功能 与 应 用 前 最 冷 欣 夫 ER RE Ft [ he hs ' a ‘ 5 f * [weet Aur Je ‘ a im d ™ y a. iT ; _ iam a Or 7 i* a% 于 rua : yas : q l e 4H 2 ’ eo r a - 4 + © 区 _ te ‘ Wit >| c— ¥ Gai a oe. = a. . 7 ae 4 i a =) ~~ J ~ 7 2 Tr , 7 f , - 1 AR ROY 中 国 科学 院 科学 出 版 基金 资助 出 版 ; : : aa | Bie bs) ee Baa HASTA . Gy’ Rt hs 项 LI S0003522 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 Ty ie we ALA WKAR RE Ie ae ok RK it 26 C1 21844 内 容 简 介 本 书 介 绍 了 生物 体内 重要 的 催化 酶 系 一 一 细胞 色素 P450 的 结构 与 组 成 、 催 化 循环 机 理 、 催 化 反应 类 型 .诱导 -调控 -抑制 作用 及 应 用 发 展 前 景 。 全 书 从 P 450 酶 系 的 基础 知识 和 研究 方法 人 手 ,介绍 国内 外 该 研究 领域 的 最 新 研究 进展 ,并 融入 作者 自己 的 研究 成 果 , 以 易于 理解 与 掌握 的 语言 将 上 述 内 容 系 统 地 展现 给 读者 。 本 书 可 供 大 学 生物 系 师 生 或 从 事 药理 学 、 环 保 学 和 昆虫 毒 理 学 方面 的 工作 者 参考 使 用 。 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 / 稚 欣 夫 , 邱 星 辉 编著 .一 北京 :科学 出 版 社 ,2001.5 ISBN 7-03-008990-1 工 . 细 … 01.04%: OR I. 细胞 色素 :氧化 还 原 酶 WV .Q554 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2000) 第 85276 号 een he HM 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 科 地 亚 印 刷 厂 印刷 科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 销 关 2001 年 5 月 第 一 版 , 开本 :787x1092 1/16 2001 年 5 月 第 一 次 印刷 印张 :16 % 印 数 :1 一 2 090 字数 :373.000 定价 : 45.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 ,我 社 负 责 调换 (新 欣 >) cil NA a a i 序 细胞 色素 P450 ,是 一 类 与 重金 属 结合 的 配 体 ,形成 的 酶 在 生物 细胞 通过 可 逆 性 的 变 化 而 进行 电子 传递 。 因 它 与 一 氧化 碳 结合 后 ,在 450nm 处 有 吸收 峰 , 故 有 此 名 。 该 物质 最 早 是 在 1955 年 从 哺乳 动物 肝脏 的 微粒 体 中 发 现 的 。 在 昆虫 中 ,1965 年 报道 其 存在 ,以 后 有 关 的 研究 陆续 增加 ,至 今 有 90 种 以 上 的 昆虫 出 现 有 关 细 胞 色素 P450 活动 的 报道 , 并 且 查 明了 以 P450 单 加 氧 酶 系 的 氧 活化 成 分 参与 生物 界 多 种 重要 的 代谢 过 程 , 从 简单 的 细菌 到 高 等 动物 与 植物 ,普遍 存在 。 近 年 来 由 于 分 子 生 物 学 技术 的 应 用 ,对 P450 的 认 识 有 极 大 的 促进 。90 年 代 以 来 ,每 年 发 表 有 关 的 论文 超过 2000 篇 ,研究 成 果 开 始 在 农 业 、 环 保 、 医 药 以 及 生物 学 基础 研究 的 各 领域 出 现 。 P450 酶 系 在 昆虫 中 的 作用 ,涉及 生长 、 发 育 、 取 食 等 过 程 , 它 对 异 生物 质 的 代谢 特性 造成 了 昆虫 对 杀 虫 剂 的 抗 药性 和 对 植物 有 毒物 质 的 耐 受 性 , 它 还 参与 昆虫 体内 激素 的 合 成 和 代谢 。 许 多 害虫 防治 工作 的 失败 经 验 , 提 高 了 人 们 对 P450 酶 系 在 其 中 作用 的 认识 , 并 且 促 进 了 对 此 领域 的 研究 发 展 。 细胞 色素 P450 酶 系 作用 的 重要 性 已 成 为 当代 生物 学 研究 中 的 一 个 值得 注意 的 领 域 。 我 国 在 药理 学 和 毒 理 学 研究 中 的 很 多 问题 与 它 有 密切 的 关系 。 因 此 出 版 一 本 专著 , 全 面 系 统 地 论述 有 关 的 基础 理论 和 应 用 的 可 能 性 与 重要 性 ,确实 是 当 务 之 需 。 本 书 的 两 位 作者 多 年 从 事 于 昆虫 毒 理 学 的 研究 工作 ,积累 了 丰富 的 有 关 经 验 和 学 识 ,写成 此 书 , 内 容 充实 ,可 读 性 强 。 在 12 章 内 ,包括 有 细胞 色素 P450 酶 系 的 研究 历史 和 发 展 、 酶 系 组 成 和 P450 的 结构 及 其 循环 催化 底 物 的 机 理 \ 不 同 生 物 类 群 中 的 P450 种 类 和 功能 ,P450 基 因 多 样 性 及 其 表达 调控 机 制 ,P450 与 某 些 疾病 的 关系 ,以 及 P450 酶 系 的 应 用 前 景 等 。 本 书 今 由 科学 出 版 社 出 版 ,是 我 国生 物 学 界 的 一 件 大事 ,预期 将 对 高 校 师 生 和 有 关 的 专业 研 究 人 员 做 出 重要 的 贡献 。 中 国 科 学 院 院士 钦 俊 德 2000 年 夏 % PO + Se 18 be a eS Sy Pe FTAA Be a ae if ss - eure BRR KD oat RA ABI EF Me ’ LRA Kx ea a! é - i 7 村 ~ 让 4) a MG Witty RA Mea ds 2 ex an AM. BUS Ants 0209 人 RE fa ae PHA vi it S00 IE A Atle Te Wy Aire! 二 oy 网 ais se ¥ AE hk RAS CR te Ee ea we ileal Wiese RR Te Boer 6 SO, eM aA wrest ay weirs: ESE Se DG DE = 1 AER ST RG ir aE ba 4 相川 | iy po ery hay esow vim Ci Pi; eS Wh TET ORAL, aA PS Ca AR ES me ,用 W i> ver i > : A) Piatt i ik (ad Go tha & ce Magy hs OF the RS Ge eel PONS hr hae aKa RES RMP 08 f NDS SoS Seas n A ce ke ae. a3 2, 对 oN , La, Fl 打消 中 让 下- SREY Bb to OA Te ORGS gt cam te ‘tea nena | 19 SOLA VR. ARRON T On A yee eet ee rer L - J O2+- PRS ae See a Lat eh BECHER oe eae x) Meh) DAs ee ORAL, a8 by il 前 在 自然 界 的 生物 王国 里 ,无 论 是 状 椎 动物 或 无 养 椎 动物 (包括 昆虫 ) 植 物 和 微生物 中 ,细胞 色素 P450 酶 系 无 所 不 在 。 在 生命 过 程 中 ,内 源 物 质 的 代谢 与 转化 或 外 源 化 合 物 的 活化 与 降解 等 都 需要 细胞 色素 P450 酶 系 的 催化 与 调控 。 由 于 该 酶 系 的 性 质 和 功能 及 其 在 生命 活动 中 它 的 作用 ,因此 在 药理 学 和 毒 理 学 的 研究 中 它 一 直 是 引 人 关 注 的 重要 研 究 领 域 。 细胞 色素 P450 酶 系 的 研究 ,已 有 350 多 年 的 历史 ,涉及 内 容 广泛 ,又 多 是 生物 体内 的 一 些 重要 问题 ,因而 其 研究 发 展 日 新 月 异 。 特 别 是 分 子 生 物 学 和 基因 工程 的 迅速 发 展 , 对 人 类 某 些 疾 病 的 发 生机 制 与 P450 基因 表达 调控 机 制 以 及 农药 的 抗 药性 和 环境 污染 物 致 癌 机 制 已 深入 到 分 子 水 平 。 由 于 细胞 色素 P450 酶 系 是 生命 科学 中 的 一 项 重要 研究 领域 , 它 又 将 是 联系 实际 问 题 的 研究 基础 。 近 些 年 来 ,我 国 在 药理 学 和 毒 理 学 的 研究 中 也 涉及 这 方面 的 研究 内 容 。 因而 有 必要 出 版 一 本 比较 全 面 的 专著 ;而 且 近 10 年 来 P450 酶 系 的 研究 及 其 应 用 前 景 日 趋 活路 和 扩展 ,也 需要 一 本 基础 理论 知识 比较 完整 的 参考 专著 。 本 书 共 128 ,内容 主要 包括 细胞 色素 P450 酶 系 的 发 展 历史 ,P450 的 分 子 结构 、 酶 系 的 组 成 及 其 对 底 物 的 循环 催化 机 制 以 及 P450 酶 系 分 子 生 物 学 及 基因 工程 研究 方面 的 情 况 。 凡 此 , 均 可 见于 有 关内 容 的 章节 。 关 于 P450 酶 系 的 生物 功能 和 P450 的 表达 调控 与 某 些 疾病 的 关系 及 其 基因 治疗 等 均 分 章 ( 节 ) 详 细 阐 述 。 另 辟 P450 酶 系 的 应 用 前 景 一 章 ,作为 开拓 该 酶 系 应 用 的 一 些 基础 知识 ,其 内 容 涉及 P450 循环 催化 途径 的 变革 ,以 及 P450 基因 在 农业 上 品种 的 改良 、 环 境 保护 中 的 生物 除 污 和 有 机 化 学 中 的 选择 性 合成 中 的 应 用 等 一 些 重要 的 发 展 研 究 领 域 。 本 书 承蒙 钦 俊 德 院 士 审 阅 并 作 序 。 书 内 的 化 学 结构 式 和 一 些 插图 以 及 在 编写 中 的 技 术 工 作 等 得 到 了 李 玉 侠 女士 热情 帮助 和 支持 。 在 此 均 深 表 感 谢 。 也 必须 指出 ,由 于 文献 较 多 ,有 些 内 容 在 编写 过 程 中 ,可 能 漏 缺 ;有 些 文献 只 收集 到 文 章 的 摘要 ,因而 文字 令 述 未 能 表达 全 意 。 由 于 本 书 的 内 容 涉及 面 广 ,再 加 上 我 们 的 水 平 有 限 , 书 内 错误 之 处 ,请 读者 多 加 指正 。 BRAK RB 中 国 科 学 院 动 物 研究 所 ,北京 2000 年 4 月 2 | Te ony Ty OF 1S ht Pe RE Ba, CAE GD) Pe EE ee a GE, +a NER SSR eh CORY PRR ton. AP CACO FE ARE | EO PA OR Wob9 于 us sea nee AE MEV APSEA ESS SP re eR He eS tn aoe a? ARGS OEY AeA Sen eee: 02 FF Pee Sno MRR AT RRS Oe rs ret ti aa bd TOR SO ete eu ee BEL. Read. £6 %Y 1k OCT SR: PRE “平江 Tt lack Ae eT Ree —~ ae: pa OM | oe OM A RAG YP HGR SEA aa St. KP BE Mea re ES (IE FEO HABE ff RSI a? ‘i etn WF -Se:H tt eB msi a OFT hoe Cee, ee sini CN RSM lakes Weoaie a ea Te Me Pee 02h SRR PRM ATE CH 075 PRES On AMR ORT Pe aR PA A chess : —-RRARAS See BR AMMA TLRS ia ARR AM BUMS CIR RH OT AACA MRSS HAVRE PR he oS at On ade dhe 2 OR SRR Oh ERE, Be AR ‘3 ; NS VOTE 8 ECR ROM Bs 1 I — CR EE On eg) HAE w+ SN WEA BR AS SR ae: 4 ae SRR Ce: RT REE eB hah SRA EAM } » PASTURE A at. RS a 4 ORE aE Sore KE MSH, (本 MAR. 2H | Wok, Ree aM ; 了 0 | 序 we 第 一 章 绪论 (1) 1.1 细胞 色素 P450 研究 简 中 pp (1) 1.2 细胞 色素 P450 的 多 样 性 pp (2) 1.3 细胞 色素 P450 功能 重要 性 与 应 用 前 景 pp (6) 参考 文献 (7) 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 本 (9) 2.1 细胞 色素 P450 酶 系 组 成 与 P450 的 分 子 特征 cocccc cece ce rece cee eeee eee eeeeee eee ees (9) 2.2 细胞 色素 P450 BEA AY VEAMEALALG coc cece ccc eee eee cece erence eens eeeeeeeeeeeeeeeees (16) 参考 文献 cece ec eee eee eee eee cee eeneeeeeeeeeeeeeeeenenseeeeaeenseeneneaeeeeeesenenenen ea eueneeenns (28) 第 三 章 细胞 色素 P450 的 分 离 纯化 pp (32) 3.1 哺乳 动物 细胞 色素 P450 的 分 离 纯化 ce eee eee ceceeeeeecee eee eeeeeeceeaeaeeeeeenaaeeeeees (32) 3.2 昆虫 细胞 色素 P450 的 分 离 纯化 pp (38) 和 (39) Po eG, | Ce eee (40) 第 四 章 ”细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 PP (43) 4.1 细胞 色素 P450 种 类 的 多 样 性 pp (43) 4.2 细胞 色素 P450 的 种 系 发 生 pp (45) 4.3 细胞 色素 P450 的 进化 起 源 与 数量 壮大 pp (47) 4.4 细胞 色素 P450 的 进化 pp (52) BER crc ct eee ee eee eeeeeeteeeeeeseneeenseseeeesensnseeececesensesensesesensesecsesensesesens (54) 第 五 章 ”哺乳 动物 细胞 色素 P4650 及 其 功能 pp (56) 5.1 哺乳 动物 细胞 色素 PASO 酶 系 对 体内 化 合 物 的 合成 与 代谢 coo eeeeee eee eee tener tee teeee (57) 5.2 哺乳 动物 不 同 组 织 中 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 pp (60) 参考 文献 crete ete e cece cece eee eeeeseneeneerensereeseesensensecseseeseneeeeesecseneerseensenees (70) 第 六 章 ”细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 PR (76) 6.1 细胞 色素 P450 对 肝病 的 影响 pp (76) 6.2 肝脏 疾病 中 CYP 表达 变化 机 制 pp (80) 6.3 病毒 感染 疫苗 注射 以 及 炎症 因子 对 肝脏 P450 的 影响 PP (83) 6.4 甲状 腺 疾病 ppp (85) 6.5 垂体 疾病 和 生长 激素 治疗 和 PP (86) 6.6 其 他 疾病 pp (86) 6.7 细胞 色素 P450 和 癌症 pp (87) “vic =| 录 第 七 章 ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 corre reer eee cece eee ee eee ee cette eee ee eens nena eens (107) 7.1 生物 合成 酶 ee (112) 7.2 解毒 酶 (128) Ce or Me) Se, ee eee (131) BAS 昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 wisaie sie vc sicnbecee cece eclsenie ce ccivisine ce dishes heen (140) 8.1 昆虫 细胞 色素 P450 基因 ppp (140) 8.2 昆虫 细胞 色素 P450 的 表达 站 pp (142) 8.3 昆虫 细胞 色素 P450 ADD GE cece cere cee cee cere eee cence ereceneeseeeeeeseeeeeeneees (147) 参考 文献 (164) 第 九 章 微生物 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 alsin oimleieinin on ecw sils'eicic'sis'ninjeais'e © sis'se'se «eaten (172) 9.1 真菌 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 pp (172) 9.2 细菌 细胞 色素 PA50 pp (178) 参考 文献 (181) 第 十 章 细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 eeeesaeassiaaeaaaee 和 swnaaieeeaaa 人 全 汪汪 (186) 10.1 细胞 色素 P450 基因 的 诱导 与 调控 (189) 10.2 ”细胞 色素 P450 的 抑制 pe (198) 参考 文献 eee (200) 第 十 一 章 细胞 色素 P450 基因 的 异 源 表 达 系 统 wa (205) 11.1 哺乳 动物 细胞 色素 P450 基因 的 异 源 表 达 系 统 pp (205) 11.2 昆虫 细胞 色素 P450 基因 的 异 源 表 达 系 统 NB (213) 11.3 植物 细胞 色素 P450 基因 的 异 源 表达 系统 ppp (214) 参考 文献 (216) 第 十 二 章 细胞 色素 P450 的 应 用 pe (224) 12.1 细胞 色素 P450 WFARIL ABER correc ec rec cece ceeeeeeeeceeeeecereeeeeeeeeeeseeees (224) 12.2 细胞 色素 P450 的 应 用 pp (229) 人 参考 文献 ooooesooeoseesoooooooooeosoooosooooooooooooooooooooooooosoeooooooooooeooooooooooooooooeoossosess (248) P450 酶 系 曾 被 冠 以 多 种 名 称 :多 功能 氧化 酶 、 细 胞 色素 P450 ABA. On A (monooxygenase) 芳香 烃 产 化 酶 和 药物 代谢 酶 等 。 它 是 广泛 分 布 于 动物 、 植 物 和 微生物 等 不 同 生物 体内 的 一 类 代谢 酶 系 。 细 胞 色素 P450 第 一 次 出 现 于 文献 中 是 在 1962 年 (Omura, 1999) 。 细 胞 色素 P450 加 单 氧 酶 (下 简称 P450 酶 系 ) 起 中 心 作 用 的 是 细胞 色素 P450 以 及 细胞 色素 P450 还 原 酶 , 因 其 主要 组 成 的 P450 蛋白 与 CO 的 结合 体 在 4530nm 处 有 特征 光 吸 收 峰 而 得 名 。P450 蛋白 种 类 的 多 样 性 及 其 底 物 的 重 私 性 使 P450 酶 系 可 以 催 化 多 种 类 型 的 反应 ,不仅 对 许多 外 来 物质 如 杀 虫 剂 及 其 他 环境 有 毒物 质 具有 代谢 作用 ,还 参与 一 些 起 重要 生理 功能 的 内 源 性 物质 如 激素 脂肪 酸 的 代谢 ,在 生物 体 中 起 十 分 重要 的 作用 。1963 年 P450 作为 氧化 酶 的 功能 得 以 盖 明 后 ,这 一 血红 蛋白 的 研究 发 展 很 快 ,出 现 在 《生物 学 文摘 》 的 有 关 P450 的 研究 论文 迅速 上 升 (Omura,1999) (图 1.1)。 由 于 P450 酶 系 的 生物 学 重要 性 , 自 其 发 现 以 来 ,该 酶 系 的 研究 一 直 是 药理 学 和 毒 理学 中 一 个 十 分 引 人 注目 的 领域 。 0 1965 1975 1985 1995 年 份 1.1 《生物 学 文摘 》(Biozogicaz Abstracts ) 中 列 出 的 P450 研究 的 论文 篇 数 1.1 细胞 色素 P450 研究 简 史 P450 酶 系 的 研究 已 有 50 多 年 的 历史 (Estabrook,1996)。20 世纪 40~50 年 代 , 化 学 药理 学 .生物 化 学 \ 内 分 弯 学 和 瘤 生 物 学 的 发 展 为 这 一 领域 的 发 展 黄 定 了 基础 (Es- tabrook,1996) 。50 年 代 的 两 项 进展 为 P450 的 发 现 和 鉴定 起 了 十 分 关键 的 作用 :GD1955 年 Hayaishi 等 和 Mason 等 同时 且 独 立地 发 现 加 氧 酶 (oxygenase);(D Chance 创立 了 适用 于 细胞 和 细胞 膜 的 浑浊 悬浮 液 研 究 的 快速 而 灵敏 的 分 光 光 度 技术 ,在 他 的 指导 下 于 1955 年 发 现 大 鼠 肝 微粒 体 被 连 二 亚硫酸钠 还 原 再 通 CO 后 在 450nm 处 有 吸收 峰 (Klingenberg, 1958). 60 年 代 前 5 年 P450 及 其 生理 功能 的 发 现 引 发 60 年 代 后 半期 有 关 P450 研究 的 迅速 发 展 ,但 由 于 条 件 的 限制 ,研究 工作 主要 集中 在 对 该 血红 蛋白 的 生物 化 学 和 生物 物理 学 特征 的 鉴定 及 膜 结合 酶 的 酶 学 功能 上 (Estabrook ,1996 ) 。 20 世纪 70 年 代 ,P450 酶 系 在 致癌 物 代 谢 中 的 重要 作用 得 到 证 实 , 许 多 研究 化 学 致 癌 的 科学 家 转向 细胞 色素 P450 的 研究 , 带 来 这 一 研究 的 第 二 次 大 发 展 (Omura et al. , “2° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 1993)。 方 法 和 技术 的 改进 使 增 溶 和 纯化 P450 及 重组 P450 酶 系 活 性 成 为 可 能 ,由 此 证 明了 许多 细胞 色素 P450 在 物理 学 和 酶 学 性 质 的 不 同 。 纯 化 的 P450 可 用 于 制备 特定 P450 的 抗体 并 由 这 些 抗体 来 测定 某 一 P450 的 存在 和 数量 以 及 抑制 特定 的 酶 反应 ,对 P450 的 化 学 反应 机 制 可 以 作 更 深入 的 了 解 。 20 世纪 80 年 代 分 子 生 物 学 技术 的 应 用 ,对 P450 的 认识 有 极 大 的 促进 ,Fuji-Kuriya- ma 等 (1982) 克 隆 和 测序 肝 P450 基因 之 后 ,P450 基因 克隆 及 其 序列 分 析 以 及 利用 特异 性 探 针 测定 影响 P450 分 布 和 合成 的 因素 ,成 为 该 领域 研究 的 热点 。80 年 代 的 另 一 成 就 是 P450cam 晶体 结构 的 确定 ,这 为 P450 催化 反应 机 制 的 了 解 芮 定 了 基础 (Poulos,1985)。 90 年 代 , 有 关 P450 的 研究 得 到 了 更 广泛 的 开展 ,每 年 有 关 P450 的 研究 论文 超过 2000 篇 ,研究 内 容 和 对 象 都 向 多 元 化 方向 发 展 ,P450 基因 表达 机 制 和 P450 结构 与 功能 关系 成 为 90 年 代 研 究 的 重点 (Estabrook,1996)。 近 10 年 来 ,P450 的 研究 成 果 已 开始 渗 人 人 农业、 环境 医药 及 基础 研究 各 领域 。 1.2 细胞 色素 P4s0 的 多 样 性 细胞 色素 于 1958 年 被 发 现 以 来 ,就 引起 了 人 们 的 广泛 重视 。 它 的 广泛 分 布 、 多 样 的 结构 、 复 杂 的 功能 及 其 基因 的 多 层次 调控 可 以 说 是 其 重要 性 的 某 些 体现 。 1.2.1 细胞 色素 P450 分 布 的 多 样 性 细胞 色素 P450 首先 在 哺乳 动物 肝 微 粒 体 中 发 现 ,最 初 被 认为 它 仅 存 在 于 动物 组 织 的 微粒 体 中 (Omura et al. ,1993) 。 至 20 世纪 60 年 代 后 期 ,细胞 色素 P450 在 微生物 中 的 发 现 证 明了 这 一 血红 和 蛋白 在 生物 界 的 分 布 要 比 想 象 的 广 得 多 (Omura et al. ,1993)。 至 今 已 在 各 种 动物 、 植 物 、 真 菌 和 细菌 中 都 发 现 有 P450 的 存在 (Omura et al. ,1993). 细胞 色素 P450 不 仅 在 不 同 种 的 生物 中 存在 ,在 同 种 生物 许多 不 同 组 织 中 也 发 现 了 P450. APES TH P450 含量 最 丰富 的 器 官 ,在 皮肤 、 肺 、 消 化 道 等 防御 人 口 及 肾 、 肾上腺 皮质 和 通 质 、 备 丸 、 卵 梨 、 主 动脉 和 血小板 等 部 位 也 被 证 明 存在 P450。 昆 虫 的 许多 器 官 或 组 织 如 中 肠 、 脂 肪 体 、 马 氏 管 甚至 头 壳 中 都 发 现 有 P450 (Hodgson ,1985)。 细胞 色素 P450 虽然 在 许多 组 织 或 器 官 中 存在 ,但 其 分 布 具 有 一 定 的 选择 性 :它们 主 要 分 布 于 外 源 化 合 物 进 入 体内 的 主要 人 口 的 组 织 ,这些 组 织 是 对 经 口 经 皮 进 入 的 外 源 化 合 物 的 第 一 道 防线 ,如 在 哺乳 动物 中 , 它 主要 分 布 于 肺 、 皮 肤 、 肠 道 , 以 及 氧化 作用 的 重要 场所 一 一 肝脏 ;在 鱼 类 ,主要 分 布 于 肺 . 肾 和 鳃 ;在 昆虫 中 多 存在 于 中 肠 、 脂 肪 体 和 马 氏 管 中 ,而 以 中 肠 含量 最 高 ( 艺 星 辉 和 冷 欣 夫 ,2000)。 可 见 P450 的 分 布 使 其 可 以 最 大 限度 的 发 挥 作 用 ( 唐 振 华 ,1990b) 。 1.2.2 P450 结构 的 多 样 性 P450 以 可 溶性 和 膜 结合 两 种 形态 存在 于 生物 体内 (Omura et al., 1993). 1967 年 Appleby MK DALE FA ( Rhizobium japonicum ) 中 证 明 一 种 可 溶性 P450 的 存在 ,随后 一 些 第 一 章 绪 论 “Zi 其 他 可 溶性 P450 也 相继 被 报道 (Omura et al., 1993). FYE P450 分 离 纯化 的 便利 使 Poulos 等 于 1985 年 获得 第 一 个 P450 晶体 (樟脑 羟基 化 P450,P450101,P450cam) 成 为 可 能 (Poulos ,1985) , 这 为 揭示 P450 结构 与 功能 的 关系 及 P450 的 作用 机 制 葛 定 了 基础 (Estabrook, 1996) 。 膜 结 合 P450 可 分 为 微粒 体 和 线粒体 P450 两 种 类 型 。 有 趣 的 是 ,线粒体 P450 BA 严格 的 底 物 专 一 性 , 它 代谢 内 源 性 省 醇 类 物质 ,对 外 来 物质 无 代谢 作用 (Omura et al. , 1993)。 而 其 他 P450 特别 是 肝 微 粒 体 中 的 P450 则 具有 非常 宽 而 重叠 的 底 物 专 一 性 (Porter and Coon ,1991 ) 。 细胞 色素 P450 的 化 学 本 质 是 蛋白 质 , 它 不 是 一 种 蛋白 而 是 分 子 质量 在 46 一 60kDa ( 黄 俊 勇 和 冷 欣 夫 ,1991) 的 结构 类 似 而 又 不 尽 相 同 ,性 质 类 似 而 又 有 差异 的 一 族 蛋 白质 ( 唐 振 华 ,1990a) 。 人 们 渐渐 发 现 来 源 于 不 同 种 ,或 同 种 不 同 品系 ,或 同一 品系 不 同 组 织 的 P450 ,其 分 子 量 光谱 特征 、 分 布 特点 、 免 疫 性 质 、 氮 基 酸 序列 调控 机 制 及 底 物 专 一 性 是 不 尽 相 同 的 。 分 离 纯化 技术 的 发 展 ,为 证 明细 胞 色素 P450 同 工 酶 的 多 样 性 提供 了 直接 的 证 据 , 如 从 大 白鼠 肝 微 粒 体 中 至 少 鉴定 出 6 种 同 工 酶 组 分 ,从 抗 性 品系 的 家 蝇 腹 部 微粒 体 中 分 离 出 4 个 同 工 酶 组 分 ( 黄 俊 勇 和 冷 欣 夫 ,1991)。 人 们 还 发 现 , 同 一 动物 在 不 同 的 发 育 时 期 P450 的 优势 同 工 酶 也 不 尽 相 同 ( 黄 俊 勇 , 冷 欣 夫 ,1991) 。 细胞 色素 P450 的 多 样 性 归根 结 底 是 由 其 基因 结构 的 多 样 性 决定 的 。 除 少数 例外 , 每 一 P450 基因 几乎 总 是 产生 单一 的 P450 蛋白 (Nelson et al. ,1993) 。P450 基因 结构 的 多 样 性 已 从 克隆 测序 的 P450 基因 中 得 到 证 实 ,至 1993 年 已 描述 的 基因 包括 分 属于 31 种 BRED ,11 种 原核 生物 的 36 个 基因 家 族 的 221 个 基因 (Nelson et al. ,1993)。 近 年 来 , 不 断 有 新 的 成 员 归 人 P450 这 一 古老 的 基因 超 家 族 , 至今 已 鉴定 出 1000 多 种 来 自 植物 \ 动 物 、 细 菌 和 酵母 的 P4$0 (Nelson, 1999), 1.2.3 细胞 色素 P450 功能 的 多 样 性 细胞 色素 P450 酶 系 可 能 是 自然 界 中 最 具 催 化 作用 多 样 性 的 生物 催化 剂 (Coon et al. ,1996) ,由 于 它 的 种 类 催化 反应 类 型 的 多 样 性 及 其 催化 底 物 的 广 谱 性 ( 表 1.1) ,Coon 等 (1996) 指 出 细胞 色素 P450 这 一 习惯 沿用 的 名 称 已 不 能 很 好 的 表示 这 一 类 物质 ,因而 提出 用 多 样 酶 类 (diversozymes) 来 命名 这 一 血红 和 蛋白 家 族 。 表 1.1 已 知 和 预测 的 细胞 色素 P450 的 多 样 性 特征 (Coon et al. ,1996) 类 别 现 知 数量 预测 的 总 数 P450 催化 的 化 学 反应 类 型 40 60 P450 底 物 10° >10° P450 的 诱导 剂 200 >103 已 鉴定 的 P450 或 CYP 300 103 每 种 哺乳 动物 的 P450 或 CYP 30 60 一 450 “ 4。 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 1.2.3.1 P450 底 物 的 多 样 性 P450 具有 很 广 的 底 物 谱 ( 表 1.2) , 既 包 括 许多 外 来 物质 如 抗体 植物 次 生性 物质 以 及 合成 的 有 机 化 合 物 ,也 包括 多 种 省 醇 和 其 他 生理 过 程 产 生 的 脂 类 。 底 物 的 化 学 结构 可 以 是 极 性 的 ,也 可 能 是 非 极 性 的 。 人 类 制造 的 环境 化 合 物 ,估计 已 超过 200 000 种 ,其 中 大 多 数 是 P450 的 可 能 底 物 ,还 有 许多 可 能 作为 P450 不 同 同 工 酶 的 诱导 剂 或 抑制 剂 (Porter and Coon,1991)。 有 些 参 与 省 醇 转 化 的 P450 对 底 物 有 高 度 地 选择 性 , 而 其 他 P450 特别 是 肝 微粒 体 的 P450 具有 重生 的 底 物 专 一 性 (Porter and Coon,1991)。 表 1.2 细胞 色素 P450 的 底 物 (Porter and Coon, 1991) 外 来 物 生理 过 程 相关 的 物质 药物 包括 抗生素 A BF SUED ARTE VO eR 抗 氧 化 剂 脂肪 酸 添 味 剂 丙酮 ,丙酮 醇 溶剂 脂 过 氧化 氢 农药 类 视 黄 酸 染料 麻醉 剂 石油 产品 醇 类 1.2.3.2 P40 催化 机 制 和 反应 类 型 的 多 样 性 总 体 来 看 ,P450 可 以 催化 成 千 上 万 的 反应 ,甚至 对 具有 相似 化 学 结构 的 底 物 也 表现 出 多 种 反应 类 型 (Guengerich,1993) 。P450 催化 反应 过 程 涉及 多 个 步骤 ,其 作用 机 制 有 多 种 。 典 型 的 反应 是 通过 电子 传递 系统 ,将 分 子 氧 还 原 , 并 将 其 中 的 一 个 氧 原子 加 到 底 物 中 ,反应 需 NADPH。 RH + O,+ NADPH + H*-ROH+H,0+ NADP* 随 生 物 所 处 环境 的 不 同 ,P450 还 有 其 他 的 催化 机 制 (Porter and Coon, 1991; Coon, 1992) ,如 : 1) 在 无 氧 情况 下 , 还 存在 过 氧化 物 支 路 ,通过 过 氧 提供 氧 原 子 使 底 物 羟基 化 (无 需 NADPH). 2) 通 过 氧 还 原 机 制 ABA AN A PI FEED ,而 是 形成 超 氧 化 物 和 过 氧化 氢 。 3)P450 不 完全 是 氧化 催化 剂 , 它 还 起 还 原 催化 作用 。 亚 铁 P450 可 提供 电子 ,在 无 氧 条 件 下 进行 分 步 反 应 。 许 多 化 合 物 如 染料 `N -氧化 物 、 环 氧化 物 都 可 接受 2 个 电子 而 被 还 原 。 因为 P450 具有 多 样 的 催化 机 制 使 P450 酶 系 对 多 种 底 物 表现 出 催化 活性 ,P450 参与 的 反应 可 归 为 包括 羟基 化 \. 过 氧化 、 环 氧化 等 在 内 的 数 十 种 类 型 ( 表 1.1)。 第 一 章 & .5 , 1.2.3.3 了 P450 反应 生物 学 效应 的 两 重 性 细胞 色素 P450 在 生物 体 中 具有 重要 的 生理 功能 。 有 些 通过 P450 的 生物 转化 作用 .如 胆固醇 (cholesterol) 转 化 成 类 皮质 激素 (corticoid) 和 性 激素 对 生物 体 是 必需 的 。 一 些 朴 水 的 外 来 物质 ,经 P450 催化 反应 后 ,形成 极 性 更 高 的 物质 而 更 易 被 生物 体 直 接 排 泄 ,或 通过 与 水 溶性 物质 如 葡 糖 醛 酸 和 谷 胱 甘 肽 结合 后 排除 ,这 通常 是 解毒 过 程 。 在 某 些 情况 下 ,外 来 物质 可 能 被 转化 为 具 细 胞 毒性 ` 致 突变 性 或 致癌 作用 更 强 的 物质 ,而 起 毒性 活化 作用 (Porter and Coon ,1991)。 1.2.3.4 P450 结构 与 功能 的 关系 细胞 色素 P450 表现 出 在 底 物 和 产物 专 一 性 方面 的 极 大 多 样 性 (Negishi et al., 1996)。P450 总 体 上 表现 出 较 宽 的 底 物 专 一 性 ,但 就 某 一 P450 往往 具有 较 高 程度 的 底 物 和 产物 专 一 性 特征 。 这 种 看 似 矛 盾 的 特征 是 由 P450 的 结构 决定 的 。 通 过 对 P450 分 子 的 三 级 结构 的 比较 研究 表明 ,P450 的 “ 底 物 -血红 素 吉 (substrate-heme pocket) "在 结构 上 的 可 塑性 (flexibility) 使 P450 可 能 与 多 种 底 物 结合 ,而 这 种 结构 的 可 塑性 是 由 “* 底 物 -血红 素 囊 "关键 位 置 上 的 氨基 酸 残 基 控 制 的 。 定 点 突变 和 以 cDNA 为 模板 的 表达 试验 证 明 ,这 些 残 基 对 P450 活性 具有 重要 作用 (Negishi et al . ,1996)。 一 个 典型 的 例子 是 小 鼠 P4502a-4/2a- SABE, P4502a-5 在 底 物 -血红 素 宫 上 的 一 个 氨基 酸 蔡 代 , 使 P4502a - 5 的 香 豆 素 7- 凑 基 化 活性 变 为 P4502a- 4 BY SB ( testosterone) 15a -羟基 化 活性 (Lindberg and Negishi,1989)。 不 同 的 P450 尽管 存在 结构 上 极其 保守 的 核 ,氨基 酸 序列 的 差异 使 任 意 两 个 P450 的 结构 都 有 所 不 同 ,P450 结构 上 的 差异 是 P450 多 样 活性 的 内 在 原因 (Gra- ham-Lorence and Peterson, 1996) 。 1.2.4 P450 基因 表达 调控 的 多 样 性 真 核 生 物 的 基因 表达 包括 了 基因 的 激活 和 转录 ,初始 转录 物 的 加 工 ,mRNA 由 细胞 核 运 送 到 细胞 质 , 由 mRNA 翻译 合成 蛋白 质 和 和 蛋白质 初 级 加 工 成 熟 ,产生 有 生物 功能 的 蛋白 质 等 主要 过 程 ,基因 表达 的 每 个 步骤 都 存在 调控 问题 ( 唐 振 华 和 胡 刚 ,1993)。P450 基因 转录 活性 的 调节 是 最 常见 ,但 不 是 惟一 的 表达 调节 机 制 (Porter and Coon,1991; Coon et al. ,1992)( 表 1.3)。 在 P4502E1 基因 表达 调控 上 涉及 转录 和 多 种 转录 后 机 制 (Coon et al. ,1992)。P4502FE1 基因 可 因 饥 饿 导致 转录 活化 ,而 伴随 糖尿 的 发 生出 现 的 mRNA 含量 增加 10 倍 是 由 于 RNA 稳定 的 结果 。 如 用 乙醇 丙酮 及 咪唑 可 诱导 2E1 蛋白 ,但 mRNA 含量 并 无 变化 ,因此 2E1 的 诱导 可 能 是 由 于 配 体 结 合 使 酶 免 遭 磷酸 化 和 降解 所 致 (Porter and Coon ,1991 ) 。 即使 是 亲缘 关系 较 近 的 P4501A1 和 1A42 ,都 有 不 同 的 基因 调节 机 制 。 因 P4501A1 的 酶 活性 可 能 与 肺癌 有 关 ,其 基因 表达 调控 备 受 重视 ( 冷 欣 夫 ,1996 ) ,成 为 目前 研究 最 为 深入 的 一 种 P4$0(Porter and Coon,1991). P4501A1 属于 可 被 多 环 芳烃 (PAH) 诱 导 的 基 因 家 族 成 员 ,这 一 基因 的 $ 侧 愤 区 包括 几 个 短 核 苷 酸 序列 ,被 称 作 异 生 素 响 应 元 件 (xeno- biotic responsive elements,XRE) 。 当 在 培养 的 细胞 中 加 入 芳烃 水 解 酶 受 体 (Ah 受 体 ) 的 “6, 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 配 体 (ligands) ,如 TCDD(2,3,7,8 -P9A — A#-X}-— SBS) AY, TCDD 与 某 些 动物 体内 的 Ah 受 体 结合 ,释放 出 热 激 蛋白 (hsp90 ) ,使 受 体 - TCDD 复合 物 与 芳烃 受 体 核 转移 酶 (ARNT) 结 合 进 入 细胞 核 ( 冷 欣 夫 ,1996) ,再 与 P4501A1 基因 的 XRE 结合 ,基因 的 转录 活性 加 强 (Porter and Coon ,1991)。 而 P4501A2 可 被 PAH 强烈 诱导 ,但 其 基因 的 $ -侧翼 区 无 XRE 序列 。 用 不 同 的 PAH 处 理 后 ,142 mRNA 含量 增加 20 一 40 倍 已 被 证 明 大 多 数 情 况 下 是 由 于 转录 后 机 制 一 一 通过 mRNA 的 稳定 性 和 1A2 mRNA 前 体 的 加 工 所 致 , Ah 受 体 可 能 参与 这 一 转录 后 诱导 过 程 (Porter and Coon,1991) 。 细胞 色素 P450 基因 的 表达 控制 是 生物 体 体 内 和 体外 多 种 因素 相互 作用 的 结果 ( 唐 振 华 和 胡 刚 ,1993) 。 一 个 基因 的 表达 往往 涉及 多 个 步骤 ,从 而 使 P450 基因 的 表达 调控 呈现 错综复杂 的 格局 ( 唐 振 华 和 胡 刚 , 1993) 。 表 1.3 了 P450 基因 表达 调控 的 多 样 性 (Coon et al. ,1992) i TAR P450 举例 转录 1Al-stAZ, 231, 2R2 207 «201d 2C12 , 2D9 ,2E1 , 2H1 ,2H2 ,3A1 /2 3A6, 4A1,11A1,11B1 ,17C1 ,22F1 加 工 和 mRNA 稳定 141 ,1A2 ,2B1 ,2B2 ,2C12 ,2FE1 2H1 ,2H2,3A1/2,11A1 Ris Ae Ee 2E1 ,3A1/2 ,3A6 1.3 细胞 色素 P4S0 功能 重要 性 与 应 用 前 景 细胞 色素 P450(CYP) 吸 引 人 们 的 注意 不 仅 在 于 它 参 与 许多 生物 过 程 , 也 因为 它 催 化 作用 的 独特 的 化 学 一 一 涉及 分 子 氧 的 还 原 和 分 裂 (scission ) , 氧 被 固定 在 底 物 中 。CYP 俊 化 作用 的 化 学 方面 虽 经 广泛 研究 ,但 尚未 完全 了 解 。 活 性 中 心 的 蛋白 结构 决定 不 同 P450 的 底 物 选择 性 。 P450 的 功能 不 仅 降 解 化 合 物 以 获得 碳 源 ,而 且 还 解毒 外 源 化 合 物 以 及 合成 具 生物 学 活性 的 化 合 物 如 省 醇 、 前 列 腺 素 (prostaglandins) 和 花生 四 烯 酸 酯 (arachidonate) 代 谢 物 。 由 于 底 物 结构 通常 是 朴 水 化 合 物 ,而 产物 的 水 溶性 更 高 ,因此 P450 可 用 于 处 理 环境 有 毒 物质 ,如 多 环 芳烃 和 碳 所 化合物 (fluorocarbons)。P450 也 被 用 于 基因 治疗 以 补偿 重要 代 谢 途 径 缺 损 , 如 补偿 CYP21 或 CYP17 这 些 在 省 醇 发 生 中 起 重要 作用 的 蛋白 。 另 外 ,P450 可 被 用 于 使 立体 和 位 置 选择 性 的 化 合 物 加 单 氧 化 作用 以 产生 重要 的 生物 活性 ,如 将 花生 四 烯 酸 转化 为 14,15 - EET, 这 一 活性 在 调节 K+ \Ca2+ 注 和 人 肾 中 起 重要 作用 (Graham and Peterson ,1999 ) 。 P450 既然 有 如 此 多 样 的 功能 作用 ,体现 出 其 生物 学 的 重要 性 ,同时 可 以 预见 P450 的 应 用 具有 广阔 的 前 景 。 通 过 调控 其 表达 和 活性 ,可 望 改 变 生物 体内 物质 的 代谢 途径 ,改变 产物 的 性 质 或 数量 。 随 着 现代 生物 技术 如 基因 工程 技术 的 发 展 , 人 们 可 以 操纵 P450 基 因 的 结构 及 其 表达 过 程 ,由 此 改变 P450 的 活性 ,甚至 构建 具有 天 然 P450 不 具备 的 新 活 性 。 第 一 章 绪 论 “ 7, 细胞 色素 P450 在 不 同 生 物 中 广泛 分 布 ,从 原始 的 细菌 到 高 度 发 达 的 哺乳 类 , 以 加 单 氧 酶 系 的 氧 活化 成 分 参与 多 种 多 样 的 代谢 反应 (Estabrook,1996)。 细 胞 色素 P450 存在 结构 的 多 样 性 ,这 是 P450 基因 长 期 进化 的 结果 。 正 是 因为 结构 的 多 样 性 ,赋予 了 不 同 的 P450 同 工 酶 不 同 的 底 物 特 异性 \ 不 同 的 催化 机 制 和 不 同 的 反应 活性 ,而 使 生物 对 多 样 的 物质 具有 代谢 能 力 。P450 分 布 的 策略 性 、 催 化 机 制 和 基因 表达 调控 机 制 的 多 样 性 对 生物 体 来 说 ,在 整个 生命 活动 中 都 是 十 分 重要 的 (图 1.2)。 胆汁 酸 A 稳 (AES ke papier i 酮 类 (homeostasis) 人 孕 酮 、 bd BE iS BE 内 分 沁 学 植物 当 醇 肾上腺 省 醇 雄 激素 - 峻 激素 神经 当 醇 天 然 产物 农药 环境 毒 理 学 ern 敏感 性 内 分 泌 破 坏 剂 〈disruptor) P450 药物 相互 作用 抗生素 sens 药物 设计 多 态 性 治疗 方案 设计 致 变 剂 活化 ea oe 化 疗 vs 生长 因子 rT 类 视 黄 酸 生物 指示 体 生物 技术 选择 性 杀生 物 齐 花 的 颜色 化 学 反应 性 氧 a5 16 1.2 P450 参与 的 生物 学 过 程 (Stegeman and Livingstone, 1998) 参考 xX mw 冷 欣 夫 .1996. 杀 虫 药剂 分 子 毒 理 学 . 冷 欣 夫 \、 唐 振 华 、 王 荫 长 主编 . 杀 虫 药剂 分 子 毒 理 学 及 昆虫 的 抗 药性 .北京 :中 农业 出 版 社 3 唐 振 华 . 1990a. 昆 虫 中 的 细胞 色素 P450 及 其 特征 .昆虫 知识 ,27(1) :52 一 55 唐 振 华 .1990b. 细胞 色素 P450 在 昆虫 适应 性 和 抗 药 性 中 的 作用 .昆虫 知识 , 27:175 一 178 唐 振 华 , 胡 刚 .1993. 细胞 色素 P450 基因 的 命名 及 其 基因 表达 的 调控 .昆虫 知识 ,30(5):311 一 314 RRA , 冷 欣 夫 . 1991. 细胞 色素 P450 酶 系 的 研究 进展 .昆虫 知识 , 28(5) :308 一 312 SRE HE , 冷 欣 夫 .2000. 棉铃 虫 幼虫 加 单 氧 酶 活性 的 组 织 分 布 . 生态 学 报 ,20(2):299 一 303 Appleby C A. 1967. 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Forms and functions of cytochrome P450. Comp Biochem Physiol Part C,121:1~3 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 2.1 细胞 色素 P450 酶 系 组 成 与 P4S0 的 分 子 特 征 细胞 色素 P450 是 一 个 酶 系 ,作为 功能 单位 ,该 酶 系 由 多 种 组 分 组 成 。 目 前 已 知 , 细 胞 色素 P450 酶 系 的 主要 组 分 包括 两 种 细胞 色素 (细胞 色素 P450 和 细胞 色素 bs ) \ 两 种 黄 素 蛋 白 ( 即 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 和 NADH -细胞 色素 bs 还 原 酶 ) 以 及 磷脂 等 , 其 中 细胞 色素 P450 和 细胞 色素 P450 还 原 酶 最 为 重要 。 2.1.1 细胞 色素 P450 细胞 色素 P450 蛋白 是 P450 酶 系 的 末端 氧化 酶 ,决定 底 物 和 产物 的 特异 性 ,是 酶 系 的 关键 组 分 。 eqs Maenesh 和 Anders (1973) 以 还 原 降 解 方法 证 明了 P450 含 血 红 素 分 子 。 这 些 还 原 降 解 产 物 及 其 衍生 物 经 气相 色谱 和 质谱 测定 确认 为 高 铁血 红 素 区 (图 a ne Gunsalus (1974) 以 纯化 的 P450 经 酸 -丙酮 处 理 得 到 血红 素 , 由 其 吡啶 -血色 原 光 谱 和 纯 的 、 分 离 的 样品 共 色谱 法 鉴定 出 细菌 的 P450 辅 基 也 是 高 血红 素 区 。 而 且 , 将 等 克 分 子 的 血红 素 加 到 脱 辅 基 色素 中 ,随后 用 胱 氨 酸 -甘油 处 理 , 尚 能 恢复 P450 加 iin npr “Hie 的 光谱 和 催化 活性 。 随 着 有 关 研 究 的 进展 ,从 假 单 胞 菌 ( Pseudomonas putida ) 分 离 的 细胞 色素 P450cam 是 首 例 用 蛋白 序列 分 析 描 述 细 胞 色素 P450 的 全 一 级 结构 。 最 近 因 分 子 生 物 学 技术 的 迅 速 发 展 ,通过 对 cDNA 序列 的 测定 可 以 推测 膜 结合 P450 蛋白 的 全 氨基 酸 序列 (图 2.2), 至 今 除 对 水 溶性 P450 的 蛋白 有 所 了 解 外 ,其 他 存在 于 各 生物 类 型 的 很 多 真 核 细 胞 的 细 胞 色素 P450 的 全 一 级 序列 也 得 到 阐 明 。 已 报道 的 P450 序列 超过 1000 个 (其 中 部 分 为 片段 )。 由 已 知 的 细胞 色素 P450 序列 对 比分 析 结 果 表 明 ,在 不 同 P450 的 氨基 酸 序列 中 , 有 同 源 区 存在 。 序 列 分 析 与 P450cam 的 结晶 结构 最 近 的 结果 提供 的 证 据 表明 ,在 同 源 内 的 胱 氨 酸 残 基 是 血红 素 铁 的 轴 配 体 (axial ligand) 。 保 守 区 的 苏 氨 酸 残 基 在 形成 氧 结 部 位 中 起 着 关键 作用 。 在 原子 水 平 上 研究 P450 结构 始 于 1985 年 ,以 第 一 篇 P450 4444 (P450cam, CYP101 ) 的 发 表 为 标志 (Poulos , 1985). Poulos 等 (1985 ,1987) 测 定 晶 体 P450cam 的 三 维 结构 的 分 辨 率 为 1.63A。 三 维 结构 (图 2.3)。 上 述 结构 包括 许多 螺旋 细 裂 片 和 反 向 平行 的 B- 折 琶 (sheet) 结 构 。 大 部 分 螺旋 位 于 分 子 的 右 半 部 ,多 数 反 向 平行 的 B- 折 和 在 左 半 部 。13 - 10° 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 1 40 80 TTETIQSNAN LAPLPPHVPE HLVFDMYN PSNLSAGVQE AWAVLQESNV PDLVWTRCNG GHWIATRGQL IREAYEDYRH A B 图 2.2 FH P450cam EA AK RAI HES BY P450cam 的 全 氨基 酸 序列 。A, 丙 氨 酸 ;C, 胱 氨 酸 ;D, 天 冬 氢 酸 ;下 , 谷 氨 酸 ;F, 葵 两 氨 酸 ;G, 甘 氨 酸 ;H, 组 氨 酸 ;IT, 异 亮 氨 酸 ;K, 赖 氨 酸 ;M, 和 蛋氨酸 ;N, 天 冬 BRK; P HAR; Q, SARK R AAR;S, HART HARB; V HAR W ZAR; Y RAR. H 线 的 序列 表示 残 基 含 BREA B -STRH AFI. (Makino 和 Shimada, 1993) 个 螺旋 体 ( 字 母 A 一 L) 在 二 级 结构 中 占 优 势 ,并 且 包 括 总 氨基 酸 残 基 的 50%。 约 20% 的 总 残 基 构 成 5 个 反 向 平行 的 B- 折 释 。 长 的 螺旋 I 和 世 几 乎 相互 平行 ,然而 E.F\G 和 I 构 成 一 种 反 向 平行 的 螺旋 束 。 螺 旋 体 D 和 世 也 是 平行 的 。 阴 区 的 葵 丙 氨 酸 350 ZAR 356 之 间 的 序列 组 成 一 个 反 向 平行 的 B- 膨 胀 体 。 这 一 区 域 包括 靠近 亮 氢 酸 356 背面 的 两 个 残 基 , 其 为 胱 氨 酸 配 体 环 , 它 含有 中 轴 硫 醇 基 血红 素 配 体 , 即 半 胱 氨 酸 337。 在 其 他 P450 酶 系 中 , 半 胱 氨 酸 357 的 周围 是 高 保守 区 。 和 氨基酸 残 基 186 一 192 和 215 一 218 是 些 不 规则 表面 环 , 其 中 前 者 与 G Al H RRR, Maas FAG 螺旋 体 相 连 。 这 些 环 由 氢 键 和 盐 桥 固 定 。 在 残 基 337 和 347 之 间 可 见 相 似 的 不 规则 表面 环 。 有 56~62 有 226~233 A 37.45, .IT .234~267 297~301 B 67~79 J 268-276 315~320 C 108~121 K 282~292 B 305-312 D 123~143 | 359~378 5 E 149~156 Ra F 176~185 G 192~205 H 218~225 图 2.3 细胞 色素 P450cam 晶体 结构 [Makino and Shimada(1993) ] 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 Ze | ae 几 年 后 , 另 一 晶体 结构 P450 gyp (CYP102 ) (Ravichandran et al., 1993) HE RR, E AAR P450 py), 3 的 血红 素 结构 域 (BMP)。 由 这 些 结构 ,建立 了 类 型 I(class 1) MAE AY I (class II)P450 的 模型 。 类 型 I 的 P450 需要 氧化 还 原 蛋 白 (redoxin) 和 含 FAD 的 依赖 NADPH 的 氧化 还 原 蛋 白 还原 酶 ;类 型 II 为 仅 需 FAD/FMN 的 NADPH-P450 还 原 酶 。 随 后 ,其 他 一 些 结构 也 被 前 明 , 即 属于 类 型 I 的 P450terp(CYP108)(Hasemann et al. , 1994) 及 P450eryF(CYP197A1 ) (Cupp-Vickery and Poulos,1995 ) 。 一 个 属于 类 型 IV-P450nor (CYPSSA1)(Park et al. ,1997) 直 接 从 还 原 态 的 喀 啶 (pyridine) 核 苷 酸 获 得 电子 ,而 无 需 电子 载体 的 介入 。 另 一 个 为 P450scc(CYP105A3 ) (Palma et al., 1994), 它 催 化 pravas- tatin 生物 合成 的 最 后 一 步 (Serizawa and Matsuoka,1991)。P450cam 和 P450gwp 处 于 不 - 同 状 态 ( 如 有 无 底 物 ) 以 及 P450cam 的 突变 型 的 晶体 结构 也 已 发 表 (Poulos et al. ,1986 ; Poulos et al. , 1987; Li and Poulos, 1997; Raag et al. ,1991; Vidakovic et al. , 1998). 在 整个 P450 基因 超 家 族 中 ,即使 P450 SAFER TN ATER 20% , 仅 有 3 个 氨基 酸 完全 保守 ,但 在 这 些 结构 已 知 的 P450 ,其 分 子 结构 存在 一 个 保守 的 结构 折 夫 (structural fold)。 对 于 所 有 已 测定 的 结构 ,P450 HATS ,但 它们 仍 表 现 出 一 级 、 二 级 和 三 级 结构 的 多 样 性 以 容纳 特定 的 底 物 和 氧化 还 原 搭档 (partners) 以 及 决定 蛋白 的 细胞 定位 (如 可 溶性 的 还 是 膜 结合 的 ,是 线粒体 的 还 是 微粒 体 的 )。 2.1.1.1 P450 的 结构 折 午 通常 P450 A 4 + BHT. KA 13 个 ua- 螺旋 ,其 中 BS 是 可 变 的 。P450 保守 的 结构 Bob BRIER DELL 及 螺旋 机 KK 组 成 。 螺 旋 I 包 含 高 度 保 守 的 苏 氨 酸 。N - 端 有 酸性 残 基 , 位 于 活性 中 心 吡咯 环 B 的 上 方 。 螺 旋 K 含 完 全 保守 的 下 -X-X-R, 可 能 参与 稳 定 核心 结构 ,位 于 血红 素 近 侧 ( 即 假定 的 氧化 还 原 搭档 结合 侧 ) 。 螺 旋 世 构成 血红 素 结合 区 的 一 个 部 分 。 有 两 套 结构 保 守 的 B- 折 释 , 一 为 B- 折 释 1, 包 含 $ 个 股 (strands) ; 另 一 为 B- 折 三 2, 包括 2 个 股 ;这 些 折 私有 助 于 形成 疏水 性 的 底 物 进入 通道 。 所 有 P450 具有 结构 保守 的 共有 序列 (consensus sequence) ,位 于 血红 素 的 近 表 面 (proximal face) 包 含 完 全 保守 的 半 胱 氨 酸 (Cys) , 它 是 血红 素 铁 的 第 5 个 配 体 ,也 是 CO - 结合 蛋白 在 450nm 有 特征 Soret 吸收 的 原因 。 线粒体 与 微粒 体 P450 的 明显 差异 在 于 世 -螺旋 的 起 点 ,鉴定 的 线粒体 P450 包含 2 个 正 电荷 氨基 酸 残 基 , 通 常 为 精 氨 酸 (Peterson and Graham, 1998). 在 蛋白 质 的 近 表 面 还 有 一 卷曲 称 为 曲 (meander) , 其 结构 高 度 保 守 ,以 前 称 为 芳香 区 (aromatic region)(Ozols et al. ,1985 ) 。 因此 ,变异 较 大 的 结构 元 件 是 螺旋 A.B\ BF\G\、 HK 人 8B- 折 至 3 和 4 以 及 环 (loop)。 这 些 可 变 区 包含 与 底 物 特异 性 有 关 的 部 分 。 2.1.1.2 底 物 结合 与 识别 以 上 提 到 的 非 保守 区 或 可 变异 区 通常 与 底 物 结合 部 位 和 氧化 还 原 搭 配 (Peterson ) 结 合 部 位 相连 。 比 较 CYP2 家 族 和 P450cam 的 序列 ,Gohoh (1992) 鉴 定 出 参与 底 物 识别 的 区 域 , 以 底 物 识别 部 位 (substrate recognition sites,SRS) 加 数字 命名 。 与 底 物 结合 相连 的 可 变 区 是 螺旋 A,B,B',F 和 G 以 及 它们 毗邻 的 环 。 环 BB' 和 BC 形成 活性 中 心 1 - 12: 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 712.4 P450aw 二 级 结构 元 件 的 拓扑 图 。a -螺旋 用 灰色 框 表示 ,8B- 折 到 的 各 股 用 灰 箭 头 表示 , 卷曲 和 环 用 与 以 上 结构 元 件 间 连结 的 线 表示 。(Graham and Peterson, 1999) (SRS-1) ,螺旋 F 和 G 及 它们 的 环形 成 活性 中 心 的 “进入 通道 "和 顶 (ceiling)(SRS - 2 和 SRS-3)。8B- 折 和 4 末端 的 B 转 角 (B- turm) 伸 人 活性 中 心 (SRS-6),8B- 股 (1-4) 的 N= 末端 区 (SRS- 5) 也 伸 人 活性 中 心 。 另 一 个 与 底 物 结合 相连 、 在 反应 机 制 中 重要 的 区 域 是 保守 的 、 螺 旋 工 的 中 心 部 分 (SRS-4)。 以 上 区 域 的 大 多 数 实 际 在 P450 酶 的 血红 素 / 活 性 中 心 , 参 与 底 物 在 囊 中 的 定向 。 螺 旋 A 下 -G 环 和 8B- 股 1-1 和 1-2 似乎 参与 底 物 识别 。 在 P450aBM3 位 于 “进入 通道 "入口 处 的 B- 股 1-1 和 1-2 的 B- 转 角 上 的 精 氨 酸 47(R47) 突变 研究 发 现 ,该 位 点 如 为 酸性 残 基 则 完全 抑制 与 花生 四 烯 酸 的 结合 ,而 如 突变 为 两 氮 酸 , 则 降低 底 物 结合 达 5 倍 。R47 突变 可 使 产物 的 形成 也 发 生变 化 ,野生 型 P450aM 3 产生 80% 的 18 -羟基 二 十 碳 三 烯 酸 (18 - HETE) ,R47A 突变 体 只 有 66% HETE, 而 14,15 - 环 氧 二 十 碳 三 烯 酸 (14,15 - EET) 则 由 野生 的 20% 变 为 R47A 突变 体 的 30% 。 但 如 在 活性 HUD ACE F87V 突变 (B'-C 环 ),14,15 - EET 的 产量 由 野生 型 的 20% 变 为 突变 体 的 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 - 13° 100%. Oliver (1997) 发 现 精 氨 酸 47 REARARAU FERRER RR (alkyltrimethylammonium) #24435 CE o 有 假说 提出 , 真 核 生物 微粒 体 膜 结合 的 P450, A FE 1 Bt 7k ES Ol ( Graham- Lorence et al . ,1995) ,其 F-G 环 和 8B- 折 到 1 和 2 的 某 些 部 分 可 以 与 膜 很 好 地 结合 ,可 能 通过 膜 来 提高 底 物 进入 的 能 力 。 另 外 , 底 物 进 入 通道 人 口 可 能 产生 明显 运动 ,这 已 从 对 P450BMp(Paulsen and Ornstein et al. , 1995; Arnold and Ornstein,1997) 和 P450cam(Gra- ham and Peterson,1999) 的 分 子 动力 学 模拟 以 及 含 二 价 铁 的 底 物 结合 型 BMP( 其 脂肪 酸 的 wo- 未 端 已 移 至 与 催化 反应 相 一 致 的 位 置 ) 的 NMR 光谱 测定 结果 (Modi et al. ,1996) 得 到 证 实 。 这 些 结果 以 及 有 关 P450eryF 的 报道 (Li and Poulos,1996) 代 表 了 真 核 P450 与 底 物 相互 作用 的 方式 , 即 底 物 结合 部 位 可 能 是 弹性 的 ,可 以 调整 它 的 形状 以 容纳 其 底 物 。 2.1.1.3 氧化 还 原 搭 档 结 合 许多 年 以 前 ,人 们 注意 到 在 内 质 网 膜 上 P450 分 子 比 NADPH P450 还 原 酶 分 子 要 多 (Peterson et al. ,1976) ,这 一 认识 及 人 们 对 P450 种 类 间 是 异 质 的 发 现 , 引 发 了 对 P450 与 P450 还 原 酶 分 子 相互 作用 是 如 何 调控 的 思考 〈(Backes et w. ,1998)。 这 一 问题 已 引 起 人 们 越 来 越 多 的 注意 ,并 试图 建立 新 的 生物 信息 学 以 及 探求 P450 与 其 还 原 酶 相互 作 用 的 实验 手段 ,以 揭示 P450 与 NADPH - P450 还 原 酶 之 间 的 相互 作用 。 P450 在 没有 结合 底 物 存在 下 被 还 原 可 能 产生 超 氧化 物 阴离子 自由 基 或 氢 过 氧化 物 , 这 种 “ 非 偶 联 ”反应 可 能 导致 组 织 损害 ,因此 底 物 和 P450 相互 作用 可 能 导致 P450 构象 的 改变 (Li and Poulos,1997 ) ,从 而 改变 P450 结合 还 原 酶 的 能 力 。Peterson and Graham (1998) 用 "进化 追踪 "(evolutionary trace) 方 法 研究 了 P450 与 其 还 原 酶 的 相互 作用 ,指出 P450 是 通过 P450 的 近 表 面 与 其 氧化 还 原 搭 档 ( 即 P450 还 原 酶 ) 相 互 作 用 ,P450 与 其 还 原 酶 的 结合 方式 在 P450 家 族 间 是 不 同 的 (Lichtarge et al. ,1996 ) 。 2.1.1.4 微粒 体 P450 的 结构 第 一 真 核 P450 的 结构 已 经 被 测定 为 CYP450 2C5, Johnson 博士 研究 组 为 获得 P450 2C5 的 晶体 结构 ,采取 去 除 N -未 端 第 3 一 21 个 氨基 酸 残 基 , 再 在 N- 末 端 加 上 4 FAA 酸 标记 以 优化 纯化 过 程 。 另 外 ,将 2C3 的 下 螺旋 的 C 末 端 尾部 替换 到 2C5 的 匹配 位 置 , 以 增加 蛋白 的 水 溶性 (von Wachenfeldt et al. , 1997), CYP450 2C5 表现 出 与 以 上 描述 的 P450 类 似 的 结构 折 释 ,螺旋 I 和 L 以 及 血红 素 - 结 合 区 高 度 保守 ,P450 2C5 中 对 应 于 以 上 结构 的 可 变 区 域 也 表现 出 可 变性 ,特别 是 螺旋 F 和 G 以 及 从 螺旋 了 至 C HK, FE 性 P450, 2 Hi (meander) Ail 8 -r# 1 和 2 通常 保守 ,这 与 P450 2C5 有 所 不 同 。 另 外 ,相对 a- 螺 旋 结 构 域 ,CYP450 2C5 的 B- 折 释 域 处 于 不 同 的 取向 ,导致 其 底 物 进入 通道 和 底 物 结合 与 根据 可 溶性 P450 预测 建立 的 模型 具有 明显 不 同 的 结构 。 KV _EBGR A LAE , P450 超 家 族 尽 管 其 序列 相同 性 小 于 20% ,但 却 具 有 相似 的 折 丢 结 构 , 其 中 有 高 度 保守 的 核心 ,也 有 与 底 物 识别 、 底 物 结合 以 及 与 还 原 酶 搭档 结合 相 联 系 的 可 变 区 域 。 这 些 结 构 的 差异 可 以 通过 结构 对 比 以 及 同 源 性 模型 来 分 析 确定 。 底 物 的 结合 与 产物 的 释放 需要 围绕 在 “ 底 物 进入 通道 ”的 区 域 产生 运动 。 随 着 P450 的 结构 与 功 能 关系 的 进一步 了 解 ,人 们 可 以 修饰 P450 的 分 子 结构 以 代谢 特定 类 型 的 底 物 ,产生 需要 -14- 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 的 有 用 的 化 合 物 。 2.1.2 细胞 色素 bs 细胞 色素 bs 是 许多 动物 组 织 微粒 体 膜 的 另 一 种 细胞 色素 , 它 是 血红 素 蛋白 。 首 次 由 Sanborn 和 Williams(1950)55 Chance (1955) 4) 5!) M #8 4 (cecropia silkworm ) 幼 虫 和 大 鼠 肝 微粒 体 中 发 现 的 。 细 胞 色素 bs 是 亲 水 - 脂 蛋 白 ,分子 质 量 为 16kDa, 由 两 种 蛋白 组 成 ,一 为 与 生物 膜 相 互 作用 的 疏水 性 蛋白 , 另 一 为 含 氧化 还 原 活性 的 血红 素 分 子 的 亲 水 性 蛋白 , 这 两 种 蛋白 以 约 15 个 氨基 酸 残 基 相连 。 氧 化 型 的 血红 素 蛋 白 的 最 大 波长 为 413nm, 还 原型 细胞 色素 的 最 大 波长 为 423、$26 和 5$53$7nm。 后 来 Spatz 和 Strittmatter (1971) 用 去 垢 剂 从 免 肝 微粒 体 分 离 得 到 细胞 色素 bs ,分 子 质 量 也 为 16kDa。 两 种 微粒 体 黄 素 蛋 白 即 NADH -细胞 色素 bs 还 原 酶 和 NADPH 细胞 色素 P450 还 原 酶 ( 详 见 下 节 ) 都 能 还 原 细 胞 色素 bs ,也 即 NADH 或 NADPH 都 能 作为 细胞 色素 bs 电子 转移 反应 中 的 电子 供 体 。Hildebrandt 和 Estabrook(1971) 已 证 明细 胞 色素 bs 参与 细胞 色 素 P450 的 电子 转移 并 提出 P450 还 原 反 应 的 第 1 个 电子 是 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 提供 的 ,而 第 2 个 电子 转移 到 氧化 的 P450 是 细胞 色素 bs 供给 的 。 2.1.3 NADPH -细胞 色素 P4S0 还 原 酶 已 知 细胞 色素 P450 催化 单 氧 酶 反应 时 ,需要 输入 两 个 电子 :在 哺乳 动物 中 , 这 两 个 电子 来 自 NADPH; 从 P. putida 分 离 的 可 溶性 P450 ,是 以 NADH 作为 外 源 电子 ;两 种 不 同类 型 的 电子 转移 链 ( 图 2.5)。 = P450 te P450 GEIR) (氧化 ) Heed ade < 氧化 ) P450 (还 原 ) Cat) (还 原 ) 2.5 电子 转移 途径 (Peterson,1986)。FP( 黄 素 蛋 白 Havoprotein) ;ISP( 铁 硫 蛋 白 iron-sulfur protemn)。 类 型 工 是 肉 进 真 核 细 胞 的 内 质 网 膜 上 ,类 型 I 存 在 线粒体 和 细菌 中 。 类 型 工 中 电子 转移 链 是 由 含 FAD 和 FMN 作为 辅 基 的 复合 黄 素 蛋白 组 成 。FAD 从 NADH 获得 电子 , 将 FMN 还 原 , 还 原型 的 FMN 将 电子 转移 给 P45$0 ,于 是 将 P450 DR. RH ASH 原 的 吡啶 核 苷 酸 先 还 原 还 原 酶 的 FAD, 然 后 转移 一 个 电子 给 2Fe,2S AREA, AREA “穿梭 "于 还 原 酶 与 P450 之 间 。 一 一 一 一 ~- -一 一 -一 一 一 一- 一- a ra ar I TEL EMO 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 5。 2.1.4 NADH -细胞 色素 bs 还 原 酶 NADH 细胞 色素 bs 还 原 酶 是 亲 水 - 脂 、 膜 束缚 的 黄 素 蛋 白 ,是 含 1 个 分 子 FAD 的 单 聚 肽 。 酶 分 子 有 1 个 大 的 亲 水 催化 区 域 结构 和 1 个 小 的 含 36 个 氨基 酸 的 疏水 性 的 膜 结 合 区 域 结 构 。 用 Triton N - 101 增 溶 ,从 聚 乙 二 醇 溶液 中 结晶 得 到 的 全 猪 肝 酶 (3SkDa) 含 有 玻 水 性 的 膜 结合 区 域 结构 ,并 得 到 亲 水 性 的 催化 区 域 结构 的 结晶 (Miki er al. ,1987)。 Ozols and Korza 等 (1985) 已 测定 小 牛 肝 微 粒 体 NADH -细胞 色素 bs 还 原 酶 的 全 氨基 酸 序列 (图 2.6)。 10 20 30 ee es 5 CB-2 C = (CH,),.-CH, 40 50 60 Pro-Ala-Ile-Thr-Leu-Glu-Asn-Pro-Asp-Ile-Lys-Tyr-Pro-Leu-Arg-Leu-Ile-Asp-Lys-Glu-Val-Ile-Ser-His-Asp-Thr-Arg-Arg-Phe-Arg- eE————-_ CB-2, R-3 一 c———_ CB, E-3 70 80 90 ee ee ee Ala -Arg- Ile-Asp-Gly-Asn-Leu-Val- Ile - 5 CB-2, R-6 -一 (B-2,F4 100 110 120 Arg-Pro-Tyr-Thr-Pro-Val-Ser-Ser-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly-Phe-Val-Asp-Leu-Val-Ile-Lys-Val-Tyr-Phe-Lys-Asp-Thr-His-Pro-Lys-Phe- CB-2, R-6 [一 一 130 140 150 ee Le Aa ee Ae Gly Prodan Gy Leelee Ver ig Tt 160 170 180 seo 一 CBA 一 c— CB-5 一 一 ca 190 200 210 Thr-Gly-Ie-Thr-Pro-Met-Leu-Gln-Val-Ile-Arg-A la-Ile-Met-Lys-Asp-Pro-Asp-Asp-His-Thr-Val-Cys-His-Leu-Leu-Phe-Ala-Asn-Gln- 一 -一 ram tsa CB-6 一 一 LRC 220 230 240 本 ee — —7, i SS DPE 1 250 260 270 (edi ila i? x: rca li gad 一 一 一 e— CB-7,W-3 “一 -一 一 一 ECB-5 一 一 SS SS te ee LT) ee oo a ELL’ Se 280 290 300 Leu-Met-Cys-Gly-Pro-Pro-Pro-Met-Ile-Gln-Tyr-A la-Cys-Leu-Pro-Asn-Leu-Asp-Arg-Val-Gly-His-Pro-Lys-Glu-Arg-Cys-Phe-A la-Phe- E CB-9 —* i Ee 2 agape ae c DP P= 2 KS DP-24E—2 图 2.6 细胞 色素 bs 还 原 酶 的 全 氨基 酸 序列 图 。CB( 以 CNBr 裂解 产生 的 肽 ),DP(ASP-Pro fiz) ,W ( ABRIL) ,R( 琥 珀 酰 化 肽 ,由 膜 裂 解 ),E(S. Aureus V8 蛋白 酶 裂解 ) ,K( 内 和 蛋白酶 Lys-C 裂解 ) , 图 内 黑 线 表示 残 基 的 鉴定 是 以 Edman 降解 法 。 - 16° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 NADH -细胞 色素 bs 还 原 酶 从 NADH 上 接收 两 个 电子 , 先 将 1 个 电子 转移 到 细胞 色 素 bs ,再 转 人 脂 酰 去 饱和 酶 参与 脂肪 酸 去 饱和 反应 ,或 传递 到 内 质 网 的 细胞 色素 P450。 Iyanagi 等 (1984) 提 出 从 NADH 转移 电子 到 细胞 色素 bs 的 图 示 如 下 : NADH i x E— FAD E—FAD— NAD E—FAD — NAD 电荷 转移 复合 体 还 原 酶 的 NADH 还 原作 用 的 起 始 是 电荷 转移 复合 体 ,NAD- 紧密 地 被 还 原 酶 束缚 。 这 种 形式 的 酶 使 细胞 色素 bs 在 两 步 中 还 原 两 个 当量 。 2.1.5 磷脂 微粒 体 水 解 酶 系统 的 组 分 和 线粒体 的 细胞 色素 P450 都 是 整合 膜 蛋 白 RRERA. 这 些 蛋 白 的 组 分 和 催化 反应 的 速率 与 专属 性 ,将 受 其 他 膜 组 分 性 质 的 影响 ,其 中 最 主要 的 是 磷脂 。 磷 脂 组 分 约 为 肝 细 胞 内 质 网 干 重 的 30% 一 40% 。 它 和 和 蛋白质 的 摩尔 比 为 353:1, 是 由 S5% 的 磷脂 酰 胆 碱 (PC) Al 20% 一 25% 的 磷脂 酰 乙 醇 胺 (PE)、 8% ~ 10% 的 磷脂 酰 丝氨酸 3$% 一 10% 磷 脂 酰 肌 醇和 4% ~ 7% 的 鞘 磷脂 等 组 成 。 微 粒 体 的 磷脂 的 脂肪 酸 组 分 为 23% 的 花生 四 烯 酸 和 其 他 不 饱和 的 脂肪 酸 (Lee et al. ,1973)。 磷 脂 对 细胞 色 素 P450 和 P450 还 原 酶 起 调节 作用 , 它 可 加 速 电 子 的 传递 而 提高 P450 的 氧化 作用 速 度 。 2.2 细胞 色素 P450 酶 系 的 循环 催化 机 制 细胞 色素 P450 酶 系 在 自然 界 可 能 是 最 具有 催化 多 样 性 的 酶 系 , 已 从 动物 、 植 物 、 真 菌 和 细菌 等 研究 表明 有 多 种 不 同 的 催化 反应 归功 于 细胞 色素 P450 的 作用 (Black et al., 1987; Gonzalez 1989) 。 几 十 年 来 ,人 们 对 P450 催化 反应 的 类 型 已 有 一 定 的 了 解 , 对 催化 反应 作用 机 制 的 认识 也 有 长 足 的 进步 。 但 由 于 P450 的 结构 与 性 质 的 多 样 性 ,有 些 P450 催化 作用 的 机 制 还 不 能 完全 确定 。 2.2.1 P450 酶 系 催化 的 反应 类 型 P450 催化 的 主要 反应 有 烷 基 的 羟基 化 , 烷 基 的 环 氧化 ,羟基 的 氧化 , 氨 、 氧 、 硫 部 位 上 的 脱 烷 基 化 , 氨 部 位 上 的 羟基 化 和 氧化 , 硫 部 位 上 的 氧化 ,氧化 性 脱 氨 、 脱 氢 和 脱 卤 素 , 氧 化 性 的 C 一 C 断裂 以 及 一 些 还 原 催化 反应 等 (Lewis,1996 ) 。 (1) 脂 族 碳 的 羟基 化 作用 ‘ i Eg mm 第 二 章 AMAR P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 .17 , RCH,H—~>RCH,0H 如 O O Et N Et OH @ eed — NH canto CH,Me NH jist CHMe O Me O Me RAW 戊 巴 比 妥 - 4 - 醇 (2) 芳 族 碳 的 羟基 化 作用 O O VA VA MeC 一 H 一 ~ MeC 一 OH N -乙酰 苯胺 对 -羟基 - N - 乙 栈 苯胺 (3) 芳 族 碳 的 环 氧化 作用 0 So -57 苯 并 花 -7,8- 环 氧 物 如 (4) 9 - 脱 烷 基 化 作用 Rs《O -oo = nO)-0H + R'CHO O / a MeC— ) OCH,CH; 一 ~ We OH + CH3;CHO H H 如 非 那 西 汀 4 -乙酰 氨基 酚 。 18 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 (5) N - 脱 烷 基 化 作用 H J RN 一 ~RNE + R’CHO CH,R 如 ic a (Oconee, + (Opmm +HCHO CH; CH; 麻黄 碱 降 麻 黄 碱 (6) S- 脱 烷 基 化 作用 RSCH,R’—>RSH + R’CHO 如 SCH3 SH oe: ‘oe er + HCHO O NH OO ee 6-FERBISM 6- Fiz (7) N -氧化 作用 R R Se Y N 一 ~ NO / | / | R R R 如 Me;N:—>Me;N —>O 三 甲 胺 氧化 三 甲 胺 (8) S -氧化 作用 R R a SN S — S->O oe R R’ 如 O 4 | | CH,CH,CH,NMe, CH,CH,CH,NMe, RAR 所 两 嗪 硫 氧化 物 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 - 19° (9) 脱硫 化 作用 RO、 RO、 位 天 二 一 R'O-P =O R’O R’O 如 OEt OEt on{O)-0-s mee on{O 0-0 me an 对 硫 磷 Xt ABS (10) 脱 胺 基 作 用 RCHNH —>RCHO + NH; 如 O CO)-capam 二 (Onan + NH; Me Me 苯 异 丙胺 苯 丙 酮 (11) 芳 胺 的 羟基 化 作用 (Ope -rm 如 (O)m 二 CO)-saas 苯胺 苯 羟 基 胺 (12) 芳 胺 的 水 解 作用 O : VA R NG—K ee NH, H O O VA VA E NHC ——= of NH), + CH3C SS De CH O HH 如 YAR Pa YT 氨基 葵 乙 醚 - 20 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 (13) 脱氧 作用 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 六 毛 环 已 烷 KAR (14) 脱 卤素 作用 H | VA | neu -* eo +HCl+ HBr ue OH BURZI: 三 氟 乙 酸 (15) 偶 氮 还 原作 用 如 Hs-{O9-{O sas 一 一 HTCO so + w{O) NH, NH, 偶 氮 磺胺 磺胺 2 ,4 -二 氨基 苯胺 以 上 列举 的 这 些 催 化 反应 过 程 是 通过 电子 传递 系统 ,从 NAD(P)H 转移 到 微粒 体系 统 中 的 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 ,或 铁 氧 还 蛋白 还 原 酶 和 线粒体 、 细 菌 体系 中 的 非 血红 素 铁 蛋 白 ,然后 到 细胞 色素 P450; 这 样 使 得 分 子 氧 (O? ) 还 原 活化 ,随后 一 个 氧 原 子 择 NED 2.2.2 P450 酶 系 的 催化 循环 机 制 细胞 色素 P450 与 底 物 的 总 反应 可 以 下 式 表 示 : 2e ,2H* P450 RH+0, ROH+ H,0 RH 代表 底 物 ,在 催化 反应 过 程 中 分 子 氧 (O; ) 裂 解 形成 水 和 羟基 化 的 代谢 产物 (ROH) 。 反 应 中 需要 两 个 电子 和 两 个 质子 。 在 线粒体 和 许多 细菌 中 ,电子 是 从 NADH 或 NADPH 通过 依赖 FAD 的 还 原 酶 来 传递 到 铁 - 硫 铁 氧 还 蛋白 。 然 而 ,在 微粒 体内 质 网 系 统 中 ,NADPH 传递 电子 是 通过 含 黄 素 蛋 白 的 FAD 和 FMN, 即 细胞 色素 P450 氧化 还 原 酶 ,无 需 FeS, 氧 还 蛋白 的 中 介 作 用 ,而 bs 也 可 能 是 提供 第 二 个 电子 的 来 源 (Backes, 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 - 21 , 1993)。 有 关 各 种 P450 系统 的 电子 传递 途径 (Takemori et al. ,1993)( 图 2.7)。 铁 氧 还 蛋白 (ferredoxin) (1) NADPH ———> 还 原本 “一 一 铁 氧 还 蛋白 ——vPP450 (FAD) (2) NADPH ————» P450 还 原 梅 ——+» P450 (FAD, FMN) NADH———> bs aoe 一 -一 一 b 一 一 一 其 他 酶 类 图 2.7 〈1) 为 线粒体 的 电子 转移 系统 。 还 原 的 吡啶 核 苷 酸 首 先 还 原 含 FAD 的 铁 氧 还 蛋白 还 原 酶 , 再 将 电子 传递 到 铁 氧 还 蛋白 。 铁 氧 还 蛋白 为 还 原 酶 和 P450 之 间 的 电子 穿梭 (shuttle) 转 移 。 (2) 为 微粒 体 的 电子 转移 系统 。NADPH 一 P450 还 原 酶 含 FAD 和 FMN 作为 辅 基 ,其 中 FAD 为 从 NADPH 来 源 的 电子 受 体 ,FMNN 为 还 原 的 FAD 和 P450 电子 转移 的 中 间 体 。 细胞 色素 P450 酶 系 的 循环 催化 反应 (图 2.8)(Porter et al. , 1991). ROH RH Fe* (ROH)Fe** so (R\(Fe-OH) "FS eo? 4 ‘ 2e ,2H XOH XOOH H,O RH(Fe-0)* : = (RH)Fe** (O,) 2 oy? RHJFer (02 ) (RH)Fe™* (05) 2H" H,0, 2.8 P450 作用 机 制图 。Fe 表示 活性 部 位 中 血红 素 的 铁 原子 ,RH 代表 底 物 ,RH(H), 代表 还 原 产 物 ,ROH 为 单 氧化 作用 产物 ,XOOH 代表 过 氧化 物 作为 交替 的 氧 供 体 上 图 为 P450 酶 氧化 底 物 的 循环 作用 机 制 及 一 些 中 间 步 又。 当 底 物 与 P450 酶 结合 后 , 酶 上 的 铁 原 子 (Fe) 被 还 原 , 它 是 由 另 一 个 叫 NADPH- 细胞 色素 P450 还 原 酶 的 电子 供 体 分 子 上 得 到 一 个 电子 (e- ) ,使 得 Fe 由 三 价 铁 还 原 成 二 价 铁 ,还 原 的 铁 原 子 便 与 分 子 氧 (O2) 结 合 。 另 一 个 电子 和 质子 (H” ) 加 到 铁 原 子 上 形成 了 底 物 (RH)Fe (05 ) 复 合 体 。 此 复合 体 失 去 一 分 子 水 后 生成 RH(FeO) 复合 体 , 并 将 其 氧 原 子 传递 到 底 物 上 。 被 氧化 的 底 物 释 出 后 ,游离 的 细胞 色素 P450 酶 又 重复 循环 。 2.2.2.1 底 物 与 P4S0 酶 的 结合 循环 反应 的 第 一 步 是 底 物 与 P450 酶 的 结合 。 已 知 项 态 的 酶 主要 以 低 自 旋 高 铁 型 、 水 分 子 占据 血红 素 袋 的 形式 存在 ,可 能 是 一 个 水 分 子 与 血红 素 的 铁 络 合 。P450 与 底 物 结 5 22s 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 合 , 亲 合 性 强 ,结合 迅速 ,并 伴随 光谱 的 变化 ,这 表明 铁 自 旋 平 衡 态 变 为 高 自 旋 态 , 尤 其 是 IT 型 底 物 ( 表 2.3)。 因 底 物 的 结合 降低 了 P450 氧化 还 原 电 位 ,而 相对 稳定 的 底 物 -结合 复合 体 就 容易 还 原 为 Fe(I) 态 ,这 样 易 于 电子 从 黄 素 蛋 白 还 原 酶 或 铁 - 硫 氧 化 还 原 蛋白 传递 。 底 物 与 P450 的 结合 也 使 得 酶 构象 发 生 改 变 ,促使 它 与 氧化 还 原 组 分 发 生 相 互 作用 , 从 而 引起 底 物 诱导 产生 两 种 (或 多 种 ) 二 级 结构 (a -螺旋 和 /或 B- 折 肆 )。 在 血红 蛋白 中 两 种 大 约 平行 的 -螺旋 可 能 随 底 物 结合 而 分 离 。 还 有 一 种 可 能 性 是 底 物 结合 诱导 酶 构象 改变 ,这 与 P450 的 加 氧 机 制 和 循环 催化 明显 有 关 。 