 如 同 以 前 一 样 测定 水 质子 的 Til， 结 果 示 于 图 7 (a) MO) 中 。 从 这 些 结果 可 以 看 出 ， 在 高 浓度 的 Ca 和 了 Ba: 存在 时 ， 由 Mn:+ 络 合 在 蛋白 上 而 引起 的 。 20 。 弛 议 增 强 又 一 次 被 几乎 完全 阻止 。 这 就 说 明 ， 所 有 的 Mn 络 合 部 位 对 于 Ca 或 Ba2 的 络 合 都 是 有 效 的 。 适 合 于 图 7 中 数据 的 Kc 最 佳 理 论 值 对 于 Ca:” - KKp1 络 合 物 为 1.6 土 0.2mM， 对 Ba2+ 一 KKp1 络 合 物 为 3.4 土 0.3mM。 所 以 Ca2+ 的 络 合 和 Mg 关 的 络 合 非常 近似 ， 而 Ba: 的 络 ” 合 则 稍微 弱 一 些 。 (a) 0 Ot eee 30 _ 40 0 1G. 2g 30) 40 [Ca**] (mM) [Ba**] «mM) A? ”人 金 属 置 换 图 〈 含 有 Kpl 和 Man 守 的 样品 的 水 质子 1/T) (a) 对 所 加 入 的 Ca2+ 浓 度 作 图 (人 p1 的 比 活 性 为 919 活 性 单位 ， 初 始 浓度 为 124uM，Mn2+ 初 始 浓度 为 923 上 MD)， (db) 对 所 加 入 的 Ba2+ 诊 度 作 图 ( 儿 pl 的 比 活性 为 919 活 性 单位 ， 初 始 浓度 为 100kM，RMn2+ 的 初始 浓度 为 TT3UM。 ) 。 实验 点 ， 实 线 是 假定 所 加 入 的 全 属 离子 竞争 络 合 所 有 的 Mn2+ 络 合 部 位 。 (a) Ca**—KpifyKa=1.6mM; (b) Ba?+—KpifjKa=3.4mM. o—-o 在 没有 蛋白 时 ， 相 应 稀释 的 空白 实验 曲线 ， 三 元 系统 ，Kp1-Mn2+- 核 蔡 酸 核 苷 酸 ATP 和 ADP 对 质子 弛 移 增 强 效应 的 影响 是 通过 对 两 种 图 的 比较 来 研究 的 : 一 种 是 M- 图 对 Kpl 作 图 ， 另 一 种 是 与 其 对 应 的 图 ， 在 这 里 是 用 新 鲜 制 备 的 含有 Mn2+ ARES ( 甚 克 分 子 比 为 1 : 1 ) 的 溶液 滴定 Kp1 溶 液 (其 比 活性 为 1421 活 性 单位 ) 。 在 所 有 的 滴定 中 ， 有 核 苷 酸 存在 时 的 弛 移 增 强 效 应 要 比 无 核 苷 酸 时 弱 一 些 ， 典 型 的 结果 示 于 图 8 中 。 定 性 地 说 ， 这 里 可 能 有 两 种 情况 (a) 蛋 白 和 核 苷 酸 仅 通 过 二 元 络 合 物 的 形式 竞争 有 效 的 Mn2+， 或 〈b) ， 形 成 了 又 一 种 构 型 的 三 元 络 合 物 〈 酶 -金属 - 核 音 酸 ) 。 在 这 种 三 元 络 合 物 中 ， 水 分 子 对 于 Mn2+ 的 初级 配 位 体 的 接近 比 它 在 酶 -金属 二 元 络 合 物 中 要 受 些 限制 。 (a) 的 情 况 下 ， 这 种 行为 可 以 从 上 述 Kpl1-Mn2+ 络 合 物 的 Kc 值 和 sb 值 和 Mn2+- 核 昔 酸 络 合 物 的 相应 的 参数 值 做 定量 的 预测 ， 综 合 所 发 表 的 MnATP:- 和 MnADP:- 的 Kc 值 (分 别 为 17aM 和 33 uM) 和 在 “ 核 昔 酸 空白 ”滴定 中 所 观察 到 的 质子 弛 移 增 强 CLAS) ， 便 得 到 特征 增强 因 子 (eb) ， 这 个 因子 对 于 MnATP2+ 和 MnADP2+ 来 说 都 近乎 于 1.5。 在 假定 只 形成 二 元 络 A 物 时 ， 从 这 些 参数 计算 所 得 到 的 曲线 ， 醒 目地 置 于 实验 曲线 下 面 ， 所 以 不 能 在 仅 形成 二 元 络 合 物 的 假定 的 基础 上 来 解释 这 个 现象 。 包括 有 三 元 络 合 物 形成 的 曲线 的 计算 取决 于 这 些 络 合 物 的 固有 的 性 质 ， 但 也 只 能 得 到 比 较 近 似 的 值 。 应 用 比 过 去 用 于 Kp2 系 统 中 更 为 直接 的 方法 将 这 些 特征 增强 (et) 的 估算 值 列 在 附录 中 ， 这 与 我 们 对 Kp2 的 校正 估算 值 是 一 致 的 。 它 表明 对 于 Kp1*Mn。ADP 来 说 ，si 值 近似 为 3.8; .对 于 Kp1*Mn。ATP 来 说 si 值 近似 于 2.5。 最 近 有 入 在 Mg2+ 存 在 的 情况 下 作 了 ATP 与 Kp1 络 合 的 凝 胶 平 衡 的 研究 ， 得 到 的 Kc 值 为 600kM。 由 于 我 们 发 现在 二 元 络 合 物 中 Mn2+ 络 合 于 Kpl 的 强度 比 Msg2+ 要 大 一 个 数量 级 ， 所 以 假设 在 二 元 络 合 物 中 也 有 -- 个 类 似 的 比率 则 是 合理 的 。 为 了 计算 方便 ， 假 定 三 元 络 合 物 与 二 元 络 合 物 的 络 合 部 位 数 相同 。 以 这 种 假定 所 得 到 的 曲线 示 于 图 8 。 这 与 实验 值 是 接近 的 ， 虽 然 它 并 不 证 实 所 作 的 假定 ， 但 却 确 实 证 明 对 三 元 络 合 物 所 假定 的 一 系列 性 质 是 合理 的 ， 因 为 它们 能 够 解释 用 其 他 方式 所 不 能 解释 e2le 0 0 全 05 300 400 [Mnz 霖 (AMD) 图 8 三 元 系统 的 M- 图 〈 用 Mn2+ 与 核 苷 酸 的 克 分 子 比 率 为 1 : 1 的 溶液 滴定 Kp1T) (Kpl 的 比 活性 为 1420 活 性 单位 ， 初 始 浓度 为 654M) . 十 ， 在 无 核 背 酸 时 ，Mn2+ 滴 定 Kp1I 的 实验 参照 点 .Mn2+ 十 ADPa 滴定 开 pI 的 实验 点 ; A Mn2+ + ADE4 滴定 KDp1 的 实验 点 ; 一 一 “包括 三 元 络 合 物 形 成 的 计算 曲线 ; …… 仅 通过 二 元 络 合 物 竞争 的 计算 曲线 ; CL why & 7 ADP 系 统 ， 下 面 的 线 为 ATP 系 统 ) 。 口 “无 蛋白 时 用 Mn2+ 十 ATP3- 及 Mn2+ 十 ATP4- 进 行 的 裤 自 滴定 O LEA 和 核 背 酸 时 用 ?fn2+ 进 行 的 空白 滴定 。 的 结果 。 所 以 我 们 得 出 结论 :确实 有 三 元 络 合 物 的 形成 。Syrtsova 等 人 也 曾 报道 了 在 ATP 存 在 的 情况 下 质子 弛 物 增 强 效应 的 减弱 ， 但 并 未 得 到 定量 的 结果 。 他 们 仅 用 三 元 络 合 物 的 形成 ， 来 解释 这 种 现象 ， 而 并 未 说 明 原因 。 Fes OG 本 文 已 阐明 了 二 价 金 属 离子 Mn 六 +、Mg:、Ca2*、Ba2 对 于 Kp1 的 专 一 的 络 合 。 这 些 结 ， 果 有 助 于 解释 许多 报道 中 提 到 的 一 个 问题 ， 即 一 些 固氮 酶 MoFe 和 蛋白 的 制剂 中 除了 Mo 和 Fe 之 外 还 有 其 他 金属 离子 的 存在 。 se 4S BE (yO EK py Leia HES es TT ie, Mn? * HR A ee A IM. Mg?* 56 & HURT Mn?*., op eA tts 6 8 te aM LH Mao? * 9 2 eB Be AE A LET ME Z Mal SSAA Ao BOAT 数据 还 说 明了 人 金属 、 筷 苷 酸 和 和 蛋白 形成 了 三 元 络 合 物 。 将 这 些 数据 和 Miller 等 人 的 数据 综合 起 来 ， 可 以 得 出 结论 , 当 Kp1 的 比 活性 达到 近乎 于 2900 活 性 单位 时 ,Mg 的 络 合 部 位 数 可 达 到 最 大 值 4 和。 正如 过 去 所 讨论 ， 有 活性 的 Kp1 是 一 种 包括 至 少 5 个 基因 产物 的 络 合 物 。 已 知 这 些 基因 产物 的 功能 包括 多 肽 的 合成 〈nifK 和 D) 及 FeMoco 爹 属 团 徐 的 合成 、 转 移 和 /或 Ei (nitB ALE) 。 全 部 有 活性 的 MoFe 鼻 白 、 每 个 分 子 可 能 有 2 个 Mo 原子 和 30 个 Fe 原子 ， 排 列 成 为 2 个 FeMoCo 禾 ,其 中 每 个 含有 1 个 Mo 原子 ,6 个 Fe 原子 ,它们 和 4 个 独特 的 称 之 为 “PP 中心” 的 4Fe-4S 禾 及 2 个 称 为 “S 的 Fe 原子 在 一 起 .过 去 所 观察 到 的 在 Mo、Fe 含量 和 蛋白 比 活性 之 也 的 粗略 的 相互 关系 可 能 是 由 于 存在 着 一 些 缺 乏 活性 得 的 蛋白 。 我 们 关于 在 Kp1 的 比 活性 和 二 价 金属 离子 的 络 合 部 位 数 之 间 的 良好 的 线性 关系 5 图 5 ] 使 得 这 种 争议 更 加 复杂 。 有 几 种 可 能 的 解释 ， 其 中 可 能 性 较 大 的 是 : (a) MgATE 的 络 合 部 位 是 在 FeMoCo 上 或 在 “P 中 心 ” 上。 (b) 与 (a) 蒜 蜜 相关， 但 更 大 的 可 能 性 是 MgATP 络 合 部 位 是 仅仅 由 于 当 FeMoco fil} ea22。 或 “P 中 心 2” 存在 的 时 候 Kpl 的 构 型 变化 而 造成 的 。 所 以 在 蛋白 上 的 MgATP 和 徐 部 位 可 能 有 一 段 距离 。 (c) 17 个 nif 基 因 产 物 之 一 〈 其 中 几 个 的 功能 仍 不 明确 ) 可 能 在 Kpi 生 物 合成 期 间 通 过 形成 MgATP 络 合 部 位 而 活化 Kpl。 由 于 Kp1 有 前 体 ， 所 以 会 含有 不 能 络 合 MgATE 的 形 式 。 (d) 在 提纯 过 程 中 ，MgATP 络 合 部 位 可 能 会 很 容易 破坏 。 PACKETEER ETE. BER en mm RRS e 它们 之 中 的 一 部 分 问题 。 fh F MgATP ANN MgADP-E FRU KIT -+3) EAR Bs 尤其 是 考虑 到 Kp1 能 活 化 ATP 和 ADP 的 末端 磁 酸 基 团 ， 因 此 上 述 的 络 合 部 位 和 Kpl 的 比 活性 之 间 的 相互 关系 可 能 说 明 水 解 反 应 是 在 MoFe 和 蛋白 上 发 生 的 , 然而 Fe 蛋白 也 至 少 在 2 个 部 位 上 络 合 MgATE 和 :MgADP， 所 以 在 固 氨 酶 作用 过 程 中 究竟 在 那 种 蛋白 中 发 生 ATP 的 水 解 仍 不 清楚 。 已 知 固氮 酶 反应 过 程 中 ，ATP 可 能 有 两 种 作用 。 其 一 ， 与 从 Fe 蛋白 转移 到 MoFe 蛋 白 的 电子 活化 有 关 ; 其 二 ， 与 底 物 的 还 原 关 系 更 为 密切 。MgATP 在 两 种 蛋白 上 的 络 合 部 位 应 与 这 个 意见 一 致 。 ， .关于 MgATP 在 底 物 还 原 中 的 直接 功能 的 一 种 假设 认为 ， 是 其 末端 的 磷酸 盐 对 于 在 一 个 Fe 或 Mo 的 部 位 上 的 水 化 物 的 形成 起 到 了 一 个 良好 的 滞留 基 团 的 作用 ， 随 后 ， 金 属 水 化 物 就 被 参与 在 N? 络 合 和 还 原 过 程 中 。 这 个 假设 与 我 们 上 述 意见 (a) 一 致 ， 即 MgATP 在 MoFe 蛋 白 上 的 络 合 位 置 直接 与 含 Mo (mt) Fe RAK: _ 同 时 也 有 人 提出 ，Mg- 核 音 酸 可 能 起 到 了 两 种 蛋 自 之 间 的 桥梁 作用 ， 3 这 就 明确 地 需要 在 两 种 蛋白 上 都 有 络 合 位 置 。 这 个 假设 将 有 助 于 推理 出 在 固 氨 酶 蛋白 上 有 非常 允 的 MgATP 络 合 部 位 数 。 如 果 这 种 “桥梁 假设 是 对 的 ， 则 我 们 关于 这 种 桥梁 性 质 的 数据 是 十 分 清晰 的 。 我 们 已 说 明 两 种 蛋白 Kpl1 和 Kp2) 都 形成 了 E-M- ay 形式 的 络 合 物 , 也 就 是 说 ， 金 } Ss R—-BRBAKRSBERATMHEA LESS. MUA EFATP ARES 分 络 合 于 一 种 蛋白 上， 同时 念 属 一 磷酸 盐 部 分 又 络 合 于 另 一 种 蛋白 上 而 形成 桥 的 可 能 性 。 由 于 金属 一 核 音 酸 络 合 于 每 种 蛋白 上 的 性 质 是 相似 的 。 如 果 形 成 一 个 桥 ， 最 有 逻辑 性 的 结论 就 i: 核 苷 酸 一 金属 络 合 物 被 夹 入 两 种 蛋白 之 间 ， 对 于 每 种 蛋白 都 呈现 出 类 似 的 面 ， 如 下 所 7: Kp2 一 一 一 ieee he pee Se SSATP, BARRA HI ZEFe Ba LHI /PMgATP NL oe” 络 合 部 位 ;但 在 过 去 的 一 篇 文章 中 ， 我 们 发 现 Kp2 上 有 4 个 Mn : ail AilMg**24 EB (ih, (HAS HE DIE Mg**— BAT RAN SBA Hh FMoFe & A 是 wzB; 的 四 聚 体 ， Fe 蛋白 是 Ya 的 二 聚 体 ， 所 以 在 桥梁 上 可 以 有 几 种 类 型 的 络 合 物 。 其 中 3 种 示 于 图 9 。 在 图 9 (a) 中 ， 我 们 表明 了 与 大 多 数 有 效 的 数据 一 致 的 结构 ， 每 一 个 Fe 蛋白 分 子 有 两 个 MgATP 络 合 部 位 ，MoFe 蛋 白 对 MgATP 的 全 部 络 合 容量 可 以 通 过 MegATP 桥 络 合 两 个 Fe 蛋白 分 子 得 到 满足 。=Fe 蛋 白 可 能 是 相继 地 而 不 是 同时 地 与 分 起 作用 的 每 半 个 MoFe 和 蛋白 相 络 合 。 所 以 可 以 形成 Fe 蛋白 和 MoFe 蛋 白 的 到 分 子 比 为 1 : 或 2211 的 络 合 物 。 另 一 种 改变 了 前 模型 (未 示 出 六 基于 同样 的 数据 ， 是 每 一 个 Fe 蛋白 子 与 每 两 个 MoFe 往 昌 的 亚 单 位 形成 MgATP 桥 。 在 图 9 Cb) 的 几何 模型 中 ， Fe 蛋白 具有 4 223 个 MgATP 络 合 部 位 ， 并 仅仅 形成 Fe 蛋白 和 MoeFe 和 蛋白 克 分 子 比 为 1:1 的 络 合 物 。 在 图 9 〈c) 中 ， 说 明了 第 三 种 可 能 性 ， 其 中 Fe 和 蛋白 仅 络 合 两 个 MgATP 分 子 而 其 余 两 个 络 合 部 位 用 于 与 MoFe 蛋白 络 合 的 桥 上 。 不 论 这 种 “桥梁 ”假设 对 于 MgATP 是 否 正确 ,我们 的 数据 有 力 地 说 明了 MoFe 蛋白 与 MgATP 的 相互 作用 是 整个 酶 反应 机 制 的 一 个 组 成 部 分 。 7 、 \ . i thar se fa S-MM:S oes SS 附 录 三 元 络 合 物 的 特性 增强 效应 对 于 一 个 顺 磁 离子 引起 的 水 质子 的 两 极 弛 耶 ， 应 用 Soloman-Bloembergen 方 程 (b) 可 算出 金属 一 蛋白 二 元 络 合 物 特征 增强 图 9 有 活性 的 固 氨 酶 的 可 能 的 Mg2+ATP 桥 模型 edo 每 一 个 模型 的 下 面部 分 表示 MoFe 蛋 白 ”(a) BH CE 4 个 MgATP2- 桥 的 Fe 蛋白 与 MoFe 蛋 白 克 分 子 比 为 23 1 的 eb Ot amrey ae ne g 个 MgATP2- 桥 的 Fe oFe a Sea ii aN 其 中 ， q= 每 个 金属 离子 的 配 位 部 位 Be, 个 Mg2+ 拟 的 Fe 蛋白 与 MoFe 蛋 白 克 分 子 比 为 1:1 的 络 合 物 。 ”它们 迅速 地 被 可 交换 的 水 占据 。f (rc) 是 PAR ah RABE Al rc 的 国 数 。 星 状 符号 表示 二 元 金属 络 合 物 ,相应 的 无 性状 标记 表示 目前 情况 下 的 游离 水 合 物 离子 Mn(HzO)e2+。 通过 类 推 ， 对 于 核 背 酸 一 金属 一 蛋白 的 三 元 络 合 物 来 OME BLAM PHM 表 示 ) RE 则 : ete afte) MU. PRA: et af(tet) eb” q*f(tc*) 假定 ， 三 元 络 合 物 和 二 元 络 合 物 的 大 小 和 迁移 率 〈 动 性 ) 相 类 似 ， 则 : f(tc') ~f(tc* ) 由 于 这 个 假定 ， 如 果 我 们 假定 蛋白 与 金属 的 络 合 只 占据 金属 的 一 个 配 位 部 位 ， 则 对 于 金属 一 蛋白 的 二 元 络 合 物 来 说 q"” = 5 。 所 以 在 有 ATP 存 在 时 , 克 分 子 比 为 1 : 1 的 Mn2+ 一 核 苷 酸 络 合 物 可 能 是 三 齿 的 ， 而 在 有 ADP 存 在 时 ， 可 能 是 二 雌 的 。 如 果 这 种 配 位 在 核 苷 酸 一 金属 一 蛋白 的 三 元 sa 24 。 将 合 物 中 是 不 变 的 ， 则 对 于 ATP 来 说 ，q*" = 2 ， 对 于 ADP 来 说 ，q" = 38 。 将 这 些 值 和 实验 值 代 替 上 述 方程 中 的 sb， 则 得 到 ATP 的 st=2.5，ADP 的 et=3.8。 对 于 Fe 和 蛋白 来 说 ， 这 些 计算 比 我 们 原来 的 计算 似乎 更 合理 一 些 。 原 载 “Biochem， Biophys, Acta” 705: 385—395, 1982 宋 AE e256 固氮 作用 的 生化 遗传 W_.J.Brill 在 许多 属 的 植物 中 都 存在 着 具有 固氮 能 力 的 原核 生物 ， 在 自生 固氮 细菌 〈 这 些 细菌 不 与 一 定 的 植物 联合 共生 ) AK lebsiella, Azotobacter, Clostridium, Rhodo-S pirillum, 4sbirilluaz 和 各 种 蓝 细 菌 ， 还 有 只 在 与 植物 共生 后 才能 固氮 的 尺 访 zopiuzr spp。( 它 能 在 植 物 上 结 瘤 ) 、 某 些 放 线 菌 “〈 它 们 在 Comptonia 和 枕 木 上 结 瘤 ) WR Anabaena azollae CEN A/EREAMM EAR) ， 然 而 还 未 发 现 真 核 有 机 体 有 固氮 能 力 。 固氮 作用 的 生物 学 、 生 物化 学 、 调 节 作 用 和 遗传 是 相当 复杂 的 。 但 是 ， 在 过 去 十 年 中 ， 由 于 活性 无 细胞 粗 提 液 的 制备 、 固 有 氨 酶 的 纯化 和 用 乙 抉 还 原 法 测定 固 氨 活性， 使 我 们 对 这 个 经 济 上 重要 体系 有 了 迅速 深入 的 了 解 。 当前 ， 一 些 有 关 固 气 作 用 的 书籍 已 经 出 版 ， 涉 及 固氮 方面 的 不 同 专题 也 已 有 过 综述 ， 它 包括 生物 化 学 、 根 瘤 的 感染 过 程 、 非 豆 科 共生 、 蓝 细菌 和 遗传 及 其 调节 。 本 文 着 重 于 对 没有 固氮 能 力 的 突变 种 〈nif- 突 变种 ) 的 分 析 来 阐明 一 些 观 点 。 在 有 些 情 癌 下 突变 种 的 研究 已 为 其 它 途 径 所 确证 ， 而 在 另 一 些 工作 中 突变 种 的 研究 则 得 到 了 新 的 信 息 。 这 篇 综述 的 目的 是 向 生物 化 学 家 们 介绍 广泛 范围 内 各 种 可 利用 的 nit 突 变种 和 它们 Be 在 价值 。 尚 未 描述 的 某 些 突变 种 将 与 其 在 生化 研究 中 的 价值 一 起 讨论 。 与 大 肠 杆 菌 相 近 的 肺炎 克 氏 杆菌 ， 是 一 种 对 包括 固氮 aift 基 因 在 内 的 基因 已 进行 过 详细 遗传 分 析 的 细菌 。 噬 菌 体 P:、 转 导 作 用 、 噬 菌 体 Mu 突变 形成 、 转 座 子 突变 形成 和 互补 分 析 等 对 研究 nif 表 达 的 调节 及 其 生化 的 复杂 性 都 有 极 大 帮助 。 所 以 在 这 篇 综述 中 ， 作 者 特别 着 重 于 这 个 有 机 体 的 遗传 研究 。 一 、 生 物化 学 与 生理 学 1. Axes il UN AA a AE A, RRR AAD I M4. AS I WPRMoFeRA 或 RE, AA SY TL MW) Ape A Bh El I VR. ASE Se AB TR BYE > Sy RH A, Lenk —- TR PASI TUS MAT RPHADI RN, BkRABEMA, KM 个 属 的 成 员 的 组 分 制备 得 到 的 抗 血清 可 以 与 从 不 同属 细菌 中 分 离 出 的 组 分 反应 。 一 个 有 待 回 答 的 问题 是 : 固氮 酶 是 同 源 发 展 来 的 ， 还 是 在 其 进化 中 趋 于 一 致 ， 以 适应 还 原 非常 稳定 Na = Bt) BT Al BAK 组 分 工 的 分 子 量 在 200000~250000 之 间 ， 含 有 两 个 钼 原子 ，28 一 34 个 非 血 红 素 铁 原子 ， 和 26 一 28 个 酸 不 稳定 硫 。 组 分 工 的 SDS 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 表明 ， 组 分 工 含 有 4 个 两 两 相同 的 亚 基 Ca2Bo), 每 个 亚 基 分 子 量 约 为 60000， 实 际 上 如 果 不 用 特定 的 SDS 制 剂 ，SDS 凝 胶 并 不 能 将 两 个 亚 基 分 开 。 亚 基 的 氨基 酸 分 析 也 证 明 它 们 相互 间 是 非常 相似 的 。 ° 26° 虽然 棕色 固氮 菌 固 氨 酶 组 分 IT 两 种 亚 基 的 C 端 和 N 端 的 氨基 酸 不 同 ， 看 来 这 两 个 亚 基 可 能 是 由 同一 个 相同 多 肽 链 修饰 而 来 的 ， 然 而 不 同 胰 酶 水 解 的 状况 却 得 出 与 两 个 亚 基 具 有 不 同 氨基 酿 顺 序 的 结果 ， 在 及 。 brexwroniace 中 ， 组 分 工 蛋白 有 两 个 结构 基因 编码 ， 通 过 缺损 这 两 个 nif 基 因 突 变种 粗 提 液 的 双向 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 访 确 定 nifK 基 因为 一 个 亚 基 编码 ，nif D 为 另 一 个 亚 基 编 码 。. 儿 个 nif D 突 变种 只 改变 一 个 亚 基 的 电 访 迁 移 率 ,那些 nif K 突 变 菌 株 只 改 变 另 一 个 亚 基 在 凝 胶 上 位 置 ， 从 而 说 明 这 两 个 亚 基 是 完全 不 同 的 蛋白 而 不 是 同一 种 蛋白 的 变 更 ， 也 许 组 分 工 两 种 亚 基 的 相似 处 是 在 固 气 酶 进化 过 程 中 发 生 基因 复制 的 结果 。 在 体内 组 分 工 的 每 一 个 亚 基 都 需要 另 一 个 亚 基 以 保持 其 稳定 性 ， 如 果 一 个 突变 种 中 任意 一 个 基因 使 得 另 一 个 基因 不 稳定 ， 那 么 另 一 个 基因 产物 也 会 很 快 降解 。 ”组 分 开 的 分 子 量 在 55000 到 65000 之 间 ， 是 由 两 个 相同 亚 基 组 成 的 ， 这 种 蛋白 有 4 个 非 血 红 素 铁 原子 和 4 个 酸 不 稳定 硫 ，C1ostridium pasteurianum 的 组 分 工 的 氨基 酸 顺 序 分 析 已 经 确定 ,在 民 .pneumoniae'Pnif M 基 因 “〈 也 可 能 是 nif V 和 mnif SHA) AAD I (4am Anif H) 产生 过 程 所 需 蛋 白 编码 ， 这 种 修饰 的 生物 化 学 还 不 了 解 。 底 物 的 络 合 及 还 原 是 在 组 分 I_ bk ADT 的 作用 种 每 次 向 组 分 I 工 传递 一 个 电子 ， 还 没有 发 现 Ni 还 原 过 程 中 有 游离 的 中 间 产 物 ， 但 有 证 据 表 明 酶 -结合 Nz- 氢 化 物 是 中 间 产 物 。 其 还 原 步 又 还 不 清楚 ， 用 组 分 工 缺 陷 型 突变 种 来 检验 酶 一 结合 中 间 产 物 是 否 在 缺陷 的 组 分 上 形成 的 工作 也 许 是 有 意义 的 。 .动力 学 数据 支持 了 当 一 个 电子 从 组 分 开 传递 至 组 分 工 之 后 两 组 分 发 生 解 离 的 观点 ， 但 是 两 种 组 分 混合 物 的 超 离心 分 析 却 表明 两 种 组 分 可 以 形成 较为 稳定 的 复合 物 。 如 上 所 述 ， 一 个 亚 基 发 生 强 烈 变 更 的 nif D 或 者 nif K 突 变种 将 阻碍 另 一 个 亚 基 的 累积 , 可 是 ,nif K 或 nifD 插 入 的 突变 种 虽然 组 分 开 的 量 是 降低 了 , 但 仍 能 使 组 分 开 积 累 。 这 不 是 由 于 极 性 或 者 转录 作用 的 调节 。 这 些 数据 ， 支 持 了 两 种 组 分 作为 一 种 复合 物 在 体内 是 以 某 种 方式 相互 作用 的 ， 和 一 个 亚 基 需 另 一 个 亚 基 来 稳定 的 设想 。 转换 数 〈50mol/ 分 钟 /固氮 酶 中 mol 140) 是 相当 低 的 。 因 此 ， 当 固氮 菌 以 Nz 做 唯 一 氨 源 生 长 时 合成 细胞 总 蛋白 中 ， 大 约 有 2 一 5 % 为 国 氮 酶 。4。vinrelandii 缺 失 固氮 酶 组 分 的 Nif 突变 种 《加 倍 时 间 6 小 时 ) 比 以 天 冬 酰 胺 为 N 源 时 合成 的 无 活性 组 分 的 nif 突变 种 (加 倍 时 间 12 小 时 ) 长 得 快 。 这 也 许 是 由 固有 气 酶 合成 时 对 外 能 和 氨基 酸 的 需求 所 引起 的 。 2 。 力 能 学 尽管 Nz 还 原 成 NH4 必 是 放 热 的 ， 但 由 于 固氮 过 程 是 要 高 活化 能 的 ， 所 以 需 腺 苷 5 -三 磷 酸 (ATP) 形式 的 能 量 。ATP 与 组 分 工 络 合并 使 它 的 氧 还 电位 降低 ，ATP 在 组 分 I 将 电子 传 给 组 分 工时 才 水 解 生 成 ADP。 看 来 每 传递 一 个 电子 有 2 个 ATP 水 解 ， 但 是 ATP 的 水 解 也 可 以 不 与 电子 传递 相 偶 联 。 例 如 ， 这 量 的 组 分 工 使 ATP/e 的 比率 增加 ， 在 体内 同属 一 个 操 纵 子 的 三 个 结构 基因 mif HDK( 至 少 是 在 开 。zbnmeuyzzoniae 菌 中 ) 保持 这 两 个 组 分 的 比率 人 恒 定 。 有 趣 的 是 生理 研究 有 可 能 检查 出 在 结构 基因 上 不 同 复制 数 〈 如 在 部 分 二 倍 体 ) 的 菌 种 中 对 细胞 生长 及 产量 的 影 喇 。 在 体外 国 氨 对 ATP 的 需要 量 并 不 一 定 反 中 其 在 体内 的 需求 。 产 量 实验 的 数据 指出 : 4z- otobacter 每 固定 一 分 子 N? 只 需 4 一 5 个 ATP 分 子 。 而 玉 。 pneumoniacets294-ATP, C. pa- sieurianum#; & 204>.NH TE we 5 wR SEA A a] PS 系 曾 用 开 。 bnaexmzoxiae 解 阻 巡 的 突变 种 进行 过 研究 。 这 种 突变 种 不 能 同化 固 气 产物 NH4。 实 验 得 到 的 结论 是 ,每 固定 一 分 子 Nz 需 21 一 25 个 ATP 分 子 。 °27 6° 5 .。 氧 不 稳定 性 固 氨 酶 中 任意 一 个 组 分 在 短期 暴 氧 后 都 会 不 可 逆 地 失 活 。 因 此 在 组 分 纯化 时 必须 保持 无 氧 条 件 。 固 所 有 机 体 都 具有 保护 其 固氮 酶 不 被 氧 所 失 活 的 机 构 。 在 严格 厌 氧 微生物 中 例 如 . C. pasteurianum) 这 种 机 构 设 有 什么 特殊 意义 ， 在 兼 性 需 氧 微 生 DP PilaK, pneumo- niactiZ HIT) 不 能 进行 有 氧 固氮， 这 些 生 物 只 在 设 有 空气 的 Nz 培 养 基 上 生长 。 钥 在 固定 态 氨 培 养 基 上 ， 在 好 氧 或 厌 氧 条 件 下 均 可 生长 。 甚 至 在 入。zbmevrzromiae 种 的 长 期 诱 变 发 生 之 后 也 没有 分 离 出 具有 耐 一 0; 的 固氮 酶 突变 种 。4zoszpirillum 只 在 微 好 氧 条 件 下 固 A, 但 能 在 有 氧 的 固定 态 氨 培 养 基 上 生长 。 推 测 充足 的 气 有 利于 氧化 克 酸 化 作用 ， 但 过 多 的 胞 内 AS (EA FE 2 et AF AS HE 454A GROPP YE AN OLS, 结果 使 内 部 A 的 浓 庆 降 低 ， 从 而 保护 了 固氮 酶 。 为 了 保持 这 样 的 呼吸 活性 ， 需 要 足够 的 碳 基 质 作 还 原 力 二 如 果 完 全 限制 电子 流 ， 固 氮 菌 4zotobacter 就 用 另外 的 Fe-S 和 蛋白 ( 已 知 的 有 Shethna 绰 自 或 Fe- SEH) 与 酶 的 两 个 组 分 复合 来 保护 它 的 固氮 酶 。 这 种 组 分 I、 组 分 开 和 Shethna FAV 13:4 :1 比例 形成 的 复合 物 ， 在 0 存在 时 增加 其 稳定 性 。 这 种 氧 稳 定 的 复合 物 似 乎 在 电 Be na cased Cader isan erin, ec 使 国 氨 酶 恢复 活性 。 有 些 可 自发 恢复 原状 的 4。zinrelondii Nif REMPRAKAAMHI 组 分 ， 但 是 这 些 组 分 在 体外 没有 活性 。 这 样 的 突变 种 应 当 分 析 Shethna 和 蛋白 是 否 存在 ， 如 果 在 突变 种 中 发 现 这 种 蛋白 ， 那 么 就 要 确定 它 是 否 形成 复合 物 ， 并 保护 固氮 酶 免 受 0x 损 伤 。 在 罕 变 种 中 ， 另 一 个 可 能 的 缺陷 是 ， 它 们 还 原 氧 的 能 力 很 差 。 大 多 数 好 氧 国 气 细菌， 在 斑 脂 培养 基 上 产生 粘性 苗 落 。 这 也 许 是 闫 磺 在 因 氨 酶 中 起 保护 作用 ， 但 是 4。pinelandii 的 无 粘性 突变 种 保持 了 它 的 好 氧 固 氨 话 性 。 在 异 养 蓝 细 菌 中 ， 国 所 酶 似乎 只 在 异形 胞 中 存在 ， 这 种 异形 胞 具有 特别 厚 的 细胞 攻 和 和 进行 不 产 氧 的 光合 作用 反应 。 一 些 不 能 固氮 的 突变 种 缺少 异形 胞 ， 所 以 异形 胞 在 固 所 中 起 主要 作用 。 缺 少 异 形 胞 外 炎 糖 脂 的 鱼 腥 藻 的 突变 种 ， 只 在 极 低 氧 水 平 下 才能 固氮 。 在 几 种 氧 敏感 的 突变 种 中 ， 有 一 种 在 好 氧 条 件 下 如 培 10 小 时 ， 完 全 去 氧 后 就 解除 了 氧 的 抑制 作用 。 也 许 在 蓝 细 茵 中 存在 着 类 似 固 氨 菌 中 Shethna 和 蛋白 的 固氮 酶 保护 蛋白 。 异 形 胞 形成 的 发 育 调 节 ， 可 以 从 研究 车 丝 体 细 胞 上 具有 不 同 异 形 胞 间隙 的 突变 种 中 了 解 到 。 它 们 也 许 有 另外 的 保 ， 护 机 理 ， 比 如 呼吸 保护 ， 或 者 吸 氢 酶 还 原 氧 的 作用 。 在 异形 胞 中 存在 吸 氢 梅 。 应 当 分 离 吸 氢 酶 缺失 型 的 突变 种 ， 以 便 鉴定 吸 氢 酶 是 否 对 固 氛 酶 起 氧 保护 作用 。 在 植物 细胞 的 细胞 质 中 的 根瘤 菌 ， 是 为 膜 外 套 所 隔离 开 的 。 细 菌 周围 包 训 着 大 量 的 豆 血 红 和 蛋白 。 豆 血红 和 蛋白 的 功能 是 结合 0:， 防 止 游离 的 氧 到 达 细 菌 内 部 的 固氮 酶 上 。 这 种 球 蛋 白 是 由 植物 编码 的 ， 而 细菌 看 来 是 产生 豆 血 红 蛋 白 的 血红 素 部 分 。 除 根瘤 外 在 豆 科 植物 组 织 中 没有 发 现 豆 血红 蛋白 。 我 们 还 不 了 解 根瘤 菌 怎 样 诱导 植物 合成 球 蛋白 的 信使 核糖 核酸 〉， 这 种 信使 核糖 核酸 存在 于 结 瘤 植物 的 细胞 胞 液 质 之 中 。 人 缺失 豆 血 红 蛋 白 但 能 结 瘤 的 根瘤 菌 ， 对 于 了 解 植 物 球 蛋 白 的 诱导 合成 和 细菌 产生 血红 素 并 将 其 转 入 球 蛋 白 中 是 十 分 有 用 的 5 结 瘤 植物 细胞 的 胞 液 质 中 含有 一 种 以 上 的 豆 血 红 蛋 白 ， 它 们 是 根据 电荷 的 不 同 而 区 分 的 。 这 些 种 中 有 两 种 其 氮 基 酸 是 不 同 的 ， 这 说 明 它 们 也 许 是 由 互 不 相干 的 基因 编码 的 ， 但 具 有 十 分 相似 的 三 级 结构 。 因 为 豆 血 红 蛋 白 在 根瘤 中 大 量 产生 ， 所 以 豆 血 红 蛋 白 基 因 的 复制 可 以 减轻 因 增加 豆 血 红 和 蛋白 合 成 而 产生 的 压力 。 互 不 相干 的 突变 种 只 要 豆 血 红 蛋 自 的 生化 功能 设 有 改变 ， 复 制 的 基因 就 可 以 累积 。 如 果 确 实 如 些 ， 那 么 没有 密切 关系 的 大 豆 变种 不 同 的 豆 228° Ee a OY 血红 蛋白 的 数量 就 应 该 是 可 变 的 。 从 豆 血 红 蛋 白 C/ 豆 血红 蛋白 a 的 比 举 在 大 豆 发 育 中 变 症 的 研究 中 ,得 出 不 同 豆 血红 蛋白 具有 不 同 功能 的 可 能 性 。 也 许 能 找到 缺少 某 一 种 豆 血 红 蛋 白 的 植 物 突变 种 ， 如 果 拷 到 能 诱导 出 一 种 豆 血 红 蛋 白 的 根瘤 菌 突 变种 ， 那 么 这 个 种 对 了 解 不 同 豆 血 红 蛋 自 的 作用 将 是 十 分 重要 的 。 人 们 期 望 的 是 ， 在 豆 科 植物 的 根瘤 菌 专 性 中 ,有 某 些 根瘤 菌 能 在 非 豆 科 植 物 Parasponia 正 形 成 固氮 根瘤 。 在 这 种 情况 下 根瘤 不 含 豆 血红 蛋白 。 为 某 些 放 线 菌 所 结 瘤 的 非 豆 科 植 物 ， 比 如 棺 未 和 Cemptania ,在 它们 的 固 氨 根瘤 中 不 含 豆 血 红 蛋 白 ， 确 定 在 这 样 的 根瘤 中 国 氨 酶 是 怎样 被 保护 的 将 是 贷 有 兴趣 的 。 梯 木 根瘤 的 固氮 酶 具有 的 特性 (包括 9 不 稳定 性 ) 与 其 它 来 源 的 固氮 酶 是 相似 的 .在 这 些 系统 中 呼吸 作 用 或 0 屏障 也 起 着 保护 作用 。 4 。 放 和 氨 作 用 很 多 固氮 细菌 在 它们 固 氨 时 放 气 ， 但 当 它们 在 NH4+ 中 生长 时 未 放 氢 〈 处 于 抑制 固 氨 酶 合成 条 件 ) ， 国 氨 酶 自身 有 放 氢 能 力 ， 当 有 电子 和 ATP、N? 时 ， 电 子 与 质子 结合 产生 H，。 在 放 氢 时 ， 需 要 固氮 酶 两 种 组 分 和 ATP 水 解 。 但 是 甚至 气相 是 Nz 时 ， 一 些 电 子 也 参与 放 氢 ， 其 祭 电 子 用 于 将 N 还 原 成 NHi+， 这 是 在 体外 鉴定 过 的 所 有 固 氨 酶 的 通 性 ， 电 子 对 N?* 或 质子 的 分 配 取决 于 组 分 比 、 电 子 的 供给 和 ATP 浓 度 。 在 正常 生长 条 件 下 “〈 指 环境 中 的 Nz 浓 度 ) ， 在 体内 电子 的 50 一 65% He EW: > Nif- 突变 种 也 不 能 放 Hz 。 这 样 放 所 :与 氮 的 固定 似乎 同 在 一 个 活性 中 心 上 。 但 是 ， 有 趣 的 是 CO 搞 制 国 Nz 却 不 抑制 放 Hs 。Hz 是 固氮 的 竞争 性 抑制 剂 。 这 样 固 N? 的 活性 中 心 似乎 又 与 放 He 的 活性 中 心 不 同 。 也 许 能 找到 一 种 Nif- ， 但 却 仍 有 固氮 酶 催化 放 了 :活性 的 少 有 的 突变 种 。 对 这 种 突变 种 进行 生物 化 学 分 析 时 ， 获 得 有 关 两 种 反应 机 理 的 重要 信息 。 固 氨 酶 放 氢 似乎 对 细胞 是 有 害 的 。 因 为 它 浪费 了 ATP 和 电子 。 据 说 放 氢 可 以 保 护 固 所 BAN SEO. Mill, {HAEC. pasteurianum 〈 严 格 厌 氧 菌 ) 也 通过 和 氢 酶 放 氢 。 对 固 氨 酶 合成 解 阻 遇 的 天。 pneumoniae BAH GENK EE PA ROMA) ， 看 来 是 利用 固 气 酶 放 氨 以 除去 过 量 的 电子 。 在 以 蔗糖 为 矶 源 的 厌 氧 生长 条 件 下 解 阻 歇 的 细胞 比 在 NH4+ 培 养 基 上 的 野生 型 细胞 生长 迅速 。 当 培养 基 中 有 延 胡 索 酸 存在 时 ， 解 阻 遏 的 细胞 不 比 野生 型 快 。 推 测 延 胡 索 酸 起 过 量 电子 的 受 体 作 用 。ATP 驱 动 的 固 氨 酶 活性 的 能 量 消耗 在 细胞 中 不 像 移 去 过 多 电子 压力 那么 重要 。 另 一 个 对 固 气 酶 放 氨 的 解释 ， 是 活性 中 心 的 特性 。 换 言 之 ， 固 氨 酶 活性 中 心 还 没有 进化 到 淘 沁 这 一 潜在 的 无 效 的 副 反应 的 程度 。 人 们 预言 ， 不 会 发 现在 自然 选择 中 已 经 淘汰 了 这 种 不 利 反 应 :， 即 共 有 活性 国 氨 酶 而 又 不 产生 氢 的 天 然 发 生 种 。 这 种 突变 种 的 选择 应 该 要 求 在 固 所 条 件 下， 比 守 生 型 生长 更 快 。 如 果 以 一 个 缺少 吸 氢 酶 突变 种 作为 亲本 选择 ， 机 率 就 更 关 : 有 些 固氮 菌 能 再 循环 释放 H， 并 使 电子 回 到 固氮 酶 上 。 这 是 由 于 吸 气 酶 的 存 在 。 吸 氢 酶 产生 的 电子 支持 了 氧化 磷 酸化 作用 合成 ATP， 或 通过 因 氛 酶 还 原 N*。 固 氨 酶 -催化 放 吾 : 而 损失 的 ATP 和 电子 可 为 吸 氨 酶 的 活动 而 得 到 部 分 补偿 。 无 氨 梅 活性 ， 但 有 活性 固 A 酶 的 玉 。bmeuimoniae 突 变种 比 野生 型 放 氢 更 多 。 因 此 在 体内 吸 氨 酶 确实 有 再 循环 固氮 酶 产 生 的 氨 。 国 氨 菌 的 mif 突 变种 保持 氧化 Hz 的 能 力 、Hsz 吸 收 也 在 有 NH4:+ 生 长 细胞 中 发 生 ， 所 以 固氮 和 Hy 氧 化 看 来 不 是 共同 调节 的 。 有 些 根瘤 菌 野生 型 菌 种 ， 通 过 吸 所 酶 氧化 氨 。 这 些 菌 种 其 固氮 效率 比 没有 吸 氨 酶 的 菌 种 4 °29 6 高 。 已 分 离 出 块 拓 吸 氢 酶 的 大 豆 根瘤 菌 突变 种 其 效率 似乎 比 野生 型 低 。 这 种 吸 氢 酶 呈 缴 粒 AR sa: AEN » . “RE RY ee GHFECR) 和 Ns 并 不 是 唯一 的 可 被 固氮 酶 还 愿 的 底 物 ， 很 多 低 分 子 量 化 & 物 . 两 所 原子 间 的 三 重 键 〈 例 如 莹 所 还 原 成 NH4+) 、 两 个 碳 原子 间 “〈 例 如 乙 烽 还 原 成 乙烯 ) 或 者 C 和 N 之 间 的 键 “〈 例 如 氰 还 原 成 申 尝 和 NEH4+) 都 可 以 被 因 气 梅 还 原 。 这 些 反 应 都 需要 固氮 酶 两 种 组 分 和 ATP。 除 放 气 外 ，CO 抑 制 固 氮 酶 的 所 有 反应 。 但 是 了 仅仅 是 Nz 固 定 的 抑制 剂 。 还 没有 关于 只 能 还 原 一 种 底 物 ， 而 不 还 原 其 它 底 物 能 力 的 固氮 酶 突变 种 的 报道 。 在 已 分 离 出 (WA RA. pneumoniae Nif 突 变种 中 ， 那 些 在 体内 不 能 固氮 的 菌 种 其 在 体内 同样 不 能 还 原 乙 氧 ， 这 证 明了 乙 燃 还 原 和 国 氮 是 处 于 同一 〈 或 重 登 ) sik an 有 趣 的 是 ， 许多 几 业 要因 多 了 梅 对 不 同 底 物 ， 几 乎 有 同样 的 反应 性 。 研究 者 已 经 广泛 应 用 乙 抉 还 原 分 析 法 测定 固氮 酶 活性 ， 但 是 乙 抉 还 原 法 得 到 的 数据 不 能 推断 赴 氮 量 。 因 为 乙 抉 还 原 到 乙烯 只 需 两 个 电子 ， 而 将 气 还 原 成 2NH4 需 要 6 个 电子 ， 但 是 在 体外 条 件 下 ， 从 乙 抉 还 原 至 Na 的 固定 ， 取 决 于 还 原 齐 浓 度 和 两 种 组 分 比率 和 ATP 浓度 。 电子 传递 缺陷 性 ， 或 者 两 种 组 分 中 一 种 组 分 没有 活性 的 突变 种 ， 在 体内 对 确定 上 述 参 数 的 影 响 是 有 用 的 。 EGE ane PEM AAR GMA) ， 曾 试图 用 作为 分 离 Nit 突变 种 或 固 氨 酶 合 成 解 阻 遏 的 突变 种 的 选择 性 试剂 。 在 解 阻 巡 突变 种 的 选择 中 ， 在 含 氰 化 物 以 NH4 HEN 源 的 培养 基 中 野生 型 将 被 杀 死 ， 解 阻 遏 的 突变 种 也 许 会 解除 氰 化 物 的 毒害 〈 把 它 还 原 成 无 毒化 合 Wy) ， 使 突变 种 能 在 这 种 培养 基 上 生长 。 不 幸 的 是 ， 这 个 技术 还 没 能 成 功 地 分 NE 种 。 培 养 基 中 过 多 的 氟 化 物 杀 死 了 所 有 的 细胞 ， 这 个 问题 ， 目 前 还 不 能 解决 。 问 题 可 能 会 是 ， 这 些 抑 制剂 在 它们 接触 固氮 酶 以 前 就 与 敏感 的 膜 部 位 遭遇 。 。 电 子 给 体 在 体外 ， 使 用 化 学 还 原 剂 ， 比 如 Sz0O4 必 固氮 酶 很 容易 国 氮 ， 在 体内 光合 作用 取得 的 电子 《在 蓝 细菌 情况 下 ) 或 者 从 碳 基质 来 的 电子 驱动 固氮 酶 活性 。Fd 和 Fld 已 被 证 明 在 体外 把 电 子 传 给 国 气 酶 ， 在 有 些 情况 下 ， 在 同一 个 细 匈 中 有 两 个 或 更 多 个 电子 载体 。 但 是 在 体内 很 难 查 明 这 些 和 蛋白 哪 一 个 是 真正 将 电子 传 给 固 所 酶 的 。 玉 。zbmzeu11omiae 菌 的 某 些 突变 种 似乎 缺少 天 然 的 电子 传递 蛋白 ， 因 为 它们 在 体外 固 氛 (加 Sz04), 但 在 体内 不 固氮 ， 其 中 一 种 缺少 nif EF 基 因 的 已 用 于 鉴定 和 纯化 菌 种 中 的 nifF 编码 蛋白 ,这 个 菌 种 可 合成 nif F 活 性 产物 。 纯 化 的 蛋白 是 一 种 含 黄 素 单 核 苦 酸 的 黄 素 蛋白 ， 它 只 有 在 固氮 酶 合成 时 才能 合成 。 当 细胞 在 NH4+ 中 生长 时 ， 它 不 能 合成 。 在 该 体系 中 ， 冷 冻 粗 提 液 以 使 野生 型 菌 的 电子 给 体 失 活 。 将 Fld 加 入 该 系统 中 ， 使 电子 流 恢 复 递 送 至 国 氛 BG» 该 系统 是 与 菠菜 叶绿体 驱动 电子 偶 联 的 .用 Nif 突 变种 测 得 的 黄 素 蛋 白 , 似 与 用 光合 作 用 偶 联 法 测 得 的 同一 有 机 体 开 。znrevmonice 分 离 出 的 蛋白 不 同 。Nit-F 突 变种 不 能 在 Nz 培 养 基 上 生长 的 事实 ， 支 持 了 Nif-E 编 码 的 黄 素 蛋 白 是 固氮 作用 的 真正 的 电子 给 体 蛋白 ， 这 也 是 黄 素 蛋 白 的 唯一 作用 ， 其 它 的 黄 素 氧 还 蛋白 在 体内 很 可 能 起 传递 电子 以 外 的 作用 ， 这 些 数 据 部 分 说 明了 用 在 体外 电子 传递 数据 所 引起 的 问题 ， 推 测 体内 的 真实 情况 。 在 天 pneumoniae} 4—T APPR we 45 Tie FBLA AG, CES on A 酶 对 S204 还 原作 用 ,这 种 为 nif F 编码 的 蛋白 含 一 个 分 子 量 为 120000 的 单 体 ,推测 这 个 nifi 了 编码 的 重 日 是 还 原 态 的 烟 酰 胺 二 核 苷 酸 磷酸 黄 素 蛋 白 还 原 酶 。nif F 或 nif IRA MA GRE 230° 心 He 7.4 JO ANGRY CHEIKH: Moi f—22Hi Ah, A. vinelandii fy—4 2% %& FhCUW45) POH — A FEIG EY AS I UATE MERIAL UL ,这 个 突 AE IG RE En A A 分 工时 就 有 固 氨 酶 活性 ， 酸 处 理 后 的 组 分 工 完全 失 活 ， 这 证 明 组 分 工 中 有 Me MIF, 分 离 后 的 组 分 工 的 Mo 辅 因 子 ， 每 个 Mo 相应 地 含 8 个 Fe 原子 和 6 个 酸 不 稳定 硫 。 这 个 畏 因子 叫 铁 钼 辅 因子 〈Fe-Mo-Ce) ， 它 的 分 子 量 大 报 低 于 5000。 另 一 种 用 于 制备 具 Fe-Mo- Co 组 合 活性 的 4。uinelandii 无 细胞 粗 提 液 的 方法 是 用 WO 代替 MoO?” 培养 细胞 :从 Wo 3% 养 细胞 得 来 的 组 分 工 的 活化 可 以 用 无 活性 辅 因子 的 种 来 进行 ， 在 体外 用 McO,?” 活化 这 种 无 活性 辅 因子 时 需要 ATP， 曾 有 人 提出 ， 念 珠 薄 的 一 个 突变 种 利用 钨 代替 钼 并 通 过 固 氨 酶 固氮 ， 但 这 个 不 平常 的 结果 尚 待 证 实 。 ”纯化 过 的 组 分 工 有 一 个 单一 的 电子 顺 磁 共振 谱 ，g 值 为 3.65， 这 个 信号 在 整体 细胞 中 也 可 以 观察 到 ， 有 些 突变 种 在 正常 水 平 的 Ee 和 Me 条 件 下 合成 无 活性 的 组 分 I， 这 些 突变 种 因 为 组 分 工 的 缺失 而 无 g 值 为 3.65 的 信号 。 突 变种 比 野 生 型 的 讯号 低 。g 值 为 3.65 的 信号 与 组 分 I 活 性 之 间 的 关系 非常 明显 ， 这 支持 了 EPR 信 号 是 由 组 分 工 活性 部 位 引起 的 假说 ，Fe-Mo- Co 也 有 EPR 谱 ， 因 而 Ee-Mo-Co 是 固氮 随 的 活性 部 位 。 当 以 磺 氢 化 合 物 作 还 原 齐 时， 在 N- 甲 基 - 甲 酰胺 里 由 于 Fe-Mo-Co 催 化 乙 烽 还 原 乙 烯 的 事实 ， 进 一 步 证 明 Fe-Mo-Co 是 活性 部 位 ， 该 反应 不 需要 ATP， 组 分 工 和 无 辅 基 组 分 I。 与 酶 的 催化 过 程 一 样 ，CO 是 Fe-Mo- Co 催化 乙 块 还 原 的 抑制 剂 ， 但 是 ，Fe-Mo-Co 单 独 不 催 化 固 级 酶 。 K. pneumoniae=7 EA (nifB、nifN、nifZ) 中 任意 一 个 缺失 都 使 细胞 产生 一 个 无 活性 组 分 I， 它 在 体外 可 用 Fe-Mo-Co 活 化 。 第 四 个 基因 mifQ， 并 不 为 国 气 作 胃 所 绝对 必 舌 ， 因 为 这 个 基因 插入 该 变种 后 ， 还 原 能 力 只 达到 野生 型 菌 固氮 能 力 的 50%， 这 个 水 平 同 洋 可 以 通过 在 体外 加 入 Fe-Mo-Cce 方 式 来 达到 。 缺 失 这 些 基因 产物 的 突变 种 对 了 解 Fe-Mo-Co 生物 合成 及 插入 到 组 分 工 都 是 重要 的 。 例 如 我们 想 要 知道 Fe-Mo-Co 是 合成 以 后 插入 组 分 I 的 呢 ? 还 是 在 组 分 工 中 合成 的 ， 以 及 Fe-Mo-Co 中 间 产 物 是 否 在 这 些 变种 中 积累 。 固 氨 酶 和 硝酸 还 原 酶 都 参与 N 代 谢 ， 二 者 都 是 含 钼 酶 。 硝 酸 还 原 酶 中 的 钼 辅 因子 与 组 分 I 的 辅 因 子 不 同 。 看 来 两 种 辅 因子 不 是 通过 一 条 途径 合成 的 。 因 为 去 掉 全 部 nif 基 因 组 ， 玉 。 Priceiuimroziae 依 然 可 以 利用 硝酸 。 但 是 ， 大 肠 杆 菌 硝 酸 还 原 酶 使 失 型 突变 种 (Nard) 在 高 水 平 Mo0, 存在 下 可 以 恢复 活性 ， 而 除非 加 入 高 水 平 Mek: - ， 它 既 使 含有 nif 质 粒 也 不 能 固 氛 。 所 以 两 种 舍 钵 酶 都 依靠 共同 Mo0,: -渗透 酶 或 其 它 初 期 的 钼 进程 。 COT Gh” 厅 癌 菌 的 突变 种 不 能 还 原 硝酸 但 仍 保持 固 所 能力， 不 能 利用 硝酸 的 首 攻 根 瘤 苗 突变 种 在 四 条 染色 体 上 有 侧 失 ， 这 些 变种 中 有 的 也 缺少 黄 叶 聆 氧化 酶 〈 一 稳 含 钼 酶 ) 活性 ， 所 有 这 些 突变 种 沟 产 生 固 氨 根 瘤 ， 这 个 系统 中 未 发 现 共 同 的 固 人 氨基 因 和 其 它 含 钼 酶 。 二 、 肺 炎 殉 氏 杆 菌 1 。nif 基 因 机 制 PA nit 突变 秘 都 靠近 肺炎 克 氏 杆菌 染色 体 上 的 组 氨 酸 Chis) 操纵 子 。 至 少 有 四 个 基 P 地 由 网 组 成 这 个 复 。 似 乎 没有 非 nif 基 因 散 布 在 nif 范 围 内 。 用 极 性 突变 作用 进行 互补 分 析 和 研究 LaC 融 合 ， 指 明基 因 组 成 七 个 不 同 的 操纵 子 ， 所 有 操纵 子 以 同方 向 转录 ， 即 向 his 甘 因 Hk 向 转录 (图 1) 。 nif 区 域 长 约 24Kb 碱 基 (Kb) ,现在 很 容易 得 到 大 量 的 nif 脱 氧 核 锋 核酸 。 因 为 整个 ni 还 区 域 和 nift 区 域 的 部 分 已 经 连接 在 可 扩 增 的 质粒 上 ， 遗 传 工程 已 用 于 生产 专门 转 导 含 na 证 的 噬 菌 体 。 胃 克隆 的 DNA 的 限制 酶 分 析 ， 已 经 得 出 ait 区域 中 大 部 分 的 物理 图 象 。 大 部 分 基因 功能 已 经 在 上 面 讨论 过 了 。 并 且 概 括 于 图 ， 在 实验 中 ， 在 一 般 细 胞 生长 条 件 下 ， 有 三 个 基因 对 固氮 来 说 不 是 主要 的 。 这 三 个 基因 〈niftL、nifN、nifV) 的 突变 作用 只 有 当 他 们 对 主要 基因 有 极 性 影响 时 才 会 发 觉 。 (Mu) 插入 这 些 基因 后 ， 突 变种 就 完全 恢复 Nif+。 这 将 要 考虑 是 否 要 确定 这 些 “ 非 主要 ”nif 基 因 产 物 起 作用 的 条 件 。 例 如 ， 它 们 中 的 一 个 基因 为 在 极 低 钼 浓度 时 才 起 作用 的 钼 渗透 梅 编码 ， 而 在 高 钼 水 平 培养 基 中 的 固氮 作用 就 不 需 这 种 酶 存在 。 双向 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ， 已 用 于 确定 这 个 体系 中 基因 一 产物 的 关系 ， 当 确定 一 些 突 恋 种 中 基因 改变 多 肽 的 分 子 量 和 电荷 以 后 ， 一 个 多 肽 就 与 一 个 特定 的 基因 对 应 大 多 数 nif 基 因 产 物 已 用 这 个 方法 鉴定 。 (体内 ) nifF, nifJ | ,蛋白 原 1 > 活性 组 分 1 deere Taj nf QB A LR F WM V SU NEKDHJ 调 ir K. pneumoniae if 基因 的 顺序 、 转录 机 制 和 功能 K. pneumoniae nif svn obese CAR, 它们 包括 大 肠 杆菌 、 Solmonella i imuium, A. vinelandin Nif 22h. #38 HM Agroboterium tumefuciens*P, TERR 2 WY 肠 细菌 中 ， 只 有 限 氧 条 件 下 才能 使 固氮 作用 得 到 厌 氧 表 达 ，.4zotobacter 能 好 氧 表 达 天 。 pneumonice nif 基 因 。 推 测 高 呼吸 活性 保护 了 国 氛 酶 ， Sn idsrelet a ae 无 活性 (O2 变性 的 ) 固氮 酶 。 ' 克隆 的 Kp niftkAhREASHS HAA why DNAZ2. EnifK.D. 五 结构 基因 内 是 否 包括 同系 内 其 它 氏 。 bmrevumtoniae 的 nif 基 因 ， 这 一 问题 尚未 确定 。 所 测定 的 因 所 有机体 的 多 样 性 ， 值 得 注意 的 在 DNA 顺 序 水 平 上 极为 密切 的 关系 ， 只 在 结构 基因 上 上 发现。 一 种 解释 是 ， 这 些 细菌 都 相对 地 是 nif DNA 新 近 的 接受 者 ， 这 种 nif DNA 是 由 基因 转移 所 得 的 。 实 际 上 某 些 根 瘤 菌 菌 种 的 nif 基 因 在 大 质粒 上 ， 但 是 如 果 nif 混 杂 地 转移 ， 那 未 nif 基 因 与 结构 基因 不 同 也 应 该 保持 密切 关系 。 另 一 种 解释 是 固氮 酶 活性 组 分 的 二 三 级 结构 要 求 兰 刻 ， 几 乎 不 能 容忍 氨基 酸 组 分 的 极 小 变化 。 所 以 从 大 量 分 析 普 通 氨基 酸 的 顺序 中 ,， 有 可 能 找 出 各 自 进 化 而 来 的 固 氨 酶 。 这 种 独特 的 一 级 结构 的 结果 可 能 是 具有 相似 密码 子 关 系 的 DNA 顺 序 ， 这 © 32° 样 彼此 间 就 具有 高 杂交 能 力 。 这 些 nif 结 构 基 因 的 发 现 ， 看 来 在 Kp 以 外 的 有 机 体 中 也 徐 集 在 一 起 ， 这 一 点 是 不 奇怪 的 。 事 实 上 ， 通 过 操纵 子 控 制 了 组 分 的 调节 作用 ， 从 而 保证 了 得 到 组 分 的 最 佳 比 。 2 .nif 基 因 表 达 的 调节 作用 培养 基 中 有 过 量 NH4 存 在 时 ，Kp 含 有 不 可 测 出 的 nif 编 码 蛋 白 或 者 活性 。 其 它 的 氮 源 也 抑制 固氮 酶 的 合成 。 一 般 说 ， 生 长 过 程 中 的 N 源 越 好 抑制 程度 也 越 高 ， 某 些 与 谷 酰胺 合成 酶 表达 有 关 的 基因 突变 阻碍 了 固 气 酶 的 表达 。 谷 酰胺 合成 酶 的 抑制 剂 〈“ 甲 硫 氮 酸 亚 丰 次 胺 和 甲 硫 气 酸 硕 ) ,有 既 使 是 在 NH4 忆 存在 时 也 引起 高 水 平 的 国 气 酶 合成 。 某 些 通过 谷 氮 酸 合成 酶 途径 同化 NHi 的 基因 突变 种 ， 也 得 到 解 阻 遏 表现 型 。 这 证 明 NH 疙 实际 上 不 是 抑制 的 影响 ， 因 子 ，mnif 的 调节 作用 似乎 与 肠 细 菌 中 组 氛 酸 的 降解 作用 〈HEut) 相似 。 在 肠 细菌 中 的 表达 需要 谷 氨 酸 合成 梅 和 居 或 谷 氨 酸 合成 酶 另外 的 基因 产物 。 这 些 gln 基 因 并 不 是 噬菌体 pl 与 n 计 或 Hut 共 同 转 导 的 调节 。 调 节 作用 好 象 与 谷 氨 酸 合成 酶 生物 合成 活性 无 关 。 关 于 谷 氮 酸 合 成 酶 的 调节 机 制 还 不 了 解 ， 也 许 是 调节 氨基 酸 的 水 平 。 已 在 NH+ 4 中 生长 的 粗 提 液 中 观察 到 ，nif 编 码 蛋 白 需 要 恢复 种 ， 除 nif REA 以 外 ， 所 有 操纵 子 都 可 表达 。 基 些 nifL 突 变种 播 入 ni 驴 重 又 产生 nifA 产 物 能 力 ， 同 时 解除 固氮 酶 合成 的 Mil, PU, AAA 〈 通 过 谷 氨 酸 合成 酶 ) 的 控制 ， 只 在 aif RLA 操 纵 子 上 发 生 ， 一 旦 这 个 操纵 子 表 达 了 ， 其 它 nif 操 纵 子 也 开始 表达 。 一 个 有 趣 但 仍 无 法 解释 的 现象 是 :含有 功能 nifA 产 物 的 突变 种 ， 将 无 色 的 腺 嗓 叭 类 似 物 6- 氰 基 嗓 叭 转变 成 紫红 色色 素 。 这 个 反应 不 需要 其 它 nif 基 因 产 物 参 与 ， 红 紫色 的 6- 氰 基 嗓 叭 对 有 久 存 在 下 分 离 解 阻 巡 的 突变 种 是 有 用 的 ， 也 可 用 其 检验 缺失 的 nif 中 是 否 包 括 nifA。 nifA 产 物 好 像 自身 催化 颜色 的 变化 ;或 者 nifA 基 因 产 物 调 节 由 一 个 与 nif 无 关联 的 基因 编码 蛋 自 的 合成 祥 这 个 蛋白 催化 紫色 反应 。 开 。z?mez1oziae 在 有 氧 条 件 下 生长 时 没有 固 气 酶 合成 ，O: 好 像 迅 速 关闭 了 除 mnifRLA 操 纵 子 以 外 的 所 有 的 ni 生 编 码 的 蛋 向 ， 有 些 Mu 播 入 ni 红 的 mi 全 恢复 种 可 以 防止 0 的 阻 遏 作用 。 这 些 种 在 有 氧 条 件 下 生长 时 合成 所 有 nif 基 因 复 制 的 蛋白 ， 但 是 氧 使 固 氛 酶 失 话 。 这 些 数 据 表 时 niiL 是 在 氧 调 站 中 起 作用 的 蛋 自 编码 ， 也 许 nifL 蛋 白 与 氧 反 应 产生 另 一 个 与 nifA A .反应 的 蛋白 ， 并 使 nifA 和 蛋白 不 能 开动 其 它 nif 操 纵 子 的 表达 。 某 些 菌 种 缺少 ni 全 蛋白 ， 但 是 有 nifA 蛋 白 ， 因 此 对 氧 的 抑制 不 敏感 ， 仍 对 NH4+ 敏感 。 野生 型 的 菌 种 在 NHi 存在 下 也 不 合成 调节 蛋白 ， 这 样 在 niftL 和 nifRLA 操 纵 子 的 启动 子 之 间 一 定 有 个 位 置 忆 该 点 产生 NH4i+ 的 调节 。 这 个 位 置 定 为 nifR， 它 是 否 为 蛋白 编码 还 不 知道 。 