^fSliilii irn^A / " "T »-^ ^^4*ver 393 Assimilationsversuche mit kolloidem Chlorophyll 399 Nachweis von Hydroperoxyd luid anderen löslichen Peroxyden S. 400. Versuche mit Chlorophyll ohne Enzym S. 402. Versuche unter Znsatz von Katalase S. 404. Über das Assimilationsexper'ment von Chodat und Schweizer . . . 406 V. Die Frage der Formaldehydbildung aus Chloroph^dl 409 Versuche zur Oxydation des Chlorophylls im Lichte 413 \'L i'ber das Verhalten der ChlorophyUkohlensäureverbindung im Lichte . .415 A. Theoretischer Teil 415 B. Über Peroxydase 420 Darstellung des Enzyms 420 Bestimmung der Peroxydasewirkung 423 C. Versuche mit Chlorophyll und Kohlensäure bei Ciegenwart von Peroxydase 427 Die Versuchsanordnung 427 Versuche bei Zutritt von Sauerstoff 429 ^'crsuche unter Ausschluß von Sauerstoff 431 Schlußwort 433 Autorenregister 438 Sachregister 440 Erste Abhandlung. Über die Konstanz des Chlorophyllgehaltes während der Assimilation. I. Einleitung. Chlorophyll ist erst seit einigen Jahren als Substanz bekannt. Während es früher zweifelhaft war, ob es ein Chlorophyll gäbe oder mehrere ähn- liche Pigmente oder eine große Anzahl von Blattfarbstoffen, sind vor kurzem Methoden geschaffen worden, um die Blattfarbstoffe beliebiger Herkunft vergleichend zu untersuchen. Es war für diesen Zweck nicht nötig, das Chlorophyll in unveränderter Form aus der Pflanze zu isolieren. Noch bevor diese Aufgabe gelöst war, konnte durch charakteristische Abbauprodukte, nämlich durch die in alkalischer Lösung entstehenden Phylline, Carbonsäuren mit komplex gebundenem Magnesium, und durch den von Säure gebildeten magnesiumfreien Phytolester Phäophytin der assimilatorische Farbstoff in seiner chemischen Eigenart beschrieben und identifiziert werden. Der Vergleich hat sich auf mehr als zweihundert Pflanzen aus vielen Klassen der Kryptogamen und Phanerogamen er- streckt. Darunter waren Pflanzen aus den verschiedensten Lebens- bedingungen, Meeresalgen, Süßwasserpflanzen und Landpflanzen, ein- heimische und tropische Gewächse. Das Ergebnis war die Identität des Chlorophylls in allen untersuchten Pflanzen. Das Chlorophyll ist hinsichtlich seiner Zusammensetzung, seiner chemischen Eigenschaften und der wesentlichen Züge seiner Struktur Willstätter-StoU, Assimilation. I 2 R. Willstätter und A. Stoll. erforscht worden^); es wurde in reinem Zustand zugänglich und man erkannte es als ein Gemisch zweier Farbstoffe, der Komponenten a und h , die sich trennen ließen. Das blaugrüne Chlorophyll a und das gelbgrüne Chlorophyll h sind komplexe Magnesiumverbindungen \'on ähnlicher Zu- sammensetzung: Chlorophyll a [MgN,C32H3oO]C02CH3 • CO2C20H3,, Chlorophyll b [MgN,C32H2A]C02CH3 • CO2C20H39. Es ist zwar noch nicht möglich, diese beiden Komponenten ineinander überzuführen, sie sind aber zu identischen Verbindungen, die ihnen noch nahestehen, abgebaut worden, so dai3 man auf die Verwandtschaft ihrer Konstitution daraus schließen darf. In den Chloroplasten werden die Chlorophyllfarbstoffe stets von zwei gelben Pigmenten begleitet, von dem Kohlenwasserstoff Carotin, dessen Zusammensetzung C40H56 ist, und der Sauerstoffverbindung Xantho- phyll von der Formel C40H56O2; zu diesen gesellt sich in der Klasse der Phäophyceen noch ein drittes Carotinoid, das Fucoxanthin. Die Isolierung der einzelnen Blattfarbstoffe bot uns die Grundlage für Methoden ihrer quantitativen Bestimmung. Die erste An- wendung von den auf colorimetrischem Prinzipe beruhenden Bestim- mungen, die wir schon mitgeteilt haben 2) und mit einigen Verbesserungen im folgenden genauer beschreiben wollen, betraf den Chlorophyllgehalt der Blätter und das Komponentenverhältnis des Pigmentgemisches. An das Ergebnis der Analysen knüpfen die folgenden Abhandlungen an, in welchen die chemischen Einrichtungen des Assimilationsapparates ein- gehender untersucht werden sollen. Der Chlorophyllgehalt normal grüner Blätter von sehr verschie- denen Pflanzen beträgt zumeist etwa 0,8 Prozent des Trockengewichts und er bewegt sich in ziemlich engen Grenzen, nämlich im allgemeinen zwischen ^) Die Ergebnisse sind kurz zusammengefaßt von R. Willstätter, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 47, 2831 [1914] und ausführUcher von R. Willstätter und A. Stoll in dem Buche „Untersuchungen über Chlorophyll" (Berlin 191 3). 2) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, W . Abschnitt. über die Konstanz des Chlorophyllgehaltes während der Assimilation. 3 0,15 bis 0,35 g f^^i" ic)0 g Frischgewicht der Blätter, 0,6 bis 1,2 g für 100 g Trockengewicht der Blätter, 0,3 bis 0,7 g für I qm Blattfläche. Auch für die gelben Pigmente gilt, daß ihre Prozentgehalte nur ge- ringen Schwankungen unterliegen; die Carotinoide machen 0,07 bis 0,20 Prozent vom Trockengewicht aus, d. i. 0,03 bis 0,07 g für das Quadratmeter Blattfläche. Gleichfalls annähernd konstant ist bei normal lebenden Pflanzen das Verhältnis zwischen den Chlorophyllkomponenten a und 6, das kurz als Q" bezeichnet werden soll. Auf ein Mol Chlorophyll b treffen un- gefähr drei Mole Chlorophyll a; der genaue Durchschnittswert aus der besten Bestimmungsreihe war 2,9 mit der größten Abweichung von :t;0,5 bis 0,6. Das Verhältnis der Farbstoffe erleidet unter natürlichen Bedingungen während der Assimilationstätigkeit des Chlorophylls keine Verschiebung, die Tageszeit beispielsw^eise ist ohne Einfluß darauf, wie im Hochsommer ausgeführte Analysen zeigen: morgens (4*') abends (5^) Q bei Sambucus 2,77 2,85 ,, Aesculus 2,89 2,82 ,, Platanus 3,52 3,34 Für diese quantitative Beziehung bilden allein eine Ausnahme die Phäophyceen, in welchen neben dem Chlorophyll a nur eine verschwin- dend kleine Menge der Komponente b vorkommt^). Auch das Verhältnis der beiden Carotinoide, kurz als Q. bezeichnet, weist keine größeren Schwankungen auf. In Blättern aus normalen Lebensbedingungen ist ihr durchschnittliches Verhältnis 0,60 mit den größten x\bweichungen von +0,1; auf ein Mol Carotin treffen andert- halb bis zwei Mole Xanthophyll. Wenn man dieses konstante Verhältnis zwischen den beiden grünen und zwischen den beiden gelben Pigmenten berücksichtigt, dann legt 1) R. Willstätter und H. J. Page, Ann. d. Chem. 404, 237 [1914]. 4 R. Willstätter und A. Stoll. die in den Formeln ausgedrückte nahe Beziehung in jedem dieser Paare besondere Annahmen nahe für eine chemische Beteihgung der Pigmente am Assimilationsvorgang. Die Zusammensetzung beider Paare differiert in gleicher Weise, nämhch um ein Mol Sauerstoff. Die Formeln der Caro- tinoide zeigen ohne weiteres diese Differenz; in den Formeln der Chloro- phylle ist sie so ausgedrückt, daß die Komponente b um zwei Wasser- stoff atome ärmer und um ein Sauerstoff atom reicher ist. Diese Beziehung in der Zusammensetzung veranlaßt die Frage aufzuwerfen, ob in dem Vorgang der Zerlegung von Kohlensäure, in welchem ein Mol Sauer- stoff entbunden wird, die zusammengehörenden Paare von Farbstoff ineinander übergehen, indem sie ihre Funktion ausüben. Zu Beginn war unsere Untersuchung daher von der Hypothese^) beeinflußt, daß die Kohlensäure durch die Affinität der Magnesiumverbindungen ange- zogen und daß ihre Reduktion durch die Chlorophyll komponente a in dem Prozesse bewirkt werde, der die absorbierte Lichtenergie verbraucht. Das Chlorophyll a oxydiere sich dabei zum Chlorophyll b und dieses werde unter Abspaltung von Sauerstoff wieder in die erste Komponente zurückverwandelt, wobei sich zwischen den beiden Komponenten ein Gleichgewichtszustand einstelle. Es galt dabei entweder als möglich, daß diese Abgabe von Sauerstoff aus der Komponente b unmittelbar erfolge oder daß sich die Carotinoide an der Rückverwandlung in das Chlorophyll a beteiligen. Als ihre Aufgabe ließ sich die Einstellung des Komponentenverhältnisses der Chlorophylle vermuten, vielleicht in der Weise, daß durch Carotin dem Chlorophyll b Sauerstoff entzogen und daß dieser aus dem gebildeten Xanthophyll wieder entbunden werde. Gleichviel ob in irgendeiner solchen Weise die gelben mit den grünen Pigmenten funktionell verbunden sind oder ob sie überhaupt nicht in der Photosynthese zusammenwirken, die Konstanz der Verhältnisse zwischen den Komponenten des Blattfarbstoffs konnte kaum als zufällig und bedeutungslos erscheinen. Die vorliegende erste Arbeit behandelt daher zunächst die Frage, ob 1) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, S. 24. über die Konstanz des Chlorophyllgehaltes während der Assimilation. 5 unter besonderen natürlichen Bedingungen die Komponentenverhält- nisse bedeutender abweichen und weiterhin, ob sie sich unter willkür- lichen Bedingungen der Assimilation wesentlich verschieben lassen. Wenn man annahm, das assimilierende Blatt sei mit einer Einrichtung ausgestattet, die das Verhältnis zwischen den Farbstoffen zu annähern- der Konstanz reguliere, so w^ar der Versuch zu unternehmen^ das Blatt assimilieren zu lassen, indem die regulierende Einrichtung überlastet oder gestört wird. Durch die quantitative Analyse des gesamten Pig- mentes nach dem Versuche sollte auf unzureichende Regulierung der Komponenten Verhältnisse geprüft werden. Die Untersuchung hat aber ergeben, daß unter beliebigen, in der Natur oder im Experiment gebotenen Bedingungen das Verhältnis der beiden Chlorophyllfarbstoffe nicht, das der Carotinoide im allgemeinen nicht erheblich verändert werden kann. Es ist mithin gar kein An- zeichen dafür gefunden worden, daß überhaupt in den Lebensbedingungen der Pflanze einer der beiden Chlorophyllfarbstoffe in den anderen, und daß durch den Assimilationsvorgang eines der beiden Carotinoide in das andere umgewandelt werde. Der Vorstellung, welche die Sauerstoff- abspaltung aus der Kohlensäure näher erklären wollte als eine inter- mediäre Oxydation von Chlorophyll und möglicherweise sekundär von Carotin, haben die Analysen den Boden entzogen. Es wird sich zeigen, daß die Versuche zugleich die viel w^eitergehende Anschauung anderer Forscher widerlegen, daß im Assimilationsvorgang das Chlorophyll zerstört werde. Um das Komponenten Verhältnis unter natürlichen, aber nicht nor- malen Bedingungen zu untersuchen, verglichen wir zunächst Licht- und Schattenblätter^). Während eine richtige Schattenpflanze, die Buche, in ihren Schattenblättern keine Abweichung von der gewöhn- lichen Erscheinung bot, trafen wir bei einigen, für Schatten Wachstum schlecht organisierten Pflanzen, zum Beispiel bei Sambucus nigra, in der Tat etwas andere Verhältnisse in den Schattenblättern als in den Lichtblättern an. Der Quotient von Chlorophyll a und b ist hier er- ^) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, S. iii. 6 R. Willstätter und A. Stoll. niedrigt auf 2,06, das Verhältnis von Carotin zu Xanthophyll auf 0,35. In diesem Fall ist also entgegen der Erwartung in dem unter schlechteren Assimilationsbedingungen lebenden Blatte der sauerstoffreichere Chloro- phyllfarbstoff sogar etwas reichlicher vorhanden. Es scheint, daß unter ungünstigen Bedingungen die Komponente a , die weniger beständig ist, sich etwas mehr zersetzt, ähnlich wie wenn Chlorophyll im Herbste abge- baut wird. Darauf wurden die Pigmente in den absterbenden Blättern analysiert, nämlich in herbstlichen Blättern, die noch normal grün und in solchen, die teilweise oder weitgehend vergilbt waren. In dieser herbstlichen Ver- änderung des Laubes werden die grünen Farbstoffe abgebaut, wobei ihr Stickstoff Vorrat der Pflanze erhalten bleibt. Die beiden Komponenten verschwinden in verhältnismäßig gleichem Schritte, so daß ihr Quotient ungefähr den normalen \\'ert 3 behält, wenn auch mit etwas größeren Ausschlägen. Die gelben Pigmente bleiben in ihrer ganzen Menge dem Blatt erhalten. Das molekulare Verhältnis der grünen zu den gelben Farbstoffen, das unter normalen Verhältnissen auch wenig veränderlich ist und sich zwischen 3 und 4 bewegt, sinkt selbstverständlich bei der Vergilbung zu beliebig niederen Zahlen. Das zurückbleibende Gemisch der Carotinoide ist zugleich in manchen Fällen an Xanthophyll reicher. Bei diesen Bestimmungen hatte es sich um Lebensverhältnisse ge- handelt, die sich allmählich einstellen und denen sich der Assimilations- apparat einigermaßen anpaßt. Bei den sich daran anschließenden Assi- milationsversuchen unter willkürlichen Bedingungen wurde die Tätig- keit der Blätter in Licht von Sonnenstärke, bei hoher Kohlensäurekon- zentration und günstiger Temperatur auf etwa das Zehnfache der natür- lichen Leistung gesteigert und in langer Versuchsdauer beobachtet. Dabei waren die assimilierenden Objekte verschiedenartigen Eingriffen unterworfen, die in der Anwendung zu hoher Temperatur oder tagelang ununterbrochener Assimilationszeiten oder in der Behandlung der Blätter mit narkotischen Mitteln bestanden. Die assimilatorische Leistung geht unter solchen Umständen stets von hohen Anfangswerten allmählich zurück. Das Verhältnis der beiden Chlorophyllkomponenten ist aber über die Konstanz des Chloröphyllgehaltes während der Assimilation. 7 unverändert geblieben. Im Gemisch der Carotinoide machte sich so wie öfters im Herbste Anreicherung von XanthophyU bemerkbar. Bei ähn- hchen Versuchen mit hoher Temperatur, aber unter Lichtausschluß, also bei gesteigerter Atmung, hielt sich wieder der Quotient der Chloro- phyllkomponenten konstant, zugleich blieb auch die Menge und das Verhältnis der gelben Pigmente unverändert. Die chemische Eigenart der in außerordentlichem Maße autoxydablen Carotinoide hat die zuerst von A. Arnaud\) geäußerte Hypothese angeregt, nach der sie eine Rolle bei der pflanzlichen Atnmng ausüben. Diese Annahme wird nun durch die Analyse der Pigmente nach der gesteigerten Atmung widerlegt. Man darf auch nicht aus der anbeträchtlichen Verschiebung des Ver- hältnisses von Carotin zu XanthophyU bei gesteigerter Kohlensäure- zerlegung auf eine assimilatorische Funktion der Carotinoide schließen^). Da bei diesen Versuchen die Bedingungen für die Oxydation der unge- sättigten Stoffe ausnehmend günstig waren, ist es ohne weiteres erklär- lich, wenn im stark assimilierenden Blatt infolge einer Nebenerscheinung der Sauerstoff gehalt der Carotinoide wächst. In der nachfolgenden Ab- handlung werden die Möglichkeiten, die nach diesen Versuchen für die Beteiligung der Carotinoide geblieben sind, noch weiter eingeengt durch den Nachweis, daß bei Ausschaltung der für die Carotinoide absorbier- baren violetten Strahlen die Assimilation ungeschwächt bleibt. Wenn die Carotinoide überhaupt eine Funktion im Assimilationsvor- gang haben, so muß es eine indirekte und es kann keine durch ihre Licht- absorption bedingte sein. Es ist möglich, daß sie zu einer Einrichtung gehören, welche das Chlorophyll vor Photooxydation schützt. Da jede der Chlorpphyllkomponenten im Assimilationsprozeß für sich bestehen bleibt, so ist die Frage aufzuwerfen, welchen Nutzen der Pflanze die Ausstattung mit zwei Chlorophyllfarbstoffen bietet, die etwas Gesetzmäßiges ist. Bei der Energieübertragung durch das Chlorophyll schreiben wir verschiedenen Eigenschaften desselben eine Bedeutung zu. ^) A. Arnaud, Compt. rend. 109, 911 [1889]. ') Die Annahme, daß sich das Carotin wie Chlorophyll an der Assimilation beteilige, hat Th. W. Engel mann ausgesprochen (Botan. Ztg. 45, 393 [1887]). 8 R. Willstätter und A. Stoll. optischen und chemischen. Es ist daher eine Aufgabe weiterer Ver- suche, Unterschiede im chemischen Verhalten aufzusuchen, die unter den Bedingungen der Assimilation in Wirkung treten können. Bevor aber auf diese Unterschiede (siehe die vierte Abhandlung) eingegangen wer- den kann, ist es wohl möglich, die Wirkung auszudrücken, die sich in optischer Beziehung aus der Kombination der beiden ähnlichen Farb- stoffe ergibt. Im Absorptionsspektrum^) der Komponente h sieht man die hauptsächlichen Bänder zum großen Teil zwischen denjenigen von Chlorophyll a liegen. Daher wird das Licht durch die Mischung der Chlorophylle vollständiger absorbiert als von einer Komponente allein, was namentlich bei der Ausnützung des schwächeren, diffusen Tageslichtes für die Pflanze von Nutzen ist. Die vergleichende Analyse der Blattfarbstoffe in den Assimilations- versuchen, die den Gegenstand dieser Abhandlung bilden, betraf außer den Komponenten Verhältnissen der Pigmente auch das Verhältnis der Farbstoffmengen, namentlich der Chlorophyllmengen, vor und nach der Assimilation. Das Ergebnis steht im Widerspruch mit weittragenden Anschauungen, die von anderen Forschern vertreten werden. G. G. Stokes-) hat in einer kurzen Erörterung über das herbstliche Vergilben angenommen, daß das Verschwinden des grünen Farbstoffs aus dem Gemisch mit dem gelben durch die Einwirkung des Lichts ver- ursacht werde, und er hat an diese Erklärung die Betrachtung geknüpft, daß während des ganzen Lebens der Pflanze immerwährende Bildung und immerwährende Zersetzung unter dem Einfluß des Lichts erfolge. Das Chlorophyll erscheint in dieser Auffassung nicht als ein bleiben- der Bestandteil des Blattes, sondern als eine vergängliche Phase, welche die chemischen Bausteine durcheilen. Auch W. Pfeffer^^) hat in der ,, Pflanzenphysiologie" ausgesprochen: ^) über das Spektrum der kolloiden Lösung von Chlorophyll a und b vgl. die vierte Abhandlung, über das Spektrum molekularer Lösungen der Chlorophyllkomponenten vgl. ,, Untersuchungen über Chlorophj'U", S. 169 und die Tafeln I, VI und VIIL ^) G. G. Stokes, On Light, London, Macmillan and Co., S. 285 [1892]. 3) W. Pfeffer, Pflanzenphysiologie Bd. i, S. 318 [1897]. über die Konstanz des Chlorophyllgehaltes während der Assimilation. g ,,Wie aber das Lebendige sich überhaupt nur im Wechsel erhält^ so dürfte sich, besonders bei intensiverem Licht, Zerstörung und Neubildung des Chlorophylls dauernd abspielen, wofür in der Tat eine Reihe von Beob- achtungen sprechen." In einer zusammenfassenden Abhandlung hat F. Czapek^) folgende Betrachtung über: ,, Chlorophyllfunktion und Kohlensäureassimilation" angestellt: ,,Nach der Theorie von Abney muß der Chlorophyllfarb- stoff, wenn er als Sensibilisator wirkt, sich hierbei selbst zersetzen. Wir kommen so zu der Ansicht, daß auch die bekannte Zersetzung des Chloro- phyllfarbstoffs am Lichte, welche sowohl außerhalb als innerhalb des Organismus zu beobachten ist, mit der Funktion des Farbstoffs in Be- ziehung zu setzen ist. Diese Meinung unterscheidet sich von mehreren früher aufgestellten Chlorophylltheorien, welche die Chlorophyllzerlegung am Lichte in richtiger Erkenntnis deren Wichtigkeit als Grundlage be- saßen, hauptsächlich und scharf dadurch, daß die Chlorophyllbildung als selbständiger Prozeß aufgefaßt wird, welcher mit der COg-Assimilation direkt nichts zu tun hat." Eine neuere Arbeit von H. Wager'-) über die Wirkung des Lichtes auf Chlorophyll geht ebenfalls von der Annahme aus, daß unter der Einwirkung des Lichts das Chlorophyll in der lebenden Zelle augenschein- lich konstant zerfalle, daß aber unter normalen Bedingungen die Blätter grün bleiben, da das Chlorophyll ebenso rasch rekonstruiert als zer- stört werde. Die Untersuchung von Wag er betrifft die Photozersetzung des Chlorophylls und ergibt, daß in bedeutender Menge Aldehyde, die vielleicht einen kleinen Gehalt von Formaldehyd aufweisen, ge- bildet werden und daß diese Photooxydation bei Ausschaltung von Kohlensäure so gut wie bei ihrer Gegenwart stattfindet, aber nur bei Anwesenheit von Sauerstoff. Dieser Befund wird mit der Annahme in Beziehung gesetzt, daß Zucker und Stärke aus Aldehyden entstehen. Die Schlußfolgerung Wagers zielt dahin, daß die Kohlehydrat bildung ^) F.Czapek, Ber. d. deutsch, bot. Ges. 20, Generalversammlungsheft S. 44, besonders S. 58 [1902]. 2) H. Wager, Proc. Roy. Soc. Ser. B, 87, 386 [1914]. 10 R. Willstätter und A. Stoll. nicht sowohl auf direkter photosynthetischer Reduktion der Kohlen- säure beruhe, als daß sie vielmehr durch Photozersetzung des Chloro- phylls bedingt werde, wobei die Verwendung der Kohlensäure zum Aufbau des Chlorophylls angenommen wird; ,,the carbon dioxyde be- töre it can be used is built up independently into the Chlorophyll mole- cule". Für die solchen Betrachtungen zugrunde liegende Hypothese der Zerlegung des Chlorophylls im lebenden Blatt lassen sich viele Literatur- stellen, aber keine genaueren Bestimmungen des Farbstoffs unter ver- gleichbaren Verhältnissen der Assimilation anführen. Wager stützte sich besonders darauf, daß nach W. N. Lubimenko^) die Menge des Chlorophylls in einem Blatt mit der Lichtintensität variiere und daß nach A. J. Ewart-), ,,when green leaves are exposed to sunlight, the decomposition of the Chlorophyll goes on more rapidly than its produc- tion, though the amount of Chlorophyll decomposed is insufficient to cause a change in the coloration visible to the eye''. Es wird damit ausgedrückt, daß bei starker assimilatorischer Tätig- keit die Neubildung hinter der Zersetzung des Chlorophylls zurückbleibe, und es wird die Erwartung nahe gelegt, daß durch Steigerung der Assi- milationsleistung das Mißverhältnis zwischen Bildung und Zersetzung des Pigments verschärft werde. Wenn also die von Wager und anderen Forschern vertretene Annahme des Chlorophyllzerfalls in der Photo- synthese berechtigt ist, so muß bei höchstgesteigerter und langdauern- der Assimilationstätigkeit grüner Blätter der Chlorophyllgehalt meß- bar abnehmen. Dies wurde nun in einer Reihe von Beispielen mit fol- genden Versuchsbedingungen geprüft : Belichtung von mehr als Sonnen- stärke, Temperatur von 30 und 40°, Kohlensäure von hohem Teildruck, ununterbrochene Assimilationszeiten von 6 — 22 Stunden. Die im fünften Abschnitt mitgeteilten Analysen, die in der Tabelle i auszugsweise an- geführt sind, ergaben vor und nach den quantitativ beobachteten Assi- milationsleistungen scharf übereinstimmende Chlorophyllgehalte. ^) H. Wager zitiert: Ann. des Sc. nat. (Botan.), 1908. ^) Nach H. Wager aus der Abhandlung: Journ. of the Linnean Soc, Botany 31 [1895 — 97]. Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstoffe. Tabelle i. Chlorophyll in lo g Blättern vor und nach der Assimilation. 5proz. COj, ungefähr 75000 Lux. Pflanze Temperatur und Assimilationszeit Chlorophyll (mg) vor der nach der Assimilation Assimilation Prunus Laurocerasus 30°, 6 Stunden 30°, 22 30% 6 40°, 6 12,2 12,4 9A 9o 12,5 i 12,8 g und Neubildung Hydrangea opulodes . . Pelargonium zonale . . Dadurch ist die Hypothese von der Zersetzun des Chlorophylls bei der Assimilation widerlegt. In der Beständigkeit des Chlorophylls während der Assimilation und in der Konstanz des Verhältnisses der Chlorophyllkomponenten ist die Grundlage gefunden für die nachfolgende Arbeit (zweite Ab- handlung), worin die Beziehungen zwischen Chlorophyllgehalt und assi- milatorischer Leistung untersucht werden sollen. II. Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstofle. Um in den Untersuchungen über die Assimilation der Kohlensäure die Frage zu behandeln, ob der Gehalt an Chlorophyll bei der assimila- torischen Arbeit der Blätter Änderungen unterliegt, und um die Ab- hängigkeit der assimilatorischen Leistung vom Chlorophyll zu unter- suchen, bedeutet die quantitative Bestimnmng des Chlorophylls, näm- lich der Summe beider Chlorophyllfarbstoffe, eine notwendige Voraus- setzung der Arbeit in allen Fällen; diese Voraussetzung erweitert sich für die besonderen Fragen, die sich auf das Verhältnis zwischen den vier Komponenten des Blattfarbstoffs beziehen, zu dem Erfordernis, das Blattpigment in die zwei grünen und die zwei gelben Farbstoffe quantitativ aufzulösen. Die erforderlichen analytischen Methoden sind zuerst im IV. Kapitel unserer ,, Untersuchungen über Chlorophyll" (Berlin 1913) mitgeteilt worden; wir entnehmen die Grundzüge derselben jenem Buche, um die 12 R. Willstätter und A. Stoll. Methoden mit neueren Erfahrungen zu vervollständigen und um sie dem Zwecke der Untersuchung über die Kohlensäureassimilation and allgemeiner den Bedürfnissen pflanzenphysiologischer Forschung anzu- passen. Die analytischen Methoden, die nicht die große Genauigkeit spektro- photometrischer Messung anstreben, sind zur Anwendung in biochemi- schen Untersuchungen bestimmt und sind dafür genau genug. Die Mengen der Farbstoffe und ihr Verhältnis im Blatte, in Extrakten oder in Präparaten werden durch colorimetrischen Vergleich mit Lösungen von bekanntem Gehalt ermittelt. Nachdem die vorliegende Untersuchung vollendet war, ist in einer Arbeit von F. Weigert^) für spektrophotometrische Messungen eine besonders bequeme und elegante Anordnung mitgeteilt worden, die für die Bestimmung des Blattfarbstoffs Nutzen bringen wird. Die Methode wird wohl keine Abkürzung der Analyse ermöglichen, aber sie gewährt den Vorteil, die Vergleichssubstanz entbehrlich zu machen. A, Bestimmung des Chlorophylls (rr + h). Die Methode der Chlorophyllbestimmung besteht in der Abtren- nung der gelben Pigmente von den grünen und im Vergleich der letzteren mit reinem Chlorophyll. Diese Trennung kann nur aus- geführt werden durch Einwirkung von Ätzalkali. Dabei werden Ester- gruppen des Chlorophylls verseift. Das Chlorophyll wird dadurch in wasserlösliches Alkalisalz (Chlorophylhnkalium) verwandelt, das nun quantitativ von den chemisch indifferenten, mit Alkalien nicht reagie- renden gelben Pigmenten in bequemer Weise geschieden wird. Man konnte bisher, solange Chlorophyll in Substanz nicht bekannt w^ar, keine Chlorophyllbestimmung in Pflanzen ausführen; man mußte sich damit begnügen, Chlorophyllgehalte zu vergleichen. Die Fehler, die dabei vorkortimen, sind verhältnismäßig gering, wenn es sich um verschiedene Blattproben einer einzigen Pflanze, ferner, wenn es sich um Blattproben ^) F. Weigert, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 49, 1496 [1916]. Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstoffe. 13 verschiedener normal grüner Gewächse und von Blättern in derselben Jahreszeit handelt. Aber die Fehler können bedeutend werden, wenn die Objekte von verschiedenem Stande oder von verschiedenen Jahres- zeiten stammen, und die Fehler müssen sehr groß werden (vergleiche Abschnitt III B der zweiten Abhandlung), wenn normal grüne Blätter mit Blättern von besonderer Eigenart (mit Aureavarietäten, mit antho- cyanhaltigen, etiolierten, herbstlichen) verglichen werden. In solchen Fällen wären nicht colorimetrische, sondern nur spektrophotometrische Messungen zulässig. Der Quotient -—- f-^. . kann schon bei e^rünen Blättern stark Carotmoid variieren, und bei den Blättern beispielsweise von Aureavarietäten treten die Carotinoide, obwohl sie sogar in geringerem Gehalt als in normalen Blättern vorkommen, doch gegenüber dem Chlorophyll sehr in den Vordergrund. Die folgende Tabelle 2 gibt einige Beispiele für die In- konstanz des Verhältnisses zwischen grünen und gelben Blattfarbstoffen. Tabelle 2. Mengenverhältnis der grünen und gelben Blattfarbstoffe. Beschreibung der Blätter Fagus silvatica 10. Juli 10. Molekulares Ver- hältais der grünen zu den gelben Pigmenten Sambucus nigra ' 27. Mai .. I 27. ,. Helianthus anni 7. Okt. 5. Nov. Schattenblätter 6,02 Lichtblätter j 3,43 Grüne Stammform | 4,83 Gelbe Varietät ■ 0,28 Grüne Blätter | 3,66 Herbstlich vergilbte Blätter 0,32 Je größer die Ausschläge in diesen Quotienten, desto bedeutender werden die Fehler bei einfachem Farbvergleich der Extrakte aus ver- schiedenen Objekten, und je gelber die Blätter, desto größer würden die Fehler beim Vergleich eines Pigmentgemisches mit reinem Chlorophyll. Chlorophyllösungen aus den Blättern. Für die Trennung der grünen von den gelben Pigmenten braucht man die Farbstoffe in ätherischer Lösung; sie läßt sich nicht direkt aus den Blättern darstellen, 14 R- Willstätter und A. Stoll. sondern nur auf dem Umweg über einen mit Alkohol oder besser mit Aceton gewonnenen Extrakt. Die Blätter müssen quantitativ extrahiert werden, und zwar in der Kälte, damit das Chlorophyll unverändert bleibt. Frische Blätter, zum Beispiel io,o g, werden mit 30 g Quarzsand und zur Neutralisation von Pflanzensäure mit etwas Calciumcarbonat unter Zusatz von ungefähr 20 ccm 40 vol. proz. Aceton sehr fein zer- rieben. Den dünnen Brei spült man mit 50 ccm 35 vol. proz. Aceton auf eine Nutsche und saugt mit der Pumpe scharf ab auf einem mit 3 mm hoher Schicht von grobem Talkmehl bedeckten Filter; die dünne Talkschicht hält selbst feine Protoplasmapartikelchen zurück und verhütet Verstopfung des Filters. Die Blattsubstanz wird dann mit 50 ccm 30—35 proz. Aceton vollends vorextrahiert. Das wässerig acetonige J^iltrat enthält oft ein wenig wasserlöslichen gelben Farbstoff, der mit Natronlauge tiefer gelb, mit Säure farblos wird. Dieser Vor- extrakt, der die Gewinnung eines reineren Hauptauszuges mit wasser- ärmerem Aceton zum Zwecke hat, wird verworfen, wenn man sich davon überzeugt hat, daß er keinen ätherlöslichen Farbstoff enthält. Die Chloroplastenfarbstoffe werden nach dem Auflockern der Mischung von Sand und Blatteilchen mit dem Spatel unter abwechselndem Saugen und kurzem Macerieren mit reinem Aceton (im ganzen etwa 100 — 200 ccm) extrahiert, darauf mit etwas 90 prozentigem und zum Schluß zur Ent- fernung letzter Spuren von gelbem Pigmente mit etwas Äther, wobei man immer in vielen kleinen Portionen möglichst wenig von diesen Lösungsmitteln verwendet. Die Isolierung des Farbstoffs ist erst fertig, wenn das Lösungsmittel nach minutenlangem Stehen auf dem Filter vollkommen farblos abfließt und wenn sich keine grünen Blatteilchen mehr auf der Nutsche finden. Die schön grüne Acetonlösung wird mit dem doppelten Volumen Äther vermischt und das Aceton anfangs durch vorsichtiges Einfließen- lassen von Wasser, später durch gelindes Schütteln mit Wasser aus dem Äther weggewaschen. Die letzten Entmischungen führt man unter Er- satz des jeweils weggelösten Äthers und, zur Verhütung von Emulsionen, unter Zusatz von etwas Methylalkohol aus und achtet darauf, daß kein Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstofte. 15 Chloroph\-ll in kolloider Form mit den Waschwässern verlorengeht. Man schüttelt schwach opalisierende Abwässer unter Zusatz von etwas Kochsalz mit wenig Äther und beobachtet diesen nach der Schichtung, um, wenn der Äther gefärbt ist, ihn zur Hauptmenge zurückzugeben. Nach im ganzen sechs- bis achtmaligem Waschen der ätherischen Schicht mit gleichen Mengen \\'asser ist das Aceton völlig entfernt, was für die nachfolgende Verseifung nötig ist, da das Chlorophyll mit Aceton bei der Einwirkung von Alkali eine störende Nebenreaktion geben würde. Die ätherische Lösung wird mit 2 — 4 ccm konzentrierter methyl- alkoholischer Kahlauge geschüttelt, bis nach der auftretenden braunen Phase wieder die grüne Farbe zurückgekehrt ist, sodann vorsichtig mit wenig Wasser versetzt; in die alkalische Schicht geht etwas Xanthophyll über, das man durch ümschütteln in den Äther zurückführt. Nun ver- dünnt man mit mehr \^■ asser und schüttelt durch, läßt die Chlorophyllin- kaliumlösung in einen 250-ccm-Meßkolben abfließen und spült durch ein zweites Ausschütteln mit Wasser nach. Es kommt vor, daß die gelbe ätherische Schicht noch fluoresciert, also noch unverseiftes Chloro- phyll enthält, das nur durch nochmaliges Schütteln mit etwas Lauge aus dem Äther entfernt werden kann. Die Chlorophylhnlösung (etwa 100 ccm"^ wird mit Alkohol bis zur Marke ergänzt. Die Vergleichslösung. Entweder das sehr leicht in reinem Zu- stand zu erhaltende sogenannte krystallisierte Chlorophyll, d. i. ein Ge- misch der beiden ÄthylchlorophyUide a und im natürlichen Verhältnis der Komponenten oder die natürliche Phytylverbindung, das reine Chlorophyll (a -f- b), kann als Vergleichssubstanz angewandt werden. Eine geeignete Konzentration für die Bestimmung der Extrakte normal grüner Blätter wird erhalten, wenn man 0,0500 g Chlorophyll oder 0,0362 g (mit Zuschlag von 5 Prozent entsprechend dem Trockenverlust, also 0,0380 g) Äthylchlorophyllid auf ein Volumen von i 1 bringt. Zum Aufbewahren dient eine konzentrierte Lösung, der größeren Haltbarkeit wegen zweckmäßiger in Äther als in Alkohol^), die angegebene Menge ^) In alkoholischer Lösung tritt die als Allomerisation l)eschriebene Umwandlung des Chloroph^'Us ein, bei der sich die Farbnuance etwas ändert. l6 R. Willstätter und A. StoU. in 100 ccm enthaltend (bzw. bei krystallisiertem Chlorophyll in 250 ccm). Man kann das verseifte Chlorophyll des Versuches unmittelbar mit dem unverseiften Chlorophyll der alkoholischen Vergleichslösung colori- metrisch bestimmen, und diese Arbeitsweise verdient bei Anwendung des schwerlöslichen krystallisierten Chlorophylls den Vorzug. Da aber die Nuancen doch etwas differieren, das Chlorophyllin nämlich etwas blaustichiger ist, wird der Vergleich noch genauer, wenn das reine Chloro- phyll in derselben Weise wie der Blattextrakt mit Kalilauge behandelt wird. Einen aliquoten Teil der Vorratslösung, zweckmäßig 10 ccm, schüttelt man mit 2 — 3 ccm methylalkoholischer Kalilauge, verdünnt nach beendetem Farbumschlag mit 40 ccm Wasser und füllt im loo-ccm- Meßkolben mit Alkohol bis zur Marke auf. Den Vergleich führten wir mit einem Duboscq- Colorimeter aus, wobei mit Schichthöhen von 25 oder 50 mm der Versuchslösung unter Vertauschung der Colorimeterzylinder zwei Ablesungsreihen gemacht und die Mittelwerte bestimmt wurden. Die Genauigkeit der Analyse bestätigte sich namentlich bei den im V. Abschnitt mitgeteilten Bestimmungen des Chlorophylls der Blätter vor und nach stundenlanger Assimilationstätigkeit. Die Übereinstim- mung des Farbstoffgehalts in den Parallelbestimmungen war nicht allein für die Konstanz des Chlorophylls während der Assimilation, sondern zugleich für die Brauchbarkeit der Methode beweisend. Bei herbstlich vergilbten Blättern werden Fehler des colorimetrischen Vergleichs durch Stoffe verursacht, die in die alkalische Lösung des ChlorophyUins mit brauner Farbe übergehen; die Störung ist um so empfindlicher, als die herbstlichen Blätter arm an Chlorophyll sind. In diesem Fall verarbeiten wir zwei Blattproben: aus einem Extrakte wird nur der Farbstoff in Äther übergeführt, aus dem anderen durch Verseifung und Ausschüttelung mit Wasser die ätherische Lösung der Carotinoide bereitet. Zu der letzteren wird eine bekannte, ungefähr dem erwarteten Farbstoff gehalt entsprechende Menge von Chlorophyll hinzu- gefügt. Die Lösung des gesamten unveränderten Blattfarbstoffes aus Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstofte. 17 der einen Probe wird also mit einer Vergleichslösung bestimmt, die ebensoviel Carotinoid neben dem Chlorophyll enthält. Den Einfluß der gelben Pigmente kann man so annähernd ausschalten. B. Bestimmung der vier Blattfarbstoffe, Die Grundzüge der Methode. Die quantitative Bestimmung der Blattfarbstoffe stellt drei Auf- gaben: Trennung der Carotinoide vom gesamten Chlorophyll, sodann einerseits Trennung von Carotin und Xanthophyll, andererseits Trennung der beiden Chlorophyllkomponenten. Die erste von diesen Aufgaben, die Trennung der gelben und grünen Pigmente, ist schon im vorigen Abschnitt zur Bestimmung des Gesamt- chlorophylls der Blätter so gelöst worden, daß das Verfahren ohne Än- derung hier anzuwenden ist. Carotin und Xanthophyll lassen sich nicht mit chemischen Mitteln trennen, da sie indifferent sind und zum Unterschied von Chlorophyll auch nicht in reaktionsfähige Derivate übergeführt werden können. Ihre Fraktionierung wird durch eine für präparative Zwecke geeignete Methode der Verteilung zwischen Petroläther und wasserhaltigem Holz- geist erzielt, die auch ein quantitatives Verfahren darstellt. Bei der Entmischung der beiden Lösungsmittel bleibt Carotin vollständig im Petroläther, während Xanthophyll sich in den Holzgeist überführen läßt. Für die Trennung der Chlorophyllkomponenten wäre theoretisch die von den Carotinoiden isolierte Chlorophyllinlösung brauchbar, aber aus praktischen Gründen ist die Verwendung eines besonderen Extrakt- anteils zur Bestimmung der Chlorophylle vorzuziehen. Auch Chlorophyll a und blassen sich für präparative Zwecke durch ein Verfahren der Entmischung von Lösungen trennen und die reinen Komponenten, die als Vergleichssubstanzen anzuwenden sind, waren nur auf solche Weise zugänglich. Für die Analyse wäre aber die Aus- führung zu umständlich und nicht genügend genau. Die beiden chemisch indifferenten und einander so ähnlichen Farbstoffe müssen für den Willstätter-Stoll, Asäimilatioii. > l8 R. Willstätter und A. Stoll. Zweck der Fraktionierung ziemlich weit abgebaut werden. Bei auf- einanderfolgender Einwirkung von Alkali (Esterverseifung) und Säure (Abspaltung von Magnesium) oder umgekehrt von Säure und dann von Alkah entstehen Spaltungsprodukte von zugleich sauerer und basischer Natur, im allgemeinen recht komplizierte Gemische. Die Bedingungen für diese Reaktionen sind aber in eingehenden Untersuchungen so aus- probiert worden, daß auch die Überführung in einheithche Spaltungs- produkte gelungen ist, in Phytochlorin e aus Chlorophyll a und Phyto- rhodin g aus Chlorophyll b. Für diese Einwirkung von Alkali darf das Chlorophyll nicht in verdünntem Zustand angewendet werden, sondern nur in konzentrierter heißer Lösung. Deshalb ist die Bildung der Chloro- phylline beim Abtrennen der Carotinoide für diesen Zweck nicht brauch- bar gewesen. Die Säureeinwirkung dagegen kann auch in verdünnter Lösung vorgenommen werden. „>uM^-i>^ (Iso-)Chlorophyllin {a, b) -__i!^if^_^ (Phytochlorin ., Chlorophyll {a,b) masäure mit MkaU, beiß { Phäophytm {a, b) - "^ 1 Phytorhodm g. Die Unterschiede zwischen den beiden Chlorophyllkomponenten sind vergrößert in den Abbauprodukten. Man kann diese mit chemischen Mitteln fraktionieren, sie werden auf Grund ihrer verschieden basischen Eigenschaften durch eine eigentümliche Methode der Verteilung zwischen verdünnter Salzsäure und Äther in analytisch geeigneter Weise getrennt. Der Abbau beider Chlorophyllfarbstoffe zu den genannten Derivaten geht auch bei sorgfältiger Einhaltung der erforderlichen Versuchsbedin- gungen nicht fehlerfrei vonstatten. Die Fehler werden kompensiert, indem man für den colorimetrischen Vergleich nicht die fertigen Stoffe Phytochlorin und Photorhodin abwägt, sondern auch die Chlorophylle oder die magnesiumfreien Derivate, am besten die Metlwlphäophorbide, und indem man mit dem Gemisch der einzelnen abgewogenen Kom- ponenten im Parallelversuch die Umwandlung in Phytochlorin und Phytorhodin und ihre Trennung zur Bereitung der Vergleichslösungen vornimmt. Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstoffe. ig Ausführung der Analyse. Für die genaue Bestimmung der grünen und gelben Pigmente sollen zusammen 40 g Blätter extrahiert werden und eine weitere Probe der nämlichen Blätter ist zur Trockengewichtsbestimmung erforderlich, wo- für die Blätter bis zur Gewichtskonstanz, d. i. 24 — 48 Stunden, im Va- kuumexsiccator aufgestellt werden. Das Extrahieren geschieht ebenso, wie es im Abschnitt A für die kleinere Blattprobe beschrieben worden ist, nur mit entsprechend mehr Lösungsmittel. Die Vorextraktion mit wasserhaltigem Aceton ist jetzt besonders wichtig, da die so zu besei- tigenden Stoffe den guten Verlauf der Spaltung durch Alkali beeinträch- tigen würden. Die Extraktion der Blätter muß quantitativ sein, auch wenn nicht ihr Farbstoffgehalt, sondern das Verhältnis der Komponenten gesucht wird; der bei unvollständigem Extrahieren zurückbleibende Anteil des Blattfarbstoffes ist nämhch viel reicher an der Komponente h. Bei den Assimilationsversuchen standen wegen der Kleinräumigkeit der Apparatur nur 10 — 20 g Blätter zur Verfügung für die Bestimmung aller vier Komponenten; sie verlor freilich dabei an Genauigkeit. Nach der Überführung des Farbstoffgemisches aus dem Aceton- extrakt in Äther wird die Lösung mit etwas Natriumsulfat getrocknet und in einen 200-ccm-Meßkolben filtriert. Dann dient sie in Hälften für die Bestimmung der grünen und der gelben Komponenten. Trennung der Chlorophyllkomponenten. 100 ccm ätherischer Rohchlorophyllösung werden in einenKolben mit eingeschliffenem Helm^) gespült und mit 1/2 ccm 2 n-alkoholischer Salzsäure versetzt. Dadurch wird das Chlorophyll in Phäophytin verwandelt und dieses wird von überschüssigem Chlorwasserstoff vor Allomerisation geschützt. \\'ir dampfen dann den Äther im Vakuum in der Kälte ab und schließlich unter kräftigem Saugen mit der Pumpe noch kurze Zeit bei 60°. Die Verseifung des Rohphäophytins läßt sich nur gut in konzentrierter Pyridinlösung ausführen und zwar durch mehrere Minuten dauerndes Kochen mit sehr viel hochkonzentriertem methylalkoholischem Kah 1) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, S. 310. 20 R. Willstätter und A. Stoll. unter Zusatz von etwas \\'asser. Sie verläuft so gut, daß die Menge der störenden schwachbasischen Nebenprodukte nicht mehr als 2—3 Pro- zent beträgt. In allen Fällen verglichen wir das nach der Fraktionierung übrigbleibende schwachbasische Rhodin colorimetrisch mit der Haupt- lösung von Rhodin g; nur wenn der Betrag unter 3 Prozent bleibt, was fast immer der Fall war, ist die Analyse brauchbar. Das selten körnig, gewöhnlich wachsartig zurückbleibende Phäophv- tin wird daher in möglichst wenig Pyridin i — 2 ccm) gelöst. In einem Reagensglas mit abgesprengtem Rand bringt man 25 — 30 ccm kon- zentrierte methylalkoholische Kalilauge zum Sieden, erwärmt hierauf in siedendem Wasserbad den Kolben mit der Pyridinlösung und gießt durch Einführen des Reagensglases in den Kolbenhals und Umkippen des Glases unter gleichzeitigem Umschütteln des Ganzen die siedende Lauge in den Kolben; das Sieden darf dabei nicht ai^^hören. Die braune Phase tritt auf und verschwindet sehr rasch und die Lösung wird oliv- grün. INIan setzt auf den Kolben ein Kühlrohr, kocht im Wasserbad 2 Minuten und dann weiter i — 1\/., ^linuten nach Zusatz von 5 ccm \\'asser, das man durch das Kühlrohr zugibt. Nun wird der Kolben ab- gekühlt und der Inhalt mit \\'asser und etwas Äther in einen \/2-l-Scheide- trichter gespült. Wir säuern vorsichtig mit 20 prozentiger Salzsäure an, bis die Farbe von Braun in trübes Graugrün umschlägt, setzen 200 ccm Äther zu und schütteln während mehrerer Minuten kräftig durch. Die trübe wässerige Schicht wird unter Zusatz \'on ein wenig Ammoniak so oft mit kleinen Ätherportionen ausgeschüttelt, bis sich der Äther nicht mehr anfärbt. Die Mutterlauge machen wir wegen der oft entstehenden Flocken mit Ammoniak alkalisch und säuern wieder an, um durch Aus- äthern noch eine kleine Menge der Spaltungsprodukte zu extrahieren. Zur Kontrolle werden die Flocken nochmals mit verdünntem Ammoniak Übergossen; geht dabei wenig Farbiges in Lösung, so ist kein Rhodin durch die Verseifung zerstört worden, während diese andernfalls zu lang gedauert hat. Die basischen Spaltungsprodukte bedürfen vor der Fraktionierung der Abtrennung von Begleitstoffen, namentlich auch von Pyridin. Die Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstoffe. 21 vereinigten Atherlösungen werden deshalb ausgezogen, und zwar zwei- bis dreimal mit je 30 com 12 prozentiger Salzsäure und weiter mit' je 10 — 15 ccm 20 prozentiger so oft, bis die saure Schicht sich farblos ab- trennt. An der Grenzschicht zeigen sich wieder Flocken, die aber keine Chlorophyllsubstanz mehr zu enthalten pflegen. Der Äther enthält außer den Carotinen braune Pigmente, deren Menge mit der Pflanzenart wechselt; erst starke Salzsäure vermag sie mit schmutziggrüner Farbe aufzunehmen. Die vereinigten sauren Auszüge der Basen überschichten wir in einem 1 , 2-1-Scheidetrichter mit 200 ccm Äther und neutralisieren sie unter leichtem Umschwenken vorsichtig mit konzentriertem Ammoniak, bis die Farbe der wässerigen Schicht trübe violett wird. Dann wird. der gut verschlossene Scheidetrichter unter Kühlung am Brunnen anfangs ge- linde, schließlich kräftig durchgeschüttelt. Die gewöhnlich noch schwach blaue wässerige Schicht läßt man in einen zweiten Scheidetrichter fließen und führt die letzten Spuren der Basen unter fortgesetztem Neutralisieren in Äther über. Die ätherische Lösung der Spaltungsprodukte, die nur bei nicht ganz guter Verseifung etwas Flocken abscheidet, wird zur Entfernung von Holzgeist und noch etwas Pyridin dreimal mit je 200 ccm Wasser ge- waschen, aber unter Zusatz von i — 2 ccm 3 prozentiger Salzsäure, da reines Wasser Phytochlorin wegnehmen würde. Hierauf schütteln wir in 4 bis 5 Malen mit im ganzen 400 ccm 3 pro- zentiger Salzsäure aus und dann mehrmals mit etwas 5 prozentiger Säure, bis diese nur schwach grün wird. Die Auszüge mit dieser stärkeren Säure erfordern nochmahge Fraktionierung. Sie werden unter Neutrali- sieren mit 30 ccm Äther extrahiert und die ätherische Lösung wiederholt mit 3 prozentiger Salzsäure ausgezogen, bis damit das Volumen der früheren 3 prozentigen salzsauren Phytochlorinauszüge auf 500 ccm ge- bracht ist. Der Ätherrest der Zwischenfraktion kommt zur nahezu rein roten Hauptlösung des Plwtorhodins. Diese ziehen wir 4 bis 5 mal, bis das Volumen der Auszüge auch 500 ccm beträgt, mit 12 prozentiger Salzsäure aus, wobei der Äther nur schwach rötlichgelb hinterbleibt. 22 R- Willstätter und A. StoU. Abgekürztes Verfahren. Es gelingt in vielen Fällen, die aus dem Acetonextrakte gewonnene ätherische Farbstofflösung mit so wenig von den die Hydrolyse störenden Begleitstoffen zu erhalten, daß es nicht nötig ist, das Chlorophyll in Phäophytin zu verwandeln. Es wird ein- facher in umgekehrter Folge der Spaltungsreaktionen, also zuerst mit Alkali, dann mit Säure behandelt. Zu diesem Zweck verjagt man den Äther bei etwa 30° im Vakuum vollständig und bringt ohne Zusatz von Pyridin die siedende methylalkoholische Kalilauge (etwa 20 ccm) auf das etwas vorgewärmte Chlorophyll. Die Flüssigkeit wird bei aufge- setztem Kühlrohr in lebhaftem Sieden erhalten; nach 2 Minuten fügt man 4 ccm Wasser hinzu und setzt darauf das Erhitzen noch 2 Minuten fort. Die tiefgrüne und lebhaft rot fluorescierende Lösung säuert man nach dem Abkühlen schwach an, um die magnesiumfreien Spaltungs- produkte quantitativ in Äther überzuführen, im ganzen in etwa 250 ccm. Die Fraktionierung mit 3 prozentiger Salzsäure kann ohne weiteres, also ohne die umständliche Reinigung durch Überführen in 12- und 2opro- zentige Säure und Zurückführen in Äther vorgenommen werden, außer wenn Begleitstoffe Emulsionen verursachen und die Entmischungen stören. Sonst ist jener Umweg auch hier nicht zu vermeiden. Die Abkürzung ist zur Bestimmung der Komponenten in hochprozentigen Chlorophyll- präparaten immer anwendbar. Trennung von Carotin und Xanthophyll . Die zweite Hälfte der ätherischen Farbstofflösungen verseifen wir mit einigen Kubik- zentimetern konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge unter kräf- tigem anhaltendem Schütteln. Nach kurzem Stehen ist der Äther ge- wöhnlich rein gelb, zeigt er aber noch rote Fluorescenz, so schüttelt man w^eiter und setzt nötigenfalls noch etwas Lauge zu. Nach vollständiger Verseifung des Chlorophylls gießen wir die ätherische Lösung vom Kaliumsalz ab und waschen mit Äther nach. Das genügt aber nicht zur Extraktion des Xanthophylls; wir setzen nochmals 30 ccm Äther zum sirupösen Chlorophyllinsalz, dann unter Um- schütteln nach und nach Wasser und warten ab, bis sich im Scheide- trichter die Emulsion getrennt hat. Zur Kontrolle schüttelt man die Quantitative Bestimmung der vier Chlorojlastenfarbstoffe. 23 alkalische Flüssis^keit nochmals mit Äther durch, der dabei g^ewöhnlich farblos bleibt. Die vereinigten ätherischen Lösungen werden mit W^asser gewaschen, dem wir etwas methylalkoholische Kalilauge zusetzen, um noch Spuren von Chlorophyllin und öfters kleine Mengen brauner saurer organischer Substanz zu entfernen, und schließlich zweimal mit reinem Wasser. Dann wird im Helmkolben der Äther im Vakuum bei gewöhnlicher Temperatur auf wenige Kubikzentimeter abgedampft, der Rückstand für die Frak- tionierung mit 80 ccm Petroläther in einen Scheidetrichter gebracht und das Kölbchen mit etwas Äther nachgespült. Für die Trennung der gelben Pigmente dienen nacheinander Ent- mischungen mit 100 ccm 85 prozentigem, mit 100 ccm 90 prozentigem und zweimal mit je 50 ccm 92 prozentigem Holzgeist. Der letzte Auszug ist meistens farblos; andernfalls wiederholen wir die Extraktion mit dem 92 prozentigen Methylalkohol. Die holzgeistigen Auszüge sind frei von Carotin. Man vermischt den ersten mit 130 ccm Äther und führt den Farbstoff durch langsamen Zusatz von Wasser in Äther über. Dann fügen wir zu der stark gelben ätherischen Lösung den zweiten methylalkoholischen Xanthophyllauszug und weitere 100 ccm Äther, da mit der abgelassenen holzgeistigen Schicht viel Äther weggenommen wird. Durch langsamen Zusatz von Wasser wird die Entmischung bewirkt, und mit dem gleichen Äther sammelt man das Xanthophyll noch aus den späteren Auszügen unter Zusatz von mehr Äther und Wasser. Die ätherische Lösung des Xanthophylls und ebenso die petrolätherische des Carotins befreien wir durch zwei- maliges Waschen mit Wasser vom Holzgeist, lassen sie durch trockene Filter in lOO-ccm-Meßkolben laufen und versetzen sie bis zur Klärung mit einigen Tropfen absoluten Alkohols. Endlich füllen wir mit Äther bezw. Petroläther bis zur Marke auf. Die Vergleichslösungen. Die folgenden Angaben beziehen sich auf die colorimetrische Bestimmung der Chlorophylle und der Carotinoide in je 20 g grünen Blättern. Von den aufgestellten Normen wird man, was Menge und Konzentration der Vergleichsstoffe betrifft, beim Ver- 24 R. Willslätter und A. Stoll. arbeiten kleinerer Blattmengen oder besonders chlorophyllarmer Objekte abgehen. a) Für die Chlorophylle. Da sich das Komponentenverhältnis auch im Falle der größten Abweichungen nur selten erheblich von 3 entfernt, so wird bei Anwendung eines und desselben Gemisches der Methylphäo- phorbide oder Chlorophyllide zur Bereitung der Vergleichslösungen kein beträchtlicher Fehler begangen, außer bei den divergierendsten Kompo- nentenverhältnissen. Dieses Gemisch besteht aus a und b im Verhältnis von 3 Molen zu i Mol, und zwar aus 0,0369 g Methylphäophorbid a (12-10^ Mol in i 1), 0,0124 g Methylphäophorbid b (4-10^^ Mol in i 1); oder 0,0541 g Chlorophyll a (i2-io"' Mol in i 1), 0,0183 g Chlorophyll b (4-10^5 jyjol in i 1). Das Gemisch der Komponenten wird, so wie beim Versuche be- schrieben, mit siedender Kalilauge verseift, nämlich das Chlorophyll in gepulverter Form und unverdünnt, das Phäophytin mit 2 ccm Pyridin verdünnt. Auch die Fraktionierung wird in genau derselben \\'eise aus- geführt, nur unterbleibt ein vorangehendes Überführen in 12 bis 20 prozentige Säure. Wir erhalten so wieder je 500 ccm Chlorin ^ in äther- gesättigter 3 prozentiger und Rhodin g in 12 prozentiger Salzsäure. Etwa eine Woche sind diese Lösungen brauchbar, bei noch längerem Stehen wird die Chlorinlösung ein wenig grünlich, die Rhodinlösung ein bißchen gelblicher, was den colorimetrischen Vergleich etwas er- schweren' würde. b) Für die gelben Pigmente. Carotin und Xanthophyll scheinen in der Farbe übereinzustimmen, aber ihre Farbintensitäten sind verschieden, und zwar nicht in einem bestimmten Verhältnis, sondern das Verhältnis der Intensitäten variiert bei verschiedenen Schichtdicken in einem Lösungsmittel und bei gleichen Schichtdicken in verschiedenen Lösungs- mitteln. Daher ist für jedes der beiden Pigmente eine besondere Ver- gleichslösung erforderlich, nämlich von Quantitative Bestimmung der vier Chloroplastenfarbstoffe. 25 0,0134 g Carotin in ^/a 1 Petroläther, ein wenig Alkohol enthaltend^ (5.10 -' Mol in I 1) und 0,0142 g Xanthophyll in ^2 1 Äther (5-10 ' Mol in i 1). Die Präparate werden zweckmäßig mehrmals umkrystallisiert, Xan- thophyll aus Methylalkohol, dann aus Chloroform, Carotin aus Alkohol, dann aus Petroläther, und sie werden in kohlensäuregefüllten, zuge- schmolzenen Röhren aufbewahrt. Carotinlösungen halten sich im Dunkeln mehrere \\^ochen unverändert, die Xanthophyllösung muß dagegen jeden Tag frisch hergestellt werden, weil sie rasch ausbleicht. Ersatz für die Vergleichslösungen. Der Zeitaufwand für die Dar- stellung reiner Präparate der Vergleichssubstanzen und ihrer Lösungen veranlaßte uns, den unbeständigen gelben Pigmenten leicht zugängliche und haltbare Farbstoffe zu substituieren. Dieser Ersatz bietet besonders für das Xanthophyll wegen der Unbeständigkeit seiner Lösungen einen großen Vorteil. Eine geeignete Vergleichssubstanz ist Kaliumbichromat in wässeriger Lösung, obwohl sein Absorptionsspektrum von dem des Xanthophylls und Carotins in Äther bezw. Petroläther abweicht. Mit der Lösung von 2,0 g Kaliumbichromat in i 1 destilliertem Wasser sind die angegebenen Vergleichslösungen der Carotinoide in folgendem Verhältnis zu ersetzen: 100 mm Carotinlösung entsprechen loi mm der Bichromatlösung, 100 mm Xanthophyllösung entsprechen 72 mm der Bichromatlösung, 50 „ „ „ 27 „ „ ~5 j> 5> jj -^4 j) )> 55 Berechnung. Die colorimetrischen Messungen werden mit meh- reren Ablesungen ausgeführt, dann die Zylinder vertauscht und die Ab- lesungen wiederholt. Bei den Bestimmungen mit 40 g normal grünen Blättern ließen wir die als zweckmäßig erprobten Schichthöhen der Vergleichslösungen im Colorimeter konstant, nämlich: 2 6 R. Willstätter und A. Stoll. für Phytochlorin 40 mm, für Phytorhodin 50 mm, für Carotin 100 mm, für Xanthophyll 100 mm. Die entsprechenden Schichten der Versuchslösungen (0,5 1 bei den grünen, 0,1 1 bei den gelben Farbstoffen) seien bezeichnet mit h„, h^,, Das molekulare Komponentenverhältnis der beiden Chlorophylle (a : b) wird, da die Vergleichslösungen im Verhältnis von 3 Molen a zu I Mol b hergestellt werden, berechnet als: Für das molekulare Verhältnis von Carotin zu Xanthophyll (ab- gekürzt c : x) ergibt sich Die colorimetrische Bestimmung ergibt zugleich die Gewichtsmengen der vier Farbstoffe in den angewandten 20 g frischen Blättern und weiterhin in i kg derselben nach folgender Berechnung: Chlorophyll a = ^o • 0,00902 • 6 • Chlorophyll ^ = 50 • 0,00916 • 2 • Carotin = 50 • 0,00536 Xanthophyll = 50 • 0,00568 40 h. h, 1 100 2 ' ~h7 I 100 2' IT Genauigkeit der Bestimmung. Die Genauigkeit der Methode wurde an Parallelbestimmungen geprüft, wofür eine und dieselbe Blatt- probe diente und die Blätter öfters halbiert wurden. Die Tabelle 3 zeigt in solchen Doppelbestimmungen große Übereinstimmung der Farb- stoffmengen und bei den Komponentenverhältnissen Differenzen von o bis 2^., Prozent für Qu und von i bis etwa 4 Prozent für Q^ ; so beträcht- lich waren aber die Differenzen für O^ nur ausnahmsweise bei etwas fehlerhafter Verseif ung des Chlorophylls. Das Verhältnis der Blattfarbstoffe während der herbstlichen Vergilbung. 27 Tabelle 3. Bestimmungen der Chloroplastenfarbstoffe von grünen Holnnder- blättern. (\'erarbeitung von 40 g frischen Blättern im JuU.) Nr. Trocken- substanz (g) in 100 g frischer Blätter Farbstoffmengen (in g) Chlorophyll Chlorophyll a i n I kg frischer Carotin Blätter Xanthophyll Molekulare T Komponentenverhältnisse Qc Qa + b X c + x I 27,8 1.615 0,599 1.616 0,607 1 0,146 0.145 0,263 0,262 1 2,74 2,70 0,588 0,588 3,33 3,55 2 24.5 1.536 I.5I4 0,552 0.559 0,134 0.133 0,226 0,230 2.83 1 2,71 i 0,629 0.613 2,83 2,88 3 28,3 1.732 1.725 0,605 0,628 0,146 0,144 0,301 0,298 2,90 2,80 0,510 0.513 3,10 3,04 III. Das Verhältnis der Blattfarbstoffe während der herbstlichen Vergilbung. Das Augenfällige beim herbstlichen Vergilben des Laubes ist das Zurücktreten der grünen im Verhältnis zu den gelben Pigmenten, also das Sinken des Quotienten aus den Chlorophyllen und den Carotinoiden; während er bei normal grünen Blättern 3 bis 3^ ., beträgt, wird er bei herbst- lich vergilbenden bedeutend tiefer gefunden, zu i/,o oder ^oo vom ge- wöhnlichen Werte und tiefer. Nach dem Aussehen der Blätter läßt sich aber nicht beurteilen, ob im herbstlichen Laub der Gehalt an gelben Pigmenten ein anderer ist als bei grünen. Die Beantwortung dieser Frage ergibt sich nebenher in der folgenden Untersuchung der herbstlichen Blätter. Die eigenthche Absicht derselben ist die Bestimmung der Verhältnisse beider Chloro- phylle und beider Carotinoide /Qo^ und Q A nach der im vorigen Kapitel angegebenen Methode. Es war zur Beurteilung der veränderten Farbstoffverhältnisse nicht immer erforderlich, die langwierige Analyse auszuführen. Mitunter wurden nur die Carotinoide von der geringen Chlorophyllmenge der vergilbten Blätter durch Verseifung des Chlorophylls abgetrennt und zur Schätzung des Anteils von Carotin und Xanthophyll durch Entmischen zwischen Petroläther und Methylalkohol fraktioniert. Auf Verschiebungen im 28 R. Willstätter und A. Stoll. Komponentenverhältnis der Chlorophylle wird man schon bei der Ver- seifungsprobe (Phasenprobe^)) aufmerksam; bei der Einwirkung, alko- hohscher KaHlauge gibt, wie bekannt, die Komponente a Farbumschlag in Gelb, h in Rot, das normale Gemisch in Braun. Bei einiger Übung erkennt man erheblichere Ausschläge im Quotienten a : b an der nach Rotbraun oder nach Braungelb verschobenen Nuance bei dieser Probe. Die quantitativ untersuchten Proben bestanden zum Teil in grünen, grüngelben und gelben Blättern von derselben Pflanze und vom gleichen Tage, ferner in herbstlichen, noch grünen von einem früheren und in mehr vergilbten Blättern von einem späteren Tage. Die Tabelle 4 verzeichnet die Farbstoffmengen bezogen auf die Frischgewichte und auf die Trocken- gewichte der Blätter; die Tabelle 5 teilt die Komponentenverhältnisse der grünen und gelben Farbstoffe mit. Tabelle 4. Gehalt herbstlicher Blätter an grünen und gelben Farbstoffen. 4c| Mengen (ing) in i kg frischer Blätter Mengen (in g) in t kg trockener Blätter Nr. Pflaiizenart , Datum Aussehen der Blätter Chloro- 1 Chloro- phyll a 1 phyll b ^ ^. Lxantho- Carotm, ^j^^,, Chloro- ! Chloro- phyll a 1 phyll b Carotin Xantho- ' 1 S =5, j II 1 Helianthus an- \ [ nuus .... 7.x. grün 23.5 1,473 0,523 1 0,113 j 0,222 6,267 2,228 0,483 0,944 8,50 1,43 - Helianth.annuus 5. XI. gelbgrün 24.5 0,508 0,128 0,061 0,249 2,074; 0,525 0,251 1,017 2,60 1,27 31 5. XL gelb 22,0 0,144 i 0,030 0,047 0,293 0,654! 0,134 0,213 1,331 1 0,79 1.54 4 ' Tilia tomentosa 13- X. grün 38,0 1,25610,382 0,126 0,218 3,311 1,004 0,333 0,575 4.32 ,0,91 5\ „ 13. X. gelbgrün 36,0 0,549 0.174 0,084 0,195 1,526 0,485 0,234 0,540:2,01 0,77 1 13- X. gelb 31.5 0.047 0,017 0,050 0,247 0,149 0,055 0,159 0,784 i 0,20 0,94 7 Aesculus Hippo- 1 i 1 castanum . . 24.x. grün 38.5 2,353 0,565 ' 0,168 0,379 6,ii2 1,469 0,435 0,984 7,58 1,42 8 Aesculus Hippo- , 1 castanum . . 24. X. gelbgrün 38,0 0,608 0,146 0,093 0,498 1,600 0.384 0,245 1,311 1,98 1 1,56 9 Acer campestris 9.x. grün 45 3,028 0,768 0,234 0,412 6,728 1,706 0,518 j 0,914 8,43 i 1,43 10 „ 9.x. gelb 50 0.124 0,044 0,284 0,406 0,248 0,088 0,568 0,812 0,34 1 1.38 II Castania sativa 18. X. grün 45 1,276 0,283 j 0,122 0,266 2,837 0,628 0,274 0,582 3,47 1 0,86 12 18. X. gelbgrün 43 — — 0,136 0,260 — — 0,318 0,604 — 0,92 13 ,. 18. X. gelb 1 4^ 0,120 0,046 0,110 0,246 0,294 0,112 jo,268 0,602 0,41 0,87 14 Sambucus nigra 21. X. grün 29,5 1.251 0,487 0,122 0,217 4,242 1,652 0,414 0,735 5,89 1,15 M R. Willstätter und A. Stoll, I'ntersuchungen über Chlorophyll, S. 144 u. 168. Das Verhältnis der Blattfarbstoffe während der herbstlichen Vergilbung. 29 Tabelle 5. Komponentenverhältnis der grünen und gelben Farbstoffe herbst- licher Blätter. Nr. Pflanzenart Datum Aussehen der Blätter ö. 1 b j Qc Qa + b c + x I Helianthus annuus 7. Okt. grün 2,86 0.34 3,66 2 5. Nov. gelbgrün 4.01 0,26 1.27 3 „ gelb 4.95 0,17 0,32 4 Tilia tomentosa 13. Okt. grün 3.34 0,62 2,92 5 ,, 13- ,. gelbgrün 3,20 0,46 1,60 6 13. „ gelb 2.74 0,22 0.13 7 Aesculus Hippocastanum 24. Okt. grün 4.23 0,47 3.06 8 24. „ gelbgrün 4.23 0,20 o,8x 9 Acer campestris 9. Okt. grün 4,00 0,60 1.51 10 ,, 9- .-, gelb 2,87 0.74 0,15 II Castania sativa 18. Okt. grün 4.59 0,49 2,30 12 ,. 18. „ gelbgrün 5>27 0,60 — 13 18. „ gelb 2,74 0.47 0,28 14 Sambucus nigra 21. Okt. grün 2,61 0,60 3>i5 Die im grünen Zustand untersuchten Herbstblätter wiesen zumeist noch normalen Chlorophyllgehalt auf, d. i. 0,6 bis 0,8 Prozent des Trocken- gewichts; niedriger war der Chlorophyllgehalt in einigen Fällen bei beginnender Vergilbung, und bei gelbgrünen Blättern pflegte man etwa V4 des ursprünglichen Chlorophylls zu finden. Die gelbe Farbe der Herbstblätter ist zwar mitbedingt durch eine beträchtliche ]\Ienge der im Herbste zunehmenden wasserlöslichen gelben, in alkalischer Lösung tiefgelben Stoffe, die chemisch noch nicht genau bekannt sind, aber diese entstehen nicht auf Kosten der Caro- tinoide. Die Summe der Carotinoide bleibt beim Vergilben ungefähr konstant, nämlich wie in den anderen Jahreszeiten 0,10 bis 0,15 Prozent des Trockengewichts oder 0,03 bis 0,07 Prozent des Frischgewichts. Die Konstanz läßt sich ungeachtet der von C.Wehmer^) gegen die Interpreta- tion ähnlicher Analysen erhobenen Einwände mit ausreichender Genauig- keit feststellen. Ein geringes Ansteigen des Carotinoidgehaltes bei weit- em Weh mer, Landw. Jahrb. 21, 513 [1892] und Ber. d. deutsch, botan. Ges. 10, 152 [1892]. 30 R. Wiilstätter und A. Stoll. gehender Vergilbung rührt natürhch von der Abnahme der Trockensubstanz in der herbsthchen V^eränderung des Laubes her. Die biologische Deu- tung des Vergilbungsvorganges, bei welchem aus dem ablebenden Blatt der grüne Anteil des gesamten Pigmentes verschwindet, wäh- rend der gelbe zurückbleibt, ist von A. Tschirch^) und namentlich E. Stahl-) sowie \'on X. Swart^) schon eingehend erörtert worden; die analytischen Grundlagen für die Betrachtung werden nun vervoll- ständigt. Nach Stahl bleiben die Carotinoide im Blatt zurück, weil ihre Bestandteile C , H und O minder wertvoll sind, während der grüne Farbstoff im Stickstoff und Magnesium zwei für die Erhaltung der Pflanze wichtige Elemente aufweist, die vor dem Ableben der Blätter den über- winternden Pfianzenteilen wieder zugeführt werden; nach M. Tswett*) und N. Swart ist allerdings diese Betrachtung zufolge den Anal3^sen hinsichtlich der Beteiligung des Magnesiums an dem Wandern emzu- schränken. Der Quotient Carotin zu Xanthophyll zeigt keine regelmäßige Än- derung. In einigen Beispielen (Castania, Acer) fanden wir ihn unver- ändert. In mehreren anderen Fällen sank der Wert des Quotienten be- deutend infolge der Abnahme des Carotingehaltes und der entsprechenden Zunahme an Xanthophyll. Es tritt also im Herbste öfters die Bildung von sauerstoffhaltigem Carotinoid aus dem sauerstofffreien ein, und es kommt sogar vor (bei Helianthus beobachtet)), daß Xanthophyll allein übrigbleibt. Bei dieser Betrachtung bleibt es unentschieden, ob das hier immer kurz als ein Xanthophyll bezeichnete sauerstoffhaltige Carotinoid, das sich hinsichtlich der Entmischung mit Methylalkohol und Petroläther ebenso wie Xanthophyll aus normal grünen Blättern verhält, mit diesem identisch oder, wie Tswett^) angenommen hat, von ihm verschieden (,,Herbstxanthophyir*) ist. \Mr konnten aus schön vergilbten Platanen- ^) A. Tschirch, Angewandte Pflanzenanatomie, S. 6i [1889]. ^) E. Stahl, Zur Biologie des Chlorophylls, Jena 1909, X. und XI. Abschnitt. ^) N. Swart, Die Stoffwanderung in ablebenden Blättern, Jena 1914. *) M. Tswett, Ber. d. deutsch, botan. Ges. 26, 94 [1907]. 5) M. Tswett, loc. cit. Die Blattfarbstoffe nach gesteigerter Assimilationstätigkeit. 31 blättern ^ November) nur einen kleinen Teil des Xanthophylls in krystal- lisiertem Zustand isolieren. Es ist leicht möglich, daß die gegen Einwir- kung jeglicher Säure sehr empfindlichen Carotinoide im Blatte bei der herbstlichen Zerstörung der Chlorophyllkörner nicht mehr gegen Säure- einwirkung geschützt bleiben. Für das Verhältnis zwischen den Chlorophyllfarbstoffen a und b in herbstlichen Blättern ergeben die Analysen keine Änderung; die Chloro- phyllkomponenten werden im ablebenden Blatte ohne merklichen Unter- schied beide abgebaut; die höher oxydierte Komponente wird nicht angereichert. Die Werte bewegen sich wohl innerhalb weiterer Grenzen als bei normalen Blättern, sie steigen bis a : 6 = 5 , aber die Schwan- kungen sind wenigstens teilweise dadurch bedingt, daß die Analyse bei den Blättern mit geringem Farbstoff gehalt weniger genau ist. IV. Die Blattfarbstoffe nach gesteigerter Assimilationstätigkeit. Nachdem sich ergeben hatte, daß unter den natürlichen Lebens- bedingungen der Pflanzen, für die der Assimilationsapparat angepaßt ist, keine Verschiebung im Komponentenverhältnis erfolgt, werden in den folgenden Versuchen die Blätter willkürlichen Bedingungen unter- worfen; sie werden entweder zu höchst gesteigerter Assimilationstätig- keit bei großer Kohlensäurekonzentration, hoher Temperatur und un- unterbrochener langer Versuchsdauer gebracht oder während der Assi- milation mit Mitteln, die das Protoplasma schädigen, behandelt, so daß es sich zeigen muß, w^nn überhaupt eine Abnahme des Chlorophylls oder eine Verschiebung im Verhältnis der Blattfarbstoffe im Assimi- lationsvorgang erfolgen kann.. Bei diesen Versuchen wurde die assi- milatorische Leistung quantitativ beobachtet und durch ihr Sinken der Zeitpunkt erkannt, in welchem der Blattfarbstoff des Versuchsobjektes zu analysieren ist. Über IG bis 20 g frische Blätter wird in einer flachen Glasdose 2,5- oder 5 prozentiges Kohlendioxyd bei konstanter Temperatur (etwa 30 °) und in konstantem Strome geleitet, der die Gasuhr zumeist mit einer Ge- 32 . K. Willstätter und A. Stoll. schwindigkeit von einem Liter in 20 Minuten verließ. Der Kohlensäure- gehalt wurde im Dunkelversuch und bei der Belichtung bestimmt und die Assimilation ohne Einfluß der Atmung aus der Differenz gefunden, und zwar fortlaufend in aufeinanderfolgenden kurzen Intervallen. Die Beleuchtung von 45 000 bis 90 000 Lux, die Temperaturablesung an den Blättern, die Absorption der Kohlensäure in Natronkalkröhren und andere Einzelheiten der Versuchsanordnung, die für die Bestimmung der assimilatorischen Leistung im Verhältnis zum Chlorophyllgehalt der Blätter noch verbessert wurden, sollen erst in der zweiten Abhandlung (Abschnitt III, A) beschrieben werden. A. Die Blattfarbstoffe bei Überlastung des Assimilationsapparates. An dieser Stelle ist nicht wie bei E. Pantanelli^), der eine eingehende Untersuchung über die in intensivem Lichte auftretenden Ermüdungs- erscheinungen der Chloroplasten \'on Wasserpflanzen veröffentlicht hat, das Studium der Ermüdungserscheinungen beabsichtigt, sondern die Überanstrengung der Assimilationsorgane wird als einer der Fälle herai)ge- zogen, in denen die vergleichende Analyse der Farbstoffe vorzunehmen ist. Erster Versuch. 20 g Primelblätter wurden in 2,5 prozentigem Kohlendioxyd bei 31 bis 32° mit 1000 kerziger Lampe in 15 cm Abstand (ungefähr 44000 Lux) 17 Stunden lang ununterbrochen belichtet ; der Gasstrom enthielt im Dunkelversuch 0,0475 g CO2 auf ein Liter Luft. Das in einer Stunde von den Blättern aufgenommene Kohlendioxyd betrug anfangs 0,120 g, in der 17. Stunde 0,090 g. Die gesamte Assi- milation der Blätter, deren Trockengewicht vor dem Versuche nur 1,6 g gewesen, betrug in den 17 Stunden, während deren der Rückgang auf ^U der Anfangsleistung erfolgte, 1,50 g COo . Zweiter Versuch. 20 g Primelblätter wurden in 2,5 prozentigem Kohlendioxyd bei 31 bis 32° ebenso wie im ersten Versuche belichtet, nämlich in einer ersten Periode von 44 Stunden und dann, nach einer Ruhepause von 23 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur, während ^) E. Pantanelli, Jahrb. 1". wissensch. Botanik 39, 163 [1903]. Die Blatttarbstoffe nach gesteigerter Assimilationstätigkeit. 33 einer zweiten Versuchsperiode von 23 Stunden. Die gesamte Assimi- lation betrug in der ersten Belichtungsperiode 2,8 g CO2 , so daß das Trockengewicht mehr als verdoppelt war. Die stündliche Assimilations- leistung sank von dem Anfangswerte 0,100 in den ersten 25 Stunden auf 0,060 g CO2 und hielt sich in den folgenden 20 Stunden auf dieser Höhe ; nach der Unterbrechung erhob sich die Leistung auf 0,070 g und sank nach 7 Stunden auf 0,055 g und dann noch tiefer. Die Blätter waren nach der ersten Assimilationsperiode noch schön grün, während der zweiten nahmen sie ein vergilbtes Aussehen an. Eine Vergleichsprobe unbelich- teter Primelblätter enthielt in 10 g Frischgewicht 0,0063 g Chlorophyll a und 0,0017 g Chlorophyll h. Beschreibung der Blätter Qa 6 Q^ Unbelichtet 1. Versuch, 17 Stunden behchtet . 2. Versuch, 67 Stunden behchtet . 3.77 4.16 3.20 0,69 0,55 0,36 Dritter Versuch. lo g Blätter von Kirschlorbeer (Anfang De- zember) wurden in 5 volumprozentigem Kohlendioxyd bei 31 bis 32° mit 3000 kerziger Lampe in 21 cm Abstand (ungefähr 68000 Lux) 22 Stunden lang belichtet. Die stündliche Assimilation betrug anfangs 0,110 g, in der 4. und 5. Stunde 0,075 g, am Ende aber nur noch 0,030 g. Die Leistung geht bei diesen Blättern viel rascher zurück als bei Primel. Da bei den Kirschlorbeerblättern durch Unterschiede im Trocken- gehalt verschiedener Blattproben (bei der Vergleichsprobe 35,5 Prozent) weniger als bei Primel der Vergleich gestört wird, sollen neben den Quo- tienten auch die Farbstoffmengen angeführt werden; der Chlorophyll- gehalt ist während der Belichtung unverändert geblieben. Beschreibung der Blätter Gehalt (mg) von lo g frischen Blättern an Chlorophyll Chlorophyll j Xanthophyll Qa Qa + 6 c + x Unbehchtet 7,2 :2 Stunden behchtet . 7,1 Willst ätter-S toll, Assimilation. 2,2 2,4 0,87 0.63 1.65 2,29 3.3 3.1 0.56 0,29 3 2.3 2,0 34 R- Willstätter und A. Stoll. Aus den angeführten Versuchen geht hervor, daß das Verhältnis der beiden Chlorophyllfarbstoffe auch bei intensiver und sehr lange dauernder Assimilation, die schon starken Rückgang der Leistungs- fähigkeit bewirkt, nicht merklich verschoben wird. Hingegen erfolgt bei den Carotinoiden ein Sinken des Quotienten Carotin : Xanthophyll, ähnhch wie bei mehreren Proben herbstlich vergilbter Blätter. Aller- dings waren die Bedingungen hinsichtlich der Sauerstoffentwicklung im Blatte und in bezug auf die Temperatur für die Oxydation des ungesättig- ten Kohlenwasserstoffs überaus günstig; ob der gemäß der Entmischung als alkohollöslich bestimmte Carotinoidanteil mit dem gewöhnlichen Xanthophyll identisch war, ist zweifelhaft. Wenn man sich der bekannten Autoxydation des Carotins erinnert, so wird man die Veränderung, welche in diesen Versuchen ein Teil des Carotins durchmacht, nicht überraschend finden und sich daher hüten, irgendwelche Schlußfolgerungen für die Funktion der Carotinoide daraus zu ziehen. B. Die Carotinoide bei gesteigerter Atmung. Da bei den Versuchen intensiver Assimilation zwar nicht Q - , aber 0- verschoben wird, so sollte durch besondere Versuche geprüft werden, ob nicht unter ähnlichen Bedingungen, aber ohne Assimilationstätigkeit, das Verhältnis der gelben Pigmente in dem nämlichen Sinne beein- flußt wird. Erster Versuch. Die Atmung von 20 g Kirschlorbeerblättern bei 30° im Dunkeln wurde während 48 Stunden im Strome von kohlen- dioxydfreier Luft in der Apparatur der Assimilationsversuche beobachtet. Der stündliche Betrag der Atmungskohlensäure sank vom Anfangswerte 0,0066 g allmählich, ohne daß die Blätter ihr Aussehen änderten, bis auf 0,0028 g, wahrscheinlich infolge Mangels an Reservestoffen. Nach dem Versuche erwies sich Q ■ = 0,46, d. i. nur um ein geringes tiefer als das Verhältnis einige Wochen früher bei einer frischgepflückten Probe gefunden worden war. Zweiter Versuch. Die Atmung von 20 g Primelblättern (mit 1,36 g Trockensubstanz) wurde bei 34 bis ^y° verfolgt. Die stündliche Die Blattfarbstofte nach gesteigerter Assimilationstätigkeit. 35 Abgabe von Kohlendioxyd betrug bei Beginn 0,0047 g und sank in drei Stunden auf 0,0034 g» die Kohlensäureabgabe nahm bedeutend zu, als Zelltod eingetreten war, sie belief sich nach 24 Stunden auf 0,0195 g CO2 und stieg noch höher. In der Versuchsdauer von 48 Stunden wurden 0,6077 g CO2 entwickelt, also ein Viertel der Trockensubstanz durch Oxydation verbraucht. Die Blätter waren dann noch schön grün, sie erschienen wie abgebrüht. Für beide Komponentenverhältnisse ergaben sich nun normale Werte, nämhch Q <^ = 3,1 und O^' = 0,58 . Die Versuche haben also erwiesen, daß das Verhältnis der Carotinoide durch gesteigerte Atmung nicht beeinflußt wird. Die Verschiebung von Q'- bei intensiver Assimilation ist daher auf andere Vorgänge zurück- zuführen, die nur im assimiherenden Blatte stattfinden. C. Die Blattfarbstoffe nach Assimilation bei hoher Temperatur. Die Versuche waren bei einer Temperatur von über ^%° anzustellen, die nach G. L. C. Matthaei^) für die Assimilationstätigkeit bereits schäd- lich ist. Für die Blätter von Pelargonium zonale war in dieser Hinsicht 40° noch zu schonend. In einem Vorversuch mit 5 prozentigem Kohlendioxyd und Belichtung von 3000 Kerzen in 21 cm Abstand (ungefähr 68000 Lux) hielt die intensive Assimilation 4 Stunden lang fast ungeschwächt an ; sie betrug stündlich 0,120 g CO2 . Darauf wurden 10 g derselben Blätter unter sonst gleichen Be- dingungen, aber bei 45 ° untersucht ; einmal stieg infolge eines Versehens die Temperatur für einige Minuten auf 52°, wobei die Assimilation aber nicht zum Stillstand kam. Die stündliche Leistung betrug ziemlich konstant während zweier Stunden 0,040 g COg, also ein Drittel des bei 40 ° erzielten Wertes. Nach dem Versuch zeigten die Blätter nur an einigen Stellen verdorbenes Gewebe. Neben denselben wurden 10 g gleiche 1) G. L. C. Matthaei, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B. 197. 47 [1904]. 3 36 R. Willstätter und A. Stoll. Blätter (mit 0,85 g Trockengewicht) zur Analyse des Farbstoffs ver- arbeitet. Beschreibung der Blätter Gehalt (mg) von lo g Chlorophyll i Chlorophyll a \ 6 frischen Blättern an Carotin i Xanthophyll b X Qa+6 Unbelichtet '1 Stunden bei 45 ° belichtet 10,3 9,4 2,2 3.0 0,70 ! 1,46 0,70 2,08 4.7 3.2 0,44 0,33 3.5 2,8 Der Chlorophyllgehalt ist im Versuche unverändert geblieben, aber der Quotient a : h war deprimiert, allerdings nicht zu einem tiefen Werte. Allein diese Verschiebung schien zum Teil durch Zersetzung von Chloro- phyll bedingt zu sein. Das Chlorophyll aus den belichteten Blättern lieferte etwas mehr, als man gewöhnlich erhält, von schwachbasischen Spaltungsprodukten, die bei der Bestimmung zum Chlorophyll h hinzu- kamen. D. Die Blattfarbstoffe nach der Einwirkung narkotischer Mittel. Durch Narkose während der Assimilation lassen sich Bedingungen schaffen, unter welchen die enzymatische Tätigkeit im Blatte gehemmt wird. Die Methode geht auf eine Arbeit von Claude Bernard^) zu- rück, der Wasserpflanzen in chloroformhaltigem Wasser untersuchte; sie. vermochten Kohlendioxyd im Lichte nicht zu zerlegen. Später haben G. Bonnier und L. M angin-) mit Hilfe von Äther- oder Chloroform- dampf die Assimilation unterbrochen, und zwar so, daß die Atmung fortdauerte. Hiernach lassen sich also die enzymatischen Funktionen ganz oder teilweise beeinflussen. Für die folgenden Versuche waren die Bedingungen so auszuprobieren, daß die Assimilation nicht stillstand, sondern geschwächt fortdauerte. Es war also eine Narkose zu suchen, durch welche, ohne daß die Blattzellen abgetötet wurden, die gesteigerte Assimilation bei günstiger Temperatur, hohem Teildruck der Kohlen- säure und intensivem Lichte herabgesetzt wurde. Versuche mit Chloroform. Abgemessene Mengen Chloroform ^) Cl. Bernard, Le^ons sur les phenomenes de la vie, S. 278 [1878]. 2) G. Bonnier und L. Mangin, Ann. des Sc. nat. (Botan.) [7] 3, 14 [1886]; vgl. u. A. Irving, Ann. of Botany 25, 1077 [iQn]- Die Blattfarbstoffe nach gesteigerter Assimilationstätigkeit. 37 wurden in einer ^/4-Literflasche verdampft. 0,75 ccm Chloroform be- wirkte an Primelblättern (15 g) rasche Veränderung des Blattgewebes; nach wenigen Minuten waren die Blätter welk und naß und beim Be- lichten verfärbten sie sich rasch, ohne daß sie assimilierten. Die Blätter von Prunus Laurocerasus waren widerstandsfähiger, und doch genügte schon 10 Minuten langes Verweilen ohne Lichtzutritt im Raum von ^j^ Litern, der den Dampf von 0,5 bis 0,4 ccm Chloroform enthielt, daß längs der Blattnerven braune Flecken auftraten und sich bald vergrößerten. Bei Anwendung von 0,2 ccm entstanden nur sehr wenige braune Flecken, aber sie dehnten sich bei darauffolgender Be- lichtung während einer halben Stunde auf ^3 der Blattfläche aus. Die sichtbare Schädigung blieb erst aus, wenn man die Dosis Chloroform auf 0,1 ccm erniedrigte. Nach solcher Behandlung ist die Assimilation der Kirschlorbeerblätter bestimmt worden. 10 g Blätter wurden bei 25° in 2,5 prozentigem Kohlendioxyd mit einer Lampe von 2000 Kerzen in 15 cm Abstand (ungefähr 89000 Lux) be- lichtet. Frische Blätter assimilierten im Vergleichsversuche 0,084 g, die 10 Minuten lang in der angegebenen Weise chloroformierten, dann durch einen Luftstrom vom Chloroform befreiten Blätter 0,070 g CO2 in der Stunde. Eine andere Probe, 10 Minuten mit etwas mehr (0,15 ccm) Chloroform behandelt, zeigte 0,088 g stündliche Leistung; eine vierte Probe, mit 0,1 ccm 30 Minuten lang chloroformiert, assimilierte in der Stunde 0,077 g CO2 . Diese Unterschiede sind keine anderen als bei irgend- welchen verschiedenen Proben frischer Blätter derselben Pflanze. Mit so geringen Chloroformdosen war also bei diesen Landpflanzen keine Be- einträchtigung der Assimilation erreicht, andererseits wurde schon von etwas größeren Dosen bei der erheblichen Dauer der quantitativen Be- stimmung Zersetzung des Chlorophylls bewirkt, anscheinend infolge der Abspaltung von Chlorwasserstoff aus dem Chloroform. Versuche mit Äther. Die einfachste Versuchsanordnung war die Einschaltung eines Gefäßes mit Äther in den Gasweg des Assimi- lationsapparates. Da aber der Ätherdampf im Kohlensäureabsorptions- apparat in störender Weise zurückgehalten würde, so nahmen wir in 38 R. Willstätter und A. Stoll. einigen, über den Einfluß der Äthernarkose auf die Assimilation orien- tierenden Vorversuchen die Narkose und die Assimilationsbestimmung in getrennten Räumen vor. 15 g Primelblätter ließen wir zunächst in der übhchen Versuchs- anordnung assimilieren (bei 25 ° in 2,5 proz. CO2 mit einer 20ookerzigen Lampe in 22 cm Abstand) und fanden eine stündHche Leistung von 0,081 g COo . Dann wurden die Blätter in eine weithalsige =^/4-Liter- flasche, worin man zuvor 0,75 ccm Äther verdampft hatte, übergeführt und 2 Stunden darin aufbewahrt. Nachdem die Blätter durch einen kräftigen Luftstrom vom Ätherdampfe befreit waren, beobachteten wir unter den früheren Bedingungen abermals ihre Assimilationstätigkeit. Sie war nicht tief, aber deuthch erniedrigt. In der ersten Stunde war die assimilatorische Leistung 0,056 g CO, , in der zweiten erholten sich die Blätter schon zu einer Leistung von 0,070 g CO2 . Daraufhin unterblieb im folgenden Versuche die Messung der Assi- milation und die Narkose erfolgte, während sich die Blätter unter Be- dingungen intensiver Assimilation befanden, mit Äthermengen, welche für die Blätter noch erträglich waren. 15 g Primelblätter befanden sich in der Assimilationskammer, deren Rauminhalt etwa 500 ccm betrug, bei 30 ° in einem Strome von 5 prozentigem Kohlendioxyd mit 3 1 Ge- schwindigkeit in der Stunde und unter BeHchtung von 3000 Kerzen in 20 cm Abstand (ungefähr 75000 Lux.) Die stündliche Assimilation be- trug vor der Narkose 0,107 g CO2 . In eine vor den Assimilationsraum ge- schaltete Waschflasche wurde 0,5 ccm Äther über eine niedrige Wasser- schicht eingefüllt. Der Äther verdampfte sodann und gelangte zu den Blät- tern durch den Gasstrom, den man so lange auf die 2'^! 2 fache Geschwin- digkeit verstärkte, bis sich der Geruch von Äther am Ausgang der Assimi- lationskammer verriet. Diese Behandlung mit Äther ist während einer Stundesechsmal mit je 0,5 ccm und ein siebentes Mal mit i ccm Äther wie- derholt worden. Dann sind die Blätter, an denen keine Veränderung zu er- kennen war, zusammen mit einer Vergleichsprobe für die quantitative Farbstoffbestimmung verarbeitet worden; die Analyse hat keine Ver- schiebung des Komponenten Verhältnisses ergeben. Der Chlorophyllgehalt vor und nach gesteigerter Assimilation. 39 Beschreibung der Blätter b O^ Unbelichtet Beliclitet, mit Äther behandelt . 1 ^.6 1 -.7 o,6o 0,50 V. Der Chlorophyllgehalt vor und nach gesteigerter Assimilation. Die folgenden Versuche beziehen sich auf die Frage, ob sich das Chlorophyll am Assimilations Vorgang in der Weise beteiligt, daß es sich dabei zersetzt und neubildet. Die Blätter verschiedener Pflanzen befan- den sich unter Bedingungen höchster assimilatorischer Tätigkeit (Licht von mehr als Sonnenstärke, 30 bis 32 °, 5 prozentiges COo), so daß sie un- gefähr das Zehnfache ihrer unter natürlichen Lebensverhältnissen zu- stande kommenden Assimilation leisteten. Unter solchen Verhältnissen würde mit einem Verbrauch des Pigmentes im Assimilationsvorgang die Neubüdung nicht Schritt zu halten vermögen. Nach sechs Stunden langer ununterbrochener Assimilationstätigkeit, die fortlaufend in kurzen Intervallen beobachtet wurde, erfolgte die Bestimmung des Farbstoffs und zwar nun ohne Rücksicht auf das Komponentenverhältnis. Tabelle 6. Chlorophyllgehalt vor und nach der Assimilation. 10 g Blätter, 5proz. CO2, ungefähr 75000 Lux, 30 bis 32°. Nr. Ptlanzenart Trocken- gewicht (g) Stündlich I. Stunde assimiliertes CO 2. Stunde 2 (g) in der 6. stunde Chlorophyllge Blatt vor der Assimilation dalt (mg) der arobe nach der Assimilation I Prunus Laurocerasus 3,4 0,09g 0,081 0,032 12,2 12,4 2 ,. 2,9 0,080 0,067 0,043 13.5 13.0 3 Primula 0,9 0,100 0,088 0,055 II. 4 II, I 4 Hydrangea opulodes I.-2 0,059 0,054 0,032 9,2 9,1 5 Funkia 1,0 0,087 0,088 0,061 10,0 10,0 6 Pelargonium peltatum 0,6 0,118 0,119 0,1 iSi) 8,3 8,2 Ähnliche Beobachtungen lassen sich aus weiteren Versuchen an- reihen. In einem dritten Experiment mit Prunus Laurocerasus betrug unter ähnlichen Bedingungen gesteigerter Assimilation der Chlorophyll- M Assimilationsleistung in der 5. Stunde. 40 R. Willstätter und A. Stoll. gehalt von lo g Blättern ii,6 mg vor, und ii,6 mg nach 6 Stunden Belichtung. Besonders bemerkenswert sind ferner zwei Beispiele aus dem vorigen Abschnitt. Man bestimmte in einem Versuche gleichfalls mit lo g Blättern von Kirschlorbeer den Chlorophyllgehalt nach 22 stündiger gesteigerter Assimilation ; er war vor der Belichtung 9,4 mg und betrug nach der Assimilation von im ganzen 1,12 g CO2 wieder 9,5 mg. In dem folgenden Beispiele ist die Versuchstemperatur sogar auf 40° gesteigert worden. Blätter von Pelargonium zonale assimilierten sechs Stunden lang bei gleichem Lichte und gleichem Kohlendioxydgehalt des Gasstroms wie bei den Versuchen der Tabelle. Das Ergebnis war dasselbe. Der Chlorophyllgehalt von 10 g Blättern betrug vor der Belichtung 12,5 mg, nachher 12,8 mg. Über diese Beispiele hinaus läßt sich aus vielen in der folgenden Ab- handlung angeführten Beobachtungen schließen, daß der Chlorophyll- gehalt nie während der Assimilation abnahm, daß er bei chlorophyll- armen Blättern der Aureavarietäten konstant blieb und bei sehr jungen Blättern sowie bei etiolierten während der Assimilationsversuche etwas anstieg. Es wird dadurch nicht ausgeschlossen, daß bei übertriebener Belichtung durch einen Vorgang, der nicht im Zusammenhang mit der Photosynthese steht, Chlorophyll verdirbt, aber eine solche Erscheinung hätte keine Bedeutung hinsichtlich der Funktion des Chlorophylls. Zweite Abhandlung. Über das Verhältnis zwischen der assimilatorischen Leistung der Blätter und ihrem Gehalt an Chlorophyll. I. Einleitung und Übersicht. Die quantitativen Untersuchungen über die Assimilation der Kohlen- säure in den Arbeiten von U. Kreusler, H. T. Brown und F. Escombe, von F. F. Blackman mit G. L. C. Matthaei und anderen Mitarbeitern haben hauptsächlich die Abhängigkeit des Vorganges von äußeren Be- dingungen behandelt, von der Temperatur, von der Belichtung und vom Teildruck der Kohlensäure. Die ältere Fragestellung, namentlich in den Messungen von Kreus- ler, hatte auf Bestimmung der Optima einzelner Faktoren hingezielt. Diese Art der Betrachtung wurde von Blackman korrigiert; es ist das Verdienst seiner Abhandlung^) ,, Optima and Limiting Factors", für die Abhängigkeit der Assimilation von den äußeren Bedingungen eine tiefere und vollkommenere Erklärung gegeben zu haben. Es exi- stieren nicht Optima der verschiedenen Faktoren, sondern die Leistung wird jeweils von dem im Minimum vorhandenen Faktor limitiert. Black- man zählt fünf einschränkende (Controlling) Faktoren auf, von denen die photosynthetische Leistung eines bestimmten Chloroplasten ab- hängig sei: *) F. F. Blackman, Ann. of Botany 19, 2S1 [1905]. 42 R. Willstätter und A. StoU. 1. der -verfügbare Kohlendioxydbetrag, 2. die verfügbare Wassermenge, 3. die Intensität der verfügbaren Lichtenergie, 4. der Betrag von vorhandenem Chlorophyll, 5. die Temperatur im Chloroplasten. Wenn ein Prozeß wie die Assimilation in der Geschwindigkeit von einer Anzahl verschiedener Faktoren abhängt, so wird sein Gang be- schränkt durch den Schritt des langsamsten Faktors. Man könnte prak- tisch, wenn von der Assimilation, nicht vom Wachstum, die Rede ist, vom Einfluß des Wassers absehen, da für die Kohlehydratbildung in der Zelle unter den in Betracht kommenden Lebensverhältnissen immer genügend Wasser vorhanden ist. Mit dem ersten, dritten oder fünften Faktor als limitierendem zu experimentieren, ist, wie Blackman sagt, verhältnismäßig leicht. Wenn beispielsweise die Belichtung schwach ist, während die übrigen Umstände günstig sind, so wird, was bei K reus- lers ^) Bestimmung der für optimal gehaltenen Assimilationstemperatur (ungefähr 15 bis 25 ° bei einem älteren Sproß von Rubus fructicosus) der Fall war, der Betrag der Photosynthese niedergedrückt werden und der limitierende Faktor wird das Licht sein; ähnlich verhält es sich mit der Kohlensäure und mit der Temperatur. Es gibt für jede Temperatur einen bestimmten größten Assimilationsbetrag, den ein Blatt leisten kann, und er ist für eine Pflanze recht konstant. Bei höheren Tempera- turen aber kann die volle Leistung nicht lange aufrechterhalten werden, die Verhältnisse werden sodann kompliziert durch einen „Zeitfaktor", in welchem verschiedene störende Einflüsse zusammengefaßt sind. So wird die Kohlensäureassimilation als das klarste Beispiel von Wechselwirkung der bedingenden Verhältnisse von dem Standpunkte aus be- schrieben, daß es sich hier — anders als bei den Wachstumserscheinungen — in überwiegendem Maße um Abhängigkeiten von äußeren Faktoren handle. Dabei ist aber von dem oben an vierter Stelle angeführten Faktor, dem Betrage des vorhandenen Chlorophylls, weder in der angeführten 1) U. Kreusler, I.andw. Jahrb. i6, 711 [1SS7]. Das Verhältnis zwischen Assimilation und Chlorophyllgehalt. 43 Abhandlung noch in den späteren Arbeiten der Blackmanschen Reihe noch in anderen eingehenden Untersuchungen weiter die Rede gewesen. Damit ist der Punkt bezeichnet, an dem die vorliegende Unter- suchung einsetzt, um sowohl den Einfluß der Chlorophyllmenge wie die Bedeutung eines mit dem Chlorophyll zusammenwirkenden zweiten inneren Faktors, eines farblosen, protoplasmatischen Bestandteils, zu erfassen. Wenn wir die im Assimilationsvorgang arbeitende Einrichtung be- schreiben, so ist wesentlich, daß das Agens unverändert bleibt, während es das Substrat in unbegrenzter Menge umsetzt. Gemäß unseren nach- folgenden Bestimmungen unter den gleichen günstigsten Bedingungen verarbeitet ' I Molekül Chlorophyll in der Stunde: in herbstlichen älteren Blättern von Ampelopsis quinquefolia i8 Mole- küle CO,; in herbstlichen jungen Blättern von Ampelopsis quinquefolia 164 Mole- küle COo; in sommerhchen Blättern von Sambucus nigra 135 Moleküle CO2; in sommerlichen Blättern von Sambucus nigra var. aurea 2463 Mole- küle CO,; in etiolierten Blättern von Phaseolus vulgaris 2736 Moleküle CO, . In gewissen Grenzen, die aus den älteren Untersuchungen bekannt sind, setzt das assimilierende Agens der Chloroplasten derart, wie wir es von Enzymen wissen, sein Substrat Kohlensäure der Konzentration proportional um und folgt mit der Reaktionsgeschwindigkeit der steigen- den Temperatur, während es zugleich, was sonst von keinem vergleich- baren Agens bekannt ist, auch von der Lichtintensität abhängt, die es proportional dem absorbierten Energiebetrage verwertet, immer unter der Voraussetzung, daß die anderen äußeren Faktoren nicht limitierend wirken. Die chemische Einrichtung des Assimilationsvorgangs ist einerseits Energietransformator, und sie ist nach einem anderen Teil ihres Wesens enz\^martig zu nennen. Es wurde noch nicht beachtet, wie sehr ihre 44 R. Willstätter und A. Stoll. Leistung und deren Abhängigkeit von äußeren Faktoren variabel ist. Das assimilierende Agens arbeitet, je nachdem es in jungen, ausge- wachsenen oder alten Blättern wirkt, mit sehr verschiedener Reaktions- geschwindigkeit. Auch ist der Einfluß der Temperatur und der Be- lichtung auf seine Leistung sehr verschieden in pigmentreichen und -armen Blättern. Daraus geht hervor, daß wir die chemische Einrichtung der Chloroplasten durch den Farbstoffgehalt allein unzureichend kenn- zeichnen würden. Es fragt sich, ob an einem einzigen chemischen Agens zwei Vorgänge sich abspielen, die Absorption und Übertragung der Lichtenergie und überdies eine von der Temperatur abhängige Reaktion, oder ob die Chloroplasten mit einer aus mehreren Komponenten zusammengesetzten chemischen Einrichtung ausgerüstet sind. Im ersten Falle hätte das Farbstoffmolekül doppelte Funktion, es wäre Absorbens der Licht- strahlen und außerdem würde es selbst den chemischen Vorgang der Kohlensäurezerlegung besorgen. Nur so könnte mit der Annahme eines einzigen Agens die limitierende Wirkung der Temperatur auf die Funktion eines Farbstoffs erklärt werden, wie sie aus den Untersuchungen nament- lich von Black man und Matthaei bekannt ist. Wenn diese Annahme der experimentellen Prüfung nicht standhält, so wird das kombinierte Wirken des Chlorophylls mit dem Protoplasma anzunehmen sein. Von der Beteihgung des lebenden Protoplasmas an der Kohlensäure- assimilation spricht die Pflanzenphysiologie, wenn auch die dem Stroma zugeschriebene Rolle nicht genauer bestimmt oder näher erforscht ist. Trotz des nur spärlich vorhegenden Versuchsmaterials gibt das W. Pfef- fersche^) ,, Handbuch der Pflanzenphysiologie" eine tiefe Betrachtung des Assimilationsvorganges, der als vitale Funktion der Protoplasma- organe beschrieben wird. Ihre Leistung kommt ,,nur bei richtigem und ungestörtem Zusammengreifen aller Teile" zustande, da ,, keine einzelne Reaktion, sondern eine verwickelte und regulatorisch gelenkte Maschinen- arbeit zu dem Endziel führt". Die Assimilationsenergie der Chloro- 1) W. Pfeffer, Handbuch i, 338 u. 342 [1897]. Das Verhältnis zwischen Assimilation und Chlorophyllgehalt. 45 plasten wird daher aufzufassen sein als ,, spezifisch different und kann auch nicht in einfachem Verhältnis zum Gehalt an Chlorophyllfarbstoff stehen, der nicht allein die Funktionstüchtigkeit des Apparates be- stimmt". Schon früher hatte Th. W. Engelmann^) Beispiele (nach Beobach- tungen mit der Bakterienmethode an Sanedesmus caudatus) für die spezifische Differenz der Chloroplasten gegeben und gelehrt, ,,daß nicht bloß Unterschiede des Farbstoffgehaltes die Größe der photochemischen Reduktionsprozesse beeinflussen, sondern auch Differenzen in der Struk- tur des farblosen Stroma" und ,,daß der Farbstoff nicht an und für sich die Zerlegung der Kohlensäure im Licht bewirkt, sondern nur, insofern er an lebendes Protoplasma gebunden ist". Nach Engel mann wäre „das farblose Stroma das eigenthch Tätige, der Farbstoff wohl wesentlich, wie früher schon häufig vermutet, nur ein Sensibilator". Es konnte begreiflicherweise auch den Forschern, denen wir die letzten gründlichen Arbeiten über den quantitativen Verlauf der Assi- milation verdanken, nicht entgehen, daß Differenzen in der Assimilations- energie der grünen Gewächse vorkommen. Derartige Beobachtungen über veränderliche Leistung der Blätter in verschiedenen Monaten sind zum Beispiel von Blackman und Matthaei^) erwähnt und auf ,, seasonal change of the leaves" zurückgeführt. Aber es ist eine Unsicher- heit diesen Befunden gemeinsam, insofern sich die Angaben über die quantitativ ermittelten Assimilationsleistungen auf gleiche assimilierende Blattflächen beziehen. In Wirklichkeit läßt sich, da keine Chlorophyll- bestimmungen ausgeführt sind, aus den Beobachtungen nicht sicher schließen, daß die assimilatorischen Leistungen auch im Verhältnis zum Chlorophyll verschieden seien. Der Chlorophyllgehalt der verglichenen Blattflächen kann ungleich gewesen sein, wie er ja zum Beispiel im Gange der Jahreszeiten erheblichen Schwankungen unterliegt; in wasser- reicherem Zustand pflegen die Blätter mehr ausgebreitet, in trocknerem Zustand mehr geschrumpft zu sein. 1) Th. W. Engelmann, Botan. Ztg. 46, 661, siehe besonders S. 717 u. 718 [1888]. 2) Siehe besonders G. L. C. Matthaei, Phil. Trans. Roy. Sog. Ser. B 197, 82 [1904]. 46 R. Willstätter und A. Stoll. Über den Anteil des farblosen Stromas an der Zerlegung der Kohlen- säure sind nur durch Bestimmung der Leistung im Verhältnis zum Chlorophyllgehalt weitere Aufschlüsse zu erwarten. Für diese Behand- lung der Frage hat es aber bisher an den Voraussetzungen gefehlt. Die Grundlage für solche quantitative Versuche bietet der in der voranstehen- den Abhandlung erbrachte Nachweis 1. der Konstanz des Chlorophyllgehaltes während der Assimilations- versuche und 2. der annähernden Konstanz des Verhältnisses zwischen den beiden Komponenten a und b des Chlorophylls. Der letzte Punkt ist fast ebenso wichtig wie der erste; denn wenn der eine Chlorophyllfarbstoff während der Assimilation in den zweiten überginge, ohne sich im Verlaufe der gesteigerten Photosynthese zurück- bilden zu können, so wäre es nicht erlaubt, die Leistungen der aus den beiden Chlorophyllkomponenten bestehenden Gemische zu vergleichen. Als ein Punkt von geringerer Bedeutung sei erwähnt, daß früher der Be- rücksichtigung des Farbstoff gehaltes auch die mangelhafte Kenntnis von den gelben Pigmenten im Wege stand, von denen nun Carotin und Xanthophyll genau beschrieben wurden, während die wasserlöslichen gelben Stoffe noch ungenügend bekannt sind. Indessen wird man die Carotinoide in diesem Zusammenhang nicht mehr zu berücksichtigen brauchen, da ihre Beteiligung an der Assimilation sehr unwahrscheinhch geworden ist. Eine auf ihren Farbstoffeigenschaften beruhende Rolle spielen sie nicht in der Photosynthese, denn der Verlauf der Assimilation wird nicht meßbar beeinflußt (siehe den letzten Teil des Abschnittes VIII), wenn die von gelben Pigmenten absorbierbaren Lichstrahlen auf dem Wege zum Blatt ausgeschaltet werden. Das Verhältnis zwischen der Menge des Chlorophylls und der assi- milierten Kohlensäure wird in der vorliegenden Untersuchung geprüft an gewöhnlichen Laubblättern in verschiedenen Entwicklungsphasen und an solchen Blättern, die ungewöhnliche Verhältnisse bieten und Grenzfälle der Assimilation darstellen, an den chlorophyllarmen Blättern der gelben Varietäten, an etiolierten Pflanzen, an chlorotischen und anderen. Das Verhältnis zwischen Assimilation und Chlorophyllgehalt. 47 Die Methode der Arbeit ist die Untersuchung unter Bedingungen maximaler Assimilationsleistung für eine gewählte günstige Temperatur, zumeist 25 °. Den Blättern wird starke künstliche Belichtung, die der Sonnenstärke ungefähr entspricht, und hoher Teildruck der Kohlen- säure, nämlich ein genügend rascher Strom von 5 vol.-proz. Kohlen- dioxyd bei konstanter Temperatur geboten. Dadurch ist erreicht, daß die äußeren Faktoren, deren Bedeutung aus den früheren Unter- suchungen hinreichend bekannt ist, den Vergleich der assimilatorischen Leistungen nicht stören, und es wird dadurch möglich, den Einflüssen der inneren Faktoren nachzugehen. Die aufgestellten Bedingungen sind also derart, daß die Leistung des am besten assimilierenden Blattes weder durch Erhöhung der Kohlensäurekonzentration noch durch Vermehrung des Lichtes bei der gewählten Temperatur gesteigert werden könnte. Bei geringerem Kohlendioxydgehalt könnte der Fall ein- treten, daß besser und schlechter assimilierende Blätter die gleiche assimilatorische Leistung zeigen, dadurch, daß es den ersteren an Kohlen- säure fehlte. Auch die gewählte Behchtung hat in den meisten Fällen für die maximale Leistung hingereicht. Nur bei den wenig Licht ab- sorbierenden gelben Blättern wäre es nötig, um die größte Umsetzung zu erzielen, mit noch höherer Lichtintensität zu arbeiten, was aber experimentellen Schwierigkeiten begegnete. Die an chlorophyllarmen Blättern beobachteten Zahlen sind daher nicht ganz vergleichbar mit den übrigen, sondern sie sind Mindestwerte. Nach der Festsetzung der Bedingungen maximaler Assimilation war erst in zweiter Linie die Wahl der analytischen Methode von Wichtigkeit. Wir folgten im Prinzip der Arbeitsweise von U. Kreusler^), die darin besteht, daß die Kohlensäure in dem zu den Blättern geleiteten und im abgeleiteten Gasstrom ermittelt wird. Diese Kohlensäuredifferenz- methode ergibt durch den Vergleich des über die Blätter im Dunkeln geleiteten und des über die belichteten Blätter gehenden Stromes ohne 1) U. Kräusle r, Landw. Jahrb. 14, 913 [1885] ; 16, 711 [1887]; 17, 161 [1888]; 19, 649 [1890]. 48 R. Willstätter und A. Stoll. Einfluß der Atmung den Betrag des assimilierten Kohlendioxyds. Im einzelnen weicht die Versuchsanordnung von der Kreuslers erheb- lich ab, darin, daß mit kleinräumigen Apparaten, geringeren Gasmengen und kürzeren Zeiten gearbeitet wird, so daß der Verlauf der Assimilation sich auch in sehr kleinen Intervallen beobachten läßt. Bei fast jedem Assimilations versuch wurde außer dem Frischgewicht und dem Chlorophyllgehalt der Blätter noch ihre Fläche und ihr Trocken- gewicht bestimmt und die Leistung auf Frischgewicht, Trockengewicht und Fläche berechnet, damit die Ergebnisse auch in anderer Art und Be- trachtung und in anderem Zusammenhang verwertet und mit den An- gaben anderer Forscher verglichen werden können. Wehn der Farbstoff- gehalt vor und nach dem Assimilationsversuch ermittelt wurde, so ergab sich dabei im allgemeinen keine Differenz, nur eine bemerkenswerte Zu- nahme des Chlorophyllgehaltes bei jungen Blättern. Für die Angaben von den Versuchsobjekten und den Assimilationen sei ein Beispiel hier angeführt: Aesculus Hippocastanum. 29. April. Hellgrüne gefaltete Blättchen. 8,0 g Frischgewicht. Bezogen auf 10 g: Trockengewicht 2,10 g, Fläche 264 qcm, Chloro- •phyll 10,1 mg. Assimilation in einer Stunde (gCOg): Von 10 g Frischgewicht 0,113, von I g Trockengewicht 0,054, von i qdm Fläche 0,043. Aus dem Assimilationsversuch unter den Bedingungen überschüssiger Licht- und Kohlensäureversorgung ergibt sich für die gewählte sTem- peratur das Verhältnis zwischen der in einer bestimmten Zeit assimi- lierten Kohlensäure und der Chlorophyllmenge. Dieses Ergebnis be- ziehen wir auf die Zeit einer Stunde und schlagen dafür die Bezeichnung vor: ,, Assimilationszahl". stündlich assimiliertes CO2 (g) Assimilationszahl Chlorophyll (g) Damit wird also die Menge von Kohlendioxyd ausgedrückt, die bei einer gewählten günstigen Temperatur unter den Bedingungen maximaler Das Verhältnis zwischen Assimilation und Chlorophyllgehalt. 