BIOMEMBRANES SD AR 杨 福 愉 主编 at Pea 和 com Digitized by the Internet Archive in 2011 with funding from Institute of Botany, CAS and Internet Archive http://www.archive.org/details/shengwumoO0yang ee Pins ee | : Am Palme aay a] 主编 简介 国 科 学 院 院 士 , 生 物化 学 家 。 生 于 1927 年 .浙江 镇 海 人 。1950 年 毕业 于 浙江 大 学 化 学 系 。1960 年 获 苏 联 莫 斯 科大 学 生物 系 Ph.D. 学 位 。 历 任 中 国 科 学 院 生 物 物 理 研 究 所 研究 员 、 副 所 长 、 生 物 大 分 子 国家 重点 实验 富 学 术 委员 会 主任 、 北 京 生 物化 寺 子 生物 学 学 会 理事 长 PE i> 与 分 子 生 物 学 学 会 副 理事 KEM SS Re “GeARAB 章 蛋 白 相互 作用 对 章 :. 2% ' ALRitTS eM : aH -ATPR® (AGAR a 提出 : 性 aH -ATES an +m mene tts thet Pt — “i ‘ae . 方面 , 发 a bURS TAL iB eis =e : 研究 联系 3 ~8S 证 tie “5 2M a G 的 观点 公 病 机 Gea a mR. ASS 1 EDAD 8 司 内 外 刊物 发 对 ex £20. MSKKG 科 Sir BARS tH a) fii} 国 科 学 院 院 士 , 生 物化 学 家 。 生 于 1927 年 。 浙 江 镇 海 人 。1950 年 毕业 于 浙江 大 学 化 学 系 。1960 年 获 苏 联 莫斯科 大 学 生物 系 Ph.D. 学 位 。 历任 中 国 科学 院 生物 物理 研究 所 研究 员 、 副 所 长 、 生 物 大 分 子 国家 重点 实验 室 学 术 委员 会 主任 、 北 京 生物 化 学 与 分 子 生物 学 学 会 理事 长 、 中 国生 物化 学 与 分 子 生 物 学 学 会 副 理 事 长 。 长 期 从 事 生 物 膜 研究 , 围绕 膜 脂 一 膜 蛋白 相互 作用 对 线粒体 膜 、 红 细胞 膜 、 人 工 膜 进 行 探索 。 发 现 Mg” 对 线 粒 体 瑞 -ATP 酶 重建 于 脂 质 体 具有 关键 作用 , 提 出 Me” 通过 改变 膜 脂 流动 性 影响 再-ATP 酶 构象 与 活性 模型 , 为 腊 脂 物理 状态 影响 膜 蛋白 的 结构 与 功能 提供 一 个 清晰 的 实例 。 在 微量 元 素 研 究 方面 , 发 现 Se ( 硒 ) 除 通过 谷 胱 甘 肽 过 氧化 物 酶 发 挥 作用 外 , 还 对 人 红 细 胞 膜 骨架 有 直接 稳定 作用 。 注 意 基 础 研究 联系 农 、 医 实践 , 在 大 量 实验 基础 上 提出 “ 克 山 病 是 一 种 心肌 线粒体 病 ” 的 观点 , 发 展 了 克 山 病 发 病 机 制 的 研 究 。 用 “ 匀 浆 互补 法 ”来 预测 谷子 等 农 作物 的 杂种 优势 , 获得 理想 的 结果 。 在 国内 外 刊物 发 表 200 多 篇 论文 , 出 版 专 著 2 部 。 曾 多 次 获 国家 自然 科学 奖 、 中 国 科 学 院 自然 科学 奖 、 科技 进步 奖 、 何 梁 何 利 奖 等 。 HA ye Biomembranes 杨 福 愉 ”主编 植物 所 图 书馆 il sii AM At & & Ka gk = | es A 8 i 介 本 书 从 分 子 到 细胞 水 平 较 系 统 、 全 面 地 介绍 了 当前 生物 膜 研究 的 国内 外 最 新 研究 进展 ,并 展示 了 生物 膜 研究 的 重要 前 沿 领域 及 其 多 学 科 交 叉 研 究 的 特色 。 不 仅 反 映 了 当前 生物 膜 的 研究 动向 , 也 对 国内 研究 情况 作 了 基 本 描述 。 全 书 共 分 7 篇 , 内 容 主 要 包括 与 生物 膜 的 能 量 转换 、 物 质 运 送 和 言 跨 膜 转 导 等 三 大 基本 功能 和 结构 的 相关 内 容 , 同 时 对 研究 生物 膜 的 理 论 、 技 术 、 方 法 及 在 医药 等 方面 的 应 用 也 做 了 介绍 。 本 书 由 40 余 位 从 事 生 物 膜 相关 研究 领域 的 一 线 科技 和 教学 人 员 撰 写 而 成 , 其 中 包括 6 位 中 国 科 学 院 院 士 。 本 书 可 供 从 事 生 命 科 学 研究 、 教 学 的 研究 生 、 科 研 人 员 和 教师 等 参考 。 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 生物 膜 =Biomembranes / 杨 福 愉 主 编 . 一 北京 : 科学 出 版 社 ,2005 ISBN 7-03-015059-7 I. 生 … II. 杨 … 亚 . 生 物 膜 IV. Q73 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2005) 第 029067 号 责任 编辑 : 庞 在 堂 /责任 校对 : 刘 小 梅 责任 印 制 : 钱 玉 芬 /封面 设计 : 王 A meh Be 出 版 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 http:// www.sciencep.com + GASH AT Eh 科学 出 版 社 发 行 各 地 新 华 书店 经 销 * 20054410 月 第 一 版 开本 : 787 x 1092 1/16 2005 4F 10 月 第 一 次 印刷 印张 : 29 1/4 印 数 : 1 一 2500 字数 : 700 000 定价 120.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 , 我 社 负责 调换 〈 科 印 》) CED) Bui 222 = 编 | (Te Tt 副 主编 he 60 UC CAKE 陈 OA 编 委 (以 姓名 汉语 拼音 排序 ) ein OK 2 BAe bx ESE ay 林 死 椿 。” 林 其 谁 ” 刘 树 森 OK BA PY eA RA tA RAK RAE FBR 徐 Fw RAR Meth KER KIER 张 志 鸿 秘 书 HR Foe \ in ZB Zi At ( 按 姓名 汉语 拼音 排序 ) 常 文 瑞 ”中国 科学 院 生物 物 理 研 究 所 ,北京 “100101 陈 Jal 中 国医 学 科学 院 基础 医学 研究 所 , 北 京 100005 Me 8 中国 科学 院 动物 研究 所 , 北 京 100080 BREE ”清华 大 学 生物 科学 与 技术 系 , 北 京 100084 程 和 平 ”北京 大 学 生命 科学 学 院 , 北 京 100871 & x 中国 科学 院 动物 研究 所 , 北 京 100080 段 KR 中 国 科学 院 神 经 科学 研究 所 , 上 海 ”200031 aa 中 国 科 学 院 化 学 研究 所 , 北 京 100080 戎 中国 科学 院 生 物 物理 研究 所 , 北 京 “100101 BAER 中国 科 学 院 生 物 物理 研究 所 , 北京 100101 吉 永 华 上海 大 学 生命 科学 学 院 , 上 海 ”200444 EER 中国 科学 院 植 物 研 究 所 , 北 京 100093 李 峻 柏 中国 科 学 院 化 学 研究 所 , 北 京 ”100080 SRE 。 中国 科 学 院 植物 研究 所 , 北 京 100093 李 淑 刘 ”中国 科学 院 植物 研究 所 , 北 京 100093 EB hm 中 国 科学 院 生 物化 学 与 细胞 生物 学 研究 所 , 上 海 ”200031 林 殉 椿 ”北京 大 学 医学 部 生物 物理 系 , 北 京 100083 林 其 谁 ”中国 科学 院 生 物化 学 与 细胞 生物 学 研究 所 , 上 海 ”200031 刘 树 和 森 中国 科学 院 动 物 研究 所 , 北京 100080 柳 振 峰 中国 科 学 院 生 物 物 理 研究 所 , 北 京 100101 户 智 刚 ”北京 大 学 生命 科学 学 院 , 北 京 100871 RIE ”东北 师范 大 学 生命 科学 学 院 , 长 春 1300 马 小 军 ”中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 生物 技术 ”, 大 连 116023 fay 欧阳 昆 富 欧阳 钟 灿 潘 华 珍 基文 涛 ve FcR GA 孙 大 业 唐 崇 钦 涂 展 春 BLUSE Eves 武 维 华 te Uh 徐 天 乐 许 彩民 许 亦 农 杨 福 从 尹 长 城 Fibs 张 传世 张 但 家 ak 伟 张 志 鸿 ww 郑 艳 华 Hit 中 国 科学 院 生 物 物理 研究 所 , 北 京 100101 北京 大 学 生命 科学 学 院 , 北 京 100871 中 国 科 学 院 理 论 物 理 研究 所 , 北 京 100080 中 国医 学 科学 院 基 础 医学 研究 所 , 北 京 100005 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 , 大 连 116023 中 国 科 学 院 植 物 生 理 生 态 研究 所 , 上 海 200032 清华 大 学 生物 科学 与 技术 系 , 北 京 100084 河北 师范 大 学 分 子 细胞 生物 学 研究 室 , 石 家 庄 = 050016 中 国 科 学 院 植 物 研 究 所 , 北 京 100093 中 国 科 学 院 理 论 物理 研究 所 , 北 京 100080 北京 大 学 生命 科学 学 院 , 北 京 100871 北京 大 学 生命 科学 学 院 , 北 京 100871 中 国 农业 大 学 生物 学 院 , 北 京 100094 中 国 科 学 院 生 物 物理 研究 所 , 北 京 100101 中 国 科 学 院 神 经 科学 研究 所 , 上 海 ”200031 中 国医 学 科学 院 基 础 医学 研究 所 , 北 京 100005 中 国 科 学 院 植 物 研 究 所 , 北京 100093 中 国 科 学 院 生 物 物理 研究 所 , 北 京 100101 北京 大 学 医学 部 生物 物理 系 , 北 京 100083 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物理 研究 所 , 大 连 116023 北京 大 学 生命 科学 学 院 , 北 京 ”100871 中 国 科 学 院 生物 物理 研究 所 , 北 京 100101 中 国 农业 大 学 生物 学 院 , 北 京 100094 复旦 大 学 生命 科学 学 院 , 上 海 ”200433 中 国 科学 院 动 物 研 究 所 , 北 京 100080 中 国 科学 院 动 物 研究 所 , 北 京 100080 细胞 是 生命 的 基本 结构 与 功能 单位 。 任 何 细胞 都 以 一 层 薄膜 将 其 内 售 物 与 环境 分 开 , 这 层 膜 称 为 细胞 膜 或 外 周 膜 。 此 外 , 细 胞 内 还 有 许多 内 膜 系 统 ,, 组 成 具有 各 种 特定 功能 的 亚 细 胞 结构 和 细胞 器 , 例 如 , 细 胞 核 、 线 粒 体 、 内 质 网 、 高 尔 基体 和 溶 酶 体 等 , 在 植 物 细 胞 中 还 有 叶绿体 等 。 细 胞 的 外 周 膜 和 内 膜 系 统统 称 为 生物 膜 。 生物 膜 是 由 脂 类 、 蛋 白质 以 及 糖 等 组 成 的 超 分 子 体 系 , 它 的 厚度 约 为 6~ 10nm。 生 物 膜 具有 重要 功能 , 生物 体内 许多 重要 过 程 〈 如 物质 运送 、 能 量 转换 、 信 息 识 别 与 传递 、 细胞 免疫 和 代谢 调控 ) 以 及 激素 和 药物 作用 、 肿 瘤 等 疾病 的 发 生 等 , 分 析 到 最 后 无 不 与 生物 膜 有 关 。 我 国 科 学 家 王 应 睐 院士 、 邹 承 鲁 院士 、 淘 佩 松 院士 、 括 宏章 院士 、 沈 人 允 钢 院士 、 伍 钦 某 教授 等 在 20 世纪 50 年 代 即 已 开始 生物 膜 研 究 , 在 能 量 转换 膜 〈 线 粒 体 的 氧化 磅 酸 化 , 叶 绿 体 的 光合 磷酸 化 ) 方面 进行 了 持 有 成 效 的 研究 并 获得 了 优异 的 成 有 末 , 引 起 了 国 际 同 行 的 和 注意。 遗憾 的 是 , 十 年 动乱 基本 中 断 了 这 方面 的 研究 。 文 革 以 后 我 国生 物 膜 研 究 才 得 以 复兴 并 得 到 了 比较 全 面 的 发 展 。 从 1981 年 开始 , 在 中 国 科 学 院 的 支持 下 ,中 国 生物 化 学 学 会 、 中 国生 物 物理 学 会 和 中 国 细 胞 生物 学 学 会 联合 召开 了 首届 生物 膜 学 术 讨 论 会 , 以 后 每 3 年 举行 一 次 , 从 未 中 断 。 在 国际 生化 学 会 、 国 际 生 物 物理 学 会 生物 能 学 小 组 和 中 国 科 学 院 的 支持 下 ,1984 年 在 北京 还 组 织 了 一 次 “国际 生物 膜 与 生物 能 学 学 术 讨论 会 "。 这 些 活动 都 对 推动 我 们 生物 膜 研究 起 了 很 好 的 作用 。 经 过 长 期 在 艰苦 条 件 下 的 努力 备 斗 ,我 国生 物 膜 研究 从 无 到 有 、 从 小 到 大 ,无 论 从 广度 到 次 度 都 已 发 生 了 明显 的 变化 。 近 年 来 , 随 着 年 轻 的 生物 膜 学 者 不 断 从 海外 归来 , 我 国生 物 膜 研 究 队 伍 逐 步 扩大 , 实力 明显 增加 。 为 了 进一步 促进 我 国生 物 膜 研 究 的 更 快 、 更 好 地 发 展 ,2003 年 先后 组 织 了 题 为 “21 世纪 我 国生 物 膜 研究 ”的 第 200 次 香山 科学 会 议 (2003-01-13 一 16) 和 第 八 次 全 国 暨 2003 年 海内 外 生物 膜 学 术 研讨 会 (2003-03-25 一 30) 。 先 后 共有 来 自 国内 外 高 等 院 校 、 科 研 院 所 等 35 家 单位 的 ISO 余 位 专家 、 学 者 参加 了 会 议 , 两 个 会 议 都 取得 了 很 大 的 成 功 , 这 是 我 国生 物 膜 研 究 发 展 过程 中 的 重大 事件 。 在 这 两 个 学 术 会 议 基础 上 , 为 了 推 波 助 调 , 我 们 组 织 编 写 并 出 版 《生物 膜 》 这 本 综合 性 的 著作 。 参 与 撰写 的 40 余 位 作者 基 本 上 是 出 席 上 述 两 个 会 议 并 作 过 发 言 的 专家 , 也 是 国内 生物 膜 研究 领域 中 具有 代表 性 的 人 物 。 这 既 反映 了 老 、 中 、 青 三 代 科 学 家 的 结合 , 也 呈现 多 学 科 交 叉 的 特色 。 他 们 大 多 仍 活跃 在 科研 、 教 学 第 一 线 , 在 任务 十 分 繁重 的 情况 下 仍 能 抽出 宝贵 时 间 为 本 书 的 完成 作出 奉献 , 是 非常 难能可贵 的 。 本 书 共 分 7 篇, 分 别 为 生物 膜 的 结构 、 生 物 膜 与 能 量 转换 、 生 物 “ 与 物质 运送 、 生 物 膜 与 信号 跨 膜 转 导 、 生 物 膜 与 细胞 调 计 、 生物 膜 与 医 光 为 关系 、 研 ” 上 物 膜 的 理论 、 技 术 、 方 法 与 仿生 物 膜 , 共 34 章 , 这 些 内 容 基 本 上 覆盖 了 [期 生物 肤 , 究 的 前 沿 、 热 点 和 a} 生物 膜 Biomembranes : 进展 。 每 一 章 既 反映 了 生物 膜 某 一 分 支 的 国际 最 新 动态 , 又 结合 作者 自身 科研 积累 作 一 定 的 叙述 。 各 章 的 摆 写 不 拘 一 格 , 特 色 鲜 明 。 在 本 书 编写 过 程 中 , 中 国 科学 院 生 物 物 理 研究 所 常 文 瑞 研究 小 组 与 中 国 科 学 院 植物 研究 所 匡 廷 云 院士 协作 将 菠菜 主要 捕 光 复合 物 (LHC-I) 进行 三 维 结晶 获得 成 功 , 经 又 射线 衍射 分 析 得 到 分 辩 率 为 2.72A 的 结果 ,该 成 果 已 于 2004 年 3 月 在 Nature 发 表 。 这 标志 着 我 国 原 子 分 辩 率 解析 膜 蛋白 三 维 结构 首次 获 得 突破 , 无 论 对 结构 生物 学 还 是 对 生物 膜 和 光合 作用 研究 都 具有 很 重要 的 意义 。 为 此 我 们 请 常 文 瑞 研究 员 、 柳 振 峰 博士 撰写 了 第 2 章 “ 膜 蛋白 三 维 结晶 ”。 我 们 希望 《生物 膜 》 一 书 对 于 从 事 生 物 膜 及 与 之 相关 领域 的 科研 与 教学 工作 者 都 会 有 一 定 的 参考 价值 。 在 本 书 编辑 出 版 过 程 中 , 得 到 了 国家 自然 科学 基金 委 、 科 学 出 版 社 及 中 国 科学 院 生 物 物 理 研 究 所 生物 大 分 子 国家 重点 实验 室 、 北 京 大 学 、 清 华 大 学 、 中 国 科 学 院 动物 研究 所 联合 主持 的 生物 膜 与 膜 工程 国家 重点 实验 室 等 单位 的 大 力 支持 , 谨 在 此 表示 深切 的 谢 i=] 40 邹 承 鲁 院士 专门 为 本 书 题写 书 名 , 我 们 对 此 也 表示 囊 心 的 感谢 与 敬意 。 生物 膜 的 研究 范围 很 广 , 发 展 也 很 迅速 ,研究 成 末日 新 月 异 , 因 此 在 本 书 中 可 能 会 有 不 少 从 妥 、 不 足 甚至 错误 之 处 , 敬 请 广大 读者 予以 批评 指正 。 AGE Al) 吾 第 1 篇 “生物 膜 的 结构 下 丰年 肠 及 敌 梅 研究 的 二 些 进展 1 生生 生生 全 an 岂 oo 和 no 本 3 1 9 外 18 和 19 SMe cna ceca Sev ancns ty Seatare Seep sense sansa ea BM el NS ie ce tere, des wa cht ps K* fei ct KG, hi Nav 则 不 能 通过 的 简 ERED K 通道 具有 通 透 选择 性 的 关键 结构 化 示意 图 ( 引 自 http:/www.Nobel.Se) 部 分 (分 辨 率 2.0A)( 引 自 Zhou et al. 2001) 财 状态 的 KcsA 进行 比较 , 从 而 提供 了 开通 道门 控 机 制 的 结构 基础 。 MacKinnon 实验 室 除 研究 开通 道外 , AA Bll Mit SERF AL «( Salmonella typhimurium) Fk CE. coli) 中 分 离 a er , 并 进行 三 维 结 构 分 析 (Dutzler et al. 2002)。C1 -通道 在 膜 上 以 双 聚 ae res ee nt), “ESRB a] (Ee 为 通道 使 C1 得 以 通过 。 总 之 , MacKinnon 实 验 室 从 1998 年 以 来 连续 对 离子 通道 的 三 维 结构 研究 作出 了 一 系 NIZE tH ee, RA 7 解 离子 通道 的 功能 提供 了 重要 结构 基础 , 他 的 成 末 也 为 从 分 子 水 平 认识 许多 神经 、 肌 肉 和 心脏 疾病 商定 了 坚实 基础 , 并 为 有 关 药 物 的 设计 与 开发 开辟 了 新 的 可 能 性 。 瑞典 诺 贝尔 奖 委 员 会 为 此 将 2003 年 度 诺 贝尔 化 学 奖 授 予 MacKinnon 与 在 水 通道 研究 有 原始 性 创新 的 美国 Agre 博士 。 SEE 对 于 细胞 来 说 ,水 是 维持 正常 的 生理 功能 不 可 缺少 的 组 分 。 在 销 化 、 呼 吸 、 排 泄 以 及 毒物 清除 等 许多 生理 活动 中 都 需要 水 的 跨 膜 运 送 。 早 在 100 多 年 前 人 们 就 猜测 除了 简 单 的 扩散 以 外 , 细胞 中 可 能 存在 转运 水 分 子 的 特异 通道 。 一 直到 20 世 纪 80 年 代 美国 Agre 及 其 同事 在 纯化 红细胞 Rh 血型 抗原 时 , 意外 发 现 一 种 分 子 质 量 为 28kDa 的 膜 蛋 白 , 命名 为 CHIP28(channel-forming integral protein 28kDa)。 经 过 一 段 时 间 ,Asgre 逐渐 意识 到 CHIP28 可 能 就 是 人 们 一 直 在 寻找 的 水 通道 (water channel), , 于 是 他 通过 该 重 白 的 基因 在 非洲 爪 蟾 卵 表 达 的 实验 证 实 了 他 的 推断 , 使 原来 水 不 能 进入 的 这 种 细胞 也 具有 摄取 水 的 功能 , 结果 细胞 会 膨胀 甚至 破裂 。 后 来 他 们 又 将 纯化 的 CHIP28 重 组 到 脂 质 体 〈 一 种 球 形 人 工 膜 ) 从 而 使 水 可 自由 出 入 , 他 们 称 CHIP28 为 水 通道 蛋白 -1 (aquaporin-1)(Agre et al. 1998), 2000 年 Agre 与 日 本 科学 家 Murata 等 合作 用 电子 晶体 学 方法 获得 分 辨 率 为 3.8A 的 第 一 张 Ar in-l 的 三 维 结构 图 像 (Murata et al. 2000)。 显 示 它 在 细胞 膜 上 以 四 聚 体形 式 存 在, 每 一 单 体 都 能 单独 行 ese el 1-7). 图 1-8 还 显示 水 分 子 通过 水 7 18 A: bye ZS RM EAI LEH ee 水 通道 在 细胞 膜 上 以 四 聚 体形 式 存 水 分 子 通过 水 通道 的 示意 图 在 ( 引 自 Murata et al. 2000) (51 http://www.Nobel.Se) 孔 蛋 白 的 结构 基础 , 窗 小 的 通道 水 分 子 只 能 排 成 单行 移动 。 由 于 通道 内 壁 原 子 形成 电场 , 只 能 允许 水 分 子 通过 而 质子 或 HOT- 因 带 有 电 符 就 难以 通过 。 后 来 , 中 国学 者 任 星 (Ren G) 和 隋 海 心 (Sui H) 也 于 2001 年 分 别 发 表 aquaporin-1 的 高 分 辨 率 (3.7A 和 2.2A) 的 三 维 精细 结构 , 前 者 也 是 通过 电子 品 体 学 方法 来 完成 的 (Ren et al. 2001), 后 者 则 是 获得 牛 红细胞 aquaporin-1 的 三 维 唱 体 后 用 和 衍射 方法 来 进行 解析 的 (Sui et al. 2001), AZ, aquaporin-1 高 分 辩 率 三 维 结构 的 解析 成 功 , 使 水 通道 对 水 分 子 的 高 效 通 透 性 、 高 度 选 择 性 从 原子 水 平 上 得 到 了 解释 。 当今 水 通道 的 研究 已 经 发 展 成 为 一 个 重要 的 领域 。 水 通道 蛋白 分 布 很 广泛 ,, 它 存 在 于 动物 、 植 物 和 微生物 中 。 就 人 体 而 言 , 迄今 已 找到 11 种 不 同 亚 型 (AQP0~ AQP10)。 水 通道 在 细胞 中 发 挥 重 要 的 作用 , 例如 , 至 少 有 7 种 水 通道 蛋白 在 骨 脏 的 不 同 部 位 表达 , 其 中 4 种 水 通道 (AQP1~AQP4) 在 成 尿 过 程 中 起 主要 作用 。 人 体 24h 大 约 有 170L 原 尿 产 He, 其 中 80% 一 90% 的 水 分 经 过 水 通道 被 人 体 再 吸收 , 最 后 大 约 每 天 只 有 1L 左 右 尿 液 被 排出 体外 。 除 对 旨 脏 浓缩 尿 机 制 外 , 水 通道 高 分 辨 三 维 结构 的 成 功 解析 无 疑 对 消化 吸收 、 皮肤 功能 、 眼 压 调节 、 脑 水 肿 形 成 、 视 觉 和 听觉 等 的 作用 机 理 的 阐明 都 有 重要 作用 。 此 外 , 作为 药物 作用 的 靶 标 , 水 通道 蛋白 的 结构 与 功能 研究 的 深入 将 有 力促 进 新 型 利尿 剂 、 治疗 脑 水 肿 等 药物 的 研发 。 鉴于 Agre 在 水 通道 研究 方面 的 原始 性 创新 , ft MacKinnon 分享 了 2003 年 诺 贝尔 化 113 Ca 系 (Ca -ATIF Ait) YEA) _ guerra 位 于 肌 浆 网 膜 上 的 Ca*-ATP 酶 (SR Ca?*-ATP Hi) 对 维持 胞 内 Ca 的 稳 态 平衡 具有 重要 作用 。 当 Ca’ 从 肌 浆 网 内 腔 释 放 时 肌肉 即 进行 收缩 , 随 后 SR Ca-ATP 酶 迅速 将 胞 浆 内 过 多 的 Ca 运 入 肌 浆 网 内 腔 加 以 储存 , 肌 肉 细胞 即 恢复 松弛 静止 状态 。 虽然 对 SR Ca”-ATP 酶 在 生化 和 分 子 生 物 学 方面 做 了 大 量 工作 , 它 的 三 维 结构 的 解析 在 很 长 一 段 时 间 内 疫 有 明显 进展 , 这 主要 由 于 SR Ca?’-ATP A) En AS ANBAR Zhang 等 (1998) 将 SR Ca’*-ATP 酶 二 维 晶体 经 电镜 衍射 再 六 行 三 维 重 ”天 得 分 辩 率 8A 的 结果 。2000 年 日 本 Toyoshima 小 组 成 功 地 获得 与 Ca 结 - -的 SR Ca .TIP 酶 的 三 维 唱 体 , HE ®y WR Biomembranes 8 经 X 射 线 衍射 获得 2.6A 分 辨 率 的 结果 (Toyoshima et al. 2000), JA 1-9A 可 以 看 到 原子 水 平 的 SR Ca”-ATP 酶 的 跨 膜 分 布 图 , 该 酶 主要 由 跨 膜 区 〈 含 10 跨 膜 w% 螺 旋 片 段 } 和 细 胞 质 微 区 组 成 , 后 者 又 分 A (actuator 调 节 ) 、N( 核 苷 酸 结合 ) 以 及 P【〈 磷 酸化 ) 三 个 微 区 。 SR Ca -ATP 酶 跨 膜 运 送 Ca 是 一 个 耗 能 (ZAR ATP) 的 主动 过 程 , 已 知 ATP 结 合 位 点 在 N 微 区 , 而 磷酸 化 位 点 却 是 P 微 区 的 351 位 天 冬 氨 酸 残 基 ,Ca2 的 结合 位 点 则 在 跨 膜 区 〈 见 图 内 两 个 浅 蓝 色 的 圆圈 )。 在 N 微 区 结合 的 ATP 怎么 能 使 P 微 区 的 351 位 天 冬 甩 酸 进行 磷酸 化 ?与 此 同时 , 结合 的 Ca 又 是 如 何 从 膜 区 结合 位 点 因 亲 和 力 的 改变 而 释放 至 肌 浆 网 内 腔 的 ? 看 来 ,这些 步 骤 的 依次 进行 必须 有 赖 于 分 子 的 构象 变化 。 因 此 ,Ca2-ATP 酶 对 Ca 的 运送 显然 有 别 于 通道 的 运送 机 制 , 后 者 在 运送 过 程 中 未 曾 发 现 有 构象 变化 的 现象 。 对 于 SR Ca”-ATP 酶 作用 的 分 子 机 制 的 研究 在 生化 方面 已 经 有 很 多 积累 , 它 的 运 送 可 分 几 个 步骤 , 如 图 1-9C 所 示 。2000 年 Toyoshima 小 组 所 解析 的 SR Ca**-ATP fig A Xb FE, : Ca* IRA, 2002 年 又 将 SR Ca?*-ATP eA E,- TG (Thapsigargin, 酶 的 抑制 剂 ) 状 态 的 三 维 结构 解析 获得 成 功 (图 1-9B) (Toyoshima et al. 2003) , 这 样 通过 两 者 比较 就 可 以 了 解 SR Ca?*-ATP 酶 有 无 C 驻 结合 状态 之 间 结 构 的 差异 。 将 图 1-9A 与 图 1-9B 加 以 比 较 , 可 以 看 出 两 者 无 论 在 细胞 质 区 还 是 膜 区 , 在 构象 上 都 有 明显 的 差别 。 目 前 Toyoshima 实验 室 已 经 将 Ca2#-ATP 酶 运送 Ca 过 程 中 其 他 中 间 物 获得 结晶 ,结构 分 析 正 在 进行 , 这 将 会 使 Ca*-ATP 酶 运送 Ca 的 分 子 机 制 得 到 进一步 阐明 。 Ca?*-ATP fig E, - Ca®* 45 E, - TG 三 维 结构 的 比较 ( 引 自 Toyoshima et al. 2003) A. 浅 蓝 色 0O 表 示 Ca SEAL. ALC MPAA E, : Ca 向 E; TG 转变 时 细胞 质 微 区 N、P 和 和 A 的 变动 方向 ,B. 箭 头 表示 Ca 进入 结合 位 点 的 可 能 途径 ,C. 表示 Ca?-ATP 酶 在 催化 Ca 运送 时 的 化 学 反应 步骤 11.4 大 肠 杆 东 MsbA (1 —°{ 2; $) mms 根据 世界 卫生 组 织 的 统计 ,全 世界 各 种 感染 疾病 约 有 60% 与 多 药 耐 受 性 的 细菌 有 关 , 每 年 大 量 癌症 患者 的 不 治 身亡 也 与 肿瘤 细胞 的 多 药 耐 受 性 有 联系 。 SRS Hitz 性 的 原因 之 一 在 于 细胞 质 膜 存在 着 一 种 内 在 膜 蛋白 一 一 ABC 转运 体 , 因此 研究 解析 它 的 疆 构 对 于 寻找 、 开 发 新 药 显然 是 很 重要 的 。 美 国 Chang 与 Roth 成 功 地 从 大 肠 杆菌 中 分 言 , 纯 化 一 种 且 有 多 药 耐 受 性 ABC 转运 体 (ATP-binding cassette transporter) 的 同 Ally Msb, (Chang et al. 2001)。 他 们 成 功 地 获得 MsbA 的 三 维 晶体 并 用 X 射线 衍射 得 到 4.5A 分 , 吉 的 解析 结果 。 这 种 ABC 转运 体 以 二 聚 体形 式 存在 , 每 一 单 体 的 分 子 质量 为 129.2ki 虽然 分 辩 率 还 不 太 高 , 对 于 其 结构 细节 还 有 人 进一步 研究 , 但 毕竟 这 是 9 g lz A: Aye Z= fa FE AI LGA 一 个 难度 很 高 的 研究 成 果 。 从 作者 的 报道 及 评论 者 的 介绍 来 看 ,在 研究 过 程 中 他 们 选用 了 20 种 细菌 , 比 较 了 20 种 不 同 的 去 污 剂 将 其 所 含 的 ABC 转运 体 进 行 分 离 、 纯 化 。 试 用 了 96 000 种 结晶 条 件 , 从 中 获得 了 35 种 结晶 样品 , 经 过 筛选 才 得 到 最 后 较 理 想 结 采 , 由 此 可 见 工作 的 艰难 。 1.1.5 我国 夺 宛 基 状 “RS 总 之 , 内 在 膜 蛋白 三 维 结构 的 解析 虽然 取得 不 少 可 喜 的 成 绩 , 但 总 的 来 讲 仍 未 取得 罕 破 性 进展 , 任 重 而 道 远 。 虽 然 探索 性 很 强 、 难 度 大 、 周 期 长 , 但 鉴于 它 的 重要 性 , 世 界 各 国 仍 给 予 很 大 的 关注 , 从 最 近 几 年 发 展 的 情况 来 看 , 与 德国 、 英 国 相 比较 , 美 国 和 日 本 有 后 来 居 上 的 趋势 。 我 国 对 生物 膜 三 维 结构 的 解析 研究 也 已 艰难 地 开始 起 步 。 清华 大 学 隋 森 芳 等 对 黄瓜 LHC-I 的 二 维 晶 体 用 电镜 进行 初步 分 析 (Liu et al. 1997) , 中 国 科 学 院 生物 物理 研究 所 张 坦 家 等 对 黄瓜 LHC-I 复 合 物 (分 子 质量 为 27kDa) 三 维 结构 的 电子 晶体 学 进行 初步 研 究 , 发 现 是 由 6 个 单 体 组 成 的 六 圆 环 (Zhang et al. 2000)。 张 坦 家 等 还 对 部 分 纯化 的 猪 心 线粒体 -ATP 酶 的 F。 部 分 进行 二 维 结晶 , 并 开展 了 电子 晶体 学 的 初步 研究 (Zhang et al 2001)。 特 别 值得 一 提 的 是 中 国 科学 院 生 物 物理 研究 所 常 文 瑞 研究 小 组 与 植物 研究 所 匡 迁 云 院士 合作 将 菠 莱 主要 捕 光 复合 物 (LHC-II) 进行 三 维 结晶 获得 成 功 , 经 X 射 线 衍射 分 析 获 得 分 辩 率 为 2.72A 的 结晶 , 该 成 果 已 于 2004 年 3 月 在 Nature 发 表 (Liu et al. 2004), 与 1994 年 发 表 的 殉 豆 LHC-I 的 电子 晶体 学 研究 结果 (分 辩 率 为 3.4A) 相 比 较 , 该 结构 显示 每 个 LHC-II 单 体 中 14 个 叶绿素 分 子 有 8 个 为 叶绿素 a,6 个 为 叶绿素 b, 复合 物 中 每 个 色素 的 位 置 已 被 准确 绘制 成 图 。 这 标志 着 我 国 原子 分 辩 率 解析 膜 蛋白 三 维 结构 首次 获 得 成 功 ,这 一 成 果 无 论 对 光合 作用 还 是 对 生物 膜 和 结构 生物 学 研究 都 具有 很 重要 的 意义 。 柳 振 峰 、 常 文 瑞 在 第 2 章 将 有 专文 叙述 , 希 望 我 国 膜 蛋白 三 维 结构 分 析 研 究 将 有 -一个 很 好 的 发 展 势头 。 1.2 TBR E565 009 6 97 12.151 5 | 生物 膜 膜 脂 主 要 分 三 类 : 甘油 磷脂 (glycerophospholipid)、( 神 经 ) #4/§(sphingolipid) 和 胆固醇 (cholesterol)。 甘油 酯 占 膜 脂 大 多 数 , 对 它们 的 研究 比较 多 。 甘 油 酯 由 亲 水 和 玻 水 两 部 分 组 成 是 O | O GC 了 一 O 一 C 一 Ri lite R,—C—O—C—H CH, — OH cH 4o= x 甘油 Hib oe X =— PO, — C!4,CH,N(CH;) 后 酰 胆 碱 = 一 PO, 一 “HICHNH at CAF he Pe] 1-10 RSet eit 由 甘油 衍生 而 来 , 如 磷脂 酰 胆 碱 、 磷 脂 酰 乙 醇 胺 等 (11-10), 过 去 认为 这 些 分 子 对 生物 膜 起 着 支撑 作用 , 是 生物 膜 的 骨架 。 但 是 , 剑 来 愈 多 的 研究 结果 表明 , 它 们 在 信号 传导 过 程 中 还 有 重要 作用 , 如 磷脂 酰 肌 醇 (PI) 的 衍生 物 一 PIP、PIP:;、IP;:、 甘 铀 二 酯 (diglyceride, DG) 、 磷 脂 酸 (phosphatidic aclid,PA) 、 溶 血 磷脂 酸 (lysophosphatidic acid) 等 都 是 信号 分 子 。 膜 脂 中 还 有 一 类 称 为 〈 神 经 ) 荆 脂 , 它 们 的 含量 低 于 甘油 酯 。 鞘 脂 与 甘油 酯 在 结构 上 的 相似 之 处 在 于 均 含 一 个 极 性 基 团 和 二 个 踊 水 尾部 , 但 鞘 脂 中 以 鞘 乞 醇 (sphingosine ) FER SAHA AD Hv (图 1-11)。 鞘 脂 基本 是 鞘 甩 醇 和 一 分 子 售 长 烃 链 的 脂肪 酸 以 氨基 键 形成 酰胺 (图 1-11), 最 简单 的 鞘 脂 为 神经 酰胺 (ceramide) 。 如 果 以 磷酸 胆 碱 取代 互 即 为 鞘 磷脂 (sphingomyelin), 它 与 甘油 酯 的 磷脂 酰 胆 碱 很 相似 ,如 有 果 以 葡萄 糖 或 乳糖 残 基 取代 神经 酰胺 中 的 互 即 为 脑 苷 〈cerebroside), MLA SE ASAI FE BE 5 HE HY FR GH pt Hh A AY 即 为 神经 节 苷 脂 ,, 40GM,, GM,, GM; 等 (图 1-12)。 CH=CH —(CH)2)i2 — CH . CH=CH —(CH,),.— CH; CH 一 OH CH 一 OH aa reir CH, — OH cHo—x ° #4 3A8% (sphingosine) #4 fs (sphingolipid) a 神经 酰胺 X =— PO; — CH, — CH, — N(CH); tela X = AEM ELBE oa X = 复合 寡 糖 神经 节 苷 脂 BpBe Hae Fels 长 期 以 来 对 鞘 脂 的 研究 比较 少 , 认 为 它们 属于 不 具有 生物 活性 的 物质 。 但 近年 来 的 研究 表明 , 这 一 概念 是 不 确切 的 。 实 际 上 ,神经 酰胺 、 靖 甩 醇 -1- 磷酸 都 是 信号 分 子 , 而 且 冰 脂 还 参与 了 细胞 的 很 多 重要 过 程 , 如 信号 转 导 、 膜 的 运输 (membrane traffickling)、 离子 通道 的 调节 、 膜 的 粘连 (membrane adhesion) 等 。 杨 福 愉 等 发 现 神经 节 苷 脂 GM3; 和 GM, 对 肌 浆 网 膜 Ca?*-ATP fig (SR Ca”…-ATP 酶 ) 的 构象 和 活性 有 调节 作用 , 前 者 对 酶 活 有 激活 作用 , 后 者 则 有 抑制 效应 (Wang et al. 1996, Wang et al. 1999)。 以 色 列 Futerman 实 验 室 报道 ,神经 节 苷 脂 GM: 对 小 鼠 脑 的 内 质 网 Ca”-ATP 酶 有 抑制 作用 (Pelled et al. 2003 ) 。 最 近 杨 福 愉 等 又 对 神经 节 苷 脂 影响 猪 脑 质 膜 Ca”-ATP 酶 (PMCA) 的 活性 与 构象 作 了 系 统 研 究 。 结 果 表 明 , GD (disialoganglioside-GDu 较 GM 多 了 一 个 唾液 酸 残 基 ) 对 PMCA 有 明显 的 激活 作用 , 而 GM、GM2、GM3 却 有 不 同 程度 的 抑制 作用 (Zhao et al. 2004)。 很 多 报 次 还 表明 , 蒜 脂 与 细胞 的 生长 、 分 化 、 衰 老 、 调 亡 以 及 应 激 反应 等 都 有 密切 关系 , 也 Bite hom. tH RT PER (GEER. WA RE) 的 发 生 有 关联 。 当 前 SHA REAR ERA MER ARM AAA BRAY DAM, HAST, AKT 经 酰胺 的 / 完 论 文 已 超过 5000 篇 。 11 g 了 音 AE BES PINE I LEH Fe GM, GM, GM, N-Acetyl- D-Galactose D-Galactosamine D-Galactose D-Glucose CH,OH CH,OH CH,OH CH,OH HO O O H H OH “Hi H OH H H H H OH H OH H OH | | a NH 7 | O=C eS | (CH,), - ) CH, CH, N-Acetylneuraminidate fie AG WS Hy 3a AE 唾液 酸 (sialic acid) (stearic acid) (sphingosine) STF GM,, GML, GM; 的 结构 式 此 外 , 尤其 特别 引 人 注 意 的 是 鞘 磷脂 和 胆固醇 是 生物 膜 一 种 微 区 结构 , BN PK (lipid rafts) FLARE (caveolae) 的 主要 组 分 , 下 面 扼要 介绍 对 它们 的 研究 概况 。 122 JUN (72 01/17 1. EM WHS RE OE FLA RD, EMAAR, 是 生物 膜 的 一 种 微 区 ,内 含 膜 脂 以 攻 脂 和 胆固醇 为 主 , 而 微 吾 素 (caveolin) 则 为 其 标志 蛋白 。 脂 谷 是 生物 膜 的 一 种 微 区 , 内 含 一 定量 的 蛋白 质 与 脂 , 后 者 也 以 鞘 脂 和 胆固醇 为 主 , 但 与 质 膜 微 圳 不 同 , 一 般 不 一 定 有 特征 的 外 貌 结构 。 2, 研 究 历史 和 生物 化 学 、 生 物 物理 特征 质 膜 微 喜 是 20 世 纪 50 年 代 日 本 科学 家 Yamada 在 美国 华盛顿 大 学 用 电镜 观察 上 皮 细 胞 时 发 现 并 命名 的 (Yamada 1955) 。 质 膜 微 圳 按 和 希腊 字 原 意 即 为 小 孔 的 意思 。 质 膜 微 圳 主要 分 布 于 上 皮 细 胞 、 内 皮 细胞 、 肌 肉 细 胞 (包括 心肌 和 骨骼 肌 )、 脂 肪 细胞 (图 1-13) 等 。 后 来 美国 西南 医学 中 心 Anderson 等 对 质 膜 微 圳 作 了 系统 研究 , 但 在 一 个 较 长 时 间 内 对 质 膜 微 圳 是 否 是 一 种 假象 (artifact) 曾 有 很 多 争论 。20 世纪 90 年 代 从 后 膜 微 喜 分离 得 到 一 种 微 喜 素 , 其 分 子 质量 为 23kDa。 在 离 体 条 件 下 , 它 能 使 脂 质 微 CARRIES DSi 的 质 膜 微 圳 结构 , 于 是 这 一 持久 的 争论 才 得 以 澄清 并 有 疙 促进 质 膜 ” :的 研究 (Parton 2003 ) 。 A ll a em 。 Cs TOL. oe, ee 2 . i , - ( ST 3 了 ce 们 NSS yore: av As SS - mat Se * of * er ie os ro e LO oon) OR SA eg Ph lig es i el 条。 me 7 > — 村 \ ey Gray 1 # Ne A. HB PAY eae ie (caveolae) ( 引 自 Anderson 1998) ; B. Hage PF BY LA A Ae Ze en 7 IH ee E (51 A Marx 2001) HSEAE 1997 年 美国 Simon 提出 的 (Simons et al. 1997) 。 它 们 在 绝 大 多 数 口 哺乳 动 物 细胞 质 膜 和 部 分 内 膜 系统 [如 高 尔 基体 、 胞 内 体 (endosome) 等 ] 都 有 分 布 。 脂 徐 是 不 含 微 圳 素 的 一 种 脂 质 微 区 , 一 般 大 小 为 230~300nm, 不 像 质 膜 微 吉 那 样 具有 可 被 电镜 观察 到 的 形态 结构 。 与 质 膜 微 吉 相 似 , 所 含 脂 类 以 鞘 脂 和 胆固醇 为 主 , 前 者 包括 鞘 磷脂 (sphingomyelin) #84 ##Hia (glycosphingolipid), , 如 神经 市 苷 脂 GM、GM、GM3。 这 三 者 区 别 在 于 分 子 内 所 含 的 春 聚 糖 残 基 有 差异 (图 1-12)。 从 生化 特征 来 考虑 , Aa Pe ihe 微 圳 都 是 生物 膜 在 低温 (4C ) 条 件 下 不 被 非 离子 去 污 剂 溶解 的 部 分 , 又 称 去 污 剂 不 溶 的 富 含 糖 脂 区 (detergent-insoluble glycolipid-riched domain; detergent-resistant fraction), A ES 28 BEBE BE AD 7 ETT DI, KHER aE ARE. AAA ae 相 (liquid-disordered phase) 和 凝 胶 相 〈gel phase), rin Hise ae Jat Hee GFE HH TE BE A 脂 与 胆固醇 而 呈现 介 于 液晶 相 与 凝 胶 相 之 加 的 Lo FAM PRR AS AFAR (liquid-ordered phase), 换言之 , 这 些 脂 质 微 区 的 脂 质 分 子 既 呈现 液态 相 , 但 又 是 有 序 的 , 1 EA 分 子 本 身 结 构 以 及 与 胆固醇 相互 作用 的 结果 。 生 物 膜 不 是 均一 的 , 它 们 存在 着 微 区 结构 是 早已 知晓 的 。 但 与 乙 相 比 , 无 论 脂 徐 还 是 质 膜 微 吉 的 脂 质 微 区 都 要 小 得 多 。 因 此 可 以 将 生物 膜 视 为 很 多 脂 质 微 区 组 成 的 体系 , 以 Lo 相 为 特征 的 脂 质 微 区 四 周 被 流动 的 、 液 态 无 序 相 的 脂 质 分 子 包围 , 犹 如 很 多 小 侠 漂浮 在 流动 的 脂 质 海 详 中 。 脂 和 侠 的 命名 也 是 由 此 而 来 。 旨 徐 与 质 膜 微 吉 既 有 很 多 共同 点 也 存在 着 一 定 的 差异 。 鉴于 前 者 分 布 较 广 , 含义 也 更 广泛 一 些 , 因 此 一 般 认 为 质 膜 微 圳 可 视 为 脂 徐 的 一 种 (Zajchowski et al. 2002)。 3, 脂 第 和 质 膜 微 圳 的 功能 :年 来 的 研究 积累 表明 , 脂 徐 和 质 膜 微 吉 除 脂 质 分 子 外 还 存在 较 多 的 和 蛋白质 。 它 们 BA uN, WEB: 信号 转 导 、 膜 的 运送 〈 包 括 内 吞 和 外 排 )、 胆 固 醇 的 运送 、 维 持 Har Ca’ ,) 稳 态 平衡 、 蛋 白质 分 选 (protein sorting) 等 。 下 面 将 侧重 讨论 信号 转 导 和 有 的 运送 两 ”功能 。 13 1 A PES FN EA LOHR (1) 信号 转 导 ERRMSG AK RIES OT, KEN So ROR. se RH, 磷脂 酰 肌 醇 类 (phosphoinositides), “Ait Hit (diacylglycerol) 等 ] 和 很 多 与 信号 转 导 有 FAYE A (BE 1-2, 仅 列举 一 部 分 , 并 不 齐全 ) (Simons et al. 2000) 。 因 此 一 般 认 为 脂 徐 或 质 膜 微 圳 是 信号 转 导 的 中 心 , 至 少 是 在 信号 转 导 中 起 着 十 分 重要 作用 的 结构 单位 。 根据 推测 , 它 们 在 信和 号 转 导 中 可 能 具有 如 下 的 作用 : @ 集 中 较 多 的 信号 分 子 为 它们 有 效 地 进行 信号 转 导 提供 平台 ,@ 如 果 存 在 一 种 以 上 的 信号 转 导 途径 , 脂 合 或 质 膜 微 吉 无 疑 会 有 利 它 们 之 闻 的 “ 串 话 (cross talk)”,@@ 信 号 分 子 在 一 定 条 件 下 可 以 进入 或 锡 出 脂 和合 或 质 膜 微 吉 , 这 可 能 是 调节 信号 转 导 的 一 种 方式 。 #4@EHE (sphingomyelin) 神经 酰胺 (ceramide) 磷脂 酰 肌 醇 类 (phosphoinositides ) 二 酰 甘油 (diacylglycerol ) 表皮 生长 因子 (EGF) 受 体 血小板 生长 因子 (PDGF) 受 体 栈 气 酸 激酶 受 体 Bradykinin B2 受 体 工 细胞 受 体 (TCR) B 细胞 受 体 (BCR) B 整 合 素 (B integrins) GPI( 糖 基础 脂 酰 肌 醇 ,glycosylphosphatidylinositol )- 锚 蛋 和 白 CD59 尿 激 酶 型 血 纤 维 蛋白 溶 酶 原 激活 剂 受 体 (urokinase-type plasminogen activator receptor, uPAR) Ephrin AS 信号 效应 分 子 G&A, Gai), Gai, Gai, Src- 家 族 激酶 Ras 蛋白 激酶 Co (PKCo) 腺 苷 酸 激酶 一 氧化 氮 合 酶 (eNOS) Wie ais Cy ( PLCy) 但 是 , 目 前 需要 进一步 阐明 的 问题 还 很 多 , 例 如 , 根 据 前 述 , 脂 徐 或 质 膜 微 圳 的 膜 脂 呈 现 Lo 相 即 液态 有 序 相 , 信 和 号 分 子 在 这 样 物理 环境 中 对 它们 的 功能 发 挥 , 如 信和 号 转 导 是 否 比较 合适 ? 此 外 , 在 生理 条 件 下 , 生物 膜 内 的 脂 张 或 质 膜 微 吉 所 含 的 脂 质 和 蛋白 质 组 分 可 能 不 尽 相 同 , 换 言 乙 , 各 种 脂 徐 或 质 膜 微 吉 所 进行 的 信号 转 导 途径 可 能 是 有 特异 性 AY, 目前 对 此 还 很 难 进 行 测 试 与 鉴别 。 如 果 这 种 特异 性 的 确 存 在 , 那么 决定 这 种 特异 性 的 机 理 又 是 什么 ? 这 显然 牵涉 各 种 脂 质 尤其 是 蛋白 质 分 选 问题 。 (2) 膜 的 运送 (membrane traffickling ) 早 有 报道 , 在 细 戎 毒素 或 病毒 一 Simian Virus 40(Sv40) 通 过 庆生 入 细胞 过 程 中 , 质 膜 微 吉 发 挥 一 定 的 作用 (Parton 2003)。 这 种 内 吞 与 党 形 CARA ETT AN ei 2 -本 H 5 WR Biomembranes 14 送 并 不 相同 , 很 可 能 两 者 是 属于 两 种 不 同 的 运送 路 线 。 大 量 实验 结 末 显示 , 不 论 物 质 通 过 细胞 膜 的 内 吞 , 还 是 从 胞 内 外 排 或 分 泌 过 程 大 多 是 以 宫 泡 (vesicle) 形式 来 运送 的 。 进 一 步 的 研究 表明 , 这 些 圳 泡 富 含 脂 合 结构 (Ikonen 2001)。 图 1-14 显示 , 在 运送 圳 泡 的 形 成 (包括 一 定 的 蛋白 质 分 选 进入 圳 泡 )、 吉 泡 与 细胞 骨架 的 相互 作用 以 及 圳 泡 抵 达 细 胞 质 膜 时 的 识别 、 销 定 (docking) 和 融合 (fusion) 等 步骤 中 , 脂 后 的 存在 是 这 些 过 程 能 够 进 行 的 重要 因素 之 一 。 很 多 实验 表明 , 如 果 缺 乏 脂 徐 形 成 的 重要 组 分 (如 鞘 脂 或 胆固醇 ) 就 会 明显 影响 上 述 的 运送 步骤 , 下 面 拟 举 几 个 具体 例子 加 以 说 明 。 在 胞 内 通过 圳 泡 进 行 物质 运送 中 脂 征 的 作用 ( 引 自 Ikonen 2001) 脂 答 内 含 的 脂 分 子 用 红色 表示 , 脂 徐 外 脂 分 子 用 蓝 色 表示 , 被 运送 分 子 用 黄色 表示 , 绿 色 代 表 细 胞 骨 架 。 图 中 1 显示 圳 泡 形 成 并 将 被 运送 分 子 包 人 ; 2 显示 圳 泡 与 细胞 骨架 形成 复合 物 ; 3 显示 运送 圳 泡 的 锁定 与 融合 1) 脂 征 结构 与 GPI- 锁定 蛋白 的 运输 〈(Ikonen 2001 ) 醇 母 细胞 中 所 合成 的 GPI ( 糖 基础 脂 酰 肌 醇 ,glycosylphosphatidylinositol) - 锁定 蛋 A Gaslp 首先 在 内 质 网 中 与 脂 答 〈 内 含 固 醇 、 麦 角 醇 和 鞘 脂 ) 相 结合 然 后 通过 高 尔 基体 运 至 细胞 质 膜 , 而 在 哺乳 动物 细胞 中 , 新 合成 的 GPI- 锚 定 蛋 白 先 与 高 尔 基体 脂 从 相 结合 。 2) 脂 徐 与 分 泌 的 调节 (Ikonen 2001) 酶 原 颗 粒 (zymogen granule) 的 合成 是 在 胰 泡 细胞 中 进行 的 。 实 验 结果 表明 , 如 果 在 胆固醇 缺失 或 攻 糖 脂 合 成 被 抑制 的 条 件 下 , 酶 原 颗 粒 的 形成 就 会 降低 。 此 外 , 在 胆固醇 RENAE PD, ve AG (amylase) 的 分 泌 就 会 增加 , 说 明 分 泌 和 蛋白 合 成 后 的 选 分 发 生 了 异常 。 3) fae SHOWA PEAY es te S644 (Madin-Darby canine kidney, MDCK) 中 胞 内 体 (endosome) 富 @Waees 9], 但 晚期 胞 内 体 (late endosome) 和 溶 酶 体 中 富 含 的 却 是 甘油 酯 , 因 而 未 发 WANs Y, feito C #! Niemann-Pick jpj(Niemann-Pick disease type C, NPC) ea 9, PYAR RIBAS, BIA A EZR. AEE tl Ss en) 15 gla Ae BAF KAI — “GHB 胞 内 体 与 高 尔 基 体 之 间 的 往返 运输 , 在 上 述 NPC 的 病变 细胞 中 从 胞 内 体 至 高 尔 基 体 的 甘 露 糖 -6- 磷酸 受 体 (MPR) 运送 发 生 了 异常 的 变化 , 从 而 影响 该 受 体 在 两 者 之 间 的 分 布 。 综 上 所 述 , 研究 脂 和合 结构 和 质 膜 微 圳 在 细胞 内 吞 、 外 排 以 及 膜 运 输 等 方面 的 作用 已 积累 一 定 的 资料 , 但 它们 的 分 子 机 制 仍 不 很 清楚 , 有 待 进一步 次 化 。 运送 圳 泡 的 形成 、 内 含 蛋白 质 分 选 、 运 送 微 圳 的 靶 向 、 识 别 、 销 定 与 融合 都 是 很 复杂 的 过 程 , 影 响 因 素 很 多 。 看 来 , 脂 徐 结 构 也 是 其 中 一 个 不 容 忽视 的 因素 , 值 得 进一步 研究 。 4, 脂 和 巷 、 质 膜 微 圳 与 疾病 的 关系 (Parton 2003) 如 果 脂 徐 和 质 膜 微 吉 与 细胞 一 些 重要 功能 有 密切 联系 , 研究 它们 的 异常 与 疾病 的 联 系 就 成 为 一 个 值得 关 广 的 问题 。 有 报道 , 癌 症 、 动 脉 粥 样 硬化 、 糖 尿 病 、 老 年 性 阁 采 与 质 膜 微 圳 及 其 内 含 的 微 圳 素 (caveolin) 的 变化 有 关 。 例 如 , 乳 腺 癌 细 胞 的 caveolin-1 AYE 量 有 降低 , 而 前 列 腺 癌 的 内 售 caveolin-1 则 有 升 高 的 现象 。caveolin-3 主要 在 骨骼 肌 、 心 肌 和 光 请 肌 细胞 中 表达 , 如 果 caveolin-3 的 基因 发 生 突变 会 导致 一 种 肌肉 帮 缩 症 的 形成 。 除 caveolin-1 以 外 , 质 膜 微 吉 内 含 的 其 他 蛋白 质 或 脂 徐 中 的 和 蛋白质 的 数量 和 质量 改变 是 否 也 可 能 与 细胞 病变 有 联系 , 这 些 都 是 值得 探索 的 问题 , 这 方面 的 研究 无 疑 将 为 探索 治疗 ” 某 种 疾病 的 药物 靶 标 提供 新 的 思路 。 化 传 喜 等 (2003) 报 道 ,caveolin-1 能 抑制 肿瘤 细胞 中 BA 4 AMA PEND P-glycoprotein(— ## ATP-binding cassette transporter 或 称 ABC 转运 体 ) 的 功能 , 从 而 降低 了 多 药 耐 受 性 , 即 增加 了 肿瘤 细胞 对 药物 的 敏感 性 。 5. ERIE AS Tey 1972 年 , 美 国 Singer Fil Nicolson $é 4 4-49 HR AS Git ah BE Pe! (fluid mosaic model) (图 1-15), 已 经 历 了 30 多 年 , 虽 然 一 般 认 为 它 在 基本 方面 仍然 是 正确 的 , 但 当时 对 生 物 膜 结构 的 不 均匀 性 并 未 给 以 足够 地 芳 虑 。 随 着 时 间 的 推移 人 们 和 逐 痢 认识 到 生物 膜 有 微 区 存在 ,通过 脂 徐 和 质 膜 微 吉 的 发 现 和 反复 鉴定 说 明 , 很 多 微 区 还 远 比 原来 想像 的 要 小 。 这 样 , 生物 膜 应 视 为 由 脂 质 、 和 蛋白 质 和 糖 组 成 的 一 个 不 均匀 的 超 分 子 体 系 ,, 膜 脂 以 甘油 酯 为 主体 , 以 鞘 脂 和 胆固醇 为 主要 成 分 的 、 大 小 不 一 的 微 区 分 散在 主体 中 , 因此 ,整个 膜 犹 如 很 多 微 区 组 成 的 马赛 克 (mosaic) (Maxfield et al. 2002) 。 无 论 是 膜 脂 主体 还 是 微 区 都 舍 数 量 不 等 的 膜 蛋 白 〈 图 1-15B), Elif, Singer 和 Nicolson $€ th AY (m2) HERE A B 攻 和 三 昌 生物 膜 模型 〈《 引 自 Lee 2091) A. 流动 镶 颈 模型 ,B. 含有 脂 质 微 区 的 生物 膜 模型 , 红 色 为 脂 质 微 区 内 含 的 至 局 质 , 绿 色 为 分 ““ 脂 质 微 区 之 外 的 蛋白 质 aS a= 月 1777/ = 物 膜 Biomembranes 16 型 需要 一 定 的 修正 。 鉴于 脂 徐 和 质 膜 微 吉 不 是 静止 的 而 是 动态 的 , 这 就 更 增加 生物 膜 结 构 的 复杂 性 。 6, 展 望 (1) 脂 徐 和 质 膜 微 融 的 存在 已 经 过 很 多 实验 室 的 验证 与 肯定 , 对 这 些 脂 质 微 区 的 生 理 功能 虽 已 提出 很 多 假说 ,但 详细 机 制 还 有 竺 进一步 阐明, 有 些 还 需要 通过 更 多 实验 加 以 验证 。 对 于 生物 膜 研究 来 说, 这 确 是 一 个 富 于 挑战 和 很 有 发 展 前 途 的 领域 。 (2) 鉴于 脂 答 和 质 膜 微 圳 都 很 小 , 不 易 在 位 研究 , 又 难以 分 离 纯化 , 这 就 需要 引进 和 创立 新 的 技术 和 方法 才能 将 这 方面 的 研究 引 同 次 入, 国际 上 已 经 符 试 将 单 分 子 技术 等 引进 脂 质 微 区 的 研究 , 这 方面 需要 大 力 加 强 。 (3) 除 细胞 质 膜 外 , 在 胞 内 膜 系 中 是 否 也 普遍 存在 脂 质 微 区 , 如 有 果 也 有 分 布 , 它 们 的 功能 又 是 什么 ? 这 些 都 值得 进一步 研究 。 (4) STREAMERS ARS Sat, Armen Sia oe FH KARE CE. Ae KMS FU SR Se A RATED EA FI HE Go EF SL A Lo A HA 否 能 表现 出 最 佳 的 功能 , 这 是 一 个 需要 认真 思考 与 研究 的 问题 。 (S) 脂 徐 和 质 膜 微 吉 与 医药 关系 的 研究 还 处 于 起 步 阶段 , 值 得 重视 并 作 进 一 步 探 Fo 总 之 ,无论 膜 蛋白 的 三 维 结构 还 是 脂 质 微 区 结构 与 功能 的 研究 都 是 生物 膜 研究 的 基 本 问题 。 虽 然 开 展 这 方面 研究 的 难度 较 大 、 周 期 较 长 、 探 索性 也 很 强 , 但 它们 都 富有 挑 战 性 ,一 旦 有 所 突破 对 生物 膜 甚至 生命 科学 的 研究 都 将 产生 重大 的 推动 作用 , 应 引起 足 够 的 重视 。 ( 杨 福 愉 ) {EPMO (GS, REC. 2003. Caveolin-1 55 P-gp 的 相互 作用 以 及 对 肿瘤 细胞 耐 药性 的 影响 . SS 7\ A BE 2003 海内 外 生物 膜 学 术 研 讨 会 论文 摘要 , p33 张 坦 家 , 孙 京 川 , 杨 挥 等 . 2001. 部 分 纯化 的 猪 心 线粒体 Fu 的 二 维 结 品 及 电子 晶体 学 . 科学 通报 , 46 (20): 1702-1704 Agre P, Bonhivers M, Borgnia MJ. 1998. Aquaporins, blueprints for cellular plumbing systems. J Biol Chem, 273(24): 14659- 14662 Anderson RG. 1998. The caveolae membrane system. Ann Rev Biochem, 67: 199-225 Chang G, Roth CB. 2001. Structure of MsbA from E.coli: a homolog of the multidrug resistance ATP Binding Cassette (ABC) transporters. Science, 293: 1793-1780 Dutzler R, Campbell EB, MacKinnon R, et al. 2002. X-ray structure of CCL, chloride channel at 3.0 A reveals the molecular basis of anion selectivity. Nature, 415: 287-294 Ikonen E. 2001. Role of lipid rafts in membrane transport. Curr Opin Cell Biol, 13(4): 470-477 Jiang Y, Lee A, MacKinnon R, et al. 2002. The open pore conformation of potassium channels. Nature, 417: 523-526 Lee A. 2001. Membrane structure. Curr Biol, 11(20): R811-R814 Liu ZF, Kang TY, Chang WR, et al. 2004. Crystal structure of spinACh major light-harvesting complex at 2.72 A resolui©'on. Nature, 428: 287-292 Liu Zh, Sui Vang SX, et al. 1997, Two-dimensional crystallization of photosystem II a/b protein complex from cucumber. Chinese nce Bulletin, 42(7): 597-599 Marx J. 2001 veolae: a once-elusive structure gets some respect. Science, 294: |. 2-1865 17 B18 AE 4B RA 2H Fe Maxfield FR, et al. 2002. Plasma membrane microdomains. 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Ion channels: a first view of K~ channels in atomic glory. Curr Biol, 8: R450-452 Simons K, Ikonen E. 1997. Functional rafts in cell membranes. Nature, 387: 569-572 Simons K, Toomre D. 2000. Lipid rafts and signal transduction. Nature Rev Mol Cell Biol, 1: 31-40 Sui H, Han BG, Lee JK, et al. 2001. Structural basis of water-specific transport through the AQP1 water channel. Nature, 414: 872-878 Sansom MSP. 1998. Ion channels: a first view of K~ channels in atomic glory. Curr Biol, 8: R450-452 Stephen White Laboratory at University of California Irvine. 2003. Membrane proteins of known 3D structures. http://blanco. biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html Toyoshima C, Nakasako M, Nomura H, et al. 2000. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6A resolution. Nature, 405: 647-655 Toyoshima C, Nomura H, Sugita Y. 2003. Structural basis of ion pumping by Ca?*-ATPase of sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett, 555: 106-110 Wang LH, Cui ZC, Yang FY , et al. 1996. 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Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K* channel-Fab complex at 2.0 A resolution. Nature, 414: 43-48 Zajchowski LD, Robbins SM. 2002. Lipid rafts and little caves. Compartmentalized signalling in membrane microdomains. Eur J Biochem, 269: 737-752 ZL. HERE He RI concen ccc de ccdeccctecveddles docasteleassee 19 2 FISH ob lind de 20 p Jap We Wie => EB SE dy oe ae so re 21 DDD 天 近 庆 的 本 7 区 证 Re ET 21 22 运 卫 临 界 胶 束 浓 麻生 2.2.5 ”去 污 剂 溶液 的 相 变 行为 本 2.42 脂 立方 相 方法 和 bicelle 结晶 方 衬 同人 cr 24 2.5 拉 体 片段 辅助 下 的 膜 蛋 自 三 维和 车 融 本 下 站 半生 和 26 TH SBS ARH wt ane 28 ver 用 X 射 线 晶 体 学 方法 测定 膜 蛋 白 三 维 结构 的 主要 瓶颈 在 于 难 以 制备 到 具有 一 定量 的 膜 蛋 白 纯 品 和 难以 获得 高 度 有 序 堆 积 的 大 尺度 膜 蛋 白 三 维 单 品 。 膜 蛋白 三 维 结晶 的 高 难度 使 得 人 们 一 度 认为 要 获得 膜 蛋白 三 维 唱 体 几 乎 是 不 可 能 的 , 直到 1980 年 膜 蛋 自 的 三 维 结 品 才 取 得 突破 性 进展 。Michel 和 Garavito 分 别 独立 地 经 过 多 年 摸索 , 做 了 大 量 的 探索 性 工作 后 ,率先 成 功 地 得 到 了 细菌 视 紫 红 质 (bR)(Michel and Oesterhelt 1980) 和 基质 孔 蛋 和 白 (Garavito and Rosenbusch 1980) 的 三 维 唱 体 ,证 明了 膜 蛋 白 是 可 以 堆积 成 三 维 唱 体 的 。 从 此 开 尽 了 膜 蛋 和 白 三 维 结 唱 和 结构 测定 的 新 纪元 , 为 高 分 辩 率 膜 蛋 白 三 维 结构 的 测定 芮 定 了 基础 。 第 一 个 报道 的 膜 蛋 白 三 维 结构 是 发 表 于 1985 年 的 3A 分 辩 率 的 光合 细菌 反应 中 心 的 X 射 线 晶 体 学 结构 (Deisenhofer et al. 1985)。 这 一 巨大 成 就 大 大 推动 了 膜 蛋 白 结 构 生物 学 和 光合 作用 机 制 研 究 两 大 领域 的 发 展 , 也 为 Deisenhofer、 Michel 和 Huber 三 位 德国 科学 家 赢得 了 1988 年 的 诺 贝 尔 化 学 奖 。 迄今 为 止 , 蛋 和 白质 数据 库 (PDB) 中 的 膜 蛋 白 三 维 结构 总 数 仅 占 所 有 结构 总 数 的 约 0.6% (截至 2004 年 3 月 的 统计 数据 )。 另 据 各 种 基因 组 计划 研究 的 结果 , 真 核 细胞 中 有 近 30% 的 蛋白 质 属 于 膜 蛋 白 , 其 中 绝 大 部 分 的 三 维 结构 都 是 元 知 的 。 当 前 , 膜 和 蛋白 结 唱和 结 19 wD & BE A= AEF ih 构 解 析 虽 然 与 普通 水 溶性 蛋白 相 比 进展 缓慢 , 但 是 由 于 膜 蛋白 结构 的 测定 工作 具有 重要 的 意义 和 高 度 的 挑战 性 ,吸引 了 越 来 越 多 的 研究 者 在 这 一 广阔 的 领域 中 积极 探索 ,也 使 得 它 成 为 一 个 受到 广泛 关注 的 前 治 研究 领域 。2003 年 的 诺 贝 尔 化 学 奖 再 次 授予 了 从 事 膜 蛋白 三 维 结构 研究 的 科学 家 Roderick MacKinnon, 以 表彰 他 在 离子 通道 结构 与 功能 研究 领域 所 做 出 的 杰出 贡献 。 在 结晶 方法 上 不 断 也 有 一 些 开 拓 性 的 方法 被 提出 并 得 到 应 用 , 获得 了 一 定 的 成 功 , 这 必 将 推动 新 的 膜 蛋白 三 维 结构 训 定 的 进程 。 下 文 将 对 这 些 新 方法 加 以 详细 的 论述 。 “1 TBR AA Ze 如 图 2-1 所 示 , 根据 堆积 原理 的 不 同 , 膜 蛋白 三 维 结晶 (membrane protein crystalliza- tion) 可 以 分 为 两 种 基本 类 型 (Michel 1983)。 在 常 文 瑞 研 究 组 的 工作 中 ,首次 发 现 了 第 三 种 类 型 【“ 详 见 2.6)。I 型 膜 蛋白 三 维 唱 体 是 由 其 二 维 唱 体 在 第 三 维 方向 上 才 县 而 成 的 , 这 些 二 维 品 体 在 第 三 维 方向 上 的 排列 可 以 包含 旋转 、 平 移 和 上 下 倒转 操作 。 在 工 型 晶体 中 , 脂 类 分 子 以 类 似 脂 双 分 子 层 的 方式 环 统 着 膜 蛋 白 (图 2-1A)。 蛋 白 、 脂 分 子 以 及 蛋白 之 间 产生 的 踊 水 相互 作用 就 如 在 生物 膜 上 一 样 , 使 得 膜 蛋白 的 膜 内 广泛 踊 水 表面 得 到 很 好 的 履 盖 。 在 膜 平面 二 维 方向 上 形成 的 玻 水 作用 和 极 性 作用 以 及 在 第 三 维 方向 上 的 极 性 作用 是 稳 定 I 型 品 体 的 主要 因素 。 脂 立方 相 (lipid cubic phase) 方法 已 被 证 明 是 一 种 可 用 以 获得 有 序 的 适合 于 X 射 线 唱 体 结构 测定 的 型 膜 蛋 白 品 体 的 有 效 方法 (Landau and Rosenbusch 1996, Nollert et al. 2002) 。 应 用 最 近 发 展 出 来 的 bicelle 结晶 方法 (FEaham and Bowie 2002) 所 E 获得 的 一 种 bR 三 维 品 体 也 属于 I 型 品 体 。 由 品 体 的 玻 水 和 极 性 两 种 相互 作用 , 因 而 在 实践 中 很 难 获 得 足够 大 的 且 有 序 度 高 的 型 晶体 。I 型 晶体 的 外 形 经 常 表现 为 薄片 ,在 第 三 维 方 和 同上 的 太 度 小 , 并 且 常 常 由 于 维 持 这 一 方向 上 堆积 的 极 性 作用 力 太 小 而 出 Bis RAY (ale, eM Ate. CET 型 晶体 中 , 膜 蛋白 的 踊 水 表面 被 双亲 性 的 去 污 剂 微 吉 覆 盖 , 其 品 体 点 阵 主 要 是 由 暴 露 在 去 污 剂 微 圳 外 面 的 膜 蛋白 的 极 性 表面 区 域 之 间 的 极 性 相互 作用 来 维持 (图 2-1B) (Michel 1983)。 大 部 分 已 测定 结构 的 膜 蛋白 ag 9 Ash bs 人 四 OX: 二 ”从 the OLIMAR REM = QR PE Re au 溶 膜 蛋白 是 成 功 获得 有 序 的 开 型 膜 蛋白 三 NS Oe wae 维 品 体 的 关键 。 由 于 多 数 的 膜 蛋白 仅 能 在 wes eee A — PC LAST FAR BE TEE 使 得 可 供 结晶 用 的 去 污 剂 范围 极为 有 限 膜 蛋 白 三 维 晶体 , 天 种 基本 类 型 有朋 st eae JAMS. A. I 型 膜 蛋白 晶 作 ,B. IDR BR, RES UBER 对 于 那些 膜 外 极 性 区 域 相对 较 小 的 膜 蛋白 。 面部 分 用 粉红 公 ca, eke = HARE (BIE Michel (如 bR 和 绿色 植物 的 主要 捕 光 复合 物 LHC- 1983, 稍 作 ok) ey 膜 Biomembranes Tl), oe 47 PAY Ue i ASAE. LE AR PE od FRAG DATs FEAT FM 扩大 可 参与 品 体 接 触 的 膜 蛋白 极 性 区 的 一 种 方法 (Michel 1983, Timmins et al. 1991)。 还 有 一 种 有 效 的 方法 是 采用 一 些 水 溶性 蛋白 ,如 抗体 Fv 或 Fab 片段 和 膜 蛋 白 特 异性 结合 来 扩 大 其 膜 外 的 极 性 区 表面 (Hunte and Michel 2002)。 由 于 制备 单元 隆 抗 体 本 身 就 是 一 项 耗 时 且 昂 贵 的 技术 , 使 得 这 种 抗体 刻 段 介 导 的 结晶 策略 的 成 功 应 用 只 有 少数 几 例 〈 详 见 2.5)。 22 去 污 州 SS 去 污 剂 (detergent) 的 特殊 性 质 在 于 它 的 双亲 性 , 即 其 结构 中 同时 含有 一 个 亲 水 的 极 性 头 部 基 困 和 一 条 玻 水 的 烃 链 。 去 污 剂 的 另 一 特性 就 是 当 它 在 水 溶液 中 的 浓度 高 于 临 界 胶 束 浓度 (CMC) 时 , 会 自发 聚集 成 去 污 剂 微 吉 (图 2-2A), EASED, BA 去 污 剂 分 子 的 亲 水 头 部 朝 同 水 溶液 中 ,形成 一 个 壳 层 将 其 踊 水 尾部 包 埋 在 微 吉 内 部 ,使 其 不 与 外 部 的 亲 水 环境 接触 。 利 用 去 污 剂 来 增 溶 膜 蛋 白 的 原理 就 是 用 双亲 性 的 去 污 剂 微 宫 与 膜 蛋白 的 玻 水 表面 结合 (图 2-2B), 将 其 与 外 界 的 极 性 环境 隔离 开 , 从 而 使 膜 蛋白 在 水 溶液 中 不 会 因为 玻 水 相互 作用 而 发 生 聚集 和 涡 证 。 选 择 合 适 的 去 污 剂 来 增 溶 膜 蛋白 分 子 是 进行 膜 蛋白 三 维 结晶 的 关键 。 理 想 的 去 污 剂 不 仅 要 能 够 使 膜 蛋白 维持 稳定 、 可 溶 的 状态 , 而 且 不 妨碍 在 晶体 成 核 与 生长 过 程 中 发 生 的 膜 重 白 极 性 表面 之 间 的 相互 接触 。 在 含 去 污 剂 的 膜 蛋白 溶液 中 , 同 时 存在 着 两 种 不 同 的 微 吉 : 一 种 是 纯粹 由 去 污 剂 组 成 的 单 一 微 吉 , 另 一 种 是 由 膜 蛋 白 及 与 其 结合 的 去 污 剂 组 成 的 复合 微 吉 ,这 正 是 我 们 所 要 结晶 的 组 分 。 在 复合 微 吉 中 去 污 剂 分 子 围绕 膜 蛋白 分 子 的 玻 水 区 形成 一 个 类 似 腰带 形 的 结构 (图 2-2B)。 这 一 与 膜 蛋白 结合 的 去 污 剂 带 的 大 小 和 形状 均 会 影响 膜 蛋 白 的 结晶 , 而 这 又 由 去 污 剂 分 子 自 身 的 性 质 决 定 。 表 2-1 列 出 一 些 已 被 成 功 地 应 用 于 膜 蛋 白 三 维 唱 体 生长 的 去 污 剂 及 其 基本 性 质 。 中 大 部 分 属于 非 离子 型 去 污 剂 , 即 其 极 性 头 部 基 团 不 带电 符 , pain 类 .还 有 一 部 分 属于 兼 性 离子 型 ,其 极 性 头 部 同时 具有 带 负 电 和 带 正 电 的 基 团 ,如 CDAO 类 。 在 选择 去 污 剂 对 膜 蛋 白 进 行 增 溶 时 需要 考虑 以 下 几 个 方面 的 因素 。 A. 去 污 剂 球 形 微 圳 ,B. 去 污 剂 增 溶 膜 蛋白 后 形成 的 腾 蛋 白 - 去 污 剂 复合 微 圳 示意 图 橘 黄色 部 分 表示 膜 蛋 白 的 亲 水 表面 , 品 红色 部 分 表示 被 去 污 剂 三 次 的 膜 蛋白 疏水 表面 21 2H [RE HELE th 名 称 简写 相对 分 子 质量 CMC/mmolL) 每 个 微 囊 所 含 的 单 体 数 类 型 * 供应 商 产 n-octyl-B-D-glucopyranoside OG 292.4 18 78 N A, 8, C n-nonyl-$-D-glucopyranoside NG 306.4 6.5 N A,S n-octyl-B-D-maltoside OM 454.6 19.5 47 N A n-decyl-$-D-maltoside DM 482.6 1.8 69 N A,C n-undecyl-B-D-maltoside UM 496.6 0.59 74 N A n-dodecyl-$-D-maltoside LM 510.6 0.17 78 ~92 N A,S,C n-dodecyl-octaoxyethylene CEs 518 0.07-0.1 120 N A,C n-dodecyl-nonaoxyethylene CiEs S83 0.07-0.1 N A,C n-octyl-tetraoxyethylene C3E, 306 8.5 82 N B,K n-octyl-pentaoxyethylene CE; 350 9.2 N B,K n-decyl-pentaoxyethylene CyoEs 378 N N,N-dimethyl-dodecylamine-/N-oxide LDAO 229.4 1.0 76 Le A,F N,N-dimethyl-undecylamine-N-oxide UDAO 215.4 Li F N,N-dimethyl-decylamine-N-oxide DDAO 201.4 10.4 Z F decanoyl-N-methylglucamide MEGA-10 = 349.5 6 N F n-octyl-2-hydroxyethylsulfoxide _ C,HESO 206.35 Zz B * 去 污 剂 类 型 : N, 非 离子 型 ,Z, 兼 型 离子 型 。 ** 供应 商 : A, Anatrace; B, BAChem; C, Calbiochem; F, Fluka; K, Kohyo; S, Sigma, 22.1 Soe a FRIESE (1175 5) mmm 根据 去 污 剂 极 性 头 部 带电 性 质 的 不 同 可 将 其 分 为 阴离子 型 、 阳 离子 型 、 兼 性 离子 型 AES TWAS HO AK, BOLO PAS, ote (SDS) 和 胆 酸 钠 , 其 头 部 基 团 带 负 电 。 阳 离子 型 去 污 剂 含 带 正 电 的 头 部 基 团 , WR BEML Oy, 如 十 六 烷 基 三 乙 基 省 化 铵 (CTAB) 。 兼 性 离子 型 去 污 剂 的 头 部 同时 具有 带 负 电 和 带 正 电 , 如 LDAO 和 甜菜 碱 。 非 离子 型 去 污 剂 头 部 基 团 不 带电 荷 , 其 亲 水 性 通常 来 自 于 头 部 的 羟 基 , 典 型 的 头 部 基 团 有 聚 环 氧 乙 烷 和 糖 环 , 如 CE* 和 QOG。 常 用 于 膜 蛋 白 纯 化 和 结晶 的 去 污 剂 多 属于 兼 性 离子 型 和 非 离子 型 。 在 同等 大 小 的 前 提 下 , 非 离子 型 的 去 污 剂 一 般 比 兼 性 离子 型 去 污 剂 温和 ,如 0OG 比 LDAO 温和 。 对 于 具有 相同 长 度 烃 链 的 同类 型 去 污 剂 来 说 , 头 部 基 团 越 大 越 温 和 。 但 是 还 得 考虑 到 若 头 部 基 团 太 大 , 可 能 会 阻碍 膜 蛋白 亲 水 表面 之 间 的 接触 , 不 利于 膜 蛋白 的 结晶 。 2 二 用 门 夸大 下 下 “IE 在 同一 系列 的 去 污 剂 中 ,疏水 链 越 长 去 污 剂 性 质 越 温和 ,例如 0OG,NG 和 DG 三 者 相 比 , DG 烃 链 最 长 《Cio) ,也 最 温和 。 但 去 污 剂 的 疏水 烃 链 越 长 ,, 三 解 性 越 低 , 临 界 胶 束 浓度 (CMC) 也 越 低 。 膜 蛋 自 结 晶 所 用 的 去 污 剂 的 疏水 烃 馆 ” 立 大 都 不 长 于 十 二 碳 链 。 HE yy ii Biomembranes 22 2.235 7 从 当前 已 被 结晶 的 膜 蛋白 实例 来 看 , a TBA BR RE Hs 75 FB BE 表面 之 间 的 相互 作用 所 造成 的 干扰 而 采取 较 小 的 去 污 剂 微 圳 与 膜 蛋 白 结合 的 策略 可 能 是 淤 在 的 成 功 因 素 之 一 。 根 据 去 污 剂 单 体 的 大 小 以 及 每 个 微 吉 所 含 单 体 数 (aggregation number) 可 大 致 推测 所 用 的 去 污 剂 微 赛 的 大 小 。 2.2.4 i 7 7° mmm M4 S15 FTE RE (ER tn FRAC RVR RE (critical micelle concentration, CMC) IL, #7 Fil 5) FU SPE ASTESA TEE, ils AER he EAR APE. RA SASH 度 高 于 CMC 值 时 , Ava Ha LA SRA CE, AES AZ FID FID TF ACE 衡 。CMC 值 越 高 ,二 者 之 间 的 交换 也 越 多 , 这 一 动态 性 质 在 膜 蛋 白 结 品 中 发 挥 着 重要 的 作用 。 在 选择 时 , 应 该 优先 益 虑 采用 具有 适中 或 较 高 CMC 值 的 去 污 剂 。 2.2.5 2615 FCCC FS | 5) _ mmm ASRS (1) ABSA ih PEG LEB SPs FAVRE HES A, ST FDR AS RE 在 一 定 的 去 污 剂 浓度 范围 和 一 定 的 温度 范围 内 , 这 里 以 典型 的 非 离子 型 去 污 剂 的 相 图 (图 2-3) 为 例 来 解释 。 超 过 这 一 特定 的 范围 , 微 圳 溶液 就 可 能 发 生 相 变 , 形 成 两 个 互 不 相 溶 的 液 相 , 其 中 一 相 中 富 集 了 高 浓度 的 去 污 剂 而 另 一 相 则 必然 被 耗 去 去 污 剂 。 依 据 分 相 点 的 一 系列 温度 和 浓度 参数 可 画 出 一 条 曲线 , 这 一 曲线 被 称 为 共 溶 边界 (consolution boundary)。 结 晶体 系 的 相 变 行为 与 溶液 中 的 各 种 成 分 均 有 关 , 包括 去 污 剂 、 蛋 白质 、 沉 淀 剂 和 添加 剂 等 。 当 发 生 分 相 时 , 膜 蛋白 一 般 被 分 配 到 富 含 去 污 剂 的 那 一 相 中 。 有 几 种 膜 蛋 白 被 观察 到 发 生 在 体系 分 相 以 后 才 结 晶 , 如 细菌 捕 光 B800-850 复合 物 (Welte and Wacker 1991) 和 OMPF 孔 蛋 和 白 (Garavito et al. 1983), 前 提 是 这 些 膜 蛋白 在 高 浓度 去 污 剂 相 中 能 够 保持 稳定 。 一 般 在 膜 蛋白 结晶 的 时 候 要 尽量 避免 体系 的 分 相 , 因 为 分 相 所 产生 的 微小 液 滴 可 能 诱发 大 量 微 晶 的 产生 , 从 而 难以 得 到 适合 于 X 射 线 衍射 的 大 单 晶 , 另 一 方面 还 可 能 对 晶体 的 有 序 性 造成 不 可 逆 的 破坏 , 降 低 晶体 的 质量 。 避 免 分 相 发 生 的 策略 多 种 多 样 , 关 键 在 于 找到 引起 分 相 的 主要 原因 。 对 于 由 PEG 引起 的 分 相 , 可 以 考虑 缩短 PEG 链 的 长 度 , 对 于 由 膜 脂 诱发 的 分 相 , 应 该 考虑 用 生化 的 分 离 手段 来 脱脂 , 对 于 主要 去 污 剂 浓 度 /% ,(w/wW) 去 污 剂 浓度 /% ,(w/wW) 非 离子 型 去 污 剂 水 咨 液 的 相 变 示 意图 A. RAC Be TS A (如 最 常见 的 CaEs) 溶液 在 高 于 共 溶 边界 的 区 域 分 相 为 两 互 不 相 溶 的 液 相 , B. 凡 -烃基 -葡萄 糖苷 溶液 的 分 相 发 生 在 低 于 共 溶 “ 界 的 区 域 23 2H WE ARLE FAS 5 Fl AS PE Je A, TAS Ee PEE reat, EK EE, SKB TK VEE SRA IST Fil KEIO ee De ST I Da OT PS YY FT A it AT Here, PRGA A ete TR. UE, i AT AEE i PS A FP a8 PER Tk EB re 两 性 小 分 子 物质 来 抑制 分 相 的 发 生 。 根据 所 采用 的 那 一 类 去 污 剂 的 相 图 来 调整 适当 的 结 品 环 境 温度 也 是 一 个 抑制 分 相 的 方法 。 在 体系 不 分 相 的 前 提 下 , 寻 找 适 当 的 结晶 条 件 并 缓慢 逼近 共 溶 边界 , 这 就 相当 于 将 膜 蛋白 -去 污 剂 复合 物 带 到 过 饱和 状态 , 从 而 使 其 结 品 成 核能 够 局 动 。 总 之 , 选择 合适 的 去 污 剂 是 获得 膜 蛋 白 三 维 品 体 的 关键 所 在 。 在 选择 去 污 剂 时 应 该 充分 考虑 去 污 剂 的 各 种 性 质 , 同时 在 结晶 条件 的 初期 摸索 时 应 该 花费 更 多 的 精力 来 寻找 最 适合 于 特定 膜 蛋 白 结 品 的 去 污 剂 , 而 非 将 主要 的 精力 用 于 调整 影响 结晶 的 其 他 因素 (Ostermeier and Michel 1997)。 另 外 , 如 有 果 单 一 的 去 污 剂 被 证 明 对 膜 和 蛋白 的 结 唱 不 是 特 BARS, PLAGE REA lal ATs FATE ay. Roth (1989) 利用 中 子 散射 方法 观 5), MRCS RUD HAE AH, Zola HSE aR ae Ak I OR 构 , 相 邻 的 去 污 剂 环 间 由 桥 状 结构 连接 , 这 种 带 状 的 去 污 剂 结构 贯穿 整个 晶体 。 这 一 结 果 解 释 了 为 什么 去 污 剂 在 膜 蛋白 结晶 过 程 中 是 如 此 重要 的 。 “3 TE] _ 两 性 小 分 子 (small-amphiphile) 的 概念 是 由 Michel 总 结 多 年 膜 蛋白 晶体 生长 的 经 验 于 1983 年 正式 提出 的 (Michel 1983)。 两 性 小 分 子 发 挥 作用 的 原理 是 : 通过 挫 入 到 去 污 剂 微 圳 中 形成 比 单纯 的 去 污 剂 微 吉 小 的 刘 合 微 宫 ,从 而 可 以 减少 微 吉 对 膜 蛋 白 极 性 表面 的 覆盖 ,使 其 能 够 更 多 地 姑 露 出 来 并 在 品 体 中 形成 更 多 的 极 性 接触 , 提 高 晶体 堆积 的 有 序 性 (Timmins et al. 1991)。 两 性 小 分 子 还 可 能 在 某 些 特 殊 位 置 替 代 那 些 不 利于 晶体 堆积 矢 去 污 剂 分 子 , 它 们 被 认为 可 以 像 去 污 剂 分 子 一 样 和 膜 蛋白 结合 , 而 且 由 于 两 性 小 分 子 与 去 污 剂 分 子 比 起 来 具有 更 小 的 极 性 头 部 基 团 , 所 以 能 够 更 好 地 适 配 到 晶体 点 阵 中 ,起 到 改善 晶体 质量 的 作用 。 另 外 ,在 膜 蛋白 结 品 体系 中 加 入 两 性 小 分 子 还 可 以 抑制 分 相 的 发 HE, 将 体系 的 分 相 点 向 高 沉 尝 剂 浓度 条 件 迁 移 , 扩 大 体系 分 相 点 和 结晶 点 间 的 沉淀 剂 浓 度 差 跑 , 从 而 使 得 膜 重 白 能 够 在 体系 分 相 之 前 结晶 。 表 2-2 列 出 常用 于 膜 蛋 白 结 晶 的 一 些 两 性 小 分 子 , 其 中 在 膜 蛋白 结晶 领域 应 用 得 最 多 的 两 性 小 分 子 应 该 是 庚 三 醇 (Heptane- 1,2, 3-triol) 和 答 甲 卫 (Benzamidine) 。 化 合 物 名 称 二 本 2: Heptane-1, 2, 3-triol 目前 为 止 最 有 效 的 两 性 小 分 子 , 被 成 功 地 应 用 于 光 反 应 中 心 、 细菌 捕 光 复合 物 、 孔 蛋白 等 膜 蛋 白 的 三 维 结晶 。 与 盐 类 沉 证 剂 配 合 使 用 效果 最 好 Benzamidine 成 功率 仅 次 于 庚 三 醇 , 与 聚 乙 二 醇 配 合 较 好 Cyclooctane-1, 2, 3, 4-tetraol TA WERE IRF Be = Octane-1, 2, 3-triol 溶解 度 低 Hexane-1, 2, 3-triol 在 高 浓度 时 才 有 效 ( 人 8%) Triethylammonium 在 pH<7.5 时 才 有 效 Phenylalanine 溶解 度 低 , 常 温 下 <2.5 {ELAR RET SOR AA NE 24 原则 上 , tin A HE 5 — in Aik EBA FS TE A Woy Fas JN FAP HR SE 2 is ER AR PEA OLE, iA — HEE & ABE AIRE -n- EE 化 合 物 。 但 有 效 的 两 性 小 分 子 应 该 符合 以 下 几 点 要 求 : 首先 不 引起 膜 蛋白 的 变性 , 其 次 能 够 抑制 体系 的 分 相 , 最 重要 的 是 要 能 够 提高 品 体 堆积 的 有 序 性 。 笔 者 认为 在 筛 选 合适 的 两 性 小 分 子 添 加 剂 时 应 该 明确 这 几 点 , 首 先 开 展 大 范围 的 搜索 ,逐步 排除 不 符合 要 求 的 , 然后 缩小 搜索 范围 , 集中 精力 优化 调整 初 具 成 效 的 添加 剂 条 件 , 进行 添加 剂 浓度 、 去 污 剂 浓度 以 及 沉淀 剂 浓度 等 多 因素 的 多 维 搜索 , 并 且 要 经 常 通 过 X 射 线 衍射 实验 鉴定 唱 体 的 质量 是 否 确 有 改善 。 2.4 Wor iE Dicelle £1 (7 (25 _ ms 在 从 生物 膜 上 被 去 污 剂 分 子 解 离 下 来 后 , eB TES RAR D BETES TATE RH 境 中 时 , 很 多 膜 蛋白 容易 遭 到 外 环境 对 其 结构 造成 的 扰动 , 并 进一步 | 起 变性 和 聚集 ,有 时 甚至 还 会 遭 到 蛋白酶 的 降解 。 针 对 这 一 问题 ,Landau 和 Rosenbusch 于 1996 年 提出 采 用 脂 立 方 相 来 模拟 生物 膜 环 境 , 将 膜 蛋 白 加 入 到 这 一 系统 中 可 以 保持 其 生物 学 活性 和 结 构 的 完整 性 。 在 这 种 双 连 续 的 脂 立方 相 中 ,由 脂 质 分 子 构 成 向 三 维 方向 扩展 的 弯曲 的 双 分 子 层 , 水 通道 贯穿 其 中 , 物 质 可 在 其 中 自由 扩散 〈 图 2-4)。 膜 蛋白 在 脂 质 双 分 子 层 中 也 可 以 自由 扩散 , 这 样 就 有 可 能 形成 相互 接触 的 三 维 结构 并 生成 品 核 和 长 成 晶体 。 用 这 种 方法 他 们 成 功 地 获得 了 高 度 有 序 的 bR 三 维 晶体 。X 射 线 衍 射 实验 的 结果 表明 这 种 晶体 SS 一 人 i856. . Po Some os) ee a "i ys Bit RE] 膜 蛋 白 从 脂 立 方 相 中 结晶 出 来 的 示意 图 ( 引 自 Caffrey 2003, , 稍 作 修改 ) MeFi SAA ARIA (PELE) 可 以 通过 连续 的 脂 双 分 子 层 横向 扩散 到 层 状 相 (lamellar phase) 中 并 进 一 上 堆积 成 I 型 晶体 。 沉 淀 剂 等 水 溶性 成 分 则 可 在 互通 的 水 通道 系统 COE) 中 自由 扩散 , 促 使 膜 蛋 和 白 结 品 25 BQH WE A = FEZ th 属于 工 型 膜 蛋白 唱 体 , 即 由 二 维 唱 体 点 阵 在 第 三 维 方向 上 有 序 排列 而 成 (Landau et al. 1996)。 此 后 , 脂 立方 相 方法 被 推广 应 用 到 几 种 膜 蛋 白 的 三 维 结 唱 上 , 包括 细菌 光合 反应 中 心 、 细 菌 捕 光 复合 物 、 盐 视 紫 红 质 等 (Chiu et al. 2000)。 采 取 这 种 方法 生长 出 来 的 bR (Pebay-Peyroula et al. 1997, Luecke et al. 1998, Luecke et al. 1999) 、 盐 视 紫 红 质 (Kolbe et al. 2000) 、 感 觉 视 紫红 质 (sensory rhodopsin) (Luecke et al. 2001, Royant et al. 2001 ) 以 及 细菌 光合 反应 中 心 (Katona et al. 2003) 的 I 型 三 维 唱 体 已 用 X 射 线 唱 体 学 方法 训 定 了 高 分 辩 率 的 三 维 结构 , 其 中 分 辩 率 最 高 的 可 达 1.55 A (Luecke et al. 1999)。 脂 立方 相 方法 使 那些 在 去 污 剂 微 吉 中 不 稳定 的 膜 蛋 白 的 三 维 结晶 和 品 体 结构 解析 变 为 可 能 。 Bicelle 是 由 特定 的 脂 和 两 性 小 分 子 混 合 物 形成 的 微小 双 分 子 层 圆 盘 状 结构 , 它 和 脂 立方 相 都 可 用 于 在 体外 模拟 天 然 膜 脂 双 分 子 层 的 环境 , 膜 蛋 白 处 于 这 两 种 脂 相 中 比 在 去 污 剂 微 圳 中 更 加 稳定 。Faham 和 Bowie (2002) 将 bR 插入 到 bicelle 中 , 首 次 成 功 地 在 bicelle 介质 中 生长 出 了 高 度 有 序 的 bR I 型 晶体 并 测定 了 其 2.0 A 分 辩 率 的 结构 , 从 而 为 膜 蛋 白 品 体 生 长 提供 了 一 种 新 的 方法 , 证 实 了 膜 蛋 白 不 仅 可 以 在 去 污 剂 微 吉 和 脂 立 方 相 中 结晶 , 而 且 还 可 以 在 第 三 种 介质 bicelle 中 长 出 适合 于 结构 解析 的 有 序 三 维 唱 体 。 25 抗体 片段 辅助 下 的 膜 蛋 白 三 维 结 品 4 就 大 部 分 的 开 型 膜 蛋白 品 体 而 言 ,, 膜 蛋白 的 膜 外 亲 水 表面 之 加 的 极 性 相互 作用 对 于 稳定 品 体 堆积 起 着 主导 作用 。 为 了 加 强 膜 外 杀 水 部 分 之 间 的 相互 作用 , 促 进 膜 蛋白 的 结 晶 并 提高 品 体 堆 积 的 有 序 性 , 可 以 采取 两 种 策略 来 达到 这 一 目的 : (1) 如 上 所 述 , 适当 地 缩小 去 污 剂 微 吉 , 可 以 使 得 更 多 的 膜 蛋 白 亲 水 表面 暴露 出 来 并 参与 晶体 接触 (crystal contact) , 有 具体 可 以 通过 改变 去 污 剂 的 种 类 或 加 入 两 性 小 分 子 以 达到 缩小 微 圳 的 目的 (2) 用 水 溶性 蛋白 与 膜 蛋 白 特 异性 结合 , 扩 大 膜 蛋白 的 极 性 亲 水 区 。 这 种 水 溶性 蛋白 可 以 是 天 然 来 源 的 蛋白 , 如 细胞 色素 氧化 酶 的 底 物 一 一 细胞 色素 < (Ozawa et al. 1980), 还 可 以 是 抗体 片段 (antibody fragment) 。 针 对 特定 膜 蛋白 的 单 克 隆 抗 体 片段 (Fab 或 Fv 片段 ), 对 于 该 膜 蛋白 具有 很 高 的 亲和力 和 特异 性 , 因而 非常 适合 用 于 和 特定 膜 蛋白 结合 并 共 结 品 (Hunte et al. 2002)。 目 前 为 止 , 这 一 策略 已 经 被 成 功 地 用 于 辅助 三 类 膜 蛋 白 的 结晶, 即 细胞 色素 < 氧化 酶 (Twata et al. 1995, Ostermeier et al. 1997)、 细 胞 色素 pc; 复合 物 (Hunte et al. 2000, Lange and Hunte 2002)L) ke KesA Fil KvAP #4 --3 38 (Zhou et al. 2001, Jiang et al. 2003), Iwata (1995) FAA Se BED UAH Fv 片段 与 四 亚 基 细胞 色素 氧化 酶 结 合 形成 复合 物 后 成 功 地 获得 了 这 种 复合 物 的 有 序 三 维 晶体 , 并 测定 了 其 2.8 A 分 辩 率 的 结构 , 首 次 提出 并 证 实 了 这 一 策略 的 可 行 性 。 之 后 ,Zhou 等 (2001) 和 Jiang 等 (2003) 又 采用 单 克 隆 抗 体 的 Fab 片段 分 别 结合 KcsA 和 KvAP 两 种 钾 离 子 通道 , 获得 了 相应 复合 物 的 三 维 唱 体 并 最 终 测 定 了 结构 .还 有 两 例 分 别 是 细胞 色素 pc 复合 物 与 Fv 片 段 结合 (Hunte et al. 2000) 以 及 细胞 色素 zci 复 合 物 同 时 与 细胞 色素 c 和 Ev 片 段 二 者 结合 (Lange et al. 2002) 后 而 结 品 。 如 图 2-5 所 示 , 在 这 几 个 被 测定 的 复合 物 晶 体 结构 中 , 抗 体 片段 在 形成 有 序 的 晶体 点 阵 中 起 了 重要 的 作用 。 从 图 2-SA 可 以 看 出 细胞 色素 氧化 酶 之 间 并 AK AEA, 每 个 抗体 Fv 片 段 与 3 个 不 同 的 分 子 相 互 作用 。 首先, FA Pt SHAR J BS 开 的 周 质 面相 结合 ; 同时 它 的 Va 结 构 域 与 第 二 个 氧化 酝 IRE = 性 表面 相互 作用 ; 最 后 , 在 与 Fv 的 抗原 结合 位 点 相对 的 那 一 面 , 它 又 与 一 个 FEv 卢 溉 接触 。 这 样 就 构成 物 膜 Biomembranes 26 了 四 亚 基 细胞 色素 c 氧 化 酶 -Fv 片 段 复合 物 的 三 维 晶 体 点 阵 堆 积 的 分 子 基 础 , 但 是 由 于 在 c 轴 方向 上 (与 纸 面 垂直 方向 ) 缺乏 蛋白 之 间 的 直接 接触 , 导 致 了 该 晶体 衍射 的 各 向 异 PE, c 轴 方 向 上 的 分 辨 率 较 低 (Ostermeier et al. 1995)。 图 2-SB 显示 了 二 亚 基 细胞 色素 c 氧化 酶 -Fv 片 段 复 合 物 在 品 体 中 的 堆积 , 该 品 形 的 堆积 方式 与 上 述 不 同 , 可 以 观察 到 细胞 色素 c 氧 化 酶 的 胞 质 面 和 周 质 面 之 间 的 直接 相互 作用 , 其 余 的 接触 都 是 由 Fv 片 段 介 导 的 , 包括 Fy 与 氧化 酶 上 的 抗原 位 点 的 结合 以 及 两 Fv 间 的 肩 并 肩 相互 作用 (Ostermeier et al. 1997)。 在 KcsA-Fab 复合 物 三 维 品 体 中 (图 2-SC) , 所 有 的 蛋白 间 相 互 接触 均 由 相 邻 的 抗体 Fab 片段 参与 , 钾 离子 通道 被 悬空 而 不 参与 晶体 堆积 。 该 复合 物 晶体 的 衍射 分 辩 率 可 达 2.0 A (Zhou et al. 2001), 而 单独 的 钾 离 子 通道 蛋白 的 晶体 只 能 衍射 到 3.2 A (Doyle et al. 1998)。 细 胞 色素 c 以 及 Fv 片段 与 细胞 色素 be, 复合 物 的 结合 使 得 该 膜 蛋白 的 膜 外 极 性 区 域 得 到 有 效 的 扩充 , 此 三 元 复合 物 的 品 体 堆 积 主 要 由 两 个 水 溶性 蛋白 来 介 导 (图 2-SD)。 同 时 , 唱 体 中 还 存在 一 处 细胞 色素 pci 复合 物 的 膜 外 极 性 表面 区 之 间 的 直接 相互 作用 , 进一步 稳固 了 唱 体 堆积 (crystal packing) (Lange et al. 2002), a or. ee v5 单 克隆 抗体 片段 在 膜 蛋 白 三 维 晶 体 堆 积 中 所 起 的 作用 A. 四 亚 基 细 了 胞 名 素 c 氧 化 酶 与 单 克 隆 抗 体 Fv 片段 复合 物 晶 体 中 Fv 片段 (紫红 色 ) 与 细胞 色素 c 氧 化 酶 (绿色 ) 间 的 相互 作 FA (PDB code E); B. 二 亚 基 细 胞 色素 c 氧 化 酶 () 与 抗体 Fv 片 段 (紫红 色 ) 复合 物 晶 体 的 堆积 (PDB code 1AR1), C. i(k Fab! (红色 ) 与 KcsA 钾 离 子 通道 (紫色 ) 复合 物品 体 的 堆积 (PDB codz 1K4C); D. 细胞 色素 zc BAW ( 青 色 ) 与 底 物 细胞 色素 c ( 蓝 色 ) 以 及 抗体 Fv 片段 (紫红 色 ) 二 者 结合 所 形成 的 复 一 物 晶体 的 堆积 (PDB code IKYO) 27 Qe WE A= FEZ es 采用 抗体 片段 与 膜 和 蛋白 共 结 品 还 有 两 个 好 处 : 一 方面 ,通过 基因 工程 手段 在 抗体 片 段 上 加 上 一 个 亲 和 标 记 , 再 用 带 亲 和 标记 的 抗体 片段 与 膜 蛋 白 结合 , 就 可 以 大 大 简化 膜 蛋白 纯化 的 流程 (Kleymann et al. 1995) ;, 另 一 方面 在 相位 求解 方面 , 可 以 利用 已 经 发 表 的 抗体 Fab 片 段 的 结构 作为 初始 模型 ,采取 分 子 置换 法 来 解决 相 角 问 题 (Zhou et al. 2001), 从 而 可 大 大 提高 结构 解析 的 效率 。 目 前 看 来 , 虽 然 抗 体 Fv 或 Fab 片段 的 制备 工作 可 能 是 高 强度 而 且 困 难 重重 的 , 但 是 对 于 那些 已 经 具备 相应 的 很 好 的 杂交 瘤 细 胞 株 的 重要 膜 蛋 白 来 说 , 这 一 方法 的 应 用 可 能 会 大 大 加 速 这 些 膜 蛋 白 结 构 测定 的 进程 。 除 了 用 抗体 片段 和 底 物 蛋白 来 辅助 膜 蛋 白 结 品 外 , 还 有 人 尝试 其 他 水 溶性 蛋白 〈 如 蛋白 乙 等 ) 与 膜 蛋白 的 融合 表达 产物 的 结 唱 (Prive and Kaback 1996, Byrne et al. 2000)。 昌 然 在 这 种 融合 表达 产物 中 , 膜 蛋白 的 极 性 表面 得 到 扩大 , 但 是 由 于 水 溶性 蛋白 与 膜 蛋白 之 间 的 连接 区 柔性 较 大 , 不 利于 获得 有 序 的 三 维 品 体 。 因 而 , 这 种 方法 至 今 仍 未 取得 实质 性 的 突破 。 C Trimer | ) ™. a614(I) 二 十 面体 脂 蛋白 体 颗粒 的 组 装 和 堆积 A. LHC-II-DGDG 脂 蛋 白 体 颗粒 的 上 半 部 分 示意 图 , 视 角 沿 着 互 格子 单 胞 的 c 轴 ;,B. LHC-II 售 积 示意 图 , 为 了 清 晰 起 见 , 未 显示 出 辅助 因子 ,C. 三 十 面体 中 LHC-I 三 体 之 间 的 界面 ,DGDG 分 子 在 这 个 界 # 三 体 间 的 相互 作用 , 起 到 稳定 脂 蛋 白 体 颗粒 的 作用 , D. 亚 型 膜 蛋白 晶体 堆积 的 模式 图 。 图 示 一 个 单 胞 的 截面 ,# 致 沿 着 二 十 面体 Cs 轴 。 膜 蛋白 与 脂 和 去 污 剂 分 子 共 同 构成 一 个 表面 亲 水 的 封闭 脂 蛋白 体 圳 泡 , 再 六 “为 结构 基 元 堆 ” “三维 晶体 。 图 D 中 膜 蛋 白 的 末 水 表面 以 粉红 色 表示 , 玻 水 表 下 为 灰色 HE Wy i Biomembranes 28 “0 贡 寺 次 生 口 品 休 _ mm 高 等 植物 落 某 主要 捕 光 复合 体 II (light harvesting complex I], LHC-I) 唱 体 结构 解 析 工 作 最 近 已 被 完成 (Liu et al. 2004)。 膜 蛋白 LHC-I 在 晶体 点 阵 中 的 组 装 和 堆积 方式 (图 2-6B,D) 有 异 于 Michel 提出 的 I 型 和 开 型 膜 蛋 白 三 维 品 体 (Michel 1983)。 可 以 认为 LHC-I-DGDG 脂 蛋白 体 颗粒 (图 2-6A) 是 由 小 片 的 膜 蛋白 二 维 品 体 卷曲 而 成 的 一 个 封闭 的 球体 , 其 内 外 表面 均 为 亲 水 的 。 脂 蛋白 体 颗粒 在 晶体 点 阵 中 的 接触 完全 是 由 膜 蛋 白 的 亲 水 基质 表面 参与 的 极 性 相互 作用 。LHC-I 三 体 的 膜 内 蔗 水 表面 被 脂 双 分 子 层 中 的 脂 分 子 踊 水 尾部 履 盖 ,完全 不 参与 品 体 堆积 。 我 们 将 这 种 膜 蛋 白 三 维 品 体 归 类 为 II 型 膜 蛋白 晶体 (图 2-6D)。 随 着 这 一 新 型 膜 蛋白 唱 体 结构 的 测定 , 为 那些 致力 于 获得 高 度 有 序 膜 蛋 白 三 维 晶体 并 测定 其 原子 水 平 结构 的 研究 者 打开 了 一 条 可 行 的 新 道路 .对 于 那些 像 LHC- Seen Ue Needles 寺 构 域 而 难以 形成 高 度 有 序 的 I 型 和 II 型 三 维 品 体 的 膜 蛋 白 来 说 , 这 一 新 方法 是 值得 一 试 。 (Am SCH) Byrne B, Abramson J, Jansson M, et al. 2000. Fusion protein approACh to improve the crystal quality of cytochrome bo(3) ubiquinol oxidase from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta, 1459: 449-455 Chiu M L, Nollert P, Loewen M C, et al. 2000. Crystallization in cubo: general applicability to membrane proteins. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 56 ( Pt 6) : 781-784 Deisenhofer J, Epp O, Miki K, et al. 1985. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolution. Nature, 318: 618-624 Dolye D A, Cabral J M, Pfuetzner R A, et al. 1998 . The structure of the potassium channel: molecular basis of K* conduction and selectivity. Science, 280: 69-77 Faham S, Bowie J U. 2002. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol, 316: 1-6 Fromme P, Witt H T. 1998. Improved isolation and crystallization of photosystem I for structural analysis. 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Detergent structure in crystals of a bacterial photosynthetic reaction centre. Nature, 340: 659-662 Royant A, Nollert P, Edman K, et al. 2001. X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 98: 10131-10136 Timmins P A, Hauk J, Wacker T, et al. 1991. The influence of heptane-1,2,3-triol on the size and shape of LDAO micelles. Implications for the crystallisation of membrane proteins. FEBS Lett, 280: 115-120 Welte W, Wacker T. 1991. Protein-detergent micellar solutions for the crystallization of membrane proteins: some general approAChes and experiences with the crystallization of pigment-protein complexes from purple bacteria. In: Michel H. (ed.) Crystallization of Membrane Proteins. Boca Raton, Florida: CRC Press. p107-123 Zhou Y, Morais-Cabral J H, Kaufman A, et al. 2001. Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K* channel- Fab complex at 2.0A resolution. Nature, 414: 43-48 第 少 章 膜 重 日 三维 结 构 的 研究 现状 Ce 解析 膜 蛋 身 三 维 结构 的 手段 ee 31 3.2 ”解析 内 在 膜 蛋 白 三 维 结构 的 困难 及 对 策 cece ceeeeeceeseneseveneees 31 WR 应 用 可 次 性 抗体 LO 32 3.225 RNs Cee ee 3.2.3 Hla) RAR AVE TR, Were Tk = AE AH Aa ...33 3.3 PYZERR Se A = SESE SEER nn... cee 全 33 3.3.1 内 合 书 精 的 熏 自 家 族人 3.3.2 Beas P AY ATP 酶 0 34 33.3) PRY EE BE ns. escsessovasczasssvecnonastveyseesvinn ate a 334 离子 通道 36 3.3.5 1 光合 细菌 的 光合 反应 复合 物 的 结构 人生 37 在 膜 蛋 白 是 指 蛋白 质 全 部 或 部 分 镶 怠 在 脂 双 层 内 部 的 蛋白 质 , 它们 是 生物 膜 功能 的 主要 体现 者 。 受 体 、 通 道 、 运 载体 、 膜 孔 和 膜 酶 等 都 是 内 在 膜 蛋 白 , 其 主要 功能 包括 : (1) 能 量 转换 。 生 物 膜 可 以 将 光 能 和 化 学 能 转化 成 其 他 形式 的 能 量 供 细 胞 使 用 , 如 线 粒 体内 膜 呼 吸 链 上 膜 蛋白 ATP 合 成 酶 , 将 跨 膜 质 子 梯度 产生 的 化 学 能 转化 成 可 以 被 细胞 应 用 的 ATP 分子。(2) 信号 转 导 。 膜 蛋白 是 细胞 与 周围 环境 、 细 胞 内 细胞 器 之 间 进 行 物 质 和 信息 交换 的 重要 调控 分 子 。 如 细胞 膜 上 的 G 蛋白 偶 联 受 体 就 是 一 类 膜 蛋 白 , 当 细胞 外 信和 号 分 子 作 用 于 G 蛋白 偶 联 受 体 , 该 受 体 将 会 激活 G 和 蛋白, 从 而 使 细胞 外 的 信号 转 入 细胞 内 。(3) 物质 运送 。 细 胞 膜 是 由 脂 分 子 形成 的 脂 双 层 , 其 内 部 具有 了 玻 水 特性 。 正 是 该 玻 水 特性 , 使 得 细胞 外 和 细胞 浆 中 的 分 子 不 能 自由 通过 细胞 或 细胞 器 膜 。 因 此 , 细 胞 与 外 界 、 细 胞 器 内 与 细胞 浆 进行 物质 交换 是 通过 腊 蛋 白 完 成 的 。 基因 组 研究 结果 表明 原核 细胞 和 真 核 细胞 的 1/4~ 13 基 因 负 责 编码 内 在 膜 蛋 白 。 因 此 清楚 前 明 膜 蛋 白 的 功能 和 作用 机 制 , 研 究 膜 蛋白 的 结构 ,特别 是 三 维 空间 结构 是 非常 重要 的 , 也 是 必 不 可 缺少 的 。 目 前 已 确定 的 内 在 膜 蛋白 三 维 结构 只 有 100 个 左右 , 这 与 解析 31 BB FRE A= FEAL HAL 近 20 000 种 且 每 年 增加 2 000 +72 A ATS VER ABEL, We ae A AE Ae A th 2 ee te. HFREARAG BIR, ACA ED KES. (EGR AE REY 进展 十 分 缓慢 , 这 是 21 世纪 生物 学 研究 的 一 个 难题 , 也 是 结构 生物 学 研究 的 前 沿 ,, 富 于 挑战 性 和 竞争 性 。 从 1988 年 至 2004 年 , 诺 贝尔 化 学 奖 三 次 授予 与 膜 蛋 白 结构 相关 的 领 域 (1988 年 光合 反应 中 心 膜 蛋白 三 维 结构 的 解析 ,1997 年 AIP 合 酶 F, 部 分 三 维 结构 的 解 析 , 2003 年 钾 离 子 通道 三 维 结构 的 解析 )。 这 进一步 说 明 膜 蛋白 功能 与 结构 的 研究 一 直 是 国际 研究 的 热点 , 它 的 突破 无 论 是 对 人 们 更 加 清楚 地 了 解 生 命 基 本 过 程 还 是 在 实际 中 的 应 用 都 有 重大 意义 。 自从 1985 年 第 一 个 原子 分 辩 率 内 在 膜 蛋 白 一 一 光合 反应 中 心 解析 至 今 的 近 20 年 里 , 尽管 膜 蛋 和 白 的 三 维 结构 解析 在 许多 领域 取得 了 世人 瞩目 的 成 果 , 但 是 进展 仍然 十 分 缓慢 。 目前 已 知 的 具有 原子 分 辨 率 或 近 原 子 分 辩 率 内 在 膜 蛋 白 的 三 维 结构 100 个 左右 (http:// blanco.biomol.uci.edu/Membrane_ Proteins_xtal.html) , 这 有 既 与 基因 组 编码 的 大 量 膜 蛋 白 差 距 甚 远 , 同 时 与 每 年 近 2 000 种 新 的 可 溶性 蛋白 的 解析 相 比 也 显得 膜 蛋 白 三 维 结构 的 研 究 进展 十 分 滞后 。 3.1 ARPT AR Ait 1 TE es 目前 确定 蛋白 质 三 维 结构 有 3 种 手段 : X een RF (X-ray crystallography). Ha 晶体 学 (electron crystallography) 和 核磁 共振 (nuclear magnetic resonance, NMR )( 表 3- 1)。 比 较 这 3 种 手段 , 可 以 发 现 , 和 射线 品 体 学 是 获得 膜 蛋白 原子 分 辩 率 三 维 结构 的 主要 手段 , 但 其 前 提 条 件 必 须 获得 高 质量 的 单 品 。 蛋 白质 的 三 维 晶 体 是 利用 蛋白 质 的 亲 水 与 亲 水 的 相互 作用 ,但 由 于 膜 和 蛋白 的 踊 水 表面 以 及 在 膜 上 不 均一 的 取 辐 , 使 三 维 结晶 极为 困难 。 电 子 品 体 学 是 近 十 年 逐 壮 发 展 和 完善 起 来 的 确定 和 蛋白质 三 维 结构 的 方法 。 由 于 电 子 与 物质 的 相互 作用 远 远 大 于 X 射 线 , 因 此 很 王 和 较 小 的 二 维 品 体 即 可 应 用 该 方法 。 内 在 膜 蛋 白 的 二 维 品 体 的 形成 是 靠 蛋白 质 的 疏水 - 玻 水 相互 作用 。 鉴于 膜 蛋 白 的 玻 水 性 , 与 三 维 品 体 比较 , 内 在 膜 蛋白 的 二 维 唱 体 较 易 形 成 。 用 电子 晶体 学 方法 解析 中 等 分 辩 率 (<8A) 的 膜 蛋 白 三 维 结构 相对 比较 快 , 一 般 一 年 左右 可 完成 , 但 解析 到 原子 分 辩 率 仍 存在 很 多 困难 , 需 要 较 长 时 间 。 由 于 膜 蛋白 分 子 质 量 通常 都 较 大 , 并 且 不 溶 于 水 , 因 此 目前 核磁 共振 还 不 适合 膜 蛋 白 三 维 结构 的 解析 , 但 该 方法 仍然 在 不 断 探 索 中 。 eA 样品 分 辩 率 每 个 条 件 所 需 蛋 白 量 分 子 质量 X 射 线 晶 体 学 三 维 晶体 高 于 3.5A 20~ 40ug es 电子 晶体 学 二 维 唱 体 高 于 8.0A Sug 没有 限制 单 颗粒 低 于 20A 0.3ug >500kDa 核磁 共振 蛋白 质 溶液 高 于 3.5A 0.5mg <40kDa CC,5N 标记 ) 32 FEET FEHR Se ARES BOOT 21 mgs APRA Nik ok A = FE A PE MEE 2 BY 2A an PL. (1) RR eR, A 些 跨 膜 受 体 和 蛋白 的 合 量 为 微克 数量 级 ; (2) PRA 2. RA | 天然 脂 双 层 通常 不 稳定 , 失去 活性 , 因此 膜 蛋白 的 分 离 、 纯 化 比较 困难 , 愉 有 用 较 居 “的 条 件 (如 去 污 剂 、 iy = HK: Wy i Biomembranes 32 有 机 溶剂 、 超 声波 等 ) 才 能 将 它们 溶解 下 来 , (3) 膜 蛋 白 唱 体 生长 困难 ,因为 无 论 是 用 电 子 品 体 学 还 征 X 射 线 品 体 学 方法 , 都 需要 膜 和 蛋白 的 二 维 或 三 维 上 晶体, 品 体 的 生长 成 了 目 前 解析 膜 蛋 白 三 维 结构 的 瓶颈 。 尽管 如 此 , 经 过 20 年 的 艰苦 努力 , 特别 是 100 多 个 较 高 分 辩 率 膜 蛋白 三 维 结构 的 解 析 , 人 们 积累 了 一 定 的 经 验 。 在 解决 膜 蛋白 天 然 合 量 低 的 问题 上 , 人 们 首先 考虑 攻克 天 然 合 量 相对 较 高 的 膜 重 白 , 如 线粒体 呼吸 链 上 的 膜 蛋 白 复 合体 , 这 一 策略 显然 已 取得 成 功 , 在 已 解析 的 膜 蛋 白 三 维 结构 中 , 有 2/3 以 上 的 膜 蛋 白 是 天 然 富 含 的 。 另 外 ,人 们 已 开 台 莹 试 通过 高 效 表 达 有 活性 的 膜 蛋白 来 狭 得 大 量 蛋 白质 。 如 大 肠 杆菌 膜 孔 蛋白 OmpA、 FepA、GalT 以 及 链 霉 菌 钾 通 道 等 , 值得 注意 的 是 , 几乎 所 有 大 肠 杆 菌 膜 孔 蛋白 都 是 表达 成 “包含 体 , 该 状态 下 的 膜 蛋 白 通 常 没有 活性 , 但 通过 加 入 去 污 剂 后 , 使 膜 蛋白 溶解 , 从 而 恢复 活性 。 由 于 大 多 数 膜 蛋 白 都 可 以 “包含 体 ” 形 式 大 量 表达 , 因 此 , 怎 样 使 该 状 态 的 膜 蛋白 溶解 恢复 活性 将 是 非常 有 意义 的 工作 。 膜 蛋白 三 维 结晶 一 直 是 膜 蛋白 三 维 结构 解析 的 最 主要 障碍 , 但 近 几 年 来 以 下 方法 为 膜 蛋白 的 三 维 结 品 提供 了 一 些 新 思路 。 在 由 于 膜 蛋 自 通常 不 溶 于 水 , 而 蛋白 质 的 三 维 结晶 是 利用 蛋白 质 的 亲 水 特性 , 因 此 , 尝试 在 膜 蛋 白 接 上 较 大 的 亲 水 基 团 从 而 使 膜 蛋白 共 结 晶 。 该 方法 在 解析 细菌 细胞 色素 所 化 酶 中 首次 获得 成 功 Gwata et al.1995)。 亲 水 性 抗体 Fv 片段 可 以 和 细胞 色素 氧化 酶 的 两 个 亚 基 相 结合 , 而 Fv 片 段 容易 形成 三 维 晶体 ,进而 使 Fv 片段 与 细胞 色素 氧化 酶 共 结 晶 。 另 一 个 成 功 的 例子 是 细菌 K' 通道 的 测定 (Zhou et al. 2000), 由 于 应 用 亲 水 KK' 通道 的 抗体 Fab 片段 , 使 K'* 通 道 的 分 辩 率 从 3.2A 提高 到 2.0A, 清 楚 地 看 到 了 水 分 子 和 K* 在 通道 中 的 排列 , 解 释 了 K* 通道 的 高 选择 性 , 以 及 近乎 以 扩散 控制 转运 K' 跨 膜 。 图 3-1 中 显示 , 每 个 KK 通道 亚 基 与 一 个 Fab 片段 结合 ,水 溶性 的 Fab 片段 相互 作用 形成 K' 通 道 与 Fab 片 段 复合 物 的 晶体 。 下 到 | 细菌 KK 通道 (黄色 ) 与 抗体 Fab 片段 ( 蓝 色 ) 复 合 物 的 三 维 晶体 堆积 图 沪 图 为 沿 晶体 的 四 重 对 成 轴 垂直 于 膜 平面 方 33 B3H PAE SHER 3.2.2 ”在 脂 立 方 相 中 进行 结晶 众所周知 , 脂 不 溶 于 水 ,在 水 中 可 以 形成 lamellar 相 、Hexagonal 相 和 脂 立 方 相等 。 在 形成 脂 立 方 相 时 , 脂 双 层 既 连 续 相 互联 接 , 又 形成 一 些 空 lal, (EAA ER it). FRE 的 玻 水 特性 , 它 们 得 以 在 整个 脂 立 方 AA EASA UE A ih, TEE ARE 下 形成 三 维 品 体 。 图 3-2 为 脂 立 方 相 膜 型 。 可 以 看 到 , 该 脂 立 方 相 为 三 维 连 续 的 膜 脂 双 层 , 中 间 是 可 以 疲 动 的 水 溶液 区 域 , 而 玻 水 的 膜 重 白 和 去 污 剂 ied 脂 立 方 相模 型 则 扇 入 立方 相 的 脂 双 层 中 。 该 方法 在 右 侧 小 图 为 放大 的 脂 双 层 , 其 中 膜 蛋 白 嵌 入 其 中 菌 紫红 质 (Bacteriorhodopsin) 三 维 结 晶 中 获得 成 功 (Pebay-Peyroula et al. 1997)。 3.23 SIAR ATE, Me Ea TIE ik = Ae 7S i 在 解析 机 械 敏感 (mechanosensitive) 离子 通道 时 ,Ree 等 从 10 种 不 同 的 细菌 中 提取 该 离子 通道 , 其 中 6 种 形成 三 维 唱 体 , 但 只 有 从 肺结核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis) 提取 的 离子 通道 生成 的 三 维 唱 体 衍 射 到 3.5A, 从 而 解析 了 该 离子 通道 的 三 维 结构 (Chang et al. 1998), 总 之 , 以 上 3 种 方法 目前 还 不 具有 普遍 性 , 但 至 少 为 膜 蛋 白 的 三 维 结 唱 开辟 了 一 些 33 PY FEI ER EAA HIG 12S ees 在 过 去 的 20 年 中 , 尽管 膜 蛋白 三 维 结构 的 解析 进展 缓慢 , 但 是 成 果 仍 相当 显著 。 特 别 是 近 几 年 内 , 每 年 有 15~20 个 原子 分 辩 率 的 膜 蛋白 三 维 结构 的 报道 。 下 面 拟 介 绍 几 个 近 几 年 来 研究 进展 较 快 的 几 类 蛋白。 33.1 IAL; BNI) 55 7 mmm I 内 在 膜 蛋白 通常 是 以 w 螺旋 跨 膜 。 然 而 , 革 兰 氏 阴性 菌 、 线 粒 体 和 叶绿体 外 膜 蛋 白 WA BARBIE HK BAB (B barrel), 是 迄今 为 止 发 现 的 惟一 以 B 折 又 跨 膜 的 蛋白 质 家族 。 自 1990 年 第 一 个 B 折 又 结构 发 现 以 来 , 目前 已 经 获得 了 这 个 家 族 13 个 成 员 的 原子 分 辨 率 结 构 , 它 们 具有 相同 的 拓扑 结构 , 但 以 4 种 不 同 的 方式 转运 物质 , (1) 非特 异性 通道 , 如 Omp32 为 三 聚 体 (Zeth et al. 2000) , 每 个 单 体 由 16 个 B 折 又 形 成 B 桶 , 中 间 为 空 穴 , 使 物质 自由 扩散 通过 (图 3-3A)。(2) 特异 性 通道 ,如 麦芽 糖 孔 蛋白 (maltoporin) 由 18 个 B 折叠 形 成 B 桶 (Meyer et al.1997) , 但 中 间 有 3 个 loop (图 3-3B) (Hi MABRY SA, 正好 可 以 和 葡萄 糖 作用 , 从 而 特异 地 转运 糖分 子 。(3) 特异 性 主 : “ 运 体 ,, 如 FepA 由 22 个 B 折 又 形成 B 桶 (图 3-3C), 也 是 迄今 发 现 的 最 大 的 B 桶 。 与 ”上 两 种 通道 不 同 , FepA 的 B 桶 如 同一 个 脚手架 , 使 得 N 端 完全 在 桶 内 折 考 “从 而 特异 “地 转运 Fe*。 值 得 下 . ass ‘a _< WE yy Hey HE Wy fi Biomembranes 34 注意 的 是 , N 端的 尾部 在 B 桶 外 部 , 当 Fe” 结合 到 FepA 时 , 该 尾部 会 发 生 构象 变化 ,将 童 号 传递 到 内 膜 蛋白 , 从 而 局 动 FepA 转运 Fe"。(4) OmpA 家族 蛋白 。OmpA RIK A 是 迄今 为 止 发 现 的 最 小 的 有 B 桶 结构 , 由 8 个 B 折 又 构 成 〈 图 3-3D)(Pautsch et al. 1998)。 OmpA 和 蛋白 有 2 个 结构 域 : N 端 结构 域 和 C 端 结构 域 。N vite 1~170 受 基 酸 ) 跨 膜 形成 B 桶 , C 端 与 细 苗 的 外 膜 肽 聚 糖 结合 。X 射线 品 体 学 已 解析 了 端 结构 域 的 三 维 结构 , 证 明 是 由 8 个 B 折 县 构成 的 B 桶 , 并 且 内 部 由 妥 基 酸 残 基 形 成 气 键 网 路 系统 , 没有 明显 的 连续 和 孔 道 , 这 与 生化 实验 的 结果 相 矛 盾 。 生 化 实验 表明 OmpA 可 以 通 透 小 分 子 , 因 此 , 结 构 与 功能 上 的 差别 可 能 是 由 于 所 得 到 的 六 端 三 维 结构 是 OmpA 在 品 体 状 态 下 的 一 种 构象 , 也 可 能 是 生化 实验 中 分 离 纯 化 的 蛋白 含有 一 定量 的 杂 和 蛋白 或 OmpA 人 没有 正确 折 登 。 细菌 外 膜 孔 道 蛋 白 (porin) 的 三 维 结构 A. dE HaHa Omp32, 上 图 为 侧 视图 , 下 图 为 顶 视 图 ,B. 特异 性 通道 maltoporin, 顶 视图 ,C., 特 异性 主动 转运 体 FepA, 侧 视图 , D. OmpA, 侧 视图 3.3.20 78 POE ATP 瑟 P 型 ATP 酶 是 通过 水 解 AIP 产 生 的 能 量 主动 运送 离子 。 其 最 主要 特征 是 形成 磷酸 化 中 间 体 , 在 催化 过 程 中 发 生 Ei-E: 构 象 相互 转化 。 用 X 射 线 唱 体 学 分 别 解析 了 肌 浆 网 Ca- ATP 酶 (SR Ca?*-ATPase) {£4 Ca’* (E, - Ca’*) (To yoshima et al. 2002) 和 没有 Ca?* (E,) (Toyoshima et al. 2000) 存在 下 的 三 维 结构 ,证 明了 Ca?*-ATP 酶 在 转运 Ca 过 程 中 , 发 生 构象 变化 。Ca2-ATP 酶 由 跨 膜 和 胞 质 区 两 部 分 组 成 , 其 中 跨 膜 结构 域 包含 10 个 o Rete, PA7s Ca?* HE M4-M6 Fil M8 螺旋 之 间 。 胞 质 区 有 3 个 结构 域 : A (anchor) 结构 域 、 P (phosphorylation) 结构 域 和 N (nucleotide) 结构 域 。 从 图 3-4 中 可 以 看 到 ,Ca2-ATP 酶 从 E .Ca 构象 到 也 构象 , 胞 质 区 发 生 明 显 的 构象 变化 : N 结 构 域 相 对 于 膜 转 了 近 90” , 而 A 结 构 域 沿 水 平方 向 转动 110" , N 和 A 结 构 域 的 构象 变化 使 P 结 构 域 的 上 部 移动 了 近 S0A。 伴 随 着 胞 质 区 构象 的 变化 ,, 跨 膜 结构 域 的 % 螺 旋 也 相应 进行 重 排 , 从 而 在 构象 , Ca2-ATP 酶 对 Ca 有 高 亲 合 性 ; TEE, HG, Ca…ATP 酶 对 Ca 的 亲 合 性 较 低 , 这 样 通过 E,-E, A). RABE, (Ca? 从 膜 的 一 侧 转 运 到 膜 的 另 一 侧 。 35 BOR FRE A SAAT AR < ? 4 7 - < f Sipe s K400 a ps 4 ? Kt we jhe Om aes T2 fA / (R198) | 4 Ie” Pes al ~ a ‘ ~ Se 67 os mS So wA Uda sg W832 es: ‘a _ rat 2 [全 人 aq ; ea M10 eS f BS “. aS Ales L78 L78 Spt id 肌 浆 网 Ca*-ATP 酶 的 三 维 空间 结构 及 其 构象 变化 Ei 构象 为 蛋白 质 在 有 Ca 存在 下 的 三 维 结构 ,E, 构象 为 蛋白 质 在 抑制 剂 毒 胡 萝卜 素 (thapsigargin) 存在 下 的 三 维 结构 3.3.3 ”线粒体 呼吸 链 线粒体 是 “动力 工厂 , 提 供 动物 细胞 所 需 的 能 量 。 线 粒 体 呼吸 链 (respiratory chain of mitochondria) 主要 由 5S 个 膜 蛋白 复合 物 组 成 (图 3-5): NADH- 辅酶 Q 氧化 还 原 酶 ( 复 合 物 D、 琥 珀 酸 -辅酶 Q 氧 化 还 原 酶 (复合 物 ID、 辅 酶 Q- 细 胞 色素 c 还 原 酶 (复合 物 II, 又 称 bci 复合 体 )、 细 胞 色素 < 氧化 酶 (复合 物 IV,cytochrome c oxidase), ATP 合 酶 (复合 物 V,FIF.-ATPase)。 从 复合 物 I 到 复合 物 IV, 经 过 一 系列 氧化 还 原 反 应 , 在 线粒体 内 膜 两 侧 形 成 一 个 正 梯 度 化 学 电势 , 而 FF.-ATP 酶 利用 该 化 学 电势 提供 的 能 量 最 终 合 成 细胞 需 要 的 ATP 分 子 。 该 呼吸 链 复合 体 结构 的 研究 是 近 几 年 来 膜 蛋白 结构 解析 中 进展 最 快 的 , 从 1995 年 至 今 , 几乎 每 年 都 有 一 个 复合 体 结 构 获 得 解析 。 至 今 ,已 分 别 获 得 了 不 同 分 辩 率 的 所 有 复合 体 的 三 维 结构 。 用 近 几 年 发 展 起 来 的 电镜 单 颗 粒 技术 , 已 获得 了 复合 物 1 20A 分辩 率 的 结构 (Grigorieff 1998), 结果 表明 它 呈 “L” 型, 并 且 膜 区 与 胞 质 区 由 一 颈 部 相连 接 。 复 合体 开 到 复合 体 IV 都 已 获得 了 原子 分 辩 率 的 三 维 结构 (Lancaster et al. 1999, Iwata et al. 1998, Tsukihara et al. 1997), 这 些 结构 的 解析 清楚 地 解释 了 电子 在 每 个 复合 体 中 的 流动 , 以 及 最 终 在 线粒体 内 膜 两 侧 形 成 的 电子 梯度 。 FIF.-ATP 酶 一 直 是 膜 蛋白 结构 研究 的 热点 。 亲 水 部 分 F, 三 维 结构 的 解析 证 明了 Boyer 提 出 的 氧化 磷酸 化 构象 变化 假说 的 正确 性 , 而 驱动 E, eRe Sy F, Wat MATH ARR AT Ae. HUE, Walker 等 人 解析 了 Fi 和 跨 膜 c 亚 基 结 # = 维 结构 (Stock et al. 1999), 但 10 个 c 亚 基 组 成 的 环 使 人 们 更 难 解释 F。 皇 如何 驱动 F “构象 变化 ,这 还 AT ER A HEE 线粒体 呼吸 链 复合 物 三 维 结构 解析 1. 复 合 物 I; 2.2441; 3. 复合 物 II;, 4. 复合 物 IV;, 5. 复合 物 V | 细胞 内 区 ;的 浓度 为 细胞 外 的 10 倍 以 上 , 由 于 该 浓度 梯 差 , K' 利 用 K' 通 道 (Potassium channel) 跨 细胞 质 膜 到 细胞 外 。K: 从 膜 内 到 膜 外 的 运送 速度 非常 快 , K' 和 Na' 都 是 球 型 离子 , 并 且 K' 的 离子 半径 比 Na” (Ko 半径 为 0.133nm,Na' 半径 为 0.095nm), 而 Na' 却 不 能 利用 该 通道 跨 膜 。 那 么 K 通道 为 什么 具有 快速 、 高 度 选 择 性 地 转运 KK 呢 ? 1998 年 , 细菌 KK 通道 的 三 维 结构 解析 , 使 人 们 对 离子 通道 Gion channel) 的 运送 机 制 有 了 清楚 地 了 解 (Doyle et al. 1998)。 该 细菌 K' 通道 由 4 个 完全 相同 的 亚 基 组 成 , 每 个 亚 基 有 2 个 跨 膜 vc 螺旋 , 这 4 个 亚 基 围 成 一 个 中 心 孔 结构 (图 3-6) 。 该 孔道 胞 浆 侧 和 口 处 富 集 带 负电 人 符 的 筑 基 酸 , 这 样 可 以 吸引 阳离子 , 排 斥 阴离子 , 使 通道 具有 阳离子 选择 性 。 和 孔道 胞 浆 侧 窗 , 膜 外 侧 宽 , 呈 锥 形 。 孔 道 的 选择 性 是 由 中 心 的 Joop 区 形成 的 。 4 个 loop 形成 短 且 窒 的 孔道 , 每 个 loop 上 都 包含 人 通道 特征 的 保守 序列 : Gly-Tyr-Gly, 其 中 所 基 酸 残 基 上 的 内 基 氧 原子 深入 孔道 内 , 灌 垂直 于 膜 平面 排列 , we eget “过 ies" 在 溶液 中 与 水 分 子 绪 合 形成 水 化 的 K', 该 水 化 的 K' 进入 孔道 后 必须 去 掉 所 有 的 水 分 子 , 这 样 K' 可 以 刚好 与 孔道 loop 区 的 4 个 氧 原子 相互 作用 , 使 能 量 得 到 补偿 。 4h el L © a. 溶液 中 的 离子 “te : ’ _) O" ©- O Cc "0 @- O 细菌 钾 离子 通道 结构 图 A. PRES : 维 室 间 结构 的 顶 视 图 , 绿 球 为 通道 ,B. Fs ae Ae PEPE A a Azk{thy Nat #1 K*; b 为 Na 和 K; 通过 离子 通道 时 去 水 化 , 与 通道 上 的 氟 基 酸 残 基 上 的 六 相互 作用 -€ b。 离 子 通过 过 滤器 Wie Be] = AEE PI ELAR 而 对 于 水 化 的 Na'*, 进 入 孔道 后 , 由 于 Na 的 离子 半径 小 于 KK , 因此 , Na- 不 能 同时 与 loop 区 内 的 4 个 氧 原 子 同 时 作用 , 这 样 脱 水 过 程 中 需要 的 能 量 得 不 到 补偿 , 因 此 ,K* 通道 只 EAT ERE Hh EKO, ANF eiligbeK /\\AY Na*, iXxE— 7 A a lageateedlp 细菌 K* 通 道 解析 后 ,相应 的 有 电压 门 控 K' 通道 、C 驻 门 控 K 通道 和 内 整流 KK 通道 等 结构 的 报道 ,使 人 们 对 天 "` 通 道 有 了 更 进一步 的 了 解 。 因 此 , na 教授 获得 了 2003 年 诺 贝 尔 化 学 奖 。 3.3.5 ”光合 细 霄 的 光合 反应 复合 愧 的 结构 _ mmm, 光合 细菌 光合 反应 系统 单位 (photosynthetic system unit, PSU) 由 外 周 天 线 蛋白 LH I, 内 周 天 线 蛋白 LHI 和 反应 中 心 RC 等 三 部 分 组 成 ,它们 在 质 膜 上 的 空间 结构 被 认为 如 图 3-7 所 示 。LH I 位 于 LHI 的 外 侧 , 它 高 效 捕 歼 太阳 能 后 , 将 能 量 传递 给 内 周 天 线 蛋白 LHI, 然 后 再 传递 给 反应 中 心 RC。 反 应 中 心 利 用 该 激发 能 使 辅酶 Q BGT Ale (ubiquinone) 发 生 电 荷 分 离 , 最 终 使 膜 的 两 侧 产生 质子 梯度 ,用 于 ATP 合 酶 合成 AITP 分 子 。 目 前 , i 过 X 射 线 唱 体 学 的 方法 已 经 解析 了 有 具有 原子 分 辩 率 的 反应 中 心 RC(Deisenhofer et al. 1985) ADP ATP 细胞 质 ES 1 Whi Jay SEMA 紫色 光合 细菌 光合 反应 系统 蛋白 空间 排列 示意 图 BEES 紫色 光合 细 郴 嗜 酸 红 假 单 胞 菌 0 acidopihila) Yh je A LH II 形成 九 聚 体 的 三 维 空间 结构 A. 侧 视图 ,B. 顶 视 图 38 和 外 周 天 线 蛋白 LH I (McDermott et al. 1995) 的 三 维 空间 结构 。 虽 然 这 些 结构 来 自 不 同 的 光合 细菌 ,但 它们 的 结构 是 非常 相似 的 。 其 中 LH 工 由 cx、B 亚 基 形 成 的 二 聚 体 聚 集 在 一 起 成 环 型 结构 , 进 而 成 为 叶绿素 和 胡 葛 卡 素 的 支架 。 叶 绿 素 在 该 支架 上 形成 两 个 环 形 结构 , 分 别 对 应 于 LH II 的 800nm 和 850nm 的 光谱 吸收 ; 胡 葛 卜 素 则 与 蛋白 质 平 行 , 横 跨 细胞 膜 ( 图 3-8)。 (FEAL ) 5 Wh Buchanan S K, Smith B S, Venkatrami L, et al. 1999. Crystal structure of the outer membrane active transporter FepA from Escherichia coli. Nature Struct Biol, 6: 56-63 Chang G, Spencer R H, Lee A T, et al. 1998. Structure of the MscL Homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science, 282: 2220-2226 Doyle D A, Cabral J M, Pfuetzner R A, et al. 1998. The structure of the potassium channel: molecular basis of K1 conduction and selectivity potassium channel architecture. Science, 280: 69-77 Deisenhofer J, Epp O, Miki K, Huber R, Michel H. 1985. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolution. Nature, 318: 618-642 Grigorieff N. 1998. Three-dimensional structure of bovine NADH: Ubiquinone oxidoreductase(complex I) at 22 A in ice. J Mol Biol, 277: 1033-1046 Iwata S, Lee J W, Okada K, et al. 1998. Complete structure of the! 1-subunit bovine mitochondrial cytochrome be, complex. Science, 281: 64-71 Iwata S, Ostermeier C, Ludwig B, et al. 1995. Structure at 2.8A resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature, 376: 660-669 Lancaster C R D, Kroger A, Auer M, et al. 1999. Structure of fumarate reductase from Wolinella succinogenesat 2.2 A resolution. Nature, 402: 377-385 Meyer J E W, Hofnung M, Schulz G E. 1997. Structure of maltoporin from Sa/monella typhimurium ligated with a nitrophenyl- maltotrioside. J Mol Biol, 266: 761-775 McDermott G, Prince S M, Freer A A, et al. 1995. Crystal structure of an integral membrane light-harvesting complex from photosynthetic bacteria. Nature, 374: 517-521 Pebay-Peyroula E, Rummel G, Rosenbusch J P, et al. 1997. X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases. Science, 277: 1676-1681 Pautsch A, Schulz G E. 1998. Structure of the outer membrane protein a transmembrane domain. Nature Struct Biol, 5: 1013- 1017 Stock D, Leslie A G W, Walker J E. 1999.Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase. Science, 286: 1700-1705 Toyoshima C, Nomura H. 2002. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium. Nature, 418: 605-611 Toyoshima C, Nakasako M, Nomura H, et al. 2000. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature, 405: 647-655 Tsukihara T, Aoyama H, Yamashita E, et al. 1996. The whole structure of the |3-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8A. Science, 272: 1136-1144 Zhou Y, Morais-Cabral J H, Kaufmann A, et al. 2001. Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K* channel- Fab complex at 2.0 A resolution. Nature, 414: 43-48 Zeth K, Diederichs K, Welte W, et al. 2000. Crystal structure of Omp32, the anion-selective porin from Comamonas acidc ans, in complex with a periplasmic peptide at 2.1 A resolution. Structure, 8: 981-992 第 4s 5) GE Ha bah Gabe ees A | (Re Ze FR Ae AG EW ae 4 FEL SB GAR — FE Ba ATO ED, none ncceccecceccececcccecceucececceseccecensecees 40 CO Ne EL ini Jes 9G 5) Sg oe eR a Pe 4] 二 关 御所 国体 天 RE 42 EN 43 4.3 电子 显微镜 三 维 重 构 在 膜 蛋 自 结构 与 功能 研究 中 的 应 用 .………. 44 人 44 和 45 1 48 。 ZS 2004 年 6 月 ,国际 蛋白 质数 据 库 (protein data bank, PDB) 中 ] 蛋白质 高 分 辩 率 三 维 结构 的 数目 已 超过 23 000 个 , 而 其 中 高 . \ 分 辩 率 膜 蛋 白 的 结构 仅 有 100 个 左右 。1985 年 ,德国 马 普 生 物化 学 ) 研究 所 的 Deisenhofer 、Michel 与 Huber 利用 X 射线 晶体 学 方法 解 析 了 细菌 光合 反应 中 心 的 晶体 结构 , 开辟 了 膜 蛋 白 结 构 研究 的 新 纪 元 ,因此 论 获 1988 年 诺 贝 尔 化 学 奖 。 虽 然 X 射 线 唱 体 学 是 解析 蛋白 质 三 维 结构 的 有 力 工 具 , 但 在 膜 蛋白 结构 与 功能 研究 方面 仍 面临 重 大 挑战 。 第 一 , 大 部 分 真 核 细 胞 膜 蛋白 含量 非常 低 , 难 以 纯化 到 可 供 培养 三 维 品 体 所 需 的 量 , 同时, 膜 蛋 白 的 大 量 表达 还 是 一 个 没 解决 的 难题 ;第 二 , 几 乎 所 有 膜 蛋白 都 是 在 去 污 剂 中 结晶 的 , 其 结 构 是 人 否 反 映 其 在 膜 上 的 状态 仍 有 质疑 ; 第 三 ,结晶 的 蛋白 一 般 处 于 基态 , 难 以 得 到 激发 态 或 过 渡 态 等 瞬时 存在 的 功能 状态 ;第 四 ,很 多 膜 蛋白 形成 多 组 分 复合 物 , 这 些 复 合 物 很 难 获得 三 维 唱 体 。 用 核 磁 共 振 (NMR) 方法 虽然 可 测定 蛋白 质 在 溶液 ) 象 ,研究 蛋白 质 的 功能 状态 ,但 对 蛋白 质 的 分 子 质 量 有 限制 林 只 能 研究 分 子 质量 小 于 50 kDa 的 蛋白 质 分 子 结 榴 。 大 多 数 六 .和 白 是 多 亚 基 复 合 物 , 分 子 质量 超过 50 kDa, NMR ZA ARB 详 大 分 子 的 结构 力 KE yy f® Biomembranes 40 所 不 及 。 20 世 纪 60 年 代 , 英国 剑桥 MRC 分 子 生 物 学 实验 室 的 Klug 和 同事 开创 了 电子 显微镜 三 维 重 构 的 基本 原理 和 方法 , 分 析 了 一 些 病毒 颗粒 的 空间 结构 和 组 装 过 程 (DeRosier and Klug 1968), Klug 因此 荣获 1982 年 诺 贝尔 化 学 奖 。 现 在 ,电子 显微镜 在 研究 生物 大 分 子 结构 与 功能 方面 获得 了 广泛 的 应 用 。 特别 是 冷冻 电子 显微镜 术 (cryoelectron microscopy ) 的 引入 , 使 得 电子 显微镜 获得 了 突飞猛进 的 发 展 , 现 已 成 为 研究 生物 大 分 子 特 别 是 多 分 子 复合 物 结构 与 功能 的 重要 手段 。 本 章 介 绍 电子 显微镜 三 维 重 构 的 理论 基础 、 电 子 显 微 镜 三 维 重 构 方法 及 其 在 膜 蛋白 结构 与 功能 研究 方面 的 应 用 。 41 LP ER AE ESO SE TC 2 fi es 电子 具有 波 粒 二 象 性 。 电 子 波 像 光 波 一 样 可 以 成 像 , 即 电子 显 微 像 。 由 于 电子 显 微 镜 的 场 深 《depth of field) 远 远 大 于 样品 的 厚度 , 样 品 中 不 同 高 度 的 像 可 认为 是 被 聚焦 在 同一 个 平面 聚焦 平面 上 , 即 一 个 物体 的 电子 显 微 像 是 该 物体 在 垂直 于 电子 束 方向 的 平面 上 的 投影 。 电 子 束 在 通过 样品 的 过 程 中 与 样品 的 原子 发 生 相 互 作 用 , 受 到 原子 核 势 场 的 作用 , 使 电子 的 运动 方向 发 生 改 变 , 但 能 量 不 变 , 这 个 过 程 称 为 弹性 散射 。 由 于 样品 各 部 分 的 原子 分 布 不 同 , 对 电子 的 散射 能 力 不 同 ,使 得 电子 显 微 像 中 各 部 分 的 强度 (或 密度 ) 相对 于 平均 强度 有 明显 的 变化 , 这 种 变化 称 为 像 衬 度 (image 电子 束 方向 contrast)。 与 X 射线 品 体 学 类 似 , 物 体 对 电子 的 散射 可 用 结构 因子 (structure factor) 来 描述 ;与 X 射 线 品 体 学 不 同 的 是 , 从 电子 显 微 像 中 可 同 时 歼 得 结构 因子 的 振幅 和 相位 。 由 于 电子 显 微 像 是 物体 的 二 维 每 幅 显 微 像 投影 , 所 得 到 的 结构 是 物体 在 电子 束 部 是 投影 像 ais Ns 方 癌 的 投影 结构 。 为 获得 物体 的 三 维 po ea 结构 , 须 进行 三 维 重 构 (three-di- \ H mensional reconstruction), H4-- {i fit “. ’ BE Ae AP HA Retain es \ / 与 中 心 截面 定理 (central section a, sass4se pene 65 6.1.1 PRS... ccecconacccnvestoseseeansestesesdavesaessas tions man 65 Me cael eS: re a | nn 66 6.1 Bre RA TAH] wane decestocesicvemecosesSenwanss occstelcs'usesstaheeey eee 67 62) SUE Lod) ee 67 6.3 JSReC RABAT AE ec. lca. eae ee 69 6.3.1 FE SEPEHRAB ASAE IAS CIR oon cece ccccccecscccesccceccesecsncterseecensrers 69 G32 TREE FSI, covvciceveccecovecerecsesucnscoesallecdensststet cote 70 6.3.3 MEF BRAS AAW AY o.com ..:.0c.-ccencecsecs-coeve-coesnceee 72 63 了 到 “ 业 宫 体 膝 脂 移 雪人 移 和 9 73 eS UL en 73 6.4.1 改变 类 要 体 简 脂 组 成风 方法 .和 73 6:4.2. JERE TRE SAPO... cs. c.deccccsscisdecks- stand 15 BES s PINES 二 76 a ERICA Ve Be, 如 光 能 的 吸收 、 光 化 学 反应 、 电 [1] 子 传递 和 ATP 的 合成 等 都 是 在 叶绿体 类 圳 体 膜 (thylakoid membrane) 中 进行 的 。 和 其 他 生物 膜 一 样 , 类 圳 体 膜 主 要 由 和 蛋白 质 和 脂 类 构成 。 脂 类 物质 通过 有 序 排列 ,形成 精细 的 双 分 子 膜 结 构 , 而 那些 镶 骨 在 脂 膜 中 的 蛋白 复合 体 或 色素 蛋白 复合 体 , ACA, 光 系统 I 工 、 细 胞 色素 pe7 和 ATP 合 酶 等 , 在 光合 作用 中 行使 着 重要 功 能 (图 6-1)。 高 等 植物 叶绿体 类 圳 体 膜 舍 有 4 种 甘油 酯 , 其 中 3 种 是 糖 脂 , 即 单 半 乳糖 甘油 二 酯 (monogala ctosyt diacylgly cerol.MGDG) , WE SL HEA HAS (digalactosyl diacylglycerol, DGDG) 和 硫 代 异 鼠 李 糖 甘油 二 酯 (sulfoquinovosyldiacylglycerol, SQDG); ih — Fhe 脂 , 即 磷脂 酰 甘 油 (phosphatidylglycerol, PG)(Dorne et al. 1990), 图 6-2 给 出 这 些 化 合 物 的 化 学 结构 。 这 些 甘 油 酯 都 是 以 甘油 为 基本 骨架 , 并 在 甘油 的 sz-1 和 sz-2 位 上 分 别 连 接着 两 个 脂肪 酸 。 构 成 类 圳 体 膜 脂 的 脂肪 酸 几 乎 都 是 具有 0 一 3 个 双 键 的 十 六 碳酸 和 十 八 碳酸 ( 表 6-1), 65 BOF EPEMEISHVAL Ok. SDE 碳水 化 合 物 CO2 ADP y+ ATP NADP + NADPH rw TAU holt WU Wi | Ht EAS Fe HO Ht+0, Ht Ht Ht HA I 细胞 色素 HA I ATP 合 酶 bf BAM 类 圳 体 膜 结构 示意 图 脂 类 物质 构成 双 分 子 层 膜 , 光 系统 工 、 细 胞 色素 of 光 系 统 I 和 ATP 合 酶 等 蛋白 (色素 ) 复合 体 镶 对 在 脂 膜 中 , 行 使 着 光 能 的 吸收 、 水 的 氧化 、 电 子 传 递 和 ATP 的 合成 等 重要 光合 作用 功能 类 圳 体 膜 是 自然 界 中 最 独特 的 生物 膜 , 它们 由 自然 界 中 最 独特 的 色素 (叶绿素 )、 蛋 白 复 合体 和 甘油 酯 构成 。 了 解 这 些 色 素 、 有 蛋白 复合 体 和 甘油 酯 在 光合 作用 中 的 确切 功能 是 光合 作用 研究 的 重要 内 容 。 本 文 将 对 类 吉 体 膜 甘 油 酯 的 结构 、 生 物 合成 和 功能 作 一 概 述 。 俗名 学 名 结构 简写 棕榈 酸 六 - 十 六 烷 酸 CH,(CH,),,COOH 16:0 硬 脂 酸 六 十 八 烷 本 CH,(CH,),PE, PC Ws (16:0, 18:0) (16:0, 18:0) G3P LPA PA 叶 绿 体 内 被 膜 植物 甘油 酯 的 生物 合成 途径 中 的 PG 都 是 由 原核 途径 合成 的 。 其 他 甘油 酯 , 也 就 是 MGDG、DGDG 和 SQDG, 既 能 通过 原核 途径 合成 ,也 能 通过 真 核 途径 合成 ,要 取决 于 植物 的 种 类 。 例 如 ,在 郸 豆 和 大 麦 中 , 除了 PG 外 , 其 他 脂 都 是 由 真 核 途径 合成 的 。 相 反 , 菠 菜 、 拟 南 芥 等 植物 类 圳 体 膜 脂 中 的 40% 是 由 真 核 途径 合成 的 。 由 于 这 类 植物 的 MGDG 含 大 量 的 十 六 碳 三 烯 酸 (16 : 3), 所 以 , 人 们 称 这 种 植物 为 16 : 3 植物 〈16 : 3 总 连接 在 甘油 的 sz-2 位 上 ), 而 不 售 16 : 3 ABE ANA BEA HED EAH fil 18 : 3 植物 。 尽管 16:3 植 物 类 圳 体 膜 脂 中 含有 较 多 的 原核 甘油 酯 , 但 是 他 们 中 的 大 部 分 MGDG、 DGDG 和 SQDG 是 由 真 核 途 径 合成 的 , 这 说 明 大 部 分 植物 类 圳 体 膜 脂 的 合成 需要 叶绿体 和 内 质 网 的 密切 配合 。 而 且 , 大 量 的 脂肪 酸 和 脂 必 须 从 一 个 细胞 器 中 迁移 到 另外 的 细胞 器 中 , 目 前 尚 不 清楚 这 种 迁移 的 机 制 。 0.3.2 (AIF): 77) (7 gm 在 甘油 酯 合成 的 过 程 中 , 极 性 头 部 的 组 装 是 确定 甘油 酯 种 类 的 关键 反应 。 根 据 活化 反应 底 物 的 不 同 ,, 磅 脂 (phospholipid) 极 性 头 部 的 组 装 有 两 种 途径 , Bll: CDP- 二 脂 酰 匡 油 途 径 (图 6-5) 和 二 脂 酰 甘 油 途径 (图 6-6) 。 前 者 活化 的 底 物 是 CDP- 二 脂 酰 甘油 , 后 者 活化 的 部 位 是 CDP- 极 性 头 部 。 不 论 是 哪 一 条 合成 途径 ,磷脂 酸 是 磅 脂 合成 的 共同 底 物 。 通过 CDP- 二 脂 酰 甘 油 合成 的 磷脂 有 PG 和 DPG, 前 者 旺 叶 绿 体 类 圳 体 膜 中 的 惟一 磷 脂 , 后 考 仅仅 存在 于 线粒体 内 膜 中 。 高 等 植物 合成 PG 需要 经 过 两 步 反 应 , 首 先 ,CDP- 二 脂 酰 二 油 和 甘油 -3- 大 酸 反应 生成 兢 酸 磷脂 本 甘油, 然后, 磷酸 磷脂 酰 甘油 脱 磷酸 后 , AE BNE) EY. 25 )-F ABE EBE AN ENGHIA DY Bk, B08 71 O i C—O Cay Tote Hea Hae Hh es 啶 核 苷 酸 基 转移 酶 (DP: O | e O C—0=—P 0 P—0G O H, CDP - 二 脂 酰 甘油 CC 一 作坊 一 人 OF | O 磷脂 合成 中 的 CDP- 二 脂 酰 甘油 途 ele aE 和 图 6-5 5=5 / \ aa =>o- ran i OO a a \ So | | 8 本 | 有 Ca 一 O 和 猴 | x | : i 本 an op | 4 | 3 rs y ee 2 一 磷脂 酸 CMP - 脂 酰 甘油 磷脂 fee a ie Ae a BCA AY — Ase . l=) = HE ty WR Biomembranes 72 ee eee eee 合成 单 半 乳 糖 甘油 二 酯 的 前 体 是 UDP- 半 乳 糖 和 二 脂 酰 甘油 (图 6-7)。 在 细胞 中 , UDP- 半 乳 糖 形成 主要 用 于 半 乳 糖 脂 (galactolipid) 和 多 糖 的 合成 。 虽 然 半 乳 糖 脂 是 叶 绿 体 膜 系统 (包括 叶绿体 被 膜 和 类 可 体 膜 ) 的 主要 组 成 成 分 , 但 是 在 完整 的 叶绿体 中 没有 发 现 UDP- 半 乳糖 。 在 菠菜 叶片 中 人 们 发 现 UDP- 半 乳糖 在 细胞 质 中 的 浓度 很 高 。 在 细胞 质 中 ,UDP- 葡萄 糖 在 UDP- 葡萄 糖 -4- 表 异 构 酶 的 催化 下 生成 UDP- 半 乳糖 。UDP- 葡 葡 糖 -4- 表 异 构 酶 是 一 个 存在 于 细胞 质 中 的 酶 , 它 与 UDP- 区 萄 糖 和 UDP- 半 乳糖 合成 有 关 , 并 对 这 两 种 化 合 物 在 细胞 质 中 的 浓度 起 着 重要 的 调节 作用 。 由 于 MGDG 是 在 叶绿体 内 合 成 的 ,MGDG 合成 酶 位 于 叶绿体 内 膜 上 , 再 者 ,UDP- 半 乳 糖 不 能 够 自由 通过 叶绿体 被 噶 , 因 此 , 人 们 认为 只 有 当 MGDG 合成 时 ,UDP- 半 乳 糖 才 会 被 运输 到 叶绿体 内 被 膜 的 外 表面 参与 MGDG 的 合成 。 | | i See UDP --5.#F UDP 0 a oe | a OO a Ol Rs—--C —0—— Ci | | CH,OH H HO 二 脂 酰 甘 油 (DAG ) 有 OH H 单 半 乳糖 甘油 二 酯 ( MGDG ) HC- 一 0 一 C 一 R, | | a R, —-C—-O—CH C oe ee | sa HL H “ H Sy H H 双 半 乳糖 甘油 二 酯 (DGDG ) 半 乳 糖 脂 的 合成 途径 植物 的 质 体 中 有 一 种 特殊 的 磅 脂 酶 , 磅 脂 酸 在 这 种 酶 的 作用 下 生成 二 脂 酰 甘 油 ,, 它 是 糖 脂 合成 的 另 一 个 重要 反应 底 物 。 用 于 合成 糖 脂 的 二 酯 酰 甘 油 是 在 多 种 酶 的 作用 下 在 叶绿体 被 膜 上 形成 。 前 面 我 们 提 到 膜 脂 合 成 的 叶绿体 内 被 膜 上 有 一 种 磷脂 酸 磷酸 酶 , 它 可 以 将 磷脂 酸 上 的 磷酸 水 解 掉 , 产生 DAG。 糖 脂 合 成 的 这 条 途径 叫做 真 核 途径 ,由 这 条 途径 合成 的 脂 叫 做 真 核 脂 , 其 特点 是 在 甘油 的 第 一 位 和 第 二 位 上 分 别 连 接着 一 个 18 :1 和 16:0, 这 条 途径 也 产生 在 sz-1 和 sz-2 都 连接 16 : 0, 但 是 这 种 分 子 基本 上 是 PG 和 SQDG 的 分 子 , 二 脂 酰 甘 油 在 叶绿体 膜 中 的 合成 也 可 以 被 邑 外 的 一 类 酶 催化 , 即 糖 脂 酰基 转移 酶 , 这 , 酶 位 于 叶绿体 的 外 被 膜 上 。 在 糖 脂 酰基 转移 酶 的 催化 下 , 将 一 个 单 半 乳糖 甘油 二 酯 分 于 “的 半 乳 糖 转移 到 另 一 个 单 半 乳糖 甘油 二 酯 分 子 中 , 产生 了 一 个 双 半 乳糖 甘油 二 酯 和 一 个 二 脂 酰 目 油 分 于 图 6-7)。 73 6 JE FEPIGHIA DAK. 254) SHE 6.3.40 SORE (SIE 2 (mm AEPWRNG A ARIA AUER, 已 有 大 量 的 实验 证 据 表明 , 含有 不 饱和 脂肪 酸 的 膜 脂 对 膜 的 稳定 性 和 对 逆境 的 抗 性 具有 重要 的 作用 。 前 面 讲 到 , 脂 肪 酸 合成 的 最 终 产物 是 硬 脂 酰 -ACP (18 : 0-ACP) 和 棕榈 酰 -ACP (16 : 0-ACP) , 然 而 在 类 圳 体 膜 脂 中 , 大 部 分 脂肪 酸 是 不 饱和 脂肪 酸 。 因 此 , 在 甘油 酯 含 成 的 过 程 中 , 有 一 个 脂肪 酸 的 去 饱和 (desaturation) 过 程 。 脂 肪 酸 的 去 饱和 由 脂肪 酸 去 也 和 酶 催化 。 在 拟 南 芥 中 , 已 知 的 去 饱 和 酶 至 少 有 9 种 , 其 中 , 只 有 硬 脂 酰 -ACP 去 亿 和 酶 是 水 溶性 蛋白 , 其 他 的 都 是 膜 结合 蛋 白 。 由 于 膜 结合 蛋白 很 难 提取 和 纯化 , 利用 传统 的 方法 研究 膜 结合 的 去 饱和 酶 有 相当 大 的 困难 。20 世 纪 90 年 代 , 美 国 的 一 些 科学 家 以 拟 南 芥 为 材料 , 利 用 遗传 学 手段 对 膜 脂 去 饱 和 特性 进行 了 研究 。 他 们 利用 化 学 诱 变 手段 获得 了 9 个 不 同 的 膜 脂 去 饱和 酶 基因 的 突变 体 。 他 们 发 现 , 当 膜 脂 的 不 饱和 程度 降低 时 ,植物 的 生长 和 发 育 、 光 合作 用 、 叶 绿 体 的 结 构 和 功能 都 受到 影响 , 特 别 当 温度 降低 时 , 其 影响 尤为 严重 (Ohlrogge and Browse 1995)。 6.4 ARMIN HC ees SRE BE (AA 4 HH R(MGDG, DGDG, PG 和 SQDG), 但 是 其 分 子 种 类 可 达 40 种 以 上 , 不 同 脂肪 酸 在 甘油 sz-1 和 sz-2 位 上 不 同 的 组 合 方式 形成 了 不 同 的 甘油 酯 分 子 。 例 如 , 在 DGDG 中 , “4 16: 0 F118 :3 分 别 连 接 在 甘油 sz-1 和 sz-2 位 上 时 就 形成 了 一 种 分 子 , 但 是 ,将 上 面 的 两 种 脂肪 酸 的 位 置换 一 下 , 就 形成 了 另 一 种 分 子 。 上 面 的 两 种 分 子 分 别 简写 为 16 : 0/18 :3 和 18 : 3/16 : 0。 高 等 植物 类 圳 体 膜 脂 中 的 主要 分 子 类 型 列 于 表 6-2 中 。 高 等 植物 叶绿体 类 圳 体 膜 脂 另 外 一 个 显著 特点 是 含有 大 量 的 多 不 饱和 脂 肝 酸 ( 含 2 个 或 3 个 双 键 的 脂肪 酸 ) , 其 中 , 县 有 3 个 双 键 的 脂肪 酸 18 :3 和 16 :3) 是 类 圳 体 膜 中 最 主要 的 脂肪 酸 ( 表 6-1) , 其 含量 可 达 80% 以 上 。 甘油 酯 分 子 类 型 MGDG 18:3/18:3 18:3/16:3 DGDG 18:3/18:3 16:0/18:3 18:3/16:0 SQDG 16:0/18:3 16:0/18:2 18:3/16:0 16:0/16:0 PG 18:3/16:0 18:3/16:1(3t) 16:0/16:0 16:0/16:1(3t) 类 圳 体 膜 脂 分 子 的 多 样 性 和 高 度 不 饱和 性 的 生理 学 意义 一 直 是 多 年 来 人 们 关注 的 课 a, 尽管 人 们 做 了 极 大 努力 , 但 是 至 今 仍 未 解决 这 个 难题 。 在 过 去 的 30 年 中 , 本 研究 领 域 的 科学 家 们 发 明 或 借鉴 多 种 方法 , 对 光合 膜 脂 的 功能 进行 了 研究 (Murata and Siegenthaler 1998 ) 。 不 论 何 种 方法 ,改变 光合 膜 脂 及 其 分 子 组 成 ,然后 测定 光合 膜 或 蛋 白 的 功能 是 研究 光合 膜 脂 功能 最 基本 的 研究 思路 和 策略 ,下 面 介绍 几 天 研究 光合 膜 脂 功 能 最 主要 的 方法 。 6.4.1 Bee SME ITZL DCS 712; pees: RE l. Fl FAAS AS 7K AAA PR ICG AR BB oy EB 利用 不 同 的 甘油 酯 水 解 酶 处 理光 合 膜 可 以 去 除 部 ”甘油 酯 , 改 变 光 合 膜 脂 的 组 成 。 HE 4 i Biomembranes 74 例如 , 在 控制 条 件 下 , 脂 酶 (lipase) BT LARS SEAR) EA FC aE EH KAD 7k PH 磷脂 酶 (phospholipase A、C 或 D) 则 可 以 将 磷脂 栈 甘 油 (PG) 由 叶绿体 膜 的 外 层 向 内 层 逐 潮水 解 掉 。 用 这 种 方法 可 以 创造 出 脂 类 含量 不 同 或 脂 类 组 成 不 同 的 光合 膜 , 进 而 研 究 脂 类 组 成 变化 对 类 吉 体 膜 或 光合 膜 蛋白 功能 的 影响 , 以 确定 光合 膜 脂 的 功能 。 用 这 种 方法 , 人 们 了 解 到 类 圳 体 膜 脂 在 类 圳 体 膜 中 不 是 随机 分 布 的 ,MGDG 和 了 PG 主要 分 布 在 膜 的 外 分 子 层 , 而 DGDG 和 SQDG 则 主要 分 布 在 膜 的 内 分 子 层 〈Siegenthaler 1998) , 2. 膜 蛋白 和 膜 脂 的 体外 重组 甘油 酯 在 合适 的 条 件 下 可 以 形成 具有 双 层 分 子 膜 的 脂 质 体 。 通过 制备 甘 币 酯 及 其 分 子 组 成 不 同 的 脂 质 体 , 然 后 将 类 圳 体 膜 蛋白 组 装 到 不 同 的 脂 质 体 中 ,研究 不 同 脂 类 及 其 分 子 对 蛋白 质 功能 的 影响 。 人 们 已 经 利用 多 种 类 吉 体 膜 组 分 , 包 括 PS IL APS TAY ie by 中 心 复 合体 、 捕 光 蛋 白 复 合体 工 (LLHC-IID) 、 细 胞 色素 zs/ 和 ATP 合 酶 来 研究 膜 脂 的 功能 , 这 种 方法 在 阐明 光合 膜 脂 的 某 些 功 能 方面 发 挥 过 重要 作用 。 例 如 ,PG 在 LHC-I 三 聚 体 的 形成 中 具有 重要 作用 (Dubertret et al. 1994); DGDG 是 LHC-I 的 二 维和 三 维 结 品 过 程 中 所 必需 的 (Kiihlbrandt 1994) ) 。 这 种 方法 的 主要 不 足 是 其 结 末 不 能 完全 真实 地 反映 植物 活体 内 膜 脂 与 膜 蛋 白 相互 作 用 情况 。 为 了 克服 这 一 缺点 , 近 年 来 采用 基因 操作 方法 , 通 过 突变 、 抑 制 和 过 量 表 达 等 方法 改变 活体 中 的 类 宫 体 膜 脂 组 成 来 研究 这 些 脂 的 功能 。 3. 遗传 工程 现代 分 子 生 物 学 的 发 展 为 光合 膜 脂 的 功能 研究 提供 了 新 的 方法 。 通 过 抑制 或 过 量 表 达 脂 肪 酸 或 脂 类 合成 酶 基因 , 从 而 改变 了 某 个 特定 脂 或 脂肪 酸 在 类 宫 体 膜 中 的 组 成 。 (1) 基因 插入 失 活 通过 插入 抗生素 抗 性 基因 可 以 导致 一 些 特殊 基因 的 沉默 。 这 种 技术 被 成 功 地 应 用 于 沉默 去 饱和 酶 基因 , PPI ee SRE BR (Synechocystis sp. PCC 6803) 去 饱和 酶 基因 (Tasaka et al.1996)。 在 Synechocystis sp. PCC 6803 中 , 脂 肪 酸 可 以 在 A?、A2、A5 和 A5 四 个 部 位 形成 双 键 , 这 些 双 键 分 别 由 4 种 去 饱和 酶 催化 形成 。 因 此 , 这 种 蓝 细 菌 的 光合 膜 中 有 4 种 十 八 碳 不 饱和 脂肪 酸 , 它 们 分 别 是 壮 酸 (18 : 1D)、 亚 油 酸 (18 : 2)、 亚 麻 酸 (18 : 3) 和 十 八 碳 四 烯 酸 (18 : 4)。 利 用 基因 插入 突变 可 以 分 别 使 编码 这 些 去 饱和 酶 的 基因 失 话 , 从 而 可 以 得 到 膜 脂 中 只 含 18 :1、18 :1 和 18 :2 或 18:1、18:2 和 18:3 的 不 同 蓝 细菌 , 然 后 研究 膜 脂 脂肪 酸 的 变化 对 蓝 细 菌 的 光合 作用 、 生 长 和 发 育 的 影响 。 通 过 这 种 方法 人 们 发 现 , 在 高 光 强 和 低温 条 件 下 , 多 不 饱和 脂肪 酸 在 维持 光 系 统 开 的 稳定 性 方面 具有 重要 的 作用 。 尽 管 基 因 揪 入 失 活 在 监 细 瑚 中 获得 了 不 少 的 脂肪 酸 突变 体 , 但 是 基因 插入 失 活 技术 在 高 等 植物 中 的 应 用 却 有 很 多 困难 。 (2) 化 学 诱 变 基因 突变 技术 已 成 为 是 生物 学 研究 的 一 个 非常 有 用 的 工具 , 与 其 他 改变 膜 脂 的 技术 相 比 较 , 利用 突变 技术 的 研究 给 我 们 提供 关于 膜 脂 组 成 是 如 何 影响 其 功能 的 更 清晰 的 信 息 。 在 高 等 植物 中 , 人 们 普遍 采用 化 学 诱 变 方法 研究 膜 脂 不 人 包 和 脂肪 酸 的 功能 。Browse 等 (199。 以 模式 植物 拟 南 芥 为 材料 , 以 乙 基 甲烷 模 酸 盐 (ethylmethane sulfonate) 为 诱 变 Kl, Au 二 年 的 努力 , 获 得 了 一 系列 类 宫 体 膜 脂 脂肪 酸 去 亿 和 酶 的 基因 突变 体 。 他 们 还 通过 单 基 六 突变 体 之 间 杂 交 的 方法 , 获 得 了 多 基因 突变 体 , 为 光合 膜 脂 生物 合成 和 功能 上 SOx EE ANRGHIA DD A, FAIS DBE 的 研究 做 出 了 突出 贡献 。 (3) 转录 后 基因 沉默 最 近 发 展 起 来 的 RNA FHC (RNA interference, RNAi) 技术 为 研究 类 圳 体 膜 脂 的 功 能 提供 了 一 个 极 好 的 工具 。 一 些小 的 双 链 RNA 可 以 高 效 、 特 异 的 阻 断 体 内 特定 基因 表达 , 促使 mRNA 降解 , 导 致 细胞 表现 出 特定 基因 缺失 的 表 型 。RNAi 是 转录 后 基因 议 默 作用 的 重要 机 制 之 一 , 在 后 基因 组 时 代 的 基因 功能 研究 和 药物 开发 中 具有 广阔 应 用 前 景 (Couzin 2002), 。 拟 南 芥 脂肪 酸 去 饱和 酶 基因 KE4D2 (Stoutjesdijk et al. 2002) 和 杭 花 脂肪 酸 去 饱和 酶 基因 FAD2 Fl SAD-1 (Liu et al. 2002) 被 发 夹 RNA 介 导 的 转录 后 基因 沉默 (hairpin RNA-mediated PTGS); RNAi 技术 还 被 用 于 有 果 蝇 膜 脂 合成 及 其 调控 研究 (Dobrosotskaya et al. 2002) 。 可 以 预见 ,RNAi 技术 在 未 来 的 脂 类 物质 合成 代谢 和 类 圳 体 膜 脂 的 功能 研究 中 将 发 挥 重 要 的 作用 。 许 亦 农 实验 室 已 经 建立 起 了 利用 RNAi 改 变 烟草 类 圳 体 膜 脂 组 成 的 技术 体系 , 利用 这 一 技术 成 功 地 抑制 了 类 圳 体 膜 糖 脂 和 脂肪 酸 去 饱和 酶 的 表达 , 获得 了 一 批 叶 片 中 MGDG 相 对 含量 比 野生 对 照 低 50% 的 烟草 植株 , 这 些 植株 生 长 和 发 育 变 缓 , 叶片 呈 黄 绿色 。 所 有 这 些 形态 和 生理 的 变化 可 能 与 MGDG 缺 失 导 致 类 圳 体 膜 及 其 色素 蛋白 质 复合 体 结构 的 变化 有 关 , 这 些 工作 为 我 们 研究 类 圳 体 膜 脂 的 功能 定 基础 。 6442 RIREPSIDUIE 5 11/01? mmm 温度 是 植物 赖 以 生长 和 繁衍 的 重要 环境 因子 , 也 是 植物 在 地 球 上 分 布 的 关键 因素 之 一 。 按 照 对 低温 度 的 抵抗 能 力 , 陆 生 植 物 可 以 分 为 两 类 , 一 类 是 抗 冷 性 植物 (chilling resistant plant) , 另 一 类 是 冷害 敏感 型 植物 。 冷 害 敏感 型 植物 大 多 是 那些 起 源 于 热带 和 亚 热带 的 植物 。 冷 害 是 指 当 这 些 植物 生长 在 5~ 15C 时 所 受到 的 伤害 。 由 于 很 多 经 济 作物 (如 水 稻 、 玉米 和 大 豆 等 ) 是 冷害 敏感 型 植物 , 因此 , 冷害 每 年 都 要 给 农业 造成 巨大 损失 。 植物 抗 冷 性 机 制 是 多 年 来 人 们 关注 的 一 个 科学 问题 。 在 20 世 纪 70 年 代 , Lyons(1973) 首 次 将 生物 膜 脂 的 相 变 与 植物 的 抗 冷 性 联系 起 来 。 他 认为 , 低 温 下 (冰点 以 上 ) 生物 膜 凝 腕 相 的 形成 导致 一 些 植物 组 织 的 伤害 , 最 终 导致 村 物 死 亡 。 在 低温 下 ,冷害 敏感 型 植物 的 膜 脂 可 以 形成 凝 胶 态 , 而 抗 冷 性 植物 在 低温 下 仍 然 可 以 保持 液晶 态 。 由 于 每 一 种 脂 膜 的 物理 性 质 〈 凝 胶 态 或 液晶 态 ) 取决 于 这 种 脂 的 极 性 头 部 、 脂 肪 酸 链 的 长 度 和 脂肪 酸 饱和 程度 , 因 此 , 人 们 认为 , 改 变 生物 膜 的 脂 类 组 成 会 改变 植物 的 抗 冷 性 。 日 本 学 者 Murata(1989) 用 组 豆 藻 (Anacystis nidulans) 首次 对 这 一 假说 进行 了 验证 。 组 囊 藻 的 细胞 膜 结构 与 真 核 植物 的 叶绿体 类 似 , 有 类 圳 体 膜 、 质 膜 和 外 膜 。 他 们 最 初 观 察 到 , 细 胞 质 膜 在 低温 下 处 在 一 种 相 分 离 状 态 (phase-separated state) 时 , 细 胞 内 的 电介质 和 小 分 子 化 合 物 就 会 向 胞 外 渗 漏 , 从 而 导致 细胞 伤害 。 另 外 , 相 分 离 温度 和 细胞 的 低温 致死 温度 会 随 着 组 圳 藻 的 生长 温度 而 变化 。 但 是 在 高 等 植物 中 ,并 不 存在 像 蓝 细 菌 那样 的 相 变 现象 。 在 时 期 门 研究 中 , 人 们 试 图 寻找 植物 的 抗 冷 性 与 细胞 膜 脂 脂肪 酸 的 不 饱和 程度 之 间 扩 泪 关 竹 ,, 但 是 最 终 没 有 取得 令 人 满意 的 结 末 。 就 在 Lyons 的 假说 提出 10 年 后 ,Mnural 元 小 组 在 20 世纪 80 年 代 初 发 现 了 高 等 植物 叶绿体 类 圳 体 膜 的 PG 分 子 组 成 在 抗 准 中 不 抗 冷 植物 中 具有 显著 差 别 (Murata 1983) 。 在 随后 的 几 年 中 , 他 们 和 其 他 的 一 “是 究 小 组 对 不 同类 型 的 植物 进 All == 3) mel Mit { 生 物 膜 Biomembranes 76 行 了 分 析 , 结果 表明 , 植物 对 冷害 的 敏感 性 与 舍 有 饱和 脂肪 酸 和 反 式 十 六 碳 烽 酸 的 PG 分 子 [16 : 0/16: 0 F116 : 0/16: 1(3t), 1 4E4> RRA BRAD f (high melting point molecules) | 存在 着 显著 的 正 相 关 。 由 于 这 些 分 子 的 相 变 温度 在 室温 范围 内 , 因此 , Murata 等 认为 这 些 分 子 或 它们 与 类 圳 体 膜 其 他 也 和 程度 高 的 分 子 一 起 可 以 使 类 圳 体 膜 部 分 区 域 形成 凝 胶 态 , 从 而 造成 膜 的 相 分离 和 电介质 的 涂 漏 , 最 终 导 致 了 细胞 的 伤害 。 为 了 证 明 PG 在 植物 抗 冷 性 方面 的 作用 ,Murata 及 其 合作 者 做 了 一 个 著名 实验 , 其 结果 发 表 在 Nature 上 (Murata et al. 1992) 。 在 这 个 实验 中 , 他 们 利用 转基因 方法 , 通 过 改变 甘油 -3- 磷酸 酰基 转移 酶 (GPAT) 的 活性 , 获得 了 PG 饱和 程度 不 同 的 烟草 植株 , 比 较 了 这 些 植株 对 冷害 的 抗 性 。 