三、 根瘤 菌 的 结 瘤 作用 根瘤 菌 菌 种 ， 对 豆 科 植物 寄主 的 结 瘤 作 用 有 特异 性 。 首 蘑 根 瘤 菌 种 只 在 紫 划 攻 上 结 瘤 ， 而 更 豆 根瘤 菌 〈 在 豌豆 上 结 瘤 ) 和 三 叶 草 根瘤 菌 〈 在 三 叶 草 上 结 瘤 ) ， 各 自 都 有 在 豌豆 和 三 叶 草 上 都 结 瘤 的 菌 种 .现在 很 多 数据 都 支持 凝集 素 参 与 侵 染 过 程 的 最 初 几 步 ,和 它们 在 根瘤 一 豆 科 植物 专 性 方面 的 假说 。 从 寄主 植物 中 分 离 出 来 的 凝集 素 似 乎 优先 与 那些 正常 侵 染 的 根 瘤 菌 菌 种 结合 ， 例 如 大 豆 的 血红 凝集 素 与 大 豆 根瘤 菌 结合 纯 不 与 其 它 种 的 根瘤 菌 菌 种 结合 。 对 侵 染 过 程 需要 凝集 素 结合 的 设想 产生 疑问 ， 是 由 于 有 些 大 豆 品 种 能 被 根瘤 菌 结 瘤 并 且 实际 上 是 在 缺少 血红 凝集 素 下 而 引起 的 。 也 许 其 它 凝 集 素 也 可 以 与 这 些 品 种 的 根瘤 菌 结合 ， ea33 。 寸 丰 能 结 瘤 的 突变 种 研究 支持 了 凝集 素 结 合 的 设想 。 已 经 分 离 出 不 能 在 童 蒂 上 结 瘤 的 曹 荐 根 海 菌 突变 种 ， 这 些 突变 种 没有 与 音 落 根 表 凝集 素 结合 的 能 力 。 细菌 凝集 素 结 合 部 位 的 性 质 还 未 和 弄 清 。 在 平板 上 产生 无 粘 胶 菌 落 的 殉 豆 根瘤 菌 突变 种 ， 没有 在 其 寄主 上 结 癌 的 能 力 ， 这 个 突变 种 在 其 生长 培养 基 的 无 细胞 滤液 中 产生 很 霄 的 矶 永 化 今 物 。 这 个 结果 支持 了 外 多 糖 是 凝集 素 结合 位 置 的 假说 。 另 一 方面 凝集 素 似乎 与 感染 菌 的 脂 多 猪 特 异 结合 。 比 野生 型 种 对 大 豆 结 瘤 效率 高 很 多 的 大 豆 根 瘤 菌 变种 好 像 缺 少 0- 抗 原 部 分 ， 三 叶 草 根瘤 菌 含 有 与 O- 抗 原 非常 相似 的 多 糖 ， 它 与 三 叶 草 凝集 素 结合 。 有 许多 关于 不 结 瘤 根 瘤 菌 变种 的 报道 ， 但 是 有 些 并 非 是 突变 种 而 是 非 根 瘤 菌 污染 物 ， 这 主要 联系 到 根瘤 菌 种 的 鉴定 问题 。 根 瘤 菌 的 分 类 是 按照 该 菌 种 对 特定 豆 科 植物 的 结 癌 而 害 ， 如 果 菌 种 不 能 结 瘤 ， 就 需要 另外 的 方法 鉴定 ， 也 许 双向 聚 丙烯 酰 胶 凝 胶 电 泳 可 以 常用 于 鉴定 菌 种 ， 因 为 这 个 方法 不 为 菌 对 植物 结 瘤 的 能 力 所 预 先 确定 ， 因 为 豆 科 植 物 一 根瘤 菌 相 互 作用 形成 紧密 共生 体 ， 所 以 植物 的 贡献 也 应 计算 在 内 。 如 上 所 述 ， 豆 血红 蛋白 的 球 蛋 自 部 分 是 由 坛 物 编码 的 ， 在 大 豆 结 瘤 植物 细胞 胞 液 质 中 也 可 能 专门 参与 这 个 共生 体 ， 为 了 更 详细 了 解 植 物 和 细菌 间 相互 作用 的 问题 ， 应 当 对 不 结 瘤 或 不 能 感染 的 植物 变种 给 予 重视 。 根瘤 菌 的 DNA 可 以 转移 到 4。uinrelanraii 突 变种 中 去 ， 一 些 转 导 后 的 固氮 菌 菌 种 从 根瘤 - 菌 给 体 种 中 得 到 了 侵 妆 的 专 性 多 糖 。 以 三 叶 草 根瘤 菌 为 DNA 给 体 时 ， 这 些 转 导 后 的 国 氨 菌 ， 能 与 三 时 草 根 结合 ， 野 生 型 4。uinelandii 不 能 与 三 叶 草 根 结 合 ， 这 些 种 间 杂 交 也 许 有 感 于 了 解 凝集 素 结合 反应 的 生物 化 学 。 根瘤 菌 的 结 瘤 能 力 似乎 是 由 质粒 一 负载 基因 编码 的 。 用 豌豆 根瘤 菌 〈 在 豌豆 上 结 瘤 ) 做 为 供 体 ， 接 合 到 三 叶 草 根瘤 (在 三 叶 草 上 结 瘤 ) 上 或 者 菜豆 根瘤 菌 〈 在 菜豆 上 结 瘤 ) 中 ， 已 经 得 到 了 具有 在 豌豆 上 结交 能 力 的 三 叶 草根 瘤 菌 或 尺 。bpjaseali 转 导 接 合体 。 此 外 ， 一 个 个 步 100 x 10。 分 子 量 质粒 的 哎 豆 根瘤 菌 就 失去 在 其 正常 寄主 上 结 瘤 的 能 力 ， 这 质粒 与 含 nif 结构 基因 的 质粒 不 同 。 豆 科 植物 只 有 当 土 壤 中 国定 态 氮 不 足 时 才 固氮， 过 量 的 NH4+ 或 NOs -完全 阻止 结 瘤 。 豆 科 植 物 中 为 结合 氨 所 调节 的 固 所 作用 似乎 不 发 生 在 固 氨 酶 合成 水 平 上 ， 也 许 是 在 厄 瘤 水 平 上 。 对 三 叶 草 根瘤 菌 和 三 叶 章 而 言 ， 固 定 态 所 好 象 阻止 凝集 素 进 入 可 被 细胞 利用 的 那 种 状 AL tik > RIE JAE AI EE, CERRO RETEAE LE, PUL 硝酸 盐 或 者 植物 中 硝酸 盐 代谢 产物 肯定 与 结 瘤 的 抑制 作用 有 关 ， 还 没有 发 现 可 以 克服 国定 态 氛 抑 制 结 瘤 的 根 癌 菌 突变 种 ， 一 些 大 豆 品 种 结 瘤 对 固定 态 氮 控 制 结 瘤 作 用 比 另 一 些 品 种 要 敏 感 得 多 。 不 能 国 氨 但 仍 能 结 癌 的 根瘤 菌 菌 种 ， 一 般 在 寄主 上 结 瘤 比 野生 型 多 。 这 可 能 是 在 结 瘤 过 程 中 国 氨 的 根瘤 菌 产生 的 固定 态 N 运 输 到 邻近 的 细胞 中 形成 了 固定 态 氨 梯 度 。 由 于 某 些 原因 根 区 有 一 定量 的 固定 态 所 ， 那 就 不 能 结 瘤 〈 也 许 是 因为 根瘤 菌 结 合 凝 集 素 失 活 ) 。 这 样 使 得 根瘤 彼此 间 分 开 。 也 许 根瘤 菌 的 游 动 性 对 侵 染 结 瘤 是 十 分 重要 的 ， 因 为 细菌 游 动 性 发 生 在 侵 染 线 中 ， 但 是 不 游 动 的 突变 种 仍然 有 在 寄主 上 结 瘤 的 能 力 。 游 动 性 和 向 化 性 ， 可 能 在 土壤 的 竞争 环境 中 起 重要 作用 。 三 羧 酸 循环 的 中 间 产 物 也 许 是 驱动 根瘤 内 固氮 作用 的 能 源 和 电子 源 ; 植物 产生 代谢 产物 此 定 到 达 根 瘤 细 胞 中 ， 因 为 氨基 酸 缺 陷 型 的 种 仍然 能 形成 有 效 的 根瘤 。 34 6 WY eae ee 在 过 去 十 五 年 内 我 们 对 固 所 作用 的 了 解 发 展 很 快 ， 因 为 一 些 关键 问题 被 发 现 及 许多 研究 老 参 加 固 氨 研究。 遗传 、 生 化 和 生理 调节 只 在 玉 。bmexzroniae 这 个 系统 内 研究 得 较为 详尽 。 其 它 在 当前 农业 上 占 更 重要 位 置 的 固 氨 细菌 〈 如 根瘤 菌 ) ， 仍 需 在 我 们 对 Kp 了 解 的 水 平 上 花 大 气力 研究 。 由 于 我 们 知识 的 增加 ， 预 计 在 今后 会 有 更 大 进展 。 豆 血红 蛋白 是 怎样 在 豆 科 和 植物 根瘤 上 合成 的 、 栏 木 根瘤 中 放 线 菌 是 怎样 防止 周 氨 酶 氧 失 活 的 、nitA 编 码 蛋白 是 怎样 与 不 同 操纵 子 nif 蛋 白 相 互 作 用 的 以 及 根瘤 菌 侵 染 和 mift 同 处 在 质粒 上 的 原因 是 什么 ? 异形 胞 是 怎样 形成 的 、Fe-Mo-Co 的 合成 反应 是 什么 ， 这 些 问题 都 需要 很 快 地 回答 ， 由 于 可 以 对 更 多 体系 进行 有 意义 的 遗传 研究 〈 如 棕色 固 氨 、 莱 膜 红 假 草 胞 菌 、 含 脂 螺 菌 、_4nacystis nida- lans. ROAR. AHR. FD 根瘤 菌 、 三 叶 草 根瘤 菌 、 大 豆 根 瘤 菌 ) ， 还 将 会 发 现 许 多 重大 的 情况 ， RRARCKXI “Microbiol. Review” 44 ; 449 一 467，1980 高 盟 生 译 “ 尤 常 构 校 e 35 。 in 根瘤 菌 的 遗传 学 和 遗传 分 析 A,AbBaesp K,Ms3no0rnuKkos 引 根瘤 菌 在 固 氨 生物 中 占有 重要 地 位 ， 从 某 种 程度 上 讲 ， 农 业 上 所 需 的 结合 态 所 是 由 它们 决定 的 。 目 前 ， 世 界 各 国 极为 重视 很 瘤 菌 的 研究 ， 他 们 除 使 用 传统 的 微生物 学 和 生物 化 学 技 术 之 外 ， 还 采用 了 现代 的 遗传 学 和 分 子 生 物 学 方法 。 根瘤 蓝 遗 传 学 的 研究 在 近 几 年 发 展 很 快 。 其 成 就 首先 为 以 下 几 项 : 遗传 图 谱 的 建立 ， 独 特 的 R“ 因 子 的 分 离 ;， 根瘤 菌 质粒 的 一 般 生 物 学 功能 特征 的 揭示 。 由 于 在 这 些 研 究 方法 电 运 用 了 遗传 工程 ， 故 而 大 大 加 速 了 工业 化 生产 根瘤 菌 突 变 体 设 想 的 前 景 。 HU 根瘤 菌 的 一 般 知 识 在 许多 专业 著作 中 ， 可 以 看 到 大 量 的 有 关 根瘤 菌 生 物 学 的 报道 。 现 将 其 中 最 一 般 而 又 是 最 基本 的 资料 综述 如 下 。 根瘤 菌 分 成 快 生 型 时间 3 一 4 小 时 ) 和 慢 生 型 〈 时 间 6 一 8 小 时 ) 两 类 。 就 每 二 个 类 型 的 根瘤 菌 来 说 ， 都 有 一 个 或 多 个 寄主 植物 与 之 进行 有 效 共 生 〈 根 瘤 菌 的 寄主 专 一 性 ) 。 最 广泛 分 布 的 根 癌 菌 的 代表 有 下 面 一 些 〈 括 绝 内 为 寄主 植物 ) 。 快 生 型 的 为 ,绿豆 根瘤 菌 〈 了 吴 B. HO. MPO. URE. Me) . AR CFT. BOR. SH) =o WE (SIE, PEG) . We. DR GLE, AE. A) ARR K 豆 ) . HABE CHS) 。 几 乎 所 有 根瘤 菌 在 加 富 培养 基 中 都 不 能 生长 。 只 有 萌 蒋 根 瘤 菌 例外 ， 它 甚至 能 在 培养 大 肠 杆 菌 的 综合 培养 基 中 生长 。 根 癌 菌 与 豆 科 植物 的 共生 生活 史 是 从 细菌 侵入 植物 根 毛 开始 ， 并 在 根 中 繁殖 形成 特定 的 根 癌 组 织 。 在 每 个 根瘤 中 有 上 亿 个 细菌 〈 形 成 专门 的 类 菌 体 组 织 ) ， 它 们 固定 天 气 中 所 供给 植物 需要 〈Scott 等 ，1976) 。 对 细菌 本 身 来 说 ， 需 要 利用 的 仅仅 是 氨基 酸 形态 的 气 ， 并 将 其 供给 寄主 植物 。 细 菌 的 营养 ， 如 供给 固氮 过 程 的 能 量 ， 在 根瘤 菌 与 豆 科 植物 共生 时 完全 靠 寄主 植物 的 光合 作用 支持 。 根瘤 菌 一 豆 科 植物 共生 时 形成 根瘤 和 实现 固氮 过 程 (nifx 一 表现 型 ) ， 是 最 重要 的 标 志 。 这 些 标志 是 一 个 地 地 道道 的 复合 体 ， 它 的 表达 取决 于 寄主 植物 的 基因 类 型 ， 但 是 目前 在 文献 中 对 此 问题 的 叙述 还 是 形式 主义 的 ， 按 多 基因 型 来 说 是 极其 简单 的 。 就 第 一 标志 来 说 ， Inf "或 Nod* 是 最 能 接受 的 信号 ， 而 第 二 标志 的 信号 则 为 E 妈 * 。 # FAE:. 慢 生 型 中 尚 有 紫 云 英 根瘤 菌 ， 寄 主 为 红 花草 ， 是 我 国 所 特有 。 Inf 一 感染 Nod 一 结 瘤 Eff—#A3tt (AR) «36° 根瘤 菌 ` 质 粒 鉴定 和 特征 ”最早 指出 根瘤 菌 中 有 外 染色 体 组 成 存在 ， 是 完全 从 遗传 学 角度 研究 的 ， #£1974— 197 64F [A] FA PE AICSCI-EtB 梯度 离心 方法 指出 ， 某 些 根瘤 菌 突 变 体 细胞 中 存在 质粒 DNA 。 随 着 从 根瘤 菌 中 分 离 具有 大 分 子 物 质 的 质粒 技术 的 发 展 ， 使 分 离 和 阐明 根瘤 菌 质粒 DNA 的 细致 工作 得 以 进行 。 目 前 实际 上 完成 的 有 两 类 : 在 第 一 类 工作 中 ， 曾 经 见 到 7 个 根瘤 菌 突变 体 的 细胞 中 都 有 质粒 DNA 的 存在 。 质 粒 的 分 子 量 让 到 很 到 的 值 : GRE DNA 的 复 性 动力 学 曲线 确定 ) ， 突 变 体 之 间 互 有 差异 : GWAR H1001 Cnf*Eff*) 41.3x10° 5 BE 豆 根 瘤 菌 1006 (inf) 40.7—1,0x 10°; 三 叶 草 根瘤 菌 0402 inf) 41.4x10°; 根瘤 菌 Dolichos KDI (Inf+Eff+) %1,6x10°, iy EST EAE SEME Fo TOR DE ERS. I EE ER ET 析 。 在 这 种 方法 中 有 趣 的 是 ， 当 用 pH12.2 一 12.4 的 SDS 处 理 时 ， 即 出 现 细 胞 溶 素 ，pH8.0 一 8.5 时 ， 溶 胞 产物 进一步 以 酚 处 理 2 一 5 分钟， 在 这 种 方法 操作 下 DNA 质 粒 变 成 悬浮 状态 ; FARRIS HERE IKE RABAT CREEL DNA 的 移动 性 判断 质 袜 分 子 量 。 应 用 这 种 方 法 作者 指出 Ps。Putidc 细 胸中 有 分 子 量 为 280 和 312 x10*% 的 质粒 存在 ,并 且 发 现 了 早先 并 不 知道 的 根 癌 土壤 杆菌 中 有 分 子 量 大 于 214x10" 的 质粒 。 从 28 个 曹 荐 根瘤 菌 突 变 体 中 发 现 25 个 突变 体 有 1 工 或 2 个 分 子 量 为 90 到 200 x 10" 道 东 顿 的 质粒 ， 而 在 彰 蒋 根瘤 菌 RCR2011、S26 和 Al145 突变 体 中 没有 发 现 DNA 质 粒 。 在 豌豆 根瘤 菌 突 变 体 Al171 (分 子 量 为 1105 之 200; >238x 10°) 和 LPR115 〈 分 子 量 为 98; >169: >212x10°) 中 有 .3 个 质粒 ,三叶草 根瘤 菌 RCR 5 细胞 申 仅 分 离 到 工 个 分 子 量 大 于 186X10'" 的 质粒 。 普 经 对 红 个 大 豆 根瘤 菌 突 变 体 进行 过 确定 质粒 数目 和 其 分 子 量 〈 用 玉 脂 糖 胶 电泳 法 ) 的 工作 ， 并 在 研究 的 细菌 突变 体 细胞 中 发 现 了 1 一 和 个 具有 不 同 分 子 量 〈 范 围 为 48 一 130x10") 的 质粒 。 ”电镜 分 析 根 癌 苗 质粒 的 工作 是 很 有 趣 的 。 其 中 有 一 项 工作 是 用 氧化 饮 一 乙 基 二 溴 化 锰 梯 度 超 离 心 靶 获得 的 两 个 章 蒂 根瘤 菌 突变 体 (Eff+ 和 Ef ) 的 质粒 。 发 现 两 个 突变 体 的 质粒 ， 就 长 度 而 言 ， 其 环 状 分 子 有 很 大 的 不 均一 性 ，Eff 突 变种 的 质粒 长 度 为 0.8 一 135 Shh, Eff” 突变 种 为 0.7 一 106。 同 时 在 第 一 个 突变 体 细 胞 中 的 DNA 质粒， 其 分 子 级 别 为 14 一 17 和 124 一 135 训 微米 ， 而 第 二 类 的 分 子 级 别 仅 约 15 毫 微米 。 作者 对 用 Bf 表 型 突变 体 得 到 的 结果 未 进行 可 伦 ， 对 观察 到 的 DNA 不 均一 性 图 像 也 未 给 予 解释 。 有 关 这 方面 比较 专门 的 工作 ， 媳 有 大 -对 二 些 快 生 型 根 癌 菌 DNA 质 粒 曾 进行 了 分 析 。 这 类 工作 对 观察 到 的 DNA 环 状 分 子 不 均一 的 图 像 ， 按 照 它 的 大 小 普 作 了 明确 的 解释 ,题目 是 “ 快 生 型 根瘤 菌 质粒 多 重 匀 称 系 统 (Myrm- rumepHa cHeTeva) 的 电镜 证 明 ”， 工 作 中 采用 了 12 个 豌豆 根瘤 菌 突变 体 ，9 个 三 叶 草 根 瘤 菌 突变 体 和 5 个 攻 薪 根瘤 菌 突 变 体 ;其 中 有 一 部 分 是 inf Minter 表现 型 。 除 了 RAR 瘤 菌 Su47 和 CC209 (inf*, Efft) 外 作者 成 功 地 从 这 些 突变 体 细 胞 中 分 离 到 DNA 质 粒 。 用 电镜 研究 DNA 质粒 时 ， 发 现 分 子 量 范 围 在 28 x 10°—352 x 10s 之 间 的 环 状 分 子 的 不 均一 性 。 对 获得 的 资料 进行 详细 分 析 指 出 ， 外 形 长 度 为 13.5 训 微米 《分 子 量 为 28x108) 的 分 子 ， 就 其 对 整个 环 状 DNA 长 度 来 说 ， 可 以 认为 是 单 体 。 根 瘤 著 类 型 和 突变 体 之 间 在 不 同形 态 DNA 质粒 量 的 比例 上 有 差异 ， 这 表现 出 这 种 单 体 在 形态 上 是 经 常 发 生变 化 的 。 漂浮 密度 〈mziagydHag rroTHocTBE) 是 DNA 质 粒 又 一 特征 。 但 在 各 研究 结果 之 间 有 很 大 的 矛盾。 例如 上 述 工作 中 ， 漂 浮 密 度 值 发 现 为 1.715gJmil( 染 色 体 的 DNA 为 1.719g/ml) 。 37° 其 它 工 作 中 ， 彰 项 根瘤 菌 DNA 质 粒 的 漂浮 密度 值 为 1.717g/ml( 染 色 体 DNA 为 1.722g/ml )。 还 有 些 工 作者 发 现 三 叶 草 根瘤 菌 细胞 随 体 〈 指 染色 体 的 肩 )》 DNA 的 漂浮 密度 为 1.718g/ml， 其 它 作者 则 发 现 1.699g/ml。 同 时 在 有 些 作者 工作 中 见 到 不 同 种 根瘤 菌 DNA 质 粒 的 漂浮 密度 值 是 相同 的 ， 并 利用 这 一 点 对 根瘤 菌 进行 鉴定 。 生物 功能 “目前 这 种 功能 首先 与 寄主 的 专 一 性 及 固氮 作用 相 联系 ， 但 也 有 关于 检查 根瘤 菌 质粒 和 其 它 指 标的 材料 。 如 认为 根瘤 菌 的 多 种 而 药 性 指标 可 能 是 具有 特殊 的 质粒 。 也 有 的 HSU, YY A BAe AIG SAE OB REAL EI TE RE FD, 是 受 专 一 的 分 子 量 为 59.6 x 10* 的 PEZ1 RAT HZ. TX PETES hl BA EB EAL 敏感 的 特性 。 研 究 各 种 更 豆 根瘤 菌 之 间 的 拓 抗 作用 时 获得 了 预想 的 证 据 。 第 一 个 工作 的 结果 直接 表明 ， 利 用 质粒 控制 根瘤 菌 对 寄主 专 一 性 是 可 能 的 ， 这 是 这 类 研 究 的 代表 作 。 在 这 项 工作 中 ， 当 三 叶 章 根瘤 菌 和 菜 豆 根 瘤 菌 突 变 体 间 的 结合 时 ， 发 现 三 叶 草 的 感染 能 力 会 从 一 个 突变 体 传 给 后 一 个 突变 体 。 这 种 可 能 性 也 从 根瘤 菌 的 In 全 标志 不 稳定 性 中 推断 出 来 。 关 于 这 方面 的 重要 证 据 ， 是 在 利用 特有 的 pPRLiII 质 粒 将 豌豆 的 接种 能 力 从 BE 豆 突变 体 传 给 其 它 根瘤 菌 突变 体 的 工作 中 获得 了 证 明 ， 这 种 质粒 是 一 种 结合 体 ， 具 有 抗菌 性 标志 ， 它 可 以 从 豌豆 根瘤 菌 突变 体 中 得 到 。 为 了 简化 质粒 传 给 另 一 个 突变 体 的 选 种 方法 ， 利 用 Tn5 转 座 子 的 摊 和 画 出 卡 那 起 素 (Km'"*) 耐 药性 标志 〈 如 pRls 工 标志 ) . HED Re 6015 突 变 体 Ts 和 突变 体 Inf 之 间 杂 交 产 生 的 Km”" 易 位 结合 体 获得 了 Inf-* 表现 型 。 此 外 ， 在 从 用 吏 豆 根瘤 菌 Ts 同 三 叶 草 根瘤 菌 、 菜 豆 根 瘤 菌 及 豌豆 根瘤 菌 SP 中 间 型 杂交 时 所 选择 的 易 位 结合 体 中 获得 PR1sJI 质 粒 的 同时 ， 也 得 到 了 和 它们 的 寄主 植物 豌豆 不 同 的 接种 能 力 。 不 久 前 发 表 了 利用 细菌 结合 体质 粒 控制 吏 豆 根瘤 菌 共生 特性 的 比较 研究 。 除 了 上 面 提 到 的 pRLsJI 质 粒 之 外 ， 还 有 以 PRLsJI (来 自 突 变 体 306) 和 PRL4JI (来 自 突变 体 309) 进行 分 析 的 。 所 有 这 些 都 控制 细菌 的 细胞 发 生 ， 在 以 高 频率 〈 单 位 受 体 细 胞 的 10 :一 10 2:) 进行 结 合 的 感染 ， 并 具有 以 10… 一 10-* 的 频率 将 供 体 染 色 体 基因 传递 的 能 力 。 所 有 三 种 质粒 都 曾 用 Tn5 转 座 子 进行 过 标记 ， 并 将 之 转 给 豌豆 根瘤 菌 1027 的 Inf*，Eftft* 一 突变 体 。 在 获得 具有 8 种 不 同 豌豆 根瘤 突变 体 Inf 杂 交 时 曾经 发 现 ，95% 机 率 的 pRLIJI 质粒 易 位 时 伴随 以 Inft 一 表 现 型 的 复位 ， 而 当 pPRLsJI 和 pRI «JL 页 粒 易 位 时 观察 到 的 Inf+ 一 表现 型 的 复位 机 率 很 小 《每 单位 昂 位 机 率 为 10 “一 10， 或 单位 受 体 细 胞 为 10*) 。 如 果 这 类 稀有 的 Inf+ 一 昂 位 结合 体 进而 用 作为 供 体 的 话 ， 则 pRLsJI 和 pRL4JI 质 粒 的 转移 即 伴随 有 高 频率 Inf+ 一 表现 型 的 复 位 。 应 该 指出 ，o :广泛 被 采用 于 转移 染色 体 基 因 方 法 ， 其 在 试图 转移 Inf+ 特 性 时 ， 根 瘤 菌 R68.45 质 粒 ( 见 下 )， 无 论 在 哪 种 情况 下 都 未 见 到 这 种 标志 转 给 Inf+ 一 受 体 ， 在 解释 获得 的 结果 时 ， 作 者 认为 ， 用 于 Inf 一 突变 体 的 互补 突变 体 的 Inf+ 一 基因 大 量 地 局 限 在 3 种 存在 于 璇 豆 根瘤 丽 细 胞 质粒 中 ， 质 粒 pPRLIJI，pRLsJI 和 pRL4 林 能 以 大 的 或 小 的 机 率 动员 这 类 基因 的 转移 。 偿 有 一 种 控制 根瘤 菌 质粒 共生 特性 的 证 据 是 在 3.JIopkegHg (波兰 ) 的 实验 室 中 得 到 的 。 还 发 现 ， 茶 些 三 叶 草 根瘤 菌 突变 体 细 胞 保温 于 35D 下 7 天 常常 失去 寄主 植物 红 花 草 的 接 种 能 力 。 以 一 种 分 离 到 的 Inf -一 突变 体 进 行 详细 研究 指出 ， 感 染 性 的 起 失 受 突变 体 细 胞 中 区 域 性 质粒 的 人 马 乏 所 控制 ， 如 果 三 叶 草 突变 体质 粒 的 分 子 量 原初 检查 是 460x10* 和 190x105; 那么 经 用 这 个 方法 后 ， 只 留 有 分 子 量 为 460 x 10* 的 质粒 。 迄今 为 止 ， 在 根瘤 菌 质粒 参加 控制 固氮 作用 过 程 方面 ， 也 有 充分 的 证 据 。 如 运用 Ri19 38 s drd，RHdrd 和 RP1 质 粒 将 nifi 一 特性 从 三 叶 草 根瘤 菌 Ti 转移 给 不 能 固 拟 的 微生物 。 关 于 后 一 类 工作 ， 有 以 nif+ 一 特性 为 供 体 ， 把 由 RP1 质 粒 转 入 ErColiK 一 12 的 三 时 草 Ti 的 Inf -Eff* 六 其 中 。 以 失去 Ti 质粒 的 根瘤 病 土壤 杆菌 品系 和 在 mi 全 一 基因 区 有 间隔 (ereHre) 的 肺炎 克 氏 杆菌 Kp52 进 行 杂 交 。 在 这 种 情况 下 ，RP1 结 合体 中 近 20%% 无 性 系 表 现 有 良好 的 乙 块 还 原 活 性 〈ni 信 一 表现 型 ) 。 众 所 周知 ，RP1 型 的 R -质粒 能 动员 其 它 质 粒 转 移 但 不 能 使 染色 体 和 RD 起 此 有 高 炳 事 的 本 是 生 称 胃 作 种 拓 本 人 种 央 让 下 特征 人 草 Ti 的 nif 基 因 分 布 在 质粒 中 的 合理 结论 。 肺炎 克 氏 杆菌 固氮 酶 DNA 结 构 基 因 与 根瘤 菌 DNA 质 粒 直 接 杂 交 的 实验 ， 证 实 nit 一 基因 是 分 布 在 根瘤 菌 质粒 中 的 。 例 如 ， 利 用 不 具有 肺炎 克 氏 杆菌 nifKD 基 因 竺 志 的 P-32DNA 片 段 与 携 有 吏 豆 根瘤 菌 DNA 质 粒 的 已 .Colii 片 段 杂交 时 ， 即 显示 出 明显 的 同 源 区 带 ， 在 这 项 工 作 中 研究 了 三 个 突变 体 的 DNA 质 粒 ， 其 中 有 一 个 LPR180。 同 源 现象 在 所 有 人 情况 下 均 可 见 到 ,这 表明 吏 豆 根瘤 菌 nift 一 基因 是 较 多 地 分 布 在 质粒 中 的 (分 子 量 为 115 一 200x10 和 200 一 240x10°) 。 在 即 一 工作 中 ， 以 首 蒂 根 瘤 菌 DNA 的 克隆 片段 检验 时 ， 曾 见 到 7 个 具有 有 般 炎 克 氏 杆 菌 nif KDH 基 因 标 志 的 DNA 的 显 性 同 源 克 隆 ， 其 中 有 一 个 克隆 是 利用 DNA 质粒 得 到 的 ， 作 者 根据 这 些 作 出 了 关于 至 少 有 部 分 nit 一 基因 是 分 布 在 背带 根瘤 菌 质粒 上 的 结论 。 tf FF TH 突变 发 生 “从 所 研究 对 象 中 得 到 突变 体 是 遗传 学 研究 的 必要 基础 。 关 于 这 方面 的 情况 ， 不 同类 型 根瘤 菌 是 有 差异 的 。 迄 今 为 止 ， 快 生 型 根瘤 菌 中 已 经 得 到 10 种 各 种 各 样 的 突变 体 ， 而 慢 生 型 根瘤 菌 突变 体 的 分 离 看 来 是 比较 复杂 的 任务 。 慢 生 型 根瘤 菌 的 最 普通 的 代表 菌 如 大 豆 根 瘤 蔚 ， 从 中 分 离 出 突变 体 的 只 有 来 自 印 度 的 个 别 报道 。 在 各 种 情况 下 ， 从 根瘤 菌 中 分 离 突变 株 ， 常 常 使 用 传统 的 突变 基因 和 加 添 青 替 素 的 方法 。 其 中 有 一 项 工作 成 功 地 使 用 了 这 种 PAK MaRS RAMS SRB ADRK NEAR. TE Km 一 R 处 理 的 突变 体 中 使 用 转 座 子 Tn5， 其 出 现 频率 达到 0.3% (Beringer, 1978) 。 遗传 物质 的 转移 ”以 R 一 因子 为 基础 的 根瘤 菌 中 转化 、 转 导 和 接合 是 人 所 周知 的 。 第 一 种 方法 在 遗传 图 像 中 暂 未 得 到 广泛 的 运用 。 但 是 在 各 种 根瘤 菌 突 变 体 之 间 运 用 遗传 标记 转化 的 转移 获得 了 许多 结果 。 所 有 的 实验 方法 ， 实 际 上 和 区 孢 杆菌 中 使 用 的 转化 方法 郊 没 有 什么 不 闻 。 在 培养 生长 最 初时 期 ， 见 到 在 转化 时 各 种 类 型 根瘤 菌 受 体 细胞 的 重组 状态 ， 与 正常 情 况 下 一 样 。 根瘤 菌 遗 传 中 的 转 导 ， 目 前 基本 上 在 彰 蒂 根瘤 菌 和 吏 豆 根瘤 菌 两 种 类 型 中 使 用 。 对 首 攻 根瘤 菌 来 说 ， 转 导 作 用 是 用 噬菌体 来 完成 转移 的 ， 这 仅仅 是 萌 蒂 根瘤 菌 41 的 半 胱 氨 酸 标志 。 以 专门 的 噬菌体 DEF 2 为 基础 的 一 般 转 导 ， 可 应 用 于 萌 薪 根瘤 菌 的 遗传 分 析 - (Casadesus，Oli- vares, 1979) 。 这 种 噬菌体 有 很 高 的 转 导 频率 〈 在 侵 染 最 适 比 1 : 1 下 为 10*)， 并 成 功 地 用 于 曹 蒂 根 瘤 菌 染色 体 图 谱 中 某 些 遗 传 标志 联结 水 平 的 检定 。 因 此 作出 了 ， 在 染色 体 图 谱 中 用 质粒 R68。45 获 得 的 联结 数值 不 很 准确 的 结论 。 记 今 为 止 ， 从 噬菌体 DEF: 中 获得 了 对 热 敏感 的 突变 体 ， 利 用 这 种 突变 体 进 行 转 导 试验 是 简便 而 有 效 的 。 有 趣 的 是 ， 以 病毒 噬菌体 RL38 和 RL39 获 得 了 成 功 。 这 类 噬菌体 在 吏 豆 根 的 频率 转 给 接 受 细 胞 工作 中 发 现 某 些 标志 ， 像 色 氨 酸 -14- 腺 WES72 (trp-14-ade72) . IRE -71- 2 4E- 2 《ade-71-rib-r) 、 甲 硫 氨 酸 - 2-R ME (met- 2 -ura) 的 联合 诱导 。 根 据 转 导 的 大 小 0 29 ， 测定 了 吏 豆 根瘤 菌 染色 体 图 谱 中 rif-stf-spe 标 志 的 顺序 。 这 类 噬菌体 能 够 实现 质粒 了 68.45 FIPRL, Ji (1 - 2 xl10 7 的 频率 ) 的 转移 。 噬 菌 体 RL38 能 够 复制 ， 并 像 在 将 豆 根 瘤 菌 突 变 体 中 的 情况 一 样 ， 能 在 三 叶 草 根瘤 菌 突变 体 范 围 内 转 导 标志 。 观 察 到 遗传 标志 能 从 吏 豆 根 瘤 菌 细胞 转 给 三 叶 草 根瘤 菌 细 胞 ， 但 是 运用 这 种 噬菌体 进行 遗传 标志 的 反 向 转 导 尚未 成 功 。 按照 专门 性 因子 进行 结合 作用 ， 在 根瘤 菌 中 还 不 清楚 。 同 时 需要 指出， 在 TeywMafa《〈 民 主 德国 ) 实验 室 中 报道 了 在 形成 色素 的 羽 扇 豆 根瘤 菌 突变 体 中 ， 借 用 两 种 专门 因子 《对 每 个 染色 体 的 一 半 来 说 ) 的 染色 体 基因 转移 系统 (Heumaun, 1977) ， 描 述 结 合作 用 系统 无 疑 是 很 有 兴趣 的 ， 而 且 很 出 色 的 是 ， 根 据 这 个 建立 了 微生物 染色 体 的 环 状 图 谐 。 但 是 这 种 细菌 突变 体 不 能 接种 到 羽 扇 豆 植 株 上 ， 因 而 不 能 使 人 相信 这 就 是 羽 扇 豆 娄 癌 菌 。 在 没有 自己 的 结合 作用 系统 的 费 氏 杆 楼 酸 杆菌 (Citrobacter freundii) 中 ， 借 喉 菌 体 Mu 在 大 肠 杆菌 性 因子 E 的 细菌 染色 体 上 的 整合 作用 得 到 了 高 结实 率 的 供 体 突 变 体 〈Hfr) 。 在 部 分 工作 中 为 得 到 彰 攻 根 瘤 菌 突变 体 的 致 育 供 体 ， 按 照 类 似 的 方法 和 采用 噬 蓝 体 RP4Mu- R- 因 子 系统 进行 了 示 踪 〈Boucher 等 ，1977) 。 在 引用 的 文献 中 只 有 史 叭 菌 体 Mu 转移 到 上 间 蒂 根 瘤 菌 的 初步 工作 报道 。 在 根瘤 菌 中 为 获得 有 效 的 结合 体 , 曾 以 产 自 RP4 的 人 工 调 配 因 子 R“ 进 行 过 尝试 (Tacot， 1976; Juliot 等 ，1979) 。 第 一 个 工作 中 曾 建立 了 不 具有 了 喝 豆 根瘤 菌 细胞 的 DNA att, RG 再 将 这 种 质粒 用 于 检查 豌豆 根瘤 菌 突变 体 在 杂交 中 染色 体 基 因 转 移 的 调配 能 力 。 第 三 个 作用 类 似 的 方法 对 站 攻 根 瘤 菌 进 行 同 样 的 检查 。 预 区 的 效果 仅 在 第 二 个 工作 中 达到 。 例 如 在 16 个 质粒 R' 诱 导 派 生 的 RP4 (SE SU SHU et fk DNA 部 分 的 HindII 向 分 布 在 了 PKm-R 质粒 位 点 HindII 中 ， 有 4 个 和 原 有 质粒 RP4 相 比较 时 表现 出 较 高 的 曹 蒂 根瘤 菌 染 色 体 基 因 转移 值 。 还 观察 到 ， 在 每 一 个 这 类 质粒 中 ， 染 色 体 标志 的 转移 具有 确定 的 位 点 ， 并 且 转 移 的 极 性 已 被 探知 。 这 种 工作 展示 了 根瘤 菌 中 遗传 物质 转移 时 ， 用 人 工 制造 R' 诱 导 质 粒 RP4 的 可 能 性 。 在 更 豆 根瘤 菌 中 ， 见 到 了 能 实现 单位 供 体 细 胞 为 10…“ 一 10 * 频 率 的 风色 体 基 因 转 移 的 结 合 质粒 (Hirsch，1979)。 不 和 久 前 对 萌 攻 根 瘤 菌 质粒 PEZI1 的 结合 特性 也 有 所 阐明 《Bedimar， 1980) 。 类 似 质粒 的 发 现 可 以 期 望 未 来 很 可 能 在 不 同类 型 根瘤 菌 中 利用 他 们 自己 的 质粒 成 功 地 得 到 有 效 遗 传 物质 的 传递 系统 。 迄 今 为 止 ， 关 于 根瘤 菌 图 谱 的 所 有 结果 ”都 是 在 音 胞 菌 RP4 和 R68.45 结 合 的 及 质粒 基础 上 获得 的 。 这 两 种 质粒 是 相近 似 的 ;及 68.45 质 粒 的 盆 离 是 和 对 钢 绿 色 极 毛 杆菌 PAC 突 变 体 染 色 体 转移 与 具有 高 的 动员 能 力 的 R.68 质 粒 二 和 料 兴 Hass， Holoway，1976) 。 遗传 图 谱 ”第 一 个 根瘤 菌 染 色 体 基 因 图 谱 是 利用 R68.。45 质 粒 的 结合 体系 统 在 聋 豆 根 瘤 菌 中 完成 的 〈Beringer，Hopwood，1976) 。 在 已 经 完成 的 工作 中 指出 ，R68& 丰 质粒 能 动 员 频 率 约 为 10 ”( 按 单位 受 体 细 胞 计算 ) 的 供 体 染色 体 基 因 转 移 ， 并 且 在 俱 体 标志 转移 中 具 ARE. WHR. MTA ee (OF MSH) 都 会 有 R68.45 质 粒 ， 按 照 选 择 图 谐 受 体 突变 株 逆 向 纯 系 得 到 的 此 类 质粒 ， 其 机 率 约 为 丰 。 所 有 这 些 给 人 们 有 可 能 去 区 分 重组 和 逆向 纯 系 ， 以 及 根据 它们 和 选择 标志 联结 的 大 小 确定 染色 体 上 遗传 标志 的 相对 分 布 呈 在 所 引用 的 工作 中 ， 曾 经 确定 和 种 吏 豆 根瘤 菌 突变 体 -Me + 24-trp16-phel-urea-144e afk EA 配置 的 。 对 寻 传 学 研究 来 说 ， 所 有 根瘤 菌 中 最 方便 的 材料 是 萌 蒂 根瘤 菌 ， 它 们 对 条 件 要 求 简单 ， 240s 在 根瘤 菌 中 其 世代 时 间 最 短 ( 约 2.5 小 时 ) ,培养 时 大 部 分 突变 体 不 分 泌 粘 液 。 并 非 偶 然 的 是 ， 育 薪 根瘤 菌 是 在 根瘤 菌 中 最 先 建立 环 状 图 谱 的 ， 如 美国 学 者 在 首 蒋 根 瘤 菌 2011 突 变 体 中 (Riead，Signer,1977)、 人 匈牙利 学 者 在 首 薪 根瘤 菌 41 突 变 体 中 (Kondorosi 等 ,1977) 等 等 。 这 些 工作 中 制图 的 原则 和 前 面 所 例 举 的 工作 是 一 样 的 。 菠 蒂 根 瘤 菌 2011 突 变 体 的 图 谱 是 用 及 p4 质 粒 完成 的 ， 并 且 在 膜 痉 器 上 进行 杂交 ， 同 时 观察 到 质粒 以 10 ”的 频率 进行 转移 ， 而 以 10 “一 10“ 频 率 〈 按 单位 供 体 细 胞 计算 ) 出 现 重 组 纯 系 。 重 组 体 的 真实 性 是 不 容 置疑 的 ， 为 在 其 繁殖 时 未 见 到 亲本 形态 的 分 离 ， 因 而 可 以 检查 供 体 的 隐 性 标志 的 遗传 性 。 在 萌 蒂 2011 染色 体 图 谱 上 ， 根 据 彼此 之 间 的 关系 曾经 推测 有 20 个 不 同 的 标志 。 存 绘制 彰 蒂 根瘤 菌 41 突 变 体 染 色 体 图 谱 中 使 用 了 R68.45 质 粒 。 在 琼脂 培养 基 表 面 进行 杂交 ,质粒 以 10 一 10 “频率 进 行 质粒 转移 ， 重 组 体 以 10 :一 10 “频率 〈 按 单位 供 体 细胞 计算 ) 出 现 。 在 染色 体 图 谱 上 确定 分 布 着 17 个 营养 缺陷 型 标志 和 2 个 对 抗生素 稳定 的 标志 (Str rif) 。 分 析 各 种 标志 之 间 的 联结 大 小 时 , 曾 确定 R68.45 质 粒 转 移 的 供 体 当 色 体 片段 的 平均 值 ,很 显然 构成 了 完整 的 桨 色 体 。 迄今 为 止 ， 染 色 体 环形 图 谱 的 获得 还 只 限于 一 个 彰 蒂 根瘤 菌 突变 体 〈GR4 突 变 体 ， 此 图 . 谱 是 用 R68.45 质 粒 绘 成 的 。 环 状 图 谱 包 括 19 个 基因 位 点 。 此 图 谱 的 特点 是 ， 在 结合 作用 试 验 申 得 到 的 许多 标志 之 间 的 联系 ， 是 用 噬菌体 DFz 转 导 得 到 的 基本 资料 绘 成 的 。 根瘤 菌 中 除了 章 送 根瘤 菌 以 外 ， 绘 成 环 状 图 谱 的 尚 有 吏 豆 根瘤 菌 300。 这 个 图 谱 包 括 16 个 基因 位 点 ， 并 且 如 前 所 述 ， 就 根瘤 菌 来 说 是 根据 各 标志 间 联 结 大 小 而 定 的 。R68.45 质粒 用 作 遗 传 物 质 的 传递 体 , 在 每 个 供 体 细胞 中 其 转移 供 体 染 色 体 标志 的 频率 约 为 10“。 根 据 频率 的 天 小 和 标志 的 接受 状况 ， 可 以 作出 关于 RR68.45 质 粒 转 送 的 某 些 供 体 DNA 上 片段， 至 少 可 以 构成 整个 染色 体 的 7 个 部 分 的 结论 。 HBR BM2011, Baie 4 BE 豆 根瘤 菌 300 染 色 体 的 共同 图 谱 列 于 附 图 ， 图 谱 分 析 表 明 ， 其 中 并 没有 负责 共生 或 固 所 的 基因 。 此 种 情况 首先 只 能 以 技术 困难 来 解释 ， 因 为 就 这 种 基因 图 谱 来 说 ， 必 须 在 植物 上 对 重组 纯 勾 进行 实验 。 但 是 有 充 分 的 根据 认为 ， 在 最 近 几 年 内 负责 根瘤 菌 和 豆 科 植物 共生 的 基因 ， 将 在 遗传 图 谱 上 绘制 出 来 。 这 里 ， 根 瘤 菌 遗传 图 谱 的 存在 已 为 这 个 推测 的 实现 提供 了 很 好 的 保证 。 如 同 大 豆 根 瘤 菌 在 大 豆 上 一 样 ， 建 立 起 一 套 迅 速 而 有 效 的 分 析 根 瘤 菌 和 植物 共生 的 方法 ， 这 并 没有 原则 性 的 困难 。 根瘤 菌 中 异种 结合 和 R” 在 英国 ， 根瘤 菌 的 遗传 图 谱 Beringer 小 组 的 一 项 工作 中 普 经 发 现 ， 外 圈 为 ， 忆 :meliloti 2011; 全 ar way HRA R.meliloti 41; R68, 45 质 AL AE SE BL BT A eg Ba =o AA R.legumonosarum 300, ALI Dd SE ARR Bal ZT AR BH f 瘤 菌 突变 体 之 间 那 样 的 效率 〈 按 接受 细胞 计算 约 10…") 进行 染色 体 基因 的 转移 。 异 种 结合 分 析 ， 按 照 分 布 在 葛 豆 染色 体 遗 传 图 谱 不 同 部 分 的 足够 多 的 标志 数 实现 的 。 根 据 获 得 的 资料 ， * 41 ’ 可 以 作 旦 所 有 三 种 类 型 染色 体 具 有 很 大 同 源 性 的 结论 。 当 三 叶 草 根瘤 菌 和 跪 豆 根瘤 菌 ， 菜 豆 根瘤 菌 和 了 吏 豆 根瘤 菌 结合 时 ， 也 曾 探 讨 了 重组 体 对 寄主 植物 专 一 标志 的 遗传 性 。 在 所 有 情 沈 下 ， 重 组 体 承 末了 突变 种 结 会 体 的 特性 〈 这 些 资 料 与 上 述 根瘤 菌 中 寄主 特性 标志 受 质 粒 控 WWE) ”在 讨论 已 有 工作 结果 时 ， 作 者 指出 了 豌豆 根瘤 菌 、 三 叶 草 根瘤 菌 和 菜豆 根瘤 苗 染 色 体 遗传 同 源 的 发 现 ， 从 根瘤 菌 派 生 突变 体 的 遗传 结构 组 成 观点 来 说 是 重要 的 。 这 里 指 的 是 ， 上 述 三 种 类 型 豆 科 植物 的 最 重要 标志 中 优良 的 遗传 势能 〈 竞 争 能 力 。 固 氮 水 平 、 对 外 界 作用 的 硬性 等 等 ) 可 能 会 集中 到 同一 个 基因 中 去 。 还 有 一 种 关于 在 根瘤 菌 种 问 结合 中 丙 豆 根瘤 菌 和 三 时 章 根瘤 菌 遗 传 材料 间 能 实现 重组 作 用 的 工作 。 结 合 是 用 R68.45 质 粒 实现 的 ， 并 且 在 两 个 方向 内 进行 。 发 现在 豌豆 根瘤 菌 (R68.45) 和 间 蒂 根 癌 菌 重组 体 〈 按 rif 和 istr 基 因 选 择 ) 结合 时 ， 在 顺序 上 发 生 的 频率 比 在 葛 豆 很 瘤 菌 突变 体 之 间 结 合 的 低 。 此 外 ， 还 观察 到 ， 供 体 的 选择 性 标志 在 重组 体 中 表达 能 ， 在 R6s8.45 质 粒 中 则 人 缺乏。 间 攻 根 瘤 菌 (了 R68.45) 和 了 豌豆 根瘤 菌 重组 体 〈 用 对 抗菌 素 稳 定 标志 和 无 机 营养 型 进行 选择 的 ) 的 反 向 结合 时 ， 发 生 的 频率 还 要 低 〈10"s* 一 10*) 。 但 是 ,它们 都 是 R+ 表 现 型 (R68.45 质 粒 决定 因素 的 存在 ) 。 在 受 体 的 某 些 标 志 情 况 下 《〈 如 trp19) ， 现 到 纯 系 重组 体 的 缓慢 生长 ， 这 暗示 划 藉 根瘤 菌 的 各 个 基因 在 跪 豆 根瘤 菌 细胞 中 表现 弱 ， 重 组 体 中 见 到 的 基因 物质 不 完全 表达 ， 说 明 间 天 根 瘤 葛 和 了 豌豆 根瘤 菌 中 缺少 相当 的 遗传 染色 体 。 显 然 ， 这 是 重组 体 中 出 现 低频 率 的 根本 原因 。 种 间 杂 交 时 ， 低 频率 的 重组 作用 能 导致 不 具有 R' 一 因子 细胞 转化 结合 体 的 后 代 增 多 了 EKA RecA Sk, EBL fil 5 F/ 选择 机 制 关 系 相 近 。 实 际 上 ， 当 以 R 一 leg (在 与 背 蒋 根瘤 菌 R68.45 杂 交 时 选择 的 ) 转化 结 合体 一 ade27+，Fhef+ 和 trp16+ 进 行 检验 时 ， 显 示 其 中 大 部 分 是 有 首 莲 根瘤 茵 染色体 参与 的 和 不 带 有 R -一 派生 的 R68.45。 获 得 的 R/ 部 分 很 稳定 ， 并 且 以 高 频率 0%) 转 给 分 布 在 其 中 和 相应 的 亦 豆 根瘤 菌 突变 体 杂 交 时 的 无 机 营养 型 的 决定 体 上 (erepwaaam) 。 类 似 的 R68.45 质 粒 R' 在 号 豆 根瘤 菌 突变 体 之 问 杂 交 获 得 的 重组 体 ， 纯 系 检验 时 也 能 分 离 出 来 。 后 一 情况 的 复杂 泪 只 在 极 困难 的 条 件 下 发 生 ， 因 为 R“ 一 纯 系 在 全 部 重组 体 中 不 到 1%%。 根瘤 菌 中 R' 的 分 离 ， 给 根瘤 菌 遗 传 分 析 ， 即 显 性 和 互补 突变 的 快速 图 谱 试 验 、 各 种 类 型 染色 体 园 源 性 研究 以 及 其 它 系 统 根 瘤 基 因 表 达 试 验 等 等 开辟 了 极 大 的 可 能 性 。 此 种 情况 可 能 对 根瘤 菌 和 植 物 共 生 基 因 的 研究 是 有 益 的 。 曾 表明 ， 当 研究 获得 根瘤 菌 trp 一 基因 的 R' 的 可 能 狂 上 时 ， 采 用 了 不 具有 各 种 彰 蘑 根瘤 菌 trp 一 基因 的 R68.45 质 粒 R'。R'“ 最 初 是 在 各 种 琉 豆 根瘤 茵 trp 突变 体 中 表达 的 ， 并 且 确 定 了 trp 一 基因 的 互补 等 位 基因 。 最 后 是 在 钢 绿 色 极 毛 杆菌 的 trp 一 突变 体 生 化 特性 方面 完成 的 。 萌 薪 根 瘤 菌 trp 一 基因 在 铜绿 色 极 毛 杆 其 细胞 条 件 下 正常 地 表达 出 来 。 相 应 地 也 成 功 地 查 明 trp 一 基因 是 如 何 具体 分 布 在 R'“ 一 质粒 中 的 ， 并 且 对 豌豆 根瘤 苗 的 基因 作 了 测定 。 在 已 列举 的 工作 中 也 曾 指出 ,正常 情况 下 萌 落 根瘤 菌 的 trp 一 基因 在 大 肠 杆 菌 中 是 不 表达 的 。 根瘤 菌 的 特异 性 突变 体 “ 记 今 为 止 ， 在 根瘤 菌 中 分 离 出 营养 缺陷 型 和 抗 药性 突变 体 的 局 时 ， 世 兽 分 出 一 批 具 有 固氮 作用 、 结 合 态 所 代谢 以 及 感染 过 程 缺陷 的 突变 体 。 对 类 似 的 罕 变 体 的 分 离 和 研究 是 难以 作出 过 高 估价 的 。 第 一 最 重要 的 是 研究 和 确定 根瘤 菌 标志 在 寄主 上 的 最 快速 方法 。 第 二 ， 进 行 这 类 突变 体 的 遗传 学 分 析 时 ， 必 须 为 创造 其 它 有 希望 的 根瘤 菌 突变 体 建 立 解决 基因 工程 具体 任务 的 条 件 。 在 Brill (美国 ) 实验 室 中 ， 曾 经 进行 分 离 大 量 根瘤 菌 共 生 国 氨 突 变 体 缺陷 型 前 专门 工 作 。 在 这 项 工作 中 ， 利 用 亚 硝 基 版 获得 近 2500 个 大 豆 根瘤 菌 61A76 的 纯 系 。 普 在 大 豆 共 生体 © 42 中 进行 过 检验 ， 并 且 找 到 5 个 与 建立 共生 无 效 的 菌 系 (SMi—5) 。 突 变 体 的 表现 型 有 下 列 几 种 ，SMI1I 和 SMs? 一 nod” (ZED LAIR) 、SMs:、SM4 和 SMs 一 nod eff 《活性 为 专 的 根瘤 ) 。 同 时 ，SMs 和 SM4 导 致 小 而 圆 的 根瘤 形成 ， 和 SMs 突 变 体 情况 一 样 ， 根 瘤 的 大 小 一 般 ， 色 淡 。SM4SM 突 变 体 纯 培 养 中 诱导 固氮 酶 活性 中 具有 nif RAR, SMi. SM2. SM; _ 和 野生 型 菌 一 样 地 进行 诱导 。SMs 突 变 体 叙 述 得 比较 详细 些 。 此 种 突变 体 的 根瘤 抽 提 物 在 加 和 棕色 固氮 菌 固 氨 酶 复合 体 蛋白 时 ， 能 饮 复 nif 活 性 ， 同 时 和 肺炎 克 氏 杆菌 固氮 酶 复合 体 蛋 白 发 生 专 性 的 抗 血清 沉淀 。 在 上 述 结 果 基 础 上 ， 作 出 了 SMs 突 变 体 是 真正 的 nif 突变 体 和 在 国 氮 酶 复合 体 蛋白 的 结构 基因 中 有 人 缺失 的 结论 。 必 须 指出 ，SMEs 在 文献 中 是 唯一 已 知 的 nif 突变 体 ， 不 仅 在 大 豆 根 瘤 中 如 此 ， 一 般 根瘤 菌 也 都 是 这 样 。 在 同一 实验 中 ， 运 用 快速 技术 分 析 与 植物 建立 共生 体 的 细菌 ， 并 着 手 寻找 提高 共生 能 力 的 大 豆 根瘤 菌 突变 体 。 运 用 硝 基 肌 使 细菌 发 生 突变 ， 在 一 些 最 低 量 营养 元 素 组 成 的 培养 基 中 进行 培养 ， 并 在 琼脂 培养 基 中 筛选 。 对 培养 成 的 纯 系 检验 它 和 大 豆 共 生 的 共生 特性 .在 2500 企 检验 的 纯 系 中 , 找到 2 个 分 离 物 (标志 如 SM31 和 SM35), 它们 比 原来 的 大 豆 根 辣 菌 品系 具有 BR 高 的 共生 固氮 水 平 〈 单 位 植物 重量 的 乙 抉 还 原 ) 。 当 在 温室 条 件 下 检验 时 ， 根 据 统计 数据 证 实 ，SM31 和 SM35 品 系 的 某 些 指标 如 每 株 植物 的 根瘤 数 、 植 物 干 重 、 结 合 态 所 〈 总 数 和 单位 mara) 均 有 增加 ， 并 超过 原来 的 野生 型 菌 种 。 无 论 是 遗传 方面 也 好 ， 还 是 生化 方面 也 好 ，SM31 和 SM35 都 设 有 表征 。 但 是 ， 由 于 突变 种 固氮 水 平 比 对 照 高 ， 在 培养 基 中 加 入 馆 盐 的 条 件 下 可 以 见 到 固氮 酶 活性 为 去 阻 遇 型 。 不 和 久 前 ， 利 用 专门 加 有 指示 剂 的 培养 基 ， GX 种 培养 基 在 还 原 势 能 变化 时 突变 种 纯 系 着 色 有 差异 ) ， 从 棕色 固氮 菌 中 分 离 到 此 种 表现 型 的 在 专门 的 工作 中 ， 曾 经 分 离 出 豌豆 根瘤 菌 的 无 效 突 变 体 。 作 者 分 析 2 个 nod 和 10 个 nod*eff 突变 体 。 在 后 一 类 突变 体 中 有 4 个 对 温度 敏感， 在 13C 下 为 eff 表 型 ，26D 下 为 eff 一 表 型 。 在 三 叶 草 根瘤 菌 中 找到 了 获得 nod 突变 体 的 有 效 方法 。 当 细菌 在 温度 提高 的 条 件 下 培养 时 ， 此 种 突变 体 便 积 累 起 来 ， 以 致 失去 分 子 量 为 190 x 10“ 的 质粒 。 应 该 指出 ， 丧 失 共 生 特 性 的 根瘤 菌 突变 体 ， 在 营养 突变 和 耐 抗生素 的 突变 体 中 早 被 人 们 知道 了 。 但 是 有 关 这 方面 的 介绍 是 零星 的 ， 并 且 常 常 是 彼此 矛盾 的 。 对 各 种 总 豆 根瘤 菌 突 变 体 共 生 特 性 的 研究 表明 ， 在 分 析 的 16 个 不 同 营养 突变 体 (ade ，met :，trp ，ura ，cys ， Leu, ily, phe, gua, arg, glu, rib» his, liv, phe +tyr ) 中 只 有 ade 一 突变 AaB Anod ， 其 余 的 是 nodreff* 。 表 现 型 nodt+eff* 也 有 7 种 而 抗生素 突变 体 : rif. str. clmn、nem、Vim、d 一 cls、spckm。 虽 然 在 抗 利 福 替 素 的 突变 体 “为 总 数 的 10%) 中 ， 也 曾 发 现 过 具有 nod'eff 表现 型 的 纯 系 。 按 共生 特性 来 说 ， 在 非 直接 的 突变 体 中 可 以 见 到 失去 正 常 分 滥 高 糖 能 力 的 区 豆 根 瘤 菌 的 突变 体 。 这 种 突变 体 不 能 接种 到 寄主 植物 聋 豆 上 去 ， 从 其 中 得 到 的 回复 体 ， 它 在 有 具 有 分 泌 多 糖 作 用 的 还 原 特 性 同时 ， 也 能 恢复 nod+ 一 表现 型 。 众所周知 ， 在 自生 固氮 生物 固氮 作用 中 ， 氨 同化 的 途径 是 通过 谷 酰胺 合成 酶 (GS) 和 ARR BE (GOGAT) 进行 的 ，GS 本 身 虽 然 是 作为 nif 基因 转录 作用 的 活化 剂 而 起 作 用 的 。 研 究 老 们 有 兴趣 的 是 ， 从 根瘤 菌 中 分 离 出 GS- 和 GOGAT 突变 体 是 可 以 理解 的 。GS- 突 变 体 〈gin 5 谷 酰胺 营养 缺陷 型 ) 曾 从 豌豆 根瘤 菌 32HL 突变 体 中 分 离 出 来 。 这 个 突变 体 引 起 寄主 植物 上 形成 根瘤 ， 但 此 根瘤 没有 固氮 活 性 。gln 5 突变 体 可 能 易于 得 到 嗜 谷 所 酰胺 的 Sf GK AL x 10“) ， 根 据 其 共生 特性 ， 此 类 回复 体 分 成 nodtett+ Ail nodreff 两 种 。 # 43 。 GS- 突 恋 体 〈Db5, 具 低 活性 的 GS) 在 彰 蒂 根瘤 菌 中 分 离 出 来 ， 这 种 突变 体 不 合成 同化 型 的 稍 酸 还 原 酶 ， 它 和 前 体 lgn 一 5 vem tk -#; piven: 。 所 有 这 HES RA A A A GS 起 关键 作用 的 推测 相符 合 。 在 最 近 的 一 些 工作 中 ， 也 分 离 出 GOGAT 突 变 体 〈 属 于 谷 氨 酸 表 现 型 G41) 。G41 突 变 体 在 纯 堵 养 中 有 正常 的 Gs 水 平 CA A PTCA FE) > 按 其 共生 特性 和 其 原来 的 野生 型 没有 区 别 。 不 寻常 的 是 ， 这 种 突变 体 与 肺炎 克 氏 杆菌 的 GOGAT(CASM ) 突变 体 不 同 。 它 不 能 利用 铵 作为 氮 源 ， 和 肺炎 克 氏 杆菌 的 GOGAT 一 GD 再 突变 体 酷 似 。 G41 突变 体 中 获得 的 结果 ， 可 以 麦 示 根瘤 菌 所 代谢 调节 的 本 质 ， 也 证 实 了 关于 根瘤 细胞 里 GS/ GOGAT 系 统 在 根瘤 所 固定 氮 的 转化 中 不 是 必需 的 观点 。 硝酸 还 原 酶 突变 体 是 另 一 类 直接 和 所 代谢 及 固 气 有关 的 根瘤 菌 突变 体 。 这 项 工作 做 得 最 出 色 的 是 匈牙利 的 学 者 。 他 们 曾经 分 离 出 25 种 不 能 代谢 硝酸 盐 的 萌 项 根瘤 菌 突变 体 ， 并 对 其 进行 了 遗传 学 和 生物 化 学 的 研究 。 突 变 体 画 人 了 首 蒋 根瘤 的 narA、narB、mnarC 和 TarD4 个 不 同位 点 的 染色 体 图 谱 中 。narA 突 变 体形 失 同 化 功能 。narB 则 趟 失 硝 酸 还 原 酶 的 同化 A St 化 功能 ，narC 和 marD 具 有 硝酸 还 原 酶 缺陷 型 的 钼 辅 因子 。 所 有 的 突变 体 接 种 到 彰 落 引导 即 具有 正常 的 硝酸 还 原 酶 活性 。 后 一 情况 和 硝酸 还 原 酶 及 因 氨 酶 的 町 辅 因子 的 说 法 契 了 矛盾 硝 酸 还 原 酶 突变 体 〈 根 据 它 对 氢 酸 盐 抗 性 进行 选择 ) 也 从 大 豆 妓 癌 苗 中 分 离 出 来 局 经 用 植物 检 验 表 明 ， 缺 少 硝酸 还 原 酶 的 同化 和 异化 功能 的 突变 体 具 有 高 的 共生 固 气 作 用 特性 。 对 遗传 工程 的 看 法 BIS ”现代 化 的 农业 生产 ， 如果 没 有 足够 量 的 结合 坊 气 供给 农 作 牺 是 不 可 想像 的 。 由 于 这 个 原因 ， 在 发 达 国 家 中 ， 都 建立 了 强大 的 生产 数 以 10 亿 吨 计 的 合成 气 肥 的 化 学 工业 这 需 要 消耗 占 整 个 人 类 不 少 于 1;6% 的 能 量 。 随 着 生物 固氮 作用 的 剧烈 增长 5 气 素 肥料 的 利用 可 缩减 到 最 小 量 。 众 所 周知 ， 生 物 固氮 中 需 利 用 太阳 作为 能 源 ， 这 种 能 源 可 以 充分 保证 植物 国 氮 时 的 销 耗 。 后 一 任务 的 完成 也 并 非 简 单 ， 但 是 很 明显 ， 人 类 近 几 十 年 内 是 需要 完成 的 ， 看 来 也 是 可 以 解决 的 。 很 自然 ， 对 此 需 x NEI), EMRE MEE LI FA, - 1977 48 fe AE FAG he (Brook Hecwen) MARGE LRARAME. FER 告 者 指出 这 样 的 事实 ， 即 希望 创立 增加 生物 固氮 的 有 效 途 径 ， 要 达到 这 一 点 ， 可 以 认为 具有 靠 遗 传 学 和 遗传 工程 来 完成 。 (Valenitine，1979) ， 与 会 者 一 到 选 定 根瘤 苗 为 最 有 前 最 的 对 象 。 对 当前 以 眼 癌 菌 作为 提高 生 由 因 气 作用 的 设想 中 | erereanente ee 论 ，1 。 根 瘤 菌 寄 主 的 扩大 (Valentine, 1978), 2, TR OX SE (Ander- pee 1980) 。 rast Sik 第 一 方面 作为 最 终 目的 ， 在 于 探 未 建立 能 和 非 豆 和 植物 进行 FAS Ho RETA ASHE. 很 自然 ， 根 瘤 菌 和 禾 本 科 植 物 建 立 共生 国 气 结 合体 是 最 吸引 大 的 方面 。 这 二 目的 有 很 有 和 体 的 先决 条 件 ， 这 就 是 自然 界 自 己 已 经 作出 了 根瘤 菌 和 广大 的 寄主 共生 的 先例 。 例 如 , BRA 根瘤 菌 突变 体能 和 豆 科 植物 而 豆 一 样 有 效 地 接种 到 非 豆 科 植物 山 架 黄 上 去 (Trinick; 1973), 在 后 一 情况 下 ， 根 瘤 不 含有 豆 科 植物 结合 体 所 有 的 豆 血 红 和 蛋白 的 特性 。 但 尽管 如 此 ， 这 种 周 气 作 用 进行 的 很 顺利 〈Trinick，Galbraith，1976) 二 根瘤 菌 与 广泛 的 寄主 共生 这 一 任务 解决 的 第 一 步 ， 是 需要 对 根瘤 菌 和 豆 科 植物 的 塌 生 关 系 作 这 入 而 又 全 面 的 研究 。 其 中 的 关键 ， 看 来 应 该 对 控制 寄主 专 一 性 标志 的 根瘤 菌 质粒 进行 e446 | | 研究 〈 见 根瘤 菌 质粒 部 分 ) 。 这 些 研 究 必 然 要 引入 DNA 重 组 技术 ， 这 样 才 能 详细 地 分 析 制 约 寄主 专 一 性 标志 的 DNA 质 粒 的 具体 连续 性 。 为 获得 这 一 结果 ， 就 需要 对 在 建立 具有 符合 人 们 意 想 的 特性 的 杂交 质粒 所 要 求 的 条 件 进 行 研究 。 制约 双子 叶 植 物 细胞 肿瘤 再 生 的 农 癌 杆 菌 DNATi 质粒 连续 性 实验 ， 很 显然 是 创建 根瘤 ” 基 和 非 豆 科 植 物 共 生 固 氮 体 的 方面 之 一 (Wilmitzer 等 ，1980)。 看 来 在 根 癌 菌 DNA 质 粒 中 应 该 建立 这 样 的 连续 性 〈 在 变化 了 的 种 型 中 最 快 ) 。 : 根瘤 菌 有 效 突变 体 的 建立 ， 可 能 用 某 些 相互 补充 的 途径 达到 。 按 照 我 们 的 意见 ， 途 径 之 一 是 和 根瘤 菌 细胞 结构 基因 操纵 技术 有 联系 。 例 如 ， 所 有 根瘤 菌 会 和 各 种 噬菌体 发 生 溶 源 性 (Mockanenxo, 1979) ， 因 而 噬菌体 未 必 能 促进 根瘤 菌 有 益 特 性 的 出 现 。 