40 Leistung von der i g Chlorophyll enthaltenden Blattmenge assimiliert worden ist. Abgekürzt ausgedrückt hat die Assimilationszahl die Bedeutung: ,,Die stündliche Leistung, bezogen auf i Gramm Chlorophyll", Die Brauchbarkeit der Assimilationszahl für theoretische Folgerungen beruht darauf, daß die Leistung für die gewählte Temperatur die größt- mögliche ist. Eine Ausnahme bilden nur gewisse chlorophyllarme Blätter, für die infolge nicht ausreichender Belichtung die Zahl noch nicht den Höchstwert darstellt. Das stört in diesem Falle wenig, da die Assimi- lationszahlen der besonders chlorophyllarmen Objekte diejenigen aller anderen übertreffen. Die wichtigsten Beispiele der vergleichenden Untersuchung lassen sich in folgende Gruppen einordnen: a) Normale Blätter. Die Assimilationszahlen normaler Laubblätter sind einander ähnlich ; die stündlichen Leistungen, bezogen auf i g Chlorophyll, betragen 6 bis 9 g CO 3. b) Junge und alte Blätter. Die Assimilationstüchtigkeit des Blattes in einem frühen Entwick- lungszustand ist größer; mit dem Wachsen des Blattes geht, bezogen auf seinen Chlorophyllgehalt, die stündhche Leistung auf ungefähr die Hälfte zurück. c) Blätter im Frühling. Li der Frühjahrsentwicklung eines Blattes steigt die Assimilations- zahl von einem etwas tieferen Werte zu einem hohen und senkt sich weiterhin zu den Durchschnittswerten. d) Blätter im Herbst. In der herbstlichen Veränderung des Laubes kommt es vor, daß die Leistungsfähigkeit der Blätter gleichbleibt, fällt oder steigt. Es gibt Blätter, die im Herbste abfallen, während sie noch hohen Chlorophyllgehalt und große Assimilationsenergie besitzen. Anders bei vergilbendem Laube; der Chlorophyllgehalt geht zurück, ähnlich die Assimilationstüchtigkeit, die Assimilationszahl ändert sich wenig. Willstätter-Stoll, Assimilation. A 50 R. Willstätter und A. Stoll. Es kommt auch vor, daß das Chlorophyll rascher abnimmt, die Assimilationsenergie langsamer. Die Assimilationszahl steigt, mitunter über die hohen Frühhngswerte hinaus. Endhch gelangten Blätter zur Untersuchung mit nur wenig ab- nehmendem Chlorophyllgehalt und rasch sinkender Leistung, Hier fällt die Assimilationszahl zu ganz tiefen Werten. Werden die herbstlichen Blätter der letzten Sorte in warmem, feuchtem Raum gehalten, so wird die Assimilation wieder belebt und steigt zu an- sehnlichen Werten. e) Chlorophyllarme Blätter (gelber Varietäten). Bei diesen werden ähnliche Leistungen, auf Frischgewicht oder Blattfläche bezogen, wie bei normal grünem Laube gefunden. Die Assi- milationszahlen sind daher außerordentlich hoch, lo bis 15 mal größer als bei chlorophyllreichen Blättern. f) Etiolierte Blätter. Die ergrünenden etiolierten Blätter zeigen, ähnlich den Blättern gelber Varietäten, große assimilatorische Leistungsfähigkeit. Die, auf Chlorophyll bezogen, hohe Leistung findet sich also immer bei Blättern mit wenig Chlorophyll. An den Grenzfällen, bei fast chloro- ph3dlfreien Blättern, läßt es sich aber zeigen, daß erst mit dem Auftreten des Chlorophylls die assimilatorische Leistung sich einstellt. Von den untersuchten Fällen werden einige Beispiele der \'er- schiedenen Gruppen mit den assimilatorischen Leistungen und den Assimilationszahlen in der folgenden Tabelle 7 angeführt. Die Kohlen- säuremengen, welche stündlich von den i g Chlorophyll enthalten- den Blattmengen assimiliert werden, bewegen sich zwischen i und 130 g- Das Ergebnis eines quantitativen Assimilationsversuches läßt sich auch mit einem der Assimilationszahl umgekehrt proportionalen Werte so darstellen, daß die ermittelte Reaktionsgeschwindigkeit veranschauhcht wird. Die Zeit, in der bei der gewählten Temperatur und bei Überschuß von Kohlensäure und Licht die molekulare Kohlendioxydmenge durch die molekulare Menge von Chlorophyll photosynthetisch umgesetzt Das Verhältnis zwischen Assimilation und Chlorophvllgehalt. 31 Tabelle 7. Assimilation in 5prozentigem CO.2, bei 25= und Licht von Sonnenstärke. Pflanzenart Beschreibung Chloro- phyll- gehalt von 10 g frischem Blatt(mg) Stündlich assimi- liertes CO2 (g) von 10 g Blatt von I qdm Blatt Assimilita- tionszahl (stündl.Assi- mil. [g] von I g Chloro- phyll) Ulmus Sambucus nigra normal grün 16,2 22,2 0,111 0,146 0,021 0,034 6.9 6,6 Sambucus nigra Ulmus gelbblätterig o,8i 1,2 0,097 0,098 0,021 0,024 120 82 Phaseolus vulgaris Tilia cordata etioliert 0,7 0,091 im Frühjahr junge Blätter 6,5 0,183 0,092 0,024 0,018 133 16,0 14,2 Ampelopsis quin- Herbst, jung. 12,7 0,100 0,015 7-9 quefoha Blätter Ampelopsis quin- Herbst, ältere 12,9 0,012 0,0024 0,9 quefolia Blätter j wird, soll als ,, Assimilationszeit'' angegeben werden, zum Beispiel: Ampelopsis Veitchii, herbstliche ältere Blätter . 189 Sekunden Sambucus nigra, normal grüne Blätter .... 28,4 ,, Sambucus nigra, gelbe Blätter i,5 ,, Diese Werte können gelegentlich neben den Angaben der stündhchen Leistung des Chlorophylls benützt werden (Abschnitt IX). Die Assimilationszahlen, in denen die Disproportionahtät von assi- milatorischer Leistung und Chlorophyllgehalt Ausdruck gefunden hat, können als Maß für die sehr variable assimilatorische Tüchtigkeit gelten und als Maß für die Ausnützung der vom Chlorophyll absorbierten Energie (bei überschüssiger Belichtung). Die gefundenen Werte gehen weit auseinander, der Ausnützungsfaktor des Lichts wächst mit steigen- der Assimilationszahl. Die Lichtausnützung, auf die im IX. Abschnitt eingegangen wird, ist also bei den chlorophyllarmen Blättern der Aurea- 52 K. Willstätter und A. Stoll. Varietäten viel vollständiger als bei normalen Blättern und sie ist bei den letzteren weit entfernt von dem theoretischen Werte. Bei dem in Kürze geschilderten Versuchsmaterial handelt es sich nicht, wie bei einigen früheren Arbeiten über veränderliche Assimilations- energie, um künstliche Eingriffe in die Lebensbedingungen der Pflanzen, deren Wirkung auf den Assimilationsvorgang weniger eindeutig w^äre, sondern es sind vor allem die unter günstigen Assimilationsbedingungen erzielten Leistungen möglichst verschiedenartiger gesunder Blätter und gleichartiger Blätter in verschiedenen Entwicklungsphasen verglichen worden. Die Schlußfolgerungen, die aus den Assimilationszahlen gezogen w^erden sollen, finden sich an verschiedenen Stellen bereits in jenen älteren Untersuchungen angedeutet. Für die Anschauung Pfeffers von der spezifischen und differenten Assimilationsenergie der Chloroplasten haben zu nicht geringem Teil die Beobachtungen von A. J. Ewart^) die Grundlage geboten. Seine eingehende L'^ntersuchung : ,,Über die vorübergehende Aufhebung der Assimilationsfähigkeit in Chlorophvll- körnern" ist in Pfeffers Institut ausgeführt worden und W. Pfeffer^) hat auch selbst über die Ergebnisse kurz berichtet. Es ist beobachtet worden, daß die Chlorophjdlkörper bei genügend langem Verweilen unter solchen Verhältnissen, die bei noch längerer Dauer endlich den Tod des Organismus herbeiführen, in einen Zustand versetzt werden, in wel- chem sie nunmehr unfähig sind, bei Wiederherstellung der besten Be- dingungen Kohlensäure zu assimilieren, daß aber diese Fähigkeit unter den normalen x\ssimilationsbedingungen allmählich zurückkehrt. Der- artige Erfolge konnten nach Einwirkung von extremen Temperaturen, von intensiven Lichtwirkungen, von Austrocknen und anderen Ein- flüssen erzielt werden. Die wichtigen Angaben über die Wiederbelebung inaktiver Chloroplasten sind von uns bestätigt worden (Abschnitt VI); einen anderen Teil dieser mit Hilfe der Engelmannschen Bakterien- methode ausgeführten Arbeit Ewarts halten wir nicht für einwandfrei, unsere Messungen treten (Abschnitt V A) in Widerspruch mit seinen ^) A. J. Ewart, Journ. of the Linncan Soc, Botany 31, 364 [i8g6], 554 [1897]. 2) W. Pfeffer, Ber. math.-phys. Klasse d. sächs. Ges. d. Wissensch. 1896, S. 311. Das Verhältnis zwischen Assimilation und Chlorophyllgehalt. 53 Beobachtungen über niedrige assimilatorische Leistungen der Blätter in der Frühjährsentwicklung. In gleichem Sinne wie die Beobachtungen Ewarts ist eine sorg- fältige Untersuchung von E. Pantanelli\) bedeutsam, welche die in intensivem Lichte auftretenden Ermüdungserscheinungen der Chloro- plasten behandelt und zu dem wichtigen Satze führt, ,,daß im photo- synthetischen Betriebe der COo-Assimilation durch grüne Pflanzen die wesentlichste Rolle der protoplasmatischen Tätigkeit des farblosen Be- standteils der Chloroplasten zufällt". „Das Plasma der Chloroplasten arbeitet, ermüdet und erholt sich; das Chlorophyll bleibt dabei in den meisten Fällen primär ganz in- different." Eine weitere Untersuchung, die auch aus dem Institut Pfeffers hervorgegangen ist, scheint gleichfalls für die Mitwirkung des Plasmas bei der Assimilation zu sprechen. O. Treboux-) hat ,, Einige stoffliche Einflüsse auf die Kohlensäureassimilation bei submersen Pflanzen" untersucht, wovon hier namentlich die Wirkung des Zusatzes verschie- dener anorganischer und organischer Säuren von Interesse ist. Der Gas- wechsel des Chlorophyllapparates wurde bei geringem Säurezusatz auf kurze Dauer gesteigert; diese Wirkung entsprach aber nicht, wie bei enzymatischen Vorgängen, der Wasserstoffionenkonzentration, sondern dem Gehalte der Lösung an Aquivalentgewichten von starken oder schwachen Säuren. Es ist auf fähig, daß sich in dieser Beziehung die Kohlensäure gleich den anderen, den organischen Säuren verhalten soll, so- bald den Pflanzen über den Bedarf für die Assimilation hinausgehende Mengen geboten werden. Die Arbeit von Treboux ist nur mit der Gas- blasenmethode ausgeführt worden, und es lassen sich Bedenken gegen ihre Beweiskraft nicht unterdrücken. Es erscheint nicht unmöglich, daß das auf Säurezusatz lebhafter entwickelte Gas mehr oder weniger Kohlen- säure anstatt des Sauerstoffs enthielt. Es ist ferner nicht unwahrschein- lich, daß der von Treboux beobachtete Vorgang, der sich wesent- 1) E. Pantanelli, Jahrb. f. wissensch. Botanik 39, 165 [1903]. 2) O. Treboux, Flora 92, 49 [1903]. 54 R- Willstätter und A. Stoll. lieh von einer enzymatischen Beschleunigung unterscheidet, nicht eine direkte Beeinflussung der assimilatorischen Leistung durch die zugesetzte Säure war, sondern eine indirekte Wirkung, nämlich primär die Wirkung auf eine Eigenschaft der Pflanzensubstanz, die in der nachfolgenden dritten Abhandlung beschrieben werden soll, auf ihr Vermögen, Kohlen- säure zu absorbieren^). Am deutlichsten war wohl bisher die Annahme eines mit dem Chloro- phyll zusammenwirkenden besonderen protoplasmatischen Faktors in einer Arbeit von A. A. Irving^), ,,Der Beginn der Photosynthese und die Entwicklung des Chlorophylls" ausgesprochen, die zu der wichtigen Reihe der ,,Experimental Researches on Vegetable Assimilation and Respiration" von F. F. Blackman gehört. Der experimentelle Befund von Irving wird in unseren Versuchen (Abschnitt X) widerlegt. Die ergrünenden etiolierten Blätter zeigen nicht, wie Irving fand, sehr niedrige, sondern sogar besonders hohe assimilatorische Energie, die Leistung entfernt sich, aber in dem den Angaben von Irving ent- gegengesetzten Sinne, von der Proportionalität mit dem Chlorophyll- gehalt. Die Erklärung, die für die beobachteten Differenzen in der assimila- torischen Leistung der Blätter zu geben ist, sollte zunächst an die ein- gangs gestellte Frage anknüpfen, ob ein einziges chemisches Agens der Chloroplasten Träger von zwei verschiedenen Funktionen ist. Diese Möglichkeit wird durch die Disproportionalität zwischen Chlorophyll und Leistung ausgeschlossen. Die verschiedene Ausnützung des Vor- gangs der Lichtabsorption durch den davon abhängigen Vorgang der Kohlensäurezerlegung lehrt, daß zwei Einrichtungen des Assimi- lationsapparates mehr oder weniger gut zusammen operieren. Diese Beweisführung und allgemeiner die theoretische Bedeutung, ^) Wenn die mit der Pflanzensubstanz verbundene Kohlensäure durch eine andere Säure verdrängt wird, so ist entweder für kurze Zeit vermehrte Gasblasenentwicklung durch ent- weichendes Kohlendioxyd die Folge, oder die Kohlensäure wird den Chloroplasten vorüber- gehend in erhöhter Konzentration zur Verfügung gestellt. In beiden Fällen ist die Wirkung des Säurezusatzes keine direkte Beeinflussung der Assimilation. '^) A. A. Irving, Ann. of Botany 24, 805 [1910]. Das A'erhältnis zwischen Assimilation und Chloroph\llgehalt. 55 die der veränderlichen Assimilationsenergie beigelegt wird, hat eine wichtige Voraussetzung, die noch zu betonen ist. Es wird dabei mit gleicher oder wenigstens ähnlicher Verteilung des Chlorophylls in den Assimilationsorganen gerechnet. Es ist nachgewiesen worden, daß die Chloroplasten das Chlorophyll in einer Dispersität wie in der kolloiden LösungO enthalten und es wird nun die Annahme gemacht, wie in der Pflanzenphysiologie stillschweigend zu geschehen pflegt, daß die Kolloid- teilchen des Chlorophylls im allgemeinen von ähnhcher Größe seien und daß nicht ein wechselseitiger leichter Übergang zwischen groben und feinen Dispersoiden stattfinde . Es lassen sich manche Erscheinungen der variablen Assimilationstüchtigkeit anführen, die ohne Annahme der Beteiligung des farblosen Stromas an der Assimilation erklärt werden könnten, wenn man voraussetzen dürfte, daß die hohen Assimilationszahlen durch sehr feine Verteilung, durch sehr geringe Teilchengröße des Kolloids, die niedrigen Assimilationszahlen durch Verminderung der wirksamen Ober- fläche infolge Kondensation der Partikel bedingt werden. Die bessere Ausnützung des Chlorophylls in den chlorophyllarmen als in den chloro- phyllreichen Blättern könnte so verstanden werden, wenn eben nicht doch die gefundenen Unterschiede im Farbstoffgehalt bei ähnlicher Leistung zu bedeutend wären. Es finden sich indessen in den Beobachtungsreihen wichtige Argu- mente, welche die Annahme einer derart verschiedenen Verteilung des kolloiden Pigments widerlegen. Der Gang der Assimilationszahlen im Frühling müßte so gedeutet werden, daß die Verteilung des Chlorophvlls anfangs gröber dispersoid sei, darauf günstiger und dann wieder ungünstiger werde. Noch unwahrscheinlicher wäre die Erklärung der Assimilations- verhältnisse im Herbst. Auch müßte die Fähigkeit der Chloroplasten, nach dem herbstlichen Rückgang der Assimilationsenergie sich zu erholen, so gedeutet werden, daß die groben Partikel sich in kurzem wieder in feine zerteilten. ^) R. Willstätterund A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, Berlin 1913, III. Kap., Abschn. 2 und im folgenden: Vierte Abhandlung, Abschn. III. 56 R. Willstätter und A. Stoll. Namentlich der Vergleich grüner und gelber Blätter ist in dieser Frage entscheidend. In dem Temperaturbereich, innerhalb dessen den gelben und grünen Blättern Licht im Überschuß geboten werden kann, ist die Abhängig- keit der Leistung von der Temperatur verschieden für gelbe und grüne Blätter. Die obere Grenze der Assimilationsleistung wird bei normalgrünen Blättern schon mit viel geringerer Lichtintensität erreicht als bei den chlorophyllarmen Blättern. Es ergibt sich also aus den quantitativen Bestimmungen der Assi- milation, daß außer dem Chlorophyll und mit demselben ein zweites chemisches Agens der Chloroplasten für die Kohlensäureassimilation notwendig ist. Die Funktion kann entweder mit oberflächlicher Betrach- tung dem gesamten Protoplasma zugeschrieben werden, oder, indem man näher auf die gegebene chemische Aufgabe (vergleiche die \äerte Ab- handlung) und auf die Lösung derselben eingeht, einem spezifischen Bestandteil des Protoplasmas. Es ist nach den Beobachtungen hinsicht- lich der spezifischen Assimilationsenergie mit großer Wahrscheinlichkeit anzunehmen, daß es sich um ein im Stroma enthaltenes bestimmtes Agens von enzymatischer Natur handelt. Die zu beschreibenden Erschei- nungen lassen sich mit dieser Annahme sämthch gut erklären. Daß der protoplasmatische Faktor enzymatischer Natur ist, wird namentlich durch die im Abschnitt XIII mitgeteilten und erörterten vergleichenden Versuche bei verschiedenen Belichtungen und verschiedenen Tempera- turen mit chlorophyllreichen und -armen Blättern angezeigt. Bei chlorophyllreichen Blättern ist unter den gewählten Versuchs- bedingungen eine Vermehrung des Lichtes ohne Einfluß auf die Assi- milation; diese sinkt nicht, wenn wir mit der Lichtstärke auf ^/g herab- gehen. Dies ist so zu verstehen, daß hier das Chlorophyll gegenüber dem assimilatorischen Enzym im Überschuß ist. Erhöhung der Temperatur bewirkt bei den normalen Blättern Steigerung der Assimilation, weil der enzymatische Vorgang durch die Temperaturerhöhung stark beschleu- nigt wird. Das \'erhältnis zwischen Assimilation und Chlorophyllgehalt. 57 Umgekehrt liegen die Verhältnisse bei den nur wenig Farbstoff ent- haltenden Blättern der Aureavarietäten. Hier finden wir nur einen ge- ringen Einfluß der Temperatursteigerung von 15° auf 30°. Das Enzym ist also hier im Überschuß gegenüber dem Chlorophyll, schon bei mitt- lerer Temperatur (25 °) genügt das Enzym für die Leistung, die das Ab- sorptionsvermögen des Chlorophylls zuläßt. Hingegen ist Steigerung des Lichtes von Nutzen; bei Verminderung der Lichtstärke erfolgt alsbald Rückgang der Assimilation. Nur wenn das Chlorophyll voll- ständig ausgenützt wird, nämlich bei stärkster Belichtung, läßt sich in den chlorophyllarmen Blättern die maximale Leistung für das vor- handene JLnzym erzielen. Die auffälligen Erscheinungen bei den herbstlichen Veränderungen des Laubes werden darauf zurückgeführt, daß entweder mehr das Chloro- phyll leidet als das Enzym (Steigerung der Assimilationszahlen), oder daß umgekehrt die enzymatische Komponente in höherem Maße ge- schädigt wird als der Chlorophyllgehalt (sinkende Assimilationszahlen). Die Wiederbelebung der zur ^Assimilation annähernd unfähig gewordenen Blätter beim Verweilen in warmem feuchtem Räume zeigt die Neubildung des Enzyms oder die Beseitigung von Hemmungen des enzymatischen Vorgangs an. Es war bei zahlreichen Versuchen uns ebenso wie früheren For- schern^) nicht möglich, mit den von der lebenden Zelle abgetrennten Chloroplasten oder, worauf die siebente Abhandlung näher eingeht, mit dem isolierten Chlorophyll Assimilation auszuführen; das negative Ergebnis wird dadurch erklärt, daß das Chlorophyll mit dem Enzym zusammenwirken muß. Es zeigte sich, daß schon milde Eingriffe in die Struktur der Zelle die Assimilation aufheben. Blätter, die wir an der Unterseite von der Epidermis mit ihren Schließzellen und Spaltöffnungen befreit hatten, assimilierten noch gut; wurden sie aber nur ganz kurz einem gelinden Druck unterworfen, so erfolgte keine Assimilation mehr (Abschnitt XIV). ^) Die entgegenstehenden Angaben von F. L. Usher und J. H. Priestley und anderen Forschern werden in der siebenten Abhandlung (Abschn. III) berücksichtigt. 58 R- Willstätter und A. Stoll. Aus der vorliegenden Untersuchung wird also gefolgert, daß eine Teil- reaktioii der Kohlensäureassimilation ein an dem Chlorophyllkolloid- teilchen stattfindender enzymatischer Prozeß ist. Die Aufgabe des Enzyms wird es sein, den Zerfall eines aus Chlorophyll und Kohlensäure gebil- deten Zwischenproduktes^ ) unter Abspaltung von Sauerstoff zu bewirken. Experimenteller Teil. IL Zur Geschichte der quantitativen Beobachtung der Assimilation. In den neueren Arbeiten werden für die Untersuchung der Assimilation teils Methoden, die als Schätzungen zu bezeichnen sind, teils quantitative Bestimmungen angewandt. Eine Zwischenstellung gegenüber beiden nimmt« die Blatthälftenmethode von J. Sachs-) ein, welche in der Ermittlung der Trockengewichtszunahme während der Assimilations- periode besteht. Da auf diese Methode viele Fehlerquellen Einfluß ausüben, bedurfte es der eindringenden Kritik in den Arbeiten von H. T. Brown und F. Escombe^) sowie von F. F. Blackman und D. Thoday^), um die hauptsächlichsten Störungen aufzufinden und zu kompensieren und die Ergebnisse denjenigen der exakteren Bestim- mungen anzupassen. Als Schätzungen, die nur für besondere Fragen den Wert von Messungen haben können, sind diej enigen Methoden zu bezeichnen, bei welchen die Ent- bindung von Sauerstoff unter der Voraussetzung eines ungefähr kon- CO stauten Quotienten ' zur Anzeige des Reaktionsverlaufes dient. In diese Gruppe von Methoden gehört namentlich che Engel mann sehe Bakterienmethode ^), deren Brauchbarkeitsgrenzen später (Abschnitt V A) bei der Besprechung der Arbeit von A. J. Ewart zu erörtern sein werden, ^) Siehe darüber die vierte und fünfte Abhandlung. -) J. Sachs, Ein Beitrag zur Kenntnis der Ernährungstätigkeit der Blätter, § 6, im dritten Band, Heft I, der Arb. d. botan. Inst, in Würzburg, 1884. 3) H. T. Brown und F. Escombe, Proc. Roy. Soc. Ser. B 76, 29, 49 [1905]- *) F. F. Blackman und D. Thoday, Proc. Roy. Soc. Ser. B 82,^ [1909]. ^) Th. W. Engel mann, Bot. Ztg. 39, 441 [1881]; 41, i [1883]; 44, 43 [1886]. Zur Geschichte der quantitativen Beobachtung dei Assimilation. 59 ferner die Leuchtbakterienmethode von M. W. Beijerincki), sowie die Gasblasenmethode, auf welche die Untersuchungen von O. Treboux (vgl. im theoretischen Teil), von E. Pantanelli-) sowie von A. Kniep und F. Minder^) gegründet sind. Die wichtigsten Verfahren für die quantitative Bestimmung können als ,, Kohlensäuredifferenzmethoden" kurz zusammengefaßt wer- den. Von den alten klassischen Arbeiten bis zu der Untersuchung (1871) von W. Pfeffer*) über ,,Die Wirkung farbigen Lichtes auf die Zer- setzung der Kohlensäure in Pflanzen" ist bei der Assimilation von Pflan- zen oder von Pflanzenteilen in geschlossenem Raum die Änderung des Gasinhalts bestimmt worden. Die neueren LTntersuchungen haben hingegen die Kohlensäuredifferenzmethode auf assimilierende Pflanzen- teile in einem Gasstrom angewandt. Zum erstenmal ist die Bestimmung der Kohlensäuredifferenz im Gas- strom zur Methode für die Untersuchung der Assimilation in eingehenden Arbeiten von U. Kreusler^) ausgestaltet worden, der kohlendioxyd- haltige oder kohlendioxydfreie Luft durch eine belichtete oder unbelichtete Assimilationskammer leitete und die Kohlensäure des gesamten Gasstroms durch Absorption mit Baryumhydroxyd analysierte. Das Prinzip von U. Kreusler ist in den letzten Jahrzehnten durch Verbesserungen in vielen wichtigen Einzelheiten und durch große Ver- feinerung zu den Methoden von H. T. Brown*') und seinen Mitarbeitern und F. F. Black man") und seiner Schule weiter entwickelt worden. Auch ist es in den Arbeiten von F. F. Black man und A. M. Smith*) gelungen, dasselbe Prinzip auf die x\ssimilation submerser Pflanzen zu ^) M. W. Beijerinck, Akad. van Wetensch. te Amsterdam, S. 45 [1901]. 2) E. Pantanelli, Jahrb. f. wissensch. Botanik 39, 165 [1903]. ^) A. Kniep und F. Minder, Zeitschr. f. Botanik i, 619 [1909]. *) W. Pfeffer, Arb. d. botan. Inst, in Würzburg i, i [1871]. 5) ü. Kreusler, Landwirtsch. Jahrb. 14, 913 [1885]; 16, 711 [1887]; 17, 161 [1888]: 19, 649 [1890]. 6) H. T. Brown und F. Escombe, Proc. Roj-. Soc. 70, 397 [1902]; Ser. B 76, 29 [1905]. ') F. F. Blackman, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B 186, 485 u. 503 [1895]; G. L. C. Matthaei, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B 197, 47 [1904]; F. F. Blackman und G. L. C. Mat- thaei, Proc. Roy. Soc. Ser. B 76, 402 [1905]. 8) F. F. Blackman und A. M. Smith, Proc. Roy. Soc. Ser. B 83, 374 u. 389 [1911]- 6o R- Willstättei- und A. Stoll. Übertragen und auch bei diesen die Bestimmung der Kohlendioxyddifferenz im Strom zu einer der Gasblasenzählung überlegenen Methode zu gestalten. Es ist gegenüber diesem Wesen der Methode von ganz verschwindender Bedeutung, wie schließlich der Kohlendioxydbetrag des Gasstroms ana- lysiert wird. Es wäre eine Überschätzung der Einzelheiten in der Aus- führung der chemischen Hilfsarbeit, wenn wir etwa mit Black man^) die Untersuchung der Assimilation auf Grund der gasometrischen, volu- metrischen oder gravimetrischen Analyse des Kohlendioxyds defi- nieren wollten; die verschiedenen Ausführungsweisen lassen sich zur gleichen Genauigkeit ausbilden. Diese Arten der Kohlensäurebestimmung sind von F. Haber um eine originelle und elegante neue Analysenmethode bereichert worden. Nach einem vor der Deutschen Chemischen Gesellschaft gehaltenen, noch unveröffenthchten Vortrag verfolgten F. Haber und J. Neustadt-) den Assimilationsprozeß, indem sie den Kohlendioxydgehalt des Gas- stroms mit Hilfe des Interferometers bestimmten. Bei Gehaltsände- rungen im Strom ergab sich der Betrag von assimilierter Kohlensäure aus der fortlaufenden optischen Beobachtung. Die Methode für die Bestimmung der GOa-Differenz im Gasstrom wird von jedem Forscher in einer für den besonderen Zweck seiner Unter- suchung geeigneten Form ausgebildet; die Arbeitsweisen von Brown und von Blackman und die unsere seien in Kürze gekennzeichnet. Bei Brown ebenso wie bei Blackman wird der Gasstrom, sei er Luft von gewöhnlichem oder von erhöhtem Kohlendioxydgehalt, gegabelt zum Zwecke der exakten Bestimmung der COa-Differenz bei Eintritt in den Assimilationsraum und beim Verlassen desselben. Brown und Escombe ermitteln das Volumen des Hauptstromes und des zur Kontrolle dienenden Zweigstromes mit Gasuhren. Beide Ströme werden in Reiset-Türme geleitet, die mit Natronlauge beschickt sind. Das Kohlendioxyd wird maßanalytisch bestimmt. Die verbesserten Absorptionsapparate haben es ermöglicht, viel stärkere Luftströme 1) F. F. Blackman, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B i86, 485 [1895]. 2) F. Haber und J. Neustadt, Bar. d. deutsch, ehem. CtCs. 47, Soo [1914]. Zur Geschichte der quantitativen Beobachtung der Assimilation. 6l (200— 400 1 in der Stunde) und kohlensäurereichere Luft anzuwenden, als es bei K reusler geschehen konnte. Die Kohlensäurebestimmung geschieht auch bei Blackman nach der Absorption in Barytwasser durch Titration. Das Unterscheidende in seiner Versuchsanordnung wird von Matthaei\. folgendermaßen ausgesprochen: ,,Two aspirators are, by an automatic device, kept dropping at exactly equal rates. The single current of air, enriched with the required amount of COo , which enters the apparatus is, by their action, divided into two perfectly equal half-currents. One of these currents is led directly through a Pettenkofer tube; the other first passes through the leaf Chamber.-' Bei der Ausdehnung der Unter- suchung Blackmans-) auf Wasserpflanzen wird die Methode durch folgende Worte angedeutet : ,,a continous current of water containing dissolved CO2 flows over the assimilating plant, and the difference in the COo-content of the water before and after contact with the plant is a measure of the assimilation taking place." Gegenüber dem kunstvollen, aber komplizierten Apparate von Black- man, mit dessen Arbeitsweise die unsere mit Rücksicht auf den hohen Kohlendioxyddruck verglichen wird, ist unser Apparat und unser Ver- fahren wesentlich vereinfacht, ohne Einbuße an Genauigkeit und Lei- stungsfähigkeit. Die Teilung des Gasstromes und die Kontrolle seiner konstanten Zusammensetzung wird überflüssig gemacht, indem wir die kohlensäurehaltige Luft mit konstanter Geschwindigkeit aus einer Druckflasche strömen lassen. Der Zweck unserer Untersuchung bedingt hohe Kohlensäurekonzentration und langsame Strömung. Der Assi- milationsraum und die Absorptionsapparate sind kleinräumig gestaltet; dadurch wird erreicht, daß der Verlauf der Assimilation während der Versuchsdauer in beliebig kurzen Intervallen beobachtet werden kann. Die Bestimmung des Kohlendioxyds geschieht auf die einfachste Weise und mit vollkommen ausreichender Genauigkeit durch Absorption mit Natronkalk und Wägung. 1) G. L. C. Matthaci, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B 197, 55 [1904]- -) F. F. Blackman und A. M. Smith, Proc. Roy. Soc. Ser. B 83, 374 [ign]- 62 R. Wülstätter und A. Stoll. III. Die Methode der Untersuchung. Der Vergleich zwischen dem Kohlensäuregehalt des Luftstromes von konstanter Geschwindigkeit, der über die Blätter im Dunkeln geleitet R worden war und dabei die Atmungskohlensäure aufgenom- men hatte, und des Stromes, der über die Blätter unter Be- lichtung gewandert ist, gibt uns ohne Einfluß der Atmung den Betrag des assimiherten Kohlendioxyds. Die Blätter befinden sich in einer Glasdose, die in ein Bad von konstanter Temperatur eingesetzt ist, und erhalten von Fig. I. Assimilationskammer (-/s nat. Größe). einer Metallfadenlampe Licht großer Intensität; die Temperatur wird an den Blättern selbst gemessen. Die kohlendioxydhaltige Luft wird aus einer Stahlflasche durch ein Strömungsmanometer und durch einen Befeuchter in die Assimilationskammer eingeführt und von da durch die Trocknungs- und die Absorptionsapparate für Kohlendioxyd in die Gasuhr entlassen. 64 R- Willstätter und A. Stoll. A. Die Assimilationsapparatur. Die Assi milations kämm er (Fig. i und A in Fig. 2). Eine flache runde Glasdose, zum Beispiel von 2 cm Höhe und 23 cm Durchmesser, wird mit einer nur wenig überragenden starken Spiegelglasplatte luft- dicht verschlossen. Diese trägt in einer mittleren Bohrung einen Gummi- stopfen, durch welchen zwei wagerecht umgebogene, 3 mm dicke Glas- röhren bis fast zum Schalenrand führen. Der geschliffene Dosenrand wird mittels eines heißen Drahtes mit Paraffin bestrichen und die Ver- schlußplatte durch Bewegen über einer Flamme auf etwa 40^" angewärmt. Nachdem man die am Deckel montierten Glasröhren, weil sie die Blätter berühren werden, rasch für sich allein mit Wasser abgekühlt hat, wird die Verschlußplatte aufgesetzt und durch vier mit Korkschutz versehene Klemmschrauben gleichmäßig angepreßt. Den Boden der Schale bedeckt ein leichtgewelltes Silberdraht- netz, das in Abständen von 3 bis 4 cm etwa 3 mm weite Löcher enthält. Die Blätter, je nach der Dicke 5 bis 20 g, werden mit ihrer Oberseite nach oben so durch die Löcher gesteckt, daß sie die Fläche mögUchst ausnützen, ohne einander zu überdecken, und so, daß die schiefen Schnitt- flächen der kurzen Stiele zum Boden reichen und in etwas Wasser ein- tauchen. Die Kammer ist nämlich mit 10 ccm Wasser beschickt, und zwar mit frischem Leitungswasser, da das Spuren von Kupfer ent- haltende destilherte Wasser unseres Laboratoriums für die Pflanzen unzuträghch ist. Durch Umschwenken wird das Wasser zu Anfang und bei längeren Versuchen immer wieder zu den Blattstielen gebracht, damit die rege Transpiration nicht das Eintrocknen der Blätter zur Folge hat. Temperaturablesung. Durch einen seitlichen Tubus der Glas- dose ist ein rechtwinklig gebogenes Normalthermometer eingeführt, in Zehntelgrade geteilt für die Temperaturstrecke von o bis 20° oder von 15 bis 35 °. Die Thermometerkugel liegt zwischen dem Drahtboden und einem Blatt ; sie ist mit Silberdrahtnetz doppelt umwunden, das eine Die Methode der Untersuchung. 65 dem Blatt parallele Fahne von mehreren Quadratzentimetern Fläche bildet, um die" Blattemperatur gut auf das Thermometer zu übertragen. Das Blatt, dessen Temperatur man mißt, darf nicht die kühlende Ver- schlußplatte berühren, es muß in der Mitte der Schale frei liegen, damit die mittlere Temperatur der verschiedenen Blätter gefunden werde. Wir bewirken dies durch Auflegen eines W-förmigen, 3 cm langen und 2 cm breiten Glasröhrchens von 3 mm Dicke, das von dem federnden Drahtnetz an den Glasdeckel angedrückt wird. Das Thermometer ragt durch einen Ausschnitt des Lichtschutzzyhnders heraus, seine Skala beginnt erst außerhalb des oberen Kühltroges. G. L. C. Matthaei 1) hat in ihren Arbeiten (1903/04) das Beispiel ge- geben für eine sorgfältigere Temperaturbestimmung der Versuchsblätter, als in den älteren Arbeiten angewandt war; sie ermittelte die Temperatur im Blattinnern mit einer an sich besonders exakten thermoelektrischen Methode. Freihch läßt sich das Verfahren nur bei relativ dicken Blättern anwenden, und es könnte seinen Zweck nur dann erfüllen, wenn dafür gesorgt wäre, daß die Blattstelle, an der die Temperatur gemessen wird, gegenüber der gesamten Blattfläche in mittlerem Abstand von der kühlenden Glaswand steht. Hierüber finden sich aber bei Matthaei keine näheren Angaben, obwohl diese Fehlerquelle bei den von Matthaei gemessenen Temperaturdifferenzen zwischen Blatt und Kühlbad (bis 10° oder mehr) besonders zu beachten wäre. Ein ähnlich hohes Tem- peraturgefälle zwischen Blatt und Kühlwasser haben wir mit unserer Methode in Vorversuchen gehabt. Es sank aber auf nur 2 bis 3°, als wir die im folgenden beschriebene doppelte Kühlvorrichtung einführten, und bewegte sich bei Blättern mit etwa gleichem Licht- absorptionsvermögen innerhalb höchstens 0,5°. Dies zeigt, daß die in verschiedenen Versuchen an den Blättern gemessenen Temperaturen ohne weiteres miteinander vergleichbar sind und daß bei dem kleinen Unterschied zwischen diesen und den Temperaturen des Kühlwassers die wahre Blattemperatur nur wenig verschieden von der abgelesenen sein 1) G. L. C. Matthaei, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B 197, 47 [1904]. Willstätter-Stoll, Assimilation. 5 66 R. Willstätter und A. Stoll. kann. Die thermometrische Messung genügt vollkommen für den ge- gebenen Zweck. Temperaturregulierung. Die Assimilationsdose wird zur Küh- lung in ein Wasserbad (W der Fig. 2) etwa 3 cm unter dem Niveau ein- gesetzt. Durch die Regulierung dieses Bades wird die Temperatur der Blätter genügend konstant gehalten, so daß die Schwankungen des in die Assimilationskammer eingeführten Thermometers ± 0,2 ° nicht über- steigen. Die Regulierung des Bades wird unter Rühren mit einer be- sonderen Vorrichtung durch die Einstellung eines Kühlstromes von konstantem Druck und konstanter Temperatur besorgt. Aus einem Gefäß mit konstantem Niveau (AQ von 30 1 Inhalt, das sich unter der Zimmerdecke befindet, lassen wir während des Versuches kaltes Wasser, das die Leitung ohne Temperaturschwankung liefert, in ziemlich starkem Strom fließen und stellen diesen mit einem Präzisionshahne (P) ein ; 'die Temperatur bleibt im Bade stundenlang auf ±0,2° konstant. Um die Temperaturdifferenz zwischen den Blättern und dem um- gebenden Bade, die sonst bedeutend zu sein pflegt, zu erniedrigen und das Konstanthalten der Temperatur zu erleichtern, war es zweckmäßig, die Hauptmenge der \'on der Lampe gelieferten Wärmestrahlen mit einem über dem Thermostaten angeordneten besonderen Filter zu absorbieren, einer 5 cm hohen Wasserschicht in einer Glasschale mit ebenem Boden. Dieses Strahlenfilter (F) ruht auf einem zur Abhaltung seitlichen Lichtes dienenden schwarzen Blechzylinder (C), welcher Bohrungen für Zu- und Ableitungen des Gasstromes und für Kühlwasser hat. Der Wasser- inhalt des Filters wird unter gleichzeitigem Rühren gekühlt durch einen raschen Strom von kaltem Wasser, das durch eine an der Peripherie der Schale hegende Bleischlange (Bi) läuft. Wir erreichen durch die Ab- haltung der Wärmestrahlen, daß der Temperaturunterschied zwischen dem Bade W und den Blättern 2 bis höchstens 3°, je nach ihrem Chlorophyllgehalt, beträgt und bei gelben Blättern nur 1°. Ist der Unterschied für eine Blattsorte ermittelt, so braucht man auch, um Temperaturänderungen vorzunehmen, nur das Bad auf die gewählte Temperatur, abzüglich dieser Differenz, einzustellen. Die Temperatur Die Methode der Untersuchung. 67 der Blätter rückt dann in 5 bis 10 Minuten auf den gewünschten Stand nach. Das Filter für die Wärmestrahlen dient bei Assimilationsversuchen in farbigem Lichte auch als Lichtfilter, indem die Wasserfüllung durch eine Farbstofflösung ersetzt wird. Um seitliches weißes Licht abzu- blenden, ist die obere Glasschale Gi bis zur halben Höhe mit einer dop- pelten Lage von schwarzem Papier verklebt, das auch unter dem Boden des Gefäßes bis zur Peripherie des im Bade W stehenden schwarzen Blechz3dinders hereinreicht. Auch dieses Bad (W) von annähernd kon- stanter Temperatur ist in erster Linie für die Versuche mit farbigem, zweckmäßig auch für die mit weißem Licht, am ganzen Boden und bis zur halben Höhe der Seitenwände mit schwarzer Bespannung versehen. Das Wasser des Bades und des Strahlenfilters muß in starker Be- wegung gehalten werden, ohne daß die Blätter von größeren Rühr- vorrichtungen beschattet werden. Wir verwenden dafür kleine, rasch rotierende Flügelrührer (Ri und Ro), die wir nach Art der Schiffsschraube hergestellt haben. Der an vertikaler Achse über den Bädern -erfolgende Antrieb mit Elektromotor oder W'asserturbine wird unter W'asser durch konische Zahnräder auf die Schraubenachse übertragen. Der Apparat ist mit einer federnden Doppelklammer über den Gefäßrand gesteckt und genügend festgehalten. Die Schraube (R2) von 2,5 cm Durch- messer bewegt im Raum zwischen Lichtschutzzylinder und Badrand das Wasser energisch und stößt es zum Teil zur Assimilationskammer, nämlich durch eine im Blechzylinder angebrachte 6 qcm große Öffnung, welche durch ein Blechdach seithch und oben gegen Licht geschützt ist. Das Wasser fließt aus dem Innern des Zylinders durch kleine Öffnungen an seiner unteren Kante ab. Temperaturänderungen, die man durch Eingießen von kaltem oder heißem Wasser an einer Stelle des Bades bewirkt, verteilen sich infolge des wirksamen Rührens in einer viertel bis halben Minute gleichmäßig im Bade von 6 1 Inhalt und im Apparate. Während die beschriebenen Kühlvorrichtungen durch die W^ärme- zufuhr im Assimilationsversuch nötig gemacht werden, muß der Apparat für den Vergleichsversuch der Atmung auf die nämliche konstante Tem- 68 R. Willstätter und A. Stoll. peratur geheizt werden. Für diesen Zweck ist das Kühlbad auf einen elektrischen Heizapparat (//) von Heraeus aufgesetzt, der mit einer automatischen Reguherung (/^/) versehen ist. Der Wasserinhalt wird bei abgestelltem Kühlwasser meistens auf 25 ° gehalten. Beleuchtung . Für die Versuche ziehen wir in Anbetracht ihrer Dauer und wegen der Unabhängigkeit von äußeren Umständen eine künstliche Lichtquelle gegenüber dem Sonnenlichte vor, da nur mit einer Lampe die sehr wichtige Bedingung der konstanten Lichtzufuhr erfüllt werden kann. Als sehr geeignete Lichtquelle diente uns eine V/g- Watt-Metall- fadenlampe der Deutschen Gasglühlicht-Aktiengesellschaft, deren Kerzen- stärke von der Fabrik zu 3000 angegeben wird. Der im allgemeinen ein- gehaltene Abstand des glühenden Drahtes vom Objekte betrug 25 cm, nur in besonderen Fällen (bei der Prüfung, ob das Licht im Überschuß ist) wurde er auf 15 cm verringert. Die Intensität des Lichtes kann, je nach der Entfernung (25 bis 15 cm) auf 48 000 bis 130 000 Lux^) ge- schätzt werden, also ungefähr auf einfache bis über doppelte Sonnen- stärke. Die Lampe wurde früher erneuert, als ihre Lichtstärke nachließ. Die V2-W'att-Osramlampe brennt geräuschlos und gleichmäßig mit weißem Lichte, das an photochemisch wirksamen Strahlen verhältnis- mäßig arm, aber an assimilatorisch wirksamen reich ist. Die Armatur der Lampe trägt einen Glasreflektor; um noch vollständiger, als es von diesem bewirkt wird, die Strahlen auf die Blätter zu werfen, überdecken wir ihn mit Filtrierpapier und legen um seinen Rand einen 20 cm hohen Zylinder von 3 facher Filtrierpapierlage, um auch seitliches Licht zu sammeln. Von dem Leuchtkörper (L), der aus einem Kreisring von 5 cm Durchmesser besteht, und von den reflektierenden Flächen des Schirmes (S) erhalten die Blätter ein in gewissem Maße diffuses Licht, sie werden nicht nur senkrecht, sondern auch schief beleuchtet und es treten in der Assimilationskammer keine Schatten auf. Die nachfolgenden Versuche werden bestätigen, daß das Licht bei 1) Die Einheit der Beleuchtungsstärke, das Lux, ist die Beleuchtung einer Fläche unter rechten Winkeln durch i Hefnerkerze in i m Entfernung. Die Methode der Untersuchung. 69 25 cm Abstand des Leiichtkörpers in allen Bestimmungen der Assimi- lationszahlen, außer bei den gelben Blättern, im Überschuß angewandt wurde; eine Annäherung der Lichtquelle war nicht imstande, die Assi- milation zu steigern. Die Beträge des assimilierten Kohlendioxyds ent- sprechen, wie die folgende Tabelle 8 zeigt, denjenigen, die in der Lite- ratur^) bei Versuchen unter ähnlichen Verhältnissen mit Sonnenlicht verzeichnet worden sind. Tabelle 8. Assimilation bei natürlicher und künstlicher Beleuchtung. Autoren Pflaiizcnart Jahreszeit Belichtung Temperatur CO2 (Vol.- Proz.) .'\ssiniilation in I Stunde (g CO2) für für 10 g 50 qcm Blatt Blatt- fläche Blackman u. Helianthus August Helle Mittags- 3obis3i ° 5.8 0,188 0,021 Matthaei tuberosus sonne mit Cumulus- wolken Blackman u. Helianthus August Helle Sonne 29,2° 6.3 0,273 0,028 Matthaei tuberosus W. u. St. Helianthus annuus Anfang JuU 3000 Kerzen in 25 cm Abstand 25,0° 5.0 0,230 0,039 W. u. St. HeUanthus annuus Ende JuU 3000 Kerzen in 25 cm Abstand 25,0° 5.0 0,228 0,036 Blackman u. Prunus Lauro- August Intensives ^9.5° 5.8 0,097 0,015 Matthaei cerasus Sonnenlicht Blackman u. Prunus Lauro- August Sehr helle Sonne 29,6° 6,0 0,089 0,014 IVIatthaei cerasus W. u. St. Prunus Lauro- cerasus Januar 3000 Kerzen in \ 20 cm Abstand 30,5° 5.0 0,099 W. u. St. Prunus Lauro- cerasus Januar 3000 Kerzen in 20 cm Abstand 30,5° 5.0 0,093 Zuführung von Kohlen dioxyd. Der Forderung, den Blättern auch das Kohlendioxyd im Überschuß zuzuführen, genügt gemäß den Vorversuchen die Anwendung eines Luftstromes mit 5 Vol.-Proz. CO2, der die Assimilationskammer in der Regel noch mit einem Gehalt von 3V2 Prozent verläßt. Durch Erhöhung des Kohlensäuredrucks wird in den untersuchten Fällen die Leistung nicht gesteigert, andererseits verträgt das Blatt die angewandte Konzentration ohne Schaden. 1) F. F. Blackman und G. L. C. Matthaei, Proc. Roy. Soc. Ser. B 76, 402, z. B. S. 428, 437, 439, 442 [1905]- 70 R. Willstätter und A. StoII. Das Gasgemisch füllen wir in eiserne Flaschen ^Z)), indem wir durch einen Kompressor oder mit Hilfe einer Vorratsflasche z. B. in eine Bombe von 10 1 zuerst unter 5 Atmosphären Druck Kohlendioxyd, dann unter 100 Atmosphären Luft einpressen. Die Druckflasche wird vor der Ver- wendung unter zeit weisem Umdrehen einen Tag lang stehen gelassen. Zur Analyse leitet man das Gas aus der Flasche durch den Trocknungs- und den Natronkalkapparat in die Gasuhr und bestimmt das zu einem Liter Luft gehörende CO2 . Regulierung des Gasstromes. Während der Assimilations- versuche soll der Gasstrom wegen des schädlichen Raumes, hauptsächlich in der Assimilationskammer, konstant sein. Das Kohlendioxyd wird in einem Intervall für ein bestimmtes Luftvolumen ermittelt, und bei un- regelmäßigem Strom würde sich ein veränderlicher Gehalt desselben im schädlichen Raum einstellen ; man fände dann bei konstanter Assimilation schwankende Beträge von CO2 auf das Liter austretende Luft. Die Gleichmäßigkeit des Gasstromes wird mit einem Strömungs- manometer (Af) beobachtet, das wir durch die Freundlichkeit des Herrn F. Haber dem Kaiser Wilhelm-Institut für physikalische Chemie ver- danken. Es ist zwischen Blasenzähler [Z] und Befeuchter (Bf) einge- schaltet. Das Gas findet in einer langen gewundenen Capillare einen mit der Strömungsgeschwindigkeit steigenden Reibungswiderstand. Der für eine bestimmte Geschwindigkeit erforderliche Druck wird als Diffe- renz zweier mit dem Anfang und dem Ende der Capillare kommuni- zierender Quecksilbersäulen abgelesen. Diesen Apparat haben wir auf eine Quecksilberhöhe von 40 mm bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 1 in der Stunde geeicht. Befeuchtung. Um das Eintrocknen der Blätter zu verhüten, ist es, obwohl ihre Stiele in Wasser eintauchen, nicht ausreichend, den Gasstrom bei gewöhnlicher Temperatur mit \"\^asserdampf zu sättigen. Die meisten Blätter blieben aber auch bei langer Versuchsdauer und starker Transpiration in frischem Zustand, da wir den Luftstrom einen Befeuchtungsapparat (ß/) von etwas höherer Temperatur passieren ließen. Er befindet sich zwischen dem Strömun^smanometer und der Die -Methode der Untersuchung. 71 Assimilationskammer. Das Gas nimmt seinen Weg durch eine mit Glas- wolle und Wasser gefüllte Wetzeische Absorptionsflasche, die in einem Thermostaten 5 ° über die Versuchstemperatur erwärmt wird. Die Ver- bindungsröhre von hier zum Assimilationsraum liegt auf einer schwach geheizten Asbestplatte. Den Thermostaten wenden wir an, um den Be- trag der im Wasser des Befeuchters gelösten Kohlensäure konstant zu halten; wegen der Nähe der heißen Lampe läßt man zur Einstellung des Thermostaten in ihm durch eine Bleischlange (B2) Kühlwasser fließen. Trocknungs- und Absorptionsvorrichtungen. Die analytischen Apparate sind zum Schutz vor Bestrahlung von der Lampe durch einen Schirm (Seh) getrennt . Beim Austritt aus der Assimilationskammer wird der Gasstrom in die Trockenröhre und dann in den Natronkalkapparat geführt. Der Trockenapparat (T) besteht aus einem kleinen Reservoir für Kondens- wasser und einer Röhre mit vier senkrecht stehenden und vier wagrecht liegenden Kugeln. Ein kleines Manometer an dem Kondenstöpfchen zeigt an, daß in den analytischen Apparaten keine Verstopfung droht. Von den Kugeln im aufsteigenden Teil sind die zwei unteren mit grobem, die oberen mit feinkörnigem Chlorcalcium beschickt, die horizontal angebrachten Ku- geln mit Phosphorpentoxyd. Diese Füllung bleibt monatelang brauchbar. Das Kohlendioxyd wird sehr gut mit Natronkalk absorbiert in U- Röhren ([/), die wir paarweise parallel stellen und verbinden. Die an das Trocknungsrohr anstoßende U-Röhre ist ganz mit feinkörnigem Natron- kalk gefüllt, die zweite U-Röhre auch zur Hälfte mit Natronkalk, und zwar mit frisch ausgeglühtem. Darauf folgt in dieser Röhre ein Stopfen Glaswolle und über der leeren Hälfte des Schenkels wieder ein Bausch Glaswolle und darüber Phosphorpentoxyd ; dadurch wird ', vermie- den, daß entstehende Phosphorsäure zum Natronkalk gelangt. Das dop- pelte U-Rohr, dessen Gewicht etwa 150 g ist, wird auf + 0,1 mg genau gewogen. Bei länger dauernden Versuchen schalten wir den Einfluß der Luftfeuchtigkeit aus durch Wägung eines Kontrollapparates. Die Gasuhr. Der von Kohlendioxyd befreite Luftstrom passiert auf dem Wege zur Gasuhr ein offenes Manometer (Mo), das zur Kontrolle des Dichtseins der ganzen Apparatur dient. Die Prüfung nehmen wir vor, 72 R. Willstätter und A. StoII. indem das Einleitungsrohr der Gasuhr geschlossen und so viel Gas aus der Druckflasche entnommen wird, daß im Steigrohr des Manometers die einge- füllte Kochsalzlösung 50 cm hoch ansteigt ; die Säule muß nach dem Schließen des Reduktionsventils an der Stahlflasche unverändertes Niveau behalten. Die exakte Bestimmung des durchgeleiteten Luftvolumens hängt von aufmerksamer Arbeit mit der Gasuhr ab. Zum Schutz vor plötzlichen Temperaturänderungen ist sie in ein Asbestgehäuse eingeschlossen. Wir vermeiden den Zutritt kohlensäurehaltiger Luft in die Uhr; bei Versuchs- beginn, wenn ein Gasstrom von 60 Litern Stundengeschwindigkeit etwa 5 bis 7 Minuten lang die ganze Apparatur durchspült, absorbieren wir das Kohlendioxyd in Waschflaschen, die mit konzentrierter Kahlauge be- schickt sind. Am Ende von jedem Meßintervall wird vor dem Abnehmen der Natronkalkröhren der Einlaßhahn der Gasuhr geschlossen, um in ihr den kleinen Überdruck zu erhalten, der zur Überwindung der Reibung des Werkes erforderlich ist. W^enn das Zählwerk nicht von genau sym- metrischer Konstruktion ist, so benützt man zweckmäßig nur ganze Um- drehungen. Die in den Versuchen der vorliegenden Abhandlung angewandte Gasuhr gestattete die Ablesung von 10 ccm und die Schätzung von i ccm. Die Temperatur der Gasuhr und der Barometerstand werden bei den Berechnungen berücksichtigt. Durch die Entbindung des äquivalenten Sauerstoffvolumens aus dem assimilierten Kohlendioxyd erfährt die austretende Luft Volumvermeh- rung, für welche ein Abzug gemacht werden muß; diese Korrektur ist bei den mitgeteilten Werten angebracht worden. B. Das Pflanzenmaterial. Die Blätter sind in allen Fällen in gleichmäßigem, frischem Zustand, möglichst unverändert nach der Abtrennung von der Pflanze, für die Assimilationsversuche angewandt worden; die Einwirkung künstlich ge- schaffener Bedingungen nach dem Pflücken haben wir vermieden. Die bis zum Beginn der Messung erforderliche Zeit der vorbereitenden Perio- den für die Sättigung mit Kohlendioxyd und für die Atmung betrug nur eine bis anderthalb Stunden. Die Methode der Untersuchung 75 G.L. C.Matt haei^) hat die Erfahrung mitgeteilt, daß die Blätter in der ersten Zeit nach dem Pflücken unregelmäßige Atmung besitzen und auch mitunter Unregelmäßigkeiten der Assimilationstätigkeit zeigen. Um sol- che Zufälligkeiten zu vermeiden, hält Matthaei ein mindestens 24stün- diges Aufbewahren der Blätter unter geeigneten Bedingungen für ratsam zur Vorbereitung für den Assimilationsversuch. Zum Unterschied von diesem Standpunkt ist es die Absicht unserer Versuche, diejenigen Eigen- tümlichkeiten zu bestimmen, welche das Blatt zur Zeit der Abtrennung von der Pflanze besitzt. Eine ausgleichende Vorbehandlung würde die Besonderheiten des Verhaltens zu verwischen und die Einflüsse innerer Faktoren auf die Assimilation abzuschwächen drohen. In der Tat sind wir gerade dadurch, daß die Blätter möghchst frisch zur Untersuchung gelangten, keinen anderen Störungen begegnet als solchen, die zu den physiologischen Eigentümlichkeiten der untersuchten Pflanzen gehörten, zum Beispiel zu den herbstlichen Veränderungen. Und wir finden, wie einige Beispiele in der folgenden Tabelle 9 zeigen, an verschiedenen Tagen mit Blättern derselben Pflanze in frischem Zustand und unter gleichen Bedingungen, mit gleichem Trockengewicht und gleicher Fläche, über- einstimmende Beträge der Assimilation. Tabelle 9. Assimilation gleichartiger Blätter unter gleichen Bedingungen. Pflanzenart Zeit Assimiliert für 10 g Blatt es CO2 (g) in I Stunde bei 25» für I g Trocken- 1 ,. , Substanz 1 f- ^ q'^- Hehanthus annuus 2. Juh 3- .. 31- .- 0,230 0,230 0,228 0.134 0,129 0,137 0,079 0,075 0,072 Sanibucus nigra 13- Juli 14- .- 0,146 0,145 0,053 0,056 0,033 0,032 Sambucus nigra var. aurea 9. Juli 10. ,, 0,096 0,097 0,050 0,051 0,020 o,o2r Hingegen machten sich Störungen, die nicht von den natürlichen Ver- hältnissen des Objektes, sondern von den ihm aufgezwungenen Bedin- gungen verursacht waren, gerade dann bemerkbar, wenn wir gewisse G. L. C. Matthaei, Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B 197, 47, 61 [1904]. 74 R- ^^illstätter und A. Stoll. Blätter, sei es nur einen halben Tag, vorsichtig aufbewahrten. In folgen- dem Beispiel (Tabelle lo) zeigten Blätter von Quercus Robur schon nach 6 Stunden eine Schädigung der Assimilation, die vielleicht auf teilweiser Schließung der Spaltöffnungen beruhte. Tabelle lo. 8,0g Blätter von Quercus Robur. Vorbehandlung Fläche der Blätter m qcm Trockengewicht ! Assimiliertes CO2 (g) bei 25» der Blätter in der i. Stunde ' in der 2. Stunde Blätter, sogleich verwendet . 383 3,60 0,157 \ 0,131 Blätter, 6 Stunden nach dem Sammeln verwendet . . . 435 3,10 0,063 ' 0.070 Für vergleichende Versuche, auch wenn sie zeitlich weit auseinander liegen, wählen wir von demselben Zweige eines Baumes (Ulme, Ahorn), Strauches (Holunder) oder Krautes (Kürbis, Sonnenblume) gegenständige Blätter aus oder in vielen Fällen die entsprechenden Blätter benachbarter Zweige einer Pflanze. Die Blätter werden morgens gepflückt, in ein feuchtes Tuch gelegt und mit Papier umhüllt. Nachdem die ersten Vorbereitungen für den Versuch getroffen sind, werden die Blätter gut vermengt und in drei Quanten geteilt. Für den Versuch, zweitens für Flächen- und Trocken- gewichtsbestimmung, drittens für die Bestimmung des Chlorophyllgehal- tes. Für den Versuch schneiden wir die Stiele unter frischem Leitungs- wasser mit einem scharfen Messer etwa 3 bis 5 mm von der Blattbasis ent- fernt und parallel der Blattspreite ab und breiten die Blätter durch Ein- stecken in das Silberdrahtnetz der Assimilationskammer zu einer mög- lichst lückenlosen Fläche aus. Die Bestimmung des Trockengewichts geschieht, unter Vermeidung der bei langsamem Trocknen eintretenden Gewichtsminderung durch Verat- mung, in einem mit Schwefelsäure und Alkali beschickten Exsic'cator, der mit der Hochvakuumpumpe evakuiert und mit elektrischen Glühbirnen geheizt wird. Die Blattflächen bestimmen wir nach der Angabe von W. Plester^), und zwar mittels kartonstarken Celloidinpapieres, auf das ^) W. Plester, Beitr. z. Biol. d. Pflanzen 11, 249, 233 [1912]. Die Methode der Untersuchung. 75 wir die Blätter, mit Glasstreifen beschwert, zum Kopieren ausbreiten. Die Flächen werden nach dem Gewichte der ausgeschnittenen Kopien berechnet. Zu jedem Assimilations versuch gehört die quantitative Bestimmung des Chlorophyllgehaltes der Blätter nach der in unseren ,, Untersuchungen über Chlorophyll"^) angegebenen und in der ersten Abhandlung dieser Reihe ausgearbeiteten Methode. Sie beruht auf colorimetrischem Ver- gleich mit isohertem Chlorophyll, dem natürlichen Gemisch der beiden Komponenten a und h. In manchen pflanzenphysiologischen Untersuchungen fmdet man, daß zur relativen Bestimmung der Chlorophyllgehalte verschiedener Blätter in Ermangelung einer brauchbaren Methode die Extrakte ohne weiteres mit- einander colorimetrisch verghchen werden-). Die Bestimmung wird aber dadurch gestört, daß manche Blätter mehr, andere weniger Carotinoide enthalten. Namentlich bei chlorophyllarmen Blättern wird die Genauig- keit der Analyse sehr beeinträchtigt, wenn man das ganze Gemisch der grünen und gelben Farbstoffe für die colorimetrische Bestimmung an- wendet. Diese läßt sich nur so mit hinreichender Genauigkeit ausführen, daß man mit dem Gemisch der Chlorophyllkomporienten a und h in ihrem natürlichen Verhältnis den Extrakt der Blätter vergleicht, nachdem durch Behandeln mit Alkali das Chlorophyll gebunden ist und die Carotinoide durch Ausäthern entfernt sind. Die frischen Blätter werden mit Quarzsand zerrieben und mit Aceton extrahiert. Den Gesamtfarbstoff führt man in Äther über und trennt das Chlorophyll durch Verseifung und Kaliumsalzbildung mit methyl- alkohohscher Lauge von den gelben Begleitern ab. Um bei allen Beispielen sowohl für Trockengewicht, Chlorophyllgehalt wie für die assimilatorischen Leistungen vergleichbare Werte angeben zu können, sind die gefundenen Zahlen fast durchwegs auf lo g frische Blätter umgerechnet worden, und zwar, wo es geschehen ist, unter gleich- zeitiger Angabe der für den Versuch wirklich angewandten Blattmenge. 1) S. 80 (Berlin 1913). *) In der im folgenden zu besprechenden Arbeit von W. Plester werden die gesamten Extrakte von Blättern grüner Stammformen und gelber Varietäten colorimetrisch verglichen. 76 R- Willstätter und A. Stoll. C. Zur Ausführung der Versuche. Nachdem die Assimilationsdose mit den Blättern beschickt ist, wird sie in das Bad eingesetzt und die Temperatur derselben auf 25°, die des Befeuchters auf 30° gebracht. Der Versuch beginnt mit dem Durchspülen des Apparates mit Ausnahme des Strömungsmanometers und der Trock- nungsröhre durch einen kräftigen Strom der 5proz. Kohlensäure. Nach 5 ^linuten wird der Gasstrom auf die endgültige Stundengeschwin- digkeit von 3 Litern eingestellt und auf der einen Seite der Assimilations- kammer das Strömungsmanometer, auf der anderen der Trockenapparat angeschlossen. Zugleich werden die Blätter vor Licht geschützt und 10 bis 20 Minuten lang in dem Gasstrom gehalten, ehe die Vorperiode der At- mung beginnt. Nach dieser Zeit beginnt die Messung derselben, indem der Einlaßhahn der Gasuhr, wenn der Zeigerden Nullstrich erreicht, geschlos- sen und ein Natronkalkapparat angeschaltet wird. Zuerst vergewissern wir uns, daß der Apparat dicht ist, mit Hufe eines Überdrucks aus der Druck- flasche, entspannen dann langsam den Druck durch Öffnen des Einlaß- hahnes an der Gasuhr und führen den Gasstrom in der richtigen, mit dem Strömungsmanometer eingestehten Geschwindigkeit durch den Apparat. Für die Berücksichtigung der Atmungskohlensäure oder vielmehr für die Bestimmung der auf ein Liter austretender Luft treffenden Kohlen- säure des Gasstromes, vermehrt um den Betrag der Atmung, genügt die Beobachtung eines Intervahs von 20 Minuten. Die Atmungswerte sind verhältnismäßig geringfügig und auch konstant genug, so daß die eine Messung ausreicht, zumal es wichtiger ist, die Blätter so frühzeitig als möglich assimilieren zu lassen. Während der Atmungsperiode wird das Niveaugefäß des Kühlwassers (A^ in Fig. 2) mit Wasser von konstanter Temperatur beschickt und die Kühlleitung eingerichtet. Kurz vor Ablauf der 20 Minuten wird das Strahlenfilter (F) über dem Bade (W) angebracht, die Temperatur des Bades auf 23 ° erniedrigt, die Heizplatte abgestellt und im richtigen Augen- blick bei geschlossenem Einlaßhahn der Gasuhr der Natronkalkapparat gewechselt und die 3000-Kerzen-Lampe im erforderlichen Abstände ein- Die Methode der Untersuchung. 77 geschaltet. In der ersten Zeit verlangt die Temperaturregulierung volle Aufmerksamkeit. Die Natronkalkapparate werden in 20-Minuten-Inter- vallen gewechselt. Diese Ausführung des Versuches bringt es mit sich, daß von den Be- stimmungen für die einzelnen Intervalle die erste bedeutungslos ist; sie ergibt nur einen scheinbaren Wert für die Assimilation, nämlich einen viel zu tiefen. Das rührt vom schädlichen Raum der Assimilationskammer und des Trockenapparates her, der im ganzen etwa ein halbes Liter beträgt. Er ist natürhch bei Versuchsbeginn mit dem angewandten Luft- Kohlensäure-Gemisch + Atmungskohlensäure gefüllt und erst im Laufe des Assimilationsintervalles oder in Fällen sehr intensiver Assimilation sogar erst während des zweiten Intervalles ist das kohlendioxydreichere Gas vollständig verdrängt, und es hat sich in jedem Raumteil des Appa- rates die durch den Kohlensäureverbrauch der Blätter bedingte Kohlen- säurekonzentration eingestellt . Die Messung des ersten Intervalles ist daher nur zur Ermittlung des Gesamtbetrages des assimilierten Kohlendioxyds zu berücksichtigen. D, Der Gang der Assimilation, Im folgenden soll an beliebigen Beispielen aus dem in den nächsten Abschnitten behandelten Versuchsmaterial der Gang der Messungen und die Ableitung der Ergebnisse dargelegt werden, so daß es weiterhin genügen wird, das Resultat eines Versuches mit einer einzigen Zahl zu verzeichnen, welche die assimilatorische Leistung ausdrückt. In der Regel ist das Resultat das arithmetische Mittel des zweiten bis vierten, bei Versuchen mit besonders hoher Leistung das Mittel des drit- ten und vierten Intervalles. Da es sich in dieser Arbeit darum handelt, die größten Leistungen zu registrieren, die das Blatt bei der gewählten Temperatur zu vollführen imstande ist, und die Leistung für weitere Schlußfolgerungen auf den Chlorophyllgehalt zu beziehen, so wählen wir für die Berechnung der As- similationszahlen in Fällen rasch nachlassender Assimilation die höchsten 78 R. Willstätter und A. Stoll. beobachteten Werte, die dann infolge der Störung durch die schädhchen Räume immerhin noch zu tief gefunden sein dürften. Erstes Beispiel (Tabelle ii): Helianthus annuus. Blätter : Von Anfang Juli, Frischgewicht g,o g, Fläche 302 qcm, Trocken- gewicht 1,75 g, Chloroph3dl 13,5 mg, Xanthophyll 1,1 mg, Carotin 0,6 mg. Versuchsbedingungen : 25 °, 3000 Kerzen in 25 cm Abstand, 5 vol.- proz. COo, Gasstrom 4,5 1 in der Stunde. Zusammensetzung des Gasstromes im Dunkelversuch: 0,1037g CO., im Gemisch mit i 1 feuchter Luft (23 °, 756 mm). Tabelle 11. Temperatur Intervall in Minuten Austretende Luft (in 1) CO2 (g) im Ge- misch mit I 1 austretender Luft Assimiliertes COg (g) für das Intervall für I Stunde 25,0° 21 1,60 0.0755 0,0451 0,126 25,0° 19 1..40 0,0569 0,0655 0,207 25.0° 20 1,50 0,0544 0,0739 0,222 25.0° 20 ^.55 0,0542 0,0767 0,230 25.5° 22 I 65 0,0561 0,0784 0,213 26,0° 18 ^'35 0,0559 0,0645 0,215 25^5° 20 1,40 0,0517 0,0728 0,218 25.0° i 21 i'55 0,0561 0,0738 0,211 Zweites Beispiel (Tabelle 12): Sambucus nigra. Blätter: Von Mitte Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 359 qcm, Trocken- gewicht 2,05 g, Chlorophyllgehalt 18,8 mg. Versuchsbedingungen : 25 °, 3000 Kerzen in 25 und in 35 cm Abstand 4,5 vol.-proz. CO2 Gasstrom 3 1 in der Stunde. Zusammensetzung des Gasstromes im Dunkelversuch : 0,0874 g CO^ im Gemisch mit il feuchter Luft (24°, 761mm). Tabelle 12. Temperatur Beleuchtung (Lux) Intervall in Minuten Austretende Luft (inl) CO2 (g) im Ge- misch mit I 1 austretender Luft Assimiliert für das Intervall s CO2 (g) für I Stunde 25,0° 48 000 20 1,00 0,0698 0,0176 0,053 25,0° 48 000 20 1,00 0,0502 0,0372 0,112 25,0° 48 000 20 1,00 0,0486 0,0388 0,116 25,0° 24 000 20 1,00 0,0501 0,0373 0,112 25,0° 24 000 20 1,00 0,0500 0,0374 0,112 25,0° 24 000 21 1,05 0,0516 0,0375 0,108 25,0° 12 000 19 0,95 0,0534 0,0319 0,102 Die Methode der Untersuchung. Drittes Beispiel (Tabelle 13): Acer Pseudoplatanus. 79 Alte Blätter: Von Ende Juni, Frischgewicht 6,0 g, Fläche 469 qcm, Trockengewicht 2,15 g, Chlorophyll 24,0 mg, Xanthophyll 1,3 mg, Caro- tin 0,7 mg. Versuchsbedingungen: 25°, 3000 Kerzen in 25 cm Abstand, 5 vol.- proz. CO2, Gasstrom 3 1 in der Stunde. Zusammensetzung des Gasstromes im Dunkelversuch: 0,1046g CO, im Gemisch mit i 1 feuchter Luft (20,5 °, 762 mm). Tabelle 13- Temperatur Intenall in Minuten Austretende Luft (in 1) CO2 mit (g) im Gemisch I 1 austretender Luft .Assimiliertes COg (g) für das Intervall für i Stunde 2.5.0° 20 1,00 0,0863 0,0183 0,055 25.0° 20 1,00 0,0661 0.0385 0,116 25.0° ! 20 I.OO 0,0631 0,0415 0,124 25,0 = 21 1,05 0,0654 0,0412 0,118 25,0 = ^9 0,95 0,0716 0,0310 0,098 25.0° 20 x,05 0,0784 0,0273 0,082 25.0' 20 0,95 0,0769 0,0260 0,078 0,0825 0,06 = Viertes Beispiel (Tabelle 14): Acer Pseudoplatanus. Junge Blätter: Von Ende Juni, Frischgewicht 6,0 g, Fläche 358 qcm Trockengewicht 2,00 g, Chlorophyll 5,0 mg, Xanthophyll 0,6 mg, Caro- tin 0,3 mg. Versuchsbedingungen: 25°, 3000 Kerzen in 25 cm Abstand, 5 vol.- proz. CO2, Gasstrom 3 1 in der Stunde. Tabelle 14. Temperatur Intervall in Minuten Austretende Luft (inl) CO2 (g) im Gemisch mit I 1 austretender Luft Assimiliert für das Intervall es CO3 (g) für I Stunde 25,0 = 20 0,95 0,0988 0,0048 0,014 25.5° 20 1,00 0,0841 0,0198 0,059 25.0° 21 J,05 0,0853 0,0195 0,056 25,0° 20 1,00 0,0843 0,0196 0,059 25,0 = 19 0,95 0,0842 0,0186 0,059 25,0° ' 21 1,00 0,0854 0,0183 0,052 1) 25,0° 1 ^^ 0,90 0,0831 0,0185 0,058 25,0° 1 20 1,00 0,0833 0,0204 0,061 ^) Dieser Wert wurde infolge Verstopfung des Gasweges zu tief gefunden. 8o K. Willstätter und A. Stoll. Zusammensetzung des Gasstromes im Dunkelversuch: 0,1039g CO2 im Gemisch mit il feuchter Luft (21,5°, 758 mm). Den Beispielen kommt noch eine über die Technik des Versuchs hinausgehende Bedeutung zu, indem sie die mehr oder minder große Konstanz der Assimilationsleistung erkennen lassen, die bei Licht- überschuß und Kohlensäureüberschuß und bei günstiger Temperatur er- zielt wird. Das dritte und vierte Beispiel sind direkt vergleichbar, da hier gleich- zeitig zwei Blattproben von demselben Baum untersucht sind: junge (Beispiel 4) und alte Blätter (Beispiel 3). Die Leistung der ersteren ist stundenlang konstant, die Leistung der alten Blätter fällt schon in der zweiten Stunde. Dasselbe Bild gleichbleibender Assimilation in gewissen Fällen, inkonstanter in anderen, zeigt sich auch an vielen weiteren Bei- spielen, von denen noch einige in der folgenden Tabelle (15) zusammen- gestellt werden. Man erkennt an ihnen, welche Umstände für die Kon- stanz entscheidend sind. Blätter, die reich an wässerigem Zelhnhalt sind, arm an Trocken- substanz (Beispiel i und 2 der Tabelle), wie Kräuter und junge Baumblätter, assimilieren mit großer Konstanz. Dasselbe ist der Fall bei chlorophyll- armen Blättern der gelbblättrigen Varietäten von Ahorn, Ulme und Taxus (Nr. 3, 5 und 7). Das Gegenteil trifft zu bei trockenen (Beispiel II und 12), chlorophyllreichen Blättern und bei solchen, die sehr hohe Assimilationsbeträge liefern (Nr. 4 und 6). Man kann aus diesen Beobachtungen mehrere interessante Folge- rungen ziehen : Der Rückgang der Assimilation ist nicht durch eine Schädigung des Chlorophylls infolge der starken Behchtung oder der hohen Temperatur bedingt. Das Chlorophyll übt keinen Schutz aus; gerade die chlorophyllarmen Blätter erweisen sich ja als die ausdauerndsten. Das Sinken der assimilatorischen Leistung erklärt sich durch die An- häufung der Assimilate in hoher Konzentration. Bei der intensiven Assi- milation in wasserarmen Blättern kommt es wahrscheinlich zu Störungen, Die Methode der Untersuchung. 8l Tabelle 15. Gang der assimilatorischen Leistung verschiedener Blätter unter Bedingungen von maximalem Licht und Kohlendioxyd. Versuche mit 10 s; frischen Blättern. „ , ., Trocken- Beschreibung ^^^^^^ j^^ der Blatter . irocKen- (gewicht T^fP^- I (in g) I "*"^ Assimiliertes CO» (g) während der . Stunde 2. Stunde 3. Stunde^. Stiinde Pelargonium peltatum zonale junge Blätter 1| Ende 0,6 fFebruar 1,0 Acer Negundo, gelbe Varietät Acer Negundo, grüne Stammform alte Blätter Mitte Juni 1,9 30 30J 30 < 30' 0,118 0,119 0,118 0,092 I 0,093 0,093 0,150 I 0,154 0,154 0,144 0,260 1 o, li Ulmus, gelbe Varietät ,, grüne Stammform alte Blätter [17. Juli 21. ,, 2,3 3.0 0,099 0,135 0,096 0,116 Taxus baccata, gelbe Varietät Taxus baccata, grüne Stammform Taxus baccata, grüne Stammform junge Zweige 26. Juni 2,5 I 27. alte, vorjährige 28. Zweige Lauras nobilis Prunus Laurocerasus junge Blätter 1 30. Juni alte, vorjährige j i. Juli Blätter 1 alte Blätter I Mitte Februar 2,8 3,5 3,1 5.0 2.9 30 0,020 0,019 0,066 0,062 0,051 0,047 0,040 0,019 [ 0,019 0,056; — 0,075 0,072 0,071 0,078 0,070 I 0,065 0,080 j 0,067 ; 0,050 indem die Assimilate nicht rasch genug in löslicher Form abtransportiert oder in unlösHcher Form abgeschieden werden. Daß dieses allmähhche Nachlassen der Assimilation nicht beobachtet wird bei den chlorophyllarmen Blättern, zeigt, daß unter den angewand- ten Bedingungen der Belichtung nicht von einer Ermüdung der Chloro- plasten gesprochen werden kann. Die Erscheinung sinkender Assimila- tion, die E. Pantanelli^) bei seinen Versuchen mit der Gasblasen- methode an Wasserpflanzen beschreibt und als Ermüdung der Chloro- plasten betrachtet, ist von ihm unter Bedingungen sehr intensiver Be- lichtung beobachtet worden. Bei höheren Temperaturen (über 30°) können auch noch andere Um- 1) E. Pantanelli, Jahrb. f. wissensch. Botanik 39, 165 [1903]; vgl. dazu die Kritik von F. F. Blackman und A. M. Smith, Proc. Roy. Soc. Ser. B 83, 389 [1911]- Willstätter-Stoll, Assimilation. ') X^ "'^ , 82 R. VVillstätter und A. Stoll. stände verzögernd auf den Assimilationsvorgang einwirken, wie Störun- gen im Protoplasma durch gesteigerte Atmung, Stoffwechselanomalien und Veränderungen osmotischer Art. IV. Assimilationsleistungen normaler Blätter verschiedener Pflanzenarten. Eine Anzahl verschiedener Pflanzenarten wurde hinsichtlich der assi- milatorischen Energie normaler Blätter verglichen. Die angewandten Blätter waren nur unter Vermeidung besonderer Verhältnisse ausgewählt, also unter Ausschluß von chlorophyllarmen, von jungen und alten Blät- tern. Tabelle i6. Normale Assimilationszahlen a) bei 25°. 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Für den Versuch ange- Von 10 g frischen Blättern Assimiliertes COj (g) in der Stunde von Assimi- Nr. Pflanzenart Datum wandtes Gewicht Trocken- Fläche Chloro- 10 g Ig i I qdm lations- zahl. der substanz (qdm) phyll frischen Trocken- Blatt- Blätter (g) (mg) [Blättern substanz fläche I Aesculus Hippocastanum 3. VI. 8.0 2,94 482 24.7 0,159 0,054 0.033 6.4 2 Acer Negundo 4. VI. 5.0 2,22 646 24.8 0,192 0,086 0,040 7.7 3 Ampelopsis quinquefolia 8. VI. 5.0 2,00 638 28,8 0,178 0,089 0,028 6,2 4 Acer Pseudoplatanus 24. VI. 6,0 3.58 782 40,0 0,207 0,058 0,027 5.2 5 Tiiia cordata 25. VI. 8,0 3.19 663 28,1 0,188 0,058 0,028 6.6 6 Laurus nobilis^) I. VII. 10,0 3.10 388 12,7 0,075 0,024 0,019 5-9 7 Sambucus nigra 13. VII. 8,0 2.75 429 22,2 0,146 0,056 0,034 6,6 8 Ulmus 20. VII. 8,0 2,94 526 16.2 0,1 II 0,038 0,022 6.9 9 Rubus 25. IX. 5.0 3,60 712 32,4 0,188 0,052 0.026 5.8 Aus den Tabellen 16 und 17 ergeben sich für viele gewöhnliche Laub- blätter ähnliche Assimilationszahlen. Dieselben liegen für die Assimila- tion bei 25 ° zwischen 5,2 und "] ,"] und ihr Mittelwert beträgt 6,4. Für die Assimilation bei 30° bewegen sich die Zahlen zwischen 6,5 und q,i und das Mittel ist 8,0. Die gewählten Beispiele weisen in der Beschaffenheit der Blätter, namentlich im Chlorophyllgehalt, bedeutende Unterschiede auf, denen eine annähernde Übereinstimmung in der Assimilationszahl gegenüber steht. Diesjährige Blätter, aber nicht von der Spitze der jungen Sprosse. Assimilationsleistungen normaler Blätter verschiedener Pflanzenarten, Tabelle 17. Normale Assimilationszahlen^) b) bei 30°. 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. 83 Angewandtes Gewicht Von lo g frischen Assimiliertes CO^ (g) BIät ern in der Stunde von Assimi- Nr. Pflanzenart Datum der Blätter Trocken- Chloro- 10 g [ Ig lations- substanz phyll frischen ' Trocken- zahl (g) (g) (mg) Blättem j substanz I Prunus Laurocerasus Febr. 10 3,40 12,2 0,098 0,029 8,1 2 Primula 10 0,90 II.4 0,105 0,117 9.1 3 Hydrangea opulodes C. Koch : 10 1,21 9.2 0,060 0,050 6.5 4 Pelargonium zonale 10 0,96 12,5 0,093 0,097 7.4 5 Hostia plantaginea Aschers. 10 1,00 10,0 0,088 0,088 8,8 In diesen Fällen scheint die Assimilationsenergie der Blätter einfach durch ihren Chlorophyllgehalt bedingt zu sein. Die Frage, ob die assi- milatorische Leistung verschiedener Pflanzen dem Chlorophyllgehalt ihrer Blätter proportional sei, ist in' der Pflanzenphysiologie schon vor Jahr- zehnten erörtert worden, noch ehe es möglich war, sie auf Grund quan- titativer Bestimmungen des Pigmentes zu behandeln. Im Institut von Sachs hat C. Weber 2) für mehrere Pflanzen nach einer Methode, die Sachs später mit der Blatthälftenmethode übertrof- fen zu haben glaubte, die Mengen der von gleichen Blattflächen und in gleichen Zeiten gebildeten Trockensubstanz ermittelt, um die Assimila- tionsenergien zu vergleichen. Er fand, daß die verschiedenen Pflanzen- arten spezifische Assimilationsleistungen vollbringen, also ,,daß die Assi- milationsenergie unter übrigens gleichen Bedingungen nicht die nämliche, sondern eine jeder Spezies eigenartige sein wird". Assimilationsenergie nach C. Weber (Leistung von i qm in 10 Stunden). Tropaeolum majus 4,466 g Phaseolus multiflorus 3,215 g Ricinus communis 5,292 g Helianthus annuus 5,569 g Die Erklärung für diese Beobachtungen hat wenige Jahre später ^) Versuche mit Warmhauspflanzen. 2) C. Weber, Arb. d. botan. Inst, in Würzburg 2, 346 [1879] und Inauguraldissertation .Über spezifische Assimilationsenergie", Würzburg 1879. 6* 84 I<- Willstätter und A. Stoll. G. Haberlandt^j gegeben in seiner Untersuchung über die ,, Verglei- chende Anatomie des assimilatorischen Gewebesystems der Pflanzen". Nachdem Haberlandt die Frage aufgeworfen, worauf diese spezifische Assimilationsenergie beruhe, ,,ist es der Unterschied im anatomischen Bau der assimilierenden Laubblätter, oder ist es Verschiedenheit im Chlorophyllgehalte, oder ist es die spezifische Konstitution des assimilie- renden Plasmas, welche die Ungleichheit der Assimilationsenergien zur Folge hat ?" hielt er es für das Nächstliegende, ,,in dem ungleich großen Chlorophyllgehalte die Ursache für die in Rede stehende Erscheinung auf- zusuchen". In diesem Sinne wurde die Menge der Chlorophyllkörner in den Blattspreiten' der von Weber benützten vier Spezies durch Zählung be- stimmt und pro Quadratmillimeter Blattfläche folgende Werte gefunden : Tropaeolum majus 383000 Chlorophyllkörner Phaseolus multiflorus 283 000 „ Ricinus communis 495 000 ,, Helianthus annuus 465 000 ,, Es zeigte sich, „daß bei ähnlich gebauten Laubblättern die spezifischen Assimilationsenergien annähernd proporticfnal sind den Gesamtmengen. der Chlorophyllkörner in den betreffenden Blattflächeneinheiten", Spezifische Anzahl Assimilationsenergie der Chlorophyllkörner * nach C. Weber nach G. Haberlandt Bezogen auf Tropaeolum majus = 100 100 Phaseolus multiflorus 72 64 Ricinus communis 118Ö 120 Helianthus annuus 124,5 122 so daß der Schluß gezogen werden durfte : ,,Die spezifischen Assimilations- energien werden sich also höchstwahrscheinlich in allen Fällen aus der Größe des Chlorophyllgehaltes und aus dem anatomischen Bau der Assimila- tionsorgane in genügender Weise erklären lassen." Diese Folgerung ist aber später von Haberlandt-) mit folgender Bemerkung ergänzt und ^) G. Haberia iTdt, Jahrb. f. wissensch. Botanik 13, 84 u. 179 [1882]. ') G. Haberlandt, Physiologische Pflanzenanatomie, 4. Aufl., S. 252 [1909]. Assimilationsleistungcn normaler Blätter verschiedener Pflanzenarten. 8=^ vertieft worden: ,, Wahrscheinlich ist die Assimilationsenergie der Chloro- plasten bei verschiedenen Pflanzen auch eine spezifisch verschiedene." In den Beispielen der Tabellen i6 und 17, in welchen entsprechend der von Haberlandt gefundenen Proportionalität der Chloroplastenzahl und der Assimilationsenergie auch der Chlorophyllgehalt mit der Leistung proportional geht, handelt es sich freilich um Blätter, die ähnliche Ver- hältnisse aufweisen, nämlich um -gut assimilierende, chlorophyllreiche Pflanzen. Es wäre verfrüht, aus der hier gefundenen annähernden Über- einstimmung auf eine einfache quantitative Beziehung zwischen Chloro- phyllmenge und Assimilationsbetrag zu schließen. Schon einige weitere Beispiele von gleichfalls normalen, chlorophyll- reichen Blättern, die also in eine Reihe mit den oben angeführten gehören, zeigen beträchtlich höhere Assimilationszahlen. Sie werden in der Ta- belle 18 aufgeführt. Es sind Blätter von einigen Pflanzen, die demnach für besonders rasches Wachstum und energische Assimilation organisiert zu sein scheinen und auch zum Teil bei den quantitativen Versuchen früherer Autoren über che Assimilation Rekordleistungen ergeben haben. Tabelle 18. Hohe A s s i m i 1 a t i o n s z a h 1 e n normaler B 1 ä t te : 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Nr. Pflanzenart Datum Tem- peratur Ange- wandtes Gewicht der Blätter (g) Von Trocken- substanz (g) 10 g fris Blättern Fläche (qcm) Ehen Chloro- phyll (mg) Assimiliertes COj der Stunde v 10 g Ig frischen Trocken- Blättern Substanz (g) in on I qdm Blatt- fläche Assimi- lations- zahl I HeUanthus annuus 2. VII. 25° 13.5 1,72 288 16,5 0,230 0,134 i 0,080 14.0 2I „ 3. VII. 25° 9,0 1.94 336 15.0 0,250 0,129 0,075 16.7 3 31. VII. 25 ° 9.0 1,67 317 20,8 0,228 0.137 0,072 10,9 4 Cucurbita Pepo 22. VII. 25° 8,0 1.3 336 17.5 0,213 0,164 0,063 12,1 5 Clerodendron tricho- 27.x. 25° 6,2 2,07 340 15.0 0,185 0,089 0.054 12,3 . tomum Thumb. 6 Fragaria vesca 10. XI. 25° 8,0 3.00 495 17.7 0,234 0,078 0,052 10,6 .7 Populus pyramidalis 2. XL -5 ° 8,0 3.19 470 19,0 0,190 0,060 0,040 10,0 hört. ! 8 Pelargonium pel- 26. IL 30° 10,0 0,60 — 8,2 0,119 0,198 14,5 tatum^) ') Pflanze aus dem Warmhaus. 86 R. Willstätter und A. Stoll. Die assimilatorischen Leistungen sind von H. T. Brown, von F. F. Blackman und anderen Forschern allein auf die Blattflächen bezogen worden. Wir halten es zur Beurteilung des Zuwachses an Assimilaten, der an Hand der prozentischen Gewichtszunahme der Blätter betrachtet werden sollte, für nützlich, in den Tabellen außerdem die Beziehungen der Assimilationsleistung zum Frischgewicht und zum Trockengewicht der Blätter mitzuteilen. Die größte beobachtete Assimilationsleistung ist nach Blackman und Matthaei^) in einem Versuche (Exp. XVI der angeführten Arbeit) mit Helianthus tuberosus erreicht worden: In brillanter Augustsonne, bei 29,3 bis 31,0°, 6,3 vol.-proz. CO2, in einer Stunde für 50 qcm Blattfläche 0,029 g ^^2, also 5,8 g auf das Quadratmeter. Die höchsten Leistungen, die in der oben stehenden Tabelle (18, Nr. I bis 3 und 4) verzeichnet sind, gehen sogar bei tieferer Temperatur noch darüber hinaus, nämlich : bei Helianthus annuus, 25 °, bis 8,0 g COo auf das Quadratmeter, bei Cucurbita Pepo, 25 °, 6,3 g CO2 auf das Quadratmeter. Für ein Quadratmeter Blattfläche, einschließlich der Nervatur, er- gibt sich daraus die Bildung von 5,4 und 4,3 g Hexose in der Stunde. Der Zuwachs beträgt nach diesen Beobachtungen 9,0 und 11,2 g Hexose für 100 g angewandtes Trockengewicht von Hehanthus und Cucurbita. Die Kohlehydratbildung, bezogen auf die Blattfläche, ist ungefähr das 10 fache der in atmosphärischer Luft von Brown und Escombe-) ge- messenen, die in einer Stunde bei 19° betrug: 0,55 g Kohlehydrat (0,88 g CO2) auf ein Quadratmeter Blatt von Hehanthus. V. Änderung der Assimilationszahl beim Wachstum. A. Die Assimilation in der Früh Jahrsentwicklung. Über die Ausbildung der Fähigkeit des Plasmas zur Assimilation im Frühjahr hat A. J. Ewart^) in der schon angeführten Arbeit Versuche ^) F. F. Blackman und G. L. C. iMatthaei, Proc. Roy. Soc. Ser. B., 76, 402, 442 [1905]. 2) H. T. Brown und F. Escombe, Proc. Kov. Soc. Ser. B., 76, 29, 44 [1905]. ^) A. J. Ewart, Journ. of thc Linnean Soc, Botany, 31, 364, 452 [1895/96]. Änderung der Assimilationszahl beim Wachstum. Sj ausgeführt. Er findet ,,that when the foliage is developing in spring, it is only wheh the leaves have reached a certain size and condition of development, which varies very much in different plants, that any power of assimilation can be detected". Das Ergebnis, daß die Fähigkeit zur Photosynthese sich langsamer als der Chlorophyllgehalt einstelle, wird durch unsere Versuche wider- legt. Das Resultat von Ewart ist durch die von ihm angewandte Me- thode vorgetäuscht, deren Leistungsfähigkeit für die Untersuchung über- schätzt worden ist. Mit Hilfe der Bakterienmethode kann nicht die Assi- milation selbst festgestellt werden, sondern nur die Differenz zwischen der Entbindung des Sauerstoffs infolge der Assimilation und seinem Ver- brauche durch die Atmung. Gerade bei den Knospen und bei den aus ihnen hervorbrechenden jungen Blättern ist die Atmung besonders be- deutend. Um für diesen Fall die Bakterienmethode zum Nachweis der Assimilation anzuwenden, wäre es zum mindesten erforderlich, durch Darbietung von konzentrierterer Kohlensäure die Assimilationsbedin- gungen im Verhältnis zur Atmung günstig zu gestalten. Mit den für die Assimilationsversuche in verschiedenen Phasen der Früh Jahrsentwicklung angewandten Blättern haben wir auch die Atmung gemessen, deren Werte, durch die Ausführung der Versuche in 5 proz. Kohlensäure in der Genauigkeit allerdings beeinträchtigt, für einige von den Beispielen im folgenden angeführt werden. Tabelle 19. Atmung von Blättern in der Frühjahrsentwicklung. Für den Ver- Von 10 g frischen Blättern in Von I qm Blattfläche Datum such ange- 1 Stundei) gebildetes COg (mg) Nr. Pflanzenart der ersten wandtes Ge- Bei der 9 Tage nach 1 1 Monat nach Messung in Messung wicht der ersten der ersten der ersten I Stunde er- Blätter (g) Messung Messung Messung zeugtes COa . (g) I Acer Negundo I. Mai 5.0 41 25 13 0,84 2 TiUa cordata 4- .. 6,0 39 24 II 0,69 3 Populus pyramidalis hört. 5- .. 8,0 42 17 10 0,96 4 Ampelopsis quinquefolia 10. ,, 5.0 45 26 — I,II 5 Quercus Robur II. ,, 5.0 49 35 13 0,89 I) Die Bestimmung ist nur für ein Intervall von 20 Minuten gemacht und die Zahlen für eine Stunde umgerechnet. 88 R- Willstätter und A. Stoll. Man erkennt, daß mit der fortschreitenden Entwicklung der Blätter die Atmung, bezogen auf das Blattgewicht, von den außerordenthch hohen frühesten Beträgen auf etwa ein Viertel zurückgeht und daß ihre Werte bei den jungen Blättern im Zahlenbereich der in atmosphärischer Luft beobachteten Assimilation liegen und sogar, über deren Betrag noch hinausgehen. Für das Quadratmeter Blattfläche beträgt beispielsweise die Atmung bei 25 ° im Beispiel Nr. 3 der Tabelle 19, Populus pyrami- dahs, in der Stunde 0,96 g CO2. Die Besonderheit der Assimilation in der ersten Entwicklung des Laubes ist eine ganz andere als Ewart angenommen hat. Die Assimila- tionszahlen der Blätter sind nämlich in der Frühjahrsentwicklung höher als nach der vollendeten Entwicklung. In den Versuchen mit 8 verschiedenen Pflanzen finden wir durch- gehends bei sehr jungen Blättern assimilatorische Leistungen, die, be- zogen auf den Chlorophyllgehalt, höher sind als bei voll entwickelten Blättern. Für die frühesten Versuche wurden die eben aus den Knospsn ausgetretenen und zwar noch kaum entfalteten gelbgrünen Blättchen ge- wählt. Dabei ist der Chlorophyllgehalt der jungen Blätter, auf das Frisch- gewicht berechnet, etwa V4 bis Va von dem älterer Blätter. In der Mehrzahl der Fälle zeigen bei etwas späteren Proben die Assi- milationszahlen noch ein weiteres merkUches Ansteigen, um erst dann, wenn der übhche Chlorophyllgehalt der entwickelten Blätter erreicht wird, zu den normalen und ungefähr konstanten Werten zu sinken. Zugleich sehen wir öfters die absoluten Beträge der assimilierten Kohlensäure trotz zunehmenden Chlorophyllgehaltes zurückgehen. Allerdings ist es nicht immer gelungen, die Blätter in so frühem Zustand der Entwicklung zur Untersuchung zu bringen, daß die Eigentümlichkeit des Ansteigens der Assimilationszahlen zutage trat, aber in allen Fällen sind die Assimila- tionszahlen viel höher gefunden worden als nach vollendetem Wachstum der Blätter. Bei den jungen, noch gelbgrünen Blättchen sind die Assimilations- zahlen berechnet mit den am Ende der Assimilations versuche bestimmten Chlorophyllgehalten, die in der Tabelle 22 allein angeführt werden, und Änderung der Assimilationszahl beim Wachstum. 89 mit den, gleichfalls am Ende der Versuche, nämlich im vierten Intervall der Messung, gefundenen Assimilationsbeträgen. Während der Assimilationsversuche hat, wie die Tabelle 20 zeigt, durch die Wirkung der günstigen Temperatur-, Licht- und Ernährungs- verhältnisse eine rasche Zunahme des Chlorophyllgehaltes stattgefunden und parallel damit eine Steigerung der iVssimilationsleistungen vom zwei- ten bis zum vierten Intervall (Tabelle 21). Schon bei den mit 10 Tage älteren Frühjahrsblättern ausgeführten Assimilationsbestimmungen blie- ben Chlorophyllgehalt und Leistung während der Versuche ungefähr konstant. Tabelle 20. Chlorophyllziiwachs in jungen Blättern. 25°, 5proz. CO,, ungefähr 48000 Lux, in 80 Minuten. Durchschnittliche 10 g frische Blätter ent- Zuwachs in Pro- Fläche eines einzel- halten Chlorophyll (mg) zenten des ur- Nr. Pfianzenart Datum nen der zum Ver- sprüngUch vor- suche angewandten vor dem nach dem handenen Chloro- Blätter (qcm) Versuch Versuch phylls I Aesculus Hippocastanum 29. April 8,6 10,1 18 2 Acer Negundo I. Mai 6,6 7.0 9,0 29 3 Tilia cordata 4- .. — 6,3 8,3 32 4 Acer Pseudoplatanus 5. .. 13 9,7 10.7 10 5 Populus pyramidalis hört. 5- .. i,7 9.2 10,6 15 6 Ampelopsis quinquefolia 10. ,, ^3 7.4 7.4 0 7 Quercus Robur 11. ,, ' 5.4 6,6 22 Tabelle 21. Steigerung der Assimilation junger Blätter während des Versuches. Für den Versuch angewandtes Gewicht (g) In 20 Minuten assimiliertes COg (g) im 2. Intervall 3. Intervall 4. Intervall Steigerung der .\ssi- milationsleistung in Prozenten, bezogen auf den Wert des zweiten Intervalls Tilia cordata j 6,0 Acer Pseudoplatanus [ 6,0 Populus pyramidalis hört. 8,0 0,044 0,044 0,08^ 0,051 0,051 0.086 0,053 0,055 0,092 Im Zusammenhang mit den Bestimmungen der Assimilation im Früh- ling sind in der folgenden Tabelle einige Werte von der späteren Jahres- zeit angeführt zur Bestätigung, daß die Assimilationszahlen ungefähr auf 90 R. Willstätter und A. Stoll. der bald nach der ersten Entwicklung erreichten Höhe verharren. In der Tabelle 22 u. a. sind die gefundenen Beträge der Assimilation auf gleiche Tabelle 22. '^^ Gang der Assimilationsleistungen , in der Frühjahrsentwic kl nng der Blätter. 25°, 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Von 10 g frischen , Assimihertes COg (g) Blättern in I Stunde von Nr. Datum Pflanzenart ^"■' '^"'^ '''"^''^^ angewandte Menge , 'S -1 ? 1 Chlorophyll (mg) IG g frischen Blättern s 1 "ffl Assimi- lations- zahl I 29. IV. Aesculus Hip- 8,0 g hellgrüne, gefal- 2,10 264 10,1 0,113 1 0,054 0,043 II, I pocastanum tete Blättchen 7.V. 7V2 Teilblätter, 8,0 g 2,06 467 15,1 : 0,182 0,088 0,039 12,1 3. VI. 3V2 Teilblätter, 8,0 g 2,94 482 24.7 0.159 0,054 0,033 j 6,4 8. X. 2 Teilblätter, 8,0 g 3.62 342 31.2 0,151 0,041 0,0441 4,8 2 I.V. Sambucus nigra 85 Fiederblättchen, 8.0 g 1.85 315 11.7 0.143 0,078 0,046 1 12,2 S.V. 35 Fiederblättchen 8,0 g 8,0 g 2,25 402 23,1 0,227 0,101 0,057 9.8 14. VII. 2,56 449 23.5 0,145 0.057 0,032 6,2 3 I.V. Acer Negundo [ 37 ganze Blätter, 5,0 g 2,24 488 8.6 0,128 0,057 1 0,026 X4,9 10. V. 14 Blätter, 5,0 g 2,28 606 18,8 0,242 0,106 0,040 j 13,0 4. VI. 4 Blätter, 5,0 g 2,22 646 24.8 0,192 0,086 0,030 7.7 10,6 4 4.V. Tilia cordata 6,0 g 2,18 573 8,3 0,088 0,040 0,015 12. V. 14 Blätter, 6,0 g 2,15 771 11.5 0,183 0,085 I 0,024 16,0 5. VI. 9 Blätter, 6,0 g 3.52 701 28,8 1 0,205 0,058 0,029 7,1 25. VI. 8.0 g 3.19 662 28,1 0,185 0,058 0,028 6,6 5 5V. Acer Pseudo- platanus 24 Blätter, 6,0 g 2,60 523 10,7 0,091 0,035 0,017 8,6 14. V. 2V2 Blätter, 4,0 g 2,55 915 18,7 0,200 0,078 0,022 10,7 24. VI. 6,0 g 3.58 782 40,0 0,207 0,058 0,026 5.2 6 5V. Populus pyra- midalis hört. 95 Blätter, 8,0 g 2,50 440 10,6 0,115 1 0,046 0,026 10,8 14. V. 23 Blätter, 8,0 g 2,27 450 16,4 0,205 0,090 0,046 12,5 5. VI. 19V2 Blätter, 8,0 g 2,81 422 18,7 0,175 0,062 0,041 9,3 7JIO.V. Ampelopsis 65 Teilblätter (antho- 1,84 406 7.4 0,078 0,042 0,018 10,5 quinquefolia cyanhaltig, rot- braun), 5,0 g 19. V. 15 Teilblätter, 5,0 g 1,98 548 15.4 0,208 0,105 0,038 13.5 8. VI. 6 Teilblätter, 5,0 g 2,00 638 28,8 0,178 0,089 0,028 1 6,2 8 u.V. Quercus Robur 94 Blätter, 5,0 g 2,76 552 6,6 0,072 0,026 0,013 1 10,9 20. V. 19 Blätter, 3,0 g 2,64 578 8,6 0,136 0,051 j 0,024 15,8 9. VI. II Blätter, 5,0 g 4.14 510 21,6 0,194 0,047 0,038 9,0 20. VI. 8,0 g 4.50 479 25.0 0,196 0,044 0,041 7.8 Änderung der Assimilationszahl beim Wachstum. 9I Frisch- und Trockengewichte und Blattflächen umgerechnet. Von den zweiten Bestimmungen der einzelnen Reihen an bleiben die Beträge unge- fähr gleich für gleiche Flächen, hingegen sinken die Assimilationsbe- träge, bezogen auf die Trockensubstanz der Blätter, obwohl diese chlorophyllreicher wird. In vielen Fällen findet sich der Rückgang auch in den Werten, die sich auf gleiche Frischgewichte beziehen. Bei den für die Versuche angewandten ganz jungen Blättchen, von denen zum Beispiel 85 — 95 Stück im Gewicht von 5 — 8 g die Füllung der Assimilationskammer ausmachten, war mit besonderer Aufmerksam- keit dafür zu sorgen, daß die Flächen sich nicht überdeckten und daß die frisch unter Wasser abgeschnittenen Stielchen in die Wasserbeschickung der Schale eintauchten. Aus den angeführten Assimilationszahlen ergibt sich, daß bei Beginn der Laubentwicklung und öfters in besonders bemerkenswerter Weise kurze Zeit (zum Beispiel 9 Tage) nach der ersten Laubentfaltung die Pro- duktion des assimilatorischen Farbstoffs und die Ausbildung der Funk- tionstüchtigkeit des Plasmas nicht parallel gehen. Die Abweichungen sind groß genug, um erkennen zu lassen, daß die Assimilation außer vom Chlorophyll noch von einem anderen inneren Faktor abhängt, dessen Ent- wicklung im Frühjahr der Erzeugung des Chlorophylls voraneilt und erst später hinter der reichlichen und sogar zu reichlichen Bildung des Chloro- phylls zurücksteht. B. Vergleich junger und alter Blätter. Dem in der Frühjahrsentwicklung beobachteten Einfluß eines inneren Faktors auf die Ausnützung des Chlorophylls begegnen wir unabhängig von der Jahreszeit beim Vergleiche verschieden alter Blätter von dem- selben Sprosse einer Pflanze, zum Beispiel der jungen hellgrünen Blätter vom oberen Ende eines Zweiges und der tief grünen von der Basis des- selben. Es zeigt sich (Tabelle 23), daß die Pigmente mit dem Wachstum des Blattes stark zunehmen und daß die assimilatorische Leistung (Ta- belle 24) ebenfalls steigt, aber nicht entfernt in gleichem Maße; folglich sinkt die Assimilationszahl. Q2 R. Willstätter und A. StoU. Tabelle 23. Gehalt jüngerer und älterer Blätter an Chlorophyll und Carotinoiden, (In 10 g Trockengewicht.) Nr. Pflanzenart : Datum ^ Beschreibung Chlorophyll (mg) Carotin (mg) Xanthophyll (mg) I 1 Acer Pseudoplatanus 1 23. Juni 24- ,. junge, hellgrüne Blätter alte, tiefgrüneBlätter 25 112 1.5 3.2 3.0 6,0 2 Tilia cordata 25. Juni 26. „ junge, hellgrüne Blätter alte, tiefgrüne Blätter 25 88 0.7 2,7 2.4 7.4 3 Laurus nobilis 30. Juni I. Juli diesjährige, hellgrüne Blätter vorjährige, dunkelgrüne Blätter 41 43 1.9 2,8 4.5 4.4 4 Taxus baccata^) 27. Juni 28. „ diesjährige, grüne Zweige vorjährige, dunkelgrüne Zweige 49 67 1.4 2,4 4.2 4.5 Tabelle 24. Assimilatorische Leistungen jüngerer und älterer Blätter. 25°, 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Nr. i Pflanzenart Datum 1 1 türd. Versuch S? angewandtes - Gewicht Von I |t (g) og fri Jlätterr % (qcm) eben |t (mg) Assimiliertes C in I Stunde n II Oa(g) von r 1 •< I Acer Pseu- doplatanus 23. VL 24. VL 4. bis 6. Blatt von oben am Zweige, hellgrün tiefgrüne Blätter von der Basis der Zweige 6,0 6,0 3.33 3.58 697 782 8,3 40,0 1 0,09810,030 0,207 0,058 0,016 0,026 11,8 5,2 2 Tilia cor- data 25. VL 26. VL junge, hellgrüne, nicht mehr anthocyanhaltigeBlätter untere , tiefgrüne Blätter desselben Zweiges .... 8,0 8,0 2,56 3,19 526 662 6.5 28,1 0,092 0,036 i 0,185:0,058 0,018 0,028 14,2 6.6 3 Laurus no- bilis 30. VL i.VIL gut ausgebildete, hellgrüne Blätter dieses Jahres . . tiefgrüne, vorjährige Blät- ter 10,0 10,0 3.10 4.95 388 345 12,7 21,2 0.075 0 018 0,024 0,019 0,023 5,9 3.7 4 Taxus bac- cata 27. VL 28. VI. junge Zweige vorjährige , dunkelgrüne 20,0 2,82 13,8 0,066 0,024 23,7 0,051 0,014 ~ 4,7 2,1 .o,„,_ ') Ganze Zweige. Schwankungen der assimilatorischen Leistung im Herbste. 93 Die jungen Sommerblätter von Linde und Ahorn in der Tabelle 24 geben ähnliche i\ssimilationszahlen wie die zweiten Messungen in der Reihe der Frühjahrsentwicklung (Tabelle 22), aber sie zeigen bei der Be- rechnung auf gleiche Trockengewichte doch lange nicht so hohe Assimila- tionsleistungen, VI. Schwankungen der assimilatorischen Leistung im Herbste. A. Normale und steigende Assimilationszahlen im Herbste (Verhalten des vergilbenden Laubes). Die Fähigkeit zur Assimilation gibt im Herbste ein ungemein wech- selndes Bild von Veränderungen. Eine häufige und am wenigsten inter- essante Erscheinung ist das Verhalten des vergilbenden Laubes. Werden die vergilbenden Blätter unter die Bedingungen maximaler Assimilation gebracht, so ist ihre Leistung im Verhältnis zum Chlorophyllgehalt gegen- über dem normalen Zustand nicht viel verändert, denn mit dem Gehalte an assimilatorischem Farbstoff hat in ungefähr gleichem Maße die Funk- tionstüchtigkeit des Protoplasmas abgenommen. Tabelle 25. Vergleich von Blättern im Sommer und nach herbstlicher Vergilbung. 25°, 5proz. CO,, ungefähr 48 ooo Lux. Nr. Pflanzenart Beschreibung D'-""'^ der Blätter 1 Hl (g) Von ii (g) [0 g fri Blättern 1 g (qcm) chen ii (mg) Assim in eil Ig Hartes CC er Stunde il >2 (g) ^ von 1 'S h \ 1 S :S lg r i 1 I Sambucus nigra 14. VII. 14. X. tiefgrün hellgrün, leicht abfallend 8,0 ' 2,56 8,0 2,05 449 445 23.5 10,2 0,145 0,061 0,057 0,030 1 , 0,032 1 0,2 0,014 6,0 2 Popukis pyra- midaUs hört. 5. VI. 2. XL tiefgrün gelbgrün 8.0 8,0 2,81 2.94 422 454 18,7 1 4.9 J 0,175 0,039 0,062 0,013 0,041 9,3 0,009 7.9 Dieser Vergleich von sommerlichen und von vergilbenden herbstlichen Blättern wird durch das ähnliche Bild ergänzt, welches gleichzeitig im Herbst gepflückte noch grüne und schon vergilbende Blätter von derselben Pflanze ergeben. 94 R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 26. Vergleich von herbstlichen grünen und vergilbenden Blättern. 2^°, 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. 'S 2 Von 10 g frischen Assimiliertes COg (g) sl2 Blättern in I Stunde von 1 >fr. Pflanzenart Datum Beschreibung der Blätter ix. " 0 ^ 1 |1 ii 1 i H 1 r II (g) 1 (g) (qcm) (mg) 2 < I ' Populus pyra- 2. XI. tiefgrün 8.0 3,19 470 19,0 1 0,190 0,000 0,040 10,0 1 midalis hört. 2. XI. gelbgrün 8,0 2,94 454 4.9 0,039 j 0,013 j 0,009 j 7,9 2 Platanus 7. XI. jüngere, schön grüne Blätter 6,0 3.42 510 19,6 0,197 0,058 0,039 10,0 5. XI. ältere, gelb- ! 6,0 grüne Blätter 3.33 582 7.5 0.055 0,017 0,009 7,3 3 Fragaria vesca 9. XI. alte, tiefgrüne Blätter 8,0 3.69 465 19,2 0,152 0,041 0,033 7.9 IG. XI. alte, gelbgrüne Blätter 8,0 3.62 496 5,1 0,043 0,012 0,009 8,3 Die Abnahme im Chlorophyllgehalt und der Rückschritt in der assi- milatorischen Leistungsfähigkeit gehen aber nicht immer parallel, son- dern es kommt vor, daß während des scharfen Rückganges im Farbstoff- gehalt der Assimilationsbetrag etwa konstant bleibt, daß folglich die Leistungsfähigkeit, die wir auf den Chlorophyllgehalt beziehen, einen gün- stigeren Wert annimmt. Diese Erscheinung wird in mehreren Beispielen veranschaulicht, in welchen wir den Gang der Assimilationszahlen vom Sommer bis zum Spätherbst verfolgen (Tabelle 27). Zwischen den unge- fähr gleichen Werten im Sommer und im Spätherbst liegen die bis zum doppelten Betrage ansteigenden Assimilationszahlen in der Zeit des be- ginnenden Vergilbens. Bei vergilbendem Laube ist übrigens jeder mögliche Fall der Leistungs- fähigkeit gefunden worden, konstante, steigende und fallende Assimila- tionszahlen. So begegnete uns auch der Fall, daß die assimilatorische Lei- stung enorm zurückgeht, so daß trotz gleichzeitiger rapider Abnahme des Chlorophylls die Assimilationszahl dennoch tief wird. Bei vergilbten Blät- tern, und zwar schon in den spätesten Versuchen der letzten Tabellen, wie auch in einer Anzahl von Beispielen der folgenden Tabelle 28 ist der Schwankungen der assimilatorischen Leistung im Herbste. 95 Tabelle 27. Gang der Assimilationszahlen während der Vergilbung. 25°, 5proz. COg, ungefähr 48000 Lux. 1 S Von 10 g frischen Assimiliertes CO2 (g) _ 1 ö'il Blättern in I Stunde von s Nr. Pflanzenart Datum Beschreibung der Blätter ^§1 l.l II 1 ü ll h2 !i 1 (g) (g) (qcm) (mg) 0« er < I Acer Pseudo- 30. VIL tiefgrün, dünn 4.0 3.88 678 49.2 0,200 0,052 0,030 4.1 platanus 17. IX. schön grün 4.0 3,88 840 31.2 0,208 0.053 0,025 6,6 5.x. grüne Blätter mit gelben Flecken 4.0 3.62 860 19.5 0,160 0,044 0,019 8,5 19. X. fast gelb 4,0 3.38 842 5.2 0,025 0,007 0,003 4.8 2 Acer Negundo 4. VL tiefgrün 5.0 2,22 646 24.8 0,192 0,086 0,030 7.7 6. X. grün 5.0 2,80 470 13,8 0,166 0,059 0,035 12,0 6. X. beinahe gelbe 5,0 2,80 506 2,9 0,016 0,006 0,003 5,5 Blätter i 3 Tiha cordata 30. VIL tiefgrün 5.0 2,00 696 28,6 0,154 0,077 0,022 5.4 18. IX. hellgrün 5.0 3.70 618 15-0 0,166 0,045 0,027 II, I 10. X. schön vergilbend^) 5.0 3.50 774 9.6 0,022 0,006 0,003 2,3 4 Hehanthus 3. VIL tiefgrün 9,0 1 1,94 336 15.0 0,250 0,129 0,075 16,7 annuus 31. VIL dunkelgrün 9,0 1.67 317 20,8 0,228 0,137 0,072 10,9 19. IX. i Blätter2)m. wenig 9.0 2,33 301 7.0 0,134 0,058 0,045 19,2 gelben Flecken 31. X. gleichmäßig grün- gelbe Blätter 2) 11,0 2,20 305 3.7 0,046 0,021 0,015 12,4 Chlorophyllgehalt oft so klein geworden, wie er bei den gelben Varietäten, die weiter unten behandelt werden, gefunden wird. Während die letzteren aber Assimilationsbeträge ähnlich und auch gleich denjenigen normal grüner Blätter aufweisen, sind die Werte der verarbeiteten Kohlensäure in dieser Gruppe gelbgewordener Herbstblätter nur noch Zehntel von normaler Leistung. In der Tabelle 28 sind die stark vergilbten Blätter, die nur noch sehr schwach assimilieren, mit gleichzeitig von den Spitzen derselben Zweige genommenen Proben verglichen, an denen die herbstliche Veränderung noch nicht so weit vorgeschritten ist. ^) Blätter von einem anderen Baum als bei den vorigen Versuchen. 2) Blätter von benachbarten Pflanzen. 96 K. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 28. Sinken der Assimilationszahlen bei gänzlichem \'ergilben. -5 . 5 proz. CO.,, ungefähr 48000 Lux. Nr. Pflanzenart .Datum |-g « 1 Von 10 g frischen { ! S .5 - ! Blättern ! Beschreibung i'^^iill ^ 2=si der Blätter j-^ äcS || ^ | .^ 1 (g) ! (g) (qcm) (mg) Assimiliertes COg (g) - in I Stunde von « Ie h 1. 1 |i ^1 rll ■ Morus alba 22. IX. grüne Blätter von 5,0 2,90 den Spitzen der 528 10,0 0,164 0,057 0,031 16,4 23. IX. Zweige vergilbte Blätter 5,0 | 2,go 592 3,4 0,030 0,010 0,005 818 2 [Populus alba 13. X. dunkelgrüne Blätter | 5,0 3,70 488 21,8 0,200 0,054 0,041 9,2 12. X. schön vergilbende 1 5,0 i 3,40 Blätter 484 5.6 0,010 j 0,003 0,002 1,8 3 Aesculus Hip- pocastanum 29.x. schön vergilbende Blätter 5.0 3.00 710 5.7 0,018 0,006 0,003 3.2 4 Syringa vul- garis 28.x. tiefgrün, ohne schad- hafte Stellen 12,0 2,87 309 II. 7 0,076 0,027 0.025 6,5 30.x. gelbgrün, mit wenig braunen Flecken 12,0 2,83 336 5.6 0,021 0,007 0,006 ' 3,7 Von den Beispielen der Tabelle 27 sind einige während der ganzen Vege- tationsperiode von der ersten Entwicklung der aus den Knospen aus- tretenden Blätter bis zur vollen herbstlichen Vergilbung untersucht wor- den, und zwar mit Blättern von denselben Bäumen (Acer Pseudoplatanus, Tilia cordata). Wir fassen das Mitgeteilte zusammen in der folgenden graphischen Darstellung (Fig. 3) der Beobachtungen des Chlorophyll- gehaltes, der auf gleiche Trockengewichte und auf gleiche Flächen bezo- genen Assimilationsbeträge unter den Bedingungen der überschüssigen Licht- und Kohlensäurezufuhr bei 25 ° und des Ganges der daraus berech- neten Assimilationszahlen. B. Niedrige Assimilationszahlen im Herbste (Verhalten des grünbleibenden Laubes). Für die Betrachtung der die Assimilation beeinflussenden Faktoren ist von größerer Bedeutung die herbsthche Veränderung solcher Blätter, die grün bleiben und zum Teil auch in grünem Zustand abfallen. Schwankungen der assimilatorischen Leistunc; im Herbste. 97 1.No\/. I.N0V. tMai 15.Mai iJuni 15.Juni Uuli K.Juli 1.Aug. 15.Aug. tSept 15.Sept. 1.0kf. 15.0kt. Wov. , ; ^, , 1 1, 1 1. in der Vegetationsperiode von Tiliacordata und Acer Pseudo- b Chlorophyllgehalt \ . ^ / o 1 rr^ ^ ■ a ^ c ^- 1 ^ ^ . . .f^ . ° platanus (25 , 5 vol.