VERZAMELDE GESCHRIFTEN

VAN

M. W. BEIJERINCK

TER GELEGENHEID VAN ZIJN

70STEN VERJAARDAG

MET MEDEWERKING DER NEDERLANDSCHB

REGEERING LliTGEGEVEN DOOR ZIJNE

VRIENDEN EN VEREERDERS

VIERDE DEEL

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VERZAMELDE GESCHRIFTEN
VAN M.W. BEIJERINCK

VERZAMELDE GESCHRIFTEN

VAN

M,W BEIJERINCK

TER GELEGENHEID VAN ZIJN

70STEN VERJAARDAG

MET MEDEWERKING DER NEDERLANDSCHE

REGEERING UITGEGEVEN DOOR ZIJNE

VRIENDEN EN VEREERDERS

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VIERDE DEEL

DELFT / MDCCCCXXI

Impr. : F. Bruckmann A.G. und 1. B. Obernetter, München

VIERDE DEEL

nhoud van het Vierde Deel.

Further researches on the Formation of Indigo from the Woad (Isatis
tinctoria). Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van
Wetenschappen, Amsterdam, Vol. III, 1900, p. loi — 116. — Verscheen
onder den titel » Verdere onzoekingen over de indigo-vorming uit Weede
(Isatis tinctoria )<(- in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-
en Natuurk, Afd., Amsterdam, Deel IX, 1900, blz. 74 — 90. . . S. i

Sur la production de quinone par Ie Streptothrix chromogena, et la
biologie de ce microbe. Archives Néerlandaises des Sciences Exactes
et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé III, 1900, p. 327 — 340. — Verscheen
onder den titel »Ueber Chinonbildung durch Streptothrix chromogena
und Lebensweise dieses Microben« in Centralblatt für Bakteriologie und
Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, VI. Band, 1900, S. 2 — 12. . S. 13

Ueber die Wirkung des Benzylsenföls au f das Wachstum des Kahm-
pilzes. Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Ab-
teilung, VI. Band, 1900, S. 72 S. 23

Sur la formation de l'hydrogène sulfuré dans les canaux, et Ie genre
nouveau Aërobacter. Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et
Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IV, 1909, p. i — 18. — Verscheen
onder den titel »Schwefelwasserstoffbildung in den Stadtgraben und Auf-
stellung der Gattung Aërobacter« in Centralblatt für Bakteriologie und
Parasitenkunde, II. Abteilung, VI. Band, 1900, S. 193 — 206. . . S. 24

On different forms of hereditary variation of microbes. Proceedings of
the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam,
Vol. III, 1900, blz. 352 — 365. — Verscheen onder den titel »Over ver-
schillende vormen van erfelijke variatie bij mikroben« in Verslagen Kon.
Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel
IX, 1900, blz. 310— 324, en onder den titel »Sur diverses formes de va-
riation hereditaire chez les microbes« in Archives Néerlandaises des Sciences
Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IV, 1901, p. 213 — 230. S. 37

On the development of Buds and Bud-variations in Cytisus adami.
Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen,
Amsterdam, Vol. III, 1900, blz. 365 — 371. — Verscheen onder den titel
»Over het ontstaan van knoppen en knopvariaties bij Cytisus adami« in
Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd.,
Amsterdam, Deel IX, 1900, blz. 336 — 342, en onder den titel »Ueber die
Entstehung von Knospen und Knospenvarianten bei Cytisus adami« in
Botanische Zeitung, Leipzig, 59. Jahrgang, 2. Abteilung, 1901, S. 113
bis 118 S. 48

i640i

Noch ein Wort über die Sulfatreduktioii in den Gewassern. Centrablatt
für Bakteriologie und Parasitenkunde, IL Abteilung, VI. Band, 1900,
S. 844 S. 53

Sur les ferments lactiques de I'industrie. Archives Néerlandaises des Sciences
Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé VII, 1901, p. 212—243. —
Verscheen onder den titel »Ueber Milchsaure-Bakterien der Industrie*
in Zeitschrift für Spiritusindustrie, Berlin, 25. Jahrgang, 1902, S. 531, 541»
543—544. 550—551, 553 S. 54

Expériences relatives a l'accumulation des bactéries de l'urée. De-
compositie n de Furée par ruréaseetparcatabolisme. Archives
Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II,
Tomé VII, 1902, p. 28 — 63. — Verscheen onder den titel »Anhaufungs-
versuche mit Ureumbakterien. Ureumspaltung durch Urease und durch
Katabolismus« in Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena,
II. Abteilung, VII. Band, 1901, S. 33— 61. . . , S. 78

Sur des microbes oligonitrophiles. Archives Néerlandaises des Sciences
Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé VIII, 1903, p. 190 — 217.
— Verscheen onder den titel »Over oligonitrophile bacteriën* in Ver-
slagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd. Am-
sterdam, Deel IX, 1901, blz. 633 — 642; en onder den titel »On oligonitro-
philous bacteria«, Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie
van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. III, 1901, p. 586—595; en onder
den titel »Ueber oligonitrophile Mikroben« in Centralblatt für Bakterio-
logie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, VII. Band. 1901, S. 561
bis 582 ■ S. 105

Further researches concern ing oligonitropholous microbes. Procee-
dings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen,
Amsterdam, Vol. IV, 1902, p. 5 - 9. — Verscheen onder den titel »Ver-
dere onderzoekingen over oligonitrophile Mikroben« in Neerslagen Kon.
Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel X,
1902, blz. 8 — 13 S. 125

Photobacteria as a reactive in the investigation of the chlorophyll-
function. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van
Wetenschappen, Amsterdam, Vol. IV, 1901, p. 45 — 49. — Verscheen onder
den titel »Lichtbacteriën als reaktief bij het onderzoek der chlorophyl-
functie« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Na-
tuurk. Afd., Amsterdam. Deel X, 1901, blz. 69 — 74 S. 129

Ueber die sexuelle Generation von Cynips Kollari. Marcellia, Padova,
I. Band, 1902, p. 13 — 20 S. 133

et Delden A. van. Sur l'assimilation de l'azote lib re par les bactéries.
Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem,
Série II, Tomé VIII, 1903, p. 319 — 373. — Verscheen onder den titel
»Ueber die Assimilation des freien Stickstoffs durch Bakterien« in Central-
blatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, IX. Band,
1902, S. 3—43 S. 139

and Delden A. van. On a colourless bacterium, whose carbon-food
comes from t he a t mosph ere. Proceedings of the Section of Sciences
Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol, V, 1903, p. 389
bis 413. — Verscheen onder den titel »Over een kleurlooze bacterie,
waarvan het koolstofvoedsel uit de lucht komt« in Verslagen Kon. Aka-
demie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XI,

1903, blz. 450 — 465; en onder den titel »Ueber eine farblose Bakterie,
deren Kohlenstoffnahrung aus der atmospharischen Luft herrührt« in
Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung,
X. Band, 1903, S. 33—47 S. 180

Phénomènes de reduction produits par les microbes. Archives des Sciences
Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IX, 1904, p. 131 — 157. —
Verscheen onder den titel »Reductieverschijnselen door Mikroben bewerkt«
in Handelingen van het 9^ Nederlandsche Natuur-en Geneeskundig Congres
gehouden te 's-Gravenhage, 1903, blz. 195 — 218 S. 192

et Delden A. van. Sur les bactéries actives dans Ie rouissage du lin.
Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem,
Série II, Tomé IX, 1904, p. 418 — 441. — Verscheen onder den titel »Over
de bacteriën, welke bij het roten van vlas werkzaam zijn« in Verslagen
Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Deel XII,

1904, blz. 673 — 693; en onder den titel »0n the bacteria which are active
in flax-rotting« in Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie
van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. VI, 1904, p. 462 — 481 . S. 212

Chlorella variegata, ein bunter Mikrobe. Recueil des Travaux Botaniques
Néerlandais, Nijmegen, Vol. I, 1904, p. 14 — 27 S. 231

Das Assimilationsprodukt der Kohlensaure in den Chromatophoren
der Diatomeen. Recueil des Travaux Botaniques Néerlandais, Nijmegen,
Vol. I, 1904, p. 28—32 S. 239

Ueber die Bakterien, welche sich im Dunkeln mit Kohlensaure als
Kohlenstoff quelle ernahren können. Centralblatt für Bakterio-
logie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, XI. Band, 1904, S. 592
bis 599 S. 242

L'influence des microbes sur la fertilité du sol et la croissance des
végétaux supérieurs. Archives Néerlandaises des Sciences Exactes
et Naturelles, Série II, Tomé IX, 1904, p. VIII — XXXVI. — Verscheen
onder den titel »De invloed der mikroben op de vruchtbaarheid van den
grond en op den groei der hoogere planten « in het Landbouwkundig
Tijdschrift, Groningen 1904, blz. 225 — 250; en verscheen onder denzelfden
titel bij J. B. Wolters te Groningen S. 249

et Rant A. Sur l'excitation par traumatisme, Ie parasitisme et l'écoule-
ment gommeux chez les Amygdalées. Archives Néerlandaises des
Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série 11, Tomé XI, 1906,
p. 184 — 194. — Verscheen onder den titel »Wundreiz, Parasitismus und
Gummifluss bei den Amygdaleen« in Centralblatt für Bakteriologie und Para-
sitenkunde, Jena, II. Abteilung, XV. Band, 1905, S. 366 — 375 . . S. 267

An obligative anaerobic fermentation Sarcina. Proceedings of the Section
of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. VII,
1905, p. 580 — 585. — Verscheen onder den titel »Een obligaat anaërobe
gistingssarcine« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en
Natuurk. Afdeeling, Amsterdam, Deel XIII, 1905, blz. 608 — 614; en onder
den titel »Une sarcine de fermentation anaerobie obligatoire« in Archives
• Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II,
Tomé XI, 1906, p. 199 — 205 S. 278

On Lactic acid fermentation in m i 1 k. Proceedings of the Section of
Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. X, 1907,
p. 17 — 34. — Verscheen onder den titel »Over melkzuurgisting in melk«
in Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amster-
dam, Deel XV, 1907, blz. 883 — 901; en onder den titel » Fermentation
lactique dans Ie lait« in Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et
Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé XIII, 1908, p. 356-378 . S. 283

Fixation of free atmospheric nitrogen by Azotobacter in pure culture.
Distribution of this bacterium. Proceedings of the Section of Sciences,
Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XI, T908, pag. 67 - 74.
— Verscheen onder den titel »Binding van vrije atmospherische stik-
stof door Azotobacter in reincultuur. Verspreiding dezer Bacterie* in
Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd.,
Amsterdam, Deel XV, 1908, blz. 46 — 53 S. 298

Beobachtungen über die Entstehungvon Cytisus purpureus aus Cytisus
Adami. Berichte der deutschen botanischen Gesellschaft, Berlin, Band
XXVI a, 1908, S. 137—147 S. 305

Die ErscheinungderFlockenbildungoderAgglutination bei Alkohol-
hefen. Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, II. Abteilung,
XX. Band, 1908, S. 137 — 157 S. 313

et Jacobsen H. C. Influence des températures absolues de 82 et 20 de-
grés centrigrades sur la vitalité des microbes. Recherches
faites au Laboratoire microbiologique de Delft et au Labo-
ratoire cryogène de Leyde. Premier congres international du froid,
Paris, 1908 S. 324

Variability in Bacillus prodigiosus. Proceedings of the Section of
Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XII, 1910,
p. 640—649. — Verscheen onder den titel «Variabiliteit bij Bacillus pro-
digiosus* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk.
Afd., Deel XVIII, 1910, blz. 596-605 S. 333

Ueber Emulsionsbildung bei der Vermischung wasseriger Lö-
sungen gewisser gelatinierender Kolloide. Zeitschrift für
Chemie und Industrie der Kolloide, Band VII, 1910, S. 16 — 20 . S. 341

und Minkman D. C. J. Bildung und Verbrauch von Stickoxydul
durch Bakterien. Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde,
Jena, II. Abt., XXV. Band, 1910, S. 30—63 S. 348

Further researches on the Formation of Indigo
from the Woad (Isatis tinctoria).

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam,
Vol. III, 1900, p. loi — 116. — Verscheen onder den titel » Verdere onzoekingen over
de indigo-vorming uit Weede (Isatis tinctoria)* in Verslagen Kon. Akademie van We-
tenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel IX, 1900, blz. 74—90.

Since my first communication on the chromogene of the woad^) I have found
that the indoxyl does not exist in it in a free condition, as I then thought,
but in a loose compound which I w^ill call isatan, and which, by an enzyme,
simultaneously present, the isatase, is easily decomposed with production of indoxyl.

I. The research of Schunck.

As soon as I had come to this conclusion, the question arose, whether the
matter prepared by Schunck from the woad in 1855, and described2) under
the name of »indican«, can be either or not identic with isatan. That in many
of his experiments he has indeed had isatan before him I consider as certain.
But in carefully reading his essay I met with number of contradictions, which
are only to be explained by Schun ck's werking with two other substances besides,
which he continually interchanges with each other and with isatan ; these are
indoxyl and a chromogene which colours intensely yellow by alkalies, occurs
abundantly in the woad, precipitates, just Hke isatan, with basic lead acetate, but
has nothing to do with indigo. If I well understand him he calls this substance
»changed indican« and considers that it differs from it by containing one or two
H*0 more, but this is a wholly unproved hypothesis.

Indoxyl was not known to Schunck at all, but his second preparation
method of the »indican« reposes on ether extraction of [the dried plant. As isatan
is not soluble in ether I suppose that during the preparation small quantities of
indoxyl originated from the isatan, which easily occurs under various influences,
and for which ether is an excellent solvent.

However strange it may be, it was the matter colouring yellow by alkalies,
and not the indigo-chromogene itself, which Schunck subjected to the three
analyses on which reposes the well-known formula of the »woad-indican«. Quite

') On the Formation of Indigo from the Woad (Isatis tinctoria). Kon. Akad. van
Wetenschappen, Amsterdam; Proceedings of the Meeting of 30th September 1899.

^) E. Schunck. On the Formation of Indigo-blue. Part I. Philosophical Magazine
(4) Vol. 10, pag. 74, 1855. For the indiglucine: Ibid. Vol. 15, pag. 127, 1858.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. I

clear he is not, but so far as I conceive his meaning, the first and the third
preparations, which he analyzed, contain no indican at all, yet he calls them the
purest; the second he considers as less pure, and he seems to have subjected it
to the analysis after having convinced himself that by precipitating it with alcohol,
lead acetate and ammonia »it contained no longer unchanged indican», which
consequently means, that he had before him the said matter turning yellow by
alkalies and thus containing no more indigo chromogene.

Word for word he says the following, first concerning his analyses in general
(1. c. Part I, pag. 89): »I have hitherto been unable, I regret to say, to ascertain
the exact composition of indican by direct experiment. On account of the deli-
quescent nature, and its so readily undergoing change when heated, it was im-
possible to subject it to analysis in a free state and I was therefore obliged to
have recourse to the lead-compound.« Then follows the description of the three
analyses themselves. Of the first he says (1. c. pag. 90) : »Notwithstanding the care,
however, which I took in the preparation of the specimen, I found that it did
not contain unchanged indican, as a little of it, when tested with sulphuric acid,
gave no indigo-blue. It is nevertheless the purest specimen of the lead-compound
which T have analysed.« Then he says of the second and third: »The next
analysis which I shall give, places in a striking light the effect which alkalies
exert on indican. I took some of the same solution of indican which I had
employed for the preceding analysis, and which I found to give, when a little
of it was boiled with acid, very pure indigo-blue; but instead of evaporating it,
I added a large quantity of alcohol to it, and then precipitated with acetate of
lead and ammonia. The precipitate no longer contained unchanged indican« . . .
»The third analysis was performed with a lead-compound made in the same way
as that of the first analysis ^).«

All this is not quite clear, but I read from it that these analyses have
nothing to do with the indigo chromogene itself, that is to say, with isatan, and
I think that they relate to a mixture of the chromogene from the woad, which
colours yellow by alkalies, and plantslime (»indiglucine«). The explanation of this
enormous fact should, I think, be sought in the following circumstances. Schunck
prepared the »indican« by alcohol extraction from carefuUy dried woad-leaves,
which in itself is quite rational, because in this way relatively concentrated and
rather pure solutions are obtained. But if the dried leaves are kept a little too
long, for instance two days at 28° to 30*^ C, or if they grow a little moisty, the
isatan vanishes completely from them. Though Schunck evidently knew that the
chromogene can easily disappear from the dry leaves, he does not mention the

') Three analyses of such doubtful substances are the sole foundation upon which
the vvell-known indican formula of Schunck

C2«H"NO*' + 2H-0 = CH^NO-f-SCCH'oO*)
Indican Indigo-blue Indiglucine

is based and which, since 1855, has been accepted, without criticism, in all great
Chemical manuals. Formerly I was inclined to write the formula thus:
C=«H"NO''-f-2H^O = C»H'NO-f3(C''H»0'')
Indoxyl Glukoron
but now, having carefully studied Schunck's essay, I think this interpretation also
worthless.

short time after which this occurs already, so that I think it very well possible
that the chromogene has disappeared during bis preparation without his having
observed it. For it is to be kept in view that his method of demonstrating the
indigo-blue qualitatively is highly deficiënt and consisted in decomposing the
chromogene by »strong mineral acids«, the very worst method to be foliowed,
as strong acids are pernicious as well to isatan as to indoxyl.

My opinion that Schunck at the moments when it was particularly important,
had not to do with the indigo chromogene itself, but with another substance,
is also based on several observations which he makes about the properties of
the »pure indican«. So we readon pag. 85 (l.c. PartI): »With caustic alkalies,
baryta and lime-water the watery solution turns of a bright yellow.« This reaction
holds only good for the impurity which remains in the dried leaves after the
isatan is destroyed in them. If in the preparations any isatan had been pre-
sent the yellow colouring would have been immediately foliowed by the form-
ation of indigo-blue, which then becomes much more distinctly visible than if
the same preparation is decomposed by acids. Evidently he has examined different
samples with acids and alkalies, and samples, free from isatan, only with the
latter, else he would certainly have found that those preparations, which by acids
produce indigo-blue, yield much more indigo if they are treated with an alkali.
Likewise the following statement of his preliminary researches is for the greater
part unintelligible if it is admitted that Schunck speaks of isatan. He says (l.c.
pag. 81): »I was enabled to infer, with positive certainty, that the halis tinctoria
contains a substance easily soluble in heat and cold water, alcohol and ether,
which, by the action of strong mineral acids, yields indigo-blue; that the formation
of the colouring matter from it can be effected without the intervention of oxygen
or of alkalies; and that the latter, indeed, if allowed to act on it before the
application of acid, entirely prevent the formation of colouring matter.« Tn opposi-
tion to this, the fact must be stated, that the best method for demonstrating
with certainty and quickness isatan or indoxyl in woad-sap, just consists in adding
alkali to it, by which the isatan is decomposed and the indoxyl is quickly oxi-
dized to indigo at the air; after this, the addition of acid may be desirable to
decolour the yellow pigment formed by the alkali, by which the indigo-blue
appears with greater purity.

The uncertainty of the whole research explains hpw it is possible, that
Schunck, when later becoming acquainted') with Polyoonum thictorium, could think
that the indican therein occurring, the composition of which, C'^ H'' NO" -f 3 H" O,
has recently been determined by Messrs. Hoogewerff and ter Meulen'-'), and
which is entirely different from isatan, could be identic with his »woad-indican«.

Consequently I believe that Schunck cannot be considered as the dis-
coverer of the isatan, though it is not to be doubted, that in his experiments,
he has sometimes had this substance before him, and, basing on the above expo-
sition I take his indican formula for not appliable to isatan.

M On Indigo-blue from Polygonnm tinctoriuiii. The (Chemical News. Vol. 39, pag.
:t9, 1879.

^) Kon. Akad. van Wetenscli. te Amsterdam, 31 Maart 1900, pa^:. 508.

2. Pnparation and properiies of isatan.

Indoxyl and isatan are very unstable and still at present most imperfectly
known substances, which only in acid solutions can easily be distinguished from
each other, in neutral solutions, without the use of of isatase, with much more
trouble, in alkaline solutions not at all, because in these isatan produces indoxyl.

The reason why at first I thought that the woad must contain free indoxyl
and no compound of it, is the fact that in the extracts obtained from young
woad-leaves, rich in isatan, as well by decoction as by cold extraction, the isatan
is decomposed and an indoxyl solution is obtained. Now I admitted in the be-
ginning, that if in the woad, as was my leading theory, a glucoside was present,
which, in analogy to the indican, must be decomposed by an enzyme, at the
decoction no indoxyl but exclusively this glucoside would be obtained, because
by boiling the enzyme is suddenly destroyed. In this view I was supported by
the fact, that this indeed takes place with Itidigofera and Folygomtm, which by
decoction yield indican, by cold extraction indoxyl.

But I began to doubt of the generality of this theory, when observing, that
Phajus grandiflorus, which belongs to the indican plants, nevertheless') produces
indoxyl at decoction. So this seemed also possible with the woad, though it was
clear, that the properties of the »glucoside« ought in this case to be quite different
from those of indican.

But I was only put on the right way, by the experience, that it is possible
to obtain from the leaves of the woad, by the extraction with dilute acids a
solution, which remains unchanged at the air, although it yields with alkalies
much indigo-blue, while an equally acid indoxyl solution slowly oxidizes at the
air to indigo. I then clearly saw why I had before obtained indoxyl from the
woad. My experiments had been performed on a small scale; I had been able
with care to select growing leaves and buds only; but they contain much isatan
and so little acid, that the enzyme isatase can become active, so that by decoction,
as well as by cold extraction with water, and even with alcohol, the produce
indoxyl, though at the decoction and alcohol extraction mixed with much isatan,
which fact I only observed later. If I had used older leaves which contain more
acid, I should have found at once isatan quite free from indoxyl.

The relative constancy of isatan in feebly acid solutions, even at boiling
temperature can be utilized for its preparation.

Though the acidity during the extracting must befeeble yet it must be strong
enough to prevent the decomposition of the isatan by the isatase. To this end
an acidity of i.6 to 3.2 cc. of normal oxalic acid per 100 cc. of the extraction
liquid, (o.i to 0.2 weight percentage) suffices, for the acidity of the older leaves
themselves amounts to about 1,5 cc. normal per 100 cc. of the juice, and this
is the very limit of acidity above which the isatan becomes inactive. If the extraction
is effected by boiling, this degree of acidity should be exactly observed. In cold
extraction, with oxalic acid, the isatan is much less subject to decomposition,
so that, below 50" C. solutions of i to 3 pCt. oxalic acid can safely be employed.

') Indigofermentation. Kon. Akad. van Wetensch., Amsterdam, Proceedings of the
Meeting of Maart 1900, pag. 573.

But at these low temperatures the acid penetrates with less rapidity into the cells,
in which accordingly the enzyme can become more or less active producing some
indoxyl. Hence, in the acid extraction at low temperature, it is advisable to rub
the leaves down in a mortar, immersed in the acid liquid.

In particular at boiling temperature and when using an extraction liquid of
an acidity of 2 to 3 cc. of normal oxalic acid, it is easy to obtain a quite un-
decomposed isatan solution from the growing woad-leaves, even of the youngest
still neutrally reacting meristemes. In consequence of the boiling temperature,
aided by the perfect surrounding of the cells with the dilute acid, the isatase
is destroyed simultaneously with the dying of the protoplasm, by which decom-
position of isatan is quite excluded. As the extraction continues, there is an inter-
change between the feabler acidity within (0.5 cc. normal pCt.), and the stronger
acidity without the young cell, and at the end of the experiment, a solution of
isatan of 0.5 to 2 cc. of normal acid per 100 cc. of juice in obtained, when the
weight of the leaves used, equals that of the extraction liquid.

More acid used in the boiling than the said percentage causes isatan decomposi-
tion, by which not only indoxyl but also brown products of decomposition originate.

Oxalic acid can be replaced by other acids and by acid salts. Thus I obtained
good results with dilute sulphuric acid and phosphoric acid, and with a saturated
solution of boric acid, at room temperature. Acetic acid causes a feebier decom-
position than oxalic acid. When the appearance of brown products of decom-
position during the boiling is taken as a criterion for the decomposition, I found
that 12 cc. of normal acetic acid added to 100 cc. of juice (ca. 0.8 weight percentage),
is about proportioned to 5 cc. of normal oxalic acid (= 0.3 weight percentage).
Acid salts act like acids. Kaliumbioxalate and biphosphate can only be used in
strongly diluted solutions. With a cold saturated solution of kalium bitartrate
the extracting may be operated at boiling temperature without decomposition;
only by prolonged boiling a little indigo-blue is produced. I prefer, however, the
extraction with oxalic acid. Therewith the solutions remain clear and of a light
yellow and can very easily be filtered*) ; af ter filtering, the remaining leaf-matter
is soft, but by no means slimy, and can quite well be pressed dry, so that, in
consequence of the high water percentage of the leaves, a quantity of extract
is obtained nearly twice as much as the original volume of the oxalic-acid solution.

If with the thus obtained isatan solution enzyme experiments are to be per-
formed, the acid must be removed, which is best done by boiling with chalk").
As the reaction of the chalk is slightly alkaline it should be very finely divided,
as larger particles form a little indigo on their surface. After filtering off the
oxalate and the superfluous chalk, a liquid results somewhat brownisch indeed,
but not so much as to be hurtful to the enzyme experiments.

This liquid cannot be evaporated to dryness without being decomposed, even
not at room temperature, because during the concentration the acidity increases.
To neutralize the syrupic matter is troublesome.

*) If the woad-leaves are bolled with more acid than 2 to 3 cc. normal per 100 cc.
of the juice, the decoction grows slimy and givcs trouble in filtering.

^) Neutralizing without endangering the subsequent enzyme action, can also be
done with lead-, mangan-, magnesia-, or baryta-carbonate, but I prefer chalk.

The extraction of the isatan can also be efïected with feebly acid alcohol,
both in the cold and at boiling temperature. Fresh leaves are then to be prefered
to dried ones, because in drying there always gets lost some, at last all isatan. The
alcohol extract must be evaporated at low temperature and finally be neutralized
with chalk. After boiling a brownish, almost neutral and very rich isatan solution
is obtained, which can be purified with neutral lead acetate.

For further concentration the isatan can be precipitated with basic lead acetate,
and the yellow precipitate be decomposed in the cold with oxalic acid. The lead
oxalate separates freely from the isatan solution, and the excess of oxalic acid
can be removed with chalk, the lead with sulphurated hydrogen. This solution
can be kept without decomposition for some time, but after a few weeks the
isatan vanishes.

In the decoction method with oxalic acid, foliowed by lead precipitation,
the chlorophyll is removed from the very first and evaporation is excluded. More
plant slime will then precipitate with the lead than by alcohol extraction, but
on further purifying, this slime can be precipitated with ether-alcohol. I have as
yet not been able to prepare dry isatan, as a powder, from these extracts, such
as I before prepared the indican.

The most characteristic difference between indican and isatan consists in
their behaviour to alkalies: indican is constant in concentraded alkaline solutions,
isatan is decomposed by very feeble alkalies, even in the cold. Concentrated
solutions of dinatrium phosphate, phosphoric salt and ammonium carbonate produce
indoxyl from isatan, already at room temperature. By acids, both indican and
isatan are decomposed, but indican with much more difficulty, which is especially
evident when using acid salts. So, isatan is already decomposed by boiling with
dilute kalium bioxalate, in which indican is constant.

Both substances precipitate with basic lead acetate, producing yellow preci-
pitates, which colour is probably proper to the substances themselves, and not
to impurities.

Isatase, the specific enzyme from woad, does not act on indican; isatan
on the other hand is not decomposed by the indigo-enzymes.

Isatan is not directly splitted by the common microbes; indirectly it may,
of course, be decomposed by the alkali produced by microbes. Indican, on the
other hand, as I have formerly shown, is directly decomposed by many microbes,
either by ferment action of the protoplasm (katabolism), or by specific enzymes,
proper to the microbes. This difference between isatan and indican is probably
related to the nature of the substances set free in the decomposition beside the
indoxyl. So the glucose, from the indican, is an excellent nutriënt for many
bacteria, whilst the very stability of the isatan in relation to microbes, seems to
indicate that the matter, which besides indoxyl originates from it, is no glucose,
perhaps no sugar at all.

j. The isatase.

The preparation of the woad-enzyme is efïected in the same way as that of
the indigo-enzymes. The related parts of the plant are rubbed down in living
state under alcohol, and the alcohol is so often renewed until all the chlorophyll

pigment is removed. After filtering and drying the crude isatase is obtained as
a white, feebly acid powder in which, of course, all substances not soluble in
alcohol are present, hence, all the other enzymes of the woad too. As the enzyme
is quite insoluble in water it can be purified by extraction with destilled water,
by which the other enzymes, at least those that are soluble, disappear. Solvents
for the isatase itself I have not yet found.

As the woad, like the cabbages, is very rich in gypsum, the crude isatase
contains so much of it that to remove it with destilled water is troublesome.
I have therefore, in order to answer the question, whether in the action of isatase
on isatan perhaps a sulphate is produced, as in the splitting of kalium myronate
by myrosine, prepared in the following way isatase free from gypsum. Woad
leaves cut fine were rubbed down in destilled water, then pressed out, and the
remaining matter extracted with water until the filtrate proved free from sulphuric
acid. Then the chlorophyll pigment was removed by alcohol and the remaining
matter dried and powdered.

Though the thus obtained preparation is poor in enzyme, because this is
localized in the chlorophyll granules, which during the pressing of the leaves are
for the greater part also pressed out, it is still sufficiënt to bring about a strong
isatan decomposition. As was to be expected, sulphates were not thereby set free.

The isatase is spread through the whole woad-plant; it occurs as well in
the growing parts as in full-grown roots, stemps, leaves, and flowers. So the
distribution is another than that of the isatan, which is wanting in all full-grown
parts, and is the more accumulated in growing roots, stems, and leaves, the
younger they are.' Another distribution also than that of the indigo-enzymes in
the indican plants, which are only found in the parts rich in indican.

On the other hand the distribution of the isatase within the cell itself,
corresponds with that of the indigo-enzymes: both are localized in the chroma-
tophores. The isatan has also, in the cell, a localisation corresponding with that
of the indican, for in as much as can be inferred from micro-chemical experi-
ments, both are found in the living protoplasm of epidermis, mesophyll and other
parenchymatous tissues. For establishing the localisation of isatan and isatase in
the cell, the same way can be foliowed which I formerly pointed out for detecting
the indican and the indigo enzymes^).

As regards the isatan, for this end, not too thin microscopic sections of young,
vigorously growing stems or leaves are put in a boiling mixture of hydrochloric
acid and isatine; by the acid indoxyl is separated, which produces, with the isatine,
red crystal needies of indigo-red, localized in the protoplasm. More difficult to
observe, but still, I think, quite convincing is the precipitation of indigo-blue, as
small granules, in the living protoplasm, when the sections, in a living state, are
put in a mixture of boiling hydrochloric acid and ferrichlorid. Remarkable is the
strong accumulation of isatan in the epidermis cells, and especially in the hairs
found on the young leaves.

The localisation of isatase in the chromatophores can be demonstrated in
two ways. Either little bits of the easily loosening epidermis of woad-leaves, or

') Indigoferinentation p. 579.

microscopic sections of sterns or leaves, all in a living state, can be put in a
neutrally reacting woad-decoction, rich in isatan, and heated to ca. 45" C. After
some minutes already the chromatophores begin to colour blue; the intensity of
colour increases some time, to reach its limit in an hour or so.

The blue-colouring of the colourless chromatophores of epidermis and stem-
pith, is here distinctly to be observed, so that, particularly the fragments of the
first, become very interesting preparations.

The localisation of the isatan in the protoplasm, of the isatase in the chro-
matophores, renders their inter-action in the living cell possible w^ithout any in-
fluence of the acid cell-sap. At the death of the cell, this state will suddenly
change and the acidity of the cell-sap determines wheter the isatase can act or
not on the isatan.

In no other plant but the woad I have hitherto been able to detect isatan.
I had expected its presence in some short-valved Cruciferae. So in Capsella bursa
pastoris, where, in case the root-neck is much hurt, a tracé of indoxyl can be
pointed out, but here also the enzyme is wanting. Likevvrise it wants in the indican
plants. Also all microbes examined are devoid of isatase.

4. Action of isatase on isatan.

The action of isatase on isatan is, as observed before, only possible in neutra
or amphoteric and very feebly acid solutions. In alkaline solutions the obser-
vation becomes uncertain, because the alkali itself splits ofif indoxyl. If the acidity
amounts to 1.5 cc. of normal acid per 100 cc. of the isatan solution, the action
is much weakened, and at ca. 1.8 cc. of normal acid, there is no more decom-
position of isatan at all, which is noteworthy as this percentage of acidity is
reached in the cell-sap of older woad-leaves. This does not however exclude isatan-
decomposition by the enzyme in the living cell, as the process can be limited to
the protoplasm, in accordance with the localisation described.

As the action of the isatan is judged after the formation of indigo-blue,
two chemical processes are involved in it, isatan splitting and indoxyl-oxidation.
If the experiment is performed with free access of air, for instance in a thin
layer of the isatan solution, with the enzyme floating on it, the indoxyl changes
directly into indigo; but if the isatan is decomposed with imperfect access of air,
for instance, in the depth of an experiment tube, then it is necessary, during the
experiment itself, to render the oxidation of the indoxyl as complete as possible
by agitation with air, which does not however always succeed wih sufficiënt
quickness, and so limits the accuracy of the experiment. Of course the liquid can-
not be alkalized, because then not only the indoxyl formed by the isatase would
become visible, but also the indoxyl set free by the alkali from the isatan not
decomposed by the isatase. If the object is to observe the isatase action at a
determined temperature, then the enzyme cannot be destroyed at the end of the
experiment by heating, but this must be effected by some enzyme poison, as for
instance sublimate.

Addition of acid to render the colour of the indigo-blue more pure must
likewise be avoided, in order not to decompose isatan.

Accordingly it is necessary to perform the reaction in a very feebly acid
solution, and to judge of the results without other precautions than a thorough
aeration. I have not been able hitherto to answer the question after the nature
of the matter, which at the isatan-splitting, most probably is set free beside the
indoxyl. Pressed yeast, produces in woad-extract, heated with crude isatase at
30° C, more alcohol and carbonic acid, than in the same extract without isatase
(in the proportion of 8:5), so that in the first there must certainly be formation
of sugar capable of fermentation. But this sugar results, probably not from the
isatan, but from the action of other enzymes, present in the crude isatase, on
glucosides or carbohydrates, present in the isatan-solution, such as myrosine on
myronates, and diastase on granulose.

The process of the decomposition cannot be studied with Fehling's cupric
solution, as the isatan is decomposed by the alkali.

That to Schunck's »indiglucine« no value can be attached follows from § i.

In order to state the influence of heating on the isatase action, the experi-
ments were arranged as described elsewhere for the indigo-enzymes*), with the
difiference, that for the above reasons, alkalisation and subsequent acidification
are here omitted. The were finely powdered enzyme is shaken in an experiment
tube with the isatan solution, and in a water bath, at determined temperature,
heated a determined number of minutes. There are always performed two experi-
ments at the same time, so that a colorimetrical comparison of the produced
indigo is possible, e. g. at 48° C. and 50" C, or at 40** Und 60", 45^ and 55*^, etc.
The best results were obtained with dilute isatan-solutions, which are brought,
as exactly as possible, to an acidity of 0.5 cc. normal per 100 cc. of liquid, and
with so little enzyme, that the complete conversion was very slowly accompHshed
and took about half an hour.

The optimum for the action was found at
48° to 50° C, but could not be determined
more accurately as differences of two 2*^ C.
produce no distinct colorimetrical difference.
At 70" C. the enzyme is completely destroyed.
The minimumlimit is low, far below o" C, as
is seen in the figure. Noteworthy is the slow-
ness with which the intensity of action decreases
at decrease of temperature, and the quickness
with which it takes place when the temperature
rices. So the action at 10" and at 0° C. respec-
tively is as strong as at 60*' and 60.5° C.

On other substances but isatan isatase seems not to act; it has certainly
no action on indican, neither could I decompose with isatase the potassium indoxyl-
sulphate in horse urine.

When judging of these experiments it must be kept in view that other enzymes
are present in the crude isatase, which may produce substances not indifferent
for the isatase action. So mention was made above of the presence of the myrosine

5

Ir

^

^

^

\

\

\

O 10 20 30 40 50 60 70° C.

Action of isatase on isatan.

') Indigofermentation p. 586.

and diastase in the crude isatase preparations, and below I will refer to the presence
of peroxydase.

j. Extractiofi of indoxyl frotn the zvoad-kaves.

Once acquainted with the chief proporties of isatase and isatan, it is possiblt
at will to extract isatan or indoxyl from the woad. Though in my former com-
munication I spoke already of the indoxyl extraction, my being unacquainted with
isatase prevented me from doing this with perfect clearness.

As alkalies produce indoxyl from isatan the extraction of woad-leaves therewith
will at every temperature produce indoxyl. But by the presence of alkalies the
indoxyl becomes so very oxidisable and then passes at the air so quickly into
indigo, that the air, ever present in the leaves, causes a great portion of the
indoxyl to get lost. On the other hand, neutral or feebly acid solutions oxidize
much more slowly ; it is true that also in these finally all the indoxyl passes into
indigo, but such solutions keep unchanged for hours at room temperature and
are fit for studying the properties of the indoxyl.

The chief point for obtaining such neutral or feebly acid indoxyl solutions
from woad-leaves, is during the extraction to furthei the isatase-action, conse-
quently to do the very thing which I formerly indicated as essential for the
indoxyl extraction from indican plants, where all depends on the action of the
indigo-enzymes. With woad this can best be effected by keeping the extraction
temperature between 45" and 50" C, and by addition of chalk or of a salt of
feebly alkaline reaction, partly to neutralize the acid of the leaves. Thus a good
result is obtained by entirely filling a wide-mouthed stoppered bottle with young
woad-leaves, and pouring over them a ^/2 pCt. dinatrium-phosphate solution (Na-
H PO' + 12 H^ O), heated at about 50° C, removing the air as much as possible,
closing the bottle and allow it to stand at 40 '^ C. for 24 hours. By decantation
and pressing the leaf matter, boiling and filtering, all the indoxyl is obtained in
an amphoteric solution, which is somewhat brownish, but is excellent for indoxyl
experiments. The presence or absence of undecomposed isatan is observed by
precipitation with lead acetate, whereby the indoxyl remains dissolved. The indoxyl
can also be shaken out with ether and in the remaining liquid sought with isatase
for isatan. Not decomposed isatan remains also in the filtrate, when the indoxyl
is allowed to oxidize at the air and the indigo-blue is filtered off.

The ether solution of the indoxyl, obtained by shaking it out of the extract,
can be evaporated at low temperature at the air, by which the indoxyl is left
behind as a liquid soluble in water, which can be coloured by different impurities.
Though the watery solution of this »purified indoxyl« is inconstant at the air,
its oxidation to indigo-blue proceeds slowly enough for studying the influence
wich different substances exert on this process.

Various circumstances have induced me to put anew the question, whether
in this oxidation an oxidizing enzyme is active^). After much doubt I have finally,

') Mr. B r é a u d a t crroneously asserts (Compt. rendus T. 127, p. 769, 1898 and
T. 128, p. 1478, 1898) that in the extracts of Isaiïs indigo-white occurs. which, by an
oxydasc is turned into indigo-hhK'.

as before, come to the conclusion that such is not the case. My primitive un-
certainty was caused by the very unequal acceleration of the oxidation of indoxyl
Solutions by different powders spread on the surface. So the oxidation is some-
what furthered by the crude enzyme of woad, and very strongly, by that of
indigofera leptostachya, but by boiling, the crude enzymes are by no means deprived
of this property. By a minute comparison of the behaviour of crude indoxyl
Solutions prepared from isatan and indican, with »purified« ones^), I ascertained
that, both in the crude enzymes and in the crude indoxyl solutions, there are
present soluble and insoluble chemical compounds, which infiuence the quickness
of the indoxyl oxidation, but which are not destroyed by enzyme poisons and by
heating, and which accordingly have not the nature of enzymes.

Crude isatase has neither an oxidizing action on pyrogallol, hydrochinon,
and guajac emulsion.

ïhough thus oxydase is wanting in the crude isatase, there is present in it,
as in all such like powders, prepared at random from higher plants, peroxydase
(»leptomine« of Rac ib o rski)*), that is the enzyme which, in the presence of
hydrogen peroxyd, colours guajac emulsion blue. But indoxyl is by no means
oxidized by it to indigo.

6. Nekrosis and Nekrobiosis.

Living tissues can die ofif in two vvays : by necrosis, that is the dying of
the protoplasm with simultaneous destruction of the enzymes, and by necrobiosis,
in which the protoplasm dies, but the enzymes remain active. The phenomenon,
formerly described by me as the »blue stripe« in partly killed woad-leaves, on
the confine of the living and the dead portions, which both retain their green
colour, reposes accordingly on necrobiosis. The action of isatase on isatan explains
this phenomenon satisfactorily and renders my former hypothesis of alkali for-
mation at the dying of the protoplasm superfluous.

The simplest way to perform the experiment is to kill the tip of a young
woad-leaf in a Bunsen flame, or in the vapour of boiling water, then to allow
the leaf to remain at ordinary temperature, by which in the said part alone indigo
precipitates. If the chlorophyll pigment is extracted with alcohol, then both the
»living« and the »dead« parts become colourless, the portion between them blue.
The phenomenon ist best distinguished in young woad-leaves; in older leaves
with a higher acid percentage, it is hardly to be observed because the acid renders
the isatase inactive.

In various other plants, too, nekrobiosis causes formation of pigments. ]f
these pigments are brown or black, and if the experiment is performed in the
usual way with the leaves of these plants, then the coloured stripe may become

') Besides from woad I prepared indoxyl by decomposing in a closed bottle a
4 pCt. indican solution with indigo enzyme at 60° C. Moreover Mr. H. ter Me ui en
had the kindness to prepare for me in the Chemical Laboratory of the Polytechnical
School indoxyl solutions in chemical way. The »purified« indoxyl was always obtained
by ether extraction.

-) Berichte der Deutsch. Botan. Gescllsch.. Bd. 16, pag. 52, 119, 1898.

still much more marked than in the woad. Particularly fit for this demonstration
are the leaves of Pyrus communis, Trollius, Aconitum, Asanim, Saltx purpurea, Populus
nigra and several other species, which at necrobiosis turn of a jet black and at
necrosis remain green. Pear-leaves especially are recommendable for the experiment;
the enzyme in them is tyrosinase, the nature of the chromogene is unknown, tyrosine
it is not. Hence, when preparing a herbarium, the chief thing to keep such plants
uncoloured, is to prevent necrobiosis. This frequently happens of itself, as the
acid cellsap is so much concentrated in drying, that enzyme action cannot occur;
so in the drying of woad-leaves, where the highly sensitive isatase remains in-
active. In other cases, to obtain this end, it will be necessary to destroy the
enzyme, either by boiling water, or by poisonus vapours.

Sometimes necrobiosis gives rise to aromatic or stimulant matters, which
are present in the plant itself as glucosides, from which they are set free by
specific enzymes at the dying of the cells. This fact is well-known regarding the
myronates and the myrosine of the Cruciferae, the amygdaline and emulsine of
the Amygdaleae, the spiraeine, gaultherine and gaultherase of Spiraea. But it holds
good, too, for the cumarine of Asperida odorata, which appears not in it as such,
but as a glucoside, which by necrosis continues unchanged and hence can be
removed from the plant by boiling, while there is besides in this plant a specific
enzyme, which by necrobiosis produces from the glucoside cumarine. This enzyme
is not identic with emulsine and differs likewise from gaultherase. In a quite
corresponding way the aromas originate from the fruit of the vanilla and the
roots of Geum urbanwn.

The comparative study of necrosis and necrobiosis in plants shows the way for
the detection of a number of new chromogenes or glucosides and specific enzymes.

Conclusions.

Indoxyl occurs not, as I formerly thought, in a free state in the woad but
as a loose compound, called by me isatan.

Isatan is only constant in feeble acid solutions, and is obtained by extracting
the woad therewith. It is decomposed, under formation of indoxyl, by alkalies
and stronger acids, and in solutions, less acid than 1.5 cc. of normal acid per
100 cc, by an enzyme, isatase, which acts the most vigorously at 50° C, and
occurs in all parts of the woad-plant.

Isatan is not decomposed by the indigo-enzymes nor by microbes in as much
as the latter do not form alkali. Isatase does not act on indican.

Isatase is localized in the chromatophores, isatan in the protoplasm, which
is in accordance with the formerly described localisation of the indigo-enzymes
and of indican.

If woad is extracted without acid, so that the isatase can act, or with dilute
alkalies, e. g. V2 pCt. solution of dinatrium phosphate, indoxyl is produced.

The necrobiotic stripe in partly killed woad-leaves results from the action
of isatase on isatan.

Sur la production de quinone par Ie Streptothrix
chromogena, et la biologie de ce microbe.

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé III,

1900, p. 327 — 340. — Verscheen onder den titel »Ueber Chinonbildung durch Streptothrix

chromogena und Lebensweise dieses Microben* in Centralblatt für Bakteriologie und

Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, VI. Band, 1900, S. 2-12.

La quinone, C^ H* O2, appartient suivant la nomenclature de Schoenbei n
aux »ozonides« ou »porte-ozone (Sauerstofftrager«)«'), et peut dans certaines
conditions oxyder d'autres substances. C'est la-des-sus p. ex. que repose Texpulsion
de l'iode de sa combinaison avec la potassium en solution acide, une propriété
tres rare chez les corps organiques, et qui n'appartient qu'a un petit nombre de
composés analogues, p. ex. Ie peroxyde de benzoyle. La production de quinone par
un microbe a donc déja en elle même un certain intérêt. La formation de ce
corps par un Streptothrix donne a la chose une importance toute particuliere, en
ce que ce genre a probablement une part active a la formation d'humus dans
Ie sol des forêts et Ie terreau des jardins. C'est une conviction que je me suis
faite déja depuis plusieurs années, et l'espèce que je cite ici sous Ie nom de Strep-
tothrix chromogena Gasperini, je l'avais déja longtemps avant qu'elle n'eüt regu ce
nom, désignée dans ma collection sous Ie nom de Streptothrix humifica. Peut-être
la production de quinone par ce microbe jettera-elle donc quelque clarté sur Ie
phénomène encore si obscur de la genese de l'humus. On ignore encore il est
vrai quels sont les corps organiques qui sont oxydés dans Ie sol par la quinone,
mais cela n'est a coup sur qu'une question de temps. La quinone n'est stable
qu'en solulion acide; en présence d'alcali elle se transforme en une matière colo-
rante brune. Comme Streptothrix chromogena produit un alcali dans les milieux de
culture non sucrés généralement en usage dans les laboratoires, c'est a l'oxydation
de la quinone qu'il faut rapporter, au moins en partie, la coloration brune parti-
culiere qui caractérise cette espèce^). Quand la quinone agit comme oxydant sur
d'autres substances, elle se transforme en hydroquinone et perd toute activité. On
est donc conduit a se demander si en présence d'une »substance excitatrice
d'oxygène« elle pourrait étre régénérée? J'ai fait quelques expériences dans ce
sens, qui sont encore il est vrai incomplètes, mais ont montré que la quinone et
Ie saccharate ferrique, qui chacun isolement sont sans action sur la tyrosine, la

') Voir p. ex. E. Bourquelot dans l'Année biologique, T. III, 1897 (1899), p. 434.
-) Aussi dans la peptone sèche du commerce se trouve-t-il une substance qui se
colore en brun sous l'influence de la quinone.

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transforment par leur action combinée, en solution neutre en un corps rouge.
en solution alcaline en un corps noir; ces deux substances modifient donc la
tyrosine d'une maniere analogue, peut-être même identique, a celle découverte par
M. Bertrand chez Ie ferment oxydant nommé tyrosinase. Il ne parait pas ce-
pendant y avoir de régénération de l'hydroquinone a l'état de quinone, car je ne
pus provoquer l'oxydation de la tyrosine au moyen de l'hydroquinone et. de
saccharate ferrique. II est probable que d'autres oxydations peuvent s'opérer de
même sous l'action de la quinone, de maniere que S'reptothrix chromogena doit
être considéré comme un agent oxydant du sol, pouvant fonctionner non seule-
ment par action de contact, mais de plus a grande distance. dans son entourage
comme »excitateur d'oxygène«.

Cette circonstance m'engage a noter ce qui suit, relativement a la biologie
de ce microbe.

7. Présence ei séparation du Streptothrix chromogena.

J'aurai a parier ici de deux espèces de Streptothrix. L'une, que j'appris a
connaitre sous un grand nombre de variétés, sera désignée sous ie nom de 6".
chromogena Gasperini*), parce que je crois que l'auteur aura eu affaire a une des
variétés de cette forme. L'autre espèce sera nommée S. alba\ je n'ai pu réussir,
parmi les descriptions existantes des formes non chromogènes, a en trouver une
qui se rapproche suffisamment de la mienne pour conclure a l'identité spécifique.

Les deux espèces se développent sous forme de petites végétations mycéli-
formes qui, quand il y a sporulation, ressemblent a des espèces de moisissures
inférieures, produisant des conidies. Ces végétations sont composées d'un »mycélium«
tres délicat et ramifié, rappelant cependant par sa structure la structure bactérienne,
attendu que toute dififérenciation en paroi, protoplasme et liquide cellulaire est invi-
sible. Il n'y a donc pas davantage formation de cloisons, et les ramifications sont dis-
tribuées sans ordre apparent sur les branches mycéliennes. Chez quelques variétés
de S. chromogena Ie mycélium se désarticule de fort bonne heure en courts frag-
ments, qui rappellent complètement certaines bactéries. L'épaisseur des mycéliums
est tres variable et peut dans certains cas egaler celle des minces filaments du
Penicilliiim. Les vieilles cultures de Streptothrix présentent quelquefois de petites
dilatations bulbiformes des rameaux mycéliens, qui rappellent les dilatations ana-
logues de r Actinomyces, d'ailleurs une forme de Streptothrix. Il n'est pas rare que
les rameaux mycéliens se terminent en pointes recourbées en forme de grifife,
qui jouant Ie róle de filaments préhenseurs, se soudent aux particules d'humus
du sol. Les spores prennent naissance a l'extrémité des »hyphes aériennes«, sous
forme de chapelets conidiformes, secs, d'un blanc de neige, divisés en articles
sphériques. On peut donc parier d'arthrospores. Aussitót que la sporulation com-
mence chez Ie Streptothrix, les mycéliums répandent une odeur de moisissure, tres
prononcée, rappelant Ie musc; de plus, tout au moins chez Ie Streptothrix chromo-
gena, ils dégagent une »odeur de terre« caractéristique'-). Les spores sont em-

*) Voir Kruse dans Flügge, Mikroorganismen, 2. Aufl., Bd. II, 1896, p. 63.
-) Je ne doute nullement que «Todeur de terre« que Ton percoit si souvent surtout
dans Ie sol des forêts, ne soit provoquée par la présence du 5". chromogena.

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portées par les courants d'air ; elles sont tres résistantes, et douées d'une longue
vie. Même chauffées dans l'eau, y en a-t-il plusieurs qui supportent des tempé-
ratures de 70 ou même 80° C. ; si bien que l'on obtient parfois des cultures de
Sireptothr'ix aux dépens de matcriaux pasteurisés. A 100° C. toutefois les spores
semblent périr sans exception. Le 5. chroinogena donne plus difficilement des spores
que le S. alba, et certaines variétés restent toujours aspores.

Les S. chromogena et alba sont des microbes tres répandus dans la terre, sur-
tout abondants dans les racines végétales et a leur surface. Je les trouvai dans
Ie terreau de jardin jusqu'a i m. de profondeur; plus bas encore le nombre absolu
des ces organismes n'est guère considérable, mais dépasse néanmoins celui des
autres microbes du sol. Cela démontre leur résistance a l'égard des conditions
défavorables pour leur nutrition. Dans le sable des dunes j'en démontrai la pré-
sence jusqu'a 2 m. de profondeur, et le ^". chromogena fut trouvé dans la boue de
la Meuse devant Kralingen jusqu'au dela de 3 m. au-dessous du niveau des eaux.
Dans les eaux de la Meuse elles-mêmes, les deux formes ne sont nullement rares.
On sait que le S. chromogena se rencontre fréquemment dans les laboratoires sur
les plaques a l'extrait de viande gelatine, exposées a I'air. Elles se distinguent
par la production d'un pigment brun, qui diffuse a grande distance.

J'ai dit que le Streptothrix se rencontre tres généralement dans les racines
et a leur surface, oü il habite les couches cellulaires superficielles de ces der-
nières, et s'y conduit comme un saprophyte et non comme un parasite. J'ai étudié
comme suit les racines et les autres organes végétaux souterrains. La surface fut
d'abord soigneusement lavée a l'eau bouillie, et essuyée avec un linge. Cette opération
ayant été répétée un certain nombre de fois, les matériaux furent réduits en
bouillie dans un mortier d'agate de maniere a pouvoir admettre que beaucoup
de cellules avaient été ouvertes et les filaments mycéliens, qui sont agglomérés
en peloton, désagrégés. La bouillie fut alors diluée dans l'eau stérilisée, et étalée
a la surface d'une plaque a l'extrait de viande gelatine. Ordinairement au bout
de 3 a 5 jours, les colonies de Streptothrix, si l'organisme était présent, se mon-
traient par centaines. Il se développe naturellement aussi plus ou moins de co-
lonies bactériennes, mais le nombre en est d'autant plus petit que la surface de
la racine a été plus soigneusement nettoyée. Comme les bactéries se montrent
bien plus rapidement dans les cultures que le Streptothrix, et que surtout les
espèces liquéfiantes arrêtent le développement de cette forme, il importe de les
enlever aussi complètement que possible par lavage. On voit donc a toute évi-
dence que le Streptothrix ne peut provenir, comme les bactéries, tout simplement
des particules du sol adhérentes a la surface des racines; il doit sans Ie moindre
doute provenir des cellules radiculaires elles-mêmes. Je dois toutefois conclure
d'expériences de culture rigoureuses, que seules les cellules mortes des racines
renferment des filaments de Streptothrix, de telle sorte que, comme je l'ai dit, il
ne peut être question ici de parasitisme.

La première plante que j'étudiai de la maniere indiquée était un vieil exem-
plaire cultivé A' Aspidium Filix mas. Ce n'était pas seulement la surface radiculaire
elle même, mais aussi l'entourage immédiat qui était rempli du Streptothrix; seule-
ment a une distance d'un décimètre environ de Ia plante le nombre en diminu-
ait tres notablement. Il est clair que les portions mortes des racines avaient formé

i6

un milieu de culture tres favorable. La deuxième plante était un exemplaire de
Struthiopteris germamca, provenant d'un autre jardin, qui me donna un résultat
presque identique. L' Osmunda cinnamomea se comporta d'une maniere analogue.

Au contraire, chez une série d'autres plantes, il ne me fut pas possible de
cultiver Ie Streptothrix aux dépens des racines nettoyées, ou seulement dans des
cas isolés, oü leur présence doit tenir a des particules de terre adhérentes char-
gées de germes du microce. lei se rangent de nombreuses racines de Papilio-
nacées ainsi que leurs nodosités; puis Ie tabac, dont je me suis tres spécialement
occupé; enfin les Graminées.

Ces résultats négjtifs m'amenèrent a me demander si quelque propriété
spécifique du Streptothrix permettrait d'expliquer ou de rendre probable sa présence
dans les racines d'une espèce déterminée. Je soupgonnai que les matières brunes,
humiques, si caractéristiques pour la surface de beaucoup de racines, et qui sont
évidemment en rapport avec leur teneur en tannin, pourraient bien avoir quelque
relation avec sa distribution, et je me vis ainsi conduit a examiner d'autres
écorces radiculaires colorées en brun au même point de vue.

Le résultat répondit a mon attente. J'examinai p. ex. les racines de Quercus
pedunculata, Coryliis Avellana, Fa^s sylvatica, Ulmus campestris, Abius glutinosa, et
j'obtins aux dépens de toutes un développement énorme de S. chromogena, parfois
aussi de S. alba. Tres soigneusement nettoyées par un lavage prolongé, les racines
fournissaient des plaques qui ne m'offraient souvent que des colonies de Strep-
tothrix seulement. Ce dernier résultat fut obtenu p. ex. avec de racines d'orme.
qui me donnèrent quatre variétés difïérentes du .S'. chromogena: puis encore avec
les racines de chêne et de coudrier.

Je décrirai un peu plus en détail les expériences sur les racines du chêne.
Je m'effor<;ai d'abord de constater de quelle maniere la distribution du Streptothrix
est en relation avec l'age des racines. Je nettoyai a eet effet les ramifications
terminales coralliformes, encore recouvertes de poils radicellaires et de la coiffe;
elles furent ensuite triturées et servirent aux ensemencements. Je rencontrai le
S. chromogena, mais seulement en nombre extrêmement restreint. Je me servis ensuite
de diverses racines recouvertes de mycéliums fongiques, notamment une racine
noire, recouverte d'un mycélium tres adhérent, et une autre racine blanche, cou-
verte de flocons blancs, formant une couche lache tres épaisse, et répandant une
forte odeur de terre. Ces deux racines provenaient de mon jardin, bien qu'elles
y fussent rares, comparées aux racines normales '). L'ensemencement me donna
des colonies isolées de .S'. chroinogena. J'étudiai en troisième lieu les portions plus
agées des racines, encore recouvertes de l'écorce primaire, mais oü commen<;ait
déja l'accroissement secondaire, et oü peut être il y avait donc déja un début
de dépérissement dans les cellules corticales primaires. Le S. chrotnogena s'y ren-
contre en masse. Comme j'ai obtenu des résultats analogues chez les autres
racines d'arbres que j'ai examinées, j'en conclus que le .5. chromogena a une
préférence marquée pour les cellules de l'écorce des racines en voie de périr.
Une plante herbacée, que j'examinai également a cause de sa haute teneur en

*) Ces mycéliums appartiennent au Meridius ou un genre de Basidiomycètes connexe.
Ce sont eux qui ont conduit a admettre le fameux »mycorhiza«.

tannin, savoir Ie Polygonum bistorta, me donna des résultats analogues; toutefois
les colonies que j'en isolai appartiennent uniquement au S. alba.

Finalement j'étudiai encore les radicelles extrêmement tenues des Rhododen-
dron ponticum. Azalea inollis, A. indica et Calluna vulgaris. Toutes me fournirent de
nombreuses colonies de Streptothrix évidemment issues de la terre adhérente, qui
ne se laissait que difficilement enlever des radicelles enchevêtrées. Mais Ie dia-
gnostic fut rendu beaucoup plus difficile par la présence en masse de bactéries
fortement liquéfiantes, surtout Ie B. fiuorescens lique/aciens, et une bacterie pig-
mentaire bleue particuliere {Bacillus caeruleiis n. s.), généralement répandue dans
Ie sol riche en humus.

Je suis obligé d'admettre que Ie Streptothrix n'a de préférence pour les ra-
cines que parce qu'il trouve dans leur voisinage comme a leur surface une
nourriture appropriée. Il n'y a pas lieu d'admettre une autre influence spécifique
de la racine vivante.

2. Cofiditions de nu tri ti on et rok de S. chromogena dans la terre arable.

Malgré que je sois donc d'avis, que l'on ne peut songer ici a une relation
sj'mbiotique dans Ie sens ordinaire, je crois cependant probable que Ie Streptothrix
doit être utile aux plantes d'une maniere quelconque, et que les conditions de
nutrition de eet organisme pourront nous renseigner sur cette utilité. Le Strep-
tothrix appartient aux microbes omnivores, et peut vivre et se multiplier dans
les conditions les plus luxuriantes au point de vue de la nutrition comme dans
la plus grande disette. Il y a p. ex. développement intense dans le bouillon de
viande et le mout de bière, qui appartiennent aux milieux de culture les plus
favorables aux microbes ; mais le Streptothrix est d'autre part capable de donner
des cultures assez abondantes dans un liquide de la composition que voici : eau
distillée renfermant 0,05 ''/o KHi.PO\, 0,05^/0 M^SOx et i"/o de glucose, l'azote
combine n'étant donc pas expressément ajouté. Vers 28° C. il se forme dans ce
liquide comme dans le bouillon, au bout de 3 a 4 jours, des flocons abondants,
ressemblant a des végétations de moisissures, qui ne se résolvent pas en filaments
isolés. On se tromperait cependant fort si l'on croyait que le Streptothrix ne
reclame nullement d'azote combine; il y en a dans l'eau distillée elle-même et
dans l'air du laboratoire en quantité suffisante pour couvrir les exigences modestes
du Streptothrix, et des expériences spéciales m'ont persuadé qu'il n'y a pas fixa-
tion de l'azote atmosphérique libre par eet organisme. Je ne puis cependant
négliger de mentionner que les besoins d'azote sont ici remarquablement faibles,
et pourraient superficiellement faire croire l'inverse. En présence de glucose, toute
combinaison azotée peut être assimilée; c'est ce que je pus démontrer spéciale-
ment pour les sels ammoniacaux, les nitrates et les nitrites, l'asparagine et la
peptone, surtout a forte et tres forte dilution.

La fixation des moindres traces d'azote combine dans les racines et leur
voisinage immédiat peut être utile en ce qu'elle contrarie les déperditions d'azote
par écoulement des eaux; de plus, quand les filaments de Streptothrix meurent
et se désorganisent, eet azote peut être mis de nouveau a profit par les plantes.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. ^

i8

II vient s'ajouter a ce qui précède qu'il peut être important pour les plantes
que dans Ie sol s'accomplissent certains phénomènes vitaux intenses, qui ne peu-
vent être accomplis que par des microbes déterminés, et non par les racines des
plantes, ou par les bactéries terricoles ordinaires. Je songe ici tout particulière-
ment aux phénomènes encore si mystérieux, qui doivent s'accomplir dans la
formation de l'humus, et auxquels les Streptothrix, aussi bien Ie S. chromogena que
Ie S. alba, prennent incontestablement part, si même ils n'y jouent pas un róle
prépondérant. Ces organismes sont particulièrement aptes a intervenir ici, tant
par les conditions qui régissent leur nutrition, que par les propriétés suivantes.
Ils sont anaérobies facultatifs, c'est-a-dire temporaires, et se rapprochent par la
des bactéries, en s'écartant de la plupart des vraies moisissures, dont les rap-
proche cependant leur type de croissance. Ils produisent des enzymes tryptiques
et diastatiques. Ils sont capables de se nourrir aussi bien dualistiquement aux
dépens d'une substance carbonée quelconque et d'une niatière azotée séparée,
qu'aux dépens de matières albuminoïdes, surtout des peptones. Cela les distingue
de nombreux autres microbes terricoles. qui ne se nourrissent que dualistiquement,
et qui sont donc adaptés a des conditions d'existence bien plus étroites. Finale-
ment Ie S. chromcgena, comme il est décrit en détail ci-dessous, produit de la
quinone, c'est-a-dire un corps qui peut agir comme ozonide ou véhicule d'oxy-
gène. Je crois que eet organisme peut déployer dans les organes végétaux morts
une activité toute spéciale, et en seconder énergiquement l'humification, tandis
qu'il est probable que la quinone joue ici un róle important. Le Streptothrix ne
provoque guère de fermentations spéciales des matières sucrées, et cela peut avoir
son importance, attendu qu'il ne sera pas ainsi la cause de pertes sensibles en
combinaisons carbonées. Le glucose et d'autres espèces de sucres produisent
seulement des traces d'acide, probablement de l'acide lactique.

Une propriété particuliere du Streptothrix, c'est encore son pouvoir énergique
de réduction des nitrates a l'état de nitrites. Bien que cette propriété soit un
apanage de nombre de bactéries terricoles, il n'y en a probablement pas une qui
soit plus active sous ce rapport. Il ne serait pas impossible que l'action des
nitrites sur les sels ammoniacaux en présence d'anhydride carbonique, d'acide
humique ou d'autres acides organiques provoque le dégagement d'azote libre;
toutefois il ne pourrait s'agir ici que de pertes minimes d'azote, et ceci unique-
ment dans le sol des jardins ou des champs cultivés. En efïet, dans le mi-
lieu proprement dit du Streptothrix, le sol des forêts, on sait que les nitrates et
les nitrites font presque complètement défaut. D'ailleurs, d'une maniere générale,
je considère ce phénomène comme tout a fait insignifiant au point de vue quan-
titatif; et je suis persuadé que les pertes éventuelles d'azote qui s'observent dans
le sol et dans le fumier, sont dues au dégagement d'azote et d'ammoniaque par
oxydation complete des substances organiques. sous l'influence surtout des bac-
téries vulgaires.

Résumant mon opinion sur les rapports des Streptothrix avec les racines
végétales, je dirai que ces microbes peuvent devenir utiles aux plantes par leur
biologie particuliere, leurs conditions de nutrition et la part qu'ils prennent a la
production de Thumus.

19

3. Sur la maniere de déceler la quinom dans les cultures de S. chromogena.

Je fus rendu attentif a la production de quinone chez Ie .S'. chromogena par
la découverte de trois réactions dans les cultures sur gelatine, réactions characté-
ristiques de la benzoquinone.

Tout d'abord, j'avais remarqué que les sels ferriques communiquent une
teinte noiratre a la gelatine brunie par Ie S. chromogena ou a une culture en
solution de peptone. Je constatai ensuite que la gelatine de vieilles cultures est
devenue insoluble dans l'eau bouillante, tout a fait comme quand on a fait agir
sur la gelatine de la quinone libre ou un sel de chrome a la lumière. Cette
réaction est tres caractéristique de la quinone et, comme on s'en assure aisément,
toute différente de l'action du tannin, a laquelle on songe involontairement dans
les phénomènes de ce genre. C'est sur la production d'une combinaison inso-
luble de la gelatine et de la quinone que repose une autre propriété du S. chromo-
gena. Cet organisme secrète de la trypsine, mais ne donne lieu que tres peu de
temps a une liquéfaction de la gelatine, et seulement a l'endroit oü il est en contact
direct avec elle, oü il a donc pu agir énergiquement avant que la gelatine ne fut
durcie par la quinone.

Je n'aurais toutefois jamais considéré cette réaction suffisante pour l'identi-
fication de la quinone, si je n'avais en outre observé la propriété tres importante
des cultures de S. chromogena de mettre, en présence d'acide chlorhydrique, de l'iode
en liberté aux dépens d'iodure de potassium, décomposition que l'on peut déceler
sans peine au moyen d'empois d'amidon. Cette réaction, dans les cultures bien
réussies, est si intense que je croyais d'abord qu'elle ne pouvait provenir que de
la présence d'acide nitreux. Mais on montre aisément qu'il n'en est pas ainsi,
car toutes les autres réactions caractéristiques de l'acide nitreux, telles p. ex. que
la réaction avec la diphénylamine, font défaut dans les cultures de S. chromogena
sans nitrate de potassium, qui cependant donnent tres énergiquement la réaction
avec l'empois ioduré.

Comme la formation de quinone n'a lieu qu'en présence d'un exces d'oxy-
gène, elle est surtout abondante dans les cultures sur gelatine, moins forte dans
les Solutions nutritives, dans lesquelles la plupart des mycéliums de Streptothrix
descendent au fond.

Pour déceler la quinone dans les cultures sur substratum solide, on peut
se servir des milieux les plus divers. On obtient par exemple un bon résultat
de la maniere suivante :

On dissout de la gelatine du commerce dans de l'eau ordinaire de la canali-
sation; la solution renfermant loo/o de gelatine, est légèrement acidulée au moyen
de quelques gouttes d'acide lactique et additionnée d'un peu d'amidon. On l'étale
en une couche mince dans une cuvette; après solidification on inocule a la surface
soit par stries soit en colonies Ie S. chromogena. Maintenue vers 23° C. la culture
commence a se développer au bout d'une couple de jours; en même temps se
montre Ie brunissement de la gelatine par suite de l'oxydation lente d'une portion
de la quinone formée. Cette oxydation toutefois est ralentie par la présence d'acide,
et la quinone s'accumule. Si donc on verse sur la gelatine de l'iodure de potassium,
dissous dans l'acide chlorhydrique, on verra apparaitre une coloration bleue
intense partout oü la quinone s'est propagée par diffusion.

2*

La réaction réussit d'ailleurs aussi tres bien sur la gelatine ordinaire au
bouillon de viande, a condition que ce milieu ne soit pas alcalin. Elle est tout
aussi belle, sinon plus belle encore, sur l'agar pur, sans autre addition qu'une
tracé d'acide ou de KH% POi et d'un peu d'amidon ; c'est-a-dire sur un milieu
que l'on peut comparer a une feuille en train de se décomposer, ou d'autres
matériaux analogues se rencontrant dans Ie sol.

Des plaques fraiches d'urine gélatinée sont aussi propres a la culture.

Cependant, on doit toujours songer que la quinone est instable a l'air en
solution alcaline, et que l'on devra donc, pour compter par exemple Ie nombre
des colonies de Streptothrix issues d'ensemencements de terre ou d'humus, opérer
sur une gelatine amiddnnée de réaction faiblement acide. Traitées par l'iodure
de potassium et l'acide chlorhydrique, des plaques de cette nature donnent une
idéé réellement surprenante de la richesse du sol en S. chro7nogena et, comme on
peut en déduire, en quinone libre.

Au cas oü l'on désire démontrer la production de quinone dans les cultures
liquides, il est a recommander que l'on fasse usage, soit d'un bouillon de viande
faiblement acidulé, soit d'une solution de peptone dans l'eau de canalisation ; on
ajoutera dans l'un comme dans l'autre cas un peu d'amidon, et Ton cultivera
vers 28 OU 30" C, qui se sont montré être les températures optimales. La démon-
stration de la présence de quinone et son dosage quantitativ peuvent se faire
comme d'habitude au moyen d'iodure de potassium et d'amidon.

L'on peut de la maniere suivante déceler directement la quinone sous forme
de quinhydrone.

Je me préparai des cultures abondantes de S. chroviogena dans des solutions
renfermant, sur 100 parties d'eau de canalisation, 0,05 KH^POi, 0,05 {NHi)iSOA.
3°/o de glucose. Ces cultures furent ensuite versées a la surface de plaques de
gelatine, dans de grandes boites de verre. La composition de la gelatine était
la suivante: 100 d'eau de canalisation, 10 de gelatine, 0,5 KH2 FOi et 0,1 d'amidon
soluble. Ce procédé a l'avantage que la surface entière de la gelatine est complète-
ment recouverte d'une végétation bien développée de S. chro?nogena, qui commence
aussitót a former de la quinone. Au bout d'un ou deux jours la plaque est com-
plètement imbibée de quinone. Il est vrai que Ie S. chromogena produit un peu
d'alcali, qui provoque l'oxydation de la quinone, mais la durée de la culture n'est
pas nécessairement assez longue pour entrainer la déperdition de beaucoup de
matière. On fait alors fondre les plaques, extrait la quinone en secouant avec
du benzol, et mélange la solution avec une solution benzolique d'hydroquinone*
L'évaporation lente me donna quelques aiguilles cristallines isolées de quinhydrone,
tres reconnaissables a leur dichroïsme et quelques autres propriétés caractéristiques.
Toutefois l'extraction de la gelatine liquéfiée par Ie benzol n"est pas facile parce
qu'il se forme une émulsion tres difficile a séparer. Je n'ai pu obtenir de quin-
hydrone aux dépens des liquides nutritifs.

4. Comment la quinone se forme-t-elle r

Il y a trois manières essentiellement différentes dont la cellule vivante produii
des substances chemiques: 1° comme produits de dédoublement du protoplasme lui-

même; ces substances peuvent être nommées autobolitesi) ; 2° comme produits de
décomposition d'un corps étranger, sur lequel Ie protoplasme agit catalytiquement;
ce sont les catabolites ; et 3° comme produits d'une action enzymatique; ces pro-
duits peuvent dans certaines conditions prendre naissance a plus ou moins grande
distance du protoplasme actif ; ce sont les télébolites. Les catabolites a leur tour
se divisent en deux groupes, suivant qu'ils prennent naissance par simple dédouble-
ment des corps étrangers: ce sont les schizobolites; ou par dédoublement avec
absorption simultanée d'autres corps: ce sont les hétérobolites. On sait que les
produits des actions enzymatiques, les télébolites, peuvent également se former
soit comme schizobolites soit comme hétérobolites: dans ce dernier cas avec absorp-
tion d'eau ou d'oxygène'"').

Les actions des levüres sont tres propres a rendre cette subdivision plus
évidente. La sécrétion d'invertine se fait sans doute aux dépens du protoplasme
et eet enzyme est donc un autobolite. Le dédoublement du saccharose par l'invertine
donne les télébolites glucose et lévulose. La production d'alcool aux dépens de
ces sucres se fait par une action catalytique du protoplasme vivant; l'alcool est
donc un catabolite^).

Dans lequel de ces trois groupes faut-il ranger la quinone? Comme on ne
saurait songer a la production enzymatique de cette substance, il s'agit de décider
si elle se forme comme autobilite ou comme catabolite.

Je crois, d'après les conditions de nutrition du S. chromogena, que la quinone
<ioit être considérée comme un produit cataboliste de set organisme, et prend
naissance par l'action du protoplasme du S. chromogena sur la peptone ou un corps
analogue.

En effet, la richesse en quinone des cultures n'est nullement en rapport avec
leur richesse en Streptothrix^ mais bien avec la teneur en albumine ou en peptone
du liquide de culture.

C'est ainsi qu'une des meilleures solutions nutritives pour le S. chromogena,
que je connaisse jusqu'a présent, a la composition suivante: 100 parties d'eau
de la canalisation, 3 de glucose, 0,1 d'amidon, 0,05 de phosphate monopotassique
€t 0,05 de sulfate ammonique. Vers 27° C. il s'y forme au bout de peu de jours
une végétation extrêmement développée de S. chromogena, en partie submergée,
en partie flottante. Néanmoins la production de quinone y est si peu abondante
que la réaction a l'iodure d'amidon y est extrêmement faible, tandis qu'après
l'addition de chlorure ferrique ou d'alcalis, la culture, antérieurement incolore,

') De |3oXi^, flèche, ce qui est lancé.

■^) Bien qu'a mon avis le mot »fermentation« ne doive s'appliquer qu'aux phéno-
mènes catabolistes dans lesquels il y a dégagement de gaz, il me paralt que de nom-
breux auteurs, qui prennent Texpression de fermentation dans un sens bien plus large,
et parlent p. ex. de fermentation pigmentaire, mucique, etc, sont tentés, sans se douter
de la différence entre auto- et catabolisme, de considérer tous les phénomènes cata-
bolistes comme fermentations. Mais si l'on identifie ces deux classes de phénomènes,
on commet une erreur d'histoire scientifique.

^) Je lis avec surprise que M. E. Buchner, qui a constaté le fait interessant que
l'on peut exprimer le protoplasme vivant de la cellule de levüre, sans qu'il perde di-
rectement son pouvoir de provoquer la fermentation alcoolique, défend encore 1'opinion
inadmissible, qu'il s'agit ici d'une action enzymatique.

demeure incolore. Si la réaction avec l'iodure d'amidon ne fait dans ce cas pas
complètement défaut, cela s'explique a mon avis par ce que la mort inévitable
de fragments mycéliens du S. chromogéna fournit a l'action tryptique d'ailleurs assez
faible de eet organisme des matériaux capables de donner des peptones, aux dépens
desquelles se forme a son tour de la quinone. Cependant la quantité dont il s'agit
ici est extrêmement faible, vu la grande sensibilité de la réaction iodée.

Si dans la solution susnommée on remplace Ie sulfate d'ammoniaque par de
l'asparagine ou du nitrate de potassium, Ie résultat reste identique. Mais il est
clair que si l'on fait usage de ce dernier corps on ne peut employer l'amidon
ioduré pour déceler la quinone, attendu que Ie salpêtre donne du uitrite de potassium,
et ceci avec une rapidité et une intensitê surprenantes '). On doit donc avoir
recours ici aux décolorations par l'alcali ou les solutions ferriques; or celles-ci
font complètement défaut dans ces conditions, de sorte que ni Ie glucose avec
l'asparagine, ni Ie glucose avec un nitrate ou un uitrite ne sont des sources de
quinone.

Il en est tout autrement quand il y a, dans les solutions, de la peptone ou
un autre corps albuminoide quelconque. C'est alors, et alors seulement qu'il y a
production abondante de quinone. Je crois donc avoir démontré mon hypothese
que seulement la peptone ou un albuminoide donnent par catabolisme de la quinone.

3 décembre 1899.

') J'ai déja observé antérieuremént que je ne connais pas d'autre microbe que l'on
puisse comparer au S. chromogéna pour l'intensité de Ia formation de nitrites aux
dépens de nitrates.

Ueber die Wirkung des Benzylsenföls auf das
Wachstum des Kahmpilzes.

Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, VI. Band, 1900,

S.72.

Gelegentlich einer Besprechung der Glukoside und Enzyme der Spiraen in
diesem Centralbl. 2. Abt. Bd. V. 1899. p. 429 habe ich über einige Erfahrungen
berichtet in Bezug auf die auBerordentlich kraftige Wirkung des flüchtigen Oels
der Kapuzinerkresse (Tropaeolum majus) auf das Wachstum des Kahmpilzes
(Saccharomyces mycoderma). Ich habe gesagt, daB ich Gadamer's Ansicht,
nach welcher dieses Oei Benzylsenföl ist, nicht beipflichten konnte, daB dasselbe
sich beim Destillieren teilweise zersetzte unter Schwefelabspaltung, und vielleicht
ein Oxybenzylsenföl darstellen könnte.

Nach erneuten Untersuchungen, welche Herr H. ter Meulen auf meine
Veranlassung begonnen, hat Gadamer jedoch vollstandig recht, und sind meine
Bemerkungen unbegründet.

Sowohl Kapuziner- wie Gartenkresse (Lepidium sativum) enthalten ein und
dasselbe Glukosid, welches, wie Gadamer richtig angiebt, mit Myrosin gewöhnliches
Benzylsenföl abspaltet. Dieses natürliche Benzylsenföl ist identisch mit dem syn-
thetisch dargestellten und kann bei der nötigen Vorsicht unzersetzt destilliert werden.
Herr ter Meulen hat durch quantitative Schwefelbestimmungen festgestellt, daB
auch die Wirkung des natürlichen Oels auf das Wachstum von M^'coderma
identisch ist mit demjenigen des synthetischen. Ein Milligramm von beiden Pra-
paraten ist zureichend, um das Wachstum des Kahmpilzes in 100 ccm Bier voll-
standig aufzuheben.

22, Dezember 1899.

Sur la formation de Thydrogène sulfuré dans les
canaux, et Ie genre nouveau Aërobacter').

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IV,

1901, p. I — 18. — Verscheen onder den titel »Schwefelwasserstofïbildung in den Stadt-

graben und Aufstellung der Gattung Aërobacter» in Centralblatt für Bakteriologie und

Parasitenkunde, II. Abteilung, VI. Band, 1900, S. 193 — 206.

11 y a quelques années^), j'ai rendu compte de la découverte d'un SpiriUuni anaérobie
obligatoire, non sporulant, dans lequel j'ai reconnu l'agent de la réduction des sul-
fates dans les canaux de nos villes, et que j'ai nommé pour cette raison Spirillum dcsitl-
furicavs. J'ai a cette même occasion émis quelques considérations sur Ie cycle du
soufre dans la nature, et montré que l'hydrogène sulfuré d'origine biologique peut
encore prendre naissance par trois autres processus, savoir, par la décomposition de
matières albuminoïdes. directement aux dépens du soufre libre, et enfin aux dépens
des sulfites et des thiosulfates. Le soufre, ainsi que ses combinaisons oxygénées les
plus simples, passent, au contact de certains microbes, avec une grande facilité, a
l'état d'hydrogène sulfuré. Il sufïit d'introduire ce corps dans une solution sucrée en
fermentation alcoolique pour s'en convaincre. Mais comme je l'ai dit, la réduction
sulfatique tout au contraire est un phénomène absolument particulier, qui n'est dü
qu'a un seul agent déterminé et ne peut être provoqué par les bactéries ordinaires 3).
Il va de soi que toute espèce de bactéries, admettant que leur protoplasme ren-
ferme du soufre, pourraient a mon avis décomposer des sulfates afin de se procurer
eet element; il en résulterait qu'après leur mort, le soufre pourrait être mis en liberté
comme hydrogène sulfuré par d'autres microbes aux dépens des albuminoïdes dont
leur protoplasma est constitué. Cependant les recherches faites dans ce but, en partie
avec les bactéries acétifiantes, en partie avec les Bacterium coli comimiue et B. lactis

') J'emploie ici la désignation hydrogène sulfuré pour la production, non seulement
de ce corps sensu stricto, mais encore des autres sulfures biogèncs, qui peuvent trans-
former l'acétate de plomb en sulfuré.

-) Centralbl. f. Bakt., 2e Abt., Bd. I, 1895, p. i. — Académie des Sciences d' Amsterdam,
1895. - Arch. Néerl., T. XXIX, 1896, p. 233.

^) La question de la réduction des sulfates, malgré mes recherches, est encore tres
mal comprise, comme je m'en apergois une fois de plus dans un article de la »lVochenschr.
f. Brauerei«, Jahrg. XVI, 1899, p. 688, oü M. Windisch pretend que la levüre de bière
produit de l'hydrogène sulfuré aux dépens du gypse. Cette opinion est complètement
erronée. La levüre ne reduit les sulfates en aucune maniere; elle ne peut même pas
réduire les nitrates a l'état de nitrites. Mais elle produit avec la plus grande facilité
de l'hydrogène sulfuré aux dépens des corps albuminoïdes, des sulfites, des thiosulfates
et du soufre.

25

aërogenes, ont montré que dans les liquides nutritifs d'oü Ie soufre était exclu aussi
complètement que possible, ces microbes se développaient tout aussi vigoureusement
que si on leur offrait en même temps des combinaisons sulfurées. 11 semble donc tout
au moins que Ie protoplasme de ces bactéries est privé de soufre. Je ne crois pas
cependant cette question complètement tranchée.

Dans mon travail sur la réduction des sulfates, j'ai dit croire possible que Ie
sulfate pourrait fournir, outre de l'acide sulfhydrique, un peu de sulfite ou d'hyposul-
fite. Maintenant que je connais mieux les phénomènes, je crois devoir conclure qu'il
ii'en est pas ainsi: tout Ie sulfate se transfornie a la réduction en hydrogène sulfuré
OU en combinaisons dont l'acide chlorhydrique déplace autant d'acide sulfhydrique
qu'il correspond au sulfate disparu. Le deficit d'hydrogène sulfuré que j'avais con-
staté jadis par la methode iodométrique, doit donc être attribué sans doute a du soufre
combine dans des matières organiques ou éliminé a l'état pur, fait que j'avais alors
admis comme probable, mais que je crois a présent démontré.

La signification biologique de la réduction des sulfates, c'est-a-dire la question de
l'utilité de ce phénomène pour les microbes actifs, surtout en présence du développe-
ment colossal qu'elle prend par exemple dans les estuaires des Pays-Bas, me porte a
croire a quelque grand avantage résultant de la réduction pour son agent. Peut-être
s'agit-il ici de créer un milieu ayant une afïinité extraordinaire pour l'oxygène ; ce
milieu déprimerait la tension de ce gaz, que l'action tres variable des courants et des
vagues amènent sans cesse dans les couches profondes, et pourrait en régulariser
Tafflux a tel point que la microaérophilie du ferment sulfatique »anaérobie« serait
satisfaite sans interruption. Je suis en effet persuadé qu'ici aussi il y a microaéro-
philie et que l'oxygène combine dans le sulfate ferreux ne suffit pas a couvrir les
liesoins d'oygène libre i). Peut-être aurai-je plus tard l'occasion de revenir sur le
phénomène biologiquement et géologiquement tres important de la formation d'hydro-
gène sulfuré dans les estuaires.

I. Prodtiction d'hydrogène sulfuré dans les canaux des villes.

Malgré que la réduction des sulfates, qui se fait aussi bien dans l'eau douce que
■dans Teau salée, produise de beaucoup la plus grande partie de l'hydrogène sulfuré
iormé dans la nature, il n'en est pas moins indubitable que dans notre entourage ce
corps ne se forme pas seulement aux dépens des sulfates, mais aussi des albuminoïdes
•et du soufre libre. Les albuminoïdes sont introduits dans nos canaux en partie par
les eaux ménagères, en partie aussi par la mort des organismes vivants. Ce sont
surtout les sulfures formés a la surface des eaux, oü ils s'évaporent, qu'il faut con-
sidérer comme provenant des albuminoïdes et du soufre libre; tandis que la réduction
des sulfates demeurera plus étroitement localisée dans le limon des couches profondes,
parce que c'est la seulement que l'anaérobiose durable est assurée, et avec elle
Texistence du Spirillum desidfuricans. L'acide sulfhydrique formé de l'une ou de
l'autre de ces deux manières dans les couches profondes rencontrera en remontant de

*) Voir pour les détails sur la microaéropliilie et la putréfaction des albuminoïdes
Tnon travail sur »Les anaérobies et roxygènc lil)re«, dans les Arch. Nccrl., Sér. 2. T. II,
1899.

26

l'oxygène dissous, et provoquera ainsi Ie dépót de soufre, auquel doivent contribuer
aussi les sels ferriques, ainsi que je l'ai exposé antérieurement. Or ce soufre se
retransforme tres facilement en hydrogène sulfuré, ce qui, comme nous Ie verrons,
est dü aux mêmes bactéries, qui prennent une part tres active a la formation de
sulfures aux dépens des albuminoïdes.

Quand la quantité des corps organiques dans la vase est tres considérable,
comme p. ex. dans les caneux de Delft, oü les tanneries et distilleries écoulent depuis
longtemps leurs eaux de déchet. les conditions d'existence des anaérobies ordinaires
de la putréfaction des albuminoïdes ^) sont réalisées, tandis que Ie Spirillum desul-
furicans est moins abondant, a cause de l'accumulation des matières organiques. Parmi
les espèces qui entrent en ligne de compte dans la putréfaction des albuminoïdes,
j'ai parlé des trois principales (Proteobacter septicum, P. skatol, P. pseudopulcher),
a une autre occasion. Il a été démontré depuis que ces microbes produisent non
seulement de l'hydrogène sulfuré, mais encore les -affreux sulfures du groupe du
mercaptan.

Cependant il est établi que dans l'eau des canaux il y a en dissolution trop
d'oxygène pour permettre la vraie putréfaction des albuminoïdes; et il est tout aussi
certain que cependant cette eau, et plus spécialement même les couches superficielles
de cette eau, perdent leurs albuminoïds sous Tinfluence de ces microbes, avec pro-
duction d'acide sulfhydrique. Les formes dont il s'agit ici doivent donc être orga-
nismes aerobics ou anaérobies facultatifs (plus exactement temporaires), et opérer
la décomposition ci-dessus quand l'accès de l'oxygène est limité.

Il n'est donc pas sans importance de résoudre la question, a quelles espèces ces
microbes appartiennent en majorité; et de rendre visible, même en présence d'air, la
production d'hydrogène sulfuré dont ils sont les agents, de telle maniere que la déter-
mination du nombre des organismes producteurs de sulfures soit possible dans un
cchantillon d'eau donné.

2. La réaction au hlanc de plontb.

J'ai trouvé la solution de cette question dans un dispositif que je nommerai la
•}>réaction au hlanc de plombe. J'ai reconnu que Ie blanc (carbonate) de plomb, quand
on Tajoute aux substratums un peu alcalins ordinairement en usage pour les cultures
bactériologiques, ne contrarie que tres peu la croissance. Les formes dégageant de
l'acide sulfhydrique surtout sont a peine sensibles au sel de plomb, peut-être juste-
ment parce que les traces qui passent en solution sont immédiatement transformées
en sulfuré insoluble et inactif. Il est vrai que certaines bactéries de l'eau a développe-
ment lent, qui ne croissent que tres mal même sur les plaques ordinaires a l'extrait de
viande gelatine, et qui n'ont guère qu'une importance toute relative dans l'examen
ordinaire des eaux, subissent l'influence nuisible du plomb; mais ceci n'enlève naturel-
lement rien de sa valeur a l'expérience. Celle-ci peut-être faite de la maniere
suivante.

On ajoute a de l'extrait de viande gelatine ou gélifié (par l'agar) une quantité
suffisante de blanc de plomb pour que l'on puisse en couler des plaques d'un blanc
de neige égal. Si on verse a la surface de ces plaques de l'eau de canal diluée d'eau
stérilisée, et qu'on cultive a 23° C, on voit au bout d'un ou deux jours se développer

27

tous les gennes producteurs de sulfures sous fornie de colonies brunes, les autres
sous forme de colonies incolores. Comme Ie sulfure de plomb déposé dans les colonies
brunes est stable au contact de l'air, eet état persiste et se dessine de plus en plus
nettement. Des stries sur plaques au blanc de plomb neuves empruntées a des colonies
de microbes sulfurogènes se comporteront de même et se développeront en cultures
brun foncé. Dans les cultures un peu plus agées, oü les colonies sont déja assez
grandes pour continuer a exercer leurs fonctions, en vertu de leur anaérobiose tem-
poraire, même a l'abri de l'air, la formation de sulfure de plomb peut être rendue
encore plus intense en recouvrant les colonies d'une plaque de verre intimement
appliquée sur la gelatine. On empêche ainsi l'évaporation ou l'oxydation d'une partie
de l'hydrogène sulfure, qui se fait toujours sentir chez les colonies non recouvertes.
Bien que ce procédé fasse se fusionner aisément un certain nombre des colonies, il
est cependant a recommander d'examiner de cette maniere une partie de la plaque
de culture. C'est seulement quand les colonies sont capables de sécréter des acides
que la croissance s'arrête, parce qu'il prend naissance des sels de plomb solubles et
vénéneux. Cette sécrétion d'acides s'observe p. ex. quand les plaques renferment du
sucre. L'acide carbonique toutefois n'a pas d'influence nuisible sur Ie phénomène.

L'ensemencement direct, p. ex. d'eau de canal diluée sur une plaque au blanc de
plomb, fournit un résultat aussi simple que facile a embrasser. On reconnait im-
médiatement qu'un grand nombre d'espèces bactériennes produisent des sulfures. Il y
a surtout un groupe d'espèces qui par sa généralité mérite spécialement l'attention,
c'est Ie groupe des bactéries de fermentation anaérobies temporaires (facultatives)
proprement dites, parmi lesquelles Ie B. coli commune, tant par son abondance que par
l'intensité de la production de sulfure, occupe Ie tout premier rang. Vient ensuite
dans l'échelle Ie B. lactis aërogenes, un peu plus rare, mais toujours encore bien
commun, qui se rattache par une série de formes intermédiaires, également ferments
énergiques et producteurs actifs de sulfures, au B. colt commune.

Bien que ces bactéries se rencontrent aussi tres généralement dans Ie sol des
jardins et la terre arable, et resistent a la dessiccation, je crois cependant qu'elles
sont capables de se multiplier suffisamment dans la vase et l'eau des canaux des
villes pour pouvoir être considérées comme appartenant a la »flore aquatique«.

Si l'on examine des quantités suffisantes d'eau de canal au moyen de l'expérience
au blanc de plomb, on s'aperqoit qu'un grand nombre d'autres espèces encore sont de
réels producteurs de sulfures ; beaucoup d'entre elles forment même individuellement
encore plus de sulfure de plomb que Ie B. coli commune lui-même. Cependant il
résulte de leur dispersion relativement faible, qu'ils n'ont qu'une importance secon-
daire au point de vue de la production totale d'hydrogène sulfure. Beaucoup de ces
organismes proviennent de la terre, et ont été emportés par la pluie dans les cours
d'eau; ils appartiennent donc en réalité a la flore terrestre.

Je me rends, comme je l'ai dit, parfaitement compte du fait que bien des formes
microbiennes ne se développent pas sur les plaqes au blanc de plomb; je n'ai pu p. ex.
jamais y rencontrer les spirilles, qui ne croissent que tres mal même sur les plaques
ordinaires a l'extrait de viande, sans plomb. Cependant on ne peut douter que les
bactéries de fermentation proprement dites, anaérobies temporaires, prennent une
part prépondérante a ce processus. Comme il ne s'agit ici que d'un groupe de formes
nettement délimité qui se distingue également par une série d'autres caractères. il

28

semble tout indiqué de les réunir en un genre commun Aërobacter. Je crois établir
par Ia un genre réellement naturel, dont les représentants possèdent une parenté
généalogique tres proche. C'est donc tout autre chose que la désignation de Photo-
bacter, que j'avais antérieurement choisie comme un nom de »genre physiologique«,
et oü se trouvaient réunis au moins trois groupes de formes non alliées. C'est tout
autre chose aussi que les »genres« Bacillus, Bacterium, Sarcine, etc, qui peuvent ren-
fermer les formes les plus distinctes.

Avant de passer a la considération de ce genre nouveau, un mot encore sur les
formes qui ne produisent pas de sulfure dans l'expérience au blanc de plomb. Parmi
ces formes Ie Bacillus fluorescens liquefaciens attire tout d'abord l'attention, tant
par sa présence générale dans l'eau des canaux que par Ie développement abondant des
colonies. Aussi la plupart des variétés du B. fluorescens non liquefaciens, de même
que l'espèce précedente tres généralement répandues dans l'eau de canal, ne pro-
duisent-elles pas de sulfure ou tres peu. Cependant je ne crois guère que ces bactéries
appartiennent a la flore aquatique ordinaire, car elles ont un tel besoin d'oxygène
qu'elles ne trouvent dans l'eau que relativement peu l'occasion de se multiplier. La
majorité de ces bactéries sera probablement emportée par les pluies dans les cours
d'eau, ce qui n'est pas a coup sur Ie cas de V Aërobacter. Une troisième espèce qui
ne produit pas de sulfure, mais que je n'ai pas encore déterminée, et que je rencontre
sur les »plaques au blanc de plomb« sous forme de colonies blanches molles, non
liquéfiantes, de batonnets courts, est interessante en ce qu'elle est peut être la bacterie
la plus générale de la flore aquatique.

Mais revenons au genre Aërobacter, qui importe seul pour Ie reste de notre objet.

3. Crcation du genre Aërobacter.

Les Bacterium coli commune et B. lactis aërogenes ont été isolés en 1886 par
Escherich de l'intestin des enfants a la mamelle ; l'auteur en fit des espèces
particulières *). Depuis lors un grand nombre d'ouvrages ont paru sur ces bactéries,
surtout sur la première; et il est établi actuellement que les deux espèces se ren-
contrent sous de nombreuses variétés, en partie intermédiaires entre les deux types. J'ai
encore apprisaconnaitre par observation directe quelques formes, qui différent sufïisam-
ment des deux espèces ci-dessus pour faire admettre une distinction spécifique. D'autre
part j'ai découvert de nouvelles séries de variétés qui relient entre elles d'une maniere
presque continue les espèces que je distingue, et aussi avec les deux espèces ci-dessus.
J'ai donc acquis la conviction absolue des rapports de parenté dans ce groupe, que je
considère comme tres naturel, et qui se distingue si nettement des autres formes bac-
tériennes que je crois indispensable de réunir les espèces et variétés en un genre
commun et naturel, Ie genre Aërobacter.

Aërobacter. Des bactéries de fermentation anaérobies temporaires, adaptées aux
Solutions sucrées, et faisant fermenter Ie glucose, Ie lévulose, et communément aussi
Ie saccharose, Ie maltose, Ie lactose, Ie galactose et la mannite en produisant de l'acide
lactique ordinaire lévogyre et presque toujours aussi des gaz. Au point de vue des quan-
tités de gaz formées aux dépens des diverses espèces de sucres, les différentes espèces

') T. Escherich, Die Darmbaktcrien des Siiuslings, Stuttgart, 1886, pp. 57 et 63.

29

se comportent différemment. Le gaz est uu melange danhydride carbonique et
d'hydrogène, auquel vient s'ajouter une faible quantité d'hydrogène sulfuré, quand
outre du sucre la nourriture renferme encore de l'albumine, du soufre ou des com-
binaisons peu oxygénées du soufre. Un trait caractéristique, c'est l'éclat nacré des
cultures sur gelatine a l'extrait de viande ou au mout, éclat provenant de la présence
de soufre libre. Les sulfates ne sont nullement réduits ; mais toutes les espèces ré-
duisent aisément les nitrates a l'état de nitrites, jamais a l'état d'ammoniaque. Les
nitrates arrêtent complètement la fermentation même en faible quantité, sans cepen-
dant nuire au développement ^). Le bouillon de viande et la gelatine au bouillon de-
viennent immédiatement alcalins, mais en présence de sucre seulement quand l'acide
lactique formé est n^utralisé par l'alcali. Les extraits végétaux oii s'établit la fermen-
tation de V Aërobacter changent également leur réaction acide en alcaline. Toutes
les espèces peuvent être rapidement desséchées sans être tuées. Il ne fut pas observé
de sporulation; tout au moins la pasteurisation a 65° C. tue-t-elle toutes les espèces.
Souvent on observe de la motilité, qui toutefois peut faire défaut. Chez VA. aërogenes
les cils sont distribués sur la sur face entière (péritriche), chez VA. liquefaciens il n'y
a qu'un seul cil polaire (monotriche). Certaines espèces produisent beaucoup de
trypsine; de la diastase n'est jamais sécrétée. L'invertine et la glucase semblent faire
complètement défaut, de maniere que le sucre de canne et le maltose sont directement
fermentés (par voie cataboliste) 2). Il s'accumule dans le corps bacteriën du glyco-
gène, quand il y a du sucre assimilable en présence; les bactéries se colorent donc en
brun-violet foncé par l'iode. Les colonies récentes sur le mout gelatine de VA. coli
var. infiisionutn se colorent f réquemment en bleu foncé par la teneur en granulose ;
mais cette réaction se modifie dans les transports successifs et passé a la
réaction brune ordinaire du glycogène. Par ses rapports avec l'oxygène et la réaction
du glycogène, V Aërobacter rappelle vivement les vraies levüres alcooliques. Les meil-
leures sources d'azote sont la peptone et l'asparagine. Sur l'asparagine seule, sans
source de carbone, il y a développement limité. La fermentation microbienne de
l'indigo est due surtout a V Aërobacter, malgré que dans des fermentations pareilles
il y ait encore beaucoup d'autres espèces bactériennes en jeu mais qui n'ont qu'une
moindre importance. Cette fermentation repose sur la décomposition de l'indican (le
glucoside de l'indigo Cu Hn NOs + ;^ H2O), avec formation d'indoxyle (Cs H7 NO)
et de glucose; en présence de l'air, l'indoxyle se transforme en bleu d'indigo (Cie
Hio N2 O2), avec une grande intensité surtout en solution alcaline. Le glucose de
l'indican, indépendamment de la présence de l'air, fermente avec production d'hydro-
gène et d'anhydride carbonique. Pour mettre cette fermentation en train, il est
pratique de faire une décoction du Polygonum tinctorium ou de VIndigofera lepto-
siachya, plantes qui croissent assez bien dans nos jardins et renferment beaucoup
d'indican ; on infecte avec du sol ou de l'eau de canal ■^). Seule la forme isolée des

') C'est la-dessus que repose l'emloi de salpêtre dans l'industrie fromagère, pour
empêcher la formation de gaz par V Aërobacter (en hollandais »rijzers«). Il sufifit déja
de 0,05 "/o du poids de lait employé.

^) C'est-a-dire par action de contact du protoplasme vivant. Voir le tome precedent
du présent recueil, pp. 338.

^) On trouve les détails sur la fermentation indigotique dans mon »Indigofermen-
tatie«. l'ersl. der Kon. Akad. v. Wetensch., Amsterdam 31 Maart 1900, p. 573.

30

matières fécales, VA. coli var. commune n'agit que lentement ou n'agit pas du tout
sur l'indican, et peut ainsi être distinguée des autres espèces et des variétés afïines.
La décomposition de l'indican est un phénomène de catabolisme, c'est-a-dire qu'il n'est
pas mis en train par un enzyme particulier, de maniere que les bactéries mortes sont
inactives.

L'optimum de température pour la croissance de VAërobacter est situé vers 28° C.
A 37" C. la croissance est fortement diminuée ou même complètement arrétée.

Pour Ie diagnostic des espèces, la culture sur mout gelatine avec ou sans indican
est spécialement a recommander. Pour déterminer la maniere tres diverse dont les
espèces et variétés se conduisent envers les sucres, il est bon de dissoudre environ
8% de ceux-ci dans de l'eau de levure et d'examiner ce qui se passé dans les »tubes
de fermentation«.

Les genres alliés sont, parmi les aerobics, d'une part les bactéries du foin
(Fenobacter) et les bactéries du sucre (Saccharobacter, auxquelles appartiennent les
diverses formes de Bacillus megatherium et B. hortulensis), d'autre part Ie groupe
des B. prodigiosus (dont la délimitation générique me parait encore incertaine) ;
parmi les anaérobies les ferments butyriques (Granulobacter). Moins étroitement
alliés sont les ferments lactiques proprement dits, qui appartiennent tous') au genre
naturel Lactobacter. Ces parentés peuvent être exprimées schématiquement
comme suit:

Saccharobacter

Fenobacter Groupe des B. prodigiosus

^ Aërobacter /
Granulobacter

Lactobacter.

Les espèces les mieux étudiées sont les suivantes:

I. Aërobacter aërogenes (= Bacillus lactis aërogenes E s c h e r i c h). Batonnets
de longueur tres diverse, parfois extrêmement courts et en f orme de micrococques ;
rarement mobiles et dans ce cas péritriches. Cette espèce forme sur mout gelatine de
grandes colonies blanches ou jaunes, molles (non visqueuses) qui ne liquéfient la ge-
latine qu'au moment de mourir ou ne Ie font jamais. De nombreuses variétés, que
l'on peut obtenir p. ex. par l'expérience d'accumulation suivante. Du seigle moulu,
mélange d'eau distillée, de maniere a donner une bouillie épaisse, est abandonné a
28" C. dans un gobelet de vere^). Au bout de 12 heures il s'y fait une fermentation
extrêmement abondante d'aërogenes, qui, transportée sur mout gelatine, fournit soit
a l'état pur soit en mélange avec diverses variétés de VA. coli, les variétés principales

') Les batonnets comme les diplococques et les micrococques.

*) A 37" C. ou obtient par la même expérience une fermentation butyrique exeiiipte
d' Aërobacter mais de même allure, et suivie aussi des Lactobacter.

31

de VA. aërogenes. Si l'on prolonge la fermentation, il s'y développe des ferments
lactiques (Lactobacter), qui supplantent les formes de Vaërogenes. Les infusions
végétales, ensemencées de terre, peuvent fournir également par transport répété une
accumulation de cette forme, même une culture pure. Cette forme se rencontre aussi
tres généralement dans Ie lait, surtout dans Ie lait un peu acide, mais pas trop vieux;
aussi dans Ie sol, dans l'eau et dans la vase des canaux. EUe fait fermenter aussi bien
Ie saccharose que Ie lactose, Ie maltose et la mannite avec grande intensité.

2. Aërobacter viscosum. Ressemble a l'espèce précédente, mais forme des colonies
extrêmement variées sur Ie mout gelatine et les substratums au saccharose ; appartient
par suite aux bactéries mucigènes les plus typiques. Fermentation active dans Ie mout
et les autres solutions sucrées, tant celles de saccharose que de maltose et de lactose.
Consiste en diplococques ou courts batonnets avec accumulation de glycogène aux
póles, non au centre ; par suite il n'y a qu'un faible brunissement par l'iode. Est
immobile. Fut isolé des fermentations ó.'' Aërobacter ci-dessus mentionnées, quand on
faisait usage de seigle, provenant du Danube ou de la Mer noire; jamais aux dépens
de seigle des pays du Nord ou des Pays-Bas.

3. Aërobacter coli. Cette espèce comprend un grand nombre de variétés, isolées
en partie des excréments, surtout de mammifères, en partie aussi des eaux ménagères
et des canaux des villes. La variété la mieux connue est VA. coli var. commune
Escherich. La forme provenant des excréments humains est assez bien carac-
térisée par son tres faible pouvoir de décomposer l'indican, et la production d'une
matière colorante jaune dans les cultures sur pomme de terre. Sur Ie mout ou Ie bouillon
gélatinés prennent naissance les colonies plates bien connues, découpées sur les bords,
transparentes comme du verre. Produit de l'hydrogène, de l'anhydride carbonique et de
l'hydrogène sulfuré dans les solutions de mout. C'est Ie sujet des travaux si étendus
et embrouillés sur Ie co/i-bacille. Certaines variétés ne produisent pas de gaz dans ie
mout et se laissent alors facilement confondre avec l'organisme du typhus, dont ils
difïérent toutefois essentiellement *).

A. coli var. infusionum ^) . Se développe sur Ie mout et Ie bouillon gélatinés de
la même maniere que VA. coli var. commune, avec lequel on confond souvent la pré-
sente variété. EUe est toutefois plus robuste et bien plus riche en glycogène, ce qui
fait que les colonies sur mout gelatine se colorent en violet-brun foncé par l'iode,
même bleu pur dans beaucoup de cas, comme il a déja été dit a propos du diagnostic
du genre. Se rencontre surtout tres généralement dans les eaux de déchet des fabri-
ques de sucre de canne et dans les infusions végétales, dans l'eau de rouissage du lin,
dans les eaux ménagères, dans Ie lait en compagnie de VA. aërogenes, dans les fer-
mentations spontanées de la farine. Cette variété de VA. coli est avec VA. aërogenes
la bacterie la plus importante de la fermentation de l'indigo, et peut donc être aisé-
ment accumulée dans les décoctions d'Indigofera leptostachya et Polygonum tinc-
torium, qui sont ensemencées au moyen d'un peu de terre, et transportées a plusieurs

*) Le Bacillus typhoïdes appartient a mon avis a un tout autre genre, auquel il faut
rapporter aussi le Bacterium, sopüi Kurth.

*) Bien que je croie cette forme suffisamment caractérisée, pour lui donner ie rang
d'espèce, la bibliographie me conduit a la subordonner provisoirement comme variété
au coli.

32

reprises. C'est en quelque sorte la forme originale du groupe Aërohacter, ce qui
résulte de ce que des cultures vieillies d'autres espèces (telles que celles <1'A. aërogenes
et A. viscosum) produisent parfois par atavisme des colonies, qui ne se laissent pas
distinguer de VA. infusionum.

4. Aérobacter liquefaciens. Cette espèce liquéfie avec une grande intensité la
gelatine au mout ou au bouillon, et appartient aux agents de fermentation les plus
énergiques a l'égard du mout. Ce sont de courts batonnets doués d'une grande moti-
lité, munis d'un cil polaire, difficile a colorer. lis se rencontrent assez rarement dans
la vase des canaux, généralement dans certains marécages. Voici comment je les
ai obtenus. Des rhizomes secs, achetés dans une pharmacie, d'Althaea officinalis,
furent coupes en morceaux, recouverts d'eau, et abandonnés a eux-mêmes pendant
une couple de jours a 28° C, dans une éprouvette de verre. Il prend naissance un
mucilage épais, entrant en fermentation violente, laquelle fournit a cóté de plusieurs
variétés A'A. aërogenes, surtout VA. liquefaciens, quand on ensemence sur du mout
gelatine. J'ai trouvé parfois la même forme dans les fermentations d'indigo ci-dessus
décrites après infection avec du terreau de jardin. Le pouvoir fermentatif est comme
chez VA. aërogenes.

Ce qui a encore une grande importance pour la distinction des espèces et variétés
les unes des autres, c'est le degré de fermentation et de croissance en présence des
principaux sucres. Le tableau suivant donne la valeur relative de ces deux fonctions,
dans de l'eau de levüre additionnée de 8% des sucres correspondants, a 28° C.

La valeur relative de la croissance a été déterminée »colorimétriquement«, c'est-
a-dire d'après le trouble apparent des cultures. La valeur de fermentation est fournie
par le nombre de centimètres cubes de gaz (mélange d'anhydride carbonique et d'hy-
drogène) qui ont pris naissance en 36 heures environ aux dépens de 25 cm.^ du liquide
nutritif ci-dessus.

Le résultat le plus interessant qui se dégage de ce tableau au point de vue
physiologique, c'est le fait que le développement et la fermentation ne s'élèvent ni ne
s'abaissent nuUement toujours ensemble, ce qui est surtout remarquable chez VA.
viscosum pour le saccharose, le maltose et le lactose. Le lévulose donne également
lieu a des observations importantes.

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5

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3

I

2

2

6

') Isolé d'excréments humains.
*) Isolé du lalt.

33

4- Aux dépens de quels corps l'Aërobacter produit-il de l'hydrogène
stdfuré? Origine de l'odeur de ptitréfaction.

L'expérience »au blanc de plomb«, telle qu'elle a été décrite antérieurement,
s'applique exclusivement a la production de sulfure aux dépens d'albuminoïdes. Ceci
se reconnait a ce que les plaques au blanc de plomb privées d'albuminoïdes, même
quand elles renferment des sulfates, fournissent, ensemencées avec VA. coli ou
d'autres espèces, des cultures complètement incolores. De même, c'est la décomposi-
tion des albuminoïdes qui doit expliquer Ie brunissement bien connu du papier a
l'acétate de plomb, suspendu dans Ie col de ballons renfermant du bouillon ou du
mout de bière, et ensemencés d'Aërobacfer. Il est curieux que les sulfures formés a
cette occasion ne répandent pas d'odeur désagréable. Cela résulte de l'observation
suivante. Quand on ensemence au moyen d'eau de canal du bouillon de viande, et
qu'on cultive en présence d'une quantité limité d'air, mais non en son absence
complete, il se forme des cultures d'odeur extrêmement nauséabonde, qui brunissent
fortement un papier de plomb suspendu au-dessus. Cette odeur ne change en aucune
maniere quand on ajoute du blanc de plomb au liquide de culture, malgré que Ie sel
de plomb se colore en brun foncé, et absorbe si complètement tous les sulfures que Ie
papier de plomb, suspendu dans Ie col du ballon, demeure complètement incolore.
Il résulte de ceci que ce ne sont pas les sulfures qui produisent l'odeur de putréfaction
nauséabonde, et que dans tous les cas les émanations des canaux ne peuvent provenir
d'hydrogène sulfuré.

Is est d'autre part certain que ces corps nauséabonds, tout comme les sulfures
eux-mêmes, se forment aux dépens des matières protéiques; car les solutions qui ren-
ferment de l'asparagine, du glucose, du soufre et du phosphate de potassium, et qui
après l'ensemencement au moyen d'Aërobacter coli mettent en liberté une grande
quantité d'hydrogène sulfuré, dégagent une odeur plus agréable que désagréable.
Quoique je soupgonne que les corps odorants sont des produits de décornposition
phosphorée des matières albuminoïdes, je n'ai pu cependant me convaincre de l'exacti-
tude de cette opinion. Je n'ai toutefois jusqu'ici fait que des expériences préliminaires
au moyen de papier d'argent. L'Aërobacter n'a aucune part a leur production; ces
corps sont surtout sécrétés par des vibrions et des spirilles, en partie aussi par des
anaérobies.

Une excellente solution nutritive pour toutes les espèces d'Aërobacter, complè-
tement exempte de matières protéiques, se préparé comme suit. A loocm.' d'eau
distillée ou d'eau de canalisation on ajoute 0,5 gr. d'asparagine, 3 — 10 gr. de glucose,
0,01 gr. de KHzPOi et 0,01 gr. de MgSO*. On remplit de cette solution des ballons
jusqu'au col, et l'on ensemence au moyen d'une espèce quelconque d'Aërobacter. Il
se développe alors vers 30" C, en 12 — 18 heures, une vive fermentation, dans laquelle
prennent naissance de l'hydrogène et de l'anhydride carbonique; en même temps il
y a développement énergique. Ajoutant du blanc de plomb, ce sel demeure incolore
de même qu'un papier de plomb suspendu au-dessus, ce qui montre Ie sulfate n'est
pas reduit.

Mélangée d'agar exempt d'albuminoïdes, cette solution peut être employee a la
préparation de plaques au plomb sans albumine. Pour enlever l'albumine de l'agar du
commerce, il faut l'extraire longtemps avec de l'eau, renfermant un peu de nourriture

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 3

34

bactérienne, p. ex. des traces de glucose, de phosphate et d'asparagine, tandis que Ie
tout reste exposé a une infection spontanée. Les bactéries protéolytiques qui s'y fixent
en masse décomposent complètement l'albumine de 1'agar, et les produits de décom-
positon peuvent étre finalement enlevés par lavage a l'eau distillée. Une pareille pré-
paration, contrairement a l'agar du commerce, ne donne plus lieu du tout a la for-
mation de sulfure^).

Les milieux de culture liquides et solides préparés de cette maniere ne dégagent
pas d'acide sulfhydrique, ni sous l'action de VAërobacter, ni sous celle des autres
bactéries ordinaires parce que ce ne sont pas elles qui peuvent réduire les sulfates.
Cet état de choses ne change pas, quand on tache, par 1'addition d'autres matières
nutritives exemptes d'albuminoïdes, d'améliorer la solution, ou bien d'y créer des con-
ditions vitales plus défavorables en diminuant ou supprimant certaines des substances
mentionées.

Les mélanges nutritifs préparés comme ci-dessus sont donc propres a déterminer
la nature du corps aux dépens desquels VAërobacter et d'autres bactéries communes
sont capables de dégager de l'acide sulfhydrique. J'ai fait dans ce sens de nombreuses
expériences; les corps suivants, outre les albuminoïdes, ont été reconnus spécialement
propres a la formation de sulfures par VAërobacter.

Il faut citer ici en premier lieu Ie soufre. J'ai fait usage du soufre précipité des
pharmacies, de la fleur de soufre ordinaire et de soufre tres finiment divisé, obtenu
par oxydation d'hydrogène sulfuré au moyen de peroxyde d'hydrogène. J'ai ajouté ces
substances, ou bien a la solution d'asparagine et glucose, ou aux plaques a l'aspara-
gine, glucose, agar, et blanc de plomb, mais privées d'albuminoïdes. Les substratums
bouillis furent ensemencés de diverses espèces d'Aërobacter et de variétés des mêmes
espèces, provenant de ma collection. Je suspendis au-dessus des solutions, dans Ie col
des ballons, du papier de plomb. Au bout de 12 heures la réaction était déja tres
nette; Ie papier de plomb au-dessus des solutions nutritives s'était noirci. Les stries
d'inoculation sur les plaques d'agar au blanc de plomb s'étaient brunies. C'est surtout
la ferme isolée des matières fécales, c'est-a-dire A. coli var. commune, qui agit d'une
maniere tres intense. UA. coli var. infusionmn suivit un peu plus tard, et VA. aëro-
genes ne se colora que tres peu dans les plaques au plomb, probablement parce que
cet organisme ne peut dissoudre qu'une petite quantité de soufre; dans Ie liquide
au contraire il était tres actif. En résumé, Ie soufre a été reconnu comme une des
meilleurs sources d'hydrogène sulfuré de nature bactériogène. L'expérience est en-
ticrement analogue a la formation d'acide sulfhydrique aux dépens de soufre, telle
qu'elle a été mentionnée ci-dessus, quand on introduit du soufre dans une solution de
sucre en fermentation alcoolique. Sur quel phénomène chimique cette transformation
repose-t-elle? C'est ce qui n'est pas encore clair. Il faut admettre qu'un peu de
soufre se dissout dans Ie liquide en fermentation, et pénètre a l'état dissous dans la
cellule de levüre ou Ie corps bacteriën. Il n'est assurément pas permis de supposer
que la transformation du soufre a lieu en dehors des cellules. L'hydrogène libre, qui
se rencontre dans les cultures d'Aërobacter, ne peut jouer un róle dans Ie processus;
cela est précisément exclu par l'expérience avec la levüre alcoolique en culture pure,
puisque l'hydrogène libre y faire complètement défaut.

') Réciproquement il n'y a pas de procédé plus élégant pour démontrer dans l'agar
du commerce la présence d'albuminoïdes, que l'expérience au blanc de plomb.

35

Üutre Ie soufre, il y a encure une autre série de curps qui, dans les cultures au
glucose et a l'asparagine, donnent, ensemencées d'Aërobacter, de l'hydrogène sulfuré
avec une grande facilitc, ce qui se démontre aussi au moyen d'un papier a l'acétate
de plomb suspendu au-dessus. Ces corps sont les combinaisons peu oxygénées du
soufre, parmi lesquelles j'ai examiné l'hydrosulfite de Schützenberger (S0>
Na), Ie sulfite l'hyposulfite, Ie tétrathionate et Ie pentathionate, tous a l'état de sels de
sodium. Comme ces sels ne nuisent que fort peu a la croissance de VAërobacter, on
peut leur présenter des quantités qui s'élevent p. ex. a o,i — 0,5% de la solution, ce
qui suffit amplement a rendre visible la transformation en acide sulfhydrique en 12
heures ou moins. On dispose les expériences comme dans Ie cas du soufre. Le sel
est introduit dans la solution bouillante d'asparagine et de glucose, rapidement refroi-
die dans le cas du sulfite de sodium, qui s'oxyde facilement a l'air a l'état de sulfate,
et ensemencée d'Aërobacter. On suspend un papier de plomb au tampon d'ouate
dans le col du ballon, et on met a l'étuve a 30". Pour les sulfites qui s'oxydent ?,i
facilement a l'air, il faut empêcher l'accès trop libre de l'oxygène, ce qu'on peut réa-
liser dans les ballons ordinaires en les remplissant jusqu'au col. C'était surtout la
transformation facile et rapide du sulfite de sodium en hydrogène sulfuré qui m'in-
téressait, attendu que ce corps, en solution légèrement acide, est certainement véné-
neux. On doit donc se demander si le phénomène entier de la production d'acide sulf-
hydrique par VAërobacter et les autres bactéries n'a pas pour but de faire disparaitre
(les Solutions ces sels du soufre, qui leur sont a plus d'un point de vue nuisible.

Tout comme on l'a vu quand on se sert de soufre pur, les espèces du genre Aëro-
bacter concordent complètement avec la levüre alcoolique dans leur relations avec
les combinaisons peu oxygénées du soufre, car j'ai déja démontre antérieurement que
ces corps, surtout les sulfites et les thiosulfates, sont transformés en acide sulfhydri-
que avec une grande facilité aussi dans les fermentations alcooliques des sucres^).

Le sulfuré formé par VAërobacter est retenu en partie a la surface ou dans l'in-
térieur des corps des bactéries. Cela résulte des faits suivants, qui ne manquent pas
d'intérêt. Quand dans une capsule de porcelaine on met un peu d'iodate de potassium
(KIO3), que l'on additionne d'un peu d'empois d'amidon et que l'on acidule légèrement,
puis qu'on y introduit au moyen d'une spatule de platine un peu de matériaux d'ense-
mencement provenant de cultures d'Aërobacter (de préférence les A. coli et A.
aërogenes cultivés sur bouillon ou mout gélatinés), Tiodate est reduit par le sulfuré
renferme dans le corps bacteriën, avec depot d'iode et bleuissement de l'amidon. Il
ne s'agit pas ici simplement de dégagement d'hydrogène sulfuré aux dépens des
albuminoïdes protoplasmiques des corps bactériens. Je déduis ceci de ce que la levüre
de bière et le blanc d'oeuf coagulé réduisent l'iodate avec une intensité beaucoup

') Ainsi se trouve aussi suffisamment réfutée la «nouvelle theorie» de la formation
d'acide sulfhydrique aux dépens de sulfates, de M. le professeur Saltet (Handel, van
het 7e Natuur- en Geneesk. Congres te Haarlem, p. 378. Haarlem, 1899) et de M. C.
Stokvis (Bijdrage tot de verklaring van de zwavelwaterstofvorming in het Amstcr-
damsche grachtwater. Amsterdam, 1899). Ces messieurs admettent que le coli reduit
les sulfates a l'état de sulfites ou d'autres combinaisons peu oxygénées du soufre, ce
qui n'est pas exact; et pensent que d'autres espèces bactériennes réduisent ces com-
binaisons du soufre a l'état d'hydrogène sulfuré, ce qui précisément pourrait être fait
par \e.coli. Afin de contribuer pour leur part a la confusion qui existe actuellement dans
ia nomenclature bactériologique, les auteurs nomment le coli »Bacillus desulfuricans*.

3*

36

moindre; mais plus encore de l'expérience antérieurement décrite, qui semble montrer
que VA. coli et VA. aërogenes peuvent être cultivés en solutions privées de soufre,
et pourraient donc être constitués de protoplasme exempt de soufre. Ce qui concorde
avec ceci, c'est que des cultures vigoureuses de VA. coli, cultivées sur les milieux a
l'agar décrits ci-dessus, privés d'albuminoïdes, ne colorent pas en bleu une solution
d'iodate a l'amidon. D'ailleurs l'iodate est décomposé aussi bien par Ie sulfure
d'ammonium et l'hydrogène sulfuré que par toutes les autres combinaisons peu oxy-
génées du soufre ci-dessus décrites, mais Ie plus difficilement par les sulfites, dont il
constitue cependant Ie réactif classique. Des corps bien plus énergiquement réducteurs
sont au contraire Ie sulfure d'ammonium, Ie thiosulfate, Ie tétra- et Ie pentathionate.
Je considère néanmoins comme hors de doute que ce ne sont pas ces trois derniers
corps, mais seulement les sulfures qui prennent part a la réduction de Tiodate ici en
question.La réduction directe de l'iodate a l'état d'iodure de potassium, qui en présence
de l'iodate non encore décomposé, après addition d'acide, peut mettre en liberté de
l'iode et colorer l'amidon en bleu, est ici exclue. Je n'ai pu démontrer ce processus
chez les bactéries ; je l'ai observés seulement chez quelques levüres, mais a un degré
faible et irregulier.

Conclusions.

Le genre Aëröhacter dont la création est ici proposée, est composé des bactéries
communes des fermentations des sucres, avec production d'hydrogène, d'anhydre car-
bonique et d'acide lactique lévogyre. L'espèce et la variété la plus connue est VAéro-
bacter coli var. commune du corps humain.

C'est bactéries sont les principaux agents de la formation d'hydrogène sulfuré
aux dépens des corps albuminoïdes, du soufre, des sulfites et des thiosulfates, ce qui
a été étudie au moyen des plaques au »blanc de plomb« et par des expériences avec
des cultures liquides.

lis ne produisent pas d'hydrogène sulfuré aux dépens des sulfates, qu'ils ne
peuvent pas réduire, l'agent de cette réduction étant le Spirillum destilfuricans.

Les corps nauséabonds qui se développent dans les eaux ne sont pas de sulfures.

23 janvier 1900.

On different forms of hereditary variation of
microbes.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. III, 1900, blz. 352 — 365. — Verscheen onder den titel »Over verschillende
vormen van erfelijke variatie bij mikroben* in Verslagen Kon. Akademie van Weten-
schappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel IX, 1900, blz. 310—324, en onder den
titel »Sur diverses formes de variation hereditaire chez les microbes* in Archives
Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IV, 1901,

p. 213—230.

The interesting lecture of Prof. Hugo de Vries in the last meeting of the
Academy on the origin of new forms in higher plants, induces me to draw
attention to some observations regarding the same subject in microbes.

Though the culture of microbes, compared to that of higher plants and animals
is subject to many difïiculties, it cannot be denied that, these once mastered, micro-
bes are an extremely useful material for the investigation of the laws of heredity and
variability. The starting from the single individual, which of course is required here,
is commonly almost as simple as for the higher organisms, and it is want of practice
only which makes it appear so troublesome. The generations succeed each other
quickly ; hundreds, nay thousands of individuals can be very easily surveyed in their
posterity; far remote classes of the natural system are represented by microbes; in
many the variability is great ^). Even the difficulty of determining the species and
varieties, which is frequently only possible by means of biochemical investigation,
can become an advantage, for the very reason that biochemical methods of distinction
are very accurate, can be extended in various directions and compared by measure-
raent. Thus the species and varieties of lactic-acid ferments are distinguished by
titration, alcohol ferments by means of the saccharometer, while different carbohy-
drates can be selected as the base of lactic-acid and alcohol fermentation. To all this
is added the circumstance that it is easy to perform with microbes experiments of
competion, which is difficult or impossible with higher plants and animals, and it is
well-known how delicate the distinctions are which are thereby revealed.

In comparing the results obtained with microbes to the rules found in higher
organisms, account should be kept, first, with the want of sexuality, by which the
variation of microbes becomes comparable to the bud-variation of the higher plants,
and, second, with the unicellularity of the microbes. As to the first point the ex-
periences with the bud-variants of higher plants seem to prove that an essential dif-
ference between bud-variation and seed-variation does not exist. As to the uni-

') Compare Rodet, De la variabilité dans les microbes, Paris 1894. Bibiiography
wants in this book and not all data are trustworthy.

38

cellularity of the microbes, it is my opinion that by it the phenomena of variation are
rendered clearer but are not changed, when compared to the multi-cellular organisms.
According to the point of view, the individual microbe can be compared to the whole
individual of the higher organism, or to a single tissue-cell oft it, — both comparisoiis
are correct *).

I. Degeneration.

In bacteriological laboratories it is well-know that by prolonged culture many
microbes undergo slow, but great changes, even in so much, that certain long continued
cultures do not agree any more with the descriptions given of them by the discoverers,
short after their first isolation from nature. In some cases the way in which the
change takes place can be rather minutely traced; three forms of variability are
therein more salient: degeneration, transformation and common variation.

A species is isolated from nature and it is found that at the culture during the
first series of inoculations, in which hundreds or thousands of cell-generations succeed
each other, it develops well, so that ni the beginning the impression is obtained of a
thorough knowledge of the nutrition and other conditions of life. But by and by it
becomes more difficult to make the new inoculations thrive and at last the culture-
material grows troublesome and uninteresting and would be quite unrecognisable if
not the various phases of the degeneration-process had been exactly observed. Pro-
longed cultivation above the optimum temperature of the growth, and a too stroug
concentration of the nutriment are in some cases the cause of degeneration. In some
microaërophilae, for instance the bactery of the »lange-wei« (Streptococcus hollan-
diae) '^), the irrational regulation of the oxygen tension causes a rapid, in few days
complete vanishing of the slimeformation, while after a much longer time, by the same
cause, the vegetative power of the bactery completely disappears. In other cases, for
instance with a phosphorescent bactery, very common in the sea (Photohacter
degenerans Fischer), the degeneration is accomplished without known cause, and
in a very short time, so that, within a few "vveeks the cultures may cease to exist. The
degeneration goes not by leaps but continously and affects all the individuals in cul-
ture equally, so that it cannot be checked by colony-selection.

2. Transformation.

At the transformation all the individuals brought in culture lose a characteristic,
while either another comes in its place, or a new characteristic arises, or, lastly, the
characteristic disappears without a distinct substitute. Thus the cultures of Photo-
hacter Inminosum grow dark in the course of some months by a slow process of trans-
formation, whereby they change into a more rapidly growing form, which acts more
strongly on the nutriment than the normal form. Here. thus increase of vegetative
power has supplied the decrease of phosphorescence.

') An interesting view herewith conncctcd is found in Whitnian, The inadequacy
of the cell-theory of development. Biologica] Lecturcs at the Wood's Holl Laboratory,
1893, pag. 105, Boston 1894.

^) Used in Holland for cheesc-making.

39

It is remarkable that the transformation in this phosphorescent bactery sometimes
sudtlenly ceases and is replaced by a process of variation where, beside a completely
dark form (the variant), the phosphorescent form with the fuU primitive phos-
phorescent power again springs up. This is not the same as common atavism, where
the 5tock which throws off the atavist does not change further, but it is probably
comparable to the splitting of a bastard into the two components. Very slow cell-
partition, caused for instance by culture at a low temperature, furthers this pheno-
menon. On the other hand, the cause of the transformation may be a too rapid
process of cellpartition in which the photoplasm, which seems to grow more slowly
than the rest of the protoplasm, remains behind in its development.

In another phosporescent bactery of the sea, common on our coast, Ph. hoUandiae,
I hitherto only saw transformation, so that this species quickly disappears from the
cultures as a phosphorescent bactery.

In a pigment bactery (BaciUus viridis) I saw, apparently without any other
change, the at first very strong power of liquefying gelatin, by and by get lost in all
the individuals.

On the other hand, I have seen in some vibrions, in a corresponding way, from
non-gelatin-liquefying individuals come forth liquefying ones.

The new forms, thus called into life give, at superficial examination, quite the
impression of new constant species. They cannot, however, be valued as such as they
differ only by one or very few characteristics from the mother forms. This is the
cause why they must be classified as variants, quite like those of the following case.

3. Common variation.

The third and most frequent form of variability is common variation. Here the
normal form continues unchanged, but now and then throws off individuals, the
variants, which, from the beginning, are likewise constant and remain so, but which
every now and then again throw off other variants, among which the normal form may
occur as an atavist. These variants probably correspond with many well-known so-
called varieties or races of culture plants and domestic animals, and likewise, I should
think, with the interesting new forms obtained by Prof. de Vries from Oenoihera
lamarckiana^). They remind us in some respects also of the Pleomorphy in the
Fungi, which especially in the Ustilaginae, can easily be observed in the laboratories
and about which, in particular Brefeld, has made many researches -).

The names variant and sub-variant I have chosen, because in the here discussed
products of hereditary variation, which differ apparently very much, but in fact only
little from the normal form, I think to see the lowest degrees of the natural system
following above the individual, and to them are given those names according to the
rules of botanie nomenclature ^).

*) These Proceedings. Meeting of 29 Sept. iqoo pag. 246. Comptes rendus. T. 131
pag. 124 en 561, 1900.

^) Botanische Untersuchungen über Hefenpilzc. Heft 5, 1883.

•) A. De Candolle, Lois de Ia nomenclature botaniquc, 2e Ed. pag. 15, 1867, and
Nouvelles remarques, pag. 48 and 63, 1883.

40

Regarding the divisions above the species, de Candolle does not think it necessary
to give definitions, in which I quite agree with him. But singularly enough he does
try to do it for the ranks beneath the species, where he takes the greater or lesser
constancy at sowing as a criterion for the differences. This is not logical, here too,
definitions are unnecessary.

Probably various causes give rise to the production of variants. Lengthened
growth at insufficiënt nutrition, and the prolonged action of the own secretion pro-
ducts of the microbes may, with some probability, be considered as such causes.

The variant seems seldom, perhaps never, by one single cell-partition to result
from the mother-form, but only after some intermediary partitions, rapidly accom-
plished. With these latter partitions correspond the sub-variants, with ^ disposition for
atavism or further variation, and only keepable by colony-selection.

I will now describe some instances of common variation ; first a few cases of the
originating of hereditary-constant variants, which seem unable to return to the
stock, then the more complicated case of constant and variable variants, among which
some with a great disposition for atavism, which case I have nearer investigated in
the West-Indian phosphorescent bactery and its relatives.

Imight augment these instances with many more, for most of the microbes with which
T occupied myself for a length of time, produced in my cultures more or less hereditary-
constant variants. Extremely variable are the mycelia of the Fungi, for which I refer
to the complicated relations of the aethyl-acetate-yeast, which I described and de-
monstrated in 1895 *)> ^^^ where transformation and common variation both occur.

4. Variation in Schizosaccharomyces octosporus^).

This curious maltose-yeast I detected in 1893 on dried orient-fruits as currants,
dates, raisins, and figs. I found a good method to separate this species from the other
microbes,by which it is possible as often as desired to bring it from nature into culture.
It proved to be a generally spread organism, which is found in Greece, Turkey,
Italy, Asia Minor and Java in one and the same variety. After many isolations I
found in 1897 3) a new variety on dates from N.-Africa. The culture is effected in
the like way as of beer-yeast on wort-gelatin. Maltose, like glucose and levulose,
undergoes a vigorous alcoholic fermentation, cane-sugar not at all.

As well the usual form as the new variety produce 8-spored spcrangia, the spores
of which colour intensely blue with iodium. During the growing a small quantity of
diastase is secreted. The vegetative condition which precedes the spore-formation, as
also the vegetative variant, which produces no more spores, of which more below,
multiply by partition (not as in other yeasts by budding) and colour yellow by iodium ;
glycogene wants completely in it, Accordingly it is possible, by treating a culture
with iodium, from thousands of colonies, instantly to recognise those containing
spores, and from the intensity of the blue-colouring with some certainty to make out

') Handelingen van het 5e Natuur-en Geneesk. Congres te Amsterdam pag. 301, 1895.

-) Centralblatt für Bacteriologie Bd. 16 pag. 49, 1894 and Ibid. Abth. 2. Bd. 3 pag.
449, 1897. In 1897 I put the variant on a level with a «vegetative race«, but as I now
think, in doing so I rated its systematic value too high.

*) Together with a new quite different species of Schizosaccharomyces.

41

the number of spores present. The variety of dates difïers from the main form by
the sporangia of the latter being ellipsoidal and thickest in the middle, while in the
Aariety, on the other hand, they are just in the middle constringed, and moreover
by several other little salient characteristics, which only become discernible by
practice.

Both, main form as well as variety produce, as the cultures grow older, a variant
so much deviating from the normal forms, that, if these variants were met with in
nature, they would certainly be proclaimed a new species if no new genus. The cells
are globular, and not as in the normal form elongated, but the multiplication is here
.ilso exclusively efifected by partition. Spores are not at all formed.

This variant springs, so far as I have been able to find out till now, at once form
the normal form, which for the rest propagates unchanged, and can constantly anew
throw off the variant. The first variants are found in cultures which have continucd
growing a few weeks without re-inoculating, and they go on some time multiplying
onthenearlyexhausted culture medium, af ter the normal form does no more do so. This
points to a gain of vegetative power, at least in the conditions that prevail in the old
culture-medium, but in new nutriment I could observe nothing of this difference.

The variant after repeated re-inoculation, at present already during more than
three years and consequently after thousands of cell-generations, has remained per-
fectly constant; never could even a single sporangium be found, which, with the help
of the iodium reaction, can be seen at a glance in the microscopic preparation.
Whether in the variant the faculty of forming spores continues latent is possible,
even probable, but not proved.

In the variety, isolated from dates, also occur sub-variants, that is intermediary
forms between normal form and variant, while in that of currants I have found no sub-
variants. The sub-variants still produce some sporangia, mostly 8-spored. Without
niuch trouble I could isolate from a thousand colonies three sub-variants, belonging
to two types; both types proved at re-inoculation to be constant, but growing older
they throw off, in the habitual way, the asporgene variant, so that, in order to be
preserved, they must be propagated from the spores. This can be done by pasteurising
the sowing material at 55" C, by which the vegetative cells die and the spores alone
survive.

In continuing this manipulation I have obtained new sub-variants. One of these
produces 4- or 8-spored globular sporangia and is at first sight a new species. Cells and
sporangia remind of the vegetative variant which should have regained the power of
producing spores. But all the characteristics are limited between those of the normal
form and the asporogene variant. So that, although this form too is hereditary-con-
stant, I cannot see a new variety in it, but only a new variant.

It is noteworthy in this case, that the variants of the same generation, that is
those which result from the same sowing, always differ by distinct breaks in the tint
of the iodium reaction, and form no flowing series between main form and main
variant. But I think this to be the consequence of the limited number of colonies
which can be overseen at each experiment, and amount to no more than one or two
thousand, and that it will be possible to fiU up the gaps with sub-variants from other
cultures, which perhaps grow rarer as the leaps are smaller. The question why sub-
variants are so much rarer than main variants, I cannot as yet fully answer, but the

42

existence of sub-variants proves that the great and suclden leaps, observed in the
variability everywhere in the vegetable and animal kingdoms, are no necessary of
variability. Furthermore these sub-variants prove that even slight deviations may be
in high degree hereditary-constant ^).

5. Variation in Bacillus prodigiosus.

This well-known red pigment-bactery is cultured by me in three distinct natural
varieties. One of them does not liquefy the culture-gelatin 2), of the two others
which do, one 2) has the power of causing various carbon-hydrates to ferment under
production of hydrogen, the other not*). All three produce, in older cultures, a
variant which is completely colourless, but in all other respects possesses the properties
of the normal form whence it has taken birth, so that there are non-liquefying and
fermenting, and liquefying non-fermenting colourless variants. All these variants
have remained hereditary-constant in my experiments and produce no atavists like to
the mother form, i. e. red-coloured colonies. There is no doubt, but, if these variants
were met with in nature, not accompanied by the normal form from which they arise,
they would be taken for as many new species. Still it would be an error to admit them
as species into the system, as a more minute investigation shows that, except in the
power of forming /pigment, they correspond in all other respects with the normal
forms, and one single point of difference determines only a variant.

I doubt by no means that B. prodigiosus can also vary in other directions; this
foUows already from the fact that I could find three very different natural varieties,
which all produce' red pigment '') But I have not taken pains to tracé other variations.

Sub-variants between the normal forms and the said colourless variants are, or
at least seem rarer than the main variants. They are rose-coloured and at colony-
selection almost as constant as the normal form. They also produce like the latter the
constant colourless main-variant, and moreover show a propensity for atavism. In
each natural varietv I have found onlv one or two rose-coloured sub-variants.

6. Variation in Photohacter indicuni.

This phosphorescent bactery was isolated by Prof. F i s c h e r of Kiel, from
seawater in the vicinity of the isle of Santa Cruz, one of the Antillies, on January 10,
1886. I received material of it in May 1887 and have without interruption cultured
it till now. Already in 1887 I perceived, that with the growing older of the cultures,
two main variants arise and even in so great a number that the normal form can be

') For the more complicated phenomena of variation in some species of Saccharo-
■myces, I refer to my paper »Sur la régénération des spores chez les levures etc, Ar-
chives Néerlandaises, Sér 2, T. 2, pag. 269, 1899.

-) Isolated from potatoesgrown hollowin thesoil and gi ven me byProf. Ri tzema Bos.

') Isolated from tubercles of red clover.

*) Isolated from bones kept at the open air on the bone-hill of the gelatin- and
glue-factory at Delft.

') The red pigment of B. prodigiosus is a product of excretion found between the
living and partly accumulated in dead bacteria, It is in my opinion the product of
specific chromoplasm, which forms a small part of the protoplasm in general.

43

supplanted by theni for the greater part, though not quite. One of these is either com-
pletely or almost completely dark, the other grows much more slowly than the normal
form and is almost motionless, while the normal form is extremely motile. I will
call these variants Ph. indicuin vnt. obscurmn and Ph. indicum vnt. parvum. Later I
found some more variants which are less common. There are besides sub-variants
ofwhichihave examined those standing^ between the normal form and obscurmn; they
produce now and then atavists, and vary also towards obscunim, but can be kept con-
stant by colony-selection.

Notwithstandig this great variability it has been possible, likewise by means of
colony-selection, during the more than 13 years continued laboratory culture, to keep
up the stock unchanged, which is remarkable, when thinking of the place where it
was first found.

The variants and sub-variants always spring from the stock in the same way.
They may be reduced to two types: variable and unvariable. All phosphorescent
variants are more or less variable.

The variant parvum shows an extreme disposition for atavism, so that already
after its first-re-inoculation on a new culture-medium, various normal forms spring
from it.

The obscurum-variants are more constant. They are either perfectly constant,
so that, as it seems, phosphorescent forms never again arise from them, or imper-
fectly, so that after going through a few cell-partitions, answering to as many sub-
variants, the normal form returns with the full phosphorescent power. Dark variants,
in this way producing luminous cultures, prove that progressive variability i) also oc-
curs in the laboratory cultures.

The variant is not the product of a single heterogene cell-partition, but of thepassing
through some preparatory cell-partitions, answering to as many sub-variants. I was
able without difficulty to distinguish two of these leaps or sub-variants, but it is
possible that there are more, too slightly differing for my observation. It is also
probable that by the conditions of culture, these preparatory cell-partitions, and with
them the sub-variants, existing between the normal form and the main variant, will
grow more or less numerous.

The obscurmn-variant is probably produced in accordance with the scheme of
Fig. I.

For the sake of simplicity here is only figured one intermediary stadium (sub-
varinat) by the dotted rod ; the dark main variant is drawn black, the normal form
white. This scheme answers to what may be called the development of the cell-variant
by heterogene cell-partition or evolution.

Less probable is the development of the variant by transformation or epigenesis
represented in Fig. 2.

The preparatory cell-partitions at the atavism of the luminous normal form from
the dark or feebly luminous sub-variants still liable to retrogression, probably answer
likewise to the schema of Fig. i.

') Distinction can be made between: — retrograding or analytic variability, in which
a characteristic disappears entirely or partly, — replacing variability, in which a charac-
teristic is wholly or partly supplanted by another, — and progressive or synthetic varia-
bility, in which a new characteristic is added to those already existing.

44

Fig. I.

Fig. 2.

Probable course of development of
the dark variant by direct heterogene
cell-partition or evolution. The first
partition produces from the single lu-
mineus bacillus one of the same, and
another of lessened luminosity. The
second partition produces from the
latter again one of the same lumi-
nosity, and another quite-dark.

Less probable course of development
of variant by indirect heterogene cell-
partition or epigenesis.

Fig. 3-

Pedigree of Ph. indicuui,
normal form.

Fig. 4-

• +' + +

Pedigree of parvum.

Fig.

-"+"'-.-^

Pedigree of variable
obsciiniiit.

If the normal form is indicated by •, the obscurnm-\ ar iSint by — , and the par-
vum-\a.Tia.nt by -f-, unreckoned the sub-variants, the pedigree of the normal form of
Ph. indicum can be represented by Fig. 3, which means, that at the two first re-in-
oculations only the normal form is produced, and that at the third likewise obscurum-
and /Jorz'Mm-variants have orginated, but from cells which were subjected to particular
conditions. The numbers 2 and 3 for the generations are chosen arbitrarily, for the
number of generations, after which the variation occurs, can be regulated at will, for
by early re-inoculating the young cultures on fish-broth-agar (not on fish-broth-
gelatin) the variation can be kept back for a long time ^).

For the variant parvum the pedigree becomes somewhat different from that of
the normal form, there being much atavism (Fig. 4).

The pedigree of obscurum can, as to the constant form, be represented by a
single mark.

The variable, obscurum, again produces atavists, but less than parvum, and
besides />o/'Z'«rm-variants (Fig. 5).

In these three last schemes are, as said, the sub-variants left out.

I have not succeeded from Ph. indicum to obtain a perfectly constant luminous
form, that is, one which produces no variants, though I have tried for years to do this
by selection, It is evident that the conditions of culture inavoidably give cause to
the rise of variants. That for the rest the faculty of varying in a very determined
vvay, is deeply rooted in the nature of the cell, is proved by the following observations.

') To these relations I hope to refer at another occasion.

45

A few years ago Mr. F i s c h e r at Kiel again sent me some material of Ph.
indicum, which had thus during many years been cultivated in his laboratory. There
was a considerable difference, compared to my stock, but the normal form and the two
variants obscurum and parvum, I could still obtain from it as constant forms by means
of colony-selection.

At the examination of numerous samples of seawater in all the seasons, taken near
Scheveningen, Bergen op Zoom and den Helder, partly f ar from the coast^), I have
never found Ph. indicum itself, but, even three times, forms which, with a broad
conception of the species, might be considered as varieties of it, and else as very
closely allied species. I call them Ph. splendidum and Ph. splendor maris. Short after
the isolation already they produced variants, one of which is quite dark and
multiplies in such a number that in cultures which are negligently re-inoculated
the normal form, and with it the photogenic power, whoUy disappear.

Thus, a culture at 22" C. of splendor maris going out from a single phos-
phorescent colony, after being in 12 days six times re-inoculated on fish-broth-gelatin,
produced 1800 dark variants on 22 colonies of the normal form. The culture re-
inoculated six times in the samè space of time on fish-agar did not yet contain any
variants, whilst at the i2th re-inoculation on agar their number was also very great.
The first not further re-inoculated cultures on gelatin, which accordingly had only
had little opportunity to grow, after 12 days did not contain variants, in accordance
with the rule that at cessation of growth no variability is manifested.

The parvnm-va.ria.nt also is in Ph. splendidum and Ph. splendor maris as
distinctly recognisable as in Ph. indicum itself, and here too, frequently produces the
primitive forms as atavists.

Basing on these experiences I think it probable, that the cause which calls forth
the variants is not exclusively acitve in our artificial cultures, but can also be active
in the sea itself, so that in this case there is a chance that dark forms, isolated from
the sea will at first be taken for particular species, but after more minute observation,
will prove to be variants of known phosphorescent bacteria.

By observing certain general conditions the production of dark variants can, as
said, be greatly slackened, but not wholly prevented. Among these are: strong nutrition
and vigorous growth a little below the optimum temperature, free access of oxygen,
such as can be attained in cultures on agar-agar, and total exclusion of the influence
exerted by the secretion-products of the bacteria themselves, which is attainable by
re-inoculating the young cultures very often on a new medium.

7. Conclusion.

I will begin with pointing to the fact that hereditary variability is a function of
growth, in particular of slackened growth, but that at cessation of growth no change
takes place. And furthermore that variability attacks only one independent charac-

') Many of these samples I owe to the kindmess of Dr. Hoek. Various species of
luminous bacteria have been found in them to the aniount of o.i to 5, even 7 pCt., of
all present bacteria. Especialiy Ph. hitninosum, and a species difficult to distinguish from
it, but still quite different, Ph. hollandiae, occur very often. Ph. degenerans also is frequent.

46

teristic at a time. In the sub-variant one characteristic of the normal form is partly,
in the main-variant it is wholly changed. In new varieties and species more charac-
teristics are varied.

Furthermore resuming the above given statements I come to the foUowing con-
clusions. The here discussed forms of hereditary variability belong to three types:
At degeneration all individuals, by a slow process of variability, lose their vegetative
power, so that the species may cease to exist. At transfortnation, which seems to
appear more seldom, all individuals lose a specific characteristic and acquire either
or not another instead. At the common hereditary variability or variation, the
normal form, probably by heterogene, cell-partition, throws off some individuals, the
variants, mostly difïering from it by a strongly salient characteristic. The normal
form itself propagates beside it quite unchanged. The variants are constant in a way
corresponding with independent species, sometimes this constancy is perfect, in other
cases atavists are produced, like to the normal form. Subvariants i. e. intermediate
forms between normal form and variant, are less found than the variants themselves,
but they are perhaps never wanting, and are in the same way constant as. the normal
forms. Whether the sub-variants are also originally formed in smaller number than
the main variants is uncertain; what is seen is that they rapidly disappear from the
cultures and are supplanted by the normal form and main variants if they are not
fixed by colony-selection. Besides, each well-defined degree of variation, however
slight, seems to be fixable.

The rare occurrence of the sub-variants throw^s some Wghi, First, (by thecomparison
of the individual microbes with the individuals of the higher organisms) on the
marked distinctness by which in higher plants and animals most varieties and species
are separated, — for they originate by repeated variation processes, relative to
different characteristics — and the chance that the common and distinctly discernable
variants will partake therein and not the rare sub-variants, more difïicult to
distinguish, is accordingly greatest i).