在 这 种 情 襄 下 ， 某 些 不 需要 的 根瘤 菌 质粒 可 能 会 出 现 。 在 设计 与 增加 nift 一 基因 工作 效率 有 联系 的 工业 化 生产 根瘤 菌 突变 体 中 ， 这 种 构思 是 十 分 显而易见 的 ， 这 中 间 可 能 有 许多 实验 要 黎 ， 也 像 寻找 DNAnif 基 因 调 节 连 续 性 变化 一样， 从 整个 细菌 基因 一 方 去 进行 探讨 nit 一 基因 遗传 控制 变化 之 类 的 工作 。 在 这 类 研究 中 ， 基 因 工程 方法 的 应 用 ， 在 很 大 程度 上 为 根瘤 菌 基 因 位 于 质粒 上 的 这 一 情况 所 简化 了 〈 见 上 ) ， 但 是 实际 上 关于 根瘤 菌 nit 一 基因 表达 的 调节 ， 人 们 尚 一 无 所 知 。: 因 此 ， 在 这 种 情况 下 ， 基 因 工程 技术 完全 应 该 先 于 相应 的 遗传 学 和 生化 学 的 研究 。 这 方面 的 工作 现在 正在 许多 实验 室 里 进行 ( 见 根 瘤 菌 专 二 性 突变 体 一 节 ,以 及 Lim 等 1979 年 关于 利用 细 胞 内 "GM 和 *PAMP 调节 固 RBA RAVE) 。 在 获取 高 效 根瘤 菌 突 变 体 中 还 有 另 一 类 设想 ， 这 就 是 hup 一 基因 RALA) 的 转移 (Lim. 1980) 。 在 因 所 过 程 中 根瘤 茵 每 固定 1 分 子 气 ， 需 要 相当 于 27 一 31 分 子 ATE 的 能 量 〈Lim 等 ,1980)。 这 种 能 量 的 大 部 分 (到 40% ) 消耗 于 固氮 酶 催化 放 和 所 (Schubert, Evans,1976)。 然 而 根瘤 著 中 具有 接受 氢 的 氢 梅 ,此 酶 能 回收 固 氨 酶 放出 气 ， 因 而 大 量 的 节省 能 量 。 这 首先 可 以 和 某 些 大 豆 根瘤 菌 突变 体 ( 吸 氮 ， 或 hup+ 一 突变 体 ) 有 关系 。 在 根瘤 菌 中 :这 种 突变 体 具有 十 分 有 效 的 再 利 困 氢 的 酶 系统 〈Lim 等 ,1978)。 大 部 分 根瘤 菌 〈 其 中 包 猛 大 豆 根瘤 菌 突变 体 ) 是 haup- (缺少 利用 氢 的 氨 酶 ) 。 从 大 部 分 快 生 型 中 ， 只 有 某 些 艾 豆 衫 癌 万 突变 体 haup+ 活 性 小 (Ruiz-Aregueso 等 ，1978) » MHABRRE MTD BIE 性 最 弱 “〈 为 大 豆 根瘤 菌 hup+ 的 0.1%) (Arsgueso 等 ，1979) 。 比较 5 个 hup+ 和 5 个 hup- 大 豆 根 宫 菌 突变 体 对 大豆 产 量 影响 的 直接 实验 表明 ， 靠 hup+ 圣 降 ， 其 指标 的 超越 是 这 祥 的 : 植物 干 重 为 15.7% ， 单 位 植 旷 干 重 中 氨 的 百分率 为 10.3%， 信 所 为 26.2% (Albrecht 等 ,1979)。 看 来 大 豆 根 癌 菌 hup+ 突 变 体 将 是 最 时 的 hup+ 基 因 来 源 。 同上 时， 文献 中 还 讨论 了 关于 从 利用 氢 的 真 养 产 碱 菌 苇 人 根瘤 菌 hup+ 特 性 细胞 的 问题 (Lim , 1980) , ! hup 基 因 的 转移 很 显然 是 根瘤 菌 遗 传 工程 中 景 近 而 又 是 直接 的 任务 之 一 。 这 方面 工作 现 在 许多 实验 室 中 刚刚 开始 。 不 久 将 首先 会 有 关于 大 豆 根瘤 菌 基 因 库 方面 的 报道 (Lim 等 ， 1979a) 。 BRCHR) “Uzs. AHCCCP Cep. Buoa. ” 6: 805—823, 1981, 陈 Ai 豆 科 植 物 的 识别 机 理 及 感染 过 程 工 .V.Bhuvaneswati 根瘤 菌 属 的 细菌 能 在 一 些 经 济 上 重要 的 豆 科 作物 上 形成 国 所 根瘤。 这 些 共生 体系 存在 的 生物 学 特性 ， 为 根瘤 菌 属 划分 成 亚 类 提供 了 基础 。 可 以 相信 ， 这 种 特性 在 豆 科 植物 和 根瘤 菌 相互 作用 的 初期 就 确立 了 (Li and Hubbell, 1969; Yao and Vincent, 1969; Dazzo， 1980as; Schmidt，1979) 。 豆 科 植 物 〈 寄 主 ) 和 根瘤 菌 〈 共 生生 物 ) 之 间 一 些 种 类 的 识别 过 程 常 常 作为 解释 生物 学 特性 的 分 子 基础 。 关 于 这 个 问题 的 有 关 报 道 已 经 在 几 篇 评论 中 详细 地 讨论 过 了 (Broughton, 1978; Dazzo,1979,1980b; Beringer et al,, 1979; Schmidt, 1979; Solheim and Paxton; 1980 ; Smittle » 1979; Graham, 1980 ; Vincent, 1967; 1980) 。 本 文 简要 地 概述 了 豆 科 植物 和 根瘤 菌 系 统 识 别 机 理 方面 现 有 的 研究 假设 ， 并 详细 讨 论 了 本 实验 室 新 近 所 作 的 一 些 研究 ， 这 些 研 究 探讨 了 一 些 普通 豆 科 植物 寄主 被 感染 的 前 期 过 程 。 TI .过 去 的 研究 和 现在 的 解释 一 、 外 源 疑 集 素 是 高 等 植物 和 微生物 之 间 相 互 识 别 的 媒介 微生物 和 高 等 植物 之 间 的 相互 识别 ， 可 以 认为 是 细胞 间 识 别 的 特殊 情况 。 它 也 许 被 看 作 细胞 与 细胞 间 的 交往 ， 这 种 交往 在 植物 和 微生物 中 引起 了 一 定 的 生化 、 生 理 和 形态 学 反应 (Callow, 1977; Clarke and Knox, 1978; Bauer and Bhuvaneswari 1979) 。 少 数 已 详细 研究 过 的 范例 ， 如 酵母 菌 的 有 性 接合 方式 CYen and Ballou, 1974; Ballou, 1977) 、 粘 菌 种 间 的 特异 凝聚 及 分 化 作用 (Rosen et al.，1975) 、 以 及 被 子 植物 花粉 和 柱头 间 的 相互 作用 等 (Mattsson et al.，:1974; Knox et al.，1976) 都 表明 细胞 间 的 识别 受 这 些 细胞 表面 的 糖 类 物质 和 和 蛋白质 分 子 之 间 的 特异 结合 作用 所 调节 。Aibersheim #il Anderson- Prouty (1975) 曾 提 出 过 一 种 相似 的 机 制 ， 这 个 机 制 包括 高 等 植物 对 病原 体 和 共生 微生物 的 识别 ， 及 一 类 称 为 外 源 凝 集 素 的 植物 蛋白 质 。 这 个 见解 近年 来 已 引起 普遍 的 注意 〈Raa et al, » 1977; Callow, 1977; Sequeira, 1978; Bauer and Bhuvaneswari, 1979; Dazzo, 1980a,b) 。 AL DR Sb RE ES GI, 〈Albersheim and Anderson-Prouty;: 1975; Bauer et a!,> 1977; Sequeira, 1978) ， 存 在 于 又 寄主 细胞 上 的 外 源 凝 集 素 分子 和 存在 于 微生物 细胞 表面 . 上 与 之 互补 的 糖 类 分 子 相 结合 ， 从 而 引起 寄主 内 一 些 特定 的 反应 。 这 些 反应 可 导致 寄主 排斥 . 或 接受 微生物 。 在 豆 科 植物 和 根瘤 菌 系统 中 ， 这 些 反 应 则 能 以 某 种 方式 促使 根瘤 菌 开 始 感染 豆 科 植物 寄主 (Bauer and Bhuvaneswari, 1979) 。 在 植物 和 病原 菌 系统 中 ， 这 些 反 应 又 能 诱导 植物 的 抗御 反应 以 排斥 致 病 微生物 的 感染 (Albersheim and Anderson-Prouty, 1975; Sequeira，1978) 。 es 46 。 支持 高 等 植物 对 根瘤 菌 及 其 他 微生物 的 识别 牵涉 到 外 源 凝 集 素 的 理由 如 下 : (1) 在 各 种 类 群 中 的 许 许 多 多 植物 种 中 都 发 现 有 外 源 凝 集 素 ， 豆 科 植 物种 子 是 外 源 凝 集 素 特别 丰富 的 来 源 (Boyd et al,,1961; Allen and Brilliantine,1969; Toms and Wes- tern, 1971; Lee et al,,1977) 。 但 对 它 在 体内 的 功能 了 解 甚 少 。 (2) 外 源 凝 集 素 是 蛋白 质 / 糖 蛋白 分 子 ， 它 能 识别 复杂 的 糖 类 结构 。 有 关 这 一 分 子 的 很 多 生化 特性 读者 可 参考 以 下 这 些 文献 : Sharon 和 Lis，19728 Lis 和 Sharon, 1973; Liener， 1976; 以 及 Sharon，1977。 《3 ) 微生物 和 植物 细胞 表面 由 极为 复杂 的 糖 类 物质 组 成 ， 如 莱 膜 及 外 多 糖 、 脂 多 糖 、 磷 壁 酸 和 细胞 壁 多 聚 糖 。 这 种 复杂 的 不 同 结构 显 然 是 合理 的 。 《4) 有 些 很 好 的 证 据 ， 特 别 在 粘 苗 中， 表明 外 庆 凝 集 素 影响 到 细胞 间 特 异 的 粘 合作 用 并 引导 细胞 的 分 化 CRay et al. » 1979; Town and Stanford, 1979) 。 二 、 豆 科 植 物 和 根瘤 菌 系 统 的 识别 机 理 Hamblin 和 Kent (1973) 曾 报 道 云 扁豆 (Phaseolus uvulogaris) 的 外 源 凝 集 素 可 能 将 菜豆 MIB CR. phaseoli) 细胞 结合 在 根 上 上 适宜 发 生 感 染 的 部 位 。Bohlool Schmidt (1974) 曾 提出 寄主 外 源 凝 集 素 对 感染 性 根瘤 菌 表 面 的 结合 作用 ， 也 许可 作为 寄主 和 共生 生物 相互 影响 中 特异 的 决定 因素 。Dazzo 和 他 的 合作 者 (Dazzo and Hubbell, 1975a,b; Dazzo and Brill, 1977 ) 曾 提 员 过 一 个 外 源 凝 集 素 交叉 结合 模式 ,用 来 阐述 白 三 叶 草 (Triyfoliunz repens) A= RIB CR. trifoliit) 共生 系统 中 的 寄主 特性 。 根 据 这 个 最 近 的 模式 ， 三 叶 草 根部 和 三 叶 草根 瘤 菌 细胞 上 存在 着 表面 抗原 、 它 与 三 叶 草 根 的 抗 血清 交叉 反应 。 这 些 作 者 指出 ， 存在 于 寄主 和 细菌 细 驳 表面 的 那些 交叉 反应 所 共有 的 抗原 决定 徐 ， 对 于 三 叶 草 根瘤 菌 和 三 叶 草根 三 者 间 具 有 免疫 化 学 的 独特 性 。 依 照 这 个 假设 ， 为 根瘤 菌 所 识别 的 、 存 在 于 三 叶 草根 表 的 三 叶 草 外 源 凝 集 素 ， 与 存在 于 寄主 和 细 蓝 细胞 去 面 上 有 具有 免疫 化 学 独特 的 糖 类 受 体 结合 ， ， 其 结果 使 细菌 对 三 叶 草 根 毛 专 性 地 附着 (Dazzo and Hubbell, 1975a, bs; Dazzo，1980a) 。 Soheim (1975) 针对 三 叶 草 根瘤 菌 和 白 三 叶 章 根 部 的 结合 作用 提出 过 一 个 近似 的 模 式 。 在 这 个 模式 中 ， 寄 主根 分 泌 出 一 种 高 分 子 量 的 “因子 ”到 根 际 并 结合 于 根瘤 菌 的 表面 ， 然后 细菌 才能 够 结合 根 毛 表面 的 一 个 受 体 。 Bauer 和 BEBhuvaneswari (1979) 提出 了 另 一 种 根瘤 菌 识别 状况 的 模式 ， 认 为 寄主 外 源 凝 集 素 和 共生 生物 表面 特有 受 体 的 相互 作用 ， 可 以 作为 寄主 和 共生 生物 进一步 反应 的 触发 剂 ， 从 而 导致 了 成 功 地 感染 。 这 些 不 同 模式 间 的 相同 点 和 不 同 点 是 值得 提出 的 。 在 识别 过 程 中 ， 所 有 这 些 模式 基本 上 都 牵涉 到 植物 外 源 凝集 素 和 根瘤 菌 表面 糖 类 物质 。 由 Dazzo 和 Hubbell (1975a,b) 及 Dazzo SE C1976) 提出 的 模式 所 涉及 到 的 外 源 凝 集 素 仅仅 是 存在 于 细菌 细胞 对 根 毛 的 物理 结合 作用 ”中 。 外 源 凝 集 素 被 认为 能 和 存在 于 植 愧 和 细菌 细胞 表面 ， 在 免疫 学 上 相似 的 受 体 相 结合 。 尽 管 这 个 见解 由 amblin 和 Kent (1973) ，Bohlool 和 Schmidt (1976) ， 以 及 So:hesim(1975) 相继 提出 ， 而 且 都 牵涉 到 促使 细菌 与 根部 结合 的 外 源 凝 集 素 ， 但 这 些 模式 仍 不 能 肯定 外 源 凝 集 素 的 糖 类 受 体 是 存在 于 植物 和 根瘤 菌 细 跑 二 者 表面 上 的 。 外 源 凝 集 素 作为 豆 科 植物 寄主 和 根瘤 菌 相 互 识 别 的 媒介 这 一 概念 ， 由 Soiheim (1975), Bauer 等 (1977) 提出 讨论 后 ，Bauer 和 Bhuvaneswari (1979) 以 及 Schmidt (1979) 又 提出 了 感染 过 程 的 开始 是 成 功 识 别 的 结果 。 依 照 这 些 模式 ， 不 有 具备 “合适 的 ”外 源 凝集 素 受 体 分 子 的 根瘤 菌 ， 不 能 被 寄主 成 功 地 识别 ， 因 此 对 豆 科 植物 寄主 的 感染 和 结 瘤 都 归于 失败 。 但 无 e 7 。 论 如 何 , 这 并 不 意味 着 凡是 具备 合适 外 源 凝 集 素 受 体 的 根瘤 菌 世 株 都 能 被 识别 ,并 在 寄主 上 结 瘤 。 正 如 Bhuvaneswari 和 Bauer (1978) 以 及 Schmidt (1979) 所 指出 的 ， 细 菌 要 成 功 地 进 入 寄主 根 组 织 还 需要 有 一 些 其 他 过 程 。 寄 主 和 共生 生物 的 感染 作用 能 被 这 些 过 程 中 任何 一 个 所 阻碍 ， 甚 至 在 成 功 地 进行 了 最 初 的 识别 后 也 如 此 。 于 是 ， 外 源 凝 集 素 作为 识别 的 媒介 这 一 概念 ,在 寄主 结 瘤 特性 方面 只 能 被 部 分 地 承认 。 另 一 方面 ，Dazzo 和 Hubbell (1975a,b) 提出 一 个 模式 ， 他 们 不 认为 外 源 凝 集 素 成 功 地 作为 识别 媒介 有 任何 直接 结果 。 按 照 这 个 模式 ， 细 菌 在 根 表 面 的 结合 作用 取决 于 识别 本 身 。 所 以 具有 具备 感染 能 力 的 三 叶 草 根瘤 菌 菌株 才能 与 三 叶 草 根 毛 结合 ， 这 种 选择 结合 作用 都 归 根 于 识别 (Dazzo et al. » 1976; Dazzo， 1980b) 。 评价 这 些 外 源 凝集 素 识别 假 说 ， 能 够 得 到 的 实验 证 据 可 概括 为 以 下 几 点 ; (1) 不 同根 瘤 菌 种 结合 不 同 豆 科 植物 寄主 ， 外 源 凝 集 素 的 能 力 与 它们 在 豆 科 寄主 上 结 瘤 的 能 力 之 间 的 生物 学 有 具 相 关 性 。 《2 ) 根瘤 菌 细 胞 对 豆 科 植物 根 毛 的 吸附 作用 的 研究 。 (3) 不 同根 瘤 菌 细胞 表面 外 源 凝 集 素 结合 的 受 体 分 子 的 分 离 、 提 纯 和 鉴定 。 C4) 在 豆 科 植物 和 根瘤 菌 相 互 作 用 中 根瘤 菌 细胞 表面 多 糖 的 证 明 。 《5 ) 外 源 凝 集 素 在 根部 的 位 置 。 三 、 主 要 研究 内 容 (一 ) 生 物 学 相关 性 的 研究 ”Bohlool 和 Schmidt (1974) 首先 证 明了 不 同根 瘤 菌 葛 株 对 于 已 部 分 提纯 、 用 荧光 素 异 硫 氟 酸 酯 CITC) 标记 的 大 豆 种 子 外 源 凝 集 素 的 结合 能力， 和 它们 在 大 豆 〈G1ycine mex) 上 的 结 瘤 能 力 有 着 不 容 忽 视 的 生物 学 相关 性 。 在 我 们 实验 室 里 〈Bhuvaneswati et al。，1977， 利 用 大 豆 根 瘤 菌 CR. japonicum) 的 22 个 菌株 帮 根 瘤 菌 属 的 其 他 几 个 菌株 ， 已 经 证 实 了 这 些 结 果 。Dazzo 和 Hubbell (1975a) 以 及 Dazzo 等 (1978) 报道 ， 三 叶 草根 瘤 菌 不 同感 染 性 菌株 对 白 三 叶 草 种 子 外 源 凝 集 素 的 结合 能 力 ， 它 们 在 栽培 的 白 三 叶 草 上 的 结 瘤 能 力 之 间 有 着 极 好 的 相关 性 。 另 一 方面 ，Dazzo Ail Hubbell (1975c)、Brtethauer 和 Paxton (1977) 、Chen 和 ?Phillips〈1976)、Law 和 Strijdom (1977) 等 ,没有 发 现在 不 同根 瘤 菌 菌株 对 其 他 几 种 豆 科 植物 寄主 外 源 凝 集 素 的 结合 作用 , 和 它们 在 这 些 植物 上 的 结 瘤 能 力 之 间 ， 在 在 着 任何 生物 学 上 有 意义 的 相关 性 。 评定 以 上 提 到 的 一 些 负 结 果 是 困难 的 。 我 们 研究 了 大 豆 种 子 外 源 凝集 素 和 大 豆 根瘤 菌 拖 个 菌株 的 结合 作用 ， 结 果 表 明 ， 外 源 凝 集 素 和 细菌 细胞 某 些 成 分 的 结合 作用 是 暂时 的 ， 并 且 依赖 于 培 养 的 条 件 (Buhvaneswari et al, » 1977; Bhuvaneswari and Bauer, 1973). 大 多 数 大 豆 根瘤 菌 菌 株 只 能 在 生长 的 忽 期 或 对 数 生 长 期 的 中 期 ， 与 大 豆 种 子 外 源 凝 集 素 相 结 合 ， 而 在 稳定 生长 期 的 前 期 和 后 期 ， 均 不 能 与 可 测 出 量 的 外 源 凝 集 素 结合 。 已 有 报道 ， 三 叶 草根 瘤 菌 (Dazzo et al。，1979) 和 从 花生 (Arachis hypogaea) 中 分 离 得 到 的 一 个 要 总 菌 菌 株 ， 随 着 培养 时 间 增加 ， 与 外 源 凝 集 素 的 结合 特性 也 有 类 似 的 变化 (Bhagwat and Tho- mas，1980) 。 在 根 际 和 根 表 培养 条 件 下 ， 对 不 同 大 豆 根瘤 菌 菌 株 与 外 派 凝 集 素 的 结合 特 性 研究 的 结果 表明 ， 即使 用 高 度 加 富 的 实验 室 培养 基 培 养 时 ， 生 长 在 根 区 内 的 所 有 了 菇 个 具有 外 源 凝集 素 受 体 的 大 豆 根瘤 菌 供 试 菌株 ， 在 生长 周期 的 每 个 阶段 都 有 一 些 世 株 检测 不 出 结合 - 的 、 欧 光 素 异 硫 氰 酸 酯 标记 的 大 豆 种 子 外 源 BEE SS (SBL) (Bhuvaneswari and Bauer， 1978) 。 这 些 表 面 受 体 瞬 变 和 可 诱导 的 特性 ， 从 一 些 不 十 分 令 人 信和 上 服 的 相关 研究 中 得 到 了 反 面 证 明 。 © 48 e “eee 外 源 凝 集 素 结合 能 力 和 结 癌 能 力 之 间 良 好 的 正 相关 性 ， 可 以 作为 可 能 有 外 源 浅 集 素 参与 的 间接 证 据 ， 但 缺乏 良好 的 相关 性 则 不 能 穆 为 否定 分 源 演 集 素 参与 最 初 相 互 作 用 的 证 据 。 (二 ) 根瘤 菌 细胞 对 豆 科 植 电 纺 毛 汲 附 作用 的 研究 Hamblin 和 Kent (1973) 曾 指出， BAB OS WEES REAPS USHA SMBS. Mia» RSet RR Tob . RERAE ABA WU ER A ig Bi ZEAE PA Re RPRERD REPRE. Dazzo 等 (1976) Ha FEA a Se ee RA AS ED RE SB Ta ES IS 能 力 之 间 ， 有 着 良好 的 相关 性 。 不 能 在 白 三 叶 草 上 结 瘤 的 根瘤 菌 ， 也 就 不 能 在 三 叶 草根 上 有 相当 数量 的 吸附 。 另 外 ，PDazzo 和 Brill (1977) 以 及 Dazzo 等 〈1976) 报道 了 三 时 草 根瘤 菌 的 葵 膜 多 糖 与 根 的 结合 作用 针 细 菌 对 根 的 吸附 作 用 能 为 2 -脱氧 葡萄糖 这 种 三 叶 草 外 源 凝 集 eH HCS SAIS. Bishop“ (1977) 及 Pazzo 和 Brill (1979) 指出 ， 当 把 三 叶 草 根瘤 菌 的 ISS (nif) 用 和 遗传 学 方法 转移 到 棕色 固氮 菌 (4zotfobacfer vinelandii) nif 〈 豆 科 植 物 的 非 共生 生物 ) 中 时 ， 有 13 欠 的 棕色 固氮 菌 mi 全 转化 剂 能 与 三 叶 草 外 源 凝 集 素 结合 。 这 些 转化 剂 和 非 转 化 剂 相 比 ， 能 大 量 粘 附 在 白 三 叶 草 根 毛 上 。 Chen#iPhiilips (1976) 报道 了 在 他 们 测试 的 , 包 播 三叶草 根瘤 划 的 所 有 根瘤 菌 中 ， 与 跪 B (Pisum sativum) AAMC AA. Broughton“ (1980) 研究 了 结合 于 强 豆 根 ASEAN, HRC RE DIR a CR. leguminosarum) ， 发 现 结 瘤 和 不 结 瘤 的 丙 株 都 有 可 佰 测 的 数目 结合 于 吾 豆 根 上 。 Bohlool 和 Schmidt (1976) 观察 到 大 豆 根瘤 菌 对 基质 表现 出 仅 性 连接 。Saplman 和 Fah- raeus (1963) 及 Dazzo 等 (1976) 也 观察 到 三 叶 草根 瘤 菌 和 白 三 叶 草 根 毛 吸附 时 也 有 相似 的 极 性 连接 。Bohlooi 和 Schmidt (1976) 提出 存在 于 大 豆 根 瘤 菌 一 些 苗 袜 上 的 这 种 极 性 体能 参 与 结合 作用 。 近 来 ，Shantharam 等 1980) 又 指出 ， 用 铁 鹏 标记 的 大 豆 种 子 外 源 凝 集 素 ， 能 和 天 豆 根 瘤 菌 61A76 菌 株 的 极 性 体 结 合 。 认为 根瘤 菌 与 寄主 根 细胞 的 结合 作用 ， 为 寄主 和 共生 生物 之 间 相 互 作用 的 必要 步骤 是 符 合 逻 辑 的 。 细 菌 对 很 毛 的 附着 对 识别 现象 ， 或 确定 生物 学 特性 上 的 意义 还 没有 什么 资料 。 在 三 叶 草 和 三 叶 草 根瘤 菌 共 生 系统 中 ， 假 定 的 识别 机 理 是 根据 根瘤 菌 对 三 时 草根 选择 性 结合 而 来 的 。 在 这 一 点 上 ，PDazzo 和 Hubbell (1975a,b) 的 模式 与 他 们 的 结果 是 一 致 的 。 必 须 解释 的 是 ， 不 能 结 瘤 的 根瘤 菌 与 三 叶 草 根 毛 的 结合 作用 。 不 能 结 瘤 的 很 瘤 菌 菌株 的 结合 作用 ， 在 性 质 上 显然 与 能 结 瘤 的 三 叶 草 根瘤 菌 是 不 同 的 ， 因 为 它 不 以 三 叶 草 外 源 凝 焦 素 作为 媒介 ， 也 不 被 2 -脱氧 葡萄 糖 所 阻 抑 。 实 验证 据 表明 ， 对 于 三 叶 草 和 三 叶 章 殷 瘤 菌 系统 ， 三 叶 草 外 源 凝集 素 音 独 帮 为 结合 作用 的 媒介 在 生物 学 上 是 重要 的 ， 或 者 说 其 构成 与 识别 是 相关 的 ， 而 且 是 最 间接 的 ， 由 它 造 成 的 识别 无 论 如 何 都 具有 相关 性 (Dazzo 和 Brill, 1977, 1979; Dazzo et al。，1978; Dazzo, 1980b) 。 假 如 我 们 知道 外 源 凝 集 素 为 什么 或 怎样 作为 明 fit 作用 的 媒 介 那 是 重要 的 ， 并 且 知 道 不 以 外 源 北 集 素 作为 结合 作用 的 媒介 是 与 之 不 同 的 ， 那 末 我 们 将 从 较 好 的 见解 中 弄 清 最 初 相互 作用 时 ， 根 瘤 菌 与 三 叶 草根 毛 选择 结合 作用 的 意义 。 在 另 一 些 豆 科 植 物 和 根瘤 菌 系统 研究 中 ， 至 今 只 有 少量 证 据 表 明 ， 根 癌 菌 对 寡 主 根 毛 的 明 附 作 用 是 定量 或 定性 选择 ， 因 而 可 导致 对 根瘤 菌 的 鉴别 。 (三 ) 外 源 凝 集 素 结合 的 不 同根 瘤 菌 受 体 分 子 的 分 离 、 提 纯 和 鉴定 Dazzo 和 Bril (1977) 利用 免疫 化 学 技术 描述 了 三 叶 草 外 源 凝 集 素 与 三 叶 草 根瘤 菌 英 哎 多 糖 物质 的 结合 作 FA. Woipert#flAibersheim (1976) 以 及 KambersgeTr (1979a,b) 也 报道 了 不 同根 癌 菌 种 的 脂 多 糖 (LPS) 与 其 各 自 豆 科 植 物 寄 主 外 源 凝集 素 的 结合 作用 。Bhagwat 和 Thomas (1980) 还 49。 报道 了 根瘤 菌 的 英 异 和 脂 多 糖 对 花生 外 源 凝 集 素 的 结合 作用 。 ae GAG Swe BESS A Hy Ae AS ead A MVE i EE SE IC Bal et al, »1978; Calvert et al, »1978; Tsien 和 Schmidt, i977). Mert 和 Bauer (1980) 发 现 ， 在 大 豆 根 瘤 菌 3Ilb 138 随 着 培养 物 从 早期 至 对 数 生 长 期 晚期 逐 渐 A. TB EME AY 细胞 百 分 这 减 少 约 50%， 并 且 ， 大 豆 根瘤 菌 3Ilb 138 和 110 了 菌株 随 着 培养 时 间 的 BS on, se He 多 糖 的 组 成 和 结构 也 改变 了 。 对 大 豆 根瘤 菌 3I11b 138 和 110 菌 株 不 同 培养 时 期 莱 膜 多 糖 组 成 和 结构 的 分 析 表 明 , 这 个 分 子 由 重复 的 成 糖 单元 组 成 ,并 含有 一 个 半 乳 糖 醛 酸 、 两 个 葡萄 糖 、 一 个 甘露 烙 和 一 个 半 乳 糖 残 基 。 另 外 ， 在 每 个 成 糖 单元 上 有 两 个 乙酸 基 〈Mort 和 Bauer ， 在 编写 中 ) 。 在 3Ilb 138 培 养 的 稳定 期 〈 非 外 源 凝 集 素 结合 期 ) ， 其 莱 膜 多 糖 约 有 75 MASEL 糖 残 基 的 第 四 个 碳 原子 被 申 基 化 了 〈4-0- 甲 基 半 乳糖 ) 。 在 生长 的 早期 或 对 数 生 长 期 中 期 〈 外 源 凝 集 素 结合 期 ) ， 其 培养 物 的 攻 膜 多 糖 仅 有 50%% 的 半 乳 糖 残 基 被 甲 基 结 合 。 这 样 ， 半 乳 糖 残 基 在 成 糖 单元 上 的 状态 看 来 就 决定 了 这 个 分 子 外 源 凝 集 素 的 结合 特性 。 三 叶 章 根瘤 菌 莱 膜 多 糖 与 白 三 叶 草 外 源 凝集 素 结合 作用 的 生物 化 学 基础 尚未 完全 和 弄 清 。 按照 Dazzo 和 Brill (1977) 的 见解 ， 三 叶 草 外 源 凝集 素 和 三 叶 草根 瘤 菌 荚 膜 多 糖 物质 的 结合 作用 ， 以 及 三 叶 草 根瘤 菌 英 膜 物质 对 三 叶 草 根 毛 尖端 的 结合 作用 ， 均 能 被 2 -脱氧 葡萄 稿 所 抑制 。Dazzo 和 Hubbell (1975b) 报道 了 对 这 种 莱 膜 抗原 物质 的 分 析 ， 指 作 2 -脱氧 葡萄 糖 可 以 作为 鞭 蜡 多 糖 的 一 个 组 分 。 然 而 Jansson 等 〈1979) 在 三 叶 草 根瘤 菌 黄 膜 多 糖 里 没有 检测 出 任何 2 -脱氧 葡萄 糖 残 基 。 在 Jansson 等 〈1979) 的 报道 中 ， 和 其 他 对 根瘤 菌 芙 膜 和 外 多 糖 的 结构 研究 中 ， 确 实 从 相对 老 的 培养 物 的 分 析 中 获得 了 胞 外 多 聚 糖 物质 。 三 叶 草 根瘤 菌 和 其 他 根瘤 菌 培养 物 是 否 也 像 大 豆 根瘤 菌 3Ilb 138 和 110 菌 株 那 样 , 芙 膜 和 外 多 糖 的 结 枯 和 组 成 随 培 养 时 间 增 加 而 发 生变 化 ， 了 解 这 一 点 是 重要 的 。 Planque 和 Kijne (1977) 报道 了 豌豆 外 源 凝 集 素 和 由 吏 豆 共生 生物 玉 豆 根瘤 菌 合 成 的 葡 聚 糖分 子 的 结合 作用 。 在 一 定 的 培养 条 件 下 ， 另 一 些 根瘤 菌 能 合成 B- 1 4 HE EM B-1,2 4) 32 HF (Dudman 1978, Zevenhuizen 和 Scholten-Koerselman ; 1979; Napoli 和 Al- bersheim, 1980; Mort 和 Bauer, HR) 。 (0) 豆 科 植物 和 根瘤 菌 的 相互 作用 中 所 牵涉 到 根瘤 菌 细 胞 表面 物质 的 证 明 早期 的 工 作者 研究 了 在 寄主 和 共生 生物 相互 作用 中 根瘤 菌 细胞 表面 多 糖 可 能 是 重要 的 (Lijunggren 和 Fahraeus , 1959; Hubbell, 1970; Solheim 和 Raa, 1973; Yao 和 Vincent 1976;. Dazzo 和 Brill, 1977) . Ex, Sanders“ (1978) LA & Napoli ffl Albersheim (1980) 从 ye ANF EEE E OPA LEA. WALE T Oe SEA A) & OE AY HH BE PE. Sanders 等 (1978) FH, BED HUIS AM AFA REA KET AD ABH, WBA GE EE Sk 瘤 。Napoli 和 Albsrsheim (1980) 发 展 了 Sanders 等 〈(1978) 这 个 最 初 的 见解 ， 分 离 册 二 类 豌豆 根瘤 菌 新 突变 种 ， 它 们 只 能 形成 少量 的 胞 外 多 糖 ， 并 具有 一 层 环绕 着 细菌 细胞 ， 且 性 质 不 同 的 尧 膜 。 这 些 突变 种 能 在 豆 科 植物 寄主 上 结 瘤 。 他 们 的 数据 表明 ， 在 培养 物 中 随 着 有 莱 膜 细胞 数目 的 减少 ， 感 染 的 效率 也 会 相应 降低 。 他 们 还 记录 了 外 多 糖 合 成 量 和 结 瘤 效 率 之 间 的 相互 关系 (Napoli 和 Aibersheim，1980) 。 这 些 突 APPR HEA ERS Hi 物 上 结 瘤 的 原因 ， 是 由 于 感染 过 程 的 前 期 步骤 受阻 。 另 外 ，Kamberger (1979b) HR. Bi 根瘤 菌 的 脂 多 糖 和 外 多 糖 在 决定 哆 豆 和 了 豌豆 根瘤 菌 共生 系统 结 瘤 特 性 方面 是 重要 的 。 Bal 等 〈《1978) Rid, RAW RRMA DACA OR RADA. TERE De ee 上 。 我 们 实验 室 的 研究 表明 ， 一 些 无 莱 膜 的 大 豆 根 瘤 菌 3Ilb 138 菌 株 ， 在 培养 过 程 中 能 够 产 so0。 生 一 种 可 溶性 外 多 糖 ， 它 在 组 成 上 相当 于 由 亲本 菌株 合成 的 芮 腊 多 糖 CY, Yamamoto, I, J。Law，A。J。Mcrt， 和 W. D. Bauer, HAH) 。 这 些 突 变种 和 共 本 菌株 一 样 FE 有 效 地 在 栽培 的 ^Wiliiams” 品 种 大 豆 上 结 瘤 。Maier 和 Brill (1978) 报道 了 两 种 不 能 结 瘤 的 大 豆 根 瘤 菌 61A76 突 变种 ， 它 们 缺乏 存在 于 野生 菌株 上 的 那 种 表面 抗原 。 作 者 指出 ， 这 些 表 . 面 抗 原 与 脂 多 糖 的 0 抗原 部 分 相连 。 然 而 ， 用 于 这 一 研究 的 脂 多 糖 制剂 的 性 质 和 纯度 没有 很 好 地 确定 。 ; DA EES fy —-22 WEEE HE TAS 2b ade EGR, «Be BASE ABE A Sp 5 PH ah FE EE 互 作 用 是 重要 的 。Napoli 和 Aibersheim (1980) 以 及 Drzzo 和 他 的 合作 者 的 研究 报告 指出 ， 黄 膜 外 多 糖 对 于 感染 作用 的 最 初 阶段 是 重要 的 。 进 一 步 的 试验 计划 揭示 它们 之 所 以 重要 的 根 由 ， 并 且 有 可 能 解答 这 样 一 个 问题 ， 即 它们 是 否 在 豆 科 植物 和 根瘤 菌 联 合 中 ， 其 识别 过 程 取 决 于 寄主 特性 。 然 而 ， 从 目前 得 到 的 证 据 中 ， 要 想 精确 地 估计 根瘤 菌 脂 多 糖 在 豆 科 植物 和 根 瘤 菌 相 互 关系 中 的 作用 是 不 可 能 的 。 用 充分 了 解 的 脂 多 糖 突 变 体 进一步 研究 ， 对 于 在 这 一 旦 要 方面 提供 更 多 的 信息 是 需要 的 。 (五 ) 外 源 凝 集 素 在 根部 的 位 置 ”如果 外 源 凝集 素 是 参与 了 根瘤 菌 的 识别 作用 ， 那 末 要 紧 的 是 了 解 感染 位 点 上 外 源 凝 集 素 的 存在 。Dazzo 等 (1978) 报道 了 与 根瘤 菌 结合 的 三 叶 章 外 源 凝 集 素 存 在 于 根 毛 尖端 〈 推 测 是 自 三 叶 草 的 感染 位 点 ) ， 用 2 -脱氧 葡萄 糖 洗 涤 根 部 能 把 这 种 外 源 凝 集 素 从 白 三 叶 草根 表 洗 脱 下 来 (Dazzo et al。，1978) 。 这 些 结果 与 外 源 凝 集 素 在 寄主 和 共生 生物 之 间 充 当 一 个 分 子 媒介 的 假 说 是 一 致 的 (Dazzo 和 Hubbell, 1975 a,b) 。Hamblin 和 Kent (1973) 指 出 ， 菜 豆 根瘤 菌 CR. phaseoli) 细胞 与 红血球 细胞 对 豆 类 根 的 结合 作用 ， 可 以 说 明 豆 类 外 源 凝集 素 存在 于 根 上 。Law 和 Strijidom (1977) 用 高 盐 洗 YE MLotononis painesii 根 提取 了 一 种 血红 凝集 素 的 外 源 凝 集 素 。 Bohlool 和 Schmidt (1974) 报道 了 大 豆 根 提取 物 中 血红 凝集 素 的 活性 。Pueppke 等 (1978) 研究 了 大 豆 种 子 外 源 凝集 素 在 大 豆 根 中 的 分 布 ， 指 出 直到 大 豆 朝 发 后 两 周 ， 仍 能 在 其 根部 检测 出 大 量 外 源 凝 集 素 的 存在 。Howard 等 (1972) 、Rouge (1975) 、Pueppke . (1979) 以 及 Solheim 和 Paxton (1980) 、Pull 等 〈1978) 报道 了 其 他 豆 科 植物 随 着 苗 龄 的 增加 ， 根 上 种 子 外 源 凝集 素 的 浓度 相应 地 降低 了 。 他 们 测试 了 多 种 大 豆 栽培 植物 种 子 外 源 凝 集 素 ， 指 出 被 测试 的 102 种 中 有 5 种 没有 种 子 外 源 凝 集 素 。Schmidt (1979) 报道 在 这 些 品 种 中 种 子 提取 物 的 血红 凝集 素 活性 很 弱 ， 但 这 可 能 是 由 于 种 子 中 含有 杂质 造成 的 。 本 实验 室 试图 确定 大 豆 根瘤 菌 细胞 结合 的 大 豆 种 子 外 源 凝 集 素 的 位 置 ， 在 大 豆 根 上 使 用 了 荧光 免疫 技 术 ， 但 迄今 未 获得 成功 (Bhuvaneswari 和 Bauer, HAH) 。Bowles 等 (1979) 报道 了 大 豆 和 花生 萌发 7 周 后 ， 在 其 根部 仍 存在 膜 结合 的 血红 凝集 素 的 外 源 凝集 素 。 然 而 ， 除 了 白 三 叶 草 的 这 种 情形 以 外 ， 根 瘤 菌 与 根 提取 物 、 或 整个 根 表 面 种 子 外 源 凝集 素 的 结合 ， 一 直 未 被 其 他 豆 科 植物 寄主 所 确证 。 由 于 我 们 不 能 确定 大 豆 根瘤 菌 在 大 豆 根 上 结合 外 源 凝 集 素 的 位 置 ， 所 以 对 此 只 能 作 几 种 可 能 的 解释 。 在 某 些 豆 科 植 物 寄 主 中 种 子 外 源 凝 集 素 可 能 不 存在 于 根部 ， 或 它 在 所 用 的 缓冲 液 中 已 变 成 不 能 被 提取 的 了 。 也 可 能 是 参与 根瘤 菌 识别 的 外 源 凝 集 素 不 同 于 存在 种 子 里 的 外 源 凝 集 素 。 假 若 我 们 设法 在 原 位 上 确定 根 上 的 根瘤 菌 识别 外 源 凝 集 素 ， 则 或 许 能 消除 这 种 不 可 靠 性 。 需 要 更 多 有 关 根 部 外 源 凝集 素 的 特性 、 分 布 情况 和 生化 性 状 ， 以 及 根 与 种 子 外 源 凝 集 素 之 间 的 关系 的 信息 ， 以 便 对 有 关 根 部 种 子 外 源 凝 集 素 的 位 置 作 一 精确 评 价 (Schmidt, 1979) 。 "5l。 IT 。 未 来 研究 重点 : 本 实验 室 新 近 的 工作 以 上 提 到 的 研究 ， 试 图 览 定 和 确定 参与 寄主 和 共生 生物 间 识 别 作用 的 分 子 的 位 置 。 从 这 些 研究 中 得 到 的 证 据 大 多 是 相关 的 和 根据 情况 推测 的 ， 因 而 是 间接 的 和 不 确实 的 。 假 车 我 们 知道 一 些 寄主 识别 最 初 的 生理 学 和 或) 形态 学 结果 ， 就 能 得 到 外 源 凝 集 素 或 其 他 任何 分 子 参与 寄主 和 共生 生物 识别 作用 的 直接 证 据 。 然 而 ， 这 些 在 豆 科 植物 和 根瘤 菌 系统 中 仍旧 是 未 知 的 。 本 车 详 细 描 述 了 我 们 为 得 到 这 一 资料 新 近 所 作 的 探索 。 根瘤 菌 感 染 温带 豆 科 植 物 寄主 要 在 根 毛 上 形成 侵 桨 线 。 有 些 证 据 表明 ， 寄 主 特性 在 侵 桨 线形 成 之 前 就 已 确定 〈Li 和 Hubbell, 1969; Yao 和 Vincent, 1969) 。 那 末 ， 推 测 某 些 季 类 的 识别 作用 在 侵 梁 线形 成 之 前 就 有 可 能 发 生 是 合理 的 。 遗 憾 的 是 ， 有 关 侵 染 线 形成 前 那 一 阶 眉 的 资料 太 少 了 。 这 儿 将 讨论 一 些 已 得 到 的 有 关 资 料 和 需要 解答 的 有 关 问 题 。 有 关 感 染 过 程 的 详细 叙述 和 报道 ， 读 者 一般 可 参考 Fihraeus 和 Lijunggren (1967) 、Ljuggnren (1969) 、Nutman (1970) 以 及 Dart (1974, 1977) 早期 的 文献 。 在 大 多 数 豆 科 植物 和 根瘤 菌 系统 中 ， 获 得 感染 的 根 毛 总 数 只 有 一 个 很 小 和 可 变 的 比例 。 侵 染 线 通 常 发 现在 弯曲 的 根 毛 上 ， 但 并 不 是 所 有 紧 曲 的 根 毛 都 具有 侵 桨 线 。 根 毛 的 基 些 卷曲 和 和 畴 变 可 由 根 将 菌 培 差 物 的 无 细胞 天 液 诱导 发 生 。 见 解 不 同 处 就 在 于 这 种 卷曲 是 侵 染 线形 成 之 前 成 为 感染 过 程 的 一 个 确定 步骤 ， 还 是 生物 学 上 特异 的 步 又 (Nutman，1959; Sahiman 和 Fahraeus, 1963; Hubbeli, 1970; Solheim 和 Raa,1973; Yao 和 Vincent,1976; Shi- makhanova, 1978) 。 我 们 需要 和 弄 清 有 关 识 别 机 理 的 一 些 尚 未 解决 的 问题 ， 这 些 问 题 包 i: 为 什么 只 有 那么 少 被 感染 的 根 毛 ? 已 经 被 感染 的 根 毛 有 何不 同 ? 感染 是 否 总 是 开始 在 根 毛 上 ? 识别 发 生 在 所 有 的 根 毛 上 还 是 仅 发 生 在 被 感染 的 根 毛 上 ? 实验 室 培 养 的 细菌 是 否 有 感 染 能 力 、 或 者 它们 在 发 生 任 何 相互 作用 前 对 寄主 根 环 境 是 否 适 应 ? 假若 它们 具有 适应 能 力 ， 是 否 包 括 新 细胞 表面 分 子 的 合成 ? 寄主 的 根 毛 是 否 都 是 可 感 当 的、 或 它们 必须 适应 于 细菌 的 存在 ? 假使 它们 能 适应 ， 又 是 如 何 参与 的 ? 总 之 ， 共 生 系 统 中 识别 的 基本 分 子 和 生理 结果 是 什么 ? 我 们 利用 大 豆 和 大 豆 根 瘤 菌 共 生 系 统 研究 了 感染 过 程 最 初 阶段 的 生理 学 ， 并 将 其 作为 长 期 探讨 的 目标 ， 弄 清楚 识别 作用 是 何 时 、 从 何 处 和 怎样 在 这 一 系统 中 发 生 的 。 以 下 是 我 们 详 细 的 结果 和 讨论 。 大 豆 根 瘤 菌 通过 根 毛 上 形成 的 侵 染 线 能 正 沼 地 进 豆 根 (Bieberdorf, 1932; Rao #l Keister, 1978; Newcomb et al, , 1979; Turgeon et al, , 1979), Ait, BHF 致 侵 染 线形 成 的 过 程 知 道 得 很 少 。 在 大 量 播 种 豆 科 植物 里 ， 研 究 这 些 最 初 过 程 的 一 个 重要 问 题 是 弄 清 何 时 ， 从 何 处 在 根 上 更 能 发 生 感 染 。 近 来 ， 我 们 应 用 所 发 展 的 测定 根 上 可 感染 部 位 的 技术 服 了 这 个 主要 困难 〈(Bkhuvaneswari et al。，1980) 。 大 豆 实生 苗 生 长 在 塑料 培育 袋 (Weaver 和 Frederick, 1972) 中 ， 以 便 观 察 根 的 发 育 并 在 接种 后 追踪 之 。 Ee ANT ABB 7k 2 TEARS LIRA (RT). RIDE BARE (SERH) RITA DOANE SAL, PRI EE HL A eA RE REAR BOL 9 FO 1。 用 活跃 生长 培养 物 制备 的 大 豆 根瘤 菌 悬 液 来 接种 这 些 植 物 ， 记 录 植 物 接 种 一 周 后 相对 于 接种 时 所 做 的 款 记 出 现 的 根瘤 。 52° RL 发育 REE RG ARE we 人 ,接种 后 的 根 旦 ,接种 5 天 后 的 根 . = Os wa eh se 4 0 ee 160 120. 380 40 MA 40 80 120. 160. BR: mm poe el LE EME US els A WE ES Me Es 20:16 12 ea a (Ae kar ke ree 图 1 |: 标记 时 的 大 豆 根 图 和 根瘤 位 置 的 确定 。 (A) 发 育 根 毛 区 和 接种 时 在 培育 袋 上 对 根 尖 和 最 小 突 发 根 毛 所 做 的 标记 QE. (B) 接种 一 局 后 相同 的 根 区 。 箭 头 标明 表皮 细胞 从 标记 时 的 根 (A) 到 记录 时 的 根 (CB) 相对 根 尖 和 最 小 罕 发 根 毛 标 记 的 移动 。 测 县 表皮 细胞 位 置 的 变化 ， 如 Bhuvaneswari 等 (1980) 所 述 。 四 个 单独 试验 平均 的 结果 综合 为 一 株 “ 典 型 ”植物 ， 其 根 尖 到 最 小 突 发 根 毛 相距 14.6 毫 米 〈 见 图 2 ) 。 箭 头 所 示 的 距离 表明 表皮 细胞 特异 的 最 初 位 置 被 移动 得 相 当 远 (Bhuvanéswari et al. , 1980) 。 2: 结 瘤 效 率 剖 面 图 .测量 150 株 实生 苗 初 生根 上 全 部 根瘤 相对 于 根 尖 标 记 的 位 置 . 计 算 初 生根 上 每 个 根瘤 到 根 尖 标记 的 相对 距离 ， 作 为 给 定植 物 根 尖 到 最 小 突 发 根 毛 距 离 的 百分数 。150 株 实生 苗 中 的 120 株 〈80 和 多 ) 能 在 窟 尖 标 记 上 面 产 生根 瘤 。 这 些 植 株 根 尖 到 最 小 突 发 根 毛 之 间 的 平均 距离 是 14.6 毫 米 土 5.0 毫 米 〈 标 准 偏差 ) ， 范 围 是 3.0 一 25.5 毫 米 (Bhuva- neswari et al, , 1930). 实际 上 所 有 植株 在 接种 时 间 都 能 在 非 根 毛 区 (NRH 区 ) 的 初生 根 上 产生 根瘤 。 有 趣 的 是 ， 没有 一 株 植物 在 成 熟 根 毛 区 CMRH 区 ) 产生 根瘤 。 但 在 接种 期 间 ， 那 儿 有 十 分 发 达 的 根 毛 出 现 〈 表 1 ) 。 接 种 期 间 ， 在 具有 短 的 产生 根 毛 的 部 位 (DRH 区 ) ， 有 0 一 20% 的 接种 村 物 能 产生 根瘤 《〈 表 1 ) 。 接 种 方法 或 所 用 的 大 豆 栽培 品种 都 不 能 有 效 地 改变 这 种 状况 。 试 验 确定 在 未 来 的 根 区 有 大 豆 生 长 极 需 的 高 的 结 瘤 效 率 〈Bhuvaneswari et al。，1980)( 图 1 下 )。 这 清楚 地 表明 ， 在 任何 给 定 的 时 间 ， 大 豆 根 上 仅 有 一 个 窄带 细胞 的 感染 能 导致 产生 根瘤 。 这 种 可 谈 感 染 的 细胞 带 ， 位 于 活性 根 伸 长 区 和 突 发 根 毛 区 之 间 。 假 若 用 大 豆 根瘤 菌 接种 ， 这 些 区 域 能 不 断 产生 根瘤 。 使 用 这 个 技术 可 以 研究 感 当 最初 阶段 和 结 瘤 开 始 的 情况 ， 并 在 可 见 的 根瘤 出 现 之 前 追踪 其 在 关键 时 刻 的 长 大 情况 。 应 用 这 个 方法 接种 ， 并 用 光学 显微镜 研究 早期 感染 过 程 (Turgeon et al。，1979) , 仅 在 短 曲 根 毛 上 发 现 约 长 10 一 30 微 米 的 侵 桨 线 。 这 些 根 毛 的 卷曲 大 约 发 生 在 接种 12 小 时 后 。 时 期 侵 桨 线 的 形成 大 约 在 接种 24 小 时 后 。 侵 染 线 到 达 根 毛 基部 大 约 在 接种 48 小 时 后 。 这 时 ， 在 侵 染 线 罕 行 过 程 中 ， A NEA Beles (Turgeon et al, » 1979) , | 253 e 表 1 ” 豆 科 植物 的 结 瘤 状 况 FEE HE Yy 植物 结 瘤 百 分 率 移 & 寄 主 (根瘤 菌 菌株 ) 非 根 毛 区 产 根 毛 区 成 熟 根 毛 区 大 豆 “Williams" 品 种 大 豆 根 瘤 菌 3I1b 138 83 11 0 R. japonicum GL “California Blackeye" 品 种 ”根瘤 菌 32H1 100 0 0 Rhizobium sp. Be “Moapa’ ht _ 萌 蒂 根瘤 菌 102 F711 90 52 25 R.meliloti , 白 三 叶 草 “Regal Ladino" At 三 叶 草 根瘤 菌 TA1 100 97 110 R.trifolii a. 表示 指定 区 域 结 瘤 植物 相对 于 根 尖 上 面 结 瘤 植物 总 数 的 百分比 。 只 是 严格 地 在 细 驳 窄带 上 感染 导致 根瘤 形成 的 这 一 事实 ， 意 味 着 可 感染 性 仅 为 根 细胞 的 一 种 用 时 特性 ， 这 一 点 已 被 延迟 接种 研究 所 验证 。 感 染 的 根 区 RARE) 按 前 述 方法 标 、 记 ， 并 在 标记 后 的 不 同时 间 给 标记 区 接种 ， 结 果 表 明 〈 图 2 左 )， 特 定 区 域 的 可 感染 性 确实 是 极为 盟 时 的 。 可 感染 的 非 根 毛 区 随 着 它 的 成 熟 而 成 为 不 可 感染 的 ， 并 变 成 发 育 根 毛 区 (图 1 上 ) 。 有 三 个 参量 能 用 来 证 实感 染 部 位 的 朋 时 特性 , 即 非 根 毛 区 根瘤 形成 的 数量 , 所 有 接种 植物 在 非 根 毛 区 结 瘤 植物 所 占 的 比例 ， 标 记 期 间 初生 根 根 尖 与 最 上 面 形 成 的 根瘤 之 间 的 距离 《标记 时 进行 根 尖 标 记 ) 。 正 象 所 期 望 的 ， 所 有 三 个 参量 都 随 着 标记 和 接种 之 间 时 间 间 隔 的 增加 而 减少 。 感 染 区 的 最 上 部 分 的 感染 性 在 2 小 时 内 丧失 。 在 这 些 条 件 下 ， 非 根 毛 区 感染 性 并 失 的 速率 与 根 的 生长 速率 〈2.4 土 0.6 毫 米 /小 时 ) 大 致 相对 应 。 假 如 我 们 考虑 到 这 三 个 参 量 ， 并 将 图 3 中 的 曲线 外 推 至 0 ， 则 可 感染 的 非 根 毛 区 变 成 完全 不 可 感染 的 须 花 约 4 一 5 小 时 。 由 此 可 见 ， 感 染 导致 在 非 根 毛 区 形成 根瘤 是 在 此 区 变 成 不 可 感染 的 以 前 ， 即 接种 后 的 4 一 5 小 时 以 内 。 当 接种 剂 中 细菌 细胞 能 在 一 个 有 意义 的 范围 内 增殖 前 ， 能 导致 根瘤 形成 的 感 染 作用 的 某 些 早期 过 程 就 可 能 已 经 开始 了 “〈 用 于 此 研究 的 大 豆 根瘤 菌 菌 株 在 本 实验 室 培养 条 件 下 的 世代 时 间 是 8 小 时 ) 。 改变 搂 种 剂 中 细菌 细胞 数量 对 结 瘤 多 少 的 影响 ， 已 被 研究 以 证 实 这 一 可 能 性 。 将 工 毫升 接种 剂 悬 液 稀释 到 含 1 x10* 至 1 x10* 细 胞 /毫升 ， 并 接种 到 植物 的 不 同 部 位 。 一 周 后 ， 记 录 在 接种 时 标记 的 殷 尖 以 上 出 现 的 根瘤 。 结 果 ( 图 2 右 ) 表明 ， 每 株 植物 根 尖 标 记 以 上 根瘤 形 成 的 数量 ， 以 及 在 标记 根 尖 以 上 结 瘤 的 植物 占 接 种 植物 总 数 的 比例 ， 与 接种 剂 细 菌 细胞 的 浓 度 呈 现 一 个 线性 和 对 数 关系 。 这 些 结果 进一步 说 明了 ， 大 豆 结 瘤 作用 最 少 需要 10 一 20 个 细菌 、 细胞 《图 2 右 )。 也 有 报道 ， 白 三 叶 章 结 瘤 最 少 需要 10 个 三 叶 章 根瘤 菌 细 胞 CPurchase 和 Nutman，1957) 。 接 种 剂 浓度 对 结 瘤 的 作用 的 全 部 意义 ， 在 这 里 是 不 清楚 的 。 对 所 观测 到 的 对 数 相关 性 的 一 种 可 能 的 解释 是 ， 在 根 毛细 胞 变 成 不 可 感染 的 以 前 ， 相 互 作 用 开始 时 可 能 需要 由 能 影响 寄主 反应 的 根瘤 菌 合成 最 低 限 量 的 一 些 物质 。 一 种 同样 合理 的 解释 是 ， 所 用 接 种 剂 中 每 10 个 细胞 中 仅 有 一 个 能 够 开始 感染 。 这 一 点 需要 用 进一步 的 试验 来 阐明 。 °54¢ EB (Medicago sativa) 和 开 豆 (Vigna sinensis) 中 ， 感 染 和 结 瘤 的 状况 FRE 很 相似 〈 表 1 ) 。 在 任何 给 定 的 时 间 内 ， 根 部 可 感染 的 细胞 被 限制 在 根 尖 以 上 一 个 狭 窗 的 区 域 肉 。 延 迟 接 种 试验 表明 ， 这 些 感染 部 位 的 存在 是 极为 瞬时 的 。 可 感染 部 位 的 背 失 率 与 开 豆 和 曹 蒂 根 的 生长 率 大 致 相对 应 。 我 们 用 萌 蒂 试验 的 结果 和 Pate 及 Dart (1959) Me Be WRK Ai fa (Medicago tribuloides) 感染 位 点 瞬时 的 存在 特性 是 一 致 的 。 ; Bienes... dip 标记 和 接种 之 间 的 间隔 时 间 〈 人 小 时 ) 每 株 植物 细胞 增加 的 对 数 图 2 A: 推迟 接种 对 根 尖 标 记 以 上 结 瘤 的 影响 。 每 批 根 尖 以 上 具有 根瘤 的 植物 百分数 (ED. Shy ti 以 上 的 根瘤 平均 数 〈 合 ) ， 最 上 面 的 根瘤 到 根 尖 标 记 的 平均 距离 , (和合 ) (Bhuvaneswari et al. ,1980) 。 A: 接种 量 对 根瘤 发 育 的 影响 。 记 录 结 瘤 以 确定 根 尖 标 记 以 上 具有 根瘤 的 植物 百分数 〈 圈 ) ， 每 株 植 物 根 尖 标 记 以 上 根瘤 的 平均 数 《 全 ) ， 最 上 面 的 初生 根 根瘤 到 根 尖 标记 的 平均 距离 (全 ) 。 纵 线 表示 标准 误差 (Bhuvaneswari et al, , 1980). : 另 一 方面 ， 白 三 叶 草 感染 的 状况 ( 表 1) ( Bhuvaneswari, T. V. , A, A, Bhagwat AW. D. Bauer, EHS) 看 起 来 与 大 豆 、 东 攻 或 开 豆 过 然 不 同 。 一 些 作者 用 白 =H 和 三 叶 草 根瘤 菌 系统 作为 模型 系统 来 研究 感染 过 程 ， 因 而 有 关 感 染 过 程 及 结 瘤 生 理 的 文 献 很 多 。 至 于 这 方面 资料 的 详细 报道 可 从 其 他 途径 得 到 (Dart, 1974; Nutman, 1949, 1959, 1962) ， 在 此 不 再 详细 地 加 以 讨论 。Nutman (1949, 1959) 和 Purchase 及 Nutman (1957) 报道 ， 自 三 叶 草 的 感染 作用 发 生 在 根部 不 连续 的 焦点 上 ， 然 后 从 这 些 原初 感染 点 沿 着 初生 根 扩散 。 我 们 进一步 观察 了 接种 后 整整 10 天 期 间 白 三 叶 草 感染 的 状况 。 由 活跃 生长 的 三 叶 章 根瘤 菌 TA1 菌 株 培养 物 制备 每 毫升 含有 108s 个 细胞 的 接种 剂 ， 在 种 有 5 一 8 株 植 物 的 袋 中 或 种 有 3 株 植 物 的 10 叶 平板 中 接种 1 毫升 。 和 先前 描述 过 的 大 豆 一 样 ， 接种 时 要 标记 根 尖 位 置 和 根 毛 区 。 对 接种 时 这 些 标 记 的 地 方 ， 可 在 接种 后 3 、5 、7 和 10 天 观察 到 根瘤 的 出 现 。 我 们 的 结果 表明 ， 接 种 3 天 后 便 能 在 根 尖 标 记 以 上 的 非 根 毛 区 观察 到 发 育 的 根瘤 。 假 车 在 接种 5 、 7 和 10 天 后 检测 同一 植物 ， 则 除了 那些 非 根 毛 区 发 育 的 根瘤 外 ， 有 具有 发 达 和 成 熟 根 毛 部 分 的 氏 生 根 上 也 观察 到 了 根瘤 。 然 而 在 成 熟 根 毛 区 出 现 的 根瘤 ， 较 之 出 现在 非 根 毛 区 的 根瘤 ， 看 起 来 好 像 发 育 期 要 早 一 些 。 要 是 不 常常 在 间 踊 时 间 内 观察 同一 植物 ， 其 根瘤 发 育 的 程序 便 容 另 遗 漏 。 我 们 观测 感染 和 结 瘤 的 状况 与 Nutman (1959) 的 结果 完全 相符 。 然 而 ， 我 们 提 出 了 一 个 修正 的 Nutman“ 焦 点 ”感染 理论 来 阅 明 我 们 的 结果 。 我 们 设想 ， 白 三 叶 草 感 染 的 发 e554 生 有 两 个 性 质 簿 同 的 相 ， 〈1 ) 迅速 开始 相 ， 正 像 描 述 的 其 他 豆 科 植物 和 根瘤 功 系 统一 样 ， 感染 发 生 在 非 眼 毛 区 和 发 达 根 毛 区 。 我 们 从 延迟 接种 试验 中 获得 的 数据 表明 ， 根 尖 标 记 以 上 那些 迅速 感染 的 部 位 仅 在 得 时 池内 保留 其 感染 性 。 此 区 感染 性 形 失 率 与 在 这 些 条 件 下 根 的 上 长 率 大 致 相对 应 。 这 种 迅速 感染 作用 与 Nutman 描 述 过 的 感染 焦点 相对 应 。 (2 ) KEIRA, 在 凡是 有 成 熟 〈 完 全 伸 长 的 ) 根 毛 的 地 方 随机 发 生 感 桨 。 我 们 推测 那些 在 成 熟 根 毛细 胞 的 侧 李 或 分 枝 上 发 生 延 迟 感 染 是 接种 的 结果 。 文 献 的 某 些 证 据 证 实 了 细 世 接 种 后 开始 的 白 三 叶 草 根 毛 分 枝 上 的 感染 作用 是 后 一 相 的 可 能 性 。Fahrasus (1957) 说 明 ， 在 分 又 的 根 毛 中 ， 侵 桨 线 通 常 是 从 分 枝 处 开始 的 。Nutman 〈1959) 则 认为 ， 4 尽管 文献 中 描述 根 毛 卷曲 顶端 的 感染 通常 比 描述 侧枝 的 感染 要 多 ， 但 后 者 是 较 为 常见 的 cnet » WEARERS RM IA. Kia, EViREMRAS Ee, Til it Fy Ae ESL PRA CEMA MADE) ， 而 开始 的 侧 部 感染 则 稳步 塔 加 ve one 直到 所 确定 的 限定 时 间 根 的 较 老 部 分 才 开 始 完全 抵制 感染 。 这 样 ， 按 照 我 们 的 解释 ， 在 接种 时 完全 分 化 的 根 毛 是 不 能 被 即 旭 感染 的 ， 但 是 当 新 的 分 枝 被 根瘤 菌 诱发 以 后 才能 成 为 可 感染 的 。 这 是 试验 时 测 得 的 。Yao 和 Vincent (1969, 1976) 以 及 Scipeim Al Raa (1973) 分 离 了 三 叶 草根 瘤 葛 无 细胞 滤液 中 的 根 毛 分 枝 因子 并 阐述 了 它 的 特性 。 有 一 些 可 信 的 证 据说 明 ， 分 枝 效 应 可 能 是 寄主 的 部 分 特性 。 根瘤 菌 进 入 到 花生 植株 里 去 的 机 理 不 完全 清楚 。 这 种 植物 仅 在 侧根 基部 具有 很 毛 ， 并 且 只 在 侧根 的 “ 腑 ”上 结 瘤 。 设 想 根瘤 菌 的 进入 是 通过 侧根 突出 体形 成 伤口 时 发 生 的 《〈Aiien， 1940) 。Chandler (1978) 提出 ， 根 瘤 菌 是 经 毛 和 表皮 细胞 的 连接 处 进入 花生 植株 的 。 