-proz. COo, Licht von Sonnenstarke). Wi Ilst ä 1 1 er-S t oll , Assimilation. y 98 R. Willstätter und A. Stoll. Der milde, bis zum 17. November frostfreie Herbst des Jahres 1914 war der ungestörten Durchführung der Versuche günstig. \Mr fanden unter den bis zum beginnenden Frost grünbleibenden Blättern solche, bei denen das Assimilationsvermögen ungeschwächt erhalten blieb, und andere, die es bei anscheinend unveränderter Beschaffenheit großen Teils oder gänzlich einbüßten. Zunächst sollen die Beispiele vorangeschickt werden, in denen die Assi- milationsfähigkeit unvermindert war, sogar nach dem Abfallen der Blät- ter, als diese einen oder zwei Tage später vom Erdboden gesammelt wur- den (Beispiel i — 3 der Tabelle 29). In den weiteren Beispielen (4 — 6) der Tabelle handelt es sich nicht um abgefallene, sondern um solche Blätter, die nach zweitägigem und nach mehrtägigem Frost gepflückt worden sind. Die Assimilationsbeträge waren noch hoch, daher trotz des ansehn- lichen Chlorophyllgehaltes die Assimilationszahlen immer noch normal. Das Vorkommen von wasserlöslichen gelbbraunen und braun gefärbten Stoffen, das den herbstlichen Blättern mitunter eine mehr olivgrüne Farbe verlieh und das bei dem Verfahren der quantitativen Chlorophyllbestim- mung besondere Berücksichtigung erheischte^), war ohne Einfluß auf die Assimilation. Glücklicherweise wurde auch der interessantere entgegengesetzte Fall aufgefunden, in dem die Funktionstüchtigkeit der noch schön grünen oder erst im Beginn des Vergilbens stehenden Blätter abgenommen hat. In einer Anzahl von Fällen (Aesculus Hippocastanum, Acer campestre und andere der Tabelle 30) ist der Chlorophyllgehalt noch ansehnlich, die assimilatorische Leistung aber gering. Noch ausgesprochener begegnen wir dieser Erscheinung bei vier an- deren Pflanzen, nämlich bei Robinia Pseudacacia, Tilia cordata und zwei Arten von Ampelopsis. Altere Blätter wurden im Oktober und November in noch gut grünem Zustand gepflückt. Sie zeigten nur sehr geringe Assi- milationsleistungen oder fast keine mehr, während vom gleichen Stamm und zur selben Zeit von den Spitzen der Zweige gepflückte jüngere Blätter ^) Siehe die erste Abhandlung, Abschn. IIA. Schwankungen der assimilatorischen Leistung im Herbste. 99 Tabelle 29. Assimilation grünbleibender herbstlicher Blätter, 25°, 5prozentiges CO2, ungefähr 48000 Lux. Nr. PfJanzenart Datum Beschreibung der Blätter (g) Von 10 g frischen Blättern §1 ^ 2:= (g) (qcm) (mg) Assimiliertes CO„ (g) in I Stunde von S c - -g S .S s « „ ^i II cl ^s ^1 -;- a ■ 1 1 < I Cydonia japo- nica Thumb. 26. X. 1 tiefgrüne, abfallende ! Blätter 10,0 4.50 301 16,3 0,119 0,026 0,038 7-3 var. Moerlosii 1 2 Clerodendron trichotomum 27- X. tief grü ne , abgef a llene Blätter 6,2 2.07 340 15.0 o;i83 0,089 0,055 12,3 Thumb. 3 Lonicera tata- rica 14. • X. grüne, abgefallene 1 Blätter 4,0 3.0 i 747 8,2 '0,050 0,017 0,007 6,1 4 Popuhis pyra- 19. midahs hört. XL tiefgrüne Blätter, nach 2 Tagen Frost 8,0 3.62 522 24.4 0,156 0,043 0,030 6.4 von — 2,5 ° in De- warschem Gefäß 1 in V2 Stunde auf + 10° gebracht 5 Fragaria vesca \2i 1 1 XL alte, tiefgrüne Blät- ter, nach 4 tägigem Frost (bis — 4°) in I Stunde erwärmt auf + I ° 8,0 3.62 435 17.4 0,136 0,038 0,031 7.8 6 j Hedera Hehx 1 8. XIL tiefgrüne Blätter, loTage nach Frost 8,0 3.83 398 29,6 0,161 0,042 0,040 5.4 bei -f- 10° gesam- i melt noch gute Assimilationszahlen ergaben. Der Vergleich der beiden Blatt- sorten vom nämlichen Zweig und von derselben, übrigens noch frühen Zeit des milden Herbstes ergibt für Ampelopsis quinquefolia (Beispiel 3 der Tabelle 31) bei genau übereinstimmendem Chlorophyllgehalt eine über achtmal größere assimilatorische Leistung der jüngeren Blätter. Dieser Unterschied findet in den Assimilationszahlen 0,9 und 7,9 der alten und der jungen Blätter seinen Ausdruck. Bei den nicht mehr funktionstüchtigen Blättern vermögen wir an mikroskopischen Schnitten keine anatomischen Veränderungen wahr- zunehmen, die für die Aufhebung der /\ssimilation verantwortlich wären. Die Chloroplasten der jüngeren und der älteren Blätter waren etwa gleich 100 R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 30. Xiedrigere Assimilationszahlen grüner herbstlicher Blätter. -5". 5Proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. 11. Von 10 g frischen Blättern .A.ssimihertes CO, (g) in I Stunde von 1 Nr. Pflanzenart Datum 1 Beschreibung der Blätter Sil Ig« (g) 11 (g) ä (qcm) 2=. (mg) 1^ s 1 I Aesculus Hip- pocastanum 13. X. tiefgrüne Blätter mit wenig roten Fleck- chen 8,0 ;3,62 1 342 31.2 0,151 0,042 0,044 4.8 29.x. tiefgrüne Teile frisch abgefallener Blät- ter 8,0 ! 1 3.50 431 20,7 0,060 0,017 0,014 2,9 2 Acer campestre 12. X. grüne Blätter vom Baume, ohne gelbe Ränder I 4.0 1 4.12 557 23.5 0,075 0,018 0,013 3.2 13. X. frisch abgefallene Blätter 4.0 4.- 672 15.2 0,020 0,005 0,003 1,3 3 ClematisVitalba 4. XI. saftiggrüne Blätter von den Spitzen 7,0 2,86 594 20,3 0.133 0,046 0,022 6,6 der Zweige 3. XI.! alte grüne Blätter ohne schadhafte 7.0 3,00 491 15.0 0,057 0,019 0,012 3.8 Stellen ■ 4 Cornus mas 6. XI. schön grüne Blätter vom Strauch, ohne braune Ränder 5.0 3,60 668 28,0 0,062 0,017 0,00g 2,2 groß und gleich geformt und alle gekörnt; sie erschienen bei den alten Blättern zahlreicher und dichter gedrängt, öfters zu Klumpen vereinigt, imd die Farbe war hier etwas dunkler und bräunlich, wahrscheinlich in- folge der Färbung des die Chlorophyllkörner umgebenden Zellsaftes. In- folge der geringeren Zahl der Chloroplasten erscheint am jungen Blatte der Schnitt übersichtlicher und klarer; der Chlorophyllgehalt ist zwar für das Frischgewicht derselbe, aber er verteilt sich bei den jungen Blät- tern auf eine größere Fläche. Die Zell wände wiesen bei den verschiedenen Blättern ähnliche Beschaffenheit und Dicke auf, sie waren mit Chloro- plasten ausgekleidet. Auch die Spaltöffnungen erschienen bei den älteren und den jungen Blättern gleich zahlreich und gleich weit geöffnet. An- häufung von Stärke ließ sich in den gealterten Blättern nicht nachweisen. Sch\vankuno;en der assimilatorischen Leistung im Herbste. lOI Tabelle 31. Aufhören der Assimilation bei noch grünen herbstlichen Blättern. -3°. 5P'"oz. CO.,, ungefähr 4S 000 Lux. 1|- \'on 0 g frischen 31ättern Assimihertes CO, (g) ^ in I Stunde von S Nr. Pflanzenart Datum Beschreibung der Blätter II 1 i Sä Trocken- ibstanz m Blatt- flächo ,imilation (g) (g) (qcm) (mg) 0 r 1 ! ' < I Robinia | 26. X. jüngere, tief grüne 4.0 3,50 850 28,5 0,207 0,059 0,024! 7,3 Pseudacacia Blätter 24. X. 1 von denselben Zweigen, 4.0 3,37 887 15.5 [0,027 0,008 0,003 1,8 ältere, gelblichgrüne . 1 1 Blätter 1 2 Tilia cordata 9.x. frisch abgefallene, gelb- 5.0 2,70 798 7,2 0,000 0,000 0,000 0 1 . grüne Blätter IG. X. grünere, frisch abge- fallene Blätter 5.0 3,30 858 11,8 0,005 0,001 0,001 0,3 10. X. gelbgrüne Blätter vom 5.0 3.50 774 9,6 0,022 0,006 0,003 2,3 Baum , 3 Ampelopsis quinquefolia 16. X. frisch abgefallene, grüne Blätter ohne braune 5.0 1,90 600 9,8 0,004 0,001 0,001 0.4 Flecken 16. X. gepflückte, ältere, gut grüne Blätter 5,0 2,10 502 12,9 0,012 0,006 0,002 0,9 17. X. jüngere Blätter von 5,0 2,30 650 12,7 0,100 0,044 0,015 7,9 den Spitzen d. Zweige 1 4 Ampelopsis jii. XL frische, grüne Blätter 7.0 2.14 438 9.7 0.020 0,009 0,005 2,0 tricuspidata von der Pflanze 1 Veitchii 13. XL ebenso 7.0 2,28 423 7.6 0,017 0,007 0,004 2,2 17. XL schön grüne Blätter 7.0 3.14 434 II, I 0,011 0,004 0,003 0,8 Belebung der Assimilation. Die Mannigfaltigkeit der bei der Assimilationstätigkeit herbstlicher Blätter beobachteten Verhältnisse läßt sich durch die Annahme erklären, daß sich der Gehalt an Chlorophyll und an einem mit ihm in der Photo- synthese zusammenwirkenden Enzym im Laufe der herbstlichen Verände- rungen der Blätter in mannigfacher Weise verschiebt; in einem Teil der Fälle leidet mehr das Pigment, in einem anderen Teil, am ausgesprochen- sten in der zuletzt behandelten Gruppe von Pflanzen, leidet das enzyma- tische System. Mit dieser Annahme steht es im Einklang, daß wir eine allmähliche 102 R. Willstätter und A. Stoll. Wiederbelebung beobachten beim Verweilen der Blätter in warmem, feuchtem Räume, so daß die fast erloschene Assimilation nochmals bis zu einem großen Betrage ansteigt. Neubildung von Chloroplasten ist dabei sehr unwahrscheinlich, denn der Chlorophyllgehalt ändert sich nicht, während bei den Assimilationsversuchen mit Blättern in der Frühjahrs- entwicklung zugleich mit der steigenden Assimilation auch die Zunahme des Chlorophylls festgestellt worden ist. Es ist auch nicht anzunehmen, daß durch Eintrocknen ein Verschließen der zu den Chlorophyll körnern leitenden Bahnen stattgefunden habe, die sich während der Einwirkung von Wärme und Feuchtigkeit wieder öffnen würden. Die Trockengewichts- bestimmung der herbstlichen Blätter mit tiefen Assimilationszahlen hat normale Beträge ergeben; übrigens ist ein Beispiel von Ampelopsis quin- quefolia mit erloschener und wieder erweckter Assimilation vor Beginn der kühlen Witterung untersucht worden, zu gleicher Zeit mit jüngeren Blättern der Pflanze, die ungeschwächt funktionierten. Die Wiederher- stellung der Assimilation ist wahrscheinlich auf eine Verbesserung des enzymatischen Systems zurückzuführen, sei es, daß Hemmungen des enzymatischen Prozesses beseitigt oder aktivierend wirkende Stoffe her- beigeführt werden oder daß sogar das Enzym selbst neugebildet oder wieder wirkungs fähig gemacht wird. Die Wiederbelebung der Assimilation ist in unseren Versuchen nicht zum erstenmal beobachtet worden. A. J. Ewart^) hat nämlich schon in der großen Arbeit, auf die wir bereits in dem Abschnitt über die Früh- jahrsent Wicklung der Blätter eingegangen sind, an ausgedehntem Ver- suchsmaterial beschrieben, daß gewisse frostbeständige Pflanzen, wie Hex Aquifolium, Buxus sempervirens, Pinus montana, Taxus baccata und andere, nachdem sie wochenlang anhaltendem, oft bis unter — 15 ° rei- chendem Frost ausgesetzt waren, zunächst keine Assimilationsfähigkeit mehr besaßen, daß sie diese aber wieder erlangten, wenn sie acht Stunden bis einen Tag bei 15° gehalten wurden. W^eiterhin hat Ewart gezeigt, daß auch krautartige Pflanzen, wie Primula marginata, Heleborus lividus, A. J. Ewart, Journ. of the Linnean Soc, Botany, 31, 364, 389 [1895/96]. Schwankungen der assimilatorischen Leistung im Herbste. 103 Poa pratensis und andere in der Mitte des Winters, nachdem sie wochen- lang von Schnee bedeckt gewesen, bei der Untersuchung zunächst nicht assimiherten, daß sie aber bei 15° in drei bis fünf Stunden mäßig aktiv und in einigen Tagen ganz aktiv wurden. Ewart bemerkt auch, daß manche Kräuter fähig sind, fortgesetzt tiefe Temperaturen zu ertragen, ohne die Assimilationsfähigkeit einzubüßen. In Übereinstimmung damit hat sich auch bei unserer quantitativen Bestimmung ergeben, daß zum Beispiel Pappel-, Erdbeer- und Efeublätter nach mehrtägigem Froste so- fort normale Leistung der Chloroplasten besaßen. Die Wiederbelebung zeigte am schönsten ein Versuch mit Ampelopsis tricuspidata Veitchii. Den Blättern dieser Pflanze ist auch im Spätherbst, bis sie vergilben oder durch Frost zerstört werden, ein besonders frisches Aussehen eigen; als sie für den Versuch dienten, enthielten sie noch nicht viel Anthocyan und sie waren noch an den Zweigen festhaftend. Die Assimilation ist in i^/o Stunden auf den dreifachen, im Laufe eines Tages auf den sechsfachen Betrag angestiegen. Tabelle 32. Versuch unter den gewöhnlichen Bedingungen mit Ampelopsis Veit- chii; am 17. November bei 4° gepflückte, schön grüne Blätter. 7,0 g Blätter; 2,2 g Trockengewicht; 304 qcm Fläche; 7,8 mg Chlorophyll. Intervall in Minuten Austretende Luft (in 1/ -assimiliertes CO, (g) . ■ •, »■ , , . ^ ^ , , I Assunilationszahl im Intervall m i Stunde Unterbrechung; die Blätter werden 1,00 0,0019 0,00() 1,00 0,0029 0,009 1,10 0,0041 0,011 0,90 0,0043 0,014 1,05 0,0067 0,020 werden i 3 Stunden bei 2^° aufl I,üO 0,0107 0,032 1,00 0,0095 0,029 1,05 0,0119 0,036 0.93 0,0102 0,031 0,8 1,2 14 1,8 2,6 2^ ° aufbewahrt und neu angeordnet. 4.1 3.7 4.0 Ein zweites Beispiel ist ein Versuch mit Ampelopsis c]uinquefolia, der einen Monat früher, noch vor Eintritt rauher Herbstwitterung mit älteren. 104 R. Willstätter und A. StoU. schön grünen, am Stiel noch festhaftenden Blättern ausgeführt wurde. Die Assimilationszahl war zu Beginn tief und sie stieg auf mehr als das Doppelte, als die Blätter nach einer Assimilationsperiode zur Erholung 12 Stunden lang bei mäßiger Wärme aufbewahrt wurden. Die Atmung zeigte einen nur kleinen Anstieg; das einem Liter aus der Gasuhr austretender Luft entsprechende Kohlendioxyd (CO2 des Gas- stromes + Atmungskohlensäure) erhöhte sich \'on der ersten Beobach- tungsperiode bis zur Fortsetzung des Versuchs am folgenden Tag von 0,0973 auf 0,0976 g. Tabelle ^^. Versuch unter den gewöhnlichen Bedingungen mit Ampelopsis quinquefolia, am 16. Oktober, mit schön grünen Blättern. 5,0g Blätter; 1,05 g Trockengewicht; 251 qcm Fläche; 6,4 mg Chlorophyll. Intervall in Minuten Austretende Luft {in 1) Assimiliertes CO» (g) im Intervall 1 in i Stunde Assimilationszahl 0,95 1,00 1,00 0,0019 0,0018 0,0015 0,006 0,003 '5 0,00; 0,9 0,8 0,7 ... 1,00 0,0030 0,011 1,00 0,0041 0,012 1,00 o>oo34 0,010 I.OO 0,0046 0,014 Unterbrechung; die Blätter werden, frisch beschnitten und mit Wasser versehen, 12 Stunden bei 26 bis 20° aufbewahrt. 1.7 1.9 20 I 1,00 0,0034 0,010 1,6 20 I 00 O.OOJ.6 ! 0.014. 2.2 In einigen weiteren Bestimmungen mit Ampelopsis Veitchii, die zu gleicher Zeit mit dem ersten Beispiel, aber mit Blättern von anderen Standorten vorgenommen wurden, trat gleichfalls ein mäßiges Ansteigen der assimilatorischen Leistung ein. Die Blätter blieben nach der Beob- achtung einer Assimilationsperiode von 1V2 Stunden über Nacht bei etwa 25 ° im Dunkeln liegen (Nr. i und 2) oder sie wurden unter Behchtung in fortlaufender Messung beobachtet (Nr. 3 und 4 der Tabelle 34). Dabei sind die Beobaohtungszeiten durch Intervalle mit gelinderen Bedingungen von Belichtung und Temperatur abgelöst worden. Assimilation der Friichthäute. 105 In einem Vergleichsversuche mit jüngeren Ampelopsisblättern (vom 17. Oktober) vedief die i\ssimilation vier Stunden lang mit völliger Kon- stanz. Tabelle 34. Belebung der Assimilation mit Ampelopsis Veitchii. Versuch unter den gewöhnlichen Bedingungen mit 7,0g Blättern. Nr. Datum Trocken- gewicht (g) Fläche (qcm Chlorophyll- gehalt mg) Assimiliertes COg zu Beginn des Versuches (g) in I Stunde nach der Erholungszeit .\ssimilationszahl zu am Beginn Ende I II. Nov. 14- .. 1,50 1,40 307 312 6,8 5.3 0,014 0,019 0,023 0,030 2,0 3.6 3.4 5.7 3 4 13. Nov. 16. „ 1,60 2,00 296 348 5.3 7.7 I.Stunde 3. Stunde 0,012 0,013 0,021 0,032 5. Stunde 7. Stunde 0,022 0,038 1 — 2,3 2,7 4,2 5,4 Bei den herbstlichen Blättern mehrerer anderer Pflanzen (Fragaria vesca, Cornus mas, Platanus acerifolia, Syringa vulgaris) ist eine Belebung der Assimilation unter günstigen Bedingungen nicht eingetreten. Fragaria vesca: lo. November; 8,0 g alte gelbgrüne Blätter. Assimila- tionsleistung anfangs in einer Stunde 0^036 g, nach 15 stündigem Verwei- len bei 30 — 20 ° 0,026 g CO2 . Fragaria vesca: 9. November; 8,0 g ältere, noch tiefgrüne Blätter. Assimilationsleistung anfangs in einer Stunde 0,122 g, nach 2V4 Stunden bei 30° 0,116 g COo. Cornus mas: 6. November; 5,0 g tiefgrüne Blätter. Assimilationslei- stung anfangs in einer Stunde 0,031g, nach 2 V2 Stunden bei 30° 0,023 g CO.,. Platanus acerifolia: 5. November; 7,0 g gelbgrüne Blätter. Assimila- tionsleistung anfangs in einer Stunde 0,033 §, nach 2V2 Stunden bei 30° 0,024 g COo. VII. Assimilation der Fruchthäute. Bei den chlorophyllführenden Häuten der Früchte werden in bezug auf den Gehalt an Chlorophyll, die Funktionstüchtigkeit der Chloroplasten und hinsichtlich der herbstlichen Veränderung ähnliche Verhältnisse wie bei den Blättern angetroffen. Die Ausrüstung mit Chlorophyllkörnern befähigt die Fruchthaut, die Abgabe von Kohlensäure aus dem Frucht- I06 R. Willstätter und A. Stoll. Innern an die Luft herabzumindern und den Verlust an organischer Sub- stanz zu vermeiden, welcher in der Frucht durch die Atmung einer ver- hältnismäßig großen Menge pflanzlicher Substanz bedingt würde. Beispiele bedeutender Assimilationsleistungen sind Kürbis und Erbse. Die Haut eines reifen Kürbis enthält unter einer grauen wachsführenden Schicht eine tiefgrüne Zellschicht, die im Chlorophyllgehalt und in der assimilatorischen Leistung, beide auf die Fläche bezogen, und in der Assimilationszahl den Blättern der Roßkastanie fast gleichkommt. Bei solchen Früchten wurde, um für die Assimilationsbestimmung die phlorophyllführenden Gewebe gleichmäßiger Belichtung zugänglich zu machen und um die Störung der Messung durch die Atmung der inneren Fruchtteile zu vermeiden, die chlorophyllhaltige äußere Schicht sorgfältig abgetrennt und ähnlich wie Blätter auf dem Silberdrahtnetz der Assi- milationskammer ausgebreitet. Den Zutritt der Kohlensäure erleichterten wir durch Freilegen des Zellgewebes, da die Epidermis zum Beispiel von Weintrauben, welche die Frucht vor raschem Austrocknen schützt, schwer durchlässig ist. Die äußere Schicht, so tief wie sie grün war, wurde in großen Stücken mit scharfem Messer abgetrennt und besonders beim Kürbis wurde beachtet, daß die an den Wundstellen austretende schlei- mige Flüssigkeit nicht die Poren der Oberhaut verklebte. Kürbis. 15 g äußere grüne Schicht der reifen Frucht (3. Oktober); Fläche 254 qcm; Chlorophyllgehalt 18,4 mg, Carotin 2,0 mg, Xanthophyll 2,6 mg. Assimilation in einer Stunde 0,088 g COo; Assimilationszahl 4,8. Erbse. Die Assimilationszahl der Hülsen unreifer Erbsen, welche auf die Fläche bezogen halb soviel Chlorophyll als die äußere Kürbis- schicht enthalten, ist noch viel höher als bei dieser, die Ausnützung des Chlorophylls also noch günstiger. 40 g Hülsen mit noch kleinen Samenanlagen der unreifen Früchte (11. Juli). Trockengewicht 6,1 g; Fläche 140 qcm; Chlorophyllgehalt 3,8 mg. Assimilationsleistung in einer Stunde 0,068 g CO2; Assimila- tionszahl 17,9. Birne. Ferner wurde die assimilatorische Leistung der Haut von Bir- nen in etwas verschiedenem Zustand der Fruchtreife geprüft. Schön grüne Assimilation der Fruchthäute. 107 und noch unreife Birnen waren im Chlorophyllgehalt, auf die Fläche be- zogen, mit recht chlorophyllarmen Blättern vergleichbar, die assimilatori- schen Leistungen ziemhch gering bis mittelmäßig, die Assimilationszahlen normal. Neben diese Beispiele (Nr. i — 3 der Tabelle 35) stellen wir die Lei- stung einer gelbgrünen, mit heibstlichem Laube zu vergleichenden Birne, Tabelle 35. Assimilationsversiiche mit der Fruchthaiit der Birne. -3°' 5Proz- COo; ungefähr 48000 Lux; Frischgewicht 20g. Nr. Datum Beschaffenheit Fläche Chloro- phyll Carotin Xantho- phyll - ö »1 Assimi- lations- zahl (qcm) (mg) (mg) (mg) (g) 1I21. Sept. tiefgrüne, halbreife Birne, 2 Tage nach 229 3,0 0,13 0.57 0,042 9.3 der Ernte verwendet 2 28. " grüne, halbreife Birne, sofort nach der Ernte untersucht 199 3.6 0,022 6,1 3 28. •• grüne, halbreife Birne, sofort nach der Ernte untersucht 224 2,65 0,17 0.33 0,023 8,7 4 28. " dieselbe Sorte, aber gelbgrüne Exem- plare, sofort nach der Ernte untersucht 230 1.35 0,13 0,25 0,015 II, I Tabelle 36. V e r s 11 c he mit Weint r a 1 1 b e n . Nr. Datum Beschreibung des Versuchs- Gewicht der Beeren oder niaterials Beerenhäute Chloro- phyll Carotin Xantho- phyll II ■ .Assimi- lations- zahl 1 (mg) (mg) (>ng) (mg) T 30- Sept. unreife, noch harte grüne Beeren 100 g ganze Beeren 3.6 — — 0,012 3.3 2 30. " halbreife, noch grüne Beeren 150 g aufgeschnit- tene, ausgebreitete Beeren 2,6 0,003 1,2 3 I. Okt. Häute derselben Beeren Häute von 100 g Beeren 1,2 — 0,002 1.7 4 2. " Häute reifer Beeren i) Häute von 250 g Beeren 1,8 0,05 0,07 0,003 1,8 5 23- JuU Itahenische, gelb- 200 g Beeren 1,8 0.3 0,4 0,0 0,0 grüne Weintrauben ^) Das zu diesen Häuten gehörige Fleisch der Beeren enthielt gleichfalls alle Pigmente, und zwar 1,9 mg Chlorophyll (a + b), 0.15 mg Carotin und 0,19 mg Xanthophyll. I08 R.> Willstätter und A. StoU. die am nämlichen Tage wie Beispiel 3 und von demselben Baume (Herzogin Angouleme) gepflückt worden ist. Der Chlorophyllgehalt war hier nur halb so groß, der Assimilationsbetrag ebenfalls vermindert, aber in ge- ringerem Maße, so daß die Assimilationszahl denselben Anstieg zeigte wie das vergilbende Laub von Acer Pseudoplatanus, Tilia cordata und andere. Weintraube (Tabelle 35). Die Assimilation in der Haut unreifer Beeren ist deutlich, aber sie ist bei der günstigen Verteilung des Chloro- phylls geringfügig zu nennen und sie wird, indem und obwohl im Herbst der Chlorophyllgehalt noch bedeutend abnimmt, absolut und verhältnis- mäßig sehr gering. In einem Falle mit gelbgrünen itahenischen Beeren war keine Assimilation mehr zu beobachten. VIII. Assimilationsleistung chlorophyllarmer (gelbblätteriger) Varietäten. Zu den Grenzfällen, deren Untersuchung einen tieferen Einblick ge- währt in die Abhängigkeit der Photosynthese von inneren Faktoren als die Prüfung gewöhnlicher Laubblätter, gehört die assimilatorische Lei- stung gelbblätteriger Varietäten verschiedener Pflanzen. Über die ,, Kohlensäureassimilation und Atmung bei Varietäten derselben Art, die sich durch ihre Blattfärbung unterscheiden", hat \V. Plester^) im Institut von C. Correns eine eingehende Untersuchung ausgeführt und er hat darin schon bemerkenswerte Hinweise auf Abweichungen von der Proportionalität zwischen Chlorophyll und Assimilation gegeben. Plester behandelte die Frage, ob die Intensität der Photosynthese dem Chlorophyllgehalt parallel geht und ob den blaßgrünen Sippen Hilfsmittel zur Verfügung stehen, mit welchen sie den durch verminderte Assimilation bedingten Ausfall decken. Plester führte den hier interessierenden Teil seiner Arbeit nur mit der Blatthälftenmethode aus, und zwar ohne Berück- sichtigung der Erfahrungen-) von Brown und Escombe sowie von Blackman und Thoday. Die geprüften blaßgrünen und gelbblätterigen ^) W. Plester, Beiträge zur Biologie der Pflanzen 11,249 [1912]. -) Vergleiche den II. Abschnitt. Assimilationsleistiing chlorophyllarmer (gelbblätteriger) Varietäten. 109 Varietäten enthielten zwischen 27,7 und 53,4 Prozent vom Chlorophyll der typischen Sippen, zum Beispiel die untersuchten Aurea-Pflanzen von Ul- mus, Populus und Acer 27,7 bezw. 45,2 und 52,1 Prozent vom Chlorophyll der Stammformen. Es ergab sich, daß mit der Chlorophyllkonzentration auch die Kohlensäureassimilation der hellgrünen Varietäten abnahm. In manchen Fällen war ein ungefähres Parallelgehen der Assimilation mit dem Chlorophyllgehalt zu erkennen. In anderen Fällen assimilierte die hell- grüne Varietät bedeutend stärker, als ihrem Chlorophyllgehalt entsprach, was auf besondere Einrichtungen hindeutete, mit welchen diese Pflanzen die höhere Kohlensäurezerlegung leisten können. Endhch kam es auch vor, daß der Assimilationsw-ert kleiner war, als der Chlorophyllgehalt der blaßgrünen Varietät verlangte. Plester folgert aus seinen Ergebnissen, daß in allen Fällen die hellgrünen Varietäten schlechter assimilieren als die Stammpflanzen, daß aber ein Teil der Einbuße durch geringere Atmung wieder gutgemacht werde. Es ist kaum zu bezweifeln, daß die verminderte Atmung eine Folge- erscheinung ist, welche darauf beruht, daß die oxydierbaren Substanzen in geringeren Mengen zur Verfügung stehen. Das Wesentliche der schon von Plester gesuchten und bei ihm an- gedeuteten Erscheinung tritt klarer zutage, wenn wir Beispiele mit weit größeren Differenzen im Chloroph3dlgehalt als die von Plester unter- suchten auswählen und prüfen, nämlich Blätter mit 15 Prozent bisherunter zu 3 und noch weniger Prozenten vom Chlorophyllgehalt der typischen Form, wenn wir ferner die Versuchsbedingungen so einrichten, daß den gelben wie grünen Blättern die äußeren Faktoren in günstiger Weise ge- boten werden, und wenn wir endlich den Assimilationsvorgang mit quan- titativen Bestimmungen verfolgen. In der folgenden Tabelle ^'] vergleichen wir für einige der unter- suchten Beispiele den Chlorophyllgehalt der gelben Varietät und der Stammform. Manche von den gelben Blättern, zum Beispiel von Sambucus nigra var. aurea, waren in Größe und Form den normal grünen gleich, sahen aber im Juni und Juh wie herbstlich vergilbte Blätter aus. Im allge- R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 37. Chlorophyllgehalt normal grüner und gelbblätteriger Varietäten. Nr. Pflanzenart Sippe Chlorophyllgehalt von 10 g fri- in Prozent sehen Blättern der Trocken- img) Substanz Von I qdm Blattfläche (mg) Verhältnis des Chlorophylls gleicher ßjatt- flächen I Acer Negundo grüne Stammform gelbe Varietät 20,8 ' 2.8 1,04 0,15 4.84 0,43 l 100 : 8,9 2 Ulmus grüne Stammform gelbe Varietät 16,2 1,2 0.55 0,05 3>io 0,29 > 100 : 9,4 3 Sambucus nigra grüne Stammform gelbe Varietät 23.5 0,8 0,92 0,04 5.25 0,18 lioo : 3,4 meinen sind nicht einmal die an Chlorophyll ärmsten Exemplare gewählt worden; man findet derart rein gelbe Blätter, daß bei der spektroskopi- schen Prüfung des alkoholischen Extraktes noch nicht das Band des Chlorophylls in der roten Region wahrgenommen wird, wenn durch die Absorption der gelben Pigmente schon das Violett bis / = 490 //// aus- gelöscht ist. Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigten die Blätter normalen Bau im Palisadengewebe und Schwammparenchym ; die Chloro- plasten glichen in Form, Zahl und Anordnung denjenigen normaler Blät- ter, nur erschien ihre Farbe rein gelb. Am besten ist es bei Sambucus gelungen, die gelben und grünen Blätter so auszuwählen, daß sie in bezug auf alle Verhältnisse außer dem Farbstoffgehalt, namentlich hinsichtlich der Blattfläche und des Trockengewichts einander ähnlich waren. In den folgenden Tabellen werden die Assimilationszahlen der chloro- phyllarmen Blätter mitgeteilt neben den \\>rten der normal grünen V^er- gleichsexemplare, und zwar für eine bei 25 ° und eine bei 30 ° ausgeführte Versuchsreihe. Allerdings entsprechen in den Tabellen 38 und 39 die Assimilationszahlen nicht genau unserer Definition insofern, als zwar den chlorophyllreichen, aber nicht den gelben Blättern Licht im Überschuß geboten worden ist. Für die chlorophyllarmen Blätter sind also diese Assi- milationszahlen, so hoch sie auch ausgefallen sind, noch Mindest werte. Es war in mehreren Versuchsreihen nicht möglich, den gelben Blättern ausrei- chende Belichtung zu gewähren, ohne ihnen bei der beträchtlichen Versuchs- dauer eine Schädigung durch zu starke Wärmebestrahlung zuzufügen. Assimilationsleistnng chlorophyllarmcr (gclbblätteriger) \'arietäten. Ill Das Ergebnis der Versuche ist eine im Verhältnis zum Chlorophyll weit größere assimilatorische Leistung der chlorophyllarmen Blätter. Ihre Assimilationszahlen betragen nämlich ein Vielfaches der gewöhnlichen Werte, zum Beispiel das lofache und fast das 20 fache; den Assimilationszahlen von 6 bis 12 der normalen stehen Werte zwischen 50 und 120 der gelben Blätter gegenüber. Vergleich der Assimila tiunsleist imgen normaler und gelbblätteriger Varietäten. Tabelle ß. Versuchsreihe bei 25° 5 proz. CC)^. ungefähr 48 000 Lux. Für den Versuch Voi 10 g frischen Blättern Assimiliertes COg (g) in I Stunde von •\ssimi- Nr. Pflanzenart Varietät Datum ange- wandtes Gewicht (g) Trocken- gewicht (g) Fläche qcm) Chloro- phyll (mg) 10 g frischen Blättern I g Trocken- substanz Blatt- fläche lalions- zahl I Quercus Stammform 20. VI. 8,0 4.50 479 25,0 0,196 i 0,044 0,041 7,8 Robur gelbe Varietät 18. VI. 8,0 3.56 55-^ 1,9 0,103 0,029 0,019 55 2 Sambucus Stammform 13. VII. 8,0 2.75 429 22,2 0,146 0,053 0,034 6,6 nigra 14. VII. 8,0 2,56 449 23.5 0,145 0,057 0,032 6,2 gelbe Varietät 7. VII. 8,0 1,88 472 0.75 0,088 0,047 0,018 117 ,, 9. VII. 8,0 1,94 477 0,94 0,096 0,050 0,020 103 ., . 10. VII. 8,0 1.94 457 0,81 0,097 0,050 0,021 120 3 Ulmus Stammform 20. VII. 8,0 2,94 526 16,2 0,111 0,038 0,021 6,9 ,, 22. VII. 8,0 3,06 447 13.7 0,135 0,044 0,030 9,9 gelbe Varietät 1) 16. VII. 8,0 2,50 401 1,2 0,098 0,039 0,024 82 " r 17. VII. 8,0 2,25 375 1,5 0,109 0,048 0,029 73 Unter den angegebenen Bedingungen verlief in Versuchen mit gelben Blättern die Assimilation gewöhnlich eine Reihe von Beobachtungszeiten hindurch mit großer Konstanz (vergleiche Tabelle 15 im Abschnitt III, D und die Tabellen 50, 52 u. ff. im Abschnitt XIII); dasselbe gilt für die Atmung. In einem Beispiel von Sambucus nigra var. aurea enthielt der Gasstrom vor der Belichtung im Dunkelversuche 0,1012 g CO2 auf ein Liter austretender Luft; imter denselben Bedingungen von Luftdruck ^) Nur mit ungefähr 24 000 I.ux belichtet. 112 R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 39. ^'ersuchsreihe bei 30° 5 proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Nr. Pflanzenart Varietät Datum Für den Versuch ange- wandtes Gewicht (g) Von 10 g frischen Blättern Trocken- p,^^j^^ Chloro gewicht phyll (g) (qcni) 1 (mg) .Assimiliertes CO2 (g) in I Stunde von 10 g Ig I qdm frischen Trocken- Blatt Blättern Substanz 1 fläche Assimi- lations- zahl I 1 Sambucus 1 nigra Stammform gelbe Varietät 27. V. 28. V. 10,0 10,0 2,33 1,82 406 431 18,3 0,4 0,206 0,028 0,088 0,015 0,051 0,006 11,2 70 2 Acer Ne- gundo Stammform gelbe Varietät 12. VI. 12. VI. 5.0 5.0 2,00 1,90 430 648 20,8 2,8 0,260 0,154 0,130 0,081 0,060 0,024 12,5 55 3 Quercus Robur Stammform gelbe Varietät 14. VI. 14. VI. S,o 8,0 4,00 3.75 537 ",5 .,9 0,262 0,098 0,066 0,026 0,049 11,7 52 und Temperatur wurde nach beendigter 6 stündiger Belichtung gefunden 0,1013 g CO2. Die Assimilation der gelben Blätter ist, abgesehen von ihrer Beziehung zum Chlorophyllgehalt, auch bemerkenswert im absoluten Betrage, den wir mit der Leistung normal grüner Blätter bei verschiedenen Tempera- turen vergleichen. In dem Beispiel der Ulme (Tabelle 40) ist der Betrag des assimilierten Kohlendioxyds bei 25 ° nur wenig niedriger, bei 15 ° fast gleich für chloroph^dlarme Blätter wie für dieselben Gewichte der chloro- phyllreichen. Berechnen wir die Assimilation auf die Flächen, so über- trifft sogar das chlorophyllarme Blatt bei beiden Temperaturen das chlorophyllreiche in den Beträgen der Assimilationsleistung. Gemäß der Annäherung in den Leistungen beider Blattsorten mit fallender Tem- peratur hat der Temperaturkoeffizient der Assimilationsreaktion bei dem chlorophyllarmen Blatt einen niedrigeren Wert als bei dem chloro- phyllrejchen, nämlich 1,34 anstatt 1,53. Wenn man die Assimilationsfähigkeit der gelben Blätter in einigen Fällen durch die Vegetationsperiode verfolgt, so unterscheiden sich die Verhältnisse von der Entwicklung normal grüner Blätter eben dadurch, daß hier die Chlorophyllbildung frühzeitig zum Stillstand kommt. Durch sein weiteres Wachstum wird das Blatt verhältnismäßig ärmer an Chloro- phyll, dennoch steigt die Leistung noch weiter (Nr. 4 und 5 der Tabelle 41), Assimilationsleistung chlorophyllarmer (gelbblätteriger) Varietäten. 113 Tabelle 40. Assimflation von gelber und grüner Ulme bei 15 und 25' 5proz. COj, ungefähr 24000 Lux. \'arietät Tempe- ratur . Gewicht der Blätter (g) Trocken- gewicht (g) Blattfläche (qcm) Chlorophyll- gehalt (mg) Assimiliertes CO, (g) in I Stunde von 8 g frischen ! i qm Blatt- Blättern fläche chlorophyllarm 35- 8,0 dieselben Blätter 2,00 2,00 321 321 0,95 0,95 0.075 0,056 2,3 1.7 chlorophyllreich ;;; 8,0 dieselben Blätter ^.35 ^.33 421 421 ' 13.0 13.0 0,089 0,058 2,1 1.4 insofern es erlaubt ist, verschiedene Blätter zu vergleichen. Es läßt sich schHeßen, daß das enzymatische System an Leistungsfähigkeit ge- winnt. Beim Vergleich eines herbstlichen mit einem sommerlichen Blatte (Nr. 2 und 3) finden wir Zunahme des Chlorophylls, Abnahme der Lei- Tabelle 41. Assimilation gelbblätteriger Varietäten in verschiedenen JahreS' Zeiten. -5 "' 5 proz- CO2, ungefähr 48 000 Lux. Nr. Pflanzenart Datum Für den Versuch an- gewandtes Gewicht Trocken- gewicht g frischen Fläche Blättern Chloro- phyll Assimiliertes 10 g frischen CO, (g) in I 1 g Trocken Stunde von I qdm Blatt- Assimila- tionszahl (g) (g) (qcm) (mg) Blättern Substanz fiäche I Sarabucus 19. Mai 8,0 1,90 426 1,90 0,100 0,053 • 0,023 53 2 nigra 10. JuH 8.0 1,94 457 0,81 0.097 0,050 0,021 120 3 24. Sept. 8,0 2,06 420 1.25 0,073 0,035 0,017 58 4 Ulmus 20. Mai 8,0 1,85 565 1,90 0,082 1 0,045 0,015 44 5 17. Juh 8,0 2,25 375 1,50 0,109 0,048 0,029 73 Die günstigen Assimilationsleistungen bei gelbblätterigen Varietäten sind nicht auf ihren Gehalt an Carotinoiden zurückzuführen. Es läßt sich an diesem Material, in welchem die Carotinoide überwiegen, am besten zeigen, daß die gelben Pigmente keinen unmittelbaren Einfluß auf den Assimilationsvorgang besitzen und es ist überhaupt noch kein Einfluß derselben auf die Lebensvorgänge nachgewiesen worden. Der Gehalt an Carotinoiden ist bei den gelbblätterigen Sippen nicht etwa größer, er ist sogar erheblich kleiner als bei den Stammformen, das V\'illstätter-Stoll, Assimilation. 114 R. Willstätter und A. Stoll. Verhältnis des Chlorophylls zu den Carotinoiden aber zeigt natürlich eine außerordentliche Verschiebung. Dieses als Quotient der Mole ausgedrückte Verhältnis Q^>±1_ von Chlorophyll (a + b) zu Carotin + Xanthophyll ist von uns früher in vielen Beispielen bestimmt i) und im Mittel der Ver- suche bei Lichtblättern = 3,07, bei Schattenblättern = 4,68 gefunden worden, ohne daß die Differenzen bei normal grünen Blättern erheblich waren; bei den e;elben Varietäten nun sinkt der Ouotient auf 1,6 bis o.^. Tabelle 42. Farbstoffgehalt normaler und gelbblätteriger Varietäten. (In 10 g trockener Blattsubstanz.) Nr. i Pflanzenart Varietät Datum Chlorophyll (a + b) ' Carotin ' Xanthophyll (mg) 1 (mg) i (mg) Molekulares Verhält- nis der grünen zu den gelben Pigmenten: Qa + b2) c + x I 2 Sambucus nigra Sambucus nigra Stammform 27. Mai s 78,5 gelbe Varietät ' 27. ,, 2,1 Stammform ^ 13. Juli 80,9 gelbe Varietät 9. ,, 4,8 3.8 o.S 3.6 1,0 6,2 3.9 5.9 1,3 4>83 0,28 5.24 1,28 3 Acer Ne- gundo Stammform i 12. Juni 103,8 1 5,4 gelbe Varietät 12. ,, 1 14,5 2,0 10,1 5.9 4.14 1,14 4 Quercus Robur Stammform gelbe Varietät 14. Juni 56,2 14- >. 5.0 2,7 0,8 4.4 1,2 4.87 1,54 5 Ulmus Stammform gelbe Varietät 20. Juli 16. ., 55.3 4.8 1.9 0,7 3.6 1,1 6,20 1,64 In zahlreichen Versuchen, von denen es genüge, ein Beispiel anzu- führen (Tabelle 43), mit chlorophyllarmen und chlorophyllreichen Blät- tern wurde das violette Licht, für das allein die Carotinoide Absorptions- vermögen haben, durch Einführung eines Kaliumbichromatfilters zwi- schen Lampe und Assimilationskammer vollständig ausgeschaltet, und zwar mitten im Versuche. Daraufhin verriet die Assimilationsleistung keine Schwächung; eine Ausnahme von dem konstanten Verlauf wurde nicht gefunden. 1) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll (Berlin 1913), Kap. IV, S. 99; siehe auch die erste Abhandlung der vorliegenden Reihe, II. Abschnitt. 2) Zur Berechnung dieses Verhältnisses wurde das Molekulargewicht des natürlichen Gemisches von Chlorophyll a und b (= 903) herangezogen. Bemerkungen über die chemische Ausnützung der Lichtenergie. 115 Tabelle 43. Assimilationsversuch mit Ausschaltung des violetten Lichtes; Sambucus nigra var. aurea, 10. Juni. 10 g Blätter mit 0,37 mg Chlorophyll, 0,72 mg Xanthophyll, 0,18 mg Carotin, ungefähr 48 000 Lux, 5 proz. COj, 25 °. Intervall in Minuten Austretende Luft in Liter Assimiliertes COg (g) im Intervall in einer Stunde 20 22 1,00 1,10 0.0055 0,0085 0,017 0,023 Kaliumbichromat (25 g in 2,5 1 Wasser bei 4 cm Schichtdicke) wird eingeschaltet. 20 100 0,90 1.05 1,00 1,00 0,0072 0,0082 0,0069 0,0076 0,024 0,023 0,022 0,023 Kaliumbichromat wird entfernt. 1,05 5.20 0,0079 0,0396 0,024 0,024 IX. Bemerkungen über die chemische Ausnützung der Lichtenergie. Die im vorigen Abschnitt besprochene Assimilationsleistung der Blätter gelber Varietäten pflegt, obwohl ihr Chlorophyll gehalt oft bis unter 5 Prozent von demjenigen normal grüner Sorten heruntergeht, in starkem Lichte, selbst bei Darbietung einer hohen Kohlensäurekonzentration nur wenig und bei niederer Temperatur gar nicht hinter den Leistungen normal grüner Blätter zurückzustehen. Die Lichtausnützung ist daher bei den gelben Blättern, deren Pigment nur wenig Licht zu absorbieren vermag, eine besonders hohe. Gerade die gelben Varietäten eignen sich in beson- derem Maße zur Untersuchung der assimilatorischen Lichtwirkung. Assimilationszeiten. Die Ausnützung der Lichtenergie ist bei Kohlensäureüberschuß von einer im folgenden näher zu erklärenden Funktion des Plasmas abhängig, Sie läßt sich anschaulich ausdrücken, indem man die Versuchsergebnisse ii6 R. Willstätter und A. Stoll. anstatt wie sonst in Form der Assimilationszahlen in ümsetzungszeiten der Kohlensäure verzeichnet. Es seien die Zeiten, in denen bei einer gewählten Temperatur, überschüssigem Kohlendioxydgehalt des Gasstro- mes und im allgemeinen überschüssiger Belichtung das Molekül Kohlen- säure durch die molekulare Chloroph-yllmenge photosynthetisch umgesetzt wird, als Assimilationszeiten angegeben. Diese smd den Assimilations- zahlen umgekehrt proportional. Die Zeiten sind also sehr klein bei Blättern gelber Varietäten, größer bei normal grünen, sehr groß bei herbst- lichen Blättern. Da das Chlorophyll im Blatte nicht in molarer Lösung, sondern in kolloider Verteilung vorkommt, so stellen diese Assimilationszeiten Mittel- werte dar aus den Leistungen der in den Kolloidteilchen außen ge- legenen Moleküle, die der Einwirkung von Licht und Kohlensäure am gün- stigsten ausgesetzt sind, und aus der Beteiligung der tiefer befindlichen Moleküle. Die Assimilationszeiten werden für peripherische Moleküle der Kolloidteilchen kleiner sein, für Moleküle im Innern größer als die gefun- denen Mittelwerte. Je feiner che Verteilung, also je größer die Oberfläche Tabelle 44. A s s i m i 1 a t i o n s z e i t e n von B 1 ä 1 1 e r n ni i t \' e r s c h ie d e n e m Chloroph3'llgehalt. log frische Blätter, bei 25°, 5 proz. CO,, ungefähr 48000 Lux. Nr. Pflanzenart ' Beschreibung der Blätter ! Chloro- Datun, Phy^l; 1 gehalt (mg) Assimi- liertes CO2 (g) in 1 Stunde Mittlere Assimi- Um- lations- | setzungs- zahl ■ zeit in Sekunden I 2 3 Sambucus nigra gelbe Varietät ' 7. Juli 1 10. grüne Stammform 1 14. 0.75 0,81 23,5 0,088 0,097 0,145 117 120 6,2 1,5 1.5 28,4 4 5 Ulmus gelbe Varietät grüne Stammform 16. JuU 20. ,, 1,2 16,2 0,098 0,111 82 6,9 2,1 25,6 6 Tiha cordata junge Blätter im Frühling 12. Mai ...3 0,183 16,0 II. 0 7 alte Sommerblätter 25. Juni 28,1 0,188 1 6.7 26,2 8 Ampelopsis quin- quefolia jüngere Blätter im Herbst 17. Okt. 12,7 0,100 7.9 22,3 9 Ampelopsis quin- quefolia ältere Blätter im Herbst 16. 12,9 0,012 0,9 189 Bemerkungen über die chemische Ausnutzung der Lichtenergie. I17 des Pigmentes, desto geringer werden die Unterschiede sein zwischen inneren und äußeren Molekülen in dem Kolloidteilchen, also auch desto geringer die Unterschiede zwischen molarem und kolloidem Pigment. In der Tabelle 44 werden die Angaben von einigen Beispielen der früheren Abschnitte ergänzt durch Anführung der Assimilationszeiten (in Sekunden). Die in der letzten Spalte angeführten Zeiten lassen erkennen, in wie weiten Grenzen sich die Ausnützung des absorbierten Lichtes bewegt, das bei der angewandten intensiven Beleuchtung dem Farbstoffgehalt etwa proportional sein dürfte. Beispielsweise benötigte das Chlorophyll in herbstlichen Blättern des wilden Weines zur Reduktion eines Kohlen- säuremoleküls 120 mal mehr Zeit als in der Aureavarietät von Holunder. Die in besonderen Fällen beobachteten erstaunlich niederen Werte der Assimilationszeiten, zum Beispiel i^/o Sekunden, werden besser zu \'er- stehen sein mit der Annahme (Abhandlung IV) einer primären Bindung der Kohlensäure an den lichtempfangenden Farbstoff, der die Energie für die Reduktion der Kohlensäure nutzbar macht. Da die assimilatorischen Leistungen der Blätter gelber Varietäten im Lichte von Sonnenintensität und im Strome von 200 fachem Kohlen- dioxydgehalt der Atmosphäre sich den Leistungen grüner Blätter unter denselben Versuchsbedingungen (vergleiche Nr. 4 und 5 der Tabelle) nähern, so w^erden die gelben Blätter um so viel eher das in der Atmo- sphäre spärlich zur Verfügung stehende Kohlendioxyd im Sonnenlichte aufbrauchen. Die Assimilationsleistungen gelber und grüner Blätter müs- sen also praktisch gleich werden. Ausnützung schwächeren Lichtes. Die Vegetation der Erde würde, da eme Schutzwirkung des Chlorophylls sehr unwahrscheinlich ist\), übermäßig chlorophyllreich er- scheinen, wenn die Licht Verhältnisse im allgemeinen günstig wären. Allein die Leistungsfähigkeit der grünen Stammform und der gelben Varietäten ^y Vgl. den Schhiß des dritten Abschnittes Il8 R. Willstätter und A. Stoll. ist nur bei starkem Licht eine ähnliche. Es wird im XIII. Abschnitt ge- zeigt werden, daß die Assimilationsleistung gelber Blätter mit abnehmen- der Intensität des Lichtes sehr rasch sinkt, während die grünen Blätter -selbst in hochprozentigem Kohlendioxyd zunächst, nämlich bis zu etwa einem Viertel des Sonnenlichtes noch annähernd konstante Assimilation zeigen. Das Erfordernis hohen Chlorophyllgehalts für normal grüne Laub- blätt'er ist also bedingt durch die schwächere Belichtung in den Dämmer- stunden und bei bedecktem Himmel. Diese häufig nur kleine Bruchteile der Sonnenstärke betragende Beleuchtung genügt infolge des hohen Chlorophyllgehaltes im normalen Laube noch zur vollkommenen Assimila- tion des verfügbaren Kohlendioxyds. Durch diese Betrachtung wird auch der besonders hohe Chlorophyllgehalt ausgeprägter Schattenpflanzen er- klärt, die zum Beispiel im Halbdunkel des W'aldinnern gewiß keines Licht- schutzes bedürfen, die aber das gesamte eindringende Licht absorbieren und ausnützen. LTntersuchungen von Brown und Escombe. Daß in der Tat schon ein Zwölftel des Sonnenlichtes für die Assimila- tion des atmosphärischen Kohlendioxyds hinreicht und daß eine Erhöhung der Lichtstärke über diesen Bruchteil hinaus in Anbetracht der niedrigen Kohlensäurekonzentration ohne Einfluß auf die Assimilation ist, hat eine Untersuchung von H. T. Brown und F. Escombe^) gezeigt; die Schwä- chung des Sonnenlichtes ist durch die Anwendung gleichmäßig absorbie- render Schichten und rotierender Sektoren erzielt worden. Um nun für diesen Eall der günstigsten Lichtausnützung weiter zu ermitteln, mit welchem Ausnützungsfaktor die strahlende Energie der Sonne bei der Kohlensäureassimilation wirke, haben Brown und Escombe mit genauen thermoelektrischen Methoden den kalorischen Effekt des ■Sonnenlichts gemessen und mit der Verbrennungswärme der entstehenden Kohlehydrate verglichen; unter der Annahme der Verbrennungswärme von 3760 cal. für i g Hexose entspricht i ccm CO2 5,02 cal. umgewandel- H. T. Brown und F. Escombe, Proc. Roy. Soc. Ser. B, 76, 29, 94 [1903]. Bemerkungen über die chemische Ausnützung der Lichtenergie. liq ter Lichtenergie. Es ergab sich für den Fall bester Lichtausnützung, also bei ^/i2 Sonnehstärke, daß beispielsweise ein Blatt von Tropaeolum majus nur 4,1 Prozent der gesamten Strahlungin Form von chemischer Energie bindet. Die von einem Blatt bei durchfallendem Licht absorbierte Lichtenergie, die allein für die Photosynthese in Betracht kommt, beträgt nach den Messungen von Brown und Escombe 65 — 76 Prozent, so daß das Blatt in atmosphärischer Kohlensäure bei \'i2 Sonnenlicht etwa 6 Prozent des absorbierten Lichtes in chemische Arbeit umzusetzen vermag. Da das Licht im Blatte außer durch das Pigment auch durch Reflexion der farblosen Bestandteile am Durchgang gehindert wird, so trachteten Brown und Escombe auf Grund von Versuchen von W. E. Wilson allein die Absorption des Pigmentes zu ermitteln durch den Vergleich der Lichtdurchlässigkeit von Albinoblättern und grünen Blättern des Acer Negundo. Für helles Sonnenlicht wurde die Durchlässigkeit im Verhältnis folgender Zahlen gefunden: Durch Glas allein 100 Weißes Blatt eingeschaltet .... 25,5 Grünes Blatt eingeschaltet .... 21,3 Hieraus wurde gefolgert, daß das Pigment des grünen Blattes 16^/2 Pro- zent des Lichtes absorbiert, welches das weiße Blatt durchläßt. Diesen Wert verglichen Brown und Escombe mit den Ergebnissen von C. Timiri- azeff^), der zur Bestimmung des Absorptionsvermögens den Blattfarb- stoff mit Alkohol extrahierte und auf dieselbe Flächenkonzentration brachte, wie sie das Blatt aufweist. So fand Timiriazeff für mehrere Pflanzen eine Absorption von ^/j bis beinahe V3 des direkten Sonnenlichts. Den nicht sehr bedeutenden LTnterschied ihrer Zahl gegenüber den Befunden von Timiriazeff führten Brown und Escombe hauptsächlich auf die verschiedenartige Verteilung des Chlorophylls im Blatte und in der alko- holischen Lösung zurück. In dieser Beziehung zwischen den Versuchen von Brown und Escombe und von Timiriazeff ist aber ein L'mstand mit Unrecht außer Betracht gebheben: Timiriazeff arbeitet mit dem ^) C. Timiriazeff, Croonian Lecture, Proc. Roy. Soc. 72, 424, 449 [1903]. 120 R. Willstätter und A. Sloll. gesamten, beim Durchgang durch Glas nur sehr wenig geschwächten SonnenUcht, hingegen legen Brown und Escombe das vomi Albinoblatt durchgelassene, nämlich auf ein Viertel abgeschwächte Sonnenlicht als Lichtquelle ihrer Berechnung zugrunde. Auf das gesamte auffallende Licht bezogen, würde sich bei Brown und Escombe nur eine Absorp- tionsvermehrung durch das Pigment von 4,2 Prozent ergeben. Ausnützungsfaktor nach Weigert. Die Bestimmung des Lichtanteils, der zufolge dem Vergleich von W'cißen und grünen Blättern vom Blattfarbstoff allein absorbiert wird, schien ein Urteil über den Ausnützungsfaktor des Lichtes zu ermöghchen. Während Brown und Escombe sich darüber nicht äußern, vergleicht F. Weigert') in seiner Abhandlung ,,Der Ausnützungsfaktor der Licht- energie" das von den grünen Bestandteilen eines Blattes absorbierte (4,2 Proz.) und das zur Leistung chemischer Arbeit ver\yendete Licht (und zwar in die Rechnung eingesetzt als 4,1 Proz.). Durch diese Be- trachtung ließ sich Weigert zu dem Schlüsse führen, daß die vom Farbstoff absorbierte Lichtenergie zu 98 Prozent, also fast quantitativ, in chemische Arbeit umgesetzt w-erde. Überlegene Lichtausnützung der chloroph341armen Blätter. Der Auffassung von Weigert widersprechen die Ergebnisse, die aus unserer Untersuchung namentlich an chlorophyllarmen Blättern hervor- gegangen sind. Bei den gelben Varietäten sinkt der Chlorophyllgehalt bis weit unter ein Zw^ölftel normal grüner Blätter und die Assimilationsleistung übersteigt dennoch bei Belichtung von Sonnenstärke in 5 proz. Kohlen- dioxyd die von Brown und Escombe unter atmosphärischen Be- dingungen gefundenen Werte um ein Mehrfaches. Brown und Escombe geben nämlich für Tropaeolum majus, eine gut assimilierende Pflanze, unter den Bedingungen der Atmosphäre im Sonnenlicht die Assimilation ^) F. Weigert, Zeitschr. f. wissenschl. Photogr. ii, 3S1 [1912]; Die chemischen Wirkungen des Lichts, Stuttgart 1911, S. oS u. 106. Bemerkungen über die chemische Ausnützung der Lichtenergie. 121 eines Ouadratdezimeters Blattfläche zu 2,07 ccm CO2 in der Stunde an; die gelben Holunderblätter mit etwa 3 Prozent vom Chlorophyll der grünen Stammform vermögen unter unseren Versuchsbedingungen (Belichtung von Sonnenintensität, 5 proz. CO2, siehe Tabelle 38 im Abschnitt VIII) etwa 9 ccm Kohlendioxyd zu assimilieren. Die überlegene Ausnützung der Lichtenergie durch die chlorophyll- armen Blätter erhellt noch deutlicher aus den Versuchen mit schwacher Belichtung. Aus den Versuchsreihen des XIII. Abschnittes seien hier Beispiele angeführt, bei welchen die Blätter einer Belichtung von nur Vir bis ^/g Sonnenstärke ausgesetzt wurden. Es ist vorauszuschicken, daß unter solchen Verhältnissen (\/,2 Sonnenstärke) mit grünen Blättern von Holun- der und Ulme Assimilationsleistungen erzielt werden von 8 bis 9 ccm CO, für das Ouadratdezimeter Blattfläche in der Stunde. Die gelbblätterigen Versuchspflanzen von Holunder und Ulme mit einem Chlorophyllgehalt von y/go bzw. Vio des normalen assimilierten in der Stunde, bezogen auf das Ouadratdezimeter, 4,2 ccm CO2 (Holunder, ^/g Sonnenstärke) und 3.4 ccm CO2 (Ulme, ^|u^ Sonnenstärke). Bei diesen gelben Varietäten ergibt sich durch Interpolation aus den Versuchen mit verschiedener Belichtung die Assimilation bei Vjo Sonnenlicht (5 vol. -proz. CO2, 25°) auf das Quadratdezimeter Blattfläche = 2,8 ccm (Holunder) und 4.5 ccm CO2 (Ulme); die Zahl von Brown und Escombe für das grüne Blatt von Tropaeolum majus bei ähnlicher Temperatur in atmosphärischer Luft und bei V',, Sonnenlicht ist, wie oben angeführt, 2,07 ccm CO2. Die Lichtausnützung durch das Chlorophyll ist also unter den von uns gewählten Versuchsbedingungen, da man etwa die gleiche Flächen- konzentration des Farbstoffs bei den grünen Blättern von Ulmus, Sam- bucus und Tropaeolum annehmen darf, 40- und 20 mal größer bei den AureaVarietäten von Holunder und Ulme als bei grünem Tropaeolum unter atmosphärischen Bedingungen. Die Ausnützung des absorbierten Lichtes ist bedingt durch das Ver- hältnis von assimilatorisch wirksamem Enzym zum Chlorophyll. Sie folgt, solange Licht und Kohlensäure im Überfluß vorhanden sind und die Tem- 122 R- Willstätter und A. Stoll. peratur konstant ist, bei gleich bleibendem Chlorophyllgehalt der enzyma- tischen Leistung und ist daher der Assimilationszahl einigermaßen pro- portional. Die Lichtausnützung bewegt sich also im allgemeinen mit wachsendem und abnehmendem Chlorophyllgehalt in entgegengesetz- tem Sinne. Einfluß der anatomischen Verhältnisse auf dieLichtabsorption. In der Untersuchung von Brown und P^scombe und in der Betrach- tung von Weigert scheint stillschweigend vorausgesetzt zu sein, es be- finde sich das Chlorophyll auf der Unterseite des grünen Blattes, wie wenn es außerhalb des Blattgewebes wäre. Der Farbstoff würde dann nur von dem Licht, welches das weiße Blatt noch durchgelassen hat, d. i. etwa ein Viertel des Sonnenlichts, bestrahlt und absorbierte davon 16,5 Prozent oder, wie Weigert es ausdrückt, 4,2 Prozent des ganzen auffallenden Lichtes. Der von Weigert angegebene Ausnützungsfaktor der Lichtenergie hatte, da die Mehrabsorption durch das Chlorophyll des Blattes als Differenz von zwei großen Absorptionswerten gefunden war, nur den Sinn einer Schätzung ; die Angabe kann aber nach den Versuchen mit chlorophyll- armen Blättern auch nicht der Größenordnung nach gelten. Die Schwie- rigkeit, die Energieausnützung zu bestimmen, wird durch eine anatomische Betrachtung des Blattes, im besonderen der Anordnung des assimilato- rischen Farbstoffes im Blattinnern erklärt. Bei gewöhnlichen Laubblättern steht die Spreite zumeist senkrecht zur Hauptstrahlenrichtung des Himmelslichtes. Betrachten wir nun zu- nächst am Beispiel des chlorophyllfreien Blattes von Acer Negundo den Gang der Lichtstrahlen. Sie treten durch die aus plattenförmigen Zellen bestehende obere Epidermis (Fig. 4) ein, passieren die dicht gedrängt und parallel zur Strahlenrichtung stehenden Zellen des Palisadengewebes und treten durch die mit den einzelnen Palisadenzellen in Verbindung stehenden Sammelzellen in das Schwammparenchym ein in nahezu ungeschwächter Intensität und, da sie das dichtere Medium senkrecht durchlaufen haben, ohne Ablenkung aus ihrer Richtung. Schon die Sam- Bemerkungen über die chemische Ausnützung der Lichtenergie. 123 melzellen und noch mehr die tiefer liegenden Zellen des Schwammparen- chyms umgeben mit ihren mannigfaltig gewölbten Flächen die Kanäle des Durchlüftungssystems. Die Lichtstrahlen treffen darin schief auf die Grenzschicht gegen das dünnere Medium Luft und werden von den als Spiegel wirkenden gewölbten Zellwänden großenteils total reflektiert und in alle möglichen Richtungen zerstreut. Ein Teil des Lichtes verläßt schließlich diffus durch die untere Epidermis das Blatt. Dies ist der Lichtanteil, den Brown und Escombe als ein Viertel des auf- fallenden Lichtes bestimmt ha- ben. Ein Teil wird bei der vielfachen Reflexion und beim häufigen Passieren in seitlicher Richtung durch die natürlich nicht absolut farblose Blattsub- stanz absorbiert. Ein besonders erheblicher Teil aber wird total reflektiert und tritt durch die obere Epidermis diffus wieder aus; diesen Teil des auffallenden Lichtes strahlt also das chloro- phyllfreie Ahornblatt zurück, ver- gleichbar mit einer Schneefläche. Das vom weißen Blatt reflek- tierte Licht hätte in den be- sprochenen Messungen auch be- rücksichtigt und bestimmt werden müssen und dieser Anteil wäre wahr- scheinlich größer gefunden worden als die Transmission, wie schon der einfache Helligkeitsvergleich eines Albinoblattes im auf- und im durch- fallenden Lichte wenigstens für sichtbare Strahlen zeigt. Daß das fein verzweigte Durchlüftungssystem im Blatte an der Re- flexion des Lichtes Schuld trägt, zeigt einfaches Pressen des Blattes oder das Vertreiben der Luft durch Auskochen. Dann erscheint das Blatt im Fig. 4. Gang der Lichtstrahlen im Blattgewebe. 124 ^- Willstätter und A. Stoll. durchfallenden Lichte heller, im auffallenden auf schwarzem Hintergrund dunkler; ein grünes Blatt wird durchsichtig grün, das weiße nahezu farblos. Im grünen Blatt tritt das Licht (Fig. 4) mit unverminderter Intensität durch die farblose Epidermis in die Palisadenzellen ein und trifft hier auf die Chloroplasten, welche die Zellwände bei vielen Blättern ganz über- decken. Der durchgelassene Teil der Strahlen trifft weiter assimilatorischen Farbstoff in den Sammelzellen und in den eigentlichen Zellen des Schwamm- parenchyms, die freilich viel ärmer an Chloroplasten als die Palisaden- zellen sind. Das noch nicht absorbierte Licht wird dann großenteils durch totale Reflexion in alle Richtungen verteilt, so daß die Chloroplasten von jeder Seite bestrahlt werden, die Körner im Palisadengewebe auch von unten. Ein Lichtbündel, das zum Beispiel an der untersten Zellschicht des Schwammparenchyms nach oben total reflektiert wird, passiert die chlorophyllführende Schicht wiederholt. Eine noch größere Schicht absorbierenden Farbstoffs durchlaufen schief nach oben zurück- geworfene Strahlen. Die Absorption der reflektierten Strahlen geht so weit, daß viele Blätter, zum Beispiel die der Roßkastanie, in hellem Sonnen- licht auf dunklem Grunde beinahe schwarzgrün erscheinen. Wie groß ist der Unterschied im Betrage des reflektierten Lichtes zwischen grünem und weißem Blatt! Beide lassen infolge totaler Reflexion einen Anteil des Lichtes nicht hindurch, das weiße Blatt strahlt denselben zurück, das grüne Blatt absorbiert ihn. In Anbetracht dieses Unterschiedes ist ein einfacher Vergleich der Lichtabsorption im grünen und weißen Blatt nicht zulässig. Bemerkungen über die Untersuchungen von Timiriazeff und über die Bestimmung des Ausnützungsfaktors. Die Bestimmung der Lichtabsorption im Blatte nach C. Timiriazeff erscheint uns gleich anderen Versuchen in dieser Richtung nicht einwand- frei, zunächst weil Timiriazeff die gewöhnliche Lösung des Pigmentes in Alkohol untersucht hat, während das Chlorophyll im Blatte sich in kolloidem Zustand behndet, und ferner, weil das Licht im Blatte den Bemerkungen über die chemische x\usnützung der I.ichtenergie. 125 Farbstoff nicht nur in einfacher, sondern infolge der totalen Reflexion in mehrfacher Schicht passiert. Man wird dem wahren Werte der Lichtabsorption durch den Farbstoff im Blatte am nächsten kommen, wenn man von dem Werte des auffal- lenden Lichtes das durch das Blatt hindurchgehende Licht (nach Brown und Escombe bei Acer Negundo 21,3 Prozent) und das vom Blatt reflek- tierte Licht, welches noch nicht bestimmt worden ist, subtrahiert. Es wird dabei willkürlich angenommen, daß die Absorption durch das beinahe farblose Blattgewebe geradezu verschwindend klein ist und vernachlässigt werden darf. Dieser Anteil des Lichtes dürfte nicht an einem Albinoblatte bestimmt werden ; er würde hier zu hoch ausfallen, da im Falle des grünen Blattes absorbierendes Pigment sich überall den Lichtstrahlen in den Weg stellt, bevor das Licht zur Absorption durch Zellwände, Vaku- olen usw. gelangt. Wollte man den Betrag des reflektierten Lichtes willkürlich gleich dem transmittierten setzen, w^as natürlich zu hoch wäre, so käme man zu dem Ende, daß mehr als die Hälfte des Lichtes, jedenfalls viel mehr als bisher angenommen wurde, vom assimilatorischen Farbstoff im grünen Blatte absorbiert werde. Die Absorption des Chlorophylls ist unterstützt durch die eigenartige Struktur des Scfiwammparenchyms, das außer seiner Funktion der Durchlüftung und der Ableitung von Assimilaten noch eine wTsenthche Aufgabe in optischer Beziehung erfüllt, indem es mit seinen spiegelnden Zellwänden zur weitgehenden Absorption des Himmelslichtes hilft. Untersuchung des Lichtdurchganges durch grüne Blätter. Gemäß den anatomischen Verhältnissen absorbiert das grüne Blatt viel mehr Licht, als es unter den natürlichen Bedingungen in chemische Ener- gie umsetzt. Trotzdem das Blatt mit einem Bruchteil, nämlich einem Zwölftel, des Sonnenlichtes seine Arbeit in der Natur zu leisten vermag, läßt es auch bei Sonnenintensität nur einen kleinen Teil des assimilatorisch wirk- samen Lichtes passieren. Wenn man ein grünes Blatt mit einem zweiten 126 R. Willstätter und A. Stoll. Blatte als Lichtfilter überdeckt, so vermag es bei Anwendung einer Licht- quelle von Sonnenstärke gemäß nachfolgendem Versuche nur noch schwach zu assimilieren. Aus einem tiefgrünen Kürbisblatt von jungem Sproß (22. Juh) wurden zwischen Basis und Spitze 269 qcm Blattfläche von 8,0 g Gewicht und 14,0 mg Chlorophyllgehalt (bestimmt nach der Belichtung) herausge- schnitten. Wir legten das Blattstück sofort in die Mitte der Assimilations- kammer auf das Silberdrahtnetz, so daß die schräg abgeschnittenen Haupt blattnerven den nassen Boden der Kammer berührten. Das anfangs etwas welke Blatt wurde wieder schön frisch während des Verdrängens der Luft aus dem Apparat durch 5 proz. Kohlendioxyd und der üblichen Vorperiode vor der ersten Assimilationszeit (Dauer der Vor- periode 40 Minuten, i 1 Luft bei 25 ° und 752 mm Hg entspricht 0,0852 g COO- Die folgende Tabelle 45 verzeichnet die bemerkenswerteren Beobach- tungen für die Assimilation erstens bei normaler Belichtung, zweitens bei Vorschaltung eines Kürbisblattes (von demselben Sproß gepflückt), drittens bei Vorschaltung von zwei derartigen Kürbisblättern. Um als Lichtschirm zu dienen, waren die Blätter im Apparate über der Assimilationskammer und unterhalb des oberen Kühlbades (F in Fig. 2) in dem schwarzen Blech- zylinder C angebracht. Das Licht ist dadurch lückenlos abgeblendet wor- den. Die in der dritten Spalte der Tabelle angeführten Temperaturdiffe- renzen zwischen dem Versuchsblatt und dem die Assimilationskammer umgebenden Kühlwasser verminderte sich schon beim Einschalten des ersten Filterblattes, aber sie kam auch beim Einschalten des zweiten Filterblattes nicht zum Verschwinden. Es werden, wie man daraus er- kennt, nicht alle Strahlen, wohl aber alle assimilatorisch nützlichen von den abblendenden Blättern zurückgehalten, trotzdem die wirksamen Strahlen in den Filterblättern bei weitem nicht vollständig zur Assimila- tion ausgenützt werden. Die Assimilationsleistung ist beim Vorschalten eines grünen Blattes auf 1/20 des ursprünghchen Betrages und beim Vorschalten von zwei Blättern auf Null gesunken; obwohl das Versuchsblatt in der langen Assimilationsleistung ergrünender etiolierter Blätter. 127 Tabelle 45. Assimilationsleistung bei direktem und mit Blättern abgeblendetem Licht. Ungefähr 48000 Lux, 25°, 5 vol. - proz. COj, 8,0 g Blattspreitc von Cucurbita Pepo mit 14,0 mg Chlorophyll. Belichtung Intervall in Minuten Temperatur- differenz zwischen Blatt und Kühlwasser Austretende Luft (1) CO2 (g) im Ge- misch mit 1 1 austretender Luft .assimiliertes CO2 (g) für das Intervall für i Stunde Ungeschwächt 20 2,3° 1,00 0,0303 0,0549 0,165 20 2,3° 1,00 0,0287 0,0565 0,170 I Blatt eingeschaltet 20 0,8° 1,00 0,0799 0,0053 0,016 20 0.7° 1,00 0,0822 0,0030 0,009 2 Blätter eingeschaltet 20 0,5° 1,00 0,0853 — 0,0001 0,000 140 0.5' 7,00 0,0846 0,0042 0,002 Ungeschwächt (beide Fil- terblätter entfernt) 20 2,3° 1,00 0,0374 0,0478 0.143 20 2,0^ 1,00 0,0351 0,0501 0,150 20 — 1,00 0.0343 0,0509 0.153 Dauer etwas welk geworden, stieg die Leistung nach dem Entfernen der Filterblätter beinahe wieder zu dem Betrag vom Versuchsbeginn. Dieser Undurchlässigkeit der Blätter für assimilatorisch wirksame Strahlen wird von der Pflanze Rechnung getragen; der Kürbis breitet durch lange kriechende Stengel seine Blätter so nebeneinander aus, daß sie sich gegenseitig nicht überdecken. X. Assimilationsleistung ergrünender etiolierter Blätter. Die Versuchspflanzen, Phaseolus vulgaris und Zea Mays, züch- teten wir im Gewächshause in den Monaten Mai und Juni. Die Samen wurden in mittelgroßen Töpfen, die mit gereinigtem und befeuchtetem Sägemehl gefüllt waren, zur Keimung gebracht. Nach dem Ankeimen bedeckte man einen Teil der Töpfe mit 50 cm hohen, aus schwarzem Papier gefalteten Hohlkegeln, die den Lichtzutritt ausschlössen, ohne die Luft- zirkulation zu verhindern. Die schwarzen Hüte waren zum Schutz vor der Erwärmung durch Sonnenlicht mit Mänteln aus glattem weißem Pa- pier überdeckt. Die ähnlich rasche Verdunstung des Gießwassers bei den 128 R. Willstätter und A. Stoll. bedeckten und den unbedeckten Kulturen ließ auf übereinstimmende Transpirationsverhältnisse bei den etiolierten Pflanzen und ihren Kontroll- exemplaren schließen. Zehn Tage nach der Aussaat beschickten wir die Töpfe mit je loo ccm van der Cronescher Nährlösung. Um diese Zeit trugen die Lichtpflanzen bereits gut entwickelte, schön grüne Blätter, während die etiolierten Bohnen an langen dünnen Stengeln nur sehr kleine, gefaltete Blätter aufwiesen. Bei den Assimilationsversuchen waren daher für das nötige Blattgewicht viel zahlreichere etiolierte Exemplare erfor- derlich als normale Pflanzen. Anders verhielt es sich mit den im Dunkeln gezogenen Maispflanzen. Diese trieben nämlich etwa gleich große und ähnlich ausgebreitete Blätter wie die normalen Gewächse; sie unterschie- den sich nur durch das Fehlen des Chlorophylls, und sie eigneten sich daher in besonderem Maße für den Vergleich der assimilatorischen Lei- stung. Die 15 Tage alten etiolierten Bohnenpflanzen wurden abgedeckt und dem Tageslicht, das auf etwa ein Drittel abgeblendet war, ausgesetzt; es herrschte nur zeitweise Sonnenschein. Schon in zwei Stunden erfolgte deutliches Ergrünen der Blätter und nach zwei Tagen waren die nun ent- falteten, aber immer noch kleinen Blätter erst etwa so grün wie die frühe- sten Proben der in unseren quantitativen Versuchen geprüften Frühlings- blätter (s. Abschnitt VA.). Nach 4 Tagen endlich erreichten sie normal grüne Farbe, während die Blattfläche noch immer sehr klein blieb. Die etiolierten und 17 Tage nach der Aussaat dem teilweise abgeblendeten Tageslicht ausgesetzten Maispflanzen ergrünten in 9 stündiger Belichtung nur sehr wenig und waren auch nach drei Tagen wohl normal groß und ausgebreitet wie die Lichtgewächse, aber nur schwach gelbgrün. Selbst nach 5 Tagen unterschieden sich die Blätter noch durch ihr helleres Grün von den Kontrollexemplaren. Bei der mikroskopischen Untersuchung erwies sich das kräf- tig gebaute Zellgewebe der am Licht gezogenen tief grünen Bohnenblätter mit verhältnismäßig großen und schön grünen Chloroplasten reichlich ausgestattet; namentlich die Wände der Palisadenzellen waren damit ganz überdeckt. In den unter Lichtausschluß gezogenen und zwei Tage * Assimilationsleistiing ergrünender etiolierter Blätter. I29 belichteten, also noch hellgrünen Bohnenblättern zeigte sich das Blatt- gewebe viel schwächer gebaut. Die Chloroplasten waren kleiner, aber ebenso zahlreich wie bei den Lichtblättern und sie bedeckten im Pali- sadenge v/ebe die Zellwände. Unterscheidend war hauptsächlich der Farb- stoffgehalt. Die noch unbelichteten etiolierten Blätter, schön goldgelb und zusammengerollt, zeigten im Schnitte bei noch schwächerem Bau doch genau dieselbe Ausbildung von Palisadengewebe und Schwamm- parenchym, wenn es auch noch an deutlich abgegrenzten Chloroplasten fehlte. Das schwach grünlichgelbe Protoplasma ist in nahezu homogener Schicht an die Zellwände angelagert und grenzt namentlich in den Pali- sadenzellen durch Brückenbildung einzelne Vakuolen ab. An einigen Stellen erscheint die Protoplasmaschicht knötchenartig verdickt wie in angedeuteter Differenzierung zu Chloroplasten, die erst bei längerem Be- lichten auf dem Objektträger deutlicher wird. Der Fähigkeit zur Assi- milation geht offenbar die vollständige Ausbildung der Assimilations- organe voraus; erst in den Chloroplasten erfolgt die Bildung des Chloro- phylls. Von den im Abschnitt VIII beschriebenen chlorophyllarmen Blättern der Aureavarietäten unterscheiden sich die nun zu behandelnden gelben Blätter der etiolierten Gewächse. In jenen Fällen ist die Eigenart der Blätter, die, bezogen auf den Chlorophyllgehalt, eine außerordentliche Leistung vollbringen, eine dauernde, bei den etiolierten Pflanzen ist die Erscheinung vorübergehend, sie ist nach vollständigem Ergrünen nur eben noch bemerkbar. Durch die große Änderung, die ihre Assimilations- energie in kurzer Zeit durchmacht, sind die etiolierten Gewächse ein be- sonders interessantes Versuchsobjekt. Die assimilatorische Fähigkeit etiolierter Pflanzen während der Zeit des Ergrünens ist von Fräulein Irving i) in einer ausführlichen Arbeit unter der Leitung von Blackman untersucht worden-). A. A. Irving ^) A. A. Irving, Ann. of Botany 24, 805 [1910]. 2) Auch die wiederholt angeführte Abhandlung von A. J. Ewart (Journ. of the Linnean Soc, Botany, 31, 554 [1897]) behandelt in ausführhcher Weise die Assimilation etiolierter Gewächse, ohne indessen einen einfachen Zusammenhang zwischen dem Chlorophyllgehalt und der Assimilation zu ergeben. Willstätter-Stoll, Assimilation. q I30 R. Willstätter und A. Stoll. hat den Versuchspflanzen nicht kohlensäurehaltige Luft zugeführt, son- dern ihnen nur die eigene Atmungskohlensäure geboten. In einer Reihe genau beschriebener Versuche findet sie, daß noch gar keine Assimilation stattfinde, selbst wenn die Pflanzen schon einen großen Teil vom Chloro- phyll besitzen, so daß sie grasgrün aussehen. Die Versuche sind mit Schößlingen von Hordeum und von Vicia Faba ausgeführt; die von den Pflanzen abgegebene Kohlensäure wird in zweistündigen Perioden im Dunkeln und bei Belichtung verglichen und der Eintritt der Photo- synthese am Kohlendioxydverbrauch in den Belichtungsintervallen er- kannt . Von den Irving sehen Tabellen sollen in Anbetracht der Wichtigkeit der aus den Resultaten gezogenen Schlußfolgerungen zwei Beispiele hier angeführt werden. Nr. der (I) Etiolierte Blätter von Gerste (25,2°) (V) Etiolierte Sproßenden von Vicia Faba (25°) Ab- lesung Abgegebenes COj (g) Belichtung Farbe der Blätter Abgegebenes COg (g) Belichtung Farbe der Blätter I 0,0035 Dunkel orangegelb 0,0021 Dunkel blaßgrün 2 0,0032 ,, 0,0017 ,, 3 0,0036 Licht 0,0015 ,, 4 0,0035 ,, Spuren von Grün 0,0016 Licht 5 0,0030 ,, 0,0022 ,, 6 0,0028 Dunkel 0,0020 ,, grasgrün 7 0,0029 ,, 0,0019 Dunkel 8 0,0024 ,, 0,0012 ,, 9 0,0028 ,, 0,0011 ,, lO 0,0026 Licht 0,0012 ,, II 0,0024 ,, blaßgrün 0,0011 ,, 12 0,0020 ,, 0,0010 ,, 13 0,0022 Dunkel 0,0009 Licht 14 0,0020 ,, 0,0009 ,, 15 0,0021 ,, 0,0007 ,, dunkler grün, doch 16 0,001g „ 0,0009 Dunkel nicht normal grün 17 0,0018 ,, 0,0007 ,, 18 0,0018 Licht 0,0008 ,, 19 0,0020 ,, grasgrün 0,0008 20 0,0021 Dunkel 0,0009 ,, 21 0,0020 .. — — Es ist überraschend und schwer erklärlich, daß unsere Versuche mit den etiolierten Blättern zu gerade entgegengesetzten Ergebnissen führen. Während nach A. A. Irving die Fähigkeit zur Photosynthese ganz unabhängig von der Chlorophyllbildung sein und in Abhängigkeit Assimilationsleistung ergrünender etiolierter Blätter. 13I von einer Komponente der photosynthetischen Maschine stehen soll, die sich bei der Belichtung später als das grüne Pigment ausbildet, be- weist im Gegenteil unsere Messung, daß die spezifische Funktionstüchtig- keit des Plasmas bereits den Ausschlag gibt, bevor Chlorophyll reichlich gebildet ist. Die unter Bedingungen maximaler Assimilation ausgeführte Untersuchung der photosynthetischen Leistungsfähigkeit ergrünender etiolierter Blätter ergibt also eine Abweichung von der Norm im entgegen- gesetzten Sinn als Irving angenommen hat. Wir haben im Hinbhck auf den Widerspruch zwischen den Beobachtungen von Irving und den unserigen einige Versuche auch unter den Bedingungen von Irving an- gestellt, nämlich die ergrünenden Blätter in kohlen säurefreier Luft ge- prüft, so daß denselben nur ihre Atmungskohlensäure zur Verfügung stand. Aber auch unter diesen Verhältnissen gelang es festzustellen, daß die Blätter bereits in einem sehr frühen Zustand des Ergrünens, nämlich mit 3 — 6 Prozent vom normalen Chlorophyllgehalt, ihre Atmungskohlen- säure vollständig verbrauchen (Tabelle 46). Unsere Versuchsanordnung war in einer wichtigen Beziehung genauer als bei Irving. Wir beobachteten nämlich die Temperatur unmittelbar an den behchteten Blättern, nicht in einem umgebenden Bade, und unterdrückten durch geeignete Kühlung die durch Bestrahlung der Blätter bewirkte Temperatursteigerung, so daß vermehrter Atmung und erhöhter Kohlensäureabgabe vorgebeugt war. Diese Gefahr ist bei Irving nicht vermieden worden, aber es ist doch zu bezweifeln, daß diese Fehlerquelle allein für die abweichenden Resultate verantworthch ist. Erster Versuch. Mit Phaseolus vulgaris. 14 Tage nach der Aussaat. Von 10'' vorm. bis 4^ nachm. (Juni) mit etwa einem Drittel Tageshcht belichtet; nach drei Stunden waren die Blätter grünlichgelb, nach sechs Stunden gelbgrün etwa wie die von uns untersuchten Aureavarietäten. Man hielt sie wieder unter Lichtausschluß und verwendete in etwas aus- gebreitetem Zustand 40 Blätter von 20 Pflanzen (4,4 g) am folgenden Tag zum Versuch. Zweiter Versuch. Mit Zea Mays. 15 Tage nach der Aussaat. Von 10^ vorm. an 24 Stunden bei halbbedecktem Himmel (Juni) offen auf- 9* 132 R. Willstätter und A. Stoll. gestellte Blätter (8,0 g), von der Basis bis zur Mitte grünlich, in der oberen Hälfte gelb. Tabelle 46. 25 °, kohlensäurefreie Luft, ungefähr 48 000 Lux BeUchtung Intervall Belichtung Abgegebenes COg (g) in Minuten I. Versuch, Phaseolus 2. Versuch, Zea Mays 20 Dunkel 0,0021 0,0017 20 ,, 0,0017 0,0017 20 Licht 0,0006 0,0010 20 ,, 0,0000 0,0005 20 ,, 0,0000 0,0002 20 Dunkel — 0,0010 60 ,, 0,0048 0,0042 20 ,, 0,0013 — Besonders bei den chlorophyllarmen Blättern ist es zur Beobachtung der Assimilation viel zweckmäßiger, überschüssige Kohlensäure zuzu- führen; man findet dann nicht nur, wie bei Irving und wie in den oben- stehenden Versuchen, ob Assimilation eingetreten ist, sondern man ge- winnt ein Maß für die Assimilationsenergie. Daher wurden die Assimila- tionszahlen unter den hier üblichen Bedingungen maximaler Assimilation ermittelt ; dabei erreichten sogar die absoluten Beträge der von Phaseolus assimilierten Kohlensäure schon nach dem ersten Ergrünen die Leistungen der gelbblätterigen Varietäten und die Assimilationszahlen waren so hoch wie bei diesen. In der Tabelle 47 sind die Beobachtungen mit den Blättern in verschie- denen Zuständen des Ergrünens und mit den am Licht gezogenen Ver- gleichsexemplaren zusammengestellt . Die Blätter der Versuche Nr. i und 2 wurden nach dem Verweilen in kohlensäurefreier Luft mit 5 proz. Kohlendioxyd umspült und nach Ermittlung des CO2 - Wertes für i 1 im Dunkeln übergeleiteter Luft behchtet. Beim ersten Versuch der Tabelle sind zwei Reihen von Messun- gen ausgeführt worden, unterbrochen durch eine Ruhepause von 3 Stun- den, mit wiederholter Kontrolle der Atmung, die konstant bUeb. Man fand nämlich für i 1 austretender Luft des im Dunkeln durch die Assimilations- kammer geleiteten Gasstromes 0,0922 g und 4 Stunden später wieder Assimilationsleistung ergrünender etiolierter Blätter. 133 0,0922 g CO2. Der Kohlensäureverbrauch bheb während des Versuches, auch nach der Ruhepause, gleich tief, und zwar von 5 g Blättern 6 bis 7 mg in der Stunde. Die Blätter sind bei dreistündigem Belichten mit der Metallfadenlampe von etwa 48 000 Lux gelb geblieben, während gleich- artige in diffusem Tageslicht sich in der nämlichen Zeit schon grünlichgelb färbten. Diese Erscheinung dürfte auf dem geringen Gehalt der Licht- quelle an violetten Strahlen beruhen, denen bei der Entstehung des Pigments eine Rolle zukommt. Hingegen machte die Chlorophyllbildung bei den schon etwas ergrünten etiolierten Blättern ebenso wie bei den Frühlingsblättern auch im Lichte der Metallfadenlampe rasch Fort- schritte. Im zweiten Versuch setzte bei noch sehr niedrigem Chlorophyllgehalt, der am Ende der Beobachtungszeit zu 0,3 mg bestimmt wurde, eine rege Assimilationstätigkeit ein, so daß sich in diesem einen Falle die ungewöhn- lich hohe Assimilationszahl 133 ergab. Das rasche Ergrünen in der Entwicklung der etiolierten Blätter vom Versuche Nr. i — 4 kommt in den Zahlen des Chlorophyllgehaltes w^eniger zum Ausdruck, weil die etiolierten Blättchen beim Belichten außergewöhn- lich schnell wachsen. Man brauchte im Versuch i 50 erste Laubblättchen, in Nr. 2 38, in Nr. 4 20 Blätter für 5 g. Die durchschnittliche Fläche eines Blattes nahm in den zwei Tagen vom dritten zum vierten Versuche von 8 auf 13 qcm zu. Am Lichte gezogene Blätter hatten 39 qcm Fläche. Während bei Phaseolus das Zurückbleiben im Wachstum der Blatt- spreiten im Dunkeln den Vergleich etwas störte, waren die Zahlen für Chlorophyllgehalt und Leistung etiolierter und normaler Blätter bei Zea Mays unmittelbar vergleichbar ; in den Versuchen 6 — 8 und im Versuch 9 mit der Lichtpflanze waren gleichviel Blätter erforderlich (8 g = 32 bis 34 Blätter). Es ist eben bei Mais besonders bemerkenswert, daß die assimilatorische Leistung der etioherten und in fünf Tagen ergrünten Blätter erheblich größer ist (0,085 g CO2 gegenüber 0,060 g in der Stunde) als die Leistung der am Licht gezogenen, beträchtlich chlorophyllreicheren Blätter {ß,y mg Chlorophyll gegenüber 11,7). Das nämliche Ergebnis berechnet sich auch 134 R. Willstätter und A. Stoll. bei der Bohne, wenn man das Frischgewicht und die Blattfläche statt der Anzahl von Blättern in Rechnung zieht. Daß die etiolierten Blätter, sobald sie nur Gelegenheit zur ersten Chlorophyllbildung 0 erhalten haben, infolge der fertigen enzymatischen Ausrüstung ihres photosynthetischen Apparates die Lichtpflanzen an Lei- stungsfähigkeit sogar übertreffen, zeigt sich auch bei der Beobachtung der Gewichtszunahmen. Die stündliche Trockengewichtsvermehrung der etiolierten Bohnenblätter in den Versuchen 3 bis 5 betrug übereinstimmend 9 Prozent, trotzdem die Zustände der Versuchspflanzen, gemäß der starken Vermehrung des Blattfarbstoffes, so verschieden waren. Bei Mais erreichte Tabelle 47. Assimilationsleistungen ergrünender etiolierter Blätter. 25°, 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. — ||S Von 10 g frischen Assimiliertes COg (g) g^*> Blättern in I Stunde von Belichtung i> «^ c 'S 7o 2 ,, ,, II. VI. 6 Stunden grünlichgelb 4.4 — — 0.7 0,091 — - 133 3 ,. 29. V. 2 Tage gelbgrün 5,0 1.40 432 8,0 0,192 0,137 0,044 24 4 ., 31. V. 4 Tage grasgrün 3,0 1.48 520 15.6 0.208 0,140 0,040 13,3 5 Am Licht gezogene Vergleichspflanze 5.0 1,28 552 18,6 0,174 0,136 0,032 1 9,4 6 Zea Mays 14. VI. 1 I Tag stellenweise 8,0 grünlichgelb 0,80 567 0.4 0,007 0,008 0,001 [ 18 7 ,. 31. V. 2 Tage grüngelb 8,0 1,00 691 2.75 0,045 0,045 0,006 16,4 8 3. VI. 2 Tage grasgrün 8,0 1,00 585 8,7 0,085 0,085 0,015 9,7 9 Am Licht gezogen e Vergk üchspflanze 1 |8.o 1.35 642 II. 7 0,060 0,044 0,009 5.1 ^) Der in den etiolierten Bohnenblättern enthaltene gelbe Farbstoff ist weder Carotin noch Xanthophyll, er ist wasserlöslich, wird mit Alkalien tief gelb und durch Säure entfärbt, um dann beim Versetzen mit Lauge wieder Farbumschlag in Gelb zu geben. Das Blatt- gewebe hinterbleibt nach Extrahieren mit Wasser oder wasserhaltigem Aceton farblos, Aceton entzieht ihm weder nachweisbare Mengen von Chlorophyll noch Carotinoid. Der wässerige Auszug der etiolierten Blätter gibt an Äther auch beim Aussalzen kein Pigment ab. Unsere etiolierten Maisblätter enthielten gleichfalls den wasserlöslichen Farbstoff sehr reichlich, neben demselben aber auch schon wasserunlösliches, ätherlösliches Carotinoid in er- heblicher Menge. Während der Belichtung schreitet die Carotinoidbildung rasch fort, anfangs aber scheint die Lichtabsorption durch den primär vorhandenen wasserlöslichen Farbstoff von Bedeutung zu sein, den wir auch allgemein bei jungen Frühlingsblättern beobachten. Untersuchung chlorotischer Blätter. 135 die Trockengewichtszunahme schon in der frühen Ergrünungsphase des Ver- suches 7 den bei der Lichtpflanze (Nr. g) gefundenen Wert von 3 Prozent, und die Gewichtsvermehrung der etioherten Blätter stieg auf das Doppelte, nachdem sie 75 Prozent des normalen Chlorophyllgehaltes erreicht hatten. Die ergrünenden etioliertenBlätter ergeben, solange ihr Chlo- rophyllgehalt noch gering ist, viel höhere Assimilationszahlen als andere jugendliche Blätter, zum Beispiel als die im Frühling aus den Knospen tretenden. Der Unterschied dürfte darauf beruhen, daß die Produktion des Chlorophylls durch den Lichtausschluß unterdrückt ist, aber nicht die Bildung des für die assimilatorische Leistung mitverantwort- lichen enzymatischen Faktors. Diese Komponente des Systems scheint sogar angereichert oder begünstigt zu sein, denn die etiolierten und dann ergrünten Blätter übertreffen nicht nur im Verhältnis zum Chlorophyllgehalt, sondern auch in den absoluten Beträgen der assimilierten Kohlensäure die normalen Pflanzen. Die etiolierten Blätter bei beginnendem Ergrünen sind in ihren Assi- milationszahlen den Blättern gelber Varietäten (Abschnitt VIII) ähnlich. XL Untersuchung chlorotischer Blätter. Die nachfolgenden Versuche betreffen eine vierte Gruppe chloro- phyllarmer Blätter. Mit den herbstlich vergilbten Blättern, mit den Aurea- varietäten, mit den etiolierten Blättern sollen hinsichtlich der Assimila- tionsenergien die chlorotischen Pflanzen verglichen weiden, mit denen unseres Wissens noch keine quantitativen Beobachtungen angestellt wor- den sind. Bei chlorophyllarmen Blättern, also auch bei den chloro- tischen, kann man nicht auffallend tiefe Assimilationszahlen erwarten, da selbst eine spärliche Leistung, bezogen auf die Chlorophyllmenge, schon einen ganz ansehnlichen Quotienten ergibt. Wenn das ganze assimilatorische System schlecht eingerichtet ist, wird man bei einem chlorophyllarmen Blatt doch noch zu mittleren oder nur mäßig deprimier- ten Assimilationszahlen gelangen. Es wäre aber auch möglich, daß dem infolge von Eisenmangel so spärlich gebildeten Pigment ein leistungs- 136 R. Willstätter und A. Stoll. fähiger enzymatischer Apparat gegenüberstände; in diesem Falle würden sich hohe Assimilationszahlen ergeben. Es wird also gefragt, ob das Eisen lediglich zur Chlorophyllproduktion unentbehrlich ist oder ob eine Eisen- verbindung mit dem Chlorophyll bei der Assimilation zusammenwirkt. Die Versuchspflanzen wurden im Gewächshaus in Wasserkulturen gezogen. Die Samen von Pferdezahnmais und von Sonnenblume ließen wir, in reines, mit destilliertem Wasser befeuchtetes Filtrierpapier ein- gehüllt, im April bei etwa 20° ankeimen. Nach 4 Tagen, als die Würzel- chen schon 2 — 3 cm lang waren, brachte man die Keimlinge in die rich- tige Lage, in senkrechte Falten von feuchtem Filtrierpapier, wo in 8 Tagen die Würzelchen bis zu einer Länge von 10 — 15 cm gediehen und grüne Blättchen zum Vorschein kamen. Darauf wurden die Keimlinge mit den in Watte gehüllten Samenüberresten paarweise oder zu dritt in durchlochte Korkplatten gesteckt und so über der Nährlösung angeordnet, daß die Wurzeln bis auf das oberste Zentimeter eintauchten. Mit der Nährlösung nach van der Crone^), worin das Ferrophosphat durch einen Mehrbetrag von Calciumphosphat ersetzt war, und für die Kontroll- versuche mit der normalen Nährflüssigkeit waren Gefäße von 3 — -5 1 In- halt beschickt, die wir zum Lichtschutz mit Blechzylindern umgeben haben. Durch täglich zweimaliges Durchblasen von Luft wurden un- gelöste Nährsalze aufgerührt und zugleich die Wurzeln mit Sauerstoff versorgt. Drei Wochen alt zeigten die Keimlinge von Helianthus nur in den Samenlappen reichliche Chlorophyllbildung, schon das erste eigentliche Laubblattpaar war nur an den Spitzen schwach ergrünt. An den noch nicht vier Wochen alten Pflänzchen, und zwar bei verschiedenen Kulturen traten da und dort braune Fleckchen an den gelben Blättern auf. Zu diesem Zeitpunkt wurde das auf die Kotyledonen folgende und das über- nächste Blätterpaar mit kurzen Stielchen abgeschnitten und zum Versuch verwendet. Diese Blätter enthielten in 10 g Frischgewicht 2,9 mg Chloro- phyll, fünfmal weniger als gewöhnliche Sonnenblumen, ungefähr dreimal ^) Detmer, Pflanzenphysiologisches Praktikum, 3. Aufl., S. 8. Untersuchung chlorotischer Blätter, 137 mehr als Aureablätter. Der gesamte Chlorophyllgehalt von 19 Pflanzen einer Kultur belief sich auf 11,5 mg. Bei Mais war die Schädigung bis zum Alter von fünf Wochen weniger auffallend. Zu dieser Zeit haben die chlorotischen Blätter für die Messung gedient zugleich mit den kräftig entwickelten, tiefgrünen Blättern der Vergleichspflanzen . Die Trockengewichte dieser aus den Wasserkulturen gewonnenen Pflanzen waren auffallend niedrig, nicht einmal 10 Prozent der Frisch- gewichte, während sonst der Trockengehalt zum Beispiel von Helianthus 20 Prozent ausmacht. Schon bei mäßiger Assimilationstätigkeit der Ver- gleichspflanzen war die Vermehrung der Trockensubstanz hoch, im Ver- such 4 etwa 9 Prozent in der Stunde. Tabelle 48. Assimilationsleistungen chlorotischer Blätter. 25°, 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Für den Versuch Von 10 g frischen j Assimiliertes CO2 (g) Blättern \ in i Stunde von Nr. Pflanzenart Beschreibung ange- wandtes Gewicht (g) Trocken- gewicht (g) Fläche (qcm.) Chloro- IG g phyll frischen (mg) JB^ättern I g Trocken- substanz I qdm Blatt- fläche lations- zahl I erstes Paar Laubblätter, grünlichgelb 5,6 — 345 1,9 0,025 0,007 13 2 3 Helianthus annuus ebenso (andere Kultur) Samenlappen der Pflan- zen vom ersten Versuch 8,0 11,6 0.75 402. 157 2.9 0,063 3>8 0,074 0,084 0,016 1 21,7 0,047 ' 19,5 4 Vergleichspflanze, in eisenhaltiger Lösung 8,0 0,95 392 11,6 0,134 0,141 0,034 11,5 5 gezogen drittes und viertes Blatt, * 8,0 0,85 425 l 1,9 0,006 0,007 0,001 3,2 ; grüngelb 1 6 Zea Mays Vergleichspflanze, in eisenhaltiger Lösung 8,0 0,95 480 15.5 ] 0,107 0,113 0,022 6,9 gezogen 1 Nach den in der Tabelle 48 verzeichneten Bestimmungen unterscheiden sich die chlorotischen Gewächse in ihrer assimilatorischen Leistungsfähig- keit gänzlich von den gelben Varietäten und von etiolierten Blättern, indem bei ihnen das spärlich vorhandene Chlorophyll nur recht mäßig ausgenützt wird. Die Assimilationszahlen der chlorophyllarmen oberen 138 R. Willstätter und A. Stoll. Blätter chlorotischer Pflanzen sind nämlich normal oder nur einigermaßen herabgedrückt. Das enzymatische System funktioniert also schlecht. Das assimila- torische Verhalten stimmt recht gut zu der seit den Arbeiten von A.^) und E. 2) Gris wohlbekannten Eigenart chlorotischer Blätter, die nur verkümmerte Assimilationsorgane, nur sehr wenig fertig gestaltete brauch- bare Chloroplasten hervorbringen. Man darf aus dem assimilatorischen Verhalten hier keine weitgehenden Folgerungen ziehen. Es darf nicht aus den quantitativen Beobachtungen geschlossen werden, daß eine Eisen- verbindung außer für die Bildung des Chlorophylls oder richtiger außer für die Bildung der Chloroplasten auch für ein Zusammenwirken mit dem Chlorophyll in der Photosynthese notwendig sei, daß also dem Eisen eine besondere Rolle im Assimilationsvorgang selbst zukomme. Den chlorotischen Blättern fehlt es in dem nicht einmal besonders chlorophyllarmen Protoplasmaschlauch an ausgebildeten Chloroplasten, während die Aureablätter zahlreiche gut ausgebildete, aber chlorophyll- arme Chloroplasten aufweisen. Die Ausbildung gelber Varietäten hat mit der Chlorosis nichts gemein. In einer ausführlichen Abhandlung über: ,,The Presence of Inorganic Iron Compounds in the Chloroplasts of the Green Cells of Plauts, con- sidered in Relationship to Natural Photo-synthesis and the Origin of life" hat vor kurzem B. Moore ^) sich mit dem wohlbekannten Nachweis des Eisens in chlorophyllhaltigen Pflanzen beschäftigt und hat dann mit emp- findlichen Reaktionen (Hämatoxylinlösung nach Macallum) gezeigt, daß nach der Behandlung grüner Pflänzenteile mit siedendem Alkohol, wodurch das Chlorophyll extrahiert wird, das zurückbleibende entfärbte Gewebe eisenhaltig ist. Indem Moore von der mit Alkohol entfärbten Pflanzensubstanz so spricht, wie wenn sie mit dem farblosen Teile der Chloroplasten gleichbedeutend wäre, glaubt er bewiesen zu haben, daß in den farblosen Bestandteilen der Chlorophyllkörner Eisenverbindungen ^) A. Gris, „De Taction des composes ferrugineux solubles sur la Vegetation" [1843] und .Nouvelles experiences sur Temploi des ferrugineux solubles appliques ä la Vegetation" [1844]. -) E. Gris, Ann. des Sc. nat. IV. ser. 7, 201 [1857]. 3) B. Moore, Proc. Roy. Soc. Ser. B, 87, 556 [1914]. Untersuchung fast chlorophyllfreier Blätter. 139 enthalten seien. In der Zusammenfassung dieser Abhandlung sind weit- gehende Folgerungen, die mit dem experimentellen Inhalt der Arbeit in keinem Zusammenhang stehen, mit dem Scheine des Bewiesenen vorge- tragen, namentlich die beiden Sätze i): ,,Inorganic iron salts and iron or aluminium hydrates in colloidal Solution possess the power of transforming the energy of the sunlight into chemical energy of organic Compounds." Und : „The iron-containing substances of the colourless portion of the chloroplast, and the Chlorophyll produced by them, then become asso- ciated in the functions of photo-synthesis as a complete mechanism for the energy transformation." Diese letzte These hat der experimentellen Begründung ermangelt und sie ist auch durch unsere Beobachtungen an chlorotischen Pflanzen noch unwahrscheinlicher geworden. XII. Untersuchung fast chlorophyllfreier Blätter. Wenn zahlreiche, in dieser Abhandlung beschriebene Versuche darauf hinzielen, die Abhängigkeit der Assimilation von einer Einrichtung des Blattes aufzudecken, die in keiner quantitativen Beziehung zum grünen (und auch zum gelben) Pigment des Blattes steht, so ist dabei keineswegs zu übersehen, daß die Assimilation der chlorophyllführenden Gewächse in notwendigem Zusammenhang mit dem Chlorophyll steht. Es wird wiederholt gefunden, daß ein Blatt mit geringem Chlorophyllgehalt mehr Kohlehydrat produziert, als ein Blatt mit größerem Chlorophyllgehalt unter gleichen Bedingungen, aber doch nur, weil eben die zusammengesetzte Einrichtung des Assimilationsapparates eine mehr oder weniger weit- gehende Ausnützung des vorhandenen Chlorophylls für die Photosynthese ermöglicht . Wir verfolgen nun die assimilatorische Leistung einer an und für sich schon chlorophyllarmen Aureavarietät mit noch weiter sinkendem Chloro- phyllgehalt, indem wir ein besonders hellfarbiges Exemplar des Gold- ^) Zu dem ersten Satze siehe auch B. Moore und T. A. Webster, Proc. Roy. Soc. Ser. B, 87, 163 [1913]- 140 R- Willstätter und A. Stoll. holunders auswählen. Es zeigt sich, daß Hand in Hand mit dem letzten Rückgang des Blattgrüns bis an die Grenze der noch bestimmbaren Menge auch die assimilatorische Leistung unter den günstigsten Bedingungen bis annähernd zum Verschwinden sinkt. Natürhch bleibt bei dem ausneh- mend niedrigen Chlorophyllgehalt die Assimilationszahl, die eigentlich nur noch geschätzt werden kann, sehr hoch. Gemäß dem untenstehenden Beispiel ist der Chlorophyllgehalt der Versuchspflanzen von 0,60 mg in 8 g frischen Blättern des Vergleichsexemplares auf 0,1 mg und die stünd- liche Leistung von 70 mg verbrauchtem COo auf 10 mg gefallen. Der Versuch bestätigt also die Unentbehrlichkeit des Chlorophylls. Auch bei Albinoblättern eines panachierten Gewächses ist die Assi- milation sehr geringfügig; die enzymatische Einrichtung eines solchen Exemplares ist gleichfalls minderwertig, so daß auch die Assimilationszahl niedrig ausfällt. Erstes Beispiel. Sambucus nigra var. aurea. Blätter: Vom 6. Juh, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 316 qcm, Trocken- gewicht 1,35 g. Der grüne Farbstoff ließ sich colorimetrisch nicht mehr be- stimmen ; der auf 100 ccm gebrachte Acetonextrakt zeigte in 10 mm Schicht das Hauptabsorptionsband des Chlorophylls im Rot nur als Schatten, schwächer als die Lösung von 0,1 mg Chlorophyll. Die Carotinoidmenge war nach colorimetrischer Schätzung 0,15 mg; die strohgelbe Farbe der Versuchsblätter war durch wasserlösliches gelbes Pigment mit verursacht. Versuchsbedingungen: 5 proz. CO2, Gasstrom 3 1 in der Stunde, 48 000 Lux, 20 bis 30 °. Zusammensetzung des Gasstromes bei den Messungen im Dunkeln vor der Belichtung 0,1012 g, nach der Behchtung 0,1013 g CO2 im Gemisch mit 1 1 Luft (23 °, 758 mm Hg). MeOperiode in Minuten • Temperatur Assimiliertes CO^ (g) in I Stunde 80 80 80 80 20° 30° 25° 0,012 0,009 0,009 0,00g Assimilationszahl mindestens 140. Untersuchung fast -chlorophyllfreier Blätter. 141 Zweites Beispiel. Acer Negundo f. foliis albo variegatis hört. Blätter: Vom lo. Juni, ohne grüne Flecken, Frischgewicht 5,0 g, Fläche 454 qcm, Trockengewicht 0,76 g, Chlorophyllgehalt 0,35 mg. Versuchsbedingungen : 5 proz. CO2, Gasstrom 3 1 in der Stunde, 48 000 Lux, 25 °. Assimiliertes CO2 in der Stunde 0,003 g CO2, Assimilationszahl 8,6. In diesen weißen Blättern fehlte der wasserlösliche gelbe Farbstoff, der sonst in allen von uns untersuchten Blattproben zu finden war. Anders als bei den beschriebenen Aurea- und Albinoblättern sind die Verhältnisse bei anthocyanführendem Laub. Es kommt häufig vor, daß in Blättern, die nicht einmal chlorophyllarm zu sein brauchen und deren assimilatorische Leistung derjenigen normal grüner Blätter gleicht, das Chlorophyll vom Anthocyan völlig überdeckt ist. Beispielsweise prüften wir scheinbar chlorophyllfreie, tiefrote Blätter einer Varietät der roten Rübe, indem wir zunächst mit wasserhaltigem Aceton das Anthocyan entfernten und dann aus dem nun grünen Rückstand das Chlorophyll mit Aceton extrahierten; die Farbstofflösung war chloro- phyllreicher als ein entsprechender Extrakt anthocyanfreier tiefgrüner Blätter derselben Art. Vergleich der Assimilation anthocyanhaltiger und anthocyan- freier Blätter von Acer Pseudoplatanus. Die Versuche wurden im Frühjahr ausgeführt, und zwar mit etwa gleich weit entwickelten Blättern von einem normal grünen Baum und von einer tiefroten Form. Die unter gleichen Versuchsbedingungen ge- wonnenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 49 zusammengestellt. Die Versuche i (mit grünen Blättern) und 3 (mit anthocyanhaltigen Blättern) zeigen weitgehende Übereinstimmung sowohl in den Chloro- phyllgehalten als auch in den Assimilationsbeträgen und folglich auch nur wenig verschiedene Assimilationszahlen. Bei den Blättern des Versuches 4 ist die Chlorophyllbildung und mit ihr, wenn auch etwas weniger, die Assimilationstüchtigkeit gegenüber den sich rasch entwickelnden normal 142 R. Willstätter uBd A. Stoll. Tabelle 4g. Assimilationsleistungen normal grüner und roter Blätter von Acer Pseudoplatanus. 25°, 5proz. CO2, ungefähr 48000 Lux. Nr. Datum Aussehen der Blätter Größe eines Blattes (qcm) Ange- wandtes Gewicht (g) Von Trocken- gewicht (g) 10 g frischen Blättern Chloro- Fläche pijyii (qcm) (mg) Assimiliertes COj (g) in I Stunde von 10 g Ig I qdm frischen Trocken- Blatt- Blättern gewicht fläche Assimi- lations- zahl I 2 5. Mai 14- .. bräunlich- grün reingrün 13 146 6,0 4,0 2,60 2,55 523 915 10.7 18,7 0,091 0,200 0.035 0,078 0,017 0,022 8,6 10,7 3 4 8. Mai 18. ., tiefrot tiefrot 13 40 4.0 4.0 2,55 2.80 785 895 10,2 10,5 0,097 0,117 0,038 0,031 0,012 0,013 9.5 11,2 grünen Blättern vom Versuch 2 zurückgeblieben. Jedenfalls geht aus den Versuchen hervor, daß der Anthocyangehalt der Blätter ohne direkten Einfluß auf die Assimilationstätigkeit ist. Im Gegensatz zum Verhalten solchen anthocyanführenden Laubes steht eine Wahrnehmung an der Schmarotzerpflanze Neottia nidus avis. In dieser Orchidacee ist das Chlorophyll maskiert; sie zeigt bekanntlich eine ähnliche Erscheinung des Ergrünens bei raschem Absterben wie Phäophyceen und Diatomeen. J. Wiesner 1), der das Ergrünen dieser Pflanze beim Behandeln mit Alkohol zuerst beobachtet hat, war der Ansicht, daß in ihr das Chlorophyll präexistiere und mit einem anderen Farbstoff gemengt sei. Durch Untersuchungen von A. F. W. Schimper^) und von O. Lindt^) war aber das Vorkommen des fertigen Chlorophylls in der Nestwurz zweifelhaft gemacht. Nachdem H. Molisch*) die hier beobachtete Erscheinung mit dem Verhalten der Phäophyceen in Paral- lele gebracht und R. Willstätter und H. J. Page^) den Nachweis ge- führt haben, daß in der lebenden Braunalgenzelle die beiden Chlorophyll- komponenten a und b in kolloidem Zustand vorkommen, nur von Fuco- xanthin teilweise überdeckt, war es anzunehmen, daß auch Neottia Chloro- ^) J. Wiesner, Pringsheims Jahrb. f. wissensch. Botanik 8, 875 [1872]. 2) A. F. W. Schimper, Pringsheims Jahrb. f. wissensch. Botanik 16, 119 [1885]. 3) O. Lindt, Botan. Ztg. 43, 825 [1885]. ^) H. Molisch, Botan. Ztg. 63, 142 [1905]. ^) R. Willstätter und H. J. Page, Ann. d. Chem. 404, 237 ri9i4]. Chlorophyllarme und normale Blätter bei Änderung der Temperatur und Beleuchtung. 143 phyll enthält. Man bekommt in der Tat mit Lösungsmitteln daraus einen schön grünen Extrakt. 50 g der gelbbraunen Blüten- und Fruchtstände von Neottia wurden in der Assimilationskammer bei 30° in 5 proz. Kohlendioxyd mit Belichtung von Sonnenstärke untersucht. Es fand keine Spur Kohlen- dioxydverbrauch statt. Messung Intervall in Minuten Temperatur CO2 (g) im Gemisch mit I 1 Luft im Dunkeln 20 30° 0,1055 „ Licht 20 30° 0,1061 ,, 20 30° 0.1057 ,, ,, 20 29° 0,1059 ,. 20 28° 0,1046 Das Ausbleiben der Assimilation bei der Schmarotzerpflanze kann auf der Unvollkommenheit des für die Photosynthese verantwortlichen enzymatischen Systems beruhen. XIII. Vergleich an Chlorophyll armer und reicher Blätter bei Änderung der Temperatur und der Beleuchtung. Die Assimilationsversuche in allen voranstehenden Abschnitten sind bei einer zum Zwecke des Vergleichs gewählten günstigen Temperatur unter Bedingungen überschüssiger Kohlensäureversorgung und über- schüssiger Lichtzufuhr vorgenommen worden. Infolgedessen waren die äußeren Faktoren der Assimilation ohne Bedeutung für die zu vergleichende Leistung verschiedenartiger Blätter. Es brauchte die Abhängigkeit der assimilatorischen Leistung vom Lichte, da dessen Steigerung die erhal- tenen Werte nicht geändert hätte, und von der Temperatur, obwohl deren Steigerung die Zahlen beeinflußt hätte, nicht beachtet zu werden. Der hauptsächliche Zweck der Arbeit war, die Leistung im Verhältnis zur Menge des assimilatorischen Farbstoffs zu verfolgen. Dadurch sind Fälle von außerordentlicher Disproportionalität aufgedeckt und es ist die Fol- gerung ermöghcht worden, daß nicht allein von der Chlorophyllmenge, 144 R- Willstätter und A. StoU. sondern durch das Zusammenwirken zweier variabler Komponenten des assimilatorischen Systems die Leistung bestimmt wird, nämlich: a) durch den grünen Farbstoff und b) durch ein anderes dem Protoplasma angehörendes Agens. Der erste Befund über die Natur dieses zweiten inneren Faktors ging dahin, daß er kein Farbstoff ist. Es sind die Carotinoide nicht an der Assimilation mitbeteihgt oder wenigstens nicht mit ihren Farbstoffeigen- schaften; die Ausschaltung der von ihnen absorbierten Lichtstrahlen be- wirkt bei den für den Versuch besonders geeigneten Objekten keine Än- derung der Assimilation. Um die Beteiligung des Protoplasmas an der Photosynthese, oder ge- nauer gesagt, um die Art des mit dem Chlorophyll zusammenwirkenden Assi- milationsagens näher zu kennzeichnen, wird in den folgenden Versuchen ge- prüft, ob diese beiden inneren Faktoren gleiche oder verschiedene Abhängig- keit von den äußeren Faktoren zeigen, von Temperatur und Beleuchtung. Die Voraussetzung für dieses nähere Eingehen auf die Rolle des Proto- plasmas ist die gewonnene Kenntnis der Fälle, in denen die assimilato- rische Leistung in auffallendem Mißverhältnis zum Chlorophyll steht. Das sind die Fälle, in denen die Wirkung der zu beschreibenden Kompo- nente, sei es durch ihr Überwiegen oder ihr Zurücktreten, am besten zum Vorschein kommt. Die Objekte mit überwiegendem Chlorophyll und die mit vorwiegendem zweiten Agens sind für die vergleichenden Versuche über den Einfluß der physikalischen Verhältnisse besonders geeignet. Daher bilden im folgenden das Versuchsmaterial : erstens die Blätter der Aureavarietäten mit wenig, aber sehr gut arbeitendem Chlorophyll, neben welchen die normalen Blätter der Stammform vergleichsweise zu prüfen sind (wir wählten für die Versuche Ulmus und Sambucus im Monat Juh) und zweitens die noch schönen Herbstblätter (von Ampelopsis Veitchii im November) von geschwächter Assimilationsenergie, also mit ziemlich viel, aber schlecht arbeitendem Chlorophyll. Die Variation der Beleuchtungsstärke wurde bewirkt durch Höher- oder Tieferhängen der Lampe, deren gewöhnlicher Abstand — der Glüh- körper 25 cm über den Blättern — die Intensität von etwa 48 000 Lux, Chlorophyllarme und normale Blätter bei Ändei-ung der Temperatur und Beleuchtung. 145 ungefähr von Sonnenstärke, ergab. Die Temperatur wurde so geändert, daß innerhalb 5 Minuten die Konstanz an den Blättern erreicht war. Die Versuchsbedingungen ließ man gewöhnlich eine Stunde lang kon- stant und führte in dieser Zeit drei Messungen aus, wovon die erste in dem Fall, daß sich die Assimilation änderte, wegen der schädlichen Räume der Apparatur außer Betracht blieb für die Berechnung der stündlichen Leistung. Erst aus den nachfolgenden Intervallbeobachtungen war der Mittelwert für die Stunde zu berechnen. Eine Erscheinung, die den Vergleich der Leistungen bei wechselnden Temperaturen und Lichtstärken erschwert, ist während der erforderlichen sehr langen Versuchsdauer und bei der hochgesteigerten Leistung die In- konstanz der Assimilationstätigkeit der Blätter, die sehr wahrscheinlich auf der Anhäufung von Assimilaten beruht (s. Abschnitt III, D). Die Leistung läßt schon in der ersten Stunde nach bei den sommerhchen Blät- tern, mehr bei grünen als bei gelben, und umgekehrt nimmt sie bei den herbstlichen Blättern zu infolge der Erholung des Assimilationsapparates. Dieser Gang der Assimilationstüchtigkeit muß festgestellt und in Rech- nung gezogen werden. Wir schalteten daher wiederholt zwischen die ab- geänderten Bedingungen und am Ende derselben Meßperioden ein mit den Verhältnissen des Versuchsanfangs. Für alle Zwischenzeiten wurde der Gang der Assimilationsleistung unter der Voraussetzung fortdauern- der Anfangsbedingungen graphisch ermittelt. Mit den Koordinaten: Versuchszeiten und Assimilationsleistungen unter Anfangsbedingungen wurden also Kurven gebildet, denen wir die Vergleichswerte für die Be- obachtungen unter den geänderten Bedingungen des Versuchs entnah- men, um deren Einfluß in allen Fällen unabhängig von der Ermüdung oder Erholung der Objekte zu finden (,Fig. 5 für die Versuche i, 2, 3 und 4, Fig. 6 für die Versuche 5, 6, 7 a, 7 b und 8). Die in den Ver- suchen gefundenen Werte korrigierten wir dann nach dem Verhältnis, in welchem sich die Anfangsleistung für den betreffenden Zeitpunkt verändert hätte. Der Gang eines Versuches und die Korrektur der be- obachteten Werte wird an dem ausführlicher mitgeteilten Beispiel er- sichtlich. Willst at t er- S toll , Assimilation. lO 146 R. Willstätter und A. StoII. Flg. 5- 3 V Flg. Änderung der Assimilationstüchtigkeit Änderung der Assimilationstüchtigkeit (die Vergleichswerte unter Anfangs- (die Vergleichswerte unter Anfangs- bedingungen, Versuch i. 2, 3 u. 4). bedingungen, \^ersuch 5, 6, 7a, 7b u. 8). A. Einfluß verschiedener Beleuchtung auf gelbe und grüne Blätter. Erster Versuch. Ulmus var. aurea (Tabelle 50). Blätter: V^om 17. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 300 qcm, Trocken- gewicht 1,80 g, Chloroph^dlgehalt 1,2 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. COo, Gasstrom 3 1 in der Stunde, 25°. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch : 0,0885 g COo im Gemisch mit il feuchter Luft (23°, 757 mm). Vergleich an Chlorophyll armer und reicher Blätter bei Änderung der Beleuchtung. 147 Tabelle 50. Assimiliertt s CO, (g) Assimilationsleistung ^g CO«) in der Stunde Beleuchtung (ungefähre Anzahl Lux) Tempe- ratur der Blätter Intervall Minuten Austre- tende Luft in Liter CO, (g) im Gemisch mit I 1 austre- tender Luft im Intervall in der Stunde Mittelwert im Versuch bei fortdau- ernden An- fangsbe- dingungen im Versuch, korrigiert ge- mäß der geän- derten Assimi- lations- tüchtigkeit 24 000 25.0° 20 1,00 0,0795 0,0090 24 000 25,0° 20 1,00 0,0630 0,0255 0,077 24 000 24 000 25,0° 25,0° 20 20 1,05 1,00 0.0633 0,0626 0,0265 0,0259 0,080 0,078 1 0,079 0,079 0,079 12 000 25,0° 20 1,00 0,0657 0,0228 — 12 000 I 2 000 25,0° 25,0° 20 20 1,00 1,00 0,0694 0,0701 0,0191 0,0183 0,057 0,055 \ 0,056 (0,079) 0,056 6 000 25,0° 20 1,00 0,0736 0,0147 — 6 000 6 000 25,0° 25,0° 21 19 1.05 0,95 0,0772 0,0767 0,0116 0,0109 0,033 0,035 [0,034 (0,079) 0,034 3 000 25,0° 20 1,00 0,0797 0,0084 — 3 000 3 000 25,0° 25,0" 20 20 1,00 1,00 0,0810 0,0816 0,0071 0,0065 0,021 0,019 \ 0,020 (0,078) 0,020 24 000 25,0° 20 1,00 0,0706 0,0174 — 24 000 25,0° 40 2,10 0,0633 0,0516 0,077 0,077 0,077 0,079 48 000 48 000 25,0° 25,0° 41 19 ^.05 0,95 0,0602 0,0610 0,0566 0,0254 0,083 0,080 i 0,082 (0,074) 0,088 24 000 25,0° 21 1,05 0,0634 0,0256 24 000 24 000 25,0° 25,0° 20 20 1,05 0,0660 0,0659 0,0228 0,0229 0,068 0,069 J 0,069 0,069 0,079 Die Abhängigkeit der assimilatorischen Leistung von der Beleuchtung ist hier schon bei starker Lichtintensität groß; bei Verminderung der Lichtstärke auf ^/g, nämlich von 24 000 auf 3000 Lux, ist die Assimilation auf ^li zurückgegangen, dagegen erfolgt Vermehrung bei der Steigerung des Lichtes auf die gewöhnliche Beleuchtungsstärke von 48 000 Lux nicht in gleichem Maße. Zweiter Versuch. Vergleichsbeispiel der grünen Stammform von Ulmus (Tabelle 51). Blätter: Vom 21. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 358 qcm, Trocken- gewicht 2,45 g, Chlorophyllgehalt 11,0 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. CO2, Gasstrom 3 1 in der Stunde, 25°. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch : 0,0872 g COo im Gemisch mit il feuchter Luft (24,5°, 755 mm). 148 R. Willstätter und A. Stoll. Tabelk 5i. Meßperiode Beleuchtung (ungefähre Anzahl Lux) Assimilationsleistung (g COj) in der Stunde Mittelwert im Versuch bei fortdauernden Anfangsbedingungen im Versuch, korrigiert gemäß der geänderten Assimilationstüchtigkeit Stunde 24 000 0, lOÖ 12 000 0,093 6 000 0,052 3 000 0,036 24 000 0,093 48 000 0,087 24 000 0,083 0,106 (0,104) (0,101) (0,097) 0,093 (0,088) 0,083 0,106 0,095 0,055 0,039 0,106 0,105 0,106 Es zeigt sich bei den chlorophyllreichen Blättern, daß die Assimilation mit der Vermehrung des Lichtes von 24 000 Lux auf das Doppelte keine Steigerung erfährt. Dritter Versuch. Sambucus nigra var. aurea Tabelle 52). Blätter: Vom 10. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 366 qcm, Trocken- gewicht 1,55 g, Chlorophyllgehalt 0,65 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. CO2, Gasstrom 3 1 in der Stunde, 25°. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch : 0,0895 g CO2 im Gemisch mit il feuchter Luft 22,0°, 764 mm). Tabelle 52. Meßperiode Beleuchtung (ungefähre Anzahl Lux) Stunde 48 000 24 000 12 000 6 000 48 000 Assimilationsleistung (g CO,) in der Stunde Mittelwert im Versuch 0,078 0,068 0,050 0,030 0,076 bei fortdauernden Anfangsbedingungen 0,078 (0,078) (0,078) (0,077) 0,076 im Versuch, korrigiert gemäß der geänderten Assimila tionstüchtigkeit 0,078 0,068 0,050 0,030 0,078 Vierter Versuch. Vergleichsbeispiel der grünen Stammform von Sambucus Tabelle 53!. Blätter: Vom 14. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 359 qcm, Trocken- gewicht 2,05 g, Chlorophyllgehalt 18,8 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 \'ol.-proz. COo, Gasstrom 3 1 in der Stunde, 25°. Vergleich an Chlorophyll armer und reicher Blätter bei Änderung der Beleuchtung. 14g 1 i i ^ 1 . V \ \ 1 1 \ b N 1 V ^ N ^ fSujJ ^OJ ^^f- 3I/IUJI99C apun^g Jdp UJ -— ■ — b:: ^ ;:^ /> HX aj > K* 'S fil ^ Tl C c 0 ^ ■^ c j3 ffi rt W) 150 R. Willstätter und A. Stoll. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch : 0,0874 g CO2 im Gemisch mit il feuchter Luft (24,0°, 761mm). Tabelle 53. Beleuchtung Meßperiode I (ungefähre Anzahl I Mittelwert im Versuch Assimilationsleistung (g CO2) in der Stunde Lux) bei fortdauernden Anfangsbedingungen im Versuch, korrigiert gemäß der geänderten Assimilationstüchtigkeit Stunde 48 000 24 000 12 000 6 000 48 000 0,116 0,110 0,099 0,072 0,096 0,116 (0,111) (0,106) (0,101) o,og6 0,116 0,115 0,108 0,083 0,116 In den Figuren 7 und 8 wird die Abhängigkeit der Assimilation von der Beleuchtung durch Kurven dargestellt, welche sich aus den beobachteten Leistungen mit der besprochenen Korrektur ergeben, die den Einfluß der Ermüdung ausschaltet. Zum übersichtlichen Vergleich des Lichteinflusses werden noch in der nachstehenden Tabelle 54 die sämtlichen Resultate so verzeichnet, daß für jeden Versuch die Leistung bei 48000 Lux = 100 gesetzt ist. Tabelle 54. Assimilation bei verschiedenen Lichtstärken. (25°, 4,5 vol.-proz. COo.) Beleuchtung in unge- Gelbe Blätter Grüne Blätter . fähren Sonnenstärken Ulme Holunder Ulme Holunder I 100 100 100 100 V2 90 ^7 100 99 ^'^ \ 64 64 90 93 Vs i 39 39 (52)0 72 • • Vi« 23 — 37 Die Änderung der Beleuchtung beeinflußt die gelben Blätter viel mehr als die grünen. Die Lichtintensität darf bei den normal chlorophyll- haltigen Blättern unter den günstigen Verhältnissen von Temperatur und Kohlensäureversorgung auf ^/g geschwächt werden, bis die Assimila- tion zurückzugehen beginnt, und auf V4, bis der Rückgang erheblich ^) Dieser Wert ist, wie aus dem Verlaufe der Kurve zu schließen, zu tief gefunden worden. Vergleich an Chlorophyll armer und reicher Blätter bei Änderung der Beleuchtung. 15 1 wird. Hingegen sinkt bei den chlorophyllarmen Blättern die Assimilation sofort mit der Abnahme des Lichtes. Die Erniedrigung beträgt beim Übergang von 48 000 zu 12 000 Lux bei gelber Ulme und bei Goldholunder 36 Prozent, während ein entsprechender Rückgang bei den chlorophyll- reichen Vergleichsobjekten nur 10 und 7 Prozent ausmacht. Bei den grünen Blättern ist der letzte Teil der Kurve in Fig. 7 und 8 horizontal, bei den gelben läßt der Verlauf der Kurven weitere Zunahme der Assimilation bei der Steigerung des Lichtes über Sonnenstärke hinaus erwarten. Das hat sich auch bei einem Versuch der Belichtung mit 75 000 Lux bestätigt, aber die gefundenen Zahlen waren nicht einwandfrei, weil die Lampe den Blättern so genähert werden mußte, daß nicht mehr genug Raum für das zur Kühlung dienende (obere) Strahlenfilter zur Verfügung stand. Der Unterschied zwischen gelben und grünen Blättern bei veränder- hcher Belichtung ist nicht ganz so groß wie zu erwarten gewesen wäre. Der immerhin rasche Rückgang der x\ssimilationsleistung auch von grünen Blättern bei verminderter, aber noch erheblicher Lichtintensität bedarf der Erklärung. Die gesamte von einem Blatt absorbierte Lichtenergie ist doch noch weit größer als die verarbeitete, was man beim Vergleich mit der hohen Leistung und dem geringeren Absorptionsvermögen der gelben Blätter findet. Die Erscheinung beruht wahrscheinlich auf der Anordnung des Farbstoffs im Blattgewebe (vgl. Abschnitt IX). Die der bestrahlten Blattoberfläche am nächsten gelegenen Chloroplasten absor- bieren in den grünen Blättern allerdings auch bei geringeren Intensitäten immer noch mehr Licht als sie verarbeiten können. Aber die tiefer ge- legenen Anteile des Farbstoffes werden von ihnen beschattet und das macht sich bei abnehmender Beleuchtung bald so stark geltend, daß das Licht in den tieferen Schichten des Blattes nicht mehr für die maximale Assimilation ausreicht. Deshalb blieb die assimilatorische Leistung der grünen Blätter bei abnehmender Beleuchtungsstärke nicht so lange kon- stant, bis sich diese zur Anfangsbelichtung (48 000 Lux) ebenso verhält wie die Chlorophyllmenge in den gelben Blättern zu derjenigen in den grünen. 152 R. Willstätter und A. Stoll. B. Einfluß verschiedener Temperaturen auf gelbe und grüne Blätter, Fünfter Versuch. Ulmus var. aurea fTabelle 55). Blätter: Vom 16. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 321 qcm, Trocken- gewicht 2,00 g, Chlorophyllgehalt 0,95 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. COo, Gasstrom 3 1 in der Stunde, Beleuchtungsstärke ungefähr 24 000 Lux. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch : 0,0870 g CO2 im Gemisch mit i 1 feuchter Luft (24,5 °, 758 mm . Tabelle 55- Asiimi atiouileistung (g CO2) in der Stunde Meßperiode Temperatur Mittelwert im Versuch bei fortdauernden Anfangsbedingungen im Versuch, Ivorrigiert gemäß der geänderten Assimilationstüchtigkeit I. Stunde 25° 0,075 0.075 0,075 15° 0,036 (0,072) 0.058 20° 0,065 (0.070) 0,070 4- 25° 0,069 0,069 0.075 5- 30° 0,06g (0,069) 0,075 6. .. 25° 0,068 0,068 0,075 Sechster Versuch. Vergleichsbeispiel der grünen Stammform von Ulmus (Tabelle 56). Blätter: Vom 20. JuH, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 421 qcm, Trocken- gewicht 2,35 g, Chlorophyllgehalt 13,0 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. COo, Gasstrom 3 1 in der Stunde, Beleuchtungsstärke ungefähr 24 000 Lux. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch: 0,0879 g COo im Gemisch mit i 1 feuchter Luft (24,0°, 755 mm). Tabelle 56. As- 111 ilation I.-istuiig (g COj) m der S tunde Meß Periode Temperatur Mittelwert bei fortdauernden im Versuch, korrigiert gemäß der geänderten im \ ersuch .Anfangsbedingungen ^ssimilationstiichtigkeit I. Stunde 25° 0,089 1 0,089 0,089 2. 15° 0.058 (0.086) 0,060 3- 20° 0.067 (0.083) 0,072 4- 25° 0,080 0.080 0,089 5- 30 ' 0.077 (0,074) 0,093 6. -5 ' 0.068 o,o6S 0.089 Vergleich an Chlorophyll armer und reicher Blätter bei Änderung der Temperatur. 153 Die Assimilationsleistung, die in diesem Beispiel grüner Blätter anfangs um ^!- größer war als bei den gelben Blättern des entsprechenden fünften Versuchs, hat bis zur sechsten Stunde des Experiments eine solche Schwächung erlitten, daß die Leistung der grünen und der gelben Blätter unter denselben Bedingungen gleich geworden ist. Siebenter Versuch. Beispiel a der gelbblätterigen Varietät von Sambucus (Tabelle 57). Blätter: Vom 7. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 378 qcm, Trocken- gewicht 1,50 g, Chlorophyllgehalt 0,6 mg. Versuchsbedingungen: 5 vol.-proz. COo, Gasstrom 3 1 in der Stunde, Beleuchtungsstärke ungefähr 48 000 Lux. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch: 0,1019 g CO., im Gemisch mit il feuchter Luft (24,0°, 758 mm). Tabelle 57- Meßperiode Temperatur .Assiinilationsleistung in CO^) in der Stunde , u • i , , l im Versuch, korrigiert Mittelwert bei fortdauernden ^^^ geänderten im Versuch Anfangsbedmgungen Assimilationstüchtigkeit I. Stunde 3- 4- 20" ^3' 0,068 0,038 0,068 0,037 0,068 0,068 (0,068) 0,038 (0,063)!) 0,071 0,037 0,068 Beispiel b der gelbblätterigen Varietät von Sambucus (Tabelle 58). Blätter: Vom 9. Juh, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 382 qcm, Trocken- gewicht 1,55 g, Chlorophyllgehalt 0,75 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. CO.,, 3 1 in der Stunde, Beleuchtungsstärke ungefähr 48 000 Lux. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkeh^ersuch : 0,0895 g CO., im Gemisch mit il feuchter Luft (21,0°, 761 mm\ Achter Versuch. Vergleichsbeispiel der grünen Stammform von Sambucus (Tabelle 59). 1) Diese Interpolation ist nach dem Verlauf der Kurve im Lichtversuch mit gelben Ho- lunderblättern (3. Vers., Fig. 8) begründet, erst die hohe Temperatur von 30° wirkt so stark schädigend ein. 154 R. Willstätter u Tabelle nd A. Stoll. 58- . Meßperiode Temperatur Absimilationsleistung (g CO2) Mittelwert bei fortdauernden im Versuch Anfangsbedingungen in der Stunde im Versuch, korrigiert gemäß der geänderten Assimilationstüchtigkeit I. Stunde 2. 3- 4- 25° 20° 30" 2.5' 0,075 0,065 0,079 0,066 0.075 (0,075) (0,073) 0,066 0,075 ' 0,065 o,oSi 0,073 Blätter: Vom 13. Juli, Frischgewicht 8,0 g, Fläche 343 qcm, Trocken- gewicht 2,20 g, Chlorophyllgehalt 17,8 mg. Versuchsbedingungen: 4,5 vol.-proz. CO2, 3 1 in der Stunde, Beleuchtungsstärke ungefähr 48 000 Lux. Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch : 0,0878 g CO2 im Gemisch mit il feuchter Luft (23,0°, 761mm). Tabelle 59. Assirailationsleistung (g CO^) in der Stunde Meßperiode Temperatur Mittelwert im \'ersuch bei fortdauernden Anfangsbedingungen im Versuch, korrigiert gemäß der geänderten Assimilationstüchtigkeit I. Stunde 25° 0,117 0,117 0, 1 1 7 2. 20° 0,097 (0.II5) 0,099 3- 30° 0,138 (0,112) 0,144 4- 25° 0,107 0,107 0,117 5- 15° 0,067 (0,102) 0,077 6. 25 0,095 0,095 0,117 Infolge der starken Schädigung, die das Erwärmen auf 30 ° bei längerer Dauer bewirkt hat, ist der Vergleich bei dieser Temperatur in unserem Versuche ungenau. Darum sind in der folgenden Tabelle 60 die Ergeb- Tabelle 60. Assimilation bei verschiedenen Temperaturen. (4,5 vol.-proz. CO2, ungefähr 48000 Lux.) Temperatur 25° 20° 15° Ulme Holunder Gelbe Blätter jGrüne Blätter , Gelbe Blätter a) 1 Gelbe Blätter b) 1 Grüne Blätter 100 100 93 104 100 81 67 104 100 85 108 100 ^1 123 100 85 66 Vergleich an Chlorophyll armer und reicher Blätter bei Anderimg der Temperatur. 155 no 130 120 110 ■00 j i 90 ^ ^ JiT SO -^ X ^x <:S^ ö^y L 70 \i0er ■^ y^^W'^ 60 l^ i2 >>^ " ^ r' 50 ^- ^ UO V "§ ■^ 20 20 10 Tempe "afur ' 15° 25° 60 3Ö° i / / 1 A 1 1 -"" .•■■■\ / ...- iA Teil olfuck\ von CO, in Hrozenfen einer /Ifmosphäre 7 2 J V 5 6 7 8 9 10 11 12 13 n 15 16 n 18 19 20 Fig. II. x\bsorption des Kohlendioxyds bei 5°; Helianthus anniuis (etwa 20 g frische Blätter). 10 t _ -T/, ^ die ' i 1 ßlalfsubsfanz ^ J<^ - — - ßr^ die ohne ih Blaftsubsfanz ^en Wassergehalt ^ ^ ■F,', ^^T „J__ y y ^1 de ^^/^ itfer / / . / Y , . — ^ ^- ^^x V / / • ..-■- -'■ • ■^ . ^ ^ r^ / ^' y r ,,.- --' A C ) ' ,-- -^ i >-'"' ---' ..-■ •■■" V V .-- 1 A V- -0- Teila r^C/f von CO, in P ^oze nfen einei - Atn 70Spj mre 1 2 3 V 5 ff 7 8 9 10 11 12 13 n 13 1Ö 17 1ö 19 20' Fig. 12. Absorption des Kohlendioxyds bei 5°; Urtica dioica (etwa 20 g frische Blätter). [2* l8o R- Willstätter und A. StoU. der Teildruck des Kohlendioxyds ist. Während bei 5 proz. Kohlendioxyd die Absorption im Beispiel von Heiianthus das 4 fache der Löslichkeit in Wasser beträgt, ist sie bei i prozentigem nahezu das 6 fache; durch Inter- polation an einer groß gezeichneten Kurve ergibt sich im genannten Beispiel für Kohlendioxyd von 0,10 Volumprozent die x\bsorption durch das Blatt als etwa das 12 fache des vom \\'asser der Blattsubstanz ge- lösten Kohlendioxyds. Die Absorptionserscheinung wird also desto be- deutender, je niedriger die Kohlensäurekonzentration ist, das heißt, je mehr sich die Versuchsbedingungen den Lebensbedingungen der Pflanzen in der Atmosphäre nähern. Eine Beziehung der Kohlensäureabsorption des unbelichteten Blattes zum Assimilations Vorgang ist noch nicht bewiesen. Aber es ist wahr- scheinlich, daß die Affinität der Blattsubstanz zur Kohlensäure auch das Verhalten des Blattes im Lichte beeinflussen wird, dadurch, daß die Kohlensäureabsorption beschleunigt, die Konzentration der Kohlensäure erhöht und die Form, in wel- cher die Kohlensäure vorliegt, verändert wird. In der Einlei- tung ist auf die für die Assimilation ungünstige Konzentration hingewie- sen worden, welche das Kohlendioxyd bei seinem Partialdruck in der Atmosphäre in wässeriger Lösung besitzt. Bei einem COo-Gehalt von 0,03 Volumprozent der Luft löst ein Liter Wasser bei 15° 0,3 ccm CO2. Das in i kg Helianthusblättern, deren Fläche wir gleich 3^/3 qm finden, enthaltene Wasser, nämlich 800 ccm, nimmt daher an der Luft bei 15 ° nur 0,25 ccm CO2 auf, während für diese Menge der Blätter nach Brown und Escombe mit einer Assimilation von 1-/3 Litern, das ist 3V3 g CO2 in der Stunde zu rechnen ist, entsprechend einer Zuckerproduktion von 2 g. Die Konzentration des Kohlendioxyds im Blatte ist unter den ge- wöhnlichen Bedingungen der Atmosphäre jedenfalls mehr als das 12 fache der wässerigen Lösung. Dieser Vergleich zwischen der Absorption durch \^'asser und durch gewisse Bestandteile des Mesophylls bezog sich zunächst auf das Anhydrid der Kohlensäure. Für die Assimilationsreaktion handelt es sich aber nicht um die Konzentration des Kohlendioxvds selbst. In der nachfol- über Absorption der Kohlensäure durch das unbeUchtete Blatt. i8l genden vierten Abhandlung dieser Reihe wird mitgeteilt, daß Chloro- phyll gegen Kohlendioxyd indifferent ist, daß es aber mit der Kohlen- säure ein dissoziierbares Additionsprodukt bildet, welches mit den pri- mären Carbonaten verglichen werden kann. Bei der Aufnahme durch das Absorbens im Blatte wird das Kohlensäureanhydrid schwerlich in einer chemisch indifferenten Form bleiben, da sich das Anhydrid in den- jenigen Fällen, wo es von organischen Verbindungen dissoziierbar addiert wird, mit ihnen zu Säuren verbindet. Während in der wässerigen Lö- sung des Dioxyds nur ein kleiner Bruchteil in der chemisch wirksamen Form der Säure existiert, wird also wahrscheinlich durch die Addition des Kohlendioxyds an eine organische Substanz die Konzentration des wirksamen Anteils erhöht und dadurch die Einführung der Kohlen- säure in die photosynthetische Reaktion gefördert. Es soll damit nicht ausgesprochen werden, daß die entstehende Carb- oxyl Verbindung von stark saurer Natur sei. Vielmehr ist daran zu er- innern, daß wir eine viel geringere Beständigkeit des Chlorophylls in kolloider wässeriger Lösung als des Chlorophylls im Blatte gegen Kohlen- säure beobachten. Möglicherweise beruht der Schutz, den das Chloro- phyll im Blatte genießt, auf der besonderen Form, welche die Kohlen- säure annimmt. Auch unter gewissen natürlichen Verhältnissen ist das Chlorophyll größerer Kohlendioxydkonzentration ausgesetzt, zum Bei- spiel wird bei der starken Atmung junger Blätter in warmen Nächten der Kohlendioxydgehalt in den Intercellularräumen den Kohlensäureteil- druck der Luft bedeutend überschreiten. Eine weitere Eigentümlichkeit der x\bsorptionsvorrichtung besteht darin, daß sie eine gewisse Regulierung der assimilatorischen Leistung bei Temperaturschwankungen bewirken kann. Die Photosynthese geht na- türlich mit fallender Temperatur zurück, die Absorptionsleistung steigt. Wie gezeigt wird, ist der Betrag der absorbierten Kohlensäure bei 5° etwa doppelt so groß wie bei 25 °. Die verminderte Reaktionsgeschwin- digkeit bei der Temperaturerniedrigung kann also teilweise ausgeglichen werden durch die Konzentrationserhöhung der Kohlensäure. In der Tat hat es sich in der zweiten Abhandlung (Abschnitt XIII) bei Assimilations- l82 R. Willstätter und A. Stoll. versuchen mit hoher Konzentration von Kohlendioxyd gezeigt, daß der Temperaturkoeffizient der Assimilation nur 1,5 war, was mit einer ver- minderten Kohlensäurekonzentration im Blatte bei höherer Temperatur in Einklang steht. Die chemische Natur des Stoffes oder der Stoffe, die im Blatte Kohlendioxyd absorbieren, ist noch unbekannt; daher bietet sich hier der analytischen und präparativen Arbeit eine wichtige Aufgabe. Die Dissoziationsverhältnisse lassen die Annahme von Alkali- und Erdalkalibicaibonaten allein, da diese geringere Dissoziationsspannungen besitzen, nicht zu, aber sie sprechen doch nicht gegen das Auftreten der- artiger Verbindungen, wie Magnesiumbicarbonat, wenn wir zugleich die Voraussetzung machen, daß das Erdalkali im Blatte gebunden an organische Stoffe mit Säurefunktion existiere. Magnesiumbicarbonat allein ist schon bei einem Teildruck von 15 bis 30 mm^) des Kohlendioxyds gesättigt. Die Substanz getrockneter Blätter zeigt, wie in Untersuchungen über die Chlorophyllase beschrieben worden ist-), amphotere Reaktion. Sie enthält säure- und alkalibindende Stoffe, so daß eine erhebhche Menge von Mineralsäure und von Alkalilauge bis zum Eintritt saurer bzw. alka- lischer Reaktion verbraucht wird. Es scheint übrigens nach den Absorp- tionsversuchen mit getrockneten Blättern, die im folgenden beschrieben werden, daß in der getrockneten Blattsubstanz der Dissoziationsdruck des Kohlendioxyds kleiner ist als bei frischen Blättern, daß ihr Verhalten also dem anorganischer Bicarbonate ähnlicher ist. Es ist nach den Dissoziationsverhältnissen und nach den im Plasma gegebenen chemischen Bedingungen wahrscheinlich, daß das Kohlensäure- anhydrid von organischen Stoffen aufgenommen wird. Die Zahl orga- nischer Verbindungen, die für diese Reaktion in Betracht kommen, ist eine ungemein große. Seit alters ist es bekannt, daß Kohlendioxyd addiert wird einerseits durch Aminogruppen von ausgesprochen basischer Art unter Carbamat- bildung, andererseits von Alkoholaten und Enolaten unter Bildung von ^) F. P. Treadweil und M. Reuter, Zeitschr. f. anorg. Chem. 17, 170 [1898]. 2) R. Willstätter und A. Stoll, Knn. d. Chem. 378. 18, 50 [1910]. über Absorption der Kohlensäure durch das unbehchtete Blatt. 183 Salzen primärer Kohlensäureester; die freien Carbaminosäuren und Alkyl- kohlensäuren sind leicht dissoziierend. Der Kreis kohlendioxydaddieren- der organischer Verbindungen^ und zwar im besonderen von solchen ein- facher Konstitution, ist in wichtigen Untersuchungen von M. Sieg- fried i) sehr erweitert worden durch den Nachweis, daß bei Gegenwart von Basen sowohl Aminosäuren wie Verbindungen mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Alkohole, Zucker und Oxysäuren) mit Kohlendioxyd in Salze der primären Amide bezw. der primären Ester der Kohlensäure übergehen. In so ausgedehnten Reihen von Kohlendioxyd addierenden Stoffen ergibt sich für die Dissoziationsverhältnisse der Carboxylverbindungen von den Formeln HN — COOH und O — COOK die denkbar größte Mannig- I I faltigkeit, wenn man noch berücksichtigt, daß jeder beliebige Grad der Neutrahsation, beginnend von den freien Carboxylderivaten der Amino- säuren, deren Bildung an der Erhöhung der Leitfähigkeit von Kohlen- säure erkannt wurde, bis zu den Neutralsalzen der Carbaminosäuren und der Kohlenestersäuren, die ausschließhch untersucht zu sein scheinen, vorkommen kann. Besonderes Interesse beanspruchen für den Vergleich mit den Verhältnissen, unter denen die Kohlensäure im pflanzUchen Plasma und in tierischen Gewebsflüssigkeiten vorkommt, die Dissozia- tionsspannungen der noch nicht untersuchten primären Alkalisalze von Carbaminosäuren z. B. HOOC — NH — CH2 — COOK und die Dissoziationsverhältnisse dieser Kohlensäureverbindungen bei Gegenwart von Salzen organischer Säuren, die eine Pufferrolle auszu- üben vermögen. Bei der Beschreibung der Carbaminreaktion deutete M. Siegfried^) bereits die Folgerungen an, welche daraus hinsichtlich der Reduktion ^) M. Siegfried, Über die Bindung von Kohlensäure durch amphotere Amidokörper I., Zeitschr. f. physiol. Chem. 44, 85 [1905]; II., Zeitschr. f. physiol. Chem. 46, 401 [1905]; HI-- M. Siegfried und C. Neumann, Zeitschr. f. physiol. Chem. 54, 423 [1908]; IV., M. Siegfried und H. Liebermann, Zeitschr. f. physiol. Chem. 54, 437 [1908]. Über die Bindung von Kohlen- säure durch Alkohole, Zucker und Oxysäuren, M. Siegfried und S. Howwjanz, Zeitschr. f. physiol. Chem. 59, 376 [1909]. 2) M. Siegfried, Zeitschr. f. physiol. Chem. 44, 83, 96 [1903]. 184 R- Willstätter und A. Stoll. der Kohlensäure in der Pflanze gezogen werden können: ,,Wo Chlorophyll ist, ist auch Protoplasma. Entstehen auch hier bei der Aufnahme von Kohlensäure durch die Pflanze Carbaminogruppen, so wird die Aufnahme von Kohlensäure hierdurch begünstigt. An Stelle oder neben der Frage: Wie wird Kohlensäure reduziert ? müßte die Frage gelöst werden : Wie werden Carbonsäuren reduziert?" und Siegfried^) fügte später hinzu: ,,Man hat sich also vorzustellen, daß die Kohlensäure nicht als solche reduziert wird, eine Annahme, die allen früheren Bearbeitungen des Problems der Reduktion der Kohlensäure zugrunde lag, sondern, daß aus ihr Carbonsäuren entstehen und daß diese reduziert werden." Bei den Versuchen an der Pflanze hat es sich nun gezeigt, daß in der Tat im Protoplasma Kohlensäureverbindungen entstehen, die wahr- scheinlich den Übergang des Kohlendioxyds aus der Luft zum Chlorophyll vermitteln. Die Frage, ob diese Kohlensäureverbindungen als solche für den Reduktionsprozeß vom Chlorophyll addiert werden, oder ob sie Kohlensäure an Chlorophyll abgeben, ist experimentell noch nicht be- handelt worden. In anderem Zusammenhang, nämhch in Betrachtungen über die asymmetrische Synthese, die an einer folgenden Stelle gewürdigt werden sollen, ist E. Fi scher 2) zu der Anschauung gelangt, daß Kohlendioxyd mit den optisch aktiven Substanzen des Chlorophyllkornes eine Vereini- gung eingehe, für welche die Proteine Gelegenheit bieten und daß die Kohlensäureverbindung weiter in Sauerstoff und ein Reduktionsprodukt, wahrscheinlich ein Formaldehydderivat, zerlegt werde. Vergleich der Kohlensäureabsorption im Blut und im Blatt. Die Einrichtung für die Kohlensäureabsorption im Blatte ist der Ver- mittlung zwischen der Atmosphäre und dem Blatte angepaßt. Bei dem niederen Teildruck des Kohlendioxyds in der Luft wäre eine Absorptions- vorrichtung mit geringerer Dissoziationsspannung geeigneter, um die ^) M. Siegfried, Ergebnisse der Physiologie, herausgegeben von Asher und Spiro. IX, 334, und zwar 350 [1910]. ^) E. Fischer, Synthesen in der Zuckergruppe II, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 27, 318g, und zwar 3231 [1894]; Organische Synthese und Biologie S. 8 (Berlin, J. Springer, 1908). über Absorption der Kohlensäure durch das unbehchtete Blatt. 185 Kohlensäure auf hohe Konzentration zu bringen; aber die Vorrichtung soll sich andererseits für die leichte Abgabe der Kohlensäure, wahrschein- lich noch vor ihrer Desoxydation, eignen. Aus diesem Grunde müssen x\dditionsprodukte gebildet werden, die chemisch reaktionsfähig und leicht dissoziierbar sind; beide Eigenschaften treffen bei vielen Kohlen- säureverbindungen, zum Beispiel bei den freien Carbaminosäuren, zu- sammen. Wie auch die Überleitung des Kohlendioxyds an die Chloro- plasten erfolge, sei es durch Abgabe von Kohlensäure selbst oder durch Addition einer Kohlensäureverbindung an das Chlorophyll, in beiden Fällen ist eine Verbindung mit freier Carboxylgruppe nötig. Aus dieser Betrachtung ergibt sich in Übereinstimmung mit den beobachteten Disso- ziationsverhältnissen, daß die Kohlensäureverbindung im Blatte vom Neutralisationspunkt erheblich entfernt ist. Im Säugetierblut, wo die Absorptionsvorrichtung der einfacheren Auf- gabe zu genügen hat, das Kohlendioxyd zur Lunge zu befördern und dort zu entbinden, ist die Dissoziationsspannung für Kohlendioxyd viel kleiner als im Blatte, da die hohe Körpertemperatur eine beständigere Additions- verbindung fordert. Bei der Temperatur von ^8 ° und bei einem Teildruck von 30 mm Quecksilber ist die Kohlensäureabsorption der Blattsubstanz sehr klein, während das Blut bei dieser Temperatur und bei demselben Teildruck, nämlich unter den natürlichen Bedingungen des Blutgaswech- sels von Warmblütern, noch mehr als zur Hälfte gesättigt ist. In bezug auf die quantitative Leistung sind die Absorptionseinrich- tungen im Blute bei 38 ° und im Blatte bei 5 bis 15 ° ähnhch, insbesondere dann, wenn wir zum Vergleich den Partialdruck des Kohlendioxyds, wie er im Blut gegeben ist, auf das Blatt anwenden. Die Menge des von 100 ccm Blut chemisch absorbierten Kohlendioxyds ist 38,1 Volumprozent, wovon 14,3 ccm auf die zelligen Elemente (Trocken- gewicht 29 g), 23,8 ccm auf das Plasma (Trockengewicht 34 g) treffen^). Durch 100 g Trockensubstanz von Blut werden daher unter den angege- benen Bedingungen chemisch gebunden 119,2 mg. ^) Vgl. A. Loewy, Die Gase des Körpers und der Gaswechsel, C. Oppenheimers Handb. d. Biochemie d. Menschen u. d. Tiere, Bd. IV, i. Hälfte, Jena 191 1, S. 64. x86 R- Willstätter und A. Stoll. 100 g Blatt nehmen bei 5 ° und 30 mm Teildruck ungefähr 40 mg Kohlendioxyd auf; davon kommen nach Abzug von 8 mg für das Wasser des Blattes etwa 32 mg auf die gesamte Trockensubstanz (20 g), daher auf 100 g trockene Blattsubstanz 160 mg Kohlendioxyd. Hinsichtlich der Form des chemisch gebundenen Kohlendioxyds im Blute wird allgemein angenommen, daß es teils an Alkalien, teils an Eiweiß- stoffe gebunden sei. In Form von Alkalibicarbonat soll rund die Hälfte des Kohlendioxyds existieren, nämlich in den Blutzellen 17, im Plasma 20 Volumprozent, während das übrige Kohlendioxyd, das ist in 100 ccm Blut 19,3 ccm, in dissoziabler organischer Bindung angenommen wird. Das Vorkommen so großer Mengen Alkahbicarbonat wird beispielsweise aus dem Zurückbleiben von sekundärem Carbonat bei vollständigem Aus- pumpen des Serums gefolgert ; indem man die in gebundener Form hinter- bleibende, erst auf Zusatz von Säure freiwerdende Kohlensäure verdoppelt, kommt man zu dem angegebenen Betrag von primärem kohlensaurem Salze. Viel besser ist die Annahme gestützt, daß ein Teil des Kohlendioxyds im Blut von den Eiweißstoffen gebunden wird^). Den Nachweis hat J. Setschenow-) in eingehenden Untersuchungen für das Serum er- bracht, in welchem die Globulinalkah Verbindungen als Träger der Kohlen- säure fungieren, und Chr. Bohr=^) hat für die Blutzellen gezeigt, daß sich die alkalifreie Globulinkomponente des Hämoglobins mit Kohlendioxyd verbindet. Die wohl begründeten Ansichten von Setschenow und von Bohr hinsichthch der chemischen Bindung des Kohlendioxyds durch die Proteine des Serums und des Hämochroms sind durch die oben zitierten Arbeiten von Siegfried auf einfache chemische Vorbilder zu- rückgeführt worden. Über die Wechselwirkung zwischen anorganischen und organischen 1) Die Frage, „wieviel von der im Blut vorhandenen Kohlensäure frei und wieviel als Bicarbonat enthalten ist", behandelt L. Michaelis in seiner Abhandlung „Die allgemeine Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration für die Biologie" (im Ergänzungsband von C. Oppenheimers Handbuch d. Biochemie d. Menschen u. d. Tiere, Jena 1913. S. 10, und zwar S. 20) unter der Voraussetzung, daß sich die Eiweißstoffe an der Bindung der Kohlen- säure nicht beteihgen. -) J. Setschenow, Mem. Acad. Imp. d. Sc. d. St. Petersbourg VII. Ser., 26, i [1879]. 3) Chr. Bohr, Skand. Archiv f. Physiol. 3, 47 [1S92] und 8, 363 [1898]. über Absorption der Kohlensäure durch das unbeUchtete Blatt. 187 Bindungen der Kohlensäure im Blute ist folgende Vorstellung üblich^): ,,Ein Teil der Kohlensäure ist auch bei niedrigen Spannungen (etwa 0,6 mm) als Bicarbonat an Alkali gebunden. Wächst die COg-Spannung an, so wird die Menge der Bicarbonate zunehmen, indem sich in steigendem Grade Alkali aus den Albuminalkalien abspaltet. . . . erst bei höheren CO2- Spannungen ist . . . von den Albuminalkalien anzunehmen, daß sie in be- deutendem Grade gespalten w^erden, und diese Verbindungen bilden dann eine Regulation der zu starken Zunahme der Kohlensäurespannung, deren Steigen über die normale Grenze hinaus hierdurch gehemmt wird." Die Vorstellung^), daß die Proteine aus ihren Alkaliverbindungen durch Kohlendioxyd verdrängt werden, daß mit w^achsender Kohlen- säurespannung im Plasma ein weiterer Teil der Kohlensäure von dem an die Albuminate gebundenen Alkali Besitz ergreife, halten wir für un- gerechtfertigt und die Annahme des Vorkommens von Alkalibicarbonat im Blute für unzutreffend. Für die Deutung der die Spannungsverhältnisse betreffenden Beobachtungen scheint uns die einfache Erklärung zu genügen, daß die Hauptmenge gebundener Kohlensäure im Blut von den Eiweißstoffen und ihren Alkali Verbindungen aufgenommen werde. Aus dem bekannten Verhalten der Aminosäuren ergibt sich: Je höher der Teildruck des Kohlendioxyds, desto mehr Kohlensäure tritt in ihre Aminogruppen ein, desto saurer werden sie, desto mehr Bicarbonat wird von ihnen verbraucht. Die Carbaminoreaktion läßt sich auch folgendermaßen darstellen: Neutrale Aminosäuren oder Eiweißstoffe und Bicarbonat existieren nicht nebeneinander, ohne auch miteinander zu reagieren, sie addieren sich nach der Gleichung: NH2— CH2— COOH+MeHCOa Z NH — CH^ — COOMe -f H^O COOK Die Additionsprodukte sind einbasische Säuren ; durch basische Grup- ^) Chr. Bohr, Blutgase und respiratorischer Gaswechsel im Handb. d. Physiol. d. Menschen von W. Nagel, I. Bd., S. 113, Braunschweig 1909. -) Vgl. E. Abderhalden, Lehrb. d. physiol. Chem. 3. Aufl., 2. Teil, S. 972 (Berlin und Wien 19 15). l88 R. Willstätter und A. Stoll. pen oder Absättigung der Carboxyle mit Alkali wird die Reaktion be- günstigt, sie führt dann zu den sekundären Salzen. Es werde angenommen, bei niedriger Spannung (etwa 0,6 mm) sei ein Teil der Alkalien mit Kohlendioxyd (als Bicarbonat) verbunden und ein anderer Teil existiere in Verbindung mit Aminosäuren oder Albuminen. Lassen wir nun den Kohlensäuredruck ansteigen, so wird nicht die Menge des Bicarbonates zunehmen, sondern im Gegenteil wird mehr Kohlen- dioxyd von den Proteinen aufgenommen werden unter Bildung von Gruppen, welche stärker sauer sind als Kohlensäure und die das Bicar- bonat zersetzen. Wird andererseits nach dem bekannten Versuche von E. Pflüger 1) das Serum vollständig evakuiert, so zerfällt infolge der Erniedrigung des Teildrucks die Carbaminoverbindung im Sinne der oben stehenden Gleichung (von rechts nach hnks) und liefert Alkah- bicarbonat und weiterhin Carbonat. Die Kohlendioxyd absorbierenden Systeme im Blut und im Blatt können sich daher aus den gleichen chemischen Mitteln zusammensetzen und ihre Verschiedenheit in den Dissoziationsverhältnissen läßt sich dar- auf zurückführen, daß die Kohlensäureverbindungen im Blute in weiter- gehendem Maße durch Alkalien abgesättigt sind als diejenigen im pflanz- lichen Plasma. Der Unterschied läßt sich durch folgende sehr vereinfachte IModelle ausdrücken : I. IL NH — CH2— COOMe NH — CH^— COOMe COOK COOMe von denen das erste mehr den Dissoziationsverhältnissen im Blatte, das zweite eher demjenigen im Blute nahe kommt. Zur Abstufung der Neutralisation trägt noch bei die Ungleichheit der absättigenden Metallhydroxyde und die Verschiedenheit in den beigemischten, die Regulierung beeinflussenden Salzen organischer Säuren. E. Pflüger, Die Kohlensäure des Blutes, S. ii, Bonn 1864. Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. i8q Experimenteller Teil. I. Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. A. Die Versuchsanordnung. Die vom Chlorophyll unabhängige Absorption der Kohlensäure wird beobachtet, indem man die Blätter in einem Strom von konstantem Kohlensäuregehalt Änderungen der Temperatur aussetzt. Bei Tempera- turerhöhung wird Entbindung, beim Abkühlen Aufnahme von Kohlen- säure gefunden. Die Unterschiede in der Sättigung der Blätter mit dem Gase werden an der Erhöhung oder Erniedrigung des Kohlendioxyd- gehaltes im Gasstrom gemessen. Daraus ergibt sich ein Bild von der Absorptionserscheinung und vom Verhalten des auftretenden Additions- produktes, aber nicht eine Messung des absoluten Betrages der absor- bierten Kohlensäure. Für diese Untersuchung eignet sich nur Kohlendioxyd von ziemlich geringem Partialdruck, nämlich ein Luftstrom mit 5 bis 10 Volumprozent Gehalt an diesem Gase, womit im folgenden gearbeitet wird. Zu hoher Kohlensäuregehalt entspricht nicht den Bedingungen des biologischen Ver- suchs, auch würde bei stärkerer Kohlensäure die Genauigkeit infolge der großen Löslichkeit von Kohlendioxyd in Wasser vermindert und die Vo- lumbestimmung der kohlendioxydführenden Luft erschwert. Die Gefahr, daß durch Kohlensäure von der angegebenen Konzentration das Chloro- phyll im Blatte zerstört wird, kann außer Betracht bleiben; wir fanden nämlich, daß Erdbeerblätter ein viel längeres Verweilen, sogar 24 Stunden bei Zimmertemperatur in Luft mit 10 Prozent Kohlendioxyd, ohne Scha- den ertragen. Ein hauptsächlicher Umstand, dem die Methode Rechnung tragen muß, ist die Beeinflussung, welche auch die Atmung durch Änderung der Temperatur erfährt, das rasche Ansteigen beim Erwärmen und Sinken beim Abkühlen. Um den Einfluß der Atmung rechnerisch ausschalten igo R- Willstätter und A. Stoll. ZU können, bestimmen wir diese in Parallelversuchen in kohlensäurefreier Luft für die niedrigere und die höhere Versuchstemperatur und beim Übergang von einer Stufe zur anderen. Ein wichtiges Erfordernis ist es, bei den Absorptions- und den Atmungsversuchen die Temperaturände- rungen genau gleich rasch vorzunehmen. Es war eine Frage, ob nicht die Änderung der Teildrucke von Sauer- stoff und Kohlendioxyd die Atmung beeinflußt, aber es ist bestätigt wor- den, daß die Atmung die nämliche Menge von Kohlensäure liefert, sei es, daß sie in reiner Luft oder in 5 bis 10 Volumprozent Kohlendioxyd enthaltender erfolgt. Man bestimmt die mit einem Liter reiner Luft vermischte Menge von Kohlendioxyd durch \\'ägung. Nach der Sättigung der Blätter mit Kohlen- säure erhält man dafür eine Zahl, die sich aus dem Gehalt der angewandten Gasmischung an Kohlendioxyd + Atmungskohlensäure zusammensetzt. Nach den Parallelversuchen für die Atmung und der Analyse des Gasstroms sind bestimmte \^>rte von CO2 aus i 1 Luft für die Versuchs- temperaturen zum Beispiel von o und 30° zu erwarten. Die gefundenen Zahlen sind demgegenüber bei der Temperatursteigerung zu hoch, bei der Abkühlung zu niedrig. Über die Blätter wird bei 0° oder 5° ein Strom von 5- bzw. 10 proz. Kohlensäure geleitet; sodann erhöht man die Temperatur rasch auf 30°. Infolge der gesteigerten Atmung ist eine gewisse Erhöhung des Kohlensäuregehaltes zu erwarten, die sich wegen der schädlichen Räume und in Anbetracht der zur Erwärmung der Blätter erforderhchen Zeit erst allmählich einstellen sollte. Es findet aber eine sehr rasche und viel -bedeutendere Kohlensäureabgabe statt, die vorübergehend den Kohlen- dioxydgehalt des Gasstromes von 5 auf 5,5 Prozent oder von 10 auf etwa II Prozent steigen läßt. Der entgegengesetzte Vorgang erfolgt beim Wiederabkühlen auf 0°. Der Kohlensäuregehalt sinkt rasch für eine gewisse Zeit auf etwa 4,5 bzw. 9 Prozent. Hier erkennt man sogleich, daß die Erscheinung keinen Zusammenhang mit der Atmung hat ; denn wenn die Atmung schwächer wird, so kann doch der Gasstrom dadurch nicht kohlensäureärmer werden, als er der Druckflasche entströmt. Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 191 Für die Sättigung mit Kohlensäure arbeiten wir unter Lichtausschluß und ordnen die Blätter in ähnlicher Weise an wie in der zweiten x^b- handlung dieser Reihe für die Assimilationsversuche. 20 g frische Blätter werden ohne Zusatz von Wasser in eine möglichst flache Glasdose eingefüllt, die wir zur Verminderung des schädlichen Rau- mes noch mit beiderseits zugeschmolzenen Glasröhren anfüllen, auf wel- chen die Blätter hegen. Eine auf den geschliffenen Rand mit Paraffin- dichtung gepreßte Glasplatte, durch deren zentrale Bohrung der Gas- strom ein- und austritt, schließt den Raum luftdicht ab. Die Dose wird zum Lichtschutz mit einem Blechmantel umgeben und in ein Wasserbad von annähernd konstanter Temperatur eingesenkt. Mittels eines Rühr- werkes und durch Eintragen von Eis wurden die Temperaturen von o° und 5° mit Schwankungen von + 0,2° gehalten; für 30° erfolgte die Einstellung mit einer automatisch regulierten elektrischen Heizplatte. Die kohlensäurehaltige Luft wurde einer Druckflasche entnommen und der Gasstrom durch Reduzierventil und Strömungsmanometer an- nähernd konstant gehalten. Die Gasmischung durchströmte eine Wasch- flasche, um für sämtliche Fälle bei der konstanten Temperatur von 30° mit Wasserdampf gesättigt zu werden, dann trat sie in die Glasdose ein und mußte die Blätter umspülen. Nach dem Austritt ging das Gas durch einen Trockenapparat, ein mit Chlorcalcium und Phosphorpentoxyd be- schicktes Kugelrohr, sodann zur Abgabe der Kohlensäure durch einen Natronkalkapparat. Derselbe bestand aus zwei U-Röhren und enthielt wie bei den Assimilationsversuchen die Beschickung von Natronkalk und von Phosphorpentoxyd. Die kohlendioxydfreie Luft passierte schließlich ein Manometer, das zur Prüfung auf dichte Apparatur diente und eine Präzisionsgasuhr, mittels deren sie unter Berücksichtigung von Tem- peratur und Barometeränderung exakt gemessen wurde. Die Zuverlässigkeit der Versuchsanordnung und des Apparates, der möglicherweise schon allein infolge der Alkalinität des Glases Kohlensäure absorbieren könnte, wurde in einem Strom von ungefähr 5 vol.-proz. Kohlensäure geprüft. Beim Durchleiten bei 0° fanden wir mit einem Liter Luft 0,1054 g COo, nach raschem Erwärmen auf 30° 0,1056 g und IQ2 R. Willstätter und A. Stoll. bei erneutem Abkühlen auf o° 0,1055 g. Es zeigte sich, daß die Absorp- tion der Kohlensäure an den Glasflächen keinen Einfluß hat. Übrigens ist die Glasdose mitsamt den eingefüllten Röhren vor jedem Versuche mit verdünnter Säure und destilhertem Wasser gespült worden. B. Versuche mit lebenden Blättern. Um den Gang der Versuche anschaulich zu machen, teilen wir das erste der Beispiele ausführlicher mit. Erstes Beispiel; mit 10 vol.-proz. Kohlensäure. Absorptionsversuch . Von jungen Erdbeerblättern mit kurzen Stielchen wurden am 21. De- zember 28 g gesammelt, wovon wir 20 g für den Versuch in der Glasdose in gleichmäßiger Schicht ausbreiteten. Der durch die zugeschmolzenen Röhren verminderte Raum betrug etwa 250 ccm. Von den Blättern dienten 4,0 g wie in der zweiten Abhandlung zur Be- stimmung der Blattfläche und weiter, indem sie im Vakuum über Schwefel- säure zur Konstanz getrocknet wurden, zur Ermittlung der Trockensub- stanz. Diese betrug für 20 g Blätter 7,0 g, die Fläche 744 qcm. Mit einer zweiten 4 g-Probe derselben Blätter im frischen Zustand bestimmten wir durch quantitatives Extrahieren und colorimetrischen Vergleich den Chlorophyllgehalt ; er betrug in 20 g Blättern 37,0 mg. Die Dose wurde im Thermostaten auf 5 ° abgekühlt und die Luft in 10 Minuten aus dem Raum verdrängt mit einem Strom von einem Liter etwa 10 proz. Kohlendioxyds in der Minute. Nun wurde der Gasstrom mit einer Niveaudifferenz von 50 mm Quecksilber am Strömungs- manometer auf die Stundengeschwindigkeit von 4 Litern aller Ver- suche eingestellt; nach 20 Minuten begann die Bestimmung des Kohlen- dioxydgehaltes der aus der Glasdose austretenden Luft. Der Kohlendioxydgehalt des angewandten Gasgemisches war zuvor für die einer ganzen Umdrehung der Gasuhr entsprechende Luftmenge (i 1) und auch für die einzelnen Drittel des Zifferblattes bei bestimmten Temperatur- und Druckverhältnissen ermittelt und er wird umgerechnet auf die bei den Versuchen jeweils gegebenen äußeren Bedingungen. Die Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 193 Differenz des Kohlensäuregehaltes im Versuche gegenüber den so berech- neten Werten gibt nach erfolgter Sättigung der Blätter mit Kohlensäure schon den Betrag der Atmungskohlensäure an, der später mit der Atmung in reiner Luft verglichen werden soll. Nach einer für die Sättigung der Blätter erforderlichen Vorperiode von 1^/2 Stunden brachten wir durch Erwärmen des Wasserbades die Temperatur unmittelbar an den Blättern innerhalb 5 Minuten auf 30° und nach einer Beobachtungsperiode von 2 Stunden durch Eintragen von Eis in ebenso kurzer Zeit wieder auf 5 °. Die Natronkalkapparate wurden im allgemeinen in Intervallen von 15 Minuten ausgewechselt, aber un- mittelbar nach den Temperaturänderungen kürzten wir die Meßintervalle zur Vergrößerung der Ausschläge auf nur 5 Minuten ab. Die nachfolgende Tabelle 66 enthält in gekürzter Form die Beobachtungen des Versuchs. Atmungsversuch. Die folgenden Beobachtungen werden als Beispiel für die parallele Bestimmung der Atmung in der Tabehe 67 angeführt. 20 g junge Erdbeerblätter am 22. Dezember, Fläche derselben 700 qcm, Trockengewicht 7,0 g, Chlorophyllgehalt 37,5 mg. Die Beziehung zwischen Absorptions- und Atmungsversuch. Zur Berechnung subtrahieren wir zunächst für jedes Intervall des Absorptionsversuches vom gefundenen CO2 das dem gemessenen Luft- volumen des angewandten Gasstromes entsprechende COo. Die Summe der Differenzen gibt für die Beobachtungsperiode einer Temperaturände- rung und des Verweilens bei der erreichten Temperatur eine Kohlensäure- bilanz, die sich aus der Atmungskohlensäure plus entwickeltem oder minus absorbiertem Kohlendioxyd der Blätter zusammensetzt. Aus dem parallelen Atmungsversuch in reiner Luft entnehmen wir für den gleichen Zeitraum die Summe der Atmungsbeträge. Die Differenz aus der Kohlen- säurebilanz und der Atmungssumme einer Periode gibt die Kohlensäure- gehaltsänderung der Blätter an. Dafür finden wir nach der Temperatur- erhöhung einen positiven Wert, Kohlensäureabgabe, nach der Temperatur- erniedrigung einen negativen Wert, Kohlensäureabsorption. Die Ergebnisse werden für unser Beispiel in der Tabelle 68 zusammen- Willstatter-Stoll, Assimilation. I3 194 R. WiJistätter und A. Stoll. Tabelle 66. Absorptions versuch. Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten ] Temperatur Eingeführtes CO2 Gefundenes CO^ Kohlensäuredifferenz (mg) im Intervall für I 1 aus- 1 (g) (g) tretender Luft O 15 5.0° 0,1860 0,1869 0,9 0,9 15 5.0° 0,1860 0,1875 1.5 1.5 15 4.9° 0,1859 0,1877 1.8 1,8 15 5.0° 0,1859 0.1872 1.3 1.3 15 5,0° 0,1859 0,1874 1.5 1.5 . 15 5.0° 0,1859 0,1870 i.i i.r iV. _ 3 5—30° 0,0607 0,0617 1,0 1 5 30,0° 0,0639 0,0699 6,0 II. 7 5 30,0° 0,0613 0,0660 4.7 J 5 30,0° 0,0607 0,0630 2,3 1 1 5 29.9° 0,0638 0,0668 3.0 8.7 5 30,0° 0,0612 0,0646 3.4 15 30,0° 0,1857 0,1939 8,2 8,2 15 30,0° 0,1858 0,1931 7.3 7.3 15 30,0° 0,1858 0,1923 6,3 6,5 15 30,0° 0,1858 0,1926 6,8 6.8 15 30,1° 0,1858 0,1927 6,9 6,9 15 30>o° 0,1858 0,1922 6,4 6,4 3V. 5 30—5° 0,0606 0,0592 — 1.4 5 4.9° 0,0638 0,0626 — 1,2 — 2,3 3 3.1° 0,0612 0,0615 + 0,3 5 5.0° 0,0606 0,0598 — 0,8 5 3.0° 0,0638 0,0638 0,0 • + 0,3 5 3.0° 0,0612 0,0623 I.I 15 4.9° 0,1857 0,1863 0,6 0,6 15 5.0° 0,1858 0,1865 0,7 0,7 ^5 3-0° 0,1858 0,1868 1,0 1,0 ^5 5.0° 0,1858 0,1866 0,8 0,8 15 5.2° 0,1858 0,1868 1,0 1,0 5V. 13 4.9° 0,1858 0,1862 0,4 0,4 gestellt. Die Entbindung von Kohlendioxyd beim Übergang von 5 auf 30° betrug 10,2 mg, die Absorption bei der Temperaturerniedrigung 9,2 mg. Das in den Blättern enthaltene Wasser würde, wenn es als reines Wasser vorhanden wäre, beim Erwärmen von 5 auf 30° nur 1,9 mg CO2 entbinden. Auf das vorhandene Chlorophyll berechnet, entsprach die Gasentwick- lung beim Erwärmen etwa 5V2 Molen CO2. Um die Erscheinung anschaulich zu machen, stellen wir das Ergebnis dieses Beispiels in der Figur 13 so dar, daß die Teilstrecken auf der Abszisse Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 195 Tabelle 67. Atmungsversuch. Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten Gefundenes CO» Atmungsbetrag (mg) Temperatur im Intervall für I 1 aus- (g) tretender Luft 0 15 5° 0,0012 ' 1,2 15 4.9' 0,0010 1,0 1,0 15 5.0° 0,0011 1,1 1,1 15 5.1° 0,0010 i.o I.O 15 5.0° 0,0010 1,0 1,0 13 5.0° 0,0011 l.l I.I 1V2 5 5—30° 0,0007 0.7 1 5 30,0° 0,0016 .,6 4.3 5 30,0° 0,0020 ..0 .| 5 30,0° 0,0021 2.1 5 30.0" 0,0026 2.6 7.1 5 30,0° 0,0024 M 1 15 30,0° 0,0070 7.0 7.0 15 30,0 = 0,0068 6,8 6,8 15 30,2° 0,0069 6,9 6.9 15 30,0° 0,0068 6,8 6,8 15 30,0° 0,0067 6.7 1 6.7 15 30,0° 0,0067 6.7 6.7 3V2 5 30—5' 0,0017 1.7 1 5 5.0° 0,0009 0.9 3.2 5 5.0° 0,0006 0.6 1 5 5.0° 0,0005 0.3 1 5 • 5.0° 0,0007 0,7 2,1 . 5 5.1° 0,0007 0,7 ' • 15 5.0° 0,0011 1,1 I.I 15 5.0" 0,0009 0,9 0,9 15 5.0° 0,0012 1,2 1.2 15 5.0° 0,0011 i.i 1,1 15 5.0° 0,0010 1,0 1,0 5V2 ^3 5.0° 0,0011 i.i i.i Tabelle 68. g junge Erdbeerblätter, 10 vol.-proz. CO,. Temperaturänderung Beobachtungsperiode Kohlensäurebilanz Atmungssumme Kohlensäuregehalts- änderung der Blätter Von 5 auf 30 ' .. 30 ., 5' Stunden 62,3 mg 2,5 mg 52,3 mg 11,7 mg + 10,2 mg — 9,2 mg die Zeit von 5 Minuten bedeuten; die in dieser Zeit gemessenen Kohlen- säuremengen werden als Flächen aufgetragen, so daß ein Quadrat i mg CO2 entspricht. Die Fläche zwischen der ausgezogenen Linie und der xVbszisse gibt für die Blätter in der 10 proz. Kohlensäure die Abgabe 196 R. Willstätter und A. Stoll. und Aufnahme von CO, einschließlich der Atmung an; die punktierte Linie schließt die Kohlensäureabgabe in Luft ein, also die Atmung allein. Die Differenz beider Flächen gibt die Mengen der abgegebenen und absorbierten Kohlensäure an. ■ B^ Iz -> 3C M 50- -> ] ^ n ~^ ^. — L t-- ! 1 — 1 L_ =, ..-J 1 w P ^ ESS^ ^ sa _ i 1 1 i ! 1 1 1 ;. .,„, ! i m ~ ~ 1 1 1 1 1 Fig. 13. Kohlensäiireabsorption der Blattsubstanz in ihrer Abhängigkeit von der Temperatur. Atmung in kohlendioxydhaltiger und in reiner Luft. Neben dem Vorgange, der in diesem Versuche bestimmt worden ist, ergibt sich auch ein Vergleich der Atmung in reiner und in kohlensäure- haltiger Luft. Die hier angeführten Beträge (Tabelle 69) erweisen einen konstanten Verlauf der Atmung, die noch durch einen Gehalt von 10 Prozent Kohlendioxyd nicht beeinflußt wird. Es ist aber nach unseren Beobachtungen zweifelhaft, ob dasselbe auch bei erheblich höherem Kohlendioxydgehalt zutrifft. Zweites Beispiel; mit 5 vol.-proz. Kohlensäure. Absorptionsversuch . 20 g junge Erdbeerblätter, Anfang Dezember, Blattfläche 990 qcm, Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 107 Tabelle 69. Atmung (mg CO,) in Intervallen von 15 Minuten (20 g Erdbeerblätter). Temperatur Atmung in reiner Luft [ Atmung in loproz. COg 30° 6,9 ] 6.5 30° 6,8 6,8 30° 6,7 6,9 30° 6,7 6,4 5° 1,2 1,0 5° 1,1 0,8 5° 1,0 1,0 5° 1,1 (0,4) [gewicht 6,25 g. CO2, abgegeben nach der Sättigung in der Periode des Übergangs von o auf 30° und in 45 Minuten bei dieser Temperatur: 25,5 mg; beim Übergang von 30 auf 0 ° und in 45 Minuten bei dieser Temperatur auf- genommen: 2,8 mg; beim erneuten Übergang von o auf 30° abgegeben: 27,9 mg. Vergleichsversuch für die Atmung. 20 g Blätter; Fläche derselben 780 qcm, Trockengewicht 6^75 g; die folgenden Zahlen für CO2 sind auf das Trockengewicht der für den Ab- sorptionsversuch angewandten Blätter umgerechnet. CO2, abgegeben in der Periode des Übergangs von o auf 30° und in 45 Minuten bei dieser Temperatur: 18,9 mg; beim Übergang von 30 auf 0° und in 45 Minuten bei dieser Temperatur 5,2 mg; bei erneutem Über- gang von o auf 30° und in 45 Minuten bei dieser Temperatur: 19,9 mg. Die Entbindung von COo beim Erwärmen von o auf 30 ° betrug daher 6,6 mg, die ^Absorption bei der Temperaturerniedrigung 8,0 mg und die Wiederabgabe bei abermaligem Erwärmen 8,0 mg. Das in den Blättern enthaltene Wasser (13,75 ccm) würde, wenn es als reines Wasser vorhanden wäre, beim Erwärmen von o auf 30° 1,4 mg COo entbinden. Drittes Beispiel; mit 10 vol.-proz. Kohlensäure. 20 g alte Erdbeerblätter; Fläche derselben 724 qcm, Trockengewicht 6,75 g, Chlorophyllgehalt 51,6 mg. 198 R. Willstätter und A. Stoll. Beim Übergang von 5 auf 30° und in darauffolgenden 75 Minuten betrug die Kohlensäureabgabe (ohne Atmungskohlensäure; 8,9 mg, von 30 auf 5° und in weiteren 75 Minuten war die Absorption 7,9 mg; beim Wiedererwärmen von 5 auf 30° und in folgenden 75 Minuten erfolgte erneute Abgabe von 9,1 mg. Der Vergleich dieses Versuchs und des unter gleichen Bedingungen ausgeführten ersten Beispiels ist von Bedeutung, weil im ersten Versuch junge verhältnismäßig chlorophyllarme Blätter, im dritten dagegen chloro- phyllreiche Blätter derselben Pflanze angewandt waren. Die jungen Erd- beerblätter mit 37,0 mg Chlorophyll zeigten bei der Temperaturänderung von 5 auf 30 ° und von 30 auf 5 ° eine Kohlensäuregehaltsänderung von ± 9,7 mg, die alten Blätter mit 51,6 mg Chlorophyll die Differenz von ± 8,6 mg. Es zeigt sich also kein Zusammenhang zwischen Absorptions- erscheinung und dem Chlorophyllgehalt. C. Versuche mit getrockneter Blattsubstanz. Die Kohlensäureaufnahme der Blattsubstanz ist unabhängig von der Lebenstätigkeit und der Struktur der Zelle; im folgenden wird gezeigt, daß die Blätter in abgetötetem Zustand, nämlich getrocknet und zerkleinert, sobald man sie wieder anfeuchtet, ebenso wie frische Blätter Kohlensäure absorbieren. Aus dem Verhalten gepulverter Blätter gegen Lösungsmittel erkennt man^), daß beim Durchfeuchten infolge der Auflösung von Mineral- salzen der kolloide Zustand des Chlorophylls aufgehoben wird. Vielleicht trägt dieser Umstand dazu bei, das Chlorophyll gegen die Kohlensäure widerstandsfähig zu machen. Jedenfalls erweist sich der Farbstoff unter den Versuchsbedingungen, nämlich bei tagelangem Einwirken der 5 proz. Kohlensäure, merkwürdig beständig. Die Versuchsanordnung ist dieselbe wie bei frischen Blättern. W'ir arbeiteten mit Brennesselblättern, die anderthalb Jahre zuvor gesammelt und an der Luft getrocknet waren. Für den Versuch wurden sie vollends im Exsiccator getrocknet, wobei sie noch 8 Prozent Feuchtigkeit ver- loren, und kurz vor der Verwendung im Mörser fein gepulvert. ^) Unsere „Untersuchungen ülier Chlorophyll", S. 63. Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 199 10 g Blattmehl, die etwa 40 g frischen Brennesselblättern ent- sprechen, werden in gleichmäßiger Schicht über die Röhreneinsätze der Absorptionsdose ausgebreitet, die den schädlichen Raum verkleinern und die Oberfläche des Pulvers vermehren. Zum Anfeuchten dienen 30 ccm Wasser, soviel als der angewandten Blattsubstanz entspricht. Es befindet sich in einem der Dose vorgeschalteten Kugelrohre und wird mit dem anzuwendenden verdünnten Kohlendioxyd bei der Versuchstemperatur gesättigt, um im richtigen Augenblick durch Neigen des Kugelrohrs zum Pulver geleitet und durch lebhaftes Umschwenken sehr rasch mit ihm vermischt zu werden. Da das trockene Blattmehl nur sehr langsam Kohlendioxyd aufnimmt, so gelingt es, den Apparat ohne erhebliche Absorption mit dem Gasstrom zu spülen und bei einer vor dem Anfeuchten vorgenommenen Bestim- mung einen nur wenig niedrigeren Wert des Kohlendioxyds zu erhalten, als der Zusammensetzung des Gasstroms vor dem Eintritt in die Absorp- tionskammer entspricht. Sofort nach der Befeuchtung des Blattpulvers mit dem kohlensäuregesättigten Wasser sinkt der Kohlensäuregehalt des Stromes bedeutend. Erstes Beispiel; mit 5 vol.-proz. Kohlensäure. Nach dem Einfüllen von 10 g Blattpulver setzen wir die Absorptions- dose in den Thermostaten von o ° ein ; die Luft wurde mit dem 5 proz. Kohlendioxyd verdrängt, zuerst 5 Minuten lang mit einem Strom von 5 1 und dann während 10 Minuten mit der Strömungsgeschwindigkeit des Versuches von 4 1 in der Stunde. Hierauf begann die Bestimmung für ein Intervall vor der Anfeuchtung; i 1 durch die Gasuhr austretende Luft gab im Natronkalkapparat 0,1019 g CO., ab. Nach diesem Meß- bereich von 15 Minuten erfolgte das Anfeuchten, das in den drei folgenden Intervallen das Sinken des Kohlensäurebetrages auf 0,0975, 0,0983 und 0,0995 g COo zur Folge hatte. Die feuchte Blattsubstanz hatte also in 45 Minuten schon 10,4 mg Kohlendioxyd aufgenommen ; diese Zahl hat freilich nur die Bedeutung eines Minimal wertes. Die Temperatur wiu-de von 0° möglichst rasch auf 30° gesteigert. Die Kohlensäurezahlen der drei folgenden 15-Minuten-Intervalle stidgen 200 R- Willstätter und A. Stoll. auf 0,1110, 0,1047 und 0,1032 g und sie gingen beim Wiederabkühlen auf 0° in den nächsten Intervallen zurück auf 0,0928, 0,0986 und 0,0997 g CO2. Die Voraussetzung für die Bestimmung der Kohlensäuregehaltsände- rung der Blätter beim Temperaturwechsel ist die Kenntnis ihrer Kohlen- säureerzeugung in reiner Luft. Wäre bei den getrockneten Blättern der Oxydationsvorgang ähnlich wie bei den lebenden, so würde der Parallel- versuch in der kohlensäurefreien Luft konstante Werte für die Kohlen- säureproduktion bei den Versuchstemperaturen o und 30° liefern. Die postmortale Oxydation verläuft aber nicht mit der Konstanz, welche die Atmung der lebenden Blätter zeigt. Dieser Umstand macht die Über- tragung der Beobachtungen vom Vergleichsversuche auf den Absorptions- versuch ungenau. Dazu kommt noch, daß die bei dem Blattpulver zur Sättigung mit Kohlendioxyd und zur Entbindung desselben nötigen Zeiten sehr bedeutend sind. Im Vergleichsversuch gab das Brennesselpulver (10 g), solange es trocken war, bei 0° in 15 Minuten 0,2 mg CO2 an den Luftstrom ab; durch das Verreiben haben die Enz3^me Zutritt zu den Substraten für die Ox3^dation erlangt. Beim Anfeuchten wird die Oxydation lebhaft; sie gab schon bei 0° in drei Intervallen 0,7, 1,0 und 0,9 mg und in den folgenden Zeiten beim Erwärmen auf 30° und bei dieser Temperatur 5j3> 4>^) 3,7 nig> dann beim Wiederabkühlen auf 0° 1,6, 0,9 und 0,9 mg. Übertragen wir diese Beobachtungen auf den Absorptionsversuch, so ergibt sich für die Periode von 30° und 45 Minuten scheinbar keine Kohlensäuregehaltsänderung der Blätter (nur in der ersten Viertelstunde Abgabe von 3,8 mg), für die nachfolgende Periode bei o ° eine Kohlensäure- absorption von 18 mg. Ungestört vom unregelmäßigen Oxydationsvorgang wurde ermittelt, daß in der ersten Periode von 45 Minuten bei 0° 13 mg, im ganzen in 2 1/4 Stunden mindestens 28 mg CO2 absorbiert wurden. Zweites Beispiel; 5 vol.-proz. Kohlensäure. Die Absicht des Versuches war, die postmortale Oxydation durch lange Dauer der Erschöpfung zu nähern, so daß die Kohlensäureproduk- Einfluß der Temperatni- avif die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 201 tion und ihre Schwankungen nicht mehr die Absorptionserscheinung störten. IG g fein gepulverte Blätter wurden in der Absorptionsdose im Luft- strom von 4 1 Stundengeschwindigkeit zunächst im trockenen Zustand geprüft; in einer halben Stunde wurden 0,9mg CO2 abgegeben. Nach dem Anfeuchten mit 30 ccm \\^asser fanden wir bei o ° in drei Stunden eine Produktion von 18,3 mg COo, und zwar im Intervall von 15 Minuten beim Beginn des Versuchs 2,2, am Ende 0,8 mg. Die Temperatur wurde auf 30 ° gesteigert und das Kohlendioxyd wäh- rend 3 Stunden bestimmt; wir erhielten 39,0 mg COo, nämlich im ersten Intervall 6,2, im letzten 1,9 mg. Hierauf kehrten wir zu 0° zurück; in 16 Stunden betrug das Kohlen- dioxyd nur 4,7 mg, nämlich am Ende der Zeit 0,1 bis 0,2 mg im Intervall. Eine vierte Beobachtungsperiode von 2 Stunden bei 30° ergab im ganzen 11,6 mg, im ersten Intervall 1,9 und im letzten noch 1,4 mg. Der ganze Oxydationsverlauf in 25 Stunden hat 74,5 mg CO2 ge- liefert, dabei ist der Betrag im Intervall bei 0° auf 0,1 gesunken. Die Bestimmung der Kohlensäuregehaltsänderung beim Übergang von 30° auf 0° ist nicht mehr gestört. Das derart vorbehandelte Material wurde nun für den Absorptionsver- such verwendet. Die reine Luft verdrängten wir durch 5 Prozent Kohlen- dioxyd enthaltende und leiteten den Gasstrom bei 0° 2^!^ Stunden lang über das feuchte Blattpulver, um dieses mit Kohlendioxyd zu sättigen. Noch in den letzten beiden Intervallen belief sich die Kohlensäureauf- nahme der Blattsubstanz auf 2,5 und 2,1 mg. Es macht sich störend bemerkbar, daß die etwas zu hohe und dichte Schicht des Pulvers sich nur schwierig mit dem Gase sättigt; dreifach so lange Beobachtungszeit wie bei den lebenden Blättern war noch unzureichend. Das zeigt sich an folgender Beobachtung. Die Temperatur wurde auf 30° gesteigert, in der ersten Stunde des Übergangs zu dieser und des Verweilens bei dieser Temperatur wurden 13,1 mg abgegeben, in der nächsten Stunde erfolgte trotz der noch andauernden Kohlensäureproduktion des Materials eine Aufnahme von 1,6 mg aus dem Gasstrom. Während das kohlensaure- 202 r<. Willstätter und A. Stoll. gesättigte Pulver bei der Temperatursteigerung Kohleiidioxyd abgab, hat ein Teil des Pulvers sogar bei 30° noch weiter Kohlendioxyd absor- biert. Endlich kamen wir zum maßgebenden Punkt des Versuches, indem wir die Temperatur wieder auf 0° erniedrigten. Beim Übergang von 30 auf 0° und in zwei Stunden bei dieser Temperatur absorbierte die Blattsubstanz 32,1 mg CO.,, ohne daß in dieser Zeit die Sättigung erreicht war. In den zwei letzten Inter\'allen der Beobachtung betrug die Absorp- tion noch je 1,8 mg. Die Zahl von 32 mg ist für den Übergang von 30 ° auf o ° ein Minimal- wert der Kohlensäuregehaltsänderung; die Zahl ist zu niedrig, weil die Sättigung unvollkommen blieb und die Nebenerscheinung der Oxydation noch andauerte. Das Chlorophvll war am Ende des Versuchs unversehrt. Drittes Beispiel; mit 5 vol.-prozentiger Kohlensäure. Unsere Arbeit muß hier die noch nicht genügend bekannten postmor- talen Oxydationsvorgänge berücksichtigen, allerdings nur insoweit es sich um die Frage handelt, ob die Kohlensäureproduktion vermieden oder wie sie möglichst vermindert werden kann. Wenn daher die Literatur nicht näher gewürdigt werden kann, so sei doch erwähnt, daß W. Palladin\\ der die Fermentarbeit in lebenden und abgetöteten Pflanzen eingehend untersucht hat, zwischen der ,, abgetöteten" und der ,, abgestorbenen" Zelle unter- scheidet und annimmt, daß man bei Einwirkung hoher Temperaturen (100 °) abgestorbene Zellen erhalte, in denen nicht nur das Protoplasma, sondern auch die Fermente zerstört seien. Eine größere Widerstandsfähigkeit der Oxydationsfermente hat V. Gräfe"-; in seinen ,, Studien für Atmung und tote Oxydation" beobachtet. Die mit einem Ausdruck von J. Wiesner als ,,tote Oxydation" bezeichnete Kohlensäureproduktion dauerte an, selbst wenn Hefe auf 130 °, Blätter von Eupatorium adenophorum auf 160° erhitzt wurden. 1) W. Palladin in ,, Fortschritte der naturwissenschaftlichen Forschung", hrsg. von E. Abderhalden, i, 253 [1910]. -) V. Cirafe, Sitzungsber. d. Akad. d. Wiss. in Wien, math.-naturw. Klasse CXIV, Abt. I, 183 [1905]- Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 203 Die Angaben über das Verhalten abgetöteter Blätter finden wir in den folgenden Vor versuchen bestätigt. Die Erscheinung zeigt die Eigenart enzymatischer Reaktionen. Mit der Annahme von solchen ist die Ab- hängigkeit von der Temperatur und besonders das allmähliche Sinken der Kohlensäureproduktion bei konstanter Temperatur im Einklang. Da außer der Einwirkung von Hitzegraden, die wir wegen der Gefahr tief- gehender Veränderungen vermeiden wollen, noch kein Büttel bekannt ist, um den Oxydations Vorgang völlig zu unterdrücken, so begnügen wir uns damit, wie schon im vorigen Beispiel, geeignete Bedingungen für seine Vermmderung zu ermitteln. An ein und derselben Probe des Pflanzen- materials wird zunächst der Oxydationsprozeß herabgedrückt und dann die Absorption der Kohlensäure untersucht. Vergleichsversuch der postmortalen Oxydation nach Trocknungbei loo °. Die an der Luft getrockneten Brennesselblätter wurden 4 Stunden lang auf 90 bis 100° erwärmt. Wir untersuchten 10 g des feinen Pulvers zunächst trocken bei 0°; in zwei Intervallen von 15 Minuten betrug die Kohlensäureabgabe nur je 0,1 mg. Dann heßen wir 30 ccm Wasser zu- fließen und fanden, wie die Zahlen in der folgenden Tabelle 70 zeigen, daß das Erhitzen der abgetöteten Blätter keinen Einfluß auf ihre Kohlen- säureproduktion ausgeübt hat (vgl. die entsprechenden ^^'erte im \^oran- stehenden Beispiel 2). Tabelle 70. Postmortale Kohlensäureproduktion von 10 g Blattsubstanz. Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten Temperatur Gefundenes COo (mg) im Intervall von 15 Minuten 15 1 0,0° 2,9 15 0,0° 3.6 13 0,0° 2,9 13 0,0° 2,6 13 0 — 30" 7.2 13 30,0° 7.6 13 30,0° 5.6 Vergleichs\^ersuch der postmortalen Oxydation beim Befeuchten mit )limatl»sung. Vor dem Anfeuchten wurde die Kohlensäureproduktion des trockenen 2 04 R. Willstätter und A. Stoll. Pulvers von lo g Brennesselblättern bei 30° in reiner Luft bestimmt; in 30 Minuten wurde i mg CO., abgegeben. Nach dem Befeuchten mit 30 ccm Sublimatlösung (V200 Mol HgClo in i 1) hielten wir die Temperatur tagelang konstant bei 30°. Die in 15 Minuten an i 1 Luft abgegebene Menge CO., betrug anfangs 7 bis 8 mg und nach 16 Stunden nur noch i mg (s. Tabelle 71). So lange blieben die Blätter ziemlich frei von Mikroorga- nismen, dann erfolgte jäher Anstieg der Kohlensäure zu hohen Werten, bedingt durch starke Entwicklung von Mikroorganismen. Bei den übrigen Versuchen, in denen man nur kurz auf 30° erwärmte, kam es nie zu störender Entwicklung von Infusorien. * Tabelle 71. Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten Temperatur Gefundenes COj (g) Gefundenes CO2 (mg) in 15 Minuten 0 15 15 30° 30° 0,0073 0,0082 7.3 8,2 15 30° 0,0050 5.0 15 30° 0,0041 4.1 16 900 30—31° 0,0614 1,0 17 23 60 360 30° 30 = 0,0049 0,0378 1.2 1,6 24 60 30° 0,0115 2,9 41 42 1020 60 30" 30' 0,5790 0,0567 8.5 14,2 Absorptions versuch. IG g Pulver von Brennesselblättern, befeuchtet mit 30 ccm der Subli- matlösung, beobachteten wir zunächst im reinen Luftstrom i Stunde bei 0°, 11/4 Stunden bei 30°, 15 Stunden bei 18°, 3 Stunden bei 30° und wieder eine Stunde bei 0°. Die gesamte Menge der produzierten Kohlen- säure betrug, ähnlich wie im zweiten Beispiel, 73,1 mg. Die im Intervall \-on 15 Minuten erzeugte Kohlensäure war bei 30° von 7,1 auf 1,4 mg, bei 0° von 2,2 auf 0,1 mg zurückgegangen. Die Luft wurde in 5 Minuten durch 5 1 5 proz. Kohlensäure verdrängt und dem befeuchteten Pulver 4 Stunden lang bei 0° im Strom von der üblichen Geschwindigkeit (Gelegenheit zur Aufnahme von Kghlensäure geboten. Dann begannen die in der nachstehenden Tabelle 72 an- Einfluß der Temperatur auf die Sättigung der Blätter mit Kohlensäure. 205 Tabelle 72. Kohlendioxydentbindiing und -absorption von 10 g Blattsubstanz beim Temperaturwechsel. Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten Temperatur Eingeführtes COg (g) Gefundenes CO, (g) Kohlensäuredifferenz (mg) im Intervall und für I 1 austretender Luft 0 15 30 0° 0,1010 0,1152 + 14.2 15 30,0° 0,1010 0,1043 + 3.5 15 30.0° 0,1010 0,1018 + 0,8 15 30,0° 0,1010 0,1013 + 0,3 15 30,0° 0,1011 0,1010 — 0,1 15 30,0 ° 0,1011 0,1009 0,2 15 30,0° 0,1011 0,1009 — 0,2 15 30,0° 0,1011 0,1009 0,2 2 15 (30— )o" 0,1011 0,0907 — 10,4 15 0,0^ 0,1011 0,0949 — 6,2 15 0,0^ 0,1011 0,0973 - 3.8 15 0,0° 0,1013 0,0981 — 3.2 15 0,0 = 0,1013 0,0991 — 2,2 15 0,0° 0,1013 0,0992 — 2,1 15 0,0° 0,1013 0,0995 - 1.8 4 15 0,0° 0,1013 0,0997 — 1,0 geführten Messungen der Kohlensäureabgabe bei 30 ° und der x\ufnahme bei 0°. Aus der Beobachtung der Absorption vor dem eigentlichen Versuchs- beginn, die 1,3 und 1,2 mg COo in den letzten Intervallen bei 0° betrug, war bekannt, daß sich die Blattsubstanz nur unvollständig mit Kohlen- säure gesättigt hatte. Beim Erwärmen auf 30° wurden in zwei Stunden 18,1 mg^) CO2 abgegeben, während zugleich die produzierte Kohlen- säure zurückgehalten blieb. Im ersten Intervall von 15 Minuten bei 30° war die Kohlensäureentbindung zehnfach so groß, als die Produk- tion von COo durch die postmortale Oxydation nach dem Vergleichsver- suche. Beim Abkühlen auf 0° nahm das Blattpulver in 2 Stunden 31,2 mg CO.2 wieder auf. Auch hier ist noch keine Sättigung erreicht worden, da in den letzten Intervallen von je 15 Minuten noch 1,8 und 1,6 mg absorbiert worden sind. 1) Wenn man die auch bei 30° noch fortschreitende Sättigung des Pulvers berücksichtigt und in Rechnung zieht, wieviel Kohlensäure dasselbe gemäß den gefundenen Zahlen noch weiter bei dieser Temperatur absorbiert hat, so ergibt sich, daß die Abgabe anstatt 18,1 min- destens 19,3 mg betragen hat. 2o6 K. Willstätter und A. Stoll. II. Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. A. Die Methode der Untersuchung. Obwohl die Kohlensäureabsorption der Blattsubstanz dem lange bekannten Verhalten des Blutes analog ist, können die Untersuchungs- methoden für diese Erscheinung nicht vom Blut auf das Blatt übertragen werden, sondern die Bestimmung erfordert ein wesentlich abweichendes Verfahren. Die Form der Blätter muß geschont werden; daher kann auf diesen Fall die bequeme Technik für die Gasaufnahme und -entbindung von den Flüssigkeiten nicht übertragen werden. Außer der Form des Blattes bedingt die Leichtdissoziierbarkeit der in ihm entstehenden Kohlensäureverbindung, daß man immer einen das Versuchsobjekt um- gebenden Raum zu berücksichtigen hat. Die Bestimmung setzt zunächst voraus, daß im Vergleichsversuche oder, was vorgezogen wird, im Vor- und Nachversuch die Atmung der angewandten Blätter in reiner Luft verfolgt wird. Für die Untersuchung des Vorganges wählen wir vorzugsweise eine niedrige Temperatur, 5 °, um die Erscheinung ansehnlich zu machen und um zu gleicher Zeit die Atmung zu mäßigen. Der Versuch wird ausgeführt in einem Gefäß von bestimmtem Vo- lumen und mit einem bekannten Gewicht und Volumen der Blätter. Wird ein Strom von bestimmtem Kohlensäuregehalt über die Blätter geleitet, so setzt sich der Minderbetrag von Kohlendioxyd in der aus- tretenden Luft aus zwei Zahlen zusammen, aus der Kohlensäure des schädlichen Raumes im Absorptionsgefäß und dem Betrage, der von den Blättern absorbiert ist. Die Kohlensäuremenge in dem umgebenden Raum ergibt sich aus seinem Volumen und aus der Zusammensetzung des Gas- stroms. Im Falle der Dissoziation wird die Kohlensäure aus den Blättern und aus dem ermittelten schädlichen Raum mit einem Strom reiner Luft verdrängt. Ein besonderer Laiistand macht die Anwendung des im Prinzip so Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. 207 einfachen Verfahrens komphziert ; nämhch die an der Gasuhr zu messende Luft entstammt nicht vohständig dem angewandten Gasstrom, sondern zum Teil dem anders zusammengesetzten Gas, das bei Versuchsbeginn den schädhchen Raum des Absorptionsgefäßes gefüllt hat. Beschreibung des Apparates. Zur Aufnahme der Blätter ist die im vorigen Abschnitt beschriebene flache Dose nicht anwendbar, weil ihr Raum mit der wechselnden Dicke der Paraffinschicht variiert, mit der die Verschlußplatte am Dosenrande abgedichtet ist. Statt dessen wenden wir als Absorptionsgefäß eine zylindrische Flasche an, von etwa 350 ccm Inhalt, mit exakt aufgeschliffenem und schwach eingefettetem Helm, der eine bis zum Boden reichende Einleitungsröhre und ein Ableitungs- rohr trägt. An beiden Röhren sind wagrecht stehende Glashähne ange- schmolzen, deren äußere Enden 2 cm lang und capillar verengt sind. In manchen Fällen wurde die Flasche zur Verminderung des Raumes mit zugeschmolzenen Glasröhren angefüllt. Das Volumen der Flasche mit oder ohne den Röhreneinsatz bestimmten wir von einem kapillaren Ende bis zum anderen durch Aus wägen mit Wasser für die Versuchstempera- tur; mittels einer Marke war dafür gesorgt, daß der konische Schliff des Helmes sich immer in derselben Stellung zum Halsschliff der Flasche befand. Das Absorptionsgefäß wurde, mit einem schwarzen Tuch umwickelt, in einen mit Asbestpappe umhüllten Thermostaten eingesenkt, der 100 1 Wasser faßte. Für diese Wassermenge w^ar es bei kräftigem Rühren aus- reichend, alle 5 bis 10 Minuten loo bis 200 g fein gemahlenes Eis einzu- tragen, um bei einer Zimmertemperatur von 20 ° die Temperatur auf 5 ° zu halten, mit Schwankungen von nicht mehr als ± 0,1 °. Im Gas- raum des Absorptionsgefäßes waren die Temperaturdifferenzen noch geringer. Höhere Temperatur, zum Beispiel 25 °, war mit einem Thermo- regulator leicht auf ±0,05° konstant zu halten. • Zur Trocknung des Gasstromes dienten bei den ersten Versuchen Apparate, die in geraden Kugelröhren bestanden und in den zwei ersten Kugeln mit Chlorcalcium, in den zwei folgenden mit Phosphorpentoxyd beschickt waren. Da es sich zeigte, daß Chlorcalcium langsam etwas 208 K. Willstätter und A. Stoll. Kohlendioxyd aufnimmt und langsam wieder abgibt, wodurch besonders bei höherem Kohlensäuregehalt des Stromes störende Fehler verursacht werden, ersetzten wir später das Chlorcalcium durch Schwefelsäure. Mit dieser war in einem U-förmig gebogenen Teil der Kugelröhre Glaswolle getränkt. Die Schwefelsäure beseitigte das Wasser des Gasstromes, ohne durch eine mehr als zentimeterhohe Säule den Strömungswiderstand zu vergrößern, und sie verhinderte das rasche Aufbrauchen des Phosphor- pentoxyds. Der Trockenapparat war auf der Seite der Gasuhr mit einem Glashahn zu verschließen. Da der Gasraum des Trockenapparates nicht genau zu bestimmen ist, wurden für reine Luft und für kohlensäurehaltige besondere Apparate verwendet, die vor dem Versuche mit der entsprechenden Gasart gefüllt waren. Beim Sättigen der Blätter mit Kohlensäure wurde der kohlen- dioxydhaltige, bei der Entgasung der kohlendioxydfreie Apparat ein- geschaltet, x^uch der Trockenapparat war, mit Blei beschwert, in den Thermostaten eingesenkt. Zur Absorption des Kohlendioxyds diente der aus zwei miteinander verbundenen U-Röhren bestehende Apparat^) mit Natronkalkfüllung und einer Schicht Phosphorpentoxyd. Um den Einfluß der Luftfeuchtigkeit auf sein Gewicht auszuschalten, w^urden nebenher Kontrollapparate mit gleicher Oberfläche gewogen und ihre Gewichtsschwankungen berück- sichtigt. Besondere Aufmerksamkeit erfordert bei allen folgenden Versuchen die genaue Messung des aus dem Apparate austretenden Volumens Luft durch eine Gasuhr von Präzisionsausführung. Es wird bestimmt, wieviel Kubikzentimeter CO2 das an der Gasuhr gemessene Luftvolumen im vor- geschalteten Natronkalkrohr zurückgelassen hat, und daraus der Kohlen- säuregehalt des aus dem Absorptionsgefäß kommenden Stromes abgeleitet. Die aus Britanniametall gefertigte Trommel der Gasuhr faßt i 1; der Zeiger ist unmittelbar auf der Achse befestigt; das in 200 Intervalle geteilte Zifferblatt hat einen Durchmesser von 2 dm und erlaubt, noch ^2 ccm gut zu schätzen. Die sorgfältig ausbalancierte Trommel rotiert 1) Siehe die zweite Abhandlung, Abschn. III, A. Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. 209 bei konstantem Gasstrom gleichmäßig. Die Messung wird durch SchUeßen des Hahnes am Trockenapparat in dem AugenbHck unterbrochen, wenn der Zeiger den Nullstrich erreicht. Infolge der lebendigen Kraft rotiert die Trommel bei der Strömungsgeschwindigkeit des Versuches noch um 2^2 Teilstriche weiter. Mit Rücksicht auf den für die Drehung erforder- lichen kleinen Überdruck schließen wir die Zuleitung zur Gasuhr jeweils vor dem Entfernen des Natronkalkapparates und öffnen erst nach Ein- schaltung eines neuen^ damit nicht aus der Gasuhr etwas Luft zurück- ströme; sonst müßte diese bei einer neuen Messung vor beginnender Ro- tation der Trommel ersetzt werden. Zu iVnfang eines Versuchs wird min- destens ein Liter reiner Luft mit der Versuchsgeschwindigkeit durch die Gasuhr geleitet, damit die ausgedehnten Flächen der Trommelkammern gleichmäßig benetzt sind und der Gasraum um die dünne Wasserschicht verkleinert ist. Am Ende der letzten Umdrehung vor Versuchsbeginn und bei jeder späteren Messung wird der Gasstrom in dem Augenblick gedrosselt, da der Zeiger den Nullstrich passiert. Die Messungen führten » wir in einem Zimmer von annähernd konstanter Temperatur aus, so daß im Gasraum der Uhr auch bei stundenlangen Versuchen höchstens Schwan- kungen um wenige Zehntelgrade vorkamen. Die Temperatur der die Gasuhr verlassenden Luft, ferner der auf o° reduzierte Barometerstand und der Dampfdruck des Wassers der Gasuhr wurden in Rechnung ge- zogen. Mit den beschriebenen Vorsichtsmaßregeln ließen sich gleichmäßige ^^>rte für das einem Liter Luft entsprechende Kohlendioxyd erzielen. In der folgenden Tabelle 73 sind aus beliebigen Versuchen mit Strömen verschiedenen Kohlensäuregehaltes je drei aufeinander folgende Zahlen einer Beobachtungsreihe angeführt. Tabelle 73. Mit 5 proz. CO2 (g) Mit 10 proz. CO2 I Mit 20 proz. CO2 (g) • 1 (g) 0,0945 0,1908 0,4221 0,0946 0,1908 0,4221 3 1 0,0945 0,1907 I 0,4223 Willstatt er- st oll, Assimilation. I4 210 R. Willstätter und A. Stoll. Die Abweichung des Trommelinhalts vom Liter und der Einfluß dieses Fehlers auf die Messung der Absorption, namentlich in Luft von höherem Kohlendioxydgehalt, wird in besonderen Versuchen ermittelt. Ausführung der Versuche. Der Luftstrom wurde einer Druck- luftleitung entnommen, auf einen konstanten geringen Druck gebracht und zur Befreiung von Kohlendioxyd durch eine Waschflasche mit kon- zentrierter Kalilauge und eine lange Natronkalkröhre geleitet. Die Ge- mische von Kohlendioxyd und Luft füllten wir mit einem Kompressor in Stahlflaschen. Die Geschwindigkeit des Gasstromes wurde an einem Strömungsmanometer beobachtet und mit einem Präzisionshahn nach einer mit dem Kohlendioxydgehalt des Gasstromes etwas variierenden Quecksili)erhöhe des Manometers reguhert, um die Luft mit konstanter Strömung durch die Gasuhr austreten zu lassen. Die Apparatur prüften wir vor jedem Versuche auf Dichtigkeit, indem wir nach dem Schheßen des Einlaßhahnes der Gasuhr so viel Luft ein- • preßten, bis in einem vor der Gasuhr angebrachten Manometer eine Wassersäule auf 50 cm Höhe anstieg. Dann mußte beim Unterbrechen des Luftzutritts die Wassersäule ihren Stand minutenlang behalten. 20 g Blätter ohne Stiele wurden im Absorptionsgefäße so angeordnet, daß die Blätter und namentlich ihre Unterseiten mit den Spaltöffnungen durch den von unten nach oben gerichteten Gasstrom vollständig bespült werden mußten. Beim Einsetzen des Stopfens war dafür Sorge zu tragen, daß die auf den Boden des Absorptionsgefäßes reichende Einleitungsröhre keine Blätter zusammenpreßte, ihre Öffnung muß frei stehen. Das so beschickte Gefäß befestigen wir, mit einem schwarzen Tuch vor Licht geschützt, im Thermostaten und verbinden es mit dem kohlensäurefreien Trockenapparat und mit dem anzuwendenden Kohlendioxyd führenden , Luftstrom. Mit diesem Strom durchspült man vor dem Absorptions- versuche w^ährend der Atmungsperiode das Strömungsmanometer und den später erforderlichen kohlendioxydhaltigen Trockenapparat und schaltet die Alkaliapparatur vor das Absorptionsgefäß, um kohlendioxyd- freie Luft eintreten zu lassen. So ist es ohne Zeitverlust möglich, einfach durch Ausschalten der Alkalivorlage sogleich das kohlendioxydhaltige Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. . 211 Gas in das Absorptionsgefäß strömen zu lassen und den entsprechenden Trockenapparat anzuschlieJ3en. In einer viertel bis halben Stunde hat sich der Temperaturausgleich vollzogen, der Gasstrom ist auf die Geschwin- digkeit von 4 1 in einer Stunde gestellt und die Blätter sind mit reiner Luft gespült. Man beginnt die Atmung in drei bis vier Intervallen von 15 Minuten zu messen und beobachtet im allgemeinen bis auf +0,1 mg konstante Werte. Beim Übergang zum Absorptionsversuche wird nach Ausschalten der Alkahvorlage das Absorptionsgefäß zum Druckausgleich einen Augenblick geöffnet und mit dem kohlendioxydhaltigen Trocken- apparat verbunden. Damit keine Luft aus der Gasuhr zurückströmt, wird immer ein wenig Überdruck in der Leitung erzeugt, ehe man den Hahn der Gasuhr öffnet. Den Natronkalkapparat wechseln wir jede Viertelstunde. Um bei Versuchen mit den höheren Kohlensäurekonzen- trationen das im Einführungsrohr des Natronkalkapparates und über verbrauchtem Natronkalk stehende Kohlendioxyd zur Absorption zu bringen, leiten wir nach dem Abnehmen des Apparates noch getrocknete Luft in ihn ein. Sobald der Kohlensäuregehalt des Gasstromes nicht mehr ansteigt, was in einer bis anderthalb Stunden der Fall zu sein pflegt, ist der Absorp- tionsversuch beendet. Die im Absorptionsgefäß zuvor vorhandene reine Luft, welche nur die Atmungskohlensäure enthalten hat, ist durch die kohlensäurehaltige ersetzt, und die Blätter sind mit dem Kohlendioxyd von gegebenem Teildruck gesättigt. Um zum Dissoziationsversuch über- zugehen, ersetzen wir nach dem Entlasten des kleinen Überdrucks im Ab- sorptionsgefäß den COa-haltigen Trockenapparat durch den COa-freien, schalten den Alkaliapparat wieder ein vor dem Absorptionsgefäß und beginnen die Entbindung des Kohlendioxyds aus den Blättern und die Verdrängung aus dem umgebenden Raum durch reine Luft. In einer bis anderthalb Stunden ist der Kohlendioxydbetrag eines im Intervall von 15 Minuten durchgeleiteten Liters Luft wieder auf den normalen Wert der Atmung gefallen, die Entbindung der Kohlensäure also beendet. Weder die tiefe Versuchstemperatur noch die Einwirkung der 10- und sogar 20 proz. Kohlensäure in der Versuchszeit scheint den Blät- 14* 212 . I^. Willstättei- und A. Stoll. tern irgendwelchen Schaden zuzufügen; sie bheben in allen Versuchen, selbst in tagelangen, unverändert grün und frisch. Am Ende wurden die Blätter zur Bestimmung des Trockengewichts herausgenommen und in den Vakuumexsiccator gebracht. Die Ergebnisse verschiedener Versuche sind zu Vergleichszwecken auf gleiches Trockengewdcht um- gerechnet. B. Berechnung der vom schädlichen Raum des Absorptionsgefäßes bedingten Kohlensäuredifferenz. I. Beim Verdrängen der reinen Luft durch kohlendioxydhaltige. Der Raum des Absorptionsgefäßes ist geeicht, das Volumen der eingefüllten Blätter wird in Abzug gebracht, um den schädlichen Raum (V) zu finden. 20 g Blätter enthalten etwa 4 g Trockensubstanz ; sie besteht zum großen Teil aus Cellulose, deren spezifisches Gewicht (1,3' das Volumen der an- gewandten Blattmenge ohne erheblichen Fehler zu 19 ccm berechnen läßt. V kommt bei anderer Temperatur und daher auch anderer Dampftension des Wassers, als im Absorptionsgefäß gegeben ist, in der Gasuhr zur Mes- sung (als Y-i'- Bezeichnet man den Temperaturunterschied zwischen Ab- sorptionsgefäß und Gasuhr mit / und den Luftdruck, nämlich den auf 0° reduzierten Barometerstand abzüglich der Dampftension des Wassers, im Absorptionsgefäß mit p, in der Gasuhr mit p^, so wird das aus dem mit Blättern beschickten Absorptionsgefäße verdrängte Luftvolumen in der p Gasuhr registriert als V^ = V (i + a T , . Noch zu berücksichtigen bleibt, daß die Luft nicht rein ist, sondern Atmungskohlensäure enthält, deren gefundenes Gewicht in Volumen (a) umzurechnen ist. Die Korrek- tur für die Atmungskohlensäure ergibt : V. = V^ — a . Nach der Sättigung der Blätter finden wir im Natronkalk das zu einem an der Gasuhr gemessenen Liter Luft gehörende Gewicht Kohlendioxyd G, ausgedrückt in mg, des Stromes \'on konstanter Zusammensetzung. Der allein durch den schädlichen Raum bedingte Minderbetrag von CO., beim Austritt des ersten Liters Luft aus der Gasuhr heiße Gj und der Kohlensäuiebetrag \'om ersten Liter Go. Bestimmung der Kohlcnsäureabsorption lebender Blätter, P 1 G^ = G - T% = G I F(i +a/)^ Go = Cfi — F(i +aO^ — 2. Beim Verdrängen kohlendioxydhaltiger durch reine Luft. Hier ist unter der Voraussetzung eines Gehaltes von G (mg) CO2 auf i 1 Luft des Gasstromes nach Sättigung der Blätter die Menge von Kohlendioxyd im schädlichen Raum zu ermitteln, der oben bereits auf Druck und Tempera- tur der Gasuhr umgerechnet wurde (Fi). Bedeutet t^ die Temperatur der Gasuhr und p^ den korrigierten Luftdruck in ihr, so ergibt sich aus dem Gewicht eines Kubikzentimeters Kohlendioxyd = 1,9769 mg (0°, 760 mm) das Volumen v des mit i 1 Luft ^'ermischten Kohlendiox37ds, ^ ^ G • (i + (xt^)' 760 1,9769 -A Das Volumen des Kohlendioxyd-Luft-Gemisches, welches G (mg) CO2 enthält, ist bei der Temperatur und beim Luftdruck in der Gasuhr V -f 1000. Daher enthält der schädliche Raum, der nach den Verhältnissen in der Gasuhr in L, umgerechnet wurde, an Kohlendioxyd: Crg = . V -f- 1000 Hier ist noch zu berücksichtigen, daß das Absorptionsgefäß nach be- endeter Verdrängung nicht mit reiner Luft gefüllt ist, sondern etwas von der während des Verdrängens gebildeten Atmungskohlensäure ent- hält. Dafür bedarf es eines Zuschlags zur gefundenen Kohlensäure, der bei höheren Versuchstemperaturen nicht unerheblich ist, zum Beispiel bei 25° 0,8 mg beträgt. G3 ist von dem gesamten bei der Verdrängung mit reiner Luft gefun- denen Betrage von Kohlendioxyd zu subtrahieren, um die von der Blatt- substanz entbundene Kohlensäure zu erhalten. Vorversuche. Um die Untersuchungsmethode und die Berechnung zu kontrollieren, wurden mit der beschriebenen, aber nicht mit Blättern beschickten Apparatur einige Vorversuche ausgeführt, bei 5 °, unter Ver- 214 R. Willstätter und A. Stoll. Wendung der die Glasoberfläche sehr vermehrenden Röhreneinsätze, und, um die Fehler deutlich hervortreten zu lassen, mit der stärksten Kohlen- säurekonzentration (in allen Fällen etwa 19 Prozent ; das Volumen des Absorptionsgefäßes betrug 232 ccm. Die gefundenen Differenzen zwischen Beobachtung und Berechnung von 0,9 mg beim Verdrängen der reinen Luft durch kohlensäurehaltige und von 1,7 mg beim Verdrängen der kohlensäurehaltigen durch reine Luft können als konstant gelten; sie sind wohl in erster Linie auf die Abweichung des Inhaltes der Gasuhrtrommel vom Litervolumen zurückzuführen. Bei der Untersuchung des Absorptionsvorganges bringen wir diese Differenzen, da sie die Ergebnisse zu günstig erscheinen ließen, in Anrechnung, und zwar bei 2oproz. Kohlensäure in vollem Betrage und bei geringerem Kohlendioxydgehalt mit einem entsprechenden Bruchteil. 1. Beispiel. Beim Verdrängen der reinen Luft durch kohlensäure- haltige betrug der durch den schädhchen Raum bedingte Fehlbetrag (oben als Gl bezeichnet) der Messung gegenüber dem einem Liter Luft entspre- chenden Kohlendioxyd nach der Berechnung 0,1051, nach der Wägung 0,1076 g CO,. Beim Verdrängen der kohlendioxydhaltigen Luft durch reine waren für den Mehrbetrag (G3 berechnet 0,0850 und gefunden 0,0878 g CO2. Es zeigte sich hier, daß die Anwendung von Chlorcalcium im Trocken- apparat ungeeignet ist; die Zeit einer Stunde für die Verdrängung der Luft war deshalb noch zu kurz, der Wert für das Kohlendioxyd auf i 1 Luft noch nicht konstant. 2. Beispiel. Mit der Schwefelsäurefüllung des Trockenapparates er- geben sich bei der Verdrängung rasch konstante Werte für den Kohlen- dioxydgehalt des Stromes. Der Versuchsfehler war hier noch zu beträcht- lich, weil die großen Glasflächen Kohlensäure absorbierten. Erst in der Folge wurde die Spülung des Glases mit verdünnter Säure vor dem Ver- suche eingeführt. Fehlbetrag beim Verdrängen der Luft, berechnet 0,1048, gefunden 0,1085 g CO2. Überschuß beim Verdrängen der kohlensäurehalti.e^en Luft, berechnet 0,0847, gefunden 0,0880 g CO.. Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter 215 3. Beispiel. Von diesem Versuch an war die Methode so vorbereitet, daß sie keine Änderung mehr erfuhr. Schon in der ersten Viertelstunde war die Verdrängung der Luft, im zweiten Intervall die Verdrängung der Kohlensäure beendet (Tabelle 74). Tabelle 74. Intervall in Minuten Barometerstand bei 21° in mm Hg Temperatm: der Gasuhr l Luft im IntervaU Gefundenes CO2 in g 15 754.8 20,2° I.OO 0,3152 15 754.8 20,2° 1,00 0.4213 15 754.8 20,2 °- 1,00 0,4214 15 754.8 20,2° 1,00 0,4215 15 754.8 20,2° 1,00 0,4212 15 754.8 20,2° 1,00 0,0856 15 — 1,00 0,0012 15 — — 1,00 0,0001 15 — — 1,00 0,0000 15 — 1,00 0,0000 Fehlbetrag beim Verdrängen der Luft, berechnet 0,1055, gefunden 0,1063 g CO2. Überschuß beim Verdrängen der kohlensäurehaltigen Luft, berechnet 0,0853, gefunden 0,0869 g CO2. 4. Beispiel. Fehlbetrag beim Verdrängen der Luft, berechnet 0,1050, gefunden 0,1060 g CO2. Überschuß beim Verdrängen der kohlensäurehaltigen Luft, berechnet 0,0848, gefunden 0,0866 g COo. C. Beispiele für die Kohlensäureaufnahme und -entbindung. Erster Versuch. Mit Blättern von Sambucus nigra in 5vol.-proz- Kohlendioxyd bei 5°. Angewandt 20 g Blätter ohne Stiele, Trockengewicht 4,0 g, Volumen des Absorptionsgefäßes 357,9 ccm. Die Absorption und Entbindung be- stimmten wir am gleichen Material wiederholt, die letzte Kohlensäure- abgabe war nicht vollständig. Die Zahlen für das in den einzelnen Intervallen mit je i 1 Luft gefun- dene Kohlendioxyd sind in der Tabelle 75 und in gleicher Weise in den 2l6 R. Willstätter und A. Stoll. nachfolgenden Versuchen auf die Temperatur und den Barometerstand des Versuchsbeginnes umgerechnet. Ergebnis: Das absorbierte Kohlendioxyd betrug 7,1 mg, das entbun- dene 6,6 mg; das wiederabsorbierte 7,9 mg und das wiederabgegebene 7,5 mg (Tabelle 75). Tabelle 75. Kohlensäiireaufnahme und -entbindung von 20 g Hohmderblättern. 5', 5 vol.-proz. CO;. V'ersuchsperiode Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten Austretende Luft (1) im Intervall Gefundenes CO, (g) im Intervall CO2 (mg) der Atmung im Inter- vall (gefunden Im Intervall absorbiertes ( — ) oder entbundenes (+) CO2 (mg) I 0,0010 oder berechnet) Atmung V4 15 gef. 1,0 V2 15 I 0,0007 o>7 'U 15 I 0,0006 1 0,6 Absorption I 15 1,000 0,0555 ' ber. 0,6 -4.4 15 1,000 0,0922 0,6 — 1-9 15 1,000 0,0934 0,6 — 0.7 15 1,000 0,0940 0,6 — 0,1 2 15 1,000 0,0941 0,6 0,0 Entbindung 4V2 150 5V2 0,0451 ber. 6,0 + 6,6 Atmung 4V. 15 I 0,0006 gef. 0,6 ^5 I 0,0006 0,6 Absorption 5V4 15 1,000 0,0540 ber. 0,6 -5.6 15 I,ÜOO 0.0917 0,6 — 1.9 13 1,000 0,0932 0,6 — 0,4 '3 1,000 0,0936 0,6 0,0 13 1,000 0,0936 0,6 0,0 6\/, 13 1,000 0,0935 0,6 0,0 Entbindung 6^4 15 I 0,0339 ber. 0,6 + 1,0 15 I 0,0062 0,6 + 5.4 7V4 13 I 0,0017 0,6 + i.i Zweiter Versuch. Mit Blättern der Brennessel in 5 vol.-proz. Kohlendioxyd bei 5°. Angewandt 20 g Blätter ohne Stiele, Trockengewicht 4,91 g, Volumen des Absorptionsgefäßes 357,9 ccm. Ergebnis : Das absorbierte Kohlendioxyd betrug 6,7 mg, das ent- bundene 6,6 mg (Tabelle 76). Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. 217 Tabelle 76. Kohlendioxydabsorption von 20 g Brennesselblättern. 5', 5 vol.-proz. C(),,. Versuch^periode 1 Versuchsdaucr in Stunden Intervall in Minuten Austretende Luft (1) im Intervall C.ei'undenes CO, (g) im Intervall CO2 (mg) der Atmung im Inter- vall (gefunden odef berechnet) Im Intervall absorbiertes (— -) oder entbundenes (+) CO, (mg) Atmung ■ 4 13 I 0,0013 gef. 1.3 15 1 0,00115 1.15 15 I i 0,00115 1.15 Absorption I 15 1,000 0,0532 ber. 1,2 — 5.3 15 1,000 0,0934 1,1 ^•^3 15 1,000 0,0944 1,2 — 0,15 15 1,000 0,0945 i.i — 0,05 15 1,000 0,0946 1,2 + 0,05 2V4 15 1,000 0,0945 1,1 — 0,05 Entbindung 3V4 go 6,2 0,0460 ber, 6,9 6,6 Atmung 15 I 0,00115 gef. 1,15 15 I 0,0012 1.2 15 I 0,00115 1.13 Tabelle yy. Kohlensäureabsorption von 20 g Helianthusblättern. 5 °, 19 vol.-proz. COo. Versuchsperiode Versuchsdauer in Stunden Intervall in Minuten Austretende Luft (I) im Intervall Gefundenes CO^ (g) im Intervall CO2 (mg) der .\tmung im Inter- vall (gefunden oder berechnet) Im Intervall absorbiertes ( — ) oder entbundenes (+) CO2 (mg) Atmung V4 15 15 0,0008 0,0007 gef. 0,8 0,7 % ^5 0,0007 0,7 Absorption I 15 1,000 0,3103 ber. 0,7 — 14.4 15 1,000 0,4191 0,7 — 1,9 15 T,000 0,4201 0,7 0,9 13 1,000 0,4205 0,7 - 0,5 13 r.ooo 0,4209 0,7 — 0,1 2^/4 15 1,000 0,4210 0,7 0,0 Entbindung 2^4 30 1,8 0,0978 ber. 1,4 + 17.6 15 0,0026 0,7 + 1.9 15 0,0013 0,7 + 0,6 15 0,0009 0.7 + 0,2 Atmung 3% 15 15 0,0007 0,0007 gef. 0,7 0,7 Dritter Versuch. Mit Blättern von Helianthus am proz. Kohlendioxyd bei 5 °. 19 vol. 2i8 R. Willstätter und A. Stoll. Angewandt 20 g Blätter ohne Stiele, Trockengewicht 3,80 g, Volumen des Absorptionsgefäßes 231,9 ccm. Die Blätter waren an der Pflanze am Vorabend mit einem Beutel von schwarzem Baumwollstoff umhüllt worden, um bei Tagesanbruch bis zum Versuchsbeginn lebhafter Assimilation vorzubeugen. Vor dem Beginn der Atmungsperiode wurden die Blätter einige Stunden im Dunkeln an tiefe Temperatur gewöhnt. So war erreicht, daß die Atmung fast auf den halben Betrag herabgemindert und daß sie konstanter war. Ergebnis: Das absorbierte Kohlendioxyd betrug 17,7mg; das ent- bundene 20,3 mg (Tabelle 77;. D. Abhängigkeit der Absorption vom Teildruck des Kohlendioxyds. Erste Versuchsreihe. Mit Blättern von Helianthus annuus bei 5°. Versuche in Kohlendioxyd von a) i, b) 5, c) 8, d) 19 Volumprozent. Angewandt waren je 20 g Blätter vom Trockengewicht a) 3,20, b) 3,90, c) 3,25, d) 4,03 g. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 78 auf 4,0 g Trockengewicht umgerechnet. Tabelle j^. Kohlendioxydaiifnahm e und -entbindung von 20g Helianthusblättern bei 5°. 30. Juni Kohlendioxyd des Gasstromes Absorption 3,2 Entbindung (mg) 24. Juni 5 9,8 9.3 9.6 9,7 2. Juli 8 13.9 13.3 6. Juli 19 • 17.0 20,2 Das gesamte Wasser^) der Blätter würde, wenn es als reines Wasser 1) Nämlich für 4,0 Trockensubstanz 21,0, 16,5, 20,6, 15,8 ccm Wasser. Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. 219 vorläge, was aber durchaus nicht zutrifft, bei dem Teildruck des i-, 5-, 8- und 19 proz. Kohlendioxyds bei 5° absorbieren: 0,6, 2,3, 4,6, 8,4 mg. Zweite Versuchsreihe. Mit Blättern von Helianthus annuus bei 5°. Versuche in Kohlendioxyd von a) 10, b) ebenfalls 10, c) 20 Volum- prozent. Angewandt waren wieder je 20 g Blätter vom Trockengewicht a^ 3,84, b) 4,17, c) 3,70 g. Für die Tabelle 79 sind unsere Beobachtungen auf 4,0 g Trockengewicht umgerechnet. Tabelle 79. Versuche mit Helianthusblättern {20 g) bei 5°. Datum Kohlendioxyd in Vol.-Proz. des Gasstromes Absorption (mg) Entbindung (mg) 20. Juli 21. ,, 19- ,. 10 10 20 10,2 12,8 19,6 14.3 13.5 22,9 Dritte Versuchsreihe. Mit Brennesselblättern bei 5°. Die vergleichenden Bestimmungen in i- bis 19 proz. Kohlendioxyd gehören zwei Reihen an. Während bisher für jede Kohlensäurekonzen- tration ein neuer Versuch mit frischen Blättern ausgeführt worden ist, diente für die folgende Reihe von alternierenden Messungen der At- mung, der i\bsorption und der Dissoziation eine und dieselbe Blattprobe in 2^/2- bis 19 proz. Kohlendioxyd. Zur Ergänzung des Vergleichs nach der Richtung niedrigeren Teildruckes ist eine neue Probe der Blätter mit I proz. Kohlendioxyd geprüft und, um das Ergebnis mit demjenigen der vorigen Versuchsreihe in Beziehung zu bringen, auch in 5 proz. Kohlendioxyd untersucht worden. Diese Bestimmung der Absorption in 5 proz. Kohlendioxyd ist dieselbe, die schon im früheren Abschnitt ausführlich beschrieben worden ist. In der folgenden Tabelle 80 werden nur die Beobachtungen der zusammenhängenden Versuchsreihe mit a) 2^/2-, b) 5-, c) 10-, d) 19 vol.-proz. Kohlendioxyd angeführt und in der Tabelle 81 mit den daraus gewonnenen Ergebnissen auch diejenigen der Vergleichswerte in i- und 5 proz. Kohlendioxyd, umgerechnet auf das Trockengewicht der ersten Blattprobe, zusammengestellt. K. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 80. Versiichsperiode Kohlen- dioxyd in 1 Vol.-Proz. 1 des 1 Gasstromes Versuchs- dauer in Stunden Intervall in Minuten Austretende Luft (1) im Intervall Gefundenes CO2 (g) im Intervall CO2 (mg) der Atmung im Inter- vall (gefunden oder berechnet) Im Intervall absorbiertes ( — ) oder entbundenes- (mg) Atmung O V4 15 I 0,0012 r 1 gef. 1,2 15 I 0,0011 i.i /4 15 I 0,0010 1 Absorption 5 i 15 1,000 0,0555 ber. 1,0 — 4.4 13 I.OüO 0,0928 1,0 1,1 15 1,000 0,0935 1,0 — 0,4 15 1,000 0,0937 1,0 0,2 13 1,000 0,0938 0,9 0,0 2 /4 13 1,000 0,0939 1,0 0,0 Entbindung O 3 45 2,8 0,0425 ber. 2,9 + 7.2 Atmung 3V4 15 I 0,0010 gef. 1,0 13 I 0,0009 0,9 3V4 _^^1^ I 0,0009 0,9 Absorption lO 4 15 1,000 0,1126 ber. 0,9 - 8.5 15 1,000 0,1882 0,9 — 1,8 15 1,000 0,1896 0,9 — 0,4 15 1,000 . 0,1899 0,9 — 0,1 15 1,000 0,1900 0,9 0,0 5V4 15 1,000 0,1900 0,9 0,0 Entbindung o . 6 45 .,6 0,0769 ber. 2,6 + II. 6 13 I 0,0013 0,9 + 0,4 Atmung 6V, 13 I 0,0008 gef. 0,8 6V4 15 I 0,0009 0,9 Absorption 2,5 7 15 1,000 0,0252 ber. 0,8 — 3.4 15 1,000 0,0436 0,8 — 1.15 15 1,000 0,0446 0,8 — 0,15 15 1,000 0,0445 0.8 — 0,25 15 1,000 0,0447 0,8 0,0 8V4 15 1,000 0,0448 0,8 0,0 Entbindung o 9 : 45 2,8 0,0225 ber. 2,^ + 4.4 15 I 0,00085 0,85 + 0,1 Atmimg 9V. 15 I 0,00075 gef. 0,75 9V4 13 I 0,00075 0.75 Absorption 19 10 15 1,010 0,2605 ber. 0,7 — II.3 15 0,990 0,4211 0,7 - 5.6 13 1,000 0,4258 0,7 — 0,9 13 1,000 0,4261 0,7 — 0,6 13 1,000 0,4262 0,7 — 0,5 13 1,000 0,4266 0,6 0,0 11V2 15 1,000 0,4267 0.7 , 0,0 Entbindung o 12V4 45 2.9 0.1471 2,0 + 19.0 15 I 0,0018 0,7 + 1,1 15 I 0,0010 0,6 + 0,4 Atmung 13 15 I 0,0006 gef. 0,6 1 13V4 15 I 0,0006 0,6 Bestimmung der Kohlensäureabsoiption lebender Blätter. 221 Das Trockengewicht der ersten Blattprobe Versuch der Tabelle 80) war 4,53, das der zweiten Blattprobe 4,91 g, ihr Chlorophyiigehalt 46^4 mg. Das Volumen des Absorptionsgefäßes betrug 357,9 ccm. Tabelle 81. Kühlensäureaufnahme und -entbindiing, \'ersuche mit Brennesseln (20 g) bei 5°. Datum Kohlendioxyd in Vol.-Proz- des Absorption Entbindung Gasstromes (mg) (mg) 30. Juli I 1.9 2,3 28. „ ^.5 4.9 4.3 30- .. 3 6,2 0,1 2S. ,, 3 0,1 7'- 28. ■ ,, 10 10,8 12,0 28. ,, 19 i8,y 20.5 E. Einfluß der Temperatur auf die Absorption. Erster Versuch. Mit Blättern A^on Helianthus annuus in 5 vol.-proz. Kohlendioxyd bei 5 und 10°. Bei diesem Temperaturunterschied ist noch kein deutlicher Ausschlag in der Absorptionserscheinung zu bemerken. Zwei Blattproben vom Trockengewicht 3,90 g zeigten bei 5° Absorp- tion von 9,6 mg und Entbindung von 9,4 mg. Die entsprechenden Zahlen im Versuche bei 10° waren 9,1 und 8,8 mg. Zweiter Versuch. Mit Blättern von Populus pyramidalis hört, in 5 vol.-proz. Kohlendioxyd bei 5 und 25°. Mit derselben Blattprobe wurde in unmittelbar aufeinander folgenden Versuchen der Vorgang bei den zwei Temperaturen gemessen (Tabelle 82). Die Absorption sinkt beim Übergang von 5 auf 25 ° auf wenig mehr als den halben Wert, näm- lich von y,i auf 3,8 mg. Angewandt 20 g Blätter ohne Stiele, Trockengewicht 6,73 g, Volumen des Absorptionsgefäßes 357,9 ccm. F. Vergleich von Blättern der grünen Stammform und gelber Varietäten. Die Absorption der Kohlensäure durch die Blattsubstanz steht in keiner Beziehung zum Pigmentgehalt, die gefundenen Zahlen sind Viel- R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 82. Versuch mit Pappelblättern in 5vol. -proz. CO2. \ersuchsperiode Temperatur Versuchs- dauer in Stunden Intervall in Minuten Austretende Luft (1) im Intervall Gefundenes CO2 (g) im Intervall CO2 (mg) der At- mung im Intervall (gefunden oder berechnet) Im Intervall ab- sorbiertes (-) oder entbundenes (+) CO2 (mg) Atmung 5.0° V4 X5 I 0,0010 gef. 1,0 15 I 0,0008 0,8 ''4 ^5 I 0,0008 0,8 Absorption 5.0° I 15 1,000 0,0552 ber. 0,8 — 4.3 15 1,000 0,0918 0,8 — 1.4 15 1,000 0.0924 0,8 — 0.8 15 1,000 0,0925 0.7 — 0,7 15 1,000 0,0932 0,7 0,0 2V4 15 1,000 0,0932 0.7 0,0 Entbindung 5.0' 3-. 90 6 0,0434 ber. 4,2 + 6,9 Atmung 4 15 I 0,0007 gef. 0,7 15 I 0,0007 0.7 4^. 