GPAT 催 化 甘 宙 酯 合成 的 第 一 步 反 应 , 即将 酰基 酯 化 到 甘油 -3- 磷 酸 的 sz-1 上 的 反应 (图 6-4)。 植 物 细胞 中 有 两 种 GPAT, 一 种 存在 于 细胞 质 中 , 另 一 种 位 于 叶绿体 中 。 两 种 酶 虽然 催化 相同 的 反应 , 但 是 反应 底 物 即 酰基 的 供 体 不 同 。 在 细胞 质 GPAT 催化 的 反应 中 , 栈 基 的 供 体 是 酰基 -CoA, 而 在 叶绿体 GPAT 中 ,酰基 的 供 体 是 酰基 -ACP。 叶 绿 体 甘油 -3- 磷酸 酰基 转移 酶 的 底 物 专 一 性 〈 即 选择 16 :0 或 18 : 1) 决定 叶绿体 PG AY Te AE 度 。 在 抗 冷 性 植物 中 , 如 吾 豆 、 菠 莱 和 拟 南 芥 中 GPAT 选择 18 : 1-ACP 做 为 催化 底 物 ; 而 在 不 抗 冷 植物 中 , 如 水 稻 、 南 瓜 和 大 豆 中 ,GPAT 则 以 16 : 0-ACP 和 18 : 1-ACP 两 者 为 反应 底 物 。 其 结果 是 , 不 抗 冷 植物 比 抗 冷 植物 含 更 多 的 PG 饱和 分 子 。 南瓜 的 抗 冷 性 差 , 其 叶绿体 中 高 熔点 PG 分 子 含量 也 高 。 拟 南 芥 抗 冷 性 强 , 其 叶 绿 体 中 的 高 熔点 PG 分 子 的 含量 低 。 和 上 面 两 种 植物 相 比较 , 烟 草 对 冷害 的 抗 性 和 高 熔点 PG 分 子 含量 均 属 于 中 等 水 平 。 Murata 的 实验 室 (Murata et al. 1992, Sakamoto et al. 2003 ) 分 别 从 南瓜 和 拟 南 芥 中 克隆 了 CGP47 基 因 , 然 后 将 它们 转 到 不 同 的 烟草 中 去 , 转 基因 烟 草 中 高 熔点 PG 的 含量 发 生 了 显著 的 变化 。 在 表达 南瓜 GPAT cDNA 的 转基因 烟草 中 , 高 熔点 PG 的 含量 由 36% 增 加 到 了 76%; 相反, 在 表达 拟 南 芥 GPAT cDNA 的 转基因 烟草 中 , 高 熔点 PG 的 含量 仅 为 28% 。 抗 冷 实 验 表 明 , 携带 南瓜 CP47 基 因 的 烟草 对 冷害 的 抗 性 减弱 , 而 携带 拟 南 芥 CP47 基 因 的 烟草 对 冷害 的 抗 性 增强 。 这 个 实验 用 转基因 的 方法 直接 证 明了 叶绿体 高 熔点 PG 分 子 对 植物 抗 冷 性 的 关键 作用 。 和 其 他 生物 膜 脂 相 比较 , 高 等 植物 类 吉 体 膜 脂 有 两 个 显著 的 特点 : 构成 类 圳 体 膜 的 甘油 酯 主要 是 糖 脂 , 而 类 吉 体 膜 以 外 的 其 他 膜 脂 , 包 括 质 膜 、 线 粒 体 膜 等 主要 由 磷脂 构 成 ; 类 圳 体 膜 脂 中 的 脂肪 酸 不 饱和 程度 , 即 含 两 个 以 上 双 键 的 脂肪 酸 数量 要 远 远 高 于 其 他 膜 脂 。 植物 中 的 脂肪 酸 合成 与 细 戎 中 的 非常 相似 。 乙 酰 -CoA 和 两 二 酰 -CoA 经 过 一 系列 反 应 后 最 后 生成 脂肪 酸 。 脂肪 酸 合成 的 最 终 产 物 是 标 榈 琶 和 硬 脂 酸 , 后 者 在 硬 脂 酰 -ACP 去 饱和 酶 作用 下 , 大 部 分 变 成 了 油 酸 -ACP。 所 以 ,16 : 0 和 18 : 1 是 参与 膜 脂 合成 最 主要 的 脂肪 酸 。 植 物 中 的 脂肪 酸 合成 途径 与 光合 作用 密切 关联 , 合 成 脂肪 酸 所 需要 的 还 原 力 abe AS tek. 类 至 二 膜 脂 的 合成 途径 有 两 条 , BD EMP 2a PAS TAY BMC) Aes 8 LE. AY Jt ad PHY 2a 4S 相互 协作 下 的 真 核 途径 .PA 是 膜 脂 合成 的 最 初 产物 。 两 种 途 生产 生 不 同 结构 的 膜 脂 分 子 , 而 SOx ZEEE BNEMIAD AK. FAIS DRE 由 原核 途径 合成 的 膜 脂 中 ,其 甘油 的 sx-2 位 上 总 是 连接 着 一 个 十 六 碳酸 , 而 由 真 核 途径 合成 的 甘油 酯 中 ,其 甘油 的 sx-2 位 上 总 是 连接 着 一 个 十 八 碳酸 。 真 核 甘 油 酯 和 原核 甘油 酯 的 比例 在 不 同 的 植物 中 有 很 大 的 差别 。 类 圳 体 膜 脂 的 不 饱和 程度 与 植物 的 抗 冷 性 密切 相关 。 抗 冷 植物 的 类 赛 体 膜 脂 中 具有 更 多 的 不 饱和 脂肪 酸 , 说 明了 不 饱和 脂肪 酸 可 以 增加 膜 在 低温 下 的 疲 动 性 和 稳定 性 , 从 而 提高 了 植物 的 抗 冷 性 。 ( 许 亦 农 ) AAA NE NEE LEGER AEE ESL LL LER S BAER ERIE Awai K, Maréchal E, Block M A, et al. 2001. Two types of MGDG synthase genes, found widely in both 16:3 and 18:3 plants, differentially mediate galactolipid syntheses in photosynthetic and nonphotosynthetic tissues in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 98: 10960-10965 Benning C. 1998. Biosynthesis and function of the sulfolipid sulfoquinovosyl diacylglycerol. Annu Rey Plant Physiol Plant Mol Biol, 49: 53-75 Browse J, Somerville C. 1994. Glycerolipids. In: Meyerowitz E. (ed.) 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EMBO J, 15: 6416-6425 Yang W, Liu S, Feng F, et al. 2004. Effects of phosphate deficiency on the lipid composition in cucumber thylakoid membranes and PSII particles. Plant Science, 166: 1575-1579 Yu B, Benning C. 2003. Anionic lipids are required for chloroplast structure and function in Arabidopsis. The Plant Journal, 36: 762-770 第 7 章 Ae Wie 3 A Jn 24 fig WR YE Ss oN he ey aoe ne ee A ee Reet AL ee 80 7.3 BRE PR IPG LL SA FS PEI EEG cccscceeccceecssccscssccssspsocevsavseccovenvodes 84 CO eee 有 生生 的 让 CR 84 (ARR 330) Sa eee ee er ee ee ee ae TACT TERT Goth ee ek nee ee 86 Td ae areas 图 的 提前 公布 , 现 在 我 们 已 经 大 步 跨 入 了 后 基因 组 时 代 。 可 是 , 仅 仅 几 十 亿 碱 基 序 列 并 不 能 告诉 我 们 : 所 有 这 些 基因 在 做 什 么 ? 它们 之 间 是 如 何 相互 关联 的 ?细胞 如 何 工作 ? 怎样 由 细胞 形成 7 过 机 体 ? 是 什么 错误 导致 疾病 ?衰老 是 怎样 发 生 的 ? 如 何 针对 性 的 开 ea 发 药物 ?这 些 便 是 后 基因 组 时 代 要 回答 和 解决 的 问题 。 蛋 白质 组 学 (proteomics) 也 正 是 在 这 种 形势 和 需求 下 出 现 并 越 来 越 受 到 广泛 的 关 注 。 它 主要 的 研究 内 容 是 : 确认 基因 组 编码 的 每 种 蛋白 质 及 其 在 生 命 过程 中 的 定量 表达 、 翻 译 后 的 各 种 修饰 , 表征 蛋白 质 之 间 的 相互 作用 及 确认 这 些 蛋 白质 复合 体 的 生物 学 功能 。 这些 生命 过 程 重要 的 性 质 单 从 基因 水 平 上 是 无 法 知道 的 ,如 经 翻译 后 的 各 种 修饰 ,一 个 基 因 序 列 有 可 能 产生 20 多 种 结构 不 同 的 蛋白 质 。 体 内 各 种 蛋白 质 的 表 达 、 功 能 的 发 挥 和 活动 规律 要 受到 时 间 、 空 间 、 环 境 等 因素 的 调控 , 这 些 只 有 用 蛋白 质 组 学 的 概念 和 技术 才能 解决 。 以 啤酒 酵母 为 例 , 根据 蛋白 质 组 学 建立 的 “酵母 蛋白 质数 据 库 已 有 约 6000 种 蛋白 质 , 包含 的 结构 和 功能 信息 有 : 等 电 点 、 分 子 质量 、 氨 基 酸 组 成 、 结 构 域 、 翻 译 后 修饰 、 亚 细胞 定位 、 功 能 类 别 、 酶 活 必 、 与 其 他 蛋白 质 的 相互 作用 、 与 疾病 的 关系 、 与 人 相关 下 所 质 的 同 源 性 、 突 变 表 型 等 。 依 据 和 蛋白 质 组 图 谱 可 使 我 们 追踪 名 条 信号 途径 中 各 个 蛋 白质 分 子 是 如 何 相互 作用 的 , 一 条 信人 笃 的 改变 又 是 如 何 影响 其 他 信和 号 途径 的 。 大 多 数 疾病 都 是 由 .4 子 参与 而 发 生 , 因 而 这 显然 很 适宜 于 临床 医学 中 关于 病因 、 疾 ji 竺 异 标志 等 研究 。 为 找寻 有 效 he HE Wy ie Biomembranes 80 WARE, RBZ. Aa bE A i, A ire AUS 25 PEE EA 质 。 蛋 白质 组 学 研究 中 和 蛋白质 的 确定 、 表 征 和 功能 描述 三 大 过 程 中 首先 面临 的 是 将 细胞 内 上 千 种 蛋白 质 分 离开 , 目 前 都 征用 二 维 凝 胶 电 访 法 , 接着 是 用 质谱 、HPLC、N 端 氨基 酸 序 列 分 析 等 方法 对 蛋白 质 进 行 表 征 。 在 记录 和 分 析 蛋 白质 表达 谱 、 正 常 异常 的 差异 确 定 、 数 据 库 及 数据 整合 等 过 程 中 不 但 涉及 数据 自动 采集 和 成 像 技 术 , 还 要 依赖 于 生物 信 息 学 的 理论 和 分 析 。 在 确定 蛋白 质 功能 时 , 除 了 酶 活性 分 析 、 受 体 结 合 分 析 、 细 胞 内 定 位 《绿色 奖 光 蛋白 融合 法 )、 酵 母 双 杂交 及 基因 剔除 等 生物 学 方法 外 , XN AA, BZ 维 NMR、 质 谱 、 生 物 信息 学 等 都 是 强 有 力 的 技术 。 由 于 有 蛋白质 的 化 学 组 成 和 结构 比 起 DNA 要 更 复杂 和 多 样 , 技术 的 难度 是 可 想 而 知 的 。 目 前 人 们 正在 积极 研究 和 开发 各 种 微 量 、 快 速 、 高 通 量 和 高 自动 化 的 技术 , 特 别 是 基于 心 片 的 自动 化 技术 , 如 将 各 种 抗体 置 于 微 阵列 上 进行 未 知 蛋 白质 的 分 析 , 这 种 技术 用 于 疾病 诊断 也 非常 有 用 。 另 一 努力 克服 的 难点 是 如 何 将 玻 水 性 的 膜 蛋 白 从 膜 上 分 离 出 来 进行 分 析 , 因 为 许多 受 体 、 离 子 通道 等 起 重要 生理 功能 的 蛋白 质 都 是 膜 蛋 白 。 近 几 年 , 随 着 研究 的 深入 , 各 种 特定 生物 膜 蛋白 质 组 学 开始 请 现 , 如 线粒体 膜 重 白质 组 学 、 核 膜 蛋白 质 组 学 、 类 圳 体 膜 蛋白 质 组 学 等 。 本 章 以 人 红细胞 膜 蛋 白 为 对 象 , 就 目前 蛋白 质 组 学 的 通用 研究 方法 、 如 何 殉 服 分 离 膜 蛋 自 质 的 难点 及 已 获得 的 一 些 进 展 作 一 简要 的 介绍 。 7 生日 质 组 子 疙 着 蛋白 质 组 学 的 主要 任务 是 直接 在 蛋白 质 水 平 上 高 通 量 地 确定 基因 及 其 在 细胞 内 的 功 能 。 至 今 已 开发 的 研究 方法 有 : 基于 质谱 法 的 和 蛋白质 组 学 技术 、 基 于 阵列 分 析 (包括 高 通 量 酵母 双 杂 交 法 、 蛋 白质 微 阵列 等 ) 的 蛋白质 组 学 技术 、 基 于 X 射 线 品 体 学 及 NMR 法 的 结构 蛋白 质 组 学 技术 。 目 前 在 一 般 研究 中 最 为 成 熟 和 稼 用 的 是 二 维 电 访 结 合 质谱 测定 的 方法 。 首先 , 对 从 组 织 、 细 胞 或 细胞 器 中 分 离 到 的 蛋白 质 混合 体 样 品 根据 各 蛋白 质 等 电 点 和 分 子 质量 的 不 同 , 用 二 维 电 访 (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 技术 将 各 蛋白 质 的 组 分 分 离 和 展现 开 来 。 用 等 电 聚 焦 (isoelectric focusing, IEF) 进 行 第 一 维 分 离 时 , 在 20 世 纪 80 年 代 初 期 出 现 的 固 相 化 pH 梯度 (immobilized pH gradient, IPG) 胶 条 是 一 个 有 具有 里 程 碑 意义 的 进步 。 它 代替 以 前 用 载体 两 性 电介质 试剂 来 产生 pH 梯度 , 其 优点 在 于 使 蛋 白质 电 访 图 样 的 重复 性 大 大 提高 , 各 实验 室 之 间 的 实验 结果 能 相互 比较 。 同 时 , 也 提高 TRAJAN DR (HES mg) , 便 于 以 后 的 比较 和 分 析 。95% 以 上 的 蛋白 质 pI 在 3.5~ 10, 所 以 目前 一 般 商用 IPG 胶 条 的 pI 范围 也 都 在 此 附近 (pH 3 ~ 10, 另 外 还 根据 线性 和 非 线性 pH 梯度 以 及 胶 条 长 度 分 类 ) 。 从 2D 凝 胶 中 分 开 的 蛋白 质 可 用 考 马 斯 亮 赣 显 色 , 也 可 用 银 染 、 英 光 染 料 或 放射 性 标 记 。 蛋 白质 斑 点 根据 样品 的 种 类 可 达 几 千 甚至 上 万 个 ,在 做 不 同 条 件 下 蛋白 质 表 达 谱 比 较 或 病理 过 程 中 寻找 表达 异 第 的 蛋白质 时 ,已 有 商用 软件 对 2D 凝 胶 中 的 蛋白 质 斑 点 扫描 图 样 进 行 分 析 和 比较 。 接 下 来 的 工作 即 是 对 感 兴 趣 的 和 蛋白 质 进行 确定 。 各 种 蛋白 质 的 分 子 质量 BANE, 所 以 原则 上 根据 凝 胶 中 蛋白 质 斑点 所 在 处 分 子 质 量 的 参数 即 可 对 该 蛋 白质 了 予 , 确认。 但 一 般 SDS- 聚 两 炳 栈 胺 凝 腕 电 访 (CSDS-PAGE) 分 离 蛋 白质 时 对 分 子 质量 估计 的 旋 差 约 5% 一 10%, 因 此 还 要 再 根据 和 蛋白质 pPI、N 冰 儿 个 氮 基 酸 残 基 的 序列 、 重 和 白 81 ee ANE E AAAS 质 的 元 素 组 成 等 参数 或 免疫 印迹 等 方法 进行 评估 。 现 在 随 着 质谱 法 的 迅速 发 展 和 应 用 , 它 在 对 蛋白 质 的 鉴定 上 已 成 为 常规 的 方法 (测定 和 蛋白 质 分 子 质量 的 误差 已 < 1%) , 特 别 是 在 高 通 量 、 高 灵敏 度 及 正确 性 等 方面 显示 出 在 其 在 蛋白 质 组 学 研究 中 的 突出 的 地 位 。 此 外 , 质 谱 法 对 生物 技术 工艺 中 的 重组 蛋白 质 及 其 他 生物 大 分 子 的 质量 监控 、 探 测 及 表 征 蛋 白质 的 翻译 后 修饰 状态 等 方面 也 得 到 广泛 的 应 用 。 质谱 法 (mass spectroscopy) 的 核心 是 将 待 测 分 子 气 化 并 使 其 成 为 离子 , 然 后 按照 质量 电荷 比 (m/z) 进行 成 分 分 析 。 按 电离 法 的 分 类 , 在 蛋白 质 组 学 研究 中 最 篆 用 的 两 类 质谱 技术 是 : 基质 辅助 的 激光 解吸 只 离 子 化 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 和 电 喷 雾 离 子 化 (electrospray ionization,ESI) , 这 两 种 质谱 技术 都 是 在 20 tH 纪 80 年 代 末 得 到 迅速 发 展 , 提 出 这 二 种 方法 原型 的 Koichi Tanaka 和 John B. Fenn 分 享 了 2002 年 诺 贝尔 化 学 奖 。MALDI 法 的 基本 原理 是 : 将 和 蛋白质 或 肽 分 子 挨 入 进 低 分 子 质 量 的 晶 态 基质 中 , 后 者 吸收 激光 脉冲 的 能 量 后 气 化 , 同时 使 和 蛋白质 或 肽 分 子 荷 电 (单价 ) BEA AAR, FEARED BCR ASAI EE tay HL a od A “SE” Za BNE EE 的 质量 检测 和 分 析 。ESI 法 则 是 直接 用 于 液体 样品 分 子 的 测定 , a A HPLC 5X6 4 访 装 置 相 连 。 从 后 者 分 离开 的 蛋白 质 、 肽 分 子 等 液 相 微 镁 在 高 电压 和 气 六 下 脱 溶剂 分 子 并 呈 离 子 (单价 及 多 价 ) 形式 供 进一步 的 质量 检测 。 在 质量 检测 方面 , 根 据 原理 的 不 同 目前 主要 分 飞行 时 间 (time-of-flight, TOF)、 四 极 杆 电场 及 离子 阱 3 种 检测 法 。MALDI 及 ESI 都 可 和 这 3 种 质量 检测 法 中 的 任 一 种 偶 联 , 目 前 通常 MALDI 用 TOF 进行 质量 检测 , 而 ESI 则 采用 另外 的 两 种 , 用 MALDI 检 测 高 于 30kDa 的 蛋白 质 时 , 激光 脉冲 会 使 蛋白 质 在 一 定 程度 上 片断 化 , 而 且 大 的 蛋白 质 往 往 非 均匀 性 大 , 这 些 都 会 导致 谱 线 加 宽 、 灵 敏 度 降低 。 一 般 地 ,MALDT- TOF 是 根据 肽 质量 指纹 图 peptide mass fingerprinting, PMF) 来 确定 蛋白 质 。 此 方法 是 用 对 氨基 酸 序列 特异 性 的 蛋白 酶 水 解 蛋白 质 , 产生 一 组 该 蛋白 质 特 有 的 肽 ,用 MALDI 测 定 这 组 肽 的 质量 。 将 实验 所 得 的 肽 质量 图 和 理论 预示 的 作 比 较 , 即 可 进行 蛋白 质 的 确定 。 实 验 中 , 首 先 从 2D wee ( 或 电 转 印 的 PVDF AR) 上 将 待 测 的 蛋白 质 斑 点 割 下 , 脱 色 后 通 常用 胰 和 蛋白 酶 进行 酶 解 , 它 直接 切 下 下 游 处 常见 的 赖 氛 酸 或 精 氨 酸 , 即 切断 下 来 的 肽 C 端 都 为 赖 氨 酸 或 精 甩 酸 。 与 测定 的 肽 质量 图 和 数据 库 中 已 知 蛋白 质 的 理论 PMEF 相 比 较 , 便 可 确认 和 蛋白质 。 在 具体 的 比 对 过 程 中 , 还 要 输入 诸如 蛋白 质 来 产 、 分 子 质量 及 pI 的 估 计 值 等 辅助 信息 来 帮助 确认 。 用 序列 特异 性 的 和 蛋白酶 水 解 的 另 一 好 处 是 从 凝 胶 上 容易 将 处 理 后 水 解 的 肽 洗 脱 下 来 便于 测定 。 ESI 经 常 和 串联 质谱 (MS/MS) 相连 接 用 于 多 肽 的 测序 。 此 时 , 先 在 肽 混合 物 中 选 择 其 中 的 一 种 , 进 入 第 一 级 质谱 仪 , 通 过 和 情 性 气体 〈 毛 气 或 氮气 ) 碰撞 解 离 , 导 致 的 碎片 再 进入 第 二 级 质谱 仪 进行 测量 。 肽 段 离子 的 解 离 主要 发 生 在 沿 肽 骨架 的 肽 键 处 , 产 生 含 氨基 端 及 含 羧基 端的 碎片 ,分析 这 种 碎片 离子 谱 图 即 能 推论 出 此 上 肪 恨 的 氨基 酸 序列 。 HH MS/MS 测定 给 出 的 是 肽 段 的 结构 信息 , 而 不 仅仅 是 其 质 : 呈 和 数据 库 比 对 作 搜索 时 结果 的 专 一 性 及 可 信 性 更 好 。 此 碎片 数据 不 仅 能 用 于 己 质 序列 数据 库 , 而 且 也 能 用 于 搜索 EST 等 核 苷 酸 数据 库 , 甚 至 用 于 搜索 原 交 AA BCE ESE Se AT DA EET A act 日 图 7-1 表示 。 — HE Wy WR Biomembranes 82 ABE 点 分 离 ac 二 维 电泳 结合 质谱 测定 法 对 蛋白 质 的 确认 ( 引 自 Rajagopal and Ahern 2001) 蓝 色 箭 头 表示 样品 的 处 理 过 程 , 红 色 箭 头 表示 信息 传递 7.2 膜 蛋 白质 组 学 近年 来 对 不 少 生 物 全 基因 组 序列 的 测定 表明 , 膜 蛋 白 约 占 总 蛋白 的 30%。 各 种 膜 蛋 白 在 细胞 内 信和 号 转 导 、 能 量 转换 、 代 谢 物 和 离子 的 运输 、 细 胞 粘连 、 细 胞 内 甜 和 外 排 等 重要 生物 学 过 程 中 起 着 重要 的 作用 。 在 药理 作用 上 膜 蛋白 也 非常 重要 , 实 际 上 许多 成 功 的 药物 都 是 靠 调节 膜 蛋 白 的 活性 而 发 生 作 用 的 。 因 此 , 对 膜 蛋 白 的 研究 已 越 来 越 成 为 许 多 课题 研究 的 热点 和 着 眼 点 , 在 膜 蛋 白质 组 学 (membrane proteomics) 领域 也 如 此 。 用 二 维 电 访 分 离 膜 重 白 的 困难 主要 是 : (1) 由 于 膜 蛋 白 的 玻 水 特性 , 它 在 等 电 聚焦 时 的 水 相 环境 中 难以 溶解 ; (2) 膜 蛋 白 的 丰 度 一 般 不 高 , 因 而 在 通 第 凝 胶 中 难以 被 检测 ,这 在 分 析 细 胞 总 抽 提 溢 时 很 突出 , 但 对 膜 样品 未 必 如 此 ;, (3) RAR AY pli ae oe, I 而 在 一 般 酸 性 至 碱 性 学 围 (PI<8 ) 的 2D 凝 胶 中 不 能 显现 。 在 常规 生物 化 学 研究 和 一 维 凝 胶 电 访 时 , 最 常用 SDS 去 污 剂 将 膜 蛋 白 溶解 。 去 污 剂 分 子 的 玻 水 尾部 和 极 性 头 部 基 团 在 膜 蛋 白 的 溶解 过 程 中 起 着 双重 作用 : 尾部 能 插入 脂 质 双 分 子 层 与 距 水 性 的 氨基 酸 残 基 结 合 , 通过 形成 去 污 剂 分 子 的 微 团 形 式 将 膜 蛋 白 分 散 开 来 , 此 外 , 极 性 头 部 能 打 断 原 有 的 离子 键 和 氢 键 , 帮 助 膜 蛋白 的 分 散 。SDS 分 子 由 于 头 部 带 负电 ,SDS- 蛋白 质 复合 物 非 常 容易 溶 于 水 相 , 一 般 而 言 , 每 克 蛋 白质 能 结合 1.4g SDS。 虽 然 SDS 能 非常 有 效 地 抽 提 膜 蛋 白 , 但 在 作 二 维 电 访 的 等 电 聚 售 过程 中 是 不 允许 带电 和 荷 的 SDS 存在 的 【实际 应 用 中 能 “ 耐 受 ”少量 SDS 的 存在 ) 。 因 此 , 多 年 来 人 们 一 直 在 寻找 使 膜 蛋白 溶解 并 适 于 二 维 电 访 的 试剂 和 方法 。 在 二 维 凝 胶 上 分 离 膜 蛋 白 时 必须 满足 3 个 条 件 : (1) 膜 蛋 白 必 须 从 膜 中 被 抽 提 出 来 , 呈 可 溶 形式 〈 一 般 为 去 污 剂 一 蛋白 质 的 复合 物 ); (2) 生物 膜 中 的 脂 质 环境 必须 解 离 , 剩余 的 脂 质 不 应 干扰 IEF 过 程 ; (3) 在 IEF 过 程 中 , 膜 蛋白 必须 保持 在 可 溶 状 态 , 特 别 是 在 等 电 点 时 , 因 为 蛋白 质 在 此 时 的 净 电 街 近 于 和 去, 随 之 减 小 了 多 肽 之 间 的 净 电 排斥 , 因 而 溶解 度 最 低 , 这 可 能 会 导致 蛋白 质 的 训 证 或 吸 “ 在 IEF 的 基质 上 。 二 竺 电 访 中 用 于 蛋白质 可 溶化 的 试剂 通常 有 : 促 溶 剂 (chaotropic agent)、 去 污 剂 (detergent) 、 还 原 剂 。 促 溶剂 的 主要 作用 是 减少 氢 键 的 形成 , 使 蛋白 质 去 折 和 受 和 变性 。 尿 83 27 A: yf E AF 素 是 最 常用 的 一 种 , 常 用 的 浓度 为 5 ~ 9.5 molL。 但 尿素 引起 蛋白 质变 性 的 同时 也 使 蛋 白质 中 所 有 了 玻 水 性 基 团 暴露 于 溶剂 , 反 过 来 又 增加 了 玻 水 性 相互 作用 的 倾向 , 所 以 单纯 用 尿素 的 效果 并 不 好 , 特 别 是 当 样 品 中 有 脂 质 存 在 时 。 后 来 发 现 当 硫 甩 和 高 访 度 尿素 合 并 使 用 时 蛋白 质 可 溶 的 效果 更 佳 。 硫 脲 本 身 在 水 中 溶解 度 不 高 , 但 在 高 浓度 尿素 中 溶解 度 大 为 提高 。 典 型 的 搭配 是 2 mol/L 硫 脲 和 5 ~ 7 mol/L 尿素 , 但 这 仅 基 于 尿素 的 方法 , 对 内 在 膜 蛋 白 的 可 溶 效果 很 差 。 对 于 去 污 剂 , 必须 是 不 带 净 电 荷 的 非 离 子 型 或 兼 亲 型 的 类 别 , 以 使 蛋白 质 只 按照 自 身 所 带 的 电荷 进行 IEF。 常 用 的 去 污 剂 有 : 浓度 为 0.4% ~ 4% 的 NP-40、Triton X-100。 CHAPS 等 磺 基 三 甲 镶 乙 内 酯 类 的 兼 亲 型 去 污 剂 比 非 离子 型 的 更 为 有 效 , 是 目前 在 用 IPG 胶 条 作 IEF 时 的 首选 的 去 污 剂 (2% ~ 4% 浓度 ) 。 近 几 年 不 断 有 新 的 去 污 剂 开发 出 来 , 线 PETE aE — FA fe CAVA SB 3-10 (图 7-2) 就 是 其 中 的 一 种 , 虽然 它 和 尿素 的 相 容 性 不 高 , 但 它 结 合 尿素 、 硫 脲 、CHAPS 一 起 使 用 时 , EIB ANE. co 外 膜 蛋 白 的 分 离 上 有 很 好 的 效果 。 之 后 , 在 分 子 结 构 上 作 了 改进 ,ASB14 去 污 剂 做 到 了 和 尿素 有 很 好 的 相 容 性 。 用 于 二 维 电泳 的 几 种 兼 亲 型 去 污 剂 分 子 结构 式 还 原 剂 应 用 的 目的 是 解 离 蛋 白质 中 分 子 内 和 分 子 间 的 二 硫 键 , 这 常常 是 蛋白 质 溶解 的 一 个 关键 步骤 ,特别 是 对 那些 真 核 细胞 中 依靠 二 硫 键 来 维持 折 和 县 结构 的 蛋白 质 。 在 蛋 白质 溶解 和 IEF 时 最 和 营 用 到 的 还 原 剂 是 二 硫 苏 糖 醇 (DTT) 或 二 硫 赤 人 玖 糖 醇 (DTE), 浓度 范 围 为 20 ~ 100 mmolL。 然 而 ,DTI/DTE 十 弱 酸 , 过 量 使 用 时 蛋白 质 中 的 二 硫 键 会 再 氧 化 , 因 而 , 在 使 用 它们 时 IEF 时 间 不 宜 过 长 。 磷 化 氢 类 试剂 是 另 一 类 还 原 剂 , 在 低 浓 度 (2 mmol/L) 时 即 对 硫 醇 有 还 原作 用 。 目 前 , 在 二 维 电 访 中 常用 TBP (tributyl phosphine) it 行 蛋 白质 的 溶解 和 IEF, 虽 然 它 在 化 学 操作 上 比 DIT 难 一 些 , 但 对 半 胱 所 酸 的 还 原作 用 要 好 得 多 , 改善 了 和 蛋白质 的 可 溶性 。 这 种 性 能 改进 的 原因 在 于 TBP 不 市 电荷 , 在 整个 IEF 过 程 中 都 保持 有 还 原 能 力 , 因 而 减 小 了 二 硫 键 形成 所 导致 请 到 白质 聚集 。 再 有 , 与 其 他 BJ IAAL, TBP 在 碱 性 pH 梯度 仍 具 有 很 好 的 还 原 效果 Lf4 TBP 在 内 的 短 链 磷 化 氨 类 试剂 也 有 不 好 的 性 能 , 如 易 挥发 、 有 毒 、 浓 缩 状态 ARS Fn AAR, Be — AAS BY HE AR EH ASAD el, rit ELA 品 还 有 脂 质 的 干扰 。 因 此, 对 不 同 的 研究 对 象 要 结合 各 种 试剂 和 条 件 进行 试验 , 从 中 摸 84 Aa tH E77 SS. 7A PEW Et FE Se A ths aR SE ok, Fh de He Ti Se EAN HD TD TS REA AE WE I HL tk PT FB AY zh 28 A JF ESILMS/ MS 质谱 快速 分 析 蛋 白质 复合 体 成 分 .蛋白质 忆 片 等 。 当然 一 种 新 方法 的 真正 实用 化 还 要 解决 不 少 难点 和 关键 , 还 需要 不 断 改进 和 提高 。 在 相当 一 段 时 间 内 , 二 维 电 访 结合 质谱 测定 法 仍 是 膜 蛋白 质 组 学 研究 的 核心 技术 。 73 ”糖尿病 红 细胞 膜 生日 去 过 的 元 贡 _ mers 回顾 一 下 生物 膜 结构 与 功能 的 研究 历史 , 无 论 在 流动 镶 骨 模 型 的 提出 、 生 物 膜 的 流 动 特性 研究 、 细 胞 骨架 分 子 结构 的 曾 明 , 还 是 膜 蛋白 的 SDS ENC HL Ko SPR 的 突破 都 是 从 研究 人 红细胞 膜 开 始 的 。 因 此 , 红细胞 膜 (erythrocyte membrane) 长 期 来 作 为 “模型 生物 膜 ” 被 用 于 多 方面 的 研究 。 近 几 年 来 , 张 志 酋 等 在 红细胞 膜 蛋白 质 组 学 的 方 法 学 及 由 此 对 2 型 糖尿 病 (diabetes) 红细胞 膜 蛋白 表达 的 异常 开展 了 工作 , 下 面 就 这 些 方面 加 以 介绍 。 (3.1 2 | mee FA—2E SDS BEE HL KAT SPA a AAET SOA te, 目的 是 能 从 人 红细胞 膜 中 抽 提 出 最 多 的 膜 蛋 白 。 为 此 , *t CHAPS. SB 3-10, SB3-14, Triton X-114, ASB 3-16, ASB 14 等 去 污 剂 作 了 比较 。 红 细胞 膜 中 条 带 3 蛋白 是 含量 最 多 的 内 在 膜 蛋白 , 因 此 实验 中 将 它 作 为 “模型 膜 蛋 白 ” 来 评估 不 同 去 污 剂 对 膜 蛋白 抽 提 的 能 力 。 结 果 表 明 ,ASB 14 的 效 果 最 佳 ,图 7-3 显示 用 ASB 14 和 二 维 电 2%SDS 2%CHAPS 0.5% ASB 14 bk A ix FAY CHAPS 之 间 的 比较 。 可 见 ,ASB 14 比 CHAPS 抽 提出 更 多 的 条 带 3。 图 中 血 影 蛋 白 、 条 带 4.1、 条 带 4.2 及 肌 动 蛋白 句 为 周围 性 膜 蛋白 。 但 在 ie 3 AE HL OKIE, TEF 的 条 件 和 过 程 必然 会 条 带 41 对 最 终结 果 产 生 影响 ,这 是 最 关键 的 一 pe 4%. IEF 前 , 先 将 100 hg 总 蛋白 质量 的 红细胞 膜 样品 溶 于 300 wl es RATS FM 的 重 泡 涨 缓冲 液 中 , 溶 液 的 成 分 包括 ; 肌 动 蛋白 6 mol/ L fe 2, 2 mol/L Fath, 20 mmol/L DIT 及 待 试 的 去 污 剂 。 17 cm 长 的 IPG 胶 条 (pH 3 ~ 10) 在 重 泡 涨 液 中 水 化 后 进 行 IEF, IPG 为 第 二 维 SDS-PAGE (采用 10 % 聚 琴 烯 酰胺 凝 胶 ) 。 银 染 后 作 图 像 分 析 和 比较 , 供 质谱 测定 时 则 改 用 考 马 斯 亮 赣 显 色 。 图 7-4 显示 分 别 用 CHAPS 和 ASB 14 去 污 剂 得 到 的 人 红细胞 膜 蛋 不 同 去 污 剂 抽 提 红细胞 膜 蛋白 后 的 日 质 的 一 维 图 谱 , 显 然 , ASB 14 BSCR SDS-PAGE 图 样 bE CHAPS 好 。 85 B71 AE NRE AAA 分 子 质量 /kDa ch 分 子 质量 /kDa 20 用 4% CHAPS (A) 和 2% ASB 14 (B) 去 污 剂 时 人 红细胞 膜 蛋白 质 的 二 维 凝 胶 图 图 中 椭圆 区 域 为 条 带 3 所 在 的 位 置 732 5/5 1 “AS 对 得 到 的 蛋白 质 二 维 凝 胶 图 像 在 商用 扫描 仪 (Bio-Rad 公 司 的 Molecular Imaging FX BRAS) 上 转换 成 数字 化 图 像 , 备 份 保存 后 作 下 一 步 处 理 和 分 析 。 目 前 也 有 了 几 种 商 用 图 像 分 析 软 件 。 张 志 沈 等 使 用 Bio-Rad 公 司 的 PDQuest V.7.0 图 像 分 析 软 件 对 图 像 进 行 蛋白 质 班 点 的 定量 检测 、 归 一 化 处 理 及 蛋白 质 班 点 的 匹配 。 在 溶解 膜 样品 和 IEF Bir BE 用 ASB 14 作 为 去 污 剂 后 , 在 一 张 二 维 凝 腕 图 上 能 分 辩 和 定量 检测 1000 个 蛋白 质 斑点 。 在 对 12 名 健康 人 和 8 名 2 型 糖尿 病 患者 红细胞 膜 蛋白 的 二 维 凝 胶 图 进行 比较 后 ,发现 二 者 之 间 有 42 个 蛋白 质 斑点 的 表达 量 存在 显著 差异 (P< 0.05) (图 7-5 )。 患 者 中 ,27 SHE 点 的 表达 量 上 调 ,15 个 班 点 的 表达 量 下 调 。 pl 分 子 质量 /kDa 红细胞 膜 蛋白 二 维 凝 胶 图 上 2 型 糖尿 病 患者 表 :异常 的 蛋白 质 斑点 ( 红 圈 ) 86 ee ee ee | 下 一 步 便 是 用 质谱 法 确定 这 些 表 达 差 异 的 蛋白 质 。 将 待 测 蛋白 质 斑点 从 二 维 凝 胶 上 割 下 , 脱 色 后 用 胰 蛋 白 酶 进行 酶 解 , 在 MALDI-TOF (Voyager-DE PRO 型 号 ) 质谱 仪 上 UW E12 2E FA PME, 在 国际 互联 网 上 利用 MS-Fit 程 序 (http: //www.prospector.ucsf.edu) BY Mascot 程序 (http://www.matrixscience.com) FIFA HY PMF 数据 库 比 对 进行 蛋白 质 的 览 定 。 图 7-5 中 的 11 号 斑点 经 胰 和 蛋白酶 水 解 后 的 PMF 图 谱 见 图 7-6 所 示 , 经 鉴定 为 fotillin-1 膜 蛋白 。 它 在 2 型 糖尿 病 患者 红细胞 膜 上 的 含量 是 健康 人 的 (4.8 士 0.2) 倍 (P< 0.05)。 进 一 步 在 二 维 凝 胶 上 用 flotillin-l 的 抗体 作 了 原 位 Western 杂交 分 析 (图 7-7) , 确 认 了 11 号 斑点 确 是 flotillin-1 蛋白 。 对 患者 红细胞 膜 上 flotillin-l 含量 的 上 调 , 用 传统 的 一 维 SDS- PAGE 也 得 到 了 验证 (图 7-8)。 100 3897.2 二 维 凝 胶 上 的 11 号 蛋白 质 flotillin-1 进一步 用 Western 杂交 分 析 予 以 确认 N P F 相对 丰 度 /% 30 flotillin-1 "790 133541658 52002 2560.6 3001.0 B- Wah aA Wh te Le 11 325 ABE (flotillin-1) 胰 蛋 白 酶 FH flotillin-1 抗体 、B- 肌 动 蛋白 抗体 在 红 细 水 解 后 的 PMEF 图 谱 胞 膜 蛋白 一 维 SDS-PAGE 上 的 Western 杂交 分 析 N,, 健 康 人 样品 , P, 患 者 样品 , FE, 阳性 对 照 同样 , FA PMP 质谱 法 鉴定 了 图 7-53 上 的 8 号 和 42 号 蛋白 质 斑点 , 它 们 分 别 为 突 触 融 合 蛋 白 (syntaxin) 1C 和 精 氮 酸 酶 。 图 像 分 析 表 明 , 患 者 红细胞 膜 上 突 触 融合 蛋白 1C 含 量 与 健康 人 相 比 较 下 降 了 (8.3 + 0.1) (P< 0.001) , 精 氛 酸 酶 的 含量 则 上 升 了 (37.2 + 3.7) 倍 (P<0.001)。 Flotillin-1 蛋白 是 1997 年 在 小 鼠 脂肪 细胞 上 新 发 现 的 位 于 脂 生 中 的 膜 蛋 白 ,2001 年 在 人 红细胞 膜 上 被 确认 是 脂 生 中 的 主要 膜 蛋 白 。 在 肌 细 胞 和 脂肪 细胞 中 , flotillin-1 的 一 个 功能 是 参与 葡萄 糖 运 输 体 (glucose transporter) Glut 4 的 转 位 , 在 胰岛 素 作 用 下 flotillin-1 作为 连接 蛋白 (adaptor protein) 将 c-cbl/CAP 信号 复合 体 带 到 质 膜 的 脂 答 上 , 从 而 导致 将 Glut4 , 泡 质 中 转 位 到 质 膜 上 《图 7-9)。 肌 和 和 5 和 脂肪 细胞 中 Glut 4 转 位 到 质 膜 上 的 过 程 还 震 妥 圳 泡 运输 、 丢 向 和 膜 融 合 的 介 导 。 目前, 一般 的 共识 是 : 细胞 内 所 有 的 膜 融 合 事件 都 志和 捕 SNARE 假 说 , Abe HE 膜 上 的 突 蚀 融合 蛋白 1 和 SNAP25 及 圳 泡 膜 上 的 小 突 触 钨 至 白 (synaptobrevin) /VAMP q 7H AOR AREF Be flotillin EBA) iS % | flotillin/cbV/CAP 复合 体 参 与 Glut 4 的 转 位 (S| A Baumann and Saltiel 2001) £5 Ace a. 2 型 糖尿 病 患者 红细胞 膜 上 突 触 融合 蛋白 1 含量 的 显著 下 调 意味 着 即使 Hotillin-1l 含量 补偿 性 地 增加 , 但 由 于 膜 融 合 过 程 的 受阻 ,Glut 4 的 转 位 仍 受到 抑制 , 造 成 患者 对 糖 代谢 的 异常 。 但 红细胞 中 的 主要 葡萄糖 运 输 体 是 Glut 1, ik 乏 Glut4, 因 而 fotillin-1l 到 底 在 红细胞 膜 中 起 何 种 作用 以 及 与 2 型 糖尿 病 的 病理 机 制 有 何 种 联系 有 待 进一步 研究 。 目 前 已 表达 了 重组 flotillin-1, 正 进一步 从 它 在 红细胞 中 和 哪 些 蛋 白质 相互 作用 、 参 与 何 种 信号 途径 等 方面 进行 研究 。 另 外 , 也 有 必要 研究 在 患者 肌 细胞 和 脂肪 细胞 中 flotillin-l 的 异常 。 一 氧化 须 (NO) 是 一 种 重要 的 第 二 信使 , 在 细胞 内 它 由 一 氧化 气 合 酶 (nitric oxide synthase, NOS) 合成 , 有 不 少 证 据 表 明 NOS 参与 了 胰 铝 素 的 作用 。 精 氨 酸 酶 是 一 种 水 解 精 迄 酸 的 酶 , 它 和 NOS 的 作用 底 物 都 是 工 型 精 氨 酸 。 因 此 ,2 型 糖尿 病 患者 中 精 氨 酸 酶 表达 的 显著 增加 可 能 和 NOS 竞争 底 物 , 从 而 下 调 NO 的 产生 。 这 表明 ,NO 和 精 氨 酸 酶 的 途径 也 可 能 与 2 型 糖尿 病 的 发 病 有 关 。 精 氨 酸 酶 是 种 水 溶性 酶 , 它 如 何 出 现在 红细胞 膜 蛋 白 的 二 维 凝 胶 上 ? 我 们 知道 ,红细胞 中 许多 糖 酵 解 酶 都 和 条 带 SAY PE 这 也 是 这 些 酶 被 调控 的 一 种 方式 。 我 们 可 类 似 地 推测 : 红细胞 内 精 氨 酸 酶 也 可 能 和 条 带 3 的 胞 质 段 相 结合 , 当 然 这 还 需要 实验 证 实 。 以 上 仅 以 2 型 糖尿 病 为 例 , 介 绍 了 膜 蛋白 质 组 学 研究 的 意义 。 实 际 上 通过 这 种 类 似 的 研究 , 在 许多 影响 人 类 健康 的 重要 疾病 〈 如 肿瘤 、 神 经 退行 性 六 病 邱 ) 上 都 大 有 作为 。 若 由 此 发 现 新 的 约 物 作用 技 蛋 白 , 则 对 新 药 的 开发 将 更 具 重 至 的 应 用 价值 。 钱 小 红 , 损 福 初 . 2003. 蛋白 质 组 学 : 理论 与 方法 . 北京 : 科学 出 版 社 Aebersoid R, Mann M. 2003. Mass Spectrometry-based proteomics. Nature, 422: 198-207 Andersen J S, Mann M. 2000. Functional genomics by mass spectrometry. FEBS Lett, 480: 25-31 Baumann C A, Saltiel A R. 2001. Spatial compartmentalization of signal transduction in insulin action. BioEssays, 23: 215-222 Bickel P E, Scherer P E, Schnitzer J E, et al. 1997. Flotillin and epidermal surface antigen define a new family of caveolae- associated integral membrane proteins. J Biol Chem, 272: 13793-13802 Bivalacqua T J, Hellstrom W J, Kadwitz P J, et al. 2001. Increased expression of arginase II in human diabetic corpus cavernosum: in diabetic-associated crectile dysfunction. Biochem Biophys Res Commun, 283: 923-927 Bryant N J, Govers R, James D E. 2002. Regulated transport of the glucose transporter Glut 4. Nat Rev Mol Cell Biol, 3: 267- 277 Fasshauer D, Eliason W K, Brunger A T, et al. 1998. Identification of a minimal core of the synaptic SNARE complex sufficient for reversible assembly and disassembly. 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Proteins and proteomics: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press ATP 合 酶 一 一 一 个 最 小 的 蛋白 质 ay FR AIK FE BE UR NR oh AS 2 SEA RE 转换 光合 膜 蛋白 光 系 统 了 超 分 子 复 合 体 的 结构 与 功能 线粒体 能 量 转 拘 分 子 机 制 的 研究 进展 BT ATP AERP ISELAE -ccccccccbscovcesscsssecstevvdssssssoceesseems eases ee 90 8.2 ”氧化 磷酸 化 机 制 研究 与 ATP 合 酶 .0 91 8.2.1 {CREE ATP 各 酶 有 91 8.2.2 能 量 偶 联 构象 变化 假说 、 结 合 变 化 机 理 和 旋转 催化 假说 .. A eT Te 92 8.2.3 “和牛 心 线粒体 E,-ATP 酶 晶体 结构 的 解析 -.cccccccccccccseccceseeseceeeee 93 8.2.4 关于 而 ITP 酶 的 了 亚 基 旋转 实 骆 生 生生 和 94 8.3 ATP ABBA Fy 与 FF。 都 是 分 子 旋转 马达 occ cceccccecessseecereececnceeeeees 96 > on ll RE 99 TP 合 酶 (ATP synthase) X#K H*-ATP 酶 或 FIF,.-ATP 酶 , 是 参 与 能 量 代 谢 的 关键 酶 .ATP 是 提供 细胞 进行 各 种 生命 活动 ( 神 经 传导 、 肌 肉 收缩 、 物 质 运 送 等 ) 的 能 源 物 质 , 它 主要 是 通过 ATP 合 酶 来 催化 合成 的 。 人 们 往往 将 ATP 比 作 生 物体 的 能 量 “ 货 币 ” 以 说 明 它 在 能 量 代谢 中 的 重要 性 ,因此 也 可 以 将 ATP 合 酶 比喻 为 “ 印 钞 机 “。 有 人 人 估计, 人体 每 天 进行 正常 活动 所 需 的 ATP 量 约 等 于 他 的 体重 , 如 体重 为 70kg, 则 每 天 即 需 合成 70kg 的 ATP, 这 主要 是 由 人 体内 无 数 的 ATP 合 酶 来 合成 的 。ATP 合 酶 在 自然 界 分 布 很 广 , 在 真 核 细胞 中 的 线粒体 、 叶绿体 以 及 异 养 菌 和 光合 细菌 的 细胞 质 膜 中 都 有 它 的 存在 。 以 高 等 动物 为 例 , 线粒体 在 重要 组 织 (如 肝脏 、 心 WE. AE. ALA. Ai) 的 细胞 内 都 有 分 布 , 每 个 肝 细 胞 平均 约 含 1000 个 线粒体 , 而 每 个 线粒体 又 有 为 数 众 多 的 ATP 合 酶 , 因此 从 整 体 来 计算 ,ATP 合 酶 的 总 数 是 惊人 的 。 81 ATP erie ny 2H ATP 合 酶 主要 由 FE, ( 伸 在 膜 外 的 水 溶性 部 分 ) 和 FE (嵌入 膜 内 ) 9] 38x ATP 448 —— —?TPR)WEA RA HARI ATP 合 酶 主要 由 F, #0 F, 两 部 分 组 成 所 组 成 (图 8-1),, 不 同 物种 来 源 的 AITP 合 酶 所 含 的 亚 基 组 成 和 数目 不 尽 相 同 。 以 牛 心 线 粒 体 ATP 合 酶 为 例 , 它 的 Fi 含有 os、 户 、Y、6、g 共 9 个 亚 基 ,Fe 含 a、b、co 共 13 亚 dE, F, 与 F。 之 间 有 QOSCP 柄 相连 接 , 此 外 还 有 抑制 蛋白 。 线 粒 体 FIF.-ATP 酶 的 总 分 子 质 量 约 为 500kDa。 对 大 肠 肝 菌 ATP 合 酶 的 研究 较为 详尽 , 它 的 Pi 含 5 种 亚 基 o、B、Y、9、 8E, 分 子 质量 分 别 是 S$3.3kDa、50.3kDa、31.6kDa、19.3kDa 和 14.9kDa, Eat KAA OG, Bs. y. 5 和 gg。F' 的 总 分 子 质 量 为 382kDa。Fe。 由 3 种 亚 基 a、b、c 组 成 , 分 子 质量 分 别 为 30.3kDa、17.2kDa 和 8.3kDa,, 准 量 关 系 为 a、b:、ce_pv。F。 的 总 分 子 质量 约 为 164kDa, 此 大 肠 杆菌 FF.-ATP 酶 的 总 分 子 质 量 共 为 546kDa。 叶绿体 ATP 酶 由 CF, 和 CF。 两 部 分 组 成 , 它 们 的 亚 基 的 组 成 和 分 子 质量 与 上 述 两 种 ATP 合 酶 大 体 相 似 , 但 又 有 一 定 的 差异 。 8.2 和气 化 磅 酸化 记 利 研究 了 ATP 他 用 8.2.1 {EES ATP OAS ems 线粒体 是 细胞 的 能 力 站 。 耗 氧 细胞 的 氧化 主要 是 在 线粒体 中 进行 的 ,以 葡萄 糖 为 例 , 它 在 线粒体 中 完成 全 部 氧化 而 形成 CO, 与 HO。 值得 指出 的 是 , 生物 氧化 是 逐步 进行 的 , 在 此 过 程 中 所 释放 的 能 量 及 时 转化 为 能 源 物 质 ATP , 整 个 过 程 称 之 为 氧化 磷酸 化 (oxidative phosphorylation) 。 主 要 氧化 过 程 是 通过 线粒体 内 膜 电子 传递 链 来 进行 的 , 磷酸 化 则 是 由 位 于 内 膜 的 ATP 合 酶 来 催化 完成 。 它 是 1960 1961 年 Green 和 Fernandez-Moran 等 通过 低温 电镜 与 负 染 技术 在 牛 心 、 鼠 肝 线 粒 体 中 发 现 的 。 当 时 对 这 些 直径 约 为 80 一 100A 的 圆 形 或 多 面 形 颗粒 的 功能 并 不 清楚 。 后 来 美国 Racker 将 其 可 溶性 部 分 加 以 分 离 , 并 发 现 具 有 和 氧化 磷酸 化 偶 联 的 功能 , 称 之 为 F, 因 子 ( 即 Fi-ATP 媒 过 大 量 工作 才 了 fe ATP 合 酶 的 组 成 , 除 PE, 外 还 有 内 在 线粒体 内 膜 的 F。, 故 其 全 名 称 为 FFu-AIP 酶 , 它 是 磷酸 化 的 关键 装置 。 关 于 氧化 磷酸 化 的 机 制 , 从 60 年 代 民 长 一 段 时 间 始 终 是 生 物 能 学 研究 的 一 个 活跃 领域 。1961 年 英国 Mitchell $2} 渗透 假说 (chemiosmotic hypothesis ) , 它 的 主要 内 容 是 通过 线粒体 内 膜 上 呼吸 链 引 ] 氧 与 电子 的 交替 传递 ,使 质 子 (H*) 从 内 膜 内 侧 癌 外 侧 定向 转移 , 由 于 膜 对 下 的 了 7 重 透 性 , 从 而 形成 跨 膜 的 质子 梯 _ HE ie Biomembranes 92 差 , 或 称 为 质子 动力 势 。 因 此 , 氧 化 所 释放 的 能 量 首 先 转换 为 跨 膜 质子 梯 差 , 后 者 再 通 过 ATP 合 酶 催化 形成 ATP。Mitchell 的 化 学 涂 透 假说 经 过 较 长 时 间 反 复 论 证 终究 为 大 多 数 生 物 能 学 学 者 所 接受 , 并 因此 获 1978 年 诺 贝尔 化 学 奖 。 但 是 对 于 跨 膜 质子 梯 差 如 何 通 过 ATP 合 酶 催化 合成 ATP 的 机 制 ,Mitchell 虽然 也 作 了 一 定 的 研究 ,并 曾经 提出 一 些 设 想 , 但 并 未 得 出 明确 的 结果 。 O22 能 量 偶 联 构象 变化 假说 、 fui EACLE AES ETC IEC rt, a 美国 Boyer 对 ATP 合 酶 合成 ATP 的 机 制 提出 了 “构象 变化 假说 。 他 的 实验 室 经 过 大 量 的 生物 化 学 与 物理 化 学 研究 , 认 为 氧化 所 释放 的 能 量 可 能 通过 ATP 合 酶 催化 亚 基 的 构象 变化 导 致 AITP 的 合成 。 该 酶 的 3 个 B 催 化 亚 基 的 构象 在 任何 时 刻 是 互 不 相同 的 , 一 个 B 亚 基 的 构象 与 ADP 有 较 大 的 亲 和 力 , 另 一 个 B 亚 基 的 构象 有 利于 使 结合 上 去 的 ADP 和 Pi 合成 ATP, 第 3 个 B 亚 基 的 构象 则 可 促进 ATP BY 放 。 这 样 , 构 象 变化 假说 后 来 又 被 称 为 结合 变化 机 理 (binding change mechanism) , 它 的 要 点 是 , (IJ ATP 合成 所 需要 的 能 量 主要 用 于 与 酶 分 子 紧密 结合 ATP 的 释放 ; (2) 在 AITP 合 成 过 程 中 ,ATP 合 酶 分 子 的 各 催化 部 位 进行 高 度 协同 的 工作 (Boyer 1979, 2002), 有 具体 可 用 图 8-2 来 表示 。 从 图 中 可 以 看 出 , ATP A ABAD F, HO, Bs, y. 05、8s 组 成 , B 亚 基 是 催化 亚 单位 。 每 个 B 亚 基 具 有 松弛 (loose)、 紧 密 结合 (tight) AIFF IK (open, 无 底 物 与 之 结合 ) 状态 。 在 任 一 时 刻 , 3 个 B 亚 基 的 构象 总 是 互 不 相同 的 。 与 B 亚 基 的 松弛 状 态 结合 的 是 ADP+Pi, 当 构象 转变 为 紧 密 结 合 状态 时 即 形成 ATP, 之 后 当 遇 亚 基 转 变 为 开放 状态 后 ,ATP 就 被 释 放下 来 。 每 一 B 亚 基 催 化 经 过 几 次 伴 随 构象 改变 而 发 生 的 结合 变化 , 节 后 ATP 合 酶 作用 的 结合 变化 机 理 示意 图 形成 一 个 AIP 分 子 , 这样 的 过 程 反 复 ( 引 自 Lehninger et al. 1993) 进行 不 断 合成 AITP。 那 么 , 驱 动 3 个 3 种 构象 为 : L, loose, Ph; T,tight, 紧 密 ,O,open, 开 放 B 亚 基 构 象 和 核 苷 酸 结 合 的 变化 所 需 93 BSH ATP 4B — —TPR)WEA AA fA 的 能 量 是 以 何 种 形式 来 提供 的 呢 ? Boyer 后 来 也 同意 Mitchell fe HME BG, Hh 言 之 , 驱动 AITP 酶 F, 的 B 亚 基 构 象 变化 所 需 能 量 是 由 跨 膜 质子 梯 差 提供 的 《图 8-2) 。 除 此 之 外 ,为 了 满足 结合 变化 机 理 所 提 出 的 3 个 B 亚 基 不 断交 替 呈 现 不 同 构象 的 要 求 , 在 各 种 可 能 性 中 , 设想 Fi-ATP 酶 某 一 不 对 称 亚 基 与 3 个 B 亚 基 轮 流 接触 将 是 一 个 合适 又 合 理 的 选择 。 这 样 , 结 合 变化 机 理 又 增加 了 旋转 催化 (rotating catalysis) 的 内 容 。 至 于 那 一 或 那些 亚 基 具体 在 起 这 样 的 作用 开始 时 并 不 十 分 明确 。 除 Boyer 以 外 , 其 他 科学 家 对 ATP 合 酶 在 催化 过 程 中 亚 基 的 转动 也 进行 不 少 研究 , 并 提出 一 些 设想 , 但 都 缺少 直接 的 证 据 。 看 来 , 要 验证 Boyer 有 关 氧 化 磷酸 化 过 程 中 亚 基 的 结合 变化 和 旋转 催化 的 假设 , 关键 在 于 ATP 合 酶 F, 的 高 分 辩 率 结构 的 解析 , 以 证 清 在 催化 过 程 中 3 个 有 B 亚 基 构 象 是 否 有 差异 以 及 酶 分 子 亚 基 的 旋转 问题 。 323 和 牛 心 线 柏 休 下 -ATP Risin (452 1%)11 fF 7 jm 经 过 长 期 的 摸索, 英国 Walker 实验 室 于 1994 年 成 功 地 完成 了 牛 心 线粒体 Fi-ATP 酶 的 晶体 结构 分 析 , 分 辩 率 高 达 0.28nm, 这 在 当时 是 高 分 辩 率 解 出 的 最 大 的 、 具 有 不 对 称 结构 的 蛋白 质 (图 8-3)。 从 解析 结果 可 以 清晰 看 到 ,F,-ATP 酶 外 形 是 像 橘子 一 样 的 扁 圆 球体 ,直径 约 10nm,o 和 B 亚 基 像 橘 子 辨 一样 交叉 分 布 组 成 六 聚 体 。Y 亚 基 呈 螺旋 结构 位 于 六 聚 体 中 央 , 其 上 段位 于 顶部 处 与 wpB 亚 基 仅 有 有 限 的 接触 , 下 段 构成 ATP 合 酶 连接 F, 与 F。 颈 部 的 一 部 分 。 从 电子 密度 图 看 , 8 和 8 亚 基 也 可 能 位 于 颈 部 , 但 尚未 能 确定 它们 的 位 置 。Walker 工 作 最 重要 的 一 点 在 于 清晰 显示 Fi-ATP 酶 在 ATP 水 解 过 程 (FE 8-2 显示 的 ATP 合成 的 道 反应 ) 中 3 个 B 亚 基 的 构象 明显 不 同 , 一 个 是 无 底 物 结合 的 开放 状态 ,一 个 是 结合 ATP 即 将 键 烈 的 紧密 结合 状态 ,还 有 一 个 是 ADP 即将 释 放 的 部 分 开放 状态 ( 即 松弛 状态 ) 。 这 就 有 力 地 支持 长 期 以 来 尚 待 证 明 的 Boyer 的 结合 变化 机 理 。 与 此 同时 , Walker 对 牛 心 线粒体 Fi-ATP 酶 的 结构 解析 也 为 进一步 验证 Boyer 旋转 催化 假说 提供 了 结构 基础 , 即 显示 出 了 Y 亚 基 位 于 osp; 中 心 , 为 验证 Y 亚 基 与 ob 亚 基 可 能 存在 着 相互 转动 提供 了 非常 有 用 的 信息 。 侧面 观 仰视 观 AMP-PNP ADP-Pi 无 结合 牛 心 线粒体 F,-ATP 酶 晶体 结构 图 ( 引 自 Ab al. 1994) A. 侧面 观察 牛 心 线粒体 F,-ATP fig oapBY;, B. 从 底 往 上 观察 牛 心 线粒体 F,-ATT 从 A 或 B 清 晰 可 见 Y 亚 基 位 于 038; 形成 的 圆柱 中 间 ;, C~E. thas BSE 3 种 构象 的 区 别 ,C 45 AMP-PNP( : 似 物 ) 结 合 时 的 构象 , 相 当 于 T ( 紧 密 状 态 );,D 为 与 ADP+Pi 结合 时 的 构象 , 相 当 于 工 (松弛 状态 ); EATERY 得 当 于 O( 开 放 状 态 )。 在 C~-E 中 , 也 可 以 了 解 B 亚 基 处 于 3 ARIS yes RA — HE ¥y WR Biomembranes 94 8.2.4 KT F\-ATP Ail y IL 25 Tie4< S55, mms Walker 关 于 Pi-ATP 酶 高 分 辨 率 的 品 体 结构 分 析 有 力 推动 了 旋转 催化 机 制 假 学 的 验 证 , 美 国 Cross 实验 室 设计 了 一 个 比较 马 妙 实验 以 检验 大 肠 肝 菌 (E. coli) 的 Fi-ATP fig Y 亚 基 相 对 于 3 个 有 亚 基 是 否 发 生 转 动 (Duncan et al. 1995)。 根 据 品 体 结构 分 析 ,Y 亚 基 的 半 胱 气 酸 YC87 与 B 亚 基 的 肽 段 "DELSEED” 很 靠近 , 他 们 用 基因 工程 方法 在 B 亚 基 靠近 Y 亚 基 的 380 位 进行 了 突变 ,引入 了 一 个 半 胱 氟 酸 残 基 〈BD380C), 以 便 使 单个 B 亚 基 与 Y 亚 基 间 易于 形成 二 硫 键 交 联 。 交 联 后 Fi-ATP 酶 的 水 解 活性 即 消 失 , 者 将 此 二 硫 键 还 原 又 可 恢复 酶 活 。 利 用 这 个 体系 , 他 们 首先 通过 氧化 获得 BPD380C 和 YC87 间 交 联 的 Pi。 将 此 复合 物 解 离 成 单 亚 基 , 但 由 于 Y 亚 基 已 与 一 个 B 亚 基 共 价 结合 , 此 时 它们 仍 以 交 联 状 态 存在 。 继 而 加 入 放射 性 标记 的 BD380C 与 之 混合 重组 形成 F 复合 物 , 然 后 将 此 复合 物 进行 还 原 , 使 原形 成 的 一 S 一 S 一 键 不 含 放 射 性 标记 的 B 亚 基 恢 复 形 成 一 SHE, 此 时 酶 的 水 解 活性 得 以 恢复 。 然 后 再 加 入 克 物 Mg-AIP, 使 酶 的 催化 重新 进行 一 段 时间 , ae 氧化 使 站 B 间 的 一 S 一 S 一 键 再 次 形成 。 最 后 将 此 复合 物 的 亚 基 重 新 解 离 ,, 并 分 析 所 得 pB-Y 的 交 联 双 体 〈 图 8-4)。 结 果 表 明 , 它 们 既 有 放射 性 标记 的 , 也 有 非 放射 性 的 。 ch. 说 明 在 催化 过 程 中 ,所 有 的 3 个 B 亚 基 都 有 可 能 与 Y 亚 基 进行 交 联 ,换言之 ,,Y 亚 基 可 以 自由 地 与 每 个 B 亚 基 相 接触 , 这 就 有 力 支 持 了 旋转 催化 的 假说 。 B D380C-F, . , B; By, Pr L By shi Ag eo S Hs Le _ 8 与 放射 性 标记 的 5 HS Ae, 氧化 解 离 成 亚 基 。 B D380C 相 混合 重组 一 一 一 > 一 一 一 —_— 一 一 > SH SH SH 十 、 Ba ay Ne Bo J \Br BL \ Bo a +Mg-ATP : HS SH PH a S S A, Ww ws 2S 氧化 后 解 离 > ak ah Bo 有 B, 为 证 明 Boyer We Fe HELIS THY SoG EZ 4l(5| A Duncan et al. 1995) 此 外 , 还 有 一 些 实验 室 采用 不 同方 法 也 得 到 支持 Fi-ATP 酶 旋转 催化 的 实验 结果 , 如 德国 Junge 研究 小 组 制备 了 Fi-ATP 酶 的 Y 亚 基 被 奖 光 探 剂 cosin-5-maleimide 共 价 标记 的 样品 ,和 洛 此 酶 加 以 固定 , 经 菊 光 谭 白 后 跟踪 灾 光 侦 振 吸收 变化 的 弛 豫 过 程 ,以 监测 eosin 标记 的 a ae 慢 转动 (Sabbert et al. 1996), 这 种 转动 只 有 在 底 物 Mg-ATP 存在 时 才 被 监 出 到 。 如 果 替 代 ATP 加 入 AMP-PNP (ATP 的 竞争 性 底 物 , 对 FE-ATP 酶 具有 抑 95 BSR ATP 4-8 ——_—-t&)WEARA Tt HASIA 制作 用 ) 就 不 能 观察 到 这 种 现象 , 这 再 次 说 明 Fi-ATP 酶 催化 过 程 与 Y 亚 基 的 转动 密切 相关 。 1997 年 ,Boyer 与 Walker 由 于 对 FIF.-ATP 酶 作用 机 制 卓 越 贡献 的 研究 与 丹麦 Skou (在 研究 Na*, K*-ATP 酶 方面 有 开创 性 成 果 ) 共 获 诺 贝 尔 化 学 奖 。 但 是 , 对 于 Boyer 的 氧化 磷酸 化 旋转 催化 机 制 的 最 有 力 支持 还 是 日 本 Noji 的 实验 。 虽然 1997 年 他 们 在 Nature 发 表 有 关 论 文 时 , 诺 贝尔 奖 委 员 会 已 经 宣布 了 Boyer 与 Walker SRLS. 但 Noji 等 对 于 Fi-ATP 酶 在 催化 ATP 水 解 时 观察 到 Y 亚 基 的 旋转 是 最 直观 的 。 Noji 等 (1997) 对 实验 的 设计 主要 也 是 根据 Walker 对 牛 心 线粒体 Fi-ATP 酶 的 晶体 结 构 分 析 , 首 先 利 用 基因 工程 方法 将 嗜 热 菌 的 Fi-ATP 酶 的 B 亚 基 的 N 端 接 上 一 个 含有 10 个 组 肛 酸 残 基 的 尾部 (histidine tag) , 以 便 使 osBiy 亚 基 复 合 物 能 够 通过 组 氛 酸 连接 到 一 BEA ONi> 的 玻璃 王 片 上 , 这 一 突变 体 在 已 coi 中 能 高 效 表达 。 将 玻璃 薄片 涂 上 结合 有 关 根 过 氧化 物 酶 的 Ni- 次 氮 基 三 乙酸 (nitrilotriacetic acid ,NTAI) 使 之 与 含有 组 氨 酸 尾 部 的 osBsY 有 很 高 的 亲和力 ,以 便 将 其 固定 于 玻璃 薄片 上 进行 相关 实验 (图 8-5)。 为 了 监 测 Y 亚 基 的 转动 , 需 要 让 其 带 上 有 荧光 标记 的 肌 动 蛋白 微 丝 。 为 此 , 通 过 定点 突变 技术 将 Y 亚 基 中 107 位 的 丝氨酸 换 成 半 胱 氨 酸 (YS107C) , 与 此 同时 将 w 亚 基 中 193 位 半 胱 氨 酸 用 丝 氢 酸 取代 〈QC193S), 这 样 ,oaspBsY 复 合 物 仅 在 Y 亚 基 有 一 个 半 胱 氨 酸 残 基 以 便 专 一 性 地 与 生物 素 (biotin) 结合 。 接 下 来 , 利 用 链 霉 抗 生 物 素 (streptavidin) 有 4 个 与 生 物 素 接 合 的 位 点 , 制 备 组 装 了 他 生物 素 - 链 霉 抗 生物 素 -生物 素 - 荧光 标记 的 肌 动 蛋白 微 丝 的 复合 物 。 通 过 这 样 的 设计 ,就 可 以 通过 荧光 的 检测 来 追踪 ospB:Y 复 合 物 中 Y 亚 基 在 催 化 ATP 水 解 过 程 中 的 运动 情况 , 用 倒置 区 光 显 微 镜 连 接 的 摄像 系统 来 进行 监测 。 实 验 结 果 表 明 ,, 当 加 入 2mmol/L ATP 时 , 在 荧光 屏 上 显示 了 转动 的 亮点 。 此 运动 可 以 持续 至 少 25s, 转 动 的 时 间 过 程 表明 ,运动 是 单方 向 、 逆 时 针 的。 这 一 实验 结果 直观 呈现 了 在 水 解 国葬 A. Noji 观察 F,-ATP 酶 Y 亚 基 旋 转 的 实验 系统 ( 引 自 Noj al. 1997); B. 倒置 茶 光 显微镜 连接 的 摄像 系统 所 摄 下 的 连续 图 像 , 间 隔 33us。 莹 光标 记 肌 动 “ 白 通 ete se HE Wy fi Biomembranes 96 ATP at fe? y WEE TE 0583 形成 的 圆 简 式 结构 中 转动 的 , 这 是 对 Boyer 提 出 的 旋转 催化 假说 最 有 力 的 支持 。 此 外 ,Noji 应 用 单 分 子 技术 证 明 Fi-ATP 酶 Y 亚 基 的 旋转 还 有 如 下 的 重要 意义 : (1) HE Wy Nee (Fill ig I PRE RS, (A Fi-ATP 酶 是 迄今 发 现 惟一 的 酶 蛋白 分 子 , 它 的 催化 作用 已 直接 证 明 是 通过 分 子 内 部 的 亚 基 进行 旋转 运动 来 完成 的 ; (2) 生物 体内 的 肌 球 蛋 A (myosin)、 驱 动 蛋 白 (kinesin)、RNA 聚合 酶 (RNA polymerase) 、 动 力 和 蛋白 (dynein) 等 都 称 分 子 马达 , 但 他 们 都 是 线形 推进 的 , 沿 着 一 条 线性 轨道 进行 运动 , 因 而 又 称 线形 分 子 马达 , 而 蛋 和 白质 分 子 旋转 马达 迄今 只 发 现 细菌 鞭毛 马达 〈 约 由 100 个 蛋白 质 分 子 组 成 的 复合 体 ) 和 ATP 合 酶 , (3) ATP 合 酶 的 Pi 部 分 (Fi-ATP 酶 ) 直径 只 有 9~ 10nm, 是 迄今 为 止 发 现 的 最 小 生物 分 子 旋 转 马达 。 853 ATP FrRBRY Fi 与 F abe it PE 15 eres ATP 合 酶 是 一 个 很 复杂 的 含有 多 种 亚 基 组 成 的 复合 体 , 主 要 由 F, 和 Fu 两 部 分 组 成 。 ARF 与 Fe 的 相互 作用 曾 进行 过 大 量 研 究 , 杨 福 愉 研 究 组 曾 证 明 Me” 能 影响 膜 脂 疲 动 性 ,继而 能 影响 Fe 的 构象 与 活性 。 这 些 变化 传递 至 Fi 的 催化 活性 亚 基 , 使 AIP 水 解 活性 发 生 改 变 (Yang et al. 1983 ,1989, 杨 福 愉 1996)。 林 治 焕 和 李 生 广 报道 , Mg 也 可 以 通过 影响 F; 而 使 F。 的 构象 与 活性 发 生变 化 〈Li et al. 1987) 。 因 此 , 在 研究 分 子 旋转 马 达 (molecular rotary motor) ATP 合 酶 时 也 必然 会 卷 虑 FE、F。 以 及 两 者 相互 关系 的 问题 。 Noji 证 明了 离 体 情况 下 Fi-ATP 酶 水 解 AIP 能 使 Y 亚 基 旋 转 的 实验 结果 , 不 仅 在 生物 能 学 研究 领域 内 引起 了 极 大 的 震动 , mM ABMS] 了 众多 生物 化 学 、 生物 物理 、 生 物 工程 、 物理 、 化 学 、 纳 米 科学 等 各 方面 专家 来 参与 这 一 分 子 旋转 马达 的 研究 。F,-ATP 酶 的 催化 过 程 是 可 逆 的 , 既 可 水 解 AIP, 也 能 合成 AIP。ATP 合 酶 分 子 在 生理 条 件 下 的 主要 功能 是 合成 ATP。 以 线粒体 为 例 , 通 过 氧化 所 释放 的 能 量 首 先 转换 为 跨 膜 质子 梯 差 , 后 者 再 通过 EF。 来 驱动 Fi 的 Y 亚 基 旋 转 使 3 个 B 亚 基 构象 发 生 交替 变化 来 合成 AITP。 早 在 1985 年 , Cox 等 对 ATP 合 酶 可 能 在 能 量 转换 过 程 中 具有 旋转 马达 作用 的 设想 也 已 提出 过 , 但 他 们 的 研究 聚焦 于 质子 顺 谊 度 梯 差 进行 跨 膜 运送 与 Fe 的 关系 。 他 们 认为 ,在 质子 顺 谊 度 梯 差 进行 跨 膜 运送 过 程 中 ,会 驱动 c 亚 基 相 对 a、b 亚 基 进 行 转动 。 这 样 , 线 粒 体 氧化 磷酸 化 的 机 制 就 可 简单 概括 为 : 通过 内 膜 呼吸 链 的 电子 传递 所 释放 的 能 量 首先 转换 为 跨 膜 质子 梯 差 , 后 者 驱动 ATIP 合 酶 的 F。 的 c 亚 基 转 动 , 并 继而 带动 F, 的 Y 亚 基 转 动 而 使 3 个 B 亚 基 构象 发 生 交 替 变 化 来 合成 AIP。 由 于 ATP 合 酶 在 一 定 条件 下 可 以 解 离 为 Fo 与 F 《图 8- 6),, 在 Fi-ATP 酶 被 证 明 为 旋转 马达 以 后 , 分 别 对 FE, 和 Fe 以 及 整体 FiF.-ATP 酶 进行 这 方 面 的 研究 是 很 自然 的 。 自从 Noji 在 离 体 条 件 下 通过 ATP 的 水 解 直 接 观 察 到 Y 亚 基 的 旋转 以 后 , 科 学 家 们 从 不 同 角度 进行 了 多 方面 的 探索 , 除 耐 热 菌 以 外 , 用 大 肠 杆菌 、 光 合 细 革 以 及 叶绿体 ATP 合 酶 的 osBiY 作 为 实验 材料 进行 Y 亚 基 的 旋转 试验 均 已 获得 成 功 。 如 上 所 述 , 当 Y 亚 基 接 上 一 个 长 度 为 1hm 的 肌 动 蛋白 微 丝 后 ,在 2mmol/L ATP 条件 下 转速 约 为 2 一 6 rs。 如 果 以 -个 微小 金 粒 (直径 40nm) 替代 肌 动 蛋白 , 转 速 可 达 130 rs, 这 与 AIP 水 解 的 最 大 速 广 相 当 。 据 估计 , 在 生理 条 件 下 ,Y 亚 基 的 旋转 速度 可 达 134 ws。 通 过 控制 ATP 浓度 可 以 求 出 Y 亚 基 每 转 120° ARE 1 分 子 AIP, 换 言 乙 ,Y 亚 基 旋转 一 圈 360 THAR 97 BS ATP Aig ———TPR)HWE AAD HARI ADP+Pi F, F, ATP ADP+Pi ATP 合 酶 FiF。 组 分 的 解 离 与 重组 ( 引 自 Yoshida et al. 2001) 3 分子 AITP。Y 亚 基 旋转 120” 所 做 的 机 械 功率 约 为 90pPN:nm, 这 与 1 分 子 ATP 水 解 的 自由 能 基本 相等 , 这 样 , 能 量 转换 效率 几乎 接近 100%。 因 此 Fi-ATP 酶 是 迄今 为 止 体积 最 小 、 转 速 最 快 、 能 量 转 换 效 率 最 高 的 蛋白 分 子 旋转 马达 〈Yoshida et al. 2001, Capaldi et al. 2002, Karplus et al. 2004), Fi 除 cx、B、Yy 亚 基 以 外 ,, 尚 含 和 sg 亚 基 , 通 过 交 联 实验 (cross-linking) , 说 明 gx、B、8 相当 于 马达 的 定子 , 而 Y 与 s 则 为 转子 (图 8-7) 。 如 果 将 肌 动 蛋白 微 丝 与 8 连接 , 在 相似 条 件 下 , 通过 ATP 的 水 解 s 也 能 像 Y 那 样 带动 肌 动 蛋白 微 丝 旋转 , 但 转速 较 慢 。ATP 合 酶 F, 部 分 的 酶 活性 具有 水 解 和 合成 ATP 的 双重 功能 , 在 Ri 与 Fe 分 离 情况 下 , 它 只 具有 水 解 AITP 功 能 ,但 在 FIF.-ATP 酶 整体 情况 下 , 跨 膜 瑞 梯度 大 肠 杆菌 ATP 合 酶 示意 图 ( 引 自 :? 2002) 此 图 与 图 8-1 和 8-6 有 所 不 同 , 在 原 有 基础 上 , 它 反映 了 最 近 几 :这 方面 的 研究 进展 。F, 含 oapB:Y8e,F。 含 a、b、cop。Q、B、5、a、b 亚 基 起 着 定子 的 作用 “Y、g、c 亚 基 具 有 转子 的 作用 ——" HE 4 WR Biomembranes 98 差 能 通过 F。 驱 动 Pi 合成 ATP。 有 报道 , 在 一 定 条 件 下 ,F, 通过 水 解 AITP 所 释放 的 能 量 可 以 借助 F。 驱动 正 的 主动 跨 膜 运送 形成 跨 膜 质子 梯度 差 。2004 年 日 本 学 者 Itoh 在 Na- ture 上 报道 ,在 离 体 条 件 下 ,将 osBiyY 复 合体 的 Y 亚 基 连 接 带 有 磁性 的 微 珠 , 当 施加 一 定 外 磁场 时 , 可 使 y? 亚 基 按 顺 时 针 方向 旋转 (与 ATP 水 解 时 Y 亚 基 的 逆 时 针 旋 转 方向 相反 ), 结果 可 测 得 ATP 的 合成 。 这 一 实验 结果 的 重要 意义 在 于 : (1) 通过 Fi-ATP 酶 的 催化 , AE 动 地 实现 了 机 械 能 可 以 转换 为 化 学 能 的 过 程 ; (2) 进一步 支持 ATP 合 酶 的 旋转 催化 学 说 , 并 肯定 ATP 合 酶 活性 的 双重 性 , 既 能 水 解 也 能 合成 。 综 上 所 述 , 作为 生物 分 子 旋转 马达 , 对 Fi-ATP 酶 来 讲 , 虽 然 还 有 不 少 问 题 需要 进 一 步 深 入 探索 , 但 总 的 来 看 , 这 方面 已 进行 了 不 少 有 意义 的 工作 , 积 累 了 较 多 材料 。 相 比 之 下 , 对 Fu.-ATP 酶 的 研究 还 比较 少 , 这 与 F-ATP 酶 是 一 种 具 于 下 水 区 的 膜 内 在 蛋白 有 密切 关系 , 对 它 的 研究 有 相当 的 难度 。 一 般 都 认为 , 跨 膜 质 子 梯 度 差 通过 ATP 合 酶 进行 ATP 合 成 , 先驱 动 F-ATP 酶 的 c 亚 基 相 对 于 a、b 亚 基 进 行 旋转 。 为 了 验证 , 有 些 实验 室 曾 用 研究 F,Y 亚 基 旋 转 的 相似 方法 来 研究 c 亚 基 的 转动 。 用 菊 光 标记 的 肌 动 蛋白 微 丝 与 c 亚 基 相连 接 , 观 察 跨 膜 质 子 梯度 差 能 否 驱动 c 亚 基 的 转动 , 但 对 实验 方法 与 所 获 结果 都 还 存在 着 不 同 看 法 .2004 年 德国 Diez 等 报道 ,运用 单 分 子 菊 光 共 振 能 量 转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技术 能 够 证 明 组 装 于 脂 质 体 的 大 肠 杆 菌 FF.-ATP 酶 在 跨 膜 质子 梯度 差 驱动 下 , Y 亚 基 的 确 发 生 转 动 。 他 们 并 不 采用 直接 观察 Y 亚 基 转 动 的 方法 , 而 是 将 两 种 荧光 探 针 分 别 标记 于 Y 和 b 亚 基 , 前 者 的 菊 光 探 针 作为 供 体 , 后 者 的 荧光 探 针 则 作为 受 体 , 当 两 者 处 于 一 定 距 离 范 围 内 会 发 生 能 量 共振 转移 , 距 离 愈 近 , 转 移 效率 愈 高 。 由 于 b 亚 基 是 固定 的 , 因 此 如 果 Y 亚 基 在 FIF.-ATP 酶 催化 过 程 发 生 旋 转 , 它 所 标记 TRICE I FS b 亚 基 标记 的 探 针 距离 就 会 随 之 发 生变 化 。 实 验 结果 表明 , 跨 脂 酶 体 的 质子 梯度 差 的 确 能 使 FF.-ATP 酶 的 Y 亚 基 上 所 标记 的 区 光 探 针 与 b 亚 基 所 标记 的 荧光 探 针 间 的 能 量 转移 效率 发 生 循环 变化 (图 8-8), 这 显然 是 Y 亚 基 由 于 转动 与 b 亚 基 的 距离 ATP 水 解 ATP 合成 用 单 分 子 荧光 共振 能 量 转移 (FRET) 方法 来 验证 跨 膜 质 子 梯度 差 驱动 大 肠 肝 菌 F\F,-ATP 酶 Y 亚 基 的 转动 ( 引 自 Diez et al. 2004) A. 天 SFP RU F\F.-ATP 酶 侧面 观 的 模型 ,FRET 的 供 体 (绿色 圆圈 ) 标记 于 Y 亚 基 , 受 体 (红色 圆圈 ) 标记 在 b 亚 FE, 1° F\-ATP 酶 从 F。 仰视 的 横 切 面 图 解 。@ 表 示 标 记 于 Y 亚 基 的 FRET 的 供 体 与 标记 于 b 亚 基 的 FRET 受 体 距 离 最 远 , 这 时 能 量 转 移 效率 最 低 ,@ 介 于 @ 与 @ 之 间 ,@ 表 示 供 体 与 受 体 距 离 最 近 , 能 量 转移 效率 最 高 。 实 验 结 果 表 明 , 当 ATP 合成 时 , 能 量 转移 效率 变化 按 @ 一 OO 一 @ 一 @ 进 行 , 而 ATP 水 解 时 按 @@ 一 @ 一 @ 一 @ 进 行 99 8 SB ATP 4 —— —TPR)HWIEA Ra fF 5K 不 断 发 生变 化 所 产生 的 结果 。 而 且 , 很 有 意思 的 是 ,在 这 里 再 一 次 证 明 ATP 合 酶 水 解 与 合成 ATP 时 Y 亚 基 的 转动 方向 是 相反 的 。 这 一 实验 也 间接 表明 跨 膜 质子 梯度 差 可 通过 影 响 FE。 的 c 亚 基 旋 转 导致 F, 的 Y 亚 基 转 动 。 乐 加 昌 等 (Zhang et al. 2005) 将 于 紫红 质 (bacteriorhodopsin, BR) 与 大 肠 肝 菌 的 FF.-ATP 酶 共 组 装 在 同一 脂 质 体 中 , 并 将 后 者 P, 的 亚 基 连 接 上 标记 荧光 的 肌 动 蛋白 微 丝 。 在 一 定 条 件 下 ,通过 光照 BR 能 将 甘 泵 入 脂 质 体 微 圳 ,形成 跨 膜 质子 梯度 差 , 后 者 继而 驱动 FF.-ATP 酶 中 EP 的 亚 基 所 连接 的 区 光标 记 肌 动 蛋白 微 丝 进行 旋转 。 TTT IE TET TST % [8] Boyer 4 ATP Afi (FF.-ATP 酶 ) 称 为 “一 个 非常 美丽 的 生物 分 子 。 基 近 七 八 年 以 来 ,对 这 一 蛋白 质 分 子 旋转 马达 各 国 科学 家 已 经 做 了 大 量 的 研究 并 取得 了 不 少 进 Fe, 但 需要 回答 的 问题 仍 很 多 ,如 ATP 水 解 驱 动 F-ATP 酶 的 Y 亚 基 旋 转 的 具体 机 制 , 跨 膜 正 梯度 差 是 如 何 驱动 F-ATP 酶 的 c 亚 基 进 行 旋转 的 , Fi-ATP 酶 和 F.-ATP 酶 都 是 分 子 旋转 马达 , 两 者 的 旋转 机 制 是 不 尽 相 同 的 , 当 两 者 结合 在 一 起 发 挥 作 用 时 , 它 们 又 是 如 何 匹 配 并 协调 起 作用 的 等 。 看 来 , 今 后 对 这 一 最 小 、 最 快 、 转 换 效率 最 高 的 蛋白 质 分 子 旋转 马达 的 研究 仍 将 继续 吸引 生物 物理 、 化 学 工程 、 纳 米 机 电 、 酶 学 、 物 理 等 方面 专家 的 兴趣 。 在 应 用 方面 ,美国 康泰 尔 大 学 的 科学 家 正在 利用 Fi-ATP 酶 作为 分 子 旋转 马达 研制 出 一 种 “纳米 直升机 , 它 是 由 Fi-ATP 酶 的 部 分 亚 基 、 金 属 推进 吉 等 组 成 的 纳米 机 电 装 置 (Soong et al. 2002), 很 可 能 这 样 的 装置 在 医药 方面 会 有 重要 的 应 用 价值 。 对 模拟 、 调 节 分 子 转动 马达 的 有 关 研 究 也 正在 局 动 与 进行 中 。 ( 杨 福 从) 杨 福 愉 . 1996. 膜 脂 一 膜 蛋白 相互 作用 及 其 在 医学 和 农业 上 的 应 用 . 济南 : 山东 科学 技术 出 版 社 . 1-13 Abrahams JP, Leslie AG, Lutter R, et al. 1994. Structure at 2. 8A of F,-ATPase from bovine heart mitochondria. Nature, 370: 621-628 Boyer PD. 1979. The binding change machanism of ATP synthesis. In: Lee CP. (ed. ) Membrane Bioenergetics. USA: Addison-Wesley, Reading, MA. 461-479 Boyer PD. 1997. The ATP synthase — a splendid molecular machine. Annu Rev Biochem, 66: 717 749 Boyer PD. 2002. A research journey with ATP synthase. J Biol Chem, 277(42): 39045-39061 Capaldi RA, Aggeler R. 2002. Mechanism of the F;-F,-type ATP synthase, a biological rotary motor. TIBS, 27(3): 154-160 Duncan TM, Bulygin VV, Zhou YT, et al. 1995. Rotation of subunits during catalysis by E. co Fi-ATPase. Proc Nat Acad Sci USA, 92(24): 10964-10968 Diez M, Zimmermann B, Borsch M, et al. 2004. Proton-powered subunit rotation in Singlz mem orane-bound FuF,-ATP synthase. Nat Struct Biol, 11: 135-141 Itoh H, Takahashi A, Adachi K, et al. 2004. Mechanically driven ATP synthesis by ase. Nature, 427: 465-468 Karplus M, Gao YQ. 2004. 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Biochim Biophys Acta, 724: 104-110 Yoshida M, Muneyuki E, Hisabori T. 2001. ATP synthase — a marvelous rotary engine of the cell. Nature Reviews Mol Cell Boil, 2: 669-677 Zhang YH, Cui YB, Yue JC, et al . 2005. Rotary torque produced by proton motive force in F,F; motor. Biochem Biophys Res Commun, in press Zhang XF, Yang FY. 1989. Further study on the role of Mg?’ in lipid-protein interaction in reconstituted porcine heart mitochondrial H*-ATPase. Biochim Biophys Acta, 976: 53-62 第 Q FREER DAS Aa 光合 能 量 转换 9.1 类 宫 体 膜 的 基本 结构 和 光合 能 量 转换 的 主要 过 程 oe 102 2 Ee 8 ae Sees Abe, ee Seem ae RE Oe 102 91.2 ”光合 电子 传递 与 质子 动力 势 的 产生 和 同化 力 形 成 .…………. 102 9.2 无 系 质 开 下 何 宝 化 与 革 动 能 的 关 过 全 104 OT SA ae eee ek Fh al Sd ee ut. 104 DD Pep ea ep ia a eo awh cairns ectek «vs ha baba ceneleds 105 ee erp ng se 4S a | a re Usa 22. 105 Db) SEs Soe TA Pies hod oe ees ia 8s. Bes eh sake hea abe Ade Reins 105 a GELS A, oe ee eS aeeee 106 > * 9.3.2 WWJ NO; cua 106 > . 93.3 3R/HO, Le 106 . 9.3.4 ”将 电子 交还 给 光 系 统 工 和 光 系 统 工 间 的 电子 递 体 .…………. 106 9 ie ee eet, er en eee, Se ae 106 9.4 RIPE a erate aaa ee ere LS Dead ate 107 9.4.1 ASS pR ADA Ra LS AF DPA KE ceeeccccceceeceeee 107 942 各 种 蛋白 复合 体 在 类 圳 体 上 的 动态 分 布 和 光合 能 量 转换 PE 22a 01 |i ea Sec Sera tal a a ea 107 9.5 叶绿体 ATP 合 酶 的 结构 功能 和 转 能 效率 的 改善 .4. 108 合作 用 (photosynthesis) 是 植物 独 有 的 功能 , 它 可 利用 光 能 , 人 生物 的 演化 、 地 球 表层 生物 圈 的 形成 和 运转 至 关 豆 要 , 为 人 类 的 生 存 和 莹 衍 提 供 了 不 可 缺少 的 基础 。 光 合作 于 “PSM, MC 其 机 理 进 行 了 大 量 研究 ,获得 了 不 少 下 有 许多 奥秘 尚未 揭 开 。 根 据 已 有 的 了 解 , 光 合作 用 大 f 分 为 两 大 阶段 , 首 先是 光 能 转换 为 化 学 能 ,形成 同化 力 , 接 刊 用 这 种 同化 力 将 二 氧化 碳 等 无 机 物 合成 有 机 物 。 前 一 阶段 是 主 类 圳 体 膜 上 进行 ,牵涉 到 一 系 — HE hy We Biomembranes 102 列 精 巧 微 妙 、 性 质 迎 异 的 步骤 , 因 此 , 特 别 难 于 探索 , 光 合 能 量 转 换 过 程 与 膜 的 动态 结 构 变 化 紧密 联系 在 一 起 , 需 要 多 学 科 有 机 交叉 起 来 次 究 。 现 结合 国际 研究 现状 和 我 们 的 工作 非常 向 要 地 综述 和 讨论 一 下 这 方面 的 进展 和 问题 。 9.1 “类 夺 体 膜 的 基本 结构 和 光合 能 量 转换 的 主要 过 程 _ 光合 作用 过 程 中 , 光 能 转换 为 化 学 能 的 步骤 都 是 在 类 圳 体 上 进行 的 。 在 低 等 原核 植 物 原 绿 藻 、 蔓 绿 藻 中 , 它 们 的 类 吉 体 直接 分 布 在 细胞 内 。 在 较 高 等 的 真 核 植物 中 , 它 们 的 光合 细胞 含有 叶绿体 , 类 吉 体 分 布 于 叶绿体 内 。 一 般 认 为 , 地 球 上 的 生物 在 瘟 长 的 进 化 历程 中 ,, 真 核 植物 细胞 内 的 叶绿体 是 由 类 似 原 绿茶、 监 绿 党 那样 的 原始 原核 生物 进入 真 核 细 胞 内 部 共生 演化 而 成 的 (Blankenship 2002)。 它们 的 类 吉 体 结构 和 功能 基本 相似 , 也 有 助 于 说 明 这 一 点 。 类 圳 体征 由 膜 构 成 的 密闭 片 层 , 将 微 环 境 区 隔 为 膜 外 、 膜 中 和 膜 腔 内 三 部 分 。 膜 的 主要 成 分 为 膜 脂 和 有 蛋白 复合 体 , 膜 脂 包 括 半 乳 糖 脂 、 磷 脂 、 硫 脂 等 , 在 类 吉 体 膜 中 , 以 半 乳 糖 脂 含 量 最 高 。 这 在 各 种 生物 膜 中 是 罕见 的 , 也 许 与 它 的 独特 功能 有 关 , 值得 深究 。 KERR LMR AR AAR HEA EIR, HRS, 细胞 色素 pk./ 和 ATP 合 酶 等 4 种 , 但 已 有 不 少 工作 表明 蛋白 复合 体 的 组 成 相当 复杂 。 区 分 为 这 4 种 ,只 是 大 致 的 分 类 而 已 , 这 在 本 文中 将 稍 有 涉及 。 在 类 圳 体 上 进行 光 能 转换 为 化 学 能 的 过 程 , 可 以 按 其 次 序 和 特性 分 成 两 大 步骤 ,, 即 原初 反应 、 光 合 电 子 传递 与 质子 动力 势 的 产生 和 同化 力 形成 (Blankenship 2002, 77 钢 等 1998 ) 。 EEC 原初 反应 (primary reaction) 在 光 系 统 I 工 和 光 系统 I 两 种 蛋白 复合 体 上 进行 。 这 两 种 蛋白 复合 体 中 含有 大 量 叶绿素 (chlorophyll) 和 类 胡萝卜 素 (carotenoid), 这 些 色素 的 结构 有 差异 , 可 以 吸收 不 同 波长 的 光 能 。 由 于 它们 是 和 复合 体 中 性 质 不 一 样 的 蛋白 结合 着 的 , 因而 即使 同一 种 色素 的 吸收 光谱 也 有 些 不 一 样 。 吸收 了 光 能 的 色素 就 处 于 激发 态 , 它 可 以 在 色素 间 传递 。 当 传递 到 反应 中 心 时 , 就 可 以 引起 光化学 反应 , 即 反应 中 心 上 处 于 类 圳 体 膜 内 侧 的 叶绿素 处 于 激发 态 后 可 以 交 出 一 个 电子 给 位 于 类 可 体 膜 外 侧 的 原初 电 子 受 体 , 使 其 带 负电 , 而 反应 中 心 的 叶绿素 则 带 正 电 , 这 也 就 是 发 生 了 电荷 分 离 , 同 时 也 产生 了 膜 内 外 的 电位 差 ( 膜 外 侧 带 负电 , 膜 内 侧 带 正 电 )。 光 系统 工 和 光 系统 I 反 应 中 心 的 蛋白 、 叶 绿 素 结合 状态 和 原初 电子 受 体 不 同 , 它 们 所 引起 光化学 反应 也 有 差别 。 根 据 其 叶绿素 吸收 光谱 在 红 光 部 分 的 峰 位 , 光 系统 开 反 应 中 心 的 叶绿素 称 P680, 光 系统 1 反应 中 心 的 叶绿素 称 P700。 9.1.2 ”光合 电子 传递 与 质子 动力 势 的 产生 和 同化 力 形成 mma 光化学 反应 产生 电荷 分 离 后 , 就 导致 一 系列 电子 传递 , 即 光 系 统 工 反应 中 心 的 叶 绿 素 P680 由 于 交 出 电子 而 带 正 电 荷 , 其 可 从 光 系统 II 蛋 白 复合 体 中 的 次 级 电子 供 体 得 到 电 子 恢复 丙 状 , 又 可 进行 另 一 次 光化学 反应 。 次 级 电子 供 体 则 从 锰 徐 得 到 电子 , 后 者 最 终 从 水 得 性子。 水 交 出 电子 被 氧化 而 在 类 喜 体 膜 腔 内 释放 出 氧气 和 氢 离 子 (质子 )。 光 系 统 工 的 语 访 电子 受 体 在 光化学 反应 中 接受 电子 后 ,即将 电子 交 子 次 级 电子 受 体 并 依次 传 下 去 而 交 给 质 醒 。 103 BOR YE BEA EDD ASZS SIE AE st FE TH ii (plastoquinone) 有 许多 特点 : (1) AERA VERY, AT CERES HS HP Po) A. 数量 较 其 他 电子 递 体 多 ; (2) 它 在 类 圳 体 膜 外 侧 接受 传 来 的 电子 , 并 和 膜 外 的 所 离子 (由 水 解 离 而 产生 ) 结合 , 然 后 脱离 光 系 统 开 转移 至 细胞 色素 pej 复 合体 , 将 电子 交 给 后 者 并 把 氢 离 子 释放 到 类 圳 体 膜 腔 内 。 这 样 经 过 质 醒 的 传递 , 电 子 就 由 光 系 统 工 交 到 了 细胞 色素 be /复合 体 且 伴随 着 将 氢 离 子 由 类 圳 体 膜 外 转移 至 类 圳 体 膜 腔 内 。 电 子 经 过 细胞 色 bo /复合 体 的 传递 , 在 类 圳 体 膜 内 侧 交 给 质 监 素 。 质 监 素 (plastocyanin) 是 一 种 合 铜 的 水 溶性 蛋白 , 可 在 类 圳 体 膜 腔 内 的 水 相 中 移动 而 将 电子 交 给 光 系 统 I。 在 光 系 统 I 中 , 叶绿素 等 光合 色素 接受 光 能 而 处 于 激发 态 后 , 将 能 量 传递 到 光 系 统 I 反 应 中 心 处 于 类 圳 体 膜 内 侧 的 叶绿素 P700, 处 于 激发 态 的 P700 可 发 生 光 化 学 反应 交 出 一 个 电子 给 反应 中 心 处 于 膜 外 侧 的 原初 电子 受 体 , 从 而 产生 了 电荷 分 离 和 膜 电 位 差 〈 膜 内 侧 带 正 电 , 膜 外 侧 带 负电 )。 带 正 电 的 P700- 可 从 由 细胞 色素 gsj 复合 体 传 来 电子 的 质 监 素 得 到 电子 而 恢复 原状 , 这 样 又 可 再 一 次 进行 光化学 反应 。 光 系统 I 反 应 中 心 的 原初 电 子 受 体 在 得 到 电子 带 负 电 后 , 可 将 电子 传 给 次 级 电子 受 体 而 本 身 恢 复原 状 。 次 级 电子 受 体 又 将 电子 交 给 其 他 电子 递 体 , 最 后 传 给 处 于 类 圳 体 膜 外 表面 的 铁 氧 还 蛋白 。 铁 氧 还 蛋 白 接 到 电子 后 可 有 不 同 的 传递 途径 , 但 一 般 主 要 是 交 给 在 类 圳 体 膜 外 水 相 中 可 移动 的 辅 酶 工 。 辅 酶 开 接 受 电子 后 和 膜 外 水 解 离 所 产生 的 氢 离 子 结合 , 变 成 还 原 态 的 辅酶 I。 综 上 所 述 , 光 系统 工 和 光 系 统 I 光 化 学 反应 所 引起 的 在 类 圳 体 膜 上 进行 的 一 系列 定 向 电子 传递 不 仅 导 致 水 的 氧化 与 辅酶 工 的 还 原 , 而 且 还 产生 了 膜 内 外 氢 离 子 浓 度 的 改变 (水 氧化 时 氢 离 子 在 膜 肥 内 释放 , 辅酶 I 还 原 时 在 膜 外 与 气 离 子 结合 , 质 柄 还 原 时 结合 的 氢 离子 来 自 膜 外 , 还 原 质 柄 氧化 时 所 离子 释放 到 膜 腔 内 , 因 而 随 着 反应 进行 , 膜 外 氢 离 子 访 度 减少 , 膜 内 氢 离 子 浓度 增加 )。 这 样 , 伴随 在 膜 上 光合 定向 电子 传递 产生 了 膜 内 外 氢 离 子 ( 即 质子 ) 浓 度 差 。 这 种 质子 深度 差 和 前 面谈 到 的 伴随 光化学 反应 所 产生 的 电位 差 合 称 为 质 子 动力 势 (proton motive force), , 可 推动 质子 通过 类 圳 体 上 的 ATP 合 酶 催化 ATP 的 合成 。 还 原 辅酶 I 和 ATP 都 是 生物 代谢 中 的 重要 能 量 载体 。 光 合作 用 中 光 能 转换 成 的 化 学 能 携带 在 这 些 分 子 上 后 , 就 可 利用 它们 来 同化 CO. 等 无 机 物 生 成 有 机 物 , 因 此 在 光合 能 量 转换 反应 中 形成 的 还 原 辅酶 工 和 ATP 常 被 合 称 为 同化 力 (assimilatory power)。 图 9-1 为 类 宫 体 上 进行 光 能 转换 为 化 学 能 过 程 的 示意 图 。 Eee 类 圳 体 膜 上 光 能 转换 为 化 学 能 去 j 示 意图 PSII, HABEU; PSI, 光 系统 I, PQ, PQH, , 质 柄 和 还 原 质 醒 , yt ps1, 细 胞 色素 pk 复合 体 ; PC , 质 蓝 素 ,Fd , 铁 氧 还 蛋白 , NADP+、NADPH, — ig Il A AHA I =_— KH ty WR Biomembranes 104 9.2 HASAN 7 _ reer 在 光 系 统 I (photosystem I) 的 光合 能 量 转换 过 程 中 , 反应 中 心 的 叶绿素 处 于 激发 态 后 即 发 生 光 化 学 反应 , 引 起 电子 传递 而 导致 水 的 氧化 和 质 柄 的 还 原 , 并 且 伴 随 着 形成 膜 内 外 电位 差 和 质子 浓度 差 〈 膜 内 质子 浓度 高 于 膜 外 )。 这 是 在 一 个 由 20 多 种 蛋白 组 成 的 蛋白 复合 体 上 进行 的 ,非常 复杂 且 为 光合 系统 所 独 有 的 过 程 。 世 界 上 许多 科学 家 对 它 进行 了 各 种 研究 , 可 是 仍 了 解 得 很 不 够 。 已 经 知道 光 系 统 开 蛋白 复合 体 是 由 3 种 蛋白 复 合体 连接 而 成 : (1) 光 系 统 开 核心 复合 体 , 含 有 光 系 统 I 的 反应 中 心 和 次 级 电子 供 受 体 等 组 分 , 以 及 一 些 紧 密 结合 的 捕 光 叶绿素 蛋白 ,(2) 放 氧 复合 体 , 包 含 锰 徐 和 处 于 类 圳 体内 侧 表 面 的 与 Ca”“、Cl 参与 氧 释 放 反 应 有 关 的 33kDa、23kDa、17kDa 的 3 个 蛋白 ,其 中 33kDa 又 称 锰 稳定 蛋白 , 是 所 有 植物 光 系 统 工 放 氧 复合 体 中 均 有 的 ,23kDa 和 17kDa 蛋白 则 在 原核 的 低 等 植物 中 没有 , 属 于 分 子 质量 较 小 的 蛋白 ; (3) 与 光 系 统 开 核 心 复合 体能 可 逆 结 合 和 分 离 的 外 周 捕 光 叶绿素 蛋白 复合 体 , 可 接受 光 能 并 在 结合 时 将 激发 能 传 递 给 光 系 统 开 核心 复合 体 的 反应 中 心 。 从 类 宫 体 纯化 出 来 的 光 系 统 开 蛋白 复合 体 中 , 人 们 可 以 将 这 3 种 复合 体 的 蛋白 大 体 分 开 或 干扰 其 中 某 一 部 分 结构 , 以 便 研 究 它 们 彼此 的 相互 作用 和 关系 。 进 一 步 的 研究 发 现 , 在 植物 生长 和 发 育 过 程 中 或 植物 受 外 界 环境 变动 的 影响 时 , 光 系统 开 蛋 白 复 合体 的 这 些 组 分 的 动态 结构 和 相互 关系 也 常会 发 生变 化 。 可 以 说 , 光 系统 开 是 光合 系统 中 非常 敏感 的 部 分 , 因 此 , 人 们 正在 深入 探讨 其 动态 结构 与 功能 的 联系 。 9.2.1 JCS |, 5 mm PRAMS SACRE WA FE 它 仍 可 进行 光 能 的 吸收 、 传递 光化学 反应 及 部 分 电子 传递 。 对 其 结构 和 组 成 的 研究 表明 ,它们 与 光合 自 养 但 不 能 释放 氧气 的 紫色 细菌 的 反应 中 心 相当 类 似 。 其 反应 中 心 的 原初 电子 供 体 和 原初 电子 受 体 都 是 叶绿素 和 脱 镁 叶绿素 。 两 者 的 分 子 结构 仅 稍 有 不 同 , 在 光合 细菌 中 是 细菌 叶绿素 和 细菌 脱 镁 叶绿素 。 曾 小 华 等 (2000) 将 紫色 光合 细菌 反应 中 心 的 细菌 脱 镁 叶绿素 用 植物 的 脱 镁 叶绿素 置换 50% 以 上 ,其 保留 的 光化学 反应 的 活性 大 于 对 照 的 70%。 这 表明 两 者 在 进 化 上 的 密切 关系 , 它 们 有 差别 但 也 有 相当 可 替代 的 共性 。 在 光 系 统 开 核 心 复合 体 中 , 反 应 中 心 的 原初 电子 供 受 体 都 是 与 D,、D, 蛋白 结合 着 的 。 其 中 Di 蛋白 (Diprotein) 是 类 圳 体 中 降解 与 再 合成 周转 最 频繁 的 蛋白 ,这 与 它 在 进 行 光化学 反应 时 较 易 受到 损坏 有 关 。 在 光合 作用 过 程 中 由 光 系 统 工 捕 光 叶 绿 素 蛋 白 接受 光 能 而 传递 到 反应 中 心 的 激发 能 的 数量 是 经 常 在 变动 的 , 如 果 它 超过 了 光化学 反应 及 其 伴随 的 电子 传递 的 利用 能 力 , 就 会 对 光合 系统 产生 破坏 作用 , 而 D, 蛋 白 常常 是 首当其冲 。 它 的 频繁 周转 在 一 般 情况 下 可 保持 其 含量 稳定 (Hong et al.1999), 在 晴天 中 午 , 植 物 接受 到 的 光 能 常常 会 超过 其 光合 系统 的 利用 能 力 , 植物 有 多 种 适 PEA, Dy 蛋白 的 快速 周转 修复 只 是 其 中 的 一 种 。 在 一 般 情况 下 大 部 分 多 余 的 激发 能 通过 所. 审 途 径 而 无 害 化 耗 散 , 包 括 : (1) 多 余 激发 能 通过 围绕 光 系 统 工 循环 电子 流 的 能 量 耗 散 “” 习 当 质 醒 处 于 还 原状 态 不 能 再 接受 电子 时 , 光 系统 工 核 心 复合 体 中 的 细胞 色素 bs 可 作为 电子 递 体 , 接受 电子 将 它 又 交 给 P680', 形成 循环 昌 子 流 使 能 量 耗 散 (Thompson et al. 1988, 王 颖 君 等 1996),(2) 伴随 光合 电子 传递 形成 的 跨 膜 质 子 梯度 导致 类 圳 体 中 105 OR JE DE A EDA AGI SIE HE PETA 发 生动 态 结构 变化 , 可 在 几 秒 钟 内 引起 过 剩 激 发 能 的 耗 散 (Park et al. 1995, Shen et al. 1996); (3) 两 种 光 系 统 靠近 和 捕 光 叶 绿 素 蛋 白 复合 体 经 磷酸 化 后 离开 光 系 统 开 而 向 光 系 统 I 移 动 , 使 多 余 光 能 分 配 到 光 系 统 工 ( 谭 新 星 等 1997); (4) 类 胡 葛 下 素 中 的 叶 黄 素 组 成 会 发 生变 化 ,含有 双环 氧 的 楷 黄 质 经 酶 催化 变 成 了 无 环 氧 的 玉米 黄 质 , 可 有 效 地 促进 多 余 沂 发 能 的 热 耗 散 (heat dissipation) (Demming et al. 1987 , 郭 连 旺 等 1994) 。 在 有 些 植物 中 , 如 大 豆 、 南 瓜 等 光 系 统 工 反应 中 心 的 可 逆 失 活 是 耗 散 多 余 光 能 的 重要 途径 (Hong etal. 1999, Zhang et al. 2003) 。 TLE TTT EET TE HAGEL 可 利用 水 释放 氧气 的 功能 是 和 其 中 放 氧 复合 体 紧密 相关 的 。 将 水 裂解 释放 出 氧气 来 ,涉及 4 个 电子 的 去 除 , 而 每 次 光化学 反应 只 引起 一 个 电子 传递 。Joliot 和 Kok 用 闪光 实验 都 观察 到 了 放 氧 有 4 个 步 又 的 动力 学 过 程 , 但 关于 其 机 制 至 今 还 是 人 们 努力 探索 的 热点 〈 翁 俊 等 2003)。 已 知 鳃 徐 是 进行 这 4 个 步 又 积累 氧化 当量 的 关键 组 成 , 除 反应 中 心 的 蛋白 与 锰 禾 有 关外 , 33kDa 重 白 对 保持 锰 复 合适 的 动态 结构 很 重要 , 23kDa 和 17kDa 蛋 自 则 有 助 于 CI- 和 Ca 较 好 地 参与 这 些 反应 。 戴 新 宾 等 (2000) 发 现 HCO; 也 参 与 该 过 程 。 从 水 释放 氧气 的 反应 是 光合 机 构 独 有 的 , 其 有 关 蛋 白 的 性 质 也 很 特殊 。Ruan 等 2001) Fim Ae (2003) 发 现 33kDa 蛋白 和 23kDa 蛋白 在 很 低 的 压力 下 〈 只 有 一般 蛋 自 所 需 压力 的 几 分 之 一 ) 即 能 解 折 又 此 特征 和 它们 在 放 氧 复合 体 中 的 功能 有 何 联系 很 值得 深究 。 9.2.3 {RISEN 2 2s Se 7 5 (Sa hb FILA GEM I VIR IEM REE ATA PS, (A ik aL, SIE 系统 开 结 合 或 脱离 。 此 过 程 的 调节 一 般 与 质 醒 和 细胞 色素 和 在 光照 条 件 下 的 氧化 还 原 状态 有 关 , 但 在 有 些 绿 藻 中 也 受 ATP 供应 的 调控 (Wollman 2001)。 在 盐 藻 中 低 渗 胁 迫 会 导致 其 去 磷酸 化 , 这 可 能 与 低 渗 处 理 促进 呼吸 作用 及 细胞 内 ATP 含量 增加 有 联系 ( 刘 贤 德 等 2004 ) 。 在 蓝藻 和 红 藻 中 ,外 周 的 捕 光 色 素 蛋 白 复合 体 不 含 叶绿素 , 而 含有 结构 与 叶绿素 差 别 较 大 的 藻 胆 素 , 且 藻 胆 蛋白 复合 体 不 是 在 膜 中 , 而 是 在 膜 外 表面 可 移动 的 。 邓 勇 等 (2003) 观察 到 此 复合 体 常 与 还 原 辅酶 工 脱 氢 酶 复合 体 似 平 有 联系 , 其 关系 有 待 进一步 研究 。 ?3 FES AEA REI % 5 (2 TLIC HE SOL EP, BAY A APC AB UU Pa a ict AH SR bo fA PA ALi Ws ae Fe 1 BIDE ABE (photosystem I) 。 细 胞 色素 &./ 复 合体 和 质 蓝 素 的 结构 和 功能 与 线粒体 电子 传递 链 中 的 细胞 色素 pc 复合 体 和 细胞 色素 < 相当 和 鞠 亿 , 这 里 就 不 多 谈 了 。 在 光合 能 量 转换 过 程 中 , 光 系 统 I 蛋 白 复合 体 的 功能 是 和 呆 放 能 引起 光化学 反应 、 发 生 电 荷 分 离 并 导致 一 系列 电子 传递 ,一端 接 受 由 质 蓝 素 传 六 一端 交 出 电子 产生 还 原 能 力 很 强 的 载体 , 用 于 同化 力 的 形成 。 它 也 是 由 20 多 组成, 其 中 不 少 蛋 白 的 功 能 还 不 清楚 。 光 系统 I 也 可 区 分 为 捕 光 叶绿素 复合 体 和 村 “过 合体 , 核心 复合 体 的 结构 和 组 成 与 绿色 硫 细 梢 的 有 些 类 似 , 包含 较 多 铁 硫 蛋白 。 光 : 统 I 处 于 膜 外 表面 的 电子 受 体 是 HE 4 We Biomembranes 106 水 溶性 的 铁 氧 还 蛋白 , PPR SCAT HL PA & PPS Id, 它们 分 别 在 生理 上 的 重要 性 以 及 究竟 受 哪些 因素 调控 , 人 们 正在 努力 探讨 , 现 对 其 一 些 去 同 的 特点 向 述 如 下 。 ie a a CEA FS, OU HE St PE eee A UL, FA TL, AE He AINY BREE Sp —. HHL fa PRI EAI Se TL EE, BI SRE 体 膜 的 外 表面 松散 地 结合 着 (Blankenship 2002) 。 ES 植物 根部 吸收 的 氨 肥 常常 是 NO; ,相当 一 部 分 是 运输 到 叶肉 细胞 中 被 还 原 成 NH 利 用 。NO; 先 在 细胞 质 中 经 NO; 还 原 酶 催化 还 原 成 NO; ,NO; 则 可 进入 叶绿体 ,被 铁 氧 还 蛋白 传 来 的 电子 还 原 。 叶 济 字 等 (1995) 的 实验 表明 , 当 叶绿体 处 于 稍为 低 渗 膨胀 的 条 件 下 , 铁 氧 还 蛋白 的 电子 不 能 传 给 辅酶 工 , 但 仍 可 还 原 NO, 。 — AR REEL CETL LL LE LL ELE LEE TTT 还 原 的 铁 氧 还 蛋白 还 可 将 电子 交 给 环境 中 的 氧 , 使 氧 还 原 。 这 样 的 光合 电子 传递 在 光 系 统 工 氧化 侧 氧 化 水 , 释 放 氧气 , 在 光 系统 I 还 原 侧 又 使 氧 还 原 , 整 个 过 程 没有 氧化 还 原 物质 积累 , 但 其 电子 传递 也 可 以 导致 质子 动力 势 的 产生 而 偶 联 ATP 的 合成 (Blankenship 2002)。 93.4 将 电子 交还 给 光 系 纺 工 和 交 系 所 IIS {1c mm 这 是 光合 磷酸 化 发 现 人 Arnon 首先 提出 的 。 它 是 围绕 光 系 统 I 的 电子 传递 , 不 牵涉 氧 的 释放 与 还 原 , 只 伴随 质子 动力 势 的 产生 和 ATP 合 成 。 有 人 怀疑 它 在 有 氧 条 件 下 不 能 发 生 , 但 沈 允 钢 实验 室 用 甘 暮 叶 细胞 做 实验 , 表 明 它 在 体内 是 可 能 存在 的 〈 沈 巩 榴 等 1964). ES 硫 氧 还 蛋白 (thioredoxin) 是 可 调节 叶绿体 中 一 些 蛋 白 活性 的 微量 物质 , 铁 硫 蛋白 将 电子 传递 给 它 使 它 处 于 还 原状 态 , 从 而 影响 叶绿体 内 一 系列 反应 (Buchanan et al. 2000) 。 上 述 铁 氧 还 蛋白 传 出 电子 的 多 种 去 向 都 可 能 发 生 , 它们 的 作用 有 差异 , 但 都 能 伴随 - 质子 动力 势 的 产生 而 导致 ATP 的 合成 。 在 光合 能 量 转换 形成 的 同化 力 中 , 还 原 辅酶 工 和 ATP 利 用 的 比例 是 随 碳 同化 及 其 他 代谢 等 过 程 的 需要 而 变化 的 。 铁 氧 还 蛋白 的 上 述 各 种 电子 传递 去 向 的 改变 能 有 助 于 调节 同化 力 这 两 个 组 分 的 比例 。 近 几 年 的 研究 发 现 , 除 了 铁 氧 还 蛋白 的 去 向 变动 外 , 即 使 它 传递 给 了 辅酶 I, 还 原 的 辅酶 工 也 可 以 将 电子 通过 类 圳 体 膜 上 的 还 原 辅酶 开脱 氢 酶 而 将 电子 传递 给 光 系 统 工 和 光 系 统 I 间 的 电子 递 体 , 而 用 于 ATP 的 产生 。 值得 注意 的 是 , 低 浓度 亚 硫 酸 盐 处 理 常 能 促进 此 途径 的 进行 ,从 而 可 以 增加 ATP 的 含量 , 提 高 光合 作用 和 经 济 产量 , 这 有 希望 成 为 一 种 无 害 、 高 效 、 简 便 易 行 的 增产 洁 施 (Wang et al. 2002)。 有 不 少 研究 表明 , 还 原 辅酶 工 脱 氢 酶 也 是 存在 于 类 圳 体 EW. 习 复 合体 , 虽 然 数量 较 光 系 统 I、 光 系统 II、 细胞 色素 &% /和 ATP 合 酶 少 , 但 在 低 等 植 和 高 等 植物 的 类 圳 体 中 都 存在 ,并 且 表 明 它 有 不 少 调节 功能 (Mi et al.1995, Wk 正 菊 等 2003), 这 是 很 值得 重视 的 问题 。 107 gO# AE PE EDDA EV SIE HE et FE Hh 9.4 FSPRIRAY AS 2 FE ES Er FE BE FE PHY ERE ASR AT oh ASA PIB AE TR AS A Ft BEA eC th CA, 这 与 其 能 量 转换 功 能 有 何 联系 是 非常 值得 广 意 的 问题 。 9.4.1 类 圳 体 的 动态 结构 变化 与 质子 动力 势 的 —e ee 人 们 早 就 注意 到 类 圳 体 在 光照 条 件 下 会 发 生 收 缩 现象 , HAG AU Ae ES REALE 光 下 形成 了 膜 内 外 质子 梯度 有 关 ,, 有 人 则 认为 这 现象 的 发 生还 与 有 机 酸 进入 类 圳 体 膜 内 有 联系 。 有 研究 表明 , 这 决定 于 测量 时 介质 中 原来 pH 如 何 , 在 微 碱 性 时 需要 存在 有 机 酸 才能 使 类 圳 体 收缩 ,在 微 酸性 时 则 不 需要 同时 存在 有 机 酸 。 考 虑 到 光合 定向 电子 传递 常 伴随 质子 转移 而 使 类 圳 体 膜 外 变 成 微 碱 性 , 因此 在 体内 情况 下 的 收缩 还 是 与 有 机 酸 存 在 有 关 的 〈 丁 焕 根 等 1989) 。 类 圳 体 在 光 下 产生 的 膜 内 外 电位 差 会 导致 类 圳 体 膨 胀 , 但 其 影响 不 如 质子 梯度 大 , 因 此 人 们 一 般 不 易 注意 到 其 作用 〈 丁 焕 根 等 1990 ) 。 类 圳 体 的 收缩 膨胀 可 能 与 其 膜 的 特性 变化 有 联系 。 通 过 测定 光合 电子 传递 的 Arrhenius 图 观察 到 , 当 它 伴 随 产 生 的 质子 梯度 存在 时 , 其 反应 的 活化 能 在 0~28C 范围 内 不 变 , 当 其 质子 梯度 用 于 进行 磷酸 化 或 加 入 解 联 剂 销 除 后 , 则 在 8C 左 右 出 现 折 点 , 在 低 于 8C 时 活化 能 显著 增加 〈 叶 济 宇 等 1981)。Shen (1994) 多 方面 观察 到 质子 在 向 类 圳 体 膜 内 侧 释 放 时 存在 区 域 化 现象 , 特 别 值得 注意 的 是 水 氧化 时 释放 的 质子 在 1C 左 右 时 是 区 域 化 的 , 25°C PYM SE IE, Weis (1998) 研究 光合 磷酸 化 时 发 现在 光照 40ms 内 、2C 时 所 合成 的 AIP 量 超过 25SC 下 合成 的 量 , 在 光照 Ss 时 , 则 后 者 合成 的 ATP 大 于 在 低温 条 件 下 合成 的 量 。 这 更 表明 在 低温 下 光照 初期 的 类 宫 体 膜 动态 结构 变化 和 膜 内 侧 的 质子 区 域 化 有 密切 联系 。 上 述 这 些 现象 都 表明 , 类 圳 体 膜 在 光 下 发 生 的 这 些 动态 变化 都 和 跨 膜 质 子 动力 势 的 形成 和 消除 有 关 , 这 有 是 很 有 意义 的 。 它 使 人 体会 到 , 光 合 能 量 转换 过 程 中 , 跨 膜 质子 动 力 势 的 形成 不 仅 可 推动 ATP 合 成 , 而 且 还 能 通过 改变 膜 的 动态 结构 影响 在 膜 上 进行 的 其 他 能 量 转换 反应 , 从 而 对 光合 能 量 转换 过 程 中 的 许多 反应 发 生 调节 作用 , 其 详细 机 制 非 BATH. 942 ANE RTE Lich AA AE AE 在 植物 体内 , ERE A 4 PB) AE I EB ERY , 1K HY PR EK BE Kk ABE IN Fs LK A A EE, ATRL, BARES AR EEE LANE 4) Hi AW. Jt ABE UW 3E 57 Fh EER EAR LL, HEABE ERED Ap FE lad WE PE PE EK ABA boy, ATP A Big lll] 4 Bch Fla) Jot SBE ASE ALK BE ARE RE 部 分 , 只 有 细胞 色素 pej 复 合体 在 各 处 的 分 布 较 均匀 (Blankenship 2002), 这 些 蛋 白 复 合体 是 光合 能 量 转换 的 主要 组 成 成 员 , 整个 过 程 的 硬 沁 进行 有 赖 于 这 些 蛋白 复合 体 在 能 量 转换 反应 中 紧密 配合 协调 完成 。 人 们 对 于 王 们 在 类 圳 体 上 不 同 部 位 的 不 均匀 分 布 的 意义 有 不 少 推测 。 由 于 在 光照 较 弱 处 生长 的 HE Et BAR LATE Pils, Kc —-RAA, RRARA ARORA ZZ SHEA UIE RAS AS AA MTRSCNERER I, HEPES HARMS nwitfeem RP, AR fF POR BRAY JE Bt AE Jt EATS, RO PRUEIEF 30 I PDEA LETT AY Fz eT HK HK 4 WR Biomembranes 108 此 协调 呢 ? MDB ORE, RADE EA PRS, EDTA U FUSE ASC ATA ED BC. KF FLV BL till, 一 般 认 为 是 通过 捕 光 叶绿素 蛋白 的 可 逆 磷 酸 化 来 完成 的 。 当 光 系 统 开 接受 的 激发 能 较 多 时 , 催 化 此 磷酸 化 的 酶 被 激活 , 使 捕 光 叶 绿 素 蛋 白 复 合体 被 磷酸 化 后 脱离 光 系 统 I 而 癌 光 系统 I 转 移 。 当 光 系 统 I 接 受到 的 激发 能 较 多 时 , 捕 光 叶 绿 素 蛋 白 复 合体 被 脱 磷酸 化 而 风光 系统 开 转 移 (Blankenship 2002)。 也 有 些 证 据 表 明 , 除了 捕 光 叶绿素 蛋白 复合 体 的 转移 , 还 有 一 种 调节 途径 是 光 系 统 I 和 光 系 统 开 Sel rin (BH Ae HE A EASE ALE AS Lit. Tan (1998) 对 这 个 问题 进行 了 研究 , 从 PIC DF AE IRA Pr Ko LIME 1k PR AB EAT, i BLE eae A ate A) BE 在 更 短 的 时 间 内 发 生 。 苏 吉 虎 等 (2003) 在 大 豆 叶 片 中 观察 到 , 当 叶片 被 红 光 照射 使 光 系 统 开 接受 到 的 光量 子 多 于 光 系 统 I 后 ,测定 与 水 氧化 释放 质子 数量 有 关 的 蝶 秒 延迟 发 光 快 相 强度 会 发 生 一 个 在 短 时 间 内 达到 最 高 值 的 变化 。 这 可 能 反映 光 系 统 工 和 光 系 统 I 逐 渐 靠 近 而 发 生 激发 能 的 满 溢 有 利于 电子 传递 的 顺利 进行 , 但 也 可 能 由 于 类 吉 体 膜 中 存在 的 数量 较 多 的 电子 递 体 一 一 质 醒 从 膜 的 其 他 部 位 不 断 向 光 系 统 工 接受 电子 部 位 移动 所 引起 的 。 在 这 两 种 可 能 导致 毫秒 延迟 发 光 快 相 强度 在 短 时 间 内 达到 最 高 值 的 因素 中 , 究竟 何者 起 主要 作用 还 有 待 进一步 研究 。 各 种 蛋白 复合 体 基 粒 和 间 质 类 吉 体 膜 上 不 同 区 域 的 不 均匀 分 布 是 否 会 影响 这 些 复 合 体 之 间 在 反应 过 程 中 的 紧密 联系 呢 ? 上 面 已 谈 到 ,一般 认为 光 系 统 工 主要 分 布 在 类 圳 体 的 县 合 部 位 , 而 AIP 合 酶 则 全 部 处 于 类 圳 体 非 登 合 区 。 可 是 ,Wei 等 (1998) 的 实验 表明 , 在 1C 下 进行 光合 磷酸 化 时 ,40ms 内 测 得 ATP 合 成 量 可 超过 25C 下 进行 的 , 这 似乎 明显 地 与 一 般 文 献 中 所 谈 到 的 光 系 统 工 和 ATP 合 酶 分 布 于 类 吉 体 的 不 同 区 域 的 说 法 有 了 矛盾 。 如 何 看 待 这 问题 呢 ? 也 许可 用 观察 条 件 不 一 样 来 解释 。 类 吉 体 在 黑暗 中 放置 一 段 时 间 后 , 开始 照 强 白光 的 最 初 40ms 内 , 从 功能 上 测 得 光 系 统 I 水 氧化 所 释放 的 质子 能 迅速 转移 到 ATP 合 酶 , 这 和 文献 中 取样 分 析 蛋 白 复 合体 在 类 宫 体 膜 上 分 布 的 条 件 很 可 能 差别 很 大 。 因此 , 如 能 加 强 探讨 在 不 同 条件 下 各 种 蛋白 复合 体 在 类 吉 体 膜 上 的 分 布 特点 , 也 许 能 更 深入 地 了 解 类 圳 体 膜 的 变动 性 , 从 而 有 助 于 解决 已 有 结构 知识 和 功能 测定 结果 之 间 表 面 上 存在 的 矛盾 。 9.5 叶绿体 ATIP 合 酶 的 结构 功能 和 转 能 效率 的 改善 _ = =— 光合 机 构 中 的 ATP 合 酶 (ATP synthase) 与 细菌 质 膜 和 线粒体 内 膜 中 的 ATP 合 酶 的 结构 功能 很 类 似 , 都 是 由 突出 于 膜 外 表面 的 包含 催化 部 位 的 蛋白 复合 体 和 钨 在 膜 中 的 具 有 质子 通道 功能 的 蛋白 复合 体 两 部 分 组 成 , 它 们 所 有 的 亚 基 种 类 也 差不多 。 石 晓 冰 等 (2001) 研究 了 叶绿体 ATP 合 酶 各 亚 基 间 的 相互 作用 , 设 想 其 结构 模式 如 图 9-2, 其 中 5 亚 基 与 其 他 亚 基 的 连接 与 文献 中 报道 的 细菌 质 膜 的 酶 的 情况 有 所 不 同 。 这 些 ATP 合 酶 的 结构 虽然 是 大 同 小 异 , 不 过 这 “小 异 ” 也 很 值得 注意 。 例 如 , 即 使 同 是 叶绿体 的 AIP 合 酶 , 不 同 植物 中 的 也 有 不 同 之 处 。 李 淑 俊 等 (1978) 将 落 茉 和 答 豆 的 ATP 合 酶 突出 于 膜 表面 和 专 白 复合 体 互 换 , 重 组 后 的 光合 磷酸 化 活力 反而 都 出 现 增益 效应 , 虽 然 它 们 与 催 化 AIF “或 有 关 的 B 亚 基 的 氨基 酸 序 列 有 92.5”% 的 同 源 性 ( 沈 允 钢 等 1998)。 又 如 ,ATP 合 酶 的 全 忆 部 位 在 突出 于 膜 外 表面 的 蛋白 复合 体 上 , 它 与 皮 中 的 部 分 脱离 后 仍 可 诱导 出 109 Ox AE BE (ARAL -SIER E Th 水 解 ATP 的 活力 , 可 是 我 们 观察 到 其 特性 与 膜 中 的 部 分 连接 时 有 所 不 同 , 与 后 者 处 于 腊 上 时 更 不 一 样 , 可 见 连接 情况 稍 有 差异 对 其 功能 会 有 显著 影响 (Shen et al. 1987 ) 。 ATP 合 酶 突出 于 膜 表面 的 蛋白 复合 体 由 5 种 亚 基 组 成 , 其 中 x BL y 亚 基 与 合成 ATP 直 接 相 关 , 它们 在 各 种 ATP 合 酶 中 组 成 相当 类 似 。5 与 s 亚 基 则 涉及 功能 调节 , 它 们 在 各 种 ATP 合 酶 中 的 差别 较 大 。5 亚 基 在 ATP 合 酶 突出 于 膜 表 面部 分 与 膜 中 部 分 的 连 接 中 负担 着 重要 作用 。Ni 等 (2004) 通 过 突变 获得 了 菠菜 叶绿体 ATP 合 酶 的 7 个 不 同 部 位 氨基 酸 缺 失 的 突变 体 蛋 白 , 用 酵母 双 杂 交 方 法 研究 它们 与 其 他 亚 基 的 相互 作用 。 结 果 表 明 ,5 亚 基 的 N 端 氨基 酸 残 基 缺 失主 要 影响 ae 5 亚 基 与 ATP 合 酶 突出 于 膜 表 面部 分 的 亚 基 相 互 作用 ,C 端 缺失 则 主要 影响 与 ATP 合 酶 在 膜 中 部 分 的 相互 作用 。 他 们 在 实验 中 观 察 到 ATP 合 酶 的 功能 对 5 亚 基 C 端 氨基 酸 残 基 的 缺失 更 敏感 。ATP AR = 亚 基 与 水 解 ATP 和 堵塞 质子 泄 吝 的 功能 有 联系 ,Shi (2001) 和 曾 小 美 等 (2003) FEE. coli PR 达 了 N 端 和 C 端 部 分 氨基 酸 残 基 缺 失 突变 体 的 蛋白 , 并 将 其 加 到 叶绿体 中 研究 它们 对 ATP 合 酶 功能 的 影响 , 结 果 表 明 N 端的 氨基 酸 残缺 对 其 功能 的 影响 更 大 。 关于 ATP 合 酶 如 何 利用 跨 膜 质子 动力 势 催 化 ATP 合成 的 机 制 , 现 在 一 般 认 为 是 按 Boyer 等 的 结合 变化 机 理 进 行 的 (Boyer et al. 1973), 即 在 质子 动力 势 (主要 是 质子 梯度 ) 推动 下 ,y Ale 亚 基 相 对 于 on; 亚 基 旋转 , 使 后 者 发 生 构象 变化 而 催化 ATP 合 成, 关于 其 准 量 关 系 至 今 还 存在 不 同 看 法 (Shen 1998)。 我 们 实验 室 发 现 , 有 一 系列 处 理 可 以 提高 它 利 用 质子 动力 势 合成 ATP 的 效率 , 包括 一 些 抗生素 (AEBS, 多 黏 菌 素 . 四 环 素 等 )、 多 元 酸 (如 苹果 酸 、 柠 檬 酸 、 磷 酸 等 ) 以 及 细胞 分 裂 素 的 类 似 物 6- 卞 基 氨 味 叭 ( 沈 允 钢 等 1998)。 多 种 测定 显示 ,它们 的 作用 部 位 有 些 在 B 亚 基 , 有 些 在 y 亚 基 或 邻近 部 位 上 。 它 们 不 但 对 离 体 叶绿体 有 作用 , 有 的 在 处 理 叶 片 时 也 能 提高 叶片 中 ATP 含量 和 光合 作用 。 从 这 些 实验 结果 来 看 , 在 植物 体内 的 ATP 合 酶 常 不 是 处 于 高 效 状 态 的 , 可 以 通过 一 些 措 施 改变 其 动态 结构 而 提高 其 转 能 效率 。 叶绿体 ATP 合 酶 复合 体 的 结构 模型 (FLAN) RE、 ,_ 戴 新 宾 , 于 勇 , KR BE. 2000. HE ABE UI se A BS HaSV) TE] & HK DR BE = 系 . 科学 通报 ,45:1858-1861 邓 勇 , 叶 济 字 , 米 华 玲 . 2003. 监 藻 NAD(P)H 脱 氢 酶 复合 体 与 藻 胆 蛋白 结合 LEDS. 中 国 植物 生理 学 会 全 国学 术 年 会 学 术 论文 摘要 汇编 , 113 打 焕 根 , 沈 允 钢 . 1989. 类 囊 体 的 收缩 变化 与 质子 运转 关系 的 研究 . 科学 肛 只 , 17: 1335-1338 HE ty WR Biomembranes 110 了 丁 焕 根 , 沈 允 钢 . 1990. 膜 电位 在 类 圳 体 膨 胀 变化 中 的 作用 . 生物 化 学 与 生物 物理 学 报 , 22: 169-174 郭 连 旺 , 许 大 全 . 1994. 自然 条 件 下 珊瑚 树 (Viburnum odoratissimum) 叶片 光合 作用 的 光 抑 制 . 植物 生理 学 报 , 20: 46-54 李 淑 俊 , BESTE, 王国 强 等 . 1978. 叶绿体 结构 和 功能 的 研究 . 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Studies on the relation between the fast phase of millisecond delayed light emission and the proton released from oxidation of water in spinACh. Photosynthesis Research, 57: 317-322 Zhang HB, Xu DQ. 2003. Different mechanisms for photosystem 2 reversible down-regulation in pumpkin and soybean leaves under saturating irradiance. Photosynthetica, 41: 177-184 第 10 Re Téa Hk az AC ARSE UW BAF 复合 体 的 结构 与 功能 [0 二 HG 下 的 结构 王 劲 能 113 (ee 83 (080 3s) Aa ne 113 10.1.2. LHC-Il 9A EBERRON cnsovcccsenscaresesecc 115 10:2. ©P43 和 ICp47 Wye SEH BE ie seictis ice. oisca-ncos eee 116 10.2.1 CP43 #1 CP47 的 组 成 与 结构 特征 本 人间 117 10.2.2 ‘CP43 $f CP47 HAE BEBE 2st enzct-eoerseoes ere 118 10.3 HABE W ELH (RC-ID) AZ Ha IAB on. ceseceececneneeesnseeeeee 119 103T RCI 的 分 子 结 构 en.ccee ccc cneocesesnoss ovo enya 119 10.3.2 RC-I 的 原初 光化学 反应 及 其 动力 学 的 研究 «oc ceeeeeeeneeenee 120 10.3.3. RCI 的 光 破 乓 作用 ee 120 WIA. 合作 用 是 绿色 植物 特有 的 生理 功能 ,其 大 规模 地 利用 太阳 能 把 CO, 和 了 2O 合成 有 机 物质 并 释放 0O:, 这 不 仅 是 人 类 生命 活动 的 物质 基础 , 而 且 是 农业 、 林 业 和 其 他 一 切 种 植 业 、 冀 牧 业 及 水 产 养殖 业 的 物质 基础 。 因 此 , 它 一 经 被 发 现 , 就 成 为 世人 了 瞩 目的 研究 领域 之 一 , 至 今 方兴未艾 。 就 目前 已 有 的 知识 , 可 以 将 光合 作用 大 致 划分 为 4 个 相对 独 立 的 中 间 过 程 : (1) 光 能 的 吸收 与 传递 : 即 捕 光 (KA) 色素 分 子 对 光 能 的 吸收 及 其 在 不 同色 素 分 子 间 的 传递 , (2) 原初 光化学 反应 : 通过 电荷 分 离 的 方式 将 光 能 转化 为 位 能 , 其 结果 产生 一 个 强 氧化 剂 和 一 个 强 还 原 剂 , 分 别 参 与 其 后 的 HO 的 氧化 和 电子 传 递 的 氧化 还 原 反 应 ; (3) 电子 传递 及 其 偶 联 的 磷酸 化 作用 : 将 位 能 转换 成 活 变 的 化 学 能 , 并 携带 在 其 形成 的 还 原 辅酶 工 NADPH ) 和 ATP 中 ; (4) 碳 素 同化 作用 : 利用 NADPH 和 ATP 将 CO; 还 原 成 碳水 化 合 物 , 与 此 同时 将 活 小 的 化 学 能 转换 成 相对 稳定 的 化 学 能 , 储 存在 这 类 光合 产物 之 中 。 前 3 个 过 程 是 在 光合 膜 (BR) 113 #10 KAHE AKAM Ha FE AAW SDE 中 进行 的 , 与 光 直 接 有 关 ,, 称 为 光合 作用 的 光 反 应 阶段 , 即 光 合作 用 原初 光 能 转化 过 程 ; 而 第 4 个 过 程 与 光 无 直接 的 关系 ,是 在 叶绿体 间 质 内 通过 一 系列 酶 促 暗 反应 完成 的 , 称 为 光合 作用 的 上 暗 反 应 阶段 , 即 光合 作用 的 碳 素 同化 过 程 。 类 圳 体 是 双 层 脂 膜 , 由 色素 、 脂 类 和 和 蛋白 质 组成。 其 中 和 蛋白质 大 都 与 色素 结合 成 各 种 膜 蛋白 超 分 子 复合 体 镶 藤 在 类 圳 体 上 ,它们 分 别 执行 光合 作用 光 反 应 阶段 中 的 各 个 过 程 。 高 等 植物 类 圳 体 中 的 膜 蛋白 超 分 子 复 合体 按 其 组 成 和 结构 可 分 为 : TEAR GEM (PS II), JERS (PSI), AHH ER bf (Cythf) 蛋白 复合 体 和 ATP 合 酶 4 大 类 《图 10-1)。 自 20 世 纪 60 年 代 以 来 , 人 们 对 上 述 膜 蛋白 超 分 子 复 合体 的 分 离 、 纯 化 、 结 构 和 功能 开展 了 广泛 深入 地 研究 , 取 得 了 许多 划时代 的 进展 , 为 揭示 光合 作用 高 效 转 能 的 分 子 机 制 标 积 了 幸 富 的 资料 。 鉴 于 篇 幅 , 本 文 以 高 等 植物 光 系 统 工 为 重点 , 结 合 我 们 多 年 的 工作 , 对 国内 外 有 关 这 类 超 分 子 复 合体 结构 与 功能 研究 的 进展 作 一 简要 的 介绍 。 BE 到 交合 膜 蛋白 超 分 子 复合 体 在 膜 上 分 布 的 示意 图 ( 引 自 匡 廷 云 2003) PS II 由 外 周 天 线 色素 蛋白 复合 体 (LHC-I) .内 周 天 线 色素 蛋白 复合 体 (CP43 和 CP47 等 )、 反 应 中 心 色素 蛋白 复合 体 (RC) 、Mn 徐 复合 物 和 外 周 蛋 白 33kDa、24 kDa 和 17 kDa 等 多 肽 组 成 。 目 前 已 分 别 将 这 些 膜 蛋白 复合 体 从 类 圳 体 中 分 离 、 纯 化 出 来 , 并 对 它们 的 结构 与 功能 进行 了 广泛 地 研究 。 10.1 DACA At" 7 eI LHC-I HH ANE. BEC AHOR. AE A(Lheb) iS Ga 5 RRS 所 形成 的 色素 蛋白 复合 体 家 族 (LHCB) 构成 。 它 在 光合 腊 能 的 吸收 和 传递 外 , 对 维持 类 圳 体 的 结构 、 调 节 激 发 能 在 两 个 光 系 统 之 间 上 光 保 护 和 对 各 种 环境 的 适应 都 起 着 重要 作用 。 LOL.) LHC NUS» "51 ) IE i Jansson “§ (1992) 根据 编码 LHC-I 和 蛋白 组 分 的 基因 :型 认为 , LHC-I 主 要 由 Lhcb1l、 = KE ty ie Biomembranes 114 Lhcb2, Lheb3, Lhcb4, LhebS 和 Lhcb6 六 种 基因 型 编码 的 蛋白 与 色素 形成 的 LHCB1、 LHCB2 LHCB3.LHCB4 .LHCB5 和 LHCB6 六 种 蛋白 复合 体 组 成 。 其 中 LHCB1 LHCB2 和 LHCB3 在 体内 形成 异 质 三 聚 体 , 称 为 主体 LHC-I, 约 占 叶绿体 总 蛋白 的 1/3, 且 结合 约 45% 的 叶绿素 (Chl), 而 LHCB4、LHCB5 和 LHCB6 在 体内 只 以 单 体 的 形式 存在 , HE 其 在 凝 胶 电 访 中 的 表 观 分 子 质 量 的 不 同 又 分 别称 为 CP29、CP26 和 CP24, 三 者 合 称 为 微 2 RCI 主体 LHC-II 在 体内 通常 是 以 三 聚 体 的 形式 存在 的 .LHCB1(28 kDa), LHCB2(27 kDa) 和 少量 的 LHCB3 (25 kDa ) 以 随机 的 方式 在 体内 组 成 异 质 三 聚 体 。 最 近 ,Jackowski 等 (2001a, b) 应 用 非 变性 等 电 聚 焦 方 法 从 菠菜 类 圳 体 中 已 分 离 出 7 种 LHC-I 三 聚 体 , 其 中 2 种 含有 LHCB1、LHCB2 和 LHCB3 三 种 多 肽 , 而 其 他 $ 种 只 含有 LHCB1 和 LHCB2 两 种 多 肽 。 类 圳 体 膜 上 含有 的 磷脂 酰 甘 油 (PG) 在 三 聚 体 的 形成 中 起 重要 作用 , 不 含 PG 的 突变 体 和 磷脂 酶 A; 消 化 处 理 导 致 三 聚 体 的 解 聚 等 都 证 明了 这 一 观点 。 近 来 一 些 研究 亦 表明 , 除 三 聚 体外 ,LHC-I 在 体内 也 可 以 寡 聚 体 的 形式 存在 (Ruban et al. 1997a, b), 这 很 可 能 与 PS TPC KIEFER. AK LHC-I 不 同 聚集 态 的 生理 功能 , 目 前 尚 不 清楚 。 最 近 有 关 我 们 的 一 些 初步 研究 , 将 在 后 面 LHC-I 的 功能 部 分 进行 介绍 。 A(29.5°) P170-T201 B(30.1°) KR P55-R87 C(11.6°) 1124-A144 D(75.0°) P205-A214 E(69.6°) W97-F105 菠菜 LHC-I 的 晶体 结构 模型 ( 引 自 Liu et al. 2004) 令 人 振奋 的 是 , 最 近 中 国 科 学 院 生物 物 理 研 究 所 与 植物 研究 所 密切 合作 , 完成 了 菠 菜 LHC-II (4 27 kDa Fil 25 kDa 两 种 多 肽 ) 的 2.72A 分辩 率 的 三 维 晶 体 结 构 解析 。 结 果 表明 : LHC-I 单 体 脱 辅 基 蛋白 含 232 个 妥 基 酸 残 基 , 有 3 个 跨 膜 的 和 2 个 位 于 圳 腔 侧 的 Q 螺旋 , 结 合 有 14 个 Chi (8 个 Chla 和 6 个 Chlb) 分 子 、4 个 类 胡 葛 下 素 (2 个 黄体 素 FL RN). UE, 还 结合 有 一 个 属于 叶 黄 素 循环 中 色素 的 混合 体 (图 10-2A); 三 聚 体 区 域 : 短 了 多 肽 链 的 三 端 、C 端 、 螺 旋 B 的 基质 端 、 蜂 兴 C 上 的 玻 水 残 基 和 结合 在 这 部 分 多 肽 链 上 的 色素 和 脂 类 化 合 物 , 形 成 一 个 玻 水 区 〈 图 10-2B), 是 类 胡萝卜 素 结合 垦 115 #102 KANE AHR MM AD FE AAAI FGDC CLA, Mee —7ARS ECE IT ee OD EL OTP AEE EKA 光 保 护 机 制 具 有 重要 的 意义 〈Liu et al. 2004) , 10.1.2 LHC-II 的 生理 功能 及 其 机 人族 | | 1. 光 能 的 捕获 与 传递 捕 光 天 线 复合 体 的 主要 功能 之 一 是 吸收 光 能 , 并 把 它 迅速 地 传递 到 光合 反应 中 心 引 起 光化学 反应 。 在 LHC-I 中 ,不同 的 Chl a, Chi b 和 类 胡 葛 卜 素 分 子 之 间 存 在 着 非常 复 杂 的 激 子 相互 作用 。 研究 它们 之 间 的 能 量 传递 过 程 和 时 间 和 常数 对 于 了 解 捕 光 色素 蛋白 复 合体 中 色素 分 子 的 排列 及 其 互相 作用 有 具有 重要 的 意义 。 较 早期 的 单 波长 和 多 波长 泵 浦 探 测 时 间 分 辨 差异 吸收 光谱 的 研究 揭示 ,LHC-I 中 Chlb 及 Chla 到 Chi a 的 能 量 传递 时 间 常数 分 别 为 6ps 和 20ps。 但 近年 来 , 在 采用 皮 秒 或 飞 秒 差异 吸收 光谱 的 研究 中 发 现 , 这 些 能 量 传递 是 由 许多 不 同 的 过 程 组 成 的 (Bittner et al. 1995 ) 。 其 中 一 部 分 传递 发 生 在 Ips 之 内 , 此 过 程 可 能 归属 于 同一 层 中 LHC-I 单 体内 的 Chlb 到 Chl a 的 传递 。 另 外 还 有 一 个 较 慢 的 过 程 (2~6ps) 归属 于 不 同 层 中 的 LHC-I 单 体 的 Chlb 到 Chla 的 传递 , 以 及 Chl a (671nm) 到 Chl a (676nm) 的 能 量 传递 。 此 外 , 还 发 现 了 一 些 14~36ps 和 几 百 ps 的 过 程 , 可 能 是 源 于 不 同 单 体 之 间 的 色素 的 能 量 平 衡 过 程 。 2. LHC-I 对 激发 能 分 配 的 调控 作用 由 于 光合 作用 光 能 转化 的 原初 过 程 是 由 两 个 光 反 应 推动 , 以 串联 的 方式 协同 进行 的 , 其 光 能 转化 的 效率 取决 于 色素 吸收 的 激发 能 在 两 个 光 系 统 之 间 的 分 配 状 况 , 通常 当 吸收 的 激发 能 在 两 个 光 系 统 之 间 的 分 配 处 于 平衡 时 , 其 光 能 转化 的 效率 最 高 。 Bonaventure (1969) 首先 发 现 , 在 限制 光 条 件 下 用 主要 被 PSI 吸 收 的 光 (> 700nm) 照射 小 球 藻 可 诱导 其 吸收 的 激发 能 向 PS I 分 配 的 比例 增加 , 称 之 为 “状态 乙 , 与 此 相 反 , 若 用 主要 被 PS TRMCAIE (650nm) 照射 小 球 藻 则 可 引起 其 吸收 的 激发 能 向 PS 1 分 配 的 比例 增加 , 称 之 为 “状态 I 。 同 年 ,Homman (1969) 和 Murata (1969) 各 自 证 BA, 这 种 光 诱 导 植 物体 内 “状态 转变 ”调节 激发 能 在 两 个 光 系 统 之 间 分 配 的 “ 满 谥 效应 ” 可 以 通过 控制 离 体 叶绿体 类 圳 体 膜 周围 的 离子 环境 在 体外 加 以 诱导 , 且 极 易 借 助 于 测定 FE Chl a 欧 光 发 射 踢 度 的 变化 进行 检测 。 他 们 发 现在 从 低 盐 介质 下 分 离 的 菠菜 叶绿体 膜 中 加 入 金属 阳离子 可 以 诱导 PS I 的 交 光 (F685) 增高 和 PS I 的 荧光 (F735) 降低 , 并 将 此 现象 解释 为 是 由 于 阳离子 抑制 激发 能 从 PS 工 向 PSI 传 递 的 结果 。 这 一 成 功 的 实验 为 进 一 步 研究 植物 体内 激发 能 在 两 个 光 系 统 之 间 分 配 的 调控 机 理 起 了 重大 的 推动 作用 。 其 后 许多 研究 者 的 工作 不 仅 证 明了 阳离子 (45 K* | Na*, Ca?*, Mg? 和 Al 等) 诱导 离 体 叶绿体 膜 Chl a 荧光 发 射 强度 的 变化 与 其 诱导 类 圳 体 膜 结构 或 构 型 的 改变 密切 相关 , 同 时 受 类 圳 体 膜 表面 静电 性 质 的 控制 , LHC-II 在 其 中 起 着 关键 性 的 作用 , 而 且 相 继 提出 了 一 些 假说 试图 解释 这 种 调控 机 理 。 3. 能 量 的 耗 散 与 光 保 护 功能 当 植 物 处 于 高 于 光合 作用 所 能 利用 的 光 强 照射 时 易 产 Nol, ews. (Aan RENT A ih PAL ill PERE eA HBR, Bk K—4 SFC) L 制 消耗 过 多 的 能 量 , 就 可 以 避免 强 光 对 光合 右 的 损伤 .植物 的 避 光 性 反应 就 是 前 条 低能 量 捕获 机 制 的 反映 , 而 过 多 能 量 的 非 辐 射 耗 散 (NRD) 则 是 通过 LHC-II 蛋 和 白 参 与 不 同 过 程 的 复杂 机 制 来 实现 。 Yamamoto “ (1996) 把 NRD 的 产生 分 为 三 个 过 程 , 这 :个 过 程 通 常 是 依次 发 生 的 , 而 = H: Wy i Biomembranes 116 在 一 些 实验 或 一 定 生 理 条 件 下 也 可 能 是 各 自 独 立 的 。 第 一 个 过 程 是 跨 膜 A pH 的 产生 , 其 诱发 较 高 的 能 量 和 NRD 快速 可 逆 的 反应 ;第 二 个 过 程 是 酸性 的 吉 腔 和 抗坏血酸 盐 诱导 紫 黄 质 脱 环 氧化 产生 环 氧 玉米 黄 质 和 玉米 黄 质 , 即 叶 黄 素 循环 , 第 三 个 过 程 是 NRD 本 身 的 机 制 。 迄 今 , 除 了 知道 其 定位 于 PS Rep, LHC- 蛋白 参与 上 述 每 个 过 程 的 其 他 方面 了 解 甚 少 。 4. LHC-I 在 维持 类 圳 体 膜 结构 中 的 作用 在 类 圳 体 膜 上 ,LHC-I 在 进行 光 能 吸收 和 传递 的 同时 , 对 类 圳 体 膜 结构 的 维持 尤其 EARNS he AE BBE. Tang 等 (1986) TEM RA ASEH, GEE 和 小麦 叶绿体 膜 缺乏 LHC-I, thik a veeny ea, 并 且 在 叶绿体 膜 转 绿 过 程 中 LHC-II 的 出 现 与 基 粒 的 形成 是 同时 进行 的 。 因 此 ,Tang 等 (1986) 认为 ,LHC-I 的 存在 是 基 粒 形成 的 主导 因素 , 而 介质 中 一 定 的 阳离子 浓度 则 是 基 粒 形成 的 外 在 条 件 。Zhou 等 (1982 ) 亦 观察 到 , 用 胰 和 蛋白 酶 消 化 分 离 的 菠菜 叶绿体 膜 会 引起 LHC-I 和 蛋白 的 降解 和 基 粒 结构 的 RRR , 在 酶 销 化 前 加 入 M 喧 则 可 使 上 述 现象 在 一 定 程 度 得 到 减轻 。 这 些 实验 结果 支持 了 Tang 等 的 上 述 观点 。 5. LHC-I 的 不 同 聚集 态 及 其 在 光 能 吸收 和 传递 中 的 调控 作用 在 植物 体内 LHC-I 主 要 是 以 三 聚 体形 式 存 在 的 , 在 随机 聚集 成 三 聚 体 的 过 程 中 亦 会 发 生 不 同 的 二 聚 体 和 多 聚 体 (BES) 形式 的 随机 组 合 。 迄 今 已 有 不 少 研究 者 观察 到 在 植物 体内 有 单 体 和 寡 聚 体形 式 的 LHC-I 存 在 (Ruban et al. 1997a,b)。LHC-I 不 同 聚集 态 的 存在 是 否 意味 着 这 些 聚 集体 在 体内 的 相互 作用 对 光 能 的 吸收 与 传递 可 能 产生 重大 的 影响 。 最 近 ,,Leng 等 (2003) 用 磷脂 酶 (PLA2) 消化 纯化 的 菠菜 LHC-I 异 质 三 聚 体 (由 29kDa、28 kDa 和 26kDa 3 种 多 肽 组 成 ), 用 芒 糖 密度 梯度 离心 或 电 洗 脱 方 法 , 分 别 获 得 了 LHC-I 的 单 体 、 二 聚 体 和 三 聚 体 ,, 初步 研究 表明 ,3 种 不 同 聚 集体 LHC-I 对 光 能 吸收 的 总 体 趋势 是 三 聚 体 较 强 , 二 聚 体 与 单 体 较为 接近 , 而 三 种 聚集 体 的 能 量 传递 效率 的 总 体 表 现 亦 为 : 三 聚 体 > 二 聚 体 > 单 体 。 上 述 类 似 的 实验 结果 已 在 我 们 从 潮 间 带 海 生 绿 藻 (Bryopsis corticulans) 类 圳 体 膜 分 离 、 纯 化 出 的 LHC-I 单 体 、 同 质 三 聚 体 〈 多 肤 组 成 的 分 子 质量 为 24.3 kDa)、 异 质 三 聚 体 〈 由 24.3 kDa Fil 23 kDa 两 种 多 肽 组 成 ) 和 2 个 寡 聚 体 中 进行 同样 的 分 析 中 所 证 实 。 即 不 同 聚集 体 LHC-I 在 光 能 吸收 与 传递 效率 上 , 总 体 表 现 为 同 质 三 聚 体 > 异 质 三 聚 体 > 单 体 > 寡 聚 体 。 这 些 研究 结果 可 能 说 明 ,, 在 植物 类 圳 体 膜 中 , 不 仅 存 在 着 不 同 的 聚集 体 , 而 且 可 能 通过 它们 的 相互 转换 调节 和 控制 光 能 的 吸收 及 其 向 反应 中 心 的 传递 , 既 可 保证 反应 中 心 有 足 够 的 激发 能 转化 为 化 学 能 , 形 成 足够 的 同化 能 力 (AITP 和 NADPH:) ff CO, 同化 所 利用 , 又 可 以 防止 过 多 的 激发 能 传 至 反应 中 心 引 起 反应 中 心 的 破坏 。 在 此 过 程 中 , 膜 脂 尤其 是 磷脂 酰 甘油 及 Chl b 可 能 起 着 重要 的 作用 , 这 是 一 个 值得 深入 研究 的 问题 。 10.2 CP43 和 CP47 的 结构 与 功能 CP43 和 CP47 是 与 PS 开 反 应 中 心 紧密 结合 的 内 周 捕 光 色素 蛋白 复合 物 , 又 称 核心 天 线 复 今 物 , 它 除了 将 LHC-I 捕 获 的 激发 能 汇集 到 PS I 反 应 中 心 之 外 ,还 有 维持 PS TI 放 氧 复合 物 的 结构 ,参与 水 裂解 放 氧 等 功能 。 此 外 , 还 有 一 些 报道 表 明 ,CP43 可 能 具有 丝氨酸 盘 白 水 解 酶 的 活性 ,能 在 光照 下 使 D, 蛋白 降解 , 而 SP47 则 是 PS 开 次 级 电子 受 体 117 g 108 He ANRR ALAR UW tA Ff EAA SDE QA 和 次 级 电子 供 体 Yz 发 挥 正常 功能 所 必需 的 。 因 此 , CP 47 CP 43 的 结构 与 功能 的 阐明 对 于 剖析 PS II 的 空间 结构 , 揭 示 PS I 内 激发 能 吸收 、 分 配 和 传递 的 机 制 , 以 及 PS I 放 氧 机 制 等 均 有 重要 作用 。 1021 4 FIL CAT 站 组 友 与 行人 全 全 1. CP43 和 CP47 的 组 成 分 析 20 世纪 90 年 代 初 ,Alffonso 等 (1994) 首次 从 甜菜 (Beia vulgaris cv. MonohilD) 和 大 (Glycine max cv.Williams) 的 叶片 中 分 离 、 纯 化 出 CP43 和 CP47, 并 对 它们 的 色素 含量 所 基 酸 组 成 和 光谱 性 质 进行 了 研究 ,初步 确定 CP43 中 含有 18~20 个 Chla 和 5 个 B-Car 分 子 ; 在 CP47 中 则 含有 19~22 个 Chla 和 4 个 B-Car 分 子 。 目 前 已 证 实 , 在 CP43 和 CP47 中 不 含 Chl b 分 子 。 由 于 蛋白 纯化 和 色素 定量 测定 方法 不 同 , 有 关 这 两 种 复合 物 中 的 色 素 化 学 计量 关系 迄今 尚 不 能 肯定 。 2. CP43 和 CP47 的 结构 特征 CP43 和 CP47 分 别 ca Fil psbC 基因 编码 。 根 据 其 核 苷 酸 序列 推 It, ve se CP43 和 CP47 和 蛋白 分 别 由 473 和 308 个 甩 基 酸 残 基 组 成 。Chisholm 等 (1988) 以 Hydropathy plot 提 出 了 CP43 (图 10-3A) 和 CP47 (图 10-3B) 的 二 级 结构 模型 , 认 为 CP43 和 CP47 均 有 6 个 跨 模 的 X 螺旋 和 5 个 分 别 位 于 基质 侧 和 面 腔 侧 的 亲 水 环 , 亲 水 环 B、D 以 及 杀 水 的 N 端 和 C 端 都 位 于 基质 侧 , 而 亲 水 环 A、C、E 则 位 于 历 腔 侧 。 该 模型 已 被 Sayre 等 (1994) 所 证 实 。 ae Gly 16 Fe fi lads 118 138 Ile ental ‘Leu pe p Va 上 ay. CP43 和 CP47 的 二 级 结构 Hydropathy plot 模式 图 ( 引 自 Bricker et al. 1990) 虽然 CP43 和 CP47 的 一 级 结构 存在 较 大 的 差异 , 但 它们 的 二 级 结构 却 非常 相似 。 这 能 与 它们 在 PSU 中 对 称 排 列 并 发 挥 相 似 的 功能 有 关 (Holzenburg .al 1993), CP43 人 WEA), FR iL ARE 面 。 细 菌 天 线 复 合 物 的 x 和 有 B 亚 基 以 及 高 等 植物 的 LHC-T 类 似 的 组 受 酸 残 基 的 分 布 特征 。 组 氨 酸 残 基 是 Chl 分 子 的 首选 配 基 , 因 此 ,CP , ”CP47 中 组 氨 酸 残 基 的 分 布 亦 可 能 与 Chl 分 子 的 结合 及 分 布 有 关 。 Hy WR Biomembranes 118 10.2.2 CP43 和 CT47 F574: gma 1. 在 激发 能 传递 中 的 作用 及 其 机 制 CP43 和 CP47 的 主要 功能 是 接受 从 LHC-II 和 CP29、CP26、CP24 等 外 周 天 线 复合 物 传递 来 的 激发 能 , 并 将 激发 能 传递 给 反应 中 心 色 素 蛋 白 复 合 物 (RC-I)。 关 于 激发 能 传 mA, Bassi 等 (1987) 曾 提出 按 外 周 天 线 色素 复合 物 一 CP43 一 CP47 一 RC-I 的 传递 模式 .。 最 近 ,Krugh 等 (1995) 通 过 对 CP43、CP47 突变 体 荧 光 发 射 光 谱 的 测定 ,证 明 能 量 不 仅 可 以 按 上 述 路 线 传 递 , 而 且 CP47 还 可 以 不 经 过 CP43 而 直接 从 外 周 天 线 色素 蛋白 复 合 物 接受 能 量 , 并 传递 给 反应 中 心 。 关于 PS I 天 线 系统 内 激发 能 的 传递 机 制 , 目 前 主要 提出 两 种 ,其 一 为 Fbrster 机 制 , 即 偶 极 一 振动 偶合 机 制 , 其 二 为 激 子 作用 机 制 (exciton action mechanism), van Dorssen 等 (1987) 分 析 了 CP47 的 低温 吸收 和 奖 光 发 射 光 谱 , 证 明 CP47 存 在 微弱 的 激 子 效应 。Julio 等 (1994) 分 析 了 CP47 中 Chl 分 子 的 艾 光 衰减 动力 学 和 共振 拉 曼 光谱 , 证 明 CP47 中 不 但 存 在 色素 分 子 之 间 的 相互 作用 ( 即 激 子 效应 ), 而 且 也 存在 色素 与 蛋白 之 间 的 相互 作用 , 并 以 后 者 为 主 。 最 近 ,Shan 等 (2001) 和 Wang 等 (1999) 采 用 热 和 光 诱 导 CP43 和 CP47 变 性 过 程 , 亦 观察 到 相似 的 结 末 。 此 外 ,Shan 等 (2000) 还 采用 吸收 光谱 和 交 光 激发 光谱 研 究 了 CP43 和 CP47 中 了-Car 与 Chl a 分 子 间 的 能 量 传递 作用 , 其 结果 表明 , 在 常温 下 CP43 和 CP47 中 均 存 在 着 B-Car 与 Chl a 分 子 间 的 能 量 传递 , 其 效率 分 别 为 29.1% 和 62.8%, 它 们 可 能 以 Daxter 的 电子 交换 机 制 进行 。 但 是 ,由 于 目前 尚 缺少 CP43 和 CP47 的 高 级 结构 方面 的 信息 , 色 素 的 结合 状态 知之 甚 少 , 因此 CP43 和 CP47 中 色素 间 的 能 量 传递 及 传递 机 制 尚 无 明确 的 结论 。 2. CP43 在 强 光 诱 导 D, 蛋白 降解 中 的 作用 许多 实验 已 经 证 明 PS I 是 强 光 引起 光 抑 制 乃 至 光 破 坏 的 重要 部 位 。 强 光照 射 不 但 引起 PS 工 电子 传递 的 下 降 , 而 且 还 启动 蛋白 的 降解 和 快速 周转 〈 于 振 宝 等 1995) 。 在 光 抑制 中 变化 最 明显 的 是 RC-I 的 Di 蛋白 。 另 外 的 一 些 研 究 发 现 , 无 论 是 PS I eA, 还 是 分 离 的 RC-I, 强 光 下 都 能 观察 到 反应 中 心 的 另外 一 个 重要 蛋白 D; 的 降解 , 但 在 同 样 条 件 下 它 的 降解 比 D; 蛋白 慢 得 多 。 此 后 , Yamamoto 等 (1995) 观察 到 , 在 体外 光 抑 制 情况 下 ,CP43 亦 发 生 降解 。 但 到 目前 为 止 , 无 论 体 外 还 是 体内 , 均 未 见 到 有 关 CP47 光 抑制 降解 的 报道 。 3. 在 维持 PS 开 结构 完整 性 和 光合 放 氧 中 的 作用 Vermass 等 (1988) 发 现 ,PpspB 基因 的 突变 将 导致 PS TE AREA TE. Callahan 等 (1989) 认 为 , 高 等 植物 类 圳 体 膜 中 CP43、CP47 主要 位 于 基 粒 片 层 (grana lamellae) , 而 D,、D; 则 主要 位 于 基质 片 层 (stroma lamellae) , 新 合成 的 D,、D; 骨 入 基质 片 层 , 在 那里 进行 翻译 后 的 加 工 , 然 后 成 熟 的 D,、D; 转 入 基 粒 片 层 并 与 CP43、CP47 结 合 形成 具 有 正常 功能 的 PS Il @ Ay, Pertersen 等 (1990) 报 道 ,CP47/D/DyCyt bss 复合 物 与 DV DzxyCyt 5 反应 中 心 复合 物 的 光 反 应 不 同 , 前 者 在 有 外 产 Fe# 时 , 在 室温 下 光照 可 诱导 POH Y? = Y” AQHEVEEPR 信号 , 而 后 者 却 不 能 。 由 此 认为 , 供 体 侧 酷 所 酸 的 光 氧 化 需要 AiG) ADR, ih CP47 的 存在 是 这 种 构象 形成 所 必需 。Santini 等 (1994) 报 道 , 失 去 CP43、cCP47 的 PS 开 复 合 物 则 以 单 体形 式 存在 。 在 高 等 植物 体内 ,33kDa 外 周 蛋 白 因 能 稳定 锰 复 的 结合 而 对 维持 放 氧 活性 所 必需 。 119 #108 He ANE AKAM ta FE AAW SDE 实验 证 明 , CP 47 abi sot He fic Be We tm AY de hit 7k EH 5 33kDa 9} fei] BE A FA (Putnam-Evans etal. 1997)。 单 克隆 抗体 试验 发 现 , 只 有 完全 去 锰 后 , 抗 体 才 能 与 CP47 的 抗原 决定 徐 相 结合 , 表 明 CP47 可 能 直接 参与 锰 禾 结合 。 此 外 ,Wu 等 (1996) 发 现 , 位 于 圳 朋 侧 的 玻 水 环 C 的 定点 突变 导致 蓝藻 (CSymecjnocystis sp. PCC6803) 放 氧 活性 下 降 和 目 养 能 力 的 丧失 , 表明 CP47 Wt C 也 与 放 氧 有 关 。Miyao 等 (1995) 报 道 ,psp C 基因 的 突变 和 缺失 尽 管 不 影响 PS 开 的 光化学 活性 , 但 导致 其 放 氧 活性 的 走失 。Vermass 等 (1993) 进 一 步 证 明 , CP43 Biz EA 中 任何 区 段 的 缺失 都 会 导致 放 氧 活性 的 走失 。Enami 等 (1997) 发 现 , 只 有 除去 33kDa 蛋白 后 , 胰 蛋白酶 才能 作用 于 CP43 ie AiR E AY Argss;-Phesss HABE, Ze HH 同 CP47 一样 ,CP43 亦 通过 其 最 大 玻 水 环 王 与 33kDa 蛋白 相 结合 。 以 上 事实 表明 ,CP43 不 但 为 光合 放 氧 所 必需 , 而 且 其 功能 区 亦 主要 位 于 最 大 玻 水 环 E。 10.3 光 系 统 工 反应 中 心 (CID 的 结构 与 功能 0 反应 中 心 叶 绿 素 蛋白 复合 体 是 进行 光合 作用 原初 光化学 反应 的 机 构 。.20 世 纪 80 年 代 中 期 , 德 国 科 学 家 Deisenhofer 等 (1985) 成 功 地 获得 了 紫色 光合 细菌 反应 中 心 叶 绿 素 蛋 白 复 合体 的 晶体 的 X 射 线 衍射 数据 ,确定 了 其 空间 结构 , 因而 获得 了 1988 年 诺 贝 尔 化 学 奖 。 紧 接着 日 本 化 学 家 Nanba 等 〈1987) 首先 从 高 等 植物 菠 全 的 叶绿体 膜 中 分 离 、 纯 化 J RC-ILD,/D,/Cyt pss 色素 蛋白 复合 体 , 并 证 明 该 复合 体 具 有 原初 电荷 分 离 活 性 , 而 且 D,, D, 多 肽 在 一 级 结构 上 分 别 与 紫色 细菌 反应 中 心 L 和 M 亚 基 具 有 很 大 的 相似 性 ,从 而 肯定 了 DVDyCyt pss。 复合 体 是 RC-I。 由 此 , 大 大 地 推动 了 RC-I 结 构 与 功能 的 研究 。 103.1 RCI 门 分 本 亏 门 LS 有 关 RC-I 的 多 肽 组 成 , 对 高 等 植物 分 离 、 纯 化 的 RC-II 进 行 SDS-PAGE 的 分 析 表 明 , RC-I 蛋白 由 分 子 质量 为 32kDa (D, 蛋白 )、34kDa (D; 蛋白 )、10kDa 和 4kDa (Cyt bss Wo FB AE) 以 及 少量 4.8 kDa (PSI ZEA Hy) 等 多 肽 组 成 。 根 据 一 级 结构 推测 DV D,/Cyt pss 的 空间 结构 ,D,、D; 多 肽 均 含有 5 个 跨 膜 螺旋 , 这 已 被 2001 年 对 PS II Ak 体 结 构 的 X 射 线 衍 射 结 末 所 证 实 。Zouni 等 (2001 ) MMB we (Synechococcus chongatus ) 中 分 离 出 二 聚 体 PSI[ 颗 粒 , 进 行 三 维 唱 体 生 长 和 射线 衍射 分 析 , 发 现 两 组 5 个 跨 膜 螺旋 各 自 排 列 成 半 环 状 , 相 互 结 合成 担 手 状 , 分 别 为 D; 和 D: 的 A~E 段 5 个 x 螺 旋 , 其 中 每 个 亚 基 中 的 C 段 和 D 段 螺旋 通过 一 段位 于 圳 腔 侧 的 长 CD 螺旋 相连 。 这 种 排列 方式 与 紫色 细菌 反应 中 心 工 和 M 亚 基 排列 方式 以 及 PS I Ht PsaA 和 PsaB 的 排列 方式 很 相似 。 这 种 相似 性 支持 所 有 光合 反应 中 心 起 源 于 共同 祖先 的 假说 。 有 关 RC-I 的 色素 组 成 一 直 是 一 个 有 争议 的 问题 。 早 期 Nanba 等 (1987) 从 菠菜 叶 绿 体 膜 中 分 离 、 纯 化 的 DVDyCyt ss 的 色素 含量 为 Chl a : Pheo :B-Car=S:2:1。Barber (1987) 最 初 从 竞 豆 叶绿体 膜 分 离 得 到 的 D/DyCyt pss 的 色素 组 成 为 Chla : Pheo : B-Car 三 4 22: 1。 但 是 Dekker (1989) 分 离 的 DJ/DyCyt b;5,, # Chla& &A11~134, 后 来 Gounaris (1990) 和 Kobayashi (1991) 等 先后 采用 两 币 去 分 离 纯化 得 到 的 D,/ D,/Cyt 55se 中 Chl a 分 子 含量 均 为 6 个 。 匡 廷 云 等 (1995) 光谱 对 丙酮 抽 提 液 RC-Ii 色素 组 成 的 分 析 表 明 Chl a : Pheo = 6 : 2。 所 以 , 目 前 - 为 从 高 等 植物 纯化 的 RC-Ii D,/D,/Cyt psse 的 色素 分 子 组 成 是 Chl a : Pheo : B-Car =( .二 :2, 比 紫色 光合 细菌 反应 中 站 多 2 个 Chla 人 分子。 生物 膜 Biomembranes 120 色素 分 子 在 蛋白 质 上 的 有 序 排列 和 特定 的 取 同 是 发 挥 其 重要 生物 学 功能 的 基础 。 紫 色光 合 细菌 反应 中 心 的 三 维 空间 结构 表明 , 光 合 细菌 原初 电子 供 体 P870 是 由 两 个 细菌 叶绿素 (BChl) 组 成 的 二 聚 体 (Deisenhofer et al. 198$)。 然 而 , 对 于 高 等 植物 RC-I 的 原初 电子 供 体 (primary electron donor) P680 在 蛋白 质 中 的 结合 状态 究竟 是 二 聚 体 , 还 是 单 体 仍 不 清楚 。 鉴 于 RC-I 的 Di、D; 蛋白 与 紫色 细菌 反应 中 心 的 L 和 M 亚 基 在 一 级 结构 上 有 很 大 的 相似 性 , 而且 L 和 M 亚 基 上 与 P870 相 结合 的 组 氨 酸 残 基 , 在 PS II Dy, D&A Et RABI, 因而 人 们 推测 P680 的 结构 与 P870 相 似 , 可 能 也 以 二 聚 体形 式 存 在 。 彭 德 川 等 (1999) FA HPLC 方法 研究 RC-II 光 破坏 过 程 中 Chl a 分 子 含量 变化 的 结果 支 持 P680 可 能 是 二 聚 体 的 看 法 。 关于 RC-I 中 其 他 色素 分 子 排 布 方式 , 到 目前 为 止 尚 缺乏 直接 的 实验 证 据 。 匡 廷 云 等 (1995) 和 修建 敏 等 (1995) 认为 反应 中 心 内 部 的 两 个 Pheo 分 子 存在 两 种 不 同 的 状态 , 其 中 一 个 与 光化学 活性 有 关 , 而 另 一 个 则 与 光化学 活性 无 关 ,, 但 其 构成 的 第 二 条 电子 传 递 支 路 对 前 者 构成 的 第 一 条 电子 传递 支 路 具有 光 保 护 作 用 。 此 外 ,我 们 还 利用 共振 拉 曼 光谱 技术 对 纯化 的 菠菜 RC-I 中 B-Car 分 子 的 结构 进行 分 析 的 结果 表明 ,该 B-Car 属 全 反 式 构 型 , 其 多 烯 链 的 平面 处 于 扭曲 状态 (Lu et al. 1996) , 与 细菌 光合 反应 中 心 的 类 胡 葛 卜 素 分 子 的 构 型 和 构象 相似 。 侯 建 敏 等 (2000) 采用 低温 (100K) 吸收 光谱 和 线 工 色光 谱 技 术 观察 到 RC-I 中 B-Car 分 子 有 两 种 不 同 的 空间 取 同 , 其 中 在 470nm 和 450nm 处 有 吸收 的 B-Car 分 子 与 膜 平面 垂直 ,, 它 对 强 光 更 敏感 。 辛 越 勇 (2002) 通过 纳 秒 时 间 分 辨 内 光 光 解 测 定 , 观 察 到 反应 中 心 形 成 三 线 态 的 B-Car 分 子 的 半衰期 与 三 线 态 P680 弛 豫 半 误 期 相同 , 同 时 还 观察 到 在 有 电子 受 体 情 况 下 , 有 一 半 B-Car 分 子 光 氧化 形成 阳离子 自由 基 。 为 此 , 他 们 认为 RC-I 两 个 B-Car 分 子 中 一 个 的 功能 是 作为 电子 供 体 , 而 另 一 个 是 作 为 P680 三 线 态 的 六 灭 剂 而 起 光 保 护 作 用 。 1032 RCI 的 原初 光 化 池 扩 应 及 其 动力 宁 门 人 元 ms 所 谓 PS I 的 原初 光化学 反应 , 是 指 在 RC-I 内 原初 电子 供 体 P680 接收 光 能 处 于 激 发 态 , 将 其 一 个 高 能 电子 传递 给 原初 电子 受 体 (primary electron acceptor) Pheo 分 子 , 形 成 离子 对 P680* . Pheo ,产生 电荷 分 离 的 过 程 。 该 反应 过 程 的 微观 动力 学 研究 是 目前 国 际 光合 作用 基础 研究 中 极为 瞩目 但 又 存在 严重 分 歧 的 一 个 领域 。 大 体 上 存在 两 种 不 同 的 观点 , 一 种 认为 电 符 分 离 的 时 间 稼 数 是 3.0ps;, 而 另 一 种 则 认为 是 21ps(Wasielewski et al. 1989), Hou“ (1995) 采用 皮 秒 和 飞 秒 时 间 分 辨 光谱 技术 , 在 PS I 工 颗粒 、PS 开 核心 复 合体 和 了 RC-I 三 种 不 同 层次 的 色素 蛋白 复合 体 水 平 上 对 PS I 原 初 光 化 学 反应 动力 学 机 制 进 行 了 研究 。 甚 中 在 对 PS 工 颗粒 飞 秒 差异 吸收 的 测量 中 分 辨 出 3 个 寿命 组 分 : 1.6ps、 3.6ps 和 22ps; 在 对 PS I 核 心 复 合 物 的 测量 中 只 分 辨 出 有 两 个 组 分 , 即 在 去 除 LHC-II 的 PS II 颗粒 中 观察 不 到 22ps 组 分 。 此 外 , 在 对 PS IL Mik’ APS II 核心 复合 物 的 飞 秒 时 间 分 辨 荣光 动力 学 的 测量 中 , 也 同样 得 到 了 3.0ps 的 衰减 组 小。 因此, 他 们 的 实验 结果 支持 RC-I 电 荷 分 离 的 时 间 篆 数 可 能 是 3.0ps 的 看 法 。 10.3.3 C-1L FS I<) (FI ROMER) HR, 极 易 受到 光照 的 破坏 。 光 破坏 全 用 涉及 原初 电子 供 体 P680、 原初 电子 受 体 Pheo、B-Car 和 D, 蛋白 的 降解 等 。 光 破坏 是 由 于 光 诱导 电荷 分 离 产 生 的 离 121 #102 KANE AKA HOF AAMAS SDE ¥-%} P680* - Pheo Fe +E HA fay HE ZA IMT FZ oe = 2% AS PO8O (3P680) , *PO80 与 溶液 中 的 氧 反 应 生 成 单线 态 氧 , rey RETR VAY ZR AS OK HG PO80 FF D,/D,/Cyt bss HEC PTA VERA ETE 质 的 变化 ,在 红 区 (Qy tH) 的 吸光 值 及 圆 二 色 信 号 下 降 (于 振 宝 等 1992,1994b) 。 同 时 也 导致 区 光 发 射 强度 发 生变 化 , 峰 位 蓝 移 。 此 外 , 卢 荣 禾 等 (1993) 还 观察 到 光照 后 暗 放置 过 程 中 这 些 变 化 还 能 继续 进行 。 由 于 单线 态 氧 寿 命 很 得 Cb Ins), , 暗 放置 过 程 中 的 破坏 作用 不 可 能 是 单线 态 氧 的 直接 作用 ,因此 推测 在 光照 过 程 中 RC-I 很 可 能 有 一 个 相 对 稳定 的 反应 中 间 体 形成 , 从 而 造成 在 暗 放置 过 程 中 使 反应 中 心 继续 受到 破坏 , 这 表明 RC-I 的 光 破 坏 是 一 个 多 步 反 应 过 程 。 1,RC-I 中 色素 的 光 破 坏 文献 中 已 用 多 种 光谱 方法 证 明 P680 受到 光照 破坏 , 但 破坏 后 的 产物 及 P680 结构 的 变化 尚 不 清楚 。 彭 德 川 等 (1999) 用 HPLC 和 FTIR 技术 发 现 , P680 发 生 光 照 破坏 时 有 脱 镁 反应 发 生 , 形成 Pheo 或 Pheo 类 似 物 ,但 光 破 坏 的 产物 不 是 单一 的 。 侯 建 敏 等 (1995) 和 匡 廷 云 等 〈1995) 还 用 HPLC 方法 详细 分 析 了 RC-I 在 强 光 照射 下 色素 相对 含量 的 变 化 ,发现 了 RC-I Pheo 的 光照 破坏 , 并 证 明 这 种 破坏 是 单线 态 氧 作 用 的 结果 , 它 发 生 在 P680 光 破坏 之 前 。 根 据 研 究 结果 ,修建 敏 等 (1996) 提出 了 如 图 10-4 所 示 的 反应 中 心 第 二 电子 传递 支 链 具有 光 保 护 作 用 模型 。 } PERE] RC-II 第 二 条 电子 传递 链 可 能 的 光 保 护 作用 (51 REM 1996) 2,RC-I 中 蛋白 的 光 破 坏 强 光照 射 对 RC-I 复合 物 的 多 肽 组 分 有 明显 影响 。 :RC-I 的 SDS-PAGE 图 谱 上 Di, 和 D:; 的 表 观 分 子 质量 明显 增加 , 谱 带 位 置 上 移 , 拳 GRRE PBR. Yb, 于 振 宝 等 (1995 ) 还 观察 到 光 破 坏 的 RC-I 复 合 物 中 存在 一 个 大 幻 41kDa 的 组 分 。Barber (1992) KE yy fie Biomembranes 122 在 光 抑 制 的 PS 开 核 心 复 合 物 中 也 曾 观察 到 这 个 41kDa 的 组 分 , 推 测 它 可 能 是 D, 多 肽 降 解 后 与 D; 多 肽 结合 的 产物 。 匡 廷 云 等 〈1993) 测定 强 光 照射 前 后 RC- 工 中 氨基 酸 残 基 镶 量 的 结果 表明 , 光 照 后 His 含量 下 降 26% 左 右 , 其 他 氨基 酸 的 含量 基本 不 变 , 这 说 明 在 光照 过 程 中 ,His 残 基 受 到 很 大 程度 的 破坏 。 在 光照 后 的 暗 放置 过 程 中 ,His 含量 既 疫 有 升 高 , 也 没有 继续 下 降 , 表 明 His 残 基 的 破坏 是 不 可 逆 的 。 用 His 的 特异 性 化 学 修饰 剂 二 乙 基 焦 磷 酸 酯 (DEPC) 修饰 RC-I 后 进行 光 抑 制 实验 , 并 与 单线 态 氧 对 RC-II 的 破坏 作用 作 比 较 , 结果 表明 被 光 破 坏 的 His 残 基 主要 位 于 易 被 修饰 的 RC-I 的 疏 水 区 , 即 色 素 结合 区 域 ( 李 淑 齐 等 2000)。 单 线 态 氧 可 能 直接 参与 了 His 残 基 上 的 咪唑 环 配 位 结合 , 而 单线 态 氧 产 生 在 P680 附 近 ,, 寿命 很 短 〈 在 水 溶液 中 约 2hs) , 所 以 受到 光 破 坏 的 His 残 基 可 能 参与 P680 的 结合 , 或 在 空间 构象 上 与 P680 接近 。Rufle 等 (1992) 将 紫色 光合 细 菌 的 晶体 结构 数据 用 计算 机 处 理 得 到 高 等 植物 RC-I 的 空间 结构 模型 , 推 测 P680 可 能 点 D, 和 D: 的 His198 结 合 , Di 的 His190 与 P680 的 空间 距离 很 近 , 它们 都 可 能 是 光 破 坏 过 程 中 单线 态 氧 攻击 的 对 象 , 这 与 杨 昆 云 (1996) 的 实验 结果 一 致 , 即 RC-I 中 受 光 破坏 的 His 残 基 位 于 P680 附 近 。 由 此 , 推出 RC-I 中 His 残 基 光 破 坏 的 分 子 机 制 可 能 是 : His 残 基 咪 唑 环 上 的 两 个 氮 原 子 与 其 他 多 肽 上 的 游离 氨基 在 单线 态 氧 的 作用 下 发 生 反应 ,形成 酰胺 键 而 导致 RC-I 多 肽 间 的 共 价 交 联 。RC-I 中 His 残 基 的 光 破 坏 与 其 光 致 蛋白 的 交 联 和 降解 有 直接 的 因果 联系 〈 杨 昆 云 1996 ) 。 3. RC-I 光 破坏 的 机 制 现 已 证 明 , 强 光照 射 RC-I 复 合 物 在 不 同 条 件 下 会 引 | 起 P680、Pheo、B-Car、Chl a 和 氨基 酸 残 基 的 破坏 , 最 终 导致 Di 和 D; 和 蛋白 的 降解 , 在 同样 条 件 下 D; 和 蛋白 的 降解 比 D, 慢 得 多 。 然 而 , 发 生 在 RC-I 的 电子 传递 供 体 侧 与 受 体 侧 光 破坏 的 机 制 是 不 同 的 。 在 供 体 侧 电子 传递 受阻 的 情况 下 , 无 论 有 氧 或 无 氧 的 存在 ,反应 中 心 复合 物 都 受到 光照 破坏 。 除 Chla 外 ,B-Car 也 明显 遭 破 坏 。 光 破坏 作用 可 能 按 如 下 顺序 进行 : 光 强 度 增 加 一 P680 捕 获 的 光量 子 数 增多 一 电荷 分 离 速率 增 大 一 供 体 侧 电子 传递 受阻 一 P680- 的 积累 一 B-Car, Chl a 等 色素 分 子 的 氧化 一 Di 蛋白 构象 变化 一 Di 蛋白 的 自身 水 解 一 光合 速率 减 小 。 也 就 是 说 供 体 侧 电子 传递 速率 小 于 电荷 分 离 速率 是 导致 PB680' 积 累 和 Di 蛋白 降解 的 根本 原因 。 在 受 体 侧 电子 传递 受阻 的 情况 下 , 反 应 中 心 复 合 物 的 光 破 坏 依赖 于 氧 的 存在 。 原 初 电荷 分 离 形成 的 离子 对 由 于 电子 传递 受 体 侧 受 阻 发 生 电 街 重组, 产生 一 部 分 三 线 态 下 680, 这 Ue = 28 25 °P 680 能 与 溶解 氧 反 应 生成 单线 态 氧 (102), , 高 度 活 泼 的 !0; 使 原初 电子 供 体 P680、Pheo 和 His 残 基 受到 破坏 , 致 使 D, 蛋白 降解 , 光 合 速率 下 降 。 4. RC-I 的 多 级 光 保护 作用 RC-I 是 光照 破坏 的 首要 作用 位 点 , 在 植物 长 期 进化 过 程 中 ,,RC-I 和 逐渐 具有 一 套 调 节 过 量 激发 能 进行 自我 保护 的 系统 ,包含 多 条 光 保 护 途 径 。 不 同 光 保护 途径 之 间 是 相互 补充 、 相 辅 相 成 的 , 可 以 根据 向 发 能 的 过 量程 度 进行 调节 , 有 效 地 保护 反应 中 心 的 正常 电子 传递 功能 , 即 RC-I 的 多 级 保护 作用 (修建 敏 等 1996)。 如 图 10-SA 所 示 , 当 了 PS II 受 体 侧 电子 传递 受阻 时 , 过 量 的 光 能 会 首先 造成 QA 或 Qi 的 积累 , 这 时 PS IBY Cyt pss 能 够 从 人 接受 电子 , 并 把 电子 传递 给 Chl a* 或 P680-, 即 通过 Cyt bsso 的 环形 电子 传递 (EFA, 已 革除 过 量 的 能 量 。 若 激发 能 继续 增加 , 可 引起 Pheo -积累 ,PS 工 中 低 电 位 Cyt dss 可 以 从 Pheo - 接受 电子 , 以 保护 反应 中 心 。 若 激发 能 继续 增多 , 则 可 以 形成 三 线 态 王 680, 123 108 KEANE AAG UW HAD FAA SDE 与 氧 作 用 生成 单线 态 氧 'O;, 这 时 通过 Pheo MICRA EA ATCA Oo, iA BIA AGE 的 目的 。 若 激发 能 过 量 时 , 则 产生 更 多 的 'O,, 造成 P680 的 光 破 坏 ,RC-I 失 去 光化学 活 性 , 还 会 造成 组 受 酸 残 基 的 光 破 坏 , 消 耗 过量 的 能 量 ,在 这 种 情况 下 , 植物 体内 的 D, 蛋 白 快速 周转 , 能 够 把 被 破坏 的 D, 蛋白 移 走 , 重新 合成 新 的 D, 蛋白 , 并 重新 组 装 在 已 失 活 的 RC-I 内 , 从 而 保护 反应 中 心 的 正常 功能 。 若 PS I 供 体 侧 电子 传递 受阻 时 (图 10-5B ), 过 量 的 激发 能 首先 会 使 冯 或 Chla 积累 , 此 时 Cyt bss 能 够 把 电子 传递 给 公 或 Chla, 从 而 保护 正常 的 电子 传递 过 程 。 铬 过 量 的 激发 能 继续 增加 时 , 会 产生 P680` 积累 ,这 时 RC-I 的 B-Car 能 够 把 电子 传递 给 P680, 本 身 被 氧化 而 形成 B-Car , 然 后 发 生 分 子 结构 的 破坏 , 这 样 保护 反应 中 心 免 受 破坏 。 