这 可 以 想象 为 底 物 与 P450 结合 如 同 开动 构象 开关 , 当 底 物 接近 时 打开 或 关闭 活性 部 位 。 底 物 量 多 时 P450B 结 唱 结 构 的 活 性 部 位 多 次 打开 , 则 表明 可 能 对 结合 底 物 有 显著 的 构象 变化 。 会 调控 铁 自 旋 态 平衡 ,氧化 还 原 电 位 以 及 氧 的 结合 、 活 化 和 插 和 人 底 物 等 (Ravichandran et al. ,1993)。 可 认为 在 活性 部 位 中 连接 带电 的 或 极 性 的 束缚 水 分 子 残 基 易 于 质子 传递 (Gerber and Sligar,1994)。 所 以 底 物 的 结合 可 能 是 引发 P450 循环 催化 的 关键 阶段 。 随 着 底 物 的 结合 后 ,下 一 步 是 P450 通过 结合 氧化 还 原配 体 进 行 单个 的 电子 还 原作 用 。 2.2.2.2 第 一 次 还 原作 用 在 P450 循环 催化 过 程 中 ,第 一 个 电子 从 还 原 酶 或 铁 硫 蛋白 (redoxin) 传 递 是 相当 迅 速 的 。 这 期 间 可 分 为 三 个 阶段 , 即 四 电子 从 NAD(P)H 传递 到 还 原 酶 ,@O 从 还 原 酶 到 铁 硫 蛋白 ,@@ 从 铁 硫 蛋 白 到 P450 分 子 。 在 微粒 体系 统 没有 中 间 的 铁 硫 蛋白 , 而 是 含 FAD 和 FMN 的 还 原 酶 直接 将 电子 传递 到 P450。 在 P450cam 中 ,电子 从 NADH 迅速 地 传递 到 假 单 孢 氧 还 蛋白 还 原 酶 (>600 人 ,4Y ) ,然而 ,后 来 传递 到 假 单 孢 氧 还 蛋白 和 P450 的 还 原 作用 显著 地 较 慢 (26 作 , 4T 330~33/s, 25T )(Archakov et al. ,1990)。 对 比 之 下 的 微粒 体 P450 的 电子 传递 链 ,电子 从 NADPH 传递 到 黄 素 蛋 白 还 原 酶 则 明显 地 较 慢 (28 人 )。 P450Bp(CYP284) 经 还 原 酶 还 原 , 由 于 有 结合 底 物 ,其 还 原 速率 可 由 11.5 人 上升 到 18A (Lewis,1996)。 从 细菌 到 微粒 体 P450 电子 传递 速率 降低 的 原因 ,是 微粒 体 P450 中 有 两 个 黄 素 电 子 传递 组 分 即 FAD 和 FMN, ,而 细菌 的 P450 系统 (P450cam ) + (Af AA Ee A 还 原 酶 仅 含 有 FAD。 微 粒 体系 统 中 黄 素 间 电子 传递 速度 则 相对 迅速 ,可 能 由 于 还 原 酶 的 两 个 黄 素 环 相 邻 非常 近 ( 约 4A) 有 利于 电子 耦合 。 氧化 还 原 组 分 与 P450 结合 使 氧化 还 原 电 位 降低 表明 ,这 种 结合 与 电子 传递 之 间 有 协同 作用 。 就 P450cam 来 说 ,一 般 认 为 P450 至 少 有 4 个 碱 性 残 基 和 血红 素 相 邻 ,它们 与 假 单 孢 氧 还 蛋白 上 的 酸性 残 基 形 成 离子 对 的 静电 作用 (Stayton et al., 1989). ZEXRJR 与 微粒 体 P450 结合 的 情况 下 也 有 类 似 作 用 。Munro 等 (1994) 证 明 在 微粒 体 P450 和 P450a\e(cyp102) 中 ,保守 色 氮 酸 残 基 电 子 由 还 原 酶 传递 到 血红 素 分 子 所 起 的 作用 ,而 且 色 氨 酸 上 的 呵 唆 氮 原 子 与 血红 素 上 一 个 丙 酸 仅 相距 3A。 在 微粒 体 P450 中 另 一 个 保守 碱 性 残 基 是 赖 氨 酸 ,类 似 于 P4508\ 的 赖 氨 酸 - 349(P450cam 中 的 赖 氨 酸 - 314) , 它 是 还 原 酶 上 酸性 残 基 的 主要 接触 点 ,也 可 能 是 假 单 孢 氧 还 蛋白 还 原 酶 和 P450cam 的 作用 部 位 (Lewis, 1995). 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 表 2.1 P450 MAN I Vwi I 型 底 物 艾 氏 剂 (aldrin) TA EE HAR (allyl necopentyl barbituric acid) AT EE 2A (allyl butyl barbituric acid) 烷烃 类 (alkanes) 氨基 上 比 啉 (aminopyrine) 异 成 巴 比 妥 (amobarbital) d-=- 葵 异 两 胺 (d- amphetamine (low concentration) ) 异 两 巴 比 妥 (aprobarbital) 花生 四 烯 酸 (arachidonic acid) FE (benzpyrene) FA SAE FP SE “F AK ( benzphetamine) KK % ( biphenyl) TET BH (butobarbital) 咖啡 因 (caffeine) 樟脑 (camphopr) 四 氧化 碳 (carbon tetrachloride) 35 fhe, IB AR ( chenodeoxycholic acid) SF (chlordane) 氯 乙 烷 (chloroethanes) 氯仿 chloroform p- chlorormercuribenzoic acid $4.14 &R (chlorpromazine) 可 卡 因 (cocaine) 皮质 省 醇 (cortisol) HE WR (cyclobarbital) FC KE (cyclohexane) 1 - 环 已 烯 基 吡 咯 烷 (1 - cyclohexenyl pyrrolidine) 1 - 环 戊 烽 基 吡咯 烷 (1 - cyclopentyl pyrrolidine) 脱氧 胆 酸 (deoxycholic acid) 去 甲 两 咪 嗪 (desmethylimipramine) 二 丁 基 硫 醚 (dibutyl sulphide) WA (DDT) 4K EFA (dieldrin) 二 氢 黄 樟脑 (dihydrosafrole) 二 葵 基 海 因 (dipenylhydantoin ) aa- 联 吡啶 (a,a- Dipyridyl) 异 狄 氏 剂 (endrin) 安 氟 醚 (enflurane) B —SE §&§ — BF (B - estradiol) 5-22 5 - 烷 基 巴 比 妥 酸 盐 (5 - ethyl 5 - alkyl barbiturates) 乙 基 吗 啡 (ethyl morphine) 环 氧 乙烯 所 (fluoroxene) 谷 硫 磷 (guthion) 氟 烷 (halothane) 庚 巴 比 妥 (heptabarbital) +A (heptachlor) 2 - 庚 酮 (2 - heptanone) 己 烷 (hexane) CEH (hexobarbital) tremorine triton X - 100 AR ( tryptophan (low concentration) ) 吐 温 - 80( tween — 80) I 型 底 物 2- 和 4 -#25£ EK AE (2 - and 4 - hydroxybiphenyls) 2,2 -羟基 联 葵 (2,2 - hydroxybiphenyl) 2 -羟基 去 甲 两 咪 嗪 (2 - hydroxydesmethylimipramine) 两 咪 嗪 (imipramine) 异 冰 片 基 乙酸 酯 (isobornyl acetate) 异 - 辛 烷 (isooctane) 三 氯 杀 螨 醇 (kelthane) 月 桂 酸 (lauric acid) 利多 卡 因 盐 酸 盐 (lidocaine (low concentration) ) 林丹 (lindane) 亚 油 酸 (linoleic acid) 亚麻 酸 (linolenic acid) 马 拉 硫 磷 (malathion) 甲 氧 滴 滴 涕 (methoxychlor) FA 48 Gt (methoxyflurane) 甲 基 环 已 烷 (methylcyclohexane) FA St AE 3 Hit ME (methylphenyl sulphide) N- 乙 酰 甲 基 硫 氢 酸 (n- Acetylmethionine) 蔡 (naphthalene) a 蔡 黄酮 (a- Naphtohflavone) B- 蔡 黄酮 (8B- Naphthoflavone) N - 乙 基 马 来 酰 亚 胺 (n- Ethylmaleimide) 二 甲 基 葵 胺 (n,n- dimethylaniline) 2 - 手 酮 (2 - nonanone) 去 甲苯 异 两 基 苯 胺 (norbenzphetamine) FA FM (nortriptyline) iE Ge (n- Octane) JE- Se it BE (n - octane thiol) WHER (oleic acid) 4b 72 MR (oxotremorine) XY Git BE ( parathion) XE He (pentobarbital ) 非 那 西河 (phenacetin ) AE HW ( phenobarbital) 3 F #HV> ( pronethalol) HU! it X (prostaglandins) 拟 除虫菊 酯 类 (pyrethrins) 黄 樟脑 (safrole) 司 可 巴 比 妥 (secobarbital) SKF - 525A SKF - 8742A 牛 磺 去 氧 胆 酸 (taurochenodeoxycholic acid) if dn BF (a — terpineol) = {§§ Ail ( testosterone) PU AR ( tetrahydrocannabinol ) 3§ hi (theophylline) FA AE (toluene) K#E WH (vinbarbital) $4 2.8 (vinyl chloride) (R)- 杀 鼠 灵 ((R)- warfarin) 毛茶 咀 唑 胺 或 拂 来 星 (zoxazolamine) - 24° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 2.2.2.3 - 氧 的 结合 底 物 结合 细胞 色素 P450 并 发 生还 原作 用 后 ,第 二 步 是 分 子 氧 迅速 与 高 自 旋 Fe( 1) P450 - 底 物 复合 体 结合 。 产 生 的 氧化 亚 铁 复合 体 相 当 稳 定 ,自动 氧化 超 氧化 物 的 速率 为 0.01 全 (25 )。 有 结合 底 物 存在 时 ,就 会 增加 氧 结合 P450 复合 体 的 稳定 性 至 12~15 fF. 生成 的 氧化 Fe(II )P450 的 UV 差 光 谱 为 :微粒 体 P450 最 大 吸收 峰 440,560 和 590nm, 细菌 P450cam 和 线粒体 P450scc 中 氧 结合 Fe(I ) 复 合体 的 UV 最 大 吸收 峰 为 418 和 SSSnm。 氧 对 还 原 的 P450 的 高 结合 亲 和 性 的 决定 因素 之 一 ,是 自 旋 间 相互 作用 的 能 量 。 它 与 两 个 自 旋 量子 数 产 物 呈 正比 (Tovrog et al .,1976)。 在 三 重 基 态 下 ,分 子 氧 有 两 个 未 成 对 电子 ,而 高 自 旋 亚 铁 P4530 有 4 个 ,所 以 自 旋 成 对 作用 是 很 重要 的 。 这 可 解释 由 低 自 旋 到 高 自 旋 Fe( 亚 ) 为 什么 会 伴随 着 底 物 与 P450 的 结合 。Fe(I ) 态 对 氧 和 CO KATE, 所 以 对 配 体 和 血红 素 铁 有 关 的 其 他 电子 因素 也 很 重要 。 血 红 素 铁 在 Fe( 1 ) 态 时 ,是 个 好 的 r- 供 体 , 有 利于 Sx - 受 体 如 氧 、 一 氧化 碳 和 氧化 氮 等 结合 。CO 与 还 原 的 P450 结合 也 很 迅速 ,其 亲 和 速 率 约 为 氧 的 1/10(Addison and Burman, 1985). 有 研究 证 明 ,细胞 色素 P450 氧化 亚 铁 复 合体 变 为 高 铁 超 氧化 物 (Fe “OO; ) 导 致电 子 由 铁 传递 到 分 子 氧 。 氧 化 的 P450 复合 体 的 自 氧化 作用 生成 超 氧化 物 ,在 重组 的 微粒 体 系统 ,P450 形成 了 氧 结合 的 两 个 不 同 的 复合 体 。 原 三 维 复合 体 的 最 大 UV 吸收 峰 为 430 和 450nm, 后 来 缓慢 地 变 得 更 稳定 ,其 最 大 吸收 峰 为 440nm。 复 合体 开 的 绝对 光谱 与 氧化 亚 铁 P450 cam 相同 , 即 420 和 5$8nm。 上 述 情况 对 氧化 亚 铁 P450cam 无 疑 是 正确 的 ,但 微粒 体 氧化 的 复合 体 的 一 级 反应 历程 是 双 相 自动 氧化 ,形成 的 是 过 氧化 物 而 非 超 氧 化 物 (Archakov and Bachmanoova 1990). O, - site ibid. nt mal ce a 2.2.2.4 第 二 次 还 原作 用 在 催化 反应 中 ,进入 第 二 个 还 原 当 量 从 总 动力 学 考虑 它 决 定 反应 速度 步 又。 此 为 氧 化 细胞 色素 P450 - 底 物 复合 体 分 解 的 主要 途径 ,其 速率 常数 P450 cam WW 3~44,, 而 微 粒 体 P450 约 为 14。Gibson and Tamburini(1984) 证 明 ,细胞 色素 bs 能 调节 第 2 个 电子 传 16 FNAB P450 复合 体 上 ,电子 从 NADH 通过 细胞 色素 bs 还 原 酶 传递 到 细胞 色素 bs 的 速率 常数 为 30 人 ,再 从 细胞 色素 bj 传递 到 P450 为 2 一 7Ms。 电 子 从 NADPH 通过 它 的 还 原 酶 传递 到 细胞 色素 P450 的 速率 常数 是 1.1Ms(Lewis,1996 ) 。 第 二 个 电子 加 到 氧化 细胞 色素 P450 复合 体 产生 了 Fe?* 0O; Bk Fe?* OF” (RH- P450 — Fe O, = RH — P450 — Fe 03° ) 这 代表 还 原 的 加 氧 P450 复合 体 的 典型 结构 。 这 种 铁 的 过 氧 (或 超 氧 ) 的 分 解 能 产生 超 氧 化 物 。 有 试验 证 明 , 还 原 的 氧 细 胞 色素 P450 复合 体 分 解 产 生 过 氧化 氨 (HzO; ) ,这 对 底 物 的 加 氧 作 用 是 非常 不 利 的 (Archakov and Ehukov,1989)。 在 无 底 物 的 情况 下 ,还原 的 P450 复合 体 易 形 成 超 氧 化 物 (速率 常数 为 29Mmin)。 由 于 还 原 的 氧 细胞 色素 P450 复合 体 与 底 物 结合 迅速 重 排 ,而 产生 所 要 求 的 加 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 - 25° 氧 的 底 物 和 水 , EE MA 30/min, WA P450 的 来 源 不 同 ,而 速率 常数 会 有 很 大 的 变化 (Ruckpaul,1984 ) 。 2.2.2.5 产物 的 形成 加 氧 的 还 原 P450 - 底 物 复 合体 分 解 ,形成 总 催化 反应 产物 的 过 程 还 不 甚 清楚 。 关 于 铁 过 氧 复合 体 的 分 解 ,形成 已 知 产 物 的 机 制 已 有 很 多 报道 (Kappus,1993; Rein et al., 1993)。 许 多 作者 支持 P450 催化 反应 中 的 中 间 体 铁 (V) 环 氧 乙 炳 (Fe= O) 作 为 加 氧 剂 , 它 与 关 根 过 氧化 酶 (horseradish peroxidase) 的 催化 循环 中 的 (Fe(v) =O) 相 类 似 ( 图 2.9)。 N 1 4 eg Fe ee Z| as Ne Nm ‘AH, THO O AH: AH, N- [NN Fe a rN Na 图 2.9 冰 根 过 氧化 酶 的 催化 循环 图 ,总 电荷 铁 态 (左上 ), 化 合 物 I 右 上 ) 是 + 化合物 II( 下 中 ) 是 中 性 的 从 加 氧 P450 在 催化 条 件 下 的 共振 Raman 光谱 表明 ,有 铁 双 氧 物 存 在 (Egawa et al., 1991) , 双 氧 的 活化 由 于 连续 加 入 两 个 电子 而 生成 过 氧化 物 如 : Or OO 分 子 氧 中 的 O 一 O 键 长 为 1.21A 拉 长 到 过 氧化 物 的 键 长 1.49A。 它 是 通过 中 间 的 超 氧化 物 阶 段 ,此 时 的 键 长 可 能 在 1.26A 和 1.33A 之 间 ( 表 2.2)。 在 此 过 程 中 , 铁 中 啉 系统 在 P450 中 表示 传递 电子 到 氧 的 调控 方式 , 氧 - 氧 键 能 逐渐 变 得 脆弱 ,从 O; 的 497 kJ Amol 到 O; &) 276k) Amol, 2!) 03" AY 146kJMmol。 双 氧 键 的 伸延 和 变 弱 易于 裂解 ,裂解 后 一 个 氧 原子 进入 底 物 , 另 一 个 氧 原子 在 重 排 过 程 中 得 到 两 个 质子 后 形成 水 分 子 ,P450 又 将 进行 下 一 次 催化 循环 (Lewis, 1996). 表 2.2 双 氧 物 的 键 长 、. 键 能 和 O—O 的 伸展 频率 (Lewis,1996 ) 种 类 键 长 /A 键 能 /kJMmol O—O 伸展 频率 / 1/cm O 一 O WA 1/31 497 1555 O—O 超 氧化 物 1.26 一 1.33 276 1107(1145) OO tAkYy 1.49 146 850 - 26° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 2.2.3 膜 对 底 物 结合 的 影响 细胞 色素 P450 在 生物 体内 的 重要 作用 之 一 ,是 将 亲 脂 化 合 物 转化 为 水 溶性 形式 ,使 提 溶 性 化 合 物 降 解 后 从 体内 排出 。 肾 上 腺 线粒体 P450scc( 含 胆固醇 脱 碳 链 酶 活性 的 P450) 和 肝 微 粒 体 P4507c 的 底 物 胆固醇 在 水 溶液 的 溶解 度 很 低 , 约 为 10 ?molML。 肝 微 粒 体 P450 底 物 实际 上 不 溶 于 水 ,但 亲 脂 性 化 合 物 易 溶 于 生物 膜 , 如 胆固醇 能 与 磷脂 膜 结 合 的 克 分 子 比 例 为 1:1。 脂 质 浓度 对 省 类 化 合 物 底 物 与 P450 结合 的 影响 研究 表明 , 工 型 差 光谱 值 是 随 系统 中 不 含 P450 的 脂 质 体 的 量 的 增加 而 降低 (Kominami 等 , 1988)。 也 表 明 底 物 对 细胞 色素 P450 有 效 浓度 的 降低 ,是 由 于 脂 质 浓度 的 增加 。 底 物 在 膜 上 的 适宜 浓度 决定 于 底 物 的 分 配 系 数 , 即 K,=[SLI]L/SA Jao SL Fl SA 表示 底 物 分 别 在 膜 内 和 在 水 溶液 中 的 浓度 ,而 L 和 和 A 表 示 在 脂 相 和 水 相 中 , 开 , 为 底 物 在 液 相 和 脂 相 的 分 配 系 数 , VA 和 Vi 分 别 为 水 相 和 脂 相 的 体积 ( 升 ), V 等 于 VA 和 Vi 之 和 ,用 以 下 方程 式 可 计算 出 底 物 在 水 相 和 脂 相 中 的 浓度 (图 2.10)(Parry dal v; 1976)< [SA ],=[S]AK,X Vi/V +1) [SL]L.=[S]/A1/K,+ Vi/V) SA SA Fi Ti) 2.10 图 示 为 底 物 与 膜 内 细胞 色素 P450 的 相互 作用 。SA 和 SL 表示 底 物 在 水 相 和 膜 相 。 天 。 和 Ky, 表示 底 物 的 分 配 系数 和 解 离 常数 。(Kominami,1993 ) 在 上 述 方程 式 中 , 底 物 在 两 相 中 的 浓度 是 随 脂 相 的 体积 增加 而 降低 。 这 可 解释 为 I 型 差 光谱 值 的 降低 是 由 于 脂 质量 的 增加 (Kominami ,1993) 。 影 响 底 物 与 膜 的 结合 也 与 解 离 常数 (dissociation constant, Ky) 3¢(Kominami et al., 1988). Kominami 等 (1986 ) 研究 了 类 固 醇 底 物 在 肾上腺 膜 内 与 肾上腺 微粒 体 细胞 色素 P450c21( 含 有 类 固 醇 21 -水 解 酶 活性 的 P450) 的 相互 作用 ,用 停 流 法 (stopped flow) 测 定 了 底 物 与 P450c21 结合 和 解 离 的 动力 学 。 用 如 下 的 模型 从 观察 的 松弛 时 间 (relaxation time) 计 算 其 动力 学 参数 。 在 这 两 个 模型 中 ,有 两 种 反应 即 省 类 化 合 物 底 物 在 膜 内 的 分 配 和 底 物 与 P450c21 的 结合 。 根据 实验 结果 推断 , 底 物 在 膜 内 的 分 配 反应 要 比 底 物 与 P450c21 结合 反应 快 。 芳 族 分 子 在 脂 质 体 小 泡 之 间 的 转移 是 通过 水 相 进行 , 而 受 脂 质 膜 释放 速率 的 调控 。 底 物 与 脂 质 体 P450c21 的 结合 和 解 离 的 动力 学 分 析 结 果 表 明 , 底 物 面 向 脂 相 的 结合 部 位 模型 较为 合理 (Kominami, 1986). Kominami 等 (1988) 研 究 了 脂 质 的 组 分 对 类 固 醇 与 P450 170 裂 合 酶 在 磷脂 酰 胆 碱 第 二 章 ”细胞 色素 P450 酶 系 组 成 及 其 循环 催化 机 制 - 27: (phosphatidyl choline,PC) 脂 质 体 和 PCES 脂 质 体 内 的 结合 常数 的 影响 。 以 PCES 模拟 肾 上 腺 微粒 体 磷 脂 的 组 成 , PCES 脂 质 体 含有 磷脂 酰 胆 碱 (PC) , WE AG Bt Z. BERK ( phos- phatidylethanolamine) 和 磷脂 酰 丝氨酸 (phosphatidylserine) ,其 克 分 子 比 为 5:3:1, 依 据 底 物 面向 脂 相 的 结合 部 位 模型 ,计算 类 固 醇 - P450170 裂 合 酶 复合 体 的 解 离 常数 。 研 究 结 果 也 支持 细胞 色素 P450 的 底 物 结合 部 位 面向 脂 相 的 观点 。 2.2.4 P450 系统 中 和 蛋白质 和 脂 类 的 相互 作用 膜 在 微粒 体 P450 系统 中 起 重要 作用 。 膜 磷脂 在 各 种 氧化 还 原配 体 间 的 促进 和 调 节 , 以 及 作为 底 物 的 载体 进入 P450 并 接近 通道 和 活性 部 位 等 多 方面 起 作用 。 微 粒 体 P450 的 20~40 残 基 间 的 N -未 端 片段 ,P450 氧化 还 原 酶 的 N= 未 端 和 细胞 色素 bs 的 C- 末端 都 被 认为 是 跨越 磷脂 双 分 子 层 ,并 用 作 固 定 膜 内 氧化 还 原 系 统 的 成 分 。P4501A1 在 有 或 无 N -未 端 30 残 基 的 情况 下 ,进行 的 旋转 扩散 (rotational diffusion) 研 究 ,证 明了 微粒 体 P450 系统 中 和 蛋白- 脂 类 的 相互 作用 。 实 验 用 鼠 肝 微粒 体 P450 1Al ,在 没有 氨基 酸 - 230( 一 种 细胞 色素 P450 的 膜 固定 体 ) 的 情况 下 ,在 酵母 微粒 体 中 表达 。 这 种 截 短 的 细胞 色素 有 7- 乙 氧 基 香 豆 素 的 去 脱 基 活性 。P450 1Al 的 旋转 扩散 经 P450 - CO 复合 体 的 诱 导 闪 烁 -吸收 向 异性 (flash-induced absorption anisotropy ) 的 测定 结果 表明 ,N -末端 截 短 P450 1A1 可 以 与 酵母 微粒 体 结合 ,而 且 与 膜 连接 的 不 仅仅 是 N -末端 的 朴 水 部 分 ,这 证 明 了 P450 的 附加 部 分 也 参与 膜 结合 (Ohta et al. ,1994)。 膜 磷 脂 双 分 子 层 由 于 底 物 的 亲 脂 性 而 影响 底 物 结合 ,这 在 真 核 细 胞 和 微粒 体 P450 中 都 起 重要 作用 。 磷 脂 分 子 的 性 质 与 微粒 体 P450 的 血红 素 蛋白 自 旋 态 平衡 的 调控 有 关 , 而 且 也 可 能 调节 P450 与 底 物 结合 作用 有 关 的 构象 变化 (Omata et al., 1987). ATA 的 P450 对 还 原 酶 的 竞争 作用 决定 于 底 物 的 存在 (Cawley et ww . ,1995) ,因为 底 物 可 诱导 P450 的 构象 改变 ,并 引起 与 氧化 还 原配 体 的 相互 作用 。 而 且 , 也 表明 由 于 膜 磷脂 、 双 磷脂 酰 甘油 的 结合 特性 促进 皮质 铁 氧 还 蛋白 和 P450 11AL(CYP11A1) 间 的 电子 传递 (Pember et al. ,1983)。 脂 质 - P450 的 相互 作用 可 能 有 增 效 性 ,因为 微粒 体 P450 能 增强 磷脂 横向 扩散 速率 使 底 物 接近 膜 结合 的 P450 的 血红 素 部 位 (Lewis,1996) 。 磷脂 的 组 分 也 影响 脂 质 体 P450scc 的 胆固醇 侧 链 活性 和 胆固醇 的 Ke 值 ,但 对 Vinx 的 影响 较 低 。 关 于 胆固醇 结合 的 Ku 值 ,由 测定 胆固醇 诱导 的 I 型 光谱 变化 来 看 它 与 膜 上 P450scc 活性 紧密 相关 。 因 此 ,可 认为 脂 质 组 分 的 作用 是 受 胆 固 醇 与 P450scc 结合 的 控 制 。 在 脂 质 对 P450scc 影响 的 研究 中 发 现 双 磷脂 酰 甘 油 (cardiolipin) 对 P450scc 有 很 明显 的 影响 ,这 种 影响 与 膜 的 物理 性 质 无 关 。 但 有 这 样 的 概念 , 即 1 个 分 子 的 双 磷 脂 酰 甘油 束 缚 着 1 个 分 子 的 P450scc, 就 影响 胆固醇 的 结合 。 双 磷脂 酰 甘 油 在 膜 内 需要 的 浓度 与 在 肾 上 腺 线粒体 内 相 类 似 , 而 且 双 磷脂 酰 甘油 的 这 种 影响 是 发 生 在 活 细胞 内 的 (Kominami, 1993 ) 。 磷脂 对 P450 的 影响 不 仅 干 扰 底 物 结合 ,而 且 还 影响 细胞 色素 P450 与 还 原 酶 之 间 的 作用 (Ingelman-Sunberg et al. ,1983; Muller-Enoch et al. ,1984) ,甚至 有 时 还 影响 反应 机 制 。 如 牛 吧 上 腺 皮质 线粒体 的 P450iip 在 无 磷脂 的 情况 下 ,就 不 能 催化 醛 省 酮 (aldos- terone) 的 形成 (Wada et al. , 1984;Ikushiro et al. ,1989) 。 。 28 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 2.2.5 活性 部 位 的 氨基 酸 残 基 参 与 P450 的 加 氧 作用 在 P450 的 血红 素 结合 区 有 两 个 保守 的 氨基 残 基 参 与 加 氧 作用 机 制 (Gerber and Sli- gar 1994; Shimizu et al. ,1994) 。 关 于 P450cam 系统 的 位 点 定向 诱 变 试验 表明 , 苏 氨 酸 - 252 诱发 变异 为 丙 氨 酸 、 幼 氨 酸 或 丝氨酸 使 樟脑 羟基 化 作用 降低 ,伴随 着 增加 过 氧化 物 的 形成 ( 表 2.3)。 由 于 苏 氨 酸 - 252 变 为 两 氨 酸 或 细 氢 酸 , 氢 键 供 体 或 受 体 氨基 酸 残 基 的 消 除 ,5 -羟基 樟脑 逐渐 转换 为 主要 产物 过 氧化 物 (Imai et al., 1989). Gerber 和 Sligar (1994) 证 明 ,P450cam 的 两 种 氨基 酸 如 天 冬 氢 酸 - 231 和 苏 氨 酸 - 252 的 位 点 定向 诱 变 表 明 ,这 两 种 保守 的 残 基 的 共同 作用 有 利于 氧 - 氧 键 的 断裂 ,这 可 能 是 导致 加 氧 产物 形成 机 制 的 关键 步骤 ,这 种 作用 可 能 对 其 他 P450 系统 也 是 适用 的 。 表 2.3 部 位 一 定向 诱 变 对 P450cam 活性 的 影响 BED 5 -羟基 樟脑 / % N2O27 % O: 的 消耗 / 1/min Thr - 252 96 5 1330 Thr = 252-s 81 15 1100 Thr -— 252-v 22 45 420 Thr-252-A 6 83 1100 Gerber 和 Sligar(1994 ) 试 验证 明 ,天 冬 氨 酸 - 251 诱 变 为 天 冬 酰胺 使 得 P450cam 的 催 化 活性 明显 降低 。 并 认为 这 个 部 位 有 酸性 氨基 酸 残 基 存 在 对 竞争 性 的 加 氧 酶 活性 是 重要 的 。 然 而 ,对 两 个 碱 性 氨基 酸 残 基 , 如 精 所 酸 - 186 和 赖 氨 酸 - 178 的 诱 变 试验 表明 ,它们 在 P450cam 活性 部 位 中 与 天 冬 氨 酸 - 251 相近 ,并 与 天 冬 氢 酸 - 251 的 阴离子 残 基 发 生 静 电 相 互 作 用 。 这 证 明了 细菌 酶 血红 素 中 有 伸展 质子 交换 网 络 (extensive proton relay net- work) 并 对 双 氧 键 的 断裂 起 作用 (Lewis,1995a; Gerber and Sligar, 1994), 关于 P450c(CYP1A2 ) 假定 的 活性 部 位 区 进行 的 定点 诱 变 试验 结果 表明 , CA 酸 -318 和 苏 氨 酸 - 319 的 重要 作用 。 这 两 种 氨基 酸 分 别 对 应 于 P450cam 的 天 冬 氨 酸 - 251 和 苏 氨 酸 - 232(Shimizu et al., ,1994) 。 还 发 现 这 些 氨基 酸 残 基 的 诱 变 , 除 了 改变 总 催化 活性 外 , 还 会 改变 底 物 代谢 作用 区 域 的 专 一 性 (Lewis,1996)。 也 有 报道 认为 ,在 CYP1A2 中 的 谷 氨 酸 - 318 和 苏 氨 酸 - 319 ,可 影响 加 氧 物 的 性 质 和 增强 易于 束缚 过 氧化 物 的 氧 - 氧 键 断裂 (Shimizu et al. ,1994) 。 参考 xX 献 Addison A W,Burman S. 1985. 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Commun. , 119: 365~371 第 三 章 细胞 色素 P450 的 分 离 纯 化 细胞 色素 P450 是 以 多 种 类 型 共存 在 同一 生物 体 中 ,P450 的 多 重 性 在 研究 微粒 体 的 代谢 活性 、 光 谱 特 征 诱导 与 抑制 中 得 到 证 明 。Lu 和 Coon(1968) 首 次 报道 了 可 以 从 免 肝 微粒 体 中 (经 葵 巴 比 妥 诱导 ) 部 分 纯化 P450 ,由 此 带 来 了 以 后 20 多 年 来 分 离 、 纯 化 工作 的 开展 。 现 在 已 从 各 种 生物 中 分 离 纯化 了 不 同型 的 P450。 纯 化 的 P450 可 用 于 制备 特定 P450 的 抗体 ,并 由 这 些 抗体 来 测定 某 一 P450 的 存在 及 其 数量 以 及 抑制 特定 的 酶 反应 ,对 P450 的 化 学 反应 机 制 可 以 作 更 深刻 的 了 解 。 由 P450 不 同 组 分 构成 的 重组 体系 可 以 用 于 分 析 P450 催化 反应 的 特异 性 ,剖析 不 同型 P450 的 功能 。 另 外 ,微生物 P450 纯化 结晶 , 使 我 们 对 P450 的 分 子 结构 有 较 清楚 的 了 解 ,为 分 析 P450 结构 功能 关系 以 及 P450 的 分 子 设 计 及 有 蛋白质 工程 方面 黄 定 了 基础 。 可 见 P450 的 分 离 纯化 在 整个 P450 的 研究 历史 中 具有 极其 重要 的 作用 。 以 下 就 真 核 生 物 P450 的 分 离 纯化 方法 及 其 发 展 作 一 介绍 。 3.1 哺乳 动物 细胞 色素 P450 的 分 离 纯 化 不 同型 P450 的 分 离 纯化 方法 决定 于 酶 的 来 源 , 细 菌 中 存在 的 可 溶性 P450 相对 易于 结晶 纯化 。 存 在 于 真 核 生物 体 中 的 能 入 内 质 网 膜 的 P450, 由 于 其 踊 水 性 趋向 聚合 而 不 易 - 形成 晶体 ,分 离 纯 化 则 较 困 难 。Sato 等 (1978) 在 论述 哺乳 动物 肝 微 粒 体 P450 的 纯化 问 题 指 出 ,细胞 色素 P450 纯化 时 的 最 大 困难 是 在 细胞 色素 P450 增 溶 时 的 不 稳定 和 与 微粒 体 膜 整合 蛋白 的 分 离 。 因 在 微粒 体 膜 上 有 磷脂 组 分 ,内 含有 未 饱和 的 脂肪 酸 ,空气 能 将 其 氧化 为 脂 过 氧化 物 ,在 此 过 氧化 物 作用 中 使 P450 分 解 , 另 外 在 增 溶 处 理 时 也 诱导 使 其 变 为 P420, 所 以 在 增 溶 处 理 的 早期 , 需 加 保护 剂 如 甘油 或 多 元 醇 使 P450 受到 保护 。 EDTA、 二 硫 苏 糖 醇 (DTT) 和 丁 代 羟基 甲 茶 等 也 是 P450 有 效 的 保护 剂 。 为 了 得 到 P450 的 绝对 光谱 而 制备 P450 微粒 , 必须 去 除 微粒 体 血 红 素 组 分 的 细胞 色 素 bs ,发 现 枯 草 菌 蛋白 酶 (nagarse) 是 最 有 效 的 去 细胞 色素 bs 的 蛋白 酶 又 可 最 少 使 P450 变 为 P420 ,甘油 是 抑制 P450 转变 为 P420 的 有 效 保护 剂 。 以 Pb 处 理 的 兔 肝 微粒 体 在 甘 油 存 在 情况 下 ,用 枯草 菌 蛋 白 酶 厌 氧 硝化 可 得 到 P450 微粒 , 约 含 5. 5 nmol/mg (Nishibayashi, 1968). 后 来 发 现 从 哺乳 动物 肝 微粒 体 的 P450 纯化 时 增 溶 作用 是 很 重要 的 。 那 么 何 种 增 溶 剂 较 好 , 哪 一 种 保护 剂 能 在 纯化 时 不 使 P450 变性 为 P420 是 开展 分 离 纯化 工作 之 前 要 考 虑 的 问题 。 长 期 的 分 离 纯化 实践 ,人 们 已 有 一 些 成 功 的 方法 ,根据 报道 的 情况 总 结 如 下 (#2 3:1). 肝 微 粒 体 P450 来 源 Pb 诱导 免 肝 诱导 大 鼠 肝 鼠 肝 Pb 诱导 免 肝 Pb 诱导 免 肝 © Pb 诱导 免 肝 Pb 诱导 免 肝 PB 诱导 大 鼠 3MC HSK Ph HF RAF PB 诱导 大 鼠 Pb HF EK FA if 增 溶剂 Lubrol-Wx Triton-N101 Emulgen-911 脱氧 胆 酸 盐 胆 酸 盐 胆 酸 盐 Emulgen-911 AB ARES AB RR EE Emulgen - 913 胆 酸 钠 Renex- 690 Lubrol-Px fi & 钠 Lubrol-Px 胆 酸 钠 第 三 章 AMAR P450 的 分 离 纯化 表 3.1 肝 微 粒 体 P450 的 纯化 方法 保护 剂 层 析 柱 甘油 DEAE-Sephadex DEAE-Cellulosealu- 甘油 mina 凝 胶 -Cr 甘油 ,DTT DEAE-Cellulose 甘油 ,DTT DEAE-Cellulose 甘油 ,DTT a 和 磷酸 钙 凝 甘油 .DTIT + aie All BE R45 BE DEAE-Cellulose- 甘油 ,DTT dT ran 甘油 ,DTT and 含 oo- 氨基- n- 辛 基 EDTA 的 Sephadex- 48 DEAE-Cellulose-Am ak aed 本 bedineXD - 2 磷酸 钙 凝 胶 甘油 ,DTT and ##BKA MC EDTA Sephadex-c - 50 & BERK ARRE 甘油 AH-Sepharose 甘油 AH-Sepharose 甘油 ,EDTA DEAE-Sephacel AO-Sepharose DEAE-Sephacel 磷酸 甘油 ,EDTA 钙 凝 胶 SAB AO-Sepharose P450 比 含量 /(nmol/mg) 0.2(& bs & P420) 5.0(4 NADH- 高 铁 氰 化 物 ) 1.0 含 大 量 P420 S20 = SEE P420) 2.4( 含 细胞 色 素 bs) 9- 11( 不 含 bs 磷脂 和 NADPH -P450 -还 原 酶 , 但 含 P420 9.0( 不 含 P420,bs and NADPH-P450 还 原 酶 ) 13.0( 4 bs, 但 有 NADPH- P450 BR BSE 在 ) 17.0 17.0( 不 含 P420、bs and NADPH-P450 - 还 原 酶 ) 8.56 12.7 17.0 14 S154 12.0 11.35 9~16 e 3. - 文献 Miyake et al. (1968) Fujita et al. (1973) Sato et al. (1973) Lu and Coon (1968) Lu and Levin (1974) Lu( and Levin 1972) Levin et al. (1974) Imai and Sato (1974a) Van der Hoeven and Coon (1974) Imai and Sato (1974b) Van der Hoeven and Coon (1974) Funae and I- maoka (1985) Funae and I- maoka(1985) BR, ERR (1987) Kastner and Neutbert (1992) 黄 俊 勇 , 冷 欣 夫 (1992) Isa et al. (1992) Kastner and Neutbert (1992) - 34° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 上 表 列 举 的 由 肝 微 粒 体 纯化 P450 方法 中 的 各 种 条 件 。 需 要 指出 的 是 @ow -氨基 - n- 辛 基 琼 脂 糖 (w-amino-n-octylspharose) 层 析 柱 分 离 P450 的 回收 率 可 高 达 90% ,回收 的 P450 总 量 的 30% 以 上 集中 在 峰 范 围 内 , 比 含量 约 为 10 nmol/mg 蛋白 ,而 且 得 到 的 P450 蛋白 很 稳定 。@ 胆 酸 盐 是 纯化 P450 蛋白 时 较 好 的 增 溶剂 。 但 其 使 用 浓度 和 对 和 蛋白质 的 比率 ,对 从 w -氨基 -n- 辛 基 琼 脂 糖 柱 分 离 得 到 高 回收 率 极为 重要 。 如 浓度 或 比率 太 低 , 定 量 的 P450 增 溶 不 完全 而 过 柱 时 被 吸附 。 磷 酸 盐 的 浓度 则 影响 增 溶 的 效果 。 胆 酸 盐 和 Emulgan 913 的 浓度 ,对 从 分 析 柱 上 分 离 P450 与 其 他 微粒 体 蛋 白 也 极为 重要 (Sato et al. ,1978). 随 着 实验 技术 的 发 展 , 由 哺乳 动物 组 织 纯化 P450 的 方法 也 不 断 改 进 , Imaoka 等 (1986) 用 阴离子 交换 (DEAE — SPW) 和 阳离子 交换 (SP- SPW) 的 HPLC 方法 纯化 PB 和 MC 诱导 的 大 鼠 肝 微粒 体 中 多 型 的 P450,Emulgen - 911 和 甘油 分 别 为 增 溶剂 和 保护 剂 。 Emulgen- 911 对 两 种 离子 交换 柱 的 适宜 浓度 为 0.4% 。 绥 冲 液 含 甘油 的 浓度 为 20% ,可 从 未 诱导 的 肝 微 粒 体 中 得 到 7 种 P450, 从 来 自 PB 和 MC 诱导 的 肝 微粒 体 中 得 到 5 种 。 P450 的 回收 率 和 层 析 柱 的 分 辩 情 况 都 较 满 意 。 哺乳 动物 细胞 色素 P450 层 析 纯化 所 遇 到 的 问题 :@ 在 内 质 网 的 P450 酶 的 多 重 性 和 结构 的 相似 性 ,在 肝 微粒 体 共 有 20 种 以 上 不 同 , 但 又 很 相似 的 P450 酶 。@ 在 这 些 大量 相 似 的 P450 BP ,每 个 酶 的 含量 很 低 , 这 对 纯化 也 带 来 一 定 的 困难 。 亲 水 - 脂 的 膜 结合 细胞 色素 P450 在 层 析 纯化 前 ,需要 用 表面 活性 剂 增 溶 。 但 表面 活性 剂 能 破坏 P450 AERIS 构 ,因此 需 加 保护 剂 不 使 其 变性 。@ 表 面 活性 剂 不 仅 干 扰 酶 纯化 分 析 时 蛋白 的 监测 ,而 且 它 与 层 析 柱 树脂 相 作 用 ,降低 层 析 的 分 辨 率 和 柱 的 结合 性 能 。 膜 增 溶 用 表面 活性 剂 是 P450 酶 分 离 纯 化 时 的 重要 步骤 ,因为 它 的 回收 率 高 ,一 般 常 用 的 是 胆 酸 钠 ,Emulgen 和 Lubrol 表面 活性 剂 。Lubrol-Px 是 P450 酶 层 析 中 较 适 宜 的 表 面 活性 剂 。 它 对 微粒 体 细 胞 色素 P450 的 增 溶 效能 约 为 96% , 它 与 胆 酸 钠 相 比 不 干扰 强 阴离子 交换 剂 。 在 鉴定 中 ,Lubrol 在 波长 为 280nm 时 无 吸收 ,此 波长 可 作为 层 析 过 程 中 的 蛋白 监测 。 两 性 离子 表面 活性 剂 , 如 CHAPS 在 效能 上 比 其 他 表面 活性 剂 低 一 些 , 但 它 有 高 富 集 性 ,适宜 作为 微粒 体 细 胞 色素 P450 纯化 时 的 增 溶 剂 。 表 面 活 性 剂 对 微粒 体 膜 增 溶 的 效能 见 下 表 。 表 3.2, 表面 活性 剂 对 微粒 体 腊 增 溶 的 效能 (Roos,1996) 产 率 /% 比率 KR 表面 活性 剂 全) ae as P450/ 看 白 (处 理 情况 ) 0.4 92 82 1 AE RADE 胆 3.0 95 92 1.03 未 处 理 酸 0.5 97 62 1.56 未 处 理 钠 0.3 71 72 0.99 未 处 理 0.1 35 51 0.69 未 处 理 Renex- 690 1.5 92 a 142 B- 蔡 黄酮 处 理 Emulgen- 911 0.2 98 82 1.20 未 处 理 0.2 85 51 1.67 未 处 理 Lubrol-PX 0.8 96 69 1.39 未 处 理 0.4 93 59 1.58 未 处 理 0.2 79 47 1.68 未 处 理 表面 活性 剂 (% ) CHAPS 0.5 0.3 0.1 第 三 章 ”细胞 色素 P450 的 分 离 纯化 Hg) 续 表 产 率 /% 比率 KR 蛋白 P450/ 蛋 白 (处 理 情 况 ) 43 1.93 未 处 理 20 3. 未 处 理 21 1.90 未 处 理 阳离子 型 表面 活性 剂 ,如 省 化 十 六 碳 烷 基 三 甲 铵 易 使 细胞 色素 P450 转化 为 P420 ,所 以 不 宜 用 作 P450 增 溶 。 同 样 的 理由 , 辛 基 葡 萄 糖苷 、\Tween - 20 和 十 二 烷 基 二 甲 基 两 烷 磺 酸 酯 等 都 不 宜 作 增 溶 剂 (Roos ,1996)。 下 表 内 列举 一 些 广 泛 应 用 的 表面 活性 剂 的 性 质 及 其 对 层 析 的 影响 。 表 3.3 了 P450 层 析 中 广泛 应 用 的 表面 活性 剂 的 性 质 (Roos, 1996) 性 质 对 强 阴 离子 交换 剂 的 干扰 在 波长 280nm 吸收 透析 对 P450 活性 强 抑制 效应 胆 酸 钠 Emulgen - 911 Lubrol-PX 是 & 否 否 是 -人 是 人 a 否 是 是 分 离 不 同 的 蛋白 要 考虑 蛋白 的 结构 特性 和 物理 化 学 性 质 , 如 分 子 的 大 小 表面 特 征 和 特定 结构 的 结合 区 域 等 。 由 于 各 P450 酶 的 分 子 质 量 相近 ,其 范围 在 (48 一 56) x 10°Da, 因此 大 小 排 阻 (size-exclusion) 层 析 不 宜 采 用 (Ryan and Levin,1990)。 分 离 纯化 P450 酶 有 许多 层 析 方 法 简 列 如 下 : 方法 低压 液 相 层 析 (LPLC) 快速 蛋白 液 相 层 析 法 (FPLC) 高 效 液 相 层 析 法 (HPLC) 离子 交换 层 析 法 (IEC) 磷酸 钙 凝 胶 层 析 法 固定 的 金属 亲 和 层 析 法 (IMAC) 琉 水 的 相互 作用 层 析 法 (HIC) 亲 和 层 析 法 : 配 体 亲 和 层 析 法 免疫 亲 和 层 析 法 蛋白 亲 和 层 析 法 层 析 聚焦 法 表 3.4 分 离 纯 化 P450 的 层 析 方 法 文献 Ryan and Levin,1990 Kastner and Neutbert,1992 Isa et al. ,1992 Ryan and Levin, 1990 Ryan and Levin, 1990 Roos , 1993 Imai and Sato, 1974 Sundin et al. , 1987 Wrighton et al. , 1986 Miyatake et al. , 1994 Blaicher and Kastner, 1993 “36 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 P450 酶 的 选择 诱导 可 得 到 更 高 P450 产量 。 依 据 P450 在 大 鼠 肝 内 的 表达 ,P450 酶 可 区 分 为 三 类 :中 不 诱导 或 轻微 诱导 的 组 成 型 表达 酶 (如 P450 2C7、2C11、2C12、2C13、 2D1,2D2) ;@ 外 源 化 合 物 诱 导 显 著 增 加 构成 表达 酶 (如 P450 1A2、2A1、2B2、2C6、2E1、 3A2、4A1) ;@ 不 能 组 成 型 表达 ,但 可 被 外 源 化 合 物 诱 导 的 酶 (如 P4501A1、 2B1、 3A1)。 对 上 列 第 一 类 酶 进行 纯化 ,只 能 用 未 诱导 的 动物 的 微粒 体 。 而 经 诱导 剂 预 处 理 动 物 诱导 的 微粒 体 的 P450 含量 高 ,适宜 于 进行 分 离 纯化 ,例如 用 葵 巴 比 妥 处 理 大 鼠 , 则 CYP2B1 和 CYP3A 同 工 酶 的 含量 显著 增加 。 然 而 ,没有 同 工 酶 的 专 性 诱导 剂 ,诱导 剂 可 能 在 诱导 几 种 P450 酶 的 同时 ,抑制 其 他 的 P450 ,如 地 塞 米松 (dexamethasone) 是 一 种 有 效 的 CYP3A 诱导 剂 ,同时 它 对 CYP2C11 有 抑制 作用 。 下 表 列 举 了 一 些 主要 的 P450 酶 的 组 成 型 表达 水 平和 几 种 外 源 化 合 物 对 其 的 诱导 效应 。 表 3.5 外 源 物 对 鼠 肝 微粒 体 每 毫克 蛋白 中 P450 HSH (pmol mg) 的 影响 (Roos,1996) 未 处 理 | OBB DEX PCN TAO 3MC INH CLO KEP ee 合计 900 820 1300 1900 1390 4390 2080 1000 1000 1935 1Al 26 22 1427 1A2 43 44 439 2A1 52 131 256 2B1/2 <10 <10 750 380 2C6 196 499 131 350 207 93 130 83 50 110 48 38 31 270 2011 28 n.d. 190 100 130 212 <10 350 <10 2C13 86 <1 13 100 110 26 46 34 66 2D1 110 110 2E1 66 37 47 42 26 310 50 3A 110 7 315 1250 3430 19 4Al 15 10 15 注 :PB( 葵 巴 比 妥 ),DEX( 地 塞 米 松 ) ,PCN( 孕 烯 酮 - 16a -H ) , TAO( = Z BET BLE RK ) , 3MC(3 - 7 SERB) , INH (5: 48) ,CLO(clofibrate) ,KEP (Kepone)。 Ryan 和 Levin(1990) 总 结 了 有 关 分 离 P450 酶 的 情况 ( 表 3.6) ,认为 不 同 P450 BENT 用 的 连续 层 析 步骤 有 以 下 几 种 : 即 离子 交换 层 析 ,磷酸 钙 吸 收 和 免疫 亲 和 层 析 等 。 许 多 已 发 表 的 纯化 P450 酶 的 方案 也 基于 这 些 方法 ,只 不 过 在 应 用 次 序 上 改变 而 已 ,但 其 结果 却 对 P450 酶 的 分 辨 率 有 重要 影响 。 此 外 ,在 分 离 个 别 P450 酶 时 ,如 有 其 他 细胞 色素 P450 酶 存在 , 就 会 影响 层 析 柱 的 效能 (Kastner and Neubert, 1992; Blaicher and Kastner, 1993 ) 。 第 三 章 ”细胞 色素 P450 的 分 离 纯 化 . 37° 表 3.6 细胞 色素 P450 分 离 的 连续 层 析 步骤 (Ryan and Levin, 1990) CYP 2Al 2Bl 1Al 1A2 2B2 了 2C6 处 理 aroclor aroclor aroclor 异 黄 樟脑 aroclor 三 = eR PB 性 别 ”雄性 人 ”雄性 人 ”雄性 人 雄性 人 雄性 人 雄性 4 从 性 雄性 人 ate + 雄性 公 雄性 人 预 分 离 PEG PEG PEG AS PEG = OA-Seph _ OA-Seph Ca-PO, 4 DEAE 1 DE52 + 十 + + 十 + + 一 + DE53 十 十 十 十 十 DEAE + 十 HA + + 十 十 十 十 但 年 52 i" OMSeph + 十 + =f ar phosphocell + + immuno + ar + + Ca-PO, a + + + + + + + + 注 : 鼠 肝 微粒 体 样品 用 胆 酸 钠 增 溶 。PB( 葵 巴 比 妥 ) ,PEG( RAB), ASCRIBE) ,OA- 琼 脂 糖 (8 - 辛 基 氮 基 琼 脂 糖 ) ,HA( 磷 酸 钙 凝 胶 ),DE51,52,53(DEAE-Cellulose DE51, DE52, DES3),CM-Seph (CM-Sepharose) , immuno (免疫 亲 合 性 ) phosphocell (磷酸 纤维 素 ) 。 有 些 P450 家 族 和 亚 家 族 成 员 的 分 离 纯化 方法 未 能 全 部 列 出 ,这 里 只 举 出 一 些 部 分 事例 ( 表 3.7) 和 一 些 不 常用 的 分 离 方 法 ,如 从 鼠 鼻 黏膜 分 离 CYP2G 应 用 层 析 聚焦 方法 (Ding and Coon,1988)。 这 些 方法 也 用 于 分 离 人 肝 活 组 织 为 材料 的 P450(Isa et al., 1992) 。 其 中 也 包括 非常 普通 的 层 析 方 法 ,如 金属 五 合 亲 和 层 析 、 和 蛋白 亲 和 层 析 和 玻 水 相 互 作用 层 析 法 等 。 表 3.7 细胞 色素 亚 家 族 成 员 的 层 析 纯化 方法 P450 Be 层 析 顺 序 文献 2D( 鼠 肝 ) N-lauryl-aminohexyl-sepharose, CM-Sepharose, DEAE-Cellulose Gonzalez et al. , 1987 2G( RAR) PEG, Polybuffer exchanger, CM-Sepharose, S-Sepharose, HA Ding and Coon, 1988 2H( 鸡 肝 ) Octyl-Sepharose, TSK-DEAE-Cellulose, HA. Sinclair et al. , 1990 4A( BUFF) AO-Sepharose, HA, DEAE-Sephacel, CM-Sepharose. Gibson et al., 1982; Tamburini et al. , 1984 4B( BUFF) OA-Sepharose, DEAE-59W, HA. Imaoka and Funae, 1990 TE: AO-Sepharose (8 -氨基 辛 基 - 琼 脂 糖 ) 。 OA-Sepharose (n - 辛 基 氨 基 - 琼 脂 糖 ) ;HA( 磷 酸 钙 凝 胶 )。 Pidgeon 等 (1991) 首 次 报道 了 用 固 相 人 工 膜 (imnmobilized artificial membrane, [AM) HPLC 系统 来 纯化 功能 膜 蛋 白 P450 和 P450 还 原 酶 。 此 人 工 膜 表 面 是 共 价 结合 形 成 的 脂 膜 ,其 膜 表 面 上 的 脂 分 子 含有 极 性 头 和 两 个 非 极 性 烷 基 链 。 脂 的 固定 需要 具有 o - 羧 酸 功 能 基 合 成 的 脂 ,羧基 使 脂 分 子 与 硅 微粒 体 表面 共 价 结 合 。 经 用 这 种 固 相 人 工 膜 已 从 大 鼠 的 肝 、 旨 和 肾上腺 微粒 体 纯化 了 P450 酶 系 组 分 。 而 纯化 的 P450 和 P450 还 原 酶 的 功能 已 由 差 光 谱 、CO 结合 和 体外 重组 酶 活性 等 鉴定 得 到 证 明 。 此 法 还 用 于 纯化 其 他 膜 蛋 白 , 包括 大 鼠 肝 血浆 膜 NADH 氧化 酶 和 高 铁 握 化物 氧 化 还 原 酶 等 。 ~ 33° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 3.2 昆虫 细胞 色素 POND BAL Ray(1967) 首 次 报道 在 丽 蝇 和 家 蝇 体 内 存在 P450。 此 后 ,从 昆虫 中 提取 微粒 体 蛋 白 多 是 根据 哺乳 动物 组 织 的 提取 方法 。 昆 虫 P450 纯化 研究 大 多 数 是 以 家 蝇 (Schonbrod and Terriere, 1975; Capdevila and Agosin, 1977; Capdevila et al., 1975) 和 果 蝇 (Drosophila melanogaster )(Naquira et al. ,1980) FRM. HP—t+ ESA EES RAT, P450 迅速 变性 为 P420。P450 的 变性 可 以 用 甘油 和 其 他 多 元 醇 保 护 (Ichikawa and Ya- mano,1967)。Capdevila et al. (1975) EA Hith.EDTA 和 DDT 存在 的 情况 下 用 Triton X -100 从 Fe 家 蝇 品 系 的 微粒 体 溶 解 了 加 单 氧 酶 组 分 。P450 再 经 交 联 葡 聚 糖 G- 200 和 DEAE- 交 联 葡 聚 糖 柱 层 析 分 离 ,由 此 得 到 两 个 性 质 不 同 的 P450 ,但 其 比 含量 较 低 (P450 0. 8nmol/mg, P4501 0. 12nmol/mg 和 蛋白)。 Schonbrod 和 Terriere(1975) 从 几 个 不 同 品 系 家 蝇 的 微粒 体 中 ,在 有 DTT 和 甘油 存 在 的 情况 下 ,用 胆 酸 钠 增 溶 ,用 DEAE-cellulose 柱 层 析 分 级 ,发 现 了 微粒 体 中 存在 2 个 不 同 的 P450 型 。 更 详细 的 工作 是 Capdevila 和 Agosin (1977) 对 NAIDM 家 蝇 P450 的 鉴 定 , 他 们 采用 的 方法 是 用 胆 酸 钠 增 溶 ,然后 用 w -氨基 - n - 辛 基 琼 脂 糖 - 4B EO BAR 基础 灰 石 、 交 联 葡 聚 糖 G - 50.DEAE - 交 联 葡 聚 糖 A-30 和 CM - 交 联 葡 聚 糖 柱 层 析 , 由 此 得 到 3 个 分 子 量 和 光谱 性 质 不 同 的 P450。 Naquira 等 (1980) 从 果 蝇 微粒 体 中 分 离 出 三 种 光谱 特征 以 及 重组 体系 催化 活性 不 同 的 P450, 它 们 的 分 子 质量 分 别 为 S1.750,50. 800,54. 800 kDa, 比 含量 分 别 为 3. 38, 4.83, 6.85 nmol/mg. 另外 ,Ronis (1988) FA 5 种 柱 层 析 部 分 纯化 了 家 蝇 细 胞 色素 P450 各 组 分 ,Sundseth 等 (1989) 用 3 种 柱 层 析 部 分 纯化 了 果 蝇 P450, Feyereisen 等 (1989) 用 两 种 柱 层 析 纯 化 了 家 蝇 P450。 HPLC 方 法 因 其 高 分 辩 率 高 回收 率 \ 高速 以 及 上 样 量 少 的 优点 ,已 于 20 世纪 80 年 代 未 被 用 于 昆虫 P450 的 分 离 纯化 , Wheelock 等 (1989) ,Scott 和 Lee (1993) 采用 HPLC 方法 ,同时 纯化 了 家 蝇 微 粒 体 P450、 细 胞 色素 bs 和 细胞 色素 P450 还 原 酶 。 此 方法 是 先 用 聚 乙 二 醇 分 级 分 离 和 用 葵 基 - SPW 柱 朴 水 互 作 层 析 (HIC) 从 大 部 分 其 他 蛋白 分 离 出 P450; 再 用 DEAE - 5SW 柱 进行 阴离子 交换 ,可 分 出 P450、 细 胞 色素 bs 和 细胞 色素 P450 还 原 酶 ,此 法 得 到 的 P450CYP6D1 的 比 含量 为 14. 4nmol/mg 蛋白 ,SDS- PAGE 鉴定 其 分 子 质量 为 S4.3kDa。 离 子 交 换 的 细胞 色素 bs 部 分 用 Cs 反 向 HPLC 进一步 纯化 ,bs 部 分 的 比 含量 51. 8nmol/mg 蛋白 ,SDS - PAGE 鉴定 分 子 质 量 19. 7kDa。 而 含 细胞 色素 P450 还 原 酶 活性 的 部 分 ,再 用 NADP -琼脂 糖 亲 和 层 析 进一步 纯化 ,可 得 细胞 色素 P450 还 原 酶 ,分 子 质量 为 72kDa。 最 近 Scharf 等 (1998 ) 用 固 相 人 工 膜 HPLC 方法 (IAM - HPLC) 44 1b #% el) (Blattella germanic L. ) 微 粒 体 P4530。 以 胆 酸 钠 Lubrol-WX 作 增 溶剂 ,甘油 和 EDTA 为 保护 剂 层 析 得 到 的 P450 样品 进一步 纯化 后 ,用 银 染 鉴定 SDS- PAGE BER At FR 量 为 49kDa(Scharf et al. ,1998) 。 第 三 章 ”细胞 色素 P450 的 分 离 纯化 - 2 3.3 植物 细胞 色素 P450 的 分 离 纯 化 动物 P450 的 纯化 较 早 就 已 经 获得 成 功 ,但 植物 P450 纯化 却 是 20 世纪 90 年 代 的 事 (Bolwell et al. ,1994)。 植 物 P450 纯化 的 步骤 基本 是 先 差 速 离心 制备 微粒 体 膜 ,然后 用 非 离子 型 去 污 剂 增 溶 ,Triton X- 114 和 胆 酸 钠 均 有 较 好 的 效果 。 经 饱和 硫酸 铵 沉淀 后 选 择 弱 阴阳 离子 交换 材料 和 凝 胶 材 料 进一步 纯化 ,氨基 辛 基 琼 脂 糖 凝 胶 和 MonoQ 较 好 。 而 DEAE 似乎 对 酶 有 损害 。 染 料 亲 和 柱 及 配 体 亲 和 柱 也 较 常 用 ( 赵 剑 er al. ,1999)。 在 纯化 过 程 中 遇 到 的 困难 是 P450 的 鉴定 ,由 于 微粒 体制 备 液 中 叶绿素 及 其 他 血红 素 蛋 白 如 过 氧化 物 酶 和 过 加 氧 酶 等 的 干扰 ,用 光谱 方法 (利用 在 X450nm 处 ,P450 有 吸收 峰 这 一 性 质 ) 测 定 的 结果 不 可 靠 。 用 高 盐 溶液 洗 掉 过 氧化 物 酶 ,是 光谱 方法 的 一 个 改进 。 植物 P450 分 离 纯 化 的 主要 困难 在 于 它 的 低 含 量 以 及 在 植物 提取 中 不 稳定 ,因为 P450 定位 于 微粒 体 膜 的 胞 质 (cytoplasmic) 表 面 , 且 植物 中 蛋白 酶 的 含量 高 。 但 出 于 对 P450 催化 反应 重要 性 的 认识 ,有 以 下 几 个 P450 已 被 纯化 到 同 质 。 表 3.8 从 植物 中 纯化 的 细胞 色素 P450 P450 来 源 文献 ge ia 36 *F ( Helianthus tubersosus ) MRE Gabriac et al. ,1991 CAH AER 4 724058) £5 (Phaseolus vulgaris ) 的 培养 细胞 Rodgers et al. ,1993 3,9 -— #8 KR (dihydrox- KA( Glycine zaz) 培 养 细 胞 Kochs and Grisebach, 1989; ypterocarpan ) 6a —#24b Kochs et al. ,1992 oo. FENG ze pee yy (Digitalis janaia) 培 养 细胞 Petersen and Seitz, 1988 香 叶 醇 /等 花 醇 环 氧化 酶 #594 ( Persea americana ) 的 中 果皮 O'Keefe and Leto, 1989 P450ryr 3k (Sorghum bicolor ) SNH Sibbesen et al. ,1994 INET 2 Bt /\\ 8 ( Berberis stolonifera ) 培 养 细胞 Stadler and Zenk, 1993 EO HE 10 1 K#4E ( Catharathus roseus ) 培 养 细胞 Meijer et al. ,1993 7- 乙 氧 香 豆 素 O- 脱 乙 基 酶 35 +f ( Helianthus tubersosus RE Batard et al. ,1995 AOS( Ai = 169) 4 BF) WK ( Linum usilatissimum ) ; Song and Brash, 1991 Aka & ( Tulipa gesmeriana ) = ; Lau et al. ,1993; Higashi et al. ,1985; 玉米 (Zea may) . O'Keefe and Leto, 1989 橡胶 颗粒 蛋白 RPP $3348 (Parthenium argentatum) Backhaus et al., 1991; Pan et al. ,1995。 这 些 蛋 白 的 分 子 质量 在 47~57kDa 之 间 。 大 多 数 成 功 纯化 的 P450 都 是 植物 组 织 或 培养 细胞 中 含量 最 丰富 的 ,可 见 蛋 白 的 丰富 度 是 分 离 纯化 工作 成 功 与 否 的 主要 因素 。 AOS 是 许多 单子 叶 植物 如 玉米 小 麦 和 郁金香 微粒 体 中 主要 的 P450 ,与 其 他 典型 的 P450 加 单 氧 酶 相 比 ,其 催化 反应 的 转换 率 高 (Lau et al. ,1993)。 真 核 生物 细胞 色素 P450 纯化 存在 许多 的 困难 ,但 是 , 近 些 年 来 随 着 对 P450 的 性 质 有 了 更 多 的 了 解 ,提纯 方法 也 有 了 许多 的 改进 ,如 用 药物 诱导 可 使 P450 的 量 增多 ,用 甘 油 等 多 元 醇 防 止血 红 素 辅 基 的 下 水 性 环境 受到 破坏 ,用 氮气 防止 P450 的 血红 素 被 脂 腊 的 不 饱和 脂肪 酸 的 过 氧化 作用 所 改变 等 。 利 用 上 述 这 些 改进 的 方法 ,已 成 功 地 纯化 了 微 - 40 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 粒 体 和 线粒体 的 P450 ,并 重组 了 P450 酶 系 活 性 ,使 人 们 对 P450 的 结构 和 功能 有 了 较 深 入 的 了 解 ,也 为 P450 基因 的 克隆 提供 了 关键 的 结构 信息 。 参考 xX 献 葛 兵 , 汪 静 英 .1987. 细 胞 色素 PASO 的 提纯 与 重组 .生物 化 学 和 生物 物理 学 报 ,19:454 一 461 赵 剑 , 杨 文 杰 , 朱 蔚 华 .1999. 细胞 色素 P450 与 植物 的 次 生 代谢 .生命 科学 ,11(3):127 一 131 RRA , 冷 欣 夫 .1992. 微 粒 体 细胞 色素 P450`NADPH 细胞 色素 P450 还 原 酶 的 纯化 与 重组 活性 .生物 化 学 杂志 ,8(5): 518~523 Backhaus R A, Cornish, K, Chen S-F, et al. 1991. 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Isolation of the heme-thiolate enzyme cytochrome P4507yr, which catalyzes the committed step in the biosynthesis of the cyanogenic glucoside dhurrin in Sorghum bicolor (L.) Moench. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9740~9744 Sinclair J F, Wood S, Lambrecht L et al. 1990. Isolation of four forms of acetone-induced cytochrome P450 in chicken liver by HPLC and their enzymic characterization. Biochem J. ,269(1):85~91 Song W-C, Brash A R. 1991. Purification of allene oxide synthase and identification of the enzyme as a cytochrome P450. Science, 253:781~784 Stadler R, Zenk M H. 1993. The purification and characterization of a unique cytochrome P450 enzyme from Berberis stolonifera plant cell culture. J. Biol. Chem. , 268: 823~831 Sundin M, Warner M, Haaparanta T, et al. 1987. Isolation and catalytic activity of cytochrome P450 from ventral prostate of control rats. J. Biol. Chem. , 262: 12293~12297 Sundseth S S, Kennell S L, Waters L C. 1989. Monoclonal antibodies to resistance-related forms of cytochrome P450 in Drosophila melanogaster. Pesti, Biochem. Physical, 33: 176~188 Tamburini P P, Masson H A, Bains S K et al. 1984. Multiple forms of hepatic cytochrome P450: onstugiadl characteri- zation and comparison of a novel clofibrate-induced isozyme with other major forms of cytochrome P450. Eur. J. Biochem. , 139: 235~246 Van der Hoeven T A, Coon MJ. 1974. Cytochrome P450 purified to apparent homogeneity from plenobarbital-induced rab- bit liver microsomes: catalytic activity and other properties. Biochem. , Biophys. Res. Commun. , 60: 569~572 Wheelock G D, Scott J D. 1989. Simultaneous purification of a cytochrome P450 and cytochrome b5 from the house fly Musca domestic L. Insect Biochem, 1965: 481~488 Wrighton S A, Thomas P E, Molowa D T et al. 1986. Characterization of ethanol-inducible liver N-nitrosodimethylamine demethylase. Biochem. , 25: 6731~6735 第 四 章 细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 4.1 细胞 色素 P450 种 类 的 多 样 性 由 于 分 子 生 物 学 方法 的 进展 ,人 们 发 现 的 P450 基因 数量 增多 。 现 在 已 进入 基因 组 学 时 期 ,许多 新 的 P450 基因 被 报道 ,至 今 已 知 序 列 的 已 超过 1000 个 (Nelson,1999a) (图 4.1,#4.1). 表 4.1 不 同 生 物 Paso 的 多 样 性 生物 已 知 序列 来 源 a ~) : Sens aie ae Oe sd 人 (动物 ) 人 99 站 zm Nel = ao 拟 南 芥 Arabidopsis (42D) 186 19995 400 Caenorhabditis elegans (2% 3 ) 65 oe 1967 1987 1989 1990 1996 1999( 守 结核 分 枝 杆 菌 Mycobacterium 20 pace, tuberculosis (44 fA ) siiiba SELB ( EB Hh ) 60 oa 图 4.1 GF P450 的 数量 1999 所 有 细胞 色素 P450 具有 一 非 共 价 结合 的 血红 素 和 环绕 高 度 保 守 的 半 胱 氨 酸 的 一 段 26 个 氨基 残 基 的 保守 序列 ,这 一 半 胱 氢 酸 提供 血红 素 铁 的 第 5 个 配 体 。 当 血红 素 铁 接受 电子 被 还 原 后 再 与 CO 结合 ,将 产生 所 有 P450 的 特征 光谱 一 一 在 450nm 附近 有 一 吸收 峰 。 具 有 以 上 特征 的 蛋白 质 称 为 细胞 色素 P450( Gonzalez, 1993). 细胞 色素 P450 的 命名 以 英文 缩写 CYP 代表 细胞 色素 P450,CYP 后 顺序 跟 有 数字 、 字母 ,数字 分 别 代表 家 族 、 亚 家 族 和 同 工 酶 (Nebert et al. ,1991)。 用 斜体 表示 P450 的 基 因 或 cDNA, 正体 代表 基因 的 产物 mRNA 或 蛋白 质 。 等 位 基因 则 在 名 称 最 后 冠 于 V1,V2 等 表示 , 假 基因 用 字母 P 表 示 。 根 据 推导 的 P450 的 氨基 酸 序列 的 相似 性 将 P450 归于 不 同 的 家 庭 或 亚 家 族 , 通 常 遵循 人 为 的 标准 , 即 同 一 基因 家 族 成 员 的 蛋白 序列 有 大 于 40% 相同 的 氨基 酸 残 基 , 把 相同 氨基 酸 残 基数 大 于 55% 的 细胞 色素 P450 归 为 同一 亚 家 族 (Nelson et al. ,1993)。P450 命名 法 的 设计 是 要 反映 P450 序列 间 的 进化 关系 ,序列 的 命 名 依据 P450 基因 推定 的 氨基 酸 残 基 的 相似 程度 。 由 于 鉴定 P450 的 序列 不 断 增 加 ,用 家 族 及 家 族 以 下 的 分 类 单元 构建 的 P450 种 系 发 生 树 经 常 因 新 序列 的 加 入 发 生 较 大 的 变 化 , 且 有 些 序列 不 能 与 其 他 序列 聚 类 在 一 起 , P450 PHAR RAE SKA RAH. Wit Nelson 又 提出 了 家 族 以 上 更 高 一 级 的 聚 类 单元 , 称 为 集团 (clan) , 它 的 意思 是 来 源 于 某 一 些 共同 祖先 的 不 同 家 族 P450 的 集合 ( 表 4.2)。 ”不 同 家 族 的 P450 在 不 同 生 物 中 的 分 布 可 见 下 表 。 在 37 个 动物 P450 家 族 中 ,有 16 个 家 族 仅 在 哺乳 动物 中 发 现 ,其 他 21 个 家 族 分 布 于 昆虫 (6 个 )、 软 体 动物 (2 个 ) 以 及 线虫 4 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 C. elegans (13 个 家 族 )。 在 哺乳 动物 中 发 现 的 16 个 家 族 中 不 仅 限 于 分 布 在 哺乳 动物 中 , 其 中 许多 家 族 在 鸟 \ 鱼 和 其 他 并 椎 动物 中 存在 ,如 家 族 1,2,3,4,11,17,19 和 26 包含 在 硬 骨 鱼 类 中 ,其 中 有 一 些 在 鸟 类 两栖 类 或 朴 行 类 中 也 发 现 了 它们 的 成 员 。 表 4.2 动物 CYP 家 族 的 分 布 (Nelson,1998) CYP 家 族 类 群 亚 家 族 1 哺乳 纲 A,B hi A A aw A 鸟 纲 A 2 哺乳 纲 A,B,C,D,E,F,G,J i K,M,N,P ee; H 甲壳 纲 两 栖 纲 Q 3 哺乳 纲 A 硬 骨 鱼 纲 A 4 哺乳 纲 A,B,F 昆虫 纲 C,D,EG,H,J,K,L,M,N,P,Q,R,S 千足 虫 C 硬 骨 鱼 纲 下 5 哺乳 纲 A 6 昆虫 纲 Ai ECDIE RE 7 哺乳 纲 A,B 8 哺乳 纲 A,B 9 昆虫 纲 A,B,C 10 软体 动物 门 A 11 哺乳 纲 A,B KAA A he A Fie B 12 昆虫 纲 A,B 13 线虫 纲 A,B 14 线虫 纲 A 15 昆虫 纲 A 17 哺乳 纲 A 硬 骨 纲 A aw A Hy A 18 昆虫 纲 A 19 哺乳 纲 A 硬 骨 纲 A 鸟 纲 A eA A 21 哺乳 纲 A 22 线虫 纲 A 23 线虫 纲 A 24 哺乳 纲 A 25 线虫 纲 A 第 四 章 ”细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 “45 , 续 表 CYP 家 族 类 和 群 亚 家 族 26 哺乳 纲 A 硬 骨 纲 A 27 哺乳 纲 A 28 昆虫 纲 A 29 昆虫 纲 A 30 软体 动物 门 A 31 线虫 纲 A 32 线虫 纲 A 33 线虫 纲 A,B,C,D,E 34 线虫 纲 A 35 线虫 纲 A,B,C,D 36 线虫 纲 A 37 线虫 纲 A,B 40 哺乳 纲 A 51 酵母 A 线虫 A 细菌 A 有 花 植 物 (angiorpermophta) A 没有 两 个 种 具有 完全 相同 的 细胞 色素 P450 ,比较 表 4.3 PAL AR) RY P450 分 布 可 见 这 种 差异 ,甚至 黑猩猩 与 人 类 的 P450 的 种 类 也 不 可 能 一 致 ,即使 他 们 的 P450 的 数量 一 致 , 但 它们 的 序列 经 500 万 年 的 歧 异 ,导致 它们 的 底 物 特异 性 可 能 发 生 改 变 。 表 4.3 Av) RAMA AREER P450 1A1,1A2,1B1,2A6,2A7,2B6,2B79,2C8,2C9, 2C18, 2D6, 2E1,2F1,2G1,2J2,2R1,2S1,3A4,3A5,3A592, 人 3A7,4A11,4B1,4F2,4F3,4F8,4F11,4F12,4X1,4Z1,5A1,7A1,7B1,8A1,11A1,11B1,11B2,17,19,21,24, 26,27A1,27B1,39A1,46,51 lal ,1a2,1b1,2a4,2a5,2a12,2b9,2b10,2b13,2b19, 2b20 , 2c29 , 2c37 , 2c38 , 2c39 , 2040, 2044, 2d9, 2d10, 2d11, 小 鼠 ” 2dl12 ,2d13 ,2d22,2d26, el, 2f2,2g1 ,2j5,2j6, 2j7,2j8,2j9,2r, 2sl ,3al3,3al6, 4a10,4a12, 4a14,4b1, 4f13,4f14, 4f15 ,4f16,4f17,4f18,4x,4z,5al,7al,7b1,8al,8b1,11al,11b1,11b2,17,19,21,24,26,27al,27b1,39,46,51 1A1,1A2,1B1,2A2,2A3,2B1, 2B2,2B3, 2C6, 2C7, 2C11, 2C12, 2C13, 2C22, 2C23, 2D2, 2D3, 2D4, 2D18, KE 2D5 ,2E1,2F4,2G1, 2J3, 2R1, 2S1, 3A1, 3A2, 3A23, 3A9, 3A18, 4A1, 4A2, 4A3, 4A8, 4B1, 4F1, 4F4, 4F5, 4F6 ,4F19,4X1,4Z1,5A1,7A1,7B1,8A1,8B1,11A1, 11B1, 11B2,11B3,17,19,21,24,26,27A1, 27B1, 39, 46,51 同 是 人 类 ,不 同 的 个 体 间 存在 P450 差异 ,这 种 差异 表现 为 P450 的 多 态 性 ,预计 人 类 50 个 P450 中 有 30 个 P450 存在 多 态 位 点 ,影响 P450 蛋白 序列 。 这 种 差异 有 时 是 重要 的 ,因为 现在 已 经 知道 ,只 要 1 个 氮 基 酸 被 取代 ,就 可 以 改变 P450 的 底 物 特异 性 , 如 S474V 突变 则 CYP2C2 接受 孕 酮 为 底 物 ,而 正常 底 物 为 月 桂 酸 (Nelson,1999b)。 4.2 细胞 色素 P4550 的 种 系 发 生 达尔 文 指出 ,只 有 一 棵 真正 的 生命 树 , 即 所 有 生物 都 有 共同 的 祖先 。 众 多 的 P450 也 “" 46, 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 图 4.2 植物 P450 的 种 系 发 生 都 来 源 于 一 个 共同 的 祖先 。 植物 P450 可 以 分 为 4 个 集团 (图 4.2) ,最 大 的 一 个 被 称 为 "A 组 (Group A)” 植物 P450 集团 , 亦 称 为 71 集团 。 CAIN) 47 个 植物 P450 家 族 中 有 25 个 归于 这 一 集团 。 另 外 三 个 集团 分 别 为 72 集团 含 CYP72 ,709,714,715 家 族 ; 85 4 CYP85, 87, 88,90, 702, 707, 708 ,716, 718; 86 AI CYP86, 94,96 和 704。 而 植物 体 的 CYP5S1,74,97,710 和 711 家 族 归 在 这 些 集团 外 。 另 外 , CYP74 家 族 的 P450 异常 ,其 螺旋 工 的 序列 不 保守 ,在 图 4.2 中 未 包括 。 4.2.2 Ba 真菌 P450 可 归 为 4 个 集团 ,还 有 几 个 未 被 归 和 人 集团 的 序列 (图 4.3)。52 集团 有 3 个 家 族 (CYP52, 63, 505), 53 集团 有 7 个 家 族 (CYP53,57,507,65,60,62,58) ,54 集团 有 5 个 家 族 (CYP54, 506,68, 69,503) ,64 集团 有 5 个 家 族 (CYP64 ,66,502,501,504) ,另外 一 些 家 族 不 能 归 在 以 上 任 何 集团 , 即 CYP51,56,59,61 和 67。 真 菌 P450 已 知 序 列 有 限 , 对 其 功能 的 了 解 也 不 充 分 ,如 参与 麦角 省 醇 (ergosterol) 生 物 合成 (CYP51 和 CYP61), 解毒 植物 毒素 吏 豆 素 (CYPS7) ,或 参与 脂 类 碳 代 谢 (CYP52 ) ,产生 毒 枝 菌 素 (mycotoxin) (CYP58, 59, 60, 62, 64,65)。 真 菌 P450 功能 的 更 详细 的 阐述 见 本 书 第 九 章 。 4.2.3 动物 43 个 动物 P450 家 族 可 以 较 好 地 聚集 成 集团 (clan)( 图 4.4)。 线 虫 (C. elegans) #A 成 员 较 纯 , 仅 包含 来 自 C. elegans 的 序列 , 它 可 能 与 2 集团 有 共同 祖先 。 这 两 集团 可 能 看 作 超 集团 (superclan)。3 集团 包括 哺乳 动物 的 CYP3 和 CYP5, 昆 虫 的 CYP6, CYP9, CYP28, C. elegans HJ CYP13 和 CYP25, 蛤 (clam) 的 CYP30, 龙 虾 (lobster) 的 CYP45。 第 四 章 “细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 :和 52A1 45 52 CLAN 63 a 505 Ag ; i 64 3 CLAN 13Al 25Al a a 42 501 4CLAN 31A2 504 29A1 67 a 53Al 下 7 57Al 10 线粒体 11Al 507 CLAN 27 24 65 44 oo ne 53 CLAN 62 1Al 2 CLAN 18 58 7 1 56 22Al 61 34A2 35Al C. elegans|c 14A1 33C1 506 19 7 CLAN 8Al 54 CLAN 68A1 7Al 69A1 39 43 503 38 4.3 真菌 P450 的 种 系 发 生 图 4.4 动物 P450 的 种 系 发 生 4.2.4 细菌 细菌 是 P450 起 源 的 领地 ,P450 进化 的 确切 时 间 和 进化 途径 现在 还 不 清楚 ,但 它 肯 定 出 现 于 大 气 氧 分 子 存在 以 前 ,图 4.5 是 77 个 P450 的 种 系 发 生 树 ,其 中 包括 来 自 结核 分 支 杆菌 中 的 15 个 ,另外 $ 个 类 似 真 核 生 物 P450 ,在 此 树 未 包括 。 4.3 细胞 色素 P450 的 进化 起 源 与 数量 壮大 从 不 同 生物 类 群 的 P450 分 析 发 现 ,哺乳 动物 植物、 真菌 中 都 存在 CYPS7 基因 , 它 们 的 功能 是 从 动物 羊毛 脂 醇 (lanosterol)、 植 物 的 钝 叶 鼠 曲 草 醇 (obtusifoliol) 脱 去 140 甲 基 ,而 被 认为 是 真 核 P450 进化 的 祖先 ,这 一 结论 可 从 以 下 几 个 方面 得 到 佐证 。 4.3.1 蛋白 结构 分 析 Yoshida 等 (1997) 将 真 核 CYPS1 的 蛋白 结构 以 及 M. tuberculosis 中 的 类 似 CYPS1 48 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 Wie ee ee ee ee 图 4.5 细菌 P450 的 种 系 发 生 105A1 Str griseolus 105A3 sad Sten caop 105D1 P4s0soy Str Str. — AFO711 an 105C Str AF040570 A. medsextanel gene 2 AF040570 A. mediterranei gene | 107G1 Str. hygro. 107B1 A ME eprae 107H Bacillus subtilis 109A 1 Bacillus subtilis 123 Myc. tuberculosis Rv0766c 130 Myc. tuberculosis Rv1256c 114 Bradyrhizobium jap. hive, tuberculosis Rv1880c Myc, tuberculosis Rv3121 c. tuberculosis Rv3518¢ 121 Myc tuberculosis Sepa 53 53008 A. eee pene? ee er ce ome oar S| 101 as M Rv1785c 135 Myce. tuberculosis atic 136 Myc. tuberculosis FAK a tuberculosis Rvs685c dnrQ Streptomyces 117 Bradyrhizobium jap. 的 蛋白 做 比较 得 到 的 种 系 发 生 关系 可 见 图 4.6。 分 支 拓扑 学 图 式 为 (细菌 (植物 (真菌 , 哺 乳 动物 )))。 这 与 大 多 数 生物 界 的 最 可 能 的 系统 发 育 相 一 致 ,表明 CYP51 与 生物 系统 是 平行 进化 的 。 从 原核 生物 纪 (era) 至 今 的 整个 系统 发 育 历程 中 ,都 有 一 保守 的 P450, 证 明 了 P450 的 原核 起 源 。 4.3.2 功能 分 析 真 核 生物 CYP51 的 代谢 作用 , 即 和 省 醇 前 体 的 14a- 脱 甲 基 作 用 是 保守 的 ,氨基 酸 序列 相同 性 很 高 ,上 且 在 所 有 真 核 生 物 CYP51 中 都 找到 了 特征 保守 域 (覆盖 推 定 的 底 物 识别 位 点 ,SRS) ,这 种 高 度 保守 性 是 由 于 对 大 多 数 真 核 生 物 来 说 ,需要 14 - 脱 甲 基 作 用 以 产生 功 能 性 省 醇 。 