15 I 0,0006 0,6 Übergang von 5 auf 30° 5V2 60 4 — — Atmung 30,0° 5V4 ^5 I 0,0051 gef. 5.1 15 I 0,0050 5.0 6V4 15 ' 0,0049 4.9 Absorption 30,0° 6V2 15 1,000 0,0627 ber. etwa 4,7 — 3.5 15 1,000 0,0966 4.6 — 0,3 15 1,000 0,0967 4.4 15 1,000 0,0965 4.2 7V2 ^5 1,000 0,0963 4,0 Entbindung 30,0° 8 30 2 0,0410 ber. etwa 7,7 + 3.7 Atmung 8V4 15 I 0,0037 gel 3.7 15 I 0,0038 3.8 ^5 I 0,0038 3.8 9 15 I 0,0037 3-7 fache der für das Chlorophyll berechneten molekularen Werte. Die Un- abhängigkeit der Absorptionserscheinung vom Farbstoffgehalt ergibt sich noch viel deutlicher aus dem folgenden Vergleich des Vorgangs in 5- und 10 proz. Kohlendioxyd an den normal grünen Stammformen von Holun- der und Ulme und an ihren gelbblätterigen Spielarten (Tabelle 83). Die chlorophyllarmen Blätter absorbieren im Verhältnis zum Trocken- gewicht nicht weniger, sondern etwas mehr Kohlendioxyd als die chloro- phyllreichen. Im Verhältnis zum Chlorophyll der gelben Varietäten würde Bestimmung der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. 223 die Absorption im Versuche mit Holunder in 10 proz. Kohlendioxyd 168, im Versuche mit Ulme in 5 proz. Kohlendioxyd 69 Mole aus- machen (Tabelle 83). Tabelle 83. Versuche bei 5° mit 20g frischen Blättern. Versuch Blätter Trocken- gewicht Absorption ^ ^. ^ CO, in .Molen Entbindung bezogen auf den (mg) (mg) Chlorophyllgehalt Mit Sambucus, in normalgrün, mit 46I) mg 5.8 10,2 ■ 5 10 vol. -proz. CO.^ Chlorophyll gelb, mit 1,5^) mg Chloro- 3.9 11,6 13.1 168 phyll Mit Ulmus, in normalgrün, mit 26,4 mg 6,11 5.8 7.4 5 5 vol. -proz. CO, Chlorophyll gelb, mit 2,1 mg Chloro- 3,18 6,8 8.4 69 phyll ■ G. Prüfung des Verhaltens von Lecithin gegen Kohlensäure. Die Eigenschaft der Blattsubstanz, Kohlensäure anzuziehen, ist be- reits von M. Tswett-) im Jahre 1901 in spekulativen Betrachtungen über die physiologische Bedeutung des ,,Chloroglobins" vermutet worden, und zwar auf Grund einer unrichtigen Literaturangabe; in späteren Ar- beiten ist der Autor auf seinen Gedanken nicht zurückgekommen. Tswett verstand unter Chloroglobin eine chemische Verbindung der Pigmente mit dem ,,Hypochlorin" und hielt es für wahrscheinlich, daß letzteres ein Lecithin sei. L-nter dieser Voraussetzung erwartete Tswett, man werde im Hypochlorin die Eigenschaft des Lecithins, Kohlensäure zu absorbieren, finden. Er führte an, daß nach einer Stelle in Fremys Enzyklopädie i g Lecithin 30 ccm COo aufnehme, während i g Wasser bei 15 ° nur i ccm löse. Diese Angabe findet sich ohne näheres Zitat im IX. Bande der Enzy- klopädie, 2. Sektion, 2. Teil, 2. Fascicule, Seite 571 (Garnier, Lambling, ^) Diese Zahlen sind aus anderen Versuchen mit derselben Pflanze, und zwar mit Blät- tern von der nämlichen Jahreszeit und dem gleichen Trockengewicht herübergenommen. ^) M. Tswett, Experimentelle und kritische Untersuchung über die physikalisch-chemische Konstitution des Chlorophvllkornes, Kasan 1901 (russisch), S. 70. 224 ^^- '^Villstätter und A. Stoll. Schlagdeiihauffen' mit den \^'orten : ,,La lecithine est une base faible dont la molecule fixe directement ä peu pres une molecule d'acide car- bonique (2'%77 de COo fixe par o gr, 092 de lecithine)." Die alte Hypothese, daß Chlorophyll zu den Lecithinen zähle oder mit Lecithin verbunden auftrete, ist widerlegt^). Da es nicht ausgeschlos- sen erscheint, daß neben dem Chlorophyll im Stroma der Chloroplasten Lecithin vorkommt, so war es von \Mchtigkeit, die Angabe über das Verhalten von Lecithin gegen Kohlensäure nachzuprüfen. Sie hat sich als unzutreffend erwiesen. Für den Versuch dienten zwei von E. Merck bezogene Präparate des Lecithins aus Eidotter. In der von G. Geffcken-) beschriebenen Gasbürette vgl. die vierte Abhandlung dieser Reihe) bestimmten wir die Löslichkeit von Kohlen- dioxyd in Wasser bei 15 ° und fanden in genügender Übereinstimmung mit der Zahl von Ch. Bohr=^) den Absorptionskoeffizienten 1,017 und 1,018. Die Vergleichslösung des Lecithins enthielt in Versuchen (a und b) mit zwei Präparaten 1,1 g Lecithin in 104,13 ccm wässeriger Lösung und nahm a) 112, 60 und b) 112,81 ccm COo auf, nur um etwa 2,2 ccm mehr als das darin enthaltene reine Wasser. Der Absorptionskoeffizient wird von 1,018 des reinen Wassers durch das Lecithin auf 1,028 erhöht. Lecithin steigert also nur in sehr geringem Maße die Löslichkeit der Kohlensäure in Wasser. Die Erhöhung kann durch eine Beimischung bedingt sein oder sie kann auf der kolloiden Natur des Lecithins beruhen, wie allgemeiner nach den Versuchen von A. Findlay und H. J. M. Creighton*) durch kolloide Stoffe die Löslichkeit der Gase in positivem und negativem Sinne beeinflußt wird. Von Bedeutung im Hinbhck auf die Anziehung von Kohlensäure durch die Blattsubstanz ist das Ver- halten des Lecithins nicht. Für die Konstitution des Lecithins ist aus seiner Indifferenz gegen 1) R. Willstätter und E. Hug, Ann. d. Chem. 380, 177, 209 [1911]; R. Willstätter. Ann. d. Chem. 350, 48 [1906] und Ber. d. deutsch, chem. Ges. 47, 2831, 28^7 [1914]- -) G. Geffcken, Zeitschr. f. ph5^sikal. Chem. 49, 257 [1904I. '■^) Ch. Bohr, Wied. Ann. 68, 500 [1899]. ■») A. Findlay und H. J. M. Crcighton, Journ. Chem. Soc. 97, 336 [1910J. Bestimimaig der Kohlensäureabsorption lebender Blätter. 225 Kohlensäure der Schluß zu ziehen, daß es nicht genügt, die Esterbindung des Cholins an die Glycerinphosphorsäure anzunehmen, sondern daß auch das Ammoniumhydroxyd des Cholins mit dem noch freien dritten Hydr- oxyl der Phosphorsäure salzartig abgesättigt ist, entsprechend der Formel : /^ i /CH3 CH, — O — P — O — CH2 — CH,. — N^-CH3 Q CH3 Die von A. Strecker i) beschriebenen basischen Eigenschaften des Lecithins sind durch die Aufhebung dieser betainähnlichen Bindung in den Salzen des Lecithins zu verstehen. Die Kohlensäure ist aber nicht imstande, die Lösung dieser Bindung zu bewirken. 1) A. Strecker, Ann. d. Chem. 148, 77 [1868]. Wiilätätter-Stoll, .\ssimilat loii. Vierte Abhandlung. Über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. Theoretischer Teil. A. Einleitung. Das Chlorophyll ist aus zahlreichen und den verschiedensten Pflanzen, von den Algen bis zu hochentwickelten Dicotyledonen, für die Analyse isoliert und das Pigment beliebiger Herkunft ist als übereinstimmend in seiner Zusammensetzung erkannt worden. Die Chlorophyllkörner enthalten in allen Fällen ein Gemisch der zwei einander nahe verwandten eigentlichen Chlorophyllfarbstoffe mit den Carotinoiden. Das blaugrüne Chlorophyll a und das gelbgrüne Chlorophyll b sind sehr ähnlich zu- sammengesetzt; sie sind Magnesiumverbindungen, in denen das Metall nicht in elektrolytisch dissoziierbarem Zustand, sondern in eigentüm- licher, komplexer Bindungsweise enthalten ist. Die wesentlichen Eigen- schaften der magnesiumhaltigen Gruppe sind ihre große Empfindlich- keit gegenüber Säure und ihre Beständigkeit gegen Alkalien. Während das Metall schon bei der Einwirkung organischer Säuren quantitativ ab- gespalten wird, bleibt der Magnesiumkomplex bei tiefgreifender Zersetzung des Moleküls durch Alkalien unversehrt ; dabei werden zunächst die Ester- gruppen des Chlorophylls verseift, und es gelingt weiterhin, eine Carboxyl- gruppe nach der anderen abzuspalten. Daher ist die magnesiumhaltige Gruppe in der Stammsubstanz noch erhalten, bis zu welcher der Abbau des Chlorophylls geführt worden ist, in dem Ätiophyllin^). Dieses ist aus dem Chlorophyll, das 55 Kohlenstoffatome enthält, durch eine wesentliche Vereinfachung des Moleküls hervorgegangen, wie seine Formel C3iH34N4Mg zeigt. Die viel einfachere Verbindung besitzt zwar nicht mehr die Lös- ^) R. Willstätter und M. Fischer, Ann. d. Chem. 400, 182 [1913]; Zeitschr. f. physiol. Chem. 87, 423 [1913]- über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 22/ lichkeitsverhältnisse und die Wachsähnlichkeit des Blattfarbstoffes, aber sie zeigt in der Farbe, der Fluorescenz, in den chemischen Eigenschaften, be- sonders in dem Verhalten der gegen Säure empfindlichen, gegen Alkalien be- ständigen magnesiumführenden Gruppe noch die Eigenart des Chlorophylls. An dem so viel einfacher zusammengesetzten Stoffe bestätigen sich die ersten Annahmen-) für die Bindungsweise des Magnesiums im Chloro- phyll. Das Atiophyllin enthält keinen Sauerstoff mehr; das Magnesium ist an den Stickstoff gebunden, und zwar substituiert es den Wasserstoff der Iminogruppen zweier Pyrrolkerne, indem es wahrscheinlich zugleich durch Partialaffinitäten mit den Stickstoffatomen zweier anderer pyrrol- artiger Kerne in Verbindung steht : Mg NN NN C31H34 Aus den Untersuchungen über die Oxydation und die Reduktion der Chlorophyllderivate sind Annahmen für die Struktur des Ätiophyllins abgeleitet worden, die zwar in mehreren Einzelheiten noch unsicher sind, die aber wohl geeignet erscheinen, eine Vorstellung von der Verknüpfung der vier stickstoffhaltigen Kerne, von zwei salzbildenden Pyrrolringen und zwei komplexbildenden pyrrolartigen zu geben. Die folgende Formel ver- einfacht das Bild noch weiter, indem darin die im Atiophyllin noch ent- haltenen 13 substituierenden Kohlenstoffatome, die Methyl- und Äthyl- gruppen u. a., weggelassen sind. HC — CH Ü >N HC — C >C HC = C HC CH HC = CH • N< ■ C- 1 -CH r// C = -CH -Mg- -N/ 1) R. Willstätter, Ann. d. Chem. 350, 48 [1906]; R. Willstätter und A. Pfannen- stiel, Ann. d. Chem. 358, 205 [1907]; R. Willstätter und H. Fritzsche, .A.nn. d. Chem. 371. 33 [1909]- 228 . R. Willbtätter und A. StoII. Das Magnesium wird durch Zink, Kupfer und andere Metalle leicht verdrängt, die fähig sind, komplexe Systeme von noch größerer Bestän- digkeit, namentlich von außerordenthcher Widerstandsfähigkeit gegen starke Säure zu bilden. Zink, Kupfer, Eisen und andere Metalle werden daher von den metallfreien Derivaten des Chlorophylls, den Phäophor- biden, Phytochlorinen, Porphyrinen und anderen leicht aufgenommen, nämlich schon bei der Einwirkung der Metallacetate auf die alkoholischen Lösungen der stickstoffhaltigen Carbonsäuren und ihrer Ester. Eür die Einführung des Magnesiums aber mußten besondere Methoden gesucht wer- den^). Die Aufgabe der Rückbildung der charakteristischen komplexen Gruppe des Chlorophylls ist auf zwei verschiedenen Wegen gelöst worden. Das erste Verfahren, das mit stark alkalischen Medien und hoher Temperatur arbeitet und daher nicht für die Bildung von Chlorophyll selbst in Betracht kommt, beruht auf der Einwirkung von Magnesium- oxyd und konzentrierter methylalkoholischer Kalilauge. Eine feinere, auch für die empfindlichsten Verbindungen anwendbare Methode besteht zunächst in der Einwirkung der nach Grignard entstehenden Alkylmagne- siumhaloide auf die magnesiumfreien Verbindungen und weiterhin in einer Spaltung der anfangs gebildeten Magnesiumhalogenverbindungen durch Mononatriumphosphat . Der Anteil, den das Magnesium an dem Bau des Chlorophvll- moleküls hat, und die Eigenart, welche die komplexe Magnesiumgruppe dem Chlorophyll in seinem physikalischen und chemischen Verhalten gibt, führt zu der Frage, ob eine für die Assimilation wesentliche chemische Funktion des Chlorophylls nachgewiesen und auf seinen Magnesiumgehalt zurückgeführt werden kann. B. Kohlensäureverbindung des Chlorophylls. Nachdem in der ersten Abhandlung dieser Reihe gezeigt worden ist, daß das Chlorophyll beim Assimilationsvorgang in seiner ganzen Menge erhalten bleibt und daß auch das Verhältnis seiner beiden Komponenten sich nicht ändert, wird nun im Folgenden untersucht, ob das Chlorophyll 1) R. Willstätter und I.. Forscn, Ann. d. Chem. 396, 180 [1913]. i/ber das X'ciiialten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 229 imstande ist, mit Kohlensäure zu reagieren und ob es dazu unter den besonderen Bedingungen, die für den Assimilationsvorgang gegeben sind, betähigt ist. An den Lösungen des Chlorophylls in organischen Solvenzien wie Äther ist bei der Behandlung mit Kohlendioxyd kein Anzeichen einer chemischen Reaktion wahrzunehmen; in den indifferenten Lösungen ist das KoMensäureanhydrid ohne Wirkung. Auch in alkoholischer Lösung des Chlorophylls beobachtet man bei tagelanger Einwirkung von Kohlen- dioxyd keine Reaktion, und es zeigt sich, daß auch nicht etwa eine Ad- dition des Kohlendioxyds an das Chlorophyll erfolgt. Wir fanden näm- lich bei vergleichsweiser Bestimmung der Absorption von Kohlendioxyd in reinem Alkohol und in alkoholischen Chlorophyllösungen keine Er- höhung der Löslichkeit durch das Chlorophyll. In überraschender Weise unterscheidet sich das Verhalten der kol- loiden Lösung V) des Chlorophylls in Wasser von jenem molekularer Lö- sungen. Hier ist es nicht Kohlensäureanhydrid, sondern die Kohlen- säure, die reagiert, und die komplexe Bindung des Magnesiums er- weist sich sogar gegen diese Säure als so empfindlich, daß sie aufgelockert und zerstört wird. Beim Einleiten von unverdünntem und ebenso, nur entsprechend langsamer, von verdünntem Kohlensäureanhydrid in die kolloide Lösung wird das Chlorophyll in Magnesiumcarbonat und Phäo- phytin gespalten, das ausgeflockt wird. Diesen Vorgang drückt für die Komponente a des Chlorophylls die folgende Gleichung aus: C,,H,,0,N,Mg + CO, + H,0 = MgC03 + C,,H,,0,N,. Nicht nur 20- und 5 proz. Kohlensäure wirkt so, sondern sogar das sehr verdünnte Kohlendioxyd der atmosphärischen Luft reagiert, allerdings nur langsam, in derselben Weise. Um die Einwirkung der Kohlensäure genauer kennenzulernen, wird *) Die Absorption von Kohlensäure durch kolloides Chlorophyll wurde vor kurzem ohne Berücksichtigung unserer in den Sitzungsberichten der Preußischen Akademie (1915, Seite 322) veröffentlichten Mitteilung in einer Arbeit von R. Kremann und N. Schniderschitsch untersucht (Monatsh. f. Chemie 37, 65g [1916, Dezemberheft]). Den Autoren gelang es nicht, die Aufnahme von Kohlensäure durch Chlorophyll zu beobachten. Die Schuld an diesem Mißlingen des Versuchs ist der Verwendung von Chlorophyll in ganz unreinem Zu- stand, in unbekannter Menge und in gefällter Form zuzuschreiben. 230 R- Willstätter und A. Stoll. das Verhalten der kolloiden Chlorophyllösung gegen Kohlendioxyd in einem Gasabsorptionsapparat geprüft. Wir vergleichen die Löslichkeit des Gases in Wasser und in der Chlorophyllösung und finden sie durch das Chlorophyll erhöht. Es ist allerdings bekannt, daß die Löslichkeit von Gasen durch Kolloide in positivem oder negativem Sinne beeinflußt werden kann. Sie wird nach den Messungen von A. Findlay und H.J.M. Creighton^) im Falle von Kohlendioxyd und Stickoxydul bei atmo- sphärischem Druck erhöht durch Kieselsäure, für Kohlendioxyd allein erhöht durch Eisenhydroxyd und durch Gelatine, während diese den entgegengesetzten Einfluß auf Stickoxydul haben ; einige andere Kolloide erniedrigen die Löslichkeit beider Gase. In mehreren der untersuchten Fälle scheint chemische Affinität von Einfluß auf die Erscheinung zu sein, bei der Kieselsäure aber eine rein physikalische Adsorption vorzuliegen. Der am Chlorophyll beobachtete Vorgang ist von anderer Größenordnung als bei der Kieselsäure und nicht von derselben Art. Die Aufnahme der Kohlensäure schreitet bis zum stöchiometrischen Betrage fort. Sie er- reicht die Grenze bei zwei Molekülen Kohlendioxyd, nämlich nach der Abspaltung des Magnesiums als Magnesiumbicarbonat. Auch ist die Auf- nahme der Kohlensäure durch die Chlorophyllösung nicht unbedingt an den kolloiden Zustand geknüpft. Oft scheiden konzentriertere kolloide Lösungen im Laufe der Versuche das Chlorophyll in geringerer Dispersität ab, und zwar wie das Verhalten gegen Lösungsmittel zeigte, mit Ver- lust seines kolloiden Zustandes; die Ausflockung hat aber nicht die Ent- bindung des absorbierten Gases zur Folge. Die Reaktion des Chlorophylls mit der Kohlensäure ist beendet, wenn das Chlorophyll vollständig zersetzt ist. Sie ist aber nicht eine einfache Zersetzung, sondern der Verlauf der Reaktion ist bemerkenswert durch die Bildung eines Zwischenproduktes, einer Verbindung von Chlorophyll mit Kohlensäure, welche dissoziierbar ist und bei der Dissoziation Chloro- phyll zurückzubilden vermag. Wenn man die Chlorophyllösung im Gasabsorptionsapparate einen Teil der zur Absättigung erforderlichen Kohlensäure aufnehmen läßt und 1) A. Findlay und H. J. M. Creighton, Journ. Chem. Soc. 97, 536 [1910]. über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 23 1 dann das Chlorophyll aus der kolloiden Flüssigkeit in Äther überführt, isoliert und verascht, so findet man den Magnesiumgehalt zu hoch gegen- über der Annahme, daß die Kohlensäure das Äquivalentgewicht von Magnesium abgespalten habe, sogar mit der, wie sich zeigen wird, zu un- günstigen Voraussetzung der vollständigen Bildung von «Magnesium- bicarbonat. Tabelle 84. Bildung, Dissoziation und Zersetzung der Kohlensäureverbindung. Versuchs- dauer Absorbiertes Abspaltung Verbrauchtes Temperatur Präparat CO2 in Proz. von Mg in COoinProz.ber. eines Moles Proz. für Mg(HC03)2 0° 35 Min. Chlorophyll a 22 6 12 0° 3 St. Chlorophyll b 18 3 1 6 0° 18 St. Chlorophyll b ^4 5 10 0° 5 St. Chlorophyll a 41 16 32 0° 19 St. Chlorophyll a + b 60 13V2 1 27 15^ 48 St. Chlorophyll b 81 27 54 Hieraus ist zu schließen, daß der Zersetzung des Chlorophylls eine Addition vorangeht. Einen tieferen Einblick in die Natur des Additionsproduktes wird man gewinnen, wenn man die Entbindung der Kohlensäure aus der Chloro- phyllösung untersucht und sie mit der Absorption vergleicht. Zunächst fanden wir beim Eliminieren der Kohlensäure aus der Chlorophyllösung niedrigere Werte als für das gleiche Volumen Wasser, da während der Operation die gelöste Kohlensäure weiter zersetzend auf Chlorophyll ge- wirkt hat. Die Empfindlichkeit des Chlorophylls stört die Messung und macht die Erklärung der erhaltenen Werte komplizierter als bei den Ab- sorptionserscheinungen des Blutes oder des reinen Hämoglobins. Es war eine Verbesserung, die Kohlensäure bei o ° auszutreiben, und noch zweck- mäßiger, schon die Absorption bei o° vorzunehmen. Durch die Erhöhung der Konzentration der Kohlensäure wird ihre Addition an das Chloro- phyll begünstigt, auch wird die Zersetzung der Kohlensäure Verbindung des Chlorophylls bei der niedrigeren Temperatur so verlangsamt, daß die Beobachtung der primären Reaktion nicht mehr gestört ist. Das gilt 232 R. Willstätter und A. Stoll. um so mehr, wenn wir die Versuchsdauer abkürzen und uns mit der Ab- sorption eines Teiles der möghchen Menge Kohlendioxyd begnügen. Die Flüssigkeit behält unter diesen Umständen die Chlorophyllfarbe unver- ändert. Die Entbindung der Kohlensäure vom Chlorophyll nimmt einen glat- teren Verlauf in alkoholischer Lösung als in wässeriger. \\'ir lassen nach der Absorption die Flüssigkeit in das vierfache Volumen Alkohol von o° einfließen und bestimmen durch Wägung das Kohlendioxyd, das sich durch einen Luftstrom verdrängen läßt und dasjenige, das erst durch den Zusatz von Mineralsäure freigemacht wird. Die gesamte Menge der absorbierten Kohlensäure wird schon bei der Erniedrigung des Teildruckes entbunden, das Chlorophyll zurückgebildet. Dies gilt außer für alle Versuche bei o ° von kurzer Dauer auch für lang und sogar sehr lang dauernde Versuche bei o° mit Chlorophyll h. Die Komponente a addiert Kohlensäure rascher und sie wird leichter zersetzt ; bei mehrstündiger Dauer der Absorption verliert sie einen erheblichen Teil des Magnesiums. Tabelle 85. Aufnahme und Wiederabgabe von Kohlendioxyd durch kolloides Chlorophyll. "' Absorbiertes Freiwillig ent- Temperatur Versuchsdauer Präparat CO2 in Proz. eines Moles bundens COj in Proz. eines Moles 0° 50 Min. Chlorophyll a 23 23 0° 5 St. Chlorophyll a 46 12 0° 18 St. Chlorophyll h 25 23 0° 71 St. Chlorophyll h 40 38 Die Entgasung in wässeriger Flüssigkeit gibt andere Resultate. Im Wasser übt die Kohlensäure selbst einen Schutz auf die Kohlensäure- verbindung des Chlorophylls aus, erst durch Verminderung des Teil- druckes von Kohlendioxyd erfolgt mehr oder minder weitgehende hydro- lytische Chlorophyllzersetzung. Nachdem für 0° und eine gewisse Versuchsdauer mit der Methode über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 23: der Entgasung jn Alkohol gezeigt worden ist, daß das Chlorophyll noch kein Magnesium eingebüßt hat, ist bei anderen Verfahren der Aufarbei- tung des Versuchs, bei einer anderen Entgasung der mit Kohlensäure gesättigten Lösung die beobachtete Zersetzung nicht dem Absorptions- versuche, sondern dem Dissoziationsversuche zur Last zu legen. Die Kohlensäureverbindung von Chlorophyll a zerfällt beim Entwickeln der Kohlensäure aus der wässerigen Flüssigkeit quantitativ in Phäophytin a und Magnesiumcarbonat, das in allen Fällen als basische Verbindung der Formel (MgC03)4 • Mg(0H)2 zurückbleibt ; der entsprechende Zerfall er- folgt bei der Kohlensäure Verbindung von Chlorophyll b nur teilweise, so daß hier doch beispielsweise mehr als die Hälfte des Chlorophylls ree^eneriert wird. Tabelle 86. Zerfall der Kohlensäureverbindiing in Wasser. Temperatur i Versuchsdauer Präparat j Verbindung des I Chlorophylls mit Kohlensäure Proz. 35 Min. I Chlorophyll a 27 40 Min. ' Chlorophyll a + h 23 3 St. ■ Chlorophyll h 18 Zersetzung des Chlorophylls Proz. 27 16 7V. Zwischen der Dissoziation in Alkohol, die für die beiden Komponenten des Chlorophylls ein zutreffendes Bild von der Absorptionserscheinung gibt, und der Entgasung in Wasser, die für sich allein bei Chlorophyll a ein ganz unrichtiges, bei h ein quantitativ unzutreffendes Ergebnis liefern würde, steht die Methode der Überführung des Chlorophylls aus der mit Kohlensäure bearbeiteten Lösung in Äther und Ermittlung des Zer- setzungsgrades durch die Magnesiumbestimmung; ein erheblicher Teil des Chlorophylls a und ein kleiner von h wird hier im Verlaufe der Disso- ziation zerstört. Chlorophyll ist die sekundäre Magnesiumverbindung des Phäophy- tins. Bei der Abspaltung des Metalls durch Kohlensäure oder andere Säuren werden beide Valenzen gelöst, mit denen das Magnesium an 234 R. Willstätter und A. Stoll. Stickstoffatome gebunden ist. Das Zwischenprodukt der Einwirkung von Kohlensäure ist daher entsprechend der nachstehenden abgekürzten Gleichung als primäre Magnesiumverbindung des Phäophytins zu be- trachten, in der eine Valenz des Magnesiums an Stickstoff gebunden, die zweite mit Kohlensäure abgesättigt ist. Aus der unversehrten Farbe der Kohlensäureverbindung ist zu schließen, daß in dem durch Partial- valenzen gebildeten chromophoren Komplex keine Veränderung durch die Kohlensäure erfolgt ist. c c c- c c c— . / \ / \ / N-..,.._ C N \- V XH 0 r>-Mg + C0, + H.0 ^-=t ...Mg — 0 — c'' N---"C N N •'C N OH C C C- 1 1 V^ ~C' \ — ll Chlorophyll Kohlensäureverbindung des Chlorophylls Der Zerfall des Kohlensäureadditionsproduktes erfolgt auf verschie- dene Weisen: 1. Es dissoziiert, am glattesten in alkoholischer Lösung, in Chloro- phyll und Kohlendioxyd im umgekehrten Sinne der voranstehenden Gleichung. 2. In wässeriger Lösung zerfällt die Kohlensäure Verbindung unter Bildung von Phäophytin und je nach den LImständen von Magnesium- carbonat oder -bicarbonat, nach den abgekürzten Formeln: N O MgC03 NH / \ y :::Mg — 0 — C ^ oder + \ NH OH Mg(HC03::, XH Kohlensäureverbindung des Phäophytin Chlorophylls Aus dem Ergebnis dieser Arbeit, daß das Chlorophyll in kolloidem Zustand, also in ähnlicher Dispersität wie in den Chloroplasten, befähigt über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 235 ist, mit der Kohlensäure eine leicht dissoziierbare Verbindung von der Art der Bicarbonate zu bilden, ist zu folgern, daß das Chlorophyll auch im x\ssimilationsvorgang eine chemische Funktion aus- übt, indem es mit der Kohlensäure chemisch reagiert^). Aber die Form, in welcher die Kohlensäure mit dem Chlorophyll in Reaktion tritt, ist damit noch nicht bestimmt. In der voranstehenden Abhandlung „Über Absorption der Kohlensäure durch das unbelichtete Blatt" ist gezeigt worden, daß vom ganzen Blatte, d. h. von gewissen, nicht im einzelnen bekannten Bestandteilen der Blattsubstanz eine chemische Ab- sorptionswirkung auf Kohlendioxyd ausgeübt wird. Also scheint es eine Einrichtung für die Zuleitung der Kohlensäure zu den Chlorophyllkör- nern zu geben, welche die Konzentration der Kohlensäure erhöht und zu- gleich die Form der Kohlensäure in einer für die Reaktion mit dem Chloro- phyll geeigneten Weise abändert. Es ist möglich, daß sich das Kohlen- säureanhydrid an eine H3^droxyl- oder an eine Aminogruppe unter Bil- dung einer Carboxylverbindung addiert und daß sich ein solches Kohlen- säurederivat mit dem Chlorophyll verbindet anstatt der Kohlensäure selbst. In der vorliegenden Arbeit werden einige Unterschiede zwischen der Reaktion der Kohlensäure mit dem Blatte und mit dem reinen Chloro- phyll bemerkt. Im Blatt wird das Chlorophyll durch die Kohlensäure viel schwieriger zersetzt als in der reinen kolloiden Lösung. Die Blätter vertragen noch Kohlendioxyd bis zu etwa 20 oder 25 Vol.-Proz. und assimiheren in solcher Atmosphäre ausgezeichnet, während die Spaltung des reinen Hydrosols von Chlorophyll in diesem Medium schon mit großer Geschwindigkeit verläuft. Das Chlorophyll genießt also in den Chloro- plasten einen Schutz gegen die Spaltung durch Kohlensäure und auch gegen hydrolytische Zersetzung, der es in reiner, sehr verdünnt kolloider Lösung unterliegt. Ferner ist die Geschwindigkeit der Aufnahme von Kohlensäure in den belichteten Chloroplasten eine viel größere als bei der Absorption 1) P. Maze, Compt.rend. i6o, 739 [1915], hat noch in seiner letzten Arbeit über die Funktion des Chlorophylls den Farbstoffen der höheren Pflanzen eine rein physikalische Rolle zugeschrieben. 236 R. Willstättei- und A. Stoll. durch die reine kolloide Lösung. In den günstigsten Fällen, die in der zweiten Abhandlung beobachtet worden sind, nämlich bei gewissen chlorophyllarmen Blättern erfolgt der Umsatz eines Kohlensäuremoleküls durch ein Chlorophyllmolekül im Blatte in 1^/2 Sekunden. Es ist noch nicht erreicht worden, eine damit vergleichbare Geschwindigkeit bei der Bildung der dissoziierbaren Kohlensäureverbindung des Chlorophylls mit Hilfe von viel konzentrierterer Kohlensäure zu verwirklichen. Diese Unterschiede zwischen dem Chlorophyll im Blatte und in der Form des reinen Hydrosols machen weitere analytische Untersuchung erforderlich. Es sind Zusätze zum Hydrosol des Chlorophylls zu suchen, welche die Addition der Kohlensäure an Chlorophyll nicht stören, die sie sogar beschleunigen und welche die Zersetzung des Chlorophylls hintan- halten. Nur ein Anfang in dieser Richtung liegt bisher vor. Es sind ver- schiedene anorganische und organische Zusätze gefunden w^orden, durch welche die hydrolytische Zersetzung des kolloiden Chlorophylls in Wasser allein und seine Spaltung durch Kohlensäure verlangsamt wird. Einer- seits wirken so Erdalkalicarbonate, besonders Magnesiumbicarbonat, ferner wirkt Gelatine in ähnlicher Weise. Aber der Schutz durch diese Stoffe gegen die Kohlensäurespaltung geschieht allein dadurch, daß die Addition der Kohlensäure infolge von Verminderung ihrer Wasserstoff- ionenkonzentration verlangsamt wird. Die natürliche Einrichtung hin- gegen besteht wahrscheinlich in einem System, das die Addition be- schleunigt und nur die Spaltung verzögert. C. Zur Theorie der Assimilation. In einigen älteren theoretischen Betrachtungen über den Assimila- tionsvorgang war schon vermutet worden, es könnte die Zerlegung der Kohlensäure auf einer Additionsreaktion des Chlorophylls beruhen. Die erste Annahme war allerdings eine Addition von Kohlenoxyd. A. Baeyer^) hat im Jahre 1870 in der berühmten Abhandlung: ,,Über die Wasserent- ziehung und ihre Bedeutung für das Pflanzenleben und die Gärung" unter dem Einfluß von Butlerows Entdeckung der Formaldehydkon- ^) A. Baeyer, Ber. d. deutsch, ehem. (rcs. 3, 63 [1870I. über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 237 densation geschrieben: ,,Man hat vielfach auf die Ähnhchkeit hingewiesen, welche zwischen dem Blutfarbstoff und Chlorophyll der Pflanzen existiert. Danach muß es auch als wahrscheinhch erscheinen, daß das Chlorophyll ebenso wie das Hämoglobin CO bindet. Wenn nun Sonnenlicht Chloro- phyll trifft, welches mit CO., umgeben ist, so scheint die Kohlensäure die- selbe Dissoziation wie in hoher Temperatur zu erleiden, es entweicht Sauerstoff und das Kohlenoxyd bleibt mit dem Chlorophyll verbunden. Die einfachste Reduktion des Kohlenoxyds ist die zum Aldehyd der Ameisensäure, es braucht nur Wasserstoff aufzunehmen: CO + H, =: COH., und dieser Aldehyd kann sich unter dem Einfluß des Zellinhaltes ebenso wie durch Alkalien in Zucker verwandeln." F. Hoppe- Seyler^) scheint dann zuerst die Vermutung geäußert zu haben, daß die Kohlensäure selbst sich mit dem Chlorophyll verbinde, näm- ich, ,,daß das Chlorophyll zunächst die Kohlensäure in eine lockere Verbin- dung aufnimmt, die dann durch Einwirkung des Sonnenlichts unter Re- generation des Chlorophylls zerlegt wird". Auf einem anderen Wege, durch Betrachtungen über die asym- metrische Synthese in der Natur, ist E. Fischer zu der Hypothese ge- führt worden, die Kohlensäure selbst werde mit Bestandteilen der Chloro- plasten verknüpft. Zuerst w^ar E. Fischers"^) Ansicht: ,,Man braucht nur anzunehmen, daß der Kondensation zum Zucker die Bildung einer Verbindung von Formaldehyd mit den optisch aktiven Substanzen des Chlorophyllkornes vorangeht." Diese Vorstellung vertiefte E. Fischer später in seiner Faraday-Vorlesung=^) ,, Organische Synthese und Biolo- 1) F. Hoppe-Seyler, Physiol. Chem., Berlin 1881, S. 139. Derselbe Gedanke ist später von neuem von A. Hansen (Arb. d. botan. Inst, in Würzburg, III. Band, S. 426, 429 [1885]), ferner von W. N. Hartley (Journ. Chem. Soc. 59, 106, 124 [1891]) und von R. Luther und J. A. af Hällström (Ber. d. deutsch, chem. Ges. 38, 2288 [1905]) . ausgeführt worden. 2) Dieser Satz ist aus der unten zitierten Faraday- Vorlesung entnommen, er ist aber schon in den folgenden älteren Abhandlungen enthalten: E. Fischer ,, Synthesen in der Zucker- gruppe 11", Ber. d. deutsch, chem. Ges. 27, 3189, und zwar 3231 [1894]; ferner ,,Die Chemie der Kohlenhydrate und ihre Bedeutung für die Physiologie" [1894] in den Untersuchungen über Kohlenhydrate und Fermente, Berlin 1909, S. iii. 3) E. Fischer, Journ. Chem. Soc. 91,1749 [1907] und in deutscher Ausgabe, bei J. Springer, Berhn [1908]. 238 R- Willstätter und A. Stoll. gie" in folgender Weise: ,,Ich will jetzt die Hypothese dahin präzisieren, daß ich diese Vereinigung schon für die Kohlensäure als wahrscheinlich annehme, denn nach den heutigen Erfahrungen kann man sagen, daß die Proteinkörper ihr genügend Gelegenheit zur Anlagerung darbieten, da schon die einfachen Aminosäuren nach der Beobachtung von Siegfried zur Bindung von Kohlensäure befähigt sind. Ich denke mir nun weiter, daß die Kohlensäureverbindung in Sauerstoff und ein Reduktionsprodukt, wahrscheinlich ein Formaldehydderivat, zerlegt wird. In diesem asym^ metrischen Komplex oder einem anderen, der sekundär durch vorher- gehende Abspaltung und Neubildung des Formaldehyds entsteht, kann dann die asymmetrische Polymerisation zum Zucker . . . vor sich gehen." Der derzeitige Stand der Frage von einer chemischen Funktion des Chlorophylls wird durch folgende Stellen der referierenden Literatur beleuchtet. In seinem Lehrbuch der Physiologischen Chemie bespricht E. Abder- halden^) die Beziehung des Blattfarbstoffes zur Assimilation der Kohlen- säure : „Nimmt er aktiv an der Entstehung der organischen Verbindungen aus Kohlensäure und Wasser teil, oder wirkt er nur als Vermittler ? Trotz- dem manches dafür spricht, daß der Blattfarbstoff sich in direkter Weise — z. B. durch Bindung von Kohlensäure und Wasser und chemische Um- wandlungen dieser Verbindungen — am Assimilationsprozeß beteiligt, ist es bis jetzt nicht geglückt, einen eindeutigen Beweis für diese Annahme zu erbringen." In ähnlichem Sinne schreibt H. Euler^) in den ,, Grundlagen und Er- gebnissen der Pflanzenchemie": ,,Vom chemischen Gesichtspunkt er- scheint es wohl möglich, daß die an und für sich schwer reduzierbare Kohlensäure in Zusammenhang mit einem größeren Molekularkomplex, wie Chlorophyll oder Protoplasmaproteinen, der Reduktion leichter zu- gänglich wird. Daß besonders ein an aktiven Atomgruppen so reicher Stoff wie Chlorophyll imstande ist, Kohlensäure in sich aufzunehmen, muß von vornherein als recht wahrscheinlich bezeichnet werden" und 1) E. Abderhalden, Lehrb. d. physiol. Chem. 3. Aufl. I.Teil, S. 82 [1914]. 2) H. Eüler, Grundlagen und Ergebnisse der Pflanzenchemie II und III, S. 119U. Ii6[i909]. über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 239 ferner: ,,wenn wir also das Chlorophyll als einen Sensibilisator bezeichnen, so gewinnen wir einstweilen dadurch noch keine konkretere Vorstellung von dessen Wirkungsweise. Insbesondere ist man darüber im unklaren, ob und in welchem Grade der Sensibilisator, hier speziell das Chlorophyll, chemisch mit dem Stoffe reagiert, dessen Reaktion er beschleunigt; mit anderen Worten, ob die Kohlensäure vor ihrer Reduktion eine Verbin- dung mit dem Chlorophyll eingeht." Die optische Beteiligung des Chlorophylls an der Photosynthese, die bei der Bezeichnung desselben als Sensibilisator noch unerklärt bleibt, hat M. TswettO durch ,,Eine Hypothese über den Mechanismus der photosynthetischen Energieübertragung" eindringender zu erklären versucht. Tswett geht von den Anschauungen über Fluorescenz aus, nach welchen die Fluorescenten unter der Einwirkung des Lichtes eigen- tümliche mit Energieaufnahme verbundene, umkehrbare Veränderungen, Übergänge in tautomere Formen, erleiden und bei der Zurückbildung der Moleküle die zuerst aufgenommene Energiemenge als Luminescenzlicht ausstrahlen. Tswett erblickt in der die Rückbildung der tautomeren Molekeln begleitenden Lichtemission die unmittelbare Quelle derjenigen Energie, die in den Produkten der Photosynthese als chemisches Potential auf- gespeichert wird. Er sieht sich dadurch zu der sehr auffallenden Annahme genötigt, daß die roten Luminescenzstrahlen von der Kohlensäure spezi- fisch absorbiert werden, wobei er bedauert, daß das Absorptionsspektrum der Säure HoCOg noch nicht beschrieben ist. Wie übrigens ihr Spektrum sein mag, es wird gewiß die Erwartung enttäuschen, daß die Kohlensäure ein Stoff mit spezifischer Absorption für rote Strahlen sei. Durch seine Hypothese glaubt Tswett eine Deutung für eine von ihm als höchst merkwürdig angesehene Beobachtung von H. T. Brown und F. Escombe^) zu finden. Diese Autoren prüften die Assimilation bei vermindertem Lichte und fanden, daß sie die Belichtung der Ver- suchsobjekte auf ein Zwölftel des Sonnenlichtes reduzieren mußten, um ^) M. Tswett, Zeitschr. f. physikal. Chem. 76, 413 [iQH]- 2) H. T. Brown und F. Escombe, Proc. Roy. Soc. Ser. B 76, 29, 86 [1905]. 240 R. Willstätter und A. StoU. den Betrag des Kohlensäureverbrauchs herabzumindern; für die Schwä- chung des Sonnenhchtes wurde die Abneysche Methode der rotierenden Sektoren benutzt. Tswett hält die folgende Erklärung dieser Erschei- nung für allein zulässig: ,,Die Kohlensäurezersetzung setzt sich während der Verdunkelungsintervalle auf Kosten der in vorangehenden Momenten aufgespeicherten Energie fort" und er sucht „diese rätselhafte Induk- tionserscheinung" durch den Hinweis verständlich zu machen^ daß das Chlorophyll im Blatte höchst w^ahrscheinlich phosphoresciere. Das Ergebnis von Brown und Escombe wird aber einfacher und befriedigend so erklärt, daß für den niedrigen Kohlensäuregehalt bei jener Versuchsanordnung ein Zwölftel Belichtungszeit schon genügt hat, um die in den kurzen Verdunkelungsintervallen zu den Chloroplasten ge- langende Kohlensäure vollständig zu reduzieren. Auch bei einer Frak- tionierung des Lichtes der Intensität nach würde ein Zwölftel für die vollständige Assimilation genügen. Die Vorstellung von Tswett, daß das Sonnenlicht zuerst absorbiert, dann in Form der Luminescenz wieder ausgestrahlt und endlich von der Kohlensäure aufgenommen werde, ist unwahrscheinlich. Wir ersetzen sie durch die einfachere Annahme, daß das absorbierte Licht im Chlorophyllmolekül selbst chemische Arbeit leiste. Der kolloide Zustand des Chlorophylls und seine optischen Eigenschaften werden durch die Addition der Kohlensäure nicht verändert. Durch die Bindung an den chromophoren Magnesiumkomplex des Chlorophylls ist die Kohlensäure oder ein Kohlensäurederivat Bestandteil des Farbstoffes geworden. In diese Atomgruppe strömt die Energie der absorbierten Strahlung und die Kohlensäure wird dadurch so umge- lagert, daß sie für den Zerfall vorbereitet ist. Jede unter Erhöhung des Energieinhaltes umgelagerte Form der Kohlensäure, die unter Sauerstoffabgabe durch einen freiwilligen Vor- gang zerfallen könnte, wäre ein Isomeres von Peroxydkonstitution. Mit einem solchen Zwischengliede ist die Abspaltung des gesamten Sauerstoffes der Kohlensäure erklärlich. An dieser Stelle trifft die aus dem Nachweis der Addition von Kohlen- über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 24I säure an Chlorophyll abgeleitete Vorstellung mit der Folgerung zusam- men, die in der zweiten Abhandlung dieser Reihe: ,,über das Verhältnis zwischen der assimilatorischen Leistung der Blätter und ihrem Gehalt an Chlorophyll" gezogen wurde. Dort ist aus der Untersuchung verschie- dener Fälle, in denen der Quotient von assimilierter Kohlensäure und Chlorophyll bei der Assimilation unter günstigsten Bedingungen von der Norm abweicht, geschlossen worden, daß außer dem Chlorophyll ein zwei- ter innerer Faktor, dessen Natur enzymatisch ist, für den Assimilations- vorgang bestimmend sei, und es ist wahrscheinhch gemacht worden, daß es sich um ein Enzym handle, das den Zerfall eines aus Chlorophyll und Kohlensäure gebildeten Zwischenproduktes unter Abgabe von Sauerstoff bewirke. Die Annahme eines aus Kohlensäure entstehenden Peroxydes erinnert vielleicht an eine Hypothese von A. Bach^) über den Verlauf der Kohlen- säureassimilation, aber die beiden Annahmen berühren sich doch nur ganz oberflächlich. A. Bach ist durch einen schematischen Vergleich zwischen den Verbindungen des Kohlenstoffes und des Schwefels dazu ge- langt, mit der Zersetzung der schwefligen Säure unter Bildung von Schwefelsäure und Schwefel den Zerfall der Kohlensäure in Analogie zu stellen, wobei er Perkohlensäure H.2CO4 als der Schwefelsäure entspre- chend ansieht; in der ersten Phase der Assimilation soll ein Molekül Kohlensäure zum Formaldehyd reduziert werden auf Kosten von zwei weiteren Molekülen Kohlensäure, während diese sich zu Überkohlensäure oxydieren : 1. 3 HXO3 = 2 H^CA + CH2O 2. 2 H2CO4 = 2 CO2 + 2 H2O2 = 2 CO, + 2 U,0 + O, . Allein diese Formulierung einer Reaktion zwischen drei Molekülen Koh- lensäure und die Annahme der Oxydation von Kohlensäure zu einer Ver- bindung höheren Sauerstoffgehaltes ist von sehr geringer Wahrschein- lichkeit. Nach unserer Vorstellung ist es eine Verschiebung der Valenzen im ^) A. Bach, Compt. rend. ii6, 1143 und 1389 [1893]; siehe auch R. Chodat, Principes de Botanique, II. Aufl., S. 64 [191 1]. VVillstätter-Stoll, .Assimilation. l6 242 R- Willstätter und A. Stoll. Kohlensäuremolekül, eine Umgruppierung der Atome, welche durch die zugeführte Energie bewirkt wird. Für eine solche Umlagerung der Kohlen- säure zu einer peroxydischen Verbindung sind, wenn man von Formeln absieht, die nur abgeänderte Schreibweisen darstellen, zwei Formeln möglich : 1. Formylhydroperoxyd oder Perameisensäure: H i) C— O O — OH, 2. Formaldehydperoxvd : H 2) C<^OH 0—0 Die Perameisensäure ist in schönen Untersuchungen von J. d'Ans und W. Frey^; und J. d'Ans und A. Kneipp) beschrieben worden; sie entsteht in umkehrbarer Reaktion aus Ameisensäure und Hydro- peroxyd : HCOOH+H,Oo 71 HCO-0,H+H,0 und sie lagert sich leicht in Kohlensäure um : 0 = 0 — H - 0=C— OH. O — OH OH Das zweite mögliche Isomere der Kohlensäure ist eine Sauerstoffver- bindung des Formaldehyds. Ein einfaches Peroxyd desselben ist noch nicht bekannt, aber es gibt eine bisher nicht erklärte merkwürdige Re- aktion dieses Aldehydes, bei welcher wir ein solches Peroxyd als Zwischen- produkt annehmen sollten. O. Blank und H. Finkenbeiner^) haben gezeigt, daß Formaldehyd mit Wasserstoffsuperoxyd in alkalischer Lösung unter Bildung von Ameisensäure glatt reagiert und dadurch alkalimetrisch bestimmt wer- den kann. Bei dieser Reaktion wird aus einem Mol Formaldeh3^d ein ^) J. d'Ans und W. Frey, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 45, 1845 [1912]. 2) J. d'Ans und A. Kneip, Ber. d. deutsch. Ges. 48, 1136 [1915]. ^) (). Blank und H. Finkenbeiner, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 31, 2979 [1898]. iiber das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 243 halbes Mol Wasserstoff frei, auch die Messung des Gases kann für die quantitative Bestimmung dienen'^. In saurer Lösung'^) wird Formaldehyd durch Wasserstoffsuperoxyd nicht zu Ameisensäure, sondern zu Kohlen- säure oxydiert, und zwar erfolgt hier die Reaktion, wie wir beobachteten, weitaus schwerer als in alkalischer Lösung. Diese Oxydation des Form- aldehyds in der alkalischen Lösung ist nicht, wie sie formuliert worden ist, als eine Reaktion zwischen zwei Molen des Aldehyds und einem Mol Hydroperoxyd nach der Gleichung zu erklären: 2 CHoO + 2 NaOH + H.O.^ = 2 H • COONa -f 2 H,0 + H.^ . Es ist viel wahrscheinlicher, daß der Formaldehyd zunächst unter Wasser- stoffentbindung, die nach H. Wielands ^ ,, Studien über den Mechanis- mus der Oxydations Vorgänge" wohl zu verstehen ist, zu einem Peroxyd oxydiert wird, das sich darauf mit einem zweiten Mol Formaldehyd so umsetzt wie Benzopersäure mit Benzaldehyd nach A. von Baeyer und V. Villiger*): 2. HXO3 + CH3O-2HXO, . Es bleibt dabei fraglich, ob das Zwischenprodukt der Ameisensäurebil- dung Formaldehydperoxyd oder Perameisensäure ist oder ob vielleicht beide nacheinander auftreten. Da es nach C. Engler und J. Weissberg ^) wahrscheinlich ist, daß sich bei der Oxydation von Benzaldehyd zu Benzoe- säure zwei verschiedene Peroxyde nacheinander bilden : O O — OH QH5-HC:0->C,H3-HC 0->C,H,-C O O so erscheint es wohl möglich, daß auch bei der Oxydation des Form- 1) G. B. Frankforter und R. West, Am. Chem. Soc. 27, 714 [1905]- 2) H. Geisow, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 37, 515 [1904]. 3) H. Wieland, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 45, 2606 [1912]; 46, 3327 [1913]; 47. -085 [1914]- *) A. von Baeyer und V. Villiger, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 33, 1581 [1900]. ^) C. Engler und J. Weissberg, Kritische Studien über die Autoxydation, Braun- schweig [1904], S. 87. 16* 244 R. Willstätter und A. Stoll. aldehyds ein eigentliches Formaldehydperoxyd primär eine Rolle spielt^). In dieser chemischen Betrachtung wurde die Möglichkeit der Isomeri- sation von Kohlensäure geprüft und es hat sich kein Bedenken gegen diese Annahme ergeben. Es sind in Perameisensäure und in Formaldehyd- peroxyd zwei verschiedene Formen umgelagerter Kohlensäure möglich, die sich zum freiwilligen Zerfall unter Sauerstoffabgabe eignen, aber die Isomerisation zu einem Peroxyde muß nicht in einem Additionsprodukt von Kohlensäure selbst an Chlorophyll stattfinden, es ist auch möglich, daß es das Additionsprodukt eines Kohlensäurederivates an Chlorophyll ist, in welchem sich die Umlagerung abspielt. Für die nachfolgenden Formeln wählen wir als Beispiele die einfachere Möglichkeit der Bildung von Formaldehydperoxyd : N Mi O — C NH O OH N O Kohlensäure Verbindung des Chlorophylls : M^— O — C , r- XH H O Chlorophyll-Formaldehydperoxyd Die Kohlensäure entbindet ini Assimilationsvorgang unter beliebigen Verhältnissen glatt die molekulare Menge Sauerstoff. Wie in der fünften Abhandlung angeführt wird, zeigt der rein assimilatorische Koeffizient CO. —~ eindeutig und ohne Hypothese an, daß die Kohlensäure unmittelbar O2 im Assimilationsvorgang in die Reduktionsstufe von Kohlenstoff selbst umgeformt wird, oder, was dasselbe ist, in die Oxydationsstufe des ein- fachsten Kohlehydrats, des Formaldehyds. Es ist nicht eine Theorie, daß der Formaldehyd die im Assimilationsvorgang erreichte Reduktions- 1) Beim Behandeln von Formaldehyd mit Hydroperoxyd und Alkali prüften wir unter verschiedenen Bedingungen, zum Beispiel beim Eintragen des Aldehydes in stark alkalisches überschüssiges Wasserstoffsuperoxyd, ob nicht neben Ameisensäure auch Kohlensäure erhalten werden kann. Wir vermochten keine erhebliche Bildung von Kohlensäure zu erzielen. Darin finden wir in Anbetracht der Unbeständigkeit von Perameisensäure gegen Alkali ein Anzeichen dafür, daß nicht Perameisensäure, sondern ein anderes Peroxvd, das weniger leicht in Kohlen- säure übergeht, als Zwischenglied auftritt. über das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlensäure. 245 stufe der Kohlensäure darstellt, sondern die Theorie betrifft nur die Art, in welcher die Desoxydation der Kohlensäure vor sich geht. Unsere Vor- stellung, die in den obenstehenden Formeln Ausdruck fand, beruht auf dem beobachteten Additions\Trmögen des Chlorophylls und sie macht die Annahme der durch Licht bewirkten und zu Peroxyd führenden Umlagerung. Die Umlagerung der Kohlensäure kann man sich so erfolgend denken, daß danach zw^ei Atome Sauerstoff auf einmal abgespalten werden oder wahr- scheinlicher so, wie es das in den Formeln gewählte Beispiel ausdrückt, daß zunächst nur die Gelegenheit zu Abspaltung von einem Atom Sauer- stoff gegeben ist und daß eine Wiederholung des Vorgangs erfolgt. Es entspricht also die in der Formel angenommene Umlagerung nicht dem vollen Potentialhub, der von der Lichtenergie zu leisten ist. An der Zwischenstufe der Desoxydation, die der Ameisensäure entspricht, wieder- holt sich die Umlagerung durch Energieaufnahme zu einer peroxydischen Verbindung, die wiederum ein halbes Mol Sauerstoff abspaltet, entspre- chend den Formeln : N O ■ \ -Mg— O — c NH H O N Mg — O — C=0 + i02 XH H N O ;; ::Mg+H,C N O Ein Zwischenprodukt der Reduktion wird nicht frei, löst sich nicht ab vom Chlorophyllmolekül. Ein Reduktionsprodukt saurer Natur (Ameisensäure) könnte sich nicht vom Magnesium abtrennen, könnte also nur unter Zersetzung des Chlorophylls, die nicht vorkommt, frei auf- treten. Die Abtrennung irgendeines Zwischengliedes der Reduktion ist aber direkt ausgeschlossen durch den Zahlenwert des Assimilationskoef- fizienten, der gemäß der fünften Abhandlung selbst unter Bedingungen ge- steigerter assimilatorischer Leistung unverrückbar und genau I beträgt. Dadurch wird bewiesen, daß das Reduktionsprodukt der Kohlensäure mit dem Chlorophyll verbunden bleibt, bis die ganze molekulare Sauer- stoff menge abgespalten ist. Die Konstanz des assimilatorischen Koeffi- zienten sagt aus, daß erst dann ein neues Molekül Kohlensäure mit einem 246 K- Willstätter und A. Stoll. ChlorophvHmolekül in Reaktion treten kann, wenn das vorher aufgenom- mene Molekül vollständig zur Formaldehydstufe desoxydiert worden ist. Der Formaldehyd, dessen Weiterkondensation keine Energiezufuhr, also nicht mehr die \\'irkung der Lichtabsorption eines Pigmentes erfor- dert, bleibt mit dem Chlorophyll nicht verbunden. In der siebenten Ab- handlung wird gezeigt, daß der Aldehyd nicht imstande ist, ein Additions- produkt mit dem Chlorophyll zu bilden. Die Abtrennung des Kohlensäure- reduktionsproduktes vom Chlorophyll wird also durch Kohlensäure oder eher schon durch Wasser erfolgen nach der zweiten Umlagerung und vor dem zweiten Schritte der Desoxydation oder unmittelbar nach demselben. Die Sauerstoffentbindung aus der Peroxydstufe geschieht durch einen freiwilligen Zerfall, den wir nach den Ergebnissen der zweiten Abhand- lung für abhängig von einer Enzymwirkung, für enzymatisch beschleu- nigt halten. Es ist möglich, daß der Sauerstoff direkt durch ein katalase- artiges Enzym abgespalten wird, welches die peroxydische Verbindung ebenso zersetzt, wie Hydroperoxyd von Katalase zerlegt wird. Es ist aber auch möglich, daß das vom Chlorophyll gebildete /Vdditionsprodukt nach seiner Umlagerung hydrolytischer Spaltung durch ein Enzym unter- liegt, wobei Hydroperoxyd entbunden wird. Die Annahme zweimaliger Abspaltung von Hydroperoxyd und seiner Zersetzung durch Katalase ist indessen weniger einfach, und es gibt für sie keine experimentellen Anhaltspunkte. Es ist wahrscheinlicher, daß das Enzym, auf dessen Wirkung viele Beobachtungen in der zweiten Abhandlung hindeuten, unmittelbarer, als Katalase es vermöchte, mit dem Chlorophyll zusammenwirkt und daß es bei der Spaltung der peroxydischen Verbindung selbst eingreift. Die bei schwach assimiherenden Blättern durch verminderte Enzymwirkung herabgedrückte, aber gleichmäßige Leistung ließe sich durch zu lang- same Beseitigung von Wasserstoffsuperoxyd nicht gut erklären; das bereits abgespaltene Hydroperoxyd würde dem Kohlensäurezerfall nicht direkt entgegenwirken, sondern im Falle seiner Anhäufung den Assimi- lationsapparat schädigen. Die Folge wäre im Versuche eine rasche Ab- nahme der Funktionstüchtigkeit, die aber nicht zu beobachten war. Darstellung der Chlorophyllpräparate. 247 Experimenteller Teil. I. Darstellung der Chlorophyllpräparate. Wenn es sich darum handelt, mit Präparaten von Chlorophyll und seinen einzelnen Komponenten quantitative Bestimmungen über das Ver- halten gegen Kohlensäure und ähnliche Messungen auszuführen, so müs- sen an die Reinheit der Substanzen andere Anforderungen gestellt wer- den, wie bei der organischen Analyse und bei den Abbau versuchen, für die das aus dem Blatt isolierte Pigment in erster Linie gedient hat. Es hat sich gezeigt, daß bei der Gewinnung des Farbstoffes in größerem Maßstab leicht etwas Magnesium aus dem empfindhchen Molekül ver- loren wird, was für präparative Verwendung bedeutungslos, für die Messungen aber von erheblichem Einfluß ist. Man erhält Präparate mit dem der Theorie entsprechenden Magnesiumgehalt mit größerer Sicherheit aus frischem als getrocknetem und gelagertem Pflanzen- material. über unsere aus jahrelangen Versuchen hervorgegangenen Methoden zur Isolierung und Fraktionierung des Chlorophylls ist bisher nur an einer Stelle, nämlich in den ,, Untersuchungen über Chlorophyll" [Berlin 1913, Abschnitt III, V, VI] berichtet worden. Es wäre nicht möglich, in der vorliegenden i\rbeit über die Wahl des Pflanzenmaterials, über die Bedingungen der Extraktion u. a. vohständige Angaben zu machen, es muß vielmehr auf die zitierte Stelle verwiesen werden. Aber wir sind ge- nötigt, auszugsweise die angewandten Verfahren hier nochmals mitzuteilen, um die neueren Erfahrungen zu erwähnen, die sich bei wiederholter /Anwen- dung der Methoden ergeben haben, und auf die besonderen Vorsichtsmaß- regeln aufmerksam zu machen, die einzuhalten sind, wenn angestrebt wird, Chlorophyll ohne Verlust oder mit möglichst geringem Verlust von Ma- gnesium und mit tunlichst geringer Beimischung von Carotinoiden zu gewinnen. Es wird für den Forscher, der kleinere Mengen reiner Prä- parate benötigt, am leichtesten sein, Chlorophyll aus frischen Blättern der Brennessel zu isolieren, während wir für die hier ane^e wandten be- 248 R. Willstätter und A. Stoll. trächtlichen Mengen zumeist genötigt waren, getrocknetes Pflanzen- material, gleichfalls Brennesseln, zu verarbeiten. A. Chlorophyll aus trockenen Blättern. Die Isolierung des Chlorophylls beruht auf der systematischen Steige- rung seines Reinheitsgrades durch Entmischungsmethoden. Die verschie- dene Verteilung der in den Extrakten enthaltenen Stoffe zwischen meh- reren Lösungsmitteln, wie Petroläther mit wasserhaltigem Aceton sowie mit wasserhaltigem Methylalkohol, wird zur Abtrennung der farblosen und gelben Begleitstoffe angewandt. Aus Extrakten, die nur 8- bis 16 proz. Chlorophyll enthalten, gehen durch die Entmischungsopera- tionen Lösungen von etwa 70 proz. Chlorophyll hervor. Wenn nun das Chlorophyll einen solchen Reinheitsgrad erreicht hat, dann ist es zwar noch in alkoholhaltigem Petroläther leicht löslich, aber über- raschenderweise nicht mehr in reinem Petroläther. Wird aus der petrol- ätherischen Lösung der Äthyl- und Methylalkohol herausgewaschen, so scheidet sich das Chlorophyll aus. Es wurde gefunden, daß ein beträchtlicher Wassergehalt der Lösungs- mittel das Ausziehen des gesamten Blattfarbstoffes wesentlich erleichtert, und daß die wasserhaltigen Extraktionsmittel gerade die störendsten Begleitstoffe nicht mitführen, welche die Löslichkeit des Chlorophylls in Petroläther erhöhen. Das geeignetste Lösungsmittel ist 80 bis 85 proz. Aceton; nicht mehr das Lösungsmittel selbst, sondern seine Mischung mit den Begleit- stoffen des Chlorophylls wird das eigentliche Extraktionsmittel für das Blattgrün, ein so ausgezeichnetes, daß die Farbstoffe damit rasch und fast quantitativ ausgezogen werden. Als Ausgangsmaterial dienen uns die mit Sorgfalt getrockneten Brenn- nesselblätter in der Form eines mittelfeinen Pulvers. Es ist ratsam, die trockenen Blätter unzerkleinert aufzubewahren und sie erst kurz vor der Verarbeitung zu mahlen. Das Chlorophyll ist gefährdet, wenn man die Blätter in zu dichter Schicht trocknet oder wenn beim Zerkleinern die Walzen der Mühle sich erhitzen oder wenn das Mehl der Blätter längere Darstellung der Chlorophyllpräparate. 249 Zeit lagert. Im Blatte, auch im getrockneten, befindet sich das Pigment in einem geschützten Zustand, aber nicht mehr nach dem Zerreißen der Zellen und Vermengen ihres Inhaltes. Oxydationsvorgänge, die bei ge- steigerter Atmung gebildete Kohlensäure und die Wirkung der Pflanzen- säuren, schädigen das Chlorophyll. Auf einer großen Steinzeugnutsche (von 50 cm lichter Weite) von niedriger Form werden 2 kg Blattmehl, die eine Schicht von nur etwa 4 cm Höhe bilden, mit der Pumpe festgesaugt und in V2 Stunde mit 6 bis 6,5 1 80 vol.-proz. Aceton extrahiert. Zuerst lassen wir ohne Saugen 2 1 Lösungsmittel in etwa 5 Minuten einsickern, dann füllen wir die Hauptmenge des i\cetons literweise nach, indem wir abwechselnd ohne Vakuum macerieren und mit nur mäßigem Saugen abfließen lassen. Am Ende wird das entfärbte Mehl mit kräftig wirkender Pumpe trocken gesaugt. Aus dem schönen Extrakt wird der Farbstoff in 4 1 Petroläther (0,64 bis 0,66 von Kahlbaum) übergeführt, indem wir ihn half ten weise im 7 1-Scheidetrichter in die ganze Petroläthermenge eingießen und unter Umschwenken je ^/o 1 Wasser langsam zufügen. Nach dem Ablassen der nur schwach gelblichgrünen unteren Schicht wird die petrolätherische Lösung zweimal mit je i 1 80 proz. Aceton entmischt; dieses nimmt Verunreinigungen, aber sehr wenig Chlorophyll weg. Die Petroläther- schicht ist durch Aufnahme von Aceton auf 6 1 angewachsen. Das Aceton wird daraus vorsichtig durch viermaliges Ausziehen mit je V., 1 Wasser unter leichtem Umschwenken entfernt. Die erste von diesen Entmischun- gen beseitigt 0,6, die zweite 0,5, die dritte 0,4 und die letzte noch 0,2 1 Aceton. Durch diese Art der Entmischung werden mit dem hochprozentig ausgeschiedenen Aceton noch Begleitstoffe beseitigt. Wir beabsichtigen nicht, das Aceton jetzt quantitativ wegzu waschen ; sonst würde das gesamte Chlorophyll und Xanthophyll ausfallen und die Reinigung wäre schwierig. Es ist zweckmäßig, zuvor das Xanthophyll abzutrennen, was durch Ausziehen mit 80 proz. Methylalkohol ohne zu großen Chlorophyllverlust gelingt. Wir schütteln mit je 2 1 80 proz. Methylalkohol dreimal aus, oder, wenn der letzte Auszug noch be- 250 K- Willstätter und A. Stoll. trächtlich Gelbes enthält, ein viertes bis sechstes Mal^). Bei der Ver- arbeitung besonders chlorophyllreicher Blätter ist es möghch, daß ein Teil des Chlorophylls während des Ausschütteins mit dem 80 proz. Methylalkohol aus dem holzgeisthaltigen Petroläther ausfällt; dies kommt namentlich bei Verwendung sehr leichter Petroläthersorten vor. Den Niederschlag bringt man für jede nachfolgende Fraktionierung wieder in Lösung durch Zusatz von 100 bis 200 ccm wasserfreiem Methyl- alkohol und wählt den Holzgeist entsprechend wasserhaltiger für die nächste Entmischung. Dem Petroläther, dessen Volumen schließlich 3,6 1 beträgt, entziehen wir durch Waschen mit Wasser in ungefähr vier Malen mit je 2 1 die letzten Anteile von Methylalkohol und Aceton. Dabei verliert der Petrol- äther die Fluorescenz, er trübt sich und das Chlorophyll fällt aus. Die Suspension im Petroläther schüttelt man mit etwas geglühtem Natrium- sulfat und mit etwa 150 g Talk und filtriert sie durch eine Schicht von 50 g Talk mit der Pumpe. Dabei bildet die feine Ausscheidung über dem Talk leicht eine zusammenhängende Schicht und stört die Filtration; wir verrühren sie von Zeit zu Zeit mit dem Silberspatel. Das petrolätherische Filtrat ist bei Verarbeitung tadelloser Blätter gelbgrün und enthält neben sehr wenig Chlorophyll und öligen Stoffen viel Carotin, das daraus mit Leichtigkeit isoliert werden kann. Olivgrün oder sogar braun fließt der Petroläther ab, wenn der Extrakt aus nicht unverdorbenem Material gewonnen ist. Durch andauerndes Nachwaschen mit Petroläther kann das Chlorophyllzersetzungsprodukt Phäophytin, das im Gegensatz zum Chlorophyll etwas löslich im Petroläther ist, zum größten Teil entfernt werden ; freilich darf seine Menge einige Prozent nicht übersteigen. Man unterbricht dieses Auswaschen, Wjenn der Petrol- äther nur noch gelb oder gelbgrün abläuft, verdrängt ihn aus dem chloro- phyllhaltigen Talk mit 300 ccm leichtest flüchtigem Petroläther und saugt trocken. Dann lösen wir sogleich auf der Nutsche das Chlorophyll mit I 1 sorgfältig destilliertem Äther aus dem Talk heraus. Die ätherische Chlorophyllösung wird durch geglühtes Natriumsulfat filtriert, auf 100 ccm ^) Die methylalkoholischcn .Auszüge sind leicht nebenher auf Xanthophyll zu verarbeiten. Darstellung der Chlorophyllpräparate. 251 konzentriert, zur Sicherheit nochmals filtriert und auf 25 ccm eingedampft. Dann fällen wir durch langsamen Zusatz von 0,8 1 leichtflüchtigem Petrol- äther das Chlorophyll aus. Manchmal bildet der Niederschlag ein filtrier- bares blauschwarzes Pulver, mitunter aber eine Suspension von so feinen Partikeln, daß man es nur gut auf Talk filtrieren kann. Es wird dann mit reinem Äther wieder ausgezogen und die auf 20 ccm eingeengte Lö- sung in einer Schale im Exsiccator zu stahlblau glänzenden dünnen Kru- sten eingetrocknet. Die Mutterlauge der Umfällung hatte nicht mehr viel Beimischungen zu entfernen; sie enthielt z. B. 0,15 g Chlorophyll in 0,5 g Trockenrück- stand. Die Ausbeute betrug öfters 13 g und bei neueren Versuchen sogar 15 g, also 6^/0 bis 7V2g aus i kg trockener Blätter, das ist drei Viertel bis vier Fünftel ihres Chlorophyllgehaltes. Das Chlorophyll ist ein blaustichig schwarzes, anscheinend krystal- linisches Pulver, leicht löslich in absolutem x\lkohol, spielend löslich in Äther, unlöshch in Petroläther. Es enthält die beiden Komponenten et und b in ihrem natürlichen Verhältnis von etwa 3:1. Bei der aufeinanderfolgenden Hydrolyse mit Säure und mit Alkali wird es daher zum normalen Gemisch der beiden Spaltungsprodukte Phytochlorin e und Phytorhodin g abgebaut, die gemäß ihren verschiedenen basischen Eigenschaften durch Fraktionieren der ätherischen Lösung mit 3 proz. und g proz. Salzsäure getrennt und bestimmt werden (Spaltungsprobe). Bei der Einwirkung von Alkalien, zweckmäßig beim Schütteln mit methylalkoholischer Kalilauge, zeigt das unversehrte Chlorophyll (im Gegensatz zum allomerisierten) Farbumschlag in Braun, sodann während einiger Minuten Wiederkehr der chlorophyllgrünen Farbe (Phasenprobe). Bei dieser Prüfung mit Alkali wird der Äther farblos, wenn das Prä- parat frei von Carotin und Xanthophyll ist. Die Phytolestergruppe des Chlorophylls, die bei Verarbeitung von Blättern mit größerem Gehalt an Chlorophyllase hydrolytisch oder alkoholytisch angegriffen wird, er- weist sich bei der Prüfung der ätherischen Lösung mit 22 proz. Salzsäure 252 R- Willstätter und A. Stoll. als intakt, wenn die Substanz in der Form von Phaeophytin quantitativ im Äther zurückbleibt ; die phytolfreie Verbindung würde als Phäophorbid extrahiert werden (Basizitätsprobe). Die Prüfung auf unversehrten Magnesiumkomplex geschieht durch Bestimmung des ^lagnesiumgehaltes. Wenn das Chlorophyll durch Säure zu leiden begann, so verrät sich die Beimischung von Phäophytin auch im Spektrum durch das Auftreten der Absorptionsbänder vor der Fraunhofer- schen Linie E und zwischen den Linien E und F. Mit bloßem Auge kann man eine geringe Beimischung von Phäophytin nicht erkennen, weil auch ein etwas größerer Gehalt an der Chlorophyllkomponente b das Gemisch gelbstichiger macht. Aus den angeführten Merkmalen, die genauer in den ,, Untersuchungen über Chlorophyll" (S. 143) beschrieben sind, ergeben sich die Anforde- rungen, welchen die Präparate von reinem und unversehrtem Chlorophyll genügen müssen, und die bei der Anwendung des Chlorophylls für physio- logische Versuche nicht außer acht gelassen werden dürfen. B. Chlorophyll aus frischen Blättern. Frische Blätter werden auch am besten mit 80 proz. Aceton extra- hiert, zuvor aber in zerkleinertem Zustand einer Vorextraktion mit wenig Aceton unterworfen, wodurch das Material entwässert, Pflanzen- schleim entfernt und Enzymwirkungen gehemmt werden. Infolge des größeren Volumens der Blattsubstanz ist der Verbrauch an Lösungsmitteln bedeutend und die Extrakte werden verdünnt. Dank der Vorbehandlung ist aber ihr Reinheitsgrad weit höher, zum Beispiel 21 (in Prozenten aus- gedrückt), als bei den Extrakten trockener Blätter und es genügt, durch Ausschütteln mit Aceton und Holzgeist den Reinheitsgrad auf 50 zu steigern, um das Chlorophyll aus dem Petroläther ausfallen zu lassen. Erstes Beispiel: 2^/0 kg frische Brennesselblätter haben wir rasch, nämhch in 20 Minuten, mit der Steinw^alzenmühle zu dünnem Brei ver- arbeitet und diesen durch Anschütteln in der Flasche mit i^/a 1 wasser- freiem Aceton entwässert und vorextrahiert. Beim Absaugen und schar- fen Abpressen liefen 2,6 1 Vorextrakt ab, die 90 g Trockensubstanz ent- Darstellung der Chlorophylipräparate. 253 hielten. Nun extrahierten wir mit 1,2 1 reinem x\ceton den wieder gemah- lenen Preßkuchen, dessen Wassergehalt das Lösungsmittel auf etwa 80 Vol.-Proz. verdünnt, unter Zusatz eines weiteren Liters 80 proz. Acetons. Beim Absaugen und Nachwaschen mit 2 1 desselben Lösungs- mittels gewannen wir 3,8 1 Extrakt mit nahezu dem ganzen Chloro- phyllgehalt der Blätter. Den Extrakt ließen wir in 1V2 1 Petroläther unter Umschwenken ein- laufen, wobei sich die Schichten scharf trennten und die untere sehr wenig gefärbt blieb. Der Petroläther wurde einmal mit ^j^ 1 80 proz. Aceton gewaschen und die auf 3,1 1 angewachsene Schicht der Chlorophyll- lösung in zwei Malen mit je ^2 1 Wasser von der Hauptmenge des Acetons frei gewaschen. Das Volumen betrug nun 1,7 1. Hauptsächlich zur Entfernung des Xanthophylls diente sodann Waschen mit 80 proz. Holzgeist in zwei Malen mit je ^2 1- Der Chlorophyllverlust bei allen Entmischungen war gering; die Lö- sung enthielt am Ende noch 4,2 g Chlorophyll und schied dasselbe quan- titativ ab bei etwa fünfmaligem Waschen mit je 2 1 Wasser. Die flockige Suspension sammelten wir mit 50 g Talk, filtrierten sie auf Talk und be- freiten sie von der Mutterlauge durch Waschen mit Petroläther. Nach dem Ausziehen des Chlorophylls aus dem Talk mit Äther und langsamen Ausfällen aus eingeengter Lösung mit Petroläther betrug die Ausbeute 4,0 g, das ist reichhch vier Fünftel des in den Blättern vorhandenen Chlorophylls. Das Präparat ist frei von gelben Farbstoffen und somit erfahrungs- gemäß auch von farblosen Begleitern und zeichnet sich durch die Rein- heit und die Einheitlichkeit seiner Spaltungsprodukte aus. Zweites Beispiel. Wenn man auf die oben erreichte hohe Ausbeute verzichtet, gelingt es, den Farbstoff aus kleineren Mengen frischer Blätter durch Abkürzung aller Operationen weit rascher in ebenso reinem Zu- stand zu isolieren. 250 g frische Brennesselblätter werden mit den Syenitwalzen in 3 bis 4 Minuten gemahlen, wobei immer eine Handvoll zweimal die W^alzen passiert und sofort in 90 proz. Aceton fällt. W'w verzichten, um Zeit 254 ^ Willstättei- und A. Stoll. ZU Sparen, auf die Vorextraktion und ziehen mit i 1 des Lösungsmittels in der Flasche den Brei in 2 Minuten zur Genüge aus. Nach dem Absaugen und Nachwaschen mit ^/^ 1 80 proz. Aceton läßt man das Filtrat in 300 ccm Petroläther einlaufen und wäscht die Chlorophyllösung nur zweimal mit ^4 ^ Wasser und zweimal mit ^^ 1 80 proz. Holzgeist. Das genügt, um das Chlorophyll bei vollständi- gem Wegwaschen des Methylalkohols aus dem Petroläther zur Ab- scheidung zu bringen. Es wird in der üblichen Weise mit Talk aufgenom- men, auf der Nutsche mit Petroläther gewaschen und sofort auf der Nutsche mit Äther ausgezogen. Den Äther trocknen wir mit Natrium- sulfat und fällen daraus nach raschem Einengen das Chlorophyll mit leichtflüchtigem Petroläther. Bis zu diesem Punkt kann man in 35 bis 40 Minuten gelangen. Die Ausbeute beträgt 0,25 g, während die angewandten Blätter (entsprechend 50 g getrockneten) 0,4 bis 0,5 g Chlorophyll enthalten. C. Trennung in die beiden Komponenten. Das Prinzip des Verfahrens ist die Verteilung des Chlorophylls zwi- schen Methylalkohol und Petroläther, wobei die Komponente a in der petrolätherischen, b in der methylalkoholischen Schicht überwiegt. Wir gehen dabei nicht von den Extrakten, sondern vom isolierten Gemisch der beiden Komponenten aus, weil dann konzentriertere Lösungen und größere Mengen angewandt werden können und das Verfahren sich so fast quantitativ gestalten läßt. Die Anfangskonzentration darf 2 g Chlorophyll in i 1 Petroläther nicht übersteigen, damit beim Extrahieren der Komponente b mit wasserhal- tigem Holzgeist der Farbstoff nicht aus dem Petroläther ausfällt. Für die Fraktionierung eignet sich am besten 85 proz. Methylalkohol; 80 pro- zentiger nimmt zu wenig Farbstoff auf, in go prozentigen würde schon zu viel von der Kompente a neben b übergehen. 8 g Chlorophyll lösen wir in 150 bis 200 ccm Äther und gießen die un- durchsichtige Flüssigkeit, um sicher zu sein, daß sie keinen ungelösten Anteil enthält, durch ein Filter in einen mit 4 1 Petroläther (^0,64 bis 0,66) Darstellung der Chlorophyllpräparate. 255 beschickten 7 1-Scheidetrichter. Dabei beginnt gewöhnlich das Chloro- phyll wieder auszufallen, und es bedarf eines Zusatzes von 50 bis 100 ccm Methylalkohol zur Klärung. Der Äther muß vor der Fraktionierung durch Waschen mit 80 proz. Holzgeist beseitigt werden, mit 2 1 in i bis 2 Auszügen, auf deren Ver- arbeitung wir verzichten. Mit diesen oder noch etwas mehr Auszügen lassen sich, wenn man Rohchlorophyll für die Isolierung der reinen Komponenten verarbeitet, zugleich die gelben Pigmente und farblose Beimischungen beseitigen. Vor dem Versuche sind der 85- und go proz. Methylalkohol mit Petrol- äther, wovon sie 5,5 und 10 Proz. aufnehmen, gesättigt worden. Im Holzgeist etwa enthaltene Säure wird durch Zusatz von ein wenig Schlämm- kreide abgestumpft. Durch ungefähr 14 Auszüge mit je 2 1 85 proz. Methyl- alkohol wird die Komponente h genügend extrahiert; das Chlorophyll dieser Auszüge wird nur auf die Komponente ^, das im Petroläther zu- rückbleibende nur auf a verarbeitet. Der erste Auszug wird nach der Abtrennung von der Petroläther- lösung durch Zusatz von i 1 ^lethylalkohol auf eine Konzentration von 90 Proz. gebracht, nun mit i 1 Petroläther gründlich gewaschen, sogleich in 2 1 Äther eingetragen und mit viel Wasser entmischt. Den zweiten Auszug vermischen wir gleichfalls mit i 1 Methylalkohol und schütteln ihn mit dem W'aschpetroläther des ersten Auszugs unter Zusatz von einem weiteren ^ 2 1 Petroläther durch. Dann wird die ge- reinigte ö-Lösung in den ersten Ätherextrakt, dem noch i 1 Äther zugefügt wird, übergeführt. Diese großen Äthermengen sind erforderlich, weil der wässerige Holzgeist viel Äther fortnimmt und der beim Verdünnen aus- geschiedene Petroläther die Überführung aus Holzgeist in Äther erschwert. Jeder Waschpetroläther wird in einem Scheidetrichter mittels durch- strömenden Wassers von Holzgeist rasch befreit, worauf der Farbstoff fein ausfällt. Die Auszüge 3 und 4 werden ebenso gereinigt und verarbeitet; der Gehalt an h geht darin erheblich zurück. Bei den üblichen Gemischen mit dem Komponentenverhältnis 2,5 bis 256 R- Willstätter und A. Stoll. 2,8 setzen wir dem sechsten methylalkoholischen Auszug vor dem Wa- schen mit Petroläther nur 900 ccm Holzgeist hinzu, dem siebenten 800, dem achten 700 und endhch dem vierzehnten nur noch 100 ccm. Man reinigt sie paarweise mit demselben Liter Petroläther, der bei seiner zweiten Verwendung noch mit ^/o 1 ergänzt wird und führt sämt- liche Auszüge in dieselbe Ätherlösung über, und zwar stets unter Zusatz von weiteren Äthermengen, anfangs von je i 1, etwa vom zehnten Auszug an von je V2 1- Bei 6-reichem Ausgangsmaterial wird noch der sechste oder siebente Auszug auf 90 Proz. Methylalkoholkonzentration gebracht und erst bei den späteren Ausschüttelungen der Zusatz von Holzgeist um je 100 ccm vermindert. Der fünfzehnte und sechzehnte Auszug hat nur noch den Zweck, das Chlorophyll a von den letzten Anteilen der Komponente h zu befreien; diese Reinigung der Petrolätherschicht führen wir zu Ende, indem wir sie noch dreimal mit je 2 1 90 proz. Holzgeist ausschütteln. Aus diesen methylalkoholischen Waschflüssigkeiten führt man den Farbstoff in Petroläther über, er ist reich an a und wird als Nebenprodukt isohert, ebenso wie das an b relativ reiche Chlorophyll der früheren W^aschpetrol- äther. Die nach dem Abtrennen von h grünblaue Lösung der Komponente a waschen wir mit Wasser, bis das Chlorophyll quantitativ ausgefallen ist, und nehmen dieses je nach seiner Beschaffenheit mit 30 bis 100 g Talk auf, um es auf der Nutsche durch eine Schicht von Talk unter schwachem Sau- gen zu filtrieren. Der Petroläther läuft dabei farblos ab. Die Talkschicht wird mit niedrig siedendem Petroläther nachgewaschen und bis zum Ver- schwinden des Petroläthergeruches abgesaugt. Dann zieht man den Farb- stoff aus dem Talk durch Anschütteln in der Flasche mit möglichst wenig reinem Äther aus und filtriert die schön tiefblaue Lösung auf einer kleinen Nutsche ab. Das Filtrat ist durch wiederholtes Filtrieren von den mit- gerissenen Talkpartikeln zu befreien. Endlich verdampfen wir den Äther beinahe ganz, spülen die konzentrierte Lösung in eine Schale und lassen den Äther im Vakuumexsiccator vollständig eintrocknen. Darstellung der Chlorophyllpräparate. 257 Die Komponente h, ausgeäthert aus den mit Petroläther gewaschenen methylalkoholischen Auszügen, befindet sich in der x\ther-Petrolätherlösung. Wir befreien diese durch Waschen mit Wasser vom Holzgeist und damp- fen nach dem Trocknen mit Natriumsulfat auf ungefähr ^/a 1 ein. Dabei steigt der Siedepunkt infolge der Anreicherung der schwerer flüchtigen Kohlenwasserstoffe auf 50 — 60°; deshalb dampfen wir weiter unter ver- mindertem Druck bei 40 — 50 ° bis auf etwa 30 oder 40 ccm ein und fällen dann die Hauptmenge des Chlorophylls h mit 300 ccm Petroläther vom Siedepunkt 30 bis 50 °. Die Fällung wird sofort auf wenig Talk abfiltriert ; die Mutterlauge enthält, wie die braune Phase erkennen läßt, vorwie- gend a. Auch das ausgeschiedene Chlorophyll weist noch etwas von der Komponente a auf und muß deshalb noch einmal, beim Verarbeiten «-reichen Ausgangsmaterials sogar zwei- bis dreimal, aus Äther mit Petrol- äther umgefällt werden, wobei jedesmal etwas von leichtlöslichem a im Filtrat bleibt. Der Niederschlag wird daher mit leicht flüchtigem Petrol- äther nachgewaschen, trocken gesaugt und wieder mit Äther extrahiert, der auf 10 ccm eingedampft und mit 400 bis 500 ccm Petroläther gefällt wird. Es ist eine Eigentümlichkeit der Komponente h, daß sie sich in viel besser filtrierbarer Form abscheidet als a\ die ausgefällten Körnchen setzen sich rasch ab, man kann davon dekantieren und sie auf Hart- filter absaugen. Die Ausbeute (aus 8 g vom Komponentenverhältnis 2,8) betrug z.B. 3,7 g Chlorophyll a und 1,15 g ö, während 2,3 g Chlorophyllgemisch als Nebenprodukt zurückgewonnen wurde. Ein anderes, aus frischen Blät- tern gewonnenes Ausgangspräparat lieferte beispielsweise, gleichfalls aus 8 g, 4,0 g Komponente a, 1,2 g h und 1,5 g zurückgewonnenes Gemisch. Da von den beiden Komponenten gegen Säurewirkung a empfind- licher, h beständiger ist, kommt es leichter vor, daß a einen etwas zu niedrigen Aschegehalt aufweist. Deshalb soll die Reinigung des Chloro- phylls a von ein wenig beigemischtem Phäophytin (zugleich von Spuren h) noch angeführt werden. Wir lösen das Präparat (zum Beispiel 4 g) in Äther und tragen es in methylalkoholhaltigen Petroläther (3 1) ein. Nun wird der Äther durch Willstätter-Stoll, Assimilation. I7 258 R- Willstätter und A. Stall. viermaliges Ausziehen mit 85- und 90 proz. Holzgeist beseitigt; etwas beigemischtes Chlorophyll b wird dabei mitentfernt. Dann scheidet sich beim Wegwaschen des Methylalkohols aus dem Petroläther das Chloro- phyll a in reinerem Zustand wieder ab, während Phäophytin im Petrol- äther zurückbleibt. Das Chlorophyll ^7 ist ein blauschwarzes Pulver, das sich mit blau- grüner Farbe und tieh-oter Fluorescenz in Alkohol spielend löst. Die Lösung in Äther ist bei größerer Konzentration geradezu blau und wird beim Verdünnen mehr und mehr grünstichig. Eine Beimischung von b verschiebt die Farbe der ätherischen Lösung mehr gegen Grün, eine Bei- mischung von Phäophytin macht die Lösung mißfarbig, olivstichig. Das Chlorophyll b, ein dunkelgrünes Pulver, zeigt etwas geringere Löslichkeit als a, namentlich noch geringere Löslichkeit in Petroläther. Die Farbe der alkohohschen und ätherischen Lösung ist leuchtend grün, bräunlichrot fluorescierend. Eine kleine Beimischung von a läßt sich nicht wahrnehmen und ist nur bei der Spaltungsprobe nachzuweisen, eine geringe Beimischung des Phäophytins hingegen verrät sich dem geübten Auge durch einen braunolivstichigen Ton der Lösung. Bei der Phasenprobe schlägt die Farbe der Komponente a in reines Gelb, von h in schönes Rot um; die ursprüngliche Farbe kehrt bei b erst in einigen Minuten zurück, viel langsamer als bei a. Die Analysen der im Hochvakuum getrockneten Präparate (vergleiche die Aschenbestimmungen im V. Abschnitt) entsprechen den Formeln: für Chlorophyll a: C^^H^^O^N^Mg + ^1, H^O (Halbhydrat), für Chlorophyll h: C-5H,oO,N4Mg. II. Kolloide Lösungen von Chlorophyll. Die Darstellung des kolloiden Chlorophylls erfolgt durch Kon- densation aus molekularen Lösungen in indifferenten organischen Sol- venzien bei der Fällung mit Wasser, die so rasch und so vorsichtig vor- zunehmen ist, daß dabei eine grobdisperse Abscheidung vermieden wird. Kolloide I.ösringen von Chlorophyll. 259 Während bisher \, nur die kolloide Verteilung des Chlorophylls in Ge- mischen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln in kleinem Maßstabe und in großer Verdünnung beschrieben wurde, ist es für die nach- folgenden Messungen der Kohlensäureabsorption erforderlich, kolloide Lösungen des Pigmentes in reinem Wasser darzustellen, und zwar Lösungen von einem halben Prozent Chlorophyllgehalt und noch dar- über hinaus. Versetzt man z.B. eine etwa einprozentige alkoholische Chlorophyll- lösung unter Umschütteln auf einmal mit dem mehrfachen Volumen Wasser, so bleibt die Flüssigkeit zwar klar, aber an Stelle der dunkelroten Fluorescenz der molekularen Lösung tritt blaugrüne Opalescenz, die für die kolloide Lösung charakteristisch ist; die Farbe in der Durchsicht ist gelblich geworden. W'ird diese alkoholhaltige kolloide Lösung mit Äther überschichtet, so geht der Farbstoff beim Schütteln nur sehr lang- sam in den Äther über, und zwar nur infolge des Alkoholgehaltes der Flüssigkeit. Der Zusatz eines Elektrolyten, z. B. von Natriumchlorid bewirkt sofort die Überführung in Äther. Für die Gewinnung der kolloiden Präparate ziehen wir die Lösung des Chlorophylls in Aceton -> gegenüber der alkoholischen vor, weil Aceton zum Unterschied von Alkohol keine Allomerisation^) des Chlorophylls bewirkt und da überdies Aceton leichter durch x\bdestillieren im Vakuum bei mäßiger Temperatur aus der wässerigen Lösung vertrieben werden kann; der Farbstoff ist in Aceton spielend löslich. Die Vor versuche ergaben, daß eine Lösung von hoher und für die Absorptionsversuche zweckmäßiger Konzentration am besten erhalten ^) R. Willstätter, Ann. d. Chem. 350, 48, 69 [1906]; ferner unsere ,, Untersuchungen über Chlorophyll" S. 167. -) Das Aceton (Sorte von Kahlbaum 56 bis 57^) ist durch Destillation unter Vermeidung von Kautschukverbindungen gereinigt worden; dabei verwarfen wir den ersten Anteil und das letzte Drittel, weil bei starkem Einengen saure Reaktion zu bemerken war. Aceton aus der Bisulfitverbindung (von Kahlbaum) war ohne nochmalige Destillation auch unbrauchbar, da es sich mitunter als alkalihaltig erwies. Auch das Wasser für die Bereitung der Chlorophyllösung wurde sorgfältig wiederholt destilliert unter Verwendung von Geräten aus schwer schmelzbarem Jenaer Glase. Die Glas- gefäße wurden vor dem Gebrauch für die kolloiden Lösungen mit verdünnter Salzsäure, de- stilliertem Wasser und Aceton gereinigt. 3) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen ül)cr Chlorophyll S. 147. 200 R. Willstätter und A. Stoll. wird, wenn man die Acetonlösung auf einmal mit etwa dem dreieinhalb- fachen Volumen Wasser von 30 bis 35° vermischt. Um das Auftreten mikroskopischer Teilchen zu vermeiden, \Trar- beiten wir nicht mehr als 0,5 g Chlorophyll auf einmal. Die Substanz wird in Aceton (40 ccm) im Literbecherglase gelöst und zu dieser Flüssigkeit unter lebhaftem Umschwenken in einem Gusse, so rasch, wie es sich aus- führen läßt, aus einem zweiten Becherglase 140 ccm ausgekochtes, schnell auf 30° abgekühltes Wasser hinzugefügt. So entsteht aus der blaugrünen Acetonlösung die mehr gelbstichige, nämlich reingrüne kolloide Lösung, die bei starker mikroskopischer Vergrößerung keine Partikelchen er- kennen lassen darf. Drei solche separate Darstellungen werden von ver- einzelt vorkommenden Flöckchen abfiltriert und in einem Kolben mit eingeschliffenem Helm\), dessen Abflußrohr einen Hahn mit weiter Boh- rung trägt, im Vakuum der Wasserstrahlpumpe bei 30 bis 35 ° abgedampft. Statt einer Capillare führt der Helm ein bis nahe auf den Boden des Kolbens reichendes, mit Gummischlauch und Klemmschraube verschlos- senes, weites Glasrohr. Dasselbe dient zum Nachfließenlassen von wei- terem Wasser, damit man das Aceton aus der kolloiden Lösung völlig verjagen kann, und auch am Ende zur Überführung der entgasten Lö- sung aus dem Kolben in den Absorptionsapparat unter Vermeidung von Luftzutritt. Bei der angegebenen Destillationstemperatur lassen sich in zweieinhalb Stunden, wenn man die Vorlage mit Eis-Kochsalz-Mischung kühlt, alles Aceton und etwa 400 ccm Wasser abdampfen, wovon die Hälfte erst im Verlaufe der Operation zugefügt werden mußte. Die auf ungefähr 250 ccm eingeengte kolloide Lösung von 1,5 g Chlorophyll wurde im entgasten Zustand, indem man sie evakuiert hielt, im Thermostaten auf die für die vorzunehmende Messung erforderliche Temperatur gebracht und zur Bestimmung der Kohlensäureabsorption verwendet. In physiologischen Versuchen der siebenten Abhandlung haben wir kolloide Lösungen von viel größerer Verdünnung angewandt, in der das Chlorophyll Gefahr läuft, durch hydrolytische Spaltung merklich Magne- ^) R. Willstätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll S. 310. Kolloide T.ösungen von Chlorophyll. 261 sium zu verlieren. Im letzten Abschnitt der vorliegenden Abhandlung wird jedoch gezeigt, wie Zusätze schützender Stoffe, z.B. geringe Mengen Magnesiumcarbonat, die hydrolytische Zersetzung des kohoiden Chloro- phylls hintanhalten. Die Nutzanwendung dieser Beobachtung haben wir bei der Darstellung sehr verdünnter kolloider Lösungen in der sieben- ten Arbeit (Abschnitt VI) gemacht. Auch in den Lösungen, an denen im folgenden die spektroskopischen Messungen angestellt werden, hat man das Chlorophyll durch Zusatz von Magnesiumcarbonat vor hydro- lytischer Zersetzung vollkommen geschützt. Beschreibung. Die kolloide Chlorophyllösung läuft mit derselben Geschwindigkeit wie reines Wasser und ohne Rückstand durch gehärtete Filter. Es ist ein Hauptmerkmal des kolloiden Chlorophylls, daß es von Äther nicht aufgenommen wird, während sonst die Mischbarkeit mit Äther in jedem Verhältnis für Chlorophyll charakteristisch ist. So gab die vom organischen Solvens befreite kolloide Lösung bei halbstündigem lebhaftem Schütteln mit Äther auch nicht eine Spur des Farbstoffes an diesen ab. Das Verhalten des kolloiden Chlorophylls gegen Benzol und Schwefelkohlenstoff ist das gleiche. Die Einwirkung von sehr geringen Mengen eines Elektrolyten genügt, um das Pigment auszufällen oder es in eines jener organischen Lösungsmittel überzuführen. Auch durch Salzsäure, wenn man z.B. die Flüssigkeit auf einen Gehalt von 0,5 Proz. Chlorwasserstoff bringt, wird Chlorophyll aus der kolloiden Lösung ausgeflockt, und zwar so rasch, daß es trotz der außerordentlichen Empfindlichkeit des Magnesiumkomplexes gegen die Säure doch nur einen sehr kleinen Verlust von Magnesium erleidet. Bei geringem Chlorwasser- stoffgehalt, wenn die kolloide Lösung z. B. weniger als o,oi proz. salz- sauer ist, wird der Farbstoff noch nicht abgeschieden, aber allmählich zersetzt ; dabei wird die anfangs rein grüne, verdünnte Lösung zunächst gelbgrün, dann oliv und schließlich braun, bleibt aber kolloidal. Nach dem Beginn des Farbumschlages läßt sich durch Soda die ursprüngliche Farbe nicht wieder herstellen. Wenn die Salzsäure zunächst ein Addi- tionsprodukt mit dem Chlorophyll gebildet hat, so ist unter diesen Be- dingungen, wobei immer noch ein Multiplum \'on Chlorwasserstoff vor- 202 R. Willstätter und A. Stoll. banden war, die Zersetzung der Magnesiumverbindung unmittelbar dar- auf gefolgt. Kohlensäure reicht weder zur Ausflockung hin wie die gewöhnlichen Elektrolyte, da die Konzentration des als Hydrat existierenden Anteils zu gering ist, noch genügt sie bei niederer Temperatur für eine ähnliche Zersetzung wie die von der Mineralsäure bewirkte. In der bei o° mit Kohlendioxyd gesättigten kolloiden Lösung der beständigeren Chlorophyll- komponente b entsteht dabei keine grobe Dispersion ; allmählich beginnt eine kleine Zahl von grünen Partikeln auszufallen, die wahrscheinlich aus der Verbindung des Chlorophylls mit Kohlensäure bestehen; beim Über- führen in Äther ist diese Substanz noch grün, also magnesiumhaltig. Die Allomerisation des Chlorophylls, die in alkoholischer Lösung so leicht erfolgt und nur durch kleinen Zusatz von Säure, zweckmäßig von Oxalsäure, verhütet werden kann, tritt nicht ein in der kolloiden Lösung. Es ist begreiflich, daß Kohlensäure hier eine Schutzwirkung ausübt; aber auch ohne Gegenwart von Kohlendioxyd liefern kolloide Lösungen bei der Überführung des Chlorophylls in Äther den Farbstoff unversehrt zurück. Er hat das Kennzeichen der braunen Phase bei Ein- wirkung methylalkoholischer Kalilauge behalten und wird von Alkalien und Säuren in die normalen Abbauprodukte übergeführt. Zur Bestimmung des Chlorophyllgehaltes einer kolloiden Lösung ver- dünnt man eine abgemessene Probe [z. B. i,oo ccm einer etwa 0,5 proz. Lösung) mit Alkohol '100 ccm) und vergleicht colorimetrisch mit einer alkohohschen Lösung von bekanntem Gehalt. Bei der Analyse sehr verdünnter kolloider Lösungen ist darauf zu achten, daß die Probe mit so viel Alkohol verdünnt wird, bis die grüne Opalescenz vollständig der roten Fluorescenz gewichen ist, d. h. bis alles Chlorophyll in mole- kularer Lösung vorhegt. Die Vergleichssubstanz muß sich zur Vermei- dung von störenden Unterschieden der Earbnuancen in ebenso wasser- haltigem Medium gelöst befinden. Das Chlorophyll a ist in ätherischer Lösung blaugrün, in Aceton bläulichgrün, in kolloider Lösung rein grün ; die Farbkomponente b ist in Äther rein grün, in Aceton gelblichgrün, in der kolloiden Lösung gelb- Kolloide Lösungen von Chlorophyll. 263 grün, also noch mehr gelbstichig. Während die molekularen Lösungen der Komponente a dunkelrot, die von b bräunlichrot fluorescieren, be- sitzen die kolloiden Lösungen von a schön blaugrüne Opalescenz, gelb- grüne die von b. Die Spektra der kolloiden Lösungen, die im folgenden beschrieben werden, sind zum Vergleiche mit den Spektren der molekularen Lösungen neben diesen in der beigehefteten Tafel abgebildet. Zustand des Chlorophylls im lebenden Blatte. Es ist aus vielen Untersuchungen bekannt, daß sämtliche Absorptions- streifen im Spektrum des lebenden Blattes gegenüber dem Spektrum eines Chlorophyllextraktes nach der schwächer gebrochenen Seite hin ver- schoben sind. Nun haben sich die Spektren von Blättern und von kol- loiden Chlorophyllösungen bei dem Vergleiche, den D. Iwanowski^), sowie A. Herlitzka'^) vorgenommen haben, als recht ähnlich erwiesen. Daraus ist, wenn auch nicht auf die Identität, so doch auf die ÄhnHch- keit des Zustandes von Chlorophyll im Blattgewebe und in der kolloiden Lösung geschlossen worden. Unsere Messungen zeigen nicht nur die Ähnlichkeit an, sondern sie sprechen entschieden für die Gleichheit des Zustandes in der kolloiden Lösung und in den Chloroplasten. Die Lage der Absorptionsstreifen ist im Spektrum der kolloiden Lösung des Chloro- phyllgemisches die nämliche wie bei den Blättern verschiedener Pflanzen. Nur ist die Lichtabsorption der Blätter größer, zum Beispiel doppelt und vierfach im Vergleich zum Hydrosol von der nämlichen Flächenkonzen- tration, weil die Lichtstrahlen (vgl. die Ausführungen im IX. Abschnitt der zweiten Abhandlung) nicht einfach in gerader Richtung das aus optisch verschiedenen Medien zusammengesetzte Blattgewebe durch- laufen. ^) D. Iwanowski, Ber. d. deutsch, bot. Ges. 25, 416 [1907] und Biochem. Zeitschr. 48, 328 [1913]; s. auch D. Iwanowski, Ber. d. deutsch, bot. Ges. 32, 433 [1914], ferner A. P. Ponomarew, Ber. d. deutsch, bot. «Ges. 32, 483 [1914]. Es ist nicht beabsichtigt und nicht möglich, an dieser Stelle die Literatur über den Zustand des Chlorophylls in den Chloroplasten vollständig anzuführen und zu erörtern. '^) A. Herlitzka, Biochem. Zeitschr. 38, 321 [1912]. 264 R- Willstättei- und A. Stoll. xA.bsorptionsspektrum der Chlorophyllhydrosole. Es war bisher nicht gelungen, das Spektrum der kolloiden Lösung zu messen, ohne daß das Chlorophyll durch hydrolytische Spaltung bei der erforderlichen gro- ßen Verdünnung und durch Photooxydation bei der intensiven Belich- tung litt. Durch Zusatz von Magnesiumcarbonat verhüten wir die Ab- spaltung des Magnesiums. Zum Schutz gegen die Zersetzung im Lichte wird vor die Absorptionscuvette eine strömende Wasserschicht von 4 cm Dicke behufs Absorption der Wärmestrahlen geschaltet. Auch lassen wir die frisch bereitete, entgaste und gekühlte Chlorophyllösung in langsamem Strom aus dem höherstehenden Vorratskolben durch den Absorptionstrog fließen. Nach der Überführung des vor dem Spektroskop behchteten Pig- mentes in Äther bestätigte die colorimetrische Analyse, daß selbst bei der empfindlicheren Komponente a unter diesen L^mständen weder Phäophytinbildung noch Oxydation erfolgt war. Für die Messung wurden 50 mg Farbstoff in 25 ccm Aceton gelöst und auf einmal mit viel Wasser (200 ccm) versetzt, das 5 mg Magnesium- carbonat enthielt. Die Flüssigkeit wurde durch Einengen im Vakuum von Aceton befreit und auf ein Volumen von 250 ccm gebracht ; sie war entgast und bheb bis zur Messung gekühlt im Vakuum stehen. Als Lichtquelle diente eine Nernstlampe, da Gasglühlicht und Metall- fadenlampe an roten Strahlen zu arm sind für die Abgrenzung des Haupt- absorptionsbandes. Das Licht der Lampe (Modell für Projektionszwecke, 95 Volt, 0,5 Amp.) wurde mit einer in 11 cm Entfernung aufgestellten Kondensorlinse (8 cm Brennweite und 6 cm Öffnung) gesammelt, so daß das scharfe Bild des Leuchtstäbchens auf den 0,1 mm breiten Spalt des Zeißschen Gitterspektroskops fiel. Die Absorptionscuvette oder die Blät- ter befanden sich unmittelbar vor dem Spalt. In den nachstehenden Tabellen (Sy bis 90) sind die Messungen der Absorptionsspektra von Blättern und Hydrosolen verzeichnet, indem der Grad der Absorption in folgenden sechs Abstufungen ausgedrückt wird: — dunkel, ziemlich dunkel, . . . mäßige Absorption, . . schwache Absorption, . sehr wenig geschwächt, | schwacher Schatten. Die Absorptionsbänder werden übereinstimmend mit der bekannten Kolloide Lösungen von Chlorophyll. 265 Tabelle 87. Absorptionsspektra von Blättern. Band I II III IV V VI VII Endabsorption Ein Holunderblatt (mit 4,6 mg Chlorophyll in i qdm) Zwei Holunderblätter Ein Tulpenblatt 664 . 61 S 696. .691 632 593 ■ 575 553 I 5^5 523-5I2... •645' 702 — 643... 633 614. 597- ■ •574- -571 556. .529 704. .699 — 644. 633 •■ -öiS- 598 . . 572 330.528 519 — Tabelle 88. Absorptionsspektrum der kolloiden Lösung von Chlorophyll {a -j- ^) (0,15 g Chlorophyll « -)- 0,05 g Chlorophyll 6 in i 1 Wasser). 2,5 Schicht in mm (= Flächenkonzentration nor- mal grüner Blätter) :> 10 1 "^^ Band I 692.. 686 — 666.. 661 710. .700- - 660 . . 650(1 728 . . 720 — 650 . •645 746 — ., II — 634 • 619 j . .637. . .622.611 568 „ III — 595 • 576 596.. 5 76 562... „ IV 552 I 536 553 1 534 V 1 „ VI 1 503 -468.. I508.491... I512.507... 526 ,. VII 452- 458- 1 500 — 521 — Endabsorption Tabelle 89. Absorptionsspektrum der kolloiden Lösung von Chlorophyll 'i. (0,20 g Chlorophyll (( in i 1 Wasser). Schicht in mm (= Flächenkonzentration nor- mal grüner Blätter) 40 Band I II III IV V VI VII Endabsorption | 691. .686 — 664. .659 718. .711 — 659. .654 636 . 619 595 • 575 466. 451 J38 473- •■■ [460 ■ — "1735- -730- 659- J638. . .622.611 595- •576-570 . 554-531 510.476^ 469— i 750 — 568 561 555- • -529- 519. . . 502 — 266 R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 90. Absorptionsspektrum der kolloiden Lösung von Chlorophyll b (0,20 g Chlorophyll & in i 1 Wasser). Schicht in mm ' 2,5 j (= Flächenkonzentration nor- I malgrüner Blätter 5 1 40 Band I 11 i 688.683. ..657.650 1 695- .686 — 651. .645 i 712. .700 — 730 — III ': — — 644.. 639 IV — 612 1 596 •595 V — — l 555 VI — — — ,. VII 1 — — . • „ VIII 1 505.. 490 — 460 I5... 524- • 533 — IX } 450 — 430- • > 501 — } 513 — Endabsorption iJ 408- ) Beschreibung des Chlorophyllspektrums numeriert, die sich auf ätherische Lösungen des Farbstoffes bezieht V\ Die Tafel veranschaulicht den Vergleich der Spektra von Chlorophyll im Blatte und in isolierter Form, nämlich in den kolloiden und den wahren Lösungen. Die Verschiebung der Absorptionsstreifen der kolloiden Lösungen gegenüber den molekularen nach Rot hin (vgl. die Tafel) zeigt am deut- lichsten das Hauptabsorptionsband im roten Teil des Spektrums. Die Achse dieses Absorptionsstreifens im Blatte und beim Gemisch der Chloro- ph\''llkomponenten (c? : 6 = 3 : i) oder bei reinem Chlorophyll a als Hydrosol wird bei -?. = 675 bis 677 /(u gefunden, während das entspre- chende Band im Spektrum der ätherischen Lösung ^'on Chlorophyll a bei / = 662 fi/i liegt. Bei der Komponente b ist die aus den Bändern I + II bestehende Hauptabsorption von /. = 652 /m des gewöhnlichen Spektrums verschoben nach / = 66q ///< beim Hydrosol. Während die wahren Lösungen der Farbstoffe die Absorption in zahl- reiche (bei Chlorophyll h sind es zehn) scharf begrenzte Bänder aufgelöst zeigen, treten bei den Hydrosolen fast nur die Grenzen der Hauptabsorp- tionen in Rot und Violett stark hervor. Die übrigen Bänder sind ge- schwächt und so diffus, daß z. B. bei Chlorophyll b von den Absorptions- ^) R. Willstätter und A. Stoll, l'ntcrsuchungen über Chlorophyll, S. 170. Spektrum eines Holunder- blattes mit 4,6 mg Chloro- phyll in 1 qdm i Spektrum von kolloidem Chlorophyll (a: h = 3: \) (5 mm-Schicht einer Lösung von 0,20 g in 1 1 Wasser) 780 7001; ( m 730 700 B ( Chlorophyll n Spektra der kolloid (Ml Chloru- phyllkomponenten (5 mm- Schicht einer Lösung von 0,20 g in 11 Wasser) Chlorophyll b Chloropliyll d Si)ektra der molekular ge- lösten Chlorophyllkompo- nenten (20 mm-vSchicht einer Lösung von 0,043 g in '30 7U0U C 1 1 Aether 50 70oli C liooi» Chlorophvll /> I K 500 F ■: I ! E öOO F J L (5 400 i Spektrum des Chlorophylls im Blatte, in kolloider und in molekularer Lösung Willstiittci Stoll, Assiniilution. Verlag von Julius Sprinj^ei in Bc Kolloide Lösungen von Chlorophyll. 267 streifen III bis VII allein IV sich von der Umgebung abhebt und auch nur als ein schwacher Schatten. Auch die im Spektrum von Chlorophyll a beobachtete Auflösung der Absorption im Blau bis Violett in einzelne Streifen läßt sich beim Hydrosol nicht erkennen; bei der kolloiden Lösung der Komponente b konnten zwei nur sehr unscharf voneinander getrennte Bänder zwischen den Fraunhoferschen Linien F und G be- stimmt werden. Das Spektrum des Blattes stimmt auch in dieser unscharfen Gliede- rung der Absorption genau mit dem von kolloiden Lösungen der reinen Pigmente überein. Die Überlagerung des Spektrums von Chlorophyll b, dessen Haupt- absorption im Rot im Vergleich zur Komponente a etwas gegen Orange verschoben ist und dessen Absorption im Blau und Violett mehr gegen Grün vorrückt als bei a, verwischt noch mehr die Abgrenzung der Bänder im Spektrum sowohl des Blattes wie des isolierten Gemisches der beiden Chlorophylle. Wenn auch der verhältnismäßig geringe Anteil der Kom- ponente b im natürlichen Chlorophyllgemisch die Absorption erweitert und die Lichtausnützung erhöht, so ist doch das Blatt in seinem Spektrum sehr ähnlich dem Hydrosol von reinem Chlorophyll a. Die besonders weit von Violett gegen Grün bis über X = 500 jnfi hereinrückende Hauptab- sorption des Blattes ist durch die Anwesenheit der Carotinoide in den Chloroplasten bedingt. In dickeren Schichten wird auch von den kolloiden Lösungen nur noch rotes Licht transmittiert. Bei Chlorophyll b genügt schon eine Schicht von 40 mm der angegebenen Konzentration, um das grüne Licht bis auf einen schmalen Schimmer bei ungefähr ?. = 540 /uu zu absorbieren, wäh- rend das rote Licht von 730,«/' an hell durchleuchtet. Verhalten der Blätter gegen Lösungsmittel. Außer den spektro- skopischen Beobachtungen betrachten wir^) das Verhalten des Chloro- phylls in den Blättern gegen organische Lösungsmittel in seiner Überein- stimmung mit den Erscheinungen an der kolloiden Lösung als beweisend für den kolloiden Zustand des Pigmentes in den Chloroplasten. 1) R. Willstätter und A. StoU, Untersuchungen über Chlorophyll, S. 58ff. 268 R. Willstätter und A. StoU. Das Chlorophyll wird trotz seiner großen Löslichkeit in den üblichen Solvenzien aus dem Pulver getrockneter Blätter nur langsam von abso- lutem Alkohol extrahiert, sehr träge von Äther, Chloroform und Aceton, endlich von Benzol und Petroläther gar nicht. Während z.B. das trockene Pulver von Brennesselblättern während etwa einer halben Stunde Aceton nicht anfärbt, entsteht bei Gegenwart von etwas Wasser sogleich ein intensiv grüner Extrakt ; das Verhalten gegen absoluten Alkohol ist ähn- lich, der Unterschied beim Zusatz von Wasser hier aber kleiner. Äther wird von trockenem Blattmehl nicht angefärbt, er bleibt fünf Minuten lang frei von Chlorophyll ; befeuchtet man aber das Pulver mit ein paar Tröpfchen Wasser, so färbt sich der Äther sofort stark grün an. Das zu- gesetzte Wasser löst aus der Blattsubstanz Mineralsalze wie z.B. Kalium- nitrat; die entstehende Salzlösung verändert den kolloiden Zustand des Chlorophylls in den Chloroplasten und macht es leicht löslich. Dieser Umstand ist von großer praktischer Bedeutung für die Isolierung von Farbstoffen aus getrockneten Blättern, die wir mit wasserhaltigen Lö- sungsmitteln ausführen. Der Zustand des Chlorophylls in den Blättern wird in eigentümlicher Weise durch Abbrühen derselben beeinflußt ; danach wird das Chlorophyll leichter extrahiert. Während das normale Blattgewebe die Chloroplasten längs der Zell- wände in scharf begrenzten, meist elhptischen Formen schön angeordnet enthält, zeigen die Blätter nach kurzer Einwirkung von siedendem Wasser die Chloroplasten stark deformiert oder geplatzt, so daß dann ihre etwas körnigen Massen ineinanderfließen und die Zellen diffus erfüllen. Das Zerfließen tritt fast augenblicklich ein. Die Blätter färben sich beim Eintauchen in siedendes W^asser in wenigen Sekunden tief grün, was am schönsten bei Braunalgen^) zu sehen ist. Spektroskopisch erweist sich diese Farbänderung der Blätter als eine Verschiebung der Absorptionsstreifen gegen das violette Ende hin; ihre Lage nähert sich etwas der beim Spektrum eines Chlorophyllauszuges 1) R. Willstätter \md H. J. Page, Über die Pigmente der Braunalgen, Ann. d. Cham. 404, 237 [1914]- Kolloide Lösungen von Chlorophyll. 26q beobachteten und ist wenig verschieden von der Lage der Streifen, die eine Lösung von Chlorophyllgemisch in Phytol aufweist. Das Chlorophyll ist aus seinem kolloiden Zustand in die Form einer wirklichen Lösung übergegangen, nämlich gelöst in seinen infolge der Temperaturerhöhung verflüssigten wachsartigen Begleitstoffen. Es ist leichtlöslich geworden, sogar Benzol extrahiert aus dem Mehl von ab- gebrühten Blättern den Farbstoff leicht. Beim Abbrühen der Blätter geht das Chlorophyll in einem stark bre- chenden Medium in Lösung. Es gelingt auch innerhalb des Blattgewebes, eine Chlorophyllösung mit denselben Solvenzien, wie sie für die Extraktion verwendet werden, zu erzeugen. Wir legen ein Blatt z. B. von Brennesseln in Aceton, bis es gleichmäßig tiefgrün erscheint und noch kein Chlorophyll aus den Zellen austritt ; die spektroskopische Messung ergibt dann Werte, die nach Lage und Intensität der Bänder mit denen des Extraktspek- trums zusammenfallen. Die folgende Tabelle gi verzeichnet die spektroskopischen Beobach- tungen, in denen das Blatt in frischem Zustand und nach der Änderung der Dispersität seines Pigmentes verglichen wird. Tabelle 91. Absorptionsspektren des Blattfarbstoffes in verschiedenen Dispersitäten und Medien. Medium und Dispersität Band I II III IV V VI Endabsorption Lebendes Blatt (Kolloides Chlorophyll) 693 — 663 •■643 625 I 611 59^-569 551 -535 520. . .505 Abgebrühtes Blatt (Molar gelöstes Chlorophyll) 686 — 657 ..645 623 1 608 590.569 550 I 535 519- ■ -505 Lösung von Chloro- phyll in Phytol 54 ] 685 — 6 / ...641 625. .603 590. .570 548.532 512 I 486 ...480- Mit Aceton behandeltes Blatt 680 — 640 . 625. . .601 588.