我 们 初步 的 结果 表明 ， 假 如 接种 后 根 产 生 基 部 根 毛 ， 根 瘤 就 将 在 那些 已 经 穿 出 侧根 的 《 腋 ” 处 产生 。 在 花生 植株 中 ， 感 染 导致 出 现 根瘤 被 限制 在 很 小 的 根 区 里 ， 看 上 去 这 个 根 区 与 基部 根 毛 发 育 比 与 侧根 发 生 的 关系 更 为 紧密 。Chandler 报 道中 的 结果 提供 了 间接 的 证 据 ， 根瘤 菌 是 通过 根 毛 而 不 是 通过 侧根 突出 时 形成 的 伤口 进入 花生 植株 的 。 亚 。 概 述 和 结论 我 们 用 五 种 豆 科 植物 对 感染 的 部 位 、 感 染 过 程 的 生理 以 及 结 瘤 状 况 作 了 有 限 的 研究 ， 揭 示 了 一 些 共 同 的 特性 : 〈1)》 感染 过 程 导 致 根瘤 形成 被 限制 在 根 细胞 的 窄带 中 ，〈2 ) 在 这 些 成 熟 的 细胞 中 ， 感 染 性 的 发 生 是 瞬时 的 ， 并 迅速 地 丧失 ，“〈 3 ) 实验 室 培养 的 根瘤 菌 能 开 始 相互 作用 ， 并 存在 于 寄主 根 上 ， 但 不 会 大 量 生长 和 繁殖 ，〈4 ) 感染 导致 的 根瘤 产生 看 起 来 最 通常 发 生 在 根 毛 上 或 许 在 接种 后 分 化 根 毛 的 分 枝 上 。 有 证 据 表 明 ， 根 瘤 英 荧 腊 多糖 在 寄主 和 共生 生物 开始 感染 时 起 着 重要 的 作用 。 然 而 其 结 构 、 组 成 和 这 些 分 子 结合 寄主 外 源 凝 集 素 的 特性 ， 随 培养 物 的 老化 而 改变 。 假 如 在 识别 过 程 中 处 源 凝 集 素 结合 英 膜 多 糖 是 重要 的 ， 那 末 根 瘤 菌 只 能 在 其 生长 的 一 定 阶 段 被 识别 ， 寄 主根 毛细 胞 的 感染 乌 看 上 去 同 凡 可 在 发 育 时 被 调节 ， 此 后 这 些 细胞 有 一 个 瞬时 的 特性 ， 根 纪 胞 有 可 能 识别 合 革 的， 发育 至 一 定 阶段 的 根瘤 菌 。 这 样 ， 寄 主 和 细菌 细胞 间 相 互 识别 作用 有 可 能 被 严密 地 调节 ， 细 和 吃 的 动态 或 许 只 限制 在 它们 发 育 的 一 定 阶段 。 原 载 “Economic Botany” » 35 (2) ，1981，pp。204 一 223 ZRAR RBM 56 豆 科 植物 所 再 循环 的 现状 H.J.Evans 摘 要 本 文 简要 地 评述 了 以 下 几 方 面 的 一 些 近况 : (@) 豆 科 植 DHARMA 损失 程度 的 因 Hs (b) 参与 大 豆 根瘤 菌 类 菌 体 AAR 应 的 电子 载体 ; (c) 评价 气 再 循环 效益 方面 的 进 展 。 决 定 豆 科 根瘤 能 否 放 氨 的 主要 因素 是 活动 吸 氢 酶 的 存在 ， 这 种 酶 参与 作为 固 氨 反应 副 产 物 所 释放 之 所 的 氧化 作用 。Burris 教授 及 其 同事 曾经 指出 ， 固 氨 酶 反应 的 放 氨 程度 受 影响 固 氮 酶 周转 速率 的 那些 因素 所 左右 ， 这 些 因素 包括 三 磅 酸 腺 并 和 还 原 剂 的 供给 ， 固 氨 酶 铁 蛋白 与 钼 铁 蛋 白 组 份 的 比例 。 根 痪 菌 类 菌 体 中 ， 氢 的 氧化 作用 由 位 于 类 菌 体 膜 上 的 一 系列 酶 催化 而 产生 。 除 了 氢 酶 本 身 以 外 ， 已 经 查 明 参 与 此 过 程 的 载体 包括 b 型 和 c 型 细胞 色素 ， 可 能 还 有 泛 柄 。 我 们 总 括 起 来 的 证 据 表明 ， 固 氨 生 物体 中 氨 的 再 循环 会 带 来 生理 效益 ， 从 而 可 能 导致 豆 科 植物 产量 的 增加 。 比 较 Hup+ 和 Hup- 野 生 型 的 纯 菌 株 ，Hup+ 系 和 Hup- 系 的 菌 体 ， 以 及 不 可 回复 的 Eup- 突 变 棕 与 作为 豆 科 植物 的 接种 剂 Hup* 亲 本 株 相 比较 ， 得 到 的 结果 与 Hup+ 特 性 有 利于 豆 科 固氮 增加 的 论断 是 一 致 的 。 但 是 我 们 推断 ， 关 于 氢 再 循环 所 给 予 豆 科 植 物 直 接 效益 的 精确 评价 可 以 从 将 Hup+ 亲 本 株 、Hup- 回复 的 突变 株 ,. 以 及 从 Hup- 突 变 株 得 到 的 Eup+ 回复 子 菌株 作 豆 科 植 物 的 接种 剂 的 实验 作出 推断 。 这 些 类 型 的 大 豆 根瘤 菌 菌株 ， 已 经 被 发 现 。Hup+ 和 Hup 野生 型 菌株 质粒 的 一 些 方面 与 Hup 突 变 株 和 亲本 株 一 样 ， 已 经 进行 了 研 Fie wee 在 农业 上 种 植 豆 科 植物 以 改良 土壤 肥力 和 增加 作物 产量 已 经 实践 几 千 年 了 pw | 1932) . 最 近 几 年 的 现实 是 我 们 贮存 的 石油 燃料 有 限 ， 这 人 迫使 我 们 重新 考虑 进一步 利用 生物 固氮 的 可 能 性 ， 把 它 作 为 手段 ， 为 作物 生产 提供 氮 源 ， 同 时 减少 我 们 对 氮肥 的 依赖 ,因为 生产 氨 肥 要 消耗 石油 燃料 或 其 他 能 源 。 研究 者 已 注意 到 ， 结 瘤 的 豆 科 植物 固定 大 气 氨 时 所 需要 的 能 量 可 能 比 用 于 固定 气 素 所 必 需 的 能 量 要 大 ， 因此 Ryle 等 提出 若 大 量 地 利用 生物 固氮 可 能 影响 产量 (Ryle 等 ，1979) 。 不 管用 绷 气 或 气 化 合 物 在 豆 科 植物 生产 潜力 上 有 何 差 异 ， 能 利用 取 之 不 尽 的 太阳 能 作 生 物 固氮 的 能 源 则 有 明显 的 优越 性 。 植物 学 家 把 是 己 的 兴趣 集中 于 探讨 如 何 改 进 固 所 生物 利用 光合 产物 的 效率 上 。 由 于 所 有 往 : 也 up+:， shaft: Hup"; MAPA ilg 57 e 的 固氮 生物 都 放 气 ， 它 是 固氮 反 应 中 被 假定 浪费 掉 的 副 产 物 ， 所 以 许多 的 研究 工作 和 最 近 发 表 的 一 系列 评论 都 致力 于 氢 的 损失 ， 和 氢 酶 和 氢 的 再 循环 。 如 Dixon (1978) , Evans (1978, 1980a, 1980b, 1981) 对 豆 科 植物 根瘤 的 研究 Bothe 等 (1978) 、Bothe 和 Eisbrenne (1978, 1981) 对 蓝藻 的 研究 以 及 Waiker 和 Yates (1978) ， 及 Yates 等 〈1980) 对 固氮 菌 的 研究 。 因为 没有 必要 另外 作 一 个 全 面 的 综述 ， 我 们 打算 就 有 关 的 资料 ， 对 下 述 问题 的 一 些 新 进 展 概括 和 讨论 一 下 :， 即 我 们 对 影响 放 氢 因素 的 理解 ;我 们 对 氢 氧 化 过 程 的 最 近 认 识 ;， 以 及 对 豆 科 植物 氢 再 循环 效益 估计 的 一 些 问题 和 进展 。 bee: 二 、 氢 是 固氮 作用 的 副 产 物 尽管 Hoch (1956) 发 现 了 豆 科 植物 根瘤 放 气 ， 但 是 ， 直 到 Bulen (1965) 和 Bulen 与 Lecompte (1966) 指出 ， 固 氨 菌 无 细胞 制剂 的 固氮 Me 催化 ， 需 ATP 和 还 原 剂 的 反应 中 大 约 有 75%% 的 电子 传递 给 氛 气 ， 余 下 的 传递 给 质子 形成 氢气 的 开拓 性 工作 发 表 之 后 才 弄 清楚 固氮 和 放 氢 之 间 的 关系 。 无 Nz 时 ， 所 有 固氮 酶 电子 都 用 于 放 气 。 已 发 现 其 他 生物 国 气 酶 的 情况 与 因 气 菌 的 酶 相同 ， 不 管 被 还 原 的 电子 受 体 属于 什么 类 型 ， 在 大 多 数 情况 下 ， 每 传递 一 对 电子 要 利用 4 至 5 克 分 子 的 ATP (Silversteinf#ilBuien, — 1978; Lijones 和 Burris，1972; Davis 等 ，1975) 。 已 经 知道 有 些 因素 会 影响 电子 流 在 各 受 体 间 的 分 配 ， 它 包括 反应 系统 中 国 氮 酶 的 铁 蛋 和 白 与 钼 铁 和 蛋白 组 份 的 比例 ，ATP 与 ADP 的 比例 。 固 气 酶 反应 的 准 量 关系 尽管 还 没 确 定 ， 但 是 可 ， FAP th BA: N2 +8e +8H* + 16ATP ERT) > 2NHs + 16ADP + 16Pi +H» 在 最 适 条 件 下 ， 大 约 有 25%% 当 量 左右 的 固氮 酶 电子 分 配给 H+， 而 当 条 件 不 适合 时 ， 大 部 分 分 配给 H+， 小 部 分 给 Nz。 在 促使 我 们 能 够 了 解 影响 上 述 电子 分 配 的 因素 之 后 ，Hageman 和 Burris(1978a, 1978b， 1979) 作出 了 重大 的 贡献 。 他 们 提出 了 令 人 信服 的 证 据 。 按 照 他 们 的 命名 法 ， 固 氨 酶 的 铁 蛋 白 和 铅 铁 蛋白 算 作 固 气 酶 的 还 原 酶 和 固氮 酶 ， 这 两 个 组 分 的 结合 与 解 离 伴随 着 每 个 电子 的 转 移 。 在 包括 ATP 与 还 原 剂 的 供给 、 固 氛 酶 还 原 酶 和 固氮 酶 比例 的 一 系列 可 变 因素 中 ， 每 一 个 极 大 地 影响 固氮 酶 周转 速率 的 因素 ， 也 影响 电子 在 基质 间 的 分 配 ， 这 种 现象 是 有 相当 大 的 生 理 意 义 的 。 例如 ， 当 ATP 和 还 原 剂 的 浓度 最 适时 ， 以 及 固 氨 酶 还 原 酶 与 固 气 酶 的 比例 高 时 ， 电 子 最 大 限度 地 分 配给 N*， 其 准 量 关 系 是 ， 每 周转 8 个 电子 就 约 有 75%% 用 于 所 还 原 。 另 一 方面 ， 当 还 原 剂 与 ATP 的 浓度 不 适时 ， 或 者 在 固氮 酶 还 原 酶 与 固 氨 酶 的 比例 低 时 ， 固 氨 酶 周转 速率 即 低 ， 结 果 分 配给 H+ 的 电子 明显 增加 ， 分 配给 Na 的 电子 相应 减少 。 当 用 Hup 菌株 接种 的 豆 科 植物 生长 时 ， 就 发 现 氢 不 能 再 循环 的 境况 ， 这 似乎 表明 ， 放 所 的 程度 应 受 左右 固氮 酶 活性 的 那些 因素 影响 ， 因 为 就 我 们 所 知 ， 固 氨 酶 是 豆 科 根瘤 中 唯一 催化 放 氢 的 酶 。 当然 ， 我 们 应 记 住 ， 厌 氧 和 兼 性 厌 氧 的 因 所 生物， 不 仅 通过 固 气 酶 放 氨 ， 而 且 还 可 通过 可 逆 的 氨 酶 放 气 ， 当 生物 没有 别 的 电子 受 体 可 利 衣 时 ， 这 种 功能 即 成 为 处 置 电子 的 最 终 系 aeD8 。 统 。 直 到 现在 还 不 能 排除 在 豆 科 根瘤 中 也 存在 这 种 放 氢 系 统 的 可 能 性 。Evans (1981) BH 了 8 个 试验 的 结果 表明 ， 用 Hup -接种 剂 接 种 的 豆 科 根瘤 由 于 放 氢 平均 损失 掉 固 氮 酶 电子 的 32% (Evans 等 ，1981) 。 但 在 Bethlenfalvay 等 (1979) 的 一 个 试验 中 ， 固 氮 酶 电子 的 60% 通过 放 氢 失控 。 Schubert 等 考察 豆 科 的 一 个 品种 时 (Schubert 和 Evans， 1976) ， 几 次 测定 表明 ， 放 和 氢 损失 占 固 氨 酶 电子 流 的 50% 到 80% 。 有 证 据 表 明 ， 环 境 条 件 ， 例 如 光照 强度 (Bethlenfalvay 和 Phillips，1977) 和 温度 (Dart 和 Day，1971) ， 影 响 豆 科 根 瘤 的 放 氨 程度。 显然 ， 许 多 影响 固氮 微 生物 体内 放 和 氢 的 环境 因素 。 hs 进行 的 试验 来 解释 。 人 们 可 以 料想 ， 诸 如 湿度 、 逆 境 、 厌 氧 条 件 和 光照 不 足 等 可 变 的 环境 因素 ， 可 能 对 用 于 支持 固氮 过 程 及 ATP 产 生 的 光合 产物 的 数量 有 影响 ， 这 些 影 响 可 以 改变 固氮 酶 电子 流 的 分 配 和 和 氧气 释放 量 。 在 考察 中 ， 我 们 检查 了 几 个 根瘤 菌 品系 ， 其 中 具有 有 活力 的 氢 酶 系统 所 表现 出 再 循环 能 力 ， 因 而 从 固氮 反应 中 释放 气 的 菌株 只 占 比 较 小 的 比例 。1978 年 我 们 已 报道 过 ， 在 33 株 大 豆 根瘤 菌 中 ， 只 有 7 株 具 有 有 活力 的 所 酶 系统 。 最 近 ，Ruiz-Argiieso 等 (1981) 已 证 明 ， 在 30 株 大 豆 根瘤 菌 中 有 4 株 有 旺 BRAS AUT tho KAMAN TLS RE ee aR AB AE A AH DD 〈Schubert 等 ，1977) ， 但 在 检查 我 们 实验 室 的 100 多 株 童 蒂 根 瘤 菌 和 三 叶 章 根瘤 菌 中 ， 没 有 一 SERRA MS 根瘤 中 释放 的 所 〈Ruiz-Argiieso 等 ，1979b) 。 O’GarafilHynes (1981) 采用 亏 分 析 法 发 现 一 些 三 叶 草 根瘤 菌 的 菌株 有 氢 酶 活性 ， 但 氢 的 净 吸 收 尚未 有 证 明 。 一 系列 用 已 知 的 根瘤 菌 Hup* 菌 株 接种 豆 科 植物 ， 并 在 控制 的 条 件 下 载 培 的 试验 表明 ， 根瘤 类 菌 体 内 有 活力 的 氢 的 氧化 系统 对 放 所 有 深刻 的 影响 。 整 个 试验 包含 29 个 Hup* 菌株 ， 它们 代表 几 个 不 同 的 种 ， 氢 的 平均 损失 量 是 固 气 酶 电子 流 的 3.8%。 这 可 与 用 Hup 菌株 接种 的 一 系列 试验 作 比 较 ， 上 面 叙述 过 的 根瘤 中 所 的 平均 损失 是 32% 。 在 用 Hup -和 Hup 菌株 进行 试验 时 必须 记 住 ， 有 些 Hup*+ 菌 株 的 氢 酶 活性 不 足以 再 利用 释 放出 来 的 全 部 所 (Evans, 1981) 。 例 如 ，Ruiz-Argiieso 等 (1978) 列举 了 两 RRR 瘤 菌 的 气 酶 活性 ， 它 们 形成 的 根瘤 是 通过 放 氢 平均 损失 固氮 酶 电子 流 的 21% 。 氢 的 有 效 再 循环 的 根瘤 菌 菌株 ， 不 仅 在 慢 室 控制 的 试验 中 降低 了 和 氢 的 损失 ， 而 且 在 大 田 条 件 下 也 显著 地 减少 了 损失 〈Hanus 等 ，1981) 。 将 大 豆 栽 培 在 很 少 有 大 豆 根瘤 菌 的 土壤 里 ， 列 举 在 表 1 中 的 用 4 株 Hup+ 野 生 型 组 或 者 4 株 Hup 野生 型 组 作 接种 处 理 的 资料 表明 ， 用 Hup+ 接 种 的 植物 根瘤 放 氢 的 平均 速率 仅 占 固 氮 酶 电子 流 的 4%， 而 用 4 个 Hup- 菌株 接种 的 大 豆 ， 相 应 的 平均 放 氢 是 26% 。 从 每 单位 大 豆 根瘤 菌 122DES 类 菌 体 干 重 所 具有 的 需 固 氮 酶 放 氨 的 最 大 速率 ， 以 及 在 相 同 条 件 下 气 的 氧化 最 大 速率 的 测定 中 ，Ruiz-Argtieso (1979a) 曾经 作出 此 菌株 类 菌 体 的 氢 氧化 人 能 力 比 放 氢 能 力 大 10 倍 的 结论 。 根瘤 函 戎 株 的 所 氧化 能 力 明 显 的 占 优势 ， 这 在 前 面 讲 过 的 在 不 利 的 条 件 下 可 能 使 固 氨 酶 的 电子 趋向 供给 质子 ， 从 而 导致 放 乞 速率 增加 ， 而 过 量 的 氨 氧 化 能 力 对 这 部 分 氢 的 再 利用 可 能 是 有 好 处 的 。 eaD9 。 Rl 大 田 试 验 条 件 下 大 豆 根 瘤 菌 划 株 对 大 豆 良 疱 类 蓝 体 和 氢 酶 活性 和 根 瘟 放 和 氮 的 影响 1 (anus 等 人 资料 ，1981) AB wig 类 菌 体 吸 氢 通过 放 气 损失 的 菌 的 苘 恢 (umol/mg i - 小 时 ) [2 SASS FLY it? (%) 143 Hupt 5,23 3 6 ~ Hupt 5,23 2 122 Hupt 2.49 5 110 Hupt 2.14 6 117 Hup- <0.05 21 135 Hup- <0.05 : 32 120 Hup- . <<0.05 31 16 Hup- <0.05 “20 1. 试验 随机 取样 重复 4 次 ，1977 年 在 俄勒冈 州 Carvallis 进 行 。 2. 根据 放 氢 速率 (当量 数 ) 占 总 电子 流 CAE) 的 百分数 进行 计算 。 总 电子 流 用 乙 抉 还 原 速率 测定 。 三 、 氢 的 氧化 作用 及 其 意义 | 氧化 途径 诸如 根瘤 范 的 类 菌 体 以 及 固氮 菌 一 类 的 好 氧 国 所 生物 中 ， 和 所 的 氧化 作用 是 由 分 布 在 细胞 膜 上 的 一 系列 酶 俱 化 的 。 这 种 酶 复合 物 和 颗粒 由 于 对 氧 的 亲 含 力 很 高 ， 人 们 称 之 为 “ 吸 氢 酶 》。 这 可 用 所 和 有 氧 亲 合力 分 别 为 50 和 10.2 训 微克 分 子 来 阅 明 。 大 豆 根 瘤 菌 类 菌 体 的 氨 酶 系 , 统 可 达到 它 最 大 反应 速度 的 一 半 《Emerich 等 ，1980b) 。 确定 跪 豆 根瘤 菌 类 菌 体 和 大 豆 根 瘤 菌 类 菌 体 中 氧化 所 反应 的 化 学 计算 都 表明 ， 一 克 分 子 氢 被 去 克 分 子 的 氧 所 氧化 而 产生 水 (Dixon, 1968; McCrac 等 ，1978) 。 对 完整 的 大 豆 根 瘤 蕊 类 菌 体 的 恬 殊 复合 物 的 研究 揭示 ， 所 的 氧化 作用 被 一 些 能 中 断 呼吸 链 的 化 合 物 闵 如 氰 化 钾 、 和 登 氛 钠 、 痰 基 握 化 物 、 和 毛茶 肪 以 及 其 他 一 些 氧 化 磷酸 化 作用 的 抑制 剂 强烈 地 抑制 CEmerich 等 ，1980b) 。 与 此 相反 ， 当 气 梅 本 身 被 去 垢 剂 溶解 ， 并 与 电子 传递 途径 的 其 他 组 份 分 开 以 后 ， 此 酶 便 不 再 对 氰 化 钾 和 登 级 钠 敏 感 ， 不 能 与 氧 起 反应 ， 但 是 能 与 如 亚 甲 蓝 、/; 二 气 意 甲 硫 酸 等 正 氧 还 电位 的 非 生理 受 体 起 反应 。Arp 等 〈1979) 和 Ruiz-Argiieso 等 (1979a) 从 大 豆 根 瘤 菌 110 菌 株 类 菌 体 中 纯化 出 对 氧 不 稳定 的 氢 酶 ， 并 指出 此 酶 是 一 种 分 子 量 为 63300 的 铁 硫 蛋白 。 | GPA LAW H, KORA MH, 4 A 统 的 pH 调节 至 适当 HELE >» FE IMA i Dak BS 9 TR wa EY +e Uy EAL ETE dF HH, 5 % BO2% (Ruiz -Argiieso#, 1979a) 。 VA ANAS 2) AERA ASH, ELAR b. ARMA A OER 链 一 系列 电子 传递 载体 传递 电子 ， 然 后 再 交 给 氧 。 但 是 直到 现在 ， 这 种 概念 仍然 是 建立 在 间 接 证 据 的 基础 上 。 最 近 Eisbrenner 等 (1981) 检查 了 Hup+ 大 豆 根 瘤 昔 122DES 的 氢 氧 化 途径 ， 发 现 氨 的 氧 HORE HE TCU ARE AEA (BomeS#, 1971) uate We AF Bi TZ BE AD HE BY (Poole Fl Haddock, 1975) 二 省 百 里 香 柄 (DBMIB) 抑制 。Eisbrenner 等 (1979) 指出 DBMIB 抑 制 蓝 菠 需 氧 吸 所 以 及 需 光 吸 气 。 在 大 豆 根瘤 疯 类 莫 体 中 ，DBMIB 抑 制 氨 的 氧化 ， 这 意味 着 泛 配 可 ee 60 。 能 参与 从 氢 至 氧 的 电子 传递 (Bothe 等 ，1977; Eisbrenner“€, 1978, 1981), Daniel (1979) 已 确立 了 泛 柄 在 大 豆 根瘤 菌 呼 吸 作用 中 的 功能 。Eisbrenner 等 (1981) 也 用 不 同 的 分 光 光 度 计 以 及 动力 学 分 析 方法 证 明 ，b 型 和 c 型 的 细胞 色 素 被 氧气 还 原 。Appieby (1969) 表明 在 大 豆 根 瘤 菌 类 菌 体 呼 吸 电 子 传递 链 中 存在 b 型 和 c 型 的 细胞 色素 。 列 在 图 1 中 的 图 解 表 明 ， 电 子 传 给 一 个 有 可 能 是 泛 柄 ， 然 后 传递 到 细胞 色素 b (550) 的 未 知 受 体 。 细 胞 色素 C 的 末端 电子 受 体 也 是 未 知 的， 但 有 可 能 是 细胞 色素 0， 这 在 大 豆 根 瘤 菌 类 菌 体 中 已 被 鉴定 可 能 在 这 个 部 位 起 作用 〈Appleby，1969; Hickok, 1981) 。 Lbo: 类 菌 体外 腊 ， O: fe 细胞 色素 | vere! . 人 | 559 |] css x}i——> O， 颗粒 KCN DBMIB HQNO NaN; aaa H:0 Hy: FARE : 2H* 2NE, N2 Al 大 豆 根瘤 菌 类 菌 体 膜 内 电子 流 途 径 示意 图 ， 电子 流 从 气 气 经 过 气 酶 颗粒 传递 至 氧 。 关 于 质子 传递 机 制 、 它 的 分 布 以 及 可 能 存在 的 电子 分 路 传递 途径 在 此 示意 图 中 未 作 考虑 。 二 溴 百里香 酮 (DBMIB)、 庚 基 羟 基 唆 啉 氧化 物 (HQNO) 、 氰 化 钾 或 释 氨 钠 的 抑制 点 如 图 所 示 。 图 解 根据 FEisbrenner 和 Evans (1981) 以 及 Emerich 等 (1980) 的 试验 。Emerich 等 (1980a) 表 明 ， 氧 化 的 豆 血 红 和 蛋白 (LbO2) 供 氧 以 支持 氢 氧 反应 。 氨 氧 化 作用 的 生理 效益 Dixon (1972) 首先 提出 ， 固 所 生物 有 功能 的 所 氧化 系统 能 产生 生理 效益 。 按 照 他 的 观 点 气 酶 可 以 〈1 ) 去 除 固氮 酶 周围 的 氧 减 少 氧 伤害 的 可 能 性 ; (2) 阻止 Hz 对 固氮 酶 的 抑 制作 用 。 已 知 氨 是 固 气 酶 的 抑制 剂 ， 是 固氮 反应 的 一 种 产物 ; €8) 通过 氢 支 持 的 氧化 磷酸 化 ， 提 供 由 于 在 固氮 反应 中 所 消耗 的 部 分 能 量 。 在 最 近 的 评论 中 ，Evans 等 (1981) BAS 现 已 积累 起 来 的 确实 的 证 据 ， 表 明 几 种 不 同 生物 的 所 氧化 能 力 都 产生 生理 效益 ， 这 对 增加 体 内 的 固氮 作用 共有 潜力 。 已 经 证 明 ， 吏 豆 根瘤 菌 尖 菌 体 (Dixon，1968)、 棕 色 固 氮 菌 CHynd- man 等 ，1953) 和 鱼 腥 藻 7120 (Peterson 和 Burris，1978) "Bh, ZA hl LA KH ATP AY A OK 此 外 Eimerich 等 〈1979) 曾经 指出 ， 氢 的 氧化 增加 大 豆 根瘤 菌 122DES 类 菌 体 中 稳定 态 ATP 的 水 平 。 在 柱 孢 鱼 胆 蔬 〈Eisbrenner 等 ，1978) ， 好 氧 圆 褐 固氮 菌 〈Walker 等 ，1978) 以 及 大 豆 根 瘤 菌 类 菌 体 (Emerich 等 ，1979) 中 已 观察 到 ， 和 氢 对 乙 炬 的 还 原 速 率 以 及 对 保护 固 氨 ” 酶 免 受 伤害 ， 有 令 人 注目 的 影响 〈 图 2 ) 。 至 于 设想 氢 酶 通过 氢 氧 反应 除去 氢 以 阻止 固 氨 酶 受 抑 淹 ， 尚 无 令 人 信服 的 证 据 。 也 没有 资料 表明 在 非 光 合 固 拓 生 物 中 ， 氢 通过 黄 素 氧 还 蛋白 或 铁 氧 还 蛋白 癌 固 氮 反 应 提供 电子 。 然 而 ，Eisbrenner 和 Bothe (1978，1979) 等 指出 ， 在 柱 孢 鱼 胆 藻 的 离 体 蜡 形 胞 中 ， 需 光 反 应 中 电子 通过 叶绿体 质 体 柄 和 光合 系统 工 〈 包 括 铁 氧 还 HA) 众 氢 传递 给 固氮 梅 。 气 和 需 光 的 辅酶 工 还 原作 用 也 已 在 念珠 藻 的 离 体 异形 胞 中 为 Eis- brenner (1981) 所 证 实 。 Dixon (1965) filEmerich*# (1980b) 分 别 用 殉 豆 根 并 菌 和 大 豆 根瘤 菌 的 类 菌 体 进 行 的 试 晨 证 明 ， 和 氢 的 氧化 作用 伴随 着 二 氧化 碳 的 释放 显著 下 降 ， 这 是 由 于 碳 基 质 氧化 速率 下 降 所 Ko Layzall (1979) 等 介绍 的 资料 支持 了 氢 的 氧化 与 矶 水 化 侣 物 的 贮 在 有 关 的 结论 。 e6l. ee 2 “好 氧 非 光合 作用 的 固 所 生物 中 吸 氢 、 呼 吸 链 和 固氮 酶 之 间 相 互 关系 的 示意 图 至 今 尚 待 试验 证 明 ， 非 光合 作用 电子 待 递 途径 的 生物 内 氢 酶 系统 通过 铁 氧 还 蛋白 (Fd) 提供 电子 支持 固 氨 酶 的 活 性 。 ( 据 Bothe、Distler 和 Eisbrenner 1978 资 料 修改 ) Layzall (1979) 观察 到， 用 Hup* 根 瘤 菌 接种 的 砍 豆 植株 每 固定 1 毫克 氮 便 以 二 氧化 碳 形式 释放 1.5 毫 克 碳 ， 而 在 对 比 测定 中 用 Hup 菌株 接种 的 羽 扇 豆 ， 每 固定 1 毫克 氮 以 二 氧化 碳 形式 呼吸 掉 3.64 毫 克 碳 。Rainbird 等 (1981) 也 比较 了 Hup*+* 与 Hup eRe aa. 它们 作 开 豆 的 接种 剂 ， 结 果 用 Hup-* 菌 株 接 种 的 植物 根 中 二 氧化 矶 释放 的 速率 降低 ， 干 重 的 积累 增加 。 固 所 生物 中 氢 再 循环 的 生理 效益 证 据 是 属实 的 。 Hanus (1979) 和 Lepo (1980) 等 最 近 发 现 ， 大 豆 根 瘤 菌 Hup-* 菌株 不 仅 具 有 氧化 类 菌 体 固氮 酶 反应 所 形成 的 氨 的 能 力 ， 而 且 能 在 自生 条 件 下 利用 氨 作 为 唯 王 的 能 源 ， 和 三 氧化 碳 为 碳 源 进 行 生长 。 这 对 于 根瘤 菌 氢 的 氧化 系统 江 在 的 代谢 意义 提供 了 直接 的 证 据 5 四 、 撮 的 再 循环 对 产量 的 影响 从 理论 分 析 得 出 的 预期 效果 在 概括 直接 测定 所 再 循环 对 豆 科 植物 产量 的 影响 之 前 ， 看 来 值得 介绍 一 下 有 助 于 估算 固 氮 中 形成 的 氨 的 氧化 作用 对 豆 科 植物 产生 效益 大 小 的 理论 基础 。 我 们 探讨 此 问题 时 ， 假 定 豆 科 植 物 的 固氮 作用 受 能 量 供 给 的 限制 ， 固 所 作用 限 制 生 长 〈Hardy 和 Havelkay 1975; Phi- llips，1980) 。 : 看 来 很 清楚 ， 当 植物 产生 足够 的 光合 产物 以 支持 国 所 和 其 他 生理 过 程 时 ， 固 气 作 用 中 产 生 的 所 的 氧化 所 回收 的 能 量 可 能 是 设 有 意义 的 。 如 上 所 述 ， 固 所 的 豆 科 植物 可 能 众 氢 再 循环 中 得 到 好 处 而 与 能 量 保存 没有 直接 关系 ， 但 是 还 不 能 用 明显 的 方法 定量 地 对 此 作出 估价 。 我 们 确定 氨 的 氧化 对 能 量 保 存 效 益 的 理论 基础 ， 是 以 Evans 等 〈1980b) 的 下 述 估计 为 根据 的 。 整 个 固氮 反应 中 《〈 反 应 式 1) 每 固定 工 克 分 子 所 需要 28 克 分 子 ATP。 这 和 包括， 固 氛 酶 的 所 还 原 和 放 氢 所 需要 的 16 克 分 子 ATP (每 转移 一 对 电子 需 4 GE FATP) ， 氛 还 原 所 需 要 的 3 对 电子 共 9 当量 ATP， 还 原 两 个 质子 产生 氢 需 要 的 一 对 电子 和 3 当量 ATP。 根据 Dixon (1978) 以 及 Boeuger (1979) HAM AH BY 研究， 我 们 假定 在 所 的 氧化 过 程 中 磅 与 氧 的 合理 比例 为 2 。 因 此 ， 氧 化 一 克 分 子 氢 所 产生 的 ATP 应 古 固 氛 酶 每 转移 8 人 电子 消耗 ATP 总 数 的 2/28 或 回收 7.1%。 在 一 系列 实验 中 ， 用 已 知 的 Hup 接种 剂 接 种 的 豆 科 se 62. ae eer 植物 ， 氢 平均 损失 为 固氮 酶 电子 流 的 32% ， 这 等 于 固 氨 酶 每 转移 8 个 电子 就 有 2.56 个 电子 损 失掉 ， 或 释放 出 1.28 克 分 子 氢 。 正如 Evans (1981) 所 指出 的 ,氧化 1.28 克 分 子 氨 应 产生 2.56 克 分 子 ATP。 假 定 能 量 限制 着 固氮 和 生长 ， 在 40 多 天 生长 期 中 ， 计 算 可 得 到 7.1% 效 益 的 综合 效果 ， 这 还 可 以 指望 能 增 加 到 20%% 以 上 (Evans 等 ，1981) 。 当 然 ， 植 物 生长 的 速 率 以 及 生长 期 的 长 短 也 是 影响 预期 增加 幅度 的 因素 。 考虑 放 氢 在 能 量 保 存 方 面 的 理论 效益 时 ，Gibson (3| A Dilworth, 1980) 推论 ， 大 豆 和 三 叶 草 根瘤 每 天 损失 的 所 〈 以 葡萄 糖 当 量 表 示 ) 分 别 为 每 天 供给 的 光合 产物 〈 以 葡萄 糖 当 量 表示 ) 的 0.43% 和 1.5% 。 因 此 认为 这 种 损失 是 无 所 谓 的 。 在 这 些 计算 中 ， 他 假定 经 过 固 氛 酶 每 损失 1 克 分 子 氨 需 要 3 克 分 子 ATP， 而 我 们 在 分 析 中 论断 ， 每 损失 工 克 分 子 氨 应 需 花费 7 克 分 子 ATP (Evans 等 ,1981) 。 更 有 ，Gibson 的 理 论 认 为 ， 所 有 形成 的 光合 产物 全 部 都 用 来 支持 固氮 。 我 们 不 同意 这 种 看 法 ， 因 为 光合 产物 还 需要 分 头 去 维持 叶 、 根 、 葵 以 及 植物 其 他 部 分 的 代谢 过 程 。 结 果 只 有 一 部 分 光合 产物 用 来 支持 “根瘤 的 代谢 。 例如 ，Minchin ffl Pate(1973) Rid, ERR 植株 中 ， 根 瘤 的 生长 和 呼吸 代谢 消耗 光合 产物 的 17% 。 按 照 我 们 的 意见 ， 每 天 的 氢 损 失 〈 以 葡萄 糖 当 量 表示 ) 在 逻辑 上 只 可 以 用 部 分 光合 产物 支持 根瘤 代谢 。 还 有 ，Dilworth (1980) 在 讨论 Gibson 的 结果 时 ， 没 有 考虑 到 氢 的 再 循环 对 生长 过 程 中 的 综合 影响 。 因 此 我 们 相信 ,Gibson 的 理论 大 大 地 低估 了 根瘤 中 氢 再 循 . 环 的 潜在 意义 。 野生 型 菌株 的 比较 在 我 们 关于 豆 科 植物 氨 再 循环 的 早期 工作 中 ， 我 们 比较 了 大 田 大 豆 根瘤 菌 和 开 豆 根瘤 菌 Hup+ 及 Hup- 单 个 野生 型 菌株 的 有 效 性 ， 并 比较 了 大 豆 和 页 豆 的 氮 含 量 。 在 这 些 对 比 中 ， 使 用 Hup* 菌 株 可 使 大 豆 植株 的 干 物 质 和 固定 的 总 氮 量 分 别 增加 24% 和 31% 。 用 黄豆 作 材料 也 获得 类 似 的 结果 。 从 这 些 单个 菌株 的 比较 中 ， 我 们 对 结论 作 了 如 下 的 叙述 (Schubert 等 ， 1978) : “对 于 能 利用 固 氨 酶 所 释放 氢 的 结 瘤 的 豆 科 植物 ， 我 们 认为 ， 固 氨 效 率 明 显 提高 ;并 推 论 ， 当 以 豆 科 植物 固 氨 效率 中 氢 再 循环 的 作用 作为 论据 的 时 候 ， 应 该 对 一 些 特 定 的 根瘤 菌 菌 株 进 行 比较 ， 除 了 考虑 氢 酶 的 存在 与 否 以 外 ， 还 应 看 到 它们 在 遗传 学 上 是 相似 的 。?” 为 了 提高 比较 试验 的 可 靠 性 ， 我 们 在 试验 中 选用 4 组 或 5 组 大 豆 根瘤 菌 Hup 野生 型 菌 株 接种 大 豆 ， 并 与 大 豆 根瘤 菌 Hup* 野 生 型 菌株 组 进行 固氮 效率 的 比较 ， 以 Carter 等 〈1978) 的 试验 作为 基础 。 我 们 假定 ， 除 氢 酶 外 ， 这 些 Hup+ 和 Hup- 菌株 之 间 在 遗传 变异 上 是 随机 的 。 有 对 比 地 对 两 个 接种 组 的 氨 再 循环 价值 进行 试验 。 在 温室 试验 中 ， 用 Hup* 菌株 组 接种 的 大 豆 ， 其 平均 产量 和 氨 含 量 分 别 为 16% 和 26%， 比 用 Hup- 菌株 接 种 的 大 豆 相 应 的 数值 要 高 。 另外 ， 在 含 氛 量 较 高 的 俄勒冈 州 土地 上 进行 生 组 大 田 试验 ， 受 试 的 Hup+ 菌株 田 块 获得 的 大 豆 种 子 ， 其 平均 所 含量 比 用 Hup 菌株 接种 的 高 8.4%。 在 这 些 大 田 试 验 中 ， 大 豆 产量 的 差异 并 不 明显 。 尽管 这 些 结果 表明 氢 的 再 循环 对 固氮 过 程 有 好 处 ， 但 必须 考虑 到 另 一 种 可 能 性 ， 即 我 们 fv» 7EHup* AlHup 苗 株 间 随 机 产生 的 遗传 变 寞 〈 除 氨 酶 以 外 ) 是 不 可 避免 的 。 最 近 ， Gibson 等 《1981) 报 道 ， 无 论 大 豆 根 瘤 菌 或 开 豆 根瘤 菌 , Hup: 特 征 对 其 豆 科 宿主 ° 63° NT 的 生长 和 固 气 元 无 明显 的 影响 。 而 且 ， 他 推论 其 相对 效率 数值 与 三 叶 章 x 豌豆 和 于 扁 豆 的 氨 含量 没有 正 相 关 性 。 然 而 ， 他 所 介绍 的 资料 表明 ， 所 有 这 三 个 种 通过 放 氢 形式 损失 的 电子 占 固 气 酶 电子 流 254%,。 ; 这 说 明 在 这 些 豆 科 植物 根瘤 中 缺少 有 效 的 氨 再 循环 系统 。 从 这 个 证 据 以 及 从 改变 了 遗传 背景 的 菌株 比较 中 ， 我 们 认为 ， 在 作出 明确 的 结论 之 前 ， 必 须 用 可 回复 的 Hup 突变 株 与 回 复 子 作 接种 剂 进行 补充 试验 。 Hup 突变 栋 与 Hup* 亲 本 菌株 作 豆 科 植物 接种 剂 的 比较 Maier 等 (1978) 在 我 们 实验 室 中 从 大 豆 根 间 菌 122DES 菌 标的 抗生素 抗 性 衍生 菌 分 离 了 一 些 Hup 突变 株 ， 他 们 采用 了 下 列 操 作 步 最 达到 富 集 Hup 突变 株 的 目的 下 在 有 氧 情况 下 ， baad AU PAR HY ETF UE ie. Hp Hup* ania A A we ee A Waa se, AmB Hup 细胞 遂 富 集 起 来 。 Maier 等 〈1978) 曾 对 Hup- 突变 株 SRi、SRz 和 SRs 的 一 些 性 质 进 行 了 摘 述 。Albrecht (1979) 在 温室 试验 中 ， 把 这 些 突变 株 与 它们 的 亲本 株 ;SR 分 别 作 大 豆 的 接种 剂 进 行 比较 ， 结果 表明 ，Hup* 杀 本 菌株 的 固氮 效率 比 突变 株 的 高 。 但 是 这 些 突变 株 不 能 恢复 Hup* 亲 本 的 表 型 , 因此 不 能 把 它们 当 作 点 突变 。 大 豆 根瘤 菌 Hup+* 菌 株 以 矿质 化 能 进行 营养 生长 的 发 现 ， 为 舟 选 大 豆 根瘤 菌 的 氨 酶 提供 了 一 种 新 方法 ， 它 使 我 们 能 从 Hup 亲本 株 ， SR 中 分 离 可 回复 的 Hup 突变 株 。 这 些 突变 株 恢复 成 Hup+ 亲 本 表 型 时 ， 其 频率 与 点 突变 所 预期 的 频率 相 符 。 最 近 ， Maier (1981) 也 已 利用 和 矿质 化 能 作 营 养 的 类 似 操作 步骤 筛选 可 回复 的 大 豆 根瘤 菌 Hup 突 变 株 。 epo (1981) ,采用 从 大 豆 根 瘤 菌 SR 来 本 栋 分 离 可 回复 的 Hup- 突 变 析 (Str'y Kan‘, Hup*) 的 步骤 概括 如 下 : (1) 用 亚 硝 酸 作 诱 变 处理 ; C2) 在 矿 化 能 营养 培养 基 上 培养 处 理 过 的 细胞 ; (3) 用 青 堆 素 和 溶菌 酶 杀 死 Hup+ 细胞 ; (4) 用 含有 低 浓 度 的 碳 基质 的 吸 所 培养 基 的 平 型 培 养 存 活 株 : 《5 ) :在 以 下 两 种 培养 基 的 平王 上 影印 (a) 矿 化 能 营养 培养 基 ， (>) 在 矿 化 能 营养 培养 基 中 加 入 一 种 有 机 碳 基 质 〈6) 丢弃 那些 能 在 矿 化 能 营养 培 养 基 上 生长 的 菌落 ; (7) 选择 那些 只 有 当 有 机 碳 基质 存在 时 才能 生长 的 菌落 ,并 检查 每 一 个 分 离 物 的 链 埠 素 和 卡 那 霉 素 抗 性 和 去 阻 AS 条 件 下 明 氢 的 能 力 以 及 使 大 豆 植株 结 瘤 的 能 力 。 这 种 程序 也 使 我 们 得 到 一 组 Hup- 突 变 株 ,其 中 有 三 株 ( 称 为 PEJ 17;PJ 18 和 PJ 20) 已 作 了 相当 详细 的 鉴定 EQ). WES, Hickok (1981) 测定 了 杂 本 株 SR 和 Hup- 突变 株 PJ18 形 成 的 大 豆 根瘤 菌 类 菌 体 的 细胞 色素 成 分 ， 它 们 在 联 二 亚硫酸钠 存在 与 否 的 还 原 态 和 氧化 态 下 ， 在 差异 光谱 上 没有 发 现 可 检测 的 差异 ， 在 一 氧化 矶 存在 或 缺乏 时 也 没有 发 现 还 原 的 细胞 色素 在 益 异 光谱 上 有 可 检测 的 差异 。PJl8 类 菌 体 悬浮 液 的 细胞 色素 与 Hup- 类 菌 体 AGRE 不 同 波长 下 〈 从 500 至 600 毫 租 米 ) 很 难 区 别 开 来 (图 3) 。 我 们 断定 ，Hup* 亲 本 株 SR、Hup 突变 株 PJ 17 和 PJ 18， 以 及 它们 的 Hup* 回 复 株 PJ17- 1 和 PJ 18-1 都 适合 于 作 大 豆 接种 剂 使 用 ， 以 便 产 格 地 估计 押 再 循环 对 大 豆 固氮 过 程 的 效 益 。 目 前 这 些 菌 株 已 用 于 这 种 目的 。 (en. 646 2 ”大 豆 根 帘 菌 ITup” 突变 株 与 Hup+ 亲 本 栎 的 比较 ( 引 自 Lepo 等 ,1981) Hup+ 亲 本 株 Hup- 突变 ' 株 IF 征 eee ee ee et er 一 ra SRE EY = SR PJ 17 PJ 18 PJ 20 FMS ea 74.5 <0.5 <0.5 <0.5 去 阻 遇 细胞 的 需 美 蓝 吸 氢 ! 97.2 <0.5 <0.5 <0.5 FLA eA PRR 82.7 <0.5 | <0.5 <0.5 去 阻 歇 细胞 的 RuBP 羧 化 梅 的 活性 2 14.2 1.7 <0.5 1.6 与 大 豆 共生 时 的 总 固氮 量 * 88.5 70.8 58.6 ND 根瘤 菌 类 菌 体 的 需 氧 吸 氢 * 43.3 <0.5 “<0.5 ND 在 低 碳 培 养 基 上 的 世代 时 间 (小 时 ) 7.8 8.0 7.0 10.0 再 up+ 表 型 的 回复 频率 1X 1078 1.3X 1079 9X 10718 化 能 自 养 生长 的 能 力 + 一 一 一 大 豆 结 瘤 能 力 十 + + ND SKA AA SR ATE + 十 rr rts 1. 单位 ， 毫 微克 分 子 / 分 钟 。 毫克 蛋 白质 。 2. RUBP 羧 化 酶 活性 用 ” 毫 微 克 分 子 CO? 固 定 / 分 钟 ， 毫 克 蛋 白质 “表示 。 3. 在 Leonard 和 盆栽 试验 中 ， 平 均 每 一 植株 固定 的 毫克 氨 。 五 、 大 豆 根 瘤 菌 Hup+ fuHup- BW 株 的 质粒 概况 有 迹 像 表 明 诺 卡 氏 菌 菌 种 和 豌豆 根瘤 菌 的 氨 酶 遗传 信息 编码 在 质粒 上 (Schlegel 1976;Brewin 等 ,1980)。 Al 而 Cantrell 等 〈1981) 开始 研究 ， 确 定 大 豆 根瘤 菌 Hup* 和 Hup -质粒 的 概况 。 最 初 用 改进 的 Carrier 和 Nester (1976) 以 及 Meyers (1976) ,的 方法 进行 质粒 的 分 离 和 电泳 。 测 定 了 6 +A ARE HERD Hup+ 野生 型 菌株 (USDA 122 DES、3I 1b 143,USDA 136, 31lb 142, 311b 110 和 3I lb 6 )， 但 未 测 出 质粒 。 WA 5099-1-1 Hup* 菌株 有 微弱 的 吸 所 能力， 它 0 显示 具有 分 子 量 为 94、135 和 160 x 10?7 道 尔 顿 的 质粒 。 ee Bin 在 Hup 菌株 USDA 117, USDA 8,31 1b 144,USDA A3 大豆 根瘤 菌 类 菌 体 悬 浮 液 的 氧 135 和 USDA 31 中 鉴定 出 分 子 量 范围 在 59 一 180 x 10? 化 对 内 源 呼 吸 还 原 的 差异 光 首尔 颜 的 质粒 ， 但 是 在 Hup -菌株 USDA 16 和 USDA 38 谱 。 该 类 菌 体 由 PJ18 菌 株 形成 。 中 未 检查 出 质粒 。 尽管 Maier 等 〈1978) 的 不 可 回复 的 Hup- 突 恋 株 是 来 自 检 查 不 出 质粒 的 Hup+ 亲 本 株 SR， 但 是 这 些 突变 株 〈SRi、SR， 和 SR ，,) 都 显示 具 有 分子量 范围 在 107 到 280 x 107 道 尔 顿 的 质粒 。 另 一 方面 ,可 回复 的 Hup- 突 变 株 (PJ 17、PJ 18 和 PJ 20) GSE 本 株 一 样 用 这 些 方 法 测 不 出 质粒 。 从 已 进行 的 试验 可 见 ， 至 今 大 多 数 Hup- 菌 株 含 有 可 辨别 的 质粒 ， 而 在 7 株 Hup- 菌株 中 除了 一 株 以 外 其 你 的 都 没有 可 检测 的 质粒 ， 因而 必然 要 考虑 到 这 样 一 种 可 能 性 ， 即 Hup “和 Hup 菌株 都 含有 极其 大 的 质粒 (FEAF 300 x 107 道 尔 顿 ) ， 现 已 采用 的 各 种 e。 65 。 rrr 方法 尚 不 能 分 辨 这样 天 的 完整 的 质粒 。 如 果 情 况 是 这 样 ， 那 么 这 种 假定 应 当 是 合理 的 ， 即 在 产生 和 分 离 Hup 不 可 回复 的 突变 株 SR:、SRz 和 SRs 的 操作 过 程 中 ， 它 们 的 质粒 是 从 一 个 很 大 的 质粒 衍生 来 的 。 这 方面 的 进一步 研究 正在 进行 之 中 。 原 载 “TIsrael J,Botany” 1:1—9, 1982 RKEF MH AR ° 66 « 细菌 与 热 市 禾 本 科 植 物 根 联合 国 氮 作用 的 评价 P, Van, Berkum B,B, Bohlool = 言 地 球 下 的 生命 依赖 于 所 ， 氛 在 大 气 、 海 洋 和 岩石 中 含量 很 丰富 ,= 但 是 ， 它 们 并 不 总 是 以 对 动 、 植 物 有 意义 的 状态 存在 的 。 植 物 能 同化 无 机 氮 化 合 物 ， 并 把 它们 运输 到 细胞 组 分 中 去 。 动 物 是 借 植 物 最 先 合成 的 蛋白 质 作 为 氮 物 质 的 主要 来 源 ， 植 物 所 利用 的 无 机 氛 又 通过 死 它 有 机 体 的 分 解 和 微生物 作用 的 最 终 产 物 一 一 匀 盐 及 硝酸 盐 而 回 到 环境 中 去 。 氮 以 这 种 方式 在 化 学 环境 和 生物 圈 间 循环 ， 但 在 这 个 过 程 中 ， 氮 又 通过 反 硝 化 作用 、 活 漏 和 作物 的 收获 而 失去 ， 尤 其 是 在 农业 生产 的 条 件 下 ， 取 走 的 氮 量 通常 比 获 得 的 多 。 由 于 氮 对 植物 的 可 利用 性 限制 了 农业 生产 ， 所 以 ， 必 须 保持 土壤 肥力 。 生 物 固氮 作 用 和 施用 氮肥 能 把 氮 归 还 给 土壤 。 用 Haber-Bosch 过 程 生 产 氮 肥 ， 即 成 本 高 又 耗 能 大 。 在 1976 和 1977 年 间 ， 发 展 中 国家 生 产 的 氮肥 占 世 界 氛 肥 的 21% ， 而 消耗 则 占 31% ， 但 是 ， 在 这 些 国 家 中 ， 可 用 于 生产 氨 的 原料 RRR TEE IE He Fe RAIN RRs FR AHR OE 的 财政 负担 。 ee dee: eh ra cic 4s inelaa Agric MIG, ear 氮肥 生产 使 许多 工厂 倒 闲 。 估 计 在 1983 年 ， 美 国 将 进口 他 们 所 需 总 气量 的 25%。 如 果 不 用 氨 Ri eCPM XK AR Po FIER RT RT PSL ASLID, Bild: tea a 直 很 低 。 各 果 上 生物 固 氨 作 用 能 够 哪怕 是 部 分 代 蔡 种 植 禾 本 科 植 物 所 需 用 的 氮肥 ， 那 么 ， 对 发 达 和 发 展 中 的 国家 都 是 有 利 的 。 这 样 ， 既 使 不 施用 高 效 氮肥 ， 食 品 的 生产 和 部 分 能 量 的 节约 也 将 是 可 能 的 jj 禾 本 科 植 物 联合 固氮 作用 并 非 新 的 概念 ， 本 世纪 初 ， 人 们 就 对 这 个 过 程 感 兴 趣 ， 最 近 已 经 报道 ， 牧 昔 和 禾 本 科 谷 物 的 联合 固氮 作用 具有 很 大 的 潜力 。 本 综述 的 目的 ， 是 要 对 禾 本 科 植 物 联 合 固氮 的 文献 子 以 评价 ， 并 指出 尚 待 深入 研究 的 领域 。 氮 素 平衡 的 研究 ;测定 禾 本 科 联 合 固氮 可 能 性 的 目的 在 植物 一 土壤 体系 中 ， 结 合 氮 水 平 的 提高 是 来 自 于 气 肥 的 使 用 、 从 空气 中 固定 气 、 光 化 学 国 气 和 植物 与 微生物 的 共生 固氮 等 。 解 释 在 土壤 中 已 积累 气 素 的 数据 是 困难 的 。 然 而 ， 可 以 断定 ， 非 共生 固氮 作用 在 农业 上 的 意义 是 大 的 。 在 英国 洛桑 试验 站 进行 的 长 期 气 素平 衡 的 研究 ， 为 非 共生 固 所 积累 气 素 ， 提 供 了 令 人 信 服 的 证 据 。 在 Broadbalk 进 行 的 小 考试 验 中 ， 和 栽培 小 麦 所 需 的 部 分 氮 量 ， 是 由 生物 固氮 作用 供给 的 。1883 年 ， 部 分 连续 的 小 麦 试验 被 隔 开 ， 并 让 自然 植被 生长 。 在 这 块 荒芜 区 内 氨 增 加 * 67。 了 。 估 计 每 年 生物 固 氛 作用 的 贡献 为 34 公 斤 R/S 项 。 已 经 报道 ， 植 物 根 际 的 国 氨 酶 活性 一 般 痢 处 于 相同 位 置 。 用 原状 土 柱 的 乙 糯 还 原 测 定 估 测 的 固氮 量 与 氛 量 积累 的 数据 一 致 。 Day 等 报道 了 豆 科 植物 和 蓝 世 在 这 个 位 置 的 固氮 作用 是 微不足道 的 ， 对 氛 素 的 积累 也 是 无 意 义 的 。 在 热带 对 森林 和 休闲 地 的 所 平衡 研究 也 证 明了 通过 非 共 生 固 氛 作用 而 累积 氮 。 经 测定 ， 休闲 地 生长 的 植被 每 年 每 公 硕 积累 氮 素 在 得 到 165 公 斤 之 间 。 这 些 禾 本 科 根 际 的 固氮 作用 已 作为 休闲 地 所 得 到 的 实际 所 增益 的 机 理 来 解释 。 在 许多 热带 地 区 ， 甘 蔗 在 不 施 氛 肥 情 况 下 已 经 种 植 了 几 世 纪 ， 这 说 明了 这 种 作物 具有 联合 固氮 作用 。 盐 沼 地 是 世界 上 最 有 生产 潜力 的 生态 系统 之 一 ， 尽 管 如 此 ， 它 们 的 所 的 收入 也 不 足以 维 持 生产 。 盐 沼 地 和 水 稻 土 类 似 ， 因 为 作物 常 种 植 在 水 生 系 统 中 。 在 远东 ， 水 稻 不 施 氛 肥 ， 已 经 种 植 了 几 世 纪 。 菲 律 宾 国际 水 稳 研 究 所 进行 的 长 期 氛 素 平衡 研究 指出 ， 不 施 氮 肥 ， 水 舟 的 产量 仍然 保持 稳定 。 蓝 藻 和 光合 细菌 对 稻田 节约 氮 是 重要 的 ， 已 经 测定 了 与 水 稻 根 联合 的 固氮 酶 活性 。 | 因此 ， 探 索 在 新 开拓 条 件 下 和 或) 在 积 款 氮 素 的 土壤 中 生长 的 落 本 科 植 物 的 固氮 作用 是 合宜 的 。 测定 秒 本 科 植 物 国 氮 作用 的 有 关 方 法 和 问题 目前 ， 对 测定 禾 本 科 植 物 固氮 作用 的 方法 的 局 限 性 还 没有 充分 认识 到 。 因 此 ， 对 测定 与 禾 本 科 植 物 联 合 的 固氮 作用 效率 的 报道 必需 给 予 严 格 的 评论 。 要 认识 到 科学 研究 的 关键 是 方 法 学 。 要 真实 地 解释 数据 和 明智 地 、 合 理 地 提出 假说 。 应 用 !sN2? 摊 入 法 直接 测定 田间 生长 的 禾 本 科 植 物 的 固氮 作用 ， 只 有 少数 报道 ,并 乎 所 有 的 文献 都 是 用 间接 的 乙 抉 还 原 程序 测定 固氮 酶 活性 的 。 在 许多 情 部 下 ， 这 些 数据 受到 批评 是 由 于 在 自然 环境 中 取 的 待 测 组 织 和 测定 固氮 作用 之 间 出 现 滞 迟 期 。 这 涉及 所 有 测定 固 气 方 法 的 可 靠 性 ， 因 此 ， 从 生态 系统 中 取样 后 ， 必 须 立 即 测定 其 固氮 作用 。 用 未 损坏 的 整体 植株 测定 也 是 必要 的 。 除 天 气 的 氮 外 ， 固 气 酶 还 能 还 原 多 种 底 物 ， 尤 其 是 把 乙 抉 还 原 成 乙烯 ;已 广泛 地 帮 为 测 定 固 氨 酶 的 间接 方法 。 已 经 采用 原 位 法 、 田 间 取 王 柱 法 、 温 室 生 长 的 植物 和 离 体 和 根 等 方法 来 推测 禾 本 科 植 物 的 乙 烽 还 原作 用 。 在 用 原 位 法 时 ， 通 常 是 在 测定 室 中 有 根系 周围 的 生 款 或 者 用 整个 原状 土 柱 和 花 盆 来 测定 的 。 原 位 测定 是 将 金属 圆 简 置 于 田间 一 处 或 多 处 生长 的 植株 周围 ， 小 心地 把 圆 简 插入 20 一 50 cm 深 的 土壤 中 。 测 定时 或 者 是 拒 植物 的 叶子 罩 住 ， 或 者 是 用 盖子 和 填充 物 把 伸 出 的 葵 封 住 。 乙 块 可 以 在 装置 内 用 CaC* 和 水 来 发 生 。 由 于 圆 简 的 底 部 不 是 密封 的 ， 气 体 可 能 漏出 。 从 测 - 定 室 中 漏 失 的 气体 可 用 丙烷 或 者 丙烯 作 内 标 来 监测 ， 或 者 观测 乙 抉 的 浓度 。 用 亏 燃 还 原作 用 的 公式 计算 时 ， 应 计算 气体 的 损失 。 曾 报道 ， 水 生 植 物 的 原 位 测定 不 用 根 周 围 含 乙 抉 的 金属 圆 简 。 其 测定 方法 是 ， 利 用 这 些 植物 能 通过 导管 把 空气 传递 到 根系 的 这 一 特点 。 把 植物 的 叶子 和 根茎 密封 在 一 个 合适 的 容器 内 (和 干净 的 塑料 圆 简 或 袋子 ) ， 该 容器 的 顶部 密封 ， 取 样 口 和 底部 的 末端 浸 于 水 位 以 下 用 水 密封 。 这 样 ， 注 入 的 乙 快 迅速 地 进入 植物 体内 ， 产 生 的 乙烯 可 在 测定 室内 监测 ， 也 可 以 取 和 检 e。 6g8。 于 水 面 下 的 葵 测 定 。 取 田 间 原 位 土 柱 或 者 盆 芒 的 或 者 在 含有 评 积 物 或 人 工 土壤 的 贫 钵 或 容器 中 的 温室 生长 植 物 测定 时 ， 要 把 整个 样本 密封 在 一 个 合适 的 密闭 容器 中 ， 然 后 注入 乙 块 。 测 定时 将 剪 下 植物 的 叶子 密封 住 ， 或 者 叶子 从 密闭 的 测定 室 中 伸 出 。 原 位 和 整 株 测 定 己 烽 还 原作 用 时 ， 还 存 在 几 个 较 大 的 问题 。/ 原 状 主 桩 测定 法 是 不 方便 的 ， 各 种 测定 法 特别 是 把 土壤 放 在 温 育 瓶 测定 时 其 结果 都 不 相同 。 在 从 测定 的 己 块 还 原作 用 推断 固 氨 作 用 时 ， 充 分 认识 到 这 些 方法 的 局 限 性 是 重要 的 ， 因 为 从 巴西 田间 取 回 的 禾 本 科 原 状 王 柱 ， 不 能 立刻 还 原 乙 块 ， 所 以 ，Abrantes 等 建议 , MRR a. :应 该 在 测定 之 前 平衡 1 到 3 天。 其 他 工作 者 也 都 同 合 这 种 提 法 。 最 近 ，Van Berkum 和 iDay: 提 出 ,如 果 在 测 定 禾 本 科 秆 物 原状 土 柱 的 国 氨 酶 活性 之 间 ， 先 在 水 中 渡 几 天 ， 那 么 ， 原 位 测定 出 的 固氮 作用 的 误差 将 会 较 大 。Pasbalum notatum 的 原状 土 柱 采 后 一 周 ， 乙 拟 还 原 率 增加 一 倍 的 结果 支 持 了 这 个 观点 。 设计 原 位 法 和 整体 法 时 ， 要 把 植物 和 土壤 暴露 于 乙 抉 中 。 这 样 ， 土 壤 对 乙 抉 还 原作 用 测 定时 ,可 能 产生 的 干扰 必须 给 以 重视 。 众 所 周知 ; 土壤 微生物 在 厌 气 条 件 下 产生 乙烯 ， 随 后 ， 乙烯 又 被 其 它 土壤 微生物 氧化 ， 其 速率 是 乙烯 产生 速率 的 50 倍 以 上 。 从 而 ， 阻 止 了 戌 烯 在 大 部 分 土壤 中 的 积累 。 然 而 又 有 报道 ， 乙 烯 的 氧化 作用 受 乙 炊 的 抑制 。 因 此 ， 原 状 土 柱 漫 育 时 不 用 乙 刀 作 对 照 来 监测 内 部 乙烯 产生 是 没有 价值 的 。 忆 烯 产生 和 固 所 作用 的 要 求 是 相同 的 ， 所 以 ， 期 望 二 者 都 能 在 根 际 发 生 。 用 !4CzH4 测 定 22 BA. 在 估计 固氮 作用 时 出 现 的 较 夫 的 误 差 ， 可 能 是 由 于 把 所 得 的 乙 九 解释 为 乙 抉 还 原 的 结果 。 测定 原状 土 柱 的 固氮 酶 活性 所 受 的 于 扰 ， 也 可 能 是 乙 抉 疾 大 土壤 中 很 少 而 引起 的 。 曾 有 报道 ， 乙 燃 能 通过 土壤 从 固 氨 酶 活性 部 位 向 取样 口 缓 慢 扩 散 ， 乙 烽 和 乙烯 能 通过 极 湿 的 士 壤 剖面 扩散 表明 ,要 使 整个 样本 饱和 必须 用 乙 燃 长 时 间 的 温 育 。 然 而 ， 己 抉 是 固氮 作用 的 竞争 性 抑制 剂 ， 它 阻止 了 气 合成 气 ， 这 也 是 不 利 的 。 曾 经 指明 ,在 国 倪 系统 中 ， 氨 消耗 完 后 , ;能 进 一 步 诱导 固 氨 酶 产生 。David 和 Fay 断 定 ， 尽 管 长 时 AA CRB PARACEL 灰 的 ， 但 其 结果 是 ， 乙 据 还 原 速率 明显 地 提高 了。 这 祥 ， 可 能 会 过 高 地 估计 田间 的 固 气 作 用 ， 同 时 也 说 明 ， 短 时 间 测 定 和 在 比较 测定 中 试验 条 件 标 准 化 是 必需 的 。 一 些 工 作者 试图 修改 整体 测定 法 ， 以 消除 气体 通过 土壤 扩散 所 引起 的 问题 。 乙 燃 和 乙烯 通过 装 有 不 同类 型 的 土壤 钢 简 试验 的 结果 表明 ， 扩 获 速 率 首 先 取决 于 土壤 结构 。 粗 沙土 抵御 气体 扩散 的 能 力 较 小 ， 在 这 种 十 类 种 植 的 禾 本 科 植 物 中 ， 忆 括 还 原作 用 的 线性 速率 可 能 性 也 已 得 到 了 证 实 。Hirota 等 把 整 株 植物 放 在 一 个 干燥 器 内 ， 剧 烈 地 搬 真 空 ， 再 用 所 和 乙 业 的 混 合 气 体 代替 空气 ， 从 而 克服 了 气体 通过 土壤 扩散 时 的 阻碍 。 应 用 这 种 技术 ， 他 们 能 立即 测定 乙 抉 还 原作 用 。 另 一 种 方法 是 去 掉 土 壤 。 当 盐 沼 地 的 整 株 禾 本 科 和 水 稻 从 有 机 沉积 物 中 取出 而 其 根 不 暴 露 空气 时 ， 便 出 现 了 乙 燃 还 原 直接 的 线性 速率 。 然 而 ， 植 物 的 组 织 对 这 些 气 体 的 扩散 具有 搞 季 性 。 在 放置 水 生 禾 本 科 叶 子 的 容器 中 ， 乙 燃 和 乙烯 的 浓度 随 时 间 发 生变 化 的 曲线 表明 ， 在 固 氨 酶 活性 能 测 出 之 前 ， 气 体 已 扩散 到 植物 的 组 织 中 。 在 大 豆 和 细菌 的 纯 培 养 物 中 已 经 证 实 ， 在 乙 燃 的 线性 环 率 能 测 出 之 前 ， 这 些 气 体 在 取样 部 分 和 国 氨 位 置 间 得 到 接 衡 是 必需 的 。 因此 ， 如 果 研 究 的 目的 是 计算 乙 氧 还 原 速率 ， 那 么 我 们 建议 ， 要 根据 短 时 间 变 化 的 结果 来 确 定 线性 是 否 能 测 出 。 与 测定 原状 土 柱 的 固 氨 酶 活性 相关 的 问题 是 如 何 确定 固 气 作用 的 位 置 。 几 乎 所 有 的 禾 本 © 69 e 科 植 物 根 系 联合 固 氨 的 证 据 都 是 根据 用 冲洗 过 的 预 温 译 离 体 根 和 土壤 的 乙 烽 还 原 速率 比较 而 得 的 。 