但 在 省 醇 生 物 合成 途径 中 哺乳 动物 、 植 物 、 真 菌 等 进行 14 - 脱 甲 基 作用 的 底 物 第 四 章 ”细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 - 49 - human 人 Rat 大 鼠 100 C. albicans C.' tropicalis S.' cerevisiae a. CYP5] P. italicum S.' pombe U. maydis 100 Z sorghum 高 梁 wheat 小 麦 M. tuberculosis CYP7A CYP7b1 CYP8A CYP8B1 图 4.6 不 同类 型 生物 P450 CYPS1 的 种 系 发 生 注 :C. albicans—A REE EE ; C. trozpicals 一 热带 假 丝 酵母 S. cerevisiae—"# 35 PRE ; S. pompe 一 栗 酒 裂 殖 糖 酵母 U. maydis— EK RA ; M. tuberculosis SIT BAT A 不 同 , 这 种 差异 是 因为 CYP51 BAR WIRE Tl (A 4.7)。 这 些 底 物 在 结构 上 差异 很 小 且 是 局 部 的 ,CYP51 底 物 特异 性 的 差别 可 能 是 因为 在 底 物 识别 位 点 发 生 了 氨基 酸 蔡 代 , 这 在 哺乳 动物 和 真菌 中 都 有 发 现 。 哺 乳 动物 CYP 的 底 物 是 最 原始 的 省 醇 ,来 源 于 溜 < Casa 中 ht a 24 个 申 基 一 氧 羊毛 脂 了 本 rootorpoio CYP51- sips ape agian 14- 脱 甲 基 作 用 HO a 胆固醇 麦角 省 醇 植物 省 本 动物 真菌 植物 图 4.7 动物 真菌 和 植物 CYP5S1 的 催化 反应 - - 50° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 烯 (squalene) 的 氧化 环 化 作用 (oxidative cyclization) , 而 真菌 的 CYPS1 的 底 物 是 24 -= 亚 甲 基 - 24,25 -二 氧 羊毛 脂 醇 ,是 羊毛 脂 醇 的 代谢 物 。 这 一 功能 的 进化 与 一 般 趋势 (真菌 蛋白 比 动 物 和 植物 同 源 蛋白 进化 更 快 ) 相 一 致 ,因此 哺乳 动物 CYP51 可 能 保留 真菌 更 多 的 CYP51 蛋白 的 原始 结构 。 估 计 现 存 的 真菌 CYP51( 以 羊毛 脂 醇 为 天 然 底 物 ) 是 由 原始 的 CYPS1 经 修饰 形成 ,CYP51 的 修饰 改变 了 它 的 代谢 途径 。 种 系 发 生 树 中 ,CYP51 最 近 的 邻居 是 CYP7/8 ,包括 省 醇 7x- 和 120 - 羟 化 酶 (CYP7A1 和 CYP8B1)。 这 些 反 应 中 被 氧 原 子 进攻 的 碳 靠 近 140 — FA Seti (C32) ,这 可 能 表示 省 醇 代 谢 的 发 展 是 由 P450 加 单 氧 酶 的 进化 引起 。 4.3.3 ABTA 大 鼠 CYPS7 基因 与 人 CYPI7 基因 都 有 9 个 内 含 子 , 且 内 含 子 插 和 人 部 位 相同 。 但 从 酵母 基因 组 DNA 文库 克隆 的 包含 啤酒 糖 酵母 ( Saccharomyces Cerevisiae) CYP5/ 基因 的 整个 编码 区 的 DNA 片段 却 没 发 现 内 含 子 ,而 意大利 青 霉 (P. italicum) CYPS7T 有 3 个 短 内 含 子 (60 一 72bp)。 氮 基 酸 序列 对 比分 析 显 示 , P. italicum CYPS7 基因 的 第 1 个 内 含 子 对 应 于 大 鼠 和 人 基因 的 第 二 个 内 含 子 ,但 其 他 内 含 子 插 人 部 位 与 哺乳 动物 基因 不 同 , 这 些 事实 表明 ,在 哺乳 动物 和 真菌 歧 异 后 ,它们 的 CYP 双 7 基因 的 内 含 子 插 人 或 删除 大 多 数 情况 下 是 独立 而 随机 的 。 4.3.4 5 - 侧 豆 区 的 结构 哺乳 动物 CYPS7 ft TATA &2> GC 元 件 丰富 的 基因 ,但 S. cerevisiae K)CYPI7 基 因 有 一 个 TATA 盒 存在 于 它 的 转录 启动 子 区 , 且 酵 母 与 大 鼠 CYPS7 的 $ -侧翼 区 相同 性 少 。 酵 母 CYPS7 基因 的 表达 可 因 生 长 环境 中 的 氧 浓度 而 改变 ,预示 存在 氧 依赖 的 调 控 部 位 。 这 些 事实 表明 $ - 侧 辟 区 的 结构 和 基因 表达 的 调控 机 制 在 哺乳 动物 与 真菌 CYPS/ 基因 十 分 不 同 , 但 它们 的 编码 区 保留 着 它们 的 共同 祖先 基因 的 核心 结构 。 S. cerevisiae(3 个 P4$0) 和 裂 殖 酵母 ( Schizusaccharomyces pombe )(2 个 P450) 是 子 圳 菌 (ascoxycete ) , 它 的 共同 的 祖先 至 少 有 2 个 P450 Bl CYPS1 和 CYP61, 可 能 不 多 于 2 个 ,否则 这 两 个 谱系 不 得 不 失去 其 他 P450 基因 上。 与 S. cerevisiae 更 近 缘 的 假 丝 酵母 (Candida ) 有 CYP52 家 族 的 P450 用 作 链 烷 羟 化 酶 ,而 其 他 真菌 没有 ,这 可 能 是 因为 假 丝 醇 母 中 P450 发 展 的 结果 ,而 非 因 为 其 他 种 类 的 P450 的 集成 或 丢失 。 类 似 的 P450 发 展 Be TE Hh A ( Aspergillus) ,至 少 4 个 CYP 家 族 (CYP59 ,60,62,64 被 用 于 黄 曲 霉 素 生 物 合 成 )。 假设 子囊 菌 的 祖先 具有 CYPS1 (7636 SE 140 - 脱 甲 基 酶 ) 和 CYP61(22 -省 醇 去 饱和 Ae) ,而 无 其 他 P450 ,那么 ,CYP61 是 从 CYPS1 进化 而 来 ,因为 CYP61 在 麦角 省 醇 生 物 合 成 途径 的 较 后 步骤 起 作用 。 要 了 解 CYP61 什么 时 候 产 生 ,就 先 要 了 解 真 核 生 物 中 麦角 省 醇 生 物 合成 在 什么 时 候 出 现 。 麦 角 人 省 醇 广 泛 分 布 于 真菌 ,但 在 植物 或 动物 中 未 发 现 它 的 同类 物 。 与 CYP61 最 相似 的 P450 是 植物 CYP710 家 族 , 但 相似 性 也 只 有 30% ,由 此 推 测 CYP61 仅 从 产生 真菌 的 (真菌 与 动物 歧 异 以 后 ) 谱 系 中 进化 而 来 ,这 意味 着 动物 和 真菌 人 人 人 Teng ee 第 四 章 ”细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 - Si: 的 共同 祖先 只 有 1 个 即 CYPS1. 以 上 论点 的 核心 是 所 有 真 核 生 物 P450 来 源 于 CYP51 ,植物 动物 和 真菌 各 自 CYP51 进化 出 一 套 独立 的 P450。 除 CYP51 以 外 ,真菌 中 没有 与 植物 或 动物 P450 家 族 十 分 相似 的 P450。 同 样 除 CYP51 以 外 ,植物 P450 也 不 同 于 动物 P450。 假设 植物 动物 和 真菌 起 源 于 共同 的 P450 祖先 (12 一 14 亿 年 以 前 ) ,为 什么 真菌 仅 有 2 个 P450 基因 ,动物 却 有 SO~80 个 ,而 植物 有 350 个 呢 ? 随 着 物种 向 复杂 化 的 进化 , 特 化 的 蛋白 得 到 助长 。 对 于 以 前 不 存在 的 新 功能 的 需要 ,蛋白 可 能 被 复制 并 发 展 以 满足 这 些 需 要 。 在 动物 和 植物 中 ,多 细胞 性 (multicellularity) 是 P450 重复 的 驱动 力 。Arapbidoz- 5is(350 个 P450) 与 C. elegans 或 哺乳 动物 的 差异 反映 了 一 个 事实 , 即 植物 在 生物 化 学 方 面 比 动物 更 复杂 ,因为 植物 原 地 不 动 ,但 要 保护 其 组 织 免 遭 动物 病原 真 菌 病毒 和 细菌 的 危害 ,它们 必须 通过 物理 和 化 学 的 手段 来 实现 。 植 物 抗 毒素 (phytoalexins) 和 有 毒 生 物 碱 是 植物 的 生物 化 学 的 亦 甲 和 矛 , 花 的 色素 是 种 的 标识 (identifier) ,因此 ,必须 多 样 化 ,而 这 两 类 物质 都 由 P450 参与 催化 合成 。 动 物 的 主要 投入 在 于 感觉 和 运动 ,而 植物 主要 在 化 学 ,这 可 以 解释 为 什么 植物 比 动 物 具 有 更 多 P450 的 原因 。 至 今 在 海绵 动物 中 仅 发 现 1 种 P450(CYP38) ,还 可 能 也 存在 CYP51 , 除 此 之 外 ,这 一 简单 的 生物 的 其 他 的 P450 很 少 。600 万 年 以 前 , 原 口 动物 (protostomes) 和 后 口 动 物 (deuterostomes) 的 共同 祖先 存在 CYP51 以 及 2,3,4 集团 的 P450 前 体 , 至 少 包含 5 个 ” P450( 图 4.4)。 再 往 回 推 , 从 两 侧 动物 -辐射 动物 ,其 中 P450 的 数字 还 要 减少 。 随 着 动 物 进化 得 越 加 复杂 ,需要 增加 它们 的 信号 传导 能 力 ,P450 可 能 被 自然 选择 用 于 形成 和 降 解 信号 分 子 如 视 黄 酸 、 凝 血 吐 烷 A. AS AE Be 动物 中 ,获得 一 个 P450 ,该 P450 可 能 成 为 其 进化 辐射 的 遗传 前 体 。 在 昆虫 中 ,4 集 团 得 到 了 大 大 的 发 展 , 它 包含 247 WRK. SHROWRETST 2 集团 ,而 C. elegans Wit 择 了 3 集团 。 昆 虫 除 选择 4 集团 外 ,还 在 集团 3 中 得 到 较 低 程度 的 发 展 。 对 于 复杂 动物 需要 30 一 80 P450s, 这 从 线虫 及 果 蝇 基因 组 P450 序列 数据 得 到 支持 。 Arabidopsis 中 已 知 的 P450 最 丰富 ,已 命名 的 序列 达 186 个 ,预计 P450 序列 可 达 350 个 。 已 知 Arabidopsis 41 个 家 族 , 占 植物 P450 家 族 数 的 87% ,上 且 植 物 P450 的 97% , 随 Arabidopsis 基因 组 计划 的 完成 ,可 以 在 Arabidopsis 中 发 现 ,这 说 明 Arabidopsis 代表 了 植物 的 P450 ,预计 植物 中 不 会 再 有 太 多 新 的 P450 家 族 存 在 。 结核 分 枝 杆 菌 ( Mycobacterium tuberculosis ) 具有 20 个 P450 ,是 细菌 基因 组 中 P450 数量 最 多 的 种 类 ,其 P450 种 类 如 此 丰富 与 细菌 P450 种 类 的 平均 数 有 较 大 的 偏差 。 在 细 菌 M. tuberculosis 中 发 现 一 CYP51 同 源 物 (homolog ) , 它 与 人 CYPS1 只 有 33% 序 列 相 同 ,其 功能 尚 不 清楚 。 最 近 发 现 M. smegmatis 具有 从 甲 瓦 龙 酸 (mevalonic) 合 成 胆固醇 的 能 力 ,这 一 转化 需要 CYPS1 活性 (14a - 脱 甲 基 酶 ) ,推测 是 M. tuberculosis 基因 的 同 源 物 。 由 于 结核 细菌 是 病原 菌 ,CYP51 基因 也 有 可 能 是 来 自 寄 主 , 或 来 自 细菌 的 形成 第 一 个 真 核 P450 的 P450 前 体 ,但 由 于 其 序列 不 同 于 哺乳 动物 的 P450 ,因此 不 能 由 “从 寄主 中 获得 "得 到 解释 。 多 种 P450 的 存在 赋予 M. tuberculosis 具有 诸如 药物 氧化 功能 的 潜力 , 要 弄 清 该 菌 P450 的 进化 方式 ,还 需要 更 多 的 序列 数据 。 以 前 认为 ,线粒体 P450 起 源 于 内 共生 体 ,这 一 假说 是 基于 线粒体 P450 是 以 皮质 铁 氧 还 蛋白 作为 电子 供 体 这 一 事实 。 如 果 线 粒 体 P450 随 内 共生 体 而 来 , 则 在 线虫 和 低 等 - 52° 细胞 色素 P450 BAA 功能 与 应 用 前 景 真 核 生 物 中 应 该 有 线粒体 P450 存在 ,在 酵母 基因 组 中 仅 有 3 个 P450 ,但 无 一 是 线粒体 的 ,在 C. elegans 中 也 未 发 现任 何 线粒体 P450 ,这 说 明 线粒体 P450 可 能 从 外 界 获得 ,很 可 能 是 由 于 微粒 体 P450 的 误 定 位 。 这 一 看 法 与 先前 的 假设 完全 不 同 。 皮 质 铁 氧 还 蛋白 系统 可 能 起 源 于 内 共生 体 , 误 定位 (mistarget) 于 线粒体 中 的 胞 质 P450 可 以 劫持 该 电子 传 递 系 统 (皮质 铁 氧 还 蛋白 ) 为 已 用 。 这 暗示 线粒体 P450 和 微粒 体 P450 的 电子 传递 系统 的 界面 是 保守 的 ,使 得 这 种 转 位 得 以 发 生 (Nelson,1998 ) 。 4.4 细胞 色素 P450 的 进化 4.4.1 P450 的 进化 对 不 同 P450 分 子 间 相互 关系 的 早期 研究 是 根据 酶 的 催化 活性 诱导 性 、 免 疫 交 叉 反 应 、 亚 细胞 定位 以 及 所 涉及 的 电子 供 体 等 ,虽然 这 为 前 明 不 同 P450 间 的 关系 提供 了 重要 的 信息 ,但 在 定量 研究 中 ,DNA 或 蛋白 质 的 一 级 结构 包含 的 信息 量 无 疑 更 加 丰富 (Gotoh, 1993) ,因此 对 P450 进化 的 了 解 大 多 是 根据 已 知 P450 的 蛋白 序列 或 由 DNA 推导 的 和 蛋白 序列 的 对 比分 析 而 来 。 通过 对 已 知 P450 的 结构 相关 性 的 对 比 及 P450 功能 的 分 析 , 有 以 下 几 点 认识 : 1) 细 胞 色素 P450 基因 是 一 个 古老 的 基因 超 家 族 , 它 们 起 源 于 一 个 共同 祖先 ,存在 于 35 亿 年 以 前 ,时 间 上 早 于 药物 \ 动 植物 相互 作用 ,有机物 燃烧 的 出 现 (Nelson et al. ,1993). 2) 古 老 的 P450 在 有 氧 呼吸 系统 占 优势 前 ,与 生物 在 无 氧 条 件 下 获得 能 量 有 关 ; 或 最 早 的 P450 以 过 氧化 酶 的 功能 方式 来 保护 细胞 免 遭 活性 氧 的 作用 (Gotoh,1993 ) 。 3)P450 的 一 个 很 早 的 功能 是 对 环境 中 化 合 物 的 同化 ,在 樟脑 和 烷烃 可 诱导 的 某 些 细菌 和 真菌 中 的 P450 还 遗传 着 这 一 早期 功能 。 在 更 高 等 生物 中 , 这 种 同化 功能 失去 作用 , P450 与 环境 物质 的 相互 作用 主要 发 生 在 生物 的 保护 系统 以 抵御 外 来 有 毒物 质 (Gotoh, 1993). 4)P450 作为 省 醇 代谢 酶 的 功能 起 源 很 早 , 在 许多 歧 异 较 大 的 P450 家 族 中 都 包含 有 一 些 代谢 省 醇 衍生 物 的 成 员 (Gotoh,1993 ) 。 5) 对 外 来 物质 代谢 的 P450 也 可 能 先进 化 成 执行 对 内 源 物 质 代 谢 的 功能 ,然后 起 对 外 来 物质 代谢 的 作用 (Gonzalez,1993) ,由 此 可 以 解释 CYP1A(CYP3A 也 有 可 能 )P450 可 被 内 源 性 省 醇 诱导 的 现象 (Gonzalez,1993 ) 。 6)P450 可 以 划分 为 代谢 内 源 物 质 和 代谢 外 来 物 两 大 功能 类 型 ,两 类 功能 的 分 化 可 能 出 现 在 某 类 P450 进化 的 初始 阶段 ;由 于 在 一 些 P450 类 群 中 存在 有 两 种 功能 的 P450, 因而 认为 两 类 不 同 功能 的 P450 基因 的 进化 可 能 相互 联系 着 ,有 时 部 分 交换 它们 的 功能 (Gotoh, 1993). P450 功能 进化 的 过 程 可 以 归纳 为 :进化 的 初期 ,一 些 原核 生物 和 简单 的 真菌 用 P450 来 保护 膜 的 完整 性 以 及 断裂 食物 以 获得 能 量 ; 随 着 动 植物 的 歧 异 ,动物 开始 取 食 植物 , 植 物 越 来 越 多 地 产生 植物 抗 毒素 及 其 他 多 环 含 氧 的 代谢 中 间 物 来 抵御 动物 ; 数 百 万 年 后 , 含 碳化 合 物 开 始 燃烧 ,动物 除 要 对 天 然 植物 代谢 物 外 , 还 需 对 燃烧 产物 进行 解毒 (Nebert and Gonzalez,1987) ,导致 外 源 物 质 代 谢 P450 的 不 断 分 化 。 第 四 章 “细胞 色素 P450 的 种 类 多 样 性 及 其 进化 人。 昆虫 P450 也 存在 两 类 功能 的 分 化 ,CYP6 家 族 成 员 与 外 来 物质 的 代谢 有 关 , 其 进化 关系 与 哺乳 动物 CYP1 及 CYP3 家 族 较 近 。CYP4 家 族 产 生 于 10 亿 年 前 ,其 中 CYP4D 亚 家 族 歧 异 较 早 (Dunkov et al. ,1996) ,在 果 蝇 、 家 蝇 、 按 蚊 中 都 有 该 亚 家 族 的 代表 ,而 有 些 P450 CYP4 亚 家 族 仅 发 现 于 果 蝇 (CYP4E) ,或 按 蚊 (CYP4H) 中 (Dunkov et al. ,1996 ) 。 从 哺乳 动物 纯化 的 CYP4 蛋白 的 重组 活性 通常 是 脂肪 酸 或 花生 四 烯 酸 。- 凑 基 化 活性 , 表 明 它 们 起 内 源 物 质 代谢 而 非 代谢 解毒 作用 , 旨 螃 CYP4C1 有 相同 的 作用 方式 。 但 昆虫 的 CYP4 家 族 有 比 哺乳 动物 更 多 的 成 员 , 且 杀 虫 剂 抗 性 的 Raleigh-DDT 品系 果 蝇 其 P450 基 因 CYPY E2 表现 出 超 量 表达 ,这 似乎 更 有 可 能 :在 双 翅 目 昆 虫 中 ,CYP4 家 族 有 与 哺乳 动物 CYP2 家 族 相 同 的 特征 , 即 大 多 数 成 员 起 解毒 作用 , 且 进 化 较 快 (Dunkov et al., 1996). 4.4.2 关于 细胞 色素 P450 进化 的 机 制 变异 体 在 种 群 中 扩散 一 般 通 过 三 个 基本 过 程 : 遗 传 漂 变 (genetic drift)、 自 然 选择 和 分 子 驱 动 (molecular drive)( 艺 星 辉 和 冷 欣 夫 ,1998)。 遗 传 漂 变 和 自然 选择 以 种 群 的 外 部 动 态 为 基础 ,导致 少量 新 的 P450 基因 的 出 现 (Gonzalez and Nebert,1990) 。 而 分 子 驱动 是 不 正常 的 DNA 行为 引起 的 基因 内 在 动态 的 结果 ,是 大 多 数 新 P450 基因 来 源 和 传播 的 原因 (Gonzalez and Nebert, 1990). 4.4.2.1 分 子 驱动 假说 分 子 驱 动 是 指 通过 随机 的 或 定向 的 DNA 的 转换 (turnover) 机 制 使 变异 体 在 一 个 种 群 中 固定 下 来 的 过 程 。DNA 转换 包括 基因 重复 、 基 因 转 变 等 分 子 活 动 (Gonzalez and Nebert,1990)。 变 异体 的 产生 可 以 通过 DNA 的 转换 机 制 (Gonzalez,1993) 。 P450 基因 遗传 多 样 化 的 主要 原因 之 一 是 基因 重复 ,这 一 过 程 可 能 存在 于 5$x104 一 5$ X10’ 年 前 。 重 复 的 基因 通过 自然 选择 而 被 固定 下 来 (Gonzalez, 1989 ) ,形成 具有 多 基因 的 基因 家 族 (Nebert and Gonzalez,1987)。P450 基因 秘 的 存在 可 能 是 基因 重复 的 遗迹 。 基因 转变 (gene conversion) 作 为 分 子 驱 动 的 一 个 因素 ,被 认为 是 P450 进化 的 一 个 主 要 决定 因子 。 在 一 些 紧 密 相 连 的 P450 基因 间 存 在 基因 转变 机 制 (Gotoh,1993)。 基 因 转 变 人 允许 基因 从 关系 较 远 甚至 无 功能 的 假 基 因 中 得 到 部 分 DNA 片段 ,以 产生 具有 新 功能 的 P450 基因 同 工 酶 (Atchison and Adesnik, 1986)。 基 因 转 变 也 可 能 是 近 缘 关系 远 的 P450 底 物 专 一 性 重 秋 及 关系 近 的 同 家 族 P450 催化 性 质 差 异 较 大 的 原因 。P450 基因 的 多 样 化 可 以 由 联合 基因 转换 (combinatory gene conversion events) 促 进 ,但 尚 没有 明确 的 证 据 支持 这 一 说 法 (Gotoh,1993)。Matsunaga 等 (1990) 发 现 一 些 独 立 的 基因 转变 具有 与 上 述 相反 的 效应 ,他 们 测定 了 大 鼠 紧 密 联 结 的 4 个 CYP2D 基因 核 苷 酸 全 序列 ,发 现在 4 个 基因 的 内 含 子 ` 外 显 子 及 侧翼 区 存在 数 个 相似 性 高 的 核 苷 酸 序列 ,证 明 是 基因 转变 的 结 果 ; 而 相似 性 极 高 的 序列 出 现在 P450 的 一 个 关键 区 段 , 即 酶 活性 部 位 的 血红 素 结合 区 , 基因 转变 使 编码 血红 素 结合 位 点 周围 的 核 苷 酸 序列 同 质 化 。 这 似乎 表明 ,基因 转变 的 作 用 在 自然 界 是 保守 的 ,可 能 是 为 防止 偶然 的 基因 破坏 的 一 种 修复 机 制 (Gonzalez and Nebert,1990)。 虽 然 基 因 转 变现 象 十 分 常见 ,但 它们 在 P450 基因 的 进化 中 是 否 起 中 心 作 - 54+ 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 用 还 不 能 肯定 (Gotoh,1993 ) 。 4.4.2.2 关于 自然 选择 作用 面 对 不 断 变 化 的 环境 条 件 ,种 群 中 的 遗传 变异 体 或 新 的 P450 基因 可 能 使 生物 处 于 选择 有 利 的 地 位 。 反 过 来 ,一 个 具有 新 活性 的 细胞 色素 P450 允许 动物 利用 新 的 植物 源 而 有 利于 动物 的 生存 (Gonzalez,1993) ,P450 的 进化 不 能 排除 自然 选择 的 作用 。 (1)P450 基因 的 适应 进化 P450 基因 的 适应 进化 已 从 分 子 和 酶 学 方面 得 到 证 实 。 在 不 同 的 细胞 色素 P450 存在 一 些 保 守 区 段 ,它们 可 能 对 所 有 P450 发 挥 共同 的 重要 的 功能 作用 ; 另 一 方面 ,不 同 P450 催化 特异 性 的 极 大 多 样 性 可 能 是 由 于 可 变 区 。 可 变 区 改变 的 两 个 主要 来 源 是 中 性 随机 漂 变 (neutral random drift) 和 达尔 文正 选择 (positive Darwinian selection), 而 对 保守 区 ,净化 (purifying) 选 择 可 能 占 优势 。 底 物 识别 位 点 (可 变 区 ) 往 往 存在 过 多 的 非 同 义 (nonsynony- mous) 核 苷 酸 替 代 , 这 一 现象 支持 了 正 选 择 促 进 P450 多 样 性 的 假说 (Gotoh,1993)。P450 的 适应 进化 也 体现 在 食性 与 P450 解毒 活性 的 相关 性 中 一 一 不 同 鳞 翅 目 昆 虫 幼 虫 中 肠 的 艾 氏 剂 环 氧化 活性 在 多 食性 种 类 要 比赛 食性 种 类 高 ,而 寡 食 性 种 类 又 比 单 食性 种 类 要 高 (Krieger et al. ,1972 ) 。 (2) 动 植物 交战"(animal-plant warfare) Rit CYP2 家 族 P450 成 员 数 量 在 过 去 的 400 一 800 百 万 年 前 明显 壮大 ,这 一 发 现 产 生 了 动 植物 “交战 "假说 (Gonzalez,1993)。 该 假说 的 主要 内 容 是 ,动物 取 食 植物 ,作为 防御 手 段 ,植物 通过 产生 植物 抗 毒素 (phytoalexins) 以 使 植物 适口 性 下 降 或 不 利于 被 消化 来 抗拒 动物 ,动物 为 利用 食物 而 合成 P450 酶 类 来 降解 这 些 有 毒物 质 ,植物 再 以 新 的 化 合 物 来 反 抗 。 由 此 不 断交 战 , 而 造成 P450 的 多 样 化 及 动 植物 的 协同 进化 。 这 种 类 型 的 交战 在 植 物 与 真菌 中 非常 典型 , 当 吏 豆 ( Pisum sativum ) 被 真菌 (Nectria haematococca ) 侵 染 时 , 诱 Bi DF (pisatin) Wr" ,这 种 植物 抗 毒素 对 真菌 有 毒 ,出 于 抵抗 ,真菌 诱导 P450 iS 素 脱 甲 基 酶 的 表达 来 解除 毒素 的 毒性 以 使 真菌 侵 染 继续 进行 。 缺 乏 这 种 功能 的 P450 的 真菌 变异 体 很 快 被 更 豆 杀 死 。 由 此 可 见 , 这 种 真菌 通过 产生 细胞 色素 P450 以 分 解 植物 抗 毒素 很 好 地 适应 了 更 豆 植 物 (Van Etten et al. ,1989). 细胞 色素 P450 构成 一 个 古老 的 基因 超 家 族 ,它们 起 源 于 一 共同 祖先 ,存在 于 35 亿 年 前 (Nelson et al. ,1993)。 通 过 长 期 的 进化 产生 了 对 内 源 性 物质 和 外 来 物质 代谢 的 两 大 功能 分 化 ,基因 重复 (duplication) 和 适应 多 样 化 是 P450 基因 进化 最 强 的 驱动 力 (Gotoh, 1993 ) 。 参考 文 献 Hp BE , 冷 欣 夫 .1998. 昆 虫 细 胞 色素 P450 的 研究 :P450 基因 的 进化 .昆虫 知识 ,35(6) :369 一 372 Atchison M, Adesnik M. 1986. 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Biochem, 122: 1122~1128 第 五 章 ”哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 哺乳 动物 细胞 色素 P450 酶 系 的 生物 功能 广泛 , 它 可 以 对 大 量 的 内 源 化 合 物 如 和 省 类 化 合 物 、 胆 酸 、 脂 肪 酸 ` 前 列 腺 素 ` 白 细胞 三 烯 (leukotrienes) 以 及 生物 胺 等 进行 氧化 `. 过 氧 化 以 及 还 原 代 谢 作 用 。 此 酶 系 还 能 代谢 范围 很 广 的 外 源 化 合 物 ,包括 药物 、 环 境 污染 物 和 醇 类 。 外 源 化 合 物 的 代谢 可 能 产生 有 毒 的 代谢 产物 ,有 些 代 谢 产物 可 能 诱发 肿瘤 的 产生 与 发 展 , 下 表 中 列举 了 部 分 P450 及 其 催化 的 反应 。 表 5.1 部 分 P450 基因 型 和 催化 反应 (Strobel et al. ,1997) P450 催化 反应 1A1 7-LAxAw R- O- 脱 乙 基 作 用 ;7 - 乙 氧 基 香 豆 素 - O- 脱 乙 基 作用 ; =F A 68 -羟基 化 作用 1A2 178- 肉 二 醇 2 -羟基 化 作用 ;苯胺 对 - 产 基 化 作用 ; 甲 基 葵 异 两 基 葵 胺 N - 脱 甲 基 作 用 2A1( 肉 性 表达 较 高 ) «= SILL A 7a- 羟 基 化 作用 ; 孕 稍 酮 7a -羟基 化 作用 2A2( 雄 性 特异 的 ) 军 丸 省 酮 13c- 和 78 -羟基 化 作用 ; 甲 基 葵 异 丙 基 苯胺 N - 脱 甲 基 作 用 ; FEE N- 脱 甲 基 作 用 2B1 At N- 脱 甲 基 作 用 ; 甲 基 葵 异 两 基 苯胺 N - 脱 甲 基 作 用 ; 环 已 烯 巴 比 妥 3 -羟基 化 作用 2B2 甲 基 苯 异 两 基 苯胺 N- 脱 甲 基 作 用 2C6 杀 鼠 灵 7 -羟基 化 作用 2C7( 肉 性 表达 较 高 ) 7- 乙 氧 基 试 卤 灵 - O - 脱 乙 基 作用 ;7 “KAR R- O - 脱 乙 基 作用 2C11( 雄 性 特异 的 ) ”睾丸 省 酮 2x -和 160 -羟基 化 作用 ; 葵 巴 比 妥 氧化 作用 ; 乙 基 吗啡 羟基 化 作用 ;7- 乙 氧 基 试 讽 灵 - O- 脱 乙 基 作用 ;7 - 乙 氧 基 香 豆 素 - O- 脱 乙 基 作用 ; EE N- 脱 甲 基 作 用 2C12( 肉 性 特异 的 ) ”硫酸 类 固 醇 15B -羟基 化 作用 ;7 - 乙 氧 基 试 卤 灵 - O- 脱 乙 基 作用 ;( 较 2C11 更 有 效 )。 2C13( 雄 性 特异 的 ) “7- 乙 氧 基 香 豆 素 - O- 脱 乙 基 作用 ; 甲 基 葵 异 丙 基 苯胺 N - 脱 甲 基 作用 2D1 debrisoguine 4 -羟基 化 作用 ;bufuralol 1 #34676 FH ; DK 2 -羟基 化 作用 2E1( 肉 性 表达 较 高 ) ”乙醇 氧化 作用 ;苯胺 EE 3Al 符 丸 省 酮 28 -和 15B- 羟 基 化 作用 3A2( 雄 性 特异 的 ) 68- 雄 性 激素 氧化 作用 3A4 SALSA ` 孕 省 酮 和 雄 烯 二 酮 的 68- 羟 基 化 作用 4A 脂肪 酸 和 前 列 腺 素 的 w- 产 基 化 作用 19( 芳 化 酶 ) 学 丸 省 酮 和 雄 烯 二 酮 的 芳 构 化 作用 17Al 17a -羟基 化 作用 21A1 7h 5 Wel Al 17 — FEZ AS BY 21 FEE 第 五 章 , 哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 7 由 上 表 可 以 看 出 ,多 型 的 细胞 色素 P450 能 有 效 地 交替 催化 代谢 。 少 数 底 物 对 某 异 构 型 是 特异 性 的 。 有 些 P450 基因 型 对 性 别 是 特异 的 , 即 其 仅 对 一 种 性 别 表 达 或 对 某 一 种 性 别 的 表达 程度 较 高 。 例 如 ,2C11、.2C13、 2A2 和 3A2 是 雄性 特异 型 ,而 2C12 为 雌性 特 异型 。 5.1 哺乳 动物 细胞 色素 P450 酶 系 对 体内 化 合 物 的 合成 与 代谢 P450 酶 系 在 代谢 哺乳 动物 内 源 性 物质 中 ,最 重要 的 功能 是 :四 对 类 固 醇 类 激素 的 生 De mh, OFFER (A.D 及 其 代谢 产物 ) 的 羟基 化 ,@ 脂 肪 酸 的 产 基 化 。 此 外 ,对 内 源 性 生 物 碱 如 可 待 因 (codeine) 和 吗啡 (morphine) 在 脑 内 的 合成 以 及 可 待 因 转化 为 吗啡 等 都 需要 P450 酶 系 的 催化 。 另 外 一 种 重要 生理 活性 物质 如 二 十 ( 烷 ) 酸 (20c-eicosanoid) 也 是 由 花 A= DO és BR (arachidonic acid) 经 P450 酶 系 催化 合成 的 。 这 类 化 合 物 还 包括 重要 的 信息 分 子 , 如 前 列 腺 素 类 ( prostaglandins ), ¥€ ti WE GE E ( thromboxanes ) 和 白细胞 三 烯 类 (leukotrienes) 。 5.1.1 P450 在 雄 激素 (androgen) 转 化 为 峻 激素 (estrogen) 的 作用 雄 激 素 芳 构 化 为 肉 激素 是 省 族 激素 生物 合成 的 重要 反应 之 一 。 参 与 此 反应 的 有 三 步 酶 催化 的 羟基 化 作用 ,反应 式 如 下 : pce ae we 应 aie 开始 两 步 反 应 发 生 在 C- 19 甲 基 上 ,使 其 产生 醛 。 最 终 的 羟基 化 反应 是 在 2 -位 上 , 并 转化 为 肉 激 素 。 在 生物 转化 过 程 中 需要 氧 和 NADPH, 所 以 每 生成 1 mol 的 肉 激素 则 需 要 3 mol 的 NADPH 和 3 mol 的 氧 (Thompson et wz. ,1974)。 能 使 芳 环 化 合 物 芳 构 化 的 P450 酶 ,又 称 P450 芳 化 酶 (P450aromatase) ,存在 于 精 梨 ( 足 细胞 和 菜 迪 希 氏 细胞 )、 卵 梨 、 胎盘 、 脑 和 脂肪 组 织 中 。 芳 化 酶 复合 体位 于 内 质 网 能 使 胎盘 和 其 他 组 织 中 的 C- 19 类 固 - 58 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 醇 转化 为 内 激素。 此 外 , 芳 化 酶 活性 也 可 发 现在 胎盘 和 其 他 组 织 的 线粒体 制备 液 中 。 依 据 它 对 雄 省 烯 二 酮 (androstenedione) , 19 -去 甲 摆 省 酮 (19 - nortestosterone) 和 16a -羟基 = §§ Bil (16a - hydroxytestosterone) 的 相对 活性 以 及 对 一 氧化 碳 的 敏感 性 ,此 酶 系 在 人 胎 盘 线 粒 体 部 分 与 微粒 体 部 分 性 质 相似 。 对 线粒体 内 外 膜 的 亚 组 分 进行 芳 化 酶 的 活性 分 析 时 ,发现 它 主要 与 线粒体 外 膜 有 关 (Canick et al. , 1978). P450 和 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 存在 于 内 质 网 ,但 它们 参与 了 芳 化 酶 反应 。 19 -去 甲 雄 当 烯 二 酮 (19 - norandrostenedione) 和 19 -去 甲 备 省 酮 的 芳 构 化 作用 可 被 一 氧 化 碳 抑制 ,但 备 和 省 烯 二 酮 的 芳 构 化 作用 对 一 氧化 碳 不 敏感 ,也 不 被 P450 抑制 剂 甲 吡 酮 抑 制 。 尝 省 烯 二 酮 和 19 -去 甲 皖 省 酮 与 胎盘 微粒 体 作 用 形成 I 型 差 光 谱 , 这 表明 底 物 与 低 自 旋 高 铁 P450 MAA. SARS I 型 差 光谱 的 量 几 乎 等 于 胎盘 微粒 体 P450 减少 的 一 氧化 碳 差 光 谱 的 数值 。 这 似乎 表明 芳 化 酶 的 底 物 也 是 胎盘 微粒 体 P450 的 底 物 , 胎 盘 微粒 体 P450 参与 了 这 些 类 固 醇 的 反应 。 芳 化 酶 复合 体 的 其 他 底 物 ,如 19 FESS ES is 二 酮 和 19 -氧化 备 当 烯 二 酮 也 与 P450 形成 I 型 差 光谱 (Thompson et al., 1974). P450 与 底 物 和 淡 当 烯 二 酮 是 竞争 性 的 结合 ,这 表明 芳 构 化 反应 可 能 是 在 相同 的 活性 部 位 进行 的 ,由 单 酶 复合 体 对 所 有 类 固 醇 进行 芳 构 化 (Ortiz de Montellano, 1986). 5.1.2 P450 在 维生素 D 代谢 中 的 作用 目前 公认 的 维生素 Di(cholecaleferol, 胆 钙 化 省 醇 ) 是 经 紫外 光照 射 皮肤 中 的 前 体 7= 去 氨 胆 固 醇 (7 - dehydrocholesterol) 生 成 。 胆 钙化 当 醇 本 身 的 生物 活性 较 小 ,而 胆 钙 化 当 醇 经 P450 羟基 化 形成 具 活 性 的 代谢 物 一 一 活性 维生素 D(lo,25 -二 羟基 胆 钙 化 消 醇 )。 反应 式 如 下 : lo.- FRE ( 肾 微 粒 体 ) HO H 胆 钙 化 省 醇 25 - 羟基 胆 钙 化 省 醇 lo, 25- 二 羟基 胆 钙化 和 省 醇 胆 钙 化 省 醇 的 氧化 代谢 ,必须 通过 25 - 羟 化 的 中 间 体 。 此 反应 主要 在 肝脏 ,有 些 羟 化 作用 也 在 肠 和 肾脏 中 进行 。25 -羟基 胆 钙化 省 醇 在 la 位 置 上 进一步 羟 化 ,生成 la,25 -二 羟基 胆 钙化 当 醇 (Gray et al., 1971). —ARU AAA FS 1b SEAS 25 - 羟 化 作用 场所 是 肝脏 的 实质 细胞 (porenchymal cell) ,专属 的 胆 钙化 省 醇 25 - 羟 化 酶 位 于 肝脏 的 内 质 网 ,此 酶 是 一 种 典型 的 微粒 体 P450 羟 化 酶 。 羟 基 化 反应 需要 微粒 体 细 胞 色素 P450,NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 以 及 二 月 桂 酰 基础 脂 酰 胆 碱 (dilauroylphosphatidylcholine) (Hayashi et 1/.,1984)。 肝 线粒体 也 含有 羟 化 胆固醇 和 胆 钙化 省 醇 的 25 - 羟 化 酶 ,此 酶 系 有 三 种 组 BHR ”哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 59 , 分 : 即 专属 的 P450 , 铁 - 硫 蛋 白 和 黄 素 蛋 白 。 后 两 个 组 分 可 被 牛 的 肾上腺 皮质 铁 氧 还 蛋白 和 皮质 铁 氧 还 蛋白 还 原 酶 替代 。 线 粒 体 酶 系统 对 胆 钙化 省 醇 的 久 。 值 远大 于 微粒 体系 统 , 由 此 看 来 可 能 是 线粒体 系统 转化 胆 钙化 省 醇 为 25 - 产 基 胆 钙化 省 醇 , 随 后 进一步 羟 化 生成 维生素 D (Ortiz de Montellano,1986) 。 与 肝 微 粒 体 25 - 羟 化 酶 对 比 , 骨 脏 线 粒 体 中 含有 la - 羟 化 酶 ,此 酶 系 含 有 P450、 铁 - 硫 蛋 白 、 黄 素 蛋 白 和 NADPH-rodoxin 还 原 酶 。 后 两 种 酶 在 重组 系统 中 可 被 肾上腺 皮质 氧 还 蛋白 或 吧 上 腺 皮质 铁 氧 还 蛋白 还 原 酶 代替 。 通 过 测定 线粒体 la - 羟 化 酶 还 原 当 量 试验 表明 ,反应 中 所 需 的 NADPH 来 自 线粒体 内 三 羧 酸 循环 中 间 体 的 氧化 ,也 可 能 是 由 能 联 转氨酶 (energy-linked transhydrogenase ) 产生 (Ghazarian et al., 1974). 25 -羟基 胆 钙化 省 醇 的 代谢 途径 除了 la - 羟 化 作用 外 ,还 有 24R - 羟 化 作用 。24R, 25 -二 羟基 胆 钙化 省 醇 是 维生素 D 的 主要 代谢 产物 。24 - 羟 化 作用 产生 于 各 种 组 织 , 特 别 是 在 肾 和 肠 中 。 此 作用 在 肾 线 粒 体 是 经 依赖 - P450 系统 催化 ,类 似 于 la - 羟 化 酶 的 催 化 。 虽 然 24 - 羟 化 作用 依赖 于 P450 ,但 不 同 于 la FEE. BS EER D 的 许多 代 谢 途 径 及 其 生物 学 意义 目前 尚 不 甚 清楚 ,预期 将 来 对 维生素 D 进行 产 化 作用 的 各 型 P450 进一步 纯化 ,将 会 对 它 的 活性 和 合成 的 调控 有 更 深入 地 了 解 。 5.1.3 P450 在 脂 类 羟 化 反应 中 的 作用 脂 类 是 不 同型 P450 的 底 物 ,这些 不 同型 的 P450 能 催化 三 类 加 氧 反 应 : 即 wu- 和- 1 - 产 化 、 环 氧化 以 及 烽 两 位 氧化 作用 。 鼠 肝 细 胞 色素 P450 能 催化 脂肪 酸 如 月 桂 酸 在 w 和 w-1 位 置 上 的 凑 化 作用 。 此 外 ,用 鼠 肾 皮层 微粒 体 也 证 明了 细胞 色素 P450 催化 月 桂 BA) w- F246 (Ellin et al., 1972; Jakobsson et al., 1970). A LEFT LEA Bi Fi ARE (prostaglandin) 可 被 加 单 氧 酶 代谢 ,形成 w - 羟 化 衍生 物 (Okita et az . ,1981) 。 前 列 腺 素 是 P450 的 天 然 底 物 ,此 酶 在 体内 起 消除 前 列 腺 素 的 作用 。 在 妊娠 免 的 肺 中 曾 纯化 出 前 列 腺 素 w- 产 化 酶 细胞 色素 P450 (P450pg - w) ,但 此 酶 在 非 妊 娠 兔 的 肺 内 未 曾 测 出 (Williams et al. , 1984). FEAR Ved AUS a BR EF A AK P450 催化 代谢 为 烯烃 环 氧 化 合 物 , 如 由 花生 四 烯 酸 经 P450 酶 合成 的 类 花生 酸 。 这 类 化 合 物 包 括 两 个 重要 的 信息 分 子 , 如 前 列 腺 素 和 凝血 Wisc (thromboxane) Ay 是 依赖 于 细胞 色素 P450 酶 的 催化 合成 的 。 花 生 四 烯 酸 经 环 加 氧 酶 (cyclooxygenase, 又 称 前 列 腺 素 合 酶 ) 转 化 为 不 稳定 的 前 体 (前 列 腺 素 H ) ,前 列 腺 素 Hy 进一步 经 P450 前 列 腺 环 素 合 酶 转化 为 前 列 腺 素 ,或 经 P450 HE EE (thromboxane) 酶 转化 为 凝血 哑 烷 A。 ,反应 式 如 下 : 此 反应 与 肝 微粒 体 P450 的 典型 反应 的 不 同 之 处 在 于 ,上 述 反应 不 需要 电子 和 分 子 氧 , 仅 是 前 列 腺 素 的 前 体 分 子 内 的 原子 重 排 。 在 微粒 体内 花生 四 烯 酸 经 P450 酶 催化 进 行 烯 两 位 氧化 反应 ,生成 产 基 廿 碳 三 烯 酸 (hydroxyeicosatrienoic acid)。 此 产物 有 趋 药 活 性 (chemotactic activity) 和 参与 发 炎 反应 (inflammatory response) (Samuelsson, 1980). 4 一 类 是 环 氧 廿 碳 三 烯 酸 , 它 在 肾脏 中 有 重要 的 生理 功能 ,这 些 分 子 能 改变 Na+ Al K* 的 运 FE ,水 的 吸收 和 血管 收缩 。 因 为 环 氧 廿 碳 三 烯 酸 有 这 些 功 能 ,所 以 它 在 高 血压 的 发 生 中 具 重要 作用 。 有 研究 结果 表明 ,用 高 盐 食 物 喂 大 鼠 后 肾脏 中 的 P450 浓度 显著 地 增加 。 因 - 60° 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 ACHE VOR 环 加 氧 酶 G CHINE P450 前 列 腺 P450 #€ ee RRA i Gee hoe gaa a! 0. Se ee Hane | Sm [ise 4 -" "Ny, C we AS aN BUT VARE L KE MMSE A, 遗传 变异 而 不 能 产生 环 氧 廿 碳 三 烯 酸 的 大 鼠 , 喂 高 盐 食 物 后 ,这 些 大 鼠 就 会 发 展 为 高 血 FE 有 研究 结果 表明 ,一 种 特定 型 的 P450 酶 参与 一 氧化 所 (NO) 的 合成 。 已 发 现 一 氧化 氮 有 某 些 重要 的 生理 作用 ,如 作为 神经 递 质 ,血压 的 调节 剂 和 杀 灭 人 侵 病 原 的 毒素 等 。 合 成 一 氧化 氮 的 两 种 酶 称 一 氧化 氮 合 成 酶 (一 种 在 脑 中 , 另 一 种 在 免疫 系统 的 巨 史 细 胞 内 ), 它 包 括 两 个 域 :一 部 分 含有 细胞 色素 P450 域 , 而 另 一 部 分 为 还 原 酶 域 (含有 两 个 黄 素 分 子 )。 这 种 结构 类 型 也 见于 细菌 的 细胞 色素 P450 酶 系 。 P450 酶 也 能 使 内 源 性 的 生物 碱 产 生变 化 ,如 目前 已 知 的 两 种 生物 碱 可 待 因 和 吗啡 能 在 脑 内 和 少数 其 他 组 织 内 合成 ,在 合成 过 程 中 P450 酶 起 催化 作用 。P450 催化 反应 还 包 括 可 待 因 转 化 为 吗啡 (Guengerich,1993 ) 。 5.2 哺乳 动物 不 同 组 织 中 的 细胞 色素 P4550 及 其 功能 在 肝 内 质 网 和 多 数 其 他 哺乳 动物 组 织 的 细胞 色素 P450 酶 系 催化 各 种 内 源 和 外 源 化 合 物 的 代谢 ,其 中 包括 药物 、 当 类 化 合 物 、 前 列 腺 素 类 、 化 学 致癌 物 以 及 其 他 外 源 有 毒物 质 。 此 酶 系 不 仅 在 许多 药物 、 化 学 致癌 物 和 其 他 有 毒物 质 的 解毒 作用 中 起 着 很 重要 的 作 用 ,而 且 承 担 了 催化 某 些 底 物 的 代谢 活化 生成 高 反应 性 的 自由 基 、` 烷 化 的 或 芳 基 化 的 中 间 体 ,再 与 细胞 大 分 子 反 应 产生 中 毒 或 致癌 。 那 么 这 些 药 物 或 其 他 外 源 有 毒化 合 物 ,经 细胞 Am ee ee 第 五 章 ”哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 “6 色素 P450 酶 系 解 毒 代 谢 后 如 何 排出 体外 的 呢 ? 在 药物 和 外 源 化 合 物 代 谢 作 用 一 般 可 分 为 两 个 不 同 的 相 , 为 工 相 和 开 相 代谢 (phase I , I] metabolism) 即 初级 和 次 级 代谢 。 首 先 是 工 相 药物 代谢 , 它 包 括 药物 的 羟基 化 作用 、 环 氧化 作用 和 催化 活化 的 其 他 反应 等 。 羟 化 或 环 氧化 的 底 物 ,再 进入 开 相 药物 代谢 的 次 级 反应 。 下 相反 应 包括 葡 糖 苷 酸 作 用 、 硫 酸化 作用 、 谷 胱 甘 肽 - S -转移 和 其 他 斩 合 反应 。 在 斩 合 反应 中 加 入 强 亲 水 基 团 到 羟 化 或 环 氧 化 的 原 底 物 上 。 活 化 的 原 底 物 的 斩 合 产物 是 强 水 溶性 的 ,因此 易于 通过 胆汁 `. 尿 液 或 凑 便 等 途径 排出 体外 。 某 些 外 源 化 合 物 经 工 相 药物 代谢 反应 后 的 产物 比 原 化 合 物 更 具 毒 性 〈 如 多 芳烃 葵 并 范 )。 许 多 化 合 物 的 环 氧 化 和 羟 化 的 代谢 产物 比 未 经 代谢 的 原 化 合 物 的 致癌 性 更 强 。 在 某 些 情况 下 , 细 胞 色素 P450 与 环 氧 水 解 酶 共同 使 茶 并 花 活 化 为 致癌 和 致 突变 的 代谢 物 。 这 样 , 细 胞 色素 P450 在 药物 和 其 他 外 源 化 合 物 的 代谢 作用 , 就 超出 了 解毒 作用 的 范围 。 某 些 斩 合 的 代谢 物 还 将 进一步 代谢 , 即 称 亚 相 药 物 代谢 作用 (phase [Il drug metabolism) ,作用 部 位 可 能 在 血 - 肝 , 血 - 肾 或 血 - 脑 等 屏障 (Ghersi-Egea et al., 1994). 此 代谢 过 程 易 于 恩 合 代谢 物 的 清除 ,例如 促使 峻 激素 葡 糖 苷 酸 在 血 - 肝 屏障 内 进入 胆汁 后 HEH (Strobel et al. ,1997) 。 5.2.1 脑 中 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 脑 和 其 他 神经 组 织 中 依赖 细胞 色素 P450 的 药物 代谢 系统 的 存在 与 功能 ,已 有 许多 报道 (Ravindranath et al. ,1995; Ravindranath and Boyd, 1995; Volk et al., 1995). ## 经 组 织 的 细胞 色素 P450 系统 对 大 脑 的 保护 起 重要 作用 ,如 单 胺 氧化 酶 在 脑 内 使 1 - 甲 基 - 4- 葵 基 -1,2,3,6 -四 羟基 吡啶 (MPTP) 活 化 为 1- 甲 基 -4- 葵 基 -2,3 -二 羟基 吡啶 欠 离 子 (MPDP* ) ,然后 转化 为 1 - 甲 基 - 4 FE SEM Me Hi (MPP* ) ,导致 多 巴 胺 神经 元 损害 ,产生 似 帕 金森 病症 状 。MPTP 药物 浓度 低 时 ,可 被 P450 2D 代谢 为 无 毒物 。 在 受 药 浓度 高 时 《如 滥用 药 者 ) 则 P450 2D 的 代谢 途径 被 单 胺 氧化 酶 代谢 途径 取代 ,生成 有 毒 的 代谢 产物 并 引起 临床 症状 。 因 此 ,可 以 认为 CYP2D 异 构 型 (isoformn) 在 人 或 动物 中 起 着 解毒 作 用 。 细胞 色素 P450 在 鼠 脑 (Guengerich and Mason,1979) 和 人 脑 (Ravindranath et al., 1989) 已 被 鉴定 。 不 同 的 鉴定 方法 证 明 脑 内 存在 许多 细胞 色素 P450 异 构 型 , 表 5.2 列举 的 仅 是 部 分 P450 酶 系 及 其 鉴定 方法 。P450 酶 系 遍 及 全 脑 ,但 不 同 的 异 构 型 在 脑 内 的 分 布 有 所 不 同 。 免 疫 组 织 化 学 研究 表明 ,P450 在 神经 元 和 胶 质 细胞 中 的 分 布 是 特异 的 和 选 择 性 的 (Hansson et al. ,1990; Hagihara et al. ,1990) ,P450 1A1,2B1,2E1 和 3A 存在 于 小 脑 Bergaman 神经 胶 质 (Hansson et al. ,1990; Warner et al., 1988). P450 酶 在 脑 中 的 表达 水 平 是 相对 低 的 , 脑 中 3,4 - 葵 并 范 和 乙 氧 香 豆 素 的 羟基 化 作 用 仅 为 肝脏 的 5% (Srivastava et ol .,1983) 。 虽 然 , 脑 P450 活性 仅 为 肝脏 的 1% ~10% , 但 在 脑 内 P450 系统 中 P450 水 平 有 微小 的 变化 ,就 可 能 显著 地 影响 脑 的 功能 。 脑 内 P450 的 影响 可 能 还 包括 神经 递 质 和 类 固 醇 激素 的 合成 与 降解 (Tyndale et al. ,1991; Warner and Gustafsson, 1995), - 62° 细胞 色素 P450 RAW ATS DNR -S ve AR 5.2 P450 酶 系 在 鼠 脑 中 的 表达 (Strobel et al. ,1997) 基因 型 鉴定 方法 文献 CYPIAI 免疫 组 织 化 学 Adams et al. ,1992; Strobel et al. ,1995; Western/PCR Bergh and Strobel, 1992; Ahlgren et al. , 1990 CYP1A2 RT-PCR Ghersi-Egea et al. , 1989 CYP2AI1 RT-PCR Ghersi-Egea et al. , 1989 CYP2B12 免疫 组 织 化 学 Adams et al. ,1992; Strobel et al. ,1995; Western/PCR Guengerich and Mason, 1979; Bergh and Strobel, 1992 CYP2C7 RT-PCR , Ghersi-Egea et al. , 1989 CYP2C11 RT-PCR Warner et al. , 1988 CYP2D PCR/ 酶 活性 Adams et al. ,1992; Warner et al. ,1988; cDNA/52 Naslund et al. , 1988 CYP2E1 免疫 组 织 化 学 Fang and Strobel, 1978; Adams et al. ,1992; Western/PCR Kapitulnik et al. , 1987; Ghersi-egea et al. , 1987 CYP3A ates i Ravindranath and Boyd, 1995 CYP3A9 脑 库 cDNA 克隆 Wang et al. , 1996 CYP4A PCR/Western Kapitulnik et al. , 1987; Wyss et al. , 1995 CYP4F 脑 库 cDNA 克隆 Kawashima and Strobel,1995 CYPIIAI(P450ssc) ”Chol ssc 活性 Cesi et al. , 1993 CYPI7A1 酶 活性 Roselli, 1991 CYP19( 芳 构 酶 ) = 酶 活性 Kohler et al. , 1988 CYP27 ( P45027) 活性 Sundseth and Waxman, 1992 Cas 免疫 组 织 化 学 Hansson et al. ,1990; Warner and Gutafsson, 1994; Western/PCR Michnovicz et al. , 1987; Stromstedt et al. , 1994; 通过 杂交 人/ 酶 活性 Kawashima and Strobel, 1995; Bergh and Strobel, 1992 脑 内 细胞 色素 P450 催化 雄 激 素 芳 构 化 为 肉 激 素 反 应 ,已 引起 人 们 的 广泛 关注 。 已 有 证 明 ,P450 芳 构 酶 (P450arom) 在 性 发 育 和 性 功能 方面 起 着 关键 作用 (Sanghera et al., 1991)。 测 定神 经 元 和 培养 的 胶 质 细胞 、 分 离 的 少 突 神 经 胶 质 细胞 和 星 胶 质 细 胞 等 的 芳 构 酶 活性 发 现 , 唯 有 神经 元 具有 芳 构 酶 活性 , 胶 质 细胞 不 能 使 军 当 酮 芳 构 化 (Cesi et al., 1993). 细胞 色素 P450 的 两 种 线粒体 类 型 ,P450scc 和 胆固醇 27 - 羟 化 酶 (P45027) 在 脑 内 参 与 胆 当 醇 的 代谢 作用 。 脑 内 脱氧 表 雄 和 省 酮 ( dehydroepiandrosterone, DHEA) 是 通过 P450scc 合成 的 (Goascogne et al. ,1987) , 它 能 调控 NMDA 和 GABAA 受 体 ,并 可 能 对 脑 发 育 .老化 和 记忆 等 起 作用 (Warner and Gustafsson, 1995). £8 Abi B@ 5298 JA ( cerebro- tendinous xanthomatosis) 的 病人 中 ,发 现 细胞 色素 P450 省 醇 27 - 羟 化 酶 基因 中 含有 点 突 变 ,这 导致 当 醇 在 中 枢 神 经 系统 中 沉积 和 进行 性 的 神经 功能 障碍 (Cali et al. ,1991)。 第 五 章 ”哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 63° 5.2.2 ”肝脏 中 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 细胞 色素 P450 酶 系 催 化 大 量 的 亲 脂 性 的 外 源 化 合 物 代谢 。P450 酶 系 的 表达 主要 是 在 哺乳 动物 的 肝脏 。 参 与 肝脏 药物 代谢 的 许多 P450 已 被 鉴定 ,其 中 有 3 个 P450 基因 族 ( 即 CYP1 , CYP2 ,CYP3 ) 承 担 大 量 的 肝脏 内 药物 代谢 作用 。 肝 微 粒 体 P450 酶 系 能 催化 大 量 的 内 源 和 外 源 化 合 物 的 代谢 ,反应 包括 碳 羟 化 作用 、 杂 原 子 加 氧 作用 、 脱 烷 基 作用 和 环 氧 化 作用 等 。 此 外 , 它 还 能 催化 还 原 反 应 。 底 物 经 P450 酶 系 催 化 代谢 所 形成 的 代谢 产物 较 母 体 化 合 物 更 具 亲 水 性 ,因而 易于 排出 体外 。 在 某 些 情况 下 ,所 形成 的 亲 电 性 的 代谢 产物 与 细胞 的 亲 核 物质 反应 导致 中 毒 或 致癌 的 危害 。 某 些 P450( 即 CYP1A,CYP3A,CYP2E1) 还 能 被 外 源 化 合 物 诱导 (Monstroy and Vereck- ey,1995) 。 为 了 进一步 阐明 肝 P450 酶 系 的 催化 功能 和 表达 调控 , 现 就 3 个 P450 基因 族 的 重要 P450 作 以 下 论述 : 5.2.2.1 CYP1 RK (1) P4501A1 人 和 上 鼠 的 CYP1A1 是 P450 基因 族 中 研究 得 较为 清楚 的 两 个 基因 (Nebert et al., 1991)。 人 1A1cDNA 是 从 二 吐 英 (TCDD) 处 理 MCF -7 人 胸 癌 细胞 产生 的 cDNA 库 首 次 分 离 出 来 的 ,为 肝 外 (extrahepatic) 的 P450 , 它 可 在 肝 外 组 织 因 吸烟 和 多 环 芳 烃 (PAH) 诱 导 产 生 (Quattrochi and Tukey, 1989; Pasanen et al. ,1988) 。P4501A1 BRAY S/F 通过 一 系列 的 分 子 反 应 。TCDD 是 P450 1A1 的 最 强 的 诱导 剂 之 一 。 某 些 动 物体 内 具有 此 化 合 物 的 受 体 , 叫 芳 基 烃 水 解 酶 受 体 (“Ah" 受 体 )。TCDD 与 “Ah”" 受 体 结合 ,然后 释放 出 热 激 蛋 白 (hsp - 90) ,使 受 体 - TCDD 复合 体 与 芳 基 烃 受 体 核 转移 酶 (ARNT) 结 合 。 此 复合 体 进 入 细胞 核 ,再 与 P450 1A1 基因 的 特定 部 位 结合 。 这 一 特定 部 位 含有 已 知 为 外 源 化 合 物 调节 因子 的 核 苷 酸 特定 序列 。 此 复合 体 与 调节 因子 的 结合 使 得 其 他 蛋白 质 ( 转 RAF) Bak P450 基因 的 启动 子 部 位 ,引发 mRNA 的 合成 。 (2) P450 1A2 P450 1A2 是 作为 乙酰 氧 乙 葵 胺 (phenacetin)O - 脱 乙 基 酶 纯化 得 到 的 (Disterlath et al. , 1985) ,并 发 现 它 在 成 年 人 的 肝 中 表达 (Wrighton et al. , 1986). MAE RR AY 3 - 脱 甲 基 作用 是 1A2 活性 的 标记 。 其 他 因素 ,如 身体 运动 、 摄 食 烧 焦 的 食肉 或 十 字 花 科 蔬 菜 等 都 能 诱导 1A2 活性 水 平 增高 (Vistisen et wz. ,1991)。 此 外 ,药物 相互 作用 如 omeprazole( 质 子 稍 抑 制剂 ) 可 诱导 体内 和 原 代 单 层 培养 的 人 肝 细胞 中 1A2 的 活性 (Diaz et al. , 1990). 从 癌症 流行 病 学 来 看 ,判断 一 个 人 对 芳 基 胺 诱导 癌症 的 敏感 性 ,可 用 咖啡 碱 3 - 脱 甲 基 作 用 探查 体内 1A2 活性 。 另 外 可 用 甲 基 黄 味 叭 衍生 物 furafylline 测定 P450 1A2 在 体内 外 的 代谢 能 力 ,此 化 合 物 是 人 1A2 有 效 的 和 选择 性 的 抑制 剂 (Sesardic et al. , 1990). 5.2.2.2 CYP2 家 族 (1) CYP2A 亚 族 P450 2A 亚 族 曾 在 大 鼠 和 小 鼠 中 已 进行 了 广泛 研究 。 在 大 鼠 中 ,2A 亚 族 包 括 2Al, - 64° 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 | | 一 -一 ~ -一 一 | dioxin | pr 4 EY ; j -tsk? | 1 i | | dioxin | a AT Re , yl: Sa Ee g pre: ; \ Protein 90 , meee ee ae? \ pegtein 90 cytoplasm to smooth _———> endoplasmic reticulum (Guengerich, 1993. ) TE : dioxin: TCDD( — WBRZ) ,Ah receptor: 芳 基 烃 水 解 酶 受 体 , heat-stock protein 90: 热 激 蛋 白 90, ARNT: 芳 基 烃 受 体 核 转移 酶 ,cytoplasm: 细 胞 质 ,cell nucleus: 细 胞 核 , transcription factor: 转 录 因 子 ,promoter: 启 动 子 ,xenobiotic regulatory element: 外 源 物 调节 因子 , messenger RNA:mRNA,P450IA1 protein; P4501A1 蛋白 ,P450IA1 gene: P450IA1 基因 ,smooth endoplasmic reticulum :光滑 内 质 网 。 2A2 和 2A3。 其 中 2Al 原 归 类 于 P450a BK ff BR 70 - 羟 化 酶 。2A2 的 氨基 酸 序列 与 2Al 有 关 , 但 并 不 表明 它 对 尝 省 酮 羟 化 作用 的 专属 性 相同 。 而 且 ,2AL1 和 2A2 在 未 经 处 理 的 大 鼠 体内 的 表达 也 不 同 ,2A2 也 不 受 PAH 的 诱导 (Ryan and Levin, 1990). 2A3 是 2A 亚 族 中 惟一 能 在 肺 中 表达 ,并 受 3 - 甲 基 胆 划 的 诱导 的 P450(Kimura et al . 1989). 在 小 鼠 中 2A 亚 族 包 括 2A4 和 2A5S。 从 氨基 酸 序列 与 大 鼠 肺 2A3 极为 相似 (Burkhart ef al .,1990)。2A4 Ay] BAF SE Bd 150 - 羟 化 酶 ,2A5 为 香 豆 素 7 - 羟 化 酶 。2A5 HS 酮 的 羟 化 作用 的 专属 性 比 2A4 更 广泛 。 有 趣 的 是 大 鼠 的 2A P450 不 能 有 效 地 催化 香 豆 素 7 - 羟 化 作用 。 此 外 ,2A5 可 被 葵 巴 比 妥 或 吡 唑 诱导 (Aida and Negishi, 1991). K/) bl 的 2A 亚 族 之 间 的 主要 差异 不 仅 在 底 物 的 专属 性 ,而且 也 表现 在 表达 的 调控 方面 。 第 五 章 ”哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 :5 - 由 人 肝 制 备 的 微粒 体 得 到 的 2A 亚 族 对 7a -或 1Sa- 皖 省 酮 不 能 进行 羟 化 作用 ,此 微 粒 体 可 羟 化 香 豆 素 。Raunio 等 (1988) 指 出 ,人 肝 微 粒 体 含有 一 种 蛋白 在 免疫 化 学 上 与 小 鼠 2A5 BK ,并且 能 使 香 豆 素 产 化 。 从 人 肝 cDNA 库 中 ,分离 出 两 个 cDNA, 根据 其 氨基 酸 序列 归 为 2A 亚 族 (Yamano et oa! . ,1990) 。 将 克隆 在 表达 系统 中 表达 ,只 有 2A6 生成 功能 酶 ( 香 豆 素 7- 产 化 酶 )。 以 氨基 酸 序列 与 其 他 2A 亚 族 成 员 比 较 ,2A6 约 85% BW F 大 鼠 肺 2A3 ,而 与 肝 2A 型 相似 小 于 70% 。 纯 化 的 2A6 能 催化 香 豆 素 的 羟 化 作用 和 7 - 乙 氧 基 香 豆 素 O- 脱 乙 基 作 用 ,而 且 这 两 种 活性 均 可 被 2A6 产生 的 抗体 抑制 (Yun et al., 1991)。 从 不 同 的 人 肝 微 粒 体 样 品 的 香 豆 素 7 - 羟 化 酶 活性 比较 结果 表明 ,人 2A6 是 香 豆 素 羟 化 酶 (Wrighton et al. ,1987; Waxman et al., 1991). (2) CYP2B 亚 族 葵 巴 比 妥 处 理 大 鼠 可 在 肝脏 中 诱导 2B1 和 2B2 的 表达 ,但 两 者 中 只 有 2B2 能 在 未 经 处 理 的 动物 中 表达 (Ryan and Levin,1990)。2B1 和 2B2 的 底 物 专属 性 是 重 委 的 ,但 2B1 对 众多 的 底 物 的 活性 远大 于 2B2 (Ryan and Levin, 1990; Guengerich et al., 1982). CYP2B 亚 族 中 的 2B6(Nebert et al. ,1991) ,其 氨基 酸 序列 近似 于 2B1(Yamano et al., 1989) ,但 人 CYP2B6 基因 是 否 在 动物 中 表达 和 酶 活性 水 平 尚未 进一步 证 明 。 _ (3) CYP2C LH 已 被 鉴定 的 CYP2C 基因 在 大 鼠 中 有 7 个 , 免 中 有 8 个 (Nebert et al., 1991), BE 因 组 分 析 在 CYP2C 亚 族 中 ,人 至 少 有 7 个 基因 (Ged et al. , 1988). 2C5 又 称 孕 酮 21- 羟 化 酶 在 兔 肝 中 表达 。 人 肝 2C8 能 代谢 维生素 A 和 维生素 A 酸 ,并 能 活化 催化 甲 基 葵 异 丙 基 蔷 胺 (benzpheamine) 的 N - 脱 甲 基 作 用 (Leo et al. ,1989) ,但 人 的 2C8 不 能 代谢 孕 酮 (Wrighton et al. ,,,1987) 。 2C 亚 族 中 另外 两 个 P450 基因 型 是 2C9 和 2C10。 它 们 可 催化 环 已 烯 巴 比 妥 和 1- 丁 基 - 3 -对 甲苯 磺 酰 基 脲 (tolbutamide) 的 羟基 化 作用 (Ged et al. , 1988; Shimade er al., 1986) 。 此 外 ,2Co9 在 酵母 中 表达 ,发现 其 S- 甲 基 妥 英 (mephenytoin) 4’-F4 (LK BAPE (Yasumori et al. ,1989) 。2C9 的 等 位 变异 体 在 哺乳 动物 细胞 系 表达 ,能 催化 1- 丁 基 - 3 -对 甲苯 磺 酰 基 脲 羟 化 作用 和 R - 甲 基 妥 英 的 4 - 羟 化 作用 ,但 不 能 使 S- 甲 基 妥 英 - 4 - 羟 化 (Relling et al. , 1989). 2C10 AREF CT FA SE eR ,但 可 代谢 1- 丁 基 - 3 -对 甲苯 磺 酰 基 RAF Cis EB HE (Brian et al. , 1989). BARRASMLME (sulfaphenazole) Fil A ERE 1 -T 基 - 3 -对 甲苯 磺 酰 基 脲 4 FE 16 7E FS a ad A), = AP ABT 4 hl] 2CO 和 2C10( Back et al., 1988; Miners et al. , 1988). P450 2C18 是 从 人 肝 分 离 得 到 的 , 它 能 催化 S —FA SE eR 4 EFA, 2 BR OS 甲 基 妥 英 -4 $44 A (Sribastava et al .,1991)。 在 S- 甲 基 妥 英 4 - 羟 化 过 程 中 利 福 平 (ri- fampicin) 可 增强 其 作用 ,而 类 固 醇 则 使 羟 化 作用 降低 (Zhou et al. ,1990 ) 。 (4) CYP2D 亚 族 用 大 鼠 胀 基 四 氢 异 唑 肛 (debrisoquine) 4 - 羟 化 酶 2D1 制备 的 抗体 免疫 印迹 实验 表 明 , 人 肝 微 粒 体 含 有 一 种 相关 的 基因 型 ,被 命名 为 2D6 (Nebert et al., 1991). FEW EA 肝 样 品 中 ,2D6 AY ZKAE-S pea a PK SE DO SEE 4 - 羟 化 酶 活性 紧密 相关 (Disterlath and Guengerich,1984) 。 有 研究 证 明 ,2D6 在 体内 外 均 可 催化 可 待 因 的 脱 甲 基 而 生成 吗啡 ,并 认为 可 待 因 药理 学 上 的 这 些 变化 ,直接 与 2D6 的 多 态 性 及 代谢 作用 有 关 。 此 外 ,2D56 在 - 66° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 体内 对 外 源 化 合 物 的 代谢 作用 ,也 可 用 2D6 特异 的 抑制 剂 如 奎 尼 丁 (quinidine) 进 行 共处 理 来 确定 因 奎 尼 丁 对 2D6 的 亲 和 人 性 而 其 本 身 又 不 被 其 代谢 ,这 样 可 精确 地 评价 2D6 对 外 源 化 合 物 的 代谢 中 的 作用 (Zanger et al. ,1988 ) 。 (5) CYP2E 亚 族 2E 亚 族 在 毒 理 学 方面 是 很 重要 的 代谢 系统 。 在 大 鼠 中 ,2E 亚 族 仅 有 一 个 成 员 即 2E1. AM 2E1 的 活性 及 表达 调控 已 进行 广泛 地 研究 。2E1 可 被 许多 有 机 小 分 子 化 合 物 所 诱导 ,所 以 它 有 非 同 寻常 的 毒 理 学 意义 。2E1 通常 催化 大 量 低 分 子 化 合 物 转化 为 比 其 母体 化 合 物化 学 反应 性 更 强 的 代谢 产物 。 首 次 分 离 的 2E1 作为 低 K,, 值 的 N =- 亚 硝 基 二 FAR N - 脱 甲 基 酶 , 它 可 被 吡 唑 丙酮 . 异 烟 肝 、 乙 醇和 异 两 醇 等 诱导 。 大 鼠 2E1 也 受 生 理 状态 的 诱导 ,例如 禁 食 、 多 尿 症 和 肥胖 ,而 导致 丙酮 或 其 他 酮 类 化 合 物 的 积累 。 已 有 研究 证 明 ,2E1 可 催化 大 量 的 普通 毒物 的 代谢 ,其 中 包括 氯 化 的 小 分 子 有 机 化 合 物 如 四 和 氯 化 碳 、 乙 醇 类 、N - 亚 硝 基 二 甲 胺 苯胺 ` 葵 丙酮 和 乙酰 氨基 葵 等 (Yang et al. ,1990)。 许多 试验 数据 表明 ,人 2E1 与 大 鼠 2E1 有 很 好 的 相关 性 。 人 2E1 AAR 2E1 的 抗 体 与 固 相 载体 的 免疫 亲 和 层 析 纯 化 的 。 经 结构 研究 表明 ,人 与 鼠 的 2E1 是 极为 相似 的 (Wrighton et al., 1986). A 2E1 也 能 代谢 N - 亚 硝 基 二 甲 胺 苯胺、 乙醇 四 氧化 碳 和 乙 PEA ZEAE (Ekstrom et al. ,1989; Raucy et wl . ,1989) ,以 及 大 量 低 分 子 量 的 致癌 物 ,其 中 包括 氯仿 `、 二 省 (或 二 氯 ) 化 乙烯 、 氨 基 甲 酸 乙 酯 氨基 甲酸 乙烯 酯 .共和 葵 乙 烯 等 。 一 种 肌 肉松 弛 剂 一 一 氯 羟 葵 唑 (chlorzoxazone) 在 体内 可 被 人 2E1 专属 的 羟基 化 (Peter et al., 1990)。 二 硫 龙 (disulfiram) 和 甲 氧 基 补 骨 脂 素 (methoxypsoralen) 是 人 2E1 的 专属 抑制 剂 (Guengerich et al. ,1991; Tinel et al. ,1987 ) 。 5.2.2.3 CYP3 Km 3A 亚 族 能 对 很 多 临床 的 和 毒 理学 方面 的 重要 药物 进行 代谢 ,并 且 又 可 被 类 固 醇 大 环 内 酯 抗体 咪唑 抗 真 菌 剂 和 葵 巴 比 妥 等 诱导 。34A1 和 342 两 个 基因 都 是 从 大 鼠 中 鉴定 的 。341 可 被 糖 皮质 素 (glucocorticoid) 诱 导 , 但 不 能 在 未 经 处 理 的 成 年 动物 中 表达 。 然 而 ,3A42 不 被 糖 皮质 素 诱导 ,只 能 在 成 年 雄 鼠 体内 表达 (Gonzalez et al., 1986). ZEA 内 的 P450 3A 亚 族 ,至 少 有 4 个 基因 , 即 CYP3A3,3A4,3A5 和 3A7。 这 些 基因 的 表达 调控 与 大 鼠 3A1 或 3A2 似乎 是 不 平行 的 。Molowa 等 (1986) 和 Beaune 等 (1986 ) 分 离 出 两 个 不 同 的 3A cDNAs, 分 别 命名 为 343 和 3A4 。 这 两 个 3A P450s 的 氨基 酸 序列 非常 相 似 。 用 组 织 化 学 方法 测定 其 表达 和 酶 活性 水 平 , 二 者 也 无 区 别 。 然 而 ,用 对 343 或 3A4 专属 性 的 寡 核 苷 酸 探 针 表明 ,mRNA 编码 的 3A4 在 人 肝 中 的 表达 的 程度 要 明显 地 高 于 3A3 (Bork er al .,1989)。 总 之 ,人 肝 的 3A 亚 族 对 大 量 的 结构 各 蜡 的 内 源 和 外 源 化 合 物 的 代谢 起 主要 作用 。34 亚 族 代 谢 的 内 源 化 合 物 包 括 各 种 类 固 醇 , 如 曙 当 酮 ` 孕 省 酮 、 皮 质 省 醇和 雄 和 省 烯 二 酮 等 的 68 -羟基 化 作用 。 脱 氧 皮质 省 酮 3 -硫酸 酯 的 16a -羟基 化 作用 (Kitada et &lL . ,1987) 。 对 外 源 化 合 物 的 代谢 ,包括 红 霉 素 、 硝 基地 平 (nifedipine)、1,4- 二 氧 吡啶 .cydosporine`\ 利 度 卡 因 盐酸 盐 (lidocaine) , 黄 曲 霉 素 (aflatoxin)\ 奎 尼 定 、17a -=- 乙 烽 雌 省 二 醇 、 植 物 碱 千里 光 宁 (senncionine)、 甲 基 葵 异 两 基 葵 胺 以 及 艾 氏 剂 等 。 3A 亚 族 中 另 一 基因 是 345$。34A45 的 代谢 功能 与 343 和 344 相 比 有 一 定 的 局 限 性 。 它 不 能 代谢 红 霉 素 、 奎 尼 定 或 17a- 乙 灿 雌 省 二 醇 , 但 能 代谢 备 省 酮 、 硝 基地 平 、 皮 质 人 省 醇 第 五 章 ” 哺乳 动 物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 67° 和 脱氧 皮质 省 酮 3 -硫酸 酯 ,其 代谢 速率 要 慢 于 3A4 (Wrighton et al. , 1990). P450 3A7 是 人 胎儿 较 重 要 的 P450 , 它 在 胎儿 体内 的 表达 水 平 很 高 ,但 在 成 年 人 肝 中 未 曾 鉴 定 出 (Wrighton et al., 1989; Wrighton et al., 1990). 3A7 tet Abs aa Re Jor tS Bel 3 -硫酸 酯 的 160 -羟基 化 作用 的 效率 比 3A3 、344 和 345 BR. REWER RR 处 理 后 的 胎儿 肝 ,可 诱导 3A ,而 未 经 处 理 的 胎 鼠 肝 不 含 与 34A 有 关 的 P45S0。 孕 妇 用 外 源 类 固 醇 诱 导 对 胎儿 3A7 的 表达 尚未 见报 道 。 一 些 其 他 P450 基因 ,包括 1A2.2C8.2C9 和 2FE1 等 在 人 胎儿 肝 中 均 未 测 出 (Wrighton et al. , 1988). BZ KALA BS 3A 亚 族 的 表达 和 调控 是 不 相似 的 ,大 鼠 3A 亚 族 代 谢 的 所 有 底 物 不 都 能 被 结构 相关 的 人 基因 亚 族 代 谢 。 所 以 ,由 动物 得 到 的 关于 34 基因 亚 族 表达 调控 或 其 代谢 功能 的 试验 结果 推广 应 用 到 人 类 时 ,必须 高 度 地 慎重 。 5.2.3 小 肠 细胞 色素 P450 对 药物 代谢 小 肠 是 通过 摄 和 人 食物 和 液体 接触 外 源 化 合 物 。 在 肠 黏 膜 细胞 中 酶 的 生物 转化 使 一 些 疏水 性 的 外 源 化 合 物 排 人 肠 腔 ,或 经 恩 合 作用 后 排出 体外 。 初 级 代谢 主要 是 防止 外 源 物 质 分 布 到 身体 的 其 他 部 分 。 生 物 转 化 也 可 能 使 外 源 物 质 活 化 为 对 生物 体 有 毒 的 物质 。 在 小 肠 内 支配 生物 转化 作用 的 系统 是 PASO 酶 系 。 关 于 小 肠 P450 酶 系 的 基因 调控 与 代谢 以 及 这 些 酶 的 功能 在 毒 理学 上 的 重要 性 , 现 作 以 下 简要 论述 。 5.2.3.1 细胞 色素 P4$0 在 人 小 肠 的 定位 | 用 P450 3A3 单 克 隆 抗体 研究 表明 ,在 人 小 肠 近 幽 门 的 地 方 P450 的 含量 最 高 ,而 远 端 较 低 。 小 肠 壁 绒毛 吸收 柱 的 上 皮 细 胞 和 肥大 细胞 显示 最 强 的 免疫 反应 性 , 而 在 杯 状 细 胞 或 在 小 的 上 皮 细 胞 免疫 染色 未 检 出 (Murray et ol .,1988)。 用 Western 印迹 技术 确 定 NADPH-P450 还 原 酶 位 于 小 肠 组 织 的 肠 细胞 和 绒毛 项 端的 浓度 最 高 (Hall et al., 1989)。 5.2.3.2 细胞 色素 P450 在 动物 的 小 肠 定 位 在 未 经 处 理 的 大 鼠 十 二 指 肠 用 免疫 印迹 法 已 检 出 P450 1A1 ,但 它 在 空肠 和 回肠 中 低 于 检测 水 平 。P450 2B1 Al 3A1 及 3A2 也 存在 于 上 述 三 个 部 位 ,而 且 在 十 二 指 肠 中 的 水 平 最 高 (de Waziers et al. ,1990)。P450 3A1/2 mRNA 在 未 处 理 的 成 年 Holtzmann KRM 小 肠 中 也 有 较 高 的 水 平 (Simnmons and Kasper, 1989). Western 印迹 法 和 酶 活性 测定 未 处 理 的 大 鼠 肠 ,未 发 现 P450 1A1,2B1 或 2B2 存在 (Sesardic et al. ,1990; Christou et al., 1987)。 用 定位 技术 在 未 处 理 大 鼠 的 小 肠 细胞 中 证 明 有 P450 2B1, if AA) Be BRE 最 高 顶端 在 量 的 水 平 来 看 也 最 高 。 所 以 ,各 种 P450 在 肠 内 的 分 布 是 随 肠 的 长 度 不 同 而 异 。P450 在 绒毛 中 的 浓度 也 是 随 绒毛 的 部 位 而 变化 ,在 绕 毛 的 顶端 P450 浓度 最 高 。 用 巴 比 妥 诱导 大 鼠 , 则 总 P450 和 P450 2B1 浓度 的 变化 也 随 小 肠 的 长 度 而 异 ( 见 下 表 ) (Kaminsky and Fasco, 1991). a 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 表 5.3 大 鼠 小 肠 不 同 距离 的 总 P450 和 P450 2B1 浓度 (Kaminsky and Fasco, 1991) 沿 肠 距 离 ac aul fae: P450 i: 7 Mis 1/3 近 侧 208.0 土 22.4 116.0+6.4 1/3 中 部 210.0 土 40.2 137.04+14.2 1/3 远 侧 99.9+34.0 50.4+24.2 5.2.3.3 Api P450 的 调控 (1) 外 源 化 合 物 的 诱导 作用 关于 外 源 化 合 物 对 肠 P450 的 诱导 作用 及 不 同 动物 肠 内 P450 活性 见 下 表 。 由 表 内 结果 表明 ,大 鼠 肠 内 P450 BANA DAS, UAE AS P450 2B1。 表 5.4 部 分 外 源 化 合 物 对 肠 P450 酶 系 的 诱导 作用 (Kaminsky and Fasco, 1991) 诱导 剂 处 理 途径 ats P450 。 VND AE 诱导 活性 RIFE 口服 CS7BL/6N /} fi P450 1Al AHH 口服 ifs te ae AHH WE f§ — 腹膜 内 注射 HEX RL 80 AHH, ECOD 地 塞 米 松 口服 KA P450p 2Y Be FH He FE N- 葵 基 咪 只 He 大 鼠 P450 3A 248 EROD, 对 - 硝 基 苘 香 栈 和 红 霉 素 脱 甲 酶 N-(2- 蔡 甲 基 ) 咪 唑 HE AR P450 3A 236 EROD, Xt -fA3E al Bk ZL BS BP cimelidine 口服 大 鼠 43.4 AHH, ECOD 二 硫 龙 口服 大 鼠 44 AHH 外 口服 大 鼠 41 AHH 乙醇 口服 KA 26 AHH 乙醇 口服 大 鼠 38 AHH, TCDD He 大 上 鼠 133 AHH,EROD B- 葵 黄酮 口服 KR 150 EROD, ECOD PcBs 口服 AAR 530 EROD, ECOD Aroclor 1242 Be 大 鼠 103 AHH, EROD Aroclor 1254 大 上 鼠 P450 1Al He KA P450 2B1 589 3 - FA Se 腹膜 内 注射 KE 75 AHH, EROD 腹膜 内 注射 KER 120 7,12-— PREF 腹膜 内 注射 KE 116 AHH, 肉 当 二 醇 - 2 FAC 腹膜 内 注射 CS7BL/ON 小 鼠 P450 1Al AHH 腹膜 内 注射 豚鼠 260 腹膜 内 注射 免 340 ABW 腹膜 内 注射 大 鼠 P450 2B1 = 25 7,12-— FRR 腹膜 内 注射 大 鼠 P450 2B1 333 EROD,ECOD 腹膜 内 注射 免 400 腹膜 内 注射 豚鼠 231 ECOD tE: AHH: 芳烃 羟基 化 作用 ,ECOD: 乙 氧 香 豆 素 O- 脱 乙 基 作 用 ,EROD: 乙 氧 试 卤 灵 脱 乙 基 作用 。 第 五 章 “” 哺乳 动物 细胞 色素 P450 及 其 功能 。 69 - 3 —FA SLAB GS P450 1A1 ,地 塞 米 松 (dexamethasone) 诱 导 P450 3A 的 两 个 基因 型 。 诱导 作用 的 最 有 效 途径 是 诱导 药物 的 口服 处 理 。 药 物 处 理 在 1 h 内 芳烃 羟 化 酶 (AHH) 活 性 迅速 增加 。 在 多 环 芳烃 化 合 物 诱导 P450 中 , Ah - 受 体 的 作用 已 由 葵 并 艺 诱 导 CS7TBL/ON LG 的 AHH 活性 所 证 实 。 但 在 DBA/2 鼠 内 用 相同 的 方法 诱导 就 不 能 表达 Ah - 受 体 的 功能 (Kaminsky and Fasco,1991) 。 有 许多 报道 比较 了 肝 和 小 肠 P450 酶 系 及 其 调节 作用 。 一 般 来 说 , 肠 P450 酶 系 对 诱 导 剂 的 反应 要 比 肝 P450 酶 系 更 迅速 ,可 能 是 因为 其 作用 更 直接 一 些 (Hasing er al., 1989)。 未 经 处 理 的 肝 和 肠 的 微粒 体 对 不 同 底 物 代谢 的 动力 学 参数 ( Vs, 天 。 值 ) 有 明 显 的 不 同 。 这 些 结 果 表 明 , 肝 和 肠 两 种 器 官 诱导 的 P450 型 功能 上 的 不 同 , 如 日 本 齐 用 2, 4,2,4 -四 毛 联 茶 口 服 处 理 , 可 诱导 肠 P450 为 3.3 倍 于 对 照 组 ,而 用 3,4,3,4 -四 氯 联 茶 处 理 时 , 则 无 诱导 效应 ,但 3,4,3 ,4- 四 氯 联 葵 在 肝脏 内 却 有 明显 地 诱导 作用 (Miranda er al., 1987), HAVA 15 种 类 黄酮 化 合 物 诱导 大 鼠 肝 和 肠 的 微粒 体 P450 ,并 以 ECOD 活 性 来 衡量 ,结果 表明 ,5,6 - 葵 并 黄酮 ,7,8 - 葵 并 黄酮 和 黄酮 分 别 加 到 微粒 体制 备 液 中 , 肝 的 活性 全 都 增加 ,但 肠 的 活性 全 被 抑制 ,其 余 的 12 种 类 黄酮 在 肝 和 肠 的 微粒 体 代 谢 全 被 抑制 (Vernet 和 Siess, 1986) ,这 说 明 两 种 组 织 有 不 同 的 P450 调控 机 制 。 表 5.5 在 鼠 肝 和 肠 微粒 体 代谢 的 动力 学 参数 (Kaminsky and Fasco, 1991) 肝 肠 se Km/(10~>X mol/L) Vinax/Lnmol/(min*mg)] K,,/(10~>* mol/L) Vix/[nmol/(min* mg) ] 7- 乙 氧 基 香 豆 素 6.2 0.123 1.9 0.8 RA Lat 0.24 17 363 FA LE FP EK AK 1.3 13 (2) 饮食 组 成 分 的 诱导 作用 饮食 组 成 分 在 肠 P450 调控 中 起 重要 的 作用 。 饮 食 成 分 中 铁 的 限定 ,会 迅速 地 使 肠 P450 降低 到 低 于 测定 值 ; 缺乏 硒 时 其 作用 相似 ,但 其 影响 要 低 一 些 。 汤 菜 brussels sprouts) 会 增加 AHH 活性 9.8 倍 ,ECOD 活性 3.2 倍 ,P450 活性 1.9 倍 ; 油 煎 的 肉 和 食物 脂肪 明显 地 增加 EROD 活性 ;缺乏 维生素 A 的 食物 能 增加 肠 P450 活性 , 而 富 含 维生素 A 食物 则 降低 肠 P450 活性 。 肠 P450 酶 系 的 表达 也 受 食物 中 胆固醇 含量 的 影响 。 一 般 来 说 ,食物 中 含 胆 固 醇 浓度 越 高 , 则 肠 内 P450 活性 也 越 高 (Hietanen et al. , 1987). 5.2.3.4 细胞 色素 P450 和 肠 毒 理学 小 肠 的 P450 催化 外 源 化 合 物 代谢 与 致癌 作用 的 关系 一 直 不 甚 清楚 。 