克 _ 实验指 南系列 现代 细胞分 子生物 学技术 \ 林菊 生主编 \ 冯作化 副主编 : Pvu I 6405 Fsp I 6425 //yBg! I 6431 yBglW 6935 k /() 在分子 ♦年上 掠 付 生命本 貭 从分+ 水早上 务手# 研究拉 术 贫 斑代細 舱分+ 生物 学技 术问世 4^ ^ M 《现 代细 胞分子 生物学 技术》 编 写人员 主 编林菊 生华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院教授 、博士 生导师 副主编 冯作化 华中科 技大学 同济医 学院生 物化学 与分子 生物学 教研室 教授、 博士生 导师 编委 (以姓 氏笔画 为序) 孙明 华 中农业 大学生 命科学 技术学 院博士 朱帆 武汉大 学生命 科学学 院博士 朱作言 中国 科学院 水生生 物研究 所教授 、中 国科学 院院士 李东华 中科技 大学同 济医学 院生物 化学与 分子生 物学教 研室副 研究员 李凌 云武汉 大学生 命科学 学院病 毒研究 所博士 汪 道文华 中科技 大学同 济医学 院同济 医院基 因治疗 研究中 心教授 、博 士生导 师 沈士亮 美国斯 坦福大 学博士 沈关心 华中科 技大学 同济医 学院免 疫研究 所教授 、博士 生导师 肖庚 富武汉 大学生 命科学 学院病 毒研究 所教授 宋家 武华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院博士 杨渝珍 华中科 技大学 同济医 学院生 物化学 与分子 生物学 教研室 教授、 博士生 导师 吴金明 华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院博士 陈义 发华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院博士 陈尉 梅武汉 大学生 命科学 学院病 毒研究 所博士 屈 伸华中 科技大 学同济 医学院 生物化 学与分 子生物 学教研 室教授 、博 士生 导师 胡炜 中国 科学院 水生生 物研究 所博士 皇 甫永穆 华中 科技大 学同济 医学院 生物化 学与分 子生物 学教研 室教授 、硕士 生导师 郜金荣 武汉大 学生命 科学学 院教授 、博士 生导师 徐玉 会美国 国家卫 生研究 院博士 黄海 涛华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院硕士 龚建 平华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院分子 医学中 心教授 、博士 生导师 程元 桥华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院博士 黎培员 华中 科技大 学同济 医学院 同济医 院博士 戴五星 华中科 技大学 同济医 学院生 物化学 与分子 生物学 教研室 副教授 、硕士 生导师 ■ ^ 序 一 21 世纪 是生命 科学的 世纪; 分子 生物学 是生命 科学领 域重要 的前沿 学科和 技术支 撑 。自从 1953 年 Watson 和 Crick 提出 脱氧核 糖核酸 (DNA) 双螺 旋结构 模型, 开辟了 现 代分子 生物学 的新纪 元以来 ,生命 科学的 发展日 新月异 ,如 农学 上新的 绿色革 命的兴 起 、医 药学上 新的诊 疗方法 的诞生 、生 命密码 的破译 、后基 因组计 划的提 出和蛋 白质组 学的 开展。 近年来 ,分 子生物 学迅猛 发展, 新技术 、新 方法层 出不穷 ,并自 成体系 ,渗 透到生 命科学 的各个 领域。 1992 年 《分 子克 隆实验 指南》 ( 病毒基 因工程 国家重 点实验 室 金冬雁 、黎孟 枫博士 主译) 和 1998 年 《精 编分 子生物 学实验 指南》 (病 毒基因 工程国 家重点 实验室 颜子颖 、王海 林博士 主译) 两部 译著的 出版, 对我国 生命科 学的发 展起了 重要 的促进 作用。 本 书是继 《分 子克 隆实验 指南》 与 《精 编分 子生物 学实验 指南》 之后 又一部 集现代 细胞分 子生物 学最新 技术之 大成的 著作, 它囊括 当今分 子生物 学的主 要技术 ,并 对近年 来迅速 发展起 来的新 领域有 所侧重 。本 书共 18 章, 详细介 绍了各 种方法 的基本 原理和 操作 步骤, 而且在 每一方 法之后 ,专 门开辟 “方法 评注” ,针 对每一 方法的 背景、 关键、 注意事 项等评 述自己 的体会 ,所 谓“知 其然, 知其所 以然” 。在内 容上, 除其他 同类书 籍 已涉及 的之外 ,还 增补了 一些新 的章节 ,如细 胞培养 技术、 细胞凋 亡检测 、流 式细胞 技术 、糖 复合物 的制备 与分析 、转 基因动 物及生 物芯片 技术等 ,尽 可能全 面地反 映当今 国 际上细 胞分子 生物学 技术的 新进展 。在 结构上 ,各 章节独 立成篇 ,又互 相联系 ,成为 一个 整体。 写作层 次分明 ,深 入浅出 ,体现 了丰富 、新颖 、实用 的特点 。本 书确 为一部 反映当 代国内 外细胞 分子生 物学技 术最新 成就的 重要参 考书。 本 书作者 大多为 留学回 国人员 或博士 ,他们 中有的 正在承 担国家 973 计划、 863 计 划或 国家重 点项目 ,有的 仍然在 国外从 事科研 工作。 他们年 轻有为 ,开拓 进取, 在出色 地完 成自己 繁重的 科研任 务之余 ,致力 于结合 自己的 科研实 践编写 著作, 向我国 读者奉 献 了又一 部难得 的好书 。对此 ,我 们深感 欣慰。 我 相信本 书的出 版必将 对我国 生命科 学及生 物技术 的发展 起到重 要的推 动作用 。谨 为此 书的问 世表示 衷心的 祝贺。 病 毒基因 工程国 家重点 实验室 2000 年 人类基 因组全 测序初 告完成 ,标 志着生 命科学 和人类 社会同 步进入 了一个 新 纪元。 随着人 类基因 组计划 (HGP) 的顺 利完成 ,蛋 白质组 、转录 基因组 、药 物基 因组、 毒物基 因组等 项研究 纷纷浮 出台面 ,成 果纷 呈迭出 。细胞 生物学 、分 子生 物学和 生物技 术 研究正 以加速 步伐向 前迈进 。例如 ,科学 家们以 9 年 的时间 ,在 1989 年克隆 了一个 囊性 纤维病 基因, 8 年之后 ,在 HGP 的协同 努力下 ,只 花了 9 天 时间就 克隆了 一个帕 金森 病基因 (引 自美国 前总统 克林顿 2000 年 6 月 26 日在人 类基因 组计划 全测序 完成庆 祝会上 的讲话 )。 由 于分子 科学技 术的加 速发展 ,预计 在不久 的将来 ,医 学家们 将有可 能应用 病人的 “ 基因表 达谱” 进行辨 证论治 。迄 今为止 ,被认 为单一 的疾病 、在 形态学 上即使 应用电 子显微 镜也无 法区分 的疾病 ,按 照基因 表达谱 的不同 ,实 际上可 以分为 数种不 同的亚 型 ,其治 疗方法 和应答 有很大 的区别 ,由 此诞生 了疾病 的分子 分类学 。不 仅如此 ,单核 苷酸 多态性 (SNP) 的研究 还发现 ,在 同种病 的不同 个体之 间还可 能存在 细微的 ,然而 非常 重要的 差别, 影响病 体对疾 病的易 感性和 对药物 的不同 反应性 。因此 ,新时 代的医 学将强 调疾病 的个体 化治疗 ,并 说明为 什么同 一种药 对某个 人效果 好而对 另外一 个人效 果不好 ,从 而达到 正确用 药提高 疗效的 目的。 在 5~20 年内 ,前瞻 性的基 因检测 (predictive gene test) 将逐 步实施 和普及 。这项 检测根 据基因 多态性 的分析 ,可以 推测人 体对疾 病的易 感性以 及与环 境因素 的关系 。例 如, 携带有 结肠癌 易感基 因的“ 正常人 ”应定 期作直 肠指检 或镜检 ,以便 发现早 期的肿 瘤 ,及时 治疗; 携带有 高血压 基因的 “正常 人”应 限制食 盐的摄 入和减 轻体重 ,等 等, 由 此诞生 了分子 预防学 。随 着人民 生活质 量的不 断提高 ,前 瞻性的 基因检 测和分 子预防 学将 日益显 示其重 要性。 它将上 千年来 “预防 为主” 的医学 理论提 高到分 子水平 ,继之 实现。 基因组 和基因 表达谱 差异性 的研究 ,将 促使 制药工 业产生 革命性 的变化 ,也 即根据 疾 病基因 组和基 因表达 谱来设 计药物 ,这样 制造出 来的药 物将更 有效和 低毒。 基因分 子生物 学的研 究也会 为人类 社会带 来一些 新问题 ,例如 怎样防 止滥用 个人基 因信 息而引 起的就 业或医 疗歧视 ,如何 防止基 因操作 使人体 变成工 业产品 等就是 一些严 峻 的课题 ,需 要大众 、科学 家和政 府共同 认识和 对待。 综 上所述 ,在这 分子医 学的新 纪元里 ,我 们从事 生命科 学的工 作者都 面临着 一个分 子 医学的 再教育 问题。 华 中科技 大学同 济医学 院肝病 研究所 、附属 同济医 院内科 学教授 、主 任医师 林菊生 博士 1995 〜 1997 年 应邀赴 美国耶 鲁大学 做博士 后期间 ,承担 NIH 的课题 ,从事 抗癌、 抗 病毒分 子药理 学研究 ,做出 了突出 的成绩 。回 国后, 在获得 4 项 国家自 然科学 基金课 题的 基础上 ,又获 得“十 五”国 家重大 科技专 项“功 能基因 组学和 生物芯 片”子 课题的 资助 。他和 另一位 留美回 国的我 国分子 生物学 研究领 域的新 秀冯作 化教授 及时地 编撰了 这本 《现 代细 胞分子 生物学 技术〉 ,正 是适应 这个新 时期的 需求, 这对于 普及和 加强细 胞和分 子生物 学教育 和科研 具有非 常重要 的意义 。我 衷心地 祝贺这 本书的 问世, 竭力向 我国从 事生命 科学的 研究者 推荐这 部生物 技术的 巨著。 生命 科学在 新的世 纪愈发 蓬勃, 细胞分 子生物 学技术 则是生 命科学 的主要 研究手 段。 一方面 ,生命 科学的 发展促 进了新 的研究 方法的 诞生; 另 一方面 ,新 的研究 技术的 建立和 完善又 极大地 推动了 各个学 科的迅 猛发展 。鉴 于细胞 分子生 物学技 术的重 要地位 及其 在生命 科学研 究工作 中的急 迫需要 ,目前 国内已 出版多 本相关 参考书 ,对我 国生命 科学 研究起 到了重 要的指 导作用 ,如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (《分 子克 隆实验 指南》 ,第 二版 ,金 冬雁和 黎孟枫 等译, 1992)、 《现 代分 子生物 学实验 技术》 (卢 圣栋 主编, 1993)、 Short Protocols in Molecular Biology (《精 编分子 生物学 实验指 南》, 颜子 颖和王 海林译 , 1998) 等。 因为细 胞分子 生物学 技术的 发展日 新月异 ,新的 技术和 手段如 转基因 动物、 生物芯 片等层 出不穷 ,所 以有必 要将这 些新的 知识汇 编成册 。另外 ,在掌 握实验 基本操 作步骤 的同时 ,如能 了解其 详细的 原理, 则思路 将更为 清楚; 同时 ,实验 中往往 会不可 避免地 出现各 种问题 (尤其 对于那 些新手 ), 导致实 验结果 不理想 或出现 偏差, 具体操 作中的 注 意事项 和影响 实验的 重要参 数对实 验的成 功和分 析也甚 为重要 •,实 验 方法的 背景资 料 、适 用范围 、预 期结果 、时间 安排等 对实验 也有重 要的参 考价值 。鉴 于此 ,我 们编写 了这本 《现 代细 胞分子 生物学 技术》 。本 书可作 为从事 生物学 、生物 化学、 分子生 物学、 生 物技术 、医 药学及 农学等 领域的 科研、 教学人 员的指 导性参 考书。 全书共 18 章, 详细阐 述了大 肠杆菌 、质粒 、噬 菌体 工具, DNA、 RNA 的制 备与分 析, 工具酶 操作, PCR 技术, DNA 转染 ,蛋白 质表达 与分析 ,蛋 白质磷 酸化和 糖复合 物分析 , DNA 与蛋 白质相 互作用 ,免 疫学, 原位杂 交和免 疫组化 ,生物 芯片, 细胞培 养 ,流式 细胞术 ,细 胞凋 亡检测 ,转基 因动物 等内容 。为保 证全书 的系统 性和结 构完整 性 ,本书 也涵盖 了其他 同类书 籍的相 关内容 ,部分 章节主 体内容 参考了〇^^价尸「加0- 本书 内容按 章编排 ,章 的结构 如下: 引言 介 绍本章 实验方 案的基 础知识 ,包 括方法 的建立 和发展 、总 体原理 、相关 内容和 实验方 法的选 择及适 用范围 。部 分内 容较庞 大的章 节也归 纳出专 门的小 节加以 阐述。 小节 及其下 属单元 为同 一类方 法的汇 总或逐 步进行 达到相 应目的 的各种 方法。 多个方 案则并 行排列 ,依 使用 频率的 高低或 由简到 繁编排 。通 常采用 第一方 案即可 ,如 需达 到特殊 目的则 可选用 后续的 方案。 原理 或概述 介绍具 体方案 的原理 或概述 其特点 和应用 范围。 材料 列出 所述方 法需要 的试剂 及设备 。但一 些实验 室常规 的试剂 和设备 未予列 出 。需 读者自 己配制 的试剂 ,其后 括号内 列出其 详细成 分和配 制方法 。商 品化的 试剂则 列出其 供应商 ,读 者可通 过当地 的代理 商联系 订购。 第一个 方案列 出全部 的材料 ,后续 的方案 如为附 加材料 ,则是 在前一 方案基 础上所 需添加 的材料 。除 非特别 说明, 所有的 水 溶液均 应用去 离子的 蒸馏水 配制。 试 剂配制 对于一 些较为 特殊的 试剂, 在本栏 详细说 明其配 制方法 和注意 事项。 操 作步骤 按顺序 列出所 述实验 方法的 每一操 作步骤 ,其后 的小字 为该步 骤的详 细注释 ,说明 该步骤 的注意 事项、 可见的 结果或 其他可 替代的 方法。 方 法评注 在每 一方法 后列出 ,或 在几个 类似方 法后一 并列出 。介 绍该实 验方案 的建立 、发展 、应 用等背 景资料 ,对实 验结果 产生重 要影响 的参数 ,实验 中可能 遇到的 问题及 其解决 方法, 实验的 结果和 时间安 排等。 参 考文献 在每 一章的 末尾列 出了此 章的主 要参考 文献, 供读者 查阅。 附录 提供了 本书中 出现的 英文缩 写的全 称及实 验室常 用仪器 和设备 ,细 胞分子 生 物学常 用操作 技术。 实验中 应严守 操作规 程和相 应的法 律法规 ,注 意安 全操作 ,避 免自身 的伤害 和环境 污染。 本书 的完成 是一项 极其复 杂繁重 的工作 ,在这 里要特 别感谢 皇甫永 穆教授 ,他 除了 出色 地完成 自己的 编写工 作外, 还在百 忙之中 ,抱病 审校了 全书的 大部分 章节, 并为本 书 提供了 宝贵的 建议; 感谢 中国科 学院资 深院士 、华 中科技 大学同 济医学 院裘法 祖教授 欣 然提笔 为本书 题词; 感谢中 国工程 院院士 、北 京病 毒基因 工程国 家重点 实验室 侯云德 教 授和我 国分子 生物学 的先驱 、耶 鲁大学 的陈兆 聪教授 为本书 作序; 感谢 肝病研 究所老 所 长梁扩 寰教授 、李绍 白教授 对本书 编者的 勉励; 感谢 黎培员 博士夜 以继日 的编辑 、排 版 和审校 ,促 成本书 的早日 出版; 感谢 华中科 技大学 同济医 学院附 属同济 医院肝 病研究 所 、内 科教研 室和消 化内科 的领导 、全 体老师 及研究 生对本 书编写 工作的 支持和 帮助。 本书内 容广泛 , 由于时 间紧迫 ,加 之编写 者对大 型工具 书的编 写经验 有限, 肯定存 在诸 多不足 ,恳 请各位 读者不 吝指正 ,以 期再版 时予以 修订和 完善。 编 者 2003 年元旦 于武汉 第一 章大肠 杆菌、 质粒和 噬菌体 1 引 W 1 第 一节大 肠杆菌 5 一、 培养基 的制备 和细菌 学工具 5 二、 在液体 培养基 中培养 9 三、 在固体 培养基 中培养 10 四、 经典的 细菌遗 传学选 择标志 12 第二 节质粒 24 一 、 质粒 的分子 生物学 24 二 、 质粒 DNA 的小 量制备 31 三 、 质粒 DNA 的大 量制备 38 四 、 质粒 DNA 转 化细胞 49 第三节 X 噬菌体 及其衍 生载体 55 一、 X 唾菌体 的分子 生物学 56 二 噬 菌体克 隆载体 60 三 、 影印 X 噬 菌体产 生空斑 72 四、 X 噬 菌体衍 生质粒 的培养 75 五、 从噬菌 体裂解 物制备 XDNA 78 第 四节丝 状噬菌 体载体 87 一 、丝状 噬菌体 的分子 生物学 87 二、 M13 噬 菌体衍 生载体 的制备 与应用 92 第 五节黏 粒载体 1〇〇 一、 黏粒载 体简介 1〇〇 二 、 应 用黏粒 载体构 建基因 组文库 1〇9 三 、 黏 粒文库 的扩增 和贮存 118 主要参 考文献 125 第二章 DNA 的制备 与分析 引 言 第一节 DNA 溶液 的纯化 和浓缩 128 第二节 基因组 DNA 的制备 一 、 从 哺乳动 物组织 中制备 基因组 DNA 136 二 、 从植 物组织 中制备 基因组 DNA 138 三 、 细菌 基因组 DNA 的制备 141 第三节 大片段 DNA 的分离 与回收 146 一 、 琼 脂糖凝 胶电泳 146 二 、 脉冲 电场凝 胶电泳 153 三 、 用 琼脂糖 凝胶分 离和回 收大的 DNA 片段 160 第四节 DNA 小片段 的分离 与回收 169 ―、 非变性 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 169 二 、筛 分型琼 脂糖凝 胶电泳 ' 174 第五节 DNA 印 迹与杂 交分析 175 ~ ■、 Southern 印迹 176 二、 DNA 的 斑点印 迹和狭 线印迹 184 三、 DNA 印 迹的杂 交分析 188 第六 节寡核 苷酸和 DNA 片段 的纯化 199 一 、 变性 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 纯化寡 核苷酸 199 二 、 羟磷 灰石层 析法分 离双链 和单链 核苷酸 202 三 、 阴 离子交 换层析 法纯化 DNA 204 主要参 考文献 209 第三章 RNA 的制备 与分析 211 引 言 211 第一节 真核细 胞和原 核细胞 RNA 的制备 211 — 、 组织 培养细 胞胞质 RNA 的制备 212 二、 胍盐法 制备总 RNA 215 三 、 植物 RNA 的制备 (酚 /SDS 法) 221 四 、 细菌 RNA 的制备 223 五 、 带有 poly(A) + RNA 的制备 229 第二节 RNA 结 构分析 和合成 231 一、 用单链 DNA 探针和 S1 核酸 酶分析 mRNA 232 二、 核糖核 酸酶保 护测定 240 三 、 引 物延伸 246 四 、 用 Northern 与狭线 印迹杂 交分析 RNA ...248 五、 新转录 RNA 的鉴别 255 主要参 考文献 262 第四章 DNA 和 RNA 的酶 学操作 263 引 言 263 第一 节限雛 A 切 核酸酶 264 一 、 限制 性内切 核酸酶 的特性 281 二 、 限 制性内 切核酸 酶消化 DNA 的方法 281 三 、 影响 酶切效 率的主 要因素 285 第二 节限 臟作 ® 286 ―、 多种限 制性内 切核酸 酶消化 法作图 287 二、 限制性 内切核 酸酶部 分消化 法作图 290 三 、 末 端标记 法作图 291 第三节 用于 修饰与 放射性 标记核 酸的酶 292 • viii • 一 、 用 于操作 核酸的 试剂和 放射性 同位素 293 二 、 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶 301 三、 不依赖 模板的 DNA 聚合酶 312 四 、 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 313 五 、 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 316 六、 不依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 318 七、 磷酸酶 和激酶 318 八 、 外切 核酸酶 323 九 、 内切 核酸酶 326 十 、核糖 核酸酶 330 ~\ -一 、 DNA 连接酶 332 十二、 RNA 连接酶 335 第四 节重组 DNA 分子 的构建 336 一、 DNA 片段的 亚克隆 337 二、 PCR 构建 重组的 DNA 分子 343 第五节 非同位 素探针 标记及 其应用 347 一 、 非同 位素探 针的标 记和比 色检测 347 二 、 非 同位素 探针的 化学发 光检测 353 主要参 考文献 357 第五章 聚 合酶链 式反应 358 引 言 358 第一节 PCR 麟 本原理 358 第二节 PCR 麟 本技术 360 一、 PCR 引物 的设计 360 二 、 模板 的制备 362 三、 PCR 的基 本反应 : 367 四、 PCR 反 应条件 的控制 与优化 368 五 、 扩增 大片段 