因 此 , 我 们 认为 , RC-I 对 于 过 量 的 激发 能 具有 多 级 的 光 保 护 作 用 , 可 以 根据 激发 能 过 量 的 不 同 程度 , 通过 不 同 的 途径 有 效 地 调节 过 量 光 能 的 分 配 , 达到 自我 保护 的 目的 。 PS TI 反应 中 心 PS II 反应 中 心 P680* 积累 PS 开 受 体 侧 电子 传递 受阻 时 RC-I 的 多 级 保护 作用 〈 引 自 侯 建 敏 等 1996) 总 之 , RC-I 的 结构 与 功能 的 研究 在 光合 作用 研究 中 占有 极 重 要 的 地 位 , 是 一 个 难度 大 、 竞 争 十 分 激烈 和 探索 性 强 的 研究 课题 。 从 目前 的 进展 来 看 , 尽 管 已 经 取得 了 令 人 瞩 目的 成 就 , 但 仍 有 不 少 基本 问题 没有 解决 , 其 中 一 些 关 键 问题 , 如 原初 反应 动力 学 常数 、 电子 传递 的 单 向 性 、 第 二 条 电子 传递 支 链 的 生理 功能 、 原 初 反应 , 电 衍 分 离 的 分 子 机 制 等 , 还 有 待 于 进一步 地 研究 。 (45 aE HUT EZ) i A a9 jh Tia Sa ae = Ee ER. 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Nature, 409: 739-743 {x 第 it 线粒体 能 量 转换 分 子 AL Fill ED Ee ad He 11.I 线粒体 的 结构 与 呼吸 链 结构 生物 学 有司 127 BLS 0 SRR ee Bay a see ctcuss cress eect, dees eats 127 11.1.2 线粒体 呼吸 链 及 呼吸 酶 复合 体 的 结构 生物 学 ees eeeseeee 129 11.2 ”线粒体 氧化 磷酸 化 的 能 量 转换 体系 130 11.2.1 线粒体 呼吸 链 氧 化 和 磷酸 化 的 偶 联 一 一 “分 子 换 能 器 ” 的 个 用 机 币 必 有 贡 ee 130 11.2.2 一 线粒体 电子 传递 链 的 “漏电 ”问题 活性 氧 生成 及 其 12), elie siecle Rie. OMNI Ali, Bae ek. cee Be ae 132 11.2.3 ”线粒体 的 能 量 耗 散 系 统一 一 质子 回 漏 和 产 热 oe eee 134 11.3 线粒体 氧化 磷酸 化 能 量 转换 的 调节 和 控制 .pe 138 q 4 > 粒 体 的 研究 已 经 过 了 一 个 世纪 (Scheffler 2001a), 由 于 线粒体 -一 “电子 传递 链 的 氧化 磷酸 化 反应 为 有 机 体 生 成 约 90% FY ATP 能 量 , 历 来 被 誉 为 真 核 细 胞 的 “动力 站 ”。20 世纪 后 $0 年内, 先 后 有 5 位 科学 家 因 在 这 一 领域 的 重大 发 现 而 获得 诺 贝 尔 奖 。 除 了 能 量 转换 作用 , 线粒体 研究 尚 发 展 到 活性 氧 生 成 、 细 胞 氧化 还 原 Redox 信 吕 转 导 、 细 胞 凋 它 调控 和 基因 表达 的 调节 等 相关 领域 , 涉 及 生物 的 进化 、 发 育 、 遗 传 、 代 谢 、 训 老 、 疾 病 、 肿 瘤 以 及 细胞 和 死亡 等 重要 问题 ( 刘 树 森 2003)。 由 于 线粒体 在 细胞 凋 亡 中 的 关键 性 作用 已 获 共 识 , 它 们 又 称 为 “细胞 生 和 死 之 马达 (Weissig et al. 2001), 1999423 A, Science 发 表 系 列 论文 强调 ,线粒体 研究 乃 是 当前 生命 科学 和 分 子 医学 中 的 新 前 沿 (Kibertis 1999) 。 本 章 着 重 介绍 线粒体 能 量 转换 作用 研究 的 若干 进 世 TLL 线粒体 的 结构 与 咱 吸 链 ” 一 雯 宁 _ 11.1.1 线粒体 结构 及 其 新 模 —— . | 现 有 生物 科学 教科 书 和 专车 所 描述 的 线粒体 结构 EE ty WR Biomembranes 128 (mitochondrial structure) 都 是 20 世纪 60 年 代 由 Palade 的 模型 演变 而 来 (图 11-1A), 线 粒 体 由 内 外 两 层 脂 膜 围 成 , 内 膜 再 向 内 延伸 成 “ 隔 舱 板 (baffle)” sl 〈cristae) , 形 成 4 个 空间 : 外 膜 . 内 外 膜 间 队 和 贱 膜 胜 (cristae lumen) .内 膜 、 内 膜 包 围 的 基质 (matrix ) 。 上 千 种 线粒体 蛋白 、 酶 、 核 糖 体 及 mtDNA 等 都 分 布 于 这 4 个 空间 内 (Scheffler 2001b)。 氧化 磷酸 化 酶 系 和 ADP/ATP 转 移 酶 (ANT) 等 转运 蛋白 主要 都 在 内 膜 风 膜 上 ; 三 羧 酸 循环 和 脂肪 酸 氧化 酶 系 等 水 溶性 蛋白 、 mtDNA 和 核糖 体 分 布 于 基质 中 。 外 膜 对 小 分 子 自由 通 透 , 含 多 种 离子 通道 蛋白 和 电位 依赖 性 阴离子 通道 (VDAC) 的 膜 孔 蛋白 eo 外 膜 和 AAA TOM 和 TIM 蛋白 复合 体 是 胞 浆 合 成 的 线粒体 蛋白 进入 线粒体 的 通道 。 内 外 膜 间 和 晓 膜 腔 含有 磷酸 肌 酸 激酶 (CEK)、 细 胞 色素 < 以 及 调 亡 因子 (AIF), procaspase 2, procaspase 3, procaspase 9 等 。 A B 内 外 膜 间 隙 外 膜 基质 cea 核糖 体 接触 点 直径 Mt ie , | a 14 nm ¥ Bo A A ite % Set 宽度 CONE Pn LS BIE tl VM l4nm TiBS BRS 线粒体 结构 的 两 种 模型 ( 引 自 Frey et al. 2000) A. Baffle 模型 B. 风 膜 接口 模型 ,C. 新 模型 的 横断 面 ,D, 新 模型 三 维 重 构 图 129 11% ZR ELAR AE FETED FHL HT Fo 近 10 年 来 , BAUER. SOEUR BL Sk a set Be AAR ALL Be AH ie = ET DR a 显 像 技术 (EM tomography) 都 已 证 明 , 经 典 的 Baffle 模型 不 能 准确 表达 线粒体 的 结构 (Frey et al. 2000) 。 风 膜 接口 模型 (crista junction model)( 图 11-1B) 是 基于 电镜 三 维 重 构 断层 扫描 显 像 技 术 的 线粒体 结构 (图 11-1D), 其 特征 : (1) 内 膜 不 直接 向 内 延 成 风 膜 , 而 是 通过 内 膜 界 面膜 (inner boundary membrane) 与 风 膜 接口 相 接 ,(2) WANE BE Ae “ 隔 舱 板式 而 是 管状 或 扁平 吉 状 结构 ; (3 ) 线粒体 中 同时 有 几 种 不 同 的 动态 风 膜 结构 (图 11-1C); (4) 线粒体 内 外 膜 之 间 的 接触 点 (contact site) 宽度 为 20 一 40nm (in vitro) 或 14nm (isitz) , 横 跨 内 外 膜 的 间距 为 20nm, 外 膜 中 的 YDAC、 内 膜 中 ANT 等 蛋白 共同 构成 可 开关 的 线粒体 膜 转变 孔 (MPTP) (Reichert et al. 2002); (5) 线粒体 外 膜 的 VDAC 与 己 糖 激酶 形成 外 膜 的 能 量 代谢 微 区 ;, 《6) 外 膜 与 内 质 网 或 细胞 骨架 等 有 结构 和 功能 尼 连接 , 形 成 线粒体 网 络 结构 (图 11-1D )。 风 膜 接口 模型 对 次 入 认识 能 量 转换 的 调节 功能 有 多 方面 的 意义 ,也 提出 诸多 新 课题 。 首先 , 线 粒 体内 的 侧 癌 扩散 梯度 和 功能 微 区 的 意义 〈 如 封闭 的 风 膜 肥 是 否 意味 A ANE 一 分 布 , 对 ATP 合 成 的 影响 等 六 风 膜 接口 对 离子 和 底 物 分 子 的 分 布 和 转运 的 控制 ; GE 在 不 同 物种 和 不 同 代谢 状 态 下 的 形态 和 数量 的 变化 、 虹 膜 腔 的 动态 变化 、 细 胞 色素 c 在 内 外 膜 空 间 和 旺 膜 腔 内 的 转移 和 不 同 分 布 对 控制 线粒体 功能 的 关系 等 。 其 次 , 线 粒 体 内 外 膜 之 间 的 连接 点 结构 与 功能 、 外 膜 与 内 质 网 的 联系 及 其 在 细胞 内 形成 的 线粒体 网 络 对 线粒体 功能 和 细胞 内 外 环境 的 信号 答应 的 意义 ; 又 如 , 线 粒 体外 膜 与 细胞 骨架 之 间 起 联 系 的 蛋白 在 控制 线粒体 运动 及 其 对 能 量 代 谢 〈《 如 神经 细胞 触 突 的 形成 和 线粒体 在 胞 内 的 运输 ) 的 意义 等 (Frey et al. 2000) 。 看 来 , 线 粒 体 研究 面临 着 一 个 新 挑战 : 如 何在 多 学 科 相 互 结合 渗透 的 基础 上 , 前 明 线 粒 体 以 能 量 转 换 为 中 心 在 细胞 的 代谢 网 络 和 信和 号 网 络 中 的 调控 机 制 及 其 结构 基础 。 11.1.2 ZC ASIP HE KP SS CASEI EE = ms 生物 体 吸收 的 氧 分 子 90% 都 是 在 线粒体 呼吸 链 末端 在 氧化 酶 的 作用 下 接受 4 个 电子 还 原生 成 水 。 线 粒 体 呼 吸 链 包 含 4 个 电子 传递 复合 体 (I~IV)、 谤 柄 (Q) 和 细胞 色素 c。 植物 和 真 参 线 粒 体 呼吸 链 还 含有 NAD(P) 互 脱 气 酶 。 高 等 植物 、 真 菌 、 酵 母 及 原生 动物 线 粒 体 中 尚 舍 有 替代 氧化 酶 (altemative oxidase), 它们 都 与 线粒体 的 抗 氰 呼吸 和 产 热 功能 关 。 线 粒 体 呼 吸 链 的 多 途径 反映 其 功能 进化 和 调控 的 多 样 性 , 有 关 牛 心 线粒体 电子 传递 链 酶 复合 体 的 研究 进展 见 综述 〈 刘 树 森 2003) 。 目前 , 线 粒 体 呼吸 链 电子 传递 的 化 学 机 制 仍 不 清楚 。Hackenbrock 的 侧 向 扩散 和 随 机 碰撞 模型 认为 , 电 子 传 递 是 复合 体 在 膜 中 侧 向 扩散 和 随机 碰撞 的 过 程 ,Q 库 的 扩散 是 电子 传递 链 的 限 速 步骤 。 但 Hochman 认为 ,氧化 还 原 复合 体 可 以 形成 暂时 的 超级 聚集 物 , 以 利于 酶 的 稳定 和 减 小 电子 扩散 的 距离 〈 刘 树 森 2000), Schagger 称 这 种 超级 复合 体 为 呼吸 小 体 (respirasome ) 。 1994 年 以 来 ,Yu 等 (1999) 、Xia 等 (1997), Yoshika if 等 (1998) 分 别 对 复合 体 II、IV 以 及 V 的 Fi-ATP 酶 都 相继 获得 分 辨 率 为 2.8A 左 右上 吉 构 解析 (Sarate 1999 ); Iverson 等 (1999) 对 大 肠 杆 菌 的 延 胡 索 酸 还 原 酶 的 晶体 上 pr Aye A GEE Toy 结构 信息 , Walker 实验 室 1999 年 又 对 酵母 FF,-ATP Mf) an (SEAT SX RATA o> 析 (Scheffler 2001b)。 呼 吸 链 复合 体 II 的 晶体 结构 解析 为 于 电子 传递 与 质子 转移 相 偶 联 的 He Wy i Biomembranes 130 Qa (Q-cycle) 理论 模型 提供 了 证 据 (图 11-2A)。 复 合体 VGE)) 的 晶体 结构 解析 证 实 了 Boyer 关 于 ATP 合 成 反应 的 结合 变 构 制 论 模型 《图 11-2B)。 有 关 能 量 转换 的 分 子 机 制 在 下 面 将 进行 讨论 。 Rieske Protein A. 线粒体 复合 体 II 晶体 部 分 结构 图 像 ,B. Bee AA V AY F, 亚 基 示 意图 (51 A Sarate 1999) 11.2 BOREAS HCE Ae CNY FE He FERS 75 英国 Mitchell( 1966) AY {CFE F UE Wath dos S Be AS CR (CY EA PE 其 基本 点 是 电子 传递 链 酶 复合 体 I_IHI 和 IV aie a RR, CE PE I A 膜 基 质 中 系 到 内 膜 外 侧 , 建 立 起 跨 膜 的 质子 电化 学 梯度 (proton electron-chemical gradient) A 已 (由 跨 膜 电位 差 A 到 和 跨 膜 pH 差 A pH 组 成 ), 质 子 再 通过 复合 体 V 回 到 基质 时 使 ADP 和 Pi 合成 为 AITP。 这 样 , 代 谢 底 物 的 氧化 还 原 势 能 差 (A Eh) 转换 成 质子 电化 学 梯度 势能 A P〈(A AH ) , 再 转化 为 ATP 的 磷酸 键 能 (A Cr)。ATP 水 解 也 可 通过 复合 体 V 使 质子 跨 膜 泵 出 重新 形成 A 已 , 此 种 逆反 应 为 ATP 酶 水 解 活性 。 同 样 ,A 忆 也 可 驱动 电子 沿 呼吸 链 逆 方 向 传递 再 转换 为 A_ Eh, = PAA ERA KA MP 式 : A 有 1 一 一 AP(ARH) 一 一 AGC。AP 除 了 合成 ATP,, 亦 可 通过 被 动 扩散 的 质子 回 漏 (proton leak) 或 通过 解 偶 联 蛋白 (uncoupling protein, UCP) 解 偶 联 反应 转换 为 热 能 , 或 者 驱动 离子 共 转 运 。 在 线粒体 合成 时 ,A 书 用 于 驱动 蛋白 从 胞 浆 到 线粒体 内 的 转 运 。 生 理 条 件 下 , 线 粒 体 和 亚 一 般 平 均 维持 在 130~ 160my 左右 。 细 胞 中 多 种 需 能 反应 不 断 消 耗 A 尸 降低 A 玛 ,其 反馈 作用 又 刺激 电子 传递 链 活 性 升 高 , 使 A 到 不 断 得 以 维持 。 Alt, AV (AP) 是 一 种 动态 的 能 量 储存 形式 , 包 括 它 的 生成 系统 、 转 换 系统 和 消耗 系统 的 整合 平衡 共同 组 成 一 个 氧化 和 磷酸 化 的 能 量 偶 联 及 转换 体系 (参见 图 11-7) 。 11.2.1 CARI P IS iE Se ft AEM CA “ar Paice” AU iil Beh (AMEMIY , icy NADH 8% FADH(A")4> fll ath ch) We ie a AS TAT A UE HY LEB A AS PAGE ME Ai 2 EA, EH FR HY FH F(e), © Zeck HL fe BEA 131 g11z ZEEE FETED FAL PT AE 传 给 氧 分 子 生 成 水 , 总 反应 是 : H —> 2H + 2e (脱氧 酶 反应 ) (1) 2H* + 2e + (1/2) O, —> 0,0 (A(tRe)s 7) (2) 图 11-3 表 示 了 线粒体 电子 传递 链 的 电子 传递 与 质子 跨 膜 转移 的 偶 联 反应 及 其 能量 偶 联 的 量度 关系 。 细胞 质 2H" oH 2H* 2H" 2H" NADH+H NAD* 2H" ort 2H" 2H 1/2 0, H,O 基质 BAe | 复合 体 I 复合 体 ITV (HVO=4 或 q/2e=4) (HVO= 4 a& q/2e = 2) (H*/O= 2 a q/2e = 4) 线粒体 呼吸 链 的 电子 传递 与 质子 跨 膜 转移 的 偶 联 ( 引 自 刘 树 森 2003 ) 从 能 量 转换 的 当量 关系 来 考察 , 线 粒 体 呼吸 的 HVO 比值 (或 电荷 q/2e) 表示 和 A Eh 转换 为 A 书 的 偶 联 量度 ; HVATP 是 A 己 转换 为 A Gy (ATP) 的 偶 联 量度 ,P/O LEA AE A Eh #44) A Gp (ATP) 总 的 能 量 偶 联 量度 。 现 已 证 明 线粒体 合成 ATP 的 质子 最 大 量 是 HYVATP=4 (其 中 1 个 下 与 PP 和 ADP/ATP 共 转 运 以 保持 热力 学 平衡 ) 。 基 于 此 ,NADH 氧化 的 HVO= 10, 最 大 P/O 比 是 2.5 (10/4) , 琥 珀 酸 氧 化 的 HVO=6,P/O = 1.5 (6/4); 抗坏血酸 氧化 的 HVO =2, 但 P/O=1.0 (4/4) 而 不 是 0.$ (2/4), 这 是 因为 电荷 q/2e = 4。 因此 , 复 合体 _ II 及 IV 3 个 偶 联 位 点 的 P/O (P/2e) 分 别 是 1.0、0.35 和 1.0, 电 荷 q/2e 分 别 为 4.0、2.0 74.0, HAH tr q /2e 比值 与 P/O 完全 对 应 , 决 定 每 个 偶 联 位 点 的 ATP 合成 数量 , 这 十 因 为 A 忆 中 的 主要 组 分 是 A 下 。 据 此 , 细 胞 中 每 1 分 子 葡 萄 糖 完全 氧化 产生 31 分子 AITP (P/O=2.58); 每 1 分 子 棕榈 酸 完 全 氧化 生成 104 分 子 ATP(P/O=2.26) (Brand et al. 1994) 。 呼吸 链 能 量 转换 的 一 个 基本 问题 是 电子 传递 如 何 与 质子 跨 膜 转移 相 偶 联 , 即 A Eh AAPA AP, AR GAIN AB, Mitchell (1966) 最 初 提出 的 Q 循环 质子 泵 模型 , 后 经 Trumpower 等 完善 ,已 形成 广泛 共识 (Yuet al. 1999, Scheffler 2001b)。Q 循环 是 在 还 原 性 泛 醒 〈QH) 到 细胞 色素 c 的 电子 传递 过 程 中 , 经 复合 体 I 的 4 个 氧 还 中 心 和 六 步 反应 完成 : (1) QH 在 Quo 中心 氧 化 , 第 一 个 电子 传 给 ISP (Rieske [2Fe-2S] BA) 后 生 BRE (Qs), Qo 把 电子 传 给 细胞 色素 bsee6, 自 己 也 同步 ), 在 QH: 氧化 中 释 出 2 了 到 内 膜 外 侧 ,\2) ISP 把 接受 的 电子 传 给 细胞 色素 c,, aby (6) 传 到 细胞 色素 ci (3) Dsos 把 电子 传 给 be (4) pse 把 电子 传 给 Qi 中 心 上 EMO; (5) Qi 在 重复 接受 bse 的 电子 时 从 基质 内 吸收 2H 还 原 成 QH。 因 此 ,&i 在 Qo 中 心 被 分 又 氧化 , 电 子 通过 bse 和 bse 两 次 进入 稳定 性 Qi 中 心 的 Q/QH: 库 , 作 而 完成 一 个 Q 循环 。 同 时 , 从 — FE ¥y fi Biomembranes 132 膜 基 质 M 侧 吸 收 2, FERRY) C 侧 释 放 4 了, 还 原 2 个 细胞 色素 c, 从 而 建立 A P, # 能 量 偶 联 比率 是 : HV2e=4, 电 和 荷 /2e=2 (图 11-3), Q 循 环 的 最 关键 性 特征 是 QH 氧化 和 Q 还 原 时 电子 传递 都 是 分 又 式 , 从 图 11-2A 可 以 看 到 电子 传递 路 线 分 又 的 分 子 基 础 。 牛 心 线粒体 复合 体 II 的 品 体 解 析 结 果 发 现 ,ISP 的 膜 外 端 [2Fe-2S] HubA c,, b 和 Int 三 种 构象 , 分 别 表示 其 接近 细胞 色素 ce、2 和 两 者 之 间 的 Int 三 个 位 置 , 说 明 ISP 膜 外 端 [2Fe-2S] 在 细胞 色素 cj 和 靖 之 间 来 回 摆动 使 电 子 癌 两 个 分 叉 路 线 依 次 传递 。 唱 体 解 析 结 果 也 证 明 复 合体 II 存在 Qu 和 Qi 两 个 氧 还 中 心 , 证 实 了 Q 循环 质子 系 假 说 (Yu et al. 1999) , Tsukihara 等 (1995,1996) 和 Yoshikava 等 (1998) 对 牛 心细 胞 色素 氧化 酶 和 Twata 等 (1995) x Ahi eUER EA = (Paracocccus denetrificans) 细胞 色素 氧化 酶 的 研究 结果 不 仅 明 确 了 各 亚 基 在 分 子 中 的 排列 ,并 对 [Fe-S] 中 心 、 血 色素 基 团 和 Cu 中 心 等 金属 中 心 的 结合 位 点 也 都 得 到 确定 (Scheffler 200l1b)。 英 国 Walker 小 组 对 牛 心 线粒体 Fi 晶体 结构 的 解析 (图 11-2B),, 证 明了 FEF 的 3 个 B 亚 基 具 有 不 同 的 构象 , 为 Boyer 提出 的 ATP 酶 催化 反应 的 结合 变化 机 理 (binding-change mechanism) 模型 提供 了 有 力 的 证 据 (Sarate 1999)。 复合 体 V 是 一 种 独特 的 、 高 速 正 协 同 旋转 的 多 亚 基 FIF.-ATP 合 酶 (Kagawa et al. 1999), 是 A 己 与 ATP(A Gp) 相 互 转 换 的 分 子 换 能 器 (molecular energy-transducer) 。 跨 膜 的 F。 组 分 是 A 尸 驱动 的 离子 马达 , 膜 外 部 分 局 是 AIP 驱 动 的 ATP 马 达 。F. 有 13 个 亚 基 (aibzcio) , 在 其 a 和 亚 基 界面 之 间 形 成 两 个 一 进 一 出 的 通道 , 与 c 亚 基 的 asp61 互相 作 用 形成 跨 膜 的 质子 通道 。F, 有 9 个 亚 基 (ospBsYoig),, 直 经 约 9nm,, 通过 4.5 nm 长 的 两 个 柄 状 结构 (ye Flbd) 与 F. 连 接 。A 已 驱动 F. 旋 转 ,ATP 驱动 Fi 旋转 。FIF.-ATP 合 酶 分 子 马达 由 转子 (Ye- F。- c) FIZEF (05836- F.- ab) 构成 (图 11-2B)。 当 入 书 驱 动 质子 通过 F。 的 质子 通道 使 马达 转子 工作 时 ,F, 的 闪 轴 沿 逆 时 针 方 同 , 以 2r3 步 的 方式 旋转 , 相 当 ¥ 42 pN .nm 的 力 距 (torque) 转动 , 其 转换 效率 约 为 100%。F-F, 分 子 马达 旋转 的 速率 (w) 受 A 已 和 磷酸 势能 ([ATP]/[ADP]+ [Pi]) 的 调节 。 当 [ATP] 低 于 2hmolL 时, 马 达 反 方向 旋转 的 速率 下 降 , 当 [ADP] 或 A 己 下降 时 , 马 达 正 方向 旋转 即 停止 。FF.-ATP 合 酶 水 解 ATP 时 亦 可 使 质子 同 膜 的 另 一 方 和 出 ; 抑制 蛋白 结合 到 Fi, 时,FiF.-ATP 合 酶 马 达 立 即 停止 旋转 , 以 防止 ATP 的 水 解 。 上 述 这 些 实验 使 人 们 真正 看 到 了 分 子 马达 在 AP 的 驱动 下 是 如 何 工 作 的 (Kagawa et al. 1999), 1978 年 ,Mitchell 未 获 诺 贝尔 化 学 奖 , 化 学 涂 透 学 说 的 AEU 一 AP 一 AG 作用 原理 也 就 成 为 生物 膜 能 量 转 换 的 中 心 法 则 , 同样 适用 于 叶绿体 和 光合 菌 的 光合 磷酸 化 的 ATP 合成 反应 , 但 线粒体 氧化 磷酸 化 还 有 诸多 问题 未 完全 解决 。 最 大 的 复合 体 I 的 晶体 结构 分 析 仍 未 成 功 , SA PRT, WD, TV 质子 系 的 电子 传递 如 何 驱 动 下 转运 以 及 下 转运 途径 也 未 完全 清楚 ,A 尸 的 能 量 如 何 分 配 到 不 同 的 需 能 反应 中 , ATP 合 成 的 HVATP 比 值 是 4 还 是 3, 是 否 存在 能 量 偶 联 的 “ 氧 还 请 扣 (redox-slip) ”以 及 基本 质子 回 漏 和 UCPs 诱 导 的 质子 回 漏 的 机 制 和 生理 意义 等 尚 待 更 多 的 研究 (Scheffler 2001b ) 。 11.2.2 eRe Tf REN “ive.” (ay YES: 线粒体 呼吸 功能 另 一 方面 是 通过 呼吸 链 中 途 “ 漏 电 ” 给 0: 产 生 超 氧 阴离子 (0 ) 等 活性 氧 (ROS), Chance (1979) 首次 发 现 , 线粒体 态 4 吁 吸 可 产生 约 1% 一 2% 的 H2O,,。 目前 已 知 ,线粒体 正常 呼吸 中 产生 的 O; 大 致 占 态 4 总 耗 氧 量 的 2% 一 6% 。 据 估计 , 人 体 133 @11z# ZEEE AE FETED FL tA ok SE 吸 氧 的 1% 一 3% AT Ey Os ,每 个 线粒体 每 天 可 产生 3 x 10" 分 子 的 O; ,每 年 约 2kg, 构 成 生物 体内 ROS 绝 大 部 分 来 源 。 在 呼吸 链 活性 受阻 、 机 体 应 激 、 衰 老 或 疾病 造成 线粒体 呼吸 链 损伤 时 , 会 引起 ROS 生成 量 进一步 增加 和 积聚 , 从 而 引起 线粒体 的 氧化 损伤 。 在 线粒体 基质 中 O;- 最 易 损伤 线粒体 顺 乌 头 酸 酶 (aconitase) 的 铁 - 硫 中 心 , a ale 环 反 应 的 进行 , 或 损伤 线粒体 DNA。 线 粒 体能 量 代谢 关系 密切 的 脑 、 肌 、 心 、 胰 、 肝 、 ae BROS 导致 的 病变 更 为 明显 。 敲 除 线粒体 内 6s Seen 10 天 内 BIIZEL (James et al. 2002), 呼吸 链 产生 的 Qi 与 正 反应 生成 HOi ,与 0 互相 作用 转换 成 'JO,, 也 可 自 歧 化 或 被 超 氧化 物 歧 化 酶 (SOD) 作用 生成 HO,,H2O; 可 通过 Fenton 反 应 生成 羟 自 由 基 (OH - ), 这 些 ROS 在 细胞 中 被 清除 的 途径 和 作用 方式 也 不 同 (James et al. 2002)。Oi 在 线粒体 基 质 中 被 Mn2-SOD 清除 , 在 胞 浆 中 被 Cu-Ze*-SOD 清除 ; 在 线粒体 内 外 膜 间 ,, 可 被 氧化 型 细胞 色素 < 清除 , 也 可 能 与 匡 互 相 作用 跨 膜 回 到 线粒体 基质 中 再 被 Mnz-SOD 清除 (Liu et al. 1996a,b), H.O, 主要 被 谷 胱 甘 肽 过 氧化 物 酶 (GSH-Px) 等 清除 。 由 于 ROS 在 细胞 中 不 断 产生 和 被 清除 , 因 此 , 稳 态 [Oi ] 仅 为 10 '°~ 10>" mol/L, [H,0,] 4% 10~° mol/L (Gardner 1997)。 线粒体 生成 O 的 主要 部 位 在 呼吸 链 复合 体 I[ 和 II, 而 以 后 者 为 主 。 已 知 复合 体 III 中 Qu 位 点 的 半 柄 自由 基 (UQH- ) 是 O, 的 单 电子 供 体 , 这 是 因为 UQ /1UQ-. 的 氧 还 电位 (— 240mV) 与 O/Oi- (— 270~ — 330 mV) 的 电位 接近 , 氧 容易 从 UQH' 接受 一 个 电 子 生成 超 氧 : UQH .+O=UQ+O +H", FE, O3° 的 生成 速率 应 与 0. 和 UQH' AYR 度 旺 函数 关系 (Gardner 1997, Johnson et al. 2003), , 如 : d[Ox \/dt = A{O,] - [UQH -] 但 是 ,Liu 和 Huang (1996 a) 首次 报道 大 鼠 心肌 线粒体 态 4 FO, 4 A TT AE 到 80 0.6 = = A E 60 Re = He 04 ° TR dp E 40 HE = ms EB ig 2 02 = 20 By =, 三 bia eal wz 0 0 100 120 140 160 180 200 100 120 140 160 180 200 跨 膜 电位 /mV 跨 膜 电 位 /mV 三 250 心 2 200 = re a 150 和 4B 4 100 os 区 5 J 50 三 区 0 0 由 一 一 my 100 120 140 160 180 200 100 0 160 180 200 O 跨 膜 电 位 /mV 跨 膜 电 位 /mV 鼠 心 线粒体 呼吸 、O “和 于 0, 生成 及 细胞 色素 As 还 原 与 跨 膜 电位 的 关系 ( 引 自 Liu et al. 1996a) HE ty fi Biomembranes 134 BCH] OF 和 了 0; 的 曲线 主要 是 与 线粒体 和 亚 呈 非 线性 相关 , (EA 亚 高 达 180 mV 左右 时 , Os 生成 量 才 突 然 上 升 。 此 种 O; 生成 对 和 A 亚 呈 国 值 现象 , 说 明 线粒体 O; 的 生成 不 是 与 呼吸 链 电子 传递 速率 成 正 相 关 ,, 而 与 其 能 量 偶 联 产物 A 更 呈 函 数 相 关 (图 11-4C, D)。 图 11-4 还 显示 还 原型 Cyt dss 的 升 高 曲线 也 与 A 亚 呈 非 线 性 相关 , 也 说 明 UQ : 氧化 速度 减 慢 易 于 Oi 生成。Skulachev (1996) 引用 和 评价 了 图 11-4 的 结果 ,, 并 用 实验 进一步 证 实 了 这 一 结论 (Skulachev 1997,1998) 。 看 来 , 线 粒 体 态 4 呼 吸 的 O; 生成 量 与 A 亚 呈 国 值 现 象 不 但 解释 了 高 A 允 时 呼吸 链 氧化 速度 减 慢 和 UQ . 寿命 延长 是 复合 体 II 漏电 ” 产 生 0i 的 主要 原因 , 而 且 还 说 明 线 粒 体 能 量 偶 联 与 解 偶 联 是 0; 消长 的 调节 机 制 , 因 为 A 殉 小 幅度 下 降 即 可 使 0; 的 产生 速率 大 幅 下 减 (Liu et al. 1996b, Skulachev 1997, Brand 2000), 鉴于 ROS 又 是 细胞 内 的 重要 信和 号 分 子 , 参 与 并 调节 机 体 的 众多 复杂 的 生理 反应 , Kagawa 等 (1999) 提 出 线粒体 A 更 能 量 在 产生 ATP Fil ROS 之 间 分 配 的 失衡 和 失调 都 是 引 起 衰老 、 细 胞 凋 它 和 发 生 多 种 疾病 的 原因 。 11.2.3 ”线粒体 的 能 量 耗 散 系统 一 质子 回 漏 和 产 执 ”SS Mitchell (1991) 强调 , 生物 能 量 偶 联 膜 是 由 诸多 氧 还 质子 泵 酶 复合 体 和 各 种 转运 蛋 白 组 成 的 化 学 徐 透 体系 (chemiosmotic system) , 不 仅 包 含 能 量 的 转换 , 还 应 主要 包含 代 谢 的 转化 和 代谢 反应 物 的 转 位 和 转移 等 功能 。 他 在 1966 年 就 预言 线粒体 AP 有 3 条 质子 回路 :,H'*-ATP 酶 合成 ATP、 直 接 扩散 回 漏 〈 质 子 回 漏 )、 与 其 他 离子 传递 系统 偶 联 交 换 。 上 述 3 条 回路 的 质子 量 之 和 应 与 呼吸 链 质 子 到 的 系 出 质子 总 量 之 和 相 平衡 。 图 11-5 中 进 phase L AG EL TT phase R 线粒体 外 侧 ee 线粒体 内 侧 BO 化 学 疹 透 学 说 中 质子 循环 间 的 偶 联 〈 引 有 自 Mitchell 1966) 呼吸 链 氧化 还 原 系统 的 质子 转 位 用 以 驱动 质子 流通 过 ATP 酶 合成 ATP。 质 子 流 亦 可 耗 散 于 质子 渗 漏 , 或 用 于 正 负荷 离 子 的 交换 。 图 中 的 离子 “对 '、“ 提 ”只 表示 其 电荷 极 性 , 不 表示 价位 数 和 化 学 计量 关系 135 g 11% AERIS IE MERA FPL MIN IOF FEET BBE SUP EAD FRAY A FR FLAN ad LPR ZAI A IA) 11-7 也 可 DL, Bowe AS Ay WHE AY HY 与 Pi 同 向 转运 (symport), H* 4 ADP Al] ATP fx |r] #4128 (antiport) 已 构成 ATP 合成 体系 中 不 可 分 割 的 组 成 部 分 。 1. 基本 质子 漏 线粒体 能 量 偶 联 体系 中 包含 质子 漏 是 Mitchell 学 说 中 的 重要 学 术 思 想 , 但 其 产生 机 制 仍 是 未 解决 的 一 个 同 题 。 英 国 Nichols 第 一 次 证 实 线粒体 的 质子 漏 现象 的 存在 , 他 们 发 现 线粒体 态 4 呼 吸 的 速率 与 A 到 之 间 呈 非 线性 关系 , FEA 更 高 达 180mvV 左右 后 , 即使 呼 吸 速率 再 增 大 ,A 更 也 不 再 升 高 (参见 图 11-4A) ,呼吸 速率 和 质子 漏 速率 两 者 都 与 A 到 呈 非 线性 关系 。 高 A 亚 时 质子 回 漏 加 大 和 膜 质 子 导 性 (proton conductance) 增加 , 这 说 明 线 粒 体 膜 为 非 欧 姆 导体 (Nicholls 1997) 。 在 哺乳 动物 中 ,, 肝 线粒体 的 质子 漏 对 基础 代 谢 耗 氧 量 ( 静 息 态 呼 吸 ) 的 贡献 约 为 23% (Brand 1990), Brand 称 之 为 基本 质子 漏 (basal Hrleag), 即 被 动 扩散 质子 漏 (passive diffusion-based H* leak), 普 遍 存在 于 所 有 线粒体 中 (Stuart et al. 1999)。 Brand 小 组 研究 了 多 种 状 椎 和 无 状 椎 动物 线粒体 的 质子 漏 (Roussel et al. 2002, Nedergaard et al. 2001, Staurt et al. 1999, 2001, Brand 1990, Brand et al. 1991), 发 现 恒温 FF HE PT BL SIO hin TF BA KAR BE 15% 一 26%, 变 温 动物 为 25% ~ 40% , FCA HE IID TE 25% LA Es FERIA OTE 2TH eB it ee A ke HE CY, BORE AG Boia 腿 肌 收缩 而 导致 呼吸 率 提 高 两 倍 时 ,线粒体 质子 漏 对 其 呼吸 率 的 贡献 仍 占 呼吸 提高 部 分 的 22% 和 47%,, 说 明 不 仅 在 态 4 呼吸 , 而 且 在 态 3 呼吸 提高 ATP 合成 来 竞争 A 忆 时, 线 粒 体质 子 漏 都 是 基础 代谢 率 的 重要 组 成 部 分 。 除 肝 和 肌肉 外 , 凤 、 胸 腺 和 脑 细胞 线粒体 中 也 同样 有 质子 漏 (Stuart et al. 1999)。 不 同 动物 实验 证 明 质 子 漏 决定 基础 代谢 : 甲状 腺 机 能 元 进 动物 线粒体 质子 漏 比 正常 线粒体 高 ,甲状 腺 机 能 低下 者 比 正 常 的 低 (Brand et al. 1991)。 较 大 哺乳 动物 的 代谢 率 比 较 小 动物 要 高 , 但 其 线粒体 的 质子 漏 较 后 者 低 ; 小 冷血 动物 代谢 率 低 , 甚 线粒体 质子 漏 也 低 ; op/op 肥胖 小 鼠 的 瘦 肉 体重 -代谢 比率 〈lean mass- specific metabolic rate) 比 瘦小 鼠 的 要 高 , 其 线粒体 质子 漏 也 增高 (Staurt et al. 1999), 基本 质子 漏 作 用 机 制 问 题 现 在 尚 不 清楚 。Brand 和 Garlid 都 曾 认 为 , 质 子 漏 动力 学 的 非 欧 姆 性 质 是 典型 的 扩散 过 程 的 特征 (Roussel et al. 2002) 。 如 果 质 子 漏 是 一 种 离 位 (质子 ) 扩散 (delocalized diffusion) , 内 膜 面积 的 差别 就 应 该 与 质子 漏 速率 的 差别 相关 。 但 从 不 同 质子 漏 速率 的 线粒体 膜 中 分 离 出 的 磷脂 制 成 的 膜 吉 泡 中 , 并 未 发 质子 透 性 与 膜 磷脂 相关 (Roussel et al. 2002, Stuart et al. 1999), 2. 解 偶 联 蛋白 介 导 的 诱导 质子 漏 five {IK Sz A (uncoupling protein, UCP) 是 最 早 发 现 的 哺乳 动物 棕色 脂肪 组 织 (BAT) 线粒体 内 膜 中 专 一 ?| 起 质子 漏 耗 散 线 粒 体 和 A 己 的 蛋白 ,分 子 质量 约 为 32kDa,, 其 主要 功 能 是 非 额 抖 性 发 热 而 不 是 生成 AITP, 又 称 产 热 蛋白 (thermogenin), UCP! 可 在 游离 脂肪 酸 的 向 活 下 , 催 化 质子 跨 膜 循环 或 是 质子 与 阴离子 的 共 转 运 , 导致 解 国 联 , 味 叭 核 苷 酸 类 可 结合 到 UCP1C 端 胞 浆 侧 的 EGPAAFFKG 的 序列 上 和 阴离子 的 跨 膜 转运 , 因而 抑制 其 解 偶 联 活性 。BAT 中 分 离 的 线粒体 耗 氧 率 很 A 殉 很 低 , 质 子 漏 速率 与 A 更 呈 现 非 欧姆 性 相关 。 但 加 入 嗓 叭 核 苷 酸 或 UCP1 基 全 后 , 线 粒 体 恢 复 到 正常 的 mA 和 偶 联 活性 , 态 4 呼吸 也 回 到 正常 水 平 , 此 时 由 质子 漏 导 致 的 态 4 呼 吸 率 与 A 更 仍 呈 非 欧姆 相关 , 说 明 线 粒 体 中 还 存在 一 种 与 UCP1 无 状 的 质子 回 漏 途径 (Nedergaard et HE % i Biomembranes 136 al. 2001, 2003) 。 虽然 UCP 1 在 BAT 细胞 线粒体 中 解 偶 联 作用 和 产 热 功能 已 形成 广泛 共识 ,但 对 UCP 1 诱导 质子 转移 的 机 制 尚 无 定论 (Nedergaard et al. 2001)。 目 前 有 两 类 假说 : (1) 质子 转 移 不 依靠 脂肪 酸 : 于 载体 模型 的 主要 缺点 是 忽视 了 UCP1 载 运 Cl 等 阴离子 的 特性 (图 11-6A); Nicholls 的 OH -阴离子 载体 模型 , 认 为 UCP1 的 解 偶 联 是 通过 运 出 OH © 4 H* 的 中 和 作用 (1 11-6B); (2) UCP1 需要 脂肪 酸 : Klingenberg 的 脂肪 酸 COO 作为 正 ' 的 阶梯 模型 , 此 模型 也 不 能 解释 UCP1 作为 阴离子 载体 的 特性 〈 图 11-6C);,SkulAChevV/ Garlid/Jezekd 模型 认为 ,脂肪 酸 和 下 "被动 扩散 跨 膜 ,UCP1 再 将 脂肪 酸 运 出 线粒体 , 如 此 不 断 载 运 王 跨 膜 循环 而 起 到 解 偶 作用 , 该 模型 难以 解释 请 蛋白 不 能 抑制 UCP1 介 导 的 解 偶 联 作 用 (图 11-6D)。 总 之 ,上述 诸 说 法 虽 各 有 所 长 ,但 都 未 能 获得 在 完整 组 织 中 令 人 信服 的 证 据 (Nedergaard et al. 2001), UCP1 UCPI 作为 质子 载体 作为 阴离子 载体 不 依靠 脂肪 酸 依靠 脂肪 酸 UCP1 的 质子 转运 的 机 制 的 几 种 模型 ( 引 自 Nedergaard et al. 2001) 1995 年 以 后 发 现 了 植物 解 偶 联 和 蛋白 (PUMP) 和 几 种 低 等 真 核 单 细 胞 线粒体 中 UCP1 同 源 和 蛋白 解 偶 联 蛋 白 家 族 UCPs 以 及 哺乳 动物 的 新 UCPs, 包括 UCP2、UCP3 和 脑 BMCP 等 (Sluse et al. 2002)。 人 细胞 线粒体 UCP2 和 UCP3 与 人 UCP1 有 59% 和 58% 的 氨基 栈 同 产 , 它 们 彼此 之 间 约 有 73% 同 源 性 。UCP2 在 几 种 组 织 细胞 中 表达 ,UCP3 主要 在 骨骼 肌 中 表达 。 这 些 新 UCPs 属于 线粒体 阴离子 载体 家 族 (MACP) 中 新 的 亚 家 族 , 是 当前 线 粒 体 研究 领域 中 一 个 新 热点 (Porter 2001, Brand 2000) 。 虽然 UCPs 已 在 转基因 动物 或 在 脂 质 体 重组 系统 中 能 显示 增加 解 偶 联 活性 或 表现 质子 传导 活性 , 但 大 量 实 验 也 提示 , 没有 证 据 证 明 其 真实 的 生理 功能 与 UCP1 一 样 是 解 偶 联 产 执 和 维持 调节 体温 (Stuart et al. 2001 ) 。 生 理 条 件 下 , UCPs 在 线粒体 表达 量 都 极 低 ,UCP2 在 正常 大 鼠 肝 中 不 表达 ,也 可 能 对 其 正常 线粒体 的 功能 并 非 必需 (Stuart et al. 1999)。 由 于 UCPs 多 是 在 各 种 应 激 条 件 诱导 表达 , 目前 只 是 推 想 其 生理 作用 可 能 是 控制 细胞 内 ATP 和 ROS 水平, 调节 NADHNAD- 比值 以 及 适应 脂肪 酸 和 和 区 人 欧 糖 代 谢 的 变化 ; 植物 UCP 是 低温 抗 附 性 (Recquier et al. 2000), 如 果 再 回 到 线粒体 质子 漏 问 题 , 根据 Staurt 等 (2001) 和 Porter (2001) 的 观点 ,UCP1 137 g11z% ZERLEB HE FETED FAL WP AEE 和 UCPs 不 参与 线粒体 的 基本 质子 漏 。UCP1 引 起 的 质子 转运 只 是 附加 在 基本 质子 漏 之 上 的 诱导 质子 漏 (inducible H' leak), 或 称 附 加 质子 吝 (augmentative H leak), 其 他 UCPs 更 多 也 只 是 参与 附加 质子 漏 (Stuart et al. 1999)。 其 证 据 是 , 酵 母 和 肝 实 质 细 胞 线粒体 中 都 没有 UCP1 和 UCPs 的 表达 , 但 其 线粒体 都 表现 明显 的 基本 质子 漏 。 近 来 , Stuart 等 (2001) 检查 了 酵母 线粒体 内 膜 中 的 21 种 阴离子 载体 蛋白 的 活性 , 证 明 都 与 质子 漏 无 关 , 复合 体 I_JII、IV 和 ANT 也 被 证 明 不 涉及 基本 质子 漏 。 他 们 结论 是 : 如 果 有 什么 蛋白 介 导 线 粒 体 的 基本 质子 漏 的 话 , 那 现在 尚未 发 现 它 。 3. 线粒体 内 膜 的 物理 特性 或 内 源 质子 转运 体 与 基本 质子 漏 自 1974 年 Nichols 证 实 线粒体 质子 漏 的 存在 至 今 已 经 历 了 30 年 的 研究 历程 , 但 直到 目前 还 没有 发 现 真正 负责 线粒体 的 基本 质子 漏 的 蛋白 。 已 有 实验 证 明 不 同体 重 和 进化 阶 段 的 哺乳 动物 中 肝 线 粒 体 的 基本 质子 漏 都 约 相当 于 静 息 态 肝 细 胞 呼吸 率 〈 基 础 代谢 ) 的 25% (Rolfe et al. 1997, Stuart et al. 1999, 2001) 。 那 么 ,是 什么 因素 决定 或 控制 线粒体 以 如 此 大 份额 的 A 尸 能 量 用 于 基本 质子 漏 呢 ? 是 能 量 浪费 还 是 生理 必需 ? 从 分 子 机 制 来 看 , 是 膜 脂 双 分 子 层 的 物理 特性 , 还 是 有 内 产 A 载体 ? 当 线粒体 态 4 呼 吸 使 A VIRB 180 mV 时 , 其 电场 强度 则 大 于 10: V/cm。 在 如 此 强 大 电场 作用 下 ,出 现下 的 跨 膜 泄漏 也 有 可 能 (Recquier et al. 2000)。 根 据 Deamer(1987) 和 Gier (1992) 的 研究 , 磷 脂 膜 对 正 的 徐 透 性 要 比 其 他 单价 阳离子 高 。 平 面 磷脂 膜 或 脂 质 体 磷脂 膜 对 正 渗透 性 系数 (proton permeability coefficient) 一 般 在 10~ °~ 10-3 cm/s 范围 内 , 比 Na 、K- 等 要 大 6~8 个 数量 级 〈K 为 10 cms)。 在 用 肝 线 粒 体 膜 磷脂 制 成 的 脂 质 体 中 ,pH7.2 ,37C 和 入 亚 为 160 my Aft fF, Mise H* 疹 透 性 系数 为 2.5 x 10-3 cms, 相当 于 29.4 nmol H*/(min - mg 磷脂 ) a Pitas. Kh, RRA ALA HW 渗透 性 系 RETA iA 7.6 x 10-2 cm/s (Stuart et al. 1999, 2001), ELLA FIT , 48 Ht ELA aoe Tea HJ FE SS ARR, 那么 跨 膜 的 质子 梯度 差 何 以 维持 ? OE SE EB EF AE 量 偶 联 膜 的 理论 基础 。 实 际 上 ,Mitchell 和 Moyle 早期 的 研究 结果 证 明 , 线 粒 体 膜 对 A 导 性 (proton conductance) 约 在 0.45 x 10 °S/cm* 的 范围 内 , 这 一 参数 值 不 比 Nar . K* 大 。 这 是 因为 普通 单价 阳离子 的 膜 沙 透 性 是 以 0.1 molL 离 子 浓 度 梯度 差 时 的 驱动 力 来 计 算 , 而 正 对 膜 的 涂 透 性 是 以 0.1UmolL 离子 浓度 差 的 驱动 力 来 计算 。 根 据 Mitchell 和 Moyle 的 数据 , 于 对 线粒体 膜 的 徐 透 性 约 在 10 :cm 人 s, 的 确 比 对 脂 双 分 子 层 明 显要 高 。 但 由 于 生理 环境 下 的 下 实际 谊 度 很 低 , 尽 管 磷脂 膜 的 内 在 He 渗透 性 高 , 但 从 膜 生 物 功 能 来 看 , 于 导 性 的 影响 可 忽略 (Gier 1992)。 由 此 ,单纯 的 磷脂 双 分 子 层 的 物理 特性 也 不 能 合理 解释 生理 条 件 下 线粒体 质子 漏 的 机 制 问题 。 内 源 质子 载体 负责 线粒体 基本 质子 漏 的 设想 很 早 就 一 直 受 到 人 们 重视 。 已 知 游 离 脂 肪 酸 (FFA ) 本 身 可 随 名 质子 跨 膜 循环 从 而 实现 其 解 偶 联 , 它 可 能 参与 UCP1 的 解 偶 联 也 是 与 其 传递 质子 有 关 。 但 是 Brand 的 早期 实验 证 明 , 离 体 鼠 肝 线 粒 体 六 态 4 呼 吸 中 , 内 源 FFA 只 可 引起 小 部 分 质子 漏 , 血 清白 蛋白 不 能 完全 抑制 线 上 本 的 质地 漏 。 他 们 证 明 , 约 有 相当 于 态 4 呼 吸 耗 氧 23% 的 基本 质子 漏 与 FFA 无 关 (R: 1997), Liu 等 (1996a,b,1997,1998,1999) 曾 提出, 线 粒 / -生成 的 O; 是 内 源 质 子 载 体 引 起 质子 漏 的 设想 。 主 要 是 基于 三 方面 的 实验 结果 和 (1) 证 明 大 鼠 心肌 线粒体 态 4 呼吸 生成 O; 速率 与 A 亚 呈 非 欧 姆 相关 (图 11-4), 这 与 Nichols 发 现 的 线粒体 质子 漏 — HE Wy ie Biomembranes 138 速率 与 A YAPRAK SECE EL, He EMI Zia TEA AEST; (2) 证 明 外 源 和 线 粒 体内 源 的 O 可 降低 /2e 和 A 于 造成 质子 回 漏 ,(3) O; 具有 酸 碱 双 重 特性 , 在 酸性 的 线粒体 内 膜 C 侧 ,O; FLA nA EF BT Wie HT EA HOS; FA, FEMA ZS iz 体 膜 M 侧 ,HO; 具 有 酸 的 作用 , 脱 质子 化 可 释放 于 和 Qi , 其 反应 平衡 式 为 O; + H*=— HO; (pK=4.8) 电 中 性 的 HO; 45 O, 和 H2O. 一 样 在 膜 脂 中 有 更 大 的 溶解 性 , 易 跨 膜 转移 , 因 而 有 可 能 起 着 内 产 质子 载体 的 作用 (Liu 1997, 1998, 1999, Liu et al. 1996a, b, 刘 树 和 森 等 1995 ) 。 可 以 认为 ,0O; 是 通过 形成 HO, 成 为 2 于 的 跨 膜 载体 , 那 么 HO; 就 是 更 理想 的 单个 正 的 载体 , 因 为 后 者 是 pH 依赖 的 非 酶 促 反 应 (DeGrey 2002)。 对 这 一 模型 的 引用 和 评述 可 参 疝 文献 (如 Diaz et al. 2003, Nedergaard et al. 2003, Echtay et al. 2002, Brand 2000, Kagawa et al. 1999, Korshunov et al. 1997, Kowaltovski et al. 1999, Pedersen 1999, Skulachev 1996, 1997, 1998, Papa et al. 1997 等 )。 近 来 Muller 提出 一 个 相似 的 新 模型 , 认 为 HO; 在 Q 循环 中 形成 后 可 能 是 先 到 膜 中 部 , 然 后 再 向 膜 两 侧 方向 转移 出 去 (Muller et al. 2004) 。 显 然 , 所 有 这 些 假 说 都 需要 更 多 的 的 实验 支持 和 验证 。 但 最 新 报道 , 光 合作 用 生成 ROS 过 程 中 可 在 膜 内 检 侧 出 HO; 自由 基 信 号 (Liv et al. 2004) , 这 一 新 结果 有 望 为 解决 上 述 问 题 提 供 有 利 途 径 。 11.3 ”线粒体 氧化 磷酸 化 能 量 转换 的 调 厂 和 控制 线粒体 的 能 量 代谢 在 细胞 .组 织 和 整体 水 平 上 的 调控 是 认识 线粒体 细胞 功能 的 核心 , 也 有 甚 重要 的 应 用 意义 。 线 粒 体 的 氧化 磷酸 化 是 一 个 复杂 的 能 量 转换 体系 , 其 调节 和 控 制 涉 及 这 一 体系 中 的 多 个 环节 , 包 括 它 的 生成 系统 、 转 换 系 统 稍 耗 系统 (图 11-7)。 究 甬 上 本 线粒体 氧化 和 磷酸 化 能 量 偶 联 和 转换 体系 ( 引 自 Korzeniewski 2001) 1. OAR; 2. 复合 体 I ; 3. 复合 体 IHU; 4. 复合 体 IV:, 5. 质子 漏 ,6. 复合 体 V -ATP 合 酶 , 7. ATP/ADP 载 运 体 ,8. Pi 载运 体 (Pi H* 共 转 运 ); 9. ATP 利用 反应 在 细胞 中 任何 利用 ATP 能 量 的 过 程 , 如 DNA、RNA、 蛋 白 的 合成 、 离 子 (K*, Na’, Ca ) 的 :细胞 膜 转 运 、 糖 原 异 生 及 肌肉 收缩 等 AIP 水 解 过 程 , 都 会 消耗 AIP, 因 而 这 些 反应 又 洁 细 胞 某 种 增加 能 量 需要 的 信号 , 以 便 使 线粒体 氧化 磷酸 化 ATP 合 成 反应 速率 与 AITP 能 量 需要 的 反应 速率 相 适 应 。 在 细胞 内 , 征 什 么 机 间 调 控 线 粒 体 的 AIP 合 成 和 消 EVE? 以 往 的 研究 已 证 明 线 粒 体 合成 AIP 时 的 呼吸 速率 增 大 , 因 而 产生 了 一 系列 概念 , 139 g11z% ZEB HE FETED FL PT AEE 如 呼吸 控制 、ADP 刺激 呼吸 、ATP 合成 对 ATP 需求 的 反馈 等 (Kunz 2001), Jax, XM 延伸 到 ATP/ADP 转 运 蛋 白 对 ATP 跨 膜 运输 起 重要 控制 作用 , 线粒体 通过 对 [ATP], ATP/ ADP 比 、 磷 酸 势 能 和 能 和 荷 等 变化 来 感知 细胞 对 ATP 能 量 的 需要 。 随 着 化 学 活 透 学 说 的 发 展 , 细 胞 对 ATP 能 量 的 需要 影响 呼吸 的 机 制 日 益 明晰 起 来 。 因 为 ,ATP 合成 降低 A P, 刺激 呼吸 链 活性 泵 出 更 多 质子 以 维持 线粒体 内 膜 A 已 (A YW) (Kadenbach et al. 2000 ) 。 但 是 , 对 ATP 的 需求 只 是 控制 线粒体 能 量 代 谢 的 一 方面 。 另 一 方面 ,Ca* 激活 线粒体 基 质 侧 的 脱氧 酶 , 增 加 对 呼吸 链 电 子供 应 以 刺激 呼吸 和 ATP 合 成 速率 。 由 此 ,线粒体 呼吸 和 ATP 合 成 速率 既 感 知 ATP 需 求 的 拉动 , 也 感知 呼吸 链 的 电子 供应 增加 的 推动 (Murphy 2001)。 肌肉 线粒体 氧化 磷酸 化 控制 的 研究 可 提供 另 一 多 位 点 调控 的 实例 。 对 ?5P 磁 共振 in vivo 测量 值 的 计算 表明 , 在 收缩 的 骨骼 肌 中 ,ATP/ADP 比 下 降 5 倍 的 同时 ,ATP 周转 率 增加 30 倍 。 这 提示 , 除 了 肌 动 蛋白 ATP 酶 和 ATP/ADP 比 作为 肌肉 线粒体 氧化 磷酸 化 控 制 步骤 外 , 还 包括 底 物 还 原 当 量 (SH:) 的 供应 、 氧 的 利用 、 质 子 漏 (proton leak) 4° 散 限制 (ATP/ADP) 以 及 肌 酸 激酶 系统 (CrP/CR) 等 控制 步骤 (Kunz 2001)。 图 11-8 简 述 了 这 些 控制 点 的 相互 关系 。 NADH/ 5 ZL AS A Ip Hee 肌 动 蛋白 处 ATP/ADP 比 骨骼 肌 线 粒 体 氧化 磷酸 化 的 控制 途径 〈( 引 自 Kunz 2001) 箭头 表示 控制 方向 植物 线粒体 除了 与 动物 线粒体 具有 相同 的 电子 传递 链 外 , 尚 含有 非 磷酸 化 的 电子 传 递 途径 , 包 括 非 质 子 泵 蛋白 复合 体 的 NAD(P)H 氧化 酶 和 替代 氧化 酶 , 前 者 对 鱼 蔷 酮 (rotenone) 不 敏感 , 后 者 对 下 CN 不 敏感 。 此 外 ,植物 线粒体 中 还 有 PUCP 等 , 因 此, 植 物 线粒体 的 氧化 磷酸 化 能 量 转换 的 调节 和 控制 关系 更 为 复杂 , 对 细胞 能 量 需 求 不 仅 涉及 线粒体 与 叶绿体 ATP 合 成 的 互相 协调 癌 题 , 而 且 还 对 线粒体 呼吸 链 的 众多 电子 传递 途径 之 间 的 氧化 和 磷酸 化 的 相对 能 量 分 配 和 途径 进行 选择 (Affourtit et al. 2001 ) 。 20 世 纪 80 年 代 就 开始 探索 和 发 展 一 些 理论 与 方法 来 研究 动 植 物 线粒体 氧化 磷酸 化 能 量 转换 系统 的 调节 控 制 , 包 括 近乎 衡 假说 、 非 平衡 热力 学 理论 等 , 后 者 把 呼吸 链 电子 六 看 作 是 ATP 合 成 4A G,) 和 和 氧化 还 原 势能 (A Eh) 的 热力 学 驱动 力 的 国 数 来 表述 (Murphy 2001), 这 些 研 究 为 90 年 代 后 发 展 起 来 的 代谢 控制 分 析 (MCA) 黄 定 了 至 础 。 目 前 在 欧洲 已 开始 把 MCA 作为 有 效 的 理论 和 实验 框架 用 于 研究 代谢 系统 己 及 气 苇 族 酸 化 的 控制 和 调 节 , 并 已 扩展 到 线粒体 的 热 产 生 、 细 胞 死亡 、 活 性 氧 生成 互 稳 态 调 贡 以 及 线粒体 疾病 等 问题 (Murphy 2001)。 鉴 于 代谢 控制 分 析 的 重要 理论 各 在 医药 和 农业 方面 的 应 用 前 景 , 在 此 未 作 更 深 和 地 介绍 和 探讨 , 有 兴趣 的 读者 滞 有 关 文 献 (Murphy 2001, Kunz 2001, Affourtit et al. 2001), (AUR AR ) FE Wy i Biomembranes 140 Ai ets RO LRT RA EE AO DEAN SE BEN ESSE 刘 树 森 . 2000. 线粒体 电子 传递 链 . 见 : SB AR SES. 当代 生物 学 . 北京 : 中 国 致 公 出 版 社 . 511-512 刘 树 森 . 2001. 线粒体 学 与 生物 医学 新 前 沿 . 世界 科技 研究 与 发 展 , 23(2): 35-41 刘 树 森 . 2003. 线粒体 医学 的 分 子 基 础 . 见 : 盛 树 力主 编 . 临床 神经 科学 前 沿 . 北京 : 北京 大 学 医学 出 版 社 . 101-143 刘 树 森 , 焦 选 万 , ESE ERE. 1995. 线粒体 呼吸 链 电子 漏 与 质子 漏 的 相互 作用 一 一 电子 漏 引 起 质子 漏 . 中 国 科 学 (B 辑 ), 25 (6): 596-603 Affourtit C, Krab K, Moore A L. 2001. 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J Bioenerg Biomembr, 31(3): 191-199 第 12 章 第 13 章 第 14 章 第 15 章 第 16 Fe 第 17 i 第 18 i 第 19 草 生物 膜 与 离子 通道 高 等 植物 细胞 离子 通道 动物 水 通道 的 结构 与 功能 钠 钾 ATP fig 钙 系 的 结构 基础 及 其 钙 离 子 跨 膜 运 送 机 制 圳 泡 转 运 与 细胞 内 物质 运输 ABC 转运 体 和 肿瘤 多 药 耐 药性 Ran GT 及 其 结合 蛋 自在 核 膜 装 配 过 f “的 调控 作用 第 2 wi EU) eae meee libls! 12:1 一 离子 通道 的 结构 与 功能 ee 146 12: 工 , 配 体 丫 换 通通 i 于 的 寺 生 146 12:1.2 - HEARS: «oe al cen 148 12.1.3 URE FIED ee ecncs eens ncccovseccsce-csencseens2es20-- ee 150 12.2, 通 道 的 离子 选择 性 通 透 及 其 结构 基础 二 和 下 150 12.331 敲 子 通道 的 电学 特 逢 1 151 TF3.1 PAGE TERAE fice ici incon 151 ; 12.3.2 AAAS SEB EWA THE sccccceccarv-ceaceccsaes occas eee 151 12.3.3 膜 的 被 动 特 性 : 动作 电位 和 突 触 电位 oo eee eeneeneneeneeee 152 123.4 BOWIE -....00 2 ccs 半 全 生生 的 154 Oe en 156 > 发 人 类 对 于 生物 膜 和 离子 通道 研究 兴趣 的 渊源 最 早 可 追溯 到 六 200 多 年 前 的 一 个 历史 事件 记载 , 即 1791 年 Galvani 观 察 到 了 电 刺 激 蛙 腿 后 产生 的 生物 电 反应 现象 。 1902 年 , Bemstein 根 据 当时 的 电离 和 电化 学 概念 提出 了 经 典 的 膜 学 说 , 他 认为 细胞 膜 表 面 两 侧 带电 离子 的 不 同 分 布 和 运动 是 产生 生物 电 的 基础 。 之 后 , 依 赖 于 单一 细胞 电 活动 测 量 手 段 和 相 关 技 术 的 运用 , 膜 学 说 得 以 被 证 实 。 实现 单一 细胞 生物 电 记录 首先 得 益 于 适宜 的 生物 材料 , 即 某 些 无 硝 椎 动物 特有 的 巨大 神经 或 肌 细胞 的 选用 。 其 中 尤其 值得 扒 崇 的 范例 是 20 世纪 30 年 代 Young 发 现 枪 乌贼 神经 轴 突 的 直径 最 大 可 达 约 100 hm, 容易 被 单独 剥离 用 于 实验 研究 。 其 次 得 益 于 1949 年 凌 宁 和 Gerard 细 胞 内 微 电 极 记录 的 技术 革新 突破 , 即 用 一 个 金属 或 细 玻 璃 管制 成 的 充 有 导电 液体 、 尖端 直 径 为 1.0 hm 或 更 细 的 微型 记录 电极 刺 入 某 个 在 体内 或 离 体 的 细胞 或 神经 纤维 膜 内 , 145 #12 Agha Ss BS fig 测量 细胞 在 不 同 功能 状态 时 膜 内 电位 与 另 一 置 于 膜 外 参考 电极 间 的 电位 差 ( 即 跨 膜 电位 ), 这 样 便 可 记录 到 单一 细胞 的 生物 电 活动 〈 徐 科 2000 ) 。 20 ft2c 40 ~50 4E{K, Hodgkin 和 Huxley 等 利用 枪 乌 贼 的 巨大 神经 轴 突 标本 和 电 生 理学 技术 进行 了 一 系列 有 意义 的 实验 , 不 仅 验 证 了 经 典 膜 学 说 中 关于 静 息 电位 产生 机 制 的 假设 , 且 对 动作 电位 (action potential) 的 产生 贡献 了 新 的 认 知 (Hodgkin and Huxley 1952a) 。 但 是 , 由 于 当时 尚 无 分 离 和 擅 述 单 通 道 电信 和 号 的 技术 手段 , 他 们 对 生物 电 的 理 解 只 能 是 安 观 的 , 对 微细 过 程 只 能 用 数学 模型 加 以 说 明 。 以 膜 电 导 改 变 的 数学 模型 为 例 , Hodgkin 等 明确 提出 , 钠 电导 (Gy.) 和 钾 电 导 〈CGrk) 的 改变 不 是 均匀 地 发 生 在 整个 膜 平 面 上 , 而 是 与 膜 上 某 些 特定 的 “点 ”有 关 。 随 后 的 实验 研究 发 现 , 一 些 药物 可 以 选择 性 地 阻 断 某 种 离子 的 跨 膜 移动 。 例 如 , 河豚 毒素 (TTX) 可 以 单独 阻 断 CNs 却 不 影响 Gx, 相 反 , CH (TEA) 可 以 单独 阻 断 CGkK, 却 不 影响 CN 同位 素 标记 的 TIX 可 特异 性 地 与 膜 上 某 些 特殊 的 “点 ”结合 , 而 标记 的 TEA 则 特异 性 地 与 膜 上 另 一些 不 同 的 “点 ” 结 合 。 基 于 诸如 此 类 的 实验 验证 以 及 细胞 兴奋 过 程 中 离子 移动 数目 之 多 之 快 的 现象 , 促 使 人 们 把 探索 的 兴趣 聚焦 在 生物 细胞 膜 结构 中 可 能 存 有 特殊 的 电压 门 控 离 子 通道 的 认定 (Aidley and Stanfield 1996) 。 几乎 与 此 同时 ,Katz 和 Fatt 等 证 实 了 神经 肌肉 接头 后 膜 存在 的 一 类 离子 通道 可 受 神 经 递 质 乙酰 胆 碱 (ACh) 而 非 膜 电 位 的 调节 。 随 后 , SAR (Glu), GABA, #24 (Gly) 和 5- 羟 色 腕 (S-HT) 等 众多 离子 通道 受 体 被 相继 发 现 和 验证 ,拓展 了 配 体 门 控 型 离子 通 道 的 研究 领域 。 到 70 年 代 中 期 ,Neher 和 Sakmann 在 电压 钳 (voltage clamp) 技术 的 基础 上 , 发 明 了 可 以 直接 观察 单个 离子 通道 活动 的 膜 片 钳 技 术 , 甚 灵敏度 能 检测 到 小 至 1.0 x 1078 A 的 膜 电 六 (Neher and Sakmann 1976) 。 膜 户 钳 技术 已 被 公认 为 是 离子 通道 研究 领域 中 最 重要 的 黄 基 石 , 如 今 , 已 被 广泛 地 应 用 于 生物 膜 离子 通道 的 鉴别 及 其 电学 特性 的 研究 。 进入 80 年 代 , 分 子 生 物 学 和 分 子 遗 传 学 技术 的 快速 发 展 有 力 地 推动 了 膜 离 子 通道 的 纯化 和 克隆 研究 。1982 年 , Numa 等 利用 o- 银 环 蛇 毒 素 与 烟 碱 型 乙酰 胆 碱 受 体 特异 结合 的 特性 ,从 电 鳗鱼 Torpedo 标 本 中 纯化 获得 了 该 类 受 体 通 道 蛋白 并 解析 了 其 整个 克隆 通道 蛋 自 的 氨基 酸 序 列 (Noda et al. 1982) 。 接 着 , 在 Catterall 等 利用 经 典 o- 蝎 毒 素 确定 了 大 鼠 脑 突 触 体 膜 电 压 门 控 钠 通道 亚 基 的 基本 组 成 构件 特征 的 前 提 下 ,Numa 等 又 克隆 并 解 析 了 电 鳗 鱼 电 器 官 中 的 电压 门 控 钠 通道 功能 性 w 亚 基 膜 蛋 白 (Noda et al. 1984) 。 由 于 钾 通 道 在 膜 上 表达 的 丰 度 极 低 , 以 及 早期 缺乏 合适 的 特异 结合 的 钾 通 道 调 制剂 , 钾 通道 分 子 结构 的 解析 不 能 依靠 生化 分 离 的 方法 , 而 是 得 益 于 颤抖 型 (shaker) 突变 果 蝇 的 发 现 和 机 制 研究 (Papazian et al. 1987) 。 迄 今 为 止 , 一 大 批 广泛 分 布 于 原核 细胞 和 真 核 细 胞 中 的 离子 通道 已 被 克隆 和 测序 , 此 外 , 全 球 性 基因 组 计划 的 启动 , 也 极 大 地 推动 了 离子 通道 基因 的 克隆 和 鉴定 。 借用 现代 光谱 学 、 生 物 信 息 学 和 和 蛋白 结晶 技术 , 又 从 空 忆 的 角度 拓 克 了 人 们 对 膜 离 子 通道 溶液 / 唱 体 构象 的 立体 视野 。 其 中 值得 一 提 的 是 , 冤 100 000 V/em) 。 此 类 通道 的 分 子 结构 中 存在 着 一 些 对 跨 膜 电位 改变 的 敏感 性 基 团 或 亚 单位 , 可 诱发 整个 通道 分 子 功 能 状态 的 改变 。 电压 门 探 通道 (voltage-gated channel) 一 般 包括 钾 通 道 、 钙 通道 、 钠 通道 和 氯 通道 。 电压 门 控 钠 通道 和 和 钙 通 道 的 功能 性 亚 基 均 各 由 4 个 玻 水 重复 结构 域 (I-IV) 组 成 , 每 个 结构 域 有 6 段 由 下 水 性 氢 基 酸 组 成 的 跨 膜 x 螺旋 序列 片段 (S1~$S6),, 在 $S5 和 S6 之 间 尚 有 一 个 P 段 (pore-forming segment), , 它 从 膜 外 面 进 入 膜 中 , 但 不 穿 膜 而 中 途 返 折 , 回 到 膜 外 。 每 个 结构 域 中 的 第 4 个 跨 膜 xc 螺旋 在 甩 基 酸 序列 上 均 有 一 个 共同 的 特点 , 即 每 隔 两 个 疏水 性 氨基 酸 间 重 现 一 个 带 正 电荷 的 Arg/Lys 残 基 。 电 压 门 控 钾 通道 分 子 只 相当 于 电压 门 控 钠 通道 和 钙 通 道 功能 性 亚 基 中 的 一 个 重复 结构 域 , 经 6 次 (S1~S6) 穿 膜 。S5 与 S6 之 间 由 一 个 相当 于 钠 通道 P 段 的 HS 段 连接 , 整个 通道 由 4 个 同 源 亚 基 构 成 (图 12-4) 。 了 正 电 荷 的 残 基 , 整 个 通道 也 为 四 聚 体 结构 。 不 同 的 是 CNG 的 门 控 并 不 受 电压 控制 ,{ Be rie ae nie sass ose ee eee RNAS § BPE (PRM HS 区 ) 等 单元 构成 。 与 之 相 比 , 只 有 两 段 跨 膜 的 内 辐 整 流 钾 通道 (inwardly rectifying K* channel, Kir) 呈现 出 异曲同工 的 相应 酷似 构架 。 另 一 方 面 , 这 些 离子 通道 间 的 氨基 酸 序 列 也 高 度 同 源 , 表 明 它 们 应 归属 于 同一 蛋白 质 超 家 族 149 812% Ae toh 5 BS fia (图 12-4), 随 着 跨 膜 电 位 的 改变 , 电 压 门 控 阳 离子 通道 带电 的 S4 片段 会 产生 位 移 , 诱 发 通道 “ 阐 门 ”的 开放 , 因而 被 认为 是 其 结构 中 感受 电压 改变 的 特异 结构 。 被 高 分 辨 解析 的 KvAP 通道 [一 种 源 于 嗜 热 性 TH HA (Thermophilic archaebacterium)#J 钾 离 子 通道 蛋白 ] 的 立体 结构 图 像 中 (Jiang et al. 2003a, b) , 其 通道 蛋白 为 平 行 的 四 聚 体 , 各 亚 单位 中 由 S3(b) 与 亿 有 4 个 正 电 荷 的 S4 区 段 共同 组 成 的 桨 式 电 CNG 通道 压 感受 器 (voltage-sensing paddle)FF4 Ef LE 在 其 蛋白 质 的 核心 内 , 而 是 裸露 于 外 轩 ems pee 细胞 膜 脂 质 位 置 , 能 够 感应 膜 电 位 在 细 胞 膜 界 面 两 侧 间 大 幅 的 跳跃 变化 (flip). kir 通道 当 膜 电位 为 负 时 , 离 子 通道 处 于 关闭 状 态 , 桨 式 电压 感受 器 位 于 细胞 膜 的 内 侧 面 (intracellular surface)。 当 细胞 膜 发 生 去 极 化 (depolarize) 时 , 细 胞 膜 两 侧 的 电 电压 门 控 离子 通道 超 家 族 结构 示意 图 场 梯度 使 带 正 电荷 的 桨 式 电 压 感 受 器 移 位 至 外 侧面 (extracellular surface) 位 置 , 通 道 蛋 白 产 生 形 变 ,“ 闸 门 ” 开 通 (图 12-5)。 es a S4-S5 linker 电压 门 控 钾 通道 门 控 示 意图 (514 Jiang et al. 2003b) A. 静 息 状 态 下 KvAP 示意 图 , 其 中 感受 电压 门 控 的 结构 元 件 用 红色 标 出 ,B. 激活 状态 下 KvAP 示意 图 与 电压 门 控 阳 离子 通道 相 比 , 电压 门 控 毛 离子 通道 中 不 仅 缺 失 S4 电 压 感受 器 , 且 骨 架 排列 结构 也 自持 特征 。 分 析 分 辩 率 分 别 为 3.0A 和 3.5A J | fs FF I (Salmonella typhimurium) FRADE CE. coli) ASH) JES BS 村 晶体 结构 (Dutzler et al. 2002), 发 现 其 呈 反 平行 的 二 聚 体 , 拥 有 两 个 位 于 中 央 的 站 呈 双 倍 旋转 对 称 排列 。 每 个 亚 基 包 括 18 个 长 短 不 一 的 % 螺 旋 均 倾斜 于 膜 内 , 每 = 的 前 半 部 分 和 后 半 部 分 在 结构 上 是 相似 的 , 但 在 膜 内 的 走向 相反 , 构 成 互相 围绕 六“ 倍 对 称 的 中 间 Cl 通 透 孔 洞 (图 12-6)。 | Kee Nell HE Wy WR Biomembranes 150 电压 门 控 毛 通道 结构 示意 图 A. CI- 通 透 的 二 个 亚 基 ,B. 二 个 亚 基 在 膜 内 的 立体 结构 12.1.3 ”机 械 [] 控 通道 生物 体内 存 有 不 少 能 感受 机 械 性 刺激 并 引起 功能 改变 的 细胞 。 例 如 ,内耳 毛 细胞 项 部 的 听 毛 在 受到 切 和 力 的 作用 产生 弯曲 时 , 毛 细胞 会 出 现 短暂 的 感受 器 电位 。 这 也 是 一 种 跨 膜 信号 转换 , 即 外 来 机 械 性 信号 通过 某 种 结构 内 的 过 程 , ?| 起 细胞 跨 膜 电位 变化 。 目 前 关于 机 械 门 探 通道 (nechanic-gated channel) 的 研究 相对 较 少 , 从 细菌 和 古 细菌 克隆 的 机 械 门 控 通 道 均 为 两 段 跨 膜 , 整 个 通道 呈 五 聚 体 结构 模式 , 易 通 透 阳离子 (Martinac 2001). 12.2 ”通道 的 离子 选择 性 通 透 及 其 结构 基础 “4 离子 通道 对 相应 的 离子 具有 很 高 的 选择 性 。 以 人- 通道 为 例 , 所 有 开 * 通道 都 具有 K* = Rb'*>Cs' 的 选择 性 通 透 性 ,但 是 对 于 半径 最 小 的 Na 和 六 却 几 乎 不 能 通 透 K" 的 通 透 性 是 Na 的 104 倍 )。 分 子 克隆 和 突变 试验 已 证 明 , 所 有 的 KK 通道 均 具 有 相同 的 孔 区 构造 。HS 区 域 (pore regiomn) 构 成 孔 区 的 外 口 衬 里 , 孔 区 的 内 口 则 由 S4、S5 以 及 S6 片段 之 间 的 连接 环 链 构成 。 通道 的 离子 选择 性 滤 嘴 应 位 于 HS 区 域 , 其 中 有 一 段 高 度 保守 的 TSXXTXGYG (在 个 别 K-* 通 道中 Tyr 会 被 Phe 取 代 ) 序列 被 认为 是 一 个 至 关 重 要 特征 序列 (signature sequence) ) 。 若 剔 除 其 中 的 Tyr 和 Gly 残 基 ,shaker 通道 将 失去 对 KK- 独 有 的 通 透 选择 性 , 表 现 出 对 包 括 K 在 内 的 其 他 单价 阳离子 (Na 、LI 六 和 Cs 等 ) 的 泛 通 透 性 。 但 其 单 通道 电导 的 大 小 几乎 与 野生 型 电压 门 控 K* 通道 等 同 , 表 明 该 特征 序列 内 Tyr 和 Gly 两 个 残 基 的 丢失 会 严 重 改变 通道 的 离子 通 透 选 择 性 , 但 不 影响 离子 的 迁移 速率 。 此 外 ,在 shaker iH FL IY 特征 序列 中 的 T-1、V-S$、G-6 和 G-8 四 个 部 位 残 基 也 已 被 分 别 验证 对 其 通道 的 离子 通道 选择 性 至 关 重 要 (Heginbotham et al. 1994) , 根据 被 解析 的 KcsA 立体 结构 , 可 以 发 现 选 择 性 涝 此 的 结构 具有 两 个 重要 的 特征 (Doyle et al. 1998) 。 第 一 , 主 链 p 环 中 的 VGYG 四 肽 请 中 原子 形成 了 一 堆 连 续 的 氧 原 FH, ‘Ct 门 对 稳定 脱水 的 天 "提供 了 许多 紧密 相 邻 的 最 具 , 计 尺寸 的 容纳 通 透 位 点 (图 12-7); & 二 , 特 征 序列 上 的 4 个 Tyr 残 基 侧 链 与 孔 区 螺旋 上 的 Trp 残 基 一 起 构成 了 一 个 芳香 族 氨基 酸 层 , 它们 的 位 置 像 袖口 般 地 环绕 选择 性 关中. Tyr 残 基 的 羟基 和 Trp 残 基 的 氮 原 子 间 形 成 的 氨 键 与 广泛 存在 的 范 德 华 力 相 互 作用 , 如 同 弹簧 般 地 把 孔道 撑 开 并 保持 | 151 12% AVR DS Fa femme, (ite K 安然 通过 《图 12-8) 。 选择 性 滤 嘴 的 纵 剖 图 ( 引 自 Doyle 选择 性 小 嘴 孔 区 横 切面 视图 (从 胞 质 内 et al. 1998 ) 侧 观 察 ) ( 引 自 Doyle et al. 1998) 图 中 显示 的 3 条 链 由 标志 性 氨基 酸 组 成 , 从 下 向 上 分 别 图 中 主要 标明 了 着 嘴 周 围 的 芳香 族 氨基 酸 网 络 。 选 择 性 滤 是 Thr (T). Val(V)、Gly(G) 、Tyr(Y) 、Gly(G)。 离 子 中 中 的 酷 氨 酸 (Y78) 通过 氧 键 和 范 德 华 力 与 孔 区 螺旋 中 Bee a ee, A (ER FY > 2 Sa i EH EF 小 球 ) 位 于 滤 嘴 的 两 端 , 大 约 相距 7.5A, 在 它们 之 间 间 隔 一 个 水 分 子 (红色 小 球 )。 内 侧 的 离子 表示 钾 离 子 在 站 嘴 中 相 邻 的 等 效 结合 位 点 之 间 的 快速 平衡 , 滤 嘴 被 孔 内 侧 和 和 孔 区 螺旋 (AEA) 包围 123 离子 通 过 扑 电 洒 行 征 LETT ETT 从 Neher 等 开创 性 地 利用 膜 片 钳 技 术 观察 了 骨骼 肌 终 板 膜 处 的 单一 ACh 门 控 通道 机 能 特性 以 来 Neher and Sakmann 1976), 已 有 多 种 离子 通道 的 单 通 道 特性 被 观察 研究 。 它们 大 多 都 具 如 下 共性 : (1) 不 论 是 化 学 门 控 或 电压 门 控 通道 它们 的 开放 和 关闭 都 是 突然 的 , 记录 到 的 电流 曲线 呈 方 波状 , 表明 相应 的 蛋白 质 分 子 可 以 从 一 种 构象 快速 地 路 变 到 另 一 种 构象 ,(2) 每 种 通道 开放 时 具有 恒定 的 电导 , 即 在 恒定 的 情况 下 , 只 能 看 到 “ 开 ” 或 “ 关 ” 两 种 状态 ,(3) 即使 是 同一 通道 蛋白 分 子 , 每 次 开放 的 持续 时 间 长 短 并 不 一 致 , 提示 通道 分 子 可 在 开放 和 关闭 两 种 构象 间 “ 摆 动 ", 停留 在 某 种 状态 的 长 短 具 有 随机 性 (4) 当 化 学 门 控 通 道 接受 到 相应 化 学 信号 分 子 的 刺激 或 电压 门 控 通 道 所 在 的 膜 两 侧 处 于 特定 电位 差 的 情况 下 ,“ 摆 动 ” 的 次 数 增多 , 开 放 的 几率 增 大 , 但 “ 失 活 ” 却 使 开 放 的 几率 减 小 。 单 通道 电流 很 容易 达到 10- 2A 水 平 , 如 将 申 写 的 等 卫 每 秒 流动 的 单价 离 子 , 则 可 发 现 每 个 离子 通 透 通道 的 时 间 不 足 100 ns, 迄 人 水 性 孔道 可 达 此 程度 。 12.3.2 ‘sti $2 it ees _—_——mmes Ayo EAA Hi od Ee LA A al? SPREAD AY Be, TE FE EES FEAT TE Be SAS ae. BAG clone AT PA ZEB RP H: yf Biomembranes 152 HL Sp A HL aC TZ BOL Hl. iL, (Bch EA AS Pa. JA A KA ee, EP i, EMTALA PRA: 7 = MPi, 其 中 己 为 通道 开放 的 几率 ,X 为 膜 通道 数目 。 如 果 通 道 的 开放 几率 不 随 电 压 或 时 间 改 变 , 则 安 观 电 疲 的 出 现 也 不 依赖 电压 和 时 间 的 改 变 。 但 在 很 多 情况 下 , 开放 几率 并 非常 数 , 可 随时 间 改 变 , 由 此 产生 了 电 疲 时 程 的 变化 , 下 面 以 电压 门 控 K- 通道 为 例 加 以 说 明 。 去 极 发 生 后 ,K- 电流 并 没有 立即 改变 。 经 过 一 个 延迟 期 ,电流 缓慢 增加 ,并 在 电压 阶 跃 发 生 数 毫秒 后 达到 稳定 水 平 , 这 种 电 六 的 缓慢 出 现 被 称 为 激活 (图 12-9A)。 单 通道 电流 是 如 何 表现 出 宏观 K 电 流 的 呢 ? 对 此 , 可 以 理解 为 一 系列 相同 去 极 激发 的 单 通道 钾 电流 总 和 。 单 通道 的 开放 略 迟 于 去 极 刺激 , 且 在 整个 去 极 过 程 中 通道 的 开放 几率 和 时 程 逐渐 增加 。 同 时 , 由 于 KK- 通道 的 开放 是 随机 的 , 呈 群发 性 (图 12-9B), 因 此 , 安 观 电流 的 激活 相 表 现 为 一 平 请 曲线 。 — 30mV B RE 几 率 0.0 时 间 /ms 在 Xenropus oocyte 上 外 源 性 表达 钾 通 道 单 通道 记录 结果 A. Patch-clamp 记录 到 的 单 通道 钾 电 流 , 从 - 100 mV 去 极 到 -- 30mV,B. 多 次 单 通 道 记 录 的 登 加 后 , 得 到 一 类 似 宏观 电流 的 曲线 12.3.3 WRU Be are: ly FEL A FS fi (mmm 细胞 膜 上 不 会 仅 表达 一 种 通道 , 流 过 整个 细胞 膜 的 总 电流 ( 膜 电流 ) 实际 是 流 经 膜 上 各 种 通道 的 电流 总 和 , 这些 电流 成 分 可 以 用 药理 学 的 方法 加 以 区 分 。 离 子 的 跨 膜 流动 定 会 改变 膜 电位 (membrane potential) , 因 此, 进行 宏观 电流 或 单 通 道 电 流 记 录 时 ,必须 利用 电压 钳 技术 稳定 细胞 膜 电位 。 以 下 分 别 简介 由 离子 跨 膜 流动 产生 的 两 个 主要 电位 变 化 : 动作 电位 和 突 触 电位 (synaptic potential) , 如 果 少 量 正 电荷 流入 细胞 , 膜 上 可 产生 一 个 被 动 反 六 特征 的 去 极 , 其 稳 态 的 幅度 与 膜 电阻 相关 ,并 遵循 欧姆 定律 〈( 户 JR)。 电阻 越 大 , 相同 0 电流 引起 的 电压 反应 就 越 大 。 膜 电阻 在 乡 大 程度 上 取决 于 膜 上 通道 的 数量 、 开放 几率 币 开放 时 的 电导 。 静 息 时 , 膜 电 PLEA ?通道 有 关 , 正 是 由 于 它们 的 活动 , 才 使 绝 大 多 数 旨 胞 静 息 膜 电位 维持 在 K* 的 平衡 电位 附近 。 另 一 方面 , 绝 缘 的 磷脂 双 分 子 层 构成 的 膜 性 两 种 导电 溶液 分 隔 开 , 形 成 膜 电容 , 正 是 膜 电容 的 存在 决定 了 膜 对 去 极 化 的 反应 快慢 , 一般 而 言 , 生 物 膜 的 平均 电 153 122 A ype 5 BS fi 8 ALVA lF/em?, HLA — 7 EE a ae AY LAE He far BE, 并 在 电容 的 两 侧 形 成 电势 差 (在 生物 膜 上 即 指 膜 电 位 ), 因 此 ,, 膜 可 以 看 成 是 由 电阻 和 电容 并 联 的 电路 (图 12-10). Hie 流 过 这 个 电路 时 既 含 电阻 也 含 电容 成 分 , 也 就 是 说 , 当 有 去 极 刺激 时 , 电 压 反 应 不 是 即 时 的 , 而 是 一 渐变 过 程 , 膜 电容 越 大 , 反 应 也 就 越 慢 , 这 就 是 膜 的 被 动 特性 。 Iptic=l 细胞 膜 可 视 为 由 一 个 电阻 和 电容 并 联 的 等 效 电路 ( 引 自 Nicholas et al. 2001) 在 RC 电路 中 , 电 流 脉冲 首先 给 电容 充电 , 形 成 区 , 在 刺激 结束 时 , 所 有 的 电流 访 经 电阻 , 形 成 六 电路 两 端的 电压 呈 指 数 关系 上 升 , 其 时 间 常 数 二 RC。 电 流 刺 激 终止 后 , 电 容 通过 电阻 以 相同 的 时 间 常 数 放电 , 电 流 大 小 相等 , 方 向 相反 在 神经 元 或 肌肉 细胞 等 可 兴奋 性 细 SOR 胞 膜 上 , 如 果 内 向 电流 足够 大 就 可 使 腊 去 极 直 至 形成 可 再 生 的 电位 变化 , 这 种 电位 变化 称 为 动作 电位 (图 12-11)。 Huxley 和 Hodgkin 利用 枪 乌贼 的 巨 轴 突 详尽 地 研究 了 形成 动作 电位 的 离子 基础 。 枪 乌贼 的 动作 电位 可 视 为 由 Na 和 K: 丙 Pp He ae 20 AVE, PP ie BITE BK 50 了 动作 电位 的 上 升 相 和 下 降 相 。 膜 去 极 起 始 , 电压 门 控 Nar 通 道 被 激活 , 随后 电 ea 压 门 控 K* 通 道 被 激活 。 由 于 Na 通道 被 orc SRK EIGLE, Sui eee eee ee cme 导致 了 膜 进 一 步 去 极 ,更 多 的 Na* 通 道 被 根据 Hodgkin-Huxley BER, 温度 为 18.5C 激活 , 增 加 了 的 内 向 电流 再 次 强化 膜 的 去 极 , 于 是 就 产生 了 一 个 具 再 生性 增加 的 膜 电位 , 即 动作 电位 。 但 是 , 由 于 受到 以 下 两 个 因素 的 制约 , 膜 的 去 极 化 并 不 会 达到 Na+ 的 平衡 电位 ,(1) 去 极 过 程 中 钠 通道 开始 失 活 , 钠 电流 逐渐 减 小 ,(2) 钾 通 道 开放 ,引发 的 净 外 向 电流 使 膜 电位 级 渐 趋向 K* 的 平衡 动作 电位 o 0 一 一 一 一 十 一 人 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 . 膜 电 位 /mV Na 电导 (Na 通道 ) Avy KR 电导 人 通才 电位 (Hodgkin and Huxley 1952 a,b)。 此 外 , ALK aie AFF Ik 对 较 长 , 膜 电位 可 能 甚至 一 度 低 于 静 息 电位 , 称 为 后 超 极 化 。 动作 电位 起 始 过 程 中 ,内 向 的 钠 电 六 与 外 向 的 钾 电 流 条 时 的 电位 称 为 国电 位 , 这 是 一 个 关键 的 电位 , 此 时 任何 可 致 钠 电流 增加 的 因素 ; (ROEHL, FARA, ££ fp EBA (HLTA CMA LTA) AY DL SR AI i fi ge 突 触 电位 可 定义 为 由 神经 递 质 释 放 产生 的 突 触 后 膜 的 电位 变化 , 兴 香 性 突 触 后 电位 He ® {i Biomembranes 154 (excitatory postsynaptic potential, EPSP) 可 致 突 触 后 细胞 兴 备 (图 12-12)。 同 样 , 突 触 后 细胞 也 可 被 抑制 性 突 触 后 电位 (inhibitory postsynaptic potential, IPSP) 所 抑制 。EPSP 可 产生 突 触 后 细胞 膜 去 极 , 如 果 去 极 强度 足够 大 , 便 会 诱发 突 触 后 细胞 产生 动作 电位 。 相 反 ,IPSP 通常 会 产生 膜 的 超 极 化 。 © 运动 轴 突 ee 肌纤维 0 1 2 3 4mm 10 ms ED) 位 于 蛙 肌 纤维 突 触 后 区 域 不 同 距离 处 记录 到 的 兴奋 性 突 触 后 电位 , 随 着 距离 的 增加 , 罕 触 后 电位 幅度 逐渐 减 小 (51 Nicholas et al. 2001) 骨骼 肌 上 的 神经 肌肉 接头 可 谓 经 典 的 化 学 突 触 。 前 面 曾 提 及 ,由 神经 冲动 刺激 神经 末梢 释放 的 ACh 分 子 会 同 突 触 后 膜 的 nACh 受 体 结 合 。ACh 的 结合 可 使 nACh 受 体 开 放 , 神经 末梢 ACh 释 放量 决定 了 受 体 的 开放 数量 , 也 直接 决定 卫 ACh 受 体 电 六 的 大 小 。 由 于 ACh fx} Na*, K* 等 阳离子 的 非 选 择 性 通 透 (Takeuchi and Takeuchi 1960, Takeuchi 1963a,b), , 而 不 似 Na-* 通 道 或 KK 通道 的 相对 专 一 性 ,生理 离子 浓度 梯度 下 ,ACh 受 体 的 反 转 电位 接近 于 0mV。 即 使 大 量 的 ACh 受 体 激 话 , 膜 的 去 极 化 最 多 达到 0 mV, 而 不 会 出 现 动作 电位 ,这 就 决定 了 EPSP 的 不 可 再 生性 , 也 导致 了 EPSP 无 法 沿 肌纤维 无 衰减 的 传播 《图 12-12) (Miles 1969) 。 但 另 一 方面 ,EPSP 可 以 使 附近 的 钠 通道 被 动 去 极 , 当 去 极 程度 足够 大 , 可 以 引发 动作 电位 。 ON TT TT 离子 通道 受 胞 内 外 环境 中 多 种 物质 的 调控 , 这 些 物质 通称 为 通道 调制 剂 , 包括 单价 或 二 价 的 阳离子 (区 、Ca* 、Zn*、M 人 等 )、 代 谢 产物 (ATP、ADP、 脂 肪 酸 )、GTP 结 合 蛋 自 、 胞 内 第 二 信使 ( 间 有 厅 的 物质 与 能 量 交 换 , 在 此 意义 上 , 植 物 、 动 物 、 微 生物 等 令 各 类 生物 有 机 体 细 胞 膜 的 功能 基本 上 是 相似 的 。 前 面 章 节 对 生物 膜 的 化 学 组 成 和 结构 已 有 详尽 介绍 , 脂 类 物质 构成 的 膜 的 双 层 分 /acuoie 结构 是 亲 水 分 子 及 带电 离子 跨 膜 苇 运 的 限制 性 屏障 , 而 膜 上 各 — | 159 B1IS#z ray = HEA Ss fo 种 行使 转运 物质 功能 的 蛋白 又 能 将 这 些 亲 水 分 子 和 带电 离子 有 选择 性 地 、 有 序 地 进行 路 膜 运输 。 植 物 细胞 内 部 的 离子 环境 与 细胞 外 环境 中 的 离子 环境 往往 存在 很 大 差异 , 而 细胞 内 不 同 区 域 或 细胞 器 之 间 的 离子 环境 也 存在 明显 差异 ,例如 细胞 外 及 液 泡 内 自由 Caz 的 浓 度 比 胞 质 内 的 自由 钙 浓 度 ([Caz]) 高 出 4 一 6 个 数量 级 , 如 此 高 的 跨 膜 电化 学 势 梯度 使 得 跨 膜 存在 着 巨大 的 Ca* 运 动 的 推动 力 。 而 细胞 之 所 以 能 维持 其 胞 内 的 各 种 正常 生理 生化 活动 ,首先 在 于 其 细胞 膜 能 维系 细胞 质 以 及 胞 内 不 同 区 域 的 各 种 离子 的 浓度 处 于 相对 稳定 的 水 平 。 参 与 植物 细胞 离子 吸收 转运 以 维持 离子 平衡 的 各 类 膜 转 运 蛋白 大 致 可 分 为 离子 载体 (包括 离子 泵 ) 和 离子 通道 两 大 类 , 它们 都 是 具有 若干 跨 膜 玻 水 区 域 的 膜 蛋白 。 离 子 载体 的 跨 膜 区 域 不 形成 明显 的 孔道 结构 , 其 作用 方式 是 先 与 被 转运 的 离子 特异 性 结合 , 然 后 通过 载体 蛋白 的 构象 改变 将 离子 从 膜 的 一 侧 转运 到 另 一 侧 。 而 离子 载体 又 可 以 分 为 执行 离子 被 动 运输 的 载体 和 主动 运输 离子 的 载体 , 后 者 被 称 为 离子 泵 。 多 数 植物 所 必需 的 矿质 营养 元 素 是 以 离子 形式 通过 质 膜 上 的 离子 裁 体 运送 进入 细胞 的 , ANH, NOs, H,PO;, SOi-、K:、CI- 以 及 某 些 呈 离子 态 的 小 分 子 有 机 物质 (如 某 些 氨基 酸 、 有 机 酸 ) 等 。 离 子 WIRE EL BEV ATP 的 水 解 , 其 对 离子 转运 是 逆 电 化 学 梯度 进行 的 。 高 等 植物 细胞 (plant cell) 质 膜 H'-ATP 酶 是 最 普遍 、 最 重要 的 离子 泵 ,其 最 重要 的 作用 在 于 建立 跨 膜 的 质子 电化 学 势 梯度 , 因 此 也 被 称 为 致电 泵 (electrogenic pump)。 由 H-ATP 酶 建立 的 跨 腊 质子 电化 学 势 梯度 是 植物 细胞 跨 膜 转运 其 他 多 种 离子 或 有 机 物质 的 动力 , 如 KK:、NOi 、 HPOf 、SO3- 、 疙 糖 、 氨 基 酸 等 。 到 目前 为 止 , 人 们 在 植物 细胞 上 确认 的 离子 泵 包括 质 膜 及 内 膜 系统 上 的 H-ATP 酶 和 Ca®-ATP 酶 以 及 内 膜 系统 上 的 H'- 焦 磷酸 酶 。 另 一 类 跨 膜 离子 转运 蛋 自 为 离子 通道 ion channel) , 多 为 膜 蛋白 复合 体 , 它 们 可 以 在 膜 上 形成 亲 水 的 跨 膜 孔道 区 域 , 以 快速 (每 个 通道 可 以 在 每 秒 钟 内 允许 10° ~ 108 个 特异 离子 通过 ) 并 有 选择 性 地 让 某 些 离子 通过 , 它们 广泛 存在 于 各 类 植物 细胞 膜 上 (Maathuis et al. 1997) , 通道 存在 “ 开 ” 与 “ 关 ” 两 种 状态 , 只 有 当 通道 处 于 开放 状态 时 , 离 子 可 以 通过 通道 蛋 白 的 孔道 区 域 完 成 跨 膜 移动 。 通道 蛋白 通过 其 构象 变化 而 控制 其 开放 或 关闭 状态 的 过 程 被 称 为 “ 门 控 ", 如 同一 扁 “ 门 ”的 开启 与 关闭 。 通 道 的 开放 与 关闭 受到 细胞 内 外 多 种 因 子 的 调控 。 正 是 由 于 这 些 离子 载体 、 离 子 泵 、 离 子 通道 的 存在 及 其 功能 的 实现 , 才 使 得 活 细胞 能 维系 其 生存 所 必需 的 内 部 各 种 离子 的 稳 态 平衡 ,保证 了 细胞 进行 正常 生命 活动 所 必需 的 离子 环境 .图 13-1 以 示意 图 形式 说 明 植物 细胞 离子 跨 膜 转 运 蛋白 的 种 类 及 分 布 。 在 最 近 20 年 间 , 随 着 对 植物 细胞 离子 通道 功能 研究 的 逐步 深入 , 人 们 已 明确 地 认识 到 离子 通道 及 其 活性 调控 在 植物 细胞 一 系列 生命 活动 过 程 中 的 重要 作用 。 本 章 着 重 介绍 有 关 植 物 细胞 钾 、 钙 离子 通道 及 阴离子 通道 研究 的 一 些 主要 内 容 。 13 2 BCP SE 活 细胞 的 膜 上 存在 多 种 不 同 的 离子 通道 , 各 种 离子 通道 可 依 不 同 鸣 分 类 方法 被 分 为 不 同类 别 的 通道 。 通 币 对 离子 通道 进行 分 类 的 依据 是 通道 的 门 二 和 车 和 所 通 透 离子 的 种 类 及 离子 转运 的 方向 。 在 按照 门 控 机 制 对 通道 进行 分 类 时 -为 电压 门 控 通 道 (该 类 通道 的 开放 及 关闭 受 跨 膜 电 位 的 调控 ), 配 体 门 控 通 道 1: 道 的 开放 及 关闭 受 特异 的 分 子 或 离子 调控 ) 以 及 张力 门 控 通 道 〈 该 类 通道 的 开 ; :用 受 膜 上 牵 张 力 的 变化 调 控 ) , 另 外 还 有 其 他 的 门 控 刺激 如 pH、 光 及 氧化 还 原 势 :, 和 过 的 通道 。 若 按照 通道 所 转 160 同 向 共 运输 体 Neen Ht 细胞 质 pH7.2 Na* AE=—120mV Sse fry Sze Sy Mg?* pHS.5 AE=—90mV ME +2k2O Ca2 | 胞 外 空间 BS ia @ KaARK SD ATP 结 合 复合 体 (ATP-binding complex ) 通道 植物 细胞 质 膜 和 液 泡 膜 离 子 跨 膜 转 运 机 制 示意 图 ( 引 自 Taiz and Zeiger 1998) 质 膜 和 滚 泡 膜 上 存在 的 水 孔 蛋 白 等 未 做 标注 运 离子 的 种 类 进行 分 类 , 则 可 将 通道 分 为 K 通道 、Ca” 通道 、C1 通道 等 。 由 于 多 数 植物 细胞 的 体积 较 小 直径 从 几 个 微米 至 几 十 个 微米 ) , 因 此 在 20 世纪 80 至 90 年 代 对 植物 细胞 离子 通道 的 研究 大 多 是 采用 膜 片 钳 技 术 , 而 至 今 仍 鲜 为 报道 的 利用 电压 钳 技 术 研 究 植物 细胞 离子 通道 的 工作 仅仅 局 限于 植物 离子 通道 基因 在 爪 蟾 卵 母 细胞 等 的 异 , 表达。 而 利用 膜 片 钳 技术 对 植物 细胞 离子 通道 的 研究 进展 也 较为 缓慢 , 主 要 原 因 包 括 : “ 些 植物 细胞 离子 通道 的 离子 选择 性 较 差 , 植物 细胞 细胞 壁 的 存在 所 形成 的 结 构 限制 ,而 利用 酶 解 方法 将 细胞 壁 去 除 后 又 往往 造成 在 原生 质 体 膜 与 微 电 极 之 间 难 以 形 成 高 阻 封 接 的 现象 等 。 161 S132 rey PAA BS Pa TEE EE ESAT TLD, 钾 是 植物 生长 发 育 所 必需 的 元 素 , Ti KY ce Pe J TAN Be 0 =F SS, 细胞 需要 高 浓度 的 KK: 来 平衡 有 机 酸 及 大 分 子 阴 离子 基 团 所 带 的 负电 符 从 而 维持 正常 的 蛋 白 结 构 , 同时 KK 还 有 降低 细胞 水 势 .快速 有 效 地 调节 跨 膜 电位 等 多 种 重要 功能 (Maathuis etal. 1996), K* 的 快速 跨 膜 转运 是 与 植物 体内 各 类 细胞 广泛 分 布 的 多 种 天" 通道 相关 的 , 目前 人 们 已 经 从 植物 的 多 种 细胞 中 记录 到 了 K-* 通 道 并 对 其 生理 功能 和 调控 进行 了 探讨 。 自从 Schroeder (1984) 首次 利用 膜 片 钳 技术 记录 了 和 看 豆 (Vicia faba) 叶片 气孔 保卫 AHN aE Ke 通道 (potassium channel) 以 来 , 人 们 已 经 从 不 同 植物 种 类 的 多 种 类 型 细 胞 记录 、 鉴 定 并 研究 了 K-* 通道 及 其 特性 , 如 三 豆 气孔 保卫 细胞 质 膜 的 KK 通道 【Wnu et al. 1995, 1994, Wang et al. 2001 ) 、 含 羞 草 的 叶 桃 马达 细胞 质 膜 必 通道 (Yuetal.2001)、 拟 南 芥 (drapiaopsis thaliana) 保卫 细胞 质 膜 儿 通道 (Schroeder et al. 2001, Pei et al. 1998) 、 i WES (Thlaspi arvense) 叶肉 细胞 质 膜 玉 通道 (Pineros et al. 2003), 7#F3é (Fan et al. 2003) 和 拟 南 芥 (Fan et al. 2001) 花粉 原生 质 体 质 膜 民 "通道 、 拟 南 芥 根 毛 质 膜 K" 通道 (Ivashikina et al. 2001) 、 豆 类 种 皮 细 胞 K* 通道 (Zhang et al. 2000) 以 及 小 麦 根 皮层 细胞 Walt K* 通道 《Gassmann et al. 1994) “@, K* 通道 分 布 的 广泛 性 及 通道 种 类 及 数量 的 丰 富 也 从 一 方面 表明 其 在 植物 生长 发 育 中 的 重要 性 。 表 13-1 列 出 了 到 目前 为 止 对 拟 南 芥 各 PEK 通道 研究 的 情况 , 其 中 有 些 KO 通道 的 信息 还 仅 是 根据 对 拟 南 芥 全 基因 组 序列 分 析 所 得 的 结 末 。 对 于 电压 门 控 的 植物 细胞 K: 通 道 , 根据 其 不 同 的 电压 依赖 性 可 分 为 超 极 化 激活 的 K' 通道 和 去 极 化 激活 的 开通 道 。 超 极 化 激活 的 天 通道 在 膜 电 位 较 静 息 电 位 更 负 而 使 细胞 处 于 超 极 化 状态 时 被 油 话 开放 , 相对 于 质 膜 而 言 , 通过 此 类 通道 的 跨 膜 K 电流 是 由 外 向 内 的 , 故 又 被 称 为 内 回 整 流 K- 通道 (Schroeder et al. 1994), , 如 气孔 保卫 细胞 的 内 向 Ke 通道 就 是 典型 的 超 极 化 激活 通道 。 而 由 去 极 化 激活 的 KK 通道 则 是 在 跨 膜 电 位 较 膜 静 息 电 位 更 正 而 使 细胞 处 于 去 极 化 状态 下 被 激活 的 通道 , 相 对 于 质 膜 而 言 , 通 过 此 类 通道 的 跨 He KO 电流 是 自 内 向 外 的 , 故 又 被 称 为 外 向 整流 K' 通道 (Tester 1990) 。 进 一 步 的 研究 表 明 , 内 向 和 外 向 整流 K* 通 道 所 介 导 的 电流 具有 不 同 的 动力 学 及 药理 学 特征 , 因此 二 者 应 为 膜 上 不 同 的 通道 重 白 〈《Maathuis et al. 1997) 。 植 物 细胞 的 各 种 K* 通 道 分 别 具 有 不 同 的 功能 , 如 根 表皮 及 皮层 、 根 毛 、 维 管束 等 细胞 膜 上 的 K* 通 道 主 要 是 对 植物 根 自 环 境 中 吸 收 及 体内 转运 天" 的 功能 负责 的 , 有 些 与 运动 相关 的 细胞 膜 上 的 K* 通道 则 主要 是 与 调节 细胞 的 涂 透 压 相 关 , 而 有 些 K* 通 道 的 作用 则 又 可 能 与 细胞 膜 电位 变化 以 及 相关 的 信和 号 转 导 过 程 相关 等 。 气孔 保卫 细胞 质 膜 K" 通道 是 迄今 为 止 研 究 的 最 为 座 入 的 K' 通道 ,我 们 以 气孔 保卫 细胞 的 运动 调节 为 例 来 简要 说 明 K* 通 道 的 作用 。 植 物 的 主要 功能 一 一 皇 执行 地 球 上 最 重 要 的 生物 化 学 反应 光合 作用 过 程 中 , 植 物 白 引 境 吸 必 二 氧化 碳 、“ 呼 出 氧气 , 同 时 植物 体内 的 水 分 也 可 以 水 汽 的 形式 扩散 至 大 * “ 涪 。 这 一 重要 的 气体 交换 过 程 是 通过 植物 叶片 被 称 为 “气孔 (stomata)” 的 结构 进 d 13-2)。 植 物 叶片 的 气 孔 由 一 对 特 化 的 表皮 细胞 围绕 而 成 , 这 对 特 化 的 细胞 称 》 保卫 细胞 (stomatal guard cell) 。 双 子叶 植物 的 气孔 是 由 一 对 肾 形 的 保卫 细胞 构成 太 。 站 列 形成 酉 圆 的 外 形 , 中 间 162 分 关 基因 名 称 FAME : 参考 文献 ‘ 通 透 离子 ”电流 HMMA HLS /pS Czempinski et al. KCO KCOI At5g55630 叶 , 花 K*,NH, 外 向 整流 © Bat 64 ii 外 向 KCO2 At5g46370 hitpalie wie 钾 通 KCO3 At5g46360 arabidopsis.org/ = ae ; 县 a5 at 道家 KCO4 Atl g02510 仅 由 生物 信 A 学 分 析出 体 功能 未 知 info/genefamily/ KCOS At4g01840 Ionchannels.html 族 KCO6 At4g18160 根 中 柱 鞘 , Ba* Lacombe et al. ‘ a5 skor/ SKOR = At3g02850 。 木质 部 软 组 KK, Rb 外 向 整流 TEA 等 22 2000a, Gaymard GORK 织 , 花 粉 et al. 1996 2+ 钾 通 道 ”GORK atse37s00 ”保卫 细胞 , x, gers 13. > Hosy-etal, 2003 2 1 WE 外 向 整流 TEA osy et al. Cs*, Ba™, Pilot et al. 2001 KAT1 — At5g46240 K*, Rb* j 7.5 ; = 保卫 细胞 APE THA Szyroki et al. 2001 KAT 保卫 细胞 , Csr+,Ba2, KAT2 。 At4g18290 。” 叶 木 质 部 、 K' Rb 内 向 整流 TFA Pilot et al. 2001 花 a KAT3/ 可 以 调控 AKT AOI RSEEE, ASP TA | J ’ 已 a At4g32650 3 aa Reintanz et al. 2002 钾 通 首 ake: M8 ‘i, SSM 无 通 透 离子 能 力 人 ee ones ak Rei 1. 2002 去 , 》 = eintanz et al. AKT1 — At2g26650 5 K* 向 整流 “Ba2+, 16 上 毛 , 叶 肉 , 保 的 Gaymard et al. 1996 卫 细 胞 AKT 叶肉 , 叶 表 (sae Deeken et al. 2002, AKT2/3 At4g22200 ss, (4H Kt ”内 向 整流 TEA , 24 ”Lacombe et al. 胞 , 起 皮 部 CaS 2000b Lacombe et al. AKTS — At4g32500 2 te 未 知 2000b AKT6/ : nee At2g25600 花粉 K+, Rb+ 内 辐 整 流 Cs+ 14 Mouline et al. 2002 是 可 供与 外 界 进 行 气体 交换 的 小 孔 。 保 卫 细 胞 的 一 个 重要 特征 是 其 部 分 细胞 壁 明 显 加 厚 , 使 得 当 细胞 涂 透 压 发 生变 化 而 膨胀 或 收缩 时 其 细胞 运动 具有 方向 性 。 一 般 情 况 下 , 多 数 植物 的 气孔 在 白天 光照 条 件 下 张 开 以 保证 大 气 中 CO: 扩 散 进 入 叶片 组 织 内 被 用 于 光合 作 FA, 而 在 夜晚 黑暗 条 件 下 气孔 关闭 以 减少 水 分 的 散失 。 在 光照 条 件 下 , PR LA Jo ATP 酶 被 激活 , 随 着 质子 被 不 断 泵 出 胞 外 , 跨 质 膜 电位 合 来 愈 负 而 使 细胞 逐渐 成 为 超 极 化 状态 , 进 而 使 内 向 KK 通道 被 激活 ; 随 着 K'* 进入 细胞 , 细 胞 内 的 水 势 下 降 , 结 果 导 致 细胞 自 环境 吸水 而 膨胀 、 气 孔 张 开 。 而 在 黑暗 条 件 下 , 保卫 细胞 跨 质 膜 的 质子 梯度 降低 , 跨 质 膜 电 位 变 得 愈 来 愈 正 而 使 细胞 逐渐 处 于 去 极 化 状态 , 进 而 使 外 向 天" 通道 被 激活 ; 随 着 民 自 细胞 流出 ,细胞 内 的 水 势 增加 ,结果 导致 细胞 失 水 而 体积 收缩 、 气 孔 关 闭 〈 图 13-2) 。 植 4 Wi Ko 通道 的 活性 受 多 种 因素 调控 。 例 如 前 述 的 气孔 保卫 细胞 的 KK 通道 的 活 性 除了 直接 受 跨 膜 电 位 的 门 控 外 , 还 间接 地 受 光 、 植 物 激素 、 钙 离子 等 的 调控 。 近 年 来 随 着 人 们 利 3 电 生 理 技术 结合 药理 学 .生物 化 学 及 分 子 生 物 学 等 方法 对 植物 K 通道 研究 | 163 $1ASF ray = FAD A 2S Fa TL Ca 渗透 道道 S 型 阴离子 通道 R 型 阴离子 通道 保卫 细胞 各 种 离子 通道 在 ABA 诱导 气孔 关闭 过 程 中 协同 作用 示意 图 ( 引 自 Schroeder et al. 2001 ) 右 侧 细胞 模型 说 明 ABA 及 其 下 游 的 钙 信号 激活 某 些 通道 而 诱导 气孔 关闭 ; 左 侧 细胞 模型 说 明 与 此 同时 ABA 及 钙 信号 抑制 质子 泵 和 钾 内 向 通道 、 进 而 抑制 气孔 开放 的 作用 的 不 断 深 入 , 特别 是 利用 模式 植物 和 模式 细胞 及 异 源 表 达 体 系 可 以 将 植物 KK 通道 活性 及 其 调控 的 研究 有 目的 地 置 于 适当 的 信号 传递 调控 途径 中 进行 , 使 人 们 对 植物 K` 通 道 的 调 控 机 制 及 生理 功能 也 有 了 进一步 地 了 解 (ChErel 2004) 。 以 下 简要 介绍 有 关 植 物 细胞 钾 通 道 的 磷酸 化 /去 磷酸 化 调控 、 一 些 蛋 白 因 子 及 微 丝 骨架 的 调控 等 研究 情况 。 在 存在 激酶 和 磷酸 酶 的 全 细胞 记录 方式 下 , 胞 内 Ca 升 高 对 保卫 细胞 内 同 K" 电 流 的 抑制 作用 可 以 被 依赖 钙 的 蛋白 磷酸 酶 2B 的 特异 抑制 剂 所 阻 断 ,证 明了 磷酸 化 作用 可 以 调 dehy KATE (Luan et al. 2002), 。 利 用 Calyculin A 和 内田 酸 (Okadaic acid) 这 两 种 磷酸 酶 1 和 2A SH al Ft Ae PR TD A He BHP a] A Ket HEL at oo Ae, 2 Py et Pp TY 2H HLS De AGEN Td HL ne a FO ld EF rT bd Fe a ee] (Li et al. 1994) 或 有 抑制 作用 (Thiel et al. 1994) , 而 在 叶肉 细胞 中 则 对 内 向 电流 没有 明显 作用 , 对 外 回电 流 却 有 激活 作用 (Li et al. 1994) 。 因 此 , 磷 酸 酶 1 和 2A 家 族 的 不 同 种 类 磷酸 酶 可 能 区 不 同 细胞 类 型 K* 通道 的 调控 作用 是 有 所 区 别 的 。 另 外 , 蛋白 磷酸 酶 2C 家 族 (4n ABIL 和 ABI2) 在 植物 激素 脱落 酸 (abscisic acid, ABA) 对 气孔 的 调控 过 程 中 起 作用 , 也 说 明 通 道 蛋 白 的 磷酸 化 /去 磷酸 化 可 能 对 其 活性 有 调控 作用 (Armstrong et al. 1995) 。 将 ATP 及 其 类 似 物 应 用 于 对 K-* 通 道 的 研究 也 为 此 提供 了 相关 证 据 。 当 利用 看 豆 保卫 细胞 的 分 离 膜 片 进行 单 通道 记录 时 , AIP 有 具有 激活 内 向 KK 通道 电流 的 作用 , 但 在 全 细胞 记录 方式 下 却 观测 不 到 这 种 作用 , 可 能 是 在 全 细胞 记录 方式 下 胞 内 较 低 水 平 的 ^TF “经 可 以 请 足 激活 通道 的 需要 (Wu et al. 1995) 。 利 用 含羞 草 叶 枯 马达 细胞 进 里 研究 表明 , 钉 通 道 电流 随 记录 时 间 延 长 的 衰减 (rundown) 可 以 被 在 胞 , 入 Mg2-ATP 所 逆转 (Moran 1996) , 类 似 的 现象 在 异 源 表达 后 的 K* 通 道 记 : 也 可 被 观测 到 (Hoshi 1995)。 通 过 对 PKA 及 其 调控 因子 调节 K* 通 道 活性 的 研 ” “人 们 进一步 明确 了 通道 蛋 白 的 磷酸 化 /去 磷酸 化 对 通道 活性 的 调控 作用 。cAMP 鸡 会 世 叶 肉 细胞 的 外 四 K* 通 道 电 生 4 二 物 膜 Biomembranes 164 流 有 激活 作用 ,而 cAMP 是 可 以 通过 与 PKA 的 调节 或 催化 亚 基 相 结合 而 调控 后 者 活性 的 ; PKA 催 化 亚 基 可 阻止 异 源 表达 的 K:* 通 道 KATI1 的 电流 衰减 , 加 入 碱 性 磷酸 酶 可 使 电流 误 减 的 时 间 提 前 (Tang et al. 1999) 。 ae GAY 14-3-3 蛋白 在 烟草 中 过 表达 后 导致 烟草 叶肉 细胞 的 外 向 Kae (SaalbACh et al. 1997) , 在 细胞 质 一 侧 加 入 纯化 的 14-3-3 蛋白 使 番茄 悬浮 细胞 的 全 细胞 Spin] K* 电流 倍增 (Booij et al. 1999) 。 三 聚 体 G 重 白 对 保卫 细胞 "通道 有 调控 作用 ,, 利 用 GTPYS 将 G 和 蛋白 锁定 于 活性 状态 时 , 鼻 豆 保卫 细胞 内 向 钾 通 道 活 性 显著 增加 〈EFairley- Grenot et al. 1991), , 而 叶肉 细胞 的 外 同 钾 通道 活性 〈Liet al. 1993) 却 明 显 降 低 , 而 加 入 GDPBS 将 G 和 蛋白 锁定 于 非 活 性 状态 时 , 其 对 两 类 钾 通 道 的 调节 作用 则 正好 相反 。 进 一 步 的 单 通道 记录 实验 证 明 , 三 聚 体 G 和 蛋白 对 重 豆 保卫 细胞 质 膜 内 向 钾 通 道 的 调控 作用 与 其 他 细胞 质 因素 无 关 (Wu et al. 1994), 即 可 能 G 和 蛋白 对 此 类 钾 通 道 有 直接 的 调控 作用 。 与 这 些 结果 相对 应 , 在 拟 南 芥 中 当 编 码 G 和 蛋白 w 亚 基 的 基因 CP47 pki (knockout) Jr, ABA 对 基因 敲 除 突变 体 气孔 保卫 细胞 的 内 各 天 "电流 的 抑制 作用 背 失 , 同 时 气孔 对 ABA 诱导 的 关闭 不 敏感 而 保持 开放 状态 (Wang et al. 2001 ) 。 在 植物 气孔 运动 (stomatal movement) 过 程 中 , 保 卫 细 胞 膨 压 的 变化 使 微 丝 结构 及 K* 通道 活性 发 生变 化 , 研 究 表明 细胞 膨 压 对 KK 电流 的 调控 是 通过 改变 微 丝 结构 引起 的 (Liu et al. 1998) 。 还 有 实验 证 明 , 微 丝 解 聚 剂 细胞 松弛 素 D (cytochalasinD) 可 以 向 活 植物 细胞 内 向 开 '* 通 道 电流 , 而 微 丝 稳定 剂 鬼 笔 环 肽 《phalloidin) 的 作用 则 相反 (Hwang etal. 1997) , 证 明 微 丝 骨 架 的 动态 变化 参与 了 对 天 通道 活性 的 调控 过 程 。 除 上 述 一 些 植物 细胞 钾 通 道 调控 机 制 方面 的 研究 外 , 一 些 研究 已 经 证 明 植物 细胞 的 不 同 钾 通道 的 活性 还 分 别 受 红 光 (Serrano 1988), #96 (Shimazaki et al. 1986), ABA 以 及 胞 质 自 由 Ca 六 浓度 变化 等 调节 (Schroeder et al. 2001 ) 。 自 20 世 纪 未 以 来 , 随 着 模式 植物 拟 南 芥 全 基因 组 物理 图 谱 的 完成 以 及 拟 南 芥 功能 因 组 研究 的 开展 , 利用 拟 南 芥 及 其 突变 体 对 植物 细胞 钾 通 道 的 研究 迅速 地 进入 了 分 子 生 物 学 水 平 ( 表 13-1)。 例 如 , 目 前 已 经 明确 拟 南 芥 全 部 9 个 shaker K* 通道 基因 表达 的 组 组 及 细胞 定位 , 并 对 它们 各 自 的 功能 进行 了 分 析 研 究 。4K77 编码 一 种 内 向 整流 的 K' 通 道 (Gaymard et al. 1996), , 利 用 4K77 的 启动 子 与 GUS 共 表 达 的 研究 证 明 ,4K77 在 根 的 皮层 及 表皮 细胞 中 有 表达 , 表 明 4K77 在 植物 从 土壤 中 吸收 K- 的 过 程 中 起 重要 作用 (Reintanz et al. 2002) 。AtKC1 与 4K77 在 拟 南 芥 根 组 织 中 共 表 达 , 调 节 AKTI 的 门 控 及 其 对 阳离子 的 敏感 性 , 推 测 AtKC] 同样 参与 了 天 "的 吸收 (Reintanz et al. 2002) 。 植 物 根 表 皮 及 皮层 组 织 自 土壤 环境 吸收 KK 后 , 在 向 根木 质 部 分 泌 并 向 植株 上 部 转运 的 过 程 中 需要 外 向 整流 的 KK 通道 SKOR, 它 介 导 运输 了 木质 部 液 半 中 约 50% 的 KK (Gaymard et al. 1998) 。 至 少 有 两 个 内 加 整流 的 K- 通道 (KATI AIKAT2) 和 一 个 外 向 整流 的 K 通道 (GORK) 在 保卫 细胞 中 有 表达 (Pilot et al. 2001, Szyroki et al. 2001), ifjH GORK 在 保卫 细胞 中 是 惟一 的 外 向 开 * 通道 (Hosy et al. 2003) 。 在 拟 南 芥 韦 皮 部 组 织 可 以 检测 到 天 AT2 的 表达 (Pilot et al. 2001) , 而 在 相同 的 组 织 部 位 还 有 AKT2 的 表达 , 后 者 编码 了 一 个 有 微弱 内 | “ine VE AAA Ke 通道 (Lacombe et al. 2000b), AKT2 具有 调控 万 皮 部 细胞 膜 电 RM. RRA EINER] (Deeken et al. 2002) 。 内 回 整 流民 通道 SPIK 特异 性 地 表达 在 花粉 中 , 有 介 导 玫 吸 收 的 作用 (Mouline et al. 2002), 4)lp 7 shaker 3¢ He K* 通道 中 惟 165 13% ray LA BS FL CAR FE MD BEE EY KH HE AE AKTS (At4g32500),, 虽 然 还 没有 对 4K75 进 行 异 源 表达 鉴定 ,但 在 转录 水 平 发 现 其 主要 在 花 中 表达 (Lacombe et al. 2000b) 。 另 外 还 有 一 个 不 属于 shaker 家 族 的 外 向 整流 K' 通 道 基因 KCO7 的 表达 及 功能 鉴定 研究 也 已 完成 , 其 主 要 表达 于 叶 组 织 和 花 器 官 中 〈Czempinski et al. 1997) 。 TTT ED LE. 钙 是 植物 生长 发 育 所 必需 的 营养 元 素 。Ca 关 对 于 稳定 植物 细胞 壁 和 细胞 膜 结构 有 重 要 作用 , 在 植物 液 泡 的 离子 和 电荷 平衡 方面 也 是 不 可 或 缺 的 。 但 对 于 植物 细胞 Ca: 作用 的 研究 更 多 地 集中 在 其 作为 细胞 最 重要 的 第 二 信使 方面 。 在 许多 植物 细胞 信号 转 导 途 径 中 , 特别 是 在 植物 适应 各 种 环境 胁迫 的 信号 转 导 过 程 中 , 胞 质 自由 Ca 作为 最 重要 的 第 二 信使 起 着 至 关 重 要 的 调控 作用 。 对 于 植物 活 细胞 , 胞 质 自 由 Ca 浓度 〈[Ca2]) 一 般 被 维持 在 极 低 的 水 平 (大 约 在 10 10 -mol 之 间 ), 而 胞 外 和 胞 内 钙 库 〈 如 液 泡 ) 的 钙 谊 度 则 一 般 在 10 : molL 的 水 平 。 因 此 , 在 胞 外 环境 与 细胞 质 之 间 (FSA) 和 细胞 质 与 内 膜 系 统 之 间 〈 路 液 泡 膜 或 跨 内 质 网 膜 ) 均 存 在 巨大 的 跨 膜 Ca 电化 学 势 梯度 。 研 究 表明 几乎 所 有 的 胞 外 刺激 (如 光照 、 重 力 、 温度 、 和 干旱 、 植物 激素 以 及 病原 刺激 等 ) 都 能 够 引起 [Ca 的 变化 , 大 多 情况 为 [Ca”]ss 升 高 , 也 有 少数 情况 表现 为 [Ca2]s 下降 。 外 界 刺激 引起 的 [Ca]. 变 化 具有 一 些 特异 性 , 如 [Ca2]s 变化 的 不 同 振幅 、 不 同 频 率 特点 及 产生 浓度 变化 的 区 域 特异 性 等 。 当 细胞 受到 某 种 信号 刺激 后 ,Ca 关 从 胞 外 区 域 或 胞 内 细胞 器 的 高 钙 区 域 快 速 地 通过 膜 上 的 Ca 王 通道 (calcium channel) 进入 细胞 质 而 导致 [Ca Jon 发 生变 化 《图 13-1)。 在 植物 细胞 的 质 膜 及 内 膜 系 统 上 都 已 记录 到 了 Ca 通道 , 按 其 电压 依赖 性 可 以 分 为 超 极 化 激活 、 去 极 化 激活 以 及 非 电 压 依赖 性 的 钙 通 透 性 通道 (Sanders et al. 2002), 。 钙 通 透 性 通道 在 各 种 不 同 细胞 上 广泛 分 布 , 而 且 常 常 在 同类 膜 上 分 布 有 不 同调 控 机 制 的 钙 通 道 , 表 明 植 物 细 胞 钙 通 道 及 其 介 导 的 跨 膜 Ca+ 转运 可 能 与 多 种 细胞 信号 转 导 途 径 相关 (White et al. 2003 ) 。 利用 膜 片 钳 技术 在 拟 南 芥 根 毛 (Foreman et al. 2003, Véry et al. 2000) .洋葱 表皮 细胞 (Pickard et al. 1993) 、 番 大 悬浮 细胞 (Blumwald et al. 1998) 、 叶 肉 细 胞 (Stoelzle et al. 2003) 及 气孔 保卫 细胞 (Murata et al. 2001, Pei et al. 2000) 等 材料 上 均 记 录 到 了 超 极 化 激 活 的 钙 通 透 性 通道 , 这 类 通道 对 其 他 的 二 价 阳 离子 (如 Ba#、M8g+、Mn、Cd、Zn2 等 ) 也 有 通 透 性 。 这 类 通道 的 激活 导致 [Ca2]s 的 升 高 , 在 根 毛细 胞 中 [Ca2]sw 的 升 高 使 此 类 通道 的 激活 电压 癌 更 正 的 方向 移动 (Very et al. 2000) , 而 在 保卫 细胞 中 则 向 更 负 的 方向 移动 (Hamilton et al. 2000) 。 在 根 毛 和 花粉 管 的 顶端 及 根 伸 长 区 细胞 , 超 极 化 激活 的 钙 通 透 性 通道 受 胞 内 征 的 激活 , 属 于 正 反馈 调控 ,这 种 调控 机 制 保证 了 这 些 细胞 能 够 获取 并 维持 细胞 延伸 所 需要 的 较 高 [Ca ]s。 (White et al. 2003) 。 对 机 城 刺 激 敏 感 的 超 极 化 激 活 的 钙 通 道 可 能 在 植物 受 重 力 、 和 触摸 或 弯曲 等 诱导 的 形态 建 皮 起, 用 (Bibikova et al. 1999) 。 活 性 氧 类 的 物质 在 根 毛 、 保卫 细胞 及 晤 浮 细胞 等 材 [以 激活 超 极 化 激活 的 Ca 通道 (White et al. 2003) 。 在 保卫 细胞 中 , 超 极 化 洋 a 通 道 在 水 分 胁迫 引起 的 气孔 关闭 中 起 主要 作用 , ABA 浓 度 升 高 可 使 此 类 Ca2 J 激 活 电 位 癌 更 正 的 方向 移 动 从 而 促进 通道 开放 , 结果 使 进入 胞 质 的 Ca 不 仅 可 以 : 膜 的 去 极 化 , 还 可 以 激活 依 赖 于 [Ca”…]sy 的 其 他 反应 《如 依赖 胞 质 钙 的 胞 内 乞 苹 改 等 ), 最 终 引 起 气孔 关闭 Pet KE iy WR Biomembranes 166 (Schroeder et al. 2001), 在 植物 细胞 质 膜 上 已 经 发 现 了 几 类 去 极 化 激活 的 Ca 通道 , 它们 有 不 同 的 药理 学 及 电 生 理 特 性 , 一 般 对 二 价 和 一 价 阳 离子 都 具有 通 透 性 , 说 明 这 些 通道 还 可 能 跨 膜 转运 除 Ca 之 外 的 其 他 阳离子 (White 2000) 。 在 拟 南 草 和 胡 葛 下 的 悬浮 细胞 原生 质 体 中 ,去 极 化 激活 的 钙 通 道 的 活性 受 细胞 骨架 调控 , 微 管 解 聚 可 以 使 其 活性 增加 (Thion et al. 1998) 。 植物 细胞 质 膜 上 外 同 整 流 的 KK 通道 也 已 经 被 证 实 为 有 去 极 化 激活 的 内 向 Ca 通道 的 活性 (White et al. 2002) 。 这 种 Ca 通过 外 向 整流 KK 通道 内 流 的 机 制 可 以 使 K- 外 流 的 同时 升 高 [Ca2]。, 从 而 更 加 促进 天 的 外 流 , 这 种 反馈 调节 可 能 在 KK 向 木质 部 的 装载 过 程 中 起 重要 作用 (De Boer 1999) 。 在 植物 细胞 的 质 膜 上 还 存在 有 非 电压 依赖 的 Ca ”通道 ,它们 在 离子 选择 性 、 电 压 依 赖 性 及 药理 学 特性 上 皆 有 其 特异 性 , 它 们 可 以 通 透 一 价 和 二 价 的 阳离子 。 推 测 可 能 在 补 充 由 Ca”-ATPases 及 了 HVCa 反 加 转运 体 中 自 胞 质 外 六 的 钙 方 面 有 一 定 作 用 , 从 而 可 保证 [Ca* Jon 的 稳 态 平衡 (White et al. 2002) 。 另 外 , 在 许多 不 同类 型 植物 细胞 中 , 非 电压 依 赖 的 Ca 通道 是 惟一 能 在 静 息 电位 下 可 以 跨 膜 转 运 Ca 的 通道 (White et al. 2003) 。 在 植物 细胞 液 泡 膜 上 也 发 现 了 三 类 不 同 的 Ca 通道 。 其 中 一 类 为 去 极 化 激活 , 对 一 价 和 二 价 的 阳离子 都 有 通 透 性 的 通道 , 在 跨 液 泡 膜 电 压 处 于 相对 稳定 的 状态 下 可 以 介 导 少量 的 Ca 关 向 胞 质 内 流 (White 2000), SV 离子 通道 (slow vacuolar ion channel) 是 其 中 最 稍 见 的 , 这 类 通道 受 多 种 因素 的 调控 , 推 负 它 们 可 能 在 胞 质 钙 信号 的 形成 过 程 中 有 重 要 作用 。[Ca2]。v 谊 度 的 升 高 或 液 泡 钙 浓度 的 降低 以 及 胞 质 碱 化 或 液 泡 液 的 酸化 可 以 使 此 类 通道 在 正常 的 跨 液 泡 膜 电位 下 开放 ,[Ca” je 对 该 通道 的 调控 作用 可 能 在 于 防止 [Ca2]s 过 高 (White et al. 2003 ) 。 另 外 两 类 液 泡 膜 钙 通 道 均 属 超 极 化 激活 通道 , 但 二 者 有 不 同 的 药理 学 特性 并 对 [Ca ]s 的 敏感 性 不 同 , 它们 都 可 以 在 跨 液 泡 膜 的 电位 处 于 正常 或 超 极 化 状态 时 被 激活 而 介 导 Ca 的 跨 液 泡 膜 流动 (White 2000 ) 。 在 液 泡 膜 上 还 存在 有 对 Ca 选择 性 很 高 的 超 极 化 激活 的 Ca 通道 , 其 活性 受 许多 胞 质 因 子 (如 了 IP;、IP, 及 cADPR 等 ) 所 调控 (Sanders et al. 2002, White 2000) 。 此 类 通道 可 能 在 细胞 响应 各 种 环境 刺激 及 一 些 重要 的 发 育 过 程 中 起 作用 ,如 对 盐 及 高 沙 胁 迫 的 涂 透 调 节 、 植 物 的 趋 化 运动 、 根 的 向 地 运动 、 叶 枕 的 运动 、 气 孔 运 动 及 花粉 管 的 伸 长 等 (White et al. 2003, Schroeder et al. 2001 ) , 而 且 有 研究 表明 , 此 类 通道 还 可 能 在 植物 的 自 交 不 杀 和 以 及 植物 的 防御 反应 中 起 作用 。 环 核 苷 酸 门 控 的 Ca 通道 被 认为 在 冷害 及 干燥 等 引起 气孔 关闭 的 ABA 信 吕 通 路 中 起 作用 , 而 且 参 与 了 植物 防御 反应 中 钙 振 沪 节律 的 产 H: (Klessig et al. 2000) 。 此 外 ,在 植物 细胞 的 其 他 内 膜 系 统 中 也 发 现 了 各 类 电压 门 控 和 配 体 门 控 的 Ca 通道 , 在 将 葫芦 科 植 物 Bzyomia dioica 卷 须 及 独行 药 (Lepidium sativum) 的 根 尖 内 质 网 的 小 吉 泡 重 组 入 人 工 脂 质 双 层 膜 后 发 现 , 内 质 网 上 存在 去 极 化 激活 的 Ca?* 通道 (Kliisener et al. 1995) , 它 们 的 活性 受 跨 膜 Ca 梯度 以 及 胞 质 pPH 的 调控 , 胞 质 酸化 可 激活 此 类 通道 。 此 类 通道 被 证 明 可 能 在 产生 短暂 升 高 的 [Ca2]s 方 面 有 作用 ,并 与 内 质 网 膜 上 的 Ca -ATPase HOVE FA AL % 调 ,共同 调控 内 质 网 内 腔 与 胞 质 的 Ca 浓度 变化 。 另 外 在 类 圳 体 膜 上 存在 由 cADPR, ADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate) , IP; 等 因子 门 控 的 Ca?* 通道 (Navazio et al. 2001 ) 。 在 甜菜 细胞 中 的 核 膜 上 记录 到 了 超 极 化 激活 的 Ca 通道, 该 167 B1IS# (ay = TAA AN Ss Pe 通道 一 般 不 受 [Ca2]s 变 化 的 影响 , 但 在 当 核 周 腔 区 域 的 Ca 浓度 超过 1 nmolyL 时 被 激活 开放 (Grygorczyk et al. 1998) 。 有 关 植 物 细胞 Ca# 通 道 基因 克隆 及 基因 功能 鉴定 的 研究 一 直 较 为 缓慢 , 近年 来 对 拟 南 芥 基因 组 序列 的 分 析 促 进 了 这 方面 工作 的 进展 .417PC7 基 因 被 认为 是 编码 一 个 去 极 化 激活 的 Ca 通道 , 该 通道 的 活性 受 [Ca”]. VATE. A ACT PC! 在 酵母 钙 通 道 基因 (CCH) 缺失 突变 体 中 表达 , 可 使 后 者 的 Ca 吸收 功能 得 到 互补 (Furuichi et al. 2001) 。 植 物 膜 联 和 蛋白 (annexin) 已 经 证 明 为 超 极 化 激活 的 Ca 对 通道 (de Carvalho-Niebel et al. 2002 ) , 而 环 核 苷 酸 门 控 通 道 (CNGC) 和 谷 氨 酸 受 体 (GLR) 家 族 编码 通道 都 属于 非 电 压 依 赖 的 Ca 通道 。 总 之 , 在 分 子 水平 上 明确 地 鉴定 各 类 植物 细胞 Ca 通道 的 功能 还 有 竺 时 日 , BR 了 需 有 效 利 用 各 类 异 源 表 达 系 统 逐 个 地 鉴定 其 功能 外 , 研究 它们 的 活性 调控 机 制 以 及 分 别 与 不 同 信号 转 导 途径 的 关系 等 也 是 叹 待 开展 的 工作 。 | 各 种 阴离子 (特别 是 Cl1- ) 在 植物 细胞 体积 的 调控 、 胞 质 及 该 泡 pH 的 调控 、 跨 质 膜 和 液 泡 膜 电 位 的 调节 、 信 和 号 转 导 以 及 细胞 的 矿质 营养 等 许多 植物 生命 活动 过 程 中 都 有 重 要 作用 。 各 种 阴离子 通道 (anion channel) 在 许多 植物 〈 如 拟 南 芥 、 重 豆 、 鸭 路 草 、 小 麦 等 ) 的 各 类 细胞 (如 保卫 细胞 、 下 胚 轴 组 织 细胞 、 根 细胞 等 ) 的 质 膜 及 内 膜 系 统 上 均 有 发 现 。 根 据 植物 细胞 阴离子 通道 的 不 同门 控 特 征 可 将 其 大 致 分 为 电压 依赖 型 、 和 蛋白 激 酶 / 核 背 酸 依赖 型 、 张 力 激活 型 、 钙 激活 型 以 及 配 体 门 控 型 通道 。 由 于 Cl 是 植物 细胞 内 最 丰富 的 阴离子 (Nilius et al. 2003) , 所 以 在 许多 情况 下 阴离子 通道 也 被 称 为 Cl -通道 , 尽管 这 些 通道 对 其 他 阴离子 (an. NO; 等 ) 也 有 一 定 的 通 透 性 。 在 蛋 豆 气孔 保卫 细胞 质 膜 上 至 少 存 在 3 种 阴离子 通道 : 两 种 电压 依赖 型 通道 (Schroeder et al. 1992) 和 一 种 机 械 张力 激活 型 通道 (Cosgrove et al. 1991 ) 。 两 种 电压 依 赖 的 阴离子 通道 篆 为 去 极 化 激活 通道 ,但 两 种 通道 具有 不 同 的 动力 学 特征 。 其 中 一 种 表 现 为 在 10 ms 艺 围 内 的 快 激活 、 快 失 活 特征 , 因 此 也 称 为 R 型 (rapid-type) 阴离子 通道 (Schroeder et al. 2001);, 另 一 种 表现 为 在 10 s 或 更 长 时 间 范 围 内 的 慢 激活 、 慢 失 活 特 征 , 也 称 为 S 型 (slow-type) 阴离子 通道 (Schroeder et al. 2001) 。 在 拟 南 芥 保卫 细胞 中 也 记 孙 到 类 似 的 S 型 阴离子 通道 (Pei et al. 1997) 和 及 型 阴离子 通道 , 说 明 这 两 种 通道 可 能 普遍 存在 于 气孔 保卫 细胞 质 膜 上 。 气 孔 保 卫 细 胞 的 R 型 阴离子 通道 的 门 控 特 征 与 动物 中 的 电压 依赖 型 Cl 通道 相似 (Dietrich et al. 1998), 。 前 面 曾 讨论 了 K- 通道 在 气孔 运动 中 的 重要 作用 , 从 理论 上 分 析 , K-” 的 跨 膜 转运 应 该 伴随 有 阴离子 的 同 向 或 阳离子 的 反 向 跨 膜 转 运 , DASE TPS MAS HE ta A a. 事实 上 , 气孔 保卫 细胞 质 膜 上 的 阴离子 通道 ( 主 要 是 对 Cl Ate) 在 气孔 运动 调节 过 程 中 有 重要 作用 。 以 恰 豆 、 鸭 路 草 为 材料 的 研究 发 现 , 阴 离子 通道 抑制 齐 ?-^C、 羧 葵 矿 办 胺 (Probenecid) 、 尼 氟 灭 酸 (niflumic acid) 能 调控 气孔 的 开放 .所 诱导 的 气孔 关 lf] (Schwartz 1995) , 另 一 种 抑制 剂 NPPB 则 能 完全 抑制 “末了 酸 诱 导 的 气孔 关闭 (Schroeder et al. 2001), ABA 有 激活 野生 型 拟 南 芥 保卫 4 上 六 离 子 通道 的 作用 。 当 将 ABA 的 信号 通路 阻 断 后 , 例 如 在 对 ABA 不 敏感 的 所 SARE abil, abi2 〈 磷 酸 酶 2C 突变 ) 中 ,ABA 就 失去 了 激活 保卫 细胞 S 型 阴离子 内 作用 (Peietal. 1997) ix 证 明了 保卫 细胞 质 膜 上 S 型 阴离子 通道 参与 了 ABA 所 计 ” 门 气孔 关闭 调节 过 程 。 进 一 步 本 KE ty WR Biomembranes 168 的 研究 表明 ,ABA 所 诱导 的 S 型 阴离子 通道 的 开放 与 磷酸 化 、 去 磷酸 化 过 程 有 关 。 另 外 保卫 细胞 型 阴离子 通道 参与 了 由 过 量 生长 素 所 诱导 的 气孔 开 度 减 小 的 过 程 , 表明 及 型 阴离子 通道 在 激素 调节 气孔 运动 的 过 程 中 也 有 一 定 的 作用 。 根 据 R 型 阴离子 通道 的 电压 依赖 性 及 动力 学 特征 推测 , 这 类 通道 有 快速 调节 膜 电位 变化 的 作用 , 可 能 与 保卫 细胞 的 兴奋 性 有 关 ; 而 S 型 阴离子 通道 则 与 胞 内 阴离子 的 持续 外 运 过 程 相关 , 与 天 的 外 向 运输 协同 作用 共同 维系 着 保卫 细胞 的 涂 透 平衡 (Schroeder et al. 2001) 。 利用 拟 南 芥 下 胚 轴 细 胞 获得 的 实验 证 据 表 明 , 阴离子 通道 参与 了 生长 素 抑制 下 胚 轴 伸 长 的 调 探 过程。 单独 使 用 阴离子 通道 抑制 剂 9-AC、DIDS 对 下 胚 轴 的 伸 长 没有 显著 影 响 , 但 却 能 够 阻碍 生长 素 对 下 胚 轴 伸 长 生长 的 抑制 作用 , 而 且 阴 离子 通道 抑制 剂 具 有 阻 断 生 长 素 的 作用 , 却 不 能 阻 断 其 他 激素 如 乙 电 和 分 裂 素 对 下 胚 轴 伸 长 的 抑制 作用 (Thomine et al. 1997) 。 拟 南 芥 下 胚 轴 表 皮 细 胞 质 膜 上 存在 与 保卫 细胞 质 膜 及 型 和 S$ 型 阴 离子 通道 相似 的 阴离子 通道 。R See aS, HEU IRAE A 位 点 (Thomine et al. 1997) , 核 苷 酸 可 以 电压 依赖 的 方式 进入 通道 的 孔道 结构 , 从 而 形 成 了 超 极 化 条 件 下 的 电压 依赖 性 阻 断 机 制 (Colcombet et al. 2001) 。 下 胚 轴 细 胞 质 膜 上 的 S 型 阴离子 通道 与 R 型 阴离子 通道 共存 , 也 受 胞 内 的 核 苷 酸 调 控 (FrAChisse et al. 2000), DIDS 对 S 型 阴离子 通道 有 抑制 作用 , 同 时 能 阻碍 生长 素 对 下 胚 轴 伸 长 的 抑制 作 FA, 而 有 R 型 阴离子 通道 对 DIDS 不 敏感 , 所 以 推测 S 型 阴离子 通道 可 能 是 生长 素 调 控 下 胚 轴 伸 长 生长 的 下 游 元 件 。 阴离子 通道 还 参与 了 光 信 号 的 转 导 过 程 。 蓝 光 处 理 双 子叶 植物 幼苗 ,会 导致 质 膜 瞬 间 的 去 极 化 , 随 之 茎 的 生长 很 快 受到 抑制 。 蓝光 所 诱导 的 去 极 化 过 程 包括 Hi-ATP 酶 的 失 活 和 阴离子 通道 的 激活 (Spalding et al. 1992) 。 蓝 光 还 能 激活 拟 南 芥 黄 化 幼苗 下 胚 轴 细 胞 质 膜 上 一 种 依赖 钙 的 受 阴离子 通道 抑制 剂 NPPB 抑制 的 阴离子 通道 , 同 时 NPPB 能 制 蓝 光 所 诱导 的 质 膜 的 去 极 化 ,并 阻碍 蓝光 对 下 有 凸 轴 伸 长 的 抑制 作用 ,表明 这 种 阴离子 通道 参与 了 植物 响应 蓝光 的 信号 转 导 过 程 。 在 小 麦 根 细胞 质 膜 上 观测 到 一 种 阴离子 通道 , 在 膜 去 极 化 或 胞 外 阴离子 浓度 较 高 的 AE BREST Cl ANNO; ASA. 该 类 通道 的 开放 受 胞 内 Ca 和 胞 外 阴离子 激活 , 可 被 DIDS 抑制 。 在 小 麦 根木 质 部 薄 壁 细胞 质 膜 上 鉴定 到 3 种 不 同 特性 的 阴离子 通道 : 内 向 整 流 性 阴离子 通道 、 快 激活 阴离子 通道 和 慢 激 活 阴离子 通道 ,推测 它们 在 薄 壁 细胞 向 木质 部 运输 矿质 营养 元 素 的 过 程 中 起 重要 作用 。 进一步 对 根 细胞 快 激活 阴离子 通道 的 研究 表 明 (Kohler et al. 2002) , 胞 质 NOs 控制 着 快 激活 阴离子 通道 的 电压 依赖 性 特征 , 这 样 胞 质 NO; 可 以 通过 改变 通道 电压 依赖 性 对 其 向 木质 部 的 运输 进行 反馈 调节 。 总 之 , 植物 根 细胞 质 膜 上 的 各 种 阴离子 通道 在 植物 根部 自 土 壤 吸收 各 种 矿质 元 素 的 过 程 中 无 疑 有 重要 作用 。 AH 是 土壤 中 含量 较 丰 富 的 阳离子 。 当 土壤 溶液 中 的 Al 浓度 达 10-3 mol/L 的 水 平 时 ,AHB* 对 植物 产生 毒害 作用 。 将 ADS 敏感 型 和 坠 Al 型 的 小 麦 栽 培 品 种 进行 比较 研究 KR, Tit APY 品种 的 根 有 大 量 向 外 分 泌 苹 果 酸 的 特性 , 蔷 果 酸 作为 AlB+ AE AFA TE 定 程 度 上 MER AD 的 毒害 作用 。 不同 的 阴离子 通道 抑制 剂 能 抑制 AlB* 所 诱导 的 苹果 酸 分 Wh, 表明 , 支 层 细胞 可 能 是 经 过 阴离子 通道 分 泌 华 果 酸 的 。 同 时 , 了 耐 AP* 栽培 小 麦 品种 的 根 顶 端 细胞 存在 一 种 能 被 AE 激活 而 输出 Cl 的 通道 (Ryan et al. 1997) 。 外 加 Al 能 169 g$13z rey PAA BS fa 激活 玉米 根 尖 细胞 质 膜 上 Cl Abad, Tal AOA Le te AE, RHA OKA AeA AP BN (AIF 诱 导 的 有 机 酸 分 泌 ) 和 这 种 Al 诱导 的 阴离子 通道 有 关 (Kollmeier et al. 2001 ) 。 液 泡 是 细胞 内 阴离子 的 主要 贮藏 场所 , 在 液 泡 膜 上 存在 几 种 不 同 的 阴离子 通道 。 目 拟 南 芥 分 离 的 钙 依赖 型 蛋白 激酶 (CDPK) 能 激活 答 豆 保卫 细胞 液 泡 膜 上 Cl” FSR AR 根 离子 (Ma -) 的 跨 膜 电 流 , 这 种 阴离子 流 受 胞 质 Ca* 和 ATP Arvada, HEM AE 阴离子 通道 可 能 在 气孔 开放 过 程 中 有 增加 胞 质 Cl 的 作用 。 当 胞 质 Ca 浓度 较 低 时 , 起 主导 作用 的 是 瞬间 激活 的 快 液 泡 通道 (FV 型 ), 它 对 阴离子 的 选择 性 很 低 , 相反 , 当 胞 内 Ca 浓度 较 高 时 , 主 要 是 慢 液 泡 通道 (SV 型 ) 起 作用 , 有 具有 很 强 的 电压 依赖 性 (Pei etal. 1996) 。 苹 果 酸 是 植物 细胞 中 含量 较 多 的 阴离子 , 在 碳 代谢 过 程 中 不 可 缺少 , 并 且 可 以 作为 液 泡 中 的 电荷 平衡 离子 。 在 景 天 科 植 物 风车 草 属 【Craptopetaium) RiP Se 到 两 种 阴离子 通道 : 一 种 与 苹果 酸 的 吸收 有 关 , 另 一 种 与 伴 末 酸 释放 有 关 (Iwasaki et al. 1992) 。 在 落地 生根 (Kalanchoe daigremontiana) 叶肉 细胞 液 泡 中 也 鉴定 到 液 泡 苹果 酸 通 道 , 具有 慢 激 活 的 特征 , 对 Ca 无 依赖 性 。 在 甘 虑 和 拟 南 芥 悬浮 细胞 中 , 也 记录 到 由 芋 果 酸 根 和 琥珀 酸根 离子 进入 液 泡 所 形成 的 电 疲 (Cerana et al. 1995) 。 在 叶绿体 内 膜 中 发 现 一 种 和 蛋白 运输 有 关 的 阴离子 通道 , 对 其 通 透 性 的 研究 表明 该 通道 还 参与 了 NO; 的 同 化 过 程 。 在 叶绿体 中 , 光合 类 圳 体 膜 上 也 存在 一 种 阴离子 选择 性 通道 , 可 以 调控 类 圳 体 对 阴离子 的 吸收 , 以 平衡 大 量 的 光驱 动 所 吸收 的 正 以 保持 类 圳 体腔 的 电 中 性 (Pottosin et al. 1995 ) 。 总 之 , 植物 细胞 的 各 类 膜 上 存在 多 种 类 型 的 阴离子 通道 , 这 些 阴 离子 通道 参与 了 植 物 的 多 种 生理 活动 及 信号 转 导 过 程 , 包括 激素 信号 转 导 、 细 胞 的 生长 、 蓝 光 信 号 转 导 、 细 胞 渗透 势 调节 、 细 胞 不 同 区 域 间 的 电化 学 平衡 、 营 养 物 质 的 吸收 及 运输 等 。 到 目前 为 止 , 只 有 少数 几 个 编码 植物 阴离子 通道 的 基因 被 分 离 , 尽管 相应 的 通道 蛋白 具有 电压 依赖 型 毛 通 道 的 结构 特征 ,但 对 其 功能 还 没有 明确 地 进行 鉴定 , 这 些 通道 的 门 控 机 制 及 其 与 细 胞 生理 活动 的 关系 也 有 竺 进一步 研究 。 13.2.4 SUA Lse5 5S 8s mrs 以 上 分 别 讨论 了 植物 细胞 的 几 类 主要 离子 通道 , 但 这 些 不 同 通道 的 作用 和 调控 在 活 细胞 的 生命 活动 过 程 中 又 必然 是 相互 关联 的 。 下 面 以 植物 激素 脱落 酸 (ABA) 诱导 植物 气孔 关闭 的 信号 过 程 为 例 , 简 要 说 明 各 类 通道 之 间 的 协同 调控 作用 。 气孔 的 关闭 需要 大 量 的 渗透 物质 (包括 Ki+、Cl- 等 ) 从 保卫 细胞 外 流 , 结 果 使 细胞 的 水 势 增 高 而 导致 水 分 外 流 、 细 胞 膨 压 降低 、 细 胞 体积 缩小 而 最 终 使 气孔 关闭 。 各 类 离 子 通道 在 介 导 由 ABA 引起 的 气孔 关闭 过 程 中 的 作用 一 直 是 人 们 研究 ABA 信号 转 导 机 制 的 重要 模型 。 当 植物 受到 干旱 等 胁迫 时 , 植 物体 内 的 ABA 增加 ,AB/ 激活 质 膜 钙 通道 而 引起 保卫 细胞 [Ca]。* 升 高 (McAinsh et al. 1990) , 而 [Ca 的 天 高 使 质 膜 质子 泵 及 内 向 钾 通 道 活 性 受到 抑制 (MacRobbie 2000) , 同 时 [Ca25 = Ga OTS BABS Nite 的 R 型 及 SS 型 两 类 阴离子 通道 (Schroeder et al. 1992), {' JRA BS AI Yb ie aH A AER, PPA CE AN Da te AP 8 EY [| 入 活 了 外 加 整流 钾 通 道 , 使 K* 从 保卫 细胞 流出 《Schroeder et al. 2001), K* 及 阴离子 Jae (PR TD ZH A BRR, 体 积 减 小 从 而 导致 关闭 气孔 (AY 13-2), lean KE i i Biomembranes 170 13.3 结语 及 展望 尽管 在 过 去 的 几 十 年 中 植物 细胞 离子 通道 的 研究 在 整体 上 落后 于 动物 细胞 离子 通道 的 研究 , 但 随 着 双子 叶 模式 植物 拟 南 草 和 单子 时 模式 植物 水 舟 全 基因 组 精细 物理 图 谱 的 完成 和 植物 功能 基因 组 研究 工作 的 快速 发 展 、 大 规模 模式 植物 突变 体 库 的 完善 、 和 蛋白 质 组 学 及 生物 物理 学 技术 与 方法 的 进步 等 多 种 有 利 因 素 的 影响 , 可 以 预见 在 未 来 数 年 间 有 关 植 物 细胞 离子 通道 的 研究 将 会 有 长 足 的 发 展 。 首先 , 在 植物 细胞 离子 通道 基因 的 克隆 和 功能 鉴定 方面 应 该 在 数 年 内 有 重要 进展 。 对 模式 植物 全 基因 组 序列 的 信息 分 析 为 通道 基因 的 克隆 提供 了 极 大 的 方便 ,而 已 接近 饱 和 的 拟 南 芥 基 因 攻 除 突变 体 库 的 利用 使 得 研究 各 种 通道 的 生理 功能 及 其 与 植物 表 型 的 关 系 更 加 容易 ,而 结合 异 源 表达 系统 的 研究 方法 也 可 对 探讨 各 类 通道 功能 的 工作 提供 很 大 的 帮助 。 其 次 , 蛋白 质 大 分 子 结构 研究 技术 与 方法 的 进步 使 得 在 分 子 结构 水 平 探讨 植物 细胞 离子 通道 结构 与 功能 的 关系 以 及 通道 的 门 控 特 性 成 为 可 能 。 例 如 , 最 近 利用 X 射 线 对 动 物 细胞 电压 门 控 钾 通道 晶体 结构 进行 的 研究 就 是 一 项 具有 划时代 意义 的 工作 (Jiang et al. 2003 ) 。 分 别 将 各 类 通道 与 植物 的 矿质 营养 元 素 吸 收 和 转运 、 植 物 啊 应 各 种 环境 刺激 的 信和 号 转 导 等 过 程 相 联系 开展 研究 , 则 可 进一步 增加 人 们 对 植物 细胞 离子 通道 的 功能 作用 及 意 义 的 理解 和 认识 。 (Gk 伟 。 武 维 华 ) se | 武 维 华 . 2003. 植物 生理 学 . 北京 : 科学 出 版 社 Armstrong F, Leung J, Grabov A, et al. 1995. 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Planta, 211: 894-898 第 A 章 动物 水 通道 的 结构 与 功能 144] SoORIRS ARR ee eee 174 14.2 7K BAHIA ncn ce A 1I4.3” 永 通道 蛋 让 的 功能 特征 、 ZeSK-SUAFS .......... eeccecesceneceereenee 176 TAA FICS TE EA BE 二 177 14.4.1 水 通道 在 尿 疹 缩 机 制 中 的 作用 .生生 全 177 14.4.2 水 通道 在 消化 生理 中 的 作用 生生 和 和 179 14.4:3: 水 通道 在 神经 生理 中 的 作用 .全 二 二 179 14.4.4 水 通道 在 呼吸 生 | 5 179 14.4.5 水 通道 在 眼球 生理 中 的 作 kl 180 14.4.6 水 通道 在 皮肤 生 ve WER. eS eee 180 T4050 水 通道 的 临 打 应 用 前 蜂 二 0 180 14.1 7G Se AL 2c es 水 通道 蛋白 (aquaporin, AQP) 是 一 族 广泛 存在 于 原核 和 真 核 生物 细胞 膜 、 高 效 选 择 性 转运 水 分 子 的 特异 孔道 。 第 一 个 水 通道 蛋白 于 1988 年 由 Agre 等 从 红细胞 膜 分 离 、 纯 化 Rh 血型 多 肽 时 偶 然 发 现 (Denker et al. 1988), @—7* 28kDa ARK PERRA EA, 称 为 形成 通道 的 28kDa 膜 整合 蛋白 (channel-forming integral mem- brane protein 28kDa, , 简称 CHIP28 ) .1991 年 完成 了 CHIP28 的 cDNA 克隆 (Preston et al. 1991), 1992 年 在 非洲 爪 蟾 卵 母 细 胞 表达 系统 中 证 实 了 其 水 通道 功能 (Preston et al. 1992) 。 从 而 确认 了 细胞 膜 上 存在 有 水 转运 通道 蛋白 的 理论 , Agre 因 此 获得 了 2003 年 的 诺 贝 尔 化 学 奖 。CHIP28 后 经 人 类 基因 委员 会 命名 为 aquaporin-1l (AQP1). 本 | 被 发 现 并 克隆 以 来 , 有 关 水 蛋白 结构 与 功能 的 研究 取得 了 迅速 的 、 系 列 性 的 进展 (Ager et al. 2002, 2003, Fujiyoshi et al. 2002) 。 到 目前 为 止 , 经 分 子 克 隆 发 现 的 哺乳 动物 水 通道 重 白 家 族 :有 4 Xx i OP 0 = AQP 10). 目前 根据 这 些 水 通道 蛋白 功能 特性 的 差异 , 将 其 分 为 两 175 #142 Dh 7k hh WZ SDE 个 亚 家 族 : AQP1、2、4、5、6 和 AQP0 的 基因 结构 类 似 , FFA AB A lal 2A HE BG 30% ~ 50% 的 同 源 性 , 且 对 水 的 通 透 性 具有 高 度 选择 性 , 成 为 AQP 家 族 中 的 水 选择 性 通 道 亚 家 族 。AQP3、7、9 和 AQP10 之 间 基 因 结 构 和 核 苷 酸 序列 相近 似 , 除 对 水 分 子 通 透 外 , 对 甘油 和 尿素 等 中 性 小 分 子 也 具有 通 透 性 , 成 为 AQP 家 族 中 的 第 二 个 亚 家 族 一 一 水 - 甘油 通道 (aquaglyceroporin)。AQP8 的 基因 结构 与 上 述 两 个 亚 家 族 都 不 同 , 而 且 对 水 、 甘油 和 尿素 都 有 通 透 性 , 有 可 能 成 为 第 三 个 亚 家 族 。 这 些 水 通道 蛋白 广汉 表达 于 体 店 代 谢 活 跃 的 组 织 细胞 。 目 前 越 来 越 多 的 证 据 表明 水 通道 蛋白 在 体内 液体 转运 生理 和 病理 中 起 重要 作用 (Verkman et al. 2002, 2003, Borok et al. 2002, King et al. 2002, Agre et al. 2003, Schrier et al. 2003) 。 14.20 7GRGE 195) _ ee 水 通道 蛋白 分 子 的 基本 结构 是 一 个 单 肽 链 , 由 两 个 同 向 重复 部 分 组 成 , 前 后 两 部 分 在 氨基 酸 序 列 上 有 同 源 性 , LER PT ei BER FAK A - HT SR - TP A (NPA) 序列 , 整个 分 子 形成 全 有 6 个 跨 膜 域 的 玻 水 性 膜 内 在 蛋白 〈 图 14-1)。 水 通道 蛋白 家 族 中 AQPI1 的 结构 研究 的 比较 清楚 。 早 期 应 用 冷冻 蚀刻 电子 显微镜 技术 证 明 AQP1 在 质 膜 上 以 四 聚 体形 式 存 在 .AQP1 和 蛋白 结晶 成 功 后 , 对 其 三 维 结构 在 原子 水 平 上 进行 了 高 分 辩 率 的 解析 (Murata et al. 2000, Sui et al. 2001, de Groot et al. 2001, Tajkhorshid et al. 2002) .AQP1 的 四 级 结构 是 由 4 个 对 称 排 列 、 长 Snom、 直 径 3nm 的 圆 简 状 亚 基 包 绕 而 成 的 四 聚 体 。 每 个 单 体 肽 链 跨越 细胞 膜 6 次 , 并 围绕 形成 腔 型 , 中 间 可 能 即 是 水 分 子 穿 越 的 孔道 , 直 径 大 约 6A (图 14-2)。 已 经 证 明 这 4 个 亚 基 作为 水 通道 的 作用 都 是 独立 的 , 但 四 聚 体 的 结构 对 于 维持 单个 亚 基 的 位 置 很 重要 。AQP1 品 体 的 三 维 结构 为 沙漏 模式 , 分 子 中 的 两 个 同 向 重复 序列 分 别 于 细胞 膜 内 外 两 侧 组 装 , 并 在 NPA 处 折 有 登 形成 只 容许 单一 水 分 子 通 过 的 孔道 。 孔道 内 部 带 正 电 和 荷 的 委 基 酸 残 基 排斥 带 正 电荷 的 质子 通过 。 另 外 , 蛋 和 白 分 子 内 部 产生 的 局 部 静电 场 使 通道 中 间 的 极 性 发 生 转 换 , 人 迫使 水 分 子 在 通过 通道 时 进行 旋转 式 双 极 运 动 , 通过 通道 上 半 部 分 时 的 旋转 方向 与 通过 下 半 部 分 时 的 旋转 方向 相反 。 这 种 旋转 方向 的 转 换 阻 止 了 通道 内 部 形成 连续 的 水 合 质子 网 , 从 而 阻 断 了 质子 通过 “质子 逃逸 ”机 制 通过 水 通道 (de Groot et al. 2003), meme AQP! 跨 膜 一 级 结构 檬 Tetrametic assembly pore in monomers high membrane density AQP] 跨 膜 四 级 结构 模式 图 14.3 水 通道 蛋白 的 功能 特征 、 表 达 与 调控 一 般 认 为 ,水 通道 是 处 于 持续 开放 状态 的 膜 通道 蛋白 ,水 分 子 的 转运 不 需 消耗 能 量 , 也 不 受 门 控 机 制 影 响 。 水 分 子 通过 水 通道 的 移动 方向 完全 由 膜 两 侧 的 涂 透 压 差 决定 ,水 分 子 从 渗透 压低 的 一 侧 向 渗透 压 高 的 一 侧 移动 , 直到 两 侧 渗透 压 达到 平衡 。 水 通道 蛋白 家 族 中 除 AQP4 外 , 其 他 成 员 的 转运 功能 都 受 示 化合物 的 抑制 。 水 通道 在 体内 各 系统 组 织 中 的 表达 很 广 ,除了 在 与 体液 分 泌 和 吸收 密切 相关 的 多 种 上 皮 和 内 皮 细 胞 高 表达 外 , 在 一 些 与 体液 转运 无 明显 关系 的 组 织 细胞 , 如 红细胞 、 白 细 胞 、 脂 肪 细胞 和 骨骼 肌 细胞 等 处 也 有 表达 。 图 14-3 综述 了 目前 比较 确定 的 哺乳 类 动物 水 通道 蛋白 家 族 的 组 织 分 布 。 水 通道 在 体内 受 神 经 、 激 素 和 细胞 因子 等 多 种 因素 的 调节 (Agre et al. 2003)。 目 前 关于 抗 利 尿 激 素 对 肾脏 集合 管 上 皮 水 通道 AQP2 的 调节 研究 较 多 , 包 括 蛋 白质 分 选 水 平 的 急性 调节 和 转录 水 平 的 慢性 调节 。 抗 利尿 激素 作用 于 内 髓 集合 管 上 皮 主 细胞 基底 膜 上 的 开 型 血管 加 压 素 受 体 (V2R) , 激 活 腺 苷 环 化 酶 , 使 细胞 内 CAMP 水 平 增加 。cAMP 一 方面 通过 蛋白 激酶 A 途径 使 AQP2 磷酸 化 , 由 此 触发 一 系列 机 制 使 胞 浆 中 含 AQP2 的 胞 内 体 (endosome) 膜 泡 与 顶 质 膜 融 合 , 将 AQP2 水 通道 转移 到 顶 质 膜 , 从 而 使 主 细胞 水 通 透 性 迅速 提高 , 集 合 管 水 的 重 吸收 增加 , 此 为 急性 调节 ;, 另 一 方面 , 如 果 抗 利尿 激素 的 作用 持续 存在 , 则 主 细胞 内 持续 增加 的 CAMP 将 进入 细胞 核 , 作 用 于 AOP2 基因 启动 子 中 的 cAMP 反应 子 (CRE), 促 进 4OP2 基因 的 转录 进而 使 AQP2 蛋白 表达 增加 , 形 成 AQP2 入 慢性 调节 。 其 他 水 通道 的 调节 方面 , 有 证 据 表 明 糖 皮质 激素 可 显著 增加 肺 毛细 血 管内 皮 ^ ?P1 的 表达 并 诱导 培养 的 支气管 上 皮 细 胞 表达 AQP3; 促 胰 液 素 (secretin) 可 使 Re ER NAA AQP! 转移 到 顶 质 膜 上 ; 肝 细 胞 中 AQP8 主要 分 布 于 细胞 内 , 在 cAMP 作用 下 可 通过 微 管 依赖 性 机 制 插 入 细胞 质 膜 , AQP9 在 附 胰 曲 细 精 管 上 皮 的 表达 有 赖 于 177 g 142 Bhp y 7k 1 1 HI ZE SDE Beek Bier 睫 状 体 非 色素 上 皮 AQP1 小 染 网 内 皮 Hee AQP] ”脉络 丛 AQP3 脑膜 上 皮 AQP4 星 形 胶 质 细胞 Pik 室 管 膜 细胞 2 AQP4 AQPI 中 耳 毛 细 血 管内 皮 结膜 AQP3 AQP2 内 耳 淋 巴 圳 上 皮 角膜 上 皮 AQP5 AQP4 螺旋 管 支持 细胞 纤毛 细胞 AQP1 毛细 血管 内 皮 AQP3,4 SEK AQP4.5 FaHe PARA _E RE AQP1 毛细 血管 内 皮 AQP1 27 ie AHH AQP1 毛细 血管 内 皮 AQP1,8 boris iri AQP1 毛细 血管 内 皮 AQP3 黏膜 上 皮 AQP4 壁 细 胞 和 主 细胞 AQP1 中 心 乳 魔 管 内 皮 AQP3,4 ”回肠 绒毛 上 皮 AQP8 空肠 绒毛 上 皮 AQP1 隐 富 上皮 AQP2 远 端 结肠 上 皮 AQP3,48 绒毛 上 皮 AQP3 膀胱 上 皮 AQP1 毛细 血管 内 皮 AQP4 快 肌纤维 AQP1 红细胞 AQP9 和 白细胞 毛细 血管 内 皮 AQP1 Wei _E Re AQP4,5 毛细 血管 内 皮 AQP1 Lo 站 alt my AQP4,5 毛细 血管 内 皮 AQPI1 腺 泡 上 皮 弄 细胞 ”AQP5 后 角 神 经 元 AQP1 ; 星 形 胶 质 细胞 AQP4 肝 内 胆管 上 皮 AQP1 胆管 上 皮 AQP4 oe AQP8,9 肝脏 颈 部 上 皮 毛细 血管 内 皮 AQE1 近 曲 小 管 上 皮 AQP1.7.8 享 利 氏 祥 降 支 上 皮 AQP1 ue 直 小 血管 内 皮 集合 管 上 皮 AQP2,3,4,6 | or ee Sc | 站 >] |) eS eS GE) BCGERE 精子 AQP7 曲 细 精 管 上 皮 AQP8 间 质 细胞 和 附睾 。 AQP9 表皮 角 化 细胞 AQP3 FARE AQP5 局 BS 水 通道 的 组 织 分 布 雄 激 素 的 存在 , 角 化 细胞 生长 因子 (KGF) 和 肿瘤 坏死 因子 (ITNEFao) 可 降低 肺泡 上 皮 细 胞 AQP5 的 表达 , 亿 酰 胆 碱 作用 于 腮腺 上 皮 细 胞 的 M3 受 体 , 通过 增加 细胞 内 和 钙 离 子 浓 度 促进 含 AQPS 的 膜 泡 同 顶 质 膜 转移 和 融合 。 水 通道 调控 方面 的 研究 正在 不 断 深 入 , 并 与 其 生理 功能 和 相关 病理 机 制 联系 起 来 。 144 ACER EE 水 通道 蛋白 在 生理 学 上 的 重要 意义 近年 来 通过 人 类 基因 突变 (gene mutation) 分 析 和 小 鼠 基因 涡 除 等 手段 得 到 了 广泛 研究 。 KE AIL, 在 人 类 已 经 发 现 了 至 少 $ 种 水 通道 的 基 因 突变 (Agre et al. 2003) :晶体 主要 内 在 蛋白 4OP0 突变 引起 白内障 ,4OP1 突变 的 个 AAPA ei ang PRE; AOP2 突变 引起 少见 的 肾 原 性 尿 骨 症 (nephrogenic diabetes insipidus) , 而 在 40P3 Fl AOP7 突变 的 个 体 则 未 发 现 明显 的 生理 异常 。 目前 关于 水 通道 生理 功能 的 结果 主要 是 通过 小 鼠 基因 贺 除 (cone knockout) 研究 获 得 的 , 以 下 分 述 水 通道 在 小 鼠 各 组 织 系 统 中 的 生理 功能 。 14.4.1 anit (EDR ea LTP ——- 至 少 有 7 AKG AE EY AB dB i ASIA, FER 《通道 在 泌尿 功能 中 起 主 要 作用 AQP1 表 达 于 近 曲 小 管 和 部 利 氏 祥 降 支 上 皮 的 顶 友 ; 基 辰 侧 膜 以 及 外 角 直 小 血 PEAK: AQP2 表 达 于 集合 管 主 细胞 , 受 抗 利尿 激素 认 ” 王 胞 内 体 圳 泡 和 顶 质 膜 之 间 | = ~~” — 5 Hy ie Biomembranes 178 FH; AQP3 FIAQPS FEBS TSE er AY 28 IR HH, EC AQP 3 FE BR ESE EP MO AQP4 EER AE HIAMEDA. AI, AQPO 表达 于 集合 管 润 细胞 ,AQP7 和 AQP8 分 别 表 达 于 近 曲 小 管 的 局 部 区 段 。 AQP! Fil AQP3 axbR 5 le AIS KS be (14-4), ZeBLA UR AAT (Ma et al. 1998, 2000); AQP2 常 染 色 体 隐 性 突变 (T126M) sit ee A BAY be AE, /) Bot HAE Jia JR BE 存活 一 周 左右 (Yang et al. 2001), ify AQP4 散 除 则 未 ?| 起 多 尿 〈Ma et al. 1997), briteAei 功能 研究 表明 , 禁 水 和 注射 抗 利 尿 激 素 都 不 能 改变 4OP7 aR RRB; (RE 部 分 增加 4OP3 wR ER/ ERAT RBH, ZEA AQP] 散 除 小 鼠 的 尿 浓 缩 机 制 严 重 破坏 , 而 4OP3 殴 除 小 鼠 尚 保有 部 分 尿 浓 缩 能 力 。4OP4 xR) ERAT EK RRA HED I A AT BARR mans a i Eas Get mes a i. oe Listenin eS ” es AQP] Fil AQP3 fax BRS [2 EA & Th Fk 进一步 研究 表明 ,4OP7 FxR/| EOL AY Dre eA WL iil] 7 HH eS BEA eS ALTE, SBA SETA EASE. CESS BEC th 7) EP Ee SG WES, AOP] 殴 除 小 鼠 的 近 曲 小 管 跨 上 皮 涂 透 性 水 通 透 性 (osmotic water permeability) 下 降 了 近 5 倍 , 表 明 在 近 曲 小 管 由 涂 透 压 驱 动 的 主要 水 转运 途径 是 由 AQP1 水 通道 介 导 的 跨 上 皮 水 转运 ; 微 穿刺 研究 亦 证 实 AQP1 殴 除 使 未 交 , 曲 小 管 管 腔 内 溢 体 沙 透 压 降低 了 50%, 表明 近 曲 小 管 的 等 渗 重 吸收 有 赖 于 AQP1 水 通道 个 导 的 跨 上 皮 高 效 水 转运 途径 ; 另 外 , i MERE SESSA UE SE SE A ER EE Se A) a BEY LE BEEK ERD PME 10 倍 户 “,, ZEHA AQP I 7k 38h 8 TS AD ey CS LEZ i a: CE ae a as BS Ll AG FES EE 作用 。 错 脏 集合 管 上 皮 细 胞 的 水 通 透 性 在 尿 谊 缩 机 制 和 原 量 调节 中 也 起 重要 作用 。T126M i79 #142 Dy 7k ith 1a WIZE SDE Ee ARE AOP2 28 8 CEA AL ER ABS Lik AQP2 Be Ay BEL BA FAN it Pd CSS BGA TJ 基底 膜 AQP3 和 AQP4 的 缺失 同 顶 质 膜 AQP2 的 缺失 一 样 阻 断 了 集合 管 的 高 效 跨 上 皮 水 转 运 途径 , 使 尿 浓 缩 功 能 发 生 障 碍 。 tis 消化 系统 是 肾脏 之 外 体液 吸收 和 分 泌 量 最 大 的 器 官 系统 , TEA RAC RS 转运 量 有 8~ 10L 之 多 。 这 些 体液 主要 包括 唾液 、 胆 半 、 胰 液 、 胃 肠 道 分 泌 溢 以 及 胃 肠 道 各 段 吸 收 的 液体 。 AQP5 在 唾液 腺 分 泌 中 起 重要 作用 (Ma et al. 1999), AQPS 表达 于 唾液 腺 浆液 性 腺 泡 的 顶 质 膜 。 另 外 , 唾液 腺 中 的 微血管 内 皮 有 AQP1 表 达 , 腺 管 上 皮 有 AQP4 表 达 。 AQP 和 4OP4 敲 除 未 引起 唾液 分 泌 障 碍 。 在 42P5 殴 除 小 鼠 中 , Die Ki (pilocarpin) 刺激 的 唾液 分 泌 显 著 降低 , 唾 液 黏 稠 高 盐 , 表 明 AOPS 缺失 阻 断 了 腺 泡 的 跨 上 皮 高 效 水 转运 途 径 , 不 能 实现 盐 主 动 转运 过 程 中 的 渗透 压 平 衡 。 AQP4 在 胃壁 细胞 的 基底 侧 膜 高 表达 , 但 4OP4 缺 失 并 未 造成 胃酸 分 泌 异 常 。 在 结肠 中 , AQP4 主要 表达 于 表面 黏膜 上 皮 细 胞 的 基底 侧 膜 。 对 远 端 结肠 进行 的 灌流 研究 表明 , 跨 上 皮 的 涂 透 性 水 通 透 性 降低 了 约 40%。 但 盖 便 中 水 的 含量 只 有 轻微 增加 , 表 明 AQP4 在 结肠 生理 中 不 起 主要 作用 。 AQP] 在 消化 系统 中 与 脂肪 消化 吸收 有 关 的 组 织 包 括 肝脏 毛细 胆管 上 皮 、 胰 腺 和 胆 圳 微血管 内 皮 、 肠 道中 心 乳 糜 管 内 皮 等 处 高 表达 。 高 脂肪 食物 在 4OP7 缺失 幼 鼠 引起 了 严重 的 生长 迟缓 , 并 有 脂肪 渔 和 胰 液 中 脂 酶 和 证 粉 酶 活性 降低 , 表 明 AQP1 在 脂肪 消化 吸收 中 起 重要 作用 , 其 作用 机 制 有 待 进一步 研究 。 1443 7H CE (22/1: (1 (mmm AQP4 (EA Hea FEE FE PZ Beas, RHE CES BaP BS Ee AY Ss EE 皮 , 以 及 参与 形成 血 脑 屏障 的 星 形 胶 质 细胞 周 足 处 高 表达 (Papadopoulos et al. 2002), 4OP4 胡 除 鼠 未 表现 出 明显 的 神经 精神 异常 。 但 4OP4 缺 失 使 小 鼠 对 急性 水 中 毒 和 缺 血 性 脑 浴 中 引起 的 脑 水 肿 (brain edema) 有 明显 的 抗 性 , 表 现 为 水 肿 程 度 减 低 , 死 亡 率 下 降 (Manley et al. 2000) 。 另 外 , 在 化 学 诱导 癫 痢 模型 中 ,4OP4 殴 除 鼠 发 生 抽 搞 的 频率 和 程 度 显著 低 于 野生 型 对 照 鼠 , 表明 AQP4 参 与 神经 元 放电 活动 .AQP4 还 在 感觉 器 官 的 支持 性 细胞 , 如 视网膜 的 Muller 细胞 和 耳蜗 的 Clausius 和 Hensen’s 细胞 表达 。4OP4 缺失 使 视网膜 电位 图 中 的 b 波 和 脑 干 听力 反应 电位 显著 下 降 , 表 明 视 力 和 听力 都 发 生 了 障碍 (Verkman 2002 ) 。 , AQP1 在 脑室 脉络 从 上 皮 高 表达 。4OP7 殴 除 使 脉络 从 的 渗透 性 水 通 透 性 降低 了 80%, 并 使 脑 状 液 的 产 率 下 降 了 25%, 表明 AQP1 参与 脑 硝 液 形成 。 另 外 ,AOP1 Cee AS C 纤 维 的 痛觉 神经 元 表达 。 渗透 压 诱导 的 状 髓 后 角 水 肿 在 4OP; Ua a BAER, Yim BE PUA SEAT | soo te DY AE AT Bs, 表明 水 通道 在 E 号 转 导 中 起 重要 作用 。 444 ot (ENP Es | 呼吸 道 和 肺 的 许多 重要 功能 与 体液 转运 有 关 。 气 道 入 新 生 期 的 肺泡 液体 清除 以 及 心 训 和 各 种 肺 损伤 引起 的 肺 水 肿 的 形成 和 消散 等 都 .的 转运 有 关 (Borok et al KE ty ii Biomembranes 180 2002), “Vis FIFE 4H iM 2 lal 7k iw HY Ge ie LH Ay Ae A ER. Iii a) AE AN BZ. AQPS ZESiiyfy I AY An A Se EE PR SR a_i e BeIA , 毛细 血管 内 皮 表 达 AQP1, AQP3 和 AQP4 者 分 别 表 达 于 鼻 黏 膜 和 支气管 上 皮 细 胞 的 基底 膜 。 应 用 水 通道 融 除 小 鼠 进 行 的 研究 表明 ,4OP7 或 40P5 缺 失 分 别 使 肺 毛细 血管 和 肺 间 质 之 间或 肺 间 质 和 肺泡 之 间 的 涂 透 性 水 通 透 性 降低 了 90% 以 上 , 但 新 生 鼠 的 肺泡 液体 清除 和 各 种 因素 引起 的 肺 水 肿 形 成 却 未 受 影响 (Ma et al. 2000, Matthay et al. 2002) 。 然 而 , 匹 洛 卡 品 刺 激 的 上 呼吸 道 黏膜 下 腺 体 分 刻 在 4OP5 散 除 小 鼠 降 低 了 50% 以 上 ,分泌 液 中 有 蛋 自 浓度 增加 了 2 倍 , 表 明 AQP5 介 导 的 浆液 腺 移 上 皮 细 胞 的 顶 质 膜 水 通 透 性 在 支气管 黏膜 下 腺 滚 体 分 泌 中 起 重要 作用 。 另外 的 一 项 研究 表明 , 4OP5 殴 除 小 鼠 肺 对 胆 碱 能 刺激 引起 的 支气管 痉挛 反应 增强 , 其 机 制 尚 不 清楚 , 可 能 与 4OP5 获 除 小 鼠 支气管 黏膜 下 腺 分 刻 异常 引起 的 间接 效应 有 关 。 14.4.5 水 通过 在 眼球 生理 中 的 作用 眼角 膜 需 要 精细 地 调节 基质 中 的 水 含量 以 维持 其 透明 性 。AQP1 在 角膜 内 皮 细胞 层 表达 ,AQP5 在 角膜 上 皮 细胞 层 表达 。 与 野生 型 小 鼠 相 比 ,AQP1 缺失 使 角膜 明显 变 薄 , 而 AQP5 缺 失 使 角膜 厚度 明显 增加 。 虽 然 在 正常 生理 情况 下 4OP1 FULAOPS aa IE ACRE 角膜 的 透明 度 , 但 AQP1 缺失 使 低 渗水 肿 后 角膜 厚度 和 透明 度 的 恢复 明显 延迟 , 表 明 AQP1 在 角膜 基质 液体 跨 内 皮 转 运 中 起 重要 作用 (Verkman 2003 )。 在 与 房 水 代谢 有 关 的 眼前 房 组 织 中 ,AQP1 和 AQP4 在 睫 状 体 非 色素 上 皮 细胞 , AQP1 在 小 梁 网 内 皮 细 胞 高 表达 。4OP1 BEBE AOPT/ 4OP4 双 项 除 引起 眼 压 明显 降低 , 表明 水 通道 可 能 通过 促进 睫 状 体 上 皮 房 水 的 分 泌 参 与 调节 眼 压 (Verkman 2003 )。 14.4.6 水 通道 在 皮肤 生理 中 的 作用 “RN AQP3 在 表皮 的 角 化 细胞 基底 层 高 表达 。 该 层 细胞 向 上 分 化 成 角 化 层 , 并 且 形 成 角 化 层 和 真皮 层 之 间 的 界面 。4OP3 缺失 的 小 鼠 皮肤 温润 度 和 弹性 明显 下 降 (Ma et al. 2002) , 表皮 屏障 功能 和 损伤 修复 功能 发 生 障 碍 。 给 4OP3 殴 除 小 鼠 口服 或 注射 甘油 可 纠 正 上 述 所 有 皮肤 功能 障碍 。AQP3 属于 水 -甘油 通道 亚 家族 , 以 上 研究 表明 AQP3 的 甘油 转运 功能 可 能 在 皮肤 生理 中 起 重要 作用 。 14.5 水 通道 的 临床 户 用 前 东 _ mea 随 着 对 水 通道 蛋白 功能 认识 的 不 断 次 化 和 完善 , 水 通道 正在 作为 治疗 人 类 疾病 的 药 物 作 用 划 点 而 引起 重视 。 水 通道 功能 的 调节 剂 可 能 为 许多 与 体液 代谢 异常 有 关 的 疾病 提供 新 的 治疗 途径 (Verkman 2001)。 例 如 肾脏 中 AQP1 、AQP2 和 AQP3 的 抑制 剂 可 能 成 为 更 为 理想 的 新 一 代 利尿 剂 ,用 于 治疗 高 血压 、 充 血性 心力 衰竭 和 水 肿 , AQP4 的 抑制 剂 可 能 减轻 脑 损伤 、 脑 卒中 、 脑 肿瘤 和 脑 感 染 等 病理 状况 下 难以 控制 的 脑 水 肿 。AQP3 表达 的 调节 剂 可 能 改善 与 表皮 含水 量 异 常 有 关 的 皮肤 病症 , 并 有 可 能 成 为 化 妆 品 的 新 型 添加 剂 。 AQPS 为 抑制 剂 可 能 帮助 改善 感染 和 过 敏 引 起 的 鼻 黏 膜 和 支气管 黏膜 液体 过 度 分 泌 等 。 RII) 181 #142 DAY 7k 1h 1 WIZ 4 SRE RN LL eer Agre P, Kozono D. 2003. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Lett, 1: 72- 78 Agre P, King L S, Yasui M, et al. 2002. Aquaporin water channels-from atomic structure to clinical medicine. J Physiol, 542: 3-16 Borok Z, Verkman AS. 2002. Lung edema clearance: 20 years of progress: invited review: role of aquaporin water channels in fluid transport in lung and airways. J Appl Physiol, 6: 2199-2206 de Groot B L, Frigato T, Helms V, et al. 2003. The mechanism of proton exclusion in the aquaporin-1 water channel. J Mol Biol, 333: 279-293 de Groot B L, Grubmiiller H. 2001. Water permeation across biological membranes: mechanism and dynamics of aquaporin-1 and GIpF. Science, 294: 2353-2357 Denker B M, Smith B L, Kuhajda F P, et al. 1988. Identification, purification, and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules. J Biol Chem, 263:15634-15642 Fujiyoshi Y, Mitsuoka K, de Groot B L, et al. 2002. 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J Clin Invest, 5: 957-962 Ma T H, Yang B X, Gillespie A, et al. 1998. Severely impaired urinary concentrating ability in transgenic mice lacking aquaporin-! water channels. J Biol Chem, 8: 4296-4299 Manley G T, Fujimura M, Ma T H, et al. 2000. Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke. Nat Med, 2: 159-163 Matthay M A, Folkesson H G, Clerici C. 2002. Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema. Physiol Rev, 3: 569-600 Murata K, Mitsuoka K, Hirai T, et al. 2000. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature, 407: 599- 605 Papadopoulos M C, Krishna S, Verkman A S. 2002. Aquaporin water channels and brain edema. Mt Sinai J Med, 4: 242-248 Preston G M, Agre P. 1991. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: member of an ancient channel family. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 11110-11114 Preston G M, Carroll T P, Guggino W B, et al. 1992. Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science, 256: 385-387 Ren G, Reddy V S, Cheng A, et al. 2001. Visualization of a water-selective pore by electron cryst7llography in vitreous ice. Proc Natl Acad Sci USA, 98: 1398-1403 Schrier R W, Cadnapaphornchai M A. 2003. Renal aquaporin water channels: from molecules to human disease. Prog Biophys Mol Biol, 81: 117-131 Sui H, Han B G, Lee J K, et al. 2001. Structural basis of water-specific transport through the AQP! water channel. Nature, 414: 872-878 Tajkhorshid E, Nollert P, Jensen M O, et al. 2002. Control of the selectivity of the aqu: hannel family by global orientational tuning. Science, 296: 525-530 Verkman A S. 2001. Applications of aquaporin inhibitors. Drug News Perspect, 7 Verkman A S. 2002. Physiological importance of aquaporin water channels. Ani i 92-200 Verkman A S. 2003. Role of aquaporin water channels in eye function. Exp Eye 137-143 Yang B, Gillespie A, Carlson E J, et al. 2001. Neonatal mortality in an aqua; knock-in mouse model of recessive nephrogenic diabetes insipidus. J Biol Chem, 276: 2775-2779 J 2 i 第 1 章 EF ATP fig £5.10. Sat ADP RS 性质 芭 二 once eee 182 15.2 BBP ATP BASSE HIISAALE ..-.ccc..cececcereccecessonesessedeou een eeeneneaaa 184 15.3 SER ATP fs o IV AEA = ESE RE .汪汪 185 15.4 ATP PSA AEE ATP RHE ARSE AGE Fo A eg REL ........ 187 Bo hy AA AS EPS PR PE Eb JA FB See ey, rin AS AR 度 比 周 围 环 境 低 , 这 种 离子 梯度 是 由 专 一 的 跨 膜 传送 系统 一 一 钠 钾 和 泵 所 产生 的 。 钠 钾 的 这 种 主动 传送 有 着 极其 重要 的 生理 意义 。 细 胞 膜 两 侧 的 钠 离 子 梯度 既是 神经 、 肌 肉 可 兴奋 性 的 基础 , 也 是 一 些 细胞 气 基 酸 、 和 葡萄 糖 传送 的 基础 。 静 止 动物 每 天 要 背 耗 相当 于 体重 一 半 的 ATP, 其 中 1/3 以 上 消耗 在 钠 钾 和 泵 上 。 丹麦 科学 家 Jens C. Skou 于 1957 年 报道 从 蟹 神 经 膜 制剂 发 现 一 种 需要 镁 离 子 的 ATP 酶 , 它 的 活力 可 被 钠 离 子 激 活 , 并 且 在 这 基础 上 还 能 被 钾 离 子 进 一 步 激 活 , 钠 钾 离 子 的 最 佳 激 活 浓 度 与 它们 在 神经 内 的 浓度 相当 。 钠 钊 ATP 酶 (sodium potassium ATPase) 是 钠 钾 系 的 分 子 基 础 。 主 要 证 据 有 : (1) 不 同 组 织 钠 钊 ATP 酶 的 活力 可 以 相 差 几 万 倍 , 但 是 跨 膜 阳离子 疲 与 钠 钊 ATP 酶 的 比 都 是 2.6 + 0.19, (2) PAE 5S PER ATP 酶 都 与 质 膜 紧密 相关 , 把 提纯 的 钠 钾 ATP 酶 重组 到 脂 质 体 上 就 能 显示 出 钠 钾 泵 的 活力 ,(3) 钠 钾 和 泵 与 钠 钾 ATP 酶 都 被 强 心 固 醇 专 一 地 抑制 , 半 抑制 的 浓度 相同 。 钠 钾 ATP 酶 使 ATP 的 化 学 能 转变 成 沙 透 压 工 作 , 维持 了 跨 细胞 膜 的 电化 学 钠 离 子 梯度 与 钾 离 子 梯度 。 这 对 于 维持 细胞 膜 电 位 与 细胞 容积 是 必须 的 。1997 年 ,Skou 因 对 钠 钾 ATP 酶 研究 的 贡献 ,被 授予 诺 贝 和 尔 化 学 奖 。 15.1 PAPI ATP ROH TE) eee BAER ATP 酶 是 质 膜 上 的 固有 和 蛋白, 一 般 研 究 用 的 制剂 有 两 种 : 一 种 是 膜 制剂 , 在 ATP 的 保护 下 利用 去 污 剂 尽量 抽 提 去 除 腊 183 15% fAEH ATP hie 上 其 他 蛋白 质 , 另 一 种 是 把 酶 从 膜 上 增 溶 下 来 再 进一步 提纯 。 BAGH ATP 酶 每 催化 一 分 子 AITP 水 解 , 从 细胞 内 系 出 3 个 钠 离 子 , 同时 系 和 人 2 个 钾 离 子 。 钠 离子 在 一 定 程 度 上 可 由 锂 离子 或 氧 离子 代替 , 而 钾 离 子 可 被 一 些 一 价 阳离子 如 锦 等 所 代替 。 AEF ATP 酶 是 一 种 P 型 ATP 酶 (P-type ATPase) (E,/ E:-ATP 酶 ), 即 在 催化 过 程 中 有 和 蛋白质 的 磷酸 化 过 程 , 磷 酸化 在 天 冬 氢 酸 的 有 羧基 上 。 钠 钾 ATP 酶 属于 P: 型 非 重金 属 转运 AITP 酶 , 含 x、B 两 个 亚 基 。Q 亚 基 的 N 端 与 阳离子 的 专 一 性 和 亲和力 关系 不 大 , 但 在 伴随 钠 离 子 和 出 的 构象 变化 中 起 重要 作用 。 钠 钾 ATP 酶 的 作用 机 制 简 化 的 表达 大 致 可 以 分 为 四 步 : E, 一 EP 一 E,P 一 E, 一 E, 。 第 一 步 , 酶 与 Mg”-ATP 反 应 生成 与 3 个 钠 离子 结合 的 EBP。EP 是 高 能 状态 , 它 可 以 被 ADP 脱 磷 酸化 而 重新 生成 ATP。 在 第 二 步 中 蛋白 有 一 系列 变化 , 钠 离子 的 亲 和 力 下 降 , 钠 离子 跨 膜 , 与 此 同时 共 价 结合 的 磷 成 为 低能 状态 的 E:P,E2P 不 能 与 ADP 反 应 。 第 三 步 磷 被 水 解 下 来 。 第 四 步 酶 回复 到 Ei 状态 , 这 一 步 是 限 速 步骤 , 关 系 到 2 个 钾 离 子 与 钠 离 子 相 对 方向 的 跨 膜 。 图 15-1 表 示 了 钠 钊 ATP 酶 的 作用 机 制 。E: 状态 的 酶 能 与 无 机 磷酸 盐 反 应 生成 E2P, 但 不 能 与 AIP 或 其 他 高 能 磷酸 化 合 物 反 应 。E: 状 态 的 酶 还 能 与 钒 酸 盐 反应 。 细胞 外 2Na- 2K* E,P[2Na’] =< E,P 全 E,P[2K’] Na* | S72 ie ED2K] E,P[3Na’] i sed E,ATP[2K"] ADP | E,ATP[3Na'] <—~— _E,ATP i E,ATP[2K’] 3Na 2K* 细胞 内 钠 钾 ATP 酶 的 作用 机 制 (4% Post-Albers 图 式 ) BAT (ouabain) 是 钠 钾 ATP 酶 的 专 一 性 抑制 剂 。 在 负 定 钠 钾 ATP 酶 活性 时 , 一 般 将 总 ATP 酶 活力 减 去 乌 本 苷 存在 下 (10-3~10-4 mol/L) fy AT? 酶 活力 的 差 表 示 钠 钊 ATP 酶 活力 。 乌 本 苷 与 强 心 固 醇 抑 制 钠 钊 ATP 酶 的 去 磷酸 化 们 在 质 膜 外 侧 与 SAPP ATP BZ. HP ZW Re Wee BRU RR EMIT ZEIT 船体 化 合 物 , 其 中 的 Resi- WSa5ACAE, TEMS wee EAE ATP 酶 的 强 列 抑制 作用 。 HET ATP 酶 尚 有 一 般 磷 酸 酯 酶 的 活力 , 能 催化 对 硝 ” 洲 酸 酯 等 的 水 解 。 在 钾 离 子 浓度 低 时 ,的 离子 促进 这 种 磷酸 酯 酶 活力 ,而 当 钾 离 子 浓 |) 时 , 钠 离 子 却 抑 制 这 种 活力 。 i 2 a" FG . KH Hy i Biomembranes 184 15.2 FAR ATP AGN AT 194 (i: meer AER ATP Aitce BH aR Se ACR PRA A, EE SE Oo FB nee, th, Ae EF HER AB 3 1 5S RAE. OF Wie A 7.4 kDa ft YE. OLE A PEF 5 Bo Pai. HEN ATP Big oc MVE 1016 + sa EMRE , 组 成 10 个 跨 膜 螺旋 , 有 3 种 亚 型 , 在 睾丸 中 还 含 第 4 种 亚 型 。o 亚 基 上 有 钠 离 子 、 钾 离子 结合 位 点 、 磷 酸化 位 点 和 与 抑制 剂 结合 位 点 。B 亚 基 是 糖 蛋白 , c 亚 基 在 插入 质 膜 前 与 B 亚 基 结 合生 成 复合 物 。 图 15-2 总 结 了 亚 基 的 结构 。% 亚 基 的 10 个 跨 膜 螺旋 可 以 分 为 N 端 4 个 和 C 端 6 个 , N 痛 4 个 跨 膜 螺旋 不 被 蛋白 酶 所 消化 。 KGAPE DKTGTLT TGES C 胞 液 结构 域 DPPR MVTGD a5 IMVTGD | iB | (P) VAVTGDGVNDS PALKKADIGVAM NH, es a2 Sh =. Me COOH ee Sey 2 4 5 x ee M 1 {2 A] 5 10 qe ZI i we, YY TS Gia ceil io 和 NT 结构 域 CT 结构 域 ahah ATP Aig w 亚 基 结构 示意 图 钠 钾 ATP 酶 x 亚 基 T 端 的 缺失 会 导致 前 向 电压 敏感 的 钠 跨 膜 转运 大 幅度 下 降 , 胞 外 区 钾 亲 和 力 改变 与 对 ADP 敏感 的 磷酸 化 酶 分 子 相对 含量 的 提高 2~3 倍 ) 等 。 Q&% 亚 基 的 胞 浆 部 分 售 一 个 位 于 曙 旋 2 与 螺旋 3 之 间 的 小 的 B 区 域 , 以 及 一 个 位 于 螺 旋 4 与 螺旋 5 之 间 的 大 的 C 结 构 域 。B 区 域 中 氨基 酸 的 点 突变 虽然 不 影响 磷酸 化 以 及 与 离 子 的 结合 , 但 会 影响 去 磷酸 化 与 离子 传送 。 一 般 认 为 它 在 导致 酶 的 去 磷酸 化 与 离子 传送 的 构象 变化 中 有 重要 作用 。C 结构 域 含 催化 中 心 , 其 N 端 有 磷酸 化 位 点 (D369), 甚 中间 与 C 端 有 ATP 结 合 位 点 。C 结构 域 的 C 端 还 有 J 区 域 , J 区 域 舍 有 一 段 不 论 在 原核 还 是 真 核 中 都 存在 的 较 长 保守 序列 , 可 能 在 偶 联 酶 活力 与 阳离子 移 位 上 有 重要 作用 。C 结构 域 含有 可 被 磷酸 化 的 天 冬 氨 酸 残 基 的 DKTGTLT 基 序 (motif), 这 个 基 序 也 是 很 保守 的 。 在 B 区 域 与 C 结 构 域 还 有 一 些 含 天 冬 酰 胺 、 天 冬 氨 酸 、 廿 所 酸 、 且 氨 酸 、 丝 氨 酸 等 残 基 的 基 序 , 可 能 与 构成 ATP 酶 的 骨架 有 关 。KGAPE 基 序 位 Cea, ESR 结合 有 三 。 当 其 中 的 赖 氨 酸 被 FITC 修饰 后 , 钠 钾 ATP A ARES ATP ody, {Hae eI AERA “ 千 丕 可 以 被 无 机 磷酸 盐 或 乙酰 磷酸 所 磷酸 化 。 在 xx 业 基 的 第 4 个 跨 膜 区 上 有 PEGL 基 序 可 能 在 能 量 转换 上 起 重要 作用 , 与 磷酸 化 残 基 间 以 一 信 40 个 氨基 酸 残 基 长 的 保守 肽 链 相 联 。 185 152% Sh tH ATP iis 图 15-3 表示 了 钠 钊 ATP 酶 % 亚 基 的 残 基 下 水 性 以 及 一 些 基 序 的 具体 位 置 。 人 钠 钊 ATP 酶 的 核心 区 包括 TIGES 基 序 前 的 一 个 跨 膜 区, 以 及 磷酸 化 位 点 DKTG 基 序 前 的 一 个 跨 膜 区 和 紧 接 ATP 结合 位 点 GDGVNDSP 基 序 后 的 序列 。 ek 人 NaK-ATP 酶 Ay) Ala LANA FP Tura ‘ie | 钠 钾 ATP Bi x 亚 基 序列 的 残 基 朴 水 性 作 图 B 亚 基 含 302 个 甩 基 酸 残 基 , 是 单 肽 链 ,N 端 位 于 细胞 浆 ,C 端 位 于 胞 外 ,, 胞 外 区 有 天 冬 酰胺 残 基 的 糖 基 化 。B 亚 基 也 有 几 种 亚 型 , 有 广泛 存在 , 凡 主要 存在 于 神经 组 织 。B 亚 基 与 % 亚 基 结 合 很 紧密 , 只 有 在 用 像 SDS 这 样 的 去 污 剂 处 理 才 会 分 开 。H、K'-ATP 酶 AY BIDE AT A OE EP ATP RAY Bi IDE AE AEP ATP WEIR AT, 它 保留 了 离子 传送 的 性 质 , 但 异 二 聚 体 较 不 稳定 ,对 钾 离 子 也 较 不 敏感 。B 亚 基 的 确切 作用 还 不 清楚 ,可 能 接 或 间接 地 参与 钠 钾 ATP 酶 的 离子 传送 功能 , 起 调节 亚 基 的 作用 。 在 昆虫 系统 中 表达 的 Q 亚 基 能 在 没有 有 亚 基 以 及 无 需 钠 离 子 与 钾 离 子 的 情况 下 水 解 ATP, 这 个 活力 不 被 乌 本 苷 抑制 , 说 明 B 亚 基 起 着 ATP 结 合 位 点 与 阳离子 结合 位 点 间 的 偶 联 作用 。B 亚 基 上 的 二 硫 键 被 还 原 会 导致 钠 钊 ATP 酶 形 失 离子 传送 功能 。 酵母 本 身 不 售 钠 钊 ATP 酶 , 因 此 是 克隆 表达 野生 型 与 突变 钠 钾 ATP 酶 的 良好 系统 。 每 克 醇 母 可 以 表达 S4ug 钠 钊 ATP A, AE BADGER ATP 酶 具有 完全 的 活力 。 用 昆虫 多 角 体 病毒 感染 的 细胞 株 Sf 9 与 High Five 的 表达 系统 可 以 达到 10 一 100 pmol/mg 蛋白 。 当 EEF ATP fig oo IAEA D369 突变 成 A 时 , 酶 的 磷酸 化 受阻 , 也 不 再 有 活力 , 但 此 时 酶 对 ATP 的 结合 亲和力 增加 了 30~40 倍 。 在 o 亚 基 将 ATP 的 Y 位 磷 转 移 到 D369 上 去 的 时 候 ,D710 是 必需 的 , 而 N713 是 重要 的 , 由 此 也 说 明了 TGDGVND 肽 段 的 作用 。 15.3 钠 镍 和 A 并 醒 % 亚 基 的 三 拓 结 构 模 建 至 今 还 没有 能 够 得 到 钠 钊 ATP 酶 的 三 维 晶 体 。 2001 年 ,Rice 等 报道 了 钠 钊 ATP 酶 的 二 维 唱 体 及 电子 衍射 三 维 重组 的 结果 , 但 解析 分 辩 率 只 达到 11A。 同 年 Hebert 等 报道 了 钠 钾 ATP 酶 的 二 维 品 体 及 电子 衍射 三 维 重 组 ,, 分辨 率 为 9.5A, 也 还 没有 达到 原子 水 平 的 解析 。 同 源 模 建 是 根据 同类 蛋白 质 中 已 有 的 原子 分 辨 三 维 结构 (three dimensional structure) 来 进行 模拟 , 以 得 到 有 相当 可 信 度 的 三 维 结构 。 钠 钟 ATP 酶 是 一 种 P 型 ATP 酶 ,在 催化 过 程 中 酶 被 可 逆 地 磷酸 化 。P 型 ATP 酶 包括 两 站 是 细菌 的 , 如 一 些 重金 属 ATP Ag; I AY af oy Ay TA AY FT IB HY, ILA AY Aad! D A, EAER ATP fit. HL 浆 网 系 钙 ATP 酶 等 , IIB 型 包括 质 膜 钙 ATP 酶 和 质子 A1 钠 钾 ATP 酶 wx 亚 基 与 胃 黏 膜 上 皮 的 氨 钊 ATP 酶 和 4 系 钙 ATP 梅 有 着 序列 的 相 似 性 。2000 年 Toyoshima 等 报道 了 肌 浆 网 系 钙 ATP fig AER), ett 7 PAR TRE 白 家 族 成 员 一 个 模型 。 可 以 认为 肌 浆 网 系 钙 ATP 酶 与 智 拓 今 的 结构 和 不 与 钙 结合 的 结构 ey HE Wy 'i Biomembranes 186 Ay AEF BE A TP Pilg oc TLE 5 BEE ASE PS BRAG GSE. BA ATP Big on TYE 5 LAR A AS ATP BA PS RAY PILE ee A A 40%, 但 是 在 肌 浆 网 系 钙 ATP 酶 中 形成 PHS TAA LAA 4 ~ 6 PSH AS EN EF ATP fig o IL ERY FE AA EIA BI] 60%, UE), 根 FEA Tal RRA FAH ATP Big oc EHP Ar AT LA Pe PS He RE Tie 0 Ud AS A 通过 同 源 模 建 (homology modeling), 742i] [Hf ATP Mig o WE 5 ZG FS RAG AIPA, TEU kk Ee 0 PAE ATP Big oc ERY 3 EA TRA RS 2 离子 的 结合 位 点 , 结 果 如 图 15-4 所 示 。 图 中 阿拉 伯 数 字 代 表 跨 膜 螺 旋 数 ,A 中 的 罗马 数 字 代表 与 钠 离 子 结合 的 3 个 位 点 , 钠 离 子 用 蓝 球 表示 ; B 中 的 罗马 数字 代表 与 钾 离 子 结合 的 2 个 位 点 , 钾 离子 用 橘 色 球 表示 。 两 条 水 平 线 表 示 膜 与 水 溶液 的 界面 , 它 们 之 间 代 表 AAEM bik KM, 与 钾 结 合 A pa N aK: / Ss 细胞 质 细胞 膜 ~ - eee uw & a \ 一 一 一 一 一 结合 位 点 跨 膜 区 M4 MS M6 M8 M9 Nar I N783 ~—*T814 — Q930 E786 D815 Na’ II V329 D811 A330 D815 V332 E334 Na’ Ill Y778 G813 E961 T814 K* I $782 D811 Q930 E786 D815 +1 v329 N783 D811 A330 E786 V332 TE: PAIK WREBSES, 黑体 残 基 是 专 一 的 , 双 下 划 线 残 基 参 与 2 个 离子 的 结合 。 187 15% hE ATP Big 从 模 建 的 结构 可 以 看 到 , 直 接 参与 阳离子 结合 的 残 基 在 肌 浆 网 系 钙 ATP Bie 5 HEF ATIP 酶 % 亚 基 中 是 相同 的 。 模 建 的 结果 与 大 量 钠 钊 ATP 酶 % 亚 基 序 列 突变 的 结果 , 包括 两 乞 酸 扫描 的 结果 是 一 致 的 。 从 模 建 的 结构 还 可 以 看 到 当 钠 钾 ATP 酶 % 亚 基 从 与 钠 结合 构象 转变 为 与 钾 结 合 构象 时 , 第 4 个 跨 膜 螺旋 向 细胞 外 侧 移动 , 第 5 个 螺旋 的 上 部 分 弯 问 第 4 螺旋 , 第 6 个 螺旋 展开 部 分 有 90 的 旋转 。 这 些 变化 使 结合 残 基 能 以 高 亲和力 与 离 子 半径 较 大 的 钾 离 子 结合 , 同时 保证 了 钠 离 子 的 释放 。 在 与 钠 、 钾 离子 结合 的 残 基 中 , 有 的 是 各 自 独立 的 , 只 参与 一 种 离子 结合 , 但 也 有 的 是 二 者 共享 的 。 表 15-1 总 结 了 钠 、 钾 离子 的 结合 位 点 。 15.4 ATP 诱导 的 钠 钾 ATP 酶 核 苷 酸 结合 结构 域 的 构象 变化 4 1975 年 Jorgensen 在 研究 蛋白 水 解 酶 对 钠 钾 ATP 酶 的 影响 时 发 现 酶 与 阳离子 结合 导 致 酶 分 子 巨 大 的 构象 变化 。 他 们 在 用 低 谊 度 去 污 剂 制备 钠 钾 ATP 酶 膜 制 剂 时 发 现 ATP 有 保护 钠 钾 ATP 酶 不 易 变 性 的 作用 , 说 明 ATP 会 诱导 酶 处 于 比较 稳定 的 构象 。 用 高 分 辨 、 异 核 、 多 维 核磁 共振 测定 大 鼠 ol 钠 钊 ATP 酶 的 ATP 结 合 结构 域 (N 结 构 域 )213 个 残 基 (Gln376 - Pro588) 在 天 然 状 态 及 与 AIP 结 合 状态 下 在 溶液 中 的 结构 .ATP 与 分 离 的 N 结 构 域 结合 较 弱 ,Ka 约 5SmmolL。 生 物化 学 实验 表明 完整 E, 状态 的 钠 钾 ATP Rig ATP 结合 的 Ka 约 0.2~0.4mmol/L, Af ATP 酶 与 其 他 阳离子 泵 不 同 之 处 在 于 钠 钊 ATP 酶 在 无 镁 、 含 EDTA 的 溶液 中 能 与 ATP 高 亲 和 度 地 结合 (Ks #4) 30~ 100nmol/L) , 为 了 得 到 核 苷 酸 结 合 的 情况 , 用 ATP、ADP、Mg*-ATP 来 滴定 N 结 构 域 。 在 AITP 滴 定 的 终点 , 在 201 个 残 基 中 有 41 个 残 基 的 酰 各 部 分 的 化 学 位 移 大 于 0.05 ppm。 图 15-5 显 示 了 天 然 状 态 和 与 AIP 结 合 的 和 结构 域 结 构 , 从 而 直观 地 看 到 了 ATP 诱导 的 钠 钾 ATP Gt ATP 酶 的 ATP 结合 结构 域 (N ; OM = AEE ky 绿色 , 天 然 N 结 构 域 , 红 色 ,ATP 结 合 多 域 FE % fi Biomembranes 188 酶 的 构象 变化 ,也 提供 了 在 酶 磷酸 化 前 单纯 地 与 ATP 的 结合 就 启动 了 构象 变化 的 实验 证 据 。 ee a Hebert H, Purhonen P, VorumH, et al. 2001. Three-dimensional structure of renal Na, K-ATPase from cryo electron microscopy of two-dimensional crystals. J Mol Biol, 314: 479-494 Hilge M, Siegal G, Vuister G W, et al. 2003. ATP-induced conformational changes of the nucleotide-binding domain of Na, K-ATPase. Nature , Structural Biology, 10: 468-474 Jorgensen P L, Pedersen P A. 2001. Structure-function relationship of Na*, K*, ATP or Mg binding and energy transduction in Na, K-ATPase. Biochim Biophys Acta, 1505: 57-74 Lutsenko S, Kaplan J H. 1995. Organization of P-type ATPases: significance of structure diversity. Biochemistry, 34: 15607- 15613 M@ller J V, Juul B, le Maire M.1996. Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPase. Biochim Biophys Acta, 1286: 1-51 Ogawa H, Toyoshima C. 2002. Homology modeling of the cation binding sites of Na*K*-ATPase. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 15977-15982 第 0 章 条 的 结构 基础 及 其 na eet HG) ULB ya VSP A ka ooh ccc iel oe rcsuciccegacsevvvasnavacnee 190 16.1.1 SURES FONE IE «ese es ssseecsecececsescncercecseesseerencnese 19] .29SEREA cy iyi. dies | i oll le ee ie ee 192 GAAS 全 生计 192 16.4 A Cate SR Ca AD Pane Ale AE (Go 区 全 二 光 194 2562 二 而 和 Ca ee ae 和 195 16.2.1“ 质 膜 Ca**-ATPase 的 结构 及 其 调控 机 制 oo eee eee 195 Oe. 2 We Cara Vise HO rape Loses netsh ocostvsaessteettdtiess 198 Ge. A ibe Ca? SAP Page Bee eee, 二 全 用 时 bends 198 & 离子 在 生命 活动 中 起 着 非常 重要 的 作用 。 细 胞 浆 中 Ca 的 浓 度 非 常 低 ( 约 10 "molyL), 而 细胞 外 Cs 的 浓度 为 胞 浆 浓 度 AJ 1000 ~ 10000 倍 ( 约 10-3moyL)。 因 此 , 即 使 少量 的 Ca2* EA, 细胞 浆 中 自由 Ca 的 浓度 也 会 明显 增加 , 这 也 是 细胞 响应 外 界 信 号 , 使 Ca” 迅速 跨 过 细胞 质 膜 作为 信使 传递 信号 的 重要 途径 。 此 ,维持 细胞 内 外 较 大 的 Ca 六 梯 差 对 于 细胞 的 正常 生命 活动 是 非 BAY, mB SARA Ca 梯 差 的 蛋白 质 之 一 为 Cat-ATPase。 Ca**-ATPase, 又 称 为 Ca# 泵 (Ca2# pump), 其 功能 是 逆 Ca:2+ 浓度 梯度 , 通 过 水 解 AITP 产 生 的 能 量 , 主 动 运送 Ca 从 浓度 低 一 侧 跨 细胞 膜 到 浓度 高 的 一 侧 。 由 于 在 Ca”-ATPase 运 送 Ca 的 过 程 中 , Ca?*-ATPase GATP 7k fe 1 HIE RARE ABE FEBRARER TH IBIAS, PLA Ca?*-ATPa | 做 P 型 ATP 酶 (P-type ATPase) (图 16-1)。Ca2+-ATPase AAR Ca” 过程 中 , 胞 浆 中 的 Ca 首先 与 具有 高 Ca# 亲 JIUE 25 » 通过 水 解 ATP 分 和 于,ATP REFER AME ir “形成 磷酸 化 中 间 体 , 变 成 了 KE ie Biomembranes 190 WR; TEE PIR, ATP Mel) Ca” 杀 和 性 降低 , 这 样 Ca 被 释放 到 膜 的 另 一 侧 , 然 后 经 过 去 磷酸 化 ,ATP 酶 回 到 原来 状态 , 完 成 一 个 催化 循环 。 2 7 E\Ca’* 一 -一 一 -一 E'Ca ATP SR ECa ATP RS ee BAL EL Car Alpe 5 E, Gar x EB, 93 8 3 97 %/ Type ID fy} \— 99 人 | 114/ AR 137 /X0 ih 8 112 103 102 wie Ak los Type IIB 118 4 1 Ge Ca” 110 10 Na 人 Type IIC P-ATPase 进化 树 ( 引 自 http:/www.patbase.kvl.dkytree.html) 16.1.1 氨基 酸 突变 和 抑制 剂 研究 由 于 很 难 获得 膜 蛋白 的 三 维 唱 体 , 同时 ,X 射 线 唱 体 学 的 结构 卫 需 受 生 化 实验 的 验证 , 因此 , 人 们 对 SR Ca -ATPase 进 行 了 大 量 的 氨基 酸 突 变 和 抑 智 ; ) 隔 芝 。 与 二 级 结构 预测 相 吻 合 , 若 突变 Asp351, 离 子 系 完全 失去 其 活性 , 证 明 A 许 酸 化 位 点 。 跨 膜 螺旋 M4、M5、M6 和 MS8 上 的 6 个 氨基 酸 被 认为 与 Ca 结合 有 变 其 中 任何 一 个 氟 基 酸 残 基 都 会 使 SR Ca?*-ATPase 失去 Ca 的 转运 活性 , 但 仍然 , 8 成 磷酸 化 中 间 体 。 与 其 他 P-ATPase 一 样 ,Laz 和 钒 酸 盐 可 以 抑制 SR -ATPase。 因 为 钒 酸 盐 是 磷酸 盐 的 类 亿 物 , 与 ATPase 形成 钒 酸 盐 中 间 体 , 从 而 抑制 ITPase 进 一 步 水 解 , 催 化 循环 KH ty i Biomembranes 192 终止 .对 于 SR Ca*'-ATPase, Afi AH fH — AAEM Hill l—_ a: A Bb SS (thapsigargin) , — Fe A #4 Thapsia gargazica 根 部 的 化 合 物 (Inesi et al. 1994), AA b 334 SR Ca?*- ATPase 定 量 地 与 跨 膜 螺 旋 M3 相互 作用 , 使 AITPase 锁 定 在 已 构 角 。 最 近 解 析 的 SR Ca”- ATPase 的 E; 构象 的 X 射线 唱 体 学 结构 就 是 ATPase 和 毒 胡 葛 卜 素 复 合 物 E; . 工 G (Toyoshima et al. 2002)。 10.1.2 SFERCA 扑 元 榴 休 “RISE SERCA 是 多 基因 家 族 产物 , 已 发 现 有 3 种 基本 亚 型 : SERCA1、SERCA2 和 SERCA3 。 由 于 基因 剪 切 位 点 的 不 同 , 每 一 种 亚 型 又 有 不 同 的 异 构 体 。SERCA1a 是 成 年 肌肉 组 织 主要 的 亚 型 , 占 肌 浆 网 蛋白 的 90% 以 上 , 这 也 是 结构 研究 主要 以 SR Caz-ATPase 为 研究 对 象 的 原因 。SERCA1b 主要 存在 于 新 生 的 肌肉 组 织 中 , 它 比 SERCA1la 多 7 个 氨基 酸 。 SERCA2a 主 要 存在 于 心肌 ,而 SERCA2b 在 平 请 肌 和 非 肌肉 组 织 中 ,SERCA2b 比 SERCA2a TEN 端 多 49 个 氮 基 酸 。SERCA3 主要 是 痕 量 地 表达 在 非 肌 肉 组 织 中 。 16.1.3 SR Ca?*-ATPase 的 结构 SR Ca”-ATPase 有 两 个 结构 域 : 胞 质 结构 域 和 跨 膜 结构 域 。 胞 质 结构 域 有 三 部 分 : A( 激 活 结构 域 )、N( 核 苷 酸 结 合 结构 域 ) 和 PCM CAG Sk). PSNR eS Ha 10 次 跨 膜 螺 旋 组 成 , 含 有 Ca 结合 位 点 。 胞 质 结 构 域 与 跨 膜 结构 域 通过 有 颈 部 相连 结 (图 16-3)。 内 腔 EME SR Ca -ATPase 的 拓扑 学 结构 及 重要 的 各 基 酸 位 置 其 中 MI 一 MI10 为 跨 膜 螺旋 ,S2 ~ S5 为 颈 部 ,A、P 和 N 为 胞 质 区 3 个 结构 域 193 108 £5 FRIES FFE MR ES BS FEAT HL tl] A 结 构 域 包含 50 AY 2A HEMRAT N 端 以 及 与 颈 部 S2 和 S3 连结 的 跨 膜 M2 和 M3 的 145 个 肥 基 酸 ,X 射线 晶体 学 的 结构 研究 表明 ( Toyoshima et al. 2003), A 结构 域 几乎 与 整个 分 子 的 其 他 部 分 完全 分 开 , 成 果冻 卷 结 构 。 胰 蛋白 (trypsin) 酶 切 结 末 表 明 ,Ca- 的 亲 和 力 和 磷酸 化 能 力 都 增加 , 提 示 在 Ca” 运送 过 程 中 , 结 构 域 将 要 发 生 运动 , 这 一 推测 得 到 了 结构 研究 的 印证 (图 16-4)。N 端 禹 基 酸 与 其 他 P-ATPase 没 有 相似 性 , 但 如 果 去 掉 或 突 变 和 端的 几 个 氟 基 酸 ,SR Ca*-ATPase 的 表达 量 有 明显 下 降 , 提 示 NN in Sy EE ED 相关 。P 结 构 域 位 于 胞 质 结 构 域 的 中 央 , 磷 酸化 位 点 (Asp351) 在 该 结构 域 中 。N 结 构 域 是 胞 质 结 构 域 中 最 大 的 部 分 , 该 结构 域 插入 P 结 构 域 中 间 , 有 较 高 的 柔性 。 核 苷 酸 与 该 结 构 域 结 合 , 与 ATP 结 合 区 域 的 筑 基 酸 中 包括 Lys515, 该 委 基 酸 可 以 被 FITC 菊 光标 记 , 进 行 结构 方面 的 研究 。 本 % Bis 4. Pe NAD ¢ - 成 PAS wt * J Bi amy Ph ae Ses a A ae a oa a = hes SR Ca®*-ATPase fi E, Fil Ep 构象 的 三 维 空间 结构 其 中 脂 双 层 结构 是 由 DOPC 脂 分 子 模拟 的 结果 。E 构象 中 跨 膜 区 部 分 的 蓝 色 圆 围 为 Ca* 结合 位 点 。 胞 质 区 中 红色 箭头 表示 从 Ei BE, 构象 转变 过 程 中 ,A、P 和 N 结构 域 的 运动 方向 ica ee 生化 和 结构 研究 都 表明 SR Ca2#-ATPase 每 水 解 一 个 ATP 分 子 ,, 转运 2 个 Ca+, 并且 发 现 ATP 酶 在 跨 膜 结构 域 有 2 个 Ca 结合 位 点 。C 弛 的 结合 位 点 是 由 Ca 与 ATP 酶 跨 膜 螺旋 上 的 酸性 氨基 酸 上 的 氧 原子 结合 形成 的 。 第 一 个 Ca 与 跨 腊 “这 1435 的 N768 和 E771、 M6 的 T779 和 D800 以 及 M8 的 E908 结 合 ; 第 二 个 Ca 与 足 M4 主 链 上 的 氧 原子 、 M4 的 E309 以 及 M6 的 N796 和 D800 结 合 。 值 得 注意 的 是 ede M4 上 的 高 度 保守 氨基 酸 PEGL*" 位 于 结合 第 二 个 Ca 结合 位 点 的 中 心 , 这 在 第 一 个 Ca 结合 到 MS/ M6/M8 形成 的 结合 位 点 后 , 由 于 M4 的 柔性 较 高 , 将 诱 -个 Ca 结合 位 点 的 形成 , 从 而 可 以 协同 地 结合 第 二 个 Ca 。 由 于 M4 直接 与 胞 质 参 。” 成 的 磷酸 化 结构 域 相连 , HE Wy i Biomembranes 194 此 , 可 以 推测 随 着 Ca 与 酶 的 结合 ,P 结构 域 的 构象 也 必 将 发 生变 化 , 这 在 ED TG AY X 射线 晶体 学 的 结构 中 得 到 了 证 明 。 2. 磷酸 化 结构 域 P 结 构 域 位 于 胞 质 结构 域 中 心 , 包含 磷酸 化 位 点 Asp351, P 结 构 域 被 分 成 两 个 部 分 ; N 端 与 跨 膜 螺旋 M4 相 连 ,C 端 连接 M5。 这 两 个 分 离 部 分 组 装 在 一 起 形成 Rossman 折叠 , 这 与 结构 预测 相 吻 合 , 磷 酸化 位 点 也 被 化 学 交 联 和 氨基 酸 突 变 等 实验 证 明 。 磷 酸化 位 点 Asp351 位 于 P 结 构 域 的 C 端 部 分 , 与 其 他 有 Rossman 折 县 的 核 苷 酸 结 合 蛋白 的 情况 一 致 。 在 它 周 围 , 与 ATP 水 解 相 关 的 氨基 酸 聚 集 在 一 起 ,形成 带 有 较 多 负电 荷 的 表面 , 因 而 有 利于 溶剂 分 子 的 进入 。 3, 核 苷 酸 结合 结构 域 核 苷 酸 的 结合 位 置 在 ATP 的 类 似 物 TNP-AMP 与 SR_ Ca2-ATPase 的 共 结 晶 结 构 中 得 到 了 确认 , 同时 氨基 酸 突变 以 及 化 学 交 联 实验 也 证 明 ATP 的 结合 区 位 于 N 结 构 域 . 在 ATP 周围 的 氨基 酸 包 括 F487、K492 和 K515, 荧 光 探 针 FITC 可 以 特异 标记 K515, 用 来 研究 核 苷 酸 周 围 氨基 酸 的 构象 变化 。X 射线 晶体 学 的 结构 表明 ,ATP 距 离 P 结 构 域 的 磷酸 化 位 点 Asp351 大 于 25A,, 在 该 距离 下 不 可 能 发 生 磷酸 化 ,因此 , P 和 NN 结 构 域 必须 发 生 足 够 大 的 构象 变化 , 才 有 可 能 把 两 者 的 距离 拉 近 进行 磷酸 化 ,这 已 在 电镜 低 分 辩 率 的 结构 和 了 构象 的 X 射 线 晶 体 学 的 结构 中 得 到 证 明 。 4, 激 活 结构 域 A 结 构 域 是 3 个 胞 质 结构 域 中 最 小 的 一 个 ,分子 质 量 约 为 16kDa, 位 于 跨 膜 螺旋 M2 和 M3 之 间 , 约 有 110 个 氨基 酸 残 基 。X 射 线 晶 体 学 的 结构 表明 ,,A 结 构 域 形成 果冻 卷 结 构 , A 结 构 域 通过 两 个 较 长 的 loop 与 跨 膜 区 相 联 。 蛋白酶 及 可 以 切断 该 1oop 区 , 但 与 Ca 相关 ,Arg198 位 于 loop 区 的 最 远 端 , 可 以 被 胰 蛋 白 酶 水 解 ,Ca+ 可 以 激活 该 水 解 , 磷 酸 化 则 抑制 该 水 解 。 所 有 这 些 生 化 实验 表明 在 SR Ca*-ATPase 转运 Ca 过 程 中 ,A 结 构 域 运动 而 引起 构象 变化 。 16.1.4 “Ca 诱导 SR Ca2-ATPase 构象 变化 | 图 16-4 表 明 SR Ca**-ATPase 转运 Ca 过 程 中 经 过 Ei-E; 构象 变化 , X 射线 晶体 学 的 结构 证 明 E, 和 了 构象 有 非常 大 的 变化 。 在 E,-E: 转换 过 程 中 ,A 结 构 域 相 对 于 垂直 于 脐 的 轴 发 生 110° 旋转, 这 是 转运 Ca” 的 关键 步骤 。 事 实 上 ,A 结构 域 在 不 同 的 中 间 态 与 P 和 N 结构 域 相 对 位 置 都 在 发 生变 化 , 从 而 SR Ca?*-ATPase 调控 Ca WIS. TEE, HR, A、P 和 N 结 构 域 相互 距离 较 大 , 跨 膜 螺 旋 MIl REEF RARE, 胞 质 区 中 人 没有 明显 的 Ca?* 通道 使 Ca# 可 以 到 达 膜 区 的 结合 位 点 ; 在 腔 内 侧 ,Ca 六 结合 位 点 的 下 面 为 下 水 所 基 酸 残 基 , 封 朵 Ca 结合 位 点 。 在 E: 构 象 , P 结 构 域 相对 与 膜 平面 转动 30",N 结 构 域 相对 于 了 进一步 旋转 30"`。 由 于 A、P 和 六 结构 域 的 运动 ,使 得 在 El 构象 完全 分 离 的 3 个 结构 域 在 E; 构象 时 相互 靠近 , 在 A-P 和 A-N 结 构 域 乙 间 形 成 很 多 氧 键 (图 16-53)。 与 胞 质 结 构 域 的 构象 变化 相对 应 , 跨 膜 区 的 螺旋 也 发 生 了 很 大 变 1 | TE E,-E, 转变 过 程 中 ,M1 朝 胞 浆 方 向 去 动 , 除 M8 没有 变化 外 ,M4~M6 都 发 生 了 明 , 的 运动 : (1) M4 向 腔 内 移动 ; (2) M5; 上 部 向 M4 方向 弯曲 : (3) M6 近 90 的 旋转 。 正 是 由 于 这 4 个 路 膜 螺 旋 的 运 动 , 在 Ei 杞 和 象 中 与 Ca 结合 紧密 的 氧 原 子 在 E: 构象 中 不 再 与 Ca 对 相 结合 , 从 而 释放 Ca” 到 腔 内 。 195 SR Ca**-ATPase 在 催化 循环 过 程 中 胞 质 结构 域 的 3 个 结构 域 (A、P 和 人 ) 的 4 种 构象 模型 D351 为 磷酸 化 位 点 , 从 EIP 到 EP 构象 转化 时 ,Ca# 被 释放 到 SR 腔 内 总 之 ,在 X 射 线 晶体 结构 解析 以 前 , 通 过 生化 和 光谱 实验 表明 ,SR Ca2-ATPase 在 转运 Ca 对 过 程 中 发 生 Ei-E: 的 构象 变化 。 最 近 的 晶体 结构 进一步 证 实 了 这 种 构象 变化 , 对 SR Ca2-ATPase 的 作用 机 制 有 了 更 进一步 地 了 解 。 另 外 , 在 晶体 结构 以 前 , 人 们 认为 SR Ca2-ATPase 与 通道 蛋白 (如 KK 通道 ) 一 样 会 有 Ca 通道 。 但 唱 体 结构 的 结果 表明 SR Ca2- ATPase 没 有 明显 的 Ca “通道 ,SR Ca…-ATPase 在 转运 Ca 过程 中 会 发 生 一 系列 的 构象 变 化 ,这 也 是 为 什么 SR Ca*’-ATPase 转运 Ca 比 离子 通道 慢 得 多 的 原因 。 结 构 研究 同时 也 表明 ATPase 的 结构 与 离子 通道 完全 不 同 。 16.2 GU Co" 人 Ta AI ja Het Ca?*-ATPase (plasma Ca?*-ATPase) 由 Schatzmann 在 1966 年 发 现 (Schatzmann 1966)。 尽 管 当时 已 经 发 现在 红细胞 膜 上 有 Ca” 依赖 性 的 ATPase 存 在 , 但 是 Schatzmann 把 ATPase 与 Ca 的 运送 联系 在 一 起 。 经 典 的 实验 表明 , 在 红细胞 膜 内 的 Ca# 在 有 ATP 存在 下 运送 到 膜 外 的 速度 大 于 未 经 ATP 处 理 的 血 影 膜 , 同 时 , 由 于 介质 中 Ca?’ fe RE ee tai PWR A Ca YR FE, 显然 , AITP 推 动 的 离子 泵 运送 Ca 跨 膜 。 虽 然 开 始 时 质 膜 Ca*-ATPase 只 发 现在 红细胞 膜 上 , 但 是 随后 发 现 质 膜 Ca”*-ATPase 存 在 于 所 有 的 真 核 细胞 中 。 用 钙 调 蛋白 亲 和 层 析 于 1979 年 首次 从 红细胞 膜 中 纯化 了 质 膜 Ca?*-ATPase (Niggli et al. 1979), 并 且 发 现 钙 调和 蛋白 和 酸性 磷脂 都 可 以 最 大 激活 质 膜 Ca2-AT1 ia Wt Ca2*-ATPase ft Ca®* WK EG ie Bt Kn(Ca**) A 10 ~ 20umol/L PF BER 0.4 - L, Ca* AID KK 增加 。 16.2.1 ” 质 膜 Cax#+-ATPase 的 结构 及 其 调控 机 制 ES 由 于 质 膜 Ca**-ATPase 的 天 然 含 量 远 远 低 于 肌 浆 网 【网 Ca**-ATPase, ltt, A 196 前 还 没有 质 膜 Ca”-ATPase 的 三 维 结构 。 但 由 于 其 与 SERCA 的 相似 性 以 及 大 量 的 生化 和 氨基 酸 突 变 实 验 , 人 们 对 质 膜 Ca*-ATPase 的 结构 及 调控 机 制 有 了 更 进一步 地 了 解 。 二 级 结构 预测 表明 ,PMCA 与 SERCA 一 样 , 都 有 10 个 跨 膜 螺 旋 , N 端 和 C 端 都 在 胞 浆 内 ,PMCA 在 胞 质 区 有 4 个 部 分 (图 16-6) : 第 一 部 分 IN 端 ) 没 有 发 现 特殊 的 功能 ,; 第 二 部 分 是 由 40 个 筑 基 酸 组 成 的 呈 碱 性 片段 , 该 片段 可 以 结合 酸性 磷脂 , 使 PMCA 激 iG; 第 三 部 分 包括 催化 位 点 一 天 冬 肛 酸 及 其 下 游 140 个 氢 基 酸 , 包括 ATP 结 合 结构 域 和 FITC 标 记 位 点 等 ;第 四 部 分 为 调控 结构 域 , 包括 钙 调 蛋白 结合 位 点 、 和 蛋白 激酶 位 点 和 Ca 结合 位 点 等 总 的 来 说 , PMCA 与 SERCA 的 结构 基本 相似 , 主要 差别 在 于 C 端 .PMCA FA) C witty 70 ~ 200 4a HERR, If] SERCA AY C sig 4 20 ~ 70 42a FER. Flt, PMCA 与 其 他 P 型 ATPase 最 大 的 区 别 在 于 PMCA 的 多 种 调控 机 制 , 从 而 影响 其 功能 。 RE (F) Pe - p) OO=EepszeDae AO 2, 质 膜 Ca*-ATPase 的 拓扑 学 示意 图 红色 区 域 为 钙 调 蛋白 结合 区 , 深 黄色 区 为 酸性 磷脂 结合 区 , 粉 色 字 D 忆 K 分 别 为 磷酸 化 位 点 和 FITC 标记 位 点 |. Ca” § 4S PMCA. 的 C e414 EH Ca?* 32 FOr 4 (Hofmann et a!. 1993), 但 实验 表明 , 该 位 点 5 Ca®’ SR SiR FICK, TA FA Bk fete OC aig, PMCA 仍然 可 以 转运 Ca, FFA ia 197 #108 £5 FRIES PAE HR FS SF PERIZ IE HL till 性 升 高 。 显 然 ,Cax 的 结合 位 点 不 在 C 端 。 与 SERCA 比较 发 现 ,PMCA 只 有 在 M4 和 M6 上 两 个 酸性 氨基 酸 (Glu309 和 Asp800) 与 SERCA 高 度 保守 , 如 果 突 变 这 两 个 氨基 酸 , PMCA 将 失去 转运 Ca+: 和 形成 磷酸 化 中 间 体 的 能 力 。 显然 , 这 两 个 氮 基 酸 在 PMCA 转 运 Ca 过 程 中 起 着 关键 的 作用 。 由 于 SERCA 三 维 结构 的 解析 , 知 道 这 两 个 氨基 酸 相 当 于 SERCA 中 第 2 个 Ca 结合 位 点 , 该 结果 也 进一步 表明 SERCA 中 第 2 个 Ca 结合 位 点 比 第 1 个 结合 位 点 重要 ,SERCA 的 活性 构象 需要 结合 第 2 个 Ca*。 由 于 PMCA 只 有 1 个 Ca 结合 位 点 , 与 生化 实验 结果 每 水 解 1 个 ATP 分 子 只 转运 1 个 Ca’, Ti SERCA 转运 2 个 Ca+ 相符 合 。 2. 钙 调 蛋白 激活 PMCA 钙 调 蛋白 作用 于 PMCA 的 C 端 , 位 于 最 后 一 个 跨 膜 螺 旋 M10 的 下 游 40 个 氨基 酸 (James et al. 1988)。 在 没有 钙 调 蛋白 的 情况 下 , 这 段 氨基 酸 作为 “自动 抑制 ”结构 域 , 与 PMCA 在 胞 质 中 的 第 二 和 第 三 部 分 结合 , 使 离子 系 不 能 催化 翻转 , 而 使 PMCA 处 于 非 活性 状态 。 当 体系 中 加 入 钙 调 蛋白 , 由 于 钙 调 蛋白 与 C 端 “自动 抑制 ”结构 域 的 相互 作 用 , 从 而 释放 与 第 二 和 第 三 部 分 的 结合 位 点 , 使 酶 处 于 “开放 ”状态 , 离 子 系 被 完全 激 活 (图 16-7)。 细胞 外 细胞 内 质 膜 Ca?*-ATPase 的 调控 模型 左边 为 自动 抑制 状态 , 右 边 为 开放 状态 3, 酸 性 磷脂 激活 PMCA 酸性 磷脂 如 PS、PA 可 以 激活 PMCA,, 使 亲 合 Ca 的 米 氏 常数 天 ,下降 到 约 0.3hmol/L, 酸性 磷脂 激活 的 PMCA 不 能 被 钙 调 蛋白 进一步 激活 , 说 明 两 者 没有 县 加 效应 (Brodin et al. 1992)。 相 反 , 钙 调 蛋白 激活 的 PMCA 可 以 被 酸性 磷脂 进一步 激活 , 说 明 酸 性 磷脂 除了 作 用 于 钙 调 蛋白 的 位 点 外 , 还 有 其 他 的 作用 位 点 。 应 用 合成 短 肤 上 和 实验 证 明 , 酸 性 磷 脂 与 PMCA 有 两 个 作用 位 点 ,一 是 在 C 端 , 与 钙 调 蛋白 结 4 重合 , 另 外 一 个 是 在 胞 质 区 的 第 二 部 分 ,在 跨 膜 螺 旋 M3 的 上 游 (图 16-6), RPE ,于 PMCA, ia FR 的 机 制 还 不 是 很 清楚 。 AR PEWEETE AF Coin, AT HEAE RISE 动 抑制 结构 域 与 PMCA 的 相互 作用 , 从 而 使 PMCA“ 开 放 ” 激 活 PMCA。 而 酸 直 ”中 作 用 于 PMCA 胞 质 区 的 第 EBay, HORE FRAIL hh Nine FE WR Biomembranes 198 16.2.2 Jet Ca?*-ATPase 的 异 构 体 质 膜 Ca2-ATPase 是 多 基因 家 族 的 产物 , 有 4 种 基本 亚 型 ; PMCA1、PMCA2 、PMCA3 和 了 PMCA4。 与 SERCA 相似 , 由 于 基因 剪 切 位 点 的 不 同 , 每 一 种 亚 型 又 有 不 同 的 异 构 体 。 但 PMCA 比 SERCA 更 加 复杂 ,PMCA 有 近 30 种 不 同 的 异 构 体 。 在 不 同 的 组 织 及 生长 发 育 过 程 中 PMCA 各 亚 基 的 表达 情况 有 所 不 同 ,, 一般 来 说 ,,PMCA1 和 了 PMCA2 存 在 于 所 有 的 组 织 中 , 而 PMCA2 和 了 PMCA3 的 表达 却 是 非常 限定 , 主要 在 脑 组 织 和 条 纹 肌肉 中 表达 。 PMCA 在 组 织 生 长 发 育 过 程 中 的 表达 谱 目 前 数据 还 较 少 , 但 最 近 研 究 鼠 的 发 育 过 程 表 明 (ZACharlias et al. 1999),PMCA1 从 胚胎 一 开始 就 表达 , 说 明 PMCA1 执行 最 基本 的 功 能 , 而 PMCA2 和 了 PMCA3 要 到 胚胎 发 育 12.5 天 后 才 开 始 表 达 , 并 且 主 要 集中 在 神经 部 位 ,PMCA4 也 是 在 12.$ 天 后 开始 表达 , 但 表达 量 很 低 , 这 与 人 类 成 年 的 组 织 不 同 , 因 为 在 成 年 组 织 中 ,PMCA1 和 了 PMCA4 表 达 量 几乎 相当 。 1623 Jills Cat ATPase (0571501, gg 在 活体 中 研究 质 膜 Cax-ATPase, 特别 是 不 同 亚 型 的 功能 目前 还 有 相当 多 的 困难 : (1) 与 SERCA 不 同 , 毒 胡 葛 卜 素 是 SERCA 专 一 性 抑制 剂 , 而 目前 还 没有 PMCA 的 专 一 性 抑 制剂 , 这 阻碍 了 在 细胞 和 组 织 水 平 研究 PMCA 的 结构 和 功能 ,(2) 虽然 可 以 用 Ca 成像 技术 观察 细胞 内 Ca 的 变化 , 但 细胞 株 通常 表 达 不 同 亚 型 的 PMCA,, 而 每 种 PMCA,, 人 它 们 能 的 功能 又 不 尽 相 同 , 因 此 细胞 内 Ca* 的 变化 是 所 有 亚 型 PMCA 的 共同 效应 ,而 不 能 反应 特定 亚 型 PMCA 的 功能 。 目前 在 细胞 水 平 观察 PMCA 的 功能 , 通常 使 用 其 他 转运 Ca 蛋 自 的 抑制 剂 。 一 般 细胞 中 Ca 的 清除 主要 有 3 种 蛋白 ; PMCA、 质 膜 Na Ca? 交换 体 和 SERCA, 它 们 能 将 胞 浆 中 Ca” 转运 到 内 质 网 内 。 因 此 可 以 用 毒 朗 葛 下 素 专 一 性 抑制 SERCA, 在 细胞 外 将 Na’ 介质 换 成 四 乙 基 胺 离子 阻碍 NavCar 交换 体 , 这 样 观察 到 的 细 胞 内 Ca 变化 即 为 PMCA 的 贡献 。 总 之 ,Car 作为 第 二 信使 在 生命 中 起 着 非常 重要 的 作用 , 很 多 生命 现象 如 细胞 调 亡 与 细胞 内 Ca 有 着 密切 的 关系 。 虽 然 质 膜 NavVCa* 交换 体 也 可 以 调控 胞 浆 中 Ca* 的 浓度 (Blaustein et al. 1999), 但 钙 泵 (PMCA 和 SERCA) 是 维持 细胞 内 CaP 动态 平衡 的 主要 调控 者 。 要 清楚 了 解 钙 系 的 功能 、 三 维 结构 的 解析 , 特 别 是 在 不 同 中 间 体 的 结构 , 这 对 于 了 解 钙 和 泵 的 催化 机 制 有 着 重要 的 意义 。 目 前 已 报道 了 SERCA 的 E, 和 了 2 构象 的 结构 , 其 他 中 间 体 的 结构 如 在 磷酸 化 状态 的 结构 等 正在 研究 过 程 中 。 虽 然 PMCA 和 SERCA 有 很 大 的 相似 性 , 但 功能 上 还 有 很 大 的 差别 , 目 前 有 关 PMCA 结构 研究 还 很 少 , 这 与 较 难得 到 足够 量 的 PMCA 有 关 。 研 究 表 明 , 钙 系 的 生理 功能 非常 复杂 ,这 与 它们 存在 多 种 亚 型 以 及 每 种 亚 型 的 功能 又 不 相同 密切 相关 。 在 不 同 的 组 织 和 不 同 的 生长 阶段 , 钙 泵 各 种 亚 型 的 表达 情况 也 不 相同 , 这 进一步 增加 了 研究 的 复杂 性 , 如 基因 项 除 PMCA2 可 使 老鼠 耳 大 (Street et al. 1998), 因 此 , 征 系 与 疾病 的 关系 现在 已 开始 成 为 研究 热点 。 (SK ALAC) Blaustein M P, Laerer W J. 1999. Sodium/Calcium exchange:its >» ysiological implications. Physiol Rev, 79: 763-854 199 #108 £5 Fe IES FAL Hi De ES FF PEARS IE HL tll Brodin P, Falchetto R, Vorherr T, et al.1992. IdentifiCation of two domains which mediate the binding of activating phospholipids on the plasma membrane Ca** pump. Eur J Biochem, 204: 939-946 Carafoli E, Brini M. 2000. Calcium pumps: structural basis for and mechanism of calcium transmembrane transport. Curr Opin Chem Biol, 4: 152-161 Dux L, Martonosi A. 1983. Ca?*-ATPase membrane crystals in sarcoplasmic reticulum.The effect of trypsin digestion. J Biol Chem, 258:10111-10115 Ebashi S, Lipmann F. 1962. Adenosine-triphosphate-linked concentration of Calcium ions in a particular fraction of rabbit muscle. J Cell Biol, 14: 389-400 Hofmann E, James P, Vorherr T, et al. 1993. The C-terminal domain of the plasma membrane Ca** pump contains 3 high affinity Ca** binding sites. J Biol Chem, 268: 10252-10259 Inesi G, Sagara Y. 1994. 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Biochim Biophys Acta, 1428: 397-405 zen WR 泡 转 运 与 细胞 内 mane Noe 17.1 Sp SLA Poy YR eS TE HSS PE ID eee eee eceececeeeneeeeeenneenneeneeen 200 @ 71) SCGEROHEN LL eee 201 712 COP T Ae oO 201 17.13 CORTE OBE REID * 体 , 通 过 与 圳 泡 跨 膜 蛋白 的 | 胞 浆 区 相互 作用 , 直 接 或 间接 地 控 剂 着 细胞 内 物质 〈 和 蛋白 质 、 脂 质 等 ) 的 分 拣 与 定向 转运 。 201 $172 $70 F612 SAVIN tei AnICAIER A 3 MERWE ORE. MwA A (clathrin) 包 被 , MAIER, AMAIA COP I eee AN COP Il WRF. 17.1.1 Fe AZ 1 mm 在 电子 显微镜 下 观察 , 可 以 看 到 真 核 细胞 内 一 般 都 有 一 种 直径 约 为 50 一 100 nm 内 心 铁 空 的 稳定 笼 状 结构 , 这 就 是 我 们 通常 所 说 的 笼 形 蛋白 包 被 圳 泡 。 笼 形 蛋白 由 180 kDa 的 重 链 和 35 kDa 的 轻 链 组 成 , 每 3 个 重 链 和 3 个 轻 链 组 成 三 曲 车 (triskelion) 结构 单位 , 三 曲 璧 单位 彼此 交 和 又 组 装 成 六 边 形 网 格 。 被 称 为 Ap 复合 体 (assembly polypeptides) 的 一 类 胞 浆 可 溶性 蛋白 复合 物 可 与 笼 形 蛋白 及 圳 泡 跨 膜 蛋 白 相 结合 ,与 笼 形 蛋 白 网 架 的 组 装 及 器 膜 蛋白 胞 浆 区 分 拣 信 号 的 识别 密切 相关 。 目 前 已 发 现 三 类 具有 不 同 起 源 和 功能 的 Ap 复合 物 , Apl 位 于 反 式 高 尔 基 管 网 结构 (TGN), 参 与 溶 酶 体 酶 的 转运 ,Ap2 位 于 质 膜 附 近 , 参 与 胞 吞 过 程 ,Ap3 是 近年 发 现 的 一 类 Ap 复合 物 , 结 构 同 前 两 者 类 似 , 但 与 笼 形 蛋白 没有 亲 和 性 , 功 能 尚 不 清楚 。 在 笼 形 蛋 白 包 被 圳 泡 组 装 过 程 中 , 还 受到 很 多 激酶 、 受 体 或 其 他 蛋白 的 影响 , 如 发 动 蛋白 (dynamin) 等 。 发 动 蛋白 是 一 种 约 有 900 个 氨基 酸 , 可 以 结合 并 水 解 GTP 的 胞 浆 蛋 白 , 在 细胞 中 表达 了 无 法 结合 GTP 的 发 动 蛋 白 突 变 体 , 将 阻 断 包 被 圳 泡 的 形 成 。 笼 形 蛋白 包 被 圳 泡 在 胞 浆 pPH 和 离子 强度 下 是 稳定 的 ,但 这 种 圳 泡 通 常 在 刚刚 形成 后 就 会 失去 洛 形 蛋 白 包 被 和 组 装 颗粒 。 真 核 细 胞 中 存在 的 Hsp70 等 分 子 伴侣 可 以 和 笔 形 蛋 白 的 轻 链 结合 , 并 引起 ATP 水 解 , 以 破坏 笼 形 蛋白 之 间 的 相互 作用 , 导 致 解 聚 , 使 笼 形 蛋白 进入 新 的 圳 泡 循环 。 笼 形 蛋白 包 被 圳 泡 主 要 形成 于 质 膜 或 TGN, 在 质 膜 内 吞 及 TGN 向 质 膜 运输 的 途径 中 发 挥 作 用 。 17.12 COP | (755 2 {© mmm COP I (2) ie 9E 18 Be PE CEM i RAE RAR EY & ea FB AE ALY, 1X HEPA K/)—-M, Hez2y 75 nm, 在 胞 浆 面 有 约 18 nm 厚 的 绕 毛 状 外 被 。 圳 泡 包 被 经 纯化 后 , 发 现 含 有 8 个 蛋白 , 其 中 1 个 为 ADP- 核糖 化 因子 (ADP ribosylation factor,ARF) , 其 余 7 个 均 属 于 COP I。 这 7 个 蛋白 按 一 定 比 例 在 胞 浆 中 以 复合 体 的 形式 存在 , 故 被 命名 为 外 被 体 (coatomer) 。COP I 是 这 类 圳 泡 的 主要 组 成 部 分 , 在 哺乳 动物 和 酵母 中 COP 序列 显示 有 高 度 的 同 产 性 ,表明 COP 在 进化 中 具有 高 度 的 保 ARF 是 一 种 胞 浆 内 的 可 溶性 GTP 结合 蛋白 , 分 子 质量 约 为 21 kDa, 属 Ras 蛋白 超 家 族 , 主要 参与 外 被 体 结构 的 组 装 , 像 分 子 开关 一 样 对 圳 泡 的 形 乒 起 重要 的 调控 作用 。 但 它 的 结构 与 Rab 有 所 不 同 , 其 C ate DAE Ase, Nie oS A SRR, HERE 点 有 利于 它 与 脂 膜 的 结合 。ARF-GDP 与 膜 上 的 GTP 交 换 EF) 相互 作用 , 使 GTP 取代 GDP。 与 GTP 结 合 后 , 构 象 变化 使 ARF-GTP 的 Ni 竹 曙 旋 结构 暴露 于 分 子 表 面 。 然 后 , 这 一 足 水 性 螺旋 被 插入 供 体 膜 中 , 从 而 使 AF 。” 供 体 膜 结 合 , 而 结合 于 膜 表 面 的 ARF-GTP 引发 吉 泡 的 形成 过 程 。 < 3 Hy WR Biomembranes 202 COP I (2 pe FEV E BEB 5 ey REAR APD ra A Md YE ST De ey RE AK TN 网 的 逆向 转运 , 并 协同 COP 1 E45 APN i A fd ey RE AYSIU Ta FS, VAR AG SOR EY 它 还 可 能 参与 由 高 尔 基 体 反 面 到 后 期 胞 内 体 (late endosome) 和 细胞 质 膜 的 圳 泡 运 输 过 程 , 也 可 能 参与 胞 吞 过 程 。 17.13 COP TI (1157 (62 mmm COP I a A ASHE EU EE Sec 蛋白 家 族 。 它 的 核心 组 成 包括 1 个 小 分 子 质量 的 GTP 水 解 酶 Sarlp 和 2 个 大 分 子 质量 的 蛋白 异 二 聚 体 复合 物 亚 基 : Sec23p-Sec24p 与 Sec13p- Sec31p。 在 COP Il @ekeeiw Mc fe , Sarlp 和 Sec23p-Sec24p 结合 , 形 成 前 胞 芽 复 合 物 (pre-budding complex), [fj Secl3p-Sec31p 则 形成 外 层 结构 。COP Il Wei $B 参与 内 质 网 到 高 尔 基体 的 顺 向 运输 。 17.2 PA Ja A Fal ies 218 AE SZ [a] YD PE ee Ss aa ALLEL LEELA ELLIE 内 质 网 (endoplasmic reticulum, ER) 是 真 核 细 胞 中 最 大 的 膜 结构 。 它 由 封闭 的 膜 系统 及 周围 的 腔 形 成 互相 沟通 的 网 状 结构 , 是 细胞 内 除 核酸 外 的 一 系列 重要 的 生物 大 分 子 如 蛋白 质 、 脂 类 和 糖 类 合成 的 基地 , 分 为 粗 面 内 质 网 和 滑 面 内 质 网 。 粗 面 内 质 网 (rough endoplasmic reticulum, rER) 膜 表 面 附着 有 大 量 的 核糖 体 , 是 膜 蛋白 、 分 泌 和 蛋白 合成 的 场所 。 滑 面 内 质 网 (smooth endoplasmic reticulum, sER) 膜 上 没有 核糖 体 附 着 , 是 脂肪 酸 及 磷脂 合成 和 代谢 的 部 位 。 | 高 尔 基 体 (Golgi complex) 是 一 系列 连续 的 膜 性 局 平 吉 泡 ,, 在 高 尔 基 体 周 围 有 许多 近乎 球形 的 膜 性 圳 泡 。 高 尔 基 体 具 有 明显 的 极 性 , 徘 近 内 质 网 的 一 侧 , 称 为 顺 面 〈cis face) , 远 离 的 一 面 称 为 反面 (trans face) 。 近年 来 , 对 高 尔 基 体 的 形态 结构 进行 深入 研究 表明 , 高 尔 基 体 至 少 由 互相 联系 的 3 个 部 分 组 成 , 每 个 部 分 的 形态 、 化 学 组 成 、 所 包含 的 酶 和 功能 各 不 相同 。 1. 高 尔 基 体 顺 面 的 网 状 结构 (cis-Golgi network, CGN) CGN 主 要 接受 来 自 ER 新 合成 的 物质 , 并 将 其 分 类 后 大 部 分 转 和 高尔基 体 中 间 膜 圳 , 小 部 分 再 返回 内 质 网 。 返 回 内 质 网 的 和 蛋白质 具有 KDEL 信号 序列 , 它 是 驻 留 在 内 质 网 内 蛋白 的 特有 序列 。 2. BREA AR (medial Golgi) 主要 由 扁平 膜 圳 与 管道 组 成 ,形成 不 同 间隔 , 但 功能 上 是 连续 完整 的 。 多 数 糖 基 化 修饰 、 糖 脂 的 形成 以 及 与 高 尔 基体 有 关 的 多 糖 合成 都 发 生 在 中 间 膜 圳 中 。 3. 高 尔 基 体 反 面 的 网 状 结构 (trans-Golgi network, TG) TGN 位 于 反面 的 最 外 层 , 与 反面 的 局 平 吉 相 连 , 另 “ 则 伸 入 反面 的 细胞 质 中 ,形态 呈 管 网 ,并 有 圳 泡 与 之 相连 。TGN 的 主要 功能 是 参与 径 ! 质 的 分 类 和 包装 ,最 后 从 高 尔 基 体 中 :出 。 有 观点 认为 ,IGN 在 蛋白 质 和 脂 类 的 转运 过 程 中 , 还 起 到 “ 扒 膜 ”的 作 用 , 保 证 远 “Py IA) Ay a FEISS 203 1/72 ie SAAD ek 17.2.3 Fei Fei (EIN LIM Allis 782 ASIA) AY 2S 4m 许多 研究 表明 , 胞 质 内 的 绝 大 多 数 细胞 器 都 处 于 一 个 动态 的 、 完 整 的 网 络 系统 中 , 以 至 于 各 类 细胞 内 物质 可 以 高 效 、 有 序 地 进行 运输 。 内 质 网 合成 的 物质 需要 按照 不 同 的 方式 分 别 运 输 到 达 细 胞 的 特定 部 位 而 发 挥 作 用 。 其 中 一 部 分 要 成 为 驻 留 蛋白 等 停留 在 内 质 网 膜 上 或 腔 内 , 另 一 部 分 经 高 尔 基 体 加 工 、 转 运 到 细胞 的 其 他 部 位 , 如 细胞 核 、 线 粒 体 、 溶 酶 体 等 细胞 绒 或 形成 分 泌 圳 泡 排出 到 细胞 之 外 。 同 时 , 也 会 有 部 分 物质 通过 逆 癌 途径 , 逆 癌 转 运 到 内 质 网 。 因 此 , 内 质 网 和 高 尔 基体 之 间 的 圳 泡 运输 起 到 关键 作用 。 1. 从 内 质 网 到 高 尔 基体 从 内 质 网 到 高 尔 基体 的 圳 泡 转 运 是 属于 自发 的 、 无 分 选 的 膜 流 方式 ,COP I sp Six 类 转运 过 程 。 在 粗 面 内 质 网 和 高 尔 基体 中 间 , 存在 一 个 比较 大 的 空间 , 被 称 为 内 质 网 一 高 尔 基 体 间隔 区 (endoplasmic reticulum Golgi intermediate compartment,ERGIC)。 在 这 个 区 域 , 从 内 质 网 膜 出 芽 的 吉 泡 有 时 会 互相 聚集 而 形成 一 个 较 大 的 具有 圳 泡 和 互通 管 腔 结构 , 称 A vesicular-tubular cluster (VTC) 。 形 成 VTC 之 后 , 它 可 以 移动 到 远离 内 质 网 而 靠近 高 尔 基体 顺 面 的 位 置 , 以 便 发 生 进一步 的 吉 泡 转运 。 2. 从 高 尔 基体 到 内 质 网 从 高 尔 基体 到 内 质 网 的 赛 泡 转 运 是 由 COP I 介 导 的 ,主要 是 将 部 分 需要 在 高 尔 基体 进行 修饰 的 蛋白 等 内 one is ae Be 质 网 驻 留 物 质 返 转运 到 内 质 网 中 。 一 一 一 上 r|- Dog an 以 蛋白 质 为 例 , 一 般 内 质 网 驻 ore 留 蛋 白 在 其 C 端 都 具有 特异 性 的 氨基 tel 6: iam — Ye 酸 序列 , 如 KDEL。 具 有 这 个 序列 的 蛋白 质 在 合成 之 后 , 就 会 驻 留 在 内 质 网 腔 中 , 如 分 子 伴 侣 蛋白 Bis 等 。 但 有 些 蛋 白 必 须 经 过 高 尔 基体 的 各 类 修 饰 , 随 圳 泡 转 运 出 内 质 网 。 如 何 将 它 们 运 回 内 质 网 , 将 是 一 个 关键 问题 。 研究 表明 , 在 高 尔 基体 膜 上 存在 一 些 ai he 本 VE © 过 修饰 之 后 , 会 和 这 类 受 体 结 合 , ee 定 在 高 尔 基体 膜 上 。 然 后 , ee of \ HH TE GRY” See, Wate eRe, 再 回 到 ae = a ee O° : » COP II 3. 高 尔 基体 内 部 的 圳 泡 转 运 ‘Oy 8 由 于 高 尔 基 体内 部 膜 圳 是 相对 独立 的 结构 , Al, fea -_ 次 转运 (图 17-1) , 才能 从 顺 面 到 达 8 内 圳 泡 运 输 示意 图 me KE Wy i Biomembranes 204 面 。 有 证 据 表 明 COP] WRB Six Pet fe, (LAA AHL HI A ia 17.3 TURE CAE 3S AL ill any L731 AIG. (211 (5 细胞 分 泌 途 径 (secretory pathway) 是 真 核 细胞 中 蛋白 质 转 运 的 经 典 方式 。 蛋 白质 在 粗 面 内 质 网 中 合成 后 , 进 入 高 尔 基 体 经 过 一 系列 翻译 后 修饰 , 然 后 转运 至 吉 泡 , 通 过 出 芽 (budding) 方式 脱离 高 尔 基体 到 达 不 同 的 位 置 , 比 如 质 膜 、 溶 酶 体 、 植 物 细胞 中 的 液 泡 等 。 细胞 分 泌 活 动 分 为 两 种 类 型 : 组 成 型 分 泌 (constitutive secretion) 和 调节 型 分 泌 (regulated secretion) 。 2A MY ie Fa ict eas SB Att ea, 随即 连续 的 进行 释放 。 大 多 数 细胞 都 采用 这 种 方式 , 它 不 仅 可 以 促成 细胞 外 环境 的 形成 , 也 对 维持 质 膜 的 稳定 有 着 重要 意义 。 一 般 膜 蛋 白 是 通过 组 成 型 分 泌 的 方式 被 转运 的 。 存 在 于 小 泡 内 的 膜 蛋白 被 转 运 到 质 膜 , 当 小 让 和 胞 膜 融 合 后 , 这 些 膜 蛋白 就 存在 于 质 膜 上 , 开 始 发 挥 特有 的 生理 功 能 。 同 时 细胞 内 吞 形成 的 小 息 又 可 以 把 部 分 质 膜 和 膜 蛋白 回收 进 细 胞 内 , 经 深 酶 体 处 理 后 , 蛋 白质 被 降解 或 再 次 循环 成 为 膜 蛋 白 , 从 而 完成 质 膜 转 运 的 动态 平衡 过 程 。 调节 型 分 泌 是 指 分 泌 物 质 在 合成 后 并 不 立即 释放 , 而 是 储存 在 大 量 的 圳 泡 中 , 这 些 圳 泡 会 聚集 在 质 膜 内 侧 相 对 集中 的 区 域 ,直到 细胞 接收 到 适当 的 刺激 才 会 引起 释放 。 调节 型 分 泌 一 般 发 生 在 内 分 泌 细 胞 分 泌 激 素 、 神 经 细胞 释放 神经 递 质 等 生理 活动 中 。 图 17-1 的 圳 泡 分 泌 过 程 , 就 是 一 个 典型 的 调节 型 分 泌 。 17.3.2 GPU ANI IR Ais RETO IZ DF mms 1. 分 泌 和 蛋白 的 合成 分 泌 和 蛋 白 和 膜 蛋白 的 合成 与 其 他 类 型 蛋白 的 合成 方式 不 同 , 它 是 通过 连 在 粗 面 内 质 网 上 的 多 聚 核糖 体 完成 的 。 研 究 者 们 发 现 , 多 聚 核糖 体 上 的 多 肽 链 能 够 直接 插入 内 质 网 的 管 蚂 , 现 在 已 经 证 明 有 信号 肽 参与 引导 此 类 和 蛋白质 的 合成 。 信号 肽 是 蛋白 质 端 一 段 特殊 的 肽 链 , 大 约 有 30 个 氨基 酸 组 成 。 当 分 泌 蛋 和 白 开 始 合 成 时 , 信号 肽 和 一 个 小 核糖 核 蛋白 体 一 一 信号 识别 颗粒 (signal recognition particle, SRP) 形成 一 段 信号 序列 。 当 核糖 体 结合 到 SRP 之 后 ,形成 的 复合 物 继而 与 粗 面 内 质 网 上 的 另 一 受 体 一 一 停靠 蛋白 (docking protein, DP) 结合 ,并 将 SRP 取 代 下 来 , 使 足 水 性 的 氨基 酸 信和 号 肽 插入 到 内 质 网 膜 中 , 粗 面 内 质 网 的 质 膜 出 现 一 个 通道 ,新生 肽 链 的 N 端 通过 此 a dt A eee, mRNA 在 多 聚 核糖 体 上 的 翻译 继续 进行 。 随 着 肽 链 的 不 断 合成 , 肽 链 继 续 通 过 内 质 网 膜 进入 管 腔 , 这 种 翻译 和 跨 膜 同时 进行 的 方式 , 称 为 伴 翻译 合成 。 在 内 质 网 完成 合成 的 步骤 之 后 , 分 泌 蛋 和 白 会 随 着 吉 泡 转运 到 高 尔 基体 。 在 这 里 ,将 进行 一 系列 的 修饰 、 分 类 , 才 使 可 分 泌 的 物质 具有 不 同 的 生理 特性 , 并 且 以 特定 的 组 合 方式 , 被 包 庄 在 分 泌 圳 泡 中 。 2. Sil) JR AAA 很 多 “ 究 表明 ,可 供 分 泌 的 蛋白 颗粒 在 高 尔 基体 反面 即将 被 包装 前 , 会 有 一 些 特异 性 的 聚集 ,; “类 聚集 的 信号 可 以 引导 高 尔 基体 出 芽 的 位 点 和 方式 , 从 而 使 分 泌 圳 泡 获 得 205 1/72 Ry a FAMB AY oe $n Fir ris ZEAY 57 Wh UAL 在 许多 细胞 中 , B52 TE res RAE ARTZ BAY / RE Be 5c had — A ah ack Be EI BOBCAT Re. FILEPATH, FP EN ALS BP BEY ld AA 互 融合 。 相 互 融合 被 SNARE 复合 物 调 控 , 该 复合 物 的 其 中 一 种 组 分 是 突 触 融合 蛋白 6 (syntaxin 6) 。 融 合 发 生 后 , 突 触 融合 蛋白 6 可 能 和 VAMP4 形成 融合 后 复合 物 , 该 复合 PRA ARF 和 AP1, 并 局 动 党 形 蛋 白 包 被 吉 泡 介 导 的 转移 途径 , 该 转移 途径 会 移 走 成 熟 宫 泡 不 需要 的 物质 和 一 些 分 泌 抑 制 分 子 , 如 突 触 结合 蛋白 IV (synaptotagmin IV) , 这 一 过 程 依赖 于 钙 调 蛋白 激酶 工 引 起 的 磷酸 化 作用 。 和 蛋白 磷酸 化 酶 PP2A 可 使 磷酸 酶 去 磷酸 化 , 从 而 解除 内 吞 小 泡 与 胞 内 体 融 合 的 阻碍 。 1733 BDA ULIS A Ts 57 F 1m “细胞 分 泌 活 动 是 一 个 十 分 复杂 的 循环 过 程 , 包括 分 泌 圳 泡 的 转运 (translocation) 、 定 回 (targeting), ##A(tethering), jAa)(priming), fit (triggering), fa A(fusion), fxr (exocytosis) 、 胞 吞 (endocytosis) 等 步骤 (图 16-1) ,在 循环 过 程 的 每 个 阶段 都 有 多 种 蛋白 和 复杂 的 生物 化 学 因素 进行 调控 。 l. Hig, EMMA Sy Wh BETTE tes OR HE PS EG CZ Jia ss BE EH Je Et FB 能 定向 的 到 达 靶 区 域 。 微 管 、 微 丝 等 细胞 骨架 成 分 可 能 在 圳 泡 的 转运 过 程 中 起 着 重要 的 作用 。 历 移 的 主动 转运 一 般 被 认为 是 一 个 耗 能 的 过 程 , 需 要 ATP 的 参与 。 细 胞 骨架 相 关 有 蛋 自 如 肌 球 蛋白 (myosin)、 肌 动 蛋 白 (actin) 等 均 参 与 圳 泡 的 转运 。 肌 球 蛋 白 与 钙 调 素 、Ca 连接 , 能 够 改变 肌 球 蛋白 的 机 械 化 学 和 酶 活性 , 从 而 影响 着 圳 泡 的 运输 。 另 外 , 一 些 驱动 蛋白 (kinesin), AAA (dynein) 等 也 被 发 现 可 能 参与 了 圳 泡 沿 细胞 骨架 的 运输 。 转运 到 分 泌 膜 区 的 圳 泡 必须 找到 合适 的 分 泌 位 点 , 才能 进入 后 续 的 分 泌 过 程 。 与 定 向 有 关 的 蛋白 主要 是 Sec6/8 复合 体 , 它 与 某 些 细胞 骨架 蛋白 相连 , 很 可 能 与 细胞 骨架 一 起 决定 吉 泡 的 定 同 , 同 时, 该 复合 体 也 可 能 介 导 圳 泡 和 质 膜 的 直接 相连 。Sec6/8 是 一 个 很 大 的 蛋白 复合 体 , 主要 参与 小 泡 的 定向 , 在 酵母 上 被 称 为 胞 吐 圳 (exocyst) , 包括 sec3、 sec5, sec6, sec8, secl0, secl5 Fil exo70 EAA", 1996 年 在 神经 元 上 发 现 了 它 的 同 源 和 蛋白 复合 物 , 称 为 Sec6/8 复合 体 , 主 要 位 于 神经 突 触 的 质 膜 , 复 合体 通过 依赖 细胞 骨 架 和 不 依赖 细胞 骨架 的 方式 发 挥 作用 。 最 近 的 研究 表明 , 它 只 存在 于 发 育 中 的 突 触 , 并 作为 激活 区 成 分 的 早期 组 织 者 。 当 圳 泡 接近 细胞 质 膜 时 , 一 些 推 系 因子 (tethering factor) 相互 作用 ,将 圳 泡 拉 近 到 受 体 膜 表面 , 介 导 宫 泡 与 质 膜 的 可 逆 性 贴 附 〈 捡 系 )。Rab 是 胞 浆 中 一 类 低 分 子 质量 的 具 有 GTP 水 解 酶 活性 的 蛋白 质 ,广泛 存在 于 从 酵母 到 人 类 的 组 织 中 。,Rab 可 以 引导 转运 圳 泡 到 达 其 正确 的 目的 地 , 决定 圳 泡 与 受 体 膜 融合 的 专 一 性 . 六 b 扣 白 全 都 含有 约 200 个 氨基 酸 残 基 , 并 且 具 有 相似 的 结构 , 但 针对 不 同 的 细胞 ! 让 性 的 异 构 体 。Rab3A 是 GTPase 的 ras 超 家 族 的 一 个 成 员 , 一 般 认 为 它 与 其 他 | iTP ABE PEE Ih], HA 等 过 程 中 发 挥 着 重要 的 作用 。 以 突 触 前 膜 为 例 ,Rab3A 会 附着 在 其 效应 复合 物 〈 如 WME) 上 , 如 采 此 时 圳 泡 已 经 处 于 一 个 相对 稳定 状态 ”Rab3A 可 以 有 足够 的 时 间 去 . HE Wy fi Biomembranes 206 7k iREN GTP, Fats Gite kT. fx Pale, ith Ww see FE 存在 一 个 准确 的 匹配 关系 。Rabs BERT 2 TAY 5 FEVaNRZE A, Say GDP 解 离 抑制 剂 (GDP-dissociation inhibitor, GDI) 形成 复合 物 , 游 离 于 胞 浆 中 。 当 神经 元 处 于 静 息 过 程 中 ,Rab3 与 GTP 结 合 , 当 有 党 香 传 和 人 时 ,Rab3 水 解 GITP 为 GDP, 此 时 Rab3-GDP 5% 泡 膜 解 离 而 与 GDI 结 合 , 而 当 圳 移 分 泌 之 后 ,Rab3 与 GDI 分 离 , 再 通过 GDP-GTP 转变 重新 结合 到 新 锚 定 的 吉 泡 上 。 在 酵母 中 ,Rabs 与 Usolp/p115 共 同 作 用 , 将 吉 泡 与 受 体 膜 连接 在 一 起 或 对 脂 膜 进 行 修饰 , 以 促进 捡 系 。 2. 锚 定 和 局 动 与 细胞 膜 形 成 捡 系 的 吉 泡 与 质 膜 形成 更 紧密 的 结合 成 为 锁定。 起 初 认 为 锚 定 是 一 个 AN ay ot act Be, Te AY WE a ee BA Fi Ze AY FEY th AT DA ay eA Tel BR, BE A SE es 经 过 一 种 被 称 为 启动 (priming) 的 过 程 , 才 能 具备 融合 的 能 力 , 成 为 一 类 称 之 为 可 释放 的 圳 泡 (readily releasable vesicle) 。 一 般 认 为 , 销 定 和 局 动 的 过 程 需 要 SNARE 蛋 自 复合 体 的 形成 。SNARE 蛋白 最 初 是 作为 X- 乙 基 马 来 酰 亚 胺 敏感 因子 (V-ethyl maleimide sen- sitive factor, NSF) 和 可 溶性 NSE 附着 蛋白 (soluble NSF attachment protein, SNAP) 的 受 体 被 发 现 的 ,因此 被 称 为 SNAP 受 体重 白 , 即 SNARE 2A]. SNARE fh 3 fae 2A xX: #2275 4 (synaptobrevin) (也 称 作 VAMP, 即 vesicle-associated membrane protein) 由 于 处 于 吉 泡 上 , 故 又 称 v-SNARE;, 突 触 融 合 蛋 白 (syntaxin) 和 SNAP-25 (25 kDa synap- tosomal-associated protein) , 由 于 它们 位 于 靶 膜 上 , 故 又 称 tSNARE。SNARE 和 蛋白 既 可 以 在 同一 膜 上 形成 异 三 聚 体 核心 复合 物 (cis-SNARE complex) , 也 可 以 在 不 同 的 膜 之 间 形成 复合 物 (trans-SNARE complex) 。 研 究 表明 ,trans-SANRE 核 心 复合 物 的 形成 可 能 是 圳 泡 启 动 的 关键 步骤 。trans-SNARE 核 心 复合 物 以 松散 和 紧密 两 种 状态 存在 , 分 别 对 应 于 两 种 不 同 状态 的 圳 泡 。SNARE 核 心 复合 物 是 一 个 杆 状 四 螺旋 束 , 核心 的 四 螺旋 束 在 相互 接触 处 都 有 一 个 由 1 个 玻 水 残 基 构 成 的 亮 禹 酸 拉 链 层 。 在 复合 物 的 中 心 , 有 一 个 保守 的 离子 层 , 它 由 1 个 精 气 酸 和 3 个 谷 所 酰胺 残 基 组 成 , 这 4 个 筑 基 酸 残 基 分 别 来 自 于 4 个 曙 旋 束 , 这 个 离子 层 通 过 四 周 的 玻 水 层 与 水 隔绝 。 SNARE 和 蛋白 复合 物 的 形成 受到 多 种 因素 的 调节 ,从 而 可 以 通过 调控 可 释放 圳 泡 的 数 目 达 到 精确 调控 分 泌 的 目的 。SM 和 蛋白 和 Munc13 蛋 白 可 能 在 此 过 程 中 起 着 重要 作用 。SM (Secl/Muncl8) 和 蛋白 家 族 是 一 类 与 分 泌 相 关 的 亲 水 性 蛋白 质 , 分 子 质量 一 般 为 60~70 kDa, 能 以 多 种 结合 方式 与 突 触 融 合 蛋 白 家 族 结合 , 进而 参与 细胞 的 分 泌 调 控 。 到 目前 为 止 , 已 经 在 线虫 、 酵 母 和 哺乳 动物 中 发 现 了 多 种 SM 和 蛋白 , 都 被 证 明 参 与 了 圳 泡 分 泌 。 编 码 SM 绰 白 的 基因 人 缺失 后 能 完全 阻止 细胞 分 泌 , 然而 研究 过 量 表达 Munc18 对 细胞 分 泌 的 作用 却 得 到 了 完全 相反 的 结论 。 在 有 果 蝇 中 过 量 表达 Munc18 抑 制 了 神经 递 质 的 释放 ; 但 是 肾上腺 嗜 铬 细胞 中 过 量 表达 Munc18-1 却 增加 了 细胞 的 分 刻 。Munc18 参 与 圳 泡 分 泌 调 控 的 具体 机 制 目前 尚 不 清楚 ,但 相关 研究 提示 SM 蛋 白 可 能 参与 调节 SNARE 的 装配 过 程 。 在 SNARE 核 心 复 合 物 形 成 之 前 ,Munc18 与 处 于 闭合 格 肥 的 突 触 融合 蛋白 结合 ,阻止 突 触 融合 蛋白 与 其 他 SNARE 和 蛋白 的 结合 。 一 旦 分 泌 过 程 尼 ,Munc18- 突 触 融合 蛋白 复合 体 解 离 , 使 得 突 触 融合 蛋白 的 空间 构 型 由 闭合 状态 转 为 天 IRAS, 并 与 VAMP 和 SNAP- 25 #2), PWC trans-SNARE 复合 物 , 并 进一步 形成 紧密 核心 复合 物 , 使 喜 泡 膜 与 质 膜 相 互 靠 近 , 此 时 圳 移 处 于 预 融合 (prefusion) 状 态 , 即 完成 启动 过 程 。 207 172 Hiatic SAAD Teh HE ft — HE 5) wh RAS aE A Eo Ct EZ ok Fe], 如 最 近 的 工作 表明 Munc-13 蛋白 可 能 是 促进 Munc18- 突 触 融合 蛋白 复合 体 解 离 的 关键 蛋白 。 线 虫 wzc713 突变 体 起 初 是 作 为 一 大 群 突变 体 的 成 员 之 一 而 发 现 的 , 这 些 突变 体 都 有 一 个 不 等 位 的 表 型 基因 , 故 称 MIiC。MHC 基 因 突 变 引 起 部 分 或 完全 次 痪 ,xnc713 是 zzc 突 变 体 的 一 个 亚 类 ,其 在 哺乳 动物 的 同 源 物 称 Munc13。 目 前 在 哺乳 动物 已 经 发 现 Munc13 有 4 个 亚 型 , 分 别 是 Munc13-1、 2、3、4。 所 有 Munc13/mnc13 都 有 一 个 复杂 的 含 羟基 的 C1 结 构 域 , 这 个 C1 结 构 域 和 PKC 的 Cl 结构 域 类 似 , 能 结合 二 酰 甘油 (DAG), 故 认为 Muncl13 与 PKC 在 DAG 第 二 信使 通道 中 可 能 起 平行 作用 。 除 C1 结合 域外 还 有 2~3 个 C2 结 合 域 ,C2 结合 域 是 Ca’’/ 磷脂 的 结合 位 点 , 也 可 以 作为 与 不 同 蛋 白 相 互 作用 的 结构 域 。 有 多 种 蛋白 可 与 Munc13 相 互 作 用 ,包括 突 触 融合 蛋 自 、Maunc18、Doc2 、 征 调和 蛋白 (calmodulin) 等 。Munc13 ¢F #7947 刻 的 过 程 中 可 能 起 到 了 一 个 分 子 开关 的 作用 , 它 可 能 通过 与 突 触 融合 蛋白 的 相互 作用 , 使 突 触 融合 蛋白 从 Munc18- 突 触 融合 蛋白 复合 体 中 解 离 出 来 , 促进 核心 SNARE 复 合 物 的 装配 。Munc13 fy DAG 和 Ca*’/ 磷脂 结合 域 提 示 Munc13 的 功能 可 能 受到 DAG Fil Ca** 的 调控 。 事 实 上 ,Ca FU DAG 的 类 似 物 佛 波 酯 都 可 以 显著 增加 可 释放 圳 泡 的 数目 。 宫 泡 的 启动 过 程 还 受到 其 他 胞 内 第 二 信使 系统 的 精确 调节 , 如 蛋白 激酶 系统 。 3. 融合 和 分 泌 一 般 认 为 , 面 泡 局 动 后 即 处 于 一 种 半 融 合 (hemi-fusion) 的 状态 , 圳 泡 与 质 膜 最 后 的 融合 和 分 泌 仍 涉及 一 些 蛋白 的 参与 和 调控 , 多 数 情况 下 还 需要 Ca?* 触发 。 对 于 膜 融合 的 分 子 机 制 , 近 年 来 有 很 多 重要 的 研究 进展 。 通 过 将 v-SNARE 和 上 +- SNARE 分 别 重组 到 脂 质 体 , 然 后 将 脂 质 体 混合 , 则 可 看 到 这 些 脂 质 体 的 融合 , 提 示 SNARE 和 蛋白 可 能 是 膜 融合 需要 的 最 少 蛋白 。 但 在 这 种 重组 实验 中 , 膜 融合 的 速率 非常 慢 , 而 且 也 不 能 受到 钙 离 子 的 调控 , 提 示 其 与 在 体内 (in vivo) 生理 情况 下 的 融合 存在 明显 不 同 。 虽 然 已 知 SNARE 人 复合 物 在 膜 融 合 中 起 着 重要 的 作用 , 但 是 它 在 膜 融 合 中 所 起 的 具 体 作 用 还 有 竺 阐明 。SNARE 复 合体 的 形成 可 使 吉 泡 与 质 膜 非 常 靠近 ,这 可 导致 两 种 结果 一 是 排 开 两 层 膜 之 间 的 水 分 子 , 促 进 自发 融合 , 二 是 促进 局 部 双 层 结构 破坏 , 胞 浆 内 形 成 复合 体 的 张力 可 通过 膜 与 SNARE 胞 浆 区 的 某 种 偶 联机 制 , 传递 到 双 层 膜 上 , 从 而 触发 融合 。SNARE 和 蛋白 形成 复合 物 后 , 将 会 进一步 结合 NSF 和 SNAP 蛋白 形成 一 个 更 大 的 20S 复合 物 , 然 后 NSFE 的 ATP 酶 活性 会 水 解 ATP, 从 而 将 SNARE 复合 物 解 聚 。 最 初 人 们 认为 膜 融 合 需要 SNARE 蛋白 的 解 聚 和 ATP 提 供 能 量 , 但 一 系列 的 证 据 表 明 ,SNARE 复合 物 的 装配 比 解 聚 对 膜 融 合 更 为 重要 。NSF 可 能 只 在 融合 发 生 后 负责 解 聚 cis-SNARE 复合 物 (117-2). 在 分 泌 晚 期 事件 中 ,Ca 的 作用 不 容 忽视 。Katz 等 在 20 世纪 60 年 代 的 经 典 工 作证 明了 Ca 在 神经 递 质 释放 中 的 核心 作用 。 在 突 触 未 端 Ca+# 通道 可 与 SNARE 蛋白 相关 作 用 形成 复合 物 , 从 而 保证 Ca” 信号 与 突 触 小 泡 在 空间 上 的 偶 联 , 志 内 分 泌 细 胞 上 也 发 现 了 一 定数 量 的 圳 泡 与 钙 离子 通道 共存 。 在 胞 内 细胞 器 上 的 虹 ” 所 中 也 发 现 了 融合 相 FAY Ca” 信号, 即 从 ER、 高 尔 基体 或 转运 小 泡 中 可 释放 在 触发 膜 融合 《包括 细胞 内 其 他 细胞 硕 膜 融合 ) 的 过 程 中 有 一 个 普遍 的 作用 Ca 触发 融合 的 机 制 尚 待 阐明 。 目 前 发 现 有 几 种 Ca 结合 蛋 自 , 如 突 触 结 合 蛋白 naptotagmin) , 征 调和 蛋白 和 CAPS (calcium-activated protein for secretion) , 都 可 能 生 “ 异 融 合 的 过 程 调 控 。Ca27 钙 HE ty NR Biomembranes 208 a © Fl La! Rab 效应 物 na VAMP ava @ Ca wow 人 | ® Bs asin 6 SNAP-25 SNARE 复合 体 4 o-SNAP 分 泌 宫 泡 与 质 膜 融合 过 程 前 后 的 分 子 作用 机 制 调 蛋 白 通 过 一 个 含 蛋白 磷酸 酶 (PP1) 的 多 亚 基 复 合体 与 膜 相 连 , 可 能 参与 膜 融 合 中 最 后 的 过 程 。 钙 调 蛋 白 -PP1 复合 体 还 可 能 在 细胞 内 膜 运 动 过 程 中 的 融合 活动 扮演 重要 角色 , 前 明 其 作用 机 制 对 于 理解 膜 融合 的 晚期 事件 有 重要 的 意义 .CAPS 可 能 是 目前 所 知 的 惟一 一 个 特异 性 在 致密 大 圳 泡 分 泌 中 起 作用 的 蛋白 。CAPS 可 与 Cax 和 磷脂 结合 , EBC KE 泡 与 细胞 质 膜 的 最 后 融合 过 程 中 起 作用 。 突 触 结合 蛋白 在 Ca 六 触发 分 泌 时 起 着 很 重要 的 作用 , 是 目前 被 广泛 认同 了 的 触发 分 泌 的 Ca 感受 器 , 它 的 缺失 会 严重 地 影响 Ca 六 触发 分 泌 的 能 力 。 突 触 结 合 蛋白 是 一 类 高 等 真 核 细胞 特有 的 Ca 结合 蛋白 , 在 神经 元 中 主要 位 于 突 触 小 泡 上 , 在 酵母 则 无 此 成 分 。 突 触 结合 蛋白 由 一 个 短 的 圳 泡 内 N 端 序列 、 一 个 单 次 跨 膜 区 和 一 个 大 的 细胞 质 部 分 组 成 。 其 中 细胞 质 部 分 的 主要 特征 是 有 2 个 串联 的 能 与 Ca 结合 的 C2 结构 域 (C2A 和 C2B)。 突 触 结合 蛋白 是 一 个 大 的 蛋白 家 族 , 在 哺乳 动物 中 目前 已 发 现 有 15 种 亚 型 .除了 突 触 结合 蛋白 I 的 功能 和 作用 机 制 研究 的 较 清 楚 外 , 其 他 突 触 结合 蛋白 亚 型 的 功能 尚 有 待 阐明 。 突 触 结合 蛋白 I 的 C2A 区 在 较 低 的 Ca 浓度 下 可 与 脂 连接 , 在 较 高 的 Ca 浓度 下 则 与 突 触 融合 蛋白 结合 。 而 C2B 志 1 能 不 依赖 Ca?* 与 IP:、IP:、IP。 连接 , 此 外 它 还 与 其 他 的 圳 泡 连 接 蛋 白 (如 SV2) 相 ” 用。 一 般 认 为 C2A 区 在 Ca 触发 分 “时 起 着 重要 作用 ,而 C2B 区 可 能 只 起 一 个 介 握 三 泡 贴 近 质 膜 的 作用 。 最 新 的 WAS 王 明 C2B 区 对 触发 分 泌 更 加 重要 , 提示 C2A 和 5C2B 区 共同 作用 参与 圳 袍 与 质 膜 融合 的 危 全 。 罕 触 结 合 蛋白 I 在 突 触 未 梢 神经 递 质 释 放 中 具有 双重 作用 , 即 抑制 自发 209 17 S746 SAMBA etn 分 泌 和 在 Ca” 存在 的 情况 下 加 速 膜 的 融合 , 如 突 触 结合 蛋白 缺陷 的 小 鼠 , 突 触 分 泌 的 快 成 分 缺失 ,但 慢 成 分 却 仍 存在 ; 突 触 结合 蛋白 突变 的 果 晶 则 表现 为 自发 分 刻 的 增加 和 诱发 分 泌 的 严重 减少 而 神经 肌肉 接头 突 触 结合 蛋白 的 过 表达 既 明显 减 少 自发 分 泌 又 增 强 对 刺激 的 易 化 作用 。 ila i; les Ee LB: RRR Fe FASS. 2000. 细胞 和 分 子 神经 生物 学 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 Ba ARIS. 2003. 膜 分 子 生 物 学 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 EP Fl. 1995. 细胞 生物 学 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 REM, 徐涛 等 . 2001. 细胞 分 刻 的 分 子 机 制 研 究 进展 . 科学 通报 , 46: 1~8 Gerald Karp. 2002. Cell and Molecular Biology; Concepts and Experiments. 3qed. New York: John Wiley & Sons, Inc. Juan S Bonifacino, Benjamin S Glick. 2004. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell, 116: 153-166 Reinhard Jahn, Thomas C Sudhof. 1999. Membrane fusion and exotytosis. Annu Rev Biochem, 68: 863-911 Waters M G, Frederick M Hughson. 2000. Membrane tethering and fusion in the secretory and endocytic pathways. Traffic, 1: 588-597 ) Xu T, Rammner B, Margittai M, et al. 1999. Inhibition of SNARE complex assembly differentially affects kinetic components of exocytosis. Cell, 99(7): 713-722 BS Re ABC 转运 体 和 肿瘤 4 Fait 25 VE EL ABC er A ico ccsscsesacesenncenasecervarsneaaeceeter dente aa 211 1 ABC RES ASEH 了 和 241 Ca NGL Sa): 5) 5) 二 二 区 下 全 和 21 18.2, 与 多 药 耐 药性 相关 的 ABC 转运 体 全 全 生生 212 18/20: PUREE a hese. Un ieee 212 18.2.2 BAG PASE cccecscecideccstees cons acces m8 | 18.2.3 乳腺 癌 耐 药 蛋 自 one eeceeeeeees ssliysiusvteliee ae 219 Oe 1 ce ak A = eee me OP 汪汪 生生 和 219 18.3 ”肿瘤 多 药 耐 药性 作用 机 制 的 模型 ees ececeeseneeseneeneeeenees 220 1.3.1 Bp CET... cccccsecccscocsectscostoese ne 220 1532 Ser 221 18.3.3 有 胞 内 酸碱度 改变 模型 .csessevecnsssseceensansens?ossue 221 Ce =| ap SEE 222 7 a 转运 体 (ABC transporter) 超 家 族 是 在 长 期 进化 历程 中 形成 的 高 度 保守 的 一 个 大 基因 家 族 编 码 的 一 类 膜 蛋 白 , 它 广 谤 分 布 于 原核 生物 和 真 核 生 物 中 。 ABC 转运 体 一 词 , 是 Higgins 于 1992 年 在 一 篇 纪念 性 述评 中 引入 的 (Higgins 1992a), 称谓 ABC, 是 因 ABC 转 运 体 超 家 族 成 员 都 含有 高 度 保守 的 .ATP 的 盒 式 结构 域 ATP-binding cassette, ABC 乃 是 ATP-binding cassette 三 个 词 字 首 的 缩写 。 在 迄今 已 知 的 有 机 体 中 , 约 有 1000 余 种 不 同 的 转运 体 。 在 人 中 约 有 50 种 , 晶 有 55 种 , “和 物 有 129 种 和 细菌 有 300 种 以 上 的 成 员 (Cai et al. 2003) 。 在 人 | 50 FH ABC 转运 体 中 , 其 中 14 种 转运 体 的 缺陷 与 13 种 遗传 性 六 “相关 (Schreiber et al.1999) 。 研 究 ABC 转 运 体 超 家 族 和 蛋白 的 结构 与 功能 , 不 仅 对 了 解 其 作用 机 制 且 有 重要 的 理论 意义 , 而 且 对 阐明 与 其 相关 的 疾病 发 生 、 发 展 的 分 子 机 制 都 具有 重要 的 实际 意义 。 本 文 着 重 介绍 与 肿瘤 细胞 耐 药 211 #182 ABC #61e (8 Filpy gs 2 Zot A 性 相关 的 ABC 转运 体 的 主要 研究 现状 。 SABC 息 二 信和 18.1.1 ABC 转运 体 的 结构 含有 结合 合 ATP 的 盒 式 结构 域 如 图 18-1 Prax, ABC 转运 体 都 舍 有 一 个 称 为 ABC 的 结合 ATP 的 盒 式 结构 域 , 由 90~110 个 氨基 酸 残 基 组 成 ,包括 walker A 和 walker B 两 个 基 序 (motif)(Walker et al. 1982), 以 及 位 于 二 者 之 间 的 含 12 个 肽 的 连接 区 (linker 也 称 C 区 )。 在 walkerA 和 B 基 序 的 上 游 和 下 游 还 有 另外 的 区 域 , 在 已 知 的 有 机 体 中 ABC 表现 高 度 的 保守 性 。 起 -一 | 99 110AA |——> A B I i | walker A ee. walker B GNSGCGKST LSGGQKQRIAIA ILLLDE * KKKEKK 水 KK KK KK OK KKK KK KK OK KK 米 一 个 典型 的 ABC 转运 体 的 结合 ATP 的 盒 式 结构 域 ( 引 自 Walker et al. 1982) 图 下 的 大 写字 母 表示 哺乳 动物 和 铝 的 P 型 糖 蛋 白 (P-gp) 的 ATP 结 合 位 点 的 高 保守 氨基 酸 序列 2. 具有 相似 的 4 个 微 区 核心 结构 序列 一 般 来 说 , 真 核 生 物 的 ABC 转运 体 的 肽 链 基本 结构 是 按 N 端 --MSD1-NBD1-MSD2- NBD2 — C 端的 顺序 排列 的 。 除 此 之 外 在 某 些 家 族 如 多 药 耐 药 相 关 和 蛋白 (multidrug resis- tance-associated protein,MRP) 中 , 还 有 一 个 与 MSD1 相连 的 LO 区 以 及 与 其 相连 的 MSD0O 跨 膜 结构 域 (Cai et al. 2003)。 图 18-2 ABC 转运 体 的 膜 拓扑 学 特征 。 EER ABC 转运 体 P-gp 的 膜 拓扑 学 特征 (2 ii et al. 2003) P 型 糖 蛋白 (P-gp) A 4 +R AG ER, MSD, 跨 膜 结构 域 ), 核 苷 酸 结合 结构 域 。MRP 的 不 同 成 员 在 其 N 端 还 有 L0 和 KMSD0 经 HE Wy i Biomembranes 212 3. 跨 膜 结 构 域 含 有 6 个 跨 膜 的 0 螺旋 在 大 多 数 真 核 生物 中 由 2 个 核 苷 酸 结合 结构 域 (nucleotide binding domain, NBD 或 ABC) 和 2 个 MSD (12 4 a 螺旋) 构成 一 个 功能 性 的 ABC 转运 体 。 一 个 功能 性 的 P-gp 分 子 的 跨 膜 结构 域 中 均 含 2 x 6 个 跨 膜 螺旋 。 但 应 注意 的 是 , TE MRP] ~ MRP3 和 MRP6 的 六 端 还 有 由 5 个 g 螺旋 构成 的 跨 膜 结 构 域 , 即 MSD0。 18.1.2 ABC 5% zs (75/1) 7 (7 _ gma 1. ABC 转运 体 呈 现 明 显 的 同 源 性 哺乳 动物 类 细胞 的 P-gp 的 氨基 酸 同 产 性 高 达 69%~94%。 研 究 表明 ,NBD Aa FER 序列 的 保守 性 最 强 , 而 MSD 则 处 于 中 等 水 平 。 2. 构成 某 些 ABC 转运 体 如 HlyB 是 由 一 个 ABC 结构 域 和 一 个 跨 膜 结构 域 结合 形成 同 质 二 聚 体 (homodimer), , 而 基 些 ABC 转运 体 如 Tapl/Tap2 则 由 异 二 聚 体 (heterodimer) 组 成 。 3. 与 多 种 底 物 的 直接 转运 相关 ABC 转运 体 可 转运 的 底 物 包括 糖 、 聚 糖 、 胆 固 醇 、 磷 脂 、 氨 基 酸 、 肽 、 蛋 白质 、 毒 素 、 药 物 、 抗 生 素 和 生物 异 源 物质 等 (Gottesman et al. 2001)。 一 般 来 说 , 转 运 底 物 的 专 一 性 是 由 其 跨 膜 结 构 域 决 定 的 , 而 转运 体 的 氨基 酸 序列 的 多 样 性 可 能 与 各 种 ABC 超 家 族 和 蛋白 能 识别 不 同 的 底 物 相关 。 4. B® ATP wea tt ABC 转运 体 转运 多 种 底 物 所 需 的 能 量 是 由 其 具有 ATP 酶 活性 的 NBD 水 解 AITP 提 供 的 。NBD 的 walkerA 和 walkerB 这 2 个 基 序 对 ABC 超 家 族 蛋 白 的 ATP 酶 的 活性 至 关 重 要 (Jha et al. 2003 ) 。 182 与 多 约 而 约 体 相 关门 ABC 3% 1 (i mms 多 药 耐 药性 (multidrug resistance, MDR) 和 是 指 肿瘤 细胞 在 抗 肿瘤 药物 长 期 和 反复 作用 下 对 其 出 现 耐 药性 的 同时 ,对 其 他 多 种 结构 尹 至 作用 机 制 不 同 的 抗 肿瘤 药物 也 产生 交叉 抗 药 性 , 这 是 一 种 独特 的 广 谱 耐 药 现象 。Biedler 等 〈1970) 首先 描述 了 MDR 表 型 , 现 已 发 现 100 余 种 与 MDR 相关 的 转运 体 , 基 本 上 可 分 为 4 个 超 家 族 : ATP-binding cas- sette (ABC); major-facilitator (MRF); small-multidrug resistance(SMRJ 和 resistance- nodulation(RND) (Gottesman et al.1993 ) 。 这 里 主要 对 与 人 的 MDR 相关 的 四 类 ABC 转 运 体 , 即 P-gp、MRP、ABCG2 和 LRP 做 相关 介绍 。 SLD || Juliano 等 (1976) 首先 在 中 国 仓鼠 卵细胞 中 发 现 了 可 降低 细胞 膜 对 药物 的 透 性 而 产 生 奎 药性 的 细胞 膜 表 面 糖 和 蛋白 , 因此 命名 为 P 型 糖 重 ;, permeability glycoprotein, P-gp) , 因 其 分 子 质量 为 170kDa, 又 名 为 P170。 1. Pee 的 结构 P- 5 是 ABC 转运 体 超 家 族 中 的 一 个 重要 成 员 , 写 包含 了 2 A Rea OS BREA He (trans-me: srane domain, TMD) 和 2 个 亲 水 的 结合 ATP 合式 结构 域 (NBD 或 ABC), 每 一 个 跨 膜 结交 域 又 包含 6 个 跨 膜 螺旋 〈 图 18-2)。 一 个 功能 性 的 P-gp 分 子 含 2 个 MSD 213 $182 ABC #7a (k Fp 2 Foot A (12 个 跨 膜 螺旋 ) 和 2 个 NBD,NBD 是 ABC 转运 体 超 家 族 成 员 共 同 具 有 的 , 而 且 NBD 还 包括 2 个 各 基 酸 序列 保守 性 很 强 的 基 序 称 walkerA 和 walkerB 〈 图 18-1)。 AY P-gp 2& Chen % (1986) 首先 发 现 的 。 图 18-3 是 根据 近 基 酸 序列 的 踊 水 性 和 功 能 结构 域 提出 的 人 了 P-gp 二 维 结构 模式 , 基 本 结构 也 是 由 2 个 MSD( 或 TMD) 结 构 域 和 2 个 NBD 结构 域 组 成 , 图 中 显示 了 ATP 的 结合 位 点 、walkerA 和 B、N 端 糖 基 化 位 点 和 磷酸 化 位 点 以 及 部 分 结合 底 物 的 突变 位 点 等 。 1280 人 了 -gp 的 二 维 结构 模式 ( 引 自 Ambudkar et al. 2003) 图 中 每 一 个 圆圈 代表 一 个 氨基 酸 残 基 , 蓝 色 实 心 圆圈 表示 P-gp 的 专 一 性 底 物 结合 的 突变 位 点 (未 全 列 出 )。A,B 示 walker A 和 B 的 ATP 结 合 位 点 ,C 为 C 区 。 在 第 一 个 胞 外 环 上 标 出 与 N 端 连 接 的 N91、N94 和 N99 糖 基 化 位 点 ,在 linker 区 (D) 上 的 红色 圆 围 P 表 示 S661, S667 和 S683 等 磷酸 化 位 点 。 在 跨 膜 微 区 (TM) 上 的 绿色 bar 表 示 光 亲 和 类 似 物 标记 区 域 2. P-gp 的 性 质 和 功能 (1) P-gp 具有 ATP 酶 活性 P-gp 水 解 AITP 所 产生 的 能 量 用 于 将 底 物 和 药物 向 细胞 膜 外 转运 , 导致 肿瘤 细胞 产生 耐 药性 , 因 此 ATP 的 水 解 和 转运 功能 是 相互 偶 联 的 (Sauna et al. 2001), ATP 水解 的 化 学 计量 关系 是 lnol ATP/mol P-gp, 无 论 是 在 膜 水 平 还 是 重建 纯化 的 P-gp 的 实验 都 证 明 , P-gp ft) ATP 酶 活性 依赖 Mg, 可 被 底 物 和 药物 以 及 P-gp 的 调节 剂 刺 激 。N- 乙 基 马 来 酰 Wiz (N-ethyl maleimide, NEM) 化 学 修饰 和 在 walkerA 和 B 或 C 区 的 保守 性 氨基 酸 残 基 的 突变 都 可 破坏 P-gp 的 水 解 活性 。 (2) P-gp 识别 和 转运 多 种 底 物 在 生理 条 件 下 ,P-gp 与 多 种 内 源 性 底 物 的 转运 有 关 (FI P-gp 可 以 转运 多 种 结构 和 功能 不 同 的 底 物 , 这 种 转运 受 不 同 的 化 合 物 介 导 ar et al. 2003), P-gp 还 可 转运 多 种 脂 类 物质 ,I 型 P-gp 与 多 种 脂 质 转运 相关 , | P-gp 对 磷脂 酰 胆 碱 的 转 运 具 有 专 一 性 。 KE 9 WR Biomembranes 214 底 物 (substrates ) 调节 剂 (modulators ) 长 春花 生物 碱 (vinca alkaloids) i i 钙 通 道 阻 断 剂 (calcium channel blockers ) 长 春 碱 (vinblastine ) 维 拉 由 米 (verapamil) 长 春 新 碱 (vincristine) 二 氧 吡 吓 (dihydropyridines ) A [a] 4% (anthracyclines ) 摘心 律 失 常 药 (antiarrhythmics ) 2) EF: (daunorubicin) 427 (quinine) bal 3= (doxorubicin) 抗 高 血压 药 (antihypertensives ) 抗生素 (antibiotics ) 利 血 平 (reserpine) 更 生 霉 素 (dactinomycin ) 抗生素 (antibiotics) 放射 菌 素 D (actinomycin D) 头孢 菌 素 (cephalosporins ) 其 他 细胞 毒素 试剂 (other cytotoxic agents) 免疫 抑制 药 (immunosuppressants ) 22 BSS (mitomycin) 环抱 菌 素 A (cyclosporin A) 紫 杉 酚 (taxol) 类 固 醇 激素 (steriod hormones ) 秋水 仙 素 (colchicine ) 黄体 酮 (progesterone ) (ee 445 (puromycin) HIV 蛋白酶 抑制 剂 (HIV protease inhibitors ) 地 高 辛 (digoxin) sequinavir 酒精 中 毒 处 理 药 物 (alcoholism treatment drug ) dissulfiram 植物 化 学 类 (phytochemical ) 姜黄 素 (curcumin) (3) P-gp &—4#¥ 4 HE KR P-gp 主要 位 于 细胞 质 膜 上 , 但 近年 发 现在 细胞 器 如 高 尔 基 体 上 也 有 少量 存在 。 正 党 生理 条 件 下 , 生物 体内 有 编码 P-gp 的 基因 , 这 可 能 与 细胞 为 抵抗 有 害 物 质 而 保护 自身 的 功能 相关 。 在 恶性 肿瘤 等 病变 条 件 下 , 由 于 了 -gp 的 过 度 表 达 导 致 对 抗 癌 药 物 的 耐 药性 , 从 而 成 为 提高 临床 化 疗 疗效 所 面临 的 至 今 尚 未 完全 攻破 的 一 个 壁垒 无 论 是 在 体外 对 高 水 平 表 达 了 P-gp 的 细胞 (Juliano et al.1976) , 或 是 在 化 疗 期 间 的 体 内 细胞 的 研究 都 表明 , 表达 P-g 印 的 细胞 对 在 结构 和 功能 上 并 不 相关 的 多 种 抗 癌 药 物 和 细 胞 毒物 如 阿 替 素 、 柔 红 霉 素 、 放 线 菌 素 D、 表 鬼 白 毒 吡 喃 区 糖苷 (etoposide) 、 秋 水 仙 碱 、 紫 杉 酚 、 长 春 新 碱 、 长 春 碱 、 氨 机 环 素 、 紫 杉 烷 和 表 鬼 白 脂 素 (epipodophyllotoxin) 等 产生 抗 性 。 无论 是 在 哺乳 动物 细胞 中 通过 内 源 性 编码 P-gp 的 MDR/mdr 基 因 的 表达 , 或 者 Je: FA MDR/mdr cDNA 转 染 细胞 , 在 完整 细胞 和 膜 微 吉 水 平 对 P-gp 功能 研究 的 结果 表明 , P- 印 的 主要 功能 是 作为 质 膜 的 药物 排出 泵 , 把 药物 向 细胞 膜 外 转运 从 而 导致 肿瘤 细胞 的 抗 药性 ,这 种 转运 功能 是 ATP 和 温度 依赖 性 的 , 且 可 被 很 多 在 结构 上 并 不 相关 的 抑制 剂 如 Ca 通道 阻 断 剂 维 拉 帕 米 〈verapamil) 、 免 疫 调节 剂 环 孢 菌 素 A 等 所 抑制 (Ambudkar et al.1999 ) 。 有 关 药 物 与 P-g 的 氨基 酸 残 基 结 合 位 点 进行 了 相当 这 入 地 研究 。 与 P-g 印 结合 的 药 物 的 共同 特征 是 疏水 性 , 分 子 质 量 在 300~2000Da。 对 上 百 种 与 P-gp 相互 作用 的 药物 生 物 物 理 : 征 和 理论 模型 的 分 析 认 为 , 电 子供 体 基 团 的 空 | 分离 (Seeling 1998) LARA 键 的 数 巨 熙 强度 可 能 决定 着 P- 印 与 药物 的 相互 作用 。 用 药 筷 光 亲 和 类 似 物 的 标记 实验 表 明 , P-gp it) | 个 MSD (TMD) 在 底 物 和 药物 的 结合 中 起 着 重要 作用 , 不 同 的 底 物 有 其 不 同 的 氨基 酸 侈 基 结 合 位 点 , 有 些 也 可 能 是 相互 重 释 的 位 点 (Ze 18-2)。 215 218% ABC Fez fh AM 2 Fmt 5 | R182 ICRA ARICAOLNTEN P-gp 上 的 药物 结合 位 点 CEI Ambudkar etal 2003) P-gp 来 源 P-gp- 药物 底 物 光 亲 合 标记 类 似 物 结合 位 点 ( 气 基 酸 残 基 ) 医 Azidopine —Azidopine —198~440, 1028~1270 于 小 鼠 Paclitaxel (taxol) 30-p-Benzoyldihydrocinnamoyl ~ — 985~1088 70-p-Benzoyldihydrocinnamoyl 683~760 He Dexniguldipine Dexniguldipine-HC1 468~527 仓鼠 Cyclosporin A Diazirine-cyclosporin 953~1007 仓鼠 Daunorubicin Iodomycin (a Bolton-Hunter derivative) 230~312 仓鼠 Azidopine Iodopine (a Bolton-Hunter derivative) 230~312 仓鼠 Prazosin Iodoarylazidoprazosin 248~312, 758~800, 1160~1218 un Prazosin lodoarylazidoprazosin 1135~1169 (4) P-gp 444 R25 Hy RL HE P- 印 的 片段 删除 和 表达 实验 证 明 , 如 果 删 除 连 接 P-gp 的 两 个 半分 子 之 间 的 linker 区 域 的 中 心 部 分 , 虽 然 可 以 在 细胞 表面 获 得 类 似 于 野生 型 的 P-gp 蛋白 表达 , 但 这 种 表达 蛋 自 既 无 转运 活性 也 无 药物 刺激 的 ATP 酶 活性 。 当 用 一 个 具有 柔性 的 二 级 结构 肽 段 去 取代 linker 区 域 的 中 心 部 分 , 却 又 可 完全 恢复 P-g 的 功能 , 这 表明 一 个 柔性 的 连接 区 域 对 于 P-gp 的 两 个 半分 子 ( 即 由 1 个 TMD 和 1 个 NBD 组 成 ) 间 的 相互 作用 , 两 个 核 苷 酸 位 点 之 加 的 通讯 是 很 重要 的 。 突 变 分 析 表 明 , 影响 药物 底 物 专 一 性 结合 的 微 区 主要 位 于 4、5、 6、11 和 12 跨 膜 微 区 〈Hrycyna 2001,Loo etal. 2002) , 并 且 认 为 药物 结合 微 区 在 细胞 质 侧 呈 漏 斗 形 且 狭 窗 , 中 心 是 直径 为 9~25A, 最 宽 处 为 约 S0 A 的 药物 底 物 结合 区 域 (Loo et al. 2002) 。 他 们 根据 半 胱 委 酸 和 划 选 突变 型 和 化 学 交 联 实验 提出 了 以 下 模型 : 一 个 共同 的 药物 结合 位 点 包括 了 跨 膜 螺旋 4、5、6、8、9、10、11 和 12 中 的 氨基 酸 残 基 , 但 是 , 这 共同 的 “口袋 ” 中 可 能 有 不 同 底 物 的 相应 结合 位 点 , 因 此 连接 结合 口袋 的 跨 膜 微 区 是 相当 动态 性 的 , 底 物 的 结合 使 结合 位 点 趋 于 “刚性 (rigidity)”, 但 这 一 假设 模型 还 需 提 供 更 多 实验 证 据 。 多 种 微 区 结构 中 的 氨基 酸 突 变 影 响 底 物 结合 的 专 一 性 。 无 论 是 在 TMD 、 可 溶性 的 胞 内 和 胞 内 环 以 及 NBD 微 区 的 突变 都 会 影响 结合 药物 底 物 的 专 一 性 (Hrycyna 2001)。 糖 基 化 对 P-gp 正确 运送 到 细胞 膜 表 面 似乎 是 必需 的 , 但 对 其 转运 功能 不 是 必需 的 。 3. P-gp 的 基因 、 表 达 和 纯化 ABC 转运 体 的 突变 常 引 起 人 类 的 许多 疾病 , 因此 获得 大 量 的 有 活性 蛋白 对 于 揭示 在 正常 和 病理 条 件 下 ABC 转运 体 的 结构 与 转运 药物 功能 的 分 子 机 制 是 必需 的 。 表 18-3 是 目 前 已 知 在 哺乳 动物 细胞 内 编码 P-gp AY ZEAL Se He my, HEAR Lap ape AY, TY AAT A, I 型 和 开 型 与 耐 药 性 相关 ,II LSA HERES 人 的 MDR 基 因 家 族 包 括 MDR1 和 MDR23。MDR7 基 因 位 于 笠 ” 号 染色 体 q21.1, 是 SHAE MERION 25 2 A], Bais P-gp。MDR7 基因 由 330kbp FR BES - cDNA 全 长 4669bp, 在 179~3840bp 之 间 为 可 读 区 , 起 始 密码 为 ATG , 共 编 码 12: ig (Gottesman 1993 ) 。 研究 表明 , 人 的 正常 组 织 有 不 同 程度 的 mad7 基因 表达 ,:/ ik. Abi AN Be ae. AE fa AS2 AL) mdr] FER AGAR. AARNE, mm CATR MUE AAA a Pr Ae A A ee BY el BY mdr FE AK PIR ii! ”种 肿瘤 在 临床 上 往往 对 化 疗 Wee - 下 HE yy He Biomembranes 216 物种 1% II #4 II 型 toa ic. zt MDR 7 SR cb MDR 2/3 小 鼠 mdr 3 mdr 7 mdr 2 Marla mdr Ib mdr 2 仓鼠 Pgpl Pgp2 Pgp3 猪 Pgp1A/1B/1C/ID Pgp3 药物 不 敏感 , 即 表现 耐 药 性 ,反之 亦 然 。 这 证 明 ,, mdr] 基因 编码 的 P-gp 表 达 水 平 与 肿瘤 的 原 发 性 耐 药 相 关 。 根 据 ABC 转 运 体 的 NBD 序 列 和 结构 组 织 的 相似 性 , 不 同 种 属 的 ABC 转运 体 可 分 为 ABC-A 到 ABC-G 等 7 个 亚 家 族 (Dean et al. 2001), P-gp 已 在 NIH-3T3 细胞 、 昆 虫 细 胞 (sf 9)/ 杆 状 病 毒 (baculovirus) , HEK293 细胞 、 大 肠 杆 菌 和 牛 冶 病 毒 (vaccinia virus) 等 系统 中 表达 。 在 细菌 中 也 已 大 量 地 表达 了 了 P-gp 的 NBD, 特 别 适合 于 核 苷 酸 结 合 性 质 以 及 与 类 固 醇 如 RU486 相互 作用 的 研究 。Cai 等 (2003) 报道 了 可 以 高 效 表 达 、 易 于 纯化 和 适 于 功能 研究 的 P-gp 和 MRP 的 毕 赤 酵 母 (Pichia pastoris) 系统 。 无 论 是 从 天 然 细 胞 (如 CHO 细胞 株 CH8B30 和 CRIR12) 膜 还 是 重组 P-gp 的 细胞 中 都 可 获得 纯化 的 P-gp, 并 将 其 重建 到 人 工 膜 上 表现 较 高 的 ATITP 酶 活性 , 可 被 药物 维 拉 帕 米 和 秋水 仙 素 等 激活 。 4,P-gp 的 空间 结构 迄今 有 关 完 整 的 P-gp 蛋白 分 子 的 高 分 辩 率 结构 未 见报 道 。Rosenberg 等 (1997) 首 次 利用 蛋白 质 电 子 晶体 学 方法 中 的 单 颗粒 技术 获得 了 分 辩 率 为 2.3nm 的 P-gp 立体 结构 (图 18-4) 。 从 膜 平面 的 俯视 图 看 ,P-gp 呈 六 角 对 称 类 圆 环 状 , 直径 约 10nm, 内 有 一 个 直 径 为 Snm 的 大 圆 孔 , 呈 漏斗 状 , 在 膜 内 形成 一 个 同 外 开放 的 水 腔 。P-gp FRR EAA snm, 在 胞 内 侧 有 两 个 3nm 的 可 能 相当 于 NBD Dx SREY FEE, Rosenberg (2001a) 还 从 CHO 细 胞 中 纯化 了 P-gp, 通过 生长 二 维 晶体 和 电镜 三 维 重 构 , 获得 了 10A 分 辩 率 的 结构 , 研究 了 催化 过 程 中 P-gp 的 三 种 不 同 构象 , 表 明 无 核 苷 酸 的 P-gp 的 两 个 TIMD (MSD) 在 膜 内 形成 一 个 腔 , 结 合 到 NBD 的 核 苷 酸 诱导 TMD 的 重新 堆积 , 并 降低 药物 结合 的 亲 和 性 。 最 近 Chang 等 (2001) 用 和 射线 晶体 学 方法 获得 了 4.5A 分 辨 率 的 大 肠 杆菌 ABC 转 TREE P-gp 的 2.5nm 分 辩 幸 的 电镜 三 维 重 构 ( 引 自 Rosenberg et al. 1997) A. 于 百 于 脂 双 层 的 外 表面 , 在 这 种 情况 下 ,NBD 位 于 膜 平面 之 下 因而 在 其 三 维 投影 结构 中 看 不 见 。 B. gp 的 侧面 观 。 箭 头 表示 非 对 称 性 开放 提供 了 由 脂 相通 往 孔 道 的 可 能 性 。 箭 头 大 小 为 1.7nm 217 $182 ABC #1e fk Fs & Zot ZS 运 体 MsbA 二 聚 体 [2 x (MSD-NBD)] 的 结构 , 确 证 了 ABC 转运 体 的 每 一 个 MSD 结构 域 中 存在 6 个 跨 膜 o 螺旋。 而 有 趣 的 是 ,Locher (2002) 观察 到 一 个 不 同 于 MsbA 的 大 肠 杆菌 ABC 转运 体 膜 亚 基 BtuCD 的 结构 ,3.2A 分 辩 率 的 X 射 线 唱 体 结构 表明 , 它 与 大 多 数 ABC 转运 体 不 同 ,, 每 一 个 膜 亚 基 (BtuCD) 含 10 个 而 不 是 6 个 wx 螺旋 。 由 两 个 膜 亚 基 (2 x BtuCD ) 形成 四 聚 体 (tetramer) , 在 两 个 膜 亚 基 之 间 形 成 一 个 大 的 转运 体 通 道 , 它 调节 维生素 B, 的 摄取 。 187 2 2% Pilih) 25711 < 5 mmm 4k 1986 4F Chen AHS ABY ABC #£ia (4% P-gp Ja, Cole (1992) 从 并 不 表达 了 P-gp 的 MDR 肺癌 细胞 株 H69AR 中 分 离 出 另 一 种 与 MDR 相关 的 蛋白 , 即 MRP1 (ABCC1), 从 此 揭 开 了 多 药 耐 药 相 关 和 蛋白 (multidrug resistance-associated protein, MRP/ABCC) 家 族 与 耐 药性 相关 的 面纱 。 氢 基 酸 序列 分 析 表 明 ,MRP 属于 ABC 转运 体 大 家 族 中 的 一 员 。 MRP 亚 家 族 至 少 含 12 个 成 员 , 包括 MRP1~ MRP9、 和 氧 离 子 通道 囊 性 纤维 化 跨 膜 传导 调 节 (CF transmembrane conductance regulator, CFTR) 4 A FUmeRE be (sulfonylurea) 受 体 SURI #1. SUR2, MRP 的 发 现 被 认为 是 研究 肿瘤 细胞 MDR 的 分 子 机 制 的 一 个 里 程 碑 。 1. MRP 的 结构 MRP 的 拓扑 学 特征 与 P-gp 基本 相似 , 由 MSD 和 NBD 结 构 域 组 成 , 在 NBD 结构 域 含有 walker A 和 B 两 个 基 序 。 除 此 之 外 , MRP 亚 家 族 中 的 MRP4、 MRPS 和 CETR 在 MSDI1 处 还 有 一 个 N 端 胞 质 结构 域 LO, 而 MRP1、2、3 和 6 以 及 SUR1 和 2 除 具 有 上 述 的 拓扑 学 特征 外 , 与 LO 相连 的 还 有 一 个 MSD0 跨 膜 结构 域 , 并 只 含有 5 个 跨 膜 wx 螺旋。 而 且 MRP 亚 家 族 的 NBD1 的 walkerA 和 了 B 两 基 序 间 还 缺失 了 在 P-gp 和 其 他 ABC 转运 体 中 均 存 在 的 13 个 保守 氛 基 酸 序 列 , 由 于 这 种 缺失 , 使 MRP 的 两 个 NBD 中 的 氨基 酸 序 列 仅 有 30% 的 同 源 性 , 两 个 NBD 在 结构 和 功能 上 也 存在 差异 。 2. MRP 的 性 质 和 功能 (1) MRP 在 胞 内 的 分 布 现 认 为 , 在 正常 细胞 中 MRP 主要 分 布 于 细胞 的 内 膜 系 统 上 。 在 肿瘤 细胞 中 ,MRP 主要 分 布 于 细胞 质 膜 上 , 少 部 分 位 于 细胞 质 中 且 多 靠近 细胞 核 , MRP 在 细胞 内 的 分 布 与 细胞 的 类 型 和 其 表达 程度 相关 (Larsen et al. 2000) 。MRP 的 量 和 质 以 及 空间 分 布 上 的 不 同 可 能 与 肿瘤 细胞 和 正常 细胞 的 功能 差异 相关 , 而 肿瘤 细胞 的 抗 药性 是 由 于 MRP 的 过 量 表达 所 致 。 (2) MRP 的 底 物 和 药物 转运 对 耐 药 性 肿瘤 细胞 的 体外 和 体内 研究 表明 , MRP1 在 底 物 和 药物 的 转运 上 与 P-gp 有 其 相似 性 , 但 又 不 完全 等 同 于 P-gp, 而 有 其 自身 的 特性 。 P-gp 直接 转运 未 修饰 的 阳离子 亲 脂 性 的 细胞 毒物 , 而 MRP -站 转 运 很 多 绥 合 的 有 机 阴离子 ,如 与 谷 胱 甘 肽 (GSH) 、 葡 糖苷 酸 和 硫酸 盐 的 组 今 峭 长 化 疗 药物 , 也 能 天 未 修饰 的 药物 和 GSH 进行 协同 转运 (Borst et al. 2000) 。 MRP1 对 同 种 药物 的 抗 性 较 P-gp 者 弱 。MRP1 的 过 如 同 P-gp 一 样 , 使 肿瘤 细 eet aa AR. TAREE Poti (vinka alkaloid), #2425 FIDKFE BLA (mitoxantrone) 等 药物 表现 耐 药性 。 但 一 般 来 说 , 由 MRP1 APS gen | 文 些 药物 的 耐性 较 P-gp 者 弱 (Ambudkar et al. 1999, Borst et al. 2000), 。 MRP1 识别 药物 的 徽 区 主要 在 TM10~11 cf HE yy WE Biomembranes 218 Fil TM16~17 (Daoud et al. 2001), (3) 对 生理 性 底 物 的 转运 MRP1 除 转 运 多 种 抗 癌 药 物 外 , 还 能 转运 生理 性 的 重要 底 物 , 如 胆 红 素 葡 糖 苷 酸 (bilirubin glucuronide) 、 葡 糖苷 酸 和 硫酸 盐 绥 合 的 胆 盐 、 谷 胱 昔 肽 二 硫化 物 (glutathione disulfide, GSSG), 17B- 雌 二 醇 (17-BestradioD 和 谷 胱 甘 肽 (GSH) 组 合 的 前 列 腺 素 (prostaglandin) A;。MRP1 对 生理 性 底 物 和 白 三 烯 (leukotriene) C4 (LITC4) 有 具有 最 高 的 亲 和 力 (Hipfner et al.1999 ) 。 (4) MRP 具有 三 脂 翻 转 酶 活性 近年 研究 表明 , MRP1 还 能 转运 脂 质 分 子 , 调节 某 些 生物 膜 如 红细胞 膜 的 不 对 称 性 , 因此 ,MRP1 可 能 像 P-gp 一 样 具有 磷脂 翻转 酶 活性 《Huang et al. 2004a ) 。 (5) 具有 ATP RIED 无 论 是 在 膜 水 平 或 是 在 脂 质 体 的 重建 水 平 上 〈Hou et al. 2000, Huang et al. 2004b) 都 证 明 MRP1 具有 水 解 ATP 的 酶 活性 , 且 对 钒 酸 盐 敏感 , 可 被 药物 、 谷 胱 甘 肽 、LTC4 Aue UDP 外 的 ADP (Chang et al. 1998) 所 激 话 。 并 且 NBD1 和 NBD2 对 水 解 ATP 都 是 必需 的 , 但 对 野生 型 和 突变 型 的 MRP1 的 研究 又 表明 ,ATP 结 合 于 NBD1, 而 水 解 ATP 是 发 生 在 NBD2 上 , 两 个 NBD 在 功能 上 却 不 是 完全 相同 的 。 突 变 分 析 表 明 , NBD 的 walker A 和 了 B 对 ATP 酶 活性 至 关 重 要 。 (6) MRP] 中 与 底 物 和 药物 结合 相关 的 氨基 酸 残 基 不 同 的 氨基 酸 序列 与 底 物 的 识别 和 转运 相关 ,MRP1 由 1531 个 氨基酸 残 基 组 成 。 在 昆虫 细胞 中 表达 含 MRP1 的 不 同 氢 基 酸 序列 片段 实验 结果 表明 , 204~229 这 一 段 是 起 决定 作用 的 氨基 酸 序 列 , 此 段 序列 是 MRP 大 家 族 成 员 的 高 保守 序列 (Bakos et al. 1998) 。 MRP 中 存在 与 底 物 和 药物 转运 的 专 一 性 相关 的 氟 基 酸 残 基 。 研究 表明 , MRP 分 子 中 的 某 些 氨基酸 残 基 对 其 转运 功能 具有 非常 重要 的 作用 , 如 Trp' 交 与 17- 雌 二 醇 、17B-D- 葡 be RA eS AA, Glu! 对 MRP1 fis AMAA AWAKE, MAES LTC4 ffl E217BG 的 转运 (Kenichi et al. 2001, Zhang et al. 2001), MRP1 AY MSD! HAY Cys’ 不仅 对 维持 MRP] 的 天 然 构 象 至 关 重 要 , 而 且 对 LTC4 的 转运 具有 关键 作用 (Yang et al. 2002)。MRP1 的 C 端 的 TM17 RAY Arg’? 对 MRP1 识别 和 转运 化 疗 药物 是 必 不 可 少 的 (Ren et al. 2002 ) 。 综 上 所 述 , 作 为 ABC 转运 体 超 家 族 的 两 个 主要 成 员 P-gp 和 MRP, 它 们 在 基本 结构 和 转运 功能 以 及 药物 抗 性 等 方面 具有 相似 性 , 但 二 者 又 有 不 同 。 概括 起 来 , 主要 表现 在 : P-gp + i KAA PE Kt ay, 而 MRP 主要 转运 阴离子 性 的 化 合 物 , MRP 转运 的 药物 常 是 与 谷 胱 甘 肽 和 其 他 阴离子 的 组 合 物 , 或 者 是 与 谷 胱 甘 肽 一 起 协同 转运 。 有 关 两 者 的 组 织 分 布 和 转运 功能 可 参阅 Ambudkar 等 (2003) 的 报道 。 3. MRP 的 基因 、 表 达 和 纯化 HH MRP 基因 编码 的 蛋白 可 以 分 成 12 个 不 同 的 亚 家 庆 , 即 ABCC1 到 ABCC12, 新 合成 的 MRP 分 子 质量 约 170kDa, 随 后 会 迅速 加 入 和 区 和 接 的 糖 基 而 形成 分 子 质量 约 190kDa 的 糖 蛋白 (Almquist et al. 1995) 。MRP1/ABCC1 是 第 一 个 被 确定 为 MRP/ABCC 亚 家 族 的 成 员 ,MRP1 基因 (ABCC1) 定位 于 人 的 第 16 AE 16p13.1, ZEAE 度 为 2.8kbp。MRP1 已 在 s 甸 昆虫 细胞 和 抗 药性 的 HeLa 细 有 5 中 表达 , MRP2 (cCMOAT) 在 219 18H ABC #61 fk Fp ZF ot ZG 肝 细 胞 的 沟 状 《canalicular) 微 区 中 表达 。 如 前 述 的 P- 印 一 样 ,Cai 等 (2003) 在 毕 赤 酵母 系统 实现 了 高 效 和 功能 性 的 MRP 表达 , 表达 的 MRP1 具 有 与 P-gp 相 似 性 的 ATP 酶 活性 。 但 MRP1 和 ATP 的 结合 与 P-gp 不同, 是 Mg 依赖 性 的 , 对 EDTA 敏感 。 在 不 同系 统 中 表达 的 MRP, 基本 上 都 可 以 用 相似 于 上 述 P-gp 的 方法 获得 具有 功能 性 的 纯化 和 重组 的 MRP 蛋白。 有 关 人 的 ABC 基因 及 其 所 编码 的 不 同 家 族 的 ABC 转运 体 、 基 因 的 染色 体 定 位 、 表 达 系 统 和 各 转运 体 相 关 的 功能 可 参阅 Dean (2001) 的 报道 。 4. MRP 的 空间 结构 目前 , 有 关 MRP 的 结构 研究 才刚 刚 开 始 ,, 而 MRP 的 空间 结构 的 研究 报道 甚 少 。 最 Ur Rosenberg 等 (2001b) 获得 了 MRP1 二 维 晶体 的 电镜 三 维 重 构 的 22A 分 辩 率 的 结果 , 表明 与 P-8p 有 许多 相似 , 比如 含有 一 个 圆 环 形 的 中 心 充满 染色 区 域 的 结构 和 两 个 似 对 称 性 的 微 区 , 这 可 能 相当 于 两 个 位 于 胞 质 面 的 NBD 结 构 域 。 这 可 能 提示 MRP1 是 一 种 二 聚 体 蛋 白 , 但 在 天 然 膜 中 MRP1 是 否 是 二 聚 体 还 不 清楚 。 1 要 启 夺 芒 生 口 “II Doyle (1998) 报道 ,不 表达 MDR1 或 MRP1 的 乳腺 癌 MCF-7 AH PRT ET eS (doxorubicin) Hi 259A A it 25 VE, 因 首先 是 从 乳腺 癌 细 胞 MCF-7/AdrVp 克 隆 并 表达 了 这 一 新 的 ABC 转运 体 而 被 称 为 乳腺 癌 附 药 蛋 自 (breast cancer resistance protein, BCRP); 其 在 胎盘 中 可 大 量 表 达 (Allikmets et al. 1998) , 也 被 称 为 ABCP (ABC transporter in placenta) ;又 因 其 在 抗 米 托 草 醒 (mitoxantrone) 的 结肠 癌 细 胞 株 S1-M1-80 中 被 发 现 亦 被 称 为 MXR (mitoxantrone resistance protein) (Brangi et al. 1999), ABCG2 转运 体 的 氮 基 酸 序列 与 ABC 转运 体 有 高 度 的 同 源 性 , 但 由 655 个 氨基 酸 组 成 的 蛋白 分 子 只 有 正常 ABC 转运 体 的 一 半 , 故 被 称 为 半分 子 转运 体 (half transporter) 。 它 由 一 个 TMD 和 一 个 NBD 结构 域 构成 , 与 由 两 个 半分 子 构成 的 ABC 转运 体 不 同 , 但 同样 表现 出 明显 的 耐 药 性 。 了 最近 , 发 现在 不 同 来 源 的 侧 群 (side population) 干细胞 中 均 有 ABCG2 基因 的 高 效 表达 ,认为 ABCG2 的 表达 可 能 作为 干细胞 分 化 的 探 针 标 记 (Zhou et al. 2002), ABCG2 可 能 在 基因 治疗 中 被 广泛 作为 选择 性 标记 (Frantisek et al. 2005) , 用 于 患者 细胞 治疗 的 移植 保护 (Krishnamurthy et al. 2004) 。 有 关 从 不 同 耐 药性 细胞 株 中 发 现 的 半分 子 转运 体 的 结构 与 功能 的 研究 沿 待 深入 (Bates et al. 2001 ) 。 1 二 [RISE is Ex AY P-gp, MRP 和 BCRP 外 , 肺 耐 药 蛋 白 (lung resistance protein,LRP) 是 与 MDR 相关 的 第 四 类 ABC 转运 体 , 是 由 Scheper 等 (1993) 最 早 发 现 的 可 引起 MDR 现 象 的 非 糖 蛋 白 , 广 泛 存在 于 多 种 正常 组 织 中 , 与 P-gp 和 MRP 相 类 似 , 在 具有 分 泌 、 排 泄 功能 的 组 织 中 分 布 较 多 。 LRP 的 cDNA 基因 全 长 为 2688bp, 编 码 896 个 氨基 酸 , 分 为 104~110kDa, 位 于 第 16 号 染色 体 短 车 p13.1~p11.2。 根 据 LRP AASB 中 编码 容 容 体 主 蛋白 (major vault protein, MVP) 基因 的 高 度 同 产 性 , 可 判断 ) 人 的 MVP, 而 且 也 可 能 是 核 孔 复合 物 的 组 成 成 分 , 在 调控 细胞 核 和 细胞 质 物 质 起 作用 。 大 部 分 窟 隆 体 位 于 胞 质 中 的 吉 抱 上 , 可 能 还 与 胞 质 中 圳 泡 运 输 有 关 。 LRP 在 许多 非 P-g 印 机 制 的 MDR 肿 瘤 细 胞 中 过 度 表 这 5 细胞 的 MDR 表 型 有 关 。LRP Wee | if 下 FE yy ie Biomembranes 220 ig ae CEA PALA, SS AHEAD ES es 25 PO UE BAAS, Ae LRP 可 能 与 肺 腺 癌 的 顺 铂 耐 药性 相关 。LRP 能 介 导 对 铂 类 、 烷 化 剂 等 这 些 由 P-gp 和 MRP 所 不 易 转运 的 药物 的 耐 药性 。 LRP 可 能 通过 两 种 机 制 引 起 MDR , 它 可 使 以 胞 核 为 靶 点 的 药物 不 能 通过 核 孔 进入 胞 核 , 即 使 进入 也 在 发 生 药 效 前 被 泵 出 核 外 ,, 也 可 使 胞 质 中 药物 进入 宫 泡 而 被 隔 室 化 ,并 通过 胞 吐 作 用 排出 细胞 外 , 其 机 制 已 被 一 些 观察 所 证 实 。 有 人 还 发 现 转 当 LRP 的 细胞 并 不 表现 了 耐 药性 (Larsen et al. 2000) 。 由 于 LRP 发 现 较 晚 , 目 前 的 研究 不 多 , 根 据 一 些 实 验 结 果 所 做 的 推论 较 多 , 但 至 今 缺 乏 强 有 力 的 实验 证 据 。 总 之 , 迄 今 的 研究 显示 , 在 与 MDR 相关 的 ABC 转运 体 研究 中 ,P-gp 和 MRP 是 研 究 较 多 和 较 清 楚 的 两 类 膜 蛋 白 。P-g 又 是 人 们 发 现 的 第 一 个 可 导致 MDR 现 象 , 并 对 甚 耐 药 机 制 研究 最 多 且 最 清楚 的 MDR 和 蛋白 。MRP 虽然 发 现 较 晚 , 但 近 十 余年 的 研究 进展 迅 速 。BCRP 是 近年 才 发 现 的 与 MDR 相关 的 耐 药 蛋 白 , 其 研究 正在 扩展 和 座 入 , 而 LRP 这 类 蛋白 的 研究 甚 少 , 其 耐 药 机 制 目前 更 不 清楚 。 18.3 肿瘤 多 药 耐 药性 作用 机 制 的 模型 “0 大 量 研 究 表明 ,ABC 转运 体 通 过 相似 的 机 制 实现 对 多 种 在 结构 上 并 不 相关 的 底 物 和 药物 跨 细 胞 外 膜 和 细胞 内 膜 的 转运 。 肿 瘤 细 胞 形成 多 药 耐 药性 主要 是 由 于 细胞 膜 上 存在 一 类 称 之 为 MDR 的 转运 体 蛋 白 , 如 了 P-gp 和 MRP 的 过 度 表达 所 引起 的 。 作 为 MDR 转运 体 的 底 物 或 药物 大 部 分 是 亲 脂 性 分 子 且 带 正 电荷 ,MDR 蛋白 可 以 转运 这 些 在 结构 和 功 能 上 都 不 同 的 多 种 药物 , 那 么 它们 是 如 何 识别 、 结 合并 转运 多 种 多 样 的 底 物 和 药物 呢 ? 目前 , 主 要 提出 了 三 种 模型 试图 解释 MDR 转运 蛋白 所 引起 的 肿瘤 多 药 耐 药 现象 。 183.1 ic 7S C25 (Fie 2am Gottesman (1993) che dike — he A [el ek 2 RE (hydrophobic vaccum cleaner model) , 认 为 MDR 转运 体 的 两 个 跨 膜 结构 域 形 成 一 个 药物 通道 ,MDR 转运 体 利用 水 解 AITP 提 供 的 能 量 把 药物 (包括 所 有 被 修饰 的 玻 水 性 药物 ) 转运 到 细胞 外 , 使 胞 内 的 药物 谊 度 维持 在 低 水 平 从 而 导致 肿瘤 细胞 产生 坠 药性 (图 18-5)。 支 持 这 一 模型 的 是 Rosenberg 等 对 纯化 的 P-gp 二 维 唱 体 的 电镜 三 维 重 构 (2.Snm 分 辨 率 ) 的 研究 结果 , 发 现 分 子 中 间 有 直径 约 Snm 的 漏斗 状 结构 , 对 MDR 转运 体 的 药物 通道 模型 的 假设 提供 了 较 直 接 的 实验 证 据 。 介质 依赖 能 量 的 外 拓 7 ”被动 扩散 细胞 质 ter ed 25 HEL FE P-gp 的 作用 机 制 (51 Johnstone et al. 2000) P-gp (WJ 4 eye ReZowsLin (红色 ), 化 疗 药物 (绿色 ) 在 ATP 存 在 下 汀 通过 脂 双 层 扩 散 被 转运 到 细胞 外 面 221 #188 ABC #E ie fk Fp 2 25 ot ZS 18.3.2 MEAG B iX ze Higgins 等 于 20 世 纪 90 年 代 初 提出 的 翻转 酶 模型 (flippase model) , 认 为 在 细胞 膜 上 的 一 种 具有 磷脂 翻转 酶 活性 的 转运 体 蛋 白 , 可 以 把 位 于 膜 内 侧 的 非 极 性 药物 分 子 像 转 运 磷脂 那样 将 药物 从 膜 内 翻转 到 膜 外 并 在 胞 外 释放 , 从 而 使 细胞 产生 耐 药性 〈 图 18-6 ) (Higgins et al. 1992b) 。 已 在 整体 动物 、 细 胞 和 分 子 等 不 同 水 平 证 明 MDR 蛋白 确 具 有 磷 脂 翻转 酶 的 特性 (Higgins 1994, Romsicki et al. 2001, Huang et al. 2004a ) 。 a vee ; 细胞 质 膜 释放 (1B) Na i 25 Pyke ZIRE AS AERO ( 引 自 Johnstone et al. 2000) 药物 先 与 膜 脂 相互 作用 , 甚 后 与 P-gp 相互 作用 , 由 膜 的 内 半 层 直接 转运 到 膜 的 外 半 层 并 释放 到 胞 外 18.3.3 胞 内 酸碱度 改变 模型 根据 胞 内 酸碱度 改变 模型 (altered partitioning model 或 ApH/membrane potential model ) WA), 细胞 膜 上 的 MDR 转 运 体 并 不 与 被 转运 的 药物 直接 结合 , 而 是 通过 其 过 度 表达 影响 离子 通道 活性 , 导致 肿瘤 细胞 内 碱 化 , 使 细胞 膜 电 势 去 极 化 改变 膜 电 势 , MDR 蛋白 类 似 于 一 种 质子 系 或 通过 非 直接 形式 减少 阳离子 和 脂 盗 性 化 疗 药物 在 胞 内 的 积累 ,或 激活 胞 内 特异 性 酶 使 胞 内 药物 降解 或 被 化 学 修饰 而 失 活 , 导 致 细胞 对 药物 的 抗 性 (Simon et al. 1994) 。 跨 膜 pPH 梯度 的 改变 主要 从 4 个 方面 影响 肿瘤 细胞 的 多 药 耐 药性 : (1) 降低 化 疗 药物 的 内 流速 率 ; (2) 改变 细胞 膜 的 生化 和 生物 物理 特性 , 进 而 影响 药物 与 膜 的 结合 和 跨 膜 扩 散 能 力 ; (3) 改变 弱 碱 性 药物 在 胞 内 的 分 布 平 衡 ,(4) 影响 药物 与 靶 位 点 作用 的 有 效 性 。 这 些 因素 的 综合 最 终 影响 化 疗 药物 在 肿瘤 细胞 内 的 滞留 从 而 产生 耐 药性 。 上 述 模型 都 有 其 一 定 的 实验 证 据 , 但 胞 内 酸碱度 改变 模型 较 其 他 两 种 模型 尚 是 一 种 存在 争议 的 假设 .肿瘤 细胞 的 耐 药 机 制 是 复杂 的 , 可 能 仅 用 某 一 种 模型 难以 圆满 解释 耐 药 机 制 。 奇 药 表 型 可 因 肿 瘤 类 别 和 细胞 分 化 阶段 的 不 同 而 异 , 甚至 有 明显 差别 。 不 同 的 肿瘤 对 不 同 的 化 疗 药物 乃至 对 同一 种 化 疗 药物 的 耐 药 机 制 不 同 ,而 同一 种 肿瘤 细胞 对 不 同 的 化 疗 药物 的 耐 药 机 制 也 可 能 不 同 。 根 据 现 有 研究 ,MD 乡 种 机 制 可 能 涉及 到 细胞 周期 调控 点 的 改变 、 细 胞 凋 亡 机 制 的 失调 .受伤 细 紫 复 和 胞 内 药物 积 标 的 减少 (Borst et al. 2002, Gottesman 2002a) 、 胞 内 Ca?’ 变化 (Yong et al. 1997, Liang et al. 2000) 以 及 膜 脂 的 变化 (Iffert et al. 2000, ig et al. 2002, Huang et al. 2003) 等 , 而 且 临 床 耐 药 与 体外 肿瘤 细胞 耐 药 表 型 和 性 J 能 有 很 大 差别 , 因此 , 如 何 在 临床 治疗 中 检验 这 些 模型 更 属 不 易 。 现 在 一 般 认 为 ,, 关 一 种 肿瘤 细胞 的 耐 药性 可 能 生物 膜 Biomembranes 299 主要 与 某 种 耐 药 机 制 相 关 , A rh 7G EE Pe A TOT 25 HE ay eS ML HBAS VA 控 相 关 的 。 18.4 问题 与 轧 自从 1976 年 在 中 国 仓 鼠 卵 细胞 中 发 现 了 分 布 于 细胞 膜 表 面 的 P 型 糖 和 蛋白 一 一 P-gp 以 K, AK ABC 转运 体 大 家 族 的 成 员 、 分 布 、 基 因 克 隆 和 表达 、 性 质 、 结 构 和 转运 功能 生理 意义 , 以 及 它们 与 多 种 人 类 疾病 的 密切 关系 等 进行 了 广泛 地 研究 , 特 别 是 与 肿瘤 细 胞 的 多 药 耐 药性 相关 的 ABC 转运 体 , 如 P-gp 和 MRP 亚 家 族 的 转运 蛋白 的 结构 和 功能 Fee TBR A TRUE, 对 于 逐步 深入 了 解 和 揭示 MDR 的 分 子 机 制 提 供 了 丰富 的 信息 , 取得 了 显著 进展 。 但 是 , 欲 彻底 前 明 MDR 精确 的 分 子 机 制 及 其 与 临床 实践 的 关系 , 仍 有 诸多 重要 问题 尚 竺 深入 探讨 。 (1) MDR 转 运 体 为 什么 能 结合 并 转运 多 种 化 学 结构 和 作用 不 同 的 底 物 和 药物 ?为 了 前 明 这 一 重要 问题 , 需 进一步 深入 了 解 和 揭示 : 与 底 物 或 药物 具有 高 亲和力 的 结合 位 点 的 结构 ; 在 NBD1 或 NBD2 的 ATP 结 合 位 点 和 水 解 是 如 何 调控 MSD 的 底 物 或 药物 的 结 合 及 其 转运 : NBD 结构 域 的 ATP 酶 活性 与 MDR 转运 功能 的 偶 联 作 用 是 如 何 进 行 的 ; 在 ATP 催化 循环 或 转运 过 程 中 MDR 转运 体 的 结构 /构象 变化 的 动态 特性 等 。 (2) 获得 MDR 转运 体 全 分 子 和 各 结构 域 及 其 与 药物 或 核 苷 酸 相 结合 的 高 分 辩 率 三 维 结构 信息 .MDR 转 运 体 或 其 结构 域 的 高 分 辩 率 三 维 结构 的 解析 , 无 疑 对 精确 前 明 MDR 转运 体 耐 药性 的 分 子 机制 以 及 了 解 药物 转运 的 精细 调控 具有 重要 的 理论 和 实际 意义 。 (3) 在 临床 上 , 化 疗 药物 和 化 敏 剂 的 联合 使 用 可 能 是 殉 服 MDR 的 重要 途径 之 一 。 很 多 在 化 学 分 类 上 不 同 , 但 化 学 结构 和 具有 不 同 靶 点 的 药物 ( 表 18-1, Ze 18-2) 由 于 在 生 理 p 了 时 一 些 药物 带 正 电荷 以 及 它们 的 两 亲 性 , 它们 通过 被 动 扩散 能 进入 细胞 。 尽管 人 们 开发 了 用 于 临床 逆转 P-gp 耐 药性 的 一 些 调节 制剂 ( 表 18-1) , 但 其 成 功率 是 很 有 限 的 (Gottosman et al. 2002b, Leonard et al. 2002 ) 。 因 此 克服 MDR 的 战略 选择 之 一 , 可 能 是 将 化 疗 药物 和 能 减弱 P-gp 或 MRP 作用 的 化 敏 剂 一 起 使 用 , 这 有 利于 化 疗 药物 在 肿瘤 细 胞 内 的 积累 从 而 增强 化 疗 疗效 ,显然 发 现 MDR 转 运 体 的 新 的 专 一 性 抑制 剂 或 阻 断 剂 是 值 得 重视 的 。 (4) 如 何 将 分 子 、 细 胞 水 平 、 动 物 整 体 和 临床 治疗 实践 的 研究 有 机 地 结合 起 来 ,是 研究 MDR 必须 考虑 和 关注 的 综合 途径 。 致谢 : 感谢 梁 兴 杰 和 黄 振 华 博士 分 别 在 MDR 转运 体 的 P-gp 和 MRP1 的 博士 论文 研究 工 作 中 所 做 出 的 有 意义 研究 , 以 及 在 撰写 本 文中 所 给 予 的 帮助 , 感 谢 万 里 昕 和 赵 学 琳 女 士 在 准备 本 文中 给 予 的 帮助 。 文 中 所 涉及 到 的 有 关 本 实验 室 在 P-gp 和 MRP1 的 一 些 研究 结 果 曾 获得 国家 自然 科学 基金 委 的 资助 (基金 号 : 39730130) , 表 示 囊 心 感谢 。 223 #18 ABC #67z fk Fy Z Zo tt Zo: a ee ee a eee Allikmets R, Schriml L M, Hutchinson A, et al. 1998. A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4&22 that is involved in multidrug resistance. Cancer Res, 58(23): 5337-5339 Almquist K C, Loe D W, Hipfner D R, et al. 1995. Characterization of the M(r) 190, 000 multidrug resistance protein(MRP) in drug-selected and transfected human turmor cell. Cancer Res, 55(1): 102-110 Ambudkar S V, Dey S, Hrycyna C A, et al. 1999. Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter. Annu Rev Pharmacol, 39: 361-398 Ambudkar S V, Kimchi-Sarfaty C, Sauna Z E, et al. 2003. P-glycoprotein: from genomics to mechanicsm. Oncogene, 22: 7468-7485 | Bakos E, Hegedu T, Hollo Z, et al. 1998. Functional multidrug resistnace protein(MRP 1) lacking the N-terminal transmembrane domain. J Biol Chem, 273(48): 32167-32175 Bates S E, Robey R, Miyake K K, et al. 2001. The role of half-transpoters in multidrug resistance. J Bioenerg Biomemb, 33(6): 503-511 Biedler J L, Riehm H. 1970. 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Proc Natl Acad Sci USA, 99(19): 12339-12344 19 章 Ran GTP 酶 及 其 结合 蛋白 在 核 腊 闭 配 过 程 中 的 调控 作用 19.1 苇 膜 的 基本 构成 .一 226 VQ. PAF ASSES) nc ceccvicnccesscpenecceconsseacsoresyevaess as UE 226 19.1 2 FEAT LST sicbedeces dancdedecsnvocassaee Nes sdacsuvesteernte ae 225 £950.35 FRI ASAE AE, cca sone ccecccealel scerecvneceusbucaeoees nee 228 19.2 Ran GTP 酶 及 其 主要 结 全 生日 本 19.3 Ran GTP 酶 及 其 结合 蛋白 系统 调节 核 膜 装配 过 程 .…………….…. 230 19.3.1 Ran 调 挖 细胞核 重建 过 程 的 发 现 二 230 19.3.2 Ran GTP 酶 循环 是 ee 建 所 必须 的 过 程 …… .230 19.3.3 Aisa BB S/R te: A EI Ze A 8 ee 231 19.4 Ran GTP 酶 调控 es 的 组 装 … 志 全 全 的 232 人 233 12.1“ 核 脆 的 基本 爸 成 “WE 19.1.1 核 大 的 形 去 生食 ER 真 核 细 胞 中 存在 核 膜 (nuclear envelope) 是 真 核 细胞 与 原核 细胞 的 典型 区 别 之 一 。 核 膜 是 细胞 核 nucleus) 与 细胞 质 (cytoplasm) 之 间 的 屏障 , 使 不 同 的 生化 过 程 在 不 同 的 区 域内 进行 。 在 电镜 下 可 见 核 膜 主要 由 两 层 膜 构成 , 即 外 核 膜 (outer nuclear membrane, ONM) 和 内 核 膜 (inner nuclear membrane, INM) 。 外 核 膜 与 粗 面 内 质 网 相连 , 结 合 有 许多 核糖 佐 ; 在 外 核 膜 和 内 核 膜 之 间 , 有 一 A> Fi, 24) 10 ~ 50nm YAIR, PRAY” (peri-nuclear space) 。 内 核 膜 面 癌 核 内 , 与 核 纤 层 (nuclear la na) 以 及 染色 质 相 连 , 没有 核糖 体 与 之 结合 。 外 核 膜 和 内 核 膜 上 二 头 有 不 同 的 蛋白 质 。 在 内 外 核 Wot 22 fall Z ND FE Hk AFL 2 GPS (nuclear pore complex, NPC), , 核 4LEBRAEKAA 90~120nm, (C5 AHL Py a EAS FL 227 19% Ran GTP K8REZAA EA ER Ha Fe Pa EA 合体 一 般 较 小 一 些 , 蛋 白质 种 类 也 相对 较 少 , 高 等 生物 的 核 孔 复合 体 相 对 较 大 , 所 含 蛋 自 种 类 也 较 多 。 细 胞 通过 核 孔 复合 体 控 制 核 内 与 细胞 质 之 间 的 物质 转运 。 广 义 的 核 膜 还 包括 核 纤 层 , 是 位 于 内 核 膜 下 的 一 层 由 蛋白 质 组 成 的 网 状 结构 , 厚 约 10 一 20nm。 核 纤 层 蛋白 (lamin) 内 与 染色 质 蛋白 结合 , 外 与 核 膜 蛋白 结合 ,为 染色 质 以 及 核 膜 提供 一 个 支 19.1.2 17% 57 _ gg 核 膜 虽 由 两 层 膜 构成 , 但 二 者 的 生物 化 学 成 分 却 有 明显 不 同 。 核 外 膜 的 成 分 与 粗 面 内 质 网 相似 , 外 表面 上 还 镶 庶 有 大 量 的 核糖 体 。 内 核 膜 含有 一 些 特殊 的 蛋白 质 成 分 (Holmer and Worman 2001), 目 前 已 知 的 特殊 蛋白质 成 分 包括 核 纤 层 蛋 白 B 受 体 (lamin B receptor,LBR)、 核 纤 层 结合 多 肽 (lamina associated polypeptide 1、2,LAP1、 LAP2)、MAN1、Emerin、Nurim、Nesprin、Otefin 等 (图 19-1)。 目 前 人 们 多 少 知道 LBR、 Emerin、LAP1 和 LAP2 与 染色 质 和 核 膜 结合 , 在 二 者 之 间 起 一 定 连 接 和 骨架 作用 ;而 对 MAN1 和 Nurim 的 功能 几乎 一 无 所 知 。 关 椎 动物 的 核 孔 复合 体 总 分 子 质 量 大 约 为 1.25 x 10 Da, 主要 由 核 孔 复合 体 蛋 白 (nucleoporin) 构成 ; 酵母 的 核 孔 复合 体 总 分 子 质量 约 为 (G-7)x10'Da。 据 近期 核 孔 复合 体 蛋 白质 组 学 分 析 结 果 , 核 孔 复合 体 蛋 白 约 为 30 HE A, 其 中 三 分 之 二 的 核 孔 复合 体 蛋 白 含 有 FG 或 FxFG 结 构 序 列 , 这 一 序列 在 核 孔 复合 体 装配 和 执行 其 功能 方面 非常 重 要 。 核 纤 层 由 核 纤 层 蛋白 聚合 而 成 , 高 等 生物 的 核 纤 层 蛋 和 白 主 要 包括 lamin A, lamin B ffl lamin C 三 种 成 分 。 细胞 质 P2p LAP1 i =mel in : Nese rin Otefin LAP2y xe | 核 膜 和 核 孔 复合 体 结 ; 核 膜 主 要 由 两 层 蜡 和 镶嵌 其 上 的 核 孔 复合 体 (NPC) 构成 。 外 核 膜 面向 细胞 asm) , 与 粗 面 内 质 网 相连 , 在 外 核 膜 和 内 核 膜 之 问 有 一 核 周 险 。 内 核 膜 面向 核 质 (nucleoplasm) , 与 核 纤 层 (mo smina) 以 及 染色 质 相 连 。 外 核 膜 和 内 核 膜 上 镶 供 不 同 的 蛋白 质 , 外 核 膜 的 蛋白 成 分 与 粗 面 内 质 网 面相 似 , 内 核 。 。 挟 白 成 分 有 其 特点 , 主 要 包括 LBR、 Nurim, MAN1, LAP. Emerin, Ote He Wy i Biomembranes 228 | 核 膜 在 细胞 周期 中 呈现 出 规律 性 的 动态 变化 , 尤其 是 高 等 真 核 细胞 的 核 膜 , 在 细胞 分 裂 过 程 中 动态 变化 十 分 剧烈。 在 细胞 分 裂 的 前 期 , 随 着 染色 体 凝集 和 纺锤 体 组 装 , 核 膜 发 生 骨 解 , 形 成 小 膜 泡 , 分 散 到 细胞 质 中 , 在 细胞 分 裂 的 后 期 和 未 期 , 随 着 染色 体 的 分 离 ,在 其 周围 将 逐步 组 装 新 的 子 细胞 核 膜 。 在 此 过 程 中 , 核 孔 复合 体 也 发 生 解 聚 和 重 新 装配 等 动态 变化 。 核 膜 的 装配 一 般 可 以 人 为 地 划分 为 几 个 阶段 , 即 核 膜 前 体 小 膜 泡 与 妆 色 质 结合 ,小 膜 泡 融合 成 双 层 膜 结构 ,, 核 孔 复合 体 组 装 在 双 层 膜 上 逐步 重新 组 装 ,以 及 核 膜 随 着 子 细胞 核 体积 增长 而 逐渐 扩充 等 (Gant and Wilson 1997)。 对 于 核 膜 动态 变 化 过 去 已 有 不 少 研究 , 但 对 核 膜 重建 的 机 制 则 缺乏 深入 认识 。 直到 2000 年 , 人 们 才 发 现 Ran GTP 酶 在 核 膜 重 建 过 程 中 起 中 心 调控 作用 (Hetzer et al. 2000, Zhang and Clarke 2000), 随 之 , 核 膜 重建 的 分 子 机 制 研究 得 以 迅速 进展 。 122 Ran GTP 用 及 大 主 发 伟 合 生 口 “AI Ran (Ras-like nuclear protein) 是 原 癌 基因 产物 Ras 超 家 族 成 员 之 一 ,是 一 个 小 分 子 G 蛋白 , 其 分 子 质量 约 为 23kDa, 大 约 95$% 的 Ran 分 子 分 布 于 细胞 核 内 。 作 为 GTP fig, Ran 有 两 种 鸟 苷 酸 结 合 形式 , 即 Ran-GTP 和 Ran-GDP。Ran-GITP 通 过 其 GTP 分 子 水 解 转 化 成 Ran-GDP, 人 们 通常 认为 Ran 通过 分 解 其 GTP 分 子 来 调节 各 种 生命 过 程 (Avis and Clarke 1996), 与 其 他 许多 GTP 酶 一 样 ,Ran 本身 的 GTP 酶 活性 很 弱 , 但 在 其 结合 蛋白 RanGAP (Ran GTPase-activating protein) 的 协助 下 , 其 活性 可 以 提高 10 万 倍 。RanGAP 的 活性 又 受到 另 一 种 Ran 结合 蛋白 RanBP1 的 辅助 , 使 Ran 的 GTP 酶 活性 再 提高 一 个 数量 级 。 当 GTP 分 子 分 解 后 ,Ran 分 子 本 身 尚 不 能 够 将 剩余 的 GDP 分子 解 离 下 来 换 成 新 的 GTP 分 子 , 而 是 需要 一 种 称 为 RanGEF (Ran guanine nucleotide exchange factor) fy Ran 结合 蛋 自 的 帮 By, 现在 已 知 的 RanGEF 仅 有 RCC1 (regulator of chromosome condensation 1 ) 一 种 。RCC1 定位 于 细胞 核 内 ,而 RanGAP 和 RanBP1 则 定位 于 细胞 质 中 。 于 是 人 们 推测 , 核 内 的 Ran 主要 为 Ran-GTP 结 合 形式 ,而 细胞 质 中 的 Ran 主要 为 Ran-GDP 结 合 形式 , 在 细胞 核 内 外 存在 一 个 Ran-GTP/ GDP 浓度 梯度 差 。 这 一 推测 由 Kalab 等 (2002) 通过 荧光 共振 能 量 转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 所 证 实 。 一 般 认 为 ,Ran-GTP/ GDP 浓度 梯度 差 对 其 执行 生物 学 功能 非常 重要 。 在 M 期 ,RCC1 fee eK LE, BREW 色 体 癌 四 周 产生 一 个 Ran-GTP/GDP 浓度 梯度 ; 但 在 分 裂 期 非洲 爪 蟾 卵 提 取 物 中 ,RCC1 位 于 细胞 质 中 。 当 加 入 染色 质 或 DNA 进行 细胞 核 重建 时 ,RCC1 RAAB AE. 除 上 述 Ran 结合 蛋白 外 , 还 有 其 他 数 种 结合 蛋白 对 维持 Ran-GTP/GDP 浓度 梯度 和 Ran 执 行 功 能 等 非常 重要 , 这 类 结合 蛋白 包括 : 内 运 蛋白 (importin) 、 外 运 蛋白 (CRMI/ exportin) 、 核 转运 蛋白 -2 (nuclear transport factor 2, NT} 2), 核 孔 复合 体 蛋 和 白 (nucleoporin ) 等 。Ran 首先 被 确认 的 功能 是 调控 细胞 核 和 细胞 质 之 睛 六 物质 转运 , 被 转运 的 物质 常常 是 一 些 含 有 核 内 定位 信号 (nuclear localization sequence NLS) 的 蛋白 质 , 与 内 运 蛋 和 白 Wma: 本 , 随 之 被 运往 细胞 核 内 。 在 核 膜 的 内 侧 , 该 复合 体 在 Ran-GTP 作用 下 解 离 , 229 #198 Ran GTP fig he FLAG A EMRE AL Fe PH PEE 被 转运 物质 从 内 运 蛋白 上 释放 下 来 ,游离 于 细胞 核 内 ,内 运 和 蛋白 和 Ran-GTP 可 能 在 一 种 外 运 因子 CAS 的 协助 下 ,返回 细胞 质 ,在 胞 质 中 ,Ran-GTP 在 RanGAP 和 RanBP1 的 作 用 下 水 解 其 GTP 分 子 , 形 成 Ran-GDP, 释 放出 内 运 和 蛋白,Ran-GDP 又 通过 结合 NTF2, 再 转运 到 细胞 核 , 在 核 内 RCCI1 的 作用 下 ,Ran-GDP 转化 为 Ran-GTP, 从 而 维持 核 内 外 的 Ran-GTP/GDP 浓 度 梯 度 (图 19-2)(Gorlich and Kutay 1999)。 含 有 核 外 定位 信和 号 (nuclear export sequence, NES) 的 蛋白 质 向 核 外 转运 时 , 需 要 与 外 运 蛋白 和 Ran-GTP 结合 成 三 聚 体 。CRMI 的 功能 可 被 一 种 药物 细 老 素 B (leptomycin B,LMB) 所 抑制 。 三 聚 体 由 内 向 外 转运 到 细胞 质 后 ,Ran-GTP 转化 为 Ran-GDP, 三 聚 体 分 解 ,NES 蛋白 被 释放 出 来 。 在 核 膜 内 外 物质 转运 过 程 中 , 核 孔 复合 体 蛋 白 尤 其 是 含有 FG 或 FxFG 结 构 序 列 的 核 孔 复 合体 蛋白 , 始 终 起 着 不 可 或 缺 的 重要 作用 。 这 些 核 孔 复合 体 蛋 白 可 以 在 核 孔 复合 体 上 为 内 运 蛋白 或 外 运 蛋白 提供 附着 位 点 , 调 控 NLS/NES 货物 的 转运 。 细胞 质 Ran-GDP => > ab Ran GTP 酶 循环 及 其 与 结合 蛋白 之 间 的 相互 作用 已 有 实验 证 明 ,90%~95% 的 Ran 位 于 细胞 核 内 。 甚 活性 调控 蛋白 RCC1 主要 定位 于 细胞 核 内 .RanGAP 和 RanBP1 则 位 于 细 胞 质 中 。 Ran 有 两 种 底 物 结合 形式 , 即 Ran-GDP 和 Ran-GTP。 由 于 RanGAP 和 RanBP ANNE HA AY Ran 据 推 测 为 Ran-GDP 形 式 。 细 胞 质 中 的 Ran-GDP 在 NTF2 的 协助 下 通过 核 孔 复合 体 转 运 入 细胞 ; 到 RCC1,, 转 化 为 Ran-GTP 形式 , 并 与 NTF2 分 离 。Ran-GTP 可 以 直接 或 间接 地 在 其 结合 蛋白 CAS 的 协助 下 运 二 有 核 内 定位 信号 (NLS) 的 蛋白 质 , 通 过 与 内 运 蛋 白 〈Imp.) 结合 成 复合 体 运 入 细胞 核 , 在 核 内 Ran-GTP fi 合体 发 生 解 离 , 释 放出 NLS & 和 白 。 含 有 核 外 定位 信号 (NES) 的 蛋白 质 , 需 要 先 与 外 运 蛋白 CRM1 和 Ran-GTI : 聚 体 , 然 后 转运 出 细胞 核 , 这 一 过 程 受 到 药物 LMB 的 抑制 ws HE %% }® Biomembranes 230 19.3 Ran GTP fig S025 GA RSC TAC LF 19.3.1 Ram iif 2H CEI Hy 网 络 模型 arr, 中 止 素 (arrestin),E, 效 应 分 子 , G,G 蛋白 ,GRK, SAGE G 蛋白 偶 联 受 体 激酶 U- ‘ee HE y i Biomembranes 250 可 以 与 其 他 七 次 跨 膜 G 和 蛋白 偶 联 受 体 生成 二 〈 多 ) 聚 体 , 那 么 该 受 体 被 激活 时 与 该 受 体 结合 的 其 他 相 邻 受 体 也 会 被 激活 , 结 果 就 会 有 除了 与 该 受 体 有 关 的 G 蛋 白 被 激活 外 ,其 他 多 种 G 蛋白 也 会 被 激活 , 就 会 呈现 出 复杂 的 信号 转 导 过 程 。 此 外 , 七 次 跨 膜 G 和 蛋白 偶 联 受 体形 成 二 聚 体 后 会 有 转 激 活 (transactivation) 的 现象 。 转 激 活 是 指 一 个 受 体 被 激活 后 进而 激活 了 异 源 受 体 。 异 源 受 体 可 以 是 同类 型 受 体 , 也 可 以 是 不 同类 型 受 体 , 还 可 以 是 一 个 七 次 跨 膜 G 蛋 白 偶 联 受 体 在 与 配 基 结合 后 不 表现 出 原 来 与 该 受 体 相关 的 信号 转 导 , 而 表现 出 与 该 受 体 相 结合 生成 异 二 聚 体 的 另 一 个 受 体 相 关 的 信号 转 导 。 转 激活 给 分 析 七 次 跨 膜 G 和 蛋白 偶 联 受 体 的 信号 转 导 带 来 了 难度 。 例 如 判断 表皮 生长 因子 受 体 是 否 是 被 七 次 跨 膜 G 蛋 白 偶 联 受 体 转 激 活 时 , 必 须 与 通过 受 体 信号 转 导 使 转录 因子 激活 基因 的 结果 相 区 别 。 除 了 表皮 生长 因子 受 体外 ,还 有 一 些 酷 氨 酸 激酶 受 体会 被 七 次 跨 膜 G 和 蛋白 偶 联 受 体 激 活 ( 表 21-3)。 由 于 七 次 跨 膜 G 蛋 和 白 偶 联 受 体会 转 激 活 栈 迄 酸 激酶 受 体 , 从 而 促进 生长 , 因 此 给 肿瘤 患者 使 用 七 次 跨 膜 G a A ee PR 剂 药物 时 需要 谨慎 。 另 外 除了 转 激 活 外 , 也 有 转 抑制 现象 , 即 一 个 受 体 的 激活 导致 另 一 个 受 体 的 抑制 。 受 体 配 基 细胞 类 型 成 纤维 细胞 生长 因子 受 体 nurse a ae eo HER2/ErbB2/neu 溶血 磷脂 酸 SSC-9 鳞 状 细胞 癌 细 胞 胰岛 素 样 生长 因子 1 受 体 凝血 酶 血管 平滑 肌 细 胞 神经 营养 素 (neurotrophin) 栈 氨 酸 激酶 受 体 HRMS RE PC12 细胞 血小板 衍生 生长 因子 Ye tin he se L 细胞 血管 紧张 素 血管 平滑 肌 细 胞 血管 内 皮 生 长 因子 受 体 2 血管 渐 组 素 原 代 心脏 毛细 管内 皮 细 胞 214 fe Se SCART — AE fri) mes fa se SSCA AERA EA, A—PBUL TORE. EMMEREALAK A 中 虽然 与 去 污 剂 形 成 复合 物 , 但 仍 很 难 获得 符合 X 射 线 衍 射 要 求 的 结晶 。 目 前 已 有 25 000 多 种 蛋白 质 三 维 空间 结构 的 报道 , 但 是 膜 蛋白 的 晶体 结构 已 分 析 的 只 有 100 多 个 (包括 不 同 物种 的 同一 种 膜 蛋 白 )。 品 体 结 构 对 于 了 解 蛋 白质 的 性 质 与 功能 十 分 重要 。 信 和 号 转 导 受 体 的 胞 外 区 位 于 亲 水 环境 下 , 单独 表达 的 胞 外 区 比较 容易 结晶。 信号 转 导 受 体 胞 外 区 是 受 体 与 配 基 结 合 的 部 位 , 且 一 般 保留 着 与 配 基 结合 的 性 质 , 因 此 能 提供 相当 量 的 信息 。 21.4.1 表皮 生长 内 了 文体 “EGR 近年 来 对 表皮 生长 因子 受 体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 胞 外 区 与 表 皮 生 长 因子 复合 物 三 维 结构 的 解析 , 使 人 们 对 表皮 生长 因子 激活 表皮 生长 因子 受 体 的 机 制 有 了 尘 符 的 认识 。 从 3.3A 复 合 物 晶 体 的 三 维 结构 看 , 表皮 生长 因子 与 受 体形 成 2 :2 复 合 物 。 虽 允 专 皮 生长 因子 本 身 在 溶液 中 能 形成 二 聚 体 结晶 , 但 是 在 复合 物 中 2 个 表皮 生 兵 因 子 之 间 , 没 有 直接 相互 作用 , 这 就 纠正 了 以 往 认为 表皮 生长 因子 起 着 拉拢 受 体 而 生 :二 聚 体 的 ; 念 。 表 皮 生 长 因子 不 是 结合 在 接近 于 受 体 生成 二 聚 体 的 部 位 , 而 是 结合 251 212 Wi Wi fs FFE FS lS 远离 受 体 生成 二 聚 体 的 部 位 (PEI 21-7) . BE REAAR F582 4 Ba TT AE Et 结合 , 因 此 可 以 认为 ,表皮 生长 因子 与 受 体 结 合 后 使 受 体 的 构象 发 生 改 变 , 从 而 影响 了 受 体 跨 膜 螺旋 的 构象 , 促 进 受 体 二 聚 体 稳定 , 导 致 胞 内 区 酷 有 酸 激酶 的 激活 。 结构 域 结构 域 I 结构 域 结构 域 1 结构 域 IAA 结构 域 1 of. 结构 域 III ae 结构 域 II 结构 域 IV FBR 表皮 生长 因子 与 表皮 生长 因子 受 体 胞 外 区 共 晶 的 晶体 结构 A. 模型 ,B. 上 面 观 ,C. 表面 观 表皮 生长 因子 受 体能 与 不 同 的 配 基 结 合 . 从 TGF o 表 皮 生 长 因子 受 体 胞 外 区 1~ 501 复合 物 2.SA 晶体 结构 来 看 , 也 显示 TGF o 结合 在 表皮 生长 因子 受 体 远 离 受 体 生成 二 聚 体 的 部 位 ,生成 2 :2 复合 物 。 细 胞 表面 通常 含 没有 与 配 基 结 合 的 表皮 生长 因子 受 体 ,本 基 的 结合 使 受 体 胞 外 区 重 定 同 , 从 而 使 激酶 结构 域 重 定向 。 虽然 表皮 生长 因子 受 体 胞 外 区 对 于 胞 内 区 栈 氨 酸 激酶 的 激活 是 重要 的 , 但 是 跨 膜 区 也 有 重要 作用 。 胞 外 区 缺失 的 表皮 生长 因子 受 体 的 酷 氨 酸 激 被 激活 的 , 由 此 可 以 认为 表皮 生长 因子 受 体 胞 外 区 有 着 对 与 配 基 无 关 的 受 人 H -性 聚合 的 抑制 作用 。 在 受 体 栈 氨 酸 激酶 家 族 中 有 一 些 受 体 的 二 聚 体 化 与 . 制 和 表皮 生长 因子 受 体 不 同 。 例 如 神经 生长 因子 (NGF) 诱导 受 体 二 聚 体 化 , 让 通过 配 基 二 聚 体 化 实现 的 。 21.4.2 2 W/E Das". (5 ee: ‘meres 以 ”一 般 认为 红细胞 生成 素 受 体 (erythropoietin rec or) 的 激活 是 由 于 配 基 诱 导 的 H: Wy i Biomembranes 252 二 聚 体形 成 , 然 而 , 一 些 实验 表明 关键 是 二 聚 体 的 构象 而 不 是 二 聚 体 的 生成 。 在 未 与 红 细胞 生成 素 结合 时 , 红细胞 生成 素 受 体 可 能 已 经 是 二 聚 体 了 。 红 细胞 生成 素 受 体 可 以 被 红细胞 生成 素 模拟 多 肽 激活 , 红细胞 生成 素 受 体 胞 外 区 (EBP) 与 模拟 多 肽 EMP1 的 复合 物 的 2.4 A 晶体 结构 如 图 21-8 所 示 。 PPE) 红细胞 生成 素 受 体 胞 外 区 结构 与 配 基 结 合 激活 JAK 的 机 制 A. 不 含 配 基 的 红细胞 生成 素 受 体 胞 外 区 ; B. 与 配 基 结合 后 的 红细胞 生成 素 受 体 胞 外 区 D1, 结 构 域 1,D2,, 结构 域 2,EMP1, 红 细胞 生成 素 模拟 多 肽 ,JAK-2, 胞 浆 内 酷 氨 酸 激酶 JAK-2 EBP 含 红细胞 生成 素 受 体 序列 1~ 225。 