Second, (by the comparison of the individual microbes with the tissue-cells of
the higher organisms) on the no less marked confines between the tissues and the
organs of one and the same individual, — for these are constituted of as many cell-
variants of the embryonal cells, cell-variants, which will supplant the cell-sub-
variants.

') I perfectly agree with Professor de Vries, that the origin of species should often
be sought in the almost suddenly produced variants, or mutants, as he calls them. This
is also the conclusion to which Galton has come regarding the races, and to which
he referred repeatedly since 1892, the last time, so far as I know, in Nature T. 58, pag.
247, 1898 in these words: »I have frequently insisted that these sports or »aberrances«
(if I may coin the word) are notable factors in the evolution of races. Certainly the
successive improvements of breeds of domestic animals generally, as in those of horses
in particular, usually make fresh starts from decided sports or aberrances aud are by
no means always developed slowly through the accumulation of minute and favourable
variations during a long succession of generations«. Along quite distinct ways Galton,
de Vries and myself have thus arrived at the same conclusion regarding the probable
origin of many races and species. But the great difficulty which lies in the explanation
of the adaptions, has not been removed, neither by Gal ton 's »aberrants«, de Vries
»mutants«, nor mv »variants«.

47

That many so-called iiew species will prove only variants of other species atid
HO »good species«, is not improbable. Especially in the microbes, where the want of
Crossing must strongly favour the prolonged continuing of the once formed variants,
it is to be foreseen that in nature will often be found variants, which will long main-
tain themselves at their habitat. If they are isolated, the discoverer will at first be
almost sure to see new species in them, and only after an accurate investigation
recognise them as variants of another species.

The sub-variants of the microbes prove, that the characteristics which in the
main variants are quite wanting disappear by little leaps from the normal forms. In
other cases, however, the main variants seem to appear suddenly, whence it would
follow, that a characteristic can also vanish at a single leap at the cell-partition ; hut
here the sub-variants may have escaped from observation.

The variants of the microbes, regarded as cell-variants, prove that out of a cell
(laughter-cells may spring unlike to the mother-cell. Though the way in which this
is eii'ected is still insufficiently known, it proves the existence of heterogene cell-
formation, whether by direct heterogene cell-partition (fig. i), or, by the less prob-
able transformation (fig. 2).

In order to show how decidedly heterogene cell-formation is still considered as
impossible, so that it is not superfluous to afford a new evidence for its existence, I
refer to the well-known book of O. Hert wig »Die Zelle und die Gewebe«, p. 64,
Bd. 2, Ed. 1898, where we read as follows: »Die Theorie der heterogenen Zeugung,
WO sie aufgestellt wurde, ist als grober Irrthum bald beseitigt worden. So gilt als eiii
allgemeines Grundgesetz in der Biologie der Ausspruch »Gleiches erzeugt nur
Gleiches« oder besser »Art erzeugt stets seine Art.« Bei allen einzelligen Lebewesen
ist erbgleiche Theilung ihres Zellenorganismus die einzige, die vorkommt und vorkom-
raen kann. Auf ihr beruht die Constanz der Art. Wenn es möglich ware, dass bei
irgend einem einzelligen Organismus die Erbmasse (Idioplasma) durch Theilung in
zwei ungleiche Componenten zerlegt und auf die Tochterzellen ungleich übertragen
werden könnte, dann hatten wir den Fall einer heterogenen Zeugung, den Fall der
Entstehung zweier neuer Arten aus einer Art. Wie indessen alle Beobachtungen
lehren, werden auch bei den Einzelligen die Arteigenschaften so streng und bis ins
Kleinste überliefert, dass einzellige Pilze, Algen, Infusorien auch noch im millionsten
Gliede, ihren weit entfernten Vorfahren genau gleichen. Der Theilungsprocess als
solcher erscheint daher auch bei den einzelligen Organismen nie und nirgends als
Mittel um neue Arten ins Leben zu rufen.«

The preceding pages prove that this view is erroneous, so that the far reaching
conclusions, drawn from it in relation to ontogeny vanish at the same time,

So far there is thus no reason in contradiction with observation, which forbids
admitting, that the ontogeny of the higher organisms consists in a regular course of
variation processes, and that full-grown plants and animals are built up of as many
cell-variants of the embryonal cells, as they contain different tissus composed of
identic cells.

On the development of Buds and Bud-variations
in Cytisus adami.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. III, 1900, blz. 365—371- — Verscheen onder den titel »Over het ontstaan van
knoppen en knopvariaties bij Cytisus adami« in Verslagen Kon. Akademie van Weten-
schappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel IX, 1900, blz. 336 — 342, en onder
den titel »Ueber die Entstehung von Knospen und Knospenvarianten bei Cytisus adami*
in Botanische Zeitung, Leipzig, 59. Jahrgang, 2. Abteilung, 1901, S. 113 -118.

Cytisus adami is a hybrid between the common laburnum, Cytisus laburnum,
and a little shrub from Styria, Cytisus purpureus, with purple flowers, New
and then are found on Cytisus adami buds of both species as bud-variantsi). The
e.xperience that these buds appear in particular on cider parts, and have, probably
without exception, passed one or more years in dormant condition before budding
and changing into the primitive forms^), induced me to cut down all the bran-
ches and the main stem of four specimens of C. adami in order in this way to
excite the development of the very old buds which were, since years, in dormant
condition on the old trunk. My expectation, that by these means I should obtain
a great number of bud-variants, proved right: in few years I saw, together with
earlier observations, appear more than a hundred buds of laburnum and about
twenty of purpureus. I was thereby enabled to establish a few paticularities about
buds and bud-variations which foUow here:

1. The ordinary axillary buds of Cytisus adami spring not from single cells
but from cell-groups. They grow on by means of a pluricellular meristem, and
not by means of one terminal cell. The latter fact was long known already and
is here anew confirmed.

2. The bud-variants, also, originate from cell-groups and not from single
cells, so that the cause which is active here in producing variability, must extend
over many cells at a time.

That this cause is in some or other way related to unfavorable conditions
of nutrition cannot be doubted.

Of course the possibility is not excluded that for C. adami buds and bud-

') The word «variante is here used in a sense somevvhat different from that in the
preceding paper on the variants of microbes, »component« might perhaps be more
precise in this case. But I keep to the usage, as the meaning is clear.

^) This does not hold good for the flowers, which have no dormant period but
constantly develop in the 2^ year, and of which the different parts are still more subject
to return to the components than the vegctative buds. But the flower may, even
unreckoned the process of fertilisation, be called the organ of variahilitv.

49

(^m

variants can spring from single cells. I think this even probable as regards some
of the many buds which develop from the »bud-crown«'). Herewith is meant
the sheath of vigorously vegetating cambium-cells which is found in the callus
and the bark, just in the prolongation of the procambium- or cambium-cells of
truncated or thrown off buds or branches, which sheath is an active centrum
for the originating of new buds. For the rest, it is not the springing forth of
a bud or new individual from a single cell which is remarkable, but the fact that
this can take place from an already constitudet cell-group. That this really occurs,
and also, that a meristem constituted of many cells may be subject to the process
of variation, is proved by the following observations.

At about ninety laburnum-hxxAs which had developed as variants, nothing
particular was to be seen, but at eight or nine were found at the base a greater
or smaller number of bud-scales which could with certainty be recognised as

bud-scales of adami {ad Fig. i A).

This observation is easy and convincing, as
all parts of laburnum, hence the bud-scales too,
are covered with silverwhite hairs, especially at
the under- or back-side, while the full-grown
portions of adami are always devoid of hairs. In
all the cases, which I examined more minutely,
the line of demarcation between the adatni- and
laburnto/i-^ovtion ran in an oblique direction, so
that the whole meristem belonged evidently to
laburnum. This was constantly confirmed by the
experience at the budding, as always pure labunuim-
shoots grew from these buds.

In 1898 an extraordinarily great number of

laburnum-v2iv\zni% were formed on my adami-trees.

In consequence of the early pruning all the buds

were situated low enough to be easily examined

with the magnifying-glass. Two of them presented

themselves as in Fig. i B. The line of demarcation

went precisely over the middle of the bud scales

and not obliquely as in the eight cases above.

The supposition that the said demarcation would

also continue precisely over the middle of the

meristem, proved right at the budding, for both the branches which sprung from

these buds in 1899, were exactly for one half, lengthwise, adami, for the other

half laburnum.

One of these »mixed branches* has attained a length of about i Metre, and
produced more than 30 leaves with axillary lateral buds, of which about 15 belonged
to laburnum, the other 15 to adatni. At its extremity was in the antumn of 1859 an
open »summer-bud«, still for one half adami, for the other half laburnum; this
summer-bud was not closed with bud-scales, and died in the winter of 1899 — 1900.

Fig I.
Two laburnum bud-variants on
a branch of Cytisus adami; the
lower bud A bears at its base
adami bud-scales, but is in the
higher portion pure laburnum;
the upper bud B is precisely for
one half adami, for the other
laburnum.

') Translated from the German «Knospenkrone».
M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel.

50

The second branch has become about 1/5 M, long, and bore more than 12 leaves
with axillary buds, again belonging for one half to laburnum, for the other to adami.
In the autumn of 1899 a closed »winter-bud« with bud-scales was formed at the
extremity. Though the line of demarcation seemed also to go over the middle of this
terminal bud, a ladurnum-hranch developed from it in the summer of 1900, which
only at the base bore some adami-Xtzvts, so that the separation within the bud
must have run obliquely and divided the meristem into a larger laburnum- and a
smaller adami-^orüon.

This description proves that the two halves of the »mixed branches* have
each grown from an independent half of the meristem, which half cannot consist
of less than one cell, so that the continued growing of the branches with one
terminal cell is out of question, accordingly it is certain that the branches of
Cytisus adami grow^ with at least 2, and probably many more meristem cells.

The two separating lines betw^een laburnum and adami which are seen over the
full length of the »mixed branches*, easily discernible on the bark as the confines
between a portion set with hairs and another without, ran in 1899 for the greater
part of course between the leaves, but in some places also through the leaves
themselves. Some of these »mixed leaves* were situated exactly for one half on the
laburnum- for the other on the adami-'^ox\\on of the branch. In this case the trifoliate
leaf was as exactly for one half an adami- and for the other a laburtium-\tB.i, and
over the whole length of the petiole and the midrib of the terminal leaflet the
line of demarcation was distinctly discernible. This would, if necessary, be sufficiënt to
prove that also each leaf takes birth from at least two, and probably more meristem
cells. But the pluricellular origin of the leaves of the higher plants has, so far as I
know, never been called in question, though this has been the case concerning the
origin of the lateral buds.

So, it was of importance to establish whether the axillary buds of these
»mixed leaves*, exactly placed on the confine, would likewise produce »mixed
branches*, by which the question would be answered if one bud might spring forth
from two or more cells at a time. The answer was not dubious: all the buds,
placed in the axils of the leaves, which were for one half laburnum, for the other
adami, produced, in the summer of 1900, as well laburnum- as adami-X^diVts, and in
this case, too, some leaves again were mixed, namely partly adami- partly laburnum-\Q2L\ts.

In most cases the line of demarcation went very obliquely through the »mixed
buds« of this second generation, so that the whole meristem early in the year
consisted of only adami or only laburnum. In one of these buds however the boundary
line went precisely through the middle, but this bud contained an inflorescence
of which the summit had died off in the winter of 1899 — 1900. At the base were
however pure laburnum- and pure adami-üowers, and one flower was precisely for one
half laburnum, for the other adami, so that also flowers evidently spring not from one
cell, but from a cell-group.

The preceding description proves that in the springing forth of the laburnum-
variant from Cytisus adami, as well a whole meristem may be concerned as half of it.
and that the cause which gives rise to the appearance of a bud-variant is active
when the meristem is completely formed, and not in the far-back moment when the
cell-group, which later manifests itself as a meristem, was still a single cell. For if

51

this were the case it could not be possible that a portion of the bud, which
produces the variant, continued to belong to C. adami itself.

Hence it follows that the bud-variant is not produced by variation of a single
cell but by that of a cell-group.

Fig. 2.

One year's purpureus, ps, sprung as a bud-variant, from a dormant adami-bud, at the

extremity of a »short-shoot« ad. On the left a »long-shoot« of adami, at the

extremitv of a »short-shoot«.

To show that also the purpureus-vanant is produced by the variation of an
already constituted adami-meTistcm, and not of a single cell, far-back in the evolution
of that meristem, I refer to Fig. 2,

Here we see a one year's purfiureus-shruh (J>s) placed at the extremity of a
»short-shoot« of Cytisus adami^). Commonly the/«/'/'«/-<?«5-variants, quite like thoseof
laburnum., spring from comcom buds, whence the exact moment of their birth is
not clear. But the peculiarity of the case figured here is that the »short-shoot«,
terminating in purpureus, had already grown for a number of years as adami, and
that consequently it is not possible to doubt, that purpureus has come forth from
the whole adami-mtnsiQm. As this meristem is pluricellular, the cause, which led to
produce the purpureus-v2.x\'an\., must thus also have affected a cell-group and not
have been confined to a single cell.

*) A »short-shoot« consists of a closely crowded succession of nodes, between which
the internodes are not developed; they grow very slowly and point to unfavorable
conditions of nutrition.

4*

52

In a few cases the purpureus-hnè was not found alone, but also some adami-
buds of the nearest surrounding were changed into purpureus. So, this summer,
in my garden, of six quite independent, dormant, three years' buds at the summit of a
»long-shoot« of Cytisus adami, separated from each other by relatively short inter-
nodes of the longshoot, no less than four are changed into purpureus, and besides,
the two unchanged adanii-hnds are placed between the higher and lower situated
purpureus branchlets. Accordingly the influence which caused the variation must
have been active simultaneously in four meristems, the distances between which,
at the time of the variation, must certainly have amounted to some tenth parts
of millimeters.

Herewith I think to have made good the two statements expressed at the
beginning of this paper, and I only wish to add that already before, but at quite
another occasion {Cécidiogénese du Cynips calicis. Archives Neêrlandaises, Sér 2, T, 2,
1897, pag. 436), I came to the opinion that variability, though habitually going
out from a single cell, is not necessarily always bound to it, but sometimes has a
cell-group as starting point, so that there can be question of uni- and pluri-
cellular variability.

The relatively great number of bud-variants of adami, which I have examined,
consisted, as usually, only of puvt laburnum- and pure/«r/>//;r«^-branches. Hybrids, in
which both factors occur, but one preponderant as compared to its part in adafni,
seem never to be produced. Still I believe that in the cell layers of the bud-meristem,
which form the separation between adami and one of the variants, there must occur
transitory cells, which, could they be independently developed and cultivated into
new individuals, would produce such derivated hybrids. Perhaps the »supplanting«
of these transitory cells by the completely varied cells, may be compared to the
rarity (discussed in the preceding paper on the variants of microbes) of the sub-
variants as compared to the normal form and the main variants, by which it seems
possible to explain, on the one hand the existence of distinctly marked bounds
between the species, on the other hand, the not less marked bounds between the
different organs and tissues of the higher organisms.

Noch ein Wort über die Sulfatreduktion in den

Gewassern.

Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, II. Abteilung, VI. Band, 1900, S. 844.

Saltet's Aufsatz in diesem Blatte^), woraus ich ersah, daB er über die ver-
wandtschaftlichen Beziehungen seiner Bakterie in Zweifel gekommen war,
veranlaBte mich, eine Kultur derselben zu untersuchen. Es stellte sich aber
heraus, daB es sich, wie ich das früher auf Grund seiner eigenen Ansicht aus-
gesprochen hatte, thatsachlich um eine Coli-Form handelt, und zwar um Aëro-
bacter coli var. infusionum, sehr allgemein in Pflanzeninfusen, in Mehl, im
Boden und in Grabenwasser^). Einige Versuche mit dieser Bakterie, Sulfat-
reduktion zu bewirken, gaben wie früher, ein vollstandig negatives Resultat, so
daB Saltet's Behauptungen unrichtig sind. Einstweilen bleibt mein Spirillum
desulf uricans also die einzige bekannte Art, wodurch Sulfatreduktion stattfindet.

•) Centralbl. f. Bakteriol. etc. II. Abt. Bd. VI. 1900. p. 699.

-) Für die Beschreibung verweise ich auf Centralbl. f. Bakteriol. etc. II. Abt. Bd. VI.
X900. p. 205.

Sur les ferments lactiques de Tindustrie.

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé VII,

1901, p. 212—243. — Verscheen onder den titel »Ueber Milchsaure-Bakterien der In-

dustrie« in Zeitschrift für Spiritusindustrie, Berlin, 25. Jahrgang, 1902, S. 531, 54i,

543-544, 550—551, 553-

Il existe dans l'industrie un procédé appelé Ie procédé du levain lactique qui peut
étre considéré comme Ie point de départ et Ie fondement de l'industrie de levüre de
boulanger. Le but de ce procédé est la production d'une fermentation lactique aussi
pure que possible dans du mout ou dans des macérations brutes de farine. Dans le
dernier cas on emploie un mélange de malt et de seigle, broyé ou moulu et traite
d'une maniere ingénieuse, pour y développer seulement un ferment lactique spécial.
On se rend aisément compte des difficultés de ce procédé quand on considère que
Ic travail se fait dans des milieux non stérilisés, ce qui est nécessaire pour la
conservation de l'amylase et des corps albumineux non coagulés, et que presque
toutes les espèces microbiennes du sol se rencontrent sur les particules de farine.
Il s'agit donc ici d'un »expériment« gigantesque d'accumulation d'une seule espèce
de microbe, d'un experiment qui se répète continuellement dans des centaines
d'usines, réparties dans tous les pays et d'un intérêt tout particulier pour les
microbiologistes. Dans les pages suivantes les principaux phénomènes vitaux du
ferment actif de ce procédé seront considérés du plus prés. Pour la clarté il
sera nécessaire d'aborder plusieurs questions regardant la fermentation lactique
en général et de donner un court aperqu de la question des espèces chez les microbes
provocateurs de cette fermentation. C'est avec le dernier point que je commencerai.

I. Les Lactococcus et les Lactobacillus.

Un assez grand nombre d'espèces de bactéries produisent en présence de sucre
dans leur milieu de culture, plus ou moins d'acide lactique. Relativement peu
nombreux est pourtant les ferments lactiques actifs, c'est-a-dire les formes qui
produisent tant d'acide qu'elles en deviennent utiles ou nuisibles a l'industrie,
notamment a quelques industries agricoles ^). Les pages suivantes se rapportent
exclusivement au dit groupe; toutes les espèces qui, d'après nos connaissances
actuelles ne semblent produire l'acide lactique qu'en petite quantité, restent ici hors

*) A comparer A. May er, Studiën iiber die Milchsauregarung, Zeitschrift für
Spiritusindustrie, Bd. 14, pag. 183, 24. Juni 1891.

55

de considération. Donc, les espèces mentionnces par M.Kayser') M.G. Tate^),
M. Péré^), M. A d e r h o 1 d'^) et d'autres ne seront pas discutées ici.

Les ferments actifs appartiennent a deux genres naturels, Lactobacillus et
Lactococcus, qui se distinguent nettement aussi bien par la forme que par leurs
qualités physiologiques et qui, d'après ma conception, sont certainement des genres
phylogénétiques et non point des »genres physiologiques«, comme par exemple
Photobacter, ou simplement morphologiques comme les »genres« Bacillus, Pseiido-
monas, Micrococcus, etc. qui tous contiennent des formes bien éloignées dans Ie
système naturel.

Le genre Lactococcus comprend les microcoques, les diplocoques et les strepto-
coques qui provoquent, a des températures au-dessous de 30^C.,la fermentation lactique
du lait; ce sont eux qui produisent ordinairement l'acide lactique dextrogyre. Les
formes les plus connues sont le ferment lactique commun de la crème aigrie,
Lactococcus lactis ^), une espèce tres polymorphe, qui comprend nombre de variétés
bien difficiles a distinguer et qui se laisse isoler le plus facilement du lait de beurre.
A présent, des cultures pures de cette espèce, tant a l'état sec que humide, se
rencontrent dans le commerce sous le nom hollandais de »zuurwekkers« (producteurs
d'acide). Un deuxième espèce importante du mème genre est le Lactococcus
hollandiae W e i g m a n n, le ferment mucipare du petit lait filant. Elle produit
seulement tres peu d'acide, et on s'en sert en Hollande pour combattre les maladies
du fromage et en Norvège on le cultive en du lait pour en préparer un aliment
populaire.

Au genre Lactobacillus doivent être rapportés les ferments lactiques actifs de
forme bacillaire qui produisent l'acide actif lévogyre et qui se rapprochent du genre
Aérobacter dont j'ai donné la diagnose en 1900 ^). Pourtant Lactobacillus se
distingue de ce genre en ce que la production d'hydrogène, caractère important
pour le diagnostic d' Aérobacter, y manque absolument, ainsi que dans tous les autres
ferments lactiques actifs.

C'est surtout ce groupe qui joue un grand róle dans la nature comme dans
l'économie. Ce sont les Lactobacillus qui provoquent, a des températures au-dessus
de 30" C, une acidification tres intensive du lait, recherchée dans plusieurs boissons
qui en sont dérivées chez les peuples primitifs et nomades. Telles sont le Kéfyr
du Caucase, le Koumys de l'Asie centrale et le Matzoon de l'Arménie. Quoique

') Kayser, Etudes sur les ferments lactiques. Annales de l'Institut Pasteur, T.8,
P- 737> 1894. Il est tres difficile de reconnaitre les espèces de cette étude, et je doute
même si parmi les 15 espèces décrites il y ait un seul «ferment lactique actif* dans
le sens que je donne a ce terme.

^) The Fermentation of Dextrose, Rhamnose and Mannitol, by a Laevolactic fer-
ment. Journal of the Chemical Society. Vol. 63, pag. 1263, 1893.

•) Formation des acides lactiques isomères. Annales de l'Inst. Pasteur, T. 7, page
7Z7, 1893.

■*) Untersuchungen über das Einsauern von Früchten und Gemüsen. Landwirth-
schaftl. Jahrbücher 1899, pag. 69.

^) Bacteriuni lactis acidi de M. G. Leichmann, Ueber die freiwillige Sauerung der
Milch. Centralbl. f. Bacteriologie, 2te Abth. Bd. 2, pag. 777, 1896.

*) Aufsteliung der Gattung Aérobacter, Centralbl. für Bacteriologie 2te Abth. Bd. 6,
pag. 198, 1900.

56

clans toutes ces préparations 1'acidification soit inaugurée par les Lactococctis, la
majeure quantité de l'acide lactique est produite par des Lactobacillus. L'acide
lactique qui se trouve dans ces boissons est donc généralement, comme on pouvait
prévoir, un mélange des acides dextro- et lévogyres, Ie dernier en prépondérance.
Plus rarement on n'y rencontre que Ie produit des Lactobacillus, c. a. d. l'acide
lactique lévogyre seul. Ce sont en outre des Lactobacillus qui produisent l'acide
dans Ie fourrage vert ensilé pour Ie bétail, — qui conduisent la maturation du
fromage dans la bonne direction, — qui provoquent l'acidification du chouxblanc
salé de nos caves, — qui remplissent chez les petits enfants, pendant la période de
la lactation, tout Ie tractus intestinal et dont se composent leurs faeces dites de
couleur vitelline '). Ce sont eux aussi qui ont servi jadis a M. Bensch et a
d'autres expérimenteurs pour la production de l'acide lactique ^). Mais la signi-
fication la plus importante des Lactobacillus est l'emploi qu'on en fait dans l'industrie
des levüres. Il s'agit ici des microbes du levain lactique dont j'ai déja parlé dans
Ie mot introductoire et qui seront traites amplement après. Mais avant d'en aborder
la physiologie je dois encore indiquer une signification tout autre que peuvent avoir
les Lactobacillus, dont certaines formes causent des corruptions bien redoutées dans
les matières contenant des carbohydrates.

C'est ainsi que la plus facheuse maladie de la bière, la maladi de »la bière
tcurnée«, est causée par plusieur espèces de Lactobacillus ■''). Tl en est de même de
la levüre de boulanger, dont les plus redoutables ennemis, — causes première de sa
corruption, — se trouvent parmi les formes de ce genre. Ce fait est assez surprenant
si l'on considère que c'est Ie levain lactique, complètement rempli de Lactobacillus,
qui forme Ie fondement nécessaire de la culture industrielle de la levüre. Mais tous
ces ferments de »corruption acide« se distinguent du ferment du levain lactique en
ce qu'ils peuvent se développer a des températures au-dessous même de 25° C,
tandisque Ie dernier a sa température minimum de croissance au-dessus de 25" C.

La question des espèces dans Ie genre Lactobacillus présente nombre de
difïicultes ; la littérature en donne a peine Ie premier début ^). Surtout quand on
a étudié longuement ce groupe on se trouve dans un véritable chaos de formes peu
différenciées mais toutes plus ou moins héréditairement constantes. Pourtant, j'ai
la conviction que cette situation scientifique n'est qu'une période de transition, et que
la grande sensibilité des qualités héréditaires de ces ferments envers les influences
extérieures bien définies, qui seront démontrées plus amplement dans les §§ 7 et 8,

') Zu vergl. A. Rondella, Ueber die acidophilen Bacillen im Sauglingsstulile
Centralbl. f. Bacteriologie Abt. i, Bd- 29, pag. 717, 1901.

*) A. Bensch, Ueber die Darstellung der Milchsaure und Buttersaure. Ann. der
Chemie und Pharmacie Bd. 61, pag. 174, 1847.

') Il y a pourtant des cas, par exemple chez certaines bières belges comme Ie
lambic et Ie faro, ainsi que dans Ie Weiszbier du nord de l'Allemagne, oü l'acidi-
fication par les Lactobacillus est indispensable pour Ie commerce et est produite arti-
ficiellemcnt. Le «Guinnes s' Stout« de Dublin nous montre un fait encore plus étonnant:
a Dublin cette bière ne peut être vendue que fraiche, tandisqu'a Londres elle ne se vend
que tout a fait acidifiée et corrompue par des Lactobacillus.

*) Pendant la correction de cette étude pour la presse vicnt de paraitrc: VV. H cniic-
berg. Zur Kenntniss der Milchsaurebactericn der Brennercimaische, der Milcb und des
Bieres, Wochenscbrift für Brauerei, 1901, N°. 30.

57

donnera des éclaircissements multiples sur l'origine des formes, et peut-être sur les
causes intimes de la variabilité en général.

La pratique de la science nous oblige partout a classifier ; dans ce cas aussi je
suis dans la nécessité de coordonner les formes dans un certain nombre de types
dont l'étendue correspond environ a la conception ordinaire d'espèce. Voici quelques-
unes des plus importantes.

Passant sous silence pour Ie moment les L. fermentum et L. delbrücki, pro-
ducteurs du levain lactique, nous rencontrons en premier lieu Ie LactobacUlus
caucasicus, dont les zooglées sont bien connues sous Ie nom de grains de Kéfyr ^).
D'abord je croyais que Ie Kéfyr devrait nécessairement contenir aussi une certaine
espèce de levüre, Ie Saccharomyces Kéfyr, mais des recherches ultérieures
(Mit démontré que Ie LactobacUlus caucasicus seul peut produire lentement, a des tem-
pcratures basses, sur du petit lait gélatinisé de petits »grains de Kefyr« solides et
cartilagineux, ressemblant parfaitement, sauf leur petitesse, aux grains du commerce,
et qui sont exempts de toute infection étrangère, d'oü il s'ensuit que les autres
symbiontes qu'on trouve plus ou moins généralement dans les grains ne sont que des-
habitantes accidentaux 2). Mais la variabilité du L. caucasicus est excessive. Les
petits grains des cultures se décomposent lors du transport en de petites colonies
molles ramifiées ou non ramifiées, de couleur blanche ou jaune et parfois visqueuses,
mais toutes tres différentes du souche original; toutefois, ces dernières qualités, et
spécialement la viscosité, sont tres inconstantes.

Le L. caucasicus se trouve toujours en petit nombre dans Ie levain lactique de
la fabrique néerlandaise de levüre et d'alcool a Delft et en peut être porté en culture
pure par des transports réitérés dans du mout liquide a 37° C. ou au-dessous de
37° C. Déja après le quatrième transport j'ai trouve, en certains cas, le L. caucasicus,
qui avait transplanté les vraies bactéries du levain, c. a. d. les L. delbrücki et
L. fermentum, tout seul. Cultivé de cette maniere le L. caucasicus produit, sur du
mout gélatinisé, a 23" C, de petites colonies blanches, formées de bacilles droits,
assez courts. La culture a 23° C. sur du moiit gélatinisé est aussi la meilleure
methode pour obtenir l'espèce en culture pure directe du levain lactique, les ferments
propres du levain, les L. delbrücki et L. fermentum, ne pouvant se développer a cette
température. Hors les L. fermentum et L. delbrücki qui ne fermentent pas le
lactose, le L. caucasicus qui produit l'acide lactique aussi bien du maltose que du
lactose, est la seule espèce du genre avec laquelle on puisse préparer un levain
lactique a acidité suffisante. Toutefois l'emploi de ce bacillus me semble dangereux
pour l'industrie de levüre car il peut vivre et se multiplier dans la fermentation
alcoolique principale au-dessous de 25" C, ainsi que dans la levüre de boulanger
elle-même dont il est un agent actif de corruption et oü il se trouve assez
généralement répandu. Pour l'isoler de la levüre de boulanger on peut cultiver
celle-ci dans du mout a 40" C. Cette température est trop haute pour la levüre
elle-même ; il n'y a que les ferments lactiques (et une levüre sauvage, le
Saccharomyces fragrans) qui puissent se développer dans ces circonstances et dans

') A comparer mon article: Sur le Kéfyr, Ces Archivos T. 23, pag. 428. 1891.
*) M. Fraude nreich a ahouti a la mème conchision (Centralb. f. Bactériol. 2= Abt.
Bd. 3, pag. 47, 1897).

58

ce cas Ie L. caucasicus peut être isolé sur des plaques de mout gélatinisé. Encore
peut-on éloigner de ces cultures Ie 5". fragrans par la »lactisation« dont il sera
question dans § 3 et qui laisse seul les Lactobacülus vivants.

Dans les dernières années il se trouve dans Ie commerce une culture d'un
Lactobacülus recommandé pour en préparer Ie levain dans les distilleries. C'est Ie
L. acidiücans longissimus de M. Laf ar^). Dans un échantillon qu'on me présenta,
je trouvai une forme du L. caucasicus. Pour completer les observations sur la
distribution de cette espèce je dois faire mention de l'apparition reguliere d'une de
ses variétés dans Ie fromage hollandais, oü elle cause, en symbiose avec Ie
Lactococcus lactis, l'acidité importante de ce produit, laquelle est de 15 a 20 cM^
d'acide normal sur 100 grs. de fromage.

Une espèce tres voisine du L. caucasicus, connue depuis plusieurs années dans
mon laboratoire sous Ie nom de L. longus, est obtenue par l'expériment suivant.
Quand on laisse Ie lait frais et bien aéré pendant deux ou plusieurs jours a des
températures de 25" a 33° C, il s'acidifie par l'acide lactique dextrogyre produit par
Ie Lactococcus lactis jusqu'a 8 ou 10 cM^ mesure en acide normal par 100 cM^ du
lait. Si l'on place ce lait aigri dans l'étuve a 37*', ou même a 40" C, il se forme
une nouvelle quantité d'acide lactique, maintenant lévogyre, par un Lactohacillus, Ie
L. longus, qui se distingue facilement du L. caucasicus par l'absence complete de la
faculté de produire l'acide lactique du maltose.

D'autres espèces sont obtenues de la maniere suivante. Si l'on exposé la levüre
de boulanger a la corruption spontanée en la plaqant dans l'air humide a 30° C,
et l'ensemence après trois ou quatre jours sur du mout gélatinisé, il se développe,
outre Ie L. caucasicus, deux autres espèces assez caractéristiques, nommées dans
mon laboratoire L. fragilis et L. conglomeratus. La première est aisément reconnue
par la grande différence de largeur dans les fragiles bacilles de la même colonie,
tandisque les colonies de l'autre sont composées de fils et de bacilles si merveilleuse-
ment contournés et tortillés qu'on peut a peine se convaincre que ce sont réellement
des bactéries*). On peut retrouver ces mêmes et encore d'autres espèces dans la
vinasse spontanément acidifiée.

Ponr Ie reste il serait inutile de multiplier davantage ces cxemples de formes
peu connues sans des descriptions tres minutieuses.

2. Caractères généraux des ferments lactiques actifs.

Avant de terminer l'aperqu cursoire des plus importants ferments lactiques
actifs, il me faut signaler quelques caractères généraux par lesquels toutes les
espèces se distinguent des autres microbes et qui rendent facile la recognition de
leurs colonies même au milieu d'innombrables colonies d'autres espèces.

En premier lieu on les reconnait, sauf a la haute acidité produite dans tous les
milieux nourriciers sucrés et a l'absence complete de mobilité, a la petitesse de leurs

') Technische Mycologie Bd. I, p. 223, Jena 1897.

-) A ce que je crois ce sont des variants du L. caucasicus, Ie mot «variant* pris
dans Ie sens que j'y ai attaché dans ces Archives 2"^^ Série. T. 6, pag. 5, 1901. Pourtant,
comme je n'ai pas vu directement la transition, je dois, pour Ie moment, les considérer
comme des espèces particulières.

59

cölonies sur uu substratum solide, mênie dans des conditions les plus avaiitageuses
de nutrition. Pourtant, comme il y a nombre de microbes qui restent chétifs sur des
substrata gelatinisés eet indice seul ne suffit pas a la recognition. Mais les ferments
lactiques actifs deviennent tout a coup visibles, parmi les mélanges les plus
compliqués, par l'application du peroxyde d'hydrogène en solution aqueuse de 3%
OU plus. Ce corps possède la qualité remarquable de rester inaltéré au contact de
tous les ferments lactiques actifs tandisqu'il se transforme presque subitement en eau
el en oxygène libre par Ie contact avec tous les autres corps vivants ou bien avec
les parties de ces corps, soit vivants, soit nécrobiotiques '), n'importe la classe du
système naturel a laquelle ils appartiennent. La manipulation de cette réaction est
tout a fait simple: la culture se fait sur une plaque solide et quand toutes les cölonies
sont devenues bien visibles, on dépose une goutte de peroxyde d'hydrogène sur les
cölonies qu'on veut déterminer. Sauf dans Ie cas oü ces cölonies sont des ferments
lactiques et oü la goutte reste translucide, il se forme après quelques secondes des
bulles d'oxygène visibles a l'oeil nu.

La mort ne suivant que tres lentement par Ie contact avec Ie peroxyde on a
tout Ie temps d'enlever les cölonies inertes de la plaque pour des cultures prochaines.
Cette réaction se prête tres bien a la démonstration si l'on verse une quantité
sufïisante du peroxyde sur la surface entière d'une plaque contenant des cölonies de
ferment lactique parmi d'autres espèces. J'ai découvert cette réaction en 1893 ^).
Plus tard Mr. L o e w a donné Ie nom de »catalase« au principe inconnu dont depend
la décomposition du peroxyde^). Par des recherches ultérieures j'ai trouvé que
seulement quelques variétés de bactéries acétiques peuvent rendre la réaction douteuse
pendant quelques minutes, ces variétés ne possédant qu' un faible pouvoir de
décomposition *). Mais avec un peu de patience on verra qu'aussi tous les
Acetohacter produisent a la fin des bulles de gaz. Dans la nomenclature de
M. L o e w les ferments lactiques actifs seraient donc les seuls êtres vivants a qui
manque la catalase.

Une réaction importante, apparemment commune a tous les ferments lactiques
actifs, mais par l'intensité de laquelle les Lactobacillus se distinguent des Lacto-
coccus, est la production de mannite du lévulose '■'). Si l'on cultive Ie Lactobacillus
fcrmentum, que jai étudié spécialement dans cette direction, dans de l'eau de levüre
a 10% de lévulose et a 37° C. on trouvera après trois jours une acidité de ca. 14 cM*
d'acide normal pour 100 cM*, si l'on évapore alors jusqu'a consistance sirupeuse

*) J'appelle »nécrobiose« de la cellule la mort du protoplasma, les enzymes restant
actifs. A comparer mon travail: Further researches on the Formation of Indigo from
the Woad. Proceedings Acad. of Sciences Amsterdam, 30 June 1900, pag. 114.

') Naturwissenschaftliche Rundschau Bd. 8, p. 671, 1893.

') Catalase, a new Enzyme of general occurrence, Washington Report of the U. S.
Department of Agriculture 1901, pag. 47.'

*) Il n'est pas douteux que dans la classification naturelle les ferments lactiques
et acétiques ne soient tres voisins. J'en connais une espèce intermediaire produisant
les acides lactique et acétique du sucre en égales quantités, et qui se trouve dans les
tanneries de cuir a écorce de chêne. Cette espèce décompose Ie peroxyde d'hydrogène
assez facilement.

*) Q ayon et Dubour g, Sur les vins mannités, Ann. de l'Inst. Pasteur, T. 8, p. 108,
1894. Sur la Fermentation mannitique. Ibid. T. 15, pag. 527, 1901.

6o

on voit après un ou deux jours toute la masse du sucre non acidifié cristallisée en
mannite. Chez Ie glucose, Ie maltose et Ie galactose la partie non acidifiée est
retrouvce inaltérée. Le saccharose produit du mannite en assez grande quantité
parceque Tacide lactique provoque l'inversion d'une partie de ce sucre produisant
du lévulose.

Les Lactococcus donnent dans les mêmes circonstances de culture une beaucoup
plus petite quantité de mannite, transformant, comme dans le cas precedent, le
k'vulose seul.

Un autre caractère marquant de nos microbes c'est qu' il n' y a que les peptones
qui puissent leur servir de source d'azote, les peptones animales avec quelque
difficulté, les végétales plus facilement. lis n'ont pas le moindre pouvoir peptonisant
envers les corps protéiques, en conséquent aucun d'eux ne peut liquéfier les plaques
de gelatine. Enfin la croissance de nos ferments est seulement possible quand il y
a des carbohydrates dans l'aliment; on chercherait donc en vain ces microbes sur les
plaques de bouillon gélatinisé sans autre addition, n'importe l'ensemencement des
plaques.

Il me faut encore envisager ici une autre question de quelque importance. La
fermentation lactique dépend elle directement de la vie, ou peut-on démontrer la
présence d'un enzyme qui transforme les carbohydrates en acide lactique?

Afin de trouver la solution de ce problème j'ai cultivé a 37° C. le L. caucasicus
déja mentionné, en grande quantité sur la surface d'une plaque de mout solidifié au
moyen de gélose, j'enlevai les minces colonies avec une spatule de platine et de cette
maniere je recueillis un assez grand nombre de bactéries vivantes. Je les mis
ensuite dans une boite de verre, a cóté d'un verre de montre avec du chloroforme;
je les y laissai pendant une heure pour les tuer, prenant pour indice de la mort
rimpossibilité de croissance dans les meilleurs milieux de culture connus ^). Puis je
mis les cadavres du Lactohacillus dans des solutions de divers sucres, et aussi dans
du mout a des températures convenables. Comme je n'ai pu apercevoir dans ce cas
aucune altération dans la réaction avec le tournesol, je dois conclure que la fermen-
tation lactique ne dépend nullement de la présence d'un enzyme mais doit être rangée
parmi les proces cataboliques, c. a. d. parmi les décompositions sous l'influence directe
du protoplasme vivant, dont j'ai décrit quelques exemples ailleurs -).

3. Le levain lactique de l'industrie.

Le levain lactique de l'industrie est préparé selon diverses manières, correspon-
dant aux divers systèmes suivis dans la fabrication de la levüre de boulanger. Les
plus importants parmi ces systèmes sont la préparation de la levüre dite »de Vienne«
et de la levüre dite »a air«.

') Je sais tres bien que eet indice est sujet a critique et que l'impossibilité de
croitre ne serait jamais considérée comme une preuve décisive de la mort pour les
organismes supérieurs adultes. Cependant pour les microbes il n'existe pas d'autre
réactif général démontrant l'existence de la vie hors la niultiplication.

-) Ces Archives. Sér. H, T. 3, pag. 338, 1900.

6i

Avant de dccrire la fabrication du levain il ne sera peut étre pas superflu de
tracer en grandes lignes les principes généraux des dites industries. L'une et l'autre
consistent essentiellement en deux fermentations alcooliques successives, la »pro-
fermentation« et la »fermentation principale*, dont la première produit la levüre
semence pour la seconde. La profermentation s'accomplit dans Ie levain lactique
qu'on mélange avec une certaine quantité de levüre de commerce qui s'y multiplie
énergiquement. Le produit de la profermentation, Ie »levain alcoolique«, est donc la
levüre semence des grandes cuves a fermentation principale, d'oü l'on tire la
levüre et l'alcool pour le commerce.

Dans la methode viennoise la fermentation lactique et les deux fermentations
alcooliques s'accomplissent au milieu des particules de farine de malt, de mais ou de
seigle, ce qui nécessite la stparation subséquente de la levüre par tamisation. Dans
ce procédé le levain lactique est donc une masse consistante qui doit être diluée avec
de l'eau ou de la vinasse pour acquérir la fluidité nécessaitre a la fermentation
alcoolique.

Chez la fabrication de la levüre a air au contraire, tout le travail a lieu dans
du mout clair, préparé par filtration préalable, comme dans les brasseries de bière.
Le levain lactique dans ce cas est donc du mout complètement liquide, acidifié par les
ferments lactiques, et c'est dans ce liquide acide que s'accomplit la profermentation
dont le produit est un »levain alcoolique« liquide. La fermentation principale est
induite par moyen de ce levain dans du mout liquide et filtré aussi. C'est enfin par
sédimentation et filtration qu'on récolte la levüre.

Les ferments actifs étant les mêmes dans les levains liquides et semiliquides
des deux methodes, il suffira de décrire mes recherches sur le levain lactique utilisc
dans le système viennois, que j'ai étudié minutieusement.

On préparé ce levain de la maniere suivante ^). Environ deux parties de farine
de malt sec et une partie de farine de seigle sont mélangées intimement avec la
plus petite quantité possible d'eau tres chaude qui peut conduire a la temperature
finale de 63° C. du mélange. On obtient ainsi une masse homogene, sans grumeaux,
de consistance demi-fluide, mais trop épaisse pour contracter des courants par
différences de chaleurs.

La temperature de 63" C. est préconisée la meilleure pour la saccharification de
l'amidon par l'amylase. L'infection avec le ferment lactique se fait dans la matière
chaude au moyen d'une petite quantité d'un levain lactique antérieur. On laisse
ensuite la pate refroidir lentement et tres paisiblement, toute secousse des cuves
contenant le levain étant nuisible par la »rupture« et le »coulement« des colonies du
ferment lactique qui se forment partout mais doivent rester intactes dans un bon
levain. Toute la masse se refroidit dans trois jours de 63° C. a 37" ou 40" C, degré
de chaleur tout prés de l'optimum pour le développement du ferment (41" C), ce
qui prouve que l'acide se forme exclusivement au-dessus de eet optimum. On trouve
a la fin une acidité variant entre 12 et 18 cM^ d'alcali normal exigé pour la
neutralisation de loo cM' de levain. Cela n'est pas du tout le maximum d'acide
qui puisse se former dans la masse. Si par exemple on abaisse la temperature au

') Pour plus de détails je renvoie au travail de M. J. Effront, Etude sur Ie
levain lactique. Annales de I'Institut Pasteur, T. 10, pag. 525, 1895.

62

commencement il est possible d'obtenir une acidité même de 25 cM*. Mais ce n'est
pas cette haute acidité que cherche l'industrie *).

En determinant la densité d'un levain après l'avoir dilué et filtré, on la trouve,
tant avant que après l'acidification, d'environ 24" du saccharomètre de Balling.
Mais a la fin de la profermentation qui s'accomplit dans Ie levain acide après
l'infection avec la levüre alcoolique elle sera abaissée a I2''B., d'oij l'on voit que Ie
premier développement de la levüre s'accomplit en des circonstances d'alimentation
et d'acidité tout a fait extraordinaires.

L'image microscopique du levain acide se distingue toujours par une grande
conformité et ferait croire qu'il ne s'y trouve qu'une seule variété de bactéries. Ce
sont des bacilles de 1,5 |i de largeur et d'une longueur assez variée. Tous les bacilles
vivants sont transparents et homogènes; mais après la mort des granulations
apparaissent ressemblant a celles qu'on remarque chez VAérobacter coli. La grande
conformité microscopique n'existe qu'en apparence, car l'analyse bactériologique
montre que Ie levain contient un tres grand nombre de variétés de ferments lactiques
qui toutes sont plus ou moins héréditairement constantes lors de la multiplication.

Aussi on se tromperait bien en croyant que Ie levain lactique industriel est un
produit de grande égalité. Prenant pour mesure les titres en acidité obtenus dans
les mêmes temps, par exemple en trois jours, on trouve dans la pratique des
divergences considérables. Ces divergences ne sauraient être expliquées par les
difïérences de composition des farines, mais elles sont intimement liées avec la
condition bactériologique du levain. Ainsi on peut rencontrer dans les levains
lactiques de l'industrie en patés des titres en acide variant entre 15 et 25 cM^ d'acide
normal pour 100 cM^ de levain, les conditions de fabrication étant parfaitement
égales. Ces difïérences se repetent, et même s'agrandissent par l'inoculation au
laboratoire de tres petites quantités de ces levains dans du moiit frais liquide, ou
dans des patés de farine, ce qui sera démontré dans § 4.

Les ferments lactiques ne produisent jamais de spores; c'est pourquoi les moüts
OU patés de farine bouillies ne contractent la fermentation lactique que par une
infection de dehors. Mais l'étude de la distribution de ces ferments a démontré
que les formes actives caractéristiques pour Ie levain ne se rencontrent dans la
nature que tres rarement, et que seul dans les distilleries elles sont fréquentes. Ce
sont donc, pour ainsi dire, des plantes cultivées qui prolongent leur existence dans
des conditions exceptionnelles, et il est certain que les farines brutes ne les
contiennent pas ou dans un nombre extrêmement restreint. L'expérience des
praticiens est en accord avec cette observation, car ils savent que dans une distillerie
ou dans une fabrique de levüre nouvellement installée il est impossible de faire un
bon levain de malt sans infection par un levain préalable. Aussi dans les laboratoires
on ne voit jamais apparaitre une fermentation lactique sans infection artificielle.
Tout au contraire, plusieurs autres fermentations dont les germes sont répandus
partout, particulièrement les fermentations butyrique, lacto-acétique et a Aërobacter,
se déclarent spontanément dans les moüts et les patés de farine sous diverses
circonstances.

*) Quand dans la suite je ferai mention d'acidité j'en indiquerai toujours la pro-
portion de la même maniere. Une acidité de 10 cM^ signifie donc la présence de 0,9 "/o
d'acide lactique; de ii,i cM' la présence de i "/o d'acide, etc.

63

Mr. E f f r o n t, qui a discuté (1. c.) habilement les diffcrentes théories du levain,
est venu a la conclusion que Ie but principal en est de porter la levüre, au moyen
de Ia concentration élevée des aliments et de l'acidité pendant la profermentation,
a un état de grande activité lors de sa transmission dans les cuves de la fermentation
principale. Quoique en principe, j'accepte cette maniere de voir, il me semble que
Mr. E f f r o n t n'a pas suffisamment reconnu l'action vraiment remarquable du
levain sur toutes les fermentations nuisibles susdites. C'est un fait acquis, — point
de départ pour un experiment de laboratoire recommandable, — que toutes ces
fermentations, aussi bien dans Ie mout liquide que dans les patés de farine brutes
uu saccharifiées, ne se déclarent pas lors de la présence d'un assez grand nombre
de germes du ferment du levain lactique ou du Lactobacülus caucasicns ^).
L'explication se trouve dans la grande intensité avec laquelle les deux dits ferments
transforment Ie sucre en acide lactique, nuisible aux germes des fermentations
étrangères.

Encore une autre circonstance biologique réalisce dans un bon levain en
augmente la grande valeur pour l'industrie. C'est Ie fait que la methode du levain
élimine d'une maniere assez complete de la levüre de boulanger, produit d'après Ie
système viennois^), les Lactobacülus de corruption, c. a. d. les L. caucasicns, fragilis
cl conglomeratus et peut être d'autres espèces 3). La biologie de tous ces microbes
étant tres imparfaitement connue, l'industriel pourrait seulement être guidé par des
tentatives multiples de pure empirie pour les combattre. Au laboratoire il n'est pas
possible de reproduire exactement les manipulations de l'industrie, et c'est pourquoi
Texplication du fait est encore incertaine. En efïet dans mes propres tentatives avec
un mélange des L. caucasicns et fermentum j'ai en vain cherché des conditions de
culture qui éliminassent totalement la première espèce, tandisque dans l'industrie
c'est toujours Ie L. fermentum qui remporte la victoire décisive.

Pour bien comprendre l'utilité du levain dans la purification de la levüre il faut
encore fixer l'attention sur l'anaérobiose presque complete de la cellule pendant la
profermentation, d'oü il résulte que les germes purement aréobies, presents dans la
levüre semence, c'est a dire les bactéries acétifiantes, les Mycoderma et les
moisissures ne peuvent se multiplier, tandisque chaque cellule de la levüre elle-même
produit moyennement trois descendants. Le nombre des nouvelles générations
pendant la fermentation principale est seulement deux, et cela pendant une aération
beaucoup plus abondante. La comparaison de ces nombres de multiplication peut
servir a éclaircir la grande influence de l'état de nutrition de la cellule dans le levain
sur le rendement final.

*) Les autres Lactobacillns et les Lactococcus ne possèdent pas ou seulement a un
moindre degré le pouvoir d'empêcher les fermentations étrangères,

*) Chez la levüre a air les conditions ne sont par les mêmes, parceque les germes
de corruption n'y sont pas identiques a ceux de la levüre viennoise.

') Au moins dans les usines oü cette methode se trouve dans sa perfection. Dans
les petites fabriques, par exemple a Schiedam, il n'y a pas question de cette perfection,
et il est bien connu que la levüre fabriquée la est plus susceptible de corruption que
celle des grandes installations. Les methodes microbiologiques démontrent que les
germes de corruption sont dans ce cas les Lactobacülus caucasicns, fragilis et conglo-
meratus.

64

Je ne saurais finir eet aperqu de la signification du levain, sans parier de la
fermentation alcoolique spontanée qui se produit presque toujours dans les patés de
farine acidulées et exposées a des températures entre 28" et 37" C. Bien loin
d'entraver cette fermentation dans la masse non acidulce les ferments lactiques la
favorisent au plus haut degré par la génération d'acide, ainsi produisant un véritable
»levain alcoolique spontané« ^). On peut tirer de ce levain plusieurs espèces de
»levüres sauvages«, la surface aérée du mélange se couvrant de Miicor, spécialement
de M. racemosus. Mais il va sans dire que la fermentation alcoolique considérée ici,
quoique sous l'influence de levüres étrangères, a peu de signification pour l'industrie
qui prepare son levain alcoolique par l'ensemencement du levain lactique avec la
levüre de boulanger, elle-même toujours riche en levüres sauvages. Aussi il faut
considérer que Ie levain lactique est préparé entre les températures de 63" et de 40" C,
ce qui exclut presque complètement la reproduction des levüres alcooliques et tue,
même la levüre de boulanger, tandisque Ie Saccharomyces fragrans, qui reste vivant
seulement dans la surface du levain et auquel je reviendrai tout a l'heure, n'est
aucunement nuisible.

Abstraction faite de l'alimentation de la cellule levüre, nos observations sur la
signification du levain lactique et du levain alcoolique qui en résulte par la pro-
fermentation, se résument ainsi:

Par l'anaérobiose dans Ie levain pendant la profermentation la levüre alcoolique
est purifiée de la plupart des germes aerobics de corruption.

Aussi les plus redoutables ferments de »corruption acide« de la levüre, les
Lactobacillus caucasicus, fragilis et conglonieratus sont éliminés de la levüre par
l'usage d'un bon levain.

Les ferments lactiques propres au levain sont, par un bon travail au-dessus de
leur température optimum, mis dans un état presque parfaitement inofïensif pour la
levüre.

Dans les moüts liquides et les patés de farine la présence du Lactobacillus
fermentmn rend impossible la fermentation butyrique et les autres fermentations
anaérobies étrangères.

4. Expériments d'infecHon au lahoratoire avec Ie lavain lactique.

Le levain brut employé dans les expériments que je vais décrire, contient
souvent des levüres alcooliques et particulièrement une espèce »sauvage« qui ne fait
pas fermenter le maltose, mais bien le saccharose, et qui est aussi tres commune
dans toutes les levüres hollandaises. Je l'appelle Saccharomyces fragrans puisque
lors de sa croissance en présence de glucose elle dégage un peu d'acétate d'éthyle.
Elle mérite quelque attention a cause de sa grande vitalité et de son tres haut
maximum de croissance, trouvé un peu au-dessus de 41° C. Pourtant j'ai réussi a
tuer cette levüre, sans dédommager les Lactobacillus, en chaufïant les levains
employés pour les expériments d'infection, pendant un quart d'heure a 65° C. On
peut se servir d'une chaleur plus forte encore, les Lactobacillus du levain supportant
méme la température de 70° C. pendant 25 minutes, quand ils se trouvent dans du

') En Hollandais «zuurdeeg*

65

mout liquide. )e veux appeler »lactisation« cette manipulation qui permet de séparer
tres facilement les Lactobacillus dudit Saccharomyces comme aussi de tous les autres
microbes. Les espèces sporogènes sont ici sans signification puisqu'elles ne se
développent pas en présence de l'acide produit par les ferments lactiques eux-mêmes.
Quant a la methode de culture suivie dans les expériments je préféré du mout
liquide d'une densité de lo" Balling. L'air ayant une influence décisive sur
I'acidification il est prudent de comparer les différences entre les cultures en matras
a fond plat et celles en vase clos. Pour les dernières on peut employer de petites
bouteilles qu'on remplit tout a fait et sans bulle d'air sous Ie bouchon a l'éméri. Le
mout inoculé avec le levain est place dans l'étuve a 37" C.

La lactisation doit être pratiquée dans tous les cas oü l'on fait les cultures
a des températures de 37" C. ou plus bas, si non, les levüres alcooliques rendant
I'acidification incertaine. Pour les expériments conduits au-dessus de 40", oü la
fermentation alcoolique est presque complètement impossible, la lactisation n'est pas
absolument nécessaire mais aussi alors il est préférable de s'en servir.

Après ces observations préliminaires nous pouvons procéder a notre sujet.
Si l'on fait des prises lactisées sur du levain industriel a divers endroits d'une
même cuve, par exemple a la surface, au milieu, aux cótés, etc, pour en infecter les
moüts ou les patés de farine au laboratoire, on trouvera de grandes différences entre
les acidités obtenues et cela d'après la régie suivante: Toutes les localités des cuves
refroidies le premier, contiennent des bactéries d'un grand pouvoir acidifiant ; toutes
celles qui se sont refroidies le dernier contiennent des bactéries d'une faculté fermen-
tative atténuée. La difficulté de faire de bonnes prises dans une masse semi-fluide
rend cette maniere d'expérimenter tant soit peu incertaine. Comme pourtant la
question est de grande signification j'ai fait la-dessus de longues séries d'expériments
qui m'ont donné la certitude que la dite régie est tout a fait correcte. Aussi nous
en trouverons la corroboration et l'explication lors de la discussion des résultats
obtenus avec les cultures pures, ce qui rend superflu de donner des chififres ici.

Mais les expériments d'infection avec du levain démontrent une autre circon-
stance non moins importante.

C'est qu'il existe une variation notable entre les prises , originaires de diverses
cuves de levains quand ceux-ci ont été agités si énergiquement que les difïérences
des localités susdites en disparaissent, et que chaque prise de la même cuve, comme
un étalon moyen, donne environ le même résultat en acidité. C'est ce qui s'ensuit
des expériments exposés cidessous, qui ont été faits d'après la methode décrite plus
haut, soit dans des matras a fond plat (»a rair«), ou dans de petites bouteilles
fermées (»sans air«). Le volume des moüts infectés pour chaque experiment était
de 50 a IOC cM^.

Avant de décrire l'expériment principal, je dois remarquer que la quantité de
matière employee pour l'infection est seulement appréciable pendant les deux
premiers jours; au troisième jour elle peut être négligée, ce cjüe l'on voit des données
suivantes:

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel.

66

Quantité de levain
inoculé.

Date de l'ihfection.

Date du titrage.

Titre en

acide.

A Tair.

Sans air.

Traces

24 Juin

26 Juin

8

II

27 „

12

13

2 Gouttes

24 „

26 „

9.5

11,5

27 „

. II

12

20 Gouttes

24 „

26 „

9.5

12

27 „

12

12

Les cliiffres suivants peuvent servir pour montrer l'influence de l'origine des
ferments. Les titrages ont été exécutés après trois jours de culture.

Provenance des ferments emplovès

Acid

té obtenue après trois jours dans
du mout liquide.

pour l'inoculation.

A l'air.

Sans air.

ire Cuve

8

12

2me

12

H

3">e „

7

10

4me „

8,5

II

5me ,,

6

8,

On voit de ce tableau que l'influence de la cuve dont on a pris les ferments
pour l'infection est considérable. Un autre résultat qui s'en dégage c'est que l'air
entrave l'acidification. Pour bien apprécier les chifïres il faut savoir que si les
ferments dans Ie levain avaient possédé toute leur énergie, l'acidité aurait monté au
troisième jour, dans ces conditions de culture, jusqu'a 17, aussi bien a l'air que sans
air, tandisque elle est restée maintenant a 13 au plus haut et est arrivée dans
quelques cas, seulement a moitié de la hauteur qu'elle aurait pu atteindre avec des
ferments actifs. Mais je n'ai jamais pu parvenir au chiffre 17 hormis les cas que
je me servais de cultures pures.

On voit de ce qui précède combien grandes sont les difïérences qu'on doit
attendre dans ces sortes d'expériments.

Il serait fatiguant de multiplier ces exemples ; seulement il me reste a remarquer
que j'ai fait une longue série d'expériments analogues, dans lesquels les acidités ont

67

varit entre i cM'' et 15 c\P d'alcali normal pour 100 cM» de mout, et que dans les
transports successifs les mêmes dift'érences se sont reitérées, c. a. d. que Ie pouvoir
acidifiant des ferments est dans chaque cas hereditaire. Je dois avouer que ces
résultats m'ont paru obscurs jusqu'au moment oü j'en ai trouvé l'explication dans
l'influence de la chaleur et de l'anaérobiose sur la variabilité du ferment lactique.

Les conclusions tirées des expériments d'infection avec Ie levain lactique de
l'industrie contenant exclusivement les ferments lactiques sans autres microbes, sont
les suivantes:

I*'. Il y a une grande ditïérence entre les acidités obtenues avec des matériaux
pris dans la même cuve mais a des localités qui se sont refroidies différemment.

2°. Il existe aussi une difïérence considérable entre les acidités obtenues avec
les étalons moyens pris sur difïérentes cuves de levain.

3". Ces difïérences sont héréditaires. Elles sont beaucoup plus faciles a observer
dans les expériments a moiit liquide dilué, que dans les patés de farine.

5. Le Lactobaciliiis delbrücki^).

Il n'est pas du tout difficile d'isoler des ferments lactiques du levain. Pour
nioi, je l'ai déja fait en 1885, et Mr. Leichmann, qui expérimenta en 1896 -),
a donné une courte description de la variété trouvée le plus facilement, et qui'1
nomma Bacillus delbrücki. Je veux accepter ce nom, mais je dois faire observer
que je l'appliquerai non pas a une seule variété, mais a toutes celles qui se laissent
isoler facilement a l'air de tout étalon de levain par la methode du mout a gélose.
Pour moi le nom de Lactobaciliiis delbrücki comprend donc toute une série de formes
tres proches entre elles et héréditairement assez constantes.

Les différences morphologiques entre ces variétés sont petites, c'est pourquoi la
description d'une seule en peut donner une image assez exacte. La distinction se
déclare dés qu'on va comparer des cultures de ces variétés dans du mout liquide aéré
et sans air, et qu'on dose l'acidité obtenue dans ces circonstances. Les colonies sur
Ic mout a gélose sont blanches ou jaune-clair, et plus ou moins crénélées au bord.
Leur grandeur est tres variable mais tant soit peu constante pour la même variété.
Leur temperature minimum de croissance étant au-dessus de 25" C, il n'est pas
possible de les cultiver sur gelatine. Pourtant avec des matériaux dérivés de cultures
liquides ou sur gélose, on peut se convaincre que ni la gelatine, ni d'autres corps
protéiques n'en peuvent être peptonisés, ce qui est d'intérêt pour la theorie du levain.

L'image de L. delbrücki est tres interessant et caractéristique quant au.v colonies
croissant sur gélose a mout a ?7° C, et fraichement isolé d'un levain industriel. Sur
ce substratum les bacilles peuvent devenir tres larges et en même temps plus ou
moins allongés, ce qui leurs donne un aspect irregulier. Cette irrégularité est encore
rehaussée par les formes fantasques de la majorité des individus qui sont contournés
ou enroulés, ou se présentent comme des cercles. La largeur moyenne des bacilles
est environ de 1,5 |i, mais dans les cultures renouvelées sur un substratum solide frais

') Le nom correct de cette bacterie serait Lactobacillus fenneniuiii var. delbrücki.
Pour la simplicité j'écris seulement L. delbrücki.

") G. Leichmann. Ueber die im Brennereiprocesse spontan auftretende Milcli-
sauregarung. Centralblatt für Bacter. 2te Abth. Bd. 2^ pag. 284, 1896.

68

on remarque des divergences vraiment extra-ordinaires entre les individus de la
méme colonie qui peuvent varier de 1,2 a 3ji; aussi il s'observe plusieurs articules
dont la largeur egale ou même dépasse la longueur. Dans les cultures liquides on
n'observe rien de cette polymorphie, tous les individus étant alors des bacilles droits
seulement variant en longueur et mesurant environ 0,6 a 0,7 ja en largeur. Dans les
cultures vieillies on voit apparaitre dans beaucoup d'individus des contours fort pro-
noncés et deux ou trois granules polaires ou médianes; ces individus ont perdu leur
pouvoir de reproduction.

Quant aux phénomènes de la nutrition avec les carbohydrates et les corps azotés,
ils correspondent assez exactement a ceux du L. fermentum et seront discutés dans
§ 6. Il est vrai que la respiration, si différente pour les deux fornies, doit nécessaire-
ment influer sur la nutrition proprement dite, et c'est l'acidification, déja traitée
ailleurs, qui en donne une idee approximative.

J'ai reconnu que les différentes variétés du L. delbrücki ne constituent pas
Tagent inaltéré de la fermentation lactique du levain et qu'il est impossible de pro-
duire Ie levain industriel parfait par la culture pure ni d'une seule variété, ni de
plusiers variétés ensemble. La raison en est que l'acidité reste de beaucoup trop au-
dessous du titre désiré dans les trois jours que l'industrie accorde pour la fabrication.

Plusieurs tentatives ont été faites dans cette direction en suivant rigoureusement
les régies prescrites par l'industrie, c. a. d. en inoculant a environ 63" C. avec la cul-
ture du ferment, soit les patés de malt, soit les moüts liquides a 50° C. et laissant
refroidir jusqu' a 40° C. dans trois jours, mais tous mes efforts ont été infructueux,
l'acidité définitive restant tres basse, i a 5 cM^, par exemple. De nouvelles inocular
tions pratiquées avec ces levains artificiels donnent Ie même résultat, pour peu qu'elles
ne résultent pas dans la perte totale du ferment et de l'acidification ce qui est Ie cas
ordinaire. Il est donc certain que Ie L. delbrücki n'est pas identique au ferment
actif d'un bon levain.

Pourtant nous verrons plus loin que Ie L. delbrücki est un descendant direct du
ferment réel du levain, comme celui-ci se dérive en certaines circonstances du premier.
J'ai fait les expériments qui ont démontré ce fait curieux non seulernent avec des
moüts liquides mais aussi avec des patés de farine de malt et de seigle, préalablemcnt
bouillies ou stérilisées.

Pour montrer combien étranges sont au premier abord les titres en acide produits
par Ie L. delbrücki, je donne ci-joint un tableau qui, a gauche, montre l'origine de la
culture de cette bacterie prise pour l'infection, et a droite, les acidités après trois jours a
37° C. dans du mout liquide, ou dans une pate de farine semi-fluide saccharifiée et
stérilisée, saccharifiée et pasteurisée et non saccharifié non stérilisée. Dans les patés
l'air n'a pas acces. Les matériaux d'infection b. c, d, a gauche proviennent des cul-
tures (b), (c), (d), indiquées a droite.

Pour les patés pasteurisées je me suis servi de préparations faites de la maniere
ordinaire suivie dans la fabrication du levain. Mais ici une précaution est de rigueur:
toute infection spontanée par Ie ferment lactique lui-même doit être exclue.

C'est pourquoi ces expériments ne peuvent s'opérer qu'au laboratoire et non pas
dans une fabrique oü ces ferments sont tellement répandus dans l'air, sur les usten-
siles et sur Ie bois des cuves qu'ils infectent les moüts et les patés presque certaine-
ment. Dans Ie laboratoire on ne rencontre pas eet inconvénient; tout au contraire,

69

quand on y veut préparer un bon levain de farine on est toujours obligé d'infecter
aii préalable avec un peu de levain lactique. C'est, nous l'avons vu déja, que les
ferments lactiques actifs sont rares dans la nature et manquent presque absolument
dans les farines.

On voit du tableau combien les expériments avec Ie L. delbrücki sont incertains
et combien il est difficile d'empêcher la fermentation butyrique, ce qui réussit sans
exception en cas d'infection avec Ie L. fennentum.

Acidité en cM» d'aicali normal par 100 cM^ de mout

Origine du Lactobacillus delbrücki

Mout

iquide

Pate

de farine.

pris pour l'infection.

stériMse.

Aéré.

Sans
air.

Pasteurisée.

Stéri-
lisée.

Non
saccharifiée.

a. Culture jeune sur moiit a

gélose

•

x(h)

5,6

Fermentation
butyrique

7

Fermentation
butyrique

b. Culture en mout en matras a

large fond, a acidité i

2(C)

6(d)

Fermentation
butyrique

7,5

Fermentation
butyrique

of. Culture en ballon, peu aérée;

acidité 2

3,5

7

8

8,2

Fermentation
butyrique

d. Culture dans bouteille, sans

air; acidité 6

6

8,5

8,6

9

9

Le seul résultat tout a fait clair qui se dégage de ce tableau c'est que l'anaéro-
biose favorise plus on moins la production de l'acide, Mais il est clair aussi que les
conditions de culture changent énormément le pouvoir acidifiant de la postérité
immédiate de notre bacterie. Quoiqu'il soit vrai qu'a la première infection on n'obtient
jamais un bon levain avec le L. delbrücki, pourtant, en répétant les inoculations avec
cette bacterie de pate en pate a 37" C, ou dans le mout liquide de bouteille close en
bouteille close, de même a 37" C, j'ai enfin obtenu de bons levains d'une acidité de
c. a. 17 cM^ au quatrième ou cinquième transport. Si l'inoculation avec cette forme
régénérée se fait alors a 63" C, en refroidissant jusqu' a 40" C, l'acidité devient
satisfaisante pour un bon levain en trois jours, mais les bactéries perdent en même
temps leur faculté fermentative et ne sauraient être employees de nouveau.

Tous ces phénomènes complexes se sont élucidés par l'étude des variations héré-
ditaires, induites dans les cultures du L. delbrücki et de son congénère L. fermentum,
par l'influence de la chaleur et de l'aëration, variations qui seront traitées dans les
§§ 7 et 8.

6. Le Lactobacillus fermentum.
Quoique par la methode de culture aérobe sur substratum solide appliquée au
levain on obtienne pour l'ordinaire le Lactobacillus delbrücki, il est possible en eer-

70

tains cas, d'en tirer une bacterie spéciale et tres interessante qui est l'agent inaltéré
du levain. J'appelle cette forme Lactobacilliis fermentum; des études exactes ont
démontré que les différentes variétés du L. delbrücki en tiennent leur origine.

Pendant longtemps je ne savais cultiver cette bacterie bien que j'en eusse
eiitrevu l'existence; la cause en était la suivante. Quoique toujours présente dans Ie
levain en tres grand nombre elle perd pendant la maturation de celui-ci la faculté de
pouvoir croitre a l'air, ce qui rend impossible de la cultiver sur des plaques de mout
a gélose aéré.

Cependant, si l'on répète les tentatives avec des levains encore jeunes, par
exemple de 36 heures et en cultivant a 37" C, on voit apparaitre, en certains cas,
parmi les formes opaques du Lactohacillus delbrücki de tres petites colonies trans-
lucides comme des gouttelettes d'eau, qui sont la forme cherchée.

Transportées sur du mout a gélose frais il n'est pas difficile d'en garder des
cultures successives héréditairement constantes, pourvu qu'on prenne les précautions
suivantes. Il faut faire des cultures a piqüre, ce qui rend possible la croissance a peu
prés anaérobie; réinoculer quand la culture est encore jeune, par exemple après une
semaine tout au plus, pour prévenir l'influence sur les cultures successives des pro-
duits d'excrétion des inoculations précédentes ; enfin, cultiver au-dessons de 41" C.
Par l'omission de ces précautions la bacterie dégénère dans Ie cours des mois et
produit des formes analogues aux différentes variétés de L. delbrücki.

L'étude attentive de cette curieuse espèce a montré que Ie caractère principal
qui régie sa grande sensibilité pour les influences extérieures est un certain degré de
microaérophilie, pas assez developpée pour parier d'anaérobiose. Toutefois cette
qualité est peu apparente et échappe tout a fait a l'observateur qui n'a pas prolongé
ses investigations sur cette bacterie pendant plusieurs mois consécutifs.

Mais commencons-en l'étude par les caractères morphologiques. Les colonies sur
mout a gélose, développées a 37" C., consistent de bacilles immobiles d'une forme tres
irreguliere, pour la plupart tres courts, bien souvent aussi longs que larges, mesurant
environ 1,5 a 2 |a, et présentant alors l'image de grandes microcoques polyédriques,
formant des chainettes plus ou moins articulées ou tordues. Dans les cultures
successives sur Ie même milieu solide ces caractères se montrent assez constants.

L'aspect microscopique se change dans les cultures liquides et semiliquides
comme dans Ie levain, oia l'on voit apparaitre la forme bacillaire, commune a tous les
LactobaciUus. C'est la que la largeur des cellules est diminuée et devient sensible-
ment la même pour tous les individus, de 0,7 a i ja; quant a la longueur elle oscille
entre des limites bien distantiées, produisant parfois de courts articules, parfois des
fils de longueur considérable. Ces différences se rapportent au degré de richesse du
milieu de culture en oxygène dont l'absence tend a allonger les individus.

Notre bacterie ne produit pas de spores, caractère général de tous les Lacto-
baciUus ainsi que des Lactococcus. Pourtant sa resistance a la température est
considérable, comme nous l'avons deja vu.

Si l'on sème une petite prise dans un matras a fond plat, contenant une mince
couche de mout bien aéré, on voit paraitre au fond de petites colonies, s'élargissant
en cercle et s'écoulant comme Ie ferait un tas de sable sous l'eau. La multiplication
dans ces colonies étant considérable, tout Ie paroi du verre se couvre en deux jours
d'une couche de courts bacilles.

71

Tout autre est l'aspect des cultures en mout a exclusion d'air. La plus siniple
maniere d'obtenir ces cultures anaérobies est la suivante. Des tubes a essai ordinaires
sont a moitié remplis de mout stérilisé oü nage une petite boule de verre, dont Ie
diamètre est a peu prés celui du tube, ce qui empêche sufïisamment l'entrée de l'air.
Avant l'usage on fait bouillir jusqu'a ce que la dernière tracé d'air soit éloignée,
refroidit rapidement, infecte avec Ie fil de platine et transfère les éprouvettes a l'étuve
de 37" C. Si l'on veut éliminer l'oxygène plus rigoureusement que dans ladite mani-
pulation on peut employer de petites bouteilles parfaitement bouchées et remplies tout
a fait de mout dont l'air a été éloigné par ébullition.

Il est tres interessant d'observer les différences dans les phénomènes de culture
corrélatifs au degré plus ou moins élevé de l'aération. Quand l'air peut librement
entrer dans Ie mout, les bactéries, comme nous l'avons vu, s'enfoncent aussitót.
Dans les éprouvettes et les bouteilles closes, au contraire, les bactéries restent en
suspension pendant les trois premiers jours et il se déclare une forte production de
gaz qui échappe en petites bulles quand on secousse les cultures. Ce gaz est de
l'acide carbonique tout a fait pur sans tracé d'hydrogène ou de méthane; la quantité
en est en proportion inverse a celle de l'oxygène en solution mais bien plus grande.
Cela se fait observer Ie plus facilement par la culture en éprouvettes avec boules de
verre, remplies de mout qui a été exposé a l'air pendant un plus ou moins grand
nombre d'heures, Ie plus de gaz se dégageant dans les tubes les moins aérés. La
formation du gaz n'amoindrit en aucune maniere Ie rendement en acide lactique au
moins jusqu'a un certain limite minimum d'aëration ; plütót, tout en accord avec Ia
règle déja mentionnée lors des expériments avec Ie levain brut, l'anaérobiose favorise
l'acidification *).

Dans l'industrie du levain on n'observe ordinairement rien de cette production
d'acide carbonique. Pour la constater avec certitude il faut abaisser la température
a laquelle on travaille dans les fabriques. Si l'on prend un étalon d'un levain jeune,
par exemple de 12 heures, et l'agite bien pour que les colonies perdent leur cohérence
et acquièrent plus de points de contact avec la pate, puis Ie met a l'étuve a 37" C,
on verra Ie levain se transformer bientót en une masse poreuse, on pourrait dire
mousseuse, par l'abondante production d'acide carbonique.

L'acidité obtenue avec Ie Lactohacillus fermentuni, transporté dans du mout
liquide dont la densité est de 10° au saccharomètre de Balling et qui a été garde
pendant trois jours a 37" C, devient au plus 17 cM^. En culture anaérobie seulement
une tres petite quantité de l'acide, environ 1% de l'acidité totale, est volatile et
consiste pour la majeure partie en acide acétique. Cultivé a aération profuse, par
exemple dans des flacons a fond plat, l'acide produit par Ie L. fermentuni est l'acide
lactique pur sans acide volatil. Si on prolonge les cultures, en inoculant toujours a
l'air et a 37" C, on trouve que l'acidité reste constante a ce chiffre pendant des
semaines successives. En cultivant dans des bouteilles fermées ou dans des tubes a
essai a boule de verre nageant sur Ie mout, la température étant tenue a 37" — 41" C.

*) Les corps produits du molecule de sucre a cóté de l'acide carbonique sont encore
inconnus. Peut être ce sont des congénères du mannite, mais Ie mannite lui-même,
comme nous l'avons vu, est seiilement un produit du iévulose tandisquc lacide car-
bonique se développe de tout sucre assimilable.

72

au plus, on voit l'acidité se diminuer peu a peu jusqu'a 15 cM*., pour s'arrêter a ce
chifïre ce qui prouve que raération est presque, mais pas tout a fait sans influence sur
la production d'acide, l'air qui se dissout dans Ie mout étant certainement favorable ^).

En comparant ces acidités a celles qu'on a obtenues en inoculant Ie mout liquide
avec des prises des levains crus, donnés page 228, on remarque une grande difïérence.
En premier lieu l'acidification avec les cultures pures est plus haute et en second lieu
l'aération retarde la production d'acide beaucoup plus chez les inoculations crues que
cbez celles a cultures pures. Ce fait tres important pour l'élucidation de plusieurs
phénomènes complexes dans l'industrie de levüre, mais qui ne peuvent être considérés
ici, doit être expliqué par Ie róle des Lactobacillus delbrücki, presents lors de
l'inoculation avec Ie levain cru, nommément par sa concurrence pour l'aliment azoté
avec Ie L. fermentum. Tout comme Ie L. fermentum Ie L. delbrücki ne trouve d'autre
source d'azote dans un mout de 10" Balling que les maltopeptones, qui n'y sont
pas comme Ie maltose en grande profusion mais manquent bientót, étant complètement
absorbées par les divers ferments lactiques. En absence du L. delbrücki toute la
quantité de peptone disponible peut produire des individus de L. fermentum tres
actifs et produisant, même a aération complete, beaucoup d'acide. Mais lors de
l'inoculation avec Ie levain cru les L. delbrücki qui y sont toujours en grande abon-
dance s'emparent partiellement des peptones entravant ainsi Ie développement du
L. fermentum, et leur activité fermentative étant bien moindre que celle du dernier
on trouve une acidité moyenne de ce que les deux espèces pourraient produire seules.

On comprendra aisément que ces phénomènes ne se déclarent pas avec une egale
netteté quand, au lieu de mout liquide a la petite densité de 10° B., on emploie un
mout plus concentré ou une pate de farine destinée a la préparation de levain, qui
tous deux contiennent plus de maltopeptones et peuvent donc, en cas d'inoculation
mixte, perdre plus de cette nourriture pour en former des individus de L. delbrücki,
tout en ayant assez encore en réserve pour produire de nouveaux individus actifs du
L. fermentum.

Il n'est pas absolument nécessaire de cultiver Ie L. fermentum dans Ie mout;
il croit aussi tres bien dans de l'eau de levüre sucrée, dans de la vinasse sucrée, enfin,
dans des infusions des radicelles de malt (en hollandais »moutkiemen«), avec divers
sucres. Les meilleurs sucres pour son alimentation sont Ie glucose, Ie lévulose Ie
maltose et Ie saccharose. Le sucre de lait est tres difficilement assimilé. Dans Ie lait
lui-même il n'y a pas de développement ou seulement une croissance tres lente, ce
qui s'explique par l'infériorité de l'aliment de carbohydrate ainsi que de l'aliment azoté.
La remarquable transformation du lévulose en mannite, déja mentionnée § 2, est
accompagnée de la même production d'acide que dans les solutions de glucose. Le
mannite lui-même n'est pas acidifié. Si l'on cultive en vase clos dans de la vinasse
a T0% de saccharose et a 37" C, on obtient un liquide tres mousseux, d'une acidité
agréable et bien acceptable comme boisson.

*) Si l'on cultive le L. fermentum sur Ia surface de plaques solides de mout a gélose
c. a. d. dans les circonstances les plus favorables d'aération, et si après plusieurs jours
on fond la plaque et titre racidité, on trouve celle-ci tres petite, de 3 a 5 cM'. d'acide
normal pour 100 cM^ du liquide au plus, ce qui prouve la microaérophilie de notre
ferment d'une maniere frappante. Mais ce fait est sans importance pour la discussion,
des phénomènes qui s'accomplissent dans le mout liquide.

73

Dans les liquides tout a fait artificiels, par exemple de l'eau de conduite sucrce
et additionnée de phosphate potassique et de divers corps azotés, c'est seulement Ie
peptone qui puisse provoquer Ie développement du ferment. Ni l'asparagine, ni les
sels ammoniacaux, ni les nitrates ne peuvent servir de source d'azote. Mais aussi
avec la peptone la multiplication dans les liquides artificiels est pénible en com-
paraison avec les liquides organiques plus compliqués que nous avons considérés.
Les relations du L. fermentum avec la chaleur étant d'une importance spéciale,
voici des expériments pour déterminer la température optimum de la croissance
mesurée par les titres d'acidification.

Comme toujours l'aliment était du mout de lo" Balling, stérilisé et aéré,
dont furent remplis des tubes a essai jusqu' a trois quarts. Ces tubes nageaient dans de
.ti:rands bains-marie, pour lesquels on employait des vases cylindriques de verre,
remplis d'eau et tenus a une température constante par un thermorégulateur. Trois

de ces vases a différentes températures
servaient a la fois. L'infection se faisait
chaque fois avec Ie même nombre de pe-
tites gouttes de même grandeur d'une
jeune culture du L. fermentum en mout.
On commenqait par chercher la tem-
pérature optimum en mesurant l'acidité
obtenue après 24 heures a diverses tem-
pératures ; eet optimum fut trouvé A
41" C. OU a 42« C, la différence entre
ces deux températures étant inappré-
ciable. Ensuite on faisait un assez
grand nombre de titrages d'acidité pour
construire une courbe qui donnat 'a
relation cherchée. Dans la figure on a
pris l'acidité trouvée a la température
optimum, comme 100 et on en a calculé
par la règle a trois les autres ordinates. Pour fixer davantage les idees je donne aussi
la liste de quelques acidités en cM» d'alcali normal, trouvées après 24 heures a
diverses températures, dans tod cM^ de mout ordinaire de 10" Balling.

_^7-\

7 I

J 3

t \

/ r

.^ i

/ ^^

z X

^v

\

30 32 34 3G 38 40 42 44 4G 48 50" C.

La température et l'acidification par
L. fermentum.

Température 8"
Acidité 2

30"
6,5

36 «
9ó

39
10

.41
• 10,5

.42".
. 10,5.

•43
. 8

46^,
3,5 •

. 5o« C.
. o.

Le minimum est tout prés de 25" C. C'est la un point important car il s'ensuit
qu' a la température de la fermentation alcoolique principale dans l'industrie de
levüre, qui est au commencement 230 c. et s'élève jusqu'a 28° a la fin, le L. fermen-
tum peut encore se multiplier et acidifier sensiblement. Le maximum se trouve a
50" C. dans le mout liquide; cependant, dans les patés de farine j'ai observé encore
un développement appréciable a 53*» C. On voit de cette courbe combien sont erronés
les nombres donnés par M. Maercker ^) et M. S tammer 2) qui croient, sur

') Handbuch der Spiritusindustrie, 5te Ausg., pag. 490, 1891.
'') Branntweinindustrie, 2te Ausg., pag. 555, 1895.

74

1'autorité de AI. Delbrück^), que roptimum de l'acidification se trouve a 50° C,
tandisqu'en réalité il est tout prés de la température optimum de croissance, c. a. d.
prés de 41". M. Hayduck^) a taché de faire disparaitre cette discordance en
admettant qu'il y a une grande différence entre l'acidification par les ferments tout
formés et l'acidification par les ferments en développement. Mais, au fait, l'expli-
cation de Terreur dans la vue de M. Delbrück parait plus simple: il se laissait
tromper par les grandes différences de température au milieu, a la surface et aux
cótés des cuves industrielles. Il en a pris la moyenne, oubliant qu'au milieu des cuves,
oü la température reste toujours tres haute, non loin de 50" C. a la fin de la fermen-
tation, il y n'a presque point de développement du ferment ni d'acidification. Aussi
il lui a échappé que Ie point essentiel pour l'industrie est Ie travail au-dessus de la
température optimum.

7. Trausformation du Lactobacillus fermentum en L. delhrücki.

Je vais maintenant démontrer que les différents bacilles du levain se laissent
transformer les uns dans \ps autres. Commenqons par la transformation du L. fermen-
tum en L. delbrücki. J'y ai réussi de deux manières: Par la culture a des tempéra-
lures au-dessus de l'optimum, et par la culture prolongée a aération tres profuse.

La seconde methode exige beaucoup de temps et ne sera pas discutée ici, par la
première Ie résultat ne se laisse pas longtemps attendre. Voici les expériments.

Le 29 Juin un matras a fond plat contenant une couche de mout liquide d'une
densité de 10" Balling fut inoculé avec une jeune culture de Lactobacillus fermen-
tum et posé dans l'étuve a 48" C, c. a. d. 7" C. environ au-dessus de l'optimum. La
A égétation était assez active, ce qui se manifestait par la production d'un sediment
considérable de bactéries, mais l'acidité n'atteignait que 5,5 cM-'', tandisqu' a 40" C.
elle aurait monté a 17 cM^.

Le premier Juillet cette culture fut ensemencée sur gélose a moiit et gardée dans
Tétuve a 37" C. Déja après 24 heures il y avait une grande profusion de colonies qui
se distinguaient a l'oeil nu de leurs parents par leur grandeur et qui appartenaient
au type ordinaire du L. delbrücki. Ces colonies furent ensuite ensemencées dans du
mout en matras a fond plat et gardées a 37°. Après trois jours l'acidité était environ
de 3 cM^ par 100 cM^ de mout, ce qui démontre la réalité de la transformation.
Ouand ces mêmes colonies sont ensemencées dans le méme mout en bouteille close,
la croissance et la fermentation sont le troisième jour bien plus intensives, l'acidité
est de 9 cM^ et il y a une forte production d'acide carbonique. On voit donc que par
la culture a l'air au-dessus de l'optimum le L. fermentum s'est vraiment transformé
en L. delbrücki, car les caractères principaux de la première forme: la manque
presque totale de croissance sur gélose a l'air et de production d'acide jusqu'a 15 cM^.
dans le mout aéré a la température optimum, ont été remplacés par la force végé-
tative beaucoup plus grande et la force fermentative beaucoup plus petite du L. del-
hrücki. Le L. delhrücki ainsi artificiellement produit se laisse cultiver pendant des
mois sur le gélose a mout sans perdre ses caractères principaux décrits § 5. C'est-a-

') Die Saueruns des Hefegutes. Zeitschr. für Spiritusindustrie. 1881, pas;.
-) Ueber Milchsauregarung. Wochenschrift f. Brauerei. 1887 N. 17.

75

dire, la forme artificielle est aussi constante que celle isolée des levains, et on ne
saurait douter que dans les derniers il prenne de même son origine du L. fermentum.

Je me suis demandé si dans l'expériment décrit chaque individu du L. fermen-
tum s'était transformé ou s'il y avait encore des individus non changés. Il est vrai
qu' a l'oeil nu et a la loupe des colonies du L. fermentum étaient totalement invisibles.
Mais il me semblait possible qu'elles pussent échapper complétement a l'attention par
leur petitesse en cas que par mon experiment leur force végétative eüt éte diminuée.
Pour résoudre la question je coupai d'une plaque de mout a gélose, au moyen d'une
spatule de platine, de petits morceaux sans colonies visibles situés entre les colonies
du L. delbrücki, et j'inoculai ces morceaux dans du mout. Pourtant je pris la pré-
caution d'employer du mout peu aéré dans des éprouvettes a boule, décrites aupara-
vant. Après 24 heures déja j'obtins de belles cultures de L. fermentum qui donc
avait perdu Ie pouvoir de croitre a l'air sur Ie gélose, mais croit et fermente encore
tres bien comme anaërobe dans Ie mout liquide.

Ce résultat un peu surprenant a été corroboré par la répétition de Texpériment
et en outre par la culture directe sans air du L. fermentum a 48° C. A cette fin
j'inoculai Ie 29 Juin une jeune culture normale de cette bacterie dans une bouteille
bien close contenant du mout .stérilisé tres peu aéré et garde a l'étuve a 48° C. Après
tiois jours, Ie 2 Juillet, l'acidité n'était que 5 cM^., c. a. d. encore moindre que dans
la culture a air, et il ne se dégageait pas de gaz carbonique. Une goutte du
contenu de la petite bouteille fut ensemencée sur mout a gélose a 37" C. Après
24 heures il ne s'était développée aucune colonie ce qui ne se changeait pas les jours
suivants; il était donc clair que Ie L. fermentum, cultivé sans air a 48° C. peut déja
perdre dans 24 heures la faculté de croitre a l'air sur la plaque. Pourtant les bac-
téries n'étaient pas du tout mortes, car un morceau de cette plaque, tiré de la localité
oü la goutte de la fermentation avait été dépossée et qui ne portait point de colonies,
ensemencé dans du mout non aéré, donnait a 37° C. une belle fermentation et une
acidité de 9 cM^. en trois jours. La même plaque ayant été conservée encore deux
jours de plus, montrait quelques belles colonies du L. delbrücki. J'en avais attendu
Ie développement en petit nombre, parceque que l'aération, bien que minime, n'avait
pas totalement manqué dans la bouteille close. Il s'ensuit que l'expériment avec la
bouteille et celui avec Ie matras donnent qualitativement Ie même résultat, tandisque
la quantité des L. delbrücki produite a l'air est beauconp plus grande qu'a exclusion
presque complete de l'air.

Quand nous considérons les phénomènes de cette transformation de plus prés,
nous voyons qu'elle consiste en deux métamorphes apparemment indépendantes: la
formation du L. delbrücki dont la force végétative a l'air sur la plaque est plus
grande que celle de la souche, et la production d'une race anaérobie qui a totalement
perdu Ie pouvoir de croitre sur les plaques a l'air. Il n'y a pas de raison sufifisante
de conclure que ces deux races antagonistes soient Ie produit d'une seule et même
partition cellulaire heterogene du L. fermentum, celui-ci se décomposant, pour ainsi
dire comme un hybride, en deux éléments qui, s'il était possible de les combiner de
nouveau, reproduiraient la forme souche. Cependant il n'est pas impossible que les
faits soient réellement d'accord avec cette conception.

Pour l'industrie la transformation du L. fermentum en L. delbrücki est de pre-
mière importance, vu que Ie L. fermentum est un microbe d'une activité extraordinaire

76

qui se nourrit de corps azotés destinés pour la levüre, et qui peut produire de l'acide,
méme a la température de la fermentation alcoolique. Le L. delbrücki au contraire,
est complétement inactif sous les conditions de cette fermentation.

8. Transfurmation du Lactobacillus delbrücki en L. fennentuiii.

Tandisque pour la transformation du L. fermentum en L. delbrücki nous avons
fait usage d'une culture a l'air au-dessus de la température optimum, c'est par
Tanaérobiose a température ordinaire que la transformation inverse s'accomplit. On
aboutit le plus vite a ce résultat en cultivant dans une bouteille tout a fait remplie de
mout et bien fermée. A l'air le développement du L. delbrücki en mout est insignifiant
et l'acidité reste tres basse, par exemple dans le tableau pag. i88 de i a 3,5, ce qui
ne change guère par des transports successifs, mais a l'exclusion de l'air les acidités
deviennent plus grandes dès le premier transport. Si l'on répète les transports de
bouteille fermée en bouteille fermée^ on observe déja au 4™^ ou au 5™^ transport en
10 OU 12 jours, un complet retour au maximum d'acide de 17 cM^, qui peut être
produit dans 100 cM'* du mout choisi.

Suivant au microscope les changements morphologiques parallèles a la croissance
des acidités dans les inoculations successives, ou ne voit absolument rien, sinon une
plus grande opacité des bacilles de plus en plus anaérobies. Mais quand on fait des
semences sur mout a gélose la difïérence devient bien autrement claire, car alors on
trouve déja dés la première culture sans air des colonies qui se laissent difficilement
distinguer des vrais L. fermentum, quoique dans le mout aéré elles ne donnent pas
l'acidité maximum. Par des transports anaérobies subséquents, les semences sur le
substatum solide produisent le L. fermentum en toute perfection, croissant en petites
colonies transparentes sur l'agar a mout et composées de courts bacilles, tres irré-
guliers quant a la largeur et la longueur.

La question ce que deviendrait notre ferment après une beaucoup plus longue
série de transports anaérobies n'a pas encore été entièrement traitée, mais je
m'occupe d'expériments pour en trouver la réponse définitive.

ConclusioH.

Du point de vue théorique il est a remarquer que les transformations décrites
donnent le premier exemple de variation expérimentale progressive et rétrogressive
h volonté. La rapidité avec laquelle elles peuvent être induites et l'exactitude que le
titrage de l'acide apporte dans leur étude en font un véritable experiment de labora-
tcire. De plus, le pouvoir fermentatif extraordinaire de la forme type du microbe du
levain, son doublé action sur le lévulose dont il transforme la partie non acidifiée en
mannite avec une rapidité remarquable, enfin, l'impossibilité de cróitre au-dessous
de 25" C, sont des caractères qui méritent l'attention.

Je ne crois pas que pour l'industrie de la levüre viennoise, dans sa phase de
développement actuelle, les cultures pures du L. fermenturn soient de signification, le
procédé du levain lactique en pate étant tres perfectionné et répondant aux exigences
des praticiens. Au contraire, leur introduction dans le levain liquide de l'industrie
de la levüre a air, serait sans doute un progrès décisif. Mais seulement une bonne

77

methode et une connaissance sutïisante de la biologie du ferment pourraient rendre
des services réels. Les conditions essentielles pour la réussite pratique seraieiit:
En premier lieu, la culture du ferment dans Ie travail du levain au-dessus de son
optimum de 41" C, ce qui transforme Ie L. fermentum, actif même aux températures
de la fermentation alcoolique, c. a. d. entre 26° et 30° C, dans Ie L. delbrücki, tefn-
porairement inactifs a ces températures au doublé point de vue de l'acidification et
de la croissance. En second lieu, de poursuivre une culture souche du ferment
a 400 C, franchement aérée pour Ie renouvellement continuel du levain.

Si dans l'avenir l'acide lactique trouve un emploi plus étendu qu' a présent, sans
doute les cultures du L. fermentum seront appliquées sur une grande échelle. Moi-
m.ême j'ai préparé a la fabrique néerlandaise de levüre et d'alcool a Delft quelques
centaines de kilogrammes de eet acide pour remplacer les ferments eux-mêmes dans
la fabrication de la levüre, me basant sur la methode du levain lactique a carbonate
de chaux et décomposant Ie lactate de chaux par l'acide oxalique. Mais j'ai ren-
contre de si grands obstacles par diverses infections, surtout par les variétés muci-
pares du Lactobacillus caucasicus, que si l'acide s'était montré vraiment utile j'aurais
certainement taché d'introduire les cultures pures du L. fermentum dans mon procédé.

Expériences relatives a raccumulation des bac-

téries de l'urée. Décomposition de l'urée par

l'uréase et par catabolisme.

ArchivesNéerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé VII,

1902, p. 28—63. — Verscheen onder den titel »Anhaufungsversuche mit Ureumbakterien.

Ureumspaltung durch Urease und durch Katabolismus« in Centralblatt für Bakterio-

logie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, VII. Band, 1901, S. 33 — 61.

Dans la phase actuelle du développement de la microbiologie, que Ion pourrait
appeler »la phase systématique«, parce que, comme dans toute science en
voie de formation, on s'y occupe de reconnaitre et de classer les matériaux fournis
par la nature, les expériences relatives a l'accumulation des microbes ont une
importance toute particuliere. Elles ont pour but d'isoler et de développer d'un
mélange d'organismes les plus divers les espèces et variétés adaptées a certaines
conditions vitales, déterminées d'avance. Il se forme ainsi des amas semblables
a ceux que la nature présente en quelque sorte d'elle-même, soit dans les fermenta-
tions naturelles, soit dans les maladies microbiennes, dont l'étude a servi de base
au développement de la bacteriologie moderne. Mais dans l'accumulation scienti-
fique on exclut tout ce qu'il y a de fortuit dans l'accumulation naturelle, pour
Ie remplacer par des facteurs déterminés ' ).

Une propriété remarquable, commune aux accumulations scientifiques et natu-
relles, consiste en ce que les amas qui en résultent ne sont pas constitués par
une variété unique de microbes, comme cela est toujours Ie cas quand on part
d'une colonie pour faire de nouvelles cultures, mais ils se composent de toutes
les variétés que l'on rencontre dans la matière employee pour infecter, et qui
peuvent se développer dans les conditions choisies. De cette maniere nous apprenons
a connaitre les espèces non seulement dans quelques variétés spéciales, mais encore
au point de vue de leur variabilité, ce qui est de toute importance pour la diagnose.
Cette importance est même telle, que l'on peut prétendre que toute détermination
microbienne doit s'appuyer sur une expérience d'accumulation.

Nos connaissances des conditions vitales de la plupart des microbes sont
cependant si imparfaites que, dans beaucoup de ces épreuves, nous n'arrivons
jusqu'ici qu'a une augmentation relative de la forme désirée, sans que les autres

*) Les »expériences d'accumulation* ne sont pas seulement importantes au point
de vue scientifique, mais encore au point de vue pédagogique. Je me propose de pub-
lier plus tard un aper^u de toutes les expériences de cette sorte qui se pratiquent dans
mon laboratoire aux exercices de bacteriologie.

79

espèces disparaissent complètement de la culture, et méme cette augmentation ne
s'observe-t-elle souvent qua un moment déterminé de fexpérience, tandis qu'a
des époques antérieures ou postérieures ce sont d'autres formes qui prédominent.
Il résulte de la que nous pouvons diviser les expériences d'accumulation en »parfai-
tes« et »imparfaites« ; les premières conduisent a une espèce unique, avec toutes
les variétés qui y appartiennent. On ne connait jusqu'ici qu'un petit nombre de
pareilles »expériences parfaites d'accumulation*, mais il est certain qu'elles augmen-
teront a mesure que nos connaissances s'étendent, car il s'agit d'une question
touchant au cceur méme de la bacteriologie. Et il est a espérer que cela sera
bientót généralement reconnu, car Ie champ des investigations est étendu.

Dans les pages suivantes je me propose de décrire une pareille expérience
d'accumulation parfaite, basée sur l'emploi de l'urée. J'y rattacherai quelques
observations relatives a la flore de l'urée en général, ainsi qu'a la biochimie de la
décomposition de l'urée.

Dans ces recherches j'ai été seconde avec beaucoup de zèle par M. A. van
Del den, qui s'est chargé en méme temps de faire les photographies.

I. Historique.

Bien que la présence d'urée dans les substances nourriciéres les plus difïérentes
occasionne avec beaucoup de facilité l'accumulation de certaines bactéries décom-
posant l'urée, personne jusqu'ici n'a essayé d'y baser une expérience d'accumu-
lation scientifique. Une connaissance superficielle de la littérature pourrait cependant
faire croire Ie contraire, puisque M. van Tieghem un des premiers investi-
gateurs de la flore de l'urée, en a certainement et avec intention poursuivi l'accu-
mulation'). C'est ainsi qu'il a exposé a l'air libre, dans des bocaux ouverts, de
l'urine ou un liquide nourricier (de l'eau de levüre a 2,5 ^jo) contenant i ^/3 "/o
d'urée, oü, par l'infection spontanée par des germes atmosphériques il observa,
parmi d'autres formes de décomposition, dans quelques cas l'hydratation de l'urée
avec formation de carbonate d'ammoniaque. Il inocula Ie ferment de ces derniers
bocaux dans d'autres remplis du méme liquide nourricier encore intact, et il y
observa alors des phénomènes de décomposition encore plus intenses. 11 pretend
que dans ces conditions il obtenait exclusivement des cultures d'urocoques. en
quel cas son expérience serait en efifet une expérience d'accumulation parfaite.
Mais, quand j'ai repris les épreuves de M. van Tieghem, exactement d'après
ses propres préceptes, ou, dans d'autres cas, en recourant aux matériaux oü
naissent et se developpent les germes qui se rencontrent dans l'atmosphère,
c. a. d. en infectant directement avec la poussière du sol, ou méme avec de l'urine
en voie de décomposition, pour éviter ainsi ce qu'il y a de trop fortuit dans une
infection par l'air, je n'ai jamais obtenu Ie résultat décrit par lui. Il est vrai que
dans ces expériences j'observais régulièrement une décomposition de l'urée, mais,
a cóté de plusieurs saprophytes inactifs, je reconnaissais la présence de plusieurs

*) Recherches sur la fermentation de l'urée et de Tacide hippurique. These 00.256,
Paris 1864, pp. 26, 29. L'acide hippurique ne se décompose pas par 1'uréase, mais bien
sous raction de certaines bactéries.

8o

bactéries bacillaires de l'urée; tandis que les urocoques n'étaient presents qu'en
quantité si minime, que je n'ai pas pu les découvrir. Comment M. van Tieghem
n'a trouvé dans ses cultures que des chainès de microcoques, dont il donne des
reproductions, voila ce que je ne puis comprendre. La condition essentielle de
l'accumulation scientifique de X Urococcus ureae Cohn, dont il s'agit ici, notamment
l'emploi convenable d'une basse température, lui était inconnue.

Voila d'ailleurs pourquoi M. Miquel, Ie monographe des bactéries de l'urée,
qui connaissait tres bien Ie travail de M. van Tieghem, n'a pas jugé néces-
saire de suivre sa methode.

Cependant M. Miquel, malgré une étude de plusieurs années des bactéries
de l'urée, n'a pas compris la haute importance des expériences d'accumulation,
et il est remarquable que pour isoler les bactéries il ne reconnaisse même pas
la moindre utilité aux accumulations naturelles. Dans l'édition complete de ses
travaux sur ce sujet ') on peut lire p. ex. : „D'abord, oü doit on rechercher ces
ferments ? Il peut paraitre rationnel et d'une bonne pratique d'aller a leur rencontre,
soit dans les urines déja fermentées, soit dans les liquides des vidanges; en un
mot, dans les endroits oü leur existence est facilement décelée par l'odeur. Cepen-
dant cette fa<;on d'opérer me parait défectueuse ; si les urines fermentées peuvent
présenter un ou plusieurs microbes, agents de l'hydratation énergique de l'urée, ces
microbes y sont pourtant peu variés .... Je préféré, pour ma part, attendre que
les ferments de l'urée se présentent spontanément a moi, soit dans Ie cours des
analyses microscopiques des eaux, soit dans les analyses bactériologiques de l'air
et du sol.« Et a la page 17 du même livre: »J'ai déja dit qu'il était préférable
de rechercher les ferments ammoniacaux parmi les organismes vulgaires de l'air^
du sol et des eaux, présentés par Ie hasard a l'observateur, plutót que de tenter
de les isoler des urines ou des matières de vidange en fermentation.«

Pour reconnaitre les microbes de l'urée, il introduit les colonies a étudier
dans de la gelatine de bouillon de viande avec 2*^/0 d'urée, oü les bactéries qui
décomposent l'urée forment du carbonate de calcium, se reconnaissant comme
une poudre cristalline blanche a l'intérieur des colonies ou dans leur voisinage,
phénomène que ne présentent pas les espèces ordinaires. Sur une pareille substance
nourricière il apporte maintenant, si je comprends bien, tous les microbes pos-
sibles, jusqu'a ce qu'il rencontre dans Ie nombre une bacterie de l'urée, se qui
est évidemment un procédé extraordinairement long.

Pour défendre cette methode, M. Miquel rappelle la difficulté qu'il y a a
isoler des liquides en question les formes qui agissent faiblement sur l'urée,
puisque ces formes sont complètement refoulées par les autres plus fortes, tandis
qu'il reste un grand nombre d'espèces inactives qui compliquent l'isolement des
bactéries de l'urée proprement dites.

Dans mon expérience d'accumulation que je décrirai tout a l'heure, ces
arguments sont complètement écartés, car au commencement se développent une
série de formes faibles, puis viennent les formes fortes ; d'autre part, dés Ie com-
mencement de l'expérience, et par la présence de l'urée même, toutes les espèces in-

') Etude sur la ferinentation ammoniacale et les ferments de l'urée, p. 13, Paris,
chez Carré et Naud, 1898. Reproduit des »Annales de Micrographie«.

8r

actives sont arrêtées dans leur développementet finalement refoulésparla concurrence
des bactéries décomposantes. Je ferai deja dès maintenant remarquer que je dois ce
résultat a l'observation, que la plupart des véritables bactéries décomposantes peuvent
résister a une concentration en uree du liquide nourricier beaucoup plus élevée que
celle qu'elles peuvent décomposer, et resistent aussi a une concentration beaucoup plus
élevée en carbonate d'ammoniaque que celle qu'elles sont en état de produire ; enfin,
les espèces ordinaires, qui ne décomposent pas l'urée, du moins la plupart d'entre elles,
sont plus sensibles aux hautes concentrations d'urée et de carbonate d'ammoniaque que
les urobactéries elles-mêmes, ce que M. M i q u e 1 a pourtant décidément contesté.

Les autres auteurs qui se sont occupés de l'étude des bactéries de l'urée, tels que
MM. V o n J a c k s c h, L e u b e et S c h e r i d a n L e a n'ont, pas plus que M. M i-
q u e 1, fait des expériences d'accumulation de ces organismes.

Un voit donc que des expériences d'accumulation de bactéries de l'urée, conduisant
a des espèces déterminées, n'ont pas été décrites jusqu'a présent de telle faqon qu'elles
püissent être répétées avec succes.

2. Géiiéralités sur les expériences d'accumulation avec l'urée.

Une étude systématique de ce sujet apprit que jamais les microbes ne décomposent
l'urée, en présence des phosphates et des autres sels nourriciers nécessaires, si elle
n'est pas accompagnée d'une source spéciale de carbone. Si on inocule par exemple,
dans une solution aqueuse d'urée, contenant une quantité convenable de phosphate de
potassium et de sels minéraux, les matériaux les plus divers contenant des bactéries
de l'urée, ou ces bactéries en cultures pures, non seulement on n'observera pas de dé-
composition de l'urée, mais même pas Ie moindre développement de microbes.

L'addition d'une autre source de carbone quelconque, pourvu qu'elle n'appartienne
pas aux substances aromatiques, en fait un liquide nourricier pour les bactéries qui
décomposent l'urée i). Même l'acide oxalique, la source de carbone qui se prête ie
moins a la nourriture des microbes, ne fait pas exception a cette règle. C'est ainsi que
dans une solution dont la composition était la suivante:

IOC parties d'eau
5 „ d'urée

I „ d'oxalate d'ammonium

0,025 M de KWPO\

et qui avait été infectée avec de la terre arable, je recoiinus qu'un peu plus de 2% de
l'urée étaient décomposés, lorsqu'elle était maintenue pendant 10 jours a 30" C.-).

') Je dois faire a ce sujet une remarque importante: ce que je dis ici n'est vrai
que quand il s'agit des premières inoculations faites avec les matériaux mentionnés.
Le transport de cette première inoculation dans un liquide alimentaire identique ne
provoque jamais l'hydratation de l'urée, sauf dans le cas oü il y a des peptones dans
ce liquide. Il ne semble pas exister d'exception a cette règle inattendue, sur laquelle
j'espère revenir a une autre occasion.

^) Pour des considérations et des expériences relatives a la valeur nutritive d'une
combinaison et a sa structure chimique, et dont la portee semble assez générale, voir
F. J. Dupont et S. Hoogewerf f , Maandblad voor Natuurwetenschappen, 1876, p. i.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 6

82

J'obtins Ie même résultat en remplacant l'oxalate d'ammonium par i% d'acétate
de sodium, ce qui prouve que l'urée satisfait temporairement tres bien au besoin d'azole
de certains microbes de l'urée.

Quand l'oxalate d'ammonium fut remplacé par i% de sel de seignette (tartrate
doublé de potassium et de sodium), je reconnus encore que finalement 2% de l'urée
étaient changés en carbonate d'ammonium. En prenant 1% de dtrate d'ammonium la
décomposition atteignait 3%, et enfin, avec du malate d'ammonium, 4% de l'urée primi-
tivement présente étaint transformés. Dans chacun de ces cas on obtenait une ou deux
formes d'urobactéries, qui paraissaient caractéristiques pour la source de carbone.
jMais, comme il a été observé dans la note de la page précédente, ces microbes dis-
paraissent des cultures par des transports successifs dans Ie même liquide.

On voit que dans aucune des solutions en question les 5% d'urée n'étaient com-
plètement décomposés, et il existe certainement une relation entre la valeur nutritive
de la source de carbone introduite et la quantité d'urée transformée.

Quand la quantité d'urée primitivement présente était inférieure a la quantité
transformable, la décomposition était complete. Tel était Ie cas dans une solution de
V on Ja c k s c h ') (dont 100 parties contiennent 0,025 ^^ KH^PO*, 0,005 de MgSO*,
0,5 de sel de seignette et 0,1 d'urée), et dans une autre contenant, sur 100 parties d'eau,
0,09 de KH'PO'^, 0,2 de CO'^(NH^)-, 0,25 d'asparagine, i d'urée; toutes deux avaient
été infectées avec de la terre arable et maintenues pendant 10 jours a 28° C. Mais
dans ces cas aussi les transports dans Ie même liquide nourricier ne pouvaient être
réitérés sans que la culture perdit totalement son pouvoir d'hydratation.

L'examen bactériologique de tous les liquides précédents a fait connaitre que ja-
mais on n'y trouve les espèces de bactéries qui, dans des conditions nutritives plus
avantageuses, sont en état de transformer en carbonate d'ammonium des quantités
d'urée beaucoup plus considérables, telles que VUrobacillus pasteurii et VUrococcus
ureae. Mais quand je commenqais par employer une meilleure solution nourricière,
contenant a cóté de l'urée des peptones, par exemple du bouillon de viande, la même
infection ne transformait pas moins de 10 a 12% d'urée en peu de jours, et les trans-
ports successifs dans ce liquide alimentaire n'occasionnaient pas du tout la perte du
pouvoir hydratant observée dans les cas déja considérés, mais produisaient des cultures
d'une force fermentative constante.

Ce résultat remarquable m'a engagé a soumettre cette dernière expérience a an
examen approfondi. Cet examen apprit que toujours, a la fin de l'expérimentation, et
même déja après une couple de transports des cultures jeunes, on obtient une végéta-
tion pure de la plus active de toutes les bactéries de l'urée, notamment de VUrobacillus
pasteurii M i q u e 1, tandis que dans les cultures jeunes se montrent passagèrement,
mais avec une grande régularité, une série de bactéries moins actives. Il suit de la que
toutes ces bactéries doivent être universellement répandues et tres communes dans nos
alentours, bien que jusqu'ici on ne leur ait accordé que peu d'attention, ou qu'elles
soient restées complètement inconnues.

Mais avant de décrire cette expérience, je veux dire quelques mots de l'examen
qualitatif et quantitatif de la décomposition de l'urée.

') Zeitschr. f. pliysiolog. Cheni., 5, 395, 1881.

83

3- Examen de la décomposition de l'iirce. Phénomène de L'»irisatio>i«.

Pour poursuivre régulièrement la transformation de l'urée dans les liquides de
culture, il suffit de déterminer la quaiitité de ce corps disparue par titrage du carbo-
nate d'ammoniaque formé, D'après la formule CHW^O+aH^O — CO^(iYH*)-, 60 g.
d'urée donnent naissance a 90 g. de carbonate d'ammoniaque. Si ce carbonate est dis-
sout, 2000 cm.^ d'acide normal sont nécessaires pour Ie neutraliser. Si donc 100 cm.^
d'un liquide nourricier a uree, primitivement neutre, exigent ioocm.=* d'acide normal
pour leur neutralisation, cela veut dire que 3 g. d'urée ont été transformés en 4,5 g. de
carbonate d'ammoniaque; de sorte que la disparition de 1% d'urée correspond a 33,3
cm.^ d'acide normal. Pour Ie carbonate d'ammonium on peut admettre que i g. exige
environ 22 cm^. d'acide normal pour sa neutralisation. Le sel du commerce se trans-
forme pourtant a la longue, en donnant naissance a du carbonate acide (CO^NH^), du
sesquicarbonate (C^O^N^H^^) et du carbamate (CO^N^H'^). Par la l'alcalinité se mo-
difie, de sorte que, du carbonate d'ammoniaque dont je me suis servi, i g. n'était pas
neutralisé par 22 cm^. mais par 15 cm^*. d'acide normal. On doit nécessairement tenir
compte de cette circonstance et titrer ce soi disant »carbonate d'ammoniaque« avant de
l'employer.

Bien que dans les expériences avec des bactéries de l'urée on perde toujours beau-
coup de carbonate par évaporation des flacons bouchés a l'ouate, la précision des
estimations n'est pas par la considérablement diminuée, puisque des dizaines, même
des centaines de centimètres cubes d'acide normal sont nécessaires pour neutraliser
100 cm^. du liquide de culture. D'ailleurs, l'évaporation est d'autant plus faible que
les Solutions sont moins concentrées, de sorte que pour les urobactéries peu actives
les erreurs sont beaucoup moins grandes que pour les formes tres actives.

La réaction sur la présence ou l'absence d'urée dans du bouillon de viande s'effec-
tue, au laboratoire bactériologique, d'une faqon simple, basée sur l'emploi d'urobac-
tcries ou d'uréase. Le liquide a analyser, — d'ordinaire un liquide nourricier con-
tenant de l'urée en voie de décomposition et dont on veut déterminer s'il y a encore de
l'urée non transformée, — est neutralisé a l'acide chlorhydrique s'il contient du car-
bonate d'ammonium, et, si la concentration du carbonate était élevée, dilué avec de
l'eau pour abaisser la concentration du sel, qui pourrait retarder la décomposition
ultérieure de l'urée. On y introduit ensuite une abondante quantité d'urobactéries (de
préférence VUrobacillus pasteurii ou VUrococcus ureae), et on l'expose dans un bain
d'eau a une température de 45 — 50" C. S'il reste encore de l'urée, il se forme au bout
de I a 2 heures du carbonate que l'on peut titrer de nouveau.

Pour établir si certaines colonies de bactéries sont, oui ou non, en état de décom-
poser l'urée et, dans le premier cas, déterminer l'intensité approximative de cette
décomposition, on arrive le plus rapidement au but en cultivant sur un milieu solide.

Nous avons dit plus haut qu'a eet effet M. M i q u e 1 se servait de bouillon de
viande gélatinisé a 2% d'urée, oia il reconnaissait les colonies décomposant l'urée par
la formation de carbonate de calcium sous forme de poudre cristalline.

Toutefois, la sédimentation de ces cristaux ne commence qu'après plusieurs heures
et ne s'effectue que tres irrégulièrement; elle dépend des autres substances présentes
dans la gelatine de culture, et de plusieurs conditions accessoires incomplètement con-
nues. Il en résulte que cette methode est de longue durée et incertaine.

84

Dans une décoction de levüre a gelatine, contenant 2 a 3% d'urée, j'ai trouvé un
milieu beaucoup plus convenable pour arriver au but proposé, son emploi nous appre-
nant déja au bout de quelques minutes si la décomposition de l'urée s'accomplit ou ne
s'accomplit pas, et cela grace a une réaction particuliere, tres curieuse, a laquelle je
donne Ie nom de phénomène d'»irisation«.

Pour ces expériences il faut que l'eau de levüre soit concentrée et obtenue par
décoction de 20 g. de levüre de boulanger dans 100 cm^. d'eau. Le liquide obtenu
d'après les préceptes ordinaires (20 g, de levüre dans 1000 cm*, d'eau), avec la gela-
tine ordinaire du commerce, ne présente pas du tout le phénomène d'irisation ^).

Si l'on préparé une plaque d'une gelatine contenant la bonne décoction de levüre
a uree, et qu'on y dépose une particule de carbonate d'ammonium ou une colonie d'une
bacterie décomposante, il se précipite non seulement du carbonate de calcium, mais
encore, si je ne me trompe, du phosphate de calcium 2). En tous cas, ce précipite a
deux propriétés tres remarquables: au commencement de l'épreuve il est absolument
amorphe et se dépose exclusivement a la surface de la gelatine, en une couche tellement
mince qu'on peut y voir de magnifiques anneaux de Newton. Cette couche »iri-
sante« s'épaississant et s'élargissant graduellement, on observe un changement lent et
régulier dans la coloration des anneaux, qui s'étalent en même temps. Après quelques
heures se produit aussi dans la profondeur de la gelatine un dépót blanc et amorphe,
qui prend la forme d'une lentille plan-convexe ; mais ce nouveau dépót ne diminue en
rien la beauté des couleurs de la surface. Cette surface colorée peut atteindre de
grandes dimensions et couvre parfois des décimètres carrés de gelatine. La vitesse
d'extension des anneaux dépend directement de l'intensité de la décomposition de l'urée,
et permet d'évaluer l'activité des bactéries soumises a l'expérience.

Les bactéries non décomposantes sont sans action sur cette gelatine.

Il me serait impossible de donner en ce moment une explication chimique satis-
faisante de ce phénomène d'irisation. Il est probable qu'il se forme une combinaison de
phosphate et de carbonate de calcium avec une substance organique, une protéine peut-
être, combinaison qui reste dissoute aussi longtemps qu'il existe de l'acide carbonique
libre, mais qui se dépose en couche mince a la surface par suite de I'évaporation de eet
acide. Je ferai encore remarquer que non seulement du carbonate d'ammonium, mais
aussi du carbonate de sodium, dépose sur la plaque de gelatine, occasionne le phéno-
mène de l'irisation; il n'en est pourtant pas ainsi du phosphate de sodium. D'autre part
la gelatine a eau de levüre employee présente une réaction faiblement acide, de sorte
que la mise en liberté d'acide carbonique pendant le phénomène ne semble pas im-
probable.

De ce qui précède résulte que la gelatine a levüre est aussi un indicateur con-
venable pour la recherche qualitative de l'urée au moven d'uréase. A eet effet on opère
de la maniere suivante.

*) Dans quelques cas cependant j'ai rencontre dans le commerce des échantilions
de gelatine qui présentaient le phénomène de l'irisation avec du carbonate d'ammonium
déja d'eux-mêmes, c. ,a d. dans les plaques obtenues par dissolution de cette gelatine
dans l'eau pure. Dans de tels échantilions de gelatine, la substance qui produit le
phénomène (probablement du phosphate et du carbonate de calcium en combinaison
organique) doit être présente déja dès ia fabrication, tandis que d'ordinaire elle y fait
défaut et doit être extraite de la levüre.

*) Probablement précédé d'une formation de carbamate (CaC- O* N- H*).

85

On commence par évaporer quelque peu la gelatine a eau de levüre, et on l'étend
ensuite avec une quantité du liquide, oü l'on se propose de déterminer la présence ou
l'absence de l'urée, a peu prés egale a la quantité d'eau disparue. On en coule alors
une plaque qu'on laisse se solidifier. Si l'on y apporte maintenant en quelque endroit
de l'enzyme uréase, ou quelque culture de bactéries a uréase, comme VUrobacillus
pasteurii ou les urocoques ordinaires (Urococcus ureae Cohn)i), on observe au
bout de quelques minutes Ie phénomène de l'irisation tout autour de l'uréase ou des
bactéries, a condition qu'il y ait de l'urée en présence. En dehors de cette substance
je ne connais aucun autre corps qui produise dans ces conditions Ie phénomène de
l'irisation.

On peut arriver au même résultat en renversant l'épreuve, c. a. d. en introduisant
dans la gelatine a décoction de levüre, non de l'urée, mais une grande quantité
d'uréase ou de bactéries de l'urée. Si l'on coule une plaque de cette gelatine, on y
produira Ie phénomène de l'irisation en y deposant une goutte d'une solution d'urée
ou d'une culture qui en contient. Il va de soi que de cette maniere il n'est pas aussi
aisé d'examiner une quantité considérable d'une solution pauvre en uree que d'après
la première methode, mais la plaque a uréase permet de comparer facilement un
grand nombre de flacons d'épreuve, en admettant toutefois que la teneur en uree ne
soit pas trop faible. Des estimations quantitatives sont possibles par les deux me-
thodes.

4. Accumulation de VUrobacillus pasteurii M i q u e 1.

Je passé maintenant a la description de l'expérience qui m'a conduit au résultat
bien net que j'ai communiqué a la fin du § 2. Elle est tres simple: a du bouillon de
viande, obtenu comme d'ordinaire, on ajoute 10% d'urée et on fait bouillir, ce qui rend
la solution légèrement alcaline. On infecte ensuite ce bouillon avec de la terre
fraiche ou pasteurisée au préalable ^) et on cultive a 23 — 30° C. Cette expérience a
jusqu'ici conduit dans tous les cas, sans exception, après un nombre variable de
jours, a une culture d'Urobacillus pasteurii, accompagnée au commencement de plu-
sieurs autres espèces de bactéries de l'urée, mais restant finalement a l'état de cul-
ture pure.

Dans cette expérience la décomposition de l'urée est assez uniforme et finit tou-
jours par être complete. Il en est encore ainsi quand on introduit 11 a 13% d'urée
au lieu de 10%. Si la teneur en uree est plus haute une partie reste indécomposée, et
pour une teneur de 20% il ne se transforme plus que 4% en carbonate.

Des nombreuses épreuves je citerai une seule, pour bien faire voir l'allure de Ia
décomposition de l'urée. A la température de l'optimum, + 30" C, la vitesse de trans-
formation est tres grande; c'est pourquoi j'ai fait les cultures a 23" C, afin de réduire
cette vitesse. lei comme toujours la proportion de carbonate d'ammonium a été expri-
mée en centimètres cubes d'acide normal, nécessaires pour la neutralisation de 100 cm',
du liquide de culture. Voici les titres trouvés:

') Ce dernier est tres facile a employer dans les laboratoires, parce qu'il se déve-
loppe parfaitement sur la gelatine de viande ordinaire en se remplissant d'uréase.

-) La pasteurisation est sans eflfet sur Ie résultat final, mais modifie complètenient
la »préflore« (p. 89).

86

12 avril: infection avec de la terre fraiche, titre primitif 0,5 cm.*
19 „ titre 32

23 „ ,, 106

24 ,, , 280

L'urée a maintenant complètement disparu et il ne s'est amassé pas moins de
13,44% de carbonate d'ammoniaque. Puisque 10% d'urée correspondent a 333 cm*.,
1^/3% d'urée ont disparu par évaporation de 2,5% de carbonate d'ammoniaque, de
sorte qu'il s'est formé en tout 16% de carbonate. Malgré cette perte considérable,
Texpérience ne doit pas être considérée comme peu précise. 11 serait d'ailleurs facile,
si on Ie jugeait désirable, d'atteindre une précision plus grande, mais pour notre but
cela était parfaitement inutile. Une fois que la décomposition est en train, on peut,
comme nous venons de dire, augmenter considérablement la vitesse de transformation
en élevant la température jusqu'a 30" C, donc diminuer de beaucoup la durée de
I'expérience.

A la fin de l'épreuve Ie liquide ne contient plus qu'un petit nombre de bactéries, de
tres minces batonnets, parmi lesquels quelques spores rondes isolées. La grande majo-
rité des spores, comme d'ailleurs presque tous les individus vivaces et capables de se
développer et reconnaissables sans difficulté au microscope, appartiennent a l'espèce
Urohacillus pasteurü, tandis que les nombreuses autres espèces, qui a l'origine s'étaient
développées parallèlement a la précédente, ont été refoulées dans Ie cours de I'ex-
périence et sont mortes, a l'exception de leurs spores qui se laissent déceler par la
methode des plaques a gelatine de viande ordinaire, sur lesquelles VU. pasteurü ne se
développe pas du tout.

L'expérience conserve, comme je l'ai dit, Ie même caractère si on élève a 13%
la teneur en uree. Le titrage donne alors jusqu'a 340 cm*, d'acide normal pour
TOD cm*, de solution, ce qui correspond a la transformation de 11,2% d'urée en
t6,34% de carbonate d'ammoniaque. Comme dans ce cas encore la transformation
de l'urée est complete, il a dü s'évaporer 4,46% de carbonate, correspondant a 93 cm^,
d'acide normal. S'il n'y avait pas eu de perte de carbonate d'ammonium, l'alcalinité
aurait été de 433 au lieu de 340.

Comme on pouvait s'y attendre, en égard a la quantité tres variable de germes
d'urobactéries qui se développent au commencement, dans de pareilles infections gros-
sières, l'instant oü l'on commence a s'apercevoir de la décomposition de l'urée est lui-
même tres variable. C'est ainsi que dans des expériences faites a environ 28" C, la
transformation commenqait:

après 2 jours, dans 3 expériences
„ 4 ,, „I expérience

» 5 M » I

Dans toutes ces expériences et dans beaucoup d'autres, toujours avec 10%
d'urée, la transformation, une fois commencée, s'achevait a peu prés avec la même
vitesse ; le titre final était de 280 a 290 cm*, d'acide normal, ce qui correspond a
8^3% d'urée présente encore sous forme de carbonate d'ammoniaque, et a 1^/3% d'urée
disparue par évaporation du carbonate. L'égalité de la durée de la transformation
s'explique par le fait que dans les dernières phases c'est toujours, comme nous l'avons
vu, la même bacterie, U. pasteurü, qui effectue le travail principal.

8?

Ainsi que je l'ai déja dit, notre expérinientatiou peut encore se faire avec de la
lerre pasteurisée, parce que les spores d'U. pasteurii, comme d'ailleurs celles de plu-
sieurs autres espèces d'urobactéries de la »préflore«, resistent quelque temps a une
température de 95° C, et pendant longtemps a des températures de 80 — 90" C. En
employant pour l'infection des matériaux pasteurisés, Ie commencement de la décom-
position se fait toutefois plus longtemps attendre que si l'on se sert de terre fraiche,
ce qui tient certainement a ce que les espèces qui ne forment pas de spores (comme
Urobacillus miquelii) et les états végétatifs des espèces sporogènes, états que l'on ren-
contre dans Ie sol a cóté des spores, ont été détruits, ce qui n'est pas sans inHuence sur
VU. pasteurii, qui exige un milieu alcalin pour son développement. Mais nous revie^^-
drons tantót sur cette difïérence.

Pour reconnaitre et distinguer les urobactéries, M. Miquel les a classes en
coques qu'il designe par Ie nom (ÏUrococcus, et en bacilles qu'il appelle Urobacillus ^).
Dans Ie genre physiologique Urococcus il classe 9, dans Ie genre Urobacillus 8
espèces, ce qui est assez pratique dans l'état iusufïisant de nos connaissances actuel-
les des relations réelles. Pour un classement plus détaillé il se base sur l'intensité de
la décomposition de l'urée et sur la quantité d'urée qui peut être décomposée en
tout, ce qui rappelle la force fermentative et Ie degré d'atténuation chez les levüres
alcooliques. lei comme la on obtient ainsi des nombres tres utiles pour une diagnose
(k'finitive, et il est certain que dans beaucoup d'autres cas on pourra se servir avec
avantage, pour Ie diagnostic des microbes, de pareilles propriétcs susceptibles d'être
mesurées et exprimées numériquement. Il me semble cependant que M. Miquel
attaché trop peu d'importance a la nature des sources d'azote et de carbone, ca-
pables d'être assimilées par les diverses urobactéries: ainsi que je l'ai déja fait ob-
server au § i, ces sources peuvent même conduire a des espèces particulières d'uro-
bactéries, par des expériences d'accumulation déterminées.

Ce serait aller trop loin que de décrire toutes les formes qui se présentent assez
régulièrement dans mon expérience et dont Ie nombre est assez considérable. Je me
contenterai d'en choisir quelques-unes particulièrement remarquables, tant par la
régularité avec laquelle on les obtient que par leurs caractères physiologiques. En
premier lieu j'ai a citer sous ce rapport VUrobacillus pasteurii lui-même, dont l'acti-
vité extraordinaire dans la décomposition de l'urée laisse bien loin derrière elle celle
de toutes les autres espèces, et qui attire spécialement l'attention, tant par sa présence
inattendue dans toute poussière et toute terre, que par l'impossibilité de se laisser
cultiver sur les plaques ordinaires. Je parlerai ensuite de 2 bacilles qui se rencontrent
généralement l'un après l'autre au commencement de l'épreuve d'accumulation, mais
sont plus tard refoulés des cultures par VU. pasteurii. La première de ces deux
espèces, qui ne forme pas de spores, est appelée ici Urobacillus miquelii, la suivante,
sporogène, U. leubei. Enfin je décrirai une sarcine mobile, tres interessante, produi-
sant des spores et par conséquent résistant a la pasteurisation des matériaux employés
pour l'infection. Je lui donne Ie nom de Planosarcina ureae-). Une fois que j'eus

*) M. Miquel a aussi fondé un genre Urosarcina avec une seule espèce. Cette
espèce appartient toutefois au genre Bacillus. Les véritables sarcines décomposant Turée,
dont je dirai quelques mots dans la suite, lui étaient inconnues.

"-) Le genre Planosarcina a été introduit par M. Migula, System der Bakterien,
n, 275, 1900. Je me rallie a sa délimitation.

88

•découvert les spores de cette espèce, je pus démontrer aisément que certaines autres
5arcines, parmi lesquelles des formes immobiles, sont également sporogènes. Une
d'elles, décomposant aussi l'urce, sera considérée d'un peu plus prés dans une note
au §8.

5. Description de VUrohacillus pasteiirü M i q u e 1.

Cette espèce, la plus active des bactéries de l'urée, a été découverte par M.
Miquel en i88g; il l'a décrite de telle fa^on qu'il est possible de la reconnaitre
aisément 1). Mais malgré sa grande répartition et son importance indubitable elle
est restée assez peu connue, parce qu'elle ne se développe pas sur les terrains de
culture ordinaires. Sa croissance ne devient possible que par la présence de carbonate
d'ammoniaque libre, et comme la teneur en cette substance peut devenir tres élevée sans
préjudice pour la bacterie, l'addition d'une quantité suffisante de ce corps a du bouillon
de viande gélatinisé fournit un terrain de culture sur lequel se développe tres bien
la bacterie en question, comme d'aillenrs certaines autres urobactéries, mais oü l'on
ne rencontre que fort peu des saprophytes ordinaires. Si l'on ajoute encore de l'urée a la
substance nourricière la proportion de carbonate, au lieu de diminuer par évaporation,
augmente pendant l'expérience, ce qui permet d'arrêter dans leur croissance les mi-
crobes les moins actifs et de ne conserver que les U. posteitrii et U. lettbei tout seuls.
Ainsi, pour cultiver VU. pasteiirü. je me sers de gelatine de viande a 0,3% de car-
bonate d'ammonique et 2% d'urée, de sorte qu'au commencement 100 cm^*. de la ge-
latine liquide sont titrés par environ 6 cm^. d'acide chlorhydrique normal.

L'ensemencement, sur ce terrain de culture, de gouttes prises d'un bouillon a
uree employé pour notre expérience principale permet de déterminer exactement
l'instant oü VU. pasteiirii commence a s'accumuler. Ce moment coïncide avec Ie com-
mencement de la décomposition de l'urée. décomposition qui n'est d'aillenrs pas mise
en train par VU. pasteurü menie, mais par d'autres espèces. C'est pourtant un fait
remarquable que Ie développement de VU. pasteurü commence déja lorsque la quan-
tité de carbonate d'ammonium formée aux dépens de l'urée est encore si faible,
qu'une gelatine de culture de même alcalinité n'en permettrait pas la croissance, notam-
ment 0,5 — i cm^. pour 100 cm^. de solution. Cela tient probablement a la forte teneur
en uree, teneur impossible dans la gelatine (ou l'agar) de culture, parce que 10%
d'urée en empêchent la solidification a froid. C'est aussi pourquoi VU. pasteurü peut
tres bien s'obtenir a l'état de culture pure dans Ie bouillon de viande a 10% d'urée,
sans qu'il soit nécessaire d'y ajouter encore du carbonate d'ammoniaque, de sorte que
ia décomposition de l'urée doit alors être mise en train par cette bacterie même. Tl
semble donc que pour VU . pasteurü l'urée puisse remplacer, au moins partiellement, Ie
carbonate d'ammonium.

A l'origine les colonies d't/. pasteurü, qui se forment sur les solides de bouillon
gélatinisé a uree et carbonate d'ammonium, ont l'apparence de plaques transparentes
et vitreuses, et se distinguent de celles des autres espèces par la longue duréc de leur
croissance. Elles atteignent finalement un développement considérable, p. ex. 2 a 3 cm.
de diamètre au bout de 2 a 3 semaines, sur des plaques nourricières suffisamment

') Fermentation animoniacale, p. 39.

89

étendues. D'ordinaire la gelatine se liquétïe au bout d'uu certain teinps, a commencer
par Ie centre de la colonie, et de temps a autre on trouve des colonies qui liquéfient
fortement dès Ie commencement et que l'on pourrait tenir pour une espèce particuliere.
Elles ne se distinguent toutefois des formes moins liquéfiantes que par leur richesse
extraordinaire en spores, et par conséquent aussi en bactéries végétatives mortes,
parce que les batonnets meurent a la suite de la formation des spores. Or, ce sont
précisément ces restes qui occasionnent la liquéfaction ^). Des inoculations rcpétees

font perdre aux microbes leur pouvoir
d'excessive sporulation, donc aussi leur
pouvoir de liquéfier la gelatine. Cela pro-
vient de ce que l'on transporte toujours
plus de batonnets végétatifs que de spores,
a moins de prendre des précautions spé-
^ ^<™^ xiT' / / oMÊk. \ l \ ciales, et beaucoup de ces batonnets per-

wBift^T^X \\i //ÉlraH Y ) dtn\. complètement la propriété de former

^^ÊMM^ ^S\\ i Iw^^m ''' _ / des spores. Si l'on a soin de pasteuriser

la matière avant de l'inoculer, de maniere
a ne semer que des spores, la sporogènese
et les autres caractères variables de la
culture transportée restent beaucoup plus
constants -).

La longueur et l'épaisseur des baton-
nets varient considérablement avec Ie ter-
rainde culture. Dans les cultures liquides de
bouillon de viande a io% d'urée, les mi-
crobes sont d'abord gros et mobiles, mais
finissent par devenir longs, minces et im-
mobiles. Sur du bouillon de viande a agar,
a 2% d'urée et 0,3% de carbonate d'am-
moniaque, iis sont assez longs (4 a 5 u
p. ex.), et leur grosseur peut atteindre
1,5 |U; en méme temps on y reconnait
plusieurs formes semblables a un clostri-
dium (fig. I, et PI. fig. i et 2). Aussi longtemps que la proportion de carbonate est
faible, la mobilité est grande; les cils sont nombreux et couvrent la surface entière;
ils peuvent dépasser les batonnets de 10 fois leur longueur.

Fig. I. Urohacillus pasteurü Miquel. Au
centre et a droite en haut les cils ont
été représentés avec la forme qu'ils ont
probablement chez les bactéries vivantes.
Le reste de la figure rend exactement
les organismes vivants. A droite en bas
on voit 6 spores sphériques isolées.
Gross. 2580.

') Le méme phénomène s'observe encore chez plusieurs autres bactéries sporo-
gènes, ainsi que chez plusieurs levüres alcooliques, comme Schizosaccharomyces octo-
sporus, dont on trouve de plus amples détails dans Centralbl. f. Bakt. etc. 2 Abth.
Bd. in, 1897, p. 521. A mon avis cette liquéfaction est produite par une modification
de la trypsine toujours présente, mais qui ne peut pas sortir par diflfusion d'une cellule
vivante, mais bien d'une cellule morte.

^) Dans mon laboratoire cette methode est appliquée depuis desannées; elle per-
met aussi de maintenir constantes plusieurs autres espèces' de bactéries sporogènes.
En 1898 déja j'ai démontré {(Centralbl. f. Bakt. etc. 2 Abth. Bd. IV, p. 657) que de cette
maniere on peut empêcher même la variation des levüres. La régie a une portee con-
sidérable et s'applique aussi a d'autres divisions du système naturel.

go

Les spores sont parfaitement sphériques et mesurent environ i |i, Mais il y a
aussi des spores beaucoup plus petites. Pendant quelques instants elles supportent
Tébullition, mais elles meurent par un chauffage prolongé non seulement a la tem-
pérature d'ébullition mais même a 90° C. Si l'on se propose donc de faire des ex-
périences avec une terre qui doit contenir VU. pasteurü vivant, on doit infecter avec
de la terre fraiche, ou pasteurisée jusqu'a 80 — 90" C. au plus. Des cultures jeunes,
sans spores, rappellent par leurs dimensions et leur mobilité les bacilles du foin.

De même que chez tant d'autres bacilles sporogènes, l'optimum de croissance est
assez élévé, probablement 32° C. dans Ie bouillon de viande contenant peu d'urée. Le
maximum est un peu au-dessous de 45" C. et le minimum est toujours plus élevé que
O^C; dans les conditions ordinaires de culture il est même au-dessus de io"C. i).

Puisque l'optimum d'activité de l'uréase est peu éloigné de 50° C, et est donc
notablement plus élevé que l'optimum de croissance. Al. Miquel observe: »Quand
on voudra provoquer une prompte fermentation avec l'espèce qui nous occupe, on pla-
cera le liquide ensemencé vers 40" C. Si c'est un développement botanique qu'on
désire surtout obtenir, on en exposera la culture a 30° C.« Il va de soi que tout dépend
de la quantité des bactéries ensemencées.

Au sujet de l'intensité de la décomposition de l'urée, M. M i q u e 1 dit qu'a 30" C,
et dans des conditions d'ailleurs avantageuses, U. pasteurü décompose par heure et
par litre 3 g. d'urée au maximum. Dans mes expériences a 30" C, j'ai trouvé comme
maximum de vitesse de décomposition 3,3 g. d'urée par heure et par litre; cette valeur
plus élevée tient sans doute a ce que M. Miquel stérilisait toujours ses liquides de
culture au-dessus de 100" C, tandis que je me contentais de les faire bouillir parce
que la stérilisation est ici inutile; et l'on sait qu'une simple ébullition conserve mieux
les propriétés nutritives des solutions que la stérilisation complete. Toutefois, pour
atteindre ce résultat,la teneur en uree ne peut pas dépasser 12% (M.M i qu e 1 dit 13%),
parce qu'une teneur plus forte diminue la vitesse de décomposition. Dans des solutions
contenant 20% d'urée je n'arrivais qu'a décomposer 4% d'urée (correspondant a
environ 120 cm^. d'acide normal pour 100 cm^. de solution). Cette décomposition était
tres lente; puis la décomposition s'arrêtait en même temps que le développement de
VU. pasteurü.

Si l'on ajoute au bouillon de viande i — 3% de glucose, la décomposition est au
commencement plus active encore, mais plus tard cette vitesse diminue.

M. Miquel dit que, dans ses expériences, il s'est encore servi d' »urine arti-
ficielle«, composée de 100 p. d'eau, 2 p. de peptone C h a p o t e a u, 0,005 de eendre
de bois et 2 — 3% d'urée. En répétant les expériences avec cette solution je n'ai ob-
tenu de bons résultats qu'en employant, comme M. Miquel, la peptone C h a p o-
teau; avec la peptone sèche de Witte ou d'autres peptones du commerce je n'ob-
servai pas de croissance.

Je n'ai pas pu découvrir jusqu'ici, pour VU. pasteurü, d'autres sources d'azote
que celles contenues dans l'urine, le bouillon de viande ou la peptone Chapoteau;
cette espèce est donc tres delicate a ce point de vue. Même l'asparagine et le glucose,
qui constituent une si excellente nourriture pour un grand nombre de bactéries, ne
sont favorables ni a la croissance de VU. pasteurü, ni a la décomposition de l'urée.
Aussi les préceptes donnés au § 2 pour les expériences d'accumulation des microbes

^) Voir (railleurs les données de M. Miquel (loc.cit., p. 62).

91

de l'urée en général ne s'appliquent-ils pas du tout a VU. pasteurii, qui est donc, au
point de vue de sa nourriture, une des bactéries les plus spécialisées qui existent.

Dans l'urine en voie de décomposition, cette espèce ne semble être présente que
si pour Tune ou l'autre raison cette urine contient une fort proportion de matières or-
ganiques; on ne la rencontre pas dans l'urine diluée avec de l'eau, oü se développent
les microcoques ordinaires. De plus, comme nous venons de dire, la température doit
être assez élevce pour que la culture de VU. pasteurii soit possible.

6. Examen de la ^préüore«. Urobacillus miqueln n. sp.

Nous avons déja fait remarquer que notre expérience d'accumulation ne fournit
pas exclusivement, comme »flore principale«, une culture pure d'U. pasteurii; elle con-
duit pendant les premières étapes a une »préflore« qui consiste en plusieurs autres
urobactéries, de sorte que cette expérience fait connaitre une »flore de l'urée* assez
étendue. Jusqu'ici je n'ai pas encore eu Toccasion d'étudier cette flore dans tous
ses détails; c'est pourquoi je me bornerai, comme je l'ai annoncé, a examiner de plus
prés trois des formes les plus caractéristiques, et je crois que quiconque reprend mes
expériences reconnaitra ces formes, qui présentent donc un intérêt général. Ainsi que
je l'ai dit au § 4, je leur donnerai les mons d'Urobacillus miquelii, Urobacillus leubci
et Planosarcina iireae.Je n'ai pulesidentifier avec certitude avec aucune espèce décrite.

Tandis que VU. pasteurii ne croit sur un substratum solide qu'en présence de car-
bonate d'ammoniaque, les bactéries de la préflore se laissent facilement cultiver sur
de la gelatine de viande ordinaire, tant avec de l'urée ou du carbonate d'ammoniaque
que sans ces matières.

Pour reconnaitre ces espèces, l'examen de la culture s'effectue de cette facon: a
•:ertains moments de l'expérimentation, déterminés par Ie titre du carbonate d'am-
monium, on tracé sur la gelatine de viande ordinaire des traits inoculatoires, et parmi
les colonies ainsi obtenues on détermine, a l'aide du phénomène de l'irisation sur la
gelatine de levüre a uree, quellesn/colonies décomposent l'urée et quelles autres ne Ie
font pas.

On observe alors deux choses: d'abord, que 10% d'urée en solution dans Ie bouil-
lon ralentissent déja considérablement ou arrétent méme la croissance et l'accumu-
lation de la plupart des espèces non décomposantes, avant même que la décomposition
de l'urée ait commencé, et en second lieu, qu'a mesure que la proportion de carbonate
d'ammoniaque augmente ces espèces sont réellement refoulées par les urobactéries, si
leur croissance n'est pas déja arrêtée par la présence de l'urée même.

Cette action pour ainsi dire vénéneuse que l'urée exerce, dans ces conditions,
sur les bactéries ordinaires est remarquable. Si l'on infecte p. ex. notre solution
avec une quantité de terre si considérable que Ie nombre des microbes qui se déve-
loppent sur de la gelatine de viande au moment de l'ensemencement soit tres grand,
et que plus tard on ensemence de nouveau mais avant que la décomposition de l'urée
ait commencé, on trouve que les formes communes, comme B. üuorescens Uquefaciens
et B. fluorescens non Uquefaciens disparaissent tres tot et totalement. Un peu plus tard
disparaissent encore les Streptothrix chromogena^), les champignons du foin, les

*) A ma description antérieure relative a cette espèce (ces Archives (2), 3, 338,
1900), je puis encore ajouter qu'elle existe en grandes quantités dans Ie sol, a 2-4 om.

92

Bacillus mycoides et B. megatherlum, bref tous les organismes généralement répan-
dus dans Ie sol.

Ces faits sont en contradiction flagrante avec la description de M. M i q u e I
qui, en divers endroits de son livre, insiste sur la grande difïiculté qu'il y a a séparer
les urobactéries des formes ordinaires. Ces difficultés n'existent pas dans notre ex-
périence, qui conduit comme on Ie voit tout au contraire a une séparation tres com-
plete et tres rationelle.

Il est toutefois remarquable que des cultures d'urobactéries, même d't/. pastenrii,
dans du bouillon de viande a io% d'urée, incomplètement stérilisé par ébullition et
contenant par conséquent des spores d'autres bactéries saprophytes, contiennent sou-
vent et bien longtemps pendant les premières phase de l'expérimentation certaines for-
mes non décomposantes, plus souvent même que l'on ne rencontre ces formes dans les
accumulations commencées avec de la terre fraiche, oü ces saprophytes ont pourtant
certainement existé a l'origine. Il faut donc que la flore de l'urée, se développant
dans Ie dernier cas, soit en état de refouler ces infections, tandis que les cultures plus
ou moins pures sont moins énergiques a ce point de vue. C'est sans doute a cette
circonstance que l'on doit attribuer les difficultés rencontrées par M. ]\I i q u e 1 , car
il dit lui-même qu'il opérait souvent avec de pareilles »cultures partiellement pures«,
provenant des poussières atmosphériques et contenant communément outre l'urobac-
térie elle même, une seule espèce de saprophyte accidentellement présente sur la
même particule de poussière.

En même temps que les diverses formes saprophytes disparaissent, la flore de
l'urée se développe déja lorsque la décomposition de l'urée ne Ie décèle encore qu'avec
peine par titrage du carbonate d'ammonium. Dans Ie cas oü l'on se sert pour l'in-
fection de terre non pasteurisée, l'image que présentent les plaques de gelatine ordi-
naire a cette époque, aussi bien dans l'état préliminaire que quand la décomposition
oe l'urée vient de commencer, est tres caractéristique: elles contiennent alors une
culture presque parfaitement pure d'une bacterie décomposante, non encore décrite a
ce que je crois, que je nommerai UrobaciUus niiquelii (Fig-. 2, PI. fig. 3).

Dans du bouillon de viande a 6% d'urée, cette espèce décompose en 8 jours
environ 1^4% d'urée (correspondant a environ 50 cm^. d'acide normal nécessaires
pour neutraliser 100 cm=*. du liquide de culture); elle appartient donc aux espèces
peu actives, mais est néanmoins remarquable comme membre particulièrement carac-
téristique de la flore de l'urée et par son ubiquité. Dans mon expérience d'accumu-
lation on peut l'observer dans toutes ses variétés, et celles-ci sont nombreuses.

Sur de la gelatine viande les colonies d'^. mlquelii sont grandes, étalées et dé-
<:oupées plus ou moins profondément sur les bords ; dans quelques formes même elles
sont fortement ramifiées, ce qui les fait ressembler a des colonies de B. zopüi et B.

de profondeur; a des profondeurs moindres ou plus grandes elle semble beaucoup
moins répandue. Elle ne décompose pas l'urée, mais dans plusieurs expériences d'accu-
mulation dans l'urée j'ai trouvé une autre Streptothrix non pigmentaire mais active,
■quoique faiblement. C'est la Ie premier exemple d'uréolvse par un organisme n'appar-
tenant pas aux bactéries. Un second exemple est Ic Saccharomyces mycoderma, dont
j'ai reconnu tout récemment, au moyen du phénomène d'irisation, Ie faible pouvoir
iirolytique.

93

astero'ides ^). Le pouvoir liqut-fiant est faible, bien que la liquéfaction s'observe tót
OU tard chez toutes les variétés, et cela avec d'autant plus d'intensité que les colonies
se ramifient moiiis sur la gelatine. Dans ces colonies la liquéfaction commence au
centre et progresse vers les bords; souvent un large bord, non liquéfié, entoure une
petite dépression centrale. Seules les colonies fortement ramifiées, semblables a des
colonies de B. asteroïdes, ne liquéfient presque pas du tout, même dans des colonies
tres vieilles. D'ordinaire les colonies ont une couleur blanche jaunatre, mais quelques

tormes sont nettement rosées.

Il ne se forme pas de spores, de sorte
qu'on ne peut obtenir VU. miquelü que dans
des cultures infectées avec de la terre
fraiche; une pasteurisation au-dessus de
80" C. les détruit a coup sür 2).

U. miquellü est une bacterie en forme

de batonnet, a mouvements propres. Les

cils ne sont pas tres nombreux et sont

groupés tout autour (péritriches). A un

point de vue phylogénétique VU. miquelü

doit certainement être classé dans le groupe

auquel appartiennent B. sopüi et B. aste-

_ ro'ides^).