核酸的 PCR 条 件优化 370 六、 PCR 实验中 应注意 的事项 374 第三节 PCR 技术 的扩展 375 $MPCR 375 二、 筑巢式 PCR 375 三 、 二次 PCR 375 四、 中断性 PCR 376 五 、 共 享引物 PCR 376 六、 不对称 PCR 376 七 、 反向 PCR 376 八 、 彩色 PCR 377 第四节 用 PCR 扩增 DNA 的基 本方法 378 一 、 以 DNA 为模 板扩增 378 二 、 以 mRNA 为模 板扩增 DNA 379 三 、 筛 选最适 Mg2* 离 子浓度 的方案 381 四 、方 法评注 382 第五节 用 PCR 定量分 析微量 DNA 383 — 、 基 本方法 383 二 、方 法评注 386 第六节 以 低丰度 RNA 为模 板扩增 cDNA 388 第七节 制备直 接用于 DNA 序列 测定的 PCR 产物 391 一 、 用 不对称 PCR 制备 适合双 脱氧测 序的单 链产物 391 二 、 用单 个引物 再扩增 制备适 合于双 脱氧测 序的单 链模板 392 三 、 用 X 外切核 酸酶消 化双链 PCR 产物 产生单 链的测 序模板 393 四、 制备用 于双脱 氧测序 的双链 PCR 产物 394 五 、 标记 PCR 产物 进行化 学测序 395 六、 PCR 产物的 基因组 测序法 396 第 八节连 接介导 PCR 与基 因组足 迹分析 和测序 397 一 、 连 接介导 PCR 的基 本原理 397 二 、 连 接介导 PCR 399 三 、 从 单层细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足 迹分析 404 四 、 从 悬浮细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足 迹分析 408 五、 基因组 DNA 的 化学测 序反应 409 六 、 方 法评注 411 第九节 用锚式 PCR 扩增 cDNA 414 一 、 锚式 PCR 的基 本原理 415 二 、 扩 增已知 序列的 3' 端下 游区段 (下 游锚式 PCR) 417 三、 扩增已 知序列 5' 端上 游区段 (上 游锚式 PCR) 418 四 、 方 法评注 421 第十节 PCR 扩 增产物 的克隆 422 一、 T-A 突出端 的产生 422 二、 利用引 物产生 半位点 •• …" 423 三、 利用引 物引入 新的酶 切位点 424 第 H ■*— 节 用 PCR 差 异显示 mRNA 425 一 、 差 异显示 PCR 的基 本原理 425 二 、 差 异显示 PCR 的基 本方法 425 三 、 方 法评注 429 主要参 考文献 430 第六章 DNA 导入 哺乳动 物细胞 431 引 言 431 第一节 DNA 转染真 核细胞 434 ―、 磷酸钙 转染法 434 二 、 用 DEAE- 葡聚 糖转染 440 三、 用电穿 孔转染 445 四 、 脂质 体介导 的转染 449 五、 基因稳 定转入 哺乳动 物细胞 452 第二节 DNA 转染 哺乳动 物细胞 的检测 457 一 、 融合 报道基 因概述 457 二 、 氯霉 素乙酰 转移酶 (CAT) 的收获 和测定 464 三 、 萤 火虫荧 光素酶 报道系 统分析 469 四 、 人生 长激素 报道系 统测定 473 五、 P- 半乳 糖苷酶 报道系 统测定 475 六、 转染后 RNA 的直 接分析 476 七 、 转 染方法 的优化 477 第三节 用逆转 录病毒 载体转 导基因 480 一 、 逆转 录病毒 转导系 统概述 480 二、 特异逆 转录病 毒产生 细胞株 的制备 485 三、 逆转录 病毒原 种的大 量制备 与浓缩 494 四、 逆转录 病毒原 株中辅 助病毒 的检测 497 五、 体外与 体内细 胞的逆 转录病 毒感染 500 主要参 考文献 502 第七章 蛋白质 的表达 504 引 言 504 第一节 蛋白质 在大肠 杆菌中 的表达 504 ~ ■、表 达策略 504 二、 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 / 启 动子表 达系统 506 三 、 融合 蛋白表 达系统 509 四 、 疑 难分析 516 第二节 杆状 病毒表 达系统 517 一 、 杆状 病毒表 达系统 的特点 和原理 517 二 、 杆状 病毒转 移载体 521 三、 构建重 组病毒 的策略 525 四、 杆状病 毒克隆 表达的 新策略 528 主要参 考文献 534 g 八章蛋 S 质分析 535 引 〇 535 第 一节蛋 白质的 光吸收 法和生 物化学 法定量 535 一、 紫外光 吸收法 535 二、 Lowry 氏 比色法 536 三 、 考马 斯亮蓝 染色法 538 第二节 蛋白 质的电 泳分离 539 一 、 蛋 白质的 一维电 泳分离 539 二 、 蛋 白质的 二维电 泳分离 (双 相凝胶 电泳) ••… : 554 三、 染色凝 胶中蛋 白质的 电洗脱 560 第三节 蛋白质 的检测 562 一、 凝胶中 蛋白质 的染色 563 二、 印迹到 膜上的 蛋白质 的检测 568 三、 蛋白质 的免疫 印迹和 免疫检 测技术 570 第四节 蛋白 质的常 规层析 法纯化 582 一、 凝胶过 滤层析 JOO 二、 离子交 换层析 <{y? 三、 免疫亲 和层析 四 、 金属 蝥合亲 和层析 ,的 第五 节高效 液相色 谱分离 和纯化 蛋白质 608 一 、 反相 高效液 相色谱 614 二 、 离 子交换 高效液 相色谱 ;. 三、 四、 高效聚 焦色谱 629 五 、 高效 疏水作 用色谱 •二 第六 节用免 疫沉淀 法纯化 蛋白质 二 ^ 一 、 用 Sepharose 交联 抗体免 疫共沉 淀放射 性标记 的抗原 二、 Sepharose 偶 联抗体 的制备 三用抗 Ig 血清免 疫共沉 淀放射 性标记 的抗原 二 …" 63 ^ 用抗 Ig-Seph 膚、 A 蛋白 -/GS 白 -Sepharose 或金 葡菌菌 体免疫 共沉淀 放射性 标记的 _ 637 "••••••••••••••••••••••• 五 、 使用 强力裂 解液和 洗涤缓 冲液进 行免疫 共沉淀 六、 Sepharose 交联 抗体 与未标 记抗原 的免疫 共沉淀 七 、 方 法评注 第 七节专 门应用 •二 Z 一通过 克隆基 因的转 录和翻 译在体 外合成 蛋白质 、 ■ f.AT. 二、 蛋白质 的生物 合成标 记技术 三、 用于微 序列分 析的蛋 白质分 离方法 主要参 考文献 第九章 DNA 与蛋白 质的相 互作用 | ••••••••••••••••••••••••••••••••* 第一 节哺乳 动物细 胞核或 细胞质 内蛋白 的提取 一、 细胞核 中提取 蛋白质 二 、 细胞 质部分 的提取 三 、 方 法评注 653 656 656 659 659 662 663 第 二节用 凝胶电 泳进行 迁移率 改变试 验检测 DNA 结合 一、 低离子 强度的 聚丙烯 酰胺凝 胶进行 电泳迁 移率改 变试验 检测法 二 、 高 离子强 度的聚 丙烯酰 胺凝胶 进行电 泳迁移 率改变 试验检 测法… 二 、方 法评注 第三节 甲 基化和 尿嘧啶 干扰反 应分析 蛋白质 -DNA 的作用 …… 一 、甲 基化干 扰反应 一 、尿 嘧啶干 扰实验 三 、方 法评注 第四节 DNase 1 足 迹法分 析蛋白 -DNA 结 a 位点 一、 DNase I 足迹 分析法 二 、光 密度及 数值分 析法对 蛋白结 合滴定 进行定 量分析 …… 三 、粗 制品的 DNase I 足逊伝 • xii • 四 、方 法评注 682 第五节 蛋 白质与 核酸的 紫外交 联反应 682 一 、 用 溴脱氧 尿嘧啶 核苷替 代的探 针进行 紫外交 联反应 683 二 、 用非 溴脱氧 尿嘧啶 核苷替 代的探 针进行 紫外交 联反应 685 三、 原位紫 外线交 联反应 685 四 、 方 法评注 686 第六节 用 生物素 / 链 亲和素 亲和系 统纯化 DNA 结 合蛋白 687 一 、 基 本方案 687 二 、 用微 型柱进 行纯化 690 三 、 用 链亲和 素-琼 脂糖进 行纯化 691 四 、 方 法评注 691 第七节 编码 DNA 结 合蛋白 cDNA 克隆 的检测 、纯化 和鉴定 692 — 、 用 识别位 点处的 DNA 探 针筛选 Xgtll 表 达文库 692 二 、 盐 酸胍对 干燥的 影印膜 进行反 复变性 与复性 695 三 、 从 Xgtll 重 组的溶 原性细 菌的粗 提取物 鉴定融 合蛋白 DNA 结 合活性 696 四 、 方 法评注 697 第八节 滤膜分 离游离 DNA 及与 蛋白质 结合的 DNA 698 一 、 蛋白 质结合 DNA 的定 量测定 698 二、 DNA 结合 特异性 的检测 699 三 、 结合 DNA 的洗脱 700 四 、 方 法评注 700 第 九节体 外合成 克隆基 因蛋白 质分析 DNA- 蛋白 质反应 701 第十节 序列 特异性 DNA 结合 蛋白的 亲和层 析纯化 703 一 、 基 本方案 703 二 、 将 DNA 偶联于 溴化氰 活化琼 脂糖上 706 三 、 用制 备性凝 胶电泳 纯化寡 核苷酸 707 四、 DNA 亲和 层析法 708 五 、 非 同位素 竞争性 DNA 的选择 和制备 710 六 、 方 法评注 711 主要参 考文献 711 第+章 蛋白质 碟酸化 的分析 716 引 言 716 第 一节憐 酸化蛋 白质的 标记和 制备… 717 一、 32P 标记培 养细胞 717 二 、 制 备细胞 裂解物 719 三、 SDS 煮 沸法裂 解细胞 720 四、 免疫沉 淀法制 备分析 磷酸化 蛋白质 721 第二节 标记的 磷酸化 蛋白质 的检测 722 一 ' SDS^PAGE 检测 722 二 、磷 酸氨基 酸分析 723 第 三节未 标记的 磷酸化 蛋白质 的检测 726 一、 Western Blot 检测未 标记的 磷酸化 蛋白质 (ECL 法) 726 • xiii . 二、 Western Blot 检测未 标记的 磷酸化 蛋白质 (125I- 蛋白 A 法) 727 第四节 蛋白激 酶活性 的检测 729 一 、 合成 肽检测 蛋白激 酶活性 729 二 、 快 速检测 蛋白激 酶活性 730 第五节 需要特 殊仪器 的蛋白 质磷酸 化分析 731 ―、 毛细管 电泳法 732 二、 电喷雾 质谱法 732 三、 HPLC 法 732 主要参 考文献 732 第 +- 章 糖 复合物 的制备 与分析 734 引 言 734 一、 糖复合 物分析 的概述 734 二 、 技 术选择 735 三、 单糖及 寡糖的 立体化 学和图 解表示 735 四 、 术 语汇编 738 第一节 糖复 合物及 其纯化 740 一 、 糖 蛋白及 其纯化 741 二 、 蛋 白聚糖 、糖胺 聚糖及 其纯化 748 三、 糖脂及 其纯化 754 第二节 糖复合 物中糖 的检测 762 一、 动物细 胞糖复 合物代 谢性放 射标记 763 二 、 氧 化反应 和硼氢 化钠还 原反应 化学标 记碳水 化合物 772 三、 糖基转 移酶法 分析糖 类结构 和功能 778 四、 蛋白质 表面糖 磷脂锚 的检测 786 五 、 酚- 硫酸测 定己糖 与戊糖 796 六、 N- 连接 糖基化 的抑制 798 第 三节糖 复合物 __放 804 一、 涎酸酶 (唾液 酸酶) 805 二、 内切性 糖苷酶 和糖酰 胺酶对 连接寡 糖释放 810 主要参 考文献 821 H+ 二 章免疫 学技术 823 引 言 823 第一节 荧光免 疫技术 823 ―、 荧光标 记技术 823 二、 荧光免 疫测定 825 第 二节酶 ■技术 829 一、 酶免疫 技术常 用的示 踪酶及 其底物 830 二 、 酶免 疫测定 834 第三 节发光 免疫测 定技术 844 一 、 化学 发光免 疫测定 845 二 、 生物 发光免 疫测定 847 三、 电化学 发光免 疫测定 848 第四 节生物 素与亲 和素标 记技术 848 一 、 生 物素与 亲和素 的生物 学特性 849 二、 生物素 与亲和 素标记 850 三 、 生 物素- 亲和素 试验系 统的基 本方法 853 主要参 考文献 855 第十 三章免 疫组织 化学和 原位杂 交技术 857 引 言 •• 857 第一节 免疫组 化技术 的分类 858 ―、 按标记 物分类 858 二 、按 染色步 骤分类 859 第二节 原位杂 交技术 的分类 861 一、 按标记 物分类 861 二 、 按 标记方 式分类 861 第 三节免 疫组化 染色和 原位杂 交技术 中的组 织处理 862 第四节 常用的 免疫组 化技术 862 一 、 培养 细胞的 免疫荧 光染色 862 二 、 组织 切片的 免疫荧 光染色 865 三 、 组 织石蜡 切片的 PAP 过氧化 物酶染 色技术 866 四 、 组 织石蜡 切片的 ABC 碱性磷 酸酶染 色技术 867 五、 组织石 蜡切片 的免疫 金银染 色技术 869 六 、 组织 石蜡切 片的酪 酰胺信 号放大 系统染 色技术 871 第五 节原位 杂交技 术中分 子探针 的制备 872 一、 DNA 探针 873 二、 RNA 探针 875 第六 节常用 原位杂 交技术 876 一、 冰冻切 片上的 原位杂 交技术 876 二、 石蜡切 片上的 原位杂 交技术 880 三 、 原位 聚合酶 链反应 881 主要参 考文献 : 884 第 十四章 生物芯 片技术 885 引 W 885 第 一节基 因芯片 885 一 、 基 因芯片 的概念 885 二 、 基因 芯片技 术的基 本过程 886 三、 基因芯 片技术 的应用 890 第二 节蛋白 质芯片 892 — 、 SELDI 财 892 — ■、 Biacore 技术 895 三 、构象 性蛋白 质芯片 896 第三 节组织 微阵列 897 第四节 芯片 实验室 898 主要参 考文献 899 第 +五章 细胞培 养技术 …… 901 引 言 901 第一节 细胞培 养的基 本概念 901 第 二节细 胞培养 的类型 与细胞 生物学 902 一 、 培 养细胞 的体内 外差异 和分化 903 二 、 培 养细胞 的形态 和分类 903 三、 培养细 胞的生 长和增 殖过程 903 四 、 培 养细胞 的增殖 动力学 904 五 、 培 养细胞 的遗传 学特征 904 第三节 培养细 胞的生 存条件 905 一 、 无污 染环境 905 二 、 温度 905 三 、 气体 环境和 氢离子 浓度、 渗透压 905 四 、 营 养物质 906 五、 培养基 907 六 、 附 着底物 907 七 、 培 养用液 907 第四 节细胞 培养的 常用操 作技术 911 一、 细胞系 的接种 和传代 912 二 、 细 胞的洗 脱方法 913 三 、 培 养血清 的测试 915 四 、 细 胞计数 915 五、 细胞活 性检测 916 六 、 细 胞的低 温冻存 和复苏 917 七、 培养基 的配制 919 第五 节细胞 外基质 在组织 和细胞 培养中 的作用 920 一 、 细胞 外基质 成分及 其来源 921 二 、 细胞 外间质 的包被 921 三 、 包 被的细 胞外基 质成分 的特征 921 四 、 在 EMC 成分 上培养 的细胞 的特异 性反应 922 五 、 三维 细胞外 基质对 细胞培 养的细 胞特异 性反应 923 第 六节培 养细胞 的生物 学污染 及其预 防检测 和排除 924 一 、 工 作环境 的无菌 924 二 、 器皿 的灭菌 925 三 、 无 菌技术 925 四 、 细菌 和真菌 的污染 926 五、 支原体 的检测 和清除 926 第七 节成纤 维细胞 的分离 与培养 928 第 八节上 皮细胞 的培养 930 第九 节人毛 细血管 内皮细 胞分离 932 • XVI • 第 十节人 淋巴细 胞的分 离与转 化培养 935 第 十一节 鼠胚干 细胞的 体外培 养与体 外分化 937 一 、 鼠胚 基成纤 维细胞 的制备 和保存 937 二 、 鼠胚 干细胞 的培养 938 .三 、鼠 胚干细 胞的分 化培养 940 四 、未分 化的鼠 胚干细 胞的基 因转导 941 第 十二节 原代神 经细胞 的分离 和培养 944 一 、 海 马锥体 神经元 的分离 和培养 944 二 、 鸡胚 脊根神 经细胞 的分离 和培养 946 第 十三节 鸡胚肌 母细胞 的分离 和培养 948 第十四 节新生 小鼠心 肌细胞 的分离 和培养 951 第十五 节成年 鼠心室 肌细胞 的分离 和培养 953 第十六 节肝星 状细胞 的培养 957 主要参 考文献 958 第 +六章 流式 细胞术 959 引 言 959 第一 节用于 流式细 胞术检 测的单 细胞悬 液制备 960 一 、 贴壁 培养细 胞的单 细胞悬 液制备 960 二 、 机械 法制备 新鲜实 体组织 的单细 胞悬液 960 三 、 石蜡 包埋组 织的单 细胞悬 液制备 961 第 二节非 同步化 细胞的 细胞周 期分析 962 第三节 单个细 胞细胞 周期素 的检测 963 第四节 评估肿 瘤细胞 对化疗 药物的 耐药性 964 第五节 单细胞 内细胞 因子产 物检测 966 主要参 考文献 968 第 +七章 细胞凋 亡的研 究方法 969 引 言 969 第 一节细 胞凋亡 的形态 学研究 969 一、 普通光 学显微 镜观察 969 二、 倒置显 微镜直 接观察 : 971 三 、 电 子显微 镜观察 971 四、 凋亡细 胞的碘 化丙锭 (PI) 排斥 分析法 972 第 二节细 胞凋亡 的生物 化学研 究方法 973 一 、 凋 亡细胞 DNA 片段 的检测 973 二、 细胞群 染色体 DNA 断裂 的测定 975 第 三节细 胞凋亡 的免疫 化学分 析方法 978 第四 节细胞 凋亡的 分子生 物学研 究方法 980 ―、 过 氧化物 酶标记 测定法 980 二 、 荧光 素标记 测定法 982 三、 生物素 -dUTP/ 酶标 亲和素 测定法 983 第五节 流式细 胞仪检 测凋亡 细胞的 几种常 用方法 984 • xvii • 一、 Annexin V 法 984 二、 TdT 法 985 二、 F-Actin 法 987 四、 Caspase-3 法 987 五、 Siib-Gl 法 989 主要参 考文献 990 g 十八 章转基 S 动物 991 弓丨 言 991 第一节 转 基因技 术的基 本原理 991 髓 991 二 、转 基因技 术的理 论依据 992 第二 节转基 因动物 常用制 备方法 : 993 一 、 转 基因动 物常用 制备方 法简介 993 二、 原核期 胚胎的 显微注 射技术 995 第三 节转基 因动物 的应用 1005 一、 基因表 达调控 、基 因功能 及发育 调控作 用研究 1006 二 、 基因 工程定 向育种 1007 三、 转基因 动物生 物反应 器研制 1008 四 、 人类 疾病模 型与基 因治疗 1009 五 、 药理 学研究 1010 六 、 器 官移植 1010 七、 环境科 学研究 1011 第四节 转 基因技 术展望 1012 主要参 考文献 1013 附录 1016 附录 1 细胞 分子生 物学常 用缩写 和数据 1016 附录 2 实 验室常 用仪器 和设备 1029 附录 3 细 胞分子 生物学 常用操 作技术 1031 主要参 考文献 1043 第一 章大肠 杆菌、 质粒和 噬菌体 引 言 大 肠杆菌 、质 粒和噬 菌体均 是分子 克隆常 用的重 要工具 ,质粒 和噬菌 体一般 用作将 DNA 引入 细胞的 载体, 而大肠 杆菌则 用来作 为质粒 和噬菌 体扩增 的宿主 ,本章 将介绍 它 们的一 些生物 学特性 与操作 方法。 大肠 杆菌是 一种棒 状细菌 ,属原 核生物 ,其染 色体为 4 638 858bp 的 环状染 色体。 大 肠杆菌 对生长 条件要 求不高 ,在 仅含如 葡萄糖 等碳水 化合物 (提供 碳源和 能量) 的培 养 基中就 能生长 ,在仅 提供氮 、磷 和微量 元素的 无机盐 极限培 养基上 也能快 速生长 。如 果 用丰富 培养基 (含 氨基酸 、核苷 酸前体 、维 生素以 及其他 一些细 菌不能 合成的 代谢成 分等) 来培养 ,那 么大 肠杆菌 将生长 得更为 迅速。 在 液体培 养基中 培养时 ,大肠 杆菌先 进入一 个生长 滞后期 ,然 后才开 始裂殖 。如果 用丰 富培养 基培养 ,大 肠杆菌 复制一 代仅需 20~30min, 这 种指数 生长相 称为对 数期。 随 着细菌 的生长 ,培养 基中的 营养成 分和氧 会耗尽 ,而 培养 基中逐 渐增加 的代谢 产物也 可 抑制细 菌的快 速生长 ,此 时菌体 密度就 会处于 一种比 较恒定 的状态 ,这 就是细 菌生长 的 饱和期 。培 养基中 细菌密 度刚到 达这一 恒定状 态时称 为新鲜 饱和期 。一 般在这 一时相 细菌的 密度约 (1X109)~(2X109) mL〃, 此时 细胞迅 速分裂 停止。 