比 较 含 与 不 含 配 基 的 EBP 结构 , 可 以 清楚 地 看 到 在 没有 配 基 时 EBP 已 是 二 聚 体 , 但 由 此 得 到 的 结构 模型 显示 相应 的 受 体 跨 膜 区 与 胞 内 区 彼此 距离 颇 远 ,JAK2 的 自 磷 酸化 位 点 与 胞 内 苞 酸化 位 点 难以 接近 而 产生 磷酸 化 。 当 EMP1 与 EBP 结合 ,D2 癌 D1 旋 转 13” , 导 致 D1 与 D2 结 构 域 靠近 , 受 体 的 胞 内 区 也 因而 接近 , 产 生 磷 酸化 。 21.4.3 ULE] 视 紫红 质 (rhodopsin) 是 一 种 七 次 跨 膜 G 蛋白 偶 联 光子 受 体 , 属 于 亚 家 族 A, 亚 家 族 A 的 受 体 占 七 次 跨 膜 G 蛋 白 偶 联 受 体 总 数 的 90%。 与 视 紫红 质 联系 的 G 质 是 转 导 蛋 白 (transducin) , 视 紫红 质 吸收 一 个 光子 导致 成 百 个 G 蛋白 激活 。 视 紫红 质 的 2.8 A 晶体 结 构 (图 21-9) 是 被 解析 的 第 一 个 七 次 跨 膜 G 蛋白 偶 联 受 体 的 结构 , 对 于 了 解 这 一 类 受 体 的 结构 与 功能 有 重大 的 意义 。 视 紫红 质 胞 外 区 的 结构 (包括 保守 的 二 硫 键 ) 是 形成 七 次 跨 膜 结构 的 基础 。 视 紫红 质 晶体 结构 的 解析 为 其 他 七 次 跨 膜 G 蛋白 偶 联 受 体 提供 了 一 个 结构 样板 。 2003 年 , Fotiadis 等 报道 用 原子 力 显微镜 研究 天 然 眼 球 视网膜 圆 盘 膜 , 发 现 圆 盘 膜 约 7~8nm ,, 呈 圆 形 , 直 径 约 为 0.9 一 1.5hm, 大 约 每 hm 上 有 48 300 + 8 300 个 视 紫红 质 单 体 。 儿 “所 有 的 视 紫红 质 均 以 二 聚 体形 式 存在 , 但 是 也 有 人 认为 Fotiadis 等 所 发 现 的 - 聚 体 是 俄 ,因为 制备 样品 时 分 离 掉 了 脂 质 。Fotiadis 等 川 坚持 认为 他 的 结果 是 正确 的 , j 为 二 聚 体 , 可 以 被 电子 显微镜 观察 到 。 253 黎 21% PR hea FEF 5S 七 次 跨 膜 G 蛋白 偶 联 受 体 视 紫红 质 的 晶体 结构 A. 与 膜 平 面 平行 的 立体 观 ,B。 从 胞 浆 侧 看 膜 平面 ,C., 从 膜 的 圆 盘 内 看 21.5 ”结束语 质 膜 信号 转 导 受 体 是 配 基 激 起 信号 转 导 通路 上 的 第 一 个 分 子 。 以 往 对 于 信号 转 导 研究 的 兴趣 主要 在 细胞 内 信号 转 导 通路 与 网 络 , 这 至 少 在 一 定 程度 上 反映 了 膜 蛋 白 的 研 究 , 特别 是 膜 蛋白 品 体 结构 解析 的 难度 。 现 在 看 来 , 信号 转 导 的 复杂 性 在 质 膜 受 体 上 已 经 有 充分 体现 。 而 质 膜 信号 转 导 受 体 往 往 是 药物 作用 的 靶 标 ,前 明 受 体 的 结构 与 功能 不 仅 有 重要 的 基础 研究 意义 , 而且 有 重要 的 应 用 前 景 。 随 着 对 膜 蛋 白 唱 体 结构 解析 能 力 的 提高 , 更 多 的 受 体 结 构 将 被 阐明 , 而 从 膜 的 角度 研究 受 体 与 膜 脂 的 相互 作用 、 受 体 在 腊 上 侧 向 扩散 的 规律 、 受 体 在 体外 与 脂 质 体 的 重组 等 研究 也 会 越 来 越 深 入 。 Constantinescu S N, Keren T, Socolovsky M, et al. 2001. Ligand-independent oli is mediated by the transmembrane domain. Proc Natl Acad Sci USA, 98 Fotiadis D.T ig Y, Fillipek S, et al. 2003. Is rhodopsin dimeric in native ret George SR ) Dowd BF, Lee S P. 2002. G-protein-coupled receptor oligor ( 林 其 谁 ) ation of surface erythropoietin receptor 4384 yds? Nature, 426: 31 ition and its potential for drug discovery. 254 Nature Reviews Drug Discovery, 1: 808 - 820 Garrett T P J, Mc Kevn N M, Lou M, et al.2002. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor . Cell, 110: 763 - 773 Livnah O, Stura E A, Middliton S A, et al. 1999. Crystallographic evidence for performed dimers of erythropoietin receptor before ligand activation. Science, 283: 987 - 990 Ogiso H, Ishitani R, Nureki O, et al. 2002. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell, 110: 775-787 Palczewski K, Kamasaka T, Hovi T, et al. 2000. Crystal structure of rhodopsin: a G protein coupling receptor. Science, 289: 739 - 745 Wetzker R, Boehmer F D. 2003. Transactivation joins multiple tracks to the ERK/MAPK cascade. Nature Reveiws Molecular Cell Biology, 4: 651- 657 第 22 章 钙 火 花 与 微 区域 钙 信号 转 导 22.1 全 火花 的 发 现 风 特征 愉 及 空间 分布 236 22.1.1 细胞 钙 离 子 梯度 的 存在 及 理论 分 析 256 22.1.2 FEAFE. SAR PS RE ATHE AR PAE .257 D213 EPRICE Be INET BG EEE nc ccscscsscncezescccvensndesecdsancecearsnta 259 22.1.4 微 区 域 钙 信号 在 细胞 中 的 空间 分 布 .25S9 2D) Dee Ge ass errr Peete enema te ened a OE nl es eed yw ockacacucies 260 D2 DA — Jey ATR ELGG, cxccccceneveevenessesececccvecnsvacseveresnssuceovsees 260 2 261 2222:3-- 光 学 单 通 道 记 录 的 优点 、 潜 力 与 局 限 .263 22.2.4 ” 单 分 子 间 和 钙 信号 转 导 的 可 视 化 once sec ecccececceccseeseceeseeeees 264 22.3 “细胞 近 障 区 及 细胞 妖 昌 的 钙 信 县 .ee 265 2 天 机 直人 光政 钙 佑 号 的 是 二 RE 266 Re EEN F5 E IL Te eA cil cae haN Toss a Glen ERE. 266 22.4.2 PR POMEL Aaa 9 TE Tel A AAD .………… 266 22.4.3 Jeet By BE PSS SB oes ceeeeeeeeeee 266 & 离子 作为 一 种 广泛 存在 的 胞 内 信号 分 子 , 在 细胞 的 整个 生命 过 程 中 起 着 关键 作用 , 影响 着 诸如 肌肉 收缩 、 突 触 传递 、 激 素 分 泌 、 基 因 转 录 、 细 胞 生存 及 死亡 等 许多 重大 的 生物 学 过 程 (Bers 2001)。 然 而 , 钙 离子 作为 无 机 二 价 阳 离子 , 只 存在 一 种 化 学 与 生物 学 上 可 区 分 的 状态 , 并 能 在 胞 浆 环 境 中 自由 扩散 。 这 就 提出 一 个 最 基本 的 问题 : 同一 种 钙 离子 是 如 何在 同一 细胞 中 介 导 多 种 多 样 的 , 甚至 是 截然 相反 的 生物 学 功能 呢 ? 在 过 去 十 几 年 的 研究 中 , 人 们 和 逐 MURS, fe sot eet Se ial + 在 形式 , 赋 予 了 其 独特 的 高 效 性 、 特 异性 以 及 无 与 伦 B 性 。 这 就 需要 通过 光 学 手段 记录 微 区 域 (0.1 ~ 1 Om) #5 (22 以 剖析 不 同 生物 学 过 程 中 钙 离 子 动态 的 时 空 构造 , 从 而 揭 5 子 行 使 信号 分 子 相 关 功 能 的 各 种 机 制 。 目 1993 年 第 一 次 在 大 鼠 心 室 肌 “中 记录 到 钙 火 花 (Cheng et al. 256 1993) 以 来 , 运用 显 微 成 像 技 术 记 录 肌 肉 细胞 中 微 区 域 的 钙 信 号 , 已 经 使 我 们 对 兴奋 一 收 缩 偶 联 的 分 子 机 制 产 生 了 全 新 的 见解 , 并 拓展 我 们 对 钙 离子 信号 传导 过 程 的 认识 〈Cheng etal. 1996a)。 本 章 重 点 对 心肌 细胞 钙 信 号 微 区 域 显 微 成 像 进行 曾 述 , 同 时 介绍 与 之 相关 的 成 像 技术 及 其 优点 、 沫 力 和 局 限 性 。 用 来 描述 细胞 外 信号 事件 的 相关 术语 列 于 表 22-1。 缩写 解释 CRU 钙 释放 单元 的 简写 , 指 的 是 在 内 质 网 / 肌 浆 网 上 成 徐 分 布 的 钙 离子 通道 (可 以 是 RyRs 与 IP;Rs 中 的 任 一 种 , 或 者 两 者 均 有 ) 钙 火 花 (Ca2 spark) 单个 CRU 的 钙 释 放 事件 光学 记录 钙 星 〈Ca2 sparklet) 单个 钙 通道 的 钙 释 放 事件 光学 记录 复合 型 钙 火 花 (compound Ca® spark) ”邻近 的 几 个 CRU 同时 活动 所 产生 的 钙 释放 事件 光学 记录 钙 火 花 (Ca* puff ) 包含 IP;Rs 的 单个 或 几 个 CRU 活 动产 生 的 钙 释 放 事件 , 可 以 说 是 钙 火 花 或 者 复合 型 钙 火 花 的 同义词 575 wt (Ca** quark) 等 同 于 RyR 产生 的 钙 星 钙 脉 冲 〈Ca2 blip) 等 同 于 IP;R 产 生 的 钙 星 5 + (Ca>* spike ) 在 有 额外 钙 缓 冲 存 在 的 情况 下 , 所 记录 的 全 细胞 平均 钙 瞬 变 。 在 心肌 细胞 中 , 主 要 反映 了 内 质 网 钙 释 放 功 能 在 有 额外 钙 缓 冲 存 在 的 情况 下 , 所 记录 的 局 部 钙 瞬 变 。 在 心肌 细胞 中 , 主要 反映 了 产生 于 Z- 线 / 横 管 位 置 单个 或 复合 钙 火 花 的 钙 释放 功能 反 义 钙 火花 (Ca* scraps ) 较 大 空间 尺度 的 平均 钙 损 耗 瞬 变 , 可 以 看 作 是 胞 浆 钙 瞬 变 的 镜像 (scraps 实际 上 就 是 sparks AY) (Al Al Ft S ) Jaye BA Pte, PA EE TSK EMI BER 线粒体 钙 火 伦 《Ca mark) 单个 线粒体 的 钙 瞬 变 22.1 ” 钙 火 花 的 发 现 、 特 征 以 及 空间 分 布 =U 22.1.1 ANUS FECTS (FFE Se Fi VC 77 Tm 在 被 生物 膜 分 隔 开 的 细胞 或 者 亚 细 胞 隔 间 两 侧 , 往 往 存在 着 恒定 的 钙 离 子 梯度 , 例如 在 细胞 膜 以 及 内 质 网 ( 肌 浆 网 ) 两 边 存在 大 约 10* 数 量 级 的 钙 离子 梯度 。 细 胞 内 的 钙 离子 稳 态 调节 系统 一 一 包括 内 质 网 ( 肌 浆 网 ) 上 的 钙 和 泵 、 肌 纤维 膜 上 钠 / 钙 交换 以 及 钙 泵 一 一 将 细胞 浆 的 钙 离 子 浓 度 维持 在 100nmol 上 EL 左右。 而 一 旦 细胞 膜 上 或 者 细胞 内 秆 库 (主要 指 肌 浆 网 ) 上 的 钙 离子 通道 开放 , 释 放出 大 量 钙 离子 , 细 胞 浆 的 钙 离子 浓度 将 迅速 上 升 , 产 生 整 个 胞 浆 范 围 的 钙 瞬 变 。 人 们 曾 一 直 把 整个 胞 浆 简 化 为 一 个 公共 字 系 统 (common pool) , 认 为 钙 离子 浓度 在 整个 胞 浆 范 围 内 的 上 升 或 者 下 降 都 是 均一 的 。 这 种 观点 的 必然 结论 是 : 在 给 定 细胞 中 , 由 于 空间 上 的 均一 性 ,, 钙 信号 的 作用 完全 决定 于 钙 离子 访 度 的 平均 幅度 大 小 及 其 在 时 间 上 的 动态 变化 。 然 而 从 分 子 水 平 莉 虑 , 细 胞 膜 上 和 钙 离子 通道 以 及 钙 离子 转运 蛋白 在 空间 上 并 不 是 连续 分 布 的 。 因 此 ,通过 这 些 空间 上 离散 的 分 子 产 生 的 跨 膜 钙 离 子 转运 过 程 就 应 该 是 个 不 连续 的 过 程 , 而且 这 些 分 子 一 旦 开始 工作 , 就 能 在 紧 靠 这 些 分 子 的 微 区 域内 产 生动 态 的 后 离子 梯度 。 理 论 上 , 许多 细胞 与 分 子 因素 决定 了 显 微 可 见 的 钙 离子 梯度 的 空 IFA, & (1) 单方 向 的 钙 离 子 流 强度 ,(2) 胞 浆 钙 离子 缓冲 能 力 , 不 少 钙 离子 缓冲 剂 本 身 又 是 三 信号 的 下 游 半 标 分 子 ,(3) 钙 离 子 在 胞 浆 六 的 扩散 (TIzu et al. 2001)。 此 外 , 257 到 22% 215 ke HE 5 GO ba BG fs BE 钙 离 子 梯度 还 会 被 各 种 亚 细 胞 空间 结构 所 制约 或 加 强 , 如 : 钙 释 放 单 元 (Ca* release unit, CRU) 与 横 管 构成 的 间 隐 (Soeller et al. 1997)、 内 质 网 〈 肌 浆 网 ) 网 络 、 被 生物 膜 隔 开 的 亚 细 胞 右 结 构 《如 线粒体 等 ) 。 22.1.2 人 钙 火 化 : ANILAESPERCHIZE AS" 70 mmm 1960 年 , FEAL AG (Barnacle) J 4.4 Sih PE WLET EP , 运用 水 母 发 光 和 蛋白 测定 钙 离子 浓度 , 科 学 家 们 首次 观察 到 活 细 胞 中 的 全 细胞 钙 信 号 一 一 钙 瞬 变 ,1970 年 , 人们 首次 运 用 显 微 图 片 记 录 到 受精 的 鲫鱼 卵细胞 中 存在 着 的 钙 信 号 一 一 钙 波 (calcium wave)。 很 快 , 科学 家 们 又 在 犬 的 普 肯 野 肌 纤维 的 兴奋 一 收缩 偶 联 过 程 中 ,成 功 地 记录 到 全 细胞 钙 瞬 变 。 随后 的 几 年 内 , 随 着 新 型 金属 铬 染料 的 采用 , 使 钙 瞬 变 的 测量 方法 进一步 改进 : 首先 是 Brown 等 使 用 arsenazo II 先后 在 朱 鱼 轴 突 和 肌肉 细胞 中 记录 到 钙 信 号 ; 接着 Kovacs 等 使 用 antipyrylazo II 来 探测 钙 信号 。 另 一 项 标志 性 成 果 是 Wier 等 (1997) 首次 运用 荧光 指示 剂 fara-2 并 结合 数字 成 像 技 术 在 心肌 细胞 中 记录 到 自发 的 钙 波 。 随 着 共聚 焦 显 微 技术 的 成 熟 以 及 新 一 代 钙 指示 剂 fuo-3 的 出 现 , 程 和 平等 在 1993 年 首次 发 现 并 命名 了 肌肉 细胞 中 微 区 域 的 钙 信 和 号 钙 火 花 (calcium spark)( 图 22-1A)( Cheng et al. 1993) 。 RP+55mV RP | 300ms | 2 fen 4 = ] J Ne 6 <0 5 细胞 内 基本 钙 释 放 事件 一 一 钙 火 花 A. 心肌 细胞 自 AR B. 松 钳 下 的 激发 钙 火 花 时 间 分 解 曲线 以 及 二 维 扫描 图 对 于 钙 火 化 现 角 可 以 这 样 描述 : 在 表面 上 均一 的 细胞 静 息 钙 信 号 的 背景 中 ,突然 爆 发 式 地 出 现 一 个 或 几 个 明亮 的 球形 信号 ,在 10ms 内 到 达 它 的 最 高 亮度 , 又 经 20ms BNA 失 无 踪 。 钙 火花 反映 了 内 质 网 ( 肌 浆 网 ) 上 单个 钙 释 放 单 元 (CRU) ches 2 受 体 (Ryanodine receptor, RyR) (Fill et al. 2002) 的 随机 平 放 肉 细 胞 中 , 和 钙 火 花 ae F 2.0um 的 直径 范围 内 。 但 是 在 某 些 情况 , KOE. 单个 钙 火 花 便 有 可 能 通过 和 钙 致 钙 释 放 (calcium-induced calcium releas R) ) SLIT ELA CRU i ee 5 火花 (compound Ca2 spark) (Parker et al. 19 , 按 一 定时 空 顺 序 激活 的 钙 火花 或 复合 丐 火化 可 发 展 成 可 传播 的 钙 波 (Cheng etal. 1° >), fet 儿 兴 和 理 一 收缩 偶 联 过 程 中 , 钙 离子 经 过 电压 激 4 工 型 钙 通道 (简写 为 LCCs, “ER? ¥% ae YY "人 4 Se * oa i ae 到 = - ‘ x > * eg ?了 -t em A Yeu . | 未 有 ? * \ . (ee * Md 2 : 5, VCE, % 膜 Biomembranes 258 又 名 二 氧 吡 吓 受 体 ,DHPR) 流入 胞 浆 , 通 过 CICR 机 制 , 油 话 产生 具有 相同 时 空 特 性 的 钙 火 花 ( 图 22-1B)。 为 了 能 得 到 单个 可 分 辩 的 独立 事件 , 必 须 控 制 钙 火花 的 激活 密度 , 可 通过 减少 细胞 胞 外 钙 离子 浓度 , 或 采用 接近 国 值 的 去 极 化 膜 电 压 (Santana et al. 1996) 在 极 短 时 间 内 使 细胞 去 极 化 (Bridge et al. 1999), 或 通过 药理 学 手段 部 分 阻 断 工 型 钙 通 道 (Cheng et al. 1995) 来 实现 这 个 效果 。 尽 管 触发 钙 火 花 的 钙 电 流 ca) 以 及 钙 火 花 的 激活 要 率 都 展现 出 钟 形 的 电压 依赖 特性 (Gomez et al. 1997),, 钙 火花 的 单 体 特征 却 并 不 随 着 细 胞 膜 电 压 以 及 触发 钙 电 疲 (zcs) 的 幅度 与 持续 时 间 的 变化 而 有 所 变化 (Santana et al. 1996), 并 与 自发 钙 火 花 特 征 相同 。 这 就 说 明 , 一 旦 被 触发 后 , 钙 火 花 就 不 再 依赖 于 它 的 触发 源 。 在 生理 条 件 下 , 单 细 胞 一 次 兴奋 一 收缩 偶 联 中 , 约 有 10' 个 钙 火 花 在 十 几 毫 秒 内 被 迅速 激 活 , 通 过 时 空 上 的 累加 产生 全 细胞 的 钙 瞬 变 , 峰 值 钙 离子 浓度 可 高 达 1umolL。 类 似 钙 火花 的 钙 信 号 也 在 完整 的 心脏 乳 突 肌 肌 条 细胞 中 被 记录 到 (Wier et al. 1997)。 在 心房 细胞 中 , 包含 有 两 种 不 同 空间 与 结构 的 肌 浆 网 : 与 肌 膜 形成 连接 的 外 周 肌 浆 网 和 细胞 中 央 认 离 肌 浆 网 , 其 中 外 周 肌 浆 网 有 较 高 的 钙 火 花 发 放 频率 。 与 心室 肌 相 比 , 心 房 细胞 的 钙 火 花 较 大 较 长 (心房 细胞 钙 火 花 12ms 内 释放 300 000 钙 离 子 ; 心室 肌 细 胞 钙 火 花 7ms 内 释放 100 000 钙 离 子 ) (Kockskamper et al. 2001)。 细 胞 膜 上 动作 电位 可 直接 激活 膜 内 钙 火 花 , 随后 通过 CICR 机 制 产 生 辐 胞 桨 次 部 传播 的 钙 波 。 在 军 房 结 细胞 中 , 节律 性 钙 火 花 以 及 复合 型 钙 火 花 在 舒张 期 的 去 极 化 过 程 中 起 重要 调节 作用 , 并 由 此 调节 心脏 的 起 搏 功能 (Bogdanov et al. 2001) 。 微 区 域 钙 信号 广泛 存在 于 多 种 可 兴 香 性 和 非 可 兴奋 性 细胞 中 , 特别 是 在 骨骼 肌 细 胞 和 平 请 肌 细 胞 中 , 虽然 它们 的 雷诺 丁 受 体 (RyYR) 的 亚 型 与 心肌 细胞 有 所 不 同 , 但 也 存在 着 钙 火 花 。 除 了 钙 致 钙 释 放 机 制 , 在 两 栖 类 骨骼 肌 细 胞 中 , 人 们 还 发 现 二 氧 吡啶 受 体 与 雷 诺 丁 受 体 之 间 存 在 直接 机 械 偶 联 ,, 在 这 里 二 氧 吡啶 受 体能 起 电压 传感器 的 作用 ,不 需要 钙 离子 内 六 , 也 就 是 说 , 去 极 化 能 直接 诱发 钙 火 花 的 产生 。 在 爪 蟾 卵 母 细胞 中 ,, 离散 的 CRU 上 存在 着 的 主要 是 IPs 受 体 , 由 此 类 受 体 介 导 的 微 区 域 钙 信号 称 为 耻 ; 受 体 钙 火花 (calcium puff) (Yao et al. 1995) 或 者 钙 脉 冲 (calcium blip) (Parker et al. 1996b) 。 同 样 , 在 非 可 兴奋 细胞 中 , 也 存在 有 类 似 于 钙 火 花 特 征 的 钙 信 号 , 产生 于 雷诺 丁 受 体 或 者 也; 受 体 (Haak et al. 2001)。 到 目前 为 止 , 在 神经 细胞 中 还 没有 确凿 的 资料 显示 钙 火 花 的 存在 , 早期 论文 中 曾 报道 有 统计 学 上 异常 高 亮度 的 像素 与 过 多 的 钙 噪 声 (calcium noise), , 然 而 并 没有 探测 到 时 空 上 可 以 辨别 的 类 似 钙 火花 的 事件 (Melamed-Book et al. 1999)。 最近 , 欧 阳 昆 富 等 已 经 在 状 髓 背 根 神经 节 DRG 细 胞 上 探测 到 质 膜 下 终 池 的 钙 火 花 , 这 是 神经 元 上 发 现 钙 火 花 的 首次 报道 ,经 进一步 的 研究 发 现 这 种 钙 火 花 发 放 与 DRG 细 胞 的 胞 体 分 泌 功 能 密切 相关 。 在 神经 生长 因子 所 分 化 的 PC12 细 胞 以 及 培养 的 海马 锥 体 细 胞 中 , GD 童 号 比 钙 火 花 在 时 间 上 更 长 ( 约 400ms), 空 间 上 更 宽 ( 约 4hum) (Koizumi et al. 1999), 推 测 其 为 复合 型 钙 信 号 , 或 者 其 产生 于 空间 尺度 很 大 的 扩展 CRU。 在 荧光 探 针 技术 方面 , fuo-3 及 其 高 殉 光 衍生 物 fluo-4 是 目前 用 于 钙 火 花 相 关 研 究 较 为 理想 的 荧光 指示 剂 。 其 主要 特征 为 极 高 的 信号 与 背景 对 比 (200 : D)、 可 见 光 激发 、 较 快 的 动力 学 和 适当 的 解 离 常数 (在 生理 盐 溶液 中 KK 为 0.4 hmolL; 由 于 蛋白 对 指示 剂 的 束 合 作用 , 在 : 乐 的 细胞 中 Ka 要 大 于 此 值 , 如 骨骼 肌 细 胞 中 A 约 为 1.1umolL)。 然 而 美 中 不 足 的 是 它们 鸭 激发 波谱 以 及 发 射 波谱 并 不 随 钙 离子 的 结合 而 移动 , 这 样 它们 的 天光 变化 就 只 能 代表 店 对 钙 离 子 访 度 变化 , 而 不 能 像 其 他 的 桨 料 “如 fnra-2、Indo-1) 通过 不 同 波 259 g 222 FEA LE 5 x RES fs FEE 谱 的 比例 度量 确定 绝对 的 钙 离子 浓度 。 在 显 微 成 像 技术 方面 , 主要 分 为 共聚 焦 显 微 技 术 与 非 共聚 焦 显 微 技 术 , 共 聚焦 显 微 技 术 包括 单 光 子 、 双 光子 激光 共聚 焦 显 微 镜 (Soeller et al. 2002), 而 非 共 聚焦 显 微 技 术 包 括 全 内 反射 荧光 显微镜 (TIRFM), 配 以 低 噪声 CCD 摄 像 头 的 宽 视 野 显 微 镜 (ZhuGe et al. 1998) 等 。 在 暗 适 应 环境 中 , 人 眼睛 也 可 在 普通 的 艾 光 显 微 镜 下 直接 观察 心肌 细胞 钙 火 花 的 释放 。 22.1.3 FORSCH SE/ IS FF (mmm 在 CHO 细胞 中 表达 外 源 性 的 雷诺 丁 受 体 [雷诺 丁 受 体 的 基因 片段 来 自 心肌 细胞 (Bhat et al. 1999) 或 者 骨骼 肌 细 胞 (Bhat et al. 1997)], 产生 的 是 非 钙 火 花形 式 的 钙 释放 。 Lipp 和 Niggli (1998) 通过 光 释放 笼 锁 钙 离子 的 方法 , 首 次 在 豚鼠 的 心室 肌 细胞 中 记录 到 无 火花 的 钙 释放 方式 , 并 把 实验 中 探测 到 的 比 钙 火 花 更 为 精细 的 钙 释放 事件 命名 为 钙 453%, (calcium quark) 。 无 钙 火 花 钙 释放 事件 的 发 现 说 明 , 在 这 些 基本 钙 释 放 事件 中 , 参 与 的 钙 信 号 分 子 数量 少 于 目前 光学 探测 的 极限 。 成 年 哺乳 动物 骨骼 肌纤维 细胞 在 生理 条 件 下 展现 出 的 是 无 火花 的 钙 释放 (Shirokova et al. 1998)。 有 趣 的 是 , 不 改变 甚 钙 释 放 机 制 , 只 用 化 学 方法 把 骨骼 肌纤维 细胞 的 质 腊 穿 透 , 就 能 产生 类 似 钙 火 花 的 信号 (Zhou et al. 2003) 。 而 在 不 成 熟 的 小 鼠 骨 骼 肌 细 胞 中 , 兴 奋 一 收缩 偶 联 发 生 位 点 在 空间 上 是 不 连续 的 , 产 生 的 是 无 钙 火 花 的 钙 释放 形式 , 而 在 没有 发 生 直接 兴奋 -收缩 偶 联 的 区 域 , 却 有 离散 的 钙 火 花 信 和 号 发 生 (Yang et al 2001), 提示 二 氧 吡啶 受 体 可 能 抑制 离散 的 钙 火 花 产 生 〈Koizumi et al. 1999) 。 另 一 方面 , 人 们 又 在 两 栖 类 骨骼 肌 细 胞 中 发 现 , 复 极 化 能 即时 中 止 处 在 上 升 相 的 钙 火 花 (Lacampagne et al. 2000)。 至 此 可 以 推出 , 二 氢 吡 啶 受 体能 调控 雷诺 丁 受 体 , 使 之 产生 极为 迅速 的 开放 关闭 行为 。 这 一 推论 在 一 定 程度 上 解释 了 哺乳 动物 骨骼 肌 细 胞 中 缺乏 离 散 钙 火 花 信号 现象 的 原因 。 22.1.4 微 区 域 钙 信号 在 细胞 中 的 空间 分 布 “II 为 了 研究 钙 火 花 释 放 位 点 在 细胞 中 的 空间 分 布 情况 , 曾 用 到 以 下 几 种 方法 : (1) 沿 心肌 细胞 横 管 或 者 长 轴 方 向 , 用 线 扫描 方式 记录 钙 火 花 并 统计 其 分 布 状况 (Parker et al. 1996b) ; (2) 在 胞 内 有 外 产 性 钙 离 子 缓冲 存在 的 情况 下 ,用 快速 的 二 维 扫描 方式 记录 和 钙 火花 的 空间 分 布 情况 (Cleemann et al. 1998); (3) 记录 高 钾 去 极 化 处 理 的 心肌 细胞 钙 火 花 释 放 情 况 , 并 做 出 钙 火 伦 释放 位 点 二 维 分 布 图 (图 22-2)。 在 某 些 条 件 下 ,能 同时 把 横 管 空 间 (Cheng et al. 1996b) 或 者 质 膜 (Parker et al. 1996a) 桨 色 , 据 此 能 推断 钙 火 花 主要 分 布 于 轴 向 间隔 为 1.8hm 的 肌 小 节 的 乙 线 / 横 管区 域 , 而 在 横 管 方向 上 , 钙 火花 释放 位 点 的 分 布 间隔 均值 为 0.8um (Parker et al. 1996b) (图 22-2)。 这 些 结果 为 解释 跨 肌 小 节 钙 离 子 梯度 以 及 兴奋 一 收缩 偶 联 中 钙 瞬 变 的 空间 非 均 一 性 提供 有 力 iF3(Song et al. 1998), 功能 性 钙 释 放 单 元 的 空间 密度 约 为 1 单位 hum, 在 一 个 心 ! 2 胞 中 约 有 104 个 钙 释 放 单 元 ,上述 数据 与 心肌 细胞 超 注 切 片 电镜 照片 上 观察 到 - 臻 (Franzini-Armstrong et al. 1999)。 假 设 一 个 心肌 细胞 有 105 个 雷诺 丁 受 体 , 平 : 西 释放 单元 约 有 100 个 雷 诺 丁 受 体 , 这 与 超 微 结构 得 到 的 数据 (267 个 雷诺 丁 受 体 J, 假 设 心肌 细胞 的 CRU 是 圆 形 的 ) 2 不 完全 一 致 , 原因 是 目前 尚 缺 乏 对 钙 释 放 单元 司 结 构 的 确切 了 解 。 同样 , 从 相关 功 全 的 数据 中 以 及 雷诺 丁 受 体 免疫 染色 照片 中 , 蕊 推算 出 心房 细胞 中 存在 相距 260 COCOmonNn HN UN ff WN — 10 心肌 细胞 钙 火 花 释 放 位 点 二 维 分 布 图 A. 静 息 细 胞 的 fiuo-4 染色 , 绿 线 代表 细胞 边缘 , 红 线 代表 乙 线 位 置 ; B. 售 平面 内 的 钙 火 花 分 布 图 , 图 中 是 550 4+ #% 15mmol/L 外 钾 去 极 化 产生 的 钙 火 花 县 加 的 结果 ; C. 横 管 位 置 上 的 钙 释 放 位 点 二 维 分 布 情况 , 共有 197 个 释放 位 点 , 颜 色 代 表 此 位 点 的 火花 发 放 数 2hm 的 钙 释 放 单 元 三 维 网 格 结构 (Kockskamper et al. 2001)。 因 此 , 以 心肌 细胞 作为 模式 细胞 , 细 胞 钙 信号 系统 不 能 被 定性 的 看 成 是 一 个 公共 凶 系 统 , 实 际 上 应 该 把 它 看 成 是 一 个 离散 、 随 机 的 系统 ,包含 10 000 个 左右 的 独立 运作 的 钙 信 号 微 区 域 , 细 胞 钙 信 号 正 是 由 这 些 钙 信号 微 区 域 通过 有 序 激 活 产 生 。 因 此 , 可 以 通过 改变 参与 功能 的 钙 信 号 微 区 域 的 数量 (从 1 1084+) , 以 及 调节 单个 微 区 域 钙 信号 的 钙 释 放量 来 对 整个 细胞 的 钙 信 号 进 行 调节 。 假如 每 个 微 区 域 能 存在 至 少 两 个 不 同 的 状态 (FF), 那么 在 一 个 细胞 中 所 有 钙 释放 单元 的 不 同 状 态 数 将 是 个 天 文 数字 (10 )。 一 些 介 导 和 钙 信 号 的 分 子 , 如 钙 调 蛋白 激酶 开 能 对 钙 离子 脉冲 的 发 放 频 率 以 及 时 程 保留 记忆 , 因 而 能 以 频率 编码 的 形式 改变 下 游 蛋 白 [ 如 心肌 细胞 中 的 受 磷 蛋白 作用 (Hagemann et al. 2000)] 的 磷酸 化 水 平 , 这 实际 上 就 是 钙 信号 时 空 多 功能 性 的 一 个 反映 。 22.2 FSB: JOS NOEL 107. es 22.2.1 Jey 5 25 UC *T (0 mmm 在 高 浓度 的 钙 缓 冲 液 中 注入 自由 的 钙 离 子 , 能 产生 一 个 瞬间 的 钙 离 子 波动 一 一 钙 针 (calcium spike) , 它 的 产生 反映 了 钙 离 子 与 缓冲 液 的 一 个 快速 动态 平衡 过 程 (Escobar et al 1995)。 高 浓度 钙 缓冲 液 限 制 下 , 钙 针 形 态 直接 反映 所 注入 的 钙 离子 流 的 波形 (Song et al. 1998)。 利 用 这 个 原理 ,发展 了 一 种 新 的 方法 来 显示 局 部 的 钙 离 子 流 (图 22-3)。 这 里 用 到 两 种 不 同 的 缓冲 剂 : 一 种 结合 迅速 但 亲和力 低 的 钙 离 子 整 合剂 Oregon Green 488 BAPTA SNCK=31mmoVyL), 另 一 种 为 高 亲和力 但 结合 缓慢 的 钙 离子 整合 剂 EGTA (pH7.2 时 , K,=150nmol/L) 。 由 于 钙 离 子 源 相 当 于 一 个 点 源 , 这 样 钙 离 子 结合 到 荧光 染料 (F) 或 EGTA 的 初始 比率 由 以 下 公式 决定 : in, | ‘ [F]) / (Kon, EGTA ° [EGTA]), HOF Kone Belk Kon, EGTA 快 100 倍 左右 , 因 此 EGTA 对 于 通道 口 附近 (GE SU) 的 荧光 信号 几乎 没有 影响 , 随 后 当 钙 言 子 朝 外 扩散 时 , 几 乎 所 有 的 钙 离 子 都 迅速 被 EGTA 所 捕获 。 这 样 , 可 以 通过 这 种 特殊 此 于 验 手段 , 来 探测 钙 离 子 流 的 时 间 变 化 曲线 并 克 定 钙 信号 源 位 置 。 同 样 由 于 动 Ae EN) 考 , 在 细胞 内 加 入 mmol/L 量 级 的 EGTA 将 不 会 对 工 型 钙 通道 (LCC) 与 雷诺 Pere Zh 罗 米 尺度 的 CICR 产 生 明 显影 响 (Sham et al. 1998), Ha AN 52a) #5 BS AN at AT 5 | 261 22% ATE SK IPSS BREF 起 的 工 型 钙 通 道 钙 依 赖 性 的 失 活 作用 。 然 而 , EGTA 能 影响 微米 尺度 以 上 的 钙 离 子 通 信 , 比如 影响 CRU 间 的 CICR。 另 外 值得 一 提 的 是 , 高 深度 的 EGTA 能 较 好 地 钳制 全 细胞 镍 瞬 变 , 并 使 得 肌 桨 网 钙 回 收 变 得 缓慢 (Song et al. 2001), 在 心肌 细胞 中 , 钙 针 主 要 用 来 探测 和 目 发 钙 火 花 的 钙 离子 六 (Wang et al. 2001), 以 及 完整 的 兴 香 一 收缩 偶 联 过 程 中 横 管 一 肌 桨 网 连接 点 (TT-SR junction) 激活 产生 的 钙 信 和 号 (图 22-3) (Song et al. 2001)。 由 于 参加 信号 的 钙 释 放 单 元 (CRU) 数目 的 不 同 , 横 管 一 肌 浆 网 连接 点 所 产生 的 钙 针 反映 的 是 单个 钙 火 花 或 者 是 复合 型 钙 火 伦 信 号 。 钙 针 的 平均 空间 幅度 以 及 肌 浆 网 钙 释 放 幅 值 (sa) 都 呈现 出 钟 形 的 电压 依赖 曲线 (图 22-3B), 然而 由 .sics 定 义 的 增益 函数 , 却 是 电压 的 单 指 数 下 降 国 数 (图 22-3C), 证 明 CICR 的 效率 依赖 于 触发 fs 的 微观 特性 。 钙 针 的 实验 结果 ,也 让 我 们 推测 出 终止 心肌 细胞 肌 浆 网 钙 释 放 的 可 能 机 制 (Sham et al. 1998) : 当 横 管 一 肌 浆 网 偶 联 被 完全 激活 后 , 即 使 LCC PAE BORAGE, 其 六 入 的 钙 离 子 也 不 能 触发 进一步 的 钙 释 放 , 预 示 着 其 进入 绝对 不 应 状态 , 如 果 先 前 的 释放 量 没 有 达到 最 大 值 , 那 么 尾 电 六 还 能 第 二 次 激发 钙 针 , 这 时 钙 释 放 很 可 能 来 自 那 些 没有 开放 的 雷诺 丁 受 体 。 这 些 观察 结 采 都 说 明 , 和 雷诺 丁 受 体 开 放 一 段 时 间 后 产生 使 用 依 赖 性 失 活 , 这 是 终止 心肌 细胞 钙 火 花 的 重要 原因 之 一 。 A B 0.3 6 ae 18 a 1)。 有 许多 实验 室 都 试图 确证 单个 LCC 开放 就 能 触发 单个 钙 火 花 , 但 都 缺乏 直接 证 据 (Shen et al. 2004)。 程 和 平等 同时 运用 光学 成 像 以 及 电 生理 学 单 通道 记录 技术 ,首次 直接 观测 到 单个 LCC 开放 能 触发 单个 钙 火 花 (图 22-5), 这 个 图 像 实时 展现 了 单 分 子 水 平 上 的 两 类 信号 分 子 间 纳米 尺度 的 钙 信号 转 导 。 B RP RP+70 mV 4 um 吸 液 管 日 a | = | 细胞 = 14 wk panna nanan 扫描 线 RyR spark 1 可 LCC Sparklet 本 RP+100mV RP] 100 ms |RP-40mV 200ms RP 心肌 细胞 钙 火 花 与 钙 星 之 间 的 偶 联 A. 由 单个 LCC 触发 的 钙 火 花 ,B. 一 个 钙 星 触发 产生 一 个 钙 火 花 的 平面 和 3D 示意 图 从 同时 记录 的 LCC 钙 星 以 及 RyR 钙 火 花 的 图 像 中 (图 22-3B) , 进 一 步 确定 了 分 子 偶 联 的 动力 学 特征 、 准 确 度 和 化 学 计量 。 通 过 单 指数 方程 拟 合 , 能 得 到 产生 钙 星 到 触发 钙 火 花 之 间 的 延迟 大 约 为 6.7ms。 根据 这 个 结果 以 及 兴奋 一 收缩 偶 联 的 显 微 性 质 , 可 以 确 定 在 0 mv 左右 时 , 在 没有 LCC 通道 持 抗 剂 FPL64176 存在 的 情况 下 , 一 个 LCC 的 开放 平均 只 有 1/50 机 会 触发 一 个 钙 火 花 (Zhou et al. 1999)。 也 就 是 说 , 与 细胞 水 平 的 完整 兴 奋 一 收缩 偶 联 过 程 相 比 较 , 分 子 水 平 的 兴奋 一 收缩 偶 联 过 程 是 一 个 随机 事件 , 并 不 是 每 一 个 钙 星 都 能 触发 对 应 的 钙 火 花 。 在 更 高 的 电压 下 , 由 于 LCC 开放 概率 的 增加 ,一 个 钙 释放 单元 内 部 将 会 有 一 个 以 上 LCC 同时 开放 , 在 这 种 条 件 下 , 钙 火 花 的 触发 可 以 有 两 个 甚至 更 多 的 LCC 参与 (Inoue et al. 2003), 目前 已 经 有 人 开始 探究 以 下 的 问题 : 在 心肌 细胞 以 及 骨骼 肌 细 胞 的 一 个 CRU 内 部 Hh, 各/ RyR 分 子 之 间 是 否 存在 着 一 定 的 相互 作用 。 在 我 们 最 近 的 一 个 改进 模型 中 , 对 大 数量 的 至 火花 电流 进行 统计 发 现 , 产生 心肌 细胞 钙 火 区 的 RyR 数 目 介 于 1~8 之 间 , 而 目 RyR 之 所 绽 可 能 存在 一 个 负 反馈 或 者 自我 调节 机 制 , 得 钙 火 花 钙 释 放 过 程 的 时 程 大 小 与 参与 的 yR 数目 成 反比 (Wang et al. 2004), 265 % 22% EGATE 5 th xX RES SS ES 第 三 个 很 有 特性 的 分 子 间 钙 信号 转 导 例子 是 平 请 肌 内 质 网 上 的 RyR 与 肌 膜 上 的 大 电 导 钙 离子 敏感 钾 通 道 (BKc,) 分 子 间 的 钙 信 号 特征 (ZhuGe et al. 1998), 这 方面 内 容 在 22.4 市 论述 。 22.3 ”细胞 近 膜 区 及 细胞 瞧 中 的 全 信号 eee 细胞 膜 附近 的 钙 瞬 变 与 各 种 各 样 的 生理 过 程 密切 相关 ,比如 兴奋 一 收缩 偶 联 、 激 素 分 泌 以 及 神经 递 质 释放 , 这 些 过 程 都 是 由 高 于 胞 浆 静 息 钙 浓度 10 ~ 100 倍 的 钙 信号 所 驱 动 。 而 实际 上 , 近 膜 区 的 钙 信 号 通常 都 会 被 胞 浆 区 的 信号 所 掩盖 (测量 钙 针 的 实验 除外 ), 于 是 有 些 科 学 家 就 尝试 用 其 他 方法 来 显示 近 膜 区 钙 信 号 的 特性 。Llinas 等 (1992) 用 低 亲 和 力 、 高 度 非 线性 的 化 学 菊 光 钙 离子 指示 剂 naequorin-J, 证 实 了 在 神经 递 质 释 放 过 程 中 , 存在 着 膜 下 高 钙 信 号 区 域 (high subsurface [Ca**] domain); Etter 等 (1996) 通 过 应 用 与 膜 相连 的 钙 菊 光 指 示 剂 Cis-fura-2 (Ky Ay 130nmolL) 与 FFP。(Ka 约 为 400nmolL) 来 探测 平 请 肌 细胞 近 膜 区 钙 信 号 。 他 们 推断 : 相对 于 胞 浆 区 的 钙 瞬 变 , 近 膜 区 钙 瞬 变 将 呈现 出 更 快 的 上 升 速 度 以 及 更 短 的 时 程 。 如 前 所 述 , 微 区 域 钙 信 号 也 存在 于 膜 包 围 的 亚 细 胞 器 中 。 近来 , Shannon 等 (2003) 发 展 了 一 种 新 的 技术 , 在 肌 浆 网 中 通过 AM 加 载 一 种 低 亲 和 力 的 染料 fuo-SN,, 通 过 这 个 指示 剂 能 拍摄 到 免 心肌 细胞 肌 浆 网 内 部 的 钙 信 号 (图 22-6)。 B 500 ms El 22-6 BN a ca ead ae A. fluo-SN 染色 下 的 内 质 网 ,B. 电 刺 激 引起 的 内 质 网 腔 钙 释 放 瞬 变 A 10 um 0.2(F/F,) 他 们 发 现 : 在 一 个 动作 电位 触发 释放 过 程 中 , 大 约 释 放 50% 左 右 的 内 质 网 腔 内 和 钙 储 备 , 并 将 这 种 负 相 内 质 网 钙 损 耗 瞬 变 命名 为 反 义 钙 火花 (calcium scraps) ,scraps 是 sparks 的 反 向 拼写 。 更 为 重要 的 是 , 他 们 发 现 与 横 管 偶 联 的 肌 浆 网 ( 钙 释 放 位 置 ) 与 长 轴 方 向 的 肌 浆 网 〈 合 回收 位 置 ) 之 间 探 测 不 到 明显 的 钙 离 子 浓 度 梯 度 丰 圭 , 这 个 实验 结果 暗示 在 肌 浆 网 内 部 钙 离 子 存在 迅速 的 转运 机 制 。 如 果 这 个 结论 进 正 实 , 将 否定 局 部 钙 损耗 导致 钙 火 花 终 止 的 理论 (Sobie et al. 2002)。 因 此 , WE Wy GE RAT RE LAE ABB mai BRAY 518-5 2) ACRE, ee) BA ALS Da Ae 生火 花 并 使 其 终止 的 机 制 提供 有 力 证 据 。 少量 千 离 子 在 线粒体 膜 两 侧 的 转运 虽然 对 兴奋 - 收 . 联 及 细胞 收缩 没有 直接 贡献 , 但 却 在 侠 “ 代 谢 以 及 钙 介 寻 的 细胞 凋 亡 等 非 收缩 功能 站 起 很 重要 的 作用 。Pacher 等 (2002) EH9c2 细 胞 分 化 成 心肌 肌 管 细胞 的 线粒体 中 ,” 半 加 载 荧光 探 针 Rhod-2 AM 发 266 现 单个 线粒体 中 也 存在 钙 瞬 变 , 称 为 线粒体 钙 火 化 (calcium mark)。 有 证 据 显 示 , 线 粒 体 钙 火 花 为 邻近 的 RYR 钙 火花 所 触发 , 但 比 RyR 钙 火 化 要 多 持续 几 百 毫 秒 。 关 于 线粒体 钙 火 花 的 存在 .重要 性 以 及 与 RYR 钙 火花 的 相互 关系 有 待 于 在 动物 心肌 细胞 中 加 以 确认 。 22.4 DIPS HUA ER SSS es 对 活 细胞 中 动态 微 区 域 钙 信号 观测 研究 的 结果 从 根本 上 改变 了 我 们 对 细胞 钙 信 号 转 导 的 认识 , 本 六 将 通过 几 个 主要 例子 来 说 明 由 微 区 域 钙 信号 成 像 技术 所 揭示 的 钙 信 号 转 导 的 普 志 原理 。 22.41 SCF (mmm CICR {EAN ES BRE Fe, BAER AEE. ee A CICR 相 当 于 一 个 正 反 馈 机 制 , 除非 它 的 放大 倍数 很 小 , 否则 一 旦 发 生 就 会 以 全 或 无 的 方 式 进 行 。 然 而 实际 上 , 心 肌 细 胞 的 兴 和 但 一 收缩 偶 联 既是 一 个 高 效 放 大 (在 0mVv 左右 有 约 10 倍 的 放大 效果 ) (图 22-3C) 又 是 以 触发 钙 电 流 大 小 和 时 程 作 出 梯次 逐 级 反应 (图 22-3B) 的 系统 。 为 了 解决 CICR 的 矛盾 性 , 早 期 的 实验 以 及 理论 工作 主要 集中 在 据 弃 公共 凶 理 论 , 建立 CICR 的 局 部 控制 理论 。 在 这 个 过 程 中 和 逐 癣 形成 以 下 关于 局 部 控制 的 4 个 基本 原 理 , 每 个 原理 均 已 被 实验 方法 加 以 证 实 。(1) 体内 的 RyR 对 生理 水 平 的 全 细胞 钙 信 和 号 感 应 相对 不 敏感 。 已 由 光 解 钙 和 洛 锁 化 合 物 所 产生 的 钙 瞬 变 实验 证 实 , 当 触发 钙 信号 均匀 分 布 时 , 全 细胞 范围 的 CICR 实际 上 是 个 低 效 率 放 大 的 系统 。(2) RyR 能 被 局 部 的 钙 信 号 有 效 激活 。 比 如 , 独 立 的 钙 火 花 不 仅 能 被 LCC 钙 星 所 激活 (Wang et al. 2001), 而 且 LCC 触 发 钙 火 花 的 峰值 速率 还 相当 大 , 相当 于 每 个 细胞 每 秒 10' 个 钙 火 花 。 这 就 是 说 , 心肌 细胞 的 CICR 既 有 高 效 性 〈 在 局 部 高 钙 触 发 下 ) , 又 有 低 效 行为 〈 在 全 细胞 低 钙 触发 下 ) 。 而 且 , 由 于 通道 的 “适应 ”或 者 失 活 ,RyR 对 钙 谊 度 脉 冲 的 反应 敏感 度 要 高 于 持续 不 变 的 钙 信 号 。(3) 在 生理 条 件 下 , 离 散 的 钙 释 放 单 元 之 间 几 乎 没有 相互 作用 。 钙 火花 的 离散 性 说 明 内 质 网 钙 释 放 不 可 能 总 是 产生 次 生 的 CICR。.CRU 间 脱 偶 联 的 细胞 以 及 分 子 因素 包 括 : 空间 上 分 离 ; 点 源 周 围 的 钙 浓 度 梯 度 相 当 陡 峭 ;, 胞 浆 内 部 存在 高 访 度 钙 缓 冲剂 ;在 钙 释 放 单 元 内 部 存在 强 有 力 的 CICR 终 止 机 制 。 钙 火花 本 身 的 短暂 性 以 及 钙 火 花 钙 流量 天 火花 上 升 时 间 的 负 调 节 作 用 (Wang et al. 2004), 都 说 明 钙 释放 单元 具有 强 有 力 的 负 反 馈 以 及 自我 调节 机 制 。 然 而 到 目前 为 止 , 确 切 的 钙 火 花 终 止 机 制 尚未 被 阐明 。 22.4.2 58 FAP ALANNEN SC JOA IETS) AI) |] 1) 5 ry 在 动脉 平 请 肌 细 胞 中 , 全 细胞 钙 瞬 变 使 细胞 产生 收缩 。 令 人 惊讶 的 是 , 抑 制 钙 火花 发 放 也 能 导致 血管 腔 收 缩 , 这 是 因为 近 膜 区 钙 火 伦 能 通过 激活 徐 状 分 布 的 BKc, 通 道 开 放 (图 22-7) 产 生 STOC (spontaneous transient outward current) 致使 膜 超 极 化 。 其 结果 是 关 闭 电 压 依赖 的 LCC,, 阻 止 了 胞 外 钙 离 子 进 入 。 因 此 , 钙 火花 一 STOC 偶 联 的 净 效 应 是 降 低 全 细胞 钙 离 子 谊 度 , 最 终 导致 血管 舒张 , 而 阻 断 钙 火 花 即 会 导致 血管 收缩 。 Ze) Pe lll 目前 天 完善 遍 认为 , > LZ RyR a Her LZ HY 2 K cg BB et ZH A aR 7 Bd AY DICKS RERAGUS, IFN ERAT WIE ube +oaiaik, 直到 有 微 - 域 高 重信 三 的 出 现 。 由 此 可 见 , 近 膜 区 高 钙 微 区 域 是 激 5 高 国 值 钙 信号 事件 的 中 心 场 | 267 和 22% EEK AEF RES la FEF ie | 应 A, : , | 1 As SWAPNINNLNAN 人 — 动脉 平滑 肌 细 胞 的 钙 花 一 STOC 偶 联 A. 鼠 肠 系 膜 细 动脉 平 请 肌 细 胞 静 息 状态 下 的 钙 火 花 信 号 ;,B. 钙 火 花 触 发 禾 状 分 布 的 大 电导 和 钙 沿 活 钾 通 道 电流 Ti 产生 STOC( 未 发 表 资 料 ) 所 , 换 名 话说 国 值 钙 信 号 事件 主要 是 在 前 述 CRU 的 空间 三 维 网 格 上 进行 的 。 22.5 ”展望 虽然 目前 在 微 区 域 钙 信号 研究 方面 取得 不 少 进展 , 然而 在 纳米 尺度 (1 一 100nm) 上 , ATE 2 WIE Yar 相关 外 信号 机 制 , 需 要 用 新 的 实验 手段 去 揭示 。 在 这 一 点 上 , Ft 学 方法 至 多 达到 70nm (如 TIRFM) 的 空间 分 辨 率 , 这 是 一 个 重要 的 物理 极限 。 要 观测 纳 米 尺 度 的 钙 信 号 需要 超 光 学 的 分 辨 率 , 需 要 新 的 具有 革命 意义 的 实验 手段 。 一 个 可 能 的 策略 是 通过 分 子 或 者 基因 操作 方法 把 钙 指 示 剂 整合 或 者 锁定 到 相关 分 子 的 确定 位 置 上 。 可 以 预言 , 新 一 代 钙 指示 剂 以 及 成 像 理 论 和 方法 , 将 会 使 细胞 钙 信号 成 像 研究 日新月异 。 新 的 细胞 钙 信 号 领域 会 被 广泛 探索 , 特别 是 通过 定向 表达 荧光 蛋白 钙 指示 剂 到 亚 细 胞 结 构 的 方法 (Zahradnikova et al. 1999), 有 入 力 揭 开 细胞 钙 信 号 时 空 动态 的 新 维度 。 这 个 方 法 也 将 会 国明 钙 信 号 的 长 时 程 生物 学 功能 〈 如 肌 细 胞 分 化 、 生长 、 肥 大 、 迁 移 、 调 亡 ), 让 我 们 热切 期 待 这 些 重大 前 景 的 出 现 。 ( 魏 朝 亮 URPHE ER RAZ 程 和 平 ) 本 Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD. 2000. The versatility and universality of calcium signaling. Nat Rev Mol Cell Biol, 1: 11-21 Bers D. 2001. Excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. 2"! ed. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publisher Bhat MB, Zhao J, Zang W, et al. 1997. Caffeine-induced release of intracellular Ca2 from Chinese hamster ovary cells expressing skeletal muscle ryanodine receptor. Effects on full-length and carb linal portion of Ca** release channels. J Gen Physiol, 110: 749-762 Bhat MB, Hayek SM, Zhao J, et al. 1999. Expression and functional characteriz’ >1. o! rdiac muscle ryanodine receptor Ca2 release channel in chinese hamster ovary cells. Biophys J, 77: 808-8 Blatter LA, Huser J, Rios E. 1997. Sarcoplasmic reticulum Ca?" release flux und a’ sparks in cardiac muscle. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 4176-4181 BogdanovK Vinogradova TM, Lakatta EG. 2001. Sinoatrial nodal cel idine receptor and Na*-Ca** exchanger: molec partners in pacemaker regulation. 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Visualization of Ca2* entry through si: ‘retch-activated cation channels. Proc Natl Acad i USA, 99: 6404-6409 23.1: TRP 通 道 结构 特 性 :ee 270 23.2 1TRP 通 道 分 巴 条 样 性 和 村 272 DSA WIRPAC s cccescvccocecsscvecduccoscuersaccccescoceouveceeuetusteot ttt aaa 272 DS Zed) RPR 21S 2S ote OR PIVYDS cidicsaedacseceassvnsseosussyxgeeeiedacsnunssenpneneseeet meee 274 232SLERPN 有 274 人 274 DE DT REP WV aoee io Oin tec OORT ete ee D5 23.3 了 TRP 通 道门 控 特 性 ccc csceececstcescecsseoosozesesed eee 276 23.3.1 SRARBYE aloo... ee 276 23.3.2 PEERY llc. ccccscn 二 届 二 二 二 汪 生 的 和 村 276 23.33 细胞 膜 刺 油 感受 得 ns. cesscceeccnncscesersecsentte nnn 2 了 23.4 TRP 通道 的 生理 劲 楷 pneeneeen 278 23.4.1 TRP 通 道 调 于 Hep 可 Ca 天 稳 检 二 278 23.4.2. TRP 3 4 Sele yr, Fass ..........:.. sossnzavhdeussedeualle sae 278 tA 2 EIA ine EM ROR? ABTA 表明 , 这 些 现 象 与 TRP (transient receptor potential) 离子 通道 有 关 。 与 经 典 的 电压 门 控 通道 和 配 体 门 控 通 道 不 同 的 是 ,TRP 通道 可 被 多 种 因素 调节 ,包括 涂 透 压 、pH 值 、 机 械 力 , 以 及 一 些 外 产 性 配 体 和 细胞 内 蛋白 。 到 目前 为 止 , ie TRP 通道 , 包 括 大 脑 、 状 人 及 外 周 神经 系统 , 但 也 存在 于 非 神经 组 20, Mite. SAA, SAL ii, PL AR “BLK. 肠 、 前 列 腺 、 胎 盘 子宫 以 及 血管 等 。 相 应 地 表达 TRP 通 道 的 细胞 类 型 既 有 神经 细胞 如 感觉 神经 元 、 初级 传人 神经 元 , 也 有 非 神经 细胞 如 血管 内 皮 细 胞 、 上 皮 细 胞 和 平和 请 肌 细 胞 。 23.1 TRT ALE Fi SP gp gg 1969 4A, Manning 等 发 现 -种 果 晶 突变 体 的 杆 感 小 体 (habdomere) 中 , 光 刺 激 只 引起 短暂 睛 AY Ca?’ te EFL res, TAS 271 23H TRP ii 5 fs oS 向 持续 的 、 平 台 样 的 变化 , 因此 , APSE EM orp, EL Bl) 19894F, Montell Ff] Rubin (1998 ) Ay oe Bt trp ZEA), fii, Hardie (1992) ARE, trp 基因 编码 一 种 Ca? 通 透 阳离子 通 道 , 并 将 这 种 通道 命名 为 TRP。 不 久 , 通过 对 EST 数 据 库 搜索 ,确认 了 TRP 通 道 的 第 一 个 人 类 同 产 物 TRPC1 的 完整 序列 (Wes et al. 1995 ) 。 TRP 通 道 与 电压 门 控 钾 通道 (Kv) 、 环 核 苷 酸 门 探 通道 (cyclic nucleotide-gated ,CNG) 具有 相同 的 进化 模式 。 TRP 通道 都 有 6 次 跨 膜 螺旋 结构 域 , N 和 C 端 均 在 胞 内 , 它 们 具有 相似 的 胞 内 长 度 和 胞 外 环 , 的 者 构 域 共 同 构成 了 非 选 择 性 阳离子 孔道 。 TRP 通 道 可 形成 功能 性 的 同 聚 或 异 聚 四 聚 体 , 从 而 在 信号 转 导 中 发 挥 作 用 。 大 部 分 的 TRP 通道 是 阳离子 非 选择 性 的 , we iii TRPM4 #1 TRPMS 是 一 价 阳 离子 选择 性 的 , TRPV5 和 TRPV6 则 对 Ca 二 具有 非常 高 的 通 透 性 。 在 一 部 分 TRP 通道 N 端 包 含 多 个 锚 蛋 白 (ankyrin) 结合 部 位 (图 23-1),TRPA 有 14 个 ,ITRPC 和 TRPV 有 3~6 个 , 而 TRPM 亚 族 却 很 少 。 这 些 锚 蛋白 能 够 抑制 IP; 和 雷诺 丁 受 体 调 节 的 胞 内 和 钙 库 释放 Ca, 也 能 将 TRP 通 道 与 细胞 骨架 连接 在 一 起 ,并 可 能 在 异 聚 体 的 形成 过 程 中 发 挥 重要 作用 。 aa 2yaPrsy- LO | TRPC TRPV TRPM UA wu EpASe 典型 的 TRP 通道 结构 ( 引 自 Venkatachalam et al. 2002) A,, 锚 蛋白 位 点 ,T,TRP 结 构 框 ,Kinase, 激 酶 功能 区 在 TRPC 和 TRPM 的 C 端 , 以 TRP 框 (EWKFAR) 为 起 点 , 存 在 一 个 保守 的 25 个 二 , 叫 TRP 结 构 域 (TRP domain) (图 23-1), 但 在 TRPYV 亚 族 中 却 没 有 发 现 一 保守 的 结构 域 。 为 什么 会 有 如 此 保守 的 结构 域 , 它 的 功能 又 是 什么 ? 这些 问题 都 还 ees. TRPM 亚 族 都 具有 长 的 N 端 和 C 端 , 在 某 些 成 员 的 C 关 育 J 酶 结构 域 (图 23-1) 。 例如 ,TRPM2 有 一 个 ADP- 核糖 焦 磷 酸 酶 (ADP- ribose | ho sphatase) Sexy, ‘TE AYE 化 ADP 水 解 为 AMP (Perraud et al. 2001), TRPM6 和 1T 有 一 个 非典 型 PLC 相互 作 用 激酶 (PLC-interaction kinase, PLIK) 结构 域 (Nadler et J)01 ,Runnels et al. 2002)。 据 FEW, i HEA (chanzyme) 参与 调节 通道 的 开 闭 , =: 们 与 通道 之 间 的 功能 联系 尚 Ge 2 ASI | 生 物 膜 Biomembranes 292 要 ea 到 目前 为 止 , 超 过 30 个 哺乳 动物 TRP 通道 已 经 被 克隆 。TRP 通道 超 家 族 成 员 都 具 有 明显 的 序列 同 产 性 和 结构 相似 性 , ee 随 之 带 来 了 命名 的 混乱 , 因 此 , 在 2002 年 , 统一 的 TRP 通 道 命 名 规则 被 提出 来 并 得 到 广泛 地 认同 。 到 目 前 为 止 , 根 据 同 源 性 的 不 同 ,TRP 离子 通道 超 家 族 可 分 为 多 个 亚 族 , 包 括 TRPA (ANKTM1), TRPC (canonical TRP) , TRPM (melastatin, Long-TRP) , TRPML (mucolipin )、 TRPN (NOMPC), TRPP (polysystin) #1 TRPV (vanilloid receptor) (| 23-2), mucolipin-3 a salary PKD1 werk 20034, Story 及 其 同事 发 PKDIL2 oy z , 在 小 鼠 背 根 神经 节 (dorsal 二 root ganglia, DRG) fae oe CE25697(lov-1) 叫 ANKTMI 的 蛋白 ,序列 分 析 PKD2L1 发 现 它 是 TRP 通道 超 家 族 的 一 CE32549(pkd2) 现 被 合 名 为 TRPA1, 这 种 < 道 在 温 17C 时 被 ; en] 一 Beacon 中 , 97% HJ TRPA | FI TRPV 1 #2 er eh | 达 在 一 起 , 提示 这 种 通道 可 能 seocR3 介 导 了 伤害 性 冷 刺激 (Story ceOCR-1 名 et al. 2003 ) 。 TREV1 最 近 ,Jordt 等 (2004) 发 JIRPV4 现 , ANKTM 1 通道 介 导 芥 未 油 APU ALK RY (A?-tetrahydro cannabinol, THC) 引起 的 伤害 ceNOMPC ie 性 痛觉 传递 , 这 说 明 ANKTMI ANE tim RET TPE, SEHR Hyp Bc TRPM3 体 也 能 使 其 激活 。 IRM : 35s, SRL ALTE LE — oe - ed 种 TRPA1I 同 产物 Painless , TRPMS 它 既 可 接受 机 械 刺 激 , 也 可 接 ee lim ERE, At ANKTM1 ae Ay F 不 同 , Painless 在 温度 大 于 27C bag i" 2 时 才 被 激 话 (Tracey et al. 2003), 23.2.2 TRPC epee TRPC7 哺乳 动物 TRPC 亚 族 可 分 RP 超 家 族 系统 树 〈( 引 自 Corey 2003) 4 类 : TRPC1; TRPC2, 1, fevbk < Aga, HK, BEG, BW, Re, Be, Beh RPGS, TPRCGRPC7, 273 23% TRP 718 5 fa SHS TRPC4、TRPC5, 其 中 TRPC1 是 第 一 个 被 发 现 的 哺乳 动物 TRP 通道 。TRPC4 #1 TRPCS 胞 内 C 端 都 有 突 触 后 致密 域 (postsynaptic density zone, PDZ) 结合 区 (VTTRL ) , 这 是 其 他 TRP 通道 所 没有 的 。 有 研究 表明 , 当 钙 库 被 耗竭 时 , 在 CHO 细胞 表达 的 TRPCI1 通道 加 大 了 细胞 的 非 选 择 性 阳离子 电流 (Zitt et al. 1996 ) 。 但 是 如 果 细 胞 单独 表达 TRPC1 通 道 蛋 白 , 当 激活 PLC- B 时 , 细 胞 并 不 产生 明显 的 内 向 电流 ,这 可 能 暗示 TRPC1 通道 可 能 与 其 他 TRP 通 道 形成 功能 性 异 聚 体 , 从 而 发 挥 作 用 〈Strubing et al. 2001), TRPC2 与 TRPC3 亚 族 只 有 大 约 30% 的 同 源 性 。 研 究 发 现 ,TRPC2 蛋白 表达 于 大 鼠 414.28 (vomeronasal organ, VNO) 微 绒毛 和 小 鼠 精 子 头 部 。 在 小 鼠 受 精 时 , 精 子 表 面 的 TRPC2 通道 能 产生 持续 的 Ca 内 流 。 而 当 TRPC2 基因 缺失 时 , 小 鼠 就 不 能 感受 外 激 素 刺 激 , 并 且 不 能 选择 性 行为 对 象 。 TRPC3、TRPC6 和 TRPC7 具 有 大 约 75% 的 同 源 性 , 形成 具有 内 外 双向 整流 的 非 选 择 性 阳离子 通道 。TRPC3 通道 的 平均 开放 时 间 比 较 短 (t = 0.1 ms), 单 通道 电导 为 66ps, 这 个 通道 仅仅 在 出 生 后 很 短 的 发 育 阶段 表达 。TRPC6 和 TRPC7 对 Ca 、Nd 选择 性 很 低 , 它 们 对 胞 内 Ca 很 敏感 , 并且 能 被 DAG 激 活 , 这 两 种 通道 主要 在 心肌 和 平 请 肌 细 胞 中 高 表达 。 当 激 活 Gq 和 蛋白 偶 联 受 体 或 酷 氨 酸 激 酶 受 体 时 ,TRPC4 和 TRPC5S 两 个 通道 被 打开 。 虽然 Gdq 和 受 体 酷 氨 酸 激酶 信号 通路 都 会 聚 到 PLC 的 活性 , 但 是 PLC 酶 活化 后 的 两 个 主 要 产物 IP; 和 DAG 却 并 不 激活 TRPC4 和 TRPC5S。PLC 活 化 机 制 是 什么 , 膜 上 受 体 是 怎 样 与 这 两 种 通道 联系 的 , 这 都 还 没有 定论 。TRPC4 和 TRPC5 也 能 与 其 他 亚 型 形成 异 聚 体 。Striibing 等 (2001) 研究 表明 , TRPC1 和 TRPC5 作为 亚 基 在 海马 形成 一 种 新 的 通道 , 这 种 通道 的 激活 并 不 依赖 于 胞 内 和 钙 库 的 耗竭 。 另 外 , 在 小 脑 皮 层 也 发 现 TRPCLTRPC4 异 聚 体 。 ET 目前 只 在 哺乳 动物 体内 发 现 了 TRPM 亚 族 , 它们 与 果 蝇 TRP 通 道 同 源 性 较 低 , 只 20% 左 在。 因为 这 一 亚 族 普遍 存在 一 个 相对 较 长 的 太 端 , 所 以 曾经 被 称 为 LITRP (Long- TRP)。TRPM 亚 族 包含 8 个 成 员 , 根据 同 源 性 分 为 4 组 : (1)TRPM1(melastatin 或 LTRPC1) 和 TRPM3 (KIAA161 3% LTRPC3); (2) TRPM7 (TRP-PLIK, TRP-phospholipase inter- acting kinase, ChaK1) #1 TRPM6 (ChaK2); (3) TRPM2 (TRPC7 或 LITRP2) #11 TRPM8 (Trp-p8); (4) TRPMS (Mtrl 或 LTRPC5) #1 TRPM4 (FLJ20041 或 LTRPC4) 。 人 TRPMI1 通 道 是 一 个 具有 1533 个 氨基 酸 的 蛋白 。 序 列 研究 表明 , 全 长 的 TRPMI1 蛋 白 只 在 正常 的 黑色 素 细胞 中 存在 , 而 在 黑 素 瘤 细 胞 中 只 存在 TRPMI1 的 多 个 短 mRNA 转 录 物 , 这 提示 TRPM1 可 能 和 癌症 有 关 。 TRPM2 是 一 个 具有 1503 个 氨基 酸 残 基 的 蛋白 , 它 在 胚胎 忒 年 期 的 大 脑 中 均 有 较 高 的 表达 。TRPM2 通道 C 端 有 一 个 Nudix 结构 域 , 因 ig ADP i473, ADP #} 演 着 第 二 信使 的 角色 ,调控 TRPM2 的 开放 , 导 致 Ca 大 aud etal. 2001)。 最 近 有 报道 说 HO, 也 能 调节 TRPM2 的 开放 , 从 而 引起 Ca2 内 ; .显示 TRPM2 可 能 在 脑 损伤 引起 的 细 F 死亡 过 程 中 发 挥 重要 作用 (Kraft et al. 2004 TR’ 6 在 舌 、 胃 及 小 肠 中 均 有 较 高 的 表达 。 它 的 7 ”依赖 于 胞 内 Ca 浓度 的 升 高 , HE Wy fi Biomembranes 274 并 受 电压 调节 , 这 种 调节 方式 和 TRPM4b 一 致 。 目 前 认为 , TRPMS 主要 介 导 甜 和 苦 这 两 种 味道 的 传递 (Perez et al. 2002), TRPM6 和 TRPM7 具有 52% 的 同 产 性 , 它 们 都 能 通 透 Ca 和 Mg。 这 两 种 通道 的 C 端 具有 非典 型 的 o- 激 酶 结构 域 , 能 够 调节 通道 自身 的 活性 , 这 种 激酶 的 活性 依赖 于 胞 浆 内 ATP 和 Mg 浓度 。 当 加 入 可 抑制 ATP 水 解 的 物质 , 如 ATP-yYS 和 AMP-PNP, 就 不 能 产生 电流 。TRPM6 是 一 种 拥有 2022 个 氨基 酸 残 基 的 通道 蛋白 。zpm6 基 因 的 突变 会 导致 血 镁 过 低 (hypomagnesemia) , 并 进而 导致 血 钙 过 低 (Schlingmann et al. 2002) 。 TRPM7 则 具有 1863 个 氨基 酸 残 基 ,, 在 脑 、 心 、 肺 、 色 、 肝 中 均 有 表达 。 和 其 他 TRP 通道 不 一 样 , PIP: 对 TRPM7 起 沿 活 作用 , 当 PIP; 被 水 解 后 , 通道 反而 被 关闭 (Runnels et al. 2002 ) 。 这 一 亚 族 中 , 还 有 一 个 令 人 非常 感 兴 趣 的 通道 是 ITRPM8。MCcKemy 及 其 同事 从 被 薄 和 谷 醇 和 冷 激活 的 三 叉 神经 感觉 神经 元 上 克隆 到 一 个 受 体 , 这 种 受 体 被 命名 为 冷 敏 感 和 薄 Any EE BS x (cold- and menthol-sensitive receptor, CMR), , 现 在 被 重新 命名 为 TRPM8。 “4 TRPM8 #4 fim BE BEE toy PY , 通道 打开 , Ab Ca dt A sZt 7c, Ami RODE HE 位 (McKemy et al. 2002) 。 ATT TT TE ATE EE ETT T TET TE TE 黏 脂 病 IV 型 是 一 种 常 染色 体 隐 性 遗传 疾病 , 特征 为 早期 角膜 混沌 、 精 神 运动 性 阻 滞 及 溶 酶 体 贮 积 。 Sun 等 (2000) 研究 发 现 , 该 病 是 由 于 ml4 (mcoln!) 基因 缺失 造成 的 。 71mzl4 编 码 一 个 6 次 跨 膜 蛋白 ,这 个 蛋白 就 因此 被 命名 mucolipin (MCOLN1)。 序 列 分 析 发 现 与 果 蝇 TRP 通 道 有 38% 的 同 源 性 , 在 孔道 区 域 同 源 性 高 达 58% 。 现 在 ,这 个 通道 被 规 范 的 命名 为 TRPML1。 随 后 ,TRPML2 (mucolipin 2) 和 TRPML3 (mucolipin 3) 相继 被 发 现 。 目 前 的 研究 表明 , TRPML 亚 家 族 和 蛋白 可 能 只 表达 在 胞 内 赛 泡 上 , 起 着 调节 胞 饮 的 作用 。 当 TRPMLI 在 果 晶体 内 的 直系 同 源 物 CUP-5 突变 时 , 引 起 过 量 的 溶 酶 体形 成 , 最 终 导致 细胞 凋 亡 。 TRPML3 主要 存在 于 毛细 胞 的 细胞 质 中 和 静 纤 毛 的 质 膜 上 , 把 TRPML3 2848), PRA FERS A 8 aI BUR I Sidi J [a] St FH FEB NOMPC2E A AU BAER FP SE EAE, th SE ER REL, 一 种 命名 为 dmNOMPC [iii itt ES Sp SEE SS fh A ELE SE,“ LW dr NOMPC 有 45% 的 同 源 性 , 与 线虫 eNOMPC 有 42% 的 同 源 性 ,因此 ,通称 这 3 种 通道 为 TRPN(NompC TRP) 通道 (Sidi et al. 2003)。 dmNOMPC 主要 表达 在 斑马 鱼 的 胚胎 期 和 幼年 期 的 内 耳 毛 细胞 中 , 目 前 在 更 高 等 的 哺乳 动物 , 如 鼠 和 人 体内 还 没有 发 现 其 直系 同 源 物 。 TT TT % #5475 (polycystic kidney disease, PKD ) 是 一 类 常 染 色 体 显 性 遗传 疾病 ,由 Pd Bi pha? HE AME. AAT, PKD1、PKD2 及 其 同 源 物 被 统一 划分 到 TRPP 这 个 分 支 。 在 哺乳 支 ) 娘 中 , 这 个 分 支 包 括 两 类 : (1) TRPP1 (PKD!) 及 PKDIL1 (PKD1-Like 1), PKDIL2, PXD1IL3, PKDREJ; (2) TRPP2 (PKD2) 及 TRPP3 (PKD2-Likel, PKD2L1), TRPPS (PK 2L2)。 但 是 , 只 有 第 二 类 蛋白 才 属 于 TRP , 道 超 家 族 。 275 23H TRP i718 5 fs oF 第 一 类 TRPP 成 员 均 为 11 次 跨 膜 蛋 白 , 它 们 的 C 端 保持 了 类 似 于 TRP 通 道 的 6 次 跨 膜 区 域 。 而 第 二 类 TRPP 通 道 与 其 他 典型 的 TRP 通 道 一 样 , 均 为 6 次 跨 膜 的 离子 通道 。 哺 乳 动 物 TRPP2 通道 与 TRPC3 和 TRPC6 有 25% 的 同 源 性 , 其 C 端 有 一 个 Ca# 结 合 结构 域 (EF) 和 一 个 超 螺旋 卷曲 , 但 没有 重复 的 锚 和 蛋白 结合 区 域 , 也 没有 TRP 结 构 域 。 另 外 , 第 二 类 通道 的 第 1、2 次 跨 膜 区 域 间 还 有 一 个 大 的 胞 外 环 。 TRPP1 和 TRPP2 均 不 能 单独 形成 离子 通道 , 它们 必须 相互 作用 才 可 形成 通 透 Ca 的 非 选择 性 阳离子 通道 。 与 之 相反 ,TRPP3 可 单独 形成 功能 性 的 通 透 Ca# 阳离子 通道 。 研 究 还 发 现 , 肾 与 视网膜 缺损 (kidney and retina defects, krd) 小 鼠 缺 少 TRPP3 (Nomura et al. 1998) , 这 表明 TRPP3 在 视网膜 发 育 中 扮演 重要 角色 。 | 哺乳 动物 TRPV 亚 族 有 5 个 成 员 , 可 被 分 为 3 组 : (1) TRPV1 (vanilloid receptor 1, VR1), TRPV2 (vanillod-like receptor1,VRL1),TRPV3;, (2) TRPV4 (OTRPC4); (3) TRPVS (epithelial calcium channel 1/calcium transportor 2, ECaC1/CaT2) , TRPV6 (ECaC2/ CaT1)., 1997 4F, Caterina 及 其 同事 发 现 , 着 概 素 (capsaicin) BAW (vanilloid) 的 衍生 物 , 能 激活 一 种 受 体 , 它 是 一 种 非 选 择 性 的 阳离子 通道 , 在 结构 上 属于 TRP 通 道家 族 。 当 温度 升 高 时 , 这 种 克隆 的 辣椒 素 受 体 也 能 被 激活 , 说 明 它 在 热 痛 刺 激 信号 的 传导 中 发 挥 重要 作用 。 这 种 受 体 当时 被 命名 为 香草 素 受 体 1 (vanilloid receptor 1, VR1), BJITRPV1, 克隆 的 TRPV1 cDNA 编码 一 种 由 838 个 氨基 酸 组 成 的 蛋白 。N 端 有 3 个 锚 蛋 白 , 靠 近 C 端 具 有 TRP 结构 域 。TRPV1 表达 在 DRG 和 三 叉 神 经 节 的 感觉 神经 元 中 (Caterina et al. 1997)。 研 究 表明, 在 大 鼠 DRG 中 ,,40% 的 细胞 表达 TRPV1, 其 中 主要 是 小 细胞 。 大 鼠 TRPV2 通 道 与 其 TRPV1 通 道具 有 66% 的 同 源 性 。 异 源 表 达 的 TRPV2 通 道 并 不 被 香草 精 类 化 合 物 或 低 pH 值 所 激活 ,但 能 被 热 激 活 (>52C ), 这 表明 TRPV2 可 能 起 着 调节 高 国 值 、 伤 害 性 热 痛 刺激 的 作用 。ITRPV2 通 道 在 DRG 的 中 细胞 和 大 细胞 中 有 较 高 表 iA, 但 也 存在 于 大 脑 、 兰 髓 青 角 以 及 脾 和 肺 ,在 非 神经 系统 的 存在 说 明 TRPV2 可 能 还 有 其 他 未 发 现 的 功能 (Caterina et al. 1999), TRPV3 是 最 近 发 现 的 TRPV 亚 族 成 员 , 与 TRPV1、TRPV2 分 别 有 38% 和 32% 的 同 源 性 , 在 皮肤 、 天 头 、DRG、 三 又 神经 、 状 茵 和 大 脑 都 有 一 定 表 达 。Xu 等 (2002) 发 现 , 当 把 温度 从 22C 升 高 到 40C,,TRPV3 被 激活 。 进 一 步 研 究 证 明 , 该 通道 对 Ca+ 的 通 透 性 比较 高 ,PcvyPNs 为 12.1。 Smith (2002) RE, 4 DRG 中 TRPV3 通道 与 TRPV1 通道 共 表 达 。 当 在 体外 异 源 表达 时 ,TRPV3 和 TRPV1 也 能 功能 性 地 结合 在 一 起 。 这 表明 , TRPV3 通 道 不 仅 能 单独 发 挥 功 能 , 也 可 以 和 其 他 TRPV 通 道 形成 异 取 体 , 调节 其 他 TRPV 通道 的 功能 。 TRPV4 通 道 与 TIRPV1、TRPV2 有 40% 同 源 性 。 当 在 | 胞 中 表达 TRPV4 时 , 形成 具有 一 定 离 子 选择 性 的 外 向 整流 阳离子 通道 (Pc.,/F Fl TRPV1 不 同 的 是 , TRPV4 并 不 被 辣椒 素 和 热 所 激活 , 却 能 感受 胞 外 渗透 压 2。 当 降低 胞 外 活 透 压 时 , TRPV4 通 道 打开 ,,EP: 为 270 mOsm。TRPV4 在 心 、 肺 、 均 有 表达 , 在 神经 系统 中 , 侧 脑 室 管 ” 细胞、 内 耳 毛 细胞 、 三 又 神经 细胞 也 都 存在 ”“V4 通 道 (Liedtke et al. 2000), TR V5 是 由 730 个 肥 基 酸 残 基 组 成 的 蛋白 , 与 TI _ 71 仅 有 30% 的 同 源 性 , 但 与 HE 4 ie Biomembranes 276 TRPV6 ZAG 66% [AUR LE, TRPVS 和 TRPV6 通 道具 有 高 度 的 Ca 选择 性 (PcvPNs>100 ) , 通 透 电流 具有 强烈 的 内 癌 整 流 特 性 。ITRPV5 主要 存在 于 茎 、 小 肠 和 前 列 腺 。TRPV6 主 要 表达 在 大 鼠 小 肠 , EKG. A LAR AOR Ak , 但 与 TRPV5 不 同 的 是 , TRPV6 在 肾 脏 基 本 上 没有 表达 。 除了 在 哺乳 动物 体内 表达 外 , 在 低 等 动物 如 线虫 体内 也 存在 TRPYV 通道 , 第 一 个 被 发 现 的 是 OSM-9。 它 在 ASH 伤 害 性 神经 元 中 有 高 表达 , 感受 有 害 的 化 学 物质 、 疾 透 压 改 变 和 触觉 。 另 外 , 有 报道 发 现 , 线 虫 的 非 伤害 性 神经 元 , 如 化 学 物质 感受 器 官 一 he ax (amphid) 神经 元 也 表达 OSM-9; AWA 气味 感觉 神经 元 中 的 OSM-9 受 G 蛋白 调控 , 传递 气味 信号 ; ADF 细胞 中 的 OSM-9 感受 外 激素 ; OLQ 细胞 中 的 OSM-9 在 痛觉 传递 过 程 中 发 挥 重 要 作用 ; ADL、AWC 细 胞 也 表达 OSM-9, 辅助 传递 气味 信息 。 线 虫 基因 组 中 的 其 他 4 个 OSM-9 的 同 产 物 ,OCR (OSM-9/capsaicin receptor related) 1~4 也 被 克隆 出 来 , 它 们 都 能 感受 机 械 压 力 (Tobin et al. 2002 ) 。 除 此 之 外 ,Kim 等 (2003) 在 果 蝇 体内 发 现 一 种 介 导 声音 传递 的 通道 , 并 命名 为 Nanchuang (韩语 “失聪 ”的 意思 , 也 叫 Nan)。 通 过 序列 分 析 发 现 , 与 OCR4 有 37% 的 同 源 性 , 与 其 他 TRPV 亚 家 族 成 员 的 同 产 性 要 略 低 。 23.3 TITRP 通 道门 控 特 性 | 23.3.1 SEF mmm 受 体操 控 理 论 (receptor-operated theory) 认为 , 神 经 递 质 、 激 素 等 配 体 激动 剂 结合 其 受 体 后 , 一 些 由 受 体 激 活 而 产生 的 信号 分 子 能 直接 结合 到 TRP 通 道上 , 从 而 特异 地 激 活 这 些 通道 ,因此 被 称 为 受 体 操控 通道 (receptor-operated channel, ROC), 目前 研究 表 明 , 哺 乳 动物 TRPC 通道 亚 家 族 和 果 蝇 的 光 感 受 左 TRP 蛋白 都 能 被 G 蛋白 偶 联 受 体 激 活 。G 蛋 白 偶 联 受 体 通常 由 脚手架 蛋白 相连 ,与 多 种 蛋白 分 子 形 成 复杂 的 蛋白 复合 体 。 当 G 蛋白 偶 联 受 体 被 激活 时 , 催 化 G 和 蛋白 并 形成 活化 的 Gx 和 GByY, 随 后 激活 PLC-B, 或 者 通过 酷 迄 酸 激酶 受 体 激活 PLC-Y;, 接着,PLC 水 解 PIP,, 并 使 其 分 解 为 DAG 和 卫 ;。 在 这 一 过 程 中 ,PIP, 扮演 了 非常 重要 的 角色 , 几 个 TRP 通道 , 包 括 TRPC3、TRPC4、 TRPM7 结 合 了 PLC-B 或 PLC-y, 这 些 PLC 可 以 调节 与 TRP 通 道 结合 的 PIP; 水 平 。 而 当 PIP, 可 以 抑制 果 晶 TRP 和 TRPL 通道 以 及 哺乳 动物 TRPV1 (Chuang et al. 2001), 而 当 PIP, 存在 时 TRPM7 活性 增加 ,PIP; 水解 时 TRPM7 失 活 (Runnels et al. 2002) 。 这 些 结 果 也 都 证 明了 TRP 通道 门 控 的 受 体操 控 理 论 。 23.3.2 (JA 1 1 mmm is , HP A Ca RR E[Ca”*], RAVE 0.1 pmol/L, Ani 4 43 ae BCR RE ATA Lumol/L 以 上 。[Ca2]; 的 增高 除了 调节 各 种 蛋白 酶 和 离子 通道 功能 外 , 也 激活 了 Cax#-ATPase (Ca# 泵 ), 从 而 使 [Ca2; 恢 复 正 常 , 避 免 高 Ca” 对 细胞 的 损伤 。 由 于 细胞 膜 和 内 质 网 膜 上 都 有 Ca 和 泵 ,所 以 胞 浆 中 的 Ca 既 会 被 抽 回 到 内 质 网 , 也 会 被 排放 到 细胞 外 。 这 样 一 来 , 由 IP; 引 起 的 Ca Ec BAHIA Ca” FE, Al, 在 耳 ; 油 活 IP; 受 体 的 同时 或 紧 随 其 后 , 细 Wen EA. we BRIT IF, 使 Ca 内 流 以 补充 内 钙 的 丢失 。 这 种 钙 通 道 就 是 钙 库 操控 通 道 (store-c -rated channel, SOC), Putney (1986) #7 4i me (capacitative Ca** en'ry, CE) 的 概念 ,他 认为 Ca 内 流 是 由 内 质 网 ( 六 耗竭 引起 的 。1989 年 后 , 多 277 g23z TRP i818 5 fs oe 个 实验 室 用 电 生 理 的 方法 证 明了 SOC 的 存在 , 而 且 在 不 同 的 细胞 上 SOC 生物 物理 特性 Axle], 说明 SOC 可 能 有 多 种 , 但 SOC 的 分 子 基 础 和 激活 机 制 尚 不 清楚 (Venkatachalam et al. 2002), Zhu 等 (1995) 首先 克隆 了 哺乳 动物 TRPC 基因 并 认为 这 些 基因 能 够 形成 SOC。 接 着 , 他 们 发 现 TRPC 是 通过 与 IP; 受 体 直接 作用 而 被 激活 的 , 并 且 分 别 从 了 王 ; 受 体 和 TRPC 分 离 出 两 个 结合 位 点 (Zhu et al. 1996) , 这 一 结果 为 SOC 激活 机 制 的 构象 偶 联 (conformational coupling) 假说 提供 了 证 据 。 随 后 , 多 个 实验 室 通 过 钙 成 像 等 技术 研究 并 推断 , 某 些 TRP 通道 , 如 TRPV6、TRPC1、TRPC2、TRPC4、TRPC5 属于 SOC, 对 于 TRP 通 道 是 否 是 SOC, 科学 界 仍 有 和 争论。 后 成 像 技 术 有 其 本 身 的 局 限 性 , 但 对 于 研究 通道 特性 来 说 , 它 是 一 个 非常 间接 的 手段 。 它 只 能 反映 自由 Cs 谊 度 , 却 不 能 映 离子 来 产 。 当 Ca 进入 胞 内 , 也 可 能 引发 Ca? TARA Ca?” iH Bk Ca Fea pk, 激活 其 他 Ca 相关 过 程 , 从 而 影响 实验 结果 。 更 为 重要 的 是 ,在 钙 成 像 实 验 中 , 作 为 Ca 王 进入 胞 内 的 驱动 力 , 电 压 水 平 并 不 能 得 到 有 效 地 控制 。 因此 ,Ca 高 通 透 性 的 TRP 通 道 , 可 能 与 其 他 所 有 的 通 透 Ca 的 通道 一 样 , 对 钙 库 操控 的 Ca 六 进入 过 程 做 出 贡献 。 但 是 ,到 目前 为 止 , 还 没有 直接 证 据说 它们 就 是 SOC。 23.3.3 AR/ICIS 5 + _ gm 1. 物理 刺激 (1) 温度 到 目前 为 止 , 温度 性 TRP 通 道 的 门 控 机 制 并 不 十 分 清楚 。 有 人 认为 , 它们 的 门 控 可 能 与 其 胞 内 的 锚 蛋 白 结构 域 有 关 。 锚 蛋白 与 细胞 骨架 的 热 敏 感 蛋 白 结合 , 间接 感受 外 界 温度 刺激 , 从 而 控制 通道 开关 (Patapoutian et al. 2003)。 但 是 ,TRPVI 的 膜 片 向 外 式 (outside-out) 单 通道 膜 片 钳 实 验 表 明 ,,TRPV1 通道 的 温度 激活 并 不 需要 细胞 骨架 的 完整 性 (Tominaga et al. 1998)。 而 与 之 相反 ,Watanabe 等 (2002) 证 明 , 热 刺 激 的 TRPV4 单 通道 电流 却 只 能 在 细胞 吸附 式 (cell-attached) 下 才能 获得 , 这 表明 TRPV4 的 温度 门 控 可 能 需 要 细胞 骨架 蛋白 的 参与 。 尽 管 最 近 有 实验 证 明 ,TRPV1 的 第 3 跨 膜 结构 域 和 其 N 端 、C 端 对 辣椒 素 的 敏感 非常 必需 , 但 TRPV1 和 其 他 温度 敏感 TRP 通 道 的 温度 门 控 特 性 仍然 不 得 而 知 。 由 于 TRP 通 道 存在 结构 多 样 性 , 其 温度 门 控 性 质 也 许 同样 存在 多 样 性 。 (2) 机 械 压 力 第 一 个 被 发 现 的 传递 机 械 感受 的 TRP 受 体 是 线虫 体内 的 OSM-9。 随 后 , 科学 家 发 现 线虫 体内 的 OCR1~4 几 种 通道 也 都 能 感受 机 械 压 力 。 而 在 哺乳 动物 体内 , 有 研究 者 扒 测 TRPV4 在 内 耳 能 够 介 导 机 械 压 力 传递 。 但 是 , 对 于 具体 的 门 控 机 制 的 研究 却 是 室 室 无 几 。 最 近 , Zhou 等 (2003) 对 酵母 液 泡 膜 YVC1-p (一 种 TRP 通 道 ) 的 研究 初步 证 明 , 当 存 在 外 向 力 (如 低 渗 ) 或 内 向 力 〈 如 高 渗 ) 时 , 膜 表面 都 会 产生 ;从 而 激活 YVC1-p, 但 是 具体 的 机 制 尚 不 明了 , 还 有 待 进一步 研究 。 2. 化 学 刺激 与 典型 的 配 体 门 控 离子 通道 类 似 , 很 多 TRP 通道 到 化 学 激动 剂 激活 。 例 如 , TRPV1 能 够 直接 被 辣椒 素 、H 和 内 源 性 大 麻 样 物 质 激 证 \PM8 能 直接 被 薄荷 醇 激活 。 这 就 是 我 ”为 什么 在 吃 辣 椒 时 会 感觉 嘴 里 发 次 , 而 在 改 当时 却 感觉 清凉 无 比 的 原因 。 但 是 ,H 禄 辣椒 素 对 TRPVI 的 门 控 机 制 却 并 不 一 样 。。 变 掩 胞 外 第 5 和 第 6 跨 膜 区 域 oe 物 膜 Biomembranes 278 之 间 的 E648 时 , 导致 TRPV1 对 于 的 敏感 性 显著 下 降 , 而 对 辣椒 素 等 物质 却 设 有 太 大 影 啊 (Jordt et al. 2000) 。 23.4 TRP WGN: SEC ees 23.4.1 TRP 通 道 调 世 胞 内 Ca?’ £22 _ mms Ca 作为 一 种 非常 重要 的 细胞 内 第 二 信使 , 广泛 地 参与 信号 转 导 过 程 , 在 肌肉 收缩 、 神经 传递 、 酶 和 汕 素 分 泌 、 细 胞 周期 调控 , 以 及 细胞 凋 亡 等 多 种 生物 活动 中 发 挥 重要 作 用 。 Ca 作为 细胞 信使 的 化 学 基础 ,在 细胞 外 和 细胞 质 之 间 、 胞 内 钙 库 和 细胞 质 之 间 存 在 C 驻 浓度 梯度 。 一 般 认 为 , 大 多 数 细胞 外 目 由 Ca 浓度 为 100~ 1000hmoVL, 比 静止 状态 时 细胞 质 C 六 浓度 大 3 一 4 个 数量 级 。 当 细胞 受到 某 些 刺激 时 , 少量 的 胞 外 Ca 进入 细胞 质 , 使 细胞 质 C 芝 浓度 大 幅 增 加 , 产生 钙 信 号 。 另 外 , 当 受 到 刺 沿 时 , 胞 内 钙 库 Ca 释放 到 细胞 质 中 , 使 胞 质 内 Ca 浓度 增加 , 这 是 钙 信 号 产生 的 另 一 重要 途径 。 近 几 年 来 ,大量 的 研究 表明 ,TRP 通道 作为 一 类 新 发 现 的 Ca 六 摄 和 途径, 在 调 市 胞 内 Ca 稳 态 , 传 递 胞 外 信和 号 方面 发 挥 重 要 作用 。 因 为 TRP 通 道具 有 较 小 的 电导 , 所 以 它们 能 够 传递 长 时 程 的 钙 信 号 , 从 而 影响 一 些 慢 的 细胞 活动 , 诸如 平 请 肌 收 缩 、 细 胞 增殖 等 。 Aarts 等 (2003) 报道 , 在 氧 葡 萄 糖 判 夺 (oxygen glucose deprivation, OGD) 条 件 下 ,TRPM37 参与 胞 内 和 钙 信 号 的 级 联 放 大 。 在 OGD 初期 , 兴 奋 毒 作用 引起 细胞 膜 上 NMDA 受 体 开 放 , 导致 Ca# 内 流 , 通过 NOS-NO 途 径 , 产 生活 性 氧 物 质 (reactive oxygen species,ROS ) , 最 终 打 开 TRPM7 通道 , 引 起 更 多 的 Ca 内 流 , 从 而 导致 细胞 死亡 。 这 一 实验 前 明了 一 条 新 缺 血 缺 氧 条 件 导 致 细胞 死亡 的 途径 , 为 临床 治疗 和 新 药 研发 提 供 了 依据 。 此 外 , Obukhov 等 (2002) 研究 发 现 , 在 共 表 达 也 1 受 体 和 TRPC4 通 道 的 嗜 铬 细胞 中 , 刺激 HI1 受 体 , 导致 了 由 ITRPC4 介 导 的 Ca 内 流 , 从 而 引起 细胞 的 胞 吐 现象 。 毋 庸 置疑, TRP 通 道 在 介 导 Ca 内 流 , 调 控 胞 内 Ca 稳 态 的 过 程 中 起 着 极其 重要 的 作用 ,, 随 着 研究 的 逐 潮 深 入 , 更 多 的 功能 也 将 被 发 现 。 23.4.2 ”TRP 通 道 介 导 感 觉 传递 1. TRP MES RIE TRP 通 道 在 果 蝇 等 无 脊椎 动物 的 光 传 导 过 程 中 起 着 重要 作用 。 光 引起 果 蝇 视 紫 红 质 构象 改变 而 被 激活 , 活 化 的 视 紫红 质 又 激活 Gq RAH HRA, Rie Gqa week, Mite 活 PLC, 催 化 PIP; 分解 成 了 P; 和 DAG, 最 终 激 话 TRP 通道 。 有 趣 的 是 , 果 蝇 的 光 传 递 依 赖 于 一 种 叫 转 导 小 体 (transducisome) 的 信号 复合 物 的 形成 。 如 图 23-3 所 示 , 转 导 小 体 通过 一 种 脚手架 蛋白 INAD [inaD (inactivation no afterpotential) 基因 编码 的 和 蛋白] , 一 边 将 TRP、PLC、 视 紫红 质 (rhodopsin)、PKC 以 及 征调 素 (calmodulin, CaM) 连接 到 一 起 , 一 边 通 过 NINAC 与 E- 肌 动 蛋 白 相 连 , 从 而 提高 了 信和 号 传导 的 速度 和 敏感 性 。 然 而 , 到 读 什 么 因素 直接 决定 了 TRP 通道 的 开放 , 现 在 还 不 清楚 。 2. TRP i 感受 温度 当 人 人 和 为 TRP 通 道 完 全 通过 PLC 或 胞 内 钙 库 而 被 “ 话 时 ,Caterina 等 (1999) 通 过 表 279 23H TRP i818 5 fs oe} ou. oS macs mae CIC TTS —_ 4 pKor til Go” ingle EN ) rave Gyo ERS hey, 4 Wwe PLCB CS $ 名 PLCB wa EEE 果 蝇 转 导 小 体 结构 示意 图 ( 引 自 Montell 2001) 达 克 隆 的 方法 分 离 出 一 种 对 辣椒 素 敏 感 的 通道 TRPV1。TRPV1 不 仅 能 被 辣椒 素 一 类 的 学 痘 物 质 所 激活 , 而 且 对 超过 43C 的 温度 也 很 敏感 。ZTRP 厅 缺失 小 鼠 对 伤害 性 刺激 的 赋值 明显 降低 。 通 常人 们 能 够 感觉 从 低 于 8C 到 高 于 50C 范围 的 温度 , FFA TRPVI RAD EY 一 些 细胞 仍然 能 够 感受 热 刺激 , 这 些 都 表明 ,还 存在 其 他 的 感觉 温度 的 通道 。 随后 ,TRPV2 被 发 现 , 与 TRPV1 不 同 , 只 有 在 明显 高 于 TRPV1 刺 激 国 值 的 温度 下 , TRPV2 才 能 被 激活 , 其 国 值 为 S2C (Caterina et al. 1999) 。 最 近 克 隆 的 TRPV3 是 第 3 种 温度 敏感 通道 , 在 比较 合适 的 温度 范围 (31~37°C) 被 激活 (Xu etal. 2002)。TRPV4 曾 被 认为 感应 细胞 诊 透 压 的 变化 ,但 最 近 的 研究 表明 , 它 也 对 温和 的 温度 (27~34C) 敏感 。 有 趣 的 是 TRPV4 在 下 丘脑 前 部 表达 较 多 , 这 一 区 域 一 般 被 认为 是 温度 的 感受 区 (Giiler et al. 2002)。 TRP 家 族 不 仅 能 感受 高 温 , 也 能 感受 低温 。TRPM 亚 族 成 员 TRPM8 能 被 低 于 25TC 的 温度 激活 , 其 激活 温度 学 围 从 25 一 8C 。 同 时 ,TRPM8 能 被 一 些 清凉 剂 , 比 如 薄荷 醇 All icilin 激活 。 像 TRPV1 一 样 ,TRPM8 在 三 叉 神经 和 DRG 小 细胞 中 有 大 量 表 达 , 有 的 细胞 同时 表达 这 两 种 通道 ,这 就 解释 了 为 什么 有 时 冷 的 伤 痛 刺 激 会 有 热 痛 的 感觉 (Mckemy et al. 2002)。 但 在 Viana 等 (2002) 的 研究 中 , 却 得 到 了 完全 不 同 的 结论 。 他 们 将 三 叉 神经 感觉 神经 元 在 体外 培养 ,观察 它 们 的 电 生 理学 特性 。 在 那些 对 冷 和 薄荷 醇 有 反应 的 细胞 亚 类 中 , 他 们 未 发 现 兴 备 性 的 冷 受 体 。 认 为 冷 使 这 些 神经 元 发 生 去 极 化 , 可 能 是 因为 关 闭 了 已 经 开放 的 钾 通 道 。 另 一 个 TRP 通道 TRPA 通道 〈 在 图 23-4 中 标 为 Anktml ) 在 低 于 17C 时 能 被 激活 , 和 TRPV1 可 以 共同 表达 在 DRG 的 某 些 伤害 性 感受 细胞 上 , 从 而 司 受 冷 的 伤害 性 感觉 。 在 低 等 动物 体内 , 也 有 TRP 通 道 能 够 直接 感应 环境 的 温 喜 天 “。 例 如 , 在 果 晶 幼虫 外 周 神经 元 中 存在 的 Painless 蛋白 , 它 既 可 以 被 机 械 压 ,能 被 高 于 38C 的 温度 激活 。 另 外 ,TRPA 在 果 蝇 中 的 直系 同 源 物 4ANKTMI1 才 温 度 敏感 。 不 过 , 与 哺 乳 动 物 TRPA 不 同 的 是 , 它 不 是 被 冷 的 温度 所 激活 ,T KF 27°C WP BE BIA Ak, CAAA KLE TRP 通道 能 感觉 从 8- “2 的 温度 变化 〈 图 23-4)。 但 Ella? 感觉 我 们 所 能 分 辨 的 所 有 温度 , 是 否 还 有 去 ”或 觉 温 度 的 TRP 家 族 成 员 , 会 280 Trpms (CMR1) FE DH (ant Gi 哺乳 动物 温度 敏感 性 TRP ia EWA (319 Patapoutian et al. 2003) 3. TRP 通道 和 痛 伤害 性 刺激 , 如 热 灼 、 寒 刺 、 强 压 和 化 学 刺激 等 产生 难受 的 疼痛 感觉 , 这 种 感觉 能 够 使 我 们 警惕 真正 的 或 潜在 的 伤害 。 目 前 研究 表明 , 有 不 少 TRP 通 道 参与 疼痛 信号 的 传 导 。 在 A8 和 C 纤 维 中 , 至 少 表达 4 种 TRP 通 道 , 包括 TRPV1、IRPV2、TRPM8 和 TRPA1, 它们 可 能 对 外 界 的 热 痛 和 化 学 刺激 敏感 。 不 过 , 目前 只 有 TRPV1 在 热 痛 信号 传递 过 程 中 的 作用 得 到 明确 证 实 。 Caterina 等 (2000) 发 现 ,TRPV1 缺失 后 , 小 鼠 对 热 痛 的 感觉 被 削 弱 。 同 时 , 这 种 小 鼠 对 一 些 致 痛 的 化 学 物质 , 如 香草 精 、 状 椒 素 、 仙 人 掌 毒 素 (resiniferatoxin) th, NU, (AXE RA NLR DAA Ry. 而且, 由 炎症 或 缺 血 产 生 的 一 些 因 子 , 包 括 质子 、 缓 激 肽 、 神 经 生长 因子 (nervous growth factor, NGF), LA 及 乙醇 、 脂 代谢 物 (如 花生 四 烯 酸 ) 等 , 直接 调节 TRPVI1 的 温度 敏感 性 , 这 就 解释 了 受 伤 部 位 为 什么 会 出 现 疼 痛 的 感觉 。 4. TRP 通道 和 触觉 一 般 认 为 介 导 触 党 的 通道 主要 是 ENacC (epithelial Na* channel) /ASIC (acid sensing ion channel) / DEG (degenerin) 超 家 族 成 员 。 然 而 , Colbert 等 (1997) RI, 表达 在 线虫 纤毛 感 觉 神 经 元 树 突 中 的 OSM-9, 负责 感觉 渗透 压 变 化 和 鼻 触 觉 。 在 哺乳 动物 体内 是 否 有 感应 触觉 的 TRP 通 道 呢 ? 尽管 目前 研究 还 未 有 突破 , 但 是 , 在 皮肤 和 角 化 细胞 中 有 较 高 表达 的 TRPV3 和 TRPV4 可 能 就 是 这 样 的 通道 。 5. TRP 通道 介 导 声音 传播 听觉 依赖 于 内 耳 的 特殊 细胞 一 一 耳蜗 毛细 胞 , 毛细 胞 能 够 将 外 界 的 声音 信号 转化 为 听觉 神经 纤维 的 电信 号 。 当 声波 引起 的 振动 进入 耳蜗 后 , 就 引起 耳蜗 顶 盖 膜 与 下 层 细胞 作 侧 向 物 动 , 随后 使 毛 束 弯曲 ,直接 使 一 类 被 称 为 转 导 通道 (transduction channel) 的 非 选择 性 让 码 子 通道 开放 , 使 毛细 胞 膜 去 极 化 , 从 而 打开 电压 门 控 钙 通道 , 最 终 导致 神经 递 质 的 释 元 ”尽管 毛细 胞 内 很 多 基因 的 功能 已 得 到 证 实 , (AE, 这 种 转 导 通道 的 分 子 基 281 23% TRP 78 5 fs oS 础 仍然 不 清楚 。 然 而 ,最 近 有 证 据 表 明 , 这 种 通道 可 能 与 TRP 家 族 有 关 。 首 先 , 通道 的 电 生 理学 特性 与 TRP 家族 类 似 , 单 通道 电导 为 100pS, 具 有 一 定 的 Ca 选择 性 , 能 够 被 La** BAT, AA Ca? 有 反馈 抑制 作用 。 另外 ,在 果 晶 刚毛 中 , 这 种 转 导 通道 负责 刚毛 的 机 械 感 觉 , 而 在 nompC 突变 果 蝇 中 , 果 蝇 机 械 感 觉 完 全 消失 。 由 于 NompC 和 蛋白 与 TRP 超 家 族 具 有 明显 的 同 源 性 ,这 意味 着 TRP 通 道 有 可 能 介 导 辩 椎 动物 毛细 胞 中 的 机 械 传导 。 目前 , 这 一 假设 已 经 得 到 证 实 。 Kim 等 (2003) 证 实 , Nan 和 蛋白 是 果 蝇 听觉 传递 所 必需 的 。Nan 和 蛋白 表达 在 果 蝇 弦 音 器 中 , 机 械 刺 激 可 使 其 激活 。 而 且 , ee nan EAM ERA PA. FRITS 声音 。 与 此 同时 ,Sidi 等 (2003) 发 现 , TRPN 通道 (NompC 和 蛋白 的 直 源 同系 物 ) 介 导 了 哺 乳 动 物 的 听觉 传递 ,TRPN 通道 在 斑马 鱼 耳 〈 毛 细胞 )、 眼 、 肋 上 有 高 表达 , 而 当 去 除 该 通道 后 , 会 导致 斑马 鱼 失去 听力 。 6. TRP 通道 与 味 党 味觉 器 官 接受 各 种 化 学 分 子 刺 激 , 从 而 产生 酸 、 甜 、 苦 、 症 、 咸 等 各 种 味觉 。 戌 味 觉 和 甜 味觉 由 ENaC/ASIC/DEG 超 家 族 、 超 极 化 激活 的 环 核 背 酸 门 控 阳 离子 通道 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN) 介 导 ;, 和 苦 和 甜 则 由 IT2R、TIR 和 mGluR 等 G 和 蛋白 偶 联 受 体 (GPCR) 介 导 。 这 些 GPCR 偶 联 G 有 蛋白, 导 致 环 核 苷 酸 谊 度 改变 ,产生 了; 和 DAG,, 但 随后 的 信号 传递 通路 就 不 确定 了 , 可 能 包括 胞 内 征 库 的 清空 和 膜 上 Ca 通 透 的 阳离子 通道 开放 。 Perez 等 (2002) 发 现 , 在 o- 味 导 素 (gustducin) 确定 的 味觉 感受 细胞 中 ,明显 表达 一 种 TRP 通 道 TRPMS, 它 与 味觉 信号 分 子 , 如 or- 味 导 素 、GY13、PLCB-2、IP3R 等 共同 表达 在 味觉 分 子 中 。 研 究 者 认为 , TRPM5 可 能 负责 苦 、 甜 信号 的 反应 。 7. TRP 通道 感受 外 激素 从 昆虫 到 哺乳 动物 , 动物 界 进化 出 具有 物种 特异 性 的 外 激素 分 泌 和 感受 系统 , 这 一 系统 主要 用 来 吸 ?1 和 识别 交配 性 伴侣 。 不同 种 的 动物 会 分 泌 具 有 性 别 特异 性 的 外 激素 小 分 子 到 皮肤 、 汗 液 和 尿 液 中 去 , 对 异性 发 出 吸引 的 信息 , 而 另 一 方面 则 起 到 标记 自己 占 空间 的 作用 , 警告 其 他 同性 个 体 不 要 来 侵犯 。 外 激素 的 作用 又 是 靠 嗅觉 来 传达 和 识别 的 。 陆 生 状 椎 动物 有 两 套 独 立 的 嗅觉 系统 ,一 套 是 藏 于 鼻孔 后 侧 的 嗅觉 皮层 (main MOE), 另 一 套 是 位 于 犁 具 右 , 其 中 慢 器 是 专门 感受 外 激素 的 嗅觉 系统 。 两 套 嗅 觉 系统 不 但 有 完全 不 同 的 相应 脑 感 受 区 , 而 且 神 经 传导 的 分 子 机 制 都 相差 很 远 。 Liman 等 (1999) 发 Bh, 编码 TRPC2 的 基因 专 一 性 的 只 在 犁 鼻 器 神经 元 表达 , 这 暗示 哺乳 动物 的 犁 鼻 器 神经 元 的 神经 信息 传导 可 能 需要 TRPC2 通 道 的 参与 。 随后 , Stowers 等 (2002) Fl FASE Ala 技术 将 小 鼠 的 TRPC2 基因 的 关键 序列 除去 , 获得 7ZRPC2 缺 陷 的 小 鼠 。 他 们 发 现 ,TRPC2 缺陷 鼠 的 犁 鼻 器 神经 发 育 正常 ,但 是 电 传导 实验 证 明 ,7RPC2 880% AIA os pe 2H 28 对 含有 外 激素 的 鼠 尿 产生 的 神经 电 传 导 反 应 异常 。 同 时 , 和 三, 人 诊 显示,7RPC2 缺 陷 雄 鼠 对 其 他 正常 雄 鼠 没有 通常 的 侵略 性 。 这 些 说 明 ,TR: 中 六 缺失 确实 影响 了 外 激 素 信息 的 传导 。 为 便于 查阅 , 现 将 各 种 TRP 通 道 的 特性 与 功能 总 ; : 23-1, (Be 波 RRA) ERA ifaees) aN “PD :eeT “opuoyrue (L209) (0= Ad)S~T 3 全 609 zTzdXyd Sdd ag i TE Te CF (BE Oz Wek se BOR igs: 9 | WY £5 1G He HF ‘4 lik i ‘L.e0] La sit S08 ITZGXd €ddul oa HO RAMU S4¢ = PD :eeTIT 3pUolrme CO)LzeD] AW S~I Eee | 896 ZGXd *ZOd zddxL Ree 4 ung UTCT O8I>L (xd=2dy[ ud 9711 UNIXNV Vad VERA 3W “`eJTL a | UF BY 6 roll gd-diy, SWd aL CAA “lt 8 eae ‘L.3N) ‘did 850 tay aa 4 Or Ee 7981 ITd-dHL “(DIY LAdRL Vitae I> 易 ZZ0Z ZiedD 9INdXL (WHE 3 Ht) MH Goda “MIL LeeD] S0 0> 2 * ot Soll SOdULT IN SINdXL «PD :eeT ‘L.2e0] 50 0> (obJAD)8L9 “CebJN)Op0T “(QrWrIZ1 yoOdLT IO0ZTI VANdNL Vitae «PD BM 91 va SSSI “SZEL €OdULT `9I9IVVIT = ENGL g BE BAe Y 4 dav ‘OH “GN “#44 dav I ta RES €0SI ZOTULT (Wd aL S Bre ee 1OdaLT "unelseleaN = Ida Ss 59596dXNS :eeT [eaD] `DVd ‘AOTd UML “(oTd-bo)yyodD = SO MY ~~ Half €98 LOdUL 5 asl apUoTrue “xpD IT ApD Leo] “OV VDTd4ANIL `(dDTd-pD)odD 5 a * BATH * Be 1£6 9DdNL = «®T “gdV-Z AOTE AL “(OTd-bd)yodD 号 人 €L6 zd90 cody! 外 (2342G “SNO * SL Ul ‘Leola “81 “ddv-7 AOTE AML * wnozepraeg “(GoTa-boyyodD =~) SY AT TE Mg) 68 “(0)LL6 1900 uli nd ea cieca UY “eT “PD qdV- Leo] “OV ADTdI-HXI `(doTdpD)odD 91 MUM “ 王 强风 8ty8 Coda aS ZG Se (dotd-bo)wodd Fey BY SO IE * (He Mu) Se wh ZLII ZDOdaL 十 OO ae ae AOTEUAL `(dDTdbo)aod9 0 ae €6L IDdNL 283 238 RS a a a ed Aarts M, Lihara K, Wei W L, et al. 2003. A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death. Cell, 115: 863-877 Caterina M J, Schumacher M A, Tominaga M, et al. 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature, 389: 816-824 Caterina M J, Rosen T M, Tominaga M, et al. 1999. A capsaicin-receptor homologue with a high threshold for noxious heat. Nature, 398: 436-441 Caterina M J, Leffler A, Malmberg A B, et al. 2000. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science, 288: 306-313 Chuang H H, Prescott E D, Kong H Y, et al. 2001. Bradykinin and nerve growth factor release the capsaicin receptor from PtdIns (4, 5) P[sub2]-mediated inhibition. Nature, 411: 957-962 Colbert H A, Smith T L, Bargmann C I. 1997. OSM-9, a novel protein with structural similarity to channels, is required for olfaction, mechanosensation, and olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. J Neurosci, 17: 8259-8269 Corey D P. 2003. New TRP channels in hearing and mechanosensation. Neuron, 39: 585-588 Giiler A D, Lee H, Lida T, et al. 2002. Heat-evoked activation of the ion channel, TRPV4. J Neurosci, 22: 6408-6414 Hardie R C, Minke B. 1992. The trp gene is essential for a light-activated Ca** channel in Drosophila photoreceptors. Neuron, 8: 643-651 Jordt S E, Bautista D M, Chuang H H, et al. 2004. Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature, 427: 260-265 Jordt S E, Tominaga M, Julius D. 2000. Acid potentiation of the capsaisin receptor determined by a key extracellular site. Proc Natl Acad Sci USA, 97: 8134-8139 Kim J H, Chung Y D, Park D Y, et al. 2003. A TRPV ion channel required for hearing in Drosophila. Nature, 424: 81-84 Kraft R, Grimm C, Grosse K, et al. 2004. Hydrogen peroxide and ADP-ribose induce TRPM2-mediated calcium influx and cation currents in microglia. Am J Physiol Cell Physiol, 286: C129-137 Liedtke W, Choe Y, Marti-Renom M A, et al. 2000. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell, 103: 525-535 Liman E R, Corey D P, Dulac C. 1999. TRP2: a candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling. Proc Natl Acad Sci USA, 96: 5791-5796 McKemy D D, Neuhausser W M, Jullus D. 2002. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature, 416: 52-58 Montell C. 2001. Physiology, phylogeny, and functions of the TRP superfamily of cation channels. SKTE Review Montell C, Rubin G M. 1989. Molecular characterization of the Drosophila trp locus: a putative integral membrane protein required for phototransduction. Neuron, 2: 1313-1323 Nadler M J, Hermosura, Inabe K, et al. 2001. LTRPCF is a Mg-ATP regulated divalent cation channel required for cell viability. Nature, 411: 590-595 Nomura H, Turko A E, Pei Y, et al. 1998. 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Mucolopidosis type IV is caused by mutations in a gene encoding a novel transient receptor potential channel. Hum Mo. Genet, 9: 2471-2478 Tobin D M, Madsen D M, Kahn-Kirby A, et al. 2002. Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons. Neuron, 35: 307-318 Tracey W D, Wilson R I, Laurent G, et al. 2003. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell, 113: 261-273 Tominaga M, Caterina M J, Malmberg A B, et al. 1998. The cloned capsacin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron, 21: 531-543 Venkatachalam K, van Rossum D B, Patterson R L, et al. 2002. The cellular and molecular basis of store-operated calcium entry. Nat Cell Biol, 4: E263-E272 Viana F, de la Pena E, Belmonte C. 2002. Specificity of cold thermotransduction is determined by differential ionic channel expression. 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Cell, 85: 661-671 Zitt C, Zobel A, Obukhov A G, et al. 1996. Cloning and functional expression of a human Ca?*-permeable cation channel activated by calcium store depletion. Neuron, 16: 1189-1191 oh Dd 章 Wes EAA Stas Fee 21 VE igen oe ee clei tae. 285 DA VOT oT a hE eS ge Soe otc sieve eden tose 286 DA Ue Perey tay he A ge PS eee Bea, odo acne ateeasscichacdenc tas 290 Pa ee ST se ok cates ten eared canning DOO 242 二 有 呜 丰 作用 司 伟 是 芒 且 生生 下 291 2 291 DA .22 内 本 王 和合 且 区 细 的 标 昨 信人 汪 让 291 i 2 局 2 之 二 信号 畦 时 对 胞 可 作用 的 调 摊 二 0 cnntoctenecesesovss 294 人 外 至 细胞 内 的 物资 运输 , 而 且 积极 调控 多 种 信号 转 导 通路 ; 另 一 方面 , 胞 吞 作 用 又 受信 号 转 导 的 调节 。 因 此 , 两 者 之 间 的 交 影响 使 得 它们 相互 协调 和 精细 控制 成 为 可 能 。 24.1 Ae VE Fe SLi eee 胞 吞 作用 (endocytosis) 是 细胞 外 物质 特别 是 较 大 分 子 和 颗 粒 进 入 细胞 的 一 种 主要 方式 , 根据 被 内 吞 物质 的 不 同 , 又 可 分 为 胞 饮 作 用 (pinocytosis) 和 胞 噬 作 用 (phagocytosis )(Mellman 1996)。 胞 噬 作 用 主要 用 于 吹 取 细胞 外 较 大 颗 粒 如 细胞 碎片 、 细 戎 、 病 毒 等 , 只 有 一 些 特 殊 的 细胞 有 胞 噬 作 用 , 如 巨 噬 细 胞 和 嗜 中 性 细胞 。 而 胞 饮 作 用 是 细胞 摄取 水 溶性 物质 以 及 液体 的 方式 , 又 可 分 为 非特 异性 的 液 相 胞 饮 作 用 (fluid ‘© pinocytosis) 和 特异 PER Se A SP Sts EA (receptor acc at. endocytosis)(Conner and Schmid 2003) (图 24-1), 42.) HALA in A ead A Ba 内 , 通 过 跨 细胞 运输 到 另 一 端 盒 个 过 程 称 为 跨 细胞 转运 (transcytosis) 。 ps HE By ii Biomembranes 286 胞 饮 作 用 (pinocytosis) 大 型 胞 饮 作 用 CEA ” 微 圳 素 介 胞 噬 作 用 (>1um) TSA SWAG 液 相 胞 9 @ (~120nm) (~280nm) 饮 作 用 物质 通过 多 种 胞 吞 作 用 方式 进入 细胞 ( 仿 Conner and Schmid 2003 ) 受 体 介 导 的 内 大 是 研究 得 比较 清楚 的 一 种 胞 吞 作 用 , 胞 外 分 子 通过 结合 细胞 质 膜 上 的 特异 受 体 , 受 体 经 过 富 集 与 配 体 一 起 内 吞 进入 细胞 浆 内 。 受 体 介 导 的 内 吞 主 要 通过 附 AEF EA RAs (clathrin-coated pit) 和 小 泡 (vesicle) 进行 , 这 一 类 胞 吞 作 用 称 为 敌 形 蛋白 介 导 的 内 香 (clathrin-mediated endocytosis )(Lamaze and Schmid 1995, Takei and Haucke 2001)。 结 合 的 受 体 会 集中 到 细胞 内 面 有 和 洛 形 和 蛋白 的 质 膜 区 , 形 成 小 窝 , 此 OAL, 最 终 与 质 膜 脱 离 进 入 细胞 浆 , 由 此 形成 的 胞 吞 小 泡 外 包 有 和 客 形 蛋白 (clathrin) 和 2 型 连接 蛋白 (adaptor protein, AP2) , 其 大 小 为 100~ 150nm。 比 如 含有 栈 迄 酸 激酶 的 受 体 、 运 铁 和 蛋白 (transferrin) 受 体 、 LDL 受 体 和 G 蛋白 偶 联 受 体 等 都 是 通过 党 形 和 蛋白 的 介 导 的 内 吞 进入 细胞 。 另外 , 受 体 介 导 的 胞 吞 作 用 也 可 通过 非 党 形 和 蛋白 介 导 的 内 吞 (non-clathrin-mediated endocytosis) 进 行 。 脂 答 (lipid rafts) 是 细胞 质 膜 上 富有 和 葡 糖 鞘 脂 类 〈glucosphingolipid ) 和 胆固醇 的 特 化 小 区 。 如 果 胞 内 面 有 微 融 素 〈caveolin) , 这 种 特殊 的 脂 徐 称 为 质 膜 微 吉 (caveolae) (Parton et al. 1994, Pelkmans and Helenius 2002, Conner and Schmid 2003), #2 4L 毒素 B 亚 基 和 糖 基础 脂 酰 肌 醇 (glycosylphosphatidylinositol, GPI) 锁定 蛋白 从 细胞 质 膜 到 高 尔 基 复 合体 的 运输 ,或 SV40 病 毒 从 质 膜 到 内 质 网 都 是 通过 质 膜 微 吉 或 脂 徐 介 导 的 内 香 而 完成 (Nichols and Lippincott-Schwartz 2001)。 从 这 些 地 方 产生 的 内 吞 体 缺乏 经 典 的 早期 胞 内 体 和 循环 胞 内 体 的 标记 蛋白 , 如 EEA1、Rab5 和 Rabll 等 。 一 些 能 结合 胆固醇 的 药物 , 如 filipin 能 选择 性 地 王 扰 脂 生 的 结构 和 功能 , 并 能 抑制 脂 徐 介 导 的 胞 吞 作用 。 液 相 胞 饮 作 用 属于 持续 性 进行 的 、 非 党 形 蛋 白 介 导 的 内 吞 , 由 大 小 为 100nm 左 右 的 Feta hee ies Ss. PARE Ute (horseradish peroxidase) 和 和 葡 聚 糖 (dextran) 就 是 通过 液 相 胞 饮 作 用 进入 细胞 的 (Lamaze and Schmid 1995), 大 型 胞 饮 作 用 (macropinocytosis) 由 无 党 形 蛋白 的 液 泡 介 导 , 由 于 液 泡 较 大 (0.5 一 2hm) , 所 以 又 称 为 大 型 胞 饮 钨 (macropinosome)。 在 生长 因子 或 佛 波 酯 (phorbol ester) 的 作用 下 , 大 型 胞 饮 泡 由 肌 动 蛋白 参与 的 质 膜 外 伸 而 形成 , 大 型 胞 饮 作 用 经 常 伴 随 着 质 Hei“ (membrane ruffling) 的 发 生 。Rho 家 族 的 小 G 和 蛋白 调节 大 型 胞 饮 作 用 , 但 它 的 形 成 机 制 和 功能 有 待 进一步 的 研究 (Conner and Schmid 2003)。 24.1.1 5 72ST SEIS 75 5) 7mm maa 当 受 体 = 生 内 吞 时 , 它 们 聚集 在 细胞 膜 小 区 , 叫 有 全 小 窝 (coated pit), AB NRE 包 内 面 有 AT ”和 笼 形 蛋 白 , 因 此 又 称 为 党 形 蛋 白 包 被 的 , 宽 。 笼 形 蛋 白 由 3 个 重 链 蛋 白 287 % 24% Nee (EVA Sia os PF (180kDa) 和 3 个 轻 链 蛋 白 (35kDa) 组 成 一 个 三 脚 复合 物 (triskelion) , 数 个 三 脚 复合 物 构成 由 五 角形 和 六 角形 组 成 的 篮球 形 网 状 结构 , 这 种 网 状 结构 形成 有 被 小 宽 和 有 被 胞 知 小 泡 的 包 被 〈coat)(Mellman 1996), AP2 复合 体 由 4 个 亚 基 组 成 ,包括 约 100kDa 的 x 亚 EAN B2 WHE, 约 50kDa 的 Hu2 亚 基 以 及 约 20kDa 的 a2 亚 基 。AP2 不 仅 介 导 澳 形 蛋白 附着 到 膜 上 , 而 且 还 协调 包 被 的 组 装 与 货物 蛋白 (cargo protein) 和 脂 类 的 选择 。AP2 在 富 集运 货物 蛋白 到 笼 形 蛋 白 包 被 的 小 窝 上 起 重要 作用 。 除 知 形 蛋白 和 AP2 外 , 与 有 被 小 宽 的 形成 , 如 Eps15、 底 物 和 蛋白 (epsin), 蛋白 (amphiphysin) 和 调控 胞 吞 小 泡 大 小 的 AP180/CALM 蛋白 等 ( 表 24-1, Takei and Haucke 2001), (McPherson et al. 2001, 许多 其 他 蛋白 参 双 载 图 24-2) 突 触 结合 蛋白 (synaptotagmin) , 名 称 结构 解释 笼 形 重 白 由 3 个 重 链 蛋白 和 3 个 轻 链 蛋白 组 成 个 三 脚 复合 物 , 数 个 三 脚 复 = 合 物 构 成 的 篮球 形 网 状 结构 形成 有 被 小 寅 和 有 被 胞 吞 小 泡 的 外 包 被 AP-2 AP2 Ho, B2, w2, o2 4A RA SEPUSR A, iit 2 亚 基 与 膜 蛋白 和 膜 脂 相 互 作用 , 通 过 wo 亚 基 与 笼 形 蛋白 结合 把 笼 形 蛋 白 构成 的 包 被 带 到 膜 上 SR Sane MEA, Sa > PIP, AY ENTH RAMEE OBS, REAL sae a—, 被 的 一 部 分 ,调节 内 吞 小 泡 的 大 小 。AP180 主要 存在 于 神经 细胞 , 而 CALM 分 布 于 其 他 种 细胞 膜 因子 突 触 结合 蛋白 se Rite & EAS APE, 促进 有 被 小 富 的 聚集 ,多 种 异 构 体 存在 于 不 同 的 组 织 Phosphatidylinositol = (4,5)—bisphosphate i} (PIP.) H PIP: 与 AP2、AP180、 突 触 结合 蛋白 以 及 底 物 蛋白 相互 作用 , 启动 或 稳定 AP2 FETE ATE A 人 货物 蛋白 , 内 含 酷 氨 酸 的 内 吞 信号 与 AP2 AY 2 亚 基 结 合 , 促 进 AP2 募集 到 突 = hts se A Ema Be) RHEE. Es AP2 的 亲 和 性 受 磷酸 肌 醇 的 调节 辅助 蛋白 成 分 Wi Lz: 发 动 蛋白 (dynamin) 为 100kDa 大 小 的 GTP 7k ARAB, ZED BRIA Be ly 8 A PH FADE RRR A HIRAI, idhict 7k GTP 催化 内 吞 小 泡 从 质 膜 脱 离 REA LPA-ATase 4 & A (endophilin) 4j40kDaXK haya BAB 人 _ 8 acid acyl transferase), 可 能 与 有 被 小 泡 的 成 熟 和 内 大 小 泡 的 脱离 有 关 , 结 合 发 动 蛋白 和 突 触 小 泡 磷酸 酶 Clathrin/ 双 载 蛋 白 AP-2binding SH3 双 载 蛋白 结合 笼 形 蛋 自 、AP2 和 发 动 蛋白 , 可 能 与 内 吞 小 泡 的 脱离 有 关 SH3 SH3 PH 交叉 蛋白 (intersectin) 含有 多 个 功能 域 , 并 有 大 小 不 等 的 多 种 异 构 体 (145 ~ ZEA WO} 200kDa).。 与 多 种 参与 胞 吞 作 用 的 蛋白 、 肌 动 蛋白 多 聚 化 的 蛋白 和 信和 号 介 导 分 SH3 SH3 SH3 子 相 互 作用 NPF 底 物 蛋白 (ENDPw 击 底 物 蛋白 为 两 个 相关 蛋白 (90 一 94kDa) 4! 26149, AP2, Eps15 #uPIP, 突 触 小 | 突 触 小 泡 磷酸 酶 (synaptojanin) ° th 145 ~ 170kDa ft) & Fp ai od See. WHS PIP. ARI, Fax 白 形 成 的 包 被 Clathrin/ aes ee 辅助 蛋白 (auxilin) 含有 催化 如 蛋白 跨 膜 运输 、 打 断 蛋白 一 蛋白 相 互 作用 的 Dna J 功 能 域 , 协 助 1 ; 包 被 的 功能 y2 — P] @B—Stoned BiStonin2 结合 突 触 结 台 。 、AP2 和 含有 EH 域 的 蛋白, 可 能 与 AP2 Stonin 从 膜 上 释放 有 关 HE % WR Biomembranes 288 在 受 体 富 集 后 , 有 被 小 窝 发 生 内 陷 , 最 后 与 细胞 质 膜 分 离 形成 内 吞 小 泡 (endocytic vesicle) 进入 细胞 内 。 有 被 小 富 从 细胞 质 膜 分 离 过 程 需要 发 动 蛋 白 (dynamin) 的 参与 。 。 白 是 一 种 100kDa 的 GTP 结合 蛋白 , 其 水 解 酶 活性 对 内 吞 小 泡 与 细胞 质 膜 分 离 是 需 的 。 在 内 陷 的 有 被 小 窝 的 颈 口 处 ,发 动 蛋 白 能 组 成 环 圈 , 在 水 解 GTP 的 驱动 下 收缩 ti 从 而 导致 内 吞 小 泡 与 质 膜 分 开 。 内 吞 小 泡 进入 细胞 浆 后 , 笼 形 蛋白 以 及 AP2 复合 PUA Dif EAs, week Fen it Lek (uncoating) 。 突 触 小 泡 磷酸 酶 (synaptojanin) )、 辅助 蛋白 (auxilin) 和 Hsc70 等 蛋白 参与 脱 包 被 过 程 ,Hsc70 水 解 ATP 催化 笼 形 蛋 和 白 网 络 结构 的 解体 , 辅 助 蛋 白 刺 激 Hsc70 的 ATP 水解 酶 活性 (图 24-2 )。 4. jee PW ciathrin Were. 脱 包 锌 Hsc70 Auxlin i mp2 I Cargo Synaptojanin Stoned B 0 Ap180 @ Dyn JSnerroem nap Actin < CF: ve 3. 融合 Ay 4 ew » Dynamin ] 4 人 < NS \ Endophilin 1. 包 被 和 装配 2. ABR BRA AP2/AP180/Clathrin/Synaptotagmin/ Dynamin/Endophilin/Amphiphysin/Actin PP2/Cargo 有 被 小 宽 和 内 吞 小 泡 的 形成 ( 仿 Takei and Haucke 2001) 有 多 种 方法 来 干扰 笼 形 蛋白 介 导 的 受 体内 知 , 例如 , BIBRA Ba) RATE eS ae 胞 内 部 离子 深度 有 关 , 降 低 细 胞 内 部 的 离子 淮 度 和 低 疾 处 理会 抑制 有 被 小 宽 的 形成 , 而 阻碍 受 体 的 胞 吞 作 用 。 表 达 无 GTP 水解 酶 活性 的 发 动 蛋 白 变异 体 (如 K44A) 会 抑制 内 吞 小 泡 的 脱落 , 因 此 干扰 受 体内 吞 (Sever 2002)。 另 外 , 表达 其 他 参与 笼 形 蛋白 介质 的 胞 吞 作 用 的 蛋白 变异 体 也 会 干扰 受 体内 吞 , 如 Esp15 结 构 域 、 笼 形 蛋白 hub 域 、AP2 连 接 蛋 白 域 或 SH3 域 。 胞 内 体 (endosome) 是 对 一 系列 与 胞 吞 作用 和 后 续 膜 运输 有 关 、 形 态 和 组 成 各 异 的 膜 系统 的 通称 (图 24-3)。 最 早 接受 内 吞 物 的 是 早期 胞 内 体 (early endosome)。 去 外 包 的 胞 吞 小 泡 与 早期 胞 内 体 相 溶 , 将 内 吞 的 受 体 带 入 。 | 体 pH 值 较 低 ,导致 配 体 与 受 体 分 离 , 游 玄 的 配 体 将 通过 晚期 胞 内 体 〈late endosome) 被 去 到 溶 酶 体 降解 。 如 LDL 与 LDL ZABLE Asay FB. 进入 晚期 胞 内 体 到 溶 酶 体 降解 , 仿 放 胆固醇 等 小 分 子供 细胞 利用 。 受 体 在 分 元 YA (sorting endosome) 被 分 选 后 , 运 到 次 期 胞 内 体 进入 溶 酶 体 降 解 , 或 289 g 24 章 KOE TEAS fe SoS 通过 再 循环 胞 内 体 (recycling endosome) 运 回 到 细胞 表面 重新 被 利用 。 各 种 胞 内 体 的 形态 和 在 细胞 内 的 分 布 存 在 着 差异 , 早 期 胞 内 体 呈 管状 并 靠 细 胞 边缘 分 布 , 而 晚期 胞 内 体 更 呈 球 形 并 更 靠近 细胞 核 。 一 部 分 晚期 胞 内 体形 态 上 呈现 多 圳 泡 状 , 由 数 个 腔 内 小 泡 (lumenal vesicle) 组 成 , 外 包 一 层 外 膜 , 称 为 多 填 泡 体 multivesicular body,MVB)。 腔 内 小 泡 被 认为 携带 运输 物 到 溶 酶 体 降解 , 而 在 外 膜 的 膜 蛋白 则 再 循环 到 细胞 质 膜 上 (Katzmann et al. 2002)。 必 须 指 出 , 整 个 胞 吞 作 用 是 一 动态 过 程 , 这 些 胞 内 体 在 形态 上 很 难 绝对 区 分 。 但 是 各 种 胞 内 体 可 根据 它们 特有 的 标记 物 来 区 分 , 如 早期 胞 内 体 的 标记 物 为 EEA1、Rab4 和 Rabs, 循 环 胞 内 体 有 Rabl11l1, 晚 期 胞 内 体 有 Rab7 和 Rab9。 另 外 , 在 膜 脂 组 成 上 也 有 不 同 , 如 了 PI3P 主要 发 现在 早期 胞 内 体 的 胞 浆 叶 上 , 溶 血 磷 脂 酸 (lysobisphosphatidic acid) 主要 存在 于 多 赛 泡 体 的 腔 内 膜 上 。 内 吞 过程 中 的 膜 运输 受 一 类 小 分 子 GTP 结合 蛋白 Rab 的 调控 (Zerial and McBride 2001), 40 RabS 调节 内 吞 吉 泡 的 形成 、 脱 包 被 以 及 内 吞 小 泡 与 早期 胞 内 体 的 融合 过 程 。 Rabl1 在 再 循环 胞 内 体内 控制 受 体 运 回 到 细胞 表面 , 而 Rab7 在 晚期 胞 吞 体 上 调节 到 溶 酶 体 的 运输 (图 24-3)。 晚期 胞 内 体 /多 圳 泡 体 内 知 物 质 经 过 早期 胞 内 体 、 晚 期 胞 内 体 运 到 溶 酶 体 降解 或 经 过 再 循环 胞 内 体 运 回 质 膜 再 利用 细胞 骨架 在 胞 吞 作用 的 过 程 中 起 重要 作用 , Bilan, 内 吞 小 泡 F < 距离 运输 依靠 微 管 的 存在 , 而 肌 动 蛋白 (actin) 对 于 酵母 细胞 的 胞 吞 作用 是 芭 需 和 正 哺乳 细胞 中 , 肌 动 蛋白 在 笼 形 蛋 白 介 导 的 内 吞 中 的 作用 并 不 十 分 清楚 , 使 上 “ 记 动 蛋白 多 聚 化 的 药物 对 胞 吞 作 用 的 影响 取决 于 细胞 的 种 类 和 状态 。 但 是 ,大量 : 肖 指 出 , 肌 动 蛋 和 白 参 与 笼 PEAT SHIEH: 在 有 被 小 宽 处 有 肌 动 蛋 自 多 聚 见 象 , 有 多 种 调控 肌 动 蛋白 动态 变化 广 所 白 把 肌 动 蛋白 与 胞 吞 作 用 相连 (Stamnes 20(0 = Engqvist-Goldstein and Drubin 2003), { 4, Hip] 以 及 相关 的 Hip1R 既 能 结合 纤维 状 | “蛋白 (F-actin), , 同 时 又 能 结 Biomembranes 290 合 AP2 和 知 形 蛋白 ;, VERE A (myosin) VI 是 一 种 朝 肌 动 蛋白 纤维 负极 移动 的 马达 蛋白 , CmEREBCERA BROAN AOE, 可 能 通过 把 新 形成 的 内 吞 小 泡 从 质 膜 拖 离 而 参与 内 吞 小 泡 的 形成 ;交叉 蛋白 (intersectin) 既 能 结合 Eps15, 又 能 与 调控 肌 动 蛋白 核 化 (nucleation) 的 Cdc42 和 N-WASP 结 合 。 因 此 , 肌 动 蛋白 可 能 为 有 被 小 宽 在 质 膜 上 的 形 成 提供 支撑 点 , 也 可 能 在 内 吞 小 泡 的 脱 膜 过程 中 起 作用 。 WL ae A BT RE Ea A E/E 介 导 的 胞 吞 起 类 似 作 用 。 另 外 , 肌 动 蛋白 在 胞 哗 作 用 和 大 型 胞 饮 作 用 有 重要 功能 。 2412 Wetes eae eee 像 其 他 膜 介 导 的 和 蛋白 运输 一 样 , A EEE EIA BA a_i HA 414 5 (Bonifacino and Traub 2003)。 目 前 发 现 的 内 吞 信 号 可 分 为 两 大 类 , 一 类 是 含 ALE RRK (dileucine), 发 现 于 Fc 受 体 、CD3 等 膜 蛋白 的 胞 内 段 。 另 一 类 为 带 酷 氨 酸 的 序列 , 最 常见 的 为 NPXY 或 者 为 YXX (N AKAM, PANT, Y AMR, XH 任何 氨基 酸 , $ 为 带 大 踊 水 团 的 氨基 酸 ), 这 类 内 吞 信号 存在 于 EGF 受 体 、 运 铁 蛋 白 受 体 、 LDL 受 体 、IGN38、B 证 粉 样 前 蛋白 (B-amyloid precursor protein) 等 膜 蛋白 的 胞 内 段 (Mellman 1996), YXX0 可 能 直接 与 AP2 的 几 亚 基 相 结合 , 如 EGF 受 体 和 神经 生长 因子 (NGF) 受 体 等 受 体 酷 禹 酸 沿 酶 在 结合 配 体 后 ,通过 受 体 胞 内 段 的 含 酷 迄 酸 的 内 厨 信 号 与 AP2 AY We 基 直 接 结合 而 被 募集 到 有 被 小 寅 。 识 别 NPXY 和 双 亮 氨 酸 内 吞 信号 的 机 制 并 不 十 分 清楚 , NPXY 可 能 直接 结合 到 知 形 蛋白 的 重 链 上 , 而 双 亮 各 酸 可 能 通过 其 他 蛋白 与 由 亚 基 结 合 。 24.13 1235 (C 1 0 6 (mmm 记 素 化 (ubiquitination) 是 和 蛋白 共 价 修饰 的 一 种 。 通 过 一 系列 的 酶 催化 作用 , 在 谤 素 (ubiquitin) 的 C 端 与 被 修饰 的 靶 蛋 白 上 的 赖 氨 酸 残 基 之 间 形 成 一 种 等 肽 键 (isopeptide bond), 泛 素 是 一 种 由 76 个 氨基 酸 组 成 的 多 肽 , 存在 于 从 酵母 到 人 的 所 有 真 核 生 物 细胞 中 , 并 且 非常 保守 。 催 化 泛 素 化 的 酶 包括 El OL PR AIZ AAA, ubiquitin-activating enzyme), E2 (又 称 为 泛 素 转 接 酶 ,ubiquitin-conjugating enzyme) 和 E3 (又 称 为 泛 素 连接 酶 ,ubiquitin- protein ligase)。 谤 素 化 可 以 是 只 连接 一 个 泛 素 蛋白 的 单 泛 素 化 (monoubiquitination) , th, 可 以 是 连接 多 个 诈 素 分 子 组 成 的 链 的 多 证 素 化 (polyubiquitination) 。 多 泛 素 化 是 通过 新 加 谤 素 分 子 的 C 端 与 前 一 记 素 的 第 48 位 赖 筑 酸 相 连 而 进行 。 目 前 普遍 认为 ,多 泛 素 化 是 引起 蛋白 降解 的 信号 , 而 单 泛 素 化 的 作用 是 调节 蛋白 的 定位 和 活性 。 泛 素 化 的 蛋白 可 通 过 去 泛 素 化 (deubiquitination) 而 脱 去 泛 素 , 因 此 , 泛 素 化 修饰 是 一 种 可 逆 过 程 。 泛 素 化 在 调节 膜 蛋 白 的 运输 和 降解 中 起 重要 作用 , 许 多 信号 受 体 结合 配 体 后 在 细胞 质 膜 上 发 生 单 谤 素 化 , 并 且 单 泛 素 化 对 于 这 些 受 体 的 内 吞 是 必需 的 (Bonifacino and Weissman 1998, Hicke 2001)。Cbl 是 一 种 E3 泛 素 连接 酶 , 在 配 体 的 刺激 下 ,Cbl 在 细胞 表 膜 泛 素 化 包括 EGF 受 体 在 内 的 多 种 受 体 栈 迄 酸 激酶 , 从 而 引起 受 体 酷 氨 酸 激酶 的 内 吞 。 因此 , 泛 素 化 为 这 些 膜 蛋白 的 胞 吞 提 供 了 一 种 内 知 信号 . 泛 素 化 还 可 改变 参与 内 吞 过 程 的 蛋白 的 活性 , 例如,EGF 诱导 Eps15 的 单 谤 素 化 ,从 而 调控 笼 形 蛋白 介 导 的 胞 吞 作 用 。 另 外 , 多 汉 圭 化 还 影响 内 吞 的 膜 蛋 白 在 胞 内 体 的 分 选 (sortino), 引导 丢 和 蛋白 到 溶 酶 体 的 降解 。 ARN . 泛 素 化 膜 蛋白 的 内 吞 机 制 与 前 面 提 到 的 具有 双 亮 氛 酸 和 含 酷 氨 酸 的 内 知 信 号 膜 蛋白 的 机 ANA, 记 素 化 的 膜 蛋白 与 含有 谤 素 结合 域 ( TIM、UBA、UEV 等 ) 的 蛋白 相 结 291 % 248 KEE EA Sa SHE @. BEAGHS AIZAa 6 RAYE AER A. Epsl5 fl Hrs , FCP Ry ae AE ct AAA KS FF & A AA4 A (Bonifacino and Traub 2003, Hicke and Dunn 2003), 242 NRE TE ISAS 242 LESS “9 ASAP SHED BLE OE SPE PEG Ae SLL A CP A eS 通路 、 调 控 基因 表达 , 从 而 影响 细胞 的 行为 和 命运 。 在 细胞 信号 传递 系统 被 激活 后 ,在 一 定时 间 内 必须 通过 一 种 或 多 种 机 制 把 信号 灭 活 , 从 而 保证 信号 传递 在 时 间 和 强度 上 的 精确 性 。 最 重要 的 机 制 之 一 是 通过 配 体 一 受 体 复合 物 的 内 吞 把 它们 带 到 溶 酶 体 降解 , 因 此 , 受 体内 吞 一 直 被 认为 是 信号 灭 活 的 机 制 之 一 (Ceresa and Schmid 2000)。 干 扰 受 体 的 内 春 、 抑 制 它们 在 深 酶 体 的 降解 可 能 会 增强 信号 , 导 致 细胞 生长 和 分 化 的 异常 。 EGF 受 体 的 胞 内 段 具 有 酷 氨 酸 激酶 活性 , 在 结合 EGF 后 通过 磷酸 化 激活 MAPK 激 了 酶 通路 ,影响 细胞 的 生长 与 增殖 。EGF-EGF 受 体 复合 物 通过 胞 知 作 用 进入 细胞 内 , 在 多 圳 泡 体 分 选 后 在 溶 酶 体 降解 或 回 到 细胞 质 膜 再 利用 。 在 到 达 多 圳 泡 体 之 前 ,EGF 受 体 的 胞 内 段 暴露 在 细胞 浆 内 能 与 下 游 的 信号 介 导 分 子 相 结合 , 保 证 信号 传递 的 继续 进行 。 当 到 达 多 圳 泡 体 的 腔 内 小 泡 后 ,EGF 受 体 与 细胞 浆 分 开 , 限 制 它 与 下 游 的 信号 介 导 分 子 的 接触 ,并 且 腔 内 小 泡 将 进一步 与 溶 酶 体 融合 , 导致 小 泡 内 的 EGF 受 体 的 降解 ,从 而 彻底 终止 受 体 的 活性 。 激酶 活性 对 于 EGF 受 体 分 选 到 腔 内 小 泡 是 必需 的 ,激酶 失 活 变异 体 只 到 达 多 圳 泡 体 的 外 膜 并 再 循环 到 细胞 质 膜 上 。 内 知 介 导 的 EGF 受 体 降解 对 EGF 信 号 的 灭 活 起 重要 作用 , 干 扰 EGF 受 体 在 多 囊 泡 体 分 选 到 溶 酶 体 的 降解 引起 小 鼠 肿瘤 的 发 生 (Di Fiore and Gill 1999, Di Fiore and De Camilli 2001), 一 系列 实验 表明 泛 素 化 在 膜 蛋 白 分 选 到 溶 酶 体 中 进行 降解 起 重要 作用 。 例如, 当 把 G 蛋 白 偶 联 受 体 CXCR4 胞 内 的 泛 素 化 点 变异 后 , 此 受 体 从 细胞 表 膜 的 内 大 不 受 影响 , 但 是 它 的 降解 被 完全 抑制 。Cbl 通过 它 的 SH2 结构 区 与 斐 酸化 的 EGE 受 体 相 结合 并 引起 受 体 的 泛 素 化 。 大 量 表达 Cbl 会 增加 EGF 受 体 的 降解 , 但 对 EGF 受 体 的 内 吞 无 影响 。 而 且 , 不 能 泛 素 化 的 EGF 受 体会 再 循环 到 细胞 质 膜 上 。 虽 然 有 些 受 体 的 降解 不 依赖 于 受 体 本 身 的 泛 素 化 ,但 是 需要 一 些 内 吞 相关 蛋白 的 泛 素 化 。 例 如 ,B- 肾上腺 素 受 体 的 降解 需要 它 的 结合 蛋白 有 - 体 止 蛋白 〈B-arrestin) 的 谤 素 化 (Luttrell and Lefkowitz 2002)。 这 些 证 据 再 次 指出 , 泛 素 化 对 一 些 膜 受 体 在 内 吞 后 的 分 选 起 关键 作用 。 24.22 NERS T SHS IE em eer 越 来 越 多 的 实验 证 据 指 出 , 受 体内 吞 不 仅仅 是 信号 灭 活 的 机 制 之 一 ,而 且 与 信号 传 递 有 着 紧密 的 关系 。 内 吞 在 信号 转 导 中 的 作用 有 : 保证 信号 持续 性 的 激活 , 通 过 空间 上 的 区 域 化 增加 信号 传递 特异 性 , 增 加 信号 分 子 对 下 游 底 物 的 | 在 结合 配 体 后 , 通过 一 系列 的 蛋白 一 蛋白 相互 作用 饼 A ARREARS AB OF 游 信号 通路 , 影 响 细胞 的 生理 功能 。 首 先 , 受 体 酷 氨 酸 ; =SOS, 后 者 催化 Ras 由 无 活性 的 GDP 结 合 型 变 为 有 活性 的 GTP 结 合 型 。 然 后 带 G xas 结 合并 激活 丝氨酸 / 苏 氨 酸 激酶 Raf,Raf 磷 酸化 MAPKK (MEK1), 后 者 进一步 :化 而 激活 MAPK (ERK1/2), 激活 的 FE 发 1/2 能 在 细胞 桨 内 磷酸 化 下 游 底 物 , 也 可 到 红 核 内 磷酸 化 转录 因子 , 影响 基 292 因 表 达 。 最初 认为 这 一 连 串 的 磷酸 化 激活 过 程 是 发 生 在 质 膜 上 , 但 是 近 几 年 的 研究 发 现 , 受 体 酷 迄 酸 激酶 引起 的 信号 传递 完全 可 发 生 在 胞 内 体 上 , 激活 的 EGF 受 体 以 及 它 的 下 游 aoa 4 SOS, Ras 和 Raf 等 都 存在 于 胞 内 体 。 因 此 , 受 体 在 细胞 质 膜 上 结合 配 体 后 启动 下 游 信号 , 当 它们 内 吞 到 胞 内 体 时 , 其 活性 继续 保持 。 与 此 相 一 致 的 是 , 当 表达 无 水 解 活性 的 发 动 蛋 白 (K44A) 变异 体 或 B- 休 止 蛋白 变异 体 来 抑制 胞 吞 作用 时 , 通过 受 体 酷 氨 酸 激酶 或 G 蛋白 偶 联 受 体 激活 的 ERK 活性 降低 , 同样, 胰岛 素 刺 激 的 PEK 活性 也 下 降 。 由 此 看 见 , 胞 吞 作 用 对 于 受 体 持续 性 的 活性 显得 非常 重要 。 内 吞 的 另 一 作用 可 能 是 把 上 游 的 信号 分 子 带 到 胞 内 有 利于 与 下 认 底 物 的 接触 ,例如 , 在 有 些 情况 下 , 阻碍 胞 吞 作 用 可 完全 抑制 ERK 的 激活 。 事 实 上 , 胞 吞 作 用 对 于 许多 受 体 介 导 的 ERK1/2 的 激活 是 必须 的 。 但 是 ,也 需要 指出 , 不 少 受 体 引 起 的 ERK1/2 的 激活 不 需要 受 体 的 内 吞 , 例 如 , 当 表 达 发 动 和 蛋白 变异 体 抑制 受 体 内 吞 时 , oz- 吧 上 腺 素 能 受 体 (oz- adrenergic receptor) 仍然 可 以 激活 ERK1/2。 另 外 ,, 胞 吞 作 用 对 信号 分 子 的 远 距 离 作 用 也 是 非常 重要 。 例 如 , 在 神经 细胞 轴 突 终端 发 生 的 NGF 信号 可 调节 远 处 胞 体内 转录 因子 CREB 的 活性 , 这 个 过 程 依赖 于 胞 吞 作 用 和 微 管 介 导 的 内 天 小 泡 的 运输 (Gonzalez-Gaitan 2003, Ye et al. 2003)( 图 24-4) 。 NGF 远 距 离 作 用 依赖 于 胞 吞 作 用 ( 仿 Gonzalez-Gaitan 2003 ) 经 典 的 G 和 蛋白 偶 联 受 体 的 信号 通路 是 通过 异 三 聚 体 G 蛋白 调节 腺 苷 酸 环 化 酶 (adenylate cyclase) 、 磷 酸 二 脂 酶 (phosphodiesterase) Fi AS Ae C “ENTE PEM BCU 15 使 分 子 cAMP、cGMP sk IP;, DAG 的 水 平 , 这 条 通路 的 激活 是 在 质 膜 上 发 生 的 。 同 时 , G 蛋白 偶 联 受 体 还 能 通过 及 -休止 蛋白 和 Src 激活 ERK1/2, 而 ERK 的 激活 需要 受 体 胞 内 作用 的 发 生 。 发 动 蛋 白 (K44A) WAAR SS SEALS LMS (isoproterenol) 和 溶血 磷 脂 酸 (lysophosphatidic acid) 引起 的 ERK1/2 激 活 , 但 对 通过 G 和 蛋白 激活 的 腺 苷 酸 环 化 酶 和 磷脂 酶 C 无 影响 。 因 此 , 胞 知 作 用 可 调节 信号 的 特异 转 导 。 胞 吞 作 用 对 信号 传递 特异 性 的 调节 还 表现 在 其 他 方面 。 通 过 受 体 栈 氨 酸 激酶 激活 的 ERK 即 可 在 胞 浆 内 起 作用 , 也 可 进入 核 内 起 作用 , 那么 怎样 才能 把 这 两 种 信号 在 空间 上 区 域 化 呢 ?” 胞 大 作用 使 得 受 体 酷 氨 酸 激酶 信号 复合 体 名 在 内 吞 小 泡 或 胞 内 体 上 , 并 把 ER 开 募 集 三 文 些 内 膜 系 统 上 , 从 而 阻碍 ERK 进入 核 , 达到 信号 区 域 化 的 目的 (Gonzalez- 293 % 248 EEE Sle SHEE Gaitan 2003) (图 24-5A )。 另 一 例子 是 NGF 对 PC12 细胞 的 作用 ,NGF 通过 TrkA 受 体 瞬 时 激活 ERK 促进 细胞 的 生存 , 此 过 程 是 通过 质 膜 上 的 TrkA 激 活 Ras,, 而 不 需要 受 体 内 香 的 发 生 ; NGF 也 可 通过 TrkA 持续 性 地 激活 ERK 促进 细胞 分 化 , 这 一 过 程 是 通过 另 一 种 小 G 蛋白 Rapl 的 作用 , 并 且 需 要 受 体 的 胞 吞 作用 (Gonzalez-Gaitan 2003) (图 24-5B )。 因此 , 胞 吞 作 用 可 使 信号 特异 化 , 产 生 不 同 的 生理 效应 。 NGF@ 24.2.3 INVESTS [511i mmm 在 发 育 中 起 重要 作用 的 Notch 信号 决定 细胞 的 正确 分 化 。Notch 以 及 它 的 配 体 Delta 都 是 一 种 单 次 跨 膜 蛋白 , 当 信号 接受 细胞 上 的 Notch 与 相 邻 信号 产生 细胞 上 的 Delta 结 合 时 ,Notch 经 过 两 步 蛋白 酶 切 加 工 过 程 而 释放 胞 内 段 。 游 离 的 Notch 胞 内 段 进入 细胞 核 调控 寺 基 因 的 表达 。 实验 证 明 , 胞 知 作 用 对 于 Notch 信 号 的 转 导 是 必需 的 。 在 果 蝇 里 , 发 动 蛋 自 的 同 源 体 shibire 功 能 形 失 变异 引起 的 表 型 与 Notch 功 能 丧失 变异 体 的 表 型 非常 相似 , 因 此 , 人 们 认为 shibire 通 过 调节 胞 知 作 用 而 影响 Notch 的 信号 传递 。 进 一 步 的 实 验 指出 , 胞 吞 作用 可 在 两 方面 影响 Notch 的 信号 (图 24-6)。 一 方面 , 在 信号 产生 细胞 上 Delta 结 合 相 邻 信号 接受 细胞 上 的 Notch 胞 外 段 后 , 引起 Notch 的 蛋白 酶 切 加 工 过 程 的 第 一 步 。 Delta-Notch 胞 外 段 复合 体 在 产生 信号 的 细胞 内 发 生 内 吞 后 , 刺激 信号 接受 细胞 上 的 Notch 的 进一步 水 解 加 工 , 从 而 释放 有 活性 的 胞 内 段 。 另 一 方面 , Delta 分子 能 与 同一 细胞 里 的 Notch 相 结合 而 抑制 Notch 与 相 邻 细胞 上 的 Delta 异 侧 千 合 , 因此 Delta 的 内 香 和 降解 有 利于 Notch 与 相 邻 细胞 上 的 Delta 结 合 而 激活 Notcp 信 kin and Von Zastrow 2002), Hedgehog 在 发 育 过 程 中 的 格局 化 (patterning) 起 重 . 如 Sonic hedgehog (Shh) 诱导 神经 管 腹部 细胞 的 分 化 。 有 两 种 膜 蛋 白 参 与 Shh 的 1 : 导 : Patched (Ptc) 和 Smooth- ened (Smo) Pte 为 Shh 的 受 体 , 跨 膜 12 次 ,而 Smo 与 :和 白 偶 联 受 体 有 同 源 性 。 当 无 Shh 时 , 与 Smo 紧密 结合 并 抑制 Smo 的 活性 。 在 St jpPtc 结 合 后 ,Shh-Ptc-Smo 复 本 RN + 物 i Biomembranes 294 合体 一 起 通过 胞 吞 作 用 到 达 分 选 胞 内 体 , 在 那里 Shh-Ptc 45 Smo 分 开 , 并 进一步 运 到 溶 酶 体 中 降解 , 而 释放 的 Smo 通过 循环 胞 内 体 回 到 细胞 质 膜 上 并 启动 信号 传递 (图 24-7) (Gonzalez-Gaitan 2003), 信号 产生 细胞 Ptc-Hh 在 溶 酶 人 EZR Sonic hedgehog 信号 的 激活 (7 Gonzalez-Gaitan 2003 ) 24.2.4 fis Se RTL EEE FEE mmm 胞 吞 作 用 在 时 空 上 调控 信号 转 导 的 强 弱 和 特异 性 ,而 胞 吞 作用 本 身 也 受信 和 号 转 导 的 影响 (Sorkin and von Zastrow 2002)。 前 面 提 到 Rabs 在 所 吞 作用 中 起 重要 作用 , 它 促进 有 被 小 汽 的 形成 、 脱 胞 被 和 胞 内 体 的 融合 等 过 程 。 作 为 :种 GTP 结 合 蛋白 , 它 的 活性 受 GDP-GTP RAE: 当 结 合 GTP 时 有 活性 ;而 当 GTP 水解 成 GDP 时 ,, 失 去 活性 。 这 *hGDP-GT 笑 环 受 促进 GDP 与 GTP 交换 的 GEF RAL “加速 GTP 水 解 的 GAP 蛋白 的 295 % 24% JOE EH Sl SHS 调节 。EGF 受 体 激活 后 刺激 Ras 的 活性 , ii Ras 下游 的 效应 蛋白 之 一 是 Rab5 的 GEF 和 蛋白 RINI, RIN 促进 Rabs 由 GDP 到 GTP 的 交换 而 激活 Rab5。 另 外 ,激活 的 EGF 受 体 还 抑 制 Rabs 的 GAP 有 蛋白 RNrtre 的 活性 , 因 此 , 激 活 的 EGF 受 体 通过 刺激 Rabs 的 活性 来 加 RADIA. 另外 , VHS AS ENS APE T AGES. flan, EGF 刺激 党 形 蛋 白 在 Tyr 477 的 磷酸 化 而 增加 笼 形 蛋 白 在 质 膜 上 的 募集 。EGF 还 引起 内 吞 调控 蛋白 Eps15 在 Tyr 850 的 磷酸 化 , 表达 不 能 磷酸 化 的 变异 体会 抑制 EGF 受 体 的 内 厨 , 因此 Eps15 的 磷酸 化 对 EGFE 受 体 内 吞 是 必需 的 (McPherson et al. 2001)。 在 PC12 细胞 里 ,NGF 通过 激活 它 的 受 体 TrkA ri RA BR) BS TE Be Fis BR EA RAIA 由 于 胞 吞 作用 与 信号 转 导 在 功能 上 的 相关 性 , 因此 一 点 也 不 奇怪 有 许多 细胞 内 因子 在 这 两 方面 都 有 功能 , 一 个 最 好 的 例子 是 B- 休 止 蛋 白 。 早 期 的 研究 发 现 B- 休 止 重 白 结合 激活 的 G 蛋 自 偶 联 受 体 并 终止 受 体 与 G 蛋白 的 结合 , 从 而 抑制 G 蛋白 偶 联 受 体 的 信和 号。 后 来 发 现 B- 休 止 蛋 白 能 与 党 形 和 蛋白、AP2 和 磷酸 肌 醇 相 结 合 , 参 与 有 被 小 人 窝 的 形成 ,并 把 G 和 蛋白 偶 联 受 体 的 激活 与 内 吞 联 起 来 。 另 外 ,,B- 休 止 蛋 白 还 能 结合 Src 和 MAPK 通路 上 的 因子 , 并 激活 MAPK 通路 (Luttrell and Lefkowitz 2002), 综 上 所 述 , 胞 吞 作 用 不 仅仅 是 一 种 信号 灭 活 机 制 , 还 调节 信和 号 转 导 , 与 信号 激活 、 激活 信号 的 持续 性 维持 和 信和 号 传递 的 特异 性 有 着 密切 的 关系 , Abid al Dela ss fe 递 中 心 , 因 此 , 胞 吞 作 用 大 大 地 增加 了 信和 号 转 导 的 复杂 性 。 另 一 方面 , 胞 吞 作 用 也 受信 号 转 导 的 紧密 调控 。 正 是 由 于 这 些 复杂 的 相互 作用 , 使 得 膜 生 物 学 研究 更 具 挑 战 性 。 对 内 吞 机制 的 进一步 阐明 也 有 利于 设计 药物 来 特异 性 地 干扰 信号 转 导 , 从 而 治疗 相关 疾病 。 〈 陈 轮 光 ) ee ee er Bonifacino JS, Traub LM. 2003. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem, 72: 395-447 Bonifacino JS, Weissman AM. 1998. Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways. Annu Rev Cell Dev Biol, 14: 19-57 Ceresa BP, Schmid SL. 2000. Regulation of signal transduction by endocytosis. Curr Opin Cell Biol, 12: 204-210 Conner SD, Schmid SL. 2003. Regulated portals of entry into the cell. Nature, 422: 37-44 Di Fiore PP, De Camilli P. 2001. Endocytosis and signaling. an inseparable partnership. Cell, 106: 1-4 Di Fiore PP, Gill GN. 1999. Endocytosis and mitogenic signaling. Curr Opin Cell Biol, 11: 483-488 Engqvist-Goldstein AE, Drubin DG. 2003. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol, 19: 287-332 Gonzalez-Gaitan M. 2003. Signal dispersal and transduction through the endocy ithy t Rev Mol Cell Biol, 4: 213- 224 Hicke L. 2001. A new ticket for entry into budding vesicles-ubiquitin. 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Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 107-117 ANAT 25 生物 膜 与 细胞 凋 亡 的 调节 第 26 章 细胞 器 与 细胞 凋 亡 ‘alcineurine —~ PPlo i ' 第 2) 章 生物 膜 与 细胞 幸 亡 的 调 寺 25.1 ”细胞质 膜 与 细胞 凋 亡 信号 的 识别 .下 生生 299 25.1.1 细胞 凋 记 受 体 全 让 1 下 和 全 全 和 和 和 299 25.0.2 SRR SARE e 二 是: 寺村 300 25.1.3 ”多 种 线粒体 膜 蛋 自 的 双重 功能 FF 天 全 生生 303 25.2 PA ea PUES a ZA He ...-...20sesncanseaconseseeceyeteen em 303 25.2.1 PAP UE TA TRS AE FF nc sc .0ccsscesoacensedo ceases 25.2.2 TBR MZ SMV IAD EG occ eceeceseseseessseenneesevseseeens B04 ZH fl J C(apoptosis) % PRA Fe Fe PEA EC (programmed cell -H4 death, PCD), 是 细胞 一 种 生理 性 、 主 动 性 的 “自杀 行为 "。 1972 年 Kerr 和 Wyllie 等 从 形态 学 的 角度 重新 描述 了 细胞 的 生理 死 人 它 , 并 将 这 种 细胞 死亡 形式 命名 为 细胞 调 读 。 细 胞 凋 记 是 机 体 在 生长 .发 育 和 受到 外 来 刺激 时 清除 多 余 、 训 老 和 受 损 伤 的 细胞 , 以 保持 机 体内 环境 平衡 和 维持 正常 生理 活动 过 程 的 一 种 自我 调节 机 制 。 人 体内 每 天 都 有 上 万 亿 个 细胞 诞生 , 同 时 又 有 上 万 亿 个 细胞 程序 性 死亡 , 两 者 处 于 一 种 动态 平衡 中 , 一 旦 失衡 就 可 能 导致 各 种 疾病 的 发 生 。 如 癌症 和 自身 免疫 性 疾病 就 与 细胞 凋 亡 的 抑制 有 关 , 而 老年 性 痴 采 与 神经 细胞 凋 亡 过 度 有 关 (Evan et al. 1998, Green 1998, Meier et al. 2000, Yuan et al. 2000)。 自 20 世纪 90 年代 以 来 , 越 来 越 多 的 肿瘤 、 发 育 生 物 学 、 神 经 生物 学 、 免 疫 生 物 学 家 和 其 他 生物 学 工作 者 以 极 大 的 热情 致力 于 细胞 凋 亡 的 研究 , 使 之 成 为 当今 生命 科学 研究 中 最 引 人 注 目的 领域 之 一 。2002 年 的 诺 贝尔 生理 学 与 医学 奖 就 授予 了 从 事 细胞 凋 亡 研 究 的 科学 家 。 生物 膜 在 细胞 凋 亡 中 起 着 关键 作用 , 细胞 凋 亡 的 关键 事件 大 多 发 生 在 生物 膜 上 。 细 胞 右 膜 , 竺 别 是 线粒体 膜 在 调 它 信号 的 接 受 、 整 合 和 放大 中 起 着 关键 作用 ”根据 起 始 因子 和 进行 途径 的 不 同 , 细 胞 凋 亡 可 以 分 为 受 体 依赖 。 目 受 体 依 赖 两 种 调 亡 形式 。 细 299 # 25% APRS AML) LAT i 胞 质 膜 在 受 体 介 导 的 调 亡 信 号 识别 和 信号 传导 中 起 重要 作用 , 以 下 就 发 生 在 生物 膜 上 的 关键 凋 亡 事件 进行 综述 。 25.1 AAV SS ANNA "2 19 0 ll ers 25.1.1 A055 _ 细胞 通过 细胞 膜 表 面 的 受 体 接收 周围 环境 传 来 的 生长 信号 ,维持 正常 的 生长 和 分 裂 , 一 旦 细胞 失去 来 自 环境 支持 生长 的 信号 , 将 自发 启动 细胞 内 的 调 亡 程序 , 进入 细胞 凋 亡 。 哺乳 类 动物 细胞 发 展 了 更 为 直接 的 调 亡 启 动 途径 , 其 中 包括 死亡 受 体 介 导 的 细胞 凋 亡 (Ashkenazi et al. 1998), SET~22 {4 (death receptor, DR) 属 TNE 受 体 超 家 族 成 员 , 包 括 TNF, Fas ffi TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) 。 它 们 都 舍 有 与 TNE 受 体 同 源 的 富 含 半 胱 乞 酸 的 胞 外 区 , 其 胞 质 部 分 还 含有 一 个 与 细胞 凋 亡 直 接 相 关 的 结构 域 , 称 为 死亡 结构 域 (death domain, DD)(Schneider et al. 2000), Fas L/TRAIL 等 配 体 与 在 细胞 质 膜 表 面 的 死亡 受 体 结合 , 促 使 受 体 聚 集 而 形成 三 聚 体 。 受 体 聚 合 后 通过 C 端 FAS 连接 的 死记 结构 域 (FEFAS-associated death domain, FADD) 募集 连接 蛋白 , 随 后 通过 FADD 的 死亡 效应 功能 域 (death effector domain, DED) 富 集 procaspase-8 或 者 procaspase-10, 在 细胞 质 膜 内 侧 形 成 受 体 一 调 它 调节 分 子 复合 体 , 从 而 引起 procaspase-8 的 自身 话 化 。 活 化 的 caspase-8 又 引发 了 下 游 分子 caspase-3 或 caspase-7 的 切割 及 活化 。 在 某 些 情况 下 , 死亡 受 体 也 能 募集 TRADD(TNF-associated death domain), 参与 DISC 复合 物 的 形成 。 在 某 些 情况 下 , 细 胞 内 有 是 够 的 caspase-8 被 激活 , 从 而 直接 导致 细胞 调 亡 的 快速 发 生 。 在 多 数 情况 下 , 死亡 受 体 介 导 的 caspase-8 活 化 需 借 助 线粒体 凋 亡 通 路 来 放大 。 死亡 受 体 激活 的 caspase-8 能 切割 细胞 浆 中 的 Bid, 切割 的 Bid 向 线粒体 转移 , 从 而 诱导 细胞 色素 < 释放 和 细胞 凋 亡 (Desagher et al. 2000) (图 25-1), Fas 了 死亡 受 体 存活 因子 其 他 的 刺激 因子 g cole 14-33} | rs FADD Cal? 入 _ | 依赖 磷酸 酶 激酶 c<1@ c<1@ (Akt, MAPK, PPla PKA, Rsks, Bcl-x, Bad PAK) ae 图 @ Pa 下 游 的 Caspases 线粒体 是 细胞 凋 亡 调控 中 心 ( 引 自 sher et al. 2000) 许多 调 亡 信号 交汇 于 线粒体 als HE Wy WR Biomembranes 300 值得 注意 的 是 ,死亡 配 体 与 其 受 体 在 细胞 质 膜 上 的 结合 , 不 仅 能 直接 激活 caspase-8, 同时 也 能 引起 NE-kB 和 c-Jun N-terminal-kinase(OJNB) 的 活化 。 这 些 信 号 分 子 很 可 能 是 凋 它 抑 制 信号 。 也 就 是 说 , 调 亡 因 子 同 时 激活 与 细胞 凋 亡 和 细胞 生存 相关 的 信号 , 这 两 种 言 号 的 平衡 决定 了 细胞 的 命运 。 25.1.2 23ST 21] mm 目前 知道 , 线 粒 体 不 仅 是 细胞 的 能 量 工 三 ,提供 真 核 细胞 代谢 需要 的 能 量 , 而 且 还 是 细胞 调 亡 的 调控 中 心 , 线粒体 可 被 形象 地 比喻 为 细胞 凋 亡 信号 的 中 继 站 (Kroemer et al. 2000)。 在 细胞 受到 调 亡 刺 激 后 , 线 粒 体 接 受到 调 亡 信号 , 并 加 以 整合 , 然 后 通过 释放 调 LAB Kon, SAT SET EK. RAE A Tal A A Ze al CUI SA a], ZEA 1a Ss 6 SL ABO. Ua Liles ea eS. et SE is Bel-2 RRA £ , 这 些 分 子 可 转移 到 线 粒 PAS, 促使 线粒体 释放 细胞 调 亡 因 子 如 细胞 色素 c、Smac、AIF 等 。 这 些 分 子 可 激活 caspase 依赖 或 者 caspase 非 依赖 的 细胞 凋 亡 机 制 , 引起 细胞 凋 亡 。 线 粒 体 本 身 不 仅 能 整合 调 亡 信 号 , 还 可 作为 细胞 调 亡 信号 的 直接 接受 器 和 作用 靶 点 ,在 调 亡 过 程 中 释放 大 量 自 由 基 和 内 切 核 酸 酶 G (endonuclease G)(Li et al. 2001) 及 丝氨酸 和 蛋白酶 (serine protease) 等 , 作 为 细胞 调 亡 的 直接 执行 者 。 很 显然 , 细 胞 调 亡 信号 的 整合 和 放大 必须 受到 严密 调控 ,也 就 是 说 , 细 胞 凋 亡 物 质 从 线粒体 释放 必须 受到 严密 调控 。 1. 凋 亡 信 号 在 线粒体 膜 水 平 的 整合 细胞 凋 亡 信 和 号 的 整合 主要 是 通过 Bcl-2 家 族 和 蛋白 (Bcl-2 family protein) 在 线粒体 膜 上 相互 作用 来 实现 的 。Bcl-2 首 先 由 Tsujimoto 等 (1984) 在 淋巴 瘤 细 胞 中 克隆 , 后 被 证 明 是 线虫 调 它 基因 CED-9 的 同 源 类 似 物 。Bcl-2 家 族 包 括 近 30 种 不 同 蛋白 分 子 , 其 中 包括 7 种 病毒 蛋白 。 基 于 功能 和 结构 的 不 同 , Bcl-2 家 族 和 蛋白 可 以 被 进一步 分 成 3 个 亚 家 族 (Reed et al. 1998, Tsujimoto et al. 2000); (1) 抗 凋 它 蛋白 家 族 , FLFR Bcl-2, Bcl-X,, Bel-w, Mcl-1, A1(Bfl-1), NR-13, Boo(Diva)“# AA% 4a 4 ALA E1B-19K , BHRF1, KS-Bcl-2, ORF16, LMW5S-HL 等 病毒 蛋白 ,它们 至 少 合 有 BH1、BH2 两 种 结构 域 , 具有 抗 凋 亡 能 力 ; (2) te 调 亡 和 蛋白 家 族 , 促 调 记 家族 蛋 白 又 进一步 分 为 Bax 亚 家 族 (包括 Bax、Bak 和 了 Bok 等 ); (3) BH3-only 亚 家 族 , 包括 Bid、Bad、Bim、Bik、Blk、Hrk(DP5)、Bnip3、BimL 和 Noxa 等 蛋白 , 它 们 只 含有 BH3 结构 域 , 具 有 促 调 亡 能 力 (图 25-2), 加 一 取 He BH he [一 HURT ee Ee an 孔道 形成 区 CEES Bot-2} 0% be al | || 0203 a4 a5 06 07 亚 家 族 配 基 微 区 Bel-2 BH Bean BHI Bax —— eo Bcl-xr 三 三 Bak 一 Bcl-w s/o 0 ce Bok 一 er a> = = ee BH) 亚 宗 族 - 一 Bik [2 NR-13 一 一 元 Blk = ee BHRF|! 一 EC Hrk eee LMWS-HI ee BNIP3 i a ORF16 DR Bim, a KS-Bcl-2 一 一 一 Bad 一 —_ E1B-19K i Bid 一 -一 一 CED-9 EGL-1 =e EWA Bel-2 宗族 蛋白 (0 引 自 Adams al. 1998) 301 % 25 # AE by 5 AN A CA 7 fil VATS oF AUBel-2, Bel-X, KA ALE FERAL A th a HE, 而 促 进 细胞 凋 亡 的 Bcl-2 家 族 蛋 白 分 子 (如 Bax、Bid 等 ) KAT AMP. EVITA 刺激 下 , 促 调 亡 蛋 白 分 子 发 生 转 录 水 平 增加 (如 p53 介 导 的 Bax、Noxa、Puma 等 ) 和 翻 译 后 的 激活 和 修饰 。 促 调 亡 分 子 的 激活 还 包括 Bax 等 蛋白 的 构象 变化 和 多 聚 化 Bid 等 蛋 白 的 切割 、Bad 等 分 子 的 磷酸 化 与 去 磷酸 化 等 。 有 意义 的 是 , 这 些 变化 促使 促 凋 亡 分 子 (如 Bax、Bid 等 ) 转移 至 线粒体 , 同 线粒体 膜 上 的 抑制 凋 亡 分 子 Bcl-2、Bcl-Xc 相互 作用 , 或 与 线粒体 膜 上 其 他 蛋白 分 子 相 互 作用 , 从 而 调节 线粒体 细胞 色素 c 和 其 他 调 亡 因子 的 释放 。 在 正常 细胞 中 ,Bid 位 于 细胞 浆 中 。 当 细胞 表面 的 调 亡 受 体 被 活化 后 , 活 化 的 caspase-8 切 割 Bid, 产生 一 个 15 kDa ft C tk Be (tBid) 和 一 个 13 kDa 的 入 端 肽 段 , tBid KES CEE N vin ES EMEC (myristoylation) 修饰 后 , 便 可 转 位 到 线粒体 上 , 诱 导 细 胞 色 Sc Ri, PMS! RAAT (Li et al. 1998, Luo et al. 1998)。 另 外 , 其 他 caspase 如 caspase-3, #7 ( granzyme) 以 及 溶 酶 体 酶 等 也 可 以 切割 和 话 化 Bid (Gross et al. 1999), 另 一 个 BH3-only 蛋白 Bad 的 功能 发 挥 受 磷酸 化 和 去 磷酸 化 的 调节 , 在 生长 因子 不 存在 的 情况 下 ,Bad 以 去 磷酸 化 的 形式 存在 ,通过 其 BH3 结构 域 可 与 Bcl-2 或 Bcl-Xr 和 蛋白 形 成 异 二 聚 体 , 从 而 持 抗 它们 的 抗 调 亡 活性 。 相 反 , 在 生长 因子 存在 的 情况 下 ,PKB 和 锚 定 于 线粒体 上 的 PKA 可 以 使 Bad BH3 的 155 位 氨基 酸 碍 酸化 , 然 后 与 胞 浆 中 的 14-3-3 蛋 自 结合 而 被 封闭 在 胞 液 中 , 因而 抑制 Bad 介 导 的 细胞 凋 亡 。 体 外 实验 表明 几 种 磷酸 酶 如 征调 磷酸 酶 〈calcineurin) 、 和 蛋白 磷酸 酶 la 和 蛋白 水 解 酶 2A 均 可 导致 Bad 去 磷酸 化 (Wang et al. 1999)。 鉴于 Bcl-2 家 族 和 蛋白 在 细胞 凋 亡 调控 中 的 关键 作用 , 这 类 分 子 被 称 为 细胞 调 亡 检 测 点 (apoptosis check-point) 蛋白 (Chao et al. 1998)。 它 们 在 细胞 凋 亡 的 信号 整合 和 调节 中 起 着 关键 作用 。 有 具体 地 讲 , 几 乎 所 有 的 调 亡 信号 , 包 括 死 亡 受 体 、caspase 都 能 够 激活 Bcl-2 家 族 中 的 促 调 亡 分 子 , 从 而 调节 细胞 凋 亡 进程 。 2. 线粒体 膜 与 凋 亡 物 质 的 释放 目前 知道 促 调 亡 和 蛋白 分 子 转移 至 线粒体 后 能 引起 线粒体 调 亡 物质 的 释放 和 调 亡 信和 号 的 放大 。 这 些 调 亡 分 子 怎样 转移 至 线粒体 , 转移 至 线粒体 后 如 何 介 导 调 亡 物质 的 释放 , 这 些 凋 亡 调 节 关 键 的 分 子 细节 疝 不 完全 清楚 。 目前 有 几 种 不 同 模型 来 解释 凋 亡 物质 释放 的 可 能 机 制 : (1) 调 亡 物质 通道 模型 (Antonsson et al. 2000, Wolter et al. 1997)。 