顺 状 土 柱 和 从 中 取出 的 禾 本 科 植 物 预 温 育 过 的 离 体 根 的 乙 抉 还 原 速率 之 间 的 相关 性 已 初步 确定 了 。 关于 离 体 根 测定 法 极 待 弄 清 的 问题 是 ,在 乙 灿 还 原 开 始 之 前 的 最 初 8 一 1 小 时 内 的 情况 。 离 体 根 有 固 氨 酶 活性 之 前 的 延迟 现象 ， 是 与 其 它 所 有 的 国 氮 系统 的 乙 块 还 原作 用 的 动态 不 同 ， 在 这 个 时 期 ， 活 性 持续 的 时 间 随 植物 的 基因 型 、 季 节 和 氮肥 的 处 理 而 异 ， 这 样 则 使 间 题 更 为 复杂 化 了 。 因 为 很 难 解释 为 什么 在 一 个 长 延迟 期 后 才 测 定 出 乙 燃 还 原作 用 ， 所 以 ， 离 体 根 测定 法 已 作 了 修改 。 根 在 不 加 乙 块 、 低 氧 分 压 下 温 育 过 夜 ( 预 温 育 期 ) ， 限 制 了 乙 抉 还 原 的 直接 测定 。 离 体 根 的 预 温 育 已 被 作为 制备 测定 禾 本 科 固 氨 样 品 的 常规 方法 。 应 用 这 种 固定 时 间 方法 测定 离 体 根 样 品 间 极 大 不 同 ; 这 可 以 用 在 重复 和 (或 ) 处 理 之 间 出 现 固 氨 酶 活性 之 前 ， 这 一 段 时 间 差异 很 大 来 解释 。 Dobereiner 等 推测 ， 在 测定 出 乙 抉 还 原作 用 之 前 出 现 的 长 时 间 延 迟 ， 可 能 是 从 植物 上 切 下 根 时 ， 人 氧气 进入 致使 固 氨 酶 失 活 的 缘故 。 然 而 ， 这 种 假说 与 几 个 已 报道 的 结果 不 一 致 。 P.notato 的 根 切 下 并 在 气 中 制备 的 测定 固 氨 酶 活性 ， 在 最 初 12 小 时 内 不 能 还 原 乙 块 。 然 而 ， 高 梁 根 在 预 温 育 期 后 暴露 在 空气 中 ， 在 12 小 时 内 就 能 还 原 乙 块 ， 这 也 给 某 些 禾 本 科 离 体 根 和 REAL ABE ZEA I CEE TR. HEA OMB (Scirpus) 属 根系 的 固 氨 酶 活性 的 瞬时 影响 已 经 与 大 豆 中 出 现 的 类 似 的 结果 作 了 比较 。 曾 指出 ， 预 温 育 期 过 夜 后 的 离 体 根 测 定 法 说 明了 禾 本 科 植 物 固 氨 速 率 的 潜力 。 然 而 ， 还 没有 证 据说 明 ， 预 温 育 一 脐 夜 的 离 体 根 是 能 够 反映 出 田间 植物 固 氨 潜 力 的 固 氨 酶 速率 所 必需 时 间 的 。 另 一 方面 ， 也 有 人 提出 ， 禾 本 科 植 物 固 氨 速 率 的 潜力 是 不 能 用 离 体 根 预 温 育 时 间 来 体现 的 。 预 温 育 较 长 时 间 后 切 下 的 高 梁 根 比 正常 过 夜 预 温 育 样品 的 乙 抉 还 原 速率 高 。 因 此 ， 禾 本 科 植 物 离 体 根 的 一 昼夜 预 温 育 期 和 测定 的 乙 炬 还 原作 用 不 是 植物 潜在 的 乙 燃 还 原 速率 。 离 体 根 法 和 原状 土 柱 法 的 乙 抉 还 原作 用 相 比 较 表明 ， 固 所 作用 的 估 测 值 在 这 两 种 方法 之 RRA 〈 表 1 ) 。 用 离 体 根 法 测定 的 固氮 作用 结果 估 值 偏 高 ， 而 禾 本 科 原状 土 柱 测定 和 用 从 这 些 样品 中 的 离 体 根 测 定 的 乙 块 还 原 速率 结果 不 符 。 离 体 根 测定 法 因 在 温 育 期 间 固氮 细 菌 大 量 增殖 ， 致 使 过 高 的 估计 禾 本 科 的 固 气 作用 CEQ) 。 因 此 ， 测 定 应 在 避免 微生物 增殖 的 情况 下 进行 。 Abrantes 等 表明 ， 把 根 切 下 后 立即 浸泡 在 蒸馏 水 中 ， 能 测定 出 比较 高 的 乙 块 还 原 速 率 。 他 们 推测 ， 这 种 处 理 防止 了 因 氧 气 进入 而 使 固 气 酶 完全 失 活 。 然 而 ， 他 们 又 报道 了 ， 在 这 种 方法 处 理 的 根 的 固氮 酶 活性 开始 之 前 ， 有 8 一 18 小 时 的 延迟 。 因 此 ， 他 们 关于 冲洗 和 酶 保护 之 间 相 互 关 系 的 假说 与 有 活性 固 氨 酶 具有 快速 的 和 线性 的 乙 抉 还 原 速率 的 报道 不 一 致 。 在 预 温 育 期 间 ， 高 梁 根 因 氨 细菌 的 增殖 ， 能 够 通过 不 洗涤 样品 或 者 在 低温 下 《4C) 温 育 来 防止 。 然 而 ， 这 些 处 理 也 阻碍 了 在 预 漫 育 期 间 固氮 酶 活性 的 产生 。 实 际 上 ， 乙 抉 还 原 速 率 是 与 苗 在 洗涤 瓶 中 的 洗涤 水 有 关 ,， 并 且 ， 在 离 体 根 预 温 育 期 后 ， 观 察 到 在 这 一 部 分 固氮 菌 的 数量 大 大 增加 了 。. 在 玉米 离 体 根 的 预 温 育 期 间 ， 固 氨 细 菌 厌 氧 代谢 产生 的 有 机 酸 维持 它们 旺盛 的 生长 。 而 未 经 洗涤 的 根 则 不 生长 。 固 氨 细 菌 在 预 温 育 期 间 的 塔 殖 是 因 洗 涤 步 又 所 致 。 因此 可 以 断定 ， 在 洗涤 过 程 中 根 样品 上 的 水 能 造成 厌 氧 代谢 和 产生 有 机 酸 。 这 些 物 质 释放 到 水 中 供 微 生物 增殖 。 当 结合 氮 消 耗 到 解 阻 过 时 ， 就 诱导 出 固氮 酶 活性 。 在 预 温 育 期 后 的 离 体 根 的 乙 块 还 原作 用 不 能 反映 出 禾 本 科 固 定 大 气 中 的 氮 的 能 力 。 已 经 报道 了 几 种 禾 本 科 植 物 离 体 根 的 快速 乙 块 还 原作 用 。 在 低 氧 分 压 下 测定 时 ， 预 温 育 °70° 表 1 预 温 育 离 体 根 与 整 株 禾 本 科 植 物 原状 土 柱 固 氨 作用 测定 的 比较 一 a er es” 土 柱 测定 预 温 育 根 测定 271.0b 205.0b 10° 275.00 67.0% 12° 14.5% 74.5% a3! 1.68 ， "68.0g 318 2.64 154,08 33! 200.0? 2100.0? 249 27.08 337.08 a. P.notatum 原状 土 柱 是 从 巴西 运 到 英国 ， 测 定 前 在 温室 生长 1 一 4 星期 。 b. 单位 : nmol C2H4/ 原 状 土 柱 . 小 时 。 c. D.decumbens Transvala 品 种 的 原状 土 柱 在 巴西 取样 后 1 一 3 天 测定 。 d， 单 位: nmol CzH4/ 克 根 干 重 。 小 时 。 e. BRMWC.dactylon, D.decumbens, Paspalum orbicularefilChloris truncatahy# kilz<. f. HAzospirillumB#EX (REAKM) ,美国 。 g. BA: 克 (Na) /公顷 。 天 。 h. 在 美国 用 下 列 温 室 生 长 的 植物 品种 同 4zos2z7z2Z727 一 起 温 育 进行 整 株 测定 : Penzmzizsetzm2 clandestinum, C.daetylon, zoysia japonica, Paspalum virgatum, Stenotaphrum secundatum@MDistidrilis stricta, ; I. 在 巴西 田间 生长 的 ， 生 殖 生 长 期 时 的 玉米 和 高 梁 ， 立 即 测定 原状 土 柱 。 “本 .在 巴西 田间 生长 的 高 梁 ，D .zecum8ens，Tramsvala 品 种 ， P.notatum@MB. mutica, 采集 原状 土 柱 后 立即 We. 表 2 与 禾 本 科 植 物 离 体 根 联合 的 固氮 细菌 在 预 温 育 期 前 后 的 可 能 最 大 量 预 温 育 期 后 的 细菌 数量 植 物 开始 时 细菌 数量 细菌 数量 增加 ( 倍 ) : eee 3.0X 105 1.0% 107 30 eal 1.3X105 一 2.5X105 1,0X 1081.7 108 8 S 0.15xX1C4-—1,. 0.19X 10°—3.2xX 10 5 —z 1 4 二 1.3X 104 19x 108 6 66 高 gb 0.1X 109—-8,3x 105 0.24X 107—3.3X 107 1 152 B, mutica” 1.1% 104 3.5% 108. 320 D. decumbens 0.6% 104 1.1X 108 18 “用 4zos2iriz1um 接 种 〔 温 宝生 长 植物 ) 。 b。 在 巴西 Rio de Janeiro km47 田 闻 生 长 的 植物 。 期 对 于 诱导 固氮 本 活 性 并 非 必需 。 在 温 育 期 间 也 没有 发 现 微生物 的 增殖 。 根 据 这 些 结果 提出 了 采集 到 的 根 在 空气 中 测定 时 ， 有 具有 快速 的 还 原 乙 业 的 能 力 ， 这 说 明 固氮 作用 是 同 田间 的 这 些 根 联合 的 。 在 采样 时 ， 如 果 离 体 根 不 能 快速 的 还 原 乙 块 ， 就 说 明 固氮 作用 不 是 局 它们 联合 的 ， 因 而 ， 要 探讨 不 本 科 植 物 离 体 根 的 快速 乙 抉 还 原作 用 ， 并 建议 把 这 程序 作为 筛选 国 氨 植物 的 方 法 。 禾 本 科 植 物 固氮 作用 的 新 概念 已 经 以 自然 和 栽培 的 生态 系统 中 分 离 出 许多 不 同类 型 的 固 气 细菌， 这 些 细 菌 在 环境 中 节 约 氮 及 其 对 高 等 植物 可 能 提供 的 效益 方面 的 证 据 ， 目 前 来 说 还 不 是 很 充分 的 。 在 1972 年 以 前 ， 固 所 作用 和 它 在 不 同 的 地 方 节约 所 的 重要 性 通常 都 是 以 固氮 细菌 的 多 少 来 推测 的 。 Moore 指 出 ， 根 据 国 氨 细 菌 的 数量 或 在 纯 培 养 中 测 出 的 效能 来 估 计 固 所 作用 是 不 确切 的 。 在 栽培 土壤 中 ， 自 生 的 固氮 细菌 分 布 很 广 ， 通 党 效率 很 低 。 Pa Sah * ONE A Bl FAB BAF Nb Bt Ay PA AME, ZEB ZEAE J en PB ee 0. FR a a fai 0 在 禾 本 科 植 物 上 发 现 的 氮 素 积累 和 细菌 对 根 的 侵 染 ， 已 激 起 人 们 对 监测 禾 本 科 植 物 联 合 固氮 作用 的 兴趣 。 与 光合 产物 供给 豆 科 植 物 根瘤 和 固氮 作用 之 间 的 相关 的 报道 ， 以 及 其 与 圭 壤 中 非 共生 固氮 作用 是 受 可 利用 能 量 所 限制 的 了 解 ， 促 使 人 们 对 禾 本 科 植 物 的 光合 作用 和 固 氨 酶 活性 之 间 的 关系 进行 研究 。 光合 作用 和 国 氢 酶 活性 之 间 的 关联 光合 作用 给 植物 的 氮 素 同化 提供 还 原 剂 、 能 量 和 碳 骨 架 。 豆 科 植物 的 固氮 作 用 取决 于 寄 主 供给 根瘤 内 细菌 的 光合 产物 的 多 少 。 然 而 ， 固 氮 作 用 的 位 置 远离 光合 作用 的 位 置 ， 因 此 ， 二 者 之 间 的 关联 必须 是 通过 光合 产物 的 运转 而 建立 的 。 用 乙 抉 还 原 测 定 观察 到 的 豆 科 植物 固氮 酶 活性 的 昼夜 变化 ， 表明 了 因 氨 作用 的 速率 直接 与 光合 作用 有 关 。 在 豆 科 植物 中 ， 这 种 看 法 已 为 在 上 暗 期 后 !5N 挨 入 的 测定 、! :4C 标 记 的 光合 物 在 根瘤 中 的 分 布 和 :“CO: 摊 入 到 根瘤 中 产生 的 氨基 酸 、 固 所 作用 的 增加 、 通 过 环境 中 CO， 加 富 而 产生 的 生物 量 等 证 实 。 在 禾 本 科 植 物 中 ， 光 合 产物 供 给 根 并 影响 了 固氮 作用 的 这 种 关系 ， 已 为 乙 烽 还 原 朋 夜 变 化 的 研究 和 测定 固氮 酶 活性 前 延长 植物 在 黑暗 中 温 育 时 间 所 证 明 。D6bereiner 等 报道 ,已 .xnof - afu 的 固氮 作用 与 光合 作用 关系 是 间接 的 ， 因 为 其 固氮 酶 活性 没有 昼夜 变化 ， 但 是 ， 延 长 植 te Bie Pin A Aa. HCP PREY. FA, DobereinerflDaythik f P,notatum . CHG RY AAs i eMC 活性 高 峰 期 是 在 中 午 和 晚上 。 固氮 酶 活性 对 植物 光合 作用 的 依赖 性 ， 也 用 试管 内 生长 的 高 梁 幼 苗 进 行 了 研究 。Diber- einer 和 Day 指 出 , 乙 抉 还 原 率 明显 的 昼夜 变化 ,进一步 证 实 了 国 氮 酶 活性 依赖 于 光合 作用 。 此 外 ， HE T Panicum maximum*i Lolium perennefY] CRD RRB EB 夜 变化 。 对 这 些 数 据 的 和 解释， 由 于 在 天 然 草地 上 生 长 的 Hyparrhenia sp。、 Andropogon sp,.Louoletia sim- 1ex 和 已.mraximtaumt 的 乙 烽 还 原作 用 的 昼夜 变化 而 复杂 化 了 。 水 稳 也 得 出 相反 的 数据 。 对 固氮 酶 活性 产生 影响 的 其 它 环境 因子 也 引起 了 乙 抉 还 原 速率 县 夜 变化 的 波动 。 测 定 影 响 乙 烽 还 原 速 率 的 参数 对 于 解释 光合 产物 的 供给 和 固氮 酶 活性 速率 之 间 的 相关 联 是 必需 的 。 这 个 观点 是 正确 的 ， 因 为 许多 环境 参数 影响 了 禾 本 科 植 物 的 乙 抉 还 原 速率 。 在 玉米 中 ， 国 氛 酶 活性 的 朋 夜 变化 ， 主 要 是 受 温 度 的 影响 ， 同 时 也 受 植物 接受 光 能 的 影响 ,土壤 光 度 的 昼夜 变化 与 Sorgjurz vulgare Brachiaria mutica) SRR ALY IA 可 能 有 相关 性 。 °72¢ 人 ee Gibson 也 指出 ， 豆 科 植 物 的 固氮 作 用 能 很 快 地 适应 温度 的 变化 。 温 度 对 原状 土 柱 、4zo- spirillum sp。 的 纯 培 养 物 和 固氮 酶 无 细胞 提取 液 制剂 的 乙 抉 还 原 效率 的 影响 也 已 得 到 证 实 。 显 然 ， 测 得 的 乙 据 还原 率 的 昼夜 变化 ， 并 不 说 明光 合作 用 直接 驱动 随 本 科 植 物 根系 的 固 氮 作 用 。 设计 在 昼夜 变化 中 光 强 度 ， 是 唯一 变量 的 试验 ， 用 来 测定 固 须 酶 活性 是 必需 的 。 在 这 些 条 件 下 ， 固 氨 酶 活性 速率 的 变化 可 能 仅仅 是 由 于 光照 强度 的 改变 而 引起 的 。 普 试图 在 秒 本 科 植 物 中 ， 通 过 人 饲 喂 :“*CO? 来 闪 明 固氮 酶 活性 与 光合 作用 的 关 系 。 长 时 间 温 育 离 体 根 后 的 乙 块 还 原 率 和 总 的 !“C (呼吸 出 的 CO* 和 酒精 提取 物 ) 之 闻 的 相 关 性 已 经 得 到 了 证实。 用 以 测定 乙 抉 还 原作 用 的 离 体 根 ， 在 35 小 时 的 温 育 期 间 可 能 通过 微生物 的 增殖 释 放出 所 标记 的 物质 。 已 经 报道 ,S .alternifloro 是 把 它 的 净 光 合 产物 的 主要 部 分 转 到 植物 的 生殖 生长 。 因 此 ， 驱动 细菌 固 氨 酶 活性 的 ATP 可 能 是 由 呼吸 作用 和 在 贮存 碳水 化 合 物 上 生长 而 来 的 。 这 些 碳 水 化 合 物 是 从 光合 作用 中 获得 标记 。 用 “CO: 标 记 的 贮存 碳水 化 合 物 也 能 说 明 酒 精 提 取 物 中 的 :“C 存 在 。 在 温 育 期 间 ， 离 体 根本 身 的 贮存 碳水 化 合 物 的 呼吸 作用 也 已 经 为 积累 :CO 作出 了 贡献 。 因 此 ， 用 同位 素 标记 来 研究 禾 本 科 植 物 的 光合 作用 和 固氮 作用 之 间 相 关 性 的 设想 是 值得 探讨 的 。 光 合 产物 为 植物 氨 素 同化 提供 碳 骨 架 。 因 此 ， 应 该 用 给 植物 饲 喂 COA *N 来 研究 光合 作用 和 固 氨 作 用 的 关系 。 Cs 和 C4 和 植物 光合 作用 是 植物 的 绿色 组 织 利用 光 能 同化 CO* 和 水 制造 矶 水 化 合 物 的 过 程 。 对 光 合作 用 的 生物 化 学 研究 揭示 了 与 还 原 戊 糖 磁 酸 循环 途径 (Cs) 不 同 ， 许 多 禾 本 科 植 物 具 有 C4 二 羧 酸 循环 途径 。 然而 ， 有 些 植 物 具 有 Cs 和 C4 中 间 型 的 特征 。 具 有 C4 二 羧 酸 光 合 途径 的 禾 本 科 植 物 ， 比 仅 具 有 Cs 途径 的 禾 本 科 植 物 ， 在 利用 可 利用 的 氮 所 产生 干 物质 和 固定 大 气 中 的 CO:> 方 面 更 为 有 效 。 由 此 ，Dibereiner 指 出 ， 在 禾 本 科 植 物 中 ，C4 二 涛 酸 光 合 途 径 的 植物 对 于 刺激 它们 根 际 细菌 的 固氮 作用 是 重要 的 。 这 些 作者 声称 ， 除 水 稻 外 ， 他 们 已 试验 过 的 所 有 植物 都 具有 C4 二 次 酸 途 径 以 作为 他 们 假 说 的 唯一 证 据 。Ci; 二 次 酸 途 径 对 热带 政 章 的 重要 性 一 般 都 已 被 承认 。 这 个 假说 如 果 是 考虑 了 下 述 原 因 ， 则 一 定 是 吸引 人 的 ， 即 4zosziiril1u7z 是 禾 本 科 植 物 中 主要 的 固氮 微 生物 。 已 经 报 道 ， 这 些 细菌 利用 苹果 酸 和 其 他 有 机 酸 为 碳 源 。 33k, Azospirillum brasilense 是 不 能 利用 葡萄 糖 和 妨 糖 作为 它们 生长 和 固 所 作用 的 唯一 碳 源 的 。 RIE AL (但 不 是 全 部 ) Ci 禾 本 科 植 物 [ 例 如 玉米 、 马 唐 -CDigitaeric) ] 光合 作用 的 最 初 产物 ， 由 于 苹果 酸 在 植物 中 的 积累 ， 过 量 的 芒果 酸 运 输 到 含有 细菌 的 根 中 并 用 以 固 Rio WS ARH, HRA TERK, TAL, EARNS AYALA BE HE AR 硝酸 盐 。 然而 ， 对 禾 本 科 植 物 中 氮 积 累 时 苹果 酸 作 用 的 所 有 生理 学 研究 ， 都 是 用 叶 组 织 进行 的 。 FOIA WEVA EH, ERA FEC AAP PR RES Azospirillum sp。 的 固氮 作用 这 个 假说 。 a Dibereiner 等 提出 ,具备 C+ 二 羧 酸 光 合 途径 的 热带 条 本 科 植 物 有 利于 根系 固氮 作用 。 因 为 这 些 植物 能 够 有 效 地 利用 高 辐射 能 。 然 而 , 并 非 所 有 的 C4 禾 本 科 植 物 都 局 限 在 热带 地 区 。 在 温带 地 区 已 报道 了 C4 禾 本 科 植 物 的 固氮 作用 的 研究 工作 。 此 外 也 报道 了 不 具有 C4 二 羧 酸 光 合 途 径 的 禾 本 科 植 物 有 固氮 酶 活性 ， 它 们 包括 水 稻 、 小 麦 和 其 它 的 禾 本 科 植 物 。 许多 报道 表明 ，C4 二 羧 酸 途 径 的 重要 性 和 热带 环境 是 禾 本 科 植 物 根 有 联合 固氮 酶 活性 角 重要 因素 ,不 过 这 些 都 是 利用 预 温 育 离 体 根 测定 的 。 用 C4 禾 本 科 植物 整体 测定 的 研究 表明 ， 它们 的 固氮 酶 活性 很 低 或 者 没有 活性 。 关 于 在 禾 本 科 植 物 中 ， 高 效 的 光合 作用 是 否 能 维持 较 高 的 固氮 率 ， 目 前 没有 确切 的 数据 。 因 此 ， 在 这 个 假说 确证 之 前 ， 有 必要 对 不 同 条 件 下 代表 不 同 光 合 途径 的 植物 的 固氮 作 用 进行 对 比 研 究 。 未 本 科 植 物 固 氮 作 用 的 个 体 发 育 和 季 市 性 变化 在 豆 科 植物 中 ， 已 经 提出 了 比较 不 同 共 生体 系 周期 的 有 用 参数 ， 尽 管 在 不 同 种 的 豆 科 植 物 中 ， 它 们 存在 着 较 大 的 差异 ， 但 是 ， 当 用 乙 抉 还 原 法 测定 时 ， 是 以 预计 栽培 作物 的 产量 或 其 所 需 肥料 量 。 由 于 这 个 理由 ， 测 定 禾 本 科 植 物 整 个 生命 周期 的 固氮 酶 活性 变化 是 贷 有 兴趣 的 ， 它 有 可 能 研究 氮肥 使 用 和 固氮 作用 间 的 关系 。 已 经 用 离 体 根 和 原状 土 柱 测定 技术 进行 了 研究 。 BAR: GPa T Pennisetum purpureum*#i Transvala 品种 的 Digitaria decumbens 体 根 固氮 酶 活性 的 季节 性 变化 。P.burburexymz 的 根系 活性 在 炎热 的 夏季 , 当 植 物 迅 速生 长 的 最 高 ， 在 开花 后 ， 活 性 降低 。 刀 .decuwrmzbens 离 体 根 中 国 氛 酶 ， 在 其 达到 最 大 活性 之 前 就 已 测 出 To . Hh, SULA 3 Wa 3G PA AS BY A HR PE IK PARSE 豆 科 植物 的 4.prc- silense 纯 培 养 和 其 它 禾 本 科 体 系 中 观察 到 HAA, ZAAAMHMBRAFE. XK 种 结合 氮 疫 有 抑制 固氮 酶 活性 的 原因 ， 可 能 是 与 施 用 氮肥 方式 〈 每 两 周 20 公 斤 氮 / 公 项) 及 所 用 的 测定 方法 〈 施 氮 两 周 后 切 根 ) 有 关 。 下 面 将 讨论 植物 的 个 体 发 育 、 施 肥 与 离 体 根 测定 的 关系 。 曾 报道 了 在 玉米 生命 周期 中 ， 离 体 根 测 定 的 固氮 酶 活性 的 差异 。 最 高 活性 是 在 “75 儿 的 抽 丝 期 ”。Daibereiner 指 出 ， 尽 管 在 处 理 和 对 照 植 物 间 没 有 统计 学 上 的 差异 ， 但 是 ， 植 物 叶 片 施 用 钥 酸 贸 后 ， 固 氨 酶 活性 提高 了 。Pexeira 等 确证 了 玉米 在 生殖 生长 期 ， 离 体 根 的 固 氛 酶 活性 最 高 ， 高 梁 也 一 样 。 但 是 在 开花 期 ， 叶 面 施用 钼 后 ， 离 体 根 的 固氮 酶 活性 也 大 大 提高 To 施用 氮肥 大 大 地 降低 了 玉米 和 高 梁 整 个 生育 期 的 离 体 根 的 固氮 酶 活性 。 尽 管 吸收 了 氮肥 的 高 梁 的 离 体 根 的 乙 抉 还 原 速率 ， 在 生育 期 间 大 大 降低 了 了 ， 但 是 ， 植 物 得 到 了 高 和 低 水 平 的 氮肥 后 ， 甚 离 体 根 的 固氮 酶 活性 变化 是 平行 的 。 豆 科 植物 的 乙 烽 还 原 速率 ， 在 开花 和 生殖 生长 期 时 最 大 。 因 此 ， te FRA HIN et, FE To da PAS PAS AR 9d Se TTB ME 9 2S EF ES ae PE TE A EE 2 AR Fi in | BS PR ARTE UE Yo 4 9h ES: TS VE P,Q, BRA AR REE AR AS BLA: Pe 的 固 氛 酶 活性 的 差异 。 高 梁 离 体 根 的 无 活性 期 是 随 植物 的 个 体 发 育 而 变化 ， 在 开花 期 时 最 短 。 这 时 ， 用 预 温 育 “ene 离 体 根 法 按照 固定 时 间 测 定 ， 它 们 的 固 氛 酶 活性 最 高 。 失 活期 间 重复 差异 是 与 固 氛 酶 诱导 而 使 乙 烽 还 原 速率 呈 非 线性 相关 联 的 ， 这 可 能 是 由 于 从 植物 的 不 同 生 育 期 取 下 根 时 ， 在 固定 测 定时 间 内 ， 乙 烽 还 原 速率 的 改变 所 致 。 在 用 结合 所 处 理 和 田间 氮肥 处 理 中 ， 低 所 区 ROAR CR ORE EK i Ke Fe, ZEB SAREE Th A TS PE & Td LH BE EY ZR I a TL 也 可 以 用 离 体 根 在 固定 时 间 测 定时 观察 到 的 结合 氮 对 固 气 酶 活性 的 明显 抵制 作用 来 解释 。 由 于 已 记录 了 在 离 体 根 预 温 育 期 固氮 微 区 系 的 增殖 ， 所 以 ， 在 禾 本 科 植 物 中 观察 到 的 固 氨 酶 活性 的 季节 性 变化 ， 可 以 用 根系 维持 微生物 增殖 和 固 气 酶 活性 发 生变 化 来 解 酸 。 细菌 的 生长 和 来 自 离 体 根 腐 解 的 、 相 对 有 效 的 、 结 合 氮 的 变化 一 起 ， 也 可 用 以 解释 已 观察 到 的 固氮 酶 活性 随 植 物 个 体 发 育 的 变化 和 施 氛 肥 的 抑制 作用 。 在 玉米 和 高 粱 的 固氮 酶 活性 的 季节 性 变化 中 ， 结 合 氮 所 起 的 诱导 作用 是 用 对 离 体 根 的 乙 抉 还 原作 用 和 叶 中 硝酸 还 原 酶 活性 相互 关系 的 研究 来 证 实 。 硝 酸 既 是 植物 中 硝酸 还 原 酶 诱导 剂 ， 又 是 它 的 底 物 。 已 经 表明 ， 影 响 硝酸 吸收 和 运输 的 因子 是 改变 硝酸 还 原 酶 活性 水 平和 把 还 原 态 所 供给 植物 的 速率 。 在 玉米 和 高 粱 中， 叶子 中 硝酸 还 原 酶 水 平 是 随 植物 年 龄 而 发 生变 化 。 用 预 坎 育 离 体 根 测 定 出 最 大 的 固 氨 酶 活性 速率 与 叶 中 低 硝酸 还 原 酶 活性 水 平 相符 。 由 此 有 可 能 推断 ， 叶 子 硝酸 还 原 酶 活性 水 平 的 下 降 说 明 植 物 包括 其 根系 中 结合 态 氮 的 水 平 较 低 ， eles ebsites cain isi 原作 用 时 固氮 酶 诱导 活性 之 前 延迟 期 较 短 。 尽管 离 体 根 测定 法 清楚 地 表明 了 植物 生育 期 中 的 固氮 酶 活性 的 差异 ， 但 是 ， 很 可 能 它 不 能 反映 氮 通 过 生物 固氮 作用 进入 植物 体内 的 变化 。 实 际 上 ， 在 植物 生育 期 中 的 乙 抉 还 原 速率 的 差异 ， 反 映 出 离 体 根 维持 预 刘 育 期 间 的 微生物 生长 和 固氮 酶 活性 的 能 力 ， 是 随 植物 的 年 龄 ms. 原状 土 柱 : 也 曾 用 测定 禾 本 科 原 状 土 柱 的 乙 抉 还 原作 用 来 研究 固氮 酶 活性 的 季节 性 变 化 ， 但 是 ， 还 不 能 说 明 这 些 差异 是 否 与 植物 个 体 发 育 有 关系 。Balandreau 采 用 原 位 测定 系统 测定 了 玉米 生长 周期 中 的 己 块 还 原 速率 。 据 报道 ， 植 物 在 发 育 期 和 营养 生长 稳定 后 ， 固 氨 酶 活性 速率 增加 了 。 他 假定 ， 在 植物 营养 生长 后 期 ， 光 合作 用 能 力 达到 最 大 ， 最 大 的 固氮 速率 的 产生 是 取决 于 这 种 能 力 的 。 在 植物 的 生殖 生长 期 ， 固 氛 酶 活性 速率 没有 进一步 的 变化 ， 气 酶 活性 速率 与 植物 的 个 体 发 育 没 有 关系 。 也 已 报道 了 威斯康辛 大 草原 的 17 种 牧草 的 固氮 酶 活性 的 季节 性 变化 。 在 已 测定 的 两 种 收 草 中 ， 画 所 酶 活性 是 随 叶 子 的 生长 而 平行 升 高 ， 随 叶子 的 衰老 而 降低 。Tijieprema 和 Burris 指 出 ， 这 个 结果 表明 ， 乙 块 还 原作 用 是 受 细菌 影响 的 ， 这 些 细菌 依赖 笋 革 供 给 能 量 。 然 而 ,在 已 测定 的 其 它 5 种 中 ， 未 曾 证 实 ， 其 乙 块 还 原作 用 是 与 专门 植物 相 联合 。 还 没有 证 明 ， 固 氛 酶 活性 变化 是 怎样 同 植 物 的 个 体 发 育 相关 的 。 水 稻 的 固氮 酶 活性 的 季节 性 变化 ， 是 与 植物 的 个 体 发 育 有 关 。 用 整 株 测 定 已 经 指出 ， 在 生殖 生长 时 期 时 ， 乙 抉 还 原 速率 最 高 。 有 趣 的 是 ， 尽 管 已 报道 用 水 稻 离 体 根 测定 法 证 明 固 氛 酶 活性 的 季节 性 变化 ， 但 是 ,最 大 活性 和 个 体 发 育 间 的 关系 没有 报道 。 盐 沼 地 的 S .alterwir - loralil 3 is 74 VE te Ba Ea 2S {E 豆 科 植物 固氮 作用 效率 的 提高 与 生殖 生长 时 期 是 一 致 的 。Hardy 等 指出 ， 发 育 中 的 豆 类 是 贮存 结合 氮 的 场所 ， 它 促进 高 效率 的 固 扰 作用 。 禾 本 科 植 物 乙 块 还 原作 用 的 最 大 速率 也 是 由 开花 历 引 起 的 ， 与 豆 科 植物 的 礼 理 相似 。 这 种 假说 的 局 限 性 在 于 研究 这 些 禾 本 科 植 物 的 固 氨 酶 活性 的 季节 性 变化 时 ， 采 用 的 是 间接 测定 法 。 在 开花 时 ， 玉 米 和 高 梁 根 系 是 发 言 完 全 的， 这 是 维持 最 大 固氮 酶 活性 所 必须 的 先决 条 件 。 也 曾 报道 ， 玉 米 和 高 粱 开花 时 占 优 势 的 根 类 型 维持 预 温 育 期 后 的 最 大 乙 抉 还 原 速率 。 这 个 可 能 ， 是 在 这 些 钞 本 科 植 物 中 观察 到 的 ， 固 氨 酶 活性 的 季节 性 变化 起 作用 的 因素 。 已 经 提出 ， 最 高 的 固 氨 酶 活性 速率 是 与 最 大 的 光合 作用 一 致 的 ,， 并且, 在 最 大 速率 后 出 现 的 固氮 酶 活性 的 降低 由 于 在 胚珠 和 根 之 间 竞 争光 合 产物 的 结果 。 另 一 方面 ，Vcn Btilow 和 Da6bereiner 已 经 指出 ， 玉 米 根 的 固氮 酶 活性 不 与 植物 的 其 它 部 分 竞争 光合 产物 。 关于 秒 本 科 植 物 的 固氮 作 用 的 周期 知之 甚 少 。 对 这 个 过 程 与 植物 体内 其 它 过 程 的 相互 关 系 知 之 更 少 。 许 多 仅仅 是 用 不 充分 的 证 据 ， 来 做 出 很 多 解释 和 推测 的 。 土 卉 湿度 对 固 氨 酶 活性 的 影响 Day 等 在 洛桑 的 Broadbodk 研 究 氨 的 收益 时 ， 注 意 到 从 湿地 取 来 的 原状 土 柱 的 固 氨 酶 活 性 速率 较 高 。 他 们 报道 ， 原 状 土 柱 的 固 氨 酶 活性 速率 与 土壤 湿度 呈正 相关 ， 己 块 还 原 速率 随 土壤 温度 的 线性 提高 而 呈 指 数 提 高 。V-assak 等 报道 了 在 土 培 湿 度 和 草地 原状 土 柱 的 固 氨 作 用 之 间 的 类 似 相关 性 。Day 等 假定 ,在 土壤 颗粒 和 根 际 ， 厌 气 性 有 机 体 的 量 是 随 土壤 温度 的 提高 而 提高 并且 POs 影 响 了 固 氨 酶 活性 。 他 们 的 假说 得 到 了 支持 ， 即 在 N? 条 件 下 温 育 原 状 士 柱 的 乙 据 还原 速率 比 在 空气 条 件 下 的 高 。 土壤 湿度 和 固 气 了 酶 活性 速率 之 间 的 关系 与 所 报道 的 D. decumbens sr 效率 和 土壤 水 分 含量 之 间 无 相 关 性 是 互相 矛盾 的 。 然 而 ,这 个 是 根据 预 温 育 离 体 根 的 固氮 酶 效率 结果 测定 的 。 像 已 解释 过 的 那样 ， 这 种 测定 方法 包括 在 预 温 育 期 之 前 ， 用 蒸馏 水 冲洗 根 。 在 预 温 育 期 冲洗 很 ， 是 细菌 增殖 和 诱导 固氮 酶 活性 所 必需 的 。 因 此 ，Abrantes 等 通过 冲洗 根 ， 正 是 在 最 适 水 分 条 件 下 测定 国 氨 酶 活性 的 。 已 报道 的 在 土壤 水 分 和 国 氨 酶 活性 之 间 的 正 相关 性 ， 支 持 了 在 湿 土 中 提高 了 不 结 瘤 植物 的 联合 固 氨 作 用 的 假说 。 水 地 植物 联合 的 固 气 酶 活性 已 经 报道 是 普遍 存 在 的 ， 并 且 比 生长 在 湿 土 或 干 土 的 植物 的 联合 固氮 酶 活性 还 要 高 些 。 这 些 结果 指出 ， 禾 本 科 植 物 的 生长 环境 是 产 生根 联合 固 氨 作 用 的 重要 因素 。 湿 环境 对 禾 本 科 植 物 固氮 作用 的 重要 性 能 够 解释 为 什么 农业 上 重要 的 禾 谷 类 植物 ， 在 用 原状 土 柱 测定 时 ， 其 乙 烽 还 原 速 率 一 般 都 低 ， 而 那些 盐 沼 地 植物 和 水 稳 就 高 。 已 经 指出 ， 这 些 水 生 环境 和 高 湿度 土壤 ， 由 于 反 硝 化 作用 和 硝酸 盐 的 淋 失 ， 其 少 效 氨 是 很 低 的 。 如 果 过 量 水 分 的 作用 是 使 环 境 .中 抑制 固 氨 作 用 的 结合 氨 的 水 平 贫 化 ， 那 么 ,控制 旱 地 植物 的 联合 作用 克服 这 个 问题 是 可 能 的 。 植 物 we 种 为 改善 维持 固氮 酶 活性 的 能 力 而 选 育 禾 本 科 植 物品 系 ， 以 及 最 终 从 固氮 作用 中 受益 ， 有 束 于 测定 这 些 过 程 的 可 靠 性 。 如 果 没 有 确切 地 区 分 禾 本 科 固 REA MEERA, Fp 么 ， 改 良品 种 的 选择 一 定 是 不 会 成 功 的 。 目 前 ， 还 没有 适用 于 选择 理想 基因 型 的 秒 杯 科 植 物 AUER, WEARS TRE. ARPA, Ce ile HPPA Ail ea a AS EW TK AE AS REE BS GP DY a HAA 。76。 作用 的 晶 系 分 开 。 然而 ， 已 经 有 人 提出 ， 植 物 育种 可 以 提高 禾 本 科 植 物 固氮 作 用 的 可 靠 性 。 研 究 忆 .nota- 妃 zz 的 结果 已 揭示 了 固氮 细菌 Azotobacter bosb1i 是 专 性 地 与 5 种 四 倍 体 的 生态 型 联合 。 在 33 种 四 倍 体 生 态 型 中 仅 有 5 种 能 促进 4. pasbza17i 在 根 际 生 长 。 已 经 指出 其 它 的 微生物 〈 例 如 苗 根 真菌 ) ， 可 能 处 于 这 种 联合 体 之 中 。 这 些 报道 是 有 意义 的 ， 因 为 这 些 结 果 不 是 依赖 于 乙 刀 还 原 的 测定 ， 而 是 根据 对 植物 刺激 特异 性 细菌 生长 的 能 力 的 研究 而 得 到 的 。 不 幸 的 是 ， 对 这 种 联合 的 微生物 的 生态 学 的 深入 研 究 还 没有 报道 。 在 测定 土壤 微生物 生态 系统 时 ， 有 趣 的 是 确定 根 是 否 优先 促进 了 特异 细菌 及 同时 损害 了 在 土壤 微生物 生态 系统 中 的 其 他 微生物 。 在 4。bbasbalii 存 在 的 情况 下 ， 这 种 认 识 是 有 意义 的 ， 因 为 已 经 报道 了 这 些 细菌 是 留 在 根 外 的 ， 并 且 是 属于 竞争 空间 和 养料 的 细 菌 。 而 且 ， 为 什么 5 种 四 倍 体 生 态 型 特异 地 刺激 这 种 固氮 微生物 ? 它们 是 以 什么 方式 作用 的 ? 搞 清 这 个 特异 的 联合 ， 可 以 培育 出 能 刺激 在 其 根 际 生 长 理想 细菌 的 植物 。 如 果 这 个 结果 是 与 产生 侵 桨 过 程 有 关 ， 那 么 ， 在 禾 本 科 植 物 和 固 氛 细菌 之 间 的 真正 共生 体 就 能 实现 。 使 用 现 有 的 测定 固氮 的 技术 ， 已 经 发 现在 禾 本 科 植 物 不 同 品 种 和 品系 中 间 ， 其 根 刺 激 固 ABTA TEND RE DA le]. Von Biilow 和 Da5bereiner 用 离 体 根 测定 法 ， 证 实 了 从 UR-1 衍 生 的 玉米 SIBO 系 都 具有 较 高 的 固氮 酶 活性 。 在 已 .notatuzz， 书 .burburer2 和 小 麦 中 也 发 现 了 基因 型 的 差异 ， 这 些 数 据 主要 局 限 性 在 于 它 是 用 离 体 根 测 定 乙 抉 还 原 速 率 的 。 如 已 讨论 过 的 那样 ， 在 预 温 育 后 离 体 根 的 乙 业 还 原 的 高 数值 ， 可 能 反映 出 某 些 根 维持 生长 的 能 力 较 大 ， 其 后 固氮 菌 的 固氮 酶 活性 就 越 强 。 未 本 科 植 物 固氮 作用 的 5N: 测定 只 有 从 ”“N? 摊 入 的 `"N 获 得 的 数据 ， 才 能 够 用 以 得 出 禾 本 科 植 物 从 根 联合 固氮 作用 中 直 接受 益 的 结论 。 实 际 上 ， 植 物 应 该 在 田间 正常 生长 条 件 下 暴 露 于 !s5Ns 中 。 测 定 :5Ns BAN 主要 局 限 性 ， 是 大 部 分 重要 禾 本 科 植 物 的 体积。 把 这 些 大 植物 暴露 于 :“Nz 需 要 大 体积 的 容 器 。 那 样 ， 这 些 试 验 费 用 就 相当 高 了 。 因 此 ,我 们 认为 ， 乙 妃 还 原 测 定 是 确定 ONT A 测定 在 植物 中 具有 固氮 作用 的 方法 。 De-Palli 等 把 :*N2z 摊 入 到 已 .rotafu 和 万 .decu7zrpens 中 去， 从 而 证 实 了 这 两 种 牧草 的 固 有 倪 作 用 ， 这 些 数据 也 常用 来 说 明 其 它 植 物 的 乙 抉 还 原作 用 ， 同 时 ， 也 可 证 明 它 们 能 丛 固 氛 作 用 中 受益 。 尽 管用 这 两 种 牧草 证 实 了 :!sNs? 的 摊 入 ， 但 是 ， 在 从 田间 取样 和 实验 之 间 相 隔 较 长 时 间 “〈 在 4 一 16 天 之 间 )。 因 此 ， 获 得 的 富 集 度 不 能 推断 固氮 作用 速率 ， 并 且 ， 在 :5Ns? 挨 AFA CPR VR NAN AS BE WEFT EE BR FAA 40 a PTET MITE AR HT ON, BA. (BE, ARR MA. JSF fh PPR EM EB ONG EBD, (AsbRuschei#t-R, HOR 幼苗 的 固氮 量 每 天 每 公顷 27460 ,27823, 858 Z ial. FACE HH lal Ae ai A HE AR FEA, FEM RAHA ON. i ARPA Ea oe EA 固氮 细菌 可 能 有 是 研究 最 广 的 土壤 微生物 之 一 ， 尽 管 这 样 ， 但 对 于 它们 在 自然 界 中 的 生物 学 和 它们 对 所 处 环境 的 结构 和 功能 的 贡献 了 解 得 还 很 少 。 在 所 有 的 固氮 生物 中 ， 只 是 对 豆 科 ea77 。 植物 的 共生 体 根瘤 菌 ， 做 了 略为 详尽 的 研究 。 然 而 ， 对 于 这 些 有 机 体 ， 我 们 的 大 部 分 知 识 都 来 自 于 对 处 于 根瘤 中 的 根瘤 菌 的 研究 。 关 于 对 土壤 和 根 际 群落 中 的 自生 菌 的 生态 学 了 解 却 很 少 。 许多 不 同属 的 固氮 菌 在 各 种 牧草 根 际 的 数量 较 高 ,在 它们 中 间 最 重要 的 是 4zosbiri1yurz， .44zotobacter、BeijerincRiac 和 Derxia 属 的 一 些 成 员 。 然 而 ， 如 果 仅 有 这 些 细菌 ， 既 使 它们 数量 大 ， 也 不 能 认为 是 重要 的 节约 氮 体 系 。 问题 是 方法 学 。 因 为 在 一 个 极为 复杂 的 环境 中 ， 如 在 土壤 中 要 把 涉及 两 种 有 机 体 间 的 相 互 作用 的 多 种 因子 区 别 开 来 是 很 困难 的 。 首先 必须 了 解 土壤 中 的 固氮 菌 和 根 际 之 间 的 生态 学 关系 ， 以 便 控制 这 个 体系 ， 从 而 获得 最 大 的 经 济 效益 。 试 管 是 不 能 提供 合适 的 生物 自然 环境 的 模型 的 ， 因为 模拟 过 多 的 自然 界 中 起 作用 的 关系 是 不 可 能 的 。 优 良品 种 和 在 试验 室 创造 的 改进 的 突变 体 之 间 的 生态 学 相互 关系 很 小 ， 也 没有 什么 农业 价值 。 新 的 探讨 和 方法 学 对 于 直接 研究 自然 环境 中 有 机 体 是 必需 的 。 最 近 的 几 篇 述评 ， 已 经 详尽 地 益 述 了 非 共 生 联 合 的 固氮 细菌 。 在 这 里 我 们 仅仅 考虑 微 生 物 的 某 些 一 般 生 态 学 特征 ,并 专注 重 于 在 热带 土壤 中 的 4zospirilluxz 和 它 与 热带 牧草 根 的 关 系 。 对 于 进一步 的 细节 ， 请 参阅 Day，Knoules，Neyra 和 Di6bereiner 的 最 近 的 综述 。 分 布 和 生物 地 理学 在 自然 界 中 ， 固 氮 生 物 是 分 布 很 广 的 。 在 品种 繁多 的 水 生 和 陆 生 环境 里 ， 丛 地球 的 两 极 地 区 到 热带 地 区 ， 都 已 经 发 现 了 其 存在 。 其 中 有 一 些 在 生态 分 布 上 是 很 窗 的 ,例如 Beiyerin- chiac， 尽 管 在 温带 土壤 中 也 有 ， 甚 至 在 两 极地 区 存在 ， 但 是 ， 它 仍 被 限 制 在 热带 地 区 。.4。 basbali， 尽 管 具有 自生 固氮 能 力 ， 但 是 已 表明 ， 它 被 局 限 在 已 .rotatuzz 的 某 些 四 倍 体 品 种 的 根 际 。 Azospirillum sp。 已 经 从 温带 和 热带 地 区 的 多 种 植物 根 上 和 土壤 中 分 离 出 来 。 多 数 研 究 者 认为 ， 这 种 有 机 体 只 有 在 热带 地 区 才 具 有 特殊 的 意义 。 Schroder 发 现在 取 自 德国 和 奥地利 的 76 个 土 样 中 ， 除 2 个 外 都 有 固 氨 螺 菌 。Dabereiner 等 报道 ， 取 自 温 带 地 区 土壤 和 根 含 有 4zostirillum 的 不 到 10% ， 而 50% 以 上 的 热带 样品 是 正 结果 。 训 积 土壤 比 受 侵 蚀 的 岩石 土壤 更 适合 4zosbirilluz 生 长 。 然而 土壤 的 pH 严重 地 影响 了 Azoszbirillum 的 分 布 〈 最 适 pH 是 7 ) ， 但 是 ,在 pH 低 于 4.。8 Ay +t, Azospirillumi® (BATE Azospirillum#y > & 革 兰 氏 阳 性 固氮 螺 菌 ， 最 初 被 名 为 Spirilluz lipoferum. *Hi Azospirillum 属 中 至 少 HY 4} a 4 FR —— A. brasilenseM Azospirillum lipof erum 。 这 些 种 在 生理 学 范畴 和 DNA 同 系 物 上 是 不 同 的 。 最 近 ， 用 免疫 荧光 和 免疫 扩散 的 研究 也 表明 了 它们 的 抗体 有 所 不 同 。 4.brasilense 含 有 两 个 亚 种 一 一 nir* 和 nir ， 这 是 依据 它们 反 硝 化 亚 硝酸 的 能 力 区 分 的 。 这 两 个 亚 种 都 具有 同化 和 异化 硝酸 还 原 酶 的 能 力 ， 但 是 4.prasilense nir 不 能 异化 亚 硝 酸 。 根 据 4.1ibeferwm 利 用 葡 殴 糖 作为 碳 源 和 对 生物 素 的 需 求 能 力也 能 把 它 和 4.brasilense 区 分 开 。 “78° 四 血清 学 分 析 已 经 揭示 了 4zospirillam 的 种 和 亚 种 的 差别 。 免疫 扩散 研究 表明 ， 至 少 有 一 个 热 不 稳定 的 凝 胶 扩 散 的 抗原 ， 它 是 属于 不 同 的 4zoszairillum 亚 种 的 27 个 品系 所 共用 的 。 而 ， 热 稳定 的 抗原 是 更 为 专 一 的 。 免 疫 荧光 也 表明 了 品系 和 种 的 差 并 ， 但 是 ， 随 着 培养 物 的 年 龄 ， 它 们 互补 反应 的 程度 也 提高 了 。 个 体 生 态 学 关于 土壤 和 根 际 中 的 4zosbirillum 的 个 体 生态 学 的 重要 间 题 ， 仍 然 没 解答。 这些 问 是 直接 与 根 上 4zospirillam 微 环境 的 特性 ， 以 及 这 个 微 环 境 的 生态 学 参数 有 关 。 细 菌 在 土壤 中 远离 它 的 自然 微 环境 时 的 行为 以 及 由 于 播种 前 进入 到 新 环境 中 的 特殊 的 4zospirillum 品 系 的 命运 都 是 有 关联 的 。 研究 这 些 问题 的 困难 仍然 是 方法 学 问题 。 免 疫 荧光 也 许 是 唯一 的 在 自然 界 中 直接 研究 特 LT GBA) 的 方法 ， 并 且 为 研究 4zoszirillum 与 它 的 微 环境 关系 提供 了 唯一 的 机 a ; #2 Azospirillum spp. 血 清 学 方面 有 用 的 信息 ， 对 于 需 要 用 试验 来 探讨 那些 有 关 的 问题 ”可 能 是 有 价值 的 ,并 且 具 有 生态 学 意义 的 。Schank 等 ， 在 取 自 田间 生长 的 接种 后 植物 根 和 根 际 制 剂 中 发 现 了 4。brasilense 的 最 早 和 尝试， 是 令 人 项 舞 的 。 然 而 ， 定 量 的 研究 对 于 鉴定 这 些 ”细菌 在 禾 本 科 植 物 根 际 的 作用 也 是 必需 的 。 根 际 竞 争 和 联合 的 特异 性 根 际 是 异 养 型 固 氨 细 菌 生长 的 理想 环境 。 根 细胞 夸 片 的 有 机 物 和 根 分 滋 的 可 溶性 物质 是 ” 能 满足 固 气 细 菌 需要 的 能 量 和 碳 素来 源 。 然 而 ， 这 些 细菌 必须 达到 非常 高 的 群体 密度 ， 才 对 植物 有 意义 。 在 豆 科 植物 体系 中 ， 菌 和 植物 之 间 的 极为 密 续 的 联合 已 经 形成 了 。 在 植物 产生 ”的 根瘤 中 ， 微 生物 控制 了 一 个 特殊 的 共生 环境 。 在 条 本 科 植 物 联合 体 中 ， 这 种 密切 的 关系 是 — a —_ 不 明显 的 。 | BARA, 自生 蜡 养 固氮 细 菌 是 一 种 完全 竞争 性 的 根 际 有 机 体 ， 它 们 生存 于 各 种 植物 的 。 根 际 。 然而 ， 通 过 联合 生物 的 固氮 作用 使 植物 受益 的 程度 还 没有 测定 出 来 。 砷 共生 团 氨 作用 可 能 "固氮 微生物 的 生长 密切 相关 汪 因 此 ， 固 须 量 直接 与 特殊 环境 刺激 的 细菌 的 相应 生长 成 正比 。 有 关 根 际 非 共生 固氮 菌 的 群体 生态 学 的 资料 很 少 。 研 究 这 个 问题 需要 直接 的 方法 ， 应 该 】 在 原 位 上 鉴定 有 益 的 生物 。 应 用 免疫 荧光 直接 在 土壤 和 根 际 进行 非 共 生 固 氨 作 用 的 个 体 生态 和 学 研究 是 有 希望 的 ， 但 是 ， 还 必须 更 详细 更 定量 的 研究 根 际 非 共 生 固 氨 菌 的 群体 生态 学 。 如 果 能 够 建立 密切 的 联合 ， 那 么 ， 在 固 氛 菌 和 植物 三 者 间 的 竞争 优势 将 会 很 大 。 理 想 的 | RAR, CRHURDASEZA, ANRC RO Liner Re EM rsIe 的 数量 ， 其 它 的 微生物 ， 例 如 菌 根 真 菌 和 共生 固氮 的 放 线 菌 Frankia 也 能 占据 根 细胞 内 和 细 人 孢 间隙 ， 并 且 同 它们 的 寄主 植物 建立 高 度 紧密 的 配合 。 已 经 间接 的 得 到 在 根 内 有 非 共 生 固氮 细菌 的 证 据 。4zospiriliurn 已 经 从 表面 无 菌 的 曙 间 生 长 的 禾 本 科 植 物 根 中 分 离 出 来 。 已 经 表明 ， 这 种 生物 能 穿 透 在 Fahraeus 胶 片 盒 中 生长 的 已 .maiiman 根 系 。Diem 等 报道 ， 固 氮 细 菌 能 从 表面 灭 过 菌 的 水 稻 根 中 分 离 出 来 ， 但 是 ， «79 。 只 是 当 根 被 压 碎 而 释放 出 细菌 时 才能 得 到 。 Di5bereiner 和 Day 观 察 到 ， 在 预 温 育 期 后 有 乙 抉 还 原 活 性 的 根 雁 片 具有 还 原 四 氮 杂 套 能 力 , 并 有 类 似 细 菌 颗粒 包 衷 着 的 细胞 。Fatriaum 和 D5bereiner 还 发 现 ， 在 有 些 植 物 的 皮层 、 内 胚层 、 木 质 部 和 中 柱 细 胞 的 内 部 和 细胞 间 的 空间 里 有 还 原 匹 气 杂 成 的 类 似 于 细 葛 的 结构 。 除了 根瘤 菌 和 豆 科 植物 系统 外 ， 对 于 在 固氮 细菌 和 植物 之 间 联 合 的 特异 性 知之 甚 少 。 A, paspaliZi EAs? L(V FE BRE P notatumh@ BME, B—-HH. Beijerinkiala 热带 植物 的 根 际 联合 ， 如 甘蔗 、 水 稻 和 Cyperus 等 。4zosbirillumz 被 认为 是 生长 在 多 种 植物 的 根 际 。Baidani 和 Dabereiner 曾 提出 ， 只 有 特殊 的 种 能 与 部 分 寄主 植物 产生 内 共生 联合 。 从 田间 生长 的 玉米 根 上 分 离 出 来 的 4zosairillam 总 是 4.1ipoferuwz， 而 那些 sn apie Ay BRAS E BA. brasilense nir 。 用 固氮 细菌 接种 ， 豆 科 植 物 一 根瘤 菌 共 生体 系 ,是 积累 用 以 农业 生产 中 一 个 好 的 例子 .已 经 发 展 了 许多 用 固 所 细菌 接种 植物 和 评价 建立 的 共生 体系 的 技术 。 用 玉 大 zobiuF 接 种 豆 科 植 物 是 必需 的 ， 因 为 已 经 表明 ， 许 多 土壤 缺少 能 使 栽培 植物 有 效 结 瘤 的 Rhpizzobiutz 品 系 。 据 报道 Azospirillum | 通常 是 生活 在 热带 土壤 中 ， 而 在 温带 国家 土壤 中 虽 有 但 也 较 少 。 通 过 接种 4zos 疝 7121， 在 玉米 根 上 〈 在 此 这 些 细菌 数 很 少 ) 生存 的 可 能 性 已 经 提出 来 了 。 期 望 用 这 些 细菌 接种 粮食 作 ， 物 和 和 玫 本 科 牧 草 ， 使 它们 能 通过 生物 固 所 作用 提高 产量 。 预 温 育 的 玉米 离 体 根 具有 较 高 的 乙 FRAG JAE 6 TG HE, ESEH A Azospirillum spp... 这 为 接 种 的 前 途 提 供 了 依据 。 要 强调 指 | 出 的 是 ， 从 未 本 科 根 上 分 离 出 来 的 4zospirillum spp. BK A il € BaF HAOCRO RE 用 ， 这 说 明 在 那 时 ， 细 菌 增殖 并 且 诱 导 了 固氮 酶 活性 。4zospirillum 是 否 是 才 本 科 原 位 测定 ， 时 的 主要 固 氨 酶 活性 来 源 还 没有 被 证 实 。 此 外 ， 也 没有 证 据 表 明 ，.4zosjirilia 元 的 固 气 酶 活 pei pital nieces Alb. FA Azospirillum MRAP DED SEARLE Ply LARA. xt A § FE THE GOLA Hn tA A PP | 性 来 推论 的 。 实 际 上 可 能 很 少 或 者 无 效 。 HE fie FAS ETT AY AP Re He, AO 1ST OH iy be 2 453 A FEB Azospiril- lum. —#P4:D.decumbens, B—PEP. maximum Aw. STeixe 细菌 的 对 照相 比 ， SAD BI A163 % A150%, (Ase, BPMPH EST HRRLAH, MRABR. 4 A Azospirillum tpt, we AAR STS 2% Pymaximum, Permisetum americanum AlCenchrusiTynvbeen ch, He KEARARE. Am, CHORE See 不 相符 合 。 这 表明 ， AE eR ee eS FAVE FANS ZG o Wet, 4H Azospirillum#iPaspallithl, 4x42 KW) Cynodon deapytonieeia oe 量 提高 了 。 在 接种 与 基因 型 的 关系 中 表明 ， 已 接种 的 植物 能 较 好 地 适应 高 肥力 ， 但 是 没有 测 定 固氮 作用 的 报道 。 当 用 整体 测定 时 ， 在 盆 中 生长 的 接种 了 4zospirillua fy C.dectylon, JU FIA Cid 原作 用 。 用 4zospirilum 接 种 玉米 ， 产 量 没 有 提高 ， 用 整体 测 定 发 现 乙 抉 还 原 率 也 不 高 。 alee, P. americanum#ly RA BEAL Bt Azos pirillum'f S ite © 80 e 植物 生长 通过 非 固氮 作 用 过 程 对 接种 的 反应 为 了 改良 植物 性 状 和 提高 作物 产量 ， 用 细菌 培养 物 处 理 种 子 或 苗 根 ， 这 称 为 种 子 或 根 的 | RTE 尽管 根瘤 菌 作为 豆 科 种 子 的 接种 剂 的 价值 是 很 清楚 的 ， 但 是 ， 接 种 4zofobacfer 作 为 固 RAAB BIBRA. Azotobacter chroococum 因为 具有 国定 大 气 中 所 的 能 力也 已 经 用 作 接 种 剂 。 在 苏联 大 面积 地 都 已 应 用 这 种 制剂 接种 ， 他 们 认为 , :作物 能 从 这 项 措施 中 逐 益 和 增产 。 Brown 指 出 ， 在 东欧 国家 中 ， 使 玉米 、 小 麦 、 KEE. REAP A A HE HS. 苏联 的 许多 结果 ， 已 为 其 它 各 国 的 科 学 家 证 实 。 接 种 改变 了 微生物 的 数量 ， 抑 制 了 病 害 ， 并 且 产 生出 刺激 植物 生长 的 物质 ， 这 些 作 用 方式 的 改变 ， 可 以 作为 接种 细菌 使 植物 得 到 增产 的 解释 。 CARH, BEA Azotobacter 4 BHA BR T "HENGE yes 发 言 的 代谢 产物 。 通过 接种 而 抑制 病害 的 只 有 少数 成 功 的 例子 。 据 报道 ， 作 为 接种 剂 的 4zotobacter 培 养 物 能 够 产生 赤 震 酸 、 四 | 吃 3 -乙酸 和 细胞 分 弄 素 。 这 些 物质 刺激 幼苗 和 植物 的 生长 。 赤 堆 酸 也 提高 了 植物 体内 的 内 PRM 3 -乙酸 的 水 Fo FER PRE LE Rw BARES ISI 3 -乙酸 合 成 的 有 关 物 质 。4zotobacter 在 纯 培 养 中 “用 作 接 种 剂 ) 和 在 根 际 中 产生 的 植物 生长 激素 ， 能 引起 植物 有 意义 的 生长 。 & ti. HE. Centrostemma, Pubesces 和 已 .notatu1 接 种 4.5asbal1i 后 能 大 大 地 改善 植物 的 生长 。Brown 提 出 ， 己 .xzotafu7z 牧 划 生 长 的 改良 可 能 是 由 于 4.pasba11i 产 生 的 植物 生 长 调节 物质 作用 而 不 是 固 所 作用 的 结果 。 2zo5piriilura 在 纯 培 养 时 ， 也 产生 植物 生长 激素 ， iH LEA Azospirillum WEB SSE A TR A 3 BE A Ba EB ETT TET | 因此 ,我们 可 以 断定 ， 接 种 固氮 菌 导 致 的 植物 性 状 的 改善 的 方法 学 是 复杂 的 ， 同 时 ， 固 。 所 作用 所 引起 的 改善 ， 首 先 依赖 于 对 这 个 过 程 的 定量 测定 ， 把 培养 细菌 的 无 握 培 养 基 施 人 对 照 水 区 给 土壤 增加 了 碳 素 ， 这 样 可 以 束缚 部 分 有 效 氮 ， 使 接种 区 反应 更 明显 。 把 4zosbiri1- 2a7i 接 种 到 含有 这 些 细菌 的 土壤 中 ， 可 能 掩盖 了 植物 对 接种 所 引起 的 微弱 生长 反应 的 检测 。 特别 是 在 乙 抉 还 原作 用 没有 表现 出 这 种 反应 时 ， 更 是 如 此 。 接种 剂 产生 的 植物 激素 也 能 够 解释 产量 增加 的 原因 。 实 际 上 ， 接 种 研究 应 该 包括 把 固 氨 细菌 施 入 试验 小 区 ， 这 些 突变 株 产 生 的 生长 激素 和 它们 的 亲本 菌株 产生 的 生长 激素 一 定 是 可 同 的 。 与 禾 本 科 植 物 根 联合 的 固氮 细菌 的 生理 学 ”将 从 有 固氮 酶 的 禾 本 科 植 物 根 中 分 离 出 的 所 有 细菌 ， 进 行 纯 培 养生 长 时 ， 都 具有 固氮 能 Ae 因此， 这 些 群落 都 例 为 自生 固 氨 细菌。 相反， 根瘤 菌 尽 管 在 纯 培 养 时 具有 固氮 酶 活性 ， 但 是 ， 生 长 时 需要 一 种 结合 氮 。 因 此 ， 根 瘤 菌 和 自生 固氮 菌 的 主要 区 别 就 在 于 后 者 在 纯 培 养 生长 时 具有 利用 大 气 中 的 N; 作 为 唯一 氮 源 的 能 力 。 关于 自生 固 氨 细菌 和 植物 根 的 联合 有 许多 报道 。 由 于 本 综述 只 涉及 禾 本 科 植 物 联合 固氮 eg8l。 作用 的 展望 ， 所 以 ， 对 固氮 细菌 的 生理 学 描述 只 限于 那些 与 禾 本 科 植 物 联合 固氮 的 细菌 上 。 AAS PE A I Be EF CRE. JF GEE PD SE TT AR 关于 禾 本 科 植 物 联合 固氮 作用 细菌 的 鉴定 ， 通 常用 加 富 根 的 培养 物 来 分 离 进 行 。 通 过 比 较 根 的 乙 抉 还 原 速 率 和 细菌 的 数量 ，D5bereiner 等 断定 ，4。 paspalli $LTEP.notatum PRR 合 国 氮 作 用 的 忽 用 几 种 已 .nofatum 基因 型 来 研究 固氮 酶 活性 、 于 物 重 和 与 细菌 数量 相关 的 总 氮 量 累积 ， 表 明了 这 种 禾 本 科 植 物 联合 固氮 作用 是 取决 于 4.pcsba11i 的 存在 。 