DNA 重组 技术中 常用的 细菌一 般都是 20 世纪 60 年代 发展起 来的大 肠杆菌 K-12 株的衍 生菌株 。对 这一 菌株 以及以 此为宿 主菌的 噬菌体 和质粒 所进行 的研究 为分子 生物学 的进展 奠定了 良好的 基础。 在天 然的大 肠杆菌 中含有 一些独 立于染 色体外 的环状 DNA •分子 ,称 为质粒 。它们 能自 主复制 ,具有 抗生素 抗性和 产生限 制酶等 重要的 生物学 功能。 20 世纪 70 年代以 来 ,研 究人员 在实验 室里利 用天然 质粒中 这些具 有特殊 作用的 DNA 片段 ,人工 构建了 许多衍 生质粒 ,而后 者成为 DNA 重组中 最常用 的载体 ,以将 DNA 引入 细胞。 一般而 言 ,用 作克隆 的质粒 应至少 包括三 个基本 部分: 复制子 、选 择标记 和克隆 位点。 在对质 粒 进行分 析和操 作前必 须分离 获得一 定纯度 的质粒 DNA。 如需从 大量克 隆中快 速制备 和分 析质粒 DNA, 可以 通过十 分快捷 的小量 制备法 获得。 如分离 大量高 纯度的 DNA, 可使用 氯化铯 - 溴化乙 锭方法 。制 备好的 质粒还 需导入 到大肠 杆菌中 才能使 其扩增 ,一 般先制 备感受 态的大 肠杆菌 ,通过 氯化钙 转化法 或电穿 孔法可 将质粒 DNA 导入 。实验 室 常用的 氯化钙 法即可 获得较 好的转 化效率 ,操 作简单 ,无 需特殊 仪器。 如果需 要特别 高的转 化效率 ,应 采用电 穿孔法 ,此 法需要 专门的 电穿孔 设备, 但简单 、快速 、可 靠。 另 一种常 用的载 体就是 噬菌体 ,实 验室采 用的多 为一种 丝状噬 菌体的 衍生体 —— M13mp 载体。 插入该 载体的 DNA 能以单 链环状 DNA 和双 链环状 DNA 两 种形式 存在, 因 而被广 泛应用 。外源 DNA 被插 入双链 DNA 中后 ,转 化入细 菌细胞 ,一 旦这种 DNA 进入 细胞内 ,双链 DNA 即进行 复制, 合成新 的双链 DNA 和源于 载体双 链中某 一条链 的单 链环状 DNA, 单 链环状 DNA 被 包装进 X 噬菌体 颗粒中 ,并在 不裂解 细胞的 情况下 分 泌到培 养液中 。将感 染细胞 离心得 到的上 清液有 很多只 含单链 DNA 的 噬菌体 颗粒。 单链 DNA 的 获得为 DNA 序 列测定 和基因 诱变提 供了新 方法。 为了便 于本章 的学习 ,对 于常 见的一 些名词 及用语 ,简介 如下: a 片段 (alpha fragment): 含 (3- 半 乳糖苷 酶氨基 末端的 肽链, hcZ 基因的 产物。 a 片段 缺少酶 的活性 ,但 能够与 〇> 片段 (见下 ) 一起形 成具有 (3- 半乳糖 苷酶活 性的蛋 白质。 a 互补 (alpha-complementation) : 片段 通过与 a 片段 联合起 来而使 |3- 半乳糖 昔酶活 性得以 恢复。 〇〇 片段 (omega fragment): 含 (3- 半乳糖 昔酶親 基末端 片段的 蛋白质 。该 蛋白 质缺乏 酶 的活性 ,但当 肽链与 一《 片段 结合后 ,卩 -半乳 糖苷酶 的活性 就能被 恢复。 c〇5: X 噬菌体 ter 功能 的作用 位点。 c〇s 位点被 ter 切割, 产生的 两个黏 性末端 (c〇S 末端 )。 Azr: —些 质粒上 的位点 ,其作 用为确 保每一 个子代 细胞能 得到一 个质粒 拷贝。 F 因子 (F factor): 在细菌 细胞内 位于质 粒环状 DNA 上的一 个基因 ,可独 立或整 合到 细菌染 色体内 ,起 决定细 菌性别 的作用 ,又称 性因子 (sex factor)。 它是在 大肠杆 菌株和 有关物 种中发 现的遗 传单元 。编 码用 于性纤 毛形成 的蛋白 ,该纤 毛允许 F 因子 在细 菌之间 转移。 SOS 反应 (sos response): 大肠 杆菌对 DNA 的损伤 或抑制 DNA 复制 的其他 作用的 反应。 在该反 应中, X 衍生噬 菌体被 诱导。 饱和 培养物 (saturated culture): 因为营 养物的 耗竭或 废物的 堆积, 细胞停 止生长 的液体 细胞培 养物。 标记 (marker): 在同一 种群中 一个机 体与另 一机体 (常指 野生型 ) 之间可 检测的 遗传 差异。 不相容 (incompatible): 两个 质粒不 能在同 一个细 胞中永 远没有 选择地 复制的 现象。 不 相容组 (incompatible group) : 不能共 存在同 一个细 胞中的 一 组 质粒。 包装 抽提物 (packaging extract): 从含有 X 嗤菌 体头部 、尾部 及包装 蛋白的 特殊大 肠杆 菌株中 得到的 提取物 。将 噬菌体 DNA 加入到 这种提 取物中 ,可以 装配成 噬菌体 颗粒。 雌 性菌株 (female strain): 不含 F 因子 并且当 与含有 F 因子的 菌株相 遇时接 受遗传 信息的 菌株。 带 动转移 (mobilization): 由可移 动遗传 成分如 F 因子 引起 DNA 从 一 细 胞到另 一 细胞的 转移。 多接头 (polylinker): 含有 连续的 许多限 制酶切 位点的 DNA 片 段称为 多接头 ,又 叫 多克隆 位点。 低拷贝 数质粒 (丨 〇w-copy-number plasmid): 当细 胞在丰 富培养 基中生 长时, 每个细 胞中 拷贝数 不超过 20 个 质粒。 对 数晚期 (late log period): 培 养物指 数生长 的后期 ,在 这之后 ,由 于营养 物耗尽 和 (或) 废物 的积累 ,生 长放慢 ,进 而完全 停滞的 阶段。 对数相 (log phase): 单细胞 在培养 过程中 ,细 胞数目 呈指数 生长的 时期。 丰富 培养基 (rich medium): 含有 复杂有 机分子 (多肽 、核 昔等) 的生 长介质 。典 型的 成分包 括:胰 蛋白胨 (小牛 ) 和 酵母浸 出液。 辅助 噬菌体 (helper phage): 编码 必需蛋 白质并 使得其 他不编 码这些 蛋白质 的噬菌 体 能够生 长的噬 菌体。 复制型 (replicative form): 单链 RNA 病毒 和单链 DNA 病毒在 复制过 程中出 现的双 链核酸 分子。 复制子 (replicator): 位于噬 菌体或 质粒上 ,能独 立进行 复制的 一部分 DNA 分子。 它包括 一个启 动复制 的基因 和一个 接受启 动子信 号而开 始复制 的位点 (称 复制区 )。 滚 环复制 (rolling circular replication) : 环状 DNA 分子 采取的 一 ■种复 制方式 ,这时 DNA 聚合 酶连续 环绕模 板复制 出现新 的环状 DNA 分子 。其 步骤: ①“负 ”链保 留为封 闭式 环状; ②“ 正”链 裂开, 并继续 沿环状 负链模 板延伸 ,同 时以新 形式的 3’ 羟基末 端作为 DNA 聚合 酶的起 始点; ③原 有的正 链以某 一单链 尾部从 滚环中 脱出; ④接 着新 的负链 开始, 并在正 单链尾 端进行 聚合; ⑤在 新的负 链形成 之前, 复制中 间体分 裂为滚 环的环 状部分 和线性 部分。 感 染复数 (multiplicity of infection, MOI): 感染的 嗤菌体 与宿主 细胞的 比率。 感受态 (competent): 细菌或 酵母细 胞能够 转变成 有效摄 入外来 DNA 的状态 (例 如 ,用氯 化钙处 理的大 肠杆菌 )。 过夜 培养物 (overnight culture): 小量的 细菌经 过过夜 (6h 以上) 的培养 ,得 到新 鲜饱和 的细菌 液体培 养物。 菌苔 (lawn): 覆盖 平板表 面的均 一 '菌 层。 极限 培养基 (minimal medium): 仅含 有盐、 维生素 、微量 兀素和 提供碳 、氮 、磷 源 的简单 化合物 的细胞 生长培 养基。 接种 (inoculation): ①将微 生物, 或某些 活细胞 移植到 适于它 生长繁 殖的人 工培养 基或 活的生 物体内 或体外 (如 动物体 或组织 培养) 的方法 ,一般 都须在 无菌条 件下进 行; ②将 疫苗等 注射到 人或动 物体内 ,以预 防某些 疾病。 克 隆位点 (cloning site): 在载 体上插 入外源 DNA 的 位点。 扩增 (amplification): ①一 些质粒 的拷贝 数增加 的过程 ,而这 时宿主 蛋白的 合成是 被抑制 了的; ②对完 整基因 组而言 ,细 胞内某 (些) 基 因单独 复制产 生多个 拷贝; ③基 因文 库成批 地大量 复制。 平板 (plate): 指培 养皿中 固体培 养基所 形成的 平面。 用于培 养单个 的细菌 克隆或 噬菌 体空斑 。该词 有时指 96 孔 微量滴 定板。 平板接 种效率 (efficiency of plating, EOP) : 在 一 ■些实 验条件 下细菌 克隆或 唆菌体 空斑的 滴度与 通过生 长在一 些参照 基质上 得到的 细菌或 噬菌体 滴度的 比值。 起点 (ori, origin): 在基 因组上 DNA 复制 开始的 位点。 溶原体 (lysogen): — •种溶 原性细 菌细胞 。也就 是细胞 中含有 以原嗤 菌体状 态存在 着 温和噬 菌体的 细菌。 松弛 DNA (relaxed DNA) : 呈 非超螺 旋状态 的环状 DNA 分子。 松 弛控制 (relaxed control): 适用 于不依 赖于菌 体细胞 周期的 复制的 质粒。 松 弛质粒 (relaxed plasrmd): 指不 受细菌 细胞内 染色体 复制所 控制的 质粒。 生长晕 (outgrowth): 在原代 组织块 培养时 ,待组 织块牢 固附于 瓶底后 ,再 将瓶轻 轻翻正 ,并继 续培养 ,经一 定时间 后细胞 自组织 块边缘 分散出 来称生 长晕。 涂板 (plating out): 将 细菌或 噬菌体 在平板 上铺开 ,使克 隆或空 斑得以 形成。 温和 噔菌体 (temperate phage): 指 感染细 菌后能 够呈溶 原性生 长的唾 菌体。 卫 星菌落 (satellite colony): 在选 择性培 养板上 ,环绕 大菌落 生长的 小菌落 。这些 菌落一 般由在 选择培 养基上 不能生 长的菌 落组成 ,但 因为大 菌落中 的细胞 中和了 选择性 成分 ,所以 它们才 得以在 大的菌 落附近 生长。 先 导蛋白 (pilot protein): 在丝状 噬菌体 被膜上 、用来 帮助其 进入细 胞的蛋 白质。 雄性株 (male strain): 含有 F 因子的 菌株。 雄性专 — 性 噔菌体 (male-specific phage) : 因为吸 附到性 纤毛上 ,仅 在雄性 菌株中 生 长的噬 菌体。 延迟期 (lag period): 指培 养物刚 接种后 ,细 胞还没 有开始 呈指数 生长前 的一段 时期。 诱导 (induction): 在遗传 学上指 由于某 一诱导 物的作 用使有 关的基 因合成 特定的 酶 (见诱 导系统 )。 诱 导系统 (induction system) : — 种调 节系统 。在基 因转录 的调节 过程中 , 调节基 因 (regulator gene) 产生 阻遏物 (repressor), 阻遏物 抑制了 操纵子 (operon) 的 转录作 用 。如果 这时有 诱导物 (inducer), 也就是 效应物 (effector) 与阻遏 物结合 ,解 除了阻 遏物对 操纵子 的抑制 ,操纵 子上的 有关结 构基因 (structure gene) 即转录 。因此 ,在此 情况下 ,转录 过程只 能在有 效应物 分子时 ,才 能进行 ,它 起的作 用称为 诱导。 严紧 型控制 (stringent control): 适用 于复制 与大肠 杆菌细 胞周期 同步的 质粒。 严紧 型质粒 (stringent plasmid): 指 质粒的 自主复 制受细 菌染色 体复制 功能所 控制, 每 个细菌 里可含 1 〜 3 个 拷贝。 原 噬菌体 (prophage): 休眠 噬菌体 ,常 整合在 宿主染 色质上 ,并 随宿主 菌一起 复制。 转化 (transformation): 将 DNA 导入大 肠杆菌 或酵母 细胞, 并稳定 地整合 于基因 组中 ,从而 使受体 细胞发 生永生 化改变 的现象 。过去 也习惯 于指正 常细胞 受致癌 病毒感 染发 生癌变 (永 生化, 失去接 触抑制 ,等等 ) 的 过程。 转染 (transfection): 病毒 DNA 或 RNA 导 入感受 态大肠 杆菌中 的过程 。也 指将任 何 DNA (包 括质粒 DNA) 或 RNA 导 入受体 细咆的 过程。 早 期对数 生长相 (early log phase): 在培 养物生 长过程 中延迟 期以后 的时期 。在该 生 长期间 ,细 胞开始 呈指数 生长。 指数期 (exponential phase), 指细胞 在液体 培养基 中培养 ,细 胞数目 呈指数 地增加 的 时期。 指 数生长 (exponential growth): 培养物 中细胞 生长数 量按时 间的指 数方程 式而增 长 ,并 且在这 段时期 细胞的 生长都 是与当 时存在 的细胞 数目呈 正比例 。即 细胞数 = 指数 生长速 率常数 (exponential growth rate constant): 细胞繁 殖世代 时间的 倒数, 以每小 时繁殖 的世代 数目来 表示。 第 一节大 肠杆菌 大肠 杆菌是 一种杆 状细菌 。其 染色体 呈环状 ,约 4. 6X106 个 碱基对 ,含有 4288 个 基因 。它能 在极限 培养基 中快速 生长。 这种培 养基仅 含如葡 萄糖这 类碳水 化合物 及盐, 前者作 为碳元 素及能 量来源 ,后 者提供 氮磷和 微量金 属元素 。如果 加入了 氨基酸 、核苷 前体 、维 生素以 及菌体 必需的 其他物 质在所 谓丰富 培养基 内培养 ,大肠 杆菌会 长得更 快 。本节 的目的 在于提 供培养 细菌基 本而又 必要的 知识。 当 大肠杆 菌要在 液体培 养基中 生长时 ,首 先将小 部分细 菌接种 到盛有 灭菌培 养基的 容器中 。在细 菌开始 分裂前 的这段 时间叫 延迟期 。在丰 富培养 基中, 典型的 菌株每 20 〜 30min 完成一 次分裂 。细 菌在 这段时 期呈指 数生长 ,亦 称对数 生长期 ,有时 更进一 步细 分为对 数早期 、对 数中期 、对 数晚期 ,细 菌密度 逐渐增 加到一 定程度 。最后 ,当培 养基 中的营 养成分 和氧耗 尽或当 培养基 中废物 的含量 达到抑 制细菌 快速生 长的浓 度时, 菌体密 度就达 到一个 比较恒 定的值 ,细胞 停止迅 速分裂 ,达 到饱和 状态。 一、 培养基 的制备 和细菌 学工具 (一) 极限 培养基 按 以下配 方配制 5 x 极限培 养基。 5 x M9 培养基 (L-1) 5 x A 培养基 (L-1) Na2HP04 30g (NH4)2S04 5g kh2po4 15g kh2po4 22. 5g NH4CI 5g K2HP〇4 52. 5g NaCl 2.5g 二水柠 檬酸钠 ■ 2.5g CaCl2 15mg (也可 不加) 5 X M63 培养基 (L-1) (NH4)2S04 l〇g kh2po4 68g FeS04-7H20 2. 5mg 在一个 2L 的烧 瓶中 ,将配 方中各 成分加 入水中 ,加 热搅 拌直至 其溶解 ,加 水定容 至 1L, 用 KOH 调 pH 至 7.0。 然后 倒入玻 璃瓶中 ,拧 松盖子 ,于 15 1bf/m2* ( 相当于 * 为 设备默 认的计 量单位 。为了 标准化 ,在 括号内 括注国 际单位 制单位 (SI 单位 )。 1.034Xl〇5pa) 高压 15min, 待培养 基冷至 50X: 以下 ( 在这个 温度时 ,手 持瓶子 可感觉 热 ,但能 握得住 ), 再加 入其他 补充成 分和抗 生素, 然后盖 紧盖子 ,并可 于室温 无限期 保存 。临用 前用无 菌水将 高浓度 培养基 稀释成 IX 培养基 ,并 且每升 加入以 下无菌 溶液: lmol/L MgS04-7H20 20 % 碳源 (糖或 甘油) lmL lOmL 如果需 要还可 加入以 下溶液 : 0.5% 维生素 氏 (硫胺 素) 0. lmL 20%酷蛋白水解物(。358111丨11〇3(^) 5mL 或 L •氨 基酸至 40;xg/mL 或 DL- 氨 基酸至 80fig/mL 抗生素 (见表 1.1) (二) 丰富 培养基 配方 如下: 但高压 灭菌需 25min, 不需 稀释。 H 培养基 (L'1) X 肉汤 培养基 (L'1) 胰 蛋白胨 10g 胰 蛋白胨 l〇g 氯化钠 8g 氯化钠 2.5g LB 培养基 (LM) NZC 肉汤 培养基 (LM) 胰 蛋白胨 l〇g NZ amine A (酪 蛋白的 酶促水 解物) l〇g 酵母 提取物 5g 氯化钠 5g 氯化钠 5g MgCl2-6H20 2g lmol/L NaOH lmL 高压 30min 20% 酪蛋白 水解物 ( casamino acid ) 5mL 超 级肉汤 培养基 (LM) TB 超级肉 培养基 (L'1) 胰 蛋白胨 32g Bacto (细菌 ) 胰 蛋白胨 12g 酵母 提取物 2g Bacto 酵母 提取物 24g 氯化钠 5g 甘油 4mL 10mol/L NaOH 5mL 以上培 养基均 加水至 900mL 并高压 ,然 后再 加入共 lOOmL 灭菌的 0.17mol/L KH2P〇4 和 0.72mol/L K2HP04〇 胰蛋白 胨肉汤 培养基 (LM) 2 X TY 培养基 (L-1) 胰 蛋白胨 l〇g 胰 蛋白胨 16g 氯化钠 5g 酵母 提取物 l〇g 氯化钠 5g TYGPN 培养基 (L-1) 胰 蛋白胨 20g 酵母 提取物 lOg 80 % 甘油 lOmL Na2HP04 5g kno3 l〇g 以上 培养基 均加水 定容至 1L 并高压 25min。 (三) 固体 培养基 按 下述方 法配制 极限培 养基平 板和丰 富培养 基平板 ,配制 前准备 好无菌 带盖的 100mm 的培 养皿。 1. 极 限培养 基平板 800mL 水加入 15g 琼脂 ,高 压灭菌 15min。 待 冷却至 50X:, 加入 200mL 无菌的 5X 极限 培养液 和碳源 ,按 需要加 入补充 成分和 抗生素 。于 超净台 上每平 板倒入 32~40mL 培养基 ,每 升培养 基可制 作大约 25~30 个 平板。 2. 丰 富培养 基平板 将水 加入以 下所列 出的培 养基配 方的成 分中, 定容至 1L, 高 压灭菌 25mm。 每个 LB 和 H 培养 基平 板倒入 32 〜 40mL 培养基 ,每个 X 肉汤培 养基平 板倒入 45mL 培 养基。 H 平板 CL'1) LB 平板 (L-1) 胰 蛋白胨 l〇g 胰 蛋白胨 l〇g NaCl 8g 酵母 提取物 5g 琼脂 15g NaCl 5g 10mol/L NaOH lmL 琼 脂或者 琼脂糖 15g 夂肉 汤平板 (L-1) 胰 蛋白胨 10g NaCl 2.5g 琼脂 10g 添加物 抗生素 (根 据需要 ): 半 乳糖苷 (根 据需要 ): 氨苄 青霉素 50{j.g/ mL Xgal 终 浓度为 20pg/mL 四环素 12fig/mL IPTG 终 浓度为 0.1mmol/L 其他的 抗生素 ,见表 1.1 其他半 乳糖苷 ,见表 1.2 平 板于室 温干燥 2~3d, 或将 平板的 上盖稍 微打开 ,于 37X: 或在层 流通风 橱干燥 30min, 将晾 干的平 板包裹 好贮于 4X:。 (四) 顶 层琼脂 培养基 顶 层琼脂 培养基 常用于 将噬菌 体或细 胞在平 板的表 面均匀 分布成 一薄层 。以 1L 的 批量配 制顶层 培养基 ,高压 15min 并使之 融化, 冷却至 5CTC, 轻 轻旋转 晃动使 其混合 均匀, 分装至 lOOmL 烧瓶中 。再 次高压 、冷却 ,于室 温保存 。使 用前, 用水浴 或者在 微波炉 熔化顶 层琼脂 ,然后 冷却至 40 〜 50t: 并 维持在 该温度 。顶 层琼脂 中琼脂 的含量 比 普通平 板要少 ,如 果置于 40 〜 50T:, 顶层 琼脂可 保持融 化状态 数天。 H 顶 层琼脂 培养基 (L-1) LB 顶层 培养基 (L-1) 胰 蛋白胨 l〇g 胰 蛋白胨 l〇g NaCl 8g 酵母 提取物 5g 琼脂 7g 琼脂 7g X 顶 层琼脂 培养基 (L-1) 顶层 琼脂糖 培养基 (L*1) 胰 蛋白胨 l〇g 胰 蛋白胨 l〇g NaCl 2.5g NaCl 8g 琼脂 7g 琼脂糖 6g 以上 4 种顶层 琼脂培 养基分 别加水 定容至 1L, 混匀。 (五) 穿 刺琼脂 培养基 穿剌 培养基 CL'1) 营 养肉汤 l〇g 半 胱氨酸 盐酸盐 10mg NaCl 5g 胸 腺嘧啶 10mg 琼脂 6g 加水至 1L, 混匀 穿 刺琼脂 培养基 用来保 存菌株 。据 认为半 胱氨酸 可很大 程度地 延长细 菌在穿 刺培养 物中 的存活 时间, 加入胸 腺嘧啶 则可使 th 厂细菌 生长。 (六) 细菌接 种时常 用的实 验工具 1) 接种环 (1) 灭菌 ,将 接种环 置于酒 精灯火 焰中灼 烧直至 变红。 (2) 冷却 ,将 接种环 触及无 菌琼脂 平板的 表面直 至其不 发出咝 咝声。 2) 无 菌牙签 圆形 木制牙 签或扁 平牙签 尖端有 时被用 来挑取 单个细 菌或噬 菌斑。 (1) 将 牙签装 在锡箔 纸盖的 烧杯或 原装盒 中高压 灭菌。 (2) 牙签 经重新 高压灭 菌后可 以重复 使用。 3) 涂布棒 (1) 加热并 弯曲一 支直径 4mm 的玻璃 管或巴 斯德吸 管制备 涂布棒 (如图 1.1)。 (2) 灭菌, 将涂布 棒的三 角部分 浸没于 95% 酒 精中, 从容器 中取出 后再通 过灯焰 ,点 燃其上 的醇。 (3) 等涂 布棒上 的火焰 熄灭后 ,将其 触碰无 菌琼脂 平 板的表 面使其 冷却。 4) 酒精灯 5) 超净 工作台 二、 在液体 培养基 中培养 图 1.1 涂布棒 的制作 (一) 过 夜培养 (1) 取 5mL 液体 培养基 加至一 支无菌 的直径 16mm 或 18mm 的 培养试 管中。 (2) 用接 种环挑 一个单 菌落, 浸没于 培养液 中并轻 轻振动 接种环 ,使 待接种 的细菌 分散 在培养 液中。 (3) 盖 好试管 ,在 摇床或 转鼓式 培养装 置上于 371C、 60 r/mm 的速 度培养 至饱和 状态 。新 鲜培养 至饱和 期约需 6h, 此时培 养液细 菌浓度 大约为 (lx 1〇9) 〜 (2 xi〇9) mL-1〇 (二) 大 量培养 (1) 按 1: 100 的比 例将过 夜培养 物加入 至一个 无菌烧 瓶中, 烧瓶的 体积应 不少于 培养液 体积的 5 倍。 (2) 如果不 采用摇 动的方 式培养 ,应使 用更大 体积的 烧瓶, 至少比 培养液 体积大 20 倍。 (3) 于 37X: , 约 300 r/min 的速度 下培养 过夜。 (三) 细 菌培养 的监测 .利 用计数 板监测 (1) 取 一 片干净 的计数 玻片或 Petraff-Hausser 小室 ,盖上 干净的 盖玻片 ,参 见下面 的图 1.2。 图 1.2 通过 计数板 计算细 菌浓度 (2) 用小 吸管吸 取少量 培养液 ,轻 轻接触 盖玻片 的边缘 ,使 液体刚 刚充满 整个小 室。 (3) 在 400 倍相差 显微镜 下观察 ,一 个小 方块中 所见的 每个细 菌大约 相当于 2 x K^mL-1, 计数 细菌数 并计算 浓度。 2. 利用分 光光度 计监测 (1) 将 培养液 稀释至 〇D6(M)sL 基因 (编码 S12 蛋白) 突 变可以 阻止链 霉素的 霉 素的敏 感性是 显性的 结合。 链霉素 抗性是 隐性的 四环素 e (溶于 70% 乙醇) 杀菌; 通过阻 止氨酰 tRNA 与核 12 12 糖体 A 位的结 合而抑 制细菌 蛋白质 的合成 主动 地将药 物从细 胞排出 注:资 料来自 Foster(1983),Gottlieb and Shaw(1967) 和 Moazed and Noller(1987)。 a. 除了 四环素 保存于 -20X:, 其 他均应 保存于 4t:。 除非另 有说明 ,所 有抗生 素均溶 于无菌 的去离 子水。 b. 羧苄 青霉素 可以以 同样的 浓度代 替氨苄 青霉素 ,羧 苄青霉 素溶于 50% 乙醇 /50% 水中, 贮存于 -20X:。 c. D- 环丝氨 酸溶液 不稳定 , 应该在 临用前 新配。 d. 对光敏 感应保 存于黑 暗处。 (二) 乳糖 操纵子 大肠杆 菌乳糖 (仏 C) 操纵 子的研 究促进 了本书 提到的 技术的 发展。 操纵 子的结 构 基因由 hcZ、 仏 hcA3 个基 因组成 (见图 1.4)。 当 细菌生 长在丰 富培养 基或含 葡萄糖 的极限 培养基 中时, he 操纵子 邻近的 基因产 生的阻 遏蛋白 ,在没 有乳糖 的条件 下 ,它与 操纵基 因结合 ,抑制 RNA 聚合酶 与启动 子结合 ,从 而抑 制结构 基因的 转录。 当_细 菌生长 在含乳 糖或某 些有关 化合物 (见表 1.2) 的培养 基时, 阻遏蛋 白就不 再与操 纵基因 结合, RNA 聚合酶 与启动 子结合 ,从 而启动 结构基 因转录 得以合 成编码 hcZ、 Zac Y" 、 ZacA 的单链 mRNA〇 在野 生型的 乳糖操 纵子中 ,由于 kc 启动子 是弱启 动子, 所以转 录起始 也需要 CAP (catabolite gene activator protein) 结合 到启动 上游的 CAP 位点后 ,才 能促进 RNA 聚合 酶 与启动 子结合 ,引起 有效的 转录。 CAP 结合 DNA 是由 cAMP 控 制的, cAMP 结合于 CAP, 使 CAP 活化, 进而与 特定的 DNA 序列 结合, 激活邻 近的基 因转录 。由于 CAP 的作用 依赖于 cAMP, 因此, CAP 又称 cAMP 受 体蛋白 (cAMP receptor protein, CRP)。 3 个基 因中有 两基因 是在乳 糖代谢 过程所 必需。 hcY 基因 编码通 透酶, 该酶与 乳糖和 某些 相关糖 的摄取 有关。 kCZ 基因 编码 P- 半乳 糖苷酶 ,它 将乳糖 分解成 葡萄糖 和半乳 糖 ,然 后被细 胞利用 。第 3 个结 构基因 (kcA) 编码 硫代半 乳糖苷 乙酰转 移酶。 该酶在 乳糖 代谢中 不需要 。它 在含乳 糖的培 养基上 生长期 间的功 能尚不 清楚。 • 14 • /ac 操纵子 阻遏物 图 1.4 乳 糖操纵 子的表 达调控 I: 乳 糖操纵 子的结 构基因 Z、 Y、 A 的转录 是通过 阻遏 物来阻 遏的; II: 无活 性阻遏 物不能 结合到 操纵基 因上, RNA 聚合 酶与其 结合, 促进结 构 基因的 转录; III: 在 RNA 聚 合酶的 催化下 ,促 进操纵 子结构 基因的 转录; IV: RNA 聚 合酶遇 到转录 终止子 ,在 p 因子影 响下, RNA 聚 合酶从 RNA 上脱落 , 再参与 新一轮 的转录 表 1.2 用于 DNA 克 隆技术 的乳糖 类似物 半 乳糖苷 贮 存浓度 a 用 途 特性 异丙基 -1- 硫代 fD •半 乳糖苷 (IPTG) 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 +D- 半乳搪 苷 (Xgal) 100mmol/L 非常 有效的 诱导物 为非 代谢性 诱导物 20mg/mL (溶于 N, N- 二 甲基甲 酰胺) 可 以鉴别 ZacZ+ 细菌, 在鉴 定重组 载体产 生的 卜半乳 糖苷酶 时特 别有用 半乳 糖苷酶 的非诱 导性显 色底物 (分解 Xgal 产 生蓝色 ), 蓝色 的产生 与 基因产 物无关 邻 硝基苯 fD- 半 乳糖苷 (ONPG) 10mmol/L 用于 P ■半 乳糖 苷酶的 分析 p ■半 乳糖苷 酶的显 色底物 (分解 ONPG 产生 黄色) 6-O-p-D •半 乳糖吡 喃糖基 -D- 体 内乳糖 操纵子 诱导物 ,通过 半乳糖 葡萄糖 (异 乳糖) 苷 酶可以 将乳糖 转化为 异乳糖 苯基 +D ■半 乳糖苷 (Pgal) 2 mg/ mL 作为 组成 性突变 体的 选择剂 半乳 糖苷酶 非诱导 性底物 ,其 摄取部 分 依赖于 基 因产物 邻 硝基苯 ■硫 代半 乳糖苷 lOmmol/L 可 以作为 突变体 通过 通透酶 基因 产物) 进 (TONPG) 的 选择剂 入细咆 ,高 浓度时 抑制细 咆生长 a. 除非另 有说明 , 上述贮 存液均 溶解于 无菌双 蒸水。 • 15 • a 互 补:像 pUC 和 M13mp 系列 的载体 ,含 有编码 (3- 半乳糖 苷酶的 cr 片段的 DNA。 这 些载体 利用了 一 种叫做 a 互补 的现象 (图 1.5), 这是由 Ulman、 Jacob 及 Monod 于 1967 年 发现的 。他 们发现 ,在 hcZ 基因 5' 端作任 何删除 ,细胞 合成的 (3- 半乳糖 苷酶的 C 末端 〇> 片 段都没 有活性 。同样 ,在 3' 端作 删除, 编码的 N 末端 a 片段失 去活性 。然 而, 如果一 个细胞 含有两 个基因 ,其中 一个指 导合成 a 片段 ,另一 个合成 co 片段, P- 半 乳 糖苷酶 的活性 就会显 示出来 。由于 许多载 体加入 了乳糖 《片 段基因 (因 为它小 且易于 操作 ), 因此使 用这些 载体需 要携带 co 互补片 段基因 的菌株 ,以便 能组装 成一活 性复合 物 。该基 因常由 F' 质 粒携带 ( 见下面 )。 使 用这些 载体时 ,让 细胞生 长在含 IPTG 和 Xgal 的培养 基上。 前者使 乳糖抑 制物失 去活性 ,从而 解除对 〇> 片段 合成的 抑制; 后者 因 (3- 半乳糖 苷酶的 作用变 为蓝色 (见表 1.2)。 在这 种培养 基上, 含有这 些载体 的细胞 具有 (3- 半乳糖 苷酶活 性并呈 蓝色。 乳糖类 似物: 有很多 与乳糖 相关的 化合物 最先被 用于乳 糖操纵 子活性 的生化 和遗传 学分析 ,并 用于 本书所 述的克 隆技术 。这 些在表 1.2 都有 描述。 (三) F 因子 F (fertility) 因子是 在一些 大肠杆 菌株中 发现的 遗传学 单位。 在本书 提到的 很多技 术都 用到含 F 因子 的细菌 。有 两个主 要原因 :首先 (正如 本章稍 后所述 ), 拥有 F 因子 的细 菌可以 被丝状 噬菌体 衍生载 体感染 ,它们 结合到 称为纤 毛的细 菌表面 结构上 ,含 F 因子的 细菌长 有纤毛 。其次 ,缺失 的编码 (3- 半乳 糖苷酶 co 片段的 基因 (下述 ) 常 常 被因子 F' 携带。 F 因子有 3 种形式 : 双链、 单拷贝 的环状 染色质 外质粒 DNA (F+); 类似 F+ 质粒 DNA, 但也 包括了 其他细 菌基因 (F'); 整合 到细菌 染色质 上不同 位点的 线形 DNA (Hfr) 中。 • 16 . (四) 无意义 抑制子 用 于重组 DNA 研 究的某 些质粒 ( 如质粒 NVX 和噬菌 Charon 4a) 在 必需基 因中含 有无意 义突变 。这些 载体必 须在特 定的大 肠杆菌 菌株中 繁殖。 在这些 菌株中 ,当 核糖体 遇到 一个链 状终止 密码子 (琥 珀或赭 石型) 时 ,信息 的翻译 不一定 停下来 ,有时 会用一 新的氨 基酸装 在延伸 的肽末 端而继 续进行 。这个 过程称 为无意 义抑制 ,并 且这些 菌株被 认 为含有 无意义 抑制子 。在 含有一 个高效 或“强 ”的抑 制子的 菌株里 ,当 遇到琥 珀密码 子时 ,抑 制的发 生率为 50%。 无意 义抑制 的机制 很简单 ,细 胞中含 有一种 tRNA 突变种 ,这种 tRNA 突变 种的反 密码子 环发生 了变异 ,使得 它能与 UAG 琥珀密 码子或 UAA 赭石密 码子碱 基配对 ,翻 译不一 定停止 ,有时 在肽链 末端加 一新的 氨基酸 ,使 延伸继 续进行 。通常 用于克 隆技术 的 无意义 抑制子 ,在表 1.3 中 给出, UGA (乳 石型) 抑制 子也包 括在里 面了, 但很少 用。 表 1.3 常 用无义 抑制子 抑制子 图 谱位置 a 抑制 子类型 插入 氨基酸 tRNA 基因 supD (sul) 43 琥珀 抑制子 丝氨酸 serU supE (su2) 16 琥珀 抑制子 谷 氨酰胺 glnU supF (su3) 27 琥珀 抑制子 酪氨酸 tyrT supB (suB) 16 赭石 / 琥珀 抑制子 谷 氨酰胺 glnU supC (suC) 27 豬石 / 琥珀 抑制子 酪氨酸 tyrT 注:材 料来自 Bachmann (1983) 及 Celis 和 Smith (1979)。 a. 图谱位 置以分 钟表不 ,参考 Bachmann (1983) 的 描述。 (五) 遗 传标记 分子 克隆中 常用的 大肠杆 菌菌株 及其遗 传标记 (见表 1.4 和表 1.5) 按 Demerec 等 1966 年提 出的命 名原则 ,采用 的菌株 所有基 因都假 定处于 野生型 状态, 除非在 基因型 上面另 外注明 ( 见框内 )。 基因 名称由 3 个斜体 小写字 母构成 ,有 时其后 跟随一 斜体大 写字母 ,和 (或) 跟 随一斜 体阿拉 伯数字 ,特 指有争 议的精 确突变 (等 位基因 )( 如 kcW, 3 个字 母的结 合常常 提示了 基因的 功能。 在基因 型中有 适当的 注释可 省 略符号 + 和 -, 但 有时重 复使用 是为了 更清晰 。缺失 突变用 A 表示 ,其 后在括 号中为 缺失基 因名称 ,接 下来是 等位基 因号码 [如 A (hc-/>r〇) XHJ]。 A 可以用 “del” 或 “d” 替换 。如果 基因型 不能明 显地反 映出表 型的话 ,跟 随着 基因型 ,表型 的名称 在括号 中表 示出来 [如 (Strr)]。 然而, 这种用 法并不 普遍。 表 I.4 列 出了常 用的基 因标记 ,同 时也给 出了它 们在菌 体细胞 中存在 与否的 鉴别方 法 。用 于不同 用途的 几个菌 株的基 因型列 出在表 1.5 中。 • 17 • 表 1.4 常用的 遗传标 记及检 测方法 营 养标记 划线或 影印平 板菌落 于具有 或不具 有待检 测的营 养成分 但含有 其他各 种必需 的营养 成分的 平板上 抗 生素抗 性标记 划 线或影 印平板 菌落于 含有或 不含有 某种抗 生素的 平板上 其 他标记 lacZ^ 在含有 Xgal 和 IPTG 的 LB 平板上 划线培 养细菌 , /aCZ+ 菌落应 该变蓝 ,而对 照菌株 (ZacZ_) 则不 应变蓝 lacZ^MlS^ 用 pUC 质粒 和对照 质粒如 pBR322 转化大 肠杆菌 , 将转化 体划线 于含有 Xgal 和 IPTG 的 Amp 抗性 LB 平板上 , pUC 质粒转 化的菌 落应该 变蓝, 而对照 质粒如 pBR322 转化的 菌落不 应变蓝 F+ 或 F' 将 M13 噬 菌体涂 布细菌 层面上 应该看 到小的 噬菌斑 (见本 章第三 节第四 部分) recA 用一根 牙签将 菌在 LB 平板上 划一条 水平线 , 同法将 + 对照 菌也划 一条水 平线 ,然 后用一 线板遮 住平板 的一半 ,用 手提紫 外灯在 254nm 紫外 光下以 3 X 10_5J/cm2 照 射平板 (通常 紫外灯 离平板 50cm 照射 20s)。 菌 对紫外 线十分 敏感 ,没有 被纸板 遮住的 菌 应被这 一水平 的射线 杀死。 recBCD 将; 液和; ^am + 稀释 液并 排点在 细菌层 ,二者 应该形 成大小 几乎相 同的噬 菌斑 hsdS~ ① 用 来自于 或者 宿 主菌的 不同稀 释度的 X 噬菌体 感染突 变菌株 和野生 型菌株 。如 果噬菌 体来自 AsdS — 宿主菌 ,那 么它在 菌 中形成 噬菌斑 的效率 比在野 生型菌 株中形 成噬菌 斑的效 率要高 104~106 倍 ,如果 是来自 AW (h- + 宿主菌 , 那么二 者形成 噬菌斑 的效率 应该是 一样的 ② 重悬一 个源于 假设的 ZidS — 菌株的 新鲜噬 菌斑于 lmL X 噬菌体 稀释缓 冲液中 ,用 AMS — 菌和野 生型菌 株滴定 X 噬菌 体悬液 ,在 AWS — 菌 株上形 成的噬 菌数目 应该比 野生型 菌株高 104~106 倍 ,每 个噬菌 斑约有 107 个噬 菌体。 hsdR_ ( hsdS + ① 同以上 步骤① ,只是 噬菌体 来源于 — 宿主菌 5' ②重 悬一个 新鲜噬 菌斑于 lmLJl 噬菌体 稀释缓 冲液中 ,在 AsdS- 菌株 和野生 型菌株 dM ) 上进 行滴定 ,二者 形成噬 菌斑的 效率应 该一样 dam 用带有 I 和 Bd 丨 酶 切位点 的质粒 ,转化 该菌株 和野生 型菌株 ,从 两菌株 中提取 质粒, 来自血 菌株 的质粒 仍能被 Mwl 和 Bdl 识别 dcm 用带有 ScrF 1 酶切位 点的质 粒转化 该菌株 和野生 型菌株 ,从 两菌株 中提取 质粒用 ScrFI 酶 切鉴定 。只 有源于 Am 菌株的 质粒才 会被完 全切开 , 即使是 DNA 被 dcm 甲基化 ,仍有 一半的 ScrFI 位点可 被切开 Ion 在 LB 平板 上划线 培养单 菌落, 同时用 野生菌 株划线 培养作 为对照 ,于 37t 培养, ZorT 菌株 克隆应 该较大 ,发 亮并且 有黏性 注: 表中所 用的方 法涉及 培养基 的准备 ,在平 板上的 划线和 影印培 养以及 X 噬菌体 来源的 载体的 操作。 a. 编码卜 半乳糖 苷酹的 〇» 片段。 k . 18 . 表 1.5 常用的 大肠杆 菌菌株 菌株 * 基因型 sup0 galkl galE : : TnlO (XcI857 AH1 feio ' uvrB kil ~ cIII " ) Strr sup0 ga Ik 2 nad'.'.TnlO (Tetr) (Xcl+ ind* pL-lacZ fusion)StrT endAl thi-1 hsdRl 7 ( r* " m* + ) supE44 ( Xcl + ) C600 hflAlSO c/ir*ITnlO mcrAl mcrB Hfr lysA dut ung thi-1 recA spoTl thi-1 thr-1 leuB6 lacYl tonA21 supE44 mcrA dutl ungl thi-1 re/AJ/pCJ105 (Cmr) recAl endAl thi-1 hsdR17 supE44 gyrA96 (Nalr) relAl FW endAl hsdRll(rk~ mk + ) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nalr) relAl lacZYA-argF) ul6g(m80lacZ AMi5) hsdR2 hsdM ^ hsdS + araD139 ^ ( ara-Leu ) 7^97 ^ ( l〇-c ) x74 galK rpsL ( Strr) mcrAmcrBl ^ ( srl- reca)3〇6 Y* traD36 proAB laclq ^(lacZ)M15 / endA gyrA96 thi-1 hsdR2 (or hsdRl 7) supE44 ^{Lac-proAB) mcrBl mcrA ^(gpt-proA) 62 leuB6 thi-1 lacYl hsdS^O recA r psL20 (StrT) ara-14 galK2 xyl-5 mtl-1 supE44 mcrBs F' traD3 6 pro A + proB + laclq lacZ^MlS / supE thi ^ ( Ulc- proAB ) Ff traD36 proA^ proB+ laclq lacZ^MlS / ^(lac-pro) xm thi rpsL (StrT) endA sbcB supE hsdR F' traD36 proA+ proB+ laclq lacZ ^ Ml 5 / endAl gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 supE44 relAl ^(lac- proAB) mcrA Ff traD36 proA+ proB^ laclq lacZ ^ Ml 5 / recAl endAl gryA96 (Narr) thi hsdRl 7 supE44 relal ^ ( lac- proAB ) mcrA HfrC (X) hsdR514 ( )supE44 supF58 lacY galK2 galT22 metBl trp55 mcrA ^lacUi69 proC \ ITn5 hsdR514 (rk~ mk + )supE44 supF58 lacY gaLK2 galT22 metBl trp55 mcrA. hsdR2 hsdM+ hsdS+ araD139 ^(ara-leu) 7^97^( lac) x74 galE15 galK16 rpsL (StrT) mcrA mcrBl end A thi A hsdRl 7 supE44 supF hsdR (P2cox3) hsdR514 (rk~ )supE44 supF58 lacY galK2 galT22 metBl trp55 mcrA (P2) F ^ ( laclZ ) £65 + / proC \ I Tn5 ^ ( laclZYA ) u^g hsdS20 ara-14 galK2 rpsL20 ( Strr) xyl-5 mtl-1 supE44 leu hsdR~ hsdM^ supE tonA (^>80r)(P2) ^(gpt-proA)62 LeuB6 thi-1 lacYl hsdS^lO rpsL20 (StrT) ara-14 galK2 xyl-5 mtl-1 supE44 mcrb^ supE supF metB trpR hsdR ~ hsdM^ tonA21 strA ^lacui^ mcrA proC \ !Tn5/pMC9 ^ lacui69 proA + ^ ( Ion )araD139 strA hflA150 chr 1 1 TnlO/ pMC9 ^ ^cui69 ProA ^ ^ ( lon)araD139 strA supF trpC22 \ \ TnlO mcrAl pMC9 a. 