^ H| <^^g|Miiiiiiiiijll I ■ Frottées sur une plaque de gelatine a

^ w y^ décoction de levüre et uree, les colonies

JÊ^ Wk ^^^ ^r^ ^'^' ""9"^^"*) produisent déja après quel-

^jr ^ ^^ ques minutes des anneaux colorés dont !a

lente extension démontre la faible activité
urolytique de cette espèce. Des cultures
sur gelatine longtemps conservés et com-
plètement liquéfiées n'agissent plus sur
l'urée, bien que leur trypsine soit encore active et puisse encore liquéfier énergiquement
la gelatine, ce qui prouve que l'uréase conservée s'altère beaucoup plus vite que la
trypsine. Plusieurs autres influences provoquent d'ailleurs la disparition complete de
eet enzyme peu résistant.

Dans la littérature je n'ai pas pu trouver de description s'appliquant bien a ce
microbe, bien qu'il soit tres probable que parmi les innombrables diagnoses de bac-
téries déja existantes, plusieurs se rapportent a certaines formes de cette espèce ex-
trêmement commune. Ces diagnoses ne pourront toutefois jamais être considérées

Fig. 2. ürobacillus miquelü n.sp. A gauche

en haut deux individus montrent le grou-

pement probable des cils. Gross. 2580.

*) B. asteroides et B. zopfii ne décomposcnt toutefois pas l'urée.

-) Des 8 urobacilles que décrit M. Mi que 1, l'U. schiitcenbergii scul ne contient
pas de spores, mais dans les autres caractères la description de cette espèce ne
s'accorde pas avec U. iniquelii. J'ai'découvert d'ailleurs plusieurs autres urobacilles non
sporogènes

*) L'habitat de ces deux dernières formes est également la terre, mais elles ont
une tendance a s'accumuler dans une solution de gelatine abandonnée a la putréfaction.

*) Aucune autre espèce ne peut s'obtenir par culture aussi rapidement en grandcs
quantités pour faire des expériences avec l'uréase.

94

comme étant d'une autorité suftisante, puisqu'elles ne se basent sur aucune expcrience
d'après laquelle chacun pourrait cultiver les formes en question en partant de maté-
riaux fournis par la nature.

7. Urobacillus leubei n. sp. comtne wenibre de la »préflore<i
de notre expérience.

A la deuxième espèce active qui, dans notre expérimentation, attire particulière-
ment l'attention par son importance et sa généralitc dans la préflore, j'ai donné Ie
nom d'Urobacillus leubei (Fig. 3; PI.
fig. 4). Malgré les différences nom-
breuses et intéressantes qu'elle présente
avec Urobacillus pasteurii, je la consi-
dère cependant comme voisine de cette
espèce. Si l'on cultive U. leubei sur de
la gelatine de viande a carbonate d'am-
monium,préparée pour la culture ó.e.VU.
pasteurii, il se forme des colonies vi-
treuses, transparentes, bien difficiles a
distinguer de la dernière espèce. Mais,
si Ton inocule VU. leubei sur de la gela-
tine de viande ordinaire, elle y croit
tres bien, tandis que nous savons que
YU. pasteurii ne se développe pas du
tout sur ce terrain. De même que VU.
miquelii, VU. leubei se rencontre déja
dans notre liquide de culture avant
même qua la décomposition de l'urée soit
devenue notable, et peut même y de-
meurer jusqu'au bout, ce qui provient
de ce que l'espèce est sporogène et que

ses spores peuvent résister aux fortes alcalinités produites par VU. pasteurii. Le
nombre des individus de VU. leubei diminue cependant dès que le titre de l'alcali
(lépasse 150 cm', d'acide normal par 100 cm^. de liquide nourricier, parce qu'a partir
de ce degré d'alcalinité les états végétatifs succombent. D'ordinaire les batonnets
sont épais de 1,5 ju, et longs de 3 a 5 |,i, mais parfois bien plus longs. Sur de la gela-
tine a bouillon de viande sans carbonate d'ammonium et sans uree, oü, comme nous
i'avons vu, il se développe parfaitement, VU. leubei donne naissance a deux espèces de
colonies: les unes sont des amas gris-jaunatre, troubles, assez minces, présentant des
spores; les autres sont plus transparentes, vitreuses, sans spores, mais ressemblent
d'ailleurs a la forme trouble. Sur ce terrain de culture les deux espèces de colonies
sont petites, et ne dépassent guère 2 a 3 mm. en diamètre; elles forment une mince
couche, dont le bord est un peu plus épais que le centre. Les végétations obtenues
dans les tubes a culture produisent également des amas minces et transparents,
mais elles se développent alors de part et d'autre du trait inoculatoire sous forme
d'une couche vitreuse transparente qui reste toutefois tres pauvre en bactéries. Sur

Fig. 3. Urobacillus leubei n. sp. Les spo-
res sont oblongues. Les cils n'ont pas
pu être exactement reproduits. Gross. 2580.

95

un terrain contenant du carbonate d'ammonium les colonies deviennent beaucoup
plus grandes. Il ne se produit de liqéfaction dans aucun des deux cas, pas même
dans les vieilles cultures sur gelatine contenant des bactéries mourantes. Les
spores sont oblongues, et mesurent 0,8 — i ji. Plusieurs batonnets, portant des spores,
sont quelque peu élargis a l'endroit oü se trouve la spore, d'oü résultent des formes
semblables a un clostridium; mais cette formation de clostridium n'est pas tres
frappante et beaucoup de batonnets a spores restent minces. On observe des mou-
vements propres dus a des cils péritriches ; mais, comme ces cils sont difïiciles a
colorer et que leur longueur n'est pas aisément mesurable, ils n'ont pas été reproduits
sur la figure.

Les spores ont une grande résistance
vitale et supportent même pendant quelque
temps la température de l'eau bouillante.
Dans un liquide de culture agité avec du
chloroforme, les batonnets mouraient en
moins d'une heure, mais les spores n'étaient
pas même tuées au bout de 24 heures.
Comme les spores supportent parfaitement
l'exsiccation, on les rencontre aussi bien
dans une terre desscchée que dans une terre
fraiche.

Dans un bouillon de viande a 6%

d'urée il se décompose environ, 2,5 d'urée

en 4 a 5 jours, ce qui correspond a un

titre d'alcali d'environ Socm^. par 100 cm^*.

fl^ ÊiêW ''g^y de liquide. Ce nombre est la moyenne pour

^^Êm ^9 plusieurs expériences, qui donnèrent de 64

^^^ a 90 cm^. La raison pour laquelle la dé-

composition de l'urée s'arrête, alors qu'il
reste encore un exces de cette substance
et qu'il existe encore une masse des bac-
téries vivantes, reste ignorée ici comme
dans plusieurs autres cas analogues, et ce
fait est d'autant plus remarquable qu'ici,
comme avec les V . miqueln et U. pasteurii,
la décomposition a lieu sous l'action de l'uréase contenue dans les bactéries. Il faut
donc que eet enzyme soit d'une activité tres restreinte, et ne puisse décomposer qu'un
petit nombre de fois son propre poids d'urée.

Fig. 4. Planosarcina ureae n. sp. Au cen-
tre un individu montrant la disposition
probabie des cils; ceux-ci sont environ 7
fois aussi iongs que la bacterie elle-même;
Les individus sporogènes ont presque
totalement perdu leur contenu. Les spores
sont sphériques Gross. 2580.

8. La présence de Planosarcina ureae n. sp. et l'absence d'Urococcus
ureae C o h n dans la »préflore«. Accumulation de eet urocoque.

La Planosarcina ureae (Fig. 4, PI. fig. 5 et 6) n'apparait, dans notre expérience
d'accumulation, ni avec la même régularité ni en aussi grand nombre que les deux
espèces précédentes ; elle appartient néanmoins aux urobactéries communes et, comme
ses caractères morphologiques sont tres interessants, je veux m'y arrêter un instant.

96

Cest une espèce facile a cultiver sur de la gelatine de viande ordinaire, sur laquelle
elle constitue des colonies plates, de consistance pateuse, jaunatres, d'assez grandes
dimensions et non liquéfiantes ; elles se reconnaissent immédiatement dans les semences
sur plaques solides par leur grandeur et leur aspect. Les colonies aussi bien que les
cultures liquides sont formées de groupes de 4 a 8 cellules, parfois davantage, tres
mobiles par des cils péritriches qui se détachent facilement quand on essaie de les co-
lorer. Les cellules individuelles mesurent 0,7 a 1,2 |a et forment des spores sphériques
de 0,6 |n de diamètre, supportant parfaitement la pasteurisation^i de sorte que dans nos
expériences d'accumulation cette Sarcina s'obtient tant par infection avec de la terre
pasteurisée que par infection avec de la terre fraiche. On peut maintenir la tempéra-
ture a 80" C. pendant 10 minutes sans préjudice pour les spores 1). Les cils sont 7 a 8
fois aussi longs que les tétrades elles-mêmes.

Dans la chambre de verre que j'ai décrite antérieurement -), les cellules isolées
et groupées, soumises a des expériences de respiration, viennent se rassembler, en
vertu de leur mobilité, dans Ie ménisque sous Ie couvre-objet.

Cette espèce contient beaucoup d'uréase et, comme U. pasteiirii', elle produit
presque instantanément Ie phénomène de »ririsafion« sur la plaque de gelatine a le-
vüre et uree.

Son activité a l'égard de l'urée n'est pourtant pas tres forte : en 5 jours je n'ai
pu obtenir qu'un titre de 90 cm*, pour 100 cm*, de liquide, ce qui correspond a peu
prés a 3% d'urée décomposée^). Les urocoques ordinaires,.apparentées probablement
a la Planosarcina, décomposent par contre 5% dans Ie méme temps.

') Les véritables sarcines, non mobiles produisent parfois aussi des spores rondes,
tres résistantes et supportant la pasteurisation. Par la il est possible d'extraire du sol
une espèce commune, d'un faible pouvoir hydrolytique a l'égard de l'urée il est vrai,
mais tres interessante a plus d'un point de vue, et qui ne se laisse cultiver que sur
la gelatine a urine de cheval. Pour obtenir cette espèce, qui ne croit pas du tout sur
la gelatine de bouillon de viande ordinaire, on chauflfe pendant quelque temps de la
terre arable dans l'eau a 80" C, et on la répand sur Ia gelatine a urine. En cultivant
a 230 C, il se forme une culture de colonies teute particuliere, contenant quelques
espèces non encore décrites, tres différentes des formes connues, et parmi elles notre
nouvelle sarcine. Les colonies d'un blanc de neige, cassantes, apparaissent comme
des disques assez solides, en forme de choux-fleur ou plus ou moins lamellaires, cré-
pus et a bord élégamment découpé; elles ne produisent pas la liquéfaction de la pla-
que, d'oü elles se détachent d'une seule pièce avec Ie fil de platine. Elles sont con-
stituées par des paquets de sarcines dont les individus isolés mesurent ca. 1,5—2(1, et
d'un détritus de microcoques trop petits pour être mesurés; c'est pourquoi j'ai donné
a cette espèce Ie nom d'Urosarcina dimorpha. Ces colonies décomposent l'indoxyl-sul-
fonate de potassium de l'urine en se colorant en bleu par l'indigo mis en liberté.
Quelques autres espèces obtenues par cette expérience sont tres curieuses, surtout au
point de vue morphologique, parce que plusieurs d'entr'elles constituent des formes de
transition entre les Sarcina et Ie Bacillus megatherium, er c'est par cette observation
que j'ai reconnu pour la première fois la relation généalogique inattendue entre ces
microbes en apparence si différents. Contrairement a ce que nous venons de voir pour
Urosarcina dimorpha, ces formes intermédiaires croissent bien sur de la gelatine a
bouillon de viande. Toutes supportent d'ailleurs la température de. pasteurisation et
on y trouve des espèces décomposant lurée.

^) Centralbl. f. Bakt. Bd. XIV, 1893. P, 827.

') S'il n'y avait pas eu de perte de carbonate d'ammonium, 3% d'urée disparue
aurait cxactement correspondu a 100 cm".

97

Dans notre expérience d'accumulation j'ai retrouvé cette espèce, même quand Ie
titre était devenu 250 cm^.; quand la teneur en carbonate d'ammoniaque devenait en-
core plus élevée elle disparaissait.

D'ailleurs je ne l'ai pas seulement obtenue en cultivant dans du bouillon de viande
a 10% d'urée, mais quelquefois aussi dans Ie liquide déja mentionné au § 2: 100 parties
d'eau, 0,025 de KH^PO*, 0,25 d'asparagine et 5 d'urée. Son besoin d'azote est donc
différent de celui d'U. pasteurii, qui ne peut pas vivre de cette nourriture.

Parmi les habitants de la »préflore« et a cóté des formes dont il vient d'être
question on voit encore apparaitre, assez régulièrement mais éphémèrement, dans
notre expérience, quelques autres espèces d'urobactéries, parmi lesquelles des micro-
coques jaunes ou incolores, plusieurs formes saprophytes, et enfin quelques bactéries
en batonnets tres particulières, mais non encore suffisamment étudiées jusqu'ici.
Ainsi que je l'ai mentionné au § 6, note i, j'y ai trouvé aussi, quoique sporadiquement,
une Streptothrix agissant sur l'urée.

Il est a remarquer que je n'ai jamais rencontre, parmi la flore si variée de mes
cultures, les microcoques tres actifs de l'urine en putréfaction, que je désigne avec
la plupart des auteurs sous Ie nom d'Urococcus ureae et que je considère ccmme identi-
ques a ceux observés par Pasteur et M. van Tieghem, et appelés Micro-
coccus ureae par CohnetLeube. M. Miquel subdivise cette espèce en plusieurs
autres, mais a mesure que je me familiarisais davantage avec ces organismes, ses
descriptions me devenaient de moins en moins compréhensibles. Voila pourquoi je me
tiens provisoirement a l'ancienne dénomination.

Je suis d'ailleurs parvenu, dans une expérience spéciale, a obtenir cette espèce,
accompagnée de quelques-unes de ses variétés, a l'état de culture a peu prés pure, en
appliquant Ie principe que beaucoup de microbes non sporogènes, auxquels appartien-
nent les urocoques, sont »cryophiles«, c. a d. peuvent se développer a des tempéra-
lures plus basses que les bacilles sporogènes, qui sont pour la plupart »cryophobes« et
même parfois »thermophiles«. Aussi voit-on se développer, dans l'extrait de levüre
contenant 5% d'urée, infecté par les détritus micrococcifères d'un urinoir^) et main-
tenu pendant quelques jours a 11 — 13° C, de belles cultures de microcoques et de
streptocoques. Mais je ne puis insister pour Ie moment sur les détails opératoires de
cette épreuve.

9. Physiologie de la décomposition de l'urée par l'uréase.
L'uréase est intimement liée a l'organisme et absolument insoluble.

On peut a présent considérer comme démontré que la décomposition de l'urée par
les urobactéries ordinaires s'effectue sous l'action d'un enzyme, l'uréase. Pour s'en
convaincre aisément je recommande l'expérience suivante. Une riche culture é.'Uro-
coccus ureae sur de la gelatine a bouillon de viande est transportée sur un verre porte-
objet et placée sous une cloche a cóté d'une cuvette contenant du chloroforme. Dans
cette enceinte fermée, saturée de vapeur de chloroforme, les microcoques meurent
bientót, sans que leur uréase soit ppur cela détruite. Si l'on transporte alors la matière

') Il semble que dans Ie sol et la terre arable VUrococcus ureae soit beaucoup
plus rare que les urobacilles.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 7

98

bactérielie morte sur une plaque de levüre a uree, cette plaque commence a iriser, au
bout de quelques instants, presqu'aussi fortement que si Ton avait employé les mêmes
microcoques vivants. L'action est cependant atténuée un peu, de sorte qu'une petite
quantité d'uréase doit être rendue inactive par Ie chloroforme.

J'ai également précipité par Talcool des cultures de VUrococcus en question dans
du bouillon de viande, et j'ai obtenu ainsi une préparation d'enzyme capable de décom-
poser l'urée, même après plusieurs années, bien que les bactéries y fussent certainement
mortes et ne se développassent plus dans les meilleurs liquides de culture.

Si l'on veut faire ces expériences avec des bactéries sporogènes, en particulier
avec VU. pasteiirii, on se heurte a des difficultés parce que Ie chloroforme ne tue pas
les spores, qui germent rapidement pendant les expériences, ce qui fait que l'on opère
de nouveau avec l'organisme vivant tout entier et non avec son uréase seule. On
peut néanmoins se convaincre aisément du fait que les états végétatifs de ces espèces,
obtenus p. ex. après deux jours de culture a 30" C. des spores d'{7. pasteurii ou d't/.
leubei sur du bouillon de viande a agar et a carbonate d'ammonium, et tués par l'ac-
tion du chloroforme, décomposent aussi l'urée au moyen d'un enzyme.

Mais si l'existence de l'enzyme uréase est certainement établie, la question de
savoir si eet enzyme est soluble ou insoluble dans l'eau est restée jusqu'ici contro-
versée. M. L e u b e dit nettement que dans la filtration d'une culture d'urocoques par
une bougie il ne passait pas la moindre tracé d'enzyme^). Par contre, M. M iquel
est tout aussi convaincu que dans les cultures l'uréase existe a l'état dissout. Il est
d'avis que l'expérience de M. Leube a donné un mauvais résultat parce qu'il a
opéré sur une quantité de liquide trop petite, ce qui a eu pour effet que toute l'uréase
est restée dans les pores du filtre; et il ajoute que, si l'on presse a travers une bougie
Chamberland plus d'un litre de liquide de culture, on finit par faire passer im
liquide contenant de l'uréase.

D'après mon opinion, c'est M. L e u b e qui a raison, et nous devons attribuer les
observations deM. M i q u e 1 a l'emploi de bougies défectueuses, présentant des fissures
dans l'émail a endroit du raccordement ; ces fissures laissaient passer peu a peu les bac-
téries. Les considérations et expériences suivantes me paraissent concluantes a ce
sujet.

Dans Ie bouillon de viande, sans uree, VUrococcus ureae se développe parfaitement
et engendre beaucoup d'uréase. Or je crois que Ie raisonnement suivant est exact. Si
l'uréase existe en solution, même colloïdale, et ne passé par la bougie qu'au bout d'une
filtration plus ou moins longue, parce qu'elle est retenue dans les pores de la bougie,

O Ueber die amnioniakalische Harngarung, Virchow's Arch. f. patholog. Anat. u.
Phys. u. f. klin. Med., 100, 540, 1885. A la page 569 M. Leube dit textuellement: »Es
gelingt nicht ein ungeförmtes, harnstoffzerlegendes Ferment von den die Harnstoff-
spaltung bewirkenden Pilzen zu trennen.« Il dit pourtant plus qu'il n'a démontré, en
affirmant dan8 la suite: »Und weiter glaube ich mich zu dem Schlusse bcrechtigt, dass
dio spezifische, freilich bis jetzt nicht naher definierte Lebensthatigkeit verschiedener
tn Reinkulturen gewinnbarer Pilze die Harnstofïzersetzung zustande bringt, nicht ein
von denselben geliefertes ungeförmtes Ferment, welches weiterhin, unabhangig von
ihnen, Harnstoff in Kohlensaureammonium zu verwandein vermochte.» Nous verrons
cependant que ces paroles de M. Leube, bien qu'inexactes pour les espèces qu'il a
lui-même étudiées, s'appliquent néanmoins, sans qu'il ait pu s'en douter, a quelques
bactéries lumineuses vivant dans la mer.

99

il faut qu'elle passé immcdiatement par du papier a filtrer ordinaire, de structure si
grossière qu'une partie des bactéries passé en même temps. Si donc dans un bouillon
a urocoques l'uréase existe réellement a l'état de solution, il faut que ce bouillon,
passé au filtre de papier, exerce sur une solution d'urée une action tout aussi forte
que Ie liquide a bactéries non filtré, en opérant a une température mortelle pour les
bactéries elles-mêmes, mais favorable pour l'action de l'enzyme, p. ex. a 50" C.

Par contre, si l'enzyme est fixé au corps de la bacterie elle-même et est insoluble,
une solution filtrée ne peut agir qu'en raison du nombre des organismes qui ont passé
par les pores du filtre; elle doit donc être beaucoup moins active qu'une solution non
tiltrée. Dans Ie dernier cas la matière restée sur Ie fïltre, bien qu'en quantité excessive-
rnent petite, doit avoir une action particulièrement forte. L'expérience a prouvé que
des deux éventualités possibles c'est la seconde qui est réalisée ; l'uréase est donc ab-
solument insoluble.

C'est ainsi que j'ai ajouté a une solution d'urée a 6% deux volumes égaux, l'un
d'une culture fraiche d'urocoques dans du bouillon, l'autre de cette même culture filtrée.
Dans une troisième épreuve j'ai introduit Ie filtre lui-même, avec la matière qui y était
restée, dans Ie même volume de solution d'urée que dans les deux premières épreuves,
et j'ai déterminé combien de cm^. d'acide normal étaient nécessaires dans ces trois
cas pour neutraliser 100 cm^. du liquide. L'expérience a été faite a 50° C, tempéra-
ture mortelle pour l'urocoque.

Après 5 h.

Après 22 h.

1. Culture d'urocoques fraiche, non filtrée ...

2. Filtrat de la même culture

3. Filtre avec les bactéries 52 ,, 1 96

50 cm' . ] 72 cm
20 „ 26 „

En comparant les résultats des épreuves i et 3 on reconnait une concentration tres
notable de l'enzyme sur Ie filtre, bien que l'épreuve 2 prouve qu'un assez grand nombre
de bactéries passent par les pores du filtre, qui n'arrêterait donc certainement pas une
solution colloïdale. On doit conclure de la que l'enzyme n'est pas dissout, mais est
fixé a la matière même de la bacterie; car si l'enzyme était en solution, même sous
forme de tres grandes molécules, on ne comprendrait pas pourquoi il se rassemblerait
sur Ie filtre dont les pores laissent pourtant passer une partie des bactéries elles-mêmes,
certainement des milliers de fois plus grandes que les molécules des colloïdes.

D'une faqon peu claire et sans preuves suffisantes, M. Sheridan Lea^) a
exprimé l'idée qu'après leur mort les urocoques perdraient leur enzyme par difïusion et
ne Ie garderaient que pendant leur vie. L'expérience que je viens de décrire prouve
clairement que cette opinion aussi est erronée, puisque j'ai opéré a la température de
50" C, mortelle pour les urocoques, ce qui aurait donné a un enzyme soluble l'occasion
de quitter par diffusion, dans un temps tres court, les restes extrêmement petits des
bactéries, et de se dissoudre dans Ie liquide; on n'observe pourtant rien de cette disso-
lution.

') Some notes on the isolation of a soluble urea-ferment from the Toruia ureae.
Joiint. of Pliysiology, li, 226, 1890.

Mais pour rendre Ie résultat plus décisif encore, j'ai comparé des cultures filtrées
et non filtrées, tuées d'avance par une exposition de plusieurs heures a 1'action du
chloroforme. Les expériences ont d'ailleurs óté organisées comme il a été dit plus haut.
Le chloroforme est fortement préjudiciable non seulement aux bactéries mais encore
s. l'uréase elle-même, ainsi qu'on le reconnait a l'épreuve III, oü le filtre, avec les bac-
téries qu'il portrait, a retenu pendant toute la durée de la filtration du chloroforme a
l'état pur, qui est ainsi resté en contact direct avec les bactéries, dont l'uréase devait
donc avoir beaucoup souf fert ; dans les épreuves I et II ce n'était qu'en solution dans
le liquide de culture que le chloroforme pouvait agir. Mais, malgré cette influence
pernicieuse du chloroforme, l'expérience est néanmoins convaincante:

Après 5 h. ; Après 24 h.

I. Culture tuée par le chloroforme, non filtrée . .

II. Filtrat de la culture tuée par le chloroforme .

III. Filtre avec bactéries. traite par le chloroforme

en liquide pur

14 cm'

3 M

70 cm-'

4 u

Malgré le peu de précision de la methode, ces nombres prouvent suffisamment et
en toute certitude qu'une difïusion de l'enzyme hors des bactéries mortes n'a pas lieu.

L'uréase est donc un enzyme insoluble, intimement lié a l'organisme mort aussi
bien qu'a l'organisme vivant.

Ce résultat a encore été confirmé par l'observation suivante. On inocule des cul-
tures d'urobactéries, vivantes ou mortes, par traits ou en masses a la surface d'une
mince plaque d'agar ou de gelatine, et on les y abandonne pendant des semaines et des
mois pour donner a l'enzyme, dans le cas oü il serait soluble, l'occasion de sortir par
diffusion des bactéries et de pénétrer dans la plaque; si on enlève ensuite a la plaque de
petits fragments oü l'on essaie de déceler la présence d'uréase par le »phénomène de
ririsation«, en plaqant ces fragments sur la plaque de gelatine a eau de levüre avec
uree, on ne trouve pas tracé d'uréase même dans les fragments pris a des distances
aussi petites que possible des traits inoculatoires. On sait que dans ces circonstances
la diastase, la pepsine, la trypsine, et même le mucus végétal, l'amidon soluble et la
gomme arabique se propagent par diffusion jusqu'a des distances mesurables; on serait
donc en droit d'attendre la même chose de l'uréase, même si elle n'était soluble qu'a
un tres faible degré et constituée par des molécules tres complexes.

Après tout ce qui vient d'être dit, il n'y a plus le moindre doute que les »solutions
d'uréase« de Musculus ^), souvent citées, n'étaient actives que parce qu'elles tenaient
en suspension quelques urocoques restés invisibles, ce qui n'est guère étonnant vu
la petitesse de ces microbes et l'époque déja lointaine oü les expériences ont été faites.
Gette possibilité a du reste déja été exprimée par M. G r e e n 2).

L'existence d'un enzyme absolument insoluble n'a d'ailleurs plus rien d'inattendu,

') Sur le ferment de l'urée. Comptes rendus, 82, 334, 1876.
-) The soluble fernicnts and fermcntation, 1890, p. 287.

depuis que j'ai démontré ') que l'isatase, l'enzyme qui forme l'indoxyle aux dépens de
l'isatan du pastel (Isatis tinctoria), ne peut en aucune faqon être extrait des cellules
mortes de la plante.

lo. Décomposition de l'urée par catabolisme.

J'ai démontré ailleurs ^) que l'indican (C^^H^^'NO'^ + ^H'^O), c. a d. la glucoside
de l'indigo du Polygonum tinctorium et de VIndigofera leptostachya, peut être décom-
posé par la cellule vivante de deux manières différentes: en premier lieu par des
enzymes spécifiques que j'ai amplement décrits, et en second lieu par Ie contact direct
avec Ie protoplasme vivant, ce que j'ai nommé catabolisme. C'est ainsi que l'on peut
dt'montrer facilement que les bactéries ordinaires de la fermentation des sucres, comme
les Aërobacter aerogenes et A. coli var. infusionum, décomposent par catabolisme,
tandis que d'autres espèces de microbes, par exemple la levüre de l'acétate d'éthyle et
plusieurs levüres du lactose, de même que les cellules des plantes a indican elles-
niêmes, se sont montrées actives en vertu d'enzymes spéciaux que l'on pourrait appeler
»indicases«.

Ce doublé aspect de la décomposition de l'indican se retrouve d'une maniere ana-
logue chez celle de l'urée. Les bactéries décrites auparavant en provoquent l'hydrolyse
par l'enzyme uréase, mais quelques bactéri^es lumineuses marines causent l'uréolyse par
Ie contact direct de leur protoplasme en voie de multiplication, donc par catabolisme,
sans qu'il soit possible de déceler la moindre tracé d'uréase dans leurs corps morts on
vivants,

Ce ne sont toutefois pas toutes les bactéries lumineuses qui catabolisent l'urée.
Parmi celles que je connais Ie mieux, on rencontre cette propriété chez les diverses
variétés de Photobacter luminosum et Ph. indiciint, avec leurs sous-espèces Ph. splen-
didum et Ph. splendor maris de la mer du nord ■^). Part contre l'urée n'est pas décom-
posée par Ph. phosphorescens et Ph. iïscheri et leurs nombreuses variétés. De même
les vibrions marins ordinaires (parfois aussi lumineux, mais perdant rapidement leur
pouvoir lumineux par culture), ne décomposent pas l'urée; pas davantage les vibrions
et spirilles lumineux découverts dans l'Elbe, la Spree et la Saaie par MM. Dunbar
et Kutscher. Parmi les bactéries lumineuses moins connues, j'ai observé une acti-

0 Further researches on the formation of Indigo from the Woad (Isatis tinctoria),
Proceed. Acad. of Sc. Amsterdam, 30 June 1900, p loi.

*) On Indigo-fermentation. Proceed. Acad. of Sc. Amsterdam, 2,^ ^ivivch 1900, p. 506.
L'action de l'enzyme aussi bien que la décomposition catabolique a lieu suivant Ia
formule

C* //" iVO» + H'O = C* ƒ/' NO + C« //'^ 0\
Indican Indoxyle Glucose.

') Ph. indicum a été découvert en 1886 par M. B. F'ischer dans 1'océan atlantique
prés de Santa Cruz, et depuis je l'ai retrouve nombre de fois dans la mer du nord,
sur la cóte hollandaise, bien qu'a l'état de variétés ou sous-espèces particulières, que
j'ai appelées Ph. splendidum et Ph. splendor maris; toutes trois décomposent énergi-
quement l'urée. Ph. luminosum a été commun dans la mer du nord pendant les années
1888 a 1895 éet a cette époque je l'ai isolé d'animaux marins et de l'eaii de mer en
milliers de colonies.

vité énergique chez une espèce, commune dans la mer et dans l'estomac des hui tres '),
qui se distingue par une croissance tres faible et une dégénérescence rapide dans 'es
cultures (Photobacter degenerans F i s c h e r). Enfin il existe encore dans la mer un
petit nombre de microbes actifs obscurs, ainsi que j'ai pu m'en convaincre par des
expériences d'accumulation ^), mais je ne les ai pas encore soumis a une etude plus
détaillée. lis sont certainement rares.

Les expériences suivantes prouvent l'action catabolique des espéces que je viens de citer.

Si l'on porte les bactéries lumineuses a étudier sur la gelatine de levüre a uree
sans sel marin, précédemment décrite, les bactéries mêmes meurent au bout de tres
peu de temps, par suite du manque de sel. Quoique la gelatine soit énergiquement
liquéfiée, la trypsine sécréteé par ces bactéries étant tres active dans ces circonstances,
il ne se produit rien de plus: l'urée reste intacte pendant toute la durée de l'expérience.
Cela prouve que l'uréase ordinaire fait défaut chez ces bactéries.

Si Ton ajoute au terain de culture 3% de sel marin, on rend ce terrain convenable
pour la croissance (mais non pour la luminosité). Si l'on inocule alors sur la plaque les
bactéries lumineuses vivantes, elles restent sans action sur Turée pendant plusieurs
heures, même quand elles sont présentes en tres grande quantité, ce qui prouve que
dans Ie corps de la bacterie il ne s'amasse pas non plus un enzyme de l'urée actif seule-
ment en présence de sel marin. Mais au bout de quelques heures commence une décom-
position énergique de l'urée; on voit se former de larges anneaux de N e w t o n, puis
il se forme dans la gelatine un précipité blanc de phosphate et de carbonate de chaux,
tout comme dans les expériences avec l'uréase. L'examen microscopique des bactéries
apprend que la décomposition de l'urée commence au moment oii les bactéries com-
mencent a se segmenter, de sorte que la décomposition est corrélative a la croissance.

Des bactéries mortes sont totalement sans action sur ces plaques d'urée au sel
marin. Une uréase speciale, active seulement en présence de sel marin y fait donc aussi
complètement défaut.

La décomposition de l'urée par des bactéries lumineuses s'effectue, dans des liqui-
des nourriciers convenables, p. ex. dans du bouillon de poisson a 3% de sel marin «;t
2 a 3% d'urée, de la même maniere que sur les plaques, sans l'intervention d'uréase.
Avec Ph. indiciini Ie titre alcaliii, atteint dans ces circonstances en 48 heures, corres-
pond a environ 80 cm=». d'acide normal pour 100 cm^. de liquide. De 7% d'urée 2% a
peu prés peuvent être décomposés. En élevant davantage'la proportion d'urée on n'ob-
serve pas une décomposition plus avancée, et a 10% la décomposition est nuUe. Les
bactéries n'émettent pas de lumière pendant ces expériences, mais elles n'ont pas perdu
pour cela la propriété photogène en l'absence d'urée. La masse des bactéries nouvelle-
ment formées est toujours plus faible que dans Ie même liquide sans uree. Après filtra-
tion elle se montre sans action sur ce corps aussi longtemps que les bactéries sont eni-
pêchées de croitre.

*) En examinant Ie contenu de l'estomac d'huitres américaines vivantes, expédiécs
de New-York a Rotterdam, j'ai trouvé cette bacterie par millions en culture pure.
Dans l'estomac des huitres hollandaises elles sont plus rarcs et mêlées a d'autrcs
bactéries lumineuses et obscures.

*) Ces expériences ent été faites dans Ie but d'accumuler pur l'urée les bactéries
lumineuses et uréolytiques marines; elles sont restées infructueuses, parcc que ces
bactéries sont refotilées par les urobactéries obscures.

103

Une diffcrence essentielle entre la décomposition de l'urée par catabolisme et la
décomposition par l'uréase réside, tout comme pour la décomposition de l'indican, dans
rinfluence que la température a sur les deux phénomènes. Le catabolisme atteint no-
tamment son optimum a la température optimale de croissance, ou un peu plus haut,
soit environ a 27° C. pour la bacterie lumineuse indienne dans le bouillon de poisson,
tandis que la décomposition par l'uréase, dans le cas oü elle provient d'Urococcus ureae,
atteint son maximum a 45 — 50" C, bien que pour ce microbe la température optimale
de croissance se trouve a viron 23" C, et que la mort survienne ici, du moins a l'état
humide, déja au bout de 2 heures a 45" C, et après quelques minutes a 50" C. Maïs
par cette température l'uréase n'est point altcrée ou ne l'est que fort peu.

La forme plus simple de catabolisme, savoir la décomposition sous l'influence du
protoplasme en repos, non en voie de croissance, ainsi qu'on la rencontre dans d'autres
processus biochimiques, tels que la respiration et la fermentation alcoolique, n'a pas
encore été observée a propos de la décomposition de l'urée. Il n'est pas improbable
pourtant que l'extension de nos connaissances combiera cette lacune, car la décompo-
sition de l'urée par l'uréase d'une part, et d'autre part la forme de catabolisme que nous
venons de décrire, qui peut être nommée »auxocatabolisme« (ou brièvement »auxo-
bolisme«) a cause de sa relation avec la croissance, sont les termes extrêmes d'une série
de processus dont le milieu serait occupé par l'action catabolique du protoplasme en
repos.

Explication de laplanche.

Le grossissement est partout de looo diamètres. Les cils ont été colorés d'après
la methode de M. Z e 1 1 n o w. Les figg. i, 4 et 5 sont des photographies de prépara-
tions vivantes.

Fig. I. Urobacillus pasteurii M i q u e 1. Culture vivante agée de 15 jours, sur du
bouillon de viande a gelatine et carbonate d'ammonium.

Fig. 2. Urobacillus pasteurii avec cils péritriches. Culture tres jeune sur du bouil-
lon de viande a agar et carbonate d'ammonium.

Fig. 3. Urobacillus miquelii n. sp. avec cils péritriches. Culture sur l'agar de
viande, jeune. Ne produit pas de spores.

Fig. 4. Urobacillus leubei n. sp. Culture vivante, sur de la gelatine a bouillon de
viande. La coloration des cils n'a pas réussi, les cils sont probablement péritriches.
Spores oblongues.

Fig. 5. Planosarcina ureae n. sp. Culture vivante, sur gelatine de viande. Les
spores sont sphériques.

Fig. 6. Planosarcina ureae, avec cils péritriches, recouvrant d'une abondante che-
velure le corps de la sarcina.

M. W. BEIJERINCK, Bacteries de l'urée.

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Fig. 3-

Fig. 4.

Fig. 5-

Fig. I et 2 Urobacillus pasteurii. Fig. 3 6'^. miquelii. Fig. 4 t/. leubei.

Fig. 5 et 6 Planosarcina ureae.

Grossissement 1000.

Sur des microbes oligonitrophiles).

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé VIII,
1903, p. 190—217. — Verscheen onder den titel »Over oligonitrophile bacteriën* in Ver-
slagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel IX,
1901, blz. 633—642; en onder den titel »0n oligonitrophilous bacteria*, Proceedings of
the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen. Amsterdam, Vol. III, 1901,
p. 586—595; en onder den titel »Ueber oligonitrophile Mikroben» in Centralblatt für
Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, VII. Band, 1901, S. 561 — 582.

Je désigne sous Ie nom d'»oligonitrophiles« ces microbes qui, dans la libre con-
currence avec les autres microbes, se développent dans des milieux nourriciers oü
l'on n'a pas introduit avec intention des composés azotés, mais d'oü l'on n'a pas
non plus pris soin d'enlever les dernières traces de ces composés. lis ont la propriété
de fixer, soit seuls, soit en symbiose avec d'autres microbes, l'azote atmosphérique
libre, afin de s'en servir comme nourriture.

lis prétent a deux séries d'expériences d'accumulation, dift'érentes en principe.
On peut notamment les laisser se développer: i". A la lumière, aux dépens de l'acide
carbonique de l'air, et l'on obtient alors des organismes oligonitrophiles colorés par
de la chromophylle. 2". Dans l'obscurité, en présence de nourriture a carbone, ce qui
donne des oligonitrophiles incolores.

J'ai fait des expériences dans les deux conditions; les épreuves a la lumière sont
de longue durée et ne sont pas encore terminées. EUes ont cependant déja fourni un
résultat dont je parlerai en premier lieu et qui m'a engagé a continuer l'étude de la
question dans divers sens. Je communiquerai ensuite quelques résultats obtenus avec
des organismes oligonitrophiles incolores.

I. Oligonitrophilie chez les Cyanophycées.

L'expérience a été faite de la maniere suivante:

De grands ballons bouchés de telle faqon que l'on y pouvait introduire de temps
en temps de l'air, privé de toute combinaison azotée par un lavage dans l'acide sul-
furique concentré, et d'une capacité de 3 litres ou plus, furent remplis pour la moitié
environ d'une solution composée de

Eau de conduite ou distillée 100 gr.
KmPO* 0,2 gr.

sans addition d'aucune autre substance; cette solution fut infectée par i a 2 gr. de

') Traduit de Centralblatt f. Bakteriologie etc, 7, 561, 1901.

io6

icrreau ^), Pendant l'hiver j'ai place ces ballons devant une fenétre exposée au sud,
au printemps et pendant Tété au nord-ouest, par une température ambiante de i6
a 20° C. Il se forme au commencement une pellicule de phosphate de cal-
cium que Ton fait disparaitre en secouant les ballons. L'eau de la distribution ne
contenant que peu de combinaisons organiques, il ne se produit aucun trouble dü a
des microbes incolores. Par contre, au bout de 8 semaines pendant l'hiver et de 4 a 5
semaines pendant l'été, il se développe une flore caractéristique, fonnée de plusieurs
espèces de Cyanophycées. Une fois qu'elle a pris naissance, cette flore croit rapide-
ment en donnant au liquide une couleur vert bleuatre ou vert de gris.

Au commencement les Cyanophycées se développent comme des colonies isolées,
fortement adhérentes aux parois du ballon; plus tard il s'en forme des pellicules, une
vraie »floraison de l'eau*, constituée principalement par des Anabaena, notamment
A. catenula. Les colonies de cette espèce, fixées aux parois, s'étendent rapidement en
formant une mince couverture. J'ai trouvé encore un plus grand nombre d'individus
d'une espèce vert bleuatre foncé, voisine de Nostoc paludosum ou peut-être même
identique avec lui; elle commenqait par adhérer au verre et plus tard elle flottait
librement dans l'eau. Plus rarement on observe qk et la une masse mucilagineuse
bleu verdatre, reconnue comme Nostoc sphericnm '^). Toutes ces espèces appartien-
nent, comme on voit, aux Cyanophycées immobiles ; les Oscillariées mobiles ne se
développent pas, dans ces conditions, d'une part parce que Ie liquide de culture, bien
qu'on n'y eüt introduit que i a 2 gr. de terreau par litre, contenait cependant trop de
matières organiques pour permettre leur développement, et en second lieu parce que
ces organismes n'appartiennent pas aux oligonitrophilcs, mais ont besoin pour leur
croissance de quantités notables de composés azotés.

Dans ces cultures les Chlorophycées, particulièrement Chlorococcnm et Chlorella,
ne font pas com^lètement défaut, ainsi qu'on pouvait s'y attendre, mais elles sont
présentes en si petite quantité que ce n'est que par l'examen microscopique qu'on les
découvre. Ce fait est surtout remarquable parce que Texpérience apprcnd qu'un li-
quide de culture dont la composition est:

Eau de conduite 100 gr.

K^HPO* 0,02 gr.

NWNO^ 0,02 gr.

et qui a été infecté par une tracé d'une culture de Cyanophycées obtenue précédem-
ment, se recouvre déja après 3 ou 4 semaines d'une pellicule verte, essentiellement
constitutée par Ie Chlorococcum infusioniim. Ce n'est que beaucoup plus tard, quand
les combinaisons azotées sont consommées, que l'on voit la couleur se foncer parce
qu'il commence a se développer des Anabaena. Dans ces conditions de culture je n'ai

') A Delft l'eau de conduite contient par litre 0,42 niK- d'azotc et Ie terreau privé
d'eau 0,56 °/o. Cet azote présent dans Ie sol y existe toutefois sous une forme qui Ie
rend assimilable pour une tres petite partie seulement par les Cyanophycées et les
autres microbes. Aussi est-il prouvé que les organismes oligonitrophiles ont la pro-
priété de pouvoir assimiler l'azote libre de l'air soit tout seuls, soit en symbiose avec
certains autres microbes. Je communiquerai plus tard les observations qui s'y rapportent.

■-) Je n'ai pas pu déterminer toutes les espèces de Cyanophycées obtenues dans
mes expériences; il se peut que quelques-unes n'aient pas encore été décrites.

I07

pas obtenu d'autres espèces que ces Anabaena, mais il se peut que cela ait tenu a lui
ttat fortuit de la matière servant a l'infection.

Quand je n'infectais pas avec du terreau et que je me servais, non de l'eau de
la distribution, mais d l'eau puisée au grand canal a Delft, une eau peu différente ;le
celle de la Meuse et assez semblable par conséquent a l'eau fluviale ordinaire, avec
cette différence toutefois qu'elle est plus fortement contaminée par des corps
organiques, l'allure de l'expérience était autre. 11 se forme notamment alors une
fiche culture de Diatomées, qui se dépose sur la paroi du ballon ou reste flottante,
mélangée de quelques Chlorophycées des genres Raphidium, Chlorella, Chlorococcum
el Scenedesmus, sans que la culture perde par la son caractère de Diatomées. Beau-
coup plus tard, c'est a dire après 8 a lo semaines, la couleur de la culture passé du
brun au bleu verdatre, parce que les Cyanophycées commencent alors a se développer,
et ce développement continue aussi longtemps qu'il reste une quantité suffisante de
phosphate de potassium et des autres nourritures minérales.

Il me semble que l'on peut expliquer comme suit cette expérience frappante:
l'eau du canal contient beaucoup plus de substances organiques et surtout plus de
composés azotés assimilables que l'eau de la distribution; aus^i longtemps que ces
substances sont présentes il ne peut se développer que des Diatomées, qui supportent,
comme on sait, une grande quantité de substances organiques. Dès que ces sub-
stances sont consommées par les microbes, et que les combinaisons azotées ont été
transformées en Diatomées, les Cyanophycées oligonitrophiles sont capables de sup-
porter la concurrence et Ie caractère de la flore est totalement modifié.

L'expérience suivante, bien simple, prouve que réellement les Diatomées peuvent
supporter, dans leurs liquides nourriciers, une forte proportion de substances
organiques et surtout de composés azotés assimilables, comme des sels d'ammoniaque
et du salpètre. Un grand verre cylindrique est rempli a moitié de terreau de jardin
et pour l'autre moitié d'eau pure ; on agite fortement Ie tout et la bouillie est placée
devant une fenêtre. Au bout de quelques jours ou de quelques semaines, cela dépend
de la température et de la saison, on voit se déposer sur Ie verre, du cóté éclairé, une
couche brun foncé de Diatomées, formée d'abord par les Diatomées qui sont sorties
du terreau en rampant vers la lumière, et se sont ensuite fortement développées par
croissance et multiplication. Après quelques mois Ie dépót est remplacé plus ou moins
complètement par des Chlorophycées, et cela se produit évidemment quand les Dia-
tomées, ainsi que certains autres microbes comme les bactéries, ont consommé la plus
grande partie des substances organiques assimilables en les transformant en matières
inipropres a l'assimilation. Dans ces conditions toutefois les Cyanophycées ne se
développent pas encore, parce que la proportion des composés azotés restants est
encore beaucoup trop élevée.

Bien que je considère comme certain que, dans mes expériences avec de l'eau
de la distribution ou puisée au canal, la flore des Cyanophycées ne se développe que
quand la proportion des substances organiques dans Ie liquide de culture est devenue
tres faible, je considère cependant cette tres faible teneur comme ayant une impor-
tance capitale pour la réussite de l'expérience. J'ai pu m'assurer dans tous les cas
qu'en l'absence presque complete de substances organiques il se produit des phéno-
mènes tout autres, sans que je puisse toutefois communiquer pour Ie moment aucun
résultat décisif obtenu dans ces conditions.

io8

En principe Texpérience de culture de Cyanophycées ici décrite n'est pas ab-
solument nouvelle; elle a en effet été faite déja en 1892 par MM. Schlösing nis
et L au rent, mais dans des conditions assez difïérentes 1). Ces auteurs ne se sont
notamment pas servis de liquides de culture, mais ont opéré sur une couche de sable
et dans des conditions beaucoup plus compliquées que les miennes. Le point impor-
tant, c'est qu'ils ont observé comme moi le développement a la lumière d'une flore de
Cyanophycées, quand les combinaisons azotées faisaient complètement défaut et que
1'acide carbonique était la seule source de carbone. lis sont arrivés a ce résultat que
ces Cyanophycées assimilent de l'azote libre, en quantités tres faibles il est vrai, mais
parfaitement mesurables. Leurs expériences ne sont toutefois pas complètement con-
vaincantes, parce que leurs cultures ont certainement contenu beaucoup d'autres mi-
crobes encore, comme des bactéries; cependant, en égard a mes propres expériences,
je considère leur opinion comme exacte.

L'oligonitrophilie des Cyanophycées rend compte en quelque sorte des deux ob-
servations suivantes: M. G r a e b n e r ■') a constaté qu'un terrain sableux frais, quand
il se transforme en tourbière de bruyère, commence par se recouvrir d'une végétatiou
(le Cyanophycées, qui penètre jusqu'a quelques mm. au-dessous de la surf ace. Et
M. Treub, qui a visite l'ile de Krakatau trois ans après l'eruption qui Ia dévasta,
a trouvé que les cendres volcaniques portaient une couche de Cyanophycées (mobiles?)
parmi lesquelles il cite spécialement Lingbya verbeekiana et L. mintitissima^). Si
1'on rejette complètement la theorie de la génération spontanée, on poufrait donc se
figurer que des germes de Cyanophycées, provenant de l'espace universel, aient été
les premiers habitants de la terre, puisque nous ne connaissons pas d'autres organis-
mes capables de former leur substance aux dépens de l'acide carbonique et de l'azote
libre de l'air.

Du moment que j'eus compris la condition capitale de la culture des Cyano-
phycées, il m'était facile d'obtenir, sur un substratum solide, des cultures pures des
formes qui avaient pris naissance dans des milieux liquides. Je me suis servi a eet
cffet de plaques de silice ou d'agar d'oü j'avais extrait, par un lavage prolongé a
i'eau, toutes les substances organiques solubles, et qui contenaient environ 0,02% de
K'^HPO*. Quand j'ensemenqais sur ce terrain les cultures en liquides de Cyano-
phycées, il s'y développait, par une exposition a la lumière devant une fenêtre au
nord, en moins de quinze jours les colonies d'Anabaena tres étendues et fortement
ramifiées. Quelque temps après il s'y formait aussi les colonies, plus petites et plus
compactes, des autres espèces.

Les plaques doivent être préparées avec beaucoup de soin, car, quand il y reste
trop de matières organiques, il ne s'y développe que des bactéries et des Chlorella*^),

') Fixation de l'azote libre par les plantes. Ann. de l'Inst. Pasteur, T. VI, p. 832,
1892. Dans leurs cultures les auteurs ont trouvé principalement Nostoc punctiforme,.
N. minntum et Cylindrospermum major.

*) Studiën über die norddeutsche Heide. Botan. Jahrb , 20, 1895.

') Notice sur la nouvelle flore de Krakatau, Ann. d. Jard. Bot. d. Buitencorg. 7, 1888.

*) Les chlorelles, comme beaucoup d'autres Chlorophycées inférieures, supportent
sans préjudice, comme je l'ai fait voir antérieurement, une grande proportion de sub-
stances organiques.

log

mais pas de Cyanophycées. C'est pourquoi je n'opère Ie lavage que quand la plaque
a dé ja été coulée dans la boite en verre, notamment de telle maniere que la boite est
placée dans une grande cuvette de verre, dans laquelle je laisse circuler jour et nuit
de l'eau fraiche de la distribution. Pour introduire Ie phosphate de potassium dans
les plaques, je verse sur ces dernières une solution de ce sel, et j'y laisse séjourner
cette solution en la déversant et la renouvelant de temps a autre. Finalement je
chaufïe quelque peu la plaque au-dessus de la flamme d'un bec de gaz, afin d'éloigner
les gouttes d'eau qui y adhèrent et ne conserver pour la semence de Cyanophycées
qu'une surface d'agar »sèche«.

Les Cyanophycées mobiles, comme les Oscillariées et les espèces voisines, ne
croissent pas sur ce terrain de culture; quand on les y transporte, elles meurent même
au bout de peu de jours. Pourtant, M. A. van Del den parvint a obtenir dans
mon laboratoire une culture pure d'une pareille espèce mobile, apparentée a
VOscillaria et provenant de l'eau du canal de Delft. Il y réussit en prenant les deux
précautions spéciales suivantes: d'abord il fallait extraire de l'agar les substances
organiques beaucoup plus complètement que dans Ie cas precedent, a quoi l'on par-
vient en se servant d'un courant d'eau distillée pour Ie lavage; en second lieu il
fallait introduire une petite quantité d'un composé nitré; Ie nitrate d'ammonium fut
reconnu comme Ie mieux approprié. Un terrain d'agar, préparé de cette faqon, est en
même temps propre a la culture de plusieurs espèces de Chlorophycées, qui pour la
plupart sont tres sensibles a des traces de substances organiques. Mais revenons au
groupe des oligonitrophiles, qui présentent la propriété spécifique de pouvoir vivre
presque sans azote en combinaison, puisqu'ils sont capables d'assimiler l'azote libre.

2. Aérobiose et auacrobiose chez les bactéries oligonitrophiles
Bactéries mcso- et polynitrophiles.

La »culture élective« d'organismes oligonitrophiles, dans des liquides de culture
oii Ie sucre fournit Ie carbone organique, a été effectuée pour la première fois par
M. W i n o g r a d s k y 1), notamment dans des circonstances oü l'anaérobiose était
possible, et oii il se formait toujours une forme déterminée de ferment butyrique que
eet auteur a appelée Clostridium pasteurianum. M. W i n o g r a d s k y se servait de
Solutions contenant 2 a 4% de glucose, la quantité nécessaire de nourriture minerale
et 2 a 4% CaCO^, mais dans lesquelles il n'introduisait pas avec intention de com-
posés azotés. Ces solutions remplissaient en partie de grands ballons de verre a fond
plat, bouchés de telle faqon que l'air y pouvait être renouvelé de temps en temps et
rcmplacé par un air purifié au moven d'acide sulfurique concentré. A eet effet Ie bou-
chon était traverse par deux tubes de verre, dont l'un débouchait a peu prés a la
surface du liquide, tandis que l'autre s'arrêtait dans Ie goulot. L'infection s'obtenait
au moyen de terreau. Il commencait par se développer une riche flore d'organismes
aerobics, ce qui rendait possible dans la suite l'anaérobiose du ferment butyrique
oligontrophile.Ilaopéréégalementavecdesculturespures de cette espèce, en l'absencede
l'air et en introduisant de l'azote dans les ballons de culture.

') Recherches sur l'assimilation de l'azote librc de l'atmosphère par les microbes.
Arch. des Sc. biol. St. Pétersbourg, T. III, 1895, n**. 4.

En répétant ces expériences, j'ai observé que la présence de traces de composés
azotés est nécessaire pour Ie développement du ferment butyrique ; la même remarque
s'applique d'ailleurs aux organismes oligonitrophiles que j'ai découverts, en ce sens
que dans des liquides de culture, préparés avec des précautions telles que l'azote
combine y fait complètement défaut, la croissance de ces organismes est tres faible
et s'arrête même bientót, aussi bien dans les cas d'aérobiose que dans les cas d'anaéro-
biose dans une atmosphère d'azote.

Les conditions de mes propres expériences différaient de celles dans lesquelles
travaillait M. Winogradsky en ceci, que je ne permettais que l'aérobiose ou du
moins que je laissais pénétrer l'oxygène en telles quantités que la fermentation
butyrique était rendue impossible ou tout au moins considérablement réduite. J'em-
ployais d'ailleurs d'autres sources de carbone. Il en est résulté la découverte d'un
genre de bactéries oligonitrophiles non encore décrites, appartenant aux aérobies.
A ce genre, aisément reconnaissable a la grosseur de ses individus, je donnerai Ie
nom d'Asotobacter ^). J'en ai reconnu jusqu'ici deux espèces différentes. L'une,
A. chroococcian, est tres répandue dans Ie terreau des jardins comme d'ailleurs dans
tous les sols fertiles -) ; l'autre est tout aussi répandue dans l'eau du canal de Delft.

Dans mes expériences je rendais facile l'accès de l'oxygène en recouvrant Ie
fond d'un grand ballon d'Erlenmeyer d'une couche peu profonde du liquide
nourricier, dans lequel s'opérait la culture; je renouvelais d'ailleurs l'air a la faqon
de Winogradsky. Comme Ie ferment butyrique ne peut pas exister en l'absence
complete d'oxygène, mais est un organisme »microaérophile«, c. a. d. que pour se
bien développer il a besoin d'oxygène, d'une faible pression il est vrai (ce que
M. Winogradsky n'a pas remarque), Ie libre acces de l'air n'est pas a lui seul
un préservatif suffisant contre Ie développement de ce ferment dans les cultures
aérobies. C'est pourquoi je me suis servi dans mes expériences de sources de
carbone que V Asotohacter assimilait facilement, mais qui n'entrent que difficilement
OU même pas du tout en fermentation butyrique. J'ai trouvé comme substances
particulièrement bien appropriées: la mannite en solution de 2 a io%, et les pro-
pionates de calcium, de potassium ou de sodium, en solutions Ag. %%. La fermen-
tation butyrique ne s'opère que difficilement ou lentement dans la mannite, elle ne
s'opère pas du tout dans ces propionates. Le saccharose et Ie glucose se prêtent
moins bien a ce genre d'expériences parce que ces sucres, surtout le glucose, se
transforment tres aisément en acide butyrique en l'absence de combinaisons azotées.
Il est vrai qu'une faible fermentation butyrique, du moins en présence de carbonate
de calcium, n'est pas fort préjudiciable a mon expérience, parce que les butyrates
sont des sources de carbone faciles a assimiler pour le Chroococcum.

') Peut-étre le nom de Parachromatium, qui indique la parenté de notre microbe
avec le genre Chromatium de M. Wi n ogradsk y , serait-il préférable. Des considérations
physiologiques m'avaient d'abord conduit a une tout autre opinion, mais des études
ultérieures me portent a croire que cette parenté générique est indubitable. M.Zettnow,
en examinant mes préparations, avait déja émis Ia même opinion.

-) Outre le terreau de jardin j'ai encore examiné: le sol d'une prairie, pris a di-
verses profondeurs, de l'argile d'un champ de froment, du sable des dunes provenant
d'un champ de pommes de terre, ainsi que du fumier de feuilles, le tout avec le même
résultat. Le sable des bruyères, au contraire, ne contient pas l'Azotobacter.

En tachant d'obtenir des cultures pures des organismes oligonitrophiles sur
substrat solide, j'ai reconnu que les bactéries saprophytes ordinaires, dont les germes
foisonnent dans les matériaux d'infection, ne se développent pas, ou presque pas, dans
les accumulations, ce qui provient de Talimentation azotée insuffisante, de sorte
que l'on peut qualifier ces bactéries de »polynitrophiles«. Certaines autres espèces
se comportent de faqon intermediaire au point de vue de l'alimentation azotée, et
seront considérées d'un peu plus prés au § 4, sous Ie nom de »mésonitrophiles«.

C'est Ie moment de faire remarquer un autre point encore, par lequel se carac-
térisent les organismes oligonitrophiles aérobies. lis ne forment notamment pas de
spores, ce qui a pour conséquence que des expériences entreprises avec du terreau
chauft'é dans l'eau bouillante ne conduisent pas a des cultures de Chroococcum. Il en
est autrement du ferment butyrique; celui-ci forme des spores qui resistent parfaitc-
ment a des températures de 90 a 100" C. Bien que la fermentation butyrique mise en
train par de la terre pasteurisée s'effectue plus lentement et moins bien qu'avec de
la terre fraiche, on constate cependant en principe les mêmes phénomènes, sauf pour
les symbiontes plus ou moins accidentels qui sont bien différents dans les deux cas ^).
Quand je traiterai les organismes mésonitrophiles, je parlerai d'une espèce parti-
culiere et interessante de ce groupe, et qui se présente tres souvent après la
pasteurisation, quoique pas toujours, comme symbionte des oligonitrophiles propre-
ment dits, savoir Ie Granidobacter sphericum.

3. Accnmtilation d'Asotobacter cJiroococcum du terreau de jardin.

J'ai obtenu de tres riches cultures de la fa(^on suivante, tres simple.
Un liquide nourricier composé de

Eau de conduite 100

Mannite 2

K^HPO' 0,02

est introduit en couche peu profonde dans un ballon d ' E r 1 e n m e y e r , infecté
avec une grande quantité, p. ex. 0,1 a 0,2 gr., de terreau frais, et exposé a une teni-
pérature de 27 a 30" C. Par la présence de K-HPO* la réaction est faiblement
alcaline ^) et il se sépare peu a peu du phosphate de calcium sous forme d'une mince
couche superficielle, formée de petits sphérites. Des combinaisons azotées autres que
les faibles quantités contenues dans l'eau et la terre font ici complètement défaut,
mais ces faibles quantités sont nécessaires pour Ie succes de l'expérience ; sans elles
il ne se développe que peu de microbes, comme nous l'avons vu, et ce développement

*) De nombreuses expériences nouvelles me font croire que cette dernière assertion.
basée sur l'autorité de M. Winogradsky plus que sur ma propre expérience, n'est
exacte que quand il y a beaucoup de carbonate de calcium en présence. J'ai reconnu
qu'en l'absence de cette substance l'azote libre nest üxé que quand Ie Chroococcum
cxiste dans la niasse, mais la quantité d'asote combine peut ntême être triplée quand les
cultures contiennent en mème temps Ie ferment butyrique ou un de ses congénères. Mais
cette question sera traitée amplement dans un travail ultérieur.

^) La réaction alcaline est avantageuse pour l'expérience. On peut aussi se servir
de KH^PO*. mais alors Ie résultat est incertain.

s'arrête bientót, ce qui s'applique non seulement au Chroococcmn mais aussi au fer-
ment butyrique. Des quantités quelque peu considérables d'azote combine sont toute-
fois préjudiciables. C'est ainsi que Texpérience ne réussit pas quand la solution
nutritive contient plus de lO mg. de KNO^ par litre, tandis que des quantités plus
faibles encore d'autres composés azotés sont déja suffisantes pour rendre impossible
la concurrence du Chroococcum avec les nitrophiles. Toutefois, même des quantités
bien plus grandes d'azote combine ne gênent en rien Ie développement des cultures
pures de notre bacterie; elles sont même avantageuses pour sa croissance.

Dans les accumulations, Ie Clostridium pasteurianum de M, W i n o g r a d s k y
se comporte de fa(;on un peu différente vis a vis de l'azote combine. De notables
quantités d'azote combine, introduites avec intention, servent d'abord a la croissance
des formes polynitrophiles ordinaires, et la fermentation butyrique commence nor-
malement dés que la diphénylamme et l'acide sulfurique ne permettent plus de déceler
des nitrates ou des nitrites, et que l'on ne trouve plus de sels ammoniacaux au moyen
du réactif de N e s s 1 e r.

Dans la solution nourricière pauvre en azote que nous venons de décrire, il se
produit a 30° C, au bout de 2 ou 3 jours, a la surface de la solution une pellicule
formée par la remarquable bacterie a grandes cellules: VAsotohacter chroococcum.
Cette pellicule superficielle se développe pendant plusieurs jours, semblable a une
Mycoderme, et se peuple de diverses espèces de petites bactéries, d'amibes et de
monades, et parfois même d'infusoires. Les petites bactéries ont besoin de plus
d'azote combine que Ie Chroococcmyi, mais moins que les espèces »polynitrophiles«
saprophytes ordinaires; on peut donc les appeler »mésonitrophiles«. Par leur nombre
elles se comportent vis a vis de Chroococcum comme les bactéries acétifiantes vis a vis
de Saccharomyces mycoderma dans une pellicule mycodermique sur de la bière
gatée; leur présence ne se reconnait qu'au microscope et ne se trahit pas par des
caractères visibles de la couche de Chroococcum. Par une analyse chimique leur
présence ne serait reconnue qu'avec peine. Si l'on fait l'expérience avec du pro-
pionate de calcium a 0,5% comme source de carbone au lieu de mannite, et en
infectant avec du terreau, on obtient au bout de 3 a 4 jours des pellicules de notre
espèce qui ne laissent voir au microscope que peu d'autres bactéries ou' n'en présen-
tent même pas du tout, mais on les découvre toujours par culture sur un substratum
solide. Il est remarquable que la présence des organismes mésonitrophiles est
avantageuse pour la croissance du Chroococcum et que, quand ils font défaut, comme
dans les cultures pures, on n'obtient jamais les belles pellicules des accumulations
grossières. Mais je reviendrai encore plus loin sur ces faits. Les bactéries sapro-
phytes polynitrophiles ordinaires, comme les fluorescentes, les espèces A'Aerohacter,
Proteohacter, Saccharobacter et les bactéries du foin sont rares dans les cultures
(VAsotohacter et y font souvent complètement défaut, bien qu'elles soient nombreuses
dans les matériaux d'infection. Comme les moisissures et les levüres font complète-
ment défaut au commencement, nous avons ici un nouveau cas d'une expérience
d'accumulation parfaite, dont j'ai décrit un autre exemple a propos des bactéries de
Turée *).

La présence d'amibes dans les pellicules de Chroococcum mérite une mention

^) Ces Archives, (2), 7, 28, 1902.

113

spéciale, parce que ces organismes se nourrissent de préférence de Chroucoccum et
se multiplient avec une telle rapidité qu'ils peuvent causer de grands ravages dans
les cultures de cette espèce. On en trouve plusieurs formes qui se développent en
abondance sur les terrains solides appropriés aux cultures pures de Chroococcmn.
Ces amibes y forment ces membranes pures que j'ai décrites antérieurement sous Ie
nom de »voile« ^) et qui sont exemptes de bactéries, de sorte qu'elles peuvent devenir
Ie point de départ pour la culture pure des amibes, qui se laissent facilement isoler
des voiles, et se combiner avec d'autres microbes qui leur servent de nourriture.
Bref, l'accumulation de Chroococcum est une expérience qui en même temps se prête
bien a l'étude des amibes.

Mais revenons a notre bacterie elle-même.

Notre expérience d'accumulation n'exige pas nécessairement l'emploi de mannite
OU de propionates, mais donne encore de bons résultats, quoique moins certains, avec
plusieurs autres combinaisons du carbone. C'est ainsi que j'ai pu remplacer la
mannite par du glucose, du lévulose, du lactose, du saccharose et du maltose, et dans
tous ces cas j'ai obtenu de riches cultures de Chroococcum. Le glucose et Ie saccharose
donnent cependant des pellicules mucilagineuses, qui tombent bientót au fond. Le
glucose et le lévulose donnent aisément lieu a une fermentation butyrique; le sac-
charose, le maltose et le lactose aussi, quoique moins facilement. Ces espèces de
sucres ne peuvent donc être employees comme nourriture qu'en solution dans des
couches peu épaisses et bien aérées des liquides nourriciers, pour empêcher plus ou
moins complètement cette fermentation due a l'absence de l'air.

La glycerine est moins bien appropriée parce qu'on ne peut s'en servier qu'en
faibles concentrations, p. ex. 2 a 3% tout au plus, et encore la pellicule ne se forme-
t-elle que lentement. Cependant les cultures que l'on obtient ainsi finissent par être
tres pures, et ne contiennent plus alors que tres peu d'autres bactéries, mais beaucoup
d'amibes. J'ai observé la même chose en employant de l'alcool éthylique qui, en
solution a 2%, se prête bien a la culture de VAzotohacter. mais est également
fpvorable au développement des amibes.

Le Chroococcum ne peut pas du tout se nourrir avec le sucre de lait, que le
ferment butyrique assimile tres bien au contraire.

Les substances suivantes sont aussi bien assimilables; je les ai rangées d'après
le degré d'assimilabilité, en ce sens que les premières substances s'oxydent le plus
facilement. Ce sont: les propionates, les butyrates, les lactates, les malates, les
succinates, les acétates et les citrates. Les produits de l'oxydation sont de l'anhydride
carbonique et de l'eau. Le Chroococcum n'attaque ni les tartrates ni les formiates.
On peut conclure de eet aperqu que notre espèce sera capable de se nourrir
encore avec beaucoup d'autres sources de carbone que celles que je viens de nommer.
Dans tous les cas le pouvoir oxydant de cette bacterie est tres développé et peut être
comparé le mieux avec celui des bactéries fluorescentes, qui se distinguent toutefois
du Chroococcum par leur besoin beaucoup plus grand d'azote combine.

La membrane impure du Chroococcum, obtenue sur les milieux nourriciers nien-
tionnés, est constituée au commencement par des batonnets tres gros et courts (4 \x
d'épaisseur sur 5 — 7 ji de longueur), arrondis aux extrémités et restant parfois

') Centralbl. f. Bakt. etc, (i), 19, 257, 1896 et 21, loi, 1897.
M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel.

114

groupés en tres grands diplocoques ^). C'est ce que l'on reconnait a la Fig. i de ia
planche, faite toutefois d'après une culture pure (voir § 5). La plupart des cellules
sont en repos, mais quelques exemplaires se meuvent lentement. La paroi cellulaire
est constituée par une membrane mucilagineuse d'épaisseur variable, qui est directe-
ment visible ou que l'on peut aisément rendre visible, quand Ie pouvoir réfringent de
la paroi diffère trop peu de celui de l'eau pour qu'elle soit nettement accusée, en
introduisant dans la préparation une espèce quelconque d'une petite bacterie qui, tie
pouv&«t pénétrer dans la paroi, permet d'en reconnaitre Ie contour comme Ie laisse
voir la Fig. 2. Pour l'explication de cette figure je renvoie d'ailleurs au § 5 oü je
parle des cultures pures.

Quelques cellules de cultures jeunes (Fig. i) laissent voir une grande vacuole,
tres nette, située contre la paroi. Les cellules nourries de mannite ferment parfois
de la graisse(voirFig, 4) qui se distribue dans les cellules d'une maniere tres reguliere,
comme des gouttelettes d'huile. Avec du saccharose et du glucose il se forme moins
de graisse, mais Ie dépót de mucus autour de la cellule est beaucoup plus considérable.

A mesure que les cultures deviennent plus agées la membrane surnageante
change de couleur et de structure; elle devient d'abord brune, plus tard même noire,
et par suite d'une segmentation répétée des bactéries elles-mémes il se forme des
paquets semblables a des sarcines. Cela ne s'opère toutefois pas toujours avec la
même facilité, mais dépend notamment de la source de carbone employee: c'est ainsi
qu'avec du sucre la formation directe des sarcines brunes est difficile, tandis qu'elle
est aisée au moyen de butyrates et même avec du sucre quand il y a eu précédemment
une fermentation butyrique. La Fig. 3 représente l'état brun, obtenu par culture pure
sur l'agar au glucose. La substance colorante brune est insoluble dans les dissol-
vants ordinaires, comme l'eau, l'alcool, l'éther, Ie chloroforme et Ie sulfure de car-
bone; elle se dissout difïicilement dans les alcalis, en subissant une décomposition.
Elle difïère complètement de la chromophylle. C'est en raison de cette substance
colorante que j'ai choisi Ie nom spécifique de chroococcuni.

Ainsi que je l'ai déja dit, Ie changement de couleur est accompagné d'un change-
ment notable dans l'apparence microscopique des bactéries. La plupart des individus
diminuent en grosseur et leur forme devient plutót sphérique, de sorte que l'on ne
voit plus les batonnets gros et courts des états jeunes, mais des microcoques assez
petits. Par suite d'une segmentation répétée, les paquets de sarcines peuvent attein-
dre des dimensions considérables. De pareilles colonies de sarcines se forment sou-
vent, et directement, quand on se sert de liquides nourriciers artificiels constitués par
de l'eau distillée aussi pauvre que possible en combinaisons azotées ; elles y peuvent
former des membranes assez étendues, dont la croissance continue pendant un temps
remarquablement long.

L'A. chroococcuni peut facilement donner naissance, surtout dans les pellicules
superficielles des accumulations grossières, a des formes d'involution ; ces formcs

*) En faisant usage de liquides nourriciers oü des propionates ou des acétates
servaient de source de carbone, j'ai obtenu parfois, dans les accumulations obtenues
avec du terreau comme matière infectante, une forme beaucoup plus petite, que je
considère toutefois comme une variété A'A. chroococcuni. J'ai isolé de l'eau du canal
nne deuxiéme variété é'A. chroococcuni, dont les cellules sont beaucoup plus lonsues.

115

peuvent devenir des cellules géantes, mesurant lo a 15 ju, donnant rimpression
d'amibes ou de cellules de levüre (Fig. 4).

En parlant des cultures pures, je reviendrai sur la formation intense de mucus,
qui se produit quand Ie liquide contient des quantités insuffisantes de composés azotés
et lorsque Ie sucre sert de source de carbone.

4. Les hactéries mésonitrophiles.

J'ai déja dit qu'a la vérité les bactéries »polynitrophiles« saprophytes ordinaires
sont rares dans les cultures des oligonitrophiles, mais qu'il s'y développe assez abon-
damment des especes particulières que je qualifie de »mésonitrophiles«, en égard a
leur besoin d'azote. L'exemple Ie mieux connu de ce groupe est Ie Bacillus radicicola
des tubercules des papilionacées; mais cette espèce je ne l'ai pas rencontrée avec
certitude dans les accumulations des oligonitrophiles 1). Bien que je n'aie pas encore
examiné complètement les espèces mésonitrophiles trouvées dans les accumulations,
il n'est cependant pas superflu d'en dire quelques mots.

Ces organismes s'observent aussi bien dans la fermentation butyrique d'après
ks préceptes de M. W i n o g r a d s k y que dans mes cultures d'Asotobacter; ce sont
en partie les mêmes organismes dans les deux expériences. Cependant, dans la
plupart des fermentations butyriques j'ai rencontre une espèce interessante que j'ai
trouvée plus rarement dans mes cultures du Chroococcum sans fermentation butyrique,
et que j'introduirai ici sous Ie nom de Granulobacter sphericum. Ainsi que son nom
rindique, cette forme appartient au genre Granulobacter que j'ai créé antérieure-
ment 2), et auquel appartient aussi Ie Clostridiuni pasteurianum.

Cette espèce, comme toutes celles de ce genre d'ailleurs, produit des spores qui
supportent la pasteurisation ; même dans les expériences oü l'on se sert de terre
pasteurisée comme matière d'infection, on peut donc l'observer aisément, et bien
souvent elle constitue dans ce cas la seule impureté qui se développe assez abon-
damment a cóté du ferment butyrique.

Le G. sphericum est microaérophile, mais a un degré moindre que Ie ferment
butyrique, et il se rapproche par conséquent du type mésoaérophile auquel appar-
tiennent les spirilles ; c'est ce que l'on reconnait le mieux par le fait qu'on peut le
cultiver sur des plaques en plein air, ce qui n'est pas le cas avec le ferment butyrique.
Quand la solution nutritive a la composition suivante:

Eau de conduite 100

Glucose 2

K^HPO^ 0,02

CaCO^ 2

et que l'infection a été faite par du terreau pasteurisé, il se produit, vers 30» C. et en
empêchant le trop libre acces de l'air, au bout de 2 ou 3 jours une fermentation

*) Voir la fin de ce paragraphe.

-) Je dois faire remarquer ici que le nom générique de Grhnulobacter s'applique a
un genre naturel, c. a d. en relation générique et systématique avec les autres genres,
et ne doit pas être considéré comme »morphoIogique« ainsi que c'est le cas pour le
nom Clostridiuni, ou comme »physiologique« ainsi que Photobacter.

8*

ii6

caractérisée par l'odeur agréable des alcools éthylique et propylique. Cette fermen-
tation est causée par notre bacterie qui se présente au microscope, en partie comme
des clostridiums presque sphériques de i a 2 ^ de diamètre, avec des spores oblongues
excentriquement placées, pour une autre partie comme de petits clostridiums ordi-
naires dont les spores sont situées aux extrémités et un peu sur Ie cóté. Les spores
sont petites, mesurent environ 0,3 a 0,5 |a, et sont placées a Textrémité la plus grosse
dans les clostridiums allongés. Traites avec de l'iode, les clostridiums sphériques
aussi bien que les oblongs se colorent en bleu intense.

11 est aisé d'obtenir des cultures pures, en transportant les organismes du liquide
nourricier en question sur un terrain solide de même composition, mais sans craie,
solidifié par 2% d'agar.

On voit souvent les colonies de G. sphericum s'y développer immédiatement en
culture pure, parce que Ie ferment butyrique ne peut pas se développer sur ce terrain
et que les autres microbes aerobics sporogènes n'existaient pas ou qu'en petite quan-
tité seulement dans l'accumulation faite avec des matériaux pasteurisés. L'absence
d'autres microbes aérobies dans ces conditions de culture prouve que parmi les
organismes sporogènes il n'y en a aucun qui soit oligonitrophile en dehors du fer-
ment butyrique, puisque dans Ie cas contraire certains d'entre eux se seraient multi-
pliés dans les ballons ouverts.

On obtient Ie G. sphericum tout aussi bien avec de la terre fraiche qu'avec de
la terre pasteurisée, du moins dans l'expérience oü se produit une fermentation
butyrique, mais on ne l'observe pas quand l'aération dans les accumulations est vrai-
ment complete.

Je n'ai pas réussi a faire croitre Ie G. sphericum, d'une faqon convenable du
moins, sur les milieux nourriciers solides ordinaires, riches en azote. Sur l'agar
imbibé d'eau de la distribution et contenant 2% de saccharose et du phosphate de po-
tassium, — terrain tres favorable a la croissance des cultures isolées, — ne réussis-
saient que fort peu d'inoculations; au contraire, on voit bientót la croissance s'arrêter
de sorte que cette espèce dégénère rapidement (comme beaucoup d'autres organismes
microaérophiles) lorsqu'elle est exposée au libre acces de l'air pendant trop longtemps.

Une deuxième espèce mésonitrophile remarquable, que Ton rencontre souvent en
grandes masses dans les accumulations de Chroococcum dans des solutions de mannite
infectées au moven de terreau, est un court SpiriUum, tres facile a reconnaitre,
d'environ i ji d'épaisseur et i a 2 ji de longueur. La plupart des individus sont
remplis de petites gouttes de graisse qui donnent a l'organisme un pouvoir réfringent
tellement élevé qu'il semble noir quand la mise au point du microscope est impar-
faite. La »figure de respiration« dans la chambre de verre fait voir avec grande
netteté Taccumulation »mésoaérophile«, sous forme d'une ligne fine assez éloignée
du ménisque ; quand il y a assez de mannite en présence elle se conserve pendant
plusieurs jours. Les seules autres bactéries dont Ie besoin respiratoire, dans ces
conditions d'absence presque absolue de combinaisons azotées, est comparable a celui
de ce SpiriUum, sont Ie ferment butyrique et ses congénères; mais celles-ci sont
beaucoup plus fortement microaérophiles, de sorte que dans la chambre de verre
elles produisent une ligne de respiration encore plus rapprochée du centre.

Cette espèce prouve que dans Ie terreau de jardin existent aussi de vrais
spirilles. Sa culture pure sera décrite a une autre occasion.

117

Je devrais encore parier d'une ou deux autres espèces mésonitrophiles, voisines
du Bacillus radicicola, mais je ne les ai pas encore suffisamment étudiées. J'ai reconnu
que ces espèces favorisent considérablement Ie développement des oligonitrophiles,
de sorte que leur examen ultérieur sera certainement fructueux.

5. Culture pure d'Asotobacter chroococcum.

L'isolement d'A. chroococcum des membranes surnageantes de nos accumulations
s'obtient aisément par Ie transport sur un terrain de culture dont la composition est
Ia suivante:

Eau distillée 100

Mannite 2

K-mPO^ 0,02

Agar 1) 2

Les 2% d'agar contiennent d'ailleurs une quantité suffisante des autres alinients
minéraux nécessaires. Cultivé a 30" C, Ie Chroococcum y donne déja au bout de 24
hcures des colonies semblables a de ramidon, et contrastant nettement avec les colo-
nies aqueuses, transparentes, des nitrophiles. Il est vrai que ces derniers organismes
étaient refoulés par Ie Chroococcum dans les accumulations, mais sur les plaques ils
se développent de nouveau, grace a la présence de composés azotés dans I'agar. Comme
toutes les autres espèces cessent de croitre au bout de peu de jours, tandis que les
colonies de Chroococcum continuent a se développer pendant longtemps, et grossissent
comme de grandes masses d'un mucus blanc, il est aisé de les reconnaitre dans Ie
mélange.

Les cultures pures de Chroococcum se développent avec beaucoup de vigueur dans
les milieux les plus divers. Je les ai cultivées pendant longtemps sur une gelatine a
décoction de feuilles de pois avec 2% de saccharose, sur de I'agar a 4% de glucose et
sur de la gelatine de viande ordinaire; sur ce dernier milieu il se produit peu ou point
de liquéfaction et la croissance n'est que faible.

Dans des milieux nourriciers liquides, la croissance des cultures pures est
notablement favorisée par la présence de petites quantités des composés azotés les
plus divers. Surtout les nitrates sont bien assimilés, même dans des concentrations de
I gr. p. litre. C'est ainsi que j'ai obtenu une croissance assez rapide dans

Eau de la distribution . . tod

Mannite 2 — 10

K-'HPO* 0,02

KNO^ 0,1

Les sels d'ammonium ne sont assimilés que ditïicilement, ce qui n'empêche pas
que j'ai observé un développement considérable dans

^) Ces plaques d'agar abandonnent du liquide après solidification; il est donc né-
cessaire de les chauflfer avec précaution dans les boites de verre mêmes, afin que Ie
liquide superflu se condense sur ie couvercle et puisse être enlevé. On comprend que
Ie chauffage doit être suffisamment modéré pour qu'ii ne se produise pas une nouvelle
fusion. On peut obtenir de cette maniere une concentration quelconque d'agar.

ii8

Eau loo

Glucose 2

K^HPO* 0,02

(NH^ymPO' 0,02

L'asparagine agit a peu prés comme les sels d'ammonium; la peptone est d'une assi-
milation difficile.

De même que les accumulations, les cultures pures deviennent d'un brun foncé
quand on les conserve pendant quelque temps, surtout quand Ie glucose sert de source
de carbone et qu'une tracé de salpètre sert de source d'azote. Il semble toutefois que
les cultures pures changent de caractère a un autre point de vue encore; je n'ai en
effet jamais pu obtenir ces belles membranes, semblables a des Mycodermes, qui se
produisent toujours dans les accumulations. Il se peut toutefois que la formation de
ces membranes soit intimement lice a la présence des nombreux autres microbes ^).
Dans tous les cas les cultures pures, transportées sur Ie terrain solide dont je viens
de parier, se reproduisent pendant longtemps sans modification.

Si l'on transporte sur ce terrain, non Ie Chroococcum en culture pure, mais une
solution nourricière contenant ce microbe avec un des mésonitrophiles dont il a été
question, sa croissance est certainement activée, surtout quand les microbes associés
sont ceux dont nous avons parlé a la fin du § 4, voisins du Bac. radicicola, Ie Granulo-
bacter sphericum ou Ie Spirillum terricole. Mais quand on choisit Ie Bac. radicicola
lui-même pour remplir Ie même róle, on peut aussi observer cette favorisation quoique
n un moindre dégré. C'est ainsi que dans une couche peu épaisse de la solution nour-
ricière suivante:

Eau de conduite 100

Saccharose 2

K^HPO' 0,02

Ie Bacillus radicicola (provenant d'un trèfle blanc) seul ne donnait qu'une croissance
médiocre, caractérisée par la formation de mucus; avec V Asotohacter seul j'observais
une assez forte croissance de cellules non mucilagineuses, qui tombaient au fond du
liquide; mais quand les deux microbes étaient réunis, la croissance était tres forte
et accompagnée d'une formation abondante de mucus. Le même résultat s'obtenait
avec un organisme mésonitrophile isolé de l'eau du canal. Mais nous verrons dans
mon travail ultérieur que l'analyse quantitative du gain en azote ne s'accorde pas
toujours avec l'impression de croissance profuse, que l'on acquiert par la simple in-
spection des cultures, au microscope ou a l'oeil nu.

J'ai entrepris d'ailleurs plusieurs expériences dans le but d'activer la croissance
du Chroococcum par symbiose avec des algues inférieures. J'ai mis a profit a eet
offet quelques-unes de mes cultures pures de Chlorophycées, comme les Stichococcus
major, Chlorella vulgaris, Cystococcus humicola (provenant de Parmelia parietina),
Pleurococcus vulgaris, Chlorococcum infusionum et la Cyanophycée Anahaena ca-
tenula. Ces expériences n'ont toutefois pas encore donné de résultat important.

L'apparence microscopique des cultures pures de Chroococcum sur des terrains
solides est semblable a celle des membranes des accumulations. Mais comme on est

*) On verra dans mon travail ultérieur que cette dernière explication est exacte.

lig

ici plus librc dans Ic choix des aliments, la concurrence étant exclue, je vais entrer
dans quelques détails.

Onremarqued'abord une grande dift"érence,suivant que l'on cultive avec une nour-
riturericheen azote ou en présence de traces seulement d'azote combine et de beaucoup
de carbone organique. Dans Ie dernier cas, surtout quand un sucre assimilable esfdis-
ponible, ilseproduit un épaississement colossal de la membrane cellulaire, sous forme de
mucus végétal qui se reconnait ici tres nettement comme substance constitutive de la
membrane cellulaire. Pour rendre visible cette paroi mucilagineuse, je me suis servi ou
bien de bleu de méthylène, qui colore la paroi et Ie contenu cellulaire avec une intensité
inégale, ou de la même methode que j'ai appliquée a l'examen des membranes des
accumulations encore impures, savoir l'introduction dans la culture d'une espèce de
quelque petite bacterie, p. ex. une bacterie du vinaigre, qui laisse nettement voir la
couche de mucus parce qu'elle ne peut pas y pénétrer. Dans la Fig. 2 on voit
l'image d'après nature du bord d'une colonie de Chroococciim dans

Eau distillée 100

Agar 2 •

Mannite 2

K^HPO* 0,02,

photographiée en même temps que la bacterie du vinaigre. L'état de développement cor-
respond au commencement de la formation des sarcines, qui peut ici se présenter même
dans les vieilles cultures, ce qui fait que dans la figure on voit Ie protoplasme des cel-
lules du Chroococcum comme des sarcines irrégulières. Les parois mucilagineuses des
agrégats cellulaires adjacents sont confondues ; les petis grains interposés sont les
bactéries acétifiantes.

Aussi longtemps que les cultures sur Ie terrain solide en question sont encore
jeunes et croissent rapidement, probablement grace a la présence de composés azotés
facilement assimilables, elles se présentent sous Ie même aspect que les membranes des
accumulations jeunes, ainsi qu'on Ie voit dans la Fig. i, qui représente une pareille
culture pure, tres jeune, mais qui aurait tout a fait la même apparence si elle avait
été faite d'après une jeune membrane d'une accumulation sur liquide nourricier. De
même que ces dernières, les cultures pures changent souvent de couleur, depuis Ie
blanc jusqu'an brun foncé ou noir; les conditions de ces changements de coloration
ne sont toutefois pas encore bien connues. La couleur brune s'obtient surtout quand
on nourrit avec du glucose et provient exclusivement de vieux paquets de sarcines,
dont les parois cellulaires ne sont pas fortement transformées en mucus. Il est
probable qu'il se forme ici des états de repos; dans tous les cas ces cultures brunes
font songer a certaines formes de Fumago et Dematium, dont la substance colorante
est probablement la même que celle du Chroococcum. Même Ie contenu cellulaire des
formes brun-foncé, représenté p. ex. Fig. 3, rappelle tellement les champignons plus
élévés que je viens de citer, que la photographie pourrait passer pour celle d'un de ces
organismes. Il est d'ailleurs remarquable que bien souvent il se développe quelques-uns
de ces champignons quand les expériences d'accumulation de Chroococcum échouent,
p. ex. parce que les germes de eet organisme manquaient par hasard dans la matière
d'infection, ou bien quand par l'emploi de KH-PO* au lieu de K^HPO'^ la réaction
acide contrarie Ie développement de notre microbe.

La ressemblance des cultures de VA. chroococcitm avec certaines Chroococcacées
est également tres frappant.

La mobilité de cette espèce est toujours restreinte et ce n'est que dans des cul-
tures tres jeunes qu'on peut l'observer facilement. Une pareille culture, agée de 24
heures seulement, sur eau a l'agar avec saccharose et phosphate de potasse, a été
représentée Fig. i. Le nombre des individus mobiles dans un champ visuel micro-
scopique ne dépasse peut être pas une dizaine et encore la plupart de ces individus
s'arrêtent-ils bientót. Cette circonstance, jointe a la structure mucilagineuse de la
paroi cellulaire, était dans mon laboratoire un obstacle a la coloration des cils, mais
M. Z e t t n o \v a eu Tobligeance de faire avec mes matériaux, cultivés par lui dans
un »bouillon a spirilles«, quelques belles préparations qui ont permis de conclure que
<le beaucoup le plus grand nombre des individus mobiles possèdent un seul cil vibratile
polaire. Quelques rares individus en ont certainement plus d'un, places décidément
sur le cóté, quoique dans le voisinage du póle. Les individus non mobiles en sont
privés.

Pour les états d'involution, en partie tres étranges (Fig. 4), je renvoie a l'ex-
plication de la planche.

6. Asotobacter agilis.

Cette espèce, que l'on ne trouve pas dans le terreau fle jardin, se rencontre dans
Feau du canal de Delft, a cóté de VAzotobacter chroococciini, et on peut l'obtenir par
1'expérience d'accumulation décrite pour ce dernier. C'est ainsi que j'ai obtenu de
belles cultures (VA. agilis dans le liquide nourricier suivant:

Eau du canal 100

Mannite 2

K^HPO' 0,02,

après exposition en couche peu profonde a une température de 25 a 30" C. L'eau du
canal doit être fraiche et non pasteurisée, quisqu'il s'agit de laisser concourir tout sou
monde microbien, sous des conditions déterminées, avec VA. agilis qui ne forme pas
de spores. Bien que l'infection en ce cas ne soit pas produite directement par du
terreau, on peut s'attendre cependant a ce que VA. chroococcum se développe en même
temps, parce que cette espèce ne fait pas défaut dans Peau du canal. Aussi cela
arrive-t-il réellement de temps en temps et il se peut alors que VA. agilis soit entière-
ment refoulé. Une des formes du Chroococcum que l'on observe souvent dans ces
circonstances n'est pas tout a fait identique avec celle que l'on obtient au moven de
terreau, et fut reconnue comme une variété dont les propiétés restent constantes par
hérédité dans les cultures pures.

Bien que les cultures pures A'A. agilis assimilent le glucose et le lévulose beau-
coup plus facilement que la mannite, ce dernier sucre m'a donné de meilleurs résultats
que les premiers dans les expériences d'accumulation. Cela provient certainement de
la facilité avec laquelle les deux premiers sucres subissent, dans leurs solutions un peu
concentrées, une fermfentation acide, préjudiciable au développement de VA. agilis.
Mais en outre je tiens pour possible qu'une partie de la mannite s'oxyde lentement a
Fétat de lévulose, sous l'action de bactéries étrangères, surtout des bactéries acéti-
fiantes, qui se rencontrent en grandes quantités dans l'eau du canal a Delft, et que

l'influence favorable de la mannite repose au moiiis en partie sur cette lente trausfor-
mation, une solution tres diluce de lévulose étant certainement favorable pour VAgilis.
En égard a la teneur tres variable de l'eau du canal en combinaisons azotées, on
pouvait s'y attendre que les expériences avec VA. agilis présenteraient une inarche
tres irreguliere, dift'éreraient au point de vue de la durée du développement et ne
réussiraient pas toujours; c'est en eft'et ce qui a lieu. Dans la plupart des ballons il
se ferme néanmoins, après 337 jours, une membrane d'^. agilis d'une pureté plus ou
moins parfaite. Comme la formation de mucus dans cette membrane est beaucoup
moindre que chez A. chroocuccum, elle est aussi beaucoup moins coherente, et dans
les préparations microscopiques la plupart des individus d'^. agilis sont séparés. Dans
des préparations toutes fraiches leur mobilité est tres faible, mais au bout de quelques
instants ils commencent a se mouvoir, et finalement il se peut que tout soit en mouve-
ment. Vu la grandeur extraordinaire et la transparence parfaite de ces bactéries, on
peut obtenir ainsi des images particulièrement belles.

En se servant d'un assez grand nombre d'individus pour les préparations micro-
scopiques, on peut obtenir sous Ie couvre-objet une »figure de respiration« visible a
l'oeil nu ^). Alors on constate que VA. agilis appartient aux organismes »mésoaéro-
philes«, c. a d. que la plus grande accumulation n'a pas lieu dans Ie ménisque même,
mais nettement a une certaine distance, ce qui veut dire que eet organisme, tout comme
les spirilles, recherche une tension médiocre de l'oxygène. Toutefois, comme les spiril-
les s'accumuleraient encore un peu plus prés du centre, il a un besoin d'oxygène
un peu plus grand, de sorte que l'on peut dire que VA. agilis se rapproche davantage
du type des bactéries aérophiles. A ce point de vue les cultures pures se comportent de
la même faqon que les accumulations grossières.

UA. agilis pouvant assimiler, tout comme Ie Cliroococcum, un grand nombre de
corps organiques, l'expérience d'accumulation pour ' cette espèce réussit encore avec
plusieurs autres substances que les sucres mentionn^. C'est ainsi que j'ai parfois ob-
tenu de bons résultats avec du sucre de canne et d'autres espèces de sucre en solution
a 2%. Dans d'autres cas j'ai obtenu de belles pellicules de VA. agilis avec %% de
lactate de calcium, ou J^% d'acétate de calcium. Avec 2% d'alcool comme source de
carbone j'ai également obtenu de riches cultures d'A. agilis, mais, avec les sels d'acides
organiques que je viens de nommer, leur développement était en retard sur celui dans
des Solutions de sucre. Avec des propionates et des succinates les résultats étaient
moins satisfaisants ; il est vrai que ces substances aussi sont énergiquement assimi-
lées, mais alors Ie développement trop fort d'autres bactéries et aussi des amibes et des
monades est gênant, parce que ces derniers organismes se nourrissent de préférence
de VA. agilis même.

L'eau du canal de Delft étant riche en substances organiques, il suft'it parfois
d'ajouter seulement un peu de K^HPO* et de cultiver a 25" — 28" pour y développer
une mince pellicule d'A. agilis. Cela ne réussit toutefois pas toujours et dépend évi-
demment du rapport variable entre la substance azotée et celle sans azote de l'eau-).

*) Voir Centralbl. f. Bact. etc, 14, 827, 1893.

*) L'eau du canal de Delft est renouvelée de temps en temps par de l'eau de la
Meuse a Rotterdam. Sa matière organique oxydable correspond a environ 24 milligranimes
ae permanganate de potasse par litre.

122

Il était a prevoir que, par suite de la grande quantité de substauces organiques
contenues dans l'eau du canal, les organismes mésonitrophiles et même les polynitro-
philes auraient une influence désavantageuse, et que les amibes, les monades et les in-
fusoires contribueraient a donner a l'expérience uu caractère beaucoup moins certain
qu'a celle décrite au § 3 pour VA. chroococciim.

La culture pure de VA. agilis s'effectue sans difficultcs particulières, si l'on prend
soin de satisfaire aux conditions de cultures mentionnées. Le terrain solide suivant
est p. ex. approprié:

Eau distillée loo

Agar 2

Glucose 2

K^HPO' 0,02.

Les autres aliments minéraux nécessaires se rencontrent en quantités suffisantes
dans l'agar. Si l'on tracé sur ce terrain des traits inoculatoires, provenant de pellicules
de VA. agilis, et que l'on cultive a 30° C, on voit déja au bout de 24 heures de petites
colonies qui continuent a croitre pendant plusieurs jours. Il est vrai que les organis-
mes mésonitrophiles, surtout une espèce tres répandue dans l'eau du canal et qui donne
naissance, sur le même terrain de culture, a de grandes colonies aqueuses, sont tou-
jours en avance dans leur croissance et que le nombre des germes de VA. agilis dont se
développent des colonies est relativement petit, mais l'image microscopique de cette
bacterie est tellement caractéristique qu'on la reconnait immédiatement dans le chaos
des différentes colonies.

Si dans le terrain de culture solide en question on remplace le glucose par >2% de
propionate de calcium, et que l'on tracé sur la plaque des traits ou stries d'A. agilis,
on observe au bout de quelques jours, autour des colonies, des champs de diffusion
assez ctendus d'une substance colorante jaune verdatre, rappelant celle des bactéries
fluorescentes, et ce caractère aussi peut servir a reconnaitre notre espèce.

Une fois qu'elle a été obtenue en culture pure, on peut la faire se développer sur
les terrains nourriciers les plus divers. Dans un bouillon de viande a la gelatine sans
substances étrangères, la croissance n'est que tres médiocre et caractérisée par la for-
mation d'alcali et du précipité blanc particulier dans le voisinage du trait inoculatoire,
caractéristique pour les bactéries productrices d'alcali. Il ne se produit pas du tout de
liquéfaction. Sur ce terrain de culture la mobilité est tres grande. Elle est toutefois
plus grande encore quand on cultive sur un bouillon de viande a l'agar.

Quand on ajoute du sucre au bouillon de viande a la gelatine, par exemple 2% de
saccharose,il y a une faible formation de mucus, c. a d. que les bactéries se recouvrent,
comme VA. chroococcum, d'une paroi cellulaire épaisse, mucilagineuse.

Sur l'agar ou la gélose de commerce au glucose et a phosphate de potasse, mais
sj^ns autres aliments, comme sur tout terrain nourricier pauvre en azote, les vieilles
cultures pures é^A. agilis, conservées dans des tubes a réaction, produisent une sub-
stance colorante tres diffusible, capable de se diffuser dans l'agar auquel elle donne une
coloration violet foncé. Il m'est impossible, pour le moment, de dire quelle est la fonc-
tion de ce pigment remarquable, qui par sa couleur ressemble au pigment non diffusible
colorant en rouge-violet le genre Chromatium parmi les sulfobactéries.

A. agilis ne forme pas de spores, de sorte que cette bacterie ne résiste pas a !a
pasteurisation, comme nous l'avons déja vu. *

123

La coloratiou des cils a présenté dans mon laboratoire des difticultcs telles que
je me suis adressé encore une fois a M. Ie Prof. Zettnow, a Berlin, auquel j'ai en-
voyé des cultures de VA. agilis pour lui demander son avis. Il a eu l'obligeance de me
donner de tres belles préparations, prouvant a l'évidence que les cils forment des fais-
ceaux polaires, ainsi qu'on Ie reconnait a la Fig. 6, qui est une reproduction d'une
photographie faite d'après une de ses préparations. A ce propos il m'écrivit que »dans
un bouillon de spirilles il n'y avait pas un seul individu qui n'eüt été animé d'un mou-
vement des plus vifs . . . D'après la nature de ce mouvement, régulier et ondulatoire,
quoique vif, et ressemblant fort a celui des monadines, je m'attendais a trouver un ou
plusieurs cils polaires, et cette prévision a été confirmée par les préparations dans un
bouillon de spirilles, oü la culture en pleine vigueur avait été tuée par la formaline.
Ce résultat n'a toutefois pas été obtenu sans peine. Les 6 a lo cils, fixés a un póle ou
aux deux póles a la fois, s'appliquent d'ordinaire contre la paroi recouverte d'un ecto-
plasma tres gluant, ce qui fait qu'ils semblent partir de la paroi latérale.« Au commen-
cement j'ai également été induit en erreur et j'ai cru voir avec certitude des cils la-
téraux, mais un examen minutieux des préparations m'a donné la conviction que la
maniere de voir de M. Zettnow est exacte, au moins pour la grande majorité des
individus.

L'accumulation de VA. agilis dans une eau de canal contenant du sucre et du
phosphate est Ie premier stade d'une flore et d'une faune excessivemeiit riches, qui s'y
développent quand on abandonne la culture a elle-même vers 18° C. Le liquide finit par
devenir pateux par suite d'un monde de microbes, composé, en dehors de VA. agilis
même, surtout de spirilles et d'autres bactéries, puis d'amibes et de monades et parfois
aussi d'infusoires.

Il est certainement remarquable qu'un tel monde de microbes puisse prendre nais-
sance en dehors de toute combinaison azotée.

7. Courte diagnose du genre Azotobacter ( P arachromaHum ) et des
espèces qui en sont déja connues.

Il n'est pas inutile peut-être de donner, a propos de la planche qui accompagne ce
travail, un court aperqu des caractères les plus importants des bactéries oligonitro-
philes dont il vient d'être question.

Azotobacter (ou Parachromatium). Crosses bactéries, se présentant a l'état jeune
comme de grands diplocoques ou de courts batonnets de 4 a 6 ^ ou moins encore, par-
fois beaucoup plus grands, a contenu hyalin présentant souvent une vacuole, et munis
d'une paroi mucilagineuse d'épaisseur tres variable. Etats jeunes plus ou moins mobiles
par suite de cils courts, isolés et polaires ou groupés en faisceaux polaires au nombre
de 4 a 10, presque aussi longs que les bactéries elles-mémes. Spores absentes. Organis-
mes oligonitrophiles, c. a d. développant dans des Solutions nutritives a source de
carbone appropriée, mais tres pauvre en combinaisons azotées, assimilant en symbiose
avec certains autres microbes l'azote atmosphérique et par la capables de concourir.
Sur ces propriétés peut être basée une methode d'accumulation et de culture pure. Les
cultures pures croissent sur les terrains nourriciers les plus divers, de préférence sur
ceux pauvres en azote. Optimum de température pour la croissance non loin de 28" C.

124

On en connait jusqu'ici les deux espèces suivantes:

I. A. chroucoccum. Donne naissance a des membranes superficielles dans les accu-
mulations sur de l'eau de conduite a 2% de mannite et 0,02% de K'-HPO*, infectée par
du terreau. Quelques individus seulement des cultures jeunes se meuvent sous l'action
d'un seul cil polaire ; la plupart sont immobiles. Les individus des membranes jeunes
correspondent au diagnostic du genre; les vieilles sont constituées de microcoques de
grosseur tres variable, restant réunis en paquets comme des sarcines et garnis d'une
paroi mucil^gineuse. Ces états agés sont souvent bruns ou noirs. Cette espèce peut
oxyder de nombreux composés du carbone en formant de l'anhydride carbonique et de
l'eau; elle est microaérophile. A cóté de la forme principale j'ai rencontre deux vari-
étés dans Ie terreau et dans l'eau de canal.

2. A. agilis. Tres répandu dans l'eau du canal a Delft. S'obtient en cultures
accumulatoires ou pures, d'une maniere analogue a celle décrite pour l'espèce précé-
dente. Tres mobile par des faisceaux de cils polaires. Belles et grosses bactéries, tres
transparentes, rappelant des monadines ; parfois avec paroi, protoplasma, noyau, gra-
nules et vacuoles nettement visibles. Croit sur les terrains les plus divers, de préférence
sur de l'eau a l'agar pur avec 2% de glucose et 0,02 de K^HPO*. Peut engendrer une
substance colorante, verte en présence de sels d'acides organiques, rouge en présence
de sucre, qui se diffuse dans Ie terrain de culture. Ne liquéfie pas la gelatine.

Explication de la Planche.

Les cinq premières photographies ont été faites d'après nature, la sixième d'après
tine préparation colorée par M. Zettnow.

Figur I. Azotobacter chroococcum. Culture jeune, agée de 24 heures, sur de l'eau
a 0,020/0 de phosphate de potassium, 20/0 d'agar et 20/0 de glucose. Quelques individus
seulement sont mobiles. Grossissement 1000,

Fig. 2. Acotohacter chroococcum. Culture un peu plus agée, sur //^O — phosphate —
mannite — agar, avec une bacterie acétifiante afin de faire voir les épaisses parois de mucus,
dans iesquelles les bactéries du vinaigre ne peuvent pas pénétrer. Grossissement 500.

Fig. 3. Azotobacter chroococcum. Etat sarcinoïde brun foncé, sur H-O — phosphate

— mannite — agar. Les paquets de sarcines sont trop épais pour pouvoir être photo-
graphies dans un même plan. Grossissement 1000.

Fig. 4. Azotobacter chroococcum. Etats d'involution sur H^O — phosphate — glucose

— agar, pris au bord d'une vieilie colonie libre. Gouttelettes de graisse surtout visibles
dans les petites cellules. Grossissement 800.

Fig. 5. Azotobacter agilis. Culture sur //^O — phosphate — glucose — agar, agée de
deux jours. Dans Ie protoplasme on reconnaït Ie noyau ainsi que les vacuoles et les
granules; dans quelques cellules £n voie de segmentation on reconnaït Ie fuseau nuclé-
aire. Grossissement 1000.

Fig. 6. Azotobacter agilis. Coloration des cils; photographie d'après une préparation
de M. Zettnow, a Berlin. Cils groupés pour la plupart en faisceaux polaires. Gros-
sissement 1000.

M. W. BEIJERINCK, Bactéries oligonitrophiles.

Fuf. 1.

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Fin. (].

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Fig. 1—4 l'aracJiroinatimn (Azotobacter) chroococcum. Fig. 5 — 6 F. agilis.

Further researches concerning oligonitropholous

microbes.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. IV, 1902, p. 5—9. — Verscheen onder den titel «Verdere onderzoekingen
over oligonitrophile Mikroben* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-
en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel X, 1902, blz. 8 — 13.

In my first paper on oligonitrophilous microbes') I still left thequestion unanswered
after the forms which develop in the light, in nutriënt liquids, which only
contain traces of nitrogen compounds, and whose nutrition with carbon can only be
effected from the carbonic acid of the air.

The experiments to answer this question were made as follows. Large flasks
were plugged with cotton wool or filtering paper, so that the air has free access, or
closed in such a way that the air could be renewed, and that, at each renewing, it
must pass through strong sulphuric acid in order to be deprived of the nitrogen-
compounds. These flasks had been half filled with

100 Tap- or distilled water

0.02 K-HPO-^

and infected with a not too slight quantity of garden-soil, e. g. i to 2 grs. per liter").

They were placed in winter at a window on the south, in spring and in
summer on the north-west, and in the beginning they were now and then shaken, in
order to sink the floating film of calciumphosphate, which forms at the surface.

As the rate of nitrogen and carbon compounds is too slight to cause any
appreciable development of colourless microbes, no further cloudiness results. but
that of the easily precipitating phosphate. But in winter after six to eight, in
summer after four to five weeks, a characteristic flora develop s consisting of s o me species
of Cyanophyceae, which, once become visible, can promptly give rise to a deep bluish-
green colouring of the liquid. In the beginning these Cyanophyceae are seen to
develop as free colonies at the sides of the flask, later there also appear floating
films, which latter consist chiefly of Anabaetia, while among the colonies growing on
the glass-wall, not only the large flat colonies of Anabaena, but likewise the charac-
teristic, but rarer bluish-grey slimy lumps of Nostoc paludosum are most striking. A

') These Proceedings of March 30, 1901.

■"') The Delft tap-water contains a present 0.42 mG. nitrogen por L., the garden-
soil used 0.56 pCt. nitrogen (analyses of Mr. A. v. Del den); but this nitrogen can
only for a minimal portion (as ammonia and nitrate-nitrogen) be assimilated by mi-
crobes. The oligonitrophili themseives posses the specific faculty of feeding on the
nitrogen from the atmospherc.

126

third, very intensely coloured species, which is nearly as common, I determined
as No $ toe sphaericum^) .

Motile Cyanophyceae, such as OsciUaria, do not result under these conditions, or
only in much smaller numbers than those mentioned ; probably f or them the proportion
of organic substances in the said nutriënt liquids is still too large and that of
nitrogen compounds perhaps too slight. I have also found that OsciUaria is micro-
aërophilous^) in the dark, so that, at the places fit for its development, at least
temporary anaërobiosis should be possible, which is not the case in my experiment.

Chlorophyceae, especially Chlorococcum and Chlorella are, as might be expected,
not wholly absent in these cultures; but their number is so small that they are
without any influence on their external character. This fact is the more remarkable
because, if to the culture fluid is added

0,02 pCt. NH* NO^

already after a shorter time than the above mentioned, a dense film of Chlorophyceae,
in which Chlorococctwi infusionum is the principal species, grows rapidly on the
surface. Only when the nitrogen-compounds added to it have been quite consumed,
the green film grows darker, as then again flakes of Cyanophyceae, in particular of
Anabaena, begin to form.

The experiments have essentially the same course when the tap-water-phosphate
flasks are not infected with garden-soil, but with a small flake taken from a previous
culture of Cyanophyceae. Here I saw however, in some cases appear Anabaena
only, which under these conditions of culture evidently supplanted the other Cyano-
phyceae.

If in my experiments I use Delft canal-water, instead of tap-water, and omit,
the infection with garden-soil, the process is somewhat different. First a rich light-
brown culture of Diaiomaceae takes rise, in which here and there colonies are seen of
Chlorophyceae belonging to the genera Raphidium, Scenedesmus, Chlorella and Chloro-
coccum, but without their multiplying sufficiently to alter the brown colour of the
culture. After 8 to 9 weeks however, the colour at once grows darker by the then
occurring increase of the Cyanophyceae, which increase continues a long ti me
evidently as long as there is a sufficiënt quantity of kalium phosphate and other
mineral food.

I think the result of this last experiment should be explained as follows.
Canal-water contains a greater amount of organic substances than the tap-water
cultures; as long as these substances are present the Diatoms are prevailing; they
use these substances for their carbon-nutrition, together with the carbonic acid
from the air, and at the same time assimilate the nitrogen-compounds. When these
are consumed the Cyanophyceae appear.

That the Diatoms can in fact utilise a fairly high rate of organic substances, is
well known to the students of that group. The following experiment which, to my
knowledge, has not yet been described, proves that the Diatoms are the very

') Not all the species of Cyanophyceae obtained couid be determined. Some of
them I think have not been described.
') It is macroaërophilous in the light.

127

coloured microbes, which can, if not assimilate, at least tolerate without injury the
full rate of organic matter and of nitrate-.and ammonia-nitrogen of fertilegarden-soil.

A high glasscylinder is filled for one half with garden-soil, for the other with
pure water. After shaking the thus o*btained mud is allowed to stand at a sunny
window. After some days or weeks, according to season and temperature, one
sees at the illumined side of the glass a deep brown film appear, consisting of the
Diatoms present in the garden-soil, which slowly creep towards the light. This
film increases some months by the multiplication of the Diatoms, but finally there
appear in it large green spots of various lower Chlorophyceae, whose propagation
becomes only vigorous, when the Diatoms and other microbes (such as bacteria
and monads) have for the greater part used the assimilable organic substances and
converted them into unassimilable material. Cyanophyceae do not grow under these
circumstances, this being prevented by the abundance of nitrogen-compounds in the
garden-soil.

Though it is certain, that the flora of Cyanophyceae in my tap- and canal-water
experiments only develops with an extremely small porportion of organic matter in
the food, I still consider this proportion to be of an essential signification for the
experiment. I have already convinced myself that at as complete an absence as
possible of organic substances, the development of the flora follows quite a different
course, but I am as yet unable thereabout to impart any decisive results.

The experiment now described, is not quite new as to its principle. In another
form it was already performed in 1892 by Schlösing fils and Laurent^), not
however with a culture liquid, but with a solid sand-soil and under conditions
much more complicated than mine. Noteworthy is that also these investigators,
cultivating in the light under the exclusion of all compounds of nitrogen, obtained
Cyanophyceae belonging to the same or almost the same genera as those resulting
from my experiments. They have moreover come to the result that by these
Cyanophyceae free nitrogen was assimilated in a slight but distinctly observable
quantity, and though they have not completely proved this assertion, as their
cultures must have contained other organisms too, e.g. many bacteria, basing also
on my own experiences I take their view to be correct.

My experiment throws some light on the two followingobservations. Graebner^)
observed that fresh sandy grounds, which are changing into moors, cover in the
beginning with a flora of Cyanophyceae; and Treub''), when visiting the isle of
Krakatau after its destruction, found that the new flora which first developed on the
volconic ashes, likewise consisted of Cyanophyceae, of which he in particular mentions
Lingbya verbeekiana and Z. minutissima. Both, the said heathsand and the ashes of
Krakatau, have no doubt been extremely poor in nitrogen-compounds.

If absolutely rejecting the theory of spontaneous generation, it might be
assumed that certain Cyanophyceae, carried over from the universe by meteorites,

') Fixation de TAzote libre par les plantes.Ann.de l'Institut Pasteur T. 6 pag. 832,
1892. The authors make special mention of Nostok punctiforme, N. minutum and Cy-
lindrospermiim majus.

'-) Studiën über die norddeutsche Heide. Bot. Jahrbüchcr. Bd. 20, 1891.

*) Notice sur la nouvelle flore de Krakatau. Ann. d. Jard. Bot. de Buitenzorg.
T. 7, 1888.

128

have been the first organisms which peopled the earth, as no other living beings
are known which, like the Cyanophyceae, are able to build up their organic constituents
from carbonic acid and atmospheric nitrogen.

Once asquainted with the culture conditions of the Cyanophyceae I could
easily obtain pure cultures on a solid medium. I therefore used as well silica as
agar which by long washing with tap-water had been freed from the soluble organic
substances, but saturated with the constituents of the tap-water. Plates of this
agar, to which nothing else had been added but 0.02 pCt. K' H P O*, and on
which tap-water cultures of Anabaena had been sown out, were placed in the light of a
window on the north, and after 10 to 14 days already produced extensive Anabaena-
colonies free from bacteria. If the plates are not thoroughly washed Anabaena
does not grow at all on them.

With plates prepared of silica instead of agar I obtained the same results.

The washing of the plates is effected by placing them, after solidification in the
glass-box, into a large beaker with water, which is continually renewed during a
few days by a current from the tap.

Then kalium phosphate is introduced into the plates by pouring over them a
solution of this salt in distilled or tap-water, which solution is renewed a few times.
Finally the superfluous water adhering to the plates is removed by heating the
glass-box for a short time over a Bunsen-flame.

Osciilaria and allied species do not grow on the thus prepared media, they
even die on it already after some days. Mr. A. van Delden, however, has succeeded
in my laboratory to obtain a pure culture on a solid medium of such a motile
form related to Osciilaria.

This culture necessitated two other precautions. First the organic substance
had to be removed from the agar more completely than is wanted for Anabaena,
and therefore it proved necessary to wash with a current of distilled water. Secotui,
the addition of a little of a nitrogen compound, e.g. a tracé of ammonium-nitrate
proved necessary, or at least favorable. On such agar the growth of the organism
remains however very scanty, and, as besides many species of chlorophyceae can
develop under these circumstances, we leave herewith the group of oligonitrophili,
whose specific faculty consists in their being able to live on the nitrogen from the air,
in opposition to the Diatoms and the Chlorophyceae. Hence this faculty seems also
peculiar to a part only of the Cyanophyceae.

The question put at the head of this paper should thus be answered as follows.

In culture liquids, containing besides the mineral constituents of the food, a
slight quantity of garden-soil, but to which no other nitrogen-compounds have been
added, develop, under the influence of the light and the carbonic acid from the air,
various species of Cyanophyceae, chiefly belonging to the genera Nostoc and Anabaena.
Germs of these are very numerous in garden-soil. The presence of nitrogen-compounds
prevents the development of the Cyanophyceae, but furthers that of certain Chloro-
phyceae and Diatomaceae.

Photobacteria as a reactive in the investigation
of the chlorophyll-function.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. IV, 1901, p. 45—49. — Verscheen onder den titel «Lichtbacteriën als reaktief
bij het onderzoek der chlorophylfunctie« in Verslagen Kon. Akademie van Weten-
schappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel X, 1901, blz. 69—74.

If in a mortar leaves of some neutrally reacting plant, e. g. of white clover are cru-
shed, diluted with destilled water, and filtered, a green filtrate is obtained, in which
are found that portion of the living protoplasm which is soluble in water, and many
chlorophyllgranules which give the filtrate a green colour.

If this green liquid is mixed with a culture of phosphorescent bacteria in fish-
broth with 3 pCt common salt, or with sea-water ^) rendered phosphorescent by a
»Iuminous bouillon*, and if this mixture is filled into a test-tube or stoppered bottle, the
liquid becomes dark as soon as the oxygen has been used by the physiological processes
of the phosphorescent bacteria and of the living protoplasm of the clover-leaves in the
filtrate.

If the dark liquid is exposed to light, it is evident that the chlorophyll and the
living protoplasm have not become inactive by the said treatment, for, by production
of oxygen, they again cause the luminosity of the bacteria. If the plant-juice is fresh
and the bottle is placed for a minute or longer in the fuU sun, then so much oxygen
is formed, that the bacteria, transferred to the dark can continue phosphorescing for
some minutes.

This experiment is of an extreme sensibility, for even the lighting of a match
is sufficiënt, after part of a second already, to produce a distinct phosphorescence
which, of course, can only be observed when by remaining long enough in the dark,
the eye has become sensible to feeble light.

If the liquid is left to stand for some hours, either as such or after mixing with
the phosphorescent culture, the power of decomposing carbonic acid gets quite lost.
Evidently the presence of living protoplasm is necessary for it. Concequently,
F r i e d e I's 2) experiment, wherein clear, filtered juice of squeezed spinage-leaves,
mixed with powdered leaves of the plant, dried at 100" C, causes decomposition of
carbonic acid, does not prove, as F r i e d e 1 thinks, that the function of chlorophyll
reposes on the action of enzymes, but on the fact, that the portion of the protoplasm

') By »sea-water« is meant tap-water with 3 pCt. Cl Na*

-) J. Friedel, l'Assimilation chlorophyllienne réalisée en dehors de l'organisme
vivant. Comptes rendus T. 132, pag. 1138, 6 Mai 1901.

g
M. VV. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel.

130

cuiicernecl in the process, occurs in the liquid state and is not solid, — hence, a new
argument for the more and more prevailing opinion, that the living protoplasm is,
if not quite, at least partly liquid. That the juice can be precipitated with alcohol,
without the precipitate becoming inactive, proves nothing for the enzyme-hypothesis,
as in many other cases the living protoplasm is proof against the action of alcohol.
If it be thought desirable to use the name of »protoplasm« only for the mixture
of the living matter such as it occurs in the cell, and to connect with that term the
idea of a special structure, I can quite well share this view, and will allow that, in
this case, the decomposition of the carbonic acid is brought about by something else
but »the protoplasm«, namely by a portion of it. To this portion, or rather, to this
particular constituent of the protoplasm, the name of »oxybiophores« or »oxy-pan-
gens« might be given, in accordance with the theory of biophores or pangenesis. With
what has always been understood by enzymes, the properties of the biophores do not
coincide but, of course, they do with those of the protoplasm itself ^).

With crushed algae 1 could also perform the above experiment, but the secretion
of oxygen was much slighter than with the sap of the examined land-plants.

On the other hand, algae vihich have not been crushed, whether enclosed in a
mixture of culture-gelatin and luminous bacteria, or simply in sea water rendered
luminous by phosphorescent bouillon, are very well fit to study the secretion of
oxygen in the light and its relation to the colour of the light.

Some years hence, Prof. K a m e r 1 i n g h O n n e s , at Leiden, had the kindness
tr enable me to make an investigation thereabout in his laboratory. Our experiment
was conducted as follows.

Between two glass-plates was enclosed fish-bouillon-gelatin diluted with sea-
water, and thus c(,)ntaining 3 pCt. Cl Na, which by a great number of phosphorescent
bacteria (Photobacter phospliorescens), mixed with it, was highly luminous at suffi-
ciënt access of oxygen. In the middle of the gelatin T had placed, before the solidi-
fication, a broad stripe of a sea-Ulva.

In the dark the gelatin quickly closes its luminosity, the glassplates rendering
access of air impossible. When exposed to the light, the Ulva produces oxygen
through the decomposition of carbonic acid, and a local spot of light appears, which
may be caused to come and to vanish at will as often as desired.

This apparatus was set up in a simple camera and could be locally illumined
by withdrawing a slide. When the slide was closed the camera was quite dark, by
which the eye of the observer became sensible to the light. Prof. O n n e s himself
supplied spectral colours of known refrangebility, taken from the spectrum of an
electric arc-light, and projected them on the Ulva in the gelatin. By me was then
observed what coloured lights were well, and what were not able to cause the decom-
position of carbonic acid. The result was the following: Only red light decomposes
carbonic acid, for only in it the phosphorescent bacteria emit a strong light; the
maximum of decomposition was found near the chief absorption-band of the chloro-
phyll-pigment, situated between B and C. and this maximum coincides about with C

') This observation holds also good with regard to Buchncr"s »alcohol-enzynie<»
of which the active agent consists in »alcohol-biophores«.

131

itself, certainly it was somewhat out of the niiddle of B — C Decoinpositiou of car-
bon ie acid in other coloured lights could not be detected.

If the Chlorophycee was replaced by a Rhodophycee, which i determined as
Porphyra vidgaris, and which, like the Ulva, is common on the stone piers at Sche-
veningen, the process was nearly the same, but with this ditïerence that the maximum
of decomposition does not coincide with C but lies quite in the orange.

As the chromatophores of Porphyra, besides the chlorophyll-pigment, contain
a red pigment soluble in water, and of whicl: two chief absorption-bands are situated
in the yellow, it is obvious that the maximum of carbonic-acid decomposition is in
this case determined by the co-operation of the coloured rays which both pigments
by preference absorb.

Our results, accordingly, correspond in the main point with those obtained by
Prof. Engelmann^), by his method based on the motion of bacteria, with this
difïerence that the production of oxygen in two other absorption-bands, situated in
the blue, as described by him, could not be observed by us.

In opposition to the sea-algae and likewise to the crushed leaves of landplants,
v.hole leaves of the latter, immersed in luminous fishbouillon, or in gelatin mixed
with phosphorescent bacteria, do not distinctly, or only for a very short time, produce
oxygen, when they are illumined after being freed from the air enclosed in their
tissues.

In the following way, however, the experiments with them went very satis-
factorily.

Instead of enclosing the leaf /';; the strongly phosphorescent gelatin it is simply
laid on the surface, and firmly pressed to it by means of a solid glass-plate.

Kept in the dark, after some time all the oxygen originally enclosed in the
tissues of the leaf is utilised by the phosphorescent bacteria and everything under
the glass-plate grows dark. If now the leaf is illumined, oxygen is formed, and
when transferred to the dark, the bacteria will be seen to continue emitting light
for some time -).

These experiments confirm the results obtained by .S t a h 1 "'). which demonstrate
that the stomata are the ways by which the gases enter and leave the leaf. For when
suitable leaves are selected with about an equal number of stomata on both surfaces,
and examined after our method, it appears to be all the same, whether the leaf is
pressed with its under or upper side against the gelatin, in both cases a luminous spot
of the shape of the leaf appears, after illumination. If. on the other hand, the stomata
are only, or for the greater part, at the under surface, and the leaf is pressed with
its upper surface on the gelatin, thus with its underside against the glass-plate, then
the oxygen accumulates between the latter and the leaf, and does not, or only partly
pass through the lamina but, reaching the gelatin along the margin of the leaf, a
luminous line following this margin is produced.

If such a leaf is illumined after being pressed with its under surface on the ge-

') Botanische Zeitung. 1883 pag. i, 1884 pag. 81.

*) For the right performance of this experiment some practice is required as the
layers of air, adhering to the leaves, and which are greatly different at the upper and
under surface, influence largely on the course of the process.

*) Botan. Zeitung. 1894 pag. 117, 1897 pag. 71.

132

latin, the oxygen issuing from the stomata directly comes into contact with the
gelatin, and a luminous spot appears shaped like the leaf.

In performing this experiment it is advisable to cut one and the same leave into
two halves and press at once both parts on the gelatin, one with the upper- the other
with the underside.

The process can, however, become very complicated by the closing of the sto-
mata, which are extremely sensitive tp the contact of the salt-containing culture-gela-
tin, and evidently also to the absence of oxygen in their surrounding, when kept in
the dark.

The fact that nyctitropic leaves evaporate the most vigorously at that side,
which is covered during the night, has been confirmed by the photobacteria-method
respecting the secretion of oxygen. So, the clover-leaf closes at night by putting the
upper surfaces of the leaf Iets against one another: hence these surfaces must exhibit
a more energetic secretion of water-vapour, and in the light, of oxygen, then the
under surfaces, which has been confirmed by the experiment.

For Robinia pseud-acacia, where at night the under surfaces cover each other,
the most vigorous secretion of oxygen is to be expected in the light from the under-
side, which is likewise confirmed by the experiment. But with Rohinia the difïerence
is less considerable than with clover.

Ueber die sexuelleGeneration vonCynips Kollari.

Alarcellia, Riv. int. di Cecid. v. I, an. 1902, fase. I-II, Padova, p. 13—20.

Als ich vor einigen Jahren fand'), dass die Knopperwespe (Cynips calicis) von
. Quercus pedunculata eine zweigeschlechtliche Generation (Andricus cerri) er-
zeugt,welche in kleinen Gallen an den Staubbeuteln von Quercus cerris lebt, drangte sich
wie von selbst die Frage auf , w^ie sich wohl die übrigen Arten der Gattung Cynips s. s.
verhalten mochten. Könnte auch dabei vielleicht zu gleicher Zeit Heterogenesis und
Heteröcie combiniert vorkommen? Besonders Cynips kollari, — ausser C. calicis die
einzige Niederlandische echte Cynipsart, — forderte zu neuen Untersuchungen auf.
Zwar hatte ich früher, auf Grund eines scheinbar überzeugenden Versuchsergebnisses,
die Meinung ausgesprochen 2), diese Art sollte sich nur parthenogenetisch fort-
pflanzen, doch war ich darüber spater wieder in Zweifel geraten, weil ich im Laufe
der Jahre sehr viele Male die Eiablage bei der Kollariwespe auf Quercus pedunculata
vergebens zu beobachten versucht hatte. Zwei Umstande haben mich bei dieser Un-
tersuchung lange von der definitiven Entscheidung zurückgehalten, namlich, die Lage
des Kies, woraus C. kollari entsteht, und die Verbreitung dieses Tieres. In ersterer
Beziehung erlaube ich mir folgende Bemerkung.

Bevor ich Andricus cerri entdeckt hatte, war ich überzeugt, dass jene Lage des
Eies, darauf zu deuten schien, dass nur die Kollariwespe selbst bei der Ablage in Bezug^
kommen könnte, weil sich leicht nachweisen lasst, dass der Blattstiel unterhalb der
meisten (nicht aller) Stücke der Kollarigalle angebohrt ist. Hiervon könnte ich an-
fangs den Nutzen nicht verstehen, wenn eine Sommergeneration dabei arbeiten sollte.
Denn es erschien mir, dass es doch vernünftiger wiire für eine zart gebaute Gall-
wespe, ihr Ei sofort in die junge Achselknospe, aus deren Basis spater die Kollari-
galle entsteht, zu deponieren, wie sich unten auf den Blattstiel des zugehörigen Trag-
blattes zu setzen, diesen zu durchbohren um erst dann jene Achselknospe zu er-
reichen. Von dieser Auffassung wurde ich jedoch zurückgebracht durch das Studium
der Entwicklungsgeschichte der Calicisgalle, wobei ich die sehr eigentümliche Wachs-
tumsfahigkeit der basalen Teile der wachsenden Eichel kennen lernte. Mit diesem
basalen Teile stimmt aber die Knospenbasis, woraus die Kollarigalle sich entwickelt,
anatomisch und auch morphologisch überein. Das Ei eben auf diese schwierig er-
reichbare Stelle zu bringen, könnte unmöglich sicherer geschehen als wie es tatsach-

') Zur la Cécidiogénèse et la génération alternante chez ie Cynips calicis. Obser-
vations sur la galle de \' Andricus circulans. Archives Neêrlandaises des Sciences exac-
tes et naturelles, t. 30, p. 387, 1897.

^) Ueber die ersten Entwicklungsphasen einiger Cynipidengalien, p. 136, — Amster-
dam 1882.

134

lich auch meistens geschieht, namlich dadurch, dass die Wespe den Blattstiel von
linten nach oben durchbohrt, den Eikörper mit jener L'asis in Contact bringt, und
den Eistiel in der Dicke des Blattstiels, beim Einziehen der Legeröhre zurück lasst,
so wie ich das 1. c. beschrieben und abgebildet habe, wenn auch nicht ganz genau in
Bezug auf die Gestalt des Eies, und, wie icli nun zcigen werde, vtillig unbekannt mit
cler wahren Urheberin.

Der zweite Umstand warum icli, nachdem ich Andricits cerri schon genau kennen
gelernt hatte, doch immer noch annahm, dass C. kollari sich nur durch Parthenogene-
sis fortpflanzt und sehr schwierig zur Eiablage zu bringen ist, war die, auf der Ver-
l:)reitung von C. kollari gegründeten Meinung, dass diese Art überall wo Quercits
pedunculata vorkommt ebenfalls angetroffen werden kann, sodass, wenn eine zwei-
geschlechtliche Generation existieren sollte, diese doch auch wohl auf jenem Baunie
vorkommen miisste, und ich suchte dieselbe nach Analogie mit Cerri in den Staul)-
beutehi. Ware diese Ansicht zutreft'end, so miisste Kollari, welche im September
tind October ausfliegt, ihre Eier in die Winterknospen mit n>annlichen Blütenkatzchen
voii O. pedunculata ablegen, und darüber habe ich dann wieder viele Versuche an-
gestellt. Alles jedoch vergebens, niemals konnte ich eine Wespe veranlassen sich
ruhig auf eine Knospe zu setzen, die Tiere liefen in den Gazenetzen immer der Licht-
quelle zu, durch alle Teile der Eichenzweige mehr abgestossen, wie angezogen.

Ich kam dann schliesslich auf den glücklichen Gedanken einige Wespen mit
Zweigen von Quercus cerris einzusperren und hatte sofort Erfolg: Die Tiere wurden
auf einmal ruhig, sie batten oft'enbar ihren Lebenszweck erreicht. Schatten oder Sonne
waren nunmehr gleichgültig, jede Wespe suchte eine Knospe, stach die Legeröhre
hinein und innerhalb einer Stunde hatte ich die Eiablage beobachtet. Alles war ein-
fach und klar; die lange gesuchte Lösung des Ratsels w^ar gefunden.

So stand die Sache im October 1898; offenbar musste nun eine sehr frühzeitig
auf Quercus cerris sich entwickelnde Galle entgegen gesehen werden. Welche Galle
sollte dieses aber wohl sein können ? Mir waren in Niederland nur zwei Cynipiden-
gallen auf O. cerris bekannt, namlich Andricus cerri unrl A. circulans. Sollte es
vielleicht doch die letztere werden? Für die Circulanswespe hatte ich aber beobachtet,
dass sie die Knospen von O. cerris selbst ansticht, und aus solchen Knospen hatte ich,
allerdings nach Versuchen, welche im Freien und fern von meinem Wohnorte ausge-
führt waren, im nachsten Jahre wieder Circulansgallen erhalten. Diese Erfahrungen
veranlassten, dass ich auf das Resultat sehr gespannt war. Lange brauchte ich darauf
nicht zu warten: Als ich im Februar 1899 einige meiner mit Kollarieiern belegten
Cerrisknospen öffnete, fand ich darin die kleinen Gallengruppen, welche für Circulans
so charakteristisch sind. und mit deren Entwicklung ich sehr gut bekannt war. Meine
Versuchsbaume standen im Laboratoriumsgarten zu Delft, ich hatte dieselben wah-
rend des Winters fortwahrend beobachtet, hier war ein Fehler unmöglich. Im April
brachen aus den Knospen die schonen, anfangs roten Circulansgallen in grosser An-
zahl hervor, und 12. Mai 1899 flogen die ersten (ƒ und Q von Andricus circu-
lans, als legitime Kinder der Kollarimutter hinaus.

Obschon ich von daran durchaus übcrzeugt bin, dass meine friihcre, in Bezug
auf die direkte Fortpflanzung von A. circulans ausgesprochene Ansicht nicht richtig
sein kann, muss ich doch bemerken, dass meine Beobachtung, dass A. circulans Eier
in die Knospen von O. cerris ablegt. wenn auch vielleicht nur ausnahmsweise, ganz

135

sicher richtig ist. Ich habe ein solches Tier wiihrend seiner Arbeit auf einer Cerris-
knospe mitsammt dem Zweige in Chloroform getötet und bewahre das Object in der
Laboratoriumssammlung, wo jeder es sehen kann. Ich glaube nun aber, dass solche
Eier verloren sind, weil C. kollari sich nicht aus den Cerrisknospen entvvickeln kann.

Dass ich dann weiter aus solchen Knospen nach Jahresfrist Circulansgallen er-
halten habe, muss auf einen Zufall beruht haben, oftenbar sind die Knospen im
Herbste 1897 von Kollariwespen besucht. Auf den ersten Bliek mag dieses unglaul)-
lich erscheinen; das Folgende macht die Sache jedoch annehmlicher. Im Sommer des
Jahres 1898 hat mein Versuchsbaum eine wahrhaft unzahlbare Menge von Circulans-
gallen getragen. Sie waren darauf beinahe an jedem Zweige zu finden. Diese Tat-
sache wird erklarlich aus der grossen Menge von Kollarigallen, welche in 1897 eben
zu Rheden, wo die Versuche ausgeführt wurden, vorkamen. Alle die tausenden, damals
dort schwarmenden Kollariwespen, welche jede c. 800 Eier enthalten, sind für ihre
Eiablage auf eine sehr geringe Zahl von Cerrisbiiumen angewiesen, ich kenne in
jener Gegend nur fünf Exemplare. Es ist deshalb nicht all zu verwunderlich, dass
m.eine vorher durch Circulanswespen angestochene Knospen spater noch einmal durch
KoUari besucht wurden.

Was die Zukunft nun iibrigens in Bezug auf die Gewohnheiten von A. circulans
lehren wird, feststeht, dass dieses Tier die sexuelle Generation zu Cynips kollari ist.

Im Herbst 1900 habe ich den Versuch mit C. kollari wiederholt, mehrere Kollari-
wespen wahrend ihrer Arbeit an abgeschnittenen Cerriszweigen mitsammt diesen in
Chloroform geworfen und in Alkohol aufbewahrt. Herr A. van D e 1 d e n, Assistent
am Bacteriologischen Laboratorium, hat davon schone Photographien angefertigt,
und er ist bereit, Abdrücke oder Diapositive für das Sciopticon abzugeben. Ich
erwahne dieses, weil C. kollari als grösste einheimische Cynipide, wegen der Gleich-
heit mit C. tinctoria, und als besonders aufïallend und bekannt durch ihre Galle. ein
empfehlenswertes Object für den. Unterricht ist.

Im October 1901 habe ich die Versuche abermals wiederholt, und nun, wahrend
ich dieses schreibe, im Februar 1902, sehe ich wieder eine neue Ernte von Circulans
auf meinen Cerrisbaumen in Entwicklung.

Es ist mir dagegen bisher noch nicht gelungen, Andriciis circulans auf Q.
pedunculata zur Eiablage zu bringen, doch zweifie ich nicht daran, dass ich dieses.
in diesem oder in einem der nachst folgenden Jahre erreichen werde, weil ich gegen-
wiirtig im Laboratoriumsgarten eine gemischte Anpflanzung von Q. cerris und Q.
pedunculata habe, welche schon im Jahre 1901 eine reiche Ernte von beiden Gallen
getragen hat, und zwar spontan, so dass Circulans in meinen Garten offenbar 2ur
Eiablage gekorrtmen ist.

Dass die Versuche mit den eingezwingerten Circulanswespen bisher misslungen
sind, erklare ich aus den eigentümlichen Gewohnheiten dieser Wespe, welche ganz
verschieden sind von denen von Cerri. Letztere Art ist ein sehr zartes Tierchen, se
zu sagen ein Sonnenstaubchen, wofür es wichtig sein muss, sofort nach dem Aus-
schlüpfen zu copulieren, was auch wirklich stattfindet, und wenn dann eine junge
Eichel gefunden ist, ohne Verweil zur Eiablage fort zu schreiten, weil die Chancen
für Vernichtung hier ausserordentlich gross sind, und der leiseste Wind das winzige
Tier fern von dem Eichenwalde würde wegführen können.

Andricus circulans dagegen ist eine viel krüftiger gebaute Wespe, welche so

136

sehr von voriger Art in ihrem Körperbau abweicht, dass man davon gut eine besondere
Gattung machen könnte. Das Tier ist gewandt beim Fliegen und schreitet nach dem
Ausschlüpfen durchaus nicht sofort zur Copulation über. Diese habe ich bisher über-
haupt nicht beobachtet, obschon ich hunderte <ĥ und 9 zusammengebracht habe. Ich
vermute darum, dass es, bevor zu copulieren, einige Zeit herumschwarmt und vielleicht
weit fortfliegt. Die Verbreitung der KoUarigalle ist mit dieser Ansicht in guter
Uebereinstimmung, denn eine Abhangigkeit dieser Verbreitung mit derjenigen von
Q. cerris habe ich erst dann bemerkt, als ich sicher war, dass dieselbe tatsachlich be-
steht. So gross kann die Entfernung sein zwischen dem Cerrisbaume, welche die
Circulanswespe hervorbrachte und dem Pedunculatabaum, worauf sie zur Eiablage
kommt, dass eine Beziehung zwischen denselben uns zunachst vöUig entgeht. Es ist
auch aüffallend, dass in meinem Garten die KoUarigallen vorzugsweise an drei kleinen
Baumen von Q. pubescens var. villosa entstehen, welche erst im Beginn Juni sprossen,
das ist beinahe 14 Tage spater als die Ausschlüpfzeit von A. circulans, was ebenfalls
auf eine langere Schwarmzeit hindeutet.

Aus der nunmehr feststehenden heteröcischen Heterogenesis von zwei Arten
der Gattung Cynips s. s., kann, auf Grund der Lebensweise der übrigen Arten, der
Schluss gezogen werden, dass auch diese jedenfalls eine sexuelle Generation besitzen
mussen, und, dass viele davon ebenfalls heteröcisch sein dürften. Durch diese Theorie
eröffnet sich eine Reihe von Kragen in Bezug auf die Zusammengehörigkeit der
zweigeschlechtlichen Arten von Q. cerris mit agamen Generationen von Q. pedun-
culata, Q. sessiliüora und Q. pubescens, wovon die sexuellen Generationen bisher un-
bekannt geblieben sind.

Zunachst ist es aüffallend, wie gering die Zahl der bekannten agamen Formen
von Q. cerris ist, wovon die zugehörigen sexuellen sicher auf derselben Baumart vor-
kommen. Eigentlich dürften nur Chiluspis nitida 9 mit Ch. l'öwi und Dryocosmus
cerriphilus 9 mit Dr. nervosus cT 9 als genügend wahrscheinlich in dieser Beziehung
zu betrachten sein. Dagegen sind die zugehörigen sexuellen Formen von allen anderen
agamen Cerriscynipiden, für soweit ichweiss, unbekannt. Dieses gilt z.B., wenn nur die
besser bekannten in Betracht gezogen werden, für die agamen cerricola, glandium,
lanuginosuSj minutulus, macroptera urid salians. Also sechs Arten. Dem gegenüber
stehen nicht weniger wie 14 sexuelle Arten von Q. cerris, wovon die zugehörigen
agamen Formen unbekannt sind, namlich: adleri, aestivalis, heijerincki, burgundus,
cerriphilus, cerrifloraUs, crispator, glandiformis, grossulariae, multiplicatus, politus,
schrökingeri, singulus und vindobonensis.

Angenommen, dass von diesen 14 sexuellen Formen sechs zu den oben genannten
agamen gehören, dann bleiben noch jedenfalls acht Arten übrig, wovon es ganz un-
wahrscheinlich ist, dass sie zu acht noch nicht entdeckten Agamen von Q. cerris ge-
hören sollten. Es ist im Gegenteil viel wahrscheinlicher, dass in den nachsten Jahren
die Zahl der neu zu entdeckenden sexuellen Formen von Q. cerris, welche gewöhnlich
klein, verganglich und versteekt sind; noch betrachtlicher sein wird, wie diejenige der
meistens viel leichter auffindbaren Agamen.

Betrachten wir nun dieVerhaltnisse bei den auf O. pedunculata, Q. sessiliüora und
O. pubescens lebenden Arten so ist es nicht weniger aüffallend, dass hier das Verhalt-

137

nis geradezu umgekehrt ist, das heisst, dass hier ein grosser »Ueberschuss« von
agamen, zu Cynips s. s. gehörigen Formen vorherrscht i). So sind unbekannt die
sexuellen Generationen von: ambigue, amblycera, argentea, aries, caliciformis, caput-
medusae, conglomerata, conifica, coriaria, coronaria', corrtiptrix, galeata, glutinosa,
hartigi, hungarica, kieiferi, lignicola, mayri, mediterranea, mitrata, panteli, polycera,
stefann, tinctoria, tomentosa, truncicola. Die neuen Erfahrungen in Bezug auf Calicis
und KoUari legen es nun nahe anzunehmen, dass einige dieser Agamen die sieben
nicht unterzubringenden Cerrisformen zur sexuellen Generation haben dürften, wah-
rend für die übrigen die sexuellen Generationen noch zu entdecken und wohl ebenfalls
auf Q. cerris zu suchen sind.

Es ware übereilt, die hier vorgetragene Ansicht nochweiter inBesonderheiten aus-
zuarbeiten, obschon sie zu einigen Arbeitshypothesen Veranlassung gibt, welche leicht
geprüff werden könnten. Nur in Bezug auf C. tinctoria erlaube ich mir noch folgende
Bemerkungen.

Ich nehme nach Herrn K i e f f e r's ausgezeichneter Darstellung der Cynipiden -')
an, dass die in der Literatur vorkommenden Beschreibungen dieser Art auf zwei
ganz verschiedene Varietaten Bezug haben, welche er als C. tinctoria und C. tinctoria
var. nestras bezeichnet 2).

Letztere, welche auf Q. pedimcnlata, O. sessiliüora und Q. pubescens vorkommt,
ist bekanntlich so nahe mit C. kollari verwandt, dass der berühmte niederlandische
Entomologe, weiland Snellen van V o 1 1 e n h o v e n , als die grosse Invasion von
C. kollari in Holland urn das Jahr 1865 stattgefunden hatte, diese Art eben unter dem
Namen C. tinctoria beschrieb. Ich zweifle gegenwartig nicht daran, dass die sexuelle
Generation von C. tinctoria var. nostrus auf Q. cerris lebt, und ich spreche die Ver-
mutung aus, dass Andricus burgundus diese sexuelle Form sein muss. Meine Grimde
dafür liegen in ihrer Uebereinstimmung mit A. circulans, welche durch Herrn
Wachtl und mich des Naheren nachgewiesen ist. Da C. tinctoria var. nestras
hier nicht vorkommt, habe ich die Hypothese weiter nicht prüfen können, doch bitte
ich jene Herren Entomologen, welche in Gegenden leben, wo diese Art heimisch ist,
mir davon Material mit lebenden Wespen zuschicken zu wollen, damit ich die bezüg-
lichen Versuche ausführen kann*).

Was nun aber die genuine Form von tinctoria betrifft, diese findet sich, wie es
scheint, nur auf Quercus infectoria^). Sie hat einen anderen Verbreitungsbezirk

*) Für die vereinzelten sexuellen mit noch unbekannter agamer Generation, lassen
sich in den Gattungen Dryophanta, Neuroterus und Aphilothrix die wahrscheinlich zu-
gehörigen Agamen anweisen.

*) Les Cynipides pag. 560. In Publication begriflfen. Die kleinen «Kronen Gallen«
von Aleppo (abgebildet in C au vet, Nouveaux éléments de Matière Médicale, t. I, pag.
139, fig- 72iy Paris 1886) halte ich für nicht ausgewachsene Tinctoriagallen. Die «Kronen-
bildung* ist für die ganze Gruppe charakteristisch und kommt auch bei Kollari vor,
besonders auf Q. pubescens.

') Aus einer Bemerkung von Herrn Dr. Trotter ersehe ich, dass C tinctoria-nostras
de Stefani nicht als Varietat sondern als »bona species* aufzufassen ist.

*) Die gleiche Bitte thue ich in Bezug auf die übrigen obengenannten Cynipsarten,
wovon keine in Niederland vorkommt.

^) Herr Dr. Trotter bemerkt hierzu das folgende: »C. tinctoria a été trouvée aussi
sur Q. pedunculata; je l'ai récoltée mei même, sur cette chêne dans l'Asie mineure*.

138

wie Hostras, und dürfte auf den Oriënt beschrankt sein, was auch Herrn K i e f f e r's
Ansicht zu sein scheint.

In systematischer Hinsicht steht Q. infectoria der Cerrisgruppe viel naher, wie
der Pedunculatagruppe, was schon daraus erhellt, dass sie, eben wie Q. cerris selbst,
zweijahrige Fruchtreife besitzt, — ein Merkmal, welches bei der grossen Analogie
zwischen Früchten und Gallen, für die Cecidiogenese gewiss von tiefer physiologischer
Bedeutung ist. — Ich betrachte es darum als möglich, selbst als wahrscheinlich, dass
die sexuelle Generation von C. tinctoria ebenfalls auf Q. infectoria zu suchen ist, und,
dass die Galle sich als eine mit denjenigen von A. circulans und A. burgundus ganz
nahe verwandte Bildung ergeben wird.

Sur rassimilation de l'azote libre par les
bactéries.

Par M. W. BEIJERINCK et A. VAN DELDEN.

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série ] I, Tomé VIII,

1903, p. 319—373- — Verscheen onder den titel »Ueber die Assimilation des freien

Stickstoflfs durch Bakterien« in Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde,

Jena, II. Abteilung, IX. Band, 1902, S. 3 — 43.

On a vu ^) que dans des solutions iiourricières, qui ne contiennent que des traces
de composés azotés mais 011 les autres aliments sont presents en quantité
suffisante, avec Ie carbone sous fornie d'hydrocarbure et oü l'air a librement acces, l'in-
fection par du terreau de jardin ou par toute autre terre fertile conduit a de riches
cultures d'une bacterie caractéristique, VAzotobacter chroococcum; cette bacterie
l'emporte bientót sur toutes les autres espèces qui l'accompagnent, au point de con-
stituer la grande majorité des organismes presents dans la masse, sans la constituer
toutefois exclusivement. Nous avons reconnu en outre que dans cette expérience
l'azote libre de atmosphère peut être fixé en grandes quantités.

Des observations ultérieures nous ont appris qu'a l'état de culture pure, dans nos
solutions nourricières pauvres en azote, Ie Chroococcum n'assimile pas notablement
l'azote (Epreuves 3la, 31^ et 3lc); au contraire, sa croissance et sa multiplication
s'arrêtent bientót, bien que la source de carbone soit encore loin d'être épuisée. On
doit conclure de la que la multiplication de Chroococcum dans les cultures grossières,
accompagnce d'une consommation complete de la nourriture carbon ique et de fixation
d'azote, repose sur une symbiose avec d'autres microbes.

Nous avons reconnu que ces symbiontes, nécessaires au développement de Clirao-
coccum, sont des bactéries appartenant a deux groupes: des bactéries sporogènes du
genre Granulobactcr et d'autres sans spores, dont nous avons particulièrement pu
examiner deux formes d'une faqon détaillée. Ces formes sont Tune V Aërohacter
aërogenes bien connu, l'autre une espèce tres polymorphe, non encore décrite et a
laquelle nous donnerons Ie nom de Bacillus radiobacter.

Toutes les espèces du genre Graniilobacter, tant aerobics qu'anaérobies, possèdent
déja d'elles-mêmes Ie pouvoir de fixer l'azote libre; ce n'est toutefois qu'en symbiose
avec Chroococcum que cette propriété est complètement développée.

Par contre, il est certain (]u Aërogenes ne peut pas fixer tout seul l'azote libre et
nous ne sommes pas davantage parvenus a démontrer ce pouvoir pour des cultures
pures de Radiobacter.

') Ces Arcliives, (2), 8. i(>o, IQ03.

140 *

On voit ainsi qu'Aërogenes et Radiohacter acquièrent la propriété d'assimilation
par symbiose avec Chroococcum, a moins que ce ne soit Ie Chroococcum même qui
acquière ainsi cette même propriété. Il se pourrait d'ailleurs que les deux éventuali-
tés soient réalisées a Ia fois.

Nous avons cru pendant longtemps que Ie Chroococcum seul devenait par sym-
biose l'agent fixateur. A présent nous sommes d'un avis contraire et devons admettre
que ce sont précisément Radiohacter et Aërogenes qui acquièrent ce remarquable
pouvoir par symbiose. Pour Radiohacter, qui est proche parent du B. radicicola des
tubercules des Papilionacées, cette maniere de voir parait naturelle, mais nous devons
accorder qu'il en est autrement pour les différentes formes d'Aërogenes. Aussi avons-
nous hésité longtemps avant d'admettre la possibilité d'une assimilation d'azote par
ce dernier groupe, surtout parce que ce ne sont pas toutes les expériences, sans ex-
ception, qui permettent de se convaincre de la réalité du phénomène; cela nous engagea
a chercher si, dans les expériences avec Aërogenes et Chroococcum, oü nous obser-
vions réellement une fixation d'azote, il n'y avait pas eu fortuitement infection par
Granulohacter. Mais, comme l'examen Ie plus minutieux de nos cultures décisives
ne nous a jamais fait découvrir ce dernier genre, nous sommes bien forcés de con-
sidérer également V Aërogenes comme un fixateur d'azote par symbiose a.\ecChroococcum.