Dabereiner 和 Day 以 及 Von Biilow 和 Da5bereinetr 证 实 了 ， 在 经 表面 灭 菌 的 离 体 根 和 加 富 Se FPO CRD EIA FARE. MAH. PLT. Azospirillum AA 科 植 DMREAARAMAREH NA. ARERR POA A. FRA ARTE, BT 以 ， 根 表面 灭 菌 的 成 功 与 否 显然 是 个 关键 。 在 从 根 内 分 离 固氮 菌 还 没有 报道 的 情况 下 ， 根 表 面 无 菌 也 已 经 得 到 了 证 实 。 不 过 ， 因 为 禾 本 科 植 物 中 固氮 作用 的 Azospirillum 在 根 上 广泛 分 布 ， 所 以 ， 已 经 引起 了 人 们 的 关注 。 因 此 ， 我 们 对 固氮 细菌 生理 学 的 讨论 只 限制 在 A. paspalli, A.brasilense FA. lipof erumk. 碳 代谢 和 氧 的 供应 正如 以 前 讨论 的 那样 ， 人 们 认为 根 区 域内 的 细菌 固氮 作 用 是 从 光合 产物 运输 中 获得 能 量 的 。 光 合 产物 也 提供 同化 进入 细菌 体内 的 固定 氛 的 碳 骨 架 ， 因 此 ， 它 可 能 是 植物 的 含 所 化 合 物 的 前 体 。 已 经 表明 ， 芋 果 酸 、 琥 珀 酸 、 乳 酸 和 丙酮 酸 有 助 于 在 讨论 范围 内 的 所 有 细菌 的 旺盛 生长 和 乙 块 还 原作 用 。4.pastbal1i 和 4。Jeboferxm 也 能 利用 葡萄 糖 和 蔗糖 作为 生长 和 固氮 作用 的 唯一 碳 源 。 相 反 ， 葡萄 糖 和 琳 糖 是 4.brasifense 的 不 良 基质 。 Azospirillum 潜在 良好 基质 有 机 酸 及 其 在 C4 禾 本 科 植 物 根 中 积累 之 间 的 关系 ， 说 明了 这 些 菌 MA 本 科 植 物 间 的 联合 共 生 。 Azospirillum spp。 是 好 气 BAG, AR MERE RO. He. HERR KAR. 乳酸 和 丙酮 酸 研究 4.brasilense 无 细胞 提取 物 的 氧 的 吸收 表明 ， 在 这 些 有 机 体 中 是 有 三 羧 酸 循环 的 。 用 只 能 维持 细菌 微弱 生长 和 固氮 的 基质 〈 六 碳 糖 及 其 磷酸 衍生 物 ) 研究 ， 没 有 发 现 其 吸 收 氧 水 平 的 提高 ， 这 表明 ， 在 4.prasilerse 中 ， 糖 酵 解 和 戊 糖 克 酸 途径 的 意义 不 大 。 在 好 气 条 件 下 ， 三 羧 酸 循环 是 产生 腺 核 苷 -6 -三 磷酸 的 主要 途径 。4.brasilense 的 呼吸 作用 产生 腺 核 苷 -6“ -三 磷酸 ， 它 是 这 种 有 机 体 的 固氮 酶 活性 所 必需 的 。 三 羧 酸 循环 对 于 产生 还 原 力 也 是 重要 的 。 在 4.brasilense 中 ， 来 自 三 羧 酸 循环 中 间 产 物 的 电子 被 传送 到 氧化 态 的 NAD 上 ， 而 还 原 态 的 NAD 可 能 是 固氮 酶 催化 Nz 还 原 为 NH4 的 许多 可 能 的 电子 来 源 之 一 。 > 因此 ， 这 些 研 究 指出 ， 供 给 光合 产物 和 氧 对 根 中 的 4.brasilerse 是 有 效 的 。 细 菌 能 为 固 氨 酶 活性 创造 先决 条 件 。 在 根 的 固氮 位 置 上 ，pO。， 是 低 的 ， 基 质 的 碳水 平 是 有 限 的 。 4。brasilense 的 固氮 效率 随 供给 矶 和 氧 分 压 的 降低 而 有 所 提高 。 利 用 这 些 结果 ,Diber - einer 和 Day 推 断 ， 禾 本 科 植 物 的 共生 体系 类 似 于 豆 科 植物 根瘤 菌 共 生体 系 ,也 具有 高 效 的 固 ee 82 用 。 关于 同和 本 科 植 物 根 联合 的 4zospiriliaum 的 生长 和 固氮 作用 的 关系 的 了 解 很 少 , 然 而 , 4 No 作为 唯一 氛 源 时 ， 缺 氧 限制 了 4.prasilense 的 生长 。Neyra 和 Da5bereiner 注意 到 , RA 的 条 件 下 ， 细 菌 生长 速率 的 下 降 远 远 超过 固 所 酶 活性 速率 的 降低 。 44.prasifense 高 效 的 固氮 作 用 可 以 用 每 个 细菌 细胞 固 所 酶 活性 的 提高 及 其 生长 速率 的 降 低 来 解释 。 然 而 ， 所 有 的 推论 都 是 基于 用 纯 培养 研究 的 结果 。 所 以 ，4zosbiriflumz 在 禾 本 科 植 物 根 中 生长 和 有 效 的 固氮 作用 间 的 关系 尚 不 明确 。 高 氧 分 压 和 固氮 酶 活性 由 于 固 氛 酶 对 氧 敏感 ， 所 以 ， 在 完全 好 气 条 件 下 ， 除 非 固 氨 酶 受到 保护 ， 否 则 ， 固 所 是 不 可 能 的 。 已 经 用 4.chnroococurzz 和 Azotobater vinelandii 做 了 许多 在 高 p0* 条 件 下 的 细菌 固氮 作 用 的 研究 。 . .4zofobacter 能 在 空气 中 国定 所 ， 因 为 它 的 固氮 酶 有 呼吸 和 结构 型 保 护 ， 也 因为 该 酶 位 于 细胞 里 边 。 尽 管 已 经 证 实在 4.pasba11i 中 没 发 现 这 些 机 制 ， 但 是 ， 毫 无 疑问 它们 是 存在 的 ”因为 这 些 细 菌 在 好 气 条 件 下 能 够 固 所 和 生长 。 与 忆 .notatam 根 联合 的 固 氨 酶 活性 对 pOs 的 变化 也 是 敏感 的 ， 已 .zotaturz 根 的 固氮 酶 活性 的 最 适 氧 分 压 是 与 4.chroococum 在 纯 培 养 时 相同 的 。 已 经 报道 微 好 气 型 是 另外 一 种 机 制 ， 通 过 这 种 机 制 ， 某 些 细菌 能 够 表达 固 所 酶 活性 ， 尽 管 这 些 细 菌 不 能 进行 呼 呼 保护 作用 ， 但 是 它们 的 固氮 酶 有 一 定 程 度 的 结构 型 保护 的 证 据 。 Azospirillum spp。 属 于 这 种 类 型 的 有 机 体 。 4zospirillum 的 固氮 作用 必须 是 微 好 气 条 件 ， 如 4。.prasilense 不 能 在 好 气 条 件 下 以 Nz 作 唯一 氛 源 生长 。Tarrand 等 也 已 经 论述 了 4zosairillumm 的 固氮 作用 微 好 气 性 性 质 ， 他 们 把 这 个 特性 作为 这 些 细菌 分 类 学 的 一 部 分 。 Azos pirillumity #36 BABE EEO. 0050, 007K BAKA 压 (0.507 和 0.7094 巴 ) 之 间 。4zosbirillum 的 固氮 作用 对 氧气 的 敏感 性 ， 也 被 作为 禾 本 科 植 物 根 的 固氮 酶 活性 只 有 在 低 氧 分 压 下 才能 测 出 的 原因 。 已 经 提出 ,同和 未 本 科 植 物 根 联合 的 细菌 固氮 酶 的 明显 的 敏感 性 ， 在 原 位 条 件 下 ， 是 受 不 良 的 氧 保护 机 制 所 调节 。 it, Van Berkum 和 Sloger 证 实 了 在 好 气 条 件 下 ， 盐 沼 地 牧草 和 水 稳 的 离 体 根 和 根 的 快速 乙 块 还 原作 用 。 已 报道 了 在 测定 之 前 ， 暴 露 空气 的 预 温 育 高 粱 根 的 乙 块 还 原作 用 。 因此 认为 ， 在 测定 时 不 能 立即 还 原 乙 烽 的 离 体 根 中 ， 无 联合 的 固氮 酶 活性 的 原因 ， 是 禾 本 科 植 物 根 中 的 固氮 酶 为 0: 所 失 活 。 温度 和 p 焉 的 作用 ”4zosbirillum 需 N? 生 长 的 最 适 温度 是 在 32 一 407C 之 间 ， 这 与 已 报道 的 来 自 热带 环境 的 固氮 细菌 的 最 适 温 度 相 同 。 在 18C 以 下，4zosbirillum 的 固氮 酶 活性 对 温度 敏感 。 在 热带 地 区 ，4zoszbirillum 的 数量 较 高 的 原因 是 这 些 细菌 需要 高 温 。 IEE PA HY Azospirillum} MAA RU Ris i. (se, ET ie KR i bth se 异 。 然 而 ， 禾 本 科 植 物 根 的 固氮 酶 活性 对 夜间 低温 的 敏感 性 ， 也 归 因 于 植物 生长 的 影响 。 * 83， Day 和 Dibereiner 报 道 了 4zospirillumz 需 N* 生 长 的 最 适 pH， 介 于 6.8 和 7.8 之 间 。 他 们 HW» Azospirillum AE EER AY Ze 和 细胞 内 ， 在 那些 部 位 能 满足 它们 对 特殊 p 互 的 需求 。 因此 ， 尽 管 4zospbirilluzza 在 土壤 中 的 生长 依赖 于 pH， 但 是 ， 也 报道 了 禾 本 科 植 物 根 为 细菌 提供 了 最 适 的 条 件 ， 甚 至 在 低 pH 土 壤 中 也 如 此 。 衣 度 和 pH 对 4.pcstbal1 的 以 及 在 已 ,zo- tatu7 根 内 的 固氮 酶 活性 的 影响 还 没有 报道 。 结合 氮 和 固氮 酶 的 关系 固 氨 酶 还 原 Nz 的 产物 是 NH4。 所 有 的 固氮 细菌 都 优先 利用 它 作为 氮 源 。 在 这 种 氮 源 下 生长 比 任何 其 它 By net. A. pasba11 和 4.brasilense 在 所 中 也 生长 得 很 好 ， 但 不 能 固氮。 当 把 4zospirz11uxz 的 细胞 从 氨 说 养 基 转移 到 无 级 培养 基 时 ， 很 快 地 变 为 能 固氮 ， 但 生长 得 很 慢 ， 而 且 ， 在 大 量 的 半 固 体 批 量 培养 中 ， 开 始 的 低 浓 度 结合 所 有 利于 它们 生长 和 固 所 。” 在 氛 中 生长 的 4。pca bcji 细 胞 ， 在 被 转 接 到 无 气 培养 基 时 也 诱导 出 上 固氮 酶 活性 。 这 些 结果 表明 ， 在 与 禾 本 科 植 物 根 联合 的 固氮 细菌 中 ， 氨 提供 了 固 所 酶 的 活性 和 合成 。 氨 对 固氮 酶 活性 和 合成 的 调节 作用 已 经 在 甚 它 的 BEM AA LE SSE. Mortenson 兽 指 出 ， 研 究 固氮 耻 合 成 的 抑制 作用 是 复杂 的 ， 因 为 在 把 所 加 给 细菌 时 寺 很 快 抑制 了 它 的 合 成 。 固 气 酶 合成 调节 作用 的 研究 大 部 分 是 用 天 . pneumoniae AA. vinelandii x£47 4 o 氛 摊 人 到 细菌 的 第 一 个 产物 是 谷 氨 酸 ， 并 且 ， 这 种 反应 是 通过 两 种 不 同 的 途径 来 完成 的 。 当 培养 基 中 所 的 浓度 高 时 (> 1 mm) ， 谷 氨 酸 赔 氨 酶 就 把 谷 氨 酸 供给 细胞 。 当 氮 的 浓度 低 时 (所 1 mm) 或 者 在 固氮 条 件 下 ， 则 由 与 谷 酰胺 合成 酶 偶 联 的 谷 氨 酸 合 成 酶 催化 反应 把 谷 氨 酸 供给 细胞 ， 而 谷 气 酸 脱 气 酶 不 起 作用 。L- 甲 硫 氨 酸 -DEL- 亚 硕 次 胺 和 EL- 甲 硫 氨 酸 砚 是 这 两 种 氨 同 化 酶 的 抑制 剂 。 把 L- 甲 硫 扼 酸 -DL- 亚 砚 次 胺 和 L- 甲 硫 氢 酸 硕 和 抑制 剂 水 平 的 NH4 一 起 加 入 到 固氮 培养 的 天 . pneumoniae A,vinlandii 中 ， 仍 能 出 现 固 氨 酶 活性 。 但 是 ， 在 设 有 这 种 谷 氨 酸 类 似 物 时 ， 固 氮 作 用 就 停止 了 。 HAMAB A. brasilense 的 固氮 培养 中 ， 也 抑制 固氮 酶 的 合成 。 在 有 过 量 的 氮 存 在 的 情 况 下 ， 工 - 甲 硫 氨 酸 亚 柄 次 腕 和 L- 甲 硫 氨 酸 硕 能 使 4.prasifense 固 氮 酶 合成 解 阻 遇 ， 而 能 测定 出 乙 燃 还 原作 用 。 氨 抑 制 玉 .pmeurzonice 和 4.brcsilense 中 的 谷 酰胺 合成 梅 ， 而 同时 提高 了 这 种 酶 的 腺 苷 化 作用 。 L- 甲 硫 氨 酸 -DEL- 亚 硕 次 胺 和 E- 甲 硫 氨 酸 砚 抑 制 谷 氨 酰 胺 合成 酶 在 这 两 种 微生物 中 的 膛 苷 化 作用， 在 固氮 条 件 下 ， 最 初 就 有 这 种 去 腺 背 化 状态 存在 。 目前 流行 的 假说 是 ， 活 化 的 去 腺 苷 化 状态 的 谷 酰胺 合成 酶 诱导 固 气 酶 合成 ， 这 种 酶 的 呼 吸 作 用 或 者 在 NH4 必 存在 下 使 其 转变 成 为 失 活 的 去 腺 苷 化 的 状态 而 抑制 了 固氮 酶 的 合成 。 谷 酰 蜂 合 成 酶 的 固氮 酶 调 闻 作 用 最 好 是 由 固氮 酶 解 阻 如 的 突变 笠 来 证 明 。 这 种 调节 作用 是 谷 栈 胺 合成 酶 结构 改变 的 结果 。 在 妈 .prasilense 中 ， 谷 酰 胶 合成 酶 在 固 气 酶 调节 中 的 作用 也 已 经 用 类 似 于 OK, pneumo- ice 突变 株 来 证 实 。 然 而 ， 也 提出 了 在 天 . sinlaiiememecheqitimigininitiie AHAB, TEA. pospalli tH AAA BEND ie PLEA HIB. 还 证 实 了 44.bprasi1ense 的 硝酸 还 原作 用 和 反 硝 化 作用 的 同化 及 异化 作用 。Neyra 等 断定 ， "84 。， 研究 4zosziri1luz 最 佳 固 气 作 用 和 最 低 反 硝化 作用 的 方法 是 重要 的 。 Nelson 和 Knoisles 观 察 到 硝酸 抑制 4.prasilense 的 固 气 了 酶 活性 ， 是 通过 活化 硝酸 还 原来 作用 的 。Magalhase 等 分 离 出 了 .4zospiriflum 的 无 硝酸 还 原 Wit 的 突变 株 ， 它 能 够 在 10mm 珊 酸 的 情况 下 固氮 。 这 些 作者 认为 ， 把 这 些 突变 株 接种 到 禾 本 科 植 物 中 能 够 在 土壤 存在 高 水 平 硝 酸 的 情况 下 产生 具有 固 气 作用 的 系统 。 D6bsreiner 和 Day 报 道 了 在 4.basba11i 中 的 固氮 酶 活性 不 受 硝 酸 的 影响 ， 并 且 提 出 在 这 个 有 机 体 中 没有 硝酸 还 原 酶 。 然 而 ， 这 些 研究 者 没 观察 到 己 .notaturz: 根 的 固氮 酶 活性 受 硝 酸 的 抑制 作用 。 他 们 提出 ， 根 把 硝酸 还 原 成 亚 硝酸 ， 并 与 硝酸 一 起 从 根 中 泌 出 ， 引 起 对 固氮 酶 的 活性 抑制 。 Azospirillum brasilensew A Be WEA. brasilensefy A AME A HEA, A AiAmeRE MA Prench he pL he Ay An He FE ee . 来， 并 且 已 经 描述 了 纯化 的 方法 。4.prasilense 的 固氮 酶 系统 有 下 述 三 种 成 分 ， Mo—Fe® A. Fet 8 ZEW 7ERhodospinllam rupruzz 中 的 Fe 和 蛋白 的 活化 因子 。4。.prasilense 的 固氮 酶 活性 取决 于 Mn2+ 和 Mg2+ 的 存在 。 尺 .ruprum 的 活化 因子 能 活化 4.prasilense 的 Fe 蛋白 。 反之 亦 然 。4。1lrasi1ense 的 Mo-Fe 和 蛋白 不 需要 活化 ， 因 为 当 把 它 同 从 K. .pxzexmzomiae 中 的 Fe 蛋白 互补 反应 时 具有 活性 。 Ho Wy AR KA Bk 有 人 指出 ， 在 豆 科 植物 中 ， 为 了 更 有 效 地 进行 固氮， 和 氢 酶 可 以 再 利用 释放 的 氨 ， 并 产生 ATP 和 还 原 力 。 已 经 研究 了 4。.brasilense 的 氢 酶 活性 .尽管 已 指出 其 活性 水 平 足以 再 循环 由 击 氨 酶 产生 的 所 有 的 氨 ， 但 是 ， 这 种 功能 对 禾 本 科 植 物 根 固 气 效率 的 重要 性 仍 有 待 于 了 确定 。 而 且 还 指出 在 4.1poferxz 中 气 酶 具有 固氮 酶 氧 保护 机 制 的 作用 。 ae 富 无 疑问 ， 禾 本 科 植 物 具 有 联合 固氮 作用 。 禾 本 科 植 物 能 从 自生 的 或 与 微生物 联合 中 获 得 大 气 中 的 握 。 其 机 制 有 三 种 : 首先 ， 由 植物 材料 分 解 的 碳水 化 合 物 支 持 了 自生 细菌 在 Nz 中 生长 ， 氮 又 回 到 微生物 区 系 的 一 部 分 生物 量 中 。 它 具有 长 期 富 集 的 性 质 。 尤 其 是 未 破坏 的 生态 系统 更 是 如 此 。 其 次 ， 在 禾 本 科 植 物 根 区 内 ， 固 氮 作 用 能 够 通过 植物 把 含 碳化 合 物 东 放 到 土壤 而 进行 ， 通过 这 种 机 制 ， 使 土壤 长 期 富 集 气 。 这 对 于 维持 热带 条 件 下 农业 和 人 口 的 增长 具有 重要 意 义 。 第 三 ， 根 联合 固氮 作 用 可 能 与 植物 代谢 密切 相关 。 如 果 这 种 国 豚 作用 能 部 分 或 全 部 代 蔡 施 用 氮肥 ， 那 么 ， 在 高 度 农业 机 械 化 的 发 达 国 家 中 将 依赖 于 这 种 形式 得 到 最 大 的 经 济 效益 。 尽管 4zosbizrillutz 和 禾 本 科 植 物 联合 体系 已 列 为 第 三 类 ， 但 是 支持 这 种 概念 的 证 据 还 没 ee 85 e 有 得 到 。 在 通气 良好 的 环境 中 的 固 气 作用， 已 经 认为 是 偶尔 的 、 和 不 足以 满足 精 耕 作 物 的 需 要 的 速率 的 。 然 而 ， 我 们 的 意见 是 ， 尽 管 对 禾 本 科 植 物 固氮 作用 的 过 程 了 解 得 非常 少 ， 但 它 并 不 影响 我 们 对 其 每 一 个 时 期 的 变化 加 深 探 讨 ， 以 期 取得 更 大 的 成 就 原 载 [ 美 ] “Microbiol.Review” 44:491—517, 1980 eR KEE * 866 CaaS, —- = Her TX FHP BY Fe Se TP Se 1 T, Yoshida G,Rinaudo 1,4] HU 1.1. 水稻 土 中 氢 素 肥力 的 保持 南亚 许多 国家 的 稻谷 生产 影响 着 世界 上 近 一 半 人 口 的 食物 供应 。 而 氮 常 常 成 为 作物 生产 限制 因子 的 一 种 元 素 。 亚 洲 种 稻 国 家 的 许多 地 方 ， 化 肥 还 没有 普遍 应 用 ， 水 稻 生 产 大 都 依靠 水 稻 土 的 天 然 肥 力 。 古 代 农 民 实 行 烧荒 的 农业 方式 ， 生 产 他 们 以 旱稻 为 主 的 食物 。 由 于 土壤 肥力 不 能 持久 ， 他 们 不 得 不 每 隔 两 三 年 从 一 块 土地 转移 到 另外 一 块 士 地 上 去 。 然 而 ， 在 浸水 田中 ， 稳 农 在 同一 块 稻田 中 种 植 水 稻 达 千年 以 上 。 尽 管 年 复 一 年 地 收获 水 稻 作 物 ， 但 是 元 素 ， 特 别 是 气 素 仍然 不 断 地 供应 ， 这 可 以 认为 是 由 于 水 稻 土 中 微生物 固定 空气 中 氮 所 致 ， 但 也 并 不 完全 都 是 微生物 固氮 的 贡献 。 日 本 各 县 的 N、P、 开 长 期 实验 证 明 ， 水 稻 土 中 氨 素 能 不 断 地 自然 供应 。Konishi 和 Sei- no 表明 ， 在 不 施肥 的 水 稻田 中 ， 每 年 至 少 从 空气 中 国定 约 20 公 斤 N/ 公 顷 《〈 有 对 照 处 理 ， 表 1) 。 施 加 磁 、 甸 可 增加 水 稻田 中 所 素 的 积累 CP. KMPH) 。 Rl 日 本 石川 县 农业 实验 站 22 年 (1929 一 1950) 种 植 水 稻 的 稻田 中 的 氨 素 平衡 所 2 (公斤 /公顷 ) 的 增加 或 减少 Sb 无 Ca A Ca ot FR +420 +651 P.K(—N) +740 +838 N.K(-P) —507 — 372 N, P(—K) 一 57 +82 N.P.K +39 +59 a. 通过 固定 空气 中 的 氮 为 正 值 ， 计 算 如 下 : 《植物 吸收 的 N) 一 〈 施 肥 的 N 十 损失 的 土壤 N) 。 Matsuo 和 Takahashi 在 日 本 长 期 的 实验 中 , 计算 了 不 施 气 的 水 稻田 中 ,所 素 的 平衡 ， 估 计 在 这 田中 平均 每 年 自然 提供 的 氮 素 49 一 90 公 斤 / 公 项， 而 在 日 本 所 有 地 区 中 则 为 70 公斤 / 公 项 。 在 日 本 的 北海 道 41 年 不 施 氮肥 的 水 稻 实 验 表 明 ， 平均 产量 为 2.8 吨 /公顷 ， 而 不 降低 土壤 肥力 每 年 从 水 稻 中 取 走 的 气量 为 53 公 斤 / 公 顷 。Kcyama 和 App 报 道 了 在 热带 和 温带 地 区 的 浸水 稻田 中 ， 每 茬 能 收益 35 一 50 公 斤 N。 菲律宾 国际 水 稻 研 究 所 〈IRRI) 实验 田中 的 Maabas 粘 土地 区 ， 在 旱季 ， 田 中 浸水 110 » 87 。 天 ， 释 放 的 土壤 净 氨 量 估计 为 57 公 斤 公顷， 雨季 ， 浸 水 94 一 98 天 时 为 77 公 斤 人 公顷。 在. 生长 水 稻 土壤 中 有 氨 素 的 自然 收 支 是 平衡 的 ， 在 计算 平 衡 时 ， 没 有 计 及 像 雨 天 或 灌溉 时 自 然 氮 的 收益 。 然 而 ， 假 如 每 种 植 季节 土壤 矿 化 为 57 公 斤 人 公顷， 那 末 它 的 总 所 (2800 公斤 / 公顷 、 假 定 0.14%% 的 土壤 N) 将 可 补偿 大 约 50 茬 ， 否 则 土壤 要 由 某 些 机 制 增加 氮 素 。 过 去 的 许多 年 中 ， 在 菲律宾 不 同 的 稻田 中 ， 不 施 氨 肥水 稻 产 量 仍然 获得 几 吨 /公顷 C2) 。 2 ”传统 品种 和 两 个 近代 品种 无 氮肥 生长 的 产量 产量 ( 吨 / 公 项 ) 湿 季 IRRI Maligaya 站 Bicol 站 Visayas 站 总 平均 a -一 一 一 一 一 一 一 小 Peta IR8 IR20. Peta IR8 IR20 Peta IR8 IR20 Peta IR8 IR20 Peta IR8 IR20 1968 8.9% 44 al 3.7 Ad a2 Bini, 4.0 B.8 225.1 4.5 2/4. 3.0 3.1 3.6 4.0 3.8 1969 2.9 .5.6 5.2 328 Mr 52 4.4 3.4 4.6 4.0 4.1 4,0 5.2 3.6 4,8 4,7 1970 2.8 4.9 4.6 2.8 4,0 4.3 0.0 2.8 2.4 335 Fl 252 3.5 2.3 13.5 3.7 1971 1.3. 28.6 3.8 2a9 = 2a5 3.2 3. Ll. 43.2 2.9 456-5 309 3:8 sh 3.08 2356 3.4 1972 2.9 13-8 4.0 3.2. 3.6 3.6 SLB 1452 3.8 334 yet 3.2 3.5 3.3 3.6 3,7 ER 2.8 4.8 4.3 3.4 3.8 3.9 2.8 4.0 3.5 3.6 3.3 3.8 3.2 3.8 3.9 1 。2 。 田 间 固 氨 的 测定 研究 水 舟 土 中 生物 固 所 作用 有 三 种 主要 的 方法 : 凯 氏 技术 、N-15 同 位 素 技术 和 乙 燃 还 原 技 术 〈CzH: 一 Ca?H4) 。 固 氨 的 直接 检验 是 测量 样品 中 总 氨 的 增加 。 用 凯 氏 法 测量 总 氨 适 合 于 固 氨 能力 强 的 体系 ， 但 对 于 在 固氮 增加 的 百分率 很 小 的 情况 下 ， 这 种 方法 就 不 可 靠 了 。 然而 ， 如 果 长 时 间 暴 露 于 Na 后 ， 能 使 体系 中 总 氨 产 生 高 比率 的 变化 ， 那 末 这 种 方法 还 是 适 用 的 。 1) App 等 用 这 种 技术 益 述 了 浸水 水 稻田 中 天 然 的 氨 素 肥力 ， 并 指出 水 稻 植 物 改 善 这 种 土壤 的 氨 素 效益 ( 表 3) 。 更 准确 地 说 ， 直 接 而 又 比较 准确 地 测定 固 氨 的 方法 ， 是 N-15 同 位 素 技 术 。 但 这 种 示 踪 技术 需要 用 昂贵 的 !5Nz， 特 别 是 当 它 大 规模 使 用 时 ， 如 在 培养 箱 和 田间 使 用 时 更 是 如 此 ， 它 还 需 用 很 贵 的 仪器 质谱 计 分 析 及 制 样 等 实验 室 程序 。 因 此 ， 在 水 稻 土 中 固氮 作用 的 研究 中 ， 应 用 :5N 同 位 素 技术 大 多 限于 实验 室 里 的 试验 。 同 位 素 技 术 是 直接 的 ， 样 品 误差 也 许 tt 凯 攻 技术 小 。 近 来 水 稻 根 区 的 固氮 活性 多 在 水 培 条 件 下 ， 用 标记 的 N-15 气 体 测定 。 采 -用 示 踪 技 术 在 水 田 土壤 条 件 下 同样 的 实验 说 明 ，N-15 同 位 素 技术 在 原 位 测定 的 水 称 填 一 植 物 系 统 的 1 或 2 周 间 的 固 氨 活性 是 足够 灵敏 的 。 乙 抉 还 原 方法 简单 、 灵 敏和 经 济 ， 它 大 大 地 促进 了 固氮 研究 ， 由 于 它 并 不 是 直接 测量 生 物 固 氨 量 ， 因 此 ， 对 于 准确 估计 固氮 作用 是 不 合适 的 。 但 是 ，CzHs 一 CzHia 技 术 已 经 用 于 稻 田原 位 条 件 下 的 固氮 研究 。 Alimaguo 和 Yoshida 采 用 了 乙 抉 一 乙烯 法 测量 浸水 水 稻 土 原 位 测定 的 装置 。 他 们 用 一 个 金属 圆 简 压 住 塑料 口袋 进行 原 位 条 件 下 ， 在 田间 测定 水 稳 根 际 的 固氮 活性 。 固 所 活性 在 田间 。 种 植 地 区 远 较 未 种 植 植物 的 行 间 为 高 。Lee 和 Watanabe 发 现在 测定 装置 中 搅拌 土壤 一 水 系统 可 以 得 到 最 佳 的 乙 需 回收 率 。 ° 88° > [ern RS MRAM LPRKRHRKLEHARER 种 BR Pe MeyN 作物 增加 水 露 土壤 变化 余 收 益 N 平 衡 N is 光 处 理 sae Wes (z) (x+y—2) % sx wm A (4 #) oo 一 wR 997+15(a) 一 795 士 39(a) 21 Pavesi (ad 18 + 一 RE 1042+22(a) 一 875 士 66(a) 21 138* ， (a) 14 a = 对 照 0 (b) —243+40(b) 0 一 243** (b) 一 实验 B (6 #) 十 一 对 有 照 1174+11(a) 一 604 士 70(a) 27 544** (a) 46 + 一 wR 1148+16(a) —961+50(b) 27 160* (b) 14 = + wR 0 (b) 193+82(c) 24 169n,s (b) 一 实 C (6 #) + + wR 1203-12 (b) —789+ 6 (a) 27 387** (a) 32 + + © P\Fe.& 1273433(b) —261-£80(b) 98 914** (b,c) 72 + + 了 .Fe 1211+43(b) —895+77(a) 92 723°* (b) 60 + + 了 、Fe, 菠 1681+21(a) 一 421 土 67(b) 106 1153** (c) 69 +S.E RmPRERS HE: MV RAMAVHR, £54201 SKF LARS, AA 一 字母 表示 的 平均 值 ， 用 Duacan 多 项 式 测 试 ， 在 5 儿 水 平 上 没有 有 意义 的 差别 。 1 .5 。 噶 养 和 光合 微生物 的 贡献 从 已 发 表 的 述评 中 可 以 看 出 ， 尽 管 水 稻 作 物 取 走 气 ， 但 是 ， 氨 素 还 是 连续 地 供应 ， 这 归 因 于 水 稻 轩 中 微生物 的 作用 。 现 在 有 兴趣 的 是 ,了 解 实际 上 哪 种 微生物 在 水 稻田 的 国 氨 中 起 着 BWA. 在 水 稻田 中 ， 对 蓝藻 的 固氮 作用 比 细菌 更 引起 人 们 的 注意 。 特 别 在 A A ED 度 ， 蓝 藻 在 水 稻 主 中 的 固氮 作用 已 经 作 了 许多 研究 。 有 关 水 稻 土 光合 细菌 的 研究 工作 已 有 一 些 报道 。 如果 各 种 生态 因子 对 于 生长 和 保持 固 氨 场所 都 是 适合 的 ， 那 末 光 合 微生物 在 水 稳 困 中 的 固 所 作用 可 能 是 大 有 潜力 的 。 测 定 光合 微生物 在 水 稻 土 中 的 作用 的 暖 室 实验 表明 ,在 浸水 条 件 下 ， 光 照 下 的 固氮 活 性 比 黑暗 时 高 得 多 。 但 是 ， 当 连续 种 植 两 着 时 ， 则 光照 和 黑暗 处 理 间 稻草 和 子粒 的 重量 以 及 水 稻 对 所 的 吸收 ， 是 没有 很 大 的 差别 。 在 非 律 宾 ， 用 原 位 装置 测定 水 稻田 光合 固 氛 作用， 得 出 了 固 氨 量 的 范围 ， 一 处 为 2.3 一 5.7 公 斤 埃 公顷 ， 另 一 处 为 18.5 一 33.3 公 斤 / 公 顷 。 虽 然 菲 律 宾 的 Los Bamos 两 块 水 稳 实 验 田 ， 国 气 蓝 营 对 了 于 水 稻 的 生长 和 收获 没有 很 大 作用 ， 但 是 在 印度 用 固 所 蓝藻 如 : 鱼 腥 藻类 (Anabaena sp.) ， 念 珠 营 CVostoc sp. ) » BEX CAulosira fertilissima) RARE (Tolypothrix tenuis) 接种 于 水 稳 田 时 ， 确 实 有 利于 水 稻 的 生长 和 收获 。 Rousuerol 报 道 了 法 国 南 部 固氮 菌 属 (Azotobacter) ARE (Clostridium) 在 水 称 田中 起 到 的 固氮 作用 。Okude 和 Yamaguchi 研 究 了 日 本 水 稳 田 光合 固氮 菌 的 分 布 ， 而 且 报 道 了 分 布 在 日 本 水 稻田 中 起 固氮 作用 的 细菌 的 重要 性 。Becking 报 道 了 贝 氏 菌 属 (Bei7yerinc- kia) 在 热带 地 区 的 广泛 分 布 ， 主 要 在 砖 红 款 中 , 它 在 pH 值 较 低 的 土壤 中 比 固 气 菌 属 ( Azo- tobacter) 更 多 。 然 而 ”还 没有 文章 对 这 些 异 养 固 所 菌 的 国 气 作用 提出 适当 的 定量 估价 。 Jensen 或 Alexander 认 为 ， 对 蜡 养 固 氨 菌 每 年 能 增加 20 一 50 公 斤 N/ 公 项 的 这 种 估算 是 过 高 了 ， 因 为 这 些 细 菌 至 少 要 消耗 相当 于 葡萄 糖 同样 营养 价值 的 有 机 物 1 工 一 2.5 吨 ， es 89。 许多 文章 报道 ， 添 加 有 机 物 于 水 田 土壤 中 ， 能 促进 土壤 中 的 固氮 活性 。 但 还 没有 报道 定 量 估 测 水 稻田 中 的 固氮 作用 。 近来 发 现 ， 水 稻 植 物 根 际 的 异 养 固氮 菌 能 固定 空气 中 的 氮 ， 水 稻 根 际 具 有 某 些 专门 的 特 征 ， 其 中 包括 空气 向 根 组 织 的 输送 ， 在 氧化 的 根 组 织 和 厌 气 土 壤 之 间 有 好 气 和 厌 气 的 界面 。 固 氨 活性 随 植物 年 龄 而 增长 ， 在 生殖 阶段 的 中 期 活性 达到 最 高 峰 。 水 稻 植 物 能 迅速 将 在 根 际 固定 的 氮 转 送 到 植物 各 个 部 位 。 蜡 养 细菌 在 水 稻 根 际 所 固定 的 氮 量 对 于 未 施肥 的 水 稻 生 产 是 非常 重要 的 。Wada 等 报道 了 固氮 最 重要 的 部 位 是 水 稻田 的 还 原 层 ， 因 此 在 检测 水 稻田 固 氨 时 的 根 际 作 用 是 不 能 忽视 的 。Matsuguchi 报 道 异 养 固 氨 占 田间 固氮 总 量 60% 以 上 。 采 用 遍 氏 技 术 直接 测定 固氮 作用 进一步 指明 异 养 和 光合 微生物 的 同时 固氮 作用 。 1 4. BA o-oo 科学 家 长 戎 来 已 经 发 现 水 稻田 中 氨 素 肥力 的 保持 。 这 种 现象 涉及 的 机 制 ， 看 来 是 生物 固 氮 的 结果 。 在 过 去 玫 十 年 中 ， 支 持 这 个 理论 的 证 据 增 加 了 。 对 于 氮 素 积 款 的 主要 贡献 的 生物 体 ， 是 光合 微生物 ， 包 括 水 稻田 中 的 固氮 蓝藻 和 蜡 养 细菌 。 各 种 固氮 生物 在 保持 水 稻田 须 素 肥力 的 作用 大 小 ， 可 能 是 依赖 于 环境 条 件 ， 但 目前 尚未 阐明 。 然 而 ， 光 合 和 寻 养 固氮 微生物 的 富 集 氮 的 作用 显然 是 重要 的 ， 特 别 是 在 水 稻 生 长 季节 的 前 期 大 概 是 很 重要 的 ; 但 是 它 在 水 稻 植 物 的 生殖 期 时 更 为 重要 。 2. 异 养 固 所 作用 的 微生物 学 2 :所 村 的 各 生物 和 2 . CHEV. HAAR) ZowTRBL: ee (Pseudomonas), Ppa sh ner ep [3] 3 RC Azotobacter), WM ASE RRR (Bei jerinckia). 黄 杆菌 属 (Flavobacteriam) . “FR CArthrobacter) . FH RR (Bacillus), & fa (Clostridium) 。 在 水 稻田 的 土壤 中 经 常 发 现 的 还 有 : 脱硫 弧 菌 属 (Desulfovibrio). | 脱硫 肠 状 菌 属 (Desulfotomaculum) ， 和 甲烷 氧化 细菌 。 德 克 斯 氏 菌 属 (Derxia) 在 浸水 土壤 中 特别 多 。 近 来 ， 固 氮 螺 菌 属 (Azospirillum) ， 肠 杆菌 属 (Enterobacter sp) . {i 单 胞 菌 属 (Pseudomonas) 、 节 杆菌 属 CArthrobacter) 、 螺 菌 属 (SPpirilla ) 、 弧 菌 属 (Vibric) ， 可 能 还 有 无 色 硫 细菌 属 〈4chnromopacter) ， 都 从 用 水 洗 过 和 雪 面 灭 菌 的 稻 根 分 离 得 到 。 这 么 大 范围 的 固氮 异 养 菌 ， 说 明 蜡 养 固 氮 作 用 适合 于 完全 不 同 的 土壤 环境 。 2. 1. 2. 定量 研 究 。 根 据 Ishizawa 等 和 Balandreau 等 的 报道 ， 在 水 稻 土 中 和 水 FA 根 际 ， 好 气 固氮 菌 比 厌 气 固氮 菌 多 。 在 洗涤 过 的 水 稻 根 上 的 固氮 菌 数量 其 趋势 也 相同 。 员 然 在 大 多 数 土 壤 中 ,细菌 群体 量 少 至 10*/ 克 土壤 ， 或 更 少 些 ， 但 是 Ishizawa 和 Tayota 指 出 ， 固 毛 菌 在 水 田中 比 旱 地 中 多 ， 在 非 火 成 岩 生成 土壤 中 比 火成岩 生成 士 壤 中 多 。 在 碱 性 土壤 中 ， 如 埃及 ， 固 气 菌 的 数量 大 概 相 当 于 10 "一 10"77/ 克 土 ， 而 在 中 性 和 酸性 土壤 中 则 很 少 。 贝 叶 林 be RR (Beijerinckia) 在 水 稻 土 中 很 多 。Matsuguchi 等 在 泰国 调查 和 测量 了 40 多 处 水 稻 田 后 发 现 ， 固 气 菌 属 (Azotobacter) FIRAIR (Clostridium) MAB Fl A10—10*/ se 4- 和 10 一 10"/ 死 土 ， 其 趋势 随 土 壤 中 pH 值 的 升 高 和 有 机 物 及 磷 的 大 量 存在 而 增加 。 国 氮 螺 菌 (Azospirillum) 第 常 可 以 从 灭 菌 的 水 稻 根 表 分 离 到 。 遗 憾 的 是 ， 这 些 细菌 的 大 量 研 究 是 定 性 的 ， 定 量 研究 很 少 。 2.2. 固氮 微生物 的 分 布 。90 。 2. 2. 1. 固氮 细菌 在 非 根 际 土壤 中 的 部 位 。 对 非 根 际 土 壤 中 异 养 固 氨 菌 注意 得 很 | 用。 然而 ， 相 当 数量 的 有 机 筷 质 《 稳 茬 和 作物 残余 物 中 的 脱落 根 ) 在 收获 以 后 遗留 在 男 间 。 在 日 本 最 近 的 研究 指出 ; (1) 有 机 碎片 是 非 共 生 固 所 的 活动 徽 区 ，〈2 ) 稳 草 的 分 解 ， 不 全 ——— we 仅 在 表层 适合 于 异 养 固氮 作用 ， 而 在 耕作 层 下 面 好 气 和 微 好 气 条 件 下 也 有 助 于 二 者 的 进 行 。 2 。2 。838 。 根 际 固 所 细菌 的 部 位 。 一 再 发 现 含 脂 刚 螺 菌 C Spirillum li poferum) 后 ， 最 感 兴 趣 的 问题 之 一 是 固 气 菌 位 于 根 组 织 内 或 根 表面 ， 它 们 与 植物 建立 了 联合 作用 。 最 近 Diem 和 Docmmerynes 计 论 了 这 一 点 。 细 胞 内 菌落 可 能 存在 ， 但 是 ， 是 分 散 的 。Lakshimi 等 只 是 观察 到 水 稻 根 毛 内 的 其 些 固氮 螺 菌 CAzospirillum) 的 细胞 。 另 外 经 常 报 道 根 细 胞 胞 间 菌落 ， 主 要 限于 根 的 哀 老 部 〈 节 区 ) 一 般 为 损伤 细胞 部 位 。Umali-Garcia 等 报道 ， 固 氨 螺 菌 (Azospirillum) 可 在 活 根 细胞 壁 的 中 层 观 察 到 。 x 2E WE SE RUA (Azospirillum ) ”中 大 多 数 能 利用 果 胶 作为 碳 源 的 能 力 是 一 致 的 。Asanuma 等 发 现 ， 水 稻 幼 苗 根 表面 的 微 生 物 分 布 很 广 ， 除 根 尖 区 外 ,主要 在 表皮 组 织 和 细胞 界面 的 破裂 部 位 。 他 们 分 散 并 附着 在 粘 胶 中 ， 或 吸附 在 表皮 细胞 表面 和 根 毛 上 。 细 菌 在 根 表层 的 比率 是 少 的 ， 只 占 总 根 表 面 的 1 一 9%。 2。2。3。 根 际 不 同 部 位 固氮 微生物 的 分 布 。 根 际 可 划分 三 个 部 位 : (1) 根 际 土 ， 包括 直接 围绕 植物 根 并 生长 着 微生物 的 土壤 范围 ，“〈2 ) 根 表 ， 由 根 表 及 生长 在 其 上 的 微 生 pyr, (83) 内 根 际 ， 由 根 表 层 组 织 及 蜡 养 微生物 所 构成 。Brown 认 为 许多 固氮 细菌 如 : VR (Azotobacter) 不 是 纯 的 根 际 细菌 ， 固 氨 菌 (Azotobater) 在 根 际 土壤 中 受 到 限制 ， 在 根 表 发 现 其 细胞 很 少 。 相 反 ，Da5beriener 和 Ruschel 报 道 ， 贝 叶 林 克 氏 菌 (Beiye- rinckia) 在 浸水 水 稻 的 根 表 比 在 根系 土壤 中 生长 得 好 。Da5beriener 等 认为 ，C4 光 合作 用 途 径 的 植物 首先 被 固氮 含 脂 螺 菌 (Azospirillum. Lipoferum) 所 感染 ， 而 Cs 植物 首先 被 固 氮 巴 西 螺 菌 〈4.brasilexse) 所 感染 。 在 浸水 水 稻 中 ， 从 表面 灭 菌 的 根 ， 分 离 得 到 的 全 部 固 sR (Azospirillum) 都 属于 固氮 巴西 螺 菌 (4。brasilerse) ， 它 们 中 96% 是 Nir (硝酸 还 原 酶 缺陷 型 ) ， 而 在 没有 种 植 的 土壤 中 分 离 仅 有 50%% 属于 固氮 巴西 螺 菌 硝酸 还 原 酶 缺陷 型 (A brasilense Nir) 。 Watanabe 等 研究 好 气 异 养 细 菌 在 IR26 水 稻 根 际 三 种 部 位 间 的 分 布 。 细 菌 的 分 离 用 平 板 计数 并 检测 出 固氮 酶 活性 。 塞 内 加 尔 栽 培 的 Morobrekan 水 稻 也 作 了 包括 放 线 菌 在 内 的 计数 。 结果 例 于 表 4。 “IR26 栽 培 稻 一 菲律宾 土壤 ”和 “Morobrekan 栽培 稻 一 塞内加尔 Sol-Dior ” 两 种 系统 中 ， 有 具有 固 氛 酶 的 细菌 比率 从 根 际 土 向 内 根 际 逐 渐 增 加 。 在 内 根 际 所 分 离 的 比率 中 ， 固 氛 酶 活性 《相应 为 81% 和 50%) 是 很 高 的 。 奇 怪 的 是 ，Moroberekan 稻 生长 在 塞 内 加 尔 Sol gris 时 ， 在 内 根 际 中 有 固氮 酶 的 细菌 比率 比 在 根 际 土壤 中 低 “〈 相 应 为 16% 和 53% ) , 而 放 线 菌 的 比例 是 从 内 根 际 到 根 际 土壤 而 逐渐 降低 “〈 相 应 为 7.2% 和 1.7% ) 。 根 据 这 些 数据 Rossos 等 指出 ， 放 线 菌 可 能 影响 固 氛 微 生物 在 根 际 的 聚集 。 + , 非 律 宾 土 壤 和 塞内加尔 Sol gristhR AA, Bas TH wy BABB. (1) KMGE 律 宾 土壤 的 内 根 际 分 离 的 所 有 菌 推测 是 无 色 杆 菌 属 《4chromobacter) ， 而 在 塞内加尔 Sol 可 is 中 最 多 的 固氮 菌 种 类 是 由 可 能 属于 节 杆 菌 属 〈.4rthropacter) 的 具有 粉红 色色 素 种 构成 My; 《2 ) Watanabe 和 Barraquio 发 现 利用 葡萄 糖 的 固氮 菌 比 利 用 鞋 果 酸 的 固氮 菌 多 得 多 ， 而 Reussos 等 发 现 从 所 有 三 种 样品 中 分 离 的 菌 广泛 利用 蔷 果 酸 ， 〈3 ) 从 非 律 宾 土 壤 中 分 离 的 固 氨 菌 对 营养 的 要 求 〈 维 生 素 和 氨基 酸 ) 比 从 塞内加尔 Sol griis 中 分 离 的 菌 更 加 显著 。 «QSle 334 _ 根 际 土 、 根 守 、 内 根 才 三 种 稻 土 系统 的 菌落 GEM 总 微生物 BREWERS) KR # xX’ RR AR Aba Kaa IR26 水 稻 一 菲律宾 土壤 根 际 土 2.3X 107 2.4 未 测定 Rm 1.5X 107 76 未 测定 内 根 际 1.1X 108 81 未 测定 Moroberekan 水 称 一 塞内加尔 $ol gris 根 Bs ot 2.8X 108 53 1.7 AK 表 1.8X108 25 4.1 内 根 fx 1.2X 108 16 7.2 oroberekan 水 称 一 塞内加尔 $ol Dior 根 Be 土 2.4X 108 17 0.5 根 .，- 表 1.6X 10° 28 0.1 内 ik 际 2.4% 107 50 0.1 EDR ia /TFE GRRL) 或 / 克 干 很 〈 棚 表 和 内 根 际 ) 表示 。 2.3. BH Ble] AI (Azotobacter) » RAR (Clostridium) KA RVARR ( Azospirillum) 在 水 稻 根 际 大 量 存在 以 外 ， 各 种 各 样 的 细菌 很 多 。 许 多 是 微 好 气 的 ， 专 性 或 兼 性 厌 气 菌 是 存 在 的 ， 但 一 般 不 多 。 根 据 以 上 的 报道 ， 固 氛 菌 根 际 的 群体 在 性 质 和 数量 上 有 很 大 幅度 的 变 ， 化 。 固氮 细菌 在 其 他 根 际 微 生物 之 中 所 占 的 比例 很 大 ， 所 以 水 稻 根 际 是 固氮 作用 活跃 的 一 个 潜在 部 位 。 然 而 我 们 在 下 面 可 以 看 出 这 种 潜力 的 表达 受到 环境 因子 或 药剂 的 限制 ， 例 如 : 放 线 菌 就 阻碍 了 他 们 的 活动 。 而 且 要 知道 ， 即 使 固氮 菌 达 到 10 "一 10 微生物 / 克 王 根 这 样 高 ， 但 也 并 不 意味 着 根 表 被 细菌 居 履 盖 ， 细 菌 覆盖 在 根 表 从 未 超过 10%。 3. 稻 田 土 梳 中 影响 异 养 固氮 的 因子 根 际 微 生物 固氮 作用 的 生态 状况 近来 已 有 论述 ，Dommergues 和 Rinaudo 的 评述 特别 注 意 到 水 稻 根 际 。 水 稻 根 际 的 国 氮 作 用 首先 依赖 于 植物 和 根 际 固 所 细菌， 环境 和 土壤 因子 也 直 接 和 间接 通过 植物 影响 到 根 际 微生物 。 3.1. 类 物 的 作用 8.1.1. 植物 的 基因 型 。 一 些 报道 证 实 ， 植 物 的 基因 型 影响 植物 与 其 根 际 因 氨 细菌 联合 。 根 据 Lee 等 的 报道 ， 用 乙 抉 还 原 活性 (ARA) 法 测定 固氮 作用 的 能 力 ， 在 抽穗 期 与 水 稻 根 干 重 有 关 ， 根 部 供给 根 际 有 机 物质 的 数量 大 概 是 这 种 关系 的 主要 因素 之 一 。 Dommergue 和 Rinaudo 在 首次 实验 中 发 现 ， 通 过 Y- 射 线 照 射 后 获得 的 两 株 不 同 水 稻 突 变 种 〈Cesariot 和 Cigalon)， 当 它们 生长 在 没有 灭 菌 的 Camargue 土 壤 中 时 ， 其 根 际 的 己 块 还 原 活 性 范围 分 WA 500 一 5320 (Cesariot) #1860—7370 (Cigalon) nmolC: 百 4/ 克 生根 .小 PB (#5). Bx 次 实验 是 应 用 了 部 分 同 种 植物 材料 原始 种 Cigalon 和 两 株 水 稻 突变 种 。 在 第 一 次 实验 中 突变 种 工 的 乙 业 还 原 活 性 最 低 ， 而 也 的 乙 抉 还 原 活 性 最 高 ， 但 在 第 二 次 实验 中 ， 生 长 在 塞内加尔 Sol gris 上 的 不 像 在 第 一 次 实验 那样 ， 三 种 水 稻 基 因 型 的 乙 业 还 原 活 性 差别 很 大 '( 表 5 ) 。 两 次 实验 结果 之 间 的 差异 是 由 于 土壤 的 化 学 和 生物 学 性 质 不 同 的 缘故 。 ee 92。 35 ”Cigalon 水 稻 和 2 株 突 变种 生长 在 Camsrgue 和 识 内 加 尔 Sol gris 的 粘性 土 壕 中 ， MHOC RARE (ARA) ( 3 ea 7k iS iD ~ ARA@mol CoH4/sé-Fik *+S.E) A “Cigalon” eee Ea “塞内加尔 Sol pile 第 一 次 实 s) BIRR) 订 ,本 4079 士 1 1383 2589 上 466 突变 株 工 - 861 士 456 3682 士 1254 RB KH 7368-41971 2330-592 S .正三 标准 误 盖 。 这 些 数据 导致 了 这 样 的 结论 ， 对 于 通过 乙 烽 还 原 活性 来 得 选 水 稻 基 因 型 的 结果 ， 在 解释 时 要 极为 小 心 ， 以 防止 把 未 确定 的 环境 条 件 引 入 概念 中 。 3。1。2。 随 时 间 变化 。 由 于 气候 条 件 随 时 间 而 变化 ， 某 些 植物 生理 过 程 的 速度 也 变 化 了 ， 因 此 ， 可 以 预料 ， 与 植物 联合 的 固 氨 活性 也 随 之 变化 。Balandreau 等 ，Trolldenler 及 Rinaudo 等 和 Becddey 及 Ahmad 报 道 了 有 昼夜 间 实 际 的 变化 。 在 水 稻 生 长 季节 乙 抉 还 原 活性 变化 的 早期 报道 中 指出 ， 抽 穗 期 活性 最 高 。 原 位 测定 证 实 了 这 个 结果 。 3.2. 气候 因子 8。2。 1T.。 光 强度 。 当 植物 还 处 于 幼苗 期 时 ， 有 利于 固氮 菌 所 需 能 量 物质 的 产生 ， 这 | 种 物质 主要 是 由 根 分 沙 物 组 成 。 由 于 根 分 泌 作用 依赖 于 光 强 度 ,项 光 10 天 的 水 稳 幼 苗 的 根 际 乙 TI 业 还 原 活性 降低 ， 这 种 降低 是 由 于 提供 根 际 的 碳 源 减少 的 缘故 ， 其 结果 与 去 顶尖 14 天 或 21 天 植物 的 乙 块 还 原 活 性 急剧 下 降 相 类 似 。Rinaudo 等 报道 了 水 稻 幼 苗 根 际 乙 烽 还 原 活 性 的 尽 ” 夜 波动 。 认 为 乙 烽 还 原 活 性 与 植物 的 光合 作用 能 力 密切 相关 。 然 而 ， 这 种 关系 在 多 数 成 熟 的 植物 中 没有 发 现 。Lee 等 报道 了 去 掉 梢 尖 的 水 稻 在 24 小 时 内 对 原 位 乙 抉 还 原 活 性 影响 很 小 。 当 植物 衰老 讨 ， 根 腐烂 物 和 根 脱 落 物 可 以 供给 固氮 菌 一 种 额外 产能 化 合 物 ， 它 大 大 补充 了 碳 _ 库 。 eo, Oe ee. eee ae se YO 光 强 度 可 以 直接 和 间接 地 影响 非 根 际 土壤 的 异 养 固氮 作用 。 直 接 作 用 主要 与 光合 固 氨 细 获 的 生长 和 活性 有 关 。 间 接 作 用 是 光合 固氮 菌 的 生长 对 土壤 中 固氮 异 养 菌 的 刺激 和 抑 制作 用 。 光 合 细菌 已 被 认为 是 水 稻 土 中 重要 的 固氮 菌 。 光 合 细菌 在 低 光 强 和 厌 气 环 境 下 ， 在 固氮 的 过 程 中 将 比 蓝 营 更 有 利 。 光合 铀 生物 在 固 甩 方面 的 间接 作用 是 与 水 舟 士 中 其 他 蜡 养 固氮 菌 相关 联 的 ， 但 它 它们 在 田 间 的 状况 的 材料 很 少 。. 3。2。2. 温度。 相对 的 低温 限制 了 光合 作用 、 运 输 作 用 、 分 刻 作 用 ， 因 而 减少 了 固 气 菌 能 量 物质 的 供应 和 固 气 菌 活动 。 因 此 ， 从 巡 辑 上 推测 温度 升 高 到 30 一 35 立 时 将 增加 根 际 的 乙 炬 还 原 活性 ， 然 而 还 很 少 有 数据 证 明 这 种 假定 。 非 根 际 土壤 的 温度 效应 与 地 理 因 子 的 关系 比 与 植物 的 光合 作用 活性 的 关系 更 为 紧密 ， 随 之 从 根部 提供 的 能 量 与 根 际 土壤 的 关系 很 大 。 由 于 温度 的 差异 ， 一 般 认 为 生物 固氮 活性 ， 热 党 地 区 比 温带 地 区 高 得 多 。 已 报道 的 异 养 固氮 菌 ， 贝 叶 林 克 氏 菌 〈BeijerincAia) 主要 分 布 在 热带 地 区 。 而 Becking 报 道 ， 这 可 能 不 是 由 于 温度 的 差异 ， 而 是 某 些 其 他 主 壤 因子 ) 如 : pS 或 微生物 之 间 的 竞争 的 缘故 。 93 。 3. 3. hRAF 3。3。1i。 土 庆 类 型 的 变化 。Rinaudo 等 和 Gafcla 等 表明 ， 同 一 水 稻 品 种 生长 在 不 同 的 有 亚 菌 的 土壤 中 ， 表 现 出 不 同 的 固氮 能 力 。 比 如 : 生长 在 Camargue 土 壤 〈 法 国 刀 17 天 Win, FE CRIA RTS HEHE RE Boundoun+3#% CHEW IN) 高 32 倍 。 这 些 差 开 显 然 St 滚 因子 有 关 ， 这 也 说 明了 土壤 是 环境 的 基本 部 分 ， 但 它 和 常常 被 忽视 。 当 然 进一步 研究 说 明 引 起 乙 抉 还 原 活性 变化 的 土壤 化 学 和 生物 学 特性 的 作用 。 如 以 上 提 到 的 那样 。 3。38。2。 气 体 氮 。 浸 水 稻 土 似乎 不 利于 生物 固 所 作用， 因为 土壤 中 氮气 的 供应 受到 限制 。 Takai 等 报道 ， 浸 水 后 两 星期 溶 于 浸水 土 中 的 氮气 一 般 是 恒定 的 ， 其 后 甲烷 气体 的 数 量 增加 了 ， 如 果 浸 水 土 中 种 植 水 稻 ， 氮 气 将 通过 植物 的 气体 输送 系统 送 到 土壤 中 。 然 而 在 没有 水 稻 植 物 时 ， 气 气 在 浸水 土 中 的 分 压 有 可 能 不 能 促进 异 养 固氮 菌 的 固 所 作用。 天气 所 扩散 到 稻田 水 中 而 且 进 入 到 稻田 表土 中 。 根 据 Mogdoff 和 Bouldin 报 道 ， 气 气 扩 散 的 浓度 在 IK FR 水 土 表面 的 6.6 厘 米 深 处 时 ， 浓 度 在 理论 值 上 接近 零 。 交 替 的 浸水 和 落 千 提供 了 高 效率 固 A 的 有 利 条 件 ， 因 为 它 增 加 了 氮气 的 分 压 。 3. 3, 3, 无 机 氮 。 不 同形 式 的 结合 态 所 在 所 有 固 扎 微生物 中 《【 除 解 阻 吉 的 突 变型 外 ) 阻 遇 固 气 酶 的 合成 。Yoshida 等 指出 160ppm 的 结合 态 所 加 入 水 稻 士 系统 申 竞争 性 地 抑制 了 COREE. WPA. CEASA, 750ppmNM, AAMT RLY A 所 活性 ， 即 使 施用 较 低 的 结合 态 所 〈10ppm 尿 素 N) 也 受到 影响 。 当 然 结合 态 氨 的 作用 比 预 ， 想 的 更 加 复杂 。 根 据 Balandreau 等 的 报道 ， 使 用 所 达到 40ppmNH4=N (120 公 斤 N/ 公 顷 ) 时 ， 对 水 稻 根 际 的 乙 炊 还原 活性 没有 抑制 作用 ; 相反 , 乙 燃 还 原 活性 咯 有 升 高 , 头 概 是 由 于 分 泌 到 土壤 中 的 分 泌 物 增多 所 致 。Trolldenier 同 样 发 现 ， 使 用 所 达到 140 公 斤 N7 公 项 时 ， 根 际 乙 抉 还 原 活 性 增加 了 。 由 于 水 稳 植 物 吸收 结 合 态 氮 ， 并 全 部 用 于 他 们 的 快速 生长 ， el UY 阻 遏 仅 产 生 在 生长 的 初期 ， 因 此 ， 早 期 施 气 肥 有 利于 植物 生长 ， 也 并 不 妨碍 生物 固氮 作 用 。 3 .38 。4 .pH 和 除 所 外 的 其 他 无 机 元 素 。 实 验 室 的 试验 表明 ， 纯 培养 的 国 气 菌 的 生 长 是 依赖 于 pH 值 的 。 许 多 田间 测量 证 实 了 这 些 结果 : ER (Azotobacter) 一 般 限 于 中 性 或 碱 性 的 土壤 中 ， 而 贝 叶 林 克 氏 菌 〈BeiyerincRic) 最 能 忍受 酸性 条 件 。 固 气 螺 菌 〈 双 zos 太 - rillum) 主要 出 现在 pH5.6 一 7.2 的 土壤 中 。 -seliibeeeiiaieaeadeetaatieen oe te 田间 测量 提出 ，p 互 的 影 喝 比 预料 的 少 。 除 无 机 氨 外 其 他 元 素 的 状况 ， 电 可 以 通过 改变 植物 的 分 泌 作用 而 影响 因 氨 作用 ， 热 而 有 | 关 这 方面 丁 解 却 很 少 。 磷 含量 肯定 是 一 个 重要 的 限制 因子 ， 特 别 在 贫 将 的 土壤 中 六 与 所 报道 的 豆 科 植物 相似 。 在 泰国 长 期 肥效 的 测定 中 ，Watanabe 和 Cholikal 观 察 到 当 水 稻 植 物 添 加 磷 时 ， 其 联合 固氮 活性 增加 了 。Trolldeniev 观 察 到 ， 缺 钾 会 引起 氧 浓度 和 氧化 还 原 电 位 的 降 低 ， 二 tai KR 件 ， 但 在 植物 生长 方面 却 存 在 有 害 作 用 。 8.3.5. 土壤 氧 和 水 状况 。 土 壤 水 含量 并 不 直接 影响 固 所 作用， 但 影响 子 气体 的 交 fh iat BE aha 氧 和 水 系 的 作用 对 固 气 作用 的 影响 是 不 能 分 开 的 。 固氮 酶 是 厌 氧 的 ， 它 们 的 所 有 体系 中 都 存在 着 氧 保护 系统 ， 空 气 中 的 氧 由 水 稻 的 气体 输 导 系 统 运转 ， 大 部 分 是 由 提供 根 际 固 扼 菌 有 利 条 件 的 根 组 织 呼 吸 作用 而 消耗 。 Rice 等 发 现 ， 好 气 一 厌 气 界面 的 产生 对 于 土壤 一 稻草 混合 物 的 固氮 作用 是 非常 重要 的 ; 在 2 毫米 的 好 气 层 中 ， 半 纤维 素 和 纤维 素 的 分 解 产 物 通 过 界面 扩散 而 支持 了 厌 气 层 中 梭 菌 se 94 。 (clostridia) 的 固氮 作用 。 在 这 模型 的 系统 和 浸水 水 稻 根 际 之 间 有 些 类 似 之 处 ,后 者 所 处 | 位置 是 从 叶 到 根部 的 空气 扩散 ， 其 结 采 产 生 了 好 气 和 厌 气 界面 。 生 长 在 厌 气 水 饱和 土 双 中 的 ee EE - — ~~ Tk FEE Yo PY AS Hi 3S BABB» PAN He A ad 8 1 AP SRE Fy BE ALT BE EI BP BG HE , FEB — PM AAA IIE RRP EA. tea PP Me al aD ek A RB ET 9 Re BE 的 微 环 境 。 由 于 这 种 保护 作用 ， 除 固氮 菌 属 (Azotobacter) 外 ， 在 许多 自生 固氮 菌 中 都 发 彰 得 不 好 ， 所 以 报道 植物 生长 在 水 田 根 际 的 乙 灿 还 原 活性 比 旱田 条 件 的 报道 多 。 水 稻 士 中 加 入 有 柄 物 促进 了 好 气 微生物 的 呼吸 作用 ， 并 且 增 加 了 排出 分 子 氧 和 降低 氧化 还 原 过 程 ， 创 造 了 水 稻 土 中 厌 气 环境 。 通 过 水 向 土壤 中 扩散 而 提供 的 氮 含 量 是 很 低 的 ， 只 能 满足 土 表 的 几 毫 米 厚 。Magdoff 和 Bouldin 提 出 了 有 利于 固氮 作用 的 假设 ， 认 为 当 纤维 素 无 氧 分 解 产 物 遇 到 ， ”诸如 N 扩 散 和 王 燥 等 好 气 条 件 时 最 好 。 — _- - Ra si ev ee aa 3。3。6。 能 量 供应 。 