有 证 据 表 明 , (EVA A Bax 可 由 胞 浆 转 移 至 线粒体 并 在 线粒体 表面 发 生 多 聚 化 , 从 而 形成 一 个 特异 的 物质 通道 , 介 导 细 胞 色素 c 等 凋 亡 物 质 的 释放 。 在 显微镜 下 能 观察 到 Bax 等 蛋白 在 调 亡 条 件 下 的 聚集 , 但 这 种 蛋白 复 合体 如 何 介 导 凋 亡 物质 的 释放 并 不 完全 清楚 。 体 外 的 实验 表明 ,Bax 的 聚集 与 调 亡 物 质 的 释放 并 设 有 直接 关系 。 有 证 据 表 明 ,Bax FERAL YD! © | )AC 通道 形成 分 子 复 合体 , 从 而 介 导 调 亡 物质 的 释放 (Shimizu et al. 2000), (5 元 族 重 白 有 可 能 通过 类 似 于 细菌 毒素 〈 如 大 肠 杆 戎 毒素 ) 蛋白 的 杀伤 方式 促使 : -, 即 通过 破坏 细胞 膜 或 细胞 器 膜 等 通 透 性 屏障 , 引 起 细胞 (aS) 溶 胀 而 死亡 (S elet al. 1999), (3) 线粒体 肿胀 模型 (Green et al. 1998)。 线 粒 体 膜 孔 和 离子 通道 的 ”使 线粒体 的 膜 间 阶 与 线粒体 基质 中 的 “, 子 重新 分 配 , 因此 使 跨 内 膜 的 正 离子 浓度 让 并 导致 呼吸 链 解 偶 联 。 由 于 HE %y i Biomembranes 302 线粒体 基质 是 高 活性 的 , BORLA ELA FP BE A BLAS PS. BRAS A DT BF EF Un, 随 着 基质 容积 的 逐渐 增 大 , 最 终 导致 外 膜 破裂 , 引 起 内 外 膜 间 的 促 凋 亡 蛋 白质 由 破裂 的 外 膜 释放 到 细胞 质 中 并 激活 下 游 的 调 亡 反应 。(4) 线粒体 膜 孔 模 型 (Zamzami et al. 2001), 线粒体 膜 上 存在 巨大 的 孔道 结构 , 称 为 线粒体 通 透 性 改变 孔道 (permeability transition pore, PITP), PITP 能 够 实现 可 控 的 开放 和 关闭 。 已 有 的 证 据 表 明 此 复合 体 横 跨 线粒体 内 外 膜 , 其 中 包括 细胞 质 中 的 蛋白 〈 己 糖 激酶 )、 外 膜 蛋白 〈 电 压 门 探 通道 YDAC)、 内 膜 蛋 白 〈 腺 苷 酸 转 运 蛋白 ANT) 和 线粒体 亲 环 蛋白 D (cyclophilin D) 等 组 分 《图 25-3)。 在 凋 亡 过 程 中 , PIP 与 Bax 等 结合 , 在 线粒体 外 膜 可 以 形成 足够 大 的 通道 , 使 细胞 色素 等 促 调 亡 物 质 能 从 外 膜 释放 。 细 胞 凋 亡 是 一 个 主动 的 需 能 过 程 , 需 要 ATP 的 供应 , 因 此 保 持 线 粒 体 膜 相对 完整 的 孔道 模型 更 为 合理 , 且 与 线粒体 在 细胞 凋 亡 前 期 保持 相对 完整 的 形态 相 吻合 。 激酶 a i fa) a) 8B bikie 2 Ag SOE a PH 改变 Caspases BH3 肽 段 肌 酸 +ADP mtCK 磷酸 肌 酸 +ADP 苑 术 苷 / 软 脂 酸 Bongkrekate/ATP/ADP =a Ca’*/oxidation? 环抱 菌 素 A 一 一 四 Cyp-D ween PTP 的 组 成 及 调节 ( 引 自 Zamzami et al. 2001) 3. 凋 亡 物质 释放 的 反馈 调节 线粒体 跨 膜 通 透 性 通道 的 形成 以 及 线粒体 溶 胀 解 体 导 致 大 量 细胞 色素 c 和 Apaf-1、 AIF 等 促 凋 亡 因 子 的 释放 , 这 些 因子 会 激活 相应 的 caspase, caspase 又 能 直接 攻击 线粒体 , 进一步 引发 更 多 的 线粒体 释放 促 凋 亡 因 子 , 形 成 凋 亡 全 号 的 正 反 馈 (Chen et al.2000)。 线 BrP TEAK!) 成 为 细胞 凋 亡 信 号 的 放大 器 , AE “PET Wel) 环 路 ”的 中 心 。 研 究 证 实 , 在 caspase #4i, 切 期 , 线 粒 体 还 保持 氧化 磷酸 化 功能 , 保 ji UPR REAPER. 303 #252 AEA 5 AN LAI Va 7 caspase 能 切割 多 种 线粒体 膜 上 的 Bcl-2 家 族 抗 调 亡 和 蛋白。 研究 表明 , 内 源 性 的 caspase-3 是 Bcl-2 的 生理 性 半 胱 所 酸 和 蛋白酶 , 在 细胞 发 生 凋 亡 时 ,caspase-3 将 在 Bcl-2 a 自 的 loop 区 进行 切割 , 使 Bcl-2 从 抗 凋 记 分子 变 成 促 调 记分 子 。 此 外 ,caspase-3 酶 切 mcll 所 产生 的 ANBcl-2 或 ANmcl-l 片段 也 能 促进 细胞 色素 < 的 释放 和 加 速 细胞 凋 亡 。 25.1.3 多 种 线粒体 膜 重 白 的 双重 功能 “gg 有 意思 的 是 , 人 们 原 认为 线粒体 的 外 膜 只 是 诊 透 膜 , 对 线粒体 的 功能 设 什 么 影响 。 但 1976 年 , 在 线粒体 外 膜 上 存在 电压 依赖 性 阴离子 通道 蛋白 (voltage dependent anion channel, VDAC) 首次 得 到 确认 , 使 人 们 对 以 前 的 看 法 提出 了 质疑 (Schein et al. 1976)。 自 此 , 多 种 VDAC 蛋白 被 发 现 , 它 们 的 功能 用 体外 重组 和 基因 殴 除 的 方法 得 到 了 证 明 。 大 量 事实 证 明 VDAC 参与 介 导 了 促 调 亡 和 蛋白 的 释放 , 并 且 Bcl-2 家 族 蛋 白 可 直接 作用 于 VDAC jad VAIL (Shimizu et al. 1999), 如 Bax/Bak/Bim 可 促使 VDAC 孔道 开放 , 导 致 内 外 膜 之 间 存 在 的 蛋白 释放 , 而 Bcl-2/Bcl Xi 可 抑制 这 一 过 程 。 氧 自由 基 可 直接 打开 VDACI1 孔道 而 允许 细胞 色素 c 释 放 , 并 且 氧 自由 基 打 开 VDAC 孔 道 与 Bax/Bak 无 关 (Madesh et al. 2001)。 高 浓度 Ca 可 打开 PITP 了 孔道, 低 浓 度 Ca 可 促进 其 他 因子 对 PTP 的 开放 作用 , 这 种 作用 已 被 确定 也 有 VDAC 的 参与 (Tsujimoto et al. 2002)。 此 外 , 胞 浆 中 的 代谢 相关 的 己 糖 激酶 工 (Hexokinase II) 能 转移 至 线粒体 , 与 VDAC 相互 作用 , 并 抑制 Bax VDAC 的 相互 作用 , 从 而 调节 细胞 凋 亡 (Pastorino et al. 2002)。 可 见 , 线 粒 体 上 多 种 膜 蛋白 既 在 细胞 能 量 代 谢 中 起 关键 作用 , 同 时 也 参与 细胞 调 亡 的 调节 。 25.2 VASP AeA AS ZS “SATE JF] eee 25.2.1 FAVRE: (1 (1) mm 内 质 网 在 细胞 调 亡 中 的 作用 越 来 越 受到 关注 。 目 前 知道 , 内 质 网 在 调 亡 信号 的 接收 和 放大 中 有 重要 作用 (Nakagawa et al. 2000)。 内 质 网 参与 细胞 凋 亡 的 途径 主要 包括 : (1) 内 质 网 和 蛋白质 成 熟 和 折 县 的 破坏 导致 内 质 网 损伤 从 而 引发 细胞 凋 亡 (2) 内 质 网 凋 亡 蛋 白 酶 caspase-12 WGA; (3) 内 质 网 钙 信 号 的 异常 (Breckenridge et al. 2003)。 此 外 , 内 质 网 膜 上 也 存在 Bak 等 调 亡 蛋白 , 在 凋 亡 因 子 的 刺激 下 ,Bax 也 能 在 内 质 网 上 富 聚 ,Bax 和 了 Bak 的 多 聚 化 和 caspase-12 的 激活 可 导致 细胞 凋 亡 (Zong et al. 2003)。 内 质 网 是 细胞 内 蛋 自 质 合成 和 成 熟 的 主要 场所 , 蛋 白质 成 熟 和 折 受 的 异常 可 导致 内 质 网 损伤 。 如 用 衣 替 素 (tunicamycin) 抑制 蛋白 质 糖 基 化 或 改变 内 质 网 内 的 氧化 还 原状 态 使 蛋白 质 糖 基 化 和 蛋 白质 二 硫 键 形 成 发 生 异 稼 , 可 使 没有 折 和 县 好 的 蛋白 质 在 内 质 网 内 积累 。 未 折 县 的 蛋白 质 与 内 质 网 内 伴侣 蛋白 BiP/Grp78 结合, 从 而 BiP/Grp78 干扰 与 Iel-o 的 结合 , 导 致 rel-o 与 TRAF-2 的 结合 Nakagawaetal. 2000)。TRAF-2 能 吸附 并 激活 内 质 网 特异 的 蛋白 酶 caspase- 12, 从 而 激活 细胞 凋 记 过 程 。caspase-12 也 能 被 细胞 内 Ca i) m-calpain 所 切割 和 激 和 话 , 被 激活 的 caspase-12 能 直接 激活 caspase-9, 从 而 诱 , 入 于 线粒体 的 细胞 调 亡 过 程 。caspase-12 基因 人 缺失 的 小 鼠 神经 细胞 等 多 种 细胞 对 损伤 诱导 的 调 它 变 得 不 敏 , 这 进一步 说 明 内 质 网 损伤 能 直接 导致 细胞 内 caspas 内 质 网 是 细胞 内 钙 库 ,Ca- 在 内 质 网 内 可 以 游离 :在 , 也 可 同 内 质 网 内 部 的 钙 网 蛋白 ( alreticulin) 和 和 合 联 蛋 自 〈calnexin) “aA 内 质 网 钙 的 吸收 主要 靠 内 质 网 的 Ca -ATPase, 其 Ca 释放 主要 靠 InsP; 受 体 或 雷诺 ” (ryanodine) 受 体 。InsP; 受 体 on foe Ue H: %y HR Biomembranes 304 或 雷诺 丁 受 体 表 达 水 平 的 降低 使 细胞 变 得 对 凋 亡 不 敏感 。 钙 吸收 或 释放 的 抑制 可 直接 导 SHI, aH ee pb SS (thapsigargin) 抑制 内 质 网 的 Ca-ATPase, 是 常用 的 凋 亡 诱 导 剂 。 钙 网 蛋白 能 调节 钙 库 吸 收 和 释放 的 平衡 , 其 表达 异 稼 也 影响 细胞 对 调 亡 诱 导 剂 的 敏感 性 (Scorrano et al. 2003), 内 质 网 应 激 一 方面 通过 直接 激活 caspase-12 来 参与 细胞 凋 亡 的 , 另 一 方面 , 内 质 网 钙 的 释放 可 直接 诱导 线粒体 的 膜 孔 开放 , 从 而 导致 线粒体 调 亡 物质 的 释放 。 在 细胞 内 , 线 粒 体 钙 吸 收 的 位 点 和 内 质 网 钙 释 放 存 在 近 距 离 相互 作用 , 即 InsP; 受 体 释 放 的 钙 能 直接 被 线粒体 膜 上 钙 吸 收 和 蛋白 在 纳米 范围 内 吸收 。 有 意义 的 是 ,最 新 的 研究 表明 ,线粒体 释放 的 细胞 色素 c 能 直接 与 InsP; 受 体 结合 ,并 激活 其 钙 释 放 活性 。 由 此 诱导 大 量 释放 的 钙 再 作用 于 线粒体 , 引 发 线粒体 凋 亡 物质 的 释放 。 由 此 看 来 , 内 质 网 和 线粒体 在 凋 亡 调控 中 存在 直接 的 相互 串 话 和 相互 作用 。 内 质 网 通过 其 钙 库 在 调 亡 信号 接收 和 放大 中 起 关键 作 用 , 而 线粒体 在 接收 凋 亡 信号 后 , 通 过 释放 大 量 的 调 亡 物质 来 启动 和 实施 细胞 凋 亡 。 25.22 溶 酶 休 梅 参与 细胞 月 广 扑 月 功 mas 溶 酶 体 在 细胞 凋 亡 调节 中 的 研究 越 来 越 受到 重视 。 溶 酶 体内 包含 了 多 种 蛋白 水 解 酶 , 在 细胞 自杀 和 细胞 内 物质 清除 中 起 关键 作用 。 溶 酶 体 中 组 织 蛋白 酶 (cathepsin) 在 细胞 凋 亡 调 控 中 发 挥 重 要 作用 。 在 氧化 应 激 中 , 溶 酶 体 组 织 蛋 白 酶 D 的 释放 先 于 线粒体 细胞 色 素 c 的 释放 。 这 类 蛋白 酶 可 能 不 能 直接 激活 caspase, 但 能 切割 Bid, 被 切割 的 Bid 能 转移 至 线粒体 , 促 使 细胞 色素 < 释放 。 溶 酶 体内 还 存在 靖 磷脂 酶 , 这 种 酶 的 激活 可 直接 导致 神经 酰胺 的 大 量 积累 , 引 起 线粒体 细胞 色素 < 释放 。 溶 酶 体内 还 可 能 存在 其 他 蛋白 酶 参 与 细胞 凋 亡 , 有 关 溶 酶 体 凋 亡 信 和 号 的 激活 和 参与 凋 亡 的 具体 途径 有 待 进一步 深入 研究 。 综 上 所 述 , 生物 膜 系 在 细胞 凋 亡 的 信号 识别 、 信 号 放大 和 凋 亡 的 实施 中 起 着 不 同 的 但 又 相互 关联 的 作用 。 不 同 细胞 器 识别 的 信和 号 并 不 相同 , 但 这 些 信号 能 在 不 同 细胞 器 间 进行 “ 串 话 ”和 放大 , 并 最 后 能 通过 caspase 和 其 他 凋 亡 相关 蛋白 酶 的 激活 来 实施 凋 亡 。 (Bef 郑 艳 华 ) GTC a eemememmaney Adams JM, Cory S. 1998. 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J Cell Biol, 162: 59-69 第 QO 章 Ne as 5 Zeal 26.1 SBT (As Ey FRI VA L_.. ..0.00-0eeceeoeosetveuas'seaceteeessidnunstesbe sansa 307 26.1.1 Bel-2 ¥ - 族 重 白 SB pkS 2 DACS| Uo brea cee ee 307 26.1.2 Bid. 的 作用 机 制 和 国生 生生 和 全 308 2622 一 细胞 核 瑟 细胞 湖人 记 和 310 i SE) ET 311 26.3.1 应 对 未 能 正确 折 父 的 蛋白 质 与 启动 凋 仑 eee eeeeeeneeee 311 26.3.2 “Ca 信号 启动 调 亡 以 及 内 质 网 与 线粒体 的 得 作用 ,= 有 ee ee ee 于 二 和 于 人 生 和 315 26.5w 座 酶 体 与 细胞 涯 它 2 二 人 316 2626m 油 华 途径 的 整合 318 胞 凋 它 (apoptosis) 是 指 一 组 特征 性 的 细胞 形态 变化 ,这 些 事件 的 发 生 与 动物 细胞 的 程序 性 细胞 死亡 (programmed cell death, PCD) 启动 相关 , 是 PCD 最 典型 、 常 见 的 一 种 表 型 。 在 形 态 学 及 生理 生化 特征 上 , 调 亡 过 程 主要 表现 为 细胞 奢 缩 、 质 膜 泡 状 结构 的 形成 、 细 胞 核 固 缩 、 染 色 质 凝聚 、DNA 的 片断 化 、 线 粒 体 膜 通 透 性 的 改变 、 细 胞 质 膜 PS 的 外 翻 以 及 胞 质 骨 架 的 改变 , 最 后 形成 调 亡 小 体 。 调 亡 小 体 很 快 被 邻近 的 细胞 吞噬 , 它 们 一 般 是 巨 吻 细 胞 , 有 时 也 包括 正常 的 上 皮 细 胞 和 血管 内 皮 细 胞 (Wyllie et al. 1980,Kerr et al. 1972 ) 。 细 胞 凋 记 是 一 个 主动 的 过 程 , 趋 向 死亡 的 细胞 还 可 以 释放 信和 号 作用 于 邻近 的 细胞 (Savill et al. 2000) ) 。 与 增殖 、 分 化 一 样 , 凋 亡 是 细胞 正常 生长 的 一 种 生理 调节 方式 , 涉 一 系列 基因 的 激活 、 表 达 以 及 调控 。 细 胞 死亡 的 另 一 种 主要 方 式 是 细胞 坏死 , 这 种 情况 下 细胞 质 和 细胞 器 发 生 不 可 逆 的 肿胀 , 质 膜 破 裂 导 致 细胞 溶解 , -二 有害 的 细胞 成 分 , 造 成 周围 组 织 出 现 炎 症 反应 。 一 般 认 为 , 细 及 受到 刺激 后 发 生 凋 亡 或 坏死 在 很 ee ae =。 胞 内 ATP 的 浓度 和 线粒体 的 功能 状态 是 影响 细胞 死亡 方式 的 = 键 因素 (Leist et al. 1997) 。 此 307 % 20 & An a 5 AW Sp, 1D AFI L APA eS, ane Be ene 2H Jal Ce & AE os AN a A EA, ae PAPA SE, OR AE A EPI 常 发 育 、 系 统 完 整 性 和 体内 稳 态 平衡 具有 重要 的 作用 。 细 胞 凋 亡 的 作用 体现 在 : 发 育 过 程 中 参与 形态 发 生 、 性 别 分 化 、 形 成 复杂 的 调节 系统 (免疫 系统 和 神经 系统 ) , 去 除 不 需 要 的 细胞 和 组 织 , 调 节 生 长 和 细胞 数目 , 排 除 异 常 的 、 有 具有 潜在 危害 性 的 细胞 以 及 防御 感染 和 损伤 (Vaux et al. 1999, Jacobson et al. 1997) 。 细 胞 凋 亡 失调 与 多 种 疾病 相关 , 包 括 AIDS、 肿 瘤 发 生 、 自 身 免 疫 失调 、 神 经 退行 性 疾病 、 缺 血性 中 风 和 不 育 等 (Thompson 1995), 早 在 19 世纪 后 半 叶 , 发 育 生物 学 家 就 对 生理 性 细胞 死亡 进行 过 研究 。1885 年 , Flemming 在 研究 哺乳 动物 卵巢 着 泡 过 程 中 观察 到 “染色 质 溶 解 ”现象 ,1915 年 ,Graper 发 现 “ 染 色 质 溶解 ”的 细胞 雁 片 被 邻近 上 皮 细 胞 吞 唾 ,1965 年 开始 ,Kerr 对 此 作 了 进 一 APE, 并 于 1972 年 将 其 命名 为 细胞 凋 计 〈Lockskin et al. 2001, Kerr et al. 1972 ) 。 早 期 与 细胞 凋 亡 相 关 的 研究 工作 主要 集中 在 形态 学 。 研 究 者 利用 显微镜 对 细胞 凋 亡 现 象 进行 了 全 面 的 观察 , 并 与 细胞 坏死 进行 了 细致 的 比较 (Clarke et al. 1996) 。 此 后 ,Horvitz (1999) , Sulston (1976) , Ellis (1991) 分 别 采 用 秀丽 新 小 杆 线虫 (Caemzozrpapaitis elegans ) 为 模式 生物 , 开 创 了 细胞 调 亡 的 遗传 学 研究 。 结 果 显 示 , 少 数 基 因 的 存在 和 表达 就 可 以 控制 发 育 过 程 中 绝 大 多 数 细胞 的 存活 或 死亡 。 自 20 世纪 80 年 代 示 以 后 , 由 于 分 子 生 物 学 的 鞍 勃 发 展 , 生 物化 学 和 遗 传 学 模型 研究 相 结合 , 细 胞 凋 亡 的 生理 作用 及 其 分 子 机 制 得 到 了 座 入 的 探讨 , 成 为 生命 科学 中 最 话 跃 的 研究 领域 之 一 (Vaux 2002 ) 。 细胞 凋 它 是 一 个 进化 上 高 度 保守 的 过 程 (Ameisen 2002) , 在 低 等 和 高 等 多 细胞 动物 中 , 都 存在 并 发 挥 着 相似 的 作用 , 而 且 其 表 型 和 一 些 核 心 的 调控 分 子 也 都 是 保守 的 。 但 在 高 等 生物 中 , 细胞 调 亡 的 分 子 途 径 是 一 个 更 加 复杂 多 样 的 调控 网 络 (Hengartner 2000, Vaux et al. 1999) 。 在 哺乳 动物 中 , 细 胞 凋 亡 可 沿 着 多 条 途径 进行 , 同 一 死亡 信号 作用 于 不 同类 型 的 细胞 , 或 者 不 同 的 死亡 信号 作用 于 同一 类 型 的 细胞 , 细 胞 凋 亡 的 途径 都 不 一 样 ; 在 不 同 的 分 化 阶段 , 某 一 类 型 的 细胞 受 同 一 死亡 信号 诱导 而 死亡 的 分 子 途 径 都 不 同 。 此 外 , 还 存在 可 变 剪 切 和 翻译 后 修饰 〈 磷 酸化 与 去 磷酸 化 、 酶 切 等 ), 从 而 使 调控 细胞 凋 它 的 分 子 机 制 更 加 复杂 (Meier et al. 2000) 。 在 调 它 过 程 中 , 发 生 一 系列 的 反应 , 如 Ca 浓度 的 改变 、 调 亡 酶 的 激活 、 线 粒 体 外 膜 通 透 性 增加 、DNA 卢 段 化 等 。 这 些 反 应 发 生 在 胞 质 、 胞 核 或 细胞 器 , 它 们 按照 一 定 的 时 空 顺序 发 生 , 共 同 完成 细胞 凋 亡 这 一 过 程 。 研 究 结果 表明 , 细 胞 核 、 内 质 网 、 溶 酶 体 和 高 尔 基 体 等 , 在 不 同 程度 上 都 具有 促 凋 它 信 号 或 者 损伤 感应 的 整合 作用 , 它 们 的 感受 器 分 别 感应 不 同 的 凋 亡 信号 , 局 部 地 活化 信号 传导 通路 并 发 出 信号 , 使 细胞 器 之 间 相 互 作用 。 这 些 细胞 右 在 凋 亡 过 程 中 发 生 了 哪些 变化 及 其 以 何 种 方式 参与 到 调 亡 途 径 中 , 是 当前 研究 中 的 一 个 热点 , 明 这 些 问 题 将 有 助 于 全 面 揭 寺 细胞 刀 它 机 制 (Ferri et al. 2001a) 。 260.1 BORER SAW es: 26.11 Bol UREN SSCA SE ET: ues me 长 基 以 来 人 们 一 直 认 为 线粒体 只 是 细胞 内 重要 的 能 ”供应 站 , 它 通过 氧化 磷酸 化 为 A HE iy f& Biomembranes 308 细胞 提供 能 量 。 早 期 的 观点 认为 ,线粒体 的 生理 状态 若 受 到 损伤 , 必 然 会 影响 到 整个 细 胞 的 稳 态 平衡 ,导致 调 亡 。 后 来 有 关 实 验 结 果 却 表明 , 呼吸 链 受阻 断 、 能 量 代 谢 的 趟 失 、 活性 氧 产 生 增 加 等 都 发 生 在 调 亡 的 较 晚 期 (Xue et al. 1997) 。 在 调 亡 早 期 , 线 粒 体 呈 现 一 些 变化 , 例 如 基质 的 碱 性 化 (Matsuyama et al. 2000) , 参 与 氧化 磷酸 化 的 一 些 蛋白 表 达 增 加 (Vander Heiden et al. 1999) , 但 是 它 的 蛋白 质 运 输 功 能 基本 正常 (von Ahsen et al. 2000)。1996 年 , 王晓东 研究 组 发 现 细胞 色素 c 具 有 激活 caspase 的 作用 (Liu et al. 1996), 这 为 线粒体 参与 细胞 凋 亡 提供 了 直接 的 证 据 ,, 从 而 使 这 一 领域 的 研究 成 为 分 子 细胞 生物 学 的 一 个 热点 (Wang 2001)。 迄 今 已 发 现 了 众多 作用 于 线粒体 的 因子 , 它 们 引起 线粒体 膜 通 透 性 (mitochondrial membrane permeabilization, MMP) 的 改变 。 这 是 最 终 影响 线 粒 体 功能 的 关键 因素 , 整 个 过 程 可 分 为 三 个 阶段 : (1) 起 始 阶段 , 调 亡 信 号 通过 各 种 途 径直 接 作 用 于 线粒体 (2) 线粒体 膜 通 透 性 发 生 改 变 ; (3) 降解 阶段 , 即 MMP 导致 线 粒 体 中 有 关 因 子 的 释放 , 激 活 下 游 的 核酸 酶 和 蛋白酶 降解 底 物 , 发 生 调 亡 (Newmeyer et al. 2003, Kroemer et al. 2000) 。 在 状 椎 动物 中 ,线粒体 变化 是 调 亡 途径 中 的 中 心 环 节 , 但 对 此 也 有 不 同 的 观点 (Finkel 2001) 。 影响 MMP 的 因子 有 很 多 , 其 中 Bcl-2 家 族 和 蛋白 (Bcl-2 family protein) 是 重要 的 一 4, 它 包括 抗 凋 亡 和 蛋白 (如 Bcl-2、Bcl-Xr、Bcl-w、A1 和 Mecl-1 等 ) 和 促 调 亡 和 蛋白 《如 Bax、 Bcl-Xs、Bak、Bad、Bid 和 BikNbk 等 )。 很 多 Bcl-2 家 族 的 蛋白 有 一 个 保守 的 C 端 跨 膜 区 , 这 个 跨 膜 区 使 这 些 和 蛋白 可 以 定位 于 细胞 核 的 外 膜 、 线 粒 体 膜 和 内 质 网 膜 (Suzuki et al. 2000, Froesch et al. 1999, Lithgow et al. 1994) 。 通 过 多 种 不 同 的 翻译 后 修饰 ,Bcl-2 家 族 的 蛋白 处 于 活性 或 失 活 状态 。 这 些 翻译 后 修饰 包括 守 聚 化 、 激 活 后 的 定位 、 磷 酸化 和 酶 切 激活 等 (Wang 2001, Huang et al. 2000, Korsmeyer et al. 2000, Desagher et al. 2000, Gross et al. 1999a) 。 抗 凋 亡 蛋 白 主 要 位 于 线粒体 膜 上 ,接受 调 亡 刺激 后 , 促 调 亡 蛋 白 (如 Bax) 从 细 胞 内 的 其 他 位 置 转移 到 线粒体 上 , 构 象 发 生 改 变 ,, 在 线粒体 膜 上 寡 聚 化 ,促进 MMP。 这 个 “转移 一 寡 聚 化 一 MMP” 反 应 受到 调 亡 抑制 因子 的 抑制 ,而 被 BH3-only 调 亡 促 进 蛋白 (如 Bid) 激活 。Bax 的 同 源 蛋 白 Bak 位 于 线粒体 膜 上 , 也 在 Bid 的 作用 下 发 生 结构 改变 而 寡 聚 化 。 在 正常 细胞 中 ,Bim 位 于 微 管 蛋 白 复 合体 上 , 4 RAVAN, Bim 转移 至 线粒体 持 抗 抗 调 亡 蛋白 的 作用 。Bad 是 通过 磷酸 化 与 去 磷酸 化 来 调节 其 活性 的 , 磷 酸化 的 Bad 与 14-3-3 蛋白 结合 , 调 亡 信 号 使 Bad 发 生 去 磷酸 化 , 去 磷酸 化 后 的 Bad 可 以 与 Bcl-2 或 Bel-X, 作用 ,这 可 能 是 由 于 Bad 蛋白 去 磷 酸化 后 其 BH3 区 域 暴 露出 来 。 在 体内 ,Bcl-2 蛋 白 也 可 以 被 磷酸 化 , 这 种 修饰 可 能 会 影响 到 它 的 抗 调 亡 活性 。 在 凋 亡 过 程 中 ,Bid、Bax、 Bcl-2 也 存在 被 剪 切 修饰 的 现象 ,这 种 激活 方式 对 不 同 的 蛋白 产生 的 影响 可 能 是 不 尽 相 同 的 , 它 在 体内 各 种 凋 它 途径 中 所 起 的 作用 还 有 待 进一步 研究 。 关 于 MMP 尚 存 许 多 未 解 之 ik, 其 一 是 Bcl-2 家 族 的 调 亡 调节 和 蛋白 发 挥 作用 是 否 需 要 特殊 的 膜 脂 环境 , 其 二 是 通 透 性 发 生 改 变 的 机 制 , 即 MMP 是 否 是 一 个 瞬 态 的 过 程 , 是 否 与 膜 弯曲 的 调节 有 关 ; 再 者 MMP 有 多 少 种 方式 , 是 否 不 同 的 凋 亡 信号 会 产生 不 同 的 通 透 性 改变 的 机 制 。 关 于 Bcl-2 家 族 蛋 自如 何 引 起 MMP 的 问题 ,研究 者 提出 过 多 种 假说 , 虽 各 有 一 定 的 实验 证 据 予 以 支持 , 但 都 不 且 有 普遍 意义 (Zamzami et al. 2003, Hengartner 2000,Antonsson et al. 2000) 。 26.1.2 _B, 的 作用 机 人 制 人 Bid 是 一 个 参与 调 它 调控 的 关键 重 白 〈Esposti 2002 , 在 类 型 工 细胞 (如 Jurkat 细 胞 309 % 20% Al 2 5 A VA 和 肝 细 胞 ) 中 ,Bid 在 Fas (CD95/APO-1) WS WAT Pa A POOR REA VE, AEA VE FA 涉及 剪 切 、 甲 基 化 、 移 位 、 磷 酸化 、 降 解 等 方式 。 在 活化 前 ,Bid 位 于 细胞 质 中 。 当 Fas 或 肿瘤 坏死 因子 (tumor necrosis factor, TNF) 受 体 被 激活 后 可 以 活化 caspase-8,caspase-B 作用 于 Bid 的 Asp59 使 之 剪 切 为 N 端 和 C 端 两 个 片段 , 剪 切 后 的 Bid (truncated Bid, tBid) 可 以 被 甲 基 化 , 由 胞 质 转移 至 线粒体 , 引 起 线粒体 各 种 调 亡 因 子 的 释放 (Li et al. 1998, Luo et al. 1998), 。 除 了 caspase-8 可 以 活化 Bid, 最 近 的 研究 发 现 ,caspase-3、 粒 酶 了 B (granzyme B), calpain 以 及 溶 酶 体 释放 的 某 些 因子 也 可 以 剪 切 Bid, 继 而 使 它 转移 到 线 粒 体 上 发 挥 作用 (Cirman et al. 2003, Alimonti et al. 2001,Chen et al. 2001, Stoka et al. 2001, Gross et al. 1999%b) 。 这 些 和 蛋白 酶 在 Bid 上 的 前 切 位 点 均 位 于 H2o 45 H30 两 个 螺旋 区 之 间 的 一 个 称 为 jobop 区 的 柔性 部 位 , 这 个 不 保守 的 loop 区 为 Bid 提 供 了 多 个 活化 位 点 。 Bid 活 性 的 另外 一 种 调节 方式 是 泛 素 介 导 的 降解 , 实验 证 明 Bid 可 以 被 记 素 蛋白 降解 系统 迅速 降解 (Breitschopfet al. 2000) , 因 此 ,Bid 的 寿命 在 Bid 促 细 胞 凋 亡 中 也 是 一 个 重要 的 调节 因素 。 此 外 ,Bid 的 磷酸 化 (S61、S$64、T5S8) 也 是 一 种 普遍 现象 , 磷 酸化 的 Bid 不 被 caspase-8 剪 切 , 这 是 细胞 控制 调 亡 的 一 种 机 制 (Desagher et al. 2001 ) 。 tBid 诱 导 细 胞 色素 c 从 线粒体 释放 可 能 通过 两 种 方式 来 完成 。 一 种 是 tBid 与 其 他 和 蛋 Aan Bax 或 Bak 相互 作用 , 引 起 它们 构象 的 变化 , 之 后 再 进一步 作用 于 线粒体 (Werner et al. 2002,Wei et al. 2001) , 例 如 ,tBid 和 Bax 与 线粒体 上 特有 的 心 磷脂 (cardiolipin, CL) 在 脂 质 体 上 协同 作用 形成 蛋白 通道 (Kuwana et al. 2002) 。 另 一 种 方式 是 tBid 自身 就 可 以 引起 线粒体 的 泄漏 , 并 不 需要 其 他 蛋白 的 参与 。 模 型 膜 体 系 的 实验 显示 ,tBid 可 以 直接 与 脂 膜 相互 作用 , 形 成 离子 通道 , 从 而 引起 脂 质 体 内 容 物 的 泄漏 (Epand et al. 2002)。 在 非 离子 型 去 污 剂 或 膜 脂 环境 中 ,tBid 可 以 形成 朝 聚 体 (Grinberg et al. 2002 ) 。 体外 和 体内 实验 还 发 现 ,tBid 具有 结合 并 转运 膜 脂 的 活性 (Esposti et al. 2002b) , 并 且 CL 与 tBid 有 特异 性 的 结合 , 这 对 引起 线粒体 MMP 有 重要 作用 , 但 具体 机 制 还 不 清楚 (Lutter et al. 2000 ) 。 杨 福 愉 研 究 组 在 线粒体 及 脂 质 体 水 平 上 对 Bid 诱 导 细 胞 色素 c 从 线粒体 中 释放 的 机 制 开 展 了 一 定 的 研究 。 发 现 与 Bax 和 神经 酰胺 (ceramide) 不 同 ,Bid 诱 导 细胞 色素 c 释 放 与 线粒体 通 透 性 改变 孔道 (permeability transition pore, PTP) 无 关 , 也 不 受 线粒体 膜 电势 、FIF.-ATPase 酶 活性 及 细胞 色素 c 的 氧化 还 原状 态 的 影响 。Bid 亦 不 能 像 Bax 或 Bak 一 样 , 引 起 线粒体 膨胀 或 线粒体 膜 电 势 的 消失 。 值 得 注意 的 是 , 单 独 的 Bid 或 tBid 可 直 接 引 起 脂 质 体 内 包 的 胰 和 蛋白 酶 或 细胞 色素 c 的 释放 (Zhai et al. 2000) 。 在 此 基础 上 着 重 考察 了 tBid 诱 导 脂 质 体 泄漏 的 机 制 , 结 果 表 明 ,tBid 诱 导 内 容 物 泄 漏 的 程度 与 内 容 物 的 分 子 大 小 密切 相关 ,, 随 着 内 容 物 分 子 直径 增加 , 潭 漏 程度 明显 下 降 。 当 Bid 浓 度 恒 定时 , 增加 脂 质 体 的 浓度 也 会 ?| 起 污 漏 量 的 降低 。 磷 脂 酰 乙 醇 胺 或 胆固醇 可 以 显著 减弱 tBid 诱 SMA Atti. Sb, WRN Hay SCO PISS EE SE Ze), (Bid 能 够 插入 酸性 磷 AB ABREREZA RA eK CARRE, in ANE (ZEA ZE! 参照 了 Bi 的 三 维 结构 特 征 , 上述 实验 结果 提示 tBid 诱 导 脂 质 体 的 污 漏 可 能 是 该 砍 脂 膜 中 形成 孔道 的 结果 (Yan et al. 2003,Zhai et al. 2001) 。 此 外 ,tBid 还 能 引 走 (ARSE, Bid PRB IE 基 比 较 集 中 的 区 域 , 即 BH3 Dx Sai Frick 22 Bi XR (hydr bie cleft), Fi) Bcl-x, 和 Bid 的 突变 体 二 行 研究 ,进一步 推测 Bid 和 蛋白 的 BH3 区 域 和 “裂隙 区 域 可 能 分 别 与 引起 脂 " Hey jie Biomembranes 310 质 体 的 聚集 或 泄漏 密切 相关 (Zhai et al. 2001), 从 线粒体 内 外 膜 则 隙 中 释放 出 的 有 关 因 子 中 , 有 一 些 可 促进 caspase 的 活化 ,如 细 胞 色素 c、Smac/Diablo 和 OmiHtrA2 (Martinou et al. 2001, Suzuki et al. 2001, Meier et al. 2000), %—2EM| FES & A (KR Micaspase HI Jal LT i# 14, AUAIF (apoptosis inducing factor) (Susin et al. 1999a) 、 内 切 核 酸 酶 G (endonuclease G) (Lietal.2001) 等 。 此 外 , 线 粒 体 还 会 释放 其 他 一 些 组 分 , 如 IAP (inhibitors of apoptosis) (Goyal 2001), 、caspase-2、caspase-3 (Susin et al. 1999b ) caspase-8 (Qin et al. 2001), caspase-9 (Krajewski et al. 1999 ) 、 Hsp10, Hsp 60 (Samali et al. 1999) 4%, ‘EZEVAT PEA HIVE A. 除了 释放 凋 亡 因 子 外 , 线 粒 体 还 与 胞 内 Ca” 的 动态 平衡 、 活 性 氧 (ROS) 的 产生 、 caspase 的 定位 等 有 密切 关系 。 总 之 ,对 整个 细胞 来 说 ,线粒体 不 仅 具 有 传统 意义 上 的 功 能 , 它 在 细胞 调 它 中 的 作用 也 日 益 受 到 重视 。 但 是 ,线粒体 途径 在 哪些 类 型 细胞 凋 亡 中 占 主要 地 位 以 及 线粒体 在 多 大 程度 上 调控 调 它 , 其 精确 地 调控 机 制 又 是 怎样 的 , 这 些 还 有 待 于 更 多 的 研究 与 探索 。 26.2 细胞核 与 细 反 局 rs 核 DNA 损伤 启动 凋 亡 具有 非常 重要 的 生理 意义 。 实 验 发 现 , 假若 DNA 损伤 不 能 启 动 凋 亡 , 则 细胞 的 突变 率 比 正常 情况 高 1~2 个 数量 级 〈Totft et al. 1999) 。 不 过 , 不 同类 型 、 不 同 发 育 分 化 阶段 的 细胞 对 核 DNA 损伤 的 反应 并 不 同 , 核 DNA 损伤 并 非 必然 会 导 ey HHL. (Zhou et al. 2000, Rich et al. 2000), DNA 损伤 反应 主要 通过 3 个 步骤 完成 ; DNA 损伤 的 识别 、 评 估 和 完成 正确 的 损伤 反应 。 在 此 过 程 中 , 一 些 检验 点 (check point) 可 以 防止 受 损伤 的 基因 组 传递 , 在 损伤 应 激 反应 系统 中 起 着 关键 性 作用 (Hanahan et al. 2000 ) 。 细胞 利用 相对 少数 的 感受 器 分 子 就 能 有 效 地 检测 全 基因 组 范围 内 的 DNA 损 伤 。 妆 色 体 未 端的 端 粒 是 自然 发 生 的 DNA 双 链 断裂 。 当 疹 粒 过 短 时 ,有 一 个 检验 点 促使 细胞 衰老 BCVAIE = PtdIns-3-OH 激酶 家 族 的 ATM (ataxia telangiectasia mutated) 激酶 即 是 这 样 一 个 检验 点 的 激活 蛋 自 , 它 直接 结合 于 双 链 DNA 的 自由 未 端 , 这 个 家 族 的 成 员 还 包括 DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) 和 ATR (ataxia telangiectasia related) 激酶 。 它们 作为 检验 点 “感受 器 ”, 可 以 催化 网 状 的 磷酸 化 级 联 反应 , 将 损伤 信号 传递 给 调控 细 胞 周期 或 调 亡 的 分 子 。 DNA 损伤 识别 所 产生 的 多 个 同步 信号 传递 到 检验 点 ,由 该 系统 对 DNA 损伤 进行 评 估 , 从 而 对 细胞 命运 做 出 合适 的 决定 , 引发 DNA 损 伤 修复 或 细胞 凋 记 过程。 在 检验 点 中 , p53 是 参与 该 控制 机 制 的 一 个 重要 因子 (Sionov et al. 1999, Vogelstein et al. 2000), ATM, DNA-PK, ATR 等 激酶 使 p53 的 入 冰 丝 损 酸 残 基础 酸化 , 极 大 地 增强 了 其 活性 和 稳定 性 , 造成 p53 积累 。 事 实 上 , 在 大 多 数 自我 复制 的 细胞 种 群 中 ,p53 的 水 平 在 DNA 损伤 后 数 分 钟 内 就 增加 了 。 活化 后 的 p53 控 制 多 方面 的 DNA 损伤 反应 , 包括 阻止 细胞 分 裂 周 期 的 进行 、 诱 导 细 胞 凋 人 它 、 维 持 遗 传 稳定 性 和 抑制 血管 生成 等 。 迄 今 已 有 大 量 的 实验 证 据 表 明 ,,p53 是 通过 两 种 方式 诱导 调 亡 的 。 第 一 ,p53 作为 入 沙 因子 发 挥 作用 , 抑 制 至 少 一 种 Fidel) (Bel-2) 的 表达 , 而 更 重要 的 是 ,p53 诱 二 上 多 促 调 亡 和 蛋白 的 表达 , 包 括 以 下 几 类 : (! Bax、Noxa 和 了 PUMA (p53 up-regulated lulator of apoptosis) (Yu et al. 2001) “EB -2 家 族 成 员 , 以 及 Peg3/Pwl (Deng etal. 2 10) 和 ASC (apoptosis-associ- 311 #208 AN 5 AN ated speck-like protein) (Ohtsuka et al. 2004) , 它 们 促进 Bax 转移 至 线粒体 , 还 有 CD95、 DR5、Rpr (Drosophila) 等 调 亡 受 体 与 配 体 家 族 蛋 白 , (2) 线粒体 中 产生 活性 氧 (ROS) 的 酶 , OHH 2A Re (LA (Donald et al. 2001); (3) 一 种 定位 于 线粒体 基质 的 蛋白 p53AIP1, 其 过 量 表 达 引 起 线粒体 膜 电 位 的 消 失 和 调 亡 的 发 生 〈Oda et al. 2000) 。 这 几 种 和 蛋白质 都 可 引起 MMP, 这 是 核 DNA 损伤 导致 调 亡 反应 的 主要 途径 。 此 外 ,p53 还 增加 Apaf-1 的 表达 , 有 利于 细胞 色素 < 诱导 的 caspase 活化 (Moroni et al. 2001), p53 也 诱导 表达 质 膜 跨 膜 蛋白 PERP (p53 apoptosis effector related to PMP-22) (Attardi et al. 2000), MIC-1 (分 刻 的 TGF-B 样 细胞 因子 ) 以 及 IGF-BP3 (分 泌 的 存活 因子 IGF-1 的 结合 蛋白) 。 另 外 , p53 也 诱导 MDM2 (人 源 的 同 源 和 蛋白 为 hDM2) 的 表达 , 该 蛋白 促进 p53 被 和 蛋白酶 体 降 解 ,使 p53 信号 受到 精细 的 控制 。 第 二 ,p53 转移 至 细胞 质 中 , 不 作为 转录 因子 而 诱导 调 LE. FEan, p53 可 能 转移 至 线粒体 , 定 位 于 线粒体 表面 或 者 内 部 , 与 Hsp70 相互 作用 (Marchenko et al. 2000) , 它 也 有 类 似 Bid 的 功能 , 可 激活 Bax 引起 MMP (Chipuk et al. 2004)。 另 有 实验 指出 ,p53 诱导 的 调 亡 可 能 是 通过 溶 酶 体 一 线粒体 途径 发 生 , 线 粒 体 MMP 和 膜 电 位 降低 发 生 在 溶 酶 体 膜 被 扰动 之 后 (Yuan et al. 2002) 。 与 此 类 似 , 扳 儿 核 受 体 (orphan nuclear receptor) Nur77/TR3 能 够 转移 到 线粒体 引起 MMP (Li et al. 2000); 最 近 还 发 现 ,该 受 体 的 配 体 结 合 结构 域 可 以 与 Bcl-2 结 合 , 引 起 Bcl-2 的 BH3 结构 域 暴 露 mes AVL A (Lin et al. 2004) 。 fe DNA 损伤 导致 调 亡 反应 的 途径 中 ,ATM 激酶 的 另 一 个 底 物 是 一 种 类 似 Src AS 氨 酸 激酶 c-Abl, 这 个 因子 可 以 分 布 于 核 内 和 细胞 质 中 。 在 细胞 质 中 ,c-Abl 抑制 一 条 重 要 的 细胞 存活 途径 , 即 PI(3)K 通过 蛋白 激酶 B/Akt 使 Bad 磷酸 化 从 而 抑制 Bad 活性 的 途 径 。 在 细胞 核 内 ,ATM Fil DNA-PK 可 以 激活 c-Abl, 后 者 可 转移 至 线粒体 , 引 起 细胞 凋 [ (Kumar et al. 2001)。 此 外 , 在 癌变 的 细胞 中 ,RhoB 参与 调节 DNA 损伤 引起 的 调 亡 反应 (Liu et al. 2001) 。 近 来 还 发 现 了 一 条 重要 的 调 亡 途径 , 即 DNA 损伤 可 以 激活 定位 于 细胞 核 的 procaspase-2, 活 化 的 caspase-2 导致 细胞 色素 c 的 释放 和 调 亡 小 体 的 形成 (Lassus et al. 2002) 。 由 此 看 来 , DNA 损伤 诱导 细胞 凋 亡 的 信号 途径 十 分 复杂 。 那么 , 在 细胞 核 中 是 否 存在 着 类 似 于 细胞 质 内 的 调 亡 小 体 (apoptosome) 整 合 核 内 的 调 亡 信 号 呢 ? 细胞 核 内 存在 着 众多 的 核 复合 体 , 它 们 负责 完成 许多 细胞 核 功 能 , 其 中 一 些 可 能 参与 调 TAN DNA 修复 , 如 PML 体 (根据 一 种 癌变 即 promyelocytic leukaemia 命名 , 在 这 种 癌 变 发 生 时 观察 到 PML 体 结构 被 破坏 )。PML 体 可 以 和 一 种 转录 抑制 因子 DAXX 协 同 作用 (Zhong et al. 2000) ,也 可 能 通过 调节 p53 乙 酰 化 控制 细胞 凋 亡 的 发 生 (Pearson et al. 2000) , 关于 线粒体 、 细 胞 核 参 与 细胞 凋 亡 途径 以 及 它们 之 间 的 相互 作用 可 见 图 26-1。 26.3 I (a5 ¥ Ca” WIA. PARAM B.A EY) o) (ER) 的 主要 功能 , 这 些 功 能 受到 扰乱 都 能 形成 ER Wi, CEP AST BS 胞 调 亡 。ER 参与 细胞 凋 亡 的 启动 通过 至 少 两 种 不 同 的 机 制 , 即 应 对 未 能 正确 折 (Ji (unfolded protein response, UPR) 和 Ca 信号 (Patil et al. 2001, Kaufm is 26.3.1 应 对 ACHE LE ADT Ft HY I 5 aoyvalc EE ee 积 AE ER IEA AY ATE LE DT eA RARE PRY, 如 ER 内 的 分 子 伴 > HE %y WR Biomembranes 312 Serpins Caspase -8, Caspase-3, Cystatins Granzyme B, Calpain — ‘ ; i dala P ; 死亡 受 体 和 配 体 Bel-2/Bel-X, CASCADE | | | | mmp CASPASE ) | | SS eg G a IAPs vie oe CASPASE CASCADE ee See i) StS ecceteccccsteausas Seer, ANTS Ss HMMA IE Be ECA EA 在 哺乳 动物 中 , Pr neato df, 图 中 显示 : (1) 细胞 外 死亡 受 体 途径 , 死亡 受 体 的 激活 导致 procaspase-8 (JS 动 型 caspase) 活化 , 在 I 型 细胞 中 , 直 接 活 化 下 游 效应 型 caspase (caspase-3 等 ) ;或 者 在 开 型 细胞 中 , 通 过 剪 切 Bid 引起 MMP, 释 放 几 种 线粒体 膜 间隙 可 溶性 蛋白 , 活 化 下 游 效 应 型 caspase。(2) 线粒体 调节 的 途径 , 细 胞 内 的 死亡 信号 (ae DNA 损 伤 ) 直接 或 间接 作用 于 线粒体 , 引起 MMP。 这 可 能 导致 调 亡 小 体 的 形成 , caspase 活 化 , 也 可 能 通过 不 依赖 于 caspase -和 eA VAT, Bll AIF 和 Endo G 转移 到 核 内 , 引 起 染色 体 固 缩 , 并 出 现 高 分 子 量 染 色 体 片 段 。(3) caspase-2 依赖 的 途 2, DNA 损伤 导致 procaspase-2 活化 , 引 起 细胞 色素 < 释放 和 调 亡 小 体 的 形成 。 在 凋 亡 过 程 中 , 细 胞 核 与 线粒体 之 间 有 密切 的 相互 作用 455: CoQ, , 辅 酶 Q; Cytc, 细 胞 色素 c; Endo G, 内 切 核 酶 酶 G; MMP, 线 粒 体 膜 通 透 性 , PTP, 通 透 性 改变 孔道 ; ROS, 活性 氧 类 ;SIMPs, 膜 间 可 溶性 蛋白 ,tBid, 被 剪 切 的 Bid 侣 Bip/Grp78、ER 跨 膜 蛋白 (protein kinase R-like ER kinase, PERK) 和 ATF-6。 在 感受 ER 胁迫 后 ,Bip/Grp78 与 两 种 ER APS HB Ser/Thr 蛋白 激酶 (Irel-c Fl Irel-B) 解 离 , 后 两 者 自发 寡 聚 化 并 发 生 反 式 自 磷 酸化 。 其 中 ,Irel-B 可 剪 切 28S rRNA, 抑 制 蛋白 质 合 成 Irel-w 可 以 通过 几 条 途径 起 作用 : (1) 幕 集 接 头 蛋 白 TRAF2 (TNF-receptor-associated factor 2), 活 化 JNK 途径 , 有 利于 细胞 发 生 凋 亡 反 应 ; (2) 经 酶 切 产 生 的 胞 质 结 构 域 转移 到 核 内 。 在 UPR 的 过 程 中 , — AACA ME, 5 eRe Alf elF 20. 的 磷酸 化 ,全面 降低 蛋白 质 的 合成 。 与 Bip/Grp78 解 离 厂 ATF-6 转 移 至 高 尔 基体 上 被 剪 切 笑 化 ,与 rel-a 的 情况 相似 , 其 胞 质 结构 域 转移 到 核 “, 促 进 基 因 (在 启动 子 区 域 有 313 % 208 Anz 5 AWA ER 胁迫 元 件 ) 的 表达 , 其 中 包括 分 子 伴 但 〈 如 Bip/Grp78 fil calreticulin) 及 一 个 转 孙 因 子 CHOP/GADD153 , 后 者 降低 Bcl-2 的 表达 而 引起 凋 记 (Shen et al. 2002, Ma et al. 2001 ) 。 Caspase-12 是 ER 参与 细胞 调 亡 调节 的 另 一 个 重要 因子 。 它 是 在 小 鼠 中 发 现 的 、 特异 的 位 于 ER 胞 质 侧 的 caspase, 其 前 体 在 受到 ER 胁迫 或 者 细胞 内 Ca 库 动 员 后 发 生活 化 , 而 在 线粒体 途径 或 死亡 受 体 途 径 中 起 作用 的 刺激 因子 则 不 能 够 引起 caspase-12 的 激活 (Nakagawa et al. 2000a) 。 随 后 的 实验 表明 Ca 依赖 性 的 蛋白 酶 m-calpain 以 及 胞 质 中 的 caspase-7 能 够 激活 内 质 网 上 的 caspase-12 前 体 , 激活 后 的 caspase-12 可 以 转运 到 胞 质 中 与 caspase-9 介 导 的 调 它 过 程 相 结合 ,完成 凋 它 反应 (Rao et al. 2001, Nakagawa et al. 2000b) 。 在 UPR 中 ,Irel-o 结 合 胞 质 接 头 蛋白 TRAF-2 与 procaspase-12 相互 作用 , 促 进 其 聚集 而 活化 (Yoneda et al. 2001) 。 在 ER 胁迫 条 件 下 , 位 于 ER 的 Bax 和 了 Bak 发 生 构象 变化 和 BERL, Be Ca 排 空 和 procaspase-12 活化 , 局 动 调 亡 (Zong et al. 2003 ) 。 实 验 还 表 明 caspase-12 这 一 途径 可 能 与 阿尔 欧 海 默 病 (Alzheimer’s disease) 有 密切 关系 (Mehmet etal. 2000) , 因 此 进一步 阐明 其 机 制 , 还 将 在 医药 方面 具有 广阔 的 应 用 前 景 。 765.2 Ca" SAAT ALN i SHC SE _ a Ca 是 真 核 细胞 内 重要 的 信号 传导 因子 , 它 的 稳 态 平衡 对 细胞 维持 正常 生理 活动 具 有 举足轻重 的 作用 。 细 胞 Ca 过 载 或 胞 内 C 呈 区 室 化 分 布 的 微 扰 都 会 导致 细胞 异常 , 从 而 引起 调 亡 或 坏死 , 甚 至 死亡 细胞 的 清除 也 依赖 于 Ca” (Orrenius et al. 2003 ) 。 作 为 细 胞 内 重要 的 钙 库 ,ER 在 Ca 调 亡 信 号 的 产生 中 有 着 重要 作用 ,ER 内 Ca 浓度 的 稳 态 平 衡 被 扰乱 以 及 Ca 六 从 ER 迅速 释放 都 可 引起 调 它 (Berridge et al. 2000,Liet al. 1999) 。 胞 质 中 Ca 深度 升 高 来 源 于 细胞 外 Ca Ae A E522 (AN ER) 的 钙 释 放 ,ER 内 Ca?* 以 游离 或 结合 [与 钙 网 蛋白 (calreticulin) 、 钙 联 蛋 白 (calnexin) 等 相 结合 ] 的 形式 存在 , 受到 肌 浆 网 /内 质 网 Ca*-ATPase、1, 4, 5- 三 磷酸 肌 醇 受 体 (InsP;R) 、 雷 诺 丁 (ryanodine) 受 体 等 的 调控 , 所 以 , 改 变 这 些 蛋 白 的 活性 或 表达 水 平 就 可 以 影响 细胞 凋 亡 。Ca+ 信和 号 通过 很 多 作用 对 象 ?| 起 细胞 调 亡 , 如 钙 调 磷酸 酶 (calcineurin) (Ca**/ 钙 调 蛋白 活化 的 蛋 白 磷 酸 酶 )、NO 合 酶 (nitric oxide synthase) (在 内 皮 细 胞 或 神经 元 中 受 Ca 活化 的 酶 , 俊 化 生成 NO) 、 核 酸 内 切 酶 、 磷 脂 酶 (如 磷脂 酶 A2, 是 Ca 依赖 性 的 酶 , 催 化 产生 花生 四 烯 酸 及 相关 的 多 不 人 饱和 脂肪 酸 )、 谷 氨 酰 胺 转移 酶 (transglutaminase, {he Ca 六 依赖 性 的 酶 , 能 催化 调 亡 细 胞 中 蛋白 质 的 交 联 ) 以 及 蛋白 水 解 酶 (protease, 包 括 Ca 活化 的 calpains Rik, 2AM RAMS) 等 。 已 经 发 现 calpains、caspase 与 其 他 蛋白 酶 之 间 有 着 很 多 的 联系 ,因此 从 Ca 信号 到 caspase 活 化 和 调 亡 发 生 有 许多 途径 , i HL, UPR 和 Ca: 信 号 之 间 存 在 相互 联系 〈EFerri et al. 2001a) 。 比 如 , 抑 制 Bip/Grp78 的 表达 可 以 增加 ER 内 Ca 排 空 ?| 起 的 调 记 ;UPR 会 上 调 钙 网 蛋白 的 表达 , 而 钙 网 蛋白 过 表达 则 易 发 生 凋 亡 。 ER 钙 库 还 受到 其 他 许多 蛋白 因子 的 调控 : (1) Bcl-” 家 族 到 与 其 相互 作用 的 蛋白 。 fal C2 az A Bel-247 48 FERAL, 可 以 调节 内 质 网 腔 中 符 ” 离 Ca 浓度 , 使 胞 质 中 的 Ca 维持 在 合适 的 中 等 浓度 水 平 , 从 而 抑制 调 它 (Pinton et )1)。Bax 和 Bak 也 定位 于 ER, 参 与 控制 Ca2+ 稳 态 平衡 (Scorrano et al. 2003) 。 FER 膜 重 白 与 Bcl-2 家 族 的 蛋白 相互 作用 会 影响 调 它 过 程 , 这 包括 Bax 抑制 因子 sAP31 (Bcl-2-associated pro- tein-31, jf ZF HIG procaspase-8, Bcl-X,, Bcl-2“ HEA) Allreticulon (RTN) 家 族 的 《 员 。Spike 是 一 种 新 发 现 的 BH3-only 蛋白 , t fF ER_E, fet] BAP31 与 Le Va HE y fie Biomembranes 314 Bel-X, 结合 。caspase-8 FIV, 891) BAP31, FON vim Bete F ER, iit 5 |e fa A4 放 Ca® i SVAL- (Breckenridge et al. 2003), Reticulon (RTN) 家 族 的 成 员 (如 了 RIN1-C、 RTN-X;) 49 Becl-X,, Bel-2 定位 于 ER, 抑 制 其 抗 凋 亡 活 性 (Tagami et al. 2000), (2) caspase, 它 们 可 能 是 作用 于 Ca” 信号 系统 的 关键 成 员 , 如 caspase-3 可 以 剪 切 内 质 网 膜 InsP;R、 质 膜 上 的 Ca-ATPase 和 Na7Ca 交换 体 等 , 从 而 扰动 细胞 内 的 Ca 动态 平衡 。 ER 和 线粒体 之 间 的 相互 作用 是 细胞 调 亡 进程 中 早期 发 生 的 事件 。ER- 线 粒 体 之 间 的 Ca 流动 对 调 亡 信 号 的 传递 十 分 重要 , 而 线粒体 在 Ca 调节 的 细胞 凋 亡 程 序 中 发 挥 着 中 心 作 用 。ER 和 线粒体 之 间 在 某 些 位 置 上 存在 紧密 而 稳定 的 相互 作用 (Hajnoczky et al. 1995) ,这 使 ER 中 的 Ca 能 够 在 短 时 间 内 转移 至 线粒体 , 从 而 迅速 改变 线粒体 中 Ca 的 平衡 , 引 起 调 记 反应 (Newmeyer et al. 2003, Filippin et al. 2003), ER- 线粒体 之 间 的 通 信和 可 能 受到 Bcl-2 家 族 的 蛋白 的 调节 (Thomenius et al. 2003), HbA, Ca” 信号 怎么 导致 线粒体 膜 通 透 性 (MMP) 改变 呢 ? 除了 和 钙 调 磅 酸 酶 催化 Bad 去 磷酸 化 外 , 目 前 尚未 发 现 Ca 信号 直接 作用 于 别 的 Bcl-2 家 族 的 蛋白 。 在 各 种 类 型 的 细胞 中 ,Ca 信号 导致 凋 亡 的 一 个 重要 机 制 是 促使 通 透 性 改变 孔道 (permeability transition pore, PTP) 开放 。PTP 位 于 线粒体 内 外 膜 连 接 处 , 其 确切 的 结构 和 组 成 沿 不 清楚 , 它 至 少 由 以 下 成 员 构 成 : 电压 依赖 性 阴离子 通道 (voltage dependent anion channel,VDAC, 又 称 膜 孔 蛋 自 ,Pporin )、 Hee 46 iz (adenine nucleotide translocase,ANT)、 亲 环 蛋 白 D (cyclophilin D,CyP- D) 边 周 型 茱 二 氮 杂 昔 受 体 (peripheral benzodiazepin receptor, PBR) 、 肌 酸 激酶 (creatine kinase,CK) 、 己 糖 激酶 II (hexokinase Il) 等 (Crompton 1999), PTP 是 一 个 电压 依赖 性 通道 , 其 开放 受到 很 多 因素 的 影响 ,包括 基质 中 高 浓度 的 Ca、 氧 自由 基 、 吡 喧 核 苷 酸 氧化 、 碱 化 、 低 跨 膜 电 位 等 。PTP 在 正常 的 生理 条 件 下 可 以 以 低 通 透 性 方式 开放 (Ichas etal. 1997) , 造 成 线粒体 膜 电 势 的 降低 , 引 起 钙 诱 导 的 线粒体 钙 释 放 (Ca**-induced Ca release from mitochondria, mCICR) 及 降低 自由 基 的 损伤 , 而 当 PTP 以 高 通 透 性 方式 开 放 时 , 会 造成 MMP, 从 而 释放 促 调 亡 的 线粒体 蛋白 (Marchetti et al. 1996) 。 凋 亡 刺 激 物 (特别 是 神经 酰胺 ) 可 以 促进 Ca 引起 的 MMP (Szalai et al. 1999) 。 同 时 ,PTP 还 是 Bcl-2 家 族 的 蛋白 发 挥 作用 的 靶 位 点 之 一 。Bcl-2 可 抑制 PITP 的 开放 (Marzo et al. 1998a ) , Bax、Bak 则 可 以 与 ANT、VDAC 等 作用 , 促 进 PTP 的 开放 (Marzo et al. 1998b) , 此 外 , tBid 还 刺激 线粒体 摄 入 Ca (Orrenius et al. 2003) 。 另外 ,Ca 还 与 心 磷 脂 相互 作用 , 导 致 膜 脂 流动 性 降低 , 形 成 富 含 心 磷脂 的 膜 微 区 和 和 蛋白质 的 聚集 , 增 加 ROS 的 产生 , 膜 脂 和 膜 蛋白 发 生 氧 化 , 从 而 导致 MMP, oR 的 过 氧化 也 有 利于 细胞 色素 c 的 解 离 和 释放 (Ott et al. 2002) 。 最 近 发 现 , 少 量 细胞 色素 c 从 线粒体 中 释放 出 来 后 , 可 以 结合 InsP3R,, 触发 Ca- 的 释放 , 这 样 形成 一 个 正 反 馈 , 促 进 大 量 细胞 色素 < 和 释放, 增强 了 依赖 Ca# 的 细胞 负 记 (Boehning et al. 2003 ) 。 有 一 种 内 切 核酸 酶 GAAD (granzyme A-activated DNase, 已 知 为 NM23-H1) 参与 一 条 不 依赖 于 caspase 而 是 由 粒 酶 A (granzyme A) 调节 的 调 它 信号 途径 。GAAD 的 抑制 因子 IGAAD (inhibitor of GAAD, 也 称 为 SET 复合 体 ) 结合 GAAD 并 定位 于 ER 上 , IGAAD 复合 体 中 的 因子 被 粒 酶 A 剪 切 后 释放 并 话 化 GAAD , 后 兰 转 移 至 细胞 核 内 引起 单 链 DNA 缺失 和 调 亡 -形态 (Fan et al. 2003)。 关 于 ER 参与 细胞 户 , 途 径 及 其 与 线粒体 之 间 的 相互 Ve FA UAL] 2¢ 315 和 20% An SAN A Caspase -12 > activation qusnae? esovee® 闻 四 e 4, 二 一 Ca Baas . | =P caspase-8 Ne Calcineurin 5 Nitric oxide synthase Wh, Endonucleases Phospholipases Transglutaminases Proteases Calpain o, Calreticulin ER 参与 细胞 凋 亡 途径 及 其 与 线粒体 、 细 胞 核 之 间 的 相互 作用 ER 参与 细胞 凋 亡 的 启动 通过 至 少 两 种 不 同 的 机 制 , 即 UPR 和 Ca: 信号, 两 者 之 间 存在 相互 联系 。 从 Ca” 信号 到 MMP 发 生 和 caspase 活 化 有 许多 途径 。ER 与 线粒体 、 细 胞 核 之 间 有 密切 的 相互 作用 , 细胞 对 ER 胁迫 的 反应 最 终 导 致 MMP 和 caspase 活化 。 在 本 图 中 还 显示 粒 酶 A 调节 一 条 不 依赖 于 caspase 的 细胞 凋 亡 途径 。 粒 酶 A 通 过 Ca2 依赖 性 的 、perforin 调节 的 孔道 进入 胞 内 , 活 化 ER 上 的 GAAD/NM23-H1, 后 者 转移 至 核 内 剪 切 DNA 455. Cyt.c, 细胞 色素 c; GAAD, 粒 酶 A 活 化 的 DNase; IGAAD, GAAD 的 抑制 剂 ,ImsP3R, 1,4,5- 三 磷酸 肌 醇 受 体 ,MMP, 线粒体 膜 通 透 性 ;, PTP, 通 透 性 改变 孔道 ,ROS, 活性 氧 类 ,RyR, 雷诺 丁 受 体 ,SERCA, 肌 浆 网 /内 质 网 膜 Ca”-ATP 酶 ; UPR, PAPAS HE IE Wath AY Ze A Mit 26.4 i ARYR TS FIN es 迄今 我 们 还 不 清楚 哪些 是 高 尔 基体 (Golgi complex) 特异 的 胁迫 , 以 及 高 尔 基 体 如 何在 凋 亡 的 调控 中 起 到 胁迫 感应 器 的 作用 。 高 尔 基体 膜 的 结构 可 能 对 膜 脂 组 成 非常 敏感 , 例如 增加 神经 酰胺 的 含量 就 能 破坏 高 尔 基体 的 膜 运 送 , 其 他 高 尔 基 体 胁 迫 可 能 包括 病毒 的 装配 、pH 或 阳离子 含量 的 变化 。 高 尔 基体 膜 富 含 促 凋 亡 的 信号 分 子 , 包 括 caspase-2、 死亡 受 体 (如 TNE-R1、CD95、TRAIL-R1、TRAIL-R2)、HICJK,Beclin 和 GD3 合成 酶 (a-2, 8-sialytransferase) , 这 些 分 子 以 不 同 的 通路 参与 细 ” 3 亡 的 调控 。 位 于 高 尔 基体 上 的 BRUCE (baculoviral ITAP-repeat-containing ubiquitin- ating enzyme) 可 能 是 一 种 IAP (inhibitor of apoptosis) , 它 能 抑制 caspase-2 的 活化 iooy et al. 2002) 。 高 尔 基 体 上 的 蛋白 质 被 caspase 剪 切 后 可 以 诱导 凋 亡 。 与 内 质 网 A ”让 似 ,位 于 高 尔 基体 的 golgin- 160 (casrsse-2 的 底 物 ) (Mancini et al. 2000) 和 Ppl115 spases-3, caspases-8 的 底 物 )、 Ire HE ii Biomembranes 316 (Chiu et al. 2002) #89 D) aH FES BAIA, AR SAL. p53 活化 可 促使 CD95 AY a> Fi Mes RE AS FS Te WG, WA re AR SE AB AY PA kk ck FE AAI (Bennett et al. 1998) , GD3 合成 酶 能 使 神经 酰胺 转变 为 GD3, 后 者 是 一 种 重要 的 凋 亡 信号 分 子 , 可 引起 线粒体 MMP (Malisan et al. 2002 ) 。 关 于 高 尔 基 体 参 与 细胞 凋 亡 的 途径 见 图 26-3。 低 强 度 胁迫 Lysosomotropic agents, Death receptors, hv , Growth factor starvation, ROS CASPASE CASCADE is ae, TNF- . Golgin -160 ” 一 和 Caspase-8 Caspase-8 | Caspase -3 ¥ 名 区 县 〗 高 尔 基 体 、 溶 酶 体 参 与 细胞 凋 亡 途 径 及 其 与 线粒体 、 细 胞 核 之 间 的 相互 作用 高 尔 基 体 膜 舍 有 促 调 亡 的 信号 分 子 , 高 尔 基 体 的 蛋白 质 (如 golgin-160 Fil p115) 被 caspase 剪 切 后 可 以 诱导 调 亡 。 溶 酶 体 当 受 到 低 强 度 的 胁迫 时 , 溶 酶 体 膜 通 透 性 发 生 改变 , 导 致 溶 酶 体 中 的 蛋白 酶 释放 出 来 , 在 胞 质 中 直接 或 间接 的 作用 于 线 粒 体 , 从 而 形成 一 条 从 溶 酶 体 到 线粒体 的 调 亡 途径 。Bid 可 能 是 这 条 途径 中 关键 的 胞 质 因 子 。 由 高 尔 基体 、 溶 酶 体 启动 的 调 亡 反应 最 终 导致 线粒体 MMP 或 caspase 活化 缩写 : BRUCE, baculoviral IAP-repeat containing ubiquitin conjugating enzyme; MMP, 线 粒 体 膜 通 透 性 ; tBid, 被 剪 切 的 Bid 26.5 ” 溶 酶 休 与 细 有 反 肌 六 SS 溶 酶 体 (lysosome) 是 内 含 酸 性 水 解 酶 的 膜 包 小 泡 , 它 们 被 称 为 细胞 内 的 “自杀 包 (suicide bag)”, 因 为 溶 酶 体 中 含有 脂 酶 、 和 蛋白 酶 、 核 酸 酶 、 糖 荐 酶 等 很 多 种 可 非特 异性 降解 大 分 子 的 水 解 酶 , 凡 与 溶 酶 体 融 合 的 吞噬 小 泡 中 内 含 的 代谢 产物 经 由 这 些 水 解 酶 作 用 后 均 可 降解 成 小 分 子 , 从 而 在 维护 机 体 的 正 篆 生理 代谢 中 起 重要 作用 。 溶 酶 体 在 细胞 自力 死亡 中 起 到 重要 作用 , 也 参与 调 亡 细胞 的 降解 过 程 (Ferri et al. 2001b)。 近 年 来 , 发 现 溶 酶 体 在 诱发 细胞 调 亡 中 也 可 能 有 重要 作用 (Brunk ct al. 2001, Bursch 2001), , 例 如 , 由 氧化 胁迫 、 生 长 因子 缺乏 、Eas 话 化 、 亲 溶 酶 体 的 去 二 剂 样 分 子 (在 JurketT 细 胞 内 )、 TNF-a FUE 3 (CERF ANA) 等 诱导 的 或 p53 调 节 (在 M -Lp53 骨 髓 白血病 细胞 内 ) (Yuan t al. 2002) 的 细胞 调 它 中 , 溶 酶 体 泄 漏 是 这 一 过 程 的 生 四 事件 。 317 9 20 # sna SMA 溶 酶 体 功能 是 通过 它 内 包 的 各 种 水 解 酶 的 活性 来 实现 的 。 在 发 现 溶 酶 体 与 细胞 凋 亡 有 关 的 过 程 中 , 一 类 被 称 为 组 织 和 蛋白 酶 (cathepsin) 的 水 解 酶 3| 起 了 关注 ,特别 是 其 中 的 半 胱 氨 酸 类 和 蛋白酶 〈 如 组 织 和 蛋白 酶 B、 孔 、L) 和 天 冬 氨 酸 类 和 蛋白酶 〈 如 组 织 蛋 白 酶 D) 成 为 研究 的 焦点 。 溶 酶 体 中 的 半 胱 气 酸 类 蛋白酶 是 木瓜 蛋白 酶 家 族 (papain family) 中 的 —2#, CFALEAR POA ENA 11 (AAS ABB. H. L. S, C. K. O, F, V、X、W)。 Kee ERE ACHAEA ATES EE, TERRE IE PF A aK 在 其 他 蛋白 酶 的 作用 下 被 激活 ,其 活性 受到 pH 值 和 内 源 性 抑制 剂 的 调控 (Turk et al. 2001, Turk et al. 1997) 。 这 些 抑制 剂 包括 : 半 胱 所 酸 和 蛋白 酶 抑制 剂 (stefin, cystatin, kininogen) , thyropin 和 一 般 性 的 蛋白 酶 抑制 剂 gc-macroglobulin。stefin 是 胞 内 抑制 剂 , 而 cystatin 和 kininogen 是 胞 外 的 , 它 们 都 不 抑制 caspase 的 活性 (Stoka et al. 2001) 。 值 得 指出 的 是 , 通常 所 用 的 caspase 抑 制剂 Z-VAD-fmk 能 有 效 地 抑制 溶 酶 体 半 胱 氨 酸 和 蛋白酶 (Schotte et al. 1999), 这 提示 需要 重新 认识 细胞 凋 亡 中 caspase 和 组 织 蛋 白 酶 的 作用 。 随 着 研究 的 深入 , 人 们 认识 到 溶 酶 体 里 的 组 织 蛋 白 酶 并 不 仅仅 扮演 着 “清道 夫 ” 的 角色 , 它们 可 能 通过 其 特 异性 的 水 解 活 力 在 更 多 的 反应 中 发 挥 功能 。 有 哪些 组 织 蛋 白 酶 参与 到 调 亡 中 以 及 它们 如 何 发 挥 作用 , 仍 有 待 于 次 入 研究 。 体内 和 体外 的 实验 已 经 表明 , 当 细胞 或 溶 酶 体 受到 调 亡 因子 胁迫 时 , 某 些 组 织 和 蛋白 酶 会 从 溶 酶 体 转 移 到 胞 质 中 , 引发 调 它 , 这 种 激活 能 够 被 组 织 蛋白 酶 的 特异 性 抑制 剂 所 阻止 。 看 来 , 很 多 溶 酶 体 中 的 组 织 和 蛋白 酶 可 能 诱导 细胞 调 亡 , 在 不 同类 型 的 细胞 凋 亡 中 可 能 会 有 不 同 的 组 织 和 蛋白 酶 参与 , 如 组 织 蛋白 酶 D (Roberg 2001, Deiss et al. 1996) 、 组 织 蛋 白 酶 B (Guicciardi et al. 2000, Vancompernolle et al. 1998) 等 能 各 自 引 发 调 亡 。 溶 酶 体 的 鞘 磷脂 酶 (sphingomyelinase) 可 以 催化 产生 神经 酰胺 , 促 进 组 组 蛋白 酶 D 的 自 水 解 而 活化 (Heinrich et al. 1999) 。 组 织 蛋 白 酶 C 参 与 细胞 毒性 工 细胞 粒 酶 B 的 活化 , 从 而 间接 激活 caspase (Pham et al. 1999) 。 组 织 蛋 白 酶 的 抑制 剂 stefin B 的 突变 引起 Unverricht-Lundborg 疾 病 (一 种 常 染 色 体 隐 性 遗传 形式 的 癌 痢 症 ) 和 小 脑 细 胞 凋 T (Pennacchio et al. 1998) 。 在 视网膜 色素 上 皮 细 胞 中 , 溶 酶 体 脂 褐 素 (lipofuscin) 的 成 分 之 一 可 引起 细胞 色素 c 的 释放 (Suter et al. 2000 ) 。 溶 酶 体 是 由 单 层 膜 包 被 的 细胞 器 , 其 内 包 的 蛋白 水 解 酶 如 何 能 参与 到 细胞 凋 亡 的 调 探 过 程 , 这 涉及 两 方面 的 问题 : 蛋白 水 解 酶 如 何 从 溶 酶 体 中 释放 到 胞 质 内 , 有 哪些 下 游 事件 发 生 。 特异 性 的 细胞 凋 亡 过 程 如 何 由 包含 有 非特 异性 水 解 酶 的 溶 酶 体 来 完成 , 这 是 一 个 尤 其 值得 关注 的 问题 【Leist et al. 2001 ) 。 一 种 可 能 性 是 组 织 蛋 白 酶 选择 性 地 从 溶 酶 体 转 移 至 胞 质 , 当 用 能 够 引起 线粒体 细胞 色素 c 释放 的 苍术 苷 (atractyloside) 处 理 溶 酶 体 时 , 也 可 以 导致 组 织 蛋 白 酶 B 的 释放 (Vancompernolle et al. 1998) 。 抑 制 凋 亡 的 Bcl-2 蛋白 可 以 保护 由 氧化 剂 ?| 起 的 溶 酶 体 泄漏 , 它 的 磷酸 化 对 于 阻 目 溶 酶 体 泄漏 及 进一步 的 调 亡 也 是 必需 的 (Zhao et al. 2003), caspase-8 可 以 在 体外 引起 仿 离 的 溶 酶 体 释 放 组 织 蛋 白 酶 B (Guicciardi et al. 2000) , 这 些 提 示 线 粒 体 与 溶 酶 体 可 昌 似 的 刘 漏 机 制 , 当 然 并 不 排除 溶 酶 体 以 完全 不 同 的 方式 释放 水 解 酶 。 另 一 种 可 能 双 枉 体 膜 的 破裂 程度 与 胁迫 因子 的 浓度 有 关 , 也 就 是 说 , 当 受 到 低 强 度 的 胁迫 时 ,,: 溶 酶 体 的 膜 变 得 不 稳定 , AK 而 非 选 择 性 的 释放 有 限 种 类 的 水 解 酶 到 胞 质 中 , 参 与 ; 当 受 到 高 强度 的 胁迫 时 , 溶 RA 站 , 水 解 酶 全 部 释放 , 引 起 细胞 坏死 。 Wy pee | HE Hy fi Biomembranes 318 释放 到 胞 质 中 的 组 织 蛋 白 酶 通过 怎样 的 途径 行使 功能 呢 ? 最 近 有 报道 , ZETNF-ai% 导 的 肝 细 胞 凋 亡 中 ,caspase-8 可 引起 溶 酶 体 组 织 和 蛋白 酶 B 的 泄漏 ,积累 在 胞 质 中 的 组 织 蛋白 酶 B 能 促进 线粒体 细胞 色素 c 的 释放 , 并 且 在 有 胞 质 存 在 时 组 织 蛋 白 酶 B 引 起 细胞 色素 c 释 放 的 效率 远大 于 纯化 的 组 织 蛋 白 酶 B 的 效率 , 这 提示 组 织 和 蛋白 酶 了 可 能 激活 了 胞 质 中 的 未 知 调 亡 因 子 , 这 种 因子 会 作用 于 线粒体 , 引 起 细胞 色素 < 的 释放 (Salvesen 2001, Guicciard et al. 2000) 。 也 有 实验 提示 组 织 和 蛋白 酶 B 可 前 切 核 DNA、 话 化 caspase- 11 (Schotte et al. 1998) Mii, 21243: A eS caspases 活化 之 间 似 乎 并 无 直接 联系 , 因 为 在 体外 溶 酶 体 抽 提 物 不 能 激活 caspase-2、3、6、8、9 等 。 胞 质 中 的 未 知 因子 还 有 待 进 一 步 研究 , 但 有 人 猜测 其 中 很 可 能 包括 Bcl-2 家族 中 的 Bid, 因 为 Bid 已 被 证 明 可 被 溶 酶 体 中 的 水 解 酶 酶 切 为 有 活性 的 片段 ,引起 线粒体 MMP (Reiners 2002, Stoka et al. 2001 ) 。 后 来 , 研究 了 溶 酶 体 中 一 些 已 知 的 组 织 和 蛋白 酶 对 Bid 的 剪 切 , 结果 表明 在 中 性 条 件 下 , 组 织 和 蛋白 酶 B、 了 _、L、S$ 和 开 都 可 以 在 Bid 蛋白 的 loop 区 将 其 剪 切 , 其 主要 剪 切 位 点 在 第 65 freA AS Res 而 同属 于 半 胱 氢 酸 蛋白 酶 类 的 组 织 蛋 白 酶 C、X 以 及 属于 天 冬 氢 酸 和 蛋白 酶 类 的 组 织 蛋 白 酶 D 则 没有 这 种 剪 切 活性 。 经 组 织 和 蛋白 酶 B、H、L 或 $ 剪 切 后 的 Bid 片 段 都 可 以 引起 线粒体 中 细胞 色素 c 的 快速 释放 〈Cirman et al. 2003) 。 近 来 有 更 多 的 证 据 表明 溶 酶 体 通 透 性 的 改变 是 细胞 调 亡 过 程 中 早期 发 生 的 事件 , 溶 酶 体 中 的 和 蛋白酶 释放 后 可 以 直接 或 间接 作用 于 线粒体 , 从 而 形成 一 条 从 溶 酶 体 到 线粒体 的 调 亡 途径 (Boya et al. 2003, Zhao et al. 2003,Yuan et al. 2002 ) , 揭 示 并 确证 这 种 联系 将 会 对 细胞 调 记 的 机 制 有 更 深入 地 了 解 。 细 胞 如 何 精确 地 调控 溶 酶 体 , 使 之 在 调 亡 途径 中 发 挥 其 应 有 的 作用 , 这 是 一 个 具有 挑战 性 的 课题 。 关 于 溶 酶 体 参 与 细胞 凋 亡 的 途径 见 图 26-3, F 2001 年 开始 , 杨 福 愉 研 究 组 开展 了 对 溶 酶 体 因子 参与 细胞 凋 亡 调控 的 研究 。 一 般 都 是 通过 溶 酶 体内 含 的 已 知 蛋白 酶 剪 切 Bid 的 活性 来 进行 分 析 与 解释 , 他 们 在 没有 相关 资料 可 供 参 考 的 条 件 下 , 从 大 鼠 肝 溶 酶 体 中 纯化 、 鉴 定 剪 切 Bid 蛋白 的 有 关 因 子 (lysosomal Bid degradation factor,LBDF )。 首 先 从 大 鼠 肝 中 提取 没有 线粒体 污 桨 的 、 高 纯度 的 溶 酶 体 , 并 制备 出 溶 酶 体 抽 提 液 来 进行 试验 , 结 果 显 示 , 溶 酶 体 中 存在 着 多 个 前 切 Bid 蛋白 的 因子 , 它 们 的 活性 呈 pH 值 依赖 性 。 我 们 主要 对 其 中 两 个 进行 了 纯化 鉴定 , 一 个 为 LBDF1, 它 在 酸性 条 件 下 能 将 Bid 完 全 降解 为 小 片段 。 经 过 数 步 柱 层 析 纯 化 步 又, 得 到 了 高 纯度 的 LBDF1, 经 串联 质谱 鉴定,LBDF1 为 溶 酶 体 中 已 知 的 组 织 蛋 白 酶 D。 另 一 个 为 LBDF3 , 在 中 性 条 件 下 将 Bid 剪 切 为 约 14kDa 的 中 等 片段 , 它 与 caspase-8 剪 切 Bid 产生 的 片段 分 子 量 非常 接近 , 并 且 LBDF3 剪 切 激 活 后 的 Bid 能 够 引起 线粒体 中 细胞 色素 c 的 释放 。 值 得 指出 的 是 ,LBDF3 的 丰 度 极 低 〈 从 60 只 鼠 肝 中 仅 能 得 到 纯化 的 1~2hg LBDF3 蛋 白 ) , 但 比 活 性 极 高 , 而 且 话 性 非常 稳定 。LBDF3 可 以 特异 性 地 剪 切 鼠 源 的 Bid, 与 已 知 的 各 种 可 以 酶 切 Bid 的 蛋白 酶 的 剪 切 位 点 均 不 同 ( 仅 在 loop 区 的 67 位 的 苯 丙 氨 酸 ), 抑制 剂 的 实验 显示 LBDF3 可 能 为 丝 委 酸 蛋 白 酶 , 这 与 在 凋 亡 中 有 重要 作用 的 caspase, 以 及 溶 酶 体 中 已 知 的 组 织 蛋 白 酶 的 性 质 均 不 相同 ,提示 LBDF3 可 能 为 溶 酶 体 中 未 曾 报道 的 一 个 蛋白 酶 , 对 它 的 结构 鉴定 还 在 进行 中 。 26.6 TRIN (Ym rrr ME S@GR ATO, AHA a as BT RE. ARRAYS i ee oy aE PA oa 319 % 20% AE 5 ANA JT, FORMA S BPI. fx Mas We, Anes Zia “A (node) ”相互 联系 , 例如 , p53 可 受到 核 DNA Fi FBLA ACA JF A OE tT Ts 转录 因子 GADD153/CHOP 的 活化 是 ER 胁迫 的 结果 , 也 可 以 通过 依赖 p53 的 途径 。 看 来 , 对 于 调 亡 控制 中 细胞 器 之 间 相 互 作用 的 重要 性 应 给 予 更 多 的 重视 。 研 究 者 发 现 , 当 一 些 具有 特定 亚 细 胞 定位 的 蛋白 的 基因 被 融 除 后 , 作用 于 其 他 部 位 的 调 亡 刺 激 也 不 能 引起 调 它 反应 ,比如 RhoB (定位 于 内 涵 体 ) 缺失 的 成 纤维 细胞 对 Taxol (破坏 微 管 动 态 的 试剂 ) BY DNA 损伤 试剂 产生 抗 性 (Liu et al. 2001), PML (promyelocytic leukaemia) 体 对 多 个 细胞 凋 亡 途 径 (死亡 受 体 、 神 经 酰胺 和 IFNs 诱导 的 ) 都 是 必需 的 (Wang et al. 1998), 缺失 I 型 msP;R 的 工 细 胞 可 以 耐 受 地 塞 米 松 (dexamethasone), TCR 激动 剂 、 电 离 辐射 或 Fas 等 凋 亡 刺 激 因子 (Jayaraman et al. 1997) 。 除 了 调控 细胞 调 亡 , 各 细胞 器 也 会 相互 联 系 以 保护 细胞 生存 , 如 众多 的 多 胁迫 信号 (包括 死亡 受 体 和 氧化 还 原 胁 迫 ) 都 可 以 活化 核 因 子 -kB (NEF-kB) ,线粒体 也 释放 IkB-o/NF-kB 复合 物 。 在 大 多 数 细胞 中 , NF-«B 的 活动 诱导 了 caspase 抑 制剂 (c-IAP1 和 c-IAP2)、Bcl-2 同 源 蛋 白 等 的 转录 , 从 而 阻止 调 亡 的 发 生 。 热 休克 蛋白 的 产生 也 受到 多 种 多 样 的 胁迫 信号 诱导 ,这些 蛋白 从 多 个 层次 抑制 凋 亡 反应 , 如 衰减 胁迫 信号 (如 通过 Hsp70 与 JNK-1 相互 作用 )、 抑 制 caspase 活化 〈 如 通过 Hsp27 与 细胞 色素 c、Hsp70 或 Hsp90 与 Apaf-1 相互 作用 ) 或 者 抑制 其 他 效应 分 子 (如 Hsp70 与 AIF 相互 作用 ) 等 (Beere et al. 2001)。 此 外 , 在 尚未 达到 调 亡 的 条 件 下 , 线粒体 损伤 同时 可 以 引起 热 休 克 反 应 、NE-kB 活化 以 及 去 除 受 损 的 线粒体 , 这 些 反 应 被 称 为 线粒体 调 亡 (mitoptosis) (Lemasters et al. 1998), 与 此 相似 ,ER 的 胁迫 可 以 诱导 分 子 伴侣 表达 , 同 时 阻止 细胞 周期 的 进行 (Brewer et al. 2000) 。 另 一 方面 , 许 多 证 据 都 提示 , 当 发 生 细 胞 凋 亡 时 , 绝 大 多 数 的 细胞 器 特有 的 死亡 反应 最 终 都 会 导致 线粒体 MMP BY caspases 活化 , 这 两 者 是 细胞 死亡 通路 的 中 心 整 合 右 , 它 们 也 相互 密切 联系 , 使 溶 酶 体 、 高 尔 基 体 和 ER 启动 的 反应 进入 共同 的 调 亡 执行 途径 。 可 能 就 是 由 于 这 个 原因 , 不 同 的 细胞 器 启动 的 细胞 凋 亡 在 最 后 阶段 都 具有 相似 的 生化 特征 。 (ry 琦 杨 福 丛 ) 人 Alimonti J B, Shi L, Baijal P K, et al. 2001. 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J Cell Biol, 162: 59-69 医药 的 关系 线粒体 疾病 与 线粒体 医学 的 分 子 生物 膜 与 疾病 生物 膜 与 免疫 5 D7 ti 线粒体 疾病 与 线粒体 医学 的 分 子 茶 础 27.1 ”什么 是 线粒体 疾病 2 其 临床 症状 如 何 ? 0.0... eeseccecececersentneeres 326 27.2 ”线粒体 疾病 和 线粒体 医学 的 研究 历史 和 现状 pp 327 27.3 ”线粒体 DNA 编码 的 线粒体 疾病 及 其 分 子 遗 传 学 基础 ……… 328 27.3.1 2837 DNA(mtDNA) 二 下 下 的 和 和 328 27.3.2 东 线粒体 DNA 遗传 学 特点 人 全 全 和 ene 329 27.3.3 ”线粒体 DNA 重要 突变 点 与 线粒体 疾病 表 型 ececeeeeeeeeee 330 27.4 FRIED BRAGA ARR ASIA FEAF once ceceecceceeecseceeeeeeeees 334 27.4.1 #% DNA Fil mtDNA 对 线粒体 生物 合成 的 双重 控制 .………: 334 27.4.2 PSE FAWGAI ARAL ACI .........csceccescssescessnerecounevessesacsesnens 335 27.4.3 ”线粒体 DNA 和 核 DNA 变异 与 线粒体 相关 疾病 eee. 337 27.5 Gere Rese. 神经 退行 性 疾病 二 和 337 27.5.1 Sehr is Rye EVRA .............c0escesenssorecase) «19a 337 2752 Sere TIPEEIBAG, ...............s.sensesenacvesnsce dann 338 27.5.3 SRR HAIR EPI ES, sess ccssscscsereanecuvsecneevenevens 338 IA es 3h a): ne 339 27.7 ”化 粒 体 疾病 的 诊断 与 治疗 的 研究 .生生 生生 和 341 27.7 呈 线粒体 疾病 的 诊断 生生 和 和 下 个 341 27.7.2 ”线粒体 疾病 的 生化 治疗 和 药物 治疗 … 了 pw 二 342 575 基因 和 治 亲生 342 27.1 什么 是 线粒体 疾病 ? oka BA ea an 4 Eee ta AE ED AE at BZ Pe rie eieed anaes 在 细胞 的 线粒体 内 , AE mtDN 和 /或 nDNA 编码 的 线粒体 蛋白 基 因 变 异 引 起 的 线粒体 结构 和 和 所 但 酸化 功能 的 损伤 , 主 要 是 呼吸 链 遗 传 性 的 疾病 。 线 粒 体 患 病 i 全 表现 为 ATP 合 成 减少 、ROS 增 多 和 乳酸 中 毒 等 造成 细胞 损伤 A A A AT HE 327 % 27/2 ZAREK TEI GALA ANID FE 在 身体 某 一 部 位 或 多 个 部 位 , 形成 多 系统 疾病 , 患者 常 有 两 种 或 更 多 病症 的 综合 表现 , 形 成 综合 征 , 临 床 症 状 十 分 复杂 多 样 并 具有 明显 个 体 差 异 , 这 与 线粒体 遗传 的 异 质 性 (heteroplasmy) 和 在 体内 的 特定 分 布 有 关 。 根 据 六 行 病 学 调查 , 线 粒 体 疾 病 的 疲 行 率 和 死亡 率 都 很 高 (aT TARIA 1/8500), 是 代谢 病 中 最 常见 的 疾病 之 一 。 对 原 发 性 线粒体 呼吸 链 疾病 (respiratory-chain disease) 目前 尚 缺 乏 有 效 治 疗 手段 , 随 着 病程 发 展 , 必 然 导 致 严重 伤 失 活动 能 力 和 早期 死亡 (Chinnrey et al. 2003) 。 表 27-1 为 已 知人 类 线粒体 疾病 的 各 种 临床 症状 (FE 2001,Chinnery et al. 2003) KSS 综合 征 (Kearns-Sayre syndrome); 眼 肌 麻 癣 , 视 网 膜 色 素 变 性 , 心 脏 传导 阻 浅 , 共 济 失调 , 矮 小 , 糖尿 病 , 甲 状 驯 机 能 减退 Leigh 氏 病 或 称 亚 急 性 坏死 性 脑 肌 病 : 有 呼吸 、 视 力 、 运 动 等 多 方面 异常 MELAS 综合 征 (mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis and strokelike episodes); 线粒体 肌 病 , 脑 肌 病 , 乳 酸 酸 中 毒 症 和 卒中 样 发 作 , 痴 采 , 耳 仁 , 斤 小 和 糖尿 病 MERRE 综合 征 (myoclolus epilepcy with ragged red fiblers) : WIBE2E, MH, WICH, He, FR Leber's 遗 传 性 视神经 奢 缩 病 (LHON): BH CBYE), AIA, GNU, Dea, HU CPEO (chronic progressive external opththalmoplegia) : 慢性 进行 性 外 眼 肌 麻痹, 类 似 KSS 综合 征 。 除 眼 肌 及 视网膜 病 外 , 还 有 中 枢 神经 系统 功能 异常 Alper 综 合 征 : die) ILA, FR, WUE, A, ERAS MDS (mitochondrial DNA deletion syndrome) :线粒体 DNA 缺失 综合 征 MNGIE (mitochondrial neuro-gastro-intestinal encephalomyopathy); 线粒体 神经 消化 道 脑 肌 病 NARP(neuropathy,ataxia and retinitis pigmentosa): 神经 性 疾病 , 共 谤 失调 , 视 网 膜 色素 病变 Pearson 综合 征 27.2 ”线粒体 疾病 和 线粒体 医学 的 研究 历史 和 现状 ”4 1959 年 ,Luft 发 现 第 一 例 女 病 患者 是 肌 细 胞 线粒体 失去 呼吸 控制 所 引起 。 1988 年 Holt 等 首次 证 明 Lebers 遗 传 性 视神经 雁 缩 病 (Leber hereditary opitic neuropathy, LHON) 是 mtDNA 11778 位 G RBA A 的 线粒体 疾病 。 目 前 发 现 的 与 人 类 线粒体 疾病 相关 的 mtDNA 突 变 位 点 已 有 129 个 。 近 几 年 来 又 发 现 大 量 核 基因 编码 线粒体 蛋白 的 突变 和 线 粒 体 缺 陷 与 神经 退行 性 疾病 、 衰 老 和 肿瘤 的 相关 。 目 前 的 共识 是 : 线粒体 遗传 性 变异 (mtDNA 和 /或 nDNA) 导致 氧化 磷酸 化 功能 的 缺陷 , 引起 神经 肌肉 疾病 导致 记忆 、 视 力 、 听力 形 失 和 体力 下 降 , 造成 心血 管 、 糖尿病 肠 胃病 .酒精 中 毒 定 、 神 经 退行 性 疾病 (AD、 PD) 以 及 肿瘤 等 多 种 疾病 。 另 外 , 线粒体 作为 环境 因素 和 5 物 的 孝 点 在 疾病 发 生 和 治疗 中 的 重要 性 也 越 来 越 受 到 重视 。 非 固 醇 类 消炎 药 对 线 粒 伟 计量 代谢 的 抑制 是 ?| 发 一 些 疾 病 的 重要 因素 , 美 国 每 年 因 阿 斯 匹 林 使 用 不 当 导 致 肠 上 , “ 吧 线 粒 体 的 损伤 使 2 万 病人 因 胃 溃 疡 死亡 (Fossilien 2001 , 基于 线粒体 遗传 性 疾病 不 断 的 发 现 和 相关 基础 研 ” “ 展 , 1994 年 瑞典 Luft 提 出 了 线粒体 医学 :的 概念 。1999 年 以 来 相继 有 衰老 的 线粒体 线粒体 疾病 、 线 粒 体 和 细胞 死亡 以 及 云 老 的 线粒体 目 由 基 理 论 等 有 关 理 论 专著 出 让。 蕊 粒 体 药 学 以 及 线粒体 疾病 诊 RKO vs Biomembranes 328 in AY AYVIG ET AAT TI Ee RAK Oe SE, LODO 以 后 的 10 余 年间, 国际 上 发 表 的 2.6 万 篇 线 粒 体 论 文中 , 线 粒 体 医药 学 的 论文 就 有 6000 多 篇 (Weissig et al. 2001), 1995 年 美国 线 粒 体 研 究 会 (MRA) 和 线粒体 医学 研究 会 (MDA) 在 匹 效 你 成立 了 联合 线粒体 医学 基金 会 (UMMF), , 设 立 专门 研究 基金 和 网 站 并 定期 召开 学 术 讨 论 会 (Chinnery 2003), 2001 年 MRA 开始 出 版 线粒体 (mitochondrion) 作为 其 学 术 期 刊 , 正 是 为 了 顺应 这 种 发 展 趋势 。 线粒体 医学 发 展 成 为 分 子 医 学 的 一 个 新 领域 , 反映 了 线粒体 研究 已 经 从 经 典 生 物 能 学 进 入 到 线粒体 生物 医学 时 代 , 并 证 明 作 为 “细胞 生命 和 死亡 之 马达 ”的 这 一 细胞 器 在 生命 科学 和 分 子 医 学 领域 中 的 重要 地 位 。 27.3 ”线粒体 DNA 编码 的 线粒体 疾病 及 其 分 子 遗传 学 基础 eee wr 27.3.1 Betis DNA(mtDNA) 图 27-1 AA mtDNA 序列 的 重要 突变 位 点 与 其 相对 应 的 疾病 表 型 (DiMiauro et al. 2003)。mtDNA 是 人 细胞 核 以 外 的 惟一 遗传 单位 , 又 称 人 体 第 24 对 染色 体 。 每 个 细胞 一 fz 10°~10*7+ mtDNA #8 U1, SIKDNAFHEL, mtDNA 非 常 小 , 呈 双 链 亲 合 环 状 简单 结 构 。1981 年 , Anderson 等 将 人 mtDNA 序列 全 部 测 出 , 含 16569 碱 基 对 , 编 码 37 个 结构 基因 , 其 中 ,12S 和 16S 两 个 IRNA 结构 基因 (图 27-1 PA LGR EAR) 和 22 个 Parkinsonism, aminoglycoside-induced deafness LS, MELAS, MELAS, myoglobinuria multisystem disease Cardiomyopathy PEO, LHON, MELAS, myopathy, cardiomyopathy, diabetes and deafness Myopathy, cardiomyopathy, : PEO Myopathy, MELAS Myopathy, lymphorna Cardiomyopathy, LHON LS, ataxia, chorea, myopathy Myopathy, PEO Diabetes and deafness Myoglobinuria, motor neuron disease, Sl sideroblastic anemia PPK, deafness, oe , AS MERRF-MELAS |fCardiomyopathy myoclonus * Progressive myoclonus, Myopathy, \ epilepsy, and optic atrophy multisystern disease, ] ; encephalonyopatty)/ | 、FBSN | ios eM | 2 ' Cardiomyopathy LS, ECM, ) PEO, MERRF, myoglobinuria MELAS, deafness a Myopathy, PEO Cardiomyopathy, ECM ECM, LHON, myopathy, cardiomyopathy, MELAS and parkinsonism Cardiomyopathy, ECM LHON, MELAS, diabetes, LHON and dystonia Cardiornyopathy, ECM, PEO, myopathy, sideroblastic anemia LHON, myopathy, LHON and dystonia 人 线粒体 基因 组 的 突变 引起 的 线粒体 疾病 ( 引 自 DiMiauro et al. 2003) 粗 字 体 显 示 的 疾病 是 经 常 与 该 特定 基因 突变 相 联系 的 疾病 , mtDNA 环 外 | 文字 代表 的 线粒体 疾病 是 由 负责 线粒体 蛋 自 合成 的 基因 突变 引起 ;红色 文字 代表 的 疾病 是 由 编码 线粒体 蛋白 的 结构 : 变 引 起 。ECM, 脑 肌 病 ,FBSN, 家 族 性 两 侧 听 神 经 声 LHON, Leber’s 遗传 性 视神经 奢 缩 病 ,LS,Leigh s 综 1 MELAS, 线 粒 体 脑 肌 病 乳酸 毒 症 和 中 风 发 作 性 疾病 , ME 2RF 综合 征 , MILS, 母 系 遗 传 Leigh s 综合 征 , NARP, 神 省 疾病 运动 失调 和 视网膜 色素 病变 ;PEO,, PEAT PEP IRL, PPK, 皮 肤 角 化 病 ,SIDS, 突 皮 “婴儿 死记 综合 征 329 4 2/ # LEEKS GRATE AND FE TH tRNA 结构 基因 (图 27-1 中 22 Ba Bhabha ET 6 FUR RR I). 13 个 编 码 多 肽 的 结构 基因 〈 图 27-1 13 个 红色 长 条 块 ), 分 别 是 呼吸 链 复合 体 I 的 7 个 亚 基 (mtDNA 环 内 的 红色 NDI, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5, ND6), @@' UA 1 7b 基 (红色 Cyb), BAP IV 的 3 个 亚 基 (红色 COXT, COX, COXIID 以 及 ATP 合 酶 (42 合体 V) 的 2 个 亚 基 (红色 英文 字 48、46)。 这 些 基因 结构 紧凑 保守 , 没 有 内 含 子 , 基 因 之 间 仅 有 几 个 或 完全 设 有 非 编 码 碱 基 , 编 码 呼吸 链 复合 体 I、II、IV 和 ATP 合 酶 《复合 体 V) 中 的 蛋白 亚 基 。mtDNA 含 重 链 (HE) 和 轻 链 (L HE) 双 股 分 子 ,mtDNA Hi he 含 28 个 基因 , 轻 链 有 9 个 基因 , 它 们 都 有 自己 的 启动 子 。22 tRNA 分布 在 mRNAs 基 因 之 间 和 了 zIRNASs 基 因 之 间 。 人 mtDNA 中 有 1~2 个 非 编码 (D-Loop), 292% 1000 个 碱 基 对 (图 27-2 上 方 的 浅黄 色 和 蓝 绿色 条 块 ) ,含有 重 链 的 复制 启 始点 (OH)、 重 链 启 动 子 (PH)、 轻 链 启动 子 (PL) 、3 个 保留 序列 区 〈CSB) 及 TAS 终 止 相 关 序 列 , 主要 负责 线粒体 DNA 的 复制 、 转 录 和 翻译 的 调控 。 轻 链 的 复制 启 始点 (OL) 不 在 D-Loop 区 , 位 于 环 左 下 方 第 5721 一 5798 号 碱 基 对 之 间 。 线粒体 DNA 的 另 一 特点 是 其 突变 率 特别 高 , 比 核 DNA 的 变异 率 要 大 20 倍 , EA mtDNA 没有 组 蛋白 保护 ,缺乏 完善 的 DNA 损伤 修复 系统 , 容 易 受 到 线粒体 基质 中 活 性 氧 的 损伤 。 mtDNA 的 突变 一 般 经 过 2 一 3 代 复 制 即 可 固定 下 来 ( 刘 树 森 2000b, 2003, Murphy 2000)。 图 27-1 中 mtDNA 环 外 的 监 色 文字 表示 的 线粒体 疾病 , 征 由 线粒体 12S rRNA, 16S IRNA 和 22 个 让 NA 的 结构 基因 变异 引起 , 影 响 到 呼吸 链 复合 体 的 蛋白 亚 基 在 线粒体 内 的 合成 。 红 色 文 字 表示 的 线粒体 疾病 是 直接 编码 线粒体 呼吸 链 复合 体 I_II、VI 和 V 和 蛋 自 亚 基 的 13 个 结构 基因 的 变异 ?| 起 。 27.3.2 线 尊 体 DNA [575 mmm 除 mtDNA 结 构 外 , AeA Ee AA PR BE RS yaa EAL AIA Ae Ball, 对 认识 线 粒 体 疾 病 与 线粒体 基因 变异 的 关系 很 重要 。 1, 母 系 遗 传 性 (maternal inheritance) 人 体 合子 (zygote) 中 全 部 线粒体 及 其 mtDNA 都 来 源 于 母体 的 卵 母 细胞 ,母体 mtDNA 传 给 所 有 后 代 , 其 中 仅 女 性 后 代 能 传递 线粒体 遗传 信息 , 这 可 能 与 舍 有 精子 线粒体 的 精 细胞 的 中 片 (midpiece) 不 能 在 受精 时 进入 卵细胞 有 关 。 mtDNA 点 突变 大 都 是 母系 遗传 , 但 其 后 代 并 不 全 都 发 展 成 疾病 表 型 , 因 为 , 突 变 mtDNA 数量 、 组 织 分 布 、mtDNA 单 倍 型 (haplotype) 以 及 mtDNA 找 贝 数 和 核 遗 传 背景 等 许多 因素 都 起 作用 。 散 发 型 线粒体 疾 病 可 能 是 在 卵 母 细胞 发 生 过 程 或 早期 胚胎 发 育 时 引起 的 。2002 年 发 现 线粒体 肌 病 患者 的 骨骼 肌 mtDNA 是 父 性 传递 一 个 特例 。 2. 异 质 性 和 同 质 性 每 个 细胞 含有 成 百 个 线粒体 和 成 千 的 mtDNA 找 贝 ,, 呜 中 所 有 线粒体 mtDNA 的 序 列 都 一 样 , 称 同 质 性 (homoplasmy)。 异 质 性 (heterop’ 则 相反 , 一 个 细胞 中 含 野 生 型 mtDNA 序 列 和 突变 型 mtDNA 序 列 两 种 线粒体 群 人 ”一 个 线粒体 内 , mtDNA 也 有 异 质 性 。 大 部 分 线粒体 疾病 患者 mtDNA 都 是 异 质 性 。 。 ,Leber's 遗 传 性 视神经 压缩 病 (LHO ) 和 非 综合 征 的 感觉 神经 性 耳 奏 相关 的 mtDKN = : 变 几 乎 全 是 同 质 性 ( 表 27-2)。 ANTAGA 人 六 [ ) i) a 麻 Biomembranes 330 线粒体 DNA D- 环 区 的 异 质 多 型 性 不 是 致 病 , 而 是 与 物种 差异 有 关 。 3. PASCAL 培养 细胞 证 明 , 突 变 mtDNA 必须 达到 一 定 比 例 才 出 现 线粒体 呼吸 链 活性 下 降 , 即 mtDNA 突 变 的 国 值 效应 (threshold effect), Atk, 在 线粒体 功能 异常 和 临床 症状 出 现 前 , 部 分 mtDNA 突变 就 已 存在 。 转 变 细胞 系 和 非 转变 细胞 系 之 间 国 值 不 同 , 体 细胞 杂交 系 tRNA 点 突变 的 国 值 要 大 于 90%, 大 片段 mtDNA 缺失 大 于 60%。 高 度 依赖 氧化 代谢 的 组 20, 如 脑 、 心 、 骨 骼 肌 、 视 网 膜 、 芭 小 管 和 内 分 泌 腺 等 , 国 值 比较 低 , 对 致 病 线 粒 体 DNA 的 突变 就 更 加 敏感 。 与 Leber's wt fe vee Zs Baa A KAY mtDNA 突变 在 所 有 组 织 细胞 中 都 是 同 质 性 , 但 患者 仅 视神经 表现 疾病 表 型 , 也 有 很 多 LHON 突变 患者 不 表现 疾病 。 因此 , 突变 mtDNA 比 例 虽 然 是 国 值 效应 的 重要 决定 因素 , 但 还 有 其 他 的 因子 涉及 ,如 核 遗传 背景 也 能 改变 国 值 。 4. 复制 分 离 现象 线粒体 分 裂 和 mtDNA 复 制 与 细胞 核 有 丝 分 裂 和 细胞 周期 不 同步 , 因此 细胞 分 裂 时 , 细胞 内 异 质 型 的 突变 mtDNA 可 能 是 随机 地 传递 到 两 个 子 细胞 中 , 因 而 能 改变 细胞 突变 mtDNA 的 不 同比 例 。 经 过 一 定 世代 细胞 分 裂 后 , 细胞 中 野生 型 mtDNA 和 突变 性 mtDNA 渐渐 分 离 为 野生 型 或 突变 性 同 质 性 , 此 过 程 称 复制 分 离 (replicative segregation)。 这 可 以 解释 为 什么 mtDNA 相 关 疾 病 临 床 症 状 经 常 有 随 衰老 过 程 和 组 织 分 布 的 变异 性 。 但 对 异 质 多 型 性 小 鼠 的 分 析 表 明 , 线 粒 体 异 质 性 的 原因 , 除 了 随机 性 传递 作用 外 , 还 有 组 织 特 异 分 布 的 作用 。 27.3.3 ”线粒体 DNA 重要 突变 点 与 线粒体 疾病 表 型 0 表 27-2 列 出 了 mtDNA 编码 呼吸 链 13 个 蛋白 亚 基 中 8 个 亚 基 的 一 些 重要 突变 点 ,, 包 括 LHON、Leigh's 综合 征 和 NARP 三 类 线粒体 疾病 。LHON 是 目前 惟一 已 经 鉴定 为 呼吸 链 复合 体 I 基 因 突 变 引 起 。ND 代表 NADH 脱 氢 酶 , 包括 NMD7 基 因 的 G3460A 3848 | ND4 基因 的 G11778A 和 MD6 基 因 的 T14484C 突变 。G11778A 有 时 也 与 非 LHON 表 型 的 由 多 森 家 族 疾 病 有 关 。NMD6 的 G14459A、T14596A 以 及 NMD4 的 Al11696G 已 经 证 明 是 与 LHON (有 或 没有 张力 障碍 ) AK; G13513A 与 LHON 和 MELAS 有 关 。 NARP 和 Leigh s 综合 征 与 AITP 酶 46 基因 的 T8993G 突变 有 关 。Leigh s 综合 征 是 婴儿 或 幼儿 期 的 一 种 毁伤 性 脑 疾病 , 其 病理 特征 是 对 称 区 脑 细胞 坏死 , 涉 及 中 脑 、 基 神 经 节 、 海 马 区 、 脑 桥 和 视神经 。 NARP 的 特征 是 神经 肌肉 无 力 、 感 觉 神经 疾病 、 运 动 失 调 、 视 网 膜 色素 病变 并 累及 学 习 困 难 和 采 诗 。T8993G 突 变 的 比例 与 临床 病症 的 严重 程度 相关 , 突 变 mtDNA 比例 大 于 95% 以 上 时 Leigh s 综合 征 才 出 现 。 相 反 , 患 者 肌肉 和 血液 中 的 突变 mtDNA 比 例 达 70% 和 90% 时 才 表 现 有 发 育 延 迟 病症 的 NARP 表 型 ; mtDNA 突 变 比例 小 于 70% 时 常常 不 出 现 疾 病 表 型 。 此 种 疾病 表 型 与 mtDNA 突变 比例 之 间 的 相关 PEELE tRNA 突变 的 相关 性 更 为 吻合 。 此 外 , 表 27-2 尚 表明 ,MD 基因 突变 与 双 侧 纹 肌 坏死 /MELAS、MELAS 或 运动 不 耐性 病症 相关 。 线 粒 体 细胞 色素 氧化 酶 (COX) 基因 T9957C 突 变 的 主要 临床 病症 都 是 运动 不 耐性 、 疲 衣 或 几 元 力 (虽然 首次 发 现 是 与 MELAS 相关 ) 。7 “全 致 病 细胞 色素 六 的 突变 都 在 肌肉 中 , 不 在 下 引 胞 中 ,这 证 实 与 运动 不 耐性 相 关 。 细 胞 色 = bb 突变 与 大 多 数 线粒体 DNA 点 突变 不 同 ,“ 们 都 是 散发 型 , 无 神经 疾病 家 331 278 RELAIS AELA EE ANID FE ee; PEA AP ASME IE, fer A RANE Ae, A te A 素 2 的 基因 突变 与 运动 不 耐性 表 型 无 关 , 一 例 是 2 基因 小 片段 缺失 ,表现 在 20 BE PENS 帕 金 森 病 和 MELAS 表 型 , 另 一 例 是 散发 型 的 心脏 肌 症 〈 表 27-2), 基因 突变 点 疾病 表 型 基因 突变 点 疾病 表 型 NDI T3308C 双 侧 纹 肌 坏 死 /MELAS G15615A 运动 不 耐性 G3460A LHON G15723A 运动 不 耐性 7bp 插入 肌 病 与 运动 不 耐性 G15762A 肌 病 ND4 A11696G LHON/ 张 力 障碍 COX! T6721C 铁 胚 性 贫血 G11778A LHON T6742C 铁 胚 性 贫血 G11778A 帕 金 森 病 S bp 缺失 运动 神经 元 病 样 G11832A 运动 不 耐性 G6830A WLR HE AVA / NDS G13513A MELAS COXI1 T7587C 肌 病 /运动 失调 / 耳 礁 G13513A LHON/MELAS T7671C 肌 病 ND6 G14459A LHOMN/ 张 力 障 碍 COXI11 G9952A 脑病 /运动 不 耐性 Leigh’s 综合 征 T9957C MELAS T14596A LHON/ 张 力 障碍 15 bp 缺失 运动 不 耐性 T14484C LHON ATPase T8993G Leigh’s 综合 征 Cyt b 4 bp 缺失 由 金森 病 /MELAS T8993C Leigh's 综合 征 G14846A 运动 不 耐性 T8993G ”NARP G15059A 运动 不 耐性 T8993C NARP/MILS G15084A 运动 不 耐性 T9176C NARP/MILS G15168A 运动 不 耐性 T8851C 双 侧 纹 肌 坏死 G25143A 心肌 病 T9176C 双 侧 纹 肌 坏死 G15498A 运动 不 耐性 表 27-3 和 表 27-4 是 人 体 最 常见 mtDNA 突变 位 点 。MELAS 突变 是 线粒体 脑 肌 病 、 乳 酸 毒 定 和 突 发 性 的 综合 征 , 主 要 是 让 NA 基因 A3243G 的 转变 所 引起 。 临 床 症 状 常 为 周期 性 偏 头 痛 、 病 灶 突 发 和 乳酸 毒 症 , 常 见于 年 轻 人 。MELAS 症 患者 约 80% 被 鉴定 为 A3243G 突变 , 但 后 者 也 与 耳 舍 和 /或 糖尿 病 、PEO、KSS、 肌 病 、 非 突 发 型 的 脑病 以 及 MELAS/MERRF 重 受 综 合 征 表 型 相关 。A3243G 突 变 对 tRNA 的 功能 影响 表现 为 让 NA 分 子 经 转录 后 的 修饰 影响 其 分 子 的 正确 折 登 、 氨 基 酰 化 和 ASFA. TE A3243G 突变 的 胞 质 杂 交 细 胞 系 中 , 发 现 耻 NA 的 DHU 颈 区 低 修饰 (fromodification) 和 氨基 栈 化 缺 Ke, 提示 外 NA ”功能 的 丢失 。 但 在 体内 要 达到 呼吸 全 “人 性 损伤 , 要 求 突变 mtDNA 有 高 达 95% 的 国 值 效应 。HeLa 细 胞 质 杂 交 系 分 析 表 明 ,; \ 的 突变 并 不 修饰 第 一 反 密 查 子 位 点 的 wobble 碱 基 ,后 者 作用 是 限制 其 对 亮 氨 酸 U 四 了 解码 和 对 苯 丙 肥 酸 UUY 密码 子 不 解码 , 这 经 党 导致 把 亮 禹 酸 错 误 地 解读 为 茉 关 “有 。MELAS 表 型 是 遗传 异 质 性 的 , 除 4A3;243G 外 , 尚 有 A3260G、T3271C 和 T3291C = ( 表 27-3)。 BRST PRANAB 2 ‘| =} Biomembranes 332 A3243G MELAS, MELAS/MERRE, 糖尿 病 +/ —, E#e, PEO/ Sif / KA, KSS, Fe 风 性 脑 肌 病 , 婴 儿 型 脑病 , 肌 病 , 肌 病 加 呼吸 衰竭 A3243T 脑 肌 病 A3250C 肌 病 加 呼吸 衰竭 A3251G PEO, 肌 病 , 精 神 紊 乱 , 突 然 性 死记 A3252G , 肾 病 , 糖尿病 , 副 甲状 腺 功能 低下 , 下 肢 轻 次 , 心 肌 传导 阻 清 , 肾 衰 C3254G 肌 病 , 心 肌 病 C3256T PEO, 茎 病 , 耳 毒 , 中 风 发 作 ,myoclonus, 副 甲状 腺 功能 低下 , 糖 尿 病 , 肌 病 A3260G 肌 病 /心肌 病 ,MELAS T3271C MELAS, 肌 疲劳 / 耳 伦 T:A 碱 基 人 缺失 脑病 , 内 分 泌 病 , 脑 钙化 A3288G 肌 病 T3291C MELAS, 肌 病 A3302G 肌 病 和 呼吸 衰竭 C3303T 心肌 病 MERRE 是 母系 遗传 的 线粒体 脑 肌 病 , 其 特征 是 肌 阵 挛 癫 痫 (myoclonus epilepsy)、 小 脑 共 济 失调 以 及 肌肉 样本 显示 不 规则 形 红 肌 (ragged red fibre), tRNA™® 基因 突变 特别 是 与 MERRF #2 FHHKA, i AE tRNA 基因 A8344G 转变 引起 MERREF 综合 征 。 但 临 床上 A8344G 表 型 多 样 , 如 PEO、 肌 病 、 不 带 肌 阵 这 的 脑 肌 病 、 有 或 没有 心肌 病 的 肌 病 、 Leigh’s 综合 征 和 多 对 称 性 脂肪 过 多 症 等 ( 表 27-4). 基因 突变 “疾病 表 型 ASG 0” MERRF, MERRF/MELAS, PEO/ 肌 病 , 3 apoelone 脑 肌 病 , 肌 病 / 心 肌 病 , 肌 病 , Leigh’ s 综合 征 , 多 对 称 性 脂肪 过 多 症 G8313A TAL Sane, PRE, SRP, myoclonus, axonal 神经 病 ,, ash, HE, Boy G8328A 脑病 G8342A PEO,myoclonus T8356C MERRF,MERRF/MELAS G8363A MERRF, OW, He, oR, IVER A8296G 肥大 心肌 证 其 他 让 NA 基因 的 突变 大 多 数 是 在 单个 个 人 或 家 六 中 鉴定 的 , 因 此 无 法 表达 其 基因 型 和 表 型 之 间 的 相关 , 本 文 也 未 一 一 列 出 Al155: 是 惟一 一 个 线粒体 纺 糖 体 12S TRNA 基因 突变 与 人 疾病 相关 的 表 型 , 在 几 L 个 家 族 中 所 定 了 这 一 基因 突变 都 是 非 综合 征 感觉 神 弓 EL, 病 患者 体 中 基因 突变 是 333 27 ZL GAG GAL B BAHIA F Ze ttt 同 质 性 , (HFS ERG Te) Ot ESS BS 7S SBS HE EE EP, 这 说 明 疾病 表 型 尚 需 有 继 发 性 因素 参与 。 在 某 些 家 族 中 可 能 是 隐 性 分 离 常 染色 体 基 因 突 变 , 但 并 在 另外 家 族 中 损 基 糖苷 的 诱 导 作 用 很 重要 。 后 者 对 细菌 核糖 体 的 作用 与 人 线粒体 12S tRNA 的 围绕 1555 核 苷 区 的 结 Rey ARLE, Arta tt SE FAS A tRNA 与 人 耳 釜 的 相关 的 证 据 (Pulkes et al. 2001), 此 外 , 最 常见 mtDNA 单 个 大 片段 缺失 是 与 KSS、PEO Fil Pearson’ s 综 合 征 表 型 相 联 系 , 但 临床 疾病 表 型 是 异 质 性 , 如 KKSS/ 2 RHE, Leigh’ s 综合 征 、Wolfram 综合 征 、 共 济 失 调 、 糖 尿 病 带 耳 克 等 , 它 们 都 是 非 母体 遗传 而 是 散发 型 发 生 。 但 单个 大 片段 缺失 mtDNA 的 复制 也 有 母系 遗传 的 证 据 , 糖尿 病 带 耳 付 主 要 是 损伤 了 线粒体 的 翻译 活性 , 这 HER tRNA 基因 有 关 。 目前 统计 , 在 成 人 线粒体 疾病 中 , 散发 型 发 生 约 为 三 分 之 一 , 可 能 发 生 在 卵 母 细胞 发 生 过 程 中 或 早期 且 胎 发 育 阶 段 。 母 系 遗 传 的 mtDNA 点 突变 占 三 分 之 二 。 一 个 正常 卵 细 胞 含有 约 10~20 万 mtDNA, 其 中 某 些 是 突变 的 。 母 系 遗传 的 机 制 是 什么 ? 一 种 假说 认 为 ,在 卵子 和 胚胎 之 间 “ 瓶 颈 ” 效 应 只 允许 少量 母性 的 mtDNA 进入 胚胎 中 去 扩 增 。 在 少 数 情况 下 , 一 些 部 分 缺失 的 mtDNA (或 者 是 其 后 代 , 视 缺 失 发 生 在 卵细胞 发 生 的 那 一 阶 Be) 可 能 请 进 (slip through) 且 胎 中 ,此 种 大 片段 缺失 的 mtDNA 请 进 有 凸 细胞 (blastocyte ) 就 可 能 进入 所 有 的 3 个 胚层 , 这 就 导致 KSS 综合 征 (多 系统 疾病 ); 如 果 “ 随 机 ”分 离 到 造血 细胞 的 谱系 就 会 引起 Pearson s 综 合 征 ; 如 果 分 离 到 肌肉 中 则 引起 进行 性 外 眼 肌 麻 疗 (PEO), Lik 3 种 疾病 患者 的 突变 mtDNA 都 是 同 质 性 , 因 为 它们 来 自 一 个 原始 分 子 的 克隆 扩 增 。 在 肥 层 分 化 后 出 现 的 生 肌 干细胞 中 编码 呼吸 链 蛋白 的 基因 突变 则 形成 孤立 的 肌 病 ,17 种 已 知 的 细胞 色素 娟 突变 中 的 15 种 突变 就 属于 这 一 类 型 , 但 其 中 mtDNA 的 父 系 遗 传 者 除外 (DiMauro et al. 2003 ) 。 线粒体 疾病 临床 症状 的 极端 变异 性 主要 归 因 于 线粒体 遗传 学 的 特点 ,尤其 是 mtDNA 的 异 质 性 和 国 值 效应 。 例 如 , 在 神经 疾病 、 运 动 失调 、 视 网 膜 色 素 病 变 综合 征 、 母 系 遗 传 的 Leigh s 综 合 征 和 由 同一 个 ATP 酶 46 基 因 突 变 引起 的 两 种 脑 心肌 病 等 中 , 它们 临床 症状 的 严重 程度 可 以 用 不 同 的 线粒体 突变 负 符 程 度 来 解释 。 但 是 比较 难 解 释 的 是 , 看 起 来 是 相同 的 突变 却 有 不 同 的 组 织 倾向 性 (tissue proclivity) , 如 MELAS 中 的 卒中 样 发 作 (strokelike episodes), MERRF 中 的 肌 阵 挛 (myoclonus), KSS 中 的 色素 视网膜 症 (pigmemntary retinopathy)。 为 什么 在 脑 的 有 些 特 定 区 域 , 如 脑 细 小 血管 、 小 脑 牙 形 核 (dentate nucleus) 以 及 视网膜 色素 上 皮 细 胞 中 都 是 高 浓度 的 mtDNA 突变 ? 相反 , 很 多 线 粒 体 糖 尿 病 患者 虽 其 mtDNA 突 变量 相对 较 小 , 但 却 易 表现 临床 症状 。 这 一 事实 提示 ,对 线粒体 糖尿 病 而 言 , 在 单纯 能 量 缺 少 因素 之 外 可 能 还 有 另外 的 病理 机 制 参与 , 例 如 氧化 能 量 水 平 与 葡萄 糖 感受 绢 、NADH 转 运 梭 (NADH shuttle ) 以 及 解 偶 联 和 蛋白 等 相互 作用 。 还 有 一 些 组 织 倾向 性 的 事例 , 如 12S RNA 3843 AS | dH. tRNA 突变 只 引起 心肌 病 , 多 个 MD 基因 突变 只 引起 视神经 细胞 赣 缩 等 。 虽 然 目 前 对 组 沪 倾 向 性 问题 尚 无 合理 解释 , 但 通过 对 动物 模型 《如 小 鼠 线 粒 体 突变 ) 的 深入 研究 也 ;对 回答 这 些 难 题 将 有 所 帮助 (DiMauro et al. 2003)。 但 是 , 笔 者 认为 , 下 述 因素 也 1 z 们 思 基 , 如 各 组 织 细 胞 的 mtDNA 表 达 有 其 特异 的 国 值 , 核 DNA 中 有 关 氧 化 磷 栈 基因 在 不 同 组 织 细 胞 内 的 定位 和 表达 不 同 , 同 时 , 它 们 在 不 同 组 织 细胞 中 对 能 量 的 调控 有 不 同调 控 方 式 : 以 及 在 转录 这 程 中 有 不 同 的 调控 因素 参与 , 如 NRF-1 因子 王 细 胞 色素 基因 的 转录 , 维 生 素 D37 叶 和 肠 中 ,无论 对 核 DNA 或 mtDNA 的 转录 都 个 ”异地 调控 作用 ( 刘 树 森 2003)。 Hye geese fy & * i Biomembranes 334 27.4 FYFE Bea AY Ae RL RS BE is HY a Fa 18 27.4.1 4% DNA Fil mtDNA 对 线粒体 生物 合成 的 双重 控 抽 mtDNA 只 含有 编码 线粒体 呼吸 链 氧 化 磷酸 化 酶 系 4 个 复合 体 中 13 个 多 肽 亚 基 的 结 构 基 因 , 以 及 为 这 些 多肽 亚 基 在 线粒体 内 合成 的 22 个 NA 和 2 个 IRNA 基 因 。 但是, 线 粒 体 的 蛋白 亚 基 约 1000 种 , 在 组 成 呼吸 链 能 量 转 换 酶 系 近 100 多 种 蛋白 中 至 少 有 75S 种 以 上 是 由 核 DNA 编码 。 此 外 ,为 了 合成 、 运 送 以 及 正确 地 装配 这 些 和 蛋白 到 线粒体 内 膜 上 , 尚 需要 约 60 种 所 谓 “ 辅 助 ”性 和 蛋白, 它们 也 完全 由 核 DNA 编码 。 这 样 , 与 线粒体 DNA 一 样 , 约 130 多 个 核 基因 及 其 表达 蛋白 的 突变 会 影响 到 线粒体 的 生物 合成 和 呼吸 链 氧 化 磷酸 化 功能 并 导致 线粒体 疾病 。Fossilien(2003) 曾 重点 列 出 35 个 位 于 不 同 核 染 色 体 上 的 核 基因 位 点 , 都 涉及 线粒体 氧化 磷酸 化 系统 的 生物 合成 、 功 能 及 线粒体 的 维持 , 其 中 有 些 与 心肌 病 有 关 。 图 27-2 表示 核 基因 组 和 线粒体 基因 组 对 线粒体 生物 合成 (mitochondrial biogenesis) 的 双重 控制 及 其 相互 作用 。 转录 复制 细胞 核 DNA 和 mtDNA 的 相互 作用 及 其 对 线粒体 呼吸 链 酶 亚 基 的 生物 合成 的 控制 ( 引 自 Zeviani 2003 ) 从 图 27-2 和 Fosslien (2003) 的 实验 结 末 可 知 , 细 胞 核 主要 是 通过 核 基 因 编 码 线粒体 呼吸 链 蛋 和 白 的 表达 、 运 送 和 组 装 来 实现 对 线粒体 复制 的 控制 。 有 4 条 途径 : (1) 呼吸 链 的 组 成 蛋白 : 其 中 复合 体 I 约 37 个 亚 基 , 复 合体 I 有 4 个 亚 基 ,, 复 合体 II 和 IV 各 10 个 亚 基 ,, 复 合体 V 约 14 个 亚 基 。(2) 线粒体 转录 因子 : “SSR A (mtTFA, TFam) 的 基 因 TFAM 位 于 染色 体 10q21。 mtTFA 表 达 后 进入 线粒体 “与 核 DNA 编 码 的 POLG (mtDNA 聚合 酶 Y) Twinkle( 与 噬菌体 T7 基因 4 的 相似 蛋白 于 同 组 成 能 分 裂 的 动态 结构 核 小 体 。 它 是 线 体 的 遗传 单位 ,调节 线粒体 基因 组 的 转录 “ 率 ; mtTFA 和 蛋白 结合 在 mtDNA 335 27s BEETLE BSG GAEL LA AAD FE 重 链 和 轻 链 的 上 游 , 对 保证 线粒体 的 复制 、 转 录 以 及 胚胎 着 床 后 的 正常 发 育 至 关 重 要 , 也 与 心肌 病 的 预防 有 关 , 在 肌 病 患者 肌 细胞 中 mtTFA 过 表达 则 是 由 于 mtDNA 大 片段 缺失 引起 的 ATP 合成 减少 的 一 种 补偿 反应 。 核 呼吸 转录 因子 NRF-1 和 NRF-2 是 调节 核 DNA 编码 的 线粒体 呼吸 蛋白 表达 的 基因 , 二 者 还 协调 线粒体 的 能 量 代 谢 基因 脂 蛋 白 受 体 基因 和 脂肪 酸 氧 化 基因 的 表达 。 上 述 转录 因子 mtTFA 则 是 NRF-1 和 NRF-2 AY RCE A , 它 是 NRF-1 和 NRF-2 中 介 的 核 /线粒体 相互 对 话 的 一 个 效应 右 ,, 维持 着 mtDNA AFT 能 。SP-1 也 是 负责 协调 核 /线粒体 相互 对 话 的 核 转录 因子 。SP-1 结合 到 核 基 因 的 局 动 子 使 CORBF 和 下 基因 表达 活性 提高 30~ 100 倍 。ANT2、Cytc、mtTFA、ATP-F1B 等 基因 的 启动 子 也 同样 受 SP-1 的 结合 和 活化 。(3) 组 装 呼吸 链 蛋白 亚 基 : 包括 外 膜 的 TOM 和 内 膜 的 TIM 复合 体 以 及 分 子 伴 侣 mtHSP60 等 负责 核 DNA Sa GAA CES Bs AT eZ 体内 的 运送 、 插 入 和 组 装 。(4) 辅助 性 蛋白 亚 基 , 如 血色 素 等 。 从 图 27-2 我 们 还 看 到 , 核 基 因 对 线粒体 基因 的 调控 是 在 线粒体 的 反馈 信号 或 其 他 生 理 信 号 刺激 下 启动 的 。 在 线粒体 的 反馈 信号 (呼吸 链 电 子 漏 生成 的 ROS, 如 辽 O:) 或 在 生理 刺激 〈 肌 肉 收缩 或 三 础 甲 腺 原 氨 酸 ,T3) 作用 下 , 核 呼吸 因子 基因 NARF-7 3 NFR-2 首先 表达 , 它们 对 调节 核 DNA 编码 的 线粒体 蛋白 的 表达 十 分 必需 。NREF-1 对 于 植 和 人 和 着 床 的 胚 胞 生长 至 关 重 要 ,VRF-7 完全 缺失 则 为 致死 性 。 在 NMRF-7 (—/—) REHM, mtDNA 水 平 极 低 , 也 没有 mtDNA 的 复制 来 支持 着 床 期 豚 胞 的 生长 和 发 育 , 一 般 3 一 6 天 Ja RABBI EL. NRF-1 (+/—) 胚 胞 中 虽 有 线粒体 , 但 其 膜 电 位 比 野生 性 豚 胞 显著 降低 (DIMauro et al. 2003 )。 人 核 基 因 含 有 NRF-7、NFR-2 或 两 者 的 结合 位 点 〈7q32/2q31) , FES PR 10q21 位 点 又 有 TFAM 和 其 他 氧化 磷酸 化 酶 蛋白 基因 的 结合 位 点 , 如 ATP 酶 的 p 和 Y 亚 基 、 复 合体 IV 的 VYb、VIa 等 。 动 物 实 验证 明 ,NRF-1 和 NRF-2 协调 线粒体 的 复制 、 能 量 生 成 、 胚 胎 气 管 和 血管 发 生 以 提供 氧 和 和 营养 物 的 支持 以 及 代谢 废物 的 排除 。 低 密度 脂 蛋 白 相 关 受 体 蛋 白 (LPR) 基因 在 其 局 动 子 区 也 有 NREF-1 结合 位 点 , 提 示 后 者 也 同样 负责 调控 脂 蛋 白 对 线粒体 能 量 转换 的 供应 。NRF-2 作 为 Ets 蛋 白 家 族 成 员 同 样 也 是 氧化 磷酸 化 和 血色 素 合成 基因 的 转 孙 因子 。 线粒体 呼吸 链 和 氧化 磷酸 化 功能 缺陷 导致 ROS 升 高 , HO; 作 为 对 核 基 因 的 反馈 信号 来 刺激 核对 线粒体 合成 的 应 答 , 从 而 局 动 两 个 遗传 体系 之 间 的 “ 串 话 ” 和 线粒体 生物 合 成 反应 。H2O: 作为 信号 分 子 在 细胞 信号 转 导 中 是 非常 重要 的 ,在 线粒体 与 衰老 、 退 行 性 神经 疾病 和 肿瘤 发 生 中 的 重要 性 也 同样 十 分 明显 。 274.2 ASIN Ai 75 _ mI 有 关 核 基因 编码 的 线粒体 疾病 的 分 子 遗传 学 研究 进 层 很 快 (DiMauro et al. 2003, Chinnery et al. 2002)。 与 此 相关 的 疾病 有 : 原 发 性 的 呼吸 年 诗 病 ;“ 辅 助 ”性 组 装 呼吸 链 蛋白 的 线粒体 疾病 ; 维持 mtDNA 稳 定 的 线粒体 疾病 ; 核 志 二 与 线粒体 基因 之 间 信 号 传导 对 线粒体 呼吸 链 功 能 和 膜 脂 的 影响 , 表 27-5 列 述 了 前 = io 核 编码 原 发 性 线粒体 呼吸 链 疾病 的 基因 突变 多 发 性 SEL, 而 且 一 般 都 表现 为 儿 童 期 的 严重 神经 疾病 , an Leigh s 综 合 征 和 脑 白质 营养 (leukodystrophy)。 但 是 最 近 报道 , 复 仿 体 开 的 基因 突变 引起 副 神 经 节 瘤 和 嗜 铬 细 有 DiMauro et al. 2003), 有 ”种 常 染 色 体 隐 性 核 基因 (SCO], SCO2, SCO “和 SCO715) 已 确定 是 细胞 色素 HR ESE (ee 6 ? Biomembranes 336 DRA 疾病 类 别 突变 位 置 遗传 模式 原 发 性 呼吸 链 疾病 Leugh 综合 征 Ae Lika: NDUFS 2、4、7、8 和 EFVI 复 合体 I 亚 基 突 变 AR 复合 体 开 缺陷 : 复合 体 开 的 Fp 亚 基 突变 AR Hoi LIS AOL Ps BE HE Bats Liki: 5A LAY NDUFVI WHEE AR (myoclonic epilepcy ) 心肌 / 脑 肌 病 复合 体 I 缺 陷 : NDUFS2 突变 AR ApS Ee PA A 复合 体 开 缺陷 : a TAY Fp 亚 基 突 变 AD 组 装 呼 吸 链 疾病 Leigh’ s 综合 征 复合 体 TV 缺陷 : SURFI 突变 AR 复合 体 TV 缺陷 : COX 10 突变 AR 心肌 / 脑 肌 病 复合 体 IV 缺陷 : SCO 2 突变 AR 肝 训 和 脑病 复合 体 IV 缺陷 : SCO 1 突变 AR 细小 管 病 、 脑 病 和 肝 衰 复合 体 UM RPA: BCSIL 突变 AR 维持 mtDNA 疾病 Ae 68 6 AE PES Ant 1 3848 AD ( 继 发 性 多 次 mtDNA #4) POLG 突变 AD 或 AR twinkle 突变 AD 线粒体 神经 消化 道 肠 脑 肌 病 胸腺 核 苷 磷酸 化 酶 基因 AR ( 继 发 性 多 次 mtDNA E44) 肌 病 带 线粒体 DNA 丢失 胸腺 核 苷 激酶 基因 缺陷 AR 脑病 带 肝 衰 脱氧 鸟 戎 激酶 基因 缺陷 AR 注 : AD, 常 染色 体 显 性 ,AR, 常 染色 体 隐 性 。 氧化 酶 (复合 体 IV) 组 装 功能 的 基因 , 另 一 核 基因 (BCSIL) 组 装 复合 体 II。SCO2 突变 能 引起 总 体 COX 活性 的 缺失 , 但 主要 表现 在 心 嘉 和 脑病 。SCO7 突变 表现 为 肝 误 和 脑病 , SCO715 突变 引起 未 成 年 人 的 脑病 和 心肌 病 。BC497Z 突变 引起 新 生 邻 近 管 吉 病 (tubulo- pathy) 、 肝 训 和 脑病 ,SCO70 也 是 编码 COX 组装 的 蛋白 基因 , 已 发 现 与 Leigh's 综合 征 BK, 并 影响 人 和 肝 组 织 ; 虽然 致 病 性 突变 也 可 能 出 现在 复合 体 II、IV 和 V 的 结构 亚 基 上 ,在 子宫 中 发 生 胎儿 由 于 得 不 到 能 量 就 会 死亡 的 病例 , 表 现 了 典型 和 孟 德 尔 遗传 学 “全 或 无 ”的 遗传 型 。 维持 mtDNA 稳 定 的 疾病 常 表现 在 成 年 人 中 , 它们 可 能 为 常 染 色 体 显 性 或 隐 性 。 隐 性 突变 出 现在 编码 胸腺 核 背 磷酸 化 酶 (thymidine phosphorylase, TP) 的 基因 , 在 线粒体 神 经 一 消化 肠 道 一 脑 肌 病 (MNGIE) 患者 中 已 被 确定 主要 是 与 骨骼 肌 mtDNA 的 多 倍 次 缺 AG FARRAR EP a ia A Ab el, ERS AZ (deoxyguanosine kinase,dGK) 基 因 的 隐 性 突变 可 引起 线粒体 mtDNA 的 丢失 , 或 表现 为 TIK 缺失 的 肌 病 , BASEN UGK HRA HE ENN. FAR, ERAS BOLE. EAE PEN EY MIR LRG (AD-PEO) 是 由 于 3 个 基因 (POLG, TWINKLE Fil Ant!) P2048 5 [HAY TP Fl Ant] 突变 很 BAY RE AE: EIA AS AN FP HR eA td BC Fe PEt DS AREF, HEHE Re PEAS PAR Be PE mtDNA 2.’ AY PEO 是 由 于 隐 性 POLG 的 突变 所 致 。 WBE) 与 线粒体 基因 之 间 信 号 缺陷 对 线粒体 呼 中 对 功能 产生 影响 (DiMauro et al. 2003)。 由 于 和 在 进化 过 程 中 线粒体 遗传 失去 独立 性 , 表 于 为 线粒体 的 完整 性 和 mtDMA 复 337 27% ZEETRIR SG GABLE ANID FE 制 功能 依赖 于 nDNA 编码 的 众多 基因 的 控制 (图 27-3)。 这 些 基 因 的 突变 , 无 论 是 数量 还 是 质量 上 将 都 直接 影响 mtDNA, 并 导致 孟 德尔 式 遗 传 疾病 的 发 生 。 数量 变化 表现 为 每 个 细胞 和 细胞 器 内 mtDNA 分 子 数 的 减少 ;质量 变化 则 表现 为 mtDNA 多 倍 次 的 丢失 ,它们 与 线粒体 mtDNA 的 单个 丢失 引起 的 散发 性 KSS、PEO 和 Pearson s 综合 征 不 同 。 眼 肌 麻 兽 (PEO) 是 mtDNA 多 倍 次 丢失 的 临床 标志 性 疾病 , 常 染色 体 显 性 的 PEO 患者 常 有 近 下 肢 无 力 、 外 周 神经 病变 、 感 觉 神经 性 耳 舒 、 白 内 障 和 内 分 泌 北 乱 以 及 严重 抑郁 症 。 常 染色 体 隐 性 的 PEO 患者 有 两 个 主要 临床 表现 : 一 是 心肌 病 和 眼 肌 麻 兽 , 另 一 个 是 外 周 神经 性 疾病 、 肠 消化 道 蠕动 异常 和 白细胞 脑病 (线粒体 肠 消 化 道 脑 病 )。 数量 和 质量 两 方面 的 影响 导致 mtDNA 基 因 组 完整 性 的 损伤 ,这 种 损伤 可 以 直接 影响 mtDNA 的 维持 和 复制 所 需 的 蛋白 , 也 可 以 是 间接 地 影响 维持 线粒体 内 核 背 酸 库 的 蛋白 , 例如 某 些 携带 常 当 色 体 显 性 PEO 的 家 族 性 疾病 常 有 twinkle 突变 。Twinkle 蛋白 是 线粒体 与 T7 鸣 菌 体 引 物 RNA 合成 酶 / 解 螺旋 酶 (primase/helicase) 相似 的 酶 蛋白 , 其 他 家 族 性 疾病 则 有 线粒体 ADP/ATP 转运 酶 基因 (ANTI) 的 突变 。 线 粒 体 特异 DNA 聚合 酶 Y 的 突 变 与 其 mtDNA 的 显 性 和 隐 性 多 倍 次 丢失 疾病 (multiple-deletion disorder) 有 关 。 线粒体 神经 肠 消 化 道 脑 肌 病 由 ITP 功 能 的 丢失 引起 , 导致 血液 胸腺 苷 浓度 的 增加 。 TP 虽 不 是 线粒体 的 酶 蛋白 , 但 对 线粒体 中 的 核 苷 酸 库 有 选择 作用 , 而 核 背 酸 库 是 维持 mtDNA 的 完整 性 和 丰 度 所 必需 的 。4N77 突变 的 致 病 性 证 明 核 苷 酸 的 作用 , 也 被 线粒体 TK FldGK 的 突变 与 线粒体 mtDNA 和 技 失 的 肌 型 和 肝 脑 型 疾病 相关 这 一 事实 所 支持 。 这 些 知识 对 于 某 些 具有 婴儿 mtDNA 丢 失 综 合 征 家 族 的 疾病 预测 和 诊断 有 意义 ,也 为 疾病 的 干 预 治 疗 提供 新 途径 , 如 对 线粒体 神经 肠 消 化 道 脑 肌 病 (MNGIE) 患者 采取 降低 血液 胸腺 苷 浓度 的 治疗 等 。 线粒体 呼吸 链 复 合体 蛋白 除 细胞 色素 c 外 , 其 余 都 是 和 藤 在 内 膜 脂 双 分 子 层 中 。 心 磷 脂 是 某 些 呼吸 链 酶 系 结构 和 功能 的 重要 组 成 部 分 , 心 磷脂 缺失 对 致 病 线 粒 体 的 呼吸 链 功 能 有 影响 。Barth 综合 征 〈 线 粒 体 肌 病 、 心 肌 病 、 发 育 迟 缓和 白细胞 减少 ) 是 X 染 色 体 相 关 疾 病 , 其 基因 G4.5 是 编码 脂肪 酰 一 辅酶 A 合 成 酶 家 族 (tafazzin) 的 基因 ,它们 的 突变 影响 心 磷 脂 的 合成 , 患 此 病 的 病人 心肌 、 骨 骼 肌 和 血小板 中 的 心 磷脂 浓度 都 特别 明显 地 降低 (DiMauro et al. 2003 ) 。 2743 ”线粒体 DNA HIE, DNA 5S RRL 75 my 图 27-3 概 括 了 线粒体 DNA 和 核 DNA 编 码 的 氧化 磷酸 化 蛋白 基因 突变 及 其 引起 的 重 要 线粒体 疾病 的 主要 临床 症状 。 27.5 BORLASTS BE. AVERETT" mmm ogee 8p (A Be Hae PS Fe hill SIR EE. BAER TH AA BORA, AREL 体 与 神经 退行 性 疾病 曾 作 过 专题 评述 〈 刘 树 森 2003) , 运 AP eee TERR. 27.5.1 Ab (Seti 1" es — Roesch “€ (2002) ‘4% f —fyil H- — ALSk Feng? 上 (Mohr-Tranebgjaerg 综合 征 ), 由 TTWM 8A 基因 的 突变 引起 , 它 编码 位 于 线粒体 ,上 膜 间 蛋白 运输 结构 的 一 种 耳 ok) # 碍 蛋白 (DDP1). we — PX BATA 生 疾 病 ,, 表征 为 渐进 性 感觉 神 338 ND1I,ND2,ND3,ND4, Cyt b COX], COX, ATPase 6 ND4L,NDS5,ND6 Sporadic myopathy COXII NARP LHON Encephalomyopathy Sporadic anemia MILS MELAS Septo-optic dysplasia — Sporadic myopathy FBSN LHON and dystonia Cardiomyopathy Encephalo myopathy Sporadic myopathy ALS-like syndrome H - 基质 Succinat Fumarate uccinate eS 线粒体 内 膜 Hea a] Bak Complex I Complex II Complex III Complex IV Complex V NDUFS1,NDUFS2 SDHA,SDHB BCSII COX10,COX15 NDUFS4,NDUFS7, SDHC.SDHD Leigh’s syndrome $CO/,SCO2,SURF1 NDUFS8,NDUFV1 Leigh’s syndrome CRACILE syndrome _Leigh’s syndrome Leigh’s syndrome _ Paraganglioma Hepatopathy Leukodystrophy Pheochromocytoma Cardioencephalomyopathy Leukodystrophy and tubulopathy No. of mtDNA. encoded subunits No. of nDNA ~39 4 10 ‘ 10 Si ~14 — encoded subunits 4% DNA Ail mtDNA 编码 的 线粒体 呼吸 链 氧化 磷酸 化 复合 体 蛋 和 白 亚 基 基 因 突 变 与 线粒体 疾病 的 各 种 临床 症状 线粒体 内 膜 中 分 布 有 呼吸 链 复 合体 I-V、 辅 酶 Q 和 细胞 色素 <。 黑 色 箭头 表示 电子 传递 和 质子 跨 膜 运动 的 方向 。 蓝 色 块 代表 核 基因 编码 呼吸 链 复合 体 亚 基 , 亚 基数 表示 在 图 下 方 的 蓝 色 条 带 内 。 内 膜 中 的 红色 块 代表 mtDNA 编码 的 呼吸 链 复合 体 亚 基 , 亚 基数 表示 在 下 方 的 红色 条 带 内 。 内 膜 下 方 蓝 色 英 文字 代表 核 基因 编码 呼吸 链 突变 的 亚 基 , 黑 色 英 文字 表示 核 基因 突变 引起 线粒体 疾病 。 内 膜 上 方 的 红色 英文 字 代表 mtDNA 编码 的 呼吸 链 的 突变 亚 基 , 黑 色 英文 字 表 示 mtDNA 基因 突变 引起 相关 的 线粒体 疾病 经 性 耳 侮 、 张 力 障 碍 、 皮 层 性 失明 (cortical blindness) 以 及 精神 病 性 综合 征 。 另 一 例 常 色 体 显 性 遗传 的 次 挛 性 截 次 症 (spastic paraplegia) 与 线粒体 运输 蛋白 的 分 子 伴侣 伴 蛋 自 (chaperonin) HSP60 的 突变 相关 (DiMauro et al. 2003 ) 。 ik 陪 27.5.2 线 栖 作 运 功 休 从 折 -II 线粒体 经 常 由 发 动 蛋 白 (dynamin) 推动 沿 细胞 骨架 微 管 在 细胞 内 移动 。Alexander 等 (2002) 发 现 编码 线粒体 动能 蛋白 相关 的 GTP 酶 的 基因 OP47 突变 与 常 染色 体 显 性 表 型 WOM AE (optic atrophy) 相关 , 或 者 与 Leber's 遗传 性 视神经 韶 缩 病 一 起 , 构 成 年 轻 成 年 人 失明 的 主要 原因 。 27.53 BoB HHER IE TPEDCIN Tce FET Val (FE PEA IAZE OE) 和 Wilson’s 病 , 前 者 是 由 于 FRDA 基因 中 的 3 个 核 苷 酸 (GAA) 重复 序列 的 扩张 。FRD4 基 因 编 码 的 共 济 蛋白 (frataxin) 进入 线粒体 内 保持 铁 离 子 稳 态 平衡 。 共 济 蛋 白 下 降 会 造成 过 多 的 自由 铁 离 子 损坏 复合 体 I[_I、HIL 和 顺 乌 头 酸 酶 的 铁 - 硫 基 团 。 一 种 常 染 色 体 隐 性 遗传 次 这 截瘫 症 是 由 于 SPC7 基 因 的 突变 。SPC7 基 因 编 码 一 种 线粒体 截 次 蛋白 ,使 患者 肌肉 中 出 现 不 规则 红 肌 和 缺失 细胞 色素 氧化 酶 导致 呼吸 链 损伤 。Wilson s JA i Se RGAE, AEE Ae AUP AE ey, EEE HA ATP fig 7B 28 ALES 4s, 7B 基因 编码 Cu 转运 ATP 酶 , 其 中 的 一 个 亚 型 位 于 线粒体 内 。Wilson s 病 的 病理 发 生机 制 直 接 涉 及 对 含 铜 的 细胞 色素 氧化 酶 的 损伤 , 也 可 由 于 铜 的 积累 导致 更 广泛 的 氧化 损伤 ( DiMauro et al. 2003) 。 正常 衰老 、 老 年 痴呆 、 肌 痿 缩 性 状 散 侧 索 硬 化 、 享 廷 顿 氏 病 、 壮 进 性 上 核 麻 疗 (progressive supranuclear palsy) 和 由 金森 病 等 的 共同 致 病 机 制 是 线粒体 缺陷 。 线 粒 体 mtDNA 的 点 突变 和 重 排 随 着 时 间 的 积累 , 最 终 要 超过 多 个 组 织 的 致 病 国 值 , 即 表 现 为 正 常 衰老 的 机 制 ; 或 者 mtDNA 点 突变 超过 中 央 神 经 系统 的 特殊 区 域 的 国 值 , 此 即 表 现 为 神 经 退行 性 疾病 (DiMauro et al. 2003, Beal 2000, Schon et al. 2000) 。 27-6 CRIS" 7mm FLTE 1956 46, Warburg 就 提出 线粒体 氧化 磷酸 化 功能 缺陷 与 肿瘤 发 生 有 关 的 设 想 。 此 后 近 50 年 来 有 关 线 粒 体 与 肿瘤 的 大 量 研 究 , 特 别 是 线粒体 DNA 变异 以 及 mtDNA il nDNA 相互 作用 与 肿瘤 发 生 相 关 性 的 重要 性 ,发 现 好 多 原 癌 基因 和 抑 癌 基 因 与 编码 线粒体 蛋白 基因 定位 于 同一 妇 色 体 区 域内 ,提示 线粒体 合成 的 变异 与 肿瘤 发 生 的 可 能 联系 ,这 也 与 我 们 早期 报道 的 有 关 人 原 发 性 肝癌 的 发 生 可 能 是 由 于 线粒体 遗 传 和 核 遗 传 两 个 系统 变异 及 其 互相 作用 失调 这 一 结果 相 一 致 ( 刘 树 森 等 1976 ) .近来 , Baysal 等 (2000) 与 Gimm (2000) 分 别 发 现 副 神经 节 瘤 和 嗜 铬 细胞 瘤 的 发 生 由 核 DNA 编 码 的 呼吸 链 复合 体 II 的 基因 突变 引起 , 为 线粒体 结构 和 功能 缺陷 与 肿瘤 相关 性 提供 了 核 DNA 突变 的 直接 证 明 , 但 更 多 文献 证 明 mtDNA 突变 与 多 种 肿瘤 发 生 的 相关 性 。 Singh 等 (2001) 概 括 了 肿瘤 细胞 mtDNA 变异 引起 三 方面 带 有 普遍 性 变化 的 特征 : 〈1) 造成 呼吸 链 缺 陷 和 氧化 磷酸 化 合成 ATP 下 降 , 由 此 形成 肿瘤 细胞 代谢 向 有 氧 糖 酵 解 途 径 变化 ; (2) 导致 线粒体 ROS 生成 增加 和 氧化 应 激增 强 , 及 与 此 相关 的 线粒体 基因 与 核 基因 之 间 的 信号 互动 , 促进 细胞 向 增殖 方向 变化 和 肿瘤 细胞 信号 转 导 途 径 增 强 ; (3) 线粒体 功能 缺陷 导致 调控 细胞 凋 它 的 信号 减弱 和 细胞 生存 信号 的 增强 , 使 肿瘤 细 胞 向 抗 凋 亡 方 向 变化 (Preston et al. 2001) 。 基 于 此 Singh 认为 : 线粒体 DNA 突变 可 能 代表 了 癌变 过 程 的 起 始 步骤 , 与 mtDNA 突 变相 关 的 线粒体 功能 缺陷 和 无 氧 糖 酵 解 代 谢 增 强 为 细胞 增殖 和 肿瘤 细胞 发 生发 展 提供 了 必要 的 胞 内 环境 , 关键 因素 是 线 粒 体 基因 组 突变 引发 的 线粒体 与 细胞 核 之 间 的 信号 对 话 . 邓 致 了 细胞 凋 它 信号 途径 的 抑制 以 及 细胞 生存 和 增殖 的 信号 途径 的 启动 ,而 线 粒 付 的 ROS 在 实现 线粒体 向 细 胞 核 信号 传递 和 癌 细 胞 发 生 、 维持 、 发 展 过 程 中 扮演 了 “中 重要 的 角色 。 图 27-4 和 图 27-5 为 线粒体 ROS 参与 的 肿瘤 细胞 信号 转 导 途 径 。 SOR % x Biomembranes 340 VU ar eels ROOT _ fam] fl cr SAEKS MAPKs NFKB 细胞 存活 , 血 管 生成 增殖 线粒体 ROS 的 信号 途径 ( 引 自 Preston et al. 2001 ) A. 由 线粒体 呼吸 链 “ 电 子 漏 ”生成 或 由 质 膜 的 NAD (P) 英 氧 化 还 原 酶 (PMOR) 生成 的 ROS 刺激 细胞 的 生 长 增殖 ,B. 在 缺 氧 条 件 下 , 呼 吸 链 的 细胞 色素 氧化 酶 等 组 分 作为 对 低 [O,] 的 感受 器 并 对 ROS 生成 的 变化 起 反应 , 在 多 种 条 件 下 都 观察 到 [HO,] 变 化 可 影响 HIF-1 的 信号 途径 环境 刺激 LS > ?活化 因子 ore 1 man zee 线粒体 损伤 L=> 7 Fe 抗 氧 化 剂 保护 Uod 2 mtTFA NRF-1 {= Oy C) Sard 0 目标 基 因 转录 细胞 核 随 代谢 能 量 的 变化 导致 > Ets-1 RAL SURAT? nee ee oe 因 转 孙 肿瘤 细胞 对 线粒体 损伤 和 环境 刺激 的 信号 应 答 及 甚 能量 代谢 变化 模式 图 ( 引 自 Preston et al. 2001 ) 图 27-4A 表示 要 促进 和 维持 癌 细 胞 的 生存 和 增殖 需要 ROS 向 细胞 核 传递 有 效 信号。 已 观察 到 HO, 可 活化 细胞 的 RIK ( 受 体 酷 迄 酸 激酶 ) 和 Ras-MAPK(Ras-mitogen 活化 蛋 白 激酶 ) 信 号 转 导 途径 , 以 及 磷脂 酶 CY(PLC y) 和 磷脂 栈 肌 醇 -3“ -激酶 (PISK) 信 忆 通路 。 核 转 录 因 子 kB (NF-kB) 传 递 ROS 信 号 既 可 作为 肿瘤 坏死 因子 wx (TNF-a) 引起 细胞 凋 亡 , oO ee Gj TNF-a 一样 , batt ae A fig (SAPK Bet wy SPE AE IZ), EMS. AE SC Ace ROS 也 可 以 阻 上 casp se AURAL, Eli, 好 多 信号 途径 都 受到 RS 的 影响 , 细 胞 的 命运 直接 依 地 341 8 2/# ZERIT SALA ANID FE 于 它们 对 ROS 应 激 反 应 的 “解读 ”来 调节 细胞 内 的 促 凋 亡 与 促 细胞 生存 和 增殖 信号 之 间 的 平衡 。 由 于 癌变 细胞 表现 了 对 生长 控制 和 调 亡 的 负 性 调节 , 因此 氧化 应 激 就 表现 为 有 利于 肿瘤 对 生存 和 生长 信号 的 选择 。 从 人 的 凤 、 肺 和 前 列 腺 肿瘤 细胞 中 发 现 的 抗 氧 化 酶 和 和 氧化 应 激 的 增加 , 也 提示 ROS 信 号 刺激 对 癌 的 发 生 、 维持 和 发 展 的 贡献 和 作用 (Preston et al. 2001), 图 27-4B 表 明 在 快速 生长 的 肿瘤 细胞 中 ,在 新 血管 生长 之 前 , 低 氧 常 是 威胁 癌 细 胞 生存 的 主要 条 件 。 癌 细胞 为 适应 局 部 低 [O,] 环境 信号 的 途径 之 一 是 抑制 衰老 和 调 亡 诱 导 的 p53 抑 癌 基因 信号 通路 和 p53 的 低 表 达 , 另 一 适应 机 制 是 激活 HIF-1 信号 途径 。HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) 是 一 种 转录 因子 , 促 进 葡 萄 糖 转运 、 糖 酵 解 、 血 管 生成 、 血 红 素 生成 以 及 细胞 增殖 等 基因 的 表达 〈 Kagawa et al. 2001) 。 实 验证 明 ,HIF-1lo 亚 基 的 表达 是 癌 细 胞 在 低 氧 下 生存 和 生长 的 必需 条 件 。 在 HIF-1 信号 途径 中 , 线 粒 体 作为 低 氧 的 传感器 , 通过 对 细胞 色素 氧化 酶 活性 的 抑制 和 诱导 呼吸 链 复合 体 II 生成 HO:, 从 而 刺 激 HIF-1lo 的 积累 和 HIF-1 靶 基因 的 表达 。 去 除 mtDNA 或 用 过 氧化 氨 酶 处 理 细胞 则 阻 抑 此 信号 传导 通路 。ROS 诱导 的 MAPK 信号 途径 和 应 激活 化 的 信号 途径 SAPK, 如 JUK 信 号 都 参与 HIF-1 的 信号 转 导 机 制 。 因 此 , 在 低 氧 (hypoxia) 应 沿 诱 导 下 , 由 线粒体 原 发 产生 的 ROS 来 介 导 的 信号 通路 可 能 是 原 位 肿瘤 发 展 的 关键 性 因素 (Preston et al. 2001 ) 。 在 图 27-5 中 , 已 知 NRF-1 和 NRF-2 各 自 调 节 核 编码 的 呼吸 链 蛋 白 的 表达 , 但 它们 对 线粒体 ROS 的 应 答 方式 相反 。 在 癌 细 胞 中 ,NRE-1 上 调 氧化 磷酸 化 基因 表达 , 而 NRF-2 则 下 调 其 靶 基 因 , 但 其 同一 家 族 的 Ets-1 则 又 上 调 , 这 一 结果 就 解释 了 为 什么 在 癌 细 胞 株 中 常 发 现 氧化 磷酸 化 酶 蛋白 的 mRNA 升 高 而 线粒体 合成 数量 却 下 降 的 原因 。 由 于 NRF-1 和 了 Ets-1 及 其 靶 基 因 转 录 产 物 不 能 协调 表达 而 造成 呼吸 链 亚 基 的 差异 , 最 终 导 致 线粒体 合 成 数量 减少 和 能 量 代谢 异常 。 正 常 脂肪 细胞 中 的 PCG-1 辅助 因子 〈 过 氧化 酶 小 体 增 殖 因 子 激 活 的 受 体 Y 辅 助 因子 1) 能 把 环境 刺激 的 信号 传递 给 NRF-1 和 NRF-2, 使 线粒体 生 物 发 生 和 和 氧化 磷酸 化 蛋白 的 合成 上 调 (Muratovska et al. 2001, Murphy et al. 2000), 但 在 肿瘤 细胞 中 , 类 似 的 辅助 因子 对 线粒体 损伤 和 癌变 信号 的 应 答 可 能 是 抑制 线粒体 的 生物 发 生 (Preston etal. 2001), 27.7 ”线粒体 疾病 的 诊断 与 治疗 的 研究 ee 线粒体 疾病 独特 的 临床 表 型 多 表现 为 肌 无 力 、 运 动 不 耐 性 、 听 力 伤 失 、 共 济 失 调 、 症状 突 发 、 学 习 障 碍 、 和 白内障、 心 衰 、 糖 尿 病 和 生长 缓慢 等 , 但 如 果 患 者 兼 有 3 种 以 上 WEE, MARS er AMS AS, (RTRs. AP ER AEE 标准 , 尚 需 在 临床 上 做 出 进一步 测试 和 确诊 。 表 27-6 列 出 “有 关 线粒体 疾病 诊断 的 一 般 程序 。 ae 208 6 x Biomembranes 342 lain i 诊断 类 型 测试 方法 诊断 目标 和 结果 家族 史 及 遗传 背景 ”临床 检测 或 患者 口 了解 未 患 病 的 家 庭 成 员 和 亲属 的 一 些 病症 ,如 耳 寿 、 矮 小、 偏 头 痛 和 PEO 述 家 庭 成 员 病史 等 来 获得 遗传 类 型 的 背景 信息 肌肉 样本 组 织 化 学 检测 异常 线粒体 增殖 和 细胞 色素 氧化 酶 缺失 免疫 组 化 检测 特定 蛋白 的 有 无 来 排除 其 他 疾病 , 或 证 实 电子 传递 链 蛋白 的 丢失 生物 化 学 检测 特定 酶 活 , 如 电极 法 检测 线粒体 的 呼吸 耗 氧 率 电镜 观察 观察 异常 线粒体 形态 ( 现 已 不 常用 ) 血样 酶 活 分 析 “乳酸 和 丙酮 酸 水 平 。 升 高 则 证 明 呼 吸 链 缺 陷 , 如 两 者 比例 异常 , 可 帮助 确定 呼吸 链 的 阻 抑 部 位 血清 肌 酸 激酶 在 线粒体 疾病 时 轻微 上 升 , 如 mtDNA 缺失 则 明显 升 高 遗传 鉴定 已 知 突变 首先 用 血样 或 肌肉 标本 筛选 已 知 突变 找 出 共同 mtDNA 突变 稀少 或 未 知 突变 可 能 找到 稀少 或 未 知 突变 , 但 尚 需 家 庭 成 员 的 样本 , 此 鉴定 耗资 耗 时 27.7.2 APPS CIATT F254 777 7s 在 搞 清 线粒体 疾病 的 病理 机 制 前 很 难 有 真正 合适 的 治疗 药物 。 目前 只 是 针对 线粒体 疾病 的 一 般 病 理 表 征 , 试 用 一 些 有 保护 线粒体 呼吸 功能 的 抗 氧化 剂 、 维 生 素 ( 如 辅酶 Qio) 等 ,它们 单独 或 联合 使 用 对 于 延缓 和 减轻 与 衰老 相关 的 线粒体 疾病 的 发 生 和 发 展 可 起 到 一 定 效果 (Fossilien 2001) 。 目 前 线粒体 作为 药物 靶 点 的 研究 已 成 为 线粒体 药学 研究 的 热 点 (Weissig et al. 2001) 。 利 用 小 分 子 药物 和 各 种 蛋白 核酸 等 生物 大 分 子 靶 癌 导 入 线粒体 内 的 各 种 方法 已 获得 相当 地 成 功 Kagawa et al. 2001), 为 发 展 线粒体 疾病 的 药物 和 基因 治疗 商定 了 技术 基础 (Murphy et al. 2000, Muratovska et al. 2001) 。 27.7.3 基因 治疗 Par a 基因 治疗 (gene therapy) 是 原 发 性 线粒体 呼吸 链 遗 传 疾 病根 本 出 路 。 基 因 转 移 法 (gene shifting) 的 基本 策略 是 通过 药理 学 、 生 理学 或 外 科学 的 不 同 途径 来 减少 突变 mtDNA 对 野生 型 mtDNA 在 细胞 内 的 比例 (Kagawa et al. 2001) 。 基 因 治 疗 线粒体 DNA 疾病 的 难点 是 要 获得 靶 向 细胞 内 的 线粒体 , 开展 这 方面 的 研究 开始 于 20 世 纪 90 年 代 , 已 BRAND in vitro 的 实验 阶段 性 成 有 末 (DiMauro et al. 2003) 。 值 得 提出 的 是 , 利 用 细胞 质 杂 交 技 术 建 立 的 胞 质 杂 种 (cybrid) 和 线粒体 DNA 在 细胞 分 裂 中 复制 分 离 的 遗传 性 规律 , 结合 基因 重组 技术 , 已 在 5 例 纯 合子 家 族 性 高 胆固醇 血 症 (homozygous familial hypercholesterolemia) 患者 的 基因 冶 疗 中 获得 成 功 (Raper et al. 1996, Kagawa et al. 2001), 患者 先进 行 肝 切 除 并 从 肝 门 静脉 植 入 导管 ,从 切除 肝 组 织 中 分 离 出 肝 细 胞 进行 原 代 培养 , 用 重组 的 逆转 录 酶 病毒 编码 人 低 密 度 脂 蛋白 受 体 基因 转 导 入 培养 的 肝 细 胞 , 然后 将 基因 改造 后 的 肝 细 胞 通过 门静脉 导管 广 入 肝脏 ,此 种 基因 工程 的 肝 细 胞 可 置换 原来 损伤 的 肝 细胞 。 这 是 因为 , 从 有 线粒体 DNA 突变 患者 的 肝 中 分 出 的 肝 细 胞 在 培养 中 不 断 增殖 , 通 过 “随机 分 离 ” 的 规律 使 富 含 野生 株 mtDNA 的 细胞 系 得 以 划 选 出 来 , 从 而 改善 高 胆固醇 血 症 和 避免 冠 动 脉 梗 寒 发 生 (Kagawa et al. 2001)。 克 于 核 基 因 突 变 的 线粒体 疾病 而 言 , 基因 治疗 己 对 付 一 般 孟 德尔 遗传 的 疾病 一 样 。 特 殊 病 ;可用 药物 治疗 , 如 对 线粒体 神经 消化 道 脑 肌 污 患 者 可 用 降低 血液 的 胸腺 喀 啶 核 背 谊 度 F 了 法 来 治疗 。 也 有 报道 在 含 铜 的 343 $27 ZERIT GAL Be AHI DF Ze ttt 分 子 伴侣 SCO2 突变 的 细胞 株 中 , 补 充 铜 可 以 逆转 细胞 色素 氧化 酶 缺失 的 现象 , 说 明 含 铜 补 充 剂 对 其 些 线粒体 疾病 患者 是 有 益 的 《DiMauro et al. 2003 ) 。 刘 树 森 . 2000a. 线粒体 电子 传递 链 . 邹 承 鲁 主编 . 当代 生物 学 . 北京 : 中 国 致 公 出 版 社 . 511-312 MIRAE. 2000b. 线粒体 医学 及 其 分 子 基础 . 程 时 主编 . 生物 膜 与 医学 . 第 二 版 . 北京 : 北京 医科 大 学 出 版 社 . 131-160 刘 树 森 . 2001. 线粒体 学 与 生物 医学 新 前 沿 . 世界 科技 研究 与 发 展 . 2: 35-43 刘 树 森 . 2003. 线粒体 与 神经 退行 性 疾病 . 盛 树 力主 编 . 临床 神经 科学 前 沿 . 北京 : 北京 大 学 医学 出 版 社 . 110-143 刘 树 森 , 化 惠 罗 : 周 德 明 等 . 1976. 鼠 肝 线粒体 ATP 酶 (F,) 与 人 原 发 性 肝癌 线粒体 内 膜 的 杂交 重组 及 其 对 肝癌 发 生 的 遗传 控制 的 初步 分 析 . 生物 化 学 与 生物 物理 学 报 , 8(4): 307-317 Alexander C, Votruba M, Pesch U E, et al. 2000. 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( *) ii haan ae , R 第 06 Be 生物 腊 与 疾病 28.1 “生物 膜 的 组 起 345 a -) nT 345 28 下 2 二 有 障 和 蛋 自 二 345 28.2 GBPBTL 销 定 重 自 及 其 与 疾病 鬼 关 了 系 , -汪汪 345 28.2.1 GPT SFE Fe IRI) neecconsenescenos-decorsnoenre-sesssaceee ene 345 28.2.2 ”GPT 销 定 蛋 自 的 分 布 和 种 类 RCR 计生 汪汪 346 28230GPE 销 定 蛋 自 的 合成 二 了 二 ce 347 28.2.4 (GPT Saxe Se AOE BRB sacs... eee 347 28.2.5 GPI Piz i A Se BE AIS nn cocnn sce ceneneusasesenaneenneioeee 347 28.2.6 GPI 锁定 蛋白 与 免疫 和 神经 细胞 活化 的 关系 so eeeeseeseeseeeees 348 28.2.7 GPRI 锁 定 蛋 自 与 受 体 nccdencnccvneveenennssanceeus ee 348 28.2.8 GPLI 销 证 下 和 目 与 疾病 348 28.2.9 GPI 锁定 蛋 自 与 细胞 表面 工程 nnn eeesneenecnenneneeneenesnees 349 28:3, to 350 28.3.1 Wee SS nee cccscececosenceserseeust ea 350 DEF TE oesiseesssscassssslestnscee eo 350 28133” PEASE watncec.n.--..cs..ccecosectcneselvsenesndeees sole 352 DB 3.4 HBF IIS anecnco....ce..--cescececesesscecedd nereesess eee 353 DEA BET io ccseecstscyencsseesnsseoeesoresecdurznnved erst nce eee 358 wi “J \ Si App Heb a PE 2 HR Ai, 细胞 外 层 的 膜 称 质 膜 , 质 膜 } VV NN Ya 一 贞 和 细胞 器 的 膜 (包括 核 膜 的 内 外 层 膜 ) 统称 为 生物 膜 。 生物 膜 有 多 种 功能 , 与 生命 科学 中 的 许多 基本 问题 密切 相关 , MY NM 如 细胞 起 源 、 和 遗传 信息 传递 生物 能 量 转 换 、 物 质 运转 、 激 素 作 三。 用、 神经 传导 、 细 胞 免疫 、 细 胞 识别 、 细 胞 分 化 和 增殖 等 , 如 果 nd AN cL ee ee ee RA BAF EEA ES, 出 现 膜 病 学 (membranopathy ) 。 VVUN me AMOR. SANIBEL NE TBR TUR —, 345 % 28 AEE SPIA 28.1 FECT 211 Sm 生物 膜 由 蛋白质 、 脂 质 和 糖 组 成 。 和 蛋白 质 约 占 30% 一 40% , 脂 质 约 占 40% ~50%, 糖 约 占 5% 。 不 同 细胞 的 膜 其 组 分 差异 很 大 , 组 成 的 差异 与 其 生物 功能 有 关 。 仅 从 某 一 个 细胞 膜 的 组 分 来 看 也 不 是 一 成 不 变 的 , 它 随 着 细胞 的 生长 、 分 化 、 外 界 病毒 (或 细菌 ) 感 染 、 服 用 激素 或 药物 、 外 界 温 度 变化 及 和 营养 状况 条 件 的 改变 而 异 。 膜 脂 主要 由 磷脂 、 糖 脂 和 胆固醇 组 成 , 不 同 的 细胞 其 脂 质 组 成 差异 较 大 。 | 磷脂 可 分 为 两 大 类 : 甘油 磷脂 和 胆固醇 。 甘 油 磷脂 包括 甘油 骨架 、 两 个 脂肪 酸 和 磷 酸化 的 醇 。 脂 肪 酸 大 多 含 偶 数 的 碳 原子 (14 一 24), 一 般 在 甘油 的 xx 位 上 结合 的 是 饱和 脂 肪 酸 , B 位 上 是 不 饱和 脂肪 酸 。 在 甘油 骨架 的 第 3 个 碳 原子 上 结合 磷酸 基 称 磷脂 酸 , 这 是 磷脂 化 合 物 的 基本 结构 。 如 有 果 磷 酸 基 分 别 与 丝氨酸 、 乙 醇 胺 、 胆 碱 或 肌 醇 结 合 , 即 形成 ee HSRLZZ SA (phosphatidylserine, PS), WEARAECAZHE (phosphatidylethanolamine, PE) 、 磷脂 酰 胆 碱 (phosphatidylcholine, PC) FIENSREWLAZ (phosphatidylinositol, PI), ix 4 FH ie His 2A RAE Beko). SHWE (sphingomyelin, SM) AA HTH, mC ZARA AA, 长 链 的 不 饱和 脂肪 酸 结合 在 鞘 气 醇 的 氮 基 上 , 鞘 氨 醇 的 羟基 被 磷酸 胆 碱 化 。 脂 膜 中 的 固 醇 以 胆固醇 为 主 , 胆 固 醇 酯 很 少 。 胆 固 醇 的 量 与 磷脂 有 一 定 的 比例 , 常 用 测定 胆固醇 /磷脂 比例 来 鉴定 膜 征 否 有 病变 , 此 比值 称 为 COP。 各 种 细胞 膜 的 CP 值 相 差 较 多 , 如 红细胞 膜 比 值 约 为 1.0, 其 他 细胞 约 为 0.03 ~0.1, 糖 脂 由 糖 和 脂 质 组 成 , REA AE. 前 者 是 由 鞘 氨 醇 、 脂 肪 酸 和 糖 组 成 。 糖 脂 普 遍 存在 于 动物 细胞 的 质 膜 外 表面 , 与 细胞 的 识别 和 免疫 功能 有 关 。 | 膜 蛋白 按 蛋白 质 在 膜 上 的 位 置 及 与 膜 的 结合 程度 可 分 为 外 周 蛋白 (peripheral protein) 和 内 在 蛋白 (integral proteim), 它 们 的 区 别 主 要 是 由 蛋白 质 的 分 离 手 段 不 同 而 决定 的 。 一 般 情 况 下 外 周 蛋 白 很 容易 从 细胞 表面 分 离 获得 , 而 内 在 蛋白 必须 有 表面 活性 剂 存在 下 才 能 获得 。 另 外 , 还 存在 一 类 由 蛋白 质 、 脂 质 和 聚 糖 共 价 连接 的 糖 绥 合 物 , 由 于 所 含 的 脂 质 为 磷脂 酰 肌 醇 ,所 以 称 为 糖 基础 脂 酰 肌 醇 锚 合 蛋白 (glycosylphosphatidylinositol linked protein,GPI-pr)。 这 类 结合 蛋白 只 通过 脂肪 酸 插 入 脂 双 层 的 外 层 , 蛋白 质 通 过 糖 脂 的 核 心 被 锚 定 在 细胞 膜 上 ,所 以 又 称 糖 基 础 脂 酰 肌 醇 锚 定 蛋白 (glycosylphosphatidylinositol an- chored protein) , 这 类 蛋白 质 参与 信息 传递 等 许多 功能 。 近年 来 又 提出 它们 在 细胞 与 细胞 之 间 蛋 白质 的 运送 过 程 中 起 着 重要 的 作用 , 并 与 某 些 疾病 的 发 病 机 制 与 治疗 有 关 。 下 面 将 对 GPI 锚 定 蛋白 的 结构 、 主 要 功能 及 与 某 些 疾病 的 关 款 作 简 要 介绍 。 28.2, GPI Hie BRS RANI me 28.2.1 GP! Hie 25) ees: «rs GPI 铝 定 蛋白 是 20 世纪 80 EAR AH IMIR, MUI RA Ey (BERL OBEP ASAE) Bye 5 GPL AEN) 到 .动物 的 进化 过 程 中 ,GPI 被 较 完整 的 / . 留 下 来 。 它 由 一 分 子 的 磷脂 酰 肌 醇 (PTD) 、 一 用 糖 核心 和 一 分 子 乙 醇 胺 构成 。 hdd Ae \ | (yn IB be branes 346 在 细胞 表面 结合 蛋白 的 PEI 端 插入 质 膜 的 脂 双 层 中 , 其 中 乙醇 胺 端 通过 一 个 酰胺 键 与 蛋白 质 分 子 的 羧基 端 相连 , 蛋 白质 分 子 通过 这 种 形式 被 销 定 在 细胞 膜 上 (图 28-1), 和 蛋白质 GPI 销 SS oh 9 ee < EEELELULAELEELLLEL EEE ELE GPI tie HANEY 28.2.2 GPI ize & ANIA A FE GPI ie RANA AR. KE RURAL EY, RUBE, TC HE SDL MFLD YONI. AP. A. AeA aA. AB, AZ 100 多 种 蛋白 已 被 确 fre GP ie BA, 包括 有 多 种 水 解 酶 、 免 疫 球 蛋 白 、 细 胞 黏附 分 子 、 补 体 调节 蛋白 、 膜 受 体 等 ( 表 28-1)。 分 类 名 称 分 布 酶 类 碱 性 磷酸 酶 (PLAP) 乙酰 胆 碱 酯 酶 (AChE) 人 胎盘 、 哺 乳 动物 组 织 人 及 羊 红细胞 、 电 鳗 电器 官 5 - 核 苷 酸 酶 (CD73) 哺乳 动物 组 织 碱 性 磷酸 二 酯 酶 哺乳 类 组 织 海藻 糖 酶 免 组 织 肾 二 肽 酶 Ki. '§ 补体 加 速 误 变 因子 (CD55) 血细胞 反应 性 溶血 膜 抑 制 物 (CD59) 血细胞 同 源 限 制 因子 《HREF ) 血细胞 LFA-3(CD58) 和 许 科 告 血细胞 神经 黏附 分 子 fH NL, Be a AHH Blast-1/CD41 a CD66 1s 2) CD67 Mer “细胞 347 % 28% AN SPR ( 续 表 ) 分 类 名 称 分 布 膜 受 体 类 FcYRII (CD16) 嗜 中 性 粒 细胞 吞噬 细胞 、NK 细 胞 、 淋巴 细胞 受 体 叶酸 受 体 红细胞 尿 激酶 受 体 单 核 细胞 、 吞 噬 细 胞 内 毒素 结合 蛋白 受 体 (CD14) 单 核 细胞 、 嗜 中 性 粒 细 胞 淋巴 抗原 类 Thy-1 HED Dl, TAR oy Hohe RT-6 鼠 的 工 宁 巴 细胞 Qa-2 鼠 的 淋巴 细胞 和 其 他 组 织 ThB 鼠 的 淋巴 细胞 和 其 他 组 织 Ly-6 鼠 的 淋巴 细胞 和 其 他 组 织 Thy-3 鼠 的 工 淋巴 细胞 表面 抗原 类 CD24 早 幼 红细胞 、 胚 胎生 细胞 Campath-II .(CDw52) 淋巴 细胞 、 单 和 细胞 、 嗜 中 性 粒 细胞 28.2.3 GDI 257 7 mmm GPI it EAS BRD 3 个 步骤 : 首先 在 核糖 体 合成 肽 链 , 新 生 的 肽 链 进入 内 质 网 修饰 ,在 端 经 肽 酶 水 解 掉 约 15 ~ 30 个 氨基 酸 残 基 , 然 后 将 C 端 水 解 掉 约 15 一 30 个 氨 基 酸 残 基 , 修 饰 后 的 蛋白 质 与 GPI 结 合 。 利 用 逐一 切除 方法 观察 氨基 酸 与 GPI 结 合 的 关 A, 结果 发 现 w 和 ww +2 位 对 GPI 结 合 的 影响 较 大 , 只 有 丝氨酸 、 甘 氨 酸 、 丙 氨 酸 及 天 冬 氨 酸 才 可 与 GPI 结 合 , 其 他 氨基 酸 都 无 作用 。GPI 蛋 白 的 合成 在 内 质 网 内 进行 , 在 矶 脂 酰 肌 醇 的 基础 上 , 结 合 多 个 单 糖 , 形 成 聚 糖 。 每 个 步骤 都 需要 特异 的 酶 , 合 成 是 一 个 非 常 复杂 的 过 程 。 28.2.4 GPL E Sc) GPI 销 定 蛋白 的 共同 特点 是 蛋白 的 C in 5 CARRE . ANTI AY GPI 锚 定 蛋白 的 多 糖 和 磷脂 的 成 分 是 不 同 的 。 膜 蛋白 的 这 种 锚 定 形式 与 镶嵌 形式 相 比 , 在 理论 上 有 许多 优点 。 由 于 它们 在 膜 上 的 运动 性 增 大 , 有 利于 在 膜 上 结合 更 多 的 蛋白 , 而 且 锚 定 蛋白 具有 更 多 的 侧 向 运动 能 力 , 有 利于 它们 和 其 他 细胞 或 有 生理 功能 的 胞 外 分 子 更 快 地 结合 和 反应 , 同时 锚 定 蛋白 可 以 被 GPI 特 异性 磅 脂 酶 C (GPI-PLC) 和 磷脂 本 D (GPLPLD) 从 GPI $i 定 蛋 白 上 解 离 , 解 离 后 的 产物 具有 第 二 信使 的 功能 。 当 然 , 这 些 特点 并 不 代表 GPI 锚 定 蛋白 的 全 部 生物 学 意义 , 各 种 GPI 蛋白 具有 特定 的 生理 忆 28.2.5 GPLSVCES SISA SF 7; _ memes GPI 销 定 的 膜 蛋白 有 参与 细胞 信号 转 导 的 功能 。 FOL 7k IR GPL iis ay 是 重要 的 第 二 信使 物质 , 解 离 的 产物 是 二 酰 甘 油 (DG) ”小 酸 肌 醇 (IP;)。DG 能 激活 蛋白 激酶 C (PKC) 的 活性 , 使 蛋白 磷酸 化 , 而 并 ,使 儿 1 钙 释 放 , 进 而 调节 细胞 的 其 他 功能 。' 江 锚 定 蛋白 与 其 他 膜 蛋白 不 同 , 它 是 脂 合 售 。 ) 组 成 部 分 , 不 溶 于 中 性 去 污 il. AY “0 中 除了 胆固醇 和 糖精 脂 外 , 还 包括 如 下 组 。 CREA (caveolin), GTP 结合 ER ESP PRA 由 f 从 从 fe Biomembranes 348 蛋白 〈G 蛋白 )、GPI 锚 定 蛋白 、 非 受 体型 蛋白 激酶 、 膜 联 和 蛋白 工 (annexinIl), Eve 种 蛋白 都 有 各 自 的 信息 通路 。 例如 细胞 外 信息 可 通过 GPI 销 定 蛋 白 传 递 到 微 圳 素 , 因 GPI 锁定 蛋白 只 插入 脂 双 层 的 外 层 , 而 微 圳 素 是 跨 膜 蛋 白 , 它 一 头 接触 GPI 锚 定 蛋 白 , 另 一 MEAG BA (G 蛋白 通过 脂肪 酸 插入 脂 双 层 内 层 ) 或 酷 氨 酸 激酶 , 这 样 便 可 以 把 信 息 传 递 到 胞 内 , 引 起 生理 效应 。 不 同 的 细胞 , 接 受 不 同 的 信息 会 有 不 同 的 生理 效应 。 膜 联 和 蛋白 可 被 Ca 激活 , 又 结合 骨架 蛋白 , 可 将 信息 传递 到 细胞 核 内 。 另 外 ,GPI HER 白 是 脂 徐 的 重要 成 分 , 脂 徐 具 有 重要 的 生理 功能 , 又 与 许多 疾病 有 关 , 是 当今 生物 科学 研究 的 热点 , 此 部 分 内 容 将 在 28.3 介绍 。 28.2.6 GPI 锁定 蛋白 与 免疫 和 神经 细胞 话 化 的 关系 | 许多 GPI 销 定 和 蛋白 与 免疫 功能 有 关 , 这 类 蛋白 与 其 他 细胞 作用 从 而 引发 生物 效应 。 工 细胞 有 较 多 GPI 销 定 和 蛋白 (LY-6、Thy-1、Qa-2), 经 相应 抗体 激活 可 使 工 细 胞 活化 。 若 将 Qa-2、Ly-6 改造 为 跨 膜 结构 , 用 抗体 激活 ,TI 细胞 不 能 被 活化 , 相反 ,H-2 不 是 GPI 锁定 和 蛋白 ,在 工 细胞 激活 中 不 起 作用 , 若 把 它 转化 成 GPI 锁 定 和 蛋白 , 就 可 被 抗体 活化 , 从 而 使 工 细胞 活化 。 从 这 些 实验 看 来 , 工 细 胞 活化 过 程 中 GPI 锚 定 和 蛋白 起 着 重要 的 作用 。 不 仅 工 细胞 表面 有 GPI 销 定 蛋 白 , 其 他 细胞 表面 也 有 , 如 中 性 粒 细胞 表面 免疫 球 蛋 白 受 体 〈(FcrR) , 当 用 抗体 激活 可 释放 具有 杀 戎 功能 的 超 氧 阴 离子 。FcrR 有 两 种 类 型 : GPI 销 定型 和 跨 膜 型 ,但 跨 膜 型 与 抗体 作用 无 超 氧 阴 离子 炎 放 效应 。 神 经 细胞 表面 有 神经 黏 附 分 子 (N-CAM) , 它 也 有 两 种 类 型 : GPI 锚 定型 和 溶解 型 。 前 者 在 信息 转 导 轴 突 伸展 方面 都 有 作用 , 而 溶解 型 只 有 使 轴 突 伸展 的 功能 。 纤 毛 状 神经 营养 因子 受 体 〈ciliary neurotrophic factor receptor) 也 是 一 种 GPI 销 定 蛋 和 白 参 与 神经 元 发 育 , 通过 酷 氨 酸 激酶 起 作用 。 28.2.7 GPI 错 定 至 日 与 又 休 “ES 有 些 受 体 本 身 是 GPI 销 定 蛋 白 , 如 叶酸 受 体 , 它 的 作用 机 制 与 一 般 的 配 体 与 受 体 的 反应 不 同 。 当 叶酸 与 其 结合 时 , 易 形成 凹陷 引起 内 吞 , 这 样 把 叶酸 从 胞 外 转 到 胞 内 , 受 体 与 叶酸 结合 后 pH 值 变 低 ,GPI 锚 定 蛋 白 与 叶酸 解 离 , 叶 酸 进 入 胞 内 。