大 肠杆菌 K42 原始 菌株为 F+X 溶原菌 , 但现在 大多数 常用的 K-12 衍生 菌株除 非有特 别的说 明都已 经失去 F 因子 和溶原 噬菌体 ,除了 在第二 列中列 出的细 菌遗传 标记外 ,所有 其他的 基因都 是野生 型的。 b. AS1 又 称之为 MM294c I+,BNN102 又 称之为 C600 A/7A。 c. CJ236 和 BE313 均常用 于寡核 苷酸介 导的定 向诱变 ,但 CJ236 菌株中 带有的 PCJ105 质 粒与这 种应用 无关。 d. DH5 是 来自于 DH1 的衍生 菌株, 其转化 效率比 DH1 略高。 DH5a 和 HD5aF' 都 携带了 缺失的 仏 操纵 子和能 够指 导合成 p ■半 乳糖 苷酶的 co 片段的 <580 溶原 噬菌体 的衍生 菌株, DH5aF' 还带有 F' 因子。 DH5a 和 DH5ar 是 专利菌 株 ,它们 可以某 种方式 制备使 得其转 化效率 略高于 DH5。 e. 含有 基因的 染色体 区源于 相应大 肠杆菌 B 菌株。 f •通过 从省却 脯氨酸 基本培 养平板 上挑取 单菌落 可保证 JM 菌株中 F' 因 子的持 续存在 。这些 菌株都 能编码 P •半 乳糖 苷糖酶 ⑴ 片段 ,常与 能编码 p- 半乳糖 苷糖酶 a 片段的 载体一 起应用 , 同时这 些菌株 也常与 M13 载 体一起 用于测 序。 g. 尚未 知该菌 株除了 列出这 些遗传 标记之 外是否 还有其 他遗传 标记。 h. pMC9, 如质粒 所列的 Y 菌株 的质粒 ,可 以指导 lac 阻遏蛋 白的大 量合成 .并 且也提 供了四 环素抗 佺和氰 苄青霉 素 抗性。 AR58 AR120 ASlb BNN102b BW313C C600 CJ236C DH1 DH5aF,d DK1 ER1451 HB101e JM101f JM105f JM107f JM109* K38 KM392 LE392 MC1061 MM294 NM539h P2392 PR722 Q359 RR1 Y1088h Y1089h Y1090h . 19 . 基因型 指菌株 中突变 的基因 。一个 基因型 是一种 理论上 的结构 ,它描 述了基 因的组 成 ,这种 组成能 够解释 菌株的 表型, 它综合 考虑到 了菌株 行为和 遗传。 表现 型指菌 株可观 察的行 为现象 ,如 lac_ 在以乳 糖作为 惟一碳 源的培 养基上 不能生 长 。表 现型用 罗马字 体表示 ,第 一个字 母大写 ,这 些字母 后面跟 着符号 + 和 -( 有时是 n 抵抗或 s: 敏感 )。 一种表 现型是 一种被 解释的 现象。 基因 型和表 现型命 名常互 相关联 ,但联 系不一 定都那 么明显 ,以下 是给出 的一些 例子。 基因型 表现型 表现型 的描述 一 些直接 的例子 trp- 31 Trp- 在极 限培养 基中需 加入色 氨酸才 能生长 uvrA UV5 对紫外 线敏感 recA Rec~ 重 组缺陷 一 些不是 那么直 接的常 见例子 携带 tRNA 抑制 子基因 ,突 变基因 产物, supE44 Sup + 非 野生型 ,抑 制无意 义突变 ,野 生型表 不为 SupG , Sup 和 不抑制 rp$L 104 Strr 抗 链霉素 (生 成一种 突变的 核糖体 蛋白, 小亚基 ,药物 的靶子 ) rpsE Spcr 抗壮 观霉素 (也 编码一 种核糖 体蛋白 ,一 种不同 的蛋白 ) gyrA Nalr 抗萘 啶酮酸 (突 变影响 DNA 旋转酶 ) —种突 变可产 生几种 表现型 dam- 3 Dam" 不能甲 基化的 DNA 中 GATC 的 A 2-APS 对 2- 氨基嘌 呤敏感 uvs 对紫外 线敏感 hsdS EcoK R~ 既 不限制 也不修 饰进入 细胞的 DNA EcoK M~ 一 些突变 导致非 直观的 表现型 recD ExoV- 非 RecBCD 蛋甶 的核酸 外切活 性缺陷 ,但 Rec+ 重组 活性未 受影响 • 20 • (六) DNA 限制性 修饰与 甲基化 这部分 和接下 来两部 分描述 了大肠 杆菌阻 止克隆 目标基 因序列 的功能 ,大肠 杆菌至 少有 4 个限 制系统 ,它 们能识 别外源 DNA 并将 其破坏 。这些 系统由 AWRMS、 maA、 及 mrr 编码, 使用突 变了的 宿主菌 株可避 免这些 系统的 作用。 DNA 的 限制和 DNA 中甲 基化碱 基的关 系如下 所述。 为了选 择合适 的菌株 ,必须 了解被 克隆的 DNA 中 甲基化 碱基的 含量。 EcoK 限 制系统 (由 AWRMS 基因 编码) 是大 肠杆菌 限制机 理最易 理解的 一个例 子 ,它 攻击带 有如下 位点的 DNA: 5,A mACNNNNNG TGC3' 37T TGNNNNNC mACG5, 在距该 位点的 不同处 引起双 链切割 ,最终 导致生 成片段 的降解 。如 果缺少 这个位 点, 或者如 果该位 点存在 ,但在 所示的 腺苷上 (mA) 没有 甲基化 ,则 DNA 不会受 攻击。 EcoK 是既 具有遗 传学功 能又具 有酶活 性的复 合物。 HsdR、 HsdM 和 HsdS 亚基需 要 非甲基 化底物 的限制 。同样 ,复合 物也能 使相同 的底物 甲基化 ,但 速率 非常低 ,使得 非甲基 化的底 物趋于 被降解 。底 物首先 只在一 条链上 甲基化 (半 甲基化 )。 该底 物的另 一条 链将由 3 个蛋白 质分子 组成的 复合体 甲基化 ,但 不会被 切割。 HsdM 和 HsdS 共同 甲基化 不是非 甲基化 的底物 就是半 甲基化 的底物 。如果 3 种 亚基任 何一个 缺陷, 3 种蛋 白 质复合 物就没 有限制 活性; 如果 HsdR 缺陷, 仍能甲 基化。 总的 来说, 尺基因 缺陷的 菌株被 描述的 表现型 HsdITM+ ( 即 EcoKR_M+ 或 RfMO, 它 会甲基 化新近 导入的 DNA, 但不 限制它 。然而 ,不 论在 还是在 /idS 缺 陷的菌 株将会 既不限 制也不 甲基化 ,表 现型为 HsdR_M_ (EcoKR—lVT 或 Rk- Mk_)〇 与 EcoK 相反, K-12 大 肠杆菌 的其他 3 个限 制系统 mcrA、 mcrB 和 mrr 特异 地攻击 在 特定序 列上甲 基化的 DNA, 而不攻 击未甲 基化的 DNA。 这类甲 基化碱 基不是 胞嘧啶 就是 腺嘌呤 (见下 )。 • 不论是 mcrA 还是 mcrB 都 能降低 来自其 他生物 基因组 DNA 文 库恢复 的克隆 数目, 并导 致这些 库中特 定片段 的恢复 的偏差 。对 McrB 来说 ,有 证据表 明是一 种核酸 酶在起 作用, 但其他 两个系 统没有 这样的 证据。 甚至 在没有 其生化 特征时 ,对这 些系统 的识别 位点也 能加以 讨论。 MoA 限 制性修 饰 DNA 是通过 HAzII (5'CmCGG) 甲 基化酶 和其他 可能的 甲基化 酶起作 用的。 McrB 限制 性修饰 DNA 是通过 14 种 其他甲 基化酶 中任何 一种起 作用的 ,这样 ,可 以推测 McrB 识别 位点是 5'GmC。 Mn •限制 性修饰 DNA 是通过 H/uzII (5'GmANTC) 或 PmI (5'CTGmAG) 甲 基化酶 而不是 £C0R I 甲 基化酶 ,其 他的也 一样。 很多 常用的 大肠杆 菌株是 McrA—, 包括 (表 1_5) BNN102、 C6〇〇、 JM107、 JM109、 LE392、 Y1088 和 Y1090。 在表 1.5 所列的 菌株中 ,仅 BNN102、 HB101 和 MC1061 属 McrB- , HB101 属 Mrr_ 。 当从 含甲基 化碱基 的机体 中克隆 基因组 DNA 时 ,应该 使用缺 乏适当 的甲基 特异性 . 21 • 限 制系统 的菌株 。所 有哺乳 动物和 高等植 物及很 多原核 细胞含 有甲基 胞嘧啶 ,所 以对于 从这 些机体 而来的 DNA 文库 ,应 该使用 McrA-B^ 菌株, 细胞和 较低等 的真核 细胞可 以含有 甲基腺 嘌呤, Mrr 敏 感性应 予考虑 。然而 ,重 要实 验材料 如果蝇 (Droso/nh me/a nogasfer ) 黑 色素细 胞和酿 酒酵母 ( Sacc/ia ceren‘5i‘ae ) 没有检 测到甲 基化的 碱基。 另外 ,在 实验中 ,一旦 DNA 在 体外被 甲基化 ,应采 用相应 的限制 缺陷宿 主作为 DNA 受体 。甲基 化酶被 用来制 造新的 限制酶 特异性 或保护 cDNA 免受接 下来的 消化。 例如, Alul 甲 基化酶 (M. Alul) 有时 被用于 保护所 ndlll 位点 ,而 McrB 会限制 M. Alul 修饰 DNA。 一旦导 入大肠 杆菌的 DNA 被复制 ,除非 克隆携 带一种 甲基化 酶活性 ,否则 ,将不 再按外 源模式 甲基化 ,转 而利用 大肠杆 菌系统 甲基化 。这样 ,克隆 就能自 由地在 Mcr+、 Mrr+ 大肠杆 菌株间 转移; 但是 ,在 试图将 DNA 导入 HsdR+ 菌株前 ,克 隆必须 首 先移入 HsdM+ 菌株。 正 常的大 肠杆菌 DNA 甲 基化有 3 种甲基 化酶的 参与。 EcoK 甲 基化酶 修饰以 上提到 的序列 ; 和 基因产 物也是 甲基化 酶它们 的识别 位点是 : 5,GmACT3, 5,CmCAGG5, 5CmCTGG3, dam dcm dem 3,CTraAG5, 5,GGTmCC5/ 3,GGAmCC5, 这 些修饰 将赋与 DNA 对一 些限制 性核酸 内切酶 ,如 iVfto I 和 I (对 Dam 修饰 DNA) 或 £coR II (对 Dcm 修饰 DNA) 的抗 性或部 分抗性 ,这些 酶常用 于体外 部分工 作。 Dam 和 Dcm 甲 基化酶 与任何 大肠杆 菌限制 功能并 无关联 。虽然 会失去 K 修饰 ,但 Dam 和 / 或 Dcm 甲基化 的丢失 不会使 DNA 对 EcoK 限 制敏感 。然而 ,在 链球菌 株中, Dam 和 Dcm 修饰 使得对 Mrr 和 Mcr 类似物 敏感。 (七) 重组 对克隆 DNA 插入 的效应 在 大肠杆 菌繁殖 期间, DNA 插入载 体有时 可以通 过有关 DNA 重组引 起蛋白 质的重 ABC 〇 £ p 〇 H ABC 排 ,幸 运的是 ,虽 然在大 肠杆菌 重组的 遗传学 及酶学 仍然 不甚了 解的情 况下, 仍可用 突变株 来解决 两个常 见 的克隆 问题。 (1) DNA 含有散 在的重 复序列 。重 组发 生在这 些 重复序 列之间 ,从 而引起 DNA 片 段丢失 (图 1.6)。 对质 粒文库 来说, 这个问 题可以 通过在 recA 一 宿主 中繁殖 DNA 来解决 ,同源 重组在 这种菌 里不会 发生。 对于用 X 衍生 载体制 备的文 库来说 ,载 体也必 须是重 组缺陷 (red) 的 。然而 , 在这种 菌株里 ,仅 30%~50% 的细胞 是活的 ,而 文库特 别是噬 菌体文 库 ,可 能难以 繁殖。 X 噬菌体 载体在 recA 株里 不会产 生 高滴度 裂解物 ,并且 red gam 噬菌 体根本 不会生 图 I.6 同源同 向重复 序列的 重组长 ,除非 recBCD 酶也没 有活性 。很多 x 载体是 red . 22 • gam, 以利用 Sp 厂选 择或便 于更大 片段的 插入。 (2) 插入 DNA 含有紧 密空间 构象的 反转重 复序列 ( 回文结 构或间 断的回 文结构 ), 这些 DNA 片 段不论 在噬菌 体还是 质粒载 体中都 不能稳 定传代 。可 能是大 一些的 回文序 列 (>300bp) 有时能 形成发 夹结构 ,这 就像 在正常 重组中 形成的 Holliday 中间体 一样, 外源 DNA 越 变越小 ,甚 至被宿 主完全 清除。 携 带回文 序列的 噬菌体 和质粒 克隆在 有些菌 株中以 较高的 频率回 复突变 。这 些细菌 的外切 核酸酶 V (ExoV; 由 mcB、 recC 和 recD 基 因编码 ), 或 SbcC 产物 (由 56cC 基 因编码 ) 失活 。很多 菌株允 许回文 结构有 recBrecC 的缺失 ,同 时还有 56cA (可 能编码 RecE 蛋白) 或5&6 (编 码核酸 外切酶 I) 缺失。 Leach 和 Stahl 首先注 意到回 文序列 稳定与 ExoV (RecBCD 酶) 有关 。他们 在入噬 菌体 中人为 制造回 文结构 并使用 recB、 mrC 及 突变 的宿主 。这种 recB、 recC 菌株 是非 正常的 ,容易 导致两 个其他 的突变 : 一个在 (外切 核酸酶 1 基因, recBC 的抑 制子) 上 ,一 个位于 AcC, 其 生物化 学特性 不清楚 。所有 这些突 变使重 组得以 保留并 使细 胞容易 存活。 Wertman 等和 Wyman 发现 ,对于 X 文库 中克隆 序列的 回文结 构的稳 定, m:C 缺陷和 s6cB 缺 陷的作 用是独 立的。 Wertman 等 首先研 究有关 r*eCD 情况。 m:D 编码 ExoV 的核酸 酶活性 ,非该 酶的重 组活性 。仅有 mrD 突变 的菌 株体为 Rec+, 并且状 态良好 ,不 会产 生其他 的变异 。上述 对入衍 生噬菌 体回文 序列稳 定性进 行的研 究中, 这样的 菌株是 最好的 宿主。 sbcC 的 效应由 Chalker 等加 以检验 ,发现 单纯的 sbcC 在维持 X 衍生噬 菌体中 回文序 列 方面比 单纯的 recD 和 recB recC sbcB 都好 ,但 recD sbcC 菌株中 回文序 列稳定 性最高 (回文 序列在 recArecDsbcC 菌 株中也 能保持 )。 另外, sbcC 突变株 的优点 是回文 结构不 论 在质粒 还是噬 菌体上 都能被 保持; 而不论 是否含 有回文 序列, 对质粒 来说, 一 缺 失突变 体都不 是好的 宿主。 (八) 重组 缺陷株 对载体 的效应 red gamX 衍 生载体 或克隆 特别是 Spi_ 选择 必须在 ExoV— 宿主 上繁殖 ,因为 长的线 性 多聚体 在缺乏 Gam 蛋白时 ,通过 ExoV 以核酸 外切方 式降解 ,多 聚体是 X 包 装的正 常底物 。这 些噬 菌体在 ExoV_RecA+ 宿主上 会生长 得很好 ,在 ExoV—RecA— 宿 主上也 不错 ,而在 Ex〇V+RecA+ 宿主上 则很差 (通 过依赖 于大肠 杆菌蛋 白的重 组产生 环状二 聚体, 噬菌体 可采用 任一种 包装机 制被包 装起来 ), 而在 ExoV+RecA- 宿主中 跟本不 长 。在 Ex〇V_RecA+ 宿主中 ,携 带一 重组热 点称为 Chi 位点 (5'GCTGGTGG3') 的克 隆会 比那些 没有的 长得好 ,其 结果导 致文库 偏差。 Ex〇V-ReCA+ 宿主 可以是 recBCsbcB 或 recD, 而 ExoV RecA+ 宿主 可以是 recB recC sbcB recA 或 recD recA〇 大 多数克 隆质粒 ,包括 ColEl 衍生体 (如 PBR322) 和 pl5A 衍生物 (如 pACYC 载 体 ), 在 ExoV 缺陷菌 株中常 是很不 稳定的 ,除 非它们 的选择 特性得 以维持 下来; 然而, 选择性 也常常 不稳定 并且难 以保持 。 recB recC sbcA 或 recD 菌株二 者都是 这样的 。然 而, RecA— 抑制这 种效应 。不稳 定性大 概可归 因于质 粒的重 组起始 的滚环 复制, 它导致 了长 的线性 多聚体 的合成 ,该多 聚体在 细胞分 裂时不 能适当 的分离 , 对于高 拷贝数 . 23 • ColEl 衍 生物如 pUC 载体 来说, 这个问 题尤为 严重; 在 recD 菌株中 ,这 些质粒 可能根 本无法 形成。 出于以 上考虑 ,广泛 用于噬 菌体和 质粒克 隆载体 的宿主 菌应当 具有如 下标记 : recA recD sbcC hsdR mcrA mcrB mrr。 这样的 菌株还 没有, 但最近 报道了 一 '种 菌株 DL491, 它是 一 ■种 recD sbcC hsdR mcrA mcrB 菌株。 第 二节质 粒 一 、质粒 的分子 生物学 < f > i 细 菌质粒 是位于 染色体 外具有 自主复 制能力 的环状 DNA 分子 。它是 共价闭 合的环 状 DNA 分子 (covalent closed circular DNA, cccDNA) 是独 立于染 色体外 能自我 复制的 最小遗 传单位 。质 粒的 相对分 子质量 一般为 106~108, 小 质粒有 1.5kb 〜 15kb, 大质粒 有 60kb~120kb。 在自 然界里 ,质 粒的多 样性普 遍存在 。野 生型大 肠杆菌 分离株 常携带 一 些特别 的质粒 。这 些质粒 具有对 抗生素 、重金 属特异 的抗性 ,对 致突变 物的敏 感性, 对不 常见的 噬菌体 、限制 性酶切 产物、 稀有氨 基酸产 物或者 对复杂 有机分 子分解 代谢的 抗性或 敏感性 。质 粒的 复制不 一定需 要质粒 编码的 蛋白质 ,同样 ,也 不一 定需要 与细胞 周 期同步 。有 些质粒 可以自 由地转 移到另 一种细 菌里, 并赋予 宿主新 的表型 ,其 他的只 能在 大肠杆 菌之间 转移, 有些质 粒根本 就不能 转移。 许多实 验室利 用天然 质粒的 DNA 片段构 建载体 。这些 人工质 粒及其 衍生物 是在重 组 DNA 工作 中用得 最多的 载体。 所有用 于克隆 的载体 都含有 复制子 、选择 性标记 、克 隆位点 3 个部分 。复 制子 是一段 DNA 片段 ,其中 包含有 DNA 复 制的起 始位点 (〇W) 及复制 所需要 RNA 和 蛋白质 的基因 。选择 性标记 最重要 ,一 般情 况下是 编码某 抗生素 的基因 。克 隆位点 是限制 性内切 核酸酶 切割的 位点, 在这个 位点插 入外源 DNA 不会影 响质粒 复制及 其让宿 主产生 选择性 表型的 能力。 (一) 高 拷贝数 和低拷 贝数的 复制子 可 以根据 拷贝数 对复制 子分类 。质 粒拷贝 数一般 定义为 在标准 培养条 件下, 单个菌 体所 含的质 粒数目 ,但有 时习惯 描述为 质粒数 / 每个 细菌染 色体数 (在丰 富培养 基中, 细菌生 长很快 ,这 时每 个菌体 里可含 3 〜 4 个染 色体; 而在 碳源供 应不良 如琥珀 酸盐的 培养 基里, 细菌生 长缓慢 ,这时 每个菌 体里只 有平均 1.1 个 染色体 )。 本 书的高 拷贝数 质 粒指在 LB 液体 培养基 中超过 20 个 拷贝数 的质粒 ,低于 20 的为 低拷贝 。由于 很容易 从高 拷贝质 粒的菌 中得到 大量的 纯质粒 DNA, 在现 代分子 生物技 术中, 这种质 粒被尽 可能的 采用。 (二) 拷贝 数的松 弛和严 紧控制 高拷 贝质粒 受松弛 型控制 。这 种质粒 ,有时 也称之 为松弛 型质粒 ,它 通过一 个质粒 • 24 • 编码 功能控 制启动 DNA 复制 ,而 不依靠 在细胞 周期开 始时合 成的一 种不稳 定蛋白 。因 为不 依靠这 种不稳 定的宿 主蛋白 ,能使 松弛型 质粒得 以扩增 ,也就 是说, 当细菌 用蛋白 合成 抑制剂 如氯霉 素和放 线壮观 霉素处 理时, 质粒的 拷贝数 能极大 地增加 。高拷 贝质粒 往往 没有任 何机制 来保证 质粒正 确分配 到子代 菌体里 。低 拷贝质 粒通常 受到严 紧型控 制 。启动 这种质 粒的复 制依赖 于细胞 周期开 始时合 成的一 种不稳 定蛋白 ,因此 ,与 细菌 染 色体复 制同步 。大部 分在严 紧控制 下的质 粒都有 一个叫 Au •的 位点, 这个位 点在一 定 程度上 能使复 制的质 粒高效 、准 确地分 离到子 代菌体 里面。 (三) pMBl 及 ColEl 衍生的 克隆载 体的复 制机制 大多数 用于常 规重组 DNA 质粒都 含有来 自质粒 pMBl 或 ColEl 的复 制子。 菌体中 含有 很多这 种质粒 的拷贝 。平均 每个拷 贝在一 个细胞 周期复 制一次 ,有 的超 过一次 ,有 的 根本就 不复制 。质 粒复制 开始依 赖宿主 RNA 聚 合酶的 RNA 引物 的合成 。当 引物转 录延 长至起 始区域 ,起始 DNA 部分 解链, 大部分 新合成 转录链 与其中 一条链 配对。 RNA 酶 H 切割 引物 ,然后 ,依 靠宿主 DNA 聚合酶 I 将经处 理的引 物延伸 到第一 条链开 始 合成。 DNA 合成 的起始 被另一 个质粒 编码的 RNA (称 RNAI) 进行负 调控, 并能与 引物 RNA 杂交。 据认为 这种杂 交在一 定程度 上改变 了引物 RNA 的二级 结构, 使得它 不能 与复制 起始区 DNA 配对。 Rop 蛋白质 有助于 杂交体 的形成 ,该蛋 白质由 质粒的 r •吵基 因编码 。像 PUC 之类的 较新型 质粒往 往带有 pMBl 的复 制子, 但没有 完整的 r •吵 基因, 因此具 有比带 有完整 pMBl 复 制子的 质粒更 高的拷 贝数。 (四) 质 粒的不 相容性 菌 体不能 同时容 纳两种 不同的 pMBl 或 ColEl 衍 生质粒 。