这 种 代谢 作用 对 结肠 瘤 发 生 速 率 存 在 某 些 相关 因素 :@ 半 合成 食物 降低 了 小 肠 P450 活性 和 增加 了 实 验 动物 发 生 结肠 瘤 的 速率 ,@) 食 物 中 脂肪 含量 高 会 降低 小 肠 P450 活性 ,并 促进 大 鼠 结 肠 瘤 的 发 生 ,@ 某 些 蔬 菜 增 加 小 肠 P450 活性 ,素食 者 可 减少 患 结肠 瘤 的 风险 ,@@ 缺 乏 铁 会 降低 小 肠 P450 活性 ,而 能 导致 人 的 胃 肠 癌 。 那 些 特异 的 外 源 化 合 物 能 在 肠 内 活化 为 至 瘤 剂 ,虽然 存在 着 这 种 可 能 性 ,然而 尚 无 实验 证 明 。 有 一 种 假设 是 ,小 肠 P450 酶 系 作为 体内 对 外 源 化 合 物 的 净化 系统 ,防止 或 减少 外 源 物 通 向 小 肠 , 这 样 即 可 防止 或 降低 其 致癌 - 70: 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 功能 。 小 肠 对 瘤 已 产生 的 抗 性 ,这 是 因为 它 含 有 很 强 的 P450 代谢 功能 。 细 胞 代谢 更 新 速 率 越 高 ,假定 的 那些 致癌 物 的 迁移 就 越 快 (Kaminsky and Fasco, 1991). 2,2,2 -三 氟 乙 醇 在 大 鼠 肠 内 可 能 是 由 P450 2E1 代谢 为 三 氟 乙 醛 ,再 转化 为 三 氟 乙 酸 后 可 对 肠 产生 严重 的 损害 ,其 后 果 是 发 生 细 菌 感染 最 终 致死 (Kim et al. , 1987). 可 见 ,P450 酶 系 能 催化 代谢 各 种 不 同 组 织 中 具 生理 功能 的 内 源 性 底 物 。 了 解 这 些 酶 的 活性 与 水 平 的 调控 机 制 ,对 我 们 理解 各 种 不 同 的 生物 过 程 的 调控 是 很 重要 的 。 阐 明 这 些 酶 的 编码 基因 结构 ,将 对 P450 演化 历史 有 更 详细 的 了 解 。 对 代谢 内 源 性 底 物 的 各 型 P450 酶 的 研究 也 将 使 人 们 对 人 类 某 些 疾病 的 分 子 基础 有 更 深 的 了 解 。 细 胞 色素 P450 在 生物 对 致癌 物 的 反应 方面 也 是 非常 重要 的 ,在 某 些 情 况 下 ,致癌 物 不 会 引起 生物 损害 , 除 非 有 特异 P450 酶 存在 。 参考 xX 献 Abdelgadir S E, Resko J A, Ojeda SR et al. 1994. 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Berlin: Springer-Verlag, 169~181. 第 六 章 , 细 胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 严重 的 肝脏 疾病 会 导致 药物 代谢 障碍 的 发 现 已 40 年 ,但 仅 在 近 10 年 才 开始 对 其 中 某 些 酶 及 其 分 子 基 础 的 变化 进行 研究 。Farrell(1987) 综 述 肝 外 疾病 对 药物 代谢 的 影响 时 指出 ,除了 从 实验 动物 的 研究 结果 类 推 外 ,对 于 哪 种 疾病 能 够 改变 肝脏 药物 代谢 酶 活性 的 知识 所 知 甚 少 。 此 后 ,分 子 生 物 学 的 方法 使 研究 者 有 可 能 对 不 同 发 病 阶 段 药物 代谢 的 变 化 进行 详细 而 深入 的 研究 ,尤其 是 对 炎症 介质 参与 的 感染 以 及 内 分 泌 功 能 紊乱 。 本 章 主要 讨论 肝脏 疾病 中 CYP 表达 的 变化 ,也 涉及 其 他 方面 的 研究 进展 。 有 关 的 问 题 , 如 编码 细胞 色素 P450 的 CYP 基因 表达 的 改变 引起 的 某 些 疾病 的 临床 变化 也 都 将 包 括 在 内 。 6.1 细胞 色素 P450 对 肝病 的 影响 6.1.1 肝脏 P450 总 体 水 平 的 变化 许多 组 织 都 表达 CYP 基因 ,但 仅 有 肝脏 的 P450 酶 活性 极 高 ,在 药物 的 清除 中 起 重 要 的 作用 。 因 而 ,可 以 设想 肝脏 疾病 会 极 大 地 损害 肝 功 能 ,从 而 降低 其 药物 代谢 能 力 。 早 期 对 肝病 患者 药物 清除 功能 的 研究 倾向 于 支持 这 说 法 ,但 仍 不 是 很 明确 ,因为 在 某 些 情况 下 ,有些 药 物 的 清除 并 不 降低 (Nelson,1964; Farrell et al. ,1978; Morgan and McLean, 1995)。 此 外 ,一 些 病 生 理 因 素 如 肝脏 的 药物 释放 ( 肝 血 流 , 血 浆 蛋白 的 吸附 ) ,肝脏 的 摄取 功能 , 供 氧 量 以 及 胆汁 的 分 泌 都 能 改变 肝 硬 化 对 药物 的 清除 (Morgan and McLean, 1995). 但 这 些 变化 因素 不 能 解释 各 种 药物 的 代谢 差异 。 已 观察 到 严重 肝病 患者 肝脏 P450 总 体 水 平 及 相关 的 酶 活性 低 于 正常 水 平 (Farrell et al. , 1979a;Brodie et al. ,1981) 。 这 些 变化 在 很 大 程度 上 导致 药物 清除 和 肝脏 解毒 功 能 的 障碍 。P450 显然 比 P450 还 原 酶 或 II 相 酶 (如 参与 药物 和 省 体 反 应 的 葡萄 糖 醛 酸 基 转移 酶 (glucuronyl transferases)、 硫 化 酶 (sulphatase) .N -乙酰 转移 酶 (N-acetyl transferase) 以 及 氨基 酸 转 移 酶 (amino acid transferases)(Hoyumpa and Schenker,1991) 对 肝脏 疾病 的 影响 更 为 敏感 。 完 全 由 后 一 类 酶 催化 的 药物 代谢 功能 可 以 维持 到 肝病 晚期 。 实 际 上 ,有 些 研究 发 现 肝 硬 化 患者 单位 细胞 内 的 葡萄 糖 醛 酸 基 转 移 酶 含量 偏 高 (Debinski et al. , 1995) ,这 说 明 人 体 可 以 通过 补偿 性 的 上 调 作 用 来 抵消 功能 性 肝 细 胞 数目 减少 而 引起 的 功 能 障碍 。 人 类 P450 表达 的 显著 降低 仅 发 现 于 严重 的 肝病 患者 。 严 重 的 肝脏 病变 包括 进行 性 肝 功 衰竭 和 不 可 逆 的 肝 硬 化 。 但 是 ,在 可 逆 性 肝 硬 化 \ 胆 汁 瘀 积 (cholestasis) 中 度 和 轻 度 肝炎 、 脂 肪 肝 等 疾病 中 ,肝脏 总 体 P450 水 平 及 相应 酶 的 含量 都 在 正常 范围 (Brodic et al. , 1981). 肝 硬 化 是 慢性 肝病 的 终结 状态 。 其 形态 学 特征 是 粗 密 的 纤维 组 织 结缔 , 以 及 被 再 生 第 六 章 “细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 。 77 , 结 节 破 坏 的 肝脏 组 织 结构 。 肝 脏 微 循环 的 北 乱 ( 肝 守 周 围 组织 纤 维 化 或 者 毛细 化 ) 和 继 发 性 门静脉 高 压 ( 这 一 过 程 将 形成 肝 外 或 肝 内 旁 路 血 流 ) 会 导致 肝脏 血 流 变化 ,由 此 造成 的 药物 释放 减少 以 及 肝脏 摄取 功能 的 减弱 阻碍 了 肝脏 对 药物 的 快速 清除 。 其 次 , 肝 人 硬化 还 可 形成 扩散 屏障 从 而 减少 肝脏 的 供 氧 量 , 氧 是 P450 依赖 的 混合 功能 氧化 酶 的 底 物 之 一 , 由 此 也 导致 了 体内 药物 代谢 障碍 ( Morgan et al. ,1995; Hickey et al. , 1995, 1996). 一 般 在 直接 测量 肝 微粒 体 的 P450 依赖 药物 氧化 酶 活性 时 ,发 现在 肝 硬 化 患者 体内 的 活性 降低 。 但 在 研究 所 观察 到 的 变化 时 ,多 是 利用 肝 移 植 患者 的 被 置换 的 肝脏 ,它们 都 处 于 “ 极 严重 ”或 “不 能 救治 ”的 状态 ,因而 不 能 代表 临床 所 见 的 大 部 分 病例 。 另 一 个 必须 考虑 的 问题 是 ,肝脏 CYP 对 于 能 改变 其 表达 的 药物 因子 或 其 他 的 环境 因素 的 反应 程度 ( 表 6.1)。 曾 经 有 人 提出 “ 病 肝 "对 转录 调节 因子 对 蛋白 合成 的 影响 不 做 出 反应 。 除 急性 肝 功 衰竭 外 ,几乎 没有 证 据 支 持 这 一 假说 。 相 反 , 几 项 体内 研究 表明 大 多 数 硬 化 肝脏 仍 能 对 刺激 药物 代谢 的 多 种 物质 作出 反应 ,如 利 福 平 (rifampicin)、 导 眠 能 (glutethimide) (Farrell et al. ,1979b) 、 安 体 舒 通 (aldactone) (Miguet et al. , 1980). tH 等 (Joeres et al. , 1988; Coverdale et al. , 1995), 7“ HEAP A AFAR A P450 水 平 的 降 低 的 原因 尚 不 清楚 ,因为 对 CYP 基因 的 上 调 作 用 仍然 明显 存在 。 对 此 可 提出 一 种 可 能 的 解释 , 即 :CYP 表达 下 降 是 由 于 补偿 疾病 所 引起 的 肝脏 酶 量 减 少 ,导致 基因 调控 机 制 的 障碍 。 正 如 以 下 将 要 讨论 的 ,各 种 CYP 表达 的 具体 变化 支持 了 这 一 假说 。 表 6.1 肝脏 疾病 中 影响 细胞 色素 P450 表达 的 因素 疾病 相关 的 因素 遗传 或 环境 因素 疾病 严重 程度 药物 遗传 学 疾病 的 病 生理 类 型 , 是 否 伴随 胆汁 疹 积 药物 的 酶 诱导 作用 , 如 利 福 平 , 安 体 舒 通 门 脉 系统 旁 路 和 相应 的 激素 变化 吸烟 肝 细 胞 的 低 分 化 状态 其 他 疾病 ,如 糖尿 病 (diabetes mellitus) 营养 细胞 因子 6.1.2 各 种 CYP 表达 的 变化 早期 对 肝 微 粒 体 碎片 的 研究 表明 ,不 同 P450 J a A AY we BL (Iqbal et al. , 1990) ,这 是 不 同 肝脏 疾病 对 各 种 P450 BAB CYP 基因 的 不 同 影响 的 结 果 ( 表 6.2)。mRNA 水 平 的 改变 表明 这 一 变化 通常 发 生 在 翻译 前 水 平 。 但 即便 是 肝 功 能 衰竭 的 病人 , 某 些 CYP 的 表达 也 不 受 影响 ,并 且 在 药物 诱导 下 可 以 呈现 超生 理 水 平 的 表 io 6.1.2.1 CYPIA 在 人 类 肝 硬 化 患者 中 ,CYP1A2 mRNA 和 P450 1A 免疫 活性 蛋白 的 降低 最 为 显著 。 三 项 独立 的 研究 分 别 报道 了 这 种 变化 (Guengerich and Turvey, 1991; Lown et al. , 1992; - 78° 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 George et al. ,199$a,b) , 另 一 种 变化 由 P450 1A 催化 的 乙 氧 基 试 卤 灵 O - 脱 乙 基 酶 的 减 少 (Iqbal et al. , 1990; George et al. , 1995a). P450 1A 的 显著 降低 也 许 能 够 解释 为 什么 严重 肝病 患者 芳烃 羟 化 酶 活性 比 依赖 P450 3A 的 乙 基 吗 啡 N - 脱 甲 基 酶 (ethylmorphine N-demethylase) 活 性 降低 更 为 显著 (Farrell et wz . ,1979a) 。 各 种 类 型 的 肝 硬 化 患者 的 CYP1A 表达 都 降低 ( 表 6.2)。 表 6.2 ”肝脏 疾病 对 各 种 P450 蛋白 的 影响 肝 硬 化 类 型 P4501A2/% P4502C/% P4502E1/% P4503A/% 肝 细 胞 性 肝 硬 化 29» 57 81 25° AAR 18° 34> 49> 41 a: 各 种 P450 蛋白 水 平 用 其 与 对 照 组 平均 值 的 相对 百分比 表示 b: 表 示 与 对 照 组 有 显著 差异 (George et al. ,1995a) 肝病 中 茶 碱 (theophylline) (Colli et al. ,1988) 咖啡 因 (Desmond et al. ,1980) 以 及 安 蔡 比 林 (antipyrine) 代 谢 的 显著 变化 反映 了 CYP1A 表达 减弱 的 重要 性 (Farrell et al., 1978)。 尽 管 其 他 P450 (尤其 是 3A4,2C8 和 2E1) 在 某 些 情况 下 也 参与 反应 ,但 这 些 物质 主要 是 P450 1A 酶 催化 代谢 的 (Tassanceyakul et al. , 1994; Zhang and Kaminsky, 1995; Sharer and Wrighton,1996)。 在 进行 性 肝 硬化 如 慢性 病毒 性 肝病 以 及 原 发 性 胆 性 肝 硬 化 (primary biliary cirrhosis) 中 ,咖啡 因 和 安 蔡 比 林 的 代谢 减弱 较 早 出 现 (Williams and Far- rell, 1989; Coverdale et al .,1995)。 因 此 ,检查 肝脏 对 这 些 物质 的 清除 可 以 定量 描述 肝 功能 并 监测 肝病 的 发 展 (Farrell and Coverdale, 1998) 。 值 得 注意 的 是 ,香烟 可 以 在 很 大 程 度 上 诱导 P450 1A2 的 表达 (Sesardic et al . ,1988) 。 安 替 比 林 (Coverdale et al. , 1995), 咖啡 因 (Joeres et al. ,1988 ) 的 清除 都 表明 这 种 诱导 作用 在 肝 硬 化 阶段 仍然 存在 。 6.1.2.2 CYP2C 相对 CYPIA 而 言 ,这 一 类 基因 受 肝 病 影响 较 小 。 因 此 , 肝 硬 化 患者 对 一 种 P450 209 的 底 物 一 一 甲 糖 宁 (tolbutamide) 的 清除 仍 处 于 正常 水 平 (Nelson,1964) 。 另 一 方面 , 消 旋 的 甲 基 妥 英 可 以 作为 CYP2C19 的 探 针 , 这 种 酶 对 肝病 非常 敏感 (Adedoyin et al., 1998). Lown 等 (1992) 利用 单 克 隆 抗体 发 现 少数 病例 中 ,P450 2C9 蛋白 含量 有 微弱 减 少 , 但 P450 2C8 含量 不 变 。Guengerich 和 Turvey (1991) 用 一 种 亚 家 族 特异 性 抗体 以 及 相应 探 针 没有 发 现 P450 2C 蛋白 的 变化 。George 等 (199$) 在 “ 肝 细 胞 性 ?肝病 中 (如 慢性 肝炎 ) 也 未 发 现 明显 变化 。 相 反 , 由 于 胆汁 流动 受阻 (如 胆汁 次 积 ) 而 导致 肝 硬化 的 患者 体 内 P4502C 蛋白 含量 明显 降低 。 因 此 ,肝病 的 类 型 以 及 严重 程度 至 少 可 以 部 分 解释 以 上 不 同 的 研究 结果 。 6.1.2.3 CYP3A 在 这 一 类 基因 中 ,CYP3A4 是 肝脏 含量 最 为 丰富 的 P450 (A 40% ) ,能 够 催化 至 少 50% 现 用 药物 的 氧化 反应 (Guengerich et wz . ,1998)。 早 期 研究 仅 发 现 , 肝 硬 化 患者 的 CYP3A 表达 与 活性 只 有 微弱 变化 ,甚至 没有 变化 。 例 如 ,Guengerich 和 Turvey(1991 ) 发 现 人 肝 硬 化 中 P450 3A 蛋白 呈现 的 减少 趋势 不 显著 ,但 Lown 等 (1992 ) 发 现 CYP3A 活性 SAR ”细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 79 , 明显 降低 ,而 3A 蛋 白 含量 却 没 有 明显 变化 。 另 一 方面 ,药物 动力 学 的 研究 已 证 实 由 3A 蛋白 代谢 的 药物 如 利多 卡 因 (1lidocaine) (Huet and Villeneuve, 1983; Meyer-Wyss et al. , 1993)、 硝 葵 地 平 (Kleinbloesem et al. ,1986) 在 肝 硬 化 时 代谢 受阻 。 在 某 些 类 型 的 肝 硬化 中 ( 肝 细 胞 性 疾病 ) ,3A 蛋白 以 及 3A 蛋白 催化 的 军 酮 68 FEE 酶 (testosterone 6B-hydroxylase) 的 活性 明显 低 于 对 照 组 。 但 是 胆汁 次 积 性 肝 硬 化 中 ,3A mRNA 以 及 蛋白 的 水 平 变化 差异 很 大 ,但 其 平均 值 与 对 照 组 没有 显著 差异 。 有 趣 的 是 , 在 体外 利用 CYP3A 的 底 物 乙 基 吗啡 和 氮 基 上 比 林 来 测量 酶 活性 , 却 发 现 原 发 性 胆 性 肝 硬 化 和 其 他 肝脏 疾病 中 CYP3A 活性 都 明显 降低 (Farrell et al., 1979a; Iqbal et al., 1990) . 6.1.2.4 CYP2E1 人 类 肝脏 疾病 中 ,CYP2FE1 表达 的 差异 也 比较 大 。 例 如 Lown (1992) 4 9 例 晚期 肝病 中 并 未 发 现 CYP2E1 变化 ,但 是 ,Guengerich 和 Turvey (1991) 发 现 42 例 肝 硬化 病人 的 CYP2E1 平均 水 平 显 著 低 于 对 照 组 。Goerge 等 (1995$a) 的 研究 认为 CYP2E1 的 表达 与 疾病 类 型 有 关 。 与 CYP2C9 相似 但 与 CYP3A 相反 的 是 ,P450 2E1 蛋白 及 相应 的 酶 活 性 在 胆汁 疹 积 性 肝 硬 化 中 明显 降低 ,但 在 肝 细 胞 性 肝病 中 却 保持 正常 水 平 。 在 肝 细 胞 性 肝病 中 ,CYP2FE1 持续 表达 的 可 能 原因 之 一 是 酒精 和 糖尿 病 的 影响 。 众 所 周知 ,酒精 可 以 诱导 CYP2F1 的 表达 ,尤其 是 通过 翻译 后 水 平 的 调节 (Hu et al. , 1995; Lieber, 1997), 而 糖尿 病 可 在 mRNA 和 和 蛋白 水 平 提高 CYP2E1 的 表达 (de Waziers et ol .,1995)。 实 际 上 ,CYP2FE1 表达 增高 很 可 能 是 酒精 性 肝 硬 化 的 致 病因 素 之 一 (Nan- ji and Zakim, 1996; Lieber,1997)。 由 于 供 氧 量 减 少 , 肝 内 组 织 处 于 缺 氧 状态 。Weltman 等 (1998) 在 营养 性 脂肪 肝 模 型 动物 中 以 及 非 酒精 性 临床 脂肪 肝 患 者 (nonalcoholic steato- hhepatiti,NASH) 中 也 观察 到 CYP2FE1 表达 增高 ,后 者 肥胖 和 高 脂 血 症 中 尤为 常见 。 早 期 研究 发 现 NASH 病人 对 安 蔡 比 林 的 代谢 减弱 (Fiatarone et wl . ,1991) 。 有 些 体内 研究 结果 也 表明 NASH 患者 CYP2E1 活性 增高 (Leclerq et al. , 1996). 6.1.2.5 其 他 CYP 人 肝脏 疾病 中 其 他 CYP 变化 ,在 中 度 肝 脏 疾 病 中 , 胀 基 四 氢 异 唑 啉 (debrisoquin) 的 代谢 不 发 生 改 变 , 这 表明 CYP2D6 对 肝病 影响 有 一 定 的 耐 受 性 (Adedoyin et al., 1998). 大 鼠 的 同 源 和 蛋白 - CYP2D1 似乎 也 能 够 抵抗 肝 硬 化 的 影响 [以 心得 安 (propranolol) 的 羟 化 作用 为 指标 ](Fenyves et al. ,1993)。 可 以 反映 体内 P450 2A6 的 香 豆 素 7 - 羟 化 反应 的 活性 也 受到 肝病 的 影响 (Sotaniemi et al. ,1995)。 关于 人 胎儿 CYP347 ,目前 仍 不 知道 其 作用 底 物 的 特异 性 。 在 成 年 人 肝脏 中 , 这 个 基因 通常 不 表达 ,但 有 人 认为 它 在 某 些 肝 细胞 癌 中 表达 。 某 些 硬 化 肝脏 能 表达 CYP3A7 在 mRNA 水 平 ,但 尚 没有 关于 其 蛋白 表达 的 报道 。CYP3A7 的 表达 说 明了 肝 细 胞 的 低 分 化 状态 与 - 胎 球 蛋白 呈 负 相关 ,从 而 可 以 作为 瘤 前 病变 的 指标 之 一 ,但 对 此 仍 需 进一步 的 研究 。 - 80 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 6.2 肝脏 疾病 中 CYP 表达 变化 机 制 6.2.1 蛋白 表达 的 变化 对 肝病 患者 药物 代谢 酶 活性 降低 提出 了 各 种 各 样 的 解释 ,包括 蛋白 质 合 成 障碍 , 酶 的 抑制 或 破坏 ,功能 性 肝 细 胞 数量 减少 等 ,推断 营养 因素 也 可 能 改变 酶 活性 (George ef al., 1996)。 但 是 所 有 这 些 假说 都 不 能 很 好 地 解释 以 上 所 述 研究 结果 。 此 外 ,没有 证 据 表明 硬 化 的 大 鼠 肝脏 不 能 有 选择 性 地 合成 P450 蛋白 (Farrell and Zaluzny, 1984). AR BRE 25 FL (BDL) FY VAS | Ac AY BAT AR, FFA Se a. 3G P450 蛋白 及 了 P450 还 原 酶 的 普遍 降低 有 关 , 后 者 可 能 由 于 胆 酸 受 去 垢 剂 的 作用 而 破坏 ,因为 在 体外 用 胆 酸 培育 肝 微粒 体 可 以 引起 同样 的 变化 (Chen and Farrell,1996)。 然 而 ,没有 其 他 证 据 表 明 肝 硬化 患者 P450 酶 受到 损伤 (Farrell and Zaluzny, 1985) ,早期 研究 也 未 能 发 现 可 逆 性 酶 抑制 现象 。 另 一 方面 ,从 病理 学 角度 而 言 ,功能 性 肝 细 胞 数量 的 减少 可 以 很 好 地 解 释 患 慢性 肝病 时 药物 代谢 酶 的 变化 ,但 却 不 能 说 明 为 什么 P450 酶 比 开 相 酶 或 P450 还 原 酶 更 易 受 影响 (Hoyumpa and Schenker,1991)。 它 同样 不 能 解释 各 种 CYP 的 变化 的 差 异 。 6.2.2 mRNA 水 平 的 变化 人 类 移植 肝脏 CYP 表达 的 研究 清楚 地 表明 了 P450 蛋白 表达 的 改变 至 少 在 很 大 程 度 上 反映 了 CYP - 特异 性 mRNA 的 变化 ( 表 6.3) ,在 各 种 肝脏 疾病 中 ,CYP1A2 mRNA 水 平 显 著 降低 ,但 142 和 3A44 的 转录 水 平 大 致 与 相应 蛋白 的 变化 平行 (George et al., 199Sb)。 在 所 有 P450 2C 蛋白 中 , CYP2C9 mRNA 的 变化 最 为 显著 , 这 或 许 反 映 了 前 面 所 说 的 各 种 CYP2C 基因 表达 的 差异 。 在 胆汁 次 积 性 肝 硬 化 中 ,与 相应 的 蛋白 水 平一 致 , CYP2E1 mRNA 水 平 明 显 降低 ,但 在 肝 细 胞 性 肝病 中 P450 2E1 蛋白 只 是 发 生 轻 微 的 变 化 。 因 此 ,对 于 CYP2E1 而 言 ,mRNA 变化 与 对 应 蛋白 含量 的 变化 相关 性 不 大 ,这 很 可 能 反映 了 翻译 后 水 平 的 蛋白 稳定 性 调节 , 即 分 子 水 平 的 酶 诱导 性 蛋白 调节 (Hu et al., 1995; Lieber, 1997). 6.3 ” 肝 硬 化 时 ,CYP mRNA 与 肝脏 微粒 体 中 蛋白 的 关系 (George et al. ,1995a,b) 相关 系数 (>。) 6.2.3 肝 硬 化 模型 动物 肝病 模型 动物 可 用 于 研究 改变 CYP 表达 的 各 种 病 生 理 因 素 。 洪 在 的 相关 因素 包括 SNR “细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 .81 . 进行 性 肝 纤 维 化 , 肝 血 窦 毛 细 化 (capillarization) , 门 脉 系统 分 流 , 肝 组 织 再 生 以 及 胆汁 瘀 积 ( 表 6.4)。 肝 细胞 损伤 ,细胞 因子 以 及 内 源 性 或 外 源 性 CYP 诱导 因子 也 可 以 影响 CYP 的 表达 ( 表 6.5)。 早 期 研究 中 ,Murray 和 Farrell(1984) 利 用 底 物 结合 光谱 的 间接 方法 ,证 明了 反复 用 CCl, 处 理 或 仅 用 肝脏 毒剂 一 次 处 理 导 致 肝 硬化 的 病 鼠 体内 各 种 CYP 的 变化 并 不 相同 。 随 后 的 研究 表明 这 与 雄性 特异 的 CYP (2C11 和 442 ) 表 达 降 低 有 关 (Murray et al .,1987a,b)。 这 种 变化 类 似 于 去 雄性 化 (demasculinization) ,但 应 用 雄 激素 不 能 逆转 这 种 变化 。 表 6.4 肝脏 疾病 中 影响 P450 表达 的 病 生 理 因 素 (Hasler et al. ,1999) (1) 肝 细胞 损伤 ,蛋白 合成 障碍 (5) 门 脉 系统 旁 路 形成 (2) 肝 细胞 质量 降低 《6) 肝 细胞 再 生 〈 分 化 细胞 呈 低 分 化 ,高 增殖 状态 ) (3) 进 行 性 肝脏 纤维 化 (7) AE RR (4) AF iin SS EA ohh 4G (8) RAE ,细胞 因子 6.5 细胞 因子 对 肝 细 胞 CYP 表达 的 影响 (Hasler et al. ,1999) 细胞 因子 CYP 物种 /实验 体系 变化 备注 , 文献 TNF-a 2C11, 3A2 KR (雄性 ) mRNA 和 和 蛋白 下 降 Nadin et al. ,1995 1A,2C11, 培养 大 鼠 肝 mRNA 和 蛋白 下 降 Chen et al., 1995; Carlson and 2B1/2,3A2 aid Billings 1996 1A,3A4 培养 人 肝 细 “ 利 福 平 的 诱导 受阻 ; 对 1A 作用 = Muntane-Relat et al. ,1995 胞 最 强 ; 1Al 结构 基因 表达 减少 IL-1(IL-18) 1A, 2C11, FFA RE mRNA 7 & A OP OB; 影响 Chen et al., 1995; Carlson and 2B1/2,3A2 细胞 CYP2C11 的 转录 Billings 1996 IL-la 1A,3A4 培养 人 肝 细 “ 利 福 平 的 诱导 受阻 ; 对 CYP 4 © Muntne Relat et al. (1995) 胞 构 基 因 表 达 没 有 影响 IL-2 1A1,2B,2C “培养 大 鼠 肝 ”蛋白 含量 减少 ,2C11 A3A2H IL-2 受 体 抗体 和 酪 氨 酸 激 酶 抑 11,2D1,3A 细胞 mRNA 水 平 降低 制剂 可 阻 断 其 下 调 作 用 ; Tinel et al. (1995) IL-4 培养 人 肝 细 mRNA 水 平 降 低 , 影 响 CYP2C11 Abdel-Razzak et al. (1993) 胞 的 转录 IL-6 2C11 培养 大 鼠 肝 AES BAT XT 3A4 作用 最 “Chen et al. (1995) 细胞 强 ; 对 CYP 结构 基因 表达 没有 3A4 “hg ARR ma Muntne-Relat et al. (1995) FRR-o/8 1A, 3A (可 A, KAD 安 替 比 林 , 茶 碱 , 氨 基础 啶 , 红 霉 能 ) . 究 素 的 代谢 降低 3A2 雄性 大 鼠 3A2 蛋白 及 mRNA 含量 降低 Craig et al. (1990) 1A,2B1,3A 小 鼠 1A1,2B1,3A 蛋白 含量 降低 Carelli et al. (1996) FRE-y | 3A2,3A23 大 鼠 ; 培养 ”3A2 和 蛋白 及 3A2,3A23mRNA 含 ”Tapner et al. (1996) 大 鼠 肝 细胞 ” 量 降 低 , 葵 巴 比 妥 诱导 阻 断 Murray 等 (1992) 研 究 CYP2C11 和 3A2 表达 的 降低 与 肝 硬 化 发 展 阶段 的 关系 发 现 , 利用 一 种 无 胆 碱 (CD) 营养 全 面 的 饲料 喂养 实验 动物 ,会 导致 脂肪 肝 和 进行 性 的 肝 纤 维 化 。 在 25 一 30 周 时 ,大 多 数 实验 动物 都 发 生 肝 硬化 ,其 形态 变化 类 似 于 酒精 性 肝 硬化 或 NASH 性 肝 硬 化 。 在 喂 饲 上 述 饲 料 6 周 时 , 肝 微粒 体 P450 总 体 水 平 保持 正常 ,但 10 周 时 ,P450 含量 降 到 对 照 组 的 73% ,这 一 变化 在 很 大 程度 上 归 因 于 CYP2C11 的 表达 减少 。 。 82 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 同时 ,P450 3A2 蛋白 的 酶 活性 也 降低 了 50% ,其 他 P450 的 酶 活性 仅 有 轻微 的 变化 ,此 后 P450 2C11 蛋 白 一 直 维 持 在 极 低 水 平 ,而 其 他 P450 蛋白 仍 没有 明显 变化 。 在 6 一 10 周期 间 的 关键 变化 在 病理 学 的 水 平 上 来 看 ,10 周 时 肝 纤 维 化 早期 表现 较 明 显 ,但 不 是 在 6 周 。 门 静脉 压 与 对 照 组 相 比 在 10 周 时 仅 轻 度 增 高 ,到 25 周 时 ,变化 仍 不 显著 。10 周 时 最 明显 的 是 血清 生化 指标 的 变化 ,尤其 是 血清 中 胆 酸 的 变化 (Azer et al., 1993) ,这 似乎 是 门 脉 系统 分 流 的 初期 征兆 ,随后 则 是 肝 血 的 毛细 血管 化 (Fenyves et al., 1993; Gariepy et al .,1993)。 在 10 周 时 ,血清 中 肉 二 醇 (estradiol) 的 浓度 也 显著 增高 ,但 雄 激 素 水 平 不 变 (Murray et al., 1992). 30 周 时 ,血清 雄 激 素 含 量 开 始 降低 ,在 肝 硬 化 的 雄性 大 鼠 体 内 , 雄 激素 水 平 非常 低 。 由 此 可 以 得 出 结论 ,喂食 CD 动物 10 周 后 肝脏 开始 纤维 化 ,导致 门 脉 系 统 分 流 而 使 WE Be Ze FAP AE RA (Farrell et al., 1988). MEHR WR A BW > A HE HF FE 10 周 时 CYP2C11 的 表达 降低 ,因为 其 血清 含量 尚未 改变 。 但 是 , 雌 二 醇 通 过 影响 垂体 生长 激素 分 沁 而 导致 雄性 特异 的 CYP 的 下 调 作 用 (Ho and Weissberger,1990) 。 因 此 , 肉 二 醇 使 雄 性 生长 激素 的 分 泌 从 常规 的 脉冲 式 模式 (分 泌 脉 冲 间 隔 为 3 一 4 小 时 ,脉冲 间隔 期 激素 水 平 极 低 几乎 不 可 测量 ) 转 变 为 肉 性 分 刻 模 式 ( 即 较 高 的 基础 水 平 以 及 不 明显 的 分 刻 峰 )。 应 该 指出 的 是 :生长 激素 的 分 记 模 式 是 大 鼠 肝 脏 性 别 依赖 性 CYP 表达 的 关键 决定 因素 (Waxman et al. ,1990,1995; Robertson et al. , 1998). 6.2.4 | JRkKAB aC IK) 对 一 种 门静脉 旁 路 模型 大 鼠 的 研究 (门静脉 结扎 PVL) (Cantrill et al. , 1989; Jiang et al., 1994) ,证 明 门 脉 系统 分 流 是 影响 大 鼠 肝 脏 CYP 表达 的 病 生 理 因素 。 门 静脉 结扎 后 P450 总 体 水 平 降低 几乎 完全 是 由 于 CYP 2C11 和 342 表达 减少 所 致 (Jiang et al., 1994)。 并 且 , 这 种 变化 发 生 于 翻译 前 水 平 , 因 为 相应 的 mRNA 含量 也 降低 ,其 中 CYP2C11 mRNA 最 终 降 至 为 零 (Jiang et wzl. ,1994)。PVL 还 与 血清 中 雄 激素 含量 降低 和 雌 激素 水 平 增高 有 关 ,这些 变化 与 促 性 腺 素 量 和 促 雄 激素 水 平 降低 有 关 , 这 表明 中 枢 性 (下 丘脑 -垂体 系统 ) 调 控 机 制 的 存在 (Farrell et o. ,1986)。 下 丘脑 切除 的 大 鼠 表现 出 类 似 的 激素 变化 (Zaphiropoulos et al. , 1989) ,利用 甲 基 尝 酮 (methyl testosterone) 并 不 能 使 PVL 大 鼠 CYP2C11 表达 的 变化 逆转 (Farrell et al. ,1986) 。 相 关 的 研究 表明 门静脉 旁 路 可 以 通过 几 种 途径 导致 血清 雌 二 醇 含量 增高 (Farrell et al. ,1988) ,其 中 包括 肝 外 性 激 素 ( 尤 其 是 雄 激 素 ) 转化 为 肉 二 醇 的 途径 (Farrell and Koltai, 1988) ,这 主要 是 由 于 肝脏 雄 激素 16a - 羟 化 反应 以 及 使 肉 二 醇 变 为 峻 三 醇 的 16a - 羟 化 作用 减弱 所 致 (Cantrill et al. 1989)。 如 果 在 PVL 和 肝 硬 化 时 , 主要 是 雌 二 醇 介 导 了 CYP2C11 的 下 调 作 用 ,那么 可 以 预 测 PVL 与 雄性 生长 激素 (GH) 分 泌 模 式 的 改变 有 关 , 如果 内 源 性 GH 分 泌 被 抑制 , CYP2C11 的 持续 性 表达 则 是 外 源 性 GH 补偿 性 作用 的 结果 。 尽 管 PVL 确实 通过 提高 GH 的 基础 水 平 而 改变 了 雄性 的 脉冲 式 分 刻 模 式 , 但 是 这 方面 的 结论 仍 不 是 很 明确 。 第 六 章 “” 细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 83> 6.2.5 肝脏 再 生 肝脏 再 生 是 肝 硬 化 的 另 一 致 病因 素 ,部 分 切除 大 鼠 肝 脏 (PH) 可 刺激 肝脏 再 生 并 使 其 CYP 的 表达 发 生变 化 (Ronis et cl . ,1992 )。 早 期 研究 (Fouts et wy . ,1961) 已 注意 到 手 术 麻醉、 断食 等 非特 异性 作用 可 以 使 肝 切 除 大 鼠 及 假手 术 对 照 组 大 鼠 中 多 种 P450 催化 酶 的 活性 暂时 抑制 (48h)。 此 后 ,雄性 大 鼠 仅 有 雄性 特异 性 CYP (2C11 和 3A2 ) 受 到 抑 制 。 免 疫 定 量 测定 也 证 实 了 这 一 现象 (Ronis et wy. ,1992)。 这 些 变化 与 血清 中 肉 二 醇 含 量 增高 以 及 睾酮 降低 有 关 (Liddle et w. ,1989) 。 在 肝 切 除 的 病人 中 也 观察 同样 的 激素 变化 (Liddle ,1992 ,但 仍 不 清楚 这 些 变化 是 否 改变 了 临床 肝病 患者 CYP 的 表达 。Ronis 等 (1992 ) 发 现 肝脏 部 分 切除 的 雄性 大 鼠 手术 后 生长 激素 的 分 泌 受 到 暂时 抑制 ,但 并 不 确 定 这 是 否 可 以 解释 CYP2C11 和 3A 表达 的 短暂 变化 (Liddle et al. , 1989). 6.2.6 胆管 结扎 的 大 鼠 对 胆管 结扎 大 鼠 (BDL) 的 研究 也 证 明 多 种 因素 的 复杂 相互 作用 导致 肝病 CYP 表达 变化 。 胆 道 结扎 可 以 引发 严重 的 胆汁 次 积 和 肝 细 胞 损伤 ,并 与 P450 蛋白 及 P450 还 原 酶 的 普遍 降低 有 关 , 但 这 可 能 是 由 于 胆 酸 的 破坏 性 作用 所 致 (Chen and Farrell, 1996). BR 了 普遍 的 非特 异性 的 降低 外 ,雄性 特异 的 CYP (2C11 和 3A2) 的 降低 尤其 显著 。 表 现 之 一 就 是 雄性 大 鼠 总 体 P450 降低 程度 (50% ) 远 大 于 雌性 大 鼠 (30% ) (Chen et al. ,1998 ) , 这 可 能 因为 CYP 2C11 和 3A42 转录 减弱 所 致 (Chen et al. , 1995). 相反 , 胆管 结扎 雌性 大 鼠 仍 能 在 mRNA 的 蛋白 水 平 持续 表达 CYP2C12 和 3A2 (Chen et al. ,1998) 。 不 同 于 前 面 讲述 的 其 他 模型 动物 ,胆管 结扎 的 雄性 大 鼠 在 胆管 结 扎 后 , 仍 能 表达 雌性 特有 的 CYP2C12 (在 mRNA 和 蛋白 水 平 ) ,这 一 过 程 被 称 作 雌性 化 。 值得 注意 的 是 肉 二 醇 的 增加 是 两 性 大 鼠 胆 管 结扎 后 非常 突出 的 激素 变化 ,尽管 雄性 大 鼠 血清 睾酮 的 含量 也 有 所 降低 。 除 去 雄性 化 (demasculinization) 以 外 , 雌 二 醇 还 能 使 雄性 大 BBUHE HE 1k, (feminization) (Chen et al. ,1998) 。 血 浆 性 激素 水 平 的 变化 及 其 对 垂体 生长 激 素 分 泌 的 影响 ,很 可 能 在 转录 后 水 平 改 变 了 CYP 2C11 ,3A2 和 2C12 的 表达 。 由 此 可 以 总 结 肝病 中 P450 表达 的 变化 包括 :破坏 性 作用 引起 的 非特 异性 改变 ,内 源 性 激素 调节 导致 的 CYP 特异 性 下 调 作 用 ,以 及 转录 激活 因子 累积 产生 的 上 调 作 用 。 但 是 在 实验 动物 中 观察 到 的 性 别 特异 性 CYP 变化 是 否 与 人 类 变化 一 致 仍 需 深入 研究 。 不 过 ,激素 显然 能 在 “结构 基因 ”水平 调节 人 类 CYP WRK. 6.3 ”病毒 感染 .疫苗 注射 以 及 炎症 因子 对 肝脏 P450 的 影响 病毒 感染 疫苗 注射 卡介苗 (BCG) 接 种 以 及 细菌 感染 都 可 通过 影响 肝脏 P450 表达 而 使 药物 代谢 发 生 障碍 。Farrell 等 对 此 有 详细 的 讨论 (Farrell,1987; Morgan, 1993; Shedlofsky et ww . ,1994)。 尽 管 在 实验 条 件 下 ,大 鼠 的 感染 性 损伤 与 肝脏 P450 表达 的 降 低 有 关 (Muntane et al. , 1995) ,但 仍 不 知道 人 体 在 非 感染 条 件 下 以 炎症 扩散 为 特征 的 疾 病 中 (如 类 风湿 性 关节 炎 (rheumatoid arthritis) 、 结 节 病 (sarcoidosis) 和 局 限 性 回肠 炎 病 - 84° 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 (crohn s disease) 是 否 会 发 生 相 似 的 变化 。 6.3.1 内 毒素 与 肿瘤 坏死 因子 - a 内 毒素 ( 脂 多 糖 lipopolysaccharide) 肿瘤 坏死 因子 - a( tumor necrosis factor-a) 白细胞 介 素 -1(CIL-1) 和 白细胞 介 素 - 6(IL-6) 都 是 CYP 表达 变化 的 可 能 介 导 因子 (Shedlofsky et al. ,1987; Wright and Morgan, 1991; Chen et w/ . ,1992) 。 两 次 给 自愿 者 注射 内 毒素 就 能 显著 降低 安 替 比 林 \ 葵 巴 比 妥 和 茶 碱 类 药物 的 代谢 ,而 这 种 变化 与 TNT-2 和 IIL-6 的 大 量 释放 呈 平 行 关 系 (Shedlofsky et al., 1994)。 同 样 给 大 鼠 注 射 内 毒素 可 以 在 转录 水 平 降低 CYP2C11 和 2C12 的 表达 (Morgan,1989 ) 。 TNF-a 能 在 mRNA 和 蛋白 水 平 使 雄性 大 鼠 CYP2C11 和 34 表达 减少 (Nadin et al. , 1995), TNF-a, IL-1, IL-6 可 以 下 调 培养 大 鼠 肝 细胞 的 CYP1A, 2C11.2B1/2.3A2 的 表达 (Chen et al. , 1995; Carlson and Billings,,1996) 。 还 有 研究 表明 IL-1 和 IL-6 可 与 结 构 基 因 启 动 子 内 的 DNA 序列 (5 端 上 游 200 个 碱 基 处 ) 相 互 作 用 从 而 影响 CYP2C11 的 表达 (Chen et al., 1995). 6.3.2 白细胞 介 素 (interleukins ) 除 IL-1 和 IL-6 9h, IL-2 也 可 使 培养 大 鼠 肝 细胞 内 多 种 CYP 表达 下 降 , 其 中 包括 P450 1A1,2B,2C11,2D1 和 3A(Tinel et al .,1995)。P450 2C11 #13A2 的 mRNA 水 平 也 相应 降低 ,加 入 IL-2 受 体 抗体 或 酷 氨 酸 激酶 抑制 剂 一 一 染料 木 素 (genistein) 可 以 阻止 IL-2 的 下 调 作 用 ,这 为 受 体 活化 的 信号 转 导 系统 参与 调节 提供 了 明确 的 证 据 (Tinel et al. ,1995)。 6.3534 aE 干扰 素 是 另 一 类 可 改变 CYP 表达 的 炎症 性 细胞 因子 。 给 病人 服用 o Al BHR AT 降低 安 蔡 比 林 (Williams and Farrell, 1986; Israel et al., 1993). 3¥ Bik ( theophyline ) (Okuno et al., 1993). 2L% & (erythromycin) (Craig et al. , 1993), BE HE OK ( amion- pyrine)(Horsmans et al. ,1994) 及 其 他 药物 的 代谢 (Israel et al. 1993). THAAD, a.B.y 干扰 素 可 降低 大 鼠 CYY3A2 表达 (Craig et 吧 . ,1989,,1990)。 对 大 鼠 培 养 细 胞 的 研究 证 实 了 IFN-Y 可 能 通过 受 体 与 细胞 直接 作用 从 而 导致 降低 CYP3A 亚 家 族 成 员 (3A2 和 3423 ) 的 mRNA 表达 (Tapner et al., 1996). IFN-a 不 影响 CYP2C11 的 表达 ( Tapner et al. , 1996) 。 其 他 研究 还 发 现 干扰 素 和 其 他 细胞 因子 (ILL-la,IL-4,IL-6) 对 体外 培养 的 人 肝 细 胞 CYP 表达 有 多 种 影响 (Abde-Razzak et al. ,1993; Muntane-Relat et QL.,1995)。 至 此 ,可 以 清楚 地 看 出 干扰 素 以 及 其 他 细胞 因子 (尤其 是 TNF-u) 可 以 通过 改变 基因 的 转录 而 影响 CYP 的 表达 。 对 参与 CYP 转录 调控 的 干扰 素 受 体 信和 号 系统 的 分 子 机 制 尚 需 进 一 步 的 研究 。 第 六 章 ”细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 85° 6.3.4 对 酶 诱导 作用 的 影 啊 干扰 素 也 可 以 减弱 某 些 P450, 如 2B 和 3A 蛋白 以 及 苯 巴 比 妥 的 催化 活性 (Carelli et al. , 1996; Tapner et al. ,1996) ,3-F SEAR RASH 1A 蛋白 酶 活性 和 8B- 葵 黄酮 (naph- thoflavone) 的 诱导 作用 (Carelli et aw. ,1996)。 有 报道 氧化 氮 参 与 IL- 18 和 TNF-a 对 CYP 的 下 调 作 用 ,但 不 参与 IL -6 的 下 调 作 用 (Carlson and Billing, 1996). Muntane-Re- lat 等 (1995) 对 体外 培养 人 肝 细 胞 的 研究 证 明 IL -6 可 以 减弱 P450 3A4 诱导 作用 ,TNF-a 则 能 阻碍 P450 1A 的 诱导 ,TNF-a 也 可 使 CYP1A 表达 降低 5S0% ,{8 IL- 1a fl IL-6 # 不 能 改变 CYP 结构 基因 的 表达 。 了 解 CYP 表达 的 改变 ,对 确定 感染 性 疾病 (如 HIVVZAIDS) 的 药物 治疗 方案 具有 指导 意义 。 应 当 注 意 的 是 药物 相互 作用 引起 的 CYP 表达 或 P450 相关 的 药物 代谢 酶 活性 的 变化 比 细胞 因子 的 作用 强 。 药 物 间 相互 作用 将 是 HIV/AIDS 治疗 的 主要 问题 (Flexner, 1998)。 特 别 是 利 福 平 (一 种 抗 霉菌 的 关键 药物 ) ,是 CYP3A4 的 强 诱导 剂 (Muntane-Relat et al. , 1995) ,同时 服用 利 福 平 将 加 速 蛋白 酶 抑制 剂 (尤其 是 indinovin 和 nelfinavir) 的 代 谢 , 因 此 抗 逆转 录 病 毒 的 作用 将 减弱 甚至 丧失 。 同 样 ,蛋白 酶 抑制 剂 和 其 他 P450 3A4 底 物 (ektoconazole,terfenadrine,erythromycin 和 midazolam), 也 可 发 生 相 互 作 用 ,对 此 Flexner 有 详细 的 综述 (Flexner,1998) 。 这 种 相互 作用 可 能 使 血液 中 药物 的 含量 增高 , 因 此 两 种 蛋白 酶 抑制 剂 同 时 应 用 可 以 增加 药 效 ,但 同样 可 能 导致 药物 毒性 。 炎 症 反 应 是 由 于 药物 和 药物 相互 作用 下 调 CYP3A4 的 表达 ,还 是 由 于 干扰 了 P450 3A4 的 诱导 所 引起 , 至 今 仍 是 一 个 疑问 。 6.4 甲状 腺 疾病 70 年 前 就 已 发 现 甲 状 腺 功能 亢进 或 甲状 腺 功能 低 的 病人 对 药物 的 敏感 性 发 生 改 变 (Shenfield,1981; Farrell,1987) 。 这 种 变化 包括 药物 代谢 的 改变 以 及 非 药物 代谢 的 生理 改变 (Shenfield,, 1981)。 对 实验 动物 的 研究 表明 甲状 腺 功能 低下 通常 与 肝脏 P450 及 P450 还 原 酶 水 平 降低 有 关 ,在 切除 甲状 腺 或 下 丘脑 的 实验 大 鼠 中 ,三 碘 四 腺 原 氨 酸 (T3 ) 可 以 刺激 依赖 P450 的 药物 氧化 作用 (Farrell,1987)。 有 的 研究 还 发 现在 甲状 腺 中 毒 时 (循环 血 量 中 T3 含量 过 高 ) , 安 蔡 比 林 (antipyrine) 的 代谢 增强 ,其 半衰期 缩短 40% ,甲状 腺 中 毒 纠 正 后 ,药物 清除 也 随 之 加 快 。 甲 状 腺 中 毒 也 与 使 峻 激素 转化 为 儿 茶 酚 肉 激 素 的 2 - 羟 化 作用 的 增强 有 关 (Fishman et al., 1965; Ruder et al., 1971), xX *+} RMAF P4501A 和 一 种 或 几 种 P450 3A 蛋白 催化 的 (Aoyama et wl . ,1990)。 但 是 ,所 观察 到 的 甲 状 腺 机 能 亢进 导致 依赖 P450 的 药物 清除 的 变化 并 不 能 说 明 P450 的 普遍 增高 ,因为 苯 妥 英 (phenytoin)(P450 2C18) 心得 安 (propranolo)(P450 2D6) 以 及 苹 丙 酮 香 豆 素 (warfarin ) ( 几 种 P450) 的 代谢 并 不 改变 (Farrell,1987) ,但 可 的 松 的 68 - 羟 化 作用 (反映 P450 3A4 的 活性 ) 明 显 减 弱 (Yamagi et oz. ,1969) 。 相 反 ,甲状 腺 功能 低下 常常 与 68 - 羟 化 作用 的 加 强 和 安 奉 比 林 代谢 障碍 相关 。 现在 ,对 体外 培养 人 肝 细 胞 CYP 表达 调控 的 研究 可 以 部 分 解释 循环 血 量 中 碘 化 甲 - 86: 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 状 腺 所 酸 (T3) 浓 度 变 化 所 导致 的 药物 代谢 改变 (Liddle et al. ,1998)。 甲 状 腺 素 被 认为 是 CYP3A4 的 负 调 控 因 子 , 很 可 能 在 转录 水 平 发 生 作 用 ,同时 又 是 CYP1A2 的 正 调控 因 子 。T3 的 代谢 与 糖 皮质 激素 和 生长 激素 有 复杂 的 相互 作用 。 在 体外 ,三 种 激素 可 以 直接 作用 于 肝 细 胞 并 调节 CYP3A4 的 表达 (Liddle et al. , 1998) 。 在 疾病 状态 下 ,垂体 激素 和 T3 对 糖 皮质 激素 分 记 及 代谢 的 影响 以 及 垂体 激素 对 T3 分 记 的 影响 ,将 产生 更 为 复杂 的 相互 作用 。 6.5 垂体 疾病 和 生长 激素 治疗 生长 激素 (GH) 和 T3 可 以 下 调 大 鼠 肝 脏 CYP3A2 的 表达 (Waxman et al., 1990), CYP2C11 ,2C13 ,3A18 在 雄性 大 鼠 体内 表达 需要 脉动 地 分 泌 生 长 激素 和 很 低 的 水 平 (Pampori and Shapiro, 1996; Robertson et al., ,1998) 。 生 长 激素 分 记 不 足 的 儿童 , 茶 碱 (theophylline) 的 清除 降低 , 而 咖啡 因 和 蜡 戊 巴 比 妥 (amobarbital) 的 代谢 却 增 强 (Levitsky et Q! .,1989)。 生 长 激素 蔡 代 疗 法 可 以 扭转 这 种 变化 。 生 长 激素 缺乏 的 成 年 人 表现 为 安 替 比 林 代谢 障碍 ,利用 重组 生长 激素 替代 治疗 也 可 以 使 这 种 变化 逆转 (Cheung et al., 1996 ) 。 已 有 证 明 GH 可 以 显著 增加 培养 的 人 肝 细 胞 CYP3A4 的 表达 , 这 种 上 调 作 用 发 生 在 翻译 前 水 平 (Liddle et al. ,1998) 。 此 外 ,GH 的 诱导 作用 与 地 塞 米 松 (dexamethasone) 相 当 , 后 者 是 P450 3A 酶 的 诱导 剂 。 对 于 甲状 腺 功能 紊乱 未 治疗 时 ,垂体 对 碘 化 甲状 腺 氢 基 酸 和 糖 皮质 激素 的 释放 及 次 级 代谢 作用 ,使 得 体内 CYP 表达 的 变化 更 为 复杂 。 到 目 前 为 止 , 仍 不 能 确定 在 GH 正常 状态 下 GH 替代 治疗 是 否 改变 了 肝脏 CYP 的 表达 并 影响 药物 代谢 速率 。 6.6 其 他 疾病 在 许多 疾病 中 ,都 发 现 患 者 药物 代谢 发 生 改 变 (Farrell,, 1987) ( 表 6.6) ,这 些 疾病 包 括 糖 尿 病 、 癌 症 、 肺 心病 以 及 肾 功能 衰竭 。 有 人 提出 CYP 表达 的 个 体 差异 ,在 某 些 尚 不 了 解 的 疾病 中 如 在 高 血压 中 起 重要 作用 (Ghosh et al. ,1995)。 通 常 在 这 些 疾 病 中 CYP 表达 的 变化 不 如 肝病 ,感染 炎症 以 及 内 分 沁 紊 乱 等 典型 。 此 外 ,在 这 些 疾病 及 其 他 一 些 常见 病 ( 瘾 痛 、 哮 喘 、 胃 溃疡 ) 中 ,治疗 引起 的 药物 代谢 改变 似乎 比 病理 因素 导致 的 代谢 改 变更 为 重要 。 表 6.6 内 分 泌 吉 乱 对 肝脏 药物 代谢 的 影响 Kal 观察 解释 文献 甲状 腺 中 毒 刺激 安 替 比 林 的 代谢 ; CYPIA (或 2C9 和 3A4) EE =“ Farrell (1987) (甲亢 ) 增强 HERR WY 2 - 羟 化 作用 加 强 CYP1A 和 3A Fishman et al. (1965); Ruder et al. (1971); Aoyama et al. (1990) ERK, 心得 安 , FAMES CYP 2C18 2D1 没有 变化 Farrell(1987) 素 的 清除 没有 变化 BNR MMAR P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 87° 续 表 可 的 松 的 68- 羟 化 作用 减弱 P450 3A4 活性 降低 Yamagi et al. (1969) FAR AR DORE IK | CYP1A (3% 2C9 和 3A4) 活性 = Farrell, (1987) 下 减弱 可 的 松 的 68- 羟 化 作用 加 强 。”CYP 3A4 活性 增高 Yamagi et al. (1969) ERBRAE AAR SS CYP 1A 和 /成 3A4 活性 减 Redmond et al. (1980) 53, 1A, 2B, 3A 活性 增强 生长 激素 替代 ”咖啡 因 和 异 戊 巴 比 妥 的 代谢 Levitsky et al. (1989) 疗法 的 纠正 作 “增强 CYPIA (或 2C9 和 3A4) 活性 ”Cheung et al. (1996) 用 安 蔡 比 林 代谢 减弱 减弱 6.7 细胞 色素 P45S0 和 癌症 细胞 色素 P450(CYP) 有 广泛 的 作用 底 物 ,因而 它们 在 致癌 化 合 物 的 代谢 方面 起 着 很 重要 的 作用 。 大 多 数 化 学 致癌 物 一 一 无 论 是 外 源 性 的 还 是 内 源 性 的 (如 委 体 激素 ) 都 需 经 生物 转化 激活 ,CYP 在 这 种 生物 激活 中 起 重要 的 作用 。CYP 也 是 抗 癌 药 物 的 生物 转化 因 子 ,能 够 增强 或 减弱 药物 的 疗效 。 在 种 群 内 ,有 的 CYP 具有 几 种 基因 型 ,其 相应 的 表 型 对 致癌 物 或 者 抗 癌 药 物 敏 感性 不 同 。 肿 瘤 组 织 和 正常 组 织 CYP 表达 的 差异 为 抗 癌 药 物 选择 性 地 作用 于 机 体 提供 了 依据 ,使 药物 作用 局 限于 肿瘤 组 织 。 6.7.1 致癌 物质 的 生物 活化 实验 动物 的 研究 表明 CYP 可 以 激活 外 源 性 致癌 物 (Guengerich,1988a; Kawajiri and FujiKuriyama,1991)。 此 外 ,在 模型 动物 中 , 某 些 内 源 性 激素 经 由 CYP 催化 转变 成 致癌 物 。 因 此 可 以 推测 ,人 类 CYP 超 家 族 的 成 员 参 与 外 源 性 或 内 源 性 致癌 物 前 体 的 生物 激活 作用 (Nedelcheva and Gut, 1994; Guengerich,1991) 。 6.7.1.1 外 源 性 致癌 物 借助 于 一 些 体 外 系统 ,对 人 类 CYP 激活 几 类 外 源 性 致癌 物 的 能 力 进行 了 研究 (图 6.1) ,主要 是 确定 哪 种 CYP 参与 激活 致癌 物 前 体 。 利 用 体外 检测 系统 已 确定 了 某 些 活 化 的 致癌 物 前 体 的 致 突变 能 力 (Guengerich et 迟 . ,1996)。 其 他 的 一 些 代谢 步骤 (包括 环 氧 化 物 水 化 酶 对 环 氧化 物 中 间 代 谢 物 的 水 解 作 用 或 者 工 相 蛋 白 的 偶 联 反应 ) 对 于 最 终 决定 外 源 物质 呈现 正 或 负 的 致癌 效果 有 重要 作用 。 ao Love HO OH O 多 环 芳 烃 化 合 物 的 两 步 环 氧化 “188 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 8 aes 杂 环 芳 族 化 合 物 直接 环 氧化 全 二 FO lO] NH, oe sess 芳 基 胺 或 杂 环 化合 物 的 胺 基 取 代 化合 物 的 N -羟基 化 作用 H,C— N—CH, H,C-N—CH,OH [H,C—N=N—OH]+HCOH 一 CH + N,+H,O 亚 硝 胺 的 C -羟基 化 作用 图 6.1 细胞 色素 P450 催化 致癌 物 前 体 的 生物 活化 作用 (Hasler et al. ,1999) 早期 对 路 齿 类 动物 的 研究 表明 葵 并 蔚 首先 被 CYP1A1 环 氧化 ,然后 由 环 氧 化 物 水 解 酶 (epoxide hydrolase) 形 成 相应 致癌 物 前 体 一 一 二 羟基 化 合 物 ( 二 氧 二 醇 dihydrodiol) ,最 终 再 一 次 被 CYP1A1 氧化 形成 致癌 物 一 一 二 醇 环 氧化 物 (diolepoxide) 。 葵 并 蔚 的 7,8 -二 羟基 代谢 物 是 由 人 类 CYPIAI 催化 的 。 前 者 在 肝脏 中 进一步 代谢 产生 致 畸 反 应 并 生成 DNA 加 合 物 。7, 8 -二 凑 代 谢 物 的 致 畸 能 力 与 肝脏 制备 物 中 CYP3A4 的 水 平 有 关 (Shimada et al. ,1989a,b)。 抗 CYP3A4 抗体 可 以 阻 断 致 畸 作用 ,而 加 入 纯化 的 人 CYP3A4 或 者 人 类 肺脏 微粒 体 组 织 可 以 恢复 致 畸 作 用 (Shimada et al., 1989b, 1992)。 由 此 可 见 ,在 肝脏 或 肺 中 , 葵 并 花 从 致癌 物 前 体 转化 为 致癌 物 是 由 CYP3A4 催化 的 。 致 癌 物 前 体 葵 并 菊 葛 (Benzo[bjfluoranthene) 和 7,12 -— FA SEAFF RA (dimethyl-benz[ajanthracene) 也 发 生 相 似 的 反应 。 这 表明 人 与 路 齿 类 动物 参与 PAH + 物 活 化 的 CYP 有 所 不 同 。 与 此 相反 的 是 ,在 人 类 的 肝 外 组 织 中 ,主要 由 CYPIAL 参与 激 活 7,8 -— FEAF (Quan et al., 1994), 二 葵 并 (a,h) 草 (Dibenzo[a,hjanthracene) 是 一 种 强 致癌 性 的 多 环 芳烃 类 化 合 物 , 它 需 要 经 过 生物 激活 后 方 能 致癌 。 通 过 对 一 系列 人 类 重组 CYP( 不 包括 CYP1A1) 的 研究 发 现 CYP1A2 和 2C9 最 为 活跃 ,CYP2B6 表现 中 度 催化 活性 (Shou et al., 1996b). CYP2C9 在 致癌 物 前 体 3,4 -二 羟 醇 的 形成 中 最 为 活 牙 ,但 CYP1A2 和 CYP2B6 也 起 了 一 定 的 作 用 。 对 多 环 芳烃 二 葵 并 蔚 (dibenzo[a,1jpyrene) 的 研究 发 现 CYP2C9, 1A1,2B6 共同 作用 形成 致癌 物 前 体 11,12 -二 氧 二 醇 (11,12-dihydrodiol) 。 但 是 ,CYP1A1 也 参与 了 反应 ,而 且 其 活性 比 CYP2C9 高 出 4 倍 (Shou et al. ,1996a)。 Shimada 等 (1996) 报 道 了 人 类 CYP1 家 族 成 员 1A1,1A2 和 1B1 对 27 种 多 环 芳烃 及 其 代谢 物 的 生物 活化 作用 。CYP1B1 对 葵 并 世 - 4,5 -二 醇 (benzo[ajpyrene 4, 5-diol) ; (+ )#EF¢ LE (a) 7, 8 -二 醇 (benzo[a]jopyrene-7,8 - diol); 二 葵 并 世 (a,1)11,12 -二 醇 第 六 章 “细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 89 , (dibenzola,l)pyrene - 11, 12 - diol) ; 4&3 A- 1,2 -二 醇 (benzoLajanthracene-1,2 - diol) Al 葵 并 草 顺 式 -5,6-=- 二 醇 ;7,12 -— FEAF 3,4 -— (7, 12-dimethylbenz[a)anthracene -3,4= diol); 共 并 菲 - 3,4 —— BE (benzo[c) phenanthrene-3, 4-diol) ; 3% A- 2,3 -二 醇 (fluo- ranthrene2, 3-diol); 届 - 1, 2 -二 醇 (chrysene-1, 2-diol); 5 — A SER - 1,2 -二 醇 (5S- methylchrysene-1,2-diol);5,6 -二 甲 基 屈 - 1,2 -二 醇 ($,6-dimethlychrysene-1,2-diol) ; # 并 届 - 11,12 -二 醇 (benzo[g]jchrysene-11,12-diol) 最 有 效 。CYP1AI 仅 有 选择 性 激活 葵 并 te 7,8 -二 醇 (( - )benzo[a]jpyrene-7,8-diol); FF HR B- 9, 10 -二 醇 (benzoLbjfluorna- thene-9,10-diol) 。CYP1A2 对 所 检测 的 多 环 芳 烃 化 合 物 不 表现 出 选择 性 。 CYP1A1 Xf 7,12 -— A SEA F Kl (7, 12-dimethylbenz(a) anthrancene) 的 代谢 最 为 活 BR, {8 CYP1A2 和 2C9 也 表现 一 定 的 催化 活性 。 不 同 的 CYP 催化 生成 不 同 的 代谢 产物 。 CYP1A1 催化 生成 5,6 -二 醇 ,大 部 分 CYP 选择 性 地 作用 于 7 位 甲 基 , 而 CYP1A1 则 选择 PEMD FETE 12 -位 甲 基 (Shou er al. ,1996a) 。 由 于 肝 外 组 织 激活 多 环 芳烃 需要 CYP 酶 的 参与 ,包括 CYP1A1,1B1 , 环 氧化 物 水 化 酶 ,依赖 NADPH 还 原 酶 ,利用 逆转 录 酶 -聚合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 可 以 测定 支气管 上 皮 细 胞 的 相应 mRNA 的 含量 。 吸 烟 者 细胞 内 CYP1A1mRNA 含量 比 CYP1B1mRNA 高 6 们 ,但 不 吸烟 人 群 中 仅 有 10% 的 人 表现 类 似 的 结果 。 其 他 酶 的 mRNA 水 平 在 吸烟 者 和 不 吸烟 者 中 没有 明显 的 差异 。mRNA 水 平 的 个 体 差 异 可 以 反映 相应 酶 水 平 的 变化 ,以 及 机 体 对 支气管 癌 易 感性 的 不 同 。 多 环 芳烃 首先 由 CYPIAL Al/sk 1B1 催化 形成 中 间 产 物 , 然 后 由 多 种 CYP( 包 括 CYPIAL, 1B1,3A4,1A2,2B6 和 2C9) 催 化 产生 最 终 的 致癌 物 一 一 二 醇 环 氧化 物 。 黄 曲 霉 素 (aflatoxin Bi ) 是 一 种 外 源 性 致癌 物 ,只 经 一 次 环 氧化 作用 就 可 被 激活 。 它 转化 为 致癌 物 必须 经 过 8 - 9 -外 环 氧 化 物 (8,9-exo-epoxide) ,但 是 主要 参与 活化 的 CYP 还 不 是 很 清楚 。 有 研究 表明 CYP3A4 和 /或 CYP1A2 都 参与 反应 (Hashimoto et al., 1995a; Ueng et al. ,1997; Langouet et al . ,1995)。 在 人 体 肺 组 织 ,活化 黄 曲 霉 Bi 环 氧 化 物 的 形成 与 CYP3A4 的 底 物 一 一 硝 葵 地 平 (nifedipine) 的 代谢 速率 无 关 ,但 是 抗 CYP3A 抗体 可 以 抑制 其 形成 。 由 此 可 推断 CYP3A4 参与 人 体 肺 中 黄 曲 霉 Bi 的 生物 激活 。 芳香 胺 类 化 合 物 先 经 CYP 催化 的 N - 羟 化 作用 ,随后 生成 具有 反应 活性 的 硝 欠 离 子 (nitronium ions)( 图 6.1) ,最 终 被 活化 为 致癌 物 。 人 体 肝 微粒 体 已 被 证 明 能 够 催化 2 - 氢 4£F (2-aminofluorene) Fil 2 - 蔡 胺 (2-napthylamine) 的 N - 羟 化 作用 ,但 不 能 催化 1 - 莹 胺 (1l-naphthylamine)。 前 两 种 芳香 胺 是 致癌 物 ,1 - 蔡 胺 不 是 ,这 些 研 究 说 明了 N - 羟 化 反应 产物 的 致癌 作用 (Hammons et wz . ,1985) 。 早 期 的 研究 表明 CYP1A2 可 以 催化 2 -氨基 RAR N - 羟 化 作用 (Shimada and Okuda, 1988). 6 -氨基 屈 (6-aminochrysene) 有 两 条 生物 激活 途径 一 一 CYP3A4 和 2B6 催化 的 N - 羟 化 途径 以 及 CYPIA2, 1A1, 1B1 或 CYP3A4 催化 形成 1,2 -二 氧 二 醛 (1,2-dihydrodial) 的 氧化 途径 (Yamazaki et al. ,1994; Shimada et al. , 1994a; Shimada et al. ,1996)。 在 某 些 还 原 性 代谢 中 由 相应 的 硝 胺 生成 芳香 胺 , CYP 也 具有 一 定 的 作用 (Chae et wL . ,1993)。 通 过 比较 一 系列 芳香 胺 的 生物 激活 作用 , 发 现 CYP1B1 对 2 - BAER (2-aminoanthracene), CYP1A1 对 4 -氨基 联 茶 (4-amino- biphenylD) 和 6 -氨基 届 ,CYP1A 对 2 -氨基 东 (2-aminofluorene) 分 别 具 有 最 强 的 催化 活性 (Shimada et al. , 1996). - 90° 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 , 另 一 类 致癌 物 杂 环 胺 类 (heterocyclic amines) 也 是 通过 CYP 催化 的 N - 羟 化 反应 激 活 。CYP1 家 族 中 的 1A1,1A2 和 1B1 主要 与 生物 激活 作用 相关 ,但 CYP3A4 和 3A5 也 有 一 定 作 用 。 由 于 CYPIA 主要 参与 杂 环 胺 的 生物 活化 ,而 它 在 消化 道 的 含量 几乎 微 不 可 查 , 如 果 这 些 物质 与 大 肠 癌 有 关 的 话 ,那么 其 生物 活化 必然 首先 发 生 在 肝脏 ,其 后 的 反应 则 可 能 在 大 肠 中 进行 。CYPIA1、1A2、1B1、.3A4、2B5 都 能 使 芳香 胺 生成 N - 羟 化 产物 , 它 们 的 参与 使 活化 反应 具有 组 织 特异 性 一 一 CYP142 在 肝脏 表达 ,而 CYP1A1 和 1B1 则 在 肝 外 表达 。 经 对 30 多 种 动物 的 研究 已 确定 将 近 300 种 N - 亚 硝 胺 类 化 合 物 (N-nitrosamines) 具 有 致癌 作用 。 人 类 广泛 接触 这 类 化 合 物 以 及 CYP 对 N - 亚 硝 胺 的 代谢 激活 作用 引起 了 人 们 对 这 类 物质 致癌 作用 的 忧虑 。CYP 使 N - 硝 基 邻 位 的 碳 原子 发 生 羟 化 作用 产生 致癌 前 体 , 后 者 再 转变 成 具有 致癌 活性 的 碳 离子 (carbonium ion) (图 6.1)(Haslar et al., 1999), 早期 对 N - 亚 硝 胺 的 乙 基 、 甲 基 、 丁 基 `\ 苯 基 衍 生物 的 研究 表明 ,CYP2E1 主要 参与 它 们 激活 作用 (Guengerich,1990b) 。 利 用 食道 微粒 体检 验 香 烟 中 三 种 潜在 的 致癌 物 :N - 硝 基 去 甲 烟 碱 (N-nitrosonornicotine NNN) ,4 - 甲 基尼 十 酰基 - 1 -吡啶 基 1- 丁 酮 (4-methyl- nitrosamino -1-pyridyl-1-butanone, NNK ) 和 N -= 亚 硝 基 二 甲 胺 (N-nitrosodimethylamine, NDMA) 的 生物 活化 作用 。 研 究 发 现 NNN 可 以 被 所 有 的 微粒 体 样 品 激活 ,NNK 却 不 能 被 大 多 数 样品 活化 。 利 用 抑制 剂 确定 CYP3A4 和 2E1 分 别 参与 NNN 和 NDMA 的 激活 , CYP1 亚 家 族 的 成 员 不 能 够 活化 NDMA(Shimada et al., ,1996) 。 此 后 ,利用 人 肝 微 粒 体 的 研究 确定 CYP2A6 和 CYP3A4 能 分 别 激活 NNN 和 NNK(Staretz et al. , 1997). AK 内 N - 尼 古 酰 胺 的 生物 激活 是 由 CYP2E1,3A4, 和 2A6 催化 的 ,在 其 他 致癌 物 的 生物 活化 中 起 重要 作用 的 CYP1 家 族 蛋 白 并 不 参与 尼 古 酰胺 的 代谢 。 杂 环 芳香 胺 是 另 一 类 环境 致 突变 剂 和 由 CYP 活化 的 致癌 物质 ,其 生物 激活 过 程 包括 氨基 的 N - 羟 化 作用 ,O -乙酰 基 或 O — it BEBE WA 2 FF SEAR EGS F (arylnitronium ion) 的 生 成 。 早 期 研究 证 明 人 肝 微 粒 体 CYP 能 活化 几 种 杂 环 芳香 胺 ,包括 鱼肉 的 热 解 产 物 以 及 香烟 ,这 些 致癌 物 包括 2 -氨基 - 3,5 — RMA (4, 5-f) PEM (2-amino-3, 5-dimethyl imidazo (4,5-f) quinoline) (MeIQ) ;2 -氨基 -3,5 —— FA SEDKME (4 , 5-f) MEM (2-amino-3-methylimida- z0(4,5-f) quinoline) (IQ) ;2 -氨基 3, 8 —— FR SE-B (4, 5-f) EMR (2-amino-3, 8-dimethyl- imidazo(4 ,5-f) quinoxaline) (MeIQx), CYP1A2 & +45 3X LE Jit Re FE ee ABE | ye FA OK MB BY) 生物 活化 (Shimada et al., 1989a). Xt LAE WJ, CYPIA2 的 生物 激活 效率 高 于 CYP1AL ,但 是 对 3 -氨基 - 1,4 -二 甲 基 - SH ML BESF (4, 3-b) #519 (3-amino-1 , 4-dimethyl- 5II-pyrido(4, 3-b) indole) 和 3 - 甲 基 - 4 SSE {RA AH ( 3-methyl-4-aminoazobenzene ) , CYP1A1 则 更 有 效 (Shimada et ww.,1994)。 在 所 检测 的 杂 环 芳香 胺 中 ,CYP1BL 对 3 - 氢 基 - 1,4 -二 甲 基 - 5H — Oh hE FF (4, 3-b) 95] (3-amino-1, 4-dimethyl-5H-pyrido (4, 3-b) in- dole) 的 催化 活性 高 于 CYP1A2(Shimada et al., ,1996)。 人 类 胎盘 蛋白 CYP3A7 在 N- 乙 酰 转 移 酶 - 2(N-acetyltransferase-2 ,NAT-2) 存 在 时 ,可 以 有 限 地 激活 IQ, MeIQX 和 MeIQ (Hashimoto et al. , 1995b). CYP2C10 被 认为 在 主要 由 CYP1A2 催化 的 2 - 氮 基 -中 啉 (2-amino-carboline) 生 物 活 化 中 起 辅助 作用 (Raza et al., ,1996) 。 杂 环 芳香 胺 这 一 类 致癌 物 是 由 CYP1 家 族 活 化 的 ,其 中 如 和 人 CYP1A2 对 焦化 的 物质 如 蛋白 质 和 碳水 化 合 物 生成 第 六 章 ”细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 .91 , 杂 环 芳香 胺 而 致癌 ,其 他 CYP 也 具有 一 定 作 用 。 6.7.1.2 内 源 性 化 合 物 最 常见 与 癌症 有 关 的 内 源 性 化 合 物 是 天 然 肉 激素 - 17B- 肉 二 醇 (17B-estradiol) 。 两 种 CYP 催化 的 肉 激 素 代谢 产物 被 认为 具有 致癌 作用 ,上 峻 二 醇 的 16a - 羟 化 作用 产物 一 一 雌 酮 ,可 以 与 DNA 共 价 结合 (Osborne et al. , 1993) 并 促进 一 种 变异 产物 表 型 的 表达 。 肉 激 素 的 4- 羟基 代谢 产物 由 于 能 够 参与 代谢 性 氧 还 循环 , 而 与 乳腺 癌 的 发 病 有 关 (Liehr et al. ,1990; Yager and Liehr,1996)。 有 报道 肉 酮 的 16c - 羟 化 作用 是 由 CYP3A4 和 3A5 催化 的 (Huang et al., 1998). HERR AY 4 - 羟 化 作用 则 由 CYP1B1 催化 (Hayes et al., 1996). FAK AT) CYP 催化 的 两 种 代谢 途径 都 可 能 与 乳腺 瘤 发 病 有 关 。 6.7.2 对 癌症 的 易 感 性 CYP 具 外 源 性 致癌 物 和 内 源 性 激素 的 生物 活化 作用 以 及 人 类 种 群 CYP 的 多 态 性 使 人 们 提出 如 下 假说 :致癌 物 敏感 性 存在 个 体 间 差 异 。 许 多 实验 研究 了 CYP 多 态 性 与 易 感性 "的 关系 。 研 究 结果 表 明 二 者 有 联系 ,但 不 能 证 明 偶 然 或 短暂 接触 外 源 性 致癌 物 与 CYP 多 态 性 和 疾病 之 间 的 关系 。 只 有 通过 今后 对 某 些 病例 或 癌变 前 损伤 ,以 及 疾病 发 展 情况 进行 深入 的 研究 才 有 可 能 明确 地 区 分 “癌症 易 感 " 表 型 。 6.7.2.1 肺 总 肺癌 的 发 病 具 有 家 族 性 ,并 与 接触 香烟 中 的 致癌 物质 密切 相关 。 人 体 肺 能 激活 吸入 的 香烟 中 芳烃 化 合 物 和 芳香 胺 。 (1) CYP 1A1 Kellerman 等 , (1973) 对 CYP1A1 的 基因 型 与 肺癌 的 易 感 性 作 了 广泛 的 流行 病 学 对 照 研 究 ,于 20 世纪 70 年 代 首 次 报道 了 CYP 酶 活性 的 高 诱导 性 与 肺癌 发 病 的 关系 。 芳 烃 424488 (aryl hydrocarbon hydroxylase, AHH), CYP1A1 催化 活性 以 及 体外 培养 淋巴 细胞 接触 3 - 甲 胆 意 (3-methylcholanthrene) 与 研究 对 象 的 肺 及 肺 外 癌症 发 病 的 关系 。 肺 癌 组 A 30% 患 者 表现 为 中 等 或 高 度 CYP1A1 诱导 活性 ,而 健康 对 照 组 仅 有 9% 。 非 肺 源 性 瘤 症 患者 AHH 诱导 活性 与 普通 人 和 群 相同 ,这 表明 AHH 与 肺癌 的 特异 相关 性 ,但 不 能 排除 吸烟 对 肺癌 的 影响 。 肺癌 患者 的 肺 组 织 中 AHH 活性 偏 高 (与 近期 开始 吸 咽 的 非 肺 源 性 癌症 患者 相 比 ) (Petruzelli et al. ,1988) 。 高 水 平 的 AHH 与 高 水 平 的 肺 DNA 加 合 物 有 关 (Petruzelli et al. , 1988; Bartsch et w! . ,1993)。 尽 管 所 有 的 资料 都 是 一 种 横向 比较 ,而 且 可 能 与 时 序 效应 相 混淆 (如 肺癌 或 相关 的 疾病 状态 可 以 直接 或 间接 增加 淋巴 细胞 的 酶 诱导 活性 ) ,但 对 非 人 灵 长 类 (Kouri et al. ,1980) 和 实验 动物 ( 鼠 类 )(Kouri et al. ,1982) 的 研究 发 现 , AHH 诱导 活性 的 增高 是 与 致癌 物 诱 发 的 肺癌 易 感 性 增加 相关 的 。 目前 已 报道 了 几 种 CYP1A1 的 等 位 基因 多 态 型 。 第 一 个 是 CYPIAI 基因 DNA 序 列 上 第 6235 位 的 工 转变 为 C, 从 而 为 MspI 提供 了 一 个 新 的 限制 性 内 切 酶 作用 位 点 (Kawajiri et al. , 1990) ,这 种 替换 发 生 在 CYPIAI 结构 基因 第 7 个 外 显 子 的 下 游 的 3 端 - 92: 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 非 编 码 区 。 非 编码 区 置换 的 代谢 性 后 果 到 现在 还 不 清楚 ,尽管 有 一 些 证 据说 明 淋 巴 细胞 2, Asin i O -去 乙 基 酶 (ethoxyresorufin O-deethylase) 的 活性 增高 ,但 是 相应 的 mR- NA 的 含量 并 不 增加 (Landi et al. ,1994; Petersen et al. , 1991; Crofts et al. , 1994). A 本 肺癌 患者 中 ,这 种 等 位 基因 的 频率 比 欧州 人 高 ,肺癌 患者 通过 遗传 获得 MspI 2 5 HY AY 机 率 比 正常 人 群 高 (Kawajiri et al. ,1990; Hayashi et wz . ,1992 ) 。 在 非 亚 裔 人 和 群 中 ,二 者 表现 为 负 相 关 性 (Sugimura et al., 1994; Hirvonen et al., 1992; Drakoulis et al., 1994; Shields et al. , 1993b; Tefre et al., 1991; Xu et al., 1996). 第 二 个 多 态 型 是 CYPIAL 基因 7 号 外 显 子 的 4889 位 的 A 转变 为 G, 使 CYP1A1 & 白 靠近 血红 蛋白 结合 区 域 的 第 462 位 氨基 酸 残 基 从 Ile 变 为 Val, 这 显然 与 MspI 限制 性 内 切 位 点 多 态 有 关 。 当 编码 Ile CYP1AI( 普 通 型 ) 或 者 Val CYP1A1( 稀 有 型 ) 的 EDNA 被 转 导 到 酵母 表达 系统 中 时 ,Val 变异 型 CYPIAL 表现 更 高 的 AHH 活性 和 苯 并 花 致 畸 能 力 (Kawajiri et al . ,1993)。 在 有 丝 分 裂 剂 刺激 的 淋巴 细胞 体系 中 , 也 得 到 类 似 的 结果 (Crofts et ol . ,1994) 。 但 是 ,另外 一 些 研 究 表明 , Val 突变 型 的 代谢 酶 活性 并 不 增强 (Zhang et al. ,1996; Persson et al. ,1997)。CYP1IAL 的 7 S4p ik FAA (Val/Val) 5 人 类 肺 组 织 PAH - DNA 加 合 物 含量 增高 并 没有 明确 的 相关 性 (Shields et al. , 1993a; Pastorelli et al. ,1998)。 在 日 本 人 中 ,这 种 多 态 型 与 肿 癌 P53 的 突变 率 增高 有 关 (Kawa- jiri et al .,1996)。 日 本 的 肺癌 患者 中 淋巴 细胞 为 Val/Val 纯 合 子 的 比率 比 健康 人 和 群 或 非 肺癌 对 照 组 高 2~3 倍 (Kawjiri et cl . ,1993)。 亚 裔 人 种 群 该 等 位 基因 频率 并 不 同 , 但 基 因 型 与 疾病 的 关系 是 稳定 的 (Sugimura et ol . ,1998) 。 有 三 份 关于 Ile Val 多 态 的 报道 指 出 非 亚 毅 人 种 群 基因 频率 较 低 , 约 3% 一 16% ,而 日 本 人 则 为 30% (Hirvonen et al., 1992; Drakoulis et al. ,1994; Hamada et ol . ,1995)。 巴 西 肺 癌 患 者 Val/Val 纯 合 子 频 率 比 对 照 组 高 2 倍 (Hamada et ww .,1995)。 在 德国 人 中 这 种 差异 更 明显 (Drakoulis et al. ,1994) ,但 在 芬兰 人 中 没有 发 现 肺癌 患者 Val/Val 基因 型 频率 增高 (Hirvonen et al., 1992). CYPIAL 多 态 与 其 他 易 感性 多 态 基因 的 (如 谷 胱 甘 肽 S -转移 酶 - MI(GSTMI) ) 共 同 作用 比 单独 一 种 多 态 作 用 与 肺癌 的 关系 更 为 密切 。I 相 和 II 相 组 合 基因 型 4CYP1A1 Val/Val 和 GSTM1 null) 可 能 是 日 本 人 和 群 中 的 肺癌 易 感 基因 型 ,因为 肺 瘤 患者 中 这 种 基 因 型 的 比率 高 达 27% (Nakachi er al. ,1993; Kihara et al . ,1995)。 总 之 ,CYP1A1 多 态 变 异型 使 致癌 物质 前 体 生物 活化 作用 增强 ,并 导致 肺癌 易 感性 增 加 这 一 假说 在 生物 学 上 是 合理 的 。 有 证 据 表 明日 本 肺癌 患者 中 ,CYP1A1ValMVal 纯 合 子 比 健康 人 和 群 或 非 肺癌 对 照 组 更 为 普遍 ,但 欧洲 人 美国 人 和 非 亚 裔 人 和 群 并 未 发 现 这 种 现 象 。 有 研究 发 现在 非 亚 裔 人 群 中 ,肺癌 与 外 周 血 淋 巴 细胞 AHH 诱导 活性 增高 有 明显 的 相关 性 ,但 是 ,并 没 发 现 肺癌 与 MspI 或 Ile(Val) 之 间 有 一 臻 关系。 有 可 能 现在 确定 的 多 态 类 型 仅 是 影响 CYPIAL 诱导 活性 的 部 分 原因 。 因 此 ,在 研究 CYPLAL 活性 增强 对 肺 瘤 的 致 病 作用 时 ,还 应 考虑 流行 病 学 的 相关 资料 (Hasler et al. ,1999)。 22 P450 不 同 的 同 工 酶 多 态 性 变异 体 的 分 布 与 癌症 之 间 的 关系 引起 人 们 的 重视 ,其 中 CYP2D6 的 遗传 多 态 性 的 毒 理 学 重要 性 近年 来 已 引起 广泛 的 研究 (Coutts and Urichuk, 1999). SANE ”细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 。 93 , 生物 体 对 一 种 邹 . 源 物 一 一 胀 基 四 氢 异 唆 啉 (debrisoquine, 抗 高 血压 药物 ) 代 谢 的 能 力 与 肺癌 的 发 病 风险 有 关 。CYP2D56 催化 胀 基 四 和 氢 异 唑 啉 的 4 - 羟 化 作用 ,而 其 代谢 表 型 是 不 可 诱导 的 (Gonzalez and Gelboin,1994) 。 代 谢 表 型 的 种 族 差异 是 很 明显 的 :7% 的 高 加 索 人 是 弱 代 谢 者 (poor metabolizers, PM) ,而 东亚 人 的 比率 则 为 1% 。 胀 基 四 氧 异 唆 啉 代谢 表 型 与 肺癌 的 关系 也 难 确定 ,因为 CYP 负责 它 的 代谢 。 CYP2D6 主要 在 肝脏 表达 , 肺 组 织 中 CYP2D6 蛋白 和 mRNA 的 含量 都 很 低 (Huang 等 , 1998)。 已 有 证 明 肝 和 肺 微粒 体 的 CYP2D6 能 够 激活 4 - 甲 基 硝 胺 - 1-(3 -吡啶 基 )-1- 丁 醇 酮 (4-methylnitrosamine-1-(3-pyridyl)-1-bntanone(NNK ) ,一 种 致癌 的 烟草 衍生 物 ), 但 是 哪 一 种 特异 CYP 参与 催化 的 仍 不 能 确定 。 对 比 吸 烟 者 中 肺癌 患 者 和 非 癌 症 对 照 人 群发 现 胀 基 四 和 氢 异 唑 啉 弱 代 谢 者 表 型 (Capo- raso et al. , 1990; Agundez et al., 1994; Bouchardy et oz. ,1996)。 在 有 关 资 料 进行 分 析 中 发 现 2.3% 的 肺癌 患者 是 中 度 或 强 代谢 (EM) 表 型 (Amos et al., ,1992 ) 。 耸 兰 的 一 项 研究 报道 肺癌 患者 EM 基因 型 与 正常 人 群 的 差 值 为 6.4(=0.05)(Hirvonen et al., 1993a). CYP2D6C 等 位 基因 编码 的 活性 酶 与 其 主要 表 型 相 比 ,具有 较 低 的 K, ARAN Vinaxt (Agundez et al. , 1994; Tyndale et al. , 1991; Broly et al., 1991), PPS WE 因 在 西班牙 肺癌 患者 中 的 频率 比 正常 人 群 高 6 倍 。 