Rothenberger 等 (1996) 报道 , 铁 的 转运 也 有 相似 的 方式 , 他 找到 一 种 蛋白 与 运 铁 蛋 白 受 体 同 源 , 称 黑 素 jek EA (melanotransferrin, 或 称 P97), 也 是 一 种 GPI 锁 定 和 蛋白。 将 转 铁 蛋 白 受 体 和 了 P97 HY) CDNA #4 A. CHO 细胞 株 , 比 较 两 种 受 体 对 铁 摄取 的 能 力 , 发 现 P97 比 转 铁 蛋 白 受 体 摄 取 铁 更 多 ,证明 P97 有 类 似 转 铁 和 蛋白 受 体 的 作用 。 28.2.8 GPIB "55 _ 近年 来 研究 报道 , 某 些 疾病 与 GPI 锚 定 和 蛋白 有 关 , 例 如 疯牛病 、 血 液 病 、 炎 症 和 某 些 肿瘤 等 。 报 道 最 多 的 是 一 种 称 为 阵 发 性 睡眠 性 血红 蛋白 尿 症 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH) 的 溶血 性 血液 病 , 其 发 病 机 制 与 GPI 锁定 蛋白 有 密切 关系 , 促 使 了 GPI 锚 定 蛋 白 研 究 的 发 展 。PNH 是 一 种 后 天 获得 的 元 隆 性 疾病 , 近年 研究 表明 是 由 于 造血 干 细 跑 发 生 突变 , 导 致 GPI 合 成 障碍 ,使 GPI 销 ” 绰 白 缺失 。 由 于 是 造血 细胞 的 突 变 , 所 以 全 向 细胞 表面 都 有 不 同 程度 的 GPI 和 蛋白 的 缺 2 (如 红细胞 、 单 核 细 胞 、 淋 巴 细 349 28% ARE DIAG 胞 、 中 性 粒 细胞 、 血 小 板 等 )。 现 已 知 PNH 血细胞 表面 缺失 十 几 种 这 类 蛋白 , 如 红细胞 上 和 缺失 C3 转化 酶 训 变 加 速 因 子 (DAF、CD55) 、 反 应 性 溶血 膜 抑 制 物 (CD59) 、C8 结合 蛋白 、 乙 酰 胆 碱 酯 酶 (AChE) 等 , 其 他 血细胞 缺失 CD14、CD16、CD24、CD48、CD52、 CD66 等 。 研 究 证 明 PNH 血细胞 缺失 这 类 膜 蛋白 不 是 由 于 不 能 形成 这 类 蛋白, 而 是 因为 生成 GPI 有 障碍 , 所 以 蛋白 无 法 连接 在 膜 上 。1993 年 Kinoshintad 研究 组 报告 PNH 患者 不 能 合成 GPI 是 由 于 和 染色 体 上 的 PIG-4 基 因 发 生 突变 ,随后 得 到 多 国学 者 的 证 实 , 经 历 百 余 年 的 PNH 病 研究 , 至 此 有 了 一 个 重大 的 突破 。 科 学 家 们 正 试图 利用 PNH 患者 自 身 异 常 的 造血 干细胞 加 以 改造 , 或 将 正常 的 细胞 加 以 扩 增 , 以 达到 治疗 的 目的 。 许 彩民 实验 室 证 明 存 放 一 定时 间 的 红细胞 可 释放 圳 泡 , mee es | CDSS Fl CD59 GPI Fi 蛋白 。 利 用 细胞 表面 工程 原理 , 将 释放 的 圳 泡 收 集 后 与 PNH 患者 血细胞 共同 旷 育 , 经 流 式 细 胞 仪 检测 发 现 , 原来 不 表达 GPI 锚 定 和 蛋白 的 PNH 异 党 细胞 可 部 分 表达 CD55 和 CD59, 并 能 抑制 红细胞 的 溶血 , 这 一 方法 为 PNH 患 者 提供 了 另 一 条 对 症 治 疗 的 途径 。 总 之 ,对 GPI 锁定 蛋白 结构 和 功能 的 了 解 , 将 会 对 某 些 疾病 的 发 病 机 制 和 寻找 治疗 手段 有 着 重要 9 意义 。 28.2.9 GPI fie 2 S21 2c | F_un 1995 年 以 来 , 有 许多 报道 说 明 GPI 蛋 白 可 从 一 个 细胞 转 到 另 一 个 细胞 。 在 体内 用 大 鼠 的 Thy-1 抗原 与 小 鼠 淋巴 细胞 保温 , 经 流 式 细胞 仪 检 测 , 发 现 小 鼠 淋 巴 细胞 上 有 大 鼠 的 Thy-1 抗原 。 如 用 另 一 种 GPI 蛋 白 FerRII (CD16), 与 缺失 CD16 的 人 中 性 粒 细胞 旷 PE, 经 流 式 细胞 仪 检 测 , 发 现在 人 的 中 性 粒 细胞 表面 有 CD16。 同 样 方法 与 T 和 B 细 胞 旷 育 , 在 T 和 B 细胞 表面 也 有 CD16 的 表达 。 这 两 个 实验 都 说 明 在 体外 GPI 蛋 和 白 可 从 一 个 细胞 转移 到 另 一 个 细胞 表面 。 在 体内 也 有 同样 的 例子 ,在 患 非洲 锥 虫 病 人 的 红细胞 膜 上 发 现 了 锥 虫 膜 的 VSG (一 种 GPI 蛋 白 ), 而 正常 人 红细胞 膜 上 没有 锥 虫 的 抗原 , 说 明 是 锥 虫 的 VSG 转移 到 人 的 红细胞 上 。 1996 年 , Medof 基 于 GPI 和 蛋白 与 蛋白 运转 的 关系 ,提出 了 细胞 表面 工程 的 设想 。 细 胞 表面 工程 应 用 基因 工程 的 方法 , 将 一 般 蛋 白 改造 成 GPI 蛋 白 , 其 方法 简单 , 只 需 把 要 转移 到 细胞 表面 蛋白 的 cDNA 与 GPI 结 合 必需 的 C 端 cDNA 融合 , 形 成 融合 cDNA, 然 后 再 转 和 人 到 细胞 内 , 使 其 表达 融合 蛋白 。 这 种 新 的 蛋白 既 有 原来 欲 改 造 的 蛋白 又 有 与 GP1 结合 所 必需 的 C 端 , 当 遇 到 GPI 时 , 即 可 结合 形成 GPI 蛋 白 。 从 细胞 上 提取 出 这 种 蛋白 , 与 欲 转 移 的 细胞 旷 育 ,GPI 蛋白 即 可 自动 组 装 到 靶 细胞 上 。 细胞 表面 工程 有 以 下 优点 : (1) 通过 融合 基因 的 方法 可 制备 较 大 量 的 GPI 蛋 白 ,(2) 对 一 些 难 进行 基因 转 染 的 细胞 , 用 此 方法 较为 容易 ,(3) 细胞 表面 可 按 要 求 直接 修饰 , 不 需 繁琐 的 细胞 培养 , 修 饰 后 的 细胞 表面 蛋白 还 保留 原 有 功 竺 ,(4) 蛋白 可 以 舒展 在 细胞 表面 , 易 于 控制 ,(5) 多 种 GPI 蛋 和 白 可 以 同时 结合 在 一 分 纪 胞 表面 。 由 于 GPI 蛋 白 有 多 种 重要 功能 ,缺乏 时 会 影响 细胞 今后 可 应 用 细胞 表面 工程 的 方法 改造 某 些 病态 细胞 , 将 缺少 的 蛋白 改造 成 GPI 蛋 /入 细 胞 , 从 而 恢复 细胞 功能 。 许多 细菌 、 寄生 虫 毒 性 蛋白 都 是 GPI 和 蛋白, 它们 把 毒素 /从 宿 主 , 使 宿主 产生 疾病 , 如 何 防止 转 ” 也 是 研究 防止 疾病 发 生 的 一 个 新 课题 。 目 彤 。 己 找到 多 种 药物 , 可 抑制 GPI ESET % 》 Biomembranes 350 ih ANA 蛋白 从 膜 上 释放 , 这 些 设想 将 会 给 防治 疾病 开辟 新 的 天 地 。 28.3 TTS 7 _ ja Hf (lipid rafts) ARAMA ARPA AG AF ae A, A EA ZA > PSY 特点 有 利于 蛋白 质 之 间 相 互 作用 和 构象 转化 , 可 以 参与 信号 转 导 和 细胞 蛋白质 运 转 。 质 膜 微 吉 (caveolae) 是 脂 生 的 一 种 类 型 ,由 胆固醇 . 鞘 脂 和 有 蛋白质 组 成 ,以 微 吉 素 (caveolin ) 作为 生化 指标 。 一 些 感染 性 疾病 、 心 血管 疾病 、 肿 瘤 、 肌 营养 不 良 症 及 及 蛋 白 病 等 都 与 late Dic Aale BBO KA. A 1972 4F Nicolson fH aint) BEER, 至 今 有 许多 关于 膜 结 构 的 报道 , 发 现 膜 中 有 富 含 胆 固 醇和 累 脂 的 微 区 (microdomain) , 这 个 区 曾 有 过 许多 名 称 : ASHE J 富 含 糖 脂 区 (detergent-insoluble glycolipid-rich domain,DIEF), 富 含 糖 脂 的 膜 (glycolipid-enriched membrane, GEM); 低 密度 Triton 不 溶 复合 物 (low-density triton- insoluble complex,LDTI) 2001 年 ,在 西班牙 名 开 了 欧 训 研究 讨论 会 上 对 “ 微 区 、 脂 第 和 质 膜 微 圳 ” 作 了 专题 的 讨论 , 下 面 简要 介绍 质 膜 微 吉 和 脂 徐 的 结构 与 功能 。 283.1 TIP (SCTE (7 mmm 1953 4f., Palade 用 非 离子 去 污 剂 提 取 内 皮 细 胞 和 平 请 肌 细 胞 膜 时 , 在 低温 下 用 非 离 子 去 污 剂 提 取 不 溶 的 部 分 , 经 浮力 密度 分 离 , 仍 可 再 分 成 两 部 分 , 较 沉 的 是 骨架 和 蛋白, 上 浮 的 是 膜 的 另 一 些 组 分 ,从 形态 观察 类 似 在 质 膜 上 的 吉 序 ,发 现 这 种 宫 泡 可 游 走 穿梭 在 细胞 之 间 , 所 以 起 名 为 质 膜 圳 泡 (plasmalemmal vesicle)。1955 年 ,Yamado 报道 了 与 Palade 相似 的 结果 , 将 这 种 圳 泡 称 质 膜 微 圳 ,是 拉丁 字 小 洞 (cave) 的 意思 。Yamado 所 称 的 质 膜 微 圳 即 是 现在 所 说 的 “ 脂 徐 ” 之 一 , 而 且 是 其 中 最 主要 的 一 种 。 质 膜 微 圳 由 胆固醇 、 鞘 脂 CHEZ RBA. SZ EA) 和 蛋白 质 组 成 。 大 小 约 50 一 100nm, 形 态 有 多 种 多 样 , 根 据 其 功能 不 同 有 瓶 型 、 宫 泡 型 和 管 型 , 多 数 是 瓶 型 。 在 细 胞 表面 有 开放 型 Ce ee eyo; 也 有 封闭 型 , 如 形成 胞 吞 吉 泡 。 从 冷冻 刻 蚀 图 观察 , 可 见 质 膜 微 圳 表面 有 曲 纹 履 盖 , 经 分 析 , 曲 纹 主要 由 微 吉 素 结合 胆固醇 而 成 。 质 膜 微 圳 的 组 装 分 两 个 步骤 : 首先 在 高 尔 基体 由 鞘 脂 和 胆固醇 形成 去 污 剂 不 溶 的 脂 质 核 , 内 质 网 合成 的 糖 基础 脂 酰 肌 醇 锁定 蛋白 和 微 融 素 艇 人 脂 核 体 , 形成 初步 的 组 装 体 ,然后 运往 细 胞 表面 。 在 此 过 程 中 微 圳 素 和 胆固醇 起 关键 作用 , 如 果 艾 除 微 圳 素 的 基因 , 就 不 能 形成 质 膜 微 吉 。 胆 固 醇 是 在 内 质 网 合成 , 如 有 果 合 成 受 抑制 , 也 不 能 形成 质 膜 微 圳 , 胆 固 醇 与 微 圳 素 的 比 大 约 在 4.5 : 1, 所 以 用 微 圳 素 作 为 质 膜 微 吉 的 生化 指标 。 微 圳 素 大 约 至 少 有 4 种 : 微 圳 素 -1x、1B、2、3。 在 膜 内 , 微 圳 素 -1 易 形成 同型 二 Bik, 在 脂肪 细胞 中 , 微 圳 素 -1、2 共 表 达 , Bake SRA, MEA -3 主要 分 布 在 肌肉 , 其 他 细胞 较 少 。 微 圳 素 的 结构 中 都 舍 有 3 个 半 胱 禹 酸 (位 于 134、144、157) 并 在 此 部 位 进行 酰 化 。 微 圳 素 是 一 种 支架 蛋白 (scaffolding protein), 支架 区 基本 已 清楚 , 它 可 直接 与 胆固醇 和 鞘 脂 结合 , 又 可 与 信息 分 子 (Src-kinase、H-ras、eNOS、G-protein 等 ) 结合 , 质 膜 微 吉 能 募集 多 种 蛋白 可 能 与 此 结构 有 关 。 | HEE 汪 膜 脂 双 层 内 含有 特殊 脂 质 和 蛋白 的 微 区 ,《“ 区 内 陷 可 形成 吉 泡 , 近年 发 现 351 % 28 AE FS PRIG BREAN FETE T MRE, IS AY CE re RAE RE LL. AE, 直至 1988 年 Simon 才 正 式 提出 “ 脂 徐 ” 概 念 。 脂 质 的 双 层 有 不 同 的 脂 徐 : Sb A ink CE Se AAS. HATA? Fl GPI 锚 定 蛋 白 , 因 为 攻 脂 含有 长 链 饱 和 脂肪 酸 , 因 温度 较 高 , 流 动 性 差 , 而 且 黏稠 , 邻 近 的 磷脂 区 脂肪 酸 多 不 饱和 , 刀 温度 较 低 , 所 以 出 现 分 相 , 膜 内 侧 也 有 相似 的 微 区 , 与 外 侧 的 脂 质 不 完全 相同 , 主 要 是 在 此 区 有 许多 栈 化 的 蛋白 ,特别 是 信号 转 导 和 蛋白 (A 28-2), 虽然 两 层 分 别 有 脂 徐 , 但 它们 是 偶 联 的 , 因为 用 非 离子 去 污 剂 提 取 时 , 不 仅 有 外 层 的 GPI 锚 定 蛋白 , 还 有 许多 信息 分 子 共 同 被 提出 。 用 一 种 GPI 销 定 蛋 白 的 抗体 介 时 锚 定 蛋白 聚 集 , 与 此 同时 Src 家 族 的 酷 氨 酸 激酶 也 被 激活 。 若 换 成 糖 式 脂 的 抗体 , 也 有 同样 的 现象 。 GPI 蛋 白 和 糖 蒜 脂 都 存 于 膜 外 侧 ,Src 酷 氨 酸 激酶 在 膜 内 侧 ,, 这 实验 明确 说 明 脂 合 内 外 层 之 间 是 有 联系 的 。 A ie ehest Al (514 Alberts et al. 2002 ) 用 不 同 的 去 污 剂 或 改变 溶解 时 的 温度 所 得 到 的 脂 质 和 和 蛋白 质 都 有 差异 , 说 明细 胞 膜 上 的 脂 徐 并 不 都 相同 。 脂 合 可 能 有 3 类: RE, PERAK. 、 富 含 多 磷酸 肌 醇 (PIP,) 膜 区 。 不 同 的 脂 徐 有 其 各 自 的 特异 蛋白 , 并 有 不 同 的 功能 , 脂 徐 的 部 分 脂 质 和 蛋 白 的 组 分 见 表 28-2。 脂 质 蛋白 质 ae 受 体 蛋 白 胆固醇 、 鞘 脂 、 糖 精 脂 微 圳 素 、flotillins、stomatins、MAL/BENE LAT 受 体 酷 氨 酸 沿 酶 (RITK, 如 EGF- (4GM1). PIP, 464: PAG、VIP36、GPI 锚 定 蛋白 类 (如 叶酸 受 体 人 R, PDGE-R, Insulin-R “#) PO ei 病毒 、 碱 性 磷酸 酶 等 ) 、 非 受 体 酷 氨 酸 激酶 (: 家 族 )、G 蛋白 、 一 氧化 氮 合 酶 (eNOS)、R Fyn, PKCa ABE A a A AE ZAR A eA, 但 更 fx 白质 需 酰 化 ,由 酰 化 后 的 脂 肪 酸 插 和 人 =. Zacharias 等 (2002) FAK ARR AAI = A A DETER IE H, AY GSW EE IE RARICCRHRR, ERR. S| RR ETA eI, FA ae od ei ” (| ( in tk Pots) anes 352 共振 能 量 转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) we 4Bitaeoz, ACHR Bre CA see BC CY Be A EA A i Se AY Be A ek SR AB AN EX, 对 胆固醇 不 敏感 , 可 能 是 另 一 类 的 脂 徐 , 说 明 不 同 的 酰 化 蛋白 插入 不 同 的 脂 徐 。Lang 等 (1998) 在 神经 元 细胞 膜 内 发 现 两 个 新 蛋白 : flotillin-1 和 fotillin-2, 不 溶 于 去 污 剂 , 与 脂 WT me, 用 其 抗体 进行 免疫 组 化 染色 , 在 光 镜 和 电镜 下 可 见 flotillin-1 和 fotillin-2 排 列 在 细胞 膜 的 胞 浆 面 , 在 延伸 的 轴 突 和 丝 足 上 都 存在 。 它 不 仅 存 于 神经 细胞 , 而 且 在 人 Jurkat 工 细胞 上 也 可 被 发 现 , 并 且 与 Thy-1, Fyn 蛋白 交 联 , 参 与 淋巴 细胞 活化 , 若 加 入 Thy-1 抗体 , 可 见 与 fotillin-1 和 fotillin-2 共聚 ,但 在 这 个 脂 徐 内 设 有 微 圳 素 , 这 说 明 含 有 flotillin 的 结构 可 组 成 另 一 类 的 脂 徐 。Salzer (2002) 用 钙 诱 导 红细胞 时 , 从 形态 和 生化 的 分 析 时 发 现 有 两 种 吉 泡 : — BPR GSE (microvesicle), A722) 130nm, 另 一 种 称 214 #27 nanovesicle), 直 径 约 60nm。 两 种 吉 泡 除 都 共有 GPI 锁定 蛋白 外 , 其 他 的 组 分 不 完全 相同 。 微 吉 泡 含有 两 种 蛋白 质 : stomatin 和 flotillin-1,2, Stomatin 是 棕榈 栈 化 和 蛋 白质 , 以 棕榈 酸 插 入 脂 合 区 , 作 用 很 像 微 吉 素 。Flotillin-1, 2 也 在 脂 徐 区 ,但 它 疫 有 被 酰 化 , FEE AURA. WAIL AAR A: 会 联 和 蛋白 (synexin) 和 抗 药 蛋白 (sorcin) 。 会 联 和 蛋白 是 膜 联 蛋白 (annexin) 家 族 的 成 员 膜 联 和 蛋白 VII (可 介 导 分 刻 小 泡 的 聚集 ), 负 责 细 胞 内 运转 和 膜 的 组 装 , 它 与 钙 结合 后 , 转 到 膜 上 形成 膜 融 合 蛋 白 。 抗 药 蛋 白 也 可 与 钙 结 合 , 结 合 后 暴露 出 玻 水 基 团 ,直接 插入 膜 , 有 观点 认为 抗 药 蛋 白 与 会 联 绰 白 都 在 脂 征 上 , 但 分 别 在 不 同 的 区 或 两 者 结合 后 进入 脂 徐 , 这 说 明 在 红细胞 的 圳 户 中 也 ATE. 28.3.3 JSC) 7) mmm 从 结构 和 组 分 上 分 析 脂 徐 有 两 个 特点 : YES RSENS EA, (EPL EA 脂 合 的 环境 有 利于 蛋白 质 的 变 构 , 形 成 有 效 的 构象 , 所 以 它 具 有 许多 功能 。 1. 参与 信号 转 导 由 于 脂 徐 内 有 多 种 信号 分 子 , 它 可 以 参与 许多 信号 转 导 通 路 。 以 了 细胞 为 例 ,T 细 胞 膜 上 有 工 细胞 抗原 抗体 (TCR), 当 它 活化 后 可 引起 许多 信息 分 子 聚集 形成 复合 体 。 最 近 Zhang 等 (1998) 报道 这 种 复合 体形 成 的 关键 是 脂 合 提供 了 平台 。 在 静止 的 了 细胞 脂 FEA ee Sre 家 族 激 酶 Lck | Fyn 和 LAT (linker activated T cel) , 还 有 少量 的 CD4 和 CD3, 其 中 最 重要 的 是 LAT。LAT 是 一 个 跨 膜 蛋白 , 是 伸 向 胞 浆 的 一 段 肽 链 , 富 含 酷 氨 酸 , 另 外 LAT 的 半 胱 氨 酸 还 可 酰 化 棕榈 酸 , 以 此 插入 脂 徐 。 当 TCR 被 激活 时 ,Src 酯 氨 酸 激酶 活化 引起 LAT 的 多 个 酷 氨 酸 被 磅 酸化 , 然后 ,LAT 聚 集 多 种 底 物 进行 磷酸 化 , 包 括 ZAP70、PLCYI、PI3K、Vav, 形 成 活化 的 大 复合 体 。 这 些 反应 都 必须 在 脂 徐 内 完成 , 如 果 LAT 不 能 进入 脂 和 化,T 细 胞 便 不 能 执行 其 重要 的 增殖 和 分 化 功能 。 其 他 免疫 识别 受 体 , 如 B 细 胞 抗原 受 体 (BCR)、 肥 大 细胞 高 亲 和 IgE 受 体 (FcERD 等 也 都 以 脂 化 作 为 传递 信 息 的 场所 。 ROY 等 (1999) 报道 调节 微 圳 素 的 表达 可 直接 影响 信息 蛋白 分 子 (包括 癌 基 因 ) 。 他 SPIE ZS 1 的 启动 子 有 胆固醇 的 调节 位 点 , 微 圳 素 记 质 膜 微 吉 内 有 运转 和 调节 胆固醇 水 平 的 作用 , 所 以 调节 微 事 素 的 表达 可 以 间接 影响 信 , 的 传递 。Parton 制备 了 一 个 微 圳 素 的 变异 体 !zavDGV), 可 抑制 HRas 介 导 的 Raf 活 化 , 若 加 入 胆固醇 可 改善 抑制 作用 。 也 设想 H-Ras 是 Ras 的 异 构 体 , 有 棕榈 酸化 ,需要 富有 ) 习 醇 的 脂 合 才能 活化 Raf, 这 个 353 % 28% . A SBR PEK BEERS HAE Hla (2001) 发 现在 细胞 质 膜 有 溶血 卵 磷 脂 类 (LP) 的 受 体 , 这 种 受 体 是 一 个 大 家 族 , 大 约 有 12 个 之 多 , 它 与 G 和 蛋白 偶 联 , 称 G 和 蛋白 偶 联 受 体 (G protein-coupled receptor, GPCR), LP 受 体位 于 膜 富 含 鞘 磷脂 的 质 膜 微 吉 区 , 包 括 溶 脂 酸 (LPA)、 溶 血 卵 磷脂 (LPC) 、 鞘 磷酸 胆 碱 (SPC) 及 鞘 磷脂 -1- 磷酸 (S-1-P)。LP 受 体 的 作用 包括 参与 调节 细 胞 迁移 、 增 殖 和 存活 , 调 节 血 管 系 统 的 成 熟 ; 激活 eNOS、 活 化 PKC 等 。 Nanjundan 等 (2001) 从 鼠 肺 细胞 内 提取 出 一 种 脂 质 磷酸 水 解 酶 LLP), 活 化 的 LLP 存 于 质 膜 微 吉 内 , 它 可 水 解 LPA、PA Fie Sa Re -1- 磷酸 , 水 解 后 的 产物 皆 为 第 二 信使 。 2. 参与 细胞 蛋白 运转 (1) 参与 跨 细 胞 运转 Anderson (1998) 报道 ,分布 在 内 皮 细 胞 的 质 膜 微 吉 开 口 于 细胞 的 表面 , 细胞 与 细胞 之 间 的 吉 泡 可 形成 一 个 通道 , 小 分 子 物 质 可 相互 交换 , 质 膜 微 吉 成 为 一 些小 分 子 化 合 物 运转 的 通路 。 (2) 参与 细胞 胞 饮 作 用 质 膜 微 吉 内 包含 许多 受 体 蛋白 , 质 膜 微 吉 将 它们 运送 到 细胞 内 可 利用 不 同 的 途径 : 受 体 与 配 基 结 合 后 , 被 质 膜 微 吉 运 送 到 胞 浆 , 配 基 与 受 体 分 离 , 受 体 随 圳 泡 回 到 质 膜 ; 质 膜 微 吉 载 着 受 体 与 配 基 , 通过 胞 浆 , 在 细胞 的 反方 向 开口 将 配 基 释 放 到 细胞 外 基质 .有 versa: 〈 如 霍乱 毒素 ) 与 细胞 上 的 受 体 结 合 , 也 以 这 种 方式 进入 宿主 细胞 内 。 (3) 参与 细胞 分 选 Martin 等 2000) 介绍 了 一 个 膜 内 在 蛋白 MAL, 属 酰 化 蛋白 家 族 , 在 于 Madin-Darby 犬 芭 细胞 (Madin-Darby canine kidney,MDCK) , 有 多 个 距 水 基 团 插入 极 化 的 上 皮 细 胞 (polarized epithilia) WARE. MAL 直接 参与 顶端 分 选 (apical sorting), 在 MDCK 细胞 内 若 加 入 MAL Jz CARR, PACA EAE, MAL 就 像 一 个 货车 , 可 在 质 膜 、 内 质 网 、 高 尔 基 体 之 间 循 环 运送 蛋 白 。 另 外 BENE 蛋白 和 MAL 一 样 , 也 属 酰 化 蛋白 家 族 , 与 微 圳 素 -1 结合 , 位 于 质 膜 微 吉 内 , 可 能 这 两 个 蛋白 是 脂 徐 的 新 成 员 。 Millan 等 (2002) 报道 当 工 细胞 执行 其 功能 时 , 发 生 极 化 形态 。 细 胞 的 一 端 延伸 , 形 成 特殊 的 突起 一 一 尾 足 (uropod) , 随 后 选择 性 的 将 一 些 黏 附 分 子 (ICAM-1、ICAM-2、 ICAM-3, CD43, CD44) 浓缩 在 尾 足 的 脂 徐 区 。 血 凝 素 (hemagglutinin, HA) 7 T 4B 的 高 尔 基 体 合成 后 , 进入 脂 合 圳 泡 , BAPE KPIS CMR, Hee SARE. a 胞 的 另 一 端 称 前 缘 , 对 抗原 和 细胞 因子 很 敏感 , 其 复杂 的 免疫 反应 都 在 前 缘 脂 徐 区 进行 。 | 从 的 生理 功能 具有 多 样 性 ,如 果 它 的 正常 生理 过 程 私 生 改 变 , 则 会 引发 多 种 疾病 。 近来 随 着 一 些微 圳 素 基因 人 缺陷 动物 模型 的 建立 , 为 人 们 理解 和 发 现 与 脂 合 相关 的 疾病 创 造 了 条 件 。 1. ARES RSE HEB 细胞 内 吞 作用 可 以 发 生 在 质 膜 微 圳 结构 上 , 许 多 半天 , 如 病毒 、 寄 生 虫 、 细 菌 及 其 毒素 都 休 公 质 膜 微 圳 进入 宿主 细胞 。 这 些 病原 体 或 毒 。 下 过 质 膜 微 圳 的 内 吞 作用 进入 宿主 细胞 , 并 不 与 溶 酶 体 融合 〈 与 溶 酶 体 融合 导致 大 ” 物 的 降解 是 经 典 细胞 内 吞 作用 的 途径 ) 这 样 , 外 源 物质 就 可 以 避 开 机 体 的 免疫 反应 年 一 系列 的 清除 行为 , 得 以 在 体内 ERESE hs Biomembranes 354 han 生存 并 发 挥 其 致 病 作 用 。Shin 等 (2001) 向 人 们 展示 了 细菌 在 小 鼠 骨 髓 源 性 肥大 细胞 (mouse bone marrow-derived mast cell, BMMC) | 24 FH WAR GLE IE RE REAM 细胞 的 机 制 。Norkin 等 (2002) 的 实验 说 明了 SV40 28 ry IR GGEA Ga, A Sie Ries 结合 , 而 转运 至 内 质 网 的 特殊 感染 途径 。 用 药物 阻 断 这 一 通路 中 某 些 蛋白 的 组 装 , 就 可 以 抑制 感染 的 发 生 。 目 前 还 有 竺 在 体内 实验 和 分 子 水 平 上 阐述 质 膜 微 吉 在 感染 性 疾病 中 发 挥 作 用 , 借 此 , 人 们 将 利用 更 为 合理 的 传送 途径 来 设计 药物 以 达到 更 为 有 效 地 阻 断 病 原 体 感染 的 治疗 目标 。 2. ARES HIV 的 感染 和 病理 HIV 是 一 个 有 外 套 的 病毒 , 感 染 人 宿主 细胞 时 , 先 与 宿主 细胞 质 膜 融 合 , 再 释放 基因 组 RNA 到 宿主 细胞 。 一 般 HIV-1 与 工 细 胞 CD4 融合 是 主动 且 不 可 逆 的 , 现 对 融合 的 机 制 有 了 初步 地 了 解 。 病 毒 外 套 有 两 个 蛋白 , 一 个 是 炙 120, 另 一 个 是 gp4l., gp4l AYN vin 是 玻 水 的 , 称 为 融合 肽 。 未 融合 前 ,gp41 包 秦 在 病毒 的 外 套 内 , 保护 它 在 亲 水 的 环境 内 。 当 HIV 与 CD4 细胞 融合 时 , 在 脂 征 区 形成 三 分 子 的 复合 体 : gp120-CD4-GSL (glycosphingolipids), 然 后 脂 和 后 带 着 病毒 复合 体 在 膜 上 平移 直到 找到 协同 受 体 (co- receptor) 。 为 什么 病毒 颗粒 能 与 GSL 结合 ? 因为 病毒 颗粒 的 gp120 上 有 一 个 V3-loop 区 , 通过 二 硫 键 与 GSL、GM3 (monosialoganglioside GM3) 结合 。 协 同 受 体现 已 清楚 ,包括 趋 化 因子 受 体 (CXCR4, CCRS, CCR3, CCR2b) 和 一 系列 的 抓 儿 受 体 (orphan receptor), 这 些 受 体 都 属 G 蛋白 偶 联 七 次 跨 膜 受 体 。 协 同 受 体 主要 作用 是 帮助 gp120 的 变 构 , 从 而 (# gp120 与 病毒 颗粒 分 离 , 暴 露出 op4l 的 融合 有 状 , 由 于 融合 肽 是 踊 水 的 , 宿 主 膜 的 脂 纺 是 它 最 好 的 栖身 之 地 , 所 以 融合 肽 进入 工 细胞 〈 图 28-3). 在 此 过 程 中 脂 徐 有 许多 作用 : 稳定 病毒 在 细胞 表面 ; 促进 CD4-gp120 复 合体 结合 到 协同 受 体 , 介 导 侧 向 移动 , 帮助 gp120 变 构 , 使 融合 肽 暴露 出 病毒 外 套 。 Nehete 等 (2002) 报道 HIV 也 可 通过 肠 道 感染 ,HIV iit gp120_ 上 的 V3-loop, 与 肠 黏膜 ( 肠 上 皮 细 胞 ) ABER RARE (glycosphingolipid, GSL ) glactosyl cerebroside (Gal Cen) 结 合 , 他 们 认为 GSL 是 g120 高 亲 和 的 受 体 , 如 用 人 工 合成 的 V3-loop 的 类 似 物 结合 GSL, 可 抑制 HIV 在 工 细胞 的 感染 , 进 一 步 证 实 他 们 推测 的 机 制 是 正确 的 。 3. AR SAS ber IA LAG A od - HERI (Creutzfeldt-Jakob disease,CJD) 、 羊 瘙痒 症 和 和 牛 海绵 样 脑病 等 , 甚 发病 原因 是 细胞 肝病 毒 蛋 白 (prion protein, PrP) 的 构象 转变 为 异常 形式 (PrPs*) 。PrP< 是 结合 在 细胞 膜 外 表面 , 带 有 GPI 销 定 糖 蛋 白 。 研 究 表明 , 小 鼠 的 神经 瘤 母 细 胞 (N2a) 的 PrP< 聚 集 在 质 膜 微 吉 样 结构 域 中 ,经 羊 瘙痒 因子 (scrapie) 感染 后 的 小 鼠 神经 瘤 母 细胞 (ScN2a) ,PrPs 也 聚集 在 相应 的 结构 中 。 细 胞 胆固醇 水 平 的 降低 可 以 抑 制 | PrPc 向 PrP 的 转化 , 这 就 提示 人 们 , 富 含 胆固醇 的 质 膜 微 圳 样 结构 域 很 可 能 就 是 肝 病毒 传播 增殖 的 场所 。Kaneko 等 (1997) 证 实 PrP* 是 由 GPI 锚 定形 式 的 PrP5 转 变 而 来 , 并 不 是 来 自 跨 膜 的 PrP5, 由 于 GPI 和 蛋白 是 质 膜 微 吉 结 构 的 标志 性 蛋白 质 之 一 , 这 也 证 实 了 上 述 实 验 的 结论 。 另 有 许多 实验 证 实 : PrP' 与 其 他 GPI 和 蛋白 一 样 在 脂 第 中 ,PrPC、PrPs 共同 定位 (co-localized) 7EABFEA; 胆固醇 缺乏 导致 Pr 的 形成 下 降 ;, 在 肝 病 毒 杆 (prion rod) (fet IRA AZFHE, amyloidfibrils) 内 找到 两 个 糖 = (Gal Cer 和 SM) 。 所 以 许多 学 者 设想 PrP- | PrPse 的 转化 是 在 脂 合 内 进行 的 〈 图 28-4 | Baron (2002) 设计 了 一 个 355 % 28 & AE yg SPA A 初始 结合 gp120 B 横向 装配 NY 胆固醇 脂 徐 和 胆固醇 HIV-1 径 CD4 诱 发 、 鞘 糖 脂 协 助 使 gp120 产生 >, 构象 变化 gp41 gp120 CD4 <> Co-receptor , Cee[ 1s ee ' fem >>. >> >> >>,> >) +> ‘B..s 3.>,2 > HS Bean = hatte HIV-1 融合 至 CD4*T 细 胞 中 所 起 的 作用 (514 Fantini et al. 2002) A. HIV-1 和 宿主 CD4*T 细 胞 的 初始 结合 。CD4 存在 于 富 含 GSL (如 GM3/Gb3) 和 胆固醇 的 脂 微 区 中 。HIV-1 表面 的 包 膜 糖 蛋 白 gp120 结 合 到 CD4 上 , 遗留 下 它 的 V3 结构 域 可 供与 脂 答 GSL 的 继 发 相互 作用 。 在 这 个 阶段 ,HIV-1 跨 膜 糖 蛋 白 gp41 仍然 以 其 非 活化 构象 形式 结合 至 gp120。B. HIV-1 融合 复合 物 的 横向 装配 。HIV-1 一 旦 结合 到 CD4 上 , 病 毒 颗粒 就 被 转运 到 一 个 合适 的 协同 受 体 上 (如 趋 化 因子 chemokine 的 受 体 CXCR4 或 CCR5, 或 者 其 化 G 蛋 白 偶 联 七 次 跨 膜 结 构 域 受 体 ), 这 些 都 是 通过 含有 各 种 脂 质 成 分 的 质 膜 外 层 上 的 可 以 自由 移动 的 GSL ASHES SH 终 未 结合 阶段 。 伴 随 着 脂 第 微 环 境 中 的 CD4 的 初步 相互 作用 ,gp120 构象 的 改变 致使 病毒 糖 蛋白 隐秘 的 区 域 (包括 BR, (RA BOREREN = fA) 给 一 个 适 当 的 协同 受 体 提 供 了 继 发 的 相互 作用 。 HP SG RAS A EA 是 协同 受 体 同 gp120 的 结合 就 将 病毒 刺 突 移 动 到 丢 膜 附近 。 此 外 , 脂 答 开 始 弥 散 , 人 允许 协同 受 体 和 CD4 -gp120 复 合 括 。 在 HIV-1 包 膜 糖 蛋白 三 聚 体内 , 为 象 改变 必然 地 暴露 了 跨 膜 糖 蛋 白 gp41 N 端 的 融合 肽 。 这 些 构象 改变 是 受 脂 管 ! 行 使 脂 类 分 子 伴侣 作用 的 GSL 诱 导 而 发 生 的 。D. 融合 反应 的 发 生 。 发 生 在 gp120 的 构象 改变 被 展示 在 左 侧 , 发 1 中 的 构象 改变 被 展示 在 右 侧 , 这 一 改变 导致 了 融合 反应 的 发 生 。 一 旦 玻 水 的 融合 肽 被 病毒 刺 突 释 放出 来 , 它 就 个 高 度 极 性 亲 水 环境 , 进 而 诊 透 进入 靶 细 胞 的 浆 膜 …, 在 这 里 , 它 将 遇 到 稳定 的 疏水 环境 。 这 种 不 可 逆 j 好 病毒 包 膜 和 质 膜 的 密切 接触 , 随 着 融合 将 核 衣 壳 带 入 到 靶 细 胞 的 胞 356 生理 条 件 下 无 细胞 的 转化 实验 : 将 神经 母 细 胞 的 去 污 剂 不 溶 的 膜 (detergent resistant membrane, DRM) 作为 PrP 的 来 产 ,, 以 羊 瘙痒 证 感染 的 小 电脑 微粒 体 作 为 PrPs 的 来 源 。 发 现在 此 环境 中 , 只 有 当 外 来 的 PrPss 插入 到 膜 后 PrPS 才 转 化 , 而 且 PrP 必须 结合 膜 脂 徐 〈 富 含 胆固醇 和 冰 磷 脂 ) 。 脂 徐 可 诱导 PrPcN 端 & 螺 旋 区 折 县 ,PrP (eH TE fa xe CIE 常 的 变 构 , 一 旦 外 来 的 PrPs* HEA Za, 打 乱 了 它 的 稳定 结构 。 一 般 在 蛋白 转化 时 需要 有 分 子 伴侣 参与 , 在 PrPo 转化 时 涉及 一 种 X 和 蛋白, 选择 性 的 存在 脂 答 中 , 很 像 HIV 中 的 JU A B Cc 构象 改变 PrPc 一 PrPs D 膜 脂 徐 中 PrPc 向 PrPse 的 转化 (| ("| Fantini et al. 2002) PrPss 的 感光 性 由 感染 细胞 向 非 感染 细胞 传播 的 可 能 模型 。 这 个 模型 是 以 Caughey 实 验 室 最 近 的 数据 为 基础 , 他 们 指出 , 脂 徐 相 关 的 眶 蛋白 转化 过 程 要 求 PrPss 插 和 人 到 邻近 的 膜 上 。A. 感染 性 肛 蛋 局 (单一 的 PrPss 分 子 或 者 富 集 PrPs 的 小 膜 囊 泡 ) 从 一 个 感染 红 汪 异 表面 释放 出 来 , 而 后 PrP: 被 插入 到 一 个 非 感染 性 细胞 太 王 膜 表面 。B. 在 这 个 阶段 , 内 源 性 PrP® 和 感染 性 PrPs 蛋白 可 短 定 位 于 易 感 细胞 的 不 同 脂 徐 区 域 , 不 同 脂 徐 区 域 的 汇合 将 ” 浴 PrPs 和 PrPs 提供 紧 密 接触 的 机 会 。C. PrP‘ 向 PrPS: 的 转化 发 生 在 膜 脂 答 中 。D. 感染 性 是 在 宿 “ 细胞 表面 被 传播 的 。 357 % 28% AO PRIA gp120, gp120 AY V3-loop 与 脂 征 中 的 糖 脂 结合 在 特异 的 结合 区 ,PrP 中 相应 于 V3-loop 的 区 域 是 含有 螺旋 一 转角 一 螺旋 的 基 序 (helix-turn-helix motif) , 它 是 由 33 个 氨基 酸 残 基 组 成 ,含有 一 个 二 硫 键 的 环 , 这 个 环 包 括 PrP5 的 第 2 个 和 第 3 个 &% 螺 旋 结 构 。PrP5 的 V3- loop 类 似 结 构 含 Try、His/Phe 残 基 , 用 来 介 导 与 复合 糖 中 的 单 糖 环 状 结构 结合 。 用 人 工 合成 类 似 PrP® 的 V3-loop 结构 的 肽 , 可 与 Gal Cer 、SM 结合 , 者 合成 这 个 肽 的 变异 体 , 则 不 能 识别 SM, 即 不 能 稳定 PrP5 的 结构 , 说 明 脂 徐 中 的 糖 脂 的 确 可 起 着 稳定 PrPo 结构 的 作用 , 当 外 源 PrPs* 进入 细胞 时 , 打 破 它们 的 稳定 , 形 成 PrP“- PrP* -co-factor 复合 体 , 进而 自动 催化 形成 肝病 毒 杆 (prion rod) 并 聚集 在 脑 内 , 使 脑 组 织 发 生病 变 。 4. A§f5 Alzheimer 病 C4 Alzheimer JH 2a A ie AA Bem AEA (B-amyloid, AB) RE, AB 是 一 种 路 膜 的 淀粉 样 前 体 蛋 白 (amyloid precursor protein, APP) 水 解 后 的 产物 。APP 和 分 泌 酶 早老 素 1 (presenilin 1) 都 在 脂 征 内 , 所 以 很 可 能 AB 最 初 也 在 脂 策 内 。 当 它 与 胆固醇 、GM 结 合 后 促进 证 粉 样 蛋白 从 go 螺旋 向 B 折 登 构 型 的 改变 。McLaurin 等 (1998 ) 报道 制备 了 一 种 含有 GMI sa, HABA, 在 pH 为 7.0 时 ,产生 wo 螺旋 , 而 在 pH 为 6.0 时 , RKB BAY. AIA GM 则 不 可 能 有 变 构 ,, 进一步 说 明 脂 谷 影响 变 构 的 设 想 。 演 粉 样 蛋白 在 脂 徐 变 构 的 机 制 与 HV、PrPc 的 变 构 非常 相似 。 人 工 合 成 的 一 个 短 肽 ( sheet breaker peptide) 可 在 演 粉 样 蛋白 结构 的 中 心 部 位 抗 B 折 登 , 可 抑制 证 粉 样 蛋白 的 变 构 。 这 个 短 肽 舍 有 2 个 葵 两 氨 酸 , 有 芳香 族 的 葵 环 , 设 想 脂 徐 中 的 糖 环 也 有 这 个 作用 , 可 以 调控 淀粉 样 蛋白 的 变 构 。 5 , 脂 和 巷 与 心血 管 疾病 内 皮 来 源 的 一 氧化 所 的 生物 利用 率 较 低 , 在 动脉 粥 样 硬化 症 发 生 过 程 中 起 着 关键 作 用 。 内 皮 型 一 氧化 气 合 酶 (eNOS) 直接 受到 微 圳 素 的 调节 ,与 质 膜 微 囊 关 系 密 切 。 实 验 表明 , 利 用 氧化 型 的 低 密 度 脂 蛋白 作为 胆固醇 的 接收 体 , 可 以 导致 质 膜 微 圳 的 耗竭 , 也 可 以 抑制 由 乙酰 胆 碱 诱导 eNOS 的 活性 ; 但 不 影响 eNOS 的 数量 和 环 前 列 腺 素 的 产量 , 也 \ 影 响 eNOS 的 肉 豆 翘 酰 化 、 标 榈 酰 化 和 磷酸 化 。 去 除 氧化 型 低 密度 脂 蛋 白 , 质 膜 微 圳 的 结构 可 以 得 到 恢复 并 且 eNOS 亦 可 再 与 质 膜 微 吉 结 合 。Bucci 等 (2000) 在 体内 实验 中 UES f (GER -1 对 eNOS 信号 通路 起 着 首要 的 作用 ,一 旦 eNOS 通路 出 现 抑制 , 则 会 消 除 由 NO 介 导 的 血管 渗透 和 收缩 反应 ; 随后 ,Razani 等 (2001) 和 Drab 等 (2001) Fil Ag 除 微 圳 素 -1 基 因 的 小 鼠 , 在 离 体 大 动脉 血管 收缩 紧张 度 测量 的 实验 中 发 现 ,缺乏 微 圳 素 - 1 导致 aeNOS 活性 水 平 低 并 导致 血管 弹性 降低 , 在 动脉 中 忒 发 现 了 这 一 现象 。 另外 , 高 度 糖 基 化 终 产物 (advanced glyosylation end product, AGE) 通过 受 体 介 导 , 在 糖尿 病 并 发 症 中 发 挥 着 重要 的 作用 。Stitt 等 (2000, 发 现 , 在 视网膜 微 循环 内 皮 细胞 中 ,AGE 与 受 体 的 相互 作用 是 在 质 膜 微 圳 中 进行 的 ,市 比 表明 , 质 膜 微 吉 的 内 化 和 信和 号 转 导 功能 或 许可 以 调控 AGE Sf sp SAY AE 6. ABE SARE 许多 原 癌 基因 和 抑 癌 基因 表达 的 产物 在 信号 转 导 证 己 着 重要 的 作用 , 一 旦 它们 ee Be AS NCR GSS DE RBZ aK. A BE 与 信号 转 导 , 由 此 自然 让 人 RARBG? 寺 构 和 功能 的 变化 与 肿瘤 发 生 有 密切 的 关 乞 -1 基因 被 作为 一 种 候选 的 抑 癌 基因 。 GRE 的 mRNA 和 重 白质 表达 水 平 i Bp fv M, 全 AN ee ySE © Bio. 49 Biomembranes 358 在 肿瘤 转化 的 NIH-3T3 培养 细胞 中 出 现下 调 , 在 乳腺 癌 转 基因 小 鼠 中 以 及 其 他 起 源 于 人 肿瘤 的 细胞 系 中 , 这 种 基因 的 表达 也 出 现下 调 。 一 般 来 说 , 确 定 小 鼠 的 一 种 原 癌 基因 或 抑 癌 基因 需要 分 析 原 始 鼠 肥 胎 纤维 原 细胞 的 生长 特性 ,因此 , 在 对 微 圳 素 -1 进行 细胞 增 殖 和 细胞 周期 评估 之 后 , 发 现 微 吉 素 -1 基 因 贡 除 的 小 鼠 且 胎 纤维 原 细胞 出 现 细 胞 周期 整体 活性 增加 , 主 要 出 现 合成 期 的 增加 。Pramudji 等 (2001) 利用 腺 病毒 载体 介 导 微 吉 素 -1 启 动 子 对 原 位 前 列 腺 癌 动 物 模型 进行 基因 治疗 , 结 果 出 现 新 生物 的 坏死 。 肿瘤 抗 药性 是 导致 对 癌症 患者 化 疗 失败 的 原因 。 研 究 发 现 多 药 耐 药性 (multidrug resistant, MDR) 的 况 细 胞 可 表达 高 水 平和 高 密度 的 质 膜 微 吉 , 这 给 人 们 了 解 多 药 耐 药性 细胞 的 产生 机 制 以 及 设计 有 针对 性 的 药物 起 了 指导 作用 。 7. ARE SABA RE (BEX -1 AUGER, -2 Piz tha fo EAA ZA a LE, in HERS -3 仅仅 局 限 地 分 布 在 肌 ZA 2, 1X — Se ES -3 可 能 在 肌肉 组 织 功 能 障碍 中 起 到 某 些 作用 。 杜氏 肌 上 营养 不 恨 症 (Duchenne muscular dystrophy, DMD) 是 一 种 严重 的 肌肉 功能 紊乱 疾病 , 其 特征 是 缺乏 肌 养 蛋白 〈dystrophin) 。 肌 养 蛋 白 是 一 种 细胞 内 的 有 蛋白质, 可 以 联系 细胞 内 的 细胞 骨架 和 细胞 外 基质 , 这 一 作用 对 于 保持 正常 肌肉 功能 和 肌肉 纤维 的 完 整 性 是 极为 必要 的 。 免 疫 电镜 观察 到 肌 养 蛋白 局 限 在 肌肉 细胞 的 质 膜 微 吉 上 。 还 有 一 些 形态 学 和 生物 化 学 的 观察 发 现 , 在 DMD 病理 过 程 中 有 质 膜 微 圳 和 微 宫 素 -3 的 参与 。 很 早 的 时 候 , 人 们 利用 电镜 和 冰冻 蚀刻 技术 在 DMD 串 者 的 骨骼 肌 中 发 现 质 膜 微 圳 数目 的 增 多 。 与 此 结果 相 一 致 的 是 , 最 近 在 mdx 小 鼠 〈 一 种 肌 养 蛋白 缺陷 的 DMD 动物 模型 ) 和 患者 的 骨骼 肌 中 发 现 , 微 圳 素 -3 的 表达 增高 了 2~3 倍 。 在 超 表达 微 吉 素 -3 的 转基因 小 鼠 中 , 表 现 出 杜氏 肌 和 营养 不 恨 样 症状 。 这 种 转基因 模型 的 建立 , 有 助 于 人 们 更 好 地 研究 和 理解 人 类 DMD 的 病理 发 生机 制 。 肌 带 型 肌 营养 不 恨 (limb-girdle muscular dystrophy,LGMD-1C) 是 另 一 种 肌 和 营养 不 良 症 , 是 由 于 微 圳 素 -3 基 因 突 变 造 成 的 , 这 种 突变 基因 编码 的 蛋白 质 很 不 稳定 ,, 易 被 降解 , 所 以 存在 甚 少 。Galbiati (2001) 模拟 人 的 基因 突变 点 , 构 建 缺 失 微 圳 素 -3 基因 的 小 BR, 证 实 微 圳 素 -3 是 形成 肌 细胞 内 质 膜 微 圳 的 主体 。 正常 动物 肌 细 胞 内 微 圳 素 -3 与 肌 养 蛋白 和 糖 蛋 白 形成 复合 体 , 存 在 于 脂 征 中 。 基 因 突 变 的 小 鼠 无 脂 徐 , 所 以 不 能 形成 复合 体 , 说 明 微 圳 素 -3 的 突变 是 产生 LGMD-1C 的 分 子 基 础 。 由 此 可 见 , 正 常生 理 条 件 下 , 微 圳 素 的 表达 是 一 个 动态 平衡 的 过 程 。 284 “9 生物 膜 功 能 丰富 , 且 与 生命 科学 中 的 许多 基本 问题 密切 相关 , 国际 学 术 界 十 分 重视 。 近 几 年 来 召开 了 多 次 国际 会 议 , 其 中 脂 合 的 结构 与 功能 成 为 研究 的 热点 。 虽 然 有 许多 问 题 已 较 清楚 , 但 仍 存在 一 些 有 待 深 入 研究 的 问题 : (1) 膜 内 外 层 的 脂 徐 组 分 有 何 异 同 , 特 别 是 内 层 膜 很 难 提取 , 至 今 对 其 组 分 还 不 清楚 ,(2) 蛋白质 如 何 识别 不 同 的 脂 第 , 进 入 一 个 有 效 的 区 , (3) 脂 合 内 跨 膜 蛋白 与 脂 徐 内 的 酰 化 熏 白 之 间 如 何 相 互 作 用 ,(4) 脂 和 化 在 膜 内 如 何 游 走 , 虽 然 对 脂 徐 与 细胞 骨 避 关 系 的 了 角 行 了 良好 的 开端 , 但 是 疝 缺 乏 更 次 入 的 研究 ,〈S) 由 于 脂 和 化 在 活 细胞 中 很 难 直观 的 被 趣 沁 ,目前 大 部 分 关于 脂 合 功能 的 研 究 依靠 的 丰 - 些 去 污 剂 抽 提 等 间接 技术 , 疝 未 能 在 活 和 网 中 利用 直接 方法 研究 脂 合 各 种 成 分 及 其 分 布 , 期 望 应 用 先进 的 技术 , 解 决 在 无 试剂 寺 尤 下 观察 天 然 单 细胞 膜 脂 与 膜 蛋 359 $ 28% ARABIA 白 的 活动 。 从 微 圳 素 的 研究 , 已 看 到 端倪 , 它 已 涉及 HIV、 癌 症 、 动 脉 粥 样 硬化 、 糖 尿 病 并 发 症 、 早 老 性 痴 采 、 疯 牛 病 及 肌 和 营养 不 良 等 疾病 , 对 脂 合 结构 和 功能 的 研究 会 给 膜 生物 学 乃至 生命 科学 和 医学 带 来 更 多 的 信息 与 启示 。 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. 2002. 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Cell, 92(1): 83-92 第 20 章 生物 膜 与 免疫 BOY Wee sities pp ee ee acie ae eB 29.1.1 GF AMAA PS TEI GT PE... essececneccsecessesacceresesscssseeneeese 302 29.1.2 Sf Je AANA PS TATE RAF occ cece ccesceeecstseetetsseseeeeseee 365 is MBS le) 3 EL ET oy Da ee 368 Fs Ai ets 2 021) es pes aad Ra le Re Ae ae 368 Bae MOTOR | cE 3h 2k ieee So ORR OE oR SLO LTT TE 369 29.3 | AAR E ePIC ie cccc ci sces eacccsccbeccensssccssssacsesesseees 371 DOB np aaa eee ae ta er hee oe ot aes a ae ofeavsseess 371 DOS Dae Wien ek Fel AE ee pcs t scale tots heh Makai 371 Py Mie Re Pm) Ne ITB 2 0) 25202) 2 |e rn rrr 372 胞 是 生物 体 结构 与 功能 的 基本 单位 。 生 物 膜 包括 细胞 外 周 — 膜 和 细胞 内 膜 系统 〈 如 内 质 网 膜 、 线 粒 体 膜 、 核 膜 等 ) , 与 细胞 的 物质 、 能 量 、 信 息 的 运输 、 转 换 、 识 别 及 传递 密切 相 关 。 细 胞 膜 是 动物 细胞 的 最 外 层 结构 , 将 细胞 内 环境 和 外 界 环 境 分 隔 开 来 , 对 细胞 起 到 保护 作用 , 是 细胞 的 天 然 屏障 。 免疫 是 机 体 针 对 外 源 性 物质 〈 包 括 微生物 和 大 分 子 物 质 , 如 HAMAS BE) 的 防御 性 反应 。 任 何 外 源 性 物质 首先 侵入 的 是 细 胞 膜 , 细 胞 膜 受 到 干扰 或 破坏 , 远 过 一 定 的 途径 触发 细胞 内 一 系 列 生理 生化 反应 。 生 物 在 抵御 外 源 性 物质 侵入 的 自主 调节 过 程 中 逐渐 进化 形成 了 免疫 系统 。 高 等 动 ‰ 和 和 人 体内 均 存 在 结构 复杂 的 免疫 系统 , 它 由 免疫 器 官 、 免 疫 细 祝 和 免疫 分 子 组 成 。 免 疫 细胞 包括 造血 干细胞 、 淋 巴 细胞 系 、 巨 只 细胞 系 、 粒 细胞 系 、 红 细胞 以 及 肥大 细胞 和 血小板 等 。 Ltd ee BOAR SS AY aE oy FLT Ge RE AH HR oy FFB He AE Re He A ts A IF a IPP ATE PET FRE, Poe A ee A) Pe EA, SR Vv () 外 人 上 iomembranes 362 也 包括 免疫 细胞 所 释放 的 各 种 细胞 因子 和 其 他 介质 的 相互 作用 。 免疫 细胞 间或 细胞 与 介质 间 相 互 识别 的 物质 基础 十 各 种 免疫 细胞 膜 表 面 分 子 , 包括 多 种 抗原 、 受 体 和 其 他 分 子 , 这 些 分 子 也 是 各 种 不 同类 型 免疫 细胞 的 膜 表面 标记 。 这 些 免疫 分 子 对 细胞 间 的 识别 与 信息 传递 、 免 疫 应 答 的 激活 与 效应 、 免 疫 调 市 等 过 程 中 发 挥 至 关 重 要 的 作用 。 研 究 这 些 膜 分 子 的 表达 和 调控 , 对 了 解 免 疫 细胞 的 起 源 、 分 化 和 成 熟 县 有 十 分 重要 的 理论 意义 , 而 且 在 分 类 学 、 诊 断 学、 治疗 学 以 及 对 免疫 性 疾病 的 发 病 学 方面 有 一 定 的 应 用 价值 。 29.1 SSeARLIS 2677 mmm 免疫 细胞 间或 细胞 与 介质 间 相 互 识 别 的 物质 基础 是 免疫 细胞 膜 分 子 。 免 疫 细胞 膜 分 子 种 类 繁多 , 主 要 有 和 白细胞 分 化 抗原 、B 细胞 受 体 、 工 细胞 受 体 、 主 要 组 织 相 容 性 复合 体 、 黏 附 分 子 、 细 胞 因子 受 体 、 补 体 受 体 以 及 其 他 受 体 分 子 。 免 疫 系统 功能 的 发 挥 与 锡 疫 细胞 膜 表 面 分 子 密切 相关 。 1, 和 白细胞 分 化 抗原 自 细 胞 分 化 抗原 (leukocyte differentiation antigen, LDA) 是 存在 于 和 白细胞 不 同 谱系 (lineage) 和 不 同 分 化 阶段 以 及 活化 过 程 中 出 现 或 消 失 的 细胞 表面 标记 分 子 。LDA 也 在 不 同 分 化 阶段 的 红细胞 系 和 巨 核 细胞 系 中 表达 , 还 广泛 存在 于 非 造 血细胞 膜 表 面 。LDA 大 都 是 跨 膜 的 蛋白 或 糖 蛋 白 分 子 , 由 胞 膜 外 区 、 跨 膜 区 和 胞 浆 区 构成 。 和 白细胞 分 化 抗原 的 研究 进展 迅速 ,1982 一 2000 年 先后 举行 了 7 次 人 类 和 白细胞 分 化 抗 原 的 国际 协作 组 会 议 , 以 人 类 和 白细胞 单 抗 的 分 化 群 (cluster of differentiation, CD) 国际 命名 法 对 白细胞 分 化 抗原 进行 命名 , 并 以 序号 表示 。 人 的 CD 序号 从 CD1~CD247, 各 和 群 抗体 所 识别 的 靶 细 胞 主要 包括 工 细胞 、B 细胞 、 髓 样 细胞 、NK 细胞 、 血 小 板 、 黏 附 细 胞 、 王 细胞 / 祖 细 胞 和 红细胞 等 13 个 组 ( 表 29-1) 。 研究 CD 分 子 结构 、 功 能 及 其 编码 基因 , 对 免疫 细胞 的 分 化 、 活 化 、 信 息 传 递 、 基 因 表 达 调控 和 细胞 癌变 的 机 制 等 方面 有 重要 的 理论 意义 , 在 临床 疾病 的 诊治 中 也 有 重要 的 应 用 价值 。 以 下 将 介绍 几 种 常见 的 与 T、B 细胞 识别 、 黏 附 、 活 化 有 关 的 CD 分 子 。 (1) CD3 CD3 表 达 于 工 细胞 和 部 分 胸 胆 细 胞 膜 表 面 , 与 工 细胞 受 体 组 成 TCR/CD3 复合 体 , 在 TCR 信和 号 转 导 中 起 到 关键 作用 。CD3 分 子 由 6 条 链 构 成 ,包括 一 个 sy 蜡 二 聚 体 ,, 一 个 8 异 二 聚 体 和 一 个 565 同 二 聚 体 或 Cn 异 二 聚 体 ,80% ~90% OP TI 细胞 是 以 TCR cRB/CD3 yY5gg 红 形式 存在 , 还 有 10% ~20%T 细胞 则 以 TCR opB/MCD3 ySeetn 形式 表达 。 Y、5 和 gs 的 基因 高 度 同 源 , 都 位 于 人 的 第 11 号 染色 体 上 。 每 一 个 YY O File HERA 括 一 个 N 端的 胞 外 区 , 一 个 短 的 连接 肽 , 一 个 跨 膜 区 及 一 个 胞 浆 区 。Y、8 和 链 的 胞 外 区 都 含有 一 个 Ig 样 结构 , 胞 浆 区 各 含 一 个 ITAM 基 序 , 在 介 导 信和 号 传导 时 具有 重要 功能 。 CAI 链 是 由 位 于 人 第 1 号 染色 体 上 同一 个 基因 转录 的 RNA 选择 性 剪 切 而 成 。6 和 BE 结构 相似 , 胞 外 区 较 短 , 只 有 9 个 筑 基 酸 。 跨 膜 区 与 CD3 y, 6 File HEN, GA 一 个 带 负电 为 天 冬 氛 酸 残 基 。 和 i 胞 浆 区 较 长 ,分别 有 113 和 115 个 氨基 酸 , 分 别 含 有 3 个 和 2 个 ITAM 基 序 , 介 导 TCR/CD3 信号 转 导 。 当 工 R 识 别 抗原 肽 -MHC 复合 物 后 , 363 % 29% 分 组 CD 编号 了 细胞 CD1 ~CD8, CD27, CD28, CD60, CD99, CD99R, CD152 ~CD154, CD160, CD226, CD245 一 CD247b B 细胞 CD10, CD19 ~ CD24, CD37 ~ CD40, CD72 ~ CD74, CD77, CD79a, CD79b, CD80 ~ CD84, CD86, CD138, CD139, CD179, CD179a, CD ~ CD180 ie FEA CDw12, CD13, CD14, CDw17, CD33 ~ CD35, CD64, CD65, CD65s, CD66a ~ CD66f, CD68, CD87 ~ CD89, CD91, CD92, CD93, CD101, CD111, CD112, CD114, CD115, CD155, CD157, CD163, CD177 血小板 CD9, CD36, CD41, CD42a ~ CD42d, CD51, CD61, CD62P, CD63, CD107a, CD107b, CD110, CD151 NK 细胞 CD16, CD56, CD57, CD69, CD94, CD96, CD158a, CD158b, CD159a, CD161, CD162R, CD244 非 谱系 CD26, CD30, CD32, CD43,CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47R, CD48, CD52,CD53, CD55, CD59, CD70, CD71, CD97, CD98, CD100, CD108, CD148, CD150, CD200, CD220 ~ CD225, CD227 ~ CD232 内 皮 细 胞 CD105, CD106, CD109, CD140a 一 CD147, CD201 一 CD209 黏附 分 子 CD1la~CD11c, CD15, CD15s, CD18, CD29, CD31, CD44, CD44R, CD47, CD49a ~ CD49f, CD50, CD54, CD58, CD62E, CD62L, CD90, CD102 ~ CD104, CD156b, CD164~ CD172a 细胞 因子 受 体 CD25, CD116 ~ CDw137,CD178, CD183, CD184, CD195, CDw197, CDw210 ~ 213a2, CDw217 树 突 状 细胞 CD85 干细胞/ 祖 细胞 CD133,CD243 红细胞 CD233 一 CD242 碳水 化 合 物 CD15u, CD60a, CD60b, CD60c, CD75, CD75s, CD173 ~ CD176 注 : 1. CD 是 流水 编号 , 但 CD113 47 fk, CD67 和 CD66b 是 重复 的 ; 2. 凡 CD 中 带 有 w 抗 原 或 抗体 如 CDw119 尚 需 继续 进行 全 面 鉴定 , 3. 有 些 CD 抗原 又 可 进一步 划分 为 不 同 的 成 员 , 一般 用 小 写 英 文字 母 表示 ; 4. CD13 个 组 划分 的 特色 性 是 相对 的 , 实 际 上 ,许多 CD 抗原 的 细胞 分 布 较为 广泛 , 有 些 CD 抗原 可 从 不 同 的 分 类 角度 而 归 入 不同 的 组 。 CD3 分 子 的 胞 浆 区 ITAM 基 序 中 的 酷 氨 酸 发 生 磷酸 化 , 构象 发 生 改 变 , 与 ZAP-70 等 信号 分 子 的 SH2 结构 域 结 合 , 活 化 PLCY, 调 节 磷 酸 肌 醇 代谢 , 启 动 Ca 和 PKC 信和 号 通路 。5 链 与 NK 细胞 的 Fcy 受 体 (FcYRII) 相关 , 如 或 如 二 聚 体 可 在 NK 细胞 表面 与 FcyRII 形 成 复合 (2) CD4 CD4 是 工 细 胞 表面 单 链 跨 膜 糖 蛋 白 , 在 促进 工 细 胞 和 抗原 呈 递 细胞 或 半 细 胞 相互 作 用 中 作为 辅助 分 子 发 挥 作 用 , 属 于 IgSF 成 员 。 在 opBT 细 胞 中 ,65% 表 达 CD4。 在 人 和 Aik, CD4 还 表达 于 单 核 细胞 。 CD4 的 分 子 质量 为 SSkDa, 由 435 个 氨基 酸 残 基 构成 , 胞 外 区 、 路 膜 区 和 胞 浆 区 分 别 有 374、21 和 40 个 氨基 酸 残 基 。 胞 外 区 有 4 个 IgSF# 。 人 的 CD4 基 因 位 于 第 12 号 染色 体 上 , 小 鼠 的 在 第 6 号 染色 体 上 。 人 和 小 鼠 的 CT 上 约 有 55% 的 同 源 性 。CD4 分 子 的 第 |. 2 个 结构 域 与 MHC-I 类 分 子 的 非 多 肽 区 。。 RK CxCP 基 序 与 p56 相 结合 。CD< 分 子 的 第 1 个 V 样 结构 域 是 HIVE, = !V gpl20 相 结合 。 fe) i 周 淋巴 器 官 中 ,CD4+ 工 细胞 为 辅 时 细胞 , 包括 Th0、Thl1 和 Th2 亚 EE, CO 是 MHC-I 类 分 子 限制 性 工 细 胞 TCR 识别 抗 片 “辅助 性 受 体 , 通 过 与 MHC-II 类 I ht ad df ESE i () i) Biomembr anes 364 分 子 的 黏附 及 胞 浆 区 与 p56 “AGES SRS. (3) CD8 大 多 数 CD8 分 子 是 由 X、B 链 通过 二 硫 键 连接 形成 的 异 源 二 聚 体 , 少 数 CD8 分 子 是 2 条 链 形成 的 同 源 二 聚 体 。x% 和 及 链 分 子 质量 均 为 32 一 34kDa,C% 链 由 214 个 氟 基 酸 构 成 , B 链 由 189 个 氨基 酸 构成 。Q% 链 入 链 胞 膜 外 区 结构 均 属 IgESF,, 各 有 一 个 V 样 区 , 与 Ig 轻 链 、 重 链 以 及 TCR xc、B 链 的 V 区 约 有 20% 30% 的 同 源 性 。 CD8 分 子 分 布 于 部 分 工 细 胞 和 胸腺 细胞 ,CD8 cx 也 表达 于 部 分 NK 细胞 表面 。 在 opT 细胞 中 , 3$5% 表 达 CD8 分 子 。CD8+T 细 胞 是 细胞 毒性 工 淋巴 细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL Tc), (44 Tcl #1 Tc2 WH, CD8 分 子 x 链 V 样 区 与 MHC-I 类 分 子 重 链 非 多 态 的 03 ZEA, 0 链 胞 浆 区 CxCP 与 p56g5 相 结合 , 参 与 工 细 胞 活化 和 增殖 的 信号 转 导 。CD8 是 MHC-I [类 分 子 限制 的 工 细胞 TCR 识别 抗原 的 辅助 受 体 , 使 CTL 识别 丢 细 胞 或 与 APC 细 胞 结合 , 并 在 MHC-I 类 限制 的 CD8* 细胞 在 胸腺 中 的 选择 过 程 也 起 重要 作用 。 目 前 研究 认为 ,CD8 opB 与 经 暴 MHC-I 分 子 结合 , 而 CD8 ao 与 非 经 典 MHC-I 分子 结 合 (Szabo et al. 2003 ) 。 (4) CD79a/CD79b CD79a/CD79b xz B 细胞 的 标记 分 子 , 表 达 于 除 浆 细胞 外 的 B 细胞 发 育 的 各 个 阶段 。 CD79a NK Iga, 4-H 32~33kDa, CD79b 又 称 IgB, 分 子 质量 为 37 一 39kDa。 二 者 胞 外 区 各 有 一 个 C2 样 区 , 属 IgSF。CD79a 和 CD79b 通过 二 硫 键 形 成 异 源 二 聚 体 ,2 个 二 聚 体 与 一 个 膜 表 面 免 疫 球 和 蛋白 非 共 价 连 接 组 成 BCR。CD79a 和 CD79b 45 TCR/CD3 复 合体 中 的 CD3 分 子 的 作用 相似 , 胞 浆 区 的 ITAM 结合 B 细胞 内 信和 号 分 子 中 SH2 结构 域 , 介 导 信号 转 导 。 B 细胞 表面 BCR 与 抗原 结合 , 内 吞 后 抗原 肽 经 B 细胞 加 工 处 理 后 与 MHC-I 类 分 子 结合 形成 MHC- 抗原 肽 复合 体 , 并 时 递 给 CD4* 工 细胞 。BCR 信号 传递 有 赖 于 CD79a 和 CD79b 胞 浆 区 ITAM 与 B 细 胞 信号 分 子 中 SH2 结构 域 的 结合 , 引 起 磅 脂 酶 C 和 某 些 酷 氨 酸 激酶 的 活化 。 2. 主要 组 织 相 容 性 复合 体 主要 组 织 相 容 性 抗原 (major histocompatibility antigen, MHA) 是 指 同 种 异体 组 组 或 器 官 移植 后 引起 免疫 排斥 反应 的 主要 抗原 , 也 称 强 移植 抗原 。 人 类 主要 组 织 相 容 性 抗 原 广 泛 表 达 在 白细胞 表面 , 又 称 人 白细胞 抗原 (human leukocyte antigen, HLA)。 主 要 组 组 相 容 性 抗原 由 一 系列 密切 连锁 的 基因 座 编码 , 又 称 之 为 主要 组 织 相 容 性 复合 体 (major histocompatibility complex, MHC), MHC 是 移植 免疫 排斥 反应 的 主要 决定 因素 , 并 在 机 体 的 免疫 应 答 中 起 重要 作用 。MHSC 基因 和 群 位 于 人 第 6 号 染色 体 短 臂 6p21.31 区 域内 , 全 长 3.6Mb。MHC 基因 密切 连锁 , 并 呈现 高 度 多 态 性 , 甚 基因 产物 分 为 两 种 类 型 : MHC-1 和 MHC-II。 任何 特定 的 工 细胞 仅 能 识别 与 MHC-I 和 MHC-I 结 合 的 抗原 。 外 源 性 多 肽 片 断 通常 与 MHC-I 结 合 , 而 内 源 性 多 肽 片断 多 与 MHC-I 结 合 。 MHC-I 表 达 在 所 有 有 核 细 胞 及 血小板 表面 。MHC-T 由 两 条 多 肽 链 构成 : X 链 〈 重 链 ) 由 MHC-I 基 因 编 码 ,B 链 (FARE) 又 称 凡 微 球 蛋白 (Pm), 非 MHC 基因 编码 。 两 条 链 通过 二 硫 镑 形成 异 源 二 聚 体 。MHC-I 的 多 态 性 及 志 光 原 结 合 特性 主要 体现 在 o 链 (Mellman et »|. 1995), o 链 分 子 质量 为 44SkDa,B 链 分 “质量 为 12kDa。MHC-I 可 分 为 365 % 290% ARS PE 胞 外 区 〈 包 括 肽 结合 区 和 免疫 球 蛋 白 样 区 )、 跨 膜 区 和 胞 浆 区 。B 链 位 于 胞 外 区 与 &% 链 非 共 价 结合 (Housset et al. 2003) 。 MHC-I 表 达 于 抗原 呈 递 细胞 , 如 树 突 细胞 、 巨 噬 细 胞 、B 细胞 和 上衣 格 汉 斯 细胞 等 。 MHC-I 也 是 异 源 二 聚 体 ,, 但 两 条 链 均 由 MHC-II[ 基 因 编 码 。Qo 链 分 子 质 量 为 32 一 34kDa, B 链 分 子 质量 为 29~32kDa。Q 链 入 链 均 为 跨 膜 蛋白 ,C 端 为 胞 浆 区 , 各 有 2 个 结构 域 om、o 和 由、 及 构成 ,每 个 结构 域 约 含 90 个 氨基 酸 残 基 。 除 o 结构 域外 ,o 和 及 、 及 各 含 一 个 二 硫 键 。 胞 外 区 可 分 为 肽 结合 区 和 免疫 球 蛋 白 样 区 。 3, 细 胞 黏附 分 子 细胞 黏附 分 子 〈cell adhesion molecule, CAM) 是 指 由 细胞 产生 并 介 导 细胞 与 细胞 间 、 细 胞 与 基质 间 相 互 接触 和 结合 的 各 类 分 子 的 统称 。 黏 附 分 子 多 为 糖 蛋 白 , 分 布 于 细 胞 表面 , 以 配 体 一 受 体 的 形式 发 挥 作用 , 参 与 细胞 信号 转 导 与 活化 、 细 胞 迁移 、 细 胞 生 长 及 分 化 等 一 系列 生理 过 程 , 并 与 炎症 反应 、 血 栓 形 成 、 肿 瘤 转移 、 创 伤 愈合 等 病理 过 程 相 关 。 根 据 结构 特点 , 可 以 将 黏附 分 子 分 为 4 类 : 整合 素 家 族 、 免 疫 球 蛋 白 超 家 族 、 选 择 素 家 族 、Ca2 依赖 的 细胞 黏附 分 子 家 族 等 。 黏附 分 子 参与 机 体 许 多 重要 的 生理 和 病理 过 程 , 主要 包括 : @ 通 过 表达 于 白细胞 上 WELZ) CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18, VLA-4, L-¢#£78 4 (selectin) , CD15、CD15s 和 了 -选择 蛋 白 相 互 黏附 , 参与 炎症 的 发 生 ,@ 通 过 表达 于 淋巴 细胞 上 的 归 梨 受 体 与 表达 于 血管 内 皮 细 胞 上 的 地 址 素 (addressin ) 相 互 黏附 使 淋巴 细胞 癌 外 周 淋巴 器 官 、 皮 肤 炎 症 部 位 或 黏膜 相关 麻 巴 组 织 归 梨 ;,@@ 通 过 CD4/MHC-I 类 分 子 非 多 态 部 分 、 CD&/MHC-I 类 分 子 非 多 态 部 分 、LFA-L/ICAM-1、LFA-2/LFA-3、CD28/B7 的 相互 作用 参 与 免疫 应 答 中 APC 呈 递 抗原 、 抗 原 识别 、 免 疫 细胞 相互 协作 以 及 CTL 杀 伤 靶 细胞 等 多 个 环节 (Kurosawa et al. 2003, Reynolds et al. 2000); @iict #54444 (cadherin), N- CAM, CD31 等 分 子 的 自身 黏附 , 以 及 某 些 黏附 分 子 与 细胞 外 基质 的 黏附 , 参 与 细胞 的 RA. Ott. Mako); © E- 钙 黏 着 蛋白 、CD44 分 子 等 与 肿瘤 的 浸 调 、 转 移 有 关 ; @ 通 过 血小板 表达 的 黏附 分 子 参与 动脉 .静脉 中 血栓 形成 以 及 其 他 形式 的 凝血 过 程 (Kim et al. 2003 ) 。 29.1.2 SH ANIIN 2 10 5 75 7 aaa 1,B 细 胞 受 体 (B cell receptor, BCR) BCR 由 B 细 胞 表面 特异 性 识别 抗原 的 分 子 和 信号 传导 分 子 组 成 ,包括 B 细 胞 表面 锡 疫 球 蛋白 分 子 (mIg) 和 与 信号 传导 相关 的 Igo (CD79a) 、IgB (CD79b) 异 二 聚 体 组 成 。 (1) 免疫 球 蛋白 免疫 球 蛋 白 (immunoglobulin) 是 B 细胞 特异 性 识别 抗原 的 受 体 , 也 是 B 细胞 的 主 要 标志 , 即 通常 意义 的 抗体 。 免 疫 球 蛋 白 是 由 两 条 重 链 ,F, 和 两 条 轻 链 (L) 通过 链 间 二 硫 键 和 踊 水 作用 连接 在 一 起 的 四 聚 体 结 构 。 重 链 为 中 VBE, 297% 450 ~ 550 个 氨基 酸 , 分 子 质量 为 55 一 70kDa 之 间 , 胞 外 区 由 1 个 可 变 ! ) 和 3-4 个 恒定 区 【〈C) 构 成 , 其 胞 浆 尾 区 所 基 酸 数量 不 等 , 轻 链 约 210 SER f 质量 为 24kDa, 无 跨 膜 区 , 售 一 个 V 达 和 一 个 C 区 。 在 重 链 和 轻 链 的 V 区 各 含有 如 变 片 段 , 它 们 的 空间 构象 形 mb. 今 表面 , 称 之 为 互补 决定 区 (comple mentar ietermining region, CDR), A 类 免疫 CAA S APA ARE: yu. Oo, © FS, AA) 【人 体 分 别 命名 为 IgG、IgM、IgA、 1 全 5 ne Biomembranes 366 IgE 和 IgD。 根 据 不 同 轻 链 的 抗原 性 可 分 为 两 类 : kx 和 4, 形 成 免疫 球 和 蛋白 分 子 时 ,2 条 轻 链 是 同型 的 。 在 人 的 免疫 球 蛋 白 分 子 中 k 型 约 占 60% 。 免疫 球 蛋 白 轻 链 可 变 区 是 由 V、 J 基 因 编 码 的 , 前 两 个 CDR 区 由 YV 基因 编码 ,第 3 个 CDR 区 由 V、J 基 因 共 同 编码 , 连 接 处 具有 多 样 性 。 重 链 可 变 区 是 由 VY、D、J 基 因 片 段 编码 的 , 前 两 个 CDR 区 由 Van 基因 编码 , 第 3 个 CDR 区 由 D、J 基 因 卢 段 的 5 端 编码 ,V~D 和 D~J 连 接 处 也 具有 多 样 性 (Stewart-Jones et al. 2003 ) 。 机 体 对 外 界 环境 中 的 抗原 刺激 可 以 产生 相应 的 特异 性 抗体 , 一 个 了 B 细 胞 只 产生 一 种 抗体 。 免 疫 球 蛋 白 具 有 多 样 性 ,这 主要 由 遗传 控制 的 , 其 机 制 包括 : OMA DNA 有 众多 的 V 基 因 片 段 和 一 定数 量 的 D、J 基 因 片 段 , 理 论 上 重 链 VDJ 重 排 的 可 能 性 为 1 x 104 左 右 ,K 链 VJ 重 排 的 多 样 性 约 为 200,A 链 VJ 重 排 的 多 样 性 约 为 120;,@ 重 链 与 KE< 和 个 轻 链 的 配对 具有 随机 性 ; @V (D) J 连 接 具 有 多 样 性 ,, 轻 链 VJ 连 接点 及 重 链 DJ 和 VY-DJ 连 接点 都 可 有 一 定 范围 的 变异 , 并 可 以 随机 插入 核 苷 酸 , 使 核 苷 酸 序列 发 生 改 变 ,@ 在 B 细胞 对 抗原 的 应 答 过 程 中 , 体 细胞 发 生 高 突变 , 特 别 使 CDR3 区 。 体 细胞 高 突变 扩展 了 RADIANS EME, FPS Ig 亲和力 的 成 部 有关。 (2) Iga 4e IgB Igo FlllgB (分 别 为 CD79a 和 CD79b) 都 是 免疫 球 和 蛋白 超 家 族 结构 相关 基因 的 表达 产 物 , 物 种 间 高 度 保守 。Igx 和 IgB 都 属于 I 型 跨 膜 糖 蛋白 ,在 了 细胞 中 以 二 硫 键 相 连 形成 异 源 二 聚 体 , 并 同 mIg AER. Igo: 和 IgB 胞 膜 外 结构 域 同 TCR/CD3 复合 体 中 CD3 HY Y, OMe het, 各 含有 1 个 免疫 球 和 蛋白 样 结构 域 , 胞 浆 内 含有 1 个 含 酷 禹 酸 的 ITAM。Iga 和 IgB 一 方面 可 以 作为 主要 的 信号 传导 分 子 传递 外 界 抗 原 结 合 受 体 所 产生 的 刺激 信号 , 另 一 方面 参与 mlIg 的 表达 及 其 转运 。IgB 可 以 单独 转运 IEM 到 细胞 膜 上 , 且 参 与 由 免疫 球 蛋 和 白 所 介 导 的 抗原 特异 性 信号 传导 。 在 垂体 细胞 系 中 , Igx 和 IgB 可 以 完全 导致 mJg 的 产生 , 并 部 分 重建 由 IgM 所 介 导 的 信号 转 导 。Igx 和 Ig 在 抗原 呈 递 中 起 重要 作用 ,影响 抗原 呈 递 的 效率 (Lanzavecchia 1996) 。 2. 细胞 受 体 (T cell receptor, TCR) TCR 是 工 细 胞 识别 蛋白 质 抗原 的 特异 性 受 体 , 识 别 并 结合 MHC- 抗 原 复 合 物 。TCR 可 分 为 OBTCR Fil YOTCR 两 种 类 型 , 大 多 数 成 熟 工 细胞 ( 约 95%) 表达 xcBTCR 分 子 。 opBTCR 是 由 x%、B 链 通过 二 硫 键 共 价 结合 的 异 二 聚 体 。x、B 链 均 由 膜 外 区 、 跨 膜 区 和 胞 浆 区 组 成 。TCR 也 属于 Ig 超 家 族 , 膜 外 区 包括 可 变 区 (V 区 ) 和 恒定 区 (CK). a B 链 的 V 区 有 102 一 119 个 筑 基 酸 残 基 , 与 I 的 V 区 结构 和 功能 相似 , 也 存在 保守 区 和 3 个 抗原 互补 决定 区 (CDR) , 是 特异 性 识别 外 来 抗原 的 结构 域 。x、B 链 的 C 区 有 138 ~ 179 个 氨基 酸 残 基 ,, 每 个 C 区 形成 由 链 内 二 硫 键 形成 的 环 肽 。Q、B 链 跨 膜 区 约 由 20 一 24 个 氨基 酸 组 成 , 均 俩 有 带 正 电 和 荷 的 妥 基 酸 残 基 , 与 CD3 带 负电 和 荷 的 氨基 酸 残 基 形成 盐 桥 , 稳定 TCR-CD3 复合 物 。Q%、B 链 胞 浆 区 较 短 , 只 有 5~ 12 个 氨基 酸 残 基 , 通 过 与 之 结合 的 CD3 分 子 来 传递 细胞 内 信号 «(Torres et al. s,., TCR 的 wx、B 链 基因 也 是 由 种 系 基 因 片 段 经 过 类 们 免疫 球 蛋 白 的 基因 重 排 后 形成 的 , TCR 多 样 性 和 特异 性 产 由 TCR HY J&A] Fr Be Bic A ae ks 免疫 球 蛋 | [基因 的 种 类 , 虽 然 其 V 基 因 的 种 类 较 免 蛋白 少 , 但 其 潜在 的 特异 性 要 多 于 免疫 球 A. | 367 第 290% ART GPE 3, 细 胞 因子 受 体 细胞 因子 〈cytokine) 广泛 调节 细胞 的 功能 , 不 仅 作用 于 免疫 系统 和 造血 系统 , 还 广 泛 作 用 于 神经 、 内 分 泌 系 统 。 细 胞 因子 是 通过 与 靶 细 胞 表面 受 体 结合 , 将 信号 传递 到 细 胞 内 部 。 细 胞 因子 受 体 多 为 跨 膜 蛋 白 , 胞 外 区 为 细胞 因子 结合 区 。 根 据 其 结构 特点 及 信 号 转 导 途径 , 可 将 细胞 因子 受 体 分 为 几 类 : RIK EA Ig FE, AM IL-1 受 体 、 IL-16 受 体 , 其 胞 浆 区 有 独特 的 与 信号 转 导 有 关 的 结构 , M-CSFR、SCFR、PDGFR 和 FGFR 等 胞 浆 区 具有 酷 迄 酸 激酶 结构 ;第 二 类 为 细胞 因子 受 体 家 族 , 包括 红 细胞 生成 素 受 体 超 家 族 、 干 扰 素 受 体 超 家 族 和 肿瘤 坏死 因子 受 体 超 家 族 , 又 分 别称 之 为 I 类 、 开 类 和 II 类 细胞 因子 受 体 家 族 ; 第 三 类 为 趋 化 因子 受 体 , 属 七 次 跨 膜 分 子 超 家 族 ;, 第 四 类 为 TGF-B 受 体 家 族 , 具有 特征 性 胞 膜 外 区 和 胞 浆 区 结构 , 并 有 独特 的 信号 转 导 途 径 ; 第 五 类 由 2 条 或 多 条 跨 膜 多 肽 链 组 成 , 如 高 亲 和 性 的 下 -2 受 体 ,含有 3 Khor RH, Ho 链 含 补 体 调 控 蛋 和 白 结 构 域 , 与 信号 转 导 无 关 , 但 可 以 增强 与 蕊 -2 结合 的 亲和力 ,由 B、Y 异 二 聚 体 完 成 信号 转 导 。 4, 补 体 受 体 补体 (complement) 受 体 是 细胞 表面 重要 的 膜 结 构 , 补 体系 统 所 产生 的 生物 学 效应 都 是 通过 补体 受 体 介 导 的 。 补 体 受 体 表 达 在 多 种 细胞 膜 表 面 , 如 红细胞 、 粒 细胞 、 巨 叹 细胞 等 , 有 不 同 的 生物 学 功能 。 (1)I 型 补体 受 体 I 型 补体 受 体 即 CD35, 是 一 种 单 链 跨 膜 糖 蛋白 , 对 C3b 和 C4b 有 高 度 亲 和 性 , 普 遍 存在 于 红细胞 、 嗜 中 性 细胞 、 嗜 酸性 细胞 、 巨 唑 细胞 、 淋 巴 细胞 、 树 突 细 胞 等 。 分 子 中 伟大 量 短 的 重复 保守 序列 , 使 配 体 结 合 位 点 与 表达 CRI 的 细胞 表面 能 维持 一 定 的 距离 。 CR1 的 主要 功能 有 : 作为 调理 素 受 体 , 增 强 吞 唑 细胞 对 C3b 或 C4b 包 被 的 细胞 或 颗粒 的 吞噬 作用 ;作为 补体 活化 调节 因子 抑制 C3 转化 酶 的 形成 , 促进 C3b 或 C4b 的 裂解 ; 促进 NK 细胞 发 挥 ADCC 作用 , 杀 伤 结合 了 C3b 的 细胞 , 清 除 免疫 系统 的 免疫 复合 物 ,CRI1 也 是 B 细胞 激活 的 调节 剂 。 (2) 开 型 补体 受 体 Tepes (CR2) 即 CD21, 是 单 链 跨 膜 糖 蛋白 , 存 在 于 B 细胞 、 树 突 状 细胞 和 上 皮 细 胞 表面 , 可 特异 结合 C3d, 也 是 EB 病毒 受 体 , 主 要 对 B 细胞 的 分 化 、 增 殖 、 记 忆 和 JIg 的 产生 起 重要 调节 作用 。 (3) II 型 补体 受 体 II 型 补体 受 体 (CR3) 是 由 o%、B 两 条 多 肽 链 构成 的 异 二 聚 体 , 属 于 黏附 分 子 整合 素 家 族 成 员 。CR3 分 布 于 嗜 中 性 细胞 、 单 核 - 巨 叭 细胞、 嗜 酸性 细胞 、NK 细胞 及 细胞 毒性 工 细 胞 和 B 细胞 。CR3 的 主要 生物 学 活性 是 促进 细胞 黏附 人 车 娃 , 通 过 促进 效应 细胞 和 驾 细胞 的 细胞 黏附 作用 增强 吞 唑 作用 ,因而 在 抗 感染 免疫 所 二 有 重要 作用 。CR3 缺陷 可 出 现 反 复 细菌 性 感染 。 (4) IV 型 补体 受 体 IV 型 补体 受 体 (CR4) 又 称 CD11c 人 CD18, 也 是 由 j 条 多 肽 链 构 成 的 异 二 聚 体 , BEE CR? 依 子 的 B 链 相同 。CR4 324549 FISH peY 单 核 - 巨 噬 细 胞 和 血小板 上 , 能 增强 F 均 体 介 导 的 吞噬 作用 , 也 可 介 导 Fe Se Ef © 竺 吞 嗜 作 用 , 还 介 导 细胞 间 的 ALB, = -与 细胞 的 活化 、 增 殖 过 程 。 Ld | | wy fen A ¥v 》 | () Lat) ie Biomembranes 368 ETP (5) V 型 补体 受 体 V 型 补体 受 体 〈CR5), 与 液 相 中 C3bi AY C3d Bhar, C3dg 和 C3d 片段 结合 , 主 要 表 达 在 中 性 粒 细胞 和 血小板 上 〈 林 学 颜 等 2000)。 此 外 ,C1q 受 体 、C5a 受 体 、C3a 受 体 和 互 因 子 受 体 等 在 不 同 的 细胞 中 具有 识别 配 体 、 转 导 信 号 和 诱导 细胞 应 答 等 作用 。 29.2 Ss iSI 5 $9 7 mas 在 免疫 细胞 分 化 发 育 的 不 同 阶段 ,细胞膜 表 面 分 子 表达 的 种 类 和 数量 均 有 不 同 , 通 过 这 些 分 子 间 的 相互 识别 与 相互 作用 , 介 导 免 疫 细胞 活化 、 信 号 转 导 , 产 生 免 疫 应 答 (immune response), 发 挥 生物 学 效应 。 免疫 识别 是 机 体 先 天 免疫 应 答 和 适应 性 免疫 应 人 答 必 不 可 少 的 起 始 阶段 , 主 要 通过 TCR、BCR 以 及 NK 细胞 膜 表面 受 体 介 导 。 正 营 情 况 下 , 机 体 接触 外 产 性 抗原 时 受 刺激 而 产生 特异 性 免疫 应 答 。 根 据 介 导 免 疫 应 答 的 成 分 , 特 异性 免疫 应 答 可 分 为 体液 免疫 和 细胞 免疫 。 体 液 免疫 是 由 血液 中 的 抗体 介 导 ,, 通 过 外 来 抗原 与 BCR 特异 性 结合 , 活 化 也 细胞 , 特 异性 识别 和 清除 抗原 , 这 是 防御 细胞 外 微生物 及 其 毒素 的 主要 机 制 。 细 胞 免疫 由 工 细 胞 介 导 , 细 胞 内 微生物 如 病毒 和 某 些 在 宿主 细胞 内 增殖 的 细 贰 不 能 与 循环 系统 的 抗体 结合 , 通 过 工 细 胞 将 微生物 破坏 或 裂解 感染 的 细胞 来 清除 感染 源 。 29.2.1 (Sif 5: 5x); _ mmm 根据 诱导 抗原 类 型 的 不 同 ,B 细胞 呈现 不 同 的 活化 方式 。 1. 工 细胞 依赖 性 抗原 蛋白 质 抗 原 属 工 细 胞 依赖 性 抗原 〈T cell dependent antigen, TD-Ag),B 细 胞 活化 多 需 Th 细 胞 的 辅助 。B 细胞 吞 鸣 能 力 较 弱 , 但 其 表面 Ig 是 高 亲和力 的 抗原 受 体 , 尤其 对 可 溶性 抗原 具有 较 高 亲和力 , 并 具有 富 集 抗 原 的 作用 。 多 价 或 二 价 TD-Ag 与 B 细 胞 膜 上 Ig 相互 作用 , 形 成 抗原 -抗体 复合 物 。B 细胞 膜 上 Ig 分 子 交叉 联结 , 并 聚集 迁移 到 细胞 的 一 极 , 形 成 “ 极 帽 "。B 细胞 通过 受 体 介 导 的 内 吞 作用 将 抗原 -抗体 复合 物 内 化 入 B 细 胞 内 , 在 酸性 溶 酶 体 中 抗原 被 蛋白 酶 水 解 成 小 肽 片段。 部 分 Ie 分 子 可 重新 返回 到 细胞 表面 , 大 部 分 被 重新 合成 的 I 分 子 取代 。 抗 原 特 异性 的 肽 片段 与 MHC-I 类 分 子 结合 形成 抗原 肽 -MHC-I 复 合体 , 通 过 内 质 网 、 高 尔 基 体 转 移 到 细胞 膜 表 面 。 抗 原 刺激 是 B 细胞 活化 的 第 一 信号 , 使 B 细 胞 初步 活化 , 开始 表达 黏附 分 子 . MHC-I[ 分 子 和 细胞 因子 受 体 等 ( 林 学 颜 等 2000) 。 在 抗原 呈 递 过 程 中 B 细胞 被 完全 活化 。 内 吞 进入 B 细胞 及 其 他 抗原 呈 递 细胞 的 TD- Ag 经 抗原 呈 递 细胞 的 加 工 , 与 MHC-I[ 分 子 结合 , 通 过 内 质 网 、 高 尔 基体 转移 到 细胞 腊 表面 。 辅 助 性 T 细 胞 (helper T cell, 又 称 Th 细胞 ) 表面 TCR 复合 体 识别 MHC-IU 抗原 肽 复合 物 , 引 起 工 细胞 应 答 。 在 B 细胞 和 Th 细胞 表面 有 协同 刺激 分 子 , 如 B7、CD28、 cD40 和 CD40L, 它们 相互 作用 使 Th 细胞 活化 产生 大 量 的 细胞 因子 。 这 些 细胞 因子 作用 于 B 细 胞 , 使 B 细 胞 完全 活化 。 完 全 活化 的 B 细胞 可 在 淋巴 结 内 或 迁 入 骨髓 内 迅速 分 化 增殖 , 一 部分 分 化 为 终 未 细胞 一 一 浆 细胞 , 浆 细胞 通 基 因 重 排 进 行 重 链 同 型 转换 , 并 发 生 亲 和 ?或 熟 , 一 部 分 了 细胞 转化 成 记忆 性 了 B 细 胞 !Grimbacher et al. 2003 ) 。 B 细 乃 不 可 通过 表面 受 体 (IL-R、FcR、CR 等 ) “ 受 多 种 因子 的 作用 而 促进 活化 , 369 % 29% AVR DR BE 例如 ILs、IgG、C3b 和 有 丝 分 裂 原 等 。 2. 革 细 胞 非 依 赖 性 抗原 (T cell independent antigen, TI-Ag ) 与 TD-Ag 不 同 , TILAg 与 B 细 胞 上 的 膜 节 结合 时 ,通过 其 大 量 重复 排列 的 相同 表 位 使 B 细 胞 完全 活化 。 但 这 种 直接 活化 作用 只 能 诱导 IgM 类 抗体 的 产生 ,不 能 形成 记忆 细 胞 , 不 产生 再 次 免疫 应 答 。 29.2.2 2/5/55 mmm PH He eae hie ESE HT Anse mk, RE T. BBE, BA ean Ren Ane VE, PES PA, SS RS J] FS) LAAN Ae EG EO IB AG 性 超 敏 反应 , 以 及 免疫 调节 功能 , 成 熟 的 工 细 胞 识别 不 同 的 抗原 导致 不 同类 型 的 细胞 免 疫 反 应 。 本 节 主 要 介绍 CD4- 工 细胞 和 CD8 IT 细 胞 介 导 的 细胞 免疫 。 1,CD4:* 工 细胞 介 导 的 细胞 免疫 (1) CD4* T 49 ft 89 78 40 CD4: 工 细胞 的 话 化 需 有 抗原 呈 递 细胞 (antigen presenting cell, APC) #45, APC 主要 包括 树 突 细胞 (Barrera et al. 2002) 、 单 核 巨 噬 细 胞 、B 细胞 、 内 皮 细 胞 等 , 不 同 的 APC 细 胞 以 多 种 方式 结合 蛋白质 抗 原 。 抗原 在 结合 至 APC 后 的 几 分钟 内 通过 吞噬 作用 或 受 体 介 导 的 内 知 作 用 进入 细胞 , 可 溶性 蛋白质 抗 原 可 借助 胞 饮 作 用 内 化 入 APC。 在 酸性 条 件 下 和 蛋白质 抗 原 被 蛋白 酶 水 解 成 小 肽 ,这 些 抗原 肽 片段 与 自身 的 MHC-II 分 子 形成 复合 物 , 运 送 至 细胞 表面 并 呈 递 给 CD4:T 细 胞 (Umemoto et al. 2002), CD4:T 细 胞 活化 需 有 双 信 号 刺激 , 即 其 抗原 识别 受 体 (TCRoB) 与 抗原 呈 递 细胞 上 的 肽 -MHC-I 复 合 物 结合 后 , 可 通过 CD3 复合 分 子 传递 第 一 信号 (Housset et al. 2003 ) 。 CD4- 工 细胞 上 其 他 辅助 分 子 如 CD2、LFA-1、CD4 及 CD28 等 可 与 APC 上 相应 的 配 体 分 子 如 LFA-3、ICAM-1、MHC-I 及 B7 等 结合 , 增 强 CD4° T 4a 5 APC 间 的 黏附 作用 , 并 提供 协同 刺激 信号 (Fearon et al. 2000, Konno et al. 2003), 使 CD4* 工 细胞 活化 并 产生 多 种 细胞 因子 。 若 无 协同 信号 刺激 ,CD4* T 细胞 将 处 于 免疫 不 应 答 (anergy) 状态 (Klemmensen et al. 2003) 。 CD4 工 细胞 经 抗原 识别 , 在 辅助 分 子 的 协同 刺激 下 , 接 受 抗 原 呈 递 细 胞 分 泌 的 工 -1 而 开始 活化 , 自 细胞 介 素 -2 (IL-2) 基因 和 下 -2 受 体 基因 话 化 表达 , 自 分 泌 的 开 -2 与 受 体 结合 ,Th 细胞 被 完全 活化 , 大 量 增殖 (Huppa et al. 2003)。 大 部 分 Th 细胞 分 化 成 免疫 效应 细胞 , 同 时 一 部 分 Th 细胞 分 化 为 记忆 细胞 (Hare et al. 2003), Th 细胞 活化 和 克隆 增 殖 后 合成 和 分 泌 大 量 的 细胞 因子 ,其 中 最 重要 的 有 IL-2、 肿 瘤 坏 死因 子 (TNF)、 淋 巴 毒 素 (LT) 和 干扰 素 (IFEN-Y) 等 , 它 们 是 产生 DTH 反 应 的 分 子 基础 。 这 些 细胞 因子 又 作 用 于 其 他 细胞 群 , 如 INEF 和 IT 能 激活 中 性 粒 细胞 和 血管 专 皮 细胞 ,IL-5 激活 嗜 酸性 粒 细胞 ,IFN-Y 激 活 单 核 巨 噬 细 胞 ,LL-2 激活 NK 细胞 以 及 工 召 细 胞 。TI 细 胞 通过 细胞 因 子 的 分 泌 , 为 其 他 细胞 的 激活 提供 必须 的 帮助 , 刺 激 丰 4 效应 细胞 活化 转化 成 为 特 异性 免疫 的 效应 细胞 (lijima et al. 2003) 。 (2) 迟 发 型 超 敏 反应 抗原 下 次 进入 机 体 , 经 24~48h 后 可 出 现 工 细胞 介 = ) 兼 有 巨 唆 细 胞 参与 的 特异 性 炎症 反应 ,请 除 抗原 。 由 于 免疫 细胞 的 激活 、 增 殖 和 乡 。 人 及 炎症 细胞 的 聚集 需要 较 长 时 间 , 类 正 反 应 发 生 较 迟 , 持续 时 间 也 --, 故 称 此 种 炎 } -应 为 迟 发 型 超 敏 反应 (delayed x xX Biomembranes 370 | 册 4 中 MVNO type hypersensitivity, DTH), DTH £32 -y CD4° T 4st, 2280 4 A A Be 胞 、 内 皮 细 胞 、 嗜 中 性 粒 细胞 等 。 在 DTH 的 致 敏 阶段 , 由 树 突 细 胞 呈 递 抗原 给 原初 工 细胞 ative T celD), 使 抗原 特异 PEAY CD4* T 2H Hata CFEH494 (Szabo et al. 2003, Choi et al. 2003 ) 。 在 激发 阶段 , 相同 的 抗 Zam A Ae. Ben B a Sh 2A PU AACE CD4* T ane, 抗原 特 异性 的 工 细胞 被 扩大 并 维持 应 答 到 抗原 消除 为 止 (Jensen 1999) , 活化 的 工 细 胞 可 借 其 工 -2 的 自分 泌 和 旁 分 泌 作 用 刺 油 抗原 特异 的 工 细胞 和 邻近 的 旁 BA T Ane. IL-2 除 能 刺激 工 细胞 增殖 外 , 还 能 促使 CD4- 工 细 胞 合成 多 种 细胞 因子 (Malissen 2003 ) 。 如 IFEN-Y 可 作用 于 APC 细 胞 巨 吹 细 胞 和 内 皮 细 胞 ,增加 它们 膜 表 面 MHC- 4a fied, 提高 其 呈 递 抗原 的 效率 ; TNFE 和 LT 可 作用 于 血管 内 皮 细 胞 使 之 表达 黏附 分 子 和 分 泌 趋 化 性 细胞 因子 《如 下 -8 等 ), 使 中 性 粒 细 胞 、 麻 巴 细胞 以 及 单 核 细 胞 等 与 血 管内 皮 黏附 并 迁移 和 外 涂 至 组 织 内 引起 组 织 炎 症 反 应 。 IFN-Y 是 强 有 力 的 巨 叭 细胞 活化 因子 。 自 血液 经 内 皮 细 胞 涂 出 的 单 核 细胞 进入 炎症 部 位 的 组 织 后 , 在 IN-Y 的 作用 下 可 分 化 为 巨 唑 细胞 。IFEN-Y 增 强 细胞 对 IgG Fc 部 分 的 高 亲 和 力 ,FcR 的 表达 能 够 促进 巨 哦 细胞 摄取 细 瑚 。 一 旦 细 戎 被 吞噬 入 细胞 内 , 巨 唑 细胞 产 生 的 活性 氧 可 以 杀 灭 细菌 。 活 化 的 巨 唑 细胞 能 够 杀伤 胞 内 的 微生物 、 肿 瘤 细 胞 , 而 静 息 的 单 核 细胞 无 此 功能 。 活 化 的 巨 鸣 细 胞 是 DTH 反应 中 主要 的 清除 抗原 和 引起 炎症 的 效应 细胞 (Urban et al. 2000) 。 活化 的 巨 噬 细 胞 可 分 刻 许 多 引起 炎症 的 细胞 因子 的 生长 因子 , 4 TNF, IL-1 Ai IL-6, 在 急性 期 可 通过 工 细 胞 、 中 性 粒 细胞 和 内 皮 细 胞 以 增强 其 细胞 介 导 的 免疫 反应 , 引 起 局 部 组 织 损伤 。 在 慢性 期 则 可 刺激 纤维 母 细 胞 增生 和 产生 胶原 纤维 , 其 分 泌 的 PDGF 和 TGF-B 可 增强 这 种 作用 , 纤 维 化 是 DTIH 反应 的 最 终结 局 。 总 之 , 急性 DTH 反 应 是 一 种 细胞 介 导 的 免疫 反应 , 是 CD4 工 细胞 识别 可 溶性 蛋白 抗原 或 CD8&8 工 细 胞 识别 胞 内 微生物 抗原 和 对 活化 工 细 胞 产生 的 细胞 因子 应 答 的 结果 。 在 早期 DTIH 反 应 中 , 以 活化 的 CD4- 工 细胞 和 活化 的 巨 哗 细 胞 浸润 为 主 , 这 些 细胞 聚集 在 活化 的 血管 内 皮 细 胞 周围 并 外 疾 至 局 部 组 织 内 。 在 晚期 慢性 DTH 反 应 中 以 徐 状 上 皮 样 巨 吹 细 胞 和 巨细 胞 为 主 , 并 伴 有 大 量 纤维 母 细 胞 形成 组 织 纤维 化 以 替代 原 有 组 织 。 2. CD8*T 细胞 介 导 的 细胞 免疫 CD8':T 细 胞 能 杀伤 表达 特异 性 抗原 的 靶 细 胞 , 它 是 抗 病毒 感染 、 急 性 同 种 异型 移植 物 排斥 和 杀伤 肿瘤 细胞 的 重要 效应 细胞 ,又 称 细胞 毒性 T 细 胞 (cytotoxicity, CTL 或 Tc ) 。 绝 大 多 数 CTL 细胞 表达 CD8 分 子 , 其 抗原 识别 受 体 (TCRoB) 可 识别 多 肽 抗原 与 自己 MHC-I 分 子 形成 的 复合 物 。 这 些 非 已 多 肽 抗原 是 在 靶 细胞 内 合成 经 加 工 后 与 自身 MHC-I 分 子 结合 并 运送 到 靶 细 胞 表面 的 。 少 数 CTL 细胞 可 表达 CD4 分 子 并 识别 和 自身 MHC-II 分 子 结合 的 多 肽 抗原 (Enders 2002) ) 。 在 正常 机 体 中 ,CD8 工 细胞 以 静 和 县 工 细胞 的 形式 存在 , 经 过 抗原 激活 并 在 Th 细胞 协同 作用 下 ,CD8& IT 细胞 分 化 发 育 为 细胞 毒性 工 细 胞 . 效应 性 工 细 胞 的 活化 需要 双 信 号, 即 TCR 与 半 细 胞 膜 上 MHC-IT 抗 原 肽 复合 物 结合 后 , 可 通过 CD3 分 子 传递 第 一 信号 ; 而 CTL 上 的 其 他 寻 助 分 子 如 CD2、LEFA-1、CD8 及 CD28 等 三 沁 细 胞 上 相应 的 配 体 分 子 LFA-3、 ICAM-1、MHC-I 及 B7 等 结合 , 不 仅 增强 CTL SHEA) 的 黏附 作用 , 同 时 也 传递 协同 刺 时 第 29 竟 AVN RPE 激 信号 使 CTL 活化 (Campbell et al . 2002) 。 在 活化 的 CD4- 工 细胞 分 泌 的 细胞 因子 (an IL-2) 作用 下 , 使 CTL 增殖 并 分 化 为 细胞 毒性 工 细胞 。 CTL 对 妓 细 胞 的 杀伤 作用 是 抗原 特异 性 的 , 且 必 须 与 靶 细 胞 直接 接触 才 有 杀伤 作用 。 CTL 主要 通过 两 种 途径 杀伤 靶 细 胞 : 穿孔 素 / 粒 酶 途径 和 死亡 受 体 途径 。 细胞 毒性 工 细 胞 活化 后 可 诱发 脱 颗粒 作用 ,排出 其 胞 浆 颗 粒 内 已 合成 的 穿孔 素 。 穿 孔 素 单 体 在 胞 外 与 高 浓度 Ca 接触 后 即 发 生 聚 合 , 插 入 靶 细 胞 膜 的 脂 质 双 层 ,形成 直径 Ay 10~20nm 的 离子 通道 。 离 子 和 水 可 由 通道 进入 细胞 ,而 K- 和 大 分 子 物质 则 从 细胞 逸 出 ,改变 细胞 渗透 压 , 造 成 细胞 裂解 。 这 种 细胞 裂解 作用 类 似 于 补体 的 膜 攻 击 复合 物 的 作用 , 并 且 穿 孔 蛋白 的 结构 也 与 C9 有 同 源 性 。 在 此 过 程 中 , 由 于 CTL 细胞 本 身 表 达 并 释放 A 型 硫酸 软骨 素 蛋 白 聚 糖 、 硫 酸软 骨 素 A 和 同 源 限制 因子 等 保护 性 调节 因子 , 避 免 了 穿孔 素 对 自身 的 攻击 。 粒 酶 是 一 种 丝氨酸 和 蛋白酶, 粒 酶 B 可 以 活化 caspase-8 或 caspase- 10, 诱 发 靶 细 胞 程序 性 死亡 。 粒 酶 与 穿孔 素 有 协同 作用 , 粒 酶 可 以 通过 穿孔 素 形成 的 通 道 进 入 靶 细 胞 ,降解 丢 细 胞 DNA, 诱导 细胞 凋 它 。 颗 粒 中 的 其 他 成 分 如 丝氨酸 酯 酶 和 蛋 白 聚 糖 也 有 损伤 细胞 的 作用 (Ivan Roitt et al. 2001 ) 。 CTIL 识 别 靶 细胞 后 ,细胞 表面 表达 高 水 平 FasL, 与 靶 细胞 表面 Fas 相 结合 , 通过 Fas 介 导 的 凋 亡 途径 杀伤 靶 细胞 , 使 丢 细胞 发 生 程序 性 死亡 。 223 HHI Ce See A" 1 Fl ms 机 体 的 免疫 应 答 处 于 一 套 精 确 、 严密 地 调控 机 制 忆 中 , 对 外 界 不 同 抗原 的 刺激 产生 协调 适度 的 免疫 应 答 , 既 不 使 免疫 应 答 损 伤 自身 , 又 维持 机 体内 环境 的 稳定 , 并 有 效 地 消除 抗原 异物 。 免 疫 系 统 中 各 种 免疫 分 子 、 免疫 细胞 在 免疫 应 答 过 程 中 彼此 相互 作用 ,在 免疫 调节 中 起 重要 作用 。 影 响 特异 性 免疫 应 答 的 因素 主要 有 : 抗原 的 类 型 、 剂 量 及 免疫 途径 , 辅佐 细胞 的 数量 和 类 型 , 效 应 性 淋巴 细胞 的 性 质 。 下 面 主要 介绍 免疫 细胞 和 细胞 膜 在 免疫 应 答 中 所 起 的 作用 。 TT 抗原 呈 递 细胞 (antigen presenting cell, APC ) 包 括 树 突 细胞 、 巨 吹 细 胞 、 淋 巴 细胞 等 , 在 诱导 了 细胞 依赖 性 的 免疫 反应 中 起 重要 作用 。APC 表达 高 水 平 MHC-I 分子 和 协 同 刺激 分 子 , 可 有 效 活化 MHC 限制 性 T 细 胞 , 若 缺乏 APC 细胞 将 导致 免疫 缺陷 。 协 同 刺激 分 子 提供 MHC 限 制 性 T 淋 巴 细胞 活化 的 第 二 信号 , 如 果 缺 乏 协同 刺激 分 子 , 则 诱导 免疫 阶 受 的 产生 (Konno et al. 2003, Lanzavecchia 1996) 。 29.3.2 Air VEVKE AIG “NE 各 类 免疫 细胞 之 间 相 互 作 用 共同 调节 免疫 应 答 。T 细 胞 、B 细胞 、 单 核 巨 噬 细 胞 既 是 免疫 应 答 的 效应 细胞 , 也 参与 免疫 应 答 的 调节 。 1. Th 细胞 抗原 刺激 后 机 体 发 生体 液 免疫 或 细胞 免疫 都 是 由 抗 ”。 闷 细 胞 和 Th 细胞 的 相互 作用 诱导 的 。 诱 体 液 免 疫 作 用 的 主要 是 Th2 , 诱发 细胞 免 六 .辅助 作用 的 主要 是 Thl, Thl 和 Th2 可 过 各 自分 泌 的 细胞 因子 相互 制约 (Szabo et 903), Thi 细胞 主要 产生 IL-2 和 IFN-, IFN-Y 可 抑制 Th2 增殖 和 功能 , 而 Th2 产生 ”上 IL-5 和 开 -10, 下 -10 是 一 种 NAINA, BARS % x Biomembranes 372 重要 的 免疫 抑制 因子 , 它 可 抑制 Thl 47 Ws IL-2 FU IFN-y, fill MHC-Il 47 4A, FF ay 抑制 巨 噬 细 胞 产生 IL-1, IL-6 等 。 2. 调节 性 T 细 胞 在 免疫 应 答 过 程 中 , 一 部 分 CD4- 工 细胞 可 活化 调节 性 工 细 胞 。 调 节 性 工 细胞 分 这 抗原 特异 及 非特 异性 抑制 因子 ,抑制 CTL、Th 及 B 细 胞 的 功能 ,发挥 负 反 馈 调 节 作 用 以 维持 机 体 的 免疫 平衡 《赵勇 2003), 3. CTL 细胞 CTL 细胞 可 针对 工 细 胞 表面 TCR 或 B 细胞 表面 BCR 可 变 区 的 独特 型 起 特异 杀伤 作 用 而 引起 免疫 抑制 。 4. B 细 胞 B 细 胞 作为 抗原 呈 递 细胞 因 其 表面 的 抗原 受 体 具有 聚集 抗原 的 作用 , 能 将 低 谊 度 的 抗原 呈 递 给 Th 细胞 , 利 于 免疫 应 答 的 发 生 。 同 时 , 一 部 分 了 B 细胞 表面 有 FEFcyR,LPS 或 抗原 - 抗体 复合 物 可 与 FcYR 结合 , 抑 制 B 细胞 免疫 应 答 , 对 早期 体液 免疫 应 答 起 负 调 控 作 用 。 2233 ARIIEEIS Ce 5e.15 J 111 1mm 从 分 子 水 平 看 ,免疫 调节 最 终 是 通过 免疫 细胞 分 子 间 相互 作用 发 挥 功能 ,其 中 免疫 细胞 膜 表 面 分 子 在 此 过 程 中 起 着 不 可 忽视 的 调节 作用 。 1. 抗体 抗体 通过 与 B 细 胞 膜 上 的 Fe 受 体 结合 直接 抑制 B 细 胞 的 激活 , 这 种 抑制 作用 发 生 于 多 抗原 表 位 诱导 的 免疫 反应 中 。 在 含有 多 抗原 表 位 的 抗原 中 , 某 一 抗原 表 位 参与 免疫 复 合 物 的 形成 , 另 一 表 位 将 结合 特异 性 B 细 胞 膜 上 的 Ig 分 子 。 免 疫 复合 物 与 B 细 胞 上 Fe 受 体 相互 作用 可 抑制 细胞 内 第 二 信号 的 产生 , 阻 断 B 细胞 的 免疫 应 答 , 从 而 下 调 体液 免疫 反应 。 当 B 细胞 表面 的 抗原 受 体 的 Fc 受 体 因 抗原 -抗体 复合 物 的 作用 而 发 生 交 联 时 ,就 可 产生 抑制 信号 , 可 抑制 B 细胞 分 化 为 抗体 形成 细胞 。 但 当 抗 原 量 多 且 抗体 量 少时 , 形 成 的 复合 物 可 与 APC 表 面 的 Fe 受 体 结合 , 则 可 增强 抗原 呈 递 细胞 的 功能 , 进而 增强 B 细 胞 产生 抗体 。 所 以 免疫 复合 物 的 调节 作用 在 反应 初期 由 于 抗原 量 大 , 多 表现 为 增强 反应 , 到 后 期 由 于 抗体 量 增 多 可 中 和 抗原 而 起 抑制 作用 。 2. 抗原 - 抗体 复合 物 抗原 -抗体 复合 物 可 改变 细胞 因子 的 级 联 放大 作用 。 如 巨 只 细 胞 接触 免疫 复合 物 后 产生 下 -1 受 体 的 持 抗 剂 , 竞 争 性 抑制 工 -1 与 其 受 体 结合 。 在 临床 上 已 成 功 地 应 用 抗体 的 反馈 调节 预防 新 生 儿 溶血 性 疾病 的 发 生 〈 王 重庆 1997), 3. MHC 分 子 特异 性 抗原 与 MHC-I 或 MHC-I 相 结合 决定 了 不 同形 式 抗原 激活 的 工 细 胞 类 型 , 而 不 同 的 工 细 胞 类 型 介 导 不 同 的 免疫 应 答 。T 细 胞 识别 细胞 表面 抗原 决定 敌 的 同时 , 还 须 识别 细胞 上 的 MHC 分 子 。 不 仅 CTL- 靶 细 胞 且 巨 噬 细 胞 -Th、Th-B 以 及 Th-Te 细胞 间 的 相互 作用 也 受 MHC 约束 , 即 具 有 同一 MHC 表 型 的 免 衣 细 胞 才能 有 效 地 相互 作用 ,所 以 T 细 胞 的 各 疫 应 答 受 MC 限制 性 的 调节 。 MHC) 子 又 是 一 种 同 种 异型 抗原 , 可 诱导 移植 免 , :排斥 反 应 的 发 生 , 典型 的 例子 是 体外 的 同 种 导体 混合 淋巴 细胞 反应 和 体内 同 种 移植 排 ) 反应 。 在 这 两 种 情况 下 , 反 应 性 373 % 290% AE 5 PE 工 细 胞 对 非 已 MHC 抗原 的 识别 有 时 不 受 自身 MHC 限制 。 4 辅助 分 子 辅助 分 子 或 协同 刺激 分 子 不 仅 提供 工 细胞 活化 的 第 二 信号 , 还 以 不 同 的 方式 调 市 免 疫 应 答 。 首 先 , 工 细胞 在 不 同 分 化 时 期 遇 到 不 同 抗原 , 表 达 的 辅助 分 子 也 有 所 不 同 , 从 而 影响 工 细胞 从 血液 到 淋巴 结 或 外 周 组 织 等 抗原 所 在 部 位 的 循环 , 其 次 , 采 些 辅助 分 子 通过 增强 APC 与 Th 细胞 间 的 黏附 , 增 强 免疫 应 答 的 效率 , 部 分 辅助 分 子 可 以 传递 负 调 节 信 号 , 如 CTLA-4 (CD152) 与 APC/B 细胞 上 B7 结合 , 可 能 对 已 活化 的 CD8'T 细 胞 的 过 度 扩 增 起 到 抑制 作用 , 使 免疫 应 答 恢复 到 相对 平衡 的 状态 〈(Krummel et al. 1996, Liu et al. 2001) 。 另 外 ,CTLA-4 可 以 提高 工 细胞 活化 的 域 值 , 一 定 程度 避免 目 身 免疫 应 答 的 发 生 , 同 时 对 Th2 细胞 的 分 化 具有 调节 作用 。 最 后 , 需 要 指出 ,除了 细胞 表面 分 子 外 ,细胞 内 膜 系 统 的 膜 蛋白 对 免疫 系统 的 发 育 与 功能 也 具有 特别 重要 的 调 市 作用 。 金 伯 泉 . 2001. 细胞 和 分 子 免 疫 学 . 第 二 版 . 北京 : 科学 出 版 社 . 13-20 林学 颜 , 张 玲 . 2000. 现代 细胞 和 分 子 免疫 学 . 北京 : 科学 出 版 社 . 90-103 EIR. 1997. 分 子 免 疫 学 . 北京 : 北京 大 学 出 版 社 . 185-197 赵勇 . 2003. 异种 移植 免疫 学 . 北京 : 中 国医 药 科 技 出 版 社 . 90-94 Barrera C, Espejo R, Reyes V E. 2002. Differential glycosylation of MHC class II molecules on gastric epithelial cells: implications in local immune responses. Hum Immunol, 63(5): 384-393 Campbell N A, Park M S, Toy L S, et al. 2002. A non-class | MHC intestinal epithelial surface glycoprotein, gp180, binds to CD8. Clin Immunol, 102(3): 267-274 Choi YK, Whelton KM, Mlechick B, et al. 2003. Productive infection of dendritic cells by simian immunodeficiency virus in macaque intestinal tissues. J Pathol, 201(4): 616-628 Enders GA. 2002. Mechanism of antigen presentation after hypertonic loading of soluble antigens. Immunology, 106(4): 511- 651 Fearon DT, Carroll MC. 2000. Regulation of B lymphocyte responses to foreign and self-antigens by the CD19/CD21 complex. Annu Rev Immunol, 18: 393-422 Grimbacher B, Warnatz K, Peter I. 2003. The immunological synapse for B-cell memory: the role of the ICOS and its ligand for the longevity of humoral immunity. 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J Immunol, 164(8): 4250-4256 Umemoto E Y, Brokaw JJ, Dupui SM, et al. 2002. Rapid changes in shape and number of MHC class II expressing cells in rat airways after Mycoplasma pulmonis infection. Cell Immunol, 220(2): 107-115 a Tis 研究 生物 膜 的 理论 , 捞 术 ,方法 与 仿生 物 膜 第 30 章 第 31 章 第 32 章 第 33 章 第 34 章 生物 膜 的 单 分 子 研究 生物 膜 研 究 的 模型 膜 系统 生物 膜 泡 形状 的 弹性 理论 聚 电解 质 稳定 化 的 脂 质 体 微 胶 宫 膜 的 生物 学 功能 研究 SO 章 HEIR A) FE 30,1 “研究 生物 单 分 子 的 技术 :5 377 30.2 “生物 膜 单 分 子 研究 的 现状 举例 ces escscsesessceseresseecsenssacenensenenees 377 30.2.1 GRA BPRS BED FRET ESE, «cee eceeceesecneeeeneeneress 377 30.2.2 受 体 与 信号 转 导 的 研究 nec cessetsecovecsovone.se 378 30.2.3 开 离子 通道 结构 与 功能 的 研究 于 379 302 有 4 村 脂 微 区 的 研究 二 cccasesseccecaccsesessseccysseocans0ts en 379 30.2.5 Free REAL FE A FAIL FEAT GE oes 人 全 全 本 下 380 一 ”十 世纪 以 来 分 子 生 物 学 的 辉 烛 成 就 使 人 们 相信 , 儿 乎 所 有 的 一 “生命 现象 都 可 以 用 分 子 的 语言 加 以 描述 。 这 从 生命 科学 的 各 个 分 支 , 包 括 生 物化 学 、 遗 传 学 、 细 胞 学 、 生 理学 、 免 疫 学 、 药 理学 、 病 理学 直至 医学 的 许多 领域 都 纷纷 园 以 “分 子 ” 二 字 可 以 宁 见 一 斑 。 然 而 仔细 考察 研究 分 子 生 物 学 的 方法 就 会 发 现 , 实 验 中 所 用 的 方法 绝 大 多 数 都 是 用 大 量 分 子 得 到 的 , 由 此 得 出 的 结果 是 许多 分 子 在 实验 进行 时 间 内 的 平均 行为 , 并 不 能 反映 单个 分 子 的 实际 情况 。 即 使 在 开始 实验 时 能 使 全 部 分 子 同步 化 , 随 着 时 间 的 推移 , 分 子 彼 此 之 间 也 会 有 所 差异 , 不 能 保证 所 有 分 子 运 动 的 一 致 性 。 单 分 子 (single molecule) 研究 的 目的 就 是 要 发 现 生 命 活 动 中 个 别 分 子 的 真实 活动 过 程 , 从 而 阐明 过 程 的 确切 机 制 , 并 以 此 为 依据 , 对 分 子 进行 修饰 和 改造 , 为 医 、 农 和 工程 技术 服务 。 因 此 , 单 分 子 研究 是 分 子 生 物 学 更 深入 一 步 发 展 的 必然 趋势 , 是 21 世纪 生命 科学 的 前 沿 之 一 。 国际 上 对 生物 单 分 子 研究 的 重视 , 大 体 上 是 从 20 世 纪 末 开始 的 。 例 如 ,1996 年 在 德国 柏林 、1999 年 在 奥地利 林 蒋 (Linz) 都 开始 每 年 名 开 一 次 会 议 , 专 门 讨 论 生 命 科 学 中 单 分 子 的 探测 、 分 析 及 其 在 医药 学 中 的 应 用 。 许 过 重要 的 刊物 , 如 Science, Nature Structural Biology, Journal of! ological Chemistry 等 都 在 1999 或 2000 *F iat SSE, STZAE ys | CRT, 2000 AAFP AAD 版 了 专门 刊物 Single Molecules, “年 来 美国 、 日 本 等 的 生物 物理 377 O# ALANA BAD FARE 会 议 , 也 都 开辟 这 方面 的 专题 讨论 会 , 足 见 这 一 领域 已 引起 极 大 重视 , 值 得 注意 。 从 研 究 内 容 来 看 , 开 始 时 观察 的 是 溶液 中 的 单 分 子 , 以 后 直接 观察 了 离 体 条 件 下 分 子 马 达 的 线性 与 旋转 运动 、 酶 反应 、 蛋 白质 与 DNA 相 互 作 用 的 结构 动力 学 , 还 报道 了 脂 双 层 中 单 个 脂 分 子 的 观察 , 人工 膜 中 离子 导电 与 单个 离子 通道 的 同时 测量 。2000 年 在 活 细 胞 表面 首次 观察 到 单 分 子 水 平 的 配 体 与 受 体 相互 作 用 与 脂 分 子 的 运动 。 以 后 又 在 活 细胞 中 观察 到 单 分 子 水 平 的 离子 通道 、 小 G 蛋白 及 其 效应 器 、 细 胞 黏附 蛋白 、 病 毒 蛋白 及 细胞 骨 如 成 分 等 , 研 究 对 象 与 问题 还 在 不 断 扩 大 之 中 。 从 以 上 所 述 可 以 看 出 , 单 分 子 研究 已 从 静 态 转 入 动态 、 从 溶液 转 和 人 脂 环境 及 细胞 , 其 中 多 数 问题 都 与 生物 膜 有 关 , 因 此 生物 膜 的 单 分 子 研究 很 自然 成 为 这 一 领域 的 核心 读 题 。 30.1 DESC VANS PACS ummm 科学 的 发 展 离 不 开 技 术 的 创新 , 单 分 子 研 究 特 别 是 生物 膜 的 单 分 子 研 究 ,, 既 要 考虑 把 研究 对 象限 定 在 单个 分 子 这 样 小 范围 的 技术 ,又 要 提出 能 适用 于 在 生物 膜 这 种 环境 中 活动 的 分 子 的 动态 方法 , 显 然 困难 较 大 。 目 前 已 有 的 技术 大 体 可 以 分 为 两 类 , 即 扫描 探 针 技 术 (scanning probe technique) 和 光学 技术 , 以 及 两 者 的 相互 结合 (Borisenko et al. 2003), 扫描 探 针 技术 主要 包括 扫描 隧道 显 微 术 (scanning tunneling microscopy,STM) 和 原 子 力 显 微 术 (atomic force microscopy,AFM), 而 又 以 后 者 应 用 较 广 。 它 利用 一 个 尖端 在 样品 表面 扫 摘 成像, 或 与 样品 接触 并 拉动 样品 研究 力 的 关系 。 由 于 尖端 及 扫描 范围 都 在 纳米 nm) 量 级 , 因 而 可 以 研究 单个 分 子 。 光学 技术 和 一 般 的 光学 显 微 技 术 基本 原理 相同 , 但 为 了 适应 单 分 子 研究 的 需要 , 必 须 作 出 相应 地 改造 。 首 先 , 必 须 克 服 由 于 光波 波长 (一 般 在 几 百 nm) 的 衍射 极限 , 使 其 能 观察 几 十 甚至 几 个 nm 的 对 象 , 其 次 , 激 发 光束 必须 很 小 , 只 照 到 一 个 或 几 个 分 子 , 再 者 , 必 须 尽 可 能 降低 本 底 艾 光 以 提高 信 噪 比 , 还 要 应 用 量子 产 率 高 的 探测 右 , 如 电 和 谷 耦 合 探测 器 (charge-coupled detector, CCD)a 25 AAIt tk PRU #3 (avalanche photodiode detector,APD) 等 。 由 此 出 现 了 全 内 反射 英 光 显 微 术 (total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)、 扫 拉 近 场 光 学 显 微 术 (scanning near-field optical microscopy, SNOM)、 共 聚焦 油光 扫描 显 微 术 (confocal laser scanning microscopy, CLSM) 、 单 粒子 及 单 桨 料 跟踪 术 (Ssingle particle and single dye tracking,SPT 和 SDT ) 等 。 光 钳 (optical tweezer) 则 是 利用 光 产 生 的 压力 操纵 分 子 的 技术 , 有 时 根据 需要 将 不 同 技术 结合 起 来 , 如 AFM/ Tweezer、SNOMVConfocal 等 ,为 满足 各 种 不 同类 型 的 研究 课题 需要 的 新 技术 还 在 不 断 发 展 之 中 。 30.2 ”生物 膜 单 分 子 研究 的 现状 举例 “33 用 AFM 可 以 直接 观察 和 操纵 单个 膜 蛋 白 分 子 ,f 起 天 光驱 动 的 质子 泵 bR 与 绰 组 成 的 所 谓 紫 膜 , 用 AFM 可 以 看 到 是 排列 整齐 的 , 用 AFM 的 针尖 与 膜 蛋白 接触 并 逐 泗 提 起 针尖 , 可 将 单个 分 子 完 全 拉 出 膜 外 , :* 上 留 下 一 个 空洞 (图 30-1A) (Oesterheii et al. 2000)。 由 于 bR 是 七 次 跨 膜 的 内 对 | , 整 个 拉 的 过 程 将 显示 出 力 的 变化 ; fe, Fe RA (force spectrum), Hitt AMR ANREFRZ— (图 30 .B), PR aS KE 9 WR Biomembranes 378 ; ps } poe 局 ’ { 219 aa 2 ¢ ) a 乔 二 : 盖 fh. 去 面 | 10nm i 时 间 ( 压 电 唱 体 在 Z 方 向 的 位 移 ) A B BROSE A. AFM 拉 出 紫 膜 中 的 bR (5/1 Oesterhelt et al. 2000) ; B. 力 谱 示意 图 ( 引 自 Zlatonova et al. 2000) 30.2.2 受 体 与 信号 转 寻 的 研究 细胞 信号 形成 与 转 导 是 用 单 分 子 成 像 研究 的 主要 领域 之 一 , 细 胞 外 的 信和 号 分 子 通 过 与 膜 上 受 体 结合 将 信号 传人 胞 内 。 用 激光 全 内 反射 奖 光 显 微 技 术 (TIRFM) 与 电荷 看 合 探 宰 器 (CCD) 相 结合 是 最 常用 的 方法 。TIRFM 利 用 光 从 折射 率 大 的 介质 (如 玻璃 ) 进 入 折射 率 小 的 介质 时 (如 细胞 ) 产 生 的 全 反射 现象 , 由 于 光 能 透 入 介面 内 约 1S0nm( 称 为 瞬 逝 波 , evanes- cent wave), 因 而 只 在 这 一 蒲 层 内 的 分 子 才 被 激发 , 从 而 达到 前 述 只 激发 少数 分 子 并 减 小 本 底 的 要 求 。 改 变 入 射 角 , 可 照射 细胞 下 层 或 表面 的 分 子 , 见 图 30-2A 上 半 部 。 图 30-2 中 以 表皮 生长 因子 (EGF) 与 其 受 体 EGFR) 的 作用 为 例 说 明 信 和 号 形成 与 转 导 过 程 的 单 分 子 研究 (Ishijima et al. 2001), EGF 用 荧光 探 剂 Cy3 标记 , 在 其 未 与 受 体 结合 前 , 由 于 分 子 的 布朗 运动 不 能 观察 到 亮点 , 但 与 细胞 膜 受 体 结 合 后 即 可 见 镑 下 有 亮点 , 表 明 EGF 已 稳定 结合 在 细胞 膜 上 。 两 个 亮点 的 碰撞 表明 受 体 的 二 聚 化 , 也 可 能 膜 上 受 体 事先 已 二 聚 化 , 其 中 一 个 亮点 发 光 程 度 突 然 加 倍 。 二 聚 化 的 结果 是 EGF-EGFR 气 合 物 诱发 胞 内 栈 氨 酸 残 基 的 自动 磷酸 化 。 这 -磷酸 化 过 程 也 可 以 用 单 分 子 方法 检验 , 即 “ 对 细胞 打 孔 , 然后 用 Cy5 标 记 的 379 % 30% AE SRAT BAD FIFE EGF 刺激 , 并 与 标记 有 Cy3 的 抗体 Cy3-mAb74 im A, “EREVA HI A ob mA LAY EGFR (图 30-2B), Sako 4#(2003 )ih xe FEA AIRE Ee FS (FRET RFE FARA LA HC BR 物 特异 识别 胞 浆 内 含 SH2 SAA, EA Pa Se HARA Bl CHA. FAIR REA 方法 可 以 研究 其 他 配 体 与 受 体 在 细胞 膜 上 甚至 活 细胞 内 分 子 的 定位 .运动 .识别 与 局 部 转 位 。 A ‘ SS 0 woe af 8, >8, = fee fat |e | st 0.0 0.2 0.4 0.5 1.0 时 间 /s B A @EGF AW " Cys-EFG Cy3-mAb74 和 rie * EGFR 4 : ‘ by rate {I . 下 j 1 10um | 7 Len Cy3-EGF 与 EGFR 的 相互 作用 及 二 聚 体 ( 引 自 Ishijima et al. 2001) 30.2.3 离子 通道 结构 与 功能 的 研究 离子 通道 精确 地 调节 着 离子 的 跨 膜 运动 , 并 产生 离子 梯度 , 担负 着 神经 传导 与 肌肉 收 缩 等 重要 生命 活动 ,但 其 分 子 机 制 仍 有 待 阐 明 。 把 现 有 的 膜 片 钳 测 单 通道 离子 电流 的 技 术 与 监测 离子 通道 的 构象 与 化 学 状态 的 单 分 子 方法 结合 起 来 , 将 使 这 一 领域 的 研究 进 一 BRA. {54 Schiitz 等 (2000 b, c) 用 Cy5 标记 一 种 毒素 Hongotoxin, 它 能 特异 地 与 钾 离 子 通道 Kv1.3 结 合 , 用 交 光 显微镜 可 观察 到 通道 在 细胞 上 的 分 布 (图 30-3)。 把 单个 通道 重 组 到 平面 双 分 子 层 , 用 单 染 料 跟踪 法 (SDT) 可 了 解 其 动态 过 程 (图 30-4B), 结 合 电流 变化 的 测量 (图 30-4C), 则 能 了 解 通道 的 开放 与 闭合 (Ishijima et al. 2001) 。 目 前 , 关 于 Ca 通道 在 活 细胞 上 的 成 像 引起 人 们 关注 (Harms et al.2001 ) , 对 短 杆菌 肽 (gramicidin) 在 膜 中 的 研究 (Borisenko et al.2003) , 澄 清 了 该 肽 在 膜 内 二 聚 化 的 几率 与 功能 意义 。 30.2.4 脂 微 区 的 研究 NE | 细胞 膜 脂 微 区 〈 包 括 脂 徐 与 质 膜 微 吉 ) 的 研究 近 到 极 大 重视 , 这 不 仅 因 为 它 们 富 含 胆 国 醇 、 鞘 脂 类 以 及 与 信号 转 导 有 关 的 蛋白 质 , .结构 与 功能 都 还 很 不 清楚 , 而 且 和 一 些 重要 疾病 , Wa, SAE Ea REE ELF < 系 有 关 。Schiitz 等 (2000 a) 用 Cys 标 ; 也 和 脂 DMPE, 应 用 单 粒 子 跟踪 法 (SPT) 可 其 插 入 人 寺 状 动脉 平 请 肌 细 胞 后 的 有 [ 广 散 或 定向 缓慢 移动 及 转动 , 而 标记 于 不 饱 DOPE 则 见 其 在 膜 上 自由 扩散 , 380 22 cnts/pxl A 离子 通道 Ee Pe 脉 脂 糖 盖 玻 片 B 3 um B. a C | rare eterno mene 0 100 200 300 N |e 荧光 强度 (cnts) 500 ms BEDS) K 通道 在 细胞 表面 的 分 布 单 离子 通道 的 电学 与 光学 同时 测量 ( 引 自 Schiitz et al. 2000b ) (5| A Zlatonova et al. 2000) 可 见 微 区 中 富 含 饱和 脂 。Zacharias 等 (2002) 进 一 步 用 奖 光 共振 能 量 转移 方法 对 表达 在 细胞 膜 上 但 标记 不 同 的 绿色 荧光 蛋白 进行 研究 , 证 明 它 们 聚集 在 几 十 纳米 的 小 范围 内 。 减 少 胆固醇 含量 将 影响 其 聚集 , 为 这 一 领域 的 研究 提供 了 今后 这 入 开展 的 条 件 。 最 近 从 老年 Fai REN AB 有 蛋白、 胶 蛋 白 和 HIV-1 糖 蛋 白 中 检测 出 一 种 共同 的 鞘 磷脂 结合 微 区 (Mahfoud et al. 2002) , 表 明 膜 整合 蛋白 与 外 周 蛋 白 可 与 脂 相互 作 用 , 从 核心 脂 徐 组 成 更 大 的 微 区 。 这 对 上 述 疾病 机 制 的 研究 提供 了 很 大 帮助 。 30.2.5 ”病毒 样 村 子 进入 细胞 过 程 的 研究 有 病毒 、 微 生物 以 及 其 他 纳米 颗粒 与 细胞 的 相互 作用 不 仅 与 膜 有 关 , 而 且 帝 入 到 细胞 内 部 , 是 单 分 子 研究 可 以 发 挥 作 用 的 领域 。 在 这 方面 ,2001 年 Seisenberger 等 的 工作 是 一 个 很 好 的 开端 ,他 们 用 单 粒子 跟踪 法 研究 了 腺 相关 病毒 (AAV) 感 染 活 HeLa AHA. | 30-5 用 相差 显微镜 同时 拍摄 细胞 像 , 以 便于 观察 革 光 标记 的 病毒 的 运动 及 其 与 细胞 的 关系 。 从 对 粒子 运动 的 分 析 , 可 知 病毒 粒子 需 连 续 碰 撞 细 胞 膜 表 ,,, 然 后 快速 内 吞 , 在 胞 浆 与 细胞 核 内 都 有 自由 的 ” 好 常 的 扩散 , 在 胞 浆 的 马达 蛋白 图 ~ Jase Wu yr Pete LI Z4- 二 \ 一 一 、 ee BE VUE Hela A 与 核 内 管状 结构 上 THEM). AIL, Gorelik 等 (5| Seis onberger et al. 2001 ) 381 8 30 # ARENT BA FIRE (2002) 用 他 们 设计 的 扫描 表面 共聚 焦 显 微 术 (SSCM) 研 究 了 单个 多 瘤 样 病毒 粒子 (VLP) 进 入 细胞 的 过 程 ,这 一 技术 实际 上 是 扫描 离子 电导 显 微 术 (Scanning ion conductance microscopy , SICM) 和 扫描 共聚 焦 显 微 术 (scanning confocal microscopy,SCM) 的 结合 , 从 他 们 的 研究 可 以 看 到 粒子 以 类 似 于 质 膜 微 吉 或 胞 饮 圳 泡 的 形式 进入 细胞 。 这 类 研究 为 药物 作用 与 病 毒 引 起 的 疾病 防治 提供 了 有 意义 的 条 件 , 因为 如 果 一 种 药物 或 一 种 对 细胞 表面 的 处 理 办 法 能 从 单 分 子 水 平 观 察 到 病毒 不 能 进入 (或 难以 进入 ) 细胞 , 将 可 能 是 一 种 有 效 的 防治 从 以 上 几 个 例子 , 可 以 看 出 单 分 子 研 究 应 用 于 生物 膜 的 一 些 概 狐 。 应 该 指出 , 单 分 子 研究 还 处 于 刚刚 开始 的 阶段 ,无论 是 技术 或 研究 课题 都 有 待 深 入 发 展 , 但 是 它 的 前 景 应 是 可 以 预期 的 。 单 分 子 研究 不 仅 能 应 用 于 分 子 、 人 工 膜 与 生物 膜 , 而 且 已 经 扩大 到 了 活 细 胞 , 这 就 为 了 解 细胞 内 进行 的 过 程 机 制 创 造 了 条 件 , 也 为 干扰 这 些 过 程 提供 了 新 思路 。 〈 林 克 椿 ) Borisenko V, Loughead T, Hesse J, et al. 2003. Simultaneous optical and electrical recording of single gramicidin channels. Biophys J, 84: 612-622 Gorelik J, Shevchuk A, Ramalho M, et al. 2002. Scanning surface confocal microscopy for simultaneous topographical and fluorescence imaging: application to single virus-like particle entry into a cell. PNAS USA, 99: 16018-16023 Harms GS, Cognet L, Lommerse PH, et al. 2001. Single-molecule imaging of L-type Ca** channels in living cells. Biophys J, 81: 2639-2645 Ishijima A, Yanagida T. 2001. Single molecule nanobioscience. TIBS, 26: 438-444 Mahfoud R, Garmy N, Maresca M, et al. 2002. Identification of a common sphingolipid-binding domain in Alzheimer, prion and HIV-1 proteins. J Biol Chem, 277: 11292-11296 Oesterhelt F, Oesterhelt D, Pfeiffer M, et al. 2000. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science, 288: 143- 146 Sako Y, Ichinose J, Morimatsu M, et al. 2003. Optical imaging: from living tissues to a single molecule, single molecule visualization of cell signaling processes of epidermal growth factor receptor. J Pharmacol Sci, 93: 253-258 Schiitz GJ, Kada G, Pastushenko VP, et al. 2000a. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. EMBO J, 19: 892-901 Schiitz GJ, Pastushenko VP, Gruber HJ, et al. 2000b. 3D imaging of individual ion channels in live cells at 40nm resolution. Single Molecules, 1: 25-31 Schiitz GJ, Sonnleitner M, Schindler H. 2000c. Single molecule microscopy of biomembranes. Mol Memb Biol, 17: 17-29 Seisenberger G, Reid MU, Endress T, et al. 2001. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno- associated virus. Science, 294: 1929 Zacharias DA, Violin JD, Newton AC, et al. 2002. Partitioning of lipid-modified monomeric GPFs into membrane microdomains of living cells. Science, 296: 913-916 Zlatonova J, Lidsay SM, Leuba SH. 2000. Single molecule force spectroscopy in | y using atomic force spectroscopy. Prog Biophys Mol Biol, 74: 37-61 bey 章 FE OH A SY pe es AR SE 31.1 hee =< 5b, ee 382 31.1.1 CRF ays BRASS .......-22-200ececeeeessecesas ts eee 383 31.1.2 首 分 子 层 膜 的 基 未 性 质 和 研究 方 范 全 和 385 S013 “国体 表面 支撑 膜 ecccecevecsee-soceeroeecensnersque serene ena 388 31.2 ”平面 脂 双 层 〈 黑 脂 膜 六 技术 390 B02.) EPRI HE IC PRES. cnecseeccvesoecesuceeoseersonscessvenee tees 390 BADD - Se ee A r,s vnncncas sex viuls casonexpeeessenunccene ea 391 31.2.3, 平面 脂 双 尼 的 制备 二 393 B38, ARBRE csc cress cases seccotnvs cers avassvovardsensdennesie Sena eas CE ph: Ce: 31.3.2 二 脂 蛋 让 体重 组 .下 397 于 生物 膜 的 复杂 性 ,我 们 通 向 需要 将 其 各 个 组 分 分 离 重组 , 分 别 进 行 研究 。 比 如 , 将 其 中 的 磷脂 组 分 提取 出 来 , 在 离 体 条 件 下 将 其 组 装 成 各 种 模型 膜 系统 来 模拟 生物 膜 ( 隋 森 芳 2003, 刘 文 龙 等 1989, 张 灵芝 1998) , 这 包括 脂 单 分 子 层 、 平 面 脂 双 层 以 3 NE 及 封闭 的 球 型 脂 双 层 (IR) 等 。 我 们 也 经 常 将 生物 膜 上 的 蛋 HUBER «=| 白 进行 分 离 纯化 , 并 在 离 体 条 件 下 重组 到 这 些 模型 膜 系统 中 , 进 而 对 其 生理 功能 进行 研究 。 利 用 模型 膜 进行 离 体 研 究 的 目的 是 弄 Reale tama 清 生 物 膜 各 个 组 分 的 功能 及 其 相互 作用 , 并 最 终 使 我 们 揭示 整个 生物 膜 行使 生理 功能 的 机 制 。 本 章 将 介绍 各 种 模型 膜 的 制备 技术 及 其 相应 的 研究 方法 。 SLT RINT. eee 20 世 纪 20 年 代 , 美 国 纽约 通用 电气 公司 的 Langmuir 建立 了 完整 的 单 层 膜 理论 , 并 将 气 液 嘲 面 单 层 膜 的 概念 推广 到 了 被 固体 吸附 的 气体 或 液体 〈 这 个 理 :后 来 使 他 获得 了 诺 贝 尔 奖 ) 。 Langmuir 在 气 液 界 面 上 开展 了 - 系列 实验 ,主要 利用 膜 天 平 研究 各 肪 酸 盐分 子 的 形状 . 大 小 以 及 , 气 液 界面 上 的 有 序 性 (Langmuir 383 $318 AEN FEAT AIR A 1917)。 早 在 19204F, Langmuir 就 报道 了 把 这 类 分 子 从 气 液 界面 转移 到 固体 底 物 上 的 实 验 (Langmuir 1920), 但 更 详细 地 描述 这 种 单 层 膜 转移 技术 的 报告 是 在 十 几 年 后 由 他 的 学 生 Blodgett 给 出 的 (Blodgett 1935)。 因 此 这 种 由 气 洲 界面 上 的 单 层 膜 转移 到 固体 表面 上 装 配 成 的 沽 膜 后 来 被 称 为 LB 膜 (LangmuirBlodgett membrane), 而 气 液 界面 的 单 层 膜 通 党 被 称 为 Langmuir 单 层 膜 。 1925 年 ,Gorter 和 Grendel 利用 Langmuir 单 分 子 层 技术 调 定 红细胞 膜 的 总 面积 。 由 于 红细胞 役 有 内 膜 , 在 溶血 之 后 只 剩 下 一 层 膜 外 壳 , 称 血 影 (ghost)。 他 们 把 抽 提 出 的 细 胞 膜 溶 于 有 机 溶剂 然后 铺展 成 单 分 子 层 。 他 们 发 现 该 单 分 子 层 的 面积 大 致 等 于 原来 红 细 胞 表面 积 的 两 倍 , 因此 他 们 提出 细胞 膜 是 由 双 层 脂 类 分 子 组 成 的 。Gorter 和 Grendel 的 工 作 可 以 算是 单 层 膜 在 生物 学 中 的 早期 应 用 。 形成 生物 膜 脂 双 层 结构 的 主要 成 分 是 磷脂 和 胆固醇 ,它们 都 是 兼 性 分 子 , 具有 极 性 的 杀 水 头 部 和 非 极 性 的 玻 水 尾部 , 可 以 在 气 液 界 面 上 自发 形成 脂 单 层 。 许 多 科学 家 认为 二 维 脂 类 单 分 子 膜 可 以 看 成 是 生物 膜 的 一 个 单 层 , 是 研究 生物 膜 结构 性 质 的 一 个 理想 的 RH AS. Shama RHA, FRAN. He. ARE CBR) 等 条 件 都 可 以 严格 加 以 控制 , 可 以 分 别 模拟 生物 膜 的 内 层 或 外 层 的 条 件 。 蛋 白质 和 糖 类 等 各 种 生物 大 分 子 〈 如 酶 、 抗 体 、 受 体 、 离 子 通道 等 ) 可 以 灸 和 怠 到 单 分 子 层 中 , 亚 相 中 也 可 以 加 入 各 种 离子 模拟 细胞 膜 的 内 外 环境 , 因 此 , 单 层 膜 给 我 们 提供 了 一 个 几乎 完全 可 以 控制 的 研 究 生 物 膜 多 种 性 质 的 人 工 模拟 系统 。 31.11 "CBT TS Fes / gm 1. Langmuir 膜 天 平 在 开始 介绍 单 分 子 层 技术 之 前 , 我 们 必须 先 介绍 一 下 单 分 子 层 实 验 的 必 备 仪器 一 一 Langmuir 膜 天 平 。 图 31-1 是 一 个 经 典 的 LB 膜 天 平 的 模式 图 。 在 一 个 惰性 材料 (如 聚 四 氟 乙 烯 ) 制 成 的 瀛 盘 K 中 用 水 ( 亚 相 ) 装 满 至 边缘 ,XX 是 放 在 水 面 上 的 挡 片 , 同 样 是 用 情 性 材料 制 成 , 可 以 在 水 面 上 移动 。 挡 片 和 盘 的 边缘 围 成 一 个 面积 连续 可 变 的 封 闲 水 域 XXAA。B 是 一 个 表面 张力 计 。 使 用 时 ,LB 膜 就 在 XXAA 水 域 上 铺展 ,表面 压 的 变化 由 表面 张力 传感器 B 检测 。 See FORA LB 膜 天 平 :意图 See 物 膜 Biomembranes 384 利用 Langmnuir 膜 天 平 最 大 的 作用 是 表面 膜 压 的 测定 。 由 于 气 液 界面 上 单 分 子 层 的 存 在 , 使 亚 相 的 表面 张力 由 为 降低 为 yY 定义 表面 膜 压 A: ia oma Thre ge Hs Bis FY Ta] AY 22 fake BY DE TR Re AY PB RR OAS a OP Ein 条 件 下 改变 挡 板 的 位 置 , 并 记录 式 的 变化 , 以 并 对 分 子平 均 面 积 4 作 图 , 得 到 单 层 膜 的 m-A 曲线, 不 同 分子 的 未 4 曲线 不 一 样 , 丈 4 曲线 可 以 视 作 单 分 子 层 的 特征 曲线 。 2. Langmuir 膜 的 制备 某 些 有 机 物质 , 当 放 入 水 的 表面 时 , 有 具有 在 气 液 界 面 上 形成 单 分 子 汰 膜 的 能 力 , 最 典型 的 有 机 化 合 物 的 例子 就 是 硬 脂 酸 , 即 十 八 烷 酸 。 这 类 材料 都 是 两 嗜 性 分 子 或 称 为 兼 性 分 子 , 即 分 子 的 一 头 是 亲 水 基 团 , 如 硬 脂 酸 的 羧基 〈 一 COOH) 溶 于 水 , 分 子 的 另 一 头 是 距 水 的 烷 基 长 链 , 如 硬 脂 酸 的 CH: (CHa) 不溶 水 , 是 亲 油 的 , 在 气 液 界面 上 朝向 空 气 。 事 实 上 凡是 具有 上 述 性 质 的 分 子 , 如 磷脂 、 胆 固 醇 、 某 些 蛋 白质 以 及 人 工 合成 的 许 多 两 性 分 子 , 都 可 以 形成 单 分 子 层 。 分 子 的 形状 和 极 性 对 所 形成 的 单 分 子 层 膜 的 稳定 性 有 很 大 的 影响 (Roberts 1985)。 为 了 得 到 一 个 单 分 子 膜 , 待 成 膜 材料 必须 首先 溶解 于 一 种 适当 的 溶剂 中 , 而 溶剂 必 须 能 够 溶解 适当 数量 的 单 分 子 材 料 , 即 具 有 展 好 的 溶解 度 。 溶 剂 是 用 来 扩展 单 分 子 层 的 , 所 以 它 同 单 分 子 材 料 不 能 起 化 学 反应 , 当 然 也 不 能 与 亚 相 咨 液 互 溶 。 溶 剂 要 有 很 好 的 易 挥发 性 , 以 至 于 丝毫 也 不 残留 在 凝聚 的 单 分 子 压缩 层 内 , 党 用 的 溶剂 有 三 氯 甲烷 、 正 已 Wee o TA RAE IT ie 7 re EY BIT AK eA LE . PE Ay IAB RE (如 离子 浓度 、pH 值 等 ) 会 大 大 影响 单 分 子 层 的 特性 。 滴 在 液体 亚 相 表面 上 的 溶液 立即 向 外 扩展 , 在 这 扩展 过 程 中 有 机 溶剂 挥发 掉 , 留 下 无 序 分 布 的 兼 性 分 子 , 此 时 邻近 分 子 之 间 平 均 间 隔 比 较 大 ,有 几 个 分 子 长 ,, 层 内 分 子 之 间 互 相 作 用 力 很 弱 , 表面 压 为 0。 减 少 漂浮 层 有 效 面积 或 继续 滴 加 单 分 子 材料 可 以 增加 表面 分 子 密度 , 当 密 度 达 到 某 一 临界 值 后 表面 压 将 发 生 明 显 变化 。 3. Langmuir-Blodgett fz 气 液 界面 的 单 分 子 膜 能 用 多 种 不 同 的 方法 转移 到 固体 衬 底 上 。 最 常用 的 方法 就 是 Langmuir-Blodgett 沉积 技术 , 这 种 技术 是 在 保持 单 分 子 层 表面 压 不 变 的 情况 下 , 让 固态 衬 底 片 〈 如 硅 片 或 玻璃 片 ) 往返 穿 过 单 分 子 层 与 水 的 界面 , 将 分 子 膜 逐 层 转移 到 固体 表 if. 转移 的 方法 有 两 种 : 垂直 提 拉 法 和 水 平 提 拉 法 。 垂直 提 拉 法 是 将 单 层 膜 保 持 在 一 定 压 力 下 , 用 事先 处 理 好 的 固体 载 片 沿 着 垂直 方向 缓慢 地 伸 和 信和 提 拉 出 亚 相 , 单 层 膜 就 会 被 连续 地 转移 到 固体 表面 上 (图 31-2), 这 种 方法 提 拉 多 层 膜 很 方便 , 但 单 层 膜 的 结构 性 质 在 转移 过 程 中 有 可 能 发 生变 化 。 单 层 膜 表面 压 力 较 低 , 或 与 国体 载 片 之 间 吸 附 性 较 差 时 , 不 宜 用 这 种 方法 , 而 应 该 用 水 平 提 拉 法 。 水 平 提 拉 法 是 将 表面 经 过 芷 水 处 理 的 载 请 水 平地 放 在 亚 相 上 , 使 单 层 膜 同 时 吸附 转 FEE A) > | (图 31-3) 。 这 种 方法 的 优点 是 可 以 保持 单 己 膜 在 气 液 界面 上 的 形态 , 但 是 不 Pret. Zs) We, 无 论 用 aA. BOP tea AOCARAY LB 膜 的 性 质 。 提 拉 312 AE Popa FEAT RAYA wb WWW boo A wuuuuuuuuwZJp___—- «Ys Y wool _ 水 平 提 拉 法 制备 LB 膜 的 示意 图 的 速度 和 气 液 界面 单 层 膜 的 质量 也 很 重要 。 在 亚 相 中 加 入 适当 的 离子 , 可 以 提高 单 层 膜 的 稳定 性 , 有 利于 提 拉 多 层 LB 膜 。 3112 0 By PSN AS ASE) FV 75 55 _ mma FCF ri LA Be HB EB BEI 有 一 个 分 子 大 小 ,与 其 表面 积 相 比 可 以 忽略 不 计 , 我 们 可 以 把 它 看 成 一 个 二 维 系统 。 单 分 子 层 的 行为 有 时 像 二 维 空间 的 气态 , 有 时 像 二 维 空间 的 液态 或 固 态 。 因 为 单 分 子 层 除 了 层 内 分 子 间 的 相 互 作 用 之 外 , 还 有 层 内 分 子 与 底部 亚 相 中 的 液体 分 子 乙 间 的 相互 作用 ,这 就 使 得 单 层 膜 可 能 出 现 一 些 三 维系 统 未 发 现 过 的 特殊 的 中 间 状 态 。 1. 单 分 子 层 的 r-A Sink 单 分 子 层 的 表面 压力 一 面积 等 温 线 类 似 于 三 维 物质 的 压力 (已 ) 一 体积 ( 门 等 温 线 , 是 反映 单 分 子 层 性 质 的 特征 函数 。 图 31-4 是 一 条 总 结 了 单 层 膜 的 各 种 现象 的 综合 性 A 等 温 线 示 意图 。 要 注意 这 并 ”是 一 张 真实 的 实验 数据 , 图 中 的 坐 本 作成 比例 , 目 的 是 为 了 把 所 有 Tt/(mN/m) 一 > j~5S0 50~100 ~1000 面积 /(A VF) 气 - 单 分 子 层 的 nA 曲线 示意 图 G 段 单 层 膜 表现 > L-G 段 是 单 层 膜 的 气相 和 液 相 平衡 共 存 区 。 工 段 单 层 胖 YAH. M 段 是 固态 /液态 共存 区 。 固 液 SAK Zia, \ 压 缩 性 很 差 的 固 相 区 S, RRS, 段 之 间 的 拐点 表明 单 生 了 国 态 一 固态 相 变 。S: 段 的 斜率 代表 分 子 本 身 的 可 压缩 性 HK hy WR Biomembranes 386 的 特征 都 包括 进去 。 这 些 特征 并 不 是 总 能 同时 观察 到 , 它 与 单 层 膜 分 子 种 类 、 亚 相 特征 及 所 处 的 温度 等 环境 因素 有 关 。 (1) 当 分 子 的 平均 面积 4 很 大 时 ,表面 压 很 低 , 单 层 膜 表 现 为 气态 , 即 图 中 的 G 段 , 其 特征 是 有 一 个 渐 近 极限 a 0, 分 子 间 距离 很 大 , 非 极 性 的 尾 链 平 躺 在 亚 相 上 ,, 分子 间 的 相互 作用 可 以 忽略 不 计 。 和 理想 气体 定律 相当 的 二 维 状态 方程 是 : 7TC4=Kk7 (2) 分 子平 均 面 积 逐 潮 减 小 , 单 层 膜 进 入 一 个 压缩 性 很 好 的 区 域 , 赤 4 曲 线 几 乎 是 水 FH), 即 图 中 的 L-G 段 ,z 值 大 约 只 有 零点 几 个 mN/m,, 这 是 单 层 膜 的 气相 和 裕 相 平衡 共 存 区 。 在 气相 的 分 子 中 间 出 现 了 分 子 相 互 接触 的 液态 畴 区 。 (3) 继续 压缩 , 单 层 膜 的 表面 压 又 开始 上 升 , 单 层 膜 进入 了 液 相 , 即 图 中 的 工段 ,, He 分 子 之 间 的 相互 作用 已 不 能 忽略 , 其 状态 方程 一 般 用 下 面 方程 描述 : m(A 一 40)=k7 式 中 ,4o 是 一 个 常数 , 相 当 于 分 子 的 有 效 截 面积 。 (4) 进一步 压缩 单 层 膜 , 克 4 曲线 又 进入 一 个 平台 区 , 即 图 中 的 M 段 , 这 是 分 子 的 固态 /液态 共存 区 , 在 液态 分 子 中 开始 出 现 了 分 子 尾 链 直立 、 排 布 紧密 的 固态 畴 区 。 (5) 固 液 共存 区 之 后 , 单 层 膜 进入 压缩 性 很 差 的 固 相 区 , 关 4 曲线 的 斜率 很 大 ,, 即 图 HAYS, 段 。 进 一 步 升 高 表面 压 , 秋 4 RAT, BERR EK, WEAR 的 S 段 ,一般 认为 拐点 处 单 层 膜 发 生 了 固态 一 固态 相 变 , 二 维 固态 分 子 的 排列 方式 发 生 了 变化 , 进 入 更 密集 的 状态 。 这 时 A 曲线 的 斜率 代表 着 分 子 本 身 的 可 压缩 性 。 如 将 S$, 段 延长 到 天 0 处 , 即 图 中 的 4 点, 可 以 得 到 膜 分 子 的 截面 积 。 (6) 再 压缩 单 层 膜 , 表 面 压 就 会 突然 下 降 , 单 层 膜 分 子 发 生 了 重 登 而 月 误 。 不 同 单 层 膜 崩溃 的 表面 压 不 同 , 分 子 的 尾 链 越 长 , 骨 溃 压 力 越 高 。 骨 溃 压 还 与 膜 天 平 的 稳定 性 以 及 亚 相 的 性 质 有 关 。 2. 蛋白 自发 插 膜 的 mt 曲线 按照 前 面 提 到 的 方法 在 气 液 界 面 上 铺展 一 层 脂 类 单 层 膜 , 而 后 在 亚 相 中 加 入 一 定量 的 蛋白 , 许 多 蛋白 都 能 和 磷脂 膜 发 生 作 用 而 插入 膜 内 , 从 而 引起 膜 表 面 压 的 变化 ,通过 测量 加 入 蛋白 后 膜 表 面 压 随 时 间 的 变化 , 可 以 获得 蛋白 自发 插 膜 的 信息 。 这 可 以 通过 我 们 前 面 介绍 的 Langmuir 膜 天 平 测量 出 来 , 也 可 以 设计 小 的 单 层 膜 槽 专门 用 于 蛋白 播 膜 的 WE (131-5). FAP ic tee ae A pe ee i) Be a 实验 装置 习 定 面积 单 分 子 膜 槽 (a) FAK fees (b. 传感器 探 c. 传感器 测量 计 ,d. 显示 屏 ) 构成 387 S318 AEH RET FEAT PLR ASR 图 31-6 显示 的 是 载 脂 蛋白 H (ApoH) 插入 DPPS 单 层 膜 的 赤 : 曲 线 。 图 中 两 条 曲线 所 对 应 的 初始 膜 压 (2) 值 分 别 为 20.0 和 15.0 mN/m。 当 Fr 稳定 后 , 将 ApoH 注入 亚 相 至 终 浓度 为 50 nmol 岂 (箭头 示 出 )。 从 图 中 的 曲线 我 们 可 以 看 出 对 任意 一 个 初始 膜 压 值 , 注入 的 ApoH 都 能 导致 体系 表面 膜 压 的 升 高 。 作 为 对 照 , 当 仅 往 亚 相 注 入 样品 缓冲 液 时 体系 的 表面 膜 压 没有 任何 改变 (结果 未 示 出 )。 从 图 31.6 的 曲线 中 还 可 以 看 到 , 1 随 着 ApoH 的 注入 ,体系 的 表面 膜 压 先 有 一 个 较 ee Whe 快 的 上 升 , 然后 逐渐 在 2h 之 内 达到 平衡 。 这 些 结 果 表 明 ,ApoH 能 与 负电 磅 脂 膜 发 生 作 用 , 并 很 重 白 插入 脂 单 层 膜 的 m+ 曲线 快 地 插入 到 磷脂 膜 中 去 (Wang et al. 1999), 3. BARR ARAB EMME 蛋白 质 与 单 分 子 层 作用 的 插 膜 能 力 依赖 于 单 分 子 层 的 物理 状态 , 随 着 单 分 子 层 初始 膜 压 的 升 高 , 蛋 白质 与 单 分 子 层 作用 导致 的 膜 压 上 升值 将 减少 。 在 溶液 中 ,蛋白 质 浓度 一 定 的 条 件 下 , 对 应 不 同 的 单 分 子 层 初始 表面 膜 压 五 , 利 用 上 面 的 插 膜 实验 将 得 到 一 组 相应 的 表面 膜 压 升 高 值 Ar, 五 与 Az 拟 合 呈 线性 关系 , 并 可 用 下 式 描述 ; An=k(7, — 7) 式 中 ,去 定义 为 临界 插 膜 压 (Briggs et al. 1985)。 该 值 的 物理 意义 是 单 分 子 层 的 表面 膜 压 一 日 超过 这 个 值 , 蛋 白 便 不 能 插入 膜 内 。 元 的 大 小 可 定量 反映 蛋白 插 膜 能 力 的 强 弱 。 由 于 封闭 脂 双 层 的 膜 压 一 般 在 32 mN/m 左右 , 因 此 实验 中 我 们 对 那些 临界 插 膜 压 超过 30 mN/m 的 蛋白 特别 关注 , 认 为 它们 有 可 能 生理 条 件 下 自发 插入 膜 中 。 10.0 图 31-7 给 出 终 谊 度 为 S0 nmol/L 的 ApoH 插入 DPPC、DPPS、DPPG 和 CEL 单 层 膜 的 Ar 25.0 7/(mN/m) to So o 一 五 曲线 。 可 以 很 清楚 地 看 出 , ApoH 插 入 负 E 电荷 单 层 膜 的 能 力 显著 强 于 插入 中 性 磷脂 膜 瑟瑟 > 人 时 , 由 于 磷脂 膜 对 光 的 吸收 很 强 ,, 致使 第 二 道 反射 光 〈( 即 进入 磷脂 膜 内 又 经 膜 / 水 界面 反射 的 光线 ) 很 弱 , 此 时 显微镜 中 观察 到 的 主要 是 第 一 道 反射 光 (不 进 入 磷脂 膜 内 直接 在 水 / 膜 界面 反射 的 反射 光 ), 因此 光线 颜色 和 入 射 光 同 , 即 为 白色 光 ; 随 着 磷脂 膜 逐 渐变 清 , 一 方面 由 于 磷脂 膜 对 光线 的 吸收 变 弱 , 致使 第 二 道 反 射 光 强度 与 第 一 道 可 比 , 另 一 方面 , 这 两 束 光 构成 了 相干 光 , 根据 光路 分 析 我 们 可 以 知道 , 这 两 束 光 的 位 相差 由 两 部 分 构成 , 一 部 分 由 第 二 道 反 射 光 在 磷脂 膜 内 多 经 过 一 段 光 程 造成 , 根据 几何 分 析 我 们 可 以 知道 这 部 分 位 相差 为 ; 4nD/Asina Sich, DWREIGHRIVIEHE, AEIeaRK, A, 位 相差 的 另 一 部 分 由 光线 在 膜 /水 界面 — 上 反射 造成 , 因为 这 是 一 个 由 光 密 物质 到 光 距 物质 界面 上 的 反射 , 因 此 将 造成 区 的 位 相 延迟 , 这 样 两 束 光 线 总 的 位 相差 为 , F 4nD/Asina + 1 显然 我 们 所 以 看 到 这 样 在 特定 的 情况 下 , 各 个 波长 光 :3 于 涉 情况 不 一 。 例 如 当 D/A, sina AOS A RCT, RES BCE A, ADB IE BB 显 微 观察 黑 脂 膜 光 路 分 析 392 干涉 相 消 , 致 使 磷脂 膜 呈 现 该 波长 光 颜 色 的 补 色 。 随 着 磷脂 膜 的 进一步 变 薄 , 由 于 我 们 知道 脂 双 层 的 厚度 大 约 在 Snm 左 右 , 比 可 见 光 波长 (380~780nm) 要 小 很 多 , 这 样 就 造成 位 相差 的 前 一 项 接近 于 零 , 因 此 对 任何 波长 的 光 ,, 第 一 和 第 二 道 反射 光 的 位 相差 均 为 r, 再 加 上 此 时 膜 极 薄 ,, 基 本 上 对 光 没 有 吸收 , ACPA RICHTER, Ale RTA, SORIA, Ai PMR ARE. 因此 , 当 磷脂 膜 的 厚度 很 王 时 , 即 为 双 分 子 层 时 , 在 显微镜 下 呈现 黑色。 根据 这 种 直观 的 现象 , 我 们 把 这 种 平面 脂 双 分 子 层 叫做 “ 墨 脂 膜 ” 。 用 白光 入 射 BLM, 根 据 反射 光 的 颜色 可 大 致 判断 膜 的 厚度 , 归 纳 如 表 31-1。 厚度 从 厚度 人 A 25 0~50 红色 360 一 400 银色 50~100 蓝 色 400 一 430 棕色 100 一 200 绿色 430 一 500 红色 200 一 280 黄色 500 一 550 蓝 色 280 一 300 红色 550 一 600 300 一 360 了 解 了 关于 BLM 的 基本 理论 知识 , 我 们 现在 开始 讨论 具体 的 实验 方法 。 首先 我 们 要 了 解 怎 样 能 够 判断 已 经 形成 了 磷脂 双 分 子 层 。 事 实 上 , 前 面 已 经 提供 了 一 种 有 效 的 检测 BLM 形 成 的 方法 ,, 即 显微镜 观察 方法 , 除了 这 种 方法 , 我 们 还 经 常 使 用 另 一 种 更 加 定量 的 方法 , 即 电 检 测 方 法 。 如 图 31-13, 在 BLM 成 膜 池 的 两 端 外 加 一 电压 信号 , 并 将 参考 电极 接地 置 电 位 为 O, 测量 工作 电极 端 电位 和 电路 中 的 电流 , 则 电路 可 等 效 为 右边 所 示 的 简单 电路 。 通 过 工作 电极 电位 和 电流 的 大 小 关系 ,我们 可 以 很 容易 地 求 出 成 膜 孔 上 磷脂 膜 的 电阻 以 及 电 BK. BLM 形成 的 电 检测 和 等 效 电路 根据 前 人 的 工作 经 验 , BLM 电 阻 测 量 的 重复 性 较 差 , 对 于 不 同 的 磷脂 , 不 同 的 工作 环境 , 测 出 来 的 值 在 数量 级 上 就 有 很 大 的 差异 , 变 化 范围 可 达 10*~ 10" 9 cm。 但 是 , 对 于 同一 公 BLM 而 言 , 当 成 膜 稳 定 后, 其 电阻 值 是 在 己 的 , 所 以 在 加 入 生物 活性 分 子 、 离子 等 引 走 为 膜 电 阻 变化 是 可 信 的 , 可 以 作为 衡量 药 ” 对 膜 影响 的 参数 。 电容 是 哗 脂 膜 的 另 一 个 重要 电 参 数 。 理 论 上 , 平板 1 容器 的 电容 大 小 与 膜 双 电 层 的 393 #312 Ae OREN FEATS ALBA 厚度 有 如 下 关系 : 式 中 ,Cm 是 BLM 的 电容 ,4 是 面积 ,8 是 介 电 常数 , 国 是 磷脂 膜 的 厚度 。 虽 然 实 际 上 测 得 电容 值 与 理论 值 会 有 一 定 的 差异 , 但 通过 电容 的 测量 来 计算 膜 厚 度 仍 不 失 为 一 个 简便 而 有 效 的 方法 。 根 据 文 献 报 道 , 卵 磷脂 BLM 的 电容 在 0.3 一 0.4 wF/em*, PC/ fli fal Aza PS/PE 测 出 的 电容 值 一 般 在 0.5~ 1hF/cm2。 一 般 可 以 认为 ,BLM 形成 后 , 其 电容 应 在 0.5UF/cm2 左右 , 这 个 电容 值 也 可 作为 BLM 是 否 形成 的 一 个 判 据 。 需要 指出 的 是 我 们 知道 磷脂 膜 电容 大 小 是 一 个 与 成 膜 面 积 相 关 的 值 , 而 这 里 的 面积 是 指 BLM 的 面积 , 这 并 不 是 成 膜 孔 的 面积 ,因为 我 们 知道 , 在 成 膜 孔 上 , 不 可 能 百分之百 的 面积 都 形成 磅 脂 双 分 子 层 。 在 成 膜 孔 上 的 磷脂 膜 的 结构 如 图 31-14 所 示 ,, 它 是 由 边缘 很 厚 的 P-G 边 界 (Plateau-Gibbs border) 支撑 , 逐 曾 过 湾 到 中 间 双 分 子 层 的 结构 。 因此 我 们 需要 用 测量 显微镜 首先 大 致 测 出 BLM 黑 色 区 域 大 小 , 然 后 根据 总 电容 大 小 计算 出 单位 面 积 电容 。 3123 7°17 (1 gm 1. 制备 BLM 的 脂 溶液 为 了 要 模拟 生物 膜 的 脂 组 分 ,多 数 研究 工作 的 BLM 是 从 需要 模拟 的 组 织 器 官 提取 的 BAS SSCP HSS. 用 得 较 多 的 有 从 脑 组 织 提 取 的 脂 , 胆固醇 、 氧 化 胆固醇 以 及 纯 的 PC、 PE, PS 等 由 于 氧化 胆固醇 制备 的 膜 在 相当 大 的 温度 范围 和 电介质 浓度 范围 内 是 极 稳定 的 ,所 以 许多 研究 是 用 氧化 胆固醇 制备 的 BLM。 氧 化 胆 国 醇 是 用 购买 的 重 结晶 胆固醇 深 于 正 丝 烷 中 , 在 沸点 时 通 以 氧气 使 之 氧化 制 得 , 所 得 无 色 溶液 即 可 直接 用 于 制备 BLM。 BLM 制备 液 中 如 含有 杂质 就 不 易 铺 制 出 BLM, 或 者 即使 铺 成 也 不 稳定 。 一 般 应 将 高 度 纯化 的 磷脂 溶 于 碳 氢 溶剂 , 例 如 癸 烷 、 辛 烷 、 苯 、 氧 仿 或 乙醇 等 。 有 时 也 用 嘻 烯 作 溶剂 ,因为 效 烯 会 在 BLM 形 成 过 程 中 被 排挤 出 来 , 使 BLM 成 为 无 溶剂 的 BLM, 这 种 BLM 更 接近 自然 生物 膜 的 基 架 。 一般 情况 下 溶剂 碳 氢 链 在 Ce~ Cx 间 较 适 宜 , 它们 在 室温 时 都 是 液态 , 极 少 溶 于 水 。 在 BLM 制备 液 中 的 脂 浓度 应 在 饱和 或 接近 饱和 的 状态 ,因为 脂 浓 度 如 过 稀 , 则 形成 的 BLM 界 面 压 小 , 不 足以 使 脂 分 子 排列 成 双 分 子 层 。 也 有 人 不 用 溶剂 而 直接 用 纯 脂 铺 成 BLM, 例 如 用 单 甘 油 酯 和 三 甘油 酯 各 于 合 物 制备 BLM, 双 层面 积 达 1.3mm2, 不 但 稳定 而 且 有 与 细胞 膜 相似 的 特征 电容 值 BLM 制备 液 中 的 脂 如 果 过 长 时 间 地 暴露 于 空气 上 由。 氧化 , 此 时 铺 制 BLM 就 较 困 难 , 甚 至 根本 无 法 铺 成 功 , 有 时 即使 铺 成 了 , 也 很 容 。” 汪 。 一 般 脑 砍 脂 溶 于 碳 氨 溶 齐 AY BLM * 备 膜 , 在 室温 下 只 可 暴露 于 空气 中 数 小 时 ,。 川 铺 制 就 困难 。 成 膜 孔 上 的 磷脂 膜 结构 394 2. xt#R BLM 的 铺 制 先 制备 一 个 有 机 玻璃 或 其 他 易于 清洗 材 料 的 实验 槽 ,中间 以 强 玻 水 性 的 聚 四 氟 乙 烯 作为 隔 板 (BLM 支持 物 ) 。 将 槽 隔 为 左右 两 个 相等 的 小 室 , 隔 板 中 间 预 先 开 一 小 圆 孔 , | 和 孔 的 面积 一 般 不 要 超过 0.25cm2。 在 制备 实验 槽 时 关键 是 要 使 隔 板 与 槽 身 胶合 严密 ,否则 测量 时 就 要 因 绝缘 性 不 佳 而 使 实验 无 法 进 行 。 覃 内 放 上 按 需 要 配制 的 溶液 , 把 小 孔 刘 没 。 然 后 把 一 泣 BLM 制 备 液 加 到 膜 支 持 物 的 毛 刷 法 铺 制 对 称 BLM 小 孔 下 方 (用 毛 刷 或 微量 注射 器 ) , 实验 装置 和 操作 如 图 31-15 所 示 。 由 于 聚 四 氟 乙 烯 具 有 良好 的 亲 脂 疏水 性 , 故 脂 较 容 易 附 在 小 孔 四 周 , 并 扩展 过 整个 小 孔 , 随 后 脂 滴 的 中 间 部 分 慢 慢 变 薄 , 最 后 成 为 双 分子 层 , 而 沿 着 小 孔 四 周 则 积 有 较 厚 的 脂 , 成 为 一 个 圈 , 它 对 BLM 起 支持 作用 , 此 即 前 面 提 到 的 P-G 边 界 。 脂 冯 在 小 孔 中 形 成 双 分 子 层 脂 膜 是 一 个 自发 的 渐变 过 程 。 通 过 前 面 介绍 的 光学 或 电学 方法 可 以 验证 双 分 子 层 是 否 已 经 形成 。 上 述 方法 制备 的 BLM,, 中 间 含 有 溶解 的 有 机 溶剂 , 双 层 分 子 左右 是 对 称 的 , 而 且 制 备 时 左右 二 室内 的 溶液 也 是 对 称 的 。 3. 由 单 层 合成 双 层 的 BLM 铺 制 法 (Szoka et al. 1980) 生物 膜 的 脂 双 层 是 内 外 不 对 称 的 , 膜 两 侧 的 溶液 成 分 也 是 不 对 称 的 , 为 了 更 好 地 模 拟 生 物 膜 , 人 工 脂 双 层 也 必须 能 达到 这 两 个 要 求 。 有 人 将 前 面 的 方法 加 以 改进 , 设 法 使 聚 四 氟 乙 烯 隔 板 可 以 上 下 移动 ,但 仍 能 保证 左右 两 侧 之 间 有 良好 的 绝缘 性 。 铺 制 时 先 将 隔 板 向 上 提起 , 使 小 孔 上 升 至 液 面 之 上 (由 于 小 孔 在 液 面 之 上 , 故 此 时 左右 二 室 的 溶液 可 以 不 对 称 ,, 譬如 一 室 中 为 NaCl 溶 液 而 另 一 室 中 为 KCl] 溶液 , 这 就 做 到 了 两 侧 溶 液 不 对 称 ) , 将 BLM 制 备 液 分 别 滴 一 滴 在 左右 两 侧 的 水 面 上 , 脂 即 在 水 面 上 扩展 为 脂 单 分 子 层 , 亲 水 端 在 水 溶液 中 , 玻 水 端 辐 空 气 。 如 果 在 两 侧 水 面 上 端的 是 不 同 的 脂 ( 例 如 一 侧 冯 PC , 另 一 侧 滴 PS) , 那 么 两 边 的 单 分 子 层 就 不 对 称 。 然 后 将 隔 板 向 下 移 , 由 于 隔 板 的 亲 脂 跤 水 特性 , 所 以 在 下 移 时 , 板 的 两 面 就 吸 住 了 脂 单 层 中 脂 分 子 的 玻 水 端 , 而 亲 水 端 仍 在 水 溶液 中 。 当 隔 板 的 小 孔 移 到 液 面 下 时 , 很 自然 地 在 小 孔 上 就 形成 了 双 分 子 脂 层 。 如 果 脂 溶剂 是 易 挥 发 的 , 这 样 形成 的 BLM 还 能 做 到 不 含有 机 溶剂 。 上 述 方 法 需要 移动 聚 四 氟 乙 烯 隔 板 , 可 以 改进 为 隔 板 固定 而 使 两 侧 溶 液 液 面 移动 的 办 法 由 二 单 层 合成 双 层 。 方 法 是 使 两 个 可 以 同步 推进 的 注射 器 与 聚 四 氟 乙 烯 隔 板 两 侧 的 溶液 连通 并 使 左右 液 面 保持 在 同一 水 平 上 。 同 步 推进 注射 器 ,使 两 侧 液 面 升 至 小 孔 下 方 2~3mm 处 。 在 两 侧 溶液 面 上 分 别 滴 加 BLM 制备 液 ,BLM 制备 液 在 液 面 扩展 为 单 分 子 层 , 此 时 再 使 二 注射 器 同步 推进 , 使 二 侧面 上 升 经 小 孔 而 达 小 孔 上 方 2 一 3mm 处 方才 停 止 。 当 两 侧 脂 单 层 上 升 经 过 小 孔 时 , 合 而 形成 脂 双 层 .整个 过 程 可 见 图 31-16。 由 单 层 会 合 而 成 双 层 在 理论 上 可 以 铺 制 两 侧 脂 分 寺 不 相同 的 BLM, 但 实际 上 是 难以 实现 的 。 加 为 铺 成 的 BLM 并 不 是 静止 不 动 的 , BURA) 分子 是 流动 的 , 两 侧 不 同 的 脂 分 子 在 P-G 边 呈 中 会 混合 在 一 起 , 而 P-G 边界 中 的 脂 分 子 “ 会 同 双 分 子 层 中 的 脂 分 子 通 过 395 31k AMON FEAT RARA EE ee —_— 液 面 上 升 法 制备 不 对 称 BLM 流动 而 进行 交换 的 , 最 后 在 BLM 中 的 脂 也 就 不 可 能 保持 不 对 称 了 。 但 是 这 种 方法 可 以 确 保 BLM 两 侧 溶 液 不 会 混合 , 因 而 可 以 进行 膜 两 侧 溶 液 不 对 称 时 的 各 种 研究 。 4. 在 滤纸 的 微 孔 中 形成 BLM 在 显微镜 下 观察 着 纸 , 可 以 看 到 上 面 有 许多 微 孔 。 有 人 把 着 纸 先 用 脂 浸泡 , 然 后 取 出 晾 二 ,这 样 兰 纸 就 具有 亲 脂 踊 水 特性 。 用 这 种 脂 处 理 过 的 滤纸 放 在 聚 四 氟 乙 烯 隔 板 的 部 位 取代 聚 四 氟 乙 烯 隔 板 (当然 要 有 特别 设计 的 夹具 , 把 滤纸 夹 在 左右 二 室 之 间 )。 然 后 用 前 面 介绍 的 方法 铺 制 BLM, 实 践 证 明 在 滤纸 的 许多 小 孔 上 都 形成 了 BLM, 只 是 每 个 BLM 的 面积 小 , 但 是 许多 小 面积 的 BLM 加 起 来 就 比 单个 “大 ” 孔 上 铺 成 的 BLM 还 大 。 有 人 用 另 一 种 方法 把 “大 ”和 孔 化 为 小 孔 ,, 方法 是 用 激光 打 孔 的 技术 将 聚 四 氟 乙 烯 隔 板 上 打上 许多 小 孔 ,, 这 些小 孔 的 面积 自然 比 站 纸 上 的 孔 大 , 所 以 用 这 种 方法 可 以 得 到 更 大 的 BLM 有 效 面 积 。 不 过 上 述 两 种 方法 形成 的 BLM 很 难保 证 每 个 小 孔 的 密闭 性 都 很 好 ,所 以 实质 上 是 带 有 通 透 性 的 BLM, 只 能 适用 某 些 实验 场合 。 313 TFBS 7 _ mmm 脂 质 体 (liposome), 或 称 豆 泡 ,是 由 脂 双 分 子 层 将 水 相 分 隔 为 内 、 外 两 部 分 的 模型 膜 体系 , 这 是 一 种 封闭 的 脂 双 层 结构 。 在 模型 膜 体系 中 , 脂 质 体 由 于 和 活 细胞 形式 最 为 接近 , 因 此 自从 20 世纪 60 年 代 中 期 以 来 ,在 生物 研究 中 得 到 了 广泛 应 用 。 特别 是 从 70 年 代 开始 ,人 们 注意 到 脂 质 体 可 用 作 药 物 等 多 种 分 — pein aC, 子 载体 , 从 而 具备 临床 诊断 、 治疗 的 应 用 潜力 , = | 6 因此 脂 质 体 研究 进入 了 生物 工程 领域 , 同 时 实 用 的 脂 质 体 商品 也 开始 出 现 ( 刘 文 龙 1989)。 3131 ISR ey Sp? $3 1, 多 层 脂 质 体 ee ne 当 将 磷脂 分 散 于 水 相 时 , 在 水 相 中 通常 y 会 出 现 脂 质 的 多 种 聚集 形式 , 如 单 体 、 微 团 . 脂 ek ie ii AN 生生 双 层 、 单 层 脂 质 体 、 多 层 脂 质 体 等 , 如 图 31-17 36ee ~o 所 示 。 其 ” 最 多 的 是 呈 同 心 球 壳 的 多 层 脂 质 体 i. (multi-la icllar vesicle,MLV) , 这 也 是 最 早 制 [ 水 相 中 脂 质 的 多 种 聚集 形式 396 得 的 脂 质 体 。 一 般 这 样 制备 的 多 层 脂 质 体 大 小 相当 不 均 义 , 一 般 在 0.2~lum, FMA 数 也 差别 很 大 , 几 层 到 十 数 层 都 有 可 能 。 制备 多 层 吉 泡 另 一 个 篆 用 的 方法 是 脱水 一 再 水 化 方法 。 首 先 将 脂 质 用 超声 分 散 于 水 相 中 , 并 加 入 待 包 庄 的 物质 ,然后 通 入 气 气 将 水 分 蒸发 掉 。 在 干燥 过 程 中 ,SUV 被 浓缩 , 彼此 融合 形成 多 片 层 的 平板 , 因 而 包 右 物质 将 夹 在 诸 请 层 之 间 , 待 干燥 完成 , 把 温 棉花 塞 人 试管 或 通 以 含水 汽 的 氮气 流 使 脂 质 再 度 水 化 。 此 时 , 多 片 层 刘 润 膨胀 , 形 成 大 的 圳 ia, 并 将 待 包 夺 物质 包 夺 起 来 。 此 时 加 入 溶液 , 将 训 合 物 振荡 分 散 即 可 得 到 包 奢 多 层 圳 泡 。 使 用 着 膜 过 着 还 可 以 对 面 泡 的 大 小 进行 分 选 。 此 方法 的 优点 是 包 右 率 极 高 ,对 DNA 分 子 能 达 S0%, 也 能 有 效 包 秦 蛋白 质 , 制 备 过 程 中 酶 活性 能 保持 近 90%, 但 此 法 不 太 适 er BUA F 2. 小 单 层 脂 质 体 将 上 述 得 到 的 多 层 脂 质 体 溶液 超声 处 理 , 在 超声 波 力 场 的 作用 下 , 赛 泡 破碎 并 重新 自发 组 合 , 这 时 将 得 到 直径 小 得 多 并 较 均 一 的 单 层 脂 质 体 结 构 , 作 为 小 单 层 脂 质 体 (small unilamellar vesicleg,SUV) , 其 直径 一 般 在 25 一 S0nm, 这 种 脂 质 体 由 于 制备 方法 简单 , 所 得 脂 质 体 单 层 均一 , 因 此 在 实验 中 得 到 了 广泛 应 用 。 通 常 制备 方法 如 下 : 将 溶 解 在 有 机 溶剂 中 的 磷脂 溶液 放 在 圆 底 小 烧瓶 中 使 用 损 气 吹 干 ,并 在 此 过 程 中 均匀 旋转 圆 底 烧瓶 , 使 最 后 磷脂 成 薄膜 均匀 贴 在 烧瓶 壁 上 , 再 用 真空 泵 或 旋转 莹 发 器 除去 残留 有 机 溶剂 ,完成 后 加 入 所 需 的 水 相 溶液 溶 涨 脂 质 泣 膜 , 之 后 , 将 脂 质 悬 序 液 用 探头 超声 或 水 浴 超 声 至 证 清 透 明 , 注意 处 理 时 温度 需 保 持 在 所 用 磷脂 的 相 变温 度 以 上 ; 超声 时 间 根 据 所 用 脂 质 、 超 声 方 法 的 不 同 而 不 同 , 一 般 探头 式 超声 激烈 得 多 , 只 需 几 分 钟 即 可 使 溶液 泪 清 ,而 使 用 水 浴 式 超声 经 常 需要 几 个 小 时 以 上 , 但 水 浴 超 声 由 于 更 容易 控 温 , 且 可 以 把 溶液 放 在 密闭 甚至 充气 气 的 容器 中 进行 , 可 以 防止 此 过 程 中 磷脂 的 氧化 ; 而 使 用 探头 超声 时 , 脂 质 体 溶 液 会 被 探头 金属 污染 , 并 且 此 过 程 会 产生 大 量 的 热 , 容易 使 样品 氧化 制备 好 的 脂 质 体 可 以 负 染 后 进行 电镜 观察 ,确定 脂 质 体 的 大 小 及 均一 程度 。 要 得 到 大 小 更 为 均一 的 脂 质 体 溶 液 , 可 将 超声 后 的 悬浮 液 经 过 凝 胶 过 让 。 制备 SUV 的 第 二 种 方法 是 将 脂 质 的 乙醇 溶液 快速 地 广 入 到 缓冲 液 中 , 随即 自发 形成 SUV。 一 般 使 用 脂 质 的 最 终 谊 度 为 3~30mmol, 形 成 的 吉 泡 直径 为 30~ 100nm。 这 种 方 法 可 避免 超声 损伤 , 且 人 简单 快速 , 但 所 得 脂 质 体 浓 度 非常 稀薄 , 最 好 再 使 用 其 他 方法 进 行 浓 缩 。 另 外 实验 中 引入 的 乙醇 也 需要 在 随后 的 纯化 阶段 去 除 。 第 三 种 方法 称 作 挤 排 靶 , 即 将 多 层 脂 质 体 悬 序 液 用 高 压 使 其 通过 一 个 French 滤器 , 实验 证 明 , 经 过 一 次 挤 排 , 且 序 液 中 将 含有 60% 的 SUV, 多 次 挤 排 后 可 得 到 大 小 均一 、 HELE 25 ~ 50nm 的 小 单 层 圳 泡 , 经 4 次 挤 排 后 SUV 含量 在 94% 左 右 。 此 方法 能 使 用 于 各 种 脂 质 , 操作 简便 , 重复 性 好 , 无 超声 损伤 且 不 ?| 入 有 机 杂质 , 目 前 得 到 了 广泛 应 用 , 并 已 有 商品 化 的 挤 排 装 置 出 售 。 3, 大 单 层 脂 质 体 大 单 层 脂 质 体 (large unilamellar vesicle, LUV) 是 :接近 活 细胞 体系 的 模拟 系统 , 而 且 可 以 具有 很 高 的 包 讲 率 , 因 此 最 有 研究 价值 。 