这是 质粒不 相容性 现象的 一个 例子。 pMBl 和 ColEl 衍生 质粒互 不相容 ,属于 同一不 相容组 。造成 这种现 象的原 因 有两个 :首先 ,质粒 复制被 RNAI 负调控 ,而该 物质与 其引物 对于另 一质粒 作用相 反; 其次 ,这 些质粒 缺乏保 证让每 一个质 粒在每 一个细 胞周期 都能复 制一次 的机制 。由 于 以上两 个原因 ,如 果在含 有一个 pMBl 衍 生质粒 的菌体 中导入 另一个 pMBl 衍生质 粒 ,选择 第二种 质粒的 细菌将 会淘汰 前一种 质粒。 (五) 常 用质粒 的复制 子特性 表 1.6 常 用质粒 的复制 子特性 复制子 原 型质粒 质 粒大小 /bp 原型质 粒标志 拷贝数 pMBl pBR322 4362 ampx % tetT 高, >25 ColEl pMK16 约 4500 kan\ tet\ ColEl*™0 高, >15 pl5A PACYC184 约 4000 emL r, tet r 高 ,约 15 pSClOl PLG338 约 7300 kanrt tetx 低 ,约 6 F pDF41 约 12 800 trpE 低, 1~2 • 25 • 续表 复制子 原 型质粒 质 粒大小 /bp 原型质 粒标志 拷贝数 R6K PRK353 约 11 100 trpE 低, <15 R1 (Rldrd-17) pEU50 约 10 000 amp1 ^ tetx 在 30t: 时低 在 >35t 时高 * RK2 PRK2501 约 11 100 kan\ tetr 低 , 2~4 Xdu Xdugal 一 b gal - a. 为 温度敏 感株。 b. 不 清楚。 (六) 质 粒图谱 图 1.7、 图 1.8、 图 1.9、 图 1.10、 图 1.11、 图 1.12、 图 1.13 及图 1.14 就 是几个 质粒 的图谱 。这些 质粒被 广泛应 用或者 说由于 它们的 特殊功 能使得 它们在 本书所 描述的 特 别技术 中非常 有用。 400 420 440 460 I III AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT EcoR I Sac I Kpn 1 1 1 8an?H I Xba I Sma I Xma I Hinc II Acc I Sa/I Psf I Sph\ H/nd III 1 /ac Z, —ThiileMetThr(Met) 图 1.7 pUC19 pUC19 属于在 基因 a 区含 有多克 隆位点 的质粒 载体家 族中的 一种。 多克隆 位点同 M13mp 系列载 体一致 , 其 序列可 参见图 1.31。 pUC19 和 pUC18 具有 相同的 多克隆 位点, 只是方 向相反 。在 合适的 条件下 ,在 多克隆 位点 处含有 插入片 段的质 粒可使 菌株显 白色, 而不是 显蓝色 。由 于缺乏 完整的 基因 (编码 Rop 蛋白 ), 并且 据 认为在 ori 区还含 有另一 种可增 加其拷 贝数的 突变, 这些从 pMBl 衍生 的质粒 可保持 很高的 拷贝数 。野 生型和 重 组型都 含有氨 苄青霉 素抗性 ,并 且能够 在氯霉 素压力 下扩增 ,另 外野生 型质粒 能够在 合适的 宿主菌 ( 如大肠 杆菌 JM101, 见表 1.5) 中 ,提供 lacZ+ 表型 • 26 . eg/ 1 pSP 启动子 / 多接头 I 57 GA ATACAA GCT TGG GCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG ATC CCG GGG CGA GCT CGA ATT C Hind III Pst I Sal I Xba I L-r — … Acc I SamH I Ava \ HincW Sma I Sac I EcoR I 图 1 • 8 pSP64 pSP64 质粒 载体包 含具有 噬菌体 RNA 聚合 酶识别 启动子 序列, PSP64 的启动 子通过 哩菌体 SP6RNA 聚 合酶 的识别 ,在 PSP64 和 PSP65 中 ,从启 动子转 读到多 克隆位 点是以 相反方 向进行 ,应用 这些载 体时, DNA 插 到多克 隆位点 中或插 入到切 割的线 性载体 的多克 隆位点 的下游 位点中 。加入 SP6 聚合酶 和核苷 三磷酸 、使 单链 DNA 插入, 在许多 方法的 操作时 都是很 有用的 • 27 • C/a I Hind III Xba I Sa/I BamH I pUR278 TGT CAA AAA GGG GAT CCG TCG ACT CTA GAA AGC TTA TCG ATG I I I I I I BamH I Sail Xba f Hind III Cla I pUR288 TGT CGG GGA TCC GTC GAC TCT AGA AAG CTT ATC GAT GAT I I I I I I BamH I Sa/I Xba I Hind III C/a I pUR289 TGT CAG GGG ATC CGT CGA CTC TAG AAA GCT TAT CGA TGA I I I I I I BamH I Sa/I Xba I Hind III C/a I 图 1.9 pUR278 PUR278 是一种 融合蛋 白表达 载体, 它是质 粒载体 家族中 的一种 ,它 包含由 /acl/V5 启动子 转录的 McZ 基因 。在 laclq 菌株中 ,由 UV5 启动子 转录的 基因 是被 抑制的 ,当 IPTG 加到 生长的 培养基 中时, 它可 以解除 抑制。 含编码 序列的 DNA 片 段能够 插入到 /acZ 基因末 端的多 克隆位 点中, LTV5 启动 子 去阻抑 引起融 合蛋白 的表达 而且易 于纯化 • 28 • £coR 14361 C/a I 23 图 1 • 10 pBR322 PBR322 是一种 十分常 用的克 隆载体 ,它 带有可 扩增的 pMBl 复制子 和编码 氨苄青 霉素抗 性和四 环素抗 性的基 因 。外源 DNA 插入其 中任何 一个抗 性基因 均会使 该抗性 失活, 从而使 带有插 入片段 的质粒 克隆因 不能在 含有抗 生 素的培 养基上 生长而 被识别 Sa/I SamHI ' ~ c 1 8amHI omp F 框 一 I I — /acZ 框 pORF2 GTA GAT CTC GGA TCC CC GGG GAT CCC I I I I I J 6〇/ll SamHI 1 ~~ - ~~ ; 一 1 BamH\ ^ Sma I 图 1.11 pORFl pORFl 是用 于鉴定 和表达 可读框 的一种 质粒。 p〇RFi 和 pORF2 包含 基因的 氨基末 端部分 ,通过 多克隆 位点 把框与 hcZ 基 因融合 。多克 隆位点 被构成 , 以便插 入包含 可读框 (ORF) 的片段 ,接 着在大 肠杆菌 中表达 ompF-ORF-lacZ 融 合蛋白 ,细胞 (或 细菌) 表达 这种融 合蛋白 ,在 Xgal 平板 培养基 上通过 (3- 半乳糖 苷酶的 活性 可以进 行鉴定 • 29 • A EcoR I 图 1 • 12 ptacl2 ptacl2 质 粒包含 w 启动子 ,它是 一种有 效的杂 交启动 子它由 -35 区冲启 动子与 -10 区如 cl/V5 启动子 组成。 这 个启动 子带有 R/ull 位点。 操纵 基因紧 接在转 录起始 的位置 ,以 便从启 动子转 录就能 够阻抑 ladq 菌株的 生长和 通过加 IPTG 于培养 基中而 解除这 种阻抑 作用, 该质粒 的特性 对表达 天然蛋 白质非 常有用 PGE374 Nco I "•CCATGGGAATTGGGG ATCTCGGATCCCCGGGGATCC." T^A /acZ 可雜 密码子 35 密码子 9 PGE372 Nco I BamH I "•CC ATGGGAATTGGGG ATCC … recA IdcZ 密码子 35 密码子 9 图 1.13 pEG374 PEG374 是一 种克隆 和表达 可读框 的载体 。这个 表达系 统的调 控原理 同带有 ompF 调 控的载 体一样 。但是 PEG374 带有 recA 因而较 ompF 载体 系统更 为可靠 ^ PEG374 只有当 插入的 ORF 将 rwA 和 /acZ 重 联时才 会出现 lacZ+ 表型, 否则则 表现为 /acZ •表型 ,在一 个细胞 中一个 单拷贝 基 因的基 础表达 童约为 1000 个分子 。所 以 在检测 带有插 入外源 片段的 PEG374 质粒的 iacZ 表型时 不必对 细菌进 行诱导 ,其在 Xgal 指示平 板上的 基础表 达对 于检测 已经 足够。 pEG374 的 连接区 的结构 ,以及 pEG372 质粒 对应部 位的结 构列于 质粒图 下面。 PEG374 质 粒由于 rwA 和心 Z 编码 序列读 框不同 ,所以 不会产 生融合 蛋白。 PEG372 质 粒除了 和 ZacZ 的编码 序列读 框相同 并能产 生融合 蛋白外 , 其余与 pEG374 质 粒相似 • 30 • pTrc99A RBS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 MetGlu Phe Glu Leu Gly Thr Arg Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gin Ala Cys Lys Leu ^mB TCACACAGGAAACAGACC ATG GMTTC GAG CTC GGT ACC CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GGCTGTTTTGGC ' ' ' r-» .* " r—1 H " " " " ' A/co I EcoR\ Sst\ Kpn I Xma I BamH I Xba I Sa/I Pst\ Sph\ Hind III Sma I Acc I Hi nc\\ pTrc99B 12345678 9 10 11 RBS TCACACAGGAAACAGACC Met Gly lie Arg Ala Arg Tyr Pro Gly lie Leu rmB ATG GGA AT 丁 CGA GCTCGGTAC CCGGGG ATC CTC TAG A GTCGACCTGCAGG(>TGCAAGCTTGGCTGTmGGC A/co I EcoR I Ssf I Kpn I Xma I BamH I Xba I Sma I Sa/I Acc I Hi nc\\ Pst I Sph\ H/ndlll pTrc99C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Met Gly Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg His Ala Ser Leu rm^ TCACACAGGAAACAGACC ATG GGG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTG GCTGTTTTGGC 1 I L- ■ . < 匕… ■■ M It t —I > 11 . il H . <1 H I Nco I EcoR I Ssf I Kpn I Xma I Bamb I Xba I Sa/I p$tl Sph I Hind 川 Sma I 々cc I Hi nc\\ 图 1 . 14 pTrc 99A、 B、 C pTrc 系列 表达质 粒载体 可用于 基因在 大肠杆 菌的表 达调控 ,这些 质粒带 有强的 trp/lac 融 合启动 子和丨 acZ 核糖体 结 合位点 (RBS), 可以以 3 种读码 框架插 入外源 片段的 PUC18 多克 隆位点 ,以及 rmB 的转录 终止子 ( 见质粒 图的多 克隆位 点序列 )。 这 些载体 可以表 达非融 合蛋白 (从 Nc〇I 位 点插入 ), 也可 表达融 合蛋白 ( 从其他 位 点正确 读码框 架插入 ), 质粒 上带有 iacTg 等位 基因可 以保证 lac/ trp 融 合启动 子的完 全阻遏 (七) 质粒 的转化 将遗 传上不 同来源 的质粒 DNA 导入细 胞或大 肠杆菌 ,所 致遗 传学的 改变过 程称为 质粒的 转化。 二 、质粒 DNA 的小 量制备 从细菌 中小量 提取质 粒的方 法很多 。这里 仅介绍 以下几 种简便 易行的 方法: 碱裂解 • 31 • 法, 1.5mLeppend〇rf 管或 % 孔 微量滴 定板的 碱裂解 改良法 ,煮沸 裂解法 ,锂沉 淀法。 在辅助 方法中 提到了 DNA 的贮存 方法。 (一) 碱 裂解法 此处仅 介绍以 下常用 的两种 方法。 碱 裂解法 乃是最 常用的 小量制 备质粒 DNA 的 方法。 1. 原理 碱变 性法抽 提质粒 DNA 是基于 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变 性与复 性的差 异而达 到分离 的目的 。将 细菌悬 浮葡萄 糖等渗 溶液中 ,加入 SDS — 类去污 剂使细 菌裂解 ,在 pH 高达 12.6 的碱性 条件下 , 染色体 DNA 的氢 键断裂 ,双 螺旋结 构解开 而变性 。质粒 DNA 的大部 分氢键 也断裂 ,但 超螺旋 共价闭 合环状 的两条 互补链 不会完 全分离 ,当以 PH4. 8 的乙酸 钾高盐 缓冲液 去调节 pH 至 中性时 ,变性 的质粒 DNA 又恢 复原来 构型, 保存在 溶液中 ,而 染色体 DNA 不能 复性而 形成缠 绕的网 状结构 ,通过 离心, 染色体 DNA 与不 稳定的 大分子 RNA、 蛋白质 -SDS 复合物 等一起 沉淀下 来而被 除去, 取上清 经 异丙醇 沉淀后 ,即得 到质粒 DNA 的 粗制品 ( 仍含有 大量的 DNA 和蛋 白质等 )。 纯化 质 粒采用 氯化锂 (LiCl) 沉 淀和聚 乙二醇 (PEG) 沉淀法 。在 LiCl 存在下 ,大部 分蛋白 质和 RNA 可形 成沉淀 ,经离 心除去 ,而 质粒 DNA 则 不沉淀 。进 一步用 RNA 酶 消化可 以除去 残存的 RNA, 然 后质粒 DNA 在 PEG 存 在下形 成沉淀 (核 苷酸则 不沉淀 ), 经离 心回 收质粒 DNA。 重 新溶解 的质粒 DNA, 用酚 :氯仿 :异戊 醇抽提 可除去 PEG 和残存 的蛋 白质。 再经过 乙醇沉 淀和离 心回收 ,即 可得到 高纯度 的质粒 DNA。 2. 材料 含 适量抗 生素的 LB 培养基 或丰富 培养基 葡萄糖 /Tris/EDTA (GTE) 溶液 (50mmol/L 葡萄糖 , 25mmol/LTris-HClpH8.0, lOmmol/LEDTA, 4X: 保存) TE 缓冲液 ( 1 Ommol/ L Tris- HC1 pH8 . 0 , 1 mmol/ L EDTA ) NaOH/SDS 溶液 (0.2mol/LNaOH, 1% (m/\〇 SDS, 临用 时新鲜 配制) 5mol/L 乙酸 钾溶液 pH4.8 95% 和 80% 乙醇 STET 溶液 [8% (m/V〇 蔗糖, 8% (m/\〇 TritonX-100, 50mmol/LEDTA, 50mmol/LTris-HClpH8.0, 过滤 除菌, 4t: 保存] TELT 溶液 [2.5mol/L LiCl, 50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 62.5mmol/L Na2EDTA, 4% (m/VO Triton X-100, l~5mL 分装, —20t: 保存] 3. 操 作步骤 (1) 接种 一个单 菌落于 5mL 无菌 LB 培 养液中 ,在 37X: 培 养至饱 和状态 (OD600 = 0.4 〜 0.6)。 (2) 取 1.5mL 培养 液离心 20s, 沉淀用 100/iLGTE 溶 液重悬 并于室 温静置 5min。 (3) 加入 ZOO^LNaOH/SDS 溶液 ,混匀 ,于冰 上放置 5min。 (4) 加入 150pL 乙酸钾 溶液, 在旋涡 混合器 上振荡 2s, 于冰 上放置 5min。 (5) 离心 3min, 然 后吸取 0.4mL 上清 液移入 干净的 微量离 心管中 ,加 0.8mL95% 乙醇 ,于室 温静置 2min。 (6) 室 温离心 3min, 用 lmL 70% 的酒精 洗沉淀 ,然 后真空 干燥。 (7) 沉淀用 30/iLTE 缓冲液 重溶, 并保存 ,取 2.5 〜 5^L 进 行酶切 分析。 (8) 加入 1/iL 10mg/mL RNA 酶溶液 (不含 DNA 酶) 以去除 污染的 RNA。 96 孔 微量滴 定板碱 裂解改 良法这 个方法 可以在 Id 内 快速制 备数以 百计的 质粒。 1. 原理 同上 (见碱 裂解法 )。 2 •材料 (亦 见上法 )。 TYGPN 培养液 异丙醇 96 孔微量 滴定板 (DynatechPS 板或相 当用品 ) 多道 加样器 (8-prong Costar, 12-prong TeK) 多 管旋涡 混合器 Sorwall RT-6000 低 速离心 机或同 等设备 ,在 H - 1000B 转 子上带 有微孔 板卡槽 3. 操 作步骤 (1) 在 96 孔微量 滴定板 上每孔 中加入 0.3mL TYGPN 培养液 ,每孔 中接种 1 个含 有 质粒的 单菌落 ,于 37X: 培 养至饱 和状态 (约 48h)。 (2) 于 4X: , 以 600 X g 离心 l〇min, 轻轻甩 去每孔 中的上 清液。 (3) 将平板 夹在多 管旋涡 混合器 上振荡 20s, 重悬 细菌。 (4) 每 孔加入 50^L GTE 溶液和 100/iL NaOH/SDS 溶液 ,放置 2min 后 再加入 50/uL 乙酸钾 溶液。 (5) 盖上 盖子, 于旋祸 混合 器上置 4 档振荡 20s, 然后于 4X3, 600 Xg •离心 5min。 (6) 从每 孔吸取 200ML 上清液 至另一 块新的 平板中 ,在 每孔 中加入 150pL 异 丙醇, 盖 好盖子 ,振 动混匀 ,于 -201C 冷冻 30min。 (7) 于 4X:, 600 Xg 离心 25min, 用 70% 乙醇洗 涤沉淀 ,轻 轻吸 去上清 ,再用 95% 乙醇 洗涤, 同样轻 轻吸去 上清。 (8) 空气 中干燥 30min 后用 50/uLTE 重 溶沉淀 。保存 ,并 每孔取 l〇pL 进行 分析。 (二) 煮沸 裂解法 1. 原理 细菌用 溶菌酶 ,曲 拉通 (Triton X-100 是一种 非离子 去污剂 ) 及加热 裂解。 染色体 • 33 • 仍然附 着在细 胞膜上 ,经 简单的 离心就 可以将 它们沉 至管底 ,用异 丙醇将 质粒从 上清中 沉淀。 可以采 用本方 法提取 1~24 个菌 落质粒 DNA。 尽管十 分快捷 ,但 制备的 DNA 的 质 量要比 碱裂解 法差。 2. 材料 含有 适当抗 生素的 LB 培养基 (见表 1.1) STET 溶液 [8% (m/V) 蔗糖, 8% (m/V) TritonX-100, 50mmol/LEDTA, 50mmol/LTris-HClpH8.0, 过滤 除菌, 4*C 保存] 卵清 溶菌酶 冰的 异丙醇 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 3. 操 作步骤 (1) 接种 一个单 菌落于 5mL LB 培 养基中 ,于 37X: 培养 至饱和 状态。 (2) 取 1.5mL 菌 液离心 20s, 加入 300pL 含 200吨 溶 菌酶的 STET 溶液 ,在 旋涡混 合 器中振 荡混匀 ,冰 上放置 30s 〜 lOmin。 为了 获得高 产量的 DNA, 一定 要使菌 体完全 重悬。 (3) 将 管放入 沸水中 (100X:) l~2min, 离心 15 〜 30min, 吸 出上清 移入一 个新的 微 量离心 管中。 (4) 加入 200^L 预冷的 异丙醇 ,于 -20t: 放置 5~30min。 (5) 离心 5min, 弃上清 ,真空 干燥。 (6) 沉 淀溶于 50/zLTE 缓 冲液中 ,保存 。取 5&L 进行限 制酶切 分析。 向 待消化 混合液 中加入 ImL 10mg/mL 的 RNA 酶溶液 (不含 DNA) 以去除 污染的 RNA。 (三) 锂 沉淀法 1. 原理 用 该方法 可直接 从培养 皿中的 细菌克 隆或液 体培养 物中提 取质粒 。细菌 依次用 Tri- tonX-100、 LiCl 和酚 / 氯 仿处理 。这些 步骤使 质粒呈 溶解状 态而将 染色体 DNA 连 同细胞 碎片一 起沉淀 。这 种方 法制备 的质粒 DNA 完 全不含 染色体 DNA。 这 里所述 的小董 提取方 法同样 可做大 量提取 。这 种方法 的优点 在于它 非常可 靠及快 速 ,只需 要不到 20min 的时间 ,而 且操 作简单 。最后 质粒的 纯度和 质量好 ,可用 于各方 面的 实验。 所有的 步骤均 在室温 进行。 2. 