但 是 ,对 法 国人 群 的 研究 却 没有 发 现 这 种 基因 型 与 肺癌 之 间 的 关系 有 统计 学 的 意义 (Stucker et al. , 1995). FEJLIM XT FRE 中 ,也 没有 发 现 胀 基 四 氧 异 唆 啉 代谢 表 型 与 肺癌 的 必然 联系 (Rannug et al. ,1995; Ben- itez et al. , 1991; Duche et al. , 1991; Stucker et al. , 1995; Shaw et al. , 1995; Capora- so ef al .,1992)。 一 个 引起 混乱 的 因素 可 能 是 种 族 ,如 高 加 索 人 的 情形 就 不 能 外 推 至 非 洲 裔 的 美国 人 (Inglemann-Sundberg et al. ,1992 ) 或 者 亚洲 人 (Bertilsson et al. , 1992). 总 之 ,关于 CYP2D6 基因 型 、 表 型 以 及 肺癌 关系 的 资料 仍然 有 相互 矛盾 之 处 ,而 且 缺 乏 说 服 力 。 从 生物 学 角度 而 言 ,EM 基因 型 是 能 够 更 有 效 地 激化 NNK 等 香烟 中 的 N - 亚 硝 基 化 合 物 。 但 是 关于 基因 在 肺 这 一 靶 器 官 中 的 表达 的 各 种 报道 ,使 得 CYP2D6 -肺癌 假说 仍 存 有 争议 (Hasler et al. ,1999 )。 (3) CYP2E1 CYP2E1 在 人 类 肝 、 肺 肾脏 中 表达 ,并 能 被 酒精 诱导 。 它 与 肝脏 的 脂肪 过 氧化 反应 , 氧 还 循环 和 肝脏 解毒 功能 有 关 。CYP2E1 的 作用 底 物 包括 小 分 子 的 朴 水 致癌 化 合 物 ,如 As. OAR A Zs A i Ha (acrylonitrile) #1 N -二 甲 基 亚 硝 胺 (N-dimethylnitrosamine) (Gonzalez and Gelboin, 1994; Rannug et al. , 1995; Ingelman-Sundberg et al., 1992). Uematsu 等 (1991) 曾 报道 了 外 周 血 中 淋巴 细胞 的 二 等 位 基因 的 Dral 多 态 性 (two allele Dral polymorphism) 现 象 。 日 本 人 C 等 位 基因 频率 是 26% ,有 证 据 表明 它 与 肺癌 有 关 , 但 研究 的 数量 不 多 ,这 种 多 态 的 表 型 目前 仍 不 清楚 (Uematsu et al., ,1991) 。 高 加 索 人 中 该 基因 的 频率 是 11% , 也 没有 观察 到 它 与 肺癌 发 病 的 联系 (Ingelman-Sundberg et al., 1992; Persson et al. ,1993; Hirvonen et al. ,1993b; Kato et al. ,1992 ) 。 但 是 关于 墨 西 哥 毅 美国 人 和 非洲 裔 美国 人 的 研究 表明 二 者 具有 相关 性 (Wu et al. ,1998) 。 基 因 频 率 偏 低 及 其 与 疾病 的 弱 相 关 性 ,说明 已 知 CYP2E1 多 态 型 对 大 多 数 人 类 种 群 的 致 病 风 险 是 比 较 小 的 。 “ 94 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 (4) 其 他 CYP CYP1B1 蛋白 在 人 体 肺 胜 中 大 量 存在 , 据 研究 报道 CYP1B1 第 199 位 Ala 密码 转变 为 Ser 与 肺癌 的 发 病 有 关 (Watanabe et al. ,1998)。CYP2C9 在 肺 组 织 以 多 态 形 式 存在 , 并 且 可 以 激活 PAHs。lle359 多 态 型 可 能 与 肺癌 发 病 有 一 定 联系 (如 <0.05)(Kadlubar et al., 1998). 6.7.2.2 ”上 呼吸 道 癌 症 CYP2E1 多 态 性 与 鼻 咽 癌 的 发 病 有 关 , 这 种 恶性 肿瘤 被 认为 是 接触 亚 硝 胺 所 和 致 (Hildesheim et al. ,1995) 。 对 一 个 由 364 中 国人 后 裔 组 成 的 种 群 进 行 研究 证 明 , 鼻 咽 癌 与 CYP2E1C2( p<0.05)4wd£A AX (Hildesheim et wz . ,1997) 。 另 一 项 报道 指出 口腔 癌 患 者 中 CYP2E1C2 等 位 基因 频率 增高 , 当然 这 并 不 排除 遗传 -环境 的 相互 作用 ,如 嚼 槟 构 \ 吸烟、 喝酒 等 (Hung et al., 1997), EMMRA PRA KM CYP1A1MspI 或 CYP2E1Dral-C 多 态 性 与 上 呼吸 道 癌症 有 关 (Lucas et al. ,1996)。 法 国 的 一 项 研究 表明 吸烟 量 ,CYP2D56 的 强 代 谢 表 型 与 鼻 咽 癌 的 发 病 有 关 (Benhamou et al., 1996). HAR 道 认 为 欧洲 人 CYP1AlmlMmml(MspI)、CYP1AL1 Val/Val .CYP2E1 C《MC、CYP2B1 CUMCI 和 CYP2D6 强 代 谢 基因 型 与 上 呼吸 道 癌 没 有 关系 (Mathias et al. ,1998) 。 6.7.2.3 ”肝癌 CYP2D6 强 代谢 表 型 基因 型 与 肝 瘤 的 发 病 有 关 ,尤其 是 在 N -乙酰 基 转 移 酶 - 2 - 基 因 型 的 共同 作用 下 (Agundez et ww . ,1996 ) 。 一 项 研究 认为 肝癌 患者 中 CYP2E1 C1/C1 的 频率 比 吸 烟 者 高 。 但 另 一 项 研究 认为 CYP2E1 Cl 的 基因 频率 与 肝癌 无 关 (Lee et al., 1997)。 日 本 的 一 项 研究 认为 CYP2E1 C2 等 位 基因 频率 与 胃癌 发 病 无 关 (Kato et al., 1992). 6.7.3 抗 瘤 药 物 的 代谢 这 里 主要 讨论 哪些 CYP 参与 抗 癌 药 物 的 代谢 ,它们 是 增强 还 是 减弱 抗 瘤 药 的 效果 , 代谢 是 否 引起 药物 的 相互 作用 ,消化 道 的 代谢 是 否 会 影响 机 体 药物 的 吸收 ,药物 代谢 器 官 或 组 织 的 特异 性 ,以 及 亚 种 群 中 ,CYP 多 态 对 药 效 的 影响 等 。 了 解 哪些 CYP 参与 某 种 抗 癌 药 物 的 代谢 是 估计 是 否 会 发 生 药物 相互 作用 的 关键 。 PPB BEAK ( cyclophosphamide) FF ABE BERK (ifosfamide) 等 烷 化 抗 癌 药 需要 生物 激活 后 才 能 转变 为 细胞 毒剂 。CYP2B6 和 3A4 最 初 被 认为 是 参与 环 磷 酰 胺 和 异 环 磷 酰胺 生物 活化 的 主要 细胞 色素 蛋白 (Chang et al. ,1993; Code et al. , 1997). JAR CYP3A4 HE 与 异 环 磷 酰 胺 的 N -去 氯 乙 基 化 作用 (N-dechloroethylation ) , 这 是 一 个 治疗 失 活 反应 (Walker et wy .,1994)。 然 而 CYP2B6 和 3A4 对 这 些 药物 的 亲和力 相对 较 低 ,由 此 提出 可 能 存在 药物 间 相 互 作用 。 近 来 对 环 磷 酰胺 、 异 环 磷 酰胺 以 及 重组 人 类 CYP 的 研究 发 现 CYP1C19 对 环 磷 酰胺 的 亲和力 最 强 , 其 次 是 CYP2C9。 而 CYP2C18-Thr (385) 和 CYP2C18-Met( 385 ) 的 表 型 对 环 磷 酰 胺 的 催化 活性 相同 ,但 对 异 环 磷 酰 胺 而 言 ,CYP2C18- Thr(385) 比 CYP2C18-Mat(385) 的 催化 活性 高 6 倍 。 因 此 ,基因 型 是 CYP2C18-Thr(385) 第 六 章 “细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 95 , 个 体 对 异 环 磷 酰 胺 的 治疗 反应 更 好 。 尽 管 还 没有 体内 研究 的 资料 ,但 已 有 的 证 据说 明 在 考虑 治疗 范围 较 窗 的 抗 癌 药 物 的 用 药剂 量 时 ,应 注意 病人 的 CYP 基因 型 。 一 项 利用 原 代 培养 人 肝 细 胞 的 研究 表明 ,与 环 磷 酰 腕 和 蜡 环 磷 酰 胺 活化 有 关 的 4 - 羟 化 反应 是 被 CYP2B,2C 和 3A 诱导 的 ,这 表明 了 两 种 药物 的 细胞 毒性 是 由 几 种 CYP 调节 的 。 此 外 ,两 种 药物 很 可 能 通过 诱导 CYP 而 影响 自身 的 生物 活化 (Chang et al., 1997). 如 果 环 磷 酰 胺 、 异 环 磷 酰 胺 等 依赖 CYP 的 抗 肿 瘤 药 物 的 生物 激活 能 被 局 限于 靶 器 官 , 它 们 的 疗效 是 最 为 理想 的 。 但 是 ,肝脏 的 前 期 代谢 使 药物 具有 血 、 肾 以 及 心血 管 毒性 ,因而 削弱 对 乳腺 癌 的 治疗 效果 (Chen et al. ,1996 ) 。 抗 癌 药 物 表 鬼 白 脂 素 (epipodophyllotoxins)、 表 鬼 白 毒 (teniposide) HAZ LK (e- toposide) 的 O -去 甲 基 作 用 (O-demethylation) 主要 由 肝脏 CYP3A4 催化 ,但 这 并 不 是 药物 清除 的 主要 步骤 (Relling et al., 1992), 其 产物 是 具有 细胞 毒性 的 儿 茶 酚 类 。 由 于 CYP3A4 能 催化 许多 药物 的 代谢 , 它 在 激活 鬼 白 乙 叉 了 武 毒 和 表 鬼 白 毒 时 可 引起 药物 间 相 互 作 用 ,这 一 点 在 唆 啉 的 体外 研究 中 得 到 了 证 实 (Zhao et al. , 1998). 抗 乳 腺 癌 药 物 -三 葵 氧 胺 (tamoxifen) 是 肉 激 素 受 体 阻 断 剂 ,可 以 被 肝 微 粒 体 催化 (Crewe et al .,1997)。 主 要 代谢 途径 是 CYP3A 催化 的 N - 脱 甲 基 化 (Jacolot et al., 1991) ,次 要 的 代谢 途径 是 4- 和 4 - 羟 化 作用 以 及 N -氧化 反应 (Lim et al .,1994)。 反 式 - 4- 羟基 三 葵 氧 胺 (Trans-4-hydroxytamoxifen) AY VE FN EK = FE AREER 100 倍 ,并 能 引起 临 床 反应 (Pathak et al. ,1995) 。CYP2D6、2C9 和 3A4 参与 三 葵 氧 胺 的 4 FEL VE A (Crewe ef al., 1997) ,但 后 来 的 研究 认为 CYP2D6 是 肝脏 4 - 羟 化 反应 的 主要 催化 剂 (Dehal and Kupfer, 1997) ,这 再 次 说 明了 CYP2T 底 物 相互 作用 的 可 能 性 。 由 于 CYP2D6 具有 多 态 性 ,所 以 三 葵 氧 胺 的 疗效 可 能 与 病人 CYP2D6 基因 型 有 关 。 抗 癌 药 红豆 杉 醇 (taxol) 也 是 一 类 CYP 作用 底 物 ,可 转化 为 无 活性 6a -羟基 红豆 杉 醇 (6a-hydroxytaxol) 和 两 种 小 分 子 代谢 产物 。 其 中 一 个 反应 是 由 CYP3A4 催化 的 (Harris 等 , 1994)。 红 豆 杉 醇 代 谢 增强 将 减弱 其 药 效 , 早 期 的 研究 认为 CYP3A( 除 CYP3A4) 催 化 6a -羟基 三 葵 氧 胺 的 形成 (Kumar et al. , 1994), (AG KAU A CYP2 家 族 (很 可 能 是 CYP2C8) 催 化 这 一 反应 (Cresteil et al. ,1994; Rahman et al., 1994). 一 种 特殊 的 机 制 阻 断 了 CYP 对 视 黄 酸 的 催化 作用 ,因此 增强 了 抗 前 列 腺 癌 药 物 liarozole fumarate 的 抗 增 殖 和 促 分 化 作用 。 药 物 的 代谢 有 多 种 效果 。 治 疗 前 列 腺 癌 的 药 物 氟 他 米 特 (flutamide) , 主要 被 CYP1A2 催化 生成 主要 代谢 产物 2 -羟基 氟 他 米 特 。 氟 他 米 特 是 雌 激 素 受 体 持 抗 剂 ,但 是 高 浓度 的 2- 羟 基 氟 他 米 特 反 而 能 激活 受 体 , 这 可 能 导致 了 晚期 前 列 腺 癌 患 者 对 氟 他 米 特 的 异常 反应 (Hasler et al. ,1999)。 6.7.4 CYP 在 肿瘤 组 织 的 表达 以 及 癌症 的 化 学 敏感 性 基于 CYP 在 正常 组 织 和 肿瘤 组 织 的 不 同 表 达 , 可 以 寻找 一 种 非常 有 和 希望 的 抗 癌 疗 法 。 癌 组织 内 高 水 平 的 CYP 可 以 提高 依赖 CYP 的 药物 的 选择 性 和 敏感 性 。 利 用 体外 培 养 的 MCF-7 乳腺 癌 细 胞 对 此 进行 的 研究 表明 , 转 染 CYP2B1 可 以 极 大 地 提高 癌 细 胞 对 环 磷 酰 胺 和 异 环 磷 酰 胺 的 敏感 性 (Chen et al. ,1996 ) 。 在 小 鼠 的 体内 , 转 染 CYP2B1 的 细 胞 对 环 磷 酰胺 极为 敏感 ,但 并 不 增加 其 对 宿主 的 药物 毒性 。 有 一 些 研 究 报道 了 肿瘤 组 织 “96。 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 和 周围 组 织 CYP 表达 有 显著 差异 。 在 试图 改进 胃 瘤 的 药物 治疗 时 ,对 CYPIA,2E1,3A4 等 在 正常 组 织 和 癌 组 织 中 的 表达 的 差异 进行 研究 具有 重要 的 意义 。Hasler 等 (1999 ) 报 道 在 癌 组 织 中 ,CYPIA 和 3A 的 含量 分 别 为 S1% 和 28% , 而 在 正常 组 织 中 ,没有 检测 到 CYPIA 和 3A。 对 CYP 在 前 列 腺 癌 中 的 表达 和 细胞 定位 研究 发 现 ,肿瘤 组 织 中 CYP1A、 2C.3A 蛋白 含量 分 别 为 63%、25$% 、60% , 而 未 亚 性 变化 的 前 列 腺 上 皮 组 织 仅 表现 CYPIA 和 2C 的 免疫 活性 (Hasler et al. ,1999)。 对 新 近 发 现 的 CYP1 家 族 成 员 CYPIBI 的 表达 部 位 至 今 仍 有 争议 。 尽 管 已 有 报道 证 明了 CYP1BlmRNA 在 正常 乳腺 组 织 的 表达 很 活跃 (Huang et al. ,1996) ,可 是 另 三 项 研究 认为 CYP1B1 蛋白 仅 在 肿瘤 组 织 中 表达 。 食 道 癌 组 织 中 CYP1AI 水 平 远 高 于 正常 食道 组 织 (Nakajima et al. ,1994)。 也 有 一 些 研 究 发 现 CYP 在 肿瘤 组 织 的 表达 水 平 低 于 周围 正常 组 织 。 原 发 性 肝癌 和 肝 转 移 癌 的 肿瘤 周围 组 织 CYP17( 芳 化 酶 ) 含 量 增高 。 六 近 病 灶 的 组 织 CYP17 活性 最 高 , 比 肿瘤 组 织 高 20 倍 ,其 活性 随 距 离 的 增 大 而 降低 。 但 乳 腺 癌 的 癌 组 织 中 CYP17 水 平 显著 高 于 非 恶变 组 织 , 这 可 能 是 由 于 转录 调控 的 改变 所 致 。 CYP 在 肿瘤 组 织 和 正常 组 织 的 表达 差异 也 可 能 不 利于 抗 癌 药 的 疗效 。 有 人 认为 CYP SP 导 的 生物 激活 作用 的 减弱 导致 乳腺 癌 对 多 种 药物 不 敏感 (Peters and Roelofs, 1997). Rintala 等 测量 了 50 例 肾 切 除 的 肾 细 胞 癌 患 者 病灶 附近 正常 组 织 的 CYP1AI1 水 平 (Rintala et al. , 1998) ,发现 低 分 化 和 / 或 转移 癌 的 CYPLAL 水 平 显著 高 于 高 分 化 和 / 尸 原 发 癌 , 因 此 , 肾 瘤 的 恶性 度 越 高 ,正常 组 织 中 CYP1A1 含量 越 高 。 直 肠 腺 癌 患 者 正常 组 织 和 肿瘤 组 织 的 CYP1AI 表达 没有 差异 。 但 在 肿瘤 组 织 内 ,CYP3A 水 平 降低 了 50%. 6.7.5 基因 治疗 向 肿瘤 组 织 导入 活化 抗 癌 化 疗 药物 前 体 的 酶 可 以 增强 药物 的 细胞 毒性 而 不 影响 正常 组 织 。 但 到 目前 为 止 ,这 方面 的 研究 仅 限 于 模型 动物 和 人 的 体外 培养 细胞 系 。 如 CYP2B1 肿瘤 组 织 内 的 表达 增加 可 以 使 其 对 烷 化 环 磷 酰胺 的 细胞 毒性 更 为 敏感 。 由 于 NADPH-P450 还 原 酶 在 体内 的 广泛 表达 ,并 能 催化 CYP 介 导 的 药物 代谢 ,因此 ,内 源 性 或 转 染 的 这 种 酶 的 超 量 表达 使 大 鼠 神经 胶 质 肉瘤 细胞 对 药物 的 敏感 性 高 于 正常 对 照 组 (Chen et ol .,1997) 。 这 种 方法 已 应 用 于 一 种 神经 胶 质 瘤 的 模型 动物 (Manome et al. , 1996)。 将 CYP2B1 导入 乳腺 癌 MCF-7 细胞 系 ,可 以 增强 环 磷 酰胺 和 异 环 磷 酰 胺 的 细胞 毒性 ,但 CYP2B1 的 抑制 剂 甲 吡 酮 (metyrapone) 可 以 阻 断 这 种 作用 ,并 可 影响 到 周围 未 经 转 染 的 细胞 。 对 一 种 模型 裸 鼠 的 研究 证 实 了 这 一 结果 (Chen et al., 1996). RW CYP4B1 可 使 惰性 的 2 —-23E A (2-aminoanthracene) Ail 4 -#§ 4 T (4-ipomeanol) HAW al 体 转 化 成 毒性 很 强 的 烷 化 代谢 物 。 转 染 CYP4B1 并 能 稳定 表达 CYP4B1 蛋白 的 人 类 及 员 齿 类 神经 胶 质 瘤 细 胞 对 药物 的 敏感 性 增加 了 6 倍 (Rainov et al. ,1998)( 有 关内 容 详 见 Br). 总 之 ,肝脏 疾病 中 P450 表达 的 改变 在 很 大 程度 上 是 由 于 各 种 CYP ZEAE AL 所 致 ,这 需要 了 解 各 种 蛋白 的 变化 情况 ,才能 评估 肝脏 硬化 对 某 种 药物 或 外 源 物 质 的 代谢 能 力 。 药 物 代谢 的 改变 同样 为 定量 测定 肝脏 功能 并 估计 慢性 肝病 (如 C 型 肝炎 ) 和 原 发 性 胆 性 肝 硬 化 的 发 病 阶 段 提供 依据 。 炎 症 介 质 可 以 改变 CYP 表达 对 病毒 性 肝炎 和 其 他 第 六 章 ”细胞 色素 P450 与 某 些 疾病 的 关系 - 97 , 传染 病 的 治疗 具有 越 来 越 重 要 的 意义 。P450 与 很 多 疾病 的 发 生 及 病理 学 的 研究 只 是 最 近 才 被 重视 ,并 成 为 发 展 非常 迅速 的 一 个 领域 。 最 后 ,能够 确定 影响 各 种 肝脏 P450 表达 的 遗传 因子 ,将 为 安全 有 效 地 药物 治疗 带 来 革命 性 的 变化 。 参考 文 mw Abdel-Razzak Z, Loyer P, Fautrel A et al. 1993. Cytokines down-regulate expression of major cytochrome P450 enzymes in adult human hepatocytesin primary culture. Mol. Parmacol. ,44: 707~715 Adedoyin A, Arns P A, Richards W O et al. 1998. 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Disp. ,26: 188~ 191 BLE ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 P450 在 植物 界 中 广泛 分 布 ,主要 定位 于 内 质 网 膜 , 也 有 一 些 发 现 位 于 高 尔 基 体 膜 上 ,, 定位 于 线粒体 和 质 膜 上 的 也 有 报道 ( 赵 剑 et al. ,1999)。 植 物 P450 酶 系 与 动物 微粒 体 P450 具有 许多 相似 之 处 ,其 基本 的 活性 单元 包括 P450 本 身 以 及 NADPH 细胞 色素 P450 还 原 酶 (Durst et al. ,1992). 植物 P450 在 植物 体 担当 着 重要 的 功能 ,可 以 催化 许多 次 级 代谢 反应 ,已 知 的 催化 反 应 已 超过 50 种 ,反应 底 物 包括 脂 类 、 共 丙烷 类 、 黄 酮 类 、 若 类 生物 碱 生 和 氰 糖苷 等 内 源 性 化 合 物 以 及 包括 农药 除草 剂 等 在 内 的 外 源 物 质 。 涉 及 的 反应 机 制 有 羟基 化 、 环 氧化 、 杂 原子 脱 烷 基 、 双 键 氧化 、 杂 原子 氧化 等 (Bolwell et al. ,1994)( 表 7.1)。 由 于 植物 组 织 中 存 在 许多 干扰 P450 研究 的 因素 ,如 叶绿体 (chlorophyll) 和 其 他 血红 素 蛋 白光 吸收 的 干扰 , 不 同型 P450 的 相对 含量 少 ,P450 的 纯化 十 分 困难 ,阻碍 了 分 离 和 重组 这 些 膜 结 合 酶 系 工 作 的 开展 。 至 今 植物 P450 反应 大 多 是 根据 光 可 逆转 CO 抑制 以 及 诱导 剂 与 抑制 剂 辅助 来 鉴定 (Bolwell et al. ,1994) , 只 有 少数 植物 P450 的 活性 在 分 子 水 平 上 得 到 了 明确 (Schuler , 1996a). 7.1 植物 P450 对 内 源 物 质 的 代谢 反应 (Bolwell et al. , 1994) 月 桂 酸 类 似 物 18 -羟基 亚 油 酸 亚 油 酸 氢 过 氧化 物 月 桂 酸 羟 化 酶 PA SERIE LB 油 酸 凑 化 酶 亚 油 酸 养 化 酶 说 内 桂 酸 - 4 (LN A BS II 阿 魏 酸 - 5 FEL RS p- 莽 草酸 - 3- 羟 化 酶 类 黄酮 - 3 - 羟 化 酶 类 黄酮 - 3 ,5 - 羟 化 酶 异 黄酮 - 2 - 产 化 酶 异 黄酮 - 3- 羟 化 酶 异类 黄酮 - 6a - 产 化 酶 Fa 马 米 生 合 酶 补 骨 脂 素 合 酶 补 骨 脂 素 5 -加 单 氧 酶 FEI RE AG TERE 10 - 产 化 酶 橙 花 醇 2,3-6 ,7 - 环 氧化 酶 Free 3,6 或 7- 羟 化 酶 BAAR — SEAL - 108 . 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 菠 烯 羟 化 酶 樟脑 6 - 产 化 酶 冬青 油 烯 羟 化 酶 若 品 醇 产 化 酶 甘薯 黑 疤 霉 酮 (ipomeamarone) FA 脱落 酸 6 FSC 毛 地 黄 苷 12 31 甘草 亭 酸 24 - 羟 化 酶 BY #3 HWA ( protopine) 6 — F846 is 二 氢 血 根 碱 10 -FB 10 BS dihydrochelirubine 12 -#2445# dianthramide 4 -#244 5 salutaridine cheilanthifoline stylopene 前 鸦片 碱 MAR N - 羟 化 酶 Xt FREI, FAIS L - 缚 氢 酸 N - 羟 化 酶 2 FEES 鉴定 P450 基因 以 及 测定 它们 的 生物 化 学 功能 是 现在 植物 P450 研究 的 核心 。 从 分 子 水 平 上 鉴定 P450 有 两 个 基本 途径 ,一 是 通过 P450 蛋白 纯化 ,再 由 纯化 蛋白 的 特征 得 选 分 离 其 基因 。 该 方法 被 证 明 非 常 困难 ,因为 植物 细胞 中 P450 的 含量 很 低 , 要 获得 一 定 数量 的 纯化 P450 蛋白 非常 不 易 。 另 一 途径 是 用 P450 基因 探 针 方 法 ,这 是 更 直接 的 鉴定 P450 基因 的 方法 ,但 该 方法 无 法 提供 有 关 P450 功能 的 信息 。 近 来 ,人 们 认识 到 还 可 以 利 用 缺失 某 一 P450 催化 反应 的 突变 体 ( 表 7.3) , 先 克隆 与 这 些 缺 失 反应 相关 的 基因 ,再 根 据 突变 体 互 补 的 原理 鉴定 基因 的 功能 。 在 某 些 情 况 下 ,P450 基因 也 通过 差别 筛选 或 差别 显示 (differential display) 得 到 确定 (Czernic et al. ,1996; Larkin, 1994; Nadeau et al., 1996; Suzuki et al. ,1996; Vetter et al. , 1992), HRAIEMKE Glycine max 的 培养 细 胞 中 鉴定 出 可 被 甲 基 茉 莉 酸 诱导 的 P450 基因 (CYP9%3A1 )。 用 该 基因 克隆 了 同一 基因 家 族 的 另 一 P450 基因 (CYP9%3A2 ) ,与 CYP93A1 具有 80% 相 同性 ,但 它 对 甲 基 茉 莉 酸 处 理 没有 响应 ,预示 二 者 的 功能 可 能 有 所 不 同 (Suzuki et al. , ,1997) 。 差 别 筛选 的 另 一 例子 是 鉴定 出 蝶 兰 ( Phalaenopsis ) 胚珠 发 育 过 程 中 特异 性 表达 的 P45$0(CYP78A2 )\Nadeau et al. , 1996) ,从 玉米 穗 状 雄 花 的 cDNA 文库 中 差别 筛选 出 一 未 知 功能 的 同一 家 族 P450 (CYP78A1 ),CYP78A1 与 CYP78A2 具有 54% 相 同性 。CYP78A2 被 认为 可 能 在 生物 合 成 (花粉 管 发 育 所 需 ) 植 物 生 长 调节 剂 中 起 作用 ,但 至 今 其 功能 还 是 个 於 。 另 外 一 些 P450 从 表达 序列 标签 (EST) 文 库 中 鉴定 (Cooker et al. , 1996; Newman et al., 1994; Shen et al., 1994). 第 七 章 , 植 物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 109 - 大 多 数 植物 的 P450 基因 未 被 克隆 ,已 克隆 的 基因 的 体内 功能 尚未 知 ( 表 7.2)。 CYP71 #2 3 — 4 MA 83 38 ( Persea americana ) 中 皮层 (mesocarp ) 中 纯化 至 均 质 的 植物 P450 , 它 可 以 催化 模式 底 物 对 -和 氯 - N - 甲 基 葵 胺 的 N - 脱 甲 基 作 用 ,但 它 的 内 源 性 底 物 目 前 还 不 清楚 。 为 弄 清 CYP71 的 体内 功能 ,将 CYP71 转 到 酵母 中 表达 , 异 源 表达 的 P450 表现 出 o- 氯 -N - 甲 基 葵 胺 脱 甲 基 作 用 (Bozak et al. , 1992) ,还 可 将 橙 花 醇 (nerol) 和 香 叶 醇 (geraniol) 转 化 为 它们 的 2,3 -和 6,7 - 环 氧 化 衍生 物 (Hallahan et al. ,1994) 。 但 是 ,在 钱 梨 中 皮层 的 提取 液 中 既 未 检测 到 这 些 单 丫 底 物 及 其 反应 产物 。 随 着 CYP71A1 被 克隆 后 ,其 他 许多 P450 cDNAs 通过 PCR(Baltrusch et al . ,1997; Clark et al. ,1997; Court- ney et al., 1996; Frank et al., 1996; Hutvagner et al., 1997; Meijer et al., 1993; Suzuki et al. , 1996; Udvardi et al. , 1994; O’ keefe and Leto, 1989) AFA P450 探 针 在 不 太 严 格 条 件 下 杂交 的 方法 来 鉴定 (Czernic et al. , 1996; Mangold et al. , 1994; Toguri et al., 1993; Toguri and Tokugawa, 1994; Umemoto et al., 1993) ,但 这 些 方法 依赖 于 对 ARH P450 基因 和 它们 编码 蛋白 的 一 级 结构 的 了 解 。 表 7.2 植物 细胞 色素 P450 克隆 基因 列表 CYP51 obtusifoliol 14a - 脱 甲 基 酶 Sorghum bicolor Bak et al. , 1998 CYP71A1 未 知 Persea americana Bozak et al. ,1990 CYP71A2 未 知 Solanum melongena Umemoto et al. ,1993 CYP71A3 未 知 Solanum melongena Umemoto et al. ,1993 CYP71A4 KA Solanum melongena Umemoto et al. ,1993 CYP71A5 未 知 Nepeta racemosa Clark et al. ,1997 CYP71A6 KA Nepeta racemosa Clark et al. ,1997 CYP71A10 ERA FAK N - 脱 甲 基 | Glycin max Siminszky et al. , 1999 CYP7IBI KA Thlaspi arvense Udvardi et al. , 1994 CYP71B2-6 未 知 Arabidopsis thaliana Mizutani et al. , 1998 CYP71B7 KA Arabidopsis thaliana Maughan et al. , 1997 CYP71C1 HBOA 48% Zea mays Frey et al. , 1995; Frey et al. , 1997 CYP71C2 =A "| YR- 2 - 酮 (indolin-2-one) | Zea mays Frey et al. , 1995; 羟 化 酶 Frey et al. ,1997 CYP71C3 HBOA-N -#24( Bi Zea mays Frey et al. , 1995; Frey et al. , 1997 CYP71C4 AYR 2 - 酮 合 酶 Zea mays Frey et al. , 1995; Frey et al. , 1997 CYP71D6 KA Solanum chacoense Hutvagner et al. , 1997 CYP71D7 KA Solanum chacoense Hutvagner et al. , 1997 CYP71D10 KA Glycine max Siminszky et al. , 1999 CYP71E1 4) MF (dhurrin) MAR Sorhum bicolor Bak et al. , 1998 CYP72A1 未 知 Catharanthus roseus Mangold et al. , 1994; Vetter et al. , 1992 CYP73Al 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 Helianthus tuberosus Teutsch et al. , 1993 CYP73A2 肉桂 酸 - 4 21k Phaseolus aureus Mizutani et al. , 1993 CYP73A3 肉桂 酸 - 4 31k Be Medicago sativa Menting et al. , 1994 SEO 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 CYP73A4 CYP73A5 CYP73A9 CYP73A10 CYP73A12 CYP73A13 CYP73A16 CYP73A? CYP73A? CYP74A1 CYP74A2 CYP74A3 CYP74B CYP7SAI1 CYP75A2 CYP75A3 CYP75A4 CYP76A1 CYP76A2 CYP76B1 CYP76C1 CYP77A1 CYP77A2 CYP77A3 CYP78A1 CYP78A2 CYP78A3 CYP79 CYP80 CYP81E1 CYP82 CYP82C1 CYP83 CYP83A1 肉桂 酸 - 4 24k BS 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 肉桂 酸 - 4 - 羟 化 酶 两 二 烯 氧化 物 合 酶 (AOS) 橡胶 颗粒 蛋白 两 二 烯 氧 化 物 合成 酶 (AOS) 脂肪 酸 氢 过 氧化 物 裂解 酶 类 黄酮 3 ,5 一 羟 化 酶 类 黄酮 3 ,5 - 羟 化 酶 类 黄酮 3 ,5 - 羟 化 酶 类 黄酮 3 ,5 羟 化 酶 未 知 未 知 外 源 物 质 ,模式 底 物 未 知 未 知 未 知 未 知 未 知 未 知 MAR N - 羟 化 酶 BET Bit 异 黄酮 - 2- 羟 化 酶 未 知 未 知 未 知 未 知 Catharanthus roseus Arabidopsis thaliana Pisum sativum Petroselinum crispum Zinnia elegans Populus tremuloides Populus kitakamiensis Populus kitakamiensis Populus kitakamiensis Linum usitatissimum Parthenium argenta- tum Arabidopsis thaliana Capsicum annaum Petunia hybrida Solanum melongena Petunia hybrida Geniana triflora Solanum melongena Solanum melongena Helianthus tuberosus Arabidopsis thaliana Solanum melongena Solanum melongena Glycin max Zea mays Phalaenopsis sp. Glycin max Sorghum bicolor Berberis stolonifera Glycyrrhiza echinata Pisum sativum Glycin max Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana BR Hotze et al. , 1995, Meijer et al. , 1993 Bell-Lelong et al. ,1997; Mizutani et al. , 1997 Frank et al. ,1996 Logemann et al. , 1995 Ye et al. , 1996 Ge and Chiang, 1996 Kawai et al. , 1996 Kawai et al. , 1996 Kawai et al. , 1996 Song and Brash, 1991 Pan et al. ,1995 Laudert et al. , 1996 Matsui et al. , 1996 Holton et al. , 1993, Teutsch et al. , 1993 Toguri and Tokugawa, 1994 Holton et al. ,1993 Tanaka et al. , 1996 Toguri et al. ,1993 Toguri et al. ,1993 Robineau et al. , 1998 Mizutani et al. , 1998 Toguri et al. , 1993 Toguri et al. , 1993 Siminszky et al. , 1999 Larkin ,1994 Nadeau et al. , 1996 Siminszky et al. , 1999 Koch et al. , 1995 Kraus and Kutxhan, 1995 Akashi et al. , 1998a Frank et al. , 1996 Siminszky et al. , 1999 Chapple, 1995 Mizutani et al. , 1998 第 七 章 ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 111: BR Arabidopsis thaliana Mizutani et al. , 1998 未 知 Glycin max Siminszky et al. , 1999 CYP84 阿 魏 酸 - 5 FEL it Arabidopsis thaliana Meyer et al. , 1996 CYP85 未 知 (brassinosteroid 合成 酶 ?) Lycopersicon esculen- | Bishop et al., 1996 tum CYP86 Arabidopsis thaliana Benveniste and Durst, 1995 CYP88 未 知 ( 赤 霉 素 合成 酶 ?) Zea mays Winkler and Helentjaris, 1995 CYP89A2 KA Arabidopsis thaliana Courtney et al. ,1996 CYP90 Cathasterone — 23 -¥44( i Arabidopsis thaliana Szekeres et al. ,1996 CYP91A1 KA Arabidopsis thaliana Mizutani et al. , 1998 CYP92A2 未 知 Nicotiana tabacum Czernic et al. , 1996 CYP92A3 KA Nicotiana tabacum Czernic et al. ,1996a CYP93A1 A Glycine max Suzuki et al. ,1996 CYP93A2 KA Glycine max Suzuki et al. , 1997 Arabidopsis thaliana Mizutani et al. , 1998 CYP93B1 (2S)- 黄 烷 酮 - 2 F240 Glycyrrhiza echinata Akashi et al. ,1998b CTP93B2 RAM I Gerbera hybrid "| Martens and Forkman, 1999 CYP93C1 Glycine max Siminszky et al. , 1999 CYP97B1 KA Pisum sativum Baltrusch et al. , 1997 CYP97B2 KA Glycine max Siminszky et al. , 1999 CYP98 未 知 Sorghum bicolor Bak et al. , 1998 CYP98A2 KA Glycine max Siminszky et al. , 1999 CYP99 KA Sorghum bicolor Bak et al. , 1998 月 桂 酸 加 单 氧 酶 Petunia hybrid Imaishi et al. , 1999 37.3 缺失 P450 催化 反应 的 突变 体 (Chapple,1998) Matthiola incana 类 黄酮 - 3’ —-F2 1 Forkmann et al. ,1980 bx3 Zea mays AR 2 BF 1 Frey et al. ,1997 cpd Arabidopsis thaliana Cathasterone ~ 23 -#244 59 Szekeres et al. ,1996 dwarf Lycopersicon esculentum 未 知 Bishop et al. ,1996 dwarf3 Zea mays GA12 - 13 -¥24( 88 Winkler and Helentjaris, 1995 eos Antirrhinum majus 26 Bel 3’ 1b Forkmann and Stotz, 1981. fahl Arabidopsis Ralisna 阿 魏 酸 - 5 SAL > et al., 1992; Meyer et al., gad Arabidopsis thaliana 贝壳 杉 烯 醇 羟 化 酶 Finkelstein and Zeevaart,1994 hfl ,hf2 Petunia hybrida 类 黄酮 - 3’, 5-24 Holton et al. ,1993 htl, ht2 Petunia hybrida 类 黄酮 - 3- 羟 化 酶 和 MPM Gu woke p Verbena hybrida 类 黄酮 - 3 ,5 一 羟 化 酶 Beale et al. ,1940 Arabidopsis thaliana 类 黄酮 - 3-316 Shirley et al. ,1995 植物 P450 从 功能 意义 上 可 以 分 为 两 大 类 型 。 一 是 具 生 物 合成 功能 的 P450 , 另 一 类 , 112 , 细胞 色素 .P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 为 代谢 解毒 的 P450。 生 物 合成 有 关 的 P450 在 木质 素 中 间 物 、 植 物 激 素 、 省 醇 、 熙 类 黄酮 类 、 异 黄酮 和 叶 喃 香 豆 素 的 合成 中 起 重要 作用 。 解 毒 有 关 的 P450 可 以 催化 外 源 化 合 物 如 除草 剂 变 成 非 毒 性 产物 。 还 有 些 P450 可 能 活化 某 些 无 毒性 的 物质 如 前 除草 剂 (pro- herbicide) 成 为 具有 毒性 的 除草 剂 (Schuler,1996 ) 。 7.1 生物 合成 酶 7.1.1 茶 两 烷 类 (phenylproanoid) 生 物 合 成 葵 丙 烷 的 生物 合成 中 eae P450 催化 反应 超过 16 个 (Werck-Reichart,1995 ) 。 从 葵 丙 氨 酸 4 - 香 豆 酰 辅酶 A。 经 三 个 催化 步骤 形成 的 代谢 物 进 入 葵 两 烷 代 谢 途 径 (图 7.1) ,其 中 第 二 步 反 应 由 aap 4 - 羟 化 酶 (C4H) 催 化 ,该 酶 是 P450。 由 于 C4H 催化 反 应 的 中 心地 位 ,C4H 活性 几乎 存在 于 所 有 植物 中 ,与 其 他 P450 活性 相 比 具有 相对 较 高 的 活性 。 因 此 ,C4H 成 为 第 一 个 鉴定 的 P4$0(Russell,1971; Russell and Conn,1967) ,也 是 惟一 的 一 个 从 许多 植物 中 和 细胞 类 型 中 鉴定 的 活性 。 os0-oces LAAAR RAR ”对 - anal wi fa 和 sa tis -S- CoA by 一 S- CoA % s Qic-S -S-CoA -S-CoA 二 一 hs ‘OCH = H OH ; OCH OCH; 对 -- 香 豆 酰 辅酶 A ”咖啡 酰 辅 梅 A 5 mien ii. bes ke oH pial \ HH LE a 2 oO FSH ater ue OCH, HO OCH cy OCH, 对 一 香 豆 醛 PARE 5- 松 柏 醋 “1S xt - SoM 松柏 醛 SH. 5_ xeon “一 一 ~ 芥子 醇 G- 木 质 素 S- 木 质 素 图 7.1 葵 丙 烷 类 化 合 物 的 代谢 途径 第 七 章 ” 植 物 细 胞 色素 P450 及 其 功能 。 113 * C4H 的 功能 是 反 式 -肉桂 酸 的 羟基 化 , 底 物 来 源 于 葵 丙 氨 酸 代谢 产物 。C4H 自发 现 以 来 ,得 到 了 广泛 的 研究 ,因为 它 参 与 的 葵 两 烷 代 谢 途 径 产 生 大 量 的 重要 代谢 物 包 括 木 质 A BMA REA EBA ABS (lignans) . — # Z Mp (stilbenes) LA R— 26 FAA TE Rit DKA D (FAR EGR KMS LR). C4H 蛋白 的 分 离 得 益 于 相 分 配 技术 的 发 展 ,在 高 浓度 的 甘油 存在 时 ,将 在 经 增 溶 的 微粒 体制 备 液 中 的 P450 提取 到 富 含 去 污 剂 的 分 配 相 中 (Werck-Reichhart et al., 1991). Ail FA3X— ak AR , M383# ( Helanthus rosexs )(Gabriac et al. ,1991 ) ,4%'F( Phaseolus aureus ) (Mizutani et al. ,1993) 中 纯化 了 C4H, 其 对 应 的 CDNAs( Mizutani et al. , 1993a; Teutsch et al. , 1993) +H FARKAP & HE Att (Werck-Reichhart, 1993) #2 [oR #2. bia, 许多 其 他 植物 中 分 离 出 C4H 的 cDNAs 或 基因 组 克隆 ( 表 7.2)。C4H JAW CYP73 家 族 , 是 典型 的 *A 组 "P450。 从 蜡 源 表达 的 属于 CYP73 家 族 (CYP73A1 - CYP73A5)P450 的 实验 表明 ,它们 具有 肉桂 酸 4 - 羟 化 酶 活性 。 已 经 分 离 的 CYP73 P450 在 氨基 酸 水 平 上 彼 此 有 75% 一 90% 相似 性 ,是 否 所 有 CYP73 家 族 成 员 都 具有 相同 的 反应 活性 还 不 清楚 (Mizutani, 1998). CAH 活性 及 其 基因 表达 受 许多 因子 的 调控 。C4H BIE Al A fh (Benveniste et al. ,1977) 和 接触 金属 离子 (Reichhart et olL. ,1979 ) 被 诱导 。 调 控 可 能 在 转录 水 平 上 (Batard et al., 1997; Bell-Lelong et al., 1997; Frank et al., 1996; Mizutani et al., 1993)。 病 原 物 攻击 可 以 诱导 C4H mRNA (Buell and Somerville, 1995), Ab, C4H 的 表 达 调 控 时 空 方 式 与 该 酶 在 木质 化 过 程 中 的 功能 相 一 致 。 C4H 具有 很 高 的 底 物 特异 性 (Pierrel et al. ,1994) ,对 肉桂 酸 的 K,, (A(R (4ymol/L), 转换 数 非常 高 (4004Amnin)。 该 酶 对 许多 能 被 P450 代谢 的 植物 产物 无 羟基 化 作用 (Pierrel et al. , 1994) ,但 对 一 些 外 源 物 质 具 有 低 效 率 的 脱 烷 基 或 羟基 化 作用 。 这 些 数 据说 明 , C4H 不 像 代谢 外 源 物质 的 酶 , 它 具 有 高 效 性 和 底 物 特异 性 (Urban et al. , 1994). C4H 的 编码 全 长 .cDNA 已 从 菊 芋 (Teutsch et al., 1993), (Mizutani et al., 1993) , 648 ( Medicago sativa )( Fahrendorf and Dixon, 1993), Mel H 32) (Helianthus ) 植物 中 分 离 的 P450 被 定名 为 CYP73A1. 木质 素 生 物 合成 支 路 ,对 -肉桂 酸 被 转化 为 咖啡 酸 (coffeate) ,随后 变 成 阿 魏 酸 (feru- late) , 阿 魏 酸 羟基 化 生成 5 -羟基 阿 魏 酸 也 是 由 P450 介 导 , 称 阿 魏 酸 5 - 羟 化 酶 (FS5H) (Grand ,1984) 。5 -羟基 阿 魏 酸 的 甲 基 化 作用 是 通过 O - 甲 基 转 移 酶 催化 完成 ,产生 芥子 酸 (sinapate) 。 芥 子 酸 、 对 - 香 豆 酸 和 阿 魏 酸 经 活化 ,形成 各 自 的 CoA 硫 酯 ,随后 被 还 原形 成 羟基 肉桂 醇 ( 葵 丙烯 醇 )(hydroxycinnamyl alcohol) ,构成 木质 素 这 一 代谢 途径 。FSH 活 性 控制 5 -羟基 阿 魏 酸 与 阿 魏 酸 的 比率 ,由 此 决定 芥子 醇 (sinapyl alcohol) 与 松柏 醇 (coniferyl alcohol) 的 比率 ,FSH 酶 因此 决定 木质 素 中 不 同 单 体 类 型 的 相对 丰 度 。 FSH 离 体 活性 的 报道 很 少 (Grand,1984) , 它 的 作用 是 将 阿 魏 酸 转化 为 5 -羟基 阿 魏 酸 (图 7.1)。FSH 突变 体 已 在 拟 南 芥 (Arabiaozsis ) 中 发 现 ( 表 7.3) ,fahl 突变 体 不 能 合 成 芥子 酰 苹果 酸 酯 (sinapoylmalate) 这 种 Arabidopsis 中 主要 的 可 溶性 葵 两 烷 次 生性 代谢 物 。 由 于 其 叶片 缺乏 芥子 酰 苹果 酸 酯 ,fahl 突变 体 在 紫外 光 下 显示 暗 红 的 叶绿素 荧光 不 同 于 野生 种 类 的 蓝 色 荧光 (Chapple et wy . ,1992 ) 。 利 用 这 种 可 视 性 的 筛选 方法 ,fahl 的 T-DNA 昆 等 位 基因 被 确定 并 用 于 克隆 编码 FSH 的 基因 ,克隆 基因 的 性 质 通 过 突变 体 - 114: 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 表 型 的 互补 得 到 证 实 (Meyer et al., 1996). FSH 基因 的 损害 ,使 fahl 突变 体 不 积累 芥 子 酰 衍生 的 丁香 基 (syringyl) 木 质 素 (Chapple et al . ,1992)。 野 生 的 Arapidozsis 丁香 基 单位 仅 构成 多 聚 体 的 20% , 且 仅 积累 在 叶 轴 (rachis) 的 硬化 薄 壁 组 织 (parenchyma) 中 。 在 花椰菜 花 叶 病毒 33S 启动 子 指导 下 , FSH 基因 的 表达 可 以 消除 木质 素 单 体 贮 量 (doposit) 的 组 织 特异 性 , 丁香 基 含 量 上 升 S0% 。 这 些 结果 表明 , FSH 的 表达 与 Arapidozsis 中 木质 素 生 物 合成 的 定量 调控 和 发 育 调控 有 关 。 如 用 Arabidopsis AH 启动 子 控制 , FSH 基因 的 表达 效率 更 高 ,产生 丁香 基 含 量 超过 90% 的 木质 素 。 可 见 P450 的 启动 子 以 及 FSH 的 编码 序列 可 用 在 生物 技术 应 用 方面 (Meyer et al. ,1996 ) 。 为 进一步 了 解 FSH , Humphreys 等 (1999) 将 FSH 基因 在 酵母 中 表达 。 发 现 FSH 不 仅 催化 阿 魏 酸 生成 5 -羟基 阿 魏 酸 , 它 还 以 松柏 醛 (coniferaldehyde) 和 松柏 醇 (coniferyl al- cohol) 为 底 物 , 且 后 两 种 底 物 的 Km 值 比 阿 魏 酸 低 3 个 数量 级 ,预示 在 木质 化 组 织 中 丁香 基 单 体 可 能 来 源 于 它们 对 应 的 邻 - 甲 氧 葵 基 (guaiacyl) ,经 羟基 化 和 随后 的 甲 基 化 作用 形 成 ,从 而 提出 了 木质 素 合成 的 更 新 途径 (图 7.1)。 黄酮 类 化 合 物 中 占 优 势 的 一 个 亚 类 是 花色 素 苷 (Holton and Cornish, 1995; Fork- mann,1991)。 通 过 葵 丙 烷 类 途径 中 的 花色 素 苷 生物 合成 支 路 , 由 前 体 o - 香 豆 酸 衍生 不 同 种 类 的 花色 素 苷 ,P450 特别 丰富 (图 7.2)。 在 这 一 系列 反应 中 ,4 - 香 豆 酰基 辅酶 A 经 查 耳 酮 (chalcone) 合 酶 (CHS) 形 成 四 羟基 查 耳 酮 。 四 凑 基 异 构 化 生成 4 ,5,7 -三 羟 黄 烷 酮 (naringenin) ,4 ,5,7 -三 羟 黄 烷 酮 转化 为 二 - 氢 菊 非 醇 (dihydrokaempferol,DHKE ) 是 两 个 不 同 P450 加 单 氧 酶 系 的 底 物 。 由 类 黄酮 (flavonoid)3 - 羟 化 酶 (F3 HH) 在 3 位 置 催化 4',5,7- 三 羟 黄 烷 酮 或 DHK 的 羟基 化 (Stotz et al. ,1985) ,类 黄酮 3 ,5 - 羟 化 酶 (F3 ,7 H) 催 化 DHK 8% — Si #648 (dihydroquercetin, DHQ) kt — A % #8 i Bl ( dihydromyricetin, DHM)。 该 两 种 P450 羟 化 酶 可 以 催化 多 种 相关 底 物 ,如 DHK 和 DHQ。 相 对 而 言 其 他 植 物 P450 如 t-CAH 和 随后 提 到 的 补 骨 脂 素 (psoralen) 5 - 单 加 氧 酶 具有 较 高 的 底 物 特异 fe. 与 阿 魏 酸 5 Fe ( AAGKA MEENA RREDA RX) EERE 支 路 的 流量 受 几 个 P450 WY RATS EN DAPE , UO 4E 28 R (delphinidin). #677 (cyanidin) 的 比例 随 类 黄酮 3- 和 3’ 5 FR ES BEE. 4 PAPE P450 都 存在 时 (如 在 怕 冬 th Petunia hybrida 中 ) 4EPRMAD ARS, MMA FP HREM , 花 青 素 衍生 物 占 优势 (Holton and Cornish,1995 ) 。 编码 类 黄酮 - 3 ,5 - 羟 化 酶 (FE-3 ,5- HI) 的 基因 是 第 一 个 克隆 的 植物 P450 基因 ,是 2h Petunia hyprida 中 ,用 生物 化 学 和 遗传 学 方法 (Holton et al. , 1993) PR re 的 , 7229 P4SOCYP75. F-3’,5’-H £46 4’ ,5,7- 三 羟基 黄 烷 酮 (naringenin) 逐 步 转化 为 圣 草 酚 (eriodictyol) 和 五 羟基 黄 烷 酮 (pentahydroxyflavanone) (图 7.3) 以 及 催化 对 应 的 工 氢 蒋 非 醇 的 羟基 化 作用 转化 为 二 氢 栎 精 (dihydroquercetin ) 和 二 和 氧 杨梅 黄酮 (dihy- dromyricetin)( 图 7.3,7.4,Menting et al. , 1994; Stotz and Forkmann, 1981), F-3’,5- H 反 应 的 产物 是 花色 素 生 物 合成 的 中 间 体 。 二 -或 三 -羟基 化 衍生 物 的 葡 糖 苷 花 青 素 (cyanidin) fl 4 & & ( delphinidin) & #4 fii ( petunia ) 和 许多 其 他 植物 的 紫 - 蓝 (purple- blue) 花 的 色素 。 利 用 F- 3 ,5’- H AA ZE 4.89 BT REE od Lt EA BY 3 (Holton, 1995). 第 七 章 , 植 物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 115° Fi — BEA praman = CO OH O 4,2',4',6'-DUF2 4 75 id 4'5,7-— 2 Rhee OH O AER HO cag sa 二 氢 欧 非 醇 OH OH O HO F3'S'H oe ae OH < Me sre oy O-glucose OH 花 葵 素 -3- 葡 糖 背 tee K3-W eR R3— MT 图 7.2 黄酮 物质 的 代谢 - 116 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 HO O HO “ams } ap ah Cs 人 ee Si J — joan, 28 Ay" “BSH OL ey OH O SH OH 0 OH 0 4, 5, 7- 三 羟基 黄 烷 酮 oaringenin) 圣 草 酚 (eriodictyol) THER 7.3 类 黄酮 - 3’ ,5’-F2(b RR (F - 3 ,5’- HER BAH, Hf AA? 基因 座 编码 F-3“ ,5’- H, Hfl/Hf2 双 突 变 体 缺 乏 由 二 氢 杨 梅 黄酮 衍生 的 花色 素 , 其 花 的 颜色 不 同 于 野生 种 (Stotz and Forkmann,1981)。 根 据 P450 血红 素 结 合生 成 的 保守 区 域 设 计 的 引物 得 到 PCR 产物 库 ,其 中 两 个 克隆 在 hf1hf2 双 突 变 体 花 冠 中 制备 的 RNA 中 无 可 识别 的 转录 物 。 该 两 个 “基于 突变 体 的 克隆 策略 ”分离 的 cDNA, 彼 此 具有 93% FATE. HA BAH? 更 大 的 影响 花 颜 色 表 达 的 效应 , 因为 Hf 可 以 同时 影响 冠 榴 (corolla limb) Affe} (corolla tube) 而 Hf2 仅 能 影响 冠 榴 。 异 源 表 达 ( 酵 母 ) 证 明 ,该 克隆 编码 的 蛋白 可 以 催化 FE- 3 ,5-H 反 应。 其 他 F-3“ ,5 一 百 的 核酸 Fro GC FEE (Toguri et al., 1993), iF (Solanum melongena ) (Toguri et al., 1993a) , FEHA( Gentiana triflora )(Tanaka et al. ,1996) 中 也 分 离 了 其 cDNA 。 在 此 要 提 到 的 是 ,F-3“ 5-H EWS LAR FAR 3-210 (F - 3’-H) ,F- 3-H Ata 4 5,7 -三 羟基 黄 烷 酮 (naringenin) 和 二 氢 菊 非 醇 转 化 为 圣 草 酚 和 二 和 氢 栎 精 (图 7.3 和 7.4,Menting et al., 1994)。F-3“ ,5 一 也 在 其 活性 部 位 可 以 容纳 双 羟 基 化 的 BAMA F-3-HARE. EC) BEAA Arabidopsis 中 获得 缺失 F- 3'- 百 活性 的 突变 体 (Doodeman et al. ,1982; Shirley et al. ,1995; Tabak et al. , 1978) ,由 此 可 以 用 基于 突 变 体 克隆 方法 分 离 FE- 3’- H SEA (Meyer et al. , 1996). OH OH OH toe cyp7s HO 9 SS JCYPTS .. F3'S'H cy) F3'5'H (“on OH | OH ae | OH F3'H | OH O 三 氧 欧 非 醇 BURA 二 氨 杨 梅 黄酮 图 7.4 类 黄酮 3- 产 化 酶 (FE- 3’- H) 与 类 黄酮 - 3 5-1 (F - 3 ,5- 了 ) 催 化 反应 特异 性 异类 黄酮 (isoflavonviols) 是 天 然 存在 的 类 黄酮 的 一 个 亚 类 , 它 几 乎 分 布 于 所 有 的 豆 科 植物 中 ,并 参与 豆 科 植物 对 植物 病原 微生物 的 防御 。 异 类 黄酮 衍生 的 化 合 物 在 大 豆 根 与 细菌 形成 固氮 根瘤 菌 的 共生 关系 中 也 十 分 重要 。 从 苯 两 烷 共 同 途 径 的 终 产物 4 - 香 豆 酰 辅酶 A (4-coumaroyl CoA) 开 始 , 已 知 4 个 P450 介 导 了 大 豆 Glycine max 中 glyceollin 的 合成 , 即 异 黄酮 合 酶 (Isoflavone synthase) , 7,4 二 羟基 异 黄酮 2- 羟 化 酶 (daidzein 2’-hydroxylase) , 3,9 -二 羟 紫 檀 60 - 羟 化 酶 (3,9- dihydroxypterocarpan 6a-hydroxylase) 及 环 化 酶 (cyclase) (Kochs and Grisebach, 1986; Hagmann et al. ,1984; Welle and Grisebach, 1988). 7E/E4§ (Cicer arietinum ) 中 ,两 种 不 同 的 P450 Bil 5 Se Be) 2’-32 46 BB (isoflavone 2’-hydroxylase; I’2H) Fl 5 3 Bed 3’- F240 Boe ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 。 117 , (isoflavone 3 -hydroxylase) 分 别 将 7 - 羟 - 4- 甲 氧 异 黄酮 (formnononetin) 转 化 为 medicarpin 和 高 丽 槐 素 (maackiain)。 其 中 Z 了 被 报道 对 4- 甲 氧 异 黄酮 [7 - 羟 - 4- 甲 氧 异 黄酮 和 鸡 豆 黄 素 (biochanin A) ] 具 有 特异 性 ,而 对 4- 羟 基 类 似 物 (7,4- 二 羟基 异 黄酮 和 5,7 ,4’-= 羟 异 黄酮 ) 很 少 发 生产 基 化 作用 (Hinderer et al. ,1987;Clemens et al. ,1993 ) 。 从 甘草 Glycyrrhiza echinata 中 分 离 了 一 编码 异 黄酮 2 - 羟 化 酶 (ID H) 的 基因 ,定名 为 CYP81E1(Akashi et al. ,1998a)。 超 量 表 达 CYP81EF1 的 酵母 细胞 微粒 体 可 以 催化 异 黄酮 (7,4- 二 羟基 异 黄 酮 和 7 - 羟 - 4- 甲 氧 异 黄酮 ) 的 羟基 化 作用 ,分 别 产 生 2 -羟基 异 黄 酮 (2 -羟基 7,4- 二 羟基 异 黄酮 和 2 -羟基 7 - 羟 - 4- 甲 氧 异 黄酮 )。 首 次 证 明了 CYP81E1 是 参与 豆 科 植物 中 异类 黄酮 衍生 的 抗 微 生物 化 合 物 合成 的 2- 羟 化 酶 。 从 甘草 中 分 离 的 另 一 P450 基因 CYP93B1 ,通过 在 昆虫 细胞 中 表达 该 基因 的 微粒 体 P450 可 以 催化 (2S)- 7,4“- 二 羟基 黄 烷 酮 (liquiritigenin) 和 (2S)- 4 ,5$,7 -三 羟基 黄 烷 酮 (naringenin) 分 别 形成 Licodione 和 2 -羟基 - naringenin。 用 酵母 表达 该 基因 得 到 的 微粒 体 P450 可 以 将 圣 草 酚 转 化 为 毛 地 黄 黄酮 (luteolin)。 为 此 认为 CYP93B1 编码 (2S)- 黄 烷 酮 2 - 羟 化 酶 ,该 酶 以 前 被 称 为 licodione 合 酶 和 黄酮 合 酶 开 ( 图 7.5)。 查 尔 本 R, OH 0. oss Js 2- Fe weiss Ri 异 黄酮 合 本 Ra CS)- 黄 煤 柄 OH HO of HO O._OH Oe x .0 x 9 OH = OH | Woe © 1 ia. Ry OH 黄酮 异 黄 酮 Licodione 7.5 黄酮 . 异 黄酮 及 Licodione 的 合成 (Akashi 等 ,1998b) Marten 和 Forkmann (1999) 从 大 丁 草 Gerbera hybrids 中 获得 了 一 全 长 cDNA, CYP93B2 ,该 基因 只 在 具有 显 性 等 位 基因 fns* 的 株 系 中 转录 。 在 花 发 育 过 程 中 , CYP93B2 的 转录 水 平 与 黄酮 合 酶 开 的 活性 以 及 黄酮 的 积累 量 相 一 致 。 由 酵母 表达 的 CYP93B2 可 以 催化 黄 烷 酮 产生 黄酮 的 反应 。 该 基因 被 证 明 是 黄酮 合 酶 LES CYP93B2 序列 有 54% 相 同性 。 植物 防御 毒素 的 另 一 大 类 是 叶 喃 香 豆 素 , 其 中 P450 参与 了 呐 喃 香 豆 素 的 生成 (图 7.6). RAKE GR HS GRAN AK 7 -羟基 香 豆 素 (umbelliferone) 而 来 ,在 香 豆 素 核 的 6,7 (2S ERMA, ZED K (Ammi majus ) 和 皱 叶 欧 芹 ( Perroselizzzzz crispum ) 。 118 - 细胞 色素 P450 BEAR MAY SRE Ss hie FA 中 ,两 个 P450 即 马 米 生 合 成 酶 (marmesin synthase) (Hamerski and Matern, 1988a) 和 补 骨 脂 素 (psoralen) 合 酶 (Wendroff and Matern, 1986) 起 催化 作用 形成 线 型 叶 喃 香 豆 素 补 骨 脂 素 。 香 豆 素 核 S-,8 -位 置 的 羟基 化 作用 也 是 由 P450 催化 的 ,分 别 为 补 骨 脂 素 5 -加 氧 酶 和 补 骨 脂 素 8 -加 氧 酶 (Matern et al. ,1988; Hamerski and Matern,1988b)。 产 物 分 别 是 佛手 酚 (bergaptol) 和 花椒 毒素 (xanthotoxin)。 这 类 羟基 化 产物 在 某 些 植物 中 是 终 产 物 (Murray et al. , 1982) ,但 在 大 多 数 伞 形 科 植物 (umbelliferone) 中 ,它们 是 O -=- 甲 基 转 移 酶 的 底 物 ,由 此 产生 花椒 毒素 (8 - 甲 氧 基 补 骨 脂 素 ) 和 香 柠檬 烯 (bergapten)(S - 甲 氧 基 补 ‘38% (methoxypsoralen)). 4 HK E ZA ON 4 ABER (angelicin) Fl 4 By KV ( spho- ndin) HED WEA , CIB ERO (osthendl) HE ZREH 7,8 -fi a KKH, 这 合成 途径 中 ,也 鉴定 出 P450 的 作用 ( 赵 剑 et al. ,1999)。 m oe bale GO at BURAK TE RESIS S He CL ee 号 “Ps seman” TCO, wee ™ pa aed HO; “3 AV REX 8- ae, eae 2 sg MRS a Ae “当归 根 素 J teh as 6 全 | 5 VE 办 人 ‘ 7 ca 当归 根 素 AR 站 we Bet & m i 本 NS O O O O ome) O OO 牛 防风 定 Hs H; 5- 羟 基 花 椒 毒 素 FELT R 图 7.6 香 豆 素 的 生物 合成 7.1.2 脂肪 酸 生物 合成 植物 的 脂肪 酸 在 形成 螨 质 和 软木 脂 等 保护 结构 中 起 一 定 作 用 ,许多 实验 证 明 ,P450 参与 脂肪 酸 的 产 基 化 和 环 氧 化 。 脂肪 酸 代 谢 过 程 中 ,月 桂 酸 羟 化 酶 (lauric acid hydroxlase , LAH) 催化 短 链 (C10) 和 第 七 章 , 植 物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 119 , 中 链 (C12-C14) 脂 肪 酸 的 羟基 化 (Salaun and Helvig,,1995) 。 在 不 同 的 植物 中 已 鉴定 出 几 种 不 同 的 LAH, 如 链 内 月 桂 酸 羟 化 酶 (in chain-lauric acid hydroxlase, IC-LAH) 在 C-8、C- 9 和 C-10 羟基 化 ,未 端 C-12 FEFETL AB (w-lauric acid hydroxlase,ow-LAH) 在 12 位 凑 基 化 , UB (w-1)-LAH 4E C-10 和 C-11 的 羟基 化 (图 7.7)。 这 些 酶 系 表现 出 严格 地 物种 特异 性 ,在 同一 植物 种 中 ,未 发 现 有 两 个 月 桂 酸 羟 化 酶 共存 的 现象 (Zimmerlin and Durst, 1992)。 近 来 的 研究 显示 ,一 个 月 桂 酸 羟 化 酶 (如 来 自救 荒野 更 豆 Vicia sativa 微粒 体 ) 具 Aw -羟基 化 月 桂 酸 及 其 链 内 不 饱和 类 似 物 以 及 环 氧 化 11 -十 二 碳 烯 酸 的 能 力 (Weissbart 等 ,1992), 上 且 顺 式 和 反 式 不 饱和 类 似 物 的 羟基 化 效率 相同 。 从 怕 冬 苘 中 克隆 了 CYP703A1 ,通过 在 酵母 中 表达 ,该 血红 素 蛋 白 具 有 代谢 月 桂 酸 的 能 力 。 该 基因 在 植物 花 发 育 的 早期 阶段 表达 ,参与 脂肪 酸 的 加 单 氧 作用 (Imaishi et al. ,1999)。 碳 链 更 长 的 油 酸 (C18, 18:1) 的 羟基 化 是 由 P450 催化 的 ,定名 为 w - 油 酸 羟 化 酶 (or- OAH)(Pinot et al. ,1993) ,其 产物 为 角质 层 (cuticle) 的 成 分 。 月 桂 酸 羟 化 酶 和 油 酸 羟 化 酶 存在 差异 ,各 自 的 底 物 不 抑制 另 一 酶 的 活性 。 COOH A OH COOH = COOH atl cen IC-LAH rere COOH OH COOH IC-LAH OH COOH OH B COOH O COOH C-LA COOH OH \ _ / 图 7.7 P450 催化 的 脂肪 酸 代 谢 。 120 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 两 二 烯 氧化 物 是 植物 中 非常 重要 的 脂 类 中 间 体 ,在 植物 体内 可 以 经 酶 催化 转化 为 植 aS AFAIK (Jasmonic acid) 。 催 化 13 - 氢 过 氧 亚 油 酸 生成 两 二 烯 氧化 物 的 酶 称 为 AMA 4 Be (AOS). AOS 可 以 转化 由 脂肪 氧 合 酶 (lipoxygenase) 催 化 衍生 的 脂肪 酸 氢 过 氧化 物 或 不 稳定 的 两 二 烯 氧 化 物 ( 图 7.8)(Song et al., 1991). 362t4> 97 Linum usitatissimum 的 茉莉 酸 合成 途径 证 明 两 二 烯 氧化 物 合 酶 将 13 - 氢 过 氧化 物 转化 为 两 二 烯 氧化 物 是 在 无 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 或 氧 存在 的 条 件 下 进行 的 。 形 成 的 两 二 烯 氧化 物 , 再 经 两 二 烯 氧 化 物 环 化 酶 转化 为 环 友 烯 酮 ,后 者 最 终 转化 为 茉莉 酸 (Song et al. ,1993b)。 催 化 13 - 氢 过 氧化 物 成 为 两 二 烯 氧化 物 的 AOS 是 许多 植物 特别 是 单子 叶 植物 组 织 中 占 优势 的 P450(Lau et al. ,1993) 。 AOS 被 认为 是 P450 ,是 根据 它 的 光 吸 收 特征 。 但 该 酶 具有 许多 异常 的 特征 ,如 不 需 氧 ,NADPH 和 P450 还 原 酶 ,表现 出 极 高 的 转换 数 70 一 80 000Mmin。 根 据 从 亚麻 种 子 中 纯化 的 AOS 蛋白 获得 的 肽 序列 信息 ,分离 克隆 了 编码 AOS 的 基因 (Song et al. ,1993a) , 用 来 自 亚麻 序列 的 异 源 探 针 从 Arabidopsis 中 克隆 了 一 个 同 源 基因 (Laudert et al., 1996)。 与 P450 血红 素 结合 域 的 保守 序列 比较 ,AOS 有 一 些 明 显 的 氨基 酸 残 基 蔡 换 。 亚 RFR AOS 显现 PSVANKQCAG 与 P450 的 特征 序列 Fx xGx x xCxG 不 同 ,存在 E- P 及 G-A 替换 ,而 Arabidopsis 序列 中 只 有 FOP 替换 。 将 这 两 个 AOS 序列 与 其 他 P450 相 比 较 , 发 现 它们 形成 氧 结合 吉 的 区 域 也 有 所 不 同 :保守 的 下 被 认为 参与 氧 的 活化 (Von Wachenfeldt and Johnson,1995) ,在 AOS 中 被 异 亮 氨 酸 (P) 替 换 。AOS 表现 出 氨基 酸 替 换 、 不 依赖 氧 和 NADPH 及 高 转换 数 等 特征 ,预示 该 酶 不 再 在 底 物 中 插 人 分 子 氧 而 是 催化 氧化 物 的 脱水 作用 。 有 趣 的 是 ,动物 前 列 腺 素 (prostaglandin) 合 成 中 有 一 个 类 似 的 反应 , 其 P450( 族 血 吐 烷 合 酶 ) 也 在 保守 下 中 发 生 了 替换 (Song et al. ,1993a) 。 AOS cDNA 序列 分 析 发 现 ,AOS 蛋白 的 N -未 端 氨基 酸 序 列 类 似 质 体 (plastid) 或 线 粒 体 运送 肽 (transit peptide)(Leon et al. ,1995; Song et al., 1993a). #E3€HK) AOS 活性 与 叶绿体 膜 相 关联 (Vick and Ximmermnan,1987) ,与 以 上 研究 结果 有 较 好 的 一 致 性 。 用 转 EA SASL ASL AOS 蛋白 定位 在 叶绿体 (Harms et al., 1995). AOS 催化 莱 Fil PRA AP AY BRE R , FEE BSE EM E (cauliflouer mosaic virus )35S 启动 子 控制 FP AOS 的 超 量 表达 ,可 以 使 茉莉 酸 的 浓度 增 至 6 一 12 1%. AOS mRNA ££ Arabidopsis 可 因 受伤 而 被 高 度 诱 导 , 在 受伤 1h 内 mRNA 与 茉莉 酸 含量 平行 增加 (Laudert et al., 1996) 。 亚 油 酸 的 含量 和 脂肪 氧化 酶 的 活性 并 不 影响 未 受伤 植物 体 中 的 茉莉 酸 生 物 合成 。 AOS 是 许多 植物 器 官 如 郁金香 鳞 葵 (tulip bulb)(Lau et al. ,1993) 中 主要 的 P450。 最 近 证 明 ,在 灰白 银 胶 菊 ( Parthenium argentatum ) 中 的 橡胶 颗粒 蛋白 (rubber particle protein,RPP) 也 是 AOS(Pan et az . ,1995)。 这 一 发 现 出 人 意料 ,因为 RPP 构成 与 橡胶 颗 粒 相 连 的 蛋白 的 S0% 。 但 这 种 蛋白 被 纯化 .其 对 应 基因 被 克隆 后 ,发现 它 与 亚 及 AOS 有 65% 相 同性 ,并 表现 出 AOS 活性 。 与 亚麻 AOS 不 同 ,RPP 在 对 应 于 P450 氧 结合 囊 中 区 域 有 TI 4%. {A RPP 不 含 质 体 运送 序列 ,缺乏 这 一 靶 定 肽 (targeting peptide) 人 允许 该 蛋白 与 橡胶 颗粒 相连 。RPP 蛋白 的 功能 尚 不 明确 。 氢 过 氧化 物 裂 解 酶 (HPO 裂解 酶 ) 也 利用 由 脂肪 氧 合 酶 产生 的 不 饱和 脂肪 酸 的 氢 过 氧化 物 为 底 物 。 它 与 AOS 不 同 的 是 HPO 裂解 酶 断裂 邻近 过 氧化 氢 功 能 基 团 的 C—C 键 (图 7.7)。 形 成 的 醛 及 其 被 还 原形 成 的 醇 在 植物 的 相互 作用 中 发 挥 作 用 ,它们 构成 果实 第 七 章 ,” 植 物 细胞 色素 P450 及 其 功能 。 121 , 和 蔬菜 挥发 物 成 分 。Shibata 等 (1995) 从 青椒 果实 中 纯化 了 两 种 HPO 裂解 酶 同 工 酶 ,从 其 吸收 光谱 分 析 是 血红 蛋白 (Shibata et wz . ,199$a)。 从 其 编码 基因 来 看 ,该 酶 是 P450 (Matsui et al. ,1996)。 像 AOS 一 样 ,HPO 裂解 酶 在 保守 的 氧 结合 区 的 苏 氨 酸 被 异 亮 氢 酸 蔡 代 , 其 血红 素 结合 结构 域 的 序列 也 与 P450 的 共有 序列 不 同 。 该 酶 与 AOS 具有 40% 相同 , 它 与 AOS 具有 不 寻常 的 氨基 酸 蔡 代 ,其 活性 不 依赖 于 氧 和 NDAPH, 且 都 利用 相同 的 氢 过 氧化 脂肪 酸 为 底 物 。 COOH 有 > Coe 两 二 烯 氧化 物 合 酶 ak a OH . “ 13- 氢 过 氧 - 亚 油 酸 两 二 烯 氧化 物 茉莉 酸 CYP74B COOH \ CHO néo =” » 十 二 碳 -9- 烯 酸 -12- 醛 六 碳 -3- 烯 醋 图 7.8 脂肪 酸 过 氧化 物 的 代谢 7.1.3 桩 类 的 生物 合成 (terpenoid biosynthesis) 桩 类 是 一 大 类 天 然 化 合 物 ,包括 激素 如 赤 霉 素 (gibberellin)、 脱落 酸 ( abscisic acid) It 合 色素 如 类 胡萝卜 素 (carotenoids)、 植 物 防 御 物 质 、. 电 子 载体 (electron carriers) 以 及 结构 膜 成 分 (MecGravey and Croteau,1995) ,P450 参与 许多 莫 类 物质 的 合成 。 7.1.3.1 Sik 单车 类 衍生 物 的 合成 中 , 柠 烯 的 羟基 化 由 P450 催化 (图 7.9A) ,羟基 化 可 以 发 生 在 环 上 C-3 和 C-6 或 侧 链 C-7 上 。 柠 烯 羟 化 酶 作用 于 柠 烯 ,其 羟基 化 部 位 表现 出 植物 种 的 FETE. BRIG TT (Mentha piperita ) , 留 兰 香 (Menzha spicata ) #1 A ( Perilla frutescens ) RANE C-3,C-6,C-7 (BRA IE (Karp et wz;.,1990)。 这 种 位 置 的 特异 性 (re- giospecificity) 有 别 于 土壤 微生物 的 森 烯 羟 化 酶 (Dhavalikar 和 Bhattacharyya,1996; Rama and Bhattacharyya,1977a; Rama and Bhattacharyya,1977b) ,土壤 微生物 羟基 化 作用 可 以 在 C-4,C-6 和 C-7 位 置 , 具 有 较 宽 程度 的 特异 性 (Dhavalikar and Bhattacharyya, 1996; Rama and Bhattacharyya,1977a; Rama and Bhattacharyya,1977b)。 另 一 种 单 熙 物质 (十 )- 冬青 油 烯 (sabinene) , 在 撒 尔 维 亚 (Saluia officinalis )(Karp et al. ,1987) 中 由 P450 介 导 的 羟基 化 也 表现 出 高 度 的 选择 性 , 它 对 (十 )- 冬 青 油 烯 的 异 构 体 [内 环 化 (一 )-“- 侧 柏 烯 (thujene) ] 和 另 一 单 莫 (一 )-B- 菠 烯 不 起 作用 。 长 春花 ( Catharanthus roseus ) 苗 及 其 培养 细胞 中 单 藉 类 呀 唆 生 物 碱 以 及 假 荆 芥 - 122 > 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 (Nepeta racemosa ) 电 | 唆 生 物 碱 的 生物 合成 中 , 单 莫 烯 醇 ( 香 叶 醇和 橙 花 醇 ) 转 化 为 10 - 羟 基 衔 生物 是 由 香 叶 醇 / 栖 花 醇 10 - 羟 化 酶 催化 (图 7.9B,Madyastha et al. ,1976;Meijer et 4a/ .,1993a; Meijer et al. ,1993; Hallahan et al. ,1994) , 产 基 化 部 位 在 C- 10. TERRY 的 一 主要 的 P450, 具 有 对 - 氯 - N - 甲 基 茶 胺 去 甲 基 活 性 (OKeefe and Leto,1989) ,可 以 使 香 叶 醇和 橙 花 醇 在 2,3 -和 6,7 -位 置 上 发 生 环 氧化 (Hallahan er wz . ,1994) ,可 见 该 P450 与 产生 生物 碱 植物 中 的 香 叶 醇 / 橙 花 醇 10 - 羟 化 酶 有 相同 的 底 物 ,但 其 作用 部 位 不 同 ,表现 为 环 氧化 酶 作用 。 Fre La 一 一 一 一 > os (Perilla frutescens ) NN N N BR | pee 紫 苏 子 醇 ( Mentha piperita ) "OH N B Sea UR S 和 CHOH -全 = CH,OH = CHO 10-2 SHE 橙 花 醇 10- 羟 橙 花 醇 图 7.9 P450 催化 的 单车 的 代谢 FEB (Abies grandis ) 中 含油 树 酯 (oleoresins) 的 合成 中 , 异 成 间 二 烯 化 合 物 的 前 体 牧 牛 儿 焦 磷酸 (geranyl phophosphate) 首 先 被 转化 为 枞 酸 二 烯 (abietadiene) ,再 转化 为 松 香 酸 的 过 程 中 ,有 两 种 P450 起 作用 即 枞 酸 二 烯 羟 化 酶 和 枞 酸 二 烯 醇 (abietadienol) 羟 化 酶 。 松 香 酸 是 该 种 植物 的 主要 树脂 酸 , 树 酯 的 合成 是 该 植物 防御 昆虫 侵害 的 主要 机 制 ,其 中 的 两 种 P450 活性 可 因 受 伤 而 高 度 诱导 。 7.1.3.2. a 赤 霉 素 (GA) 是 重要 的 植物 生长 调节 剂 ,其 生物 合成 过 程 为 由 ent -贝壳 杉 烯 〈kau- rene)—ent — Jl F242 4s H (kaurenol)— ent -贝壳 杉 烯 醛 (kaurenal) 一 ent -贝壳 杉 烯 酸 (kaurenoic acid )— ent - 7a -羟基 贝壳 杉 烯 酸 等 4 个 连续 的 步骤 都 是 由 P450 催化 的 (Graebe, 1987; Mihaliak et al. ,1993; Hedden and Kamivya,1997) ,前 三 个 步骤 都 由 贝壳 杉 烯 氧化 酶 催化 ,后 一 步骤 由 贝壳 杉 烯 酸 羧 化 酶 催化 (Graebe,1987; Jennings et al., 1993)( 图 7.10)。 以 上 四 个 步骤 在 植物 [如 简 瓜 (Cucurpita maxima), Bi FZ ( Pisum BLE ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 i 9a3 sativum), %K( Zea mays ) AAAS HH IP BE ( Gibberella fujikuroi )] 中 相同 ,在 形成 ent - 7a -羟基 贝壳 杉 烯 酸 后 ,真菌 和 植物 的 代谢 反应 分 化 ,但 两 者 都 包含 有 P450 介 导 的 反应 ,如 青豆 中 赤 霉 素 的 生物 合成 途径 中 ,P450 还 介 导 GA12 - 醛 ~ GA12 > GAS3 的 转化 (Graebe,1987 ) 。 贝壳 杉 燃 氧化 酶 | | 贝壳 杉 烯 氧化 酶 | | 贝壳 杉 烯 氧化 酶 | | 贝壳 杉 燃 酸 羟 化 栈 ty Teen sc NOM p 7 YW J 7 H CH,OH CHO OOH COOH Goon coor ent- 贝 壳 杉 烯 ent -贝壳 杉 烯 醇 ent -贝壳 杉 烯 醛 ent- 贝 过 杉 烯 酸 ent-7a- 羟 基 贝 壳 杉 烯 酸 7- 羟基 GA12 “”GA12 图 7.10 赤 霉 素 的 生物 合成 用 遗传 学 方法 ,把 表 型 矮小 的 GA 缺失 植物 用 于 克隆 " 非 - P450 "的 GA 生物 合成 基因 座 (Chiang et al. , 1995; Sun et w.,1992) ,由 此 已 经 殉 隆 了 一 个 P450 编码 基因 。 生 物 化 学 互补 实验 以 及 GA 中 间 物 分 析 表 明 玉 米 突 变 体 dwarf 3(as ) 缺 失 转化 GA12>GAS3 的 P450(Winkler et al. , 1995). D3 基因 的 产物 为 一 个 新 的 P450 家 族 定名 为 CYP88 ,为 4E“A 44” 2848) P450(Durst and O'keeffe,1995) , 除 在 其 氨基 末端 存在 一 个 不 完全 的 27 氨基 酸 重复 外 ,其 他 序列 有 P450 典型 特征 。 该 酶 的 功能 尚未 知 。 在 无 外 源 GA 存在 下 不 发 芽 的 Arapidozsis 突变 体 中 ,鉴定 了 5 个 影响 GA 生物 合成 的 基因 座 (gal ~ 8ga5 )。ga3 突变 可 能 缺失 特异 性 的 贝壳 杉 烯 醇 (kaurenol) 氧化 酶 (Finkelstein and Zeevaart,1994) 或 多 功能 的 贝壳 杉 烯 (kaurene) 氧 化 酶 (将 贝壳 杉 烯 一 贝 壳 杉 烯 酸 )(Kende and Zeavaart, 1997) ,这 需 待 克隆 GA3 基因 后 进一步 证 实 。 ae =e 膜 内 省 醇 无 14ac- 甲 基 , 省 醇 前 体 如 动物 和 真菌 羊毛 脂 当 醇 (lanosterol) 和 植物 的 钝 叶 鼠 曲 草 醇 的 脱 甲 基 作用 由 CYP51 家 族 的 P450 催化 。 植物 钝 叶 鼠 曲 草 醇 14c - 羟 化 酶 催化 三 个 连续 的 氧化 过 程 ,在 省 醇 核 中 引入 一 个 双 链 。 同 时 以 甲酸 的 形式 释放 一 个 甲 基 矶 。 用 玉米 微粒 体制 备 液 的 测定 结果 显示 ,该 酶 具 有 很 高 的 底 物 特异 性 , 它 对 羊毛 脂 省 醇 以 及 一 些 结构 十 分 类 似 的 化 合 物 都 无 催化 活性 (Taton and Rahier,1991) 。 