En étudiant les combinaisons des Granulohacter avec Chroococcum nous avons
découvert la circonstance remarquable suivante: Le nomhre des hatonnets de Granulo-
hacter,presents dansles solutions nourricières et suffisants pour produire une croissance
profuse du Chroococcum, peut étre si petit qu'il est souvent difficile de les découvrir
au microscope parmi les milliers de cellules de Chroococcum. D'un cóté, il nous semble
prouvé par la que l'avantage de la symbiose de Chroococcum pour les bactéries fixa-
trices d'azote ne peut pas consister en une simple diminution de la pression de l'oxy-
gène, par suite de la forte croissance de Chroococcum, bien qu'il soit démontré que
cette diminution de pression est propice a la fixation d'azote, du moins par Granulo-
hacter. D'un autre cöté nous en tirons cette conclusion importante que le premier
produit de l' assimilation d'azote est un composé azoté qui existe dans le liquide d,
l'état libre, c. a d. en dehors des bactéries qui le forment, et est ainsi a la disposition
de tous les microhes et aiitres organismes dont il peut satisfaire le hesoin d'azote.

Cette règle doit être générale. Elle est certainement vraie pour le produit
engendré par Granulohacter et absorbé par Chroococcum, qui s'en sert pour sa crois-
sance. Elle doit aussi s'appliquer au composé azoté produit par Radiohacter, car, bien
que dans la symbiose de cette espèce avec Chroococcum dans un liquide nourricier
privé d'azote ce soit surtout le Radiohacter qui se développe, on observe néanmoins
aussi une forte croissance de Chroococcum, de sorte que cette espèce aussi y doit
avoir une combinaison azotée a sa dispositon. Dans ces conditions il n'y a pas lieu
de douter que Ia même règle s'applique a Aërogenes.

Nous n'avons pas encore pu déterminer la nature de cette combinaison, formée
aux dépens de I'azote libre de l'atmosphère; a la fin de ce travail nous donnerons
quelques considérations relatives a ce produit. Pourtant son existence certaine ren-
verse la vieille theorie, d'après laquelle l'albumine des bactéries serait Ie premier pro-
duit d'assimilation d'azote que l'on puisse reconnaitre, de sorte que Topinion actuelle-
ment la plus répandue, au sujet de I'augmentation naturelle de la quantité d'azote dans
Ic sol, doit également être modifiée.

141

Comme les spores, surtout celles des espèces aerobics de Granulobacter, sont tres
résistantes et supportent même une forte ébullition, et que la présence de ces microbes
dans les cultures de Chroococcum, même quand cette présence peut être décelée
difficilement par un examen microscopique, sufïit a produire une notable fixation
d'azote, il est nécessaire de prendre des précautions toutes particulières pour les cul-
tures combinées avec les espèces qui n'engendrent pas de spores, et de stériliser soig-
neusement les liquides nourriciers. C'est cette circonstance qui a fait que nous avons
cru pendant si longtemps que, chaque fois que nous observions une fixation d'azote
dans les cultures de Chroococcum, combine avec des microbes non-sporogènes, ces
cultures contenaient quelques rares germes de Granulobacter qui, en dépit de toutes-
nos précautions, avaient été presents dans la matière d'infection considérée a tort
comme pure, et avaient ainsi passé dans Ie liquide noUrricier ou y étaient tombes lors de
rinfection. Mais, ainsi que nous l'avons dit tantót, après de nombreuses expériences,
il n'était plus possible de douter de l'exactitude de nos observations.

Toutes les espèces du genre Granulobacter perdent facilement leur pouvoir fixa-
teur d'azote libre par une culture prolongée a l'air, comme c'est Ie cas p. ex. pour les
cultures pures sur un terrain solide. La preuve de ce fait nous a paru importante et
nous a engagés a insérer dans les tableaux mainte détermination qui autrement n'au-
rait pas dü être prise en considération, en égard a la faible quantité d'azote fixée.
Mais, comme ces déterminations se rapportaient toujours a des cultures qui, au com-
mencement, c. a d. après leur isolation récente, avaient donné un gain d'azote tres
considérable, il n'était pas sans intérêt de les noter.

La perte de cette fonction va exactement de pair avec Ie pouvoir que possèdent
les mêmes formes de se contenter de peu d'oxygène pour leur croissance, c. a d. avec
la perte de leur microaérophilie, ce qui résulte aussi de leur culture en plein air. *)

Pour des expériences sur la fixation d'azote, oü l'on se sert de Granulobacter, ces
remarques sont importantes: si l'on désire fixer beaucoup d'azote, il est recommandable
de se servir de cultures pures fraichement isolées. A eet effet on doit introduire dans
la solution nourricière du terreau pasteurisé et Ie Chroococcum; au bout de 2 a 3 jours
on obtient une culture profuse de Granulobacter + Chroococcum. On inocule ensuite
sur de l'agar au glucose, et les colonies aerobics de Granulobacter ainsi obtenues, qui
généralemcnt s'étcndent de tous cótés jusqu'a de grandes distances, sont immédiatemcnt
mises a profit pour les cultures combinées. Si l'on veut transporter Ie microbe sur un
terrain solide dans des éprouvettes pour des cultures en séries, on fait bien d'y ajouter
Ie Chroococcuntj parce qu'on évite ainsi jusqu'a un certain point la dégénérescence du
Granulobacter, Ie Chroococcum diminuant la tension de l'oxygène en solution dans ie
milieu de culture.

La haute pression de l'oxygène atmosphérique a pourtant une influence analogue sur
la variation de Chroococcum et sur celle des symbiontes qui ne forment pas de spores,
notamment Ie Radiobacter, quoiqu'ici les effets soient moins nets et échappent aisément
a l'observation. Je dois toutefois insister ici sur ce point. Le Chroococcum est une
bacterie tres variable, tant au point de vue de la physiologie de sa nutrition que sous
d'autres rapports ; c'est ainsi qu'elle peut perdre sa propriété remarquable de se colorer

') On ne peut pas se servir ici du mot »anaérobiose«, puisqu'il s'agit d'cspèces qui
se laissent fort bien cultiver a l'air libre.

142

en brun, parfois de fac^on locale dans une seule colonie, de maniere a donner une colo-
nie divisée en de nombreux secteurs, les uns obscurs les autres clairs. C'est cette varia-
tion qui explique les irrégularitcs des nombres obtenus dans l'analyse de nos accumu-
lations, si Ie mélange des espèces obtenu dans chaque cas particulier ou Ie proccdé de
culture ne fournissent pas une explication suft'isante des divergences observées.

Nous pouvons donc dire tout simplement que la fixation d'azote exige un état
déterminé d'accomodation, qui se trouve réalisé chez les germes en question, aussi bien
dans Ie sol même que dans les cultures fraichement isolées, obtenues par Ie procédé des
plaques, et qui se perd plus ou moins rapidement, et d'une fa<^on plus ou moins com-
plete, dans nos cultures en plein air et sur substratum solide. En transportant toute-
fois les accumulations sans interruption dans les solutions nourricières, la constance
peut être conservée.

On verra que nos expériences ressemblent a celles de M. Winogr adsky ^). (Jue
nous sommes arrivés, a plus d'un point de vue, a d'autres résultats que lui doit être at-
tribué pour une partie au fait que nous avons diminué, pour une partie de nos expérien-
ces, ou même empêché complètement l'anaérobiose qui était la base des expériences de ce
savant; pour une autre partie a l'introduction de Chroococcinn, par laquelle nous avons
atteint une amélioration notable du procédé de culture, même dans les expériences avec
des organismes anaérobies, ce qui nous a permis, dans des cas avantageux, de fixer
deux fois plus d'azote libre que les quantités les plus fortes que M. Wi n o g r a d s k y
a obtenues.

I. Les cultures accumulatrices de Cliroococcum
^ aupointdevuebactériologique.

Pour l'accumulation de Chroococcum nous nous sommes servis du liquide nour-
ricier suivant, déja décrit antérieurement: Eau de conduite loo, mannite (ou glucose)
2, K^HPO* 0,05. Nous en avons introduit une couche peu épaisse dans de grands
ballons a fond plat, et nous avons cultivé pendant 24 heures environ a 28" C. et plus
loin a 23" C. Les ballons étaient bouchés au moyen d'ouate et avec du papier a filtrer
entouré d'un fil de plomb ; une aération artificielle de la mince couche liquide était su-
perflue. Nous avons établi par plusieurs expériences qu'il n'était pas possible de re-
connaitre aux quantités d'azote fixé quand l'air entrant était privé de traces de com-
binaisons azotées, par un lavage a l'acide sulfurique, et quand il ne l'était pas, ainsi
que l'on pouvait s'y attendre, en égard a la courte durée de l'expérience et des quan-
tités considérables d'azote assimilées. D'ailleurs les cultures a croissance rapide et
précoces, 011 Ie sucre disparaissait Ie plus vite, rapportaient Ie plus d'azote; cela ne
s'applique toutefois pas aux cultures pures, dont la croissance est généralement lente.

La première infection de la solution nourricière avait lieu ordinairement avec du
terreau frais ; dans les inoculations suivaiites il était inutile d'ajouter encore du ter-

') Recherches sur Tassimilatiün de Fazote libre de l'atmosphère par les microbes.
Arch. d. Sc. biol. de St. Pétersbourg, T. IIL 1895, n». 4.

143

reau.quoique l'additioii d'une petite quantité de terre stérilisce, dans Ie but d'introduire
une petite quantité de composés azotés, fut tres favorable a la croissance. Déja au
bout de deux ou trois transports les amibes, monades et infusoires ont disparu et, mal-
gré Ie mélange assez complexe de bactéries, la culture conserve pendant tous les autres
transports un caractère assez uniforme, toujours accompagné de fixation d'azote, ainsi
que Ie prouva une série de plus de 40 transports.

Cette série entière de plus de 40 inoculations fut conduite dans la solution de
mannite (100 p. d'eau de la distribution, 2 de mannite, 0,05 de K'^HPO*). Une con-
centration de sucre plus forte que 2 a 4% ne se montra pas favorable a la fixation
d'azote: quand on emploie plus de 2% la disparition du sucre est tres lente. On peut
opérer Ie transport d'une solution de mannite dans une solution de glucose (2 p. de glu-
cose au lieu de mannite) et alors Ie rapport d'azote est tres grand. Il n'est toutefois
pas possible de faire ces transports sans interruption dans un liquide nourricier au glu-
cose, parce qu'il se développe alors rapidement des bactéries aérobies acidifiantes, pro-
ductrices d'acide lactique, ou des ferments butyriques qui empêchent toute croissance.
Les organismes aérobies acidifiant Ie glucose sont précisément les plus communes de
toutes les bactéries, notamment les Fluorescentes (liquéfiantes et non liquéfiantes) et les
espèces d'Aërobacter. Nous devons donc mettre en évidence que l'emploi de notre
liquide nourricier, avec la mannite comme source de carbone, oü non seulement !e
Chroococcum, qui est un puissant formateur d'alcali en toutes circonstances (même en
présence de glucose), mais oü les Fluorescentes aussi ne forment que de l'alcali et
oü Ie ferment butyrique ne se développe que difïicilement, ou même pas du tout, a une
importance capitale dans nos expériences. La simplicité et la netteté de nos résultats
doivent être attribuées a eet emploi.

Aussi n'avons-nous généralement pas ajouté de craie a nos liquides de culture, et
dans les cas oü nous l'avons fait, pour neutraliser l'acide probablement formé, nous
n'avons pas obtenu de résultats favorables. Nous devons même faire remarquer que,
dans toutes les expériences rapidement terminées et qui rapportèrent beaucoup d'azote,
nous n'avons pas pu déceler d'autre acide libre que de l'acide carbonique ^), et que dans
toutes celles oü se formaient des quantités notables d'acide lactique ou butyrique libres,
ce que la présence de craie n'empêchait qu'incomplètement, la fixation d'azote n'était
que médiocre.

Dans tous les cas la culture accumulatrice de Chroococcum est capable de trans-
former un peu d'acide libre en acide carbonique et en eau. Quand il s'agit d'acide buty-
rique, cette oxydation est accompagnée d'une forte coloration brune des pellicules de
Chroococcum, a laquelle on reconnait immédiatement ces cultures. Mais toujours
quand il y a production d'acide, d'une facon permanente ou passagere, Ie rapport
d'azote fixé laisse a désirer.

Par contre, Ie développement d'anhydride carbonique et d'hydrogène par Granu-
lohacter et Aërobacter, non accompagné de formation d'acide, indique une bonne assi-
milation d'azote. Bien souvent on constate alors la formation de petites quantités des
alcools propylique et butylique.

') Il est évident qu'il peut s'être formé de l'acide libre que les microbes oxydaient
ou neutralisaient au fur et a mesure qu'il était mis en liberté.

a) Les symbiontes non-sporogènes de Chroococcum
dans les cultures accumulatrices.

Au bout de 3 OU 4 jours Chroococcum remplit la masse entière du liquide de cul-
ture d'un mucus assez transparent, dans lequel on distingue au microscope un grand
nombre de batonnets tres fins de diverses bactéries, a cóté de l'espèce principale que
Ton reconnait immédiatement a sa forme plus grosse. Pour se rendre compte Ie plus
lot possible du mélange d'espèces assez varié, on n'a qu'a ensemencer d'une part sur du
bouillon de viande a gelatine avec 3% de saccharose et a cultiver a 23^ C, d'autre part
sur de l'agar pur dissous dans de l'eau de conduite contenant 2% de glucose et 0,05%
de K-mPO\

Au moyen du premier terrain de culture, sur lequel Chroococcum ne se développe
pas (ou seulement par exception, en grandes colonies semblables a des gouttes d'eau),
on obtient par ensemencement des accumulations, même après des inoculations répé-
tées, un grand nombre d'espèces de bactéries, mais dans des rapports tres variables.
De beaucoup la plus répandue est une espèce de bacterie particuliere, tres variable,
tres interessante a notre point de vue, non seulement parce qu'en symbiose avec Chroo-
coccum (Epr. 39 — 44) elle permit d'obtenir l'assimilation de quantités considérables
d'azote, mais encore parce qu'elle produisit l'assimilation d'azote dans quelques cul-
tures d'espèces de Gramilohacter (Epr. 28 et 29) oü Chroococcum. faisait défaut.

Elle donne naissance a des colonies de petite dimension, mucilagineuses, molles
OU visqueuses, blanches, ne liquéfiant pas la gelatine, et engendrant de l'alcali en toutes
circonstances. On observe d'ordinaire sur chaque colonie une pellicule irisée de car-
bonate de chaux, qui facilite Ie diagnostic sans toutefois l'assurer, parce que Ie même
éclat de nacre s'observe sur les colonies d'Aërogenes et de Coli. A la surface de vieilles
cultures sur bouillon de viande a gelatine, contenu dans des éprouvettes, il se forme
une couche irisée par suite de la mise en liberté d'alcali, notamment a cóté du trait
inoculatoire, ce qui est aussi Ie cas chez plusieurs autres bactéries, e. a. du groupe des
Fluorescentes, mais cela ne s'observe pas chez Aërogenes et Coli dont l'irisation se
produit sur les colonies même. L'éclat nacré des colonies peut toutefois faire défaut et
alors Ie diagnostic est plus difficile. En outre la forme et la dimension des colonies est
irès variable, et cette diversité est un caractère hereditaire. Après transport dans un
bouillon a 0,02% de nitrite ou 0,1% de nitrate de potassium, on observe une dénitrifi-
cation, c. a d. formation d'écume par la mise en liberté d'azote. Cette propriété serait
tres précieuse pour Ie diagnostic, si elle ne se perdait pas par culture. Dans nos cul-
tures cette propriété ne se perdait toutefois pas, du moins quand nous inoculions dans
du bouillon de viande a gelatine, mais elle se perdait au contraire par transport dans
la solution de mannite pauvre en azote ; ce n'est que quand nous avions pris con-
naissance de ce fait que nous avons reconnu combien était commune cette espèce, que
nous avions prise d'abord pour un mélange de plusieurs espèces. Sur un terrain d'agar
au glucose avec phosphate de potassium les colonies deviennent assez grandes, surtout
en présence dt.Chroococcum, et alors il est difficile de les distinguer 6! Aërogenes, parce
que tous deux recouvrent d'une couche aqueuse, assez transparente, les colonies de
Chroococcum avec lesquelles ces microbes sont venus en contact.

Aussi bien les cultures dans un liquide que les colonies sur milieu solide sont con-
stituées par de fins batonnets, mobiles ou immobiles. Surtout les batonnets mobiles peu-

145

vent devenir excessivement petits et rappellent alors vivement les exemplaires mubiles
de B. radicicola. Les immobiles sont d'ordinaire plus grands, souvent un peu courbes et
assez souvent groupés en masses étoilées, tout a fait semblables aux »étoiles« que j'aidé-
crites antérieurement pour la dernière espèce. Tout comme chez B. radicicola il semble
que ces agrégats étoilés prennent naissance par un mode de ramification et de segmen-
tation particulier. lis sont souvent, mais pas toujours, entourés de mucus. D'ailleurs
on ne les observe pas toujours et cette variabilité aussi augmente les difficultés du
diagnostic de cette espèce. Mais, quoique ce groupement rayonné ne soit pas un phéno-
niène constant, nous Ie considérons cependant comme important au doublé point de
vue morphologique et systématique; c'est pourquoi nous avons choisi pour notre espèce
Ie nom de B. radiobacter.

Si l'on transporte une culture pure dans notre solution de mannite pauvre en azute,
on peut observer une croissance notable qui peut donner l'impression d'une accuniula-
tion d'azote. On ne constate toutefois une telle fixation d'azote que quand on a intro-
duit en même temps Ie Chroococcum dans Ie liquide nourricier. Ouand il se forme un
mucus visqueux dans une pareille culture mixte, la croissance de Chroococcum reste
en arrière et l'on n'observe qu'une faible assimilation d'azote. Par contre, si Ie mé-
lange de bactéries reste mou et délié et se compose en majeure partie de Chroococcum,
il est certain qu'il se fixe une grande quantité d'azote. Les cultures des expériences
43 et 44 sont p. ex. restées dans eet état et elles ont fixé en un mois 70 mgr. d'azote par
litre de liquide de culture, et 4 mgr. par gr. de mannite transformc.

En dehors de la dénitrification dans un bouillon de viande avec 0,1% de KNO-^,
nous n'avons pas observé de fermentation chez Radiobacter, mais nous avons constate
une microacrophilie plus prononcée chez les cultures en solution sucrée que chez celles
sans sucre. Ce sucre ne se transforme jamais en acide; au contraire, Radiobacter rend
Ie liquide de culture toujours quelque peu alcalin. Des sels d'acides organiques sont
énergiquement oxydés en anhydride carbonique et eau. Même les acétates ont été
reconnus comme nutritifs. Nous avons également opéré avec succes avec des malates,
des citrates, des propionates et des butyrates. L'optimum de croissance est situé entre
25 et 27" C, mais la température ordinaire est tres favorable pour la fixation
d'azote.

En examinant les accumulations transportées sur des plaques d'agar au glucose,
on observe souvent des colonies minces, plates et transparentes qui sortent des grandes
colonies de Chroococcum, dont elles s'éloignent en partie jusqu'a d'assez grandes dis-
tances. Leur transparence peut être telle qu'on ne les reconnait que par un examen
minutieux a la loupe, en lumière directe ou réfléchie. Elles peuvent aussi avoir, une
plus grande force végétative et former alors des plaques assez troubles, appliquées
contre l'agar.

Au microscope on y trouve de petits batonnets, courts et minces, dont quelques-uns
seulement sont mobiles. Dans tous leurs caractères principaux, comme au point de vue
de la formation d'enzyme et de la nutrition, leur analogie avec Radiobacter est grande,
mais nous ne sommes pas parvenus a dcmontrer avec certitude qu'en présence de
Chroococcum ils fixent de l'azote ; nous n'avons pas davantage observé de dénitrifica-
tion. Nous les tenons néanmoins pour une forme dégénérée du Radiobacter même.

En transportant les cultures accumulatrices de Chroococcum sur du bouillon de

M. W. Beijerinck. Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 10

146

viande a gelatine avec saccharose, on reconnait avec un peu d'habitude, parmi ies colo-
nies de Radiohacter, qa et la, parfois méme partout, deux formes d'Aërobacter aëro-
genes^) ainsi que Aërobacter coli. Chez ces espèces aussi on remarque Tirisation ca-
ractéristique pour les colonies de Radiohacter, mais celles d'Aërogenes et de Coli sont
ordinairement beaucoup plus grandes que celles de Radiohacter. Sur de la gelatine au
malt elles croissent aussi facilement et même avec plus de vigueur que Radiohacter ;
elles produisent alors souvent des bulles de gaz. Comme nous avons réussi a obtenir,
dans les cultures mixtes de Chroococcum, a l'aide d'Aërogenes une faible assimilation
d'azote libre^), nous communiquerons encore sur cette forme les détails suivants:

La variété nommée Aërogenes i dans les expériences répond aux descriptions
ordinaireset engendre aux dépens du saccharose, outre de l'acide carbonique et de l'hy-
drogène, encore de l'acide lactique. Dans les accumulations de Chroococcum avec du
glucose (liquide nourricier 2) oü cette forme est présente, il se forme tant d'acide que
la croissance de Chroococcum en est complètement arrêtée ; on ne peut donc faire
d'expériences avec cette espèce que dans une solution de mannite. La forme décrite
comme Aërogenes 2 engendre dans du bouillon a saccharose, également de l'acide car-
bonique et de l'hydrogène, mais au lieu d'acide lactique une certaine quantité d'alcali.
Dans les cultures accumulatrices cette propriété se conserve par transport, mais Ie
pouvoir de fermentation et celui de former un alcali se perdent déja après deux ou
trois inoculations d'une culture pure dans du malt, en même temps que Ie pouvoir aci-
difiant prend naissance. Voila donc un exemple typique d'accomodation a des condi-
tions nutritives spécifiques. Je dois encore faire remarquer ici que toute séparation
ó.' Aërogenes ne fournit pas nécessairement une forme avec laquelle il est possible d'ob-
tenir, en compagnie de Chroococcum, une assimilation d'azote, et que même avec les
formes en question les expériences n'ont pas réussi sans exception, ce qui nous a con-
duit a examiner maintes fois et avec beaucoup de soin les cultures 011 l'assimilation se
produisait, sans que nous ayons pu y découvrir des bactéries étrangères.

. Il n'y avait pas lieu d'examiner encore d'autres bactéries présentes dans les
accumulations, non que les formes déja mentionnées constituassent toute la richesse
de cette flore, mais parce que nous croyions pouvoir conclure de l'apparition irreguliere
de plusieurs d'entr'elles qu'elles ne pouvaient avoir qu'une importance fortuite. C'est
ce que l'on peut certainement prétendre au sujet des Fluorescentes, dont FL non Jique-
faciens disparait complètement après de nombreux transports, tandis que Fl. liqur-
faciens ne disparait pas totalement, il est vrai, mais diminue souvent notablement après
quelques inoculations, pour redevenir tout a coup beaucoup plus important. Il n'est
toutefois pas impossible que la difficulté de reconnaitre les espèces de bactéries en
général ait fait que nous n'ayons pas trouvé l'une ou l'autre forme, importante cepen-
dant, mais qui n'existait pas par hasard dans notre série principale de plus de quarante
inoculations, spécialement examinée. Je dois néanmoins faire observer que plusieurs
autres séries plus petites ont été également examinées bactériologiquement d'une ma-
niere assez précise et que nous y avons toujours recnnnu Ie Radiohacter et Aërnhactcr
a cóté de Chroococcum.

*) Bacillus lactis aërogenes.

-) Ainsi que nous l'avons déja dit il n'a pas été possible de découvrir dans ces
cultures mixtes, ni au microscope ni par culture, la moindrc tracé d'infection étrangère.

147

b) Les formes aérobies et sporogènes de Granulobacter comme compagnons
de Chroococcum dans les cultures acctimulatrices.

Les symbiontes de Chroococcum dont il vient d'être question n'engendrent pas de
spores et ne se rencontrent donc pas dans les accumulations pasteurisées. Maïs, aussi
bien dans les accumulations ordinaires que dans celles que l'on obtient dans les liquides
nourriciers infectés au moyen de terre pasteurisée et de Chroococcum, on renfontre
encore teute une série de bactéries sporogènes dont, pour autant qu'elles se conservent
dans les transports successifs, grace a l'assimilation d'azote, plusieurs appartiennent
au genre Granulobacter. Elles sont pour la plupart »aérobies«, mais appartiennent
aussi en partie aux ferments butyliques et butyriques »anaérobies«, que nous traiterons
spécialement dans Ie paragraphe suivant. Les mots »aérobie«Get »anaérobie« sont
employés ici dans Ie sens ordinaire, mais on doit remarquer que toutes les espèces
de Granulobacter sont plus ou moins »microaérophiles« ^) les ferments butyliques et
butyriques même au point qu'en plein air ils ne croissent pas du tout et les autres
fort peu. Quoique l'on puisse donc isoler et cultiver les dernières a l'air libre, ces
espèces n'en supportent pas a la longue la pression complete et finissent par perdre
plusieurs de leurs propriétés primitives. Pour les formes mobiles on peut démontrer la
microaérophilie d'une faqon particulièrement frappante: en préparation microscopique
sous couvre-objet on les voit notamment se réunir, a la maniere des spirilles, suivant
une »ligne de respiration«, a quelque distance du ménisque, oü la pression de l'oxygène
est relativement faible.

D'ordinaire il est aisé de reconnaitre ces espèces aussi dans les accumulations
obtenues par infection avec de la terre fraiche, mais dans les transports successifs
cela devient de plus en plus difficile; au bout de plusieurs inoculations Ie Radiobacter,
et les autres compagnons non sporogènes de Chroococcum, refoulent Ie Granulobacter
d'une faqon si complete, qu'il n'est plus possible de Ie découvrir sous Ie microscope et
que même les methodes par culture restent sans résultat.

Leur isolation réussit par contre aisément quand on part de la methode, citée
en seconde ligne, c. a d. de la culture »par accumulation partielle«, qui résulte de
l'infection d'une solution nourricière a mannite au moyen de terre pasteurisée et de
Chroococcum. La pasteurisation s'obtient en suspendant la terre pendant 5 minutes
dans de l'eau chauffée a 85" C. Dès que les cultures a 28" C. commencent a montrer
une pellicule de Chrococcum bien développée, ce qui prouve que la fixation d'azote est
en train, on s'en sert pour tracer des traits inoculatoires sur des plaques d'agar au
glucose et phosphate^), donc sur Ie même terrain que celui sur lequel nous avons
isolé Ie Chroococcum lui-même; ces plaques sont ensuite exposées également a une
température de 28" C. Nous avons isolé de cette maniere 5 formes appartenant au

') Ainsi que je l'ai montré antérieurement (ces Archives, (2), 2, 397, 1899), il n'existe
pas d'organismes anaérobies, dans Ie sens strict du mot; mais les organisms appelés
anaérobies ont besoin d'oxygène libre.

^) De pareilles plaques, obtenues au moyen de 2 gr, d'agar, 2 gr. de glucose et
0,05 gr. de K^HPO* dans 100 cm', d'eau de conduite, sont tres humides après solidifi-
cation dans la boïte de verre; on doit donc les chauffer avec précaution et lentement
d l'état solide jusqu'a ce que leur surfaces soit entièrement »sèche«. Les quelques gouttes
d'eau qui s'évaporent se condensent sur Ie couvercle, que l'on essuie après.

148

genre Granulobacter i), dont chacune fixe de l'azote par symbiose avec Chroococcum.
Elles sont assez proches parents les unes des autres et peuvent probablement être
réduites a une ou deux espèces.

Nous avons notamment constaté que les formes isolées des accumulations perdent
plus ou moins complètement leur caractère primitif par transport répété dans les
cultures pures; il en résulte une convergence des diverses formes vers une forme
limite, qui n'est toutefois atteinte par aucune d'elles.

On doit chercher la raison de cette transformation dans Ie fait que ces organismes
ne supportent pas, a la longue, la pression de l'oxygène atmosphèrique ; tout ce qui
diminue cette pression retarde aussi la vitesse de transformation. On y arrive p. ex.
en introduisant, dès Ie commencement, dans les cultures pures de Granulobacter des
espèces fortement aérophiles, p. ex. Chroococcum + Radiohacter. Mais même eet
artifice ne preserve pas complètement contre une modification des propriétés originel-
les, et l'on trouve a la longue, en toutes circonstances, dans les cultures pures des
variétés difïérentes de celles que l'on y avait introduites.

D'après les rapports de parenté les cinq formes aérobies, dont nous avons fait
usage dans nos expériences, peuvent être classées comme suit:

Granulobacter polymyxa,

„ „ var. tenax,

„ „ var. mucosum,

„ sphaericum,

„ reptans.

Gr. polymyxa. Cette espèce, tres répandue dans Ie sol, a déja été décrite antéri-
eurement par l'un de nous dans un travail sur la fermentation butylique -); nous
l'avons retrouvée depuis tres souvent dans Ie terreau de jardin. Le B. solauiperda
Kramer^) est probablement identique avec elle, ou du moins c'est une variété
tres voisine. Le Polymyxa produit dans l'extrait de malt une fermentation active et de
longue durée; il se forme alors une culture mucilagineuse, qui se recouvre d'une
couche de mousse filante et persistante et qui se dilate fortement par le gaz provenant
de la fermentation et consistant presque exclusivement en acide carbonique. L'écume
est constituée par des batonnets mobiles et par des clostridies minces, sporifères, ne
contenant que peu de granulose. Sur de la gelatine au malt il commence par se former
des colonies transparentes, minces, qui plus tard liquéfient cnergiquement et sont alors
fort semblables a celles de B. mesentericus vulgatus.

Cette espèce, je l'ai cultivée depuis plusieurs années comme une espèce aérobie
ordinaire, et c'est avec une pareille culture d'ancienne date que j'ai observé, en sym-
biose avec Chroococcum, régulièrement une fixation notable d'azote (Epr. 45), tandis
qu'une culture pure oü le Chroococcum fait défaut ne se développe qu'exceptionelle-
ment (voir § 5) dans la solution nutritive pauvre en azote. Les nitrates sont énergi-
quement réduits en nitrites et sels d'ammonium, mais non en azote. En présence de
sucre les premières substances constituent la meilleure source d'azote, mais les nitrites

') Pour la description de genre je renvoie a mon travail: Sur la fermentation et
les ferments butyltques. (Ces Archives, (i), 29, 10, 1896.)

') Fermentation et ferments butyliques (1. c. avec planche).
^) Migula, System der Bakterien, Bd. H, 1900, p. 573.

149

et les sels ammoniacaux aussi peuvent remplir ce cóle. Notre microbe supporte toutes
ces combinaisons azotées dans des concentrations beaucoup plus élevées que Chroococ-
cuntj ce qui fait que quand on a un mélange des espèces dans une solution nourricière
privée d'azote, la dernière disparait par l'addition même de petites quantités (p. ex.
o,i %) de ces combinaisons en faisant place au Polymyxa.

Les deux variétés de Polymyxa, qualifiées de Tenax et Mucosuin, unt été
isolées du sable de bruyère aride, oü elles sont tres répandues ^). Le nom de Tenax
a été donné a cette variété parce qu'elle s'attache fortement a l'agar, d'oü elle ne se
laisse détacher que difficilement au moven d'un fil de platine. Miicosum, par contre,
recouvre d'une couche mucilagineuse épaisse et peu adhérente la plaque d'agar au
glucose et ressemble beaucoup a Chroococcum, sauf que les colonies de ce dernier sont
troubles comme de l'empois, tandis que celles de Miicosum sont plutót transparentes.
Au microscope on observe chez Tenax et chez Mucosum des batonnets et de minces
clostridies avec spores allongées (Epr. 47 et 48).

Granulobacter sphaericuni. Cette bacterie interessante a déja été décrite briève-
ment dans une communication précédente sur des 'oligonitrophiles ^). Depuis nous
Tavons soumise a diverses expériences et nous l'avons isolée a nouveau maintes fois.

Les petites clostridies, presque sphériques ou piriformes, avec spores allongées,
se laissent isoler ordinairement des accumulations infectées par du terreau ou par du
sable des dunes, de préférence après chauffage de ces matériaux jusqu'a 85" C. Par
transport les clostridies s'amincissent et s'allongent, tandis que, par une culture pro-
longée a l'air libre, plusieurs souches perdent leur force végétative. Dans d'autres cas
la forme est beaucoup plus stable et se rapproche alors davantage de l'espèce précé-
dente ; chez cette forme moins variable les spores et les clostridies sont d'ailleurs plus
grandes. La transformation des cultures est surtout lente quand on cultive sur de
l'agar au glucose pauvre en azote; en symbiose avec Chroococcum + Radiohacter on
observe alors une croissance exuberante et une forte formation de mucus chez les
trois espèces. Nous n'avons jamais observe de croissance sur de la gelatine au malt.
Les colonies sur de l'agar au glucose ont une tendance a se développer latéralement
et a se ramifier; elles rappellent ainsi Bacillus subtilis.

La variabilité de Gr. sphaericum est intimement liée a sa microaérophilie, qui est
assez prononcée. La forme n'est pas absolument anaérobie, ainsi qu'il résulte déja
de sa simple isolation a l'air libre; cependant les cultures exposées en plein air perdent
rapidement leurs propriétés, surtout le pouvoir de fermentation et la tendance a former
des clostridies. De même l'intensité avec laquelle se fixe l'azote libre en présence de
Chroococcum diminue sous l'influence d'une aération prolongée; le pouvoir ne se
perd toutefois pas complètement et, quand on ne regarde pas au temps, le rendement
final, obtenu avec des cultures vieillies et peu actives, n'est même pas beaucoup plus
petit qu'avec des cultures fraiches.

') Plusieurs échantillons de sable de bruyère, recueillis a Wagcningen et pris a
diverses profondeurs, m'ont été fournis par mon ami M. le Dr. O. Pitsch. Je n'ai pu
déceler A. chroococcum dans aucun d'eux. Pourtant, au moyen des formes de Granu-
lobacter que j'en ai isolées, je n'ai pu observer de fixation d'azote que quand le liquide
de culture contenait en outre A. chroococcum, d'autre provenance, et j'ai vainement
taché d'isoler du sable d'autres espèces qui fixassent l'azote de l'air en symbiose avec
Granulobacter.

^) Ces Archives, (2), 8, 204, 1903,

150

Des colonies fraichement isolées, cultivées en méme temps que Chroococcum
dans Ie liquide nourricier a glucose et sans azotfe, croissent avec beaucoup de rapidité
en assimilant l'azote libre et donnent naissance a un mélange d'alcool propylique
et d'un peu d'alcool butylique, ainsi qu'a un arome spécifique particulièrement agréable.
Il se forme en même temps de petites quantités d'hydrogène et d'anhydride carbon i-
que. L'aspect microscopique de ces cultures est surprenant a cause de la riche crois-
sance des deux espèces, mais, dans des conditions encore inconnues, Ie développement
de Chroococcum s'arrête et eet organisme peut alors méme être refoulé complètement
par Gr. sphaericum. De pareilles cultures peuvent néanmoins fixer beaucoup d'azote,
d'oii l'on doit conclure que Gr. sphaericum doit de lui-même, sans Chroococcum, être
en état de fixer l'azote libre et d'employer même pour sa croissance la combinaison
azotée a laquelle il a lui-même donné naissance. Pourquoi la présence de Chroococcum
est pourtant si avantageuse, voila ce qui est encore incomplètement expliqué. Il est
certain que cette influence ne consiste pas seulement en un enlèvement d'oxygène, car,
si telle était la seule cause, bien d'autres bactéries devraient être en état de remplir
Ie même róle que Chroococcum, ce qui n'est pas du tout Ie cas. C'est ainsi que nous
avons essayé les cultures combinées suivantes, aussi bien dans des solutions de mannite
que dans des solutions de glucose, et toutes avec un résultat négatif: Sphaericum +
Mesent. vulgatus, Sphaericum + Subtilis, Sphaericum + Aërogenes i, Sphaeri-
cum + Fluorescens non Uquefaciens, Sphaericum + Aërogenes 2, Sphaericum + Ra-
dicicola (de trèfle blanc), Sphaericum + Radiobacter. En aucun cas nous n'avons
observé une croissance quelque peu importante, bien que nous eussions conduit les
cultures pendant des mois. Nous avons souvent essayé aussi d'activer la croissance
de pareilles cultures combinées, ou même de cultures pures de Sphaericum, en limi-
tant l'accès de l'air, Ie tout en vain. Seule l'addition de Chroococcum était capable
de produire une croissance et une fixation d'azote, surtout avec Gr. sphaericum.

Sphaericum est une bacterie tres répandue que l'on trouve aussi dans l'eau de
la distribution, au point que, quand nos solutions ordinaires de mannite ou de glucose
étaient simplement portées a l'ébullition sans être stérilisées, des semences de Chroo-
coccum s'y développaient parfois fortement; mais on constatait alors toujours une
infection avec l'une ou l'autre espèce de Granulobacter.

Gramdobacter reptans. C'est une forme intermediaire entre l'espèce précédente
et Gr. polymyxa; on l'obtient en culture pure de la même faqon que Gr. sphaericum,
notamment dans notre solution nutritive ordinaire, pauvre en azote, par infection
avec du terreau pasteurisé + Chroococcum. Dés que la forte croissance a commencé,
on s'en sert pour tracer des traits inoculatoires sur de l'agar au glucose; il se forme
alors, comme dans Ie cas precedent, des colonies fortement ramifices, en couche mince
et s'étendant bien loin. On peut toutefois obtenir aussi les colonies caractéristiques
de Reptans en transportant les cultures, obtenues par infection au moyen de terre
pasteurisée + Chroococcum, sur des plaques de gelatine au malt, oü Sphaericum ne
se développe pas et 011 les colonies de Reptans sont tres faciles a reconnaitre. Elles y
forment notamment de masses en plaques minces, étendues, assez consistantes, con-
stituées par des batonnets et des clostridies allongées et sporifères. Par l'iode elles se
colorent en bleu intense ou violet foncé. Dans une solution de malt Reptans produit
une forte fermentation, tout comme Polymyxa. Les batonnets qui se forment pendant
cette fermentation se groupent sous Ie couvre-objet dans des figures de respiration

151

comme des spirilles, toutefois a uae distance beaucoup plus grande du mciiisque, ce
qui prouve leur forte microaérophilie. Des cultures longtemps poursuivies dans du
rnalt liquide liquéfient énergiquement la gelatine au malt oü on les transporte, tandis
que des colonies fraichement isolées y croissent pendant des semaines sans provoquer
de liquéfaction.

Bien qu'il soit certain qu'il se tixe beaucoup d'azote dans les accumulations bien
aérées, par symbiose de Chroococcum avec les espèces aerobics de Granulobacter, nous
sommes néanmoins convaincus que ces espèces sont d'autant plus actives que leur
microaérophilie est plus prononcée, ce que Ton peut reconnaitre a l'éloignement de
leur »ligne de respiration« du ménisque dans les préparations microscopiques. Nous
avons reconnu dans tous les cas que des colonies fraichement isolées, fort microaéro-
philes, de Sphaericum et de Reptans fixent, dans un temps déterminé, plus d'azote que
les mêmes colonies devenues plus aérophiles par une longue culture a l'air libre. Leur
activité spécifique ne se perd toutefois pas complètement, même après une culture
aérobie de deux années.

c) Les ferments aiiaérobies bufyriques et butyliques des
cultures accumul atrices.

Bien que Ie but principal de ce travail soit de prouver la fixation d'azote dans les
cultures aerobics, la clarté cxigc que nous communiquions quclques résultats obtenus
avec les espèces vraiment anaérobies de Granulobacter, c. a d. avec les formes de ce
genre ne croissant pas a l'air libre, mais cependant microaérophiles, comme les précé-
dentes. Les espèces dont il s'agit ici ont été décrites antérieurement comme Gr.
butylicum et Gr. saccharobutyricum ^). Les cultures qui ont servi a ces descriptions
étaient obtenues dans des expériences a l'aide de malt de farine, et ne sont pas,
a la vérité, complètement identiques avec les ferments butyriques et butyliques trouvés
dans nos accumulations actuelles. C'est ainsi qu'un malt de farine n'entre pas im-
médiatement en fermentation butylique, sous l'influence d'une culture de Chroococ-
cum + ferment butyrique dans notre liquide nourricier au glucose ; il faut pour cela
une certaine accomodation -'), et il en est de même du ferment butylique. Au reste, les
formes que l'on obtient dans ces conditions de culture si différentes sont tellement
identiques qu'on ne doit pas songer a baser sur la difïérence d'accomodation la déter-
mination de nouvelles espèces ou même de variétés. Aussi sommes-nous pleinement
convaincus que ce sont les mêmes spores qui, dans l'infection au moyen de terreau de
mout de farine ou de notre liquide au glucose pour accumulation d'azote, produisent
Ia fermentation butyrique ou bien, quand elles appartiennent a Gr. butylicum, la fer-
mentation propyl-butylique,et que ce n'est que dans ces conditions nutritives spécifiques
que prend naissance l'accommodation dont nous venons de parier et qui fait donc
encore défaut chez les spores présentes dans ie terreau.

Au sujet de la fixation de l'azote libre par Ie ferment butyrique, nous sommes
arrivés en principe au même résultat que M. W i n o g r a d s k y ^), qui a donné

') Fermentation et ferments butyliques (ces Archives, (i), 29, 7, 1896).
-) Un examen de la question difficile et tres importante de Taccomodation chez
les bactéries ne serait pas a sa place ici. Je m'en occuperai a une autrc occasion.
") Assimilation de l'azote libre, loc. cit.

Ï52

a l'agent de cette fermentation Ie nom de Clostridium Pasteurianum; il existe cepen-
dant une différence entre son expérience et la nótre au sujet des bactéries concomi-
tantes, qui rendent possible la fixation d'azote dans les fermentations butyriques.
D'après lui il s'agirait uniquement d'un enlèvement d'oxygène, qui pourrait fort bien
se produire par les espèces aérobies sporulentes, lesquelles restent vivantes, comme Ie
ferment butyrique lui même, dans la terre pasteurisée. Quant a nous, nous n'avons
jamais obtenu de culture satisfaisante aussi longtemps que nous suivions Ie précepte
de M. W i n o g r a d s k y , de pasteuriser la terre servant a l'infection. Il est vrai
que bien souvent il se produisait ainsi dans nos liquides nourriciers une vraie fer-
mentation butyrique, mais cette fermentation s'arrêtait toujours bientót, comme toute
croissance d'ailleurs.

Il ne se changeait rien a ce résultat quand nous nous servions peur les transports
de liquides contenant, au lieu de glucose, du saccharose ou de la manite, avec ou
sans craie ; pas davantage en ajoutant pendant l'infection telle ou telle autre bacterie
ordinaire, non sporulente, comme les Aérobacter, Radicicola, Fluorescens liquefaciens
ou Fluorescens non liquefaciens. Ce n'est que par la présence de Chroococcum que les
circonstances étaient complètement modifiées: la fermentation butyrique s'accomplis-
sait alors régulièrement jusqu'a ce que tout Ie sucre avait disparu et l'on obtenait un
rendement d'azote semblable a celui que M. W i n o g r a d s k y avait atteint, c. a d.
3 mgr. d'azote fixé par gr. de sucre ou même plus. Dans beaucoup de ces cas l'examen
par culture Ie plus minutieux ne permettait plus de découvrir, après quelques trans-
ports, aucune autre bacterie aérobie que Chrnococcum et aucune autre anacrobie que
Ie ferment butyrique.

De pareilles cultures, productives au point de vue de la formation d'acide butyri-
que et de fixation d'azote, se caractérisaient toujours par Ie fait, que la pellicule
superficielle de Chroococcum finissait par se colorer en brun foncé passant au noir,
en même temps que l'acide butyrique et Ie butyrate de calcium qui se formait au
commencement disparaissaient complètement avec formation de carbonate de calcium,
oxydation produite par Chroococcum. Ce processus d'oxydation, pour lequel Chroo-
coccum est la seule bacterie appropriée que nous ayons trouvée, et l'absorption
d'oxygène, nécessaire a l'anaérobiose du ferment butyrique, sont a notre point de
vue les principales circonstances, mais non les seules, qui rendent la première bacterie
si utile pour la fixation d'azote par Ie ferment butyrique.

Dans nos expériences d'infection au moyen de terreau pasteurisé, il est souvent
arrivc qu'il ne se produisait pas de fermentation butyrique, mais une fermentation
propyl-butylique *), aussi bien dans une solution de glucose que dans une solution de
mannite. Dans de pareils cas les bactéries concomitantes aérobies et sporulentes
pouvaient donner un gain d'azote, même en l'absence de Chroococcum, tout comme
s'il se formait de l'acide butyrique. Mais, même dans ces circonstances, la présence
de Chroococcum était si décidément avantageuse que ce n'était pas la peine d'étudier
plus loin les phénomènes qui se produisaient quand Ie Chroococcum faisait défaut.
Enfin, plusieurs infectioits au moyen de terreau, qui n'était même pas pasteurisé, ont

') Autrefois nous étions d'opinion que cette fermentation produisait essentiellement
de 1'alcool butylique, et voila pourquoi eet agent avait {loc. cit.) re(;u ie nom de Gr.
butylicHin. Plus tard nous avons reconnu que la masse contenait surtout de Talcool
propyliquc.

153

fourni des cultures uü manquaient il est vrai les caractères extérieurs de la fermen-
tation butyrique et propyl-butylique, mais oü nous trouvions au microscope uu petit
nombre de bacilles et de clostridies que nous devions considérer comme agents de
cette fermentalion, et prccisément dans ces expériences oii nous observions en même
temps une croissance particulièrement vive de Chroococcum et Radiobacter nous ob-
tenions uu rendement d'azote tres élevé (Epr. 15 et 17).

S'il s'est produit une forte fermentation butyrique dans ce genre d'expériences,
une gouttelette de la culture, introduite dans la chambre de verre ^) pour Tobservation
de la ligne de respiration, donne un résultat tres convaincant, d'une part par la forma-
tion d'une ligne d'accumulation, particulièrement nette, des batonnets microaérophiles
tres mobiles, a une distance considérable du ménisque, d'autre part par la croissance
tres forte de Chroococcum dans Ie ménisque même, aux dépens de la combinaison
d'azote formée par Ie ferment butyrique. Quand on a affaire a une culture du ferment
butylique anaérobie, l'expérience ne réussit pas du tout avec la même élégance.

Comme les ferments butyriques et butyliques observés dans nos expériences pré-
sentaient des ditïérences considérables, il n'est pas impossible que les variétés ren-
contrées ici se comportent autrement que celles rencontrées ailleurs.

Avant de terminer ces considérations, nous désirons encore faire remarqer que,
dans les accumulations oü du terreau frais avait servi a l'infection, de sorte que
toutes les bactéries capables de se développer avaient pu se multiplier dans nos liqui-
des nourriciers, nous avons observé Ie phénomène suivant. Dans la culture aérobie
i! arrive souvent que toute la masse, abandonnée a elle-même sans être remuée et
maintenue au-dessous de 28" C, finit par se »gélatiniser« complètement par suite d'une
formation abondante de mucus sous l'influence de Chroococcum-^, Ce mucus a deux
propriétés remarquables. Mélange avec Ie réactif de N e s s 1 e r , il commence par Ie
jaunir; ensuite la coloration change en noir par la séparation de mercure métallique.
ce qui prouve une action réductrice. En second lieu il est capable d'entrer en fermen-

*) Notre chambre de verre se distingue de celle décrite précédemment en ce que
la préparation est appliquée contre la face inférieure du porte-objet, qui doit donc être
aussi mince que Ie couvre objet lui-même; Ie couvre-objet ne tombe pas en vertn de
la capillarité. L'installation est la suivante: une petite cuvette rectangulaire, de 6 cm.
sur 4, et de i cm. de profondeur, peut être complètemenf fermée au moyen d'une pla-
que de verre de l'épaisseur d'un couvre-objet. La gouttelette destinée a la culture ou
a l'observation microscopique adhère a la face inférieure de cette plaque et est recou-
verte par un grand couvre-objet ordinaire, de telle maniere toutefois qu'il reste, par
l'intermédiaire d'un fil de platine, un espace en forme de coin entre Ie mince porte-
objet et Ie couvre-objet qui y adhère (ainsi que je l'ai représenté dans Centralbl. f.
Bact. Bd. IV, 1893, p. 827). Dans eet espace les microbes s'accumulent, soit par dépla-
cement, soit par multiplication, a l'endroit oü la tension de l'oxygène est la plus con-
venable pour l'espèce considérée. La cuvette contient un peu d'eau afin d'eviter l'éva-
poration de la gouttelette d'épreuve, et la chambre toute entière est a son tour placée
dans une autre cuvette, contenant également de l'eau. Une pareille culture peut, sans
se dessécher, être observée durant des semaines et des mois. On peut se procurer
l'appareil complet chez M. J. W. Giltay, fabricant d'instruments scientifiques a Delft.

-) Ce mucus se compose (aini que je l'ai fait voir dans ces Archives, (2), 7, 209,
1902) des membranes cellulaires, fortement épaissies, de cette espèce. Un mucus, en
apparence tout a fait semblable, peut être formé dans nos solutions nutritives par B.
radicicola et Radiobacter, mais les propriétés chimiques en sont autres.

154

tation butyrique et alors la masse gélatinisée se liquéfie complètement avec forniation
de gaz. Comme la cellulose ne subit pas la fermentation butyrique, mais bien la
pectine de la membrane cellulaire, nous sommes tentés de conclure que Ie mucus ae
Chroococcum est formé par cette dernière substance. Il est aisé de démontrer que
dans la liquéfaction, sous l'action du ferment butyrique, de la couche de pectine de
la paroi cellulaire ordinaire chez les plantes supérieures agit un enzyme spécifique,
secrété par ce ferment, la pectinase. Il n'est pas impossible que ce soit Ie même en-
zyme qui agisse dans notre cas sur Ie mucus de Chroococcum et en provoque !a
liquéfaction.

2. Gain d'azote dans les accumulations grossières
de Chroococcum.

Pour Ie dosage de l'azote nous nous sommes servis de la methode de K j e 1 d a h 1,
avec la modification qu'y a apportée M. J o d 1 b a u e r '), en vue des traces de nitrates
introduites dans mainte expérience par l'infection au moyen de terreau.

Afin d'obtenir une masse bien appropriée a la combustion dans l'acide sulfurique,
nous avons précipité la culture de bactéries a l'aide de quelques gouttes d'acétate
basique de plomb et nous avons filtré; nous avons ensuite sêché et brülé Ie précipité
avec Ie filtre et nous avons jeté Ie filtrat.

Nous avons cependant reconnu que nous perdions de cette faqon une petite
quantité de l'azote fixé, de sorte que nos résultats sont tous un peu plus faibles que
les gains réels; la différence est toutefois peu considérable, et nous gagnions beaucoup
de temps en évitant l'évaporation dans Ie vide.

La donnée indiquée par »Blanco« dans Ie tableau suivant indique la correction
qu'il fallait apporter par suite de la teneur en azote des réactifs employés dans
l'analyse: de l'acide phénolsulfurique, de la poussière de zinc, du mercure, de la soude
caustique et de l'acide sulfurique. Il y avait aussi une correction due a la teneur
en azote des fitres, de la terre et de l'eau, éléments qui tous ont été analyses plus
d'une fois. En multipliant par 1,4 les dixièmes de centimètres cubes d'acide sulfu-
rique normal, on trouve Ie poids correspondant d'azote en milligrammes. Dans la
terre dont nous nous sommes servis, stérilisée et privée d'air, il y avait ainsi 4X1,4
= 5,6 mgr. A^ par gramme, notre eau de conduite 0,42 mgr. A^ par litre, notre man-
nite, 2,8 mgr. par gramme, tandis que notre saccharose et notre glucose étaient
exempts d'azote.

O Nederlandsche Staatscourant, 1899, n". 277. On brüle Ie filtre sec avec 15 cm l

d'acide phénolsulfurique {100 p. de phénol-|-900 SO*H^ de 1,8). Au bout de quelque

temps on ajoute encore 2 gr. de poussière de zinc, 2 cm^ d'acide sulfurique concentré

et une goutte de Hg d'environ 1 gr. On abandonne pendant quelque temps avant de

passer a la combustion, afin d'éviter une formation de mousse. La combustion au bain

de sable dure de 4 a 5 heures. — On lave la masse dans un ballon d'un litre de capa-

cité, on y ajoute 125 p. de soude caustique (500 gr. A'^ai/O + 10 gr. A''a*5" par litre) et

en outre 25 cm', de Na^S (250 gr. de Na^S par litre); on distille enfin avec 2 morceaux

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de zinc et on récoltc Ie destillat dans — SO*H'-.

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Difïérence
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Après la
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0,3
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Nous allons maintenant donner d'abord, sous forme de tableau, un aper(^u des ren-
dements d'azote fournis par les accumulations grossières, cultivées au moins pendant
24 heures a 28" C. et puis a 23 — 25" C.

Afin d'examiner si, a la fin de l'expérience, il restait encore du glucose ou de la
mannite, nous avons opéré comme suit:

Glucose. Dans un mince tube a réaction on verse un peu de bleu de mcthylène et
de potasse caustique et on fait bouillir, puis on introduit au fond du liquide bouillant,
au moyen d'un tube de verre, quelques gouttes de la solution a examiner; s'il reste
encore du glucose, Ie bleu de méthylène se décolore immédiatement par réduction.

Mannite. On laisse s'évaporer sur un porte-objet une goutte du liquide a exa-
miner. S'il contient encore de la mannite, on voit se former au bord de la goutte un
anneau blanc caractéristique d'aiguilles cristallines.

La présence d' acide lactique était décelée par la belle réaction au moyen d'yttrium
de M. Ie Prof. H. B e h r e n s. A eet efifet on extrait l'acide en secouant Ie liquide
en présence d'éther, puis on évapore l'éther dans un verre de montre, on neutralise
a Tammoniaque et on ajoute une petite quantité d'un sel d'yttrium; l'acide lactique ^e
précipite alors sous forme de microsphérites de lactate d'yttrium, fortement biréfringents
et tres caractéristiques.

Dans ces expériences la fermentation butyrique était presque ou tout a fait im-
possible, mais il se pourrait qu'il eüt existé des organismes anaérobies, a l'état de
germes isolés, dans toutes les expériences avec les accumulations grossières ; dans
quelques-unes d'entr'elles même en grandes quantités. Il est toutefois bien difficile de
les distinguer, au microscope ou par culture, de Polymyxa, Reptans et Sphaericum,
car il faut pour cela que les anaérobies soient excessivement nombreux. Dans toutes
ces expériences l'azote était surtout fixé sous forme d'albumine bactérienne dans !es
cellules de Chroococcum, car, bien que les cellules de Granulobacter et Radiobacter
soient relativement beaucoup plus riches en albumine que celles de Chroococcum, leur
nombre est cependant beaucoup trop restreint, pour l'emporter dans l'ensemble.

(Voir Ie tableau aux pages suivantes).

156

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159

Au sujet de la faqon dont les expériences ont été taites nous ferons encore les
remarques suivantes:

Pour l'expérience initiale nous avons pris comme matière d'infection du terreau
frais. Les cultures grossières ainsi obtenues contenaient Ie Chruococcum en abondance
et servaient pour les inoculations. En répétant les transports nous obtenions toute
une série de cultures, dont chacune pouvait servir comme point de départ a plusieurs
séries parallèles. La petite quantité de terreau desséché, qui fut remplacé plus tard
par du terreau stérilisé, servait partout de nourriture azotée, ce qui accélérait Ie
développement des cultures. Nous introduisions ainsi, comme on voit, d'ordinaire en-
viron 3 mgr. A'^ dans 200 a 300 cm ^. de liquide nourricier.

Voici maintenant Ie résumé des résultats obtenus par les déterminations d'azote
dans les cultures grossières:

En employant du terreau comme matière d'infection, nous n'avons jamais obtenu
des cultures grossières, assimilant l'azote, oü Ie Chroococcum n'a pas pu être reconnu.
Il est vrai que Ie temps au bout duquel Ie développement de cette bacterie était re-
connaissable était tres variable, mais nous avons toujours observé que, aussi long-
temps que ce développement n'avait pas encore commencé, il n'était question ni d'une
forte croissance des bactéries concomitantes, ni d'assimilation d'azote.

Quand cette espèce avait fait par hasard défaut dans la matière d'infection, nous
n'observions pas de croissance notable dans la solution nourricière a mannite, que
nous employions de préférence; l'addition d'une culture pure suffisait alors pour mettre
en train la croissance des autres bactéries et l'absorption d'azote.

Les plus hauts rendements d'azote que nous ayons pu atteindre ont été obtenus
dans de pareilles cultures grossières, p. ex. dans les épreuves 8, 10 et 11 faites en
novembre et décembre 1901. Comme matière d'infection avaient servi Ie 17e et Ie 20e
transport de notre série principale dans une solution a mannite. Le liquide nourricier
ne contenait toutefois pas de la mannite mais du glucose. Déja au bout de 6 jours
le sucre avait disparu et la quantité d'azote, fixée dans les expériences, était de 6,93
a 6,79 mgr. par gr. de sucre ou 138,6 a 135,8 mgr. par litre de liquide de culture. Ces
quantités sont plus que le doublé des plus grands nombres trouvés par M. W i n o -
g r a d s k y dans ses fermentations butyriques, qui ne dépassaient pas 3 mgr. d'azote
par gramme de sucre. En outre nos cultures ont une durée beaucoup plus courte.
Dans ces expériences il n'y avait pas plus de fermentation butyrique que de fermen-
totion propyl-butylique. Il est néanmoins probable qu'il existait dans les cultures
beaucoup de bacilles de ces fermentations et que ces organismes prenaient une part
active a la fixation d'azote. Leur présence n'était toutefois pas indispensable, puisque
la combinaison Radiobacter + Chroococcum est suffisante pour la fixation d'azote et
que dans beaucoup d'épreuves cette combinaison existait certainement seule. Dans
ces cultures, comme dans les cultures tres productives en azote en général (mais pas
sans exception), il se produit un assez fort dégagement de gaz, occasionné par di-
verses formes d'Aërobacter^ dont trois ont été découvertes dans les cas considérés.
Ainsi qu'il a été dit au § i, deux d'entr'elles produisaient un acide, la troisième un
alcali. Par l'analyse microscopique nous avons reconnu que la masse principale des
bactéries était constituée en majeure parti par Chroococcum, en second lieu par Radio-
bacter et en troisième lieu par ces formes d'Aërobacter.

Quoiqu'il mérite mention que surtout les batonnets et les clostridies des ferments

i6o

butyriques et butyliques contiennent beaucoup d'albumine et possèdent une membrane
de mucus beaucoup plus mince que les cellules de Chroococcum et de Radiobacter, c'est
a peine si dans l'analyse les espèces de Graniilobacter viennent en considération.
Nous ne voulons pas prétendre par la que ces organismes soient sans importance pour
la fixation d'azote dans les cultures grossières. Tout au contraire, il est certain que
raéme un nombre restreint d'individus de Grantdohacter est tres actif a ce point de
vue, notamment par formation d'une combinaison azotée au moyen d'azote libre, com-
binaison que Ie Chroococcum transforme encore dans la suite. Mais c'est la une toute
autre question que celle de savoir d'oü provient en définitive l'albumine bactérienne
trouvée par l'analyse. D'ailleurs, comme nous l'avons déja dit, Ie Graniilobacter peut
faire complètement défaut dans ces cultures.

Le tableau fait voir que malgré l'emploi d'une matière infectante apparement
semblable, et dans des conditions nutritives certainement identiques, le résultat des
cpreuves est néanmoins tres variable ; c'est ce que l'on remarque surtout quand on
compare entr'elles les cultures 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 et 18, toutes prises a notre
série principale et transportées de la faqon décrite. Cela doit évidemment être attribué
a des circonstances dont il est bien difïicile de se rendre maitre dans les expériences,
et qui proviennent d'une part du noxnbre relatif de germes, semés par hasard, et des
diverses espèces existant dans les cultures, d'autre part de l'état particulier d'accomo-
dation de ces espèces. L'expcrience 14 prouve que, dès que Aërogenes se multiplie
notablement, la formation d'acide lactique entraine une forte diminution de l'assimila-
tion d'azote.

On voit dans l'épreuve 19 que l'addition de Radicicola du trèfle rouge ne suffisait
pas a elle seule pour garantir un résultat favorable.

Nous croyons du reste que la description des expériences dans le tableau est suffi-
samment claire et que des considérations générales plus étendues sont inutiles.

3. G a i n d'a zote dans les cultures »partiellementgrossières«.

Nous désirons nous occuper maintenant des rendements d'azote obtenus dans les
cultures que nous avons qualifiées de »partiellement grossières«.

Ce sont des cultures oü nous n'avons pas semé le mélange complet de bactéries exis-
tant dans la terre fraiche, mais seulement les formes sporogènes, restant vivantes
après un chauffage de 5 minutes a 85" C, auxquelles on peut d'ailleurs ajouter encore
quelques formes déterminées non sporogènes.

(Voir le tableau aux pages suivantes).

On voit d'après ce tableau que, conformément aux données de M. \V i n o -
g r a d s k y, nos cultures ont prouvé a l'évidence que la présence d'espèces non sporo-
gènes n'est pas absolument nécessaire pour la fixation d'azote (Epr. 20, 22, 23).
Toutefois, quand nous ajoutions Radiobacter au terreau pasteurisé, le résultat s'amé-
liorait quantitativement dans certains cas (Epr. 28), et restait défavorable dans
d'autres (Epr. 29). Mais quand nous semions le Chroococcum en méme temps que dn
terreau pasteurisé, les résultats devenaient décidément plus favorables (Epr. 21, 25,

i6i

26, 30) et comparables a ceux des meilleures cultures grossières, bien que nous n'ayons
jamais pu réaliser les plus hauts rendements obtenus avec ces dernières.

En présence de craie et par infection avec de la terre pasteurisée Ie glucose entre
tres facilement en fermentation butyrique; dans notre solution nourricière n". 2 cette
fermentation est accompagnée d'une fixation d'azote. On ne comprend pas tres bien
pourquoi les nombres obtenus dans ces expériences (Epr. 20, 22 et 23) sont si faibles.
Ni une modification dans l'aération ni l'emploi de saccharose, de lévulose ou de man-
nite n'améliorèrent ces résultats. Le rendement d'azote s'élevait il est vrai quand ia
fermentation butyrique avait commencé, en présence de Radiobacter, mais elle n'a
jamais atteint le maximum que nous nous attendions a observer.

La grande importance de Chroococcum pour cette série aussi se reconnait p. ex.
quand on compare entr'elles les expériences 21 et 22, dont la première, dans laquelle
cette espèce était introduite en même temps que du terreau pasteurisé, donna 4,93 mgr.
d'azote fixé par gramme de sucre, tandis que les spores obtenues par la pasteurisation
du terreau, oü le Chroococcum faisait donc défaut, ne produisaient que 1,6 mgr.
L'expérience 22 prouve en outre qu'il ne s'agit pas ici d'une diminution de l'accom-
modation des ferments, puisque le terreau pasteurisé, employé tout seul, donc sans
symbiose avec Chroococcum, ne produisait que 0,17 mgr. pendant le même nombre de
jours de culture que dans l'expérience 21. Les résultats avantageux que l'on peut ob-
tenir par ces cultures partiellement grossières dans le glucose, contrairement aux cul-
tures complètement grossières de la série précédente, doivent être expliqués par cette
circonstance que beaucoup de bactéries contenues dans le terreau non pasteurisé
transforment le glucose en acide; tel est notamment le cas pour toutes les Fluores-
centes, aussi bien celles qui liquéfient que celles qui liquéfient pas la gelatine, tandis
que dans les cultures partiellement grossières cette formation d'acide, si pernicieuse
pour la fixation d'azote, n'est a redouter principalement que de la part du ferment
butyrique; toutes les autres espèces sporogènes ne sont que faiblement productrices
d'acide. On sait que de la craie, même tres finement divisée, ne neutralise qu'assez
difïicilement les acides dans les solutions nourricières, et l'influence favorable de
Chroococcum réside sans aucun doute en partie dans sa forte action oxydante sur les
acides organiques, et d'autre part dans son pouvoir de former en toutes circonstances
un alcali.

Dans de nombreuses expériences avec plusieurs espèces d'autres bactéries, nous
ne sommes pas parvenus a remplacer cette influence favorable de Chroococcum (et
Radiobacter), pas plus dans les solutions a mannite que dans celles a glucose. Nous
avons essayé A'érogenes, Coli, les Fluorescentes, Prodigiosus et Radicicola, soit
séparément, soit combinées entr'elles de diverses faqons ou avec du terreau pasteurisé,
le tout en vain. Nous basant sur la relation de parenté entre Radiobacter et Radici-
cola, nous croyons cependant que surtout cette dernière espèce devrait être en état
de remplir le même role, si la culture en laboratoire ne la mettait pas dans des circon-
stances anormales.

Aux expériences remarquables de cette série appartient 26, oü les seules bactéries
qui accompagnaient Chroococcum étaient des espèces qui restent vivantes dans l'eau de
conduite soumise a l'ébullition. Nous avons obtenu plus d'une fois de pareilles cul-
tures. Au microscope on n'y reconnait, a cóté de beaucoup de Chroococcum, que des
batonnets qui permettent aisément une culture aérobie sur des plaques d'agar au

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. II

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glucose a 28" C. Les colonies que l'on obtient ainsi appartiennent pour la plupart a
Granulohacter polymyxa, et parmi elles on remarque la bacterie ordinaire de la pomme
de terre, Bacillus mesentericus vidgatus, ainsi que des états intermédiaires entre cette
espèce et Ie Gr. polymyxa. En un seul cas nous avons pu y reconnaitre une colonie de
Sphaericum. Le rendement d'azote obtenu dans cette expérience, 3,49 mgr., peut êtro
considéré comme bon. Déja après Ie premier transport de pareilles cultures grossières
dans la même solution nourricière, le rendement d'azote s'abaissait et devenait, par
transports répétés, égal a celui que l'on obtient par des cultures combinées de Cliroo-
coccunt + Polymyxa ou Chr. + Sphaericum (Epr. 51 et 52). Cette perte graduelle du
pouvoir d'assimiler l'azote libre va, ici comme toujours, de pair avec la diminution de
la microaérophilie chez ces espèces, propriété avec laquelle cette fonction varie pour
ainsi dire proportionellement.

Pour de plus amples détails nous renvoyons encore une fois a la description des
expériences dans le tableau.

4. Gain d'azote dans les cultures dites »alternantes«.

Nous donnons le nom de »cultures alternantes« a un genre spécial de nos cuK
tures partiellement grossières. Ce sont des cultures obtenues par transport dans des
Solutions nourricières oü une nourriture différente fait se développer une autre com-
binaison microbienne que celle qui avait été introduite. Après un nombre de trans-
ports suffisants dans les nouvelles conditions, la combinaison est transplantée une
dernière fois dans la solution primitive. Dans le cas spécial nü nous avons appliqué
cette methode, nous avions en vue d'éloigner les organismes anaérobies peut-être
encore inconnus. Il est vrai que nous avions déja taché d'atteindre ce résultat en
traqant, au moyen des cultures grossières, des traits inoculatoires sur des plaques
d'agar au glucose, et en d'écoupant de ces plaques des mélanges de colonies qui parais-
saient convenir pour le but proposé, mais nous n'étions pas arrivés de cette maniere
a un résultat absolument convaincant. Nous avions notamment constaté que le trans-
port direct d'une culture grossière donnait toujours un résultat beaucoup plus satis-
faisant que l'infection du liquide nourricier au moyen de fragments de la plaque
d'agar, même quand nous employions a eet effet le trait tout entier, c. a d. non
seulement les colonies mais aussi les espaces intermédiaires. Nous croyions d'abord
devoir admettre que nous avions tué par la culture, au contact de l'air libre, une
bacterie anaérobie indispensable pour la fixation intensive d'azote. Mais plus tard
nous avons compris qu'il ne s'agissait pas ici d'une élimination d'organismes anaé-
robies, mais d'une diminution de la microaérophilie de toutes les formes fixant l'azote.
Par l'étude de Gr. sphaericum aussi bien que de Gr. reptans il était en effet établi,
comme nous 1'avons déja fait observer, que du moins chez ces espèces-la la propriété
de fixer l'azote libre diminue par une culture aérobie; nous étions donc en droit
d'attendre la même chose des symbiontes non sporogènes, spécialement de Radio-
bader.

C'est pourquoi nous avons essayé d'atteindre cette élimination de toutes les formes
de Granulohacter, aussi bien anaérobies qu'aérobies, sans faire usage d'un terrain
nourricier solide, notamment par transport d'une culture grossière avec mannite dans

i65

une sülution oü puisse se produire, il est vrai, une vigoureuse croissance de Chroo-
coccum, de sorte que Toxygène disparaitrait pour la plus grande partie, mais qui ne
contienne pas de sucre, afin d'exclure Ie développement de Granulobacter. Pour
atteindre ce but, des sels d'acides organiques ont été reconnus Ia source de carbone la
plus appropriée. Il est vrai que dans les circonstances choisies il ne se fixe pas
d'azote du tout, mais l'expérience a appris que cette fonction peut être temporairement
suspendue sans pour cela disparaitre pour toujours dans les inoculations ultérieures.
Nous avons employé p. ex. la solution suivante:

Eau de conduite loo

Acétate de sodium 0,5

K^HPO* 0,05

Terreau frais 2

Le terreau sert de source d'azote, indispensable dans ces expériences parce que,
comme nous l'avons dit, il n'y a pas d'assimilation d'azote libre dans une solution
d'acétate de sodium. La culture a lieu a 25" et la pellicule bactérienne qui se forme,
constituée principalement par du Chroococcum, est transportée dans une solution
nutritive semblable, mais préalablement stérilisée. Ces inoculations sont répétées
jusqu'a ce que l'on ait obtenu l'élimination des Granulobacter, qui ne sont pas capa-
bles de vivre ou de concourir dans la solution d'acétate; puis on transplante de nouveau
dans la solution de sucre.

Voici un aperqu d'une pareille expérience:

Liquide
de culture.

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Différence

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Diflférence
corrigée.

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Mannite 0,4
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La mannite avait complètement disparu sans qu'on eüt observé des phénomènes
de fermentation, et dans l'examen microscopique aussi bien que bactériologique nous
n'avons trouvé que des formes aspores, dont la plus petite partie était Aërogenes, le
reste contenant, outre le Chroococcum, plusieurs variétés de Radiobacter ; il n'y avait
certainement pas de Granulobacter. La quantité d'azote fixée était néanmoins consi-
dérable. Nous nous croyons donc en droit de conclure que ce procédé constitue un
moyen, non seulement pour écarter certains groupes de bactéries avec des propriétés
physiologiques déterminées, mais encore pour conserver tout a fait invariables, au
moins a travers toute la série de transports nécessaires pour la purification, les
espèces capables d'assimiler l'azote.

i66

5. Ga in d'a z o t e dans les cultures pures et les
cultures combinées d'espèces bien connues de bactcries

a é r o b i e s.

Nous réunissons dans ce groupe toutes les expériences qui se rapportent a des
espèces isolées et a des combinaisons d'espèces difïérentes en culture pure.

Nous avons établi tout d'abord qu'a lui seul Chroococcum, place dans nos solu-
tions nourricières, n'est pas capable de fixer l'azote libre (comme dans les exp. 310 et
3it), OU ne l'assimile (comme dans 31c) qu'en quantités tellement minimes qu'il n'est
pas possible d'y attacher beaucoup d'importance. Quand nous avons reconnu plus tard
que ces mêmes cultures, quand on y introduit des spores de Granulohacter, provenant
soit de l'air soit du liquide de culture imparfaitement stérilisé, fixent l'azote en quan-
tités considérables et que même un nombre relativement restreint de batonnets de
Granulohacter, difïicilement reconnaissables, est encore efficace, nous avons cru
pendant longtemps devoir admettre que, dans toutes les cultures combinées de Chroo-
coccum avec des espèces non sporogènes, qui se montraient accumulatrices d'azote, il
devait être entre, sans qu'on s'en soit aperqu, des germes de Granulohacter.

Mais, par l'accroissement de nos connaissances sur ce sujet, nous avons reconnu
que cette maniere de voir était trop étroite et qu'il doit certainement exister des bac-
téries, aérobies et sans spores, complètement différentes de Granulohacter, capables
de fixer l'azote libre en symbiose avec Chroococcum. Ces espèces, dont nous avons
considéré Radiobacter et Aërogenes de plus prés au § i, et que nous avons citées en
traitant des cultures alternantes, sont moins spécialisées que Granulohacter dans leurs
conditions nutritives; contrairement a ce dernier genre, elles peuvent, p. ex. se nourrir
parfaitement de sels d'acides organiques, particulièrement de malates, citrates et suc-
cinates, mais avec ces espèces il ne se produit de fixation d'azote qu'en présence d'un
sucre comme source de carbone^). Cette dernière circonstance doit probablement être
attribuée a cette autre que chez ces espèces aussi la microaérophilie n'est possible qu'en
présence d'un sucre, et il semble que la microaérophilie soit toujours la condition in-
dispensable pour l'assimilation de l'azote libre.

Des cultures pures a considérer en premier lieu, dont celles avec Chroococcum
(3la, 3I&, 3lc) ont déja été suffisamment discutées, quelques-unes seulement (Epr. 32
•T 35) ont été notées dans Ie tableau, parce que des nombreuses expériences faites
a ce sujet la plupart donnaient déja au premier coup d'oeil la conviction qu'aucune
fixation d'azote n'y pouvait avoir Cu lieu, puisqu'il n'y avait pas eu de croissance; aussi
ces cultures n'ont-elles pas été analysées. Il peut toutefois arriver aussi que, sans
assimilation notable d'azote, il se forme une si grande quantité de mucus qu'on se
trompe au sujet de l'intensité du premier phénomène et qu'une analyse semble néces-
saire, et inversement une culture combinée avec une croissance faible en apparence
peut cependant, dans certaines circonstances, donner lieu a une assimilation d'azote.
Voila comment nous avons été conduits a examiner aussi les cultures pures d'Aëroge-
nes, Coli, Radiobacter et des granulobactéries Muco.<;um, Reptans, Sphaericum et

*) Dans les dexniers temps nous avons reconnu que les lactates, les malates, Tamidon
et la cellulose sufifisent, dans ces conditions et en l'absence complete des Granulohacter,
a la fixation de l'azote libre. Nous reviendrons plus tard sur ce fait important.

167

TenaXj Ie tout avec un rcsultat négatif, il est vrai ; aussi ces expériences n'ont-elles
pas été reprises. Pour Ie Granulobacter polymyxa nous avons pu faire voir que cette
espèce peut se développer toute seule, sans azote combine, dans des conditions encore
imparfaitement déterminées. L'expérience qui a fourni ce résultat a été faite au
moyen d'une solution nourricière au glucose; mais nous avons perdu la culture
et un nouvel essai est resté infructueux. Nous avons d'ailleurs assez de raisons pour
admettre que nos autres granulobactéries Reptans, Mncosiim, Tenax et Sphaericum
sont également en état d'assimiler tout seuls, dans des conditions convenables, l'azote
libre de l'air.

(Voir Ie tableau aux pages suivantes.)

Il est remarquable que dans un cas déterminé (Epr. 33), notamment avec ie
champignon de la pomme de terre (B. mesentericus vulgatus), nous ayons obtenu un
résultat positif au moyen d'une culture pure, mais cette propriété spécifique avait déja
disparu après Ie premier transport et nous ne l'avons plus retrouvée dans d'autres iso-
lations^). Il est néanmoins probable que cette espèce, par suite de son ubiquité
générale, ait quelque importance au point de vue de l'accumulation d'azote dans la
nature.

Si nous passons aux cultures combinées, nous devons faire remarquer en premier
lieu qu'en I'absence de Chroococcitm elles donnent un résultat douteux ou décidément
négatif. Telles sont les expériences avec Mesentericus vulgatus + Radiobacter (Epr.
34), Sphaericum + Radiobacter, Sphaericum + Radicicola, Reptans + Radiobacter,
Reptans + Radicicola, Mesentericus + Radicicola, Mesentericus + Fluorescens et Sub-
tilis en diverses combinaisons.

Comme nous avons des motifs pour admettre que dans des conditions déterminées,
même en culture pure, toutes les formes de Granulobacter peuvent assimiler l'azote
libre, ces expériences avec résultat négatif ne peuvent encore être considérées comme
convaincantes ; nous concluons plutót a un état insuffisant d'accomodation dans tous
les cas oü des Granulobacter faisaient partie des combinaisons.

Nous sommes arrivés maintenant a l'examen de celles des combinaisons dont
Chroococcum fait partie et nous y observons souvent, comme avec les cultures gros-
sières, une accumulation fort notable d'azote. Ce sont surtout les combinaisons avec
Reptans et Sphaericum qui sont remarquables. Nous y avons observé notamment les
laits suivants. Il se peut, et tel est Ie cas pour les cultures les plus productives, p. ex.
pour les épreuves 49 et 50 que Ie Chroococcum ne remplisse dans la matière soumise
a l'analyse qu'un róle tout a fait secondaire, et que cette matière soit constituée pres-
que entièrement par des batonnets, clostridies et spores de Sphaericum ou Reptans

^) La forme employee ici a été isolée du terreau de jardin par l'expérience suivante:
quand on infecte au moyen de ce terreau des plaques de pommes de terre vivantes,
a l'air libre et a une température inférieure a 25" C. on ne voit rien s'y développer.
Mais a 37" C. il se développe sur Ie tissu vivant 3 espèces de bactéries, savoir: toujours
B. mesentericus et B. subtilis et rarement Granulobacter polymyxa. Ces circonstances nous
fournissent une bonne diagnose pour les formes de ce groupe. A l'abri de l'air et a des
températures inférieures a 25" C. il peut se développer aussi, sur des pommes de terre
vivantes, 2 formes anaérobies qui produisent ce qu'on appelle la »putréfaction humide«,
c. a d. la fermentation pectique.

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173

même. Une pareille éventualité nous donne la conviction que, dans des conditions con-
venables, ces dernières bactéries doivent être en état de croitre et de fixer l'azote a
elles-seules, donc sans symbiose avec Chroococcum. un fait sur lequel nous avons
déja attiré l'attention en parlant des cultures pures.

Nous ne nous figurons pas encore clairement quelle circonstance spécifique cela
exige. Pour la bonne réussite d'une pareille expérience, les espèces citées doivent
certainement se trouver dans un état particulier d'accomodation, en rapport avec leur
microaérophilie. Il est d'ailleurs remarquable que toutes les cultures combinées de
Chroococcum avec des formes de Granulobacter ont donné lieu a une assimilation
d'azote plus ou moins intense, indépendamment de la présence d'autres bactéries con-
comitantes, de sorte que la grande importance de ces combinaisons pour Ie phénomène
en question est mise absolument hors de doute.

Nous avons en outre acquis la conviction que la combinaison Chroococcum 4-
A'érogenes (Epr. 36 et 37) aussi peut donner lieu a une assimilation d'azote, faible il
est vrai, mais incontestable.

Pour les résultats remarquables, quoique pas tout a fait compréhensibles, obtenus
avec la combinaison Chroococcum + Radiohacter, nous recommandons d'examiner les
expériences 39 a 44. L'examen complet de notre tableau fait voir d'ailleurs que Ie
pouvoir d'assimilation présente, dans les cultures combinées, un caractère beaucoup
plus variable encore que dans les cultures grossières, ce qui s'explique par Ie rapport
qui existe entre cette fonction et la microaérophilie, avec laquelle elle augmente ou
diminue, en ce sens que l'état »anaérobie« des bactéries concomitantes serait la con-
dition pour obtenir Ie rendement d'azote Ie plus élevé. Nous avons notamment pu
prouver, ainsi que nous l'avons déja fait remarquer maintes fois, que dans les cul-
tures aerobics sur plaques, surtout avec des espèces de Granulobacter, Ie besoin
fl'oxygène augmente, c. a d. que la microaérophilie diminue, et en même temps Ie
pouvoir d'assimiler l'azote doit diminuer. La culture sur plaques, base de toutes ces
expériences, est donc préjudiciable pour l'assimilation d'azote au point de vue quanti-
tatif, ainsi qu'on Ie reconnait Ie mieux en comparant l'expérience productive 50 avec
l'expérience 51, tres peu productive; on voit par la combien l'activité de Sphaericum
est diminuée par culture a l'air libre. On constate quelque chose d'analogue avec
Reptans, d'après les expériences 53 et 54 d'une part et 49 d'autre part.

Nous avons enfin a parier de ces groupes de cultures combinées oü nous avons
employé, a cóté de Chroococcum, deux autres espèces encore. En comparant les résul-
tats de ces expériences (53 a 61), on voit immédiatement qu'elles n'ont rien appris de
particulier. Nous sommes revenus néanmoins plus d'une fois a ce genre d'expériences,
d'une part parce que nous espérions arriver ainsi a une combinaison par laquelle il
serait possible de fixer tout autant d'azote que dans les cultures grossières, et d'autre
part parce que ces cultures produisent une quantité de mucus si considérable, que
nous croyions pouvoir nous attendre a un fort rendement d'albumine, jusqu'a ce
que l'analyse nous apprit que nous étions trompés. Bien que dans plusieurs de ces
expériences la durée de la culture ait été trop courte pour que nous eussions atteint
Ie rendement maximum d'azote, il ne nous est pas possible de bien expliquer comment
ce rendement est si faible; ici aussi nous songeons a une accomodation insufifisante
des bactéries soumises a l'expérience aux conditions nutritives dans lesquelles elles
ont été placées.

174

Pour Ie reste, dans ce cas aussi nous croyons que nous avons donné dans ie
tableau precedent assez de détails des expériences pour pouvoir nous abstenir de plus
amples développements.

6. E X p é r i e II c e s sur la n i t r i f i c a t i o n de l'a z o t e 1 i b r e.

Une solution composée de loo p. d'eau de la distribution, i de glucose et 0,05 de
K-HPO* fut infectée Ie 23 déc. 1901 avec Ie 26e transport de notre culture grossière
a mannite. Par comparaison avec des cultures parallèles nous avons constaté que Ie
23 janv. 1902 il y était déja fixé 70 mgr. d'azote libre par litre, en même temps qu'il
s'était formé une épais mucus de Chroocbcciim, a réaction tres faiblement alcaline.
I/azote devait avoir été fixé en majeure partie sous forme de protoplasme du Chroo-
cocctitn lui-même. Le 23 janv. nous y avons introduit un peu de terreau frais, d'une
part pour ajouter des bactéries capables de transformer l'albumine de Chroococcum en
sel d'ammonium, et en second lieu pour introduire les ferments de la nitrification. Après
3 semaines nous avons distinctement pu constater la formation de nitrite et vers le
milieu de mars 1902 nous n'y trouvions plus de nitrite, mais seulement du nitrate
en grande quantité. Par voie colorimétrique, au moyen de la réaction de diphény-
lamine et acide sulfurique, nous avons trouvé que le filtrat du liquide contenait en tout
environ 250 mgr. de nitrate par litre (calculé comme KNO^). Comme les 70 mgr.
d'azote correspondent a 500 mgr. de KNO^, nous voyons qu'au bout de 7 semaines la
moitié a peu prés de l'azote libre assimilé était nitrifié. Et comme eet azote a du
être entièrement contenu dans l'albumine de la masse bactérienne nouvellement formée,
surtout dans Chroococcum, nous avons ainsi une mesure approchée de la vitesse avec
laquelle se nitrifié l'azote, présent dans le corps de Chroococcum a l'état d'albumine.

Nous avons repris ces expériences plus d'une fois et toujours avec le même
résultat.

En les effectuant, il est recommandable de ne pas se fier exclusivement a la réac-
tion qualitative au moyen de diphénylamine et d'acide sulfurique, mais d'opérer quan-
titativement comme nous l'avons décrit, et cela pour la raison suivante:

Quand on introduit du terreau frais, sans plus, dans l'eau de la distribution, la
réaction par diphénylamine et acide sulfurique ne réussit pas au commencement,
même quand on mélange 5 a 10 gr. de terreau avec 50 cm^. d'eau. Et cependant ce
terreau contient des substances capables d'être nitrifiées après dilution avec de l'eau
et par aération, sans qu'il soit nécessaire d'ajouter des sels ou d'autres substances.
Au bout de quelques jours la réaction a la diphénylamine + acide sulfurique est
positive, indépendamment de l'azote atmosphérique fixé ou non fixé.

Mais nous avons trouvé que 0,5 gr. de terreau dans 50 cm», constituait la limite
de sensibilité de la réaction, car en employant moins de terreau encore, il n'y avait
plus moyen de découvrir du nitrate ou du nitrite. Si l'on a donc employé pour l'ex-
périence en question plus de 50 cm», d'eau et moins de 0,5 gr. de terreau pour l'infec-
tion, un résultat positif de la réaction qualitative susdite prouve déja, sans aucune
determination quantitative, que de l'azote atmosphérique a été nitrifié 1).

*) Notice historique. Après la publication du travail sur roligonitrophilie (voir ces
Archives, (2), 8, 190, 1903), dont la communication a l'Académie des Sciences d'Amster-

1/5

7. Résumé et conclusion.

Il y a deux procédés importants pour obtenir des accumulations d'organismes
oligonitrophiles, conduisant a des cultures de bactéries qui fixent énergiquement l'azote
libre de l'atmosphère; d'abord, Ie procédé de culture complètement grossière, ensuite,
Ie procédé de culture partiellement grossière.

Une culture complètement grossière s'effectue comme suit:' On introduit loo p.
d'eau de conduite, contenant 2 p. de mannite et 0,05 de K^HPO'^, en couche peu pro-
fonde dans un large flacon d'E rlenmeyer, on inf ecte au moyen de terreau f rais
et on cultive entre 23 et 28" C. Déja au troisième jour commence une culture de bac-
téries oü Chroococcum est prépondérant. Après quelques transports la plupart des im-
puretés ont disparu, mais il reste toujours quelques Fluor escentes, qui ne produisent
pas d'acide dans la solution de mannite. Si l'on inocule cette culture dans 100 p. d'eau
de conduite, 2 de glucose et 0,05 de K^HPO'^, on obtient la combinaison Chroococ-
cum + Granulobacter (sous diverses formes) + Radiohacter, qui donne lieu au ren-
dement d'azote Ie plus élevé que l'on ait atteint jusqu'ici, savoir 7 mgr. d'azote fixé par
gr. de sucre assimilé. Il n'y a pas moyen de répéter les transports dans la même so-
lution au glucose, par suite de la formation d'acide par les Fluorescentès, ce qui
entrave la croissance.

Mais, si l'on transporte alors dans une solution a mannite, ou si l'on suit la
methode de culture »alternante«, en employant passagèrement l'acétate de chaux
comme source de carbone, — nourriture qui ne convient pas aux Granulobacter, —
on arrive enfin, avec la mannite, a la combinaison des deux espèces non sporogènes
Chroococcum + Radiohacter, par laquelle peuvent être fixés, dans la solution a man-
nite, environ 4 mgr. d'azote par gramme de mannite assimilé. Dans cette culture les
Granulobacter font défaut, mais on y trouve encore des Fluorescentès, ainsi qu'une
petite quantité d'Aërogenes et Colt.

Le procédé de culture partiellement grossière est Ie suivant: On prend une so-

dam date du 30 mars et du 25 mai 1901, M. Ie Dr. W. Krüger de Halle a. S., dans
une lettre du 6 sept. 1901, a attiré notre attention sur le passage suivant d'un travail
qu'il avait publié dans Landwirtschaftl. Jahrb. 1900, p. 701: »Hier mag zunachst noch
ein Versuch kundgegeben werden, der dafür Zeugnis ablegt, dass unter denselben Ver-
haltnissen, unter welchen wir die Algen züchteten« (le travail de M. Krüger traite
notamment la question de savoir si les algues a chlorophylle inférieures sont en état
d'assimiler l'azote libre, dont la réponse est négative) »bei Organismen v^elchen das
Vermogen eigen ist, sich des freien Stickstoffs der Luft als Stickstoffquellen zu be-
dienen, StikkstofFaufnahme aus der Atmosphare stattfindet. Von mehreren Versuchen
sei hier das Ergebnis eines derselben mit einem aus dem Boden gezüchteten Organis-
mus angeführt. Dazu wurde w^ieder eine Nahrlösung ohne Zusatz von Stickstoffver-
bindungen, die pro 100 ccm. nur 0,0003 S- Stickstofif enthielt, verwendet.« .... Au bout
de 62 jours il constate dans 100 cm*, une augmentation de 4,6 mgr., dans 200 cm'.
6,8 mgr. et dans 300 cm^. 8,5 mgr. d'azote fixé. M. Krüger continue en ces termes:
»E8 wurden also nicht unbetrachtliche Mengen von elementarem Stickstoff assimiliert
und die Entwicklung der Kuituren machte keineswegs den Eindruck, dass dem Or-
ganismen irgend ein vvichtiger Nahrstoff nicht zu Gebote stand,« L'organisme dont il
est question ici était Chroococcum, ainsi que nous avons pu nous en assurer a l'aide
d'un tube de culture que M. Krüger nous envoya en même temps que sa lettre: !a
culture n'était toutefois pas pure, mais un mélange complexe de microbes.

lution de lOOp. d'eau de conduite, 2 de mannite et 0,05 de K-H PO*, on bien 100
d'eau, 2 de glucose, 2 de craie et 0,05 de K'-^HPO* ; on infecte avec Chroococcum -t
terreau pasteurisé et on cultive de nouveau entre 23 et 28" C. Après des transports
répétés on obtient une combinaison fixant de l'azote, formée de Chroococcum et de
diverses espèces de Granulobacter, avec des impuretés constituées par quelques bac-
téries accessoires, sporogènes. Le plus haut rendement d'azote atteint dans ce genre
d'expériences, savoir 5 mgr. d'azote fixé par gr. de sucre (Epr. 39), a été fourni par
une combinaison de Chroococcum avec la bacterie aérobie, mais fortement microaéro-
phile, Granulobacter reptans.

Tous les Granulobacters sont plus ou moins microaérophiles. On peut mesurer
approximativement cette propriété en appliquant aux colonies sur agar au glucose la
réaction a l'iode. On voit alors que les organismes les plus microaérophiles contien-
nent aussi le plus de granulose et se colorent donc en bleu intense, tandis que les in-
dividus les moins microaérophiles (donc les plus aérophiles) ne prennent qu'une teinte
bleu clair 1).

Il semble d'ailleurs que Tassimilation de l'azote libre aille de pair avec la micro-
aérophilie chez toutes les espèces capables de remplir cette fonction. La propriété de
la microaérophilie se manifeste par cette circonstance que, dans une goutte du liquide
de culture, placée dans la chambre humide, il se forme, soit par croissance, soit par
motilité, des accumulations non dans le ménisque même, mais a quelque distance vers
l'intérieur, oü l'air dissous doit avoir une tension plus faible. Cette préférance pour
une basse pression de l'oxygène se perd toutefois par hérédité dans des cultures a
l'air libre, du moins pour Granulobacter, et en même temps disparait l'état d'accomo-
dation nécessaire pour la fixation d'azote. Cette perte de l'état d'accomodation par
culture aérobie permet d'expliquer pourquoi les combinaisons de cultures pures d'espè-
ces connues ne peuvent donner lieu a une fixation d'azote, importante au point de vue
quantitatif, que quand elles sont fraichement isolées des cultures accumulatives gros-
sières.

Nous sommes d'avis que le résultat principal de nos recherches est que nous
avons prouvé, comme il a déja été remarqué dans l'introduction, que dans l'assimila-
ilon de l'azote libre par les bactéries il commence par se former une combinaison so-
luble, qui sort par diffusion des organismes actifs, se propage autour d'eux ef est
ainsi mise a la disposition d'autres microbes-).

Pourquoi cette combinaison, dont la nature chimique est encore inconnue en ce
moment, est si difficilement assimilable pour les bactéries qui la produisent, et si facile-
ment au contraire pour Chroococcum qui s'en sert pour sa croissance, voila un point
(lui n'est pas encore élucidé. Mais il faut remarquer que cette dernière espèce se conduit
vis a vis des combinaisons azotées en général d'une maniere exceptionelle, non
seulement au point de vue de l'avidité extraordinaire avec laquelle elle extrait de la

*) Par cette simple expérience on peut obtenir des «bactéries de l'alinite*, capables
d'assimiler l'azote libre, non seulement, comme r»alinite« du commerce, dans l'ima-
gination de l'observateur, mais en réalité. Qu'on se garde bien de confondre a ce pro-
pos Ia réaction bleu-violette sur la granulose des Granulobacter avec la réaction rouge
violette sur le glycogène, si caractéristique pour le grcupe Me gather iutti, non fixateur
d'azote.

-) Ou même de végétaux supérieurs, comme c'est Ie cas avec Radicicola.

177

solution même les moindres traces de ces substances, mais aussi au point de vue de
l'action qualitative qu'elle montre a leur égard.

Nous avons notamment reconnu que Chroococcum est uuc des rares bactéries
qui engendrent directement de rammoniaque') aux dépens de nitrates et de nitrites, et
cette action de Chroococcum sur les nitrates peut devenir tellement intense que,
dans des conditions de croissance avantageuses, il n'y a même pas moyen de prouver
i:ne formation intermediaire de uitrite^). A notre coniiaissance, Ie Chroococcum est
unique a ce point de vue.

Il est bien vrai qu'il y a encore d'autres bactéries qui furment NH^ au moyen
de nitrates et de nitrites, mais cela a lieu d'une autre maniere, ainsi qu'on Ie reconnait
au tableau suivant, oü nous avons établi un parallèle entre Chroococcum et les bac-
téries B. subtilis et B. mesentericus, isolées de pommes de terre vivantes. Nous nous
sommes servis des liquides nourriciers suivant:

I. Eau de conduite loo

Malate de calcium 2

K^HPO* 0,05

KNO'^ 0,05

2. Le même que i, avec KNO-

au lieu de KNOK

3. Le même que i, avec mannite au lieu de malate de calcium.

4. Le même que 3, avec KNO-

au lieu de KNO''.

Liquide de culture

I
Ca Mal KNO^

1 3
Ca Mal KNO' Mannite KNO^

4
Mannite KNO*

Chroococcum NH^

pas de KNO-

NH*

pas de KNO''

NH"

Mesentericus vulgatus

et KNO^

pas de NH^

NH"
et KNO'

NH'

Subtilis

pas de NW

pas de NH^ pas de N H^

pas de NH*

mais unique-
ment KNO^

mais unique-
ment KNO-

Ainsi qu'on pouvait s'y attendre, Granulobacter polymyxa, avec ses variétés
Tenax et Mucosum, appartient comme Mesentericus aux bactéries qui forment de
l'ammoniaque aux dépens de nitrates et de nitrites. Pour Sphaericum et Reptans il
nous a été impossible d'en fournier la preuve, probablement a cause d'un défaut dans
l'expérimentation.

On voit d'après ce tableau que la formation d'ammoniaque aux dépens de
KNO^, en présence d'un malate comme source de carbone, n'a pu être démontrée que

*) Par contre, la formation d'ammoniaque aux dépens d'amides et d'albuminoïdes
est une fonction tres répandue parmi les bactéries, et bien connue par les cristaux de
phosphate doublé d'ammonium et de magnesium qui se forment dans de vieilles cul-
tures, de dififérentes espèces, sur agar ou sur gelatine.

*) Quand la croissance est ralentie et que les conditions vitales sont défavorables,
nous avons pu constater la transformation de nitrate en uitrite même chez Chroococcum.

M. W, Eeijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel.

178

pour Chroococcum, mais pas chez les deux autres espèces, qui se distinguaient au
contraire de Chroococcum par une formation abondante de nitrite.

Une dénitrification, c. a d. une séparation d'azote libre de nitrites, ne s'opère ni
par Chroococcum ni par les deux autres espèces.

Nous avons donné ces dcveloppements sur la conduite de Chroococcum vis a
VIS des nitrates et des nitrites, parce que nous nous sommes plus d'une fois demandé
si la combinaison azotée, mise en liberté par les bactéries qui fixent l'azote libre, nc
serait pas un nitrite; mais nous n'avons jamais découvert de traces de nitrites dans
les cultures pendant la fixation d'azote, pas plus que de l'ammoniaque en présence
de Chroococcum. Et l'hypothèse que les nitrites se forment passagèrement, mais dis-
paraissent immédiatement parce que Chroococcum les transforme en ammoniaque, et
que l'ammoniaque elle-même est employee pour la croissance de l'une ou l'autre espèce
de bactéries, ne satisfait pas théoriquement, parce que les Granulohacter qui fixent
l'azote ne se nourrissent pas facilement avec leur propre produit d'assimilation, mais
satisfont au contraire aisément leur besoin d'azote au moven de nitrites.

Nous avons également considéré la possibilité de la formation d'un sel d'hydra-
zine OU d'hydroxylamine et nous avons essayé de les découvrir par des réactions basées
sur les propriétés réductrices de ces substances, sans arriver toutefois a un résultat
décisif.

Faisons encore remarquer enfin que Chroococcum forme de l'alcali en toutes cir-
constances, mème en présence de glucose et d'autres espèces de sucre, ce qui est d'ail-
leurs aussi Ie cas pour Radiohacter.

Nos considérations, il faut l'avouer, n'expliquent rien des processus chimiques de
la fixation d'azote, mais elles font connaitre des faits qui peut-être faciliteront un jour
une telle explication.

Nous croyons qu'il est prouvé que toutes les espèces de Granulobacter, tant aero-
bics qu'anaérobies, placées dans des circonstances avantageuses, sont capables d'eni-
ployer pour leur croissance, quoique difificilement, la combinaison azotée qu'elles engen-
drent, et peuvent donc fixer l'azote en culture pure. M. Winogradsky l'avait déja
observé pour Ie ferment butyrique et nous avons pu nous convaincre de l'exactitude de
son assertion, non seulement pour ce qui regarde eet organisme-la mais aussi pour ie
ferment butylique. Quant aux formes aérobies de ce genre, nous avons pu prouver !a
même propriété pour une souche de Granulohacter polymyxa, mais d'autres. isolations
n'étaient plus en état de croitre, sans intervention de Chroococcum,, dans nos liquides
de culture pauvres en azote. En un seul cas une culture pure de Bacillus mesentericus
vulgatus, isolée du terreau au moyen de tranches de pommes de terre vivantes, assimi-
lait l'azote libre sans l'intervention d'autres bactéries, mais elle avait déja perdu ce
pouvoir après un seul transport.

Toutes nos observations prouvent qu'il existe dans Ie sol même et particulièrement
dans Ie terreau une combinaison azotée, formée par les bactéries assimilatrices d'azote,
qui se propage dans toutes les directions et est mise a profit par d'autres organismes
pour leur nutrition azotique, Surtout Chroococcum parait remplir a ce point de vue un
róle important dans Ie sol, et nous avons fait voir que Ie protoplasme de cette bacterie
se transforme aisément en ammoniaque et peut être nitrifié ensuite, ce qui fait qu'il
est possible de transformer en peu de temps l'azote atmosphérique libre en nitrate.

179

Pour expliquer l'influence extraordinairement avantageuse que Chroococcum
exerce sur la culture artificielle, spécialement des Granulohacter, nous devons encore
rappeler que ces dernières bactéries produisent des acides qui entravent leur développe-
ment; or, ces acides sont en partie neutralisés, en partie oxydés par Chroococcum.

Pour ce qui regarde Radiobacterj cette espèce aussi doit transformer l'azote en
une combinaison qu'elle cède a son entourage et qui peut servir d'aliment azoté du
moins a Chroococcum et certainement aussi a Radiohacter même, quand Chroococcum
est présent. Les rapports entre ces deux espèces de bactéries rappellent vivement ceux
qui existent entre Ie Radicicola, apparenté de prés a Radiohacter, et les Papilionacées.

L'observation, que certaines variétés de Radiohacter dénitrifient énergiquement,
c.ad. éliminent l'azote des nitrates et nitrites dans des conditions nutritives convenables.
nous a conduit a nous demander s'il n'y aurait pas d'autres bactéries dénitrifiantes
capables de fixer l'azote libre en symbiose avec Chroococcum, mais toutes nos ex-
périences dans cette direction ont donné un résultat négatif.

Delft, Laboratoire de Bacteriologie de l'Ecole Polytechnique.

12*

On a colourless bacterium, whose carbon-food
comes from the atmosphere.

By M. W. BEIJERINCK and A. VAN DELDEN.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. V, 1903, p. 398—413. — Verscheen onder den titel »Over een kleurloóze
bacterie, waarvan het koolstofvoedsel uit de lucht komt« in Verslagen Kon. Akademie
van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XI, 1903, blz. 450 — 465;
en onder den titel »Ueber eine farblose Bakterie, deren Kohlenstofifnahrung aus der
atmospharischen Luft herrührt« in Centralblatt für Bakteriologic und Parasitenkunde,
Jena, II. Abteilung, X. Band, 1903, S. 33—47-

We give the name of Bacillus oligocarbophilus ^) to a colourless bacterium,
whose carbon nutrition in the dark (and likewise in the light), takes place at
ihe expense of a not yet well-known atmospheric carbon compound (or compounds),
from which the energy, wanted for the vital processes, is also derived-).

The culture of this bacterium on sölid media or m nutriënt solutions, containing
soluble organic substances has not yet succeeded, which may, of course, have been
caused by an erroneous choice of these substances. On the other hand, pure cultures
en solid and in liquid substrata, without soluble carbon compounds, are easy to be
made.

') It is probable that W. Heraeus (Ueber das Verhaiten der Bacteriën in Brunnen-
wasser sowie über reducirende und oxydirende Eigenschaften der Bacteriën. Zeitschrift
f. Hygiëne, Bd. I, pag. 226) already in 1886, has had cultures of B. oligocarbophilus
before him. He says the foUowing: .... «Ausserordentlich auflfallend war das Ergeb-
niss dieser Versuche in der Hinsicht, dass eine Vermehrung der Bacteriën in einer
Flüssigkeit eingetreten war, welche keine organische Verbindungen sondern nur Salze
enthielt. Ein unansehnliches, kaum sichtbares Pünktchen von Bacterienzoogloeën hatte
sich im Verlaufe von zehn Tagen so stark vermehrt, dass die ganze Oberflachc der
Lösung von einer dicken Haut bedeckt war.« Analytical results are not given, and the
remark makes the impression of being accidental and is lost among insignificant ob-
servations. — Wino gradsky' s statement, concerning the accumulation of organic
carbon in nitrifying solutions, evidently refers likewise to this microbe, but his de-
scription suffers of indistinctness (Annales de l'Institut Pasteur, T. 4 pg. 270 et 462,
1891). — In the experiments of Godlewski (Bulletin international de l'Académie d.
SC. de Cracovie, Dec. 1892 pag. 408 et Juin 1895 pag. 178), the vanished CO" is not,
as he thinks, absorbed by the ferments of nitrifïcation but by the Mg O . Mg CO'.

') We also found another, rarer species, belonging to the genus Streptothrix Cohn,
with corresponding properties. It will not however, be further discussed here.

i8i

i.Crude cultures of bacillus oligocarbophilus.

Bacillus oligocarbophilus is obtained by the following accumulation experiment,
which, because of the purity of the thereby resulting vegetation, may be called a
»perfect accumulation experiment.«

Into a large Erlenmeye r-flask a thin layer is introduced of a nutriënt liquid
of the same composition as used for the water culture of higher and lovver green
plants, but with alkaline instead of acid reaction.
One takes for instance:

Distilled water loo

Kaliumnitrate o.oi to o.i

Dinatriumphosphate 0.02

»Mineral solution« i drop.

This »mineral solution« contains in one drop:

8 Mgrms MgSOi . 7 HïO

0.05 ., MnSOi . 4 HzO

0.05 „ FeCb . 3 H2O

If from this liquid nitrogen, phosphor, kalium or magnesium is left out, special
experiments have proved, that no, or but an insignificant growth is obtained. As to
the necessity of the likewise added elements sulphur, manganese and iron, there still
exists some doubt.

The inoculation is made with a not too small quantity of garden-soil, the flasks are
closed with a cotton plug, or with filter paper, without impeding the entrance of air
by diffusion, and the culture is left in the dark at 23 — 25" C. After two or three weeks,
the fluid, which itself remains perfectly clear, is seen to cover with a thin, white, or
feebly rose-coloured, very dry film, difficult to moisten, and macroscopically resem-
bling a M ycoderma- fi\m, but consisting of minute bacteria, microscopically often invi-
sible without staining, and sticking together by a slimy substance. This is Bacillus
oligocarbophilus.

The growth of the film continues for months, whereby a considerable accumula-
tion of organic carbon may be observed, which is not only visible to the naked eye by
the vigorous bacterial growth, but can also be proved by direct weighing, and by a
comparison of the permanganate numbers found before and after the experiment, of
which some instances are given below.

As there is reason to admit that our bacterium is generally distributed in garden-
soil, and was without doubt always present in the crude material used for the inocula-
tion, the failing of the film-formation in some of the flasks must necessarily result
fiom the chosen culture fluid being less favorable to the feebier germs and not allo-
wing their growth. So we observed that water, distilled in a copper apparatus, caused
many more failures than when distilled in glass; we therefore afterwards always used
the latter. In other cases monads, which immediately devoured the bacteria, were
cause of the failure; by transfers and by the use of pure cultures, these voracious
organisms could be rendered harmless or removed. When the distilled water is repla-
ced by tap-water, the number of flasks remaining without growth after inoculation
with the same quantity of garden-soil is much smaller.

l82

If once a pellicle has formed, transfers into the said culture liquid, prepared
either with distilled or with tap-water, come easily and without exception to develop-
ment.

2. Source of nitrogen required.

In the above mentioned nutriënt liquid we have chosen kaliumnitrate as source
of nitrogen. As well, however, kaliumnitrite or some anorganic ammonium salt may be
used. Very good results were obtained with:

Distilled water loo

Ammonium sulphate (or NH4 Cl) o.oi — o.i

Dikaliumphosphate 0.02

'Mineral solution« i drop

and with:

Distilled water 100

Kaliumnitrite o.oi — o.t

Dikaliumphosphate 0.02

»Mineral solution« i drop.

As both these liquids answer to the conditions of life of the microbes of nitrifica-
tion, the formation of uitrite or nitrate is actually to be observed when using them,
and when inoculating with garden-soil or with crude cultures. With the easily pro-
duced pure cultures of B. oligocarbophüus, of which more below, a good development
of the film is possible, by which experiment it can at the same time be proved, that
this microbe itself does not nitrify. Hence, ammonium salts or nitrites, added to excess
can, even for a year or longer, continue unchanged under the luxuriantly growing
pellicle of B. oligocarbophüus, whereas, in the presence of nitrifying ferments, they
completely disappear in a few weeks, being then found back as nitrates. If the fer-
ments of nitrification alone are present, there is no question of film-formation and the
nutriënt solutions remain perfectly clear.

Not only the nature of the nitrogen-furnishing substances, but also their quantity
can in these experiments, as already inferred in the recipes, vary between fairly wide
limits, and the same may be said concerning the conditions for the water culture of
higher and lower green plants. The limits allowable for B. oligocarbophüus, have not
yet been precisely fixed, but they certainly have a broader range for this organism
(circa o.i — 10 pro mille) than for the higher plants (0.5 — 5 pro mille).

By many experiments it was established, that in absence of kalium, phosphor, and
magnesium, a still slighter growth occurs, than when no nitrogen compounds are
given. Evidently B. oligocarbophüus finds in the atmosphere, in a condition fit for
nutrition, a quantity of nitrogen, which, although insufficiënt, should not be overlooked.
If the distilled water in the artificial solution is replaced by tap-water, a some-
what higher rate of organic substance is produced. As in tap-water a small quantity of
nitrogen compounds occur, — here, at Delft, about 0.4 milligrams of combined nitrogen
per litre, — whilst it contains the other necessary elements (phosphor and kalium, of
course, excepted) in an obviously favorable form for the nutrition of our mikrobe, one
can simply use for its culture:

Tap-water 100

Dikaliumphosphate 0.02

i83

It shüuld, hüwever, be kept in view, that the productivity ia bacterial substance,
in consequence of the film formation, is not determined by the vokime, but chiefly by
the extent of the surface of the medium, which is in f ree contact with the air. Hence,
in a very thin layer of tap-water, the nitrogen may soon be consumed, whereas, with
the same amount of nutriënt liquid, but with a smaller surface, consequently in a
thicker layer, the provision of nitrogen will suffice for a longer time. Therefore, in
order to óbtain from a flask of determined size, the maximum production of B. oligo-
carbophilus, a nitrogen compound should be added when a small quantity of tap-water
is used, which addition is not necessary when cultivating in a greater quantity in a
flask of the same size.

3. P u r e culture.

Our bacterium does not grow at all or only to a slight extent on the commonly
used bacteriological media, these containing too much organic food. But it is easy to
produce pure cultures on solid media, when observing the same precautions which I
described in the Meeting of the Academy of 27 June 1892 for the pure culture of the
ferments of nitrification on agar-plates i), and to which I referred in the Meetings of
30 March 1901 (Proceedings p. 586) and 25 May 1901 (Proceedings p. 5) when dis-
oussing the culture conditions of the oligonitrophilous Cyanophyceae.

In all these cases it is necessary as completely as possible to remove all soluble
organic substances from the solid medium, which is to be efïected by a prolonged
Avashing w-ith distilled Avater. The agar thus prepared, with the required nutriënt
i.alts, for instance in the proportion:

Distilled water 100

Agar 1.5

K.HPOi 0.0 1

KNOh (of NH4CI) o.oi

is boiled and plated, and used for strew-or streakcultures originating from a film of
B. oligocarbophilus. Very soon the common saprophytic bacteria which never lack in
the film, are seen to develop on the plate and when these by their growth and respira-
tion have consumed the soluble carbon compounds, which were not yet removed from
the agar by the extraction with water, B. oligocarbophilus itself begins to grow. This
is usually the case af ter 14 days. Then, however, the colonies become easily recogni-
sable, our bacterium being the only species which in the given circumstances can feed
on the atmospheric carbon, and so go on growing, whilst the growth of all other
species soon comes to a stop.

Even the colonies of the nitrifying ferments, which, as I have demonstrated before
(1. c), can grow fairly well on this medium, when instead of nitrate an ammonium
salt is used, remain very small, never exceeding i mM. or less. On the other hand,
the colonies of B. oligocarbophilus attain dimensions of i cM. and more and may then
easily be transferred in a pure condition into test-tubes on the said medium. They
grow on the agar as thin, snow-white or rosy-tinted, very dry, flatly extended layers,
which strongly remind of the pellicle floating on the liquid.

*) Nature, Vol. 46, pag. 264, 1892.

x84

Also on silica plates, prepared in glass dishes, which, after extraction of the
chlorides are soaked with a nutriënt solution, B. oUgocarbophiliis can produce very
fine cultures, appearing after some weeks, as snowwhite colonies with indented mar-
gin, and which by a right selection of the salts, can finally spread over the whole plate.
Then the remarkable phenomenon is observed, that the silica liquefies a little in the
centre of the colonies and sinks in by evaporation.

The silica plates are made as follows. A commercial solution of potassium silicate,
diluted with a known quantity of water, is titrated with normal hydrochloric acid. As
the solidification is much favoured by an alkaline reaction, a complete neutralisation
at the preparation of the plate should not occur, and as a plate, with a high percent-
age of silica, contracts strongly after coagulation, and expresses much water, the
dilution must be sufficiënt for this contraction to be delayed. Into a small beaker-glass
was introduced, in a certain case, 5 cM* of potassium silicate diluted with 25 cM» of
water, and into a second glass the required quantity of hydrochloric acid, amounting
te 10 cM» of normal acid. The acid is mixed with the diluted silicate and the mixture
poured into a glass dish. The solidification delays the longer as the mass is more
diluted, but it is easy, after some practice, to make very solid plates. The plate is first
freed from the chlorides by streaming tap-water, then washed out with boiled water,
and afterwards treated with the solution of nutriënt salts. When these have suffi-
ciently diffused into the plate, the glass dish is gently warmed at the underside, until
the adhering water has evaporated and the plate shows a »dry«, glossy surface. The
surface is flamed in the B u n s e n-burner, by which only a partly but sufficiënt sterili-
sation is to be attained.

Not only B. oligocarbophilus, but also the ferments of nitrification grnw on this
medium very well. By mixing of the diluted solution of the silicate with chalk, mag-
nesium carbonate, or ammonium-magnesium phosphate, snow-white plates may be ob-
lained, which are particularly fit for the culture as well of all these microbes as of
several lower algae. Even earth-diatoms, of the genus Nitzschia will grow thereon.

Once more it must be observed, that in the silica plates organic substances must
be absent, even fragments of cork, fallen into the silicate solution, may disturb the
experiment.

The pure cultures, obtained on agar or silica plates, are as well fit for the furtht-r
experiments on liquid media as the crude cultures, of which many experiments, con-
tinued for years, have convinced us. Every thought of symbiotic relations on which
the carbon assimilation by our bacterium might repose is thereby excluded, so that at
least the biological side of this part of our problem is clear.

Concerning the further properties of our bacterium in pure cultures, we can be
brief. In the films, as well as on in the colonies on the solid media, it consists of
minute, thin and short rodlets, probably always immobile. They are ca. 0.5 ju wide and
0-5 — 4 |Li long. The length however is very variable and frequently particles are seen
0.5 j^ wide and 0.7 — i jli Ion?-. Of ten, when not using reagents, such as dyeing sub-
stances or acids, no structure at all is to be observed, neither in the colonies nor in the
flowing pellicle, but the bacteria at once become visible by staining the preparations.
The thick cellwalls form the chief constituent of the colonies; albuminous matter is
only present in a slight quantity in this bacterium.

i85

4. The nutrition vvith atmospheric carbon.

A jjood appreciation of the carbon accumulation may be had as well by a direct
weighing as by the permanganate method.

For both determinations it is possible, to suck off the fluid, which is practically
free from hacteria, wholly or partly from beneath the film, so that the quantity of the
culture material, destined for the filtration or the determination of the permanganate
number, is not too voluminous.

In our experiments there only resulted a precipitate of calciumphosphate or cal-
ciumcarbonate, when we had used our tap-water, which is rich in lime, and when
kaliumphosphate, to excess had been added. These precipitates can, however, be dissol-
ved beneath as well as in the film by dilute acid, and then the acid can be expelled by
further washing. The film is so dry and wetted with so much difficulty, that all these
manipulations may be effected without much loss of material.

The permanganate number was determined after K u b e I's ^) methorl.

In relation to the quantity of organic matter found by direct weighing or by the
permanganate method and formed from the atmospheric carbon, the foUowing should
be well observed.

As B. oligocarhophilus grows only on the free surface of the medium, and not
in the depth, the thickness of the layer of the nutriënt solution and consequently its
volume, is, as already observed, actually indift'erent. That is to say, by enlarging the
surface of the solution, a bacterial film of any dimensions is to be obtained, which
circumstance is of importance for appreciating the productivity of a certain quantity
of a nutriënt solution, the more so as the thickness of the bacterial film is usually
only one cell-layer. How very thin the required thickness of this layer can be, growth
being still possible, may be derived from the fact, that, especially when using distilled
water with nutriënt salts, the film can mount at the apparently dry glass-wall from i
to 1.5 decimeter high, and not seldom extends on it nearly to the cotton plug. Only in
certain vinegar bacteria I observed the same.

As it seems that our bacterium forms no compounds prejudicial to its growth, so
the only circumstance, which governs its increase relatively to a given volume of
liquid, provided its surface be of a sufficiënt extent, is the lack of one or more cle-
ments necessary for the nutrition. Carbon cannot be among the number, our experi-
ments being made with free entrance of air.

Although it is thus established, that only the number of bacteria, produced
in a certain time per surface-unit, indicates the rate at which the atmospheric carbon
is assimilated, we vvill yet give the quantities in relation to the volume of the solution,
because then a comparison can be better made with the numbers found by other authors
for polluted waters.

5. H o w much carbon is assimilated.

First we determined by an experiment, in which, after vigorous shaking, a cul-
ture was divided into two equal portions, how much one half contained at direct

') Tieniann-Gar t ner's Handbiich der Untersucliung der Wasser, 4c Aiifl. pag.
255, 1895.

i86

weighing, of bacterial substance, whereas the other half was titrated with kaliuni-
permanganate. We used for this a three months old culture on:
Tap-water loo

Na.-HPOj 0.02

KCl 0.02

KNO3 0.02

The film from the part, destined for the weighing, was separated from the liquid
by filtration, washed out on the filter with strongly diluted hydrochloric acid, and
subsequently with distilled water, to remove the chlorids. Subsequently the filter with
the film was dried, first at 40" — 50" C. and then at 100" C, until the weight remained
constant. So we found that per litre 180 milligrams of bacterial matter were pro-
duced, and that, after deduction of 14 milligrams, used by a litre of our tap-water it-
self, the corresponding permanganate number was 94. We can thus, with an accuracy
sufficiënt for our purpose, accept that the relation between the two figures is as 2 : i,
that is to say, that the doubling of the permanganate number gives the weight of the
dry bacterial substance, and, as this latter number is much more quickly to be found
than the weight, we have contented ourselves with it in most our further deter-
minations.

We shall now give some more figures. Like the preceding they all relate 10
bacterial films produced in E r 1 e n m e y e r-flasks on 100 cM^. liquid with a free
liquid-surface of about 80 cM^.

By weighing we found in one case on:

Tap-water 100

KCl 0.02

KNO' 0.02

K2HPO, 0.04

after 5 month's culture 235 milligrams per litre. On:
Distilled water 100

KCl 0.02

KNO.s o.i

K2HPOt 0.02

»Mineral solution« i drop

after 5 months 220 milligrams per litre.

Some numbers, found by the permanganate method follow, and in the first place
some relating to tap-water.

The greatest production which we had, was obtained with tap-water 0.02 K2HPO4
and 0.02 KNO3, after a year's culture and amounted to 250 mgrs. of permanganate
per litre, nearly corresponding with 250 X 2 = 500 milligrams of dry bacterial sub-
stance.

After a shorter time the production is likewise smaller; so we found in a cul-
ture on: Tap water 100

NajHPOi 0.02

KCl 0.02

KNO3 0.02

after 5 month's culture (January to May) 202 mgrs. of permanganate, corresponding

with 404 mgrs. of bacterial matter per litre.

i87

If the tap-water was replaced by distilled water, the production of dry urganic
substance was commonly smaller, which cannot, however, result from the nutrition
by substances in the tap-water, oxidisable by kaliumpermanganate, for the i4mgrs.
of permanganate, which our tap-water consumed per litre, we found quantitatively
back, at the end of the cultivation period, in the clear liquid beneath the pellicle of
B. oligocarbophiles, which liquid can easily be sucked off with a pipette, without any
considerable bacterial contamination. Moreover the experiments with distilled water
have likewise exhibited great divergency in production, and though the cause has not
been established with perfect certainty, we still think it probable, that these differences
result from the greater or smaller density of the cotton plugs, by which the speed
of air entrance is greatly influenced. We base this supposition on results obtained
with flasks, only differing in the width of the mouths, and to which we shall refer
later. It is furthermore certain that we have not to do here with the infection of
other bacteria, or with monads, for the pure cultures displayed as considerable diver-
gency as the crude ones. Neither can the chief cause be attributed to a change in
percentage of the air in gaseous carbon compounds, the differences being observed
simultaneously in cultures placed side by side in the same locality.
But we now give some further numbers. In an experiment with:
Distilled water loo

KvHPOi 0.02

KNO2 o.i

KCl o.oi

»Mineral solution« r drop

sterilised and inoculated with a pure culture of B. oligocarbophilus, were found, after
^7 days' cultivation (2 Jan. — 19 Febr.) at 23" C, 66.6 mgrs. of permanganate, corres-
ponding with circa 133 mgrs. of dry bacterial substance per litre.
In another experiment with:

Distilled water 100

Na2HP04 0.02

KNO2 o.oi

»Mineral solution« i drop

likewise sterilised and after a culture of 40 days, at 23" C. the permanganate number
amounted to 6omgs., corresponding with 120 mgrs. of dry bacterial matter per litre.
In a third case in:

Distilled water 100

K2 HPO4 0.02

(NH4)2S04 0.02

NasCOs o.oi

»Mineral solution« 2 drops

after cultivating from 5 May to i Dec, 155 mgrs. of permanganate per litre were
found.

In a culture in: Distilled water 100

Na2 HPO4 0.02

KCl 0.02

KNO3 0.02

»Mineral solution« i drop

i88

from I June to i Dec. we found 165.5 mgrs. of dry bacterial substance, corresponding
with ca. 83 mgrs. of permanganate per litre. As we see, the differences are con-
siderable.

When a little natrium acetate was added to the anorganic solution, and when
using a pure culture for inoculation, we could neither state an augmenting nor a
diminishing of growth.
Thus we obtained in:

Distilled water 100

KCl 0.02

KNO2 o.i

Natriumacetate 0.02

K2HP0i 0.02

»Mineral solution« i drop
by means of weighing, 220 mgrs. of dry bacterial substance per litre, corresponding
with iio mgrs. of permanganate, which figures are not exceedingly high and might
likewise have been produced in the same time (4 months) from the air alone, without
acetate.

In all these experiments with distilled water, the free surface of the liquid was
also 80 cM2, and the air had to pass through a dense cotton plug, with which the
Erlenmeye r-flasks were closed. Already before we drew attention to the impor-
tance of the way in which the flasks are closed; be here still mentioned that we made
scme special experiments, which proved that a very narrow opening of the flasks,
slackens the growth of B. oUgocarhophilus, so that years may go by before the film
has vigorously developed. We could not, however, expected anything else, for the
considerable volume of air, required for the growth of the said quantities of bacteria,
can onlv verv slowlv diffuse inward and ontward through the narrow canal.

6. Carbonic acid cannot serve as food.

Various experiments were made to establish what may be the volatile atmo-
spheric carbon compound which renders the growth of B. oligocarhophUus possible.
That it cannot be carbonic acid, whether free or combined, resulted from the follow-
ing experiments. In closed culture-flasks with the best nutriënt solutions, and ar-
ranged in such a way, that at times a little free carbonic acid mixed with pure air,
could artificially be introduced, it was not possible to get any growth. This experi-
ment, which seemed of particular interest, has been so frequently repeated, and so
long continued under different conditions, that we consider it as quite certain, that
free carbonic acid cannot serve for the nutrition of B. oUgocarhophttus.

For testing the influence of combined carbonic acid, cultures were made, firstly
in the following solution:

Tap-water 100

Dikaliumphosphate o.oi

Kaliumnitrate o.oi

Natriumbicarbonate o.i

When cultivating at the free air surely a luxurious growth was obtained, hut it
was by no means more vigorous than when the bicarbonate was left out.

i89

If in this liquid the nitrate was replaced by aii animonium salt, the result was
quite the same.

Secondly, the bicarbonate was replaced by common natrium carbonate, the same
quantities of the different salts being used. But in this case the action proved rather
injurious than favorable. It is true that the film had become considerable after a few
months, but it was directly to be seen that the growth was so much inferior to that
of cultures obtained in the same circumstances but in absence of carbonate, that the
determination of the permanganate number seemed superfluous. Here, too, the re-
placing of nitrate by an ammonium salt or by a nitrite caused no change.

As a remarkable fact it may be mentioned, that in these experiments, in our large
flasks, containing a litre of air, the thin bacterial film mounted very high up the
dry glass-wall, which is likewise often observed in the Solutions made with distilled
water, and may repose on the absence of dissolved lime salts.

If the tap-water was substituted by distilled water, the addition of natrium car-
bonate did not cause an increase of bacterial growth either. We found, for in-
stance, in:

Distilled water loo

KjHPOi 0.02

(NH.)*S04 0.02

NaiCO;i o.i

»Mineral solution« i drop

after 7 months (5 May — i Dec.) 155 mgrs. of permanganate, corresponding with
ca. 300 mgrs. of dry bacterial substance per litre, which production is less than that,
obtained in other cases under the same circumstances but without carbonate, so that
here also, the action of the carbonate, the long time of cultivation being taken into
consideration, was not favorable. Quantities of carbonate, smaller than 0.1% were
neither successful.

The results of this examination can be thus summarised, that for the growth of
B. oligocarhophilus an atmospheric carbon compound is actually consumed, but that
this cannot possibly be free carbonic acid. Furthermore, that also combined carbonic
acid cannot serve for its nutrition.

7. Nature of the assimilated atmospheric carbon compoun d.

If the carbonic acid of the air cannot be the food of B. oligocarbophilus, what
other atmospheric carbon source might then come into consideration ?

It is clear, that we should think here of the carbon-containing component of the
air, discovered in 1862 by the botanist Herman n Karsten^), and recently dis-
covered anew by French experimenters, especially by Mr. Henriet-). It is true
that the chemical nature of this substance has been hitherto unknown^), but yet it is

*) H. Karsten. Zur Kenntniss des Verwesungsprocesses. Poggendorff's Annalen
Bd. 191, pag. 343. 1862. To this place, as also to the not unimportant older literaturc
on the carbon compound of the air, my attention was drawn by Mr. G. v an I terso 11.

-) Comptes Rendus T. 135, pag. 89 et loi. 1902.

') Henriet thinks that the substance must be a monosubstituted formamid with
the formula HCO.NHR, where R represents a still unknown alkylrest. But then it is

Distilled water

lOO

KiHPOi

0.02

Mg. S.Mn, Fe

traces.

Tap-water

100

KoHPOi

0.02

igo

certain that we have here to do with an easily oxidisable compound (or compounds),
for a prolonged contact with alkali and air already suffice to split off carbonic acid
from it. Furthermore, according to the statement of the French investigator, the sub-
stance probably contains nitrogen.

This latter circumstance gives rise to the question whether this nitrogen, like the
carbon, is fit for assimilation by our microbe. Though this question has already partly
been answered in the negative by the preceding experiments, it should still be remar-
ked here that in nutriënt liquids, without an expressly added nitrogen compound, for
instance in:

Or still better in:

without any further addition, a not inconsiderable growth of B. oligocarbophilus
may occur, so that at least traces of an assimilable nitrogen compound may be drawn
from the air by this bacterium, whereas, for the possibility of assimilation of the free
atmospheric nitrogen no indications were found.

We now turn to another question, which the assimilation of the atmosperic carbon
gives rise to, namely: How great is the quantity of the volatile substance wanted for
the formation of the bacterial film produced in our cultures? This question is closely
connected with the following: How much of the compound is moreover consumed
by the respiration of our bacterium, escaping as free carbonic acid? For answering
these questions we have to measure the quantity of the carbonic acid corresponding
with a determined weight of dry bacterial substance, granted that the carbon per-
centage of this substance be known.

Our experiments relating to the measurement of the quantity of carbonic acid pro-
duced, are not yet closed, but as to the first part of the question, we give the following
calculation to fix the volume of air wanted for the production of the carbon, actually
accumulated in the bacterial films. We hereby make two chemical suppositions which,
to be sure, are fairly well in accordance with truth. First, we admit that the carbon,
freed from the unkown compound, as carbonic acid by a prolonged contact with alkali,
is consumed quantitatively by our bacterium and, secondly, that the bulk of the bac-
terial cells consists of a substance possessing nearly the composition of cellulose*).

Let us now consider the case when, in H litre-flask with lOO cM^. of fluid and
a free surface of 8o cM^, after a month's culture a quantity of 20 mgrs. of dry bac-
terial substance is formed, which, calculated as cellulose, contains 44% C. ; we then
find in the 20 mgrs. of dry matter 8.8 mgrs. of carbon. According .to Henriet the
atmospheric carbon compound, present in a certain quantity of air, under prolonged

not easy to understand, why the production of carbonic acid takes place so readily.
It might then rather be expected that, with an alkali a formiate would result and no
carbonate.

O If accepting that the composition of the bacterial cells corresponds with that
of albuminous substances, then, instead 44% C„ 52 to 55% C. should be brought into
account, and in this proportion the volume of the air should be augmented.

igi

action of alkali, gives out as much carbonic acid as occurs already in a free state in
the same volume of air, that is per litre 0.3 cM». = 0.6 mgrs. in which 0.163 mgrs,
of carbon are pesent. Thus, for 8.8 mgrs. are wanted 55 litres of air. Consequently,
in the course of a month these 55 litres of air must have diffused through the cotton
plug inward and ontward of our K> litre-flasks, in order to produce the found quantity
of carbon, that is 76 cM^. hourly.

Though this figure should not be considered a priori as impossible, it still appears
to be very high, and the difficulty of accepting it increases, if still the addition has
to be made of a yet unknown, but apparently considerable amount consumed for the
bacterial respiration, which, as remarked above, seems necessary. We therefore think
that it must be admitted that the quantity of the atmospheric compound (or com-
pounds) assimilable by B. oligocarbophilus , is much larger in our laboratory atmo-
sphere, than in that of the Paris boulevard, analysed by Henriet, and that we have
here to do with an extremely variable factor. The circumstance, too, that we have
not as yet been able in our greenhouse, where the air, in the common sense of the
word, is surely much purer than in the laboratory, to obtain a vigorous growth of B.
oligocarbophilus pleads for this view. But here we could not always keep the tem-
perature high enough, so that we consider our experiments in this direction not yet
closed. Besides, we should observe, that in an empty, isolated room of the laboratory;
the quantities of combined carbon drawn from the air, were as great, or only little
less than in the laboratory itself, where the air was certainly impurer.

We are accordingly conscious that further experiments, with fresh atmospheric
air are wanted to decide, whether the carbon compound occurs in the atmosphere in
a constant or in a varying percentage. Only thereby it will be possible to ascertain the
distribution of this compound, by which, at the same time, the signification of B.
oligocarhophilns in nature will become clearer.

As to this signification, the question arises whether our microbe in substrata
containing sufficiënt mineral nutrients (N, P,' K, Mg, S, Fe, Mn), but being poor in
organic substances, is able to build up the latter in the dark from the volatile carbon
compounds occurring in the atmosphere of the surrounding medium. And furthermore,
whether carbon nutrition takes place exclusively in the floating dry films, — hence, in
the earth, only on the relatively dry surface of the earth particles, — or that also in
the depth of fluids growth and carbon assimilation be possible. The hitherto gathered
experience about the self-purification of rivers and the biological purification of water
in general, seems to exclude the latter hypothesis, and our own experiments too,
render it not probable. The result of these experiments consists, in our opinion, in
the very discovery of a microbe, which, in consequence of the film-formation, has the
specific faculty, to absorb for its nutrition and multiplication, from a gas, namely the
air, traces of volatile carbon compounds, by which the struggle for existence with the
rest of the microbic world can be successfully sustained. The biological purification
of water would, according to this view, find a counterpart in the biological purification
of the air by Bacillus oligocarbophilus.

Phénoménes de reduction produits par les
microbes').

Archives des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IX, 1904,
p. 131 — 157. — Verscheen onder den titel «Reductieverschijnselen door Mikroben be-
werkt* in Handelingen van het g" Nederlandsch Natuur-en Geneeskundig Congres,
gehouden te 's-Gravenhage, 1903, blz. 195—218.

Les phénoménes de reduction produits par la vie urganique reposent sur une
désoxydation ou une hydrogénation. C'est ainsi que la plupart des bactéries
sont capables, moyennant une nutrition intense et un libre acces de l'air, d'isoler Ie
selenium des sélénites et Ie teilure des tellurates ; quels que soient les processus chimi-
ques qui constituent cette reduction, en derniére analyse ils doivent consister en un
enlèvementd'oxygène. Lamêmeremarque s'applique au pouvoir que possèdent plusieurs
bactéries de transformer les nitrates en nitrites. Par contre, la transformation du lévu-
loseOHi^O" en mannite CH^^O", qui se produit par l'action des ferments lactiques de
l'industrie dans de bonnes solutions nutritives, ne peut être attribuée qu'a une addition
d'hydrogène. II en est de même du passage des sulfonates de I'indigo bleu a ceux
de I'indigo blanc sous l'action de beaucoup d'espèces de bactéries, ainsi que Ia for-
mation, pas nioins générale, de l'acide sulfhydrique aux dépens du soufre.

Quand on essaie de classer dans un de ces deux groupes chaque cas particulier
oü l'on observe un phénomène de reduction, on se heurte souvent a des incertitudes, et
en y regardant de plus prés on reqoit I'impression que Ia distinction que nous venons
de faire est artificielle, c. a d. que la désoxydation n'est pas a proprement parier un
processus a part, mais qu'elle repose sur l'action de I'hydrogène sulfuré ou d'autres
substances aisément oxydables, mises en liberté par les microbes ; il se peut d'ailleur s
que, comme les réductions mentionnées en second lieu, elle repose sur une addition, par
les microbes, d'hydrogène a Ia substance cédant de I'oxygène. On ne doit toutefois pas
se figurer ici Ia présence d'hydrogène libre; c'est plutót de I'hydrogène impossible a
déceler par'voie chimique et qui reste combine au protoplasme. Cette derniére remar-
que s'applique d'ailleurs aussi a Ia véritable hydrogénation. Ainsi, par exemple, les
ferments lactiques actifs produisent beaucoup d'anhydride carbonique mais pas du tout
d'hydrogène libre, ce qui n'empêche pas que ce sont eux précisément qui ajoutent de
I'hydrogène au lévulose, a certains corps colorants et probablement a beaucoup d'autres
substances encore. Quoi qu'il en soit, il est pratique de conserver la distinction entre
les deux groupes de phénoménes de reduction.

') Conférence avec démonstrations faite a Delft, Ie 16 avril IQ03. a l'occasion du
9e Congres des Naturalistes et Médecins hollandais.

193

Les processus de désoxydation exigent une source particuliere d'énergie extéri-
eure. A eet efïet, les microbes incolores se servent de l'une ou l'autre substance orga-
nique, sur laquelle ils transportent 1'oxygène qu'ils enlèvent au corps qu'ils réduisent;
sauf dans Ie cas de la décomposition de l'anhydride carbonique, dont je parlerai plus
tard.enquel cas c'est du soufre élémentaire, de l'hydrogène sulfuré etc. qui font l'office
de source d'énergie. D'ordinaire cette substance organique est oxydée a l'état d'anhy-
dride carbonique et d'eau, et même d'ammoniaque quand elle contient de l'azote. On
a donc affaire ici a un phénomène de »combustion intérieure«, une forme de respiration
intramoléculaire par laquelle la substance organique consommée (qui est évidemment
tout a fait différente du corps plus ou moins hypothétique, agissant directement d'une
maniere réductrice et que nous considérerons plus loin) est oxydée comme aliment res-
piratoire; a eet oxygène consommé on peut donner Ie nom d'»oxygène d'oxydation«.
Un bon exemple de ce cas, oü l'azote libre est tres nettement un produit de réduction,
est Ie processus de dénitrification, caractéristique d'un assez grand nombre d'espèces de
bactéries, et dont l'allure peut être représentée comme suit, si nous prenons p. ex.
l'asparagine comme nournture organique pour base:

5 C*Hm^O^ + 12 KNO^ - 6 K-'CO'' +9 CO"- + 5 {NH^yCO^ + 6 .V2
5 X 205 12 X 110,7 6 X 285,3 9X97,6 5 X 221,6

Les nombres places sous les substances actives dunnent les chaleurs de formation;
la différence prouve que la transformation est exothermique, avec développement
d'environ 1344,8 cal., soit 1,1 cal. pour chaque gramme de salpètre consommé.

On voit que l'oxygène libre n'intervient pas directement dans ce phénomène. Ce-
pendant les microbes qui Ie ^oduisent ne sont pas véritablement anaérobies, car on
peut les isoler de la maniere ordinaire par culture sur plaques a l'air libre, et il n'est
pas difficile de faire voir qu'en empêchant l'accès de l'oxygène libre on arrête Ie pro-
cessus de dénitrification au bout d'un temps relativement court. L'oxygène transporté
par Ie processus de réduction joue donc un tout autre róle que l'oxygène libre même
et n'est pas en état de Ie remplacer complètement. Il est nécessaire d'appliquer égale-
ment cette conclusion a la respiration ordinaire, aussi bien a la respiration d'oxygène,
accompagnée du développement d'anhydride carbonique, qu'a la respiration intramolé-
culaire proprement dite, oü il ne se combine pas, il est vrai, d'oxygène que l'on peut
déceler par voie chimique, mais dont il est pourtant bien prouvé qu'une réserve d'oxy-
gène, liée au protoplasme, est nécessaire pour entretenir Ie processus a la longue. Ce
raisonnement n'est modifié en rien par Ie fait, düment constaté a ce qu'il parait, qu'il
intervient dans la respiration intramoléculaire une substance provenant de la cellule
vivante, c. a d. une portion déterminée seulement du protoplasme, car l'expérience a
prouvé que l'activité de cette substance est limitée et de courte durée, de sorte qu'elle
a besoin d'être renouvelée pour que l'action reste continue, et c'est précisément pour ce
renouvellement que la quantité excessivement petite d'oxygène »libre«, mais lié au
protoplasme, sera nécessaire comme »oxygène excitateur«.

Il y a lieu, je pense, de faire remarquer ici que Ie doublé róle, si nettement joué
par l'oxygène dans les phénomènes de réduction produits par les microbes aerobics,
se retrouve d'une faqon correspondante chez les microbes que l'on qualifie d'»anaéro-
bies«. La aussi on peut faire voir, dans tous les cas connus jusqu'ici, qu'a cóté de la

M. W. P.eijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 13

194

consommation »intramoléculaire« d'oxygène, comme source d' énergie pour l'oxydation
de la substance organique, a laquelle peut servir par exemple l'oxygène combine fourni
par la réduction des sulfates (»oxygène d'oxydation«), une quantité tres petite d'oxy-
gène lihre (»oxygène d'excitation«) doit toujours être fournie par Ie milieu ambiant.
Il est vrai que cette dernière quantité est tres petite et ne peut pas être décelée par
voie chimique, mais d la longue l'absence complete d'oxygène libre arrête absolument la
croissance et toute autre manifestation vitale, n'importe dans quelle classe d'organis-
mes, donc aussi les processus de réduction, même chez les »anaérobies obligatoires«.
On voit par la qu'il n'existe pas d'organismes anaérobies dans Ie sens strict du mot;
voila pourquoi j'ai déja proposé a d'autres occasions de caractériser ce besoin, faible
mais toujours existant, d'oxygène libre chez ces microbes par Ie terme »microaéro-
philie«.

L'expérience suivante, faite avec des bactéries phosphorescentes, prouve que des
traces d'oxygène libre sont présentes même dans ces cas-la oü les réactions chimiques
ordinaires ne permettent pas d'en trouver, comme par exemple dans une solution
saturée d'hydrogène sulfuré dans l'eau, oü Ie bleu de méthylène et les sulfanates de
l'indigo bleu son transformés en substances réduites incolores.

Un flacon bien bouché a l'émeri est rempli d'une culture de bactéries phosphores-
centes, on attend jusqu'a l'obscurité complete, c. a d. jusqu'a ce que les dernières traces
d'oxygène libre aient disparu. Puis on remplit une pipette de la substance que Ton
veut examiner au point de vue de l'oxgène, p. ex. une solution aqueuse d'acide sulfhy-
drique, on ouvre Ie flacon et on plonge la pipette jusqu'au fond de la culture obscure.
L'air entrainé par cette opération occasionne une luminescence de quelques instants.
Quand elle a cessé on laisse s'écouler Ie liquide de la pipette et l'on observe alors nn
phénomène lumineux tres net. Des solutions de sulfite dè soude, conservées en flacons
fermés, contiennent encore plus d'oxygène libre que les solutions concentrées d'hydro-
gène sulfuré. Par contre, on constate que les cultures des microbes aérobies et anaéro-
bies ontlapropriété d'absorber facilement les dernières traces d'oxygène libre présentes
dans leurs milieux nourriciers. C'est la la raison pour laquelle les cultures des organis-
mes anaérobies réussissent si bien d'ordinaire, quand on emploie d'autres microbes
pour éliminer l'oxygène libre, de maniere a ne conserver que la faible réserve d'oxy-
gène libre, liée au protoplasme des bactéries anaérobies elles-mêmes. On voit de plu'^
qu'il n'est pas possible de chasser des milieux nutritifs les dernières traces d'oxygène
libre, même par des réactifs comme H-S et Na^SO^, sans l'intervention des microbes
eux-mêmes. Tout cela s'accorde fort bien avec la conception de la »microaérophilie«,
mais pas du tout avec de l'anaérobiose obligatoire.

II. Réduction des Sélénites, Séléniates, Tellurites
et Tellurates.

M. Schuerlen introduisit 0,05 a 0,1% de Na^Se O^ ou Na^TeO^ dans de la
gelatine a bouillon de viande, et montra que toutes les bactéries mises a l'épreuve
mettaient en liberté du selenium rouge vif ou du teilure noir. L'expérience est basée
sur Ie fait que les sélénites et les tellurites, contrairement aux sulfites, sont stables au
contact de l'air, mais sont aisément réductibles par les bactéries. Toutes les espèccs
de bactéries ne présentent pas toutefois cette propriété. C'est ainsi que dans l'eau de

195

canal j"ai pu découvrir deux especes dont les colonies sur plaques a stk'nite ou tellurite
restaient incolores.

Il est remarquable que M.Schuerlen n'ait pas examiné comment se comportent
les tellurates. Contrairement aux tellurites, qui sont déja tres pernicieux a 0,05% et
aux sélénites dont la mauvaise influence se fait déja sentir a 0,1%, Ie K^TeO'^, peu
soluble, n'est pas vénéneux niême en exces. Sa réduction est un peu difficile que
celle du tellurite, mais, quand on humecte d'eau de canal une plaque de gelatine ou
d'agar a bouillon de viande, contenant K'^TeO'^ en exces, on obtient au bout de quel-
ques jours une culture oü les colonies les plus fortement réductrices, comme les vibri-
ons et les formes de coli, sont noir intense, tandis que les autres, a pouvoir réducteur
moins puissant, présentent toutes les nuances entre Ie gris clair et Ie noir, et produisent
ainsi une véritable échelle permettant de juger de l'intensité de la fonction réductrice.
Les séléniates se décomposent beaucoup plus difficilement, ce qui n'empêche pas qu'a
l'abri de l'air, p. ex. dans des tubes a réaction profonds, on puisse obtenir de belles
cultures rouge foncé. Sur des plaques a Na^SeO* exposées a l'air ne se colorent que
quelques cultures tres fortement réductrices de Coli et Vibrio, qui perdent déja ce pou-
voir par un seul transport a l'air. Mais sur un terrain solide, dans des tubes bien pro-
fonds et a l'abri de l'air, les formes de Coli font toujours voir la réduction des séléniates
d'une faqon particulièrement nette. Toutes ces expériences se prêtent tres bien a des
démonstrations.

III. Réduction des nitrates en nitrites et en sels
ammoniacaux.

Outre Ie processus de dénitrification ^) dont il a été question et dans lequel il se
forme de l'azote libre aux dépens des nitrates, il peut aussi se produire une réduction
de ces substances en nitrites ou en sels ammoniacaux. La formation d'un nitrite est
une fonction tres généralement répandue chez les bactéries, mais elle ne se présente
jamais ni chez les levures ni chez les moisissures. La formation d'ammoniaque aux dé-
pens des nitrates (et des nitrites) est un phénomène beaucoup plus rare, que l'on ob-
serve par exemple chez les bactéries dites »du foin« et chez Asotohacter, quand on les
cultive dans les liquides contenant un nitrate et du sucre.

La formation de nitrite dans les cultures sur plaque est prouvée par l'expérience
suivante, tres démonstrative.

Dans la gelatine ou l'agar a bouillon destinés a la culture sur plaques on intro-
duit 0,5% d'amidon et 0,1% de KNO^. Dés que les colonies ou les traits commencent
a se développer on y verse une solution de IK+HCl, et l'on voit alors les colonies qui
ont formé KNO^ s'entourer d'un champ bleu sur un fond incolore. Comme la diffusion
du nitrite est rapide, la réaction doit être faite avec de jeunes cultures. Dans les
expériences avec l'eau de canal, la moitié a peu prés des colonies avaient formé du
nitrite. Les fluorescentes ne possèdent pas cette propriété ou ne la possèdent qu'a un
faible degré.

') On trouve des détails sur la dénitrification dans Gayon et Dupetit, Réduc-
tion des nitrates par les infiniment petits, Nancy 1886, et G. van Iterson, Accumu-
lation experiments w^ith denitrifying bacteria, Proceed. Acad. of Science Amsterdam,
vol. 5, pag. 148, 1903.

13*

[96

IV. Réduction de l'acidemolybdique libre.

Quand on introduit de l'acide molybdique libre dans une eau de viande et qu'on
J'infecte par du terreau, on voit se produire, au bout de quelque temps, une coloration
bleue par la formation du molybdate de l'oxyde de molybdène; tel est d'ailleurs Ie cas
aussi avec de l'acide phosphotungstique libre. Toutefois, comme les bactéries ne ré-
duisent pas les sels de ces acides, pour la recherche de ces organismes cette réaction
n'a pas grande valeur.

Mais il est remarquable que les ferments alcooliques, les fernients de l'acétate
d'éthyle et VOidium lactis possèdent la propriété de transformer, en présence de l'air,
l'acide molybdique en sel bleu (molybdate de l'oxyde de molybdène) a un degré beau-
coup plus fort que les bactéries, ce qui donne lieu a l'expcrience suivante

Dans un flacon contenant une gelatine a extrait de malt, déja refroidie mais en-
core liquide, on introduit une petite quantité, p. ex. 0,5% d'acide molybdique pulvér isé
et sec, on agite et on déverse sans tarder en plaque. Quand on inocule par traits les
espèces de microorganismes mentionées, on observe qu'au-dessous des végétations la
gelatine prend, au bout de quelques jours, une couleur indigo-bleu foncée. lei aussi il
n'est pas possible d'employer les sels molybdiques: l'expérience ne réussit qu'avec
l'acide molybdique libre. Les ferments lactiques et acétiques que l'on trouve en si
grande quantité dans la levüre de boulanger ne donnent pas cette réaction. Ce n'est
donc pas un processus de réduction ordinaire, mais il semble qu'il repose sur Taction
d'un produit de secrétion encore inconnu.