-564 548.526 514. . .502 Dieser Vergleich erklärt zur Genüge den Zustand des Chlorophylls in dem mit heißem Wasser oder mit Lösungsmitteln behandelten und leb- hafter grün gewordenen Blatte. Gemische von Lecithin und Chlorophyll. Man hat öfters die Frage behandelt, ob das Chlorophyll in den Chloroplasten mit einer färb- 270 R. Willstätter und A. Stoll. losen Grundmasse, namentlich mit Lecithin, verbunden oder vermischt sei. Um für die Einwirkung der Kohlensäure das Chlorophyll in einer dem natürhchen Zustand möglichst ähnlichen Verteilung anzuwenden, haben wir den Einfluß verschiedener Beimischungen auf das kolloide Chlorophyll geprüft. Wenn man bei der Bereitung der kolloiden Lösung schützende Stoffe beimischt, z. B. Traubenzucker oder ein Schutzkolloid wie eine Spur von arabischem Gummi anwendet, so wird die Haltbarkeit des kol- loiden Chloroph^ils erhöht und die Gewinnung einer sehr konzentrierten, prachtvoll grünen Lösung erleichtert. Ähnlich wirkt Lecithin. Wir lösten z. B. 0,1 g Chlorophyll und 0,5 g Lecithin in 30 ccm Äther und verdampften ihn in einer mit Watte in dünner Schicht ausgelegten Schale mit Hilfe eines warmen Luftstromes rasch und vollständig. Beim Übergießen mit Wasser quoll das Lecithin auf und ein Teil davon ging kolloidal in Lösung, indem es zugleich das Chlorophyll mit prächtig grüner Farbe aufnahm. Größere Partikel, die unter dem Mikroskop wahrnehm- bar w'aren, erschienen in Form und Farbe den Chloroplasten ähnlich. Makroskopisch war die Flüssigkeit einer Aufschwemmung von Chloro- plasten ähnlich und sie war beim Verdünnen durchsichtig grün ; sie opali- sierte und besaß zugleich deutliche rote Fluorescenz. An Äther gab die Lecithinsuspension Chlorophyll nur schwer ab. Es hätte scheinen kön- nen, daß der Zustand des Chlorophylls in den Blättern nachgeahmt sei, aber das Spektrum war mit dem des Blattes nicht übereinstimmend, sondern entsprach der Lösung von Chlorophyll in Phytol oder dem ab- gebrühten Blatte. Band I und II. Chlorophyll in kolloidem Lecithin .... 682 — 658 . . . 645 Chlorophyll in Phytol 685—654 . . .641 Chlorophyll im abgebrühten Blatt .... 086 — 657 . . . 645 Daraus ging hervor, daß das Chlorophyll in einer gewöhnlichen, mole- kularen Lösung im Lecithin enthalten war. Anders war das Ergebnis, wenn man das bereits für sich kolloid gelöste Chlorophyll mit Lecithin als Begleitkolloid vermischte. Wir fügten überdies löshche Stärke hinzu und erreichten durch die Wirkung der beiden Begleitstoffe einen solchen Schutz der Kolloidteilchen des Chlorophylls, daß auch der Zusatz eines Kolloide Lösungen von Chloroplnil. 2/1 Elektrolyten ohne Veränderung ertragen wurde. Nun hatte das KoUoid- gemisch^ ) das Spektrum der gewöhnlichen kolloiden Chlorophyllösung, glich also darin dem Blatte : Band I mit IT 689 — 661 • • 648. Zum Unterschied von diesem bleibt die Flüssigkeit aber auch beim Kochen unverändert. Es kann daher Lecithin (und Stärke; nicht oder nicht allein der Begleitstoff sein, der im Blatte beim Erwärmen das Pigment in molekulare Lösung überführt. Die in diesem Abschnitt angeführten Beobachtungen führen zu dem Ergebnis, daß die kolloide Lösung im Wasser diejenige Form des Chloro- phylls darstellt, die der Anordnung des Pigmentes im Assimilations- apparat am nächsten kommt. Wir sind daher berechtigt, aus dem Verhalten der kolloiden Lösung gegen Kohlensäure Schluß- folgerungen auf das Verhalten des Chlorophylls im lebenden Blatte zu ziehen. Verhalten der Chlorophyllösungen gegen Luft und stärkeres Kohlendioxyd. Das Verhalten von Chlorophyll in molekularer Lösung gegen Kohlen- säureanhydrid und in kolloider Lösung gegen Kohlensäure ist grund- verschieden. Es ist bemerkenswert, daß auch die Lösung in 80 proz. Alkohol sich gleich einer wasserfreien Lösung verhält. Chlorophyll a behandelten wir in absolutem Alkohol mit einem Strom von reinem trockenem Kohlendioxyd im Dunkeln; die Lösung blieb un- verändert grün, etwas leuchtender in der Farbe als eine ohne Kohlensäure aufgestellte Vergleichsprobe. Auch nach mehreren Tagen war das Chloro- phyll in der Farbe noch un\ersehrt, nur war es allomerisiert. Die quan- titative Bestimmung der Löslichkeit von Kohlendioxyd in alkoholischen Chlorophyllösungen im VL Abschnitt wird zeigen, daß das Kohlendioxyd 1) 0,1 g Lecithin wurde in 2 ccm Äther gelöst, dann mit 2 ccm Aceton versetzt und hierauf mit 20 ccm Wa.sser, in dem 0,05 g Stärke gelöst waren. Mit dieser kolloiden Flüssigkeit ver- setzte man eine Lösung von 0,1g Chlorophyll in 4 ccm Aceton, fügte noch 20 ccm Wasser hinzu und verjagte die organischen Solvenzien durch Eindampfen auf 30 ccm im Vakuum bei. 30°. 272 R- Willstätter und A. Stoll. mit dem Chlorophyll unter solchen Bedingungen überhaupt nicht zu reagieren vermag. Auch in 80 proz. Alkohol bleibt bei tagelanger Einwirkung der Magne- siumkomplex intakt. Ebensowenig reagiert das Chlorophyll in Äther oder anderen indiffe- renten Lösungsmitteln mit Kohlendioxyd. Die kolloide Lösung des Chlorophylls wird hingegen bei gewöhnlicher Temperatur beim Einleiten von unverdünntem Kohlendioxyd schon nach einer halben Stunde etwas olivstichig, weiterhin olivgrün, und sie ist nach einigen Stunden unter Abscheidung von Flocken braun. Die Kohlensäure hat also schon zum beträchtlichen Teil dem Chlorophyll das Magnesium entzogen und es in Phäophytin verwandelt. Kohlendioxyd von 20 Vol.-Proz. wirkt ähnlich, nur langsamer, ent- sprechend der geringeren Konzentration. Das Gasgemisch wurde aus einer Stahlflasche durch eine mit Kupfersulfat beschickte Gaswaschflasche in die schön kolloide Lösung der Komponente a eingeleitet. Schon nach zwei Stunden war diese etwas gelbstichig, der Farbumschlag war nach vier Stunden deutlich. Nach zwei Tagen war mehr als die Hälfte des Chlorophylls zersetzt, aber keine Ausflockung eingetreten. Ein Strom von 5 proz. Kohlendioxyd, das von unbelichteten wie be- lichteten Blättern ohne Schaden ertragen wird, bewirkt in der kolloiden Lösung gleichfalls die Zersetzung, so daß das Pigment in vier Tagen etwa die Hälfte des Magnesiums verlor. Selbst das 0,03 proz. Kohlendioxyd der atmosphärischen Luft wirkt, allerdings langsam, auf das kolloid gelöste Chlorophyll ein. Um die Erscheinung quantitativ zu verfolgen, leiteten wir im Dunkelzimmer 80 Tage lang gewöhnliche Luft durch einen Teil der kolloiden Lösung, zugleich kohlensäurefreie durch eine zweite Probe, während wir einen dritten Anteil derselben Lösung völlig entgast in einem Kolben auf- bewahrten. Für den Versuch diente das reinste Präparat von Chloro- phyll {a + h), das als Nebenprodukt erhalten war bei der Fraktionierung des Chlorophylls in die Komponenten, die zugleich für den ungetrennt zurückgewonnenen Anteil eine wirksame Reinigung (von beigemischtem Kolloide Lösungen von Chlorophyll. 273 Phäophytin und von Carotinoiden) bedeutete. Die kolloide Lösung von 2 g Substanz wurde nach der Entgasung für die Parallelversuche in drei Kolben übergeführt. Wir stellten für solche Zwecke eine besondere Pipette her, um die ent- gaste Flüssigkeit ohne Berührung mit Luft umzufüllen. Die Pipette (75 ccm) besitzt die untere Marke unmittelbar unter dem Bauche und unter derselben noch eine Erweiterung von etwa 25 ccm Inhalt und einen Hahn zwischen dieser und dem Abflußende. Man setzt die Pipette in den Gummischlauch des Helmkolbens ein, öffnet ihren Hahn und evakuiert. Dann läßt man durch den Abflußhahn des noch immer luftleeren Helmkolbens etwas Luft eintreten und öffnet die Klemmschraube des Verbindungsschlauches. Nachdem die Flüssigkeit die Pipette bis zur oberen Marke gefüllt hat, setzt man diese mit geschlossenem Hahn in ein T-Rohr ein, das mit dem verengten Halse des für die Aufbewahrung der Lösung dienenden Kolbens luftdicht verbunden ist. Mittels des T-Stückes wird der Kolben evakuiert. Beim Füllen aus der Pipette bleibt der Teil der Lösung, der mit der Luft in Berührung steht, in der unteren Erweiterung der Pipette zurück. Durch Saugen und gelindes Erwärmen wird die kolloide Lösung kurze Zeit zum Sieden gebracht, ehe man den Kolben zuschmilzt. Für die Einwirkung der kohlensäurehaltigen Luft dienten 0,8 g Chloro- phyll in 150 ccm Lösung, für die Kontrollversuche je die halbe Menge. Dementsprechend ordneten wir den doppelten Strom kohlensäurehaltiger Luft an wie kohlensäurefreier. Eine mit langem Abflußrohr versehene schwach gehende Wasserstrahlpumpe erzeugte geringen Unterdruck in einem 4-l-Saugkolben, der zum Druckausgleich und zugleich als Sicher- heitsflasche diente. Die Saugflasche war mit dem Kolben, worin sich die kolloide Lösung befand, durch eine Bohrung des Stopfens verbunden, während durch eine zweite das außen verengte, bis an den Boden reichende Einleitungsrohr die Luft zuführte. Um Zurücksteigen der Chlorophyll- lösung in die Waschflasche zu verhüten, war die Röhre über dem Stopfen zu einer großen Kugel erweitert ; andererseits stellten wir die Chlorophyll- lösung zum Schutze gegen eine in der monatelangen Versuchsdauer mög- liche Störung in der Wasserstrahlpumpe höher auf als diese. Die Luft \V i 1 1 s t ä 1 1 e r - S t o 1 274 ^- Willstätter und A. Stoll. durchwanderte einen mit Glaswolle und Kupfersulfatlösung beschickten Waschapparat, im Parallelversuch mit kohlensäurefreier Luft außerdem eine Absorptionsflasche mit konzentrierter Kalilauge. Wir regulierten den Strom der kohlensäurehaltigen Luft so, daß 4 1 in der Stunde durch- strömten. Während des Versuches nahm nur die mit kohlensäurehaltiger Luft behandelte kolloide Lösung olivgrüne Farbe an, ohne daß indessen Aus- flockung eintrat. Die drei Proben sind so aufgearbeitet worden, daß wir in je einer Hälfte der kolloiden Lösung die gebundene Kohlensäure, in der anderen Hälfte den Aschegehalt des Farbstoffes nach Überführung in Äther ermittelten. Aschebestimmung. Das Pigment wurde aus der kolloiden Lösung unter Zusatz von Kochsalz in ätherische Lösung gebracht. Wir dampften diese auf etwa 2 ccm ein und fällten sie mit 50 ccm leichtflüchtigem Petroläther; die letzten Anteile vom Äther verdrängte man durch aber- maliges Abdampfen der Flüssigkeit und erneutes Versetzen mit 50 ccm Petroläther. Nach dem Stehen im Eisschrank enthielt die über dem ab- geschiedenen blauschwarzen Pulver stehende Flüssigkeit höchstens ein paar Milligramm Chlorophyll gelöst. Das Präparat ist auf gehärtetem Filter abgesaugt und zuerst im Exsiccator, dann im Hochvakuum über P2O5 zur Konstanz getrocknet und verascht worden. Die Asche des unter Luftabschluß aufbewahrten Präparates war durch hydrolytische Abspaltung von Magnesium etwas herabgemindert. 1. Asche des Chlorophylls aus dem geschlossenen Kolben. 0,06505 g Substanz gaben 0,00266 g Asche, entsprechend 2,47 Proz. Mg. 2. Versuch mit kohlensäurehaltiger Luft. 0,26790 g Substanz gaben 0,00980 g Asche, entsprechend 2,20 Proz. Mg. 0,05896 g Substanz gaben 0,00214 g Asche, entsprechend 2,19 Proz. Mg. Die Erniedrigung des Magnesiumgehaltes vom theoretischen Werte 2,70 Prozent auf den gefundenen Wert von im Mittel 2,20 Proz. ent- spricht der Zersetzung von ungefähr 19 Proz. des angewandten Chloro- phylls. Bestimmung der gebundenen Kohlensäure. Die mit kohlensaure- Bestimmung der Aufnahme und Entbindung von Kohlendioxvd. 275 haltiger Luft gesättigte Lösung wurde ^'4 Stunden lang mit einem Strom reiner Luft von gelöstem Kohlendioxyd befreit. Dann ließen wir durch das Gaseinleitungsrohr lo ccm doppelt normaler Schwefelsäure einfließen, wodurch gebildetes Magnesiumcarbonat und Chlorophyll zersetzt wurde. Das entbundene Kohlendioxyd verdrängten wir in 2^/3 Stunden bei einer Temperatur von 35 bis 40° der Flüssigkeit mit 10 1 durchströmender Luft und absorbierten es im Natronkalkrohr. Nach weiterer zweitägiger Ein- wirkung von Schwefelsäure fanden wir bei nochmaligem Durchleiten von Luft kein Kohlendioxyd mehr (beobachtet 0,0 mg im Natronkalkrohr). 1. Kontrollversuch im geschlossenen Kolben. x\us der Lösung von 0,2 g Chlorophyll wurden 0,03 mg CO2 ausgetrieben. 2. Kontroll versuch mit kohlensäurefreier Luft. Aus der Lösung von 0,2 g Chlorophyll wurden 0,3 mg CO2 ausgetrieben. 3. Versuch mit kohlensäurehaltiger Luft. Aus der Hälfte der Lösung (0,4 g Chlorophyll) wurden 4,6 mg CO2 ausgetrieben. Demgemäß trafen nach Korrektur für das COo der Parallelversuche auf die angewandten 0,8 g Chlorophyll 8,0 mg CO2. Unter der Annahme, daß das COo in der Form des basischen Carbonates Mg (0H)2 • (MgC03)4 vorlag, waren 10,0 mg CO2 in das Chlorophyll eingetreten. Demnach waren 25 Proz. des Chlorophylls durch Kohlensäure zer- setzt. IIL Bestimmung der Aufnahme und Entbindung von Kohlendioxyd. Die Löslichkeit von Gasen in Flüssigkeiten kann auf zwei Arten ein- fach bestimmt werden. Entweder ermittelt man mit einer Bürette, deren Gasraum mit einer bekannten Menge der Flüssigkeit in Verbindung steht, das Volumen des bis zur Sättigung aufgenommenen Gases oder man entbindet aus der gesättigten Lösung das Gas durch ^Minderung des Par- tialdruckes und bestimmt es durch Wägung in Absorptionsapparaten ^ wenn es chemisch reaktionsfähig ist. Werden die beiden Methoden nach- 276 I<- Willstätter und A. Stoll. einander auf eine und dieselbe Lösung angewandt, so kontrollieren sie sich. Sie ergeben übereinstimmende Werte, wenn das Gas in der Flüssigkeit entweder gelöst oder in leicht dissoziabler Verbindung vorhanden war. Ein Fehlbetrag bei der Bestimmung durch Entbindung gegenüber der Absorption zeigt an, daß von dem Gase verbraucht worden ist, indem es entweder mit der Flüssigkeit oder mit einem darin enthaltenen Stoffe eine unter den Versuchsbedingungen nicht dissoziierende Verbindung ein- gegangen ist. In unserem Falle der Versuche mit Kohlendioxyd kann ein Carbonat gebildet werden. Dann wird durch chemische Zersetzung, durch Zusatz von Mineralsäure, das nicht dissoziable Kohlendioxyd nach der Ent- bindungsmethode bestimmt, nachdem zuvor das gelöste und das in dis- soziabler Verbindung vorhandene Kohlendioxyd durch Partialdruck- minderung, sei es durch Evakuieren oder mit einem kohlensäurefreien Gasstrom entfernt w^orden ist. Eine der beiden Methoden allein genügt für eine Löshchkeitsbestim- mung, also auch für die Bestimmung, ob durch einen gelösten Stoff die Löslichkeit eines Gases im Lösungsmittel positiv oder negativ beeinflußt wird. Beide Wege zugleich, nämlich die Differenz zwischen absorbiertem und entbundenem Gase sind erforderlich, wenn auf die Natur einer von dem Gase gebildeten chemischen Verbindung geschlossen werden soll, die unter den Versuchsbedingungen beständig ist. Findet man in einer kolloiden Lösung die Löslichkeit eines Gases durch Bestimmung der Absorption erhöht im Vergleich mit dem reinen Lösungsmittel und wird einfach durch Verminderung des Partialdruckes das gesamte Gas entbunden, so ist die Differenz zwischen dem absorbierten Gase und dem im reinen Lösungsmittel löslichen auf die Bildung einer leicht dissoziierenden Verbindung mit dem Kolloide zurückzuführen . Bei der kolloiden Chlorophyllösung erstreckt sich die Methode auf die Erhöhung der Löslichkeit von Kohlendioxyd in Wasser durch den Zusatz des kolloiden Chlorophylls, auf die Dissoziation eines Kohlensäure- additionsproduktes von Chlorophyll und auf eine nicht umkehrbare Zer- Bestimmung der Aufnahme und Entbindung von Kohlendioxyd. 277 Setzung des Chlorophylls unter Bildung von Magnesiumcarbonat und Bicarbonat. Absorptionsmethode. Apparat. Für die gasvolumetrische Bestimmung der Absorption folgten wir mit einem Apparate, der in Fig. 15 abgebildet ist, im wesent- lichen der Versuchsanordnung von W. Ostwald, die in der Arbeit von G. Just^) über ,,Die Löslichkeit von Gasen in organischen Lösungsmit- teln" angegeben worden ist und später noch einige Vervollkommnungen erfahren hat. Eine einfache Gasbürette (ß) mit Dreiweghahn {H]_j ist durch eine Stahlcapillare i^K) mit einem Absorptionsgefäß {A) verbunden, worin die Flüssigkeit bei konstanter Temperatur mit dem Gase geschüttelt wird. Die Gasbürette steht zusammen mit einem Manometerrohr (Mr) von gleichem Durchmesser in einem weiten Glaszylinder (G), der zur Verhütung von raschen Temperaturschwankungen mit Wasser gefüllt ist. Der Meßbereich des x\pparates wird nach einer Arbeit von G. Geffcken^), welche die Löslichkeitsbeeinflussung der Gase durch Elektrolyte behan- delt, bedeutend erhöht durch Anwendung der von O. Blei er 3) vor- geschlagenen Gasmeßröhren mit Reserveräumen {R). Mit dem gra- duierten engen Bürettenrohr steht eine Anzahl kugeliger Erweiterungen von genau bekanntem Inhalt in Verbindung, welche die Anwendung eines viel größeren Gasquantums ermöglichen. Mit dem Apparate von Geffcken ist auch eine in anderem Zusammenhang zu beachtende Unter- suchung von A. Findlay und H. J. M. Creighton*) ausgeführt, die den Einfluß von Kolloiden und feinen Suspensionen auf die Löslichkeit von Gasen in Wasser betrifft. Die Autoren verlängern und graduieren die Manometerröhre (Mr), um die Messung auch bei erhöhtem Drucke vorzunehmen. Nach der Versuchsanordnung der angeführten Arbeiten herrscht in dem Absorptionsgefäß und in der Gasbürette ungleiche Temperatur, die ^) G. Just, Zeitschr. f. physikal. Cham. 37, 342 [1901]. 2) G. Geffcken, Zeitschr. f. physikal. Chem. 49, 255 [1904]. 3) O. Bleier, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 30, 2758 [1897]. *) A. Findlay und H. ]. M. Creighton, Journ. of the Chem. Soc. 97, 536 [igio] 278 R. Willstätter und A. Stoll. Übrigens auch während des Versuchs nicht konstant bleibt. Dadurch wird die Berechnung der Absorption komphziert, und die Verschiedenheit der Temperaturen bedingt Fehler bei der Berücksichtigung der Dampftension eines Lösungsmittels. Wir ziehen es deshalb vor, Temperaturgleichheit im Absorptionsgefäß und der Gasbürette herzustellen. Aus dem Thermostaten (T) von loo 1 Wasserraum, worin das Absorptionsgefäß geschüttelt wird, schicken wir mit einer für diesen Zweck konstruierten kleinen Zentrifugalpumpe (Fig. 14 und Z in Fig. 15) einen raschen Strom Wasser (7 1 in der Minute) durch den die Bürette umge- _ benden Glasmantel und lassen das Wasser in ,—. (r\\ rk^^f^lL^^! [ ^^^'^ Thermostaten zurückfließen; die Ver- LjI r \' yP i 1 bindungsleitungen sind zweckmäßig mit As- bestpapier gut isoliert. Die Temperaturdiffe- IjH * ir w''^^^ x'^wz zwischen der Gasbürette und dem Ther- mostaten war bedeutungslos ; sie betrug selbst in den Versuchen bei o ° nur 0,05 °. Den Thermostaten, der mit Asbestpappe gegen äußere Temperatureinflüsse etwas ge- schützt war, stellten wir auf 0° ein, indem wir in einer immer 15 cm hohen Schicht von fein gemahlenem Eis durch ein Rührwerk {Rw^ Wasser in lebhafter Strömung hielten ; es war nötig, bei Versuchsbeginn etwa 50 g Kochsalz zuzufügen, um trotz der Erwärmung von außen genau die Schmelztemperatur des Eises zu erreichen und bei langdauernden Versuchen das im Überlauf abfließende Kochsalz zu ersetzen. Die Ein- stellung auf 15 ° (mit Schwankungen von weniger als +0,1 °) geschah unter Anwendung eines Thermoregulators (Tr) durch Heizung mit einem Mikrc- brenner (M) und gleichzeitiges Kühlen mit einem langsamen Strom kalten Wassers von konstanter Temperatur. In bezug auf die Trocknung des Gases verfuhren wir anders als Geff- cken, der vor der Anwendung das Gas trocknet, am Ende des Versuchs Fig. 14. Zentrifugalpnmpe. (Vs nat. Größe.) Bestimmung der Aufnahme und Entbindung von Kohlendioxyd. \ 279 ocp :=)' 28o K. Willstätter und A. Stoll. aber den Gasrest in der Bürette als gesättigt mit dem Dampfe des Lö- sungsmittels annimmt, was nicht ganz sicher ist. Statt dessen sättigen wir das Gas vor der Einführung in die Bürette bei der Versuchstemperatur, nämhch mit einer Waschflasche (W) im Thermostaten, mit dem Dampf des Lösungsmittels. Eine weitere Vereinfachung gegenüber der Arbeits- weise früherer Autoren erfolgt beim Einfüllen der entgasten Flüssigkeit. Bei der Herstellung der kolloiden Lösung wird an der Pumpe das an- gewandte organische Lösungsmittel (Aceton) und mit ihm ein großer Teil des Wassers abdestilliert. Die dadurch entgaste Flüssigkeit führen wir aus dem verschlossenen Helmkolben, wie im zweiten Abschnitt erwähnt, in das evakuierte Absorptionsgefäß über. Da es sich zeigte, daß die Stahlcapillare in erheblichem Maße Kohlen- säure absorbiert, schützten wir ihre Innenwand mit einer dünnen Vaselin- schicht und vermieden dadurch die Störung gänzlich. Gang der Versuche. Hatte die in den Thermostaten gestellte kol- loide Lösung, die sich im Helmkolben unter Luftabschluß befand, un- gefähr die Versuchstemperatur angenommen, so wurde das Abflußrohr des Absorptionsgefäßes^) {A in Fig. 15), das etwa 204 ccm faßte, in den Gummi- schlauch des Helmkolbens eingesetzt und der Hahn h geöffnet. Darauf evakuierte man das Absorptionsgefäß bei b mit einer guten Pumpe und ließ durch einen Hahn am Abflußrohre des Helmkolbens ein klein wenig Luft in den letzteren eintreten. Beim Öffnen der Klemmschraube steigt die Flüssigkeit langsam in A, und ein kleiner Teil darf bei b ab- fließen. Die oberste Schicht der Flüssigkeit, die mit der sehr verdünnten Luft in Berührung getreten war, bleibt im Helmkolben zurück. Der Hahn h wird geschlossen und das Gefäß, dessen Abfluß mit einem schüt- zenden Hütchen versehen ist, in den Thermostaten eingesetzt. Das Kohlendioxyd wird in einer Reinheit von mehr als 99,9 Proz. einem Kippschen Apparate entnommen, der ungefähr nach den Angaben von F. PregP) für die Mikroanalyse gefüllt und inzwischen vorbereitet *) Den Apparat hat in guter Ausführung die Firma Dr. H. Gockel & Co. in Berhn N geliefert. ~) F. Pregl in Abderhaldens Biochem. Arbeitsmethoden Band V, S. 1333 [191 1]. Bestimmung der Aufnahme und Entbindung von Kohlendioxyd. 281 worden ist. Die mittlere Kugel hat man mit Marmorstücken möglichst voll gefüllt; durch Ansteigenlassen der Säure in den Marmor hinauf und rasches Schließen des Hahnes wurde die Salzsäure möglichst vollständig in die oberste Kugel gehoben und dort durch das Kohlendioxyd einzeln hereingeworfener Marmorstücke gänzlich von Luft befreit; während dieses Vorganges vermischte man wiederholt die Säure im unteren Räume des Apparates mit dem Inhalt der oberen Kugel. Den raschen Gasstrom beim Entlüften des Entwicklers läßt man durch eine seitliche Abzw^eigung (s) zwischen Apparat und Waschflasche austreten. Nachdem die Flüssigkeit im Absorptionsgefäße die Thermostaten- temperatur angenommen hat, was man am Stillstand des Meniskus in der Capillare b erkennt, wird die Gas waschf lasche (1^) mit der Bürette bei a verbunden und durch geeignetes Drehen der Dreiweghähne H^ und H C:;^ — > Cf und I — > C^H OH I OH ^ OH H CH2OH H 1 \ \ C2H,04 Ameisensäure CoHgOg Glykolsäure Formaldehyd Oxalsäure Glvoxal 3i6 R- Willstättei- und A. Stoll. Diesen Reduktionsprodukten entsprechen folgende Quotienten aus Kohlendioxyd und abgespaltenem Sauerstoff: CO -~~^ für Oxalsäure = 4, O2 ,, für Ameisensäure = 2, ,, für Glykolsäure = 1,33 .. . Ob die Reaktion diese Zwischenstufen überspringt oder ob sie die- selben stufenweise herabschreitet, kann die Bestimmung des assimila- torischen Koeffizienten entscheiden, namentlich unter jenen Bedingungen, welche die Anhäufung eines Zwischenproduktes erwarten lassen. Die Bildung organischer Säuren als Vorstufen der Kohlehydrat- synthese war Liebigs^) Assimilationserklärung, nach der nicht auf einmal, sondern ruckweise unter sukzessiver Sauerstoffabgabe zuerst Oxalsäure, dann Weinsäure, Äpfelsäure und endlich neutrale Kohle- hydrate sich bilden sollten. Eine ähnliche Anschauung über Zwischenglieder der Assimilation wird in der Gegenwart vertreten von E. Baur^), der unter dem Titel ,,Der Weg der Assimilation" in folgender Weise ,,die Möglichkeit erörtert, daß bei der photochemischen Reduktion der Kohlensäure in den grünen Pflanzen Oxalsäure in erster Reaktionsstufe entsteht": ,, Schon weil von allen organischen Stoffen die Oxalsäure der Kohlensäure am nächsten steht, wenn man jene nach Reduktionsäquivalenten ordnet, schon des- wegen wird man zu der Vermutung gedrängt, daß die Oxalsäure das erste Produkt der Reduktion der Kohlensäure sei. Das weitverbreitete, zum Teil massenhafte Vorkommen der Oxalsäure in Blättern (z. B. der Cras- sulaceen) fände dann eine Erklärung, die vielleicht weniger not- dürftig wäre als die gegenwärtige, wonach das Calciumoxalat eine Aus- scheidung unvollständig oxydierter, wertlos gewordener organischer Sub- stanz sein soll. Die Sache hat aber noch eine andere Seite. Wenn das ^) J. Liebig, Ann. d. Chem. 46, 38, 66 [1843]; Justus von Liebig, Die Chemie in ihrer Anwendung auf Agrikultur und Physiologie, i. Teil, Der chemische Prozeß der Ernährung der Vegetabilien, S. 31 [1862] ; vgl. dazu die Betrachtungen von A. Ma yer (Lehrb. d. Agrikultur- chemie, 6. Aufl., Bd. I, Heidelberg 1903, S. 63), die geeignet sind, den Widerspruch zwischen der Hypothese T^icbigs und der Gesetzmäßigkeit des assimilatorischen Gasaustausches zu mildern. ^) I£. Baur, Zeitschr. f. physikal. Chcm. 63, 683, 706 [1908]; 72, 323, 336 [1910]. über die Konstanz des assimilatorischen Koeffizienten bei gesteigerter Assimilation. 317 Licht die Kohlensäure auf einmal zu Fornialdehyd reduzieren soll, so hat es einen ungeheuren Potentialhub zu leisten. Viel bequemer erreicht die Pflanze dasselbe Ziel, wenn das Licht nur bis zur Oxalsäure zu redu- zieren braucht. Die weitere Reduktion zu Kohlen hydrat kann durch frei- willigen inneren Zerfall geschehen ..." Eine neuere Arbeit von E. Baur^) ,,Über Bildung, Zerlegung und Umwandlung der Glykolsäure" ,, zeigt, wie man von der Oxalsäure, dem wahrscheinlich ersten Produkt der Assimilation, zu den Kohlenhydraten übergehen kann, die in der Pflanze wohl an Stelle des Formaldehyds bei der Zerlegung der Qykolsäure auftreten. Äpfelsäure und Citronensäure kommen zur Glykolsäure in ein ähnliches Verhältnis wie die Stärke zur Glucose; es sind vorübergehende Aufspeicherungsformen der Glykolsäure. Insgesamt erkennen wir in den Pflanzensäuren, nämlich in der Oxalsäure, Ameisensäure, Glyoxalsäure, Glykolsäure, Äpfelsäure und Citronensäure, die Vorstufen der Kohlenhydrate, wie übrigens schon Justus von Liebig klar geworden war". Die periodische Anhäufung und Aufzehrung von organischen Säuren im Zellsafte der grünen Blätter ist indessen als eine Erscheinung der Atmung klargelegt^). Die Säuren sind Zwischenstufen der Kohlensäure- bildung; dadurch, daß sich erst im Lichte ihre Verbrennung vervoll- ständigt, wird die Atmungskohlensäure dem assimilatorischen Umsatz von neuem zugeführt. Am ausgesprochensten ist dieser Vorgang bei den Crassulaceen und bei den Opuntialen, nämlich die Assimilation auf Kosten dieser inneren Kohlensäureversorgung, die im experimentellen Teil der Arbeit an einigen Beispielen succulenter Gewächse (Cacteen) quantitativ bestimmt wird. Es wäre schwierig, die Vorstellung, daß Pflanzensäuren im Assimilationsvorgang gebildet und dann sogar im Assimilationsapparat angehäuft werden, in Einklang zu bringen mit der großen Säureempfind- lichkeit des Chlorophylls, die sich auch noch im Verhalten des Farbstoffes gegen Kohlensäure äußert. ^) E. Baur, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 46, 852 [19 13]. 2) Diesen Einwand gegen die Ansicht von Baur hat schon H. Eijler erhoben; vgl. H. Euler, Zeitschr. f. physiol. Chem. 59, 122 [1909]. 3i8 R. Willstätter und A. Stoll. Die Annahme nicht nur von sauren, sondern von irgendwelchen Sauer- stoff reicheren Zwischenghedern der Assimilation, die frei vorkommen und angehäuft werden können, steht vollends, wie in dieser Arbeit CO gezeigt wird, mit dem Koeffizienten ~=^- = i und mit seiner Unveränder- lichkeit bei der Steigerung der assimilatorischen Leistung im Wider- spruch und wird dadurch ausgeschlossen^). Diese Widerlegung trifft auch die Assimilationshypothese von E. Er- len mey er ^), welche die Ameisensäure als Zwischenglied annahm, und die in neuerer Zeit von R. Meldola^) eingehend in Betracht gezogene Hypothese von H. Brunner und E. Chuard^), die Glyoxylsäure und andere Pflanzensäuren, sowie Glucoside und Stärke als gleichzeitig ge- bildete erste Assimilationsprodukte ansah. Gleichfalls ohne die Verhältnisse des assimilatorischen Gaswechsels zu berücksichtigen, haben vor kurzem G. Bredig^) und ferner K. A. Hof mann und K. Schumpelt^) Bedenken geäußert gegen die Annahme, ,,daß der Assimilationsprozeß in den grünen Pflanzen- teilen von der atmosphärischen Kohlensäure aus über den Form- aldehyd seinen Weg nimmt zu den Kohlehydraten". Sie finden es un- wahrscheinlich, daß die Kohlensäure unter dem Antrieb der Licht- energie in Formaldehyd und Sauerstoff übergehen soll, ,,weil der Energie- anstieg bei diesem Vorgang ein außergewöhnlich großer ist und etwa 120 Cal. beträgt". Hofmann und Schumpelt ähnlich wie zuvor Bredig führen aus: ,,Uns will es bedünken, daß man auf Grund bekannter lichtelektrischer Versuche eher annehmen sollte, daß das Licht eine elektrolytische Spaltung des Wassers herbeiführt, von ^) Die Bedeutung des Koeffizienten wird offenbar häufig unterschätzt. Als ein Beispiel dafür sei aus der neuen Literatur der Satz angeführt: „Falls nun bewiesen wird, daß die Zer- legung von Kohlendioxyd in Kohlenoxyd und Sauerstoff in der Pflanze durch dunkle elektrische Entladungen oder überhaupt durch kurzwelHge Strahlen geschieht, so müßte dann allerdings auch Ozon entstehen." (E. Fonrobert, Das Ozon, Stuttgart 1916, S. 30.) 2) E. Erlenmeyer, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 10, 634 [1877]. ^) R. Meldola, ,,The Living Organism as a Chemical Agency; a Review of some of the Problems of Photosynthesis by Growing Plauts". Journ. of the Chem. Soc. 89, 749 [1906]. *) H. Brunner und E. Chuard, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 19, 595 [1886]. ^) G. Bredig, Die Umschau 18, 362 [1914]. 6) K. A. Hofmann und K. Schumpelt, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 49, 303 [1916]. über die Konstanz des assimilatorischen Koeffizienten bei gesteigerter Assimilation. 319 deren Produkten der Sauerstoff gasförmig entweicht, während der Wasser- stoff die Kohlensäure zunächst zu Ameisensäure reduziert." Allein diese Vorstellung erklärt nicht das gesetzmäßige Handinhandgehen von Sauer- stoff entbindung und Kohlensäure verbrauch. Die Konstanz des assimila- torischen Koeffizienten sagt aus, daß in den chlorophyllhaltigen Ge- wächsen der entbundene Sauerstoff nicht aus Wasser, sondern aus der Kohlensäure stammt. Zur Geschichte des assimilatorischen Koeffizienten. In den älteren Analysen des Gasaustausches assimilierender Pflanzen, namentlich in denjenigen von J. B. Boussingault^), war das Volum- verhältnis der von den Blättern im Licht absorbierten Kohlensäure zu dem gleichzeitig von ihnen entbundenen Sauerstoff bestimmt worden. Da an dem Gaswechsel zwei entgegengesetzt gerichtete Vorgänge beteiligt sind, so war das gefundene Verhältnis eine Resultante aus den Quotienten von Sauerstoff und Kohlensäure bei der Assimilation und der Atmung. Dieser Koeffizient, den Bonnier und Mangin als ,,resultante des deux fonctions ä la lumiere = R" und den Maquenne und Demoussy als „coefficient chlorophyllien brut" bezeichneten, ist annähernd gleich I gefunden worden, er bewegt sich in allen Versuchen von Boussingault zwischen o,8i und 1,17. Erst in den Arbeiten von G. Bonnier und L. Mangin-) sind Methoden aufgesucht worden, um die Assimilation und die Atmung ge- trennt zu beobachten und die Messung der beiden einander entgegen- gerichteten Vorgänge auszuführen. Der Erfolg war die Bestimmung des respiratorischen Koeffizienten r = . ^ " und des reinen assimilatori- V 10 sehen Koeffizienten (,,action chlorophyllienne seule") a = in einer großen Anzahl von Beispielen. Einleitend deuteten Bonnier und INIangin an, daß bei den Pflan- ^) J. B. Boussingault, Agronomie, Chimie agricole et Physiologie, 2. Aufl., [1864], III. Bd., S. 266 und besonders S. 378; ferner Bd. V desselben Werkes [1874] S. i. 2) G. Bonnier und L. Mangin, Compt. rend. 100, 1303 [1885] und Ann. Sc. nat., (Bot.) (7). 3. 5 [1886]. 320 R. Willstätter und A. Stoll. zen, für welche die Resultante von Boussingault annähernd gleich I ist und für die nach ihren eigenen Messungen^) der Atmungskoeffizient von I stark abweicht, der entgegengesetzte Gaswechsel des reinen Assi- milationsvorgangs nicht den Koeffizienten i ergeben kann. Aus dem Gesamtgasaustausch einerseits und dem respiratorischen Gaswechsel andererseits läßt sich also, wie es neuerdings wdeder von Maquenne und Demoussy geschieht, auf den eigentlichen assimilatorischen Koeffi- zienten schheßen, aber die Ableitung ist ungenau und unsicher. Man verdankt Bonnier und M angin die folgenden vier Methoden ,,ä separer l'action chlorophyllienne de la respiration". 1. Vergleich des Gaswechsels im Licht und im Dunkeln. Unter Licht- ausschluß wird allein die Atmung und im Parallelversuch die Assimilation zusammen mit der Atmung beobachtet. Dafür ist Temperaturgleichheit erforderlich, die nur in diffusem Licht zu erzielen war. Aus der Differenz zwischen beiden Versuchen im Kohlendioxyd- und Sauerstoffgehalt der Gasräume wurde der assimilatorische Koeffizient abgeleitet. Die Bestimmung erfordert eine Korrektur, da nach vorangegangenen Untersuchungen von Bonnier und M angin 2) die Atmung im Dunkeln und bei Belichtung verschieden ist. Sie wird im Lichte um 5 bis 33 Proz. gehemmt. Die Korrektur ist abgeleitet aus vergleichenden Atmungs- versuchen mit Geweben, die als chlorophyllfrei betrachtet wurden (mit etiolierten und mit chlorophyllfreien Pflanzen und mit keimen- den Samen). Allerdings ist diese Korrektur, selbst wenn man sie auf chlorophyllhaltige Blätter übertragen darf, nicht genügend genau und der Atmungsunterschied mit und ohne Licht von störendem Einfluß, weil bei der Anordnung von Bonnier und Mangin Assimilation und Atmung Gasmengen von ähnlicher Größe oder gleicher Größenordnung umsetzen. 2. Hemmung der Assimilation durch Narkose. Bonnier und Man- ^) G. Bonnier und L. Mangin, Ann. Senat., (Bot.) (6), 17, 209 [1884]; 18, 293[i884]; 19, 218 [1884]; (7), 2, 315, 365 [1886]. Über eine verbessei-te Form des gasanalytischen Appa- rates von Bonnier und Mangin siehe E. Aubert, Rev. gen. bot. 4, 203 [1892]. 2) G. Bonnier und L. Mangin, Compt. rend. 96, 1075 [1883] und Compt. rend. 99, 160 [1884]. über die Konstanz des assimilatorischen Koeffizienten bei gesteigerter Assimilation. 321 gin haben gefunden, daß durch Äthernarkose die Assimilation gelähmt oder wenigstens geschwächt wird, während die Atmung konstant fort- dauert. Der assimilatorische Koeffizient ergibt sich aus der Differenz zwischen den Kohlendioxydmengen im Versuch mit Athernarkose und im Parallelversuch ohne Äther und aus der zugleich gefundenen Sauerstoff- differenz. Wenn die Assimilation nur abgeschwächt wird, so fallen die Differenzen der Gasmengen klein, die Quotienten daher wenig genau aus. Unsicher erscheint uns die Voraussetzung, daß die Atmung mit und ohne Äther im Lichte gleich sei. Man kann ihre Steigerung im Lichte durch Äther wohl vermuten, wenn man zum Beispiel den Einfluß des Lichtes auf die Oxydation der Pflanzensäuren in Succulenten berücksichtigt^X 3. Schwächung der Assimilation durch Kohlensäureentziehung. Nach einem schon von Saussure-) angewandten und von Garreau^ wieder- aufgenommenen Prinzip wird die Assimilation in einem geschlossenen Raum durch Beschickung mit Baryumhydroxyd herabgesetzt, das mit den Blättern in der Absorption der respiratorischen Kohlensäure kon- kurriert; im Vergleichsversuch wird wieder die Assimilatian zusammen mit der Atmung gemessen. Da das assimilierende Blatt nach H. T. Brown und F. Escombe^j in der Kohlensäureabsorption eine mehr als halb so große Leistungsfähig- keit wie konzentrierte Kalilauge besitzt, so kann die Versuchsanordnung auch hier nicht zu einer Trennung der beiden Vorgänge, sondern nur zu einer mäßigen Schwächung der Assimilation führen ; die Differenzen wer- den also gering. Es ist ein Fehler, daß die Löshchkeit der Kohlensäure in der wässerigen Flüssigkeit nach dem Zersetzen des Baryumcarbonats mit Säure nicht beachtet wird. 4. Vergleich von Blättern mit verschiedenem Chlorophyhgehalt. Die Differenzen im Gaswechsel werden der ungleichen assimilatorischen Lei- stung allein zugeschrieben. Eine Schwierigkeit wird darin bestehen, ver- ^) H. A. Spoehr, Biochem. Zeitschr. 57, 95 [1913]. '^) Th. de Saussure, Recherches chimiques sur la Vegetation, S. 34, Paris 1804. ^) Garreau, Ann. Sc. nat., (Bot.) (3), 15, 536 [1851] und 16, 271 [1851]. *) H. T. Brown und F. Escombe, Phil. Trans. Roy. See. Ser. B 193, 223 [1900]. Willstätter-Stoll, Assimilation. 21 I. Methode 2 . Methode 3. Methode 1,24—1,28 I ,16-1^ ,28 1,22 1,12 — 1,26 1,14 1,13 1,10—1,25 1,10 1,10 1,10—1,30 112, 1,10 322 R- Willstätter und A. StoII. gleichbare hellgrüne und dunkelgrüne Blätter zu finden, die sich in ver- schiedenem Entwicklungszustand befinden und doch in der Atmung über- einstimmenM. Die nach diesen Methoden gefundenen assimilatorischen Koeffizienten^) — -^^ sind größer als i und bewegen sich im allgemeinen zwischen 1,1 VOl v^W2 und 1,3; die folgende Tabelle verzeichnet die Mehrzahl der genauer an- gegebenen Beispiele von Bonnier und M angin. Hex aquifolium . . Sarothamnus scoparius 1,12- Evonymus japonicus Pinus silvestris . . . Leider sind die Ergebnisse von Bonnier und M angin durch Rech- nungsfehler entstellt^); nur in einigen Beispielen ist die Korrektur 1) Vgl. die zweite Abhandlung, Abschn. \'. A. über die Atmung der Blätter im Frühling. 2) Bei F. Czapek, Biochemie der Pflanzen, 2. Aufl., I. Bd., S. 523 (Jena 1913) sind als COo Werte des assimilatorischen Koeffizienten ' nach Bonnier und Mangin versehent- O2 lieh die respiratorischen Koeffizienten angeführt. 3) Als Beispiel der zweiten Methode führen Bonnier und Mangin folgende mit Hex ausgeführte Analyse an (Ann. Sc. nat., (Bot.) (7), 3, 18 [1886]): ,, Eprouvette sans ether . . CO- = 0,00 O = 20,03 Az = 79,97 Eprouvette avec ether . . CO^ = 3,54 O = 15,63 Az = 80,83 Ou, en ramenant les volumes au meme taux d'azote: Eprouvette sans ether . . CO^ = 0,00 O = 20,03 . Az = 79,97 Eprouvette avec ether . . CO- ^ 3,50 O = 19,81 Az = 79,97 En supposant les feuilles exactement comparables, la quantite d'acide carbonique absorbee sous l'influence de l'action chlorophyllienne seule egale 3,50; la qualite d'oxygene exhalee au meme moment, egale 4,18; par suite, le rapport des gaz echanges par cette action seule est 4,18 O ^ -~ = a= 1,16". 3.50 c In der drittletzten Zeile des Zitates ist das Wort ,, qualite" durch das Wort ,, quantite" zu ersetzen. Die umgerechnete Zahl O = 19,81 in der fünften Zeile ist irrtümlich, sie ist durch 15,46 zu ersetzen. Durch einen unbegreiflichen Fehler ist die Sauerstoffdifferenz 4,18 gebildet aus dem beobachteten Sauerstoffgehalt der Eprouvette (15,63) im Ätherversuch und aus dem für gleichbleibenden Stickstoff umgerechneten Werte (19,81) dieses Sauerstoffgehalts. Die Sauerstoffdifferenz war in Wirklichkeit 20,03 minus 15,63 oder gemäß der umgerechneten Zahlen minus 15,46, also 4,57. Der Quotient 4,57:3,50 ist aber 1,31. In einem zweiten Beispiel derselben Methode mit Hex (loc. cit. S. 34) betrugen die ge- fundenen Differenzen; 3,54 für CO2 und 5,60 für Og. Der Quotient aus diesen Zahlen beträgt nicht, wie loc. cit. angegeben, 1,28, sondern 1,58. über die Konstanz des assimilatorischen Koeffizienten bei gesteigerter Assimilation. 323 der Zahlen durch die Angabe von Versuchsdaten ermöglicht. Es zeigt sich in eben solchen Fällen, daß der Koeffizient bedeutend von i abweicht. Für Hex aquifolium berechnen wir aus den Beobachtungen von Bonnier und Mangin den assimilatorischen Koeffizienten anstatt 1,16 bis 1,28 nach der zweiten Methode = 1,31 und 1,58. In den dreißig Jahren, seitdem Bonnier und Mangin ihre ein wichtiges Ziel anstrebende Arbeit veröffentlicht haben, sind be- merkenswerte Untersuchungen über den gesamten Gaswechsel der Pflanze ausgeführt worden, namentlich von H. Jumelle^) und von Th. Schloesing fils-), aber die Methodik der getrennten Messung des assimilatorischen und respiratorischen Gaswechsels scheint keinen Fortschritt gemacht zu haben. Eine neue Unter- suchung von L. Maquenne und E. Demoussy^) greift auf die Möglichkeit zurück, durch Bestimmung des Atmungskoeffizienten, sowie des Koeffizienten des gesamten Gaswechsels (coefficient chloro- phyllien brut ^p.-) indirekt den reinen assimilatorischen Koeffizienten abzuleiten. Wie im Prinzip der Methode, so ist auch in der Technik in gewisser Beziehung ein Rückschritt gegen Bonnier und Mangin voll- zogen. Der Gaswechsel wird in Vergleichsversuchen im Dunkeln und bei Belichtung beobachtet, aber nicht die Schwierigkeit überwunden, Temperaturgleichheit einzuhalten; während Bonnier und Mangin diese durch Anwendung von diffusem Licht erreichten, arbeiten Maquenne und Demoussy ohne besondere Regulierung mit direktem Sonnen- licht. ' Die so gefundenen Koeffizienten des gesamten Gasaustausches liegen zwischen engen Grenzen und nahe bei i und die respirato- rischen Quotienten sind in den meisten Fällen, nämhch in 29 unter 34, ihnen gleich, also nur in 5 Beispielen erheblich abweichend. Wir zitieren die ersten vier Beispiele der Tabelle von Maquenne und Demoussy, worin ^^ aber nur die Resultante aus der Atmung und der Assimilation bedeutet : ^) H. Jumelle, Compt. rend. 112, 888 [1891]; 113, 92o[i89i]; Rev. gen. bot. 4, 49 [1892]. 2) Th. Schloesing fils, Compt. rend. 115, 881 und 1017 [1892]; 117, 756 und 813 [1893]. ') L. Maquenne und E. Demoussy, Compt. rend. 156, 306 [1913]. 324 ^- Willstätter und A. StoU. C(> o o co^ Ailante i,o8 1,02 Aspidistra 0,97 1,00 Aucuba (printemps; 1,1 1 1,10 Begonia 1,1 1 1,03 Maquenne und Demoussy schließen aus der nahen Beziehung zwischen dem Koeffizienten des gesamten Gaswechsels und dem At- mungskoeffizienten: ,,Une pareille influence ne peut etre generale que si le coefficient chlorophyllien reel a lui-meme une valeur bien deter- minee et sensiblement constante" und ,,he coefficient chlorophyllien reel c -. s'approche donc assez de l'unite pour qu'il soit impossible d'affirmer qu'il ne lui est pas egal." Die Pflanzenphysiologie ist bis jetzt für den Koeffizienten der Assi- milation allein auf die Bestimmungen von Bonnier und M angin an- gewiesen, die methodisch interessant, aber zahlenmäßig sehr ungenau sind. Es scheint, daß die chemische Bedeutung dieser Zahl nicht hinreichend erkannt worden ist. Während die Resultante aus der Assimilation und Atmung, also die Zahl von Boussingault, gar nichts über die photosynthetische Reaktion aussagt und keine genügende Grund- lage für die Formaldehydhypothese geboten hat, zeigt der reine assi- milatorische Koeffizient ein deutig und ohne Hypothese die nied- rigere Oxydationsstufe des Kohlenstoffs an, in welche das Kohlen- dioxyd unmittelbar in der Assimilationsreaktion umgeformt wird. Die Bestimmungen von Bonnier und M angin scheinen uns aus- zusagen, daß der Koeffizient J^ zwischen 1,10 und 1,30 liege. Wäre das Verhältnis ^-^ = 1,25, so würde dies bedeuten : Die Kohlen- V^W2 säure wird reduziert zum zweifach hydroxylierten Äthan, nämlich zum Athylenglykol CH.^ (OH) • CH.2(0H) oder zum Acetaldehyd CH3 • CHO. Wäre der Quotient 7^-= 1,166 . . ., so würde dies bedeuten : Die Kohlensäure wird reduziert zum dreifach hvdroxylierten Propan, also beispielsweise zum Glycerin. über die Konstanz des assimilatorischen Koeffizienten bei gesteigerter Assimilation. 325 Wenn die Konstante genau i ist, so sagt sie aus: Die Kohlen- säure wird reduziert zum Kohlenstoff, der natürlich als Hydrat auftritt; das einzige Hydrat des Kohlenstpffs mit nur einem Atom Kohlenstoff im Molekül ist der Formaldehyd. Ahnliches gilt nicht für den Atmungsquotienten, der keine einfache chemische Bedeutung hat. Dieser Koeffizient ist eine Resultante aus vielen verschiedenen Reaktionen, von denen manche lebenswichtige Syn- thesen sind und andere der Umformung und Beseitigung von Abfall- stoffen dienen. Die Einatmung des Sauerstoffs und die Abgabe der Kohlensäure sind durch viele Zwischenreaktionen getrennt, während die Assimilation aus jedem Kohlendioxydmolekül seinen gesamten Sauerstoff freimacht. In der Methodik zur Bestimmung des assimilatorischen Koeffizienten war bisher ein Hauptfehler der zu bedeutende Einfluß, welchen man dem Atmungsvorgang neben dem Assimilations Vorgang gelassen hat. Jede kleine Ungenauigkeit, die durch den Vergleich der Atmung im Assimila- tionsversuch und in den im Dunkeln oder mit Narkose im Licht oder mit chloroph.vllarmen Pflanzenteilen ausgeführten Parallelversuchen ent- stand, mußte sich im assimilatorischen Koeffizienten geltend machen. Es ist deshalb vorzuziehen, die Bestimmung des Koeffizienten in Ver- suchen mit derart vermehrter Assimilation auszuführen, daß unter keinen Umständen die Ungenauigkeiten, die durch den Einfluß der Atmung auf die Messung des assimilatorischen Gasaustausches entstehen, die Zahl des assimilatorischen Koeffizienten merkbar beeinflussen können. Die Bestimmung des assimilatorischen Koeffizienten. Der assimilatorische Koeffizient, der in der Literatur verschieden ge- schrieben wird, bald -^^ oder J^ Bonnier und Mangin, Ma- quenne und Demoussy), bald reziprok (Czapek, Kniep im Hand- wörterbuch der Naturwissenschaften), soll im folgenden durch die CO, Formel ' ausgedrückt werden, daher der Atmungsquotient sinngemäß o, - durch " . 326 R. Willstätter und A. Stoll. Die Methode, den assimilatorischen Koeffizienten zu bestimmen, unterscheidet sich von früheren Versuchen wesentUch dadurch, daß nicht im geschlossenen Räume, sondern im strömenden Gase das Verhältnis von Kohlendioxyd zum Sauerstoff gesucht wird; es ist nur dadurch möglich, den Blättern konstante Bedingungen der Assimilation zu bieten. Die Unter- schiede im Gasstrome sind allerdings kleiner als im geschlossenen Rezi- pienten, aber dieser Nachteil wird durch genauere Gasanalyse, nämlich durch Anwendung größerer Gasvolumina, kompensiert. Andererseits schließt man einen bei Versuchen mit geschlossenen Gasräumen unver- meidlichen Fehler aus, welchen die Eigenschaft auch der unbelichteten Blattsubstanz verursacht, Kohlensäure in Abhängigkeit vom Teildruck zu absorbieren (vgl. die dritte Abhandlung). Die Fragestellung unserer Arbeit brachte es mit sich, daß die Blätter bei konstanter Temperatur unter Bedingungen maximaler assimilatori- scher Leistungen geprüft wurden, so daß die Atmung, wenn sie auch im Licht und im Dunkeln nicht genau gleich ist, mit den möglichen Differen- zen doch keinen Einfluß auf den assimilatorischen Koeffizienten ausübt. Wenn wir einige Beispiele der im Vorangehenden mitgeteilten Assimila- tionsversuche mit den zugehörigen Atmungsbestimmungen ergänzen, so bemerkt man, daß unter den angegebenen Umständen die Atmung nur */2o bis 1/30 der Assimilation ausmacht. Tabelle 95. "\^ergleich des assimilatorischen und respiratorischen Kohlensäure Umsatzes. (lo g Blätter, 2^", i Stunde.) Pflanze Populus p3'Tamidahs hört. . Prunus Laurocerasus (30°) Helianthus annuus Atmung (g CO.,) in reiner Luft 0,010 0,0035 0,011 Assimilation (g COg) in 5 proz. CO.2 0,190 0,110 0,250 Die Versuchsanordnung der quantitati\'en Assimilationsbestimmungen wird daher beibehalten, mit der man Atmung und Assimilation im Gasstrom von konstanter Geschwindigkeit beobachtet, und zur Bestim- über die Konstanz des assimilatorischen Koeffizienten bei gesteigerter Assimilation. 327 mung des Koeffizienten kommt hinzu, daß im Dunkelversuche und wäh- rend der Behchtung Proben des Gasstromes für die volumetrische Be- stimmung des Sauerstoff- und Kohlendioxydgehaltes entnommen werden. In diesen Analysen ergibt: 1. Die Kohlendioxyddifferenz in der Luft \-or und nach dem Strömen über die Blätter im Dunkeln den Betrag der Atmung. 2. Die Kohlendioxyddifferenz zwischen dem im Dunkeln und bei Be- lichtung über die Blätter geleiteten Gase die assimilatorische Leistung. 3. Die Kohlensäure- und Sauerstoff differenz zwischen dem Versuchs- gas und dem im Dunkeln über die Blätter geleiteten Gase den Atmungs- quotienten. 4. Die Kohlensäure- und Sauerstoff differenz zwischem dem Gase im Dunkelversuch und bei Belichtung den Assimilationsquotienten ohne Einfluß der Atmungstätigkeit. Für den Zweck der Arbeit waren nur die Analysen von Bedeutung, die sich auf die Assimilation beziehen. Um daneben den Atmungsbetrag und den Atmungsquotienten zu finden, braucht man nur im Hinblick auf die kleineren Zahlen des Gaswechsels den Gasstrom zu verlangsamen, von 3 1 in der Stunde beispielsweise auf 0,3 1, und die Blätter enger ge- drängt in eine kleinräumige Röhre einzufüllen. Konstanz des Koeffizienten. In gesteigerter und langdauernder Assimilation bei Temperaturen CO, von 10 bis 35° bleibt der Quotient -—-^ konstant und er beträgt genau l. Das ist an verschiedenen Laubblättern und an einem Laubmoose fest- gestellt worden und trifft auch für Fälle zu, die bisher als Ausnahmen galten, wde für Hex aquifolium. Auch wenn der assimilatorische Apparat der Blätter überanstrengt wird, so daß die Leistung scharfen Rückgang erfährt, sei es infolge der Anhäufung von Assimilaten oder durch Ermü- dung des enzymatischen Systems, so wird dadurch doch im assimila- torischen Gaswechsel keine Anomalie herbeigeführt, und sie läßt sich auch nicht erzwingen. Da sich kein Anzeichen von verminderter Sauer- stoffentbindung auffinden ließ, so ist es nicht möglich, daß ein Zwischen- 328 R- Willstätter und A. Stoll. glied der Desoxydation frei vorkommt. Nach der Addition der Kohlen- säure an Chlorophyll tritt keine vom Chlorophyll losgelöste Zwischenstufe^) der Reduktion auf. Es bleibt zwar unentschieden, ob am Chlorophyll selbst in einem Hube die Umwandlung der Kohlensäure unter Energie- aufnahme erfolgt oder in mehreren Stufen, aber es ist zu schließen, daß das Chlorophyll erst dann, wenn aus einem Molekül Kohlendioxyd der gesamte Sauerstoff entbunden worden ist, für die Aufnahme und Um- formung eines neuen Moleküls Kohlensäure frei wird. Da der assimilatorische Koeffizient genau i ist, so sind, wie Ma- quenne und Demoussy angenommen haben, die Abweichungen der Zahlen von Boussingault, der Quotienten aus dem gesamten Gas- wechsel assimilierender Blätter, nur dem Einfluß des Atmungskoeffizien- ten zuzuschreiben. Der Wert für ^^ muß dann unter i sinken, wTundie Pflanze vorherrschend Fette oder andere Reduktionsprodukte der Kohle- hydrate speichert, und er muß andererseits die Zahl i übersteigen, so- lange in der Pflanze die Ablagerung von Oxalsäure oder Glykolsäure oder anderer organischer Säuren überwiegt. IL Die Untersuchungsmethode. Unverändert gegenüber der zweiten Abhandlung (Abschn. III, A; Fig. I und 2) sind der Apparat und die Bedingungen der Assimilation und die Bestimmung der assimilatorischen Leistung, die sich ohne Ein- fluß der Atmung aus der Differenz im Kohlensäuregehalt des mit kon- stanter Geschwindigkeit im Dunkeln und bei Belichtung über die Blätter geleiteten Gasstroms ergibt. Da das Verhältnis von Sauerstoff zu Kohlen- dioxyd nun gleichfalls im Dunkelversuche und bei Belichtung unter hin- länglich konstant bleibender Atmung ermittelt wird, so ist die Atmung auch ganz ohne Einfluß auf den Koeffizienten der Assimilation. Das ist ein wichtiger Vorteil, den die Bestimmung des Quotienten im Versuche mit strömendem Gase bietet. Die Kohlensäuredifferenz des Gasstromes ^) Siehe dazu den theoretischen Teil der vierten Abhandhing, Abschn. C. Die Untersuchungsmethocic wird einerseits wie früher bestimmt durch Absorption von Kohlendioxyd in gewo- genen Natronkalkröhren und Messung des zugehörigen Luftvolumens mit der Prä- zisionsgasuhr (unter Berücksichtigung von Barometerstand und Temperatur) und ande- rerseits wird sie durch die volumetrische Analyse gefunden; beide Messungen sind nicht fortlaufend, sondern sie sind Proben, die sich kontrollieren und ergänzen. Die erstere Bestimmung, die gravimetrische, nehmen wir auch in diesem Falle vor, um dabei die Strömungsgeschwindigkeit des Versuchsgases für die konstant gehaltene Ouecksilberhöhe des Strömungsmanometers zu erfahren. Dann läßt sich aus der volu- metrisch bestimmten Kohlensäuredifferenz jeweils die stündliche Assimilationsleistung berechnen gemäß dem Verhältnis des kohlen- säurefreien Luftvolumens der Bürette zur bekannten stündlich austretenden Luft- menge. Das Verhältnis von Sauerstoff zu Kohlendioxyd bestimmen wir \'or und während der Assimilation gasanalytisch mit Hilfe des Apparates von H. Dreh- schmidtO, dessen Gestalt wir für diesen Zweck modifiziert haben. Er ist bei gleicher Genauigkeit der Ablesung für viel größere Volumina als üblich eingerichtet und er- möglicht daher relativ genauere Bestim- 1) H. Drehschmidt, Ber. 21, 3242 [1888]. deutsch, ehem. (ies. Fig. 16. Gasbürettc zur Analyse großer Volumina. 330 R. Willstätter und A. Stoll. mungen. Die Dimensionen des Apparates (Fig. i6^ sind so vergrößert, daß die Bürette bis zur Öffnung der Capillare, die an die Pipetten an- geschlossen wird, 200 ccm faßt. Da nur die Meßbereiche von o bis 7 Proz. für Kohlendioxyd und von etwa 17 bis 27 Proz. für Sauerstoff in Be- tracht kommen, so ist die zylindrische Röhre vom Nullpunkt an bis zu 14 ccm graduiert mit 1^2 nim Abstand für 0,1 ccm; dann folgt eine kugelige Erweiterung der Bürette und darauf vom Teilstrich für 34 ccm bis 54 ccm wieder ein in 0,1 ccm graduiertes Stück von gleicher Weite wie unten. Von diesem Punkt an bis zur Ausgangscapillare ist die Bürette stark erweitert und ungraduiert. Die zur Ausschaltung des Temperatur- und Luftdruckeinflusses während des Versuchs dienende Kompensations- röhre hat ähnliches Volumen und ungefähr gleiche Maße, nur das weite Stück etwas tiefer. Das Differentialmanometer des Apparates besteht in einer graduierten horizontalen Capillare, die mit einem durch Bichro- mat gefärbten Tröpfchen Schwefelsäure beschickt ist; abweichend von der beschriebenen Form ist das Differentialmanometer an die Ausgangs- capillaren der Bürette und der Kompensationsröhre angeschmolzen. Nur die Absorptionspipetten werden mit Gummiverbindungen angeschlossen. Die Hempelschen Pipetten sind für die Kohlensäurebestimmung mit 50 proz. Kalilauge beschickt, für die Sauerstoffbestimmung mit Na- triumhydrosulfit, gelöst im sechsfachen Gewicht von 8 proz. Natronlauge. Für die Ausführung der Analyse werden einige Bemerkungen von Nutzen sein. Um die Gasproben aus der Assimilationsapparatur zu ent- nehmen, verbindet man eine seitliche Abzweigung derselben zwischen der Assimilationskammer (Fig. 2) und dem Trockenapparat mit der quecksilbergefüllten Bürette (Fig. 16) und läßt mit dem Einströmen des Gases das Quecksilber so rasch abfließen, daß keine erhebliche Druck- differenz in der Assimilationskammer auftritt; zur Kontrolle dient das offene Quecksilbermanometer vor dem Trockenapparat. Durch Druck- änderung würde die Geschwindigkeit des Gasstromes und die Löslichkeit der Kohlensäure im Wasser der Apparatur und in den Blättern beeinflußt. Mit der ersten Bürettenfüllung wird nur der Apparat gespült, erst die zweite wird analysiert. Zu Beginn der Analyse und vor jeder späteren Die Untersuchungsmethode. 33 1 Ablesung wird das Wasser im Bürettenmantel durch Einblasen von Druckluft minutenlang tüchtig bewegt. Nach dem Einstellen des Queck- silbers auf den Nullpunkt liest man Temperatur und Barometerstand ab und setzt die Räume des Kompensationsrohres und der Meßbürette in Kommunikation mit der Außenluft. Die Absorptionspipetten sind vor dem Anschließen an die Bürette bis zum äußersten Ende des Capillarschlauches mit Flüssigkeit gefüllt; der Schlauch wird so über die Bürettencapillare gestülpt, daß keine Luft- blase in die Capillare zu der Gasprobe eintritt. Beim Zurückführen des Gases aus der Absorptionspipette ist zu vermeiden, daß . Flüssigkeits- tröpfchen in die Bürette gelangen und zu beachten, daß die Absorptions- flüssigkeit eben noch ein wenig (i bis 2 mm) in die Bürettencapillare ein- tritt, diese also beim Pipettenwechsel verschließt und den Zutritt von Luft verhindert. Durch langsames Zurückführen des Gases läßt es sich vermeiden, daß an den Drahtnetzspiralen der Hydrosulfitpipette Gasbläs- chen hängenbleiben; zur Sicherheit wird die Pipette vor und nach der Sauerstoff bestimmung unter Klopfen lebhaft geschüttelt. Zur Sättigung des in die Bürette zurückgebrachten Gases mit Wasserdampf wird die Wand derselben stets etwas feucht gehalten, indem man von Zeit zu Zeit auf das Quecksilber der gefüllten Bürette ein Tröpfchen Wasser gibt, das sich beim Sinken des Quecksilberspiegels gleichmäßig auf die Wand verteilt. Die Großräumigkeit des Apparates macht es nötig, daß man \'or dem Verbinden der Gasräume des Kompensationsrohres und der Bürette mit dem Differentialmanometer das absorbierte Gas in der Meßbürette, so gut es durch Heben und Senken der Quecksilberbirne möghch ist, auf Atmosphärendruck bringt. Dann ist die Druckdifferenz zwischen Kom- pensationsrohr und Bürette so gering, daß bei vorsichtigem Öffnen des Bürettenhahnes der Schwefelsäuretropfen sich wohl noch bewegt und zur genauen Einstellung auf gleiche Drucke dienen kann, daß er aber nicht weggeblasen wird, wie es bei größeren Druckdifferenzen geschieht. Durch leichtes Drücken des quecksilbergefüllten Schlauchstückes am unteren Bürettenende versetzt man den Schwefelsäuretropfen in Schwingung und erleichtert seine Einstellung in Gleichgewichtslage. Nach jeder Bestim- 332 R- Willstätter und A. Stoll. mung läßt man \'on oben durch einen vierten Weg des an die Bürette an- geschmolzenen, rechtwinklig gebohrten Hahnes destilliertes Wasser durch die Capillare fließen, um diese und die Hähne nach außen bis zum Ver- schwinden der alkalischen Reaktion zu spülen. Im Arbeitsraum von annähernd konstanter Temperatur wnd die Be- stimmung auf + 0,01 ccm genau ; der Fehler beträgt daher bei dem großen Volumen der Bürette nur + 0,005 Proz. In den Versuchen mit inten- siver Assimilation macht die Kohlensäuredifferenz zwischen Dunkel- und Belichtungsversuch für den Raum der Gasbürette 3 bis 4 ccm aus. Der Fehler in der. Bestimmung beeinflußt daher den assimilatorischen Koeffi- zienten in der zweiten Dezimale nur um ein bis zwei Einheiten. Die Analyse eines der Versuchsgase aus der eisernen Druckflasche ergab in drei aufeinanderfolgenden Bestimmungen folgende Zahlen : COo: 5,48, 5,47, 5,47 Proz.; Oo: 19,63, 19,63, 19,63 Proz. Zur Berechnung der stündlichen Assimilationsleistung aus der volu- metrisch gefundenen Kohlensäuredifferenz {d ccm) zwischen Licht- und Dunkelversuch wird diese unter Berücksichtigung der Temperatur (/) und des Barometerstandes (Öq, nach Reduktion auf 0° und Abzug der Wasser- dampftension) gemäß der für verdünntes Kohlendioxyd geltenden Dichte- zahl (1,9652) in Gramme umgerechnet und multipliziert mit dem Quo- tienten aus dem durch die Gasuhr stündlich austretenden Luftvolumen fin 11 Minuten tritt i 1 aus) und dem kohlendioxydfreien Volumen einer Bürettenfüllung vom Versuchsgase {v — 1\, in ccm). Die stündliche Assi- milationsleistung beträgt daher: 60 • 1000 d ■ bo • i,q652 n (v — Vi) (l -\- a t) ' 760 III. Der assimilatorische K(3effizient unter Bedingungen gesteigerter Assimilation bei verschiedenen Temperaturen. Der erste Versuch mit Sambucus nigra bei 25° unter Bedin- gungen maximaler Leistungen für diese Temperatur hat ohne L^nter- brechung 10 Stunden Dauer gehabt. Nach einer Ruhepause von 12 Stun- Der assimilatorische Koeffizient bei verschiedenen Temperaturen. 333 den, während deren die Blätter bei 20 bis 25 ° im Dunkeln lagen, ist der Belichtungsversuch weitere 5 Stunden fortgeführt worden. Angewandt: 7,0 g Blätter (Mitte Juli) mit etwa 350 qcm Fläche. Versuchsbedingungen: 25°, 6^2 vol.-proz. COo, Behchtung von 45000 Lux. Geschwindigkeit des Gasstromes : i 1 Luft verläßt die Gasuhr in 18,5 Minuten unter 40 mm Quecksilberdruck. Zusammensetzung des Gases im Dunkelversuch (25°, vor der Assi- milation : 1. Nach anderthalbstündiger Atmung: 200,30 ccm enthielten 13,40 ccm COo und 38,71 ccm Oo. 2. Nach zweieinhalbstündiger Atmung: 200,30 ccm enthielten 13,41 ccm CO2 und 38,73 ccm Oo. Zusammensetzung des Gasstromes im Dunkelversuch (25 °) nach der 12 stündigen Unterbrechung : 200,30 ccm enthielten 13,87 ccm CO. und 38,48 ccm Oo. Tabelle 96. Der Koeffizient bei langdauernder intensiver Assimilation bei 25 (Mit 7,0 g Blättern von Sambucus nigra, öVo vol.-proz. CO,,, ungefähr 45000 Lux.) Belichtungsdauer CO.-Differenz (für 200,3 ccm Gas) ccm Oo-Differenz (für 200,3 com Gas) ccm CO, 0, stündlich assimiliertes CO., (g) im Versuch ^^ ^ lZhuc^^s I Stunde 3.12 3.25 0.95 \) 0,087 0,124 3V4 Stunden 3.24 3.^9 0.99 0,091 0,130 4V4 3.00 3,04 0,99 0,084 0,120 6V2 ., 2.61 i 2,73 0,96 0,073 1 0,104 9 2,18 2,23 0,98 0,061 0,087 10 2,22 2,21 I.OO 0,062 0,088 12 Stunden Verdunkel ung 1 Wieder V2 Stunde 1,30 1.47 1,02 0,042-) 0,060 4 Stunden 2,29 2,24 1,02 0,064 0,091 5V4 1,87 1,90 0,98 0,052 0,074 Während der ganzen Versuchsdauer sind die Blätter schön frisch und grün, geblieben. Trotz des bedeutenden Rückganges der Assimilation ^) Die Abweichungen bei diesem ersten \'ersuch rühren noch zum Teil von Anal\scn- mängeln her. ■2) Die.ser tiefe Wert ist \om schädlichen Kaum der .\pi)aratur bedingt. 334 R- Willstätter und A. Stoll. (Tabelle 96), die nach der langen Ruhepause keine merkliche Erholung erkennen ließ, ist der assimilatorische Koeffizient vom i\nfang bis zum Ende nahezu konstant und gleich i gefunden worden. Zweiter Versuch: Unter denselben Verhältnissen wurde ein schwach assimilierendes Objekt, das Laubmoos Leucobryum glaucum Schimp., geprüft. Angewandt : 30,0 g Sprosse (Ende November^i ; Trockengewicht nur i ,8 g. Versuchsbedingungen: 25°, 5 vol.-proz. CO2, Beleuchtung von 22000 Lux. Geschwindigkeit des Gasstromes : i 1 Luft verläßt die Gasuhr in 20 Mi- nuten ; Zusammensetzung des Gases vor der Assimilation : 200,3 ccm ent- hielten 10,62 ccm CO2 und 42,28 ccm Oo. Nach 30 Minuten Belichtung betrug die Leistung, auf 10 g Blatt- substanz umgerechnet, 0,0063 g CO2; es enthielten 200,30 ccm Gas 9,93 ccm CO2 und 42,98 ccm O2. Kohlensäuredifferenz 0,69 ccm, Sauerstoffdifferenz 0,70 ccm. Assimi- latorischer Koeffizient 0,99. Dritter Versuch. Eine andere Pflanze war Versuchsobjekt der Assimilation unter denselben Bedingungen, indessen in sauerstoffarmem ^Medium. Während auf die Fragestellung, die zu dieser Versuchsanordnung führte, erst in der folgenden Abhandlung näher eingegangen werden soll, sind hier weitere Bestimmungen des assimilatorischen Koeffizienten anzuführen. Das Versuchsgas enthielt im ersten Fall 7,40 Proz. Kohlendioxyd und 1,35 Proz. Sauerstoff. Angewandt: Pelargonium zonale, 12,0 g Blätter (Mitte Juh) mit 1,68 g Trockensubstanz. Die Assimilation wurde nach 2 Stunden durch eine Ruhepause von 3^/2 Stunden unterbrochen und nach wiederholter zwei- stündiger Belichtung abermals durch eine Verdunkelungsperiode von 15 Stunden, worauf eine dritte Belichtungszeit von 6 Stunden folgte. In der letzten Dunkelperiode war der Gasstrom abgestellt, so daß sich der Kohlensäuregehalt des die Blätter umgebenden Gases stark erhöhte. Unter diesen Verhältnissen begannen die Blätter zu leiden, sie bekamen Der assimilatorische Koeffizient bei verschiedenen Temperaturen. 335 an einigen Stellen braune Flecken, die während der letzten Belichtung zahlreicher und größer wurden. Das Ansteigen des assimilatorischen Koeffizienten am Schlüsse kann von gesteigerter Atmung in verdorbenen Blättern herrühren. Versuchsbedingungen : 25 °, Beleuchtung von ungefähr 45 000 Lux, Strömungsgeschwindigkeit 3,0 1 in der Stunde unter 38 mm Ouecksilber- druck. Zusammensetzung des Gases im Dunkelversuch nach einstündigem Strömen über die Blätter: 166,30 ccm enthielten 12,45 ccm CO.2 und 2,11 ccm Oo . Zusammensetzung des Gases in der ersten Ruhepause nach zweistün- diger Verdunklung: 166,30 ccm enthielten 12,54 ccm CO2 und 2,11 ccm O2 . Tabelle 97. Der Koeffizient bei langdauernder Assimilation in sauerstoffarmem Gase (25°). (12 g Blätter von Pelargonium zonale, ungefähr 45000 Lux.) COa-Differenz 0,-Differenz CO, stündlich assimiliertes CO2 (g) Belichtungsdauer (für 166,30 ccm Gas) com (für 166,30 ccm Gas) ccm im Versuch von IG g Pelargonium 3/^ Stunden 3,01 3,04 0,99 0,098 0,082 2 3.51 3.57 0,98 0,115 0,096 3V2 Stunden ^^erdunkeIung Wieder =^;.j Stunden 3.22 3,24 ; 0,99 0,105 0,0875 2 2,94 ^.97 \ 0,99 15 Stunden \'erdunkelung 0,096 0,080 Wieder i\.. Stunden 2,22 1 2,27 1 0,98 0,073 0,06 r 3 2,27 2,35 : 0,97 0,074 0,062 6 1.87 ^.77 1,06 0,061 0,051 Der assimilatorische Koeffizient ist beim Rückgang der Leistung bis auf zwei Drittel unverändert geblieben. Erst die schließliche Störung durch beginnendes Verderben der Blätter machte die Zahl ungenau. Vierter Versuch. Der Sauerstoffgehalt des Gasstromes konnte ohne Einfluß auf das Ergebnis noch weiter herabgesetzt werden. Vor der Be- lichtung waren die Blätter 6 Stunden im sauerstoffarmen Medium, das anfangs beim Austritt aus der Assimilationskammer 1,22, nach 3 Stunden 0,45 und nach 6 Stunden 0,23 Prozent Sauerstoff enthielt. 336 R. Willstätter und A. StoU. Angewandt: Pelargonium zonale^ 12,0g Blätter (Mitte Juli,. Versuchsbedingungen : 25 °, Beleuchtung ungefähr 45 000 Lux. Zusammensetzung des Gasstromes unmittelbar vor der Belichtung: 166,30 ccm enthielten 12,60 ccm COo und 0,38 ccm Oo. Während anderthalbstündiger Belichtung betrug die stündliche assi- milatorische Leistung, auf 10 g frischer Blätter umgerechnet, 0,090 g CO, . Für das Bürettenvolumen von 166,30 ccm machte die COo-Differenz 3,34 ccm, die Sauerstoffdifferenz ebenfalls 3,34 ccm aus. Der assimila- torische Koeffizient war genau 1,00. Fünfter Versuch. Versuche in Sauerstoff freiem Gase wurden mit einem gegen Sauerstoffentziehung widerstandsfähigen Objekte, Cyclamen europaeum (Zierart), ausgeführt. Angewandt : 20,0 g Blätter (Mitte November) ; Trockengewicht 2,30 g. Versuchsbedingungen: 25°, 7 Vol.-proz. CO. enthaltender Stickstoff, Beleuchtung 22 000 Lux. Geschwindigkeit des Gasstromes : i 1 Stickstoff verläßt die Gasuhr in 20 Minuten; Zusammensetzung des Gasstromes nach einstündigem Durchströmen im Dunkeln: 166,30 ccm enthielten 12,77 ccm CO., ^^^^ 0,01 ccm O2 . Nach 1^/2 stündiger Belichtung: 166,30 ccm enthielten 7,97 ccm COo und 4,75 ccm Oo . Aus der Kohlensäuredifferenz von 4,80 ccm und der Sauerstoffdifferenz von 4,74 ccm berechnet sich der assimilatorische Koef- fizient 1,01. Sechster Versuch. Dieselbe Pflanze befand sich 2 Stunden im Sauerstoff freien Gasstrom, ehe die Belichtung von einer Stunde begann. Dann ließen wir weitere 4 Stunden im Dunkeln das sauerstofffreie Gas durchströmen und belichteten abermals i^/o Stunden bis zur volumetri- schen Bestimmung (die genauere Beschreibung des Versuches findet sich in der sechsten Abhandlung, Abschnitt II, C, als Nr. 6). Die stündliche Leistung in der ersten Belichtungszeit war 0,064 §j i^^ der zweiten 0,053 g COo für 10 g Blattsubstanz. Der assimilatorische Koef- fizient betrug nach der ersten Analyse 1,01, nach der zweiten 1,00. Siebenter Versuch. Bei 35° mit Sambucus nigra. Der assimilatorische Koeffizient bei verschiedenen Temperaturen. 337 Versuchsbedingungen: 7,0 g Blätter (Juli) mit etwa 350 qcm Fläche; Beleuchtung von 45 000 Lux, 6^2 vol.-proz. COo, Strömungsgeschwindig- keit: I 1 Luft verläßt die Gasuhr bei 39 mm Quecksilberdruck in 19 Minuten. Zusammensetzung des Gases im Dunkelversuch nach anderthalb- stündiger Atmung bei 35°: 200^30 ccm enthielten 13,63 ccm CO2 und 38,68 ccm O.. Tabelle 98. Der assimilatorische Koeffizient bei 35°. (7 g Blätter von Sambucus nigra, 6V2 vol.-proz. COj, ungefähr 45000 Lux.) Belichtungsdauer COa-Differenz (für 200,30 ccm Gas) ccm O2- Differenz (für 200,30 ccm Gas) ccm ^ stündlich assimiliertes CO2 (g) im Versuch von lo g Sambucus 1 Stunde 2 Stunden 4V2 .. 4.07 2,95 2,23 4-II 2,94 2,24 0,99 1,00 1,00 0,115 0,164 0,082 0,119 0,063 1 0,090 Zwischen die erste und zweite gasometrische Bestimmung wurde eine gravimetrische eingeschaltet und nach anderthalbstündiger Belichtung 0,0332 g CO2- Verbrauch für 19 Minuten, also 0,103 g für die Stunde er- mittelt. Dieser Wert liegt zwischen den nach einer und nach zwei Stunden gefundenen Zahlen der Tabelle 98. Der rasche Rückgang der Leistung war durch Schädigung des assimila- torischen Apparates bei der hohen Versuchstemperatur verursacht; auch unter diesen Umständen ist der assimilatorische Koeffizient scharf 1,00 geblieben. Bei 40° und im übrigen unter den Verhältnissen wie im ersten und vierten Versuch assimilierten die Sambucusblätter nicht mehr und sie erholten sich, nachdem sie drei Stunden bei dieser Temperatur geatmet hatten, beim Abkühlen nicht wieder. Achter Versuch. Bei 10° mit Aesculus Hippocastanum. Versuchsbedingungen: 6,0 g Blätter (Ende Juli) mit etwa 350 qcm Fläche. Beleuchtung von 45 000 Lux, 5 vol.-proz. COo, Strömungsge- schwindigkeit : I 1 Luft verläßt die Gasuhr bei 38 mm Ouecksilberdruck in 20 Minuten. Willstätter-Stoll, Assimilati 338 R. Willstätter und A. Stoll. Tabelle 99. Der Koeffizient bei niedriger Assimilationstemperatur (10°). (6 g Blätter von Aesculus Hippocastanum, 5 vol.-proz. COg, ungefähr 45000 Lux.) Belichtungsdauer COg-Differenz (für 200,3 ccm Gas) Oa-Differenz (für 200,3 ccm Gas) Stündlich assimiliertes COg (g) im Versuch ^ von lo g Aesculus V2 Stunde 2 Stunden 3V4 .. 0,88 1,20 1,12 0,90 1,19 1,12 0,98 1,01 { 1,00 0,023 0,038 0,031 [ 0,052 0,029 j 0,048 Zusammensetzung des Gases im Dunkelversuch nach einstündiger Atmung bei 10°: 200,30 ccm enthielten 10,45 ccm CO2 und 42,44 ccm Oo . Die Herabsetzung der Assimilation durch die niedrige Ternperatur bedingt keine Erhöhung des assimilatorischen Koeffizienten, so daß also keine Andeutung für stufenweise Abgabe des Sauerstoffs gefunden wird. IV. Der assimilatorische Koeffizient in Fällen scheinbarer Abweichungen von der Zahl 1,00. a) Der Koeffizient in einem der Beispiele von Bonnier und Mangin (Hex). Da die Messungen von Bonnier und Mangin in einer Anzahl von Pflanzen, namentlich bei Hex aquifolium, von der Zahl i bedeutend ab- weichende Koeffizienten ergeben haben, so ist ein Versuch unter den oben beschriebenen Bedingungen gerade mit dieser Pflanze ausgeführt worden, weil hinsichtlich des Stoffwechsels ihr lederartiges Blatt einen Übergang zwischen dem normalen Laubblatt und dem fleischigen Blatt der Succulenten darzubieten scheint^). Die Blätter (im Juli) waren vorjährige und noch ältere; angewandt wurden 13,0 g Frischgewicht mit ungefähr 350 qcm Blattfläche und 5,33 g Trockengewicht. Die Assimilation wurde drei Stunden lang bis zu starkem Rückgang der Leistung gemessen, und die Versuchsbedingungen waren: 25°, Beleuchtung von 45000 Lux, 5 vol.-proz. COo, Gasstrom von 3I stündlicher Geschwindigkeit bei 38 mm Ouecksilberdruck. *) Vgl. L. Jost, Vorlesungen über Pflanzenphysiologie, 3. Aufl., Jena 1913, S. 260. Der assimilatorische Koeffizient in Fällen scheinbarer Abweichungen von der Zahl i. 339 ■ Zusammensetzung des Gasstroms im Dunkelversuch vor der Assimila- tion nach zwei Stunden Atmung bei 25 ° : 200,30 ccm enthielten 10,42 ccm CO2. Zusammensetzung des Gasstromes im Dunkelversuch nach der Assi- milation und wiederum zweieinhalb Stunden Atmung bei 25 ° : 200,30 ccm enthielten 10,37 ccm COo und 42,21 ccm O2. Der Berechnung ist der Mittelwert von CO2 zugrunde gelegt : 10,40 ccm und für den Sauerstoff die Zahl 42,18, die mit diesem Werte von CO2 aus der Summe beider Gase, 52,58 ccm, abgeleitet ist. Tabelle 100. Der assimilatorische Koeffizient (Hex aquifolium, 25^^). (13 g Blätter, 5 vol.-proz. COo, ungefähr 45000 Lux.) Belichtungsdauer COa-DJfferenz (für 200,3 ccm Gas) ccm Oj-Differenz (für 200,3 ccm Gas) ccm Stündlich assimiliertes COg (g) 2/4 Stunden 3 3,65 2,70 3,65 2,70 1,00 1,00 0,096 0,071 0,074 0,055 Der Koeffizient der Assimilation stimmt mit der bei den anderer Pflanzen bestimmten Zahl genau überein. b) Der Koeffizient bei den Succulenten. Es ist bekannt^ , daß bei der Assimilation der Succulenten zu tiefe CO. \\>rte von — — ^ gefunden werden, weil diese Pflanzen in der nächtlichen O2 Atmung einen bedeutenden Vorrat an organischen Säuren bilden, um denselben am Tageslicht aufzuzehren. Dieses Verhalten wird von H. A. Spoehr"-) in seiner Arbeit „Photochemische Vorgänge bei der diurnalen Entsäuerung der Succulenten'' zusammenfassend in folgender Weise er- klärt : ,,Die Ansäuerung der Succulenten (oder irgendeines Pflanzenteils) ist das Resultat erschwerten Sauerstoffzutritts, unvollständiger Verat- mung von Zucker. Im Lichte verschwindet nun die angehäufte Säure, teils wegen der durch die Reduktion von Kohlensäure \Trbesserten 1) Vgl. L. Jost, Vorlesungen über Pflanzenphysiologie, 3. Aufl., Jena 1913, S. 259. 2) H. A. Spoehr, Biochcm. Zeitschr. 57, 95 [1913]. 22* 340 R. Willstätter und A. Stoll. Sauerstoffversorgung, teils wegen einer direkten photochemischen Spal- tung der Säure." Die Succulenten sind eingerichtet, möglichst wenig Wasser durch Transpiration zu verlieren; die Fläche der oberirdischen Organe ist ver- kleinert, die Spaltöffnungen wenig zahlreich. Dadurch wird andererseits der Eintritt des Kohlendioxyds (wie des Sauerstoffs) in die pflanzlichen Gewebe erschw^ert und die Pflanze ist darauf angewiesen, Atmungskohlen- säure einzusparen. Die Verarbeitung der nicht flüchtigen organischen Säuren am Lichte bedingt ein Plus von Sauerstoff im Verhältnis zu der von außen aufgenommenen Kohlensäure. Die Bestimmung des assimila- torischen Koeffizienten stößt also bei den Succulenten auf die Schwierig- keit, daß die assimilatorische Leistung unrichtig erfaßt wäre, wenn man sie nur gemäß der Absorption von Kohlensäure bestimmen würde. Es sollte nun versucht werden, mit unserer Methode für die Bestimmung des Koeffizienten bei gesteigerter und langdauernder Assimilation den Ein- fluß der inneren Kohlensäurezufuhr und der äußeren zu unterscheiden, ferner ersteren herabzumindern, um den assimilatorischen Koeffizienten wenigstens annähernd zu bestimmen. Die gesamte Assimilation der Succulenten ergibt sich in der beschrie- benen Versuchsanordnung aus der Sauerstoffdifferenz des Gasstromes im Dunkelversuch und im Licht, die Assimilation auf Kosten der äußeren Kohlensäure ergibt sich aus der entsprechenden Kohlendioxyddifferenz und die Assimilation auf Rechnung innerer Kohlensäureversorgung aus dem Unterschied zwischen jenen beiden Assimilationswerten. Es gelingt bei stundenlanger Dauer des Versuchs dadurch, daß der Vorrat an Pflan- zensäuren aufgebraucht wird, den Koeffizienten, der zu Anfang den Scheinwert ^/s oder sogar ^/g (wie wenn Kohlendioxyd zu Methan reduziert würde) hat, der theoretischen Zahl immer näher zu rücken, z. B. auf 0,85 und 0,89 und so zu zeigen, daß die Assimilationsreaktion bei den Succulenten keine Ausnahme darstellt. Wie bedeutend der Anteil der im Innern ge- bildeten Kohlensäure an der assimilatorischen Versorgung der Succulenten ist, zeigt folgende Tabelle loi, in der die innere und die äußere Kohlen- säurezufuhr zu Anfang und im Verlaufe der Belichtung verglichen wird. Der assimilatorische Koeffizient in Fällen scheinbarer Abweichungen von der Zahl i . 341 Tabelle 10 1. Assimilation auf Rechnung äußerer und innerer Kohlensäure- versorgung bei Succulenten. (25 — 35°, 5 vol.-proz. COg, ungefähr 45000 Lux.) Phyllocactus (60 g) j Opuntia (170 g) Belichtungs- Stündliche Assimilation j Belichtungs- Stündliche Assimilation dauer äußeres CO2 (g) inneres CO., (g) | dauer äußeres CO. (g) 1 inneres CO. (g) V2 Stunde 0,037 0,019 V2 Stunde 0,056 0,027 1^/4 Stunden 0,039 0,0lS 4 stunden 0,056 0,014 3 0,037 0,015 5V2 ., 0,049 1 0,006 Von 25 ° auf 35° gest eigert 12 Stunden \ erdunkelt, auf 30° gesteigert V2 Stunde 0,042 1) 0,017 V2 Stunde 0,029 0,037 2V2 Stunden 0,039!) 0,007 2 Stunden 0.034 0,033 — — — 6 0,024 1 0,004 Versuch mit Phyllocactus. Die Cactee (60 g) war vor dem Versuch 24 Stunden im Dunkeln, in ein feuchtes Tuch eingehüllt. Die Belichtung begann, nachdem die Atmung 4^/3 Stunden beobachtet war und die Analyse gezeigt hatte, daß zwischen der großen Menge Pflanzensubstanz und der angewandten Atmosphäre Gasausgleich eingetreten war. Zusammensetzung des Gases im Dunkelversuch (25°) vor der Assi- milation : I. Nach 2 Stunden: 200,30 ccm enthielten 10,74 ccm CO2 und 42,02 ccm O.,. Tabelle 102. Der assimilatorische Koeffizient bei Phyllocactus. (60 g Blattsubstanz, 25 — i^°, 5 vol.-proz. COj, ungefähr 45000 Lux.) Belichtungsdauer COä-Differenz (lür 200,30 ccm Gas ccm ©.-Differenz (für 200,30 ccm Gas) ccm CO, stündlich assimiliertes CO.. 1 für 10 g im Versuch aus der ! ^^^ ^j^^ CO.,- 0,-D,fferenz ber. Differenz ber. (g) Blatt aus der O3- Differenz ber. 1/2 Stunde 1,28 .96 ! 0,64 0,056 0,006 0,0090 1^/4 Stunden 1,38 2,00 1 0,69 0,057 0,006 0,0095 3 1,27 I.S3 I 0,69 ; 0,052 0,006 0,0085 Xac h 4 Stunden Licht Tempe ■atursteigerung von 2^ "^ auf 35 ° Wieder 1/2 Stunde 1,46 1 2,07 1 0,71 0,059!) j 0,007 0,010 2^/2 Stunden ^,^^7 i,Ol 0,85 0,046 !) 1 0,0065 0,0075 1) Die Zahlen für die Assimilation bei 35 ° sind Mindestwerte, da die Atmung für diese Temperatur nicht ermittelt und der Wert von 2=^ ' in die Kcchnung eingesetzt wurde. 342 R. Willstätter und A. Stoll. 2. Nach 4^2 Stunden: 200,30 ccm enthielten 10,70 ccm COo und 41,90 ccm Oo. Versuchsbedingungen : Beleuchtung von 45 000 Lux, 25 ° und nach 4 Stunden 35°, 5 vol.-proz. CO2. Geschwindigkeit des Gasstromes: 1,00 1 in 18,5 Minuten bei 38 mm Quecksilberdruck. Die stündHche Leistung, auf das Gewicht der Pflanzensubstanz be- zogen, ist auch unter den günstigen Bedingungen auffallend niedrig; sie wäre freilich höher bei doppelseitiger Belichtung, wie unter natürlichen Verhältnissen. Die gasanalytische Bestimmung wurde durch eine gravi- metrische bestätigt und nach 70 Minuten Belichtung 0,0385 g stündliche Kohlensäureaufnahme von außen gefunden, gasometrisch aus der Kohlen- dioxyddifferenz 0,039 §'• Versuch mit Opuntia. Die Zweige befanden sich anderthalb Tage unter Luftzutritt im Dunkeln in feuchtem Papier und Tuch und wurden einen Tag vor Versuchsbeginn zurecht geschnitten und in die Assimilationsdose eingelegt; ihr Gewicht war 170 g, die einseitige Fläche etwa 300 qcm. Die Thermometerkugel steckte im Innern eines fleischigen Sprosses. Die erste Belichtung dauerte ununterbrochen 10 Stunden, nach einer Ruhepause von 17 Stunden im Dunkeln bei 20 bis 30° wurde aber- mals 6 Stunden belichtet. Versuchsbedingungen : 25 °, später 30 °, Belichtung von 45 000 Lux, 5 vol.-proz. CO2, Gasstrom von 3,0! in der Stunde. Zusammensetzung des Gases im Dunkel versuch nach 12 Stunden Atmung bei 25°: 200,30 ccm enthielten 10,84 ccm COo und 41,92 ccm O2. Nach einer weiteren Stunde (kurz vor der Behchtung^ : 200,30 ccm enthielten 10,77 ccm CO2 und 42,00 ccm Oo. Zusammensetzung des Gases nach 12 Stunden L^nterbrechung (bei etwa 20°) und darauffolgendem 3\/o stündigem Durchleiten bei 30°: 200,30 ccm enthielten 10,81 ccm COo. Nach einer weiteren Stunde: 200,30 ccm enthielten 10,81 ccm CO2 und 42,10 ccm Oo. Die gesamte assimilatorische Leistung der Opuntia unter den Versuchs- bedingungen (25°) ist, auf das Pflanzengewicht bezogen, ^/so von der- Der assimilatorische Koeffizient in Fällen scheinbarer Abweichungen von der Zahl i. 343 Tabelle 103. Der assimilatorische Koeffizient bei Opuntia. (170 g Sprosse, 25 und 30°, 5 vol.-proz. COg, ungefähr 45000 Lux.) CO.>-Differenz 0.,-Differenz Stündlich assimiliertes CO.. (g) Belichtungsdauer (für 200,30 ccm Gas) ccm (für 200,3 ccm Gas) ccm CO, im Versuch aus der Oa-Differenz ber. für 10 g aus der COj- Differenz ber. Blatt aus der O.,- Differenzber. V2 Stunde 2,00 2.98 0,67 0,083 0,0033 0,0049 4 Stunden 2,00 2,50 0,80 0,070 0.0033 0,0041 5V2 .. 1.75 1,90 0,89 0,055 0,0029 0,0032 10 1.45 — — 0,0024 Wieder V2 Stunde 2 Stunden 6 12 Stunden Verdunklung, Steigerung auf 30°, 5 Stunden Atmungsvers 1,05 j 2,37 0,44 0,066 1,23 2,42 0,51 0,067 0,86 1 1,01 0,85 0,028 0,0017 0,003g 0,0020 I 0,0039 0,0014 0,0016 jenigen gewöhnlicher Blätter (Sambucus). Die Verarbeitung der von außen aufgenommenen Kohlensäure beträgt nur ^40 des gewöhnlichen Wertes. Nach der Ruhepause und der Temperatursteigerung überwog der Ver- brauch von aufgespeicherter Säure sogar die Absorption aus kohlensäure- reicher Atmosphäre. Der scheinbare assimilatorische Koeffizient hat daher an diesem Punkt des Versuches den tiefsten Wert, von welchem CO das Verhältnis — ^ sich in 6 Stunden infolge des Nachlassens der inneren Kohlensäure Versorgung auf 0,85 erhebt. Sechste Abhandlung. Über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen. I. Theoretischer Teil. Assimilation bei Abwesenheit freien Sauerstoffs. Verschiedene Methoden zum Nachweis und zur Schätzung der Assi- milation sind im Gebrauche, die in der Erkennung von freiem Sauerstoff bestehen, nämlich der Nachweis mit Phosphor nach Boussingault, mit Hämoglobin nach Hoppe-Seyler, mit Indigweiß nach Beije- rinck und mit den Leuchtbakterien nach Beijerinck. Diese Methoden haben zur Voraussetzung, daß die Assimilation in sauerstofffreier Atmo- sphäre eintritt. Sie scheinen also den Beweis dafür in sich zu tragen, daß die Gegenwart von Sauerstoff für die Assimilation nicht notwendig ist . Ähnhcher Art ist die Engelmannsche Bakterienmethode; hier wird zwar nicht eigentlich das Auftreten von Sauerstoff in einem zuvor sicher sauerstofffreien Gasraume erkannt, sondern durch die Bewegung der sauerstoffempfindlichen Bakterien werden die an den einzelnen Orten des mikroskopischen Objektes auftretenden Unterschiede in der Sauer- stoffkonzentration nachgewiesen, also die über den Verbrauch bei der Atmung hinaus freiwerdenden Sauerstoffmengen in der zuvor des Sauer- stoffs beraubten Umgebung mit großer Empfindlichkeit angezeigt. ,,Es gibt eine ganze Anzahl von Tatsachen," äußert Jost^^ mit Bezug auf diese Methoden, ,,die beweisen, daß zum Beginn der Assimila- ^) L. Jost, Vorlesungen über Pflanzenphysiologie, 3. Aufl., Jena 1913, S. 159. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 345 tion nachweisbare Spuren von Sauerstoff nicht vorhanden zu sein brau- chen; das ist um so merkwürdiger, als so ziemhch alle Lebensprozesse der grünen Pflanzen von der Gegenwart des Sauerstoffs abhängen." In einem gewissen Gegensatz zu den Voraussetzungen jener Methoden stehen mehrere Beobachtungen über die Sistierung der Assimilation bei Sauerstoffmangel, die im folgenden xA-bschnitt besprochen werden sollen. Nach Jost liegt nun der Gedanke nahe, daß zwar kein freier, wohl aber locker gebundener Sauerstoff den Pflanzen zur Verfügung stehe, zum Beispiel auch in Fällen, wie in dem bekannten Assimilationsversuche von Hoppe-Seyler^) in faulendem Hämoglobin. Nach der zusammen- fassenden Darstellung von Jost soll mit der Zeit die Fähigkeit der Pflanze aufhören, ohne Sauerstoff mit der Assimilation zu beginnen; ,,es wäre also zu entscheiden, ob dieser Moment dann eintritt, wenn der locker gebundene Sauerstoff verbraucht ist, oder wenn die Chlorophyllkörner inaktiviert werden". In der vorhegenden Arbeit wird die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit freien und locker gebundenen Sauerstoffs unter- sucht, und es wird dabei experimentell unterschieden zwischen der Schä- digung des Plasmas durch Sauerstoffmangel, die sekundär Störung der Assimilation herbeiführt, und dem unmittelbaren Einfluß der Sauerstoff- entziehung auf die Assimilation. Es hat sich bestätigt, daß die Anwesen- heit von freiem Sauerstoff im Gasraum und in der Zelle für die Assimila- tion entbehrlich ist, und es zeigt sich, daß andererseits der Eintritt der Assimilation auf der Funktion einer dissoziierbaren Sauerstoffver- bindung im Assimilationsorgan beruht. Es bleibt somit kein Widerspruch zwischen der Entbehrlichkeit des freien Sauerstoffs und derUnentbehrhch- keit des Sauerstoffs in Form lockerer Verbindungen in der Zelle. Ältere Versuche über Assimilation bei Sauerstoffmangel. Bei der Erörterung des Zusammenhanges zwischen Sauerstoffmangel und Assimilation pflegt man auf eine Arbeit von J. B. Boussin- 1) F. Hoppe - Seyler, Zeitschr. f. physiol. Chcm. 2, 423 [1879]. 346 R- Willstätter und A. Stoll. gault^) Bezug zu nehmen, in der die Wirkung Sauerstoff freier Atmo- sphäre, von Wasserstoff, Stickstoff, Methan, auf die assimiherenden Pflanzen behandelt wird. Die Pflanzen geraten bei der Einwirkung dieser Gase im Dunkeln in einen Zustand der ,, Asphyxie", sie verlieren trotz unver- änderten Aussehens die Fähigkeit, im Lichte Kohlensäure zu zerlegen. „On peut, je crois, attribuer la perte de cette faculte ä ce qu'elles ont ete privees pendant trop longtemps de l'oxygene qui leur est indispensable pour elaborer de l'acide carbonique par une combustion lente, en un mot pour respirer." Viel eingehender hat später N. Pringsheim^^ die Abhängigkeit der Assimilation grüner Zellen von der Gegenwart des Sauerstoffs unter- sucht und die Frage behandelt, ,,ob eine normal assimilierende Pflanze ohne irgendwelche Beeinträchtigung ihres Chlorophyllapparates aufhört zu assimilieren, wenn ihr auch nur eine kürzere Zeit der Sauerstoff ent- zogen wird, den sie für ihre Atmung und Plasmabewegung bedarf". Es handelt sich also um die Funktion des Sauerstoffes für Atmung und Plasmatätigkeit; der Einfluß der Sauerstoffversorgung auf das Plasma wird beschrieben, und als eine sekundäre Erscheinung, welche der Sauer- stoffmangel des Plasmas herbeiführt, wird die Störung der Assimilation angesehen. ,, Grüne, gut assimilierende Zellen mit lebhafter Protoplasmabewegung wurden im hängenden Tropfen in der mikroskopischen Gaskammer beob- achtet, durch welche mit möglichstem Ausschluß von Sauerstoff ein kon- tinuierlicher Strom von Kohlensäure und Wasserstoff geleitet wurde ..." ,,Läßt man die Zellen ununterbrochen im Finstern, so nimmt die Rotation, die eine Zeitlang noch mit unveränderter Energie fortfährt, nach und nach ab, wird schwächer und das Plasma zeigt endlich nur noch äußerst geringe, meist nicht mehr ganz regelmäßige Bewegungserscheinungen, bis auch diese aufhören und das Plasma endUch absolut stillsteht." ,, Verharrt . . . die Zelle eine längere Zeit in diesem Zustand, ... so findet man die Zelle endlich durch Sauerstoff not oder Sauerstoffmangel zugrunde gegangen." ^) J. B. Boussingault, Compt. rend. 61, 60S [1865]; Agronomie 4, 329 [1868]. 2) N. Pringsheim, Sitziingsber. d. Preiiß. Akad. d. Wissensch. 1887, S. 763. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 347 „Wartet man aber den Eintritt der , Asphyxie' im Finstern nicht ab, und hebt man die Verfinsterung des Objektes auf, bevor die Asphyxie noch eingetreten ist, etwa um die Zeit, wo die Rotation der Zelle eben erst zur Ruhe gelangt ist, oder das Plasma nur noch sehr schwache Spuren von Bewegung zeigt . . ., so überzeugt man sich leicht, daß die Zelle . . . in diesem Zustande bei völlig normaler Erhaltung ihrer anatomischen Beschaffenheit und ihres Chlorophyllapparates nicht mehr zu assimilieren vermag." „Werden diese Zellen nun, nachdem der Zustand der Plasma- ruhe bei ihnen im Finstern eingetreten ist, jetzt noch in der Gaskammer und im Strome von Wasserstoff und Kohlensäure beliebig lange . . . be- lichtet, so ändert sich in ihrem Verhalten nichts, die Rotation in ihnen kommt trotz der Belichtung nicht wieder zurück . . ." ,,Die Sistierung der Bewegung ist daher . . . eine einfache Wirkung des Sauerstoffmangels, da sie durch Sauerstoffentziehung hervorgerufen in leichtester Weise durch Sauerstoffzufuhr immer wieder gehoben werden kann." ,, Diesen Zustand der grünen Zellen will ich als ,Inanition' oder , Ernährungsohn- macht' bezeichnen." ,,Wird die Chara-Zelle bei gleicher Anordnung des Versuches im hän- genden Wasser- oder Bakterientropfen in der mikroskopischen Gaskam- mer von Beginn des Versuches an und während seiner ganzen Dauer ununterbrochen belichtet, während der Strom von Kohlensäure und Wasserstoff gleichfalls ununterbrochen durch die Gaskammer strömt, so sehen wir auch hier genau so wie bei Versuchen im Finstern nach kürzerer oder längerer Zeit Rotation und Sauerstoff abgäbe aufhören." „Wir sehen demnach auch bei ununterbrochener Belichtung der Objekte in Kohlensäure und Wasserstoff den Ruhezustand des Plasmas und die Inanition der Zelle eintreten, und zwar aus keinem anderen Grunde, als weil es der Zelle an freiem Sauerstoff für ihre Atmung und die von dieser abhängigen mechanischen Arbeiten und chemischen Funktionen des Plasmas fehlt." Auf Grund dieser Versuche glaubt Pringsheim die Gewißheit zu erlangen, „daß die Sauerstoffabgabe einen für sich bestehenden, von der Kohlensäurezerlegung nur indirekt abhängigen, jedenfalls von ihr ge- 348 R- Willstätter und A. Stoll. trennten Vorgang bildet, dessen Eintreten und dessen Größe eigenen Be- dingungen unterliegt und nicht ganz allein und ausschließlich durch die Assimilation und die Assimilationsgröße bestimmt wird". Während es in diesen Versuchen von Pringsheim nicht gelungen ist, nach dem Eintritt der Inanition durch Belichtung wieder Assimilation herbeizuführen, wird es in unserer Untersuchung erreicht, die Assimila- tion nach ihrer vollständigen Stillegung durch Sauerstoffentziehung wieder zu erwecken, einfach durch Belichtung ohne Sauerstoffzufuhr. In der von Pringsheim und anderen angewandten Behandlung mit dem Medium Wasserstoff, für das die Pflanze nicht eingerichtet ist, hat der Zustand des Protoplasmas, dessen Versorgung einen ansehnlichen Sauer- stoff druck verlangt, auf die Dauer gelitten, und der Assimilations- apparat ist indirekt in Mitleidenschaft gezogen worden. Schlußfolge- rungen über die Assimilationsreaktion selbst können aus den alten Be- obachtungen nicht gezogen werden. Dieselben Einwände sind gegen die Untersuchung zu erheben, die später in Pfeffers Institut A. J. Ewart^) ausgeführt hat. In einem Abschnitt 2) der im Vorausgehenden wiederholt besprochenen Arbeit wird im Zusammenhang mit den transitorischen Sistierungen der assimilatorischen Befähigung durch verschiedene äußere Eingriffe und andere Konstellationen auch die Einwirkung irrespirabler Gase auf die Assi- milation behandelt. Es ist nicht die Absicht der Versuche Ewarts, den Einfluß des Sauerstoffmangels zu verfolgen ; es wäre auch nicht erlaubt, die Wirkung des Wasserstoffs mit Sauerstoffmangel zu identifizieren. In den Versuchen von Ew^art, welche diejenigen von Pringsheim ergänzen, wird mit ähnlicher Anordnung gearbeitet und die Assimila- tion mit der Engelmannschen Bakterienmethode nachgewiesen. Die Wasserstoffatmosphäre war, wie schon Pringsheim erkannte, nicht frei von Sauerstoff, sondern nur arm daran; das Medium enthielt bestimmt noch Sauerstoff, nämlich den durch die Photosynthese entbundenen, in den 1) A. J. Ewart, Journ. of the Linnean Soc. 31, 364 [1896], 554 [1897]; siehe auch W. Pfeffer, Ber. d. Sachs. Ges. d. Wissensch. 1896, S. 311. 2) A. J. Ewart, a. a. O. S. 403. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 349 Experimenten über Sistierung der Assimilation bei andauernder Be- lichtung. Unter solchen Bedingungen ist der Sauerstoff eben immer vor- handen, aber mit so geringem Partialdruck, daß die Schädigung des ge- samten Protoplasmas nicht ausbleibt, die weiterhin Herabminderung und Stillegung der Assimilation zur Folge hat. Präparate von Chara und Elodea verloren in stundenlangen Versuchen im Wasserstoffstrom im Lichte wie im Dunkeln das Assimilationsver- mögen. Moose hingegen, die Ewart bemerkenswert resistent gegen Schä- digungen und Vergiftungen findet, behielten unter denselben Bedingungen im Lichte unbestimmte Zeit ihre Assimilationsfähigkeit. In den Ver- suchen mit den Moosblättern überholte Ewart die Ergebnisse von Pringsheim, und zwar auch darin, daß bei den Chloroplasten der Moose (Bryum caespititium, Orthotrichum, Dicranum scoparium) nach Eintritt der Inanition allein durch Belichtung im kohlensäurehaltigen Wasser- stoff, auch ohne Sauerstoffzufuhr, die Assimilation wieder erzielt wurde. Für diese Erscheinung gab Ewart folgende Erklärung: ,,The condition first produced in the Chlorophyll grains is one of inanition, characterized by an inability to assimilate, but from which recovery is possible. If the exposure goes to far, the Chlorophyll grains are killed and lose their power of recovery, and this is quickly followed b}' the death of the entire cell." Assimilation nach Entziehung von freiem und von gebundenem Sauerstoff. Die Methode, mit der wir die assimilatorischen Leistungen unter ver- schiedenen Verhältnissen der Sauerstoffentziehung prüften, war die quan- titative Bestimmung der Sauerstoffkonzentration und die quantitative Bestimmung der assimilatorischen Leistung (bei hoher Kohlensäurekon- zentration und starker Belichtung). Versuchsanordnung und Assimila- tionsbedingungen waren die gleichen wie die in den voranstehenden Ab- handlungen; auch die gravimetrische und volumetrische Analyse lehnte sich an die zur Bestimmung des assimilatorischen Koeffizienten (siehe die fünfte Abhandlung, Abschnitt II) getroffenen Einrichtungen an. 350 R- Willstätter und A. Stoll. Von der Genauigkeit der quantitativen Bestimmung, die nicht zu weit hinter der Empfindhchkeit der Engelmannschen Bakterien- methode zurücksteht, gibt die folgende Schätzung ein Bild. Wenn man entsprechend der Empfindlichkeit der Engelmannschen Methode mit der Entwicklung von i Hundertbilliontel Milligramm Sauerstoff durch einen Chloroplasten rechnet und dafür die Zeit einer Sekunde ansetzt, so ergibt sich bei 500 000 Chloroplasten auf i qmm Blattfläche für die im Versuche angewandte Menge von bis zu 400 qcm die Sauerstoffentwick- lung von 0,72 mg in einer Stunde. Diese Menge wird gravimetrisch in einem Messungsintervall von 20 Minuten als Kohlensäuredifferenz von 0,3 mg und volumetrisch als Sauerstoff differenz von 0,02 Proz. bestimmt. Man kommt unter diesen Umständen nahe an die Grenzen der quantitativen Methoden (vgl. die fünfte Abhandlung, Abschnitt II); die volumetrische Bestimmung erlaubt eine Genauigkeit von + 0,005 Proz. und die gravi- metrische gibt Ausschläge von +0,1 mg. Die sauerstofffreie Atmosphäre bestand in kohlensäurehaltigem Stick- stoff, den man für die Mehrzahl der Versuche von den letzten Anteilen Sauerstoff durch Überleiten über glühendes Kupfer befreite. Die Versuchspflanzen waren von sehr verschiedener Widerstandsfähig- keit : zwei Pelargoniumarten, besonders empfindlich gegen Sauerstoff- mangel, Cyclamen europaeum, hervorragend widerstandsfähig, und von zwei Laubmoosen das eine, Polytrichum juniperinum, ähnlich resistent wie Cyclamen, das andere, Leucobryum glaucum, leicht reagierend auf Sauerstoffentziehung wie Pelargonium, aber zum Unterschied von diesem zählebig. Durch Erniedrigung des Sauerstoffteildruckes auf ein Hundertel von demjenigen in der Atmosphäre wird die Assimilation selbst bei den emp- findlichsten Objekten nicht gestört und in ihrem Maße nicht herabgemin- dert. Das ist nach den älteren Beobachtungen immerhin auffallend, und es deutet an, daß sauerstoffarmer Stickstoff besser ertragen wird als sauerstoffarmer Wasserstoff. Bei vollständiger Verdrängung des Sauerstoffs aus dem Gasraume, aber nur kurzer Dauer des Sauerstoffmangels war die Wirkung auf die über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 351 Pelargonienblätter eine weitgehende. Nach zweistündigem Durchströmen des sauerstofffreien Gases (die Hälfte dieser Zeit ungefähr war zur Ver- drängung der Luft erforderlich) waren die Blätter unfähig, bei Belichtung und auch bei Sauerstoffzufuhr die Assimilation wiederaufzunehmen. Obwohl die Blätter im Aussehen keine Veränderung zeigten, waren sie im Zustand fortgeschrittener Vergiftung. Die Plasmatätigkeit in diesen Objekten hat bei Sauerstoffmangel sehr rasch gelitten; der Fall bietet gegenüber Bekanntem nichts Neues. Geeigneter für das Experiment sind Blätter, deren Protoplasma den Sauerstoffmangel längere Zeit verträgt. Nach einstündigem oder mehr- stündigem Durchleiten von vollkommen sauerstofffreiem Gase, nach einer Zeit, in welcher freier Sauerstoff gänzlich entfernt wird und in der bei Pelargonium schon die Asphyxie eintritt, zeigen Cyclamen und Poly- trichum noch Assimilationstüchtigkeit; die Leistung bei Belichtung ohne Sauerstoffzufuhr ist zwar schon geschwächt, aber nur in geringem Maße. Das ist die Erscheinung, die schon W. Pfeffer^) nach den Beobach- tungen von Ewart folgendermaßen verzeichnet: ,,Ein stundenlanger Ent- zug des Sauerstoffs raubt vielen Chlorophyllkörnern nicht die Fähigkeit, bei Wiederzutritt des Lichtes sofort die Kohlensäurezersetzung aufzu- nehmen." Viel bemerkenswerter ist die Erscheinung nach langdauernder Sauer- stoff entziehung bei den resistenten Objekten. Läßt man Cyclamen oder das Laubmoos Polytrichum weit länger als in den ersten Versuchen, zum Beispiel 15 Stunden und über 24 Stunden unter völligem Sauerstoffaus- schluß, so findet man in kohlensäurehaltigem Stickstoff beim Belichten, daß die Assimilation ausbleibt, daß sie aber nach kurzer Zeit einsetzt und daß sie schon während der ersten 30 Minuten Belichtungszeit scharf an- steigt bis etwa zu demjenigen Betrag, den das Objekt unter diesen Ver- hältnissen noch zu ergeben vermag. Bei längerer Versuchsdauer ist dann das weitere Ansteigen der assimilatorischen Leistung unbeträchtlich. Die Haupterscheinung nach der weitgehenden Sauerstoffentziehung ist der Stillstand der Assimilation und ihre Selbsterregung und rasche 1) W. Pfeffer, Pflanzenphysiologie, 2. Aufl., I, 581. 352 R- Willstätter und A. Stoll. Wiederbelebung. Als eine Nebenerscheinung ist eine bleibende Schwächung der Assimilation zu verzeichnen, die wenigstens zum Teil auf der Schä- digung des Protoplasmas bei seiner ungenügenden Sauerstoffversorgung beruht. Anormale Verhältnisse in der Zelle, seien sie chemische Vorgänge oder physikalische Veränderungen, stören die Assimilation sekundär, hier wie in dem vorher beschriebenen Falle, und vereiteln sie sogar im Beispiel der Pelargonienblätter. Man kann bei zweckmäßiger Versuchsanordnung geradezu die Ab- hängigkeit der Assimilation vom Protoplasma unbeachtet lassen, um den unmittelbaren Einfluß des Sauerstoffes auf den Assimilationsvorgang auf- zusuchen. Die beobachtete Wiederbelebung ist verschieden von der bei den frühe- ren Autoren beschriebenen. Man ist früher Fällen begegnet, in denen sich in größerem Zeitraum bei erneuter Sauerstoffversorgung die normale At- mung und andere Tätigkeit des Protoplasmas herstellen ließ, so daß mittel- bar die assimilatorische Funktion wiedererweckt wurde. In unseren Ver- suchen hingegen tritt sofort und direkt die Erregung der Assimilation ein durch Spuren von Sauerstoff, die entweder von freiwilligem Zerfall einer aus Chlorophyll und Kohlensäure gebildeten Verbindung oder von kleinen Resten anderer dissoziierbarer Verbindungen herrühren. Die geringen Mengen Sauerstoff, die bei der beginnenden Assimilation der entsauerstofften Blätter in der kurzen Zeit der ersten Messung ent- bunden werden, reichen keineswegs hin, um die normale Atmung des Plasmas wieder zu versorgen, die schon bei viel höherem Teildruck des Sauerstoffs erheblich leidet. Der Druck des Sauerstoffs bleibt hier sehr niedrig, w^eil ihn bei seiner raschen Diffusion durch Intercellularen und Spaltöffnungen der strömende Stickstoff fortführt, zum größten Teile, wie die Gasanalyse zeigt. Die angeführten Erscheinungen werden in der Tabelle 104 durch einige Beispiele von assimilatorischen Leistungen veranschaulicht, die nach dem Verweilen im sauerstofffreien Medium bei Belichtung in kohlensäurehal- tigem Stickstoff unter den Bedingungen gesteigerter Assimilation gemessen wurden. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 353 Tabelle 104. Assimilation in COo-haltigem Stickstoff nach \'er\veilen in Sauerstoff freiem Medium. :2 0oo Lux, 7,5 Proz. COj.) Blätter Trocken- substanz von 10 g Blättern (g) Aufenthalt in Oj-freiem Medium vor der BeHchtung Stündlich assimihertes CO, (g) in den ersten 20 Min. Belichtung nach ^/a Stunde nach I bis 1^/2 Stunden 20 g Cyclamen europaeum 1,15 weniger als V4 Stunde 0,12 0,157 20 g Cyclamen europaeum dasselbe Objekt 0,97 1 Stunde 2 Stunden 15 Stunden 0,03^ 0,07 0,0018 0,127 0,106 0,018 10 g Polytrichum 4,50 1 2 Stunden < 0,037 iunip. • i i I dasselbe Objekt mehr als 24 Stunden! 0,004 0,056 0,032 0,013 0,015 Die Versuche haben also ergeben, daß der Sauerstoff unbedingt not- wendig ist für die Assimilationsreaktion, daß aber zur Versorgung des Assimilationsapparates eine sehr geringe Menge von Sauerstoff ausreicht, und daß nicht freier Sauerstoff, aber dissoziabel gebundener für die Assi- milationsreaktion unentbehrlich ist. Der große Unterschied zwischen den Versuchen mit Cyclamen und Poh'- trichum nach kurzer und nach langer Sauerstoffentziehung macht es wahr- scheinlich, daß die Beseitigung des Sauerstoffs in zwei Phasen verläuft, daß sie nämlich 1. in der Verdrängung des freien Sauerstoffs, 2. in der Entziehung von dissoziabel gebundenem Sauerstoff besteht. In der ersten Phase, beim Durchströmen der Assimilationskammer mit dem sauerstofffreien Gase im Dunkeln, wird die Verdrängung des Sauerstoffs aus dem die Blätter umgebenden Gasraum und die Entfernung ^) Dieser Wert ist infolge zu frühen Einschaltens des Natronkalkrohres zu tief gefunden» \\' i 1 1 s t ii 1 1 e r - S t o U , Assimilation. 2 ^ 354 R- Willstätter und A. Stoll. des, wie W. Pfeffer^) gezeigt hat, in der Zelle vorhandenen h-eien Sauer- stoffs bewirkt. Nach dieser Phase sind die Blätter von Cyclamen und Polytrichum fähig, sofort wieder intensiv zu assimilieren. Die zweite Phase besteht in dem Zerfall einer an der Assimilation be- teihgten dissoziierenden Sauerstoffverbindung, der dann erfolgt, wenn ihr Sauerstoff druck höher ist, als der Teildruck des Sauerstoffs im Medium. Bei den widerstandsfähigen Pflanzenobjekten wird nach dieser Phase Stillstand der Assimilation und rasche Erregung derselben gefunden. Die Annahme eines mit Sauerstoff beladenen Agens im Assimilations- apparate der Blätter erinnert an den von P. G. Unna"^) in eingehenden Untersuchungen geführten wichtigen Nachweis, daß Sauerstofforte, die als Sauerstoffüberträger betrachtet werden, in tierischen Geweben, und zwar besonders in den Zellkernen verbreitet sind. In der zweiten Abhandlung dieser Reihe ist aus der Disproportionalität zwischen Chlorophyllmenge und assimilatorischer Leistung gefolgert wor- den, daß das Chlorophyll im Assimilationsvorgang mit einem Enzym zu- sammenwirke. Durch die vorliegende Untersuchung wird es wahrschein- lich, daß das am Assimilationsvorgang beteiligte Enzym als eine disso- ziierbare Sauerstoffverbindung wirkt. II. Experimenteller Teil. A. Assimilation in sauerstoffarmer Atmosphäre. Unter den Beispielen für den assimilatorischen Koeffizienten in der V. Abhandlung sind Bestimmungen in sauerstoffarmem Medium aus- CO geführt worden, die für das Verhältnis — ^ keine Abweichung vom nor- malen Werte ergeben haben. Dieselben Proben sind auch in dem Zu- ^) W. Pfeffer, Untersuchungen aus dem botanischen Institut zu Tübingen i, 684 [1885]; „Beiträge zur Kenntnis der Oxydationsvorgänge in lebenden Zellen", S. 449 (Leipzig 1889). 2) P. G. Unna, ,,Die Reduktionsorte und Sauerstofforte des tierischen Gewebes", Arch. f. mikrosk. Anatom. 78, Festschrift Waldeyer [191 ij; Berliner klin. Wochenschr. 50, 589 und 809 [1913]; , .Chemie der Zelle" in der Festschrift, dem Eppendorfer Krankenhause gewidmet [1914] ; ,,Die Sauerstofforte und Reduktionsorte", Arch. f. mikrosk. Anatom. 87, Abt. I, 96 [1915]. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 355 sammenhang mit den nachfolgenden Assimilationsversuchen in sauer- stofffreier Atmosphäre von Bedeutung. Die Versuchsbedingungen sind die bereits beschriebenen; die Anordnung der Assimilationsexperimente ist der zweiten, die volumetrische Bestimmung von Kohlendioxyd und Sauer- stoff der fünften Arbeit entnommen. Die assimilatorische Leistung ergab sich aus der Kohlensäuredifferenz der Gasproben, gemäß dem Verhältnis des kohlendioxydfreien Luftvolumens der Gasbürette zu dem aus dem Assimilationsapparate stündlich austretenden Luftvolumen. Versuch mit Pelargonium zonale. In einem Gasstrom von 1,35 Vol.-Proz. Sauerstoff und 7,40 Proz. Kohlendioxyd (siehe die fünfte Ab- handlung, Abschnitt III, dritter Versuch). Assimilation von 12,0 g Blättern bei 25° unter Beleuchtung von unge- fähr 45 000 Lux. Die assimilatorische Leistung nach einstündigem Durchströmen des sauerstoffarmen Gases betrug in zweistündiger Belichtungsdauer durch- schnittlich 0,1 1 g COo in der Stunde. Das ist ein ganz normaler Wert der assi- milatorischen Tätigkeit unter den Verhältnissen größter Leistung. Nach einer Ruhepause von 31/0 Stunden belief sich die Assimilation auf 0,10 g CO2 stünd- lich. Sie ging nach abermaligem 15 stündigem Verdunkeln und Verweilen im stehenden Gase, dessen Sauerstoffgehalt weitgehend veratmet wurde, während einer dritten Belichtungszeit von 6 Stunden auf 0,07 g CO2 zurück. Versuch mit Pelargonium zonale (a. a. O. vierter Versuch) in einem Gasstrom, dessen Sauerstoffgehalt im Dunkelversuch beim Aus- tritt aus der Assimilationskammer anfangs 1,22, nach dreistündigem Strömen 0,45 und nach 6 Stunden, nämlich vor Beginn der Belichtung, 0,23 Vol.-Proz. betrug. Der Kohlendioxydgehalt war 7^/2 Proz. Assimilation von 12,0 g Blättern bei 25° unter Beleuchtung von un- gefähr 45 000 Lux. Die Leistung während 1^/2 stündiger Belichtung betrug 0,10 g in der Stunde. B. Stillstand der Assimilation in sauerstofffreier Atmosphäre. Versuchsanordnung. Das Versuchsgas in der eisernen Druckflasche enthielt 7,40 Vol.-Proz. CO2 und 1,35 Sauerstoff gemäß folgenden Analysen : ^3* 356 R- Willstätter und A. Stoll. Volumetrische Bestimmung: 166,30 ccm enthielten 12,30 ccm COo und 2,24 ccm O2 bei 22,0° und unter 721 mm Druck (19,5°). Gravimetrische Bestimmung: Auf 1,00 1 COs-freien Gases kamen 0,1349 g CO2 bei 21,5° und unter 721mm Druck (19,5°). Um diesem Gase den Sauerstoff vollständig zu entziehen, leiteten wir es mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 1 in der Stunde durch ein im elektrischen Ofen erhitztes Quarzrohr von 12 mm lichter Weite, das anfangs nur mit einer dicht gerollten Kupferdrahtspirale beschickt war. Der Apparat stand in einem dem Versuchsraum benachbarten Zimmer. Die von Zeit zu Zeit erforderhche Reduktion der Drahtnetzspirale wurde durch Einleiten von Methylalkoholdampf in die glühende Röhre bewirkt. Als bei dem ersten und zweiten Versuche die Assimilation im sauerstoff- freien Medium gänzlich unterblieb, trugen wir der Möglichkeit Rechnung, daß Spuren von Kohlenoxyd entstehen und bei der langen Versuchsdauer die Tätigkeit der Chloroplasten beeinflussen könnten. Für alle folgenden Versuche ergänzten wir daher die Beschickung der Röhre mit einer etwa 10 cm langen Schicht von Kupferoxyd. Daraufhin machte sich aber als eine Fehlerquelle das eigentümliche Verhalten des Kupferoxyds in der Hitze, das bei seiner Verwendung in der organischen Elementaranalyse nicht in Erscheinung tritt, in recht störender Weise geltend. Das Kupfer- oxyd verliert nämlich bei hoher Temperatur langsam einen Teil seines Sauerstoffs^). Der Gasstrom wurde deshalb, um die Sauerstoffabgabe des Oxyds zum Stillstand zu bringen, einige Tage und Nächte ununterbrochen bei heller Rotglut durch das Rohr geführt und dann wurde für den Ver- such die Temperatur der Kupferoxydschicht ein wenig erniedrigt. Endlich leiteten wir den Gasstrom zum Schutze gegen Kupferstaub durch eine 10 cm hohe Watteschicht und zum Sättigen mit Wasserdampf durch eine mit Wasser von 30° beschickte Waschflasche. Erster Versuch. Pelargonium peltatum, 20,0 g frische Blätter bei 25^ und mit Beleuchtung von etwa 45000 Lux. Das Gas wurde vor dem Eintritt in die Assimilationskammer analv- ^) Vgl. Gmelin - Krauts Handbucli der anorganischen Chemie, 7. Aufl., Bd. V, Abteiig. i, S. 736, 741, 1564. Über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen. 357 siert: 166,30 ccm enthielten 12,68 com COo und 0,04 ccm O2 (infolge kleiner Fehler in der Bestimmung etwas zu hoch gefunden) entsprechend einem Gehalte von 7,62 Vol.-Proz. CO2 und 0,02 Oo. Nach 3 stündiger Atmung der Blätter bei 25 ° in diesem Strome ent- hielt das aus der Assimilationskammer austretende Gas in 166.30 ccm 12,70 ccm CO2. Hierauf begann die Belichtung. Nach 2 Stunden ergab die Analyse des austretenden Gases in 166,30 ccm 12,65 ccm CO2 und 0,07 ccm O2 . Diese Zahlen zeigen kaum eine spurenweise Assimilationstätigkeit an. Zweiter Versuch. Pelargonium zonale, 12,0 g Blätter bei 25° mit Beleuchtung von 45 000 Lux. Die Atmung im sauerstolffrer n Strom bei 25° im Dunkeln dauerte eine Stunde. Dann ermittelten, wir in 166,30 ccm 12,70 ccm COo und 0,01 ccm Oo und fanden diese Zahlen gravimetrisch bestätigt. Nach einstündiger B.^lichtung, als die Blätter noch unverändert frisch aussahen, enthielten 166,30 ccm über die Blätter geleiteten Gases 12,45 ccm COo und 0,00 ccm Oo. Die Kohlensäuredifferenz im Versuche betrug also, ohne daß die Blätter Sauerstoff abgaben, 0,25 ccm, was einer scheinbaren stündlichen Assimilationsleistung von etwa 0,008 g COo entspricht. Nach dem Fehlen des Sauerstoffs ist aber diese kleine Kohlensäuredifferenz eher dem Absorptionsvermögen der Blattsubstanz als einem Reste der Assimilationsfähigkeit zuzuschreiben. In der Tat waren die Blätter gar nicht mehr fähig zu assimilieren. Wir boten ihnen alsbald die günstigsten Bedingungen, indem das sauer- stofffreie Gas während 20 Minuten im Dunkeln durch einen sauerstoff- haltigen Strom verdrängt wurde, dessen Kohlendioxydgehalt aus einem früheren analogen Dunkelversuche mit 10 g Sambucusblättern bekannt war, nämlich in 200,30 ccm 13,62 ccm betrug neben 38,68 ccm Oo. Beim Strömen über die belichteten Pelargonienblätter fanden wir in 200,3 ccm austretendem Gase 13,59 ccm ^^2. Dritter Versuch. Pelargonium zonale, 12,0 g Blätter, Temperatur und Belichtung wie oben. Die Blätter waren lange Zeit unter Entbehrung des Sauerstoffs, nämlich 358 R- Willstätter und A. Stoll. 4 Stunden in einem Stickstoff-Kohlensäuregemisch mit etwa o,i Proz. Sauerstoff und i^/o Stunden in Sauerstoff freiem Gasstrom, der beim Aus- tritt aus dem Assimilationsapparat in 166,30 ccm 12,65 ccm CO2 und 0,00 bis 0,01 ccm O;, aufwies. Schon im Dunkelversuche nahmen die Blätter zum Teil Olivfarbe an, ein Blatt blieb noch schön grün. Der Be- lichtungsversuch dauerte i Stunde und die Analyse des austretenden Gases wurde am Ende dieser Zeit vorgenommen; in 166,30 ccm Gas fan- den wir 12,62 ccm CO2 und 0,03 ccm Oo. Vierter Versuch. Pelargonium zonale, 12,0 g Blätter; gleiche Be- dingungen wie oben. In diesem Versuch ist die Atmungsperiode abgekürzt worden, so daß die Blätter nach dem Dunkelversuch noch unverändert erschienen; wäh- rend der Belichtung wurden sie indessen dunkler grün, auch stellenweise olivstichig; die Zellstruktur erwies sich verändert. Das Verdrängen der Luft durch die sauerstofffreie Gasmischung dauerte eine Stunde und ebenso die Atmung in diesem Medium. Darauf enthielten 166,30 ccm Gas 12,65 ccm CO2 und 0,00 ccm Oo. Die Blätter wurden 2 Stunden dem Licht ausgesetzt und zwei volume- trische x^nalysen ausgeführt. Nach I Stunde enthielten 166,30 ccm Gas 12,62 ccm COo und 0,07 ccm Oo . Nach 2 Stunden enthielten 166,30 ccm Gas 12,58 ccm COo und 0,00 ccm Oo . Die Blätter haben also nicht assimiliert und sich auch nicht mehr erholt. C. Stillstand und Wiederbelebung der Assimilation in Sauerstoff freier Atmosphäre. In den bisherigen Beispielen ist erst geraume Zeit nach Beginn der BeUchtung die Assimilation gemessen worden. Da keine Assimilation mehr stattfand, so können die Blätter auch nicht in einem früheren Zeit- punkt der Belichtung noch assimiliert haben, sonst hätte der entwickelte Sauerstoff zur Belebung der Assimilation genügt. Eine Unvollkommen- über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen. 350 heit der Beobachtung lag aber darin, daß es ungewiß blieb, ob die zur Assimilation unfähigen Blätter noch lebten oder ob das Ausbleiben der Assimilation eine Folgeerscheinung eingetretener Störungen in den Lebens- vorgängen der Pflanze war. Sobald es indessen gelingt, die Assimilation nach dem StiUstand wieder zu beleben, so erweist es sich, daß der Sauer- stoffmangel den Assimilationsapparat gelähmt hat, ohne eine weiter- gehende Schädigung zu bewirken. Bei einigen folgenden Beispielen, namentlich bei Cyclamen europaeum, wurde unter den bisher beschrie- benen Versuchsbedingungen kein Stillstand der Assimilation gefunden. Es war vor allem erforderlich, die Leistung unmittelbar von Beginn der Belichtung an zu bestimmen, um das anfängliche Ausbleiben der Assi- milation zu erkennen. Bei solchen Pflanzen, die bei und nach der Sauer- stoffentziehung besonders widerstandsfähig sind, wurde nach anfäng- lichem Stillstand die Assimilation in zunehmendem Maße wieder erweckt, und zwar bis zu dem Betrage, den die Objekte unter den günstigsten Verhältnissen überhaupt noch zu ergeben vermögen. Diese Erscheinyng kann durch die Anwesenheit von Sauerstoffspuren herbeigeführt w-erden, die entweder den Blättern noch nicht entzogen waren oder die durch freiwilligen Zerfall einer aus Chlorophyll und Kohlensäure im Lichte ge- bildeten Verbindung entstanden. Während auf die Pelargonienblätter der sauerstofffreie Gasstrom schon in einer oder in wenigen Stunden so ein- wirkte, daß keine Wiederbelebung der Assimilation mehr erfolgen konnte, und daß die Blätter bald zugrunde gingen, ist bei Cyclamen europaeum und bei einer der untersuchten Moosarten tagelanges Verweilen unter dem Partialdruck Null des Sauerstoffs nötig, um die Hemmung der Assi- milation herbeizuführen ; dabei blieben die Versuchspflanzen unbeschädigt. Versuchsanordnung. Das Versuchsgas, das mit gleichmäßiger Strömungsgeschwindigkeit von 3 1 in der Stunde die Gasuhr verläßt, wird von Anbeginn der Belichtung an durch den gew^ogenen Natronkalk- apparat geleitet, und zwar 20 Minuten lang, also entsprechend dem Aus- tritt von I 1 Stickgas. LTnter solchen Umständen entspricht die gegen- über einer Vergleichswägung im vorangehenden Dunkelversuch gefundene Kohlensäuredifferenz nun nicht der wirklichen assimilatorischen Leistung 360 R- Willstätter und A. Stoll. der Blätter in dem Intervalle, weil ja das kohlensäureärmere Gas der Belichtungszeit das kohlensäurereichere der Atmungsperiode aus den schädlichen Räumen der Apparatur, die etwa ^l^ 1 betragen, zu verdrängen hatte. Erfahrungsgemäß war die assimilatorische Leistung bei unmittel- bar mit der Belichtung einsetzender und gleichbleibender Assimilation etwa doppelt so groß als der aus der Kohlensäuredifferenz gefundene scheinbare Wert für die erste Beobachtungszeit. Belege dafür finden sich im Beispiel des neunten Versuchs, wo in kohlensäurehaltiger Luft die Assimilation gemessen wurde, wie sie unmittelbar bei Beginn der Belichtung einsetzte, und in den der zweiten Abhandlung zugrunde liegenden Messungsreihen (bei 25°, 5 vol.-proz. CO,, 48000 Lux, aus denen einige Zahlen angeführt werden sollen: Pflanze Datum Assimiliertes COg (g) im I. Intervall im 2. Intervall im 3. Intervall von o bis 20 Min. von 20 bis 40 Min. von 40 bis 60 Min. Ampelopsis quinquefolia Quercus Robur Sambucus nigra, gelbe Var. Acer Negundo, gelbe Var. . Acer Negundo, weiße Var. 8. Juni N. 0,0150 0,0283 0,0298 0,015.4 0,0308 0,0313 0,0041 0,0096 0,0096 0,0043 0,0098 0,0100 0,0006 0,0011 0,0010 9. Juni V. 9. Juni N. 10. Juni V. 10. Juni N. Demgemäß setzen wir in diesen Versuchen durchwegs für die Berech- nung der Assimilationsleistung in dem wichtigen ersten Intervall die ge- fundene Kohlensäuredifferenz verdoppelt ein. Ergibt sich dabei ein niedriger, mitunter sogar ein außergewöhnlich niedriger Wert und wird schon in der nächsten Bestimmung zum Beispiel nach im ganzen 30 Minu- ten Belichtung eine bedeutend höhere Zahl gefunden, so darf daraus ge- schlossen werden, daß die Assimilation im Laufe der ersten 20 Minuten mit beinahe Null begann und daß sie infolge spurenweiser Sauerstoffent- bindung wieder zurückkehrte. Eine Störung bei der Ermittlung beginnender niedrigster assimila- torischer Leistungen könnte dadurch eintreten, daß die Blätter bei star- kem Belichten trotz der angeordneten doppelten Kühlung eine etwas höhere Temperatur annehmen, als das Thermometer anzeigt. Die dadurch bewirkte Kohlensäureentbindune^ aus der Blattsubstanz würde sich der zu über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen. 361 erkennenden Erscheinung des Kohlensäureverbrauches entgegensetzen. Aus diesem Grunde ist im folgenden mit geringerer Lichtstärke als sonst gearbeitet worden, mit etwa halber Lichtintensität, die aber (vgl. Ab- schnitt XIII der zweiten Abhandlung) noch zur vollen Betätigung der Assimilationsfähigkeit hinreicht . Fünfter Versuch. Cyclamen europaeum Zierart), 25° und Be- leuchtung von etwa 22 000 Lux. Die mit 20,0 g frisch gepflückten, tiefgrünen Blättern (Trockengewicht 2,30 g, Fläche ungefähr 300 qcm) beschickte Assimilationskammer wurde zuerst mit einem raschen Strom von sauerstoffarmem Gas gespült. Dann ließ man den konstanten Strom der sauerstofffreien Gasmischung ein- treten. Im Zeitabschnitt von 30 bis 50 Minuten führten wir den aus der Assimilationsdose austretenden Gasstrom in den Natronkalkapparat und nach 60 Minuten zur volumetrischen Anal\'Se in die Gasbürette. In diesem Zeitpunkt begann die Belichtung und die gravimetrische Bestimmung mit dem Natronkalkapparate. Zusammensetzung des Gases im Dunkelversuche : Gravimetrische Bestimmung: Auf 1,00 1 Stickstoff kamen 0,1388g CO2 (bei 18,0° und unter 707 mm bei 16°). Volumetrische Analyse: 166,30 ccm Gas enthielten 12,77 ccm ^C)., und 0,01 ccm O, (bei 18,0° und unter 707 mm bei 16°). In der ersten Belichtungsperiode wurde 0,1187 g CO2 auf i 1 austreten- den Stickgases (bei 18,0° und unter 707 mm bei 16°) gefunden und aus der Kohlensäuredifferenz gegenüber dem Dunkelversuch von 0,0201 g auf die stündliche Assimilation von 0,12 g CO2 geschlossen. Nach 1^/2 Stunden BeHchtung ergab die Gasanalyse in 166,30 ccm 7,97 ccm CO2, also 4,80 ccm C02-Differenz, und 4,75 ccm O2 (bei 18,4° und unter 707 mm bei 16°). Aus dieser Kohlensäuredifferenz berechnet sich für den vorgerückteren Zeitpunkt die stündliche Leistung von 0,157 g CO2 . Die Assimilation war im sauerstofffreien Medium schon zu Anfang bedeutend, und sie erreichte im Laufe der Belichtung einen im Verhältnis zur Fläche und zum Trockengewicht der Blätter hohen Betrag. Die Blätter bewahrten unverändertes Aussehen. 362 R- Willstätter und A. Stoll. Sechster Versuch. Cyclamen europaeum (Zierart). Im vorigen Versuch hat einstündiger Gasdurchgang genügt, um die Umgebung der Blätter gänzhch sauerstofffrei zu machen. Aber erst da- durch, daß die Alpenveilchenblätter unter dem Partialdruck Null des Sauerstoffs längere Zeit bleiben, tritt der Einfluß auf die Assimilation zutage. Gerade hierdurch wird die langsame Entleerung von Sauerstoff- orten im Blatt wahrscheinlich. Die Versuchsanordnung (20,0 g Blätter mit einem Trockengewicht von 1,94 g, Temperatur, Beleuchtung^ war die gleiche wie im vorigen Beispiel, nur die Zeit der Atmung nach dem Verdrängen des Sauerstoffs länger. Die für die nachfolgende Messung der Assimilation erforderliche gravi- metrische Bestimmung des Kohlendioxyds im Strome unter Einschluß der Atmungskohlensäure wurde nach 1^2 stündigem Durchgang des sauerstofffreien Gases vorgenommen; auf i 1 austretenden Gases kamen 0,1375 g CO2 (bei 17,5° und unter 702 mm bei 15°). Am Ende der 2 stündigen Dunkelperiode, nämlich unmittelbar vor der Belichtung, ergab die volumetrische Analyse in 166,30 ccm Gas 12,70 ccm COo und 0,02 ccm O, (bei 17,8° und unter 702 mm bei 15°). Es ist ungewiß, ob die gefundene Spur Sauerstoff dem Gasstrom oder den Blättern entstammte. In der gravimetrischen Bestimmung wurde für i 1 an der Gasuhr (17,8 °, 702 mm bei 15 °) am Anfang der Belichtung 0,1329 g CO2 gefunden; die Differenz im Vergleich mit dem Kohlensäurebetrag im Dunkeln führte zu dem niedrigen Wert 0,027 S CO2 der stündhchen assimilatorischen Leistung. Diese Zahl, etwa ein Viertel des analogen Wertes im fünften Versuche, ist aber dadurch etwas zu niedrig gefunden worden, daß wir die Natronkalkröhre unmittelbar \'or der Belichtung, 2 Minuten früher als im fünften Versuche, angeschlossen und dadurch den Einfluß des schäd- lichen Raumes über das rechnerisch berücksichtigte Maß hinaus ver- größert hatten. Nach I stündiger Belichtung ergab die volumetrische Bestimmung : 166,30 ccm Gas enthielten 8,80 ccm COo und 3,88 ccm O, (bei 17,5 ° und unter 702 mm bei 15°), Kohlensäuredifferenz = 3,90 ccm. Die stund- über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 363 liehe Leistung für diesen Zeitpunkt betrug schon 0,127 g, war also normal; die Blätter haben sich durch ihre Sauerstoffproduktion hinsichtlich der Assimilationsfähigkeit so rasch erholt, daß die gesuchte Erscheinung nicht recht deutlich wurde. Dies wiederholte sich bei nochmaliger Entfernung des Sauerstoffes. Das die Blätter umgebende Gas wurde während einer Stunde durch sauerstofffreies verdrängt und dieses 3 Stunden lang durch die Assi- milationskammer geleitet. Am Ende dieser Atmungsperiode im Dunkeln ergab : die gravimetrische Bestimmung: 0,1369 g COo für i 1 an der Gasuhr (bei 18 ° und unter 705 mm bei 15 °), die volumetrische Analyse: in 166,30 ccm Gas 12,66 ccm COo und 0,01 ccm O2 (bei 18° und unter 707 mm bei 15°;. Nun erfolgte gleichzeitig mit der Belichtung die Einschaltung des Natronkalkapparates. Im ersten Intervall der Assimilationsperiode kam auf I 1 austretenden Stickgases (bei 18,5 ° und unter 707 mm bei 15 °) 0,1253 g COo; die Kohlensäuredifferenz von 0,0111 g bedeutet eine stünd- liche Leistung von etwa 0,07 g CO.,. Diese ist erheblich erniedrigt im Ver- gleiche mit dem fünften Versuche. Volumetrische Analyse nach 1^/3 Stunden Belichtung: 166,30 ccm Gas enthielten 9,40 ccm COo und 3,26 ccm O2 (18,8 °, 707 mm bei 15 °). Gemäß der Kohlensäuredifferenz von 3,26 ccm betrug jetzt die stündliche Assi- milation 0,106 g COo. Nunmehr verdrängten wir mit dem sauerstofffreien Strom das Gas, welches im Laufe der Assimilation sauerstoffhaltig geworden, und setzten die Blätter längere Zeit dem Sauerstoffmangel aus. Sie wurden während 15 Stunden im Assimilationsraum unter Verschluß der Ein- und Austritts- öffnung gehalten, und zwar bei 15 mm Quecksilberüberdruck, um bei der Abkühlung während der Nacht Eindringen von Luft zu verhüten. Der Überdruck blieb bis zum folgenden Tage erhalten. Vor der Belich- tung war es nötig, die Atmosphäre der Assimilationskammer zu verdrän- gen, nicht um Spuren von Sauerstoff zu entfernen, welche die Atmung mittlerweile verbraucht hätte, sondern um das durch die innere At- 364 R- Willstätter und A. Stoll. mung gebildete und zum Teil bei der erniedrigten Temperatur (15 °) von der Blattsubstanz reichlicher absorbierte Kohlendioxyd bis zum Gleich- gewicht mit dem Versuchsgas zu entfernen. Am Ende der Dunkelperiode und vom Beginn der Belichtung an führten wir wieder die gravimetrischen Bestimmungen und vor der Belichtung sowie nach i stündiger Dauer derselben die volumetrischen Analysen aus. Dunkelversuch : Auf i 1 austretenden Gases kamen 0,1387 g CO2 (bei 18° und unter 714 mm bei 16°); 166,30 ccm Gas enthielten 12,82 ccm CO2 und 0,01 ccm O2 (bei 18° und unter 715 mm bei 17°). Im Lichte: Auf i 1 Stickgas kamen 0,1384 g CO2 (bei 18,3° und unter 715 mm bei 16°); 166,30 ccm Gas enthielten 12,30 ccm CO2 und 0,40 ccm O2 (bei 18,3° und unter 715 mm bei 17°). Die Blätter haben wiederum Sauerstoff entwickelt, diesmal allerdings nur noch wenig, und zwar weniger, als der verbrauchten Kohlensäure entsprach, da sie ihren Mangel an Sauerstoff auf Kosten des freiwerden- den decken konnten. Es handelte sich bei der Assimilation, die gemessen wurde, nicht etwa um innere Kohlensäureversorgung durch angehäufte pflanzliche Säuren, die einen zu geringen Kohlensäureverbrauch vor- täuschen würde ; in einem solchen Falle müßte der entbundene Sauerstoff die absorbierte Kohlensäuredifferenz übertreffen. Für das erste Intervall der neuen Assimilationsperiode ergab sich aus der Kohlensäuredifferenz eine sehr niedrige stündhche Leistung, nämlich von nur 0,0018 g, für den Zeitpunkt von einer Stunde nach Beginn der Belichtung erreichte die stündliche Leistung bereits 0,017 g. Die Er- holung war ansehnlich, aber weitere Fortschritte machte sie nicht. Neben der Schädigung, die bei der gewählten Versuchspflanze rückgängig ge- macht werden kann, gehen irreparable Wirkungen der langdauernden Sauerstoffentziehung, die schließlich den Tod des Blattes herbeiführen würden, einher. Je länger dauernd der Sauerstoffmangel, desto geringer die Assimilationsfähigkeit und desto unvollkommener die Erholung. Nach der gravimetrischen Bestimmung im Intervall von i Stunde bis I Stunde 40 Minuten seit Beginn der Belichtung waren in 2 1 durch die Gasuhr austretenden Stickstoffs enthalten : 0,2655 g CO2 (bei 18,5 ° über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen. 36^ und unter 715 mm bei 17°); die stündliche Leistung betrug also nur 0,018 g COo. Bis zum Ende dieses Versuches ist das Aussehen der Cvclamenblätter normal geblieben. Siebenter Versuch. Cyclamen europaeum (Zierart). Beim Experiment mit Alpenveilchenblättern, die morgens (23. Nov.) ge- pflückt und ohne Gelegenheit zur Versorgung mit Assimilaten sofort lang- dauerndem Sauerstoffmangel unterworfen wurden, ging die Schädigung über die im vorigen Versuch bewirkte hinaus, und das Ergebnis entsprach den Versuchen i bis 4 mit Pelargonienblättern. Das Versuchsobjekt ist unfähig geworden zur Assimilation und zu ihrer Wiedererweckung. Unterscheidend gegenüber den Beobachtungen an Pelargonien ist nur die längere Dauer der Sauerstoff entziehung, die notwendig ist. Die Blätter (20 g) befanden sich 2 Stunden bei 25 ° im strömenden sauerstofffreien Gase, darauf 15 Stunden im stehenden, und zwar anfangs bei derselben Temperatur, dann bei 17°. Die Blätter blieben tiefgrün und unverändert frisch. Bei Belichtung entwickelten sie aber anfangs gar keinen Sauerstoff und im Verlaufe einer Stunde nur eine Spur. Die Belichtung dauerte i^/o Stunden, darauf ließen wir reine Luft durch den Assimilationsraum strömen und die Blätter darin 2^, Stunden bei 25° stehen. Nun wurde ein Assimilationsversuch in 5 Proz. Kohlen- dioxyd enthaltender Luft ausgeführt, der aber trotz des tadellosen Aus- sehens der Blätter negativ verlief. Erst einen Tag später waren die Blätter vom Rande gegen die Basis hin oli\' und sie erschienen, ähnlich wie ge- drückte oder abgebrühte Blätter, dunkler grün längs den Hauptadern. Volumetrische Bestimmungen zum Assimilationsversuch: Vor der langen Atmungsperiode enthielten 166,30 ccm Gas 12,81 ccm CO2 und 0,01 ccm Oo . Unmittelbar vor der Belichtung enthielten 166,30 ccm Gas 12,72 ccm CO2 und 0,00 ccm Oo. Nach 10 Minuten Belichtung enthielten 166,30 ccm Gas 12,73 ccm CO., und 0,00 ccm O,,. 366 R. Willstätter und A. Stoll. Nach I Stunde Belichtung enthielten 166,30 ccm Gas 12,73 ccm CO2 und 0,09 ccm O2 . Gravimetrische Bestimmungen zum Erholungsversuch: Unmittelbar vor der Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,0943 g COo. Während o bis 20 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gas- uhr 0,0946 g CO2 . Während 20 bis 40 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gas- uhr 0,0952 g CO2. Während 40 bis 60 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gas- uhr 0,0947 g CO2. Achter Versuch, mit einem Laubmoose, Polytrichum juniperinum Hdw. Um das Verhalten der Moose, deren Widerstandsfähigkeit gegen Sauerstoffmangel die in der Einleitung angeführte Arbeit von A. J. Ewart nachgewiesen hat, bei der vollständigen Entziehung des Sauerstoffs zu untersuchen, verwendeten wir zwei Laubmoose, die im Feuchtigkeits- gehalt weit differieren, ein besonders trockensubstanzreiches Haarmoos und (im neunten Versuch) ein Weißmoos von krautiger Beschaffenheit und sehr niedrigem Trockengehalt. 10 g frische Polytrichumzweige gaben 4,50 g Trockengewicht. 10 g frisches Leucobryum gaben 0,60 g Trockengewicht. Das Haarmoos ist gegen Sauerstoffentzug sehr resistent, wie Cyclamen, das Weißmoos dagegen so empfindlich wie Pelargonium, nur mit dem Unterschiede, daß diese Moosart den Stillstand der Assimilation viel besser überlebt. 10 g frische Polytrichumstengelchen wurden da, wo sie von Grün in Braun übergehen und holzig werden, mit einer scharfen Schere abgeschnit- ten und in das Silberdrahtnetz' rasch so eingesteckt, daß ihre Enden den nassen Boden der Kammer berührten. Die beim Einstellen in den Assi- milationsraum etwas welken Blättchen erschienen nach kurzem Verweilen in der feuchten Atmosphäre der Kammer wieder frisch und blieben unver- ändert bei der Belichtung und im ganzen Verlaufe des 3tägigen Versuches. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoffmengen. 367 Das Kohlensäure-Stickstoffgemisch war in diesem Versuche nicht ganz frei von Sauerstoff, sondern es enthielt davon noch 0,02 bis 0,04 Vol.-Proz. Nach 3 stündigem Durchleiten des Gases war die Assimilationsfähigkeit merklich geschwächt und es gelang, sie in einer halben Stunde wieder zu beleben von der stündlichen Leistung 0,037 t>is zu 0,056 g CO2. Zur vollständigen Sauerstoffentziehung heßen wir die Pflanze in dem annähernd Sauerstoff freien ^Medium in langen Dunkelperioden atmen. Dann bestätigte die Gasanalyse, daß die letzten Spuren des Sauerstoffs aufgezehrt waren. Nach einer 24 stündigen Atmungsperiode war in der ersten Zeit der darauffolgenden Behchtung die Assimilation des Laub- mooses auf einen Bruchteil des normalen Wertes herabgedrückt, sie betrug nach der Messung im ersten Intervall von 20 Minuten nur 0,012 g CO2 für die Stunde und sie erholte sich im Laufe der erstenStunde zu annähernd .dem dreifachen Betrage. In einer anschließenden zweiten Atmungsperiode von 42 Stunden Dauer war die Atmosphäre in der verschlossenen Kammer mindestens während der letzten 24 Stunden vollkommen Sauerstoff frei. Hierauf er- wies sich die assimilatorische Leistung bei Beginn der Belichtung als sehr gering, stündlich 0,004 g ^O.,, und sie stieg während einer Stunde Belich- tung auf beinahe das Vierfache. Daß die Assimilation immerhin hinter der normalen Leistung des Objektes zurückbleibt, entspricht nur der all- gemeinen Erscheinung bei langdauernder Einwirkung der Versuchs- bedingungen. Die beobachteten assimilatorischen Werte sind in der Tabelle 105 zu- sammengestellt und die Einzelheiten des Versuches aus den nachstehenden analytischen Angaben ersichtlich. Tabelle 105. Assimilation von Polytrichum nach Sauerstoffentziehung. (25^, 7V2 pi'oz. CO,, 22000 Lux.) Dauer der einzelnen Atmungsperioden im Dunkeln. Oo-Gehalt des Gases im Dunkelversuch in Proz. Stündlich assimiliertes CO2 (g) bei Belichtung von o bis 20 Min. ^'-i Stunde i Stunde 3 Stunden bei 25 ° 17 St. bei 17°, 6 St. bei 2- 40 St. bei 16°, 2 St. bei 2j 0,04 bis 0,02 0,02 bis 0,00 0,02 bis 0,00 0.037 0,012 0,004 0,056 0,027 0,013 0,032 0,033 368 R. Willstätter und A. Stoll. Erste Atmungsperiode (3 Stunden) : Nach 2 stündigem Durchleiten des Versuchsgases enthielten 166,30 ccm desselben 12,85 ccm COo und 0,07 ccm O. (bei 18,5° und unter 725 mm bei 17,5°;- Am Ende der Periode entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1400 g COo (bei 18,8° und unter 725 mm bei 17,5°;. Erste Belichtungsperiode (25°, 22000 Lux): Während o bis 20 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1338 g CO2 (bei 18,6° und unter 725 mm bei 17°), woraus auf 0,0124 g assimilatorische Leistung im Intervall geschlossen wurde. Nach 30 Minuten Belichtung enthielten 166,30 ccm Gas 11,17 ccm CO2 und 1,49 ccm Oo (bei 18,6° und unter 725 mm bei 17°); Kohlensäuredif- ferenz 1,68 ccm. Während 50 bis 70 Minuten Belichtung kamen auf i 1 an der Gasuhr 0,1193 g CO2 (bei 19,1° und unter 725 mm bei 17°). Zweite Atmungsperiode (ungefähr 24 Stunden): Nach 2 stündigem Durchleiten blieb das Gas 17 Stunden bei 17° und 3 Stunden bei 25° in der verschlossenen Assimilationskammer; das hieraus verdrängte Gas enthielt in 166,30 ccm 14,67 ccm COa^und 0,00 ccm Oo. Das kohlendioxydreiche Gas verdrängte man 3 Stunden lang durch das Versuchsgas und fand gegen Ende dieser Zeit auf i 1 austretenden Stickstoffs 0,1387 g CO2 (bei 18° und unter 719 mm bei 16°). Unmittelbar vor der Behchtung enthielten 166,30 ccm Gas 12,71 ccm CO2 und 0,01 ccm O2 (bei 18,4° und unter 719 mm von 16°). Zweite Belichtungsperiode : Während o bis 20 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1367 g CO2 (bei 18° und unter 719 mm bei 16°). Während 20 bis 40 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1291g CO2 (bei 18° und unter 719 mm von 16°). Nach I Stunde Behchtung enthielten 166,30 ccm Gas 11,70 ccm CO2 und 0,97 ccm Oo (bei 18° und unter 719 mm von 16°); Kohlensäurediffe- renz 1,01, Sauerstoff differenz 0,96 ccm. über die Abhängigkeit der Assimilation von der Anwesenheit kleiner Sauerstoff mengen. 369 Dritte Atmungsperiode (42 Stunden): Nach 40 stündigem Verweilen des Mooses im Dunkeln bei 16° wurde die Temperatur von 25 ° wiederhergestellt und das Gas aus dem Assi- milationsraum in 2 Stunden durch den Strom des Versuchsgases verdrängt, das vollkommen Sauerstoff frei war. Gegen Ende der Periode enthielten 166,30 ccm Gas 12,80 ccm CO2 und 0,00 ccm O2 (bei 16^/0° und unter 715 mm von 16°). Unmittelbar vor der Belichtung entsprachen i 1 aus der Gasuhr tre- tenden Stickstoffs 0,1404 g CO2 (bei 16V2 ° und unter 715 mm von 14°). Dritte Belichtungsperiode : Während o bis 20 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1397 g CO2 (bei 16^/2° und unter 715 mm von 15°). Nach 30 Minuten Belichtung enthielten 166,30 ccm Gas 12,41 ccm COo und 0,36 ccm Oo (bei 16^/0° und unter 715 mm von 14°). Während 40 bis 60 Minuten Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1354 g CO2 (bei 16^2° und unter 715 mm von 15°). Neunter Versuch. Leucobryum glaucum, Schimp. Die Beschickung der Assimilationskammer bestand in einem gleich- mäi3igen Rasen von 30,0 g Sproßen des Weißmooses, die an den Enden der g-rünen oberen Teile mit der Schere abgeschnitten waren. Ein Vor- versuch in 5 Vol.-Proz. CO2 enthaltender Luft diente zur Orientierung über das nur schwächliche Assimilationsvermögen des Objektes unter sonst normalen Verhältnissen und zur Kontrolle der rechnerischen Berücksichti- gung des schädlichen Raumes in der Assimilationsapparatur, wie sie je- weils bei der Bestimmung in der ersten Belichtungszeit erfolgte. Im Dunkelversuch in C02-haltiger Luft enthielten 200,30 ccm Gas 10,62 ccm CO2 und 42,28 ccm O2 (bei 1772° und unter 726 mm von 15°) und unter denselben Bedingungen entsprachen i 1 an der Gasuhr aus- tretender Luft 0,0960 g CO2. Im ersten Belichtungsintervall von 20 Minuten entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,0928 g CO2 (1772°, 726 mm von 15°). Verdoppelt man in Anrechnung des schädlichen Raumes die Kohlendioxyddifferenz von 0,0032 g, so ergibt sich durch Umrechnung auf i Stunde die Leistung VVillstätter-Stoll, Assimilation. ji 370 R- Willstätter und A. Stoll. 0,019 g. Dieser Wert wird durch die volumetrische Analyse nach 30 Minu- ten Behchtung bestätigt. 200,30 ccm Gas enthielten 9,93 ccm CO2 und 42,98 ccm O2 (bei 17^2° und unter 726 mm von 15°). Daraus folgt die stündhche Leistung von 0,019 g CO2. Nun begann die^ Entziehung des Sauerstoffs, indem das sauerstofffreie Gas während i Stunde die kohlensäurehaltige Luft verdrängte und dann 2 weitere Stunden durch die Assimilationskammer strömte. Diese Dauer hat genügt, die Assimilation fast ganz aufzuheben, und zwar so, daß auch nur mehr eine teilweise Wiederbelebung möglich war. Das Aussehen des Mooses war indessen unverändert frisch. Unmittelbar vor der Belichtung entsprachen i 1 an der Gasuhr aus- tretendem Stickstoff 0,1414 g CO, (bei 17^2° und unter 726 mm von 15°) und 166,30 ccm Gas enthielten unter denselben Bedingungen 12,72 ccm CO2 und 0,00 ccm O2 . Der Assimilationsversuch wurde bei 25 ° mit Beleuchtung von 22 000 Lux vorgenommen. In den ersten 20 Minuten entsprachen i 1 an der Gasuhr 0,1411 g CO2 (bei 17^2° und unter 726 mm von 15°), die Kohlensäuredifferenz betrug also 0,3 mg. Nach der Behchtungszeit von 30 Minuten enthielten 166,30 ccm Gas 12,69 ccm COo und 0,03 ccm Oo. Zur Erholung blieb das Objekt in der luftgefüllten Kammer über Nacht ; am folgenden Tage zeigte sich im Assimilationsversuch unter den günstig- sten Bedingungen in drei Intervallen von 20 Minuten ein Kohlensäure- verbrauch von 0,0020, 0,0014, 0,0016 g COo entsprechend stündlichen Assimilationsleistungen von 0,006, 0,004, 0,005 g CO2, d. i. 1/4 bis ^'3 der Anfangsleistung. Siebente Abhandlung. Untersuchung über Zwischenstufen der Assimilation. I. Über die Reduktion der Kohlensäure ohne Mitwirkung des Chlorophylls. Von den zahlreichen Fällen der Umformung des Kohlendioxyds in die niedrigeren Oxydationsstufen des Methans sind zur Nachahmung der pflanzhchen Photosynthese und zu ihrer Erklärung namentlich einige Methoden herangezogen worden, die auf der Anwendung von elektrischen Entladungen, von ultravioletter Strahlung und von Radioaktivität be- ruhen. Eine Reihe von Arbeiten hat die Zerlegung der Kohlensäure ohne Mitwirkung des Chlorophylls zum Gegenstand und führt zu dem Ergebnis, daß auch andere Energieformen als die der Sonnenstrahlen zur Reduktion der Kohlensäure ausgenützt werden können, daß also die Leistung der autotrophen Gewächse sich durch künstliche Prozesse der Kohlenstoff assimilation ersetzen läßt. Diese Arbeiten verdienen großes Interesse in chemischer Hinsicht, geringes in pflanzenphysiologischer. Sie sagen gar nichts über den Vorgang im Chlorophyllkorn aus. Es be- darf keines Beweises für die Möglichkeit, die stabilste Verbindung des Kohlenstoffs durch die chemische Energie von Reduktionsmitteln oder durch andere Mittel der Energiezufuhr zu zerlegen. In der Tat ist die Reduktion auf die verschiedenartigsten Weisen gelungen, die keinen Zu- sammenhang mit den Verhältnissen in der Pflanze haben und aus denen keine Schlußfolgerungen auf den natürlichen Vorgang gezogen werden können. Eine Aufgabe der Pflanzenphysiologie besteht darin, die Vor- richtungen der Chloroplasten für die Kohlensäurezerlegung und die 372 R. Willstätter und A. Stoll. Kohlehydratsynthese genauer zu erforschen und die einzelnen Phasen des in den Assimilationsorganen verlaufenden Vorganges zu bestimmen. Diese Aufgabe wird der Lösung nicht nähergerückt, wenn unter irgend- welchen Bedingungen der Zerfall der Kohlensäure bewirkt wird, nämlich statt einfach durch Erhitzen mittels anderer Arten der Energiezuführung. Das Ziel, aus Kohlensäure und Wasser lediglich durch Zufuhr von Energie Zucker aufzubauen, also ,,eine künstliche -Assimilation ohne Chlorophyll, Chloroplasten, ohne lebende Zelle und ohne Enzyme" durch- zuführen, hat W. Löb^) in einer Reihe gründhcher Arbeiten angestrebt und als Energieform für den endothermen Vorgang die dunkle elektrische Entladung angewandt, auf die als geeignetes Mittel für den Ab- bau der Kohlensäure schon die älteren Arbeiten von B. C. Brodie^), M. Berthelot^) und S. M. Losanitsch und M. Z. Jovitschitsch*) hingewiesen hatten. Lob untersuchte das Auftreten von Formaldehyd bei den Reaktionen zwischen Kohlendioxyd oder Kohlenoxyd mit Wasser- stoff und Wasser sowie bei der Zersetzung \'on feuchtem Kohlendioxyd. Dies ist eine komplizierte Erscheinung, von der folgende Teilvorgänge in direktem Zusammenhang mit der Formaldehydbildung stehen : 2 CO. = 2 CO + O, , CO + H^O = CO, + H, , H, +C0 = H,CO. Bei der Kombination von Kohlenoxyd, Wasserstoff und Wasser ließ sich neben der reichlichen Bildung von Formaldehyd ein Polymeres des- selben oder richtiger ein Kondensationsprodukt nachweisen, der Glykol- aldehyd CHO • CHoOH, der bekanntlich nach mehreren Arten weiter zu Hexosen kondensiert werden kann. ,,In dieser Reaktionsfolge" sah W. Lob ,,das Problem einer künstlichen Kohlensäureassimilation, die lediglich aus Kohlensäure, Wasser und Energie Zucker aufbaut, gelöst." 1) W. Lob, Zeitschr. f. Elektrochemie ii, 745 [1903] und 12, 282 [1906] und Landw. Jahrb. 35, 541 [1906]. 2) B. C. Brodie, Ann. d. Chem. 174, 2S4 [1874]. ^) M. Berthelot, Compt. rend. 126, 609 [1898] und 131, 772 [1900], Ann. Chim. Phys. [7], 22, 445 [1901]. *) S. M. Losanitsch und M. Z. Jovitschitsch, Ber. d. deutsch, chem. Ges. 30, 135 [1897]. über die Reduktion der Kohlensäure ohne Mitwirkung des Chlorophylls. 373 Und er folgerte daraus: ,,Die Versuche über das Verhalten der feuchten Kohlensäure gegenüber der dunklen Entladung bieten eine experimentelle Stütze für die bekannte Assimilationshypothese von Baeyers in modi- fizierter Form, die sich in folgenden Gleichungen wiedergeben läßt: (i) CO, + Ho_0 = CO + H, + O,. (2) H, + CO = H,CO. (3) 2 :H, + CO) =: CH.OH • CHO. (4) 6 H2CO = C„Hi,0« . (5) 3 CH,0H • CHO = C.Hi^O, ." An Stelle der dunklen elektrischen Entladung bietet auch das ultra- violette Licht der Quecksilberdampflampe eine geeignete Energiequelle für die Kohlensäurereduktion und die sich daran anschließenden ersten Synthesen. Mit dieser Methode haben D. Berthelot und H. Gau- dechon^) die Reaktion zwischen Kohlenoxyd und Wasserstoff unter- sucht und die Vereinigung zum Formaldehyd erzielt. Die photochemi- schen Versuche sollen nach der Meinung von Berthelot und Gau- dechon mehrere noch strittige Punkte hinsichtlich des Mechanismus der Chlorophyllwirkung klarlegen und genau ein Reaktionsschema ver- wirklichen, das M. Berthelot-) im Jahre 1864 in seinen ,,Le9ons sur les methodes generales de Synthese en chimie organique" aufgestellt habe, um die Synthese der Kohlehydrate, Stärke und Zucker, durch das Licht in den grünen Pflanzenteilen in folgender Weise durch die Annahme von Formaldehyd als Zwischenglied zu erklären : ,,. . . par le fait de la respiration vegetale, l'eau passe ä l'etat d'hydro- gene et l'acide carbonique ä l'etat d'oxyde de carbone. Ces deux corps ainsi reduits reagissent Tun sur l'autre, ä l'etat naissant, et engendrent tous les composes naturels . . . D'apres cette maniere de voir l'oxyde de carbone serait dans la nature vivante, aussi bien que dans nos forma- tions artificielles la source du carbone des matieres organiques ... La formation des matieres organiques dans les vegetaux, par le fait de la reaction de l'oxyde de carbone sur l'hydrogene naissant, c'est-ä-dire en 1) D. Berthelot und H. C^audechon, Comp. rcnd. 150, 1690 [1910]. 2) M. Berthelot, loc. cit. S. iSo. 374 R- Willstättei- und A. StoU. vertu de l'action reciproque exercee entre les elements, carbone, hydrogene et oxygene, mis en presence ä equivalents egaux: CO +H = CHO, represente im phenomene comparable, ä certains egards, avec celui que nous avons realise dans la decomposition du formiate de baryte par la chaleur. Le formiate de baryte, en effet, fournit ä la fois ces memes elements carbone, hydrogene et oxygene, et les met en presence ä equi- valents egaux : C-^HBaO^ = CO^ BaO + CHO ." Auch mehrere Abhandlungen von J. Stoklasa^ betreffen die An- wendung ultravioletter Strahlung für die ,, Photochemische Synthese der Kohlehydrate". Anknüpfend an Versuche- ' über das Vorkommen glyko- ly tischer Enzyme erörtern Stoklasa und Zdobnicky zwei in den grünen Pflanzenteilen von ihnen angenommene Vorgänge der Kohlen- säurezersetzung durch Sonnenlicht, die sie durch folgende Gleichungen ausdrücken : „2 CO, + 2 H, = 2 HCOH + O, ", „HoCOg + H, = HCOH + CH, + H,0 + 2 O,." Sie bemerken dazu: ,, Unsere Hypothese, daß das Kohlendioxyd durch Wasserstoff in statu nascendi unter Einwirkung der Sonnenstrahlen in der chlorophyllhaltigen Zelle zu Formaldehyd reduziert wird, hat sich bewahrheitet, doch muß nebstdem noch in der chlorophyllhaltigen Zelle die von Baeyer beobachtete Reaktion, die durch folgende Gleichung versinnlicht wird, CO, + H,0 = HCOH + O, stattgefunden haben." Die Bildung des erforderlichen Wasserstoffs wird folgendermaßen erklärt: ,,Bei den autotrophen Pflanzen ist der erste Prozeß der Kohlendioxydreduktion Aufbau und Assimilation, der zweite ^) J. Stoklasa und W. Zdobnicky, Monatshefte f. Chemie 32, 53 [1911] und Biochem. Zeitschr. 30, 433 [1911]; J. Stoklasa, J. Sebor und \V. Zdobnicky, Biochem. Zeitschr. 41, 333 [1912] und 47, 186 [1912]; vgl. dazu W. Lob, Biochem. Zeitschr. 31, 358 [1911] ""d 43. 434 [1912]. -) J. Stoklasa und A. Ernest und K. Chocensky, Zeitschr. f. physiol. Chem. 50, 303 [1907]. über die Reduktion der Kohlensäure ohne ^[it\vi^kung de> Chl(jropli\ lIs. 37^ ist gerade im Gegenteil Abbau, Dissimilation, und man darf wohl vermuten, daß diese beiden Prozesse in kausalem Konnex stehen." Von ihren Beob- achtungen heben Stoklasa, Sebor und Zdobnicky hervor: ,, Durch die Einwirkung der ultravioletten Strahlen auf Kohlendioxyd und Wasserstoff, welch letzterer sich in statu nascendi befand, bei Gegenwart von Kaliumhydroxyd bildete sich Zucker", und sie kommen zu der Schlußfolgerung, ,,daß unsere Zuckersynthese unter der Einwirkung der ultravioletten Strahlen der Ouecksilberquarzlampe analog den Verhält- nissen, die in der Natur, also in der chlorophyllhaltigen Zelle herrschen, verläuft". Gesetzt den Fall, die experimentellen Angaben von Stoklasa seien zu bestätigen, so ist doch jegUche Parallele mit den Vorgängen in der Pflanze schon in Anbetracht der Verhältnisse des assimilatorischen Gas- wechsels ausgeschlossen. Ohne Reduktionsmittel und zugleich ohne optischen Sensibilisator haben F. L. Usher und J. H. Priestley^") in ihrer im folgenden noch eingehender zu berücksichtigenden dritten Arbeit über ,,The Mechanism of Carbon Assimilation" die Zersetzung einer wässerigen Lösung von Kohlendioxyd bewirkt, und zwar mit zwei Methoden: Durch Einwir- kung von -Hexylenaldehyd, welcher in überwiegender Menge in allen grünen Pflanzen \^orkommt, mit den verwendeten Formaldehydreagenzien intensive Färbungen gibt. Die von den verschiedenen Forschern mit Pflanzendestillaten erhaltenen Farbreaktionen sind auf die anderen in den Pflanzen vorkommenden Aldehyde, welche wir zum Teil noch gar nicht kennen, zurückzuführen." Die Reaktionen der Destillate von Blättern, die auf ihrem Gehalt an Hexylenaldehyd beruhen, waren wohl geeignet, ehe man diesen kannte. 382 R- Willstätter und A. Stoll. das Auftreten von Formaldehyd vorzutäuschen. Im Jahre 1881 hat J. ReinkeM entdeckt, daß in den Destillaten grüner Blätter eine flüch- tige Verbindung von Aldehydcharakter enthalten ist; nach seiner Annahme sollten wir es in dieser Substanz ,, wirklich mit Formaldehyd oder vielmehr dessen nächsten Abkömmlingen zu tun haben". Die Blätter von mehr als 50 untersuchten Pflanzen gaben aldehydisch reagierende Destillate, chlorophyllfreie Pflanzenteile, Wurzeln von Salix, gleichfalls, aber nicht eine Anzahl von Pilzen. Da die Destillate etiolierter Keimlinge zum Unter- schied von den am Licht gezogenen kein Reduktionsvermögen zeigten, so erschien es wahrscheinlich, „daß diese Substanz ein Erzeugnis des Chloro- phyllapparates unter Mitwirkung des Lichtes ist". Später haben J. Rein ke und E. Braunmüller-; die Menge der Aldehyde in verschiedenen Pflan- zen bestimmt und sind großen Schwankungen begegnet; in der Mehr- zahl der Fälle, aber nicht in allen, war der Aldehydgehalt von im Dunkeln gehaltenen Blättern geringer als von belichteten. Die Aldehydreaktion beruhte indessen, wie Th. Curtius und J. Reinke^) im Jahre 1897 durch die Kondensation mit m-Nitrobenzhydrazid gezeigt haben, nicht auf dem Vorkommen von Formaldehyd, sondern von einem oder mehreren Aldehyden, deren Zusammensetzung erst durch die gründlichen Unter- suchungen von Curtius und Franzen enträtselt worden ist. Kurze Zeit nach der ersten Mitteilung von Reinke fand A. Mori*) in chlorophyllführenden Pflanzenorganen einen Aldehydgehalt, und zwar nur dann, wenn dieselben dem Lichte ausgesetzt gewesen. Er zeigte, daß die Wasserdampfdestillate verdünnte Silbernitratlösung reduzierten und fuchsinschwefhge Säure röteten, und er glaubte daraus auf die Anwesen- heit von Formaldehyd in den Pflanzen schließen zu können. Jene Er- scheinungen sind aber keine spezifischen Reaktionen des Formaldehyds. ^) J. Reinke, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 14, 2144 [1881]; Untersuchungen aus dem botanischen Laboratorium der Universität Göttingen, III, 187 [1881]; J. Reinke und L. Krätzschmar, Untersuchungen aus dem botanischen Laboratorium der Universität Göt- tingen, IV, 61 [1883]. 2) J. Reinke und E. Braunmüllcr, Ber. d. deutsch, bot. Ges. 17, 7 [1899]. ^) Th. Curtius und J. Reinke, Ber. d. deutsch, bot. Ges. 15, 201 [1897]. *) A. Mori, Proc. verb. della See. Toscana di Scienze naturali 8. Jan. 1882 und Nuovo Giornale Botanico Ital. 14, 147 [1882]. Über das Vorkommen \ on Formaldchyd in den f^rünen Pflanzcnteikn. ^8j Eingehendere Untersuchungen über die Aldehydreaktionen grüner Pflanzenteile wurden sodann von G. Pollacci^) veröffentlicht. Die Destil- late aus den Blättern von Pflanzen, die im Lichte gestanden hatten, wirkten reduzierend, gaben Fällungen mit Anilinwasser und mit Phenyl- hydrazinen und zeigten verschiedene Farbreaktionen, die indessen nach Czapek-), Euler^), Bokorny-*) und nach Curtius und Franzen nicht speziell dem Formaldehyd zugeschrieben werden dürfen. G. Plancher und C. Ravenna') haben die Versuche von Pollacci nachgeprüft und seinen Angaben widersprochen. Die Destillate grüner Blätter gaben nur einige allgemeine Aldehydreaktionen, aber sie ver- sagten in bezug auf mehrere charakteristische Farbreaktionen des Formaldehyds und lieferten keine Niederschläge mit p-Bromphenyl- hydrazin, obschon übrigens sie wegen des Gehaltes an Hexylenaldehyd damit hätten Fällungen geben müssen. Vermutlich waren in diesen Proben die Substanzmengen zu gering, die Verdünnung zu groß. Den Befund von Pollacci, daß ein Zweig von Vanilla planifolia bei Gegenwart von Kohlendioxyd im Lichte Schiffsches Reagens rötet, finden Plancher und Ravenna nicht beweisend für die Gegenwart von Formaldehyd, da auch der bei der Assimilation entbundene Sauerstoff die fuchsin- schweflige Säure röte. Wir sind gleichfalls der Meinung, daß die Rotfär- bung unter diesen Verhältnissen nicht einmal die Gegenwart irgendeines Aldehyds sicherstelle. Aber die fuchsinschweflige Säure reagiert nicht auf Sauerstoff, sondern sie rötet sich bei der Entziehung von schwef- liger Säure, zum Beispiel durch alkalische Mittel. Ein neues Reagens auf Formaldehyd, „welches sich als besonders emp- findHch und für Formaldehyd spezifisch gezeigt hat", beschrieb V. Gräfe«) 1) G. Pollacci, Atti Istit. Botan., Pavia VI, 27 [1899] und VII, 45 [1899] und .\tti della Reale Accad. dei Lincei Ser. V, 16, I, 199 [1907]; E. Mameli und G. Pollacci, Atti dclla Reale Accad. dei Lincei Ser. V, 17, I, 739 [1908]. 2) F. Czapek, Botan. Ztg. 58, IL Abteiig. 153 [1900]. ^) H. Euler, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 37, 341 1 [1904]. *) Th. Bokorny, Chemikerzeitung 33, 1141 und 1150 [1909]. ^) G. Plancher und C. Ravenna, Atti dclla Reale Accad. dei Lincei Ser. V, 13, 11, 45'> [1904]. 6) V. Gräfe, Österr. botan. Zeitschr. 56, 289 [1906]; siehe auch J. Stoklasa und W. Zdobnicky, Monatshefte f. Chemie 32, 53, 73 [1910]. 384 R- Willstätter und A. StoU. und er benützte es zum Nachweis des Aldehyds in der Pflanze. Die Reak- tion ist eine grüne Färbung mit der Lösung von Diphenylamin in konzen- trierter Schwefelsäure; dies ist also das Reagens, das auch mit nitrosen Verbindungen und mit allen möglichen Oxydationsmitteln intensive Fär- bungen gibt. Bokorny fand die Reaktion mit Formaldehyd nicht bestätigt, und Curtius und Franzen zeigten, daß Formaldehyd gar keine Färbung mit Diphenylaminschwefelsäure liefert; sie vermuten, daß die im Laboratorium von Gräfe in Wien verwendete Schwefelsäure unrein war. Da auch andere Aldehyde unter den Versuchsbedingungen von Gräfe Färbungen geben, so hat Gräfe keinen Nachweis von Formaldehyd erbracht. G. Kimpflin\) operierte an lebenden Agaven mit einer Lösung von p-Methylamino-m-kresol (d. i. der Entwickler „Metol") und konzentrier- tem Natriumbisulfit und beobachtete nach dem Belichten der Blätter an ihren Schnitten einen roten Niederschlag, wie ihn Formaldehyd mit dem Reagens erzeugt. R. J. H. Gibson-) suchte seine ,,Photoelectric Theory of Photosynthesis"^) mittels einer von Mulliken, Brown und French angegebenen Probe auf Formaldehyd zu stützen, indem er frisch belichtete Blätter zerschnitt, die Stückchen mit Wasser extra- hierte und die Flüssigkeit zur alkoholischen Lösung von Gallussäure zu- fließen ließ, die mit konzentrierter Schwefelsäure unterschichtet war. Ein blaugrüner Ring an der Grenzzone soll für Formaldehyd beweisend sein. Aber auch bei dieser Probe verhält sich der Hexylenaldehyd ähnlich, wenn er auch weniger intensive Färbungen gibt; überdies geben nach H. Wager ^) auch Lösungen von Zucker und Stärke bei dieser Probe eine ausgesprochene Reaktion. Endlich hat L. Gentil^) in Rübenblät- tern und Wurzeln den Formaldehyd mit zahlreichen quahtativen Proben nachgewiesen und durch Reduktion von Silberlösung quantitativ bestim- ^) G. Kimpflin, Compt. rend. 144, 148 [1907]. 2) R. J. H. Gibson, Ann. of Botany 22, 117 [1908]. 3) Die Hypothese von Gibson lautet: „that the light rays absorbed by Chlorophyll are transformed by it into electric energy, and that this transformed energy effects the decompo- sition of carbonic acid." 4) H. Wager, Proc. Roy. Soc. Ser. B 87, 386, 394 [1914]. ^) L. Gentil, Bulletin de l'Assoc. des Chimistes de Sucrerie et Distillerie 27, 169 [1909]. über das Vorkommen von Formaldchyd in den grünen Pflanzenteilen. 385 men wollen. Nach Curtius und Franzen sind die verschiedenen hier angewandten Reaktionen dann ungeeignet, wenn außer Formalde- hyd noch andere Aldehyde vorliegen können, was in Pflanzendcstillaten wirklich der Fall ist. Der gesuchte Nachweis konnte also nur mit einer Methode geführt werden, die den einfachsten Aldehyd von allen Homologen und von Wasserstoff ärmeren Aldehyden sicher unterscheidet. Curtius und Franzen 1) schlugen bei der Untersuchung der Hainbuchenblätter einen neuen Weg ein. ,,Die in den Blättern vorhandenen Aldehyde wurden nach Entfernung der flüchtigen Säuren durch Oxydation mit Silberoxyd in die entsprechenden Säuren verwandelt und in dem so erhaltenen Säure- gemenge die dem Formaldehyd entsprechende Säure, die Ameisensäure, welche sich ja in ganz charakteristischer Weise von allen übrigen Säuren unterscheidet, nachgewiesen." ,,Da die Ameisensäure durch Oxydation ihres Aldehydes mit Silbernitrat entstanden ist, so schließt ihr Nachweis auch den Nachweis von Formaldehyd in der Hainbuche in sich." Allein diese Feststellung ist von H. Fincke'-) angegriffen worden und Curtius und Franzen =^) haben die Berechtigung des erhobenen Einwandes anerkannt. Fincke hat zunächst bezweifelt, ob ,,auf diese Weise Formaldehyd, der in der Pflanze vorhanden ist, wirklich und in der Hauptmenge gefunden wird", und er hat auch den Beweis dafür ver- mißt, ,,daß beim Nichtvorhandensein von Formaldehyd im Reaktions- produkt keine Ameisensäure enthalten ist". Freilich war Ameisensäure mit aller Sicherheit in dem mit Silberoxyd behandelten Aldehydanteil nachgewiesen und es fragte sich, woher diese Säure stammte. Ihre Herkunft ist von Curtius und Franzen er- kannt worden, als sie eine wässerige Lösung von Methyl- oder Äthyl- alkohol längere Zeit mit Silberoxyd digerierten; im Reaktionsgemenge befanden sich Spuren der beiden entsprechenden Carbonsäuren. ,,Da ^) Th. Curtius und H. Franzen, Bcr. d. deutseh. ehem. Ges. 45, 1715 [iQi-]- 2) H. Fincke, Biochem. Zeitschr. 52, 214 [1913]. ^) Th. Curtius und Ff. Franzen, Ann. d. Chem. 404, 93, 105 [1914]. Willstätter-StoU, Assimilation. 2S 386 R- Willstätter und A. Stoll. nun Methylalkohol ein regelmäßiger Bestandteil der Laubblätter ist, läßt sich die Herkunft der kleinen Mengen Ameisensäure aus der eben erwähn- ten Reaktion erklären." H. Fincke hat sich in seiner verdienstlichen Arbeit auch einer empfindlichen neuen Reaktion bedient, die in höherem Maß als die bisher bekannten Farbreaktionen spezifisch für Formaldehyd ist, um frisch ge- pflückte Blätter auf Spuren von Formaldehyd zu prüfen, nämlich den Saft der Blätter von Roßkastanien, Löwenzahn, Rhabarber u. a., sowie die Wasserdampf destillate aus verschiedenen Pflanzen. Das Ergebnis war vollständig negativ; „diese Versuche zeigen, daß in belichteten grünen Blättern verschiedener Pflanzen eine Formaldehydkonzentration i : 200000 bzw. I : 100 000 nicht vorhanden ist". Die angewandte Reaktion^' — verschieden von der bekannten Schif f- schen Probe — besteht in der Einwirkung von fuchsinschwefliger Säure bei Gegenwart von Salzsäure. Curtius und Franzen bestätigen, daß mit diesem Formaldehydreagens alle anderen Aldehyde, nur wenn sie in größerer Menge vorhanden sind, eine vorübergehende Färbung liefern, und daß die wässerige Lösung der bisher bekannten Blätter- aldehyde keine Färbungen damit gibt. Die Probe eignet sich, um Formaldehyd neben anderen Aldehyden zu erkennen, in farblosen wässe- rigen Flüssigkeiten bis zur Verdünnung i 1500000. Fincke nennt das Reagens nach Grosse - Bohle ^), der es in erster Linie für den Formaldehydnachweis in der Milch empfohlen habe, und er bemerkt, daß die Reaktion nachträglich von G. Deniges^) in ähnlicher Form — unter Verwendung von Schwefelsäure statt Salzsäure — veröffentlicht worden sei. Hinsichtlich der Priorität ist die Angabe indessen nicht genau; Deniges erwähnt, daß er die Untersuchung von Milch mit fuchsinschwefliger Säure in der sauren Lösung schon im Jahre 1896 empfohlen^) habe. ^) H. Fincke, Biochem. Zeitschr. 51, 253, 260 [1913]. 2) H. Grosse - Bohle, Zeitschr. f. Untersuchg. d. Nahrungs- und Genußmittel 14, 88 [1907] und 27, 248 [1914]. ^) G. Deniges, Compt. rend. 150, 529 [1910]. ^) G. Deniges, Journ. d. Pharm, et de Chim. [6], 4, 193 [1S96]. über das Vorkommen von Formaldehyd in den grünen Pflanzenteilen. ^8j Bemerkungen zur Farbreaktion mit fuchsinschwefliger Säure. Die Einwirkung der Aldehyde auf fuchsinschweflige Säure ist unter allen Bedingungen, mit und ohne Gegenwart von Mineralsäure, eine Kon- densation unter Bildung von sauren Farbstoffen. Diese Aldehydfarbstoffe sind gleich dem Fuchsin alkaliunbeständig, aber zum Unterschied \^on diesem farbbeständig in saurer Lösung, in stärkerer Säure von mehr blauer Nuance als in verdünnter, immer blauer als Fuchsin. Die fuchsinschwefhge Säure rötet sich leicht, auch bei Abwesenheit von Aldehyden, durch Wegdissoziation von Schwefeldioxyd und Rück- bildung von Fuchsin. Daher ist es zum Beispiel bei der Prüfung pflanz- licher Objekte nützlich, zurückgebildetes Fuchsin auf einfache Weise vom Aldehydfarbstoff zu unterscheiden. In einer unveröffentlichten Untersuchung von R. Willst ätter und G. Schudel wurde beobachtet, daß Oxoniumfarbstoffe wie Cyani- din und Pelargonidin ihrer wässerigen Lösung auf Zusatz von Pikrinsäure leicht mit Äther entzogen werden können; das Pikrat geht mit der Farbe des Anthocyänidins in den Äther über, die wässerige Schicht wird ent- färbt. Es wurde gefunden, daß auch Ammoniumverbindungen wie die basischen Farbstoffe derTriphenylmethanreihe sich ebenso verhalten. Fügt man zu einer verdünnten Fuchsinlösung etwas wässerige Pikrinsäure und Äther, so geht in diesen das gesamte Fuchsin über. Wird die Probe nach der Kondensation mit fuchsinschwefliger Säure mit einem Aldehyd aus- geführt, so bleibt der Äther farblos. Der Unterschied beruht darauf, daß die Aldehydfarbstoffe, deren Konstitution übrigens noch nicht ganz auf- geklärt ist, eine Sulfogruppe enthalten. Beispiele. Reines Aceton gibt Rotfärbung (zufolge der Entfär- bung mit Säure oder der Pikratprobe ist es Fuchsin), wenn man etwas Reagens zum Aceton zufügt. A. Villiers und M. Fayolle^) haben sich bemüht, Aceton so weit zu reinigen, daß es fuchsinschweflige Säure nicht mehr röte; es ist ihnen entgangen, daß die Färbung durch die Dis- soziation des Reagens bedingt wird. Man kann Aceton auf Aldehydgehalt i) A. Villiers imd M. Fayolle, Bull. Soc. Chim. [3], 11, 691 [1894]. ^5^ 388 • i<- W'iUstätter und A. Stoll. prüfen bei Gegenwart von etwas überschüssigem Schwefeldioxyd und etwas Wasser. Anders ist es bei Glucose. Es gilt als zweifelhaft, ob sie die fuchsin- schweflige Säure röte^). Villiers und Fayolle zeigten, daß lang- sam Rotfärbung eintritt, wenn man i g Glucose zu lo bis 12 ccm des Reagens zufügt. Es ist besser, konzentrierte (50 proz.) Glucoselösung mit wenigen Tropfen des Reagens zu versetzen; die bald eintretende Rotfärbung beruht nach der Pikratprobe nicht auf Rückbildung von Fuchsin, sondern auf Kondensation. Gelatine gibt mit fuchsinschwefliger Säure Rotfärbung, die von A. J. Ewart^) in seiner Kritik der Arbeiten von Usher und Priest- ley über Assimilation in Gelatine-Chlorophyllfilms auf einen Aldehyd- gehalt zurückgeführt w^orden ist. Die Farbreaktion ist aber in diesem Fall nur durch die basischen Eigenschaften der Gelatine hervorgerufen. Man bemerkt mit der Pikratprobe oder beim Versetzen mit etwas Mineralsäure, daß die Rotfärbung nur durch Fuchsin bedingt ist. Fuchsinschweflige Säure wird durch Sauerstoff oder Hydroperoxyd nicht gerötet; sie rötet sich beim Durchleiten eines indifferenten Gases oder beim Zufügen zu einem schwach alkalischen Mittel wie zum Beispiel zu calciumbicarbonathaltigem Wasser. Dadurch ist in manchen Assimila- tionsversuchen (vergleiche die Besprechung der Versuche von R. Chodat und K. Schweizer im Abschnitt IV) die Anwesenheit von Formalde- hyd vorgetäuscht worden. Auch gibt das mit möglichst \\-enig Schwefeldioxyd entfärbte Reagens beim Eintragen in viel Wasser eine allmähliche Rotfärbung. Man darf deshalb zur Prüfung einer sehr verdünnten Aldehydlösung nicht eine nur eben entfärbte fuchsinschweflige Säure ohne weitere Kautelen benützen, sondern ein etwas weniger empfindliches Reagens, das noch Schwefel- dioxyd enthält. Wir bereiten die fuchsinschweflige Säure durch langsames Einleiten ^) Nach V. Meyer und P. Jacobson, Lehrbuch der organischen Chemie, 2. Aufl., I. Band, I. Teil, S. 681, tritt mit dem Traubenzucker keine Färbung ein. 2) A. J. Ewart, Proc. Roy. Soc. Ser. B 80, 30 [rgoS]. über das Vorkommen von Fornuildchyd in den grünen Pflanzenteilen. 389 von Schwefeldioxyd in die i proz. Lösung von Parafuchsin oder Fuchsin in vollgefüllter Flasche und behandeln so lange mit dem Gas, bis 0,1 ccm Lösung in 10 ccm Wasser auch in mehreren Minuten keine Rösafärbung mehr gibt. Schwefligsäuregehalt des Reagens verringert die Empfindhchkeit der Aldehydprobe, weil der entstehende Farbstoff durch schweflige Säure wie Fuchsin entfärbt wird, wenn auch schwerer. Andererseits erleidet die fuchsinschweflige Säure von zu geringem Schwefeldioxydgehalt Disso- ziation schon bei derjenigen Konzentration, in der das Reagens zweck- mäßig angewandt wird. Die Empfindlichkeitsgrenze^) mit diesem Alde- hydreagens finden wir daher bei etwa i : i ooo ooo, statt bei noch viel größerer Verdünnung. Die Prüfung auf Formaldehyd mit dem Reagens in saurer Lösung'^) nach Deniges und Grosse - Bohle führen wir aus, indem zu IG ccm der zu untersuchenden Flüssigkeit zwei Tropfen konzentrierte Salzsäure (o,i ccm) und vier Tropfen i proz. fuchsinschweflige Säure (0,2 ccm) zugefügt und, wenn es sich um die größten Verdünnungen handelt (anwendbar für i : i 000 000 1, einen Tag lang gewartet wird. Die Gegenwart der Mineralsäure bewirkt, daß die Reaktion stark ver- zögert wird und daß die Unterschiede in der Reaktionsgeschwindigkeit bei Formaldehyd gegenüber anderen Aldehyden wesentlich vergrößert werden; hierauf beruht die Unterscheidung des Formaldehydes von den anderen. In der mineralsauren Lösung ist die Farbe den Aldehydmengen pro- portional. Das gilt nicht von der Fuchsinschwefligsäurereaktion ohne Salzsäure; bei Formaldehydkonzentrationen beispielsweise, die sich wie 4:2:1 verhielten, fanden wir bei der Schi ff sehen Probe Farb- 1) Die Empfindlichkeit der Schiffschen Probe Hesse sich bedeutend steigern durch An- wendung einer mit Schwefeldioxyd unvollständig entfärbten Fuchsinlösung (z. B. 75 Proz. fuchsinschweflige Säure, 25 Proz. Fuchsin). Nach der Einwirkung der Aldehydlösung versetzt man mit etwas Säure, um das Fuchsin aufzuhellen und den Aldehydfarbstoff zu beobachten. 2) Wenn man Salzsäure auf fuchsinschweflige Säure einwirken läßt, so bleibt diese zum Teil unverändert und wird zum Teil so verwandelt, daß die Leukoverbindung eines gegen Alkah und gegen Säure farbbeständigen Farbstoffs entsteht, der, zufolge der Ätherlöslichkeit seines Pikrates, keine saure C.rnppc mehr enthält. CjO R. Willstätter und A. Stoll. stärken im Verhältnis von 20 14 : i. Fügt man zu der mit sehr verdünn- ter Aldehydlösung und schwefligsäurearmem Reagens ausgeführten Schiffschen Probe nachträglich Salzsäure, so steigt die Farbintensität sehr langsam. III. Versuche über den Formaldehydgehalt von Chlorophyll. Wenn es gelänge, in grünen Blättern Formaldehyd nachzuweisen, so dürfte man, wie oben ausgeführt wurde, ein solches Vorkommen doch nicht mit dem Assimilationsvorgang in Zusammenhang bringen. Es war daher ein guter Gedanke, den S. B. Schryver^) gehabt hat, den Form- aldehyd nicht in den ganzen grünen Pflanzenteilen, sondern im Chloro- phyll selbst zu suchen. Die Aussicht, eine kleine Menge Formaldehyd aufzufinden, wird dadurch erhöht, daß der Aldehyd, wenn er in Form einer dissoziierbaren Verbindung mit dem Chlorophyll auftritt, sich darin 500 mal konzentrierter befindet als im ganzen Blatte, dessen Pigmentgehalt durchschnittlich 0,2 Prozent beträgt. Schryver hat für den Nachweis eine von E. Rimini^) angegebene Farbreaktion benützt und sie verbessert. Er läßt Phenylhydrazinchlor- hydrat auf die zu prüfende Flüssigkeit einwirken und oxydiert mit Ferricyankalium + Salzsäure zu einem schönen fuchsinroten Farbstoff. Die Probe zeigt nach Schryver den Formaldehyd noch in Ver- dünnung I : I 000 000 deutlich an. Wir können dies bestätigen, wenn die Vorsicht eingehalten wird, nach dem Versetzen mit Phenylhydrazin eine gewisse Zeit zur Beendigung der Kondensation verstreichen zu lassen; der entstehende Farbstoff ist als Base gelb und ätherlöslich, der Zusatz von Säure ist zur Bildung des Farbsalzes erforderlich. Gegenüber der Reaktion mit fuchsinschwefliger Säure und Salzsäure hat die Probe den Nachteil, daß auch andere Aldehvde Färbungen geben, zum Beispiel Hexylenaldehyd eine schön violettrote. Nach Th. Curtius und 1) S. B. Schryver, Proc. Roy. Soc. Ser. B 82, 226 [1910]. -) E. Rimini, Chem. Centralbl. 189S, I, S. 11 52. Versuche über den Formaldeh\clgehalt-von Chlorophyll. ^gi H. Kränzen 1) läßt sich Formaldehyd mit der Schryverschen Probe nicht im Gemenge mit anderen Aldehyden nachweisen. Eine schwache Seite der Untersuchung von Schryver ist die Be- schaffenheit der Chlorophyllpräparate. Sie wurden auf zu primitive Art gew^onnen. Als Chlorophyll bezeichnet und verwendet Schryver, was aus Gras durch Alkohol (oder Methylalkohol extrahiert und nach dem Verdampfen des Auszuges zur Trockne in ätherische Lösung über- gegangen war. Es fehlen Angaben über Farbe und andere Eigenschaften des Pigmentes, das nach unseren Erfahrungen günstigen Falles mit dem 20 fachen an Begleitstoffen verunreinigt gewesen sein wird. Der Nach- weis von Formaldehyd gelang nur so, daß die Chlorophyllpräparate durch Verdampfen der ätherischen Lösung auf Glasplatten in die Form von Films gebracht wurden, die Schryver mit der Phenylhydrazinlösung stehen ließ oder einige Minuten auf ioo° erhitzte. Unter diesen Umstän- den beobachtete Schryver die charakteristische Farbe der Formalde- hydreaktion. Die colorimetrische Bestimmung von Formaldehyd mit Hilfe derselben wird von Schryver erwähnt, doch hat er keine quan- titative Angaben über den aus dem Chlorophyll erhaltenen Formaldehyd gemacht, auch nicht über die angewandte Menge von Chlorophyll oder Gras. Wir haben die Versuche von Schryver mit Präparaten von reinem Chlorophyll, die aus trockenen und aus frischen Blättern dargestellt waren, wiederholt und keinen Formaldehyd gefunden. Die für die einzelnen Proben angewandten Mengen von Chlorophyll, etwa einem großen tief- grünen Roßkastanienblatt entsprechend, waren zwischen 25 und 50 mg und die Empfindlichkeit der Farbreaktion hätte ausgereicht, um 0,01 mg Formaldehyd im Chlorophyllhlm, d. i. \ 100 der dem Chlorophyll ent- sprechenden molekularen Formaldehydmenge, nachzuweisen. Das Chloro- phyll war entweder in Form von Films nach Schryver oder auf Talk niedergeschlagen oder es befand sich in kolloider Lösung und wurde mit Kohlensäure zersetzt und dann geprüft. Die im Versuch angewandten 1) Th. Curtius und H. Franzen, Sitzungsber. d. Heidelberger Akad. d. Wissensch., mathem.-naturw. Klasse, Jahrg. 1912, 7. Abhdig., S. 17. 392 R- Willstätter und A. Stoll. Präparate hatten freilich bei der Reinigung zaWreiche Operationen durch- gemacht, indessen keine so gefährhchen wie die Präparate von Schryver, che mit Alkohol und mit Äther wiederholt zur Trockne eingedampft wurden . Übrigens ist schon früher von uns bei der Trocknung von Chlorophyll- präparaten im Hochvakuum zur Gewichtskonstanz festgestellt worden^), daß sie keinen Formaldehyd abspalten. Die krystallisierten Chlorophyllide wurden sehr langsam gewichtskonstant. In den mit flüssiger Luft gekühlten Vorlagen des Hochvakuumapparates fand sich keine Spur Formaldehyd, nur Äther und Wasser . Chlorophyll selbst ( Phy tylchlorophyllid) erle idet nur ge- ringfügige Gewichtsabnahme beim Erwärmen unter sehr niedrigem Druck 2). Es ist wahrscheinlich, daß für den Befund von Schryver der in nicht geringer Menge angewandte Äther verantwortlich zu machen ist. Äthersuperoxyd, das beim Arbeiten mit gewöhnlichem Äther leicht vor- kommt, kann allein oder durch Einwirkung auf Spuren von Methylalkohol Aldehyd gebildet haben. Sollte es künftig versucht werden, die Angaben Schryvers experimentell zu stützen, so wird es ratsam sein, Blätter bei günstiger Temperatur und starker Belichtung in hochprozentiger Kohlen- säure assimilieren zu lassen und sie dann sofort nach dem raschen Ver- fahren, das mitgeteilte^) worden ist, auf reines Chlorophyll zu verarbeiten. Es ist hier an die in der zweiten Abhandlung (IX. Abschnitt) mit- geteilten Assimilationszeiten zu erinnern; unter gewöhnlichen Bedingungen wird in einem tief grünen Blatt von einem Molekül Chlorophyll in 4 Minu- ten ein Kohlensäuremolekül verarbeitet, unter Verhältnissen gesteigerter Leistung aber in etwa 25 Sekunden. Der negative Ausfall des Formaldehydnachweises nach Schryver genügt noch nicht, seine Annahme unwahrscheinhch zu machen. Es liegt nahe, sie zu der Hypothese auszugestalten, daß die Kohlensäureverbin- dung des Chlorophylls zu einer Formaldehydverbindung desselben des- oxydiert werde und daß noch im Chlorophylladditionsprodukt die Kon- 1) R. Willstätter und M. Utzinger, Ann. d. Chem. 382, 129, 147 [1911] und R. Will- stätter und A. Stoll, Untersuchungen über Chlorophyll, Berlin 1913, S. 221. 2) Chlorophyll, aus ätherischer Lösung durch Abdampfen gewonnen, wird im Hoch- vakuum schon in der Kälte rasch gewichtskonstant. 3) Siehe die vierte .\bhandhmg, I. Abschn., B. Versuche über den Formaldehydgehalt von Chloroi)lnll. 393 densation zum Kohlenhydrat erfolge. Aber der Gedanke von Schry ver wird auch noch direkt widerlegt. Die Verbindung von Formaldehyd mit dem Chlorophyll hat Schry ver wie es die folgenden Gleichungen ausdrücken, mit der Schi ff sehen Reaktion zwischen Aldehyden und Aminoverbindungen verglichen: R R I CH • NH2 + HCOH ^- CH • N : CH^ + H^O ; i I COOK COOK [Chlorophyll] ^ + HCHO ^:r [Chlorophyll] ^ CH^ + H,0 . Es wurde also ein Gleichgewicht angenommen: ,,As the condensation product is somewhat stable, equilibrium will be maintained when only a small amount of free aldehyde is present." Ob wirklich eine umkehrbare Reaktion zwischen Formaldehyd und Chlorophyll stattfindet, läßt sich mit kolloiden Chlorophyllösungen prü- fen, und wir haben solche Versuche unter Anwendung von ^ /., oder Vi der molekularen Chlorophyllmenge ausgeführt. Der Farbstoff hat keinen Formaldehyd aufgenommen . Prüfung des Chlorophylls nach Schryver. Erster Versuch. o,iog Chlorophyll (Präparat aus getrockneten Blät- tern) wurde in 20 ccm frisch gereinigtem Äther gelöst und je 5 ccm in einer flachen Glasschale von 400 qcm Fläche verdampft, um die Pigment- schicht mit der Flächenkonzentration eines tiefgrünen Blattes zu erhalten. Neben der Prüfung des Chlorophylls nahmen wir einen Vergleichsversuch mit ebensoviel Äther allein vor. Der Film, von dem sich das Chlorophyll in Häutchen lostrennte, benetzte sich schlecht mit der Phenylhvdrazin- lösung. Eine der Proben erhitzten wir 4 Minuten auf dem Wasserbad unter Rühren; hier fiel die Farbreaktion negativ aus. Bei einer Probe in der Kälte gab es eine sehr schwache Färbung, bei einer anderen eine etwas stärkere als im Blindversuch mit dem Äther allein. Einen zweiten Versuch führten wir ebenso aus mit 0,21 g Rohchloro- phyll, das auf einfachste Weise durch E.xtrahieren mit 85 proz. Aceton, 394 I^- Willstätter und A. Stoll. Fällen mit Wasser und x\ufn^hmen in Äther frisch gewonnen und etwa 45 prozentig war. Bei zwei Proben in der Kälte und einer unter Erwärmen vorgenommenen trat bei der Reaktion mit Phenylhydrazin und Ferricyan- kalium nur spurenweise Rotfärbung ein, nicht stärker als mit Äther allein. Ein dritter Versuch ist mit Chlorophyll aus frischen Blättern, einem aus konzentrierter ätherischer Lösung mit Petroläther gefällten Präparate, so ausgeführt worden, daß wir 50 mg in 5 ccm Äther lösten und die Flüssig- keit mit 4 g gereinigtem, feingemahlenem Talk aufnahmen. Unter Um- rühren ließ man den Äther verdunsten ; bei dieser Verteilung fand glatte Benetzung mit dem Phenylhydrazinreagens statt. Bei 6 stündiger Ein- wirkung derselben in der Kälte trat bei der Prüfung keine Spur von Rot- färbung ein, während 0,01 mg Formaldehyd unter gleichen Verhältnissen eine schöne Farbreaktion gaben. Prüfung der kolloiden Chlorophyllösung auf Formaldehyd. Von dem gleichen Präparat aus frischen Brennesseln stellten wir eine kolloide Lösung her, wobei es zum Verjagen des Acetons nötig war, eine Stunde an der Pumpe bei 30° einzuengen. 10 ccm der kolloiden Lösung, die 20 mg Chlorophyll enthielten, versetzten wir unter Umschütteln mit 2 ccm der Phenylhydrazinchlorhydratlösung. Ein Teil des Farbstoffes fiel rasch aus, der Rest büßte in einer Stunde die kolloide Verteilung ein. Nach 6 Stunden filtrierten wir von dem Niederschlag ab, um mit Ferri- cyankalium und Salzsäure zu prüfen; die Flüssigkeit war rein gelb. In einem weiteren Versuche zersetzten wir zuerst das kolloid gelöste Chlorophyll (50 mg eines Präparates aus getrockneten Blättern i durch 12 stündiges Einleiten von Kohlendioxyd, ohne den kolloiden Zustand zu verändern. Auf Zusatz des Phenylhydrazins trat während einer Stunde Ausflockung ein. Das Phäophytin wurde durch etwas Talk abfiltriert und im Filtrate mit Ferricyankalium und Salzsäure auf Formaldehyd geprüft, der, wäre er an Magnesium gebunden im Chlorophyll enthalten, vollständig in die wässerige Lösung hätte übergehen müssen. Die Reak- tion von Rimini-Schryver fiel negativ aus. Verhalten von kolloidem Chlorophyll gegen Formaldehyd. Eines der Chloroj^hyllpräparate, die sich als frei von Formaldehyd Die Frage der Bildung \on Formaldehyd und Hydroperoxyd aus Kohlensäure. 395 erwiesen hatten, führten wir in kolloide Lösung über und vermischten Proben von lo com, die 50 mg enthielten, mit 0,85 ccm i proz. Form- aldehyd (entsprechend einem halben Molekül CHoO), andere Proben mit der Hälfte dieser Menge. Dem Chlorophyll war unter Bedingungen, die hinsichtlich seines Zustandes den Verhältnissen im Blatte möglichst gleichen, 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur Gelegenheit gegeben, Formaldehyd aufzunehmen. Dann wurde das ChlorophvU aus den ein- zelnen Proben mit je i ccm gesättigter Kochsalzlösung ausgeflockt und sowohl die wässerige Flüssigkeit wie der gefähte Farbstoff untersucht. Die Lösungen wurden filtriert und die Filter nachgewaschen, einen kleinen Rest von Chlorophyll entfernten wir aus den Filtraten mit etwa 10 ccm Äther. Das Volumen der Proben betrug am Ende 40 ccm; wir prüften sie mit 0,80 ccm i proz. fuchsinschwefliger Säure. Mit chlorophyll- freien Lösungen von gleichem Formaldehydgehalt sind in parallelen Ver- suchen die nämlichen Operationen vorgenommen worden und sie be- kamen natürlich dasselbe Volumen. Der colorimetrische Vergleich ergab genaue Übereinstimmung zwischen Formaldehydlösungen, die mit Chloro- phyll behandelt waren, und den Vergleichsproben . Die ausgeflockten Chloro- phyllpräparate sind in frisch gereinigtem Äther (je 10 ccm) gelöst und in der Form von Films nach Schry ver auf Formaldehyd geprüft worden ; das Er- gebnis der Reaktion von Rimini-Schryver war auch hier ganz negativ. Im System Chlorophyll + Formaldehyd ist also keine Reaktion ein- getreten. IV. Die I^""rage der Bildung von Formaldehyd und Hydroperoxyd aus Kohlensäure unter Chlorophyllwirkung außerhalb der Pflanze. Über die Untersuchungen von Usher und Priestley und von Schryver. F. L. Usher und J. H. Priestley 0 haben in den Jahren 1906 bis 1911 drei Untersuchungen über den Mechanismus der Kohlensäure- 1) F. L. Usher und J. H. Priestley, Proc. Roy. See. Ser. B 77, 369 [1906], 78, 318 [1906] und 84, loi (1911]. 396 • R- Willstätter und A. Stoll. assimilation in den grünen Pflanzen veröffentlicht, die viel Beachtung fanden und die biochemische Literatur^) auch in der jüngsten Zeit noch beeinflußten. In den beiden ersten Arbeiten wurden Sätze von weittra- gender Bedeutung aufgestellt, aber mit unzulänglichen Experimenten gestützt. Es wäre kaum angebracht, nach der gründlichen Kritik, die diesen Arbeiten namentlich von A. J.Ewart^), ferner von E. Mameli und G. Pollacci^), H. Euler ^), Th. Curtius und H. Franzen^) u. a. zuteil geworden, darauf zurückzukommen, wenn nicht eine in an- derem Zusammenhang schon zitierte Arbeit von S. B. Schryver^) die Beobachtungen von Usher und Priestley in wichtigen Punkten bestätigt hätte und wenn nicht Usher und Priestley ihre Theorie in der später erschienenen dritten Untersuchung im wesentlichen auf- recht gehalten und auf ihren ersten Angaben weiter gebaut hätten. Nach der Auffassung von Usher und Priestley soll die Zer- setzung der Kohlensäure in den chlorophyllhaltigen Pflanzenteilen vor sich gehen: ,,independently of vital or enzymic activity." Elodeasprosse wurden zur Abtötung des Protoplasmas und Zerstörung der Enzyme mit Wasser abgebrüht. An solchen Objekten') glaubten Usher und Priestley die Zersetzung der Kohlensäure unter Bil- dung von Formaldehyd zu finden. Dabei wurde das Ausbleichen des Pig- mentes als eine Wirkung von Hydroperoxyd betrachtet und als Beweis für dessen Bildung angesehen. Das Ergebnis der Assimilationsversuche mit den abgestorbenen Pflanzen beschreiben die Autoren folgendermaßen : ,,Photolysis of carbon dioxide begins in the normal way, giving rise to hydrogen peroxide and formaldehvde. The enzymes having been destroyed ') Siehe zum Beispiel die Ausführungen von W. M. Bayliss in „The Xature of Enzyme Action", London 1914, S. 142. 2) A. J. Ewart, Proc. Roy. Soc. Ser. B 80, 30 [1908]. ^) E. Mameli und G. Pollacci, Atti R. Accad. dei Lincei Ser. V, 17, I, 739 [1908]. ■*) H. Euler, Zeitschr. f. physiol. Cham. 59, 122 [1909] und Grundlagen und Ergebnisse der Pflanzenchemie, IL Teil, S. 119, Braunschweig 1909. *) Th. Curtius und H. Franzen, Sitzungsber. d. Heidelberger .^kad. d. Wissensch., math.-naturw. Klasse, Jahrg. 1912, 7. Abhdlg., S. 17. 6) S. B. Schryver, Proc. Roy. Soc. Ser. B 82, 226 [1910]. ') Unsere Versuche, mit beschädigten Blättern Assimilation zu erzielen, fielen völlig negativ aus; sie sind im XIV. .-\bschnitt (C) der zweiten .Abhandlung angeführt. Die Frage der Bildung von Fornialdchyd und H\droperoxvd aus Kohlensäure. 397 the hydrogen peroxide, instead of being catalysed in the usiial manner, oxidises the Chlorophyll to a colourless substance at which point the reaction necessarily comes to an end." Die daraus abgeleiteten theoretischen Folgerungen gipfelten in dem Satze: „The normal products of the photolysis are hydrogen peroxide and formaldehyde, though under certain condition formic acid may be formed. In the plant the decomposition of the hydrogen peroxide is pro- vided for by a catalysing enzyme of general occurrence." Da die Anhäufung des Formaldehyds so lange erfolgen soll, als das Gleichgewicht der von Usher und Priestley angenommenen um- kehrbaren Reaktion CO, + 3 H,0 ^- ^ HCHO 4- 2 H3O, sich nach rechts verschiebt, im Versuche infolge des Aufbrauchens von Wasserstoffsuperoxyd durch Chlorophyll, so unternahmen Usher und Priestlev den Schritt vom Assimilations versuche in der abgestor- benen Pflanze zum Experiment mit Films von Chlorophyll, die ge- wöhnlich auf einer Gelatirieunterlage, in manchen Beispielen auch nur auf der Oberfläche von Wasser ausgebreitet waren. Wie in den Versuchen mit abgestorbener Elodea, so vermeinten Usher und Priestle\^ bei dieser ,, Rekonstruktion der Photosynthese außerhalb der Pflanze" in der Gelatine das Auftreten \^on Formaldehyd mit fuchsinschwefliger Säure erkennen und zugleich bei Gegenwart von Leberkatalase auch Sauerstoffentwicklung nachweisen zu können, so daß : ,,Up to this point the process is entirely non-vital, and can be recon- structed in vitro." Gegen diese Untersuchung erhob Ewart mehrere berechtigte Ein- wände. Er zeigte, daß Gelatine an sich die Aldehydreaktion mit der Schiffschen Probe gibt und daß in abgestorbenen Blättern auch beim Belichten unter Ausschluß von Kohlensäure Aldehydspuren entstehen. Die Sauerstoffentbindung im Assimilationsversuche außerhalb der Zelle fand Ewart nicht bestätigt, und das Ausbleichen des abgetöteten Blattes oder Chlorophyllfilmes gilt ihm nicht als Nachweis von Hydroperoxyd, sondern als Oxvdationswirkuup des Luftsauerstoffs. 398 R. Willstätter und A. StoU. Ohne die Kritik von Ewart zu erwähnen, beschrieb Schryver eine Wiederhohmg der Assimilations versuche nach Usher und Priest- ley mit Chlorophyllfilms, allerdings ohne Gelatine. Im Lichte beob- achtete er bei Zufuhr von Kohlensäure deutliche, ohne Kohlensäure nur spurenweise Formaldehydbildung, im Dunkeln keine; somit glaubte Schryver, ,,die photochemische Synthese von Formaldehyd durch Chlorophyll" aus Kohlensäure zu beweisen. In ihrer letzten Abhandlung haben Usher und Priestley nur in wenigen Punkten ihre Angaben modifiziert, indem sie zum Beispiel einräumten, daß das dem Hydroperoxyd zugeschriebene Ausbleichen der Chlorophyllfilms von der Anwesenheit der Kohlensäure unabhängig ist. Ihre neuen Assimilationsversuche außerhalb der Zelle bestätigten die Al- dehydbildung und sprachen noch entschiedener als die früheren für das Auftreten von Hydroperoxyd. Chlorophyll-Gelatine-Films mit einem Gehalt von Katalase blieben bei der Belichtung noch ganz grün, während zu gleicher Zeit parallele Proben ohne Katalase ausbleichten; bei der Gegenwart von Kohlensäure wurde starke Aldehydbildung bemerkt. Auch diese Angaben erweisen sich als nicht stichhaltig. Ch. H. War- ner^) hat in einer unter der Leitung von Blackman ausgeführten Untersuchung festgestellt, daß der Formaldehyd durch die photoche- mische Zersetzung der Films infolge der Einwirkung von Luftsauerstoff entsteht und daß er nicht aus der Kohlensäure stammt. Die Films bilden Formaldehyd weder in Stickstoffatmosphäre, noch in sauerstofffreier Kohlensäure. Das Ausbleichen der Films scheint unter der Wirkung von Hydroperoxyd zustande zu kommen, und zwar unabhängig von der An- wesenheit der Kohlensäure. Gleichzeitig kam H. Wager-; zu ähnlichen Schlußfolgerungen. Die von ihm wie früher von Usher und Priestley beobachtete Aldehyd- bildung wird nicht mehr als eine Photosynthese aus Kohlensäure und Wasser angesehen, sondern als Photozersetzung von Chlorophyll, und es ist zweifelhaft, ob der entstehende Aldehyd Formaldehyd selbst ist oder 1) Ch. H. Warner, Proe. Roy. Soc. Ser. B 87, 37S [1914]. 2) H. Wager, Proc. Roy. Soc. Ser. B 87, 386 [1914]. Die Frage der Bildung von Formaldehyd und Hydroperoxvd aus Kohlensäure. 300 nicht. Dieser Aldehyd ist nach Wäger einfach ein Oxydationsprodukt des Chlorophylls, dessen Zersetzung im Lichte nur in Gegenwart von Sauerstoff und unter Absorption desselben stattfindet, aber ebenso bei Abwesenheit wie bei Gegenwart von Kohlensäure. Das oxydierende Agens scheint nach Wager nicht Hydroperoxyd zu sein. Diese kritischen Ausführungen von Warner und von Wager sind zu bestätigen; die Aldehydbildung nach üsher und Priestley und Schryver sowie nach R. Chodat und K. Schweizer^^ hat mit der Zerlegung der Kohlensäure nichts zu tun. In einem Punkte aber ist die Kritik jener Forscher nicht ausreichend. Es ist nicht der Zerfall von Chlorophyll, es ist \ielmehr, wie im folgenden Abschnitt (V) gezeigt werden soll, die Zersetzung irgendwelcher Begleitstoffe des Blatt- pigmentes, welche Aldehyd liefert. Assimilationsversuche mit kolloidem Chlorophyll. Weder die kritischen Ergebnisse von Wager und von Warner, noch die erfolglosen Versuche mit Chlorophyll ösun gen unter wech- selndem Kohlensäuredruck, von denen H. Euler-) berichtete, schlössen die Möglichkeit aus, unter günstigeren Versuchsbedingungen die Zerlegung der Kohlensäure im Lichte durch Chlorophyll doch zu verwirklichen. Die bisherigen Versuche sind namentlich in zwei Beziehungen zu verbessern, erstens in bezug auf die Beschaffenheit des Chlorophylls, nämlich seine Unversehrtheit in der Zusammensetzung, seine Reinheit von zersetzlichen und zersetzend wirkenden Begleitstoffen und seine Konzentration, und zweitens hinsichtlich der Form, in der das Pigment angewandt wird. Wir arbeiten wirklich mit Chlorophyll. Den natürlichen Verhältnissen kommt hinsichtlich der Verteilung des Chlorophylls und hinsichtlich seiner Lichtabsorption am nächsten die Anwendung des Pigmentes in kolloiden Lösungen. Mehrere Versuche wurden ohne, andere bei An- wesenheit von Katalase vorgenommen. Die Prüfung auf Zerlegung der Kohlensäure geschah in einigen Versuchen, die wegen des methodischen 1) R. Chodat und K. Schweizer, Arch. d. Sc. phys. et nat. [4J, 39, 334 [1915]. 2) H. Euler, Zeitschr. f. physiol. Chem. 59, 122 [1909]. 400 R. Willstätter und A. Stoll. Zusammenhangs mit anderen Bestimmungen schon im XIV. Abschnitt (A) der zweiten x\bhandlung mitgeteilt worden sind, gewichtsanalytisch, in anderen durch Prüfung auf Aldehyd, ferner auf Hydroperoxyd. Alle Ergebnisse sind gänzlich negativ. Assimilation von Kohlensäure durch Chlorophyll außerhalb der leben- den Zelle ist noch nicht verwirklicht. Nachweis von Hydroperoxyd und anderen löslichen Per- oxyden. Auf den Angaben früherer Forscher, von Schönbein bis zu Cho- dat^^ fußend, kann man eine zuverlässige und empfindliche Methode für diesen Nachw^eis ausarbeiten. Von R. Chodat und K. Schweizer wird ein System angewendet, das aus Peroxydase zusammen mit einem von Peroxyd -f- Peroxydase oxydierbaren Körper (Pyrogallol, Guajakharz-Emulsion, p-Kresol) be- steht. Dabei ist aber die Empfindlichkeit dieser Stoffe gegen Sauerstoff innerhalb sehr weiter Grenzen der Reaktion des Mediums außer acht ge- lassen worden. Pyrogallol ist nicht nur, wie allgemein bekannt, in ver- dünntester alkalischer Lösung gegen Sauerstoff empfindlich, auch die Gegenwart von Alkalicarbonaten, Erdalkalien und, was besonders wichtig ist, von Carbonaten und Bicarbonaten der Erdalkalien, auch von Glas- substanz erweist sich als genügend, um die Einwirkung des Luftsauerstoffs herbeizuführen. Unter diesen Verhältnissen geht die Oxydation langsam und stufenweise vor sich und führt zu reinem Purpurogallin. In den Ver- suchen von Chodat und Schweizer war in der zu prüfenden Lö- sung Calciumbicarbonat zugegen und es ist seine Wirkung übersehen worden. Aber es sind überhaupt bei den Assimilationsversuchen mit Kohlensäure Erdalkalien nicht auszuschließen, sie gehen aus Kalksalzen hervor, die in Peroxydasepräparaten enthalten sein können und in Roh- chlorophyllpräparaten immer enthalten sein müssen. Auch in Versuchen mit kolloidem Chlorophyll und Kohlensäure müssen die Flüssigkeiten das aus Chlorophyll durch Kohlensäure abgespaltene Magnesium als Bi- ^) R. Chodat, in Abderhaldens Handbuch der biochem. Arbeitsmethoden 3. Bd., 1910, S. 42, 49. Die Frage der Bildung \on Formaldehyd und Hydroperoxyd aus Kohlensäure. 401 carbonat enthalten und in manchen Versuchen auch noch etwas Magne- siumbicarbonat, das bei der Bereitung der kolloiden Lösungen zu ihrem Schutze zweckmäßig zugesetzt wurde. Wässerige Pyrogallollösung färbt sich auf Zusatz v-on Magnesium- carbonat ,, Kahlbaum" oder von gefälltem Calciumcarbonat allmähhch braun; beim Versetzen mit verdünnter Schwefelsäure schlägt die Farbe in Gelb um, das Oxydationsprodukt geht wie reines Purpurogallin in Äther. Zusatz von Hydroperoxyd zur magnesiumbicarbonathaltigen Lö- sung scheint keinen Einfluß auf die Reaktion zu haben. Die Reaktion erfolgt noch rascher bei Anwesenheit von basischem Magnesiumcarbonat, wieder rascher mit Magnesiumoxyd. Proben von 25 mg Pyrogallol in 10 ccm Wasser wurden unter Durch- leiten eines langsamen Luftstromes geprüft : a) ohne Zusatz, aber in Glas- anstatt in Quarzgefäßen, b) unter Zusatz von 0,05 mg Peroxydase, die ihrer Herstellung nach eine Spur Erdalkaliverbindung enthalten konnte, c) unter Zusatz von 0,1 mg Magnesiumcarbonat, als Bicarbonat in Lö- sung gebracht. Nach einer Viertelstunde war die Probe c) tiefgelb, b) eben beginnend gelb, a) farblos. Nach einer halben Stunde enthielt c) 1,8 mg Purpurogallin, hingegen nach 24 Stunden a^ nur 0,1 und b^ nur 0,3 mg Purpurogallin. Magnesiumcarbonat oder Calciumcarbonat verhält sich gegenüber dem Pyrogallol wie eine Oxydase; man kann die Reaktion einer pflanzlichen Oxydase nicht davon unterscheiden^). Es wird dadurch noch besser ver- ständlich, daß H. Euler und L Bolin-) in ihrer Untersuchung ,,Über die Reindarstellung und die chemische Konstitution der Medicago-Laccase" zu dem Ergebnis gelangt sind, daß diese Oxydase in einem Gemisch von Kalk- salzen verschiedener aliphatischer Säuren besteht, worin besonders Glykol- säure, Äpfelsäure, Citronensäure und Mesoxalsäure erkannt worden sind. 1) Es soll hier nicht die Rede sein von der bekannten Ähnlichkeit der Wirkung von Ferro- salzen und Manganosalzen mit den Oxydasen (vgl. C. Oppenheimer, Die Fermente und ihre Wirkungen, 4. Aufl., Leipzig 1913, Bd. II, S. 763), sondern es handelt sich hier um Zusätze, welche die Reaktion des Mediums verschieben und dadurch bewirken, daß das Pyrogallol selbst zum Acceptor und zum Überträger des Luftsauerstoffs wird (vgl. auch dazu C. Oppen- heimer, a. a. O.). ~) H. Euler und I. Bolin, Zeitschr. f. physiol. Chem. 61, i [1909]. Willstätter-Stoll, Assimilation, 26 ^02 R- Willstätter und A. Stoll. Zur Ausführung einer Peroxydasereaktion, zum Beispiel zum Nachweis \'on Hydroperoxj'dspuren, muß man daher entweder in sauerstofffreiem ^Medium (in einem von Sauerstoffspuren befreiten Stickstoffstrom) ar- beiten oder, was aus praktischen Rücksichten vorzuziehen ist, in sauer- stoffarmem Medium bei Gegenwart von Kohlensäure. Der Kohlensäure- gehalt ward so gewählt, daß die Peroxydasereaktion nicht unterdrückt, daß aber die Wirkung der Alkalien ausgeschaltet wird. Wir haben dafür eine Stahlflasche mit 5 bis 10 Proz. Kohlendioxyd und 90 bis 95 Proz. Linde-Stickstoff in Verwendung. Pyrogallollösungen mit oder ohne Zusatz von Erdalkalicarbonaten oder von Peroxydase blieben bei tagelangem Durchleiten eines solchen Gas- gemisches vollkommen farblos. Setzt man aber zu einer lo-ccm-Probe, welche 25 mg Pyrogallol und Perox3^dase (0,05 mg eines guten Präparates) enthält, eine kleine Menge, zum Beispiel 0,01 mg, Hydroperox3/d, so tritt also in einer Verdünnung von i : 1 000 000) beinahe augenblicklich eine gut wahrnehmbare hellgelbe Färbung ein. Deutlicher wird das gebildete Pur- purogallin beim Ausschütteln mit wenig Äther. Um hier die Enzymwirkung auf superoxydhaltigen Äther zu verhüten, schaltet man die Peroxydase durch Zusatz von i ccm verdünnter Schwefelsäure aus. Durch Vergleich der Schi<:htenhöhen der ätherischen Lösungen von gleicher Farbstärke kann man auch im Reagensglas noch die kleinsten Mengen von Hydro- peroxyd schätzen, indem man mit einer Probe von bekanntem Gehalt einen Parallel versuch vornimmt. Die zu untersuchenden Flüssigkeiten werden zuerst durch den sauerstoffarmen Gasstrom von Luft befreit, ehe man sie mit 25 mg Pyrogallol in i ccm Wasser versetzt ; das Durchleiten wird beim Zufügen der Enzymlösung oder von Hydroperoxyd fortgesetzt. Um zu entscheiden, ob eine beobachtete Purpurogallinreaktion durch Hydroperoxyd oder andere gelöste Peroxyde hervorgerufen ist, kann eine Probe mit Katalase, die nur das einfachste Peroxyd zersetzt, behandelt und abermals geprüft werden. Versuche mit Chlorophyll ohne Enzym. Die kolloiden Lösungen waren nach den Angaben von Abschnitt VI, C mit einem Zusatz von \/io Mol Magnesiumcarbonat bereitet, der die Die Frage der Bildung \on Formal(leh\-d und Hydroperoxyd aus Kohlensäure. 403 Hydrolyse der komplexen ^lagnesiumverbindung auch in der großen Ver- dünnung verhindert. Wir arbeiteten mit der in den voranstehenden x\bhandlungen beschrie- benen Apparatur für Assimilationsversuche, die nun, da keine Gasanalyse vorzunehmen war, mit der Assimilationskammer endete. Die Assimila- tionsdose befand sich also im Kühlbad von konstanter Temperatur und wurde mit etwa 45 000 Lux belichtet ; der Gasstrom ging von der expo- nierten Kammer in eine zweite Dose, die für die Parallelversuche unter Lichtausschluß diente und die sich in einem mit demselben Kühlwasser- strom regulierten Bad befand. Um die Gasmischung, zum Beispiel ein Gemisch von 25 Vol.-Proz. Kohlendioxyd und 75 Proz. Stickstoff, zu bereiten, evakuierten wir eine Stahlflasche von 10 bis 20 Litern und füllten sie mit einer Kohlensäure- flasche unter atmosphärischem Druck; dann preßten wir aus der Stick- stoffflasche unter Anwendung eines Reduzierventils auf einen Überdruck von drei Atmosphären. Um geringere Gehalte an einem Gase einzufüllen, lassen wir in die evakuierte Stahlflasche aus einem Gasometer ein gemes- senes Volumen einströmen und pressen dann das zweite Gas aus einer Vorratsflasche auf den erforderhchen Überdruck nach. Erstes Beispiel. Von der kolloiden Lösung wurden 50 cqn mit 23 mg reinem Chlorophyll (a -f /^) angewandt. Das Gas enthielt 25 Vol.- Proz. CO2 und \/3 Proz. Sauerstoff. Nach dem Verdrängen der Luft begannen wir bei 0° Badtemperatur zu belichten und steigerten nach einer halben Stunde und im Laufe einer folgenden halben Stunde die Temperatur bis auf 15 ° und hielten sie wäh- rend weiterer 3 Stunden bei 15 °. Schon in der ersten Stunde Belichtung begann die Ausflockung des Chlorophylls, und sie war am Ende des Versuchs vollständig. Im parallelen Dunkelversuch änderte sich das Hydrosol nicht. Das Chlorophyll wurde unter Salzzusatz mit Äther isoliert und die wässerige Mutterlauge auf Aldeh\'d und Hydroperoxyd geprüft. Im Lichtversuch war aus 30 bis 31, im Dunkelversuch aus 42 bis 43 Proz. des Chlorophylls das Magnesium als Carbonat ausgetreten; 26* 404 R- Willstättcr und A. Stoll. im ersteren Falle deshalb weniger, weil der Dispersitätsgrad des Pigmentes abgenommen hatte. Zweites Beispiel. Angewandt 100 ccm kolloide Lösung von 23 mg Chlorophyll; 5 Vol.-Proz. Kohlendioxyd enthaltende Luft; Be- lichtung bei 15 ° während 4 Stunden ; am Ende war das meiste Pigment ausgefällt. Im Lichtversuch waren 20 Proz., im Dunkelversuch bei 5V2 Stunden Einwirkung der Kohlensäure 32 bis 33 Proz. Phäophytin gebildet. Drittes Beispiel. 50 ccm frisch bereitete kolloide Lösung von 31 mg Chlorophyll {a-\-h); 5 Vol.-Proz. Kohlendioxyd enthaltende Luft. Die Belichtung wurde langsam auf die volle Stärke gesteigert und dauerte bei 15° etwa 5 Stunden. Nach 2^'. Stunden schien die Lösung noch unverändert zu sein, aber sie enthielt am Ende des Versuchs allen Farbstoff als zusammenhängendes feines Häutchen In diesem Fall konnte das Gel ohne Aussalzen und Ausäthern abfiltriert werden, so daß die Mutterlauge in reinstem Zustand zu prüfen war. Durch Kohlensäurewirkung waren im Lichte 18 Proz., in der Dunkel- probe 27 bis 28 Proz. des Chlorophylls zersetzt. Auf Formaldehyd wurden je 10 ccm mit fuchsinschwefliger Säure und mit der Reaktion von Rimini- Schryver geprüft. Der Befund war durchwegs negativ; wurden gleiche Proben aber mit 0,01 bis 0,02 mg Formaldehyd versetzt, so gaben sie deutliche Aldehydreaktion. Die Prü- fung mit Pyrogallol + Peroxydase erwies in allen Fällen die Abwesenheit löslicher Peroxyde; ein Zusatz von 0,02 mg Hydroperoxyd zu 10 ccm Flüssigkeit verriet sich deutlich. Versuche unter Zusatz von Katalase. Die hier angewandte Katalase war im Jahre 1911 von R. Will- stättcr und A. Madinaveitia^) aus Pferdeleber nach den Angaben von F. Battelli und L. Stern -'^ gewonnen und durch Umfällung aus der wässerigen Lösung mit Alkohol gereinigt worden. Beim Auf- ^) A. Madinaveitia, Zur Kenntnis der Katalase, Promotionsarbeit, Technische Hoch- schule Zürich [191 2]. 2) F. Battelli und L. Stern, Societe de Biologie 57, 374 [1904]. Die Frage der Bildung von Formaldehvd und Hvdroperoxvd aus Kohlensäure. _|.05 bewahren (6 Jahre) hatte das sehr wirksame Präparat nur nahezu die Hälfte seiner ursprünglichen Leistungsfähigkeit eingebüßt. Die Prüfung geschah nach den Angaben von Madinaveitia. 5 mg des feingepulverten Enzyms wurden mit Wasser zerrieben und die feine Suspension, die sich nur mit großem Verlust durch Hartfilter fil- trieren lassen würde, auf 100 ccm verdünnt. Davon ließen wir in Doppel- proben je 1,00 ccm aus der Pipette zu 25 ccm einer in genau parallelem Versuche titrierten etwa HoOo-Lösung von 0° zufließen und unter- 100 " ^ brachen nach 10 Minuten die Reaktion durch Zusatz von 20 ccm 2 n- Schwefelsäure, um dann das un\Trbrauchte Hvdroperoxvd mit KMnOa 100 zurückzutitrieren. 85 Proz. des Hydroperoxyds waren zersetzt. Man kann den Wir- kungsgrad der Katalase zum Vergleiche auf denjenigen beziehen, welchen G. Bredig und R. Müller von Berneck^) für kolloides Platin an- geben, indem man die Substanzmenge im Liter berechnet, die erforder- lich ist, um eine Reaktionskonstante K = 0,0107 ^^ geben. Nach Ma- dinaveitia waren 0,00014 g-) Hepatokatalase nötig, um im Liter diese Konstante zu geben; nach unseren Bestimmungen beträgt die ent- sprechende Menge der aufbewahrten Katalase 0,00025 g- Wenn die aus einem tierischen Organe gewonnene Katalase die Funk- tion übernehmen kann, aus einem durch Energieaufnahme entstehenden Umwandlungsprodukt der Kohlensäure Sauerstoff zu entbinden, so wird Ameisensäure oder Formaldehyd entstehen. Wenn nun auch hier die Formaldehydprobe negativ ausfällt, so ist wenigstens eine stärkere Zer- setzung des Chlorophylls zu erwarten als durch Kohlensäure allein. Bei diesen Versuchen wurde, um Oxydation des Chlorophylls zu vermeiden^ mit sauerstoffarmem Kohlensäure-Stickstoffgemisch gearbeitet. Erstes Beispiel. 