该 酶 已 从 高 梁 ( Sorghum bicolor ) 秧 苗 中 纯化 出 (Kahn et al. , 1996) ,根据 其 多 肽 氨基 酸 序列 数据 设计 简 并 PCR 引物 已 克隆 出 其 cDNA (Bak et al., 1997) 。 另 外 用 CYP81 作 探 针 , 低 严格 (low-stringency) 杂 交 从 小 麦 中 分 离 了 CYPS1(Ca- belloHurtact,1997) 。 大 肠 杆 菌 表达 CYP51 与 钝 叶 鼠 曲 章 醇 显示 出 类 型 [结合 光谱 特 征 ,而 与 羊毛 脂 当 醇 无 此 特征 ,这 从 分 子 水 平 上 进一步 体现 出 该 酶 具 高 的 底 物 特异 性 (Bak et al. ,1997)。 钝 叶 鼠 曲 草 醇 140 - 脱 甲 基 酶 是 一 非 *A 组 "的 P450, 也 是 第 一 个 与 其 他 植物 P450 无 同 源 关系 的 酶 。 它 的 定名 是 P450 命名 法 则 的 一 个 例外 , 钝 叶 鼠 曲 草 醇 14u - 脱 甲 基 推定 的 氨基 酸 序列 与 酵母 和 大 上 鼠 的 羊毛 脂 醇 14a - 脱 甲 基 酶 分 别 有 32% 和 36% 的 相同 性 (Bak "124 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 et dl .,1997)。 根 据 40% 法 则 这 些 酶 应 分 属 3 个 P450 家 族 , 但 它们 催化 相似 底 物 的 相同 类 型 的 反应 (14a - 脱 甲 基 ), 且 它们 的 氨基 酸 相 同 程度 接近 40% 。 因 此 ,将 羊毛 脂 当 醇 140 - 脱 甲 基 酶 和 钝 叶 鼠 曲 草 醇 14c - 脱 甲 基 酶 归 为 同一 P450 家 族 即 CYP51。 HO HO 图 7.11 植物 钝 叶 鼠 曲 草 醇 的 脱 甲 基 作 用 7.1.4 生物 碱 许多 研究 报告 前 明 P450 在 生物 碱 合成 中 的 作用 。 但 在 许多 情况 下 ,生物 碱 合 成 中 的 生物 碱 及 其 催化 剂 含量 很 低 而 且 分 布 于 特定 的 细胞 中 。 小 宁 合 酶 (berbamunine syn- thae,BS) 催 化 两 个 分 子 N - 甲 基 乌 药 碱 (methylcoclaurine) 氧 化 形成 二 聚 体 的 生物 碱 WBE T (FI 7.12). FAM) 38 ( Berberis stolonifera ) 培 养 细 胞 中 纯化 的 小 竖 宁 合 酶 与 还 原 酶 重组 体系 ,表现 出 高 度 的 位 置 和 立体 特异 性 。 用 等 摩尔 的 底 物 (人 R)- 和 (S)- N - 甲 基 乌 药 碱 ,小 竖 宁 合 酶 产生 几乎 全 是 (R,S)- 小 餐 宁 ,但 用 不 同 配 比 的 单 体 底 物 DET A HE A) Ba) BT ASE XT BRA guattegaumerine 或 相关 生物 碱 2’-norberbamunine (Czernic et al., 1996). PER HE BSBA ,体内 不 同 二 聚 体 生物 碱 的 相对 丰 度 可 能 依赖 于 可 获得 单 体 的 摩尔 比率 。 氧 化 程度 更 高 的 二 聚 体 阿 莫 灵 (aromoline) 也 发 现在 小 竖 培 养 细胞 中 ,但 并 非 是 小 光 宁 合 酶 催化 的 产物 ,可 能 由 另 一 P450 的 催化 产生 。 根 据 纯化 蛋白 的 序列 数据 已 克隆 编码 小 竖 宁 合 酶 的 EDNA, 该 基因 在 杆 状 病毒 系统 中 表达 (Krau and Kutchan, 1995) ,其 转换 率 为 34 一 62Mmin( 以 产生 的 二 聚 体 计算 ) ,与 从 它 的 天 然 来 源 测 得 的 S0Mmin 类 似 。 但 是 即使 有 等 摩尔 的 (了 R)- 和 (S)- N - 甲 基 乌 药 碱 存在 , 杆 状 病毒 系统 中 表达 的 酶 催化 产生 的 二 聚 体 生物 碱 的 种 类 有 明显 不 同 , 以 guattegaumerine 为 主要 产物 。 这 种 差别 的 原因 现在 还 不 太 清 楚 ,P450 还 原 酶 来 源 的 不 同 可 能 有 较 大 的 影响 ,由 此 预示 蛋白 折 私 的 细微 变化 或 蛋白 -蛋白 相互 作用 (电子 传递 ) 可 能 影响 二 聚 体 产 物 的 比率 。 用 BS 的 cDNA 为 探 针 ,与 小 此 基 因 组 DNA Southern 分 析 表 明 ,基因 组 DNA 有 一 条 强 的 杂交 带 和 二 条 较 弱 的 杂交 带 ,这 表明 在 小 导 基 因 组 中 存在 一 些 相亲 的 核酸 序列 ,这 些 序列 有 可 能 是 编码 进一步 氧化 小 尼 宁 (berbamunie) 成 阿 莫 灵 和 黄 皮 树 碱 (obamegine) 的 P450. INSET A RHEL es le OER, AWE Ee WA A (biradi- cal coupling) AY PL ill PS AA RA, ORD EAR ZW Fa BE RET A HEE 部 位 能 容纳 二 个 生物 碱 单 体 , 7) BEE EE BB a is SHE FESS 小 餐 宁 合 酶 与 典型 的 P450 区 别 在 于 催化 (R)- 和 (S)- N - 甲 基 乌 药 碱 各 一 分 子 , 通 过 SLE ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 125 - 图 7.12 DRT HARK 分 子 间 C—O #24472 K(R)-A(S)-= RAE WBN T . X— RNR NADPH - 细 胞 色素 P450 AUB A) SET A ee A VE, HE RR C—O #@ (Stadler and Zenk, 1993; Kutchan , 1995). AFL FE EOE Dy Bak BY — TS I 8 EF EEA i, EMM EDA Rhee he DE P450 催化 的 。 其 中 高 度 氧化 的 生物 碱 macarpine, E FE 7E & ( Eschscholtzia califormica ) Al #232 ( Papaver somniferum ) 的 生物 合成 途径 至 少 包括 6 个 P450 (Tanahashi and Zenk, 1990;De-Eknamkul et al., 1992; Kammerer et al., 1994), 这 些 P450 严格 依赖 于 NADPH 和 分 子 氧 。 7.1.5 生 握 糖苷 的 合成 两 类 植物 天 然 产物 ( 生 和 氰 糖苷 和 芥子 油 苷 ) 来 源 于 蛋白 或 非 蛋白 氨基 酸 ,在 其 生物 合 成 过 程 中 ,以 醛 胀 (aldoximes) 作 为 中 间 体 。 RUE HE 2000 多 种 植物 中 发 现 , 当 组 织 受 伤 时 , 生 氰 糖苷 分 解 为 糖 \ 酮 或 醛 以 及 氰 tA. BRAFA (dhurrin) Sorghum picolor 中 主要 的 生 握 糖苷 。 它 的 生物 合成 由 两 个 多 功能 系统 完成 ,第 一 个 系统 是 由 酷 氨 酸 经 N -羟基 酷 氨 酸 变 成 o - 羟 葵 基 乙 醛 肝 (o-hy- droxyphenylacet aldoxime) , #3 — “+ F 3 M Xt £8 AE ., RE 5 ET FEE HZ. HB ( o-hydrox- yphenylacetonitrile) #4 tA X41 -F23£ AE Z, BEA ( p-hydroxymandelonitrile) (A 7.13). 催化 酷 氨 酸 羟基 化 的 P450( ARERR N - 羟 化 酶 ,或 P450TYR) 已 被 纯化 (Sibbesen et al. , 1994) ,用 其 抗体 筛选 出 了 其 对 应 的 基因 CYP79A1 (Koch et al., 1995). SOT KE 因 推 导 的 氨基 酸 序列 发 现 , 在 氧 结合 囊 保 守 区 ,存在 一 保守 氮 基 酸 替 代 : 由 苏 氨 酸 蔡 换 为 天 冬 氨 酸 , 在 邻近 天 冬 氨 酸 还 存在 且 氨 酸 。 这 些 结构 特 征 可 能 与 酶 对 底 物 的 特异 性 有 关 。 无 独 有 偶 ,在 真菌 中 发 现 的 酷 氨 酸 代谢 酶 (CYP56) 也 存在 且 氨 酸 以 及 天 冬 氨 酸 替换 特征 (Koch et al. , 1995). CYP79 的 功能 已 从 它 在 大 肠 杆菌 的 表达 的 活性 中 得 到 进一步 证 实 , 重 组 体系 具有 催化 酪 氨 酸 生成 对 - 产 基 乙 醛 且 的 活性 (Sibbesen et al. ,1995 ) 。 + 196 * 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 L- eng a, NADPH CYPT9 HO HO (Z)—p- 羟基 苯 基 乙 醛 有 sasha p- RIEL CYPTIEI oe NADPH rity CN P— FEE CMG 9 Als “a rp anagen a ae fap HO HO 多 乘 氰 苷 对 -羟基 茶 甲 醛 图 7.13 SRAPHA 第 七 章 ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 127°: 参与 蜀 乘 氰 苷 生物 合成 的 另 一 个 P450(P450ox) 的 基因 也 从 Sorghum bicolor (L. ) 中 分 离 ,命名 为 CYP71E1。 用 在 大 肠 杆菌 中 异 源 表 达 得 到 的 CYP71E1 BA BAN ABA DAME AE TF AE HE ZEA FEAR Z, BAA (Bak et al. ,1998) 。 Sorghum bicolor (L.) 中 参与 蜀 乘 氰 苷 生物 合成 的 两 个 多 功能 细胞 色素 P450 (CYP79A1 和 CYP71E1) 具 有 不 同 的 性 质 和 功能 ,其 中 CYP79A1 具有 很 高 的 底 物 专 一 性 , 酷 氨 酸 是 已 知 的 惟一 底 物 ,而 CYP71E1 对 底 物 要 求 较 低 ,可 以 有 效 地 代谢 芳 族 胀 ,但 对 脂 族 肝 代 谢 较 慢 。CYP79A1 和 CYP71E1 对 许多 不 同 除草 剂 都 无 代谢 作用 。 因 此 报道 的 Sorghum 对 灭 草 松 (bentazon) 的 抗 性 与 CYP79A1 和 CYP71E1 无 关 (Kahn et al., 1999)。 FA NADPH 作 辅 助 因子 ,CYP79A1 和 CYP71E1 的 K,, 和 V (HPS! 0.013mmol/ L Al 111nmol/(mg: pro: s) , 4,79 NADH 作 辅 助 因 子 则 对 应 的 值 分 别 为 0.3mmolML 和 42nmol/(mg'pro's) ,可 见 NADPH 更 合适 。CYP79A1 是 稳定 的 酶 ,而 CYP71E1 不 稳定 , 在 室温 下 降解 。CYP71E1 催化 且 发 生 异 常 的 脱水 作用 形成 相应 的 且 , 再 进行 C- 羟 基 化 。 混合 CYP79 和 CYP71E1 的 重组 体系 可 将 酷 氨 酸 转化 为 对 - 凑 基 葵 甲 醛 (图 7.13) ,表明 离 体 的 重组 体系 可 以 完成 蜀 乘 氰 苷 生物 合成 途径 中 除 糖 基 化 外 的 所 有 反应 (Bak,1998) 。 7.1.6 P450 催化 DIMBOA 生物 合成 植物 中 包含 的 防御 次 生性 物质 很 多 ,其 中 包括 环 化 的 异 羟 且 酸 。 禾 本 科 累 积 的 1,4- 葵 并 噬 嗪 - 3 - 酮 (1,4-benzoxazin-3-one) 衍 生物 包括 DIMBOA (2,4 -二 羟基 - 7 - 甲 氧 基 - 1,4 FF UR 3 - 酮 ) 和 DIBOA(2,4 -二 产 基 - 1,4 EFT R- 3 - 酮 ) ,它们 在 植物 病原 菌 和 昆虫 抗 性 中 起 重要 作用 (Niemeyer,1988) 。 小 麦 和 玉米 中 主要 是 DIMBOA, 黑 麦 中 主要 是 DIBOA。DIMBOA 类 物质 的 生物 合成 包含 P450 催化 反应 ,如 将 HBOA(2 -羟基 - 1,4 - 葵 并 唾 嗪 - 3 - 酮 )N -羟基 化 为 二 羟基 衍生 物 DIBOA(Bailey and Larson,1991) 。 从 玉米 中 鉴定 出 一 个 DIMBOA 缺失 突变 体 (zl ) ,这 加 速 了 DIMBOA 生物 合成 有 关 P450 基因 的 克隆 (Frey et al., 1995). BRUE,4 个 CYP71 克隆 (CYP71C1 一 CYP71C4 ) 参 与 了 DIMBOA 生物 合成 已 得 到 了 明确 地 证 明 。 首 先 用 回 交 遗 传 方法 (reverse genetic) 鉴 定 了 玉米 突变 体 缺 失 DIMBOA 合成 的 功能 是 由 于 CYP71C2 基因 中 Mu 转 座 子 插 人 (Frey et w.,1997)。 其 次 ,将 cDNA 在 酵母 中 表达 证 明 这 些 P450 PH HEE IEE DIBOA 间 氧 化 过 程 中 的 某 一步 ( 图 7.14)。CYP71C3 编码 N - 羟 化 酶 ,催化 HBOA 向 DIBOA 转化 (Bailey and Larson,1991) 。 OTOH OH OOH cye710¢3 Ou CYP71C4 On CYP71C2 0 ie: CYP71C1 Cr { 2 N N%o No N“O Kz | | | OH H H H H ng = S05 19% -2 — fl 3— $53 — SUR 2 fi HBOA DIBOA 图 7.14 DIMBOA 生物 合成 - 128 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 ORES OA CYP71C 基因 组 克隆 序列 分 析 显 示 , 几 个 基因 有 共同 的 内 含 子 定 位 。Bzi 基因 座 编 码 色 氮 酸 合成 酶 及 其 同 源 物 (homologue) , AI Fe 4695/4 3 -磷酸 甘油 (glycerol phosphate ) 为 N5| YE , FA-F DIMBOA 的 生物 合成 (Frey et al., 1997). Bal 基因 与 CYP71C4 基因 相距 不 到 2.5kb。 可 见 玉米 DIBOA 生物 合成 途径 的 酶 由 4 号 染色 体 的 相对 较 小 区 域 的 DNA Sa 码 , 且 至 少 其 中 4 个 基因 具有 共同 的 进化 祖先 。 7.1.7 催化 油菜 素 类 固 醇 生物 合成 的 P450 (CYP90 ,CYP85 ) 油菜 素 类 固 醇 (brassinosteroid) 是 植物 激素 ,从 Arabidopsis 中 克隆 了 一 个 P450 基因 (CPD ) 编 码 非 *A 组 ”的 P450 ,定名 为 CYP90。 加 入 外 源 的 23 - 产 基 化 的 油菜 素 内 酯 前 体 teasterone( 结 构 见 图 7.15) 可 以 互补 CPD 突变 表现 型 ,而 用 其 他 前 体 无 此 效果 ,为 此 认为 CYP90 催化 cathasterone 羟基 化 为 teasterone( 图 7.15). CYP90 HAAS 8 个 内 含 子 ,其 中 有 二 个 内 含 子 与 人 CYP21A2 基因 的 内 含 子 的 位 置 相 同 , CYP21A2 基因 编码 孕 酮 (progesterone)- 21 - 羟 化 酶 (Higashi et al. ,1986; White et al. ,1986) 也 是 省 醇 代谢 酶 。 这 些 结果 显示 ,参与 植物 和 人 省 醇 羟 基 化 作用 的 P450 间 可 能 有 比 大 多 数 植物 和 动物 P450 间 更 近 缘 的 进化 祖先 。 最 近 用 突变 体 方法 从 番茄 中 克隆 出 另 一 个 非 *A 组 "的 P450, 定 名 为 CYP85 ,可 能 是 催化 油菜 素 类 固 醇 生物 合成 的 另 一 P450(Bishop et al. , 1996). CYP90 oo cathasterone -23- 4/48 HO cathasterone teasterone 7.15 油菜 素 类 固 醇 的 生物 合成 7.2 解毒 酶 植物 P450 除了 具有 生物 合成 的 活性 外 ,还 具有 分 解 天 然 产 物 的 功能 。 在 Salvia of- ficinalis , 单 莫 樟脑 被 氧化 为 6 -外 -羟基 樟脑 ,这 一 过 程 是 由 微粒 体 P450( 樟 脑 6 -外 - 羟 化 酶 ) 催 化 完成 (Funk and Croteau,1993) 。 而 存在 于 假 单 孢 菌 的 可 溶性 P450(P450cam, CYP101) 产 基 化 樟脑 的 位 置 在 5 -外 (5 -外 - 羟 化 酶 ) (Sligar and Murray,1986)。 一 些 用 作 模 式 底 物 以 测定 哺乳 动物 P450 活性 的 合成 的 荧光 底 物 (如 7 - 乙 氧 香 豆 素 和 7- 乙 氧 试 锣 灵 ) 也 可 被 植物 中 的 某 些 P450 分 解 (Batard et al. ,1995) 。 另 一 类 主要 的 P450 介 导 的 反应 是 除草 剂 \ 农 药 和 外 源 物 质 的 解毒 途径 。 植 物 对 许 多 除草 剂 产生 的 生物 化 学 抗 性 是 因为 除草 剂 被 快速 转化 为 羟基 化 的 失 活 产物 (Frear et al. , 1991) ,这 些 产物 随后 与 植物 细胞 壁 的 糖 类 分 子 结合 。P450 对 除草 剂 的 代谢 作用 已 知 包括 小 麦 和 玉米 对 绿 麦 隆 (chlortoluron) 的 N - 脱 甲 基 作用 和 环 甲 基 的 羟基 化 作用 第 七 章 ”植物 细胞 色素 P450 及 其 功能 。 129 , (Mougin et al. , 1990;Fonne-Pfister and Kreuz,1990)、 小 麦 中 禾 草 灵 (diclofop) 的 芳 基 羟 化 作用 (McFadden et al. ,1989; Zimmerlin and Durst ,1990 ,Persans and Schuler,1995 )、 小 麦 中 醚 茶 磺 隆 (triasulfuron ) 和 绿 磺 隆 (chlorsulfuron ) AY FF HEF EK (Moreland et al. , 1993;Persans and Schuler ,1995; Thalacker et al!. ,1994)、 玉 米 中 氟 喀 黄 隆 (primisul- furon) 的 芳 基 和 喀 啶 环 羟基 化 (Fonne-Pfister et al. ,1990)、 玉 米 对 灭 草 松 (bentazon ) 的 芳 基 羟 基 化 作用 等 (McFadden et al. , 1990). PRIKZIb, P450 也 介 导 一 系列 天 然 和 合成 杀 虫 剂 及 外 源 物 质 的 代谢 (Cole , 1983) (图 7.16)。 从 植物 代谢 的 除草 剂 范围 看 来 ,一 种 植物 中 可 能 存在 几 种 不 同 的 P450 催化 除草 剂 的 解毒 。 现 在 还 不 能 明确 具有 这 种 解毒 功能 的 P450 是 否 与 微生物 合成 作用 的 P450 相 同 。 近 期 的 研究 结果 显示 ,内 源 性 的 月 桂 酸 和 外 源 性 的 禾 草 灵 可 能 被 相同 的 P450 羟基 化 (Zimmerlin and Durst,1992) 。 用 酵母 表达 的 反 式 -肉桂 酸 羟 化 酶 (CYP73A) 的 重组 体 系 证 明 ,内 源 性 反 式 -肉桂 酸 和 外 源 性 的 绿 麦 隆 和 对 -和 氯 - N - 甲 基 葵 胺 都 可 被 t- CAH 代 谢 ,但 反应 速率 不 同 (Pierrel er al. ,1994) , t-CAH 对 其 内 源 性 底 物 代谢 效率 (297[min) 比 BRA ME(0.014/min) AWS. BRAKE t-CAH 凑 基 化 作用 的 部 位 对 应 于 植物 体内 产生 的 最 少量 的 绿 麦 隆 代谢 产物 ,因此 植物 体内 催化 绿 麦 隆 另 一 位 置 羟基 化 ,可 能 是 一 种 不 同 于 tCAH 的 P450。 表 7.4 植物 P450 催化 的 外 源 物 质 的 代谢 举例 杂 原 子 脱 烷 基 灭 草 隆 (monuron) N- 甲 基 - 4 - 氯 苯胺 氨基 比 林 ERA ME 乙 氧 香 豆 素 ZARA R 特 丁 异 两 (metolachlor) 绿 麦 隆 hl 5298 (flumetsulam) 从 植物 中 已 克隆 和 鉴定 具有 代谢 除草 剂 的 P4$0, 如 CYP71A11, CYP73A1, CYP76B1,CYP81B1,CYP81B2 表现 出 对 绿 麦 隆 的 代谢 活性 ( 表 7.5)。 R75 具 除 草 剂 代谢 作用 的 植物 P450 底 物 P450 内 源 性 外 源 性 CYP71A10 多 种 除草 剂 CYP71A11 BRB ME . CYP73A1 be Re CYP76B1 多 种 外 源 物 质 CYP81B1 脂肪 酸 BRA ket CYP81B2 oe - 130 , 细胞 色素 P450 MAY ORES OL ARTS CO,CH; 9 OCHE-. ; N 2 ABR A 人 9 so by } yo H H ak [-O-Glc] OCHE, 氟 喀 黄 隆 CO;CHs 0 * OCHF, a4 《yo = se COCH: = _COCHF, OCHF, SONCN 4 HH = HO OCHF, 毛 磺 隆 [-O-Glc] Cl Cl CH, O N CH; CT — CHa CF Tas H H apart HO -< h e OCH, 醚 葵 磺 隆 : [-O-Glc] OCH CHO ee OCH,CH,Cl CH, NS S of sonty 一 (sol - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 CYP4D2 ,CYP4D8 , CYP4E4 ) ,基因 间 的 歧 异 程度 较 大 。 位 于 2 号 染色 体 的 42D 一 45C 区 间 的 基因 和 全 联接 较 宽 ,可 以 认为 是 能 系列 ,其 上 有 属于 3 个 基因 家 族 (CYP4 , CYE6 , CYP9 ) 的 6 个 P450 基因 (Dunkov et al. ,1996). P450 基因 秘 可 能 是 通过 基因 重复 (duplication) 和 随后 的 歧 异 以 获得 新 功能 的 正 向 选 择 的 遗迹 (Cohen and Feyereisen ,1995). AHR CYP6 HARM AR RH A) BRAS 和 染色 体 倒 位 的 结果 (Cohen and Feyereisen ,1995). 8.1.4 细胞 色素 P450 的 遗传 多 态 性 (genetic polymorphism ) 昆虫 P450 基因 座 的 多 态 特 征 在 昆虫 中 普遍 存在 。 在 香 芹 黑 凤 蝶 中 分 离 出 三 种 等 位 基因 , 基因 组 CYP6B1V3 基因 的 核 苷 酸 与 CYP6B1VI、CYP6B1V2 cDNA 分 别 有 99.53%、99.59% 的 相同 。CYP6B1V1 与 CYP6B1V2 编码 的 蛋白 质 序列 间 只 有 9 个 氨基 酸 差异 。CYP6B1V3 的 变异 在 位 置 和 排列 上 与 其 他 两 个 cDNA 相同 :6 个 氨基 酸 变 异 位 置 与 CYP6B1V1 相同 、 三 个 与 CYP6B1V2 相同 ,表明 CYP6B1V3 基因 在 进化 上 居于 CYP6B1V1 和 CYP6B1V2 中 间 。CYP6B1V3 蛋白 前 280 氨基 酸 与 CYP6B1V2 相同 ,其 后 256 AZERMH CYP6B1V1 蛋白 相同 ,表明 CYP6B1V3 可 能 通过 CYP6BIV1I 和 CYP6B1V2 等 位 基因 的 交换 而 形成 (Prapaipong et al. ,1994)。 在 家 蝇 中 发 现 CYP6D1 © 的 5 个 等 位 基因 (Tomita et al. ,1995) ,它们 的 cDNA 序列 有 97.61% ~ 99.10% 的 相同 性 ,编码 蛋白 的 氨基 酸 有 98.06% ~99.81% 相同 。 抗 性 LPR 家 蝇 品 系 的 CYP6D1 分 别 有 8,11,7,6 一 7 个 氨基 酸 与 CS,aabys,ISK,Rutger 品系 家 蝇 的 等 位 基因 不 同 , 氮 基 酸 蔡 代 的 位 置 出 现在 CYP6 家 族 P450 的 两 个 高 度 可 变 的 区 域 , 其 中 在 残 基 218、220、225、227 位 置 的 氨基 酸 蔡 代 靠 近 推 定 的 底 物 结合 区 (Tomita et al. ,1995). CYP6B1V1 和 CYP6B1V2 同 工 酶 对 线 型 叶 喃 香 豆 素 具 有 几乎 相同 的 代谢 活性 ,似乎 表明 中 间 类 型 的 CYP6B1V3 同 工 酶 可 能 有 与 CYP6B1V1 和 CYP6B1V2 相似 的 代谢 能 力 (Prapaipong et al. ,1994), CYP6D1 等 位 基因 和 氮 基 酸 的 不 同 是 否 导致 对 拟 除 虫 菊 酯 农药 不 同 的 催化 活性 , 尚 待 证 实 (Tomita et al. ,1995) 。 除 在 家 蝇 、 香 芹 黑 凤 晃 存在 遗传 多 态 现象 外 ,在 烟草 天 蛾 中 也 发 现 CYP4L1、 CYP4MI .CYP4M2 基因 的 等 位 基因 (Snyder et al. ,1995). 8.2 昆虫 细胞 色素 P450 的 表达 昆虫 P450 酶 系 组 成 及 酶 活性 水 平 上 的 整体 表达 规律 已 有 较 详 细 的 阐述 (Agosin, 1985; Hodgson,1985) ,以 下 的 论述 是 有 关 特 定 P450 基因 在 mRNA 和 和 蛋白 水 平 的 表达 。 昆虫 P450 表达 调控 表现 出 较 大 的 变异 ,有 些 P450 可 以 在 所 有 生活 阶段 中 表达 (如 CYP4D1 和 6A4A1 ) ,而 有 些 P450 仅 在 少数 组 织 中 存在 ,而 其 他 却 无 处 不 在 (CYP6D1 )。 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 143 , 表 8.2 昆虫 P4S0 的 表达 (Scott et al., 1998) NI x + CYP4C1 Blaberus discoidalis NI CYP4D1 Drosophila melanogaster CYP4E1 D. melanogaster CYP4L1 ,2 Manduca sexta CYP4MI1 M. sexta CYP4M2 M. sexta CYP4M3 M. sexta CYP6AI1 M. domestica CYP6A2 D. melanogaster CYP6AS , 9 D. melanogaster CYP6A3 ,6 CYP6CI 2 M. domestica CYP6A4 ,5 M. domestica CYP6B1 , 3 Popilio polyzxenes CYP6B2 H. armigira MG, HF, FB CYP6B4 ,5 P. glaucus MG CYP6D1 M. domestica FB, PI,RS 等 CYP9AI Heliothis virescens FB,G CYP18 D. melanogaster CYP28A1 D. mettleri CYP28A2 D. mettleri CYP28A3 D. nigrospiracula YE: + :表达 , 一 :不 表达 ; +: ARE; NI: KA; BW : 体 壁 ; FB: ABA; HF: 前 肠 ;G: 肠 ; MG: PH; MT: SK 管 ; PT: 后 肠 ; RS: 生 殖 系统 ; V: 内 脏 。 8.2.1 P450 基因 表达 的 生长 发 育 调节 昆虫 P450 基因 的 表达 表现 出 生长 发 育 控 制 ,一 般 认 为 其 表达 与 其 功能 的 需要 相 一 致 。 与 外 来 物质 代谢 有 关 的 家 蝇 CYP6A1 的 mRNA 在 家 蝇 幼 虫 和 成 虫 中 均 有 表达 ,而 卵 和 晴 期 的 mRNA 含量 非常 之 低 (Carino et al. ,1994)。 与 拟 除 虫 菊 酯 抗 性 有 关 的 CYP6D1 mRNA 仅 能 在 成 虫 期 表达 (Scott et al. ,1996) 而 难于 解释 。 果 蝇 CYP4D1 基因 的 mRNA 在 其 生活 史 的 各 个 阶段 都 有 表达 ,未 龄 幼虫 达到 最 高 ,化 晴 始 迅速 下 降 (Gandi etal., 1992), ABIX CYP4D1 蛋白 的 生理 作用 知之 甚 少 ,根据 其 mRNA 的 表达 方式 推 测 其 代谢 活性 为 幼虫 和 化 晴 初 期 所 需 。 烟 草 天 蛾 ( Manduca sexta) CYP4 家 族 基因 的 表达 也 表现 出 发 育 调节 :中 肠 CYP4 mRNA 含量 在 幼虫 取 食 盛 期 . 游 动 中 期 (mid-wandering)、 预 。 144 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 晴 和 晴 期 表达 较 高 ; 除 CYP4M1 Yb, CYP4 mRNA 的 表达 在 成 虫 中 都 很 低 (Snyder et al. ,1995). 8.2.2 P450 基因 表达 的 组 织 特异 性 从 烟草 天 蛾 克隆 的 CYP4 家 族 的 5 个 P450 基因 中 , CYP4L1 仅 在 脂肪 体 中 表达 , CYP4M3 和 CYP4L2 仅 在 中 肠 中 存在 ,另外 两 个 基因 (CYP4MI , CYP4M2 ) 则 在 上 述 两 种 组 织 中 均 有 表达 (Snyder et al. ,1995 ) 。 8.2.3 P450 基因 表达 的 品系 差异 抗 性 品系 昆虫 往往 表现 出 P450 的 组 成 型 超 量 表达 (constitutive overexpression). Xf 有 机 磷 农 药 抗 性 的 Rutgers 品系 家 蝇 CYP6A1 mRNA 至 少 高 出 感性 sbo 品系 的 10 倍 ,这 PBB RIAL KHAN SD BABA RH (Carino et al. ,1994) 。 拟 除虫菊 酯 农药 抗 性 的 LPR 品系 家 蝇 腹 部 的 各 组 织 中 CYP6D1 mRNA 的 表达 10 倍 于 感性 CS 品系 (Scott, 1996). 在 对 DDT 抗 性 的 91-R 果 蝇 CYP6A2 mRNA、 编 码 蛋白 P450 - Bl 分 别 是 感性 品系 的 20 一 30 和 20 (Waters et al. ,1992a)。 8.2.4 P450 基因 表达 的 可 诱导 性 诱导 似乎 是 P450 的 共同 特征 ,但 诱导 具有 选择 性 复杂 性 和 重 礁 性 的 特点 (Scott et al. ,1996)。 Ah CYP6A1 mRNA 和 CYP6D1 编码 的 蛋白 P450rpR 均 可 被 葵 巴 比 妥 和 增 效 醚 (pbo) 诱 导 ,但 均 不 被 蔡 、 环 成 二 烯 类 (如 狄 氏 剂 或 艾 氏 剂 )B- 蔡 黄 素 (B-napthoflavine) 诱 导 , 而 乙醇 仅 能 诱导 CYP6AI (Scott et al . ,1996)。 香 芹 黑 凤 蝶 CYP6B1 基因 mRNA 的 诱导 剂 花椒 毒素 (xanthotoxin) 也 可 诱导 P450IpR(Scott et al., 1996). Ati BP AA CYP6B2 cDNA 为 探 针 鉴 定 出 两 个 大 小 不 等 的 mRNA(2.1kb,1.8kb) , 氧 菊 酯 仅 诱导 大 mRNA 的 表达 且 表 现 出 剂量 效应 : 当 棉 铃 虫 取 食 高 含量 氯 菊 酯 (permethrin) 的 食物 ,其 大 mRNA(2.1kb) 含 量 是 对 照 的 5 倍 , 当 取 食 低 含 量 氯 菊 酯 的 食物 时 ,大 mRNA 含量 只 增 至 对 照 的 2 倍 ; 而 葵 巴 比 妥 对 该 两 种 mRNA 的 表达 均 有 影响 :1.8kbmRNA 和 2.1kbmRNA 分 别 是 对 照 组 的 4 倍 和 2 倍 (Wang et al. , 1995). CYP4 家 族 的 烟草 天 蛾 P450 基因 的 表达 也 表现 出 可 诱导 性 的 特征 。 中 肠 CYP4M3 的 mRNA 可 分 别 被 2 -十 三 烷 酮 (tridecanone) ,2 -十 一 烷 酮 (undecanone) 和 安 妥 明 (clofi- brate) = 5 45.3 4.15 倍 , 但 CYP4M2 不 受 这 些 物质 的 影响 (Snyder et al. ,1995)。 35 M8 ( Blaberus discoidalis ) 脂肪 体 的 CYP4C1 可 被 神经 内 分 泌 肽 激素 (hypertre- halosemic hormone, HTH) Mi. HTH ae eR BBA DMA NRTA , 它 的 主要 作用 是 Hest AS Wi OE RR WA POE A IE RT. Northern 48 3é at OT #28, ASK RP CYP4C1 mRNA 含量 极 低 , 当 施用 100pmol 的 HIH 时 ,mRNA 可 增加 50 倍 (Bradfield et 让 99] 司 EE 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 145 , DURALBE Ae P450 基因 也 有 一 定 的 诱导 作用 ,这 在 CYP4 家 族 的 几 个 成 员 中 发 现 ,它们 是 : RAS AR CYP4C1 (Bradfield et al., 1991), 烟草 天 蛾 中 肠 CYP4L2, CYP4MI 基因 (Snyder et al. , 1995). 8.2.5 昆虫 P450 基因 表达 的 调控 机 制 有 关 昆 虫 P450 基因 表达 调控 机 制 的 认识 是 源 于 对 P450 的 诱导 及 抗 性 与 感性 昆虫 品系 基因 结构 和 表达 的 比较 ,这 方面 的 工作 集中 在 对 杀 虫 剂 或 植物 次 生性 物质 抗 性 有 关 的 CYP6A1 ,CYP6A2 ,CYP6B1 ,CYP6D1 基因 的 研究 。 8.2.5.1 Ae CYP6A] 基因 表达 可 能 受 反 式 作 用 因子 的 调节 1989 年 Feyereisen 等 从 葵 巴 比 妥 诱导 的 家 蝇 中 克隆 了 一 个 P450cDNA(Feyereisen et al. ,1989) ,该 基因 编码 的 CYP6AL 蛋白 可 以 氧化 环 成 二 烯 类 杀 虫 剂 (Andersen et al., 1994), CYP6A1 基因 位 于 染色 体 V ,其 转录 起 始 位 点 的 上 游 是 一 些 与 葵 巴 比 妥 诱导 有 关 的 序列 ,其 编码 序列 被 位 于 Glu364 密码 子 的 单一 内 含 子 (60bp) 所 打 断 (Cohen et al., 1994)。 用 克隆 的 CYP6A1 cDNA 作 探 针 从 Rutgers、sbo 品系 家 蝇 进 行 CYP6A1 mRNA 的 序列 测定 ,发现 mRNA 在 抗 性 Rutgers 家 蝇 的 组 成 性 表达 至 少 高 出 sbo 家 蝇 的 10 倍 (Gandi et al. ,1992) 。 通 过 Rutgers MASS BEN sho 品系 家 蝇 的 杂交 试验 显示 , CYP6Al 在 抗 性 品系 家 蝇 的 超 量 表达 是 受 位 于 染色 体 开 的 不 完全 显 性 基因 座 所 控制 (Feyereisen et al. , 1989). Rutgers 和 sbo 品系 家 蝇 CYP6AI 的 $ 上 游 区 完全 相同 ,排除 了 CYP6A1 存在 顺 式 作用 突变 而 认为 这 种 超 量 表达 是 反 式 作用 因子 突变 的 结果 。 这 一 反 式 作用 因子 负 调 节 ( 抑 制 )CYP6A1 的 表达 ,突变 解除 了 这 一 抑制 。 该 突变 可 能 是 : O 影响 基因 表达 的 启动 子 区 的 突变 ; @ 调 节 基 因 编 码 区 的 突变 ,使 开放 读 框 中 断 ,或 指导 一 个 修饰 蛋白 的 合成 以 使 此 蛋白 不 能 与 CYP6Al 基因 的 顺 式 调 节 元 件 结合 ,或 影响 与 其 他 转录 调节 因子 的 相互 作用 ; 四 突变 影响 反 式 作用 因子 翻译 后 修饰 ,而 导致 其 功能 的 丧失 (Feyereisen et al. ,1995 ) 。 8.2.5.2 CYP6A2 基因 的 表达 可 能 涉及 转录 后 机 制 CYP6A2 是 从 果 蝇 中 分 离 的 基因 ,编码 P450-B1 HA. FE DDT 抗 性 的 91-R 品系 的 mRNA 的 表达 是 感性 91-C 品系 的 20 一 30 倍 ,P450-B1 蛋白 在 91-R 品系 的 表达 是 91-C 的 20 倍 (Sundseth et al. ,1989) ,两 品系 的 mRNA 和 P450-B1 蛋白 的 表达 的 这 种 线性 关 系 表明 ,翻译 后 机 制 可 能 并 不 起 作用 (Waters et wz. ,1992b)。 从 91-C 和 91-R 品系 果 蝇 得 到 的 CYP6A2 mRNA 大 小 不 同 ,预示 在 该 两 品系 果 蝇 中 P450 CYP6A2 结构 存在 差异 。 通过 基因 组 DNA 克隆 限制 性 酶 谱 和 DNA 序列 分 析 表 明 91-C 和 91-R 品系 CYP6A2 基 因 结构 的 差异 在 3 - 端 。91-C 品系 P450 CYP6A2 基因 的 3- 末端 有 一 513bp 序列 在 91-R 品系 果 蝇 中 不 存在 ,这 一 序列 称 为 转 座 因 子 (transposable element)17.6 的 长 末端 重复 (long terminal repeat, LTR) ,定位 在 转录 序列 的 3 - 端 非 翻译 区 ,其 明显 的 效应 是 将 基因 的 多 腺 苷 酰 化 信号 和 PolyA 位 点 向 下 游 移 动 S00bp 以 上 (Waters et al. ,1992b)。 由 LTR 的 特征 及 其 定位 推测 CYP6A2 基因 表达 调控 涉及 mRNA 稳定 的 转录 后 机 制 (Tomita et 146 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 al., 1995). LTR 的 存在 导致 比 91-C 品系 果 蝇 mRNA 更 长 的 艇 合 mRNA AK, TT RK 合 的 转录 物 是 不 稳定 的 ,很 快 被 降解 。 且 藤 合 mRNA 不 能 有 效 地 被 多 腺 苷 酰 化 ,这 本 身 也 就 降低 了 mRNA 的 稳定 性 (Waters et al. , 1992). 对 以 上 观点 ,Delpuech 等 (1993) 提 出 了 不 同 的 看 法 。 他 们 通过 对 代表 24 个 种 群 和 广 泛 地 理 分 布 的 22 个 黄 猩猩 果 蝇 (Drosopjpizia melanogaster )#il 9 个 D. simulans 系 的 果 蝇 分 析 ,发 现在 D. melanogaster 25% 的 抗 性 品系 和 30% 的 感性 品系 存在 LTR。 该 作者 认 为 LTR 不 可 能 是 果 蝇 对 DDT 敏感 性 的 原因 ,敏感 91-C 果 蝇 LTR 的 存在 仅 是 果 蝇 中 广 为 分 布 的 多 态 性 的 一 个 例子 ,而 与 DDT 抗 性 无 关 (Delpuech ez al. , 1993). 在 91-R 的 CYP6A2 基因 存在 一 个 96bp 序列 ,位 于 编码 序列 下 游 , 它 的 功能 尚 不 清 FE ,不 能 排除 这 一 序列 起 加 强 子 的 作用 (Waters et al. , 1992). 8.2.5.3 顺 式 调控 元 件 可 能 调节 CYPOBIV3 的 表达 CYP6B1V3 是 从 香草 黑 凤 蝶 分 离 的 基因 , 它 与 昆虫 对 呐 喃 香 豆 素 的 代谢 有 关 。 香 芹 黑 凤 蝶 在 接触 花椒 毒素 和 香 柠檬 烯 24 h 后 ,CYP6B1V3 转录 物 的 表达 分 别 被 诱导 7 售 Al 2 #5, AROMA SH 4 AREA (angelicin) ABH CYP6B1 的 转录 。 这 些 结果 表明 , CYP6B1 基因 被 叶 喃 香 豆 素 的 转录 调节 具有 等 级 性 (hiearchy) : 线 状 的 花椒 毒素 本 身 可 被 CYP6B1 基因 产物 所 代谢 ,强烈 诱导 CYP6B1 转录 , 香 柠 檬 烯 也 可 被 CYP6B1 BAW, 但 诱导 程度 低 得 多 ;而 角 型 叶 喃 香 豆 素 的 当归 根 素 不 被 CYP6B1 代谢 ,也 不 诱导 该 基因 的 转录 (Propaipong et al. , 1994). 用 包含 CYP6B1V3 基因 RNA #46 07.8 ASRS EE (report gene) CAT 所 构建 的 838CYP-CAT 转录 融合 体 , 转 染 到 与 香 齐 黑 凤 蝶 近 缘 关 系 较 远 的 昆虫 sf9 细胞 中 ,被 转 染 的 细胞 具有 高 的 CAT 活 性 ,而 无 该 启动 子 的 亲本 载体 ,没有 检测 到 CAT 活性 (Propaipong et al.,1994)。 通 过 加 入 不 同 量 的 花椒 毒素 于 838CYP-CAT 转 染 的 细胞 与 对 照相 比 , CAT 活性 增强 ,表明 该 CYP6B1V3 基因 启动 子 至 少 保持 部 分 对 花椒 毒素 诱导 起 重要 作 用 的 顺 式 元 件 (Propaipong et al. ,1994)。 通 过 序列 分 析 , CYP6B1V3 基因 的 启动 子 序列 包含 TATA 和 CAAT 盒 ,分 别 位 于 转录 起 始 位 点 前 30 和 129 74K +E RAL ( Propaipong et al., 1994), Hefthsc 4 EME EAM CYP6B1V3 的 转录 诱导 中 的 作用 尚 不 清楚 (Propaipong et al. , 1994), 8.2.5.4 顺 式 和 反 式 因子 可 能 共同 调节 CYP6D1 基因 的 表达 CYP6D1 基因 是 从 家 蝇 中 分 离 的 另 一 P450 基因 , 它 与 家 蝇 对 拟 除 虫 菊 酯 农药 的 抗 性 有 关 (Scott,1996b)。CYP6D1 mRNA 在 抗 性 LPR 品系 的 表达 10 倍 于 感性 CS mA, CYP6D1 蛋白 在 LPR 品系 与 CS 品系 相差 9 倍 , 可 见 LPR 品系 家 蝇 CYP6D1 mRNA 和 CYP6D1 蛋白 含量 的 增加 是 相似 的 (Scott,1996)。Southern 印迹 分 析 证 明 , CYP6D1 基因 表达 不 是 基因 扩 增 造成 的 (Scott,1996; Tomita et &gL. ,1995$)。 这 些 结果 表明 ,LPR 品系 家 蝇 CYP6D1 蛋白 含量 的 上 升 是 由 于 转录 增加 或 mRNA 稳定 或 两 者 共同 作用 的 缘故 (Tomita et al. ,1995 ) 。 CYP6D1 基因 位 于 1 号 染色 体 ,其 超 量 表达 (mRNA 和 和 蛋白质 ) 被 证 明 是 与 位 于 1 号 染色 体 和 2 号 染色 体 上 的 调控 因子 的 综合 作用 相关 ,表明 CYP6D1 在 LPR 品系 的 表达 EE —— 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P1450 及 其 功能 。 147 , 增加 同时 受 位 于 1 号 染色 体 上 因子 的 顺 式 调节 和 2 号 染色 体 上 因子 的 反 式 调节 (Scott, 1996). 敏感 品系 家 蝇 CYP6D1 基因 的 mRNA 可 被 苯 巴 比 妥 诱导 ,而 抗 性 LPR 品系 无 此 现 象 。 诱 导 是 受 位 于 2 号 染色 体 的 因子 所 调控 (Liu and Scott,1997b) ,这 一 因子 反 式 作用 于 号 染色 体 上 的 CYP6D1 基因 。 值 得 注意 的 是 ,在 LPR 品系 家 蝇 中 控制 CYP6D1 的 超 量 表达 的 因子 也 位 于 2 号 染色 体 上 ,两 者 可 能 为 同一 因子 (Liu and Scott, 1997). 8.3 昆虫 细胞 色素 P450 的 功能 至 今 ,人 们 发 现 昆虫 细胞 色素 P450 酶 系 存在 两 大 功能 类 型 , 即 对 内 源 物 质 和 外 源 物 质 代谢 。 8.3.1 对 外 源 物 质 的 代谢 定位 于 细胞 微粒 体 分 级 中 的 P450 BAR, 主要 作用 是 对 外 源 性 物质 的 代谢 , 由 于 P450 的 这 种 功能 对 生物 体 而 言 在 大 多 数 情况 下 起 解毒 作用 ,因此 常 将 P450 酶 系 归 为 解 毒 酶 。 许 多 事例 表明 P450 酶 系 对 杀 虫 剂 及 植物 毒素 的 代谢 作用 是 大 多 数 昆虫 产生 抗 药 性 和 对 寄主 植物 的 适应 性 的 主要 机 制 。 8.3.1.1 在 昆虫 取 食 中 的 作用 所 有 生物 都 为 生存 而 与 逆境 抗争 ,昆虫 也 不 例外 。 草 食 昆虫 在 取 食 植物 获得 能 量 的 同时 ,也 摄 入 植物 中 对 其 生长 不 利 的 化 学 物质 。 据 估计 ,所 有 植物 都 包含 一 定 种 类 的 防御 化 合 物 (Rhodes and Gates,1976) ,这 些 防 御 化 合 物 对 昆虫 来 说 存在 一 定 程度 的 急性 或 慢 性 毒性 ,可 以 使 昆虫 致死 或 使 昆虫 发 育 或 繁殖 异常 。 为 了 取 食 ,昆虫 必须 有 一 定 的 适应 机 制 (Jones,1972) 。 数 百 万 年 来 ,昆虫 对 大 量 的 植物 次 生性 物质 进行 了 长 期 不 断 地 适应 , 形 成 了 多 种 适应 对 策 : 行 为 的 、. 生 理 的 或 生化 的 , 避 毒 . 贮 毒 、 排 毒 或 解毒 ,其 中 代谢 解毒 是 大 多 数 昆虫 对 植物 次 生物 质 的 适应 机 制 。 代 谢 解 毒 过 程 是 由 昆虫 体内 一 系列 称 为 解毒 酶 的 催化 作用 而 完成 的 ,其 中 具 普 遍 而 重要 意义 的 是 P450 BBA. Krieger 等 (1972) 首 次 提出 P450 酶 系 在 昆虫 对 寄主 植物 适应 中 具有 重要 的 意义 ,这 一 看 法 源 于 他 们 对 35 种 鳞 翅 目 幼虫 中 肠 中 加 单 氧 酶 ( 艾 氏 剂 环 氧化 酶 ) 的 活性 与 其 取 食 植物 的 科 的 数量 存在 相关 性 的 观察 结果 ( 表 8.3) ,由 此 认为 多 食性 昆虫 因 暴 露 于 较 多 种 类 或 数量 的 植物 次 生物 质 而 比 寡 食 性 又 比 专 食 性 昆虫 具有 更 高 的 P450 BAI. Krieger 等 (1972) 的 研究 带动 了 许多 有 关 解 毒 酶 的 代谢 活性 与 寄主 植物 防御 物质 相互 关 系 研 究 的 开展 。Rose (1985) 用 更 多 的 鳞 翅 目 昆 虫 重复 Krieger 等 的 实验 ,发 现 昆 虫 的 寄 主 范围 与 昆虫 的 加 单 氧 酶 活性 并 不 存在 相关 性 ,但 却 指出 寄主 植物 中 的 一 些 化 学 成 分 比 食性 更 能 表明 加 单 氧 酶 活性 的 高 低 (Rose 1985) , 因为 取 食 单 熙 类 物质 含量 高 的 昆虫 , 往 往 具 有 较 高 的 加 单 氧 酶 活性 。 虽 然 Krieger 的 研究 结果 曾经 受到 质疑 (Gould 1984; Rose, 1985) ,但 近 30 年 来 ,大 多 数 研 究 结果 支持 P450 酶 系 在 植物 毒素 解毒 中 起 重要 作用 。 - 148 , 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 表 8.3 鳞 翅 目 幼虫 中 肠 环 氧化 酶 活性 与 食性 的 关系 (Krieger et al. 1972) 幼虫 食性 (植物 属 数 ) 蛋白 中 艾 氏 剂 环 氧化 酶 /[pmol/(min*mg)] 单 食性 (1) 8 20.4 土 9.1 FERHE(2~10) 90.0+ 33.6 多 食性 (>11) 297.4 土 65.9 P450 酶 系 参与 植物 防御 物质 的 代谢 已 有 实验 证 明 , 随 底 物 分 子 的 结构 不 同 ,催化 反 应 的 产物 各 异 。 在 昆虫 -植物 相互 关系 中 起 作用 的 P450 所 催化 反应 的 类 型 内 见 下 表 8.4 (Brattsten, 1992). } 8.4 细胞 色素 P450 催化 的 反应 反应 底 物 举例 BFL 脂 族 长 叶 薄 荷 酮 (pulegone) 芳 族 Ft (benzo pyrene) N - 脱 烷 基 吗啡 (morphine) O - 脱 烷 基 可 待 因 (codeine) S- 脱 烷 基 涕 灭 威 (aldicarb) r- 键 氧化 作用 脂 族 环 氧化 除虫菊 脂 1(pyrethrin 1) 芳 族 环 氧化 花椒 毒素 (xanthotoxin) 氧化 脱硫 甲 基 对 硫 磷 (methyl parathion) 非 共享 电 子 对 的 氧化 作用 N -氧化 烟 碱 (nicotine) S- 氧 化 甲 拌 磷 (phorate) (1) RAR 细胞 色素 P450 通常 进攻 碳 原子 ,很 少 进攻 杂 原 子 。 碳 的 氧化 作用 通常 是 羟基 化 过 程 (图 8.1)。 如 果 邻 近 杂 原子 的 碳 被 氧化 ,其 反应 可 能 是 在 被 烷 基 取代 的 N.O KS RF 上 发 生 脱 烷 基 作 用 (图 8.2)。 细 胞 色素 P450 也 可 进攻 邻近 杂 环 所 上 的 碳 原子 (图 8.3), 如 烟 碱 和 吡咯 双 烷 类 (pyrrolizidine) 生物 碱 的 代谢 ,也 可 进攻 杂 环 氧 上 的 碳 原子 (图 8.4) 如 花椒 毒素 。 OH 图 8.1 碳 的 羟基 化 作用 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 。149 , 8.2 N,O- 脱 甲 基 作 用 CH, CH, ee LE a aog | | 烟 碱 sa iO i ey Oo ioe N 吡咯 双 烷 类 生物 碱 图 8.3 邻近 杂 原 子 C 的 羟基 化 作用 OCH, o> O \ . fA 花椒 毒素 图 8.4 条 环 氧 上 C 的 环 氧 化 (2) r- 键 氧化 这 些 反应 是 双 键 的 环 氧 化 ,产生 脂 族 烃 环 氧 化 物 或 芳 族 烃 氧化 物 。 这 些 产 物 往往 具 有 高 度 的 反应 性 ,可 能 与 生物 细胞 大 分 子 如 蛋白 .RNA\、DNA 形成 结合 物 ,反应 为 原 毒素 的 活化 作用 。 但 有 时 环 氧化 起 解毒 作用 ,活化 还 是 解毒 取决 于 底 物 分 子 的 结构 (图 8.5)。 (3) 非 共享 电子 对 的 氧化 这 些 反 应 往往 导致 硫 酯 键 氧化 成 亚 砚 和 砚 。 叔 胺 转化 为 N -氧化 物 。N -氧化 物 烟 碱 和 其 他 生物 碱 的 主要 代谢 中 间 物 (图 8.6) ,N -氧化 作用 通常 是 解毒 作用 。 P450 酶 系 在 植物 防御 物质 代谢 中 的 作用 已 得 到 充分 的 证 明 (Brattsten and Wilkin- 。 150 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 2 人 除虫菊 酯 1 0 0 0 0 一 一 一 一 和 No ZA So 图 8.5 酯 族 和 芳 族 碳 的 环 氧化 作用 CH 『 下 es SS N N we Ee is N N 烟 碱 图 8.6 N- 氧 化 作用 son,1977; Frank and Fogleman,1992) ,但 鉴定 参与 植物 防御 物质 代谢 的 单个 P450 是 很 困难 的 (Scott et al. ,1998) 。 近 年 来 有 3 个 系统 提供 了 P450 参与 昆虫 对 寄主 植物 防御 物 质 代 谢 有 关 的 分 子 信息 。 1) 果 蝇 -仙人 掌 系 统 ”Fogelman 等 (1997) 发 现 , 仙 人 掌中 的 防御 物质 对 大 多 数 昆虫 种 类 是 有 毒 的 ,但 其 中 却 生活 着 几 种 果 蝇 ,研究 认为 这 些 栖 息 于 沙漠 中 的 果 蝇 具有 取 食 仙人 掌 的 能 力 。P450 诱导 可 能 是 这 种 适应 性 的 重要 机 制 。 从 D. mettlen 中 发 现 P450 的 CYP28 家 族 , 这 些 P450 可 被 仙人 掌 的 生物 碱 诱导 ,从 而 推测 这 些 P450 可 能 参与 这 些 毒 素 的 代谢 (Danielson et al. ,1997). 2) 呐 喃 香 豆 素 - CYP6B 家 族 系统 ”昆虫 P450 酶 系 与 寄主 植物 适应 性 的 关系 研究 得 最 为 深入 的 是 CYP6B 家 族 。 呐 喃 香 豆 素 发 现 于 至 少 8 种 植物 科 中 ,它们 对 大 多 数 生物 具 有 较 高 的 毒性 ,包括 细菌 、 植 物 、 鱼 、 鸟 类 和 哺乳 动物 ,因为 它们 光 活 化 后 可 以 与 DNA 上 的 喀 喧 碱 基 直 接 发 生 不 可 逆转 的 反应 (Berenbaum and Feeny ,1981; Berenbaum, 1991)。 在 植物 中 存在 两 种 类 型 的 叶 喃 香 豆 素 , 即 线 型 如 花椒 毒素 、 香 柠檬 烯 、 角 型 如 当 归根 素 (angelicin) 和 牛 防 风 定 (sphondin)。 这 些 植 物 尽 管 存在 这 种 防御 物质 ,但 凤 蝶 属 (Pazpilio) 昆 虫 仍 可 以 取 食 含有 这 类 物质 的 植物 ,其 中 香 芹 黑 凤 蝶 几乎 专 一 性 取 食 含 叶 喃 香 豆 素 的 植物 , 且 可 以 耐 受 食物 中 含量 高 达 0.1% 的 花椒 毒素 (Berenbaum,1991 )。 研究 发 现 这 种 昆虫 的 P450 加 单 氧 酶 可 以 解毒 花椒 毒素 (Bull er al. ,1986) ,其 代谢 活性 可 被 花椒 毒素 诱导 为 对 照 的 5 倍 (Cohen et al . ,1989)。 其 诱导 作用 具有 一 定 的 特异 性 , 除 花 椒 毒素 外 ,其 他 一 些 结构 相关 的 线 型 叶 喃 香 豆 素 具 有 一 定 程度 的 诱导 ,而 角 型 呐 喃 香 豆 素 以 及 其 他 一 些 化 合 物 和 葵 巴 比 妥 却 不 是 诱导 剂 (Berenbaum et al. ,1990). 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 。 151 , 从 该 昆虫 中 分 离 出 可 被 花椒 毒素 选择 性 诱导 (Hung et al., 1995; Prapaipong et al., 1994) 的 P450 基因 CYP6B1 (Cohen et al., ,1992) 。 通 过 用 杆 状 病毒 表达 系统 在 鳞 翅 目 昆 虫 细 胞 系 中 表达 CYP6BIV1 和 CYP6B1V2 表明 ,这 两 个 等 位 基因 编码 的 P450 可 以 代谢 线 型 叶 喃 香 豆 素 而 对 当归 根 素 和 牛 防风 定 无 作用 (Ma et al. , ,1994) 。 这 提供 了 CYP6B1 在 花椒 毒素 代谢 解毒 以 及 昆虫 对 植物 防御 物质 忍受 性 中 起 作用 的 明确 证 据 。 BAA RRR WR A RR, 预示 该 昆虫 还 存在 其 他 的 P450。Hung 等 (1995) 从 香 芹 黑 凤 蝶 克隆 了 第 二 个 P450 基因 CYP6B3 , 它 与 CYP6B1 具有 88% 的 氮 基 酸 序列 相同 性 ,可 被 线 型 或 角 型 叶 喃 香 豆 素 所 诱导 ,但 CYP6B3 的 底 物 还 未 见报 道 。 从 以 上 事实 中 , Berenbaum 等 指出 :具有 对 某 一 特定 化 学 成 分 的 高 诱导 活性 是 为 草食 者 具有 对 含 这 类 化 学 成 分 寄主 的 一 种 适应 机 制 (Berenbaum et al. ,1996 ) 。 香 弃 黑 凤 蝶 对 含 毒 素 的 寄主 植物 的 适应 ,可 以 通过 两 个 途径 即 具 有 解毒 作用 的 P450 的 多 样 性 以 及 Mpa) JZ OE Oe AES ZR AY Va FE SESE HL (Scott et al. , 1998). 3) 烟 草 天 蛾 - 烟 碱 系统 ”在 P450 与 寄主 植物 防御 化 合 物 关 系 的 研究 中 ,P450 的 诱导 占 有 中 心地 位 (Brattsten,1979; Yu,1986)。 草 食 昆 虫 取 食 不 同 寄主 植物 ,其 P450 含量 或 P450 酶 系 活 性 显著 不 同 (Yu,1986) 。 诱 导 在 许多 昆虫 中 为 一 普遍 的 现象 。 P450 酶 系 的 诱导 可 以 影响 昆虫 的 行为 和 对 有 毒物 质 的 取 食量 ,例如 烟草 天 蛾 (ML sexta ) 对 尼古丁 的 代谢 是 由 P450 RAEN. EH TAS P450 是 该 昆虫 取 食 烟草 的 关 键 , 烟 草 天 蛾 受 食物 中 尼古丁 的 严重 影响 。 在 P450 酶 系 未 被 诱导 时 明显 抑制 取 食 活动 , 经 诱导 后 尼古丁 的 消耗 上 升 , 再 用 P450 的 抑制 剂 处 理 昆虫 时 其 尼古丁 的 消耗 下 降 。 这 一 现象 显示 了 P450 诱导 与 尼古丁 消耗 的 直接 因果 关系 (Snyder and Glendinning, 1996 ) 。 从 烟草 天 蛾 的 中 肠 中 克隆 的 两 个 P450 基因 CYP4M1 和 CYP4M3 可 以 被 食物 中 的 尼 古 本 诱导 ,但 对 脂肪 体 无 作用 (Snyder et al. ,1995) 。 值 得 注意 的 是 ,该 两 基因 还 受 u -十 三 烷 酮 和 ao -十 一 烷 酮 的 诱导 ,而 这 两 个 化 合 物 是 烟草 天 蛾 的 另 一 寄主 野生 番 荔 中 的 有 毒 成 好 5 8.3.1.2 在 昆虫 抗 药性 中 的 作用 杀 虫 剂 抗 性 是 害虫 防治 的 一 大 障碍 ,由 抗 性 引发 的 诸如 农药 使 用 次 数 和 剂量 增加 , 产 量 降低 ,环境 污染 以 及 虫 媒人 畜 疾 病 的 流行 等 问题 已 给 人 类 带 来 巨大 灾难 (Scott ,1996 )。 抗 性 治理 作为 害虫 有 效 防 治 的 关键 ,已 引起 包括 生产 者 、 科 学 家 和 政府 部 门 的 高 度 重视 。 抗 性 机 制 的 了 解 是 抗 性 治理 的 基础 (Scott,1996) ,有 关 抗 性 机 制 的 研究 已 得 到 广泛 的 开展 ,多 年 来 的 研究 结果 表明 ,昆虫 产生 抗 药性 有 不 同 的 机 制 。 已 公认 的 抗 性 机 制 包 括 : 对 杀 虫 剂 暴露 的 减少 ,对 杀 虫 剂 代谢 作用 的 增强 以 及 靶 部 位 敏感 性 的 降低 等 。 其 中 P450 加 单 氧 酶 系 ( 简 称 P450 酶 系 ) 对 杀 虫 剂 代谢 作用 的 增强 已 证 明 是 大 多 数 重 要 害虫 对 杀 虫 剂 产生 高 水 平 抗 性 和 交互 抗 性 的 主要 原因 (Scott, 1996). 发 现 抗 性 与 MFO 有 关 的 证 据 首先 来 自 间接 的 推测 , 即 通 过 研究 一 些 增 效 剂 ( 如 氧化 胡椒 基 丁 醚 , 增 效 散 等 ) 的 作用 才 发 现 的 。1960 年 Sun 和 Johnson 发 现 这 些 化 合 物 能 抑 制 艾 氏 剂 的 环 氧化 作用 和 硫 逐 磷酸 酯 杀 虫 剂 的 活化 作用 。Hodgson 和 Casida (1961) 也 发 现 它们 能 抑制 氨基 甲酸 酯 类 的 氧化 作用 。Eldefraw 等 在 1960 年 证 明 ,以 西 维 因 和 增 效 散 混合 处 理 时 能 消除 家 蝇 对 西 维 因 的 抗 性 。 "152 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 MFO 酶 系 在 抗 性 中 极为 重要 的 直接 证 据 来 自 MEO 的 离 体 测 定 。 主 要 通过 : OAH 剂 氧化 代谢 的 直接 测定 ,@) 模型 底 物 氧化 代谢 的 测定 , @ 对 MFO 酶 系 的 主要 组 成 如 细 胞 色素 P450 水 平 的 测定 OP450 光谱 特征 的 变化 。 研 究 结果 表明 , 抗 性 的 发 展 普遍 与 微 粒 体 氧 化 作用 增强 有 关 (Wilkinson,1983 ) 。 以 MFO 活性 增加 的 机 制 产生 抗 性 的 昆虫 , 除 增 强 了 对 靶 标 杀 虫 剂 的 代谢 外 ,还 会 加 强 对 划 标 杀 虫 剂 结构 并 不 相关 的 杀 虫 剂 的 代谢 , 这 是 因为 这 些 杀 虫 剂 可 以 通过 一 个 或 几 个 微粒 体 氧化 途径 被 降解 ,这 为 交互 抗 性 提供 了 一 个 很 好 的 解释 (Wilkinson,1983)。 代谢 抗 性 的 化 学 本 质 是 杀 虫 剂 代 谢 活性 的 增强 , 归 因 于 相关 酶 在 数量 或 质量 上 的 改 变 ,可 能 涉及 的 机 制 包括 基因 扩 增 \ 酶 基因 突变 以 及 基因 转录 的 增强 等 。 与 蚜虫 和 蚊虫 等 酯 酶 介 导 的 抗 性 不 同 ,未 发 现 P450 介 导 的 抗 性 是 由 基因 扩 增 所 引起 ,调控 基因 的 突变 引 起 的 P450 的 超 量 表达 可 能 是 P450 介 导 抗 性 的 主要 机 制 。 (1) Rx 1) LPR 品系 LPR (learn pyrethroid resistant) 品 系 家 蝇 是 经 氯 菊 酯 选择 的 品系 ,对 大 多 数 常 用 拟 除 虫 菊 酯 类 杀 虫 剂 表 现 出 高 水 平 的 抗 性 。 许 多 证 据 表 明 ,加 单 氧 酶 是 LPR 品系 对 拟 除 虫 菊 酯 类 杀 虫 剂 抗 性 的 重要 机 制 ,包括 : @ 离 体 研 究 发 现在 加 单 氧 酶 介 导 的 对 氧 菊 酯 、 溴 氰 菊 酯 或 氯氰菊酯 的 解毒 作用 上 ,LPR 品系 比 敏 感 品系 高 约 10 7; @ 在 溴 氰 菊 酯 体内 代谢 作用 上 ,LPR 品系 比 敏感 品系 增强 ; @ 用 P450 的 抑制 剂 增 效 醚 可 以 抑制 氯 菊 酯 的 抗 性 (从 5900 倍 降低 32 倍 ) 。P450 介 导 的 解毒 作用 与 家 蝇 1 号 和 2 号 染色 体 有 关 。 从 LPR 品系 家 蝇 中 纯化 出 P450(P450lpr) ,由 其 部 分 肽 序列 设计 简 并 引物 分 离 了 其 编码 基因 CYP6D1 ,免疫 抑制 实验 证 明 CYP6D1 是 LPR 品系 家 蝇 对 溴 氰 菊 酯 和 氯氰菊酯 代谢 的 主要 P450。 代 谢 中 间 物 分 析 显 示 CYP6D1 是 在 上 述 拟 除 虫 菊 酯 的 葵 氧 葵 基 分 子 (phenoxybenzyl) 的 单一 位 点 上 起 作用 。 用 bs 抗 血清 证 明 LPR 品系 家 蝇 微 粒 体 CYP6D1 介 导 氯氰菊酯 的 代谢 需要 细胞 色素 bs (Liu and Scott, 1996). Northern 印迹 分 析 证 明 , LPR 品系 CYP6D1 mRNA 表达 水 平 比 敏感 品系 家 蝇 高 10 倍 ,这 与 微粒 体 蛋 白 抗 性 品系 高 出 敏感 品系 8 倍 的 结果 相 一致 。 基 因 组 DNA 杂交 (用 CYP6D1 -cDNA 探 针 ) 的 South- ern 印迹 分 析 显 示 CYP6D1 mRNA 在 LPR 品系 家 蝇 中 水 平 增加 不 是 基因 扩 增 的 结果 (Tomita and Scott,1995) 。 等 位 基因 特异 性 PCR 方法 实验 证 明 CYP6D1 位 于 1 SRE 体 上 (Liu et az . ,1995)。 用 转录 抑制 剂 ( 放 线 菌 素 D) 注 射 于 LPR 品系 家 蝇 和 敏感 aabys 家 蝇 , 在 不 同时 间 分 离 mRNA 的 定量 结果 表明 ( 放 线 菌 素 D 可 以 抑制 两 个 品系 转录 过 程 ),CYP6D1 mRNA 的 高 表达 不 是 mRNA 稳定 的 结果 (Liu and Scott, 1998). 连 缀 转录 分 析 (run-on transcription assay) 证 明 CYP6D1 mRNA 的 丰 度 在 LPR 品系 Lt aabys 高 致 10 倍 ,这 与 Northern 杂交 (Liu and Scott, 1996; Tomita et al., 1995) Wi 果 相 一 致 。 这 第 一 次 直接 证 明了 增强 转录 是 杀 虫 剂 抗 性 的 原因 (Liu and Scott, 1998). CYP6D1 转录 增强 是 由 顺 式 和 反 式 调控 因子 介 导 的 (Liu er al., 1995), AW CYP6D1 转录 速率 的 增加 是 由 1 号 和 2 号 常 染 色 体 决定 的 。 有 关 CYP6D1 转录 增强 的 机 制 现 在 还 不 清楚 ,对 比 LPR 品系 家 蝇 以 及 5 个 拟 除虫菊 酯 敏感 品系 的 CYP6D1 5 file 区 存在 一 些 差异 ,5 -侧翼 区 的 不 同 可 能 是 CYP6D1 在 不 同 品系 家 蝇 中 的 差别 表达 中 起 作用 (Scott et al. ,1999)。 a 第 八 章 ” 昆 虫 细 胞 色素 P450 及 其 功能 * 155 * 从 LPR 及 其 他 4 个 家 蝇 品 系 的 CYP6D1 序列 对 比分 析 发 现 ,推导 的 蛋白 序列 LPR 品系 与 cs,aabys,ISK 和 Rutgers 品系 分 别 有 8, 11, 7 和 6 一 7 个 氨基 酸 不 同 (Tomita et ii.,1995)。 其 中 有 5 个 氨基 酸 在 cs,,aabys,IKS 和 Rutgers 相同 ,但 与 LPR 品系 家 蝇 有 别 , 即 Asp~>Ala (150), Ile>Leu (153), Thr-Ser (165), Glu->Gln (128), Met—lIle (227) (Tomita et al., 1995). ASEBEE HH SLE 6 家 族 细 胞 色素 P450 的 两 个 高 度 可 变 区 , 且 改 变 的 残 基 218,220,225 和 227 靠近 推定 的 底 物 结合 区 (Gotoh and Fujii-Kuriya- ma,1989)。 这 些 CYP6D1 蛋白 的 氨基 酸 差 异 是 否 会 导致 对 除虫菊 酯 杀 虫 剂 催化 活性 的 不 同 , 还 有 待 进一步 证 明 。 2) Rutgers 品系 家 蝇 Rutgers 品系 家 蝇 最 初 是 用 二 嗪 磷 选 择 ,表现 出 对 二 嗪 磷 以 及 其 他 杀 虫 剂 的 抗 性 。 从 Rutgers 家 蝇 中 克隆 了 CYP6A1 ,是 第 一 个 克隆 的 昆虫 P450 基 因 (Feyereisen et al., ,1989) 。Northern 印迹 分 析 结 果 表 明 ,Rutgers 品系 中 CYP6A1 是 敏感 品系 家 蝇 的 3 倍 ,在 LPR 品系 中 表达 量 更 高 (Carino et al. ,1992 ) Southern 印迹 分 析 显 示 CYP6A 的 表达 增加 不 是 基因 扩 增 的 结果 (Carino et al., 1994; Fey- ereisen et al. ,1995 ) 。 从 现 有 资料 来 看 ,还 不 能 确定 CYP6A1 与 杀 虫 剂 抗 性 有 关 。 有 一 些 抗 性 品系 家 蝇 中 CYP6A1 mRNA 的 含量 比 敏 感 品系 高 ,但 也 有 相反 的 情况 如 LPR 品系 的 CYP6A1 mR- NA 比 Rutgers 更 高 ,而 LPR 品系 对 二 嗪 磷 的 抗 性 水 平 比 Rutgers 品系 家 蝇 低 。 现 在 还 不 Al CYP6A1 蛋白 是 否 在 抗 性 品系 家 蝇 中 含量 更 高 ,而 且 也 未 见报 道 CYP6A1 可 以 解毒 Rutgers 品系 家 蝇 产 生 加 单 氧 酶 介 导 抗 性 的 杀 虫 剂 ,如 二 嗪 磷 。 Rutgers 和 aabys 的 CYP6A1 等 位 基因 十 分 相似 ,在 507 FARR PEMA S TAR (Cohen et al. , 1994). Tf] Rutgers 和 SBO 品系 具有 相同 的 CYP6AL 4K RAPS (Cohen et al. , 1994), Guzov 4 (1998) KA Rutgers 品系 家 蝇 中 克隆 了 一 线粒体 P450 基因 CYPI2A1 ,并 在 大 肠 杆 菌 中 得 到 表达 ,从 而 纯化 了 表达 的 CYP12A1 蛋白 。 该 蛋白 与 牛 线粒体 的 电子 供 体 构成 的 重组 酶 系 可 以 代谢 许多 种 杀 虫 剂 和 蜡 生 素 ,但 对 保 幼 激素 、 晓 皮 激 素 和 脂肪 酸 等 内 源 性 底 物 无 代谢 活性 。CYP12A1 基因 作 图 在 2 号 染色 体 上 , 与 杀 虫 剂 代 谢 作 用 的 微粒 体 CYP6A1 相同 ,这 表明 线粒体 P450 可 能 参与 外 源 物 质 的 代谢 。CYP12Al 与 昆虫 抗 药 性 的 关系 还 未 见报 道 。 (2) Re 91-R fh KRHA ( Drosophia melanogaster ) 在 实验 中 用 DDT 选择 , 它 对 DDT 的 抗 性 小 于 10 倍 (Dapkus and Murrell, 1997) , 抗 性 受 多 因素 的 控制 ,涉及 3 条 染色 体 。91-R 还 表 现 出 对 马 拉 硫 磷 (malathion) 的 交互 抗 性 (100 倍 ) ,其 抗 性 机 制 不 明确 。 FR P450 的 电泳 呈现 两 个 主要 的 带 ,P45$0s-A 和 P450s-B(Sundseth et al. ,1989 ) 。 这 些 P450 被 纯化 并 用 于 制备 单 克隆 抗体 (Sundseth et al., ,1990) 。P450s-B 免疫 反应 蛋 白 在 所 有 品系 中 的 表达 水 平 相似 (Sundseth et al., 1989; Waters et al., 1992b). FA P450s-B 特异 性 单 克 隆 抗 体 筛选 文库 ,获得 了 包含 P450(CYP6A2 ) 的 克隆 (Waters et al., 1992b)。Northern 印迹 分 析 表 明 CYP6A2 在 91-R 中 表达 较 敏 感 品 系 高 (Waters et al., 1992b) ,Southern 印迹 显示 抗 性 与 敏感 品系 的 信号 强度 相同 ,表明 抗 性 品系 CYP6AI 的 增强 表达 不 是 因为 基因 扩 增 (Waters et al. ,1992b) 。 在 敏感 品系 CYP6A2 的 3“- 非 翻译 。 154 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 区 包含 的 转 座 因子 (transposable element)17.6 的 长 未 端 重复 (LPR ) ,而 在 抗 性 91=R 品 系 家 蝇 中 不 存在 (Waters et al. ,1992b) ,为 此 Waters 等 提出 LTR 可 能 是 CYP6A2 在 91 — R 和 敏感 品系 家 蝇 差 异 表 达 的 原因 (Waters et al. ,1992a,b)。 随 后 的 研究 表明 LTR 的 存在 与 抗 性 (Delpuech et al. ,1993) 和 CYP6A2 表达 (Dombrowski et al. ,1998) 不 相关 。 杆 状 病毒 系统 异 源 表达 的 CYP6A2 可 以 代谢 艾 氏 剂 \ 七 氯 和 二 嗪 磷 (Dunkov et al. , 1997) ,在 系统 中 加 入 家 蝇 P450 还 原 酶 以 及 bs 可 以 加 强 CYP6A2 的 活性 (Dunkov et al. , 1997)。 值 得 注意 的 是 二 嗪 磷 产 生 两 种 中 间 体 ,一 种 是 其 活化 型 ,由 脱硫 作用 产生 二 嗪 氧 磷 (diazoxon) , 另 一 种 是 由 酯 断裂 酶 (ester cleavase) 氧 化 形成 的 解毒 产物 2 - 异 两 基 - 4= 甲 基 - 6 — FE SEH ME (2 - isopropyl -= 4 - methyl - 6 - hydroxy Primidine) (Dunkov et al., 1997)。 一 个 P450 同时 解毒 和 活化 杀 虫 剂 的 另 一 例子 是 CYP6D1 可 以 同时 解毒 和 活化 有 机 磷 杀 虫 剂 (Hatano and Scott,1993 ) 。 比较 5 个 D. melanogaster 品系 发 现 ,CYP6A2 蛋白 含量 与 二 嗪 磷 抗 性 水 平 不 相关 (Bride et al. , 1997). Paquette 品系 中 CYP6A2 含量 最 高 ,但 仅 表现 出 对 二 嗪 磷 抗 性 的 2 倍 (Bride et al., 1997), 这 表明 CYP642 的 超 量 表达 不 是 二 嗪 磷 抗 性 的 主要 机 制 。 CYP6A2 具有 活化 和 解毒 的 双重 性 ,也 可 能 是 CYP6A2 与 果 蝇 抗 性 水 平 不 相关 的 一 个 原 因 (Dunkov et al. ,1997)。 P450s-A 免疫 反应 蛋白 在 91 - R 和 敏感 品系 可 被 PB 诱导 (Fuchs et al., 1994). FA P450s- 也 抗 体 的 免疫 印迹 法 显示 3 条 带 ,在 敏感 品系 ,其 中 1 条 被 显著 的 诱导 ,而 在 91 - R 品系 中 仅 轻 度 诱导 (Fuchs et al! .,1994)。 随 后 的 研究 表明 CYP6A2 在 敏感 和 抗 性 果 蝇 中 均 可 被 诱导 ,只 是 敏感 品系 果 蝇 被 诱导 的 水 平 更 高 (Brun et al., 1996). 从 91-R 品 系 果 蝇 中 克隆 和 测序 了 CYP6A8 Fl CYP6A9 基因 ,CYP642 ,A8 Fil AY 紧密 成 簇 位 于 染色 体 2R 上 ;相对 于 敏感 品系 , CYP6A8 在 91-R 品系 中 表达 较 高 (Maitra etal., 1996). WA, FA RT-PCR 方法 从 D. melanogaster 中 克隆 了 12 个 P450 HEA 段 ,并 在 抗 性 和 敏感 品系 中 发 现 了 其 中 一 些 P450 的 等 位 突变 体 (Dumkov et al. , 1996). 这 些 P450 基因 及 等 位 突变 与 抗 性 的 关系 还 不 清楚 。 (3) Bm i ES /|\ WR ( Blattella germanica) 由 加 单 氧 酶 介 导 抗 性 的 研究 工作 , 主要 集中 在 对 拟 除虫菊 酯 杀 虫 剂 抗 性 品系 Munsyana 的 研究 ,该 品系 来 源 于 施用 和 毛 氰 菊 酯 8 年 之 久 的 地 方 , 对 氯氰菊酯 表现 出 82 倍 ,对 毒 死 昕 5 倍 抗 性 (Scharf et al. , 1997). FA PBO (EAA 菊 酯 抗 性 由 82 倍 降低 至 76 倍 ,表明 加 单 氧 酶 在 氯氰菊酯 抗 性 中 不 起 作用 或 作用 很 少 。 最 近 的 研究 表明 ,该 品系 对 氰 成 菊 酯 (fenvalerate) 杀 虫 剂 的 抗 性 为 825 倍 , 用 P450 抑制 剂 则 抗 性 倍数 降 至 15 一 70 倍 之 间 (Wu et al., 1998). Dong 等 (1998) 和 Wu 等 (1998 ) 认 为 Munsyana 对 和 氰 成 菊 酯 的 抗 性 机 制 包括 加 单 氧 酶 水解 酶 、 谷 胱 甘 肽 S- 转移 酶 降低 表 皮 穿 透 以 及 靶 标 部 位 的 不 敏感 性 等 多 种 机 制 。 离 体 代谢 研究 表明 , 氰 戊 菊 酯 代谢 产物 在 抗 性 品系 比 敏 感 品系 多 ,Munsyana 品系 微粒 体 少 量 依赖 NADPH 的 氰 成 菊 酯 代谢 可 被 PBO 或 水 解 酶 抑制 剂 脱 叶 磷 (s,s,s - tributyphospyorotrithioate,DEF) 抑 制 (Wu et al. ,1998)。 Munsyana 品系 的 P450 含量 4.5 倍 于 敏感 品系 ,4 - 氯 - N - 甲 基 葵 胺 的 代谢 前 者 是 后 者 的 2.5 倍 (Scharf et al. ,1998b ) 。 从 Munsyana 品系 德国 小 螃 中 用 HPLC 方法 纯化 了 P450 MA, 用 小 鼠 制 备 的 第 八 章 , 昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 * 155° P450 MA 多 克隆 抗 性 (Schart et al., 1998b) 免疫 印迹 揭示 抗 血 清 与 一 个 分 子 质量 为 49 kDa 的 蛋白 结合 ,在 Munsyana 抗 性 品系 中 比 敏 感 品系 表达 更 高 。 抗 血清 抑制 4 -A-N- 甲 基 葵 胺 的 代谢 ,但 抗 血清 对 拟 除 虫 薄 酯 代谢 的 抑制 尚未 见报 道 。 用 和 毛 氰 菊 酯 选择 的 德 Eel) Wie ih FA, HE P450 MA 表达 有 所 下 降 , 而 以 毒 死 蝗 选 择 则 , PASO MA 表达 增加 ,P450 MA 的 表达 规律 与 4 - 氯 - N - 甲 基 葵 胺 代谢 相同 (Scharf et al. ,1998a) 。 五 甲 基 葵 对 敏感 ATES BR P450MA 均 有 诱导 作用 (Scharf et al. ,1998b) 。 虽然 P450 MA 在 Munsyana 品系 中 表现 出 超 量 表达 满足 了 P450 介 导 抗 性 的 条 件 之 一 ,但 P450 MA 是 否 参 与 杀 虫 剂 代谢 尚 不 得 而 知 ,因此 难以 证 明 P450 MA 在 杀 虫 剂 抗 性 中 的 作用 。 (4) HMA 1) RAF RUIR (Heliothis virescens) 经 过 实验 室 选 择 ,Herbert 品系 的 烟 芽 夜 蛾 对 硫 双 灭 多 威 和 氯氰菊酯 分 别 为 7150 倍 和 91 倍 的 抗 性 (Rose et az . ,1997)。 对 和 氯氰菊酯 的 抗 性 ,用 PBO 可 降低 至 59 倍 ,该 品系 总 P450 含量 是 敏感 昆虫 的 4 倍 ,微粒 体 对 模式 底 物 的 代谢 也 比 敏 感 品 系 昆 虫 增强 (Rose et al., 1997). 1997 年 从 该 品系 中 克隆 测序 了 P450 基因 CYP9A1. Northern 杂交 分 析 表 明 CYP9IAI 在 敏感 品系 昆虫 中 表达 低 , 用 Herbert 与 敏感 品系 杂交 Fl 代 的 表达 稍 高 (Rose et al., 1997), CYP9A1 作 图 于 连锁 群 7(Linkage group 7)(Rose et al. , 1997). CYP9A1 是 否 与 加 单 氧 酶 介 导 的 抗 性 有 关 还 需 更 进一步 的 研究 。 2) 棉铃 虫 (Belicoverzpa armigera ) 棉铃 虫 拟 除 虫 菊 酯 的 抗 性 机 制 是 一 个 有 争论 的 问 题 。 早 期 的 工作 显示 拟 除 虫 菊 酯 的 抗 性 可 被 PBO 抑制 , 拟 除 虫 菊 酯 结构 与 抗 性 水 平 的 关系 类 似 于 CYP6D1 介 导 的 LPR 品系 家 蝇 的 抗 性 (Forrester et wz . ,1993)。 但 随 后 的 离 体 代谢 研究 表明 抗 性 品系 棉铃 虫 的 加 单 氧 酶 介 导 的 顺 式 氰 戌 菊 酯 或 氯 菊 酯 代 谢 与 敏感 品系 比 并 无 增加 (Gunning et al. , 1995; Kennaugh et al. , 1993). 用 血红 素 结 合 区 附近 的 保守 氮 基 酸 残 基 设 计 简 并 引物 筛选 CDNA 文库 获得 了 棉铃 虫 P450 基因 CYP6B2 (Wang and Hobbs,,1995)。 用 包含 CYP6B2 的 克隆 比较 了 不 同 品系 和 诱导 剂 作 用 下 mRNA 的 表达 (Ranasinghe et al. ,1997; Wang and Hobbs, 1995) ,表明 CYP6B2 可 能 参与 拟 除 虫 菊 酯 的 代谢 。 以 后 进一步 研究 发 现 ,敏感 与 抗 性 品系 棉铃 虫 CYP6B2 的 表达 水 平 很 低 (Pittendrigh et al. ,1997; Ranasinghe and Hobbs, 1998) ,推翻 了 以 上 看 法 。 最 近 从 棉铃 虫 中 克隆 了 另外 两 个 P450 基因 CYP6B6 和 6B7, 其 中 CYP6B6 与 CYP6B2 十 分 相似 。 且 CYP6B2.CYP6B6 和 CYP6B7 三 个 P450 相似 性 都 很 高 ,以 至 用 cDNA 探 针 无 法 区 分 它们 (Ranasinghe and Hobbs,1998)。Noerthern 印迹 分 析 显 示 , 与 敏 感 昆 虫 相 比 3 个 抗 性 昆虫 中 有 两 个 其 CYP6B7 mRNA 水 平 较 高 。 但 考虑 到 无 “加 单 氧 酶 介 导 解毒 增加 "的 证 据 以 及 所 用 品系 抗 性 机 制 的 不 确定 性 ,Scott(1999) 认为 Ranasinghe and Hobbs (1998) #é th AY “CYP6B7 是 栅 铃 虫 拟 除虫菊 酯 代谢 的 P450 的 结论 还 为 时 过 Bo 用 简 并 引物 和 RT-PCR 方法 ,8 个 新 P450 的 部 分 序列 已 被 克隆 (Pittendrigh et al., 1997) ,其 中 CYP4G8 mRNA 在 抗 性 品系 棉铃 虫 表达 是 敏感 品系 棉铃 虫 的 2 倍 ,其 他 P450 片段 要 么 不 可 检测 ,要 么 各 品系 间 含 量 相似 (Pittendrigh et al., 1997), AIK8 + , 156 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 P450 在 杀 虫 剂 抗 性 中 起 作用 还 不 得 而 知 。 (5) 3% & (mosquito) 最 近 , 加 单 氧 酶 证 明 是 五 带 淡色 库 蚊 ( Culex quinquefasciatus ) (Jpal-per 品系 ) 对 拟 除 虫 菊 酯 杀 虫 剂 抗 性 的 主要 机 制 (Kasai et al. ,1998b)。Jpalper 品系 库 蚊 是 经 氯 菊 酯 选择 , 表现 出 对 氯 菊 酯 2500 倍 的 抗 性 ,这 种 抗 性 倍数 可 因 PBO 降低 至 43 倍 。 与 敏感 品系 相 比 Jpal-per fm AE BCR P450 和 b5 含量 是 敏感 品系 的 2.5 倍 。 离 体 代谢 (幼虫 微粒 体 ) 表 明 , 中 肠 和 其 他 身体 部 分 对 氯 菊 酯 的 代谢 ,Jpal-per 品系 分 别 是 敏感 品系 的 5 倍 和 20 倍 (Ka- sai et al. ,1998b) 。 用 RT-PCR ,根据 已 知 CYP6 序列 设计 引物 ,从 五 带 淡 色 库 蚊 中 分 离 了 一 个 新 P450, CYP6E1 (Kasai et al. ,1998a) 以 及 6 个 其 他 新 序列 。PCR 分 析 显 示 ,Jpal-per 品系 与 敏感 品系 相 比 ,CYP6EI 的 表达 相似 , 预示 P450 的 超 量 表 达 可 能 不 是 该 品系 抗 性 的 机 制 (Ka- sai et al. , 1998a). Kasai 等 (2000) 又 从 五 带 淡 色 库 蚊 肠 中 克隆 了 另 一 P450 基因 CYP6F1 Northern 分 析 表 明 CYP6F1 在 氰 菊 酯 抗 性 品系 中 表达 比 敏 感 品 系 高 。 其 推定 的 氨基 酸 序列 具有 腊 锚 定 信和 号、 还 原 酶 结合 位 点 、 血 红 素 结合 位 点 以 及 底 物 识别 位 点 。 种 系 发 生 分 析 表 明 , CYP6F1 4 CYP6D1 关系 很 近 , 后 者 已 知 参 与 拟 除 虫 菊 酯 的 解毒 ,但 现在 无 直接 证 据 表 BA CYP6F1 与 拟 除虫菊 酯 的 抗 性 有 关 。 (6) P450 介 导 抗 性 的 机 制 从 以 上 分 析 可 以 看 到 ,至 今 只 有 一 个 P450 清楚 地 证 明了 在 抗 性 中 起 作用 ,但 许多 重 要 的 发 现 可 以 从 P450 和 杀 虫 剂 抗 性 研究 结果 中 总 结 出 。 