V. Expériences de réduction avec des substances colorantes.

C'est un fait bien connu que des substances colorantes organiques, comme les sul-
fonates de l'indigo, Ie bleu de méthylène, Ie tournesol et bien d'autres encore, sont
transformées en combinaisons incolores par un grand nombre de bactéries et repren-
nent a l'air leur couleur première. Le lait convient particulièrement bien pour la
démonstration de ces transformations, quand on y ajoute p. ex. du tournesol ou de
l'indigo et qu'on le laisse s'aigrir ou se gater dans des tubes a réaction profonds. La
consommation d'oxygène peut être mesurée approximativement par l'épaisseur de la
couche colorée qui se trouve au-dessus du lait caillé et décoloré, et qui indique jusqu'a
quelle profondeur l'air y pénètre. De même le bleu de Prusse et le bleu de Turnbull,
formés par précipitation dans du bouillon de viande, sont transformés en corps inco-
lores par plusieurs espèces de bactéries, et redeviennent bleus a l'air. Les réactions
que l'on rencontre a ce dernier propos sont surprenantes et méritent un examen plus
approfondi.

En outre, la plupart des bactéries sont capables de former une substance colorautc
bleu intense aux dépens du ferricyanate ferrique brun. La réaction est bien appropriée
pour des cultures sur plaques et s'opère comme suit, A de la gelatine au bouillon de
viande on ajoute un peu de citrate d'ammonium, de pyrophosphate de fer citri-ammo-
niacal et du ferricyanate de potassium; de cette faqon on obtient, après solidification,
une plaque jaunatre, presque absolument inoffensive pour les microbes. Quand on y
verse de l'eau de canal on reconnait en premier lieu les formes de Coli et les formes
voisines a la couleur bleu intense de leurs colonies. Petit a petit on voit aussi se co-

197

lorer les colonies moins actives, de sorte que cette methode aussi permet d'estimer d'une
maniere assez précise Ie degré d'intensité du pouvoir réducteur des diverses espèces.
Mais nous ne savons pas encore bien a quel phénomène biochimique ce processus doit
être attribué.

Chez les ferments alcooliques la fonction réductrice des substances colorantes est
taible ou absente. Toutefois, par l'emploi d'une grande quantité de levure, Ie bleu de
méthylène peut être décoloré. Ce pouvoir est lié ici au protoplasme d'une faqon ana-
logue a la fonction alcoolique, ainsi qu'il résulte du fait que chez la »Dauerhefe« de
MM. Buchner et Rapp^), qui ne peut pas croitre mais bien provoquer une fer-
mentation, la fonction réductrice du bleu de méthylène existe encore.

Si l'on tient a attribuer a un enzyme la fonction réductrice de la cellule de levure,
comme on Ie fait souvent aujourd'hui peur la fonction alcoolique, rien ne s'y oppose,
pourvu que l'on observe que Ie mot enzyme perd alors sa signification primitive.

Le meilleur exemple du fait que certaines bactéries chromogènes sont capables ie
décolorer les substances colorantes qu'elles önt elles-mêmes formées (ce que l'on
appelle la »réaction caméléon«) est fourni par Bacillus pyocyaneus, qui produit la
pyocyanine. Le même phénomène s'observe d'ailleurs chez B. viridis et B. indigo-
ferus.

La plupart des autres bactéries pigmentaires chromogènes, comme B. cyanogemis
du lait bleu, B. violaceiis qui est si abondant dans les eaux sales et B. prodigiosus, ne
réduisent pas le pigment qu'elles préparent.

Chez les formes chromatophores, c. a d. chez ces espèces dont Ia substance co-
lorante n'est pas cédée au milieu ambiant, mais reste liée au protoplasme, on n'observe
évidemment jamais de réduction du pigment.

VL La réduction des sulfates avec formation de H^S, sou f re,
sulfites, thiosulfates et tétrathionates.

A. La réduction des sulfates en général.

Les deux phénomènes de réduction les plus importants, continuellement en train
dans notre entourage dans ce qu'on appelle la »minéralisation« des substances organi-
ques, sont la réduction des nitrates, dont il vient déja d'être brièvement question, et
celle des sulfates.

La réduction des sulfates peut être »indirecte«, — terme qui sera expliqué tout
a l'heure, — ou »directe«.

Le dernier processus, particulièrement interessant par son ubiquité et son inten-
sité, est de la nature d'une vraie fermentation. Son étude rencontre de grandes dift'i-
cultés, parce que les bactéries qui le produisent appartiennent aux »anaérobies«, sont
tres sensibles aux changements des circonstances extérieures, et ne peuvent être ob-
tenues que tres difficilement en cultures pures. Comme il est important de connaitre
avec précision les conditions vitales de ces organismes, j'ai entrepris sur cette question,
avec Ie concours de M. A. van Del den, un examen soigneux et de longue durée.

') On peut se la procurer chez M. Sch roder, fabricant de levure, Landwehr-
strasse, a Munich.

Alais avant de communiquer les résultats de ces recherches, il est nécessaire de
faire quelques observations sur la »réduction indirecte« des sulfates. II s'agit d'uiie
fonctiontrèsfaiblement développée, malgré des conditions nutritives tres avantageuses,
chez divers microbes aérobies ou anaérobies sporogènes. J'ai cru tout d'abord que
l'hydrogène sulfuré, qui s'y formait, devait être mis tout entier sur Ie compte du
soufre combine dans les matières albuminoïdes contenues dans la nourriture; mais j'ai
reconnu qu'il n'en est pas ainsi, et qu'il y a réellement des sulfates qui disparaissent,
apparement parce qu'ils participent a la construction du protoplasme, riche en soufre.
des corps de ces microbes, décomposésaprès leur mort avec dégagement d'acide sulfhydri-
que ou d'autres sulfures. On voit par la que dans ce cas Ie H^S est en fait formé aux
dépens des matières albuminoïdes, mais ces dernières ont dü être formées d'abord
a l'aide des sulfates, de sorte que ce phénomène mérite bien Ie nom de »réductinn in-
directe« des sulfates.

Je recommande les deux expériences suivantes pour 1'observation de cette forme
de la réduction.

B. Piitréfoction de la ührine avec ou sans sulfates.

Quand on introduit dans deux petits ballons un peu de fibrine finement divisée,
qu'on la mélange avec de l'eau pour en forme une pate, qu'on y ajoute 0,02%
lOHPO* et 0,001 MgCl^ et en outre a un des ballons 0,02% MgSO*, qu'on infecte
■enfin par du terreau et qu'on cultive a 35 C, on observe ce qui suit.

Au bout de deux ou trois jours du papier au plomb, suspendu dans Ie col des
ballons, se colore en noir dans Ie ballon a MgSO'', mais est resté blanc dans Ie ballon
sans sulfate. La »réduction du sulfate« est donc certaine, mais elle est si faible que
la quantité qui a disparu ne dépasse pas ^/2o% MgSO". Les myriades de microbes
ont absorbé Ie sulfate et leurs cadavres se décomposent avec production de sulfides.
Quelques jours plus tard Ie ballon a fibrine sans sulfate commence aussi a dégager
fortement H^S, ce qui prouve qu'a ce moment Ie soufre de la fibrine elle-même est mis
€n liberté a l'état sulfure.

Comme ce phénomène s'observe aussi bien quand on infecte avec du terreau
pasteurisé qu'avec du terreau frais, il est évident qu'il est produit par des bactéries
sporogènes.

(". Forviation indirecte de sulfides par Coli et Aërogenes.

J'ai fait voir antérieurement *) que, moyennant une nutrition et une aération
actives, les bactéries de fermentation des groupes Coli et Aërogenes, universellement
répandues, sont capables de produire, aux dépens des matières albuminoïdes, des sul-
fides qui transforment en sulfure Ie carbonate de plomb. L'expérience suivante prouve
que ces bactéries peuvent former également une petite quantité de sulfide, par voie in-
directe, aux dépens de sulfates. On met un peu de carbonate de plomb entre deux
filtres, que l'on place dans luie cuvette en verre; on préparé ainsi deux de ces cuvet-
tes; dans l'une on verse un peu d'une solution nutritive de la composition suivante:

') I'ormation de l'hydrogène sulfuré dans les canaux. Ces Archives, (2), 4, i, 1901

199

H^O

. lOO

Asparagine . .

• 0,5

Saccharose . .

5

K-'HPO' . . .

0,02

MgCP ....

0,01

et dans l'autre un peu de la même solution oü l'on a remplacé MgCl^ par MgSO*.

A la sur f ace des filtres on tracé des traits inoculatoires avec Coli et Aërogenes
et on cultive a 28° C. Au bout de un a deux jours on observe que sur les filtres avec
MgSO'^ les traits de Coli sent devenus brun pale, ceux de Aërogenes brun foncé, tan-
dis que sur les filtres a MgCl^, pour Ie même développement, les traits sont restés in-
colores. Comme les diverses variétés de Coli et Aërogenes se comportent différemment,
l'expérience ne réussit pas toujours avec la même netteté.

L'explication du phénomène est la même que dans Ie cas precedent.

D. La réduction directe des snlfates par des spirilles.

Comme cause de la »réduction directe« des sulfates dans la boue de nos canaux
et fossés, j'ai découvert en 1894 une petite espèce de spirille anaérobie, a laquelle
je donnai Ie nom de Spirillum desulfuricans^). Comme eet organisme ne présente
généralement qu'un tour de spire et est tres petit, on doit Ie rattacher au genre
Microspira que M. Migula a établi depuis. Des recherches ultérieures ont appris
que la réduction des sulfates dans l'eau de mer est également produite par une
Microspira, obtenue en culture pure pour la première fois par M. A. van Delden
et qui requt Ie nom de Microspira aestuarü, parce qu'elle habite a proprement parier
les bas-fonds (en hollandais »walden«) et les alluvions (»schorren«) de notre cóte 2).

Quiconque connait nos cótes argileuses sait que Ie sol en est coloré en noir par
du sulfure de f er, jusqu'a une profondeur assez grande, inconnue d'ailleurs; cette sub-
stance est Ie produit de l'activité de M. aestuarü et se forme par la réduction de
FeSO* OU de CaSO* en présence d'un sel de fer. Les conditions vitales des formes
d'eau douce et marines sont a peu prés les mêmes; la difïérence principale est un pou-
voir réducteur plus grand chez M. aestuarü, qui est capable de former 925 mgr. de
H^S par litre, correspondant a 2240 mgr. de SO^, tandis que M. desulfuricans, a
pouvoir beaucoup plus faible, ne peut former que 246 mgr. de H^S tout au plus, ce
qui revient a 580 mgr. de SO^ par litre. Une seconde dift'érence capitale consiste en
ceci, que M. desulfuricans ne peut supporter que de o a environ 2% NaCl dans son
milieu nourricier, tandis que M. aestuarü en supporte de i }^ a 6%. Ces nombres
prouvent donc que dans une. eau saumatre, contenant de i K- a 2% de sel marin, les
deux formes peuvent exister cóte a cóte. Pour ce qui regarde la nourriture organique,
les conditions vitales des deux espèces sont sensiblement les mêmes. De nombreuses ex-
périences ont appris que la vie de nos spirilles peut être entretenue a l'abri de l'air
par les substances alimentaires les plus diverses, y compris la cellulose en décom-

*) Le Spirillum desulfuricans, agent de la réduction des sulfates. Ces Archives 29,
233, 1896.

*) A. van Delden, Beitrag zur Kenntnis der Sulfatreduction durch Microspira.
•CentralbL f. Bacteriol. 2te Abt. Bd. 11, pg. 81, 1903,

200

position; voila pourquoi dans la nature on peut observer une formation de sulfures
partout oü des matières organiques se trouvent a cóté de sulfates, c. a d. presque par-
tout. Nous avons reconnu que les lactates et les malates sont des sources de carbone
particulièrement avantageuses, et que comme sources d'azote surtout l'asparagine et
la peptone se laissent facilement assimiler. Comme solutions nutritives complètes
je recommande surtout les liquides suivants. Pour M. desulfuricans:

Eau de conduite ou de canal . . loo

Lactate de sodium 0,5

Asparagine 0,1

K^HPO' 0,05

MgSO^.yH^O 0,1

Sel de Mohr 0,01 — 0,02

et pour M. aestuarii:

Eau de conduite 100

NaCl 3

K^HPO' 0,05

Lactate de sodium 0,5

Asparagine 0,1

MgS0*.7H^0 0,25—0,4

Sel de Mohr 0,02 — 0,01.

Par suite du phosphate de potassium ces mélanges ont une réaction légèrement
alcaline; ils sont troubles par un précipité de phosphate de fer et de chaux. On doit
faire les expériences dans des flacons pas trop petits, a bouchon de verre fermant her-
raétiquement, et complètement renlplis pour éviter autant que possible Ie contact
de l'air.

Le processus de réduction qui s'y opère a lieu de la maniere suivante, ainsi que
les déterminations quantitatives de Tanhydride carbonique et de l'hydrogène sulfuré
nous en ont donné la certitude:

2 C^H^NaO^ + 3 Nd'SO^ - 4 NaKO^ + 2 CO^ + 3 H^S + 2 mo.

Ce processus est exothermique et donne lieu a un dégagement de 42,7 cal., soit
0,1 cal. par gr. de Na^SO* reduit.

On commence l'expérience avec un peu de vase de canal ou de mer. Pour être
certain de la réussite de l'expérience on peut ajouter au flacon un peu de sulfite de
sodium, mais ce n'est pas indispensable. Quand la forftiation de H^S a dure assez
longtemps, dix jours par exemple, pour que plus de la moitié de la quantité de sulfate
disponible soit décomposée, on transporte une gouttelette de la culture dans un flacon
contenant la même nourriture, mais stérilisée et oü l'on n'a pas introduit de sulfite.
On répète les transports et bientót on obtient un processus d'allure tres constante.
L'examen bactériologique a du reste fourni a ce propos un résultat tres remarquable.
Par transport sur une plaque de gelatine a bouillon de viande, oü Microspira desul-
furicans ne peut se développer puisqu'il est anaérobie, les réductions grossières par
cette dernière espèce fournissent toujours une culture pure d'une variété déterminée de

Coli ^), tandis que les cultures grossières de M. aestuarii, transportées sur uiie gelatine
a bouillon de viande avec 3% NaCl, oü M. aestuarii ne peut pas non plus se développer
comme anaérobie, donnent exclusivement un Micrococcus particulier.

Ni cette forme de Coli, ni Ie Micrococcus ne peuvent réduire les sulfates directe-
ment, mais ce sont les seuls microbes qui, dans la lutte pour l'existence, peuvent
l'emporter sur les autres organismes aérobies, qu'ils refoulent donc, et ce sont eux qui
enlèvent l'oxygène des solutions nutritives d'une faqon si complete que les micro-
spirilles de la réduction de sulfates peuvent s'y développer vigoureusement.

Pour obtenir ces derniers organismes en culture pure, on peut se servir des li-
quides mentionnés, mélanges avec 10% gelatine, mais on doit y ajouter en outre un
corps avide d'oxygène. A eet effet on peut employer avec avantage une quantité de
H^S plus que suffisante pour enlever presque tout l'oxygène dissous (voyez pag. 194);
mais, comme dans ces circonstances il n'est pas permis de faire usage d'un sel de fer
comme indicateur, pour reconnaitre les colonies productrices de H^S, l'emploi de
Na^SO^ par M. van Delden constitua un grand progrès.

Mais même dans ces conditions la culture pure de nos spirilles est difficile, parce
que ce ne sont jamais des germes isolés qui se développent, mais des agrégats de ces
germes, et l'on conqoit que ces agrégats contiennent presque toujours quelques in-
dividus de Coli ou du Micrococcus.

Il s'ensuit que, quand on inocule les cultures grossières pour la première fois dans
la gelatine, les colonies qui, par la formation de sulfure de fer, prouvent qu'elles con-
tiennent des spirilles actifs, ne sont jamais pures mais contiennent aussi Ie Coli ou Ie
microcoque. Pourtant, si l'on effectue un nouveau transport de ces colonies sur Ia
gelatine de culture, au fond d'une éprouvette profonde, il y a de grandes chances de
voir se développer ici ou la un agrégat de spirilles tout a fait pur, ce que l'on reconnaït
d'ailleurs a la coloration noire intense, produite dans ce cas par la colonie. Nous som-
mes réellement parvenus de cette maniere a purifier M. desulfuricans aussi bien que
M. aestuarii, et a les conserver a l'état pur par des transports réguliers a l'intérieur de
la gelatine nourricière.

Les expériences de réduction faites avec ces cultures pures sont surtout intcres-
santes parce qu'elles commencent bientót et sont beaucoup moins dépendantes de la
nourriture que les cultures grossières; cela provient évidemment de l'absence d'espèces
microbiennes ennemies, comme les bactéries putréfiantes et les ferments butyriques, qui
refoulent si aisément ces spirilles des cultures grossières, p. ex. dans l'eau de viande
et dans les solutions sucrées. Dans des flacons remplis de bouillon de viande, avec une
tracé de sel de Mohr comme indicateur, les cultures montrent a 30° C. la réduc-
tion des sulfates déja au bout de 24 heures. Ce n'est donc pas tant la grande sensibilité
des spirilles réducteur pour de hautes concentrations des substances organiques que l'in-
fluence des microbes antagonistes, mieux adaptés que les spirilles a ces hautes concen-
trations, qui explique pourquoi la réduction des sulfates dans des expériences de labo-
ratoire est restée si longtemps obscure.

Enfin, j'ajouterai encore que M. desulfuricans, aussi bien que M. aestuarii, trans-
forment les sulfites et les thiosulfates (Na^S^O'') en H^S encore plus facilement que

que c

) C'est la ce qui a fait croire a M.Saltet (Handel. 7e Congres, Haarlem i8go, pg.378)
"'est Coli qui provoque la réduction des sulfates.

les sulfates, et que la présence de nitrates et de nitrites empêche complètement tous
ces processus.

La grande quantité de WSj continuellement produite dans la nature par les micro-
bes réducteurs des sulfates, entretient comme on sait une flore et une faune micro-
biennes tres riches et tres remarquables. Cette substance est en outre Ie point de
départ de bien d'autres phénomènes de réduction encore, soit qu'elle agisse directement
et décolore p. ex. des substances colorantes, comme Ie bleu de méthylène, soit qu'elle
ci'mmence par être plus ou moins complètement oxydée. Dans ce dernier cas elle donne
naissance a du soufre libre, aux thiosulfates (S^O^Na^), aux sulfites (SO^Na^), aux
tttrathionates (S'^O^Na^), ou enfin elle régénère les sulfates eux-mêmes. Tous ces
corps donnent lieu a des processus tres interessants, que nous avons appris a connaitre
seulement dans les derniers temps.

Ces corps peuvent du reste se comporter de deux faqons différentes. En premier
lieu, ils peuvent retourner a l'état d'acide sulfhydrique. En second lieu, leur oxydation
peut fournir l'énergie nécessaire aux microbes intéresses pour se servir exclusivement
d'acide carbonique comme source de carbone, c. a d. pour réduire eet acide carbonique
et Ie transformer donc en des combinaisons plus riches en carbone.

Ces deux biochimismes seront traites successivement; commenqons par la bio-
Senèse des sulfures. Tandis que la propriété de réduire les sulfates appartient au
groupe bien déterminé de Microspira, il n'en est pas de la formation de H^S aux
dépens des combinaisons inférieures du soufre et de Toxygène, ou aux dépens du
soufre même, qui sont aisément transformés en sulfures par un grand nombre d'espèces
de microbes. Voici quelques cas principaux.

VII. Formation de sulfures aux dépens d'o xydes inférieurs
du soufre et du soufre lui-même.

A. La réduction des sulfites par la bacterie des sulfites.

En isolent les spirilles réducteurs des sulfates nous avions remarqué de temps en
temps que notre gelatine de culture contenait quelques colonies, oü s'amassaient de
grandes quantités de soufre libre. Dans certains cas nous avions constaté Ie même
phénomène dans des expériences, a l'aide des chambres de verre, pour observer des
mouvements ou des lignes de respiration. Enfin nous avons reconnu que dans ce phéno-
mène agit une espèce de bacterie particuliere, qui possède les deux propiétés remar-
quables suivantes. Moyennant une riutrition carbonée convenable, elle reduit les sul-
fites a l'état d'hydrogène sulfuré, et, si l'on permet une aération modérée, elle oxyde Ie
1-nS avec dépót de soufre. Ces réactions peuvent donc être représentées par les deux
formules suivantes:

I. C^H^NaO' + 2 Na^SO^ = CO^NaH + 2 CO^Na^ + 2 H-S.
II. 2 H^S + 02 = 2 H^O + S^.
Cette bacterie est »anaérobie« (fortement microaérophile) ; elle ne se laisse pas
cultiver a l'air libre et dans des tubes profonds elle donne, dans la gelatine a lactate et
asparagine, a quelque distance de la surface un niveau de soufre tres remarquable. On
constaté que ce soufre n'est déposé a l'état de gouttelettes que dans l'intérieur des
colonies, qui sont constitutées par de petits batonnets courts et mobiles.

Il n'y a que quelques bactéries dont Ie corps même contient des gouttes de soufre.
s ne produisent pas de spores et ne liquéfient pas la gelatine.

B. Aiitres microbes qui peiivent transformer les sulütes en sulüdes.

La propriété de réduire les sulfites n'appartient pas exclusivement a la bacterie
des sulfites; il semble que tous les microbes qui forment aisément H^S aux dépens du
soufre et des thiosulfates la possèdent. Il est du moins certain qu'il en est ainsi pour
les levures actives, c. a d. celles de la bière, du vin et du pain (Saccharomyces cere-
visiae, S. ellipsoideus, S. panis), et pour les bactéries du groupe Coli.

Vu la facilité avec laquelle les sulfites absorbent l'oxygène de l'air pour s'oxyder
a l'état de sulfates, les expériences ne peuvent pas se faire sur plaques mais doivent
être faites a l'abri de l'air, donc dans des liquides ou au fond de tubes a réaction
profonds.

Avec la levure on rcussit Ie plus facilement en ajoutant o,i% Na-SO^ a une so-
lution a io% de sucre de canne, que l'on fait vivement fermenter. Le papier au plomb
permet de constater le dégagement de H^S.

On peut examiner le groupe Coli au moyen d'un mélange dont la composition est

Eau IOC

Glucose ... 5

Asparagine . o,i

K^HPO' . . . o,oi

SO^Na^ . . . 0,05.
Au bout de 24 heures de culture a 28" C. le papier au plomb, suspendu au-dessus
du liquide dans le col du ballon, se colore en noir.

Le même mélange a gelatine et 0,01% de sel de Mohr comme indicateur, intro-
duit dans des tubes profonds, se colore en noir au bout de quelques jours, quand on y
sème le Coli a la surface ou quand y introduit le même microbe a l'intérieur.

C. Formation de sulüdes aux dépens de thiosulfates ou du soufre.

Quand on remplace dans les dernières expériences le sulfite (Na-SO'^) par du
thiosulfate (Na-S^O^), on constate que le dégagement de H^S est encore plus vif. Le
processus change d'ailleurs en même temps de nature car, bien que l'on n'observe
aucune séparation de soufre, on doit néanmoins admettre que du soufre se sépare
réellement pour être immédiatement transformé en H^S. Le sulfite produit restant
peut alors subir a son tour la désoxydation dont il a été question a propos de cette
substance même. Les raisons pour lesquelles on se figure le phénomène de la sorte som
les suivantes. En premier lieu, par la séparation de soufre du thiosulfate il se dégage
de la chaleur, ce qui fait que cette scission peut être utile comme source d'énergie et
peut aisément avoir lieu. En second lieu, en présence de la nourriture organique
nécessaire, plusieurs bactéries transforment 5" en H^S (ou un autre sulfure), de sorte
qu'il n'est pas nécessaire que le soufre, séparé du thiosulfate, devienne visible
comme tel.

Ces faits donnent lieu a diverses expériences, dont je citerai les suivantes.

Expérience aux vibrions. A de la gelatine au bouillon de viande ordinaire on

204

ajoute '■A% Na^S^O^ ou 2% de fleur de soufre et un peu de pyrophosphate de fer citri-
ammoniacal des pharmaciens comme indicateur; après la coulée et la solidification de
la plaque on y verse de l'eau de canal, dont on enlève ensuite l'excès et on cultive a
23" C. Au bout de quelques jours on voit s'y développer Ie mélange ordinaire de bac-
téries, oü les colonies de vibrions deviennent brun-noir par la formation de FeSj tan-
dis que celles des bactéries qui produisent moins énergiquement H^S, comme Coli,
se présentant avec une teinte brun-clair. Contre toute attente, on observe que eet
FeS ne s'oxyde que tres lentement a l'air, et c'est la ce qui donne a l'expérience son
élégance. Cette oxydation se produisant toutefois, les colonies dont Ie pouvoir de for-
mer H^S est faible restent incolores.

Pour plus de simplicité, nous ne parlons ici que de H^S, mais il se peut fort bien
qu'il se produise encore d'autres sulfides; cela ne fait toutefois aucune différence en
principe.

Cette expérience peut servir a prouver que sur des restes d'animaux en putréfac-
tion les vibrions sont beaucoup plus nombreux que dans Ie sol ou dans l'eau de canal
brute, et qu'il est possible d'accumuler ces organismes en introduisant la matière a
examiner dans des solutions de peptone ou dans un bouillon de viande.

Dans mon laboratoire on prouve ainsi, avec grande certitude, l'existence dans
notre eau de canal d'une espèce de vibrion, différente de Vibrio proteus, et a laquelle
nous donnons Ie nom de Vibrio devorans, en égard, a la faqon, caractéristique dont
elle ronge les plaques de gelatine.

Expériences avec des levures et avec des bactéries du groupe Coli. Les ex-
périences précédemment décrites, relatives a la formation de H^S, aux dépens de
sulfites, par des levures alcooliques et par Ie groupe Coli, peuvent être rendues beau-
coup plus convaincantes encore en remplaqant Ie sulfite par de la fleur de soufre ou
par un thiosulfate. Siirtout la présence des deux substances nommées en dernier lieu
dans des fermentations alcooliques intenses donne lieu a une formation énergique de
sulfide OU de H^S.

En vertu de ce qui précède, il est donc tout naturel que la vase des canaux, mc-
langée de fleur de soufre, dégage un torrent de H^S, surtout quand on y ajoute en
outre 0,01 % K^HPO'^ et une source de carbone, p. ex. de la cellulose (l'azote y est
déja présent en quantité suffisante).

VII, La q u e s t i o n de l'e x i s t e n c e d'e nzymes réducteurs spéci-
fiques, r»Hydrogénase« et la »Réductase«.

Quand on fait un extrait de levure de boulanger ou de levure de bière au moyen
d'alccol a 50%, la cellule meurt; si l'on introduit maintenant un peu de fleur de soufre
dans l'extrait filtré, clair et sans cellules, on constate qu'il s'en dégage un peu de
H^S. En abandonnant l'extrait a lui-même ou en Ie chaufïant on observe qu'il perd
rapidement cette propriété. Il parait donc que dans ce cas aussi la parti du proto-
plasme vivant, d'oü provient l'hydrogénation, est quelque peu soluble, et il est recom-
mandable de lui donner Ie nom d'»hydrogénase« 1).

*) L'ingénieur M. Rey Pailhade, qui a découvert eet enzyme, Ta appelé »philo-
thion«. Sur un corps d'origine organique hydrogénant Ie soufre a froid. Comptcs rendus,
106, 1683, 1888.

205

Il n'est pas impossible que Ton parvienne un jour a prouver 1'existence d'une
hydrogénase dans les bactéries considérées dans ce travaii. Il ne peut toutefois pas
être question ici d'un enzyme soluble, tel que la diastase ou la trypsine, — dans tous
les cas la substance est insoluble pour de beaucoup la plus grande partie.
Il parait que c'est un clément constitutif du protoplasme dont elle ne se laisse pas
séparer. Aussi, dans Tétude ultérieure de la fonction réductrice devra-t-on nécessaire-
ment prendre comme point de départ la cellule vivante elle-même. De cette maniere
seulement la fonction sera connue dans toute son étendue, mais non par une pré-
paration de quelques parties mourants ou mortes du protoplasme, enlevées a la cellule
par de rudes procédés chimiques, oü la fonction dont il s'agit ne peut être que diffi-
cilement démontrée et dont l'étude ne peut conduire qu'a des conceptions défectueuses
du mécanisme de la vie. Ce n'est que dans Ie cas oü il est possible d'extraire de la
cellule une substance active, de telle faqon que Ie processus qui se produit sous l'action
de cette substance soit plus intense et plus parfait que sous l'action des cellules elle-
mêmes, que I'isolement en a quelque importance. Cependant, pour ce qui regarde les
enzymes ordinaires solubles, même dans ce cas l'utilité de leur isolement n'est pas
bien grande, car les préparations obtenues sont généralement si impures que quelques
impuretés de plus ou de moins sont presque sans influence.

Il n'a pas été possible de déceler r»hydrogénase« dans des levures ou des bac-
téries tuées au chloroforme ou a l'alcool. Cet enzyme »meurt« donc avec Ie proto-
plasme; mais la possibilité de conserver l'activité d'une petite portion par un extrait
alcoolique fait avec précaution prouve que la vie s'y maintient avec plus de ténacité
que dans Ie »protoplasme moyen.«

Tout ce qui vient d'être dit ici de l'hydrogénase s'applique d'une maniere corres-
pondante a cette partie du protoplasme qui possède la propriété d'enlever de l'oxy-
gène, et que l'on pourrait donc qualifier de »réductase«. Mais a propos de cette der-
nière substance on n'est pas encore parvenu a démontrer son action en dehors de la
cellule vivante; aussi certains auteurs considèrent-ils cette forme de Ia fonction ré-
ductrice comme un criterium spécifique de la vie et rejettent-ils toute idéé d'enzyme.

VIII. R é d u c t i o n de l'a n h y d r i d e c a r b o n i q u e p a r d e s b a c t é r i e s
incolores, avec Ie soufre, l'hydrogène sulfuré,
un thiosulfate ou un tétrathionate comme source d'énergie.

M. Winogradsky a prétendu que les ferments de la iiitrification emploient
l'énergie, mise en liberté par l'oxydation des sels ammoniacaux en nitrites et des ni-
trites en nitrates, pour la réduction de l'anhydride carbonique afin de se procurer Ie
carbone nécessaire a la nutrition. Je n'ai pas pu me convaincre de l'exactitude de
cette assertion, mais j'ai fait voir dernièrement *) que M. Winogradsky n'a pas
remarqué l'existence, dans les liquides nitrifiants, d'un microbe (Bacillus oligocarbo-
philus) qui se nourrit du carbone organique contenu dans l'air du laboratoire.

C'est a ce microbe, dont la respiration fournit donc de l'énergie de la maniere
ordinaire, et non aux ferments de la nitrification, que l'on doit attribuer l'accumulation

') Centralbl. f. Bacteriologie, 2te Abth. Bd. lo, pag. },t„ 1903.

2o6

de carbone que Ton observe parfois dans les liquides nitriiïants de laboratoire. Aussi,
dans une serre, oü l'air est beaucoup plus pur, on n'observe qu'une tres faible fixation
de carbone atmosphérique, bien que la nitrification soit tout aussi cnergique, acondition
loutefois que les appareils de culture ne contiennent pas d'organismes verts.

Dernièrement M. Natanssohn^') a repris la question. Il a montré que Toxy-
dation de H-S et de Na^S^O^ dans l'eau de mer permet a certaines bactéries marines
de réduire CO^ et de s'en nourrir.

L'exactitude de cette observation, je puis l'affirmer et l'étendre par mes propres
expériences.

J'ai reconnu tout d'abord que Ie phénomène se produit plus facilement encore dans
l'eau douce que dans l'eau de mer et que les bactéries spécifiques de ce processus sont
tres répandues dans l'eau et dans la vase des canaux.

Les épreuves sont excessivement simples et élégantes.

A. Réduction de l'anhydride carhonique avec un thiosulfate,
un tétrathionate on H^S comme source d'énergie.

Dans un ballon ordinaire avec libre acces de l'air on introduit la solution
suivante:

H^O IOC

Na^S^-OK sH^O 0,5

K^HPO* 0,02

(NH*)Cl 0,01

NaHCO^ 0,1

MgCl^ 0,01;

on infecte avec une grande quantité d'eau ou de vase de canal et on cultive entre 25 et
30° C. Au bout de deux ou trois jours la surface se recouvre d'une fine couche de
soufre, contenant une des bactéries dont il s'agit sous forme de batonnets courts et
mobiles.

Par transport de la pellicule dans Ie même mélange mais sans vase, on obtient déja
au bout de 24 heures une magnifique culture, tres riche en bactéries.

Dans Ie liquide de culture Na^S-0^ peut être remplacé par Na^S'^0^ ou CaS, et Ie
0,1% de bicarbonate de sodium par 0,05% Na^CO^. Les réactions qui se produisent
alors sont:

L S^O-^Na^ + O — SO'Na^ + S
IL S^O^Na^ + Na^CO^ + 0 = 2 SO'Na'-' + CO'-" + S^
et III. H^S + 0 = H^O + 5-;

ces processus sont tous exothermiques et l'énergie qu'ils mettent en libérté produit la
réduction de l'anhydride carbonique.

Quand on prend toutes les précautions nécessaires pour éliminer les dernières
traces de substances organiques, l'expérience réussit tout aussi bien. Au contraire,
l'addition de matières organiques les plus difïérentes aux liquides de culture entrave

*) Ueber eine neue Gruppe ven Schwefelbacterien. Mitt. a. d. Zool. Station Neapel,
Bd. 15, H. 4, p. 655, 1903.

207

Ie développement de ce microbe rcmarquahle. Aussi 1'acide carbonique ne peut-il être
remplacé ni par l'urée, ni par des oxalates ou des formiates.

Quand on traite la pellicule au benzène pour dissoudre Ie soufre, Ie benzène est
rendu trouble par des gouttelettes d'eau oü se rassemblent les bactéries. Ces dernières
sont précipitées par l'alcool, qui dissout Ie benzène, et l'on constate alors que Ie nombre
des bactéries est si considérable que l'on ne saurait douter de la réduction de l'an-
hydride carbonique pour la production de la substance organique accumulée dans la
matière bactérienne.

Pour obtenir la bacterie en culture pure, on etend les cultures liquides sur une
plaque obtenue en mélangeant la solution décrite a de l'agar. Les colonies de bactéries
productrices de soufre sont reconnaissables, au bout de deux ou trois jours, a la grande
quantité de soufre qui s'y sépare et qui leur donne un aspect poussiéreux, ce qui n'a
pas lieu chez les espèces concomitantes. Parmi ces dernières Ie Vihrio devorans
déja mentionné a la pag. 204 est remarquable, parce qu'on constate que la présence de
soufre favorise son accumulation et que cette espèce, qui ne peut décomposer CO^,
se nourrit des cadavres des bactéries du soufre. Je propose de donner a cette dernière
espèce Ie nom de Thiohacillus thioparus. C'est une bacterie en forme de batonnets
courts, tres sensible aux conditions extérieures, ne formant pas de spores, apparentce
aux Microspira, et dont la figure de respiration est du type des spirilles.

B. Dcnitrification avec S comme source d'éuergie pour
la réduction de CO^.

L'expérience suivante, oü l'oxydation du soufre aux dépens de KNO^, c. a d. un
processus de dénitrification inorganique, est la source d'énergie, n'est pas moins con-
vaincante que les précédentes pour la réduction de CO^ avec production de matière
organique.

Un flacon bien bouché et privé d'air est rempli de:

Eau de canal ... 100

Soufre ^) 10

KNO'^ 0,05

Na^CO^ 0,02

CaCO'' 2

K^HPO* 0,02;

la culture se fait vers 28» C. L'eau et la vase de canal contiennent la bacterie qui,
dans ces conditions, peut se nourrir de CO^ comme source de carbone, c. a d. peut
réduire CO^ a l'état des combinaisons plus riches en carbone dont Ie corps des bac-
téries est constitué.

L'eau de canal contient d'ailleurs un peu de substance organique, favorable a la
niise en train du processus dénitrificateur.

Au bout de quelques jours, on reconnait au fort dégagement d'azote libre et d'an-
hydride carbonique que Ie processus a commencé, et l'on peut maintenant transporter
dans un flacon ferme, rempli de:

') Finement pulvérisé.

208

H'0

. . 100

Soufre . . .

iO

KNO^ . . .

0,05

K^HPO' . .

0,02

CaCO-' . . .

2

Na^CO' . .

0,01

MgCP . . .

0,01,

oü la transfonnation se poursuit modérément a 28" C, principalement suivant la
formule

6 KNO^ + 5^+2 CaCO^ = 3 K^SO' + 2 CaSO* + 2 CO^ + 3 N^;
ce processus est de nouveau exothermique et donne lieu au dégagement de 659,5 cal.,
soit I cal. par gr. de KNO^ employé.

Dans un flacon hermétiquement clos, d'une capacité de 210 cm=*., 900 mgr. de
KNO^ disparaissaient en une douzaine de jours, en présence d'un exces de soufre et
de craie. On introduisait Ie salpètre tous les deux ou trois jours par quantités de
100 a 200 mgr., quand on constatait que la quantité précédemment ajoutée avait
disparu.

La quantité de soufre, correspondant au salpètre ainsi transformé, aurait dü
être de 0,4325 gr., pesée a état de BaSO*. En réalite on ne trouvait que 0,283 gr. de
BaSO*. Il s'ensuit que la moitié a peu prés du salpètre avait disparu d'autre maniere,
problement par une dénitrification aux dépens de substances organiques faisant partie
des bactéries elles-mêmes, vivantes ou mortes.

Le liquide superposé au soufre et a la craie qui se déposent dans les flacons,
primitivement limpide comme de l'eau pure, se trouble peu a peu par suite du déve-
loppement considérable des bactéries. Ce ne sont d'ailleurs pas seulement les bactéries
actives dans le processus, et que j'appellerai Thiobacillus denitriücans, qui s'accumu-
lent, mais on y reconnait aussi en grand nombre le. Thiobacillus thioparus dont je
viens de parier, ainsi que quelques véritables saprophytes et parmi elles un petit
spirille, un Vihrio, et le plus souvent aussi plusieurs individus de la bacterie dénitri-
fante bien connue Bacillus stutseri on d'une forme voisine.

La présence de Th. thioparus prouve qu'a cóté du sulfate il doit se former encore
d'autres combinaisons sulfureuses dans le liquide. Il est aisé de démontrer que l'hy-
drogène sulfuré, dont on constate tres tot la présence, dès qu'il n'y a plus de salpètre,
en fait partie. Il est probable que la substance organique des corps des bactéries, qui
peut donner lieu a une importante dénitrification, comme je viens de le dire, est en
même temps le point de départ pour cette formation d'acide sulfhydrique.

La facilité avec laquelle se produit ce dernier phénomène, alors qu'au commence-
ment il n'y avait en présence aucune autre source de carbone que l'anhydride car-
bonique, en fait a coup sür un processus naturel des plus importants, constituant un
grand facteur dans la formation de H^S, présent en si grande quantité dans la vase
marine, la oü la profondeur de l'eau n'est pas bien grande.

Il est plus difficile d'obtenir une culture pure de la bacterie du soufre dénitri-
fiante qu'une pareille culture de l'espèce oxydante ordinaire, parce qu'il ne se développe
que fort peu de germes sur les terrains de culture solides. Comme notre bacterie
possède aussi Ia propriété d'oxyder un thiosulfate a l'air avec séparation de soufre, bien

209

qu'a un degrc beaucuup plus faible que Ia dernière espèce, on peut se servir, pour !a
composition du terrain de culture, de la même recette qui a été donnée a propos de
Th. thioparus, savttir:

Eau 100

Na^S^'O^ 0,5

K-'HPO* o,or

NaHCO' 0,02

Agar 2.

Sur ce terrain de culture les deux bactéries du soufre sont faciles a distinguer.
Alors que Th. thioparus forme de petites colonies, complètement enterrées sous Ie
scufre et faisant par la l'effet d'une poussière jaune, TJt. denitriücans est caractérisé
par de grandes colonies tres minces, étalées, presque limpides, oü Ie soufre mis en
liberté ne s'observe qu'en petite quantité et produit un trouble peu apparent, fornn"' de
petites gouttelettes.

Par des transports répétés sur Ie même terrain, Th. deiiitn'hcans ne se conservait
que pendant quelques opérations; il finissait par disparaitre a cause d'une force végé-
tative trop faible. Mais il est si facile d'isoler cette espèce des cultures accumulatrices,
qu'il semble superflu de conserver les cultures pures.

Par inoculation sur une plaque de gelatine a l'eau de viande, étendue d'un volume
égal de gelatine a l'eau pure et mélangée de 0,25% Na- S- O^, Th. denitriücans forme
des colonies, petites il est vrai, mais mettant beaucoup de S en liberté; cela est d'autant
plus remarquable que sur ce terrain Th. thioparus ne croit pas du tout.

Pour terminer eet aperqu je ferai encore remarquer que dans quelques cas j'ai
réussi a faire des expériences de dénitrification en flacons fermés, oü l'énergie était
fournie par Na- S^ O^ ou H^ S et oü Na^ CO^ faisait l'office de source de carbone; je
ne parvins cependant pas a donner par transports successifs une allure reguliere a ce
processus, ni a déterminer avec certitude les microbes actifs (appartenant probable-
riient aux spirilles).

Conclusion:

Résumant tout ce qui précède, nous arrivons a l'aperqu suivant.

Les réductions produites par des microbes peuvent être basées sur une désoxyda-
tion ou sur une hydrogénation. Pour les substances actives dans ces phénomènes. c. a d.
pour ces parties constitutives du protoplasme (endoenzymes) qui sont Ie siège de ces
actions, je recommande les noms »réductase« et »hydrogénase«. Ce ne sont toutefois
pas des enzymes ordinaires, puisqu'ils deviennent inactifs sous l'action des anesthé-
tiques.

Au lieu des sélénites et tellurites venéneux, il vaut mieux ajouter 0,1% de tellurate
de potassium (Ke" Te O*), un poison assez faible, a de la gelatine ou de l'agar au
bouillon, pour obtenir un terrain oü les bactéries aérobies se développent bien; en même
temps la différente intensité avec laquelle Ie teilure noir est séparé constitue une bonne
mesure du pouvoir réducteur. Le groupe Coli et les vibrions sont sous ce rapport appa-
remment les plus actifs. Les levures et les moisissures ne réduisent pas les tellurates.

M. W. Beijerinck , Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. I4

Diiïérentes espèces de levures et Oidium lactis réduisent l'acide molybdique libre
a I'état de sel bleu.

Les sels ferriques organisques sont encore mieux appropriés que les sels ferreux
pour démontrer la formation de sulfures ou de sulfides sous l'action des microbes aéro-
bies. Le FeS ainsi formé est tres stable a l'air, surtout dans de la gelatine au bouillon.

La réduction des sulfates en H-S, opérée par les microbes anaérobies: Microspira
desulfuricans dans l'eau douce et M. aestuarü dans l'eau de mer, donne lieu a une flore
et a une faune microbiennes tres riches en espèces, adaptées k H^ S ; de plus, après la
réduction de H-S a I'état de soufre élémentaire, de sulfite (Na'^SO^), de thiosulfate
(Na-S^O^) ou de tétrathionate (Na^S^O^), elle permet de nouveaux proceSsus reduc-
teurs dont ces substances sont le point de départ.

Le soufre, les sulfites et les thiosulfates sont transformés tres facilement en H- S
par M. desulfuricans et M. aestuarü, de même que par plusieurs autres microbes, tant
anaérobies qu'aérobies, surtout par des bactéries du groupe Coli et des vibrions.

Ces recherches conduisirent a la découverte d'une bacterie anaérobie non sporo-
gène, produisant H^ S aux dépens de sulfites et oxydant eet H^ S a I'état de soufre par
une faible aération. Cette espèce appartient probablement au genre Thiobacillus, mais
elle a besoin d'une source organique de carbone pour se nourrir.

L'eau et la vase de canal contiennent en abondance deux espèces de bactéries,
capables d'enlever leur nourriture carbonique a l'anhydride carbonique dans l'obscurité ;
elles doivent donc réduire CO^. Chez l'une d'entr'elles, Thiobacillus thioparus, l'ener-
gie nécessaire a cette réduction est fournie par l'oxydation de H^S ou de Na-S^O^
OU Na^ S'^ O^ a I'état de Na^SO* et S; chez l'autre, Th. denitrificans, l'énergie est
empruntée a l'oxydation de 5" par la réduction d'un nitrate en AT' libre, a l'abri de l'air
(dénitrification), suivant la formule:

6 KNO' + 5 5- + 2 CaCO^ = 3 K^SO' + 2 CaSO' + 2 CO^ + 3 N^.

Dans ce processus, qui est exothermique, Ic uitrite n'est pas reconnaissable, ou ne
Test que passagèrement. Dés que le KNO^ est consommé, il se forme H^ S qui peut
lui-même donner lieu a une dénitrification. Dans la boue de nos canaux il se forme
donc toujours des substances organiques (corps bactériens), même dans l'obscurité, en
présence de soufre ou d'hydrogène sulfuré. La même remarque s'applique a la vase
marine.

L'énergie nécessaire a la réduction des sulfates est empruntée, tout comme dans
la dénitrification ordinaire, a la nourriture organique, p. ex. a un lactate suivant la
formule:

2NaC'H^0^ + 3 Na^SO' = 3 WS + 4 NaKO^ + 2 CO^ + 2 H^O ;

cette transformation développe 42,7 cal., soit 0,1 cal. par gr. de Na^SO*.

L'oxygène enlevé au sulfate ou au nitrate donne donc lieu a un phénomène de com-
bustion interne et peut par conséquent être appelé »oxygène d'oxydation«. Cet oxy-
gène ne peut toütefois pas entretenir la vie a la longue: cela exige continuellement de
nouvelles quantités d'oxygène libre, que l'on peut appeler de r»oxygène d'excitation«.

Les aérobies ont besoin de grandes quantités de eet »oxygène d'excitation* tandis
que les anaérobies se contentent de peu. Il n'existe pas d'anaérobies dans Ie sens strict
du mot, il vaut donc mieux parier de »microaérophiles«. Mais pratiquement il est
recommandable de continuer a se servir du terme »anaérobies« pour toutes les espèces
qui ne se développent pas a l'air sous la pression ordinaire, et ne peuvent par la pas
être obtenues en cultures sur plaques aérées.

Dans les milieux de culture ordinaires, soi-disant rendus exempts d'oxygène par
des moyens chimiques, oü l'on va cultiver des anaérobies, »répreuve des bactéries
phosporescentes« permet de déceler aisément de l'oxygène libre. Cela s'applique aussi
a l'eau sulfhydrique et a des solutions saturées de sulfites. Mais les solutions de H^S
formées, en flacons hermétiquement clos, par les microbes de Ia réduction des sulfates
ne contiennent plus d'oxygène, comme on peut s'en assurer aussi a l'aide de notre
épreuve. Il en est de même pour les fermentations alcooliques énergiques. Les
microbes eux-mêmes possèdent donc Ie pouvoir d'éliminer complètement l'oxygène de
leur entourage, alors que les agents chimiques en sont incapables.

14*

Sur les bactéries actives dans Ie rouissage du lin.

Par M. W. BEIJERINCK et A. VAN DELDEN.

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé IX,
1904, p. 418—441. — Verscheen onder den titel »Over de bacteriën, welke bij het roten
van vlas werkzaam zijn« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en
Natuurk. Afd., Deel XII, 1904, blz. 673-693; en onder den titel »On the bacteria which
are active in flax-rotting« in Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie
van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. VI, 1904, p. 462 — 481.

I. Jusqu'oü doit aller Ie rouissage.

Le but du rouissage est de dissoudre partiellement et de ramoUir l'écorce de la
tige du lin, par l'enlèvement de la pectose; il en résulte la mise en liberté des
faisceaux corticaux que l'on peut ensuite, après séchage, séparer aisément du bois par
le broyage et le taillage. La pectose (pt fig. i) ^) est la substance qui constitue les
parois des jeunes cellules ainsi que les couches extérieures des parois des vieilles,
Pour autant que ces parois sont formées de cellulose dans sa forme résistante, un
ben rouissage ne les transforme pas-).

Par le rouissage peuvent aussi se dissoudre les lamelles intermédiaires qui agglu-
tinent les fibres des faisceaux, et alors les faisceaux se désagrègent en fibres élémen-
taires. Il n'est pas désirable que le processus aille jusque la, parce qu'alors la filasse
ne consiste plus en longs »rubans« cohérents, mais en fibres séparces dont la longueur
n'atteint que 2 cm. environ.

Les faisceaux corticaux se désagrègent toutefois beaucoup plus difficilement que
l'écorce, parce que les lamelles intermédiaires des fibres du lin contiennent, outre la
pectose, encore de la lignose ') (Ig fig. i) qui n'est pas transformée par le rouissage.

Précisément par l'absence de lignose, l'écorce est attaquée beaucoup plus facile-
ment que les faisceaux corticaux, au point que ces derniers, quand le rouissage est
bien conduit, restent cohérents et se laissent détacher en entier par le taillage.

L'art du rouissage est donc de laisser le processus aller jusqu'a un certain point
et de ne pas le dépasser.

') Le nom »pectose« est employé ici dans son sens le plus étendu; il comprend
notamment aussi certaines modifications des parois cellulaires, même a l'état de matu-
rité (voir pag. 437).

*) Pour les microbes qui attaquent la cellulose voir Omeljansky, Centralbl. f.
Bacteriol., 2e Abt., Bd. 8, p. 193, 1901, et G. van Iterson, Verst. Kon. Akad. Amster-
dam, 24 avril 1903.

•) J. Behrens, Natürliche Röstmethoden. Das Wesen des Röstprocesses vom
chemischen Standpunkte. Centralbl. f. Bacteriol, 2^ Abt., Bd. 8, p. 161, 1902.

213

Fig. I.
Fig. I (550). Coupe transversale de l'écorce et du bois d'une tige de lin. l^a. pectose pt
est pointillée, la cellulose ce est restée blanche, \a.lignose Ig est hachurée; ^/j épiderme;
cp cellules corticales primaires avec paroi externe de pectose; / fibres corticales avec
paroi externe de pectose et de bois; es cellules corticales secondaires et ca cellules du
cambium dont les parois sont complètement constituées par de la pectose; xy bois
avec ponctuations, aréolées ou non.

Il n'est toutefois pas aisé, en pralique, de déterminer exactement quel est ce point.
La raison en est surtout que les tiges de lin, que l'on a liées en gerbes a l'époque de la
récolte, n'ont pas toutes atteint Ie méme degré de maturité. Comme les tiges peu müres
»rouissent« plus facilement que celles dont Ie degré de maturité est plus avance et qui
sont donc plus dures, Ie produit que Ton obtient, en les soumettant au même processus,
est fort peu homogene. Voila pourquoi sur les bords de la Lys, aux environs de Cour-
trai, on se donne beaucoup de peine pour trier Ie lin autant que possible avant Ie rouis-
sage, afin d'obtenir des gerbes homogènes. De plus, on y opère Ie rouissage en deux
fois, ce qui permet d'égaliser les différences qui se sont produites dans la première
opération.

214

Nous plaqant au point de vue de la theorie, nous admettons que Ie rouissage doit
continuer jusqu'a ce que Ie bois (xy fig. i) se détache aisément des faisceaux corticaux
(f fig. i) (»rouissage fort«), mais ne peut pas aller aussi loin que ces faisceaux se
désagrègent en leurs fibres élémentaires (»rouissage faible«). A eet effet il est néces-
saire que l'écorce secondaire {es fig. i) des tiges de lin se dissolve complètement et
que l'écorce primaire (cp fig. i) se sépare en ses cellules i).

2. Pectose et pectine.

La pectose est un composé calcique, dont la composition n'est pas encore bien
connue. Abstraction faite de Ia teneur en chaux, cette substance est chimiquement
voisine de la cellulose, mais n'est pas identique avec elle. D'après MM. T o 1 1 e n s et
Tromp de Haas^) on trouve, après élimination de la chaux, a peu prés la formule
n (C^H^^O^) OU n (C^^H^^O^^); mais pas exactement, car un petit reste de O prouve
l'existence d'un groupe COOH, qui serait toutefois substitué dans la pectose (ces au-
teurs se servent ici du terme pectine). L'acide formant cette combinaison, M. Tol-
lens Ie tient peur de l'acide gluconique (C^H^-0''), ou du moins un acide étroitement
lié a celui-la, qui se trouverait dans la pectose en combinaison dans une lactone ou un
ether, donc a l'état neutre. M. Tollens qualifie la pectose d'oxymucus végétal, mais
ne parle pas de la chaux.

Par un traitement acide les diverses formes de pectose sont plus ou moins hydro-
lysées, mais la pectose du lin subit difficilement cette transformation. Il commence par
se former de la pectine ou de la métapectine, substances qui ont un caractère acide et
que l'on appelle parfois, pour cette raison, acides pectique et métapectique. La pectine
se gélatinise en présence de chaux, sous l'action de l'enzyme pectase, de même que
sous l'action des alcalis et de l'ammoniaque, également en présence d'un sel de cal-
cium. Si la chaux fait défaut les combinaisons des alcalis avec la pectine sont solubles
dans l'eau. On ne connait pas une véritable gélatinisation de l'acide métapectique.

Quand l'hydrolyse est plus avancée, la pectine et la métapectine, donc aussi la
pectose, forment du galactose et du pentose; d'après M. Tollens certaines espèces
de pectine produisent aussi du dextrose et de l'arabinose, tous sucres que Granulohac-
ter fait aisément fermenter.

L'ébullition avec de l'acide azotique transforme la pectose et la pectine en acide
mucique.

La pectose est insoluble dans l'eau froide, l'eau chaude et l'oxyde cupro-ammonia-
cal ; Ie chlorure de zinc iodé ne produit pas de coloration bleue. La pectose de la tige

*) Il n'est pas certain que cette maniere de voir soit exacte (ou plutót sera re-
connue comme exacte quand l'industrie du lin aura cessé d'être une industrie agricole
primitive). Puisqu'un bon rouissage ne cause pas Ie moindre préjudice a la fibre de
lin elle-même, on peut^jse demander si' Ie fileur n'obtiendrait pas des fils d'épaisseur
beaucoup plus uniforme en partant des fibres isolées, plutót qu'en se servant de fibres
agglomérées en faisceaux d'épaisseur variable.

*) Untersuchungen über die Pectinstoflfe, Liebig's Annalen der Chemie, 286, 278,
1895 et Tollens, Ueber die Constitution des Pectins, Ihid., p. 292. Comme l'hydrolyse
des substances pectiques donne non seulement du glucose et du galactose mais encore
du pentose, M. Tollens donne comme composition possible {CH^O^YK'H^O^.

215

du lin est d'ailleurs dift'icilement attaquable par les acides et les alcalis dilués et ne
change pas sous une action de courte durée de la vapeur d'eau surchauft'ée.

La pectose peut-être ramollie par les actions consécutives d'un acide d'abord, d'un
alcali ensuite. Si on laisse macérer les tiges de lin dans une solution diluée d'acide
chlorhydrique, qui transforme la pectose en pectine, — cette dernière restant cependant
encore, comme une lamelle insoluble, empêchant les cellules de se séparer, — qu'on lave
ensuite pour éliminer les sels calciques que l'acide chlorhydrique a rendus solubles. et
qu'on traite enfin a l'ammoniaque ou au carbonate de soude, Ie ramollissement est
considérable. C'est sur cette methode, donnée pour la première fois par M. Man-
gin*), qu'est basé Ie rouissage chimique patente par B a u e r, un procédé resté sans
résultat pratique et prouvant que r»inventeur« ignorait les conditions auxquelles un
lin bien roui doit satisfaire.

Nous sommes parvenus a mieux dissoudre la pectose des tiges de lin en les plon-
geant dans une solution concentrée d'oxalate d'ammonium; Ie rouissage n'était toute-
fois terminé qu'au bout de 3 semaines, de sorte que cette expérience aussi est pratique-
ment sans valeur.

Tandis que la préparation de la pectose pure est rendue difficile par son insolu-
bilité, il est aisé de préparer de la pectine. A eet effet 2) on prend par exemple les
rhizomes de la Gentiana liitea des pharmaciens, on les pulvérise, laisse digérer d'abord
dans l'eau et verse ensuite sur la matière ainsi lavée une grande quantité d'une solution
de HCl a 3%; après l'y avoir laisse séjourner pendant 24 heures on filtre et on fait
précipiter par ralcool. Après avoir dissous Ie précipité dans l'eau bouillante, on préci-
pite de nouveau par l'alcool et on répète cette opération jusqu'a ce que toute tracé de
chlore ait disparu. La pectine que l'on obtient ainsi a une réaction faiblement acide.
En solution aqueuse elle se coagule sous l'action de la pectase en présence d'un sel de
calcium, ou sous l'action d'un alcali + sel de calcium, en formant une gelee coherente'
et transparente.

3. Le rouissage est produit par des microbes et peut être appelê
fermentation de la pectose.

La dissolution et l'élimination de la pectose de l'écorce de lin s'opère d'une faqon
complete, et sans que la paroi de cellulose des fibres soit endommagée, sous l'action
de quelques espèces de microbes, appartenant aux moisissures et aux bactéries ; c'est
sur cette action que se basent les methodes de rouissage ordinaires.

Ce sont des moisissures qui sont les agents actifs dans la methode de rouissage,
tres primitive, que l'on applique dans les prés et que l'on apfielle » rouissage par la
rosée« (dauwroterij) ; ce sont au contraire des bactéries qui font rouir Ie lin plongé
dans l'eau et produisent le »rouissage blanc« et »bleu« (wit- en blauwroterij).

*) Comptes rendus, iio, 295, 1890. Bien qu'on puisse lire partout que par la methode
de Mangin la pectose passé »en dissolution*, je dois observer que cette assertion est
exagérée: il n'est pas question ici d'une désagrégation des tissus en leurs cellules aussi
complete que dans le rouissage.

^) La recette est de MM. Bou rquelot et H érissey, /oz^rw. rf^ P/iar;H. ^? J^ C/ii;;;.,
(6). 8, 145, 1898.

2l6

Dans Ie »rouissage par la rosée« il se forme uii produit fort peu homogene dont
nous ne nous occuperons pas.

Dans Ie »rouissage bleu« dans des fossés, ainsi que dans Ie »rouissage blanc«,
rélément actif est une certaine bacterie anaérobie. Cet organisme particulièrement
important appartient au genre Granidobacter ; nous l'appellerons G. pectinovorum^)
(Gp fig. 2). Actuellement l'industrie du rouissage n'est plus qu'une methode de culture
plus OU moins rationelle de cêtte espèce.

A un point de vue théorique il est interessant de faire remarquer qu'il y a aussi
quelques bactéries aérobies qui provoquent Ie rouissage en plein air. Ce sont diverses

I-'ig. 2 (350). Rouissage observé dans
une préparation microscopique, placéc
dans une goutte d'eau provenant d'un
bon rouissage, et qui consiste en une
coupe longitudinale de l'écorce et du
bois d'une tige de lin. La significa-
tion des lettres est la même que dans
la fig. i; en outre: se cellule obtura-
trice d'une stomate; or cavité respira-
toire dans l'écorce primaire; Gp Gra-
nulobacter pectinovorum; la vraie bac-
terie de la pectose; Gu Granulobacter
iirocephalum. On voit l'écorce primaire
cp se séparer en ses cellules par ia
dissolution de la pectose, tandis que
l'écorce secondaire es et Ie cambium
ca disparaissent complètement.

ep cp f cp CS ca xy

Fig. 2.

espèces de ce groupe de bactéries que l'on appelle les bactéries du foin, et dont les
principales sont: Bacillus mesentericus vulgatus, B. subtilis et Granidobacter ( Bacil -
lus) polymyxa (^ B. solaniperda Kramer); on les connait aussi sous Ie nom de
»bactéries de la pomme de terre«.

4. Expériences de rouissage en petit pour examiner Ie pouvoir rouissaut
des microbes en culture pure.

**

Afin de déterminer s'il y a moyen de rouir a l'aide de l'un ou l'autre microbe

déterminé, on doit disposer d'un lin non roui et complètement stérile. On obtient ce
lin en soumettant les tiges pendant quelque temps a une température de 125 a 130" C,
dans Ie stérilisateur a vapeur ; ce surch^ufïage est lui-même sans efïet au point de vue
du rouissage, et laisse aussi la fibre inaltérée.

') Il a été découvert par M. Winogradsky (Coniptcs rendus. 121, 742, 1895).
M. Störmer (Mittheil. der deutschen Landzvirthschafts-Gi'scllschaff, 32, 103. 1003) s'est
servi du nom Plectridium pectinovorum.

217

Püur les expériences en petit avec les organismes anaérobies, nous avons pris
tout simplement de larges tubes a réaction, et nous y avons introduit du lin, lavé ou
non a l'eau, en masse sutïisamment serrée pour que Ie frottement contre la paroi
de verre renipêchat de venir flotter a la surface de l'eau dont nous remplissions Ie
tube. Après avoir bouché ces tubes a l'ouatc nous les avons mis dans Ie stérilisateur.

Il est vrai que pendant la culture l'air pouvait s'y introduire par Ie bouchon, mais
quand on prend des tiges de lin assez longues, de 20 cm. p. ex., eet acces de l'air n'est
pas désavantageux pour les anaérobies, pourvu que l'on prenne la précaution d'intro-
duire en même temps dans les tubes une espèce vulgaire de microbe acrobie, qui vit a
la surface et y absorbe l'oxygène. Dans ce but nous nous sommes toujours servis d'une
levure du genre Toruia.

Pour examiner les microbes aérobies on etend Ie lin en couche mince au fond d'un
large ballon d'E r 1 e n m e y e r, et après y avoir verse une couche d'eau peu profonde
on stérilise Ie tout; puis, après refroidissement, on infecte avec l'espèce que l'on veut
observer et on cultive a 35'' ou a une température plus basse. suivant l'espcce que l'on
veut étudier. Au bout cle 2 a 3 jours Ie rouissage est achevé.

En examinant de cette iaqon les nombreux microbes que nous avons pu isoler
du lin en voie de rouissage, Ie résultat a été négatif pour de beaucoup Ie plus grand
nombre. C'est ainsi que nous avons observé que Ie rouissage v'est /jös produit par les
diverses espèces de levure alcoolique, de Mycoderma, de Toruia, d'Oidiuni et de
levure rouge, ni par les ferments lactiques, les bactéries du vinaigre et les diverses
formes du groupe Aërobacter, telles que A. coli et A. aerogenes; tous ces organismes
se rencontrent en tres grand nombre dans les eaux rouissantes naturelles.

Les espèces aérobies du groupe des bactéries du foin (B. mesentericus. B. poly-
iiiyxa et B. subtilis) mentionnées au § 3, au moven desquelles on peut parfaitement
rouir quand l'air a suffisamment acces, sont rares dans une bonne eau de rouissage.

5. Lc rouissage est proditit par un ensyme, la p-ertosinase, sécrété
par les bactéries de la pectose.

L'action sur Ie lin du Granidobacter pectinovorum anaérobie, aussi bien que des
bactéries aérobies du foin et des moisissures, est produite par un enzyme spécifique,
la pectosinase^). Cet enzyme exerce, tout comme les acides, une action hydrolysante,
transforme d'abord la pectose en pectine, puis la pectine en sucres ; ce sont
ces derniers qui entrent en fermentation, sous l'influence de G. pectinovorum
(Gp fig. 2), en formant de l'hydrogène, de l'anhydride carbonique et un peu d'acide
butyrique. Par les bactéries du foin ils sont assimilés et transformés par la respiration
ordinaire.

D'après ce qui précède il s'agit ici du galactose et du xylose, et peut-être, dans
quelques cas, du glucose et de l'arabinose qui, comme nous l'avons vu tantót, ent été

*) Cet enzyme n'est pas identique avec la »pectinase« de MM. Bourquelot et
Hérissey (Comptes rendus, 127, 191, 1898; Journ. de Pharm. et de Chimie, (6), 10 145,
1898) du mout vert, car on ne peut pas rouir Ie lin avec ce produit, mais la pectinase
de ces auteurs est certainement identique avec la »cytase« de M.M. Brown et Morris
{Journ. Chem. Soc. Trans., 1890, p. 458).

2l8

trouvés par M. T o 1 1 e n s comme des produits de l'hydrolyse des substances pectiques
par des acides.

La pectosinase est difïicilement soluble dans l'eau d'oü l'on peut Ia précipiter par
ralcool. En présence de chloroforme et quand les microbes eux-mêmes faisaient
défaut, nous sommes parvenus, au moyen de cette substance, a dissocier en leurs cel-
lules de minces plaques de pommes de terre, et a liquéfier des plaques de pectine, pré-
parées en faisant coaguler au moyen de pectase + CaCP une pectine extraite de
Gentiana lutea (voir § 2). L'action de l'enzyme isolé est faible, beaucoup plus faible
que quand les bactéries qui Ie sécrètent sont elles-mêmes présentes a l'état vivant. C'est
ce qui résulte p. ex. de la facilité avec laquelle les bactéries du foin désagrègent a
37" C. des plaques de pommes de terre vivantes, tandis que cette désagrégation s'opère
difïicilement par l'enzyme, que ces bactéries mettent en liberté, préparé chimiquement.

L'étude de la pectosinase est rendue tres difficile par l'insolubilité de cette sub-
stance dans l'eau, et encore plus par la faqon rapide et apparemment capricieuse dont
toutes les bactéries de la pectose, que nous avons examinées, perdent Ie pouvoir de
la mettre en liberté. D'une grande importance est surtout la propriété suivante de
l'enzyme, en rapport avec cette autre de la bacterie elle-même, productrice aussi bien
de l'enzyme que de 1'acide.

Tandis que l'action de la pectosinase est favorisée par la présence d'nn pen
d'acide, la croissance de la bacterie de la pectose est par la ralentie.

Pour ce qui regarde Ie processus du rouissage même, dont Ie but immédiat est
évidemment la production de l'enzyme, on a a tenir compte surtout, si pas exclusive-
ment, des propriétés et spécialement des circonstances de production des microbes
eux-mêmes. A ce point de vue l'acidité, ou plus exactement la formation d'acide la
plus faible possible sera donc favorable au processus.

Il résulte de ce qui précède que la question principale dans Ie rouissage est celle-
ci: Quelles sont les conditions vitales des bactéries actives, et de quelle maniere peut-
on en obtenir, dans les tiges de lin, une multiplication et une accumulation telles que
les autres microbes sont refoulés, et que Ie processus s'accomplit régulièrement, grace
A la formation d'une quantité suffisante de pectosinase, sans accumulation d'acide?

Il est vrai que M. Winogradsky a déja donné en partie une réponse a cette
question, par la découverte de la bacterie de la pectose. Mais Ie point Ie plus im-
]>ortant dans l'arrangement d'une épreuve de rouissage, savoir Ie renouvellement de
l'eau, lui a échappé. Il n'existe donc pas, en ce moment, d'indications nettes relative-
ment aux moyens qui permettent d'arriver d une accumulation naturelle, dans les tiges
de lin, des bactéries spéciüques du rouissage, et pas davantage quant a la fagon dont
ce processus peut être dirigé rationnellement.

C'est cette lacune que nous allons maintenant combler.

6. Expérience a circulation d'eau puur Vexplication du rouissage.

Une éprouvette A (fig. 3) est complètement remplie de lin V, au point que,
par frottement les unes contre les autres et contre la paroi de verre, les tiges ne peu-
vent remonter a la surface de l'eau avec laquelle on remplit l'éprouvette. On obtient
ainsi 5 a 10 parties en poids de lin sur 100 p. d'eau.

219

Un tube de verre B pénètre jusqu'au fond du verre A et sert a amener de l'eau
pure, venant d'un réservoir C place a une certaine hauteur. Cette eau filtre en s'éle-
vant a travers les tiges de lin a mesure que l'eau provenant du lavage s'écoule par
D; cette eau enlève ainsi la plupart des substances solubles, tandis que la pectose in-
soluble reste dans les tiges. Ce qui s'écoule en D peut être appelé r»eau de rouissage«
(root-water). Au commencement de I'expérience elle contient beaucoup de substances
dissoutes et peu de bactéries, et difïère donc considérablement de l'eau qui découle
plus tard, et qui contient au contraire beaucoup de bactéries et peu de corps dissous.

Fig. 3. Appareil peur
rouissage dans un cou-
rant d'eau. A éprou-
vette avec lin V, B
tube par lequel l'eau
qui vient du réservoir
C arrive au fond de
A, D tube abducteur,
T thcrmostat.

Fig. 3.

L'éprouvette A est placée dans un thermostat T, qui la maintient a une tempéra-
ture de 28 a 35" C.

Quand on retire Ie lin de l'éprouvette au bout de 2 a 3 jours, on constate que Ie
rouissage est plus ou moins parfait quand Ie courant d'eau a été suffisant pour renou-
veler l'eau de l'éprouvette cinq a dix fois. Comme notre éprouvette contenait 300 cm''.,
il fallait y laisser passer 1,5 a 3 litres. Dans ces expériences en petit il est bon de
faire arriver Ie courant d'eau au fond du tube et de laisser s'écouler les couches
supérieures, afin d'empêcher que les gaz de la fermentation ne bouchent les tubes; un
pareu procédé serait défectueux dans les expériences en grand, oü l'eau du lavage,
étant plus lourde, doit être enlevée par en-dessous.

Quand on examine au microscope I'écorce rouie, ou bien encore la moëlle, ou Ie
liquide contenu dans la tige, on y trouve une accumulation de la bacterie caractéristi-

que, mentionnée plus haut, Granitlobacter pectinovoruin (Planche, fig. i); elle a re-
foulé pour ainsi dire tous les autres microbes et remplit littéralement les espaces entre
les cellules (Gp fig. 2) ; en plusieurs endroits elle recouvre complètement la surface des
fibres et a fait dissoudre totalement les cellules a parois minces de l'écorce secondaire,
de sorte que les faisceaux corticaux ont été tout a fait détachés du bois. Une solution
d'iode colore cette bacterie en bleu presque sur toute sa longueur, par suite de !a
granulose qu'elle contient.

C'est un organisme anaérobie. L'expérience précédente, oü un courant d'eau
acrée lave continuellement les tiges de lin, prouve cependant que son développement
n'est pas arrêté par une quantité d'air assez considérable; un examen plus minutieux
a même appris qu'ici comme dans d'autres cas d'anaérobiose une aération modérée,
loin d'être désavantageuse, est bienfaisante et même nécessaire a la longue pour que
la croissance continue.

Comme nous avions observé qu'aux environs de Courtrai et a Courtrai même
l'eau de la Lys était fortement chargée d'acide sulfhydrique, nous avons cru interes-
sant d'ajouter a l'eau, qui devait servir au rouissage, environ 50 mgr. de H^S par
litre; cela suffisait pnur qu'il restat encore un peu de H^S dans l'eau provenant de
l'expérience. Nous avons pu nettement constater qu'il en résultait un ralentissement
du processus, qui était aussi moins parfait que quand il n'y avait pas d'hydrogène
sulfuré; Ie G. pectinovorum s'était néanmoins fortement accumulé.

Toute autre était l'influence de KNO^. Quand nous ajoutions cette substance
a l'eau d'expérimentation a raison de 0,2 gr. par litre, nous en retrouvions encore une
tracé dans l'eau d'écoulement. Dans ce cas l'accumulation de G. pectinovorum et Ie
rouissage étaient parfaits. Aussi M. P 1 a i s i e r , commerqant en lin a Hendrik Ido
Ambacht, au jugement duquel nous avons soumis les échantillons de nos lins rouis,
a-t-il trouvé notre lin au salpètre »excellent«. Mais il va de soi que les lionnes eaux
i"i rouissage sont ordinairement tout a fait exemptes de nitrates.

En réalité, dans notre expérience de rouissage, l'accumulation repose non seule-
ment sur l'aération, nécessaire quoique faible, mais encore sur cette circonstance que
Ie courant lave Ie lin pendant les 24 premières heures d'une fagon si efücace, que les
combinaisons asotées solubles sont presque complètement éliminées et qu'il ne reste
que l'albuminoïde protoplasmique, difücilefnent soluble, des cellules du lin; avec les
iiydrates de carbone encore presents et la pectose, cette matière albumino'ide est préci-
scment la nourriture par excellence de G. pectinovorum, et aussi la nourriture requise
pour produire la sécrétion de pectosinase et mettre en train Ie processus du rouissage.
Si ce lavage n'a pas eu lieu, c. a d. si l'on fait cette expérience sans courant d'eau,
on observe bien un développement considérable de toutes espèces de bactéries, mais
les deux premiers jours il ne se produit pas une véritable accumulation de G. pec-
tinovorum et Ie rouissage n'a pas lieu, ou a lieu beaucoup plus imparfaitement.

Le raison de ce phénomène, tres remarquable, doit être cherchée exclusivement
dans une concurrence entre diverses espèces de microbes. C'est ce qui résulte du fait
que, sans renouveler l'eau, on peut parfaitement rouir le lin a l'aide d'une culture pure
de G. pectinovorum. Il suit de la que les substances éliminées du lin par l'eau cou-
rante ne sont pas elles-mêmes nuisibles pour G. pectinovorum, mais eïles favorisent la
croissance des autres espèces, particulièrement des micrococques lactiques, dont la
multiplicationdans»reau de rouissage« un peu concentrée est si rapide que G. pectino-

vorum ne peut se développer que difficilemeni et trop tard. Mais de plus il est bien
établi que dans un liquide dilué la sécrétion de pectosinase est plus abondante que
dans une solution nutritive plus concentrée. Ainsi par exemple, nous ne sommes pas
parvenus a rouir Ie lin en Ie plaqant dans un extrait de mout, dilué et stérilisé, indi-
quant environ 2" au saccharimètre de Balling, mélange de craie et subissant une fer-
mentation rapide sous l'action d'une culture pure de G. pectinovorum. Il parait donc
que dans des conditions nutritives aussi favorables la pectosinase ne se forme pas
du teut.

Il y a donc une doublé raison pour laquelle Ie lessivage est favorable au rouis-
sage: la bacterie de la pectose devient prépondérante et la sécrétion de pectosinase
est activée.

Si l'on compare l'image microscopique des bactéries du lin (PI. fig. i), roui sui-
vant notre »expérience a circulation«, avec celle des bactéries obtenues de la maniere
ordinaire, c. a d. par Ie rouissage »blanc« ou »bleu«, on est frappe de la grande dif-
férence entre les deux préparations. Dans Ie dernier cas on ne voit pour ainsi dire
que les espèces qui rendent la culture impure, et l'on a de la peine a découvrir Ie
G'. pectinovorum; dans l'expérience a circulation d'eau G. pectinovorum semble se
trouver en culture presque pure *).

7. Simplification de l'expérience précédente.

Quand nous eümes établi la grande importance du lavage des tiges de lin et de
I'aération pour Ie processus du rouissage, nous avons cherché a remplacer la »méthode
de circulation« par un procédé de renouvellement de l'eau plus rationnel et plus
pratique.

Nous y sommes parvenus de la maniere bien simple que voici.

Après avoir laissé l'eau séjourner sur Ie lin pendant 24 heures, nous l'avons dé-
versée complètement, de maniere a laisser les espaces entre les tiges se vider et per-
niettre a l'air d'y pénétrer. Nous y avons ensuite verse de l'eau fraiche d'environ
30" C, ou bien une bonne eau de rouissage provenant d'une opération antérieure. En
fmployant de l'eau fraiche, nous constations qu'il était recommandable de répéter Je
renouvellement toutes les 24 heures, mais, quand nous disposions d'une bonne eau
de rouissage, un second renouvellement était déja superflu, parce que cette eau con-
tenait déja une quantité suffisante de Gr. pectinovoroum.

Cette methode d'opérer, que l'on pourrait appeler »méthode de déversement«,
fournissait également des échantillons excellents de lin roui au bout de 2% k T, jours.
Elle semble même avoir sur la methode de circulation, dans une application en grand,
eet avantage que par Ie déversement l'eau de rouissage concentrée est enlevée beau-
ccup plus complètement aux interstices entre les tiges que par Ie lent déplacement du
courant d'eau. Pour la même raison Vaération sera plus complete, en tous les points
des gerbes de lin, par »déversement« que par »circulation«.

Nous basant sur l'expérience ainsi acquise, nous pouvons donc être certains que
toute autre methode de renouvellement de l'eau, garantissant une aération et un lessi-
vage sufifisants, pourra remplacer les methodes de »circulation« et de »déversements<,

') Voir aussi § 12.

a condition que l'on ait soin de ne pas endommager les tiges de lin, si frêles et si
aisément blessées pendant Ie rouissage.

C'est Ie moment de faire remarquer encore une fois que, bien que G. pectinovoruui
appartienne aux bactéries anaérobies obligatoires, l'aération relativement forte dont
il vient d'étre question est pourtant réellement favorable a son développement. Cela
est du reste pleinement d'accord avec l'expérience acquise avec tous les autres orga-
nismes anaérobies bien étudiés. Chaque nouvelle recherche prouve donc, avec une
évidence de plus en plus grande, que les organismes anaérobies dans Ie sens strict du
mot n'existent pas, et que la maniere dont ces êtres se comportent vis a vis de l'oxy-
gènelibre est mieux rendue par Ie terme »microaérophilie« que par celui d'»anaérobiose«.

8. Application de notre expérience dans l'industrie du rouissage ^).

En pratique Ie rouissage a lieu jusqu'ici d'une faqon tres primitive. Même sur
les bords de la Lys, prés de Courtrai, d'oü viennent au marché les meilleures fibres
de lin, un observateur même peu attentif est frappe des mauvaises conditions dans
lesquelles on travaille et des fautes que l'on commet.

Une première tentative d'amélioration a été faite dans notre pays, en 1893, par
la Société pour l'industrie Liniaire Néerlandaise, qui a taché de remplacer Ie rouis-
sage en eau libre, par Ie rouissage »en cuve«.

Cette methode consiste a placer les gerbes de lin, verticalement et serrées les
unes contre les autres, dans une grande cuve en bois, présentant a quelque distance
du fond une cloison en tamis, sur laquelle repose Ie lin et sous laquelle peut se ras-
semblerl'eaude lavage, qui descend par son propre poids quand la cuve a été complète-
ment remplie d'eau.

De même M. Ie baron R e n g e r s, a Oenkerk, a essayé d'améliorer Ie rouissage
du lin en opérant suivant Ie »procédé a l'eau chaude«. Dans ce procédé les gerbes de
lin sont placées dans une marmite en fer, complètement fermée, que l'on remplit
ö'eau tiède (28" a 35" C.) ; Ie rouissage y serait accompli en trois jours.

Le rouissage »en cuve« de même que celui »d l'eau chaude« ne peuvent toutefois
s'effectuer avec succes, que si l'on soigne en même temps pour un renouvellement con-
venable de l'eau; ce renouvellement est possible de diverses manières, mais on n'en
a pas sufüsammeftt tenu compte jusqu'ici.

Le rouissage »en cuve« présente les avantages suivants.

i". Les cuves peuvent être placées dans les batiments d'une fabrique, oü peuvent
aussi s'effectuer les autres manipulations que le lin doit subir.

') Le rouissage »en cuve« empêche le blanchiment du lin a la lumière, une opération
tres importante dans le rouissage »blanc«, combine jusqu'ici avec séchage a l'air libre
et au soleil. A l'avenir, dans les établissement liniaires, on devra donc avoir recours
a un procédé de blanchiment chimique. Des expériences ont appris qu'on pourra se
servir a eet effet d'ozone ou d'eau oxygénée. Des déterminations de solidité au dynamo-
mètre devront apprendre s'il y a moyen d'employer des hypochlorites («blanchiment
électrique«) sans affaiblir les fibres. Grace au concours bienveillant de MM. les Proff.
Kraus et van der Burg, l'Ecole Polytechnique de Delft dispose des appareils né-
cessaires, pour ce genre d'exp4riences. Il est évident que le rouissage »en cuve« aura
comme conséquence qu'on s'occupera de la fabrication de bons appareils de séchage et
de plus d'une difficulté que l'industrie mettra un certain temps a vaincre.

223

2". La température de l'eau destinée au rouissage peut être réglée a volonté, ce
qui fait disparaitre la différence entre les methodes de rouissage en cuve et a l'eau
chaude. Le rouissage peut d'ailleurs s'opérer toute l'année.

3°. Il est facile de regier le lessivage et l'aération du lin, ce qui assure l'accumu-
lation et la multiplication de la bacterie de la pectose, tout en écartant les microcoques
de la fermentation lactique, les grands ennemis de l'industrie liniaire.

Ce qui précède permet de prévoir quelles sont les conditions théoriques auxquelles
le rouissage en cuve doit satisfaire en genéral; il est bon toutefois d'insister encore
sur les points suivants, d'oü dépend le succes ou l'insuccès de l'opération.

En premier Hen, on doit faire en sorte que l'eau plus dense, qui résulte du
lavage du lin, puisse être aisément enlevée. Quand on emploie une cuve a doublé fond,
elle se rassemble sous le lin ; on peut donc commencer par remplir la cuve complète-
ment d'eau, laisser reposer pendant 24 heures, puis laisser toute l'eau s'écouler. De
cette maniere le lin vient en contact avec l'air d'une fa^on tres uniforme, et toutes
les parties des gerbes, même les plus serrées, sont convenablement aérées (»méthode
de déversement«).

Il suffit de renouveler l'eau une seule fois*).

On commet une faute grave en laissant s'écouler par en-dessus l'eau provenant
du lavage et introduisant l'eau fraiche par en-dessous. De cette maniere, en efïet, on
ramene l'eau du lavage entre tiges de lin: de plus, on empêche ainsi un lessivage uni-
forme parce que l'eau ascendante suivra évidemment les voies oü Ia résistance est la
plus faible, c. a d. les intervalles entre les gerbes, et ne pénètrera pas dans les endroits
les plus serres oü sa présence est surtout nécessaire. En opérant de cette faqon, on
entrave donc la croissance de la bacterie de la pectose, tout en favorisant celle des
ferments lactiques. De plus l'aération, qui a lieu pour ainsi dire d'elle-même et partout
uniformément par un déversement complet de l'eau de lavage, deviendrait par la tres
irreguliere et imparfaite.

En second lieu, il ne suffit pas, après le premier déversement, de remplir la cuve
d'eau fraiche, mais on doit y ajouter une grande quantité d'une honne eau de rouis-
sage, provenant d'une opération antérieure, afin d'introduire partout dans le lin les
bactéries de la pectose ; le lin n'apporte par lui-même qu'un petit nombre de ces micro-
bes, qui ne sont pas du tout universellement répandus, ni sur le lin, ni dans les eaux.

Avant d'avoir a sa disposition une bonne eau de rouissage, il sera nécessaire de
renouveler l'eau une seconde fois après 24 heures, donc deux jours après le remplis-
sage de la cuve, et de la remplacer par de l'eau fraiche. On peut faire cette seconde
opération en toute sécurité, car au bout de deux jours les bactéries se sont déja accu-
mulées en telle quantité dans les tiges de lin que le second lavage ne les enlève qu'en
partie.

Combien il est aisé d'obtenir une bonne eau de rouissage, cela résulte de la des-
cription de l'expérience a circulation d'eau (§ 6).

*) Les expériences faites avec des cultures pures de la bacterie de la pectose ont
prouvé qu'en theorie il n'est même pas nécessaire de renouveler l'eau complètement;
mais il est probable que par le rouissage en cuve, entrepris en grand, l'état idéal ne
pourra jamais être atteint par suite de la concurrencc d'autres organismes particulière-
ment des ferments lactiques et butyriques, qui tendent a refouler la bacterie de la
pectose.

224

En troisième lieu, il sera nécessaire de regier avec soin la température. Nos
expériences en petit ont montré que la température la plus favorable est comprise
entre 28» et 35" C. Au bout de 2)4 33 jours on retire alors des cuves un lin roui de
qualité excellente (voir la note au bas de la p. 43i)- H se peut qu'en prolongeant la
durée du rouissage on puisse abaisser la température jusqu'a 25° ou 27" C. Les résul-
tats pratiques devront nous apprendre s'il a la quelque avantage.

9. Culture pure de la bacterie de la pectose.

La culture pure de G. pectinovorum, espèce de Graiiulobacter qui, comme toutes
les autres, produit des spores, réussit sans trop de peine de la maniere suivante.

Dans une boite de verre on préparé un terram de culture, composé d'extrait de
mout dilué d'environ 2" Balling avec 2% d'agar et 2% de craie; sur ce terrain
on etend un peu de matière enlevee a l'ccorce d'une tige de lin, bien rouie et pasteu-
risée a 90" C, afin d'obtenir des colonies en traits de G. pectinovorum. La pasteurisa-
tion est nécessaire pour tuer les bactéries concomitantes, qui ne produisent pas de
spores, particulièrement les ferments lactiques ; elle ne peut toutefois s'effectuer a une
température trop élevée, parce que la plupart des spores de la bacterie de la pectose
nieurent elles-mêmes au point d'ébuUition de l'eau.

On place la boite de verre dans un exsiccateur bien clos avec robinet a trois
voies, oü Ton met en outre une écuelle d'hydrosulfite alcalin. On évacue l'exsiccateur
a la trompe et on Ie remplit d'hydrogène (ou d'acide carbonique), puis on évacue de
nouveau et on répète cette opération jusqu'a ce que l'on puisse admettre que l'oxy-
gène, que l'on n'enlève jamais entièrement, a atteint Ie minimum de pression que les
bactéries anaérobies peuvent supporter ; c'est du reste aussi dans Ie but de diminuer
cette pression que nous introduisons l'hydrosulfite. L'exsiccateur est place dans un
thermostat d'environ 35" C; au bout de 2 a 3 jours on voit les colonies des anaérobies
se développer suivant les traits inoculatoires.

Ces colonies appartiennent surtout aux quatre espèces suivantes de Granulo-
bacter:

i. G. pectinovorum

2. G. urocephalum

3. G. saccharobiityricum

4. G. biitylicum;

j'ai donné son nom a la troisième espèce et j'ai décrit la quatrième dans un travail
antérieur ^). Seules les deux premières espèces, G. pectinovorum et G. urocephalum,
sont de véritables bactéries du rouissage; la première est tres active, la seconde l'est
beaucoup moins. Les deux autres espèces, les ferments butyrique {G. saccharobuty-
ricum) et butylique (G. butylicum) ne rouissent pas du tout. Les colonies de ces
quatre espèces se colorent en bleu foncé quand on y verse une solution d'iode, par
suite de la granulose qu'elles contiennent. De plus, dans toutes les colonies on trouve
des batonnets qui ne se colorent pas en bleu par l'iode et que j'ai décrits, a une autre
occasion ^), comme »formes a oxygène« de Gramdobacter. Quelques-unes des colonies

') Sur la fermentation et Ie ferment butyliques; ces Archives, 29, i, 1896.
') Ibidem, p. 35.

225

sont méme exclusivement constituces par cette forme, ne se colorent pas en bleu par
I'iode, et ne contiennent pas de clostridies, mais seulement des batonnets oü l'on trouve
rarement des spores.

Si Ton n'a pas pris soin de pasteuriser la niatière empruntée aux tiges de lin et
employee pour la semence, il se forme sur les plaques, parmi plusieurs autres espèces,
particulièrement des colonies de microcoques lactiques, dont ies dimensions sont beau-
coup plus fortes que celles des colonies de Granulnhacter et qui sont par la facilement
reconnaissables.

10. Description de Granulobacter pectinovorum.

Sur Ie terrain de culture, décrit §9, les colonies de G. pectinovorum sont faciles
a reconnaitre par Ie »plu'-nomène du moirc«, représenté sur la planche, fig. 3. 11 coa-
siste en ceci que, quand on laisse tomber la lumiere obliquement a travers la cnlonie,

Fig, 4 (650). Culture
de Granulobacter pecti-
novorum dans une so-
lution de pectine et de
sulfate d'ammonium.
Les extrémités epais-
sies contiennent des
spores oblongues; les
parties sombres des
batonnets indiquent de
la granulose.

Fig. 4.

(11 observe des champs singuliers, presque rectangulaires, sombres ou clairs, dont la
teinte peut varier ce qui provient d'une réflexion sur des groupes de bactéries, oü les
individus sont parallèles entre eux tandis que les axes des groupes sont a peu prés
perpendiculaires.

Quant a la bacterie elle-même, la description qu'en donne M. W inogradsky ')
correspond parfaitement a mes observations. C'est une espèce assez grande, produisant
des spores dans une dilatation voisine d'une extrémité, mais non a l'extrémité même,
ce qui la fait ressembler a la larve d'une grenouille (PI. fig. 2). La longueur des ba-
tonnets est de 10 a 15 jnet i'épaisseur 0,8 |u ; ces batonnets' peuvent cependant devenir
beaucoup plus longs; les vieux individus deviennent plus épais et se dilatent jusqu'a
3 ^ a quelque distance de l'extrémité; la spore oblongue, qui se forme dans cette dila-
tation, mesure 1,8 jit sur 1,2 ju.

Dans un extrait de mout dilué et a 1'abri de l'air il s'opère une vive fermentation,
mais sans formation d'acide butyrique.

Avec l'amidon ^), rinuline, la mannite, l'érvthrite, la glycerine et la gomme ara-
bique on n'obtient point de fermentation.

') Comptes rendus, 121, 744, 1895.

-) M. Winogradsky dit au contraire que ranudon entre en fermentation.

M. VV. B eije r i nek, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. -5

226

Avec la peptone ou un bouillon de viande dilué, ou encore avec de l'albumine
comme source d'azote, notre bacterie fait fermenter Ie glucose, Ie lévulose, Ie galac-
tose, Ie sucre de lait et Ie maltose, et il se forme alors un peu d'acide butyrique. Les
substances albuminoïdes et la gelatine sont peptonisées.

En employant l'ammoniaque comme source d'azote nous n'avons pas pu faire fer-
menter ces sucres dans les cultures pures.

La pectine prcparée comme au § 2 se décompose quand on prend de l'albumine,
de la peptone ou du bouillon de viande, et même, quoique difïicilement, avec de l'am-
moniaque comme source d'azote; par la la bacterie occupe une place a part et se
distingue nettement d'autres organismes, surtout des ferments butyrique et butylique,
qui n'attaquent pas du tout la pectine. Cette décomposition est accompagnée d'une
sécrétion de pectosinase.

G. pectinovonim n'attaque pas du tout la cellulose dans sa forme resistante, soit
p. e. comme papier a filtrer, soit comme précipité amorphe. Aussi Ie rouissage n'a-t-il
pas la moindre influence sur la fibre de lin elle-même. Au contraire la cellulose de
moindre résistance, comme celle des racines comestibles, p. e. des navets et du choux-
rave, est difïicilement mais indubitablement dissoute et fermentée. Mals, quoique
cette substance se colore en bleu par l'iode en présence du chlorure de zinc, il est
difïicile de la différencier nettement de la pectose, a laquelle elle se rattache par toute
une série de corps intermédiaires.

Ainsi qu'on peut s'en assurer sur la photographie (PI. fig. 2), l'image fournie par
la culture pure sur de l'extrait de mout a l'agar, est tout a fait difïérente de celle du
ferment butyrique, qui donne des clostridies courtes et épaisses.

Il en est de même dans les liquides de culture. La fig. 4 ci-contre représente la
bacterie de la fermentation de la pectine de rhizome de gentiane a 35° C. dans:

Eau de conduite

100

Pectine

2

(Nmj^SO'^

0.05

K'^HPO*

0,05

Craie

2.

Les parties sombres indiquent les endroits oii s'est accumulée la granulose. Les
clostridies, toujours peu développées dans cette espèce, font ici complètement défaut.
La forme de notre bacterie, dans ce liquide de culture et dans d'autres du même
genre, est caractéristique, et ne se retrouve que chez G. urocephalum.

II. Description de Granulobacter urocephalum.

La difïérence entre G. pectinovorum (Gp. fig. 2, PI. fig. 3) et G. urocephalum
(Gu fig, 2, PI. fig. 4), qui s'accumule aussi, quoique en moins grande quantité, dans
Ie lin rouissant, consiste d'abord dans la forme, — celle de Urocephalum rappelant uu
baton de tambour, bien que la aussi la spore ne soit pas ronde, mais oblongue, comme
on peut Ie voir nettement sur la fig. 2 du § 3. Puis, la première espèce sécrète une
quantité bien plus grande de Tenzyme pectosinase que G. urocephalum, et c'est de la
que provient la présence beaucoup plus générale de G. pectinovorum dans Ie lin rouis-
sant. Leur nom indique déja que les deux espèces se colorent en bleu par l'iode.

227

Voici encore une dift'érence caractéristique entre les deux. Quaiid on les conserve
sur des plaques d'agar avec extrait de mout dilué et craie, les colonies de G. pectino-
vorum (PI. fig. 2) passent bientót a l'état de détritus, dans lequel les spores seules sent
encore nettement reconnaissables, les colonies de G. urocephalum, au contraire, restent
beaucoup plus longtemps intactes et les bactéries y conservent nettement leur forme.
Ce phénomène de bactériolyse a probablement quelque rapport avec la sécrétion de
pectosinase; on l'observe aussi chez les bactéries du foin.

Mais la difïérence principale entre G. urocephalum et G. pectinovorum, c'est
qu'avec des sels d'ammonium comme source d'azote la première des deux espèces peut
faire fermenter toute espècc d'hydrates de carbone, tels que glucose, Ie sucre de lait, Ie
sucre de canne et la dextrine, alors que G. pectinovorum exige pour cette fermentation
de la peptone ou du bouillon de viande. Par contre G. urocephalum attaque la pectose
d'une fa(;on si peu vive qu'on n'observe pas de fermentation, même quand on prend du
bouillon comme source d'azote. Chez G. urocephalum la formation de trypsine est
presque tout aussi vive que chez G. pectinovorum et beaucoup plus vive que chez G.
saccharobutyricum. La sécrétion de diastase est nulle chez G. pectinovorum et chez
G. urocephalum elle est tres faible, beaucoup plus faible même que chez Ie ferment
butyrique.

Les deux espèces produisent beaucoup de mucus végétal qui provient des parois
épaissies et liquéfiées des bactéries elles-mêmes; on Ie retrouve dans Ie residu que
l'on obtient par l'évaporation de l'eau provenant du rouissage. Ce residu contient
encore de la pectine et évidemment les bactéries elles-mêmes, qui ep constituent la
plus grande partie.

12. Expérience d'accumulation de G. urocephalum. Pourquoi les
ferments butyrique et lactique disparaissent dans un bon rouissage.

La forte accumulation de G. pectinovorum dans nos expériences de »circulation«
et de »déversement« est la conséquence d'une doublé adaption de ce ferment: il est
adapté d'une part aux albuminoïdes insolubles de Ia tige de lin par son fort pouvoir
peptonisateur, d'autre part a la pectose insoluble par la sécrétion de pectosinase.

La raison pour laquelle G. urocephalum aussi se multiplie dans Ie lin, quoiqu'a
un moindre degré, et celle pour laquelle Ie ferment butyrique, pourtant si répandu et
si résistant, disparait, ont été fournies par la methode suivante d'accumulation de
G. urocephalum, trouvée par M. G. van Iterson lors d'une recherche sur la fer-
mentation butyrique.

Quand on ajoute a l'un ou l'autre carbohydrate, p. ex. a de l'amidon soluble, du
glucose, du saccharose ou du sucre de lait, une tres petite quantité d'albumine ou de
peptone, ou encore un peu de bouillon de viande, comme source d'azote, — p. ex. dans
Ie rapport:

Eau de conduite

100

Glucose

5

Albumine

0,1

K^HPO*

0,05

Craie

5 —

228

que Ion infecte ensuite au moyen de terreau, et que Ton cultive a 35" dans un flacon
ferme, il commence par se produire il est vrai une fermentation butyrique propi-e
produite par G. saccharobutyrictinij notamment aussi longtemps qui'il y a encore dans
Ie liquide des conibinaisons azotées solubles ; mais bientót elle est remplacée par une
fermentation due a G. urocephaliim, qui produit de l'acide butyrique en moindre
quantité et se laisse reconnaitre aisément au microscope.

Quand on etïectue un transport du liquide en fermentation dans Ie même liquide
frais, Ie ferment butyrique ne disparait pas entièrement, il est vrai, mais Ie caractère
spécifique de la fermentation a Urocephalum devient néanmoins plus convaincant. Si
Ton ajoute a la matière, lorsque la fermentation est terminée, une nouvelle quantité
de sucre (et de craie), on constate que la purification du ferment va encore plus loin.

En employant moins de sucre, on trouve que les composés azotcs solubles, pre-
sents p. ex. dans l'albumine, deviennent gênants parce qu'ils favorisent Ie développe-
ment du ferment butyrique.

Si l'on répète cette épreuve, en remplacant l'albumine par un sel ammoniacal,
G. urocephalum disparait totalement et Ie ferment butyrique, G. saccharobiityricuiii,
reste maitre du terrain.

Que ce résultat est tout simplement un effet de la concurrence entre les deux
organismes, on en trouve la preuve dans Ie fait, qu'en culture pure et avec les deux
sucres qui viennent d'étre nommés et un sel ammoniacal comme source d'azote G. uro-
cephalum croit parfaitement et produit une forte fermentation. Une culture pure sur
une gelatine a extrait de mout dilué a du reste appris que, tout comme G. pectinovo-
rum, G. ttrocephalum liquéfie la gelatine beaucoup plus fortement que Ie ferment buty-
rique; il sécrète donc plus de trypsine.

Voici donc la raison pour laquelle, dans l'expérience de circulation, ces trois bac-
téries s'accumulent dans Ie lin d'une faqon aussi inégale, et en même temps pourquni
G. urocephalum tient Ie milieu entre la bacterie de la pectose et Ie ferment butyrique:

Le lavage enlève les combinaisons azotées solubles et les microbes n'ont plus a
leur disposition que l'albumine végétable insoluble. Cela assure le triomphe de G. pec-
tinovorum et de G. urocephalum, deux bactéries fortement peptonisantes, sur le fer-
ment butyrique qui ne possède pas cette facculté ou ne l'a qu'a un faible degré.

Le ferment butyrique sécrète beaucoup plus de diastase que G. pectuwvoruui et
G. urocephalum; aussi longtemps que ce ferment est présent, il est donc une source
certaine de sucre, puisque la fécule ne fait jamais complètement défaut.

Dès que le ferment butyrique a disparu, les hydrates de carbone solubles sont
rapidement éliminés par le lavage et la fermentation, et il ne reste plus alors que Ja
pectose insoluble, ce qui fait que G. pectinovorum, qui sécrète beaucoup de pectosinase,
l'emporte finalement aussi sur G. urocephalum qui en produit peu ou n'en produit pas.

Les microcoques lactiques ne produisent pas d'enzyme capable d'attaquer l'albu-
mine, la pectose ou les hydrates de carbone. Du moment qu'ils n'ont a leur disposition
que de l'albumine insoluble et des hydrates de carbone insolubles, ils sont incapables de
se multiplier et sont enlevés par le courant d'eau.

229

Explication de la Planche.

Fig. I (600).
Goutte d'eau, exprimée d'une tige de lin soumise au rouissage a »circulation d'eau«,
colorée a l'iode. EUe fait voir l'accumulation naturelle de G. pectinovorum, tres abon-
dant, et de G. urocephalum, moins abondant. (^a et la des «formes a oxygène«, non colo-
rables par l'iode.

Fig. 2 (900).
Granulobacter pectinovorum en culture pure sur de l'agar a extrait de mout dilué
La granulose est colorée en bleu par l'iode. On voit entre les bactéries beaucoup de
détritus formés par bactériolyse.

Fig. 3 (15).
Colonies de G. pectinovorum sur Ic mêmc terrain de culture, présentant k- «phéno-
mène du moiré «.

iMg. 4 (.900).
Granulobacter uroceplialuin en culture pure sur de l'agar a extrait de moiit dilué.
Pas de détritus entre les bactéries.

M. W. BEIJERINCK, et A. van Delden.

Fig. 1.

Fig. 2.

Fig. 3-

Sur les bactéries actives dans rouissage du lin.

Chlorella variegata, ein bunter Mikrobe.

Recueil des Travaux Botaniques Néerlandais, Nijmegen, Vol. I, 1904, p. 14—27.

Weil der hier zu besprechende Mikrobe einzellig ist, erscheint es auf den
ersten Bliek widersinnig, dabei von »bunt« zu reden, denn eine einzelne
Zelle kann unmöglich zu gleicher Zeit chlorophyllhaltig und chlorophyllos sein.
Sobald man jedoch das Bunt als Variationsform auffaBt und den normalen Ent-
wicklungsgang irgend einer Organismenart als eine Reihe nacheinander statt-
findender Variationsvorgange, so wird es auch verstandlich, dass ein einzelliger
Mikrobe, wobei die Produkte der Zellteilung einander kurz nach deren Ent-
stehung verlassen, in Bezug auf diese Produkte variiren, also z. B. als erblich
farblos und erblich grün vorkommen kann, trotzdem doch nur eine einzelne Art
vorliegt und der Artbegrifï so enge genommen wird wie man will.

Dass der hier angeführte Vergleich ein naturgemasser ist, ergiebt sich aus
dem Umstande, dass die meisten Pflanzen durch die Erzeugung farbloser Wurzeln
und nicht grün gefarbter Blüthen, deutlich zeigen, dass das Buntwerden ein
Variationsvorgang ist, welcher mit ihrer normalen Entwickelung aufs Engste zu-
sammenhangt.

lm vorliegenden Falie handelt es sich um Verhaltnisse bei einem Mikroben,
welcher die Mitte halt zwischen einer Grünalge und einem Pilze, namlich um
eine Art der sehr einfachen Algengattung CJilorella '), welche als C. variegata be-
zeichnet werden soll. Zwar kann der farblose Zustand zu der Pilzgattung Prototheca-')
gebracht werden, doch muss der Hauptname sich wohl auf die am reichsten aus-
gestattete Form beziehen.

Unsere Art lebt im Saftflusse der Ulme und vielleicht auch von anderen
Baumen, welcher Saft herausfliesst wenn die Weidenraupe (Cossus ligniperda^ sich
im Stamme angesiedelt hat. Weil in den umfangreichen dadurch hervorgerufenen
Wunden eine zuckerhaltige Flüssigkeit entsteht, welche von Insekten, besonders
von Wespen, aufgesucht wird, kann es nicht wundernehmen, dass darin eine Alkohol-
gahrung zustande kommt, welche eben von jenen Tieren von Baum zu Baum
verbreitet wird, wobei auch alle übrigen Mikroben, welche neben den Alkohol-
hefen vorkommen, an den Beinen der Wespen haften bleiben und ebenfalls ver-
breitet werden. Besonders durch Professor Ludwig sind wir mit dieser eigen-
thümlichen Flora bekannt geworden, obschon Ludwig den Saftfluss nicht als
primar durch die Weidenraupe verursacht betrachtet, sondern einen parasitischen

') Beijerinck, Bot. Zeitung 1890, p. 730.

^) W. Krüger, in Zopf's »Beitrage zur Morphologie und Physiologie niederer
Organismen». Heft 4. p. 69. 1894.

232

Pilz als den Erreger annimmt, was für gew isse Falie aiich vvohl richtig sein dürfte,
obgleich viele Infektions-Versuche an Eichen und anderen Baumen, welche ich an-
gestellt habe mit Saftflussmaterial, welches Prof. Ludwig mir gesandt hatte, immer
resultatlos geblieben sind.

Auch ist es sicher, dass hier bei Delft nur dann Saftfluss vorkommt, wcnn.
wie gesagt, eine Raupe den Baum bewohnt und nur daraus habe ich C. varuj^ata
isoliert. Zwar fand ich einmal bei de Grebbe eine Eiche mit derselben höchst
eigenthümlichen Ausschwitzung, welche ich durch Prof. Ludwig schon kannte
und die sich durch einen ausserordentlichen Wohlgeruch auszeichnet, welcher
entsteht bei der durch Endomyces magni/sü hervorgerufene Alkoholgarung, doch
fehlte Chorella darin ganzlich, wahrend andererseits Endomyces, wie es scheint
nimmer im Saftflusse der Raupenbaume gefunden wird.

Von sehr verschiedenen Baumen aus der Provinz Gelderland stammendes
Saftflussmaterial erhielt ich vor mehreren Jahren durch die Güte von Dr. J. T.
Oudemans, Amsterdam, und fand darin drei Proiotheca- und ebensoviele Chlorella-
arten, worunter besonders eine sehr schone und gros?,zé[\\gt Frotot/ieca-diVt^) ge-
mein ist. Es hat sich herausgestellt, dass diese nicht nur weit verbreitet ia
<len Baumsaften, sondern auch ein Bewohner des Schlammes unserer Stadtgraben
und in gewissen Fallen von menschlichen Faeces ist, worin also auch Chlorellen
lebenfahig sein dürften. Ich fand dieselbe jedoch besonders viel im Flusse einer
Birke und von einem Abies pinsapo.

Auch Chlorella variegaia war in den aus Gelderland erhaltenen Mustern gegen-
wartig, doch isolierte ich das für meine Versuche verwendete Material dieser Art.
wie gesagt, hier in Delft aus Ulmenfluss.

Die Isolierung, sowohl von Chlorella wie Protothcca findet am besten statt
durch Aussaat des Rohmateriales auf Biergelatine, welcher Kulturboden gewahlt
wurde, weil beim Saftflusse eine Art »Bier« entsteht, infolge der Gegenwart der
im Flusse niemals fehlenden Alkoholhefen, worunter ganz allgemein einige Glukose-
hefen, wahrend Maltosehefen darin nicht vorkommen -).

Chlorella 7<ariega/a wurde in dem bunten Mikrobengemisch durch folgende
Eigenthümlichkeit erkannt: Die anfangs vollstandig farblosen Koloniën, welche
ganz wie Hefe-Kolonien aussehen, mikroskopisch jedoch die inr Prrtotheca charakte-
ristische endogene Fortpflanzungsweise besitzen, farben sich, nachdem sie zwei
oder drei Wochen auf dem genannten Kulturboden gehalten, tief grün, zunachst
am Rande, schliesslich jedoch auch in der Mitte.

Mit letzterer Eigenthümlichkeit wurde ich erst bekannt, als ich die unter dem
Namen Prototheca isolierte und als ganz farblos in meine Sammlung einverleibte
Form spater zu meinem Erstaunen als eine Chlorella zurückfand.

') In der Krarschen Sammlung zu Prag findet dicsc Art sich mit meinem Namen
als Artnamen, ohne dass ich weiss war davon der Autor ist: derzeit habe ich dieselbe
an mehrere Correspondenten geschickt.

-) lm oben erwahnten Saftflusse von der Eiche von de Grebbe fand icli, in Ueber-
einstimmung mit den Angaben von Lu dwig für das Thüringer Material, Saccharomyces
apiculatus und 5". ludwigii neben sehr viel Endomyces magnusii, wahrend die Hauptmasse
<lcs Schleimes sich als Essigbacterienschleim herausstellte, worin eine rundzellige,
sporenerzeugende Glukosehefe die anderen genannten PiJze der Zahl nach weit übertrifft.

233

Die Art wurde dann in Untersuchung genommen mit den folgenden Re-
sultaten.

Eben wie bei allen anderen Arten dieser Gattungen ist, sobald die bei der
Isolierung obwaltenden Schwierigkeiten überwunden sind, kraftiges, wenn auch
sehr langsames Wachstum auf die verschiedenartigsten Nahrböden möglich; als
besonders gunstig stellten sich zuckerreiche Materialien wie Würzegelatine und
ahnliche heraus und darauf entwickelen die Impfstriche sich zu ansehnlichen,
etwas festen, sich seitwJirts ziemlich weit ausbrcitenden Massen.

Hierauf, gerade wie auf Biergelatine, ist die schliesslich erreichte Endfarbe
verschieden, wie sich weiterhin ergeben vvird. Das Resultat der Kultur der aus
der Natur isolierten und nur einmal übergeimpften Art ist zunachst ein farb-
loses. schliesslich ein gleichmassig grünes Produkt.

Findet dann jedoch eine weitere Ueberimpfung statt, so tritt der variegate
Charakter hervor, indem die Impfstriche, welche anfangs ganz weiss oder gelblich
sind, am Rande zwar diese Farbe blcibend beibehalten, in der Mitte jedoch sich
tief grün farben, und auch hier und dort einen vollstandig grünen Sektor bis
zum Rande hinaussenden.

Das ganze Bild ist ausserordentlich auffallend und erinnert an irgend einen
Teil einer bunten Pflanze mit unregelmassiger Zeichnung, wie z. B. an die Blatter
gewisser bunter Ahornvarietaten.

Das mikroskopische Bild der grünen Teile zeigt zwar sehr verschieden grosse
Zeilen auf, diese sind aber alle, klein und gross, ziemlich gleichmassig grün.

Der weisse oder gelbe Teil besteht aus einem Gemisch von zwei Zellenarten :
farblose und gleichmassig grünliche, ohne scharf begrenzte Chromatophoren. Die
Chlorophyllmenge in diesen Letzteren ist aber viel kleiner wie in den tief grünen
Zeilen aus der Mitte der Striche und auch verschieden in den verschiedenen
gelblich grünen Zeilen unter sich.

Gut ernahrte Zeilen enthalten viel Glykogen, welches sich besonders in den
farblosen Prototheca-Y oxva&rv so reichlich anhauft, dass mit lod eine tief rotbraune
Farbe entsteht. Das Glycogen ist offenlmr auch das Assimilations-Produkt bei
der Kohlensaurezerlegung in den Chromatophoren von Chlorella.

Macht man Kolonienaussaaten von dem grünen mittleren Teile, so entstehen
daraus, so fern dieser Teil noch jung ist, nur allein grüne Koloniën; nach
langerer Aufbewahrung mischen sich in der Aussaat auch gelbliche zwischen den
grünen.

Die Kolonienaussaat der weissen oder gelblichen Randpartie, auf Würze- oder
Biergelatine, giebt innerhalb 3 oder 4 Wochen, der Hauptsache nach wieder weisse
oder gelbliche Koloniën, jedoch vermischt mit einer sehr wechselnden Anzahl
grüner. Ueberdies zeigen die gelblichen Koloniën früher oder spater vollstandig
grüne Sektoren oder Punkte, welche so absolut ordnungslos die Koloniën durch-
setzen, dass man darin die »fluktuirende«, und dennoch »sprungweise« Varia-
bilitat auf den Kulturplatten, welche keine zwei identischen Koloniën aufzeigen.
im lebendigen Bilde vor sich sieht.

Ganzlich stabile Prototheca-2.\x%i?iné.^ wurden auf den Würze- und Bierplatten
nicht erhalten.

Dieses gelang dagegen, was man vielleicht nicht erwarten würde, bei der

234

Kultur auf viel nahrungsarmeren Boden, wo die Ernahrung wenigstens zum Teile
stattfinden musste, mit Kohlensaure aus der Luft und bei Zutritt von Licht. Ich
benutzte gut ausgewaschenen Agar mit Spuren Ammonnitrat und Kaliumphosphat,
welcher auf die gewöhnliche Weise schief in Reagentienröhren erstarrt war.
Hierauf wurden lange Striche gezogen, welche so verdünnt waren, dass nur
Kolonienreihen entstanden. Sowohl aus den grünen wie aus den weissen Koloniën
erwachst ein sehr eigentümliches, nur wenig verschiedenes Bild, namlich ein buntes
Gemisch von tief grünen, einigen gelblichen und vielen erblich stabilen weissen
Koloniën. Aufifallend ist dabei folgendes: dort, wo die keilförmige Agarschicht
am dünnsten, also im oberen Teile der Röhren. bleiben alle neugebildeten Ko-
loniën ganzlich weiss, und hier dauert das Wachstum auch kürzcr wie auf den
dickeren Stellen des Agars. Ganz in der Tiefe, wo die Schicht am dicksten und
die Ernahrungsbedingungen wohl am günstigstcn, entsteht ein Gemisch von tief
grünen und vollstandig farblosen Koloniën. Mehr in der Mitte werden ausser
diesen Beiden auch gelbliche gefunden.

Obschon der bei diesen Versuchen vervvendete Agar, selbst wenn gut aus-
gewaschen, doch noch recht tauglich ist, findet man bald, dass die Gegenwart
der geringen nicht vollstandig beseitigten Menge löslicher organischen Substanzen
von grossem Einfluss auf das Zustandekommen der Spaltungserscheinung ist, und
ein Vergleich der mit Würze-, Bier- und armen Agarböden ausgeführten Versuche
ergibt folgendes Resultat.

Eine sehr starke Ernahrung mit organischen Körpern, wie Zucker und Peptonen,
ermöglicht die Fortexistenz der gelblichen Form, welche aus weissen Frototheca-
zellen besteht, untermischt mit gelblich gefarbten. So bald die Erschöpfung des
Bodens beginnt, bleibt am Rande der Striche das Wachstum ziemlich unverandert,
wahrend in deren Mitte die tief grüne Chlorella die Ueberhand gewinnt.

Bei noch viel grösserer Erschöpfung, wie solche auf den Agarplatten mit
anorganischen Salzen und Ernahrung mit Luft-Kohlensaure erfolgt. entstehen
viele vollstandig weisse erheblich stabile PrototJieca-Y^o\on\^n, neben der tief grünen
Normalform.

Wahrend im letzteren Falie Lichtzutritt natürlich notwendig ist für die Er-
nahrung, kann auf den reicheren Boden auch im vollstandigsten Dunkeln Wachstum
und Ergrünen stattfinden. Aus vergleichenden Versuchen geht aber hervor, dass
das Licht auch unter diesen Bedingungen die Chlorophyllbildung begunstigt.

Werden die vollstandig farblosen Koloniën ausgesat in anorganische Nahr-
lösungen, wie z. B. in : loo Leitungswasser, 0,02 K" H P O S 0,04 N H^ N O^, so
findet auch im Lichte, wie zu erwarten war, meistens kein Wachstum statt. Es gibt
jedoch Ausnahmen, welche bei der Verwendung von gelblichen Koloniën zur Regel
werden, und wobei normal grüne Chlorella-Y^n\\.\\x^n entstehen, was offenbar darauf
beruht, dass auch vereinzelte grüne Zeilen, oder solche, welche wenigstens die
Anlage zum Grünwerden noch bewahrt haben, in den weissen zur Aussaat ver-
wendeten Koloniën vorkommen und bald die Ueberhand über alle anderen bekommen.

Die Kolonienaussaaten unserer Art auf Biergelatine zeigen, wenn dazu altere
und oft überimpfte Kuituren verwendet werden, dass die erbliche Kraft des »Buntes«
in den einzelnen Keimen ausserordentlich verschieden ist, denn das Verhaltnis
zwischen Grün und Farblos ist in den Koloniën so verschieden wie irgend möglich.

235

Wenn also, wie aus dem Vorgehenden erhellt, Ernahrungsbedingungen die ent-
ferntere Ursache dieser Variabilitatsform sein mussen, so ist klar, dass der Zu-
sammenhang nur ein indirekter sein kann und dass irgend eine direkte Wirkung
jener Ernahrungsbedingungen auf unsichtbare Anlagen hat stattfinden mussen,
mit ebenfalls zunachst unsichtbaren Resultaten.')

Die Frage, ob die hier beschriebene Variabilitatserscheinung wohl oder nicht
übereinstimmt mit dem Verhalten der höheren bunten Pflanzen, dürfte dahin
beantwortet werden mussen, dass die verschiedenen, mehr oder weniger erblich
stabilen Kolonienformen, welche leicht aus Chlorella variegaia gezüchtet werden
können, gewissermassen einige der verschiedenen Variationszustande reprasentieren,
welche jeder für sich bei verschiedenen bunten Phanerogamen vorkommen.

Theoretisch dürfte dieses erklarlich erscheinen aus dem Umstande, dass die
gegenseitige Freiheit der C/dorellaztWQn, welche bei den höheren Organismen
fehlt, auch freiere und morphologisch und physiologisch umfangreichere Variations-
vorgange gestattet, wie die unlösbare Verbindung zwischen den Zeilen höherer
Pflanzen und Tiere. Hier können im allgemeinen nur die Fortpflanzungszellen
eine etwa vorhandene Anlage zur Variation auch wirklich aussern, wahrend die
somatischen Zeilen eine solche Anlage nur in jenen höchst seltenen Fallen zur
Schau tragen können, wenn daraus Knospen entstehen, die dann als Knospen-
varianten hervortreten. Bei Chlorella besteht der Gegensatz zwischen Fort-
pflanzungs- und somatischen Zeilen nicht, und jede Variation kann sofort auf den
Kulturmedien beobachtet werden.

Dass tatsachlich bei Chlorella mehrere in erblicher Hinsicht verschiedene Bunt-
varianten entstehen, ergibt sich aus dem Früheren. So ist der ganzlich weisse
Prototheca ein wie es scheint constanter, der gelbliche ein höchst variabler Variant.

Die ganz grüne Form ist bei Ernahrung mit guten Kohlenstoffquellen, wie
Zucker, sehr geneigt, die gelbliche Form abzuwerfen durch gewöhnliche Variation,
das heisst, indem sie selbst dabei grün bleibt; doch zeigen die verschiedenen
Zeilen derselben Kolonie dabei grosse Verschiedenheit in Bezug auf ihre Constanz.
Bei Ernahrung mit Kohlensaure als Kohlenstoffquelle allein, scheint die Varia-
bilitat der grünen Form ganzlich zu fehlen ; wenigstens gelang es nicht aus solchen
in Flüssigkeiten entstandenen Kuituren, durch Kolonienaussaaten sofort weisse
Koloniën zu erhalten, alle waren ausnahmslos grün.

Wenn ich nun eine Parallele ziehe zwischen diesen Verhaltnissen und den
bei höheren Pflanzen zu beobachtenden, so liegt ein überreiches Material vor,
wovon ein paar Beispiele aus eigener Erfahrung.

In vielen Fallen ergiebt sich das Bunt bei den höheren Pflanzen als sehr
unbestandig sowohl bei »Knospenselektion« wie bei »Samenauslese«, jedoch ist
diese Unbestandigkeit in verschiedenen Fallen ebenso verschieden, wie die Un-
bestandigkeit, welche die Koloniën in einer Aussaat aus der gewöhnlichen gelb-
lichen Varietat von Chlorella variegata zeigen, wovon jede von den Uebrigen ver-
schieden ist.

In die Categorie des Bunten mit sehr geringer erblicher Kraft bei A&x y>Knospen-
auslese<i, gehort eine im Jahre 1894 aufgefundene Brennessel ( Urtica dioica), welche

') Zu einer abnlichen Auffassung kommt d e Vr i e s, Mutationstheorie II vrg. 401, 1903.

236

einen sehr schonen bunten Zweig trug. Dieser Zweig wurde in Stücke zer-
schnitten, als Stecklinge im Grünhause eingepflanzt, wo diese sich leicht bewurzelten
und wieder verzweigten. Diese neuen Zweige wurden wieder aufs neue abge-
schnitten und gepflanzt. Allein, obgleich dafür nur diejenigen Aeste gewahlt wurden,
welche noch mehrere bunte Blatter trugen, konnte der Rückgang zum Grün
nicht verhindert werden, und schon im Herbst 1895 war keine Spur des Bunten
in den Stecklingen mehr zu sehen.

Anders verhalt sich Thymus serp\llum var. citriodora. Diese in den Garten oft
kultivierte Pflanze wird in den Garten als völlig constant »bunt« betrachtet.
Dennoch gelang es, daraus innerhalb drei Jahre eine konstant grüne Varietat zu
erhalten durch wiederholte Wahl für Stecklinge derjenigen Seitenzweige, welche
etwas weniger »Bunt« zeigten wie die Normalform, also durch »Knospenselektion«.
Der Versuch war sehr einfach und interessant. Die Pflanze ist namlich eine hölzige
Miniaturstaude, deren Stecklinge leicht Wurzel treiben. Fehler sind in umfang-
reichen Stecklingsbeeten, wie die meinigen es waren, schon deshalb unmöglich,
weil T/iy/iins serpyllum citiiodoia gynodiöcisch ist, und die Varietat citriodora nur als
weibliche Form vorkommt, welche in den Garten zwar stark blüht, aber niemals
Samen erzeugt.

Die am Ende des Sommers für die weitere Auswahl bestimmten Pflanzen
wurden unter Glas überwintert, weil sie für Frost etwas empfindlich sind. Das
Bunt verschwindet bei diesem Verfahren sehr langsam und in kleinen Sprüngen.
Wenn es scheinbar schon ganzlich beseitigt ist, bemerkt man an den alter werdenden
Pflanzen hier und dort wieder einen kleinen gelben Fleck, oft nur auf einem Blatte
einer ganzen Pflanze. Es ergiebt sich also, dass noch Spuren der Anlage zurück-
geblieben sind. Jedoch besitze ich nun auch eine Reihe ganz grüner Exemplare,
woraus auch die Anlage des Buntes ganzlich entfernt erscheint.

Ich würde nun auf Grund zahlreicher Erfahrungen eine weitere Parallele
aufstellen können zwischen den sehr variabelen Koloniën von C. variegata einer-
seits und der bei .///.'r.wrc?'/ verschiedener bunter Pflanzen bemerkten ausserst schwachen
erblichen Constanz andererseits. Obschon Beispiele davon wohl den meisten Bo-
tanikern gelaufig sein dürften, da eben die grosse Veranderlichkeit des Bunten bei
der Aussaat Regel ist, mag doch zur Festigung des Gedankenganges eine einzige
derartige Beobachtung erwahnt werden. Seit mehreren Jahren kultiviere ich die
einblattrige Honigkleevarietat Mi'Iilotus coeruleus \2lX. connata; bisweilen in ziemlich
umfangreichen Aussaaten. Dann und wann entsteht dabei ein buntes Exemplar, und
da die Pflanze selbstfertil ist, kann man leicht durch Einbinden in einem Gaze-
netz, viele durch Inzucht erzeugte Samen davon gewinnen. Bei wiederholten Ver-
suchen ist es jedoch nicht gelungen, daraus bei der Aussaat auch nur eine Spur
von Bunt in der neuen Generation zu bemerken, und auch bei der Fortzucht aus
letzterer, ergaben •sich die Enkel ausnahmslos als vollstandig grün. Doch wie
gesagt, dürften solche Verhaltnisse so allgemein bekannt sein'), dass es unnötig
ist, dabei langer zu verweilen.

') So behandelt de Vries, Mutationstheorie I, p. 597, 611, 1901 die BuntblatteriR-
keit in seinem Kapitel: «Nicht isolierbare Rassen*, welche Auffassung jedoch zu all-
gemein ist, weil das Bunt ebenso gut völlig fixiert sein kann, wie jede andere Eigen-
schaft.

237

Interessanter scheint es deshalb, diese Betrachtungen zu schliessen mit der
Besprechung eines Falies, wo das Bunt als völlig constante Eigenschaft sowohl
bei der Stecklingszucht wie bei der Aussaat auftritt. Diesen Fall erkannte ich
bei Barbarea vulgaris var. variegata, welche ich in 1895 aus einer Samenhandlung in
Erfurt erhielt, und ich legte mir die Frage vor, ob hierbei trotz der Constanz,
dennoch Selektion möglich war.

Die erste Aussaat ergab ein sehr gleichmassiges Resultat. Es wurde ein
einziges Exemplar ausgewahlt, und dieses gab, durch Gaze gegen Insektenbesuch ge-
schützt, einen guten Samenertrag, sodass die Pflanze sich als selbtfertil herausstellte.

Die starke, unserem Klima völlig angepasste Art, wird in den Beschrei-
bungen zweijahrig genannt, ist jedoch wie so viele Zweijahrige, durch starkes
Schneiden leicht Jahre lang zu halten. Ueberdies können Seitenzweige, als Steck-
linge verwendet, sich leicht bewurzeln und neue Pflanzen liefern, sodass es sich
hierbei um ein in jeder Beziehung geeignetes Versuchsmaterial handelt.

Die damit ausgeführten Versuche bezweckten, erstens durch Zweigselektion
das Bunt zu erhöhen oder zu vermindern, was schon darum Erfolg versprach.
weil besonders im Spatsommer eine grosse Difïerenz in der bunten Farbe der
Zweige bemerkbar ist, und zweitens das gleiche Resultat durch Samenauslese bei
strenger Inzucht zu erhalten.

Ersteres ist jedoch völlig misslungen. Selbst durchaus grün erscheinende Zweige
gaben ebenso ausnahmslos wieder die bunte Hauptform, wie die wegen ihres stark
ausgepragten Bunten gewahlten, sodass schliesslich der Versuch aufgegeben wurde.
Wie man sieht, ist dieser Fall im völligen Contrast mit demjenigen des Citronen-
thymians, wo die Zweigselektion schon im dritten Jahre ein definitives Resultat
gegeben hatte.

In den Saatbeeten ist eine ziemlich grosse jedoch nur scheinbare Ver-
schiedenheit im Bunte zwischen den jungen Pflanzen bemerkbar. Bei der grossen
Mehrzahl sind Samenlappen und erstes Blatt ganzlich grün, dann zeigt aber entweder
das zweite, das dritte, oder erst das vierte Blatt irgend einen Buntflecken; spater
geht jeder Unterschied völlig verloren. Die Selektion hat nun darin bestanden,
einerseits eine Familie zu zuchten, wobei die am frühesten, anderseits die am
spatesten bunt werdenden Exemplare ausgewahlt wurden, wobei jedesmal wieder
ein einzelner Samentrager verwendet und also strenge Inzucht beibehalten wurde.

Obschon sehr langsam bin ich doch auf diesem Wege sicher weiter gekommen,
und zwar in beiden Richtungen der Wahl.

Ob es mir gelingen wird durch Selektion aus den Saatbeeten schliesslich eine
völlig grüne Pflanze zu erhalten, ist selbst jetzt noch, nach siebenjahriger Aus-
wahl nicht sicher, doch bin ich nun jedenfalls so weit, dass die grüne »Familie«.
wovon ich drei Pflanzen bewahrt habe, deutlich verschieden ist von der ursprüng-
lichen Form, was ebenfalls gilt in Bezug auf den Stamm, worin das Bunt accu-
muliert wurde. Von einem Fortschritt in Sprüngen kann ich in diesem Falie kaum
sprechen ; die Selektion niusste so zu sagen mit fluctuirend variirenden Formen
geschehen. Da ich durch einen Paralellversuch feststellen wollte. in wie weit die
Inzucht hierbei vielleicht der Variabilitat entgegen gewirkt hatte, wurde in einem
Garten zu Gorssel ebenfalls eine Aussaat unserer Pflanze jahrlich für Selektion
terwendet, jedoch ohne jede Wahl eines bestimmten Samentragers, sondern nur

238

durch Aussuchen der am meisten versprechenden Keimlinge aus dem umfang-
reichen Saatbeete, welches von den gemischten Erfurter Samen stammte.

In diesem Falie habe ich jedoch überhaupt nichts erreichen können ; ich
erhielt immer nur den Ausgangstypus ganz allein, so dass die Rasse sich als eine
vöUig constante herausstellte. Ich beabsichtigte jedoch diese ausserordentlich ge-
eignete Versuchspflanze noch weiter zu studieren.

Wenn ich den Parallelfall aus den Kolonienaussaaten von Chlorella varie}:;ata
aufsuche, welcher mit dem Verhalten von Barbarea vulgaris var. variegata zu ver-
gleichen ist, so scheint es mir, dass dabei eben die Normalform in Betracht gezogen
werden muss, welche frisch aus der Natur isoliert auf Biergelatine zunachst farb-
lose Koloniën ergiebt, welche spater ganz grün werden und erst durch Ueber-
impfung infolge der Bildung von gelben und grünen Sektoren sich als »bunt«
herausstellen.

Der Vergleich gewinnt sehr an Deutlichkeit, wenn man die ganze bunte
Pflanze als eine Zellkolonie aufïasst, deren Zeilen den verschiedenen Zeilen einer
variierenden Kolonie von Chlorella variegata entsprechen. Ware es möglich, alk
Zeilen einer bunten Barbarea^^'^2Lnz^ zur Vermehrung zu bringen und daraus neue
Pflanzen zu zuchten, so ist es wahrscheinlich, dass dabei ziemlich verschieden
aussehende, also mehr oder weniger bunte Pflanzen würden erhalten werden,
welche den weniger stabilen Ueberimpfungen von Chlorella zu vergleichen waren,
die jedoch, wenn es zur Ausbildung von Geschlechtszellen kame, wohl ohne jeden
Zweifel nur solche erzeugen könnten, welche wieder den Typus in völlig normaler
Ausbildung hervorbringen würden.

Das Assimilationsprodukt der Kohlensaure in den
Chromatophoren der Diatomeen.

Recueil des Travaiix Botaniques Néerlandais, Nijmegen, Vol. I, 1904, p. 28 — 32.

Da ich in der mir zur V'erfügung stehenden Literatur keine bestimmte Ant-
wort auf die hier gestellte, für die Planktologie hochwichtige Frage gefunden
habe, und ebensowenig auf die weitere, damit zusammenhangende Frage nach der
Natur der in der Diatomeenzelle gespeicherten Reservenahrung, erscheint die Mit-
teilung meiner eigenen Erfahrungen in dieser Beziehung nicht überflüssig. Waruni
die weitschichtige DiatomeenHteratur eben über diese Punkte so wenig klare
Angaben enthalt, folgt aus dem Umstande, dass .die zahlreichen Diatomeenforscher
wohl viel mikroskopiert aber nur wenig kultiviert haben.

Dennoch ist die Kultur von mehreren, zu den Gattungen Nttzdiia, Navicula
und Cocconenid gehörigen Arten sehr einfach ; nur ist es notwendig, dieselben durch
das Plattenverfahren von den Grünalgen und ahnlichen Organismen zu trennen
und das ist eben die Schwierigkeit, welche die Mikroskopiker nicht überwinden
konnten.

Die Hauptbedingung für die Reinkultur der Diatomeen, der Cyanophyceen
und vieler niederen Grünalgen ist einfach diese: im Nahrboden dürfen nur Spuren
von löslichen organischen Körpern vorkommen, wahrend die mineralischen Nahr-
salze ebenfalls nur in sehr verdünntem Zustand verbanden sein mussen.') Bei den
Cyanophyceen kommt, wie ich früher gezeigt habe, noch der begunstigende Ein-
fiuss der Abwesenheit von Stickstoffverbindungen, weil diese Organismen den
freien Stickstoff zu assimilieren vermogen. Die Diatomeen besitzen dieses Ver-
mogen zwar nicht, doch entwickeln sie sich am besten, wenn auch in ihrem
Nahrboden die Stickstoffverbindungen nur sehr verdünnt vorkommen, so dass für
deren Reinkultur der namliche Boden wie für die Cyanophyceen gut geeignet
ist."") Als solche erkannte ich mit strömendem Wasser ausgewaschene Kiesel-
oder Agarplatten. Für die Anfertigung von Kieselplatten verfahrt man folgender-
massen :

Die concentrierte Wasserglaslösung des Handels wird mit Wasser verdünnt
und genau mit Salzsaure titriert. Es wird dann durch Ausprobieren festgestellt.

*) Die ersten Reinkulturen von Diatomeen erhielt ich im Jahre 1895 bei der Iso-
lierung der Nitritfermente auf gewaschener, Kreide und Chlorammon-haltigem Agar.
Vor Kurzem hat auch Richter, Ber. d. d. Botan. Gesellschaft Bd. 21, pag. 493, 1903,
über die Reinkultur von Diatomeen geschrieben.

-) Oligonitrophilie bij Cyanophyceen. Centrbl. f. Bacteriologie. 2t Abt. Bd. 7,
p. 562, 1901.

240

mit wie viel Wasser verdünnt werden muss, um, gerade bevor die Erstarrung
erfolgt, die Salzsaure gut mit der verdünnten Lösung vermischen und in eine
Glasdose, worin die Erstarrung zu eincr Platte stattfindet, ruhig ausgiessen zu
können. Es wird dann im Wasserstrom aiisgewaschen, durch Aufgiessen einer
Salzlösung, z. B. von V20 ''/o K^ H P Q-* und '/20 '^lo NH* Cl, die nötige Nahrsalz-
quantitat hineingebracht, ') das Uebermass der Salzlösung abgegossen, das an-
hangende Wasser durch schwache Erwarmung abgedunstet und vorsichtig flambiert,
wobei man leicht einen sterilen, ca. s^/f^ Kieselsaure haltigen Boden, mit schön
glanzender Oberflache erhalt. Hierauf wachsen sowohl Grünalgen wie Diatomeen
sehr üppig und bei Fortlassung des Ammonsalzes auch die Cyanophyceen.

Ein ebenso gutes Resultat gibt die Kultur auf scharf ausgelaugtem Agar,
welcher übrigens auf die gleiche Weise behandelt wird. Sowohl der Wasserglas-
lösung wie dem Agar kann zuvor Kreide zugesetzt werden, was z. B. bei Versuchen
mit den Nitritfermenten notwendig ist.

Um Diatomeenkolonien auf diesen festen Boden zu erhalten, kann man sowohl
Gartenerde wie Grabenschlamm darauf zur Aussaat bringen. Dass die Garten-
erde sehr reich an Diatomeen ist, habe ich bei einer früheren Gelegenheit schon
nachgewiesen.

Die Ursache warum ich e^n nun in diesem Zusammenhang die Einzel-
heiten der Kultur bespreche, ist, dass ich die gleichen Diatomeenarten dabei unter
sehr verschiedenen Ernahrungsbedingungen kennen lernte und gerade dadurch
Sicherheit erlangte in Bezug auf das Kohlensaure-Assimilationsprodukt derselben.

Es handelt sich hierbei namlich um /ef/es Oei, und es ist bekanntlich sehr
leicht, diesen Körper vermittelst der Osmiumsaurereaction nachzuweisen sobald es
in freien Tropfen in den Zeilen liegt, viel schwieriger dagegen wahrend es noch
im Protoplasma, hier also in den Chromatophoren eingeschlossen oder besser gesagt,
gelost ist, doch gelingt auch dieses, wenn man die Farbetönungen beleuchteter
und verdunkelter, mit Osmium behandelter Chromatophoren nur mit der nötigen
Vorsicht vergleicht.

Glycogen, Starke und Paramylum fehlen bei allen von mir untersuchten
Diatomeen, centrischen sowohl wie penaten, vollstandig; selbst dort wo in den
Chromatophoren ein Pyrenoid erkennbar zu sein scheint, konnten keine deut-
lichen mit diesen Stoffen angefüllten Amylumheerde erkannt werden.")

Die Kulturbedingungen lehrten folgendes : so lange die Diatomeen kraftig
genug wachsen, um das gebildete Oei zu assimilieren, und in protoplasmatische
und andere Körpersubstanzen zu verwandein, bemerkt man keine Anhaufung des-
selben und die Chromatophoren enthalten davon nur Spuren. Jede Ursache aber
welche das Wachstum beeintrachtigt, bei übriger ungestörter Kohlensaureassimi-
lation, gibt zu einer kraftigen und leicht sichtbaren Anhaufung von Oeltropfen
Veranlassung, welche zuerst in den Chromatophoren selbst, dann auf deren Ober-

') Und mit 3"/() Cl Xa versetzt, wenn es sicli um die Kultur von Meeresdiatomeen
handelt.

"-) Schütt, Bacillariaceen in Natürl. Pflanzen-familien. Thl. I, Abt. ib, pag. 47,
1896 sagt dagegen: »Die Chromatophoren mancher Arten besitzen eine oder mehrere
Pyrenoide mit oder oline Amylumheerde. « Welche Arten hier gemeint sind. wciss
ich nicht.

241

flache sichtbar werden, und spater die Zellhöhlung ausfüllen, wobei es bis zur
vollstandigen Verdrangung der gesammten Vacuolenflüssigkeit gehen kann.

Wie mussen nun aber die Kulturbedingungen beschaffen sein, damit das
Wachstum gehemmt wird ohne Schadigung der Kohlensaure-Assimilation ?

Dieses ist auf sehr verschiedene Wege zu erreichen. wovon ich hier nur
einen besprechen will, welcher auf der Tatsache beruht, dass das Kohlensaure-
assimilationsprodukt der Diatomeen eben identisch ist mit der durch diese Or-
ganismen gespeicherten Reservenahrung. ')

Sobald bei übrigens günstigen Lebens- und Wachstumsbedingungen irgend
ein für das Wachstum notwendiges Element fehlt, wird dieser Vorgang etwas
herabgesetzt, ohne dass die Funktionen der Einzelzelle dabei beeintrachtigt zu
werden brauchen. Dieses Prinzip gibt ein besonders übersichtliches Resultat. wenn
das fehlende Element der gebundene Stickstofif ist, und so kommt man zu folgen-
dem Versuche : Ein guter, nach obiger Vorschrift angefertigter f ester Kultiirbrden
wird einerseits mit ein wenig z. B. '/:>o "/o Cl NH ^ versehen und andererseits ohne
gebundenem Stickstoff verwendet. Zur Aussaat auf beiden Boden verwendet man
am besten eine schon früher hergestellte Diatomeenkultur, doch kann auch Dia-
tomeen-haltige Gartenerde oder Grabenschlamm ohne weiteres verwendet werden.

Nach ein oder zwei Wochen ist das Resultat ganz unzweifelhaft. Die Kultur
auf dem Chlorammon-haltigen Boden ist stark gewachsen und halt kein deutlich
bemerkbares Oei; dagegen hat die Kultur auf dem Stickstoff-armen Boden mehr
oder weniger massenhaft Fett gespeichert.

Auch mit Kulturflüssigkeiten kann mit gleichem Erfolge experimentiert werden,
doch muss man dabei den Luftzutritt genau überwachen, um ein wirklich über-
zeugendes Resultat zu bekommen, was am besten geschieht durch Kultur in sehr
dunner Schicht der Nahrlösung.

Da ich die gleichen Ergebnisse mit verschiedenen Diatomeenarten der olien
genannten Gattungen des Süsswassers und des Meeres erhalten habe, ist an die
allgemeine Gültigkeit des Satzes, dass fettes Oei das erste sichtbare Assimilations-
produkt der Kohlensaure in den Diatomeenzellen ist, nicht zu zweifeln.

Ich gehe jedoch noch einen Schritt weiter, denn mikroskopische Erfahrungen
haben mich gelehrt, dass auch die übrigen von mir untersuchten Phycochrom-
haltigen Planktonorganismen, namlich gewisse Peridineen und Chrysomonadineen
z. B. Phaeocystis pouchetii, ebenfalls in ihren Chromatophoren fettes Oei erzeugen,
wahrend Starke und Glycogen darin fehlen. Vielleicht ist die Regel auch auf
viele höhere Braunalgen anwendbar, wovon ich jedoch nur wenig Erfahrung
habe.

Jedenfalls dürfte die Tatsache, dass die Diatomeen Oelbilder sind, Licht
werfen auf ihre allgemeine und grosse Bedeutung für das Plankton, indem das Oei
wohl als eine sehr zweckentsprechende Schwebeinrichtung betrachtet werden muss.

') Es ist notwendig, Letzteres scharf zu betonen, vveil es eine ziemlich allgemeine
Regel, ich möchte beinahe sagen ein Naturgesetz ist, dass bei übrigens günstigen
Wachstumsbedingungen die Zeilen von allerlei Tieren, Pflanzen und Alikroben, bei
Mangel an assimilierbarem Stickstoff fettes Gel erzeugen, soweit diese Zeilen überhaupt
zur Fettbildung geeignet sind.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 16

U^ber die Bakterien, welche sich im Dunkein
mit Kohlensaure als Kohlenstoffquelle ernahren

können.

Centralblatt fiir Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, XI. Band,

1904, s. 592—599-

Bekanntlich hat Herr Winogradsky angegeben'j, daB die von ihm ent-
deckten Mikroben der Nitrifikation die Energie, welche dieselben durch
die Oxydation der Nitrite in Freiheit setzen, verwenden für die Zerlegung der
Kohlensaure, und daB dieselben aus letzterem Körper als Kohlenstoffquelle ihre
organische Leibessubstanz aufbauen sollten. Indessen habe ich mich von der
Richtigkeit dieser Ansicht nicht überzeugen können, stieB dagegen bei der Nach-
prüfung seiner Angaben auf einen, eben für die in Nitratbildung begriffenen
Kulturflüssigkeiten charakteristischen Mikroben (Bacillus oligocarbophilus).
welcher sich mit den organischen Kohlenstoffverbindungen der Laboratoriums-
luft ernahrt ^).

Die Anhaufung von organischem Stoff, welchen man bei der Nitrifikation
dann und wann auch nach meiner Erfahrung beobachtet, muB deshalb auf diesen
Mikroben, dessen Atmung auf die gewöhnliche Weise Energie erzeugt, zurück-
geführt werden. Auch bemerkte ich in meinem Grünhause, wo die Luft viel
reiner ist als im Laboratorium, bei gleich starker Nitrifikation gar kein oder erst
viel spateres Wachstum von B. oligocarbophilus, welcher von Anfang an
den Kuituren zugesetzt war.

Im vorigen Jahre ist Herr Natanssohn'^) auf die Frage zurückgekommen,
und hat gezeigt, daB im Meere Bakterien vorkommen, welche durch Oxydation
von' Schwefelwasserstoff oder von Thiosulfat (Na'^S^O^) imstande sind, Kohlen-
saure zu reduzieren und daraus ihre organische Körpersubtanz aufzubauen.

Ich kann die Richtigkeit seiner Versuche durchaus bestatigen und durch
eigene Erfahrungen ausdehnen.

Zunachst war es mir bekannt, daB die Erscheinung sich noch leichter nach-
weisen laBt für SüBwasserformen als für diejenigen des Meeres, welche letztere
jedoch auch an der hollandischen Kuste ganz allgemein sind. Weiter ist mir
der ProzeB noch unter einer ganz anderen Form vorgekommen, namlich als Denitri-

') Annal. de l'Institut Pasteur. T. VI. 1891. p. 270 und 462.
') Centralbl. f. Bakteriol. Abt. II. Bd. X. 1903. p. 33-

*) Ueber eine neue Gruppe vonSchwefelbakterien. (Mitt. der zool. Station zu Neapel.
B. XV. 1903. Heft 4. p.655.)

243

fikationsvorgang mit freiem Schwefel als Energiequelle. SchlieBlich erkannte ich
die gleiche Erscheinung bei der Spaltung der Rhodanate durch Bakterien, be-
sonders beim Ammoniumrhodanat (CNS.NH"*), welches ebenfalls mit Bildung
freien Schwefels stattfindet.

Meine Beobachtungen habe ich zum ersten Male vorgetragen am i6. April 1903
auf der 9. Versammlung der niederlandischen Naturforscher und Arzte zu Delft')

Ich will zunachst meine Versuche beschreiben, welche denjenigen von Herrn
Natanssohn ganz parallel sind.

I. Die Reduktion der Kohlensaure mit Schwefelwasserstoff,
Thiosulfat oder Tetrathionat als Energiequelle.

Man füUe einen gewöhnlichen oder einen E r 1 e n m ey e r- Kolben mit einer
nicht zu dicken Schicht der folgenden Nahrlösung, welche keine andere
Kohlenstoffquelle wie Natriumbikarbonat und als Energiequelle
Natriumthiosulfat, Na2S20^ enthalt:

H*0 100
Na^S^O^SH-O 0,5

NaHCO^ 0,1

K-HPO^ 0,02

NH^Cl 0,01

MgCP 0,01

Kochen oder Sterilisieren ist überflüssig^).

Es wird infiziert mit einer reichlichen Quantitat Graben- oder Kanalwasser
oder mit einer Spur Grabenschlamm^), und es wird kultiviert im Thermostaten
bei 28" C bis 30" C. Ob im Licht oder Dunkeln ist gleichgültig. Nach 2 oder 3
Tagen bedeckt sich die Oberflache der Kulturflüssigkeit mit einer Schicht freien
Schwefels, welche dicht mit Bakterien erfüllt ist.

Man impft eine Spur dieser Haut über in eine ganz ahnliche Lösung, wobei
also jede Verunreinigung mit organischen Stoffen aus dem Wasser oder dem
Schlamm ausgeschlossen ist, und sieht dann sicher nach 24 Stunden eine noch
kraftigere Hautbildung wie bei der Rohimpfung.

Eben wie beim Versuche von Herrn Natanssohn findet hierbei die fol-
gende Spaltung statt.

S^O^Na^-f 0 = Na«SO^ + S,
welcher ProzeB exothermisch ist und also als Energiequelle fungieren kann.
DaB diese Energie tatsachlich für die Kohlensaurereduktion des Natriumbikar-
bonates, d. h. also für die Bildung der organisehen Stoffe der Bakterienkörper,
verwendet wird, ist unzweifelhaft. Diese wichtige Tatsache ergibt sich daraus,

*) Phénomènes de réduction produits par les microbes. (Archives Néerlandaises.
Sér. II. T. IX. 1904. pag. 131.)

*) Oder schadlich, insoweit das Bikarbonat sich spalten kann.

') Der Grabenschlamm in Holland, sowie der Meeresschlamm an unserer Kuste
enthalt überall FeS oder H*S, entstanden durch Sulfatreduktion durch Microspira
desulfuricans im SüBwasser, durch M. aestuarii im Meere.

16*

244

daB der Versuch desto besser gelingt, je sorgfaltiger man org-anische Kohlen-
stofïquellen fernhalt. ')

In diesem Versuche laBt sich das Thiosulfat durch Schwefelwasserstoff oder
besser durch CaS ersetzen, wovon wegen der stark alkalischen Bakterien nicht
mehr wie ca. o,i Proz. zu verwenden ist, und wobei nach Abspaltung von H^S
durch Kohlensaure der Oxydationsvorgang nach der Formel

H^S f O = H^O + S
stattfindet.

Weil H^S jedoch schon an der Luft oxydiert, ist letztere Reaktion weniger
elegant, in der Natur jedoch sicher viel wichtiger und allgemeiner, wie die erstere,
weil das Thiosulfat in den Gewassern viel seltener ist.

Etwas schwieriger, jedoch auch sehr schön und überzeugend, gelingt der
Versuch mit Tetrathionat, nach der Formel

S*0'^Na2 -h Na^CO^' + O = 2 SO^Na2 -,- CO' + S^

wobei, wie man sieht, eine Zugabe von Natriumkarbonat aquivalent dem ver-
wendeten Tetrathionat notwendig ist, um die in diesem Falie gebildete freie
Schwefelsaure zu binden").

Das Dithionat, Na'''S^O'', wird durch unsere Bakterien nicht gespalten. Das
Ammonsalz als Stickstofïquelle kann durch Nitrat ersetzt werden. Andere Kohlen-
stoffverbindungèn, wie Kohlensaure, um das Kohlenstoffbedürfnis zu befriedigen,
konnten nicht aufgefunden werden. Sicher untauglich dafür sind Ureum, Formiate,
Oxalate sowie die komplizierteren organischen Stofïe.