但 是 六 证明, 相对 上 面 两 种 体系 MLV 和 SUV,,LUV 的 制备 难得 多 , 而 且 相 当 不 稳定 ,非常 不 纪 破 碎 。 尽 管 如 此 , 人 们 还 是 发 397 # 1H 生物 膜 研究 的 模型 膜 系统 展 了 多 种 方法 制备 LUV, 人 常用 的 有 注入 法 、 反 相 蒸发 法 等 。 将 非 极 性 溶剂 中 的 脂 质 溶 液 在 使 溶剂 能 挥发 的 条 件 下 注入 到 水 咨 液 中 , 溶液 中 的 溶 质 即 以 薄膜 的 形式 残留 在 气泡 和 液 相 的 界面 上 。 可 以 计算 出 , 薄 膜 的 组 成 仅 是 几 个 脂 双 层 。 当 气泡 通过 水 相 上 升 时 , 片 层 分 散 后 形成 单 或 寡 片 层 的 脂 质 体 。 注 入 法 的 好 处 是 适 用 面 广 且 制备 快速 , 但 所 得 脂 质 体 溶液 相当 稀 , 需 进一步 浓缩 。 Szoka 等 (1980) 发 明了 一 种 反 相 蒸发 法 来 制备 大 单 层 脂 质 体 , 该 法 是 首先 将 脂 质 溶解 在 挥发 有 机 溶剂 中 , 同 时 在 溶液 中 加 入 水 相 溶液 , 振 荡 分 散 , 在 通 氮气 的 情况 下 超 声 几 分 钟 使 形成 均 相 稳定 的 乳白 色 溶 液 , 此 时 脂 质 分 子 形成 内 翻 型 微 团 (inverted micelle) 。 然 后 将 此 混合 物 转移 到 旋转 营 发 器 中 , 用 水 泵 抽 气 去 除 有 机 溶剂 , 当 大 部 分 溶 剂 除去 后 , 悬 序 液 呈 凝 胶 状 , 经 几 次 洲 涡 振荡 后 继续 减 压 蒸发 直到 得 到 均一 的 悬 序 液 ,此 时 形成 的 是 包 右 水 相 的 单 层 脂 质 体 溶 液 , 通过 滤 膜 或 凝 胶 过 滤 的 方法 可 以 进一步 对 脂 质 体 大 小 进行 分 选 。 此 法 的 优点 是 水 相 包 庄 体积 相当 大 , 可 达 65% 左 右 , 且 适 用 面 比 较 广 , 但 其 缺点 也 相当 明显 , 即 待 包 右 物 质 需 要 暴露 在 有 机 溶剂 中 很 长 时 间 , 且 要 经 过 短 时 间 超声 , 这 些 都 非常 容易 导致 待 包 右 的 蛋白 变性 或 DNA 断裂 。 313.2 HRSA eA ITE ECE IEE 由 于 生物 膜 的 复杂 性 和 膜 蛋 白 与 其 他 膜 成 分 之 间 的 相互 作用 , EC EI FR AI 研究 膜 蛋白 的 结构 与 功能 十 分 困难 。 因 此 , 为 避免 其 他 膜 成 分 的 干扰 , 可 将 特定 的 膜 蛋 白 从 天 然 膜 上 分 离 纯 化 后 , 重组 插入 脂 质 体 中 形成 脂 蛋白 体 (proteoliposome) , IEE fk 重组 是 分 析 膜 蛋白 功能 和 作用 机 制 的 有 力 工具 , 同时 还 能 分 析 膜 脂 一 蛋白 和 蛋白 一 蛋白 的 相互 作用 、 膜 上 蛋白 拓扑 特征 、 配 体 一 受 体 识别 与 结合 等 。 脂 质 体重 组 (liposome reconstitution) 的 关键 在 于 制备 出 高 质量 含有 膜 蛋白 的 重组 脂 蛋 白 体 。 如 前 所 述 , 脂 质 体 分 为 多 层 脂 质 体 (MLV) 、 小 单 层 脂 质 体 (SUV) 和 大 单 层 脂 质 体 (LUV)。 显 然 , 多 层 脂 质 体 (MLV) 因为 层 数 较 多 , 不 利于 膜 蛋白 的 功能 分 析 。 而 小 单 层 脂 质 体 (SUV) 必 须 考 虑 脂 双 层 的 曲率 效应 对 脂 质 和 蛋白 分 布 的 影响 ,也 不 适合 分 析 膜 脂 一 蛋白 相互 作用 。 所 以 , 脂 蛋白 体 的 重组 通常 使 用 大 单 层 脂 质 体 (LUV) , 以 下 主要 概述 目前 普遍 应 用 于 脂 蛋白 体重 组 的 各 种 方法 。 1. 重组 方法 脂 蛋 白 体重 组 方法 主要 按 脂 质 体 的 制备 方法 分 类 , 即 按 脂 质 双 分 子 层 闲 合 以 前 脂 膜 在 水 溶液 中 的 分 散 方式 的 差别 , 分 为 以 下 4 种 主要 的 技术 方法 : 有 机 溶剂 介 导 的 方法 、 机 械 方法 、 直 接 插入 方法 、 去 污 剂 介 导 的 方法 。 (1) 有 机 溶剂 介 导 的 方法 有 机 溶剂 介 导 的 纯 脂 质 体 的 制备 方法 包括 乙醇 注入 法 乙醚 注入 法 和 反 相 蒸发 法 。 这 类 方法 制备 的 脂 质 体 , 一 般 包 封 容量 大 , 俘 获 效 率 高 , 但 兼 性 的 膜 蛋白 在 有 机 溶剂 中 容易 变性 , 极 大 地 限制 这 类 方法 在 膜 蛋白 重组 中 的 应 月 iud et al. 1995), 这 类 方法 中 只 有 反 相 蒸发 法 适合 重组 膜 蛋白 。 通 :等 方法 处 理 脂 质 、 蛋 白质 、 水 和 过 量 有 机 溶剂 的 混合 物 形成 均匀 单 相 体系 (W/O: 然后 减 压 蒸发 有 机 溶剂 , 形 成 大 单 层 的 脂 蛋 白 体 (LUV, 0.2~ Shm) 。 脂 蛋 白 体 的 - 有 汉 决 于 非 极 性 溶剂 的 性 质 和 它 SAH 本 积 比 。 这 种 方法 中 蛋白 质 重组 效率 高 , 脂 “ .上 和 蛋白质 含量 均匀 分 布 , 膜 上 蛋白 质 :位 的 单 向 性 好 , 脂 质 与 蛋白 比例 范围 较 大 , 人体 的 离子 通 透 性 低 。 脂 质 体 在 物 膜 Biomembranes 398 重组 后 通 稼 用 聚 碳酸 酯 膜 挤 压 过 着 ,使 脂 蛋 白 体 的 粒 径 变 均 义 。 但 膜 蛋 白 在 重组 过 程 中 仍 需要 接触 有 机 溶剂 , 且 在 减 压 蒸发 有 机 溶剂 时 需要 加 热 , 重 组 后 膜 蛋 白 很 难 具 有 较 高 的 生物 学 活性 , 因 此 此 法 只 适合 耐 受 有 机 溶剂 的 膜 蛋白 。 (2) 机 械 方 法 机 械 方 法 包括 超声 高压 破 碎 (french press ) 、 聚 碳酸 酯 膜 挤 压 (membrane extrusion) 、 冻 融 超声 等 方法 。 这 类 方法 一 般 简 单 快速 , 不 需要 加 去 污 剂 . 当 脂 质 溶 于 有 机 溶剂 后 , 通 氮气 或 减 讨 除去 有 机 这 剂 , 脂 质 会 在 容器 的 底 壁 上 形成 薄膜 。 而 脂 质 薄 膜 加 入 水 后 能 发 形成 多 层 脂 质 体 悬浮 液 , 然 后 运用 超声 和 高 压 破碎 等 机 械 方法 减少 脂 质 体 层 数 , 将 多 层 脂 质 体 转化 为 小 单 层 脂 质 体 。 聚 碳酸 脂 膜 挤 压 能 均 化 脂 质 体 粒 径 , 而 冻 融 、 脐 水 一 再 水 化 等 技术 能 增加 脂 质 体 大 小 ( 张 灵芝 1998, Rigaud et al. 1995), 脂 质 和 和 蛋白 质 混 合 的 多 层 脂 质 体 悬 序 液 超声 后 形成 小 单 层 脂 蛋 白 体 。 超 声 方 法 分 为 探 针 型 和 水 浴 型 两 种 。 脂 蛋白 体 的 大 小 取决 于 脂 质 体 的 脂 质 组 成 .超声 的 时 间 和 频率 。 超 声 过 程 很 难 标准 化 控制 , 因 而 重复 性 较 差 , 而 长 时 间 超 声 容易 导致 许多 膜 蛋白 的 失 活 和 脂 质 的 变性 。 因 超声 得 到 的 脂 和 蛋白 体 过 小 (20 ~ 40mm) , 通常 使 用 冻 融 技术 增 大 脂 质 体 粒 径 , 即 冻 融 超声 法 。 高 压 细 胞 破碎 仪 高 压 挤 压 脂 质 和 蛋白 质 混 合 的 多 层 脂 质 体 悬浮 液 , 脂 质 体 膜 破碎 后 重建 ,形成 单 层 脂 蛋 白 体 (直径 30~ 80nm) 。 与 超声 相 比 ,该 方法 操作 同样 简单 迅 速 , AL 重复 性 好 , 脂 蛋白 体 的 粒 径 均匀 , 稳 定性 好 , 温 和 的 制备 条 件 下 蛋白 质 不 易 变性 。 脂 蛋 和 白 体 的 大 小 取决 于 脂 质 成 分 和 高 压 破 碎 时 的 瘟 度 , 尤其 是 压力 。 但 高 压 挤 压 时 温度 不 易 控制 , 此 外 高 压 细胞 破碎 仪 价格 昂贵 。 聚 碳酸 酯 膜 挤 压 是 挤 压 脂 质 体 通过 固定 孔径 的 聚 碳酸 酯 膜 。 单 层 脂 蛋白 体 通过 聚 碳 酸 酯 膜 几 次 后 粒 径 大 小 变 成 相对 均匀 , 大 部 分 等 于 或 略 大 于 聚 碳酸 酯 膜 的 孔径 〈 一 般 0.2hm)。 这 种 方法 通常 与 其 他 技术 方法 结合 使 用 , 增 加 脂 蛋 白 体 粒 径 分 布 的 均匀 程度 。 冻 融 技术 能 促使 脂 质 体 融 合 形成 较 大 的 脂 质 体 。 在 冻 融 超声 法 中 , 将 超声 制备 的 脂 质 体 与 蛋白 质 混 合 , 放 在 干冰 或 液 所 中 快速 冻结 后 , 在 室温 下 融化 , 能 得 到 很 大 的 脂 蛋 Af (大 部 分 MLV)。 脂 蛋白 体 经 过 短暂 的 超声 后 能 制备 单 层 脂 蛋 白 体 , 粒 径 大 小 20~ 200nm, 这 种 方法 适合 用 于 对 超声 或 去 污 剂 敏感 的 蛋白 。 但 是 重组 后 蛋白 的 定位 不 理想 , 脂 蛋 白 体 的 粒 径 分 布 广汉 , 更 重要 的 是 冻 融 过 程 产生 的 细小 改变 可 能 扰动 膜 蛋白 结构 , 导致 蛋白 的 聚集 和 聚 沉 等 。 目 前 , 冻 融 过 程 和 脱水 一 再 水 化 循环 制备 脂 蛋 白 体 主要 用 于 电 生 理 实 验 。 (3) 直接 插入 法 某 些 膜 蛋 白 能 自发 插入 含有 胆固醇 、 短 链 卵 磷脂 、 去 污 剂 或 自由 脂肪 酸 等 两 性 分 子 的 小 单 层 脂 质 体 (SUV,20nm) 。 低 涂 度 的 胆 酸 盐 (cholate) 、 溶 血 卵 磷脂 (lysolecithin ) 、 OG (octyl glucoside) 能 促进 膜 蛋 白 自 发 插入 小 单 层 脂 质 体 。 直 接 插入 法 的 机 制 分 为 两 步 : 蛋白 质 迅速 插 入 部 分 小 单 层 脂 质 体 (SUV); 脂 质 体 之 间 缓 慢 地 不 断 发 生 融 合 , 形成 较 大 的 单 层 脂 质 体 。 脂 质 体 中 脂 双 层 的 不 对 称 性 、 热 运动 、 几 何 约束 以 及 酸性 磷脂 组 成 等 都 能 促进 蛋白 质 的 直接 插入 (Rigaud et al. 1995)。 这 种 方法 优点 是 膜 上 蛋白 质 定位 是 单 癌 的 。 但 由 佛 质 体 间 的 融合 不 可 能 均 久 和 完 全 , 因 而 脂 沪 白 体 粒 径 分 布 很 广 , 脂 质 体 中 蛋白质 含 二 LATA). 399 $318 AEN EAT RAI RA (4) 去 污 剂 介 寻 的 方法 由 于 膜 生 日 一 般 是 具有 亲 水 性 和 距 水 性 的 兼 性 分 子 , 大 多 数 需 要 去 污 剂 将 其 从 天 然 细胞 膜 中 分 离 、 溶 解 和 提纯 , 同 时 去 污 剂 能 防止 蛋白 质变 性 和 聚 沉 而 有 利于 膜 蛋白 的 纯 ft 〈 图 31-18)。 目 前 , 膜 蛋白 重组 过 程 大 多 数 使 用 去 污 剂 , 制 备 的 重组 脂 质 体 粒 径 分 布 均匀 , 但 不 可 避免 舍 有 微量 的 去 污 剂 残余 。 去 污 剂 介 导 的 所 有 重组 方法 基本 过 程 都 包括 两 个 步骤 : 首先 ,和 蛋 白质、 过 量 脂 质 和 适量 去 污 剂 的 共同 微 团 化 , 形成 脂 质 一 蛋白 质 一 去 污 剂 微 团 和 脂 质 一 去 污 剂 微 团 的 混合 溶液 ; 其 次 , 从 微 团 咨 液 中 除去 去 污 剂 , 则 蛋白 质 插入 的 脂 双 层 逐 步 封闭 形成 脂 蛋 白 体 (Rigaud et al. 1995, Rigaud 2002), 重组 膜 蛋 白 必 须 使 用 温和 的 去 污 剂 ,不 致使 蛋白 变性 。 去 污 剂 介 导 的 各 种 方法 的 主 要 差别 在 于 去 除去 污 剂 采 用 的 技术 不 同 , 主 要 有 透析 法 、 凝 胶 色 谱 法 、 稀 释 法 和 聚 茶 忆 Kit (polystyrene bead) 玻 水 吸附 法 等 〈 图 31-18) 。 各 种 去 除去 污 剂 技术 是 基于 去 污 剂 不 同 的 物理 化 学 性 质 , 例 如 临 界 胶 束 浓度 (critical micelle concentration, CMC), (HK 小 和 和亲 水 一 亲 脂 平衡 (hydrophilic-lipophilic balance, HLB) 等 。 微 团 的 天 小 与 去 污 剂 在 微 团 中 数目 有 关 , 而 亲 水 一 亲 脂 平衡 则 涉及 去 污 剂 的 亲 水 性 和 下 水 性 的 两 性 。 去 污 剂 分 子 内 亲 水 性 和 杀 脂 性 部 分 分 布 方式 的 差异 可 引起 微 团 立 体 结构 的 不 同 , 形成 的 混合 微 团 可 以 是 球状 或 管状 等 。 去 除去 污 剂 技术 的 选择 取决 于 去 污 剂 本 身 的 性 质 , 去 污 剂量 的 选 择 则 依赖 于 脂 质 的 性 质 和 涂 度 以 及 去 污 剂 的 性 质 〈 如 CMC), 重 i uQ -* er BRAS CNT 组 去 污 剂 介 导 的 脂 蛋白 体重 名 透析 法 所 用 的 去 污 剂 应 该 具有 较 高 的 临界 微 团 浓度 , “类 去 污 剂 ( 胆 酸 盐 、 脱 氧 胆 酸 、 八 烷 基 葡 糖苷 (octylglucoside), Chaps, Chapso) 。。 易 通过 透析 除去 。 精 确 控制 透析 条 件 , 能 得 到 单 层 重组 脂 质 体 (90 ~ 100nm) 。 制 皇 。 引 质 体 的 粒 径 非 常 均匀 , 但 透 析 耗 时 ,= 污 剂 与 蛋白 质 长 时 间接 触 可 能 导致 蛋白 变 必 :外 , 透析 过 程 要 连续 进行 , 否 WME RY 沸 质 体会 大 小 不 均 。 脂 质 体 的 大 小 受 去 污 剂 ! 。, 析 速 率 的 影响 ,一 般 透 析 速 率 400 | 减 慢 , 脂 质 体 粒 径 会 增加 。 使 用 流动 透析 槽 可 以 控制 去 污 剂 的 透析 速率 , 并 且 大 大 降低 透析 时 间 。 在 透析 袋 外 加 入 吸附 去 污 剂 的 生物 珠 (biobeads) 可 以 减少 换 透析 液 的 次 数 . 凝 胶 过 滤 法 适合 于 临界 微 团 浓度 较 高 和 形成 微 团 较 小 的 去 污 剂 。 将 重组 微 团 混 合 溶 液 通过 凝 胶 柱 洗涤 时 , 树 脂 将 去 污 剂 和 脂 质 体 分 离 , 蛋 白 会 插入 脂 质 体 。 凝 胶 过 着 应 根 hay aca ERE, , 而 不 同 的 制备 条 件 形成 单 层 脂 质 体 的 大 小 不 同 。 这 种 方 能 快速 除去 大 多 数 去 污 剂 和 有 机 溶剂 , 因 而 形成 脂 质 体 中 残余 的 去 污 剂 水 平 较 低 。 这 ee 脂 蛋 白 体 粒 径 分 布 广 , 蛋 白 揪 膜 不 完全 。 此 外 , 溶液 中 脂 质 和 和 蛋白 浓度 在 过 凝 胶 柱 时 至 少 被 稀释 两 倍 , 而 且 树脂 可 能 吸附 脂 质 和 和 蛋白质, 可 预先 用 脂 质 和 有 蛋白 饱和 树脂 以 减少 吸附 。 稀释 重组 微 团 的 混合 溶液 也 能 得 到 脂 蛋 白 体 。 蛋 白质、 磷脂 和 去 污 剂 的 混合 咨 液 直 接 用 无 去 污 剂 的 缓冲 液 稀释 。 当 去 污 剂 浓度 降 到 临界 微 团 访 度 以 下 时 , 脂 蛋白 体会 自发 形成 , 这 种 方法 特别 适合 于 大 量 脂 和 蛋白 体 样品 的 制备 。 但 是 溶液 中 脂 和 蛋白 体 访 度 比较 低 , 残余 的 去 污 剂 含 量 特别 高 , 容 易 导 致 脂 质 体 港 漏 , 因 而 需要 增加 样品 浓缩 和 去 除去 污 剂 步骤。 通常 脂 蛋 白 体 样品 能 通过 超 滤 或 离心 等 方法 浓缩 稀释 法 的 稀释 比率 对 蛋白 分 布 均匀 性 和 脂 和 蛋白 体 的 形态 影响 很 大 。 临界 微 团 浓度 较 低 和 形成 微 团 较 大 的 去 污 剂 (Triton X-100 等 ) 不 适合 用 凝 胶 过 滤 和 透析 除去 ,但 是 能 通过 玻 水 树脂 〈 生 物 珠 SM2 等) 吸附 除去 。 生 物 珠 能 够 快速 吸附 去 污 剂 , 最 后 生物 珠 可 以 过 着 除 去 。 这 种 方法 适合 所 有 的 去 污 剂 , 同 样 包括 临界 微 团 访 度 较 高 的 去 污 剂 。 该 方法 能 制备 大 单 层 脂 质 体 , 形 成 脂 质 体 的 大 小 依赖 于 脂 质 组 成 、 缓 冲 液 成 分 和 温度 , 更 重要 的 是 生物 珠 的 特性 以 及 与 去 污 剂 结合 的 难 易 。 去 污 剂 方 法 重组 制备 脂 蛋 白 体 取决 于 很 多 因素 , 例 如 去 污 剂 特性 、 和 蛋白 质 特性 、 去 污 剂 和 脂 质 的 比例 、 脂 质 组 成 、 溶 液 离子 强度 以 及 去 除去 污 剂 的 技术 等 , 因 此 , 不 同 膜 蛋白 的 重组 工艺 可 能 有 所 不 同 。 现 在 , 对 脂 质 体 的 形成 机 制 和 脂 质 一 去 污 剂 体系 物理 化 学 行为 的 理解 能 解释 重组 脂 蛋 白 体 的 经 验 途 径 和 限制 实验 参数 数目 的 基本 原理 。 2. 去 污 剂 介 导 的 膜 蛋白 重组 的 机 制 目前 , 从 去 污 剂 一 脂 质 一 蛋白 混合 物 中 去 除去 污 剂 后 , 脂 蛋白 体 自发 形成 的 分 子 机 制 只 有 部 分 被 理解 .为 了 更 好 掌握 去 污 剂 重组 过 程 中 蛋白 质 与 脂 质 结合 的 可 能 作用 机 制 |, 最 简单 的 思路 是 去 除去 污 剂 时 脂 质 体 的 形成 过 程 与 加 入 去 污 剂 时 脂 质 体 的 溶解 过 程 是 相 反 的 , 其 中 可 能 出 现 中 间 态 的 顺序 也 相反 。 iis a 随 着 去 污 剂 浓度 的 增加 , 脂 质 体 的 溶解 过 程 分 为 三 步 ( 图 31- 19) 。 第 一 步 , 水 中 去 污 剂 浓 度 和 脂 双 层 中 去 污 剂 含量 都 增加 , 去 污 剂 不 断 插 入 脂 双 层 , mee ES 步 结 束 时 , 脂 双 层 中 的 去 污 剂 达到 饱和 , 7k PASS FHA a EE 临界 微 团 浓度 。 第 二 步 , 脂 双 层 开始 溶解 , 去 污 剂 饱 和 的 脂 质 体 向 磷脂 一 去 污 剂 微 团结 构 转 换 , 两 种 结构 共存 , 并 且 两 种 结构 中 去 污 剂 含量 基本 不 变 。 第 三 步 , 溶液 中 只 有 磷 脂 一 去 污 剂 微 团 结构 , 微 团 中 去 污 剂 含量 随 着 去 污 剂 总 浓度 增加 而 增 大 。 去 除去 污 剂 时 脂 质 体形 成 过 程 可 能 包含 顺序 相反 的 三 个 阶段 脂 质 体 形成 前 ,溶液 中 去 污 剂 单 体 和 磷 脂 一 去 污 剂 微 团 的 平衡 ; 所 有 磷脂 一 去 污 剂 微 团 向 去 王 剂 饱和 的 脂 质 体 转换 , 两 种 结构 Fs Al 剂 从 去 污 剂 饱 和 的 脂 质 体 中 去 除 。 401 3318 AY OREN FEHR AY RA 脂 蛋 白 体 重组 过 程 更 加 复杂 ,因为 溶液 中 存在 两 种 微 团 , 即 脂 质 一 去 污 剂 徽 团 和 脂 质 一 蛋 和 白质 一 去 污 剂 微 团 。 根 据 去 污 剂 的 特性 , 膜 蛋白 和 脂 质 作 用 而 形成 脂 蛋 白 体 的 机 制 可 分 为 3 类 : 蛋白 直接 插入 去 污 剂 饮 和 脂 质 体 [ 八 烷 基 葡 糖 苷 和 十 二 烷 基 麦 革 糖苷 (dodecylmaltoside) 介 导 的 重组 ] (图 31-19A);, 和 蛋白 从 混合 微 团 上 回去 污 剂 饱和 的 脂 质 体 转运 (Triton X-100 介 导 的 重组 ) (图 31-19B);, 在 微 团 向 层 状 结构 转化 过 程 中 蛋白 参 与 脂 蛋 和 白 体 的 形成 〈 胆 酸 盐 和 Chaps 介 导 的 重组 ) (图 31-19C)。 去 污 剂 的 去 除 速率 可 能 导致 不 同 的 机 制 , 第 二 ee fee aie 可 能 脂 质 一 去 污 剂 微 团 没 有 时 间 形 成 去 污 剂 饮 和 的 脂 质 体 , 此 时 脂 质 一 蛋白 质 一 去 污 剂 微 轩 可 参与 脂 蛋 白 体 的 形成 , 变 成 第 三 种 机 制 。 此 外 , 形 成 脂 质 体 时 蛋白 的 聚集 状态 、 微 团 大 小 、 脂 质 组 成 、 离 子 强 度 都 有 可 能 对 分 子 机 制 产生 影响 (Rigaud et al. 1995, Rigaud 2002, Parmar et al. 1999), 研究 各 种 膜 蛋白 的 插 膜 机 制 可 以 采用 “step-by-step” 策 略 (图 31-20), 分 成 3 个 步骤 。 第 一 步 , 在 预先 制备 的 脂 质 体 加 入 不 同 谊 度 的 去 污 剂 , 使 溶液 处 于 脂 质 体 溶解 过 程 中 不 同 的 阶段 。 溶 液 中 去 污 剂 浓度 的 范围 , 包 括 层 状 结构 向 混合 微 团 转换 时 所 有 浓度 , 即 去 污 剂 与 脂 质 的 比例 范围 , 包括 Rs 到 Ru。 第 二 阶段 , 在 溶解 过 程 不 同 阶段 分 别 加 入 蛋白 , 注意 脂 质 和 蛋白 的 比例 。 第 三 阶段 , 去 除去 污 剂 , 通 常用 生物 珠 吸附 去 污 剂 , 然 后 分 析 脂 蛋 自体 中 蛋白 的 插 膜 、 膜 上 定位 和 生物 学 活性 。 A. Step-by-step 溶 解 ‘ee 全 制备 的 脂 质 体 % ts 增加 去 污 剂 浓度 at poe © ) © Hy OG 2©; . Heed 二 si -@ eer ; R., " | B. 加 入 和 蛋白质 p Ss , 二 2 i 4 2 e & 区 x * Z ay of, C. 去 除去 污 剂 站 从 人 生物 珠 » ; EA he i ps 31-19 ESppive See aan pees ei eae 的 插入 机 制 R_ 是 脂 质 体 二 始 溶解 时 脂 质 体 中 去 污 剂 与 脂 质 的 比例 , R_ 是 脂 乒 未 完全 溶解 时 微 团 中 去 污 剂 与 脂 质 的 比例 FE Qf “step-by-step” 重 组 策略 = 天 qi HE %y WR Biomembranes 402 这 种 “step-by-step ”策略 不 仅 提供 去 污 剂 存在 下 脂 质 和 蛋白质 结 合 机 制 的 原始 信息 , 而 且 是 一 种 比 去 污 剂 介 导 的 方法 更 加 合适 的 重组 方法 。 这 种 方法 中 蛋白 能 保持 与 天 然 膜 上 相 比 的 生物 活性 , 很 容易 决定 蛋白 与 脂 质 结 合 的 最 优 条 件 。 显然 ,不 同 的 膜 蛋 白 和 脂 质 作用 的 分 子 机 制导 致 最 后 的 蛋白 定位 的 单 向 性 不 一 样 。 第 一 种 机 制 具 有 最 佳 单 向 性 , 约 83% ~ 95% 和 蛋白 是 同一 方向 。 其 次 是 第 二 种 机 制 , 约 70% ~ 80% 和 蛋白 是 同一 方向 。 最 后 一 种 分 子 机 制 接近 方向 是 随机 分 布 的 。 因 此 , 各 种 影响 分 子 机 制 的 因素 、 去 污 剂 的 性 质 、 形 成 脂 质 体 时 蛋白 的 聚集 状态 、 微 团 大 小 、 脂 质 组 成 、 离 子 强 度 等 都 有 可 能 对 随后 脂 蛋 白 体 上 和 蛋白 定位 的 方向 有 影响 。 此 外 , 和 蛋白 本 身 的 结构 不 对 称 可 能 对 蛋白 定位 也 可 能 产生 影响 。 特 别 强调 是 , 膜 蛋白 重组 进入 去 污 剂 饱 和 的 脂 质 体 时 , 膜 蛋白 单身 播 膜 〈 第 一 种 机 制 ) 通常 用 于 制备 最 有 效 的 脂 和 蛋白 体 。 3. 重组 的 注意 事项 重组 前 和 蛋白质 最 好 是 单 体 状 态 , 这 样 才能 高 效 地 插入 脂 质 体 中 。 重组 中 脂 质 、 蛋 自 、 去 污 剂 加 入 的 时 机 和 顺序 、 和 蛋白 和 脂 质 的 加 入 比例 等 都 可 能 会 影响 形成 脂 质 体 时 蛋白 的 聚集 状态 , 从 而 影响 膜 蛋 白 和 脂 质 作用 的 分 子 机 制 , 因 此 需要 选择 合适 的 加 入 时 机 、 顺 序 和 比例 。 脂 质 成 分 选择 也 非常 重要 。 考 虑 到 脂 质 体 主要 用 于 膜 蛋白 的 功能 分 析 ,, 脂 质 要 求 既 能 够 形成 密封 性 良好 的 脂 蛋 白 体 , 又 尽量 与 天 然 细 胞 膜 组 分 相似 , 这 样 有 可 能 得 到 较 高 , 的 生物 学 活性 。 此 外 , 加 入 胆固醇 可 以 用 于 稳定 双 层 膜 避 免 融合 , 加 入 少量 带电 和 荷 脂 质 也 能 防止 脂 质 体 的 聚集 帝 淀 。 如 果 使 用 非 饱 和 脂 质 时 , 应 在 重组 液 中 加 入 少量 抗 氧化 剂 (Rigaud et al. 1995), 4., 脂 蛋白 体 的 纯化 和 保存 ( 张 灵 芝 1998) 膜 蛋 白 分 离 和 纯化 与 脂 蛋 白 体 的 重组 常常 会 使 用 去 污 剂 和 有 机 溶剂 。 残余 的 有 机 溶 剂 或 去 污 剂 可 能 对 实验 结果 有 明显 影响 , 同时 残留 的 去 污 剂 可 能 导致 脂 质 降解 和 蛋白 变 性 , 影 响 蛋 白 生 物 活 性 , 甚 至 增加 脂 蛋 白 体 的 被 动 通 透 性 , 致 使 膜 蛋 白 的 转运 功能 难以 检测 。 通 过 透析 、 多 聚 吸 附 剂 (如 生物 珠 SM-2) 吸附 和 凝 胶 过 着 等 方法 能 除去 残留 的 去 污 剂 。 聚 葵 乙 烯 珠 能 有 效 去 除 几 乎 所 有 的 去 污 剂 , 其 他 杂质 可 用 柱 层 析 、 透 析 、 离 心 等 技术 分 离 。 大 小 不 同 的 脂 质 体 能 通过 柱 层 析 和 超速 离心 分 离开 来 。 脂 质 体 通过 聚 碳酸 酯 膜 挤 压 , 粒 径 会 变 小 而 均匀 。 脂 蛋 白 体 保存 要 防止 脂 质 氧化 、 膜 蛋白 变性 和 脂 质 体 融 合 。 脂 蛋白 体 一 般 4C 避 光 保存 , 在 装 脂 质 体 的 容器 里 充满 扼 气 等 情 性 气体 , 一 周 内 脂 质 体 性 质 一 般 不 会 改变 。 a SCH, Hea. 1989. 生物 膜 与 脂 质 体 技术 . 长 沙 : 湖南 科学 技术 出 版 社 BARDS. 2003. 请 分 子 生 物 学 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 张 灵 芝 . 1998. 脂 寺 体 制备 及 其 在 生物 医学 中 的 应 用 . 北京 : 北京 医科 大 学 ,” 司 协和 医科 大 学 联合 出 版 社 403 31a A PREG FET PARAS Blodgett K B. 1935. Films built by depositing successive monomolecular layers on a solid surface. J Am Chem Soc, 57: 1007- 1022 Briggs M S, Gierasch L M, Zlotnick A, et al. 1985. /n vivo function and membrane binding properties are corelated for Escherichia coli lamB signal peptides. Science, 228: 1096-1099 Langmuir I. 1917. Monomolecular layers of fatty acids at air-water interface. J Am Chem Soc, 39: 1848 Langmuir I. 1920. The mechanism of the surface phenomena of flotation. Trans Faraday Soc, 15: 62 Mueller P, Rudin D O, Tien H T, et al. 1962. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature, 194: 979-980 Parmar M M, Edwards K, Madden T D. 1999. Incorporation of bacterial membrane proteins into liposomes: factors influencing protein reconstitution. Biochim Biophys Acta,1421(1): 77-90 Roberts G G. 1985. An applied science perspective of Langmuir-Blodgett films. Advances in Physics, 34: 475-512 Rigaud J L, Pitard B, Levy D. 1995. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta, 1231(3): 223-246 Rigaud J L. 2002. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz J Med Biol Res, 35(7): 753-766 Szoka F, Olson F, Heath T, et al. 1980. Preparation of unilamellar liposomes of intermediate size (0.1-0.2 micron) by a combination of reverse phase evaporation and extrusion through polycarbonate membranes. Biochim Biophys Acta, 601 (3): 559-571 Tien H T. 1974. Bilayer Lipid Membranes (BLM)-Theory and Practice. New York: Maree Dekker Wang S X, Cai G P, Sui S F. 1999. Intrinsic fluorescence study of interaction of human apolipoprotein H with phospholipids vesicles. Biochemistry-US, 38: 9477-9484 Xiao C, Yang M, Sui S F. 1998. DNA Containing organized molecular structure based on controlled assembly on supported monolayers. Thin Solid Films, 327-329, 647-651 uy , Cie Paes os . 全 4 ® ° wat 6 % ¢ ° : oe “ 要 Pe o-*-s 人 ¥ » gs -二 * " . 站 e ” Fo ”市 oc APs *ec* wi a Fe OM FZ TS 9 PE 32:0) BY oe) Spe hole ce eee 404 32.2 ”细胞膜 的 分 子 组 成 和 简化 模型 nee ee ccc ce eeeeeseeeeceeeseeeneneneees 405 32.3 ”生物 膜 的 Helfrich 自由 能 和 闭合 膜 泡 的 形状 方程 …… 406 32.4 形状 方程 的 特 解 : SCE AI 2 FR oe ececeeaeceneeeneenenenee 407 32.5 FEAR TAB BEHE FETE «en ccnn cn ccecceonsnaeseces oveneten 瑟 下 更 408 32.5.1 Nitsche 方程 408 32.5.2 dC aaAFE -A PR aI REE RY as csscscoccssncecevecsncnnessncneneees 408 32 乒 二 开 听 膜 爷 的 形状 方程 和 边 押 条 伴生 409 32.7 “生物 膜 弹性 理论 在 其 他 领域 中 的 应 用 .Ne 410 VM ee ey ed OPI ES pp 410 32.7.2 eH AVGR FL URI TAF. 生生 411 32.7.3 生物 膜 的 AFM 成 像 te 411 So eae a EE eter 412 LE. 这 一 章 里 , 我 们 先 介绍 细胞 膜 的 分 子 组 成 和 简化 模型 , 引入 描述 生物 膜 弹 性 的 Helfrich 自由 能 , 并 由 此 导出 闭合 膜 泡 的 形状 方程 。 形 状 方程 的 一 个 特 解 能 够 较 好 的 解释 生物 力学 中 的 一 个 难题 一 一 为 什么 生理 条 件 下 正常 的 红血球 都 是 双 凹 夸 形 状 ? FB 状 方程 的 另 一 个 特 解 预言 了 轮胎 状 膜 泡 的 存在 , 这 种 轮胎 的 大 小 半径 之 比 恰好 是 v2, 这 一 预言 很 快 被 实验 所 证 实 。 其 次 介绍 形状 方程 的 一 些 推广 情形 , 包括 Nitsche 推 广 的 表面 方程 、 近 唱 相 -A 液 唱 的 平衡 结构 、 微 乳液 镁 动力 学 。 然 后 介绍 开口 膜 泡 的 形状 方程 与 边界 曲线 方程 , 最 后 介绍 生物 膜 泡 形状 的 弹性 理论 在 碳 纳米 管 力学 , 尤其 最 近 在 细胞 生物 膜 的 原子 力 显微镜 (AFM) 成 像 等 领 域 中 的 应 用 。 32.1 Bf FEAR NRE — a NO AFTRA, AE 18034F, Plateau (1873) 研 究 肥皂 膜 的 形状 时 , 训 从 变 分 问题 || aa =0 得 到 了 极 小 曲面 方程 ; 405 % 322 AE ART OTETR AI SE LEFE LE H=0 (1) Fi, AAA RIZE BBA ee RAPE 为 了 研究 液体 在 毛细 管 里 的 上 升 现 象 , Young (1805) 和 Laplace (1839) 研 究 了 另外 一 个 变 分 问题 LAD ||dv+X 利 aa]=0, 得 到 了 常平 均 曲率 的 曲面 方程 H=AD/((2A) (2) 其 中 AP 是 空气 /液体 表面 的 压力 差 ,4 是 表面 张力 系数 ,F 是 液体 的 体积 。 实 际 上 , 方 程 (2) 也 可 以 用 来 描述 闭合 的 肥 星 泡 ,AP 可 以 视 为 肥 旦 泡 的 外 压 减 去 内 讨 。1956~1958 年 ,数学 家 Alexandrov (1962) 证 明了 一 个 意外 的 定理 : 三 维 欧 氏 空间 中 具有 常平 均 曲 率 的 侍 入 曲面 (可 以 理解 为 不 自 交 的 曲面 ) 只 能 是 球面 。 因 此 , 通常 的 财 合 肥皂 泡 都 是 球形 的 。 1812 年 ,Poisson 用 || Ad4 来 描述 薄 壳 的 曲率 能 , 它 的 变 分 导致 了 一 个 新 的 曲面 方程 V?H + 2H (H?— K) =0 (3) rh V? & Laplace-Beltrami 8 -f—, K 是 高 斯 曲率 。 许 多 数学 工作 者 (4nSchadow, Willmore 等 ) 对 这 个 方程 进行 了 研究 。 近 年 来 , 随 着 软 物质 研究 领域 的 日 益 广 泛 , 尤 其 是 生物 膜 的 Helfrich 自发 曲率 模型 的 提出 和 发 展 ,Poisson 的 理论 得 到 了 很 大 的 推广 和 复兴 。 以 下 主要 介绍 Helfrich 自发 曲率 模型 在 生物 膜 、 近 唱 相 -A 液 晶 (SALC) 中 的 应 用 以 及 生物 膜 的 理论 在 碳 纳米 管 、 微 乳 冯 动 力学 和 生物 膜 的 原子 力 显微镜 (AFM) 成 像 中 的 应 用 。 32.2 AAV 33 21 SC Ais] 75%) as 细胞 膜 对 生命 活动 极其 重要 , 它 定义 了 细胞 与 外 部 环境 的 分 界面 (Njus 2000) 。 Mts ka, ERA, BA AES 成 , 其 中 脂 和 蛋白 质 是 主要 成 分 。 一 种 重 要 的 脂 类 是 磷脂 , 如 图 33-1 所 示 (Alberts et al. 1994, Childs 1995, Wolfe 1993), 它 有 — AFR VERS 287k sien FOS RK De BEE, EL. MADER RA, BEE AT DA a 看 成 一 个 双亲 的 棒 。 当 一 定量 的 磷脂 分 子 分 散在 水 中 ,由 于 玻 水 相互 作用 ,它们 能 够 自 组 织 地 形成 团 合 的 双 层 膜 , 使 得 亲 水 端 露 在 外 面 , 而 疏水 端 被 屏蔽 在 里 面 。 历史 上 , 细 胞 膜 的 简化 模型 很 多 (Edidin 2003 ), 其 中 被 广泛 接受 的 是 Singer Fil Nicolson i tH AJ {at ah Fe ie Be AY (Singer et al. 1972), 4nF 33-2 Pras, 4H | Hens = —7WRHB a SR, 磷脂 分 子 A B 可 以 在 AR a iA Feo), 而 蛋白 磷酸 分 子 的 化 学 式 和 示意 图 H: ty HR Biomembranes 406 WA FW ER ER FP, Fr Hee A I Ee ER A SC A A Me I AS EZ, Yb —2EE A ADR AL FB AD SE th A BEE RE. Ua 1) BE i Bae es Fe A AH IZA ESE RL od RR EL PORE 2 FR 称 为 生物 膜 。 ANN it, es ih ‘| j ae We) yj q “nb | if | 人 ht | i | ee Y i ne Ah tk oo BER] iia) i846 | A Edidin 2003) 32.3 ”生物 膜 的 Helfrich 自由 能 和 闭合 膜 泡 的 形状 方程 “4 对 生物 膜 的 形状 的 研究 基于 以 下 几 个 假设 : 磷脂 分 子 可 以 简化 为 极 性 的 棒 ;, 膜 的 厚 度 〈( 约 为 4nm) 远 远 小 于 膜 的 尺度 〈 约 为 几 个 微米 六 膜 的 弯曲 刚度 约 为 2047UDuwe et al. 1990, Mutz et al. 1990), 这 里 丰 为 玻 尔 菊 曼 常数 ,7 为 正常 体温 , 所 以 在 常温 下 对 于 弯曲 的 膜 , 可 以 忽略 其 热 涨 落 , 膜 的 两 侧 存在 非 对 称 的 因素 。 因 此 , 从 数学 上 看 来 , 生 物 膜 可 以 被 看 成 是 一 个 光 请 曲面 , 而 从 物理 上 看 来 , 生 物 膜 处 于 液晶 相 。 Helfrich(1973) 根 据 液晶 的 弹性 理论 , 从 液晶 的 弹性 能 导出 了 生物 膜 的 曲率 能 为 : 已 =|| ((ke/ 2)(2H+¢0)°+KK]dA (4) 其 中 , 大和 大 为 膜 的 弯曲 刚度 ; 万 为 膜 的 平均 曲率 ;co 为 膜 的 自发 曲率 , 它 体现 了 膜 两 侧 的 不 对 称 性 ; 天 为 膜 的 高 斯 曲率 。 注 意 , 这 里 所 取 的 值 与 Helfrich 原始 公式 中 的 取 值 相反 。 对 于 闭合 的 膜 泡 , 应 用 微分 几何 Gauss-Bonnet 公 式 , 高 斯 曲率 积分 是 常数 , 其 变 分 为 零 , 可 忽略 , 可 将 (4) 式 写 为 : (k.12)q) QH+e,) A (5) Ane % EBIRAISE KDW AYP, AA) SR YOA A RES A: F= Ch ((k,(2)(2H+c,)+AdA + pilav (6) 407 | 第 32% Ae Py hes a FEAR AI SBF IE 其 中 人 为 膜 的 表面 张力 系数 ,AP 为 膜 的 外 压 减 去 内 压 。 对 上 式 进行 变 分 , 可 以 得 到 描述 闭合 生物 膜 泡 的 平衡 形状 的 方程 (Ou-Yang et al. 1987, 1989); AP — 20H + k.(2H+c)) (QH — eH —2K) + 2k, V?H=0 (7) 以 下 将 方程 (7) 向 称 为 闭合 泡 的 形状 方程 。 324 形 发 方程 的 性 解 : 红 血 东 和 V7 es 生理 学 中 有 一 个 著名 的 难题 : 为 什么 人 体 中 的 正常 血红 细胞 (red blood cell) #32 厌 形 的 〈 图 32-3) (och 1983)? 为 了 解释 这 个 形状 问题 , 著 名 的 生物 力学 家 加 元 桢 等 提出 , 红细胞 的 细胞 膜 在 不 同 的 位 置 有 不 同 的 厚度 , 从 而 产生 双 凹 奉 (biconcave) 形 1K (Fung et al. 1968) , 然 而 电镜 的 观察 表明 膜 的 厚度 是 均匀 的 。Lopez (1968) 假设 , 红细胞 表面 电 稠 分 布 不 均匀 导致 这 种 形状 , 然 而 Greer 和 Baker 等 (1970) ea 电 街 分 布 是 均匀 的 。Deuling 和 Helfrich(1976) 对 目 由 能 方程 (6) 进行 轴 对 称 的 积分 到 了 轴 对 称 泡 的 形状 方程 。 他 们 的 数值 结 末 显 示 , 当 co>0 时 , 可 以 得 到 phat a (WATKAT . ae eta Ace. HAT A AT PR Be Te J FE FB 个 特例 , 正 确 的 做 法 应 该 是 从 普遍 形状 方程 《7) 导出 轴 对 称 的 形状 方程 。 红细胞 〈 红 ), 血 小 板 〈 蓝 ) 和 淋巴 细胞 ( 绿 ) (3 引 自 http:Wlibrary.thinkquest.org) 关于 红细胞 形状 研究 的 第 一 个 严格 解析 解 是 Nait' 993) 得 到 的 , 当 AP=A=0 时 , 下 面 的 方程 组 2(p) = z(0) + ‘tanyip’) é (8) siny(p) = 一 copln(p/; 满足 形 少 方程 (7), 其 中 z(D) 是 红细胞 沿 旋转 对 称 轴 的 4 的 轮廓 线 ,WD) 是 与 对 称 轴 距 HE Wy i Biomembranes 408 离 为 p 处 该 曲线 的 切 角 (图 32-4) 。 不 难 证 明 , 当 co>0 时 , 方程 组 (8) 表 示 双 凹 碟 形 状 。 有 两 个 问题 值得 进一步 探讨 : 尽管 方程 组 (8) 是 光 请 的 , 并 且 代 入 自由 能 方程 (0) 式 是 可 积 的 , 但 是 在 po=0 处 ,WPp) 的 高 阶 导 数 发 散 , 因 此 寻找 更 加 光滑 的 严格 解 仍 是 数学 上 的 难题 , 尽管 当 co>0 时 , 方 程 组 (8) 表 示 双 凹 碟 形状 , 但 是 却 不 能 由 友 、co、AP 和 p 4 完全 确定 描述 双 凹 碟 形状 的 参数 z(0) 和 由 方程 组 (8) 描 述 的 解析 解 ps, 这 一 点 可 能 需要 通过 稳定 性 的 探讨 来 解决 。 1990 年 , 理论 首次 预言 在 co 小 于 某 个 阔 值 时 形状 方程 存在 稳定 的 环 面 解 , 环 面 的 生 成 圆 半 径 之 比 恰好 为 v2 (Ou-Yang 1990), 这 一 预言 很 快 被 3 个 不 同 的 实验 组 证 实 (Mutz et al. 1991, Rudolph et al. 1991, Lin et al. 1994), 以 上 两 个 例子 使 我 们 确信 Helfrich 自发 曲率 模型 在 描述 形状 问题 时 抓 住 了 生物 膜 的 本 质 特征 一 一 生物 膜 是 液晶 。 最 近 , Naito 等 1995a) 预告 了 超 Delaunay 曲面 的 解析 解 , 正 等 待 实验 证 实 。 到 目前 为 止 , 球 面 、 柱 面 、 环 面 、 双 凹 碟 面 和 超 Delaunay 曲面 是 仅 知 的 能 够 满足 形状 方程 的 5 类 解析 解 , 而 其 中 是 闭合 曲面 的 只 有 球面 、 环 面 和 双 凹 碟 面 。 Zhang 等 (1996) 也 发 现 了 二 维 情况 下 方程 (7) 的 周期 性 柱 面 解 。 值 得 注意 的 是 ,Harbich 和 Helfrich(1984) 观 察 到 的 过 量 水 中 的 卵 磷 脂 结构 具有 该 周期 性 解 的 特征 。 325 JOA RESET) 1 ms 32.5.1 Nitsche 7 Fj 近年 来 , 生物 膜 形 状 问题 的 解析 工作 引起 了 数学 家 极 大 地 关注 , Helfrich 的 自发 曲率 模型 也 被 认为 是 Poisson 弯曲 弹性 理论 的 复兴 (Nitsche 1993)。 在 Nitsche 的 极 小 曲面 百科 全 书 (Nitsche 1989) 中 ,Helfrich 的 曲率 能 被 推广 为 如 下 形式 , Pp Pc F=()[W(H)+ kK\dA (9) 其 中 YHA) AER AR. Nitsche 还 推导 出 相应 的 Euler-Lagrange 方程 : 人 人 到) 一 4 万 和 (10) 其 中 WMH, 24 YH (k/2)(2H + c 凡 时 , 这 个 方程 化 为 AP=0 情况 下 的 方程 (7)。 但 是 ,推广 的 方程 仍然 不 能 包括 所 有 软 物 质 中 的 形状 问题 , 在 液晶 的 形状 问题 中 , 需 要 进 一 步 推广 。 32.5.2 近 癌 相 -A (Pee 1°70) _ mmm SALC 的 平衡 结构 形状 也 是 一 个 长 期 未 解决 的 问题 。Friedel 和 Gradjean (1910) 发 现 SA 的 焦 锥 结构 ,在 数学 上 也 被 称 为 Dupin 柱 面 , 面 与 面 之 间 保 持 等 间距 。Bragg (1934) 质疑 : 为 什么 在 相同 的 条 件 下 , 这 些 柱 面 会 优 于 其 他 儿 何 结构 而 被 首选 ?为 了 回答 这 个 问题 , 我 们 ;要 把 Helfrich 自由 能 推广 为 产 | 四 CD, 六 各 d4, 其 中 四 是 任意 函数 ,4 409 % 32 AE YOR RT OTETR AT FE LEFE IC 是 内 表面 面积 , 刀 是 柱 面 厚 度 。 对 己 进 行 变 分 得 到 对 应 的 Euler-Lagrange 7j fe (Naito et al. 1995Sb ) : ie - K+¥)@, +2HK + V?)®, — 2H@=0 (11) 其 中 D,=ID/DH, Dx=IAD/IK, AAS HH MAY PEATE AS EAST? alli A) gdu'du! 和 L,du'du , 那么 Vv = (1/ vg) 0(KL;; VZ0)), 这 里 a d/ou', 2 Sie ay 220 方程 (LU 可 以 认为 是 Poisson 曲率 弹性 能 变 分 问题 的 最 广泛 推广 。 32.6 FPOIBHENIIE Ks Fe A 71 5 mers 最 近 , 日 本 的 实验 小 组 观察 到 踩 蛋白 (talin) 分 子 打开 磷脂 双 层 膜 的 过 程 (Saitoh 1998, Nomura 2001), 这 激发 了 对 开口 膜 泡 (open vesicle) 的 形状 方程 和 边界 条 件 的 理 论 研 究 。 墨 西 哥 的 广义 相对 论 研究 小 组 的 Capovilla 等 (2002) 首 次 研究 了 这 一 问题 , 但 是 他 们 的 方法 难于 被 凝聚 态 物理 学 家 所 理解 。 在 最 近 的 一 篇 文章 中 , 涂 展 春 等 将 外 微分 方 法 用 于 处 理 曲面 上 的 变 分 问题 , 简 单 地 导出 了 开口 泡 的 形状 方程 和 边界 条 件 (Tu et all. 2003)。 这 种 方法 既 能 避免 弘 复 的 张 量 运算 , 相 对 来 说 更 易 被 凝聚 态 物理 学 家 所 接受 。 如 图 33-5 所 示 , 我 们 将 开口 膜 泡 表示 为 带 边界 C 的 光 请 曲面 M。 在 曲面 上 的 任何 一 点 已 , 都 可 以 建立 一 个 正 交 归 一 的 坐标 系 {e, ex, e} , 使 得 es 为 法 矢量 。 对 于 边界 C 上 的 点 , Fre, Adee CHD, 而 e: 指 癌 曲面 M 上 的 点 。 我 们 将 开口 膜 泡 的 自由 能 写 为 : F =P [(ko/2)(2H + co)? + KK + A]dA + reds (12) 其 中 ,Y 表 示 边 界 的 线 张力 系数 ,8 表 示 边 界 曲线 的 距 长 。 利用 外 微分 方法 , 对 自由 能 方程 (12) 进 行 变 分 , 可 以 得 到 开口 泡 的 形状 方程 : k(2H + co)(2H* — co — 2K)+ 2k.V?H — 2AH = 0 (13) 以 及 边界 条 件 : [K(2H + cy) + kkjJc = 0 (14) [— Ke - V(2H)+ 7k, + kdt,/ds]c = 0 (15) [(k./ 2)(2H + 9)? + KK + A+ 7] = 0 (16) 其 中 , k,. ky AUT, ay ll ve HATS Hs | ME 8 es, V 是 二 维 梯度 算 子 。 安 攻 2 基带 边界 C 的 开 410 方程 (13)~(16) 实 质 上 是 曲面 和 边 上 的 力 和 力矩 平衡 方程 。 方 程 (13) 是 曲面 上 的 点 沿 面 法 线 e@3 方 各 的 力 平 衡 方程 ;方程 (14) 是 曲线 上 的 点 沿 它 的 切 矢 量 e 方 癌 的 力 算 平 衡 方 Fes 方程 (15) 征 曲线 上 的 点 治 面 法 线 e: 方 癌 的 力 平 衡 方程 ; 方程 (16) 是 曲线 上 的 点 治 e> 方 加 的 力 平 衡 方程 。 32.7 ”生物 膜 弹 性 理论 在 其 他 领域 中 的 应 用 “0 生物 膜 弹 性 理论 (elasticity theory) 还 可 以 被 应 用 于 其 他 领域 , 例 如 用 来 研究 碳 纳 米 管 的 力学 行为 、 六 体 膜 钨 和 微 乳 液 滴 动 力学 、 生 物 膜 的 AFM 成 像 等 。 7 EDS 1° {5 _ 自从 碳 纳米 管 发 现 以 来 (Dijima 1991), 它 的 力学 性 质 引 起 了 人 们 广泛 的 兴趣 (Yakobson et al. 2001, Treacy et al. 1996, Wong et al. 1997)。 其 中 有 两 个 问题 一 直 是 不 清楚 的 : 一 个 是 宏观 的 弹性 理论 是 否 还 适用 于 碳 纳米 管 第 二 个 是 单 层 碳 管 的 杨 氏 模 量 和 厚度 怎么 定义 。 这 两 个 问题 实际 上 是 关联 在 一 起 的 , 如 采 假 定安 观 板 帝 理论 在 介 观 尺度 有 效 , 就 可 以 很 好 地 定义 单 层 碳 管 的 杨 氏 模 量 和 有 效 厚度 (Yakobson et al. 1996), Lenosky 等 (1992) 提 出 了 摘 述 弯曲 的 单 层 石墨 结构 力学 行为 的 格 点 模型 : E= is, —ry+eS) [e, P+ éS\(1—n,-n)+ e5\(n,- u(n,-u) (17) (y) i 人 (ij) (i) ftrh ERAGE, BPI PK AR PAN ee RE A TK, JAPA eH 共振 对 能 量 的 贡献 。mn=1.42A 为 平面 石墨 结构 的 碳 碳 键 长 , 方 为 变形 后 原子 ;和 7 之 间 的 键 长 , 屿 为 原子 ;指向 其 近邻 原子 7 的 单位 矢量 , 凡 为 原子 ;的 3 个 近邻 原子 构成 的 平面 单位 法 矢量 ,> ,表示 对 原子 ;的 近邻 原子 求 和 ,> 表示 对 所 有 的 近邻 原子 求 和 。 Lenosky Y) @) SE FA ey 8 REZ PAE te BIZ RG 8s=0.96eV,8&=1.29eV,8&8=0.0SeV, 但 是 他 们 疫 有 给 出 ga 的 值 , 后 来 Zhou 等 (2000) 用 力 常数 法 给 出 as=57eV/A:。 Ou-Yang 等 (1997) 忽略 键 长 的 改变 ,利用 研究 生物 膜 弹 性 理论 的 微分 几何 工具 将 方程 (17) 连续 化 , 证 明 弯 曲 石墨 结构 的 曲率 能 可 以 写成 Helfrich 曲率 能 (cuo=0) 的 形式 : E° =|] [Samy + hx Jad (18) 其 中 到 = 1.17eV, ki /k=— 0.645, eae, ER ey Bvt, Tu 等 (2002) 发 现 当 存在 面 内 应 变 a 时 , 键 长 的 改变 需要 加 以 考虑 , 经 过 连续 化 后 , 可 以 把 方程 (17) 化 为 : sla E =|[ K (2HY + k,K|dA +|[ 3 + k,Q|dA (19) Firth J=(E,+8,\/2, Q=Enby — By, k=24.88eV, k/ k= — 0.678, TEE AW Ai / ke ~ hy/ kay 我 们 才 可 以 把 方程 (19) 写 成 宏观 板 壳 的 变形 能 形式 (Landau et al. 1986) . E= 1 | plan — 2(1 — v)K|d4 + ale . (2 — 201 — v)Q|dA4 (20) 其 中 ,D- 五 1 aya 为 壳 的 要 曲 刚度 ,C = 苑 为 壳 的 # 伸 刚度 ,u、 六 大 分 别 为 壳 的 泊 411 第 22 章 AEA RETOTE TRA SELEFE LE 松 比 、 杨 氏 模 量 和 厚度 。 至 此 , 我 们 可 以 说 宏观 壳 的 弹性 理论 适用 于 介 观 碳 纳米 管 , 并 且 由 此 可 以 定义 单 层 碳 纳 米 管 的 泊 松 比 、 杨 氏 模 量 和 有 效 厚度 分 别 为 从 0.34、 玫 4.70 TPa、 h=0.75A, Fea ———_ © | SCHR eS Die AS HRY FU ok SLUR TR oh FY bP — FEI. ~ Schneider 等 (1984) 假 定 了 “黏附 层 ” 边界 条 件 来 描述 界面 上 的 力 平 衡 , cat AS ae Pe FL TY i FA 和 体积 则 认为 是 不 变 的 (Jenkins 1977, Milner et al. 1987)。 与 此 不 同 的 是 ,van der Linden 等 (1989) 认为 , 对 于 流体 膜 泡 只 有 面积 是 常数 , 而 对 于 微 乳 液 镁 只 有 体积 是 常数 。 为 了 解决 这 一 困难 , Komura 等 (1993) 注 意 到 形状 方程 (7) 实 质 上 就 是 边界 上 的 力 平衡 条 件 , 而 不 必 考 虑 面积 或 体积 是 否 是 常数 , 对 于 流体 膜 泡 和 微 乳 液 滴 都 适用 , 因 而 他 们 称 方程 (7) 为 广义 Laplace 方程 。 为 了 建立 两 相 黏 性 六 界 面 上 的 动力 学 边界 条 件 , 方 程 (7) 被 推广 为 : [AP — 20H + k.(2H + c)(2H* — cH — 2K)+ 2k.V?H]n = Ao-n (21) 其 中 , n 是 界面 上 单位 法 矢量 ,Ac = Om — ou 是 界面 上 的 黏 滞 应 变 张 量 之 差 。 对 于 不 可 压 流体 , 黏 滞 应 变 张 量 与 流 场 之 间 有 如 下 关系 : (Gout, in)ap = TJout, hig 名 in)ap Si (V Vue in) Ba] (22) FEA, Mout, in Ee EL PY UTA AS Ba FA BL. Vour, in EF PU th, ET EASA Navier-Stokes 方程 (Landau et al. 1970), 32.73 “生物 本 站 AFM (jms 原子 力 显 微 镜 (atomic force microscope, AFM) 具有 独特 的 空间 分 辩 率 , 因 此 可 以 用 来 研究 细胞 生物 膜 的 结构 和 力学 性 质 。 但 是 ,由 于 生物 膜 的 独特 环境 和 柔软 的 力学 性 能 , 不 能 再 像 固体 材料 那样 去 解读 AFM 的 数据 , 数据 的 分 析 具 有 很 大 的 挑战 。 为 了 克服 这 一 困难 ,Fan 等 (2003a) 提 出 了 一 套 理论 方案 , 他 们 的 理论 方案 充分 地 体现 了 生物 膜 柔 软 的 力学 特征 和 带电 环境 , 其 中 生物 膜 的 形状 方程 也 得 到 了 进一步 地 应 用 和 拓展 。 为 攻 虑 生物 膜 内 外 的 带电 环境 , 需 要 用 包含 电磁 场 的 准 静 态 Navier-Stokes 方程 : — V;P + nV3V + SR =0 (xE Q) V;- V=0 Ge Q)) (23) 和 线 化 的 Poisson-Boltzmann 方程 : Va30 =KO (x = Q ha (24) V3¢=0 CE QQ) 其 中 ,V: 和 Yi 表示 三 维 梯度 算 子 和 Laplace 算 子 ,sa SAINTS IT HL BL, Vee ARTE A itt, x © 人 2 表示 对 于 溶液 中 的 点 成 立 , x 表示 对 于 尖端 上 的 点 成 立 , 表示 电势 kK ”是 Debye 长 度 。 注 意 在 写 出 上 述 两 方程 “经 用 到 了 Debye-Hiickel 线 化 412 近似 (Bromberg 1984), 为 了 考虑 膜 的 弹性 , 基 于 形状 方程 (7) 的 流体 动力 学 边界 条 件 , 方 程 (21) 被 进一步 推 三 为 : [ AP — 20H + k.(2H + c)(2H? — co — 2K)+ 2k.W2H]n + VA=At-n (25) Fan 等 (2003b) 认为 膜 的 表面 张力 会 因 APM 的 尖端 靠近 而 局 部 改变 , 所 以 上 式 出 现 了 项。 此 外 Ar 表示 膜 外 侧 和 内 侧 的 应 力 张 量 差 , 由 于 考虑 准 静态 流体 , 可 以 忽略 流体 黏 滞 力 的 贡献 , 故 它 主要 来 自 溶液 带电 环境 的 贡献 , 因 此 只 需 考虑 Maxwell 静 电 应 力 张 量 六 sa[(V:)(V:g) 一 于 (Vig)] , 其 中 1 表示 单位 张 量 (Landau et al. 1984)。 908 生物 膜 泡 的 形状 问题 为 物理 学 家 和 数学 家 提供 了 一 个 广泛 的 研究 领域 (Du-Yang et al. 1999, Ou-Yang 2001), 也 为 生物 学 家 提供 研究 生物 膜 泡 的 理论 框架 。 尽 管 已 经 取得 了 一 系列 成 果 , 但 这 个 领域 还 处 于 初期 , 期 待 着 更 多 的 理论 和 实验 上 的 进展 。 从 理论 上 看 , 需 要 在 以 下 几 个 方面 取得 进展 。 闭合 膜 泡 形状 方程 (7) 的 解析 解 的 寻找 。 由 于 方程 (7) 是 非 线性 偏 微分 方程 , 是 否 能 找 到 更 多 的 满足 方程 (7) 的 解析 特 解 仍然 是 一 个 具有 挑战 性 的 数学 难题 , 寻找 代表 闭合 曲面 的 解析 解 更 加 困难 。 满足 开口 泡 形状 方程 (13) 和 边界 条 件 方程 44) 一 (16) 的 数值 解 的 实现 。 找 到 满足 方程 (13)~(16) 的 解析 解 儿 乎 是 不 可 能 的 , 尽 管 我 们 已 经 找到 少数 的 几 个 (Tu et al. 2003), 此 有 必要 寻求 数值 解 。 即 使 在 轴 对 称 的 情况 下 , 上 面 的 方程 与 轴 对 称 的 几何 限制 一 起 构 成 一 组 非 线性 微分 方程 的 初 边 值 问 题 。 数 值 求解 这 种 问题 仍然 具有 很 大 的 困难 。 ( 涂 展 春 ”欧阳 钟 灿 ) iene IE NEGO: Si SR a NN FCM. 1983. 生物 力学 . 北京 : 科学 出 版 社 Alberts B, Bray D, Lewis J, et al. 1994. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. New York: Garland Science Publishing Alexandrov A D. 1962. Uniqueness theorems for surfaces in the large. Amer Math Soc Transl, 21: 341-416 Bragg W. 1934. Liquid crystals. Nature, 133: 445 Bromberg J P. 1984. Physical Chemistry. Boston: Allyn & Bacon Capovilla R, Guven J, Santiago J A. 2002. Lipid membranes with an edge. Phys Rev E, 66: 021607 Capovilla R, Guven J. 2002. Stresses in lipid membranes. J Phys A: Math Gen, 35: 6233-6248 Childs G V. 1995. http://www.cytochemistry.net/Cell-biology/membrane.htm de Gennes P G. 1975. The Physics of Liquid Crystals. Oxford: Clarendon Deuling H J, Helfrich W. 1976. The curvature elasticity of fluid membranes: a catalogue of vesicle shapes. J Phys (Paris), 37: 1335-1345 Deuling H J, Helfrich W. 1976. Red blood cell shapes as explained on the »asis of curvature elasticity. Biophys J, 16: 861-868 Duwe H P, Kaes J, Sackmann E. 1990. Bending elastic moduli of lipid bilayers: modulation by solutes. 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Phys Rev B, 62: 13692-13696 聚 电 解 质 稳 定 化 的 脂 质 体 35 hh Sire the le eth tk cect es muse eas 415 全 汉人 本 有 417 33.2.1 Sra ER ECA DMPA 脂 质 体 oes cceeeeeeeeeeee 417 BFF» Earp ap GL A etc. ace icc heScd sd detec chon essa godotoncees 419 本 章 阐述 了 脂 质 体 的 制备 及 基本 特征 , 同时 介绍 了 层 层 组 装 技术 应 用 于 棍 脂 修饰 的 聚 电解 质 微 胶 圳 的 方法 , 另 一 方面 给 出 了 聚 电解 质 稳定 化 的 脂 质 体 特 征 。 在 聚 电解 质 微 胶 吉 表面 吸附 不 同 密度 的 磷脂 双 层 , 可 以 改变 聚合 物 的 渗透 性 质 。 对 于 磷脂 不 完全 修饰 的 微 胶 吉 , 其 对 小 分 子 染 料 是 可 渗透 的 。 而 磷脂 修饰 完全 的 微 胶 吉 , 无 论 是 单一 磷脂 还 是 混合 磷脂 小 分 子 染 料 均 无 法 渗透 进 入 微 胶囊 的 内 部 , 实 现 微 胶 吉 由 可 渗透 向 不 可 渗透 的 转变 。 在 磷 脂 履 盖 的 微 胶囊 表面 吸附 聚合 物 之 后 , 用 低 浓 度 乙 醇 溶 液 进行 处 理 , 微 胶 宫 的 沙 透 性 质 没 有 明显 改变 。 由 此 得 出 , 外 层 吸附 的 聚 合 物 对 磷脂 双 层 有 保护 功能 ,起 到 了 聚 电解 质 稳定 脂 质 体 的 作用 。 33.1 ASV ASS tS 511 rs 由 闭合 的 类 脂 (lipid) 双 层 在 水 相 中 形成 的 有 序 组 合体 称 为 Ha fs 〈liposome) , 它 们 的 直径 从 几 十 到 几 百 纳米 , 微 米 级 的 称 为 大 宫 泡 (gaint vesicle) 。 脂 质 体 最 显著 的 特征 是 黏附 (adhesion)、 fa (fusion) 和 变形 (fluctuation)。 通 常情 况 下 , 脂 质 体 的 制备 方法 有 注入 法 和 薄 壁 法 。 注 入 法 是 将 成 膜 类 脂 溶解 在 有 机 溶剂 中 , 然后 将 此 溶液 用 注射 器 缓慢 注入 三 “” 中 溶液 中 , 在 一 定 的 温度 下 超声 处 理 , 直 到 溶液 泪 清 透明 ,” “ 便 获 得 脂 质 体 的 分 散 液 。 干 燥 的 脂 质 体 能 在 透射 电镜 下 观 稀 有 具体 的 样品 制备 过 程 为 : 先 把 伏 尔 马 (Formvar) AIA AR, =P, 配置 成 0.3% 的 溶液 ; 将 一 块 洁 净 的 玻璃 片 浸 入 到 溶液 上 3min 后 垂直 提出 , 静 置 Smin , 生 物 膜 Biomembranes 416 待 氯仿 挥发 完全 后 会 在 玻璃 片上 留 下 一 层 攻 薄 的 伏 尔 马 膜 , 用 刀片 轻 轻 刮 掉 周 边 的 伏 尔 马 膜 , 再 在 上 边界 处 用 小 刀 划 线 , 把 玻璃 片 以 45" 轻 轻 放 入 Millipore 水 中 , 伏 尔 马 膜 会 从 玻璃 片 表 面 剥 落 , 漆 在 水 面 上 , 用 狠 子 小 心地 把 230 目 铜 网 铺 在 伏 尔 马 膜 上 , 再 用 滤 CHEAT Fel II TK OB SROKA eo, I, ates 将 约 LOW Re EE, Fe 纸 从 边缘 吸 去 多 余 的 样品 ; 由 于 脂 质 体 的 对 比 度 很 低 , 不 能 直接 用 电镜 观察 ,所 以 用 2% 的 酷 酸 双 氧 铀 溶液 襟 在 铜 网 上 染色 约 Imin 左 右 , 多 余 的 染 液 用 滤纸 吸 去 , AP, 可 进行 电镜 观察 。 不 同 的 磷脂 (phospholipid) 在 形成 稳定 的 脂 质 体 时 有 不 同 的 相 转变 温度 , 通 常 认 为 在 高 于 磷脂 的 相 转变 温度 时 才能 形成 稳定 的 脂 质 体 .用 负 染 色 电 镜 法 研究 不 同 温 度 下 L-oa- WL PY toe FE oe AS’ (DMPA)、L-o- 双 十 六 烷 基 础 脂 酸 (DPPA)、L-o- 双 十 八 烷 基 磷脂 酸 (DSPA) 、L-o- 双 十 六 烷 基 础 脂 酰 胆 碱 (DPPC) 等 磷脂 分 子 聚集 体形 态 变化 , 发 现 PA 型 磷脂 分 子 对 温度 比 DPPC 分 子 聚集 体 敏 感 ,DPPC Ria 温度 (Blume 1993), 其 中 较 低 的 为 预 转变 温度 , 较 高 的 为 主 转变 温度 。 在 预 转变 温度 下 , 双 层 处 于 有 序 的 胶 晶 相 , 此 时 碳 氧 键 从 双 层 面 上 和 翘 起 。 在 主 转变 温度 以 上 , ane 膜 经 历 了 从 有 序 的 胶 晶 相 到 无 序 的 液晶 相 。 在 主 转变 温度 和 预 转变 温度 之 间 的 相称 为 条 纹 相 (ripple phase) ( Matuoka et al. 1994) , 这 个 相 的 特征 就 是 有 周期 性 重复 链 段 的 振动 膜 结构 组 成 , 该 特征 在 中 性 溶液 中 仅 在 PC 和 PG 磷脂 中 被 观察 到 (Blume 1993), PA 型 分 子 只 有 一 个 相 转 变温 度 , 不 存在 预 转变 温度 , 由 此 可 见 ,DPPC 在 41C 以 上 易 形成 囊 泡 , 而 当 温 度 底 于 41C , 降 低 到 35C 时 仍然 主要 以 圳 泡 形 式 存在 , 而 相应 的 PA 型 磷脂 分 子 不 存在 这 样 的 温度 。 图 33-1 为 DPPC 稀 溶 液 在 40C 时 聚集 形态 的 透射 电镜 图 , 进 一 步 升 高 温度 到 45C , 仍然 得 到 清晰 的 圳 泡 ( 图 33-2), 表明 两 个 温度 下 DPPC 聚 集体 形态 几乎 没有 变化 。 如 果 把 该 体系 置 于 25C 或 更 低 的 温度 时 , 电 镜 下 可 以 观察 到 DPPC 分 子 的 片 层 结构 。 40C 时 稀 溶 液 中 DPPC EIB 45C 时 稀 溶 液 中 DPPC 圳 泡 脂 质 体 在 生物 体内 可 以 自发 形成 , 但 在 人 工 制 各 中 却 受 很 多 因素 影响 。 分 子 本 身 结 构 、 温度 和 溶液 酸 碱 性 对 磷脂 分 子 聚 集体 形态 的 影 路 朋 大 , 其 中 温度 和 pH 值 对 脂 质 体 稳 定性 的 影 听 最 大 。 表 33-1 列 出 了 几 种 磷脂 形成 脂 质 体 乒 相 转 变温 度 随 溶液 酸 碱 性 的 影响 。 sa .JJ 二 417 338 Fe HE WEEE (EHNA pH 4.0 pH 7.0 pH 12.0 DMPA 52.9 51.3 21.5 DPPA 65.4 64.7 42.7 DSPA = 74.4 = DPPC 41.5 41.6 40.8 当 溶 液 的 pH < 7h, PA 型 磷脂 的 端 基 质子 化 或 部 分 质子 化 , 有 可 能 形成 分 子 间 氢 键 网 络 (Garidel et al. 1998),, 在 端 基质 子 化 或 部 分 质子 化 的 情况 下 , 端 基 之 间 的 静电 排斥 作用 和 水 合作 用 也 随 之 减弱 。 当 溶液 为 碱 性 时 ,PA 型 磷脂 端 基 上 的 质子 会 部 分 或 全 部 电离 , 此 时 PA 型 磷脂 分 子 带 一 个 或 两 个 单位 负电 和 荷 , 破坏 了 分 子 间 氢 键 网 络 , 端 基 之 间 的 静电 排斥 作用 和 水 合作 用 增强 (Jihnig et al. 1979), 这 些 作用 强烈 地 影响 着 磷脂 分 子 的 性 质 , 分 子 之 间 有 “排斥 ”的 趋势 , 从 而 使 磷脂 的 相 转变 温度 明显 降低 。 已 经 知道 , 当 磷脂 经 历 其 相 转 变温 度 时 , 磷 脂 分 子 的 形态 会 发 生变 化 ,因此 溶液 酸 碱 性 对 磷脂 分 子 的 形态 影响 主要 是 通过 影响 其 相 转 变温 度 来 实现 的 。 对 于 PA 型 磷脂 而 言 , 使 其 碱 化 的 效果 与 在 酸性 状态 使 其 升温 对 其 形态 的 影响 相似 。 因为 在 酸性 状态 下 升 高 温度 也 可 以 破坏 分 子 间 氢 键 网 络 , 分 子 中 的 烷 基 链 由 有 序 态 逐 渐 向 无 序 态 转变 ,分子 间距 离 增 大 , 分 子 堆 积 趋 于 “ 玻 松 "。 如 DMPA, 在 30C 碱 性 条 件 下 ,分 子 以 椭圆 形 圳 泡 存在 , 而 在 同样 温度 水 溶液 中 则 无 法 形成 椭圆 形 的 吉 泡 聚集 体 。 对 于 PC 型 磷脂 , 由 于 改变 溶液 的 酸 碱 性 不 能 改变 其 端 基 的 性 质 , 其 相 转 变温 度 受 溶液 酸 碱 性 影 响 不 大 , 所 以 在 温度 一 定 的 情况 下 , 改变 溶液 的 酸 碱 性 , 对 PC 型 磷脂 分 子 的 聚集 形态 影 响 不 大 。 所 有 这 些 , 已 经 通过 负 染 色 电 镜 法 所 得 到 的 图 片 证 实 。 33.2” 聚 电 解 质 稳定 的 脂 质 体 33.2.1 取 电 解 质 各 定 化 门 PMEA | 7,5 mmm 图 33-3 为 30C 时 DMPA 脂 质 体 负 妆 透 射电 镜 图 。 从 图 中 可 以 看 出 , 脂 质 体 是 椭圆 emeeeey 30C(A) 和 1SCB) 时 DMPA 脂 9 Te (4 Fe Be EI “Of 物 膜 Biomembranes 418 形 的 ,把 此 溶液 冷却 到 15C 时 ,DMPA 分 子 多 以 胶 束 形式 存在 于 溶液 中 。 说 明 当 温度 低 于 磷脂 的 相 转变 温度 时 , 脂 质 体 不 能 稳定 存在 (Zaslavsky et al. 1981)。 然 而 , 如 果 通 过 静电 作用 将 聚 电 解 质 (polyelectrolyte) 吸附 到 DMPA 脂 质 体 表面 上 , 同 样 冷却 到 相同 温 度 后 , 发 现 溶液 中 仍 有 椭圆 形 脂 质 体 存在 〈 图 33-4A) 。 如 果 在 室温 下 把 磷脂 溶 液 和 聚 电 解 质 溶液 混合 均 义 , 再 加 热 到 30C 以 上 , 用 负 桨 电镜 法 可 以 清楚 看 到 磅 脂 / 聚 电解 质 圳 泡 的 存在 (图 33-4B)(Ge et al. 2003a ) 。 A B 30C(A) 和 15C(B) 时 表面 覆盖 PAH 的 DMPA 脂 质 体 的 负 染 色 电镜 图 Zaslavsky 等 (1980) 研 究 发 现 , 有 机 溶剂 (如 醇 及 醇 的 衍生 物 ) 能 破坏 脂 质 体 的 结构 , DMPA 脂 质 体 用 乙醇 处 理 过 后 将 变 成 棒状 的 胶 束 《图 33-5). 通过 对 表面 覆盖 聚 电解 质 的 DMPA 脂 质 体 的 研究 发 现 , 在 脂 质 体 的 外 层 履 盖 聚 电解 质 后 , 降 低温 度 和 用 表面 活性 剂 处 理 聚 电 解 质 修饰 的 磷脂 溶液 , 发 现 脂 质 体能 保持 圆 形 的 要 泡 结构 , 说 明 外 层 聚 电解 质 对 脂 质 体 起 到 了 保护 作用 。 聚 电解 质 修 饰 的 DMPA 脂 质 体 及 媳 入 乙醇 处 理 后 的 电镜 图 A. 表 面 吸附 有 带 正 电荷 的 聚 电 解 质 聚 烯 两 基 氨 基 盐 酸 喜 (PAH) 的 脂 质 B. 表面 覆盖 聚 电 解 质 PAH 的 脂 质 体 用 乙醇 处 理 后 仍然 能 够 维持 其 原 有 的 形状 419 BIS# FR Het Ape AGE (Es 33.2.2 HAY) FE (CA fl 5 Emm 为 了 更 直观 地 研究 脂 质 体 的 性 质 , HF ER ER ER AS ll CH A ER A SR HS WO Gre BE (microcapsule) , 然后 把 磷脂 吸附 在 微 胶 圳 表面 , 可 以 构成 一 个 由 聚 电 解 质 多 层 膜 支 撑 的 大 脂 质 体 。 Decher (1991, 1997) 最 早 在 平面 固体 介质 上 利用 层 层 组 装 (layer-layer-assembly ) 技 术 构 造 了 纳米 尺寸 的 多 层 聚 电解 质 膜 。 这 种 方法 的 本 质 是 通过 分 子 间 静电 作用 , 使 带 正 负电 和 荷 的 大 分 子 交 替 吸 附 在 固体 表面 ,使 固体 表面 带 相应 的 正 负 电 符 , 以 便 下 一 步 吸附 。 到 目前 为 止 , 已 有 很 多 材料 , 如 蛋白 质 、 核 酸 、 磷 脂 、 有 机 和 无 机 纳米 颗粒 被 吸附 在 平 面 介 质 上 ,从 而 得 到 有 特定 厚度 、 组 成 和 性 质 的 多 层 膜 。 如 果 把 作为 模板 的 平面 载体 改 为 胶体 颗粒 组 装 上 多 层 膜 后 , 除 去 内 核 , 可 以 得 到 空心 的 聚 电解 质 微 胶囊 (Caruso et all 1999), 实 现 多 层 膜 从 二 维 向 三 维 的 转变 。 因 而 可 以 利用 有 特定 结构 和 界面 性 质 的 胶体 粒 子 设计 构造 微 胶囊 (图 33-6), 聚 电 解 质 吸附 和 去 除 模板 得 到 空心 的 聚 电解 质 微 胶囊 模板 多 采用 可 溶解 于 盐酸 的 喀 胺 甲醛 胶体 粒子 , BY DT TE HEL AY) SR A SG SE ED 盐 (PAH) 和 人 带 负 电 的 聚 葵 乙 炳 磺 酸 钠 (PSS)( 平 均 分 子 质量 为 70 000 Da) 作 为 层 层 组 装 材料 。 分 别 溶解 于 0.5 mol/L 的 氯 化 钠 溶液 中 , 每 次 吸附 时 间 为 30min, 吸 附 完 成 后 , 用 离心 分 离 的 方法 除去 多 余 的 聚 电 解 质 去掉 上 层 清 液 ) , 然 后 用 水 洗 3 次 后 进行 下 一 步 吸附 。 吸 附 达 到 了 预期 的 层 数 之 后 , 加 入 0.1 mol/L 的 盐酸 , 放 置 2 一 3min, 除 核 , 离 心 , 洗 涤 , 除去 多 余 盐酸 后 把 获得 的 空心 聚 电解 质 微 胶 圳 重新 分 散在 适当 的 溶剂 中 保存 备用 。 在 制备 聚 电解 质 微 胶 吉 过 程 中 , 除去 模板 是 关键 的 一 步 ,Gao 等 (2001a, b) x} FLARE 和 营 详 细 的 研究 。 有 具体 实验 过 程 如 下 : 用 罗丹 明 荧 光标 记 直 径 为 6.4hum 的 MEF, 再 交替 吸附 8 层 PSS/PAH 聚 电解 质 , 然 后 用 共聚 焦 激 光 显 微 镜 跟踪 MF 在 pH 为 1.0 的 盐酸 溶液 中 的 溶解 过 程 。 由 于 罗丹 明 的 菊 光 强度 不 受 溶液 pH 的 影响 , 以 根据 荧光 强度 的 变化 表 征 核 的 溶解 过 程 。 从 研究 结果 可 知 , 完 全 的 核 溶 解 过 程 ise 20s。 在 核 溶 解 过 程 中 , 核 的 直径 在 20s 内 增加 很 快 , 之 后 趋 于 不 变 。 用 荧光 标记 的 磷脂 可 以 验证 磷脂 吸附 在 微 胶 圳 上 ALR EA) 0.025 mg/ml DMPA (5% NBD-DPPC) 磷脂 水 溶液 , 加 入 已 经 制备 好 的 聚 电 ” 责 空 心 球 溶 液 [PSSPAH):] 中 , - Fo H Wy WR Biomembranes 420 吸附 30min (fe HEFCE EET Tl (ECA BBA fy). PRE 15°C 5000g 离心 10min, 除 去 上 层 清 液 , 用 水 洗涤 3 次 , 制 样 后 用 共有 聚焦 激光 显微镜 观察 。 从 图 33-7 可 以 看 出 , 在 聚 电解 质 空心 球 外 层 吸 附 了 磷脂 膜 , 但 同时 在 空心 球 内 部 也 有 交 光 , 这 说 明 在 吸附 过 程 中 , 小 分 子 的 磷脂 通过 空心 球 壁 渗透 进入 了 聂 电 解 质 空心 球 内 。 根 据 Sukhorukov 等 (1999) 的 研究 可 以 知道 : 在 溶液 PH<6.5 时 《所 用 的 溶剂 为 Milli-Q 水 ,p 了 为 5.3), 聚 电解 质 空 心 球 对 于 分 子 质 量 小 于 4000 Da 的 分 子 是 可 渗透 的 , 而 对 于 分 子 质量 大 于 4000 Da 的 分 子 是 不 涂 透 的 。 因 此 在 加 入 磷脂 溶液 后 , 在 磷脂 吸附 到 聚 电解 质 空心 球 的 过 程 中 , 必 然 有 一 定量 的 磷脂 渗透 进入 空心 球 内 部 。 因 为 空心 球 的 最 外 层 为 带 正 电 街 的 聚 胺 基 两 烯 酸 盐酸 盐 , 所 以 带 负 电 的 磷脂 可 以 通过 静电 吸附 作用 在 球 的 外 层 形成 均匀 的 磷脂 层 。 而 外 部 少量 很 弱 的 灾 光 材料 , 可 能 是 洗涤 不 完全 造成 的 。 由 此 可 见 , 大 脂 分 子 能 吸附 到 聚 电 解 质 空心 球 表面 , 且 在 至 心 球 表面 形成 均匀 的 磅 脂 层 《Ge et al. 2003b) 。 莹 光标 记 的 磷脂 吸附 在 聚 电解 质 微 胶 圳 表面 的 共聚 焦 激光 显微镜 图 把 浓度 分 别 为 0.0125 mg/ml 和 0.025 mg/ml AYRE ASA He HA Bl ea BR AS Ze ee Bs BR a Fe A ac th RA ISI DER, IRE 30min, 离 心 , 除 去 上 层 多 余 的 磷脂 溶 液 , 用 水 洗涤 3 次 。 在 空心 球 的 外 层 均 匀 地 包 右 了 一 层 磷脂 膜 后 , 用 共聚 焦 激 光 显 微 镜 进行 观察 , 结 果 如 图 34-8A 和 了 B 所 示 。 可 以 看 出 , 在 磷脂 浓度 很 低 时 , 微 胶囊 内 部 充满 了 荧光 桨 料 分 子 , 说 明 获 得 的 微 胶囊 对 于 极 性 小 分 子 染 料 是 可 渗透 的 。 这 可 能 因为 磷脂 没有 在 表面 形成 致密 的 双 层 或 者 多 层 结构 , 不 能 阻挡 住 外 部 的 极 性 小 分 子 桨 料 涂 透 入 内 部 。 由 于 静电 吸附 , 微 胶 圳 壁 上 的 奖 光 强度 比 周 围 本 体 中 的 荧光 强度 大 , 所 以 比较 亮 。 而 当 吸 附 磷 脂 的 浓度 比较 高 时 , 吸附 在 壁 上 的 磷脂 可 以 在 聚 电解 质 空心 球 表面 形成 致密 的 WE (或 者 多 层 ) 膜 , 从 而 有 效 阻 止 小 分 子 极 性 染料 渗透 入 微 胶 圳 内 部 , 所 以 微 胶 圳 内 部 是 黑色 的 , 说 明 没 有 桨 料 分 子 涂 透 进 入 内 部 (Sukhorukov et al. 2000) 。 由 此 可 以 看 出 , 通 过 在 聚 电解 质 空心 球 表 面 吸附 磷脂 可 以 控制 这 种 新 型 微 胶囊 的 渗透 性 ,从 而 可 以 把 小 的 极 性 分 子 包 庄 在 微 胶囊 中 , 这 对 于 研究 其 渗透 和 吸附 性 质 是 十 分 重要 的 。 运 用 共聚 焦 激 光 显 微 镜 的 优点 是 可 以 在 溶液 中 进行 形态 观察 ,但 其 不 足 之 处 是 分 辩 率 比较 低 且 需要 加 入 荧光 染料 。 扫 拉力 显 微 僻 可 以 克服 这 些 缺 点 ,同时 在 纳米 水 平 上 提供 高 精度 的 结构 信息 (Leporatti et al. 2000) , 未 面 给 出 了 于 燥 状 态 下 扫描 力 显 微 镜 的 微 胶 宅 表面 结构 图 (图 33-9)。 Sa a a 421 8338 RR ee fie FE (Cg (| 33-8 RS eS ena Gs Aes A. 吸附 低 浓 度 磷 脂 的 聚 电 解 质 空心 球 对 小 分 子 极 性 染料 可 涂 透 , 微 胶囊 内 有 大 量 的 染料 分 子 ,B. 吸附 高 浓度 磁 脂 的 聚 电 解 质 空心 球 对 小 分 子 极 性 染料 不 渗透 , 内 部 黑洞 表明 桨 料 分 子 被 阻挡 在 圳 壁 外 B A. 吸附 低 浓度 DMPA 磷脂 的 聚 电解 质 胶 圳 的 扫描 力 显微镜 图 (接触 模式 ) ,B,A 中 方 框 范 围 内 进 一 oe 出 的 高 精度 扫描 力 显微镜 图 图 33-9 和 33-10 分 别 为 不 同 状态 下 , 磷 脂 修饰 的 微 胶 圳 显微镜 图 。 从 图 中 可 看 出 , 磷脂 修饰 的 微 胶 吉 表 面 是 连续 的 膜 , 由 于 溶剂 的 蒸发 而 使 微 胶 圳 发 生 裙 皱 。 图 33-9 为 吸 — we oh Fe 7 A GC Rk EY BES, Fy: 聚 电解 质 厚度 为 1.3 nm。 FA PS BY YY 10 4S J SR HP De AY JE E24 25 nm, ane TAT OBS EY ee EIA) 3.4 nm, 两 者 之 差 即 为 磷脂 层 的 厚度 , 大 约 为 Snm, 说 明 磷 脂 是 双 层 吸附 。 将 图 33-9A 中 划 框 部 分 (CT AE) 放大 , 可 以 看 出 微 胶 PEA) Ze i (RH fie FE BEY BLE re aR EEG Co RTA HP , 得 到 了 对 |; aI FANE AY BE AGE THA FS HEL APE IO Gl We BE . TEAC RES ee BY RE EE 35 和 图 33-9A 中 无 折合 区 进 一 步 放大 得 到 微 胶 吉 的 表面 精细 结构 , 其 平均 粗糙 度 为 图 33-10 为 把 聚 电解 质 微 胶 吉 分 散在 高 浓度 纯 DK 液 中 ,获得 的 扫描 力 显微镜 。 在 无 裙 皱 区 计算 微 胶 圳 的 壁 厚 为 32 nm, 由 于 溶剂 ” 三 而 导致 壁 裙 钱 。 对 图 33-10A 中 无 折 县 区 放大 得 到 微 胶 圳 的 表面 结构 如 图 33-10B, 主 ”: 均 粗糙 度 为 3.3 nm, 物 膜 Biomembranes 422 — 0 4.14um A B A. 吸附 高 浓度 DMPA 磷脂 的 扫描 力 显微镜 图 ,B.A 中 方 框 内 高 精度 扫描 力 显 微 图 实验 证 实 , 表面 吸附 的 磷脂 层 可 以 调节 聚合 物 微 胶 吉 的 表面 渗透 性 , 在 药物 释放 体 系 中 这 是 一 个 很 重要 的 性 质 , 利 用 此 性 质 包 庄 药物 分 子 可 用 于 控制 释放 。 此 外 , 聚 电解 质 吸附 在 磷脂 修饰 的 聚合 物 微 胶 圳 的 表面 , 将 影响 磷脂 双 层 的 稳定 性 。 用 菊 光 标记 的 聚 电 解 质 在 磷脂 修饰 的 聚合 物 微 胶 吉 表 面 进行 吸附 , 可 以 得 到 聚 电 解 质 稳 定 的 磷脂 修饰 的 聚合 物 微 胶囊 。 图 33-11 所 示 的 外 层 红色 的 荧光 环 , 证 明 聚 电解 质 再 次 吸 附 在 磷脂 修饰 的 微 胶 宫 表 面 。 吸附 聚 电解 质 后 , 用 低 谊 度 有 机 溶剂 处 理 , 然 后 水 洗 除去 多 余 的 有 机 溶剂 , 将 其 重新 分 散在 水 中 , 发 现 微 胶 襄 的 表面 依 然 有 强烈 的 红色 奖 光 , 这 说 明 磷 脂 修饰 的 胶 吉 最 外 层 吸附 聚 电解 质 后 再 用 有 机 溶剂 处 理 , 可 有 效 阻 止 磷脂 层 的 结构 变化 。 在 层 层 吸附 组 装 技术 中 , 随 着 不 同 电 = 茶 的 物质 被 交替 吸附 , 微 胶囊 表面 的 电 性 也 交替 变化 , 以 此 证 明 不 同 电荷 的 物质 成 恬 关 沁 明天 光标 记 的 聚 电 解 质 吸附 在 磷脂 修饰 0 用 SpsORIME2ET, PA 33-12 ILA, PAR FL A J BEE, “4 RAR AE 烯 酸 盐酸 盐 时 , 微 胶 圳 的 表面 电荷 为 正 值 , 大 约 为 43mV。 当 表面 覆盖 了 带 负电 荷 的 磷脂 之 后 , 微 胶 圳 的 表面 电势 变 为 负 值 , 约 为 -= 37mV, 这 说 明 磷脂 顺利 吸附 到 了 微 胶 圳 的 表 面 。 如 果 用 低 浓 度 的 有 机 溶剂 对 微 胶 宫 进 行 处 理 , 有 机 溶剂 将 破坏 微 胶 圳 表面 的 磷脂 层 。 当 微 胶 圳 再 次 被 分 散在 水 中 ,, 微 胶 吉 的 表面 带 正 电 和 谷 。 如 果 在 磷脂 覆盖 的 微 胶 圳 表面 吸 附 一 层 带 正 电荷 的 聚 氮 基 内 烯 酸 盐酸 盐 , 微 胶 圳 的 表面 电荷 将 转变 为 正 值 , 大 约 为 44mV, 说 明 聚 电解 质 已 被 吸附 在 磷脂 的 表面 。 用 低 去 度 的 有 机 溶剂 处 理 微 胶囊 , 测 得 表 面 电势 为 正 值 , 说 明 聚 电 解 质 吸附 在 微 胶囊 的 外 层 ,; 间 一 步 证 实 聚 电 解 质 对 磷脂 修饰 的 微 胶 圳 起 到 了 保护 作用 (Ge et al. 2003d ) 。 SE ee ee 423 8338 SB He fie A gE (CA A PSS/PAH/DMPA/Rb-PAH 乙醇 处 理 PSS/PAH/DMPA 乙醇 处 理 PSS/PAH/DMPA 吸附 不 同 物质 的 微 胶囊 的 表面 电势 图 为 了 定量 地 表征 磷脂 修饰 的 微 胶 宫 的 活 透 性 ,用 激光 长 时 间 照射 , 麻 白 微 胶 吉 内 部 的 染料 分 子 , 之 后 定量 地 记录 外 部 染料 分 子 扩散 进入 微 胶 吉 的 速率 , 直 至 胶 圳 内 部 的 区 光 强 度 与 外 部 保持 不 变 。 图 33-13 是 用 共聚 焦 激 光 显 微 镜 测 得 的 微 胶 吉 麻 白 与 恢复 过 程 。 从 图 中 可 看 出 , 奖 光 漂 和 白 前 微 胶 面 是 可 认 透 的 (内 外 奖 光 强度 相似 ),, 漂白 后 微 胶 吉 内 部 为 黑色 (图 33-13B), 说 明 内 部 的 荧光 分 子 被 漂白 掉 。 图 33-13C 为 荧光 恢复 过 程 中 的 共聚 焦 激 光 显 微 镜 图, 此 时 微 胶 吉 内 部 染料 较 少 。 待 奖 光 恢复 完全 , 随 时 间 变 化 荧光 强度 不 再 改变 , 说 明胶 圳 内 外 桨 料 分 子 谊 度 趋 于 平衡 《图 33-13D) 。 恢复 eee al poo Sum B Gc D BERmes, HR ORAKER EWE AOL iRe FASE SS BE OE Se ET ARE oy FE BY 6-CF By 72 TL Fb i oe PE WE TE BP HT, 可 TR fc BE TARE a FER 6-CF 的 扩散 系数 , 下 面 国 数 对 实验 曲线 进行 拟 合 (Klonis et al. 2002) : I=[,[1 —Sexp( 一 t/T, (1) 424 {er Sa AN 33-14 Pas, PARAS EH Tp AIL. FEV, UE Fes (1) 的 结构 也 同时 遵守 Fick 规律 =~ GC) Q) 其 中 ,C、C 分 别 表示 微 胶囊 外 部 和 内 部 的 染料 浓度 。 在 溶液 中 当 小 分 子 染 料 穿 透 具 有 一 定 厚 度 和 直径 的 壁 时 渗透 系数 人-1/7h, 同 时 渗透 系数 , CDi (3) 其 中 , 六 天 分 别 为 微 胶 豆 的 半径 和 厚度 , 刀 为 渗透 系数 。4 的 值 在 拟 合 时 得 出 , 从 而 计 算出 渗透 系数 站 荧光 强度 比 100 150 200 250 300 350 400 450 时 间 /s 荧光 漂白 恢复 全 过 程 曲 线 图 , 样 品 为 (PSSPAH), 微 胶 吉 对 于 (PSS/PAH): (Kee, A = 1.83, 微 胶 吉 的 半径 约 为 3 x 10 cm, 微 胶 吉 的 壁 厚 约 3 x 10 “cm, 由 上 面 的 方程 可 以 计算 出 该 胶 圳 的 涂 透 系数 万 为 0.33 x 10 2 cm’/s, 此 数值 与 文献 报道 (Alexei et al. 2001) 类 似 体 系 相 一 致 。 但 该 值 比 平面 状态 下 计算 出 的 族 透 系 数 高 两 个 数量 级 (Klitzing et al. 1996), 这 是 因为 在 平面 膜 中 设 有 去 核 过 程 。 随 着 核 的 去 除 , 内 外 涂 透 压 的 不 同 可 能 会 在 壁 上 产生 缺陷 ,而 这 种 缺陷 对 微 胶 圳 的 涂 透 性 影响 RAK, 导致 微 胶 圳 比 平面 膜 有 更 高 的 涂 透 性 。 对 于 平面 膜 而 言 , 每 一 层 的 吸附 更 紧密 , 所 以 涂 透 系数 更 小 (Ge et al. 2003c ) 。 ( 李 峻 柏 SNM TT) | Alexei A, Suckhormkov G B, Donath E, et al. 2001. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. 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Chem Phys Lipids, 28: 181-187 a BA i | 胶 喜 用 的 生物 学 spies 34.1 FBR EE ey EAP TBE. cacecsadsisscsasseeoosdstutuanee seni 427 ORM se LU) ir 有 生 和 427 34.1.2 * GRUB REDRAI AE AP IAB cscs cle eee 428 34.2 PORRBIHESH RIZE ........00. ee 429 34.2.1 和 伍 胶 要 膜 的 制备 材料 .ecscnccceccsceenesostereccee nee ee 429 BAD) PMP Se TP os enas cdo co cece cere 429 34.3” 微 胶 圳 膜 在 生物 医学 领域 的 应 用 pp 433 34.3.1 组 织 细胞 移植 的 免疫 隔离 工具 once ececeeneeneneseneaneeennens 433 34.3.2 ”生化 药物 控制 释放 载体 ee 436 34.3.3 提供 基因 冶 疗 的 新 途径 六 .二 二 ocd 437 GAA 展望 438 和 #E (microcapsule) 是 利用 天 然 或 合成 的 高 分 子 材料 对 固 1 村 包 封 粒 径 为 5 一 1000hm 的 中 空 微 圳 。 制 if Re BE FE, 微 圳 化 技术 的 主要 特点 是 改变 活性 物质 的 理化 性 质 ( 相 态 、 溶 解 度 等 ) , 保 护 物 质 免 受 环境 条 件 的 Oe dg panu scene: Ce 质 等 。 微 胶囊 一 般 由 一 层 薄 膜 即 微 胶囊 膜 (microcapsule membrane) FORE ye we, 如 图 34-1 所 示 。 组 成 微 胶囊 膜 的 材料 称 为 圳 材 , 组 成 圳 芯 物 的 材料 称 为 芯 材 。 包 封 细胞 、 蛋 白质 、 核 酸 等 生物 活性 物质 的 微 胶 圳 称 为 生物 微 胶囊 , 其 典型 特征 是 通过 半 运 省 微 圳 膜 屏 项 圳 内 包 封 物 质 使 不 与 外 界 环境 直接 接触 , 但 外 环境 二 养 物 、 可 内 细胞 代谢 物 及 治疗 性 药物 可 以 通过 膜 扩 散 , 达 中 培 养 、 催 化 、 免 疫 隔 离 (imnmunoisolation) 、 基 因 运 载 、 药 物 释 放 等 目的 。 427 % 34 章 (BE PERE SADE DEAE WGEZS) ACA 微 胶囊 照片 (20x ) 作为 一 种 极 有 前 途 的 载体 , 微 胶 吉 已 被 用 于 动物 细胞 培养 、 细 胞 和 酶 的 固定 化 、 生 化 药物 控制 释放 、 抗 癌 药 物 筋 选 、 人 工 绒 官 及 基因 运载 工具 等 生物 医学 领域 。 随 着 对 生 物 技 术 和 膜 技术 研究 和 认识 的 不 断 深 入 ,生物 微 胶 吉 的 应 用 领域 正在 不 断 拓 宽 , 应 用 前 景 非常 广阔 。 34.1 微 胶 圳 膜 的 结构 及 生物 学 功能 34.11 (SUCRE 51-51) gm 微 胶 吉 膜 结构 和 表面 性 质 的 表征 对 微 胶囊 膜 渗透 性 具有 重要 作用 。 利 用 传统 的 光学 显微镜 和 扫描 电子 显微镜 (SEM) 可 以 观测 微 胶囊 形态 、 大 小 、 膜 厚 、 表 面 及 断面 显 微 结构 。 近年 来 又 出 现 借助 现代 仪器 分 析 方法 开展 微 胶 圳 膜 结构 和 表面 性 质 的 研究 报道 。 Levy 等 (1991) 利用 傅 里 叶 变换 红外 光谱 (FTIR) 分 别 测定 了 人 血清 白 蛋白 与 对 苯 二 酰 所 表面 交 联 制备 微 胶 圳 过 程 中 pH (5.9~ 11)、 交 联 反应 时 间 (2~ 60 min) 对 表面 酥 基 、 栈 基 、 羧 基 等 功能 团 吸收 峰 的 影响 。 pH 升 高 导致 栈 基 和 酯 基 峰 增强 而 羧基 峰 减 弱 , 且 在 pH 为 9 时 得 到 表面 粗糙 直径 <15hm 的 微 胶 圳 , 微 胶囊 进一步 在 pH 为 7.5 缓 冲 液 中 浸泡 , 导 致 酝 基 消失 而 羧基 增强 、 酯 基 减 弱 , 相 应 的 微 胶囊 膜 表面 变 得 光滑 , 直 径 明 显 增 大 。 延 长 反应 时 间 导 致 酯 基 、 酝 基 峰 增强 而 羧基 峰 减 弱 , 反 应 2min 得 到 形状 很 好 的 球形 颗粒 , 冻 干 后 为 表面 光滑 完整 的 卵 形 颗粒 ; 反应 Smin 后 为 表面 粗糙 的 球形 颗粒 , 且 时 间 越 长 膜 表面 粒状 物 越 多 。 Xu 等 (1998) 利用 原子 力 显 微 镜 (AFM) 对 处 于 液体 六 “中 的 微 胶 吉 表面 三 维 形态 进 行 了 观测 , 实验 了 表面 不 同 摩尔 比 的 反 凝 胶 和 凝 胶 离 子 /Ca*) 对 其 表面 形态 和 粗糙 度 的 影响 。NaVCa 比值 越 高 (分 别 为 0.9 : 1、2.5 : 0 .5 : 0.6) , 微 胶 圳 表面 垂直 方 向 最 大 高 度 (Zoe) 越 低 (相应 为 488、369、263nm), 。 : 值 为 0.9 : 1、2.5 : 0.6 的 样品 表面 有 皱 缩 ,4.5 : 0.6 的 样品 则 是 光滑 的 , 而 光学 显 微 , 【观测 到 0.9 : 1 的 样品 有 皱 缩 , 428 无 法 区 分 后 两 个 样品 。 使 用 两 个 参数 平面 在 垂直 方向 的 偏离 度 (Rs) 及 其 平方 根 (RMS), 对 微 胶 吉 表 面 粗糙 度 进 行 了 定量 评价 , 结 末 对 应 于 NaVCa- 比值 升 高 , R 和 RMS 均 降低 , 即 微 胶 宫 表 面 粗 烙 度 降低 。 Asaki 5 (1998) 制备 了 含有 海棠 酸 作为 水 溶性 大 分 子 配 基 的 聚 酰胺 微 胶 吉 , 萃 取 铜 、 钴 、 镍 、 银 等 金属 离子 , 实 验 中 发 现 不 仅 微 胶 吉 内 部 的 配 基 , 而 且 微 胶囊 膜 本 身 都 能 够 吸附 累积 金属 离子 。 他 们 利用 X 射线 光电 子 谱 (XPS) 分 析 了 微 胶 圳 表面 组 成 , 发 现 海藻 酸 配 基 的 一 些 功能 团 穿 过 微 胶 吉 膜 分 布 于 表面 , 所 以 膜 表 面 也 能 富 集 金属 离子 。 34.1.2 (rt SCF JIE) 4707 7) Emma 微 胶 圳 的 吉 膜 具有 选择 透 过 特性 , 允 许 低 分 子 质量 溶 质 Cae. TO. ARIA 子 等 ) 自由 通过 才 膜 , 保 证 圳 内 细胞 存活 和 正常 生理 功能 , 人 允许 圳 内 移植 组 织 或 细胞 的 小 分 子 治 疗 因 子 (如 胰 铝 素 、 多 巴 胺 ) 释 出 吉 外 , 对 病变 机 体 进 行 治 疗 和 调节 ;阻止 宿 主 免 疫 细胞 (REA, Benes) 和 免疫 分 子 (免疫 球 和 蛋白 、 抗 体 、 补 体 等 ) 通过 圳 膜 , 避 免 宿 主 对 移植 组 织 或 细胞 的 免疫 排斥 作用 。 例 如 ,Lim 和 Sun (1980) Ze BAAD ie 党 酸 钠 (alginate)- 聚 赖 氨 酸 (polylysine)- 海藻 酸 钠 微 胶 吉 (Alg-PLL-Alg, 简称 APA) AYSE 膜 可 截留 分 子 质量 大 于 1.1 x 10 Da 的 物质 , 故 分 子 质量 为 1.6 x 10Da 左 右 的 抗体 及 免 疫 活性 细胞 不 能 进入 微 胶 吉 , 体 现 了 微 胶 吉 对 细胞 的 免疫 保护 作用 , 微 吉 化 异种 胰岛 可 以 在 宿主 体内 存活 并 保持 26 个 月 的 降 血糖 功能 。 微 胶 吉 的 免疫 隔离 原理 如 图 34-2 所 示 。 氧气 及 和 营养 物质 foe CER C ee oS # 免疫 蛋白 或 免疫 细胞 治疗 性 分 子 Se 微 胶 圳 免疫 隔离 所 理 示意 图 作为 细胞 移植 的 有 效 免疫 隔离 工具 ,, 微 胶 圳 的 主要 优点 是 : (1) 微 胶囊 制备 过 程 简 便 ; (2) 微 胶 圳 死 腔 体 积 小 , 有 利于 氧 和 和 营养 物 的 供应 , 有 利于 圳 内 细胞 对 宿主 体内 和 光 欧 糖 等 调 六 因素 快速 反应 ,(3) 减少 移植 物 的 体积 : (4) 虽然 微 吉 膜 很 薄 , 但 其 机 械 强 “UE?” ee Te 429 % 34% PARE BENE IAD ED BEAR 度 很 高 , 可 承受 3~6N 的 正面 压力 , 不易 破裂 , 不 会 造成 移植 组 织 或 细胞 的 泄漏 ; (5) 微 胶囊 材料 无 毒 , 免 疫 原 性 小 , 生 物 相 容 性 好 , 不 易 引 起 宿主 免疫 反应 ; (6) 微 宫 膜 的 相 对 分 子 质 量 截留 性 能 好 , 有 具有 免疫 隔离 和 免疫 保护 作用 。 34.2 HIKED HD till 481 F177 (5s 34.2.1 侈 胶 雪 改 的 州 委 村 半 mm 制备 微 胶 吉 膜 的 常用 材料 包括 : 天 然 高 分 子 材料 , 如 明胶 、 阿拉 伯 胶 、 海藻 酸 钠 、 3 聚 糖 、 演 粉 和 蛋白 等 , 是 药物 扩散 最 常用 的 膜 材 料 之 一 , 成 膜 性 能 和 稳定 性 好 , 无 毒 半 合 成 高 分 子 材料 ,如 纤维 素 类 衍生 物 , 黏 度 大 , 易 成 囊 , 毒性 小 ;合成 类 高 分 子 材料 , 如 非 降解 性 的 聚 乙 炳 醇 、 聚 碳酸 酯 、 聚 乙 二 醇 、 聚 酰胺 和 聚 丙烯 酸 树脂 类 等 , 成 膜 性 能 和 化 学 稳定 性 好 , 以 及 可 生物 降解 的 聚 酯 类 、 聚 乳酸 、 聚 丙 交 酯 和 消 旋 丙 交 酯 一 乙 交 酯 共聚 物 等。 作为 细胞 移植 的 包 封 材 料 , 一 般 要 求 具有 优良 的 生物 相 容 性 (如 无 毒 .免疫 原 性 低 )、 长 期 的 生物 与 机 械 稳定 性 、 一 定 的 机 械 强 度 和 良好 的 成 膜 性 、 在 微 胶 事 制备 中 无 需 苛刻 的 制备 条 件 等。 目前 ,细胞 微 圳 化 装置 几乎 惟一 性 地 由 水 凝 胶 制备 而 成 。 这 是 一 类 可 在 水 中 膨胀 但 不 溶解 的 合成 或 天 然 聚合 物 材 料 , 包 括 天 然 来 源 的 腕 类 、 纤 维 素 衍生 物 的 盐 、 亲 水 性 聚 合 物 等 。 作 为 制备 细胞 微 圳 化 装置 的 理想 材料 , 水 凝 胶 具 有 以 下 特性 : (1) 易于 形成 光 滑 透 明 的 胶囊 , 可 方便 地 观察 胶 圳 内 的 细胞 状态 ,(2) 组 织 周围 的 机 械 或 摩擦 刺激 可 以 通过 凝 胶 柔 软 圆滑 的 特性 而 消除 ,(3) 作为 材料 亲 水 性 的 结果 , 在 流体 和 组 织 周 围 设 有 界面 张力 , 这 样 可 将 蛋白 吸附 和 细胞 黏附 减 小 到 最 低 限 度 , 以 上 两 个 因素 使 微 胶囊 具有 高 的 生物 相 容 性 ,(4) 水 凝 胶 对 低 分 子 质量 营养 物 和 代谢 物 具有 高 的 通 透 性 ,(5) 材料 通过 聚 电解 质 络 合 原理 在 生理 条 件 成 膜 , 反 应 条 件 温和 , 有 利于 移植 细胞 的 活性 保存 。 在 人 工 细胞 (artificial cell) 领域 , Chang(1957) 首 先 用 基于 聚 电解 质 水 凝 胶 的 微 胶囊 膜 , 这 是 一 层 在 两 种 带 相 反 电 荷 的 聚 电解 质 之 间 形 成 的 界面 膜 , 由 它 构成 了 微 胶囊 的 外 壁 。 这 层 蒲 膜 的 厚度 与 细胞 大 小 在 同一 数量 级 上 , 含 细胞 的 圳 核 , 或 呈 液态 或 固定 化 凝 胶 。 最 早 由 Lim 和 Sun(1980) 发 展 起 来 的 聚 阴 离子 海藻 酸 钠 与 聚 阳 离子 聚 赖 氨 酸 复合 膜 是 第 一 个 用 于 细胞 微 圳 化 的 微 胶囊 系统 , 具 有 制备 条 件 温和 、 细 胞 相 容 性 好 的 特点 。 近 20 年 来 ,已 在 这 种 方法 的 基础 上 做 了 各 种 工艺 改进 , 极 大 促进 了 细胞 微 囊 化 材料 的 发 展 。 已 经 成 功 地 用 于 细胞 微 圳 化 的 材料 见 表 34-1。 34.2.2 (CR 5 5 _ gu II 1, 聚 电解 质 络 合 带 相反 电荷 聚合 物 的 反应 是 在 活 细胞 周围 形成 物 豆 性 噶 屏 障 的 最 简单 方法 。 由 于 采 用 水 溶性 荷 电 聚 合 物 , 因 此 更 利于 制备 和 发 展 含水 包 豆 ” 完 , 这 种 系统 对 微 圳 化 细胞 具 有 良好 的 生物 相 容 性 。 (1) SRB, RAB FOA RH 最 具 代 表 性 APA 或 ACA 微 胶囊 的 制备 工艺 如 下 “细胞 悬浮 于 19%6 一 3% 海 藻 酸 钠 溶液 中 , 通 过 特制 注射 泵 和 液 滴 发 生 器 将 细胞 悬浮 液 “、 CaCl 溶液 中 , 交 联 5min, 形 430 聚合 物 微 圳 化 细胞 类 型 宿主 动物 模型 HEMA-MMA 和 各 种 聚 丙 粳 酸 酯 PC-12 体外 CHO, 人 成 纤维 细胞 体外 大 鼠 胰岛 体外 HepG2 大 鼠 Alg-PLL-PEI 大 鼠 胰 岛 糖尿 病 大 鼠 Alg-PLL-Alg mGH-C2C12 成 肌 细胞 snell drawf mice 大 鼠 胰 岛 大 鼠 人 胰岛 人 腹膜 大 鼠 肝 细胞 Gunn 大 鼠 模 型 大 鼠 肝 细胞 A RUBE 小 牛 肾 上 腺 嗜 铬 细胞 路 齿 动 物 大 脑 PC-12 灵 长 类 动物 大 脑 大 鼠 胰 岛 大 鼠 Alg 复合 物 几内亚 猪 体外 HEMA-co-MAA 红血球 Ba-Alg 大 鼠 胰岛 STZ- 糖尿 病 小 鼠 猪 胰岛 STZ- 糖尿 病 小 鼠 琼脂 小 鼠 BO 胰岛 STZ- 糖尿 病 小 鼠 仓鼠 胰岛 NOD 小 鼠 琼脂 /PSS/PB/CMC 复合 物 PC-12 几内亚 猪 大 鼠 胰岛 STZ- 糖尿 病 小 鼠 MIN6 体外 光 交 联 PVA 小 鼠 胰 岛 小 鼠 腹膜 成 固化 的 海 荣 酸 钙 凝 胶 珠 (图 34-3) 。 然 后 将 其 置 于 PLL 或 脱 乙 酰 壳 多 糖 (chitosan) 溶 CBE THe TLE tay TR PCA Sir TE HEL tay AY PLL 或 脱 乙 酰 壳 多 糖 反应 ,在 胶 珠 表面 形 成 Alg-PLL 或 Alg- 脱 亿 酰 元 多 糖 复合 膜 。 宫 膜 形 成 后 , 其 表面 存在 净 正 电荷 , 移 植 过 程 中 易 引 起 宿主 免疫 细胞 附着 , 引 发 炎症 反应 和 纤维 化 反应 。 通 常 将 胶 吉 悬浮 在 0.16% 海 藻 酸 钠 或 其 他 带 负 电荷 的 溶液 中 ,除去 胶 吉 表面 过 剩 的 正 电荷 , 改 善 胶囊 的 寿命 和 生物 相 容 性 。 最 后 , 将 微 胶 圳 置 于 柠 栋 酸 钠 溶 该 中, 对 圳 核 海 营 酸 钙 中 的 Ca 进行 置换 , 可 (ERE AAS. (2) Se As St A ALA im BCS REE, PTR LEAL 01, al sek es aN Tl Pk LH LE, APRA / AHN ee BOCAS UB, Foo BR AER dim BE AEE. SY ee HH , 这 种 没有 选择 涂 透 屏障 的 均 相 琼脂 层 足 以 包 封 细 胞 。 PL EARS A IE I 胞 突起 物 , 但 可 以 通过 再 次 涂 层 而 消除 。 通过 生成 较 致 密 的 胶 珠 《如 将 琼脂 浓度 从 5% 提 i 2) 7.5% ~ 0%) 或 在 胶 珠 周围 引入 一 层 选 择 活 透 性 屏障 , 可 以 改进 微 圳 化 移植 物 在 体 43] 草 微 胶 才 膜 的 生物 学 功能 研究 海藻 酸 钠 和 活 细胞 AT CaCl, 溶液 CaCl, tae REE WUE HI AREA AAI FE TEE. 1K Pa TR Be VE De Be FE i Fe HEL top SR APE ZK, BY SR AE (PSSa) polybrene hexadimethrine Br 或 羧 甲 基 纤 维 素 (CMC) 组 成 。PSSa 的 功能 是 阻 止 异 源 抗体 暴露 在 宿主 免疫 系统 中 ,改进 微 胶 圳 强度 并 可 能 阻止 代 偿 性 活化 。polybrene hexadimethrine Br 目的 在 于 防止 PSSa MARR HP Yt. CMC 的 目的 在 于 改进 体内 生物 相 容 性 〈( 即 防止 纤维 增生 ) 。 与 粒 径 小 于 0.Smm 的 经 典 琼 脂 微 胶 圳 不 同 ,Jain 等 将 琼脂 / 细 胞 混 悬 液 滴 加 到 无 菌 矿物 油 中 制备 了 直径 6~ 8mm 的 琼脂 胶 珠 。 在 胰岛 的 异种 移植 物 模 型 中 , 它 们 不 仅 能 够 维持 微 圳 化 细胞 的 体内 活性 , 还 可 有 效 恢复 正常 血糖 , 这 种 大 尺寸 胶 圳 在 大 规模 制备 和 回收 方面 具有 明显 优势 。 (3) 合成 聚 电 解 质 为 了 改进 微 胶 吉 强 度 并 更 好 地 控制 微 胶囊 特性 , 除 APA 微 圳 化 系统 外 , 还 开发 了 其 他 一 些 天 然 和 合成 的 聚 电 解 质 系统 。 将 合成 聚 电 解 质 林 代 APA 微 圳 化 系统 的 研究 是 Gharapetian 等 (1986) 首 先 报 道 的 , 所 用 的 合成 聚合 物 包 托 阴 离子 丙烯 酸 / 甲 基 内 烯 酸 、 阳 离子 二 甲 基 氟 基 乙 基 甲 基 琴 烯 酸 酯 /二 乙 基 毛 基 乙 基 扩 和 导 输 酯 、 甲 基 琴 烯 酸 酯 等 。 其 基本 工艺 路 线 是 : 将 符 电 聚合 物 溶 液 的 细胞 悬浮 液 挤 压 扎 , 并 滴 入 带 相 反 电 和 荷 聚 合 物 的 TRUER SE NC PEA CL FE 研究 表明 ,合成 聚合 物 制备 微 胶囊 存在 如 下 癌 斤 采 用 的 革 些 聚 电解 质 有 严重 的 细胞 毒性 , 聚合 物 性 质 与 微 胶 吉 制 备 之 间 存 在 复杂 ; 最 突出 的 是 , 与 APA 微 胶 圳 不 同 , 这 类 材料 制备 的 胶 吉 不 是 球形 。 使 用 合成 聚 电 上 “的 重要 挑战 在 于 对 移植 细胞 体内 HE Wy fi Biomembranes 432 存活 性 的 明确 表达 。 在 体外 研究 中 , 尽管 某 些 合成 聚 电解 质 复合 物 比 APA 微 胶 圳 性 能 优 越 , 但 体内 研究 却 远 远 清 后 。 即 便 如 此 , 合 成 聚 电解 质 在 细胞 微 圳 化 中 的 初步 研究 仍 是 鼓舞 人 心 的 , 并 且 会 为 聚 电解 质 工程 开拓 新 的 途径 。 2. 界面 相 转 化 Sefton 等 (1987) 发 展 了 一 种 界面 沉淀 工艺 , 可 用 于 在 非 水 溶性 热塑性 聚合 物 中 包 封 哺乳 动物 细胞 。 微 圳 化 可 以 通过 以 下 步骤 完成 : 首先 将 细胞 悬 液 挤 压 形成 液 核 , 再 用 聚合 物 包围 液 泣 以 形成 液 壳 , 抽 提 聚合 物 溶剂 使 液 壳 固化 。 这 种 液态 的 核 一 壳 液 冯 可 通过 同 轴 挤 压 装置 生成 , 这 种 装置 依赖 于 流体 剪 切 以 从 液 相 生成 单个 的 液 滴 。 最 初 是 采用 空气 度 前 pee. 为 了 改善 液 和 滴 的 均一 性 以 及 减少 气流 剪 切 对 细胞 的 破坏 , 在 液 一 空气 界面 采用 了 一 种 震荡 挤 压 装置 用 于 液 滴 的 生成 , 用 这 种 方法 可 生成 直径 900 hm 的 均一 胶囊 。 由 于 采用 了 非 水 溶性 聚合 物 , 在 微 胶 圳 制备 中 存在 有 机 溶剂 对 细胞 的 毒性 问题 。 针 对 这 一 问题 , 可 以 设计 减 小 细胞 活性 损失 的 工艺 过 程 。 在 液 滴 挤 压 过 程 中 , 当 一 种 黏度 / 密度 增强 剂 加 入 CHO 的 细胞 悬浮 液 中 时 , 细胞 活性 的 理论 值 可 从 25% 增 加 到 50%。 另 一 个 需要 解决 问题 是 微 胶 吉 中 溶剂 的 长 期 讳 留 。 当 微 圳 表面 溶剂 被 抽 提 后 , 相 转化 导致 固 化 胶囊 膜 的 形成 , 这 使 胶囊 内 部 的 少量 溶剂 难以 向 外 扩散 , 造 成 胶囊 内 部 较 高 的 局 部 溶 剂 浓度 。 在 聚合 物 溶剂 中 , 早期 采用 的 是 相对 无 毒 的 PEG-200。 最近 , Morikawa 等 (1997 ) 建议 采用 iopamidol 作为 细胞 相 容 性 聚合 物 溶剂 ,37% iopamidol 水 溶液 能 够 溶解 聚 两 烯 酸 酯 , 从 而 使 非 水 溶性 聚合 物 在 含水 系统 中 包 封 哺乳 动物 细胞 成 为 可 能 。 Dupuy 等 (1991) 开发 了 一 种 包 封 活 细 胞 的 原 位 聚合 技术 , 与 聚 电解 质 和 相 转 化 膜 不 同 , 原 位 聚合 技术 生成 的 是 一 种 通过 共 价 键 网 络 支持 的 膜 。 此 领域 中 的 早期 工作 集中 在 采用 两 烽 酰 胺 作为 聚合 单 体 。 在 这 种 技术 中 需要 考虑 自由 基 种 类 〈 引 发 剂 和 单 体 ) 的 毒 性 , 微 圳 制备 过 程 中 要 限制 反应 分 子 扩 散 进 入 细胞 。 3. 共 形 包 衣 共 形 包 衣 是 细胞 微 吉 化 的 一 个 特例 , 这 是 在 小 的 细胞 群 或 小 组 织 块 上 直接 形成 屏障 的 方法 。 这 种 方法 通过 圳 膜 包 围 细胞 群 而 除 了 微 胶囊 的 死 腔 , 因 而 有 效 改善 了 胶 圳 表 面 和 细胞 群 之 间 的 质量 传递 , 并 提高 了 细胞 的 包 封 效率 。 质 量 传递 的 改善 不 仅 对 细胞 存 活 很 重要 , 而 且 对 细胞 产生 的 治疗 性 药物 的 快速 投递 也 很 重要 。 共 形 包 衣 技术 不 适 于 单 细 胞 , 因为 这 将 造成 较 大 的 膜 材 料 与 细胞 群 的 比例 , 但 是 对 于 具有 较 大 尺寸 的 细胞 群 来 说 却 是 理想 的 。 共 形 包 衣 最 初 用 于 胰腺 胰岛 并 不 令 人 惊讶 , 但 是 还 没有 技术 上 的 原因 解释 为 什么 只 要 细胞 作为 固体 组 织 块 培养 , 其 他 细胞 表 型 就 不 能 共 形 包 衣 (如 作为 多 细胞 聚集 体 培 养 的 肝 实 质 细 胞 ) 。 Alg-PLL 共 形 包 衣 技 术 采 用 非 连续 梯度 海 党 酸 钠 和 交 联 剂 (Ca?* i Ba?* ) 对 胰岛 进行 离心 。 若 有 必要 , 可 再 增加 PLL RAR, SAHA Alg-PLL 微 圳 化 技术 形成 的 膜 厚 度 相似 , 用 海藻 酸 锦 包 衣 形成 的 膜 厚 度 约 为 10hm。 共 形 包 衣 胰岛 的 胰岛 素 分 泌 动 力学 与 游 离 胰岛 相似 , 表 明 共 形 包 衣 胰 岛 具 有 优良 的 传 质 性 能 。 在 共 形 包 衣 技术 的 改进 研究 中 , May 和 Sefton (1999) 使 胰腺 胰岛 在 离心 过 程 中 , 通 过 聚 丙烯 酸 酯 的 PEG-200 溶 液 , 随 后 再 通过 水 相 , 使 聚合 物 在 胰岛 周围 沉淀 。 这 种 技术 已 用 于 球形 物 模型 的 包 封 , 但 还 没 有 对 话 细胞 包 封 结果 的 报道 。Sawhney 等 (1994) 报道 了 一 种 在 胰腺 胰岛 周围 共 形 聚合 形成 聚 乙烯 醇 噶 的 界面 聚合 工艺 。 这 种 工艺 在 水 相 中 进行 , 通 过 吸附 在 细胞 表面 的 光 引 RE ee a eee oe ee Fe 433 % 34H (ABE ADF DEAE. 发 剂 在 胰岛 表面 引发 聚合 , 并 有 了 PEG- 丙烯 酸 酯 单 体 在 共 形 膜 中 的 自由 基 聚 合 反应 参与 。 所 形成 的 共 形 膜 是 均 相 膜 , 厚 度 为 10~ 100 hm。 对 光 引 发 剂 的 选择 极其 重要 , 它 不 仅 应 县 有 一 定 的 与 细胞 膜 相 关 的 玻 水 性 , 还 不 会 过 度 吸附 以 干扰 细胞 膜 的 自身 结构 。 目 前, 还 没有 对 膜 通 透 性 详细 研究 的 报道 , 但 是 包 衣 胰岛 的 刺激 指数 〈 即 与 对 照 条 件 相 比 , 胰 品 在 刺激 条 件 下 胰 名 素 的 分 刻 比 率 ) 等 价 于 游离 胰 名 的 刺激 指数 , 表 明 较 小 的 分 子 可 以 通 it PEG 共 形 包 衣 膜 自由 传递 。 34.3 (okie FEN EE Yn Be“ SHCA 7 Fs BEE AE i a: FAR a re 2 PE Ee 28 I) ER PY SHR Fat BCE MRE PE act EFA eT AE A ese aes CB, 以 保证 细胞 分 泼 的 有 效 物 质 扩 散 EA ARORA REE PROBE, TE BEER Ee DAS BA Bis FEED, ESE, SES HEL Bh PRAY PSHE IE lade. TAD ENY , GoBe EMRE Ay EK ad FBT EA BE Be AH RAF BEALE PE, Fad lat lle AB PF AT AT ail Be EMRE REAL RT, tin BL BEA ACA Ode PE PE (A hile] 2000), 34.3.1 组 织 细 胞 移植 的 免疫 隔离 工具 | ETP ETE ETI TE TE EGS, 1. 糖尿 病 等 内 分 泌 系 统 疾病 的 治疗 糖尿 病 (diabetes mellitus) 是 以 持续 高 血糖 为 其 基本 生化 特征 的 一 种 综合 病症 。 各 种 原因 造成 胰岛 素 供应 不 足 或 胰岛 素 在 靶 细 胞 不 能 发 挥 正常 生理 作用 , 使 体内 糖 、 蛋白 质 、 脂肪 、 水 及 电解 质 等 代谢 发 生 率 乱 , 就 发 生 了 糖尿 病 。 目 前 针对 糖尿 病 尤 其 是 胰岛 素 依 赖 型 糖尿 病 的 治疗 仍 以 胰岛 素 针剂 为 主 , 通过 同 种 或 异种 胰岛 组 织 /细胞 移植 (tissue/cell transplantation) 治疗 胰 铝 素 依赖 型 糖尿 病 成 为 当今 研究 热点 。 微 胶 圳 则 依靠 膜 的 隔离 保 护 性 能 和 选择 透 过 作用 , 可 以 保证 生物 活性 物质 扩散 通过 , 抗体 或 免疫 细胞 被 截留 隔离 , 从 而 在 生理 上 避免 了 个 体 的 免疫 排斥 , 成 为 解决 组 织 细胞 移植 过 程 免疫 排斥 问题 的 理想 手段 , 因 而 引起 众多 研究 者 的 兴 用 于 人 工 胰腺 的 微 胶 吉 研 究 已 有 20 多 年 的 历史 。 以 Lim 和 Sun (1980) 发 明 的 海藻 酸 钠 一 聚 赖 氨 酸 一 海藻 酸 钠 (alginate-polylysine-alginate, APA) 微 圳 技术 最 为 成 熟 。 马 小 军 研究 小 组 在 该 方面 的 研究 处 于 国内 领先 地 位 , 最 突出 的 研究 成 果 是 成 功 地 用 价格 低 廉 的 壳 聚 糖 材 料 替 代目 前 国际 常用 的 价格 昂贵 的 聚 赖 氨 酸 , 制备 出 生物 相 容 性 良好 的 海 藻 酸 钠 一 壳 聚 糖 一 海 营 酸 钠 (alginate-chitosan-alginate, ACA) 微 胶囊 , 用 于 微 圳 化 组 织 细胞 移植 ( 王 勇 等 1999,2000, 李 明 春 等 1999,Liu et al. 2002 )。 人 工 胰腺 移植 是 潜在 的 替代 外 源 性 胰岛 素 治 疗 I 型 糖尿 病 最 有 前 景 的 治疗 方法 , 而 决定 其 治疗 效果 的 技术 关键 除了 免疫 隔离 膜 外 ,还 需要 快速 有 效 地 、 大 量 地 从 胰腺 中 分 离 有 活性 的 胰岛 。 目 前 对 胰岛 收获 量 尚 缺乏 可 接受 的 标准 化 计算 方法 , 因 为 胰岛 是 一 个 很 大 的 细胞 团 , 在 溶液 中 很 快 沉 降 , 取 样 很 难 具 有 代表 性 。 并 且 大 鼠 胰岛 细胞 团 直径 从 50~300um, 细胞 种 类 较 多 , 但 是 用 计数 方法 估计 胰 吕 “全 量 仍 不 失 为 一 种 较 好 的 方法 。 双 硫 逐 是 一 种 能 和 和 锌 离 子 结合 的 特异 性 染料 ,使 胰 皇 ” 工 色 ,非常 容易 辨认 , 体 内 外 试 验证 明 不 影响 胰岛 的 功能 , 并 且 可 用 于 体外 培养 后 请 乌 染 色 (图 34-4)。 人 工 胰腺 的 首次 尝试 是 1980 年 加 拿 大 Lim 实验 ”有 日 APA 微 圳 包 右 大 鼠 胰 岛 , 可 在 lay 乓 \ 它 。 二 二 二 全 HE) i Biomembranes 434 大 鼠 胰岛 分 离 及 微 胶 圳 包 埋 A. 分 离 的 大 鼠 胰岛 组 织 ; B. 微 胶囊 包 埋 的 大 鼠 胰岛 组 织 糖尿 病 小 鼠 体 内 维持 功能 达 26 个 月 之 久 。 马 小 军 课 题 组 与 解放 军 总 医院 合作 也 成 功 地 完 成 了 APA 微 圳 包 埋 大 鼠 胰 岛 异 体 移植 治疗 糖尿 病 大 鼠 的 实验 (图 34-5) 。 近 年 来 , 动 物 胰岛 的 分 离 和 纯化 技术 得 到 改进 , 使 得 微 吉 化 异种 胰岛 移植 的 研究 取得 了 很 大 进展 ,在 齿 齿 类 、 大 类 及 灵 长 类 糖尿 病 动物 中 均 获 得 了 成 功 。1989 一 1993 年 间 , 马 小 军 课题 组 与 加 拿 大 多 伦 多 大 学 医学 院 合作 将 APA 微 圳 化 猪 胰岛 移植 于 9 只 自发 性 糖尿 病 猴 的 腹腔 中 , 其 中 7 只 猴 不 再 需要 胰 铝 素 而 血糖 水 平 维持 在 正常 范围 达 120~804 天 , 移植 后 猴 的 糖 耐 量 明显 升 高 , 糖 基 化 血红 蛋白 水 平 明 显 降 低 , 并 可 在 宿主 钦 体 内 检测 出 猪 C 肽 的 存在 (图 34-6) (Sun et al. 1992 ) 。 微 圳 化 胰岛 异体 移植 治疗 大 鼠 糖 尿 病 的 效果 图 A. 正 常 状态 ,B. 糖尿 病 模型 ,C. 左 : 胰岛 素 治 疗 , 右 : 微 圳 化 胰岛 细胞 治疗 Se i a ae 435 % 342 (MC BERE NIA DFA DER B GRE CIR A Se APES HELI TBE IRA OAR A. 治疗 前 ,B. 治疗 后 由 此 可 见 , 人 工 胰腺 技术 研究 的 成 功 使 全 世界 大 约 13 500 万 糖尿 病 患者 看 到 了 电光。 尽管 人 工 胰腺 真正 大 规模 用 于 临床 还 有 一 段 路 要 走 , 因为 如 何 获得 大 量 的 胰岛 细胞 以 降 低 成 本 还 设 有 真正 解决 。 但 我 们 有 理由 相信 , 随 着 基因 重组 技术 的 逐步 成 熟 以 及 干细胞 分 化 技术 的 深入 开展 , 细 胞 来 源 问 题 将 在 几 年 内 得 到 最 根本 的 解决 。 到 那 时 , 糖 尿 病 患 者 的 治疗 就 可 以 像 进行 皮下 注射 一 样 简 单 , 只 不 过 这 回 不 是 一 天 打 3 次 , 而 是 打 一 针 可 持续 半年 甚至 一 年 或 更 长 时 间 。 更 主要 的 是 人 工 胰 腺 使 患者 不 用 再 吃 降 糖 药 ,不 用 再 打 胰岛 素 ,, 不必 再 为 控制 饮食 而 烦恼 , 不 会 再 受 心 脑 血 管 及 眼 肾 神经 系统 等 糖尿 病 并 发 症 的 困扰 。 人 工 胰腺 异体 或 异种 移植 治疗 糖尿 病 模型 动物 的 成 功 , 为 微 吉 化 人 工 器官 治 疗 其 他 内 分 泌 疾 病 提 供 了 美好 的 前 景 。 对 于 内 分 泌 功 能 低下 的 疾病 ,都 可 以 考虑 微 吉 化 人 工 器 官 原 位 移植 来 得 到 根本 治疗 , 如 甲状 腺 功能 减退 症 (简称 甲 低 )( 吴 美 慧 等 1999)、 甲 状 旁 腺 功能 减退 症 (Darquy et al. 1987, Hasse et al. 2000)、 生 长 激素 缺乏 性 侏儒 症 (Peirone et al. 1998) 等 。 2. 帕 金 森 病 等 神经 系统 疾病 的 治疗 帕 金 森 病 又 称 为 震颤 麻痹 , 是 常见 的 中 枢 神 经 系统 变性 疾病 。 帕 金森 病 的 主要 病变 部 位 是 在 脑 部 的 黑 质 和 纹 状 体 。 多 巴 胺 为 抑制 性 神经 递 质 ,由 集中 在 脑 干 黑 质 内 的 一 种 神经 元 产生 , 通 过 纹 状 体 环 路 向 纹 状 体 输送 多 巴 胺 。 与 多 巴 胺 作用 相反 , 乙 酰 胆 碱 为 纹 状 体 的 兴奋 性 神经 递 质 。 正 稼 人 的 这 两 种 递 质 处 于 一 种 动态 平衡 状态 。 当 患 有 由 金森 病 时 , 患 者 脑 中 墨 质 内 的 神经 元 变性 或 过 早死 亡 , 黑 质 细 胞 大 量 销 失 , 多 巴 胺 合成 及 输出 减少 , 而 乙酰 胆 碱 的 作用 相对 元 进 , 从 而 使 人 体 运 动 协调 机 能 遭 到 破坏 , 活 动 减缓 甚至 停止 , 出 现 由 金森 病 的 一 系列 临床 症状 。 治 疗 帕 金森 病 此 入 有 效 的 药物 就 是 多 巴 胺 ,但 是 , 外 源 性 多 巴 胺 不 能 通过 血 脑 屏障 进入 脑 内 发 挥 有 ;亲人 作 用 。 因 此 , 将 能 够 分 泌 多 巴 胺 的 细胞 移植 于 患者 颅 内 实现 多 巴 胺 原 位 释放 可 见 比较 好 的 治疗 效果 。 马 小 军 课 题 组 与 解放 军 310 医 院 合 作 以 在 侧 由 你 庄 状 样 大 鼠 和 猴 为 模型 , 分 别 将 APA 微 圳 化 和 非 微 吉 化 牛 凤 上 腺 嗜 铬 细胞 (bovine-: ial chromaffin cell, BCC) 及 空 微 圳 定 加 植 入 右 侧 脑 纹 状 体内 ,结果 表明 植 入 的 微 圳 化 能 在 动物 脑 内 存活 并 分 泌 多 巴 HE Dy iW Biomembranes 436 Wee BA ey Ii, ZU TEMA a BRIE AC bt ASR is A Chea UTES), TEA 10 个 月 (图 34-7), 4E#E{t BCC 仅 能 改变 部 分 动物 的 偶 侧 旋转 , 且 作用 时 间 基 本 只 能 持续 1 个 月 ; 空 微 圳 组 则 与 对 照 组 模型 一 样 , 症 状 没 有 改善 ( 薛 毅 珑 等 1999)。 » 1 > ' | 1 | : | Ly 7 . & | > 由 金森 病 猴 治疗 前 后 对 照 图 A. 治疗 前 ,B. 治疗 后 微 吉 化 组 织 细胞 移植 治疗 帕 金 森 模 型 动物 的 成 功 , 为 该 技术 应 用 于 其 他 神经 系统 疾 病 开 辟 了 新 的 有 效 治疗 途径 。 科 学 家 们 先后 对 许多 神经 系统 疾病 , 如 享 廷 顿 舞 蹈 病 (Emerich et al. 1997)、 阿 尔 茨 海 默 病 〈 又 称 老 年 性 痴呆 或 早老 性 痢 呆 ) (Kordower et al. 1994) | WL till) Fs he {Lie (Aebischer et al.1996) 等 都 进行 了 动物 实验 研究 。 3. 血 友 病 等 酶 或 基因 产物 缺陷 性 遗传 疾病 的 治疗 微 圳 化 组 织 细 胞 移植 技术 同样 应 用 于 酶 或 基因 产物 缺陷 性 遗传 疾病 的 治疗 , 比较 成 功 的 研究 有 血 友 病 (Hortelano et al. 2001), 444 HEI" FAIR (Ross et al. 2000) 等 。 34.3.2 生化 药物 控制 释放 载体 蛋 和 白质 和 多 肽 类 大 分 子 生化 物质 (如 生长 激素 、 胰 岛 素 、 肝 素 、 干 扰 素 、 白 细胞 介 素 等 ) 由 于 在 侏儒 症 、 糖尿 病 、 肝 硬化 以 及 许多 癌症 等 难以 治愈 疾病 的 治疗 过 程 中 表现 出 药 理 作用 强 、 不 良 作 用 少 且 很 少 ?引起 过 敏 反应 的 特点 而 备 受 重视 。 另 一 方面 , 重组 DNA 技 术 的 出 现 使 得 具有 疗效 的 蛋白 质 的 规模 生产 成 为 现实 (Sadee 1986)。 然 而 由 于 此 类 生化 药 物 稳定 性 差 , 采 用 传统 口服 给 药 后 在 人 体 胃 肠 道内 吕 被 酶 降解 , 所 以 目前 多 限于 注射 给 药 。 另 外 , 此 类 药物 体内 半 误 期 短 , 以 至 于 不 得 不 多 注射 以 维持 疗效 。 此 外 在 非 保护 状态 下 这 类 药物 的 生物 利用 度 通常 很 低 (<5%6), 不 能 获得 满意 的 疗效 。 所 以 , 开发 适 于 蛋 白质 和 多 肽 类 生化 药物 的 释放 体系 已 成 为 重要 的 研究 方向 。 微 胶 圳 膜 能 最 大 程度 地 保持 圳 内 生化 物 乓 活性 , 且 通过 调节 制备 条 件 可 以 控制 微 胶囊 膜 的 厚度 和 孔 尺 寸 , 从 而 实现 ee 437 % 348 ie BERETA DF DARE 圳 内 生化 药物 控 释 (drug controlled release) KZ FE. WUREFETE ZS MAY AEA 在 于 : 提高 稳定 性 , 包 括 贮藏 稳定 性 和 使 用 稳定 性 , 微 圳 膜 可 阻隔 环境 因素 对 药物 理化 性 质 的 破坏 , 如 温度 、pH、 温 度 等 , 提 高 生物 利用 度 ;, 实现 剂型 转换 , 可 实现 药物 的 靶 向 传输 ;药物 毒 副作用 小 ; 服用 方便 、 安 全 , 易 于 被 患者 接受 〈 马 小 军 2002) 。 因 此 , 针 对 各 种 生化 药物 的 微 吉 化 控 释 剂型 的 研究 层出不穷 。 Redding 等 (1984) 等 将 黄体 激素 (LHRH) 包 埋 于 乳酸 一 乙醇 酸 共 聚 物 PLGA) 微 胶囊 中 , 采取 肌肉 注射 途径 实现 该 肽 在 大 鼠 体 内 持续 释放 30 天 以 上 , 显著 降低 了 雄 激 素 依赖 型 前 列 腺 瘤 的 质量 和 体积 ,成 功 抑制 了 大 鼠 血 清 中 睾酮 水 平 , 而 且 效 果 优 于 每 天 皮下 注射 等 量 或 双 倍 剂量 的 未 包 圳 激素 。 纤维 原 细 胞 生长 因子 县 有 刺激 细胞 生长 和 组 织 修 复 的 功能 , 传统 的 基于 聚合 物 基质 的 释放 体系 虽然 能 实现 缓 释 , 但 其 99% 的 分 裂 活性 将 丧失 。Edelman 等 (1991) 将 其 与 肝 素 一 琼脂 糖 凝 胶 珠 键 合 以 便于 长 期 稳定 保存 , 再 以 海藻 酸 钠 包 圳 , 然 后 在 肝素 酶 酶 解 断 键 作 用 下 实现 了 该 因子 以 活性 状态 的 控制 释放 。 Johnson 等 (1997) 将 重组 人 生长 激素 包 埋 于 PLGA 微 球 中 , 经 皮下 注射 入 大 鼠 和 恒 河 猴 体内 , 实 验 结 果 表 明 微 圳 化 激素 性 质 稳 定 , 动 物 血 清 中 重组 人 生长 激素 维持 高 水 平 达 30 天 以 上 , 是 等 量 激素 以 溶液 形式 经 皮下 注射 后 维持 时 间 的 20 倍 。 Takada 等 (1998) 设 计 了 1leuprorelin 的 微 胶 吉 控 制 释放 体系 , 以 大 鼠 和 狗 为 动物 模型 , 一 次 注射 即 可 实现 30 天 内 维持 血清 中 稳定 的 leuprorelin 水 平 。 访 微 吉 化 leuprorelin 对 前 列 腺 癌 、 子 宫 内 膜 异 位 及 性 激素 依赖 型 疾病 的 临床 疗效 已 在 60 多 个 国家 得 到 了 证 实 。 Isobe 等 (1999) 将 重组 人 骨 形 成 蛋白 包 埋 于 乳酸 一 乙醇 酸 共聚 物 微 胶 吉 中 并 移植 人 大 鼠 上 皮下, 经 组 织 化 学 检测 发 现 随 着 骨 形 成 蛋白 的 释放 , 具 有 了 碱 性 磷酸 酶 活性 的 骨 诱 导 细 胞 出 现在 胶 圳 周围 , 而 且 在 异 位 骨 诱 导 形 成 过 程 中 并 不 生成 软骨 , 该 结果 表明 骨 形 成 蛋 白 的 作用 是 诱发 间 质 细胞 分 化 为 成 骨 细 胞 。 另外 对 干扰 素 (Pitt 1990), fe ARPS (Heya et al. 1991). 人 免疫 缺损 病毒 疫苗 (Singh et al. 1997) 等 物质 释放 体系 的 研究 结果 均 表 明 微 胶 吉 〈 微 球 、 微 粒 ) 可 以 起 到 控 ( 缓 ) 释 作用 , 保 护 了 药物 的 生物 活性 , 延 长 了 半衰期 , 提 高 了 稳定 性 , 不 同 程度 地 提高 了 药物 的 生物 利用 度 。 临床 应 用 的 主要 技术 问题 是 如 何 更 好 地 保持 圳 内 和 蛋白质 的 生物 活性 以 及 作为 控制 释放 载体 的 微 胶 宫 材料 的 生物 相 容 性 ,同时 还 需 开 发 条 件 温 和 且 易 于 规模 化 生 产 的 微 胶 圳 制备 技术 。 343.3 0 FEURASTS ST (5 5 (I 基因 治疗 (gene therapy) ( 顾 健 人 等 2001) 是 将 具有 治疗 价值 的 基因 装配 于 能 人 体 细胞 中 表达 所 必 备 元 件 的 载体 中 ,导入 人 体 细胞 直接 进行 表达 。 目 前 常用 的 基因 治 疗 有 ex vivo Filin vivo ARETE. FH, ex vivo 途径 是 指 将 含有 外 源 基 因 的 载体 在 体外 导入 人 体 自身 细胞 , 经 体外 细胞 扩 增 后 , 输 回 人 体 。 这 种 诠 径 的 优点 是 易于 操作 , 技 术 较 成 熟 , 自 体 细胞 回答 较 安全 , 缺 点 是 仅 针 对 个 例 患者 ““ 易 形成 规模 。 而 训 vivo 途径 是 将 外 源 基因 装配 于 特定 的 真 核 细胞 表达 载体 ,直接 。 本 内 。 这 种 载体 可 以 是 病毒 型 或 非 病 毒 型 ,甚至 是 裸 DNA。 这 种 途径 的 优点 是 易于 ,, 恒生 产 载体 , 但 也 存在 明显 的 缺点 , 即 基因 进入 体内 靶 细 胞 技术 难度 高 且 不 安全 。 具有 免疫 隔离 作用 的 微 胶囊 膜 技术 在 基因 治疗 领 | 渗透 使 传统 的 基因 治疗 途径 实 H: ty WR Biomembranes 438 PLT AES. BIA NSE AA ED eA ES AT AA, ZAR) 细胞 规模 化 扩 增 后 , 包 埋 和 人 入微 胶囊 中 , 输 回 人 体 。 在 微 胶囊 膜 的 保护 下 , 细 胞 表达 基因 产物 发 挥 治疗 作用 。 现 在 很 多 学 者 也 将 其 称 为 基于 细胞 的 药物 释放 系统 (cell-based drug delivery system) 。 这 种 新 的 基因 治疗 途径 的 优势 表现 在 : (1) 表达 目的 蛋白 的 细胞 能 够 在 体内 不 断 投 递 药 物 , 实现 长 期 稳定 的 药物 浓度 , (2) 可 在 疾病 局 部 实现 特定 位 点 给 药 , 增加 药物 疗效 ,(3) 由 于 借助 微 事 化 细胞 移植 来 投递 药物 , 对 二 患者 来 说 , 一 年 一 次 的 细胞 植 和 要 比 每 天 的 基因 注射 更 简便 而 易于 接受 (Dove 2002) 。 Read 等 (2002) 和 Joki 等 (2002) 几乎 同时 报道 了 应 用 该 技术 治疗 肿瘤 的 研究 成 果 , 他 们 都 将 表达 抗 血 管 发 生 和 蛋白 血管 内 表 细 胞 生长 抑制 因子 一 -endostatin 的 基因 工程 细胞 包 埋 在 微 胶 吉 中 。Read 等 将 其 植 人 脑 肿 瘤 模型 大 鼠 的 颅 内 , 移 植 后 4 个 月 ,70% 微 圳 化 细胞 仍 保持 活性 , 其 分 刻 的 血管 内 表 细 胞 生长 抑制 因子 使 77% 肿 瘤 出 现 细胞 凋 亡 、 缺 氧 、 坏死 。Joki 等 将 其 植 和 人 皮下 接种 人 神经 胶 质 瘤 细 胞 的 裸 鼠 模型 体内 , 微 圳 化 基因 工程 细 胞 在 植 入 21 天 后 ,62.2% 肿瘤 生长 被 抑制 。 而 Prakash 等 (1995, 1996) 将 表达 脲酶 基因 的 大 肠 杆菌 包 埋 在 微 胶 圳 中 口服 灌注 给 肾 衰 大 鼠 模 型 , 纠 正 了 大 鼠 的 血浆 尿素 水 平 , 这 一 研究 成 果 更 加 扩展 了 基因 治疗 途径 。 马 小 军 课题 组 也 针对 该 技术 提出 了 以 微 吉 化 基因 工程 酵母 细胞 作为 肠 道 生物 微 反 应 器 的 概 念 , 对 其 临床 应 用 的 可 行 性 做 了 初步 研究 (图 34-8) (于 炜 婷 等 2004) , 为 基因 治疗 技术 的 这 入 广泛 应 用 提供 了 新 的 研究 思路 。 微 胶囊 口服 后 在 小 鼠 胃 肠 黏膜 的 黏附 A. 2h, ARaHRRAMT; B. 12h, 肠 黏膜 黏附 44 RENEE 2) A BL cE i Se 愉 起 来 的 膜 技术 。 随 着 生命 科学 的 发 展 , 该 技术 不 仅 引 起 了 工程 学 家 的 重视 , 在 医学 和 生物 技术 领域 同样 引起 了 极 大 关注。 这 种 膜 技术 是 在 交叉 学 科 中 发 展 起 来 的 , 内 容 涉 及 材料 科学 、 化 学 工程 学 、 生物 学 和 医学 科学 的 原理 和 方法 , 目 前 尚 处 于 初级 阶段 , 将 其 真正 应 用 于 临床 还 有 诸多 问题 尚 待 解决 。 和 ae 439 章 PCB NIA DS DEAE 这 些 问 题 按 隶 属 关系 可 概括 为 两 类 , 一 类 是 应 用 工程 学 问题 , 另 一 类 是 生命 科学 问题 。 应 用 工程 学 中 存在 的 问题 主要 表现 在 两 方面 : 材料 性 能 问题 和 材料 加 工 工艺 问题 。 不 同 的 应 用 领域 需要 不 同性 能 的 材料 , 这 些 材料 的 性 能 不 仅 与 其 化 学 组 成 有 关 , 而 且 与 其 加 工 工艺 过 程 密切 相关 。 通 常 , 用 于 药物 控制 释放 的 材料 是 生物 可 降解 的 , 而 且 有 一 定 的 稳定 性 。 当 药物 释放 完毕 , 控 释 材 料 不 会 作为 一 种 外 源 异 物 而 存在 于 生物 体内 ; 在 药物 释放 的 过 程 中 , 控 释 材料 不 会 瞬间 降解 而 将 药物 完全 释放 出 来 。 而 用 于 组 织 右 官 移 植 的 微 胶囊 却 希 望 像 生物 体 本 身 的 器 官 组 织 一 样 可 以 永远 保持 生物 活性 , 不 老化 。 而 且 , 微 圳 化 材料 需要 有 良好 的 生物 相 容 性 , 当 接触 肌体 或 生物 质 时 不 会 对 其 生物 活性 造成 损 害 。 微 圳 化 移植 材料 还 需要 有 良好 的 免疫 隔离 性 能 , 从 而 达到 微 吉 化 的 细胞 或 组 织 不 被 宿主 免疫 系统 破坏 的 目的 。 当 前 , 针 对 微 吉 化 细胞 这 种 新 型 治疗 产品 提出 对 其 组 成 材料 的 物化 性 质 和 成 分 、 纯 化 等 级 、 反 应 条 件 及 重复 性 等 方面 建立 标准 化 , 即 建立 移植 级 生 物 材 料 (Gorka et al. 2004)。 加 工 工艺 所 面临 的 挑战 是 加 工 过 程 的 规模 化 、 标 准 化 , 即 整 个 加 工 过 程 必须 在 可 挖 环境 下 进行 , 建 立 规范 操作 和 严格 的 质量 控制 标准 。 生命 科学 中 存在 的 问题 更 为 复杂 , 内 容 包括 : 微 胶 宫 膜 在 体内 吸收 与 降解 动力 学 , 控 释 载体 对 靶 向 位 点 的 识别 能 力 , 药 物 在 靶 癌 部 位 释放 的 浓度 梯度 , 药 物 与 丢 位 临近 器 官 组 织 的 相互 作用 以 及 属 官 移植 过 程 中 微 胶 吉 材 料 与 组 织 的 相互 作用 机 制 等 。 这 些 问 题 的 解决 有 待 于 对 膜 微观 结构 进一步 加 深 了 解 ,有待 于 从 细胞 水 平 以 及 分 子 水 平 加 深 对 材 料 与 组 织 相互 作用 的 了 解 。 随 着 膜 科 学 家 与 生物 学 家 、 医 学 家 等 的 广泛 合作 ,以 及 生物 膜 研究 技术 的 不 断 发 展 , 微 胶囊 膜 技术 将 会 日 趋 成 熟 。 它 将 在 传统 膜 概念 的 基础 上 引进 更 多 生物 学 知识 , 创 立新 的 膜 基础 理论 , 开 发 全 新 的 技术 产品 。 (Fie Axe ” 马 小 军 ) | 顾 健 人 , 曹 雪 涛 . 2001. 基因 治疗 . 北京 : 科学 出 版 社 . 1-2 李 明 春 , 王 勇 , 马 小 军 . 1999. 反应 时 间 对 壳 聚 糖 /海藻 酸 钠 微 胶囊 制备 的 影响 . 化 学 通报 (网 络 版 ), 13: 99060 刘 袖 洞 , 何 详 , 刘 群 等 . 2000. 微 胶囊 及 其 在 生物 医学 领域 的 应 用 . 科学 通报 , 45: 2476-2485 马 小 军 . 2002. 微 胶囊 与 人 工 器 官 . 北京 : 化 学 工业 出 版 社 . 144 EB, WK, 马 小 军 . 1999. 壳 聚 糖 /海藻 酸 钠 生物 微 胶 圳 的 研究 进展 . 生物 工程 进展 , 19: 13-16, 20 王 勇 , 何 详 , 马 小 军 . 2000. Deacetylation of Chitosan Films. 国际 网 上 化 学 学 报 ,11: 02b051ne 吴 美 慧 , 张 晓 梅 , 郝 金 盛 等 . 1999. 微 吉 化 猪 甲状 腺 组 织 移植 治疗 甲状 腺 功能 减退 大 鼠 的 实验 研究 . 解放 军医 学 杂志 , 24: 242-244 BER, 王 振 福 , 李 新 建 等 . 1999. 微 囊 化 牛 虽 上 腺 散 质 嗜 铬 细胞 脑 内 移植 治疗 偏 侧 由 金森 病 样 大 鼠 及 猴 的 实验 研究 . 解放 军医 学 杂志 , 24: 238-241 于 炜 婷 , 雄 应 , 刘 袖 洞 等 . 2004. 海藻 酸 钠 - 壳 聚 糖 微 胶 圳 作为 肠 道 内 生化 微 反 应 器 的 研究 . 高 等 学 校 化 学 学 报 , 25: 1381-1383 Aebischer P, Pochon N A, Heyd B, et al. 1996. Gene therapy for amyotro lateral sclerosis(ALS) using a polymer encapsulated xenogenic cell line engineered to secrete hcNTF. Hum Ge .er, 7: 851-860 Asaki M, Ichinose T, Monjushiroh H, et al. 1998. Polyamide microcapsules c ing alginic acid: extractakility of metal ions and surface chara cterization by XPS. J Microencap, 15(4): 453-463 Chang T M S. 1957. Hemoglobin corpuscles. Research Report for Honours ology. 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J Biomed Mat Res, 41(3): 461-467 443 # Sl mR I oo-adrenergic receptor op- 肾上腺 素 能 受 体 292 ABC transporter ABC 转运 体 15,210 acetylcholine receptor, AChR 乙酰胆碱 受 体 45, 46 action potential 动作 电位 145 adaptor protein ”连接 蛋白 286 ADP- ribose pyrophosphatase ADP- 核糖 售 磷酸 酶 ”271 ADP ribosylation factor, ARF ADP- 核 糖化 因子 201 advanced glycosylation end product, AGE “高度 糖 基 化 终 产物 357 alternative oxidase 替代 氧化 酶 ”129 amphid Xia 276 anionchannel 阴离子 通道 167 ankyrin #424 271 annexin fREKA 167 antigen presenting cell, APC 抗原 呈 递 细胞 371 apical sorting ”顶端 分 选 353 apoptosis HA@JAT-2 298, 306 aquaporin, AQP ”水 通道 蛋白 174 aquaporin-1 水 通道 蛋白 -1 6 artifical cell 人工 细胞 429 atomic force microscope, AFM 原子 力 显 微 镜 411 ATP binding cassette transporter ABC 转运 体 8 ATP synthase ATP 合 酶 ”90, 108 augmentative H* leak 附加 质子 漏 137 avalanche photodiode detector, APD SS Aqot Ak RUMI = “377 avidin 亲 和 素 389 Bbarrel BHR 33 B cell receptor, BCR B 细胞 受 体 365 back projection 反 投 影 42 bacteriorhodopsin ” 菌 紫 红 质 , 细 菌 视 紫 红 质 45, 99 B-amyloid, AB 省 粉 样 蛋白 357 basal H* leak 基本 质子 漏 “” 135 Bcl-2 family protein Bcl-2 家 族 蛋 白 300, 308 biconcave XNA 407 binding change mechanism ”结合 变化 机 理 92 bioluminescence resonance energy transfer, BRET 生物 发 振 能 量 转移 247 biotin 生物 素 389 brain edema “” 脑 水 肿 179 breast cancer resistance protein, BCRP Fast 25 - sz = — 物 膜 Biomembranes 444 budding [Hz 204 C Ca** release unit, CRU 和 钙 释 放 单 元 257 Ca** pump Ca*3# 189 calcium-induced calcium release, CICR #52¢F5R##iiq 257 calcium blip ”和 钙 脉 冲 ”258 calcium channel Ca?*iiifi 165 calcium noise 5p 258 calcium puff #5kK{—E 258 calcium quark #545_ 259, 261 calcium scraps Jz CFB {E 265 calcium sparklet #5 262 calcium spike 5£+ 260 calcium wave #5j& 257 calmodulin, CaM 5/2: 236 capacitative Ca** entry,CCE ” 获 能 型 钙 内 六 276 cargo protein ”货物 蛋白 287 carotenoid 胡 昔 小 素 102 cathepsin 组 织 蛋 白 酶 317, 318 caveolae “ 质 膜 微 吉 11,51, 54, 286, 344, 350, 351, 357, 379 caveolin (#25, APA 11, 52, 56, 344, 348, 350, 357 caveolin scaffolding domain 内 陷 素 支 架 结 构 域 ”S$6, 350 cell adhesion molecule, CAM ”细胞 黏附 分 子 365 central section theorem 中心 截面 定理 ”40 chanzyme 通道 酶 271 chaotropic agent 促 溶 剂 82 charge-coupled detector,CCD ”电荷 耦合 探测 器 377 check point 检验 点 310 chemiosmotic hypothesis ”化 学 渗透 假说 91 chemiosmotic system ”化 学 渗透 体系 134 chilling resistant plant 抗 冷 性 植物 75 chlorophyll ”叶绿素 102 cholesterol 胆固醇 8 ciliary neurotrophic factor receptor 纤毛 状 神经 营养 因子 受 体 348 clathrin 笼 形 蛋白 201, 286, 348 clathrin-mediated endocytosis S20 AsrSHIAZ 286 cluster of differentiation, CD 47>{t#f 362 coated pit 有 被 小 富 ”286 coatomer 外 被 体 201 cold- and menthol-sensitive receptor, CMR 4 CBX Aye HPAP URS «274 common pool 公共 池 系 统 256 complement 补体 367 compound Ca” spark 复合 型 钙 火 花 257 confocal laser scanning microscopy,CLSM ”共聚 售 激光 扫描 显 微 术 377 consolution boundary ji Fe 22 constitutive secretion ZH KAZI 204 445 co-receptor 协同 受 体 354 crista junction model WHE O RA 129 cristae lumen lf 128 critical micelle concentration, CMC I FREY 22, 399 cryoelectron microscopy ”冷冻 电子 显微镜 术 40 crystal packing “晶体 堆积 26 cyclic nucleotide-gated, CNG “” 环 核 苷 酸 门 控 通 道 271 cytokine ”细胞 因子 367 death domain, DD ”死亡 结构 域 299 death receptor, DR ”死亡 受 体 ”299 delayed type hypersensitivity, DTH iRAR ABR 369 density gradient centrifugation ”密度 梯度 离心 61 detergent +757] 20, 82 detergent insoluble membrane/detergent resistant membrane 去 污 剂 不 溶 细胞 膜 ”S2 detergent-insoluble glycolipid-riched domain ”去 污 剂 不 溶 的 富 含 糖 脂 区 12, 350 diabetes 糖尿 病 84 dimerization 二 聚 体 化 ”245 docking protein, DP ”停靠 蛋白 204 dominant negative mutant 负 显 性 突变 体 230 dorsal root ganglia, DRG ” 背 根 神 经 节 272 drug controlled release ”药物 控 释 437 Duchenne muscular dystrophy, DMD 杜氏 肌 营 养 不 良 症 358 dyadic junction ”二 分 体 连 接 264 dynamin KARA 338 early endosome 早期 胞 内 体 288 elasticity theory ”弹性 理论 ”410 electrogenic pump “致电 泵 159 electron crystallography ”电子 唱 体 学 31,41 electron tomography 电子 断层 成 像 41 electrospray ionization, ESI 电 喷 雾 离 子 化 81 endocytic vesicle Aj#/)i 288 endocytosis ff# 205, 285 endonucleaseG ”内 切 核 酸 酶 G 300,310 endoplasmic reticulum, ER ”内 质 网 “202 endosome 胞 内 体 12, 14, 288 epidermal growth factor receptor, EGFR ”表皮 生长 因子 受 体 250 erythropoietin 红细胞 生成 素 244 erythropoietin receptor 红细胞 生成 素 受 体 251 evanescent wave “ 瞬 逝 波 378 excitatory postsynaptic potential, EPSP 3445-4638 fit iq Ha / 53 exciton action mechanism ” 激 子 作用 机 制 118 exocytosis fg. 205 exportin 外 运 和 蛋白 228 # Gl © RR Sea oe HE 4 i Biomembranes 446 FAS-associated death domain, FADD FAS- 连接 的 死亡 结构 域 “299 fatty acid 脂肪酸 ” 67 fluid mosaic model ”流动 灸 秽 模 型 15,52 fluid-phase pinocytosis” 液 相 胞 饮 作 用 285 fluorescence resonance energy transfer, FRET ”荧光 共振 能 量 转移 ”98, 228, 247, 352 folate receptor ”叶酸 受 体 57 force spectrum i 377 fusion fle 205 G protein-coupled inwardly rectifying K* channel, GIRK G 和 蛋白 偶 联 内 向 整流 钾 通 道 ”155 G protein-coupled receptor, GPCR G 和 蛋白 偶 联 受 体 353 galactolipid 半 乳 糖 脂 65, 72 gated channel 门 控 通道 ”146 gating |] 146 GDP-dissociation inhibitor, GDI GDP 解 离 抑 制剂 ”206 gene knockout 基因 殴 除 177 gene mutation 基因 突变 177 gene therapy 基因 治疗 342, 437 glucose transporter 和 葡萄糖 运 输 体 86 glycerophospholipid 甘油 磷脂 8 glycosylphosphatidylinositol anchored protein ” 糖 基础 脂 酰 肌 醇 锁定 蛋白 345 glycosylphosphatidylinositol linked protein, GPI-pr 糖 基础 脂 酰 肌 醇 锚 合 蛋白 345 Golgi complex ”高尔基 体 202, 15 GPI-anchored protein GPI 锁定 和 蛋白。 57 granalamellae 基 粒 片 层 118 granzymeA 和 粒 酶 A 314 half transporter 半分 子 转运 体 219 heat dissipation ” 热 耗 散 105 helix-turn-helix motif 螺旋 一 转角 一 螺旋 的 基 序 357 helperT cell 辅助 性 工 细 胞 , Th 细胞 368 hemagglutinin, HA 血 凝 素 353 heteroplasmy “ 异 质 性 329 heterotrimeric G-protein ” 异 三 聚 体 G 蛋白 238 high subsurface [Ca**] domain ”高 钙 信 号 区 域 ”265 homology modeling 同 源 模 建 ” 186 homoplasmy 同 质 性 329 image contrast 像 衬 度 40 immobilized pH gradient, IPG 因 相 化 pH 梯度 80 immune response . 免疫 应 答 368 immunoglobulin 免疫 球 蛋 白 。 365 immunoisolation 免疫 隔离 426 importin 内 运 和 蛋白 228 NC 2 | 447 K L inducible H* leak i&&)i-f-ikj 137 inhibitory postsynaptic potential, IPSP ”抑制 性 突 触 后 电位 ”154 inwardly rectifying K* channel, Kir AV [al (ac FAHia = 148 ion channel ”离子 通道 146, 159 KesA 链 霉 菌 K 通道 3 lamin 入 年 层 蛋白 “227 Langmuir-Blodgett membrane LB 膜 383 large unilamellar vesicle, LUV ”大 单 层 脂 质 体 396 late endosome “晚期 胞 内 体 14, 288 layer-layer-assembly 层 层 组 装 419 Leber hereditary opitic neuropathy, LHON Leber’ s 遗传 性 视神经 雁 缩 病 327 leukocyte differentiation antigen, LDA 自 细 胞 分 化 抗原 362 ligand-gated channel 配 体 门 控 通 道 ”146 light harvesting complex II, LHC-II 捕 光 复合 体 开 28, 45 lipase 脂 酶 “74 lipid cubic phase “ 脂 立 方 相 “19 lipid rafts AB#E 11,51, 52, 350, 351, 379 lipid-ordered phase 脂 质 有 序 相 51 liposome 脂 质 体 395, 415 liquid-ordered phase ”液态 有 序 相 12 lung resistance protein, LRP 肺 奉 药 蛋 白 219 lysosomal Bid degradation factor, LBDF 溶 酶 体 中 剪 切 Bid 蛋白 的 有 关 因 子 318 lysosome 溶 酶 体 316 macropinocytosis ”大 型 胞 饮 作 用 286 major histocompatibility antigen, MHA 主要 组 织 相 容 性 抗原 364 major histocompatibility complex, MHC 主要 组 织 相 容 性 复合 体 364 mass spectroscopy 质谱 81 maternal inheritance 母系 遗传 性 329 matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI 基质 辅助 的 激光 解吸 附 离子 化 81 mechanic-gated channel ”机械 门 控 通 道 150 mechanosensitive “机 械 敏感 33 membrane lipid microdomain 膜 脂 质 微 区 ”50 membrane potential 膜 电 位 152 membrane protein crystallization ” 膜 蛋白 结晶 “19 membrane proteomics “ 膜 蛋 白质 组 学 82 membrane traffickling 膜 的 运送 13 membranopathy “ 膜 病 学 ”344 microcapsule 微 胶 吉 419, 426 microcapsule membrane 微 胶 圳 膜 426 mitochondrial membrane permeabilization, MMP ”线粒体 iM 308 molecular rotary motor ”分子 旋转 马达 “96 multidrug resistance, MDR ”多 药 附 药性 212 multidrug resistance-associated protein, MRP 多 药 附 药 相 ”有 重 白 211 # I 448 multi-lamellar vesicle, MLV 多 层 脂 质 体 395 multivesicular body, MVB ”多 宫 泡 体 289 N nephrogenic diabetes insipidus \SJEMESR ARIE 177 N-ethyl maleimide sensitive factor, NSF N 乙 基 马 来 酰 亚 胺 敏感 因子 206 nitric oxide synthase, NOS “一 氧化 氮 合 酶 87, 313 non-gated channel 非 门 探 通 道 146 nuclear assembly 细胞核 重 建 ”230 nuclear envelope 核 膜 226 nuclear export sequence, NES ” 核 外 定位 信号 229 nuclear lamina 核 纤 层 226 nuclear magnetic resonance, NMR 核磁 共振 31 nuclear pore complex, NPC ” 核 孔 复合 体 226 nuclear transport factor 2, NTF2 #%4#ia74% -2 228 nucleoporin 核 膜 孔 蛋白 ”228 nucleotide binding domain, NBD 核 苷 酸 结合 结构 域 212 open vesicle 开口 膜 泡 409 optical single channel record ”光学 单 通 道 记 录 263 optical tweezer 光 钳 377 orphan nuclear receptor 孤儿 核 受 体 311 ouabain ATF 183 oxidative phosphorylation 氧化 磷酸 化 91 oxygen glucose deprivation, OGD SA #j##xIZF 278 passive diffusion-based H* leak 被 动 扩散 质子 漏 “”135 peptide mass fingerprinting, PMF 肽 质量 指纹 图 81 peripheral benzodiazepin receptor, PBR 边 周 型 验 二 氮 杂 昔 受 体 314 permeability glycoprotein, P-gp 了 型 糖 和 蛋白 15,212 permeability transition pore,PTP ” 通 透 性 改变 孔道 ”302, 309, 314 phagocytosis ” 胞 唑 作用 285 phase-separated state “” 相 分 离 状 态 75 phosphatidylglycerol, PG fAaRE HH 67 phospholipase “磷脂 酶 ”74 phosphoslipase C,PLC ”磷脂 酶 C 239 photosynthesis ”光合 作用 101 photosynthetic system unit, PSU ”光合 反应 系统 单位 37 photosystem! 3¢AZE1 105 photosystem I] 光 系 统 工 104 pinocytosis ” 胞 饮 作 用 285 plasma Ca?*-ATPase ij flit Ca**-ATPase 195 plastocyanin ” 质 监 素 103 plastoquinone %Jmfk 103 polycystic kidney disease, PKD 24#€'3 3 274 polyelectrolyte 3¢HUfel 418 ON QCQ,Q,G,G,G,Q),G 449 Q R polyubiquitination ”多 泛 素 化 ”290 porin fR4L&A 34, 128,314 postsynaptic density zone, PDZ ” 突 触 后 致密 域 273 potassium channel 开通 道 3,36, 161 pre-budding complex 前 胞 芽 复 合 物 202 primary electron acceptor 原初 电子 受 体 120 primary electron donor 原初 电子 供 体 120 primary reaction 原初 反应 ”102 priming Jaa) 206 prion protein, PrP© [puja 354 programmed cell death,PCD 程序 性 细胞 死亡 ”298, 306 protein sorting ”蛋白质 分 选 12 proteoliposome “ 脂 蛋 白 体 397 proteomics ”蛋白质 组 学 79 proton conductance “质子 导 性 135 proton electron-chemical gradient ”质子 电化 学 梯度 130 proton leak ”质子 漏 130 proton motive force “质子 动力 势 103 proton permeability coefficient 于 渗透 性 系数 137 P-type ATPase 了 型 ATP 酶 183, 189 Q-cycle Q 人 循环 ”130 receptor-mediated endocytosis” 受 体 介 导 胞 吞 作 用 285 receptor-operated theory ” 受 体 操控 理论 276 redox-slip” 氧 还 请 扣 132 regulated secretion jj) #477 204 replicative segregation 复制 分 离 330 respirasome “呼吸 小 体 129 respiratory-chain disease 呼吸 链 疾病 327 rhodopsin 视 紫 红 质 252 ripple phase 条纹 相 416 RNA interference, RNAi RNA 于 扰 75 rotating catalysis ”旋转 催化 ”93 Ryanodine receptor,RyR ”雷诺 丁 受 体 257,313 scaffolding protein ”支架 蛋白 350 scanning confocal microscopy,SCM ,” 扫 摘 共聚 焦 显 微 术 381 scanning ion conductance microscopy, SICM ,” 扫 拉 离子 电导 显 微 术 381 scanning near-field optical microscopy, SNOM ”扫描 近 场 光学 亚 微 术 377 scanning tunneling microscopy,STM ”扫描 隧道 显 微 术 37° selective filter 选择 性 过 滤器 48 selective permeation 选择 性 通 透 147 signal mass ”信号 积 262 signal recognition particle, SRP ”信号 识别 颗粒 204 # Gl 全 一 pe i Sane 去 三 H: 4 i Biomembranes 450 signal transduction {#5465 59, 158, 243 signature sequence “特征 序列 ”150 single molecule 单 分 子 376 single-particle analysis” 单 颗粒 分 析 41 small unilamellar vesicle, SUV 小 单 层 脂 质 体 396 small-amphiphile 两 性 小 分 子 23 sodium potassium ATPase 钠 钾 ATP 酶 182 soluble NSF attachment protein, SNAP ”可 溶性 NSF 附着 蛋白 206 sorcin 抗 药 蛋白 ”352 sorting endosome “分 选 胞 内 体 288 sorting 分 选 ”290 sphingolipid (神经 ) 鞘 脂 8 SR Ca?*-ATP fi HJLAZ PX) Ca?*-ATP By 7, 34, 190 stomatal guard cell 气孔 保卫 细胞 161 stomatal movement 气孔 运动 164 store-operated channel, SOC ”和 钙 库 操控 通道 ”276 streptavidin ” 链 霉 抗 生 物 素 95 stroma lamellae 基质 片 层 118 structure factor 结构 因子 40 sulphoquinovosyldiacylglycerol, SQDG ,” 硫 代 异 鼠 李 糖 基 甘 油 二 酯 ”66 supported planar bilayer 支撑 平面 脂 双 层 388 synaptic potential 2 fphHafiz 152 synaptotagmin 突 触 结合 蛋白 207 synexin AEA 352 T cell dependent antigen, TD-Ag 工 细 胞 依赖 性 抗原 368 T cell receptor, TCR _ 工 细胞 受 体 366 tethering factor ##AA-f 205 thermogenin 产 热 蛋白 135 thioredoxin ” 硫 氧 还 蛋白 106 three-dimensional reconstruction 三 维 重 构 40 threshold effect 国人 值 效应 ”330 thylakoid membrane lipid ”类 圳 体 膜 脂 69 thylakoid membrane “类 圳 体 膜 ”64 tissue proclivity 组 织 倾向 性 333 tissue/cell transplantation 组 织 /细胞 移植 ”433 total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM 全 内 反射 荧光 显 微 术 377 transactivation 4647 250 transcytosis ”路 细胞 转运 ”285 transducisome “ 转 导 小 体 278 transduction channel 445:ii8 280 transferrin 运 铁 蛋白 286 transient receptor potential, TRP TRP 通 道 270 trans-membrane domain, TMD ” 跨 膜 结构 域 212 7-transmembrane G-protein coupling receptor 七 次 路 膜 G BARRA 243 transport vesicle ”转运 宫 泡 200 Vi ae we emeremei om 451 TRP domain TRP 结 构 域 271 TT-SR junction 横 管 一 肌 浆 网 连接 点 261 tyrosine protein kinase M2 ASE AH 244 U ubiquitination 泛 素 化 ”290 uncoating fp 288 uncoupling protein, UCP ff#{REK2 130, 135 unfolded protein response, UPR ”应 对 未 能 正确 折 和 县 的 蛋白 质 311 vanilloid receptor 1, VR1 香草 素 受 体 1 275 voltage clamp 电压 钳 145 voltage dependent anion channel, VDAC ”电压 依赖 性 阴离子 通道 314, 303 voltage-gated channel 电压 门 控 通 道 148 voltage-sensing paddle 桨 式 电 压 感受 器 149 vomeronasal organ, VNO 48823 273 W water channel 水 通道 6 x X-ray crystallography 和 射线 晶体 学 31 z zymogen granule fgJR RIAL 14 E Wilt (Q—1551 0101) 封面 题字 : 邹 承 鲁 责任 编辑 : 庞 在 堂 4 书 从 分 六 到 细胞 水 平 较 系 统 、 全 面 地 介绍 了 目前 生物 膜 研究 的 国内 外 最 新 研究 进展 , 并 展示 了 等 物 膜 研究 的 重要 前 沿 领域 及 其 多 学 科 交叉 研究 的 特色 。 不 仅 反映 了 当前 生物 膜 的 研究 动身, 也 对 国内 研究 情况 作 了 基本 描述 。 全 书 共 分 7 篇 , 内 容 主要 包括 与 生物 膜 的 能 量 转 换 、 物 质 运 送 和 信号 跨 膜 转 导 等 三 大 基本 功能 和 结构 的 相关 内 容 , 同 时 对 研究 生物 膜 的 理论 、 技术 、 方 法 及 在 医药 等 方面 的 应 用 也 做 了 介绍 。 本 书 由 40 余 名 从 事 生物 膜 相 关 研 究 领域 的 一 线 科技 和 教学 人 员 撰 写 而 成 , 其 中 包括 6 位 中 国 科学 院 院 士 。 本 书 可 供 从 事 生 命 科学 研究 、 教 学 的 研究 生 、 科 研 人 员 和 教师 等 参考 Biomembranes The study of biomembranes is one of the most rapidly growing areas in today’s molecular cell biology. Biomembranes consists of 7 parts: (1) Structure of biomembranes, (2) Biomembranes and energy-conversion, (3) Membrane transport, (4) Biomembranes and signal transduction, (5) Biomembranes and apoptosis, (6) Biomembranes and medicine and (7) Advanced methods and techniques for biomembrane study. The authors were asked by the editors not only to describe the current status of research in their fields, but also to mini-review the topics they chose. Biomembranes should be appropriate for graduate students as well as active investigators and instructors in the life sciences. It will also serve as an excellent refresher for advanced courses in molecular cell biology and related fields. 7-03-015059-7 queen & 村 生命 科学 编辑 部 联系 电话 : 010-64012501 http://www.lifescience.com.cn e-mail:spbio@163.net ISBN 7—03-015059~7 = Ur: 120.00 元 销售 分 类 建议 :生物 医学 /生物 技术 /分 子 生物 学