50 ccm einer frisch bereiteten kolloiden Lösung von 25 mg reinem Chlorophyll unter Zusatz von 0,5 mg Katalase, die in 10 ccm Wasser fein verteilt waren, 25 Proz. Kohlen dioxyd und ^) G. Bredig und R. Müller von Berneck, Zeitschr. f. physik. Chem. 31, 258 [1899]. 2) Auf S. 27 und 33 der Arbeit von Madinaveitia ist angegeben 0,00016, mit den Versuchsdaten berechnet sich aber genauer 0,00014. 406 R. Willstätter und A. Stoll. 1/3 Proz. Sauerstoff enthaltender Stickstoff. Die Beimischung des En- zyms bewirkte im Lichtversuch raschere Ausflockung des Pigmentes; die Belichtung wurde, damit Licht- und Dunkelversuch gut verglichen wer- den konnten, bei eben beginnender Ausflockung abgebrochen, nämlich nach 1V2 Stunden Belichtung bei 15°. Die Zersetzung des Chlorophylls im Belichtungsversuch (entsprechend 21 Proz. Phäophytin) und im Dunkelversuch (23 bis 24 Proz. Phäophytin) stimmte so gut überein, daß die Bildung einer stärkeren Säure als der Kohlensäure nicht angenom- men werden darf. Zweites Beispiel. Chlorophyllösung (20 mg in 40 ccm), Enzym- zusatz und Zusammensetzung des Gases wie im vorigen Beispiel, aber die Versuchstemperatur o °, auch Kühlung während des Aufarbeitens, um weitere Einwirkung der Kohlensäure hintanzuhalten. Der Versuch dauerte 1^/2 Stunden. Nach dieser Zeit war die Ausflockung des Chloro- phylls eben beginnend. Im Licht versuche wurden 10, in der Parallelprobe 10 bis II Proz. des Magnesiums abgespalten. Die Farbreaktion auf Formaldehyd mit je 10 ccm der von Farbstoff befreiten Lösungen fiel negativ aus. Daher kann in keinem der Ver- suche eine Menge von 0,05 mg Formaldehyd entstanden sein. Über das Assimilationsexperiment von Chodat und Schweizer. In der IX. Abhandlung^) der aus dem botanischen Institut von Genf veröffentlichten Reihe ,,Nouvelles recherches sur les ferments oxydants" von R. Chodat wird die Assimilation der Kohlensäure in vitro unter der Wirkung von Chlorophyll untersucht und das Ergebnis verzeichnet: ,,i° la chlorophylle en presence du COo produit de l'aldehyde formique, dans la lumiere; 2° dans ces memes conditions, eile produit proportionnellement de l'eau oxygenee." In bezug auf den Nachweis von Aldehydspuren schließt sich diese Untersuchung den älteren von Usher und Pries tley und von Schryv^er an und sie ist in dieser Beziehung im Zusammenhang mit ^) R. Chodat und K. Schweizer, Arch. d. Sc. phy.s. et nat. [4], 39, 334 [1913]- Die Frage der Bildung von Formaldehyd und Hydroperoxyd aus Kohlensäure. 407 ihnen oben widerlegt worden. Bemerkenswerter ist die Prüfung auf das entstehende Wasserstoffsuperoxyd durch Anwendung eines Systems von Peroxydase mit einem oxydierbaren Stoffe Pyrogallol, Guajakemulsion, p-Kresol), wovon die Autoren sagen: ,,La Peroxydase est un reactif precieux pour suivre la marche de la photolyse du CO., et de l'eau par la chlorophylle (in vitro)." Die Versuche von Chodat und Schweizer sind von uns wieder- holt worden, zunächst mit einer einzigen Abänderung, nämlich unter An- wendung von reinem Chlorophyll in gewogener Menge, aber in derselben Form wie bei Chodat und Schweizer, d. i. niedergeschlagen auf kohlensauren Kalk, und zweitens noch mit der weiteren Änderung, daß wir das Pigment statt mit Calciumcarbonat mit gereinigtem Talk ver- dünnten. Die Anwendung des Calciumcarbonats als Träger von Chloro- phyll ist eine sehr ungeeignete Maßregel, denn die Gegenwart \'on Erd- alkalicarbonat wirkt, wie in der vierten Abhandlung (Abschnitt VII) ge- zeigt worden, der Addition von Kohlensäure an Chloroph^/ll stark ent- gegen. Im Versuche mit Chlorophyll auf Talk trat bei der Einwirkung von Kohlensäure im Licht weder eine Spur von Peroxyd noch von Aldehyd auf. Mit Chlorophyll auf Calciumcarbonat fiel im Dunkel- ebenso wie im Lichtversuche die Wasserstoffsuperoxydprobe positiv aus; denn diese Peroxydreaktion ist nur vorgetäuscht durch den als Bicarbonat vorhan- denen Kalk ; sie tritt hier ebensogut auch ohne Peroxydase nur mit Luft- sauerstoff ein (siehe oben den Abschnitt: Nachweis von Hydroperox3'd und anderen löslichen Peroxyden). Der aus dem vermeintlichen Nach- weis des Hydroperoxyds von Chodat und Schweizer abgeleitete Satz: ,,La catalase des feuilles vertes sert ä decomposer l'eau oxygenee, produit accessoire de la photolyse au cours de laquelle l'oxygene atomique apparait." ermangelt somit der experimentellen Begründung. Im Folgenden werden die Fehler im einzelnen aufgedeckt, die im Spiele waren. Erstes Beispiel. Das reine Chlorophyll (0,06 g) wurde mit i com Äther aufgenommen und die Lösung mit 10 ccm sehr leicht fluch- 4o8 R. Willstätter und A. Stoll. tigern Petroläther verdünnt und auf lo g gefälltes Calciumcarbonat ge- gossen. Diesen Brei ließ man an der Luft unter Umrühren vollständig eindunsten. Er bildete ein hellgrünes Pulver. Wir rührten es mit loo ccm Wasser, das bei i8° mit Kohlensäure gesättigt war, in einer flachen Schale zu einer feinen Suspension an und verschlossen die Schale sogleich luft- dicht durch eine aufgeschraubte Glasplatte. Bei 20° Badtemperatur be- lichteten wir mit etwa 45 000 Lux 8 Stunden lang unter häufigem Um- schwenken, um immer neue Teile der Suspension dem Lichte auszusetzen. Da die flache Dose von 400 qcm Fläche ^ j^ 1 Rauminhalt hatte, so gab die angewandte Kohlensäure mit der Luft des Gefäßes ein Gemisch von un- gefähr 20 Vol.-Proz. Kohlendioxyd. Der parallele Dunkelversuch war unter gleichen Versuchsbedingungen angesetzt. Durch die Behchtung war die Chlorophyllsuspension deutlich aufgehellt und olivstichig. Wir filtrierten sie ab und lösten auf dem Filter mit Alko- hol den Farbstoff heraus, um ihn in Petroläther überzuführen. Beim Herauswaschen der Hauptmenge des Alkohols fiel ein Teil, der durch Oxydation braun und unlöslich geworden, in Flocken aus. Der colori- metrische Vergleich des in alkoholhaltigem Petroläther löslichen Anteils im Belichtungs- und im Dunkelversuche ergab einen Chlorophyllverlust von 25 Proz. Im löslichen Anteil war auch Phäophytin enthalten, aber infolge der schützenden Wirkung des Calciumcarbonats verhältnis- mäßig wenig trotz der langen Versuchsdauer, im Dunkelversuch 10 Proz., im Lichtversuch etwas mehr. Auf Hydroperoxyd wurden mit Pyrogallol + Peroxydase vier Proben (je 10 ccm) vom Filtrat des Belichtungsversuches unter Durchleiten von 25 Proz. Kohlendioxyd enthaltendem Stickstoff geprüft. Die Proben bUeben bis zum folgenden Tage farblos. Um die Empfindlichkeit des Systems zu bestätigen, fügten wir zu einer der Proben nach einer Stunde, zu einer anderen am nächsten Tage 0,01 mg Hydroperoxyd hinzu; darauf trat sofort Gelbfärbung ein. Bei der tagelangen Dauer der Probe blieb natürlich Oxydation nicht ganz ausgeschlossen; aber auch dann war auf Zusatz von Säure beim Ausäthern weniger als ein Drittel des im Vergleichs- versuche von 0,01 mg Hydroperoxyd gebildeten Purpurogallins vorhan- Die Frage der Formakkln dl)iklun!4 aus Clüoroplnll. 409 den. Wenn man andererseits die Luft nicht ausschloß, und eine Probe von IG ccm, die wir dem Dunkelversuch entnahmen, mit 25 mg Pyrogallol versetzte, so trat auch schon ohne Anwesenheit von Peroxydase sogleich starke Gelbfärbung ein, weil eben die Flüssigkeit sich mit Calciumcarbonat gesättigt hatte. Aldehyd war mit fuchsinschwefliger Säure nicht aufzufinden ; es trat wohl Rotfärbung ein, aber sie beruhte nur auf Rückbildung von Fuchsin durch die Einwirkung des Calciumcarbonats. Die von Schryver ver- besserte Probe von Rimini ergab eine nicht zu beachtende Spur \'on Formaldehyd, weniger als ^/g einer Vergleichslösung von 0,01 mg, was für den ganzen Versuch höchstens 0,036 mg Formaldehyd bedeutete. Zweites Beispiel. Die von kohlensaurem Kalk bedingten Stö- rungen der Nachweise werden durch Verdünnung des Chlorophylls mit Talk vermieden. Derselbe war zuvor gründlich mit Säure gereinigt und unter Kochen säurefrei gemacht. Für 5 g Talk verwendeten wir dreimal mehr Chlorophyll als im ersten Beispiel; die Versuchsbedingungen waren die nämlichen wie zuvor, die Belichtung dauerte aber nur 7 Stunden. Die Chlorophyllsuspension wurde olivstichig, die Einwirkung der Kohlen- säure ging hier viel weiter wie im Versuche mit Calciumcarbonat als Verdünnungsmittel. Dennoch fiel die Probe auf Peroxvd, die hier ohne besondere Vorsichtsmaßregeln nach Chodat und Schweizer ausgeführt werden konnte, gänzlich negativ aus. Die Aldehydprobe mit fuchsin- schwefliger Säure gleichfalls, und die Reaktion von Schryver ergab höchstens eine solche Spur Formaldehyd, daß sie durch Vergleich mit 0,01 mg Formaldehyd nicht mehr zu schätzen war und außer Betracht gelassen werden muß. V. Die Frage der Formaldehydbildung aus Chlorophyll. Im vorigen Abschnitt ist bei der Würdigung und bei der Xachj)rüfung von Arbeiten, die auf die Anwendung des Chlorophylls außerhalb der Pflanze zur Zerlegung- der Kohlensäure im Lichte hinzi(^ltcn. die I^^rage 410 R- Willstätter und A. Stoll. der Reinheit des angewandten Chlorophylls nur gestreift worden. Sie war dort nicht von ausschlaggebender Bedeutung, insofern es sich gezeigt hat, daß selbst mit den besten Chlorophyllpräparaten, welche der der- zeitige Stand unserer Kenntnisse und präparativen Methodik zu gewinnen erlaubt, gar keine Einwirkung auf Kohlensäure unter künstlichen Ver- suchsverhältnissen zu erzielen ist. Die Frage nach der Beschaffenheit und Brauchbarkeit der Chlorophyllpräparate ist aber bei denjenigen Unter- suchungen in den Vordergrund zu rücken, in denen man die Bildung von Formaldehyd und von Hydroperoxyd oder anderen niederen Peroxyden statt auf Kohlensäurezerlegung auf den Zerfall des Chlorophylls zurück- zuführen versucht hat. Die Photolyse des Chlorophylls verfolgt eine neuere Richtung der Forschung, die einsetzte, als die Befunde der extra- cellulären Formaldehydbildung durch Chlorophyll wenig befriedigten ; sie wird durch die Untersuchungen von Ch. H. Warner i) und H. Wager-) und von A. J. Ewart^) vertreten. Der nach zahlreichen Beobachtungen angenommenen Zersetzung des Chlorophylls im Lichte wird eine große Bedeutung beigemessen; Wager hat seine Theorie der Assimilation auf die Voraussetzung gegründet, daß im natürlichen Assimilationsvorgang Zerfall und Aufbau des Chlorophylls beständig erfolge. Dann würden die Formaldehydmoleküle, die Bausteine der Kohlenhydrate, aus dem Chloro- phyll hervorgehen, also nur auf einem weiten Wege chemischer Meta- morphosen aus der Kohlensäure. Es wäre nicht allzu bedenklich, mit einiger Vorsicht in den Schluß- folgerungen Versuche der Kohlensäurezerlegung auch unter Anwendung von Chlorophyllpräparaten vorzunehmen, die mit Begleitstoffen ver- mengt sind, wenn nur das Chlorophyll selbst in jeder Beziehung unver- ändert ist. Hingegen lassen sich Untersuchungen über die im Licht auf- tretenden Zerfallprodukte nur mit reinen Präparaten vornehmen. Ein Chlorophyllpräparat kann zwei Fehler haben: es kann Bei- mischungen enthalten und es kann Zersetzung erlitten haben, so daß es 1) Ch. H. Warner, Proc. Roy. Soc. Ser. B 87, 378 [1914]. 2) H. Wager, Proc. Roy. Soc. Ser. B 87, 386 [1914]. =») A. J. Ewart, Proc. Roy. Soc. Ser. B 89. i [1915]. Die Frage der Formaldehydbildung aus Chlorophyll. 4II also nicht mehr Chlorophyll ist. Die Chlorophyllpräparate, mit denen die zahlreichen physiologischen Versuche vorgenommen worden sind, scheinen beide Fehler aufgewiesen zu haben. Es war zu früh für die Ausführung physiologischer Versuche. Usher und Priestley sowie Chodat und Schweizer gewannen Chlorophyll durch Ausziehen der Blätter mit Alkohol und Über- führen des Farbstoffes in Benzin nach einem Verfahren, das von Chodat und Schweizer irrtümlich Hoppe-Seyler zugeschrieben wird. Auch Wager extrahierte Blätter in der Siedehitze mit Alkohol, dampfte die Extrakte zur Trockne ab und löste den Rückstand in Petroläther. In keiner der angeführten Arbeiten über Photosynthese, in denen so bedeu- tende Sorgfalt und Mühe auf das physiologische Experiment verwendet wurde, findet sich auch nur eine Andeutung von Beschreibung des ver- wendeten Chlorophylls in chemischer oder physikalischer Hinsicht oder eine Angabe über Menge und Konzentration des Farbstoffes oder wenig- stens über die Menge des pflanzlichen Ausgangsmaterials. Die Forschung sollte auf diesem Gebiete den Anforderungen chemischer Sauberkeit mehr als bisher gerecht werden. Nach Warner findet die Bildung von Formaldehyd durch die Zer- setzung der chlorophyllhaltigen Films im Lichte in einem Oxydations- vorgang statt und das Ausbleichen des Films scheint durch Hydroperoxyd hervorgerufen zu werden; an der Bildung von Aldehyd wie von Hydro- peroxyd hat Kohlensäure keinen Anteil. Warner erkennt es bereits als wünschenswert, die Versuche mit reinem Pigment zu wiederholen und erwartet interessante Aufschlüsse von Assimilationsversuchen bei (legen- wart pflanzlicher Enzyme. Die Erkenntnis, daß die Kohlensäure auf die Entstehung von Aldehyd und Peroxyden beim Belichten des Chlorophylls ohne Einfluß ist, hndet sich ferner bei Wager. Nach seinen Beobach- tungen namentlich an Papierstreifen, die mit Chlorophyll gefärbt sind, wird Chlorophyll am Licht rasch oxydiert, wobei wenigstens zwei Sub- stanzen auftreten, ein Aldehyd oder eine Mischung von Aldehyden, und zweitens ein aktives chemisches Agens, das aus Jodkalium Jod frei macht. Endlich geht auf das Verhalten der Blattfarbstoffe gegen Sauerstoff und 412 R- Willstätter und A. Stoll. gegen Kohlensäure die letzte Abhandlung von A. J. Ewart^) ein, die wir infolge der Zeitverhältnisse nur im Referate kennengelernt haben und die danach mit der früheren kritischen Arbeit des Forschers schwer in Einklang zu bringen ist. Ewarts Angaben beziehen sich auf Versuche mit Pigmenten, die nach unserem Verfahren hergestellt, aber, doch nicht einheitlich gewesen zu sein scheinen. In der Photooxydation sollen Chlorophyll und Xanthophyll in Formaldehydgas und feste Stoffe zerfallen, welche aus Wachsen und Hexosen bestehen. Ferner enthält das Referat die Angabe, die nach der Zusammensetzung der Pigmente nicht verständlich ist, daß sich Chlorophyll mit Kohlensäure unter Bildung von Xanthophyll und farblosem Wachse verbinde. Es hat sich im Gegensatze, wie uns scheint, zu diesen Angaben in unseren Belichtungsversuchen mit Chlorophyll im sauerstoffhaltigen Gas- strom gezeigt, daß das Chlorophyll verhältnismäßig beständig gegen Sauerstoff ist und daß in den ersten Stufen der Oxydation von Chlorophyll im Licht kein Formaldehyd, überhaupt keine Aldehyde entstehen, son- dern Verbindungen, die dem Chlorophyll noch nahestehen ; dabei werden auch keine niedrigen Peroxyde frei. Das gilt für stundenlanges Exponieren kolloider Chlorophyllösungen, deren Flächenkonzentration ähnlich wie bei tiefgrünen Laubblättern ist, also 5 bis 7 mg Chlorophyll auf das Ouadratdezimeter beträgt. Man kann allerdings durch fortgesetzte Einwirkung von Sauerstoff im Lichte das Pigment auch weitergehend zerstören, und es ist nicht zu be- zweifeln, es ist aber nicht von Interesse, daß schließlich aus dem Farb- stoffmolekül, das ja eine Methoxylgruppe und den an Methylgruppen reichen Phytolrest enthält, auch die niedrigsten Spaltungsstücke wie Formaldehyd hervorgehen können. Die vollständige Zerstörung des Chlorophylls sollte aber für die physio- logische Frage außer Betracht gelassen werden ; denn in der Pflanze bleibt, wie in der ersten Abhandlung entgegen den Vorstellungen von Wager bewiesen worden ist, auch unter Bedingungen aufs äußerste gesteigerter ^) A. J. Ewart, Chem. Centralbl. 1915, II, 960. Die Frage der Formaldehydbildung aus Chlorophyll. 413 Assimilationsleistung das Chlorophyll in seiner Menge und in seinem Komponentenverhältnis unverändert . Es scheint übrigens nicht, daß die Bildung von Aldehyd und Peroxyd in den Versuchen der anderen Autoren dadurch zu erklären ist, daß sie das Pigment einer weitergehenden Einwirkung von Sauerstoff im Lichte unterwarfen, sondern es ist wahrscheinlich, daß die Begleitstoffe des Chlorophylls stärkerer Photooxydation unterlagen, und durch die Wirkung ihrer Zerfallprodukte, zum Beispiel von Peroxyden, auch den Farbstoff rascher in die Zersetzung hineinzogen. Versuche zur Oxydation des Chlorophylls im Lichte. In reiner Kohlensäure erfährt kolloides Chlorophyll beim Belichten keine andere Veränderung als die Entziehung von Magnesium. Wenn der Dispersitätsgrad des Kolloids unverändert blieb, so war nach der Belich- tung ebensoviel Chlorophyll in Phäophytin umgewandelt wie im Dunkel- versuche. Wurde nach der Belichtung die Phäophytinbildung durch Behandeln mit Säure vervollständigt, so stimmten die Lösungen der Be- lichtungs- und Dunkelversuche in Farbe und Intensität überein. Bei der Belichtung einer Lösung von Chlorophyll a in kohlensäure- freier Luft wurde während 4 Stunden die Lösung immer mehr olivgrün, so daß sie am Ende in ihrer Nuance einem Gemische von zwei Dritteln Chlorophyll a und einem Drittel Phäophytin entsprach. Die Farbinten- sität der behchteten Lösung hatte sich nicht vermindert, sondern sogar deutlich zugenommen. Diese Vermehrung der Farbstärke während mehr- stündiger Behchtung bei Sauerstoffzutritt war in allen Versuchen sichtbar, mit dem Gemisch der Komponenten wie mit dem einzelnen Farbstoff. ÄhnHch fiel der Vergleich mit Phäophytin in bezug auf die Farbintensität aus, wenn zugleich teilweise Zersetzung durch Kohlensäure und Einwir- kung des Sauerstoffs stattgefunden hatte. Wir fanden (im zweiten Bei- spiel der Versuchsreihe ohne Katalase, Abschnitt IV) nach 4 stündiger Belichtung von Chlorophyll (a +6) bei 15° in 5 Proz. Kohlendioxyd enthaltender Luft, daß die Farbe der Pigmentlösung wieder so olivstichig war wie von einem Gemisch aus zwei Dritteln Chlorophyll und einem ^14 R. Willstätter und A. Stoll. Drittel Phäophytin und daß die Farbstärke um 20 Proz. gegen die Dunkelprobe zugenommen hatte, die 5^2 Stunden mit demselben Gas- strom behandelt war. Das Oxydationsprodukt des Chloroph341s läßt sich, da es in alkohol- haltigem Petroläther unlöslich ist, von Chlorophyll und Phäophytin tren- nen. Zum colorimetrischen Vergleich des Farbstoffes und zur Bestimmung des gebildeten Phäophytins hatte man das Pigment nach der Belichtung in Äther übergeführt. Diese Lösung dampften wir unter Vermeidung höherer Temperatur zur Trockne ein und nahmen den Rückstand mit etwas absolutem Alkohol und mit 150 ccm Petroläther auf. Dann schied sich beim Herauswaschen der Hauptmenge des Alkohols im Scheidetrich- ter das Oxydationsprodukt in braunen Flocken aus, die noch etwas Chloro- phyll enthielten. Sie wurden durch Anschütteln der wässerigen Suspen- sion mit frischem Petroläther und vorsichtigen Zusatz von Alkohol von neuem in petrolätherische Lösung übergeführt und auf gleiche Weise wieder abgeschieden, nunmehr frei von beigemischtem Chlorophyll. Die petrolätherischen Lösungen enthielten Chlorophyll zusammen mit Phäophytin; um sie mit der Ausgangslösung colorimetrisch zu verglei- chen, zersetzte man diese so weit mit Säure, daß die Farbtöne überein- stimmten. Im angeführten Versuche waren noch 80 Proz. der ange- wandten Farbstoffmenge als Chlorophyll + Phäophytin vorhanden und 20 Prozent Oxydationsprodukt entstanden. In einem anderen Versuche (drittes Beispiel ohne Katalase, Abschn. IV) waren nach 5 Stunden Belichtung in 5 Proz. Kohlensäure enthaltender Luft nur 12 Proz. des Farbstoffs durch Oxydation petrolätherunlöslich geworden. Bei der analogen Aufarbeitung und colorimetrischen Bestim- mung der Dunkelversuchsproben sind die angewandten Farbstoffmengen ohne Verlust wieder gefunden worden. Im Versuche mit Chlorophyll-Calciumcarbonatmischung nach Cho- dat und Schweizer vgl. Abschnitt IV) waren nach 8 Stunden Be- lichtung in etwa 20 Proz. Kohlendioxyd enthaltender Luft noch 75 Proz. des angewandten Farbstoffes petrolätherlöslich, als Chlorophyll -\- Phäo- phytin vorhanden. über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäureverbindung im Lichte. 415 Das Oxydationsprodukt ist wahrscheinlich nicht einheithch. Es ist bis auf ein Spürchen in Alkohol und Äther leicht löslich, mit olivbrauner Farbe. Die Lösungen geben mit methylalkoholischer Kalilauge noch die braune Phase, wie Chlorophyll und Phäophytin, einen vorübergehenden Farbumschlag in Rotbraun. Beim Schütteln der ätherischen Lösung mit konzentrierter Salzsäure geht in diese wie bei Phäophytin nur ein Teil mit blauer Farbe; wird durch Verdünnen der Säure die Substanz wieder in Äther zurückgeführt, so ist die Farbe etwas grünlicher als zuvor. Die geringe Basizität spricht dafür, daß die Phytolestergruppe noch unver- ändert ist. Bei stundenlanger Behchtung ^'4 bis 8 Stunden) unter Sauerstoffzutritt war also das Chlorophyll nicht ausgebleicht, sondern nur zum kleineren Teil und nicht weitgehend oxydiert, nur anoxydiert. Daß unter diesen Bedingungen noch kein Formaldehyd nachgewiesen werden konnte, ist bereits im vorigen Abschnitt angegeben worden. VI. Über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäureverbindung im Lichte. A. Theoretischer Teil. In der vierten Abhandlung wurde das Verhalten von Chloroph3'll gegen Kohlensäure beschrieben: es bildet eine dissoziierbare Verbindung. Da die Zerlegung der Kohlensäure und Entbindung der molekularen Menge Sauerstoff in der Pflanze nur unter der Aufnahme der vom Farb- stoff absorbierten Energie der Lichtstrahlen erfolgt und da dieser Vorgang, wie in der zweiten Abhandlung wahrscheinhch gemacht wurde, unter Beteiligung eines Enzyms verläuft, so ist anzunehmen, daß er sich aus mehreren Teilvorgängen zusammensetzt : aus einer Umformung der Chlorophyllkohlensäureverbindung in ein energiereicheres Isomeres und aus dem enzymatisch beschleunigten freiwilligen Zerfall des letzteren unter Abspaltung von Sauerstoff. Nach dieser Vorstellung wird ein Ad- ditionsprodukt aus Chlorophyll mit Kohlensäure oder mit einem Kohlen- 4i6 R. Willstätter und A. Stoll. Säurederivate unter Energieaufnahme umgelagert in eine Verbindung von Peroxydkonstitution. Wenn man die einfachste Form, in der Kohlen- säure an Chlorophyll addiert sein kann, der Betrachtung zugrunde legt, so wird die Umwandlung durch folgendes Schema ausgedrückt : N O NH OH Chlorophyll- Kohlensäureverbindung N O -■^Mg-O-C I r ■ NH HO Umgelagerte Chlorophyll- Kohlensäureverbindung Es wird nun versucht, die Photoisomerisation der Kohlensäurever- bindung des Chlorophylls mit einem Reagens nachzuweisen, das Peroxyde empfindlich anzeigt, nämlich das Verhalten des Chlorophylls gegen Kohlen- säure im Lichte mit Hilfe der Kombination aus Peroxydase und Pyrogallol zu prüfen. Mittels der Peroxydase soll eine entstehende Peroxydgruppe ergriffen werden, die sich sonst infolge des Fehlens der Einrichtung für die Sauerstoffabspaltung wieder in die ursprüngliche Bindungsweise zurück verwandeln würde. Die Fragestellung ist eine andere als in unseren Versuchen der voranstehenden Abschnitte und in den dort angeführten Arbeiten anderer Forscher. Es wird jetzt vorausgesetzt, daß die Zerlegung der Kohlensäure unter den gegebenen Bedingungen nicht stattfindet, daß also aus der Kohlensäure weder eine niedrigere Oxydationsstufe des Methans, noch ein niedriges, lösliches Peroxyd unter den Bedingungen des Experimentes hervorgeht. Das System aus Peroxydase und einem Phenol dient nicht mehr als Mittel zur Untersuchung der wässerigen Lö- sung von Kohlensäure auf eine Zwischenstufe der Sauerstoffentbindung, sondern als Reagens auf eine Veränderung in der Chlorophyll-Kohlen- säureverbindung selbst, die als Zwischenprodukt der Assimilation ange- nommen wird. Um die Einwirkung des Lichtes auf kolloide Chlorophyllösungen, die zugleich Peroxydase und Pyrogallol enthalten, in kohlensäurehaltiger Atmosphäre zu verfolgen, waren die Bedingungen so zu wählen, daß weder über das Verhalten der Chloroph3dlkohlensäureverbindung im Lichte. 417 die Reaktion von Chlorophyll mit Kohlensäure gestört, noch die Zuver- lässigkeit der Peroxydasereaktion beeinträchtigt wird. Die Peroxydase war aus Cochlearia armoracia (Meerrettich) gewonnen ; unsere ersten Präparate, nicht besser als in der Literatur beschriebene, waren unbrauchbar, indem sie auf das kolloide Chlorophyll ausflockend wirkten. Das sollte aber ein besonderer Vorteil des gewählten Reagens sein, daß es sich mit dem Hydrosol verträgt, während von Elektrolyten das Chlorophyll aus der kolloiden Lösung gefällt wird. Das erwähnte Hindernis gab den Anlaß zu Verbesserungen der präparativen und ana- lytischen Methoden. Es gelang, hochwertige Präparate des Enzyms auf einfachem Wege darzustellen und die Prüfung der Peroxydasewirkung zu vervollkommnen, so daß sich die Brauchbarkeit des Reagens unter den Verhältnissen des Assimilationsversuches kontrollieren und bestätigen Heß. Die Reaktion der Peroxydase wird allerdings mit steigender Konzen- tration der Kohlensäure geschwächt und es bildet sich als Oxydations- produkt des Pyrogallols in stärker kohlensaurer Lösung nicht mehr ein- heithches Purpurogallin, das wir für die colorimetrische Bestimmung zu isolieren pflegen. Aber die Störung macht sich nicht bemerkbar beim Nach- weis von Peroxydspuren und die Empfindlichkeit der Peroxydase bleibt auch in hochprozentiger Kohlensäure noch mehr als ausreichend. Die Dispersität des Chlorophylls wird nicht beeinträchtigt durch das schon recht reine Enzym, dessen Menge verhältnismäßig beträchtlich gewählt wurde, zum Beispiel 0,25 mg für den Versuch mit 30 mg Chloro- phyll. Jeder Zusatz zur kolloiden Chlorophyllösung mußte noch in einer anderen Beziehung geprüft werden, nämlich hinsichtlich seines Einflusses auf die Reaktion von Chlorophyll mit Kohlensäure. Gewisse Stoffe, die sich als Schutzkolloid eignen könnten, wie Gelatine, sind nicht anwendbar, da sie die Addition von Kohlensäure an die Magnesiumverbindung ver- zögern oder verhindern. In dieser Weise wirkt auch, wie in der vierten Abhandlung (Abschnitt VII) gezeigt worden, Magnesiumcarbonat. Das kolloide Chlorophyll wird durch Erdalkalicarbonate vor der Eliminierung des Magnesiums geschützt; diese Erscheinung beruht aber auf der Ver- zögerung der Kohlensäureaddition an Chlorophyll. Der Zusatz von Ma- itätter-StoII, Assimilation. 4i8 R- Willstätter und A. Stoll. gnesiumcarbonat ist für den Schutz des kolloiden Chlorophylls vor hydro- lytischer Zersetzung bei der hier erforderlichen Verdünnung der Lösung nicht ganz zu entbehren, aber er läßt sich auf ein Minimum beschränken, das die Bildung des Additionsproduktes nicht mehr beeinträchtigt. Der Zusatz von Pyrogallol bewirkt keine Störung, weder Entziehung des Ma- gnesiums noch Verzögerung der Kohlensäureabsorption, auch nicht Aus- flockung. Die Pyrogallollösung wird schon im Dunkeln durch Luftsauerstoff bei der Berührung mit Glassubstanz und bei Gegenwart der doch noch nicht vollkommen reinen Peroxydase langsam gefärbt, aber diese Nebenreak- tion ist bei Anwendung kohlensäurehaltigen Gases ausgeschlossen. Im Dunkelversuche, den man stets parallel mit dem Belichtungsversuche beobachtete, bildete sich also fast kein Purpurogallin, ebenso im BHnd- versuche ohne Chlorophyll im Licht. Nach dieser Orientierung über die Komponenten des Systems haben wir die Belichtungsversuche bei Gegenwart von Peroxydase und Pyro- gallol mit kolloiden Chlorophyllösungen im Luftstrom ausgeführt, der 5 bis 20 Proz. Kohlendioxyd enthielt. Das Resultat war reichliche Pur- purogallinbildung. Aber diese Erscheinung war nur eine Folge langsamer Oxydation des Chlorophylls. Indem das Chlorophyll Sauerstoff aufnimmt, überträgt es ihn wie irgend ein anderer molekularen Sauerstoff absor- bierender Körper auf das System von Peroxydase mit Pyrogallol. Die Entstehung des Purpurogallins hat also keinen Zusammenhang mit der Umwandlung der Kohlensäure durch Chlorophyll. Die Behchtungsver- suche sind mit kohlensäurefreier Luft wiederholt worden. Die Oxydation des Pyrogallols unterblieb nun nicht, sondern es trat noch mehr Purpuro- gallin auf, um so viel mehr, als in dem parallelen Dunkelversuche, da die Autoxydation des Pyrogallols nun nicht mehr durch Kohlensäure gehemmt war, an Purpurogallin gebildet wurde. Bei dem negativen Ausfall können zwei Faktoren der Versuchsanord- nung mitgesprochen haben : die Zersetzung des Chlorophylls durch Koh- lensäure und die Photooxydation des Chlorophylls. Die Konzentration der Chlorophyll- Kohlensäure Verbindung ist bei der Versuchstemperatur von über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäureverbindung im Lichte. 419 15 ° sehr gering, weil nämlich der zweite Schritt der Kohlensäureeinwir- kung, die Spaltung der komplexen Magnesiumverbindung, sehr rasch auf den ersten Schritt nachfolgt, auf die Kohlensäureaddition. Die Spaltung der Kohlensäureverbindung wird verzögert und das Additionsprodukt der Kohlensäure angereichert beim Herabsetzen der Versuchstemperatur auf 0°, ohne daß die gesuchte Umwandlung der Kohlensäure gehemmt wird, die als eine Lichtreaktion von der Temperatur unabhängig ist. Daß die assimilatorische Leistung in der Pflanze bei Temperaturerniedrigung stark herabgesetzt wird, das beruht nach den in der zweiten Abhandlung (Abschnitt XIII) mitgeteilten vergleichenden Versuchen an chlorophyll- armen und an normal grünen Blättern wahrscheinlich nur auf der Ver- zögerung eines enzymatischen Teilvorganges der Assimilation. Der andere ungünstige Faktor in den Belichtungsversuchen war der beobachtete Angriff des Sauerstoffs auf das Chlorophyll. Durch die Kon- kurrenz des Sauerstoffs mit der Kohlensäure werden die leichter zugäng- lichen Moleküle an der Oberfläche der Kolloidteilchen an der Bildung des Additionsproduktes gehindert. Es gibt andererseits einige Bedenken gegen vollständigen Ausschluß von Sauerstoff bei diesen Versuchen. Bei der Assimilation in der grünen Pflanze hat sich nach den Erfahrungen der sechsten Abhandlung die Gegenwart von Sauerstaffspuren als unentbehr- lich erwiesen und möglicherweise kommt auch für die Übertragung des Sauerstoffs von einem hochmolekularen unlöslichen Peroxyde auf das Pyrogallol durch die Peroxydase Spuren von Sauerstoff eine gewisse Be- deutung zu. In einer zweiten Versuchsreihe sind nun dem Chlorophyll günstigere Bedingungen für die Photoreaktion mit der Kohlensäure geboten worden. Die kolloide Lösung wurde bei o° dem Lichte ausgesetzt in einer Atmo- sphäre von kohlensäurehaltigem Stickstoff mit sehr niedrigem Sauerstoff- gehalt. Auch unter diesen Bedingungen ist vom Peroxydasesystem keine Bil- dung einer peroxydischen Chlorophyllverbindung angezeigt worden, gleichviel ob mit reinen Präparaten von ChU)rophyll oder mit Rohchloro- phyll gearbeitet wurde, das Carotinoide und noch andere Begleitstoffe 420 R- Willstätter und A. Stoll. enthielt. Die Purpurogallinbildung ist unter diesen Verhältnissen gänz- lich unterblieben. Aus diesem Mißlingen des Nachweises kann noch nicht geschlossen werden, daß die Voraussetzung des Versuches unzutreffend ist, die An- nahme, daß sich die Chlorophyllkohlensäureverbindung in eine peroxy- dische isomere Form umlagere. Es könnte sein, daß die Meerrettichper- oxydase sich zur Reaktion mit dem gesuchten Peroxyde, wenn es hier in den Kolloidteilchen auftritt, nicht eignet. Es darf aber auch die Möglichkeit nicht außer acht gelassen werden, daß nicht die Kohlensäure selbst, addiert an Chlorophyll, der Photoisomerisation anheimfällt, sondern daß sich unter natürhchen Verhältnissen eine noch nicht festgestellte Kohlensäurever- bindung an das Chlorophyll anlagert und umgeformt wird. Es ist in der Tat in der dritten Arbeit beobachtet worden, daß im Blatt ein spezifisches Ab- sorbens vorhanden ist, das mit der Kohlensäure eine dissoziierbare Ver- bindung eingeht ; durch das Additionsprodukt wird der Übergang der Kohlensäure von der Luft zu denChloroplasten vermittelt und überdies viel- leicht die Form verändert, in der die Kohlensäure zum Chlorophyll gelangt. Das positive Ergebnis der in diesem Abschnitt mitgeteilten Versuche liegt in der Erkenntnis, daß es zwischen den Verhältnissen des Assimila- tionsexperimentes und den natürlichen Assimilationsbedingungen wesent- liche Unterschiede gibt, die eingehende analytische Prüfung notwendig machen. Diese Unterschiede zeigen sich deutlich in dem merkwürdigen Schutze, den das Chlorophyll in den Chloroplasten genießt sowohl gegen Photooxydation wie gegen die Abspaltung des Magnesiums durch Kohlensäure. B. Über die Peroxydase. Darstellung des Enzyms. Nach den Angaben der Literatur, den Methoden von A. Bach und R. Chodat^), wird das Enzym aus zerkleinerten Wurzeln, Meerrettich oder ^) A. Bach und R. Chodat, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 36, 600 [1903] und R. Chodat in Abderhaldens Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden 3. Bd., S. 45 [1910]; A. Bach und J. Tscher niack, Ber. der deutsch, ehem. Ges. 41, 2345 [1908]; A. Bach, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 47, 2122 [1914]. über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäurevcrbindung im Lichte. 42 1 vveißer Rübe, durch Extrahieren mit verdünntem Alkohol oder durch Pres- sen und fraktionierte Fällung des Preßsaftes mit Alkohol gewonnen. Zur Reinigung wird das Enzympräparat von A. Bach und J. Tscher niack mit basischem Bleiacetat behandelt und der Dialyse unterworfen und nach einem neuen, allerdings sehr langwierigen Verfahren von Bach durch Ültrafiltration von Begleitstoffen befreit. Eine neue Methode zur Gewinnung von Peroxydase beruht auf der Beobachtung, daß durch Einwirkung von Oxalsäure das Enzym auf der Pflanzensubstanz niedergeschlagen und beim Behandeln mit Alkalien, zum Beispiel mit Baryumhydroxyd freigemacht wird. Man kann nach der Fällung der Peroxydase durch che Säure die Pflanzenteile auspressen und waschen und die überwiegende Menge von Begleitstoffen beseitigen, ehe man das Enzym wieder entbindet und extrahiert. Es scheint, daß durch die Behandlung mit Oxalsäure Gruppen der Pflanzensubstanz freigelegt werden, welche die Peroxydase aus der wässerigen Lösung absorbieren, indem sie dieselbe binden. Bei der Sättigung der sauren Gruppen der pflanzlichen Masse mit Baryumhydroxyd wird das Enzym wieder in Freiheit gesetzt, so daß es fast ohne Gehalt an Baryum sich mit Wasser extra- hieren läßt. 2 kg Meerrettich wurden in \'o bis i mm dicke Streifen quer zur Wurzel- achse geschnitzelt und 12 bis 20 Stunden lang in fheßendes Wasser ein- gelegt. Dies ist eine Reinigung durch Diffusion, bei der die Zellwand dialysierend wirkt ; die un^•ersehrten Pflanzenzellen geben nur wenig En- zym ab, während sich von niedriger molekularen Stoffen viel beseitigen läßt. Dann wurden die Schnitzel an der Pumpe abgesaugt und in 4I wässerige Oxalsäure eingelegt, die 16 g krystahisierte Oxalsäure enthielten; bei dieser Behandlung schrumpften die zuvor stark gequollenen Wurzel- stücke ein. Nach vierstündiger Einwirkung ging aus einer Probe beim Mahlen und Abpressen fast kein Enzym mehr in den Saft über. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Behandlung mit der Säure beendet, da bei längerer Dauer das Enzym zu leiden beginnt. Die Schnitzel (1,9 kg wurden darauf viermal in der Syenitwalzenmühle, die letzten Male mit sehr eng gestellten 422 R. Willstätter und A. Stoll. Walzen^ ganz fein gemahlen; sie geben einen zähen, plastischen Brei. Um ihn scharf abpressen zu können, mußte er mit 4 1 Wasser angerührt wer- den. Dann ließ sich durch doppeltes Koliertuch ein milchiger Saft ab- pressen, wobei sich das Gewicht des Rückstandes auf 800 g verminderte. Um die enzymhaltige Pflanzensubstanz noch weiter zu reinigen, setzten wir sie mit 6 1 Wasser über Nacht an, saugten dann auf der Nutsche unter wiederholtem Nachwaschen ab und preßten mittels einer Fruchtpresse möglichst trocken, auf ein Gewicht von 630 g. Bei der ersten Behandlung mit Baryumhydroxyd, die bei langsamem Zufügen von 400 ccm halbgesättigter Lösung eine halbe Stunde dauerte, wurde die Reaktion fast neutral; der danach erhaltene Preßsaft war nur wenig wirksam und eignete sich nicht zur Verarbeitung. Die eigentlichen Enzymlösungen entstanden erst bei drei weiteren Behandlungen mit Ba- ryumhydroxydlösungen ; zunächst wurde die Masse mit 500 ccm gesät- tigtem Barytwasser durchgearbeitet, die man langsam zufügte, und nach einer halben Stunde ein nur wenig alkalischer, stark enzymhaltiger Aus- zug (550 ccm) abgepreßt. Man neutralisierte ihn sofort mit Kohlensäure, wobei wenig Carbonat ausfiel, und versetzte mit dem gleichen Volumen Alkohol, der die Trübung noch vermehrte. In der nämlichen Weise entstand mit 250 ccm verdünntem Barytwasser eine zweite, stark aktive Lösung, die wir wie die erste und zusammen mit dieser verarbeiteten, und mit abermals 250 ccm verdünnter Baryumhydroxydlösung ein dritter Enzymauszug, der, für sich allein verarbeitet, nur eine geringe Ausbeute, aber das beste Präparat lieferte. Nach ein- bis zweitägigem Stehen im Eisschrank filtrierten wir die wässerig-alkoholischen Lösungen durch groben Talk an der Pumpe ab und dampften sie im Vakuum unterhalb 30° bis auf 40 ccm ein. Nun wurde nochmals von einer geringen Menge bräunlichem Niederschlag durch Talk abfiltriert und die Lösung mit dem 5- bis 6 fachen Volumen absolutem Alkohol gefällt. Die Peroxydase schied sich in vo- luminösen Flocken aus, die bei 0° nach einigen Stunden eine bald mehr teigartige, bald mehr körnige Masse bildeten. Wir saugten das Präparat auf gehärtetem Filtrierpapicr ab; beim Trocknen im Exsiccator wurde es über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäureverbindung im Lichte. 423 bräunlich und spröde, langsam aufquellend mit Wasser, aber vollständig und klar löslich. Die ersten Enzymauszüge lieferten 1,5 g, der letzte 0,15 g Ausbeute, derartige Präparate erwiesen sich bei der Prüfung genau nach den An- gaben von A. Bach und R. Chodat^ als 2 bis 2V2 rnal wirksamer als das mittels der Ultrafiltration gereinigte Präparat von A. Bach, dessen Ausbeute aus 2 kg Meerrettich 0,127 g betrug. Bestimmung der Peroxydasewirkung. Die schädigende Wirkung des Hydroperoxyds auf Perox}^- dase. Für die Anwendung der Peroxydase im Assimilationsexperiment ist zunächst zu zeigen, daß die Umstände des Versuches die Wirksamkeit des Enzyms nicht beeinträchtigen. Es ist darum geboten, hier einige neue Erfahrungen über die Prüfung der Peroxydasewirkung mitzuteilen. Es ist von A. Bach und R. Chodat erkannt worden, daß die Peroxydase selbst durch Hydroperoxyd angegriffen wird, daß sie also unter den Bedingungen ihrer Anwendung zugrunde geht. Um die Wirkung der Peroxydasepräparate trotz dieses störenden Umstandes vergleichend zu bestimmen, haben Bach und Chodat für die Ein- wirkung auf Pyrogallol und Hydroperoxyd gewisse Bedingungen vor- geschlagen, unter welchen indessen das Enzym verbraucht wird. Auch in seiner letzten Arbeit über die Peroxydase hat A. Bach diese Bedin- gungen der Bestimmung des Enzyms zugrunde gelegt. Da also die ana- lytische Methode zuläßt, daß die Peroxydase selbst unter den Reaktions- verhältnissen leidet, ist die Ausbeute an Oxydationsprodukt, zum Beispiel an Purpurogallin, willkürlich und innerhalb weiter Grenzen von den Ver- suchsbedingungen abhängig. Die Angabe wird gegenstandslos, die Zahl läßt sich behebig weiter steigern, sobald es gelingt, der Empfindhchkeit des Enzyms Rechnung zu tragen und dasselbe während seiner Anwendung zu schonen. Während das reinste Präparat von A. Bach pro Milligramm 98 mg Purpurogallin geliefert hat, gab unter besser gewählten Bedin- 1) A. Bach und R. Chodat, Ber. d. deutsch, ehem. Cies. 37, 1342 [1904] und A. Bach, Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 47, 2122 [1914]. 424 R. Willstätter und A. Stoll. gungen ein nach der oben stehenden Vorschrift gewonnenes Peroxydase- präparat beispielsweise pro Milhgramm 1150 mg Purpurogalhn. Einige vergleichende Versuche zeigen, daß mit zunehmender Ver- dünnung des Hydroperoxyds die Leistung des Enzyms wächst, da es selbst der Oxydation immer weniger unterliegt. 5,0 mg exsiccatortrockene Peroxydase wurden in sehr wenig Wasser mit dem Glasstab zerdrückt, dann mit 2 ccm verrülut und auf 100 ccm verdünnt; die Flüssigkeit war farblos und vollkommen klar. Im ersten Versuche, nach den Bedingungen von Bach und Chodat, war I mg Peroxydase auf 200 ccm verdünnt und mit i g Pyrogallol ver- setzt; 6 ccm 2\/2 proz. Hydroperoxyd wurden auf einmal unter sofor- tigem Umschütteln zugefügt. Zweiter Versuch. Unter Anwendung von ^/\ mg Enzym in 200 ccm fügte man 10 ccm 2^/2 proz. Hydroperoxyd in derselben Weise hinzu. Dritter Versuch. Ebenso wie 2., aber mit i ccm Hydroperoxyd. Vierter Versuch. Zu ^'4 mg Enzym in 200 ccm wurden 5 ccm 2^/0 proz. Hydroperoxyd in einer halben Stunde langsam zugetropft. Die Purpurogallinbildung, auf i mg Enzym berechnet, betrug : I. 198, 2. 43, 3. 267, 4. 408 mg. Während man früher angab, wieviel die Peroxydase bis zu ihrer Zer- störung durch verhältnismäßig konzentriertes Oxydationsmittel zu leisten imstande ist, sind nun die Bedingungen zu ermitteln, unter welchen das Enzym innerhalb eines zur Messung geeigneten Zeitraumes an Wirksam- keit praktisch nichts einbüßt. Auf dieser Grundlage können entweder halbe Umsetzungszeiten der Peroxydasepräparate, also Zeiten halben Ver- brauchs von Hj^droperoxyd festgestellt werden, wenn dessen Reaktion mit Pyrogallol für die Berechnung genügend bekannt ist, oder man kann, indem der Peroxydase sowohl Pyrogallol wie Hydroperoxyd in starkem Überschusse dargeboten werden, die Mengen des in gleichen Zeiten zu Purpurogalhn oxydierten Pyrogallols miteinander vergleichen. Da bei genügendem Überschuß an Pyrogallol + Hydroperoxyd der Umsatz in der Zeiteinheit der Enzymmenge proportional ist, so können auf diese Weise die Konzentrationen der Peroxydasepräparate bestimmt werden. über das Verhalten der C"hloroph\ilkohlensäure\erbindung im Lichte. 425 Die Enzympräparate dürfen dann höchstens so konzentriert angewandt werden, daß die Konzentrationsänderung des überschüssigen Substrates die in der Versuchszeit umgesetzte Menge praktisch nicht beeinflußt. Es gehngt in der Tat, durch Arbeiten mit sehr verdünntem Hydro- peroxyd auch bei gewöhnhcher Temperatur die Peroxydase viel länger unverändert zu halten, als für den Versuch erforderlich ist; dies ergibt sich aus folgenden Werten einer unter den später angeführten Verhält- nissen vorgenommenen Bestimmung: Reaktionsdauer in Minuten : 5 10 20 30 45 60 Purpurogallinbildung in mg: 19,6 ^c),2 60,6 79,6 109,6 123,1 Das Hydroperoxyd war nach dieser Zeit aufgebraucht. Auf erneuten Zu- satz ging die Purpurogallinbildung weiter. Wegen der Gefahr für das Enzym darf das Oxydationsmittel natürlich nicht in großem Überschuß vorhanden ein. Pyrogallol hingegen wird in großem Überschuß dar- geboten, damit Konzentrationsänderungen durch seinen Verbrauch in der Versuchsdauer ohne Belang sind und damit die Weiteroxydation von gebildetem Purpurogallin möglichst zurückgedrängt wird^;. Ausführung der Bestimmung. Die Bedingungen der Peroxy- dasebestimmung sind also: Anwendung von sehr verdünntem Hydro- peroxyd und von sehr großem Überschuß des Pyrogallols. Die Reaktion wird in einem Intervall von 5 bis 10 Minuten bestimmt und dann durch Ansäuern mit Schwefelsäure stillgelegt ; das Purpurogallin wird dann ausgeäthert und colorimetrisch ermittelt. 2,0 1 destilliertes Wasser von 20,0 °, worin 5 g reinstes Pyrogallol ge- löst sind, werden im Rundkolben, der sich in einem Bade von konstanter Temperatur von 20,0° befindet, kräftig gerührt. Man trägt 20ccmo,25proz. säurefreies Hydroperoxyd ein und danach im Augenblick des Versuchs- beginns zum Beispiel 0,25 mg Peroxydasepräparat in der Form \'on 1) Die Purpurogalhnausbeute hat in der Literatur keine geringe Rolle gespielt. Unter den angegebenen Verhältnissen beträgt sie natürlich nur einen kleinen Bruchteil des Pyrogallols. Als wir hingegen Pyrogallol in konzentrierter Lösung bei Gegenwart von viel Peroxydase sehr langsam mit Hvdroperoxyd von niedriger Konzentration behandelten, konnten wir die Ausbeute an Purpurogallin auf mehr als 80 Proz. des Pyrogallols steigern, während A. Bach und R. Chodat zwischen 16,2 und 16,8 Proz. des Pyrogallols an Purpurogallin erzielten und A. Bach bis zu 27 Proz. (A. Bach, Ber. d. deutsch, ehem. C^cs. 47, 2123 [19x4]). 426 R. Willstätter und A. Stoll. 5 ccm Lösung aus 5,0 mg in 100 ccm Wasser. Nach 5 oder nach 10 Minu- ten wird die Reaktion durch 50 ccm reine verdünnte Schwefelsäure unter- brochen. Die Gelbfärbung trat sofort ein und vertiefte sich; Fällung entstand in dieser Zeit nicht. Ohne längeres Stehen der Flüssigkeit wurde das Purpurogallin in 3 oder 4 Malen erschöpfend ausgeäthert, wobei die wäs- serige Schicht gewöhnlich schwach rötlich blieb. Die ätherische Lösung, 250 oder 500 ccm, wird im Colorimeter mit einer Vergleichslösung von 100 mg krystallisiertem Purpurogallin in i 1 Äther bestimmt. Eine Peroxydaselösung lieferte in 5 Minuten bei Anwendung von 0,125 ^^S Enzym 9,6 mg, bei Anwendung von 0,5 mg Enzym 36,7 mg Purpurogalhn. Wenn die Ausbeute die Grenzen von 15 bis 25 mg erheb- lich überschreitet, so benützt man die erste Bestimmung nur als Vor- versuch und ändert die Konzentration der Enzymlösung in geeigneter Weise ab, damit die Purpurogallinausbeute mit der Enzymmenge pro- portional bleibt. Die Peroxydase unter den Bedingungen des Assimilations- versuches. Es war zu prüfen, wie die Wirksamkeit des Enzyms unter extremen Verhältnissen des Assimilationsexperimentes beeinflußt wird, also bei längerer Einwirkung von Luft und andererseits von reiner Kohlen- säure. Daher wurde die Peroxydase in Parallel versuchen entweder in Wasser oder kohlensäuregesättigtes Wasser, in diesem Falle unter wei- terem Einleiten von Kohlensäure, eingetragen und die Wirkung in 15 und 30 Minuten verglichen. Versuch Purpurogallinbildung (mg) in 1 3 Minuten | in 30 Minuten Neutrale Lösung i 58,0 j 89,4 Kohlensäuregesättigte Lösung 26,0 j 43,3 Bei Gegenwart der Kohlensäure ist die Ausbeute an Purpurogallin in beiden Intervallen etwa gleich viel niedriger, die Enzymwirkung auf annähernd die Hälfte abgeschwächt ; die Peroxydase behält also für ihre Anwendung im Assimilationsversuche ausreichende Empfindlichkeit. Die über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäureverbindung im Lichte. 427 Oxydation des Pyrogallols verläuft im kohlensäuregesättigten Medium nicht so einheitlich, die wässerige Schicht ist nach dem Ausäthern des Purpurogallins stark rotbraun. Die Oxydation ist dagegen ganz glatt bei Anwesenheit von etwas Magnesiumbicarbonat. Da dieser Zusatz bei den Versuchen mit Chlorophyll auch vorkommt, ist sein Einfluß auf die Wir- kung der Peroxydase geprüft worden und er hat sich als ganz unerheblich erwiesen. Bei Abwesenheit von Kohlensäure würde durch Magnesium- carbonat die Bestimmung der Enzymwirkung infolge der beschleunigten Luftoxydation des Pyrogallols gestört. C. Versuche mit Chlorophyll und Kohlensäure bei Gegenwart von Peroxydase. Die Versuchsanordnung. Um dem Chlorophyll eine ähnliche Flächenkonzentration wie im Blatte zu geben, werden kolloide Lösungen von viel größerer Verdünnung hergestellt als für die Messung der Kohlensäureabsorption in der vierten Abhandlung. So verdünnte Lösungen verlieren schon bei der Darstellung Magnesium, bis gegen lo Proz. des Gehaltes, und werden daher oliv- stichig. Es gelingt aber, sie durch einen kleinen Zusatz von Magnesium- bicarbonat vor dieser Zersetzung zu schützen. 0,20 g Chlorophyll lösten wir in 40 ccm Aceton und versetzten es auf einmal mit 200 ccm Wasser, das Vio Mol Magnesiumcarbonat (2^/, mg als Bicarbonat in 2^/2 ccm Wasser gelöst) enthielt. Die prachtvoll grüne Lösung wurde von einzelnen Flöckchen abfiltriert und zum Verjagen des Acetons im Vakuum bei gewöhnlicher Temperatur unter Zufügen von 100 ccm Wasser auf 200 ccm eingeengt. Dann verdünnte man im evaku- ierten Kolben mit 170 ccm Wasser und entgaste durch weiteres Ab- dampfen von etwa 10 ccm. Die Lösung enthielt nun in 10 ccm 5 bis 6 mg Chlorophyll ; sie war in der Farbe unverändert und vollkommen klar und ließ sich bei peinlicher Vorsicht während der erforderlichen Maß- nahmen meistens vor Ausflockung bewahren, während dies bei größerer Chlorophyllkonzentration schwer möglich ist. Von dem bis zum Gebrauche evakuiert aufbewahrten kolloiden Chloro- 428 R- Willstätter und A. Stoll. phyll wurden 50 ccm abpipettiert und langsam unter Umschwenken mit der Peroxydaselösung (5 ccm mit einem Gehalt von 0,25 mg) versetzt, welche schon das Pyrogallol (50 mg) enthielt. Die kolloide Flüssigkeit blieb unverändert klar. Wir füllten sie für die Belichtungs- und für die Dunkelversuche in die flachen Glasdosen ein, die mit Paraffin luftdicht abgeschlossen wurden, und leiteten in der Assimilationsapparatur bei 15 ° den Gasstrom über und durch die Flüssigkeit. Die belichtete Lösung war oft schon nach einer halben Stunde infolge der Purpurogallinbildung gelbstichig und sie unterschied sich deutlich von der Vergleichsprobe des Dunkelversuches, die nur der langsamen Zersetzung durch Kohlensäure unterlag. Die Versuche zielten auf die Bestimmung des Purpurogallins hin. Es läßt sich durch seine Unlöslichkeit in alkoholhaltigem Petroläther von Chlorophyll quantitativ trennen und aus der wässerig-alkoholischen Schicht zur colorimetrischen Analyse in Äther überführen. Auch diese Operation wurde mit dem Belichtungs- und dem Dunkelversuch parallel ausgeführt, um durch Berücksichtigung der kleinen Menge von Purpurogallin aus der Dunkelprobe den während des Aufarbeitens entstehenden Fehler auszu- schalten. Mit dem Farbstoff der petroläthenschen Schicht wurde der oxydierte und der durch Kohlensäure zersetzte Anteil des Pigmentes ermittelt. Die kolloide Chlorophyllösung vermischten wir im Scheidetrichter mit dem gleichen Volumen Alkohol und mit 10 ccm gesättigter Kochsalz- lösung, um die Ausflockung des Farbstoffes zu bewirken. Noch ehe sie vollständig war, wurde durch anhaltendes kräftiges Schütteln mit etwa 100 ccm niedrig siedendem Petroläther das Chlorophyll extrahiert, wäh- rend die wässerig-alkoholische Schicht sich bei den Belichtungsversuchen tief gelb, aber noch etwas grünstichig gefärbt abtrennte. Die Ausschütte- lung war zwei- bis dreimal zu wiederholen, bis der Petroläther sich nicht mehr anfärbte. Die vereinigten Auszüge, mit etwas Wasser gewaschen, enthielten das von Sauerstoff veränderte Pigment als braunen flockigen Niederschlag. Die davon abgegossene klare Lösung von Chlorophyll und l^häophytin verdünnten wir im ^leßkolben auf 250 ccm und verglichen über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäure Verbindung im Lichte. _j.29 sie colorimetrisch mit einer Lösung, die Chlorophyll und Phäophvtin in bekanntem Verhältnis enthielt, und zwar so ausprobiert, daß die Farbe mit der Versuchslösung übereinstimmte^). So wurde colorimetrisch der Grad der Zersetzung durch Kohlensäure und zugleich der Chlorophyll- verlust durch Oxydation gefunden. Die abgetrennte purpurogallinhaltige Schicht durfte nicht stehenge- lassen werden; damit auch beim Ausschütteln mit Äther, der peroxydisch zu wirken pflegt, kein Purpurogallin mehr entstand, versetzten wir sie mit 20 ccm verdünnter Schwefelsäure. Das Purpurogallin ist dann (juan- titativ ausgeäthert worden, drei bis vier Male, bis der Äther sich nur noch sehr schwach rötlichgelb anfärbte. Man mußte den Alkohol und einen in geringer Menge beigemischten braunroten Farbstoff mit Wasser aus der ätherischen Lösung vollkommen wegwaschen, um das Purpurogallin colorimetrisch bestimmen zu können. Das Waschwasser wurde seinerseits mit Äther ausgezogen und dieser, für sich gewaschen, zur Hauptmenge .zurückgegeben. Die Purpurogallinlösungen betrugen in Belichtungsver- suchen 250, in Dunkelproben 100 ccm und wurden mit der ätherischen Lösung \^on 100 mg in i 1 Äther verglichen. Versuche bei Zutritt von Sauerstoff. In der ersten Versuchsreihe war die Temperatur 15 °, die Belichtung mit 45 000 Lux dauerte 4 Stunden, der Kohlensäuregehalt des Gas- stroms variierte in weiten Grenzen, der Sauerstoffgehalt betrug immer 20 Prozent. In den Versuchen (i, 3, 4') mit Luft oder verdünnter Kohlensäure blieb die Dispersität des Chlorophylls bis zum Ende unverändert, in höherprozentiger Kohlensäure fing dagegen schon bald nach Beginn der Belichtung die Ausflockung an. Etw^as günstiger war das Verhalten, als wir die Flüssigkeit vor der Belichtung eine Viertelstunde mit der Kohlen- säure behandelten. Die Lösung hielt sich darauf zwei Stunden, aber nach vier Stunden war wieder alles Chlorophyll ausgeschieden. In diesem Falle ist also die Purpurogallinausbeute etwas zu tief infolge der ^) Vgl. die vierte Abhandlung, Abschn. VII. 430 R. Willstätter und A. Stoll. gröberen Verteilung des Chlorophylls in den letzten Stunden der Be- hchtungszeit. Da die Addition von Kohlensäure an Chlorophyll von ihrem Partial- druck abhängt, so war Abhängigkeit von der Konzentration der Kohlen- säure für den Nachweis der Peroxydbildung aus der Kohlensäureverbin- dung des Chlorophylls zu erwarten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle Nr. io6 wiedergegeben; es hat sich gezeigt, daß die Purpurogalhn- bildung gar keinen Zusammenhang mit der Kohlensäurekonzentration des Gasstroms hat. Es ist vielmehr der in allen Versuchen mit demselben Teildruck wirkende Sauerstoff, der durch Photooxydation des Chloro- phylls gleichmäßige Purpurogalhnbildung bewirkt. Die Menge des oxy- dierten Pigmentes ist verhältnismäßig gering; ohne selbst stark verändert zu werden, hat das Chlorophyll Sauerstoff übertragen. In den beiden letzten Spalten der Tabelle erscheint auffallend, daß auch beim Fehlen der Kohlensäure das Chlorophyll einen Teil des Magne- siums verloren hat. Da Pyrogallol an dieser Erscheinung nicht Schuld trägt, so scheint bei seiner Oxydation eine stärkere Säure entstanden zu sein. Tabelle io6. Versuche mit Chlorophyll und Peroxydase in Sauerstoff und Kohl ensäure. Ver- such Nr. Zusammensetzung des Gasstroms Angewandtes Chlorophyll (mg) Gebildet im Licht- versuch es Purpui im Dunkel- versuch ogallin (mg) infolge der Lichtwirkung allein Durch Photo- oxydation zerstörtes Chlorophyll (mg) Durch Säur« bildetes Phäc des petroläth im Licht- versuch Wirkung ge- phytin (Proz. erlösl. AnteUs) im Dunkel- versuch I 2 3 4 5 Proz. CO2, 95 Proz. Luft 80 Proz. CO2, 20 Proz. O2 20 Proz. CO2, 20 Prot. O2, 60 Proz. N, COa-freie Luft 26 26 30 30 12,3 11,0 13,1 21,5 0,7 0,9 8.4 11,6 etwa 10,5 12,2 13. 1 4.5 6,0 3.0 48 38 22 30 II Da die Verhältnisse für die Bildung der Kohlensäureverbindung des Chlorophylls bei 0° günstiger sind, während eine vom Lichte bewirkte Veränderung derselben unabhängig von der Temperatur ist, wird im fol- genden bei o ° gearbeitet und mit kürzerer Belichtungsdauer (nur 2 Stun- den), um die Photooxydation des Chlorophylls noch mehr zurücktreten zu lassen. Die Gasmischung enthielt 20 Proz. Kohlendioxyd und 20 Proz. über das Verhalten der Chlorophyllkohlensäurcverbindung im Lichte. 431 Sauerstoff, die Purpurogallinausbeute im Belichtungsversuche betrug ^,8 mg, während vom Chlorophyll (angewandt 29,5 mg) i mg durch Oxydation angegriffen war. In einem unter gleichen Bedingungen, allein in kohlensäurefreier Luft ausgeführten Versuche stieg das Purpurogallin an auf 7,7 mg bei der Belichtung und betrug im Dunkelversuch 2,1 mg, während das am Licht oxydierte Chlorophyll 3 mg ausmachte. Versuche unter Ausschluß von Sauerstoff (Tabelle 107). Durch Erniedrigung des Sauerstoffgehaltes auf i Proz. und Erhöhung der Kohlensäurekonzentration wird die Purpurogallinbildung stark ver- mindert und vom Chlorophyll geht im Versuche und bei der Aufarbeitung nur eine geringfügige Menge verloren. Bei vollständigem Ausschluß des Sauerstoffs tritt keine Spur von Purpurogallin mehr auf; die einzige Än- derung am Chlorophyll ist teilweise Phäophytinbildung. Die Versuchs- dauer war der Beständigkeit der kolloiden Lösung angepaßt, mit dem Beginn der Ausflockung endete die Belichtung. Zusatz von Magnesium- carbonat hatte nur zur Folge, daß die Zersetzung des Chlorophylls durch Kohlensäure gehemmt war; che etwas erheblichere Purpurogallinmenge ist, wie der Vergleich mit der Dunkelprobe zeigt, auf die Wirkung des Carbonates beim Aufarbeiten der purpurogallinhaltigen Lösung zurück- zuführen. In den beiden letzten Versuchen mit Rohchlorophyll, das neben Tabelle 107. Versuche mit Chlorophyll und Peroxydase ohne Sauerstoffwirkung. Beschreibung des Versuches Zusammensetzung des Gasstromes Itl 1^ Put im Licht- versuch Gebilde purogalli Dunkel- versuch es n (mg) infolge der Licht- allein Durch Sä gebilde phytin petrolätl An im Licht- versuch urewirkung es Phäo- (Proz. des erlöslichen teils) im Dunkel- versuch I. 2 Stunden, 0° 99 Proz. CO2, I Proz. O^ 36,5 2,2 unmeß- bar 2,2 28 20 2. 2 Stunden, 0° Reines, sauerstofffreies CO2 36.5 0,4 0,4 17 3. 4 Stunden, o° 25 Proz. CO2, 75 Proz. N2, Oa-Ausschluß 35 i.o 0,5 0,5 15 10 4. Chlorophyll + i Mol 25 Proz. CO2, etwa 75 Proz. 37 ■ 2,5 1,9 0,6 . 7 9 Mg CO3, 2Stdn., 0° N2, V3 Proz. Oo 5. Rohchlorophyll, 6,2 Proz. CO2, 93\'2 Proz . 28 1,6 I.I 0,5 16 18 3 Stunden, 15° N2, V3 Proz. O2 6. Rohchlorophyll, 25 Proz. CO2, etwa 75 Proz. 28 0,8 0,4 0.4 21 15 2V2 Stunden, 0° N2, V3 Proz. O2 432 R. Willstätter und A. StoU. 45 Proz. Chlorophyll die beiden Carotinoide und andere Begleitstoffe enthielt, ist im Gasstrom mit ^/a Proz. Sauerstoff auch nicht mehr als eine Spur von Purpurogallin aufgetreten. Die Zersetzung des Chlorophylls durch Kohlensäure scheint vom Lichte nicht beeinflußt, das Zwischenprodukt der Magnesiumabspaltung, die Kohlensäureverbindung, also im Lichte weder in eine stärker saure noch in eine weniger saure Verbindung umgewandelt zu werden. Die Versuche mit Kohlensäure ohne Sauerstoffwirkung im Lichte und im Dunkeln las- sen (Spalte 7 und 8 der Tabelle 107) bei der colorimetrischen Analyse des phäophytinhaltigen Chlorophylls keinen deutlichen Unterschied in der Phäophytinbildung erkennen. In anderen Versuchen ist die Frage durch Veraschen des mit Kohlensäure behandelten kolloiden Chlorophylls ge- prüft worden. Die Magnesiumbestimmung nach gleicher Behandlung mit Kohlensäure im Dunkeln und bei Belichtung ergab Schwankungen, aber keine bestimmten Ausschläge. Schlußwort. Unsere Arbeit war der Frage gewidmet, mit welchen chemischen Mitteln die Zerlegung der Kohlensäure durch das Sonnenlicht in den Chloroplasten geschieht. Es wurde untersucht, ob und in welcher Weise das Chlorophyll im Assimilationsvorgang chemisch reagiert, ob eine Rolle der Carotinoide in den Lebensvorgängen der Pflanze nachgewiesen werden kann, und in welcher Art Bestandteile des farb- losen Stromas, die näher zu bestimmen sind, mit dem Chlorophyll zusammenwirken . Eine Funktion der gelben Pigmente konnte weder bei der Assimilation noch in der Atmung nachgewiesen werden. Das Chlorophyll hingegen vereinigt mit der Bedeutung, die augenfällig durch seine Farbstoffnatur bedingt ist, eine schwerer erkennbare Funktion, die auf seinem chemischen Reaktionsvermögen beruht. Das Pigment wird durch Kohlensäure unter Abspaltung des Magnesiums zersetzt; Zwischenprodukt der Reaktion ist eine cUssoziierbare Kohlensäureverbindung. Das Verhalten gegen Kohlen- säure wurde mit dem Pigmente in dem Zustand geprüft, der seiner Dis- persität in den Chloroplasten am ähnlichsten ist, nämlich an seinem Hydrosol. Auf die Beobachtung, daß das Chlorophyll, und zwar seine beiden Komponenten a und b mit der Kohlensäure dissoziierbare Additions- produkte bilden, gründet sich eine Theorie der Assimilation. Das absor- bierte Licht leistet im Chlorophyllmolekül selbst, dessen Bestandteil die Kohlensäure durch ihre Anlagerung an den Magnesiumkomplex wird, seine chemische Arbeit, indem es durch eine Umgruppierung der Valenzen das Kohlensäuremolekül in eine für den freiwihigen Zerfall geeignete Form Willstätter-StoU, Assimilation. op, 434 ^- Willstätter und A. Stoll. isomerisiert (vierte Abhandlung . Durch die Addition der Kohlensäure an das Lichtabsorbens unterscheidet sich die Reaktion von der Wirkung anderer Sensibilisatoren. Diese Betrachtung soll unentschieden lassen, ob die Kohlensäure als solche, wozu sie befähigt ist, an Chlorophyll ad- diert oder ob ein Kohlensäurederivat angelagert wird. Nicht das Chloro- phyll aUein, sondern das unbehchtete Blatt, also Bestandteile der Blatt- substanz, die nicht im einzelnen bestimmt sind, verbinden sich mit der Kohlensäure zu lockeren, dissoziierenden Additionsprodukten. Es ist wahrscheinlich, daß dadurch die Zuleitung der Kohlensäure von der Luft zu den Chlorophyllkörnern vermittelt, die Geschwindigkeit der Kohlen- säureaufnahme erhöht und die Form der Kohlensäure verändert wird (dritte Abhandlung . Diese Erklärung der \\'irkung des Chlorophylls durch Addition und Umlagerung der Kohlensäure hat nichts mit der Vorstellung gemein, daß im Assimilationsvorgang das Chlorophyll zerstört und wieder aufgebaut werde. Solche Annahmen werden durch den Nachweis widerlegt (erste Abhandlung), daß das Chlorophyll in seiner Menge und auch im Ver- hältnis seiner Komponenten während der Assimilation unverändert bleibt, auch bei behebig gesteigerter und langdauernder Leistung. Die Beziehung zwischen assimilatorischer Leistung und der Menge des Chlorophylls konnte, da diese konstant bleibt, unter der Bedingung verfolgt werden, daß die äußeren Faktoren: Kohlensäureteildruck, Belichtung und Tem- peratur, auf die Leistung ohne Einfluß waren. Der Quotient aus der assimilierten Kohlensäure und der Chlorophyllmenge, die ,,Assimilations- zahl", unterliegt großen Schwankungen, je nach der Chlorophyllkonzen- tration in den Blättern, ferner mit dem Wachstum und in den Jahres- zeiten. Aus der genaueren L^ntersuchung der Fälle, in denen die Assi- milationszahl von der Norm am weitesten abweicht, war zu schließen (zweite Abhandlung), daß außer dem Pigment ein zweiter innerer Faktor von enzymatischer Natur für den Assimilationsvorgang bestimmend ist, und zwar wahrscheinlich ein bei der Zerlegung des von Chlorophyll und Kohlensäure gebildeten Zwischenproduktes wirksames Enzym. Mit diesem Ergebnis steht die Beobachtung in Einklang, daß ein sehr geringer Sauer- Schlußwort. 435 stoffgehalt des Blattes für den Assimilationsprozeß unentbehrlich ist. Ein mit dem Chlorophyll bei der Assimilation zusammenwirkendes Agens scheint als eine dissoziierende Sauerstoffverbindung zu reagieren (sechste Abhandlung). Mit der Betrachtung des Vorganges, in welchem aus der Kohlensäure Sauerstoff abgespalten wird, ist die Frage nach dem Reduktionsprodukt eng verknüpft, das zu den Kohlenhydraten kondensiert wird . VonBaeyers Erklärung, daß Formaldehyd das Zwischenglied der Zuckerbildung sei, ist viel umstritten, und es wird oft auf nicht zulässige Art versucht, die bisher hypothetische Annahme zu beweisen, zum Beispiel durch den Nachweis des Formaldehyds in den Blättern. Eindeutig, ohne Hypothese, ist es bewiesen, daß die Kohlensäure des- oxydiert wird zur Reduktionsstufe des Kohlenstoffs selber oder, was ganz das nämliche ist, zur Formaldehydstufe, wenn gezeigt wird, daß in der Assimilation genau und unverrückbar der gesamte Sauerstoff aus der Kohlensäure entbunden wird. Man hat sich viel mit dem Ge- samtgaswechsel der Pflanze befaßt, aber nur vereinzelte und un- vollkommene Bestimmungen gibt es für den rein assimilatorischen Gasaustausch. Unsere Untersuchung (fünfte Abhandlung) behandelte den assimila- torischen Gas Wechsel bei hochgesteigerter Assimilationsleistung. So wird der Einfluß der Atmung ausgeschaltet und eine scharfe Bestimmung des assimilatorischen Koeffizienten ermöglicht. Zugleich verfolgte diese An- ordnung das Ziel, bei der gesteigerten Leistung unter verschiedenen Be- dingungen Abweichungen des Koeffizienten, sei es zu Beginn oder bei langer Dauer, zu erzwingen, wenn sie überhaupt möglich sind. Das Er- gebnis war: der Koeffizient beträgt i und ist konstant. Ein Zwischen- glied der Reduktion wie Oxalsäure, Ameisensäure u. dgl. wird daher nicht frei. Wenn die Reduktion am Chlorophyll schrittweise erfolgt, so wird keine Kohlenstoffverbindung vor der vollständigen Desoxydation vom Chlorophyll losgelöst. Da es die Formaldehydstufe ist, zu der die Kohlensäurezerlegung führt, so ist es eine Annahme von großer Wahrscheinlichkeit, daß ^36 R. Willstätter und A. Stoll. nicht allein die Stufe erreicht, sondern daß Formaldehyd selbst ge- bildet wird. Denn er ist die einzige Kohlenstoffverbindung dieses Substitutionsgrades mit nur einem Kohlenstoffatom im Molekül. Alle organischen Verbindungen von derselben Zusammensetzung sind Derivate des Formaldehyds, nämlich seine weiteren Kondensations- produkte. Da man den Formaldehyd in größter Verdünnung nachweisen kann, so haben schon viele Forscher Versuche unternommen, seine Bildung aus Kohlensäure außerhalb der lebenden Zelle durch die Wirkung des Chloro- phylls zu erzielen. Allein die Aldehydspuren, die bei solchen Versuchen öfters beobachtet wurden, sind durch Photooxydation entstanden, und zwar im allgemeinen aus Begleitstoffen des Chlorophylls. Nun hat die Möglichkeit, mit dem reinen Pigmente zu arbeiten und die Versuchsbe- dingungen den Verhältnissen in den Chloroplasten besser anzupassen als es früher geschah, uns dazu geführt, ebenfalls im Experimente unter der Wirkung von Chlorophyll im Licht die Kohlensäurezerlegung zu probieren oder auch nur die Bildung von peroxydischer Verbindung aufzusuchen (siebente Abhandlung). Alle diese Versuche waren unzweideutig und voll- ständig negativ. Sie sind darum nicht ohne Wert, da sie auf einem Felde, das eine Scheinernte trug, reinen Tisch schaffen. Ein Fortschritt wird nur nach der Erkenntnis möglich sein, daß die Belichtung von Chloro- phyll in Kohlensäureatmosphäre nicht genügt und daß in dieser Ver- suchsanordnung noch wesentliche Umstände fehlen, um den Assimi- lationsprozeß nachzuahmen. Die Untersuchung der Pigmente in den grünen Gewächsen hat einen Vorsprung gegenüber den für die Assimilation auch unentbehrlichen Be- standteilen des farblosen Protoplasmas. Hier findet die chemische Analyse Aufgaben zur vollständigeren Beschreibung der assimilatorischen Ein- richtungen. Im Blatte ist das Chlorophyll in vollkommener Weise gegen Photooxydation geschützt, der es als reines Hydrosol anheimfällt. Im Blatte ist das Chlorophyll vor der am reinen Kolloide beobachteten Zer- setzung durch die Kohlensäure bewahrt, ohne daß deren Aufnahme ge- hemmt wird. Im Gegenteil wird im Blatte die Kohlensäure mit weitaus Schlußwort. 437 größerer Geschwindigkeit absorbiert als bei der Wirkung sogar von un- verdünnter Kohlensäure auf das Hydrosol. So sind über den Zustand des Chlorophylls in den Chloroplasten, in bezug auf die Form, in welche die Kohlensäure übergeht und hinsichtlich der im Assimilationsvorgang wirksamen Enzyme neue Fragen dadurch aufgetaucht, daß die Arbeit einen tieferen Einblick gewährte in die Unter- schiede zwischen den Bedingungen des Assimilationsexperimentes und den Verhältnissen in der lebenden Zelle. Abderhalden, E. 187, 238. Abney, W. de W. 9, 240. Ans, J. d' 242. Amaud, A. 7. Aubert, E. 320. Auerbach, F. 165. Bach, A. 241, 420 u. f., 423, 4^5- Baeyer, A. von 164, 236, 243. 376, 435- Baker, S. M. 164, 380. Barschall, A. 165. Battelli, F. 404. Baur, E. 316 u. f. Bayliß, W. M. 396. Beijerinck, M. W. 59, 168, 170. 344- Bernard, Cl. 36. Berthelot, D. 373. Berthelot, M. 372 u. f. Blackman, F. F. 41 u. f., 44 u. f., 58u.ff., 69, 81, 86, 108, 129, 156 u. f., 398. Blank, O. 242. Bleier, O. 277. Böhm, J. 174. Bohr, Ch. 186 u. f., 224, 282, 308. Bolin, I. 401. Bokorny, Th. 163 u. f., 380, 383 u. f. Bonnier, G. 36, 319 u. ff., 338. Borodin, J. 174. Boussingault, J. B. 319, 328, 344. 346. Braumüller, E. 382. Bredig, G. 318, 405. Brodle, B. C. 372. Autorenregister. Brown, H. T. 41, 5S u. ff., 86, 108, 118 u. ff., 172 u. f., 239 u. f., 321. Brunner, H. 318. Butlerow, A. 236. i : Chocensky, K. 374. Chodat, R. 163, 379, 388, 399 u. f., 406 u. f., 411, 420, 4^3. 425- Chuard, E. 31S. Correns, C. loS. 1 Creighton. H. J. M. 224, 230, j 277. ! Curtius, Th. 377, 3S1 u. ff., 3S5 u. f., 391, 396. Czapek, F. 9, 322, 325, 378, j 383. ! Demoussy, E. 319 u. f., ^2^ \ u. f., 328. I Deniges, G. 386. I Detmer, W. 136. Drehschmidt, H. 329. Engelmann, Th. W. 7, 45, 58, 168, 350. Engler, C. 243. Erlenmeyer, E. 318. Emest, A. 374. I Escombe, F. 41, 58, loS, 118 u. ff., 172 u. f., 239 u. f., I Euler. H. 238, 317, 3S3, 396, I 399, 401. j Ewart, A. J. 10, 52, 58, 86 u. f., 102 u. f., 129, 348 j u. f., 379, 388, 396 u. ff., I 410, 412. FayoUe, M. 387 u. f. Fincke, H. 380, 385 u. f. Findlay, A. 224, 230, 277. Finkenbeiner, H. 242. Fischer, E. 184, 237 u. f. Fischer, M. 226. Fonrobert, E. 318. Forsen, L. 228. Frankf orter, G. B. 243. Franzen, H. 377, 381 u. ff., 385 u. f., 391, 396. Frey, W. 242. Friedel, J. 168. Fritzsche, H. 227. Garreau 321. Gaudechon, H. 373. Geffcken, G. 224, 277. Geisow, H. 243. Gentil, L. 384. Gibson, R. J. H. 3S4. Gräfe, V. 164, 202, 380, 383- Gris, A. 138. Gris, E. 138. Große-Bohle, H. 386. Haber, F. 60. Haberlandt, G. 84 u. f. Hällström, J. A. af 237. Hansen, A. 237! Hartley, W. N. 237. Herlitzka, A. 263. Herzog, R. O. 168. Hoff, J. H. van't 156 u. f. Hof mann, K. A. 318. Hoppe-Seyler, F. 237, 344 u. f., 411. Howwjanz, S. 183. Hug, E. 224. Autorenregister, 439 Jost, L. 33S u. f., 344 u. f. Jovitschitsch, M. Z. 372. Irving, A. A. 36, 54, 129 u. ff. Jumelle, H. 323. Just, G. 277. Iwanowsky, D. 263. Kanitz, A. 156. Kernbaum, M. 375. Kimpflin, G. 384. Kneip, A. 242. Kniep, A. 59, 325- Krätzschmar, L. 382. Kremann, R. 229. Kreusler, U. 41 u. f., 47 u. f., 59, 170. Liebermann, H. 183. Liebig, J. von 316 u. 1 Lindt, O. 142. Lob, W. 372 u. ff. Low, O. 380. Loewy, A. 185. Losanitsch, S. M. 372. Lubimenko, W. N. 10. Luther, R. 237. Madinaveitia, A. 104 u. f. Mameli, E. 383, 396. Mangin, L. 36, 319 u. ff., J38. Maquenne, L. 319 u. f., 323 u. f.. 328. Matthaei, G. L. C. 35, 41, 44 u. f., 59. 61, 65, 69,73, 86, 156 u. f. Mayer, A. 316. Maze, P. 235. Meldola, R. 318. Michaelis, L. 186. Minder, F. 59. Molisch, H. 142, 168, 170U. f. Moore, B. 138 u. f., 162 u. i, 376. Mori, A. 382. Müller von Berneck, R. 405. Neumann, C. 1S3. Neustadt, J. 60. Oppenheimer, C. 401. Ostwald, \V. 277. Page, H. J. 3, 142, 268. Palladin, W. 202. Pantanelli, E. 32,53,59,81. Pfannenstiel, A. 227. Pfeffer, W. 8, 44, 52 u. f., 59, 348, 351- 354- Pflüger, E. 188. Plancher, G. 383. Plester, W. 74 u. f., loS u. f. Pollacci, G. 383, 396. Ponomarew, A. P. 263. Pregl, F. 280. Priestley, J. H. 57, 375, 379, 395 u-ff-. 406, 411, Pringsheim, N. 346 u. ff. Ravenna, C. 383. Rayleigh, Lord 283, 287. Reinke, J. 382. Reuter, M. 182, 289. Rimini, E. 390. Sachs, J. ^S, 83. Saussure, Th. de 174, 321. Schimper, A. F. W. 142. Schoesing fils, Th. 323. Schniderschitsch, N. 229. Schryver, S. B. 379, 390 u. ff., 396, 398 u. f., 406. Schumpelt, K. 318. Schweizer, K. 163, 379, 388, 399 u. f,, 406 u. f., 411. Sebor, J. 374 u. f. Setschenow, J. 186. Siegfried, M. 183 u. f., 238. Smith, A. M. 59, 61, 81. Spoehr, H. A. 321, 339, 376, I 378. ! Stahl, E. 30. Stern, L. 404. Stokes, G. G. S. Stoklasa, J. 374 u. f., 383. Strecker, A. 225. Swart, N. 30. Thoday, D. 58, 108. Timiriazeff, C. 119, 124. Treadwell, F. P. 182, 289. Treboux, O. 53, 59, 164. Tscherniack, J. 420 u. f. Tschirch, A. 30. Tswett, M. 30, 223, 239 u. f. Unna, P. G. 354. Usher, F. L. 57, 375, 379, 395 u.ff., 406, 411. Utzinger, M. 297, 392. Vieser, E. 164. Villiers, A. 387 u. f. Villiger, V. 243. Wager, H. 9 u. f., 379, 384, 398 u. f., 410 u. f. Warner, Ch. H. 379, 398 u. f., 410 u. f. Weber, C. 83. Webster, T. A. 139, 163, 376. Wehmer, C. 29. Weigert, F. 12, 120, 122. Weißberg, J. 243. West. R. 243. Wieland, H. 243. Wiesner, J. 142, 202. Wilson, W. E. 119. Zdobnicky, W. 374 u. f., 383. Sachregister. Abbrühen der Blätter 2bS u. ff. Absorptionsapparate für Kohlendioxyd 71. Absorptionsbüretten 277, 329. Absorptionsspektren ätherischer Chlorophyll- lösungen 266. — der Chlorophyllkomponenten 8, 264 u.- ff. — ^ kolloider Chlorophyllösungen 263 u. ff. Absorptionsspektrum des Blattes 263 u. ff. Absorptionsvorrichtung des Blattes für COg 171, 172 u. ff. Aceton, Prüfung auf Aldehj'd mit fuchsin- schwefUger Säure 387. Aether, Einwirkung auf die Assimilation 37. Aetiophyllin 226. Albinoblätter 118, 122, 140 u. ff. Aldehydbildung außerhalb der Zelle 395 u. ff., 409 u. ff. — bei der Photozersetzung des Chlorophylls 398, 412 u. f. i Aldehydreaktionen 381 u. ff. ; Algen 166. Allomerisation 15, 262, 297. Ameisensäure 242, 245, 315, 385. Aminosäuren als COg-Überträger 163, 182 u. ff. 238. Amphotere Reaktion der Blattsubstanz 182. Analytische Methoden zur Bestimmung der Assimilation 47, 58 u.ff., 326 u.ff., 349 u.ff. i Anatomische Beobachtung etiolicrter Blätter • 128. herbstlicher Blätter 99. — — von Aureablättern iio. Anatomischer Bau des Blattes und die Licht- ausnützung 122 u. ff. Anthocj-anhaltige Blätter 141. Asparaginzusatz zu assimilierenden Blättern 167. Asphyxie 346. Assimilate 236 u. ff., 315 u. ff. Anhäufung 80, 327. Assimilation, Abhängigkeit von äußeren Fak- toren 41. der Beleuchtung 36, 118, 120, 143 u. ff. der Temperatur 56, 113, 143 u. ff. — — — Sauerstoffgegenwart 344 u. ff. — Aufliebung 52, 351 u. ff. — Ausbleiben in COo-haltigem Stickstoff 351, 355 u. ff. — außerhalb der Zelle 57, 161 u. ff., 395 u. ff., 399 u. ff. — bei Abwesenheit freien Sauerstoffs 344. — bei Sauerstoffmangel 345 u. ff. — beim Eintrocknen der Blätter 169. — Belebung s. Wiederbelebung. — Bestimmung 47, 57 u. ff., 328 u. ff., 349 u.ff. bei Wasserpflanzen 39, 166. — — Empfindlichkeit 350. mit dem Interferometer 60. mit der Kohlensäuredifferenzmethode 47- 59. 3^7. 337. 350- mit Schätzungsmethoden 58, 344. Untersuchungsmethode 61, 62 u. ff. — der Fruchthäute 105 u. ff. — Einfluß irrespirabler Gase 348. von Säuren 53. — Frostwirkung 99, 102, 169. — Gang 77. — — während der Jahreszeiten 96 u. ff. — getrockneter Blätter 170. — gleiche Werte bei gleichen Blättern 73. — in Stickstoff 350. — in Wasserstoff 346 u. ff. — Konstanz 80, iii. — Konstanz des Chlorophyllgehaltes i u.ff., 10, 39, 46. — künstliche, erforderhche Reinheit des Chlo- rophylls 399, 410 u. f. — — mit Chlorophyll 57, 161, 399 u. ff. Sachregister 441 Assimilation, künstliche mit Chlorophyll auf Kalk 407 u. ff. mit Chlorophyll auf Talk 407 u. ff. mit Katalase 397, 399, 404 11. ff. — — mit Peroxydase 427 u. ff. — — ohne Chlorophyll 371 u. ff. — — ohne Enzym 402 u. ff. — nach Eingriff in die Blattstruktur 57, 161. — nach Entziehung von freiem und von ge- bundenem Sauerstoff 349 u. ff. — Rekordleistungen 86. — Säurewirkung 53. — Schädigung durch hohe Kohlensäui-ekon- zentration 167. — Selbsterregung 352, 358 u. ff. — Sinken 80, 145. — Stillegung durch Sauerstoffentziehung 345, 349 u. ff. — Störung durch Assimilate 80. — Formaldehyd 163 u. ff. — transitorische Sistierung 52, 349. — von beschädigten Blättern 57, 161 u. ff., 166 u. ff. — ^•on Laubblättern in Wasser 166 u. ff. — Wiederbelebung 52, 57, loi u. ff., ^^2, 358 u. ff. — zerriebener Blätter 168. Assimilationsapparat, Ermüdung ^2, 53. — Überlastung 32, 327. Assimilationsapparatur 31, 64 u. ff., 32S u.ff., 359- Assimilationsbedingungen, gesteigerte 10, 31, 47. 315. 332 u.ff. — günstigste 47, 109, 132. Assimilationsenergie, s. auch Assimilations- zahl, 45, 84 u. f. — spezifische 52, 56, 83 u. ff. Assimilationsenzym s. assimilatorisches En- zym. Assimilationshypothese der Sauerstoff auf- nähme und -abgäbe von Chlorophyll 4. — der Zerstörung und Neubildung von Chloro- phyll 8u. ff., 410. Assimilationskammer 64. Assimilationsleistung s. auch Assimilations- zahl. — Bestimmung 47, 58 u. ff., 327, 332, 330. — Disproportionalität mit dem Chlorophyll- gehalt 51, 54. — Gang während der Jahreszeiten gh, 113. — Höchstwert 86. — in atmosphärischer Luft 86, 180. Assimilationslcitung, maximale 47, 49, 132, 315. — Sinken 80, 145. — Spezifität 52, 83. — Steigerung während der Versuche 89. — Vergleich mit frei aufgestellter Kalilauge 172. — \'crhältnis zum Chlorophyllgehalt der Blät- ter 41 u. ff. — verschiedener Blätter, s. A.ssimilations- zahlen. Assimilationsoptima 41. Assimilationsreaktion 236 u. ff., 315 u. ff., 371, 415 u. ff. A.ssimilationstheorie, Ansicht von Abderhalden 238. Bach 241. Baeyer 236. Baur 316. Bcrthelot, D. 373. Berthelot. M. 373. Blackman 41. Bredig 318. Brunner und Chuard 318. Chodat 406. Czapek 9. Engelmann 43. Erlenmever 318. Euler 238. Fischer, E. 237. Gib.son 384. Hofmann, K. A. 31 8. Hoppe-Seyler 237. Liebig 316. Loeb 372. Maze 235. Meldola 318. Pfeffer 8, 44. Sehr wer 393. Stokes 8. Stoklasa 374. Tswett 239. Usher und Priestley 375, 393. Wager 9, 398, 410. Willstätter und StoU 235, 240 u. ff., 323, 327 u. f. .\ssimilationsversuche, Ausführung 76 u. ff. Assimilationszahl, Änderung beim Wachstum 86 u. ff. — chlorophyllarmer Blätter 50, 108 u. ff. Vergleich mit grünen Blättern 36, — chlorotischer Blätter 133 u. ff. 442 Sachregister. Assimilationszahl, Definition 48. — der Blätter im FrühUng 49, 86 u. ff. ■ im Herbst 49, 93 u. ff. ■ — etioüerter Blätter 50, 127 u. f. — fast chlorophyllfreier Blätter 50, 139 u. ff. — Gang bei Vergilbung 49, 94 u. ff. während der Jahi-eszeit 96, 113. — hohe Werte 50, 1 1 1 . — junger und alter Blätter 49, 91 u. ff. — Mindestwerte 47, iio. — niedrige Werte 50, 96 u. ff. — normaler Blätter 49, 82 u. ff. — von Fruchthäuten 105 u. ff. Assimilationszeit 50, 115 u. ff., 392. — Definition 50. Assimilatorische Leistung, s. Assimilations- leistung. Assimilatorischer Koeffizient 244, 242, 315 u. ff. bei Assimilation in 0,-armem und -freiem Medium 334 u. ff. . bei gesteigerter Assimilation 315 u. ff. bei höherer Temperatur 336 u. ff. — -^ bei Hex 338. bei langdauernder A.ssimilation 315, 332 u. ff. bei niederer Temperatur 337 u. f. — — bei Succulenten 339 u. ff. Bestimmung 325 u. ff. frühere Bestimmungsmethoden 3 19 u. ff. Geschichte 319 u. ff. Konstanz 245, 315 u. ff., 327. — — Untersuchungsmethode 328 u. ff. Assimilatorisches Agens 43, 54, 56, 144, 160. — Enzym 56, 58, loi, 102, 121, 135, 138, 139, 143, 160, 241, 246, 354, 415. Atmung abgetöteter Blätter 198 u. ff. — der Blätter in COg-Luft 190, 196. ■ in reiner Luft 196. — Konstanz 104, iii, 133, 211. — der Frühjahrsblätter 87. — Einfluß bei der Assimilation 47, 76, 87, 319 u. ff., 326. — Funktion der Carotinoide 7, 34. Atmungskoeffizient 319 u. ff. .A-tmungskohlensäure, Berücksiclitigung bei der Assimilation 62, 76. Aurcavarietäten 50, 56, 108 u. ff., 177. Ausnützung der Lichtenergie 51, 115 u. ff. — des Lichtes und anatomischer Bau des Blattes 122. — schwachen Lichtes 117. Ausnützungsfaktor des Lichtes 118 u. ff. Äußere Faktoren bei der Assimilation 41. Bakterienmethode 58, 87, 344. Basizitätsprobe des Chlorophylls 252. Befeuchtung des Gasstroms 70. Belebung der Assimilation, s. Wiederbelebung. Beleuchtung bei Assimilationsversuchen 68. Beleuchtungsänderung bei grünen und bei gelben Blättern 56, 143 u. ff. Benzaldehyd, Oxydation 243. Blätteraldehyde 377, 381 u. f., 385. Blattfarbstoffe, Bestimmung 2, 11 u. ff. — in absterbenden Blättern 6, 16. — in gelben Blättern 113. — nach Assimilation bei hoher Temperatur 35- — nach Einwirkung narkotischer Mittel 36. — nach gesteigerter Assimilation 10, 31 u. ff. — nach Überlastung des Assimilationsappa- rates 10, 32. Blattflächenbestimmung 74. Blatthälftenmethode 58, 108. Blattspektrum 263 u. ff. Blut, Kohlensäureabsorption 185 u. ff. Braune Phase des Chlorophylls 28, 251, 297. Carbamatbildner 163, 167, 182 u. ff., 238. Carbaminoreaktion 183 u. ff. Carbaminosäuren 182 u. ff. Carotin, Zusammensetzung 2. Carotinoide, Abtrennung vom Chlorophyll 12, 14. — Autoxvdation bei der Assimilation 7, 34. — Einfluß bei der Chlorophyllbestimmung 13. 75- — Empfindlichkeit gegen Säure 31. — Funktion bei der Assimilation 4, 7, 34, 46, 113 u. ff., 144. Atmung 7, 34. — gelber Varietäten 113. — herbsthcher Blätter 6, 27 u. ff. — in Licht- und Schattenblättern 6. — nach Assimilation bei hoher Temperatur ^5 — nach gesteigerter Assimilation 6, 31 u. ff. — nach gesteigerter Atmung 7, 34. — nach Narkose 36. — nach Überlastung des Assimilationsappa- rates 6, 32. — Trennung 17, 22. — Unterschied in der Zusammensetzung 4. — Verhältnis 3, 27 u. ff., 30 u. ff. Sachregister. 443 Carotinoide, Verhältnis zum Ciilorophyll 6, 13, 27, 114. — Verschiebung des Verhältnisses 4, 5, 7, 30 u. ff. Carotinoidgehalt der Blätter 3, 29, 113. Chemische Ausnützung der Lichtenergie 115 u. ff. Chloroform, Einwirkung auf die Assimilation 36. Chlorophyll, Abbau i, 18, 226 u. ff., 251. — absterbender Blätter 6, 27. — als Sensibilisator g, 45, 239 u. ff. — Basizitätsprobe 252. — ■ bei Belichtung in sauerstoffreiem Medium 403, 419, 431. — Beschreibung 251. — Bestimmung 2, 12, 17 u. ff., 75, 262. — — Einfluß der Carotinoide 12 u. ff. neben Phäophytin 309, 428. — chemische Funktion 228, 235 u. ff., 240, 415 u. f. — Darstellung aus frischen Blättern 252 u. ff. aus getrockneten Blättern 247 u. ff. — Derivate 18, 226 u. ff. — Einwirkung von Säure und Alkali 18, 226. — erforderliche Reinheit zu Assimilations- versuchen 252, 399, 410 u. f. — Formaldehydgehalt 246, 390 u. ff. — herbstlicher Blätter 27 u. ff. — Identität in allen Pflanzen i, 226. — im Blatt, Unterschied von reinem Chloro- phyll 181, 189, 235, 420. - — Verhalten gegen Lösungsmittel 267 u. ff. — Kohlensäureverbindung 117, 228 u. ff., 234, 292 u. ff., 415 u. ff. Dissoziation 230 u. ff., 292 u. ff. im Licht 415 u. ff., 430 u. f. mit Peroxydase 416 u. ff., 427 u. ff. — — Spaltung in Alkohol 232, 294, 303 u. ff. in Gegenwart von Äther und Na- triumchlorid 231, 233, 294, 300 u. ff. in Wasser 232, 293, 298 u. ff. Umlagerung 241 u. ff. — — Zersetzung 230 u. ff., 293 u. ff. — kolloide Lösung, s. kolloides Chlorophyll. — Magnesiumbestimmung 297. — Menge vor und nach der Assimilation i, 8, II, 39- — Merkmale 251. — mit Lecithin 269. Chlorophvll, nach gesteigerter Assimilation 31 u. ff. — Phasenprobe 251. — Photooxydation 397, 398, 410U. ff., 4i3U.ff. — Prüfung auf Formaldehyd 390 u. ff. — quantitative Bestimmung i, 11 u. ff., 75, 262. ■ Einfluß der Carotinoide 13, 75. — Reaktion mit Formaldehyd 393 u. ff. — Schutz im Blatte 181, 189, 212, 235, 249, 420, 436. — Schutzkolloide 162, 270, 417. — Schutzstoffe 7, 181, 189, 235, 236, 309 u. ff., 417 u. f., 420. — Schutzwirkung vor schädhcher Bestrah- lung des Blattes 80. — Spaltungsprobe 251. — Trennung von den Carotinoiden 12, 15. ■ von Purpurogallin 428. — Veraschung 29S. — Verhältnis zu den Carotinoiden 6, 13, 27, 114. — Verhalten gegen Kohlensäure 226 u. ff., 288 u. ff., 292 u. ff. — — — — in organischen Lösungsmitteln 229, 272. gegen Sauerstoff im Licht 413 u. ff., 418, 30. — Verseifung iS, 19. — Verteilung 55. — Zersetzung durch Kohlensäure 229 u. ff., 230, 288 u. ff. — — — ■ — im Licht und im Dunkeln 430 u. f. durch Photooxydation 9 u. ff., 398 u.ff. 410 u. ff., 413 u. ff., 418, 430. — Zusammensetzung und Aufbau 2, 226. — Zustand im Blatt 55, 263, 267 u. ff. — Zuwachs bei jungen und etiolierten Blät- tern 8, 9, 127 u. ff. Chlorophyll a, Beschreibung 258. — Reinigung von Phäophytin 257. Chlorophyllarme Blätter, Vergleich mit chloro- phyllreichen 56, 120, 143 u. ff. Chlorophyllase 251. Chlorophyll b, Beschreibung 258. Chlorophyllfilms 391 u. ff., 397 u. f. Chlorophyllfreie Blätter 50, iio, 139 u. ff. Chlorophyllgehalt gelber Blätter 113. — grüner Blätter 2, 3, 29. Gang während der Jahreszeit 96. — Konstanz während der Assimilation i, 8, II, 39, 46. 444 Sachregister. imila- Chlorophyllgehalt, Verhältnis zin tionsleistimg 4iu.fi'., 46. — von Aureablättern 109. — Zunahme bei jungen Blättern 40, 48, 89. Chlorophyllgelatinehydrosol 313 u. f. Chlorophyllkomponenten, Funktion bei der Assimilation 7. — Trennung 17 u. ff., 12, 254 u. ff. — Unterschied in der Zusammensetzung 2, 4, 258. — Verhältnis 3. im Herbst 6, 27, 31. in Licht- und Schattenblättern 5. nach Assimilation bei hoher Tempera- tur 35. nach gesteigerter Assimilation 6, 31 u. ff. nach gesteigerter Atmung 7, 35. nach Narkose 36. nach Überlastung des Assimilations- apparates 32. — Verhalten gegen Kohlensäure i^^z, 288 u. ff. 292 u. ff. Zusammensetzung 298. 391. Chlorophyllösungen aus Blättern 14. Chlorophylloxydationsprodukt 414 u. f. — Trennung von Chloi-ophyll 414, 430. Chlorophyllpräparate anderer Forscher 399, 410 u. f. Chlorophyllspaltungsprodukte 18, 20 u. ff. Chlorophyllzersetzung und Neubildung in der Pflanze 8, 410. Chloroplasten, Ermüdung 32, 53, 81, 145. — Kohlensäurekonzentrationserhöhung 173, 180. Chloroplastenfarbstoffe, s. Blattfarbstoffe. Chloroplastenzahl 84, 350. Chlorotische Pflanzen 135. — — Züchtung 136. Colorimetrische Analyse von Chlorophyll- und Phäophytingemischen 309, 428 u. f. Diffusionsgeschwindigkeit von CO, durch die Spaltöffnungen 172. — durch eine durchlöcherte Scheide- wand 172. Disproportionalität zwischen Chlorophyll und Assimilationsleistung 51, 54. Dissoziabel gebundener Sauerstoff im Assimi- lationsapparat 353 u. f. Dissoziierbare Chlorophyll- Kohlensäure Ver- bindung 228 u. ff. Dissoziierbare KohlensäurevcrlMndung der Blattsubstanz 173 u. ff. Dunkle elektrische Entladung zur COa-Reduk- tion 372 u. ff. Eisen, Funktion bei der Assimilation 138. Eisenarme Blätter 135 u. ff. Eisenhydroxyd bei Belichtung in CO., 139, 162, 376- Elektrolytische Spaltung des Wassers beim Assimilations Vorgang 318. Energieanstieg bei der Assimilation 318. Engelmannsche Bakterienmethode 58, 344. Empfindhchkeit 350. Entgasen von Flüssigkeiten 260, 283. Enzymatischer Faktor der Assimilation 56 u. ff., loi u. ff., 241, 246, 354, 415. Ergrünen der Blätter 89, 127 u. ff. Ermüdung der Chloroplasten 32, 53, 81, 145. Ernährungsohnmacht 347. Etioherte Blätter, Wachstum 133. Etiolierte Pflanzen 50, 54, 127. Züchtung 127. Fluoreszenz des Chlorophylls, Zusammenhang mit dem Assimilationsvorgang 239. Formaldehyd aus Begleitstoffen des Chloro- phylls 379, 399, 4^2 u. f. — Beseitigung durch die Blattsubstanz 380. — Dampfspannung 165. — Ernährung der Pflanzen 164, 380. — Prüfung von Chlorophyll 390 u. ff. — Reaktion mit Hydroperoxyd 242. störender Einfluß bei der Assimilation 163. — Verhalten gegen Chlorophyll 246, 393, 395. — Vorkommen in grünen Pflanzenteilen 376 u. ff. Formaldchydbildung außerhalb der Zelle 161, 372 u. ff., 395 u. ff., 409 u. ff. bei der Photooxydation des Chlorophylls 379, 398 u. f- — bei der Zersetzung von organischen Säuren 378. j Formaldehydgehalt von Chlorophyll 246, i 390 u. ff. Eormaldehj'dkondensation 246, 373, 376- j Formaldehydnachweis in den Blättern 377, 381 u. ff. ! — . Geschichte 381 u. ff. Formaldehydperoxyd 242. Formaldehydreaktion nach Grosse-Bohle 386. — nach Rimini-Schryver 390. Sachregister. 445 Formaldehydreaktion nach Schiff 3S7 u. ff. Formaldehydreaktionen 3S3 u. ff. Formaldehydstufe bei der Photos \nthcsc 236 u. ff., 315 u. ff. Frostwirkung auf die Assimilation 99, 102. Frühjahrsentwicklung der Blätter 4g, 86. Fruchthäute, Assimilation 105 u. ff. Fuchsinschwefligsäurereaktion ^Sj u. ff. — in saurer Lösung 386. — Prüfung mit Pikrinsäure und Äther 387. Fucoxanthin 2. Funktion des Plasmas bei der Assimilation 44U. ff., 52 u. ff., 91, 102, 144, 160 u. f. Funktionstüchtigkeit des Assimilationsappa- rates 45 u. ff., 143 u. ff., 160. Gasanalysc 206 u. ff., 329 u. ff. Gasblasenmethode ^^, 59. Gasmischungen, Bereitung 69, 403. Gasstromregulierung 70. Gasuhr 71, 208. — genaues Arbeiten 72, 208. Gelatine als Schutzmittel gegen Chlorophyll- zersetzung 236, 313 u. f. — Prüfung auf Aldehyd 388. Gelbe Blätter, Assimilationsleistung und -zahl 50, 51, 108 u. ff., 143 u. ff. Glucose, Zusatz zu Chlorophyll 3] Irrespirable Gase, Einfluß auf die Assimilation 346 u. ff. Junge Blätter, A.ssimilation 49, 86 u. ff. 397- 399. Kaliumbichromatfilter 114. Katalase bei Assimilationsversuchen 404 u. ff. — Prüfung der Wirksamkeit 403. Katalaseartiges Enzym bei der Assimilation ^46, 399, 405. 415- Kohlendioxyd, Bestimmung der Eöslichkeit 282, 308. — Dichtebestimmung 2S-. Kohlenestersäuren alsCO.,-Überträger 183 u. ff. Kohlensäure, Löslichkeitserhöhung durch Kol- loide 230, 314. — peroxydisch umgelagert 240, 244 u. ff., 416. — Zerfall umgelagerter — 240, 241 u. ff., 413 u. ff. Kohlensäureabsorbierende Fläche des Meso- phylls 173. Kohlensäureabsorption chlorophvilfreier Pflan- zensubstanz 174. — der Blätter, Abhängigkeit vom Partial- druck des CO, 178, 218 u. ff. Abhängigkeit von der Temperatur Prüfung mit fuchsinschwefliger Säure 388. ^7^^' ^^^' ^^9 u. ff., 221 u. ff, Glykokollzusatz zu Chlorophyll bei Assimila- tionsversuchen 163, 312. Hämoglobin zum Nachweis der Assimilation 345- Heizplatte 68, 191. HerbstUche Blätter, Assimilation 49, 37, 93 u. ff. Abhängigkeit \-om Licht und von der Temperatur 144 u. ff., 138. Herbstliche Vergilbung der Blätter 27 u. ff., 94 u. ff. Herbstxanthophyll 30. Hexose, Verbrennungswärme 118. Hexylenaldehyd 377, 381. Hydroperoxydbildung bei der Assimilation 241, 246, 395 u. ff. Hydroperoxydnachweis 400 u. ff. Inanition der Blatt zellen 347 Innere Faktoren bei der Assimilation 43 u. ff., I 185 — Bedeutung für die Assimilation 174, iSo, 184. — — — Berechnung 194, 212 u. ff. ■ Bestimmung und Apparatur 176, 189 u. ff., 206 u. ff. Verhältnis zum Chlorophyllgehalt 173, ^77> 194. 221 u. ff. Verhältnis zum Wasser der Blätter 175, 178, 194, 197, 219. Vergleich m-t frei aufgestellter Kali- lauge 172. — durch das unbelichtete Blatt 137, 171, 172 u. ff., 233. — Einfluß der Atmung auf die Messung 176, 189. — erfrorener Blätter 173. — gelber Blätter 177, 211 u. ff. — getrockneter Blätter 176, 182, 198 u. ff. — im Blatt und im Blut 184 u. ff. quantitati^•e \'crhältnisse 91, 160. Interferometer zur Bestimmung der Assi lation 60. — von I-ecithin 223. mi- Kohlensäureadditionsverbindung des Blattes, chemische Xatur 181 u. ff. 446 Sachregister. Kohlensäureaulnahnie und -entbindiing durch Chlorophyll 228 u. ff., 275 u. ff. Apparat und Bestimmung 230, 277 u. ff. Kohlensäuredifferenzmethoden zur Bestim- mung der Assimilation 47, 59, 327, 332, 350. Kohlensäureerzeugung abgetöteter Blätter 198 u. ff. — hocherhitzter Blätter 203. Kohlensäureisomerisation bei der Assimilation 240 u. ff., 415 u. f., 419 u. f. Kohlensäurekonzentrationserhöhung im Blatte 172 u. ff., 180, 235. — in den Chloroplasten 174. Kohlensäurereduktion durch verschiedene Energieformen 371 u. ff. — Geschwindigkeit 117, 236. — ohne Chlorophyll 371 u. ff. Kohlensäureverbindung, Addition an Chloro- phyll 184, 185, 235, 244. — der Proteine 184, 186 u. ff., 238. — des Chlorophylls 117, 228 u. ff. ■ Umlagerung 241 u. ff., 415 u. ff. — im Licht mit Peroxydase 416, 427 u. ff. Kohlensäure Verbindungen im Blut 1S4 u. ff. Kohlensäurezersetzung des Chlorophylls 229 u. ff., 288 u. ff. Kolloide Verteilung des Chlorophylls im Blatte 55, 263 u. ff. Kolloides Chlorophyll, Beschreibung 261 u. ff. Darstellung 162, 258, 264, 402, 427. hydrolytische Spaltung 260, 427. Spektrum 264 u. ff. Schutz durch ^Magnesiumcai^bonat 236, 310 u. ff., 417. Verhalten gegen Elektrolyte 25g. gegen Kohlensäure 226 u. ff., 262, 271 u. ff. gegen Lösungsmittel 261. gegen Luft 229, 271 u. ff. Komplexe Bindung des Magnesiums 226. — Verbindungen anderer Metalle 228. Konstanz der Assimilation So. — des assimilatorischen Koeffizienten 315 u. ff. — des Chlorophyllgehaltes der Blätter bei der Assimilation i u. ff., 10, 39 u. ff., 46. Kühlung in der Assimilationsapparatur 65. KünstUche Assimilation, s. Assimilation. Laubmoose 334, 349, 351. Lecithin, Verhalten gegen Kohlensäure 223. Lecithin, zur Konstitution 224. — Zusatz zum Chlorophyll 162, 269. Leuchtbakterien zum Nachweis der Assimi- lation 59, 168, 170, 344. Lichtabsorption, Erhöhung durch die zwei Chlorophyllkomponenten 8, 267. Lichtausnützung, Abhängigkeit vom anatomi- schen Bau des Blattes 122 u. ff., 263. — chlorophyllarmer Blätter 120. — der Blätter 51, 115 u. ff. Lichtfilter 67, 114. Lichtdurchlässigkeit von Blättern 119, i25u.ff. Lichtquelle bei Assimilationsversuchen 68. Lichtstrahlen verlauf im Blatte 122 u. ff., 263. Limitierende Faktoren 41. Löslichkeitserhöhung des CO2 durch Kolloide 230. Lux 68. Magnesium, Bindung im Chlorophyll 226 u. ff. — Einführung in Chlorophyllderivate 228. Magnesiumabspaltung aus Chlorophyll durch Kohlensäure im Licht und im Dunkeln 430 u. f. Magnesiumbestimmung in Chlorophyll 297 f. ]\Iagnesiumcarbonat als Schutzmittel gegen Chlorophyllzersetzung 236, 310 u. ff., 417. — bei der Oxydation von Pyrogallol 401, 427. Magnesiumgehalt des Chlorophylls, Prüfung 252. Maximale Assimilationsleistung 47. Metallfadenlampen 68. Mikroskopische Untersuchung des Blattgewe- bes von Blättern gelber Varietäten iio. von etiolierten Blättern 128. von herbsthchen Blättern 99. Moose 349, 351. Narkotische Mittel, Einwirkung auf die Kom- ponentenverhältnisse 36. Natronkalkapparat 71, 191. Optima der Assimilation 41. Oxalsäure 315 u. ff. Oxydation abgetöteter Blätter 202 u. ff. — hocherhitzter Blättter 203. — von P^TOgallol 401. Panachierte Blätter 118, 122, 140, 141. Perameisensäure 242. Perkohlensäure 241. Peroxydase 402, 416 u. ff., 420 u. ff. Sachregister. 447 Peroxydase, Darstellung 420 u. ff. — Schädigung durch Hydroperoxyd 423. Peroxydasewirkung, Bestimmung 423 u. ff. — im Assimilationsversuch 416 u. ff., 427 u. ff. Peroxj^dbildung bei Photozersetzung des Chlo- rophylls 404, 408, 412, 430. Perox^-disch umgelagerte Kohlensäure 240, 242 u. ff., 415 u. f. Peroxj^dnachweis 402. Pflanzenmaterial, Vorbehandlung 72 u. ff. — zur Chlorophylldarstellung 247. Pflanzensäuren 316 u. ff. — in Succulenten 317, 339. — Zersetzung im Licht 378. Phäophytin, Bestimmung neben Chlorophyll 309, 428. Phäophytinbildung aus Chlorophyll durch Kohlensäure im Licht und im Dunkeln 430 u. f. Phasenprobe des Chloroph^-lls 28, 251, 258. Phosphor zum Nachweis der Assimilation 344. Photoisomerisation der Chlorophyll-Kohlen- säureverbindung 240 u. ff., 416 u. ff. Photolyse, s. Photooxydation. Photooxydation der Chlorophyllbegleitstoffe 399, 410 u. ff. — des Chlorophylls 9, 398 u. ff., 410 u. ff., 413 u. ff., 418, 430. Photozersetzung von Pflanzensäuren 378. Phytochlorin e 18, 20 u. ff. Phytorhodin g 18, 20 u. ff. Pipette zum Abmessen von Flüssigkeiten un- ter Luftausschluß 273. Postmortale Oxydation von Blättern 198 u. ff., 202 u. ff. Potentialhub der Lichtenergie bei der Assi- milation 245, 317. Proteine, Kohlensäureverbindung 184, 186 u. ff., 238. Protoplasmafunktion bei der Assimilation 44, 54, 91, 102, 144, 160 u. f. Purpurogallin, Trennung von Chlorophyll 428. Purpurogallinausbeute 425. Pyrogallol, Oxydation im Peroxydasesystem 402, 427 u. ff. mit Luftsauerstoff 401. — Verhalten gegen Chlorophyll 312. — zum Peroxydnachweis 402, 404, 408. Reduktionsstufen imAssimilationsvorgang 244, 315 u. ff. Respiratorischer Koeffizient 319 u. ff. Rotation des Plasmas bei Sauerstoffmangel 346. Rührer der Assimilationsapparatur 67. Sättigungskurve für CO, im Blatt 179. Säure Wirkung auf die Assimilation 53. Sauerstoff, dissoziabel gebunden 353 u. ff. — Entbehrlichkeit von freiem — bei der Assimilation 344, 350, 354. — Funktion bei Atmung und Plasmatätig- keit 346. — locker gebunden 345. — Unentbehrlichkeit von locker gebundenem — bei der Assimilation 345 u. ff. Sauerstoffabgabe von Kupferoxyd 356. Sauerstoffbestimmung 330. Sauerstoffentbindung im Assimilationsvor- gang 240, 244 u. ff., 315 u. ff. — rechnerische Berücksichtigung bei der Be- stimmung der Assimilation 72. — stufenweise — bei der Assimilation 245, 315 u. ff. Sauerstoffentziehung bei Blättern 349 u. ff. Sauerstofffreie Atmosphäre bei Assimilations- versuchen 349 u. ff., 355 u. ff. Sauerstoffmangel bei der Assimilation 345, i55 u- ff- Sauerstofforte 354. — Entleerung 359 u. ff., 362 u. ff. Sauerstoffüberträger 354. Sauerstoffverbindung, dissoziierbare 345 u. ff. Schädlicher Raum der Apparatur 77, 206 u. ff.. 360. Schiffsche Aldehydreaktion 387. Schmarotzerpflanzen, Assimilation 142. Schutzkolloide für Chlorophyll 162, 236, 417. Schutzstoffe des Chlorophylls 7, 181, 186, 235, 417, 420, 436. Schwammparenchym, Funktionen 125. Selbsterregung der Assimilation 352 u. ff., 338 u. ff. Sensibilisator, Chlorophyll als 9, 45, 239. Spaltöffnungen, Diffusionsgeschwindigkeit von CO.2 172. Spaltungsprobe des Chlorophylls 251. Spaltungsprodukte von Chlorophyll 18. Spannungskurve für COg im Blatt 179. Spektrophotometrische Analyse der Blattpig- mente 12. Stärke als erstes Assimilationsprodukt 318. — Zusatz zu Chlorophyll 162, 270. Stickstoff, Assimilation in — 350. 448 Sachregister. Strahlenfilter 66. Strömungsmanometer 70. Stroma, Beteiligung bei der Assimilation 44, 46u.ff., 52U. ff., 91, 102, 144, 160 u. ff. Succulenten 339 u. ff. Temperaturablesung an belichteten Blättern 64. 131- — thermoelektrische 65. Temperaturänderung, Einfluß auf die Assimi- lation gelber, grüner und herbstlicher Blät- ter 56, 113, 143 u. ff. Temperaturkoeffizient bei der Assimilation von gelben, grünen und herbstlichen Blät- tern 112, 156 u. ff., 182. Temperaturregulierung bei Assimilationsver- suchen 66. Transpirationder Blätter, Berücksichtigung 70. Trockene Blätter, Assimilation 169 u. ff. Kohlensäureabsorption ig8 u. ff. Kohlensäureproduktion 198 u. ff. Trockengewichtsbestimmung der Blätter 19, 74- Trocknimg des Gasstroms 71, 191, 207. Ultraviolettes Licht zur COj- Reduktion 373 u. ff. Uranlösung im Licht mit CO, 163, 376. Überschüssige Kohlensäure bei Assimilations- versuchen 47, 68, 80, 132. Überschüssiges Licht bei Assimilationsver- suchen 47, 69, 80. Verbrennungswärme der Hexose 118. Vergilbung der Blätter im Herbste 93 u. ff. 49, Vergleichslösungen, Ersatz i-,. — zur quantitativen Bestimmung von Caro- tinoiden 2^. von Chlorophyll 15. — — — — von Chlorophyllkomponenten — — — — von Purpurogallin 426, 429. Verhältnis der Carotinoide 3, 27. • — - der Chlorophyllkomponenten 3, 27. Verseifungsprobe, s. Phasenprobe. Violettes Licht, Ausschaltung bei Assimila- tionsversuchen 67, 114. Wasserlösliche gelbe Farbstoffe in etioUerten Blättern 134. — in Frühlingsblättern 134. — — — in herbstlichen Blättern 16, 29, 98 Wasserstoff, Assimilation in 346 u. ff. Wasserstoffsuperoxyd, s. Hydroperoxyd. Wiederbelebung der Assimilation 50, 52, 57, loi u. ff., 352, 358 u. ff. Xantophyll, Trennung von Carotin 17, 22. — Zusammensetzung 2. Zeitfaktor bei der Assimilation 42, 156. Zellstruktur, Einfluß auf die Lichtabsorption im Blatte 122. — • Eingriffe in die — und Assimilation 57, 161 u. ff., 168. Zentrifugalpumpe zur Kühlung bei Absorp- tionsversuchen 278. Zwischenstufen der Photosynthese 58, 236 u. ff., 241, 245, 315 u. ff., 328. Druck der Spamerschen Buchdruckerei in Leipzig ä^r^l yi^'^wm% w