Bei allen diesen Versuchen kann das o,i Proz. Natriumbikarbonat durch
0,05 Proz. Na^CO^ ersetzt werden, jedoch ist dann das Resultat weniger sicher.
Ofïenbar ist die leichte Abspaltung der freien Kohlensaure dem Stoffwechsel
unserer Bakterie gunstig.

Es ist wichtig, die genannten Mengenverhaltnisse genau zu beachten, besonders
ein zuviel an Karbonat ist schadlich. Auch bei 2 Proz. Na'S^O^ steht alles schon
still, und es findet dann überhaupt keine Schwefelabscheidung statt. Bei ca. 1,5 Proz.
Na'S'^O^ liegt die Grenze der Konzentration, welche die Spaltung noch ermöglicht
und ebenfalls die Thiosulfatmenge, welche mit 0,01 Proz. Natriumbikarbonat aqui-
valiert. Es könnte also 0,1 g Natriumbikarbonat (oder 0.5 g Na^CO^) das plastische
Aequivalent zu 0,5 g Thiosulfat genannt werden.

Bei dem Versuche mit 0,5 Proz. Na^'S^O^ ist nach 4 oder 5 Tagen die Spaltung
vollstandig beendet. Wünscht man die Bakterien dann abzusondern und vom
Schwefel zu trennen, was nicht ganz leicht ist, so muB man wie folgt verfahren :

Man saugt mit einer Pipette die unterhalb der Haut befindliche Flüssigkeit
ab, wobei allerdings schon viele Bakterien verloren gehen ; weil die Flüssigkeit
jedoch kaum trübe ist, ist dieser Verlust relativ gering. Die aus Schwefel und
Bakterien bestehende Haut wird nun mit soviel Benzol geschüttelt, bis aller Schwefel

') Ganz anders also, wie im früher beschriebenen Falie der Nitrifikation, wobei
Bacillus oli goc arbop hi 1 us sich mit den organischen Verbindungen, welche in
der atmospharischen Luft vorkommen, ernahrt.

*) In den Betrachtungen, welche Herr Natanssohn an die Wirkung des Thetra-
thionats knüpft, kann ich ihm nicht folgen; dieselben sind unrichtig.

245

gelost ist. Hierbei entsteht eine trübe Emulsion, weil das Wasser, welches den
Bakterien anhangt, sich nicht abscheidet, sondern als kleine Tröpfchen im Benzol
suspendiert verbleibt, und finden in diesen Tröpfchen gerade sich alle Bakterien
vor. LaBt man die Emulsion einige Zeit stehen, so sinkt das bakterienhaltige
Wasser nach unten, wodurch es möglich wird, den gröBten Teil des Bensols und
also des darin gelösten Schwefels zu entfernen.

Das noch wenig Schwefel und viel Benzol enthaltende Wasser wird nun mit
einem UebermaB Alkohol von 96 Proz. versetzt, welcher sowohl das Benzol wie
den Schwefel lost, die Bakterien dagegen quantitativ prazipitiert.

Allerdings ist die so erhaltene Menge an organischer Bakteriensubstanz gering,
jedoch vermittelst Permanganat leicht nachweisbar und die Entstehung derselben
aus Kohlensaure vollstandig gesichert.

Die Reinkultur sowohl der SüBwasser- wie der an den niederlandischen
Kusten ganz allgemeinen Meeresform gelang auf ahnliche Weise, wie schon von
Natanssohn angegeben worden ist. Für die SüBwasserform wurde die oben
angegebene Kulturflüssigkeit mit 2 Proz. Agar erstarrt und auf der Platte Material
von der schwefelhaltigen Haut abgestrichen. Die Schwefelbakterie wird dann
nach ein paar Tagen kenntlich durch die starke Schwefelabscheidung auf den
Kolonieen, welche bei den Verunreinigungen fehlt. Für die Isolierung der Meeres-
form muB dem Agar noch 3 Proz, Kochsalz zugesetzt werden.

Hat man für die Kultur Nitrat anstatt Ammonsalz als Stickstoffquelle ver-
wendet, so findet man unter den verunreinigenden Formen eine mit B. Stutzerei
verwandte Bakterie, welche offenbar eine denitrifizierende Wirkung ausübt, wobei
die abgestorbenen Schwefelbakterien den organischen Stoff als P^nergiequelle für
die Denitrifikation darbieten.

Die Bakterie selbst ist ein kleines und dunnes Kurzstabchen von 3 bei 0,5 |Lt,
welches keine Sporen erzeugt und sehr beweglich ist.

Die Respirationslinie bildet sich nach dem Spirillentypus, d. h. die Bakterien
sammeln sich durch ihre Bewegung in einiger Entfernung vom Meniskus an.

Bei der Aufbewahrung ergibt sich die Art als sehr empfindlich : schon nach
einer Woche oder selbst noch früher erweisen sich die Kolonieen auf der Agar-
platte als abgestorben.

Ich schlage vor, die SüBwasserform Thiobacillus thioparus zu nennen.

Ich gehe nun zur Besprechung eines ganz anderen Weges über, der zu farb-
losen Bakterien führt, welche im Dunklen Kohlensaure zersetzen und zu ihrer
organischen Nahrung verwenden können. Es handelt sich um Denitrifikation ver-
mittelst des freien Schwefels.

2. Die Reduktion der Kohlensaure durch Denitrifikation mit
freiem Schwefel als Energiequelle.

Die hier in Betracht kommende Bakterienart ist von der vorigen verschieden,
und wird infolgedessen als Thiobacillus denitrificans bezeichnet werden.
Sie wird durch folgenden Versuch erhalten, wobei als Energiequelle, welche zur
Kohlensaurezerlegung Veranlassung gibt, gediegener Schwefel fungiert, welcher
durch Denitrifikation in Sulfat verwandelt wird.

246

Zur Ausführung des Versuches wird, wie folgt, verfahren : Eine gut
geschlossene Flasche ist ganzlich angefüllt mit:

Grabenwasser 100

Schwefel als Pulver 10
KNO^ 0,05

Na^CO^ 0,02

CaCO^ 2

K^HPO^ 0,02

und es wird bei 30** C kultiviert. AuBer denitrifizierenden Bakterien, welche auf
Kosten der organischen Substanz des unreinen Wassers leben, enthalt das Wasser
auch T. denitr if icans in genügender Menge, um auch den Denitrifikations-
prozeB mit Schwefel als Grundlage einzuleiten, so daS nach 5 bis 6 Tagen ein
regelmaBiger Stickstofïstrom sich zu entwickeln beginnt. Man impft nun in die
gleiche Flüssigkeit über, worin jedoch das unreine Wasser durch destilliertes
Wasser ersetzt ist. Also in

H'O 100

Schwefel 10

KNO" 00,5

Na^CO' 0,02

CaCO' 2

K^HFO* 0,02

MgCl^ 0,01.

Darin wird innerhalb einer Woche der gleiche Vorgang, jedoch in betrachtlich
starkerer Intensitat bemerkbar. Dieser verlauft der Hauptsache nach nach der
Formel

6KNO^ + 5 S + 2 CaCO^ = 3 K^SO* + 2 CaSO^ + 2 CO^ + 3 Ni

welcher Vorgang exothermisch ist und 659,5 Kalorieen entwickelt, also ca. r Kal.
pro Gramm zerlegten KNO^.

In einer Flasche von 210 cm' warden 900 mg KNO^ in 12 Tagen zum Ver-
schwinden gebracht, wobei der Salpeter je in Dosen von 100 — 200 mg zugesetzt
wurde, wenn es sich zeigte, daB die vorher zugesetzte Menge verschwunden war.

Die Schwefelmenge, welche dem verschwundenen Nitrat entspricht, betragt
nach obiger Formel, wenn als BaSO^ gewogen, 0,4325 g. Faktisch wurden jedoch
nur 0,283 S BaSO* gefunden, so daB ungefahr die Halfte des Salpeters auf andere
Weise zerlegt sein muB, wahrscheinlich durch einen DenitrifikationsprozeB auf
Kosten von organischer Substanz von Bakterienleichnamen stammend, welche
ihrerseits also wieder auf die Reduktion der Kohlensaure zurückzuführen ist.

Die in den Flaschen oberhalb des sedimentierten Schwefels und der Kreide
stehende Flüssigkeit ist anfangs natürlich wasserklar. Beim Fortschreiten der
Reaktion trübt sie sich jedoch sehr betrachtlich, und zwar nicht allein durch
T. denitrificans, sondern auch durch einige andere Bakterien, worunter T.
thioparus, welcher an und für sich nicht denitrifiziert, in auffallend groBer
Menge, wie sich aus den Plattenkulturen ergibt, sowie ein sehr feines und eigen-

247

tümliches Spirillum, welches nicht isoliert werden konnte, und ferner einen
Vibrio (Vibrio de vo rans n.sp.) und das früher auch schon genannte deni-
trifizierende, mit B. Stutzeri verwandte Stabchen.

Die Gegenwart von T. thioparus zeigt, daB die Flüssigkeit auBer dem
Schwefel und Sulfat, auch noch andere Schwefelverbindungen enthalten muS.
Es ist denn auch vermittelst einer Spur eines Ferrosalzes leicht nachzuweisen,
daB da.zu H^S gehort, sobald das KNO^ verschwunden ist. Doch verschwindet
dieser H*S wieder bald, wenn aufs neue Salpeter zugesetzt wird, so daB auch
H^S zu einem DenitrifikationsprozeB oder wenigstens zu Nitratreduktion ver-
anlassen kann. Die groBe Leichtigkeit, womit Schwefelwasserstoff entsteht, wenn
die verschiedenartigsten (jedoch durchaus nicht alle) lebenden Bakterien (sowie
die aktiven Alkoholhefen) mit Schwefel in Berührung kommen bei Gegenwart
von organischer Substanz, hier also mit toter Bakterienleibessubstanz, erklart die
Gegenwart des H'^S zur Genüge.

Gerade die groBe Leichtigkeit, womit man sowohl diesen letzteren Vorgang,
wie die früher besprochene Denitrifikation, welche auf der Gegenwart von aus
Kohlensaure gebildeter organischer Substanz beruht, in den alteren Kuituren
beobachtet, zeigt deutlich, daB der Schwefel in mehrfacher Beziehung eine wichtige
Rolle im Kreislaufe der Natur zu erfüllen hat, denn es ist klar, daB dieses Ele-
ment in seinen verschiedenen Verbindungsformen in den dunklen Tiefen des
Meeres und der süBen Gewasser immerfort tatig ist bei der Neuschaffung von
organischer Substanz.

Die Reinkultur von T. d e n i t r i f i c a n s ist schwieriger, wie diejenige von
T. thioparus, gelingt übrigens auf demselben Kulturboden, also auf

Leitungswasser

lOO

Na'-^S'-'O^ . SH^O

0,5

K*HPO*

0,01

NaHCO^

0,02

Agar

2.

Weil hierbei von T. de n i t r i f i can s ebenfalls Schwefel abgetrennt wird, wenn
auch in sehr geringer Menge, muB auch diese Art im stande sein, das
Thiosulfat nach der früher gegebenen Formel zu oxydieren. Uebrigens sind die
Kolonieen ganzlich verschieden von denjenigen von T. thioparus, indem erstere
als groBe dunne, beinahe glashelle, sehwierig sichtbare, mit Schwefeltröpfchen
durchsetzten Anflüge die Agarplatten bedecken, wahrend S. thioparus darauf
kleine runde, wie trockener, gelber Staub aussehende Kolonieen erzeugt.

Auch T. denitrificans ist ein Kurzstabchen, welches sehr beweglich ist
und mikroskopisch sich kaum von T. thioparus unterscheidet. Wie bei letzterem
sind die Kolonieen empfindlich und sterben schon wenige Tage nach der Iso-
lierung vollstandig ab. Auch verlieren dieselben, selbst bei frühzeitiger Ueber-
impfung auf neue Platten ganzlich das Vermogen, weiter zu wachsen, d. h. sie
verlieren ihre Vegetationskraft, schon langst, ehe sie abgestorben sind.

Wahrend es nicht gelang, T. thioparus auf Fleischbouillongelatine zu
kultivieren, ist es möglich, T. denitrificans darauf zur Entwickelung zu bringen.
Es ist aber dazu notwendig, die gewöhnliche Bouillongelatine mit zweimal dem

248

Volum H^O-Gelatine zu versetzen. Fügt man dann noch überdies 0,25 Na'S'O'
hinzu, so geben die Striche, von reinkultiviertem T. deni t ri f i cans stammend,
kleine, viel Schw^efel erzeugende Kolonieen, welche denjenigen von T. thioparus
auf den »anorganischen« Agarplatten ganz ahnlich sind.

Die Zersetzung der Rhodanate findet unter profuser Absonderung-von freiem
Schwefel unter ahnlichen Bedingungen statt, wie die vorgehend beschriebenen
Prozesse, z. B. in der zuerst genannten Kulturflüssigkeit, wrenn man darin das
Thiosulfat durch '/^ Proz. Ammonrhodanat (CNS.NH*) ersetzt, wobei ein eigen-
tümlicher Biochemismus obwaltet, auf den ich spater zurückzukommen hoffe.

L'influence des microbes sur la fertilitè du sol
et la croissance des végétaux supérieurs.

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Série II, Tomé IX, 1904,
p. VIII — XXXVI. — Verscheen onder den titel »De invloed der mikroben op de
vruchtbaarheid van den grond en op den groei der hoogere planten* in het Landbouw-
kundig Tijdschrift, Groningen 1904, blz. 225 — 250; en verscheen onder denzelfden titel
bij J. B. Wolters te Groningen.

Dans la première partie de son traite de chimie de la terre arable, paru en 1860,
G. J. Mulder a dit: »En divers endroits dans la terre de culture s'opèrent
continuellement deux phénomènes contraires d'oxydation et de réduction ; l'oxydation
a lieu la oü l'air a librement acces, la réduction la oü l'air ne peut plus agir en toute
liberté, c. a d. dans les couches relativement profondes, ou bien dans un terrain com-
pact ou dans un sol trop humide.«

Dans ces quelques mots Mulder a exposé les deux processus les plus impor-
tants qui donnent a la terre sa fertilitè. Le phénomène d'oxydation, par lequel les
.substances organiques disparaissent, est généralement avantageux, tandis que la ré-
duction, OU toute autre décomposition qui l'accompagne, n'est pas désirable d'ordinaire,
parce qu'elle peut entrainer une accumulation indéfinie de matière organique.

Dans l'état oü se trouvait la science en 1860, on ne se doutait pas encore du róle
prépondérant que jouent les microbes dans les actions qui s'opèrent dans le sol; mais
précisément a cette époque les découvertes de Pasteur, relatives aux organismes
des fermentations, commencèrent a être bien établies sur une base scientifique par la
réfutation du dogme de la génération spontanée, remplacé par la théroie de la bio-
genèse, qui revient en principe a ceci: que toute cellule vivante résulte d'une autre
cellule. Mainte transformation s'opérant dans le sol ou a sa surface, qui autrefois ne
semblait explicable que par des actions chimiques, fut reconnue comme une consé-
quence des phénomènes vitaux de microbes spécifiques, se multipliant d'une faqon in-
dépendante. La nouvelle explication n'a rien changé aux faits: la destruction de la
matière organique est restée un processus d'oxydation, mais on sait a présent que cette
oxydation est produite en majeure partie par la respiration des microbes vivant dans
le sol et qui, tout comme les organismes supérieurs, absorbent de Toxygène pour ceder
de l'anhydride carbonique a leur entourage; comme véritables agents de ces trans-
formations, ces microbes sont donc devenus l'objet principal de toutes les considé-
rations relatives a ce sujet, et le labeur agricole, le travail rationnel du sol arable,
peut être défini comme la methode de conserver l'équilibre entre les actions micro-
biologiques, nécessaires au développement des plantes supérieures.

250

C'est sur un pareil équilibre entre les oxydations et les réductions produites par
les microbes qu'estbasée la f ormation de Thumus fertile des champs et des bois. Si l'oxy-
dation prédomine trop, eet humus peut disparaitre. Mais quand la réduction l'emporte,
la matière organique s'accumule et Ie sol perd sa fertilité par la formation de tourbe.
Quand l'oxydation est activée dans une tourbière, les microbes peuvent généralement
réparer Ie mal et, diminuant l'excès de substance organique, refaire un humus feftile.

Mais Ie dégat causé par la réduction n'est pas toujours réparable par une oxy-
dation ultérieure, surtout quand cette oxydation est de nature chimique et que les bac-
ttries sont impuissantes. Nous en trouvons un bon exemple dans les terres acides si
redoutées, formées par alluvionnement ou par endiguement dans les terrains argileux
voisins de la mer, et dont l'origine et la composition ont étc expliquées par les belles
recherches de M. Ie Prof. van Bemmelen sur Talluvium hoUandais. La stérilité
de ces terres provient de l'oxydation, par l'oxygène de l'air, de pyrite et de soufre a
l'état de sulfate ferrique et d'acide sulfurique vénéneux, tandis que la pyrite et Ie
soufre eux-mêmes avaient pris naissance, dans une phase antérieure, Ie sol étant en-
core baigné d'une eau saumatre, par la réduction de sulfates a l'état d'hydrogène sul-
furé, sous l'action de microbes, en présence d'oxyde de fer.

Le carbone de toute substance organique est originaire de l'acide carbonique de
''atmosphère, qui n'en contient qu'environ 3^ dix-millièmes. Si le carbone de eet acide
pouvait être isolé et recouvrait la surface terrestre d'une couche uniforme, l'épaisseur
de la pellicule ainsi formée n'atteindrait pas encore un demi millimètre. Cette minime
quantité est pourtant la seule source de carbone pour la construction du corps de tous
les êtres vivants; la lumière fournit l'énergie, et cette énergie est emmagasinée par
la réduction de l'acide carbonique, avec élimination d'oxygène, dans la chlorophylle
des plantes supérieures et inférieures. Ce chimisme commence par la formation de
sucre, d'amidon ou de graisses qui, sous l'action des forces vitales, forment de nou-
velles combinaisons avec les nitrates ou les sels ammoniacaux, les phosphates et les
sulfates, tous presents dans le sol et fournissant l'azote, le phosphore et le soufre, in-
dispensables pour la vie; le potassium, le magnesium, le calcium, le fer et le man-
ganèse, tout aussi nécessaires bien qu'en faibles quantités, sont également enlevés
au sol.

A cette fixation d'acide carbonique, processus formateur de tout ce qu'il y a
d'organique, est opposée la destruction, la régénération de l'acide carbonique aux
dépens de la matière organisée, par la respiration des êtres vivants en général, des
microbes en particulier. Par la respiration des microbes, qui s'opère partout a la sur-
face du sol, ce n'est pas seulement le carbone qui est remis en liberté sous forme
d'acide carbonique, moyennant une consommation d'oxygène, mais l'azote, le phos-
phore, le soufre, le potassium, le magnesium, le fer et le manganèse retournent aussi
a l'état minéral. Ce n'est que dans ces dernières années que l'on a compris et apprécié
a sa juste valeur la signification de ce grand phénomène naturel, la »minéralisation«
des substances organiques, qui donne lieu a ce que l'on appelle aujourd'hui r»autopuri-
fication« du sol, des rivières et de la mer; et ce n'est plus l'agriculture seule qui la
met a profit, mais l'industrie l'applique en grand dans la »purification biologique« des
eaux d'égoüt des villes, a coup sur un des progrès hygiéniques les plus importants qui
aient jamais été réalisés.

Comme la quantité d'acide carbonique présente dans l'air reste a peu prés con-

251

stante, et qu'il n'y a aucune raison d'admettre la possibilitt d'une augmentation ou
d'une perte par l'espace universel, il faut qu'il y ait en quelque sorte équilibre entre
la quantité qui passé de la surface du sol dans l'atmosphère, en flot ininterrompu, par
la »minéralisation«, et celle qui se fixe dans les plantes vertes; car les observations de
de S a u s s u r e et les calculs de Schleiden ont appris que toutes les autres
sources d'acide carbonique, telles que la respiration des hommes et des animaux ainsi
que la combustion du bois et de la houille pour Ie chaulïage, ne fournissent qu'un
dixième tout au plus de la quantité d'acide mise en liberté par les microbes. Seule
l'émission d'acide carbonique par l'action des volcans est un facteur qui nous est
encore inconnu.

On conqoit aisément que, si la terre était privée des microbes, il en résulterait
bientót des conditions désavantageuses pour les êtres supérieurs. Par suite de la ré-
ductiondans les plantes vertes, la teneur en acide carbonique de l'atmosphère s'abbais-
serait rapidement et la végétation commencerait a languir; mais il se serait produit
déja d'abord un arrêt dans la destruction de la matière organique ; la chute des
feuilles sur Ie sol, par laquelle il se dépose p. e. annuellement, dans un bois de hêtres,
environ 4000 kilos de substance sèche par hectare, — une quantité qui maintenant est
prérisément egale a ce que les microbes sont capables de minéraliser, — donnerait
lieu a une énorme accumulation. Les graines, en tombant a terre, n'y trouveraient
plus un endroit favorable a leur germination; Ie flot alimentaire des arbres ne con-
tiendrait plus de sels ou du moins n'en contiendrait pas assez, et les forêts disparai-
traient de la surface du globe. Le même sort frapperait, plus lentement peut-être
mais tout aussi sürement, chaque autre formation de plantes. En même temps la
diminution de l'acide carbonique dans l'atmosphère, qui abaisserait le pouvoir
absorbant pour la chaleur, ainsi qu'il résulte des recherches de M. A r r h e n i u s ,
aurait comme conséquence une période glaciaire sur toute la terre.

Dans la mer aussi le manque d'acide carbonique se ferait sentir ; la »nourriture
primordiale*, composée essentiellement de Diatomées et d'autres algues inférieures,
n'augmenterait plus et bientót on ne pourrait plus dire des eaux vivantes: »rien n'est
proie de la mort, tout est proie de la vie«, — la aussi la mort triompherait.

Ainsi donc, bien loin de s'opposer a la vie, les microbes sont précisément les tra-
vailleurs, cachés mais infaillibles, qui rendent possible la vie sous toutes ses formes.

Alais l'utilité des microbes ne se borne pas a la conservation de Téquilibre
atmosphérique. L'acide carbonique qu'ils développent dans les couches superficielles du
globe exerce sur les plantes supérieures d'autres influences encore, fort bienfaisantes.
C'est son action qui conduit a la désagrégation des minéraux, par laquelle les divers
silicates, en se décomposant partiellement, donnent naissance aux zéolithes si impor-
tants pour la fertilité du sol, parce qu'ils contiennent le potassium et l'acide phospho-
rique sous une forme qui les rend facilement assimilables. Mais il y a plus. On a
constaté que la teneur normale en acide carbonique de l'air atmosphérique, d'environ
3.K' dix-millièmes, est bien au-dessous de ce que l'on a trouvé comme optimum pour
l'assimilation carbonique chez les plantes vertes; eet optimum est en efïet de 3 a 4%,
c. a d. une quantité cent fois plus grande que la quantité normale. Mais, précisément
par la vie particulièrement intense des microbes, l'air du sol contient toujours une
forte proportion de ce gaz, souvent même 335%, d'oü il résulte que la couche d'air
recouvrant immédiatement le sol, particulièrement l'air compris entre les feuilles de

252

plantes croissant en société et qui n'est presque pas agité par Ie vent, est beaucoup
plus riche en acide carbonique que les couches plus élevées. Cette circonstance fa-
vorise considérablement, sans aucun doute, la croissance exuberante de toute végéta-
tion dense, et dans la lutte pour l'existence elle doit avoir constitué un facteur dans
I'adaptation chez les espèces plastiques. Elle nous renseigne sur la signification des
belles rosettes de feuilles appliquées contre Ie sol, que l'on observe chez nombre de
plantes appartenant aux families les plus diverses, et qui, au point de vue de leur
structure et de leur situation, ne sauraient être organisées d'une faqon plus avan-
tageuse pour absorber l'acide carbonique de l'air du sol.

En appliquant ces faits, dont Timportance pratique n'échappera a personne, a la
culture des plantes en serres fermées, c. a d. en favorisant la croissance par une aug-
nientation artificielle de la proportion d'acide carbonique dans l'air, on devrait tenir
compte en même temps de la quantité de lumière disponible puisque, a partir d'une cer-
taine teneur en acide carbonique, la lumière du jour devient insuffisante pour sa dé-
composition, de sorte que son intensité devrait être augmentt'e par exemple au moven
de lumière électrique.

La vie des microbes dépend jusqu'a un haut degré des substances sur lesquelles
ils agissent et dont ils se nourrissent ; parmi ces substances, celles-la surtout sont im-
portantes qui sont présentes en grandes quantités, et qui ne se transforment que lente-
ment sous l'influence de la vie microbienne. A ces exigences satisfont en premier lieu
les corps qui constituent les parois cellulaires des feuilles, des tiges et des racines
des plantes supérieures, et en second lieu les matières albuminoïdes provenant du pro-
toplasme des cellules mortes. C'est donc de ces substances que nous allons nous oc-
cuper particulièrement.

En ce qui concerne la nature chimique des parois des cellules végétales, cette
nature varie avec la situation anatomique et la fonction physiologique des tissus con-
sidérés de la plante. Outre la cellulose, qui parait ne faire défaut nulle part, on trouve
encore, dans l'épiderme et dans les couches corticales, la subérine et quelques autres
corps presents en moindre quantité, tandis que Ie caractère particulier du bois est
déterminé par la lignose et la pentosane, que l'on y trouve mélangées avec la cellulose.

La maniere dont les microbes attaquent ces divers corps n'est pas encore par-
faitement connue; ce sont les transformations subies par la cellulose qui ont été
examinées avec Ie plus de soin.

A la température moyenne des climats tempérés et chauds, et a un degré d'humi-
ditié suffisamment élevé, cette substance si stable au point de vue chimique est facile-
ment décomposée par plusieurs espèces de microbes qui peuvent la transformer com-
plètement de diverses faqons. Les produits ultimes de cette transformation sont de
leauetde l'acide carbonique quand elle s'opère sous l'influence d'organismes aérobies;
de l'acide carbonique, de l'acide acétique et de l'acide butyrique, ou de l'hydrogène,
de l'acide carbonique et du méthane, quand elle a lieu sous l'action de bact«ries
anaérobies ; enfin, quand il y a des nitrates en présence et que l'air n'a pas librement
acces, certains microbes de la dénitrification produisent de l'azote libre et de l'acide
carbonique.

Les deux premières transformation sont de beaucoup les plus importantes pour
la fertilité du sol, parce que c'est en principe sur elles qu'est basée la fixation de
l'azote libre de l'atmosphère.

253

Les quantités prodigieuses d'hydrogène et de gaz des marais que les microbes
anaérobies forment, partout et toujours, aux dépens de la cellulose, pourraient faire
croire que ces gaz doivent s'accumuler dans l'atmosphère; pourtant, les déterminations
précises de M. G a u t i e r ont appris qu'ils n'y existent qu'a l'état de traces. Pour
ce qui regarde l'hydrogène, on pourrait peut-être expliquer sa disparition en admet-
tant comme possible sa diffusion dans l'espace universel; mais une telle explication
n'est certainement pas applicable au méthane, dont la densité est la moitié de celle de
l'oxygène et qui, d'après tout ce que nous savons ne saurait donc quitter nutre atmo-
sphère. Comme ce gaz se développe en quantités bien plus considérables encore que
l'hydrogène, si considérables même qu'on a pu l'exploiter dans les dernières années,
sous Ie nom de »brongas« (gaz minéral), dans les polders de la Hollande septen-
trionale et Ie faire servir qa et la pour l'éclairage et Ie chauffage, il faut évidemment
qu'il y ait une cause générale qui Ie fasse disparaitre de l'atmosphère, et il est probable
qu'ici encore ce sont des plantes vertes qui se chargent de cette fonction. Ces plantes
vertes peuvent, en effet, se nourrir non seulement avec de l'anhydride carbonique
mais parfaitement aussi avec de l'oxyde de carbone, de sorte que rien ne s'oppose a
l'hypothèse que certaines espèces soient également capables de se rendre maitre du
carbone contenu dans Ie gaz des marais.

Rien n'est caché pour l'oeil de la science. Un germe isolé, un seul microbe échappe
a l'observation directe, mais il devient observable du moment que, grace a une bonne
nutrition, il peut se multiplier et I'unité se transformer en milliers. Quand ces milliers
restent au même endroit, comme c'est Ie cas dans la methode de culture sur un terrain
nourricier solide, introduite par M. K o c h , l'oeil nu peut distinguer Ie nombre, la
colonie, la oü Ie microbe isolé passait inaperqu. Dans ces conditions on reste indépen-
dant de la grandeur absolue des germes; même ce qui était encore au-dessous de la
limite de visibilité microscopique doit devenir, par segmentation répétée, une quantité
visible. L'étude microscopique a pourtant appris que des microbes, si petits qu'on ne
peut les distinguer individuellement, même par les plus forts grossissements, sont ex-
cessivement rares; ils ne se présentent que dans quelques maladies contagieuses, et
même dans ces cas-la il est probable qu'on pourra les voir quand les moyens d'obser-
vation se seront encore améliorés *).

Pour Ie sol il n'y a pas lieu d'admettre l'activité de pareils microbes in-
visibles.

Pour pouvoir se reproduire, la plupart des microbes du sol doivent être nourris
des mêmes substances minérales que les végétaux supérieurs, mais ils ont en outre
besoin d'un corps organique comme source de carbone. Si cette source de carbone est
la cellulose, on peut s'attendre, quand la réaction est acide, a ce qu'il se développe des
moisissures, et des bactéries quand la réaction est alcaline.

En tenant compte de ces considérations générales, on peut laisser la nature elle-
même donner une réponse nette a la question de savoir quelles sont les moisissures et
quelles sont les bactéries qui se nourrissent de cellulose, et sont donc les agents de sa
transformation dans Ie sol.

Voici comment on opère pour découvrir la flore des moisissures de la cellulose.

On prend quelques morceaux de papier a filtrer, ou d'étoffe de lin ou de cnton.

*) Les »contagia fluida«, dont il n'est pas question ici, sont tout autre chosc.

254

toutes substances formées de cellulose pure; on les imbibe d'une solution diluée de
monophosphate de potassium et de nitrate d'ammonium, p. ex. Vio% de ces deux sels,
dans l'eau de la distribution; par sa provenance, cette eau contient déja une quantitó
sufïisante des autres rnatières nutritives minérales, nécessaires aux microbes, telles
que Ie magnesium, Ie soufre et Ie fer. Le morceau de papier, ainsi préparé, est mis
dans une boite de verre pour prévenir la dessication, et on y verse un peu d'eau oü
!'on a introduit d'avance, a l'état de poussière fine, le sol ou l'humus dont on se pro-
pose de cultiver les moisissures de la cellulose; cela fait, on n'a plus qu'a abandonner .
la préparation a elle-même, en la maintenant a une température d'environ 25" C. Au
bout de deux semaines les germes des moisissures se développent vigoureusement,
et donnent naissance a de grandes et élégantes colonies oü nous trouvons la même
flore particuliere qui, dans les sombres recoins du sol, travaille sans cesse a la
minéralisation de la cellulose des feuilles mortes, des tiges et des racines, pour
régénérer les substances alimentaires des végétaux supérieurs.

Comme il se produit dans cette transformation de la cellulose nouvelle, faisant
partie de la substance de l'organisme même, notamment des filaments mycéliens des
moisissures, il n'est pas étonnant que le papier ou l'étoffe, même complètement décom-
posés, ne perdent pas toute consistance; il reste un tissu serre, formé par la masse
coherente de ces microbes. Mais cette masse meurt bientót a son tour et est alors
soumise a de nouvelles transformations, sous Tinfluence d'un autre monde microbien —
d'autres chainons dans le grand enchainement des phénomènes naturels.

De petits changements dans les conditions nutritives suffisent a modiiier con-
sidérablement la nature de l'association de microbes qui se développe. Dans le cas
qui nous occupe, il suffit de remplacer la source d'azote, le nitrate d'ammonium, par
le phosphate doublé d'ammonium et de magnesium, faiblement alcalin, et le phos-
phate acide de potassium par le phosphate basique, pour empêcher la croissance de
la plupart des moisissures de la cellulose, et rendre possible le développement de la
flore des bactéries de la cellulose, composée de quelques espèces seulement.

Quand on humecte le papier ou la toile, ainsi rendus alcalins, de quelques gouttes
d'un extrait de feuilles a moitié décomposées et réduites en poussière, et que l'on
rultive a 30» C, on voit se former, au bout de peu de jours, les colonies de la plus
importante des bactéries de la cellulose, le Bacillus ferrugineus, qui surgissent en
divers endroits de la surface blanche en taches couleur de rouille, constituées par de
tres petits batonnets, la plupart tres mobiles et incolpres eux-mêmes, mais sécrétant
un pigment brun imbibant des fibres et se séparant parfois a l'état de cristaux. Le
róle de eet organisme aérobie dans la disparition de la cellulose contenue dans le sol
est important sans aucun doute, et comparable a celui des moisissures en ceci, qu'il se
forme aussi de l'anhydride carbonique et de l'eau comme produits ultimes de la dé-
composition.

Une conclusion remarquable que l'on peut tirer de ces rechercheh c'est que,
f^uand elle est sufïisamment hiunide, la cellulose ne se transforme pas en substances
liumiques. Pour en corroborer la preuve on a pris de grands morceaux de papier a
filtrer et des lambeaux de toile et de coton, que l'on a places entre des plaques d'as-
beste blanche; on les a enfouis, en automne, a diverses profondeurs dans une terre
molle de jardin, et a la fin de l'hiver on n'a retrouvé de ces substances qu'un tissu de
filaments mycéliens incolores, appliqués contre l'asbeste restée blanche. Il est prouvé

255

par la qu'il ne s'était pas formé d'humus, que Ton n'aurait pas manqué de reconnaitre
a sa coloration brune.

La question suivante se présente donc en quelque sorte d'elle-méme : Si ce n'est
pas la cellulose qui est Ie point de départ dans la formation des constituants non azo-
tés de l'humus, c. a d. de sa majeure partie, quelles sont donc les substances qui leur
donnent naissance ?

Les corps solubles contenus dans les cellules, tels que les sucres, les acides et
sels organiques et l'amidon se transforment dans Ie sol beaucoup plus facilement
encore que la cellulose, et les expériences ont appris d'ailleurs qu'ils ne constituent
pas la matière première dont est formée la masse principale de l'humus. Ce ne sont
que les combinaisons solubles du tannin, présentes il est vrai en quantités relativement
petites, qui participent, d'après M. Adolphe Mayer, a la formation de l'humus.

Mais nous venons de voir qu'aux substances végétales les plus répandues appar-
tiennent la subérine des épidermes et des tissus corticaux, et la lignose et la pentosane
du bois ; et il certain que c'est de ces substances-la, surtout du bois, que provient ia
masse principale de l'humus.

Le bois, qui comprend aussi les réseaux des nervures foliaires et les faisceaux
ligneux des tiges et des racines herbacées, ne se décompose que tres lentement a l'in-
térieur et hors du sol, parce qu'il n'y a que peu de microbes qui l'attaquent, apparte-
nant au groupe des champignons lignicoles, qui enlèvent par leurs filaments mycéliens
la cellulose aux parois des fibres et des vaisseaux ligneux, en abandonnant la lignose
dont ils ne peuvent se nourrir et qui se transforme plus tard en humus, sous des influ-
ences d'ordre purement chimique a ce qu'il parait. La facilité avec laquelle la lignose
est attaquée par divers réactifs chimiques, auxquels la cellulose résiste partaitement,
rend cette maniere de voir admissible; de plus, la nature aromatique de la lignose.
qui est un produit dérivé du tétrahydrobenzol, explique pourquoi ce corps est assimiié
difficilement par les microbes. D'après cette conception la plupart des substances
humiques appartiennent, selon toute probabilité, aux corps aromatiques.

On ne sait pas encore au juste ce qu'il advient de Ia pentosane, le troisième éU'-
inent constitutif des tissus ligneux, lors de la désagrégation du bois; mais M. Tol-
len s a fait voir que dans les tourbières elle disparait avant la lignose, ce qui fait
qu'une vieille tourbe doit être exclusivement produite par cette dernière substance.
Pour le vieil humus en général, la même conclusion semble nécessaire.

Au sujet des derniers produits de la décomposition des épidermes et des tissus
corticaux, on est encore dans l'incertitude, mais il est indubitable que le mycélium de
certaines moisissures participe a cette décomposition et contribue par la a la forma-
tion d'humus.

Ainsi que je l'ai déja fait observer, le deuxième constituant, difficilement décom-
posable, des plantes mortes, qui par sa quantité, et surtout par sa composition, est tres
important pour la fertilité du sol, consiste dans les corps albuminoïdes, qui prennent
naissance après la mort du protoplasme. A vrai dire il y a la deux groupes
de corps, dont les uns sont aisément attaques par les microbes, tandis que les autres
resistent a leur action ou ne sont attaques qu.'a la longue. C'est ainsi que des expéri-
ences de fumigation, entreprises par Boussingault, ont appris que les albumi-
noïdes végétaux contenus dans les tourteaux de colza contiennent a peu prés 20%
d'une matière azotée qui ne subit aucune transformation ultérieure. Bien que la na-

256

ture chimique de ces substances remarquables soit encore inconnue, il est certain
que c'est précisément a leur présence que l'on doit attribuer la forte proportion d'azote
que l'on trouve dans les terrains riches en humus, comme Ie terreau de jardin ordi-
naire, ainsi que dans la tourbe, proportion qui atteint assez souvent 4% du poids de
matière sèche. Dans des climats chauds et secs cette proportion peut devenir bien
plus élevée encore. Dans un vieil humus de la Californie, formé dans des conditions
de faible humidité et d'aération active, M.H i 1 g a r d a même pu constater une teneur
en azote de 15%, présente probablement dans une substance semblable a la chitine, et
qui constitue les parois de certains filaments mycéliens. Puisque ces substances azo-
rées aussi constituent une partie intégrante de l'humus, il n'y a pas lieu de s'étonner
de la nature complexe de ce corps, et l'on conqoit aussi que, avant de tirer de la teneur

Fig. I. Appareil pour la fixation de l'azote atmosphérique libre avec la cellulose comme

source de carbone; a chaux sodée; bef ponce imbibée d'acide sulfurique dilué; d acide

sulfurique concentré; e eau; kk' flacons de culture avec cellulose dans Ie thermostat t;

l trompe; ww' tampons d'ouate.

en azote d'un sol une conclusion relative a sa fertilité, on doit se rendre compte tout
d'abord de la composition qualitative des combinaisons dans lesquelles eet azote se
présente.

Les transformations que subit la partie aisément attaquable des albuminoïdes,
sous l'influence des microbes, nous allons les considérer en même temps que les change-
ments analogues que subissent les albuminoïdes, résultant du protoplasme des corps
morts des microbes eux-mêmes, ou formés sous leur influence immédiate, comme pro-
duit de la fixation de l'azote atmosphérique libre.

Cette fixation particulièrement importante pour la fertilité s'observe dans la
nature sous deux formes différentes, en premier lieu comme conséquence du développe-
ment de certaines espèces de microbes qui, en présence d'une nourriture carbonique
appropriée, satisfont leur besoin d'azote en assimilant l'azote libre de l'atmosphère,
en second lieu comme conséquence de la symbiose de certains microbes avec les ra-
cines des Papilionacées.

257

G. J. Mulder connaissait déja Ie premier de ces deux processus, et c'est avec
raison qu'il l'a mis en rapport avec la décomposition des substances organiques. Cette
décomposition s'opère sous l'action combinée, harmonique, d'au moins trois espèces
différentes de bactéries, et la source de carbone, qui parait être leur nourriture car-
bonique par excellence, est précisément la cellulose. Ces trois espèces ne peuvent
être efïicacement actives que si la pression de l'oxygène est quelque peu diminuée;
il s'ensuit que, dans des conditions artificielles, ce biochimisme doit s'opérer dans une
couche liquide d'épaisseur telle que l'oxygène de l'air y puisse être consommé aussi
rapidement qu'il y pénètre, tandis que dans Ie sol il ne s'opère pas a la surface, mais
a une certaine profondeur, faible il est vrai.

La fixation d'azote ne s'opérant que lentement, l'air servant a des expériences de
laboratoire, dont la durée est de quelques semaines, doit d'abord passer par un mé-
lange de soude caustique et de chaux et par de l'acide sulfurique dilué et concentré,
pour être privée de toute combinaison azotée. Afin que la réaction du liquide reste
toujours alcaline, ce qui est nécessaire pour la fixation, on ne peut y introduire qu'une
petite quantité de cellulose, autrement sa consommation rapide produirait trop d'a-
cides. Le mélange suivant convient tres bien a l'expérience: loo parties d'eau de con-
duite, 2% de papier a filtrer pur et finement divisé, 2% de crai^ et ^Uo de biphos-
phate de potasse, tandis qu'une tracé de terreau est nécessaire pour introduire les
bactéries fixatrices d'azote, qui paraissent exister partout et qui se développent le
mieux vers 25" a 30°. On voit par la que les conditions nécessaires pour le processus
existent en divers endroits dans le sol.

Les trois espèces de bactéries actives sont: en premier lieu l'agent (Fh, fig. 2)
de la fermentation acéto-butyrique de la cellulose que l'on pourrait également appeler
le »ferment hydrogénique«, parce qu'il se forme toujours de l'hydrogène comme pro-
duit accessoire. Ce microbe se présente comme de courts filaments ou des batonnets,
collés contre les fragments de cellulose (ü) et pouvant former a leur extrémité une
petite spore oblongue ou ronde. En second lieu une espèce de bactéries, apparentée
de prés aux bactéries des racines des Papilionacées, et que j'appelle Bacillus radio-
hacter (Ra) a cause de la fa^on particuliere dont les batonnets se ramifient et se dis-
posent. Enfin, en troisième lieu, une espèce du genre remarquable Asotohacter {As)
qui, par les grandes dimensions de ses batonnets et l'excessive rapidité avec laquelle
elle se reproduit, constitue de beaucoup la plus grande partie de la masse bactérienne
nouvellement formée.

Voici comment ces trois espèces se partagent le travail. Le ferment hydrogénique
attaque seul la cellulose et la transforme, par l'action d'un enzyme, en une espèce de
sucre qui entre en partie en fermentation, par le ferment lui-même, et donne naissance
a de l'acide acétique, de l'acide butyrique, de l'anhydride carbonique et de Thydro-
gène; les acides acétique et butyrique forment des sels avec la chaux contenue dans
le sol. Une autre partie de ce sucre sert de source de carbone aux deux autres espèces
de bactéries, qui peuvent se nourrir en outre des deux sels ainsi formés mais en au-
cune faqon de la cellulose même. De ces deux espèces c'est le Bacillus radiohacier
qui est le véritable fixateur d'azote, mais, au lieu de garder pour lui seul Tazote qu'il
a fixé, il en fait une substance azotée soluble, qui se répand dans le liquide environ-
nant ou dans le sol, oü elle peut servir de source d'azote pour divers organismes aux-
quels appartiennent précisément, dans le cas qui nous occupe, le ferment hydrogéni-

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 17

258

que et VAzotobacter. Ces derniers organismes se servent de cette nourriture azotée
pour former leur protoplasme, dont il reste, après la mort, une matière albuminoïde
qui provient surtout de VAzotobacter, parce que par sa masse cette espèce l'emporte
de beaucoup sur toutes les autres. Comme VAzotobacter peut oxyder, a l'état d'anhy-
dride carbonique et d'eau, non seulement les sels des acides acétique et butyrique,
mais encore ces acides eux-mêmes, eet organisme doit aussi avoir quelque importance
en maintenant neutre la réaction du milieu environnant.

La quantité d'azote libre, qui peut être fixée de cette maniere, est considérable,
car une vingtaine de déterminations, efïectuées dans mon laboratoire par M. G. van
I t e r s o n, ont appris qu'elle peut atteindre 839 milligrammes pour chaque gramme
de cellulose décomposée ; ce qui donnerait annuellement, par exemple dans un bois de
hêtres fournissant 4000 kilos de feuilles sèches, un gain d'azote d'environ 25 kilos par
hectare.

Il n'y a pas a en douter, cette source universelle de combinaisons azotées, si elle
ne suffit pas aux exigences d'une culture intensive, est du moins plus que suffisante
pour satisfaire au besoin d'azote des plantes supérieures dans les conditions natu-
relles, par exemple pour les forêts dont Ie bois est régulièrement exploité. Il est
même certain qu'il*^ en résulterait une accumulation d'azote désavantageuse pour la
végétation, si les bactéries de la dénitrification ne se chargeaient pas de ramener a
l'ctat de gaz une partie de l'azote fixé, après la transformation des corps albuminoïdes
en nitrates, par la nitrification.

Cette conclusion, relative a l'influence des bactéries dénitrifiantes dans Ie cycle
des transformations de l'azote, est inévitable quand on songe a la grande ténacité avec
laquelle eet element reste dans ses combinaisons, comparativement a toutes les autres
actions chimiques qui s'opèrent dans Ie sol, ce qui fait qu'a notre connaissance la
dénitrification est Ie seul processus de destruction universel qui compense la forma-
tjon incessante de combinaisons azotées. Si cette destruction avait fait défaut nous
constaterions, dans Ie cours des périodes géologiques, une accumulation de ces ma-
tières bien plus considérable et bien plus générale que ne nous offrent maintenant les
gisements de salpètre et de guano, qui ont dü prendre naissance seulement dans des
conditions locales et rarement réalisées.

M. Brandt est arrivé a la même conclusion pour ce qui regarde la mer. Sans
les bactéries de la dénitrification, qui la aussi existent partout, Ie salpètre que les
rivières y déversent s'y serait accumulé au point que la vie organique y aurait disparu
depuis longtemps.

Ce n'est que dans les derniers temps que Ie passage de l'azote atmosphérique libre
a l'état de combinaison, sous l'influence des microbes seuls, a été reconnu comme un
pht'nomène naturel de grande importance; mais déja en 1886 les remarquables recher-
ches de H e 1 1 r i e g e 1, au laboratoire d'agriculture de Bernburg, avaient donné la
certitude que les plantes papilionacées acquièrent Ie pourvoir de fixer l'azote de l'air,
quand certaines espèces de bactéries du sol pénètrent dans leurs racines et y donnent
naissance a des excroissances en forme de tubercule (fig. 3). L'expérience actuelle-
ment acquise nous permet de décrire comme suit ce qui se passé dans ces racines.

Certaines bactéries tres petites (fig. 7) et qui ne sont pas universellement
rcpandus dans Ie sol, pénètrent, d'une faqon qui n'a pas encore été suffisam-
ment élucidée, dans quelques-unes des cellules des jeunes racines de la plante (pois.

259

trèfle, vesce, lupin, serradella etc), et provoquent une segmentation excessive et tout
n fait anormale de ces cellules (fig. 4), donnant ainsi naissance a des excroissances
plus OU moins fortement développées, les tubercules bien connus, que l'ou peut consi-
dcrer comme des racines latérales métamorphosées. Les bactéries se multiplient rapi-
dement dans Ie tissu intérieur de ces tubercules, dont Ie contenu cellulaire finit par
être une combinaison des substances vivantes constitutives de deux organismes de
nature aussi différente que possible: d'une bacterie et d'une plante supérieure. Bien-
tót les bactéries subissent des modifications tres considérables, tant au point de vue de
Ia forme qu'au point de vue de leurs propriétés: elles finissent par ressembler quelque
peu aux groupements étoilés de Bacillus radiobacter et perdent Ie pouvoir de se déve-
lopper en dehors des cellules de la plante qu'elles habitent. C'est dans eet état qu'on
leur donne Ie nom de »bactéroïdes« (Bt) et Ie tissu de la plante qui les contient est Ie
»tissu a bactéroïdes« (Bt fig. 5). Bien qu'incapables de se reproduire, ces »bac-
téroïdes« doivent néanmoins être considérés comme des êtres vivants, et ils po>-
sèdent Ie pouvoir de produire, moyennant Ie concours du protoplasme des cellules
nourricières, qui apportent la nourriture carbonique nécessaire a leur nutrition, —
probablement un hydrate de carbone, — une combinaison azotée aux dépens de l'azote
libre venant de l'extérieur; ils cedent ce produit a la plante qui en est pénétrée, au
point que toutes ses parties, tant aériennes que souterraines, sont mises en état de se
développer davantage et de se fournir de composés azotés plus compliqués.

Tout comme dans Ie cas du Bacillus radiobacter, la nature de la substance sécré-
tée par les bactéroïdes est encore inconnue, mais la grande analogie qui existe entre
les rapports de la première espèce avec Asotobacter d'une part et ceux des bactéroïdes
avec Ie protoplasme des racines des Papilionacées d'autre part, nous donne Ie droit
d'attendre que l'explication complete de la première relation, qui se prête mieux que
l'autre a des recherches expérimentales, fera aussi la lumière sur la seconde.

De méme que B. radiobacter, dont elles sont de si proches parents, les bactéries
des racines des Papilionacées (fig. 7) sont, a l'état libre, des batonnets tres fins, mo-
biles OU immobiles, ayant une forte tendance a former du mucus (Mm fig. 5). Elles
se laissent cultiver aisément, en dehors de la plante, sur un terrain de culture solide
composé d'une décoction de l'une ou l'autre plante, p. ex. de feuilles de pois ou de
trèfle, a laquelle on a ajouté 2% de sucre de canne et 10% de gelatine, c. a d. con-
tenant aussi bien une source de carbone que de l'azote combine, ce qui est indispensable
pour ces expériences de culture, puisque les bactéries des Papilionacées ne sont ca-
pables de fixer l'azote libre que dans l'intérieur des racines de ces plantes. Aussi la
formation des bactéroïdes ne s'observe-t-elle pas, dans ces cultures artificielles, si ce
n'est d'une faqon tres incomplete.

La grande influence de la plante nourricière sur ces remarquables produits se
manifeste encore d'une tout autre maniere, dont Ie fait suivant donne la preuve. Tan-
dis qu'il est prouvé que c'est précisément la même espèce de bacterie qui pénètre dans
la racine du trèfle et dans celle de la vesce, les bactéroïdes du trèfle {Btt, fig. 6) sont
globuleux ou pyriformes, alors que ceux de la vesce (Btv) sont ramifiés. Mais ce
fait n'est pas unique, une vraie infinité de cas analogues pourrait être citée.

Les bactéries des Papilionacées présentent encore entr'elles des différences no-
tables d'espèce. C'est ainsi que l'on trouve chez Ie serradella et Ie lupin jaune des
organismes bien différents de ceux des racines des autres Papilionacées, tres rares

26o

dans Ie sol et ne se rencontrant abondamment que la oü les plantes en question ont
déja été cultivées antérieurement. Ce fait explique la circonstance suivante. Si l'on
veut défricher une nouvelle portion de bruyère ou de sable des dunes pauvre '^n azote
combine, et que l'on se propose d'y introduire de l'azote au moyen de serradella ou de
lupin, on doit opérer d'abord une infection artificielle avec quelques charretées d'une
terre provenant d'un ancien champ de serradella ou de lupin, car on peut être cerlain
que, sans cette précaution, et quoique les bactéries vulgaires des Papilionacées soient
présentes en nombre suffisant, ces plantes ne se développeraient pas par défaut de
leurs symbiontes propres.

Il règne cependant encore beaucoup d'incertitude au sujet de l'état dans lequel
doivent se trouver les bactéries des Papilionacées pour que l'infection d'espèces déter-
minées de ces plantes soit suivie d'une fixation d'azote satisfaisante, et il devient de
plus en plus probable que Ie rendement d'azote des plantes de culture ordinaires, telles
que les pois, les haricots, Ie trèfle et la vesce, dont les bacilles se rencontrent partout,
il est vrai, mais Ie plus souvent sous une ferme peu virulente, comme on l'appelle,
pourrait être amélioré en employant pour l'infection des formes plus actives. La
difificulté réside toutefois en ceci que l'on ne connait pas encore exactement les causes
qui déterminent cette virulence. On peut bien tenir pour certain que la pression de
l'oxygène a une influence prédominente, mais a un point de vue bactériologique il est
tres difficile de regier exactement cette pression, et Ie mieux est encore de laisser a
la nature une liberté aussi grande que possible, c. a d. de permettre l'influence de
facteurs dont on ne saurait tenir compte, ce qui exclut évidemment une intervention
rationelle. Il est bien certain qu'en employant des cultures pures on n'obtient géné-
ralement aucun rcsultat. Voila ce que prouvèrent, il y a plusieurs années déja, les
expériences entreprises a Bernburg par feu Ie Prof. Hellriegel, a l'aide des cul-
tures pures que j'avais obtenues a Delft; nous avons toujours observé avec elles une
croissance moins forte des plantes d'expérience et une fixation d'azote moins grande
que quand l'infection avait été faite, simplement et grossièrement, au moyen de
racines et de tubercules radicaux broyés, ou même rien qu'avec Ie sol oü les Papilio-
nacées en question s'étaient développées antérieurement. Plus tard ce résultat négatif
a été confirmé en grand a l'aide des cultures pures, appelées »nitragine« par les inté-
resses, et que l'on a introduites dans Ie commerce fort mal a propos, mais qui ont eu
du moins cette utilité, que les expérience que l'on a faites avec elles ont fait com-
prendre ccmbien il était nécessaire de connaitre la nature de la virulence, et d'or-
ganiser dans les laboratoires agronomiques des recherches systématiques a ce sujet.

Le produit final de la fixation de l'azote libre, de quelque maniere qu'il ait été
obtenu, est, comme nous venons de le voir, du protoplasme vivant, appartenant soit a
la cellule microbienne, comme dans le cas de la combinaison Radiohacter-Azotobacter ,
soit a la cellule végétale, comme dans le cas des Papilionacées. La mort de la cellule
fait que le protoplasme se transforme en matière albuminoïde. Mais, comme les plantes
supérieures sont incapables d'assimiler cette substance, elle serait perdue dans le sol
s'il n'y avait partout certains microbes capables de la transformer en ammoniaque,
et d'autres microbes encore transformant cette ammoniaque en nitrates par la nitri-
fication.

La formation d'ammoniaque, ou plus exactement de carbonate d'ammonium, aux
dépens de matières albuminoïdes est une fonction excessivement répandue dans !e

26l

monde des microbes, et a coup sür la plus importante de toutes les phases de minérali-
sation des corps organiques. Les espèces de microbes les plus diverses, et les plus
communément répandues dans Ie sol, se chargent de cette fonction ; par exemple des
moisissures ordinaires (Fig. 8, A, i) quand Ie milieu ambiant est quelque peu acide,
ainsi que les »levures rouge« (A, 2) et »blanche« du sol, appartenant au groupe des
Blastomycètes. Dans Ie cas d'une réaction alcaline ce sont surtout des bactéries qui
sont activ€s, notamment les espèces les plus vulgaires, comme Bacillus üuurescens
liquefaciens (A, 3). Il n'y a donc rien d'étonnant a ce que les matières albuminoïdes,
de provenance tant animale que végétale, et même celles qui proviennent des microbes
eux-mêmes, soient des substances tres passagères dans Ie sol, — tout comme dans les
eaux d'ailleurs, — avec cette restriction toutefois qu'un cinquième environ en est
difficilement attaquable.

La faqon dont s'opère cette transformation de l'albumine n'est pas encore connue
dans tous ses détails, mais on sait qu'elle consiste en deux actions difïérentes. Dans
la première l'albumine est rendue soluble par des enzymes peptonisants, élaborés par
certains microbes, et c'est dans la seconde qu'il se forme de l'ammoniaque, a l'inté-
rieur du corps des microbes, aux dépens de l'albumine peptonisée et dissoute. Les sels
ammoniacaux qui se forment de cette faqon peuvent parfois être transportés a de
grandes distances par des filaments de mycélium; dans d'autres cas ils sont immé-
diatement mis en liberté hors de la cellule.

Les combinaisons ammoniacales, non seulement celles qui ont pris naissance dans
Ie sol même, mais encore toutes celles qui y ont été introduites d'autre maniere, su-
bissent des transformations ultérieures par les organismes de la nitrification, dont
l'influence sur la fertilité est des plus grandes.

C'est vers 1891 que M. W i n o g r a d s k y a dècouvert ces remarquables bac-
ttries et a fixé leurs conditions vitales. Il a fait voir qu'elles ne sont capables de for-
mer des nitrates que dans Ie cas oü les solutions nutritives employees ne contiennent
presque pas de substances organiques en dissolution. Cela'veut dire que les microbes
nitrifiants croissent et agissent précisément la oü la nourriture manque pour les mi-
crobes ordinaires; et ce sont eux qui rendent instables les combinaisons ammoniacales,
même dans l'eau pure. Dans Ie sol la quantité de substances organiques solubles est
généralement assez petite pour ne pas empêcher la nitrification; des substances diffi-
cilement solubles, comme la cellulose, ne la gênent pas, ce qui fait que dans des détritus
de feuilles et dans l'humus des bois ce processus peut s'opérer sans interruption.

La nitrification s'opère en deux phases, auxquelles correspondent deux espèces
de bactéries. La première, — Ie ferment des nitrites (fig. 8, B), — oxyde les sels
ammoniacaux en formant de l'acide nitreux libre, qui se combine a l'état de sel avec
la potasse ou la chaux contenue dans Ie sol ; la deuxième, — Ie ferment des nitrates
(fig. 8, C), — transforme Ie uitrite ainsi formé en nitrate, par une nouvelle addition
d'oxygène.

Il est aisé de cultiver Ie ferment des nitrites sur des plaques d'agar a carbonate
de chaux, bien lavées et imbibées d'un peu de phosphate de potassium et de chlorure
d'ammonium; on obtient alors des colonies jaune citron ou brunatres, formées de bac-
téries globulaires munies d'un long cil.

Le ferment des nitrates est de toute autre nature; il se présente comme une bac-
terie tres petite, difficilement visible, dont on n'a pas encore pu obtenir avec certitude

202

une culture pure, privée de bactéries étrangères. Ce ferment est surtout reniarquable
par la quantité minimale qui s'en trouve dans des solutions de nitrite fortement nitri-
fiantes, oü il est presque introuvable par les methodes microscopiques, et qui, a l'oeil
nu, ont tout a fait l'air d'être absolument privées de bactéries. Peut-être la vie orga-
nique ne fournit-elle pas d'autre exemple d'un processus chimique d'une telle intensité
mis en train par une si petite quantité de matière vivante.

Les conditions physiques capitales de la nitrification sont une forte humiditL- et
un libre acces de l'air; si l'aération est incomplete Ie salpètre formé dans Ie sol peut
même disparaitre rapidement sous l'action des bactéries de la dénitrification. Ces
circonstances sont tellement importantes que Ie but principal du travail de la terre
dans l'agriculture doit être de donner au sol une telle structure que l'oxydation y
soit partout favorisée et la réduction diminuée autant que possible.

Comme les plantes supérieures s'emparent avec avidité du salpètre, on retrouve
cette substance avec la plus grande facilité dans les plantes elles-mêmes, qui commen-
cent par l'amasser pour ne la faire servir que plus tard a la formation d'autres coni-
binaisons azotées ; — parfois même cette transformation n'a pas lieu. Chez les plantes
herbacées surtout, l'accumulation de salpètre dans les tissus est souvent tellement
considérable qu'après l'enfouissement leur feuillage vert peut être considéré non seule-
ment comme »engrais a matière albuminoïde«, mais encore comme »engrais a sal-
pètre«. Le moyen Ie plus facile de se rendre compte de la teneur en nitrate du sol
est d'ailleurs de chercher ce corps dans les plantes qui y croissent, en découpant a
diverses hauteurs dans la tige des plaques que l'on plonge dans une solution de sulfate
de diphénylamine; l'intensité de la coloration bleue donne la mesure de la richesse en
salpètre de la plante, donc aussi du sol.

Dans des conditions ordinaires, la nitrification exige non seulement la présence
des ferments actifs proprement dits, mais encore celle d'autres microbes vulgaires,
qui en assurent la régularité par la minéralisation des substances organiques. Il
s'ensuit qu'il n'y a pas moins de sept a huit espèces de bactéries, a propriétés et fonc-
tions tres différentes, qui doivent opérer simultanément, et dans un ordre exactement
déterminé, pour effectuer le passage de l'azote libre a l'état de nitrate, du moins si
c'est la cellulose qui sert de source de carbone, — bien une preuve de l'étonnante
complication des actions biologiques dans le sol.

En 1885, Frank a fait voir que plusieurs arbres de nos bois, tels que le chêne,
le hêtre, le charme, le pin commun et bien d'autres plantes et arbustes, entre autres
la bruyère a balai, produisent des racines enveloppées d'un épais manteau de mycé-
lium, qui dans certains cas pénètre même jusque dans l'intérieur des cellules des ra-
cines et que l'on ne peut pas considérer comme un parasite nuisible, mais plutót
comme un symbionte utile, avantageux et même indispensable pour la nutrition. On
donne a cette association le nom de »mycorhize«. A vrai dire, cette découverte
n'était pas nouvelle, car bien avant déja on savait que les racines de divers
saprophytes incolores de l'humus de nos bois de hêtre et de sapin, tels que Monotropa
hypopitys, sont recouvertes de filaments mycéliens qui en traversent même les couches
cxtcrieures ; mais la constatation du fait que ces mycorhizes sont universellement
rcpandus était nouvelle, et dans la suite on en a trouvé bien d'autres exemples, et des
plus surprenants, chez des groupes de plantes tres différents.

Pour examiner de plus prés les rapports entre ces organismes, nous trouvons des

263

sujets d't'tude bien appropriés 3ans les premiers stades de développement de plusieurs
de nos plus belles Orchidées de serre, telles que les genres Cattleya, Laelia, Angrae-
cum et beaucoup d'autres. Ceux qui se sont occupés de la culture de ces plantes sa-
vent que parfois seurs graines germent facilement, mais que dans d'autres cas cette
germination est excessivement difficile, sinon impossible. On crüt y reconnaitre l'in-
flueiice de l'un ou l'autre microbe, qui n'existait pas partout, et qui devait pénétrer
dans Ie jeune germe pour lui donner Ie pouvoir de continuer son développement.
Cette supposition fut confirmée et l'on sait maintenant que Torganisme en question
est Ie mycélium d'une moisissure.

Les graines et les plantules de Cattleya mossiae et de deux ou trois autres
espèces, provenant de la magnifique collection d'Orchidées de Jhr. C h. S m i s -
s a e r t a Apeldoorn, et fournies au Laboratoire de bacteriologie a Delft, en divers
stades de leur développement, par l'hortulanus M. Oversluys, ont permis de faire
a ce sujet les constatations suivantes.

Les graines excessivement fines de la piante que je viens de citer se composent,
comme celles de toutes les autres Orchidées, d'un embryon oü l'on ne reconnait ni
bourgeon, ni racine embryonnaires, et dont Ie tégument, qui est en forme de poche
et rempli d'air, tombe sitót que la germination est en train.

Au commencement de la germination la graine se gonfle fortement et l'embryon
indivis, qui ne se compose que de quelques cellules remplies d'albumine et d'huile, se
colore légèrement en vert sous l'action d la lumière. Si Ie mycélium de la moisissure
symbiotique fait défaut, la segmentation cellulaire et la croissance s'arrêtent la et les
jeunes germes palissent et périssent au bout de peu de temps. Ouand il est présent,
au contraire, l'embryon continue a se développer et il se forme peu a peu un petit
tubercule vert (Pt, fig. 9) oü l'on reconnait a la partie supérieure, quand il a atteint
une grosseur d'un mm. environ, un bourgeon embryonnaire Vg, en même temps
qu'une grosse racine Ra se fait jour, quelque part sur Ie cóté, a travers une déchirure
de l'écorce. Ce n'est qu'au bout de 8 a 12 années que la piante peut fleurir.

Dans les tubercules embryonnaires Ie mycélium se reconnait aisément au micros-
cope, et on peut Ie cultiver en transportant des plaques des tubercules sur un terrain
de culture solide, qui ne contient que fort peu de substance organique soluble; tel est
p. ex. de l'agar pur avec des traces de phosphate de potassium et de nitrate d'ammo-
nium, oü l'on voit s'étendre en tous sens ramifications excessivement grêles et ca-
ractéristiques de la moisissure.

Il est tres interessant de poursuivre les changements qui s'opèrent dans les
graines de Cattleya, quand on les sème, avec et sans ce mycélium, sur la même pla-
que translucide d'agar ; au bout d'environ trois semaines on constate déja une grande
différence, l'avantage étant pour les premières, et en même temps on voit que toutes
les moisissures étrangères sont sans influence sur Ie processus de la germination ou
lui sont même défavorables.

La maniere dont Ie mycélium pénètre dans la racine peut s'observer aisément.
Les filaments suivent de préférence les cellules du porte-embryon ou choisissent a eet
effet les poils radicaux Rp qui se rencontrent qa et la, en groupes de 3 a 5 a la sur-
face inférieure de l'embryon; il n'y a que quelques filaments qui traversent directe-
ment l'épiderme. Ce n'est que quand ils ont atteint des cellules relativement profondes
que ces filaments continuent a se développer, en subissant des transformations que

264

l'on retrouve d'une fa^on a peu prés identique chez 'beaucoup d'autres mycorhizes.
On voit d'abord la cavité cellulaire se remplir presque tout entière de masses mycé-
liennes (Mc), enroulées en pelote, qui donnent naissance, dans les cellules plus pro-
iondes, a des masses granuleuses compactes et brunatres (7c), ne ressemblant plus
du tout a un mycélium. Comme l'examen microscopique a appris que ces masses sont
consommées plus tard par la petite plante de Cattleya comme nourriture de réserve,
nous pouvons donner aux cellules qui les contiennent Ie nom de » cellules nutritives«.

On n'a pas pu trouver de mycélium dans les autres parties de la plante. Par
centre, dans les jeunes cellules voisines du sommet de la racine on observe des inclu-
sions particulières, ressemblant fort aux granulations des cellules nutritives; mais on
n'est pas parvenu a démontrer qu'il y a quelque rapport direct entre ces inclusions
et Ie mycélium. Ces inclusions (01), que l'on trouve aussi dans d'autres jeunes or-
ganes des Orchidées, ont été décrites pour la première fois par M. Wakker, qui leur
a donné Ie nom d'oléoplastes; il est a désirer que de nouvelles recherches soient entre-
prises a leur sujet, car elles ont indubitablement une grande importance dans Ie déve-
loppement de ces végétaux.

Pour en revenir au mycélium, il y a lieu de se demander s'il est nourri par l'em-
bryon, ou bien si c'est l'embryon qui est nourri par lui, ou encore si les deux éven-
tualités sont réalisées a la fois.

Si l'on songe que diverses espèces d'Orchidées, dans les racines desquelles on
trouve un mycélium qui n'est pas précisément Ie mème que Ie symbionte de Catlleya,
mais en est du moins tres rapproché, appartiennent aux habitants incolores de l'hu-
mus, p. e. la Neottia nidus avis de notre flore, et que ces plantes enlèvent leur nourri-
ture organique a I'humus du sol. sans aucun doute par Ie concours du symbionte, il
est tout naturel de conclure que la fonction du mycélium de Cattleya doit être la
même; la réponse a la question précédente sera donc que c'est Ie mycélium qui
nourrit Ie germe.

Mais de quelle nature, se demander a-t-on, est la nourriture que Ie mycélium
transporte vers l'embryon vert, qui de son cóté, grace a la chlorophylle, produira
certainement lui-même une nourriture organique aux dépens de l'acide carbonique
de l'air.

A ce propos, M. Stahl a prouvé que les plantes a mycorhize évaporent généra-
lement peu d'eau; par Ie courant de transpiration elles n'enlèvent donc au sol que
fort peu de nourriture minerale, et Ie petit nombre, voire même l'absence de poils
radicaux est une circonstance qui y contribue. Le mycorhize doit donc avoir comme
fonction importante de pourvoir la plante de sels inorganiques, et de rendre par la
l'évaporation moins nécessaire.

Mais le pouvoir du symbionte de transformer en combinaisons ammoniacales les
substances albuminoïdes qui sont répandues de tous cótés dans le sol environnant, et
qui comme telles ne sont pas assimilables pour les plantes supérieures, a une impor-
tance beaucoup plus grande encore. Ces matières sont absorbées par le mycélium et
y sont certainement transportées sur de grandes distances jusqu'a la plante a mycor-
hize même, qui re<;oit ainsi Ia nourriture azotée nécessaire. Quelques auteurs ont
cru devoir chercher l'utilité du symbionte dans une fixation d'azote libre, mais des
recherches faites expres m'ont appris que dans les mycélia de Cattleya et Orchis une
telle fixation ne s'opère pas.

205

On pourrait encore se demander s'il y aurait quelque avantage pour certaines
plantes supérieures, vertes, a pouvoir extraire du sol des substances organiques sans
azote, alors même qu'elles sont en état d'en former elles-mêmes au moyen d'acide
carbonique. Il semble qu'on doive répondre affirmativement a cette question, car on
a pu s'assurer, par des expériences de cultures faites avec plusieurs espèces d'algues
inférieures vertes, que ces organismes-la du moins se développent beaucoup plus
rapidement quand ils se nourrissent avec une nourriture organique, comme Ie sucre,
que lorsqu'ils doivent vivre de l'acide carbonique seul; on ne risque donc pas de se
tromper quand on suppose qu'il en sera de même pour les plantes a mycorhize. Si
Ie mycorhize a tant d'importance a plus d'un point de vue, il n'y a rien d'étonnant a
ce que, dans Ie développement graduel du règne végétal, cette association ait pris nais-
sance, dans plusieurs divisions indépendantes de ce règne, comme un organe destinó
a la nutrition au moyen des substances organiques et inorganiques contenues dans Ie
milieu environnant.

Dans ses »Le<;ons sur les phénomènes de la vie«, Claude Bernard a pro-
noncé les mots mémorables suivants: »Le but de toute science, tant des êtres vivants
que des corps bruts, peut se caractériser en deux mots: prévoir et agir«. Tel aussi
doit être Ie but de la Microbiologie Agricole, de la jeune science encore dans sa
période de formation, dont j'ai voulu vous donner, en quelques fragments, un aper(;u
rapide. Et s'il est vrai, comme il y en a beaucoup qui Ie soutiennent, que plus tard
I'histoire de la civilisation qualifiera Ie 19e siècle de »siècle des microbes«, parce que
c'est dans son cours que l'homme est parvenu a triompher des germes malfaisants des
épidémies, on a toute raison de croire qu'a la fin du 20e siècle la microbiologie agri-
cole, qui s'occupe spécialement des microbes utiles, aura aussi atteint son but et
portera a son tour Ie cachet caractéristique: prévoir et agir.

M. W. BEIJERINCK. L'influence des microbes.

Ra

Az

Ra

Az

l-h

1'^ig. 2. (600). Fibres £ du lin, attaquóes par les
microl)es actifs dans la fixation de 1'azotc libre qui
les séparent en fibrilles élémentaires; Fh ferment
hydrogénique; Ra Bacillus radiobacter ; As Azato-
bacter chroococciim.

Fig. 3 (3)- Types de tnbercules de Papilionacées;

a de Robin ia pseiido-acacia; b de l'icia cracca; c de

Trifoliiim pratriise.

Rd

Fv
Fig. 4 (40). Coupe d'un tubercule de J'icia faba; Rd racine de la
plante mère; Pr poils radicaux; Bt tissu a bactéroïdes du tubercule;
Cp écorce; Fz' faisceau vasculaire du tubercule.

(>

Fig. 5 (400). Morceau d'un tubercule de Vicia faba, vu sous uu plus

fort grossissement; Bt cellules a bactéroïdes avec filaments du mucus

bacteriën Mn; Cp écorce du tubercule.

Fig. 5.

M. W. BEIJERINCK. L'influence des microbes.

Fig. 6 (looo). Bti bactéroïdes du trèflc; Bti
bactéroïdes de la vcsce.

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Fig.8. A. Organismes qui torment de rammoniaiiuc

aux dépens desmatières albuminoïdes i (25)Espèce

dePciiicUliiiin. 2. (looo)Levure rouge du sol. 3. (1000)

Bacillus fluorescens liqiiefaciens avec cils.

B. (1500). Ferment des nitrites avec cils.

C. (1500). Ferment des nitrates.

Fig. g (50). Coupe d'un jeune enibryon de Cattleya
mossiae; Pt Ie prothalle avec les poils radicaux Rp;
Fl la première feuille; Vg Ie point végétatif du
bourgeon; Ra la première racine avec les oléo-
plastes Ol; My mycélium du symbionte; Mc les
cellules a mycélium. Tc les cellules nutritives.

Fig. 7 (1000). Culture des bactéries (Bacillus
radicicola) de J'icia faba dans une solution diluée
de sucre de canne en décoction de feuilles de pois.

Sur Texcitation par traumatisme, Ie parasitisme
et récoulement gommeux chez les Amygdalées.

Par M. W. BEIJERINCK et A. RANT.

Archives Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé XI,

1906, p. 184 — 194. — Verscheen onder den titel »Wundreiz, Parasitismus und Gummi-

fluss bei den Amygdaleen* in Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena,

II. Abteilung, XV. Band, 1905, S. 366—375.

Il y a déja longtemps qu'on a reconnu ^) qu'un hyphomycète, vivant en parasite
dans récorce des Amygdalées, appelé Coryneum beijerinckii par M. Oudemans
(Hedwigia, 5 sept. 1883, n". 8), mais probablement identique a Clasterosporiuni
amygdalearum S a c c. (= Helminthosporium carpophilum (L é v.) Aderh.), donne
lieu a un écoulement de gomme abondant et persistant, quand on l'inocule dans Ie
cambium de ces arbres.

Au commencement, on a émis de divers cótés des doutes sur l'exactitude de cette
observation, qui a été confirmée d'autre part. Actuellement il ne saurait plus régner
de l'incertitude a ce sujet; la preuve en a été fournie au moyen des cultures pures 2)
du champignon en question. Ce soat particulièrement les recherches détaillées de M.
A d e r h o 1 d ') qui ont étendu a plus d'un point de vue notre connaissance du phéno-
mène de la gommose parasitaire.

Mais, dans toutes les recherches antérieures, on n'a pas assez fait attention au
rapport qui existe entre Técoulement gommeux et l'excitation produite par une bles-
sure, ni a celui entre cette excitation et Ie parasitisme; voila comment il se fait qu'une
theorie satisfaisante du processus manque encore complètement. Les nouvelles ex-
périences, que j'ai entreprises avec Ie concours de M. A. R an t , dans Ie but de faire
la lumière sur ce cóté de la question, ont permis de se faire une meilleure idéé de Ia
relation entre ces phénomènes, dont les pages suivantes donnent un aperc^u prélimi-
naire, et qui sera traitée plus en détail a une autre occasion.

') M. W. Bei jer inck, Maladie de la gomme chez les plantes; ces Archives, 19, 1886.

^) Les cultures pures sont d'une préparation bien plus difficile qu'on ne l'atten-
drait d'un champignon, dont la croissance est aussi vigoureuse. Il est recommandable
de se servir d'une décoction de feuilles de pêcher dans de l'agar a peptone, ou de
l'agar a mout dilué, et on obtient alors, soit une forme tres virulente, tres sporulante,
OU une forme peu virulente, avec peu de spores, ou même un mycélium stérile, qui se
comporte comme saprophyte, ou du moins comme un faible parasite. Depuis 1886 j'ai
fait de nombreuses expériences avec de pareilles cultures pures.

') Ueber Clasterosporiuni carpophilum (Lév.) Aderh. und dessen Beziehungen
zum Gummifluss. Arbeiten der Biolog. Abtcil. des Gesundheitsamtes, Bd. II, IQ02, Heft 5,
p. 515.

268

Comme objets d'exptrience nous nous sommes surtout servis du pêcher et du
pécher-amandier ^), parce que ces espèces sont tres sensibles a des lésions et y réa-
gissent aisément par un écoulement de gomme. Le cerisier, Ie prunier et l'abricotier
ne donnent pas aussi facilement de la gomme quand on les blesse, mais présentent
d'ailleurs des phénomènes identiques.

Nous communiquerons d'abord les observations faites sur des tiges tres jeunes,
encore vertes, puis celles sur des tiges plus agées, présentant un ou plusieurs anneaux
totalement lignifiés.

I. Lésion du cambiuni de jeunes rameaux verts.

Quand en plein été on blesse jusque dans le cambiuni et le bois secondaire de
jeunes pousses du pêcher ou du pêcher-amandier, on constate qu'en moins d'une se-
maine, parfois même en 4 jours, des gouttelettes de gomme apparaissent sur quel-
ques blessures. Prés du sommet de la pousse l'écoulement gommeux est faible ; puis
vient une zone, longue de i a 2 décimètres, oü le phénomène est le plus intense; plus
bas encore il diminue de nouveau, et il finit par disparaitre complètement quand on
s'éloigne davantage du sommet. La région la plus sensible est donc celle qui est
située au-dessous et tout prés de la zone du maximum de croissance longitudinale,
mais ce n'est pas cette zone elle-même. La raison pour laquelle elle ne se confond pas
avec cette zone, c'est sans doute que l'écoulement gommeux est en rapport avec la
croissance en épaisseur cambiale, aussi bien celle du cambium que celle du procam-
bium; or, dans les parties qui s'allongent encore cette croissance est faible, et les
autres tissus parenchymateux sont incapables de se transformer en gomme. Cette
circonstance est d'une importance capitale pour l'explication du phénomène.

Il importe aussi de remarquer le fait que, quand on fait l'expérience sous la
forme considérée ici, les portions du rameau déja recouvertes d'une couche subéreuse
ne présentent pas non plus d'écoulement gommeux, quand en été on les blesse au cam-
bium. Mais je montrerai tantót qu'il n'en est pas ainsi en toutes circonstances, et
que cela dépend notamment de la saison ; on doit donc conclure que c'est l'état physio-
logique dans lequel se trouve le tissu qui détermine la possibilité ou l'impossibilité de
la formation de la gomme.

L'examen microscopique des blessures oü se forme de la gomme a appris, que cette
5ubstance sort de fins canaux qui se trouvent a l'intérieur de l'anneau de cambium,
qu'ils touchent directement par la face extérieure. Au point de vue anatomique cette
gomme correspond donc a l'aubier secondaire, qui s'est arrêté dans son développement
et est devenu fluide quand il était encore a l'état cambial ou cellulaire. La formation
de canaux séparés résulte du fait, que les cellules du cambium des rayons médullaires
se transforment bien plus difïicilement en gomme que le jeune bois entre ces rayons.
Cependant la gommose peut finir par afïecter aussi les rayons médullaires en voie de
formation, et il se forme alors des cavités gummifères plates ou des canaux ellipti-
ques larges. Les cellules et faisceaux de cellules trichomatiques, bien connues et sou-
vent figurées, qui pénètrent dans les canaux gummifères, proviennent d'ordinaire de
la transformation du jeune cambium des rayons médullaires.

') Amygdalus amygdalo-persica; Du ham ei Dumonceau, Arbres fruitiers. Tab. 4;
Grenier et Godron, Flore de France, T. I, 1848, p. 512.

269

La situation et l'extension des canaux gummifères sont étroitement liées a la
localisation et rimportance de la blessure. Quand la lésion est faible, on ne trouve
les canaux que dans son voisinage immédiat; ce n'est que quand la blessure est pene-
trante et atteint la moëlle des rameaux que les canaux se forment sur tout son pour-
tour. Les canaux atteignent une longueur de i a lomm. ; leurs extrémités sont
situées a peu prés sur une ellipse, dont la blessure occupe Ie foyer inférieur (c. a. d.
tourné vers la base du rameau). Ainsi donc l'excitation traumatique peut s'observer
un peu plus loin vers Ie haut que vers Ie bas de la blessure, et latéralement elle
s'étend encore moins loin que dans Ie sens longitudinal. Quand la lésion ofïre peu
d'étendue, p. ex. quand on a pratiqué une petite incision transversale ou simplement
une piqüre, on observe, d'accord avec ce qui précède, que les canaux les plus larges
sont au centre et que latéralement ils deviennent d'autant plus étroits qu'ils sont plus
éloignés de la blessure.

Résumant ce qui précède, nous arrivons a cette conclusion, que la gomme trau-
matique, qui se forme en été dans les jeunes rameaux verts, sous l'influence d'une
excitation s'étendant elliptiquement autour de la blessure, se forme aux dépens de
l'aubier en voie de développement, tandis que tous les autres tissus, dont Ie développe-
ment est plus avance ou achevé, quelles que soient leur nature et leur situation, ne sont
pasaffectéspar Técoulement gommeux. En un mot, Ie phénomène repose sur une trans-
formation patholique du tissu ligneux embryonnaire, causé par une excitation trau-
matique.

2. Lésion dit cambium de branches plus agées.

Quand on coupe aux mois de février et mars des branches, agées d'un an ou plus
agées encore, d'un pêcher-amandier, d'un abricotier, d'un cerisier ou d'un prunier, et
qu'on les place avec leurs bases dans l'eau dans une chambre chaufïée, on observe au
bout de 5 a 10 jours que toutes les branches saines et vigoureuses, sans exception,
laissent suinter de la gomme par l'anneau cambial de la section. Des coupures que
l'on pratiqué a cette époque dans de pareils rameaux, traversant l'écorce et penetrant
jusque dans Ie cambium, présentent Ie même écoulement, qui est sourtout sensible
quand la section est oblique ou transversale, tandis qu'il l'est moins quand la plaie est
longitudinale.

Des blessures analogues, faites a l'air libre dans cette saison, ne donnent pas lieu
a un écoulement gommeux, sans doute parce que la température est trop basse pour
rendre possible les processus biochimiques nécessaires au phénomène. D'autre part,
ces mêmes branches, quand on les blesse de la même faqon en été, ne réagissent pas
par un écoulement de gomme, pas plus quand on les conserve dans l'eau dans une
chambre que quand on les laisse sur l'arbre. Il en résulte clairement que c'est surtout
de l'état particulier du cambium au printemps que dépend la formation de la gomme.
Mais il n'en est plus ainsi quand la plaie est infectée par Coryneum, qui excite tou-
jours a une production de gomme abondante.

Quand on examine au mois de février l'anneau cambial au voisinage d'une section
d'oü coule la gomme, on observe ce qui suit:

On constate en premier lieu qu'en cette saison Ie »cambium« se compose de
plusieurs couches et non d'une couche unique de cellules. Dans tous les cas, Ie con-

270

traste entre l'écorce et Ie bois n'est pas fort marqué dans ce tissu cellulaire, et il est
inipossibled'indiqueroü s'établira la limite entre les deux. Mais ce qui est particulière-
ment interessant, c'est la formation de canaux gummifères dans ce manteau cam-
bial, composé de plusieurs (4 a 6) couches de cellules, dans Ie voisinage, et même
jusqu'a une distance considérable des portions Icsées, d'une faqon qui est tout a fait
la même que nous l'avons décrit tantót pour les jeunes rameaux verts. Il est vrai
que, vu Ie manque de différenciation dans Ie cambium, et l'inactivité de la crois-
sance en épaisseur, leur origine dans la partie qui correspond a l'aubier, et non a
l'écorce secondaire, est difficile a établir et exige un examen minutieux et poursuivi
du développement du bois. Mais on arrive a la conclusion certaine, que la gomme se
forme, dans ce cas aussi, aux dépens du bois embryonnaire.

Dans cette épreuve en chambre avec des branches agces, l'extension et la dis-
position des canaux gummifères sont plus nettes et d'un examen plus facile que pour
les jeunes rameaux. C'est au milieu de leur longueur que ces canaux ont la plus
grande largeur, et leurs extrémités sont étroites; les canaux du milieu, c. a d. ceux
qui sont les plus rapprochés de la blessure, sont les plus volumineux. lei aussi
les canaux aboutissent a l'intérieur d'une ellipse, dont la plaie occupe a peu prés Ie
foyer inférieur. On reconnait donc facilement que l'excitation se propage plus loin
dans Ie sens du sommet que vers la base de la pousse ; une circonstance que l'on pour-
rait expliquer en admettant que l'excitation se propage dans Ie xylème avec la »sève
ascendante.« L'observation de M. A d e r h o 1 d, que l'infection par Corynenm de
blessures faites au-dessus d'un »anneau« sans écorce, dans un rameau annelé par inci-
sion, donne lieu a un écoulement gommeux beaucoup plus fort qu'au-dessous de
l'anneau, n'est pas en désaccord avec cette supposition, puisque la »sève descendante«
apporte au-dessus de l'anneau les aliments, dont Coryneum a besoin pour se déve-
lopper et qui manquent bientót au-dessous de l'anneau.

Des deux cótés d'une blessure laterale, les canaux s'étendent d'autant plus loin
que la lésion est plus profonde et plus étendue ; il est donc possible de transformer en
un système de canaux gummifères, par des incisions profondes, l'anneau cambial
presque tout entier, tout comme pour les sections transversales. lei comme pour des
rameaux verts, Ie cambium des rayons médullaires produit bien plus difficilement
de la gomme que les portions interradiales, qui produisent plus tard Ie vrai bois. Pour-
tant, quand l'excitation traumatique est tres énergique, Ie cambium des rayons médul-
laires se liquéfie également, et les canaux communiquent alors latéralement en don-
nant naissance a des cavités plates.

En résumé, nous arrivons pour les branches agées aux mêmes conclusions que pour
les jeunes pousses: l'écoulement gommeux est dü a une liquéfaction de l'aubier em-
bryonnaire, produite par excitation traumatique.

Le fait bien connu, que l'on observe souvent (mais pas toujours) chez les Amyg-
dalées, dans le bois de tout age, des cavités et des canaux gummifères, s'accorde par-
faitemenent avec ce qui précède, quand on admet que les canaux du vieux bois,
éloignés du cambium, se sont formés il y a longtemps déja, quand la région dévastée
était encore a l'état embryonnaire. Le bois complètement formé ne se liquéfie jamais.
Il résulte encore de ce qui précède, que le cambium n'est pas détruit par le processus,
car, en dehors des cavités a gomme, il a formé régulièrement les anneaux ligneux
annuels.

271

Quelle est la dimension que peut atteindre un canal gummifère, et comment il
se fait que la même couche de cambium forme alternativement du bois et de la
gomme, sous l'intluence d'une excitation traumatique persistante, comme dans Ie cas
d'infection par Coryneum^ voila des questions non encore résolues.

3. Excitation produite par des poisons ou par brülure.

Bien que nous ne sachions pas pour Ie moment ce qu'on doit entendre par exci-
tation traumatique, il est cependant a supposer qu'il s'agit d'une influence des cellules
mourantes, nécrobiotiques, sur les cellules cambiales vivantes. On peut donc s'at-
tendre a ce que des poisons violents, introduits dans Ie cambium, agissent d'une
maniere analogue, et peut-être bien plus énergique encore, qu'une simple blessure,
puisqueladiffusiondupoison peut entrainer la mort d'un nombre plus grand de cellules
successives. Il était d'ailleurs probable que des lésions par brülure se comporteraient
de même, quoique plus faiblement que de forts poisons. Cette supposition a été re-
connue exacte.

Je me suis servi comme poison de sublimé corrosif, et en été j'ai obtenu avec
cette substance des résultats décisifs déja au bout de 4 a 7 jours; des piqüres faites
dans de jeunes rameaux verts de pêcher, et infectées par ce poison, donnaient beau-
coup plus de gomme qu'on n'aurait pu l'attendre de simples piqüres. Puisque Ie
sublimé est un poison mortel pour les champignons, Ie traitement par cette substance
excluait toute possibilité que la cause immédiate de la gommose füt la présence d'une
"bacterie parasite, p. ex. une bacterie mucogène non cultivable ; la gomme n'est donc
pas un mucus bacteriën, ainsi que Ie pretendent quelques auteurs peu experts. Le fort
écoulement gommeux produit par le champignon Coryneum s'explique par le fait qu'il
engendre un poison violent, agissant comme le sublimé, et qui produit une exci-
tation traumatique de longue durée.

La circonstance, que les plaies infectées par le sublimé se résolvent en gomme,
même chez les parties agées des branches et a une époque oü la lésion seule ne don-
nerait lieu a aucun écoulement, est d'accord avec l'action particulièrement intense de
cepoison. C'estainsiqu'aumoisde juilletdesrameauxd'abricotier assez vieux ont fourni
beaucoup de gomme par des blessures traitées au sublimé, alors qu'en cette saison les
mêmes blessures guérissent aisément, quand elles ne sont pas empoisonnées, par
formation d'un cal, mais sans produire de la gomme.

Les lésions par brülure ont donné le même résultat, quoique moins marqué ; ce
qui est facile a comprendre, puisque le sublimé, en penetrant lentement par diffusion
dans les tissus mourants, détruit pendant longtemps de nouvelles cellules, de plus en
plus éloignées de la blessure. Pour les brülures au contraire, que j'ai provoquées au
soleil au moyen d'une loupe, le champ atteint est et reste limité. Il est évident qu'au
centre d'un pareil champ on trouve des cellules mortes, entourées d'une zone de cel-
lules nécrobiotiques, ces dernières ayant ceci de caractéristique, que leur protoplasme
est mort, tandis que les enzymes ou autres substances enzymateuses ont conservé leur
activité. Particulièrement dans ce cas la conclusion semble inévitable, que l'influence
de ces derniers corps, c. a d. des substances nécrobiotiques, sur les cellules vivantes
qui les environnent est la cause de l'écoulement gommeux.

Cette maniere de voir nous fait supposer qu'il y a quelque analogie entre 'a

272

transformation du bois embryonnaire en gomme et l'action des enzymes cytolytiques,
rappelant la »cytase« des physiologistes, qui peut dissoudre des cellules entières, et
non la même notion chez les botanistes, par laquelle ils ont en vue la liquéfaction de
la paroi cellulaire seulement, et pour laquelle les noms plus spéciaux de cellulase, gé-
lase et pectosinase conviennent mieux.

L'hypothèse émise en 1886 (1. c), que la substance enzymateuse, engendrant la
gomme, proviendrait du champignon Coryneum, s'écarte de la maniere de voir
actuelle, en ce sens que l'on peut maintenant considérer comme démontré, que l'action
excitante du champignon repose sur un poison, et que ce sont les cellules végétales
nécrobiotiques elles-mêmes qui secrètent l'agent de la gommose.

Cet agent quitte sans doute les cellules et agit sur les cellules environnantes
jusqu'a una certaine distance; c'est ce qu'on peut conclure du fait, que la gomme ne
provient pas exclusivement des cellules de la plante, mais peut, dans Ie cas d'une in-
fection par Coryneum, être formée en partie par la transformation des cellules mycé-
liennes du champignon lui-même, ainsi que je l'ai représenté dans mon mémoire de
1886. J'y ajouterai encore que l'étude des cultures pures a démontré, que ces cellules
mycéliennes, qui ont la propriété de se transformer, ne se rencontrent que dans les
plaies gummipares des Amygdalées et ne se forment jamais dans les cultures sur
un autre terrain que Ie bois vivant.

L'hypothèse que les enzymes cytolytiques, provenant des cellules nécrobiotiques,
seraient la cause de la maladie de la gomme, se trouve corroborée indirectement par
Ie fait que, chez les plantes supérieures, on constate l'activité d'un corps cytolytique,
lors de la formation des trachéides et des vaisseaux dans Ie méristème cellulaire ou
dans Ie procambium. lei la transformation repose indubitablement sur une cytolyse,
dans laquelle les parois longitudinales lignifiées des éléments atteints restent seules
intactes, tandis que les matières produites par la cytolyse consistent, au moins par-
tiellement, en corps de nature gommeuse, que l'on peut retrouver dans les vaisseaux.

Suivant notre maniere de voir, l'excitation traumatique ne ferait donc qu'activer
un processus qui se produit déja dans la vie normale, et notamment, puisque récoule-
ment gommeux n'est réellement important que dans l'aubier secondaire, précisément
la oü la cytolyse physiologique doit être certainement la plus forte dans les conditions
normales.

La gomme que l'on trouve dans beaucoup d'espèces de bois se laisse donc ranger
sans difficulté dans Ie même ordre de phénomènes. En effet, si notre hypothese est
exacte, il faut que la gomme qui se produit dans la formation normale des vaisseaux
soit résorbée dans les circonstances ordinaires; mais il n'y a pas lieu de s'étonner
que cette résorption n'est pas toujours complete, et que bien souvent une partie de !a
gomme échappe a cette résorption et se retrouve alors, comme produit physiologique,
même dans les vaisseaux complètement développés.

Voici comment nous pouvons résumer provisoirement, d'après ce qui précède, la
theorie de l'écoulement gommeux:

1. La plante normale engendre des substances cytolytiques, qui contribuent a la
formation des vaisseaux et des trachéides.

2. La gomme physiologique qui se forme par leur action est ordinairement ré-
sorbée, mais dans certaines circonstances on peut encore la retrouver comme telle
dans Ie creux des vaisseaux mürs.

273

3- L'écoulement gonimeux repose sur une activité excessive de pareilles sub-
stances cytolitiques, engendrées par les cellules nécrobiotiques, la nécrobiose signi-
fiant la fonction cellulaire qui subsiste après la mort du protoplasme, les substances
enzymateuses ayant conservé leur activité.

4. Les poisons, comme Ie sublimé corrosif ou Ie poison produit par Coryneum,
augmenteraient doiic indirectement la cytolyse dans Ie cambium et dans l'aubier qui
en résulte.

Il est clair que, dans cette theorie, deux processus peut-être tout a fait dif-
férents, savoir la cytolyse et la lignification, n'ont pas été suffisamment séparés. Mais
la possibilité que les corps qui participent a la lignification, comme la vanilline, Ie
iiiéthylfurfurol, la pyrocatéchine etc, prennent également part a la cytolyse, rend in-
fructueuse pour Ie moment toute spéculation relative a ce sujet.

4. Influence de sapropJiytes sur l'excitation traumatique et l'écoulement
de gomme che:: de jeunes rameaux verts. Parasitisme.

Nous avons vu tantót que dans les expériences de traumatisme, faites sur de
jeunes rameaux en juillet, ces rameaux n'étaient capables de produire de la gomme
que sur une faible longueur; les parties relativenient agées ne produisent pas de
gomme en été, mais leurs blessures guérissent rapidement et radicalement par for-
mation d'un cal.

En comparant entre eux plusieurs des rameaux ainsi blessés, on constate une
différence notable quant a la longueur de la zone, oü se trouvent les blessures présen-
t?nt l'écoulement gommeux; cette zone peut notamment être plus courte que i -déci-
inètre, mais elle en peut aussi dépasser deux.

Voici quelle semble être l'explication de ce phénoméne important:

D'après notre maniere de voir, l'écoulement gommeux est la conséquence directe
d'un processus nécrobiotique ; toutes les causes qui produisent la nécrobiose donnent
donc lieu a eet écoulement. Or. si de simples blessures suffisent déja a la produire
dans des conditions déterminées, d'autres circonstances aussi, entrainant la mort des
cellules, doivent avoir la même conséquence. Pour ce qui regarde les saprophytes, c.
a d. les microbes qui, sans engendrer des poisons specifiques, vivent des sucs végétaux
ou se développent dans ces liquides, ces organismes doivent, quand ils se multiplient
outre mesure, entrainer la mort des cellules voisines de leur hóte en empêchant l'accès
de l'oxygène, et occasionner ainsi une augmentation de l'excitation traumatique,
quand ils sont introduits dans des blessures. Si cette idéé est exacte, on peut s'at-
tendre a ce qu'une jeune pousse portant des saprophytes ofïre des blessures produisant
de la gomme en nombre plus grand que d'autres qui n'en portent pas. Pour mettre
cette supposition a l'épreuve, j'ai pris des rameaux tout a fait semblables, et je les ai
blessés d'une faqon identique; chez quelques-uns d'entr'eux j'ai introduit Dematium
pidlulans dans la blessure. Ce champignon est un véritable saprophyte des Amyg-
dalées et il se trouve tres souvent, sans qu'on s'en aperqoive, sur des feuilles tendres,
mais saines, sur des rameaux et surtout sur de jeunes fruits; mais il n'est pas assez
répandu pour infecter toute blessure obtenue par une simple lésion. Ma prévision a
été pleinement confirmée: Ie jeune rameau vert, artificiellement infecté par Ie cham-
pignon, portait des blessures présentant la gommose jusqu'a une distance du sommet

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 18

274

bien plus grande que Ie rameau non infecté. Mais les portions agées de la poussc
possèdent l'inimunité a l'égard de ces saprophytes, ce qui fait que des plaies infectées,
faites dans des branches agées de deux ou plusieurs années, guérissent normalement,
sans donner de la gomme; donc tout autrement, comme on voit, que dans les cas
d'infection par Coryneum.

J'ai obtenu un résultat analogue au moyen d'un saprophyte que j'ai isolé et déter-
miné comme Phyllosticta persicae. Avec des bactéries isolées de la gomme je n'ai
pas réussi a produire Ie même phénomène; j'ai recorinu qu'ils étaient absolument in-
actifs, probablement parce qu'ils ne pouvaient pas se développer suffisamment dans
les sucs des cellules tuées par la lésion, pour produire l'asphyxie des cellules non
atteintes, en empêchant complètement l'accès de l'oxygène. Mais on trouvera cer-
tainement d'autres espèces de bactéries, qui se comporteront comme les saprophytes
dont je viens de parier i).

Je profiterai de cette occasion pour faire quelques remarques sur la flore sapro-
phytique normale des plantes supérieures en général.

MM. Burri et Düggeli sont d'avis que c'est une espèce déterminée de bac-
téries, qu'ils ont appelée Bacillus herbicola^), qui est non seulement Ie principal re-
présentant, mais pour ainsi dire l'unique représentant de cette flore. Bien que j'ac-
cordeque cette bacterie '), que j'ai moi-même découverte, il y a déja plusieurs années,
et que j'ai appelée B. anglomerans '^), est universellement répandue, des recherches
étendues m'ont cependant appris qu'il y a encore d'autres microbes qui jouent un
róle important comme saprophytes normaux.

Pour ce qui regarde en premier lieu la maniere dont se présente Ie B. aiiglo-
merans (^ B. herbicola) et sa répartition, je recommande Ie procédé suivant pour
découvrir cette espèce: on n'a qu'a laisser germer une graine (Ie trèfle, Ie froment,
Ie chanvre, Ie lin, Brassica, Vicia, Phalaris et bien d'autres semences encore ont été
employés) sur un morceau de papier buvard humide, place dans un thermostat de
25 a 30° C. Dès que la racine de l'embryon apparait, plusieurs cellules de la calyptra
sont déja écorchées, et, dans la masse mucilagineuse ainsi formée, notre bacterie ne
manque presque jamais de se développer, puisqu'elle supporte bien l'exsiccation et
qu'elle existe toujours dans la poussière qui couvre l'enveloppe de la graine. On n'a
donc rien d'autre a faire, qu'a saisir au moyen d'une pincette les graines qui ont
germé, et a tracer au moyen de l'extrémité de la racine des traits inoculatoires sur
la surface d'une plaque de gelatine appropriée, p. ex. au bouillon de viande. Au bout

') Cette prévision a déja été confirmée par des recherches récentes de MM. Ader-
hol d et Ruhland, Centralbl. f. Bakteriologie. Bd. 15, pag. 376, 1905.

-) Die Bakterienflora gesunder Samen und Keimpflanzen (Centralbl. f. Bakt., Abt. II,
Bd. XII, 1904, p. 602),

^) L'histoire de cette bacterie prouve d'une fa?on caractéristique que la determi-
nation des espèces bactériennes, même les plus vulgaires, n'est pas de la compétence
de tout Ie monde. La présence de cette bacterie sur les racines de toute espèce de
plantes a conduit Frank a leur attribuer la formation des tubercules des Papiliona-
cées, ainsi qu'il résulte clairement de sa fig. 34, PI. I des Landivirtschaftl. Jahrb. 1890.
Son Rhicobium leguminosarum n'est donc pas autre chose que nion B. anglomerans ou
que Ie B. herbicola de MM. Burri et Dügelli, et il n'a absolument rien a voir dans
les tubercules des Papilionacées.

*) Botanische Zeitung; 1888, p. 749.

275

de I a 2 jours on obtient ainsi des séries entières de colonies, parfois constituées ex-
clusivement par Ie B. anglomerans, d'autres fois mélangées d'autres bactéries com-
munes. L'espèce en question se reconnait aisément aux zooglées tres caractéristiques
(qui se rencontrent pourtant sous la même forme chez d'autres espèces encore), et Ie
plus souvent aussi a la couleur jaune ou brun clair des colonies; mais ces dernières
ne sont pas rarement incolores, ce qui rend Ie diagnostic un peu plus difficile.

Tandis que M. D ü g g e 1 i pretend que B. herhicola se rencontre aussi en grandes
quantités sur les feuilles de toute espèce de plantes, mes propres recherches m'ont
donné la conviction, que cela n'est pas rare, il est vrai, mais que leur existence sur
les feuilles est loin d'être aussi générale que dans Ie niucus de la calyptra des som-
mets des racines. En outre, la véritable flore saprophytique, du moins celle des
feuilles des arbres, que j 'ai étudiéespécialement.consisteprincipalement en de tout autres
microbes, notamment des Dématies, des Blastomycètes, parmi lesquels on doit ranger
les levures rouges et incolores du sol, et certaines moisissures tres communes, appar-
tenant aux genres Trichosporium, Cladosporium et Epicoccum^): par contre, les bac-
téries ne s'y présentent que rarement et quantités considérables, et je m'étonne que
MM. Burri etDüggeli n'aient pas remarqué ce fait pourtant tres évident. Ce
sont iurtout les Dématies qui, en plusieurs espèces, constituent la majeure partie de
cette flore, et c'est précisément pour cela que je me suis servi, pour mes expériences
d'infection de blessures cambiales, d'une espèce de ces microbes fort répandue sur les
Amygdalées. Le fait, que les Dématies se rencontrent comme véritables saprophytes
dans l'écorce de branches mortes de diverses Amygdalées, ne diminue en rien leur
importance au point de vue de la »flore normale« des plantes, car il est évident que
les microbes de cette flore doivent trouver, sur les feuilles tout a fait saines. Tune ou
l'autre nourriture par laquelle ils deviennent des saprophytes^), et qu'ils pourront se
nourrir encore mieux dans les cellules mortes de leur hóte.

Pour notre but, il semble inutile de pénétrer plus avant dans les nombreuses
questions qui se présentent ici, et qui sont encore loin d'être épuisées; revenons donc
a la maladie de la gomme.

Pour ce qui regarde maintenant les parasites proprement dits, qui provoquent
l'écoulement gommeux, nous n'avons pu découvrir, en dehors du Coryneum parti-
culièrement actif, que Monilia fructigena sur des rameaux d'abricotier et aussi, mais
avec bien moins de certitude, une Cytospora fort répandue sur les branches de ceri-

') De nombreuses expériences, faites avec des végétaux qui étaient absolument
dépourvus de pucerons, ont prouvé qu'en général il ne s'agit pas ici d'un développe-
ment dans le miellat formé par ces insectes.

^) Il faut évidemment que cette nourriture soit absorbée a l'état dissous. Il est
probable que cette absorption n'a lieu que par un temps pluvieux, et non par un
échange osmotique entre les cellules du microbe et de la pjante. En faveur de cette
maniere de voir on peut citer le fait, que les plantes qui ne sont pas humectées par
la pluie (comme Robinia, Crambe, Hypericum etc.) ne portent qu'un nombre relative-
ment restreint de germes, tandis que les feuilles que la pluie mouille, telles que celles
de Sambucus, Ulmus, Fraxinus, du pêcher, du prunier etc, représentent le cas ordinaire,
oü les feuilles sont pour ainsi dire couvertes de germes. Ce fait nous fait comprendre la
signification biologique du revêtement cireux (fleur ou pruine) qui recouvre les feuilles
des plantes non mouillables, comme moyen d'éviter le dépót de germes de microbes en
général et de parasites en particulier.

i8*

276

sier. Il est vrai qu'avec cette dernière espèce nous n'avons pu produire d'écoulement
gommeux ni chez Ie pêcher, ni chez Ie cerisier, mais nous avons eu plus de succes en
infectant fortement Ie prunier avec ce parasite').

Ce qu'il y a de caractéristique dans l'action du parasitisme en général, c'est la
grande intensité des phénomènes d'empoisonnement, observés dans les blessures infec-
tées et dans leur voisinage; ces phénomènes sont si intenses, que de jeunes rameaux,
(lans Ie cambium desquels on a introduit Coryneum, périssent aisément sur toute
leur longueur, pendant que les tissus deviennent bruns, et alors c'est seulement de la
zone de transition entre les tissus morts et vivants que découle la gomme. En infec-
tant avec précaution, p. ex. de petits piqüres, on peut facilement conserver Ie rameau
vivant et obtenir un écoulement de gomme par toutes les blessures. Partout oü il y a
du cambium, on peut provoquer en toute saison, au moyen de Coryneum, un écoulement
abondant de gomme chez toutes les Amygdalées examinées; au point de vue anatomi-
que, on observe alors les mêmes phénomènes que l'on obtient par une simple blessure
OU par empoisonnement par Ie sublimé, mais a un degré beaucoup plus fort, et c'est
encore une fois la formation, dans la région cambiale, de canaux gummifères que
l'on retrouve plus tard dans Ie bois secondaire, qui est ce qu'il y a de plus frappant.

5. Comparaison de l' écoulement gommeux avec l' écoulement
de gomme-résine.

L'écoulement de gomme chez les Amygdalées, comme conséquence d'une excita-
tion par traumatisme, n'est pas du tout un phénomène isolé; au contraire, jusque dans
les détails anatomiques, il est identique a des cas bien étudiés d'écoulement de
gomme-résine chez les Dicotylées, oü l'on a même observé avec certitude un mycélium
parasitaire, que l'on n'a toutefois pas exactement interprêté. Pour l'écoulement de
gomme-résine on a deux cas a considérer. Ou bien il n'y a pas de canaux résinifères
dans la plante saine, et ces canaux ne prennent naissance que par suite d'une exci-
tation traumatique (Styrax hensoin), tout comme chez les Amygdalées, ou bien la
plante normale contient déja de pareils canaux {Canarium, Shorrea, Tolnifera).
Mais M. Svendsen^) a clairement démontré pour ce dernier cas que les canaux
normaux n'ont rien a voir dans la formation de la gomme-résine pathologique, qui
découle de nouveaux canaux, formés, par suite de la lésion, dans la région cambiale,
d'accord avec ce qui s'observe chez Styrax henzoin aussi bien que chez les Amyg-
dalées.

Ce mode de formation des canaux gommeux n'est d'ailleurs pas seulement la
règle pour la gomme et la gomme-résine, mais encore pour la résine traumatique elle-
même, comme l'a démontré M. Tsirch-'').

Il résulte des descriptions anatomiques de ces auteurs, que Ie produit pathologi-

•) De nombreux essais pour produire, sous l'influence d'un poison ou de parasites,
un écoulement de gomme chez Elaeagnus argentea ont été infructueux.

*) Svendsen, Harzfluss bei den Dikotylen (Archiv f ar Mathematik og Natur-
videnskab af Heiland, Sars, Torup, 26, i, 1905). Dans ce travail sont décrites les
préparations faites par M. leProf. Treub a Buitenzorg. On y trouve aussi la biblio-
graphie.

') Ueber den Harzfluss. Flora Bd. 93, p. 180, 1904.

277

que dérive partout de la liquéfaction du jeune bois secondaire embryonnaire, de sorte
que la gommose aussi bien que récoulement de gomme-résine et de résine proprement
dite doivent être considércs invariabletnent comme des troubles pathologiques dans Ie
processus de la lignification.

La comparaison est rendue encore remarquable par Ie fait que, dans tous les
cas, Ie parasitisme semble jouer Ie même róle, c. a d. qu'en prolongeant une ex-
citation traumatique il active l'écoulement de résine et de gomme-résine de la même
maniere que la gommose.

L'exactitude de cette assertion a déja été établie expérimentalement pour la
gomme damar, de l'ile d'Obi prés de Célèbes, ce qui résulte d'un rapport sur cette
substance, soumis au Gouvernement Hollandais par Ie forestier en chef M. S. P.
Ham, et dont l'auteur a eu l'obligeance de me procurer une copie. M. H am a con-
staté que cette gomme-résine, produite par une Diptérocarpée (suivant B o e r 1 a g e
une espèce de Hopea non encore décrite), coule beaucoup plus abondamment et régu-
lièrement quand on infecte au préalable les blessures par des morceaux de la même
gomme.

Les échantillons employés pour l'infection contenaient, sans aucun doute, Ie my-
célium OU des spores d'un parasite, et il est évident qu'il s'ouvre ici pour la botanique
pratique un vaste champ d'étude des moyens pour obtenir, d'une faqon plus rationelle
et en plus grande quantité, les substances précieuses considerées ici. Dans ces re-
cherches il s'agira en premier lieu d'obtenir en cultures pures les parasites actifs, et
ensuite on devra examiner quelle est la meilleure methode pour infecter, au moyen de
ces organismes, des blessures artificielles. Avec Corynemn on obtient fort simple-
ment une infection générale de plusieurs blessures, en arrosant les branches lésées, ou
même les arbres entiers, d'une eau contenant les spores. L'eau et les spores pénètrent
aisément par capillarité dans les piqüres et les incisions, que dans ce procédé on ne
peut rendre ni trop fortes, ni trop nombreuses, parce que Ie résultat est certain et
qu'autrement Ie parasitisme pourrait prendre un développement tel, qu'il entrainerait
la mort de parties végétales, dans lesquelles un parasitisme plus modéré aurait donné
lieu, pendant longtemps, a une excrétion abondante.

Delft, Laboratoire de Microbiologie
de rUniversité Technique.

An obligative anaerobic fermentation Sarcina.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. VII, 1905, p. 580 — 585. — Verscheen onder den titel »Een obligaat anaërobe
gistingssarcine» in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Af-
deeling, Amsterdam, Deel XIII, 1905, blz. 608 — 614; en onder den titel »Une sarcine
de fermentation anaerobie obligatoire« in Archives Néerlandaises des Sciences Exactes
et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé XI, 1906, p. 199 — 205.

The following simple but yet delicate experiment gives rise to a vigorous fer-
mentation, caused by a sarcine, wherein microscopically no other microbes
are perceptible and which, when rightly performed, can produce a real pure culture
of this fermentation organism. The simplicity of the experiment is the result of
many previous investigations, partly made conjointly with Dr. N. Goslings,
which have gradually rendered clear the conditions of life of the examined microbe.

Bouillon vv^ith 3 to 10% glucose, or malt wort, is acidifïed with phosphoric acid
to an acidity of 8 cc. normal per 100 cc. of culture liquid and introduced into a bottle,
which is quite filled with it and fitt^d with a tube to remove the gas. The infection is
done with an ample quantity ^) of garden soil, from which the heaviest and roughest
portion has been removed, but in which so much solid substance is left behind that
in the nutriënt liquid it forms a muddy deposit from 5 to 7 or more millimeters thick.
The culture is effected in a thermostat at 37" C. After 12 hours already the liquid
is in a strong fermentation, which lasts from 24 to 36 hours, and whereby the surface
is covered with a rough scum, produced by gas bubbles mounting up from the depth.
Whilst the liquid itself remains wholly free from microbes, the microscopical image
of the deposit shows a luxuriant, pure or almost pure culture of a sarcine, of which
the elementary cells measure for the greater part about 3.5 \i, so that the species
belongs to the largest forms known, and the multicellular sarcine-packages are easily
visible to the naked eye. The cells are colorless and transparent and the packages
present irregular sides. Here and there, but much less generally, a brownish intrans-
parent form is seen, with more regularly cubical packages of which the cells measure
2 to 2,5 |i.

The scum floating on the fermenting fluid consists of slime in which the evolved
gas remains for a time imprisoned. This slime is produced by the outer side of the
sarcine cells, whose walls for the rest consist of cellulose, which becomes violet-blue
by zincchloride and jodine. This reaction was discovered in 1865 in the stomacal
sarcine by Suringar^), who on this account argued the vegetal nature of this

') With linie soil for infection, the experiment becomes doubtful.
*) W. F. R. Suringar, De sarcine (Sarcina ventriculi Goodsir), pag. 7,
Leeuwarden 1865. Here very good figures are to be found.

279

organism, which fuUy corresponds to the small-celled fermentation sarcine. The
iarge-celled form more resembles the figures which L i n dn e r ') gives of his Sarcina
maxima, found, as he expresses it, in »Buttersauremaischen«, hence, in wort wherein
a spontaneous butyric fermentation. I am not, however, convinced that both these
forms do really belong to two different species of sarcine, as it is well known that
in this genus of microbes great morphological differences may occur in the same
spaties.

The gas is a mixture of about 75% carbonic acid and 25% hydrogen; methan is
not present. Besides, a moderate quantity of acid is formed, which for example, in a
nutriënt liquid with an acidity of 6 cc. per 100, may mount to 12 cc, a percentage
only found back in the technical lactic fermentations. Furthermore a peculiar odor
originates, reminding of the ordinary lactic-acid fermentation, by Lactobacillus. If,
as is probable, this acid will prove to consist entirely, or for the greater portion,
of lactic acid, the fermentation sarcine may be considered as the most differentiated
lactic-acid ferment hitherto known.

When using a sufficiënt quantity of soil for the infection, that is a relatively
great number of sarcines, which thereby, in the given circumstances, may compete
with advantage with, and conquer all other microbes, the experiment described suc-
ceeds within very wide Hmits. Thus the sarcine fermentation may in this case be
obtained as well in an open flask as in a closed bottle, whence it follows that the
sarcine can suffer a moderate quantity of oxygen; and it will appear below, that a
slight quantity is even wanted under all circumstances. Notwithstanding this, the
name of obligative anaerobic remains applicable as the cultivation at full atmospheric
pressure is impossible. The acid may further be varied between 3 and 11 cc. normal
phosphoric acid per 100 cc. The phosphoric acid may be replaced by lactic and even
by hydrochloric acid, if the acidity of the latter is not taken higher than 6 to 7 cc.
per 100 cc, but not by nitric acid.

Instead of glucose cane sugar may be used, but with milk sugar and mannite the
experiment does not succeed. As source of nitrogen only peptone can be used, such
as found in malt-wort or bouillon: simpler nitrogen sources, like asparagin, ureum,
ammonia and saltpeter, are unfït for the nitrogen nutrition of the sarcine. The limits
of the temperature are wide and may vary between 28° C. and 41" C.

Although the experiment may thus be modified in many respects, the first des-
cribed arrangement is recommendable, as it is best adapted to the optimum of the dif-
ferent conditions of life of the organism.

A property peculiarly important for this research is the readiness with which
the function of fermenting, that is the power of evolving gas, gets lost under the in-
fluence of a secretion product, probably the acid, and through which all transports
with old material become perfectly useless. Hence it is necessary to transport cul-
tures still in fermentation to insure the success of further experiments.

That some aeration enhances the life-functions of this obligative anaerobic and
that access of a little air is even necessary in the long run, is evident from the fact
that the most vigorous fermentation are obtained in a closed bottle, with the deposit
got in an open flask, whereas renewing of the nutriënt liquid formed above the de-

') Mikroskopische Betriebscontrolle in den Garungsgewerben, 3e Aufl. p. 432, 1901.

28o

posit in a closed bottle will after few repetitions give rise to diminuatiun t)r cessa-
tion of the fermentation.

For the continuation of the culture by inoculating sliglit quant ities of mater lal
of a rough fermentation into the same nutriënt liquid, two precautions should l)e
taken. First, the inoculation should be done into the medium, freed from air by boi-
ling, the bottle being entirely filled with the hot liquid, so that on cooling no air can
dissolve. Second, an acidity of less than 7 proves not sufficiënt, hence this should be
8 or 10 cc, as otherwise the lactic acid ferments might prevail and supplant the
sarcine.

From the necessity of expelling the air we see that the fermentation sarcine
undoubtedly belongs to the ordinary anaerobics, which, considering the success of the
rough accumulation experiment witli aeration, might perhaps not have been expec-
led; but the fact holds good in the same way for the butyric acid ferment, generally
accepted as an obligative anaerobic, so that, also with respect to the fermentation
sarcine, there should be spoken of »microaerophily«. Further examination shows
that in deep test-tubes with maltwort-agar, very easily pure cultures may be obtained,
whereby the sarcine is recognisable by the obvious size the remarkably rapid deve-
lopment of its colonies. On the other hand, on maltwort, or broth-bouillon-glucose-
agar-plates with or without acid at 37" C, with access of air, no growth at all of the
sarcine takes place, as might be expected. Of course the packages can also be seen
on the plates without growing and be removed in a pure condition. When we make
use of little acid for the rough accumulation, colonies of lactic acid ferments, belon-
ging to the physiological genus Lactobacilliis, will develop on the plates at the air,
which can grow as well with as without air, but whose other life conditions corres-
pond to those of the sarcine. In this case the experiment shows at the same time
that everywhere in garden soil real lactic acid ferments are present, whereof the
proof had not been given until now.

When using much acid, for example 10 cc. or more normal acid per 100 cc. of
culture fiuid, through which the vital functions of the sarcine, such as rapidity of
growth and the faculty of assimilating oxygen, are lessened, certain alcohol fer-
ments, proper to garden soil, come to development, but they can, together with some
of the other impurifications of the rough accumulations, as moulds, Mucor and
Oidium, be checked and expelled by exclusion of air, hence, by culture in closed bott-
les. To this end however, it is necessary to render the conditions for the sarcine as
f avorable as possible and not allow a temperature below 37" C.

The staying out of the butyric acid fermentation (caused by Graniilohacter sac-
charobutyricuni), which so readily originates with exclusion of air in glucose-bouil-
lon and maltwort, is due to the acidity of about 8 cc. or more, whereby this fermen-
tation becomes impossible.

Although it is evident from the foregoing, that the growth of the sarcine is
less inhibited by the acid than that of the lactobacilli and of the butyric ferment, it
may still be easily proved that already 7 cc. acid per 100 cc, are less f avorable than
3 or 5 cc, also for the development of the sarcine itself, so that the higher amount
of acid in the accumulation only serves to render competition with the said ferments
possible. Tf by timely transports into maltwort with more than 8 cc. phosphoric acid,
or by separation in solids, real pure cultures are at disposal, the further transfers.

28l

with entire omission of the acid, show that then also vigorous growth and fermen-
tation may occur. We thus see how wide the limits are of the life conditions of the
sarcine, as soon as competition with all other microbes is quite out of question.

The discovery of this certainly unexpected fermentation has sprung from the
working out of the general question which organisms of the soil can develop in a
sugar-containing culture fluid in presence of an acid and with imperfect aeration. At
temperatures of about 30° C. and lower, alcoholferments. Mucor racemosus and
Oidium prove to be the strongest, but then already a few sarcines are observed. At
about 40" C. most alcoholferments of garden soil, besides Mucor and Oidium can no
more compete with the sarcine and the lacto bacilli, which then become predominant.
This being fixed the last steps which led to the culture of the fermentation sarcine
alone, were the recognition of the obligative anaerobiosis, and of the superiority of
the resistence of the sarcine with respect to anorganic acids compared with that of
Lactobacillus and the butyric ferments.

Above, already, I pointed to the perfect correspondence of the small-celled form
of the fermentation sarcine to the description which S u r i n g a r gives of the
stomacal sarcine, and I suppose that in the cases of non-cultivable Sarcina
ventriculi, of which, for instance, de Bary speaks^), there should really be thought
of the fermentation sarcine. This view is supported by different observations in the
c>lder literature, cited by S u r i n g a r. But still more convincing is my accumulation
experiment, which proves that the conditions for the existence of this sarcine are
just of a nature to render its life in the stomach possible.

It will be easy to obtain certainty thereabout by a repetition of this experiment,
not with garden soil for infection material, but by using the stomacal contents of such
a case of stomacal sarcine. The »not cultivability« of de B a r y may mean the same
as anaerobiosis, for it is well known how difficult it is, even at the present time, to
cultivate anaerobics if the particulars of their life conditions are not exactly known.

For the rest I do not doubt of the precision of Falkenhei m's ^) and M i -
g u 1 a's •*) observations, who have seen aerobic colonies of micrococci originate from
stomacal sarcine. It is true that I for my part have not succeeded in confirming this
observation with regard to the fermentation sarcine, but for other species of Sarcina
I have, with certainty, stated the transition into micrococci, and with various anae-
robics, although not belonging to the genus Sarcina, I have seen now and then co-
lonies originate of facultative anaerobics, which in all other respects, corresponded
to the obligative anaerobics used for the cultures. Therefore this modification also
seems possible for some individuals of the fermentation sarcine. Accumulation er
transfer experiments with stomacal contents will however only then give positive
results, if these are used when still in fermentation; with long kept material nothing
can be expected.

Already the older observers*) as Schlossberger (1847), Simon (1849)
and Cramer (1858) have tried, although in vain, by a kind of accumulation ex-

') Vorlesungen über Bacteriën, ie Aufl. pg. 96, 1887.

*) Archiv f. experiment. Pathologie und Pharmacologic. Bd. 10, pg. 339, 1885.

') System der Bacteriën. Bd. 2, pg. 259, 1900.

*) Cited from Suringar (!. c).

282

periments, to cultivate the stomacal sarcine, wherefore they prepared, as nutriënt
liquid, artificial gastric juice with difïerent additions. Remarkable, and illustrating
the biological views of those days, is the fact, that for the infection they did not use
the stomacal contents themselves, but beer yeast, supposing, that the sarcine might
originate from the yeast cells, which somewhat resemble it, and are always found in
the stomach together with the sarcine itself.

On Lactic acid fermentation in milk.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. X, 1907, p. 17 — 34. — Verscheen onder den titel »Over melkzuurgisting in
melk« in Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XV,
1907, blz. 883 — 901; en onder den titel «Fermentation lactique dans Ie lait« in Archives
Néerlandaises des Sciences Exactes et Naturelles, Haarlem, Série II, Tomé XIII, 1908,

P. 356—378.

In milk left to itself, which in consequence of spontaneous infection, contains the
more generally distributed germs with certain regularity some special floras are
observed, whose composition is chiefly controlled by two factors: temperature and
oxygen pressure. If the latter is very slight, that is, if the microbes of the milk are
reduced to more or less anaërobic conditions, the floras become simple of composition
and produce certain fermentations. The three principal of these are the Aërobacter-,
the Butyric acid- and the Lactic acid fermentations, of which the two first are al-
ways characterised by the evolution of hydrogen and carbonic acid, whilst in the
lactic acid fermentations, which may occur under different forms, beside the lactic
acid, no gas at all, or carbonic acid only is formed. Sometimes this fermentation is ac-
companied by a vigorous slime formation, which slime consists of the swollen cell
walls of the inferred lactic acid ferments.

For domestic purposes the lactic acid fermentation should be considered as use-
ful; both the others as noxious.

The fermentation experiment the dairy industry applies to judge of the purity
of milk has for its object to lietermine the commonness or the rarity of the germs of
Aërobacter and of the butyric acid ferment. To this end a high standing glass is
filled with milk, placed in a water bath of 40" C. and it is observed whether any fer-
mentation gas is evolved, and if so, after how much time. In good milk this produc-
tion of gas does not occur because then the lactic acid ferments develop so quickly
that the other microbes are expelled. Artificially the Aërobacter fermentation is
easily obtained by infecting non-acidifïed milk with faeces, soil or canal water and
cultivating at about 37" to 40° C. After 6 to 12 hours production of gas is observed
originating from Aërobacter coli or more rarely from A. aërogenes. The nature of
the thereby obtained varieties changes with the temperature.

At temperatures beneath 40° the Aërobacter fermentation, after lasting some
hours, is replaced by a butyric acid fermentation which again, after some time is
succeeded by a lactic acid fermentation. Externally the Aërobacter and the butyric
acid fermentations cannot be distinguished, but this can be done easily with the mi-
croscope.

284

If 3 to 5% chalk is added to a culture in a stoppered bottle at 35" to 40" C, the
butyric acid fermentation can go on longer, and by early transplanting, likewise in
milk with chalk and with exclusion of air, check the development of lactic acid fer-
ments, without, however, quite dispeiling them.

' Microscopically the butyric acid fermentation may be recognised by the long,
thin, at neutral reaction highly motile rods, sometimes mixed with elongated or
more rounded clostridia, colouring blue by iodium, all belonging to the species
Graimlobacter saccharobtityriciim.

To accumulate from such a crude butyric acid fermentation in milk the lactic
acid ferments, which hardly ever lack there, it will suffice to transplant some drops
into milk without chalk, and, if necessary, to repeat this after the butyric acid
fermentation, which always sets in at first, is finished. Whether this be done in
open or closed bottles or tubes, at 37" to 40** C, lactic acid rods of the genus
Lactohadllus will be seen to appear, which by repeated transplantations completely
dispel the butyric acid ferments.

If in these experiments instead of using fresh, unheated infection material,
the soil, water, or faeces are previously heated to 80*^ or 95° C, by which only
spore-forming microbes can develop in the milk, the fermentations of Aérobacter
and the lactid acid ferments do not arise, their germs producing no spores, but
a butyric acid fermentation is obtained, from which the aerobic spore-formers
may be dispelled by repeated transplantation at exclusion of air.

I. Properties of the active lactic acid ferjiients.

As many bacteria of the most different groups can produce lactic acid it
seems not superfluous to indicate what are the characteristics of the lactic acid
ferments proper.

The active forms of dairy industries, yeast manufactories, distilleries, tanneries,
and breweries, although joined by transitions, may be practically classified into
the physiological genera Lactococciis , Lactobacillus and Lactosarcina, of which the
two first only occur in the dairy products^).

They are always immotile, no-spore forming bacteria, which bear drying
very well and which, by heating to 65° or 75" C, in which they just remain alive,
while these temperatures are deadly ao most other non sporeproducers, may be
separated from these (»lacticisation«). They require for nitrogenfood peptones,
such as are found in milk, malt extract, or other juices of plant- or animal
origin, and for carbon food certain sugars, which may differ for different species.
They do not peptonise proteids and, thus, do not liquefy gelatine; the secreted
lactic acid can dissolve a certain quantity of caseine, but chemically this sub-
stance remains unchanged. These circumstances regulate their distribution in

*) In the chief floras of milk- and dairy products occur, to my knowledge, no
species of Lactosarcina. When Emmerling asserts to have found a yellow 5arcma
in Armenian mazun (Centralbl. f. Bacteriologie, 2te Abt. Bd. 4, p. 418, 1898), this can
only have been a common infection from without. Also in butter sarcine species may
accidentally occur but they do not belong to the chief flora, which consists of lactic
acid ferments and lipophili.

285

nature, where they are by no means general, but may rapidly, multiply, especi-
ally under the influence of man. They are, however, found in the soil and can,
by methods mentioned below, be accumulated and cultivated in a condition of
pureness.

They are always more or less distinctly microaürophilous, some species or
varieties can, however, grow very well at the air; other forms cannot and be-
have as real anaërobics. Access or absence of air is commonly of no consequence
to the acid formation, but in the yeast industry a species is used, which at full
atmospheric pressure produces no acid, and in the dairy industry are also forms
which display the same property.

Always, even on good nutriënt media, to which belong in particular malt-
extract agar, and milk- or whey-agar, the growth of the colonies remains li-
mited, especially if the air and the produced acid can act simultaneously. If the
acid is neutralised by chalk the growth of the colonies at the air may also be-
come important. Yet, in most cases, the recognition of these ferments may repose
on the smallness of their colonies compared with those of other bacteria.

Catalase is constantly absent, and hereupon an excellent diagnosis can be
based, for which it is only necessary that a culture plate, on wich all kinds of
bacteria may occur, be flowed with strongly diluted hydrogensuperoxyd which
is by all microbic species, except the lactic acid ferments, indififerently whether
they belong to Lactococci/s, Lactobacillus or Laciosardna, changed into a scum of
little oxygen bubbles.

Even the lately described ^) large celled Sarciiia, which in consequence of
continued research I now consider as identic with the stomach sarcine (Sarciiia
ventricuU), and whose acid producing power is very slight, - i. e. 3c.c. of normal
acid per loo cc. of maltextract or glucose broth, — does not at all decompose
hydrogen superoxyd.

If we consider how generally catalase is met with in the animal and ve-
getable kingdom, as also in the microbes, its very absence in the lactic ferments
appears in a peculiar light.

All active lactic acid ferments from milk invert sugar (invertase reaction)
and can more or less easily decompose esculine and indican (emulsine reaction).
The reaction on esculine is demonstrated by introducing, for example, o,i"/o of
this substance and a fews drops of ferricitrate solution into whey agar or whey
gelatin. Streaks drawn on it of species which decompose esculine produce inten-
sely brown or black diffusion fïelds of esculetiniron, brown at more alcaline, black
at more acid reaction, so that the lactic acid ferments become recognisable by
the black fields in the midst of which their colonies are placed ^). So long as
esculine is present it is recognised by the magnificent blue fluorescence of the
whole plate at feeble alcaline reaction. Indican may be used in a corresponding
way but then no iron salt is wanted as the indoxyl produced from the glucosid
oxidises of itself at the air to indigo blue. The lactic acid ferments decompose

*) These Proceedings 25 February 1905. Archives Ncerlandaises T. i and 2. T. 11,
p. 200, 1906.

2) The knowledge of this extremely sensitive reaction, which has been applied for
years in my laboratory, I owe to my colleague Mr. H. Ter Meulen.

286

these two glucosides, slowly indeed, yet these reactions are very characteristic
and useful. Amygdaline is not decomposed by the lactic acid ferments^).

To the most remarkable properties of the lactic acid ferments belongs their
power of reducing levulose to mannite^), which latter substance may even in
concentrated nutriënt solutions be recognised by its ready cristallisation at
evaporation. A single drop dried on the object glass, commonly gives at micro-
scopical investigation full certainty as to the existence of this reaction.

The lactic acid ferments thereby strongly contrast with the so nearly allied
vinegar bacteria, in as much as the latter do just the reverse, i. e. they change
by oxidation mannite into levulose.

Like so many other bacteria the lactic acid ferments possess, also with
regard to various pigments, a strongly reducing power, as is easily shown by
inoculation into deep test-tubes of boiled milk coloured with litmus. The red
litmus is first in the depth. later till near the surface quite discoloured, to turn
red again by shaking with air. The thickness of the red layer in the curdled
milk admits an accurate measure of the intensity of the growth and of the
reduction process. The thinner the red layer the more intensive both functions
must be.

2. Factors of variability.

Many, perhaps all lactic acid ferments display a high degree of variability
as well in physiological as in morphological properties. Nevertheless this varia-
bility in different stocks, coming from different isolations of the same species, is
not always equal by far, which may give rise to trouble in the study of the
specific properties. The circumstances causing the variability are but partly known;
decidedly belongs to them an oxygen pressure, too far above or too far beneath
the optimum for the vital functions, which may, especially for the bacterium of
the long whey {Ladococcus hollandiae), be demonstrated with exceeding clearness.

This remarkable species is characterised by a vigorous slime formation when
cultivated in milk or whey, but loses this power at temperatures above 20" C,
as well at the ordinary pressure of the atmospheric oxygen, as at complete ex-
clusion of it, if the changed influence is allowed to act during some time on
the growing microbes. This is shown by cultivating the whey in a closed bottle;
the upper layer, just beneath the stopper, where a little air can find access, be-
comes quite liquid and contains a hereditarily constant, common Lactococcus, for-
ming little acid and no slime. Also by cultivating the long whey microbe in
tubes of boiled milk with access of air, after one or two re-inoculations, a Lacto-

') Amygdalin is decomposed with much more difficulty by the action of microbes
in general than the other glucosides named in the text. Moulds mostly decompose it
into amygdalinate of ammonium; beer yeast into amygdalonitril glucosid and glucose.
Splitting under production of bitter almond oil, hydrocyanic acid and glucose I detected
hitherto only with Saccharomyces apiculatus and with the anaërobic ferment of butyric
acid fermentation, Granulobacter saccharobutyricuDi.

^) Ferments lactiques de l'industrie. Archives Néerlandaises 1901. Kayser, Fer-
mentation lactique. Annales de l'Institut agronomique 1904.

287

coccus is produced, which forms no slime at all. I the material for the re-ino-
culation is secured from the depth of the cultures grown in closed flasks, at
places where the access of air is impossible, and the inoculation is repeated once
or more in the same way, a Lactococcus is likewise obtained which displays no
tracé of slime production.

At some depht beneath the surface, however, is a zone in which unchanged,
slime forming, hereditarily constant material is found.

What in this case can be very easily ascertained, proves, at accurate investig-
ation, also to be true for the other species of lactic acid ferments, namely, that
they only then continue to display constant specific characters, when they are
continuously cultivated at a certain pressure of the oxygen, else, these characters
are seen to disappear, whilst in fact, or apparently, news ones originate. Hence,
in some cases it may be proved, in others the probability is shown, that each
species must occur in three varieties, joined by intermediate forms, i.e. the normal
form, a »high pressure variant«, and a »low pressure variant«.

As in wholly different groups of bacteria corresponding facts may be ob-
served, there is cause to assign a fundamental signification to them.

A decisive factor which may cause the production of variants is furthermore
the temperature, fox experience proves that a prolonged cultivation above the
optimum temperature of growth, gives rise to the appearance of forms distinctly
different from the original stock.

In other cases the cause of the variability is unknown ; not seldom for
example, we find at the very first culture of a species taken from nature, strongly
varying colonies, which prove to belong to the same species only because many
colonies by sector-variation display the genetic alliance ot the variants to the
wild stock.

But then, too, there is reason to admit that the new vital conditions, to
which the microbes are subjected just by the change of oxygen pressure and
temperature, are the chief factors of the variation process which is, as it were,
seen in action. This observation is of so general a nature and is so closely related
to the essence of life, that it must be considered as probable, that also in higher
plants and animals, local changes in the access or exclusion of oxygen, in con-
nexion with temperature, play an important part in the morphogenesis.

As the examination of other species of microbes shows that the absence of
certain nutriënt substances in the culture medium, at free aëration and during
growth, may cause hereditary variation, for example in Schizosaccharoinyces octo-
sporus, which in old cultures changes into the spore-free variant^ totally differing
from the chief form, there is reason also to believe, that also the said factor
must be considered to explain the great variability of the lactic acid ferments;
but the observations there about are not vet fit for definite conclusions.

3. Elective culture of the microbes of the slit/ix lactic acid fer/itentatioii.

There is reason to assume that the slime producing lactic acid ferments are
the normal forms and the non-slime formers, species or variants derived from
them. Hence, the former deserve to be considered in the first place.

288

To the typical slime producing species belongs the microbe of the long whey
(Lactococcus ]iollandiaej,, which particularly before the introduction of pure cultures
in the dairy industries, played an important part in the fight against cheese de-
fects in North-Holland, and is still here and there practically used to that end.

Further I have found that the popular food known in Norway as »tjaette
molken«, a sample of which I owe to the kindness of Mr. Pennink of Rotter-
dam, consists of milk. in which the long whey microbe, or at least a nearly
allied form, secretes acid and slime.

Other materials in which these and allied microbes occur, were till now
unknown, evidently because of the uncertainty about culture conditions and the
lack of a good accumulation method. Taking the idea »species« in the broad
sense, I think there is no objection as to bringing the group of forms, found
in the manner described below, to the species just mentioned.

Starting from the following properties, the most characteristic for the mi-
crobes of the slimy lactic acid fermentation :

i^*. The optimum temperature for their growth is at 20*^ or lower,

2"*^. they can only compete in anaërobic cultures with the other microbes, and

3'"'^. the medium must consist of substances containing peptones as nitrogen
and carbonhydrates as carbon source, I succeeded in finding a method giving
rise to their accumulation.

It is true that I only examined a single material in this way, the common
baker's yeast, but the investigation of the soil of fermenting or fermented sub-
stances, in short of materials of most varying description may be done in a
corresponding way.

The experiment is arranged as follows.

Into a 30 cc. closed bottle, filled with maltextract, to which is added ''2%
of peptone siccum and which contains ca. 10% extract, a little pressed yeast
is introduced, for instance '/ü gram. Placed at a temperature of 18" to 20^ C. a
quiet fermentation sets in, which is allowed to continue 24 to 72 hours, whereby,
because of the absence of air the yeast hardly grows, but the various lactic acid
ferments reproduce quickly. Other microbes do not develop. Not seldom in this
first culture have the contents of the flask already become somewhat slimy.

Whether this be the case or not, a not too small quantity from it is trans-
planted into a bottle quite filled with boiled, air-free milk, for instance 1/2 cc
into 30 cc of milk. At the same low or a somewhat higher temperature only
a flora of lactic acid ferments can develop, and if the slime-forming species is
present, it is the most vigorous. We then see that after 2 or 3 days the milk
become slimy and by inoculation into milk whey, a culture will start which
sometimes dififers so little from the ordinary long whey, that we may conclude
to an identity of species.

Of course, I cannot foretell that such microbes occur in any yeast sample
taken at random, hence I must add that for my experiments I used pressed
yeast from the Yeast and Alcohol manufactory at Delft.

Such a culture in milk differs it is true in some respects from what is
obtained by growing long whey from North Holland in milk, as in the former

289

case short rods or oblong cocci are observed, and in the latter, shorter ferms
more reminding of the common micrococci.

I expect that by repeating this experiment various deviating varieties will
be found, and by application of the method to other infection material perhaps
new species of slime lactic acid ferments may be discovered.

4. Elective culture of the lactococci of creain souring.

As the lactococci and lactobacilli, which both occur in spontaneously or
otherwise soured milk, in cheese, and various other dairy products, seem to grow
nowhere better than in milk/) the culture experiments here considered, should
be taken with milk.

In order out of the innumerable microbes of the crude milk practically to
come to a pure culture of Lactococcus, the management is as follows.

The optimum of growth is at 30" C. or lower, and as all species of Lacto-
coccus (like those of Lactobacillus) are strongly microaërophilous, sometimes even
anaërobic (i, e. cannot grow at all at fuU atmospheric pressure on plates), it is
best to cultivate in absence of air.

A stoppered bottle is quite filled with commercial milk and placed at 30 C.
After 24 hours or somewhat later a Zactococcus-üova. begins to replace the other
microbes, while not seldom a feeble fermentation of B. co/i or B. acrogenes has
preceded.

After one or two re-inoculations under the same conditions, but into well
boiled milk, which is done by transferring a tracé of the fïrst culture to the
second bottle, quite filled with boiled, air-free milk, and so on, the lactococci
free themselves completely from all foreign microbes and a material is obtained,
which displays a high degree of purity and of practical usefulness. If the acidi-
fying power of the microbes obtained by the experiment is lower than wished
for, for example 5, whilst 8 to 10 cc. of normal acid on 100 cc. milk is desired,
this must be attributed to the accidentally present stock. It is necessary then
to begin a new experiment, following the same way as described, or it can be
advisable to perform the first inoculation with some good butter-milk.

As buttermilk, however, very often contains lactose yeast, in the latter case
a vigorous alcohol fermentation may at first be expected in the bottles. But it
soon disappears by inoculation into milk rendered free from oxygen by boiling.

If in this way, thus in absence of air, the culture has been prolonged, a
fairly constant acid amount is obtained at each renewed inoculation, which does

*) It is not impossibie that there are »peptones« which, together with glucose or
lactose, are still better food for the lactic acid ferments than milk itself. How very
differently peptones of dissimilar origin act on microbes is easily observed in yeast
species which in general grow better on »plant peptones« than on »animal peptones*.
The introduction of the word »bios« to denote those nitrogen compounds which are
best fit as yeast food, is an attempt to circumscribe the peptoneproblem has been
given. The relation between »peptones« and the lactic acid ferments is still closer than
between these substances and the different yeasts; but it is here not the place to in-
sist on this point.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 19

2go

not, however, rise above lo — 12 cc. normal in 100 cc. of milk. On whey agar
or whey gelatin plates the growth at the air of the thus obtained lactococci is
different, as sometimes a great many aerobic colonies arise, which cause the same
acidification as the cultures in the bottles, while in other cases nothing is seen
to grow.

The first group corresponds with the usual commercial forms destined for
the souring of cream, which commonly consist of cifltures of the microbes dried
on milk sugar or starch; moreover there are commercial aerobic pure cultures
in milk or whey, which are sold in bottles.

The second group, that is the cultures non-growing at the air, may still
better be used for the cream souring than the aerobic stocks, as the anaërobic
forms of Lactococciis show more aptness to secrete the flavour desired in butter,
than the more aërophilous bacteria^).

As well for this reason as for the great purity of the cultures made after
this »bottle method«, there is reason to prefer them in dairy work to the com-
mercial so-called pure cultures, which for the greater part are by no means pure,
but mostly contain, besides lactococci, numerous contamination germs of the
milk. In consequence of frequent investigations I can therefore advise insterested
persons to use the here described method. Best would be if these cultures were
prepared in the creameries themselves, but also the sellers of pure cultures, by
following the above prescriptions, will obtain a better product than by the more
usual way of selection of aerobic colonies. Besides, the management is simpler
and more scientific.

To my opinion there is no satisfying ground to class the aerobic and an-
aërobic forms of Lactococcus, which can be produced after the said method, in
separate species. They are but variants of one and the same species, whose
oxygen requirements are different, which also appears from the fact that in the
course of time one and the same stock shows considerable differences with re-
gard to the said relation. Moreover, by several isolations all transitions between
the more or less aerobic stocks may be obtained.

Finally it should be borne in mind, that by applying the »bottle method«
at low temperature, in rare cases instead of a culture of real Lactococcus a Lacto-
bacillus is obtained, which may likewise be had by colony selection from cheese.
Using this Lactobadllus I did not observe at all the pleasant flavour of the an-
aërobic lactococci, so that I do not recommend these bacilli for cream souring.

5. Elective culture of tlie lactic acid bacilli.

If milk, soured spontaneously by Lactococcus lactis, or still better, buttermilk,
is placed at exclusion of air in a thermostat of ca. 40" C, the original acid
amount of 8 to 12 cc will in most cases rise after some days to about 18 or
20 cc per 100 cc of milk. For this experiment it is best to use a stoppered
bottle of 250 to 300 cc. capacity quite filled with milk. If for the first experiment

') Of late I have also met with such like anaërobic lactic acid bacteria in com-
mercial preparations.

291

a smaller quantity is used the result becomes uncertain, either by the disturbing
influence of the air, or by the scarcity of the inferred bacteria.

The first change commonly observed in the sour milk is a moderately vigo-
rous alcoholic fermentation, caused by the hardly ever lacking lactose yeast, and
at the same time a complete separation of the caseine, which is driven to the
surface of the liquid by the carbonic acid.

Microscopically we find that the lactococci present at first, are succeeded by
more lengthened forms, truncated at the ends and united in chains, whereby
the acid titer may considerably diminish, for instance in 12 hours from 8 cc. to
6 cc, which should be ascribed to the lactose yeast, for which the free lactic
acid can serve as carbon food. By transference, at exclusion of air, the lactose
yeast, as in the elective culture of lactococci, is rapidly dispelled by the then
stronger lactic acid ferments.

Real lactobacilli mostly appear after 2 or 3 days and then the acid rises rapidly
parallel to their multiplication to 20, even to 25 cc. normal per 100 cc of milk.
When this degree of souring is reached, there is usually no further increase ob-
served, not even after several days, and whenever this does take place, there should
be thought of aëration, by which the growth of vinegar bacteria and acetic acid
formation from alcohol, have become possible.

The pure culture of lactobacilli is sometimes easy, in other cases, with more
anaërobic stocks, it is more difficult. Always, however, it is troublesome with
these pure cultures to obtain a considerable souring in milk and there is most
chance of success (but even then the succes is not quite certain) by souring
lactobacilli together with Lactococcus which serves for the first souring to 8 cc
If this amount of acid is reached, and the pressure of the oxygen sufficiently
diminished, which in a stoppered bottle is likewise brought about by the presence
of the lactococci, the lactobacilli can develop and cause further souring.

From the observation that by the described experiment more or less perfectly
anaërobic lactobacilli are obtained, follows that here as in the case of Lactococcus
different varieties may be expected. At a continued research the differences prove
to extend over other characteristics also and may become so great, as well from
a morphologic as from a physiologic point of view, that it seems necessary to
create new species.

Especially the dimensions of the rods, the more or less branched state of
the colonies on agar plates, the slime formation, the either or not originating of
carbonic acid as fermentation gas beside the lactic acid, and the action or non
action on different sugars give rise to this consideration. The deeper however
we enter into these distinctions, the more troublesome it becomes to devise such
descriptions as are wanted to present to other investigators an image of the re-
sults of our own researches; so numerous become the forms which nature, or
better perhaps, which culture produces, and so slight are the differences by which
these forms are distinguished, if we do not confine ourselves to the extremes of
the groups*).

*) For further information sec W. Henneberg, Zur Kenntnis der Miichsaure-
bakterien. Sonderabdruck aus Zeitschrift für Spiritusindustrie. No. 22—31, 1903. Pa-
rey, Berlin.

19*

292

If the latter is done, two distinct forms call attention, which on a former
occasion I named^) Lactobacillus caucasicus and L. longus. Without attributing a
special value to this classification I yet wish to keep to it as I think that the
facts to be mentioned are fairly well comprised thereby.

The longusgroup is characterised by its not acting on maltose, so that in
maltextract no, or very little acid it formed, but it does decompose milksugar.
In milk the forms of this goup, if grown after a previous culture of Ladococcus
which has produced 5 to 8 cc. of lactic acid per loo cc, of milk, will once more
produce a certain, even a like quantity of acid so that ca. i6 cc may be titrated,
the latter amount being however an exception. Generally no evolution of car-
bonic acid is observed but sometimes it is, and then so much gas can arise that
a milk beverage is acquired foaming like champagne.

By a series of transitions, the longus forms obtained at 40^^ C, are joined
with lactobacilli which at a lower temperature find their optimal vital conditions,
but which are rarer in milk.

The caucasicus group comprises those lactobacilli, which are able, indepen-
dently of lactococci to produce in milk a very high acid formation. At 37 to
40*' C. it is possible after three days of their action to titrate 20 to 25 cc. of
normal acid per 100 cc of milk. When that amount is reached further acid
formation stops. In this case, too, there is a parallel form which, beside much
lactic acid, also evolves carbonic acid. What by-product is then formed from the
lactose molecule beside the carbonic acid is not yet clear; probably it is aethyl-
alkohol. G. Bertrand has proved that these ferments can produce succinic acid.
They greatly owe their notoriety to their presence in kephir, which subject I
have touched before^). Later however I have come to the conclusion ^) that
their distribution is by no means restricted to kephir only, but that they also
occur in our climate, sometimes in buttermilk, in cheese and even in common
baker's yeast.

6. Yoghurt and maya.

The use of soured milk as drink and food is so familiar to many Eastern
countries, and dates from so remote an antiquity that there can be no doubt as
to its favourable effect on health, and the establishment of various societies which
try to popularise new preparations of that nature, seems to prove that te atten-
tion of the Western nations begins to be drawn towards it.