现在 已 经 知道 ,P450 转录 增强 可 以 增加 P450 蛋白 的 表达 和 加 强 对 杀 虫 剂 的 解毒 作 用 (Liu and Scott, 1998) ,转录 过 程 受 顺 式 和 反 式 调控 (Liu and Scott, 1998)。 和 杀 虫 剂 抗 性 基因 可 能 在 基因 组 中 作 图 不 同 于 参与 杀 虫 剂 代 谢 的 P450 的 基因 位 点 。 负 责 P450 反 式 调控 的 因子 也 可 能 调控 其 他 P450( 可 能 不 涉及 抗 性 ) 的 表达 。 由 此 可 见 不 仅 P450 底 物 特 异性 是 变化 的 ,P450 的 调控 也 是 变化 的 。 揭 示 同 一 因子 调控 那些 P450 的 表达 ,有 助 于 了 解 昆 虫 交叉 抗 性 问题 。 抗 性 的 产生 可 能 通过 一 个 P450 的 解毒 (如 CYP6D1) ,因此 选择 某 P450 的 特异 性 抑 制剂 可 能 有 效 地 消除 抗 性 。P450 进攻 的 部 位 可 能 限于 杀 虫 剂 的 单一 部 位 (Zhang and Scott, 1994) ,因此 换 用 其 他 结构 的 杀 虫 剂 可 有 效 地 杀 死 害虫 。 某 些 杀 虫 剂 内 P450 SP 解毒 作用 需要 细胞 色素 bs(Dunkov et al. ,1997; Zhang and Scott, 1996) ,这 为 抗 性 的 治 理 提供 了 另 一 作用 划 标 。 不 同 于 酯 酶 介 导 的 抗 性 ,P450 超 量 表达 不 是 基因 扩 增 的 结果 。 不 能 排除 在 抗 性 品系 中 不 超 量 表达 的 P450 与 抗 性 有 关 ,因为 P450 氨基 酸 残 基 的 改变 可 能 导致 抗 性 。 丽 蝇 对 有 机 磷 杀 虫 剂 的 抗 性 ,已 被 证 明 是 编码 羧 酸 酯 酶 的 基因 的 一 个 氨基 酸 改变 的 结果 (New- comb et al . ,1997) 。 在 敏感 品系 中 该 酶 代谢 -乙酸 蔡 酯 而 不 是 有 机 磷 杀 虫 剂 , 抗 性 品系 含 该 酶 的 突变 体 , 它 不 再 代谢 oo -乙酸 葵 酯 ,但 有 效 地 代谢 有 机 磷 杀 虫 剂 (Newcomb et al .,1997)。 加 单 氧 酶 介 导 的 杀 虫 剂 代 谢 也 可 能 存在 这 种 机 制 , 现 在 已 知 仅 一 个 氨基 酸 变化 就 可 以 彻底 改变 一 个 P450 的 底 物 特异 性 (Lindberg and Negeshi,1989)。 因 此 , 仅 根 据 超 量 表达 这 一 现象 来 决定 某 一 P450 是 否 与 抗 性 有 关 是 不 正确 的 。 第 八 章 ,” 昆 虫 细 胞 色素 P450 及 其 功能 - 157 - 根据 已 有 的 研究 结果 ,P450 加 单 氧 酶 介 导 昆 虫 抗 性 的 可 能 机 制 包括 : 1)P450 的 超 量 表达 与 杀 虫 剂 抗 性 ”许多 研究 结果 表明 ,P450 相关 的 抗 性 昆虫 往往 表 现 出 某 种 P450 的 超 量 表达 ,感性 家 蝇 P450 6D1(P450lpr) 只 占 总 P450 的 7% ,而 对 拟 除虫菊 酯 抗 性 的 家 蝇 , 这 一 PASO 的 含量 上 升 为 总 含量 的 67% (Wheelock and Scott , 1990)。 异 源 表 达 的 CYP6A1 , CYP6D1 , CYP6A2 , CYP12A1 具有 对 杀 虫 剂 代谢 的 活 性 ,直接 证 明了 这 些 P450 的 超 量 表达 在 杀 虫 剂 抗 性 形成 中 起 作用 (Berge ,1998 ) 。 关于 P450 超 量 表达 的 遗传 基础 目前 了 解 得 还 不 够 全 面 ,调控 基因 的 变异 被 认为 是 P450 超 量 表达 的 主要 原因 。 有 机 磷 杀 虫 剂 抗 性 的 家 蝇 , 其 抗 性 与 2 号 染色 体 相 关 , 而 CYP6A1 则 位 于 5 号 染色 体 ; 与 家 蝇 拟 除虫菊 酯 抗 性 相关 的 CYP6D1 基因 位 于 1 号 染色 体 , 而 其 表达 则 受 位 于 2 号 染色 体 的 因子 调控 。 这 些 事实 说 明 , 抗 性 昆虫 P450 的 超 量 表 达 很 可 能 是 反 式 遗传 因子 作用 的 结果 (Berge et al. ,1998)。 这 一 因子 的 突变 使 在 感性 昆 虫 中 低 表 达 的 P450 ,在 抗 性 昆虫 中 表现 为 超 量 表达 (Berge et al. ,1998)。 对 果 蝇 的 CYP6A2 (Berge et al. ,1998),CYP6E2 (Berge et al. ,1998), CYP6A9 (Maitra et al., 1996) 基 因 ,棉铃 虫 的 CYP6B7 (Ranasinghe et al. ,1998) 的 研究 结果 表明 ,它们 的 超 量 表 达 也 受 反 式 因 子 的 调控 。 LPR 品系 家 蝇 对 拟 除 虫 菊 酯 的 抗 性 证 明 是 CYP6D1 超 量 表达 的 结果 ,通过 对 其 抗 性 的 遗传 分 析 表 明 ,这 种 抗 性 是 多 基因 的 ,CYP6D1 超 量 表达 同时 受 位 于 1 号 染色 体 上 的 完全 显 性 因子 ( 顺 式 ) 和 2 号 染色 体 的 不 完全 显 性 ( 反 式 ) 的 控制 (Liu and Scott, 1996). 用 20 -羟基 晓 皮 酮 (20HE) 处 理 Oregon 品系 果 蝇 ,其 抗 性 相关 的 细胞 色素 P450B 含 量 以 及 酶 系 的 活性 提高 , 当 抑制 晓 皮 酮 的 合成 时 CYP6A2 mRNA 含量 降低 。 这 一 现象 表 明 ,20HE 对 细胞 色素 P450 CYP6A2 的 超 量 表达 及 其 介 导 的 抗 性 具有 调控 作用 (Spiegel- man et al., ,1997)。 2) 氮 基 酸 替换 与 杀 虫 剂 抗 性 ”在 某 些 PBO 增 效 的 抗 性 品系 家 蝇 中 并 未 发 现 CYP6A1 mRNA 的 超 量 表达 ,推测 P450 介 导 的 抗 性 可 能 还 存在 其 他 抗 性 机 制 。 通 过 比较 果 蝇 的 不 同 抗 性 水 平 的 3 个 品系 的 CYP6B2 序列 ,发 现存 在 3 个 氨基 酸 替 换 (R355S, L336V, V476L) ,推测 这 3 个 氨基 酸 突 变 可 能 影响 CYP6A2 活性 中 心 位 点 。 异 源 表达 (下 .coii) 实 验证 明 , 这 些 突变 虽 未 改变 CYP6A2 对 摆 丸 激素 的 活性 , 却 增强 了 对 7- 乙 OC 氧 香 豆 素 (ethoxycoumarin) ,7 - 葵 酰 氧 基 香 豆 素 (benzoyloxycoumarin) ,特别 是 对 DDT 的 代谢 活性 , 认为 氨基 酸 蔡 换 也 可 能 与 昆虫 P450 介 导 的 抗 药性 有 关 (Berge et al., 1998 ) 。 3) P450 的 超 量 表达 和 和 氨基酸 替换 联合 作用 P450 的 超 量 表达 对 家 蝇 和 果 蝇 抗 药性 的 形成 具有 重要 作用 ,而 果 蝇 的 抗 药 性 有 可 能 是 CYP6A2 的 超 量 表 达 和 氨基酸 替 换 联 合作 用 的 结果 , 即 抗 性 昆虫 超 量 表 达 了 对 杀 虫 剂 具有 较 高 催化 效应 的 CYP6A2 等 位 基因 。 有 研究 表明 ,P450 的 超 量 表达 可 能 降低 昆虫 的 适合 度 ,因为 超 量 表达 的 P450 可 能 同 时 具有 对 内 源 性 的 激素 分 子 的 功能 。 而 氨基 酸 蔡 换 可 能 对 昆虫 的 适合 度 影响 较 小 ,因此 导致 抗 性 的 氨基 酸 替 换 一 旦 在 种 群 中 固定 下 来 ,将 可 能 促进 超 量 表 达 机 制 的 丧失 (Berge et al. ,1998 ) 。 - 158 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 8.3.2 昆虫 P450 的 生理 功能 人 们 对 昆虫 P450 酶 系 的 作用 侧重 于 它 在 外 源 物质 代谢 中 的 代谢 解毒 , 近 20 年 来 , 研 究 发 现 P450 酶 系 在 许多 内 源 性 的 生理 物质 的 代谢 中 起 重要 作用 。 8.3.2.1 保 幼 激素 (juvenile hormone,JH) 及 其 类 似 物 的 代谢 (1) 保 幼 激素 的 代谢 保 幼 激素 在 化 学 上 是 衍 于 倍 半 熙 烯 碳 链 的 环 氧 酸 甲 基 酯 (epoxy acid methyl ester) , 其 合成 和 释放 部 位 为 昆虫 的 咽 侧 体 。 它 们 在 昆虫 从 胚胎 到 成 虫 的 发 育 过 程 中 起 着 重要 作 用 。JH 合 成 受阻 ,昆虫 表现 为 幼虫 期 过 早 地 变态 和 成 虫 期 的 不 育 。 JH- 焉 ( 甲 基 - 10,11 - 环 氧 -3,7,11 -三 甲 基 - 反 , 反 -2,6 -十 二 碳 二 烯 酯 ) 合 成 的 最 后 一 个 酶 , 称 为 甲 基 法 呢 酸 酯 环 氧化 酶 (methyl farnesoate epoxidase) ,该 酶 的 P450 AS it FE RE % (Blaberus giganteus) 和 飞 蝗 (Locusta migratoria) 中 得 到 证 实 (Hammock,1975; Fey- ereisen et al. ,1981) 。Hammock(1975) 报 道 了 B. giganteus 甲 基 法 呢 酸 酯 环 氧 化 成 保 幼 WA Tl (THI ) 的 作用 受 咽 侧 体 匀 浆液 中 类 似 P450 的 酶 催化 的 ,随后 在 飞 蝗 的 研究 中 证 明 甲 基 法 呢 酸 酯 立体 选择 性 的 环 氧 化 作用 受 咽 侧 体 微 粒 体 P450 催化 (Feyereisen et al. , 1981). 家 蝇 JH- I (E,E-cis - 甲 基 - 10,11 - 环 氧 -7- 已 -3,7 -二 甲 基 - 2,6 -= 十 三 碳 二 烯 酸 酯 ) 环 氧化 成 其 二 环 氧化 物 (Hammock and Quistad,1981) 作 用 部 位 是 JHI 的 6-7 双 键 , 这 一 活性 依赖 于 NADPH, 可 被 CO 和 增 效 醚 抑制 , 受 葵 巴 比 妥 诱导 , 且 杀 虫 剂 抗 性 家 蝇 比 感性 家 蝇 活 性 高 。 这 些 特征 证 明 P450 参与 了 这 一 环 氧化 过 程 (Pratt et al., 1990). — 个 类 似 的 作用 在 果 蝇 中 也 发 现 (Ajami and Riddiford,1973)。 用 重组 的 大 鼠 肝 P450 酶 系 离 体 实验 进一步 证 实 了 细胞 色素 P450 参与 了 JHI 的 代谢 (Agosin et al. , 1979; Morella et al. , 1980). 近期 的 研究 发 现 了 一 种 新 的 P450 BY CYP4C1 ,该 基因 在 大 肠 杆菌 表达 后 经 纯化 和 活 性 重组 ,可 以 转化 为 包括 从 法 呢 醇 (farnesol) 到 JH- 亚 在 内 的 倍 半 桔 烯 类 似 物 (sesquiter- penoids) 各 自 的 12 -( 反 式 )- 羟 基 化 中 间 体 (Sutherland,1998)。 这 一 代谢 过 程 的 生理 功能 poe pad JH - 1 —AUky O O \ \ CH,O \ \ \ CH,O A A 甲 基 法 呢 酸 酯 JH -Il 图 8.7 保 幼 激素 的 代谢 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 。 159 , 还 不 清楚 ,但 从 它 的 时 序 表达 规律 预示 它 与 J 英 滴 度 的 迅速 下 降 有 关 ( 清 除 JH 的 可 能 前 体 ) ,或 者 它 的 表达 标志 着 咽 侧 体 的 功能 已 转变 成 产生 一 个 新 的 未 知 功能 的 羟基 - JH 相 关 的 分 子 。 从 飞 蝗 咽 侧 体 中 检测 出 12 -( 顺 式 )- 羟 基 -JH- 亚 (Darrouzet et al. ,1997) , 表 明 有 类 似 功 能 的 P450 可 能 在 许多 昆虫 中 存在 。 P450 BBA TE JH 相关 化 合 物 代 谢 中 的 作用 也 受到 关注 ,纯化 的 P450 CYP6A1 重组 实验 证 明 ,该 酶 具有 催化 多 种 蓝 类 代谢 的 功能 , 它 甚至 可 以 使 甲 基 法 呢 酸 酯 变 成 其 双环 氧 化 物 (Andersen et al. ,1997) ,而 后 者 是 环 氧 化 物 水 解 酶 的 底 物 ,由 此 再 进入 其 他 物质 代 谢 途 径 。 从 生殖 活跃 时 期 AACE HEPES ( Diploptera punctata ) 的 咽 侧 体 (CA)cDNA 文库 中 分 离 出 编码 细胞 色素 P450 的 EDNA, 定 名 为 CYP4C7。CYP4C7 选择 性 地 在 咽 侧 体 中 表 达 , 其 mRNA 不 存在 脂肪 体 或 脑 中 ,在 中 肠 、 盲 吉 (caeca) 中 适量 表达 。CYP4C7 mRNA 在 咽 侧 体 中 的 表达 是 在 JH 合成 高 峰 后 迅速 增加 ,至 第 7 天 达 最 高 ( 产 卵 前 )。 产 卵 后 和 生殖 期 间 降 低 。 用 大 肠 杆菌 表 达 的 CYP4C7 HAS AHR NADPH 细胞 色素 P450 还 原 酶 , 细胞 色素 bs LAR NADPH 构成 的 重组 体系 中 ,可 以 将 (2E,6E)- 法 呢 醇 羟基 化 为 (10E)- 12 FSFE WERE. CYP4C7 将 JH 亚 转化 成 la - 反 式 -羟基 JH- 开 ,对 其 他 类 似 的 倍 半 车 也 有 代谢 作用 。 倍 半 昔 的 -羟基 化 作用 可 能 在 生殖 滋养 周期 终结 时 抑制 JH 合成 中 起 作 FA. CYP4C7 55 Blaberas discoidalis CYP4C1 有 44.3% 相 同 ,与 果 蝇 D. melanogaster CYP4D1 34.9% , 与 Manduca sexta CYP4M2 有 34.9% HIRI]. (Sutherland et al. ,1998). (2) JH 类 似 物 的 代谢 JH 类 似 物 的 烷 基 3,7,11 -三 甲 基 - 2,4 -十 二 碳 二 烯 酸 酯 (dodecadienoate) 类 化 合 物 可 以 被 家 蜗 、 丽 蝇 ( Phormia regina ) FURKHR Sarcophaga bullata 微粒 体 氧 化 (Yu and Ter- riere,197Sa,1975b,1977a,1977b,1977c) 。 支 链 烷 基 类 似 物 (包括 控 虫 素 ) 的 产物 尚未 得 到 鉴定 ,但 无 支 链 类 型 (包括 增 丝 素 ) 的 氧化 产物 是 2,3 或 4,5 双 键 的 环 氧 化 物 。 这 种 酶 活性 在 抗 性 品系 昆虫 中 较 高 , 且 可 被 葵 巴 比 妥 诱导 。 由 了 酯 酶 作用 形成 的 酸 可 代谢 为 环 氧 化 物 (Yu and Terriere, 1977a) (图 8.8). Hammock 等 (1977) 证 明 家 蝇 幼 虫 和 成 虫 中 控 虫 RZ P450 氧化 酶 代谢 的 主要 产物 是 O - 脱 烷 基 作用 形成 的 羟基 酯 (hydroxy ester). (3) 抗 -JHs 物质 的 代谢 }\ #3 F-Et ( Ageratum houstonianum ) 中 提取 的 两 种 活性 成 分 ,可 以 使 敏感 昆虫 过 早 虹 皮 , 它 们 是 7- 甲 氧 - 2,2 -二 甲 基色 烯 和 6,7 -二 甲 氧 - 2,2 -二 甲 基色 烯 , 称 为 早熟 素 I 和 早熟 素 I (Bowers ,1981) ,它们 抑制 咽 侧 体 的 发 育 或 者 使 这 些 腺 体 过 量 坏死 而 破坏 JH 的 产生 。 经 早熟 素 处 理 的 敏感 昆虫 ,其 JH 水 平 下 降 ,导致 幼 虫 过 早 变态 以 及 卵巢 功能 的 消失 。 在 几 种 昆虫 中 发 现 早熟 素 - 开 的 中 间 物 (3,4 -二 氢 二 醇 ) ,提示 早熟 素 的 生理 作用 可 能 是 通过 这 中 间 体 的 环 氧化 物 进行 的 。 早 熟 素 的 这 种 环 氧化 物 作 用 是 由 微粒 体 P450 催 化 完成 (Ellis-Pratt ,1983) 。 早 熟 素 经 环 氧化 作用 形成 早熟 素 3,4 - 环 氧化 物 将 使 细胞 大 分 子 产 生 烷 基 化 作用 ,从 而 损伤 某 些 敏感 昆虫 的 咽 侧 体 (Feyereisen et al. , 1981; Ellis- Pratt,1983)。 通 常 认为 早熟 素 是 咽 侧 体 环 氧化 酶 (具有 JH 合成 功能 ) 的 底 物 ,但 还 需 更 多 的 证 据 。 。 160 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 控 虫 素 控 虫 素 - 4, 5 -氧化 物 0 | ijo7 | VAN A AN \ wi 增 丝 素 - 2 ,3- 氧化 物 酯 酶 sj 二 醇 酸 (diol acid) 8.8 JHA OH (i) Sa “P450 ox — Bie zB 图 8.9 BE Be el BY FRE HE, 8.3.2.2 MERSBHRA gi, F8z §S§ WE (ecdysteroids) 4: & FZ FE1E AY MASK ff BE (ketosteroids ) ,在 调节 昆虫 发 育 和 变 态 中 发 挥 着 重要 的 作用 。 在 昆虫 中 检测 出 的 省 醇 种 类 很 多 ,其 中 研究 得 最 多 的 是 锐 皮 酮 (ecdysone, a — Hi Az Bl) Al 20 -羟基 晓 皮 酮 (B — i 7 Bi], 20 - hydroxyecdysone) 。 昆 虫 的 前 第 八 章 “” 昆 虫 细 胞 色素 P450 及 其 功能 - 161° Fe RA) Whe le), (ELIS AP SS SSE Be oe oy a SE BE mE Be A, TT A RS 20 FEE WE 酮 的 前 体 。 (1) 瞩 皮 酮 前 体 的 生物 合成 从 胆固醇 到 虹 皮 酮 的 合成 是 由 多 步 酶 促 过 程 催化 的 ,在 前 胸腺 和 卵 梨 的 卵泡 细胞 ,由 胆固醇 ->7 -脱氧 胆固醇 (7 - dehydrocholoesterol ) $2 Si i E+E WS A AY FB — 46 (Ress, 1995) ,已 知 几 种 P450 具有 催化 烃 化 合 物 的 去 饱和 作用 而 不 形成 羟基 化 中 间 体 的 功能 , 因此 推断 P450 可 能 在 7 -脱氧 胆固醇 合成 中 起 作用 。 飞 蝗 幼虫 前 胸腺 和 上 峻 成 虫 卵 梨 的 卵 泡 细胞 有 细胞 色素 P450 在 Cz5\Cz> Cp 羟基 化 中 起 作用 已 得 到 充分 证 实 (Kappler et al., 1986;Kappler et al. , 1988), FRI SB SRR YS Bea P450 性 质 。 R85 SFHSREGBEMAKH AMER P450 脂肪 体 、 中 肠 ` 马 氏 管 .器官 芽 前 胸腺 卵泡 细胞 、 马 氏 管 、 脂 肪 体 中 肠 微粒 体 、 线 粒 体 线粒体 线粒体 线粒体 由 胆固醇 到 Cs 羟基 化 酶 底 物 (2,22,25 -三 脱氧 晓 皮 酮 ) 的 形成 ,也 有 可 能 由 P450 HE 化 ,但 至 今 尚 未 开展 其 酶 学 方面 的 研究 。 (2) BRM Zt KE St KAA 20 -加 单 氧化 酶 20 FERRE BC ARTE a — Ht HE EAT, GK A Nigg 等 (1974) 的 报道 a7 作用 是 依赖 于 NADPH 由 线粒体 酶 催化 的 (Nigg et al., 1976). FER RW BATA ( Schisto- cerca gregaria ) 中 发 现 一 类 似 的 酶 (Johnson and Rees,1977) ,通过 标志 酶 研究 ,该 酶 活性 存在 于 10kg 细胞 分 级 (主要 成 分 为 线粒体 ) ,在 微粒 体 中 也 可 检测 出 活性 ,但 其 比 活 力 比 线粒体 低 得 多 。 该 酶 活性 依赖 于 NADPH 和 分 子 氧 ,可 被 CO 抑制 ,这些 事实 积极 地 支持 了 了 P450 o Hi BZ AR a] BE Re Fe ot PER. Bait CO 抑制 作用 的 光 逆 转 现象 以 及 P450 抑制 剂 甲 吡 酮 (metyrapone) 的 抑制 作用 ,进一步 证 明了 P450 催化 o — BE Be A 向 B- 旷 皮 酮 的 转化 。Gilbert 及 其 同事 以 烟草 芽 天 蛾 ( Manduca sexta ) 的 研究 充分 证 明了 线粒体 细胞 色素 P450 系统 参与 — HE BE Al 1] B — HE BE A448 4 (Hodgson, 1985) 。 (8 o BE RFE A RIE HEAY B — He Be AY) P450 Bi AA A Ee 20 -加 单 氧 酶 ,该 酶 是 目前 研究 得 最 为 深入 的 一 种 酶 。 该 酶 在 多 种 昆虫 中 发 现 , 分 布 在 昆虫 的 不 同 组 织 ,主要 在 脂肪 体 、 中 肠 、 马 氏 管 ,而 在 分 记 晓 皮 酮 的 前 胸腺 中 尚未 发 现 。 有 趣 的 是 ,该 酶 存在 双 定位 现象 ,可 以 分 别 定 位 在 微粒 体 或 线粒体 中 ,也 可 以 同时 存在 于 这 两 亚 细 胞 分 级 中 , 随 种 类 、 组 织 和 实验 条 件 的 不 同 ,其 中 一 种 可 能 占 优势 。 如 飞 蝗 的 马 氏 管 (Feyereisen and Durst, 1978) ,太平 洋 扫 翅 归 (Diploptera punctata ) 中 肠 (Halliday et al. , 1986), KH HK (Pieris brassicae ) 的 器 官 芽 (imaginal disk) (Blais and Lafont,1986) ,微粒 体 酶 占 优 热 ; 而 沙 Ye HE ( Schistocerca gregaria ) 4 FR (Greenwood and Rees, 1984) ,烟草 天 蛾 (Smith et al., 1979) , 棉 贪 夜 蛾 ( Spodoptera littoralis ) 脂 肪 体 ,线粒体 酶 占 优 势 ; 烟 草 天 蛾 的 中 肠 ,2 个 细 胞 分 级 都 有 很 高 的 活性 (Weirich et 迟 . ,1985)。 因 此 ,有 人 提出 同 种 昆虫 可 能 不 止 一 个 基因 编码 具有 这 一 催化 活性 的 P450。 微 粒 体 酶 和 线粒体 酶 这 两 个 酶 系统 对 皮 酮 的 久 。 0.4um 1.5um - 162: 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 值 同 一 数量 级 ,但 其 他 生物 化 学 特征 不 同 , 这 就 难以 确定 哪 一 酶 系统 起 主导 作用 。 P450 酶 系 这 种 双 定 位 现象 是 不 寻常 的 ,因为 从 哺乳 动物 中 的 研究 结果 我 们 已 知 线 粒 体 与 微粒 体 P450 具有 不 同 的 电子 传递 途径 (分 别 由 皮质 铁 氧 还 蛋白 还 原 酶 /皮质 铁 氧 还 蛋白 与 NADPH 细胞 色素 P450 还 原 酶 ) 。 因 此 鉴定 线粒体 酶 和 微粒 体 的 酶 系统 的 电子 传递 途径 显得 十 分 必要 。 由 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 制备 的 抗体 可 以 降低 太平 洋 抛 翅 螃 中 的 微粒 体 晓 皮 酮 20 -加 单 氧 酶 的 活性 (Halliday et al. , 1986) ,但 在 线粒体 酶 没 - 有 类 似 的 实验 证 据 。 在 烟草 天 蛾 脂肪 体 、 线 粒 体 中 发 现存 在 铁 氧 还 (ferredoxin) 类 型 的 铁 硫 蛋 和 白 ,但 未 知 其 性 质 和 功能 (Smith et al., 1979). Srivatsan 等 (1990) 从 家 蝇 幼 虫 线 粒 体 分 级 中 纯化 了 6 种 细胞 色素 P450 ,它们 与 猪 肾 上 腺 皮质 铁 氧 还 蛋白 及 铁 氧 还 蛋白 还 原 酶 的 重组 体系 可 以 催化 晓 皮 酮 的 20 -羟基 化 。 (3) RRMAHHR-PRAUW 20 -羟基 晓 皮 酮 因 Ci5 的 进一步 羟基 化 形成 26 — tbe EZ AB it FEY (Lafont et al. ,1983), 起 始 步骤 Cz5 羟 基 化 作用 是 由 微粒 体 P450 催化 的 (Kayser,1997)。 随 后 继续 氧化 变 成 醛 和 羧 酸 ,这 可 能 还 是 多 功能 的 P450 进一步 氧化 作用 的 结果 。 此 外 ,其 他 种 类 的 P450 也 可 能 参与 这 些 反 应 。 有 实验 表明 Cz5 羟 基 化 酶 可 被 晓 皮 酮 和 非 省 醇 兴 奋 剂 (nonsteroodal agonist) RH- 5849 所 诱导 (Williams et al. ;1997) ,而 可 诱导 性 是 P450 的 一 个 特征 ,这 进 一 步 支持 Cz6 羟 基 化 酶 是 P450 的 推断 。 MRK ( Drosophila acanthoptera ) 分 离 的 P450 基因 CYP12B1 BA SARA wMAR 体 P450 高 度 的 区 域 (regional) 同 源 性 ,种 系 发 生 分 析 表 明 CYP12B1 与 哺乳 动物 线粒体 P450(CYP24 家 族 ) 亲 缘 关 系 最 近 ,CYP24 被 认为 通过 代谢 维生素 D3 在 钙 的 体内 稳 态 过 程 中 发 挥 重要 的 作用 。 从 同 源 P450 功能 是 保守 的 这 一 思路 出 发 ,根据 黄粉 虫 (Tereprio miolitor) 钙 结合 蛋白 及 其 调控 的 现 有 认识 ,推测 CYP12B1 的 作用 是 通过 20 -羟基 脱皮 酮 的 形成 或 降解 来 调节 钙 的 体内 稳 态 ,这 一 假设 还 需 证 实 (Danielson and Fogleman,1997)。 8.3.3 ”脂肪酸 代 谢 间 肪 酸 ( 如 月 桂 酸 ) 的 wm -=- 凑 基 化 作用 已 在 几 种 昆虫 中 如 飞 蝗 (Feyereisen and Durst, 1980) , ABB (Ronis et al. ,1988; Clarke et al. ,1989) 和 果 蝇 (Cuany et al. ,1990) 中 发 现 , 羟基 化 部 位 发 生 在 C2 和 Cy. ARB Crp WFLA MARRS 5 倍 ,家 蝇 微粒 体 与 大 BR. P450 CYP4A1( 具 月 桂 酸 羟基 化 作用 ) 的 抗体 间 不 存在 免疫 交叉 反应 (Clark et al., 1989)。 从 太平 洋 扫 翅 螃 脂肪 体 获得 了 CYP4C1 cDNA(Bradfield , 1991) ,该 基因 的 表 达 可 因 饥 狐 和 在 去 头 昆 虫 中 注入 hypertrehalosemic 激素 而 大 量 诱 导 。 通 过 类 比 兰 椎 动物 CYP4 家 族 P450 的 功能 ,Keeley 等 (1994) 提 出 CYP4C1 可 能 催化 脂肪 酸 w -羟基 化 作用 , 并 有 可 能 参与 酮 体 的 形成 。 哺 乳 动物 中 类 花生 四 烯 酸 的 代谢 ,在 昆虫 中 尚未 发 现 。 8.3.4 碳 氢 化 合 物 的 生物 合成 昆虫 表皮 含 大 量 的 碳 氢 化 合 物 ,Reed 等 (1994) 有 关 家 蝇 的 研究 为 碳 氢 化 合 物 的 生 物 合成 提供 了 重要 的 线索 。 长 碳 链 (18 - 28 碳 ) 酰 基辅 酶 A 酯 转化 为 烃 ,经 历 两 个 步骤 , 第 八 章 ”昆虫 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 163 + 首先 是 酰基 辅酶 A(acyL-CoA) 还 原 为 醛 ,随后 是 酰基 链 脱 去 一 个 碳 的 脱羧 基 作 用 。 在 家 蝇 表 皮 微 粒 体 , 第 二 步 反 应 依赖 于 分 子 所 和 NADPH, 并 且 被 CO 以 及 家 蝇 NADPH 细胞 色素 P450 还 原 酶 的 抗体 所 抑制 (Reed et al. ,1994) 。 在 反应 过 程 中 ,末端 羧基 以 CO, 形 式 出 现 ,并 未 检测 出 去 饱和 中 间 体 ,为 此 推测 出 这 一 氧化 脱羧 反应 是 由 具有 独特 性 质 的 P450(P45S0hvw) 催 化 完成 (Reed et al. ,1994;Reed et al. , 1995). 8.3.5 信息 激素 的 代谢 从 许多 信息 素 的 结构 就 使 人 们 想到 P450 可 能 在 其 生物 合成 ( 环 氧化 物 \ 醇 等 ) 或 分 解 代 谢 中 (去 饱和 ) 起 作用 (Brattsten,1979; Hunt and Smirle,1988; Fang et al. ,1995; White et al. , 1979), S47 HE 4K ( Lymantria dispar ) 信 息 素 (disparlure ) 和 黑 钻 孔 小 襄 (Dendroctonus terebrans ) 信 息 素 以 及 其 他 一 些 昆虫 的 信息 素 及 防御 化 合 物 所 具有 的 结构 显示 ,P450 在 从 起 始 合成 或 由 食物 中 植物 次 生物 质 的 中 间 物 合成 这 些 物 质 中 起 作用 。 雌性 家 蝇 性 信息 素 的 主要 成 分 是 (Z)- 9 Hh = els, EE P450 hyd 催化 作用 的 产物 。 而 (Z)- 9 - 廿 三 碳 烯 的 进一步 代谢 由 表皮 微粒 体 的 一 个 更 典型 的 P450 酶 所 催化 ,产物 是 (z)- 9,10 - 环 氧 廿 三 碳 烷 和 (Z)- 14 - 廿 三 碳 - 10 - 酮 (Ahmad er al. ,1987)。 该 酶 进攻 链 内 距 末端 第 9 个 碳 原子 ,产物 可 能 是 双 键 的 环 氧化 或 是 甲 又 基 的 羟基 化 。 经 羟基 化 的 产 物 ( 醇 ) 可 以 进一步 生成 酮 (Ahamad et al. ,1987)。 该 酶 在 表皮 和 脂肪 体 存 在 ,但 其 最 高 比 活力 表达 在 雄性 触角 (antennae) (Ahamad et al. ,1987) ,显示 该 特异 性 酶 参与 信息 素 的 分 解 代谢 。 在 信息 素 代谢 中 起 作用 的 P450 中 的 许多 种 类 具有 高 度 的 特异 性 ,如 黑 钻 孔 小 过 信 息 素 ( 类 车 信息 素 ) 是 由 食物 中 的 aes (pinene) 产 生 , 其 中 u- 菠 烯 一 au Ie AD 转化 是 激素 产生 的 起 始 步骤 ,由 该 虫 的 微粒 体 酶 催化 。 该 微粒 体制 备 液 表现 出 对 — Phe 非常 高 的 特异 性 [5.07nmol/( 产 物 . nmol P450.min)]。 与 之 对 比 ,大 鼠 肝 微粒 体 未 经 诱 导 该 值 仅 为 0.07, 经 a - 菠 烯 诱导 的 大 鼠 肝 微粒 体 也 只 有 0.12 (White et al., 1979). HT 预见 ,对 该 类 P450 选择 抑制 剂 的 设计 将 有 较 好 的 应 用 前 景 (Feyereisen,1999) 。 分 异 发 丽 金龟 ( Phyllopertha diversa ) 利 用 一 种 特殊 的 生物 碱 1,3 -二 甲 基 - 2,4 - (1H, 3H)-E ME mK — fe] [1,3 - dimethyl-2,4-(1H,3H)- quinazolinedione] ,作为 它 的 性 信 息 素 , 这 个 咖啡 因 类 型 的 化 合 物 可 被 该 虫 触 角 和 蛋白 降 解 。 主 要 的 分 解 途径 为 N- 1 位 置 ee 8.10)。 起 作用 的 酶 与 膜 结合 , 需 NADPHL | Trias bad vi. Thue, mama ie Eee H Pe x 图 8.10 4>S¢ ACHE FH ( Phyllopertha diversa ) 性 信息 素 的 降解 164 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 且 对 P450 的 抑制 剂 ( 如 proadifen 及 甲 吡 酮 ) 敏 感 ,被 认为 是 P450。 比 较 12 种 昆虫 ,包括 亲缘 关系 很 近 的 金龟 子 以 及 一 些 模型 鳞 翅 目 昆虫 , RMR AAD WW Sf ( Popillia japonica ) 有 相似 的 酶 活性 外 ,其 他 昆虫 均 未 检测 到 这 种 活性 。 说 明 该 酶 系统 特异 性 地 在 雄性 金龟 子 触角 中 表达 ,作为 嗅觉 信号 降解 的 机 制 。 用 结构 类 似 的 化 合 物 一 一 咖啡 因 测定 发 现 , 该 金色 子 触角 酶 系统 可 以 降解 咖啡 因 , FE 要 形成 茶 碱 ,但 其 速率 比 信息 素 低 1 个 数量 级 。 表 明 该 酶 系统 具有 较 强 的 底 物 特异 性 。 在 黄 猩 猩 果 蝇 的 触角 中 检测 出 活性 高 的 NADPH -细胞 色素 还 原 酶 ,因而 推定 该 昆虫 的 P450 酶 系 在 气味 清除 过 程 中 起 作用 (Wojtasek and Leal, 1999). 参考 文 mw SRE EAS KA. 1999. 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AHF ARR, THD ARO 料 上 都 有 霉菌 的 存在 。 真 菌 对 不 同 碳 和 和 氮 源 代谢 的 能 力 是 它们 生存 的 条 件 。 真 菌 可 以 通 过 产生 于 细胞 外 和 细胞 内 的 有 关 酶 来 降解 复杂 生物 多 聚 体 。 此 外 ,真菌 还 可 以 分 泌 不 同 类 型 的 初级 和 次 级 代谢 物 ( 如 抗生素 ) 以 催化 许多 不 同 结构 的 复杂 化 合 物 如 环 芳烃 和 省 醇 化 合 物 的 羟基 化 。 生 物化 学 证 据 表明 ,这些 生物 转化 反应 通常 是 P450 酶 系 介 导 的 ,P450 介 导 的 转化 步骤 是 许多 特异 性 真菌 生物 转化 作用 的 一 部 分 。 遗憾 的 是 ,认为 P450 酶 参与 某 些 反 应 通常 是 基于 一 些 非 结论 性 的 试验 ,如 根据 对 NADPH 的 依赖 性 以 及 P450 抑制 剂 的 抑制 作用 。 研 究 得 最 深入 的 反应 是 多 环 芳烃 如 茶 并 花 的 降解 、 省 醇 ( 如 黄体 酮 ,羊毛 当 醇 ) 的 生物 转化 和 长 链 烷 烃 的 同化 。 9.1.1 真菌 细胞 色素 P450 的 催化 反应 9.1.1.1 多 环 芳烃 和 生物 转化 多 环 芳烃 (PAH) 由 3 个 或 3 个 以 上 的 芳香 环 组 成 ,不 易 被 微生物 降解 ,被 认为 是 环境 污染 治理 的 难题 。 有 些 PAH, 如 葵 并 花 已 知 是 强 的 致癌 物 (Pelkonen and Nebert, 1982). 不 同 的 霉菌 如 美丽 小 克 银 汉 霉 ( Cunninghamella elegans ) , 班 尼 小 克 银 汉 霉 (C. bainieri ) , 深 黄 被 孢 霉 ( Mortierella isabellina ) 22 ABA ( Beauveria bassiana ) 具 有 羟基 化 一 种 或 多 种 PAH 的 能 力 (Sutherland,1992; Cerniglia et al. ,1983,1992;Cerniglia, 1984; Griffiths et al. ,1991,1993;Holland et al. ,1987,1994; Holland,1992)。 从 石油 污染 的 地 Kare hie SHR, A RAR EE (Penicillium janthinellum ) 具 有 很 高 的 降解 HERD RARE (Launen et al. ,1995)。 从 腐生 和 植物 病原 担子 菌 中 也 筛选 出 具有 强 的 MERLE RET AY ELA Crinipellis stiparia (Wunder et al. ,1994;Lambert et al. ,1994; Lange et al. ,1994). 9.1.1.2 省 酵 分 子 的 生物 转化 另 一 类 深入 研究 的 生物 转化 是 药 用 省 醇 ,特别 是 孕 省 酮 的 立体 特异 性 羟基 化 作用 (Mahato and Majumdar,1993) 。 已 知 具 有 省 醇 羟基 化 作用 的 真菌 见 下 表 , 省 醇 不 同 部 位 的 羟基 化 可 以 由 不 同 种 类 的 真菌 来 完成 (Vitas et al. ,1995;Rozman and Komel, 1992) (图 9.1, % 9.1). 在 一 些 真菌 中 ,P450 酶 实际 参与 孕 省 酮 位 点 特异 性 的 羟基 化 作用 已 有 报道 ,如 美丽 小 克 银 汉 霉 (C. elegans )(Dlugonski et al. ,1991)、 拟 青 霉 ( Paecilomyces lilacinus ) (Vitas 第 九 章 ”微生物 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 * 173 - 21 CH; 图 9.1 真菌 孕 省 酮 的 羟基 化 ,箭头 表明 不 同 真菌 羟基 化 作用 的 位 点 etal. , 1995), % 4 #8 & ( Rhizopus nigricans ) (Breskvar et al . ,1991)。Ahmed et al. (1995) 通过 从 布 拉 氏 须 霉 ( Phycomyces blakesleeanus ) 中 纯化 出 孕 当 酮 羟基 化 作用 的 酶 , 再 重组 酶 系 ,证 明了 细胞 色素 P450 在 这 一 生物 转化 中 的 作用 。Breskvar et al. (1991) 从 黑色 根 霉 中 克隆 了 省 醇 羟基 化 酶 的 部 分 序列 。 表 9.1 不 同 真菌 的 省 酵 羟 基 化 作用 部 位 羟基 化 作用 部 位 |‖ 真菌 羟基 化 作用 部 位 梨 形 毛 霉 Mucor piriformis 140 -羟基 化 布 拉 氏 须 霉 Phycomyces blakesleeanus Ta- 羟基 化 wa HHS Aspergillus ochraceus 葡萄 座 腔 菌 Botryosphaeria obtusa 旋 孢 霉 Cochliopolus lunatus 细胞 色素 P450 介 导 的 省 醇 的 是 酵母 的 羊毛 省 醇 14a - 脱 甲 基 作 用 以 及 霉菌 的 齿 孔 醇 (eburicol) 14a - 脱 甲 基 作 用 。 产 物 是 麦角 省 醇 (ergosterol) ,其 结构 与 哺乳 动物 的 胆固醇 类 似 , 具 有 保持 膜 的 流动 性 的 功能 ,也 为 完成 细胞 周期 所 必须 的 (Vanden Bossche,1990)。 许多 农业 和 药理 上 重要 的 杀菌 剂 的 作用 机 制 是 抑制 该 酶 的 活性 (Vanden Bossche, 1990; Kapteyn et al. ,1992 ) 。 9.1.1.3 烷烃 生物 转化 (alkane bioconversion) 一 些 假 丝 酵 母 属 ( Candida ) 真 菌 的 P450 可 以 催化 烷烃 的 同化 或 降解 ,如 麦 牙 糖 假 丝 酵母 (Candida maltosa ) ,热带 假 丝 酵母 (C. tropicalis) 及 (C.azpicora )。 这 些 转化 作用 包括 n -烷烃 的 末端 羟基 化 和 脂肪 酸 的 。 -羟基 化 作用 ,参与 这 些 反应 的 P450 是 烷烃 可 诱导 的 细胞 色素 P450 (Scheller et al. ,1996)。 在 其 他 真菌 也 发 现 类 似 的 生物 转化 反应 (Van Dyk er al. ,1994) 。 一 些 酶 的 对 应 基因 已 被 克隆 ( 表 9.2)。 9.1.1.4 其 他 paso 介 导 的 真菌 生物 转化 真菌 一 些 其 他 的 生物 转化 作用 也 是 由 P450 催化 的 ,包括 更 豆 素 (pisatin) 脱 甲 基 作 用 (如 丛 赤 壳 菌 Nectria haematococca ) (Weltring et al. ,1988) , 葵 甲 酸 酯 的 对 -羟基 化 作用 (如 黑色 曲霉 Aspergillws niger )(Van Gorcom et al. ,1990;Boschloo et al. ,1990) 以 及 NO JR (RRR Fusarium oxysporum ) (Shoun and Tanimoto,1991)。 一 个 特殊 的 细胞 色 素 P450 (P450 foxy) 参与 脂肪 酸 w-1,0- 3 羟基 化 ,该 P450 BMAF PS, 和 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 融合 蛋白 ,包括 类 似 细 胞 色素 P450 的 结构 域 和 类 似 细胞 色素 P450 还 原 酶 的 结构 域 , 因 此 ,不 再 需要 细胞 色素 P450 还 原 酶 作 电子 供 体 (Nakayama et al. ,1996)。 类 似 的 蛋白 (可 溶性 脂肪 酸 羟 化 酶 P450 BM3 ) 在 巨大 芽孢 杆菌 (Bacillus megaterium ) 中 也 发 现 (Narhi and Fulco, 1986). P450 foxy 与 P450 BM3 都 有 很 高 的 转换 速率 ,这 是 因为 它们 的 电子 供 体 结构 域 和 P450 结构 域 紧 密 联 结 。 ORL. 2 真菌 P450 基因 生物 化 学 技术 鉴定 真菌 细胞 色素 P450 BRAS P450 纯化 困难 的 严重 阻碍 ,因此 克隆 P450 蛋白 的 对 应 基因 有 助 于 真菌 P450 的 研究 。 所 有 已 分 离 的 真菌 细胞 色素 P450 基因 都 归 在 51 - 66 家 族 (Nelson et al. ,1996)( 表 9.2)。 表 9.2 真菌 细胞 色素 P450 基因 CYP51 CYP52A3 CYP52A4 CYP5S2A5 CYPS5S2A9 CYP52A10 CYPS2A11 CYP52C2 CYPS52D1 CYPS2A1 CYP52A2 CYP52A6 CYP52A7 CYP52A8 CYP52B1 CYP52C1 CYPS52E1 CYP52E2 CYP53A1 CYP53B1 CYP54 EKAIBS Penicilloum italicum 啤酒 糖 酵母 Saccharomyces cerevisia 白色 假 丝 酵母 Candida albicans Candida glabrata tS RL MEE Candida guilliermondii UDF RARE Candida parapsilosis BUHT LZ ERE Candida tropicalis 克 普 斯 氏 假 丝 酵母 Cordicda krusei ERB BH Ustilago maydis SEY AU BBE AE Schizosaccharomyces pombe 马克 斯 克 谱 维 氏 酵母 Kluyveromyces marxianus BFA Candida maltosa . maltosa . maltosa . maltosa . maltosa . maltosa . maltosa . maltosa . tropicalis . tropicalis . tropicalis . tropicalis . tropicalis . tropicalis C. apicola C. apicola 4, qh Aspergillus niger 小 红 酵 母 Rhodotorula minuta # AAPA Beauveria bassiana 粗糙 链 孢 菌 Neurospora crassa 功能 (俗名 ) 齿 孔 醇 / 学 毛 肖 醇 140 - 脱 甲 基 (14DMD) n -烷烃 同化 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 n -烷烃 同化 葵 甲 酸 对 - 羟 化 酶 (BPH) 葵 甲 酸 对 - 羟 化 酶 , 异 丁 类 转化 苯 甲 酸 对 - 羟 化 酶 未 知 BILE ”微生物 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 175: 续 表 功能 (俗名 ) NO 还 原 , 可 溶性 ,(P450norA,P450norB) NO 还 原 ,线粒体 (P450norl ) Ae PRT Fusarium oxysporum Cylindrokarpon tonkinense CYP55A3 Cylindrokarpon tonkinense NO 还 原 , 可 溶性 (P450nor2 ) CYP56 S. cerevisiae 二 酷 氮 酸 形成 (DIT2) CYP57A1 Nectria haematoucca T9 Di DF Mie A E/E AA (PDA) CYPS7A2 Nectria haematowcca CYP59 Aspergillus nidulans 柄 曲霉 素 生物 合成 (stosverA) CYP58 拟 分 枝 孢 镰 孢 Fusarium sporotrichioides Trichothecene 生物 合成 (Tri4) CYP60A1 Aspergillus parasiticus Ordl,O- 甲 基 柄 曲霉 素 ~~ 黄 曲霉 毒素 CYP60A2 构 巢 曲霉 Aspergillus nidulans 柄 曲霉 素 生物 合成 (stc F) CYP60B Aspergillus nidulans 柄 曲霉 素 生物 合成 (stc L) CYP61 Saccharomyces cerevisiae (HM A22 -去 饱和 酶 ,麦角 当 醇 生物 合成 (erg 5) CYP62 Aspergillus . nidulans 柄 曲霉 素 生物 合成 (stc B) CYP63 Phanerochaete . chrysosporium 未 知 CYP64 Bf HHAE Aspergillus flavus Ordl, fi] CYP60A1 CYP65 F. sporotrichioides Trichothecene 生物 合成 (tri 11) WLR Agaricus bisporus 受 生 长 发 育 调节 的 基因 ,类似 CYP 64 编码 齿 孔 醇 或 羊毛 当 醇 14c - 脱 甲 基 酶 (EDM,CYP51 或 P450i4pM) 的 CYPS1 家 族 基 因 是 研究 得 最 清楚 的 真菌 P450 KARAS. BE 14a - 脱 甲 基 酶 是 麦角 人 省 醇 生物 合成 途径 的 限 速 酶 ,编码 CYPS1 的 P450 基因 已 从 一 些 生物 ,如 啤酒 酵母 (S. cerevisiae) , 意 大 Al #5 2 ( Penicillium italicum ) , 票 啤酒 糖 酵母 ( Schizosaccharomyces pombe ) Fl 3 Ae A BY Fl ( Ustilago maydis ) 中 克隆 出 ,许多 吡咯 杀菌 剂 是 针对 这 种 P450 酶 ,因此 CYPS1 及 其 基 因 也 是 农业 研究 中 诱 人 的 主题 (Vanden Bossche,1990)。 最 近 因 免疫 缺陷 (immuno-defi- ciency) 疾 病 的 病人 增多 ,所 以 140 - 脱 甲 基 酶 抑制 剂 (DMIs) 更 加 引起 人 们 的 兴趣 。 真 菌 侵 染 (特别 是 假 丝 酵母 Candida 和 曲霉 Aspergi2i ) 引 起 的 这 类 疾病 难以 用 现 有 的 杀菌 剂 治疗 。 运 用 分 子 遗 传 学 的 方法 已 在 许多 这 类 真菌 中 分 离 了 CYP51 基因 (Morace et al., 1997;Geber et al. ,1995)。 参 与 麦角 省 醇 生物 合成 途径 的 第 二 个 细胞 色素 P450 编码 基 因 已 在 啤酒 酵母 中 发 现 (Skaggs et al. ,1996 ) ,这 个 erg5 基因 (CYP61) 编 码 省 醇 人 22 - 脱 饱和 酶 (desatarose) ,该 基因 与 哺乳 动物 细胞 色素 P450 有 明显 的 同 源 性 (homology) ,而 与 P45014pM 同 源 性 有 限 。 CYP52 是 个 大 的 基因 家 族 ,至 少 包括 8 个 参与 n -烷烃 同化 的 基因 已 从 一 些 假 丝 酵 母 种 类 中 鉴定 出 。 各 基因 的 底 物 特异 性 不 同 ,使 生物 体 具 有 修饰 许多 不 同 ” -烷烃 的 能 力 (Seghezzi et al. ,1992 ,1991; Schelleret al. ,1996 ) 。 参与 PAH 羟基 化 作用 的 全 长 P450 基因 尚未 见报 道 , 但 参与 较 小 的 芳 环 化 合 物 羟 基 化 的 P450 基因 已 被 分 离 , 从 A. niger (bphA,Cyp53)(Van Gorcom et al. ,1990) 中 分 离 了 编码 葵 甲 酸 酯 对 -羟基 化 酶 ,从 小 红 酵 母 (Rhodotorula minuta )(Fukuda et al. ,1994) FZ 白 僵 菌 ( Beauveria bassiana ) 中 克隆 了 同 源 的 CYP53 HA, L - 葵 丙 氨 酸 可 诱导 小 红 酵 母 的 CYP53 ,该 P450 可 以 转化 苯 甲 酸 酯 -对 -羟基 葵 甲 酸 酯 以 及 催化 异 戊 酸 -一 异 丁 烯 “176 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 (Fukuda et al. ,1994) ,但 CYPS3 体内 作用 现在 还 不 清楚 。 参与 NO 还 原 的 异常 细胞 色素 P450 AEA ( CYPSS) MABE PE BE TE ( Kizawz et al . ,1991)。 它 与 其 他 真 核 细胞 细胞 色素 P450 不 同 ,其 编码 酶 P450nor 是 可 溶性 的 , 依 赖 于 NADH( 而 非 NADPH) ,存在 于 细胞 质 中 (而 非 内 质 网 ), 且 不 同 于 其 他 所 有 真菌 P450 酶 ,P450nor 不 依赖 电子 供 体 酶 发 挥 其 催化 功能 (Kizawa et al. ,1991; Nakahara et al. ,1993)。 现 在 有 2 个 P450nor 同 工 酶 存在 ,一 个 位 于 细胞 质 中 ,一 个 推定 在 线粒体 中 。 这 两 个 同 工 酶 被 认为 由 相同 基因 编码 ,通过 差别 N -末端 加 工 形成 (Nakahara and Shoun, 1996) 。 另 一 个 类 似 的 系统 发 现 于 反 硝 化 真菌 (Cyiizdrokarzpon tonkinense ) 中 , 5 RHF 孢 由 一 个 基因 编码 两 个 蛋白 有 所 不 同 , 它 有 两 个 独立 的 CYP55 基因 ,不 同 基因 编码 的 蛋 白 对 NADPH 或 NADH 作 电 子供 体 的 选择 性 不 同 。 这 一 结果 表明 , C. tonkinense 的 CYP55 同 工 酶 ,不 同 于 其 他 的 细胞 色素 P450, 各 有 自己 的 NADPH 和 NADH 的 结合 部 位 (Kudo et al. ,1996). 一 些 参与 植物 致 病 的 真菌 也 表达 P450 BH. Aare) BER A A BE (PDM) EHS 一 个 发 表 的 例子 [更 豆 ( Pisum sativum 工 . ) 的 病原 菌 ]。 更 豆 素 是 由 植物 分 记 作 为 抗 微 生 物 剂 , PDM Boe FH ASB EVE A (Van Etten et al. ,1989) 。 编 码 PDM 的 基因 (zza , CYP57) 已 从 高 致 病 性 的 PDA-T9 和 从 不 致 病 性 的 PDA6 - 1 N. haematococca 株 中 分 离 的 (Weltring et al. ,1988;Maloney and Van Etten ,1994;Reimmann and Van Etten, 1994). PDA-T9 pda 基因 可 被 竞 豆 素 诱导 ,诱导 由 存在 于 PDA-T9zpaa 基因 的 转录 调制 区 的 35 - bp DNA 元 件 (青豆 素 响应 元 件 ) 介 导 (Straney and Van Etten,1994) 。 在 不 致 病 性 PDA6-1 真菌 中 导 和 人 PDA-T9 基因 ,PDA6-1 获得 了 快速 解毒 殉 豆 素 的 能 力 (Schager et al. ,1989; Weltring et al. ,1988)。 在 PDA-N. haematococca 菌株 中 导入 PDA-T9 基因 ,所 有 的 转化 KAMER SADR (AWA 173 的 受 体 菌 表现 出 明显 提高 对 豌豆 的 侵 和 人 性 , 且 所 有 的 受 体 菌 其 侵入 性 都 不 如 PDA- 菌株 (如 PDA-T9) 高 。 这 个 结果 表明 PDA 对 于 病菌 的 侵 和 人 性 是 重要 的 ,但 不 是 惟一 的 (Ciuffetti and Van Etten, 1996). 与 植物 致 病 有 关 的 另 两 个 细胞 色素 P450 ERC NMDA Re (Fusarium sbporotrichioides ) 中 分 离 出 。 在 这 种 菌 中 ,侵入 性 增强 需 先 产生 倍 半 桔 tri- chothecene (Desjardins et al. ,1992 ) trichothecene 生物 合成 途径 的 基因 以 基因 簇 的 方式 存在 (Hohn et al. ,1993) ,其 中 两 个 是 属于 细胞 色素 P450, 即 Tri4 (CYP58 ,Hohn et al. , 1995) 和 Tri 11. 与 毒素 产生 有 关 的 P450 已 在 产生 黄 曲霉 毒 素 (aflatoxinogenic) 的 真菌 如 寄生 曲霉 ( Aspergillus parasiticus ) 和 黄色 曲霉 (A. flavus ) 中 发 现 (Keller and Hohn,1997)。 非 产 黄 曲霉 毒素 的 构 梨 曲霉 (A. miduwlaxs ) , 除 缺 少 由 柄 曲霉 素 转化 为 黄 曲 霉 毒素 所 需 的 基因 外 ,具有 完全 的 合成 黄 曲霉 毒 素 前 体 柄 曲霉 素 的 所 有 酶 。 与 trichothecene 生物 合成 途径 相似 ,编码 构 策 曲霉 柄 曲霉 素 生物 合成 的 酶 位 于 一 个 基因 簇 上 。 此 基因 簇 包 含 25 个 开放 读 框 (stcA-stcX 以 及 aflIR), 其 中 4 个 基因 stcB (CYP62 ),stcF ( CYP60A2 ) stcL (CYP60B ) 和 stcS (CYPS9 ) 是 细胞 色素 P4$0(Brown et al. ,1996;Keller et al. ,1995 )。 黄 曲霉 毒素 合成 的 最 后 一 步 即 转化 柄 曲霉 素 为 黄 曲 霉 毒 素 的 P450 基因 ,已 从 产生 黄 曲 霉 毒素 的 寄生 曲霉 (CYP60A1) 和 A. javus(CYP64) 中 分 离 出 。 FREE TE (Neurospora crassa ) 获 得 唯一 一 个 P450 基因 CYP54 。 这 个 基因 的 表 第 九 章 “” 微 生物 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 177° 达 可 被 放 线 菌 酮 (cycloheximide) 诱 导 ,但 其 功能 还 不 清楚 (Attar et al. 1990)。 从 两 个 无 隔 担子 菌 ( homobasidiomycetous , Phanerochaete chrysosporium 和 双 孢 蘑菇 (Agaricus bis- zorus ) 中 发 现 另 两 个 P450 序列 , 即 CYP63,CYP66. 啤酒 糖 酵母 基因 组 的 全 序列 已 测 出 。 这 一 生物 体 P450 基因 的 种 类 很 少 ,包括 编码 SRF 140 - 脱 甲 基 酶 的 CYP51 基因 以 及 参与 合成 二 酷 氨 酸 的 dzt2 EA, —BAREY 母 芽 孢 壁 表 面 层 的 重要 化 合 物 。 另 外 , 啤酒 糖 酵 母 中 的 省 醇 A”- 去 饱和 酶 (erg 5, CYP61 ;Skaggs et al. ,1996) 已 被 鉴定 是 P450。 很 明显 ,酿酒 酵母 所 有 P450 基因 参与 管 家 (housekeeping) 活 性 ,而 在 酵母 中 未 发 现存 在 于 其 他 真 核 生物 的 参与 许多 非 必 需 的 解毒 反应 或 复杂 次 生性 物质 合成 的 P450 基因 。 9.1.3 真菌 细胞 色素 P450 酶 系 的 调控 如 同 哺乳 动物 一 样 ,许多 真菌 的 细胞 色素 P450 可 被 底 物 诱导 。P450 的 活性 依赖 于 电子 供 体 蛋白 即 P450 还 原 酶 (CPR) 的 活性 ,CPR 的 表达 水 平 应 与 不 同 P450 的 表达 水 平 相 适 应 。P450 与 CPR 的 共同 调控 已 有 报道 ,以 Aspergillus ochraceus 为 例 , 孕 酮 可 以 诱 导 细 胞 色素 P450 介 导 的 孕 酮 1la - 羟 化 酶 活性 ,是 P450 活性 以 及 CPR 活性 诱导 的 结果 (Ghosh et al. ,1983)。P450 与 CPR 活性 共 调 节 的 现象 在 其 他 几 种 真菌 P450 系统 中 也 发 现 (Baillie,1993;Bhatagnar et al. ,1982;Dutta et al. ,1983) ,表明 P450 与 CPR 的 共 调 节 是 真菌 的 共同 特征 。 Cyp52 在 C. maltosa 中 的 表达 可 能 被 ”- 烷 烃 诱导 (Ohkuma et al. ,1995; Sutter et al. ,1990)。 将 CPR 启动 子 与 Kluyveromyces lactis 报告 基因 Lac 融合 形成 的 结构 转化 到 C.maltosa 菌株 ,发 现 CPR 活性 的 调控 是 在 转录 水 平 (Ohkuma et al. , 1995; Sutter et al. ,1990)。 这 些 结果 清楚 地 表明 Candida 存在 转录 调控 机 制 ,导致 CPR 和 CYP52 表达 水 平 的 共 调 控 。A . niger 细胞 色素 P450 参与 葵 甲 酸 代谢 ,其 P450 基因 bphA 和 P450 还 原 酶 基因 CPRA 可 被 底 物 葵 甲 酸 所 诱导 ,ppjhA AlcprA mRNA 的 诱导 分 别 大 于 100 FA 小 于 20 倍 (Van den Brink er al. ,1995;Van den Brink et al. ,1998)。 但 cprA 和 bphA mRNA 水 平 的 增加 并 不 伴随 CPR 和 BPH 活性 水 平 的 增加 (Van Gorcom et al. , 1990; Van den Brink et al. ,1995 ,1996a; Van den Brink et al. ,1998)。 将 bphA 和 czxrA 启动 子 分 别 与 编码 报告 基因 LacZ 的 半 乳 糖苷 酶 (galactosidase) 以 及 编码 报告 基因 uidA 的 葡 糖 苷 酸 酶 (glucuronidase) 融 合 ,研究 发 现 报告 基因 mRNA 水 平 被 诱导 超过 20 倍 ,但 报告 酶 的 活性 仅 诱 导 3~5 倍 (Van den Brink et al. ,1998)。 且 经 葵 甲 酸 诱 导 后 ,大 多 数 cprA 的 转录 物 分 子 更 大 。 这 些 数据 表明 , 除 转录 调节 外 ,也 存在 转录 后 调节 机 制 。 研究 得 最 清楚 的 真菌 P450 是 pda 基因 (N. haematococca ) ,这 个 基因 可 被 其 底 物 珊 豆 素 高 度 诱导 。 启 动 子 缺失 研究 (Ruan and Straney, 1996) 以 及 电泳 分 析 实 验 (Straney and Van Etten,1994; He et al. ,1996) 揭 示 诱 导 作 用 是 由 pda 基因 启动 子 区 的 一 段 35 - bp 长 的 DNA 序 列 ( 称 静 豆 素 响应 元 件 ) 起 作用 。 在 霉菌 中 特定 P450 酶 系 的 底 物 诱导 作用 可 能 并 非 是 普遍 的 特征 。 用 P450 的 通用 诱导 剂 葵 巴 比 妥 处 理 A. ochraceus Fl A. parasiticus 的 菌 丝 体 ,可 使 CPR 活性 以 及 茶 并 EE eR ESS I 3 一 $ 倍 (Ghosh et al. ,1983;Bhatnagar et al. ,1982)。 但 葵 巴 比 妥 或 - 178 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 ARF LE Ab FEIN ln] Aspergillus fumigatus 的 CPR 活性 (Baillie,1993) ,也 不 影响 A. niger CPR mRNA 含量 (Van den Brink et al. ,1995)。 oF SUN OS 真菌 P450 参与 许多 生物 转化 过 程 ,包括 解毒 反应 以 及 初级 和 次 级 代谢 物 的 产生 。 P450 活性 可 以 通过 同时 扩 增 P450 和 CPR 基因 的 拷贝 数 而 得 到 提高 ,这 种 P450 超 量 表 达 体 系 可 以 在 生物 除 污 以 及 当 醇 生产 各 方面 得 到 应 用 。 另 外 ,可 用 作 哺 乳 动物 P450 酶 对 药物 代谢 研究 的 有 效 手 段 。 真 菌 P450 表达 调控 机 制 的 了 解 有 助 于 对 P450 酶 系 普 遍 机 制 的 深入 认识 ,也 可 为 生物 技术 提供 有 价值 的 信息 。 9.2 细菌 细胞 色素 P450 第 一 个 检测 出 的 细菌 P450 来 自 固氮 微生物 Bradyrhizobium japonicum 的 假 菌 体 (bacterioids)(Appleby,1967) 。 编 码 3 个 P450 和 1 4+ P450 假 基因 的 基因 簇 已 被 克隆 ,其 中 的 两 个 P450 酶 已 被 纯化 ,但 未 发 现 它们 具有 氮 固 定 的 作用 (Tully and Keister,1993)。 放 线 菌 (actinomycetes) 具 有 不 同 的 生物 型 ,可 表达 许多 宽 底 物 特异 性 的 酶 ,这 可 能 是 它们 在 不 利 环境 条 件 下 生存 的 重要 内 容 , 因 为 它们 必须 依赖 不 同 的 氮 源 (Okeefe and Harder,1991)。 从 放 线 菌 目 细菌 中 鉴定 的 P450, 具 有 催化 烷烃 的 关 基 化 作用 、 五 氯 基本 LEI EFA GEA AEB O - 脱 烷 基 作用 (Kailson et al. ,1993)。 菌 株 编码 参与 除草 剂 EPTC (S-ethyl dipropyl-carbamothioate) 降 解 的 细胞 色素 P450 已 从 红 球 菌 属 (Rhodococcxs sp. ) 菌株 N186/21 中 克隆 并 在 大 肠 杆菌 中 超 量 表达 (Nagy et al. ,1995)。 分 解 磺 酰 脲 类 除草 剂 的 P450 已 从 线 灰 链 霉菌 ( Streptomyces griseolus) ATCC11796 中 鉴定 出 ,并 从 中 分 离 出 两 个 P450 基因 , 且 纯化 出 其 编码 的 蛋白 ,这 两 个 P450 都 可 被 磺 酰 脲 和 葵 巴 比 妥 诱导 (O- keefe et al ,1991)。 其 他 链 霉 菌 属 ( Strezptomzyces ) 细 菌 的 P450 包括 西 唐 氏 链 霉菌 (S. se- iozi) 中 邻 甲 氧 基 葵 酚 (guaiacol) 脱 甲 基 作 用 的 P450 和 灰 包 链 霉菌 (S. griseus) PRAER 转化 作用 的 P450 soy (Trower et al. ,1989)。 从 小 单 孢 属 ( Micromonospora griseorubida ) 中 分 离 了 编码 参与 mycinamicin 抗生素 生物 合成 的 P4$0(Inouye et al. ,1994) ,从 Amylo- cata autotrophica 中 分 离 编 码 维生素 D- 3 25 -羟基 酶 基因 (Kawauchi et al. ,1994)。 在 哺乳 动物 中 ,由 D-3 转化 为 其 活性 型 需要 2 个 羟基 化 步骤 即 1a 和 25 -羟基 化 。 至 于 芽孢 杆菌 ,已 从 巨大 芽孢 杆菌 ( 孔 . megaterium )ATCC14581 中 检测 出 2 个 P450 活性 。P450 BM1 和 P450 BM2 可 被 巴 比 妥 (barbiturate) 诱 导 ,P450 BM1 的 Barbie 盒 位 于 5 侧翼 区 。P450 BMI1 是 含 410 AER, 分 子 质量 为 48kDa 的 蛋白 ,与 P450 cam 最 相 似 (He et al. ,1989)。P450 BM2 是 48kDa 脂肪 酸 产 化 酶 (Narhi and Fulco,1987)。P450 BM1,BM2,BM3 在 B. megaterium 12 个 ATCC 株 的 11 个 都 存在 ,但 在 ATCC13368 中 未 检 出 ,该 菌株 包括 一 个 类 型 1 的 P450 (P450meg) , 它 可 以 在 158 位 置 羟基 化 不 同 的 符 BE, P450meg 基因 已 被 克隆 和 测序 ,但 其 生理 功能 尚 不 肯定 (Rauschenbach et al. ,1993)。 奈 瑟 氏 球 菌 科 (Neisseriaceae) 中 ,醋酸 钙 不 动 杆菌 ( Acinetobacter calcoaceticus ) 的 几 个 株 系 的 P450 可 被 n -烷烃 诱导 。 从 生长 在 十 六 烷 的 A. calcoaceticus EB104 株 纯 化 了 烷 BILE ”微生物 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 ,179 , EFS AL HE (P450). Be ft AJB ( Morazella ) 菌株 Gu2 表达 一 种 分 子 质 量 为 S2kDa 的 P450 ,为 其 在 木质 素 降解 产物 中 生长 所 需 ,该 酶 可 能 是 烷 氧 苯酚 (alkoxyphenol) 脱 甲 基 酶 (Asperge and Kleber, 1991). 9.3 细菌 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 (Munro 和 Lindsay, 1996) CYP 名 称 来 源 功能 或 性 质 CYP101 P450cam 亚 臭 假 单 钨 菌 P. putida 樟脑 羟 化 酶 CYP102 P450BM-3 巨大 芽孢 杆菌 B. megaterium 脂肪 酸 产 化 酶 CYP103 P450pin Fl A. tumefaciens 植物 可 诱导 CYP104 P450pin F2 A. tumefaciens 植物 可 诱导 CYP105A1 P450sul 线 灰 链 霉菌 S. griseolus 除草 剂 可 诱导 CYP105Bl P450su2 S. griseolus 除草 剂 可 诱导 CYP105A2 P450VD25 A. autotrophica 维生素 D- 3 羟 化 酶 CYP105C1 P450(choP) 链 霉菌 Streptomyces sp. CYP105D1 P450soy 灰 孢 链 霉 菌 S. griseus 异 生 素 转化 CYP106A1 P450BM - 1 巨大 芽孢 杆菌 B. megaterium 脂肪 酸 羟 化 酶 CYP106A2 P450meg B. megaterium fi EEL CYP107A1 P450ergF S. erythraea 红 霉 素 生 物 合成 CYP107E1 P450(mycG) M. griseorubida Mycinamicin 生物 合成 CYP108 P450terp Pseudomonas sp. i in BEAL CYP111 P450lin 求知 假 单 孢 菌 P. incognita 里 哪 醇 8 - 甲 基 凑 化 酶 CYP112 P450BJ-1 B. japonicum 厌 氧 表达 CYP114 P450BJ-3 B. japonicum 厌 氧 表 达 CYP117 P450BJ - 4 B. japonicum 厌 氧 表达 CYP113Al P450eryK 红 霉 素 链 霉菌 S. erythraea 红 霉 素 生物 合成 CYP115P P450BJ- 2 B. japonicum P450 假 基因 CYP116 红 球 菌 属 Rhodococcws sp. N286/21 菌株 除草 剂 降解 P450 参与 烷烃 的 氧化 已 在 发 光 弧 菌 (Vibrio fisheri V. Lahrveyi) 和 明亮 发 光 杆 菌 (Photobacterium phosphoreum ) 中 鉴定 出 ,这 些 细菌 氧化 醛 而 发 光 。 在 弧 菌 属 (Vibrio) 和 发 光 杆 菌 属 ( Phorobacterium ) 的 其 他 种 类 也 有 组 成 型 P450 的 存在 。 从 生长 于 里 哪 醇 (linalool) 的 未 知 假 单 孢 菌 ( Pseudomonas incognita ) 的 一 个 菌株 中 分 离 了 两 个 细胞 色素 P450 , 它们 催化 里 哪 醇 降解 途径 的 两 个 不 同 的 反应 (Sligar and Mur- ray,1986) ,其 中 里 哪 醇 8 - 甲 基 羟 化 酶 (P45S0lin) 已 被 克隆 和 测序 (Ropp et al. ,1993 )。 P450cym 是 从 P. putida PL -分 离 的 ,羟基 化 o - 伞 花 烃 (o - cymene) 产 生 枯 叶 醇 (cumic alcohol) 以 作 碳 源 (Sligar and Murray, 1986). 研究 得 较 清 楚 的 细菌 P4530 有 以 下 4 种 : 1) P450cam 恶臭 假 单 孢 菌 (P. putida )ATCC17453 的 P450cam 发 现 于 1965 年 , 它 催 AC D -樟脑 S -外 -羟基 化 作用 ,随后 樟脑 降解 为 乙酸 和 异 丁 酸 以 提供 代谢 所 需 (Martinis et al. ,1991) 。 编 码 P450cam 的 基因 (coxzC ) 以 及 许多 樟脑 降解 途径 中 的 其 他 酶 位 于 230kb 的 CAM 质粒 上 。caxz C 基因 已 克隆 并 在 大 肠 杆菌 中 得 到 功能 表达 (Unger et al. ,1986 ) 。 P450cam 被 NADH 还 原 , 电 子 传递 经 过 铁 - 硫 蛋 白 假 单 孢 氧 还 蛋白 和 含 FAD 的 假 单 - 180 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 ARE AWIRE, E175 cam B 和 cam A 编码 ,位 于 cam cC 的 3 区 。 另 一 基因 cam D 编码 5 -外 -羟基 樟脑 还 原 酶 ,位 于 ce A 和 co B #5’ 区。 这 4 个 基因 组 成 一 个 操纵 子 cam DCAB ,编码 樟脑 降解 开始 步骤 所 需要 的 酶 。 该 操纵 子 被 二 聚 体 阻 遏 蛋白 即 cam R 基因 的 蛋白 产物 负 调 节 , cam R {iF cam D 前 ,其 转录 方向 与 ca DCAB FAR. cam A 和 cazz B 已 被 克隆 和 测序 。 完 整 的 P450 酶 系 (P450cam. 假 单 钨 氧 还 蛋白 以 及 假 单 孢 氧 还 蛋白 还 原 酶 ) 已 在 大 肠 杆 菌 中 表达 (Peterson et al., 1990). cam R 基因 也 已 测 序 (Aramoki et al. ,1994) 。 2) P450 BM3 20 世纪 70 年 代 中 期 从 巨大 芽孢 杆菌 ( 孔 . megaterium) PRET RAAB 肪 酸 羟基 化 活性 的 P450 ,已 从 芽孢 杆菌 中 将 P450 BMG3 纯化 到 同 质 , 它 快速 催化 链 长 KA C12~C18 的 饱和 脂肪 酸 的 加 单 氧 酶 活性 ,其 中 对 C15 和 C16 脂肪 酸 的 活性 最 高 ,可 达 4000/(mol'min)。 其 他 底 物 包括 相似 链 长 的 单 不 饱和 脂肪 酸 、 脂 肪 族 醇 和 脂 肪 酰胺 (Narhi and Fulco, 1986) ,脂肪 酸 酯 不 是 P450 BM3 的 底 物 。 脂 肪 酸 底 物 的 羟基 化 作用 一 般 在 w- 2 位置, 也 可 发 生 在 w-1 和 wmw-3 (Miura and Fulco,1974)。 标 榈 酸 羟基 化 产物 可 以 进一步 作 氧 化 作用 的 底 物 而 进一步 羟基 化 (Boddupalli et al. ,1990)。 不 饱和 脂肪 酸 的 双 键 也 可 被 环 氧化 (Buchanan and Fulco, 1978). P450 BMG3 分 子 质量 很 大 ,119kDa, 仅 需 底 物 和 NADPH 就 有 全 活性 (Narhi and Ful- co,1986)。1lmol 纯化 的 P450BM3 包含 Imol FAD.FMN 和 血红 素 。 可 以 催化 细胞 色素 C 以 及 其 他 人 工 电子 受 体 (Narhi and Fulco,1986,1987)。 水 解 酶 部 分 水 解 P450 BM3 得 到 两 个 结构 域 , 其 中 66kDa 多 肽 包含 两 分 子 黄 素 ,保持 还 原 酶 活性 ; 另 一 结构 域 为 SSkDa 的 血红 素 结构 域 ,可 与 底 物 结合 ,也 可 与 CO 结合 ,在 450nm 有 吸收 峰 (Narhi and Fulco, 1987)。P450 BM3 被 认为 是 两 个 结构 域 的 融合 蛋白 ,这 两 个 结构 域 分 别 对 应 于 真 核 生 物 微粒 体 P450 酶 系 的 组 成 成 分 即 P450 和 NADPH P450 还 原 酶 (Narhi and Fulco, 1987). 编码 P450 BMG3 的 基因 (CYP102 ) 已 被 克隆 并 在 大 肠 杆菌 中 得 到 表达 ,从 大 肠 杆 菌 中 表达 的 P450 经 纯化 后 与 从 巨大 芽孢 杆菌 (也 . megaterium ) 纯 化 的 P450 BM3 有 相同 的 功 能 、 免 疫 化 学 和 电泳 特征 ,其 N -末端 序列 也 一 致 (Narhi et al. ,1988) 。 P450 BM3 FRE RBS, AG RBS mRNA 的 增加 是 转录 增强 的 结果 (Pike et al. 1985). #0 P450 的 巴 比 妥 诱导 十 分 异常 ,在 培养 基 中 加 入 8mM 的 葵 巴 比 妥 可 以 28 倍 诱导 P450 BM3, 而 苯 巴 比 妥 本 身 不 是 P450 BM3 的 底 物 (Narhi and Fulco, 1982). 其 他 巴 比 妥 、` 芳 基 腺 和 酰胺 也 是 P450 BMG3 的 诱导 剂 。 诱 导 剂 强度 的 重要 因素 是 杂 脂 性 。 最 强 的 巴 比 妥 诱导 剂 是 甲 丙 烯 基 甲 成 (methohexital) (Kim and Fulco,1983)。 巴 比 妥 诱导 表达 需要 有 P450 BM3 基因 SMR 1kb 核 苷 酸 序列 存在 (Wen et al. ,1989). 3) P450terp 在 o ~ ii in TH ( terpinol) 4 K ABA A RO SRS I 的 P450, #K A P450terp。P450terp 可 羟基 化 单 丫 ,相似 于 P450cam 羟基 化 樟脑 。 P450terp 基因 (CYP108 ) 已 被 克隆 ,其 酶 已 被 纯化 ,并 已 测定 其 分 子 结构 (Hasemann et al. ,1994), 4) P450eryF P450eryF 已 从 Saccharopolyspora erythaea 中 发 现 ,这 是 已 知 的 惟一 一 个 具有 生物 合成 功能 的 细菌 P450。 细 菌 可 产生 红 霉 素 (erythromycin) A。P450eryF 众 化 6 - deoxyerythronolide B 产生 erythronolide B, erythronolide B 是 红 霉 素 A 这 种 大 环 内 酯 (macrolide) 抗 生 素 的 前 体 (Shafiee and Hutchinsom,1988)。 从 S. erythaea 中 鉴定 第 九 章 ”微生物 的 细胞 色素 P450 及 其 功能 - 181 - 了 两 个 P450 BE (orf405 和 eryF) {AM P450eryF 与 红 霉 素 生 物 合成 有 关 。 与 底 物 结合 的 P450eryF 的 结构 已 鉴定 (Cupp-Vickery and Poulos,1995 ) 。 大 多 数 细菌 P450 催化 分 解 过 程 ,并 非 生 物 生 存 所 必需 的 ,通常 它们 的 作用 是 利用 特 异 的 有 机 化 合 物 。 细 菌 具 有 代谢 昔 烯 和 烷烃 的 能 力 , 引 起 人 们 的 关注 。 细 菌 P450 BRA 具有 用 于 有 机 废物 和 污染 物 处 理 的 潜力 ,而且 可 用 于 药物 和 其 他 化 学 品 合成 的 生物 转化 。 细菌 的 底 物 特异 性 可 以 通过 诱 变 进行 修饰 ,可 用 于 脂 溶性 化 合 物 的 立体 氧化 。 许 多 细菌 存在 P450 的 强 超 量 表达 , 上 且 这 些 酶 可 以 可 溶性 的 高 浓度 存在 在 溶液 中。 这些 性 质 可 使 人 们 从 细菌 P450 深入 认识 P450 反应 机 制 、P450 结构 -功能 关系 以 及 P450 诱导 机 制 。 而 对 P450 机 制 的 了 解 可 以 建立 工业 化 的 工艺 生产 药物 、 化 学 品 以 及 设计 P450 的 抑制 剂 。 微生物 P450 研究 的 进展 极 大 地 推动 着 整个 P450 领域 的 发 展 。 参 考 文 献 Ahmed F, Williams R A,Smith K E. 1995. 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RNA 聚合 酶 多 核 苷 酸 磷 酸化 酶 p450 基 因 ATP GTP.tRNA.rRNA m 一 脱 辅 基 蛋 白 “一 -一 一 P450 Rie 转录 ( 核 ) 翻译 (内 质 网 ) (区 厂 和 和 关 人 sir sea 酸 的 磷酸 化 ) 降解 和 分 解 代谢 <——— 7420 图 10.1 P450 基因 表达 调控 的 几 个 步骤 (Lewis,1996) 不 同 P450 在 生物 体 各 组 织 器 官 的 细胞 中 的 调控 方式 现在 知道 的 不 多 ,如 今 莲 勃 发 展 的 分 子 生 物 学 技术 可 以 进行 基因 分 析 和 操纵 ,为 这 一 领域 的 发 展 展示 出 广阔 的 前 景 。 但 有 一 点 是 清楚 的 ,细胞 色素 P450 的 诱导 机 制 是 多 样 的 ,许多 诱导 作用 与 相关 P450 基 因 本 身 的 调控 元 件 有 关 (Hines et al. ,1994; Tukey and Johnson, 1990; Omura et al., 1993). . 3 P450 基因 表达 的 调控 受 一 系列 因子 的 控制 ,如 诱导 剂 的 存在 ,P450 基因 本 身 ( 操 纵 子 ) 的 状态 。P450 基因 的 调控 序列 (regulatory segments) 是 变化 的 (Kemper,,1993)。 即 便 是 属相 同 基因 家 族 或 亚 族 的 P450 基因 ,其 调控 序列 都 有 所 不 同 。 因 此 ,一些 关 系 密切 的 P450 基因 的 表达 与 调控 方式 存在 差异 (如 CYP2B1 和 B2 ,CYP3A1 和 CYP3A4A2 )。 由 于 基因 调控 元 件 的 不 同 , 可 能 出 现 某 些 基因 是 组 成 型 表达 , 某 些 基因 可 被 诱导 。 不 同 器 官 和 组 织 \ 不 同性 别 \ 不 同 的 发 育 阶段 P450 的 表达 可 能 不 一 致 。 天 然 激 素 和 外 源 性 化 合 物 可 以 影响 不 同 P450 的 含量 (Gibson and Skett,1994) , 这些 因 子 可 能 直接 或 间接 地 与 特定 P450 基因 的 调控 区 域 发生 相 互 作 用 。 诱 导 剂 与 结合 在 P450 基因 调控 元 件 的 受 体 或 阻 歇 46 H (repressor protein) 结 合 ( Nebert et al. ,1991) ,如 芳烃 (aromatic hydrocarbon ,AH) 诱 导 剂 与 芳烃 受 体 结合 ,再 与 芳烃 受 体 核 转运 蛋白 (AH receptor nuclear translocator, Arnt) 因子 结合 ,此 结合 物 进 入 核 内 再 与 P450 CYP1 基因 的 调控 区 域 的 一 定 元 件 (elements) 结 合 , 引 发 P4501 从 头 合成 (Hankinson,1995)。 诱 导 剂 也 可 以 通过 与 阻碍 蛋白 结合 而 影响 诱导 过 程 (通常 阻 遇 蛋白 结合 在 P450 基因 的 操纵 基因 区 域 )(English et al. ,1994) , BH 蛋白 被 释放 ,基因 结构 区 域 的 编码 序列 启 始 转录 , 葵 巴 比 妥 类 型 的 诱导 以 及 过 氧化 物 酶 体 增殖 因子 (peroxisome proliferator) 介 导 的 诱导 是 以 这 种 方式 起 作用 ,也 即 P450 基因 表达 的 调节 通过 反 式 作用 调控 因子 对 顺 式 作用 的 DNA 响应 元 件 (response elements) 的 效应 来 控制 (Omura et al. ,1993) 。 除 诱导 外 ,P450 的 催化 活性 可 能 因 一 些 因 子 而 降低 , 称 为 下 调控 (down-regulated) 如 抑制 、 低 表达 (poor expressiion ) (由 于 遗传 多 态 、 等 位 变异 或 其 他 第 十 章 ”细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 “ 187 > 因子 ) 和 翻译 后 修饰 导致 缺乏 与 血红 素 的 亲 和 性 而 使 P450 蛋白 失去 功能 (Jansson,1993 ; Pyerin and Taniguchi,1991) 。 值 得 注意 的 是 , 底 物 或 诱导 剂 在 浓度 达到 一 定量 时 ,可 能 起 抑制 剂 的 作用 (Okey,1990 ) 。 免 疫 特异 性 (imnmunospecific) 抗 体 可 能 通过 阻 断 P450 与 其 氧化 还 原 成 分 如 还 原 酶 或 细胞 色素 bs 的 相互 作用 而 抑制 P450 的 催化 活性 (Edwards et 4 .,1991)。 生 物 膜 本 身 也 有 可 能 在 P450 的 调控 中 起 主要 作用 ,蛋白 激酶 C(protein ki- nase C) 的 调控 受 膜 本 身影 响 (Epand and Lester,1990) 。 据 报道 细胞 色素 bs 可 以 通过 竞 争 性 结合 到 邻近 的 丝氨酸 磷酸 化 位 点 的 区 域 来 抑制 P450 的 磷酸 化 作用 (Jansson et al. , 1990). P450 的 磷酸 化 作用 控制 着 P450 的 翻译 后 修饰 ,磷酸 化 作用 使 P450 失去 血红 素 而 被 降解 (Oesch-Bartlomowicz and Oesch, 1990) ,随后 P450 变 成 失 活 型 P420(Correia, 1991). 磷酸 化 作用 是 由 依赖 CAMP 的 蛋白 激酶 A(protein kinase A) 介 导 的 (Pyerin and Taniguch, 1991; Jansson,1993) 。 除 细胞 色素 bs 外 ,一些 诱导 剂 如 乙醇 丙酮 能 保持 某 些 P450( 如 CYP2E1) 较 高 的 水 平 , 它 们 的 作用 是 通过 与 邻近 丝氨酸 的 氨基 酸 位 点 或 丝 氮 酸 结合 ,抑制 蛋白 激酶 对 P450 的 磷酸 化 作用 ,这 通常 被 认为 是 2E 基因 诱导 的 可 能 机 制 ”(Coon et w .,1992) ,这 种 诱导 机 制定 名 为 蛋白 质 稳 定 作 用 。