材料 TELT 溶液 ( O.lmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA pH8.0, 5% Triton X-100) LB 培养基 (含适 量的抗 生素) 1:1 (m/V) 酚 / 氣仿 • 34 • 100% 乙醇 ,置 -20X: 预冷 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) lOmg/mL 无 DNA 酶的 RNA 酶 A (供 选择) 1 .5mL 微量 离心管 3. 操 作步骤 从 琼脂平 板上的 菌落分 离质粒 DNA, 按如下 步骤: (1) 用 一小匙 ,将 LB 平板 上直径 2~5mm 的整个 细菌克 隆舀出 ,转移 到盛有 IOOjuL TELT 溶 液的微 量离心 管内。 (2) 振荡 ,充 分悬浮 细胞。 接步骤 (6)。 从 液体菌 液中分 离质粒 DNA, 按以下 步骤: (1) 接种一 个细菌 克隆至 1.8 mL 加 有适量 抗生素 的灭菌 LB 培 养基里 。于 30X: 摇 18~24h, 生长到 饱和。 可用带 塑料盖 子的玻 璃试管 。以 适当的 倾斜角 度放置 ,以取 得满意 的搅动 效果。 (2) 将 全部培 养物小 心转入 1.5mL 的微 量离心 管内。 在这个 阶段液 体培养 基体积 会减少 到大约 1.5mL。 (3) 台 式高速 离心机 (10 000 Xg) 离心 20s, 沉淀 细菌。 (4) 竖直 试管, 用连接 真空泵 上的巴 斯德吸 管吸弃 上清。 (5) 加 100/xLTELT 溶液 ,于旋 涡振荡 器上悬 浮细菌 沉淀。 (6) 加 100pL 1:1 的酚 / 氯仿 ,于旋 涡振荡 器上充 分混匀 5s。 这种混 合液置 室温不 要超过 15min, 质粒的 产量可 随时间 延长而 提高, 但超过 15min, 可 导致酚 介导的 DNA 修饰。 (7) 15 000><^'(最大速度)离心111^11。 (8) 用一 支吸管 或类似 装置小 心取出 75^L 上层 水相, 转入一 干净微 量离心 管内。 不 要搅动 已分层 的两相 ,如 果混合 ,再 离心, 当收集 上相时 ,避免 带出界 面上的 沉淀。 (9) 加 150pL 预 冷的无 水乙醇 至上清 ,混匀 ,以 便沉 淀质粒 DNA。 (10) 最大速 度离心 5min, 以沉 降质粒 DNA。 (11) 倒 掉上清 ,倒 立离心 管使液 体尽可 以流出 ,然后 用滤纸 条小心 将管壁 上的水 珠 吸掉。 (12) 用 lmL 冰无水 乙醇洗 沉淀, 按以上 (9), (10) 两步 操作。 离心后 ,小心 弃上清 ,避 免沉 淀块被 弄丢。 (13) 盖上 试管盖 ,用 图钉或 注射针 在盖子 上打一 个小孔 ,将 试管置 于真空 干燥器 内 (无 干燥剂 ), 抽 真空直 到质粒 DNA 沉淀完 全干燥 为止。 水泵真 空装置 足够了 ,一 般不 会超过 15min。 (14) 将沉淀 溶解在 30)uL 的 TE 缓 冲液里 ,旋涡 器混匀 ,将所 有附着 于离心 管内壁 上的 DNA 都溶 解下来 ,保存 在适宜 条件下 ,取 2~5/uLDNA 溶液到 20^L 的反 应体系 里进行 酶切。 有 RNA 污染者 ,会干 扰在琼 脂糖凝 咬上的 DNA 片 段检测 ,因此 可在反 应体系 中加入 lfxLlOmg/ mL 的 RNase 溶液 (不含 DNase) 来消除 其影响 0 如需制 备更多 的质粒 DNA, 将 TELT 及酚 / 氯仿液 的量按 所用培 养液的 体积相 应增加 。如 果培养 • 35 • 液 不超过 5mL, 在用 TELT 缓冲液 悬浮后 ,将细 菌转入 微量离 心管内 ,最后 的质粒 DNA 沉淀用 lmL 无水 乙醇洗 2 次 。如培 养液在 5~100mL 之间 ,在 玻璃试 管内用 TELT 及酚 / 氯 仿处理 ,离 心机为 Sor- vail R05C, 6000 x g 离心 5min。 (四) 质粒 DNA 的保存 质 粒可以 通过菌 种而得 以保存 ,如果 将生长 在选择 培养板 上的菌 种置于 4X:, 最多 只 能维持 1 个月 。要 达到长 期保存 的目的 ,含 质粒的 菌种必 须在有 适当选 择成分 存在条 件下 生长至 饱和, 在菌液 中加入 等体积 的灭菌 甘油或 7% (V/V) 二 甲亚砜 (DMSO), 然后装 入灭菌 小瓶中 -70X: 冻存 。细菌 复苏时 ,应 当在选 择培养 板上重 新生长 ,质粒 DNA 也应当 进行酶 切分析 确证。 质粒 DNA 在 TE 缓 冲液里 ,于 4X: 可 保存几 个星期 ,在 -201C 或 -70t: 可 保存若 干年。 大多数 研究人 员常用 DNA 直 接冰冻 法来保 存质粒 。因为 用其他 贮存法 在复苏 时, 菌体中 的质粒 有时会 被丢失 、重排 ,或积 累插入 序列及 转座子 。在穿 刺培养 瓶中保 存含 质粒细 菌的过 程中, 也会发 生重排 ,但还 没有见 到任何 影响保 存于冰 冻细菌 中质粒 重排的 报导。 质粒 DNA •的保 存步骤 : (1) 短 时间保 存可将 选择培 养基上 的菌落 保存于 4X:; 长时间 保存可 将菌液 -70X: 保存于 甘油或 DMSO 溶液中 。从选 择平板 上挑取 菌落进 行培养 ,并 通过 限制酶 分析检 测质粒 DNA。 (2) 溶于 TE 缓冲液 的质粒 DNA 可在 4t: 短时间 保存, 并可于 -20X: 或 -70t: 长时 间 保存。 (五) 方 法评注 1. 背 景资料 小 量质粒 DNA 在重组 克隆的 分析中 是非常 重要的 。现在 有很多 种质粒 DNA 小量 提取 的方法 ,研 究人员 一般都 倾向于 选择比 较适合 自己的 方法。 本单元 提供了 3 种用得 最 广泛并 且可靠 的方法 ,即碱 裂解法 、煮 沸法 、锂沉 淀法。 任何一 种方法 都会给 研究者 的工 作提供 很大的 帮助, 具体选 择那一 种取决 于个人 爱好以 及质粒 的种类 、大小 和宿主 菌 。实 际上, 所有这 3 种 方法都 可以提 供足够 数量和 高质量 的质粒 DNA 来满足 大多数 酶操 作和细 菌及酵 母菌的 转化。 在这些 方法中 ,环 状质粒 DNA 先 于线性 染色体 DNA 复性。 无论是 用碱还 是去污 剂来 处理, 都可以 破坏碱 基配对 ,引 起线性 染色体 DNA 变 性分离 。相反 ,因 为质粒 DNA 具有 超螺旋 构象, 并呈共 价闭合 的环状 ,它不 能分开 ,环 状质粒 DNA 变性后 ,在 重新回 到原条 件后很 容易形 成正确 配对的 超螺旋 结构。 在碱 裂解法 少量制 备中, SDS 和 NaOH 起到破 坏细菌 菌体的 作用, 随后乙 酸钾使 共价闭 合质粒 DNA 重 新退火 ,而 染色体 DNA 和 蛋白质 被陷在 由钾与 SDS 形成 的复合 物里。 热裂解 可使得 染色体 DNA 保 持附着 于细菌 胞膜上 ,同 时质粒 DNA 留在 上清液 • 36 • 中 。在锂 法中, Triton X-100/LiCl 引 起细胞 质内膜 的溶解 。然而 ,在 显微 镜下可 发现, 它们对 细菌的 整个形 态毫无 影响, 也不会 让细菌 里的质 粒被释 放出来 。接下 来的酚 / 氯 仿导 致了细 胞体内 蛋白质 的变性 和沉淀 ,随之 而来的 细菌快 速收缩 就把可 溶的, 超螺旋 质粒 DNA 优先挤 了出来 ,而 保留了 染色体 DNA 和变 性的细 胞蛋白 ,形 成一堆 细胞残 物。 在这些 条件下 ,细菌 的形态 ,特 别是 细胞壁 可以保 持至少 30min, 这 时细菌 才开始 裂解 。在所 有的制 备方法 当中, 染色体 DNA 连同细 胞残留 物最终 都被离 心去除 ,而可 溶性、 超螺旋 的质粒 DNA 通过 乙醇沉 淀得以 浓缩。 一般 来说, 所有这 3 种方 法都能 提供相 当数量 高质量 的质粒 DNA, 并可满 足大部 分的 应用。 DNA 产量 主要取 决于质 粒种类 ,而不 是分离 方法。 来源于 pBR322 的质粒 产 量一般 要少些 ( 但在大 多数情 况下是 足够的 ), 近年 来源于 PUC 类 的载体 ,由 于其质 粒 基 因受到 了损害 ,它们 的拷贝 数要高 一些。 对于小 的质粒 (25 000Xg, 最 好使用 悬挂式 转子 (12 OOOr/min, HB-4)〇 由 于变性 染色质 的存在 ,煮后 的溶液 会十分 黏稠, 接近半 固态物 。因此 , 小心将 其倒入 离心管 • 40 • 时, 不要流 到外面 。悬 挂式转 头与固 角式转 头比较 ,前 者可使 染色质 DNA 及变 性蛋白 质以更 紧密的 沉淀 附着于 管底, 但固角 式转头 也能用 ,KWSorvallSS34,20 000r/min(47 000Xg);BeckmanJA- 17, 17 OOOr/min (40 000 X g); Beckman 70Ti, 44 OOOr/min (200 000 X g) 或 SW-41, 25 OOOr/min (100 000x¥)o (7) 将上清 缓缓倒 入一干 净离心 管中。 从这 一步可 直接到 CsCl/ 溴化 乙锭平 衡梯度 法纯化 ,如 果体积 过大而 不便于 操作, 可按下 列步骤 进行; 如果 用聚乙 二醇的 沉淀, 这些步 骤是必 须的。 (8) 加入 0.6 倍 体积的 异丙醇 ,颠 倒混匀 ,于 室温置 5~10min。 (9) 室温 , 15 000 x g 离心 lOmin (SS34 转子 11 500r/min; JA-17 转子 10 500r/ min)〇 (10) 用 2mL 70% 乙醇 洗涤沉 淀块。 简单离 心一下 ,收 集沉淀 。弃去 乙醇, 在真空 泵下 干燥沉 淀块。 沉淀块 能长期 保存于 4X:。 Triton 裂解法 1. 原理 以 下所述 方法是 Clewell 和 Helinski 方法的 改良法 ,在 他们所 提出的 方法中 要用到 Brij-58 和 SDS。 这 里改用 TritonX-100, 裂解 作用较 为温和 ,分离 如黏性 质粒等 大的质 粒时 很有用 。质粒 DNA 可进 一步以 CsCl 梯 度法及 PEG 沉 淀纯化 ,在本 节第二 部分会 提到 增加的 材料。 2. 材料 葡萄糖 /Tris/EDTA (GTE) 溶液 (50mmol/L 葡萄糖 , 25mmol/LTris-HClpH8.0, lOmmol/LEDTA, 4X: 保存) 10mg/mL 鸡蛋清 溶菌酶 (新鲜 准备) 0.5mol/L EDTA 10mg/mL 无 DNase 的 RNase Triton 裂解 混合液 (3% Triton X-100, 200mol/L EDTA, 150mol/L Tris-HCl pH8.0) 1:1 酚 / 氯仿 24:1 氯仿 / 异戊醇 3. 操 作步骤 (1) 按 碱裂解 法步骤 (1) 〜 (3) 所 述培养 及收集 细菌。 (2) 用 5mL GTE 溶 液悬浮 500mL 培养 物所得 的沉淀 ,转移 到适当 的离心 管内。 (3) 加入 1.5mL 鸡蛋 清溶菌 酶溶液 ( 配方见 煮沸法 ), 2mL0.5mol/LEDTA, 25pL RNase 冰浴 15min〇 (4) 加 2.5mLTrit〇n 裂 解溶液 ,轻 轻混匀 ,置 4X:20mino 当菌体 裂解后 ,溶 液会 变得非 常黏稠 ,可见 絮状不 透明物 ,继续 孵育; 溶液 一定要 混匀, 但不能 . 41 • 用旋涡 混匀器 ,也 不能剧 烈振摇 ,否则 染色质 DNA 会 被剪切 ,这样 就不能 在下一 步中被 沉淀。 (5) 4*C , 40 000 x g 离心 70min (18 OOOr/min, Sorvall SS~34; 17 OOOr/min, Beck- man J A- 17)。 (6) 小心 将上清 倒入一 干净离 心管。 质粒 留在上 清中。 胶状沉 淀含有 染色质 DNA 和细 胞残体 ,不要 掉进干 净管里 。最 好拿一 支吸管 挡 在管口 ,这 样在倾 倒试管 时就可 以防止 沉淀块 滑入干 净管中 。沉 淀块的 量在每 次制备 时都有 很大的 不同, 有时为 了避免 沉淀物 的污染 有必要 弃去一 些黏稠 的上清 。从 这一步 可直接 跳到用 CsCl/ 溴化乙 锭平衡 梯度法 来进行 纯化。 如果体 积过大 ,接着 做下面 的步骤 。如 果用 PEG 沉淀 ,下 列步骤 则非做 不可。 (7) 先用酚 / 氯仿 抽提, 然后再 用氯仿 / 异 戊醇抽 提上清 。加 0.6 倍体 积异丙 醇至水 相中, 置室温 5~10min。 (8) 室温下 , 15 000 x g 离心 l〇min 以沉 降核酸 (S&34 转子 11 500r/min; JA-17 转子 10 500r/min)。 (9) 用 2mL 70% 乙醇 沉淀, 离心收 集沉淀 ,吸 弃乙醇 ,用真 空泵干 燥沉淀 块即是 提取 的质粒 DNA。 沉淀 块可在 4X: 长期 保存。 (二) 质粒 DNA 的纯化 氣化绝 / 渓化 G 锭平衡 离心法 1. 原理 在抽 提质粒 DNA 过程中 ,对 于相 对分子 质量大 的质粒 DNA, 抽 提方法 激烈, DNA 易 于损伤 ,而 且容易 被线状 染色体 DNA 污染, 尤其是 相对分 子质量 与质粒 DNA 相近 的 染色体 DNA。 用 氯化铯 (CsCl) 密度梯 度超离 心法抽 提质粒 DNA 具有 纯度高 ,步骤 少 ,方法 稳定, 且获得 的质粒 DNA 多数 为超螺 旋构型 等特点 ,但它 成本高 ,需 要有超 速 离心机 设备。 CsCl 是一种 相对分 子质量 大的重 金属盐 ,在超 速离心 场较长 时间的 作用下 ,就会 在离 心管中 形成浓 度梯度 。当 DNA 的沉 降速度 达到平 衡时, 染色体 DNA、 质粒、 RNA 等 各种分 离颗粒 ,在密 度梯度 中沉淀 或漂浮 ,它 们在 密度梯 度中的 位置分 布不依 据沉 降速率 、相 对分子 质量大 小及离 心时间 ,而 是取决 于它们 之间的 密度差 。由 于它们 之间在 介质梯 度里的 水合作 用不同 ,因此 ,其密 度也总 有区别 。为 了增加 样品中 各成分 的密 度差别 ,将 DNA 样品 加溴化 乙锭一 起离心 。溴 化乙锭 (EB) 是一种 吖啶类 染料, 它 可以嵌 入双链 DNA 的碱基 对之间 ,使 DNA 的 解旋体 积增大 ,浮力 变小。 EB 容易插 入线状 DNA, 而与环 状质粒 DNA 的结 合量小 于线状 DNA 的 结合量 ,从 而使两 者的浮 力 密度出 现悬殊 的差异 。当 DNA 的沉 淀速度 与打散 速度达 到平衡 ,在 合适的 CsCl 密度 梯度范 围中, DNA 就处 在一定 位置上 ,这时 DNA 的 浮力密 度就等 于该位 置上的 CsCl 的密度 。由 于质粒 DNA 的浮力 密度大 于线状 染色体 DNA 的浮力 密度, 染色体 DNA 的 区带 在上层 ,质粒 DNA 的区带 在下层 。两者 能明显 地分开 而达到 分离的 目的。 • 42 • 在提取 样品中 ,还 含有 大量的 RNA, 一般 来说, DNA 与 RNA 的浮力 密度与 CsCl* H20 相互作 用有关 ,而 RNA 在 CsCl 中 总是与 Cs+ 相结合 ,故密 度很大 。在 超离 心时, RNA 将沉 入离心 管管底 ,这 就可以 与质粒 DNA 相 分离。 2. 材料 质粒 DNA 粗制品 TE 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA) GTE^U (15% WM, 50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA, 临 用时加 溶菌酶 1.5mg/mL) 氯化铯 lOmg/mL 溴化乙 锭溶濟 20%SDS 溶液 Dowex AG50W-X8 阳 离子交 换树脂 CsCl/TE 溶液 : 100g CsCl 溶于 lOOmL TE 缓冲 液中。 TE 缓冲液 A〇.2mol/L NaCl) 100% 乙醇和 70% 乙醇 Beckman VTi 65 或 VTi 80 转 子或与 其相当 的转子 3. 试 剂配制 10mg/mL 溴 化乙锭 (EB) 溶液 戴手 套谨慎 称取溴 化乙锭 (FlukaAG 相对分 子质量 394.33) 约 200mg 于棕 色试剂 瓶中 ,按 10mg/mL 的浓度 加双蒸 水配制 ,溶解 后贮于 41C 冰 箱备用 (EB 是 DNA 的诱 发剂 ,也是 强的致 癌物, 切勿碰 到皮肤 或溅出 )。 4. 操 作步骤 (1) 粗 裂解物 (质粒 DNA) 制备方 法最后 一步得 到的沉 淀溶于 4mLTE 缓冲 液中, 加入 4.4gCsCl, 溶解后 ,再 加入 0.4mL10mg/mL 溴化 乙锭。 小心: 溴化乙 锭是一 种诱变 剂并能 造成环 境污染 ,操 作时应 戴手套 ,并且 妥善处 理。 (2) 将 溶液转 入一个 5mL 的 超速离 心管中 ,酌 情往管 中加入 CsCl/TE 溶液 ,封好 离心管,于201〇,500 000\尽离心3.511或于201,以350 000\忌离心1仆以上。 (3) 首先 从管的 顶端插 入一支 20G 针头 ,然 后用带 另一个 20G 针头的 3mL 注射器 将质粒 带吸出 ( 针头插 入质粒 带下约 lcm)。 (4) 进行第 二次超 速离心 [步骤 (2)、 (3)], 除去 混杂的 RNA 和 染色体 DNA 以获 得更高 纯度的 质粒。 (5) 按质粒 DNA/EB 溶液的 1.5~2 倍 体积装 Dowex AG50W-X8 柱子 ,用数 倍体积 的 TEA0.2mol/L NaCl) 溶 液清洗 和平衡 柱子。 (6) 用注 射器将 含有溴 化乙锭 的质粒 DNA 溶液 直接加 到树脂 的顶部 ,注意 不要摇 动 树脂。 (7) 立即 收集流 出液, 然后用 2 倍 于上样 体积的 TE/(0.2mol/L NaCl) 溶液 洗脱两 • 43 • 次 (最 后收集 液的体 积大约 是从梯 度离心 所得到 的质粒 DNA 溶液 体积的 3 倍 )。 也 可以用 TE 饱 和的正 丁醇来 除去溴 化乙锭 。充分 旋涡振 荡混匀 ,然 后除去 有机相 ,重复 几次直 至在 紫外灯 下看不 见红色 ,然 后加入 2 倍 体积的 TE 缓冲液 以稀释 其中的 氯化铯 ,在本 方法中 产生的 含有溴 化乙锭 的有机 废物应 该妥善 处理。 (8) 加入 2 倍体积 100% 乙醇于 室温或 -20X: 沉 淀质粒 DNA。 4X: 下 ,以 lOOOOXg 离心 10min〇 (9) 沉淀用 70% 乙醇洗 涤一遍 ,真空 干燥, 溶解于 TE 缓冲液 ,并于 4t: 保存。 层析法 (离 子交换 层析和 分子筛 层析) 1. 原理 用层析 方法纯 化质粒 DNA 主 要是利 用质粒 DNA 与初 始裂解 物中其 他分子 的物理 性质 的差别 。核酸 带负电 ,因此 可用离 子交换 层析的 方法进 行纯化 (见有 关离子 交换层 析 的方法 和讨论 )。 同样, 大分子 的质粒 DNA 可以 通过凝 胶过滤 层析方 法去除 分子杂 质而得 到纯化 。其纯 度高, 可用于 DNA 测序。 为获 得适于 层析纯 化质粒 DNA 的粗制 裂解物 ,对粗 制裂解 物制备 方法做 了一些 改进。 1) 柱容量 质粒 DNA 的综合 容量是 大多数 普通柱 子的限 制因素 ,柱子 过载并 不能提 高质粒 DNA 的产量 。因 此应该 根据树 脂的容 量来调 节细菌 的培养 体积、 质粒拷 贝和培 养基的 类型, 从而优 化质粒 DNA 的 回收率 。超 出柱子 容量的 DNA 会直 接从柱 子流过 而被丢 失 。提 高产量 的方法 之一是 收集前 次从柱 子流出 的液体 ,用 一根新 的或再 生过的 柱子进 行 纯化。 pZ523 柱 的最大 容量为 4~5mg 质粒 DNA, 而 Qiagen-tip 2500 (Qiagen) 和 WizardMaxiprep (Promega) 柱只有 l~2mg 的容量 。如 果超 出柱子 的容量 ,增 加细菌 密度 和质粒 DNA 的浓 度对提 高产量 也无济 于事。 2) 粗制 解裂物 的制备 如 果利用 Qiagen-tip 2500 和 Wizard Maxiprep 柱, 细菌应 该不完 全裂解 ,因 此在制 备原 始裂解 物时可 以不用 溶菌酶 消化。 为了去 除相对 分子质 量高的 RNA 应加入 终浓度 为 50ML/mL 的 RNA 酶 A (用 浓度为 lmg/mL 的贮 液配制 )。 为 了去除 沉淀时 漂浮物 [碱 裂解 法步骤 (6)] 可 以将上 清液用 干净包 布过滤 ,并 且在离 心之前 加氯仿 抽提; 也 可以再 次对上 清液进 行离心 ,异 丙醇沉 淀来制 备粗制 裂解物 ,并且 最后的 沉淀可 以溶解 于适 合进行 柱层析 的缓冲 液中。 3) Sephadex G50 过柱 利用不 同孔径 的凝胶 (加 SephadexG50, Pharmacia 公司) 柱 ,分离 纯化蛋 白质、 酶 、质粒 DNA 和 RNA 等生物 样品。 