Both in the preparations of the Eastern nations and in those of industry
are always found lactic acid ferments of the genus Lactobacillus, mostly of Lacto-
coccus too. These lactic acid ferments alone determine the character of the »leben
raïb« of Egypt*), of the »yoghurt« of Bulgary''), and probably also that of the

*) Sur les ferments lactiques de l'industrie. Archives Néerlandaises. Sér. 2, T. 6,
p. 212, 1901.

*) Sur Ie Kefyr. Archives Néerlandaises, I. 23, p. 428, 1891.

') Ferments lactiques de l'industrie 1. c.

*) Annales de l'Institut Pasteur. T. 16. p. 65, 1902.

") Massol et Grigoroff, Revue médicale de la Suisse romande 1905, p. 716.
Bertrand cl Weisweiller, Action du ferment Bulgare sur Ie lalt. Ann. de l'Institut
Pasteur, T. 20, p. 977, 1906.

293

»prostokwacha« and the »véranetz« of Russia, which Metchnikoff mentions.
In the »kephir« of the Caucasus, the »koumys« of Central Asia, ') and the »mazun«
of Armenia ") occurs moreover, lactose yeast, which may, however, under certain
circumstances be wanting, without the character of these beverages being lost.
All other microbes, which are mentioned in literature as occurring in the said
beverages or their ferments, such as Oidiiwi, Mucor, other moulds, tbrula, red
yeast, vinegar bacteria, butyric acid ferment, proteolytic bacteria, are only present
by deficiënt preparation, so that it may be said that in all examined cases a
pure lactic acid fermentation proves to be the wanted process, whilst eventually
also an alcoholic fermentation is whised for or suffered^).

Hence, in the commercial preparations which start from yoghurt, only lactic
acid ferments are cultivated. I have in particular investigated the products of
»Le ferment«, mentioned beneath, as also a substance, sold as »maya« or Bul-
garian ferment,'^) to which my attention was drawn by Dr. De Lint at Sche-
veningen. Here I will shortly describe the latter preparation.

It consists in a yellowish strongly acid reacting powder, composed, after
chemical, microscopical and bacteriological examination, of caseine lactic acid,
lactose, fat and lactic acid bacteria; it is evidently nothing else but yoghurt
evaporated at low temperature, perhaps in the vacuüm. As to the preparation
of the »yoghurt« itself by means of this ferment, it is done as follows and gives
good results.

Milk is evaporated to half its volume, cooled to a (not nearer indicated)
temperature, for which I took 40*^, as 45'^ proved too high and 2^']'^ too low, and
on a quantity of 250 cc, so much ferment is strewn as can be put in a little
spoon distributed with the flacon containing the maya. After 6 hours already
the curdling of the milk becomes perceptible, after 24 hours I titraded 12 cc
and after 3X^4 hours 20 to 2^ cc of normal lactic acid per 100 cc of the
evaporated milk, which by that time is changed into yoghurt.

As a titer of 10 cc corresponds to o.q'^/o of lactic acid, the titer 20 corre-
sponds to somewhat less than 2^/0 of the vanished milk sugar. Supposing that
the evaporated milk contains about 9.6^/0 of milksugar it follows that 7% of
milksugar has remained undecomposed. The caseine is of course curdled and the
whole has changed into a solid but soft, sweet tasting mass.

') For Kephir and Koumys see Weigmann in Lafar Technische Mykologie. Bd. 2.
p. 128. 1905.

-) Centralblatt für Bacteriologie, 2te Abt., Bd. 15, p, 577, 1906.

') The study of literature leads at first view to a quite other result, as many
microbiological descriptions are made by beginners, not sufficiently acquainted with
the properties of lactic acid ferments, and who have attributed an exaggerated weight
to the different kinds of infections named above.

*) On the bottle stands: Maya bulgare. Société de la maya bulgare, Garnier&Co.,
Paris, 16 Rue Popincourt. The Société de Pury, Montreux, brings into commerce a
ferment of the same nature under the name of »maya bacilline«, and theSociété Henne-
berg. Geneva, a liquid preparation as »lacticose«. Besides there are to be had in Paris
Lactobacilline de Metchnikoff in »Le Ferment«, Fournisseur de l'Assistance pu-
blique, "]"] Rue Denfert-Rochereau, who sells also, the »Biolactyle« of Fournier and
the »Baciline paralactique« of Ti s sier (the preparations of this firm make a very
good impression).

294

The evaporation of the milk is not necessary, hut when prepared from or-
dinary milk, the yoghurt remains more liquid, and as the acid formation is
equally strong as in evaporated material, there remains about 2.S°,o of the ori-
ginal 4.8°/o milksugar, so that in this case the taste is much less sweet.

If in the said way yoghurt has been prepared in the presence of air and
is re-inoculated into a new quantity of milk, then the result is yoghurt of the
same acidity as the fïrst time. But after 3 or 4 transferrings difficulties arise
and only with great quantities of infection material further souring can be ob-
tained. The experiment succeeded much better when the yoghurt was prepared
in a quite filled stoppered bottle; the transferring can then be longer continued,
but I do not know whether this will do in the long run. Evidently the difficulty
here, too, is the right choice of oxygen pressure, whereby the inferred lactic acid
bacteria preserve their properties unchanged; and this difificulty is stil! increased
by the presence of two different forms, with unequal optima as to temperature,
and probably as to oxygen pressure also.

One of these forms is again a Lactococcus, the other a Laciobacillus.

The former deviates somewhat from the common Lactococcus, in as much as it
is more extended, reminding of short rods, and furthermore by possessing a higher
optimum as to the temperature whereby the growth is quickest, which optimum
proves nearer to 37" than to 30" C. Hence, this forms is as it were a transition
to a Lactohacilliis. Isolation on milk agarplates was very easy, even at 30" C.

As to the second species, the Laciobacillus proper of yoghurt, it was trouble-
some to grow its colonies on milk agar plates, but on malt extract agar it was
more easily obtained. In literature it has been named Bacillus Massol hy Grigoroff,
but I think that name superfluous as the characters correspond fairly well with
those of the kephir bacilli which also occur in our country ; for instance, as
has been observed before, in yeast and buttermilk. Sown in slightly soured milk
this Laciobacillus can produce the strong acid mentioned above, without the help
of other bacteria. Evolution of carbonic acid does not take place and the product
has a very pure taste, although a beginning of fat cleavage seems inevitable at
such a high amount of acid.

Metchnikoff ascribes a very favourable influence to the use of yoghurt,
as it diminishes the phenomena of autointoxication starting from the intestinal
canal, and he explains this effect by accepting that the Laciobacillus, after passing
the stomach, continues active in the intestine, and checks^) the formation of the
obnoxious products which derive from other bacteria species. I do not doubt but
this may be brought about by the lactic acid, but I think it highly improbable
that the presence of the lactic acid bacteria from the yoghurt themselves should
be required in the intestine. I think this conclusion is necessary, first because,
without the use of yoghurt or other soured milk preparations, there occur in the
intestine lactic acid ferments of different species, and second, because the con-

') Quelques remarques sur Ie lait aigri. Rémy, Paris 1907. In this paper Metch-
nikoff gives many assertions but no decisive experiments. Besides, his bacteriological
elucidation, p. 26, is not clear. The elaborate and interesting work of Dr. A. Combe,
L'autointoxication intestinale, Paris 1907, is neither quite convincing from a micro-
biological point of view.

295

ditions for lactic acid formation by the active ferments are wanting or must at
least be very unfavourable there.

As to the first point I refer to the following experiments.

If sterile milk is infected with faeces of different origin (man, cattle) and
treated as described for the elective culture of Lac/ococcus, without access of air
and repeatedly re-inoculated at a temperature between 2$^ to 26° C, the said
genus of microbes is indeed obtained by which as good cream souring can be
obtained as with the pure cultures prepared in the before described way.

If sterile milk is infected in a corresponding way and exposed to the con-
ditions wanted for Lactobacillus, that is, if cultivated in absence of air at 40 to
45° C, a fermentation of coli will first arise and later or simultaneously a butyric
acid and no lactic acid fermentation, which latter would inevitably arise if the
lactic acid ferments were present in a rather considerable number. Only by repeated
transferences Lnctobacillu% is produced, which after some inoculations forms 10 to
13 c. c. of normal acid.

Hence, there is no doubt as to the presence of Lactobacillus and Lactococcus
in normal faeces. They are, however rare, and belong by no means to the intestinal
flora proper, like coli, but to the accidental flora, which consists of all that is
introduced and is able to pass the stomach and intestines alive, without multi.
plying. There seems to be no cause to attribute any important influence to
this fact.

As to the second point, why in the intestinal canal the conditions for the
growth of the active lactic acid ferments are wanting, it is that in the contents
of the intestines an alcalic reaction exists, and that the sugars which are formed
or introduced there, in as much as they are not absorbed by the intestinal wall,
will surely be attacked by coli, which in these circumstances is the stronger and
dispels all competitors.

Why coli (and acrogenes) so completely defeat the lactic acid ferments, should,
to my opinion, be explained by the important fact, not sufficiently considered in
literature, that the first mentioned species can quite well live on peptone only,
and multiply at its expense, while the active lactic ferments completely lack this
faculty and, beside peptone, require a carbonhydrate for food.

If, moreover, it is borne in mind that coli in the presence of a carbonhydrate
can also feed on other sources of nitrogen than peptone, for example on amines
and ammonium salts, whereas the active lactic acid ferments cannot, and deci-
dedly want peptones for nitrogen food, it is clear that for the different forms
of coli practically every where in the intestinal contents a good feeding material
is present, and that in the few localities where it would also be sufficiënt for
the lactic acid ferments, it will be seized upon by coli. Where only peptones occur,
coli will moreover increase the already alcalic reaction of the contents and thus,
not for itself but for the lactic acid ferments, render the conditions of life more
unfavourable.

Hence it seems evident why in the intestinal canal a coliflora can exist but
no lactic acid flora.

The yellow coloured faeces of babies during the lactation period may be
alleged to support this view. They consist microscopically almost solely of bacteria.

296

for far the greater part of common colibacteria ^), among which there occur real
lactic acid ferments, but as in the case described before in quite an inferior
number. This fact acquires a special significance when we consider that Escherich,
the discoverer of the colibacillus, has proved that this condition exists directly
behind the baby's stomach, where coli and aërogenes are predominant which, in
reference to the preceding, necessitates the conclusion that even at those portions
of the intestines where a lactic acid flora should first be looked for, it is evi-
dently unable to sustain itself.

There is no doubt but here too, the strongly disinfecting action of the
stomachal hydrochloric acid plays a part, as this acid, at a much lower titer than
the lactic acid checks the growth of the lactic acid ferments, but hence can be
neutralised by much less alcali, which is not indifferent to coli, which produces
alcali.

In so far as the theory of Metchnikoff and Combe is right, after which
yoghurt or other sour milk preparations counteract the auto-intoxication from the
intestinal canal, it seems certain that here should more be thought of the in-
fluence of a milk diet and the free acid taken up with the milk, than of a specific
intestinal flora. But in how far the apparently proved decrease of indol and
phenol, whose quantity is considered a determining the degree of auto-intoxication,
deviates, at a nutrition with soured milk preparations instead of meat, from this
decrease when non-soured milk is used, — to my opinion the real core of the
question, — has not been considered by the said authors.

Admitting that the soured preparations really deserve to be preferred, I
think that especially in Holland, it must be possible with good buttermilk in as
simple a way to reach the wished for end, as with the various exotic ferments,
whose descriptions give the irapression that the preparators are but imperfectly
acquainted with the general phenomena of the lactic acid fermentation in milk.

Although I see no fundamental difference between the use of buttermilk and
yoghurt, it is certain that the latter may be prepared in a very simple way under
medical control, and hence, to my meaning, deserves to be recommended in
certain cases.

Summarising the preceding I come to the following conclusion,

In milk three chief forms of lactic acid fermentation, determined by tempe-
rature, are to be distinguished, namely at very low temperature, the slimy lactic
acid fermentation; at a middle temperature the common lactic acid fermentation
caused by Lactococcus ; and at higher temperature the lactic acid fermentation by
Lactobacillus.

The elective culture of the microbes of the slimy fermentation succeeds by
cultivating baker's yeast in absence of air between 15"^ and 18° C. in malt extract
and transferring to boiled milk or whey at as somewhat higher temperature. The
acidity obtained remains low and amounts to 3 to 5 cc. of normal acid per
100 C.C. of milk.

*) For different children not always the same varieties; sometimes, for instance
non-fermenting forms reminding of Lactobacillus, for which I before indeed took such
bacteria.

297

The elective culture of Lactococcus takes place by allowing milk to sour in
a stoppered bottle at 2.0^ to 25° C. and transfer it repeatedly to boiled milk at
that temperature. The thereby obtained stocks of Lactococcus lactis are mostly
anaërobic but specifically not to be distinguished from the more aerobic forms
which may be produced by the same experiment. The acid mostly remains at
about 8 cc. of normal acid per 100 cc. of milk, but may become 10 to 12 cc

The elective culture of Lactobacillus succeeds best by cultivating buttermilk
in absence of air at 37^ to 40" C. and inoculating it into boiled milk, at 30" C.
and higher, the acidity can rise from 18 to 25 cc of normal acid per 100 cc
of milk.

The active lactic acid ferments are very variable; as factors of hereditary
constant variation are recognised cultivation at too high or too low oxygen
pressure, and cultivation at a temperature above the optimum of growth.

Lactic acid ferments do not lack in the intestinal flora, but play there an
inferior part.

A considerable difïerence between Eastern and Western lactic acid ferments
does not exist.

Yoghurt and other such like sour milk preparations deserve the attention of
hygienists.

Fixation of free atmospheric nitrogen by Azoto-
bacter in pure culture.

Distribution of this bacterium.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. XI, 1908, p. 67 — 74. — Verscheen onder den titel «Binding van vrije atmo-
spherische stikstof door Azotobacter in reincultuur. Verspreiding dezer Bacterie« in
Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd.. Amsterdam,
Deel XV, 1908, blz. 46—53.

When carbon hydrates are used as source of carbon in Azotobacter cultures,
there existed until now some doubt whether the then occurring fïxation of
free nitrogen was originally elïected by Azotobacter itself or by other bacteria found
in symbiosis with it, because Azotobacter in pure culture with carbon hydrates and
free nitrogen only, does not show any considerable development.

For this reason I was formerly of opinion that in such cultures Bacillus radio-
bacter, a species closely allied to the bacteria of the Papilionaceae, and which is
never absent in accumulations of Azotobacter, would be the real cause of the nitrogen
fixation ^).

Continued research, however, rendered this supposition more and more improbable,
and the facts which are now to be stated have proved bevond any doubt that the said
faculty belongs indeed to Azotobacter itself.

These facts have regard to the very peculiar relation between Azotobacter and
the salts of the organic acids, more in particular to calcium malate.

I. Calcium malate as source of carbon.

When into a wide Erlenmeyer jar a nutriënt liquid is introduced of the
composition: 100 tap-water, 2 calcium malate, 0.05 K-HPO*, with addition of some
10 — 20 cM=* canal-water, or as much soil for infection, care being taken that the
iayer of liquid in the jar be not thicker than 2 — 5 cM, on cultivation in a thermostat
at 30" C, usally after 2 or 3 days ^) a floating Azotobacter film appears, consisting
of strongly motile individuals, and relatively soon obtaining a considerable thickness.
Ilereby so much calcium carbonate is produced that it forms a closed, floating Iayer,
so to say a cover, on the surface of the liquid.

') These proceedings of March 1901. Centrbl. f. Bact. 2te Abt. Bd. 9 pg. i, 1902.
Archives Néerl. (2) T. 8 p. 190 and 319, 1903.

-) Especially in spring and autumn these experiments succeed. In sunimer and
winter Azotobacter seems sometimes absent in the said quantity of water.

299

If some of this film is inoculated into another jar containing the same medium,
corresponding phenomena are seen when the culture conditions are alike. At fir.st
sight already, there can be no doubt but under these circumstances fixation of con-
siderable quantities of nitrogen must take place, and chemical analysis proves that
this is really the case.

The microscopic image of the Aaotobacter growth in the malate commonly
shows smaller individuals of greater motility than the formerly described forms which
are obtained in the mannite solutions. They keep about the middle between A. chroo-
coccum and A. agilis, and remind strongly of a variety found in America, which has
received the name of A. vinlandi. The plate cultures of such a malate accumulation
again prove not to be pure but to consist of the usual mixture of non spore-forming
species. They are best grown on a medium of the composition: loo tap water, i cal-
ciummalate, 0.05 K^HPO*, i to 2 agar, on which the Asotohacter colonies become
already visible af ter 12 hours at 30° C, which is not the case with any other species
of microbes known to me. As these plates are somewhat cloudy by the produced cal-
ciumphosphate and the imperfectly dissolved malate, it is desirable to mix the ingre-
dients in the way as follows. Into a culture tube are first introduced some drops of a
neutral, concentrated solution of kaliummalate and herein are dissolved both the cal-
ciummalate and the kaliumphosphate, with a little water to dilute, but the smallest
quantity possible, as the dissolving power of the kaliummalate is much stronger in
the concentrated than in the dilute solution. Then the contents of the tube are mixed
with the agar solution.

The malate plates prepared in this way have proved to be better for the growth
of Azotobacter germs than the mannite and glucose plates, so that of a definite
number of germs there develop more to colonies on the former than on the latter.
Hence it has become possible more exactly to compute the number of individuals of
our species present in a sample of soil than after the old method, to which circum-
stance we return below.

Before going further I wish to notice the following concerning other salts of
organic acids as carbon food for Azotobacter.

Except with calciummalate there could be obtained an abundant or moderate
growth with calciumlactate, calciumacetate and calciumpropionate, particularly when
usingcanal water for the first infection. It was remarkable that the transport of a malate
culture into lactate appeared to succeed nearly as well as of malate into malate, while
even relatively rich crude cultures in propionate- or acetatesolutions, obtained directly
from soil or water when inoculated into corresponding media, hardly grow on, if at
all. This fact is the more remarkable when we consider that by inoculation of a
malate film into propionate or acetate as abundant cultures are obtained as in the
said crude cultures in these media. But if it is tried to continue such cultures by
re-inoculating anew into propionate or acetate they also soon lose their power of
growth. From this we see that the preceding culture conditions to which the inocu-
lation material has been subjected, are by no means indifferent to the vitality of the
following generations, which are evidently very easily weakened and then nearly
quite lose the faculty of fixing nitrogen. The importance of this fact cannot be
denied and certainly deserves a nearer examination.

Calciumcitrate, calciumtartrate and calciumsuccinate, with either garden soil or

300

canal water for infection, give but slowly a moderately developed bacteria film but
it grows during a very long time. The film on the citrate is rich in spirilla and
the Asotobacter form found in it difïers in many respects from the ordinary varieties.
In all these cases the quantity of bacteria grown during the first 2 or 3 weeks, is
still too slight to necessitate a determination of the nitrogen, and could by a rough
comparison with former computations be valued at some tenths of milligrams N^ per
gram of the dissolved lime salt. After "a long time however, the fixation of nitrogen
with these salts is also considerable.

With calciumglycolate in absence of nitrogen compounds no growth of microbes
could be observed at all.

2. Quantity of the üxed nitrogen.

Neglecting for the moment the volatile acid, to which we shall return below, the
analysis of the cultures is performed as follows.

The whole quantity of the liquid, in which are present the calciumcarbonate
formed by oxidation from the malate or the other organic salt, besïdes the as yet not
decomposed malate, the salt of the volatile acid, and the bacteria, is treated with a
known quantity of normal hydrochloric acid by which the carbonic acid is expelled
on heating; a then following titration with normal alkali and phenolphtaleine as indi-
cator, shows how much calciumcarbonate is produced and consequently how of the
organic salt is oxidised.

After addition of a little suiphuric acid the liquid is evaporated to dryness and
after K j e 1 d a h I's method examined on nitrogen, while in each of the materials
used the rate of nitrogen is stated separately. The calciummalate of Merck,
Darmstadt, proved nearly free from nitrogen.

Now follows a table of some analyses ^) which give an idea of the amount of
nitrogen fixed through Asotobacter, when organic salts are used as carbon food.
(See table.)

These numbers show that the amount of nitrogen which can be fixed in the
crude culture is at most 4.9 and 2,8 m.g. per gram of oxidised calciumsalt, obtained
respectively with calciumpropionate and calciumacetate (experiment 10 and 11),
while, per gram of calciummalate was fixed about 2,6 m.g. (experiment 2), and per
gram of lactate 1,8 m.g. (experiment 9). It seems that the fixation goes on more
rapidly at the beginning than later in the course of the experiment, whence it fol-
lows that when little of the organic salt is used proportionately more nitrogen is fixed
than by larger amounts. This should be taken into consideration in judging the
favourable results obtained with propionate and acetate, for then solutions were used
with only 1% of the salt. As to these salts, they have proved to be in general an
unfavourable source of carbon for Asotobacter if the rapidity of the growth is taken
as indicator of the process, and only then to be able to give good results, when for
the inoculation, cultures in malate solutions are used, in which a certain variety of
our species is present. But also then, as observed above, already at the first passage

') I owe to Mr. D. C. J. Minkman, assistant to my laboratory the determina-
tions here referred to.

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302

from acetate into acetate the growth stops almost entirely. Pure cultures of Azoto-
hacter develop hardly at all ^) in solutions of calicumacetate and natriumacetate,
whatever may have been the conditions to which these cultures were previously
subjected. Propionates and lactates still require a nearer investigation.

Of calciummalate, on the other hand, it has decidedly been proved that not only
the crude culttures succeed very well and fix much nitrogen even at repeated pass-
ages in the same medium, but that this also holds goed with regard to the pure cultures
of Azotobacter. This is the first case in v^^hich I got ithe certainty that other microbes
are wanted, neither in the medium nor in the infection materials, but Asotobacter
alone to cause the said phenomena. Various authors surely have repeatedly described
the fixation of free nitrogen in pure cultures of Asotobacter, among others of late
with respect to the acetates, but never had I been able to confirm the accuracy of these
statements until I made a sysitematic investigation with calciummalate, a salt which
had never before been used to this end, although I had already called attention to it
as an excellent source of carbon for Asotobacter in my papers of 1902.

It must be allowed that the amount of fixed nitrogen in these pure cultures is not
ccnsiderable, about 1.5 m.g. for each gram of oxidised malate, but perhaps here too,
will be observed a greater production if only the very young cultures are examined;
then, however, only little of the salt be oxidised and the absolute quantities will of
course be small.

It seems not superfluous here to call to mind that it is by no means the same
whether a known amount of calciummalate be absorbed from a dilute solution or
from a more concentrated one. In the latter case the malate will be more easily assi-
rnilable for the Asotobacter cells, which will induce a stronger oxidation and thus
an increased oxygen assimilation in equal times, so that the tension of the oxygen in
the liquid will be less than in the less concentrated solutions. As the growth of
Asotobacter seems favoured by this lower tension, and in any case, a rather strong
concentration of the carbon food proves favourable to the process of nitrogen fix-
ation in absolute quantity this circumstance has been taken into consideration in all
the experiments. Further, we did not always wait for the moment at which the
malate had disappeared from the medium, but commonly it was much earlier sub-
jected to the analysis for the reason mentioned above.

The observation that calciummalate can, glucose, cane-sugar and mannite on
the other hand, cannot form the starting point for nitrogen fixation in liquid pure
cultures, while yet the said carbon hydrates are in the crude cultures much more
productive and may even give gains of nitrogen of 7 m.g. per gram of decomposed
sugar, gives rise to the supposition that these carbon hydrates must previously be
changed by other bacteria into organic acids and that these, at the moment of their
production, serve as carbon food for Asotobacter and primarily cause the fixation
of the nitrogen.

Of course it cannot be malie acid which hereby originates from the sugar; but
the important growth of Azotobacter to which also the acetates, the propionates and
lactates may give rise, suggest the question whether perhaps the acids of these salts
may be first produced from the carbon hydrates and then govern the nitrogen fixation.

*) The different varieties behave, however differently and some will begin to grow
but the growth soon ceases.

303

It is to be remarked that as well in the malate as in the lactate cultures slight
amounts occur of a volatile acid, which will perhaps prove to be acetic acid, althuugh
it has net been positively demonstrated by means of B e h r e n s' uranylanatrium-
acetate reaction. It is of importance to know that this volatile acid is not only found
in the crude, but also in the pure cultures of Azotobacter, so that it is certainly
a product of this species itself.

In order to ascertain the amount of the volatile acid and the corresponding
quantity of decomposed malate, it is supposed in the table to be acetic acid only and
produced af ter the formula:

2 r* /ƒ* O" Ca + 202 ^ c* //6 o* Ca + Ca CO' + 3 CO^ + H^-0
Calciummalate Calciumacetate.

But it may also be formed w^ithout access of oxygen. The volatile acid is deter-
mined by distillation with sulphuric acid and silver sulphate and titration the distillate
with normal alkali.

From the table we see that in the crude cultures nitrogen can without doubt be
fixed with calcium acetate as carbon source. In truth we have not succeeded in
effecting the same in pure cultures, but now that we have the certainty that Azoto-
bacter alone, with malate as carbon food, is able to fix nitrogen, it must be admitted
that this also holds good for the acetate cultures, although it is not clear of what
nature is the assistance which other bacteria thereby must necessarily lend. Besides
it should be noted that the fixation of nitrogen in the pure cultures, also when malate
is used as carbon food, is less considerable than when other bacteria, too, can live
on this substance at the same time.

3. Distribiition of Azotobacter in the soil.

Earlier, already, I showed that it is possible to detect a few Azotobacter colonies
among the thousands of those of the other species, when fertile garden soil is sown
on mannite-kalium-phosphate plates. The use of calciummalate instead of sugar has
proved to be of importance for the examination of the soil in this direction. First it
should, however, be observed that no solid or liquid medium ^) could be found on
which all the germs of Azotobacter sown out really develop into colonies. Thus, by
sowing about 2400 germs (determined by microscopic counting), on various culture
plates, 50, 12, I, 30, 8, 20, 10, 20 and 75 colonies developed so that the growth in
percents was only 2, 0.6, 0.5, 0.3, 0.3, 0.8, 0.4, 0.8 and 0.3. In another experiment
were obtained of 10.000 germs sown on glucose-calcium, malate plates, 20, 25 and
48%, and on calcium-kaliummalate-plates 32.5, 36 and 65%. But in other cases, on
agar plates with malate only the results were much better. The germs had been
shaken up in sterile tap-water or in malate solutions, of which i cm» was spread over
the plate, care being taken that the water was quite taken up into the agar,
by its power of imbibition, which is easily effected by softy heating the plate so that
the superfluous water evaporates.

') The use of thin layers of liquid media for colony-culture of microbes has been
described in Centralblatt f. Bacteriologie, 2te Abt. Bd. 20, 1908, p. 641.

304

We see from these data that commonly only a small part of the sown germs
comes to growth. Whether perhaps the water itself has a deadly influence on some
individuals, or that their death is caused by their passing on the solid medium, could
not yet be made out by experiment. Thus, although there be ground to allow that
more germs occur in the soil used than are found, the possibility exists that by
continued investigation the experiment may be made so as to exclude that source
of error.

But in spite of the uncertainty of the method the following resuh could be stated.

By sowing a small quantity, for instance less than — gram of garden soil on calcium-

malate-kaliumphosphate i% agar, after 24 hours at 30» C. commonly no Azotohacter
is observed, but a moderate number of moist colonies of about i mm. in diameter,
first draw attention by their extension and prove to consist of different varieties of
Bacillus niegatherium, containing many spores. They dont cause any considerable
oxidation of the malate and as the colonies no more grow after the second day, they
evidently develop at the expense of the traces of nitrogen compounds which at first
are present in the plates. After the second day a great number of Streptothrix alba
appear. This microbe is so common in all the examined samples of soil that there
can exist no doubt as to its either favourable or pernicious influence on the fertility;
but the nature of this influence is as yet wholly unknown.

In a still later stadium the surface of the plate becomes covered with numerous
relatively small colonies of bacteria, among which some species immediately draw
attention by their extension and commonness,

The oxidation of the malate by all these microbes is slight, so that even after
weeks the plates contain but little calcium carbonate, which seems almost entirely
produced by the said larger colonies and by Streptothrix. All these species seem not
to oxidise at all, or perhaps it is more accurate to say, not to oxidise any more after
the last traces of fixed nitrogen have been assimilated. As to Streptothrix, from its
relatively vigorous oxidising power it foUows by no means that this should be
associated with fixation of nitrogen; this species surely does not possess that faculty.
If for the experiment soil is used shaken from the roots of garden-plants, which are
no Papilionaceae, the result is fairly the same; perhaps the number of the above men-
tioned oxidising forms is more numerous, but this is still doubtful.

Otherwise, however, is the result when the soil is examined which adheres to
the roots of clover, pease, and beans when these plants are cautiously dug up. When
the soil adhering to such roots is rubbed fine and after dilution in water sown on a
malate plate we find, after a period of 2 days at 30° C, first that the said oxidising
colonies have very abundantly developed. But, besides, among these colonies much
larger ones are distributed, which oxidise much more vigorously and prove to belong
to Azotobacter, which shows that a distinct relation exists between the distribution
of this genus and the said Papilionaceae. Whether this relation will appear to be
universal and what may be its signification, further experiments have to decide.

Beobachtungen über die Entstehung von Cytisus
purpureus aus Cytisus Adami.

Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft, Berlin, Band XXVI a, 1908,

S. 137—147-

Seit meiner ersten Mitteilung über diesen Gegenstand ^) war ich in der Lage, noch
eine Reihe neuer Falie von der Entstehung von Cytisus purpureus aus Adami
zu beobachten und darüber wünsche ich folgendes zu berichten.

lm Jahre 1903 hatte ich an einigen Exemplaren von C. Adami um die Mitte Mai,
als die Blüten sich öffneten und das Laub ausbrach, alle ein- und zweijahrigen
Zweige kurz eingeschnitten, so daB die Schlafaugen des Vorjahres sowie die Sommer-
knospen am einjahrigen Holze zur Entwicklung kommen muBten. lm August stellte
sich heraus, daB sich darunter nicht weniger als vier selbststandige Piirpureus-
gruppen befanden, die alle tatsachlich aus Sommerknospen am einjahrigen Holze
entwickelt waren. Die Bezeichnung Purpureusgruppen muss deshalb gebraucht wer-
den, weil sich ergab, daB die Rückschlagserscheinung zwar einen besonders stark
entwickelten, daneben aber einige weniger kraftig gewachsene Zweige von Purpureus
geliefert hatte, welche aus Knospen entstanden waren in den Blattachseln von bezüg-
lich einander entfernt gestellter Blatter des namlichen Zweiges. Zwischen diesen
Purpurens\i\\os^&n war auch ein Rindenstrich von Purptireusgewche nachweisbar, so
daB dieselben zu e i n e m Komplexe gehörten und alle zusammen auf einen einzelnen
\'ariationsvorgang zurückzuführen waren. Auf dem gleichen Hauptzweige, neben
und (jberhalb der Purpureuskuospen, waren ^Jow/knospen sichtbar, aus deren Stel-
lung hervorging, daB nur ein relativ kleiner, stark in die Langsrichtung ausgewach-
sener Teil der SproBachse zu Purpureus geworden war. Das ganze Verhalten ist
also ahnlich dem früher für die Entstehung von Lahiirnum aus Adami beschriebenen,
WO alles jedoch viel übersichtlicher ist wegen der Leichtigkeit, womit man Blatter
und SproBrinde von Laburnum an der seidenglanzenden Behaarung erkennen kann,
welche sowohl bei Adami wie bei Purpureus ganzlich fehlt.

Wie gesagt, stellte sich heraus, daB das gleiche Verhalten in allen vier beobach-
teten Pallen obwaltete, und es wurde dadurch möglich, vermittelst eines geeigneten
Schnittes, wodurch alle benachbarten Adamizvit\%t entfernt und die schwacheren
Ptirpureussprosst gefördert wurden, auch die letzteren zur Weiterentwicklung zu
bringen, wodurch noch bis in 1904 die Erscheinung der gruppenweisen Entstehung
deutlich h^rvortrat; von da an hat aber der kraftigste PurpureussproQ stark über-
hand genommen, sich aus der Basis reichlich verzwelgt und die niedriger gestellten
Schwachlinge zum Sterben gebracht.

*) Verh. Akad. v. Wetensch. Amsterdam, 24. (Jktober igoo; Botan. Zeitung 1901.
M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 20

3o6

Die variierten Knospen waren in den hier betrachteten Fallen, wie gesagt, aus
Sommerknospen am Frühlingsholz entwickelt, die Purpureuszweige waren also als
Johannissprosse aufzufassen. Doch will ich hier sofort hinzufügen, dass ich seitdem
noch drei weitere Falie von Purpttretishüdung beobachtet habe, welche sich auf Win-
terknospen bezogen, und wovon ich bei zweien mit Sicherheit feststellen konnte, daB
die variierten Knospen Adamizwe'igt erzeugten, welche einige voneinander entfernte
Purpureussprosse trugen, neben welchen normale Blatter und Knospen von Adanii
saBen; auch hier waren alle Purpureussprosse auf einen einzelnen zu Purpureus ge-
hörigen Rindenstreifen eingepflanzt, welcher sozusagen inselartig allseitig durch
Adamirinde^ eingeschlossen war.

Ein ebensolcher aus einer Winterknospe hervorgegangener Pi(rpureus\a.rvdut
\>t in Fig. I dargestellt. Hier sieht man den Ptirpureusstreiitn ps, durch eine Schat-
tierung angegeben, wahrend die Adamirinde weiB gelassen ist. Die Enden des Strei-
fens sind bei o. und b zu suchen. Bezüglich des Oberendes b war kein Zweifel ; ob a
sich ganz am Unterende des Zweiges befand oder etwas höher, konnte nicht sicher-
gestellt werden; ersteres ist wahrscheinlich.

Aus dieser Beschreibung geht also hervor, daB der Akt des Variationsvorganges
im gleichen Sommer stattfindet, in dem der Schnitt ausgeführt wird, wobei das Resul-
tat aber früher oder spater sichtbar werden kann, je nachdem die variierte Knospe
noch im gleichen Sommer auswachst und vielleicht selbst Johannissprosse erzeugt,
wie in dem in Fig. i dargestellten Falie, oder als geschlossene Knospe überwintert.

Bezüglich der Stellung der variierenden Knospen am ganzen Baume hat sich
herausgestellt, daB die Pi/r/'Mr^H.yvarianten nur sehr selten aus ruhenden Knospen
am alten Holze entstehen, was eben für Laburnum Regel ist, wahrend umgekehrt
Laburnuni nur selten am einjahrigen Holze entsteht, wo eben Purpureus vorzugs-
weise auftritt.

In bezug auf die Gestalt des variierten Sektors der Adamiknospen muB noch fol-
gendes bemerkt werden.

Eigentlich ist das Wort Sektor nicht ganz richtig gewahlt, denn die Begrenzun^
des Gewebes, welches in einen der Komponenten zurückgeschlagen ist, ist durcli-
aus nicht von Radialflachen, welche durch die Knospenachse von Adami gehen, ab-
gegrenzt, sondern besitzt eine unregelmaBige UmriBlinie. Eben diese UnregelmaBig-
keit erscheint besonders merkwürdig, weil daraus hervorgeht, daB der morphologische
Aufbau des Sprosses nicht in naherem Zusamnienhang steht mit dem Variabilitiits-
vorgang. Dieses Verhalten wird deutlich, wenn man die Stellung der Adami- und
PurpureushYéiiitr am Zweige betrachtet. Gewöhnlich weicht diese Stellung an den
normalen Sprossen nur wenig ab von ^/g, so daB das achte Blatt vertikal oberhalb
eines mit o zu bezeichnenden Ausgangsblattes steht. Es stellt sich nun heraus, daB,
wenn das Blatt o ein auf dem Purpureiisstktor sitzendes Purpureushlatt ist, nicht
notwendigerweise auch das achte zu Purpureus gehort, sondern daB der variierte Sek-
tor meistens eine so unregelmaBige Gestalt hat, daB das achte Blatt ein Adamiblatt
ist, wahrend das neunte, das zehnte und vielleicht das siebente wieder zu Purpureus
gehören könnén. Ganz die gleiche Bemerkung kann man bezüglich der Inflorescenzen
von Adami machen. Die Divergenz der Blüten betragt dar in ungefahr 130" oder
nahezu */ii, wobei die drei Nebenspiralen, worin die Blüten geordnet sind, deutlich
hervortreten. Bei der Sektorvariation, welche bekanntlich in den Inflorescenzen öfter

307

vorkommt als an vegetativen Sprossen, folgt dieser Sektor nun weder der Orthostiche
noch einer Parastiche, sondern zeigt auch hier unregelmaBige Gestalt.

Was die Tiefe betrifït, bis zu welcher der variierte Sektor in den Zweig hinein-
dringt, so zeigt die Beobachtung, daB sich darüber nichts allgemeines aussagen laBt,
weil diese Tiefe mit der seitlichen Ausdehnung des Sektors zusammenhangt.

Fig. I. Purpureussektor (Ps), schattiert mit vier Pur pur euszw eigen Ps. welche zu Jo-
hannissprossen ausgewachsen sind, an einem Adamizweise, gezeichnet im Oktober
gleich nach dem Blattfall. Der vorjahrige Zweig Ad*^ zeigt bei c einen Wundcallus,
auf dessen Rand der variierte diesjahrige SproB Ad- sitzt. Die Adamiknospen stehen
an der ganzen Zweiglange. An der Spitze steht ein Adanii\a.ngsproQ, welcher sich
ebenfalls als JohannissproB entwickelt hat.

Bezüglich der leichten und sicheren Erkennung der Purpureussprosse am Adami-
zweig mag noch folgendes bemerkt werden. Weil die Blatter letzterer Art gewöhn-
lich sehr viel kleiner sind als diej enigen von Adami, namlich mehr als dreimal kürzer
und schmaler, macht die Unterscheidung an ausgewachsenen Sprossen meistens keine
Schwierigkeit. Ganz anders aber, wenn sich die Seitenknospen, welche man zu unter-
suchen hat, was sehr oft vorkommt, zu Kurzsprossen oder Blattrosetten mit verkürzter

3o8

Achse entwickelt haben; die AdatnihVattQr solcher Sprosse können klein bleiben und
dann kann es eben schwierig werden, an einem einzelnen Blattchen oder einem Blatt-
stücke festzustellen, ob es zu Purpurens oder zu Adanii gehort. Dafür kann dann
die früher beschriebene ^) Nekrobiosereaktion verwendet werden, welche wie folgt
ausgeführt wird.

Die Spitze des zu untersuchenden Blattes wird vermittelst der kleinen Flamme
eines Zündhölzchens in der Weise behandelt, daB das Gewebe davon schnell und voll-
standig durch die ganze Dicke des Blattes abstirbt, wahrend die Basis des Blattes
vollstandig unverandert und lebendig bleibt. Dabei entsteht dann in der Mitte des
Blattes eine Region, welche nur maBig erhitzt wird, so daB darin zwar das Absterben
des Protoplasmas stattfindet und Dislokationen der an das Protoplasma gebundenen
Körper möglich werden, wahrend selbst leicht zersetzbare Körper, wie Enzyme un-
zersetzt bleiben können. Finden sich nun, was in sehr vielen Blatten der Fall ist,
unter diesen in Freiheit gesetzten Stoffen solche, welche aufeinander reagieren unter
Produktion eines Pigmentes, so farbt sich die nekrobiotische Region oft sehr intensiv,
wahrend ebensowohl die schnell getötete Spitze des Blattes, wie die lebend gebliebene
Basis unverandert grün bleiben.

Bei diesem Versuche verhalten sich die Blatter von C. laburnum, C. Adami und
C purpureus auf eine grundverschiedene Weise ; das Laburnuf nh\a.tt zeigt bei der
Nekrobiose keine Veranderung 2), das Pitrpureush\a.tt wird dadurch tief schwarz 2)
und zwar momentan, das Adamihlatt zeigt erst nach mehreren Minuten in der nekro-
biotischen Region eine Braunfarbung. Hierdurch ist es möglich, sofort Purpureus
zu erkennen, selbst wenn nur Blattchen oder Blattstücke von einem Zentimeter oder
noch weniger vorliegen.

Die Reaktion wird besonders wichtig in den seltenen, jedoch interessanten Pal-
len, wenn ein und dasselbe Blatt zum Teil aus Purpureus, teils aus Adami besteht.
Solche „gemischte" Blatter finden sich namlich dann, wenn sie an der Grenze des
variierten Sektors inseriert sind, so daB sie bei der Entwicklung die beiden Kom-
ponenten in sich aufnehmen muBten *).

In der Figur 2 (siehe S. 309) ist in a ein solches »gemischtes« Blatt dargestellt.
Das Mittelblattchen besteht an der Basis links aus Purpureus, oberhalb der punk-
tierten Linie ps und zur rechten Halfte aus Adami. Die durch Punktierung ange-
gebene Trennungslinie zwischen Purpureus und Adami kann über die ganze Lange
des Blattstiels verfolgt werden, das linke Seitenblattchen ist also rein Purpureus, das
rechte Seitenblattchen rein Adami. Von allen drei Blattchen wurden die Spitzen er-
hitzt und getötet, die Basis lebendig gelassen. Alles nekrobiotische Gewebe, welches

*) Kon. Akad. van Wetenschappen, Amsterdam, 30. Sept. 189Q, S. 91, 30. Juni 1900
S. 74-

^) Übrigens ist Laburnum so leicht an der Behaarung der Blatter kenntlich. daB
darüber niemals Zweifel herrschen kann.

') Der Chemismus, worauf die Pigmentbildung beruht, ist noch nicht bekannt.
Eine eigentliche Enzymwirkung ist dabei nicht allein das Ausschlaggebende (obschon
sicher nachweisbar), sondern Sauerstoffeinwirkung auf einen phenolartigen aus dem
absterbenden und permeabler werdenden Protoplasma freiwerdenden Körper dürfte
jedenfalls die Hauptsache sein.

*) Solche »gemischte« Blatter zwischen Adami und Laburnum habe ich schon sehr
viele gefunden und jn den anfangs genannten Abhandlungen beschrieben.

309

zu Purpureus gehort, zeigt dabei tiefe Schwarzfarbung direkt nach dem Versuche,
wahrend beim Adamigcwehe erst viel spater die durch einen Halbschatten ange-
gebene schwachere graue Verfarbung sichtbar wird. lm Mittelblattchen bat offenbar
das Adamigewehe dasjenige von Purpureus zur Seite gedrangt und überwuchert.

yL-<r? Z

Fig. 2. Der Nekrobioseversuch mit einem Purpureush\atte b und einem gemischten
Blatte o. Das gemischte Blatt a besteht links von der punktierten Linie ps bis ps^
aus Purpureus, rechts aus Adami (ad—ad^). Das Oberende der Trennungshnie geht
bei ps quer durch das Blatt. Alle Blattchen sind an der Spitze getötet, an der Basis
lebend, in der Mitte nekrobiotisch. Das nekrobiotische Band ist schwarz bei Purpureus,
grau bei Adami (und unsichtbar bei Laburnum).

Hier ist die Stelle, um noch auf folgenden Umstand hinzuweisen.

In der Blütenregion von Cytisus Adami ist es nichts seltenes, daB ein Stück eines
Blütenblattes durch einen auf einen Teil des Blattes lokalisiert gebliebenen Vari-
ationsakt in einen der Komponenten verandert ist. So habe ich manchmal Fahnen von
Adamiblüten gefunden, von denen ein kleines Randstiick in Laburnum verwandelt

310

war; in anderen Fallen waren die Flügel zum Teile zu Purpureus geworden. Eine
solche Veranderung kommt jedoch bei den grünen Blattern niemals vor; sind diese
variiert, so ist immer auch die Achse, welche das Blatt tragt, in Mitleidenschaft ge-
zogen, das heiBt die Variation hat entweder in einem früheren Stadium stattgefun-
den, wie im vorigen Falie, oder eine viel umfangreichere Zellgruppe der Vegetation
als die BliTtenregion affiziert, welch letztere Auffassung ich für die wahrscheinlichere
halte. Dieser Umstand steht in guter Übereinstimmung mit der schon früher ausge-
sprochenen Auffassung, die Blüte müsse als das Organ der Variabili-
t a t betrachtet werden, wofür eine Menge von Gründen der verschiedensten Art an-
geführt werden können.

Vergleichen wir das für die PurpureushWdung beschriebene Verhalten und die
Erscheinungen in der Blütenregion mit den in meiner ersten Mitteilung dargestellten
Erscheinungen bezüglich der Entstehung von Laburnum, so sieht man, daB schon eine
Feihe von Fallen beobachtet sind, wo nicht eine ganze Knospe, sondern ein unregel-
maBig begrenzter Teil davon in die Komponenten zurückschlagt. Bezüglich Laburnum
kann ich noch hinzufügen, daB ich bei der Beobachtung mehrerer neuer Falie zu dem
Schlusse gekommen bin, daB dieses partielle Variieren nicht Ausnahme, sondern ganz
bestimmt Regel ist, so daB man auch an bei weitem den meisten selbstandigen La-
burnumsprosstn, ganz unten, also wo der Zweig an der Mutterachse festsitzt, einige
Knospenschuppen oder ausgebildete Blatter von Adami findet^). Ich bin deshalb
gegenwartig überzeugt, daB sowohl bezüglich der Purpureus- wie der Laburnum-
bildung aus Adami die partielle Knospenvariation die Regel, die totale die Aus-
nahme ist, und ich betrachte es selbst als möglich, daB auch alle diej enigen Falie,
welche den Eindruck einer totalen Umwandlung der .^^rfomiknospe in eine der Kom-
ponenten machen, tatsachlich dennoch auf partieller Variation beruhen.

Eine andere und wie ich meine wichtige Beobachtung bezüglich der Purpureus-
bildung, welche ich gemacht habe, als ich mit dem vorstehend beschriebenen Verhal-
ten bekannt geworden war, und wodurch einiges Licht auf die Ursachen geworfen
wird, welche den Variationsakt veranlassen, ist folgende.

Nachdem festgestellt war, daB nicht die zu Sprossen ausgewachsenen Purpureus-
zweige selbst die ursprünglich variierten Einheiten sind, sondern daB dieselben Sei-
tenbildungen darstellen eines variierten Teiles einer Knospenachse einer früheren
Generation, erhob sich wie von selbst die Frage, welches die Stellung der variierten
Knospe am Mutterzweige war, und ob sich auch irgend ein Umstand würde aus-
findig machen lassen, durch welche die Variation vielleicht bedingt gewesen sein
könnte. Eine genaue Untersuchung der Ansatzstelle der Sprosse, welche die Seriën
von Purpureusz\ft\gtn trugen, ergab nun das bemerkenswerte Resultat, daB diese
Stelle in der unmittelbaren Nachbarschaft, — in zwei davon selbst auf dem Rande,
— eines Wundcallus vorkam, gebildet durch das Zurückschneiden des einjahrigen
AdamizyNt\gts unmittelbar oberhalb der variierten Knospe im Voraufgegangenen
Jahre, das ist also in dem Jahre, in welchem die variierende Adamïkno&pt entstan-
den war, jedoch lange nach dem Augenblicke dieser Entstehung. In Übereinstimmung

') Diese Beobachtung wird durch zwei Umstande erschwert: erstens dadurch, daB
die zu Laburnum werdenden Knospen meistens kleine Schlafaugen sind, und zweitens
dadurch, daB viele scheinbar durch Knospenvariation entstandene Lafejirnumknospen,
tatsachlich Seitenknospen alter Laburnumkurzzweige sind.

311

niit meinen früheren Angaben ergibt sich also auch hier einerseits, daB der Akt der
Variabilitfit nicht eine einzige Zelle, sondern eine ziemlich umfangreiche Zellgruppe
ergriffen hat, aber auBerdem, und darauf wünsche ich an dieser Stelle den besonderen
Nachdruck zu legen, veranlaBt mich die Stellung der variierten Knospen in nachster
Nahe einer Wunde, anzunehmen, daB der Wundreiz ein mitwirkender Faktor jenes
Variabilitatsaktes gewesen ist. Allerdings ergibt sich diese Folgerung nicht als not-
wendiges Postulat der Beobachtung. Bedenkt man aber, wie auBerst selten die
Purpureusknospen sind, so hat das genannte Verhalten einen so hohenGradvonWahr-
scheinlichkeit, daB die Annahme, es soU die Verwundungsstelle in allen beobachteten
Pallen nur ganz zufallig sich in der unmittelbaren Nachbarschaft jener Pnrpureus-
knospen gefunden haben, zu verwerfen ist.

Die Einwendung, daB, wenn ein Wundreiz bei der PurpureushWAxxng mitwirke,
dieser Vorgang allgemeiner sein sollte, muB folgenderweise beantwortet werden. Zu-
nachst ist es klar, daB der Wundreiz a 1 1 e i n die Erscheinung nicht hervorruft, son-
dern daB andere nicht bekannte mitwirkende Faktoren dabei ebenfalls in Betracht ge-
zogen werden mussen . Andererseits muss wohl überlegt werden, daB das Zurück-
schneiden der Zweige, deren Knospen variiert sind, nicht stattgefunden hat mit der
Kenntnis, daB die Stelle am Zweige, wo dieser Schnitt zustandekommt, einen so
wichtigen EinfluB auf den Variationsvorgang ausüben kann, sondern daB dieser
Schnitt ganz willkürlich ausgeführt ist, wobei es viel wahrscheinlicher ist, daB das
Abschneiden an einer Stelle stattfindet, welche von einer Knospe so weit entfernt
ist, daB diese Knospe auBerhalb des Bereiches des Wundreizes verbleibt, als umge-
kehrt, und daB selbst dann, wenn sehr viele Zweige zurückgeschnitten werden, doch
immer zu erwarten ist, daB nur vereinzelte Knospen eben am Rande eines Gallus vor-
kommen werden. Hierbei ist übrigens die Jahreszeit, in der der Schnitt ausgeführt
wird, nicht gleichgültig. Findet dieser z. B. im Frühjahre statt, so bildet sich der
Gallus an der f reien Wundflache selbst, wahrend beim Sommerschnitt ein ziemlich
langes Stück des Zweiges unterhalb der Wunde absterben kann, woraus folgt, daB
der Wundreiz, welcher vom Rande der lebend gebliebenen Teile ausgeht, seinen Ein-
fluB im Sommer auf eine gröBere Entfernung ausdehnen kann, wie im Frühjahr. Wie
weit im gesunden Gewebe dieser Abstand werden kann, ist einigermaBen zu bemessen
aus den Angaben, welche bezüglich der Lange der durch Wundreiz herA-orgerufenen
Gummikanale beim Pfirsich und Mandelpfirsich festgestellt sind ^) und wofür un-
gefahr i Zentimeter als obere Grenze in der Langsrichtung des Zweiges gefunden
wurde. In der tangentialen Richtung erstreckt sich der Reiz weniger weit, was zur
Aufstellung des Begriffes ,,Wundellipse" geführt hat; im gegenwartigen Falie wo-

') Beijerinck et Rant, Sur l'excitation par traumatisme et récoulement gom-
meux chez les Amygdalées. Archives Néerlandaises. Sér. 2. T. II, p. 184. 1905. Vor
kurzem hat Herr Ruhland (Berichte d. deutschen Bot. Gesellschaft. Bd. 25 1907)
dieser Untersuchung eine Kritik gewidmet, und er verspricht spatere ]\Iitteilungen
bezüglich der Ausdehnung des Wundreizes beim GummifluB der Amygdaleen, ohne zu
bemerken, daB eben das ein Hauptgegenstand unserer Untersuchung war, und das Re-
sultat kurz aber klar auf S. 186 und 188 dargestellt ist (vgl. auch Rant, Die Gummosis
der Amygdalaceae, Amsterdam, 1906, wo auf Seite 81 fï. auch Figuren von der Wund-
ellipse gegeben sind.) DaB Herr Ru h 1 an d sich bezüglich der Wirkung des Sublimates
als Gift für die lebende Zelle und für Enzyme Vorstellungen macht, welche ganzlich
abweichen von der Wirklichkeit, moge hier nebenbei bemerkt werden.

312

bei es sich um Wunden handelt, welche durch das Wegschneiden von ganzen
Sprossen entstehen, kann natürlich nur die Ausdehnung des Wundreizes in der
Langsrichtung in Betracht kommen. Die Bildung der traumatischen Gummikanale
hat noch einen anderen darauf influierenden Umstand ans Licht gebracht, ich meine
den ausschlaggebenden EinfluB, welcher die Jahreszeit, in welcher die Verwmidung
stattfindet, sowie die Temperatur auf den traumatischen Erfolg ausüben und welche
beim verholzten Zweige darin besteht, daB im Februar und Marz bei ca. i8" C, also
im Zimmer, eine Schnittwunde schon nach wenigen Tagen in GummifluB gerat,
•\vahrend dies bei Temperaturen unterhalb 12° bis 10° C durchaus nicht geschieht.
Spater im Sommer, wenn die Temperatur auch im Preien 18" C geworden ist, geben
ganz ahnliche Verwundungen j edoch gar keine Veranlassung zum GummifluB, woraiis
deutlich hervorgeht, daB nicht allein der Wundreiz die Erscheinung beherrscht, son-
dern daB dafür noch überdies eine gewisse Temperatur, sowie noch nicht aufgeklarte
Umstande anderer Art realisiert sein miJssen. Da nun die Bildung von Laburnum
und Ptirpureits a.us Adanii gewissermaBen der GummifluB analoge Vorgange sind, inso-
v'eit beide Vorgange als die Erweckung schlummernder Eigenschaften aufzufassen
sind, muB auch in beiden Fallen auf ahnliche Ursachenkomplexe geschlossen werden.
Für experimentelies Eingreifen zum Zwecke der Purptireushildung hat man also
auBer dem Wundreize, dessen Wirkung als höchst wahrscheinlich zu erachten ist,
noch auBerdem den physiologischen Zustand des ^(/amtzweiges, sowie die Temperatur
in Betracht zu ziehen, für welche beiden letzteren Einflüsse noch keine genügende
experimentellen Erfahrungen vorliegen, um eine richtige Wahl derselben anzuordnen.

Wenn auch nicht bezüglich der Gummosis, welche an den alteren Asten jedes
Lebensalters in Ubereiiistimmung mit der Erwartung stattgefunden hat, so muB es
doch als möglich betrachtet Averden, daB auch das Alter der Zweige, in dem der
Schnitt stattfindet, auf einen Variationsvorgang, im vorliegenden Falie also auch bei
der Purpureushïldung, mit eingreifen kann, wodurch ein neuer und nicht wohl be-
rechenbarer Faktor in Erwagung zu ziehen ist.

Obschon also die geschilderten Beobachtungen zu einer ersten Yerbesserung
bei der Purpureuserzeugung Veranlassung geben, namlich zur Ausführung des
Schnittes derart, daB jedesmal eine Adamiknospt neben oder auf dem Wundrande zu
sitzen kommt, wodurch die Chancen für die Purpureushïldung wahrscheinlich ver-
bessert werden, so wird dadurch jedoch noch keineswegs auf ein gesichertes Resultat
gerechnet werden können. Der Fortschritt auf diesem Gebiete wird nur ein lang-
samer sein können, weil die Versuche zwei Jahre umfassen, ehe ein vollstandiger
Überblick zu erhalten ist, und überdies sehr viele derselben aus allerlei mechanischen
und zufalligen Gründen fehlschlagen mussen.

Die Erscheinung der Flockenbildung oder
Agglutination bei Alkoholhefen').

Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, II. Abteilung, XX. Band, 1908,

s. 137—157-

Sofort nachdem das Reinzuchtverfahren auf PreChefe angewandt wurde, stellte
es sich heraus, daB die Reinhefe beim Heruntersinken nicht flockt oder agglu-
tiniert, wie das bei roh kultivierter Hefe immer mehr oder weniger deutlich statt-
findet, und daB letztere Hefe eine kürzere Zeit zum Absetzen braucht wie erstere.

Die Ursache dieser in mehreren Richtungen wichtigen Erscheinung beruht auf
zwei ganzlich verschiedenen Umstanden, namlich e r s t e n s auf der Existenz von
gewissen, in der rohen PreBhefe nicht seltenen Hefearten, welche, an und für sich,
also auch in Reinzucht das Vermogen besitzen, stark zu flocken, gerade also wie die
l'nterhefe, wovon sie jedoch ganzlich verschieden sind, weil sie, wie die PreBhefe
selbst, sich als Oberhefen herausstellen (Autoagglutination), und zweitens dar-
auf, daB einige Bakterienarten, welche zu den aktiven Milchsaurefermenten ge-
hören, die Eigenschaft haben, die an und für sich nicht flockenden Hefearten zur
Flockung zu bringen (symbiotische Agglutination).

I. Die aiitoagghitinierenden Hef en.

Bezüglich der Autoagglutination mag folgendes bemerkt werden:
Eine starke Autoagglutination zeigt die gewöhnliche Unterhefe der Bier-
brauereien, welche eben wohl durch diese Eigenschaft ihren Namen bekommen hat,
wahrend die Braueroberhefe ohne Bakterien nicht agglutiniert, und worauf ein in
§ 4 beschriebenes einfaches Verfahren zu basieren ist, um beide nebeneinander ziem-
lich genau quantitativ zu bestimmen. Ferner kommt diese Erscheinung vor bei einer
in PreBhefe nicht seltenen besonderen Maltosehef e, welche schon von Pasteur entdeckt
und beschrieben ist unter dem Namen »levüre caséuse« 2) und wofür ich den Namen
Saccharomyces curvatus vorschlage, wegen der gekrümmten Gestalt derjenigen Zei-
len, welche beim Plattenverfahren sich verlangern, wahrend die kürzeren Zeilen
nicht von PreBhefen zu unterscheiden sind. Auch sind die Kolonieen auf Würzeplatten
bei dieser Art am Rande eigentümlich aufgebogen, wodurch dieselbe oft in einem

') Die Worte »Flockenbildung« und »Agglutination« werden im folgenden als
Synonyme gebraucht, doch muB bemerkt werden, daB es sich hierbei um Vorgange
handelt, welche von der Agglutination bewegiicher Bakterien verschieden sind, obschon
in allen Pallen der auf irgend eine Weise erzeugte, den Mikroben anhaftendc Schleim
als nachste Ursache anzunehmen ist.

-) Études sur la bière. 1896. p. 196.

314

Gemische leicht erkenntlich ist. Da sie beinahe ebenso kraftig giirt und wachst, wie
die PreBhefe selbst, und sich wahrend und nach der Garung mit erstaunlicher Schnel-
ligkeit und Vollkommenheit absetzt, verdient diese Art die besondere Aufmerksamkeit
der Physiologen.

Sie bildet einen Teil der gewöhnlichen Backerhefe, doch findet sie sich darin so
selten, daB die Isolierung ohne eine vorlaufige Anhaufung nicht gelingt. Diese An-
haufung kann, wenigstens für die hollandische PreBhefe, soweit nach dem alten
Wiener Verfahren gearbeitet wird, auf folgenden Umstand gegründet werden: Die
Curvatus- Hefe ist gegenüber excessiven oder schadlichen Bedingungen weniger
empfindlich wie die PreBhefe selbst.

Als solche Bedingungen können nun besonders folgende praktisch verwendet wer-
den: Erhitzung, Thermokultur, Faulnis und langes Aufbewahren, und Einwirkung
von giftigen Dünsten, wie von Aether, Schwefelkohlenstoff, Chloroform, Alkohol etc.
Alle diese Umstande können bei richtiger Anwendung eine relative Vermehrung der
Curvatus-Heie gegenüber der PreBhefe herbeiführen. Als Beispiel will ich das Faul-
nisverfahren etwas niiher besprechen. Gewöhnliche PreBhefe wird unter einer Glas-
glocke, um die Verdunstung einzuschranken, im erwarmten Zimmer einfach der
sauren Verderbnis überlassen. Es entstehen dabei massenhaft Milchsaurefermente
und meistens auch Mycoderma. Die PreBhefezellen sterben dagegen schnell ab. Es
wird nun etwas von diesem Material in angesauerter Würze bei 38° C und mit par-
tiellem LuftabschluB ausgesat, damit Mycoderma zurücktreten und S. curvatus sich
anreichern soll.

Weil diese Hefe schnell und leicht zu Boden sinkt, sammelt man etwas von dem
Prazipitat und macht davon eine Reinkultur auf einer Würzeagar- oder Würze-
gelatineplatte.wobei die nun zahlreichvorhandenenKolonieen sich leicht zwischen den
übrigen Arten erkennen und aufheben lassen. Weil die Agglutinierung der Würze-
kulturen eine sehr vollkommene ist, und noch kraftiger sein kann als die durch Milch-
saurefermente bewirkte Agglutinierung der gewöhnlichen PreB- und Bierhefe, ist
die ganze Erscheinung eine höchst auffallende und interessante, welche sich gut für
einen Vorlesungsversuch eignet.

Obschon das Absetzen so schnell und voUstandig stattfindet, daB es sich als eine
technisch brauchbare Eigenschaft herausstellt, konnte in Versuchen in grösserem
MaBstabe die Curvatiis-^tl^ die PreBhefe nie vöUig ersetzen, weil ihre Triebkraft,
sich wenigstens in Brotteig, als etwas niedriger ergab, vielleicht weil die Verteilung
derselben in der zahen Masse auf Schwierigkeiten stöBt. Andererseits vergart diese
Hefe Maltose und Saccharose bei Laboratoriumsversuchen nahezu mit gleicher In-
tensitat wie Bier- und PreBhefe.

DaB langes Aufbewahren von PreBhefe zu einer relativen Anhaufung der Cur-
vatushfti&n führen kann, ergibt sich schon aus dem Umstande, daB im Schlamme
des Stadtgrabens zu Delft relativ leicht Curvatus-ütit zu finden ist; und daB auch
die Methode der Thermokultur, d. h. das Kultivieren bei oder oberhalb dem Tempera-
turmaximum der PreBhefe, zur Anreicherung der mehr thermophilen Hefen zum
Plervortreten von S. curvatus Veranlassung geben kann, hat sich bei vielen Kultur-
versuchen gezeigt, welche mit PreBhefen verschiedener Herkunft ausgeführt sind, und
wobei auch noch andere charakteristische Hefen entdeckt wurden, worüber j edoch
erst spater zu berichten ist.

315

Die Einwirkung von flüchtigen Giften laBt sich am besten wie folgt feststellen:
Es werden in einer Glasdose nebeneinander aufgestellt eine kleine Schale mit der zu
untersuchenden Hefe in dickbreiigem Zustande, und eine zweite Schale mit dem leicht
verdunstenden Stofif. Der Dampf verbreitet sich durch den Raum und es findet nun
ein Absterben der verschiedenen Mikrobenarten statt, in der Reihenfolge ihrer
Ernpfindlichkeit dem gewahlten Gifte gegenüber, welche Reihenfolge durchaus nicht
die namliche ist für die verschiedenen Körper. Es kamen zur Untersuchung Toluol,
Schwefelkohlenstoff, Ather, Chloroform, Alkohol, Ammon und Salzsaure, welche bei
der Einwirkung auf PreBhefe schlieBlich nur die sporenbildenden Bakterien lebendig
zurücklieBen. Die Untersuchung geschieht durch zahlreiche Prisen, welche dem
Hefebrei mit dem Platinfaden nach bestimmten Zeitintervallen entnommen werd;^n
und auf Würzegelatineplatten ausgesat werden. Werden diese richtig gewahlt, so
liiBt sich zeigen, daB die autoagglutinierende Ciirvatus-Heie sich unter dem EinfluB
der Dampfe in hollandischer Backerhefe relativ anhauft, nachdem die eigentliche
PreBhefe schon gröBtenteils abgestorben ist.

In dritter Linie habe ich hier als autoagglutinierend zu verzeichnen eine eigene
Varietat der gewöhnlichen PreBhefe selbst, welche darin früher nicht gefunden wurde,
jedoch, seitdem man bei den PreBhefefabriken das Lufthefeverfahren einführte, ein
nicht gerade seltener Komponent davon geworden ist. AuBer der Agglutination so-
wie einem etwas geringeren Vergarungsgrad (wohl infolge der schwierigeren gleich-
maBigen Verteilung in der Würze) konnte ich keine Verschiedenheiten hinsichtlich
dieser Hefe und der PreBhefe auffinden.

Als weitere sehr eigentümliche, selbstagglutinierende Art muB eine Saccharose-
hefe angeführt werden, welche weder Maltose noch Laktose vergart, die als Ver-
unreinigung von Lufthefe isoliert wurde und in meinem Laboratorium Saccharomyces
muciparus genannt wird. Diese Art ist nahe verwandt mit der früher kurz beschrie-
benen Saccharomyces fragans, einer nicht agglutinierenden, leicht kenntlichen Art,
welche als stetiger Bewohner des Sauergutes sofort die Aufmerksamkeit auf sich
zieht, dadurch, daB dieselbe (mit einer nahe verwandten Art S. disporus^)) die hohen
Temperaturen des Sauerungsverfahrens bei der Herstellung des Sauergutes, ohne
abzusterben, vertragen kami, wahrend dabei die PreBhefe selbst, die Weinhefe, die
Monilien, die Chalaren, die Oidien und die Dematien ausnahmslos absterben und nur
gewisse Mykodermen noch mit amLeben bleiben, welche letztere dem erfahrenenFor-
scher jedoch niemalsSorge machen. Ich erwahne diese verwandtschaftliche Beziehung
der Muciparus- Hefe mit S. fragans deshalb speziell, weil ich vermute, dass auch
erstere Art wohl in Sauerguten vorkommen wird, obschon ich dieselbe darin noch
nicht auffand, sondern, wie gesagt, nur in der Lufthefe.

Diese Hefe ist bemerkenswert durch ihre eigentümliche Vatiabilitat; man kann
beinahe sagen durch ihre Pleomorphie. Man findet namlich, daB alte Gelatinekulturen
sich regelmaBig in zwei durchaus verschiedene Formen spalten, namlich in eine
Ferm mit runden und elliptischen Zeilen, welche mit der Hauptform identisch ist,
und eine zweite, welche aus wahren Mycelfaden besteht. Ubrigens stimmen diese
beiden Formen in physiologischer Hinsicht nahe überein. Dennoch kann man sich

*) Diese sehr verbreitete und eigentümliche Hefe wurde vom chemischen Ingenieur
Herrn N. L. Swart entdeckt.

3i6

kaum zwei Hefearten denken, welche mehr voneinancler verschieden waren, als
Hauptform und Variante eben dieser Art. Sporenbildung ist ziemlich selten be-
obachtet, vielleicht nur deshalb, weil das früher beschriebene Verfahren '), urn die
Sporen erzeugfenden Individuen anzuhaufen, hier noch nicht angewandt wurde.

Muciparus gehort zu den kleineren Hefen, und deren elliptische Hauptform
miBt ca. 4 — 6 jo., wahrend der mycelartige Variant zwar sehr lang wird, meistens
jedoch dünn bleibt, und bei schlechten Ernahrungsverhaltnissen so dünn wie Faden-
bakterien werden kann.

Mit dieser kurzen Übersicht schlieBe ich die Betrachtung der selbstflockenden
Hefen und gehe über zur Besprechung der Erscheinung als Bakterienwirkung.

2. Hefeaggltitination diirch Symbiose mit Lactococciis.

Herr Barendrecht ist der erste gewesen, welcher eine hefeflockende
Bakterie unter dem Namen Leiiconostoc agglittiuans beschrieben hat -). AuCer
dieser gibt es noch mehrere andere agglutinierende Bakterien. Alle diese gehören zu
den aktiven Milchsaurefermenten ') der Garungsindustrie, und können in die »physio-
logischen Gattungen« Lactococcus und LactobaciUus untergebracht werden, wobei
dann der Name Leiiconostoc agglutinans in Lactococcus agglutinans zu verwandein
ist, weil es sich hier um ein Streptococciis-2t.rügts Milchsaureferment handelt, welches
mit den gewöhnlichen Laktokokken der Milchwirtschaft unzweifelhaft verwandt, ob-
schon davon verschieden ist, und z. B. aus Maltose viel mehr Saure erzeugt.

Lactococcus agglutinatis, welcher in verschiedenen Varietaten vorkommt, kann
leicht aus Lufthefe isoliert werden, worin diese Art in genügender Anzahl vor-
kommt, um in Kolonieenkulturen von Lufthefe auf Würzeplatten, welche bei 23" C
kultivert sind, sofort als kleine, ziemlich fest zusammenhangende mehr trockene als
schleimige Kolonieen zwischen den Hefen erkannt zu werden.

Hat man keine Lufthefe zur Verfügung, sondern nur gewöhnliche Handelshefe,
so ist es besser, ein Anreicherungsverfahren vorhergehen zu lassen.

Eine wissenschaftliche Anhaufung erfordert aber, daB man bekannt ist mit den
Gruppeneigenschaften der anzuhaufenden Formen. Diese sind im vorliegenden Falie
sofort anzugeben, wenn man weiB, daB unsere Bakterie zu den aktiven Milchsaure-
fermenten gehort. Diese Fermente nun haben die folgenden allgemeinen Eigenschaf-
ten: Sie können anaërob wachsen und dennoch meistens (nicht immer) durch aërobe
Plattenkulturen isoliert werden. Sie verwenden Zucker als Kohlenstoffquelle und
Pepton als Stickstofïnahrung und die optimale Wachstumstemperatur liegt für Lacto-
coccus bei ca. 30" C. Dadurch kommt man leicht zu folgendem einfachen Anhjiufungs-
verfahren: Eine gewöhnliche Stöpselflasche wird ganzlich mit durch Kochen luftfrei
gemachter Würze angefüUt, mit roher PreBhefe infiziert und im Thermostaten bei
30" C kultiviert. Schon nach 24 Stunden zeigt sich eine ziemlich starke Alkohol-
garungund aus derFlüssigkeit siehtman beim Stehen schwach agglutinierte Hefe nach

') Regeneration der Sporenbildung bei Alkoholhefen. (Centralbl. f. Bakt. Abt. II.
Bd. IV. 1898. p. 658).

-) Dieses Blatt. Bd. VII. 1901. p. 623.

•^) Essigbakterien, welche Hefe agglutinieren, gibt es nicht.

317

uiid nach untersiiiken. Die gewöhnlichen Verunreinigungen der Hefe, wie Mycodentid
und die Essigbakterien, sind durch diese erstere Kultur schon vollstandig beseitigt,
die aktiven Alkoholhefen jedoch noch nicht genügend. Um auch letzteres zu errei-
chen, wird ein Tropfen der ersten Kulturflasche in eine neue, der ersten gleiche
Flasche übergeimpft und wieder bei 30° kultiviert. Nun verschwindet die PreiBhefe
beinaheoderganzlich,undzwarbekommt man eine schwache, von Milchsaurefermenten
hervorgerufene Kohlensaureentwicklung 1^), zugleich mit einer starken Milchsaure-
bildung, welche in Würze von 12 Saccharometergraden in 3 Tagen 12 — 15 ccni pro
100 ccm betragen kann.

Wird nun hiervon auf eine Würzeagarplatte ausgesat, so entwickelt sich nach
weiteren 24 Stunden bei 30° C eine Kultur von verschiedenen Milchsaurefermenten,
worunter sich Lactococcus agglutinans in groBer oder sehr groBer Anzahl vorfindet
und sich leicht abheben laBt, indem die Kolonieen etwas schleimig sind und in einem
Stücke am Platinfaden hangen bleiben. Weil diese Eigenschaft der Schleimbildung
jedoch leicht verloren gehen kann, muB man, im Falie keine schleimigen Kolonieen
gefunden werden, einfach gut entwickelte Streptokokkenkolonieen wahlen. Die bei
diesem Versuche meistens zu gleicher Zeit auftretefiden Lactobacillen agglutinieren
nach meiner bisherigen Erfahrung nicht; um solche zu erhalten, muB ein anderer
Weg befolgt werden, worauf ich unten zurückkomme. Hier muB noch speziell darauf
hingewiesen werden, daB für die Flaschenkultur die Temperatur von ca. 30° ganz
essentiell ist, wird diese nicht eingehalten, sondern durch 40" C ersetzt, so wird
Lactococcus agglutinans vollstandig verdrangt durch das gewöhnliche Milchsiiure-
ferment derGarungsindustrie, namlich durch Lactobacülus fermentum oder dessen ab-
geleitete Form, L. Delhrücki, welche durchaus nicht zur Hefeagglutination Veran-
lassung geben.

Es braucht kaum gesagt zu werden, daB andere Materialien als PreBhefe, z. B.
die verschiedenen Grundstoffe oder Flüssigkeiten der Garungsgewerbe, Milch, Garten-
erde, Früchte u.s.w., auf dieselbe Weise für Anhaufungsversuche der agglutinierenden
Kokken verwendet werden können, wie die PreBhefe selbst. Man kommt dabei zu
dem Resultate, daB. diese Mikroben keine weitere Verbreitung besitzen und am sicher-
sten, auBer aus Hefe, aus garenden Würzen der verschiedensten Herkunft isoliert
werden können.

Nimmt man den Namen Lactococcus agglutinans in der weitesten, man könnte
sagen L i n n é schen Speciesfassung, so gehören dazu alle in Würze viel Milchsaure
produzierenden Lactokokken, welche wohl mit Maltose, aber nicht mit Milchzucker
wachsen und sich deshalb in Milch nicht entwickeln. Dennoch ist nicht daran zu
zweifeln, daB sie mit den gewöhnlichen Kokken der Milch- und Rahmsauerung, nam-
lich Lactococcus lactis, sowie mit dem Fermente der „lange Wei", Lactococcus Iiol-
landicus, nahe verwandt sind.

Eine sehr wichtige Eigenschaft von L. agglutinans besteht darin, daB beim

*) Merkwürdigerweise handelt es sich hierbei um eine Alkoholgarung, so daB diese
Milchsaurefermente zugleich Alkoholfermente sind. Auf diesen Umstand wird spater
mit analytischen Belegen zurückgekommen werden, und zwar in Verbindung mit der
Mannitbildung aus Lavulose, welcher Vorgang für die Milchsaurefermente ebcnfails
charakteristisch ist.

3i8

Aufbewahren der Kuituren auf Würzeagar bei Luftzutritt das Vermogen, Hefe zu
agglutinieren, nach einigen Wochen verloren geht, bei Z immer temperatur z. B.
schon nach 3 Wochen oder bei gewissen Varietaten nach ein paar Monaten. AuBer-
lich haben die Kolonieen sich dabei nicht abgeandert und auch die Saurebildung
kimn ungeschwacht sein, nur bemerkt man, daB die schleimbildenden Varietaten,
deren Kolonieen von den Platten leicht in einem Stücke entfernt werden können, auch
diese Eigenschaft verloren haben und ganz weich und halbflüssig fortwachsen,
wodurch sie groBe Analogie mit dem Lactococcus hollandicus zeigen, welcher eben-
falls sehr leicht das Vermogen der Schleimbildung verliert. Auch die Ursache des
Verlustes ist in beiden Fallen dieselbe, namlich Kultur bei zu hoher Temperatur
und bei zu reichlicher Lüftung. Schrankt man den Luftzutritt und die Warme ge-
nügend ein, z. B. durch Kultur im Keiler in geschlossenen, ganzlich angefüllten
Flaschen, so bleibt das Agglutinierungsvermögen unverandert fortbestehen, eben wie
das Vermogen der Schleimbildung bei der ,, lange Wei", weshalb einiger Grund vor-
liegt, die Agglutinierung auf Schleimbildung seitens der Bakterien zurückzuführen.
W^eil aber manche Hefe stark agglutinierende Bakterien ganz weiche Kolonieen er-
zeugen und niemals als fadenziehende Kuituren erhalten werden, muB dann auch ge-
schlossen werden, daB in letzterem Falie die Schleimbildung ebensosehr unter dem
EinfluB der Hefe steht, wie unter dem der Bakterie selbst.

Ein anderes und sehr einfaches Verfahren, um L. agglutinans, vor dem Verlust
des Agglutinationsvermögens zu schützen, besteht darin, daB man die Kuituren auf
Würzeagar an der Luft zusammen mit reinkultivierter PreBhefe aufbewahrt, das Ge-
misch beider Mikroben auch als solches überimpft, und zwar auf die gewöhnliche
Weise als Kuituren in Reagenzröhrchen. Schon jetzt weiB ich, daB bei diesem Ver-
fahren, wenigstens wahrend eines ganzen Jahres (ich vermute auch viel langer), keine
Verminderung des Agglutinationsvermögens stattzufinden braucht.
In dieser Beziehung mag noch folgendes bemerkt werden:

Das Verhalten von L. agglutinans zur PreBhefe ist ein sehr bemerkenswertes,
auch bei der symbiotischen Kultur beider Mikroben auf festem Boden, wo von Ag-
glutination natürlich keine Rede sein kann. Es stellt sich namlich heraus, daB unsere
Bakterie mit ganz auffallender Leichtigkeit durch die wachsenden Hefekolonieen
selber fortwachst (beweglich sind die Milchsaurefermente niemals), so daB man nur
selten halb mit L. agglutinans infizierte Hefekolonieen antrifft, wie das bei Essig-
bokterien und anderen Milchsaurefermenten, weiche bei Aussaaten von Rohhefen mit
auf den Platten wachsen, so oft vorkommt, sondern gewöhnlich überall in der Kolonie
auch die Bakterie findet. Merkwürdiger noch wird dieser Umstand dadurch, daB man
in manchen Fallen die mit L. agglutinans zufallig infizierten Kolonieen sofort erken-
nen kann an ihrer stark ausgepragten und sehr frühzeitig sichtbar werdenden ge-
krauselten Oberflache, wodurch es bisvveilen möglich ist, z. B. aus Lufthefe, weiche
als Streukultur auf Würzeagarplatten ausgesat ist, beide Symbionten zusammen ab-
zuheben und weiter zu kultiveren. Es muB hier besonders betont werden, daB dieses
Verfahren nur gelingt bei der Verwendung von Agarboden, und auf Gelatineplatten
kein Resultat geben kann, weil darauf die Erscheinung viel weniger deutlich ist. Die
Krauselung solcher Kolonieen beruht in erster Linie auf einer ungewöhnlichen Lange,
weiche die Hefezellen erreichen und weiche Veranlassung gibt zum UnregelmaBig-
werden der Oberflache infolge der schwierigeren Verschiebuiig l.ïnglicher wie runder

3ï9

Körper, welche einander seitlich drücken. Zwar krauseln die Kolonieen der PreBhefe
sich bekanntlich immer, wenn sie alt werden, hier gibt es jedoch eine Krauselung
der symbiotischen Kolonieen zu einer Zeit, wenn die reinen, auf Würzeagar wach-
senden Hefekolonieen noch ganz glatt und feuchtglanzend sind. Handelt es sich um
eine starke Agglutination verursachende Lactococcus-V arïetat, so kann die Erschei-
nung sehr aufïallend werden, und darum ein schönes Beispiel abgeben für makro-
skopische und mikroskopische Formveranderung eines Lebewesens durch Zusam-
menwachsen mit einem anderen. Zu gleicher Zeit liegt darin ein gutes Merkmal, um
stark agglutinierende Formen unserer Bakterie zu erhalten, obschon bemerkt werden
muB, daB die Krauselungserscheinung auch bei vielen Hefekolonieen, welche ganz
rein sind, so ausgepragt hervortreten kann, daB dadurch vollkommene Nachahmung
der mit Agglutinans infizierten Kolonieen entsteht.

Die ErklJirung der Krauselung infolge der Symbiose dürfte vielleicht darin be-
stehen, daB L. agglutinans die Wand der Hefezellen einigermaBen angreift, teilweise
in Schleim überführt und so zu einem Dünnerwerden derselben Veranlassung gibt.
Bei gleichem Turgordruck werden solche Zeilen leichter wachsen, und wenn ihre
Enden mehr nachgeben, wird ihre Mitte sich dabei verlangern. Wie diese Erwei-
chung jedoch geschieht, ist noch nicht aufgeklart, vielleicht durch ein unbekanntes,
durch L. agglutinans erzeugtes Enzym; sicher ist, daB Saurebildung dafür nicht aus-
reicht, denn einerseits laBt sich durch künstliche Zufügung von Saure nichts Be-
sonderes erreichen und andererseits gibt es Milchsaurefermente, welche noch mehr
Saure wie L. agglutinans erzeugen, und dennoch bei der Symbiose mit PreBhefe die
Koloniestruktur nicht abJindern.

Da L. agglutinans viele Hefezellen zum langsamen Absterben bringt, verflüssigen
Hefekolonieen und Striche, welche mit L. agglutinans infiziert sind, die Würze-
gelatine, worauf sie wachsen, sehr viel früher wie die nicht infizierten. Dieses ist
also ganz in Übereinstimmung mit der früher von mir angebenen Tatsache, daB die
Proteolyse durch Alkoholhefe ein nekrobiotischer Vorgang ist.

Alle untersuchten Alkoholhefen werden durch unsere Bakterie mehr oder
w eniger vollkommen agglutiniert, so auBer der PreBhefe die Oberhefe der Brauereien,
die Weinhefen, Saccharomyces fragrans, S. apiaüatus, S. Liidzvigi, ScJiisosaccharo-
mvces Pomhe.

3- Agglutinierende Lactobacillen.

Es wurde schon gesagt, daB es auch Arten von Lactobacillus gibt, welche Hefe-
agglutination hervorrufen kunnen. Man kann dieselben auf verschiedene Weise er-
halten, besonders dadurch, daB man PreBhefe in einem warmen Zimmer verderben
laBt, wobei bekanntlich einige Lactobacillen als aktive Verderbnismikroben auftreten.
Um diese zu isolieren, bringt man die verdorbene Hefe bei LuftabschluB in eine
ganzlich mit Würze angefüUte Stöpselflasche, welche man dann in den Thermostaten
stellt. Kultiviert man bei 37" oder höher, so entwickeln sich neben Lactobacillus
fermenttifn und L. Delbrücki noch andere Arten, wovon eine bei der Aussaat der
Rohkultur aus der Flasche auf Würzeagar zwischen den vielen Kolonieen letztge-
nannter Art leicht aufzufinden ist durch die eigentümliche, dichte, nicht schleimige
Konsistenz der Kolonieen, welche in ihrer Mitte etwas vertieft, am Rande nach oben

320

gebogen sind. Diese bestehen aus kurzen rechten Stabchen, und bei der Kultur in
Würze zusammen mit PreB-, Bier- oder Weinhefe geben sie zu starker Agglutination
Veranlassung. Man kann die Art auch ziemlich viel in garenden PreBhefenmaischen
finden, und wegen der eigentümlichen Konsistenz der Kolonieen nannte ich dieselbe
Lactobacillus densus.

Infiziert man eine mit Würze ganzlich angefüllte Stöpselflasche wie vorgehend
mit verdorbener PreBhefe und kultiviert bei 33°, anstatt bei 37", so erhalt man neben
wenig Lactococcus agglutinans, welcher bei dieser hohen Temperatur zu degene-
rieren anfangt, zwar ebenfalls ein Gemisch von verschiedenen Lactohacillen, aber in
dieser ersten Rohkultur ist L. fermentum nicht mehr Hauptform; Reinkulturen auf
Würzeagarplatten zeigen, daB dabei, neben L. detisus, oft eine höchst eigentümliche
Art, welche ich schon früher als Lactobacillus conglomeratus beschrieben habe, die
Hauptrolle spielen kann, wenn sie auch nicht immer gegenwartig ist^). Diese Art
ist leicht kenntlich durch den eigentümlichen sauerlich-widerlichen Geruch ihrer
Kuituren in Würze und an der höchst eigentümlichen Form, welche die Stabchen, bei
hohen Temperaturen und starker Lüftung kultiviert, annehmen. Koloniën auf Würze-
agar bei 40" C bestehen namlich aus Klumpen so wunderlich in- und aneinander-
gestellter Stabchen, Kokken und Faden, daB man kaum meint, eine Bakterienkultur
vor sich zu sehen, was eben zur Aufstellung des Artnamens veranlaBte. Bei niederen
Temperaturen zeigen die Kuituren in Würze die Form gewöhnlicher Stabchen und
Faden, wie die anderen Lactobacillenarten, mit denen sie auch durch die betrachtlich
intensive Milchsaurebildung übereinstimmt.

Für den gegenwartigen Zweck ist diese Art von besonderem Interesse, weil das
Agglutinationsvermögen derselben bezüglich aller untersuchten Hefearten sehr stark
ausgebildet ist, und ihre Reinkulturen in Würze an und für sich ebenfalls eine kraf-
tige Agglutination anzeigen, durch welche letztere Eigenschaft sie unter den mir be-
kannten Lactobacillenarten einzig dasteht. Weil sie überdies, in Würze, in ge-
schlossener Flasche kultiviert, zu einer ziemlich kraftigen Kohlensaureentwicklung
Veranlassung gibt, gehort dieselbe zu den gut charakterisierten Formen.

Obgleich ein Stamm dieser Art schon mehrere Jahre in Reinkulturen auf Würze-
agar fortgeimpft wurde, hat derselbe das Agglutinationsvermögen unveriindert bei-
behalten, abweichend also von den so variablen Laktokokken. Doch geht das Ver-
mogen der Kohlensaurebildung schlieBlich verloren.

Keine andere Art ist so sehr wie diese zu empfehlen für Vorlesungsversuche
über Hefeagglutination. Solche, wie überhaupt alle auf Agglutination bezüglichen
Versuche werden am einfachsten mit gewöhnlichen, mit Wattepfropfen geschlossenen
und zu einem Drittel oder Viertel mit Würze von lo" B. gefüUten Reagenzröhren vor-
genommen, worin die reinkultivierten Hefen samt den agglutinierenden Fermenten

') Ein niemals fehlendes Anhaufungsverfahren für diese Art, welche in verfaulter
Hefe so allgemein ist, kann ich noch nicht geben, doch glaube ich, daB jemand, der
sich mit den verschiedenen Versuchen, welche auf Lactobacillen führen, genügend ver-
traut gemacht hat, wohl die richtige Spur finden wird, um diese und einige andere
typische Formen der sauren Faulnis in »natürlicher Reinzucht« zu erhalten. Es ist
zu bedauern, daB Henneberg in seiner mühevollen Arbeit über Milchsaurefermente
(Zeitschr. f. Spiritusindustrie. 1903. No. 22) sich mit der so aussichtsvollen Frage der
Anhaufung nur so wenig beschaftigt hat.

321

geinipft und bei 30" C kultiviert werden; nach 2 oder höchstens 3 Tagen ist die
Agglutination am deutlichsten.

Kocht man Würzekulturen reiner agglutinierender Bakterien, so ergibt sich, daö
nachtraglich darin ausgesate Hefe vorzüglich wachst, jedoch nicht agglutiniert.

4. Kolonieenzüchtung in üüssigen Ndhrmedien.

Wenn man in groBe Glasdosen mit vollstandig ebenem Boden*), welche auf einer
schwarzen, ebenen Tischplatte genau horizontal aufgestellt sind, eirte dunne Schicht
einer geeigneten Nahrflüssigkeit bringt, worin die zu kultivierenden Keime in sehr
groBer Verdünnung suspendiert sind, so laBt sich leicht einsehen, daB, wenn vollstan-
dige Ruhe herrscht, die Keime sich, je nachdem sie zu beweglichen oder unbeweg-
lichen Arten gehören, zu Schwarmen oder Kolonieen ausbilden, welche kürzer oder
langer frei nebeneinander liegen und dann leicht in reinem Zustande übergeimpft
werden können. Das Verfahren wurde zunachst verwendet für die Reinkultur von
Spirillen, wobei man bezüglich des Gelatineverfahrens auf Schwierigkeiten stöBt,
und ist besonders geeignet für das Auffinden der flockenbildenden Hefen, sowie für
die Untersuchung von Hefen im allgemeinen.

Bei den beweglichen Bakterien kann es vorteilhaft sein, der Kulturflüssigkeit
zum Zwecke der Verdickung eine geringe Menge, z. B. ^/lo Proz., Gelatine oder Ir-
landisches Moos beizugeben, damit keine Konvektionsströme stattfinden können, doch
ist das bei richtiger Ausführung des Versuches nicht notwendig, welche Bemerkung
natürlich auch für die Hefekultur gilt. An dieser Stelle soll nur über letztere ge-
sprochen werden, und ich nehme als Beispiel die Untersuchung von PreBhefe.

Die dazu verwendete Nahrflüssigkeit ist wieder Würze, welche also entweder
wohl oder nicht mit einer Spur Gelatine versetzt, und worin das zu untersuchende
Material genügend verdünnt suspendiert ist. Die Keime sinken bald zu Boden oder
bleiben suspendiert und entwickeln sich zu Kolonieen, welche allerdings auf dem Bo-
den zu kleinen, scharf begrenzten, zirkelrunden Feldern auseinander fallen infolge
ihrer Schwere. Auch die Milchsaurefermente, welche immer unbeweglich sind, ver-
halten sich ahnlich. Nur gewisse Essigbakterien können sich von der Stelle fort-
bewegen, und sind eben daran kenntlich; aber auch die meisten Essigbakterien sind
nicht beweglich, und bekanntlich sind dieselben in PreBhefen ziemlich selten. Die
Aërobakterarten (wie Coli und Aërogenes) sind in PreBhefe zwar immer gegen-
wartig, aber so vereinzelt, daB man dieselben bei der hier in Betracht kommenden
Verdünnung nicht bemerkt, und nur durch geeignete Anhaufungsverfahren nach-
weisen kann.

Wenn es sich nun um den Nachweis der agglutinierten Kolonieen handelt, so
wird wie folgt verfahren: Zunachst sei bemerkt, daB dieselben, wenn auch nicht ge-

*) Dieselben werden dem hiesigen Laboratorium geliefert durch Herrn Instrumenten-
handler Giltay in Delft. Hat man keine Dosen mit ebenem Boden, so kann man
diese dadurch herstellen, daB man auf den unebenen Boden der gewöhnlichen Glas-
schalen eine dunne Schicht einer konzentrierten Lösung von Agar in Wasser ausgicBt,
welche man erstarren laBt. Dieselben sind jedoch nicht für alle Zwecke brauchbar,
z. B. können sie nicht verwendet werden für Algenkulturen. Dafür muB man den Agar
durch Kieselsaure ersetzen.

M. W. Beij erinck. Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 21

322

rade selten, doch durchaus nicht allgemeiii sind ; deshalb muB die Verdünnung nicht
zu weit getrieben werden und z. B. ein paar Tausend Kolonieen auf 2 dm^ Boden-
flache zur Untersuchung kommen. Diese Untersuchung ist eine sehr einfache und
besteht darin, daB man mit der gröBten Vorsicht die Kulturtlüssigkeit von den am
Boden liegenden Kolonieen abgieBt. Tut man dieses unvorsichtig, so sieht man natür-
lich gar nichts; geschieht es jedoch ruhig und langsam, so flieBen alle gewöhnlichen
Formen mit der Flüssigkeit ab, wahrend alles, was agglutiniert ist, entweder an
der Stelle bleibt, oder beim AbflieBen als zusammenhangende Flocken sofort kennbar
ist, mit dem Platinfaden aufgehoben und durch Ubertragen in Uhrglaser mit reiner
Würze oder mit Wasser von den anhangenden Mikroben befreit werden kann. Die
auf dem Glasboden zurückgebliebenen agglutinierenden Kolonieen können ebenfalls
durch vorsichtiges Abspülen leicht genügend gereinigt werden, um beim nun folgen-
den Abstreichen auf Würzegelatine Striche zu erzeugen, entweder der Autoagglutina-
toren S. curvatus, S. muciparus und der Flockvarietat der PreBhefe selbst, oder der
durch Lactococcus agglutinans, und viel seltener durch Lactobacillus densus und
Lactobacillus conglomeratus symbiotisch agglutinierenden gewöhnlichen Art.

Weil die Flockenbildung auch in industriellen Betrieben stattfindet, kann man aus
gewöhnlicher, im Laden gekaufter PreBhefe auf folgende einfache Weise symbiotisch
agglutinierende Kolonieen erhalten: Man schüttelt die Hef e mit Wasser auf, laBt ab-
setzen und gieBt das Wasser mit der oberen Hefeschicht ab; der Bodensatz wird aufs
Neue aufgeschüttelt und absetzen gelassen, es wird aufs Neue abgegossen und diese
Manipulation wird einige Male wiederholt. SchlieBlich gieBt man den Rückstand in
eine Glasdose, welche auf einem schwarzen Tische steht. Man bemerkt dann mit einer
schwachen Lupe sehr leicht, daB zwischen den losen Hefezellen schleimige Flocken
umhertreiben, welche mit dem Faden aufgehoben, abgewaschen und auf Würzeagar-
platten abgestrichen werden. So bekommt man leicht Einzelkolonieen von agglutinie-
renden Lactobacillen und Lactokokken und auch, wenn auch viel seltener, Kolonieen
von 5". curvatus und von autoagglutinierender PreBhefe selbst,

5. Nachweis von Unterhefe und Oberhefe nebeneinander.

Es ist klar, daB man durch das im vorigen Abschnitt beschriebene Verfahren
Ober- und Unterhefe nebeneinander quantitativ bestimmen kann. Die Agglutination
der Unterhefe ist aber eine so vollstandige, daB man in diesem Falie auch noch auf
folgende Weise auskommen kann: Anstatt flüssiger Nahrmedien macht man auf die
gewöhnliche Weise eine Streukultur des zu untersuchenden Gemisches auf der Ober-
flache einer Würzeagarplatte, wozu die Hefe in Wasser aufgeschüttelt und dann, nach
richtiger Verdünnung, auf die Agarplatte gegossen und wieder abgegossen wird, wo-
durch eine genügende Zellenzahl am Agar festgeklebt zurückbleibt. Durch vorsich-
tiges Erwarmen laBt man die Platte abtrocknen und kultiviert bei 30" C. Wenn die
Kolonieen entwickelt sind, werden sie gezahlt. Dann wird vorsichtig mit Wasser
übergossen, welches die Oberhefekolonieen auflöst und die agglutinierenden Unter-
hefekolonieen zurücklaBt, wodurch letztere allein bestimmt werden können und wobei
man nach einiger Übung sehr gute Resultate erhalt.

Da es erwünscht ist, solche Versuche auf anderem Wege kontrollieren zu kön-
nen, mag hier noch ein anderes Verfahren erwiihnt werden, um den gleichen Zweck

323

zu erreichen, namlich vermittelst der auxaiiographischen Methode, welche iii diesem
Falie wie folgt angewendet wird:

Man suspendiere in Fleischbouillon- oder in Hefewassergelatine, welche, um
nicht allzu fest zu werden, nur 7 Proz. Gelatine enthalt, das Hefematerial, und zwar
in solcher Verdünnung, daB die sich entwickelnden Kolonieen gezahlt werden kunnen.
Man gieBe sie in eine Glasdose und lege nun nach dem Erstarren an der einen Seite
der Dose auf die Oberflache der Gelatine ein wenig Melibiose und, soweit möglich
davon entfernt an der anderen Seite etwas Glukose. Der in einem Zirkelfelde sich
durch Difïusion verbreitende Zucker erzeugt nun in der bekannten Weise Auxano-
gramme. lm Melibioseauxanogramm finden sich aber nur Unterhefekolonieen, wah-
rend im Glukoseauxanogramm Ober- und Unterhefe beide zur Entwicklung kommen,
welche nun leicht abgezahlt werden können.

Bei einem solchen Versuche verwendet man keine lo-proz. Gelatine, weil die
Harte des Bodens das Hefewachstum behindert, besonders von der Oberhefe.

Nach dem Abzahlen der Kolonieen überzeuge man sich, ob in den Zwischen-
riiumen zwischen denselben nicht gewachsene Hefezellen vorkommen, was natürlich
einige mikroskopische Übung voraussetzt.

In mit Unterhefe versetzter PreBhefe kann man durch die Melibiosemethode
auch ziemlich genau die Unterhefe quantitativ bestimmen, weil weder die PreBhefe
selbst, noch S. curvatus, S fragrans, S. muciparus und S. mycoderma mit Melibiose
wachsen, sich also in dieser Beziehung wie Oberhefe betragen.

Influence des températures absolues de 82 et

20 degrés centrigrades sur la vitalité

des microbes

Recherches faites au Laboratoire microbiologique de Delft et au
Laboratoire cryogène de Leyde.

Par M. W. BEIJERINCK de Delft et H. C. JACOBSEN de Delft.
Premier congres international du froid, Paris, 1908.

Bien que quelques expérimentateurs se soient déja occupés de rechercher si
les microbes peuvent conserver leur vitalité a des températures tres basses,
de nouvelles études, distinées a résoudre les problèmes fondamentaux que présente
cette question insuffisamment approfondie, ne seront certainement pas superflues.

Les mémorables recherches de L. Pasteur ont définitivement résolu la
question de la génération spontanée et nous savons que les germes, connus a
présent, ne peuvent naitre que d'autres germes. Sans doute, la connaissance des
microbes, si imparfaite encore, doit nous faire croire a la possibilité et même a
la probabilité de l'existence actuelle ou antérieure de formes plus simples, dont
la réalité a jusqu'ici échappé a toutes les tentatives scientifïques faites pour la
démontrer, et qui, par une longue série, lentement graduée, enchainerait Ie monde
vivant a la matière organique non vivante. L'état imparfait de nos connaissances
nous oblige a examiner toutes les hypotheses capables d'amener la solution du grand
problème qui se présente ici. Parmi ces hypotheses, celle de l'origine extra-tellu-
rique de la vie mérite une attention particuliere, tant a cause de l'importance
pratique qui s'attacherait a sa vérification qu'a cause de son caractère purement
philosophique.

Richter^) et plus tard Helmholtz (1876) en Allemagne et William
Thomson en Angleterre (1871) avaient admis, il y a longtemps déja, que des
germes vivants pouvaient être apportés a la terre par des météorolithes. Cohn
a repris la question et a émis l'hypothèse que les poussières atmosphériques
pourraient quitter la terre et, après leur parcours a travers l'espace, aborder a
d'autres corps célestes, peut-être stériles jusque-la, et les peupler de la même
maniere que la terre l'aurait été elle-même autrefois.

') Dr. Schmidt's Jahrbuccher fuer die ges. Alcdicin, Bd. 126, p. 248, 1865: Bd. 151
p. 321, 1871.

325

Récemment, la valeur de cette hypothese a été renforcée par les expériences de
plusieurs savants et plus particulièrement par les recherches approfondies de
M. Arr h énius.

M. Arrhénius a démontré que des particules de la grosseur des germes
microbiens a 1 etat sec, peuvent être mises en mouvement dans Ie vide par les
radiations lumineuses et acquérir une vitesse considérable. De plus, il a démontré
la vraisemblance de l'existence de forces électriques, qui pourraient entrainer ces
particules non seulement hors de notre atmosphère, mais hors de Ia sphère
d'attraction du globe terrestre dans l'espace, oü la lumière s'en empare et les fait
voyager vers d'autres corps célestes. Ces considérations, qui viennent a l'appui
du panspermisme cosmique, nous amènent a rechercher quels sont les organismes,
connus a présent, qui pourraient conserver leur vitalité, sous les conditions par-
ticulières oü ils seraient places, s'ils quittaient notre terre. Ces conditions sont
principalement les suivantes: température basse, peu supérieure au zéro absolu;
absence totale d'eau, au moins a l'état liquide; absence totale d'oxygène, rendant
impossible la fonction respiratoire aérobie.

En ce qui concerne l'humidité, il semble a présent démontré que même les
semences des végétaux supérieurs, tels que Ie blé, l'orge et Ie trèfle, conservent
leur vitalité dans une atmosphère si sèche, que Ie spectroscope n'y décèle aucune
tracé de vapeur d'eau. Certaines spores de bactéries resistent aussi, parfaitement
bien, a une dessication absolue opéré a des températures ordinaires. On peut
donc admettre que ce ne serait pas la dessiccation qui pourrait détruire les germes
après qu'ils auraient quitte notre planète.

L'influence des basses températures, considérée en soi, est, d'après nos ex-
périences, plutót favorable que nuisible a la conservation de la vitalité, comme
Ie prouve Ie fait suivant: Les bactéries lumineuses a une température ordinaire
sont tres sensibles a la dessiccation ; une culture, absorbée par du papier buvard,
perd rapidement au dessèchement sa luminosité et les bactéries ne sont plus
cultivables. Tout au contraire, a la température de l'air et de l'hydrogène liquides,
qui, par la réfrigération de l'eau, sont, elles aussi, accompagnées d'une dessicca-
tion complete, la vitalité n'est aucunement altérée pour Ie Photobacter plwsphorescens
et n'est que légèrement et passagèrement influencée pour Ie Ph. hidicum. Il est
donc évident que les basses températures protègent les bactéries contre les influ-
ences nocives qui accompagnent la dessication a la température ordinaire. On
ignore la nature précise de cette influence, mais dans toute culture de microbes
il existe des produits d'excrétion, dont la toxicité pour ces organismes est bien
connue et qui se manifeste en certains cas par la liquéfaction du protoplasme
des microbes. Bien avant la visibilité du phénomène limite, l'action d'une influence
pernicieuse ne semble pas exclue. Il en est de même pour les températures supé-
rieures qui activent les réactions chimiques de toute nature et, sans doute aussi,
la toxicité microbienne qui, au fond, doit être quelque réaction chimique entre
les molécules de forme complexe.

Les levures aussi, quoique tres sensibles a la dessiccation a température
ordinaire, resistent assez bien aux basses températures et leurs spores semblent
même rester absolument indemnes au dessèchement dans l'air liquide.

Quant a la possibilité de l'existence d'une vie latente totalement anaérobie

326

et pour un temps presque illimité, rien ne semble s'y opposer; au contraire, Ia
présence d'oxygène semble parfaitement superflue dans de telles conditions, toutes
traces de respiration et de phénomènes biologiques en général étant absolument
exclues.

On verra d'autre part, par les recherches qui seront exposées dans les pages
suivantes, de nouvelles preuves de l'indifférence absolue de beaucoup de germes
a l'cgard des tres basses températures, oü toute activité vitale semble supprimée.
Les résultats de ces recherches donnent un caractère scientifique incontestable a
la theorie du panspermisme cosmique et permettent d'entrevoir les conséquences
importantes qui résulteraient du développement sur notre planète de germes
provenant du dehors. Mais en outre de cette theorie d'ordre spéculatif, notre
sujet présente encore une grande importance a un point de vue purement pratique;
il nous a donc semble, a ce doublé point de vue, d'un intérêt réel d'utiliser les
facilités qui nous ont été offertes par M. Ka m e r li n gh On nes dans Ie labo-
ratoire cryogène de Leyde pour completer nos études sur ce sujet. Toutes les
expériences suivantes mettant en tx'uvre les basses températures ont eu lieu a
Leyde, tandis que les cultures de bactéries s'effectuaient au Laboratoire micro-
biologique de l'Université Technique de Delft.

Quelques expériences préliminaires faites avec l'air liquide ( — 191 degrés
centrigrades) commencées Ie 22 novembre 1907, nous permirent d'acquérir une
certaine habileté expérimentale. Les premières recherches portèrent sur des bac-
téries ordinaires qui se trouvent dans Ie lait ordinaire, Ie ferment lactique du
lait acidifié spontanément a température moyenne (Lactococliis) sur des Phoiobac-
terium phosphorescefis de poissons lumineux ne liquéfiant pas la gelatine, sur la
Chlorella vulgaris appartenant aux Chlorophycées, sur un N'ostoc et sur un Ana-
b(Bfia, tous deux des Cyanophycées, les deux dernières en culture impure, conte-
nant, en outre, des Chlorophycées et des Bactéries. La réfrigération ne dura que
peu de temps, il s'écoula quinze minutes entre l'instant oü la congélation dans l'air
liquide fut complete jusqu'au moment oü la culture en fut retirée.

Tout d'abord on constata que les éprouvettes de gelatine trop remplies et
dont Ie contenu était verticalement ou obliquement solidifié ne pouyaient être
employees, car elles éclataient toutes par la dilatation de la masse interne qui
se congelait en dernier lieu. C'est pourquoi, dans tous les cas oü il s'agissait de
cultures sur gelatine, on se servit dés lors d'éprouvettes contenant seulement
une couche tres mince de gelatine. La congélation dans des tubes incomplète-
ment remplis de liquide ou de gelatine, tels que Ie fond restait en partie décou-
vert. n'offrait pas non plus de difficultés. Il fallait seulement prendre soin d'o-
pérer la liquéfaction tres lentement ou tres rapidement, suivant Ie cas, afin que
la masse déja fondue ne put se congeler de nouveau, ce qui, par la dilatation
qui en aurait été la conséquence, eüt infailliblement fait briser l'éprouvette. Pour
hater la liquéfaction dans la partie supérieure de la masse congelée, on versait
sur les tubes de Talcool ou du pétrole, c'est-a-dire des liquides a chaleur spéci-
fique bien supérieure a celle de l'air. Les éprouvettes contenant les 10 centimètres
cubes de la culture destinée a l'expérience et appartenant au groupe des micro-
bes aérobies, étaient suspendües a l'intérieur de chambres de De war, remplies
d'air liquide.

327

Les résultats de ces expériences préliminaires furent les suivants:

Lait ordinaire du marché 15 minutes a — 191 degrés centigrades, au début
et a la fin de la réfrigération ensemencée sur du petit lait gelatine: ni Ie nombre
des colonies ni celui des espèces n'avaient subi de changements appréciables.

Acidijication dans Ie lait brut. Deux portions de 50 centimètres cubes de lait
stérilisé avaient été mêlées, Tune avec i centimètre cube de lait ordinaire du
marché, frais, et l'autre avec i centimètre cube de ce mème lait après réfrigé-
ration (15 minutes a — 193 degrés centigrades), et puis cultivées pendant cinq
jours a 30 degrés centigrades. Le titre en acide, déterminé avec de l'alcali nor-
mal, était alors: pour la première portion 10'^'"^, 4; pour l'autre, I0'^'"'\ i ; il
s'était donc produit une légere diminution par suite du froid.

Acidijication par le Lactococcus, réfrigérée ou non réfrigérée.
Elle ne montrait pas non plus de modifications considérables.
Il était cependant a remarquer, que le lait stérilisé mis en
présence de ce lait brut réfrigéré ne donnait que de rares
colonies 6! Oïdium lactis et de levure de lactase, tandis que, avec
le même lait non traite, il s'en produisait un grand nombre.
Il est donc évident que ces derniers microbes ne supportent
la réfrigération que difïicilement.

Photobacter phosphorescens. Cultivé sur de la gelatine de
poisson, ce microbe fut mis en suspension dans de l'eau

de mer et examiné par la methode de culture sur le sub- „ ,, ,,

Ballon d essai
stratum indiqué avant et après la réfrigération (15 minutes contenantlaculture
a — 193 degrés centigrades) : on ne constata pas de dififérences. réfrigérée.

Chlorella vulgaris, peut-être la forme la plus primitive de
toutes les Chlorophycées, cultivée en des conditions tres di-

verses, après une réfrigération de 15 minutes a — 193 degrés centigrades, ne pré-
senta aucun changement appréciable.

Mais il en fut différemment pour \' AnabcEfia et pour le Nostoc, deux genres
de Cyanophycées qui, dans les mêmes conditions, se comportèrent de faqon toute
autre: la plupart des germes, dans cette expérience, périrent. De plus, les cul-
tures réfrigérées, cultivées a la lumière dans de l'eau de conduite a 0,05 pro cent
d'azotate d'ammoniaque et 0,05 pro cent de biphosphate de potasse, tardent tres
longtemps a se développer en comparaison avec les cultures ordinaires.

Ainsi donc, les résultats de ces premières expériences montrent que ni la
Chlorella, ni les bactéries n'étaient altérées par une réfrigération de 15 minuteS
a — 191 degrés centigrades, tandis que les Nostoc, les Anabcena, VOïdium lactis et
la levure de lactase étaient partiellement détruites.

Le 29 novembre 1907, une nouvelle série de recherches fut entreprise oü
l'influence de l'air liquide fut plus longtemps appliquée, et oü l'on se servit en
outre d'hydrogène liquide.

Afin que l'hydrogène, qui s'évaporait sous l'action d'une pompe d'aspiration,
fut aussi peu que possible dépurifié d'air, les microbes étaient enfermés dans des
ballons d'essai terminés par un chrochet pour y fixer un fil de cuivre (Voir
la figure ci-contre). Les résultats de ces recherches sont donnés par le tableau
suivant :

328

Expériences faites avec de 1'air Expériences faites avec de Fhy-

liquide, lo heures a — 193 degrés drogène liquide, 45 minutes a —

centigrades. 253 degrés centigrades.

Laii ordinaire du marché examiné sur de la gelatine au petit lait avant et apr'es la

réfrigération.

Nombre de colonies par centimètre Nombre de colonies non altere,

cube twn altéré.

Lait acidifié.

Recherche du nombre de Lactococcus sur de la gelatine au petit lait.
Nombre de colonies par centimètre Nombre de colonies non altéré.

cube non altéré.

Photobacter phosphorescens et Ph. indicuvi.
Examinés sur de la gelatine ou de l'agar au bouillon de poisson
et dans du bouillon liquide.
Pendant Ie transport a Delft l'in- Jdetn.

tensité de la phosphorescence des tubes
fut diminuée, mais elle se rétablit plus
tard. Le nombre de colonies n'etait
pas changé.

Expériences faites avec de l'air Expériences faites avec de l'hy-

liquide, 10 heures a — 192 degrés drogène liquide, 45 minutes a —

centigrades. 253 degrés centigrades.

Chlorella vulgaris, examinée sur de la gelatine au mout.

Beaucoup de cellules sont mortes; on lei de même on trouve un certain

les retrouvefacilement parmiles colonies. nombre de cellules mortes.

Levure pressée, examinée sur du mout gélatinisé.

La levure était détruite pour envi- Détruite pour une grande partie

ron 95 pro cent; les cellules mortes mais il en survivait 10 pro cent, donc

se colorent en bleu par le bleu de plus que dans l'air liquide,
méthylène.

Spores de Mucor racemosus. Réfrigération des spores en suspension dans de l'eau et
examinées par cultures en colonies sur du mout gélatinisé.

Le nombre des colonies reste iden- Idem.

tique avant et après le refroidissement,

Spores d' Aspergillus niger.
Comme dans le cas precedent. Idem.

Anabcena et Nostoc. Les cultures placées dans une solution nutritive.
Toutes les cellules détruites. Idem.

329

Les résultats de cette deuxième série d'expériences ont donc été analogues
a ceux de la première. Les bactéries communes du lait, Lactococcus et les bac-
téries lumineuses resistent a la réfrigération, de même que les spores de moisis-
sures Aspergillus niger et Mucor racemosus. Les cellules de Chlorella sont détruites
en partie par la réfrigération prolongée ; il meurt également un pourcentage con-
sidérable (95 pro cent) des cellules de la levure pressée; les Nostoc et les Ana-
b(Pfia sont tous tués.

Com-me l'emploi de l'hydrogéne liquide comparé a celui de l'air liquide ne
causait pas de dififérences appréciables, tandis qu'il offrait plus de difficultés pra-
tiques, on ne se servit dans la suite que d'air liquide.

Une troisième série d'expériences uniquement opérées avec l'air liquide pen-
dant trois et onze jours commenqa Ie 13 décembre 1907.

Les germes du lait ordinaire de macché, les Lactococcus, et les PJwtobaciei' phospho-

rescens ne montrèrent aucune altcration, même après onze jours de réfrigération.

Avec les Photobacter indicum Ie phénomène, signalé déja, se manifesta de

nouveau après trois jours de refroidissement, c'est-a-dire que les cultures réfri-

gérées, arrivant a Delft, avaient en partie perdu leur luminosité.

Les cellules de Chlorella vulgaris, soumises pendant onze jours a la réfri-
gération de l'air liquide, étaient détruites dans la proportion de 50 ^lo environ,
ce qu'on put constater par l'application du bleu méthylène et par l'ensemen-
cement sur du mout gélatinisé. Les Cyanophycées, c'est-a-dire les Nostoc et les
Avabaena du sol, qui s'accumulent dans les cultures fixant 1'azote libre, c'est-a-
dire dans de l'eau de conduite, contenant 0,05 pro cent de phosphate de potasse
ensemencé avec du terreau de jardin et exposé a la lumière, furent détruites
par Ie refroidissement. Pour la levure pressée en culture pure sur du mout géla-
tinisé, au bout de trois jours, la plus grande partie des cellules avaient péri,
comme Ie montrent l'emploi du bleu méthylène et la culture sur de la gelatine
au mout: seulement i pro cent des cellules restaient incolores. La fermentation
dans Ie mout se produisait avec a peu prés la même intensité que sans refroi-
dissement.

La levure de vin (vin de Bordeaux) était également sensible a la réfrigé-
ration, Ie tiers des cellules ayant péri. Mais comme la culture primitive contenait
des spores, on pouvait se demander si peut-être les spores seules avaient résisté.
Le calcul prouvant qu'il n'y avait que 5 a 10 pro cent de cellules sporogènes,
un grand nombre de cellules végétatives avait en effet survécu.

Les cultures de Schizosaccharomyces octosporus contiennent normalement des
asquès a huit spores, et des cellules végétatives qui ont perdu le pouvoir sporo-
gène. Après la réfrigération de onze jours, toutes les cellules végétatives se
colorèrent en bleu par le bleu méthylène, mais non par les spores. Ensemencées
sur de l'agar au mout, il ne se développait que des colonies contenant de asques,
ce qui prouve que toutes les cellules végétatives avaient péri.

Nous voyons donc que, en ce qui concerne les bactéries, cette derniére
série d'expériences conduisait au même résultat que la précédente; il en était
de même pour les Cyanophycées et les Chlorella. Les Chlorella sont, comme on le
voit, beaucoup plus résistants que les Anabcena et les Nostoc, ce qui est assez
inattendu.

330

Les résultats pour les levures furent les plus interessants. La levure pressée
et Ie Schizosaccharomyces octosporus se montrent tres sensibles, la levure de vin un
peu moins; Ie Saccharomyces fnycoderma résiste parfaitement a la réfrigération.
C'est pourquoi, dans les recherches qui suivirent et qui furent commencées Ie
22 juin 1907, on se préoccupa tout particulièrement des levures.

Dans cette nouvelle série d'expériences, une culture de levure pressée sur
de la gelatine au mout fut réfrigérée pendant quinze jours : i pro cent seule-
ment des cellules fut conservé.

Cette épreuve fut répétée avec une culture pure développée de cellules qui
avaient survécu a une réfrigération de trois jours. On comptait les cellules vi-
vantes de la levure, après l'avoir suffisamment diluée d'eau, directement au
microscope, d'après la methode du bleu méthylène. On trouva que 61 pro cent
des cellules avaient péri. Puis, avec la methode des colonies sur la gelatine au
mout, on constata que 62 pro cent des cellules étaient détruites. Un échantillon
de levure commerciale, contenant outre Saccharomyces panis lui-même, des Saccharo-
myces fiiycoderma, une levure sauvage, Ie S. pseudo-fragrans et des bactéries, fut
réfrigéré pendant o, "?, 6, p, 12 et 15 jours et examiné comme dans Ie cas pre-
cedent. En admettant, que Ie nombre de bactéries n'avait pas changé, on put
calculer, d'après Ie nombre total des colonies qui s'étaient développées, Ie pour-
centage des levures restées en vie.

Nombre de colonies présentes sur les plaques.

Après un séjour p ,, Saccharomyces Saccharomyces Saccharomyces ^ .- •

dans l'air liquide ' panis. mycoderma pseudo-fragrans.

0 jour

IQI

155

5

25

6

3 jours

105

35

19

25

50

6 -

242

22

14

25

206

9 —

116

15

0

25

93

12 —

119

20

16

25

83

15 —

200

26

6

-5

168

Le nombre des bactéries étant constant, on voit que Ie Saccharomyces pa?iis
périt entre le deuxième et le troisième jour jusqu'a un minimum qui reste dès
lors le même; pour le S. mycoderma le résultat est incertain ; le S. pseudo-fragrans
a complètement disparu dès le troisième jour.

Des expériences spéciales faites avec le .Saccharomyces mycoderma, le ^. api-
calatus et X Oïdiion lactis prouvèrent qu'une réfrigération de quinze jours était
sans effet sur leur vitalité, tandis que dans une levure de lactose, une proportion
de 75 pro cent disparut dans les mêmes conditions. Le fait depuis longtemps connu,
que l'ensemencement des spores de levure produit des colonies beaucoup plus
riches en spores que celles venant de cellules végétatives, donna lieu a quelques
expériences complémentaires faites avec de la levure de vin de Bordeaux et des
Schizosaccharomyces octosporus. On y ajouta encore deux levures tres riches en
spores et souvent cultivées dans notre laboratoire, le Saccharomyces zygosaccharo-
myces et le 5. uvarum (espèce voisine de S. paslorianus). Toutes ces levures se
trouvaient sur de la gelatine au mout, mais la culture de la dernière espèce
était si récente que les spores ne s'étaient pas encore développées. Pourtant 55

331

a 75 pro cent des cellules supportèrent sans inconvénient un refroidissement de
quinze jours dans l'air liquide. Mais il y a d'autres cas encore oü les jeunes
cellules, pleines de protoplasme, montrent une grande résistance aux influences
nocives; c'est un caractère généralement répandu dans Ie règne végétal. Les
cellules de levures sporogènes se laissent même reconnaitre aisément au micro-
scope, grace a leur richesse en matière vivante, parmi celles destinées a rester
stériles dont les vacuoles sont beaucoup plus grandes.

Le Saccharomyces zygosaccharomyces, isolé de raisins de Corinthe, était une
culture assez vieille et contenant tres peu de spores. Après une réfrigération de
vingt-cinq jours, il ne produisit que de colonies pleines de spores, ce qui prouve
que les spores seules avaient survécu. C'est donc une excellente methode pour
régénérer cette espèce quand le pouvoir sporogène s'en est afifaibli.

Le Schizosaccharomyces pombe donne un résultat absolument analogue.

Le Schizosaccharomvces octosporus, si remarquable par sa facilité a produire
différentes variétés tout a fait stables et qui se distinguent par leur pouvoir
sporogène tres inégal, fut soumis a l'influence de l'air liquide pendant quinze
jours tant sporogène que non sporogène. Les spores résistèrent parfaitement tandis
que les cellules végétatives disparurent a l'exception de quelques rares cellules
qui se reproduisirent sur de la gelatine au mout. Peut-être serait-il possible d'ob-
tenir de cette maniere une forme plus stable a l'égard de basses températures,
telle que nous en avons décrit une dans les expériences avec la levure pressée
des boulangers.

Enfin, deux espèces de Nostoc, l'une de couleur rouge sombre, l'autre d'un
bleu gris, furent soumises a un refroidissement prolongé. Ainsi que le cas s'était
présenté pour les autres Cyanophycées précédemment étudiées, ces Nosloc péri-
rent, comme on put s'en rendre compte par la sortie du phycocyan des cellules
et la magnifique couleur qu'il donna a l'eau ambiante. C'est la peut-être la meil-
leure maniere de préparer ce pigment interessant mais peu stable. La fluores-
cence en rouge-orange de cette solution e$t tres remarquable; son spectre coïn-
cide avec les deux bandes les plus marquées du spectre d'absorption de la chloro-
phylle, c'est-a-dire avec la bande entre B et C dans le rouge et avec la bande
placée dans l'orange.

De tout ce qui précède, on peut tirer la conclusion suivante:

Tous les microbes sporogènes, même les moisissures et les levures, resistent
aux basses températures, tandis que plusieurs de ces mêmes organismes a l'état
de cellules végétatives y sont beaucoup plus sensibles, bien qti'il se trouve souvent
parmi les cellules mortes quelques raras cellules végétatives qui, elles aussi con-
servent leur vitalité. Si l'on ensemence de nouveau ces cellules végétatives sur-
vivantes, tout au moins en se servant de la levure pressée des boulangers, on
obtient une espèce bien plus résistante que l'espèce primitive.

En contradiction avec ce qu'on pouvait attendre, d'après les opinions géné-
ralement acceptées, sur la simplicité des Cyanophycées, des expériences ont montré
que ces organismes, et plus particulièrement les Nostoc et les Anabcrna sont assez
sensibles au froid. Leur mort par le froid cause la diffussion hors de la cellule
des pigments solubles dans l'eau, tels que le phycocyan, qui donne avec la chlorphylle,
la coudeur particuliere a ces microbes. Ce serait Ia peut-être la meilleure mé-

332

thode a employer pour se procurer des quantités considérables de ces pigments
si instables.

Le genre Chlorella, Ie plus simple des Chlorophycées, résiste beaucoup mieux
a la réfrigération.

Quant aux bactéries non sporogènes, nous avons vu que les espèces vul-
gaires, trouvées dans le lait ordinaire du marchc, conservent leur vitalité sous
n'importe quel refroidissement. Au point de vue pratique on ne peut donc rien
espérer du froid dès qu'il s'agit d'une stérilisation absolue. Mais l'influence nocive,
bien que passagere, de la température de l'air liquide sur la luminosité de Photo-
bacter hidicum nous semble assez importante parce qu'il faut en conclure que la
réfrigération prolongée ne pourra pas être supportée par cette espèce.

En ce qui concerne la question de la panspermie cosmique, la conclusion
de ces séries d'expériences est que ce ne sont certainement pas les Cyanophycées
qui peuvent être mises en mouvement a travers l'espace par l'influence de la
lumière sans perdre leur vitalité, mais qu'on peut admettre, quoiqu'un peu dou-
teuse, la possibilité de ce transport a l'état vivant pour les cellules jeunes de Chlorella,
forme la plus simple parmi les Chlorophycées, de plus, sans doute, pour les
spores de certaines moisissures et levures et de plusieurs bactéries, enfin pour
plusieurs bactéries non sporogènes aussi, mais pas pour toutes les espèces connues.

Variability in Bacillus prodigiosus.

Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster-
dam, Vol. XII, 1910, p. 640—649. — Verscheen onder den titel «Variabiliteit bij Bacillus
prodigiosus* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd.,
Deel XVIII, 1910, blz. 596— 605.

In a fermer paper ^) I showed how easily new constant variants of Bacillus
prodigiosus and ether microbes may be obtained. Here follow^ some further
observations, made with the aid of Mr. H. C. Jacobsen, assistant in my La-
boratory. '

Tfu keeping constant of the cultures.

The principle on vv^hich the keeping constant of B. prodigiosus seems to re-
pose is preventing the cultures from becoming alkaline by their own action. Thus,
by re-inoculating in quick succession, for instance every 24 hours, into bouillon
or on bouillon-agar at 30° C, each form of Bacillus prodigiosus, whether the na-
tural or normal form, or a variant obtained from it, remains unchanged probably
for an indefinite time.

For the transplantations only very little material must be used and abun-
dance of food.

If some lactic acid is added, for instance 0,5 to 1.5 cm^ normal per 100 cm^
of bouillon, the culture likewise remains unchanged after a prolonged series of
transports, if these are always carried out before the acid is neutralised by the
alkali produced from the bouillon by the bacteria themselves").

Addition of i to 2 pCt. of glucose acts in the same manner as free acid,
B. prodigiosus therefrom producing acid which may rise, if sufficiënt glucose is
added, to 3 to 4 cm^ normal per 100 cm' of bouillon. As the titre of alkali, ori-
ginating in the bouillon alone, can amount to 2.5 cm^ N per 100 cm^ of bouillon,
and as from i pCt. of glucose there results no more than 1.5 to 2 cm'^ N of
acid, addition of i pCt. of glucose is sufficiënt to prevent variation, if the re-
inoculations take place quickly; but not if efifected with long intervals, for in the
latter case more alkali may result from the bouillon than acid from the glucose.

If to the bouillon so much ammoniumcarbonate or natriumcarbonate is added
that the titre of alkali amounts to about 3 cm^ N per 100 cm^ of the medium,

') Royal Acad. of Sciences, 21 Nov. 1900.

-) At 4 cm* of acid per 100 cm* of culture liquid the growth of B. prodigiosus
slackened, at 9 cm* it is quite stopped.

334

B. prodigiosus likewise remains constant af ter repeated inoculations at 30° C,
whilst the control culture, without carbonate but for the rest under the same con-
ditions, strongly varies. The same result may be obtained with magnesiumhydro-
phosphate (Mg H POi . 2 H2O) to excess; this, however, quickly precipitates,
and in order to be active should be used in a bouillon-agarplate or in a thin
layer of liquid. In ordinary bouillon-agarplates i pCt. of this salt changes entirely
into crystals of ammoniummagnesiumphosphate (Mg NH4 PO-t . 6 Hz'O) the plate
becoming quite transparent ; a plate with 3 to 4 pCt. on the other hand, remains
white and turbid.

Although it may be admitted that by these various means the formation of
secretion products by the bacteria is prevented, on whose stimulating action the
variability probably reposes, yet it, is not clear how this preventing takes place.
Evidently substances should be thought of here which, once produced, cannot or
only with difficulty leave the bacterial body.

Of the said means quick transplantation is the simplest for always disposing
of constant stocks for the experiments.

The origin of the variants in general.

When cultures, placed under favourable nutritive conditions, but for the rest
prepared without special precautions, are growing older between 10° and 30° C,
they exhibit a certain variability at which, as formerly described (1. c), variants
are thrown off, while beside these the original form is found unchanged. As by
transplantations in rapid succession (and under constant and favourable conditions)
no change occurs during thousands of cell-partitions, this variability cannot repose
on some law governed by internal causes only, but a particular agency is wan-
ted, which may have its seat within the cells^ but which must yet be enacted on
by external circumstances.

Although the variability can reveal itself already in an ordinary same well
arranged culture, e.g. in bouillon or in maltwort, allowed to stand for a few
weeks, yet this process may considerably be accelerated by repeated transplan-
tations, not after a very short time, but with longer intervals, for example two
days, with cultures kept at 33° C, a not too small quantity of the material for
the inoculation being used, e. g. two loops of the platinum thread. After three
or four repetitions, so after about a week, the variation can then be in full
course, the first culture, left to itself, not yet showing any perceptible change.

This evidently reposes on the foUowing ci-rcumstance. The influence which
causes the variability in the culture when it gets older, acts in the chosen con-
ditions already after two days. If now a re-inoculation is performed, the germs
affected by that influence can increase as well as those that remained normal,
whilst by not re-inoculating, thus in the first culture, the non-affected germs are
by far more numerous and remain so as the cell-division slackens after the second
day, because of want of food. At inoculation after two days there result at each
time new modified germs, and those which are modified already, are enabled to
augment without losing their modification.

In this explanation it must further be accepted, that a transplantation after

335

two days gives no cause for atavism ; for if this were the case, the reverse ought
to take place of what is observed: after a week's growth the first culture should
be more varied than that which has repeatedly been transplanted, but this is not
so. This shows how carefully the variation experiments must be carried out in
order not to become obscure.

Particularly the cultures on solid media must very accurately be observed.
If these are allowed to stand for some days or weeks without further precautions,
then in many cases, even with magnifying glass or microscope no variation at all
can be detected, although it is actually going on, commonly to »rose« or »white«.

Colony culture then shows that here and there varied germs or groups of
such germs must be present, for from the seemingly homogeneous matter large
numbers of white and rosé variants are obtained, which prove as constant as
the normal form itself. However unchanged colonies, representing the pure stock
and producing a material as fit for further experiments as the original culture,
He among the variants.

Experiences afforded by other bacteria seem to prove that the frequent re-
petitJon of the thus possible process of selection, produces a form which varies
less than the original material. But it is not here the place to enter upon this
important fact.

All colony cultures of B. prodigiosus are best made on bouillon-agar-plates,
which after solidifying have been cautiously dried on a thermostat at circa 40° C.
The water which then condenses on the glass cover can easily be removed; if
this is neglected, B prodigiosus, which is strongly motile, spreads over the surface
of the agar and the colonies coalesce.

I shall now enter into a short discussion of the most important variants.

The obtained variants.

The variants derived from B. prodigiosus may be considered as plus- or gain-
variants, minus- or loss-variants, and qualitative variants. This is exposed below
in the table of descent, which shows the origin of the obtained forms ; the quali-
tative variants {auratus and hyalinus) are placed on the same line with the normal
form, the plus-variants above it, the minus-variants beneath. Hence, the arrows
not only denote the descent but also whether the variability reposes on gain or
loss of characters, or if it is qualitative. Dotted arrows indicate that atavism has
with certainty been observed. The names indicate the chief qualities characterising
the variants.

A survey of the variants without regard to their descent precedes; then
follows their pedigree which does not repose on hypothesis, but simply gives the
result of the experiments.

The obtained variants are:

1. Bacillus prodigiosus. Normal form, isolated from nature^).

2. „ „ roseus i.
3- „ » » 2.

') About 1890 from mouldering bones of a gclatinfactory near Delft.

336

Bacillus prodigiosus. albiis.

„ /ixaiinus.
viscosus.

„ albus.
auratus.

., viscosus.

albus (=7?)
albus (=4?).
hyalinus

„ 7'iscosus.

„ „ albus.

„ albus (=5?

The relation and origin of these variants is given in the following table

aur. VISCOSUS

cjr.visc. albus

hyal. viscosus

viscosus albus

hyal. VISCOSUS
ai bus

auratus <-

prodigiosus normal

roseus/

aur.albus

roseus Z

-^ hyalinus

albus

albus hyalinus hyaLalbus

The upward arrow.6 denote »gain-variation«, the horizontal »quahtative variation«, the
downward arrows »Ioss-variation«. Dotted arrows signify that atavism has been observed.

The two qualitative colour-variants, auratus which is orange-coloured and
hyalinus of a deep vine-red, vary in a way quite corresponding to the normal
form and like this throw off, under the same circumstances, slime-variants and
white variants. Besides, the normal form may return by atavism as w^ell from
auratus and hyaltinus themselves as from the variants derived from them. In the
pedigree table atavism is indicated by dotted arrows for a few of the cases where
it has been staded whit certainty. But there is no doubt that also the other
variants are disposed to atavism.

It should moreover be noted that the «///-<z/'//5- variant approaches, at least in
colour, the natural variety Bacillus Kieliensis, but that the latter possesses a stronger
power of fermentation, and produces much gas (COi -\- Ha) from maltwort with
dextrose or cane-sugar, the former fermenting only dextrose.

For the rest, B. Kieliensis itself, which varies in a way quite analogous to
that of the normal form of prodigiosus here considered, has not yet been ob-
tained as a variant from the latter.

A new character which may rise in addition to the already existing ones,
is the prodnction of a large quantity of slime substance by excessive growth of

337

the cell-wall, which slime may spread through the liquids, and makes the indivi-
duals of the colonies on agarplates cohere into one tough mass. From B. Kk-
liensis was even a variant obtained whose colonies appear on the agar plates as
a very consistent, almost dry zoogloea, but the analogous variant did not till
now arise from the common prodigiosus. The viscosiis (6), derived from the latter,
is an ordinary red slime bacterium.

This red-coloured, tough-slimy form, which may be called B. prodigiosus
viscosiis, is no doubt a plus-variant. lts production has been observed under the
most different nutritive conditions, between the temperatures io° (in a cellar)
and 30" C, but always and exclusively in liquid media, never on a solid one.
The latter circumstance is apparently the reason why the numerous experimenters,
who have studied B. prodigiosus, have not seen this variant. It is true that
Scheuerlen') observed that o\ó. prodigiosus-cyxXiMvts sometimes turn slimy, but
he ascribed it to their becoming alkaline and overlooked that a new constant
form was produced.

The only distinct condition which seems different in the liquid cultures
compared with the solid, is the access of oxygen. In the depht of the liquid this
access must, of course, be very deficiënt for a long time, or even be entirely
lacking, as the upper layers of the culture, which are rich in bacteria, take up
all the oxygen. Consequently anaërobiose becomes possible in the depht, which
is not the case in cultures lying free on a solid medium, and this partial an-
aërobiose is apparently the stimulus which induces the formation of the slime
variant. That here a rather complex influence and not a direct action must be
ascribed to the partial withdrawing of the oxygen, follows from the fact that
the culture of B. prodigiosus at complete exclusion of air, as in a closed bottle,
does not, even with repeated transports, give rise to the slimy variant. At tem-
peratures of about 35" C. this variant is no more formed, although the growth
of prodigiosus is then still very strong; at 2,7^ the growth slackens or ceases en-
tirely, according to the food.

In the following liquid media the production of the slime variant has with
certainty been observed, as well after repeated re-inoculations as after prolonged
keeping of one and the same culture at 25** to 30'* C. : in broth, in broth with
I pCt. of glucose, in malt-wort, in tap-water with 5 pCt. of pure gelatin and 0,02
pCt. K2HPO1, and in tap-water with 2 pCt. of glucose, 0.5 pCt. of asparagine,
0,02 pCt. KaHPOi, always cultivated at 30" C. and with repeated transports after
two days or longer. From this we also recognise that there is no question of
a direct influence of the food on the production of the variant.

The auralus- and hyalinus-wsiüdints, also, have only taken rise in liquid cultures,
namely in broth and in the glucose-asparagine solution. Moreover, hyalituis, which
is of a deep vine red, is easily obtained from a solution of pure gelatin in tap-
water with 0.02 pCt. K2HPO4, after repeated re-inoculations, at 30'' C, whereby
also Jiyalinus viscosus results.

The colourless or white variants, which only dift'er from the original form
in producing no pigment, should certainly be considered as minus-variants. They

') Archiv für Hygiëne. Bd. 26 p. i.
M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel.

338

are obtained with more ease than the slime variants and, at least as to N" 4^
have also been detected by other authors*).

Except under the said conditions, apt to keep them constant, all the cultures
as well in liquid as on solid media, vary sooner or later towards white. The
original form does remain preserved, but a colourles variant is thrown off, which
is still more constant than the stock itself.

Not always does one and the same variant result in this case: two unco-
loured constant forms, N*' 4 and 5 can easily be distinguished if they originate
at the same time, and their colonies are on the same agarplate so that they may
be compared somewhat magnified. One, albus hyalimis, then looks more blueish
transparent, the other, albus, is more of a cloudy and opake white; under the
microscope the former proves to consist of smaller cells than the latter.

The cause of the production of white variants cannot be a more or less
abundant access of oxygen, but must probably be sought in a stimulus, exerted
by secretion products which remain enclosed in the interior of the cells.

Although the presence of ammoniumcarbonate in the medium (broth-agar),
as also cultivation at temperatures higher than 30" C. e. g. at 33*^ C, prevent
pigment production, no hereditary variation at all is caused by these influences.
If the thus treated colourless cultures are transported at 20° to 25^ no white
variants are obtained from them, but the normal form is found back unchanged,
if at least the above mentioned precautions to preserve the constancy of the
stock are not neglected.

When the white variants of the normal form are cultivated at 30" C. in
bouillon or in malt-wort, the cultures will, after a few re-inoculations, turn slimy
like those of the red normal form itself. Colony culture on bouillonagar proves
that white slime variants are thrown ofï, in the same way as the normal form
throws off the red ones. The white slime variants (N^ 7 ? and 14) correspond
by the nature of their colonies to the two white forms, albus (4) and albus hyalinus
(5), considered above.

There is still another method to obtain the colourless slime variant from
the red one. If this latter is cultivated at 30*^ in malt-wort or in bouillon, we
find after one or two transferrings, each time after two days, and when sown
on bouillon-agar, many white slime colonies together with the unchanged red,
moreover a considerable number of quite normal, not slimy red colonies, X". i,
which is to be considered as atavism, but an atavism reposing on the loss of a
character. The white slime variant, thus obtained by minus-variation, and found
in the table as N". 7, seems identic with the one produced by plus-variation from
the not slimy white variant, which latter for that reason has not been specially
mentioned.

Already in my earlier paper I spoke of rosé variants, which so to say, keep
the middle between the normal form and the white variant. They may be pro-
duced in various ways, for instance, by cultivating the normal form on plates
of pure gelatin dissolved in distilled water (H2O, lo^/o of gelatin) at room tem-

') In Lehmann and Neumann's Atlas 4th Ed. 1907, Table 30, Fig 3, shows a
coioured image of a »pure culture* of prodigiosus, consisting of red and white colonies.

339

perature, at which rapid growth and vigorous melting occur. By daily streaking
off on a bouillon agarplate the same colony obtained on such pure gelatin, and
provided the temperature be kept between 14" and 17*^ C, we find, on the fifth
or sixth day, the first rosé variants, either or not with the white, which under
these conditions appear later. Two rosé variants (table N^. 2 and 3) are easily
distinguished, but it is possible that there are many more whose perception is
beyond the reach of our observation. In any case, it is a fact that the character:
»the faculty of producing pigment«, is divisible in many ways. The hereditary
constancy of at least one of these rosé variants proved not to differ from that
of the normal form.

Another method to obtain rosé variants is cultivation of the normal form
in bouillon, which by evaporation has been reduced to a threefold concentration.
After a single transport already, a large number of rosé variants (3) had appeared
by the side of normal forms; by a much lighter colour they showed a disposition
to lose their colour entirely. The variability of the different rosé variants is not
the same; the form, obtained by the concentration experiment (3) produces, more
readily than the rosé variant (2), as well red normal forms (i) as white ones (4).
For the rest, this more variable variant has also proved to remain constant when
quickly transplanted.

Cases of atavism are frequently observed in these experiments. Thus, for
example, the production of the normal form from viscosus (6) may easily be seen
if the latter grows for a fortnight without transport on a bouillon-agarplate ; along
the margin of the streaks some few normal colonies (i) will then become per-
ceptible.

The «'//'/«-variants, also have a disposition to throw off a few red normal
forms, but they do so only after growing for weeks or months on bouillon-agar;
at first they are very constant.

The to a certain extent completely regular production of the same variants
of Bacillus prodigiostis, suggests the existence of variability in a special and deter-
mined direction, of orthogenesis, as Eimer expressed it.

As under different nutritive conditions the same variant may appear, the
food itself cannot be the stimulus; there must be, as said above, another cause
in the interior of the cells, which, for B. prodigiosus, seems only active in an
alkaline environment.

On the other hand, the food, in a wider sense, has certainly a decisive
influence on the variability, albeit indirectly. So we considered already the in-
fluence of the alkaline reaction of the medium if this alkali is produced by the
microbes themselves. Another example is the following. As well in malt-wort as
in bouillon the viscosus variant is regularly produced; but from malt-wort the
auratus variant, which so readily takes rise in bouillon, is not obtained at all.
Indeed, every culture condition gives a peculiar but constantly returning mixture
of variants, differing both quantitatively and qualitatively from that found under
any other conditions. But the real factors here active could not as yet be detected.

From the foregoing the following results may be derived.

I. Bacillus prodigiostis produces as well qualitative, as gain- and loss-variants,

340

all obtained with certainty by determined experiments; the stock-form is always
found unchanged in the same culture with the variants.

All the variants are from their origin as constant as their stock.

The true factors which govern the variability in these experiments are still
unknown.

2. By rapidly repeated re-inoculations and by other methods, normal form
and variants may be kept constant, as it seems for an unlimited length of time.

3. All the variants vary in a way analogous to that of the normal form,
thus, the aura/us-va,nant produces an «//A^///i-slimevariant, which must be consi-
dered as a gain-variant, and an a/l>us-variant, which must be taken for a loss-
variant.

The natural variety B. Kieliensis, which approaches the ^?//-'Yi'///i-variant, also
varies in an analogous way. The variation thus seems to be directed or ortho-
genetic.

4. Gain-atavism in loss-variants and loss-atavism in gain-variants, can be
obtained whith certainty by dertermined experiments. Qualitative variants, too,
may give rise to atavism.

5. The experimental variants of B. prodigiosiis have not yet been found in
nature. From another bacterium, Bacillus herbicola, a variant, took rise which I
had before repeatedly isolated from nature and which I had taken for quite
another species.

6. The variants of prodigiosiis, and this holds good for many other microbes
also, differ from each other and from their stock forms in the same way as
closely related natural species or varieties do among each other. But their dis-
position to atavism is much more pronounced.

7. The sub-variants, e. g. the rosé variants of different colour-intensity, arise
in the same way as the chief variants and possess the same degree of constancy.

Ueber Emulsionsbildung bei der Vermischung
wasseriger Lösungen gewisser gelatinierender

Kolloide.

Zeitschrift für Chemie uiid Industrie der Kolloide, Band VII, 1910, S. 16 — 20.

\ / or kurzem habe ich ein Enzym beschrieben ^), welches aus Rohrziicker und
' aus Raffinose sowohl in Nahrlösungen wie in Agarplatten einen nicht
difïundierenden, offenbar grobmolekularen Schleim erzeugt, welcher die Polari-
sationsebene nach links dreht und mit Lippmann's Lavulan verwandt ist. Das
Enzym wird durch einige allgemein verbreitete sporenbildende Erdbakterien her-
vorgebracht, wie Bacillus mesentericus (der Heubazillus), B. megatherium
und besonders B. emulsionis, welcher in Rohrzucker selbst allgemein ist. Alle
diese Bakterien könnten »Emulsionsbakterien« genannt werden.

Die Erscheinung ist sehr charakteristisch und besteht darin, daB in Rohr-
zuckernahrlösungen durch die genannten Arten eine ausgesprochene, aus Schleim-
tröpfchen bestehende weiBliche Emulsion entsteht, welche auf und in Agarplatten
bis auf Zentimeterentfernung ringsum der Koloniën ebenfalls leicht sichtbar wird.
Dieser Schleim ist nicht diffusionsfahig, muB deshalb an Ort und Stelle im Agar
entstehen, was sicher durch ein Enzym stattfindet. Dieses Enzym wurde Visko-
saccharase genannt, und ist vielleicht das erste Beispiel eines auBerhalb der Zelle
synthetisch wirkenden Enzyms. DaB hier wirklich Synthese stattfindet, folgt aus
der MolekulargröBe des Schleimes, welcher biologisch als Wandsubstanz aufzu-
fassen ist.

Die so aufgedeckte Emulsionserscheinung veranlaBt mich, auf eine ahnliche
Eigentümlichkeit gewisser anderer, und zwar gelatinierender Körper aufmerksam
zu machen, welche ich allerdings schon vor einigen Jahren beschrieben habe "),
doch für manchen Leser neu und nicht ohne Interesse sein dürfte.

I. Die Emulsionserscheinung beim Vermischen wasseriger
Kolloidlösungen.

Wenn man nicht allzusehr verdünnte Lösungen von Agar und Gelatine in
heiBem Wasser, z. B. eine 10 proz. Gelatine- und eine 2 proz. Agarlösung, zu ver-

') Viscosaccharase. An enzyme, which produces slime from cane-sugar. Procee-
dings Acad. of Sciences, Amsterdam, Januar 1910, S. 635 and May 1910. Mit Abbildung.

^) Ueber eine Eigentijmlichkeit der löslichen Starke. Centralbl. f. Bakteriologie
2. Abt. 2, 627 (1896).

342

mischen versucht, bemerkt man, daB dieses trotz langeren Schüttelns niemals
vollstandig gelingt, sondern daB diejenige Lösung, wovon man die geringste
Quantitat verwendet hat, als kleine, mikroskopisch nachweisbare Tröpfchen schwebend
verbleibt in dem gröBeren Volum der zweiten Lösung. Oft enthalten die schwe-
benden Tröpfchen wieder kleinere Tröpfchen der anderen Lösung. Beim Erstarren
wird dieser Zustand fixiert, ist dann aber etwas schwieriger zu beobachten, weil
das Lichtbrechungsvermögen beider Körper nur wenig verschieden ist und weil
dann relative Bewegungen ausgeschlossen sind, welche im flüssigen Medium die
Differenz deutlicher machen. Allenfalls kann man sich jedoch bei sehr schiefer
Beleuchtung von dem beschriebenen Tatbestande überzeugen.

Verwendet man anstatt Agar eine lo proz. Lösung von löslicher Starke,
welche in einer lo proz. Gelatinelösung aufgeschüttelt wird, so wird die Erschei-
nung noch deutlicher und kann, wie ich das früher beschrieben habe, zur Her-
stellung eines künstlichen »Zellgewebes« verwendet werden, worin der »Zellinhalt«
aus Starke, die »Zellwande« aus Gelatine bestehen, oder umgekehrt, je nachdem
wenig Starkelösung und viel Gelatine oder viel Starke und wenig Gelatinelösung
vermischt werden.

Ueber das genauere MaB der dabei in Betracht kommenden Mengenver-
haltnisse belehrt uns eine bemerkenswerte Mitteilung von Wa. Ostwald'), woraus
hervorgeht, daB zwischen 74 und 26 Proz. der einen Lösung beide Zustande
möglich sind, wahrend nur dann, wenn der Prozentgehalt der einen Lösung
oberhalb ca. 74 Proz. verbleibt, diese nur allein als »Inhalt«, daB heiBt als dis-
perse Phase vorkommen kann.

Weil das spezifische Gewicht einer Starkelösung höher ist wie das der gleich
konzentrierten Gelatine, kann man bei deren Vermischung auch beobachten, wie
die aufgeschüttelten Tröpfchen [der Starkelösung beim ruhigen Stehen nach
unten sinken und zur Bildung einer ziemlich klaren oberen Gelatineschicht ver-
anlassen.

Vermittelst der Jodreaktion stellt sich heraus, daB die Gelatinelösung zwischen
den Starketröpfchen eine schwache blaue Farbung annimmt, so daB eine Spur
Starke als wirklich aufgelöst zu betrachten ist. Umgekehrt enthalten die Starke-
tröpfchen auch ein wenig Gelatine in wirklicher Lösung.

*) Beitrage zur Kenntnis der Emulsionen. Koll.-Zeitschrift 6, 103 (1910). Ost-
wald sagt, die Minimumzahl betrage ca. 22 Proz. Dieses- ist jedoch nicht richtig,
wie aus folgender Betrachtung hervorgeht. Stapelt man gleiche Kugeln zu einem drei-
oder viereckigen Stapel aufeinander, wobei eine und dieselbe möglichst dichte Anord-
nung entsteht, so berührt jede Kugel 12 andere. Bringt man durch die 12 Berührungs-
punkte Tangentialebenen, so bilden diese zusammen einen regularen Rhomboeder.
Stellt man die Seitenlange dieses Rhomboeders gleich Eins, so wird dessen Inhalt

gleich — V^3, wahrend der Inhalt der eingeschriebenen Kugel in dieser Einheit — ^V6

wird. Das Verhaltnis beider ist das gesuchte MaB, weil die Rhomboeder genau den

Raum ausfüllen. Dieses Verhaltnis ist aber -j. , was in Prozenten auskommt auf ca.

74,04 für die Kugelinhalte und ca. 26 für die Zwischenraume. Bei kubischer Auf-

stapelung wird das gleiche Verhaltnis .^, also ca. 52 Proz. für die Kugeln und ca. 48 Proz.

für die Zwischenraume. (Vgl. hierzu die Notiz Wo. O s t w a 1 d s auf S. 64 dieses Heftes.)

343

Selbst sehr verdünnte Lösungen gut angefertigter löslicher Starke*), z. B.
von 0,1 Proz. und weniger, bleiben in Gelatine emulsioniert.