大 量 的 固氮 作用 是 取决 于 矶 和 能 量 的 适当 供应 ， 当 植物 处 于 纪 莫 时 期 ， 根 分 泌 物 和 根 分 解 产物 、 根 表层 和 表层 细胞 等 是 根 际 微生物 主要 的 能 量 物质 来 源 。 随 着 植物 的 衰老 ， 根 脱落 物 可 以 提供 固氮 菌 用 以 获得 产能 化 合 物 的 外 部 来 源 。 足 以 说 明 ， 在 生长 中 由 植物 根系 活动 所 分 泌 到 土壤 中 的 有 机 物 数量 ， 因 根 损伤 和 其 他 微生物 的 存在 而 增 加 。 在 没有 灭 菌 条 件 下 ， 生 长 的 水 稳 根 际 产生 可 利用 物质 的 数量 报道 很 少 。 在 IRRI， 用 同 位 素 技术 计算 了 IR8 和 IR22 水 稻 根 分 泌 物 的 数量 ， 在 开花 初期 ， 释 放 到 土壤 中 同化 的 …“C 的 百分比 是 1.9% 和 2.2% ， 在 收获 期 为 3.2% 和 6.7% 。 但 这 种 碳 量 只 表明 碳 是 从 根 分 泌 物 和 根 际 土 壤 中 获得 的 ， 它 不 包括 由 根 际 细菌 所 矿 化 的 碳 。 Martin 的 数据 表明 ， 在 分 葛 初 期 和 开花 期 之 间 毯 移 到 田间 生长 小 麦 根 系 的 光合 产物 大 约 是 1800 公 天 碳 公顷。 佑 计 在 流体 和 其 他 化 合 物 中 存在 的 30% 根部 碳 不 能 被 微生物 分 解 和 巨 速 利用 ， 将 有 1000 公 斤 碳 / 公顷， 可 为 微生物 区 系 和 微 动 物 区 系 所 利用 。 腊 养 固氮 作用 所 需 的 碳 量 还 有 些 疑 问 ， 但 一 般 估 计 是 30 一 40 公 斤 矶 固氮 工 公斤 。 如 果 在 浸 水 稻 根 系 中 的 碳 和 所 数量 与 小 麦 处 于 同一 数量 范围 ， 那 末 它 们 可 获得 异 养 固 氮 量 25 一 30 公斤 NA 公顷 的 最 高 限 。 每 1000 公 斤 可 利用 碳 公 项 所 得 的 实际 固 氨 量 是 很 少 的 ， 因 为 不 上 只 浊 补 偿 了 根 的 呼吸 作用 ， 而 且 还 诱导 了 不 同 细菌 群体 间 对 碳 的 竞争 作用 ， 其 中 许多 是 没有 固 FURIE DAY 在 水 稻 中 ， 国 氮 菌 在 总 微生物 区 系 占 有 很 大 百分比 ， 假 如 其 他 限制 因子 不 阻碍 这 个 过 程 的 话 ， 那 末 可 以 推测 根 际 流出 的 大 部 分 能 量 可 以 用 于 固 所 作用 。 在 非 根 际 主 培 中 的 大 多 数 异 养 固氮 菌 ， 依 靠 可 利用 碳 物 质 作 为 它们 区 系 的 能 量 来 源 。 在 自然 条 件 下 ， 土 壤 中 的 有 机 质 如 : 腐 殖 酸 ， 不 易 快 速 分 解 。 因 此 ， 新 鲜 的 有 机 质 如 死 的 植物 组 织 或 根 组 织 ， 进 入 到 稻田 中 并 留 在 土壤 中 ， 这 将 是 水 稻 土 自然 环境 中 蜡 养 细菌 固氮 作用 的 良好 能 萤 来 源 。 推 测 ， 水 稻 植 物 的 总 王 物 重 是 10 吨 /公顷 〈25 儿 是 根 ) ， 保 持 在 水 稻田 中 的 有 机 物 ， 残 余 物 大 概 有 2.5 吨 公顷。 稻草 非常 有 利于 促进 水 稻田 中 腊 养 细菌 的 固氮 作用 。 JAN-15 技术 测量 田间 土壤 中 的 固氮 能 力 是 42 一 45 公 斤 Nz/ 公 硕 ， 而 稻草 低 于 工 % 时 的 浸水 生年 壤 中 为 13 一 150 公 斤 Nz/ 公 项。 土壤 中 稻草 5 一 20% 时 ， 固 握 率 高 达 500 一 1000 公 斤 Nzy ZS 是 硕 ， 这 个 研究 是 在 浸水 条 件 下 接种 进行 的 。 然 而 . 在 水 稻田 间 这 是 不 寻常 的 事情 ， 因 为 假定 工 公顷 含有 200 万 公斤 土 ， 那 末 1LE%% 的 稻草 就 需要 20 吨 /公顷 。 8.3. 7. 固氮 细 菌 和 其 他 土壤 微生物 的 相互 作用 。 固 氛 细 菌 在 有 其 他 括 抗 或 协同 微 生物 存在 时 ， 生 长 最 旺 羽 。 有 关 这 种 相互 作用 的 天 多 数 研 究 已 在 试管 中 进行 。 然 而 ， 某 些 » 95 最 近 的 观 终 和 实验 注意 到 ， 发 生 在 没有 死 菌 土壤 中 ， 生 长 植物 根 际 的 过 程 。 eee TRA WAR (Azotobacter) RMN AGERE (Beijerinckia) Wii 抗 作用 。Roussos 等 指出 了 从 生长 在 塞内加尔 Sel gris 的 Moeroberekan 水 稻 内 根 际 分 离 出 具 有 固氮 酶 的 细菌 比例 很 低 ， 这 可 能 是 由 于 放 线 菌 持 抗 作用 的 结果 。 放 线 菌 对 固氮 细菌 在 根部 群体 的 实际 作用 比 想象 的 更 加 复杂 。 因 此 ，Rinaudo 等 发 现 用 两 种 放 线 菌 接种 到 生长 在 没有 灭 菌 土壤 的 水 稻 ， 根 际 的 乙 炽 还 原 活 性 降低 25 色 本 实 验 1) 。 但 是 ， 当 同样 的 放 线 菌 菌 种 加 上 所 用 固氮 菌 组 成 刘 合 培养 ， 根 际 乙 烽 还 原 活 性 比 单 独 接种 固氮 菌 时 高 75% 〈 表 6 ， 实 验 2 ) 。 实 验 1 中 乙 抉 还 原 活 性 的 降低 被 解释 为 ， 可 能 是 放 线 菌 间 的 持 抗 作用 和 土著 固氮 微生物 区 系 的 作用 。 在 实验 2 中， 混合 培养 时 乙 烽 还 原 活 性 BAPE Da Hel et Ed TL 2 Ba UL FD PE FB 28k A 0 36 EER RLM (Sol gris) EMoroberekan7k Hie bn ee (4) 和 2 PRR (AL MALS RS w ARA (nmol C2Ha//pit + £S.E) 接 种 Fe EE hs a OS Oe te oe 植物 1 株 克 于 根 x i wh FA 173423 ) 4640-1900 Al+Al5 130483 | 310041950 实 he F4 132+34, | - 3100-+950 F4 十 Al 十 Al15 234 士 176 5690-3850 S. 卫 一 标准 误差 。 根据 Remacle 和 Rouatt 的 报道 ， 在 大 麦 的 早期 ， 分 解 果 胶 的 细菌 对 于 根 和 种 子 残留 物 的 分 解 ， 并 且 释 放出 可 被 利用 的 碳 氢 人 化合物， 因此， 促进 了 固氮 菌 (Azotobacter) 的 繁殖 。 这 种 促进 作用 ， 可 以 在 固氮 菌 和 分 解 果 胶 细菌 混合 培养 ， 并 接种 在 灭 菌 土壤 中 ， 生 长 的 水 稻 根 际 中 观察 到 。 有 趣 的 是 ,在 检测 从 塞内加尔 水 稻 根 际 分 离 处 理 的 34 个 固氮 螺 菌 〈4zos 齐 天- llum) 菌株 中 ，Diem 等 发 现在 所 研究 的 菌 种 中 有 53%% 能 利用 果 胶 作为 固氮 物质 。 其 他 土壤 微生物 可 能 包括 在 括 抗 过 程 中 。Rinaudo 和 Germai 获 得 的 结果 表 WH, Hirsch- manniellaRee th G27 AAD ESE Hh) He DA fr AT Be 7k Ak 稳 土 中 非 共 生 固 氨 的 抑制 作 用 。 3 。 4 。 总 结 比较 共生 固氮 系统 和 水 稻 根 际 固氮 系统 的 差异 列 于 表 7 。 在 水 稻 根 际 固氮 菌 明 显 地 找到 了 一 个 有 利 的 微 环 境 ， 但 在 植物 生长 和 固氮 微生物 活性 之 间 却 设 有 紧密 的 关系 ， 大 概 因 为 他 们 保持 与 其 他 微生物 区 系 成 员 的 竞争 作用 。 和 植物 和 固氮 菌 之 间 的 松散 的 联合 ， 说 明了 这 个 系 统 对 环境 因素 的 影响 是 很 敏感 的 ， 因 此 是 很 不 稳定 的 。 所 以 目前 在 固氮 方 面 的 国际 讨论 会 在 推荐 这 种 关系 时 ， 常 命名 为 “联合 共生 ?” ， 将 提交 到 “生物 学 协会 > 。 96 | : ~ Rl 豆 科 和 根 际 固 氨 系统 的 比较 一 一 一 一- -一 -一 -一 -- 一 -一 -一 固 毛 细 功 Bie 国定 1 umolN 固定 所 的 特性 所 需 能 量 氧 保护 系统 种 类 侵 染 (葡萄 糖 克 分 子 ) 利用 方式 豆 科 一 根 ”根瘤 菌 专 性 细胞 内 1 植物 细胞 以 NHY 一 N 的 瘤 菌 共生 和 色素 ， 形式 直接 被 豆 科 如 : 豆 血 红 植物 利用 蛋白 RAR vem 非 专 性 根 表 、 3—4 (HARA) ARI 间接 和 部 分 直接 系统 于 不 同 老 的 或 8 一 10 (RRM) 02 的 被 植物 利用 的 种 ， 死 根 表 推测 某 些 环境 因子 能 保护 作用 常常 与 层 细胞 提高 效率 2 或 3 倍 其 他 微 MRR 生物 联 S$ 合 4. 水 稳 土 中 国 氮 作 用 的 贡 控 水 稻 作 物 的 生产 还 不 能 完全 不 施用 气 肥 。 然 而 在 许多 种 稳 国 家 中 ， 肥 料 的 使 用 是 极 有 限 的 ， 增 加 生产 ， 实 际 是 依靠 稻 土 中 的 天 然 肥力 。 有 关 促 进 水 稻 生 长 的 氛 素 营养 的 两 个 主要 方 WM: (1) KBB PARAS, (2) 水 稻 生 产 中 氛 的 效率 。 画 一 方面 ， 充 分 供应 化 学 肥料 的 种 稳 国 家 ， 由 于 他 们 的 环境 问题 和 能 源 短 缺 问题 ， 为 农 ” 业 开 拓 可 利用 的 生物 氨 源 的 可 能 性 方面 具有 很 大 的 兴趣 。 为 了 增加 氨 素 ， 我 们 应 该 考虑 改善 环境 条 件 以 提高 因 所 作用。 与 自生 和 联合 固氮 相 关连 的 各 种 因子 已 经 讨论 过 了 ， 还 应 该 对 共生 固氮 系统 加 以 考虑 ， 为 了 充分 利用 固定 的 氮 在 田间 管理 中 ， 防 止 通过 淋 洗 或 反 硝 化 氨 的 丢失 ， 并 用 接种 固氮 细菌 的 方法 促进 水 稻 根 际 的 固 氛 作 用 ， 或 筛选 高 固氮 的 水 稳 品 种 ， 研 究 这些 问 题 的 年 代 已 经 到 来 了 。 4 。1 。 有 机 物 的 应 用 日 本 的 稻草 直接 利用 于 水 稻田 ， 目 前 已 广泛 被 日 本 农民 所 接受 。1972 年 的 研究 表明 ， 晶 本 水 稳 的 平均 产量 ， 谷 粒 为 4.93 吨 /公顷 ， 稻 草 为 4.89 吨 /公顷 。 稻 草 物质 加 到 水 稻田 中 ， 将 是 固氮 菌 良好 的 能 量 来源 。 从 腐烂 的 稻草 中 释放 到 空气 中 的 二 氧化 碳 ， 能 为 作物 用 于 光合 作 用 ， 随 之 可 以 影响 水 稻 根 际 的 固 氛 作用 。 然而 ， 东 南亚 许多 国家 中 ， 存 在 着 传统 性 地 燃烧 稻草 防止 水 称病 害 问题 。Williams 等 报 道 ， 甚 至 稻草 增加 比率 到 30 吨 /公顷 时 ， 无 论 是 燃烧 还 是 加 入 任何 水 平 的 氮肥 ,在 5 年 内 水 稳 收 获 的 平均 产量 没有 可 测 出 的 差别 。 应 用 象 稻 草 或 纤维 素 那 样 的 有 机 物 ， 会 促进 浸水 土壤 中 的 生物 固 氨 作用。 然而， 当 水 稳 植物 生长 期 内 ， 将 有 机 物 加 到 水 稻田 中 固 氨 活性 的 实际 测量 却 很 少 报道 。Matsuguchi 所 作 田 疝 实验 指骨 ， 利 用 稻草 促进 水 稳 土 的 固 氨 活性 与 每 公顷 加 氮肥 50 公 斤 的 结果 相同 。 Ponnamperuma 报 道 ， 稻 草 的 加 入 将 增加 水 稳 土 中 的 总 N 含量 ,每 季 可 达 39 一 57 公 JF N/ 公 项 。 4 。 2 。 联 合 固 氨 作用 的 促进 水 稻 植 物 的 氮 素 营养 与 它 的 光合 作用 活性 和 碳 代谢 密切 相关 。 当 生殖 期 ， 把 碳 供给 水 稻 9 97 ， 根 际 ， 这 将 是 促进 联合 固氮 菌 的 固 须 作用 一 企 非 常 重 要 的 因素 。 有 人 提出 ， 一 些 水 生 系统 和 禾 谷 类 作物 可 提供 能 量 给 异 养 的 固氮 菌 。 对 于 促使 水 稻 植 物 提 供 能 量 的 任何 方法 将 被 重点 考 虑 和 癸 究 。Hale 和 Moore 广 泛 地 评述 了 影响 根 分 泌 作 用 的 各 种 因子 ， 如 : 植物 、 环 境 和 化 学 药剂 等 方面 的 工作 。 除 自 生 晃 养 菌 的 固 绿 作 用 外 ， 根 际 的 联合 固 扼 作 用 也 能 为 使 用 于 水 稻田 的 有 机 物 所 促 it. ; AT Kini AGH, iiveA Scho 7k ah VEY. in PAY ABER EA 所 不 同 的 ， 根 重 和 固 所 活性 之 间 的 相关 性 是 很 大 的 。 按 照 高 光合 作用 活性 、 叶 色 深 度 或 根 氧 化 活性 这 样 系统 选 育 水 稻 品 种 ， 将 要 进 --- 步 的 探讨 。 在 生殖 期 ， 固 氮 菌 大 量 的 微生物 群落 聚集 在 水 稻 根 际 。 固 氮 菌 聚焦 在 根 组 织 内 和 根 表 与 水 稻 植 物 紧密 联合 。 然 而 ， 还 没有 报道 固氮 菌 专 一 紧密 地 与 稻 根 的 结合 。 某 些 细菌 诸如 固 氛 7 ha AUR] CAzospirillum lipoferum) 人 工 接种 一 些 委 划 ， 增 加 了 收 草 的 产量 。 目 前 也 曾 thi, FHI RE PEAR (Azospirillum brasilense) 成 功 地 接种 于 玉米 或 水 才 。 关 于 水 稻 ， 除 Gauthier 和 Rinaudo 外 ， 只 有 很 少 人 进行 赋 究 。 这 些 作 者 表明 ， 应 用 32 个 不 同 的 固氮 螺 菌 (Azospirillum) 种 接种 生长 在 试管 中 -3 Als Mai. HGRA CBIR ME I AA 同 ， 在 未 灭 菌 的 塞内加尔 的 Sel gris 中 ， 根 际 的 乙 烘 还 原 活性 或 者 增加 〈+ 60% ) 或 者 减 少 (-80%) 。 这 个 反应 随 土壤 类 型 不 同 而 异 。 另 一 个 实验 ， 用 同样 的 实验 设备 进行 ， 表 角 用 EL Paw (Azospirillum brasilense sp.7) 接种 ,大 大 促进 了 植物 生 长， 但 这 种 促进 GOGAT PECK (HS) . Ak, WAR RA CAzospirillum sp.7) 产生 刺激 生长 的 物质 。 和 但 是 ， 到 现在 为 止 ， 在 幼苗 情况 下 所 观察 到 的 这 种 接种 有 益 的 作用 ， 在 大 规模 实验 中 还 没有 观察 到 。 在 后 来 的 实验 中 , 缺乏 这 种 反应 还 归 因 于 接 人 的 固氮 螺 菌 (4zoszirilluxzy 种 被 竞争 作用 所 抵消 的 结果 。 这 一 过 程 在 小 的 设备 中 不 会 发 生 ， 实 验 是 接种 培育 与 本 地 的 微 生物 区 系 作 了 大 量 比较 的 。 28 接种 固氮 巴西 螺 菌 (4.2>asiense sp.7) Bj) LIMWIA BH MoroberekankB MH CRERBHEAZLKH ip | ARA 植物 生长 土壤 接种 camol C2) +S .E 地 上 部 分 根 部 Avy, 5* mg/ 植 株 土 S. 卫 mg/ 植 株 士 S. 忆 Sol gris 0 60+56 48+18 68 士 11 十 50 士 21 136+13 85+12 Bel Air 0 200-+33 75414 4545 + 322+146 10617 47+ 3 Eoundoum 0 61416 62415 48 士 了 十 47 士 31 125 士 18 87+9 3S5 卫 二 平均 标准 误差 。 4.3. 田间 管理 保持 唐 水 条 件 的 土壤 ， 似 乎 是 水 稻 士 中 氮 素 积 黑 的 关键 。 流 水 休 耕 在 Maahar 粘 土 中 ， 平均 每 季 增 加 总 N 含 量 为 50 公 斤 / 公 项 。 水 稻 植 物 在 根 际 固定 的 氮 , 迅 速 地 转移 到 植物 组 织 中 去 。 在 生殖 期 ， 水 稻 根 际 的 固 所 作用， 在 水 稻 的 氮 素 营养 方面 起 到 了 作用 ， 因 此 对 水 稳产 量 也 有 所 贡献 。 e 98 e 水 稻谷 粒 产量 与 水 稻 植物 生殖 期 的 氨 素 含量 直接 相关 ， 它 决定 单位 面积 小 穗 的 数量 和 谷 粒 成 熟 率 的 平均 值 。 在 日 本 ， 水 稻 植 物 籽粒 的 产量 很 高 ， 一 般 在 孕穗 期 后 ， 繁 殖 期 吸收 总 植 | 物 N 的 30 一 40%。 现 在 日 本 农民 在 生殖 期 把 氨 肥 施 到 水 稻田 中 。 在 孕穗 初 期 到 拓 穗 期 之 间 使 用 所 在 日 本 被 称 为 “进行 期 ”而 在 抽穗 期 到 成 熟 之 间 被 称 为 “人 敏感 期 ”。 然而 使 用 氮肥 明显 节 抑 制 在 根 际 的 固氮 菌 及 固氮 螺 菌 〈4zosjiiril1um) 的 活性 Troll- deniev 报 道 了 使 用 N、P 或 K 在 水 稻田 的 长 期 肥效 试验 能 大 大 地 促进 水 称 根 际 的 固 气 酶 活性 。 用 已 知 固 气 酶 解 阻 过 的 突变 固氮 菌 菌 株 接种 ， 这 种 突变 种 甚至 在 所 存在 时 也 能 产生 固氮 酶 ， 有 释 放大 量 的 国定 态 氮 ， 可 能 对 于 促进 施用 氨 肥 的 水 稻田 中 的 国 所 作用 ， 是 有 意义 的 。 在 水 稻 生 产 中 ， 应 该 使 用 不 抑制 生物 固 氨 活 性 的 化 学 肥料 ， 以 及 某 些 对 土壤 中 蜡 养 国 氨 菌 有 很 少 影响 的 农药 。 要 仔细 地 观察 它们 在 水 稻 中 的 效用 。 因 为 共生 固 所 作用 大 大 地 影响 着 训 科 定 牺 的 生产 和 土壤 的 氨 素 肥力 ;所 以 一 直 被 认 注 它 是 农业 生产 中 最 重要 的 生物 过 程 。 豆 科 作 物 与 水 稻 作 物 的 间 种 或 混 种 ， 可 以 促进 水 稻田 的 氨 素 积累 。 豆 科 作 物 能 在 浸水 土壤 条 件 中 生长 ,增加 士 壤 氮 ， 这 将 是 值得 研究 的 课题 。 | 4. 4. BE PURSE AUER, TELESIS RL. AT, ART (atin aaah apie — EAP, CARSON, ATEP ES KBD AD eR, 就 RA TERS ARE EE, RE, ARTA RR. ae 拷 术 革新 将 很 快 地 解决 这 个 问题 。 同 时 考虑 到 田间 管理 的 实践 ， 如 在 避免 抑制 土壤 细菌 固 氨 活性 方面 的 肥料 和 其 他 农业 化 学 药剂 的 使 用 或 水 的 控制 等 等 ， 将 是 非常 重要 的 。 | 5.27 OR | FURS RE TPS ok PT Za OR RE TT RE AIC HGR TOTS 的 简单 经 过 ， 证 明了 在 自然 条 件 下 ， 蜡 养 国 气 作用 在 水 稻 土 中 保持 氨 素 肥效 的 重要 性 。 然 而 ,光合 因 所 苗 和 蜡 养 固氮 菌 对 水 稻 所 素 营 养 的 实际 贡献 还 不 很 清楚 。 显 然 是 依赖 于 水 稳 的 环境 条 件 ， 植 物 的 生长 情况 或 某 些 其 他 因素 等 。 在 浸水 稻田 中 ， 蜡 养 固 人气 作用 主要 的 限制 因子 是 作为 能 量 来 源 的 有 机 网 的 供应 和 稻田 中 REM. 水 入 植物 的 存在 显然 是 最 重要 的 因素 。 水 稳 根 际 的 最 高 固氮 活性 是 在 植物 的 开 花期 , 正 象 在 根瘤 活 性 一 样 。 在 这 个 时 期 ,水 稻 植 物 根系 已 经 发 育成 了 , 并 且 在 王 重 、 表 面积 和 空气 输 导 系统 方面 都 达到 了 最 佳 值 。 浸 水 土壤 创造 了 独特 的 生态 部 位 ， 所 谓 的 在 土壤 表面 和 永 称 植 物 根 际 之 间 的 好 气 一 厌 气 界面 。 这 个 生态 部 位 在 稻田 的 异 养 固氮 作用 看 起 来 很 重要 。 U “水 稳 根 际 固 气 作用 的 微生物 学 研究 ， 将 促进 对 固定 氮气 有 巨大 贡献 的 固氮 菌 的 鉴定 。 它 | 不 尔 在 豆 科 一 根瘤 苗 之 问 的 关系 那样 专 一 地 结合 于 水 稻 根 部 的 细菌 种 类 。 近年 来 ， 高 国 气 的 品种 选 育 ， 用 联合 固 氨 菌 接种 种 子 ， 或 创造 异 养 固氮 作用 有 利 条 件 的 称 田 管理 措施 等 等 ， 对 于 促进 水 稻田 生物 固氮 的 作用 等 都 将 要 进一步 进行 探讨 。 原 载 “Micfobiolegy of Trepical Soils and Plant Productirity” pp. 75—107, 1982 & fei AAR ° 99 « 异型 胞 中 的 固 须 作用 P- Fay 一 导 a 自从 十 多 年 前 提出 异形 胞 是 几 类 蓝藻 (又 名 蓝 细 菌 ) 固氮 作用 部 位 的 见解 以 来 (Fay 等 ， 1968) ， 肛 形 胞 的 研究 已 经 日 益 引 起 科研 工作 者 的 注意 。 最 重要 的 是 对 这 些 可 能 是 最 古老 的 yt HBA 的 发 育 、 组 成 和 功能 的 有 了 进一步 的 认识 ， 而 有 关 蜡 形 胞 研究 的 创新 论文 和 综述 也 比 过 去 显著 增加 。 本 文 只 限于 讨论 有 关 促 进 异 形 胞 中 国 氨 过程 理解 的 一 些 发 现 ， 读 者 如 需要 对 蜡 形 胞 生物 学 更 进一步 的 了 解 可 参阅 最 近 综 合 评论 。 此 外 ， 还 可 参阅 有 关 蜡 形 胞 的 发 育 和 营 类 固氮 的 更 专门 的 评论 。 异形 胞 种 类 可 能 是 蓝藻 中 固氮 作 用 的 最 重要 代表 ， 固 氮 作 用 不 限于 蜡 形 胞 类 型 ， 偶 而 也 存在 于 异形 胞 之 外 。 存 在 空气 时 ， 只 有 产 异 形 胞 的 种 类 才能 固氮 ， 这 是 对 环境 中 缺乏 化 合 态 “ 氮 的 反应 。 例 外 的 是 粘 球 阁 属 (Gloeocapsa, Gloeotbece) 中 少数 近 缘 的 非 异 形 胞 种 类 。 虽然 后 者 能 在 低 光 照 强 度 “〈 容 许 低 光 合 放 氧 率 ) 和 好 气 条 件 下 固氮 ， 然 而 它们 在 氮气 中 生长 得 很 慢 。 相 反 的 是 在 海洋 丝 状 体 非 异 形 胞 类 束 毛 藻 属 (CT richoolesmium) . Mi#RIR 〈Oscil1- latoria) 的 天 然 群体 中 已 测 得 高 固氮 率 ， 只 是 其 国 氮 能 力 尚 无 确证 。 Stewart 和 Lex (1970) 首先 证 明 在 没有 蜡 形 胞 的 丝 状 体 种 类 鲍 氏 织 线 BH (Plectonema bor yanum) 中 能 合成 国 氮 梅 ， 这 种 藻类 能 在 无 化 合 态 扎 和 低 氧 压条 件 下 生长 “培养 县 连 续 通 入 含有 氨 气 和 二 氧化 碳 的 混合 气体 。 近 来 在 广泛 筛选 缺 氧 条 件 下 合成 国 气 酶 的 非 异 形 胞 种 类 CR BRM A Chroococcales, Hf EH A Leurocapsales, PMi¥# A Oscillatoriales) Myf , 已 发 现 131 个 供 试 种 类 中 有 52 个 GH 40%) 能 还 原 乙 块 ， 但 是 没有 一 个 能 在 通气 条 件 下 无 化 合 氨 而 能 光合 生长 ， 这 可 能 是 由 于 固氮 酶 暴露 于 氧气 中 即 迅 速 而 不 可 逆 地 形 失 活性 之 故 。 有 一 些 间接 证 据 支 持 下 述 见 解 ， 当 丝 状 体 培养 在 低 氧 压 时 ， 蜡 形 胞 种 类 中 的 营养 细胞 ， (HGS) 也 能 合成 固氮 酶 。 然 而 ， 也 有 一 些 反对 这 种 见解 的 异议 ， 例 如 当 藻 类 随后 暴露 于 空气 中 时 ，“ 厌 氧 ” 固 氮 酶 活性 并 非 迅 速 而 显著 地 受到 不 可 逆 地 抑制 ;在 微 通 气 条 件 下 ， 二 氧化 碳 固定 和 有 氛 素 固定 之 间 并 没有 引起 光化学 的 “同化 力 ” 竞 争 ;， 厌 气 生 长 导致 固有 所 酶 活性 增加 2.5 倍 ， 而 如 果 所 有 营养 细胞 都 合成 固 氨 酶 ， 则 可 望 更 高 〈20 倍 以 上 )〈 见 表 1)。 固氮 酶 活性 的 增强 可 归 六 于 在 低 的 氧 分 压 下 酶 功能 更 为 有 效 ， 也 归 因 于 藻类 的 氮 饥 俄 〈 当 培 养 物 中 通 入 氮气 及 二 氧化 碳 时 即 会 发 生 ) 激发 异形 胞 的 形成 和 固 扫 酶 合成 。 有 些 研究 者 断 定 ， 当 丝 状 体 在 大 气 条 件 中 生长 时 ， 固 氮 酶 存在 于 所 有 细胞 中 。 然 而 ， 最 近似 乎 趋 于 一 致 的 意见 时 ， 在 好 气 条 件 下 大 多 数 如 不 是 全 部 的 话 ) 固 氨 酶 活性 是 位 于 异形 胞 中 。 在 无 游离 氧 或 低 氧 压 时 ， 非 异形 胞 类 型 中 有 固 气 酶 合成 已 有 确证 ， 然 而 有 关 这 种 合成 的 天 然 存 在 的 范围 大 小 以 及 蓝藻 厌 氧 固氮 的 生态 学 意义 方面 的 知识 还 很 少 。 在 自然 界 中 ， 厌 气 。100 。 %81 4rabeana cgzindrica 的 完整 丝 状 体 的 乙 炊 还 原 ( 引 自 Smith 和 Evans，1971) 一 -一 ~. 生长 测定 时 的 气相 nmol C2H, 与 厌 气 测定 比较 被 阻 抑 条 件 (大 气压 力 ) ml Rie 3 (%) 空气 生长 0.9No. ~40,1C2He 21 be, (95 22 0.9Ar2+0.1C2H2 20 一 十 0.9 空 气 二 0.1CzHy 16 24 5 %C02 0.902 +0. 12 Hs 0 100 4 RUE an 0.9N2 +0. 1CzHs 55 一 (95 多 Na 0.9Ar2+0.1C2He 53 = + 0.94 +0.1C2H2 37 32 5 %CO2) 0.902 +0.1C2H2 0 100 条 件 占 优 势 而 光 强 度 足 够 光合 生长 〈 在 补偿 点 以 上 ) BOATS RUS. A. PAR EE (包括 氧 压 ) 迅速 变化 可 能 引起 固 氨 酶 不 可 逆 地 破坏 ， 因 而 限制 种 的 增殖 潜力 。 因 此 ， 虽 然 REAR 〈 术 语 叫 气 输 入 ) 的 生态 学 意义 是 可 疑 的 ， 但 它 在 较 特 殊 〈 如 富 硫 ) 生态 区 域 中 仍 然 是 一 个 重要 固氮 资源 。 过 去 十 多 年 的 研究 ， 已 经 消除 了 早先 对 于 异形 胞 是 固氮 主要 功能 的 特异 细胞 这 一 概念 的 怀疑 。 已 有 足够 证 据说 明 异 形 胞 的 生化 和 结构 转化 具有 这 样 一 种 性 能 : 成 熟 的 异形 胞 成 为 执 行 氛 素 固定 重要 功能 的 良好 工具 。 因 此 ， 蜡 形 有 不仅 保持 一 个 中 心 固 氨 系统 ， 而 且 包含 有 以 下 功能 顺序 的 机 制 ; a) 提 供 一 个 对 酶 功能 最 有 效 的 微 环境 ; b) 产 生 固氮 所 需 的 能 量 和 还 原 剂 ; ce) 国定 氨 素 成 为 有 机 化 合 物 ; d) 通 过 异形 胞 和 营养 细胞 的 分 隔膜 ， 为 碳 素 输入 和 氨 素 输出 保持 一 个 双重 运输 体 异形 忠 的 上 述 生 理 功 能 ， 为 讨论 异形 胞 固 所 的 有 用 资料 提供 一 个 合 得 的 框架 。 异形 胞 发 育 和 固氮 酶 合成 当 蓝 车 在 氨 素 有 限 条 件 下 活跃 生长 时 ， 营 养 细胞 通过 转化 形成 异形 胞 。 在 异形 胞 存在 和 固氮 能 力 之 间 有 一 个 直接 相关 性 的 基本 观察 ， 形 成 了 异形 胞 是 固氮 作 用 部 位 的 概念 。 虽 然 ， 可 给 态 化 合 氮 趋 向 于 抑制 异形 胞 的 形成 《和 固 氨 酶 的 合成 》 ， 但 抑制 只 是 部 分 的 ， 除 非 培养 基 中 的 氢 态 氮 浓 度 过 高 《高 于 8 x 10-4 克 分 子 ) 。 因 此 ， 在 异形 胞 中 国 氛 作 用 能 够 伴随 营养 细胞 对 化 合 态 氨 的 同化 而 继续 进行 ， 这 显然 赋予 这 些 菠 种 以 明显 的 生态 学 耀 势 能 力 。 异形 胞 发 育 的 研究 能 方便 地 用 一 种 含有 未 分 化 的 丝 状 体 作 为 研究 材料 ， 这 种 材料 是 生长 在 氨 浓 度 足 以 完全 抑制 异形 胞 发 育 时 产生 的 。 当 从 此 种 未 分 化 的 菌 丝 体 中 去 除 氨 时 〈 即 轩 化 到 不 含 化 合 氨 的 培养 基 中 ) ， 异 形 胞 才 得 以 形成 ， 这 就 便于 结合 异 彤 胞 发 育 进 行 生化 、 超 微 结构 和 生理 变化 的 研究 。 营养 细胞 转化 成 异形 忠 的 特点 是 ;贮存 产物 的 溶解 ， 细 胞 内 膜 体 系 的 形成 、 蛋 白质 降解 - 101 . 和 新 蛋白 质 合成 、 多 层 包 膜 的 沉积 和 在 异形 胞 与 邻近 营养 细胞 之 间 高 度 特殊 接 乱 或 “ 蕊 乡 区 的 形成 。 凡 备 物 的 代 放 mas ORB. BEBYRL. TEIN. HEARNE, % 07k “羧基 体 (Carbexyso- mes)] 的 多 样 性 是 蓝 某 的 特征 并 与 其 营养 细胞 的 颗粒 状 外 形 密切 相关 〈 图 1a) 。 这 些 贮存 物 质 能 使 细胞 在 长 期 营养 缺乏 时 维持 生活 。 Lang (1965) 和 Kulasooriya 等 〈1972) 已 揭示 ,在 异形 胞 形成 时 ， 细 胞 内 含 物 含量 的 变化 有 二 特有 的 顺序 ， 而 在 发 育 完全 的 异形 胞 中 内 含 物 几 乎 完全 消失 〈 图 lb) 。 在 细胞 分 化 的 早期 聚 磷 体 的 消失 在 光学 显微镜 下 显而易见 。 在 胆 蛋 白色 素 消失 后 ， 含 所 蓝藻 素 颗 六 也 深 解 ， 其 功能 为 贮存 蛋白 质 并 在 光合 作用 中 对 光 的 吸收 和 透射 有 重要 作用 。 多 角 体 在 异形 忠信 音 后 期 溶解 。 当 氨 素 耗 尽 的 初期 ， 所 有 细胞 中 的 淀粉 粒 数量 都 有 增加 ， 这 表明 在 缺乏 可 吸 改 氨 源 时 光合 作用 通 向 隘 水 化 合 物 的 合成 。 当 光合 类 讲 体 在 异形 胞 中 获 开 时 ， 演 粉 区 和 脂肪 消 Fe AE RB Hida cat a he hag 3/374 02 | El a Anabaens cylindrica 的 营养 细胞 的 超 微 结 构 特 iE, & 显示 细胞 壁 《CW) ， 原 生 质 膜 (PM), 光合 器 (类 圳 体 TH) 和 各 MAA Sy CRB (PP) s Sfatk (PH) > BEX (Cc) _ 518 VasconcelesfilFay (1974) 的 电子 显 微 照 片 图 3 。 a ee = lee + a no a Pees eG 图 15 A.cylindrica 的 成 熟 异 形 胞 围 着 多 层 外 膜 ， (纤维 层 FL; 同 质 层 HL， 薄片 层 LL) 显示 精细 的 细胞 质 膜 体系 (CMS) ， 缺 少 颗粒 内 含 物 引 自 De Vaseoucelos 和 Fay (1974) 电子 显 微 照 片 图 3 ， 区 2a A.eylindrica 的 发 育 中 的 异形 胞 ， 说 明 类 训 体 结构 的 破 散 并 在 细 胜 周边 丸 积 乡 聚 糖 蜂 粒 (PG). ESBS 之 间 的 隔膜 (S) 显示 微 胞 质 孔 5 引 自 G ,Hatfull (未 发 卖 ) SF BREE. ° 103 ， aS ar we Al2b A.cyliadrica 的 发 育 中 的 异形 胞 ， 表 明 在 质 膜 下 累积 脂肪 (CL). 引 自 G.Hatfull (未 发 表 ) 电子 显 微 照片 。 细胞 质询 体系 的 转化 当 蜡 形 胞 分 化 时 ， 细 胞 质 膜 体系 发 生 广 泛 变 化 。 营 养 细胞 的 光合 类 圳 体 破 碎 并 呈 典 型 的 周边 排列 ， 而 一 个 新 的 ， 精 细 的 汇合 膜 舍 系 形成 并 介 出 细胞 外 (国生 和 。 它 可 以 根据 联 结 谍 的 紧密 空 除 和 孔道 下 “ 稳 富 ” 状 扭 曲 膜 而 加 以 识别 。 可 以 想象 ， 细 胞 质 膜 体系 的 结构 转化 以 及 “羧基 体 〈Carboxysomes) ”的 溶解 和 蛋白 质 降 解 OUP) ， 是 和 有 异形 胞 的 色素 和 脂肪 组 成 的 变化 一 致 的 。 一 般 在 分 化 的 细胞 中 外 和 ABI VIRB, Pa Pe RE ETE ( 见 下 述 ) 。 蛋白 质 降 解 和 新 蛋白 的 合成 Wocd 和 Haselkorn (1976) 最 近 证 明 ， 鱼 腥 藻 属 CAnabeana) ;的 一 种 蓝 营 的 异形 胞 和 营 闫 细胞 在 固氮 条 件 下 都 没有 蛋白 水 解 活性 。 可 能 在 两 种 业 型 细胞 中 ， 是 一 个 单一 酶 负责 这 ， 一 活动 。 在 薰 体 转 移 到 无 化 合 氮 的 培养 基 以 后 ， 营 养 细胞 中 的 蛋白 质 很 少 降 解 。 在 营养 细胞 中 含有 35 种 主要 蛋白 质 中 的 17 种 ， 但 在 异形 胞 中 都 消失 了 ， 其 中 大 部 分 〈17 种 中 的 16 种 ) 似 ， | 乎 在 异形 胞 发 育 的 早期 即 分 解 了 。 消 失 的 蛋白 质 之 一 是 核 酮 糖 -1，5- 二 磷酸 羧 化 酶 ， 这 是 光 ， 合 戊 糙 磷 酸化 途径 的 关键 酶 类 。 和 蛋白 水 解 活性 似乎 是 引起 分 化 细胞 特有 的 基本 变化 的 重要 因 | 在 固氮 条 件 下 生长 时 ， 很 少 蛋白 质 是 在 营养 细胞 和 异形 胞 中 同时 合成 ;而 在 丝 状 体 由 含 氨 术 | 氮 的 培养 基 中 转移 到 无 氮 增 养 基 中 以 后 ， 蛋 白质 合成 形式 质 的 差别 即 很 快 确定 了 。 已 经 看 四 出 ， 国 氨 酶 的 蛋白 质 组 成 成 分 是 在 早期 合成 的 ， 早 在 异形 胞 分 化 后 期 可 测 出 固 氨 酶 活性 之 前 2 104° : REA ERM ~CNostoc muscor um) SIG Hed Se F Ba ALS Ae oS BE He A a BE 质 迅 速 转 化 。 | 起 氨 饥 俄 的 类 似 症 状 。 在 这 种 情况 下 ， 除 异形 胞 增加 外 ， 固 气 活 性 同时 降低 。 固 氨 酶 合成 显 RAR MSIL CAI 8 ) 。 重 新 供给 钼 ， 生长 。 可 以 推测 ， 攻 体 在 缺 钼 时 还 继续 合成 酶 原 〈 组 分 1》 ， 它 可 以 迅速 结合 加 入 的 金属 以 1 工 蛋白 质 合成 迅速 活化 ， 为 这 一 假说 提供 了 5 沉积 而 或 。 细 胞 壁 似乎 是 原生 质 膜 和 新 形成 的 即 已 合成 。 氨 素 丧失 和 忽 钼 的 效果 当 预 先生 长 在 化 合 氨 中 的 异形 胞 车 类 起 失 可 同化 氨 源 时 ， 可 观察 到 洛 体 结构 和 上 生物 化 学 转化 〈 可 溶性 和 特有 的 氨 源 分 解 ， 淀 粉 和 脂肪 的 同化 ) 的 初期 典型 缺 氨 特征 。 这 可 以 在 异形 胞 爱 言 初期 的 细胞 矶 ， 握 比率 由 4.5 : 1 升 高 到 8 : 工 的 逐渐 增加 中 明显 地 反 瞻 出 来 。 当 肥育 的 异形 胞 天 部 分 蛋白 质 隆 解 并 可 能 输出 含 佘 物质 到 营养 细胞 中 时 ， 营 养 细胞 中 的 代谢 和 生 斩 合成 活动 能 编 持 到 异形 胞 发 育 完 全 ， 新 固定 的 所 可 继续 供给 以 维持 细胞 生长 。 然 而 ， 如 因 某 些 原因 这 些 国 氨 物 供应 不 上 ， 那 只 有 指望 氨 素 贮存 物 的 分 解 ， 而 异形 胞 分 化 过 程 将 扩大 到 丝 状 件 内 更 多 细胞 。 当 头 类 堵 关 在 无 气 素 的 气体 〈 含 拨 和 CO?) 中 而 固氮 受到 轿 目 时， 上述 现 象 即 会 发 生 。 在 这 样 的 条 件 下 ， 蜡 形 胞 形成 和 国 氨 酶 合成 率 继续 增加 ， 而 营养 细胞 的 发 言 有 eau 9 ais a 严重 缺 氨 特性 。 irae Ay 25 S22 BE bor Fs BF RAYA, BS | BREE SFE. o TE] eh PER BY Sah ks FS oT Ae Ss PB Te 获得 完全 的 催化 功能 。 与 此 类 似 的 固 氛 菌 (Azotobacter vinelandii ) #1 ta RARE : (Plectonema boryanum) fyi sah 44> 0 FON: GEE FD Vat 论据 。 10 异形 胞 外 膜 和 和 孔道 外 膜 是 多 层 结 构 ， 在 先 产 生 的 细胞 壁 外 部 异形 胞 频率 站 外 肛 之 间 的 未 变 条 件 。 外 踢 分 三 层 ， 最 外 层 是 人 纤维 质 ， 中 避 是 均 质 体 ， 内 层 是 薄片 层 ， 这 三 图 3 ， 缺 钼 〈 空 心 标记 ) 和 继 后 供 钼 〈 实 层 在 异形 胞 发 育 时 顺序 形成 。 薄 片 层 的 形成 和 心 标记 ) 对 Areldiadiics 的 ta 名 未 国 氨 活 性 的 显示 一 致 ， 可 能 标志 着 异形 胞 发 育 含量 4 叶绿素， 三 角形 标记 ! 溃 蓝 素 ， 的 完成 圆 形 标记 ), (b) 固氮 酶 活性 及 〈c) eek 异形 胞 产量 的 影响 除 异 形 胞 和 营养 细胞 接触 点 以 外 ， Spee es ( 引 自 Fay 和 De Vasconcelos,1974, 延 盖 过 整个 异形 胞 。 在 接触 点 处 外 膜 收 缩 结 合 Arch, Mikrobiol 99, 221; 图 1 ) 着 孔道 形成 一 狭 窗 的 颈 样 凸 出 物 ， 外 膜 在 此 处 膨大 增 厚 ;然后 向 细胞 中 部 又 逐渐 减 薄 。 越 过 横 隔 膜 ， 异 形 胞 的 质 蜡 和 营养 细胞 联结 处 以 一 个 称 为 “ 微 质 膜 孔 >” Gnicroplasmedesmaza) 的 细 筷 道 相 联 ， 此 处 被 认为 是 细胞 内 溶液 运输 和 代谢 产物 交换 的 渠道 。 微 质 膜 孔 的 存在 已 为 4nrabeana cy1zdyxzica 的 冰 :; Oe oh Al ill 2 EE dh PT UE SK 在 两 个 营 养 细 之 间 有 300 个 微 质 膜 孔 穿 透 过 隔膜 ， 而 在 异形 胞 和 邻近 的 营养 细胞 之 间 只 有 50 个 微 质 膜 丰 胞 之 连 。 它们 约 为 800 人 长 和 802 `\ 页 《〈 约 为 真 核 微 质 膜 孔 直径 的 鞋 ) 。 它 们 在 原生 质 剥 蚀 面 上 显示 ©1056 Hi. ia Eh MR chim LS, OTHE 是 由 分 开 的 孔道 构成 ， 作 为 相 邻 细胞 癌 质 膜 空 间 的 桥 道 。 冰冻 蚀刻 的 研究 揭示 了 在 异形 胞 和 营养 细胞 的 质 膜 中 质 膜 粒 的 浓度 、 粒 子 大 小 及 分 布 丰 同 。 这 可 以 说 明 在 异形 胞 分 化 过 程 中 ， 质 膜 组 成 和 功能 的 变化 。 固 鹏 酶 的 氧 保护 作用 固氮 酶 的 催化 反应 是 一 个 厌 氧 过 程 ， 而 无 论 是 从 严格 厌 气 或 好 气 中 提取 出 的 都 对 氧 极端 敏感 。 不 管 是 从 异形 胞 或 非 异 形 胞 蓝藻 中 取得 的 固 所 酶 ， 一 旦 姑 露 于 氧气 中 都 同样 迅速 失 ) 活 。 在 放 氧 的 光合 生物 中 所 产生 的 固氮 酶 对 氧 敏感 ， 被 认为 是 支持 这 种 假说 的 负 证 ,， 因 为 此 种 假说 认为 在 固氮 蓝藻 和 蜡 形 胞 中 必然 有 某 些 保 护 机 制 起 作用 ， 它 在 光 中 不 放 氧 而 深 持 一 个 固 气 的 还 原 环 境 。 在 异形 胞 中 这 些 作 用 是 如 何 实现 的 还 很 少 了 解 ， 虽 然 我 将 在 这 一 节 中 尽 可 能 引用 资料 讨论 一 些 主要 因素 。 异形 胞 外 膜 的 功能 异形 胞 外 膜 高 度 特异 化 的 功能 以 及 异形 胞 的 精细 极 孔 区 是 一 个 颇 费 思 索 的 课题 。Win- kenbach 等 (1972) KB fifa fale (Anabeana cylindrica) 异形 胞 的 薄片 层 是 由 甘油 脂肪 组 成 ， 并 提出 由 于 这 一 月 是 有 朴 水 性 的 ， 可 能 作为 对 于 如 固氮 产物 之 类 的 亲 水 分 子 运动 的 障 壁 ， 因 而 限制 其 运动 在 孔道 中 通过 微 质 膜 孔 输 到 邻近 营养 细胞 ， 关 阻止 它 从 异形 胞 中 渗 漏 。 然而 ，Granhall (1976) -报告 鱼 腥 藻 属 中 一 个 种 的 异形 胞 的 薄片 层 是 纤维 质 的 。 这 和 双 old 及 其 同事 的 发 现 相抵 触 ， 因 而 引起 蓝藻 中 纤维 素 的 古老 争论 。Granhall (1976) 还 发 现在 以 ， 纤维 素 酶 处 理 丝 状 体 以 后 ， 固 氮 酶 活性 降低 ， 并 提出 纤维 质 的 薄片 层 在 异形 胞 中 具有 保护 氧 敏感 固氮 酶 的 氧 障 作 用 。 这 就 要 提 到 Stewart 的 一 个 早先 见解 ， 他 认为 外 膜 可 以 降低 扰 气 和 氧气 的 扩散 率 ， 履 盖 在 异形 胞 表面 以 达到 固氮 酶 与 Nz 充 分 饱和 的 水 平 ， 并 藉 助 于 呼吸 率 的 增加 以 肃清 异形 胞 中 的 氧气 。 然 而 ， 有 关 异 形 胞 外 膜 功能 的 任何 说 法 尚 无 确证 。 异形 胞 中 的 呼吸 活性 Fay 和 Wasby (1966) 早先 发 现 的 异形 胞 具有 一 个 活动 呼吸 系统 已 经 由 试验 完全 证 实 ， 然而 和 录 形 胞 中 的 实际 呼吸 率 还 有 差距 。 这 可 能 是 由 于 在 离 体 异 形 胞 中 测定 的 活性 和 在 完整 的 丝 状 体 测 定 的 活性 不 同 之 故 。 蜡 形 胞 经 分 离 后 可 能 影响 代谢 活性 有 两 个 主要 方面 的 原因 ， 首先 ， 所 有 用 机 械 力 量 从 营养 细胞 中 分 离异 形 胞 的 方法 都 会 对 异形 胞 造成 伤害 ， 因 而 很 大 可 能 会 影响 到 离 体 细胞 的 生理 活性 ;其 次 ， 由 于 异形 胞 不 能 固定 CO，( 见 下 面 大 并 依靠 营养 细 胞 供给 呼 玖 基质 ， 在 异形 胞 分 离 前 县 有 的 基质 贮存 量 可 能 会 决定 离 体 异 形 胞 呼吸 率 及 持续 时 间 。 在 离 体 异 形 胞 中 的 氧 吸收 由 于 NDAP-* 的 加 入 和 氧化 戊 糖 磷酸 化 途经 〈 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 ， JR Et - 6 ~ WN 6 - DEAR PERE) 的 关键 中 间 体 以 及 异 柠 檬 酸 和 丙酮 酸 的 加 入 而 得 到 加 强 。 这 似乎 表明 ， 呼 吸 基质 在 异形 胞 分 离 前 供给 不 足 或 在 分 离 过 程 中 已 从 异形 胞 中 渗 漏 出 。 最 近 ， Peterson 和 Burris〈1978) 已 测定 了 用 较 温 和 的 酶 解 方 法 分 离 出 的 异形 胞 中 的 氧 吸 收 率 和 和 氧 所 反应 〈 见 更 下 面 ) ， 比 完整 的 丝 状 体 中 观测 的 高 两 倍 。 他 们 同时 指出 ， 由 一 个 细胞 色素 基 呼吸 转移 系统 行 中 间 反 应 ， 而 以 一 个 氧化 酶 终止 反应 。 虽 然 在 异形 胞 中 呼吸 的 主要 功能 是 产 A lel RUD Soe CULE PT) ， 但 在 呼吸 的 氧 消 耗 同 时 从 酶 作用 部 位 清除 氧 ， 结 果 和 在 好 气 ， 性 固 气 细 苗 中 一 样 ， 能 保护 固 气 作用 不 受 氧 的 失 活 作用 影响 。 因 此 ， 在 异形 胞 的 固氮 作用 中 ， 有 效 的 呼吸 系统 似乎 是 有 两 个 重要 功能 。 异形 胞 中 的 还 原 条 件 早期 的 研究 者 认为 光 形 胞 是 无 明显 功能 的 结构 。 这 种 观点 第 一 次 为 异形 胞 比 营养 细胞 还 : ¢ 106。 Se ee To ae 原 2; 83, 5 -三 茶 气 化 四 唑 (CTTC) 更 有 效 的 报道 所 动 播 了 了。 此后， 异形 胞 中 存在 强 还 原 条 AMA RE RE HORA A, TO ROR ie eae (CHG) 。 虽 然 ， 在 营养 细胞 中 四 唑 盐 还 原 率 是 随 微 好 气 培 养 〈 在 光合 作用 中 放出 氧 不 断 移 ppt 2S SFPD CRN LR ae eR HEREVK, MA-TPAMAILORE RH GHE-KRALO) ， 它 在 更 早 的 黄 素 蛋 白 电 子 转移 水 平 接受 电子 ， 显 示 出 沿 着 异形 伯 丝 状 体 存 在 着 一 个 电子 梯度 ， 说 明 在 异形 胞 ， 原 异 形 胞 及 其 邻近 的 营养 细胞 中 有 最 强 的 还 原 条 件 。 这 支持 Wolk 和 Wojciuch (1971) 的 一 个 早年 见解 ; 营养 细胞 可 能 大 大 有 助 于 提供 异形 胞 的 还 原 条 件 。 异形 胞 有 强 还 原 条件 的 主要 理由 无 疑 是 缺少 放 氧 光合 作用 。 有 大 量 不 同 证 据 支持 异形 胞 缺乏 光 系 统 工 的 论点 : a) 异形 胞 在 有 光照 时 不 固定 COz; b) 异形 胞 在 光 中 不 能 放 氧 ; c) 异形 胞 缺少 和 已 知 光 系 统 I 反 应 相 结合 的 光合 重要 色素 〈c- Se 阿 罗 藻 蓝 素 、 C- 蔬 红 素 、 叶 绿 素 aeso) 5 d) 异形 胞 产生 叶绿素 a 荧 光 少 而 且 在 产生 荧光 时 没有 光 还 原 变化 ; e) 异形 胞 没有 希 尔 〈Hill) 反应 活性 ; 2) 异形 胞 缺乏 位 ， 这 是 包含 在 水 光 解 中 的 光 系 统 工 的 重要 成 分 ， g) 与 营养 细胞 相 比 ， 异形 胞 显示 He RRL BA COL MAPE-1, 5 -二 磷酸 羧 化 酶 和 甘油 醛 3 -磷酸 脱 氨 酶 ) 的 活性 很 低 并 缺少 多 角 体 〈 这 被 认为 是 羧 化 酶 的 贮存 形态 ) 。 异形 胞 中 固氮 酶 的 存在 早 在 六 十 年 代 支 持 关 于 蓝藻 异形 胞 中 含有 固 氨 酶 的 概念 已 有 大 量 直 接 证 据 ， 然 而 检验 这 ”二 假说 的 打算 直到 发 现 分 离异 形 胞 的 合适 方法 才 得 实现 。 最 先 的 尝试 是 在 柱 孢 fa EMC Ano- beana cylindrica) 的 离 体 异 形 胞 中 〈 培 养 在 充 满 大 气 条 件 下 不 加 辅 因 子 ) ， 以 :5N 结合 说 明之。 结果 虽然 志 败 了 ， 但 是 关于 蜡 形 胞 生理 、 生 化 和 超 微 结构 的 进一步 资料 完全 符合 固 氛 ”功能 的 假说 ， 并 已 被 认为 是 证 明 这 一 假说 的 描述 。 因 氨 活性 的 论证 因 氨 酶 生化 特性 的 更 多 知识 和 测定 酶 活性 的 更 灵敏 乙 顽 还 原 技术 应 用 的 新 发 展 ， 鼓 舞 了 ”科研 大 员 进 二 步 的 尝试 ;Stewart 及 其 同事 于 1969 年 成 功 地 证 明 ， 在 严格 厌 氧 条 件 下 分 离 并 提供 有 能 源 (ATP) 发 生 系统 和 人 工 还 原 剂 〈 连 二 亚 硫 酸 盐 ) 培养 时 ， 蜡 形 胞 有 固氮 酶 活 性 。 尽 管 固 气 酶 活性 率 相对 地 低 ， 但 在 成 功 地 试验 过 程 中 不 仅 在 异形 胞 中 已 证 实 有 乙 烽 还 原 活性 ”而 且 还 有 较 高 还 原 率 。 离 体 异 形 胞 在 氢气 和 光照 过 程 中 ， 甚 至 不 需 外 加 辅 因子 也 能 还 Ch, BARMAN. RL, CPE RRR BS, BZ) °N—A ARG EMR IG He AE He as, BAB BSS 果 。 完整 的 4cyl1irclrica 丝 状 体 在 富 含 3N 的 氮气 中 经 过 5 一 120 分 钟 ， 然 后 将 丝 状 体 放 在 二 个 French 正 机 的 杯 中 受 压 ， 以 分 开 营养 细胞 并 分 离 出 完好 的 异形 胞 。 结 果 发 现 ， 从 离 体 细 胞 和 营养 细胞 中 提取 的 !5N 丰 度 处 于 不 同 水 平 ， 表 明 二 者 之 间 固 气量 相等 和 效率 不 同 ， 或 者 异形 胞 中 的 固定 的 氨 素 迅速 转移 到 营养 细胞 中 。 此 外 ， 试 验 受 损失 很 大 可 能 是 在 分 离 过 程 中 WA SEI Ha + i Woik 等 〈1974) 改 进 了 测定 技术 ， 将 细胞 置 于 短 半 FECT 网 = 10 4) BI HE SNA ° 107 « 踪 氮 中 , 并 以 放射 性 自 显影 测定 :sN 的 结合 。 结 果 发 现 ， 在 异形 胞 中 放射 活性 最 高， 在 邻近 营 养 细 胞 中 的 活性 高 于 离异 形 胞 较 远 的 。 这 一 观测 结果 最 好 的 解释 是 先 在 异形 胞 中 固定 的 N 沿 着 丝 状 体 逐 个 细胞 向 外 迅速 转移 。 他 们 认为 ， 在 完整 的 4.cy1findrica 丝 状 体 中 ， 至 少 有 25%% 的 :"Nsz 固 定 在 异形 胞 中 。 体内 固氮 酶 活性 恢复 程度 假定 固氮 酶 不 限于 在 晃 形 胞 中 ， 而 且 多 数 也 在 营养 细胞 中 ;那么 可 望 在 异形 胞 部 分 离 体 后 ， 完 整 的 丝 状 体内 原 有 固氮 酶 活性 恢复 不 超过 5 一 10%， 这 相当 于 在 4.cylinadricac 和 相近 玫 类 生长 在 无 化 合 氮 培 养 基 中 出 现 的 异形 胞 平均 频率 。 事 实 上， 计算 表明 在 完整 的 丝 状 体 中 至 少 有 13 一 30% 固 须 酶 活性 是 在 肛 形 胞 中 测 出 的 。 如 果 在 丝 状 体 中 所 有 细胞 的 固有 气力 相 同 ， 这 比 原 期 望 的 高 得 多 。 这 种 计算 还 没有 考虑 到 从 破坏 细胞 中 释放 出 的 酶 活性 的 损失 。 因 此 ， 这 似乎 便于 解释 从 总 的 丝 状 体 提 取 物 中 分 离 出 的 异形 胞 固 所 活性 的 恢复 。4.cylizdrica 的 异 形 胞 和 营养 细胞 提取 物 之 间 固 氮 活 性 的 分 布 说 明 : 1 ) 分 离 过 程 影响 完整 丝 状 体 中 原 有 活性 的 50% ，2 ) 其 余 90%% 活 性 在 异形 胞 的 无 细胞 提取 物 中 得 到 恢复 。 显 然 ， 这 些 数 据 足 以 说 明 FTG Na xe Ll RUG 隆 主 要 的 、 很 可 能 是 唯一 的 部 位 。 %22 Anabeana cslizdrica 的 异形 胞 和 营养 细胞 之 间 固 氮 酶 活性 的 分 布 。 包 括 MgClz，ATP 一 发 生 系 统 和 NazSz04 的 混合 反应 ( 引 自 Tel-OF 和 Stevwart，1976) 全 部 活性 原 有 全 部 无 比 活性 a 料 CnmolczH4 活性 细胞 液 (nmol C2H4/mg /分 钟 ) HI ” 的 活性 25 蛋白 质 /分 钟 ) 完整 丝 状 体 } 36.00 fe if 100.0 一 0.194 SBR OER PEER 18.36 51.0 二 e: BFA 1.76 4,9 9.6 0.008 SPF ZI Pe BR 16.69 46.0 90.4 0.680 Fea] Sg a5 A Fs JS HL tc PS AE EZ Fleming filHaselkorn (1973; 1974) 用 聚 两 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 法 分 离 并 分 析 了 灰色 念珠 藻 (Wocstoc muscorum) 在 异形 胞 分 化 和 固氮 酶 合成 期 间 的 异形 胞 和 营养 弛 胞 中 含有 :“S 一 硫化 物 中 产生 的 ?ss 一 标记 的 蛋白 质 〈 丝 状 体 随后 从 含 化 合 氟 培 养 基 转 移 到 无 所 培养 基 中 )。 他 们 鉴定 了 分 化 和 未 分 化 丝 状 体 ， 发 现 只 有 蜡 形 胞 中 有 三 个 蛋白 质 段 带 而 营养 细胞 中 则 没 有 。 经 比较 ， 三 段 中 有 两 段 已 鉴定 为 具有 固氮 菌 CAzotobacter) 的 结 品 PRBAR. TH =RHEARWOTFRABRKE (Clostridium) 铁 和 蛋白 相同 。 因 此 ,从 电泳 法 研 究 所 得 结果 和 早先 讨论 的 酶 分 析 结 果 一 致 。 Bs (iil ai FY ae AZ oy ! 蓝 绿 荣 中 的 固 气 酶 活性 所 需 的 基质 和 辅 因子 与 细菌 固氮 酶 类 似 。ATP 的 适宜 浓度 在 2 一 lana Zl, Me 合适 浓度 约 为 5 毫克 分 子 ， 连 二 亚 硫 酸 盐 在 2 一 5 Sofia. Mg 能 被 Mn 和 Ca 所 取代 ， 然 而 耗费 还 原 AK. Anabeana cylindrically Moy AU (the Ay 比 活 性 为 每 莹 克 重 白质 每 分 钟 50 一 100 台 微 死 分 子 乙 断 《和 细 黄 固氮 酶 测定 结果 比较 ) 2 AY cyl1iaadrica 的 组 分 I 蛋 白 〈Mp-Fe 和 蛋白 ) 能 S)AChloropsendomonas ethylicum#® )\Clostri- dium pesteurianum' PRAWADT LEA 互补 ， 但 反 交 叉 互 补 股 有 活性 。 反 互补 效率 很 低 的 e。 108。 oe ee Oe 原因 不 明 ， 但 可 能 是 组 分 中 氨基 酸 成 分 和 结构 不 同 的 结果 。 SIG Ha +f El Ri he — AA KK 近来 ， 对 固 所 蓝藻 的 氢 代 谢 的 兴趣 有 一 高 潮 ， 根据 Dixon (1972) MSchuberth Evans (1976) 早先 设想 ， 好 气 性 固氮 细菌 中 国 氮 酶 和 和 氢 酶 之 间 的 联系 可 能 用 于 放 氢 的 再 循环 ， 因 而 可 回收 在 固氮 作用 正常 过 程 中 损失 的 还 原 剂 和 能 量 。 氢 酶 的 类 型 在 多 种 不 同 微生物 〈 包 括 自 养 和 异 养 、 厌 氧 和 好 氧 细 菌 、 蓝 涝 和 真 核 攻 类 ) 中 都 有 催化 H2=2H* + 2e7 可 逆反 应 的 酶 。 根 据 对 它 它们 的 生化 特性 的 试验 研究 ， 似 可 归纳 为 三 种 不 同 的 酶 : a) 所 谓 “ 经 典 的 ” 气 酶 ， 催化 细 基 和 藻类 中 吸 氢 和 放 氢 的 可 逆反 应 。 这 种 “可 逆 ” 和 氢 酶 是 不 需 ATP 的 ， 对 一 氧化 碳 敏感 并 易 为 0> 失 活 ， 但 Nz 对 它 无 效 。Eujita 等 ' (1964) 报告 HE Anabaena cy1ixaadrica 的 加 蕊 ?的 细胞 中 有 这 一 类 酶 5 b) 固 氛 微生物 的 固氮 酶 催化 的 不 可 逆 放 Hz? 反应,， 这 一 反应 是 需 ATP 和 还 原 剂 的 ， 对 一 氧化 矶 不 敏感 ， 但 可 被 乙 块 和 Niz 所 抑制 。 然 而 ， 即 使 在 100 色 氮气 中 ，Nz 抑 制 也 并 不 完全 ， 因而 洋 随 着 固 气 酶 活性 总 有 一 定 了 ?的 释放 。 固 氛 酶 放 所 是 由 于 人 负 乏 其 他 还 原 性 基质 〈 如 在 氨 中 或 被 CO 抑制 的 其 他 基质 还 原 时 的 蛋白 质 还 原作 用 )。 c) 几 种 好 气 固 氮 细 菌 和 蓝藻 具有 一 种 所 谓 “ 吸 收 或 不 可 逆 氢 酶 ， 它 只 能 在 有 适宜 电 受 体 时 催化 豆 z 吸 收 。 它 的 功能 似乎 是 在 固 氛 酶 催化 放 氢 时 重新 利用 展 失 的 还 原 力 。 异形 胞 固氮 酶 的 放 氢 Haystead 等 (1970) 首先 报道 了 从 4。cyliacrica 中 提取 的 固氮 酶 催化 氢 释 放 。 生 长 在 固 氮 条 件 下 的 丝 状 体 的 提取 物 ， 当 它 培养 在 侈 有 ATP 和 还 原 剂 “〈 连 二 亚 磷 酸 盐 ) 的 氨 气 中 时 即 PKA. BRIE A. cylindrica EAR APPAR MARAE, {AGE RHA. AME ALACRA EE, MABARKEE GLPED . K— Ri 5 Ee, ET MARRY PRA, 正 是 所 发 现 的 对 去 偶 联 剂 和 电子 传递 抑制 剂 有 同样 敏感 程度 的 氢 释 放 作 用 和 乙 块 还 原作 用 。Qs* 的 大 气 浓度 或 N-(3， 4-— 3A) NN-='RZEWR (DCMU) 处 于 对 光合 固定 CO 和 放 0z 的 抑制 浓度 时 ， 对 4。cy- lindrica 的 完整 丝 状 体 放 和 氢 没有 什么 影响 。 这 正好 支持 关于 固 氛 酶 催化 氨 释 放 是 与 异形 胞 有 关 的 假说 。 在 异形 跑 、 国 所 酶 活性 和 在 挟 气 中 放 氢 能 力 之 间 的 密切 相关 性 也 可 以 得 出 同样 的 结论 。 