mRNA 的 稳定 也 将 导致 P450 的 诱导 (Porter and Coon ,1991; Waxman and Azarott,1992 ) 。 P450 基 因 的 缺失 (deletion ) 或 突变 可 能 导致 P450 催化 活性 的 完全 丧失 或 减少 。 P450 基因 点 突变 和 所 基 酸 残 基 的 改变 可 能 产生 失 活 的 或 弱 活 性 的 酶 (Daly and Idle, 1993)。 人 类 CYP2D EARN AAA 低 代 谢 者 "(poor-metabolizer) 的 生物 型 就 是 这 一 类 型 (Heim and Meyer, 1991; Price-Evans, 1993; Meyer,1991)。 生 省 醇 (steroido- genic) 的 P450 基因 表达 严格 受 激素 的 调控 (Okey,1990; Gibson and Skett,1994 ) ,如 促 激素 (trophic hormone) 控 制 排卵 周期 (ovulation cycle) ,可 以 影响 在 月 经 期 (menstrual peri- od) 的 特定 阶段 相关 生 和 省 醇 P450 的 水 平 (Jefcoate and McNamara,1991)。 促 滤 泡 激素 (follicle stimulating hormone, FSH) 调控 CYP11A1 和 CYP19 含量 , 而 促 黄 体 激 素 (luteinizing hormone,LH) 促 进 卵 梨 CYP17 活性 ,FSH 和 LH 组 合 控制 着 月 经 循环 特定 时 期 的 肉 二 醇 (estradiol) 和 黄体 酮 的 产生 。 从 胆固醇 到 雌 二 醇和 黄体 酮 的 合成 中 , CYP11A1,CYP17 和 CYP19 起 了 重要 的 催化 作用 ,FSH 和 LH 含量 的 高 峰 刚好 在 排卵 前 ,与 肉 二 醇 浓度 的 迅速 增加 同步 。 随 后 黄体 酮 的 增加 (排卵 7 天 后 ) 在 下 丘脑 / 重 体 轴 发 挥 负 反馈 作用 机 制 ,以 降低 28 天 循环 中 前 14 天 的 FSH 和 LH 水平。 但 促 激 素 (ACTH, FSH,LH 和 PTH) 在 精 介 和 卵巢 等 不 同 组 织 中 为 什么 可 以 调控 生 和 省 醇 P450 的 表达 还 不 太 清 楚 , 有 可 能 是 通过 调节 不 同 当 醇 激 素 ( 或 它们 的 中 间 因 子 ) 与 P450 基因 的 响应 元 件 的 结合 来 实现 ,如 性 别 特异 的 P450 其 表达 是 由 生长 激素 调控 的 (Omura et al.’, 1993). 同一 因子 可 能 诱导 几 种 P450 酶 的 表达 , 这 与 真 核 基因 的 组 织 方 式 有 关 (Omura et 4aL .,1993) 。 编 码 不 同 酶 的 多 个 结构 基因 ,可 以 以 基因 串 (battery) 或 座 (locus) 的 形式 联接 在 一 起 ,如 Ah 基因 座 (Nebert,1989a; Nebert et al., 1990, 1991) 编码 CYPIA1 和 CYP1A2 以 及 另 四 个 工 相 酶 即 NADPH 甲 蔡 本 氧化 还 原 酶 (Nmo - 1)、 醛 脱氧 酶 (Aldh - 1). UDP - 葡 糖 苷 酸 ( 基 ) 转 移 酶 (Ugt-1) 和 谷 胱 甘 肽 转移 酶 (Gt -1)。 诱 导 剂 与 Ah 受 体 结合 后 转移 到 核 中 ,再 与 Ah 基因 串 的 有 关 调 控 元 件 相 互 作用 ,不 仅 引 发 CYP1AI 的 合成 而 且 引 发 CYP1A2 以 及 开 相 酶 的 合成 (Nebert et wz. ,1990)。 这 些 开 相 酶 可 以 进一步 处 - 188 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 理 生 物体 中 由 CYPP450 介 导 反应 的 产物 ,与 P450 在 功能 上 相 协 调 。 另 一 例子 是 P450 的 诱导 可 能 与 其 还 原 酶 有 共同 的 调控 机 制 ,如 蒜 巴 比 妥 、 地 塞 米松 ( 抗 炎 药 ,dexametha_ sone) ` 孕 烯 醇 酮 - 16a - 且 (PCN)`\ 丙 酮 乙醇.DDT 和 利 福 平 除 诱导 多 种 P450 外 ,还 诱导 NADPH -细胞 色素 P450 氧化 还 原 酶 (Shen and Kasper,1993 ) 。 这 些 所 谓 的 串联 (tandem) 基 因 在 生物 体 的 不 同 组 织 的 排列 可 能 彼此 不 同 , 这 可 能 是 这 些 基因 在 不 同 组 织 中 表达 存在 差异 的 原因 (Kemper,1993; Hines et al., 1994), mk 生 DNA 修饰 的 组 织 (例如 ,在 一 个 基因 串 中 某 一 结构 基因 的 缺失 或 修饰 , 某 一 调控 元 件 的 变异 ) 就 可 能 产生 一 低 活 性 或 无 活性 的 特定 P450。 不 同 组织 中 基因 串 存 在 差异 可 以 解 释 性 别 双 态 现象 (sexual dimorphism) 如 小 鼠 肾 和 肝 中 的 CYP2A4 和 CYP2A5 在 不 同性 别 中 的 差异 表达 ; 当然 ,激素 的 差异 也 可 能 是 性 别 双 态 现象 的 原因 (Ryan and Levin, 1993). 因此 ,P450 介 导 的 化 合 物 的 代谢 表现 出 的 组 织 ` 性 和 种 类 差异 是 P450 同 工 酶 具有 不 同 的 表达 或 调控 机 制 的 结果 (Padmanaban and Nirodi, 1994; Hines et al., 1994). Ala P450 的 表达 可 能 协同 调控 ,但 可 能 具有 组 织 特异 性 ,这 取决 于 激素 及 其 他 因子 对 调控 方 式 的 影响 。 表 10.1 组 成 型 P450 的 内 源 性 调控 因子 (Okey,1990; Gibson and Skett, 1994) ee Ce wim fach fora: [we wim |Acr fxr: [emt mem facth fxn |e CYPITAL LH Ce Ee Co c 注 :ACTH: adrenocorticotrophic hormone 促 肾上腺 皮质 激素 ,LH:lutenizing hormone 促 黄体 激素 FESH: follicle stim- ulating hormone 促 滤 泡 激 素 ,PTH: parathyrold hormone 甲状 旁 腺 激素 。 CYP11LBl CYP11A1l 表 10.2 诱导 剂 对 P450 及 NADPH -细胞 色素 P450 还 原 酶 的 协同 诱导 作用 (Shen and Kasper, 1993) WE ee faa pe | mop fad ees | cpa | ee) oes ae ae | aan [own [ne [anton 全 天生 VE 下 机 大 可 下 让 注 :DHEA: 二 氢 表 雄 省 酮 (dihydroepiandrosterone),DDT: p, p-dichlorodiphenyl trichlroehtane,TCDD: 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 3MC: 3 - 甲 基 胆 万 (3 - methylcholanthrene) ,BNF:8- 鞭 黄酮 (8B- naphthoflavone),2 - AAF: 2 -Z. AEF (2 - acetylaminoflurene) ,PCN: 孕 烯 酮 - 16a -fff, DEPH: 二 -(2 - 乙 基 已 基 ) 邻 葵 二 甲酸 酯 (di-(2- ethyl- hexyl) phthalate). "| 4 | | 第 十 章 “” 细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 - 189 - 10.1 细胞 色素 P4550 基因 的 诱导 与 调控 10.1.1 P450 基因 诱导 机 制 的 多 样 性 P450 基因 表达 经 历 图 10.1 的 几 个 阶段 。 真 核 生物 产生 特异 的 mRNA 还 需 进一步 加 工 以 去 除 (剪接 ) 非 编码 区 (外 显 子 ) 以 产生 具有 翻译 活性 的 mRNA,mRNA 经 翻译 形成 脱 辅 基 P450 蛋白 。 P450 诱导 可 能 在 P450 基因 表达 的 各 阶段 都 发 生 ,诱导 表现 出 不 同 的 机 制 。 某 些 诱 导 机 制 如 转录 活化 可 能 比 其 他 机 制 更 普遍 ( 见 第 一 章 )。 通 常情 况 下 ,一 类 诱导 剂 表现 特 定 的 诱导 作用 ,即便 是 同一 个 P450 和 诱导 剂 ,也 有 可 能 不 止 一 种 机 制 起 作用 。 10.1.2 P450 基因 的 调控 元 件 在 P450 基因 中 存在 一 些 不 同 的 调控 元 件 ( 图 10.2)。 这 些 元 件 可 以 控制 蛋白 质 的 表 TK ,或 者 通过 转录 活化 或 转录 阻 遇 ,取决 于 元 件 的 功能 和 结合 因子 的 性 质 (Omura et al., 1993) 。 这 些 元 件 的 排列 可 能 在 不 同 的 P450 会 有 所 不 同 ,而且 启 动 子 和 阻 巡 蛋白 的 结合 也 受 许多 因素 的 影响 ,包括 细胞 类 型 . 性别、 年龄 (Horbach et al., ,1992) 以 及 生物 体 的 发 育 状 况 (Hines et al. ,1994) 。 调控 因子 的 结合 可 能 改变 DNA 序列 中 的 某 一 段 如 响应 元 件 的 几何 形状 ,增加 DNA 的 曲 度 ,由 此 导致 远离 片段 间 在 立体 空间 上 靠近 而 发 生 相 互 作 用 (Hines et al., 1994). 因此 $- 侧 喜 区 的 某 部 分 的 结合 可 能 调节 基因 调控 部 位 的 效应 。 调 控 元 件 通常 位 于 转录 启 始 位 点 的 上 游 区 ,有 人 研究 发 现 响 应 元 件 可 能 位 于 第 一 外 显 子 区 (Hines et al. , 1994). 因此 远 距 离 的 调控 也 可 能 导致 P450 的 诱导 。 许多 调控 因子 与 响应 元 件 相互 作用 可 以 产生 活化 或 阻 巡 效应 ,如 TCDD 与 胞 质 Ah 受 体 结合 导致 CYP1AI 基因 的 转录 活化 (Reyes et al. , 1992; Burbach et al. ,1992; Han- kinson,1995) 。 某 些 诱导 剂 的 响应 元 件 如 异 生 素 响应 元 件 (xenobiotic,XRE) 和 糖 皮 质 激 % (glucocorticoid) Maj hi 704 (GRE) HER (estrogen ) Maj hi 7044 (ERE) 8] RE FETE FA IA P450 基因 中 (Kemper,1993 ) ,这 些 元 件 与 诱导 剂 的 诱导 作用 相关 。PB 类 型 的 诱导 是 通 过 配 体 与 阻 遏 蛋白 或 其 他 蛋白 结合 ,然后 释放 这 些 蛋 白 , 由 此 产生 转录 活性 。 几 个 响应 元 件 可 能 存在 于 同一 基因 ,这 可 以 解释 某 一 P450 可 以 被 不 同 的 诱导 剂 诱导 。 P450 基因 的 调控 区 既 有 相同 又 有 不 同 , 这 在 理论 上 解释 了 不 同 种 \ 性 别 和 组 织 中 P450 调控 的 变异 。 如 生 人 省 醇 P450 的 基因 (CYPIAI1 、11BI 、17、19、 及 21) ,在 它们 的 调 控 区 都 具有 响应 元 件 (CRE) ,这 些 响 应 元 件 通过 一 个 特异 性 结合 蛋白 与 CAMP - 介 导 的 调 控 相 联系 (Kemper,1993)。 已 知 所 有 这 5 种 P450 ,它们 的 含量 受到 cAMP 的 调控 。 分 析 这 5 种 P450 基因 序列 发 现 ,所 有 基因 其 $ -侧翼 区 具有 TATA 盒 (位 于 转录 启 始 位 点 的 上 游 20~40bp 之 间 ) ,在 TATA 盒 的 上 游 20 或 以 上 碱 基 对 处 有 一 基础 转录 元 件 (basal transcription element,BTE) ,在 BIE 区 通常 包含 CAAT 盒 ( 如 肝 特 异性 P450) 和 一 个 GC 盒 。 而 在 可 被 葵 巴 比 妥 诱 导 的 基因 CYP2B1 和 CYP2B2 VAR CYP102.CYP106 基因 的 - 190 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 BTE 区 域 存在 一 特异 性 17bp 的 序列 , 称 为 Barbie 盒 (Padmanaban and Nirodi, 1994; Ful- co,1991) 。 组 织 特异 性 元 件 ( 如 那些 可 以 与 肝 细胞 核 因 子 结合 的 元 件 ) 可 以 在 RNA 转录 位 点 上 游 40 一 200bp 之 间 存 在 ,更 常见 于 转录 起 始 位 点 上 游 的 -80~ — 120bp 处 (Kem- per,1993) 。 在 组 织 特异 性 因子 调控 元 件 的 更 上 游 通常 可 以 发 现 一 些 糖 皮质 激素 响应 元 件 (GREs) ,这 是 某 些 P450 可 被 糖 皮质 激素 诱导 的 原因 。 比 较 特 别 的 是 CYP1AI BB, 其 GRE 存在 于 第 一 个 外 显 子 上 (Hines et wy . ,1994) 。 在 启动 子 位 点 (BTE 和 TATA) Al 大 约 -200bp Xb , 4 4 BE P450 也 可 能 包含 CRE, 家 族 2 和 3 的 P450 包含 异 生 素 响应 元 件 (XREs ) ,而 CYP1 家 族 基 因 的 XRE 大 致 在 启 始 位 点 的 -500 和 -3500bp 之 间 (Hines et al., 1994). ~-1000bp2KLL E ~-100--~-1000bp ~-40bp ~-25bp +1 加 强 子 元 件 组 织 特 异性 RE 、 BTE TATA 盒 编码 区 XRE 等 GRE 等 调控 区 转录 启 始 位 点 10.2 P450 基因 的 简化 结构 以 上 讨论 的 响应 元 件 的 位 置 和 数量 因 不 同 P450 家 族 (或 亚 家 族 ) 而 不 同 , 有 时 同一 亚 家 族 的 P450 其 响应 元 件 的 位 置 和 数量 也 不 一 致 。 研 究 得 最 为 清楚 的 调控 区 是 CYP1A1 3 (Kemper, 1993). KB CPYIAI 有 5 个 XRE(-3586,- 1233, — 1089, —1010, —537bp), HF — 1000 至 - 1100bp 之 间 的 两 个 XRE AA SS Ah 受 体 结合 位 点 。 这 5 个 XRE 中 ,包含 一 个 核心 序列 CACGC ,为 17bp 同 源 序列 的 一 部 分 (homologous sequence) (Omura et al. ,1993; Hines et al. ,1994) 。CYP1A2 的 调节 区 与 CYP1AL 有 所 不 同 , 例 如 ,在 1A2 基因 中 有 较 多 的 HNF-REs(1Al 中 只 有 1 个 ),1A1 有 5 个 AhR 响应 元 件 存在 于 5 侧翼 区 (而 1A2 只 有 一 个 )(Hines et al. , 1994). jX#2HH 1A2 更 可 能 在 肝 中 表达 , 1A1 更 容易 被 1A 的 诱导 剂 所 诱导 (Gonzalez and Gelboin, 1994; Omura et al., 1993)。 通 过 分 析 P450 基因 的 调控 区 ,可 以 获取 许多 有 用 的 信息 ,如 在 2B1/2 和 CYP102 调控 区 发 现存 在 共有 的 核 苷 酸 序列 (Barbie 盒 ) ,这 些 基因 都 有 可 被 葵 巴 比 妥 诱导 的 这 一 共同 性 质 (Kemper, 1993 ) 。 10.1.3 诱导 剂 的 结构 与 诱导 机 制 的 关系 从 P450 诱导 剂 结构 上 的 差异 可 以 判断 P450 的 诱导 机 制 可 能 有 所 不 同 。 例 如 , CYP1 的 诱导 剂 都 与 Ah 受 体 结合 ,在 分 子 结构 上 具有 显著 的 相似 性 ,如 TCO 表现 一 定 的 平面 性 和 一 定 程 度 矩 形 结 构 (Landers and Bunce, 1992), PB - 类 型 诱导 剂 如 CYP2B 诱导 剂 ,虽然 大 多 数 具 有 非 平 面 和 V -= 型 分 子 构象 ,但 诱导 剂 之 间 结 构 的 相似 性 却 不 明显 。 CYP2E 诱导 剂 的 特征 是 相对 较 小 、 结 构 多 样 的 分 子 (Lewis et al., 1994a), H PA— 些 通过 与 丝氨酸 结合 ,具有 稳定 蛋白 质 以 免 被 降解 的 作用 。 这 种 诱导 剂 至 少 需要 一 个 负 电 性 原子 以 便 与 丝氨酸 形成 氢 键 ,从 而 阻止 丝氨酸 的 磷酸 化 这 一 翻译 后 修饰 作用 ,乙醇 、 第 十 章 ”细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 - 191 - 丙酮 、 乙醚 是 典型 的 CYP2E 诱导 剂 。 可 以 诱导 CYP3A 的 化 合 物 包括 内 源 性 和 合成 的 省 醇 (Okey,1990; Waxman et al., 1985) ,由 此 认为 与 DNA 结合 的 省 醇 激 素 受 体 , 如 糖 皮质 激素 受 体 可 能 介 导 CYP3 的 诱导 (Wright and Paine, 1994)。 在 CYP3 基因 的 $ -侧翼 区 存在 省 醇 受 体 响应 元 件 (GRE 和 ERE) (Kemper, 1993) 4% S MBSA CYP3 诱导 这 一 假说 。 CYP4 的 诱导 与 过 氧化 物 酶 体 的 增殖 相关 (Gibson,1992; Hardwick, 1991), Ww 化 物 酶 体 增 殖 是 中 齿 动物 致癌 作用 的 重要 特征 (Lake,1995)。 过 氧化 物 酶 体 增 殖 因子 活化 受 体 (peroxisome proliferator-actived receptor,ppar) 被 鉴定 是 CYP4 诱导 和 过 氧化 物 酶 体 增殖 的 介 导 因子 ,ppar 这 一 受 体 蛋 白 属于 省 醇 激 素 受 体 超 家 族 。 因 此 ,存在 于 有 关 基因 调控 区 域 中 的 ppar -结合 响应 元 件 , 可 能 同时 调控 两 个 过 程 即 CYP4 蛋白 和 过 氧化 物 酶 体 增殖 酶 的 合成 。 这 种 诱导 机 制 不 同 于 CYP1 的 诱导 ,过 氧化 物 酶 增殖 因子 是 通过 取代 与 ppar 结合 的 内 源 性 配 体 ,也 不 是 通过 结合 在 ppar 上 而 起 作用 。 对 于 后 者 (CYP1) , 配 体 与 Ah 受 体 的 结合 亲 和 性 与 CYP1 的 诱导 密切 相关 (Denomme et al. , 1985; Golas et al., 1990). 3210.3 P450 BSF (Lewis, 1996) 1. 多 环 芳烃 (如 3MC, BP, BA 和 DBA) 2. Wy BERR 2. —ACARRAR HH CLA RR 2. 地 塞 米松 3. B- 蓉 黄酮 3. DDT 3. %&{K 81H (spironolactone) 4. DIK 4. 1,4 - 双 [2-(3,5 -二 氯 - 吡 啶 基 4. 红 霉 素 (erythromycin) A) 5. 吗 | 吃 并 味 唑 5. 八 氯 苯 乙 烯 5. 利 福 平 (rifampicin) 6. 玫瑰 树 碱 6. 反 - 芪 氧化 物 6. 三 乙酰 夹 竹 桃 霉 素 (triacetyloleandomycin ) 7. TCDD 7. RRA 7. 5&2 ¢™ (clotrimazole) 8. AK 8. SRK 8. HRM (ketoconazole) 9. BRK 9. 狄 氏 剂 9. 内 源 性 糖 皮质 类 固 醇 〈 如 可 的 松 , 皮 质 醇 ) 10. BRE 10. FBR 11. 2-LBREG 12. 烟草 . 原油 注 :3MC:3 -FAEAR RM; PB: FFE; BA: FF K. DBA: —#3£& ; TCDD:2,3,7,8 -四 氯 二 葵 - po- 二 氧 蕊 。 DDT:o,o- 二 氯 二 葵 基 -三 氯 乙 烷 。 。 192 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 10.1.4 P450 基因 诱导 调控 模型 哺乳 动物 包含 至 少 17 不 同 P450 基因 家 族 , 编码 大 约 50 ~ 60 种 P450 (Nelson, 1999)。CYP1 - 4 家 族 编 码 肝 中 表达 的 酶 ,代谢 外 源 化 合 物 ( 药 物 、 环 境 化 合 物 、 其 他 异 生 素 类 ) 以 及 内 源 性 亲 脂 物质 。 这 些 基 因 在 不 同 层 次 以 不 同方 式 调节 ,表现 出 组 织 特异 性 , 可 被 内 源 性 激素 和 细胞 因子 调节 ,结构 歧 异 的 外 来 化 合 物 可 以 促进 P450 基因 转录 启 始 , Fis P450 蛋白 的 含量 。 这 种 P450 的 诱导 应 答对 于 依赖 P450 的 药物 代谢 药物 动力 学 , 药物 -药物 相互 作用 ,对 外 源 化 合 物 的 毒性 与 致癌 性 以 及 对 内 源 性 激素 的 代谢 都 有 重要 的 影响 (Conney,1982) 。 其 他 13 个 基因 家 族 (CYP 5,7,8,11,17,19,21,24,26, 27,39,46, 和 51) 不 代谢 外 源 物 质 ,而 是 以 重要 的 内 源 性 生理 物质 为 底 物 ;CYP5 和 8 MMR ABT 列 环 素 生 物 合成 有 重要 作用 ;CYP11, 17, 19 和 21 催化 从 胆固醇 到 省 醇 激素 所 需 的 羟基 化 反应 ;CYP7, 24, 27 和 51 催化 胆汁 酸 , 活 化 维生素 D3 和 胆固醇 生物 合成 所 需 的 羟基 化 作用 ;CYP26 催化 视 黄 酸 的 羟基 化 。 这 些 生 物 合成 P450 也 以 组 织 特异 性 方式 , 受 内 源 性 激素 和 其 他 因子 的 调控 。 许多 CYP1 - 4 家 族 的 P450 基因 可 被 外 源 化 合 物 转录 活化 ,通过 4 种 依赖 受 体 的 机 制 的 某 一 种 诱导 P450 基因 的 表达 。 特 异性 外 源 物 质 受 体 蛋白 在 基因 诱导 中 发 挥 关 键 作 用 ( 表 10.4)。 表 10.4 核 受 体 介 导 的 P450 诱导 2 ers we ca a Lx ET TR * 为 PAS 转录 因子 家 族 成 员 ,不 是 核 受 体 。CAR 等 的 全 称 见 表 10.5。 10.1.4.1 Ah 受 体 与 CYP1 的 诱导 Ah 受 体 是 转录 因子 中 的 PAS 家 族 (图 10.3) ,是 一 种 螺旋 - 环 -螺旋 蛋白 (Sogawa and Fujii-kuriyama,1997) , 它 促进 CYP] 基因 的 表达 。 在 胞 液 中 芳烃 配 体 与 Ah 受 体 结合 ,Ah 受 体 被 活化 ;活化 的 受 体 转移 到 核 中 ,与 核 因子 Amt RAR RA, FE DNA 增强 子 序 列 ( 异 生 素 响 应 元 件 ,XRE) 结 合 ,促进 靶 基因 的 转录 。 在 许多 细胞 类 型 和 不 同 种 间 ,以 上 过 程 是 保守 的 ,代表 了 多 环 芳 烃 对 CYP1 基因 的 诱导 机 制 。 CYP1IA1 的 转录 活化 是 通过 配 体 结 合 的 Ah 受 体 (Nebert,1989a; Nebert and Gonza- lez, 1985; Nebert et al. , 1990; Lin et al. , 1991; Fujii-Kuriyama et al. ,1989) 。 强 诱导 7] 0) — BEBE (TCDD) ¥F HK Ah 受 体 上 的 90kDa 热 休 克 蛋 白 (HSP90) 置 换 下 来 ,这 一 受 体 第 十 章 “” 细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 。 193 , DNA 结 合 ET 二 聚 体形 成 活化 作用 -一 一 与 Hsp90 缔 结 图 10.3 AhR 与 Arnt 的 结构 ( 左 ) 及 Ah 受 体 介 导 的 P450 诱导 作用 示意 图 (Sogawa and Fujii-kunyama, 1997) 再 与 另 一 蛋白 结合 ( 即 Ah 受 体 核 转运 因子 , Ah receptor-nuclear translocation factor, Amt) ,此 复合 物 从 胞 液 中 转移 到 核 中 ,再 与 CYP1A 的 调控 区 特定 部 位 结合 ,其 中 XRE1 和 XRE2 位 点 起 重要 作用 (Omura et al. , 1993). CYP1A1 与 Ah 受 体 复合 物 结合 后 ,可 以 使 CYP1A1 的 构象 发 生 弯曲 的 变化 ,这 样 在 直线 上 远离 的 片段 可 以 靠近 (Nebert,1989b)。 伴 随 Ah/Arnt 复合 体 这 种 异 质 二 聚 体 (heterodimer) 的 结合 后 DNA 构象 的 变化 可 能 导致 双 螺旋 部 分 解 链 (Richard-Foy,1994 ) , 在 与 基础 转录 元 件 (BTE) 结 合 的 阻 遏 蛋白 释放 后 ,于 启 始 位 点 暴露 出 DNA 碱 基 , 由 RNA 聚合 酶 下 催化 转录 (Hankinson,1995)。 要 触发 BTE 结合 蛋白 (BTEB) 释 放 , 要求 DNA 在 5 - 侧 辟 区 有 一 定 的 弯曲 (curvature) , 异 质 二 聚 体 与 XRE 结合 引起 的 构象 变化 可 以 向 下 游 传递 到 BTE( -43bp)。 BTEB 的 序列 分 析 表 明 ,BTEB 中 与 DNA 结合 的 特征 序列 (motif) 可 能 是 " 锌 - 指 " 结 构 (Fuji-Kuriyama et al. , 1992), 这 种 “螺旋 -转角 -螺旋 ”(helix-turn-helix) 结 构 作 为 DNA 结 合 特征 序列 在 其 他 蛋白 中 也 很 普遍 ,螺旋 结构 可 以 填 人 DNA 双 螺 旋 的 大 沟 中 (major groove). 。 可 以 推断 DNA 的 某 一 段 序列 包含 一 个 共同 的 核心 (CAGCG) ,位 于 双 螺 “ 旋 的 大 沟 中 (Kemper, 1993)。 配 体 结合 在 某 特 定 受 体 ( 如 Ah 受 体 ) 改 变 了 蛋白 的 构象 , 使 DNA 的 响应 元 件 与 蛋白 的 DNA 结合 区 更 有 可 能 发 生 相互 作用 。 受 体 的 DNA AR 征 序列 和 配 体 结合 域 在 顺序 上 可 能 臣 离 较 远 ,但 多 肽 链 被 配 体 诱导 产生 折 友 可 以 把 这 些 序列 拉 近 (Lewis et al. ,199Se) 。 10.1.4.2 “孤儿 受 体 "机制 与 CYP1 基因 的 诱导 不 同 , 另 三 种 生物 异 源 物质 的 诱导 机 制 涉及 三 种 不 同 的 “孤儿 5” (orphan receptors, 即 其 内 源 性 、 生 理 配 体 还 不 清楚 的 受 体 )。 这 些 “ 和 孤儿 受 体 "属于 核 受 体 / 省 醇 受 体 超 家 族 。 核 CAR 受 体 是 近期 发 现 的 , 介 导 葵 巴 比 妥 (PB) 和 许多 其 他 “PB 样 "的 亲 脂 化 合 物 对 CYP2B 的 诱导 作用 (Waxman and Azaroff,1992)。PXR( 又 称 - 194 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 、 功 能 与 应 用 前 景 PAR 和 SXR) 是 孕 烷 核 受 体 , 对 于 不 同 的 化 合 物 包括 某 些 天 然 和 合成 的 省 醇 的 作用 产生 应 答 ,活化 CYP3A 基因 。 第 三 类 是 过 氧化 物 酶 体 增殖 因子 活化 受 体 (peroxisome prolifer- ator — activated receptor, PPAR) AJ Wat CYP4A 家 族 中 脂肪 酸 羟 化 酶 的 诱导 ,许多 诱导 剂 属 于 *“ 非 基因 毒性 "致癌 物 和 过 氧化 物 酶 体 增殖 因子 的 酸性 化 合 物 。 所 有 这 三 类 受 体 在 肝 中 高 度 表达 ,并 对 内 源 性 配 体 产 生 应 答 。 这 些 受 体 的 内 源 性 配 体 的 发 现 ( 表 10.5) 支 持 了 这 些 受 体 在 调节 肝 CYP 表达 中 的 作用 。 表 10.5 P450 的 核 受 体 :内 源 性 配 体 及 DNA 响应 元 件 (Waxman,1999) 核 受 体 以 AGGTCA 为 基础 的 DNA 响应 元 件 can bk = Dn ran ba rs De ran 可 忆 ok %£:Ah: aryl hydrocarbon (芳烃 ) , CAR : 28 AR AY AE GES 1K (constitutive androstane receptor) PXR: 2245 X 324K (pregnane X receptor); LXR: 肝 X 受 体 (liver X receptor). PPAR :过 氧化 物 酶 体 增 殖 因子 活化 受 体 (peroxisome proliferator-activated receptor) 。 FXR: 法 尼 醇 又 受 体 (farnesol X receptor);TR: 甲状 腺 激素 受 体 (thyroid hormone receptor) 。 另外 两 个 核 受 体 LXR 和 FXR, ,可 以 分 别 被 氧 当 醇 类 (oxysterol) 和 胆汁 酸 活 化 ,它们 对 肝 P450 的 表达 也 起 着 重要 作用 一 调控 胆 当 醇 7a- 羟 化 酶 ,该 酶 为 胆汁 酸 生物 合成 过 程 中 的 关键 酶 。 外 源 化 合 物 XenoR-RXR Xo ep te Clg is (AGGTCA-N,), Bs 一 一 —} DR, 十 一 一 一 一 > ER, —> - 咱 下 , CYP 转录 10.4 核 受 体 在 CYP 基因 诱导 中 的 作用 YE: Xeno R 异 生 素 受 体 ; RXR: 类 视 黄 酸 x 受 体 ; AGGTCA: NK RKB 复 ;DRx,ERx, IRx: 表示 六 聚 体 重复 的 核 苷 酸 排 列 方向 如 箭头 所 示 (Waxman, 1999) EGR 5 种 P450 调控 的 核 受 体 属于 相同 的 核 受 体 基因 家 族 (NR1 ) ,共享 一 个 共同 的 杂 二 聚 体 配 体 即 类 视 黄 酸 X- 受 体 (RXR) ,易于 与 其 他 核 受 体 及 其 他 胞 间 信 和 号 途径 进行 交谈 式 相互 作用 (cross — talk interations) (图 10.5) ,包括 被 一 定 细 胞 因子 和 生长 因子 活 第 十 章 “细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 。 195 - 化 。 这 些 核 受 体 各自 的 内 源 性 配 体 已 被 鉴定 ,其 生理 受 体 功能 渐渐 得 到 阐明 。 由 此 推断 , 这 些 受 体 主 要 起 调节 肝 P450 活性 的 作用 , 以 响应 内 源 性 化 合 物 或 激素 的 刺激 。 因 此 P450 被 异 生 素 诱导 在 某 些 情况 下 可 能 导致 内 源 性 调节 途径 的 泰 乱 , 由 此 带 来 病 生 理学 的 后 果 。 SRACE Oi Fil t------------- > 激素 ,细胞 因子 , 生长 因子 受 体 和 转录 因子 P450 酶 SNES mI AIRES, 脂肪酸, 前 列 腺 素 代谢 图 10.5_CYP 基因 诱导 :外 源 化 合 物 与 内 源 化 合 物 调控 途径 的 相互 作用 (Waxman,1999) 10.1.5 诱导 引起 P450 的 半衰期 变化 P450 的 诱导 通常 可 以 增加 P450 A> SEA (Correia, 1991), FRABEL, SAN 转换 取决 于 其 N -未 端 氨基 酸 的 性 质 。 在 大 多 数 P450 的 N -末端 残 基 中 存在 甲 硫 氢 酸 , 这 可 能 是 诱导 产生 的 蛋白 有 较 长 半衰期 的 一 个 原因 。 诱导 增加 P450 的 半衰期 可 能 的 另 一 机 制 是 改变 P450 的 转换 率 (Jansson,1993 ) 。 P450 转换 受 cAMP 调控 的 磷酸 化 作用 控制 ,P450 变性 后 失去 血红 素 变 成 P420 ,再 被 降 解 (Jansson et wz . ,1990) 。 诱 导 剂 与 P450 结合 可 能 通过 蛋白 激酶 介 导 的 磷酸 化 作用 途 径 阻 断 P450 的 降解 (Jansson,1993 ) 。 表 10.6 P450 的 半衰期 (小 时 )(Correia,1991) 机 7 i 15 re re NE 2 ra Ne 2 可 机 a 机 re, 10.1.6 P40 诱导 的 实际 后 果 从 实际 的 角度 ,P450 的 诱导 可 以 中 改变 治疗 剂 的 功效 ,四 导致 生物 体 对 药物 或 环境 。 196 - 细胞 色素 .P450 ANA RES OL ABT 化 合 物 的 “毒化 "和 ”解毒 "的 失衡 。 10.1.6.1 P450 诱导 引起 的 治疗 剂 功效 的 改变 一 些 药物 既是 P450 诱导 剂 ,同时 还 是 它 自身 诱导 产生 的 P450 的 底 物 ,因此 诱导 剂 可 以 促进 它们 自身 的 代谢 ,这 样 就 降低 了 药物 的 药 效 时 间 和 强度 。 许多 异 生 素 促进 的 不 仅 是 它们 自身 的 代谢 ,还 促进 其 他 化 合 物 的 代谢 与 清除 ,如 人 施 用 葵 巴 比 妥 增强 了 一 些 其 他 药物 如 安 替 比 林 、 苯 安 因 (phenytoin)、 口 服 避孕 药 和 华 法 林 (warfarin) 的 清除 速率 (Park and Breckenridge,1981)。 在 大 多 数 情况 下 ,P450 诱导 引起 的 药物 相互 作用 具有 较 低 程度 的 临床 意义 ,但 如 药物 具有 低 的 治疗 指数 ( therapeutic in- dex) ,诱导 可 能 严重 抵消 其 功效 而 可 能 导致 致命 的 后 果 。 一 个 广为人知 的 例子 是 病人 在 进行 抗 凝血 治疗 过 程 中 接受 葵 巴 比 妥 ,其 血浆 中 的 华 法 林 含 量 降低 ,但 经 几 天 或 几 星 期 葵 巴 比 妥 处 理 后 , 华 法 林 剂 量 需要 增加 以 保持 达到 其 治疗 功效 的 水 平 , 如 果 中 断 施 用 苯 巴 比 “ 妥 , 由 于 “诱导 ”的 P450 活性 降低 到 “正常 ”的 水 平 , 因 此 华 法 令 的 代谢 降低 ,这 样 可 能 使 血浆 华 法 林 的 含量 高 ,导致 致命 性 出 血 (Goldberg,1980; Park and Breckenridge, 1981). 10.1.6.2 PSO 诱导 与 药物 和 环境 化 合 物 的 毒性 P450 诱导 在 生物 异 生 素 的 毒性 中 发 挥 着 复杂 作用 。 一 些 P450 可 以 将 相对 无 反应 性 的 母体 化 合 物 转化 为 具 化 学 反应 性 的 中 间 物 ,产生 的 中 间 物 具有 毒性 或 致癌 性 (carcino- genic) 。 但 是 P450 的 诱导 也 可 能 加 速 有 毒 外 源 物质 的 失 活 和 清除 。 因 此 ,P450 诱导 并 非 普遍 有 益 ,也 非 总 是 有 害 。P450 诱导 的 益 害 的 确定 需要 考虑 许多 因子 ,包括 :中 靶 标 ( 需 官 ) 或 生物 化 学 体系 ,@ 生 物 异 生 素 的 性 质 ,@ 某 种 外 源 物 质 可 以 诱导 何 种 P450 ,由 相对 于 施用 的 底 物 ,诱导 剂 服 用 的 时 间 ,@ 生 物 异 源 底 物 的 施用 方法 。 (1) 肝 毒 性 肝 是 生物 异 生 素 代谢 的 主要 部 位 , 它 也 是 反应 性 中 间 物 毒性 的 主要 犁 标 。 如 大 剂量 的 扑热息痛 (acetaminophen) 作 用 于 肝 ,可 以 产生 严重 其 至 致命 的 肝 坏 死 (Mitchell et al. , 1984)。 如 用 葵 巴 比 妥 样 (phenobarbital-like) 诱 导 剂 和 用 “MC -型 "诱导 剂 预 处 理 肝 , 则 毒 性 加 强 (Mitchell et al. ,1984) ,药物 代谢 酶 的 诱导 表现 为 不 良 的 反应 。 用 葵 巴 比 妥 预 处 理 员 齿 动物 ,可 以 加 强 省 化 茶 和 四 和 氧化 碳 的 肝 毒 性 (Mitchell et al. , 1984)。 但 将 经 MC 预 处 理 后 的 路 齿 类 动物 暴露 于 省 化 茶 和 四 和 氯 化 碳 时 ,可 免 于 肝 毒 性 (Conney, 1982; Mitchell et wz . ,1984)。 葵 巴 比 妥 和 MC 都 增加 省 化 葵 的 环 氧化 物 的 形 成 ,但 MC 处 理 的 动物 以 2,3 - 环 氧化 物 占 优势 表现 出 良性 反应 ,而 葵 巴 比 妥 处 理 动物 产 生 3,4 - 环 氧化 物 可 以 破坏 肝 中 的 关键 细胞 成 分 (Mitchell et al. ,1984) ,这 个 例子 说 明 酶 诱导 的 利 或 台 取 决 于 诱导 剂 的 性 质 ,也 取决 于 底 物 的 性 质 。 (2) P450 诱导 与 癌 症 的 关系 一 些 P450 在 致癌 物 代谢 中 起 关键 作用 ,或 者 活化 前 致癌 物 precarcinogens) BUH 型 ,或 者 使 某 些 致癌 物质 解毒 (Conney,1982; Guengerich,1988) 。P450 可 被 MC -型 化 合 物 .PB -类 化 合 物 、 乙 醇 或 异 黄 樟 素 诱 导 , 所 有 这 些 诱导 的 P450 可 以 活化 一 个 或 多 个 前 致癌 物 转换 成 能 致癌 的 分 子 型 (Guengerich,,1988) 。 例 如 ,乙醇 诱导 大 鼠 的 P450j 具有 高 的 N - 亚 硝 基 二 甲 胺 脱 甲 基 作 用 ,因此 产生 致癌 物 (Ryan et al. , 1988) , 芳 基 胺 和 氨基 联 第 十 章 “细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 - 197 > AEXt P450 1A2 的 诱导 性 与 癌症 的 诱发 有 关 (Nebert,1988b) 。 有 关 P450 在 癌症 中 作用 的 大 多 数 研究 是 针对 致癌 作用 的 过 程 , 但 要 注意 的 是 ,诱导 的 P450 在 决定 病人 对 用 于 癌症 化 疗 药物 的 反应 起 重要 作用 ,如 广 为 使 用 的 抗 肿瘤 (anti- neoplastic) 剂 环 磷 酰 胺 需要 代谢 活化 以 发 挥 其 治疗 效果 。 大 鼠 用 茶 巴 比 妥 预 处 理 可 以 提 高 某 些 环 磷 酰 胺 活化 的 致癌 中 间 物 的 量 ,而 用 MC -型 诱导 剂 ,8 - 蔡 黄 酮 降低 环 磷 酰 胺 的 活化 (Halses and Jain,1980)。 因 此 ,P450 活性 的 操纵 可 以 用 于 临床 以 达到 最 好 的 治疗 功 效 ,使 负 作用 降 为 最 低 。P450 可 诱导 性 的 改变 可 能 在 许多 肿瘤 对 传统 化 疗 药物 的 抗 性 中 起 作用 。 如 在 对 阿 霉 素 (adriamycin) 细 胞 毒性 产生 抗 性 的 乳腺 癌 细 胞 系 中 ,TCDD 不 再 诱 导 芳 烃 羟基 化 (AHHD) 活 性 (Moscow and Cowan,1988 ) 。 一 个 类 似 的 现象 发 现 于 大 鼠 肝 经 致癌 物 二 乙 基 亚 硝 胺 和 2 -乙酰 氨 东 (acetylaminofluorene) 诱 导 的 前 肿瘤 小 结 (preneo- plastic nodules) ,这 些小 结对 许多 化 合 物 的 细胞 毒性 产生 了 高 抗 性 , 且 抗 性 伴随 着 细胞 色 素 P450 含量 的 降低 (Cameron et w. ,1976) 。 在 抗 性 肿瘤 细胞 和 前 肿瘤 小 结 中 P450 含 量 和 P450 可 诱导 性 的 降低 可 能 是 肿瘤 细胞 抗 细胞 毒剂 的 机 制 的 一 个 部 分 (Fairchild et al. , 1987; Moscow and Cowan, 1988). LA FLA CYPIAL 为 例 说 明 瘤 症 与 诱导 的 关系 。 P450 1A1 表现 出 AHH 的 高 活性 , 它 可 以 被 3- MC 型 化 合 物 所 诱导 。AHH 将 前 致 瘤 物 如 葵 并 吡 转化 为 具有 化 学 反应 性 的 中 间 物 。 多 环 芳烃 的 二 醇 环 氧化 物 具 有 很 高 的 毒 性 和 致 变性 ,可 以 通过 与 关键 DNA 位 点 共 价 结合 而 致癌 (Conney,1982 ) 。 AHH 诱导 是 由 Ah 受 体 介 导 的 。 近 交 小 鼠 的 “敏感 "品系 含有 一 高 亲 和 性 型 的 Ah 受 体 , 当 用 3 — FA SEAR (MC) , 489+ EE (BP) BRARFF (BA) Ab BBE , 几 个 组 织 都 表现 出 高 的 可 诱导 性 。 而 含 低 亲 和 性 的 Ah 受 体 的 小 鼠 在 用 MC 或 其 他 未 卤 代 的 多 环 芳烃 处 理 时 ,不 表现 明显 的 AHH 诱导 作用 (Eisen et al. , 1983). “SUR” | BLE PAH 毒性 和 致癌 的 敏感 性 也 不 同 于 不 敏感 小 扇 。 “敏感 "小 鼠 比 * 非 敏感 "小 鼠 在 经 皮下 注射 MCC 或 BP 诱导 剂 后 对 纤维 肉瘤 (fibrosarcomas) 敏 感 (Nebert and Negish, 1984) ,经 气管 内 (intratracheal ) 滴 注 MC 或 BP, 易 患 肺 癌 肿 瘤 。 另 一 方面 , 不 敏感 "小 鼠 比 “敏感 "小 鼠 在 经 腹膜 内 注射 7,12 -二 甲 基 葵 基 羯 易 患 淋巴 肉瘤 (lymphosarcomas) , 经 皮下 注射 3MC 诱导 易 患 白血病 (leukemias) ,经 口服 葵 并 花 诱 导 易 患 白 血 病 (Nebert and Negishi,1984)。 由 此 可 见 “ 敏 感 " 小 鼠 (AHH 高 可 诱导 性 ) 比 “ 非 敏 感 " 小 鼠 在 经 多 环 芳烃 诱导 后 ,对 某 些 肿瘤 敏感 而 对 另 一 些 亚 性 肿瘤 不 敏感 。 这 些 现象 表明 给 药 途 径 在 决定 P450 诱导 对 生物 体 好 或 坏 方面 的 重要 性 ,也 表明 驱 露 在 异 生 素 的 生物 体 其 遗传 学 特征 的 重要 性 。 具 AHH 高 诱导 性 的 “敏感 "小 鼠 , 在 前 致癌 物 与 组 织 更 直接 接触 的 情况 下 ,具有 更 大 的 致癌 风险 。 相 反 ” 非 敏 感 " 小 鼠 , 远 离 前 致癌 物 给 药 部 位 的 靶 标 位 点 肿瘤 发 生 的 风险 更 大 (Nebert and Negishi, 1984; Okey et wy . ,1986) 。 如 果 前 致癌 物 如 BP 口服 或 经 皮下 注射 人 “敏感 "小 鼠 ,BP 快 速 诱 导 肝 中 高 水 平 的 AHH 活性 ,诱导 的 AHH 活性 可 以 有 效 地 代谢 BP, 肝 的 这 一 作用 降 低 了 前 致癌 物 向 其 周边 组 织 如 肺 \ 皮 肤 或 骨 侯 传送 ,因此 降低 了 这 些 组 织 致 癌 作 用 的 风 险 。“ 非 敏感 "小 鼠 的 基础 肝 AHH 活性 低 , 经 BP 作用 后 ,活性 无 明显 上 升 , 因 此 肝 不 能 有 效 地 清除 BP。 由 于 肝脏 ”第 一 步 清 理 " 作 用 不 力 ,使 BP 通过 血液 循环 传递 到 周边 组 织 。 如 果 前 致癌 物 直接 用 于 肿瘤 敏感 的 组 织 如 肺 或 皮肤 ,AHH 的 高 度 诱 导 意 义 不 大 , 因为 AHH 的 活性 可 以 有 效 地 将 前 致癌 物 转变 为 致癌 反应 性 中 间 物 ,这些 中 间 物 在 这 些 组 织 中 不 容易 被 结合 和 分 泌 ( 不 如 肝脏 )。 从 以 上 例子 可 以 看 出 ,诱导 作用 的 好 坏 ,不 能 简单 地 下 - 198 - 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 10.2 细胞 色素 P450 的 抑制 已 知 P450 具有 许多 的 抑制 剂 ,其 中 有 些 是 P450 同 工 酶 特异 的 。P450 酶 被 抑制 的 机 制 有 几 种 ,可 以 将 P450 的 抑制 剂 分 为 几 种 特定 类 型 。 10.2.1 竞争 性 抑制 剂 与 P450 竞争 分 子 氧 或 底 物 的 抑制 剂 ,这 类 抑制 剂 可 与 血红 素 铁 或 P450 的 活性 位 点 结合 ,如 CO 可 与 氧 竞 争 与 血红 素 的 结合 ,类 似 的 分 子 包 括 NO,CN AF BULD (Hill et al. , 1970a) ,这 些小 分 子 配 体 是 强 的 x- 受 体 。 除 以 上 小 分 子 外 ,还 有 许多 有 机 P450 抑制 剂 ,它们 可 以 连结 血红 素 分 子 , 但 本 身 也 是 P450 的 底 物 ,这 些 有 机 配 体 都 含有 负电 性 原 F(N XO) RESP MS MLR RBC. ASABE A GOR, = sae BE, BK BK We ARIF SAG SAG Me Pr-Dn 键 作 用 以 及 可 能 将 在 P450 中 保守 的 半 胱 氨 酸 上 的 Site (SH) HF EE HE TH] ZT FR (Hawkins and Dawson,1992 ) ,成 为 血红 素 的 特别 好 的 配 体 。 抑 制剂 上 的 其 他 基 团 也 有 可 能 与 P450 活性 位 点 上 的 某 些 残 基 相互 作用 (Correia and Ortiz de Montellano, 1993). 负电 性 配 体 原 子 ( 即 N 或 O) 并 不 一 定 必须 在 芳香 环 上 才 有 抑制 作用 ,脂肪 胺 和 醇 亦 有 可 能 作为 P450 的 抑制 剂 。 10.2.2 , 不可逆 和 机 制 型 抑制 剂 机 制 型 抑制 剂 是 指 化 合 物 经 酶 的 作用 而 活化 ,由 此 可 与 血红 素 分 子 或 蛋白 质 的 活性 位 点 结合 (Testa,,1990) ,后 者 如 SKF - 525A 和 和 毛 霉 素 (chloramphenicol) 。 还 有 一 些 与 血 红 素 结合 的 抑制 剂 是 以 自杀 底 物 (suicide substrate) 方 式 起 作用 ,如 甲 撑 二 氧 茶 。 另 一 类 自杀 抑制 剂 是 卤 代 烷 , 特 别 是 小 分 子 量 的 氯 代 烷 如 氯仿 ,四 氯 甲烷 ,它们 形成 亚 碳 中 间 体 以 相 类 似 甲 撑 二 氧 葵 的 方式 与 血红 素 连 接 (Testa and Jenner, 1981). 另 一 类 重要 的 可 以 与 血红 素 不 可 逆 结 合 的 机 制 型 抑制 剂 是 末端 烽 或 烯 ,如 P450 的 专 性 抑制 剂 gestodene、 开 环 巴 比 妥 (secobarbital ), Hi A BE FW SE Z. BH AE (allylliso- propylacetamide) Fil Z. REE — BE (ethinylestradiol) (Murray, 1992), RUA Kina Me AUR AS P450 4H aT ACHE FA Ae Ci IM ie dF ZT RFA OM RE Wi (Correia and Ortiz de Montellano,,1993) 。 这 种 化 合 物 的 作用 伴随 着 血红 素 的 失 活 和 破 坏 , 因 此 是 非 竞争 性 的 。 还 有 一 些 其 他 类 型 的 化 合 物 也 可 产生 不 可 逆 作 用 (类 似 于 末端 含 Ns BIR BY HEFT ZT FEE CE A) , SA is AL th = UG (diazenes) , AHH ( phenyhy- drazine) (phNHNHz) #il ££ (th HE, 2 SE AE F- = WA (aminobenzotriazoles) , bé 3E — Al ok WE (alkyldihydropyridines) LA — es — AEM ( dialkydihydroquinolines) #5 P450 的 辅 基 血红 素 反 应 ,形成 共 价 结合 的 血红 素 加 合 物 (Ortiz de Montellano and Reich, 1986). 除 与 血红 素 或 活性 位 点 共 价 结合 的 P450 抑制 剂 外 ,还 有 一 些 化 合 物 可 与 P450 的 某 第 十 章 ”细胞 色素 P450 基因 表达 调控 机 制 - 199 - 些 类 型 的 氨基 酸 残 基 如 赖 氨 酸 和 半 胱 氨 酸 反应 ( 表 10.7)。 微 粒 体 CYP2B4 的 表面 暴露 的 赖 氨 酸 残 基 被 不 可 逆 化 学 修饰 ,可 能 抑制 P450 的 活性 (通过 阻 断 P450 与 其 氧化 还 原 搭档 相互 作用 )。 另 一 类 更 特异 性 的 P450 抑制 剂 是 抗体 ,它们 也 与 表面 特征 有 关 。 识 别 P450 表面 的 抗原 决定 于 其 产生 的 抗体 可 以 阻 断 P450 与 其 氧化 还 原 搭档 的 相互 作用 (Edwards et al. , 1995; Murray et al. , 1993a) ,抗体 也 有 可 能 阻碍 底 物 进入 血红 素 , 这 两 种 情况 特异 性 抗 体 都 起 抑制 剂 作用 。 10.2.3 金属 离子 作 P450 的 抑制 剂 金属 离子 可 以 抑制 P450 ,但 通常 对 P450 不 表现 特异 性 (Testa and Jenner,,1981)。 目 前 有 些 证 据 表 明 ,如 硝酸 铅 优 先 抑制 CYP1A2(Degawa et al. ,1993 ) , 而 锅 和 冬 盐 可 以 抑 fii] CYP2E ,但 不 抑制 CYP3A(Alexidis et al. ,1994) 。 金属 离子 如 Co 作为 P450 的 抑制 剂 的 可 能 机 制 是 Co 能 抑制 血红 素 的 生物 合成 和 增强 血红 素 的 降解 速率 。 除 一 些 其 他 过 渡 金 属 和 重金 属 离子 外 ,也 发 现金 属 盐 具有 相 同 的 机 制 。 锅 的 作用 方式 可 能 不 同 , 它 是 通过 促进 P450 转化 为 其 失 活 态 的 P420 而 起 作用 。 这 可 能 涉及 到 与 硫 醇 或 羧 酸 基 团 的 结合 而 影响 蛋白 质 的 构象 ,其 作用 位 点 在 血红 素 结合 位 点 附近 ,有 可 能 是 连接 血红 素 的 保守 半 胱 氨 酸 。 血 红 素 远 端 . 保 守 苏 氨 酸 上 游 某 位 置 的 保 守 酸 性 残 基 ( 天 冬 氢 酸 或 谷 氨 酸 ) 也 有 可 能 与 Co 结合。 10.2.4 P450 抑制 剂 的 应 用 P450 在 生物 体 具 有 重要 的 物质 代谢 作用 ,其 催化 作用 的 抑制 可 以 改变 物质 的 代谢 途 径 或 速率 。 由 于 P450 介 导 的 某 些 反应 是 与 生理 有 关 的 ,特别 是 有 些 P450 与 当 醇 代谢 的 密切 联系 ,设计 可 以 抑制 生 和 省 醇 途径 的 抑制 剂 以 控制 疾病 真菌 侵 染 和 其 他 方面 具有 重要 的 临床 意义 (Correia and Ortiz de Montellano, 1993), P450 抑制 剂 是 有 效 的 杀菌 剂 ,一 些 吡咯 类 (azole) 衡 生物 可 以 抑制 从 羊毛 当 醇 到 才 角 省 醇 的 生物 合成 途径 ,其 中 的 C- 14 脱 甲 基 步 又 是 由 真菌 P450 CYPS1 催化 的 。 另 一 些 P450 的 抑制 剂 主要 用 于 不 同 癌症 的 处 理 , 如 绝经 后 的 乳腺 癌 、 前 列 腺 癌 以 及 相关 的 病症 ,如 良性 的 前 列 腺 增生 (Correia and Or- tiz de Montellano,1993) 。 在 高 血压 醛固酮 过 多 症 (hyperaldosteronism) 的 处 理 以 及 缓解 花生 四 烽 酸 、 视 黄 酸 代 谢 异 常 相关 的 病状 也 有 潜在 的 用 途 (Correia and Ortiz de Montel- lano,1993) 。 特 别 是 芳 化 酶 (CYP19) 抑 制剂 已 应 用 于 乳腺 癌 的 治疗 ,而 抗 前 列 腺 剂 (anti- prostatic agents) 中 包括 具有 抑制 CYP17 和 CYP19 的 化 合 物 。 药物 代谢 途径 的 预测 对 于 药物 开发 很 关键 ,因此 ,根据 抑制 原理 设计 P450 介 导 代谢 作用 的 诊断 探 针 ,可 用 于 药剂 的 筛选 。 表 10.7 例 出 了 一 些 P450 的 特异 性 抑制 剂 。P450 的 抑制 剂 还 可 用 作 植 物 生 长 调节 (Coulson et al. ,1984) 新 除草 剂 开 发 、 抗 微生物 剂 和 杀 菌 剂 等 (Durst,,. 1991; Durst and Benveniste, 1993), - 200 . 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 表 10.7 P450 的 特异 性 抑制 剂 (Lewis,1996 ) 机 =IC = 206 2E1 二 烯 两 基 化 硫 (diallyl sulfide) 11Al (20R) — 20 — phenyl — 5— prognene - 38,20 — diol 17A1 (1S,2S,3S,5R)-( + )- 异 松 菊 烯 基 - 4 -咪唑 基 乙 酸 酯 | 4 - 环 已 基 - 甲 基 - 2(4 -吡啶 基 )- 丙 酸 酯 19A1 vorezole, ‘amsinogtatet sande ; Xt P450 底 物 结构 专 一 性 以 及 P450 的 活性 特征 的 了 解 , 有 助 于 设计 P450 的 专 一 性 抑制 剂 (Halpert,1995) 。 专 一 性 P450 抑制 剂 除 具 有 与 血红 素 结合 的 结构 ,或 有 与 P450 与 底 物 结合 袋 中 的 特定 氨基 酸 相互 作用 的 能 力 外 ,在 拓扑 上 还 要 有 与 活性 位 点 的 互补 特 征 。 例 如 ,P450 2D6 专 一 性 抑制 剂 奎 尼 定 (quinidine) 具 有 两 个 起 关键 作用 的 氮 原 子 ,一 个 位 于 嘲 啉 核 上 , 它 的 作用 是 与 血红 素 连 接 , 而 位 于 奎 宁 环 的 氮 在 生理 pH 条 件 下 可 以 质子 化 ,而 与 2D6 活性 位 点 的 天 冬 氮 酸 残 基 发 生 离 子 对 作用 。 另 外 ,在 奎 尼 定 还 有 一 羟基 ,与 位 于 血红 素 囊 附近 的 互补 氨基 酸 残 基 ( 可 能 是 丝氨酸 ) 形 成 氢 键 (Lewis,1995a) 。 参考 xX 献 Alexidis AN, Rekka EA, Kourounakis PN. 1994. 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Commun. , 201:973~979 第 十 一 章 ”细胞 色素 P4550 基因 的 异 源 表 达 系 统 随 着 分 子 生 物 学 和 重组 DNA 技术 的 发 展 , 人 们 可 以 对 P450 基因 进行 操作 ,并 在 异 源 的 体系 中 表达 。 蜡 源 表达 与 天 然 表 达 的 关系 可 见 图 11.1。 有 目标 P450 基因 的 cDNA 可 在 多 种 表达 系统 中 表达 ,用 细菌 .酵母 .昆虫 ,还 是 哺乳 动物 细胞 表达 系统 取决 于 各 自 的 目 标 、 费 用 方便 程度 以 及 所 需 产 量 。 p4so 3] w mRNA aE 。 P450 蛋白 (自然 表达 ) 反 转 录 酶 cDNA ECRA” | 鸣 菌 体 包装 质粒 克隆 特定 全 长 cDNA 异 源 表 达 一 ww P450 和 蛋白 表达 载体 mRNA 构建 和 基因 转移 图 11.1 P450 KR (native) FF WF (heterologous) #iK (Doehmer and Griem, 1993) 11.1 哺乳 动物 细胞 色素 P450 基因 的 异 源 表达 系统 11.1.1 在 细菌 中 的 表达 KiGt RR (E. coi ) 常 用 于 P450 的 表达 ( 表 11.1) , 它 的 优点 是 :四 表达 水 平 高 ,@ 容 易 操 作 ,GD 有 许多 菌株 突变 体 和 含 强 启动 子 的 载体 可 供 使 用 (Friedberg et a! .,1999)。 其 缺点 是 在 大 多 数 情况 下 ,哺乳 动物 cDNA 在 表达 以 前 , 先 要 经 修饰 。 除 修饰 前 切 P450 cDNA 的 5 和 3- 非 翻译 区 外 , 启 始 密码 子 也 需 修 饰 以 免 哺乳 动物 的 mRNA 形成 2 级 结构 (Friedberg et al. ,1999 ) 。 真 核 细 胞 的 细胞 色素 P450 紧密 与 大 肠 杆菌 的 细胞 成 分 联结 ,这 对 该 细胞 成 分 产生 负担 ,而 且 活性 酶 需要 非 共 价 血红 素 的 产生 并 挫 人 到 新 生 的 多 肽 中 ,这些 特 征 表 明 高 效 表 达 异 源 P450 对 于 大 肠 杆 菌 ( 宿 主 细胞 ) 可 能 带 来 问题 。 但 现在 已 建立 了 越 来 越 多 的 表达 系统 成 功 地 用 于 表达 细胞 色素 P450 ,在 某 些 情况 下 ,表达 量 超过 500nmol /L, 为 人 们 提供 "2206 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 了 大 量 的 具有 酶 活性 的 蛋白 。 表 11.1 P450 在 大 肠 杆 菌 中 的 表达 (Gonzalez and Korzekwa, 1995) P450 修饰 载体 细胞 产量 rpCYP2FE1 无 pKKHC MV1304 0.3% rbCYP2E1 NH), 端 去 除 第 3 一 29 氨基 酸 pKKHC MV1304 0.1% raCYP7AI1 NH) 端 去 除 第 3 一 24 氨基 酸 pPKK233 一 1 XL1-Blue 2.0% bpCYP17A1 人 pCWOrit JM1-0 16mg/L GC ‘TTATTA = TY CYP2C3 用 经 修饰 的 CYP17Al 替代 pCWOrit JM109 400nmol/L hCYPIA2 用 经 修饰 的 CYPITAL 替代 pCWOrit JM109 700nmol/L CYP4A11 用 经 修饰 的 CYPITAL 替代 pCWOrit JM109 40nmol/L bCYP4A1-OR ”用 经 修饰 的 CYP17AIL BH pCWOrit NR 700nmol/L CYP3A4-OR 用 经 修饰 的 CYPI7A1 替代 pCWOrit DH5a 200nmol/L CYPI7A1-OR ”用 经 修饰 的 CYP17A1 HK pCWOrit DH5a 700nmol/L CYP3A4 NH), 端 切除 第 3 一 12 AMR pCWOrit DH5a 370nmol/L hCYP1A2 用 经 修饰 的 CYPITAL 替代 pCWOrit DHS5a 245nmol/L CYP2C9 用 经 修饰 的 CYPITAL 替代 pCWOrit DHS5a 20nmol/L hCYP2E1 Glu) ,其 表现 为 叶片 宽度 加 大 , 节 间 和 叶柄 变 短 。 将 这 突变 体 在 rot3 - 二 亲本 中 表达 ,植株 叶片 宽度 加 大 ,叶柄 不 变 。 转 基 因 植 物 与 野生 植物 和 rot3 - 1 植物 具有 相同 长 度 的 节 间 ,但 前 者 节 间 厚度 是 后 者 的 1.5 售 。 F3'5 H ers mascara iefap ser ca ab “Oe (O)-OF mah te Ole oe 6 OH 0 4 ,5,7 - 三 羟 黄 烷 酮 TERA F3H F3H F3'S'H OH OH HO O OH HO. O @& on 4 Ee a OH F3’s'H & FB... O ; , OH OH , OH f “OH OH O OHO :7 ate OH O — supe — Sued 3 DER DER | 3GT 3GT KEK - 3 - 葡 糖苷 花 青 素 - 3 - 葡 糖 苷 TERR - 3 - 区 糖苷 COF3H: 黄 烷 酮 3 - 羟 化 酶 ,F3'H: 类 黄酮 3 一 羟 化 酶 ,F3 S'H: 类 黄酮 3 ,5 一 羟 化 酶 , DFR :二 氢 黄 酮 醇 - 4 -还 原 酶 ,3GT:UDP - 葡 糖 类 黄酮 3 - O - 葡 糖 基 转 移 酶 @ 矮 牵 牛 中 ,由 于 DFR 底 物 特异 性 ,不 能 产生 天 葵 素 衍生 物 。 - 242 , 细胞 色素 PASO 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 12.2.2.4 抗 除草 剂 的 转基因 植物 植物 细胞 色素 P450 在 除草 剂 选择 性 和 抗 性 中 发 挥 重要 的 作用 。 在 植物 中 已 克隆 鉴 定 了 几 种 P45$0(CYP71A10,CYP71A11,CYP73A1,CYP76B1,CYP81B1,CYP81B2 ) 表 现 出 除草 剂 的 代谢 活性 。 在 哺乳 动物 肝 及 昆虫 的 微粒 体 中 也 发 现 许 多 具有 催化 除草 剂 代谢 解毒 的 P450(Ohkawa et al. ,1998) 。 因 此 ,将 这 些 基因 转 人 到 植物 体 中 ,可 望 培育 出 有 代 谢 外 源 物 质 的 转基因 植物 ,以 增强 作物 抗 性 ,降低 农药 残留 ,甚至 可 用 于 植物 净化 (phy- toremediation ) 。 (1) 转 基因 (大 筷 CYPIA1) AF 在 烟草 中 转 和 人 大 鼠 CYP1A1 cDNA 以 及 大 鼠 CYP1A1/ 酵 母 P450 还 原 酶 融合 酶 基 因 ,表达 出 定位 于 微粒 体 的 相应 酶 。 离 体 试验 表明 转基因 植物 比 对 照 表 达 出 更 高 的 7- 2 氧 香 豆 素 活性 ,并 对 绿 麦 隆 产 生 抗 性 (Shiota et al. ,1996)。 转 基因 植物 具有 与 对 照相 同 EA) WC ES FRY HP MC - 绿 麦 隆 的 能 力 , 但 对 绿 麦 隆 的 代谢 速率 要 比 对 照 植物 快 。 绿 麦 隆 代 谢 是 通过 环 - 甲 基 羟 基 化 和 N - 脱 甲 基 作 用 。 环 - 甲 基 羟 基 化 作用 的 加 强 是 转基因 植物 对 除草 剂 抗 性 的 原因 。 这 些 转基因 植物 表现 出 对 阿 特 拉 津 (AT) 和 pyriminobac-methyl PM 等 除草 剂 的 抗 性 , 即 单一 P450XCYP1A1 在 植物 中 表达 可 能 产生 对 不 同 除草 剂 的 交互 抗 性 (Inui et al. ,1998). (2) 转 基因 (人 类 CYPIAI) 3H 日 本 Kobe 大 学 的 Ohkawa 研究 室 将 人 的 CYPIA] 基因 转 人 马铃薯 中 (Inui et al., 1999) ,获得 了 表达 人 类 CYPIAI 的 S1384 和 表达 人 类 CYPIA1 /酵母 NADPH -细胞 色 素 P450 还 原 酶 (YR) 融 合 酶 的 F1386 和 F1515$。 转 基因 植物 S1384 和 F1515 可 以 分 别 表 达 产 出 CYP1A1 和 其 融合 蛋白 。 离 体 分 析 显 示 ,转基因 植物 S1384 ,F1386 和 Fl1515 的 7 - 乙 氧 香 豆 素 O - 脱 乙 基 作 用 是 对 照 植物 的 3.5,4.2,3.8 倍 ,[HC] 绿 麦 隆 (CT) 体 内 代谢 活 性 是 对 照 的 6.4,5.8 和 5.3 倍 之 间 无 显著 的 差异 ,这 表明 CYP1A1 的 单独 表达 对 转基因 马 铃 昔 是 合适 的 ,无需 表 达 融 合 酶 。 转 基因 植物 S1384 表现 出 对 AT 和 PM 的 耐 受 性 ,而 S1386 和 F1515 仅 表 现 出 对 PM 的 耐 受 性 ,但 对 照 植 物 经 AT 和 PM 处 理 后 均 致 死 。 这 些 结果 表明 表达 人 类 CYPIAL 的 植物 可 以 代谢 结构 和 除草 机 制 不 同 的 除草 剂 (CT 和 AT) ,由 此 产生 了 对 CT AT 以 及 PM 等 除草 剂 的 交叉 耐 受 性 。 S1384 植物 对 除草 剂 的 代谢 主要 通过 环 - 甲 基 羟 基 化 和 N - 脱 甲 基 作 用 (图 12.10A), 部 分 植物 毒性 的 中 间 物 DM( 图 12.10) 在 S1384 植物 中 比 对 照 少 。DM 可 能 进一步 在 S1384 中 被 代谢 形成 无 植物 毒性 的 中 间 体 如 DMOH 和 与 葡 糖 的 结合 物 ,这 些 结果 与 表达 Kit CYP1A1I 的 转基因 马铃薯 相 一 致 。 转基因 S1384 植物 对 除草 剂 AT 的 耐 受 性 是 因为 双 脱 烷 基 代谢 中 间 物 DIDE 的 积 累 。 从 图 12.10B 可 以 看 到 ,[&C]AT 产 生 DIDE 是 通过 脱 丙烷 作用 后 再 经 脱 乙 基 作 用 , S1384 产生 的 DIDE 是 对 照 的 5 倍 , 而 F1386 与 对 照相 同 。 因 此 ,S1384 表现 出 的 对 AT 耐 受 性 比 F1386 和 Fl1515 高 ,可 能 是 由 于 形成 DIDE 的 能 力 更 强 的 缘故 。 (3) 转 基因 (大 豆 CYP71AI10 ) 烟 草 从 大 豆 中 克隆 的 CYP71AI10 基因 转 人 烟草 中 ,用 剪 叶片 作 的 体内 实验 表明 , 转 71Al10 基因 的 烟草 对 4 种 除草 剂 的 代谢 比 对 照 植物 更 强 ( 表 12.5)。 由 于 71Al0 介 导 的 — eee 第 十 二 章 ”细胞 色素 P450 的 应 用 , 243 , 人 —_ Bel HE, KE Pb i gaa airy O OP i CH HOCH NHCNZ CH cri {oats ‘ : CH; - Cl DM DMOH (部 分 植物 毒性 ) (无 植物 毒性 ) Cl fF B | H.CHNSySNHCH(CH,), 转基因 HLS ae as mua eke Cl Gl Aa A N* ~N N N oe HN ANHCH(CH), DI DE ( 部 分 植物 毒性 ) (部 分 植物 毒性 ) RI DN bis ie N* “N HNAw Ann, DIDE (无 植物 毒性 ) 图 12.10 高 等 植物 中 绿 麦 隆 (A) 和 阿 特 拉 津 (B) 的 主要 代谢 途径 除草 剂 代谢 ,转基因 植物 明显 增强 对 利 谷 隆 和 绿 才 隆 的 抗 性 (Siminnsky et al. ,1999)。 R125 葵 基 脲 除 草 剂 代谢 剪 叶 12h 后 测定 代谢 (% )(X+SE) 除草 剂 CYP71A10 转化 xt FR 优 草 隆 fluometuron 91(4.5) 15(0.6) #4 KE linuron 87(2.0) 12(2.6) $83 ME chlortoluron 85(2.0) 39(7.5) 敌 草 隆 diuron 49(7.0) 20(2.0) 虽然 CYP71A10 具有 代谢 4 种 除草 剂 的 能 力 , 但 因 产 生 的 代谢 物 毒 性 的 差异 , 转 基 因 植物 对 除草 剂 表现 的 抗 性 有 所 不 同 。 优 草 隆 和 敌 草 隆 的 N - 脱 甲 基 代谢 物 ,其 毒性 比 其 母体 化 合 物 毒性 仅 微弱 降低 ,而 N - 脱 甲 基 利 谷 隆 几 乎 没有 除草 活性 。 在 对 照 植物 中 , 绿 麦 隆 也 较 大 程度 地 被 代谢 ,但 经 检测 其 代谢 中 间 物 主要 是 仍 有 毒性 的 N - 脱 甲 基 的 绿 麦 隆 ,而 在 转基因 植物 中 , 绿 麦 隆 的 代谢 产物 为 无 毒性 的 羟基 化 或 双 脱 甲 基 化 代谢 物 。 - 244 . 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 优 草 隆 Cl Cl es Cl RESO eae ° _ ,CH, a Pee aa ae i O 公 tt _ CH 利 谷 隆 机 wun Cl Cl 6) O f _ CH; ae =C— a agen ad Ys C-N、cH sy CN、CH, 优 草 隆 , 利 谷 隆 , 绿 草 隆 , 敌 草 隆 及 其 代谢 物 的 结构 12.2.2.5 CYP105A1 在 分 子 生 物 学 研究 和 育种 中 的 应 用 CYP105A1 是 土壤 细菌 ( Streptomyses griselus ) 中 编码 P45S0sw; HHA, CRAB 酰 尿 类 除草 剂 的 未 端 氧化 酶 (O'keefe et al. ,1988) 。 因 其 代谢 中 间 物 与 植物 中 的 酶 相似 , 常用 于 植物 P450 对 除草 剂 代 谢 作 用 的 模式 系统 。 CYP105A1 在 烟草 (Nicoriaza tabacum ) 中 的 表达 研究 发 现 , 它 的 功能 表达 要 求 该 P450 靶 向 叶绿体 的 基质 ,表明 P450 严格 依赖 于 铁 氧 还 蛋白 。 酶 活性 测定 和 转基因 植物 的 除草 剂 耐 受 性 测定 结果 显示 ,除草 剂 (R7402) 被 P450sul N - 脱 烷 基 化 作用 产生 的 中 间 物 比 R7402 本 身 毒 性 更 高 。 具 有 P450sul 活性 的 植物 比 无 P450sul 的 植物 更 易 受 到 R7402 的 毒害 。 将 P450sul 在 植物 特定 组 织 中 表达 ,可 以 将 具有 植物 毒性 的 R7402 中 间 体 隔离 在 单 一 植物 组 织 。 如 在 烟草 花药 的 绕 秸 层 特异 性 表达 P450 sul ,用 R7402 处 理 其 未 成 熟 的 花 芽 , 可 以 降低 花粉 的 活力 ,达到 化 学 雄性 不 变 的 目的 ,为 杂交 种 子 的 生产 提供 新 的 途径 (O keefe et al. ,1994)。 EGR LO 第 十 二 章 ”细胞 色素 P450 的 应 用 。 245 - 12.2.3 P450 在 环境 监测 和 保护 中 的 作用 12.2.3.1 P450 用 作 环 境 污染 的 指示 剂 环境 污染 物 可 能 抑制 或 诱导 生物 体 P450 酶 系 的 活性 。 根 据 污染 物 浓 度 与 酶 活性 的 定量 关系 ,可 以 预测 环境 污染 的 程度 。 鱼 肝 的 加 单 氧 酶 活性 可 以 被 许多 化 合 物 诱导 ,如 多 环 芳烃 (PAH) ,8B- 蔡 黄酮 (BNF ) 。 极 性 氯 代 芳 烃 包 括 二 咀 英 (TCDD) 可 以 强烈 诱导 芳烃 产 基 化 (AHH) ,7 - 乙 氧 试 灵 讽 -O- 脱 乙 基 活 性 (EROD) 和 7 - 乙 氧 香 豆 素 - O - 脱 乙 基 活 性 (ECOD)(Schenkman and Griem, 1993). 在 昆虫 中 ,P450 酶 系 活 性 也 因 暴 露 于 外 源 物质 而 变化 ,Sturmn 和 Hansen(1999) 报 道 摇 蚊 (Chiroxzomzzs riparius) 的 ECOD 和 EROD 活性 ,在 接触 浓度 为 S0wg 夺 的 3,4 -二 和 氧 苯胺 中 4d 后 ,活性 被 抑制 30% , 然而 在 蔡 的 作用 下 , 酶 活性 被 诱导 至 对 照 的 1.3 倍 。 Miota (2000 ) 报道 了 另 一 种 摇 蚊 ( Chironomus tentant ) 幼虫 暴 圳 在 含 阿 特 拉 津 (atrazine) 的 情况 下 ,其 艾 氏 剂 环 氧化 活性 上 升 ,微粒 体 的 SDS- PAGE 电泳 图 谱 中 45kDa 的 蛋白 带 明 显 增强 。 12.2.3.2 ”细胞 色素 P450 在 生物 除 污 中 的 应 用 人 类 社会 产生 的 有 毒 废物 日 次 增多 ,人 迫切 需要 开发 一 种 有 效 的 途径 以 解毒 或 降解 这 些 废物 。 特 别 是 多 环 芳烃 及 多 贞 代 有 机 物 ,它们 的 生物 利率 低 且 在 化 学 上 是 惰性 的 ,成 为 环境 污染 治理 的 一 大 难题 。P450 酶 系 可 以 通过 羟基 化 、 环 氧化 \. 脱 烷 基 化 、 脱 卤化 氢 等 作 用 催化 多 种 结构 不 同 的 物质 ,使 许多 类 型 的 化 合 物 的 化 学 性 质 发 生 改 变 。 人 类 创造 的 环 境 化 合 物 ,估计 已 超过 200 000 种 ,其 中 大 多 数 可 能 是 P450 的 底 物 。 生 物 中 的 P450 具有 的 降解 外 来 物质 特有 的 内 在 能 力 以 及 广泛 不 同 的 底 物 谱 , 在 环境 的 生物 除 污 应 用 中 具有 广阔 的 前 景 。 (1) 天 然 P450 的 利用 微生物 P450 无 处 不 在 ,它们 具有 强 的 还 原 和 氧化 能 力 , 对 于 环境 的 生物 净化 十 分 有 用 。 近 期 的 工作 证 明 ,天 然 存 在 的 P450 可 以 降解 除草 剂 阿 特 拉 津 , 硫 代 氨基 甲酸 酯 以 及 i GE (Kellner et al. ,1997) 。P450cam 是 目前 了 解 得 最 清楚 的 细胞 色素 P450 , 它 来 源 于 假 单 抱 菌 , 除 具 有 烷烃 羟基 化 活性 以 外 , 它 还 具有 还 原 脱 卤 作 用 ,如 六 氯 乙 烷 和 五 毛 乙 烷 经 P450cam 还 原 脱 卤 作 用 被 分 别 转化 为 四 氯 乙烯 和 三 氯 乙烯 (Li and Wackett,1993)。 六 氯 乙 烷 具 有 与 该 P450 的 天 然 底 物 (樟脑 ) 相 当 的 结合 亲和力 和 宫 互 补 性 。P450cam 还 具 有 氧化 三 氯 乙 烷 和 1,2 -二 氯 两 烷 产 生 1,1,1 -三 氯 乙醇 和 氯 丙酮 的 作用 。 随 着 分 离 鉴 定 的 P450 数量 的 增加 ,人 们 还 会 发 现 许 多 具有 "生物 除 污 "意义 的 P450。 (2) 工 程 化 的 P450 1) 定 点 诱 变 产 生 的 P450 ”应 用 有 关 P450 活性 位 点 的 研究 成 就 ,有 可 能 重新 设计 P450 的 活性 部 位 以 结合 和 催化 P450 的 非 天 然 底 物 。P450 底 物 结合 囊 的 细微 改变 ,可 以 改 变 P450 的 底 物 特异 性 和 催化 效率 ,通过 修饰 P450 酶 可 以 用 于 特定 的 环境 污染 物 的 生 物 净化 。 - 246 , 细胞 色素 P450 BARN ZY RES AR P450cam 活性 部 位 氨基 酸 残 基 在 控制 酶 的 底 物 结合 和 氧化 作用 中 的 作用 ,已 通过 诱 变 的 方法 进行 了 研究 。Loida 和 Sligar(1993) 证 明 ,将 小 分 子 的 非 天 然 底 物 如 乙 基 葵 限 定 在 靠近 血红 素 的 P450cam 突变 体 可 以 提高 底 物 氧化 作用 的 偶 联 效率 , 且 各 活性 部 位 的 突 变 效应 是 累加 的 。 分 子 动力 学 模拟 研究 表明 ,通过 Phe87Trp 突变 降低 小 分 子 如 五 毛 乙 烷 在 P450cam 活性 中 心 中 的 构象 自由 度 , 可 以 提高 脱 卤 作用 效率 (Manchester and Om- stein, 1995), Wong 及 其 同事 发 现 ,P450cam 的 1 个 或 2 个 活性 位 点 的 突变 ,可 以 改变 其 底 物 的 特 异性 ,他 们 得 到 的 P450cam Y96A 突变 体 具有 和 氧化 如 二 苯 基 甲烷 这 些 不 被 天 然 P450 酶 氧 化 的 物质 。Y96A 以 及 Y96F 起 作用 的 区 域 和 立体 选择 性 也 与 野生 种 类 不 同 。Y96A 突 变 体 的 底 物 结合 吉 具 有 更 大 的 空间 ,表示 它 对 底 物 的 要 求 可 能 具有 更 大 的 可 塑性 (Jones et al. ,1996;England et al. ,1996)。 2) 随 机 诱 变 产生 的 P450 ,” 除 推理 设计 外 ,还 可 通过 随机 诱 变 的 方法 产生 具有 生物 除 污 意义 的 新 的 P4530。 这 种 方法 的 优点 是 可 以 迅速 筛选 出 所 希望 表 型 的 P450 , 而 无 需 先 预测 。 对 于 P450 结构 未 知 的 情况 下 ,随机 突变 十 分 有 用 (Kellner et al. ,1997)。 构 建 这 种 P450 的 一 个 新 的 技术 是 通过 DNA 改组 (Stemmer, 1994a; 1994b)。DNA 改组 优 于 传统 的 PCR 或 化 学 随机 诱 变 , 因 为 通过 改组 和 筛选 可 以 获得 目的 基因 的 多 个 突变 (Kellner et al. ,1997)。. 这 种 方法 类 似 于 酶 的 自然 进化 即 通过 “突变 一 表 型 选择 "循环 来 获得 所 需 的 基因 。 这 一 技术 已 用 于 提高 绿 荧光 蛋白 的 荧光 (Crameri et al. ,1996)。 3) 电 子 忧 统 系统 ”了 P450 加 单 氧 酶 需要 电子 供 体 , 这 由 电子 传递 系统 提供 。 生 物 工 程 改 造 的 P450 以 及 天 然 P450 在 其 非 天 然 宿主 中 的 活性 表达 ,需要 有 效 的 电子 传递 系统 。 P450 用 于 生物 净化 的 一 个 难题 是 在 重组 系统 中 难以 获得 有 效 的 电子 传递 (Peterson and Prough,1986) 。 一 些 研究 组 织 正 在 研究 还 原 酶 与 P450 的 相互 作用 ,以 寻找 在 非 天 然 生 物 系 统 中 获得 有 效 电子 传递 的 方法 (Uvarov et al. ,1994; Shanker and Atkins 1996; Sibbesen et al. ,1996). Sibbesen 等 (1996) 报 道 了 第 一 个 异 源 表 达 的 自给 催化 系统 ,他 们 利用 短 肽 连接 体 产 生 了 假 单 孢 氧 还 蛋白 还 原 酶 - 假 单 孢 氧 还 蛋白 -细胞 色素 P450cam 三 融合 蛋白 。 这 种 三 融合 蛋白 在 大 肠 杆菌 中 表达 具有 氧化 樟脑 以 及 其 他 底 物 的 活性 ,这 表明 在 非 天 然 宿 主 中 可 以 产生 具有 活性 的 P450 系统 。 Shanker 和 Atkins(1996 ) 用 不 含 质粒 的 假 单 孢 细菌 中 的 P450cam 与 荧光 酶 素 依赖 的 光 还 原作 用 相 偶 联 建造 了 一 个 类 似 的 具有 催化 活性 的 系统 。 由 于 还 原 脱 卤 作用 需要 两 种 蛋白 的 表达 ,因此 这 一 实验 证 明 , sities lapis aiabies ed P450 中 以 达到 生物 除 污 的 目的 。 虽然 通过 基因 工程 的 方法 可 以 改变 P450 的 代谢 途径 ,但 通常 情况 下 , 仅 依 赖 P450 的 作用 将 多 环 芳烃 及 多 讽 代 有 机 物 等 环境 污染 物 完全 生物 降解 是 很 困难 的 。 简 单 的 做 法 是 把 天 然 或 基因 工程 的 P450 对 目标 污染 物 的 生物 转化 作用 作为 生物 除 污 整个 过 程 的 一 部 分 ,使 P450 作用 的 产物 可 被 天 然 存在 的 其 他 生物 作用 途径 吸收 和 降解 。 一 个 出 色 的 例子 是 Wackett 的 工作 (Wackett,1995)。Wackett 构建 了 一 个 假 单 孢 细菌 系统 可 以 表达 P450cam 催化 五 毛 乙 烷 还 原 脱 卤 作用 ,该 过 程 的 产物 可 被 甲苯 双 加 单 氧化 酶 氧化 脱毛 ,这 样 可 使 五 毛 乙 烷 完 全 脱毛 ,最 终 变 成 CO,。 第 十 二 章 ”细胞 色素 P450 的 应 用 - 247 , 随 着 认识 和 技术 的 进步 ,在 不 久 的 将 来 ,人 们 完全 可 以 设计 出 对 特定 靶 标 物质 具有 催 化 活力 的 P450。 计 算 机 模拟 、 位 点 指导 的 诱 变 以 及 随机 诱 变 方法 已 经 为 人 们 实现 目标 提 供 了 有 力 的 手段 。 重 组 非 天 然 系统 以 完成 电子 传递 可 以 优化 生物 除 污 系统 。 这 些 技术 的 有 机 结合 为 生物 净化 展现 出 诱 人 的 发 展 前 景 。 可 以 相信 ,通过 利用 对 污染 物 高 转化 活性 的 工程 P450 ,与 P450 反应 产物 进一步 降解 的 其 他 生物 过 程 结合 ,可 以 加 速 污染 物 的 生物 除 污 进程 (Wong,1998)。 12.2.4 P450 在 化 学 合成 中 的 作用 有 些 CYP 催化 反应 表现 出 产物 和 底 物 的 立体 选择 性 ,利用 这 一 性 质 可 以 将 P450 用 于 特异 化 学 品 的 生产 。 甲 氧 滴滴涕 在 哺乳 动物 体内 ,首先 氧化 脱 单 甲 基 生 成 手 性 单 羟基 化 合 物 ,对 映 体 比率 决定 于 反应 条 件 。 当 在 体外 用 葵 巴 比 妥 预 处 理 大 鼠 时 , 则 鼠 肝 微粒 体 氧化 脱 甲 基 作 用 发 生 和 急剧 地 变化 ,此 变化 依赖 于 底 物 的 初 浓度 ,因为 底 物 为 高 踢 水 性 和 对 各 P450 同 工 酶 不 同 亲 和 性 。Kishimoto 等 (1995 ) 曾 报道 微粒 体 CYP 同 工 酶 在 甲 氧 滴 滴 说 的 氧化 脱 甲 基 对 映 体 的 选择 性 。 反 应 式 如 下 : 反应 中 的 微粒 体 CYP 同 工 酶 为 经 葵 巴 比 妥 预 处 理 鼠 肝 微 粒 体 中 纯化 得 到 的 细胞 色 素 P450 的 4 种 同 工 酶 ,为 P450w(CYP2C6)、P450B8(CYP2A1)、P450Y(CYP2B1) 和 P4508 (CYP2B2)。 这 些 同 工 酶 在 甲 氧 滴 滴 涕 氧化 脱 甲 氧 作用 中 的 参数 和 对 映 体 的 选择 性 见 下 # 12.6. 12.6 CYP 同 工 酶 在 甲 氧 滴滴涕 脱 甲 基 作 用 的 参数 和 对 映 体 的 选择 性 (Kishimoto et al. ,1995). 细胞 色素 P450 Km — Vinxt mol/(mol cyp: min) 人 (S)/L(S) + (R)] a(CYP2C6) 0.36 0.40 1 95~ 100 B(CYP2A1) 0.38 0.36 0.95 95~100 y(CYP2B1) 1.07 1.20 1.12 36~40 3(CYP2B2) 2.34 1.22 0.52 42~46 PB -微粒 体 (1%BSA) 0.85 1.07 1.25 (2% BSA) 1.68 1.04 0.62 上 述 同 工 酶 对 甲 氧 滴滴涕 作为 底 物 ,至少 有 两 种 特征 :一 为 低 对 映 体 选 择 性 和 低 底 物 亲 和 人 性 ; 另 一 种 为 高 选择 性 和 高 亲 和 性 。 从 上 表 中 可 以 看 出 Cyp 同 工 酶 中 ,CYP2C6 和 , 248 , 细胞 色素 P450 酶 系 的 结构 功能 与 应 用 前 景 2Al 表现 为 高 选择 性 和 高 亲 和 人 性 ,而 CYP2B1 和 2B2 的 对 映 体 选 择 性 和 底 物 亲 和 性 都 较 低 。 在 甲 氧 滴 滴 涕 的 氧化 脱 甲 基 反应 中 ,所 用 的 是 CYP2B1 和 2C6 同 工 酶 (1:1) 的 重组 系统 与 浓度 不 同 的 底 物 作用 ,其 代谢 物 对 映 体 选 择 性 的 变化 决定 于 底 物 的 浓度 。 如 底 物 浓度 低 时 ,所 形成 S- 对 映 体 约 为 75% , 底 物 浓度 高 时 ,此 比率 减低 为 S5$% 。 因 每 个 同 工 酶 对 同一 个 底 物 进行 代谢 作用 时 ,它们 之 间 的 Kin 和 Vs 参数 以 及 对 映 体 选 择 性 等 都 可 能 不 同 (Kishimoto et al. ,1995). 参考 文 献 瞿 礼嘉 , 顾 红 雅 , 胡 苹 等 .1998. 现代 生物 技术 导论 .北京 :高 等 教育 出 版 社 ,254 一 285 Arnold E H. 1998. 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