Mit Agar und Starke gelingt die Reaktion nicht, offenbar weil sich nicht
mehr wie 2 Proz. Agar lösen laKt, welches noch in der Starkelösung gelost
bleiben kann. Auch dieser Umstand scheint mir sehr bemerkenswert.

DaB die »Emulsionserscheinung« eine ziemlich unerwartete ist, geht z. B. aus
folgender Bemerkung Bütschli's hervor^) : »Dieses für zwei wasserige Lösungen
sehr eigentümliche Verhalten, das mir, ofifen gestanden, wenig wahrscheinlich
verkam, konnte ich zu meiner Ueberraschung . . . bestatigen,« Er gibt eine Be-
schreibung dieser Beobachtungen, ohne den meinigen neue hinzuzufügen und ohne
eine Erklarung zu versuchen. Ich glaube, und eben darum erwahne ich Bütschli's
Mitteilung, daB, wenn er sich mit diesen Versuchen eingehender beschaftigt hatte,
er seiner »Schaumstrukturhypothese« eine ganz andere Form gegeben und be-
sonders dieselbe nur auf leicht sichtbare mikroskopische Verhaltnisse, und nicht
auf amikroskopisches Gebiet angewandt haben würde.

2. Erstarren der Emulsionen.

Das Gemisch der zwei Kolloidlösungen, wie Agar und Gelatine, verhalt sich
beim Erstarren den reinen Lösungen beider Substanzen ganz ahnlich. Doch ver-
dient in dieser Beziehung folgendes bemerkt zu werden.

Einige Beobachter nehmen an, daB der ErstarrungsprozeB einer Gelatine-
oder Agarlösung auf die Verschmelzung der kleinen Tröpfchen der dispersen
Phase zu gröBeren beruht, wodurch die tatsachlich beobachtete VergröBerung
der inneren Reibung beim Annahern des Erstarrungspunktes zu erklaren ware.
Bei unserem künstlichen Gemisch ist jedoch, wenn man sich der Erstarrungs-
temperatur annahert, von einer solchen Verschmelzung nichts zu sehen, grobe
und feine Emulsionen erstarren bei gleichen Temperaturen ohne jede bemerkbare
Strukturveranderung. Es findet hier, soweit sichere Beobachtungen darüber Auf-
schluB geben können, nichts Besonderes statt. Ob die TröpfchengröBe gering
oder betrachtlich ist und ob diese sich wohl oder nicht andert, hat auf Erstarrungs-
temperatur und Viskositat jedenfalls nur einen sehr geringen EinfluB. Die Auf-
fassung, daB das Erstarren gelöster quellbarer Körper im allgemeinen der Ver-
gröBerung der hypothetischen amikroskopischen Tröpfchen der dispersen Phase
parallel gehe oder darauf beruhe, kann ich deshalb zurzeit noch nicht als wahr-
scheinlich betrachten. Ueberhaupt scheint mir die Hypothese der Emulsionsstruktur
der Kolloidlösungen, so wichtig und interessant dieselbe sicher ist, sehr schwach
begründet. Nach meiner Ansicht sind konzentrierte Rohrzucker- oder Maltose-

*) Die Bereitung geschieht wie folgt: Kartoffelstarke wird mit starker Salzsaure
übergossen und einige Zeit in der Kalte aufbewahrt. Nach einiger Tagen oder Stunden,
je nach der Salzsaurekonzentration, kann die Starke beim Kochen mit Wasser sich
vollstandig klar und durchsichtig lösen und beim Abkühlen porzellanweiB undurch-
sichtig erstarren. Zur Beseitigung der Salzsaure wird das Praparat mit sehr viel
destillierteni Wasser ausgewaschen, woran anfangs ein wenig Natriumkarbonat zu-
gegeben war.

-) Untersuchungen über mikroskopische Strukturen (Leipzig 1898), 251.

344

lösungen physikalisch vollstandig vergleichbar mit konzentrierten Gelatine- oder
Agarlösungen. So lassen die ersteren sich ebensogut wie die letzteren mit sehr
konZentriertem Alkohol als Emulsionen prazipitieren, und doch glaube ich nicht,
daI3 die Chemiker eine Zuckerlösung ohne weiteres als Emulsion auffassen.
Warum dieses dann wohl bezüglich Agar, Gelatine oder Starke geschehen muB,
finde ich nicht deutlich. Doch will ich nicht verkennen, daB die mechanische
Verkleinerung z. B. einer Agaremulsion in Gelatine schlieBlich zu einer Art
Pseudolösung führen könnte, welche die Struktur einer Lösung eines Emulsions-
kolloids nach der gelaufigen Vorstellung, besitzen könnte. Ob die mit der Krümmung
steigende Oberflachenspannung der Tröpfchen an dieser Verkleinerung nicht bald
ein Ende stellen sollte, scheint mir jedoch fraglich. Jedenfalls könnte ich beini
Kochen meiner Emulsionen, wie lange auch fortgesetzt, die TröpfchengröBe
schlieBlich nicht mehr verringern, immer blieben dieselben grob mikroskopisch.

3. Osmotisches Gleichgewicht in den Kolloidgemischen.

Betrachtet man die wasseranziehende Kraft der Tröpfchen inbezug auf ihre
Umgebung, so ergiebt sich folgendes.

Zunachst muB bemerkt werden, daB eine eigentliche Diffusion bei unseren
Versuchen von der einen in die andere Phase nicht stattfinden kann. Daraus
folgt jedoch nicht, daB die relativen Konzentrationen unverandert bleiben sollten.
Die Tröpfchen der Starkelösung oder des Agars, welche in der Gelatinelösung
schweben, mussen namlich mit letzterer im osmotischen Gleichgewicht stehen oder
jedenfalls nach einiger Zeit ein solches Gleichgewicht erreichen. So lange sie dieses
nicht tun, muB notwendigerweise eine Wasserbewegung stattfinden, welche nach
der Gelatinelösung gerichtet ist, wenn darin ein höherer osmotischer Druck herrscht,
wie in den Starke- oder Agartröpfchen, und umgekehrt. Im ersteren Falie mussen
die Tröpfchen kleiner, im zweiten Falie mussen dieselben gröBer werden. Nennen
wir eine solche Lösung eine »kritische«, wenn eine der beiden Phasen zu ca.
26 Proz. gegenwartig ist, so muB, wenn das Volumen der Tröpfchen dieser Phase
kleiner wird, unmöglich ein Zustand zu erreichen sein, worin dieser x\nteil als
disperse Phase hervortritt. Wird das Volum desselben jedoch vergröBert durch
Wasserübertritt aus dem Dispersionsmittel in dieselbe, so wird sich das Verhal-
ten umkehren können, denn wir erreichen nun das zwischen 26 Proz. und 74 Proz.
gelegene Ostwald'sche Gebiet, wobei beide Phasen einander ersetzen können.
Unter Umstanden wird dieses zu einer experimentellen Entscheidung bezüglich
der GröBe des osmotischen Druckes solcher Lösungen führen können.

Im speziellen Falie der löslichen Starke wird letzteres noch dadurch möglich
sein, daB die Tröpfchen einer schwach konzentrierten Starkelösung ein geringeres
spezifisches Gewicht, wie diejenigen einer konzentrierten Gelatinelösung haben
können, wahrend wir früher sahen, daB konzentrierte Starkclösungen viel schwerer
wie Gelatine sind. Bei bestimmten Versuchsbedingungen werden also anfangs
schwebende Starketröpfchen nach unten sinken können infolge osmotischer Wasser-
entziehung.

345

4' Das Aiiflösen eines trockenen Kolloides in einer anderen
Kolloidlösung.

LaBt man für die eine der beiden Lösungen den zu emulsionierenden Körper
selber in trockenem Zustande an deren Stelle kommen, so andern sich die zur
Beobachtung kommenden Erscheinungen etwas. Versucht man z, B. trockene
Gelatine in einer Agarlösung durch Erhitzen zu lösen, stöBt man auf Schwierig-
keiten, und wie lange man auch das Kochen fortsetzt, niemals bekommt man
eine so gleichmaBige Verteilung, wie beim Schütteln schon vorher dargestellter
Lösungen beider Substanzen. Beim Erstarren kann man auch keine gut zusammen-
hangende Platte bekommen, jedoch nur kleisterartige, unregelmaBige durchfeuchtete
Massen, welche aus Klumpen und Kugeln bestehen.

Auch hier muB die Erklarung allerdings teilweise in der Unmöglichkeit der
Diffusion des einen Kolloids in das andere gesucht werden. Jedoch sind dabei
auch folgende Umstande zu berücksichtigen, welche mit dem Streben nach einem
Quellungsgleichgewicht zusammenhangen.

Beim Kontakte z. B. von trockenem Agar mit flüssiger Gelatinelösung wird
erstere Substanz der zweiten anfangs Wasser entziehen und dadurch stark auf-
quellen. Je weiter diese Quellung fortschreitet, desto schwacher wird die saugende
Kraft des Agars jedoch werden, und bald wird der Augenblick kommen, daB das
Agar die schwache, jedoch nicht ganz fehlende wasseranziehende Kraft der Gelatine-
lösung nicht mehr überwinden kann. Der Saugkraft des Agars setzen sich in
diesem Falie offenbar zwei Krafte entgegen: der osmotische Druck der lo proz.
Gelatinelösung, welcher denjenigen des nur bis ca. 2 Proz. löslichen Agars über-
trifift, und zweitens der mechanische Widerstand, welchen die relativ konzentrierte
Gelatinelösung auf die VolumvergröBerung des Agars, welche nur mit einer sehr
schwachen Kraft stattfindet. ausübt.

Wie auBerordentlich klein die Kraft ist, womit 2 Proz. Agar das Wasser
zurückhalt, geht aus folgender Beobachtung hervor. Wenn man aus einer frisch
gegossenen und eben erstarrten Agarlösung ein Stück herausschneidet und dieses
biegt, so wird man sehen, daB die leiseste mechanische Krümmung auf der kon-
kaven Seite das flüssige Wasser in kleinen Tropfen heraustreten laBt. Ja die
leiseste Berührung einer solchen Platte hat Wasseraustritt zur Folge; die ge-
ringste Erwarmung hat einen gleichen Efïekt und nach meiner Meinung kann
diese Erscheinung Licht werfen auf 'die Filtration flüssigen Wassers aus allerlei
Pflanzenteilen und selbst die Saftsteigung in den Baumen erklaren, wobei aller-
dings angenommen werden muB, daB das Protoplasma, seiner Struktur nach. mit
erstarrtem Agar zu vergleichen ist und die Kontraktilitat desselben die für den
Wasseraustritt notwendigen lokalen Druckverschiedenheiten hervorruft.

Auf ahnliche Weise wie bei den Lösungsversuchen von Agar in Gelatine
oder umgekehrt wird man finden, daB Kartofifelstarkekörner, welche beim Ver-
kleisterungsprozesse in reinem Wasser sehr schnell anschwellen (wahrend nur
eine Spur der Granulose in Lösung geht) beim Aufkochen z. B. in lo proz. Ge-
latinelösung, viel weniger quellen, wie sich durch mikroskopische Messung leicht
feststellen laBt.

346

5- Quellungsgleichgewicht und Doppelbrechung.

Obschon die nun zu besprechende Beobachtung nur indirekt mit der Emul-
sionserscheinung verbunden ist, glaube ich dennoch, daB die Erörterung derselben
imstande ist, weiteres Licht auf die vielen hier in Betracht kommenden Fragen
zu werfen.

Die oben erörterte wasseranziehende Kraft zwischen den beiden Phasen der
Doppelkolloidemulsion besteht ebensogut im flüssigen wie im erstarrten Zustande.
DaB dadurch Erscheinungen der Doppelbrechung des polarisierten Lichtes her-
vorgerufen werden körinen, ergiebt sich aus folgendem Versuche.

Man gieBe in eine Glasschale eine dunne Schicht einer konzentrierten z. B.
20 proz. Gelatinelösung, man lasse erstarren und schneide aus der Platte ein
Stück Gelatine heraus, welches entfernt wird. Das so erhaltene Loch wird nun
vollgegossen mit einer verdünnten Gelatinelösung, z. B. eine von 2 bis 5 Proz.,
und zwar in der Weise, daB man wieder eine ebene Flache bekommt. Man lasse
wieder erstarren und lasse die heterogene Platte einige Zeit stehen.

Wie zu erwarten, entzieht die konzentrierte Gelatine der verdünnten Wasser;
die zunachst sichtbare Folge davon ist die Entstehung eines erhabenen Walles
neben der Trennungslinie in der 20 proz. Gelatine und einer tiefen Einsenkung
in der 2 prozentigen. Dieses muB offenbar auf Wasserbewegung beruhen, wodurch
die konzentrierte Gelatine verdünnt, die verdünnte konzentriert wird, und an-
scheinend muB dieses so lange fortgehen, bis auf beiden Seiten der Trennungs-
linie eine gleiche Gelatinekonzentration herrscht, weil erst dann Quellungsgleich-
gewicht herrschen kann. Die zweite Eigentümlichkeit, welche dabei zur Beobach-
tung kommt, besteht nun darin, daB die anfangs isotropen Gelatinen verschiedener
Konzentration, beide doppelbrechend geworden sind, und zwar entgegengesetzt,
so daB sich bezüglich polarisiertem Lichte die eine positiv, die andere negativ
verhalt. Offenbar ist die Spannungsverschiedenheit, welche infolge der Wasser-
bewegung entstanden ist, die Ursache dieser Doppelbrechung. Es herrscht nam-
lich in der geschwollenen Gelatine ein Druckzustand, in der eingesunkenen eine
Spannung, wie das die für Druck empfindlichen Bakterienarten so überzeugend
beweisen, indem dieselben in der Einsenkung parallel, im erhabenen Wall senk-
recht auf die Trennungslinie wachsen, wenn man anstatt reiner Gelatine eine
geeignete Nahrgelatine verwendet.

Nach meiner Meinung handelt es sich hierbei um eine Erscheinung, welche
eine Erklarung gibt von sehr vielen Fallen, wobei Doppelbrechung in organischen
Strukturen beobachtet wird. Als solche wünsche ich die Starkekörner anzuführen,
welche bekanntlich aus Schichten ungleichen Wassergehaltes bestehen, und eben
darin dürfte nach dem Vorstehenden ein ausreichender Grund für ihre Doppel-
brechung gelegen sein und die Annahme doppelbrechender, kristallinischer
Mizellen, welche Nageli als notwendig vorausgesetzt hat, überflüssig werden.

6. SchluBbetrachtung.

Ware der Vergleich der »Emulsionskolloide« mit den sichtbaren Emulsionen
ohne weiteres richtig, dann müBte nach meiner Meinung eine zweiprozentige

347

Gelatinelösung sich ebensogut in ein :o prozentige emulsionieren lassen, wie eine
zweiprozentige Agarlösung. Dieses ist jedoch durchaus nicht der Fall : Gelatine-
lösungen von allen Konzentrationen mischen sich sofort miteinander, obgleich
auch hier von Diffusion natürlich keine Rede sein kann. DaB diese Vermischung
wirklich stattfindet, kann man leicht feststellen, wenn man die 20 prozentige Ge-
latine darstellt aus Gelatine, welche zuvor mit einem unlöslichen Farbstofï, wie
Karmin oder Indigoblau, gefarbt ist; beim Vermischen der gefarbten Lösung mit
der zweiprozentigen ungefarbten wird man sofortige und voUstandige Durch-
dringung der beiden Flüssigkeiten beobachten. Es ist deshalb nicht recht einzu-
sehen, warum eine Gelatinelösung an und für sich dann wohl aus emulsionierten
»Tröpfchen« bestehen würde.

Nimmt man mit Wilhelm Ostwald') an, daB bei einer bestimmten unteren
Grenze der TröpfchengröBe die Oberflachenspannung abzunehmen beginnt, dann
erscheint es nicht berechtigt, das Wort »Emulsion« noch anzuwenden auf ein
Gemisch, worin die disperse Phase aus Tröpfchen besteht, deren GröBe unterhalb
dieser Grenze gelegen ist. Man ist dabei in ein neues Begrififsgebiet angelangt,
und ein neuer Terminus wird notwendig, ebenso wie es notwendig ist, Moleküle
und Ionen durch besondere Namen zu bezeichnen.

In einem solchen Sinne betrachtet, ist die neue Auffassung der sogenannten
»Emulsionskolloide«, wie dieselbe so klar ausgesprochen und durchgeführt ist in
Wo. Ostwald's »Kolloidchemie«, auch für mich annehmbar und der Ausdruck
einer sehr fruchtbaren physikalischen Theorie. Sichtbare Emulsionen mogen diese
Theorie anschaulich gemacht haben, ihre Eigenschaften sind ganz andere, wie
diejenigen, welche die Kolloide charakterisieren. Und wenn es sich herausstellen
sollte, daB die Eigenschaften der »Emulsionskolloide« nur erklart werden können,
wenn man annimmt, daB die Lösungen derselben aus kleinen wasserhaltigen Sub-
stanzmengen bestehen, welche im Dispersionsmittel schweben, dann mussen diese
Substanzmengen derart charakterisiert sein, daB sie sich prinzipiell von den
Tröpfchen der mikroskopischen Emulsionen unterscheiden.

') GrundriB der allgemeinen Chemie, 4. Aufl., 545 (1909).

Bildung und Verbrauch von StickoxyduI durch

Bakterien.

Von M. W. BEIJERINCK mit Mitwirkung von D. C. J. MINKMAN.
Centralblatt für Bakteriologie undParasitenkunde, Jena, II. Abt., XXV. Bd., 1910,8.30—63.

Die Bildung von StickoxyduI beim Denitrifikationsprozesse ist schon durch
die Entdecker dieses Vorganges beobachtet, namlich durch Schlösing')
bei der Milchsauregarung des Zuckers und der Urinfaulnis bei Gegenwart von
Nitraten, und von Gay on und Dupetit^) bei Denitrifikationsversuchen mit
Ammoncitrat bei Gegenwart von Asparagin und Kaliumnitrat.

Diese letzten Autoren haben zwei verschiedene denitrifizierende Bakterien-
arten, welche sie als a und |3 bezeichnen, durch Mittel, welche allerdings als
nicht einwandfrei zu betrachten sind, wie sie meinen, in Reinkultur gebracht,
und sie glauben festgestellt zu haben, daB a unter geeigneten Bedingungen sowohl
StickoxyduI wie freien Stickstoff erzeugt, wahrend |3 allein Stickstoff und kein
StickoxyduI aus Nitraten erzeugen sollte. Der Wunsch, festzustellen, inwieweit
diese Angaben richtig sind, und besonders die Frage, ob es vielleicht Mikroben
gibt, welche dem StickoxyduI angepaBt sind und dieses exothermische, bei der
Spaltung Warme entwickelnde Gas als Energie- oder Ernahrungsquelle ver-
wenden können, gaben die erste Veranlassung zu den folgenden Zeilen. Die
groBen Quantitaten StickoxyduI, welche wir bei vielen unserer Versuche fanden,
erregten unser Interesse und führten zu weiteren Fragen.

Merkwürdigerweise sind, nach der schon weit zurückliegenden Arbeit von
Gay on und Dupetit keine neuen Erfahrungen über Stickoxydulbildung bei
der Denitrifikation gemacht, ofïenbar weil das Gas von den spateren Untersuchern
für Stickstoff gehalten wurde, wovon es sich auch nur unterscheiden laBt durch
eine bestimmte Versuchsanstellung.

Ueber das Verschwinden des Stickoxyduls unter dem Einfluss von Mikroben
oder Pflanzen überhaupt liegen keine Untersuchungen vor"^).

Allgemeines und Methodische s.

Die gegenwartig gewöhnlich als richtig angenommene Theorie des Denitri-
fikationsprozesses kann durch die beiden folgenden Formen dargestellt werden:

') Journal de Pharmacic et de Chimie, Sér. 4. T. 8. 1868. p. 213. Comptes rendus
T. 66. p. 236.

^) Réduction des nitrates par les infiniment petits. (Station agronomiqiie de Bordeaux.
Nancy 1886. p. 51)

") Pfeffer, Pflanzenphysiologie. 2. Aufl. Bd. i. p. 399 u. 559- 1897.

349

2 NOsK 4- C. . . = 2 NO.K + CO2

und 4 NO2K + 3 C. . . = 2 N2 + 2 COïK + CO2

worin C , . . den Kohlenstofï der Kohlenstofifquelle bedeutet, und die Erfahrung

zum Ausdruck kommt, daB es sich bei diesem Vorgange um eine innere phy-

siologische Verbrennung handelt').

Da wir das Stickoxydul als niemals fehlendes, oft als beinahe das Haupt-
produkt der Denitrifikation erkannten, muB diese Theorie abgeandert werden
weil darin eben dieser prinzipielle Umstand aiiBer acht bleibt.

Ferner ist auch eine Erganzung der Theorie notwendig geworden.

In ersterer Beziehung sei folgendes hervorgehoben : Nach unserer Auf-
fassung muB der freie Stickstoff nicht auf Nitrit, sondern auf Stickoxydul zurück-
geführt werden. Wir werden namlich zeigen, daB das Oxydul sehr leicht durch
die in der Denitrifikation vorkommenden Bakterien gespalten werden kann, und
erinnern an den Umstand, daB diese Spaltung, wie gesagt, eine exothermische
ist. Dieses, in Verbindung mit der Erfahrung, daB es leicht gelingt, den Nitrat-
stickstoff nahezu quantitativ in Oxydul überzuführen, laBt es als unabweisbar
erscheinen, die Oxydulphase zu betrachten als eine Stufe des Prozesses der Nitrat-
reduktion, welche notwendig durchlaufen werden muB.

DaB dabei auch der Nitritphase eine wichtige Rolle zukommt, steht für uns
ebenfalls fest, woraus sich ergibt, daB das Oxydul jedenfalls zum Teile, vielleicht
zum gröBten Teile als eben aus Nitrit entstanden aufzufassen ist.

DaB dieses jedoch der alleinige Ursprung dieses Gases sein sollte, erachten
wir als unwahrscheinlich, und glauben die Nitrifikationstheorie erganzen zu mussen
mit der, nach unserer Meinung unabweisbaren Annahme, daB ein Teil des Oxy-
duls direkt aus dem Nitrat hervorgeht.

Wir kommen demzufolge auf Grund unserer Erfahrungen und Erwagungen
zu dem Schlusse, daB auBer der Nitritbildung aus Nitrat die drei folgenden Re-
aktionen charakteristisch für die Denitrifikation sind :

2 NO3K + 2 C. . . N2O + CO3K2 -r CO2
2 NO2K + C. . . = N2O + CO8K2

2 N20 + C... = 2 N2 + CO2

DaB diesen drei letzten Formeln eine gröBere Wahrscheinlichkeit zukommt
wie den obengenannten, wobei zu gleicher Zeit 4 Moleküle Nitrit und 3 Mole-
küle Kohlenstofï an der Reaktion teilnehmen sollen, liegt auf der Hand.

Weil das Stickoxydul in Wasser sehr löslich ist (0,67 Vol. bei 20" C), mussen
die darauf zu untersuchenden Garungsgase oberhalb Quecksilber, oder besser ober-
halb einer gesattigten Chlorcalciumlösung, worin bei Zimmertemperatur weniger
wie drei Volumprozent auflösen, gesammelt werden. Die dafür bei vielen Ver-
suchen verwendete Einrichtung ist in Figur i dargestellt.

Zweck dieses Apparates war, das Gas oberhalb Quecksilber zu sammeln und
dabei einen so klein wie möglichen Quecksilberspiegel zu bekommen, um die
Bildung des giftigen Dunstes dieses Metalles im Apparate und zu gleicher Zeit
das Gewicht des Ganzen minimal zu machen. Die Konstruktion ist folgende :

') Für die weitere Literatur über die Denitrifikation verweise ich auf : B. Lommer-
mann, Kritische Studiën über Denitrifikationsvorgange. Jena 1900, und A. M a assen ,
Arbeiten aus dem Gesundheitsamte. Bd. 18. 1901. p. 23.

350

Zu Boden des Glases a Fig. i A ist der eiserne Ring e vermittelst einer Gips-
schicht f in der Weise gefestigt, daB nur die drei Haken e Fig. i C herausragen.
Innerhalb des Glases a und auf dem Gipsboden wird die Kulturflasche c auf-
gestellt, deren Boden einen horizontalen Kragen mit drei Ausschnitten hat, welche
letztere die Haken des eisernen Ringes durchlassen und bei Drehung der Flasche

Figur I. Apparat von Minkman zum Auf fangen von Garungsgasen mit ininimalem
Quecksilbervolum und minimalem Quecksilberspiegel.

A. Langsschnitt a Becherglas; b Gasglocke mit Hahn und Tubulatur; c Garungs-
flasche mit Glashelm d; e eiserner Ring mit 3 Höckern zur Befestigung der Garungs-
flasche; f Gipsschicht zur Befestigung des eisernen Ringes am Boden des Becherglases;
Hg, Hg', Quecksilber.

B. Bodenansicht der Garungsflasche, um die drei Einschnitte des Kragens zu zeigen,
wodurch die drei Hoeker des eisernen Ringes passieren können, die beim Drehen der
Flasche diese mit »BajonettverschluB« am Boden halten.

C. Der eiserne Ring mit den drei Haken e, welche durch die Einschnitte des Kragens
des Bodens (B) der Flasche passieren können.

diese durch BajonettverschluB an dem Boden von a befestigen, so daB das ein-
zugieBende Quecksilber die Kulturflasche c nicht heben kann. Diese Flasche ist
mit aufgeschliffenem, weitem Glashelni d abgeschlossen, aus dessen geraumiger
Oefifnung das Gas, ohne allzusehr überzuschaumen entweichen kann. Die Gas-
empfangsglocke b paBt ziemlich genau um die Flasche c, so daB, wenn das Queck-
silber in das Glas a gegossen und durch den Hahn der Empfangsglocke b bis
zum Rande des Glashelmes d aufgesogen wird, nur ein schmaler, ringförmiger
Quecksilbermeniskus Hg-Dunst abgeben kann in den schadlichen Raum sr, welcher
von Anfang an etwas Luft enthalt. Wie das Gas die Glocke b aufheben und
für die Gasanalyse gesammelt werden kann, ist aus den Figuren klar. Obschon
es nicht zu vermeiden ist, daB der innere Quecksilbermeniskus sich mit der etwas
überschaumenden Kulturflüssigkeit befeuchtet. laBt sich mit dem Apparat doch
befriedigend arbeiten.

351

Anstatt Quecksilber kann in diesem Apparate eine gesattigte Chlorcalcium-
lösung verwendet werden.

In anderen Fallen wurde die Garung einfach in einer geschlossenen Stöpsel-
flasche eingeleitet, und sobald die Gasentwicklung begann, der Stopsel abge-
nommen und durch einen Gummistöpsel mit Gasableiter ersetzt, was leicht ohne
Infektion geschehen kann.

Der qualitative Nachweis des Stickoxyduls geschieht dadurch, daB man nach
der Entfernung etwa vorhandener Spuren von Sauerstoff vermittelst der Phos-
phorpipette einige elektrische Funken durchschlagen laBt, wahrend das Gas sich
oberhalb der Starke-Jodkalium-Salzsaurelösung befindet. Ist Stickoxydul vor-
handen, so entsteht Stickoxyd, und wenn man eine Luftblase hineinlaBt NO2,
welches Jod frei macht und die Flüssigkeit unter dem Gase tief blau farbt. Auch
wird dabei direkt ein wenig NO2 gebildet.

Bestehen mehr als 70 Proz. des Gases aus Stickoxydul, so kann ein glühender
Holzspan darin entflammen. Bei einem Gehalte zwischen 50 Proz. und 70 Proz.
entflammt ein Holzspan zwar nicht, doch verbleibt er in dem glühenden Zustande.

Für den quantitativen Nachweis von Stickoxydul in Gasgemischen kommen
vor allem drei Methoden in Betracht. Ist mehr als 25 Proz. gegenwartig, so kann
das Gemisch, wenn es mit dem gleichen Volum Wasserstoff versetzt ist, durch
den elektrischen Funken explodieren; ist weniger vorhanden, so muB das Gas
nach Vermischung mit Knallgas zur Explosion gebracht'), oder nach Ver-
mischung mit einem bekannten Volum Wasserstoff in der Drehschmidt'schen
Platinkapillare verbrannt werden. Weil letzteres Verfahren einfach und allgemein
anwendbar ist, wurde dasselbe bei unseren spateren Versuchen stets gebraucht.

Die Gasanalyse findet dann wie folgt statt: Zunachst wird die Kohlensaure
absorbiert und die Volumverminderung abgelesen : der Gasrest wird nun mit dem
gleichen Volum Wasserstoff vermischt und durch die erhitzte Platinkapillare ge-
führt, worin das Stickoxydul verbrennt nach der Formel :

N2O + H-i = H2O -^ N2
und also eine Kontraktion des Volums auf die Halfte stattfindet. Die tatsachlich
abgelesene Kontraktion gibt also an, wieviel Stickoxydul gegenwartig war. Der
Rest der ursprünglichen Menge ist der von vornan gebildete freie Stickstoft'.

Falls etwas Sauerstoff im Gasgemische vorkommt, wird dieser nach der
Kohlensaureabsorption mit der Phosphorpipette bestimmt.

Bei unseren in dieser Abhandlung betrachteten Versuchen waren Stickoxyd
und Stickstoffperoxyd niemals gegenwartig, doch haben wir diese Gase in geringer
Menge bei der Denitrifikation mit Melasse gefunden, trotzdem die Reaktion des
Nahrmediums alkalisch war.

SchlieBlich sei noch bemerkt, daB i g KNO3 bei vollstandiger Denitrifikation
ca. 112 ccm Stickoxydul oder ebensoviel freien Stickstoff erzeugen kann, wahrend
diese Zahl für Ammonnitrat 140 ccm pro g betragt.

«) Hempel, Gasanalytische Methoden. 3. Aufl. p, 176. 1900. K e mp 's Methode der
Verbrennung mit Kohlenoxyd ist etwas umstandlicher.

352

Kapitel i. Bildung von Stickoxydul durch Bakterien.

I. Einrichtung von Denitrifikationsversuchen im Allgemeinen.

Es gibt eine groBe Menge von Versuchen, wobei Denitrifikationserschei-
nungen stattfinden können, weil die verschiedenartigsten Kohlenstoffquellen sich
dafür als geeignet erweisen, wenn zugleich irgend ein Nitrat gegenwartig ist.
Wichtig ist, zu beachten, daB der Vorgang am schnellsten bei Temperaturen
von 30" bis 37*^, je nach den wirksamen Arten, verlauft, und unterhalb dieser
Temperaturen sehr verzögert wird. Bei geeigneter Versuchseinrichtung kann man
schon innerhalb ein oder zweier Tage reichliche Gasmengen sammeln. Gewöhnlich
bekommt man gute Resultate, wenn die Kulturflüssigkeit eine Flasche mit gut
eingeschliffenem Stopsel ganzlich anfüllt, sodaB die geloste Luft dann offenbar
zureichend ist, um den immer notwendigen »Reizsauerstoff« heranzuführen. Doch
hat sich herausgestellt, daB eine Luftblase unter dem Stopsel für bestimmte
Arten notwendig ist. So für den in Gartenerde ziemlich seltenen, carotinhaltigen
Bacillus vulpinus. Immer muB man bedenken, daB es überhaupt keine
absoluten Anaeroben giebt, und daB selbst die Nitratgruppe nicht imstande ist,
den für alles Leben notwendigen »Reizsauerstoff« abzugeben, dafür sind gröBere
oder kleinere Quantitaten freien Sauerstoffs unumganglich notwendig. Eben bei
denitrifizierenden Bakterien ist der Nachweis dieses Naturgesetzes von besonderer
Leichtigkeit. So z. B. für B. Stutzeri. Wenn man namlich diese, die Gelatine
nicht verflüssigende Art in groBer Individuenzahl mit Bouillon, i Proz. Kalium-
nitratgelatine, welche durch langeres Kochen vollstandig sauerstofïrei gemacht
ist, vermischt, in einer tiefen Reagentienröhre erstarren laBt, und etwas unter-
halb der Schmelztemperatur der Gelatine kultiviert, so wird man sehen, daB in
der Tiefe nur im Anfang des Versuches etwas Wachstum und Gasbildung be-
merklich sind, welche jedoch alsbald schwinden, wahrend mehr nach oben diese
Prozesse regelmaBig weitergehen. Anfangs waren offenbar selbst in der Tiefe
noch zureichende Mengen Reizsauerstoff gegenwartig, die aber alsbald auf-
gebraucht sind, wobei das weitere Wachstum trotz des reichen Salpetergehaltes
unmöglich wird.

Bei dieser Art bemerkt man dann zu gleicher Zeit in der Gelatine in
geringer, aber deutlicher Entfernung von der freien Oberflache ein Niveau, wo
die Koloniën kraftiger wachsen wie darüber (kraftiger also wie im Meniskus
selbst) und wie darunter, was auf Mikroaërophilie beruht, welche ebenfalls be-
merkbar wird durch das Zustandekommen einer »spirillenartigen« Atmungsfigur
bei Bewegungsversuchen mit dem mikroskopischen Praparat in der Glaskammer.

Doch kehren wir zur Denitrifikation selbst zurück. LaBt man, wenn es nicht
auf groBe Genauigkeit ankommt, den Vorgang in einer gewöhnlichen Stöpsel-
flasche verlaufen, so findet zunachst ein Auspressen von Schaum statt, wodurch
zwar ein Teil der Flüssigkeit verloren geht, welcher aber durch das Gas ersetzt
wird. Wünscht man das Gas zu sammeln, so wird der Glasstöpsel durch einen
Kautschukstöpsel mit Gasableiter ersetzt und oberhalb der gesattigten Chlor-
caliumlösung aufgefangen.

Als sehr geeignete Kohlenstoffquellen für denitrifizierende Bakterien sind

353

Bouillon einerseits und ferner die Saize der organischen Sauren erkannt, besonders
diejenigen mit Kalium, Natrium und Ammon als Basen.

Auch der gewöhnliche Aethylalkohol ist eine gut geeignete Kohlenstoffquelle.
Kultiviert man bei LuftabschluB in loo Leitungswasser, 0,5 Alkohol, i KNO3,
0,05 KïHPOi bei 37° und mit Gartenerde als Infektionsmaterial, so erhalt man
eine kraftige Denitrifikation, welche bei der Überimpfung (wenigstens im Winter
1909 zu Delft) eine schone, blaugrüne Flüssigkeit lieferte, worin Bacillus
pyocyaneus vorherrschte.

Als weniger geeignet ergaben sich die Kohlenhydrate und die höheren Alko-
hole. Doch können mit Glyzerin, Mannit und Zellulose sehr kraftige Denitrifika-
tionen erhalten werden, wenn man übrigens geeignete Versuchsbedingungen einführt.

Wenn man z. B. eine Flasche füUt mit Leitungswasser, 2 Proz. Mannit,
I Proz. KNO3 und 0,05 Proz. K2HPO1, infiziert mit viel Gartenerde und kulti-
viert bei 2)7^ C, so entsteht nach 24 Stunden eine heftige Denitrifikation mit
höchst bemerkenswerten Bakterien. Impft man davon über in die gleiche Nahr-
lösung, so bekommt man jedoch keine weitere Denitrifikation; die ganze, sehr
eigentümliche Flora der Rohkultur verschwindet dabei.

Ersetzt man unter übrigens gleichen Bedingungen den Mannit durch 2 Proz.
Glyzerin, so erhalt man ebenfalls eine heftige Denitrifikation, welche auch bei
der Überimpfung wieder hervortritt, jedoch mit betrachtlichen Anderungen in
der Flora, verglichen mit derjenigen der Rohkultur.

Wird Zellulose (Filtrierpapier) unter den bezeichneten Bedingungen gegeben,
so bekommt man ein Gemisch von zwei Denitrifikatoren, namlich Bacillus
nitrogenes (=B. Stutzeri) und eine eigentümliche, die Zellulose zersetzende
Art; doch ist der Vorgang sehr langsam, wenn auch lange dauernd').

Merkwürdigerweise entsteht in allen diesen Fallen kein Wasserstoff.

Verwendet man 2 Proz. Glukose und i Proz. KNO3, so entsteht mit frischer
Erde als Impfmaterial eine starke Buttersauregarung, und die Garungsgase ent-
halten neben Stickstoff und Kohlensaure auch Wasserstoff, aber kein Stickoxydul.
Eine Überimpfung vertragen solche Garungen mit Zucker jedoch nicht. Es laBt
sich nachweisen, dass in diesen Fallen Ammon aus der Nitratgruppe entsteht,
doch findet sich unerwarteterweise in den Garungsgasen wahrend der zuletzt ein-
tretenden Ammonphase einer solchen »Glukose Nitrat-Denitrifikation« kein Wasser-
stoff mehr, dagegen freier Stickstoff, selbst zur Zeit, wo die Nitrat- und Nitrit-
reaktionen schon verschwunden sind.

Weil die Möglichkeit des Zustandekommens der Buttersauregarung bei Ge-
genwart von Salpeter nicht uninteressant ist, will ich hier noch folgendes Bei-
spiel anführen : Es wurden aus 2 g Glukose 2 g Kreide, i g KNO3, 0,05 g CINHi
und 0,05 K2HPO4 in 100 ccm Leitungswasser, bei 37" C in geschlossenen Flaschen
kultiviert, mit 2 g Gartenerde als Impfmaterial, vom 14. — 16. Juni nahezu 500 ccm
Gas gesammelt von der mittleren Zusammenstellung 53 Proz. CO», 2)^ Proz. Ha
und 15 Proz. N2. Aus einer ahnlichen Kultur ohne KNO^ wurden in derselben
Zeit an Gas erhalten ebenfalls ungefahr 500 ccm von der mittleren Zusammen-

') G. van I terson, Akad. vanWetensch. Amsterdam. Bd.2. 1903. p. 686. (Centralbl.
f. Bakt. Abt. IL 1904. Bd. 4 p. 1.689).

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. 23

354

stellung 50 Proz. CO2 und 50 Proz. Ha. Es waren also im ersteren Falie 75 ccm
weniger Wasserstofï und Kohlensaure gebildet wie im zweiten, doch zeigte das
mikroskopische Bild in beiden Flüssigkeiten sehr viel Granulobacter, und bei
der aëroben Aussaat wurden aus beiden Garflüssigkeiten Garungsbakterien aus
der Coligruppe erhalten.

Die mit Glukose, Starke, Rohrzucker und ahnlichen Kohlenstoffquellen er-
zeugten Buttersauregarungen sind bei Gegenwart von Nitraten die einzigen bisher
bekannten Denitrifikationen, wobei kein Stickoxydul entsteht. Die Frage verdient
eine weitere Untersuchung.

Weil beim Fortlassen der Ammonsalze bei diesen Versuchen aus dem Nitrat
selbst Ammon gebildet wird, ist der allgemeine Verlauf derselben in beiden Fallen
ahnlich, doch erscheint Zufügung des Ammonsalzes geeignet, den Versuch zu ver-
einfachen.

Verwendet man neben Glukose 8 Proz. KNO3, so entsteht keine Butter-
saure, sondern eine heftige N i tro x usgarung, und das Garungsgas enthalt keinen
Wasserstoff, jedoch ca. 90 Proz. N2O.

Mit Formiaten (und mit Ureum) ist Denitrifikation, wie es scheint, unmöglich,
wenigstens sind bisher alle Versuche in dieser Richtung miBlungen.

Mit 2 Proz. Natriumacetat, i Proz. KNO3 und 0,5 Proz. K2HPO4 in Leitungs-
wasser entsteht bei 37" C eine eigentümliche Flora von Sporenbildnern, welche
das Überimpfen schlecht vertragt.

Mit Natriumpropionat gelingt die Denitrifikation viel besser, Hat man mit
Gartenerde geimpft und impft man über in die gleiche Nahrflüssigkeit, so be-
kommt man eine schön grünblaue Lösung, worin als Hauptdenitrifikator Bacillus
pyocyaneus (Delft, 1909).

Ebenso wie Alkohol ist Propionat also eine geeignete Substanz, um letztere
Bakterienart in Erde nachzuweisen. Mit freier Stearinsaure erhielten wir im
Sommer und Herbst 1908 ein ahnliches Resultat, wie mit Propionat; nicht jedoch im
Jahre 1909, obschon auch dann, wie wir sehen werden, B. pyocyaneus auf andere
Weise leicht aus Erde zu erhalten war. Es muB also im letzteren Jahre in unserer
Umgebung eine andere Varietat dieser Art verbreitet gewesen sein, wie früher.

Als besonders gute Nahrsubstanzen für die Denitrifikation ergaben sich die
Salze der Citronensaure, Weinsaure und Apfelsaure; an Artenreichtum zeichneten
sich die Seignettesalzkulturen (Kaliumnatriumtartrat) aus. So erhielten wir aus
5 Proz. Lösung dieses Salzes mit 2 Proz. KNO3, unter den schon mehrfach ge-
nannten Bedingungen garend, bei der Aussaat auf Fleischbouillonagar nicht weniger
wie 5 Denitrifikatoren, worunter B. pyocyaneus, B. nitrogenes (in 2 Varie-
taten), eine Varietat von B. vulpinus und ein früher noch nicht beobachteter
Micrococcus; daneben noch ein paar Arten, welche nicht denitrifizierten.

Anderseits gelang es'), durch die Verwendung von 2 Proz, Calciumtartrat
und den relativ hohen Salpetergehalt von 2 Proz., aus Kanalwasser bei der
Temperatur von 28" und durch wiederholtes Überimpfen zu einer sehr weitgehenden
»Reinigung« der Kultur und schlieBlich beinahe zu einer Reinkultur zu kommen

') G. van Iterson, Ophoopingsproeven met denitrificeerende Bakteriën. (Verband.
Akad. v. Wetensch. Amsterdam. Deel 11. 1903. p. 3.)

355

von B. nitrogenes (B. Stutzeri)*), wobei sovvohl der Kalk als auch der hohe
Nitratgehalt, weil für viele Bakterien schadlich, als »reinigende« Faktoren zu be-
trachten sind.

Wie gut die Denitrifikatoren des Meeres sich durch Calciummalat anhaufen
lassen, zeigte Herr Gran").

Was sich mit Ammoncitrat und Salpeter bei 37" erreichen laBt, ist in der
klassischen Untersuchung von Gay on und Dupetit (1. c.) ausführlich gezeigt.

Von stickstoffhaltigen Kohlenstofïquellen sind auBer Pepton die folgenden
für unseren Zweck bemerkenswert: Zunachst die Harnsaure und das Asparagin,
welche sich besonders gut eignen für die Anhaufung bei 37° des so vielseitigen
und so allgemein verbreiteten Bacillus pyocyaneus. Die Überimpfungen in
der Asparaginlösung (0,05 Proz. Asparagin, i Proz. KNO3, 0,5 Proz. K-HPOi)
schlagen jedoch bisweilen fehl. Auch kann es vorkommen, daB sie sich sehr
schön rot farben, ohne sich stark zu trüben. Obschon die Reaktion solcher
Kulturflüssigkeiten alkalisch bleibt, erhalt man daraus auf Platten Reinkulturen
von B. pyocyaneus. Weil das Pyocyanin sich zwar rot farbt mit Sauren, jedoch
blau bleibt mit Alkaliën, muB der hier gebildete Farbstoff von Pyocyanin ver-
schieden sein (Pyoerythrin).

Ferner muB hier das Glykokoll genannt weerden, wovon 2,5 Proz. mit i Proz.
Salpeter mit Gartenerde bei ^y" wundervolle zoogloen oder sarcineartige Bakterien-
klumpen liefert, w^elche wahrscheinlich zu der sporenbildenden, unter diesen Be-
dingungen sich ganzlich deformierenden Art geboren, welche spater als Bacillus
nitroxus besprochen werden soll, woneben sich aber auch noch andere Arten
entwickeln.

Auch 0,5 Proz. Alanin mit i Proz. KNO:? ist für Denitrifikation bei ^y^
ausgezeichnet und interessant wegen der gemischten, an S[)orenbildnern reichen
Flora.

In einer 0,5 Proz. Glukosaminlösung mit i Proz. KNO3 und Gartenerde als
Impfmaterial entstand bei 37^ C zu unserer Überraschung eine heftige Granulo-
bactergarung. Die prachtigen, plumpen, stark beweglichen Stabchen farbten sich
mit Jod, nur mit Ausnahme eines Poles tiefblau. Beim Überimpfen in gleicher
Lösung entwickelte sich, gemaB der Erwartung, überhaupt keine weitere Garung.

Manche dieser Angaben beziehen sich auf noch nicht ganzlich durchgearbeitete
Versuchsreihen, und werden hier nur angeführt, weil es Typen sind, wovon jeder
in verschiedenen Richtungen einiges Interesse hat.

Als besonders geeignet für Denitrifikationsversuche haben die verschicdensten
Autoren Nitrat-Bouillon erkannt, wobei entweder Fleisch oder andere tierische
Substanzen für die Anfertigung verwendet wurden. Auch wir haben wegen ver-
schiedener Ursacheri eben damit experimentiert, und zwar besonders deshalb, weil
man aus der Literatur den Eindruck bekommt, daB daraus kein Stickoxydul ge-
bildet wird, und dieses Gas nur unter ganz besonderen Bedingungen aus Ammon-

') Migula, System der Bakterien. Bd. 2. 1900. p- 793 (Bacil lus nitrogenes).
Lehmann und Neumann, Bakteriologische Diagnostik. p. 237. 1906 (Bacillus
S t u t z e r i ) .

-) Studiën über Meeresbakterien. I (Bergens Aarbog. 1901. No. 10.).

23*

356

citrat-Asparagin-Nitrat entstehen sollte. Wir haben aber, dieser Auffassung ganz
entgegengesetzt, gefunden, daB die Xitrat-Bouillon wohl die vorzüglichste Nahr-
lösung ist, um den Vorgang der Stickoxydulbildung zu studieren.

Der Bakterienzustand in den angeführten Rohkulturen ist auBerordentlich
verschieden, und, wie gesagt, noch nicht vollstandig durchgearbeitet. Folgende
Regel laBt sich mikroskopisch nachweisen als allgemein zutreffend: Bei einem
Nitratgehalt von 5 Proz. bis 12 Proz. herrschen, bei den beschriebenen Bedin-
gungen, sovvie auch in Nitratbouillon bei 370 langere, bewegliche, sporenbildende
Stabchen vor, welche zu mehreren nahe verwandten Arten oder Varietaten zu
bringen sind, die den anaëroben Keimen der eigentlichen stinkenden EiweiB-
faulnis sehr nahe stehen. Bei einem geringeren Salpetergehalt, von z. B. 0,1 Proz.
a r Proz. und bei niederer Temperatur, zeigt das mikroskopische Bild zwar in der
Rohkultur mit Bouillon, wenigstens im Anfang der Kultur, ebenfalls Sporen-
bildner, doch in den Überimpfungen und in den Kuituren mit Laktaten, Malaten,
Tartraten und Citraten als Kohlenstoffquellen wohl unter allen Bedingungen vor-
wiegend schnell bewegliche, kleine Stabchen, wahrend die Sporenbildner dabei
zurücktreten.

Das Resultat der Kulturversuche nach dem Plattenverfahren zeigt, daB die
Flora in allen Pallen, wobei wenig Nitrat gebraucht wird, auBer den eigentlichen
denitrifizierenden, auch einige nicht denitrifizierenden Arten, und zwar die letzteren
scheinbar in Mehrheit oder groBer Mehrheit enthalt, woraus jedoch in Verbindung
mit genauer mikroskopischer Untersuchung geschlossen werden muB, daB die in
Betracht kommenden denitrifizierenden Bakterien auf unseren Platten nur zum
kleinen oder sehr kleinen Teil Koloniën erzeugen.

Bei jedem verschieden angeordneten Versuche ist die Artenzahl im ganzen
ziemlich gering, meistens herrscht dabei nur eine wohl und eine nicht denitri-
fizierende Art vor. Unter sehr günstigen Ernahrungsbedingungen ist die Arten-
zahl gröBer, wovon wir ein Beispiel kennen lernten in dem Seignettesalz (Kalium-
natriumtartrat), welches eine besonders gute Kohlenstoffquelle ist.

Weil es schwer ist, aus den Rohkulturen zu einer bestimmten Ansicht be-
züglich der Verbreitung und Allgemeinheit der Denitrifikatoren in den Roh-
materialien zu kommen, haben wir viele Versuche gemacht zu einer direkten
Erkennung der Koloniën dieser Bakteriengruppe auf den Kulturplatten, wobei
wir sowohl die Alkali- wie die Gasbildung als charakteristische Reaktion für das
Auffinden derselben zu verwenden suchten. allein bisher vergebens. Vorlaufig sind
wir deshalb auf Anreicherungen in bestimmten Nahrlösungen angewiesen, wobei
festgestellt wird, mit welcher Minimumquantitat Impfmaterial und Denitrifikation
zu erhalten ist.

2. Bildung von Stickoxydul in den Roh denitrifikation en.

Von der reichlichen Bildung von Stickoxydul, welche bei gut eingerichteten
Versuchen stattfindet, kann man sich auf folgende einfache Weise überzeugen :

Man fülle eine gutschlieBende Stöpselflasche mit eingeschliffenem Glasstöpsel
von ca. 200 ccm ganzlich mit Fleischbouillon, welche mit 8 Proz. Kaliumnitrat

357

versetzt ist, iind infiziere mit einer reichlichen Menge Gartenerde, z. B. lo oder
20 g. Stellt man die Flasche dann bei 2)7^, so findet man am anderen oder am
nachstfolgenden Tage, daB durch ein sehr starkes Bakterienwachstum eine pro-
fuse Schaumbildung stattgefunden hat und ein betrachtlicher Teil der Kultur-
flüssigkeit zwischen Halswand und Stopsel der Flasche durch einen eigentümlichen
KapillarprozeB nach auBen befördert ist, wahrend der dadurch freigewordene
Raum sich mit dem Garungsgase angefüllt hat, indem der lose aufgesetzte, aber
dennoch gut anschlieBende Stopsel, infolge des inneren Druckes wohl Füssigkeit
aus-, jedoch keine Luft hineingelassen hat. Das Gas ist ein Gemisch von Stick-
oxydul, Stickstoff und Kohlensaure, wahrend der 24 ersten Stunden gewöhnlich
mit weniger, nach 48 Stunden und spater, in dem hier betrachteten Falie mit
ca. 90 Proz. Stickoxydul. Wird die Flasche vorsichtig geöffnet und ein glühender
Holzspan hineingebracht, so sieht man denselben sich plötzlich entzünden. So
lange noch genügend Nitrat und organische Nahrung vorhanden sind, um die
Garung lebhaft im Gange zu halten, kann dieser Versuch mit gleichem Erfolge
wiederholt werden, jedoch verringert sich der Garvorgang infolge der Alkali-
karbonatbildung.

Erhöht man den Salpetergehalt der Bouillon auf 10 Proz., ja auf 12 Proz.,
so ist der Verlauf des Versuches derselbe, wie bei 8 Proz. Vermindert man diesen
Gehalt dagegen auf 5 Proz., 2 Proz. oder i Proz., so vermindert sich der Gehalt
der Garungsgase an Stickoxydul bis auf ca. 50 Proz., mit gleichzeitiger Zunahme
des Stickstoffgehaltes, so daB es nahe liegt, anzunehmen, daB zwar zuerst Stick-
oxydul entsteht, daB dieses aber unter Sauerstoffabgabe sich weiter reduziert,
eine Ansicht, welche, wie wir spater sehen werden, im allgemeinen sicher richtig
ist. Bekanntlich entstehen die Garungsgase ausschlieBlich aus der Nitratgruppe,
wahrend die Amid- und die Ammongruppe nicht angegriffen werden. Ersetzt
man das Kaliumnitrat durch Ammonnitrat, so verandert sich deshalb der Verlauf
des Versuchs nicht. Der naheliegende Gedanke, es könnte in diesem Falie eine
katalytische Spaltung des Ammonnitrats zu Stickoxydul und Wasser zu stande
kommen, ergibt sich also als unrichtig. Ebensowenig findet unter dem EinfluB
der Mikroben eine Katalyse von Ammonnitrit unter Abspaltung von freiem Stick-
stoff statt.

Dennoch kann die Verwendung von Ammonnitrat nützlich sein, wenn es
sich darum handelt, der schadlichen Beeinflussung des Denitrifikationsprozesses
durch das Alkali, welches dabei entsteht, vorzubeugen. Aus dem Ammoncarbonat
kann namlich durch Hinzufügung des schwer löslichen und an sich unschad-
lichen Magnesiumhydrophosphats (MgHPOi. 2 H2O) das Ammon als unlösliches
NH4MgP04 prazipitiert werden, wahrend die Kohlensaure entweicht, was bei den
fixen Carbonaten nicht gelingt').

Bestimmt man den Gehalt an Stickoxydul in den Garungsgasen der früher
in kursorischer Übersicht genannten Denitrifikationen, so findet man, daB dieser
Körper nur mit einer Ausnahme stets vorhanden ist, wenn auch in sehr wechselnden
Mengenverhaltnissen. Die Ausnahme betrifft die denitrifizierenden Buttersaure-

') Liebert, Akad. van Wetensch. Amsterdam, 6. Mei 1909. p. 990.

358

garungen, wobei neben Kohlensaure und Wasserstoff nur Stickstoff entsteht. Wir
sehen also, da6 es sich bei dem Stickoxydul um einen Körper handelt, welcher
im Denitrifikationsprozesse sehr oft ein ebenso wichtiges und in gewissen Fallen
ein viel wichtigeres Produkt ist, wie der Stickstoff selber. Es muB daher sehr
auffallend erscheinen, daB Gayon und Dupetit die Haupteinteilung ihrer Arbeit
darauf gründen, daB nur bei der gleichzeitigen Verwendung von Ammoncitrat
und Asparagin als Kohlenstoffquelle Stickoxydul entsteht und niemals anders.
Bei ihren zahlreichen Versuchen mit Bouillon sollte das Gas sich nicht gebildet
haben. Wie dieser vollstandige Widerspruch mit unseren Resultaten zu erklaren
ist, und wie es möglich ist, daB so gute Beobachter sich derweise irren konnten,
wird sich spater ergeben.

3. Beispiele von Analysen des Gases der Rohdenitrifikationen.

Weil es sich also herausgestellt hat, daB die bisherige Auffassung des Deniiri-
fikationsprozesses gewissermaBen eine prinzipielle Veranderung erfahren muB,
erscheint es angemessen, einige unserer Versuche genauer zu beschreiben, um
die quantitativen Verhaltnisse für verschiedene Falie zu beleuchten.

In einem Versuche mit Fleischbouillon (20 g Ochsenfleisch, 100 g Wasser
viele Stunden gekocht und digeriert) mit i Proz. NH4NO3, infiziert mit viel Garten-
erde, welche zuvor 3 Minuten lang mit Wasser gekocht war, um allein die Sporen-
bildner in Kultur zu bekommen, entwickelte sich bei 27^ schon nach 24 Stunden
viel Gas, welches am 2. Kulturtage 25 Proz., am 3. Tage 75 Proz. N2O enthielt.
Beim Mikroskopieren waren nur langere, teilweise zu Clostridien angeschwollene
Stabchen nachweisbar; viele davon enthielten mittelstandige Sporen. In viel ge-
ringerer Zahl waren Stabchen mit terminalen Sporen zu finden. . Wir konnten
nicht daran zweifeln, daB es sich hierbei der Hauptsache nach um den sporen-
bildenden Denitrifikator Bacillus nitroxus mit seinen Nebenarten handelt,
welcher spater naher betrachtet werden wird.

Bei einem anderen Versuche wurde frische Erde als Infektionsmaterial in
Fleischbouillon mit 5 Proz. NH4NO3 gebracht und am 3. Tage nach der Impfung,
als die Gasbildung infolge der alkalischen Reaktion sich verzögerte, mit MgHPOi
versetzt, zur Bindung des Ammonkarbonates. Mikroskopisch wurden nur lange,
bewegliche Stabchen gefunden, teilweise schon mit Sporen, Nichtsporenbildner
fehlten. Trotzdem das Impfmaterial weder gekocht, noch pasteurisiert war, steht
es fest, daB auch in diesem Falie unser B. nitroxus im weiteren Sinne die
Hauptrolle spielte.

Aus der ganzen verwendeten Ammonnitratmenge (namlich 12,5 g batten
sich 1750 ccm Gas, als Stickstoff oder als Stickoxydul berechnet, entwickeln können,
weil r g NHiNOs 140 ccm N2 erzeugen kann, wenn die NOa-Gruppe ganzlich
spaltet und die NH4-Gruppe unverandert bleibt.

Im ganzen wurden an Gas aufgefangen 859 ccm, wovon die Zusammen-
setzung aus folgender Tabelle hervorgeht :

359

Datum

Gas im
ganzen
in ccm

NïO

in
ccm

N»Oin

0/0

COain
ccm

CO. in

«/o

in

ccm

Nïin

Frische Erde in
Bouillon mit s'/o
NH4N03bei37''C.

15. Jt

i6.

jni Beginn .

30

18

60

8

^1

4

13

Beginn der Kultur.

17.

, Morgen

161

88,5

55

67,6

42

4,9

3

Mit MgHP04 in

17-

, Mittag . .

178

46,4

26

124,6

70

7

4

UberschuB versetzt,

18.

,

180

75.6

42

100,8

56

3,6

2

weil die Gasbildung

19.

,

198

179,2

88

18,8

12

0

0

sich verzögerte und

21.

,

88,5

71,7

81

7,1

8

9,7

II

dadurch wieder be-

22.

'

24

19.4

81

1,9

8

2.7

II

schleunigt.

Total

859

498,8

58

328,8

383

31,9

3,7

Aus diesem Versuche sieht man, daB die Denitrifikation durch die Sporen-
bildner in Rohkultur nur ganz wenig freien Stickstofif, namlich 3,7 Proz., dagegen
sehr viel N2O, namlich 58 Proz., erzeugt hat, wahrend das übrige Gas aus Kohlen-
saure bestand. Stickoxyd war nicht gegenwartig. Überhaupt haben wir dieses
letztere Gas bei keinem der hier beschriebenen Versuche gefunden, wohl des-
halb, weil wir nur bei neutraler oder alkalischer Reaktion arbeiteten (vergl. S. 351
drittletztes Alinea).

Wenn man viel weniger Ammonnitrat oder Kaliumnitrat verwendet und eben
wie im vorigen Versuche mit viel frischer Erde impft, so vermindert sich das
Stickoxydul, wahrend der freie Stickstoff sich vermehrt, wie aus folgendem Ver-
suche hervorgeht. Es wurden am 5. Juni 1909 250 ccm Fleischbouillon mit 2,5 g
NHiNOs (also i Proz.) in geschlossener Flasche mit frischer Gartenerde ge-
impft und bei 37*^ kultiviert ; die Gasbildung war wie folgt:

Gas im

N2O

NO.

in "/o

CO2

CO2

in */'o

N»0

Nïin

"/o

Frische Erde in

ganzen
in ccm

in
ccm

in
ccm

in
ccm

Bouillon mit i^/o
NH4NO3 bei 37».

7. Juni

8. „
10. „

200

64
22

168

41

I

84
64

5

14
20
0,9

7
3
4

18

20

9
33
21

Der Versuch be-
ginnt 5. Juni.

Total

286

210

73,7

16,9

58 0/0

59

20,5

Hatte 350 ccm Gas

als N2 oderN20

geben können.

Wurde am 7. Juni

übergeimpft in die-

7. Juni, Uber-

selbe Nahrlösung.

impfung

jedoch mit nur 2 g

8. Juni

99

24,3

25

7,3

7,5

65,5

67,5

NH4 NOs, welche

9- „

100

22,5

22,5

5

5

72,5

72,5

also 280 ccm Gas als

10. „

33

Z,Z

10

I

3

28,7

8

Nï batte geben könn.

Total

230

50,1

21.8

13,3

5,7

166,7

7,25

Hieraus sieht man, daB das Gas im Anfang 73,7 Proz. N2O, nach der Über-
impfung nur noch 21,6 Proz. N2O enthielt, wahrend der Stickstofïgehalt dabei von
20,5 Proz. auf 72,5 Proz. gestiegen war.

300

Mikroskopiert man diese und ahnliche bei 2)7^ geführte Garungen, so findet
man, daB darin neben vielen Sporenbildnern sehr viele kleine, nicht sporen-
bildende Bakterien vorkommen, welche letztere bei der Überimpfung stark an
Zahl sich vermehren.

Wir glauben aus diesen und ahnlichen Versuchen schlieBen zu mussen, daB
selbst bei der Verwendung von nur i Prozent Nitrat in Bouillon bei der Impfung
mit viel frischer, nicht pasteurisierter Gartenerde in der Rohkultur zunach'st nur
B. nitroxus zur Entwicklung gelangt, obschon das Nahrmedium für andere
denitrifizierende Arten gunstiger ist, was, allem Anscheine nach, zu dem bemerkens-
werten Resultate führt, daB unsere sporenbildende Nitroxusgruppe die in Garten-
erde bei weitem am allgemeinsten verbreiteten Denitrifikatoren umfaBt, weil sie
anders sofort, das heiBt schon in der Rohkultur, ihren Konkurrenten Platz machen
müBten.

Weil man meinen könnte, daB in den vorhergehenden Versuchen die bekannte
Spaltung des Ammonnitrats in Stickoxydul und Wasser, welche durch Erhitzung
stattfindet, auch durch die Mikroben hervorgerufen werden könnte, erinnere ich
zunachst an die schon erwahnte Erfahrung, daB bei allen früher untersuchten
Denitrifikationen das Ammon der Nahrlösung nach Beendigung der Denitrifikation
quantitativ zurückgefunden wird. Für unseren speziellen Fall wünsche ich die
Richtigkeit dieser Ansicht noch durch ein paar besondere Beispiele zu erlautern,
welche zeigen, daB das Stickoxydul in gleicher Menge aus Kalium- oder Natrium-
nitrat, wie aus Ammonnitrat entsteht. Als erstes Beispiel nehnie ich den Fall von
Fleischbouillon mit i Proz. KNO3, infiziert mit frischer Gartenerde bei 37 ^ wobei
anfangs wieder nur Sporenbildner, spater auch viele kleine Nichtsporenbildner
auftreten. Die Gase hatten folgende Zusammensetzung:

Beginn

Datum

Gasim
ganzen
in ccm

N2O

in
ccm

N2O

in >

CO2

in
ccm

CO2

in o/o

Nïin
ccm

N»in
"/o

15- Juni

17. Juni

18. „

192

54

146
13

76

24

11,5

6
40

33,5
41

18
76

Pro g KNO» entsteht

iiaccmsNa. Verwendet

2 g KNOa kann also 224

ccm ergeben.

Total

246

159

64,6

11,5

4,7

75,5

30,7

Wie man sieht, ist auch hier das Gas gröBtenteils Stickoxydul. DaB im
ganzen 246 ccm Gas entstanden ist, also 22 ccm mehr, wie überhaupt an Stick-
stoff (oder Stickoxydul) würde gebildet werden können, muB für die Halfte auf
Kohlensaure zurückgeführt werden. Wasserstoff fehlte ganzlich.

Bei der Aussaat dieser Kultur auf Fleischagar entwickelte sich massenhaft
eine der gewöhnlichen Begleitbakterien der denitrifizierenden Arten, wahrend die
jetzteren selber auf den Platten ohne ganz bestimmtes Anhaufungsverfahren oft
nur in geringer Zahl aufkommen. Diese Denitrifikatoren gehörten auch in diesem
Falie der Ni t r oxu sgruppe an. Die nicht denitrifizierende Begleitbakterie ergab
sich als zur Coligruppe gehörig und als starker Garungserreger in Glukose-Pepton-

301

lösung bei 2>7^- Übrigens werde ich auf das Verhalten der Garungserreger bei
der Denitrifikation noch zurückkommen.

Als anderes Beispiel wahlen wir einen Versuch mit Bouillon mit 8 Proz.
KNO3, geimpft mit viel frischer Erde und geführt bei 2,7^ C.

Das Gas war wie folgt zusammengesetzt :

Beginn

Datum

Gas im
ganzen
in ccm

NïO

in
ccm

N,0

in7o

COain
ccm

CO2

in7o

N2 in
ccm

N2 in

19. Juni

21. Juni

160

118,5

74

22,4

14

19

12

22. „

88

81

92

3,5

4

3,5

6

24- „

66

58

89

1,3

2

6,6

10

25. „

21

18,5

88

0,4

2

2

10

I. Juli

30

25

83

1,6

0,5

4,5

15,4

Total

365

301,0

35,2

29,2

4,5

35,1

10,7

Die so groBe Menge von N2O schon von Anfang an muB bei diesem Ver-
suche nicht nur aus dem hohen Salpetergehalt, sondern auch daraus erklart werden,
daB nur ganz allein durch Sporenbildner denitrifiziert wurde. Bezüglich des zuerst
gesammelten Gases muB bemerkt werden, daB wenigstens im Anfang relativ viel
Kohlensaure gelost bleiben kann. Mit einem noch höheren Salpetergehalt, namlich
12 Proz., gelingt der Versuch noch beinahe ebensogut, doch nahert man sich
dabei dem Grenzwert. Vergleicht man nun diese Zahlen mit den mit Ammon-
nitrat erhaltenen, so sieht man aufs neue, daB die Ammongruppe an sich beim
Denitrifikationsvorgange nicht in Betracht kommt. Dasselbe gilt bezüglich der Amido-
und Aminogruppen, wie sie sich in Pepton, Harnsaure, Ureum und Asparagin
finden, doch erscheint es unnötig, dabei langer zu verweilen.

Die Entstehung eines Gasstromes, welcher tagelang dauert, sich konstant auf
einem Gehalt an Stickoxydul von 88 Proz. bis 92 Proz. halt, und das durch einen
so einfachen Versuch, scheint mir ein bemerkenswertes biologisches Resultat, und
man sieht aus dem Vorhergehenden, wie ungerecht es ist, daB in den neueren
Arbeiten über Denitrifikation das Stickoxydul überhaupt nicht berücksichtigt wird.

4. Welche waren die Bakterien a und |3 von Gayon und Dupetit?

Obschon die Beantwortung dieser Frage an und für sich von untergeordneter
Bedeutung scheint, kommen wir darauf dennoch kurz zurück, weil die Erwagung
derselben zur Aufdeckung eines Fehlers in der übrigens so ausgezeichneten Ab-
handlung der genannten Autoren veranlaBte, welcher für unseren Zweck not-
wendigerweise aufgeklart werden muB.

Wie oben in der Einleitung gesagt, sollen die Mikroben a und |3 von Gayon
und Dupetit sich dadurch von einander unterscheiden, daB a wohl und |3 nicht
imstande ist, Stickoxydul zu erzeugen in einer wie folgt zusammengesetzten Lösung:
1000 g Wasser, 10 g Kaliumnitrat, 7 g Zitronensaure, 5 g Asparagin, 5 g Kalium-
phosphat, 5 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Chlorcalcium, Spuren von Aluminiumsulfat,
Ferrosulfat und Natriumsilikat, neutralisiert mit Ammon, wahrend sie in ihren
Fleischbouillonkaliumnitratlösungen nichts von der Bildung vonStickoxydul bemerkt

362

haben, weder durch a noch j3. Da nach unserer Erfahrung alle denitrifizierenden
Bakterien in allen Nahrlösungen sowohl Stickstoff wie Stickoxydul, wenn auch
in sehr wechselnden Mengen, erzeugen, kann diese Angabe unmöglich richtig sein.
Wie kann es denn erklart werden, daB die Autoren bei ihrem Mikroben |3 über-
haupt kein Stickoxydul fanden, bei ihrem Mikroben a nur dann, wenn in ihrer
Ammoncitrat-Nitratlösung noch überdies Asparagin vorkam, und daB sie die Ein-
teilung ihrer Arbeit gründen konnten auf das Fehlen des Oxyduls bei allen Ver-
suchen mit Bouillon?

Urn darauf zu antworten, mussen wir die weitere Frage aufwerfen, auf welche
Weise Gayon und Dupetit 1886 das Stickoxydul neben dem Stickstoff nach-
gewiesen haben. Die Autoren sagen nichts über die dabei befolgten Methoden.
Doch steht es für uns fest, daB eben darin die Erklarung ihrer Angaben gelegen
sein muB. Wir sind namlich überzeugt, daB sie ihre quantitativen Bestimmungen
ausgeführt haben vermittelst des Explosionsverfahrens durch den elektrischen
Funken nach der Vermischung des Gases mit Wasserstofï, obschon die Methode
der Explosion mit Knallgas schon seit 1877 in Verwendung war'). Dagegen dürfte
die Verbrennung in der Platinkapillare erst im Jahre 1888 in Gebrauch gekommen
sein, wenn auch schon seit 1877 bekannt").

Als wir unsere eigenen Versuche begannen, befolgten wir ebenfalls die
Explosionsmethode mit Wasserstoff, und kamen bald zu dem aufifallenden Resultat,
daB unsere denitrifizierenden Bakterienkulturen Gasgemische erzeugten, worin ent-
weder mehr als 25 Proz. oder gar kein N.^O vorkam. Wir kamen dadurch zur
Ansicht, daB bei unserer Versuchseinrichtung ein Gas, welches weniger als 25 Proz.
NjO enthielt, nach dem Vermischen mit dem gleichen Volum Wasserstoff nicht
mehr explodieren konnte. Es stellte sich heraus, daB diese Ansicht der Hauptsache
nach richtig ist ; zwar konnten mit gröBeren Funken noch etwas geringere Mengen
N2O wie 25 Proz. des gesamten Gases zur Explosion gebracht werden, doch lag
die Grenze nicht weit von dieser Zahl. Das war denn auch die Ursache, daB alle
unsere spateren Versuche mit der Platinkapillare stattfanden, und Gayon und
Dupetit, welche aller Wahrscheinlichkeit nach nur die Wasserstoffmethode be-
folgten, haben offenbar nicht bemerkt, daB dieselbe bei der Gegenwart von weniger
als 25 Proz. N2O nicht mehr zu verwenden ist.

Durchblicken wir namlich ihre Zahlen, so ergibt sich, daB diese Forscher
in den 8 von ilinen gegebenen Gasanalysen, wobei N2O gefunden wurde, die fol-
genden Prozentzahlen an diesem Gase fanden: 49 Proz., 40,96 Proz., 41,09 Proz.,
16,55 Proz., 75,75 Proz., 47,68 Proz., 31,83 Proz., 23,23 Proz. Hiervon scheint nur
die Zahl 16,55 Proz. auf den ersten Bliek unserer Hypothese zu widersprechen.
Aber dieses nur scheinbar, denn es wurden neben dieser Quantitat Stickoxydul
23.10 Proz. Kohlensaure und 60,35 Proz. Stickstoff gefunden. Weil nun der Wasser-
stoff erst dann mit dem Gase gemischt wird, wenn die Kohlensaure entfernt ist,
muB man das Stickoxydul nicht in Prozenten auf das Gesamtgas berechnen,

') Bunsen, Gasometrische Methoden. 1877. Hempel, Berichte der d. Chem.
Gesellschaft. 1882, p. 903.

*) Orsat, Note sur l'analyse industrielle des Gas. Paris 1877. D r e li s c h m 1 d t ,
Berichte der d. Chem. Gesellsch. Bd. 23. 1888. pag. 3295.

363

sondern in Prozenten auf dasselbe nach Abzug der 23,10 Proz. Kohlensaure, so
daB, wenn auf 76,9 ccm Gas 60,35 cmm N2 und 16,55 ccm N2O gefunden werden,
das dann doch jedenfalls auf 21,5 Proz. N2O auskommt, ofïenbar die untere Grenze,
welche die Autoren noch auffinden konnten, und sehr nahe gelegen bei unserer
Minimumzahl von ca. 25 Proz. Alle Quantitaten weniger wie 21,5 Proz. N2O sind
Gay on und Dupetit also entgangen, wodurch sie zu dem Schlusse kamen,
daB ihr Mikrobe |S überhaupt kein NjO erzeugt, und ihr Mikrobe a, dieses Gas
nur dann liefert, wenn kultiviert in ihrer Ammoncitratlösung bei Gegenwart von
Asparagin.

Diese Behauptungen sind folglich beide unrichtig und mussen derweise korrigiert
werden, daB bei allen ihren Versuchen a und |3 beide, eben wie bei uns, unzweifel-
haft stets Stickoxydul gebildet haben, doch daB sie dieses Gas erst nachweisen
konnten, sobald dessen Gehalt 16,5 Proz. des Gesamtgases oder 21,5 Proz. des Gases
nach Abzug der Kohlensaure betrug. Weil nun bei keinem ihrer Versuche durch
Mikroben |3 16,5 Proz. N2O gebildet wurden, sondern immer weniger, so muBten
sie glauben, daB derselbe überhaupt kein N2O erzeugte, und weil ihr Mikrobe a
nur bei Gegenwart von Asparagin in ihrer Ammoncitrat-Nitratlösung mehr als
16,5 Proz. N2O erzeugte, meinten sie, daB dadurch ohne Asparagin überhaupt kein
Stickoxydul entsteht.

Fragen wir uns nun schlieBlich, mit welchen der gegenwartig bekannten
denitrifizierenden Arten die Mikroben a und |3 von Gay on und Dupetit zu-
sammenfallen, so betrachten wir es als wahrscheinlich, daB a nur Bacillus
py o cy aneus, |j nur B acil lus Stutzery (= B. n it r o ge n es) gewesen sein
kann ; doch erscheint die Sache nicht wichtig genug, um die dafür aus den Details
ihrer Untersuchung abzuleitenden Gründe hier ausführlich zu besprechen, um so
mehr, weil es feststeht, daB ihre Kuituren nicht rein waren.

Anhangsweise wünsche ich bei dieser Gelegenheit noch hervorzuheben, dafi
die vielfach zitierten, aber ganz ungenügenden Versuche von Giltay und Aberson
mit einer die Kulturgelatine verflüssigenden Art ausgeführt wurden, welche, wie
aus einigen incidentellen Bemerkungen in ihrer Abhandlung abzuleiten ist, wohl
Bacillus pyocyaneus gewesen sein kann, was jedoch bei ihren unzureichenden
Angaben durchaus zweifelhaft bleiben muB. DaB diese Autoren kein Stickoxydul
gefunden haben, welches bei ihren Versuchen doch sicher gebildet ist, ist daraus
zu erklaren, daB sie zum Nachweise dieses Gases die Löslichkeit desselben in
Alkohol in Anwendung zu bringen versuchten, also wohl die schlechteste Methode,
die überhaupt gewahlt werden konnte. Das einzige, was sie bezüglich des Stick-
oxyduls (und des Wasserstoffs) sagen, lautet wörtlich:') »De l'absence d'hydro-
gène nous nous sommes assurés en faisant jaillir dans Ie gaz, préalablement mêlé
d'oxygène, des étincelles électriques. L'absence d'hcmioxyde d'azote fut constatée,
dans quelques analyses, en abandonnant Ie gaz dégagé, après absorption de l'acide
carbonique par la potasse solide, au dessus de l'alcool, dans lequel Ie gaz hilarant
se dissout facilement«. Daraus kann der T.eser jedoch unmöglich eine Über-
zeugung erhalten.

') .Sur un mode de dénitritication. (Archives Néerlandaiscs. T. J5. 1802. p. 356.)

364

5. Bacillus sphaerosporus und Bacillus nitroxus.

Bei unseren oben beschriebenen Versuchen mit Nitratbouillon haben wir
gesehen, daB in allen Rohkulturen bei weitem die gröBte, in vielen Fallen wohl
die gesamte Menge des Stickoxyduls durch Sporenbildner hervorgebracht wird.
Es soll auf diese letzteren nun naher eingegangen werden.

Sporenbildende in den Reinkulturen schwach denitrifizierende Arten sind
schon seit langer Zeit bekannt, und, wenn auch unkenntlich, in der Literatur
verzeichnet. Als ich noch meinte, daB dadurch allein Stickstofï erzeugt wurde,
konnten dieselben nur als weitere Beispiele der langen Reihe denitrifizierender
Arten angesehen werden. Seitdem sich jedoch ergab, daS eben die Sporenbildner
so auBerordentlich geeignet sind, Versuche bezüglich der Stickoxydulbildung an-
zustellen, erregen sie ein viel höheres Interesse. Es mogen deshalb die Bedingungen
ihres Vorkommens und die Methoden zur Erhaltung derselben, sowie ihre weiteren
Eigenschaften naher besprochen werden.

Obschon bei den Denitrifikationsversuchen im allgemeinen, wobei Sporen-
bildner die Erreger sind, eine kleine Anzahl verschiedener »guter« Arten in Betracht
kommen dürfte, handelt es sich bei Nitratbouillon wohl nur um eine einzige
umfangreiche »Sammelart«, eine Formengruppe zahlreicher Typen, wovon wir an
dieser Stelle zwei mit besonderen Artnamen belegen wollen, und welche nicht
richtig aufgefalit werden können, wenn man die Denitrifikationsvorgange allein
als Grundlage für elektive Kultur verwendet. Um die verwandtschaftlichen Be-
ziehungen zwischen den sehr abweichenden, hier zur Beobachtung kommenden
Unterarten und Varietaten zu verstehen, ist es nötig, erstens auch die EiweiB-
faulnis als Ausgangspunkt für die Kultur zu wahlen und mit einiger Beharr-
lichkeit die daraus zu isolierenden Aëroben auf ihr Denitrifikationsvermögen zu
untersuchen, und zweitens, die zugleich an Acetate und an hohe Temperaturen
adaptierten Formen in betracht zu ziehen.

Für das Erste wird in Wasser gelöstes und suspendiertes EiweiB mit Garten-
erde infiziert, zum Sieden gebracht, eine Stöpselflasche mit dieser Flüssigkeit ge-
füllt, oder auch ein offener Kolben und bei 30 — ^,7'^ gebrütet. Nach ein paar
Tagen beginnt die stinkende Faulnis mit denselben Erscheinungen, wie ohne vor-
heriges Kochen, aber natürlich auch ohne die nicht sporenerzeugenden Arten,
welche also für den Hauptvorgang gleichgiltig sind^). Die eigentliche Faulnis wird
also allein durch die sporenbildenden Anaëroben hervorgerufen, daneben finden
sich aber sehr bemerkenswerte, oft rundsporige Aëroben, wovon wir eine besonders
allgemeine und morphologisch interessante unter dem Namen Bacillus phaerosporus,
gleich betrachten werden. Auch die Anaëroben selbst sind zum Teil ebenfalls
rundsporige Formen und unzweifelhaft nahe verwandt mit B. sphaerosporus,
indem es feststeht, daB die ersteren dann und wann, bei noch unbekannten Be-
dingungen die rundsporige aërobe Varietat abwerfen, welche nicht wieder in
den anaëroben Zustand zurückzuführen ist und sich vergleichen laBt mit den

') Die von Hauser als Faulnisbakterien beschriebenen Proteusarten können über-
haupt nicht als eigentliche Faulniserreger betrachtet werden, weil es nur Halbanaëroben
sind (wie Coli) und weil sie die eigentlichen widerlichen Faulnisprodukte (vSkatol und
Mcrkaptan) nicht erzeugen.

365

asporogenen Sektorvarianten anderer Bakterien, worüber wir noch sprechen werden
bei B. nitroxus. Natürlich ist es nicht leicht, diese versteckte Form der Varia-
bilitat zu erkennen, und bei der Seltenheit der Erscheinung denkt der Anfanger
leicht an Infektion.

Jedoch gibt es keine Schwierigkeit, die hier in betracht kommenden Aëroben
aus den Rohanhaufungen zu isolieren, weil sie erblich konstant sind und von
Anfang an reichlich in der EiweiBfaulnis vorkommen, wozu sie, wie gesagt, selbst
keine Veranlassung geben, weil sie bei der Abwesenheit von Nitraten und Kohle-
hydraten, die EiweiBkörper nur aërob spalten.

Diese Gruppe aërober Faulnisbewohner enthalt mehrere denitrifizierende Formen.
Die in kultureller und morphologischer Beziehung am meisten auffallende darunter
ist ein typisch rundsporiges Stabchen oder Clostridium (Tafelfig. i), durch viele
Übergangsformen verbunden mit stabchen- und clostridienartigen Varietaten, welche
langliche oder überhaupt keine Sporen erzeugen. Die Art gehort zu den allgemein
verbreiteten Erdbakterien, und die Schwierigkeit ihrer richtigen Erkenntnis (in
der Literatur konnte ich keine darauf ganzlich passende Beschreibung finden, die
rundsporige als B. f us i sp o r i us bezeichnete Form gehort wohl nicht hierher)')
liegt in dem auBerordentlichen Formenreichtum, wodurch man sozusagen bei jedem
Versuche etwas anderes zu finden meint, — da eine nicht, da eine wohl verflüssi-
gende Varietat ; ein Stabchen oder ein Clostridium; stark beweglich oder
unbeweglich; eine Form mit langlichen oder eine mit runden Sporen; verflüssi-
gende Koloniën, welche Auslaufer in die Kulturgelatine aussenden oder nicht;
welche heil oder trüb, gelb oder ganz ungefarbt ercheinen ; welche nur durch
homogene Koloniën reprasentiert werden, oder in deren Koloniën Bakterien von
sehr verschiedener GröBe vorkommen, von Stabchen von 3 \x Dicke herab bis
zu ganz kurzen mikrokokkenartigen Stabchen von 0,2 bis 0,3 |U Dicke, kurz, ein
wahres Formenchaos. Alle diese Varietaten zeigen, wie das meistens der Fall ist
bei polymorphen Arten, eine groBe Konstanz, jedoch ist in den alteren Kuituren
auch starke Variabilitat zu beobachten, so besonders im Vermogen, Sporen zu
erzeugen, welches Vermogen leicht verloren geht, was ebenfalls für die Beweg-
lichkeit gilt.

Aus Gartenerde kann man die wenig oder nicht beweglichen Varietaten dieser
Art noch auf eine ganz andere Weise anhaufen, wie durch das Faulnisverfahren,
namlich dadurch, daB man die Erde impft in eine Flüssigkeit von folgender Zu-
sammensetzung: 100 Leitungswasser, 0,5 Natriumacetat oder Calciumacetat, 0,02
Dikaliumphosphat, und bei 40" C kultiviert. Nach ein paar Tagen wird eine Aus-
saat gemacht auf Bouillongelatine bei 22^ C, wobei dann eine Menge langsam
wachsender, durchsichtiger, nicht oder sehr schwach verflüssigender, zu mehreren
Varietaten gehörender Koloniën entsteht (Bacillus s ph a e ros p o rus calco-
aceticus), welche in sehr verschiedenem MaBe zur Sporenbildung befahigt sind,
runde oder langliche Sporen erzeugen, mehr oder weniger beweglich sind, schnell
oder langsam wachsen, wenig oder nicht verflüssigen, kurz die gleiche Verander-

*) Möglicherweise hat Winkler sie vor sich geiiabt, als er die Beschreibung im
Bakteriol.Centralbl.Abt.il. Bd. i. 1895. p. 609 aufstellte, und Duel au x, als er seine
Gattung Tyrothrix aus Kase isolierte.

366

lichkeit besitzen, wie ihre Verwandten aus der EiweiBfaulnis. Versucht man die
Kultur überzuimpfen unter gleichen Bedingungen, wobei sie erhalten wurde, so
bekommt man kein oder nur sehr dürftiges Wachstum. Einige, allerdings nur
gelegentliche Versuche, um unter diesen Formen Denitrifikatoren zu finden, gaben
kein sicheres Resultat.

Fragt man sich, mit welcher beschriebenen Bakterienspezies die verschie-
denen hier betrachteten Formen am nachsten verwandt sind, so muB wohl ge-
antwortet werden, mit B. subtilis ; doch ist auch diese eine schwierige »SammeI-
art«, welche in einem Bakteriengemisch nur sicher kenntlich ist, wenn durch ein
gutes Anhaufungsverfahren (in diesem Falie z. B. der Versuch mit lebenden
Kartofïelscheiben bei 27^ C) die nötige Einschrankung in der
übrigen Bakterienwelt gebracht ist.

Von den nachstverwandten Anaëroben können Tetanus und
B. acidi urici*) genannt werden, wahrend die Namen B.
septicus und B. putrificus coli wohl hierher gehörige
Formen bedeuten, jedoch noch allzu unsichere Sammelbegriffe
sind, um als Vergleichsobjekte gröBere Klarheit zu bringen.

AuBerordentlich charakteristisch und nach meiner Meinung
auf Grund seiner allgemeinen Verbreitung wohl als die Haupt-
form der angeführten Bakteriengruppe zu betrachten, ist der
im Photogramm i dargestellte interessante rundsporige Stamm
von B. sphaerosporus. Als typischer Bewohner des Stall-
mistes und leicht aus Erde im allgemeinen, besonders aus trocke-
nem Staub von gedüngten Feldern zu erhalten, ist derselbe doch
am sichersten zu finden in den nach oben gegebener Vorschrift
angefertigten Praparaten der EiweiBfaulnis. Auf Fleischgelatine
erkennt man ihn an den langsam verflüssigenden und doch
schlieBlich sehr groB werdenden gelblichen Koloniën, welche oft
am Rande korkzieherförmig in die Gelatine bohrende Auslaufer
erzeugen. Die gelbe Farbe rührt von den Bakterienkörpern selbst
her. Das mikroskopische Bild ist schön ; Stabchen, gewöhnlich an einem Ende
verdickt, mit endstandiger Kugelspore im dicken Teile. Echte Clostridien sind
seltener. Die Stabchen sind beweglich und tragen peritriche Cilien. Die Lange
ist variabel, 2 — 5 |.i; die Dicke ebenfalls, und wechselt zwischen 0,7 — 1,5 |a; die
Sporen messen i \i.

Kohlehydrate werden nur langsam angegriffen und veranlassen die Ablagerung
einer reichlichen Glykogenmenge, welche sich mit Jod tief violett braun farbt;
organische Salze werden zu Carbonat oxydiert; alles genau so wie bei B. ni-
troxus, worüber spater; die Hauptnahrung besteht jedoch für beide Arten aus
EiweiBkörpern. Ureum wird nicht gespalten. Garungserscheinungen fehlen entweder
ganz, oder werden in schwachem Grade beobachtet in Lösungen von 2 Proz. Glukose
und 2 Proz. Pepton bei LuftabschluB bei 2)7^ C. Für diese Kultur ist die Kugel-
röhre Fig. 2 zu empfehlen, worin der nicht vollstandige LuftabschluB durch eine

Figur 2.

Anaërobe

Eprouvetten-

kultur mit trei

bender, hohler

Glaskugel.

') Li eb er t, in Kon. Akademie van Wetenschappen te Amsterdam, 6. Mei 1909
p. 990.

367

treibende hohle Glaskugel erreicht wird, deren Diameter nur wenig geringer ist
wie derjenige der Röhre selbst. Unter den Garprodukten wurden Kohlensaure
und Wasserstofif erkannt, was auch wieder für B. nitroxus gilt.

Nur die frisch isolierten Kuituren zeigen in Fleischbouillon bei LuftabschluB
mit 0,1 Proz. KNO3 bei 30^ a 37" eine deutliche Denitrifikation. Überimpfungen
und lange aufbewahrte Kuituren denitrifizieren nicht mehr. Alles dieses gilt eben-
falls für gewisse Varietaten von P. nitroxus, welcher zu B. sphaerosporus
in engster Beziehung steht.

Doch gehen wir nun über zu unserem Hauptthema, namlich zu den Bak-
terien aus den Denitrifikationen, welche der Hauptsache nach oder ausschlieBlich
nur durch den soeben genannten Sporenbildner verursacht werden. Als Ausgangs-
punkt wahlen wir eine Anhaufung, wo nur allein Sporenbildner gegenwartig sein
können.

Eine solche wird dadurch erhalten, daB entweder gekochtes oder scharf
pasteuriertes Impfmaterial, oder, wie früher schon hervorgehoben, eine sehr hohe
Nitratkonzentration in Bouillon verwendet wird, in welch letzterem Falie frische
Erde für die Infektion, und zwar immer in betrachtlicher Menge zu nehmen ist,
und wobei die Nichtsporenbildner eben durch das Nitrat in ihrer Entwicklung
zurückgehalten werden. Dies ist jedoch nicht spezifisch für die Nitrate, sondern
kann auch durch andere Salze in konzentrierter Lösung herbeigeführt werden.

Es muB aber noch einmal hervorgehoben werden, daS die denitrifizierenden
Sporenbildner so allgemein in Gartenerde verbreitet sind, daB sie in Nitratbouillon
mit Nitratgehalten zwischen i Proz. bis 12 Proz. bei 20^ bis 2>7'^ C, wenn viel
Gartenerde als Impfmaterial verwendet wird, in der Rohkultur in der Weise alle
anderen Bakterien verdrangen, daB man mikroskopisch kaum von den letzteren
etwas bemerkt, und nur Stabchen mit und ohne Sporen von Denitrifikatoren
erblickt. Zwar zeigt das Plattenverfahren dabei oft das umgekehrte Verhalten,
doch liegt das daran, daB auf den gewöhnlichen Kulturplatten die denitrifizierenden
Sporenbildner schwierig, die anderen Arten leichter wachsen. DaB mithin ge-
schlossen werden muB auf die groBe Allgemeinheit der Sporenbildner in den
Bodenproben, folgt übrigens auch erstens daraus, daB man auf Erbsenlaub-Dekokt-
Agar bei 30° C aus der genannten Rohkultur tatsachlich die Koloniën der Sporen-
bildner bei weitem allgemeiner findet wie diejenigen der übrigen Arten, so daB
tatsachlich die in den gewöhnlichen Bouillonplatten gegebenen Ernahrungsbedin-
gungen verbessert werden, wenn dafür die genannte Pflanzensubstanz angewendet
wird. Zweitens muB jener SchluB gezogen werden aus dem Umstande, daB die
Überimpfungen der bezeichneten garenden Kulturflüssigkeiten, wenigstens bei
niedrigen Nitratgehalten, selbst bei i?'^ C, sich mehr und mehr anreichern mit
den nicht sporenerzeugenden Arten, worunter B. pyocyaneus wieder eine
Hauptrolle spielt. Hieraus ergibt sich namlich offenbar, daB die Lebensbedingungen
auch in den Rohkulturen für diese Arten ganz gute gewesen sein mussen und
nur ihre geringe Anzahl ihren, im Boden viel allgemeiner verbreiteten Sporen-
bildner-Konkurrenten Überlegenheit verlieh. Und dieses sieht man auch wieder
aus dem Gehalte der Garungsgase an N2O, welcher Gehalt in den Rohkulturen,
in Bouillon mit i Proz. KNO3 oder 2 Proz, NH4NO3 von 76 Proz. bis 84 Proz.
betragen kann, und schon bei der ersten Überimpfung auf 20 Proz. bis 25 Proz.

368

zurücksinkt, ganz in Übereinstimmung mit der Verschiedenheit der Stickoxydul-
bildung zwischen Sporen- und Nichtsporenbildnern.

Findet dagegen diese Überimpfung statt aus einer Rohkultur mit 8 Proz.
a 12 Proz. Nitrat in eine solche, welche ebenfalls 8 Proz. a 12 Proz. Nitrat ent-
halt, wodurch die vorwiegende Entwicklung der Sporenbildner bleibend gesichert
ist, so sieht man schon nach 24 Stunden die Gasentwicklung beginnen; am zweiten
Tage wird eine heftige Schaumgarung beobachtet und das Gas enthalt 80 Proz.
oder mehr Stickoxydul, so daB ein glühender Span plötzlich darin entflammt,
und die nicht sporenerregenden Denitrifikatoren offenbar in ihrer Entwicklung
zurückgehalten werden.

Auch das mikroskopische Bild zeigt der Hauptsache nach in diesem Falie
nur Sporenbildner allein.

Wir mussen hier jedoch noch hinzufügen, daB hohe Nitratgehalte in den
Nahrflüssigkeiten nahezu allen Denitrifikatoren für die Stickoxydulbildung gunstiger
sind, wie geringe, wovon bei den Reinkulturen Beispiele gegeben werden, so daB
auch die Nichtsporenbildner unter diesen Bedingungen mehr Oxydul erzeugen
würden, wenn sie nicht von den Sporenbildnern verdrangt waren.

Es gelang uns leicht durch das Plattenverfahren, aus den Rohkulturen drei,
bezüglich Wachstum und Form abweichende, sporenbildende Denitrifikatoren zu
isolieren. Dafür wird am besten Erbsenlaubdekoktagar verwendet'), worauf diese
Formen besonders kraftig fortkommen. Zwei davon sind Stabchenbakterien, die
dritte ist bei normaler Ausbildung ein kurzes Clostridium. Trotz der morpho-
logischen Verschiedenheit muB es sich wohl um eine einzige Spezies handeln,
nicht nur weil die Lebensbedingungen der drei Formen identisch sind, sondern
auch weil die physiologischen Eigenschaften bezüglich Ernahrung und Denitri-
fikation übereinstimmen. Diese Art ist dann die mit dem Namen Bacillus fiitroxus
bezeichnete. Weil die Clostridiumform auf den Platten bei weitem die allgemeinste
ist, soll diese hier mehr im besonderen betrachtet werden.

Die Koloniën auf Erbsenlaubagarplatten sind bei 30" dicke, flach aus-
gebreitete, gelbliche, weiche, glanzend-feuchte Massen mit scharfem Rande, von
4 bis 10 mm Mittellinie, anfangs aus clostridienartigen Stabchen zusammengesetzt
(Tafelfig. 3 und 4). Auf Fleischbouillongelatine, bei Zimmertemperatur, bleiben
dieselben ziemlich klein, doch wachsen sie auf diesem Substrate auffallend lange
fort, verflüssigen etwas und senden nicht selten Auslaufer in das Nahrsubstrat,
gerade wie B. sphaerosporus. Obschon der Hauptsache nach im erwachsenen
Zustande aus kurzen Clostridien (Tafelfig. 5 und 6) bestehend, finden sich in den
meisten Koloniën auch neben diesen viele gewöhnliche Stabchen von verschie-
dener Lange und Dicke und ohne Sporen, wovon die kleinsten so sehr von der
Hauptform abweichen, daB man anfangs kaum glauben kann, daB es sich dabei
um eine Infektion handelt. Überdies fehlen die kleinen Stabchen in einzelnen
Koloniën ganzlich, welche dann allein aus Clostridien bestehen, was noch mehr
den Gedanken an eine Infektion erweckt.

Auf Bouillonagar, worauf die Koloniën ziemlich klein, z. i — 3 mm in Mittel-

') Dargestellt durch 20 g junges, kraftig wachsendes Erbsenlaub, einige Stunden
lang mit 100 g destilliertem Wasser zu kochen und zu digerieren.

369

linie, bleiben und zwischen den Symbionten schwierig aufzufinden sind, wurden
diese feinen Stabchen überhaupt nicht gefunden. Auf diesem Kulturboden sind
aber die Glieder, welche bei der Teilung in den jungen Koloniën entstehen, in
anderer Beziehung nicht weniger polymorph, so daB man in derselben Kolonie
Faden, Stabchen von verschiedenster Lange, Kugeln, Zeilen, welche durch-
aus an A p i cu 1 a tu shefe erinnern, birnenförmige und sonderbar gekrümmte
und gewundene Konglomerate in bunter Vereinigung nebeneinander findet
(Tafelfig. 2).

Auf Erbsenlaubagar erzeugen die Closlridien sehr leicht Sporen. Diese sind
dann bohnenförmig und messen i bis 2 |a. Sie geben den Clostridien ein ungemein
eigentümliches Aussehen, wodurch Ahnlichkeit mit Granulobacter sphae-
ricum entsteht. Jedoch zeigt das in den Clostridien reichlich abgesetzte, sich mit
Jod braun farbende Glycogen, daB es sich hier um einen anderen Reservestotï
handelt, wie die bei Granulobacter abgelagerte Granulose.

Bei weniger gunstiger Ernahrung, z. B. in Glukose-Peptonlösung, oder in
Bouillon mit oder ohne Nitrat, erzeugt B. nitroxus schwieriger Clostridien,
welche wieder höchst veranderlich der Form nach sind. Aber auch die darin
vorherrschende Stabchenform zeigt neben vielen normalen eine Reihe abweichender
Gestalten. Entstehen darin Sporen, so sind diese sehr oft vollstandig kugelig und
viel kleiner wie die bohnenförmigen. Man sieht, daB man hier wieder vor einem
Falie ahnlicher Vielgestaltigkeit steht, wie bei dem aus der EiweiBfaulnis isolierten
Denitrifikator. Bei dem letzteren auBert die Vielgestaltigkeit sich aber durch den
Vergleich verschiedener, jedoch unzweifelbar verwandter Formen unter identischen
Ernahrungsbedingungen, bei B. nitroxus dagegen durch den Vergleich der
Formen von ein und derselben Varietat bei verschiedener Ernahrung.

B. nitroxus zeigt aber auch sehr leicht eine Variabilitatserscheinung mit
erblich konstantem Erfolge. Betrachtet man namlich die Koloniën, welche ein
paar Wochen auf Erbsenlaubagar gewachsen sind, genau, so wird man finden,
daB in einzelnen davon eine Sektorvariation stattgefunden hat, welche darin
besteht, daB ein sektorförmiger Teil der Kolonie keine Sporen erzeugt hat. Wird
davon eine weitere Aussaat gemacht, so ergeben die daraus hervorgehenden Ko-
loniën sioh als asporogen, und das Vermogen der Sporenbildung erscheint voll-
standig verloren, auch bei weiteren Überimpfungen unter günstigen Ernahrungs-
bedingungen.

Die Denitrifikation in Fleischbouillon mit 0,1 a i Proz. Kaliumnitrat findet
weit besser statt bei LuftabschluB, z. B. bei der Kultur in der Kugelröhre (Fig. 2),
wie bei Luftzutritt, und bei lange fortgesetzter Kultur an der Luft können die
Überimpfungen dieses Vermogen ebenso vollstandig verlieren wie B. s p h a e r o-
sporus. Dieses erweckt den Gedanken, daB in den Rohdenitrifikationen auch
ganzlich anaërobe Stamme von B. nitroxus vorkommen, eine Frage, worüber
wohl bald mehr Licht aufgehen wird, da es feststeht, daB, wie schon gesagt,
auch zu B. sphaerosporus anaërobe Nebenformen gehören, welche unter den
Bedingungen der EiweiBfaulnis leben; doch sind unsere Untersuchungen darüber
noch nicht abgeschlossen. Merkwürdigerweise konnte in Erbsenlaubextrakt mit
Nitraten wohl Wachstum, jedoch keine deutliche Gasbildung beobachtet werden,
eine ebenfalls noch nicht genügend durchstudierte Eigenschaft.

M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vierde Deel. -71

370

Zufügung von Asparagin, 2^/0 Glukose oder Glycerin zu Nitratbouillon ist
dem Denitrifikationsvorgang nicht ungünstig, und auch verdünnte Malzwürze mit
Nitrat ist leicht zu denitrifizieren. Ohne peptonartige Stickstofïquelle findet in
den Reinkulturen von Nitroxus keine Denitrifikation statt, wohl jedoch in
den Rohkulturen. so besonders kraftig in Seignettesalz-Asparagin-Nitratlösung
bei 2,7" C.

Gewöhnliche Garungserscheinungen in bezug auf die Kohlehydrate können
am basten in der Kugelröhre Fig. 2, also wieder bei partiellem LuftabschluB,
beobachtet werden. Dieselben sind bei B. nitroxus schwach und nicht bei jeder
Kolonie ist die Eigenschaft gleich stark ausgebildet. Auch hier war wieder eine
Lösung von 2 bis 5 Proz. Glukose mit 2 Proz. Pepton das Medium, worin die
Garung am deutlichsten stattfand.

DaB manches von dem in diesem § berührten Gegenstande an Unbestimmtheit
leidet, mag dadurch entschuldigt werden, daB es sich hier um die Bakterien der
EiweiBfaulnis und ihre Verwandten handelt, worin die Beschreibung um so
schwieriger wird, je besser man mit deren Formenreichtum bekannt ist.

6. Erzeugung von Stickoxydul in den Reinkulturen
der Nichtsporenbildner.

Die Überzeugung, daB alle Denitrifikatoren unter gewissen Umstanden, be-
sonders bei hoher Nitratkonzentration und hoher Temperatur, Stickoxydul her-
vorbringen, hat sich durch die Untersuchung der Reinkulturen dreier ganzlich
verschiedener Arten, namlich Bacillus pyocyaneus, B. Stutzeri und
Micrococcus denitrificans gut bestatigt. \^on einigen solcher Versuche
folgt hier eine Beschreibung:

a) Stickoxydulbildung durch B. pyocyaneus.

Am 29. Juni wurden 150 ccm Fleischbouillon mit i Proz. Ammonnitrat.
welches sich im Kulturapparat (Fig, i) bei LuftabschluB befand, infiziert mit
einem aus Gartenerde isolierten Stamm von B. pyocyaneus und bei 2>7^ C
kultiviert. Die Analyse des über Quecksilber gesammelten Gases gab folgendes
Resultat :

Beginn

Datum

Gas in
ccm

Stickc

in
ccm

xydul

in 0/0

Kohle

in

ccm

nsaure

in7o

Stick
in
ccm

stoff

in%

29. Juni

i.Juli

43

28

65

3

7

12

28

6. „

60

43,2

72

6

10

10,8

18

10. „

90

50,4

56

9

10

30,6

34

15- „

48

20

44,7

"

12,5

22

54

Total

.41

141,6

58,3

24

9.9

75.4

31,8

Bei mikroskopischer und kultureller Plattenuntersuchung stellte sich heraus,
daB das Praparat sicher rein geblieben war.

Wie man sieht, war besonders im Anfang viel Stickoxydul im Gase gegen-
wartig, so daB am 6. Juli ein glühender Span darin aufflammen konnte. Da sich
die relative Oxydulmenge spater verminderte, kann damit zusammenhangen, daB

371

nur I Proz. Nitrat verwendet war, welcher Gehalt natürlich schnell zu einer sehr
geringen Menge sinken muöte, was ausnahmslos auch in anderen Fallen und in
den verschiedensten Rohkulturen mit starker Verminderung des Oxydulgehaltes
einhergeht. Am 15. Juli war Nitrat oder Nitrit durch die Diphenylaminschvvefel-
saurereaktion noch nachweisbar.

b) Stickoxydulbildung durch B. Stutzeri.

Wir haben mit zwei Varietaten dieser Bakterie experimentiert, wovon die
eine (Var. Nr. i) stammte aus einem Denitrifikationsversuch mit Seignettesalz,
infiziert mit Gartenerde, die zweite (Var. Nr. 2) aus Fleischbouillon mit i Proz.
Ammonnitrat, ebenfalls mit Gartenerde in Denitrifikation versetzt. Beide Varie-
taten bilden deutlich verschiedene Koloniën.

I. Versuch. Am 8. Juli wurde Bouillon mit i Proz. Ammonnitrat in ge-
schlossener Flasche infiziert mit Stutzeri (Var. Nr. i) und kultiviert bei 37 ^

Das Gas wurde oberhalb gesattigter Chlorcalciumlösung gesammelt, wovon
wir wissen, daB es die Garungsgase so gut wie gar nicht lost. Die Analyse
lehrte folgendes:

Stickoxydul

Kohlensaure

Stickstoff

Beginn

Datum

Gasvolum
in ccm

in
ccm

in>

in
ccm

in 7o

in
ccm

in%

8. Juli

9. Juli

32

3

9A

4

12,5

25

78,1

Am 15. Juli wurde

12. „

43

4

9.3

6

14

33

76,7

der Versuch be-

15. „

23

2

9

8

13

18

78

bildung dauerte
jedoch fort.

Mikroskopisch und kulturell konnte nachgewiesen werden, daB die eingeimpfte
Bakterie vorherrschte, doch war eine nicht denitrifizierende Infektion einge-
schlichen. Der langsame Verlauf des Versuches muB wahrscheinlich auf zu hoher
Temperatur und ungenügender Lüftung beruht haben.

2. Versuch. Bouillon mit i Proz. Ammonnitrat wurde am 8, Juli mit
B. Stutzeri Nr. 2 infiziert. Bei 31*^ C waren erst am 17. Juli 36 ccm Gas ent-
wickelt, wovon 4 ccm oder 4 Proz. Stickoxydul und z^ ccm oder 89 Proz. Stick-
stoff, wahrend die Kohlensaure noch ganzlich gelost war. Das Gas war über
Quecksilber aufgefangen.

3. Versuch. Wie vorgehend, jedoch mit 2 Proz. Ammonnitrat.
Die Gasanalyse ergab :

Gesamt-

Stickoxydul

Kohlensaure

Stickstoff

Beginn

Datum

gas

in

in

in

in ccm

ccm

in 0/0

ccm

in <"„

ccm

in %

8. Juli

9. Juli

22

4,5

20,5

2

9

15.5

70,5

41

6

14,6

6

14,6

29

70,8

37

3

8,1

4

10,8

30

81,1

Das Gas war oberhalb gesattigter Chlorcalciumlösung gesammelt, und die
Untersuchung zeigte, daB die Kultur rein geblieben war.

24*

372

4. Versuch, wie vorstehend, aber mit 5 Proz. Ammonnitrat.

Gesamt-

Stickóxydul

Kohlensaure

Stickstoff

Beginn

Datum

gas
in ccm

in
ccm

in «/o

in
ccm

in 7°

in
ccm

in ö/o

10. Juli

12. Juli

31

3

9.7

4

13

24

77

15- ..

24

5

21

12

50

2

29

Am 12. Juli war MgHPOa, zugesetzt, um das Ammoniumcarbonat zu ent-
fernen, wodurch viel Kohlensaure freigestellt war.

Alle diese Versuche zeigen, daB die Kulturbedingungen nicht gunstig waren,
wie das aber mit Reinkulturen von denitrifizierenden Bakterien in Fleischbouillon
so oft eintritt, ohne daB die Gründe dafür immer klar werden. Bekanntlich kann
B. Stutzeri sich in Lösungen von organischen Salzen bei Temperaturen zwischen
30 und 33 "^ C viel kraftiger entwickeln, doch war es uns zunachst allein darum
zu tun, zu zeigen, daB auch diese Bakterie Stickóxydul erzeugt bei der ge-
wöhnlichen, für Denitrifikation gewahlten Versuchsanstellung.

c) St ick ox y du 1 bil dun g durch Micrococcus den i t r i f i cans.

DaB auch der neue, von uns bei Versuchen mit Seignettesalz aufgefundene
denitrifizierende Micrococcus in Reinkultur Stickóxydul erzeugen kann, geht
aus folgender Beobachtung hervor:

Am I. Juli wurde Fleischbouillon mit i Proz. Ammonnitrat in dem Queck-
silberapparat mit Reinkultur des Micrococcus infiziert und bei 37° kultiviert.
Das Wachstum war langsam, und die Gasanalyse lehrte folgendes :

Stickóxydul

Kohlensaure

Stickstoflf

Beginn

Datum

Gasvolum
in ccm

in
ccm

in "/o

in
ccm

in 7o

in
ccm

in "/o

I. Juli

10. Juli

50

10

20

.9

38

21

42

15- »

22

5

23

5

23

12

54

Ein fünfter Teil des Gases war also Stickóxydul.

Der Versuch wurde nicht weiter verfolgt, weil es uns auch hier nur um
das qualitative Resultat zu tun war.

Aus unseren eigenen Versuchen mit Bouillon-Nitrat, Asparagin-Nitrat und
Seignettesalz-Nitrat in Verbindung mit denjenigen von Gay on und Dupetit
mit ihrer Asparagin-Ammoncitrat-Nitratnahrlösung muB also geschlossen werden,
daB unter allen bisher untersuchten Umstanden bei der Denitrifikation neben
freiem Stickstoff Stickóxydul entsteht. lm allgemeinen wird die Bildung des
Stickoxyduls stark gefördert durch hohe Nitratkonzentration und auch relativ
hohe Temperaturen scheinen diesen Vorgang stets zu begunstigen. Diese beiden
Umstande sind eben für die Entwicklung des denitrifizierenden Sporenbildners
(Bacillus nitroxus) sehr gunstig und gleichfalls, wenn auch in geringerem
MaBe, für B. pyocyaneus, welcher ebenfalls zu den kraftigsten Stickoxydul-
bildnern gehort. Sind die genannten Bedingungen nicht realisiert, so erzeugen

373

auch diese Bakterien mehr freien Stickstoff. Bacillus Stutzeri tut letzteres
unter allen Umstanden.

lm Anfang unserer Untersuchung hatten wir den Eindruck, daB eine langsame
Gasbildung bei übrigens günstigen Entwicklungsbedingungen stets auf die Ent-
stehung von relativ viel Oxydul hinweist, doch haben wir spater für diese Regel
mehrere Ausnahmen gefunden.

Es steht fest, daB die Oxydulbildung auch in der Natur regelmaBig statt-
finden muB; eine der Ursachen, wodurch die direkte Beobachtung davon erschwert
wird, werden wir im folgenden Kapitel betrachten.

Kapitel 2. Verbrauch von Stickoxydul durch Bakterien.

I. Verbrauch in Rohkulturen.

Die groBen UnregelmaBigkeiten, welche vom Anfang unserer Versuche an
bei der Stickoxydulbildung beobachtet wurden, veranlaBten, die Frage zu stellen,
ob dieses Gas vielleicht von den Erzeugern selbst würde verbraucht werden
können. Auf sehr einfache Weise konnten wir nachweisen, daB dieses tatsachlich
der Fall ist, und zwar nicht allein durch rohe Bakterienanhaufungen, sondern
auch durch bestimmte Arten in Reinkultur. Der von uns schlieBlich für diese
Versuche verwendete Apparat besteht aus einem Kochkolben
von 200 ccm Inhalt, worin 50 ccm mit der Kalturflüssigkeit
und 150 ccm mit stickoxydulhaltigem Gasgemisch angefüllt
wurden. Der Kolben ist geschlossen mit Gummistöpsel und
und Glashahn (Fig. 3), welch letzterer Füllung und Probe-
entnahme des Gases durch die Gasbürette gestattet. Die Fül-
lung geschieht derweise, daB durch Kochen der Nahrflüssigkeit
und Abkühlung bei geschlossenem Hahn ein Vacuüm er-
zeugt wird, welches nach Verbindung mit dem mit Stick-
oxydul angefüllten Gasometer sich mit diesem Gase voll-
saugt. Die Infektion findet statt, indem in den Raum in der
kleinen Glasröhre oberhalb des Hahnes steriles Wasser mit
dem zu verwendenden Impfmaterial gebracht und der Hahn
etwas geöiïnet wird zur Schaffung nach innen.

Wir verwendeten zuerst Stickoxydul, aus Ammonnitrat
bereitet, von der Zusammensetzung:

N2O . 84,6 Proz.

N2 9,4 Proz.

O2 6,0 Proz.

Spater beinahe reines N2O, bereitet aus salzsaurem Hydro-
xylamin und Kaliumnitrit :

NH2OH . HCl + KNO2 = N2O -f KCl H- H2O.

Das Gas wurde im Gasometer über gesattigter Chlorcalciumlösung aufbewahrt.

Das qualitative Kriterium für die Zerlegung des Stickoxyduls ist die Druck-
zunahme im Innern des Kolbens. Wird namlich das Gas assimiliert, so entsteht

Figur 3.
Kolben mit Glas-
hahn fürMikroben-
kultur in Stickoxy-
dulatmosphare bei
constanten! Volum.

374

eine Kohlensauremenge, welche dem Sauerstofï und eine Stickstofïmenge, welche
dem Stickstoff des Oxyduls entspricht:

2 N2O + C. . . = 2 N2 -f CO2,
so daB eine Volumzunahme von vier auf sechs, also auf 1V2 zustande kommt.
Bei den Rohkulturen ist der Stickoxydulverbrauch so betrachtlich und findet so
schnell statt, daB die einfachste Versuchsanstellung schon überzeugend ist. Mit
den meisten Reinkulturen mussen genauere Beobachtungen angestellt werden;
nur B. Stutzeri zerlegt sehr kraftig.

Schon unsere ersten Versuche mit groBen Kolben von 500 ccm und einem
flüssigen Inhalt von 100 ccm gaben sofort positive und sehr überraschende Resultate.
Hier folgt die nahere Beschreibung einiger unserer Versuche.
Am 25. Mai wurde ein E r 1 e n m ey e r kolben von 500 ccm mit 100 ccm
Fleischbouillon gefüllt, mit etwas Gartenerde infiziert und darein gebracht ca.
400 ccm eines Gases, welches 84,6 Proz. N2O, 9,4 N2 und 6 Proz. O2 enthielt, und
kultiviert bei 37^ C.

Als am 27. Mai deutlich Überdruck bemerkbar war, wurde die erste Gas-
analyse ausgeführt, wobei sich zeigte, daB der Stickoxydulgehalt auf 70 Proz.
gesunken war.

Am I. Juni wurden drei neue Gasanalysen ausgeführt mit 35, 30 und 26 ccm
Gas, alles mit dem gleichen Resultate, daB das Gas zusammengesetzt war aus:

5 Proz. N2O, 2 Proz. CO2, 90 Proz. N2 und kein Sauerstofï.
Beinahe alles Stickoxydul war also verschwunden.

Mikroskopisch waren nur sehr kleine Bakterien nachweisbar. Kulturell wurde
neben vielen kleinen nicht denitrifizierenden auch B. pyocyaneus gefunden
und eine verflüssigende fluoreszierende Form.

Interessanter sind die Versuche, wenn anstatt Bouillon einfachere Kultur-
flüssigkeiten verwendet werden.

Am 25. Mai wurden 500 ccm einer Kulturflüssigkeit von der Zusammen-
setzung: 100 Leitungswasser, 0,5 Asparagin, 0,05 K2HPO4 mit Erde infiziert, in
einem E r 1 en m ey e rkolben von 500 ccm eingebracht und der weitere Raum
angefüllt mit dem oben genannten Gase, welches 84,6 Proz. N2O enthielt und bei
27° kultiviert. Schon am 26. Mai war Druck bemerkbar und es wurden nur noch
3 Proz. N2O bei der Gasanalyse gefunden.

Am 27. Mai wurde aus dieser Kultur ein Tropfen übergeimpft in eine
identische Kulturflüssigkeit und bei 37° kultiviert. Am i. Juni zeigte die Gas-
analyse in 40 ccm kein N2O mehr, dagegen 17 Proz. CO2, 83 Proz. N.^ und
keinen Sauerstofï. Es wurde daraus am 29. Mai aufs neue unter identischen Be-
dingungen übergeimpft und kultiviert. Das Gas am i. Juni, also einer jungen
Kultur, hatte die Zusammensetzung: Kein N2O, 13 Proz. CO2 und 87 Proz. N2.
Die Kulturflüssigkeit war strotzend mit kleinen Bakterien erfüllt, welche bei der
Kultur meistenteils als B. Stutzeri, ferner als B. pyocyaneus und ver-
einzelte andere Arten erkannt wurden.

Hierdurch war also erwiesen, daB der Hauptsache nach denitrifizierende
Bakterien das Stickoxydul gespalten batten, und daB sie den Sauerstofï desselben
ebensogut für die Verbrennung des Asparagins hatten verwenden können, wie
denjenigen des Nitrats.

375

Weil der Stickstoff natürlich in der Flüssigkeit aus dem gelösten Stick-
oxydul frei gemacht wird, kann man in solchen Kuituren beim Schütteln des
Kolbens, trotz des darin herrschenden Druckes, Gasentwicklung sehen.

Weil uns dieser Versuch wichtig erschien, haben wir denselben in unserem
kleinen Kulturapparat (Fig. 3) von 200 ccm mit 50 ccm der gleichen Nahrlösung
und 150 ccm Gas von der Zusammensetzung 77,6 Proz. N2O, 8 Proz. Sauerstofï
und 14,4 Proz. N2 bei 37^ aber ohne jede Infektion, wiederholt. Der Versuch
begann am 29. Mai, am 5. Juni hatte das Gas genau die gleiche Zusammen-
stellung behalten und Bakterienwachstum war nicht eingetreten,

Wir haben noch drei weitere Versuche ausgeführt mit einer Kulturflüssigkeit
von folgender Zusammenstellung: Leitungswasser, i Proz. Calciummalat, 0,05 Proz.
Chlorammon, 0,05 Proz. K2HPO4, infiziert mit Erde, kultiviert bei 37° im Apparat
Fig. 3-

In einem am 25. Mai begonnenen Versuche war am 27. Mai alles N2O ver-
schwunden. In einem anderen am 27. Mai begonnenen Versuche war eine iden-
tische Nahrlösung, jedoch als Impfmaterial ein Tropfen der vorgehenden Kultur
verwendet, und hieraus wurde am 29. wieder ein Tropfen unter identischen Be-
dingungen übergeimpft.

Das Gas im letzteren Versuche ergab bei der Analyse 3 Proz. N2O, 33 Proz.
CO2, 64 Proz. N2, kein Sauerstofï. Auch hier war also das Stickoxydul beinahe
Acrbraucht. Die bakteriologische Untersuchung bei Aussaat auf Bouillonagar und
Bouillongelatine lieferte viel B. pyocyaneus und stark wachsende Koloniën
einer nicht verflüssigenden Art in sehr groBer Menge.

Wenn man bei der Beurteilung dieser Resultate bedenkt, daB Asparagin
ohne Sauerstoffquelle eine sehr schlechte Bakteriennahrung darstellt, so ist durch
das vorgehende erwiesen, daB Stickoxydul eine ebenso gute Quelle für Oxydations-
sauerstoff wie die Nitrate ist.

2. Verbrauch von Stickoxydul durch Reinkulturen.

Weil wir durch die vorgehenden Versuche sichergestellt hatten, daB gewisse
Denitrifikatoren, wie B. Stutzery und B. pyocyaneus, sich durch Stick-
oxydul in Asparagin- und Malatlösungen ebensogut anhaufen lassen, wie durch
Nitrate, lag es auf der Hand, zu erwarten, daB eben diese Arten auch in den
Reinkulturen das Oxydul zerlegen würden.

Um dieses definitiv zu erweisen, folgen hier die Resultate zweier Versuche
mit zwei Varietaten von B. Stutzeri und von einem mit B. pyocyaneus:
In allen Pallen war die Kulturflüssigkeit wieder Leitungswasser, 0,5 Proz. Asparagin-
0,5 Proz. K2HPO1, wovon 50 ccm in unseren kleinen Kulturapparat (Fig. 3) ge-
bracht wurde mit 150 ccm Stickoxydul aus Ammonnitrat bereitet von der Zusammen-
setzung: 77,6 Proz, N2O, 8 Proz. O2 und 14,4 Proz. N2. Es wurde bei 37^ kultiviert
und ebenfalls am 29. Mai infiziert.

Beim ersten Versuche wurde geimpft mit einem alten Stamme von B. Stut-
zeri aus der Sammlung. Am 5. Juni bestanden 36 ccm des Gases aus 1,6 ccm oder
4,4 Proz. N2O, 7 ccm oder 19,4 Proz. CO2 und 27,4 odér 76,2 Proz. N2, Sauerstofï
fehlte. Es war also das gesamte Stickoxydul zerlegt und in freien Stickstofï
verwandelt.

376

Bei einem anderen Versuche wurde geimpft mit einem neuen Stamm von
B. Stutzeri, aus einer Asparagin-N20-Anhaufung isoliert. Am 5. Juni bestanden
42 ccm des Gases im Kölbchen aus i ccm oder 2,4 Proz. N2O, 8 ccm oder 19 Proz.
CO2 und 33 ccm oder 78,6 Proz. N2, Sauerstoff fehlte. Auch hier war also das
N2O verbraucht. Beide Kuituren waren mikroskopisch und kulturell rein geblieben.
Beim dritten Versuche fand die Infektion statt mit B. p y o cy a n e u s. Der
N20-Verbrauch war in diesem Falie viel langsamer wie mit B. Stutzeri,
doch farbte sich die Kulturflüssigkeit nach mehreren Tagen blau durch Pyo-
cyaninbildung. Am 5. Juni bestanden 47 ccm des Gases im Kölbchen aus 34 ccm
oder 72'/2 Proz. N2O, 1,4 ccm oder 3 Proz. CO2, 7,8 ccm oder 17 Proz. N und
3,8 ccm oder 8 Proz. O2, so daB merkwürdigerweise noch kein Sauerstoffverbrauch
nachzuweisen war. Am 24. Juni bestanden 20 ccm des Gases aus 14 ccm oder
70 Proz. N2O, 0,6 ccm oder 3 Proz. CO2, 4,4 ccm oder 22 Proz. Nz und i ccm
oder 5 Proz. Sauerstoff, so daB letzteres Gas bis zum Ende des Versuchs nach-
weisbar blieb. Die Denitrifikation des Stickoxyduls durch B. pyocyaneus ist
durch diesen Versuch jedoch erwiesen.

Wir haben die Versuche mit Reinkulturen wiederholt mit viel reinerem N2O,
welches aus salzsaurem Hydroxylamin und Kaliumnitrit bereitet war und aus
96 Proz. N2O und 4 Proz. N2 bestand.

Wir arbeiteten mit dem Kolben (Fig. 3) und mit der Kulturflüssigkeit: 50 ccm
Leitungswasser, i Proz. Calciummalat, 0,02 Proz. CINH4, 0,02 Proz. K?HP04 und
150 ccm N2O, immer bei 37"; alle Versuche begannen am 10. Juli.

Aus einem Kontrollversuch ohne Infektion ergab sich, daB die Zusammen-
setzung des Gases nach Qtagiger Brütung kaum verandert war: 20 ccm aus dem
Apparat gesogen, ergaben 19 ccm oder 95 Proz. N2O und i ccm oder 5 Proz. N2.
In einem Versuche mit B. Stutzeri (isoliert aus Fleischbouillon-Ammon-
nitrat) stieg der Druck im Apparat in 9 Tagen derart, daB wir am 19. Juli 94 ccm
durch Überdruck austreten lassen konnten. Hiervon batten 50 ccm die Zusammen-
stellung:

N2O 3 ccm oder 6 Proz.

N2 34 - „ 68 „

CO2 ....... 13 „ „ 26 „

so daS nahezu 90 Proz. des Oxyduls in Stickstoff und Kohlensaure (zum Teil
als Carbonat) verwandelt waren.

Mit B. pyocyaneus war das Resultat, daB 45 ccm durch Überdruck aus-
geblasen werden konnten, wovon 25 ccm analysiert wurden und ergaben :

N2O 17 ccm oder 68 Proz.

N2 5 „ „ 20 „

CO2 3 „ „ 12 „

so daB hier wie bei dem früheren Versuch mit B. pyocyaneus, die Zerlegung
zwar schwacher, jedoch ebenfalls unzweifelhaft war.

3. Kann .Stickoxydul zugleich als Sauerstoff- und Stickstoff-
quelle verwendet werden ?
Bei den vorgehenden Versuchen war stets neben dem Stickoxydul noch eine
besondere Stickstoffquelle zur Verfügung, sei es als Chlorammon, als die Amid-

377

gruppe des Asparagins, oder als die stickstoffhaltigen Körper der Fleischbouillon.
Urn nun die hier gestellte Frage zu beantworten, haben wir den Apparat von Dr.
Söhngen verwendet (Fig. 4) '). Der Kolben a wurde beschickt mit Leitungs-
wasser, i Proz. Calciummalat, 0,05 Proz. K2HP04 und weiter angefüllt mit dem
mit etwas Luft verunreinigten
Stickoxydul, wovon oben die
Zusammensetzunggegeben ist.
DerKolben d erhieltdasgleiche
stickstofffreie Gemisch und
stand mit der atmospharischen
Luft in Verbindung. Es wurde
am 25. Mai infiziert mit Erde
und bei 30° C kultiviert, weil
wir eineTemperatur von 37'' zu
vermeiden wünschten, um im
Kolben d Bindung des atmo-
spharischen Stickstoffs durch
Azotobacter zu ermögli-
chen, wofür 2)?'^ zu hoch ist.
Schon am 29. Mai war es klar,
daB die Absorption des Oxy-
dulsbegonnenhatte, denn beim
Öfïnen des Hahnes c zeigte sich
Überdruck. Am 4. Juni ergab
die Gasanalyse folgendes : 4
Proz. N2O, 25 Proz. CO2 und
71 Proz. N2 ohne Sauerstoff.
so daB beinahe alles Stick-

oxydul verbraucht war. In diesem Kolben hatte sich eine dichte Spirillenkultur
einer kleinen, Spirillum tenue ahnlichen Art entwickelt, welche nicht nur in
dar Tiefe, sondern auch als treibende Haut vorkam, vermischt mit vielen Sphaeriten
von Calciumcarbonat. Dieses Resultat war besonders dadurch aufifallend, daB im
Kolben d, also in Berührung mit der Luft in Übereinstimmung mit der Erwartung,
eine Azotobacterhaut entstanden war wahrend im Kolben a diese Art voU-
standig fehlte. Das Stickoxydul hatte sich deshalb bezüglich Azotobacter
wie eine Lösung eines Ammonsalzes oder eines Nitrates betragen und dessen
Wachstum verhindert. Merkwürdig war es auch, daB eben in diesem Falie ein
Spirillum erhalten war, welches als Denitrifikator den Stickstofï aus dem Oxy-
dul frei gemacht hatte, wahrend uns bei keinem andern Denitrifikationsversuch
Spirillen begegnet sind.

Obschon wir hinzufügen mussen, daB eine Überimpfung der Spirillenkultur
unter gleichen Bedingungen kein Spirillenwachstum ergeben hat, steht es fest,
daB die an der Spitze dieses Paragraphen gestellte Frage zu bejahen ist für die
bezeichnete Rohkultur.

Figur 4. Apparat von Dr. Söhngen für Mikroben-
kultur in Gasatmosphare bei konstantem Druck
(c ofïen), oder bei konstantem Volum (c zu).
Für Füllung mit oder Entnahme von Gas werden
Gummischlauche mit Glasröhre in die erweiterten
Teile der Tubulaturen geschoben : a Kulturkolben
mit Gasatmosphare; b, c Hahne; d Kolben mit
Nahrlösung und Luft.

') Centralbl. f. Bakteriol. 2. Abt. Bd. 15. >S. 513, 1005.

378

DaB auch B. Stutzeri in Reinkultur, wenn auch schwierig, N2O als Stick-
stoffquelle verbrauchen kann, ergibt sich aus folgendem Versuche:

Als Kulturflüssigkeit kam wieder Leitungswasser, i Proz. Calciummalat,
0,2 Proz. Kaliumphosphat, mit Weglassung des Ammonsalzes in Verwendung.
Die Kultur fand statt in dem Kolben Fig. 3 bei 30^ vom 10. bis 19. Juli. Das
verwendete Stickoxydul war das pöprozentige Gas aus Hydroxylamin. Der Über-
druck war wieder gering; 25 ccm Gas, am 19. Juli ausgesogen ergaben :
I ccm oder 4 Proz. CO2
20 „ „ 80 „ N2O
4 „ „ 16 „ N2.
Es waren also nur 16 Proz. des N2O verschwunden, doch ist die Zahl zu groB,
um ein Versuchsfehler sein zu können.

4. Gibt es Stickoxydul zerlegende Bakterien, welche Nitrate
nicht deni t r if iz ieren können?

Die Frage muB für Nahrlösungen mit und ohne eine andere Quelle ge-
bundenen Stickstofifs wie das Oxydul, gesondert beantwortet werden. Der im
vorigen § zuerst beschriebene Versuch scheint zu erweisen, daB das dabei ge-
fundene Spirillum wohl das Oxydul und nicht Nitrate zu denitrifizieren ver-
mag, und zwar bei Abwesenheit anderer Stickstoffverbindungen. Wir glauben
das wenigstens ableiten zu mussen aus dem genannten Umstand, daB wir das-
selbe niemals bei anderen Denitrifikationsversuchen gefunden haben.

Zur Beantwortung des zweiten Teiles der Frage haben wir unsere Calcium-
malat-Chlorammon-Kaliumphosphat-Lösung infiziert mit der Reinkultur einer Nitrat
nicht denitrifizierenden Art, welche aus einer Calciummalat-N20-Kultur isoliert war
In dem Kolben Fig. 3 war vom 10. — 19. Juli bei 30 "^ C nur geringer Überdruck
vorhanden, zu schwach, um genügend Gas für die Analyse auszupressen. Da-
rum wurden 30 ccm mit der Quecksilberbürette abgesogen und analysiert, sie
ergaben :

4 ccm oder 13.5 Proz. CO2
21 „ „ 70 Proz. N2O

5 „ „ 16,05 Proz. N?.

Hier muBte also sicher, wenn auch schwache Oxyduldenitrifikationen statt-
gefunden haben, und also auch Wachstum auf Kosten des Oxydulstickstoffs,
trotzdem wir, wie gesagt, keine Denitrifikation von Nitrat mit dieser Bakterie
bemerkt batten.

5. Chemosynthese mit Stickoxydul als Energiequelle.

Das Wort »Chemosynthese« zur Bezeichnung der biochemischen Bildung von
Kohlenstoffverbindungen durch Zerlegung von Kohlensaure vermittelst chemischer
Energiequellen anstatt des Lichtes, also als Analogon des Wortes »Photosynthese«,
ist von Pfeffer eingeführt ') und soll auch hier verwendet werden. Bei der
groBen Bedeutung dieses Gegenstandes, der sozusagen einen der Wege vorzeichnet,

') Pflanzenphysiologie. 2. Aufl. Bd. i. p. 346, 1897.

379

deren Verfolgung uns vielleicht zu tieferer Einsicht in das Problem der spontanen
Generationen führen wird, erscheint es zweckmaBig, eine kurze Übersicht der
bisher bekannten Vorgange auf diesem Gebiete vorauszuschicken. Es handelt sich
urn die folgenden Prozesse :

Vorgang

Beobachter

Erreger

I.

Luft-Wasserstoff- oder Knall-

T. de Saussure

Kleine bewegliche Stabchen,

gasoxydation

1839')

welche eine schleimige Haut

M. Niklewski 1907')

auf derNahrlösungerzeugen

Wir

(Bacillus Saussurei).

2.

Ammon- und Nitritoxydation?

Winogradsky 1890')

N i t r 0 s 0 m 0 n a s und N i t ro -
bacter.

3.

Oxydation von Thiosulfat und

Natanssohn 1902*)

Kleine Stabchen mit Spirillen-

Schwefelwasserstoff

Wir

bewegung (Thiobacillu s
thi oparus),

4-

Oxydation von Tetrathionat

Wir 1902

Wie vorgehend.

5-

Denitrifikation mit Schwefel

Wir 1902*)

Spirillenartige Kurzstabchen
(Thiobacillus denitri-
ficans).

6.

Denitrifikation mit Thiosulfat

Wir 1902

Erreger unbekannt.

7.

Methanbildung aus Kohlensaure
und Wasserstoff

Söhngen, Delft i9o6«)

Fermente derMethanbildung.

8.

Oxydation des Schwefels durcli

Jacobsen, Delft 1908

Noch nicht beschriebene Be-

Luft

obachtungen.

Der zweite und wichtigste dieser Vorgange muS noch mit einem Fragezeichen
angedeutet werden, weil Winogradsky nicht bekannt war mit B. oligo-
carbophilus^), welche sich eben bei den Bedingungen der Nitrifikation kraftig
entwickelt auf Kosten der organischen Kohlenstoffverbindungen der Laboratoriums-
luft, was bei wochenlang andauernden Versuchen auch bei den Nitrit- und Nitrat-
fermenten als möglich vorausgesetzt werden muB, weil es feststeht, daB kleine
Quantitaten organischer Stoffe für diese Mikroben sehr förderlich sind.

Dennoch ist es wahrscheinlich, daB hier wirklich Chemosynthese stattfinden
kann, jedoch nur allein aus Notbedarf, das heiBt nur dann, wenn alle organischen
Nahrungsstoffe fehlen. Das ware ganzlich analog mit der Photosynthese bei
Chlorella, Stichococcus, Pleurococcus,Chlamydomonas und an-
deren niederen Algen, welche im Lichte nur dann Kohlensaure zerlegen, wenn
keine geeignete organische Nahrung erreichbar ist.

Bezüglich des ersten, dritten und tierten Vorganges laSt sich derselbe Ein-
wand nicht erheben, denn sie verlaufen in wenigen Tagen, also viel zu schnell,

>) Mémoires de la Soc. de physique etc. de Génève. T. 8. 1839. p. 163.

2) Bulletin intern, de l'Acad. des se. de Cracovie, Dec. 1906.

*) Annales de l'Institut Pasteur. T. 4 et 5. 1890, 1891.

') Mitteilungen aus der Zool. Station zu Neapel. Bd. 15. 1902. Heft 4.

') Phénomènes de réduction produits par les microbes. (Archives Néerland. T. o. IQ03.

131).
'^) Ontstaan en verdwijnen van waterstof en Methaan etc. Dissert. Delft 1006.
') Centralbl. f. Bakteriol. Abt. II. Bd. 10. 1903. p. 33.

38o

als daS die Mikroben aus der vvinzigen organischen Kohlenstofïquelle der Atmo-
sphare schöpfen könnten, welche nur deshalb für B. oligocar bophilus (und
vielleicht die Fermonte der Nitrifikation) zureichend ist, weil deren Wachstum
sehr langsam verlauft und erst nach Wochen betrachtlich wird. Überdies ist die
Hinzufügung organischer Kohlenstoffquellen, wenigstens für die Vorgange 3, 4,
5 und 6 bestimmt nachteilig.

Bei der Denitrifikation mit Schwefel Thiosulfat kann auch darum nur an
Chemosynthese gedacht werden, weil der Verlauf davon in geschlossencm Raume
stattfindet, wo nur minimale Luftblasen eindringen können^).

Der oben gegebenen Aufzahlung der bisher bekannien Chemosynthesen können
wir nun als neues Beispiel einen Vorgang zufügen, wobei als Energiequelle einer-
seits die Oxydation des Wasserstofïs, andererseits die exothermische Spaltung des
Stickoxydes zugrunde liegt, nach der Formel:

N,0 -f H, = H,0 + N,.

Dieses entspricht einer Volumvcrminderung des ursprünglichen Gasgemisches
bis auf die Halfte, und der Verlauf der Reaktion ist deshalb festzustellen, wenn
dieselbe in geschlossencm Raume stattfindet.

Wir verwendeten für den Versuch den Kulturapparat von Dr. Söhngen
Fig. 4, worin die Füllung wie folgt stattfand : Der Kolben a war für die Kultur
bestimmt und wurde anfangs ganzlich mit der Nahrlösung

Leitungswasser . . 100

Bikaliumphosphat 0,02

Chlorammon 0,02

Natriumbicarbonat . . ... 0,1

beschickt, worin als Impfmaterial etwas Gartenerde aufgeschüttelt war. lm kurzen
Röhrchen oberhalb b wurde dann am 28. Mai die Gaszuleitung aufgcsetzt, die
Hahne b und c geöfïnet und 150 ccm N^O + 150 ccm Hj oberhalb der in a zu-
rückbleibenden Flüssigkeit gelassen. Das verwendete Gas war beinahe ganzlich
sauerstofïfrei und enthielt nur 4 Proz. N . Die Kultur fand bei 30° C statt.

Schon nach 3 Tagen war eine Trübung in der Flüssigkeit entstanden und
deutlich Druckverminderung in a bemerkbar, welche sich dadurch ablesen lieB,
daB beim Öffnen des Hahnes c das Niveau bei a nach oben, bei d nach unten
ging, und zwar, wie durch ein angebrachtes Merkzeichen angegeben wurde, wurden
in jener Zeit ca. 150 ccm übergehebert, also ein so groBes Volum, daB eine
starke Absorption des Gases sichergestellt und ganzliches Verschwinden des
Wasserstoffes wahrscheinlich war.

Auf der Oberflache der Flüssigkeit iu a hatten sich eine dunne, schleimige,
treibende Haut gebildet, welche der unter ahnlichen Bedingungen entstehenden

^) Bezüglich der Denitrifikation mit Schwefel muli ich noch bemerken, daB dieser
Vorgang oft schwierig einzuleiten ist. Man tut am besten, dafür ziemlich, aber nicht
allzu fein zerteilten oder zermahlenen Schwefel zu verwenden (kein Sulfur preci-
pitatum der Apotheken) und mit viel Grabenmoder zu infizieren. Einmal im Gange,
handelt es sich jedoch dabei um einen sehr energischen Vorgang, wobei jedes kleinste
Stückchen Schwefel in einen eng anschlieBenden Bakterienpanzer eingehüllt ist, welcher
soviel organisches Material enthalt, daB jeder Zweifel an Chemosynthese aus Kohlen-
siiure ausgeschlossen ist. Im Garungsgase wurde kein Stickoxydul gefunden.

38i

Haut in Luft und Wasserstoff von Bacil lus Saus s u r e i zwar auBerlich ahn-
lich, mikroskopisch davon jedoch betrachtlich verschieden war. Hier handelt es
sich namlich um kleine, nicht bewegliche Kurzstabchen, wahrend die Saussurei-
haut gröBtenteils aus zwar unbewegten, jedoch beweglichen Stabchen besteht, die
sobald sie freikommen, fortschwimmen.

Aussaaten von der Stickoxydul-Wasserstoff-Bakterienhaut auf verdünnten
Fleischbouillon-Agar haben die bezügliche Bakterie noch nicht geliefert, wahr-
scheinlich ist für deren Kultur ein armeres Nahrsubstrat notwendig, als wie für
B. Saussurei. Merkwürdigerweise entwickelten sich auf der Fleischbouillonplatte
wie bei den Methanoxydationsversuchen von Dr. Söhngen^), mehrere Keime
von B. pyocyaneus, welcher hier jedoch sicher nicht das primare Agens der
Oxydation, sondern ein sekundarer Symbiont war, welcher von den bei der Chemo-
synthese gebildeten organischen Körpern lebte.

Für die Gasanalyse wurden am 8. Juni 29 ccm herausgezogen. Diese ent-
hielten keine Kohlensaure.

Für die Untersuchung auf Wasserstoff wurden 14 ccm mit der gleichen Luft-
menge vermischt und sowohl der Explosion unterworfen, wie in der Dreh-
schmidtschenKapillareverbrannt, jedoch ohne daB dabei eine Volumverminderung
bemerkbar war. Wasserstoff fehlte also ganzlich.

Es wurden nun wieder 14 ccm Gas herausgenommen, mit 14 ccm Wasser-
stoff vermischt und aufs neue in der D re h s ch m i d t schen Kapillare verbrannt,
ebenfalls ohne Kontraktion, so daB auch das Stickoxydul fehlte und also aus dem
Kulturkolben ganzlich verschwunden und in Stickstoff verwandelt war.

In einem Kontrollekolben mit gleichem Inhalt, jedoch mit sterilisierter Erde
versetzt, anstatt mit lebendem Impfmaterial, konnte keine Veranderung in dem
Gaszustand gefunden werden, nachdem die Flüssigkeit sich mit Gas gesattigt
hatte und dann wochenlang bei 30** aufbewahrt wurde.

Dieser Versuch war also vollstandig überzeugend.

Wir haben dann in denselben Apparat eine neue, aus gleichen Teilen Wasser-
stoff und Stickoxydul bestehende Gasmenge zugelassen, und nach einigen Tagen
wieder, wenn auch schwachere Kontraktionen beobachtet.

Inzwischen war die treibende Bakterienhaut nach unten gesunken, und ein
damit eingeimpfter neuer Kolben hat zwar wieder unter gleichen Bedingungen
die Zerlegung von NO^ + H' gezeigt, nicht aber in gleichem MaBe wie die Roh-
kultur, so daB die nahere Beschreibung des Versuches überflüssig erscheint, um
so mehr weil die chemosynthetische Kohlensaurezerlegung vermittelst der Wasser-
stoffstickoxydulmethode durch obige Versuche, wie wir meinen, unzweifelhaft er-
wiesen ist.

Bevor wir diese Betrachtungen abschlieBen, sei noch darauf hingewiesen,
daB wir bisher vergeblich versuchten, Methan mit Stickoxydul durch Mikroben
zu zerlegen. Und ferner, daB wir glauben, daB Schwefel und Schwefelwasserstoff
für die Chemosynthése mit N^O, wenn auch schwieriger, sich auf ahnliche Weise
eignen als wie für die obengenannten Chemosynthesen mit Luft und Nitraten.
Jedenfalls war bei der Denitrifikation mit Schwefel kein N2O, sondern allein CO

') Versl. (1. Kon. Akad van Wetensch. Amsterdam. Dl. 14. 1905 p. 289.

382

und Nj im Garungsgase nachweisbar. Doch sind in dieser Beziehung unsere Ver-
suche noch nicht beendet.

Zusammenfassung.

Fassen wir zunachst die Resultate zusammen, welche wir bezüglich der Stick-
oxydulbildung gefunden haben, so ergibt sich folgendes :

i) Abgesehen von der Chemosynthese mit Schwefel und Nitraten als Grund-
lage, kommt Denitrifikation mit alleiniger Stickstofïbildung, also ohne Stickoxydul,
als selbstandiger, jedoch vorübergehender, bei der Überimpfung miBlingender
ProzeB nur vor unter dem EinfluB anaërober Granulobacter- Arten in Garungen
mit Kohlehydraten als Kohlenstofifquelle. Dabei entwickelt sich zugleich Wasser-
stoff und findet Ammonbildung aus einem Teile des Nitrates statt. Übrigens
liefern die denitrifizierenden Mikroben bei allen anderen untersuchten Kulturbe-
dingungen Stickoxydul neben freiem Stickstoff, wenn auch in stark wechselnden
Verhaltnissen.

2) Bouillon mit 5 bis 12 Proz. Nitraten gibt bei 20° bis 37'^ und mit Erde
als Infektionsmaterial einen Gasstrom mit mehr als 80 Proz. N,0, so daB ein
glühender Span sich darin entzündet. Bei geringerem Nitratgehalt entsteht relativ
weniger Oxydul und mehr freier Stickstoff. Der hauptsachlich dabei tatige Mi-
krobe ist der polymorphe Sporenbildner Bacillus nitroxus mit seinen Unter-
arten.

Auch im Boden durf te Bacillus nitroxus der Hauptdenitrifikator sein.

3) Mit Reinkulturen von Bacillus pyocyaneus, kultiviert in Bouillon
mit I Proz. Nitrat entsteht bei 37*^ ein Garungsgas mit 65 bis 72 Proz. Stick-
oxydul.

Etwas ahnliches sagen Gay on und Dupetit bezüglich ihres Mikroben a
(wohl B. pyocyaneus), wenn kultiviert in Ammoncitrat-Asparagin-Nitratlösung.

4) Bacillus Stutzeri, rein, liefert bei 37° in Bouillon mit i Proz. Am-
monnitrat Garungsgas mit 10 Proz. N2O, in Bouillon mit 2 Proz'. NHiNOs Gas
mit 20 Proz. N2O.

5) Unser aus i Proz. Seignettesalz 1 Proz. Kaliumnitrat isolierter Micro-
coccus denitrificans lieferte bei 37** in Bouillon mit i Proz. NH1NO3 Gas
mit 20 Proz. N2O und 42 Proz. N2.

6) Denitrifikation durch .Sporenbildner ist in den Rohkulturen intensiver,
wie in den Reinkulturen. Dieses kann nicht allein durch die Gegenwart der
Symbionten erklart werden, doch hangt es zusammen mit den Eigenschaften der
Keime selbst, wahrscheinlich derweise, daB auf den aëroben Platten nur die
schwacher denitrifizierenden Individuen zur Entwicklung gelangen.

7) Kleine Mengen von Stickoxydul mussen sowohl im Boden wie in der
Atmosphare gegenwartig sein.

Die Versuche bezüglich des Verbrauches des Stickoxyduls haben folgendes
ergeben :

1) Besonders die denitrifizierenden Bakterien zerlegen bei günstigen Er-
nahrungsbedingungen das Stickoxydul mit Leichtigkeit, wobei Stickstoff abge-
trennt, der Sauerstoff zu Kohlensaure wird. Bacillus Stutzeri besitzt diese

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Eigenschaft in starker Ausbildung, was die Hauptursache der geringen Stick-
oxydulbildung durch diese Art ist, und zugleich das gute Anhaufungsverfahren
dafür erklart, wenn anstatt Nitrat Stickoxydul verwendet wird,

2) Stickoxydul kann für einige Bakterien, worunter ein Spirillum, als
Sauerstoffquelle dienen und verhindert das Wachstum von Azotobacter.

3) Es gibt Bakterien, welche Nitrate nicht direkt denitrifizieren, wohl aber
das durch andere Arten gebildete Stickoxydul zersetzen können.

4) Die bisherige Theorie des Denitrifikationsprozesses :

2 NO3K + C . . . = 2 NO2K + CO2
4 NO2K + 3C... = 2N2 4-2 CO3K2 + CO2
muB durch eine andere, innerlich wahrscheinlichere ersetzt, namlich :
2 NO3K -h C . . . -- 2 NO2K -f CO2
2 NO2K + C . . . = N2O + CO3K2
2 N.0+ C... = 2 N2 + CO2
und zu gleicher Zeit mit folgendem Vorgange erganzt werden:
2 NO3K + 2 C . . . = N2O + CO3K2 + CO2.

5) Zu den bekannten Chemosynthesen konnte als neu hinzugefügt werden
die Kohlensaurezerlegung durch einen Mikroben, welcher seine Energie erhalt,
indem aus Wasserstoff und Stickoxydul bei Gegenwart von Chlorammon und
Natriumbicarbonat Wasser erzeugt wird.

Tafelerklarung.

Die VergröBerung ist überal! 72omal. Die Aufnahme geschah mit Obj. ZeiB Apo-
chromat 2,5 mm Wasserimmersion und Project. Ocular 2.

Fig. I. Bacillus sp h a e r o spor us. Kultur auf Fleischbouillongelatine, 3 Tage
alt, lebend.

Fig. 2. Bacil lus nitroxus. Kultur auf Fleischagar, 2 Tage alt, lebend.

Fig. 3. Bacillus nitroxu s. Kultur auf Erbsenlaubagar, 2 Tage alt, lebend.

Fig. 4. Wie vorgehend, gefarbt mit Carbolfuchsin.

Fig. 5. Bacillus nitroxus. Kultur auf Erbsenlaubagar, 3 Tage alt, in Sporen-
bildung begriflfen, lebend.

Fig. 6. Eine andere Stelle von vorgehendem Praparate, lebend aufgenommen.
Delft, im September 1909.

M. W. BEIJERINCK, Stickoxydul durch Bakterien.

•'A.

Fig. I.

Fig. 2.

Fig. 3.

Fig. 4.

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- *

Fig. 5. Fig. 6.

Fig. i: Bacillus sphaerosporius. Fig. 2, 3, 4, 5 und 6: Bacillus nitroxus.