固 氨 酶 俱 化 气 释 放 所 在 部 位 的 直接 证 据 已 由 Peterson 和 和 Burris (1978) 得 到 ， 他 们 已 UERAE A. cylindrical} Bik RIG PAATOA BAHAR. St FG Hed Hs Se Ag Beneman#lWeare (1974) if #2 A. cylindrica fy RR AAR AD CR LL 有 测定 条 件 下 放 受 的 还 原 率 都 高 ， 虽 然 这 两 个 反应 大 概 都 是 固氮 酶 催化 所 引起 的 。 他 们 推 HU, PERLE FR ARS, iScheee ae le HE AS TATE WR A AY EH FE A, cylindrically A PR x0 Ja FS Fe PR AIEEE A. FEMMADCMU 〈 因 而 去 除 还 RAMEA) 并 通 入 厌 氧 混合 气 (Magers +CO.) I, RANTEBERK, RRBMRAESL 中 还 原 乙 糯 的 能 力 ， 显 然 这 是 由 于 还 原 剂 贮 存 消 耗 的 原因 。 它 们 正常 酶 活性 能 够 在 有 H2z 存 AEM EK. Ps AAR TEE KA 2—3 % AeA BI MIF AC. ASM, FEY DCMN 处 理 的 丝 状 体 中 ，Hz 不 能 维持 光合 CO， 的 固定 。 所 有 这 些 都 说 明 ， 世 吸收 不 能 被 “nul wag” 气 卫 所 催化 ， 但 与 一 个 “吸收 乞 氨 复 相 联 ， 它 能 在 其 他 还 原 剂 无 效 时 维持 固氮 酶 .10。 活性 。 在 几 个 实验 室内 的 更 详细 研究 有 助 于 解决 异形 胞 蓝藻 中 国 氮 酶 一 氢 酶 关系 的 复杂 性 ， 并 县 证 实 了 有 异形 胞 中 气 酶 催化 Hz 吸收 的 几 种 重要 功能 ， 第 一 ， 说 明丽? 利用 是 一 个 严格 依赖 0 的 氨 氧 反应 〈 一 个 Knallgas 型 反应 ) ， 通 过 细胞 色素 一 氧化 酶 基于 吸收 的 电子 传递 链 ， 在 这 一 反应 中 9: 被 Hz 还 原 ， 并 被 配对 到 氧化 奋 酸 化 反应 中 。 它 基本 上 是 一 个 瞳 反 应 ， 这 一 反应 已 由 Benemann 和 Weare (1974) 从 反面 所 证 实 ， 虽然 它 也 能 为 光合 作用 中 产生 的 9, 所 起 动 。9? 在 低 浓 度 时 是 一 个 很 有 效 的 氧化 剂 ， 而 高 分 压 0，(21%) 则 是 抑制 剂 。 这 一 反应 能 ， 为 一 氧化 碳 所 抑制 ， 而 这 种 抑制 又 能 在 有 光照 时 为 细胞 色素 氧化 酶 居间 的 呼吸 作用 所 恢 复 。 第 二 ， 已 证 明 在 有 一 氧化 碳 加 乙 抉 存在 时 ， 观 察 到 固氮 酶 催化 的 吾 ? 释 放 显 著 增 加 ;这 是 由 于 气 酶 催化 Knallgas 反 应 的 抑制 作用 ， 它 相当 于 在 正常 生理 条 件 下 Hz 消耗 量 。 所 以 ， 纯 生理 学 的 H: 释 放量 是 在 固氮 酶 催化 Hs 释放 总 量 和 和 氢 酶 催化 再 ?再 利用 之 间 的 差额 。 第 三 ， 证 明 氧 酶 催化 蔚 ? 的 利用 不 需要 厌 气 适应 性 ，Hsz 吸 收 只 是 当 4nrabeana 生长 在 Nz 中 和 在 NH4 态 所 中 生长 的 培养 受到 抑制 因而 缺乏 异形 胞 时 才 发 生 的 ， 在 离 体 的 异形 胞 中 也 发 生 豆 ?吸收 。 这 清楚 地 说 明 ， 当 异形 胞 蓝藻 在 有 0 存在 时 ， 吸 氢 酶 只 局 限于 异形 胞 中 而 不 在 营养 细胞 中 。 异形 胞 中 氢 酶 催化 Hs* 再 利用 的 功能 ， 和 其 他 固氮 微生物 类 似 之 处 是 : a) 贮存 还 原 剂 和 能 量 ， 否 则 将 通过 固 握 酶 催化 Hz 释放 而 受到 损失 ;，b) 从 固 氛 酶 活性 部 位 移 去 0z， 因 而 保护 了 酶 免 受 氧 的 失 活 作 用 ;， c) 防止 异形 胞 中 H* 的 累积 ， 以 免 抑 制 氮 素 固定 。 Bothe (1977) 提出 一 个 在 固氮 酶 吸 氢 酶 和 呼吸 链 之 间 复 杂 相 互 关 系 的 图 示 ， 见 贸 4, ph: of 丙酮 酸 -=Fd 2H* ek C:H: G-6-P N; 3 DPH-Fd 6 P 脱 氢 酶 ADP ee 蛋白 SE 4 Fr Pe A 氧化 还 原 酶 脱氧 酶 .H:O 40: 4 固氮 酶 、 氢 酶 和 呼吸 传递 体系 之 间 关 系 ( 引 自 Bothe 等 ,197T) 生物 光 解 体系 的 发 展 异形 胞 蓝藻 中 0， (在 营养 细胞 中 ) 和 Hs (在 异形 胞 站) 的 同时 发 生 的 论证 ， 鼓 舞 了 了 Bonemann#lWeane (1974) 进 一 步 提出 了 一 个 有 效 的 好 气 性 太阳 能 转化 的 “生物 光 解 体系 寻 的 发 展 设想 。 这 样 一 个 体系 的 效率 和 经 济 效能 已 由 Weissman 和 Benemann (1977) Wk Jaff- ries“ (1978) 更 详细 地 研究 。 他 们 发 现 4.cyl1indrica 的 培养 “〈 连 续 通 人 人 毛 气 ) 在 有 限 光 有 照 “e 110 ° 条 件 下 行 光合 作用 ， 能 产生 Hs 和 0: 达 30 多 天 ， 而 在 塔 强 光 照 强度 时 ， 只 达 18 天 。 测 得 的 最 天 产 气 效率 是 每 克 干 党 体 每 小 时 产 Hz13 到 32 毫 微 升 之 间 ， 而 经 由 4.cylindrico 光 合 固氮 酶 从 系 将 光 能 转化 为 化 学 能 的 热力 学 效能 介 于 0.35 到 0.85% 之 间 。 虽 然 还 有 难以 克服 的 困难 《如 低 效 率 、 丝 状 体 的 片段 性 或 生物 光 解 体系 的 稳定 性 ) 需要 进一步 研究 解决 ， 但 初步 结果 妍 不 都 令 人 气色 而 旦 推测 异形 胞 态 的 蓝藻 在 生物 能 发 生体 系 的 发 展 中 ， 可 能 有 重要 作用 。 异形 胞 中 能 量 的 发 生 反应 在 蓝藻 中 能 量 代谢 的 主要 模式 是 光合 作用 ， 而 在 光合 作用 和 固氮 作用 之 间 的 密切 相互 关 系 已 在 早年 许多 研究 中 明确 ， 这 些 生物 的 光合 作用 可 能 满足 固 氨 作用 对 于 还 原 力 《〈 能 量 来 源 和 结合 所 的 矶 框架 ) 的 基本 需要 。 试 验证 明 ， 在 完整 的 4.cylindrica 中 ， 生 物 固氮 对 碳 框架 的 依赖 程度 经 过 氨 饥 俄 的 予 处 理 〈 结 果 建 立 碳 贮存 ) 后 可 暂时 提高 。Cox 和 Fay (1969) 曾 说 明生 物 固 氨 的 光 币 激 主要 是 通过 光化学 产生 的 ATP 供 给 起 作用 。 完 整 的 4.cyilindrica 的 乙 痪 还 原作 用 谱 显 然 和 光 系 统 工 相似 ， 而 和 光合 放 氧 的 作用 光谱 截然 不 同 ， 这 说 明 在 生物 固 氨 中 初步 外 贫 有 光合 ATP 一 发 生体 系 。 然 而 ， 已 知 蓝藻 可 在 暗 处 利用 原先 光合 作用 产生 的 内 部 基质 或 在 异 养 代谢 中 同化 外 部 物质 而 固定 氨 素 。 因此 ， 假 定 暗 呼吸 代谢 可 能 同样 满足 对 ATP 和 还 原 剂 的 需要 。 ESIGN HE ASE T Ae A RRR IE PE AD ¢F TES SEP RUBE ATE HIER St 1 fy BEAR. JARRE ROG Mh 2) ory BLT 出 。 已 知 蜡 形 胞 含有 叶绿素 a， 特别 高 的 反应 浓 诬 集中 于 叶绿素 700，8- 胡 有 罗 仆 素 和 叶 黄 素 比率 高 并 具有 光 系 统 工 的 色素 组 成 特征 。 支 持 在 异形 胞 中 存在 一 个 活性 的 光 系 统 工 的 直接 斌 验证 据 是 ， 从 离 体 异 形 中 中 的 薄片 部 分 中 测 得 依赖 光 的 电子 转移 ， 并 测 得 P700 的 光 导 氧化 作 用 和 一 种 细胞 色素 ， 假 定 在 异形 胞 中 这 些 色素 体系 可 能 保证 固 氨 的 需要 ， 这 已 表明 离 体 异 形 胞 的 吸收 光谱 和 固 氨 酶 活性 的 作用 光谱 之 间 的 明显 相似 性 。 多 变 鱼 腥 藻 ~CAnabacna uariab- ilis) 的 离 体 异 形 胞 的 光合 磷酸 化 价 已 为 Scett 和 Fay (1972) MUX. i HA.Cylindri- ，c6 的 离 体 晃 形 胞 在 有 ATP 截 留 体系 〈 已 精 激 酶 和 葡萄 糖 ) 存在 时 ， 可 测 得 10 倍 以 上 高 的 光 合 率 〈 每 毫克 叶绿素 每 小 时 50 训 到 分 子 ATP) 。 最 近 ，Tel-Or 和 Stewart (1966, 1977) 的 研究 证 实 了 在 异形 胞 中 存在 有 一 光电 子 转 移 体系 ， 并 证 明 离 体 异 形 孢 在 有 电子 供 体系 统 〈 还 原 的 2，2- 二 氧 酚 - 靛 酚 )》 时， 能 产生 光合 还 原 NADP。 由 此 可 推测 ， 异 形 胞 含有 足够 量 铁 氧 还 蛋白 和 铁 氧 还 蛋白 -NADE+ 氧 化 还 原 酶 ， | 以 影响 电子 畦 递 到 NADP*。 异 形 胞 的 光合 电子 传递 链 的 精细 分 析 已 经 显示 出 ， 在 异形 胞 中 不 仅 存 在 光 系 统 工 的 组 成 ，《〈P700 细 胞 色素 b 563, 铁 - 硫 蛋 白 ， 铁 氧 还 蛋白 ) ， 而 且 也 有 联 结 营 养 细 了 胞 中 光合 体系 2 和 光合 体系 工 反应 的 电子 传递 链 的 组 成 〈 质 蓝 素 、 细 胞 色素 e 554, 质 柄 ， 细 胞 色素 b 559) 。 氧化 磷酸 化 作用 和 暗 固 氨 异形 胞 在 需 氧 暗 反应 中 能 产生 ATP， 虽 然 在 4.oariabi1is 和 A.cylindricath 4 BSH ho 形 胞 氧化 磷酸 化 率 比 在 光 反 应 中 的 低 得 多 。 当 拟 鱼 腥 BR CAnabaenopsis circularis) (CAT HA 最 异 养 潜力 的 种 类 ) 的 丝 状 体 置 于 暗中 时 ， 固 氨 酶 活性 迅速 降低 ， 虽 然 也 能 靠 适 当 的 有 机 质 贮备 维持 低 的 固氮 率 。Bottomley 和 Stewant (1977) 在 研究 A.circularis 的 ATP 和 固 气 酶 活 性 之 间 关 系 时 ， 认 为 固氮 酶 活性 在 暗中 降低 不 是 由 于 缺乏 国 氨 酶 合成 或 物质 不 能 进入 细胞 ， j 是 孙 代 谢 本 来 就 不 能 发 生 足 够 的 ATP 或 维持 最 大 国 氨 作用 的 还 原 剂 除非 在 暗 的 庆 氧 条 件 下 ， 在 ATP 贮 在 和 国 氨 酶 活性 之 间 尚 未 发 现 始终 一 致 的 相关 性 。 他 们 推测 ， 维 持 国 所 作用 的 ellle ATP 贮 : 存 和 在 光合 作用 或 一 般 代 谢 中 的 显然 不 同 。 FIG PAAR RANK TERR Wik Rig HABER AR PRAM RIE RMKRURE. ERS. BA FAA (ARID) 具有 在 ATP 和 强 还 原 剂 存在 时 才 发 生 。 常 用 的 人 工 还 原 剂 是 连 二 亚硫酸钠 。 然而 ， 在 体外 能 发 生 多 大 还 原 芝 和 什么 是 固 须 禾 的 生理 学 电子 供 体 的 问题 还 需要 进一步 加 强 研究 ; 顷 素 的 直接 光 还 原 的 一 个 早期 的 见解 是 基于 准 量 的 研究 ， 然 而 ， 进 一 步 的 研究 表明 ， 固 气 和 放 和 氧 的 比率 是 变动 不 定 的 ， 而 且 显然 决定 于 还 原 剂 的 贮存。 在 Anabaeua cyjinadrica 的 完整 的 丝 状 体 中 丙酮 酸 刺激 氮 吸 收 以 及 在 这 种 藻类 的 无 细胞 提取 物 中 两 酮 酸 的 脱羧 作用 和 国 AEA ARR HEN RELE LATE POW: 还 原 能 力 不 是 在 光合 反应 中 发 生 而 是 在 与 丙酮 琶 脱羧 相 联系 的 暗 反应 中 发 生 ， 丙 酮 酸 在 蓝藻 固氮 酶 中 可 能 起 天 然 电 子供 体 作 用 。 在 巴 氏 校 菌 (Clostridium pasteu rianum) 中 国 氮 酶 的 生理 学 还 原 剂 已 证 明 是 铁 氧 还 蛋 自 ， 并 已 发 现 内 盖 酸 是 铁 氧 还 蛋白 还 原作 用 的 电子 主要 来 源 。 上 述 各 种 假说 已 在 进一步 研究 中 试验 ， 并 在 以 下 各 节 中 讨论 。 生理 学 还 原 剂 Bothe (1970) 和 Smith 及 Eveans (1971) 已 指 tH» AK Anabeana cylindrica *P4> Fl fy RAID EA BE (EAD A PP RAE 22 AR A ll BD AY HHT A I 9 DE 铁 氧 还 蛋白 体系 ， 一 种 培养 在 含 叶绿体 或 含 叶绿素 的 4zateanra 颗 粒 的 光照 条 件 下 ， 另 一 种 是 在 瞳 培养 条 件 下 结合 NADP- 和 一 种 有 机 基质 〈 和 葡萄 糙 -6- 磷 酸 及 丙酮 酸 或 并 宁 柑 酸 ) 。 他 们 新 定 ， 两 种 体系 都 能 在 体内 从 NADP* 转移 电子 到 铁 氧 还 蛋白 和 固氮 酶 中 的 作用 ;而 从 NADP 互 转移 电子 到 铁 氧 还 蛋白 中 ， 可 能 是 由 铁 氧 还 蛋白 ;， NADP+ 氧 化 还 原 酶 瞬间 完成 。 对 -这 一 论点 的 进一步 支持 是 ， 已 发 现 铁 氧 还 和 蛋 乌 是 固氮 作用 的 天 然 还 原 剂 ， 它 专门 阻挡 需 铁 氧 MEAN LEB. HSER A. cylindricaWCRikRs 而 且 还 证 明 在 离 体 异 形 胞 中 ， 铁 氧 还 生日 ， 需 NADE 氧化 还 原 梅 有 还 原作 用 。 这 就 说 明 不 管 在 光照 或 黑 瞳 条 件 下 ， 铁 氧 还 蛋白 都 可 从 中 传递 电子 给 固 俘 酶 。 级 素 的 光 还 原 先前 我 们 已 讨论 过 有 关 蜡 形 胞 具有 一 个 活性 光 系 统 工 的 证 据 ， 在 有 还 原 齐 来 源 时 这 一 个 体系 能 影响 NADP- 的 光 还 原 。Wolk 和 Wojciueh 早 先 (1971) 在 离 体 异 形 胞 中 乙 刀 受到 直接 的 光 还 原 , 他 们 认为 可 能 来 自 有 机 质 的 电子 是 经 由 光 系 统 工 传 到 固氮 酶 。Lex 和 Stewart(1973) 注意 到 在 有 3 '-(3,4- 二 毛茶) -1 ，1“- 二 甲 脲 (DCMU) 存在 时 ， 乙 块 还 原 的 光 刺 激 能 被 乙酸 氟 “〈 一 种 在 三 羧 酸 循环 中 的 乌 头 酸 酶 的 抑制 剂 ) 所 排除 。 他 们 认为 ， 这 表明 来 自 一 种 有 机 质 的 电子 可 能 经 由 三 羧 酸 循环 到 光 系 统 I， 然 后 经 由 铁 氧 还 蛋白 到 固氮 酶 。Douze 等 (1974) 观察 到 抗坏血酸 加 上 供给 光 系 统 工 电子 的 2,6- 二 所 MRM (DPIP) ， 能 够 在 碳 饥 猴 的 4.cylinrdrica 中 被 DCMU 清除 乙 抉 还 原 的 抑制 。 他 们 推测 ,在 这 样 条 件 下 ， 几 乎 所 有 电 子 都 被 光 系 统 工 传递 到 固氮 酶 中 。 虽 然 从 4。variabi1is 提 取 的 整个 丝 状 体 的 研究 ， 进 一 步 支 持 关 于 有 机 酸 可 能 供给 光 系 统 工 电子 的 推论 ， 但 是 否 也 适用 于 蜡 形 胞 还 不 一 定 。 在 离 体 的 4。cyliindrica 异 形 胞 中 ， 还 未 发 现 有 能 供给 光 系 统 工 电 子 的 生理 物质 。 蜡 形 胞 内 的 中 间 代 谢 作 用 在 蓝 党 中 主要 的 糖 代谢 路 线 是 氧化 戊 糖 酶 嫌 酸化 途径 ， 而 三 羧 酸 循环 的 功能 主要 在 氨基 Aa oer We ke, PEE ERA aE. FPA HEL, EIGN PR a AR ell2e PE: 氧化 戊 糖 磷酸 化 途径 ， 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 脱 气 梅 和 ?- 棍 酸 谷 氨 酸 脱 气 酶 :而 对 还 原 戊 糖 磷 酸化 途径 《〈 卡 尔 文 循 坏 ) 和 糖 酵 解 途径 的 酶 所 乎 测 不 出 来 。 这 说 明 在 单 细 胞 蓝藻 中 ， 氧 化 友 . 糖 磅 酸化 途径 的 运行 是 在 光合 作用 中 有 核 酮 糖 -1,5- 二 磁 酸化 产生 的 葡萄 糙 -6- 磷 酸 有 氢 酶 存 在 时 ， 受 结构 变化 的 控制 。 在 4.cylincdrica 的 营养 细胞 中 而 不 是 异形 胞 中 也 有 类 似 控 制 机 制 。 异 形 胞 中 葡萄 糖 -6 -磷酸 脱氧 酶 的 高 浓度 及 其 在 光合 和 暗中 的 无 抑制 功能 现象 说 明 ， 这 种 酶 在 供给 固氮 酶 还 原 剂 中 可 能 有 重要 作用 。 在 离 体 异 形 胞 中 关于 电子 传递 的 最 近 研 究 已 完 全 证 实 了 这 一 推论 。 异形 胞 中 还 原 势 的 发 生 当 氢 酶 的 天 然 还 原 剂 问题 已 彻底 解决 时 ， 对 体内 供给 NADP* 还 原 当 量 的 原初 物质 还 不 清楚 ， 事 实 上 是 否 只 是 单一 物质 能 网 维持 国 氮 酶 似乎 还 有 疑问 。 — REFE A. variabilisM A. cylindricahV ET AREER DP 需 铁 氧 还 蛋白 丙酮 酸 脱羧 了 酶 的 测定 ， 对 于 丙酮 酸 存在 于 天 然 来 源 还 原 剂 中 的 概念 已 得 到 一 些 支持 。 当 4.cyl1inrdrica 生 长 在 元 素 氮 或 硝 态 氮 源 条 件 下 ， 其 酶 活性 比 培养 在 氮 态 氮 中 的 高 五 倍 。 虽 然 曾 推测 固氮 酶 催化 反应 的 生理 作用 可 能 发 生还 原 性 铁 氧 还 蛋白 ， 但 尚 无 证 明说 明 蜡 形 胞 中 有 这 种 梅 。 而 且 从 整 体 4.cyifinadrica 中 提出 的 丙 珊 酸 自给 固氮 酶 活性 的 证 据 ， 也 还 不 能 最 后 结论 为 在 异形 胞 中 也 能 表达 。 可 能 更 确切 的 研究 是 有 关 丙 酮 酸 和 其 它 物 质 及 代谢 中 间 体 在 离 体 异 形 胞 国 须 作用 中 起 一 定 作 用 。Bradley 和 Cam (1976) 证 明 4.cy1iiradrica 的 离 体 异 形 胞 的 固氮 酶 活性 能 为 磷 酸 丙酮 酸 所 激化 。Peterson 和 Buris (1976) RH, EMA AA Ae RR Alt kc BE 酸化 途径 的 中 间 物 时 离 体 异形 胞 在 有 NADP* 存 在 的 情况 下 氧 吸收 加 强 。 最 近 ,Apte 等 (1978) 已 证 明 ， 不管 在 光 中 或 暗中 ， 用 葡萄 鳍 -6 -应 酸 脱 氢 酶 和 铁 氧 还 蛋白 NADP-* 氧 化 还 原 酶 处 理 后 ， 离 体 异 形 胞 都 能 从 葡萄 糖 -6- 磷 酸 向 铁 氧 还 蛋白 传递 电子 。Lockau 等 (1978) 又 证 明 ， BIG Hep ay OE -6 - BEAR, 6 - WERE AIA OR A Se 柠檬 酸 能 支持 固 氛 酶 活性 ， 并 指出 氧化 Dove ie BERR (L589 ht SUS Fe A (Krebs) 三 羧 酸 循环 能 以 等 量 的 中 间 电 子 经 由 NADP+ 传递 给 固氮 酶 。 氮 素 固定 的 同化 通常 认为 ， 在 微生物 中 氨 同 化 的 主要 路 线 是 受 谷 氨 酸 脱氧 酶 催化 ， 由 2 - 酮 戊 二 酸 还原 AMAA. AHMAR, HEMAM (HAARMAM. BABAR) 在 最 初 氮 结 合 反应 中 起 作用 。 其 它 氨 基 酸 是 在 氨基 转化 反应 中 形成 ， 而 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 可 能 是 在 这 当中 各 自 POE RE AIR RAR ZMK 氮 基 酸 脱 氢 酶 对 氨 显 示 相 当 高 的 Km 值 ， 因 此 当 细 胞 生长 在 过 多 氮 ARBRE PM 大 量 胞 外 游离 殷 。Tempbest 等 (1970) 指出 ， 当 Aerobacter aerogenes ERTS ABR 时 ， 有 相当 量 的 谷 氮 酸 脱氧 酶 产生 ， 在 限 所 培养 中 ， 这 些 酶 的 活性 即 大 大 降低 。 另 一 方面 他 们 还 发 现 ， 在 这 样 条 件 王 谷 氨 栈 胺 合成 的 活性 显著 增加 而 谷 氨 配 在 一 个 新 发 现 的 氮 转 化 反应 中 同时 形成 。 这 一 反应 是 由 谷 氮 酸 合成 酶 〈 谷 氛 栈 胺 2 - 酮 成 二 酸 酰 腕 转 化 酶 ) 催化 的 ， 两 个 反应 的 顺序 如 下 : 1) NH, + 谷 氨 酸 + ATP seo Reh +ADP+Pi+H;O 2 ) SARK + 2 - 酮 戊 二 酸 +NADPHS AE 28 +NADP* 谷 所 酸 合 成 的 这 一 途径 表明 有 一 个 过 低 的 Km， 但 需要 消耗 能量， 这 被 认为 是 付 给 细菌 13 4 同化 很 低 浓 诬 氛 的 “代价 ”。 继 后 由 Nagatanj 等 (1971) 证 WA, BARAK Klebsiella be11DNice 中 广泛 存在 。 在 固氮 条 件 下 ， 这 种 细菌 经 由 新 发 现 的 路 线形 成 谷 氨 酸 ， 而 需 氨 生 长 的 细胞 同时 含有 谷 氨 酸 脱 气 酶 和 谷 氨 酸 合成 酶 两 条 途径 。 关 于 氨 的 低 Km 值 的 意义 ,联系 到 谷 气 栈 腕 合成 酶 一 谷 氨 酸 合成 酶 从 径 ， 显 然 证 明 其 在 一 个 氮 耗 尽 环境 中 具 有 同化 氢 的 能 力 。 固氮 的 最 初 产 物 在 早年 的 示 踪 研究 中 ，Magee 和 Burris (1954) 已 发 现 将 Wostoc muscorum 置 于 15N- 标 记 气 气 中 90 分 钟 后 ， 最 高 的 “N 富 集 是 在 谷 氮 酸 中 。 近 来 ，Stewart 等 (1975) WR CRT IN- 标 记 Nz 中 短 时 间 CH FILO BH) 的 4.cyl1izadrica 的 所 结合， 结果 发 现在 2 分 钟 后 在 谷 氨 酸 的 酰胺 基 轩 中 即 出 现 最 高 同位 素 富 集 ， 其 次 是 在 两 氨 酸 和 谷 氮 酸 中 ， 而 在 谷 氛 酸 ， 和 天门 冬 氨 酸 和 丝氨酸 中 很 少 发 现 有 标记 原子 。Thomas 等 〈1975) 应 用 放射 活性 12N 标 记 Nz 方 法 ， 将 曝露 于 示 踪 剂 的 时 间 尽 量 减 少 到 15 秒 , 结果 看 出 固 所 作用 中 同化 的 最 初 !*sN- 标 记 有 机 产物 ERAN, HRKERARM. HEREAM (AAR. MAR. HAM. REAR KREME, 2a. Fi) 上 曝 于 :223N=- 标 记 Ns 中 只 需 工 分 钟 即 可 标记 上 。 在 同样 试验 中 ,， 4L-PRA FR-DL- MLR (MEX) “一 种 - 谷 氮 酸 结构 类 似 物 和 谷 氨 酰胺 合成 酶 抑制 剂 ) .存在 时 ， 测 不 出 有 :N- 标 记 谷 氨 酰 胺 和 谷 氨 酚 。 在 曙 一 试验 中 ,Lawrie 等 (1976) 利用 :“C 示 踪 研 究 ， 在 !4CO; 中 经 氮 饥 饿 30 分 钟 后 的 4 。cylindrico 重 新 吸收 Na (MR) ， 并 说 明 :“C 结 合 到 氨基 酸 中 ， 在 柠檬 酸 和 Or SE Ul. AE ON-AIR BA cylindricaZe Kh, HG 胞 移出 ， 移 动 率 大 约 是 每 两 个 相 邻 细胞 5 秒 钟 。 代谢 物 的 转移 通过 分 隔 的 异形 胞 积 营 养 细 胞 间 复 杂 的 联系 似乎 必然 有 代谢 物 的 连续 交换 。 溶 液 必须 通 过 两 层 原生 质 膜 和 三 层 隔 膜 。 此 处 运动 的 次 道 很 可 能 是 与 质 膜 相 联 的 微 质 膜 孔 〈 见 前 述 ) 。 营养 细胞 的 高 呼吸 活性 〈 硝 基 - 蓝 四 只 还原 的 ) 靠 近 异 形 胞 并 接近 营养 细胞 和 异形 胞 的 隔膜 ， 可 能 促使 活性 溶液 输送 通过 营养 细胞 -异形 胞 联结 。 考虑 到 两 种 类 型 细胞 的 相互 依赖 性 ， 即 使 将 异形 胞 很 小 心地 和 营养 细胞 分 隔 ， 也 将 导致 它们 正常 功能 的 混乱 。 曙 形 胞 在 离 体 后 即 不 起 作用 ， 一 经 分 离 即 导致 高 度 专 性 破坏 ， 而 在 正 常 条 件 下 是 不 分 裂 细 胞 。 异形 胞 的 形成 和 固 握 酶 合成 的 调控 Fecgg 在 其 早年 (1944) 研究 中 已 发 现 ， 在 4.cyfozadrica 中 细胞 氮 素 含量 和 蜡 形 胞 频率 之 间 有 相关 性 。 氨 素 基质 可 能 抑制 异形 胞 的 形成 ， 而 供给 可 同化 的 有 机 矶 则 刺激 异形 胞 产生 。 最 忽 异 形 胞 的 分 化 是 伴 跪 细胞 C:N 比 的 增加 〈 从 4.5:1 到 8:1) ， 因 所 酶 活性 只 是 在 第 一 批 异 形 胞 发 育 完 全 时 才能 测 出 。 控制 异形 胞 分 化 的 因素 Fogg (1949) 假定 在 A.cylindrica 丝 状 体 生长 时 可 能 产生 所 或 其 它 衍 生物 ， 是 一 种 有 定期 浓度 梯度 的 抑制 物 ， 当 这 种 物质 在 细胞 内 的 浓度 降 至 一 个 临界 水 平时 即 形成 异形 “116 。 Wilok (1967) 观察 到 ， 蜡 形 胞 自 丝 状 分 离 后 会 刺激 其 余 异 形 胞 的 发 育 ， 因 而 认为 异形 胞 释 放出 一 种 抑制 剂 ， 它 沿 着 丝 状 体 运 动 ， 防 止 营 养 细胞 分 化 形成 新 的 异形 胞 。 当 异形 胞 产生 这 种 抑制 效果 了 时， 似乎 促进 国 毛 酶 活性 的 独立 性 ， 并 认为 可 能 不 是 所 本 身 而 是 其 它 基 质 起 抑制 作用 。 关于 甲 硫 氨 酸 亚 码 次 胺 (MSX) 也 能 促进 异形 胞 分 化 《和 国 氨 酶 合成 ) 的 发 现 进一步 证 明 ， 不 管 是 氨 还 是 谷 氨 酰 立 合 成 酶 、 谷 氨 酸 合成 酶 或 是 它们 反应 的 产物 ， 都 有 阻 抑 固氮 酶 合成 的 作用 ， 并 且 也 抑制 异形 胞 的 发 育 。 已 经 观察 到 ， 加 入 谷 氨 酰 胺 、 谷 氨 酸 、 天 冬 氨 酸 或 丙 氨 酸 都 能 减轻 MSX 对 4.cyliindrica 谷 氨 酰 胺 合成 酶 的 失 活 作用 。 所 有 这 些 化 合 物 都 能 防止 异形 胞 分 化 ， 这 就 可 一 致 认为 不 管 是 谷 氨 酰 胺 合成 酶 或 者 是 其 产生 的 活性 都 包含 在 异形 胞 的 调控 中 。 控制 固氮 酶 合成 的 因素 在 革 兰 氏 负 反 应 细菌 中 ， 谷 氨 酰 胶合 成 酶 是 两 种 形态 ， 一 个 活性 的 去 腺 苷 化 和 一 个 非 活 性 的 腺 苷 化 形态 。 已 有 人 提出 ,由 于 谷 氨 酰 膀 合 成 酶 的 催化 功能 , 控制 着 包含 在 久 1ebsiel1a 中 的 氮 素 代谢 和 固氮 作用 的 酶 合成 。Roweli 等 (1977) 发 现 ， 没 有 证 明 在 4.cyiindricc 中 谷 氨 醚 胶合 成 酶 有 两 种 形态 ， 也 没有 证 据说 明 在 男 氛 酶 合成 中 有 活性 酶 的 催化 作用 控制 ， 当 4 cylindrica PE AMINE A RAGA EMT, FERS. A. MME WIA SFAMRAKZARHAWARAEZAMARMKE, FHARMARAMARESS 氨 酰 胺 或 其 代谢 产物 的 控制 。 异形 胞 产生 的 控制 和 固氮 酶 合成 之 间 的 关系 在 大 气 条 件 下 异形 胞 的 存在 和 固 氨 能力 之 间 的 密切 关系 ， 以 及 培养 基 中 高 浓度 氨 态 氨 阻 抑 异 形 胞 的 形成 和 固 气 酶 的 合成 的 观察 ， 正 是 有 关 异 形 胞 是 蓝藻 固 氨 活性 部 位 响 念 的 主要 证 据 。 根 据 异 形 胞 分 化 和 国 氨 酶 合成 之 间 的 直接 关系 可 推测 的 ， 从 遗 苇 学 研究 也 得 出 结论 。 虽 然 已 经 获得 突变 体 ， 其 中 蜡 形 胞 发 育 正 常 但 缺乏 产 车 固 氨 酶 的 能 力 ， 通 常 缺 固 和 氨 酶 的 突变 体 也 不 能 发 育 异 形 胞 ， 而 且 突 变 体 无 例外 地 没有 固 气 作用， 但 有 产生 异形 胞 的 能 力 。 这 些 发 现 得 到 一 致 见解 ， 即 nif 和 het 基 因 分 别 存在 但 又 紧密 相 联 在 异形 胞 类 蓝藻 的 染色 质 中 。 原文 载 自 [ 印 ]“Recent Advances in Biological Nitrogen Fixation” (1980) pp。121 一 165 “Nitrogen Fixation in Heterocysts” 陈 廷 伟 译 e117。 吉 接 测定 圆 褐 固氮 菌 (4zotobacter chroococcum ) fy IF We VE AA. Zu A 固氮 酶 活性 间 相 互 关系 的 质谱 法 人 引 ZEA #8 EEA «(Azotobacter chroococcum) 和 一 些 根 Jf (Rhizobium) 的 类 菌 体 中 ， 含有 单 疝 的 不 需 ATP 的 氢 酶 ， 它 可 能 有 三 种 作用 :在 将 固氮 酶 产生 的 氨 再 氧化 时 ， 第 一 是 将 消耗 掉 的 ATP 和 还 原 能 力 再 循环 ;第 二 是 防止 氢 对 固 气 酶 活性 的 抑制 作用 ， 第 三 是 利用 过 量 的 氧 ， 这 样 就 有 助 于 保持 固氮 酶 活性 部 位 附近 的 厌 氧 条 件 。 然 而 氢 酶 和 固氮 酶 间 的 相互 关系 至 今 还 不 清楚 。 应 用 稳定 性 同位 素 气 (D2) 测定 氢 酶 活性 是 很 成 功 的 ， 同 时 也 揭示 了 在 好 气 固氮 菌 中 ， 固 气 酶 释放 氢 的 能 力 ， 否 则 我 们 只 能 通过 氢 酶 抑制 剂 来 证 明 其 在 体内 的 状 Uo : 在 这 些 研 究 中 ， 困 难 在 于 大 气 组 成 的 变化 ， 它 使 在 酶 部 位 实际 发生 的 情况 被 推迟 和 减 弱 。 如 果 在 液态 中 进行 气体 测量 ， 则 可 望 得 到 较 好 的 精度 。 在 这 方面 用 Clark 电 极 测定 溶解 氢气 的 安培 法 成 功 地 应 用 于 观察 类 菌 体 及 Rhodopseudomones capsulata 中 H， 的 代谢 作用 。 由 此 发 展 为 测定 在 酶 活动 中 所 含有 的 其 他 气体 化 合 物 直 接 质谱 方法 ， 这 个 方法 可 以 测定 在 液 相 中 溶解 的 气体 。 在 本 实验 室 则 用 以 研究 Azotobacter chroococcum 中 呼吸 作用 、 氢 酶 和 固 握 酶 活性 之 间 的 相互 关系 。 Mig 1 my 料 和 ,六 法 《Atlas》 CH4 型 质谱 计 ， 它 装 有 峰 强 度 测 量 的 自动 系统 。 离 子 源 通过 不 锈 钢 真空 管 直接 与 反应 容器 连接 〈 图 1 ) ， 这 个 反应 容器 是 一 7 个 宽 15 毫 米 、 高 60 毫 米 的 带 一 个 恒温 水 浴 套 的 8 有 机 玻璃 圆 简 ， 容 器 的 体积 可 在 3 一 8 毫升 之 Al 连续 测量 在 液 得 牛 盗 解 气体 的 反应 器 间 调 节 ， 这 种 调 节 是 用 三 个 0 型 环 固定 的 活塞 1 : 带 有 O 型 环 的 锁 紧 螺 旋 ，2: 活塞 ; 3 : 恒温 水 浴 进行 的 。 应 用 注射 针头 透 过 接近 底部 的 小 孔 将 =; 4; OF; 5: REIS; 6 : 带 孔 的 保护 框 板 T: RORCM: 8: 热处理 钢 架 ; 9 。 通 向 质谱 计 出 气体 混合 物 注 入 容器 内 介质 中 。 然 后 降下 活塞 口 ，10: 充气 或 注入 反应 剂 的 进口 。 使 过 量 气体 通过 中 心 管道 排出 ,并 用 螺旋 锁 紧 。 介质 用 磁 搅 棒 不 断 搅动 ， 部 分 溶解 的 气体 通过 12.5 微 米 厚 的 聚 四 氟 乙 烯 膜 扩 散 ， 当 水 蒸气 在 «118 e 液 气 阱 中 冷凝 后 , 才 导 入 离子 源 。 在 这 样 条 件 下 质谱 讯号 与 在 液 相 中 气体 组 份 的 浓度 成 正比 。 在 这 些 实验 中 所 应 用 的 微生物 4zotobacter chroococcum 菌 种 是 由 Dommergues 博 士 的 实 验 室 分 离 的 ， 并 在 B。Burk 培 养 基 上 培养 ， 在 发 醇 器 连续 培养 中 多 加 5 WMA. A 连续 通气 ,， 但 培养 是 用 氧 电极 作 指 示 以 限制 氧气 量 。 将 -8 毫 升 培 养 基 《在 570 毫 微米 处 光 密 度 接 近 0.5) 移 至 反应 容器 中 ， 然 后 用 0.8 份 氨 气 和 0.2 份 氧气 或 者 0.7 份 氨 气 、0.2 份 氧气 和 0.1 份 氛 气 喷 洗 ， 直 至 大 气 一 溶液 平衡 达到 峰 32 和 峰 4 的 指定 水 平 。 过 量 气 体 按 上 面 所 述 的 方 法 排出 后 。 氧 (32), fil (4) MA (2) 的 变化 或 者 是 在 一 个 检测 试验 中 分 别 检测 或 者 是 在 同一 样品 重复 试验 中 分 别 检测 ， 整 个 深 解 的 气体 分 压 都 用 大 气压 表示 ， 培 育 温 度 在 整个 实 验 中 都 保持 在 30Z 。 质 谱 自 身 的 消耗 ， 即 气体 压力 的 一 级 函数 ， 是 用 在 同样 条 件 下 水 或 用 未 接种 的 充气 介质 测定 的 。 eR eH 论 图 2 中 表明 溶解 气体 浓度 的 变化 。 在 0.01 气 下 呼吸 作用 比 没有 气 时 高 〈 每 分 钟 消耗 分 别 为 0.04 和 0.03 大 气压 氧 ) 。 同 时 ， 气 消耗 呈现 出 一 个 具有 较 快 和 较 慢 组 分 的 双 动 力学 。 用 这 ， 些 数据 在 半 对 数 座 标 上 作 图 〈 图 2 内 插图 ) 。 缓 慢 部 分 得 到 的 直线 与 质谱 自身 的 消耗 平行 。 单 向 氢 酶 的 实际 气 吸 收 用 较 快 部 分 表示 ， 在 氧 分 压 降 到 大 约 0.01 大 气压 后 5 分 钟 ， 氛 的 吸收 几乎 完全 中 止 。 与 此 同时 只 有 在 气 存 在 时 ， 放 氢 发 生 陡 变 。 在 另 二 组 试验 中 ， 比 较 了 有 无 氢 酶 时 气体 产生 和 吸 55) 收 的 不 同 动力 学 ， 抑 制 混合 物 含 0.5 毫 升 CO 加 0.5 毫 升 CoH. MAH 3 毫升 Ar ， 在 充气 结束 后 在 培养 基 上 保持 0 、D: 气 体 ， 有 氧 时 CO 和 Cs Hz 的 消耗 略为 减少 ,最 15h} 后 气 吸 收 下 降 为 原来 的 才 一 于。 但 是 ， 在 有 同 — OR 下 任何 情况 下 放 氨 的 情况 都 一 样 。 起 这 些 结果 可 得 出 结论 ， 放 氢 与 氢 酶 活性 的 终止 无 1 关 沁 而 与 气 酶 活性 的 开始 有 关 ， 这 两 个 活性 是 直接 地 与 氧 分 压 水 平成 反比 。 这 一 点 与 Droszd 和 Postgate 提出 ，， 《 弄 二 关 》 模 式 一 致 ， 可 用 以 益 明 固 氨 酶 对 于 过 量 氧 的 “HR” 保护。 预先 在 0.09 大 气压 氧 生 长 4zotopacter chroococcum, *4P :0 从 0.05 升 至 0.2 大 气压 时 固 氛 酶 & 关 闭 ””， 然 后 在 恢复 到 原来 状态 时 再 “开启 ”， 此 模 a e AE SAU UTE HEAL 2 ERE 程 PO, OP ee nen Rte 低 时 ， 前 者 是 “关闭 ”而 后 者 是 “开启 ”。 这 与 根据 培 AKA, EMRE MOM, Felt MOAR AS hy BA TA 1) I RS PE RE — OAT MATIC, GMI fy» Aw Eh ee ca cmonom Dixon 在 提 到 好 气 固氮 菌 4zotobgacter chroococcum 差别 。 _ . thas 的 单 向 氨 酶 不 同 动能 时 ， 强 调 其 在 固 氨 酶 活性 部 位 的 附 9 ospecmene oseeme 并 近 对 氧 保护 作用 。 原 载 “BIOCHIMIE”，I978，60: 339—341 RARE LARK 21196 EAE Pye A (Azospirillum brasilense Sp. 7) SESE PAA A EY wi i AOE Y.M,Berlier P,A,Lespinat a #£ Azospirillum brasilense sp,7 菌 种 的 培养 中 ， 用 质谱 的 动力 党 方 法 监测 体内 厂 块 还 Ry TRIM A. JSAM JA SE A. (ETE FE PO RARER, Rp BT 了 ， 而 且 氧 的 扩散 速度 和 细菌 呼吸 作用 达到 平衡 。 只 有 在 CO 存在 时 才 观 察 到 固氮 酶 导致 的 _ 放 氢 。 而 CO 能 够 抑制 吸 氨 酶 的 活性 ， 正 常情 况 下 它 能 使 全 部 产 生 的 氢 再 循环 。 然 而 ， 在 厌 氧 条 件 和 有 和 掘 存 在 时 ， 可 以 观察 到 双向 氨 酶 的 活性 ， 同 时 存在 D; AMI A ik He IHD. 与 固 所 酶 放 氢 比较 ， 厌 氧 放 H* PADS CIR EEA OR, TINS hh ACO BM Hil, AX 地 说 气 分 压 对 此 疫 有 作用 。 这 个 结果 表明 厌 氧 放 Hz 和 HD 可 被 认为 是 由 于 气 饱 和 吸收 过 程 和 清除 电子 接受 体 时 可 逆 气 酶 活性 所 致 ， 尽 管 固氮 酶 和 氢 酶 这 两 种 酶 的 活性 差异 如 此 显著 ,但 在 它们 各 自 的 作用 条 件 之 间 发 现 有 较 密 切 的 关系 。 尽管 固氮 菌 在 其 生态 习性 和 生理 需求 方面 各 异 ， 但 是 早已 观察 到 固 氨 酶 和 气 酶 的 同时 存 在 。 一 般 讲 氨 酶 在 好 气 属 如 Azotobacter vinelandii 中 是 单 向 的 《和 氢 吸 收 》， 而 在 厌 氧 属 中 如 Cjostridium pasteurianumil| XE A] WEA. 近来 ， 证 明了 两 种 类 型 的 氢 酶 在 一 些 蓝 细 菌 甚至 Clostridium pasteurianumze Dpirl 9 6 吸 气 酶 的 可 能 作用 ， 特 别 是 在 固氮 酶 对 氧 钝 化 作用 的 呼吸 保护 和 在 放 氢 时 失去 还 原 能 力 的 再 循环 方面 已 经 比 或 清楚 了 ， 同 样 期 望 着 具有 这 样 气 酶 的 菌 种 对 于 固氮 作用 的 有 益 影 响 。 正 像 Mortenson (1978) 着 重 指 出 的 那样 ， 在 固氮 酶 解 阻 巡 的 条 件 下 ， 和 氢 酶 的 浓度 总 是 增加 的 ， 因 此 ， 可 能 提出 这 样 的 问题 : 两 种 酶 之 间 在 功能 上 的 关系 是 偶然 的 ， 还 是 由 于 它们 处 手 某 种 状态 时 才 发 生 ， 例 如 ， 调 节 状 态 。 在 微 好 气 的 固氮 基 中 ， 它 们 的 代谢 需要 氧 ， 但 是 也 由 于 很 低 的 氧 分 压 而 使 固氮 酶 钝 化 ， 气 酶 可 能 在 固 气 梅 的 氧 保护 中 起 作用 。 可是， 在 本 实验 室 以 前 工作 中 没有 测定 出 在 根 际 固氮 菌 Psexdomonas 属 中 含有 吸 受 酶 ， 实 际 上 这 个 属 通过 固氮 酶 活性 放出 大 量 的 氨 。 本 工作 针对 Fa — BP AL bs [ed AULA Azospirillum Brasilense 的 淋 内 氢 酶 和 固氮 酶 活性 进行 了 研究 ， 研 究 应 用 了 质谱 和 水 记忆 体 即 重 亿 和 重 盈 标记 乙 抉 的 连续 动力 学 方法 。 在 研究 了 固 氨 酶 功能 需要 的 氧 ， 以 后 ， 一 方面 我 们 认为 这 个 菌 种 具有 一 种 需 氧 驭 氢 梅 活性 ， 这 种 活 放 能 将 固氮 酶 产生 的 全 部 家 进行 下 循环。 马 一 方面 ， 在 厌 扰 条 件 下 ， 它 显示 出 双向 活性 ， 它 的 意义 正在 讨论 中 ， 两 个 酶 的 作用 条 件 的 相互 关系 ， 同 样 也 正在 研究 中 。 .120 。 Mm RP 和 -方法 FAR: sp.7 菌 种 是 Day 和 Debereiner (1976) 在 巴西 分 离 出 来 的 ， 并 且 分 为 SBpirilluxn lipoferum# 14, BE WA Azospirillum brasilense. A WF 中 也 用 了 Gauthier 和 El1- merich (1977) 获得 的 无 固 氨 酶 活性 而 需 谷 酰胺 的 突变 种 。 培养 基 和 生长 条 件 : tk TE i ESOT, 体积 为 1 升 的 发 酵 饶 在 无 氨 液 体 培 养 基 中 生 长 ， 开 始 时 加 100mg 酵 母 浸 提 物 以 促进 初始 生长 。 当 光 密 度 达 到 约 0.6 时 (波长 为 660nm )， 开始 慢 慢 地 更 新 培养 基 〈0.05/ 小 时 )》 ， 以 便 使 菌 量 保持 指数 生长 。 通 气 是 用 含 2 名 0; 的 氛 气流 通信 培 养 液 ， 缓 慢 地 搅拌 〈 每 分 钟 工 转 ) 以 便 使 氧 能 缓慢 扩散 ， 其 速度 正好 等 于 细菌 呼 REA WTAE. | 质谱 的 动力 学 测定 : 这 个 方法 和 用 4zobacter cjhrooccocczm 所 得 到 的 第 一 个 结果 早已 报 道 了 。 从 发 酵 负 中 取出 13 毫 升 样品 放 到 一 个 圆柱 型 容器 中 ， 使 之 不 与 空气 接触 ， 此 时 ， 培 养 xe Aa AM AAAI Aw (90/10V/V) 充 至 饱和 ， 在 充气 结 束 后 ， 把 容器 的 活 塞 压 下 以 便 排 除 残 余 的 空气 。 其 它 不 同 的 气体 或 试剂 可 以 用 注射 器 的 针头 通过 固定 在 容器 最 下 层 的 噶 进 一 步 注 入 。 在 培养 中 扩散 出 被 导入 或 产生 的 溶解 气体 ， 根 据 它 们 的 浓度 ， 可 通过 附 在 这 个 容器 底层 12.5 微 米 厚 的 聚 四 氟 乙 烽 膜 ， 联 接 到 质谱 离子 源 的 真空 管 上 ， 随 后 通过 冷 阱 ， 以 冷凝 水 燕 汽 ， 最 后 气体 进入 离子 源 离子 化 和 分 析 。 不 同 质谱 峰 可 以 用 手动 扫描 ， 以 便 几乎 同时 记录 Hz 和 HD (质量 2 和 3) 、D: 吸 收 〈 质 量 4) . Oth HE CH M32), CHB 原 为 乙烯 ， 可 以 接着 引入 重 氢 乙 块 (C;? Da )， 并 在 质量 为 30 上 记录 放出 的 气 化 乙烯 (CCzDzHs ) 峰 。 当 记录 Ns 和 CO 作 抑 制剂 时 ， 常 规 的 乙烯 〈CzH4) 在 质量 为 28 的 峰 处 很 可 能 观察 不 清 Te 这 些 质谱 信号 转换 成 分 压 或 溶解 气体 的 浓度 ， 在 用 已 知 的 不 同 气体 混合 物 在 相同 条 件 下 所 作 校 正 曲 线 时 应 间 时 考虑 到 它们 各 自 的 溶解 度 和 它们 的 电离 产物 。 同 时 质谱 本 身 的 消耗 也 必须 测定 ， 并 且 要 从 结果 中 减 去 。 实验 是 在 30C 下 完成 的 。 这 些 结果 参照 培养 基 中 用 Lowry 方法 测定 的 蛋白 质 组 成 ， 或 从 凯 氏 总 氮 计 算 。 | BE: FR 固 氨 酶 活性 条 件 ; 培养 物 用 纯 氨 充 洗 并 与 重 所 标记 的 1 cm MCA Sh 1 oh. HR 去 CzD: 的 残余 气体 〈 这 时 分 压 大 约 为 0.07 巴 ) 。 在 无 氧 时 CzD;: 不 还 原 (图 1) 。 但 是 ， 当 加 入 少量 氧 0.01cm3) 时 ， 溶 解 氧 的 分 压 立 即 下 降 到 大 约 0.003 巴 ， 而 且 在 CDzHz 释 出 前 可 以 观察 到 。 在 前 述 氧 分 压 本 底 水 平 再 一 次 达到 后 ，CzDszHsz 的 释 出 仍然 没有 变化 ， 但 当 踪 去 培养 液 上 小 的 氧气 泡 时 ，CzDzHz 的 杰出 在 一 分 钟 内 停止 。 当 新 鲜 的 氧 加 入 时 GRA Ze 明 ) ， 再 一 次 观察 到 同样 的 情况 。 当 加 CO 时 ，CasDazHaz 产生 停止 。 在 同样 的 条 件 下 发 生 放 H20 IS 4E Azospirillum brasilense'PAxt HW RUNGE ea ay, (HAE 0,003 巴 的 氧 压 就 能 使 这 个 酶 完成 全 失 活 ， 而 这 个 值 仍 低 于 在 文献 中 所 提 到 的 值 。 这 就 导致 必须 在 呼吸 作用 和 从 气相 中 扩散 的 氧气 之 间 保 持平 衡 〈 在 这 里 在 容器 的 顶部 通过 残留 气泡 表现 则 ) 。 只 要 在 培养 。121。 基 中 氧 分 压 没有 升 到 0.025 巴 ， 固 氨 酶 的 钝 化 就 是 可 逆 的 ; 当 氧 分 压 高 于 这 个 值 时 ， 固 氨 酶 的 钝 化 就 成 为 不 可 道 了 。 如 Nelscn 和 开 nowles (1978) 49 Hi AY, Azospitillum brasilense 有 具 有 较 差 的 呼吸 保护 作用 。 由 上 述 结 果 看 来 ， 似 乎 sp.7 菌 种 仍然 通过 可 逆 性 钝 化 的 方 法 表现 出 自身 的 保护 能 力 ， 即 由 Drcszd 和 Postgate 所 提出 的 在 Azotobacter 中 的 “ 构 像 保护 ”5 锐 对 固 气 酶 活性 的 影响 也 见 诸 图 1 。 在 加 入 ;1 毫克 分 子 的 毛 化 铵 于 培养 基 后 ， 放 毛 慢 慢 下 降 ， 并 在 2 分 钟 内 停 上 。 再 加 氧 将 导致 所 的 下 吸收 。 在 CzD: 还 原 过 程 中 加 入 NHecCl， C2zDiH2z 产 生 的 行为 〈 未 画 出 ) 是 相同 的 。 | + — —_— Zi 60 30 id, 8 12 16 20 图 1 在 Azospiriltum brasilense sp.7 中 国 氮 酶 引起 的 乙 抉 还 原 和 放 氢 氢 分 压 的 效应 。13 毫 升 培 养 RA Av, FES, Ml cmasaCzD。， 放 置 1 分钟 ，10 分 钟 后 ， 加 入 Ticas 的 CO 然后 二 放置 1.25 分 钟 ， 在 16.5 分 钟 时 ， 加 入 1 毫克 氯 化 贸 ， 在 箭头 指示 的 时 间 加 六 Jiems 氧 气 . 忆 曲线 41: CzDzHsz 的 释 出 .曲线 2 : 加 入 CO 后 的 放 囊 2 阴影 面积 : 溶解 的 氧 分 压 。 可 逆 的 氢 酶 活性 的 证 明 : 培养 基 是 用 毛 和 气 〈90/10V/V) 的 混合 物 充 洗 的 ， 充 洗 后 紧 闲 容器 ， 并 记录 质量 数 为 2 8 和 4 的 峰 。Dz 的 吸收 动力 学 可 自 图 2 看 到 ， 开 始 的 发 收 速 0 4 8 12 图 2 EAzospirillum brasilense sp.7 中 氢 酶 的 活性 13 毫 升 培养 液 用 氨 一 气 (90/10 V/V) FEve, 在 10.50 分 钟 时 加 入 0.05cms 氧 气 Rabie HA 1: PRM BSR CHR MRIS RRR) . eR 4 STD. Hee 1 4 (ER A Pere EB. ATA (RR F/R RAM) .在 4 和 1 之 间 是 不 同 的 。 曲 线 2 和 3 : 放 瓦 ?和 HED BRM (BHI F/R BAR). © 122 ¢ 率 是 对 1 毫克 蛋白 质 为 36 毫 微克 分 子 / 分 钟 ， 此 时 ，Hs 和 HD 的 释放 速率 分 别 为 11 毫 微克 分 子 / 分 钟 和 10 毫 微克 分 子 / 分 钟 变化 ， 平 衡 是 趋向 吸收 过 程 的 。 然而 ， 当 同样 培养 基 的 凡 品 用 增加 Diz 的 分 压 连 续 地 充 洗 时 ， 虽 然 短 时 间 D; 的 吸收 动力 学 每 次 都 是 接近 指数 ，pD; 越 低 ， 速 度 常 数 越 高 〈 表 1 ) 这 样 在 全 部 pDz 苑 围 内 反应 的 级 数 就 不 是 1 ， 在 0.02 和 0.05 巴 D:z 间 放 H? 速 率 的 增加 是 微不足道 的 ， 而 放 HD 速 率 的 增加 在 0.02 和 0.10 巴 之 间 都 是 明显 的 ， 提 高 D:* 压 力 并 没有 导致 任何 部 分 释放 速率 的 进一步 增加 。 少量 氧 〈0.05 一 0.1lcms) 的 供应 将 引起 D， 的 吸收 直接 增加 10 倍 ， 并 且 使 原来 放出 的 Ha 和 HPD 被 再 吸收 “〈 图 2 ) 。 与 固氮 酶 导致 H 产 生 相 反 ， 这 里 记录 的 放 Hz 和 HPD 在 A 分 压 降 至 以 前 未 底 水 平 后 并 没有 恢复 ， 仅 在 所 有 残留 氧气 用 新 的 Ar 一 Dz 冲 洗 培养 基 除 去 后 才 恢 复 。 这 样 ， 当 供给 较 大 量 的 氧 时 ， 像 固氮 酶 不 可 首 的 钝 化 一 样 ，D:z 的 吸 收 以 及 放 Hz 和 HD 同 样 的 不 可 逆 地 减少 了 ( 表 2) 。 331 GUSSET AzosPirillum brasilense sp.TD :吸收 ， 和 放 Hz 和 HD 放 出 的 影响 PD 近似 速度 常数 Daz 吸 收 率 hie Ho i 放 了 HD 速 率 放 了 Hz 十 HD 速 率 (B) (#57 Fh) 〈 毫 微克 分 子 /每 分 钟 ) 《〈 训 微克 分 子 / 每 分 钟 ) “〈 毫 微克 分 子 / 每 分 钟 ) 〈 豪 微克 分 子 /每 分 钟 ) 闵 训 二 0.109 27 11 T 18 0.05 0.065 40 11 9 20 0.10 0.045 49 12 11 23 0.20 0.031 76 12 10 22 0.35 0.023 97 12 11 23 2 ASMA PISA Az0sPiri/lum brasilense sp.7 氢 酶 活性 的 影响 1 OTR) 2 (Oz) 3 (C2D2) 4 (CO) 5 (NHj ) 6 (NHY 抑 制 细胞 ) 厌 氧 放 也 2 10.9 “414 13.3 7.9 7.8 3.9 Mik HD 9.8 1.5 10.6 7.8 me 2.5 RADAR 36.0 12.0 36.0 38.4 33.9 1 12.0 需 氧 Dz 吸 收 348 一 342 144 一 一 .对照 没有 抑制 剂 或 阻 过 剂 ， 2 .在 充 洗 结束 时 加 入 0.25cms 的 氧 ; 3 .在 充 洗 并 放置 1 分 钟 后 加 入 1 cmsC2D2; 4. 在 充 洗 并 放置 1 分 钟 后 加 入 1 cm*CO; 5. 在 充 洗 结束 时 加 入 1 SHOT RR: 6. 用 苹果 酸 一 N 也 ;1 阻 抑 的 细胞 进行 试验 。 结 果 用 毫 微克 分 子 / 毫 克 蛋 白质 表示 。 几乎 完全 抑制 固氮 酶 放 氨 的 乙 块 ， 在 这 里 对 于 De 的 吸 收 以 及 放 H 和 HD 没 有 明显 的 影 响 《〈 表 2 ) ， 如 一 氧化 夸 没 有 影响 厌 氧 微生物 的 吸收 ， 但 却 减 少 了 需 氧 微生物 的 吸收 以 及 放 H2#MIHD (#2) . M0. WS wh TCR TS RAC, BLA 地 抑制 了 固氮 酶 的 活性 〈 图 1 ) ， 其 结果 使 放 Hz 和 HPD 被 部 分 地 抑制 了 。Ar-0: 大 气压 下 用 NEH4+ 预 先 培养 的 细胞 ， 其 固氮 槛 合成 受到 抑 制 时 厌 氧 吸 收 和 释放 过 程 比 在 可 比较 光 密 度 下 固氮 培养 时 速度 是 降低 了 ( 表 2) 。 “123。 ster te S0014749 讨论 和 结论 #2 Azospirillum brasilense sp.7 菌 系 中 和 其 他 所 有 固 氨 萝 一 样 ， 固 氮 棍 催化 质子 还 原 成 分 子 毛 ， 与 4zotobacter :以 及 大 多 数 尽 iizopium 属 相似 ， 但 不 同 于 其 他 微 好 气 微生物 ，sp。 7 菌 显示 出 体内 有 氢 本 活 性 ， 在 低 氧 压 下 ， 能 够 再 循环 固氮 酶 产生 的 所 有 氨 。 在 厌 氧 条 件 下 和 D ,存在 时 ， 氛 的 吸 疏 以 及 放 Hz 和 HD 是 同时 发 生 的 。 从 它 的 厌 氧 特性 以 及 对 于 抑制 剂 的 灵 敏 度 来 看 ， 与 固 气 酶 导致 这 Hs 相 比较 ， 放 Ha 和 HD 似 为 氢 酶 的 活性 所 致 ， 而 且 在 无 分 子 氢 时 固 氨 酶 不 能 催化 2H+ +D; 2HD 交 换 。 在 高 气压 下 放 Haz 甚 至 放 HD 是 相对 地 不 敏感 了 ， nt 的 吸收 却 增 训 了 ， 这 惑 排 除了 在 互 * 和 D: 之 间 的 同 分 子 交换 反应 是 主要 过 程 ， 但 是 相反 ,， 却 表 明了 是 两 个 不 同 速率 的 独立 的 可 逆反 应 过 程 。 释放 的 活性 已 在 无 细 驳 颗粒 和 从 4zotobacter 纯 化 的 氨 酶 中 发 观 ， 虽 然 好 气 菌 种 对 Hz 的 吸收 很 低 、 难 以 与 在 厌 氧 细菌 或 者 一 些 光 合 细菌 如 Chrormatiwz 中 所 出 现 的 放 Hz 活 性 平行 。 至 于 吸 氢 醒 在 活体 内 有 具 放 Hz 活性 的 可 能 性 ，Schlegel 和 Schneider (1978) 认为 这 与 没有 未 端 电 子 受 体 有 关 。 在 电子 受 体 浓 度 作 为 控制 吸收 动力 学 的 限制 因子 时 ， 在 高 pDz 时 速度 常数 ”的 偏差 实际 上 表明 了 复杂 情况 。 在 好 气 时 CO 抑制 P: 的 吸收 ， 而 在 厌 氧 时 则 没有 ， 这 现象 也 有 助 于 这 种 假设 。 ， 看 来 似乎 低 的 气 分 压 是 能 够 人 饱和 这 个 吸收 过 程 的 ， 同 时 也 能 排除 残余 电子 受 体 ， 以 使 放 Haz 的 过 程 逆转 。 但 必须 进一步 研究 ， 以 确定 放 H 和 琢 收 的 活性 是 由 单个 膜 结合 酶 可 逆 作用 Bree (tbo ta Rhodos pirillaceaeDB FEL & Clostridium pastenrianums< FE A 中 所 发 现 的 由 两 个 处 于 不 同位 置 酶 所 引起 的 。 研究 sp. 7 固氮 酶 对 氧 的 敏感 性 , 吸 氢 酶 可 能 有 助 于 保 护 固氮 酶 免 遭 氧 钝 化 作用 。 在 培养 基 用 氨 和 所 混合 物 充 洗 与 只 用 氢 充 洗 相 比 ， 氧气 的 消耗 确实 多 两 倍 ， 但 这 效应 可 能 仅 在 活体 内 没有 氢 存 在 时 直 有 可 能 。 的 确 ， Ke Ais FEA RE On 和 Hs 再 循环 方面 的 两 个 作用 是 互相 依存 Wo BRP RBI. MMR ww AT HE LE, 在 碳 限制 的 4zobacter 培 养 中 和 气 气 自 养 的 丸 j1irzopiuz 中 已 经 证 明了 ， 这 一 点 将 在 以 后 文章 中 验 定 。 要 强 谓 另 一 点 是 气 酶 活性 无 论 是 那个 方 同 ， 在 下 列 的 情况 下 都 明显 地 减少 ， fn Ze FAL 失 活 (AREGRRAWEANH.*) RENN PARR ABRAM A eM HT. sp. 7029 突 变种 表现 出 既 无 固氮 酶 叉 无 所 酶 活性 ， 但 是 ， 在 Naz 存在 时 经 过 几 次 再 培养 ， 两 个 梧 的 活性 都 饮 复 了 。 这 些 结果 表明 ， 在 两 个 酶 之 间 的 互相 依赖 性 是 处 于 它们 调节 的 永 平 。 这 称 气 酶 活性 和 固 甩 酶 的 解 阻 抑 状 态 之 间 的 相关 性 在 4zotobacter vinelandii PRM T, 最 近 又 在 各 aztpopacter auiotrobpjiicas 中 得 到 证 实 。 极 可 能 是 像 在 研究 大 GAR BB (Rhozo- bium jabpomicuz) 时 所 假设 的 那样 ， 即 氨 海 的 生物 合成 是 通过 作为 固氮 酶 活性 副 产 物产 生 的 分 子 气 记 解 阻 抑 ， 因 此 是 由 国 壳 酶 调节 系统 间接 控制 的 。 在 这 里 设计 的 直接 质谱 方法 将 有 助 于 研究 活体 内 和 传 外 条 件 下 氢 酶 的 调节 状况 。 1424 “Archives of Micrebicicgy” 125; 67—72 (1980) KREG REDK iy