目前也 常用于 DNA 的 微量过 柱以达 到纯化 DNA 的 目的。 DNA 的 微量过 柱常用 SephadexG50 葡聚 糖凝胶 。做成 300/iL 凝胶的 Eppen- dorf 管 (简称 EP 管) 小柱 ,对 1 〜 5吨 的 DNA 样品离 心过滤 20s, 就能 得到高 纯度的 质粒 DNA。 这种 DNA 可直 接用于 DNA 测 序用。 2. 材料 质粒 DNA 粗制品 Sephadex G50 (Pharmacia 公司) 3mol/L 乙酸钾 溶液, 90% 甲酸 滴定至 pH5.5 Triton 裂解 混合液 (3% Triton X-100, 200mol/L EDTA, 150mol/L Tris-HCl pH8.0) 3. 树 脂处理 * DOWEXAG50W-X8 离子交 换树脂 (100) 按下 列步骤 大批量 (200 〜 400mL 包装) 洗涤 制备。 在更换 洗液时 ,用一 个大的 Buchner 管和滤 低收集 树脂, 这样操 作非常 方便。 (1) 用 10 倍以上 体积的 0.5mol/LNaOH 洗 涤树脂 ,直 到在溶 液中看 不到颜 色为止 (树 脂会保 留其缓 冲颜色 )。 (2) 用 5 〜 10 倍体积 0.5 mol/L HC1 洗涤。 (3) 用 5 〜 10 倍体积 0.5 mol/L NaOH 洗涤。 (4) 用 5 〜 10 倍体积 双蒸水 洗涤。 (5) 用 5 〜 10 倍体积 0.5 mol/LNa〇H 洗涤。 (6) 用 双蒸水 洗涤到 pH = 9 为止。 (7) 于 41C, 0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris pH7.5 长期 保存制 备好的 树脂。 4. 操 作步骤 (1) 取一支 10mL 试管 ,加入 含有抗 菌素的 LB 液体 培养基 2mL, 再将大 肠杆菌 JM103 (pUC18) 的菌 落接种 于培养 基中, 37X: 振荡培 养过夜 ,约 16h 左右。 (2) 转移上 述菌液 1 .5mL 于 EP 管中, 室温下 14 OOOr/min 离心 15s。 (3) 小 心移去 上清液 ,把 EP 管倒 立在吸 水纸上 吸干。 (4) 加入 lOOpL 溶菌液 ,把 EP 管盖紧 ,倒翻 4 次 ,冰浴 10min。 (5) 加入 200/^L 碱性 SDS 溶液 ,温和 地翻转 EP 管 5 次 (可观 察到溶 液逐步 由混浊 变为 透明) 冰浴 5min。 (6) 再加入150/^31!1〇1/1^1<八〇91^4.8,将£?管盖紧后轻轻来回倒转2〜3次,混 勻 后冰浴 20minQ (7) 14 000r/min 室 温离心 15min。 (8) 将上清 转移到 另一个 EP 管中 (不 要把底 部混浊 吸进去 )。 加入 lmL 冷 的无水 乙醇 (或加 满为止 ), 盖紧, 并翻转 EP 管 3 次。 (9) 将 EP 管置于 - 201C 10 〜 20min。 (10) 15 OOOr/min 离心 10mino (11) 倒弃 上清液 ,真 空干燥 ,用 20 〜 40/ug/mLRNaseA 的 TE 充分 悬浮, 37X: 10min〇 (12) 将微型 柱套入 EP 管内 ,取约 150ML 的 S 印 hadex G50 水 合凝晈 于微型 柱内, 5000r/min 离心 lmin, 弃水分 ,重 复一 次。 微量 过柱法 使用的 柱可用 〇.5mL 的 EP 管自制 。制 作方法 是用针 尖在管 底刺一 个小洞 ,洞 的大小 只能 让水溶 液通过 而凝胶 颗粒不 能通过 。柱使 用前要 经过装 胶离心 检査, 好的柱 可以反 复清洗 使用。 • 45 • (13) 将 微型柱 套入一 洁净的 EP 管内 ,做 好标记 ,将 20 〜 40^LDNA 样品 移入柱 内, 10 000r/min 离心 20s。 (14) 取下 微柱, EP 管内的 液体为 纯化的 DNA 样品 ,取 0.5 〜 l^L 样 品进行 琼脂糖 凝胶 电泳测 纯度。 PEG 沉淀法 1. 原理 采用 PEG (6000 或 8000) 沉淀 DNA, 大小 不同的 DNA 分子 所用的 PEG 的 浓度也 不同, PEG 的 浓度低 ,选择 性沉淀 DNA 相对 分子质 量大, 大分子 所需的 PEG 的 浓度只 需 1% 左右 ,小分 子所需 PEG 浓 度高达 20%。 因此 ,控制 PEG 浓度可 以选择 性沉淀 DNA, 其分辨 率大约 lOObp。 本方 法快速 、可靠 、方便 ,可 以在任 何步骤 时终止 ,并且 DNA 回 收完全 。既 不涉及 离心, 又避免 了溴化 乙锭的 使用。 2. 材料 质粒 DNA 粗制品 葡萄糖 /Tris/EDTA (GTE) 溶液 (50mmol/L 葡 萄糖, 25mmol/LTris-HClpH8.0, lOmmol/LEDTA, 4X: 保存) NaOH/SDS 溶液 [0.2mol/LNaOH, 1% (m/V) SDS, 临用 时新鲜 配制] 3爪〇1/1^乙酸钾溶液,?1*1〜5.5 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) lOmg/mL 无 DNase 的 RNase 聚 乙二醇 (PEG) 溶液 (30%PEG 8000, 1.6mol/LNaCl, 存于 4t:) Tris 饱和酚 24:1 氯仿 / 异戊醇 10m〇l/L 乙酸铵 100 % 和 70% 乙醇 3mol/L 乙 酸钠, pH5.5 Sorvall SS^34 和 Beckman JA-I7 转头 (或 相当的 转头) Sorvall HB-4 转头 3. 操 作步骤 (1) 用 lmL 葡萄糖 /Tris/EDTA 溶液 重新悬 浮粗裂 物制备 沉淀。 (2) 加入 RNase 至 终浓度 20/ig/mL, 37X: 孵育 20min〇 (3) 加入 2mL 新鲜 制备的 NaOH/SDS 溶液 ,混匀 ,置 室温下 5~10min。 (4) 加 1.5mL 乙酸 钾溶液 ,混匀 ,室 温置 5~10min。 (5) 室温 下离心 10min, 20 000 X g (11 〇〇〇r/min SS*34 转头; HB~4 或 JA-17 转 12 500r/min)〇 (6) 将 上清移 入一个 干净试 管中。 白 色沉淀 主要是 SDS •钾 复合物 ,包 括残留 在粗裂 物中的 染色质 DNA。 这些 残留物 在每次 制备后 • 46 • 都不同 。粗 裂物主 要成分 是质粒 DNA, 没有 必要将 染色质 DNA 完全去 除干净 。有的 实验如 杂交筛 选 ,需要 没有任 何污染 的质粒 DNA。 如 果质粒 的限制 酶切片 段要用 来作杂 交探针 ,在 凝胶纯 化后, 污染目 的片段 的微量 染色质 DNA 将被 去除。 在这种 情况下 ,步骤 (1)~(5) 可以 省略, 将粗裂 解液沉 淀 悬浮于 4mLTE 缓冲液 , RNase 加至终 浓度为 20Mg/mL, 37X: 孵育 20min, 按步骤 (7)~(12) 处理。 (7) 用 饱和酚 ,然 后氯仿 / 异戊醇 抽提。 (8) 加 1/4 倍体积 10m〇l/L 的 乙酸铵 ( 终浓度 2mol/L) 至水相 ,混匀 ,加 2 倍 体积预 冷的 100% 乙醇 ,将 试管置 于冰上 lOmin, 然后 4X3 下, 10 000><€离心1〇111丨11回收质粒 DNA (HB-4 或 SS-34 转, 80 000r/min; JA-17, 8500r/min)。 (9) 70%乙醇洗涤沉淀,真空快速干燥。21111^丁£重新悬浮,加入0.8〇^?£0溶 液, Ot: 孵育 l~15h。 用 PEG 沉淀 ,质粒 DNA 回收的 百分率 随着在 0~4t: 孵育 时间的 增加而 提高。 Ot: lh 后离心 ,通 常 50% 或更多 (0.5~3mg) 的质 粒能被 回收。 41C 孵育时 间超过 12h, 则 可以将 质粒完 全回收 ,而且 首次 离心后 的质粒 DNA 就可 用于其 他的实 验了。 (10) 4X: 下, 10 000 x g 离心 20min 回 收质粒 (HB-4 或 SS~34 转头, 8000r/min; JA-17 转头 8500r/min; 大 多数情 况下为 10 000r/min)o (11) lmLTE 重新悬 浮质粒 DNA 沉淀 。乙醇 沉淀。 (12) 将质粒 DNA 溶于 TE 缓 冲液。 1. 主 要参数 (三) 方 法评注 1) 碱 裂解法 这是一 种可靠 的方法 ,很少 发生无 法挽救 的问题 。当 加入 NaOH/SDS 时, NaOH/ SDS 溶液 使线性 (即染 色质) DNA、 质粒 DNA 和蛋 白质均 变性而 沉淀。 当溶液 在高盐 浓度状 态下被 中和时 ( 如加入 乙酸钾 溶液时 ), 质粒 DNA 复性 呈溶解 状态, 而线性 DNA 和 蛋白质 仍呈沉 淀状态 ,离 心就可 使质粒 DNA 与它们 分开。 这种沉 淀可能 是因为 变性 的线性 DNA 分 子之间 多联结 、缠绕 ,导 致一 个大的 不溶的 DNA 网 的形成 。在这 种条 件下, 蛋白质 -SDS 复合 物也沉 淀下来 。如 果加乙 酸钾溶 液后溶 液黏性 不降低 ,可 滴 加浓甲 酸或乙 酸挽救 。每 加一滴 ,混匀 ,直到 黏性降 低为止 。黏 性降 低是突 然发生 的 ,这时 ,就 会出 现线性 DNA 和蛋白 质沉淀 ,而 质粒 DNA 复性 呈溶解 状态。 2) 煮沸法 该法的 缺点是 ,一 旦失败 ,就 很少有 机会能 挽救了 ,惟一 可挽救 的是最 后质粒 DNA 的回收 。失败 往往由 于溶菌 酶的失 活引起 ,抢 救措施 是改用 新鲜酶 。不恰 当的煮 沸时间 也是失 败的原 因之一 。最佳 的煮沸 时间由 于菌种 的不同 可以有 所变化 ,采 用一个 具有 成功经 验的菌 种可以 避免这 个问题 ,时间 长短可 以由煮 沸小量 提取法 确定。 Triton 裂解法 : 这种方 法远较 所述的 其他方 法柔和 ,因 为破 菌的条 件相对 要温和 (比如 ,采用 Triton 和溶 菌酶, 而非煮 沸或离 子强度 、酸碱 度的剧 烈变化 )。 由 于所用 的条件 接近作 用下限 ,溶液 必须小 心配制 ,溶 菌酶也 必须有 活性。 如果贮 存得当 ,粉状 溶 菌酶可 以保持 相当长 的时间 ,有时 候也得 用新的 。当 加入 Triton 裂解混 合液时 ,溶 • 47 • 液应该 变得相 当黏稠 ,这 种现象 意味着 已经裂 解了。 当质粒 DNA 从污染 物团块 分离出 来时 ,第 (5) 步的 离心也 很关键 。如果 在这步 沉淀物 没有被 压得很 紧的话 ,当 倾出 含有质 粒 DNA 的上 清时, 沉淀物 会被倒 出试管 。如 果发生 这种事 的话, 就再离 心一次 。如果 这种 情况总 是发生 的话, 可按比 例增加 试剂的 体积和 (或) 延长离 心时间 ,或者 用更高 的离 心速度 离心。 3) CsCl/ 溴化 C 锭离心 DNA-CsCl/ 溴 化乙锭 溶液的 密度是 否正确 很重要 。当 在步骤 (1) 中 测量溶 液体积 时 ,请务 必准确 (使 用刻度 塑料管 ), 因为这 决定了 要加入 氯化铯 的量。 如果加 入的氯 化铯量 不合适 ,条 带位置 将变高 (加得 太多) 或变低 (加 得过少 )。 理想 的条带 应该在 中间略 高一点 的位置 。当离 心时, 保证足 够的时 间来建 立梯度 ,也 是很重 要的。 如果条 带在 离心结 束时出 现扩散 ,表 明溶液 不合适 ,并且 还要继 续离心 。当 达到 平衡时 ,条带 会 被很好 地限制 在一个 梯度里 。如果 CsCl 沉淀, 如在最 后几步 离心沉 淀质粒 DNA 时, 发现 有大块 、白色 的结晶 沉降物 ,可 将溶 液升至 室温并 在室温 下离心 。如 问题仍 然不能 解决, 则检查 在加入 乙醇前 ,溶液 是否用 TE 缓冲液 稀释了 3 倍。 偶尔超 速离心 管破裂 ,内 容物渗 漏入转 头孔里 。如 果离心 管过期 ,或 没有装 满或封 得 不合适 ,这种 事故就 会发生 。如 果大部 分溶液 留在转 子孔里 ,可 以将其 吸到一 干净刻 度管里 ,在上 面加入 TE/CsCl 溶液 ,再 离心。 虽然产 量由于 损失而 减少了 ,但 DNA 的 质量 不会受 到影响 。如果 转头与 CsCl 溶 液接触 ,用温 水清洗 干净。 氯化铯 腐蚀性 很强, 能在转 子上留 下凹痕 ,并缩 短其使 用寿命 。离心 室应当 在每次 离心后 都检查 ,如 有红色 锈斑 ,用温 水清洁 ,彻底 干燥。 4) PEG 沉淀 质粒 DNA 的纯 度取决 于加入 PEG 前溶液 中残存 染色质 DNA 的量。 在该方 法中, 经步骤 (1)~(5), 哪 怕是微 量的这 些残留 也被去 除了; 但并不 是非得 这样才 能成功 。对 于用 PEG 有效 的片段 ,在粗 裂液中 DNA 的 浓度必 须大于 lOpg/mL。 这并不 用担心 , 因为实 际上质 粒的浓 度比这 大几个 数量级 。用 PEG 沉 淀均可 获得极 高纯度 的质粒 DNA。 用 PEG 沉淀时 必须注 意两点 问题, 一是要 有一定 盐浓度 ,常用 4mmol/LNaCl; 二是 通过离 心后一 定要把 PEG 去除 干净。 2. 预 期结果 以 上采用 不同的 方法提 取质粒 DNA, 一 般都要 用琼脂 糖凝胶 电泳法 和酶切 图谱进 行鉴定 (图 1.15), 了解 质粒的 属性和 纯度。 目 前常用 的很多 质粒都 来源于 PUC 系列。 这种质 粒含一 个复制 起始点 ,该 起始点 比前代 PBR 衍生 质粒的 起始点 更有效 。从 500mL 细菌培 养液里 ,无 论用 哪种粗 裂解物 制 备以及 PEG 沉淀后 ,都可 以得到 1 〜 5mg 的质粒 DNA (无 其他细 菌产物 污染) 。用 CsCl/ 溴化 乙锭密 度梯度 法纯化 得到的 产童为 PEG 沉 淀法的 50% 〜 75%。 3. 时 间安排 细菌培 养到一 定浓度 需一个 晚上, 大多数 都在第 2 天将 培养物 离心。 用碱裂 解法制 备粗裂 解物需 90min 可以 完成, 煮沸法 大约需 35min, Triton 裂 解需要 2.5 〜 3h。 粗裂 • 48 • 1 1 1 2 2 2 3 3 3 A U H-N H-S U H-N H-S U H-N H-S 图 1.15 大 肠杆菌 (TB 株) 转 化体中 制备的 3 种质粒 DNA 的限制 性图谱 1、 2、 3 这 3 种克隆 作如下 处理: U, 没有 切割的 DNA; H-N, 用杻 《d III 和 AWe I 双酶切 的质粒 DNA;H-S,用rt>K^III和S/)/ll双酶切的质粒DNA;2.5fIL的XDNA(约l^tg)用^^t'ndm进行消化。 然 后在含 50mmol/LTris •磷酸 (pH8.0) 和 lmmol/LEDTA, 0.7% 琼脂糖 凝胶上 进行电 泳分离 ,电泳 的 电流为 70mA, 电泳的 时间为 lh。 3 种克隆 的质粒 DNA 酶切 结果均 是阳性 解物的 PEG 沉淀 法可在 2h 的时 间里 得到纯 的质粒 DNA, 然而如 要得到 更多的 产物, 则需要 13~16h。 CsCl/EB 密 度梯度 法需要 1.5~3d 不等 ,依所 需质粒 DNA 质量 而定。 采用这 些方法 ,从含 所需质 粒的大 肠杆菌 中得到 高品质 的质粒 DNA 需要 2d 〜 1 周 时间。 除了完 成全部 实验所 需的时 间外, 还要考 虑到不 同方法 的某些 步骤所 花费的 时间。 PEG 沉淀在 收菌后 4 〜 5h 可得到 纯质粒 DNA, 但是 需要每 10~30min 不 停地观 察和操 作。 收菌后 ,用 CsCl/EB 法纯 化需要 15~18h, 但最后 14h 全是用 来离心 。当然 ,离心 时 不必直 接观察 。因此 ,如 果当天 需要用 质粒, 用碱裂 解法制 备粗裂 解物及 PEG 沉淀 纯化 ,也许 是最合 适的。 纯化时 ,置 0X: 约 lh 后收集 PEG 沉淀物 [步骤 (10)]。 如果 快 下班了 ,时间 不允许 ,可先 用煮沸 法制备 粗裂物 ,用 CsCl/EB 密 度梯度 法纯化 。总 之 ,根据 不同的 方法及 其可以 停下来 的步骤 ( 例如沉 淀步骤 ), 选 择最方 便及适 合于特 定工作 条件的 方法。 四 、质粒 DNA 转 化细胞 此 处介绍 了三种 大肠杆 菌的转 化方法 。氯 化钙法 是基本 的方法 ,这种 方法转 化效率 高 ,简单 ,不 需要 任何特 殊设备 ,并且 可以将 感受态 细胞贮 存起来 。另一 种一步 转化方 法转 化效率 也很好 ,而且 更快些 。然而 ,因为 这种方 法开发 得相对 晚些, 它的重 复性和 可 靠程度 还不是 很好。 如果 需要更 高的转 化效率 ,可以 使用电 转化法 。虽然 这种方 法简单 、快速 、可 靠, 但它 需要电 转化仪 。与 氯化钙 法一样 ,制 备的细 胞也能 贮存。 • 49 • 1. 原理 (一) CaCl2 转化法 许 多细菌 (如大 肠杆菌 ) 不 能摄取 有功能 活性的 DNA, 但可 以通过 人工的 方法导 入 DNA。 用 CaCl2 处理 受体菌 (如大 肠杆菌 ), 可诱 导短暂 的“感 受态” ,使之 具有摄 取外源 DNA 的能力 ,从 而能摄 取不同 来源的 DNA。 DNA 与 Ca2+ 结 合亦可 形成对 DNase 有抗性 的复合 物结合 在细菌 表面, 经一个 短暂的 42X: 热休 克可 促进细 菌摄取 DNA-Ca2+ 复合物 ,提 高转 化效率 。然 而即使 在最佳 条件下 ,也只 能将部 分质粒 DNA 导 入细菌 。为鉴 定这些 转化体 /需利 用质粒 的筛选 标记。 这些标 记赋予 细菌以 新的表 型 ,使 转化成 功的细 菌很容 易被筛 选出来 。如 PUC19 质 粒带有 氨苄青 霉素抗 性基因 (Am//), 以 其转化 的大肠 杆菌就 能够在 含氨苄 青霉素 的选择 培养基 上生长 ,未 转化的 受体菌 则不能 在这种 选择培 养基上 生长。 2. 材料 大 肠杆菌 单菌落 LB 培养基 (见 本章第 一节) CaCl2 溶液 (60mmol/L CaCl2, 15% 甘油, 10mmol/L PIPES pH7.0, 滤膜 除菌或 高压蒸 气灭菌 ,冰冻 ) 质粒 DNA (见本 章第二 节第二 、三 部分) 带有 氨苄青 霉素的 LB 平板 (见本 章第一 节第三 部分) Beckman JS*5. 2 转 子或与 其相当 的转子 所有与 细菌接 触的物 品和液 体都应 该是无 菌的。 3. 操 作步骤 (1) 接 种一个 大肠杆 菌的单 菌落于 50mL LB 培 养液中 ,于 37X: 摇 床中培 养过夜 (250r/min)〇 (2) 在一个 2L 的烧瓶 中加入 400mLLB 培养 液中, 再加入 4mL 培养液 ,于 371C 摇 床 (250r/min) 过夜 培养至 OD6〇。 为 0.375。 (3) 将培 养液分 别转至 8 个 50mL 预 冷无菌 的聚丙 烯管中 ,于冰 上放置 5~ lOmin, 然后于 4亡 下, 160〇Xg •离心 7min, 弃 上清。 (4) 细胞 沉淀用 10mL 冰冷的 CaCl2 溶 液重悬 ,于 4X:, 以 lOOOXg 离心 5min, 弃 上清。 (5) 细胞 沉淀用 10mL 冰冷的 CaCl2 溶 液重悬 ,冰 上放置 30min, 于 4X:, llOOXg 离心 5min, 弃 上清。 (6) 用 2mL 冰冷的 CaCl2 溶液重 悬各 管细胞 ,然后 按每管 250pL 的量 分装于 预冷的 无 菌聚丙 烯管中 ,立即 冻存于 -70X:。 (7) 按照 以下各 步骤用 10ng pBR322 转化 100/iL 感受态 细菌。 将合适 体积的 转化物 (1/iU 和 25/iL) 涂 于含有 氨苄青 霉素的 LB 平 板上, 37X: 培养 过夜。 • 50 • 每一 个体积 (ML) 的转 化克隆 数乘以 105 相当于 每毫克 DNA 的转 化数。 (8) 将 10ngDNA(10~25ML) 加入 到一个 1.5mL 无菌 的圆底 试管中 ,并 放置冰 上 。将 盛有感 受态细 菌的管 子握在 手上使 菌液迅 速融化 ,然后 立即将 lOOyL 感 受态细 菌加入 到管中 ,轻 轻旋动 ,并放 置冰上 lOrnin。 (9) 将 管放入 42X: 水浴 2mm 进 行热激 ,然 后加入 lmL LB 培养 液于每 一支试 管中, 于 37X: 置滚筒 式摇床 (25〇r/min) 培养 lh。 (10) 将几个 稀释度 菌液涂 布于含 合适抗 生素的 平板上 ,于 371C 培养 12~16h。 剩 下的转 化物可 贮存于 4X: 并用 于以后 涂板。 (二) 感 受态细 菌一步 法制备 和转化 1. 原理 * 参照 CaCl2 转化法 ,此 法更简 单一些 ,各 种菌株 都能按 这种方 法制备 感受态 细菌, 并 且能够 得到如 CaCl2 转 化法的 转化率 ,但其 转化率 比电转 化要低 得多。 2. 材料 (亦见 CaCl2 转化法 ) 2X 转化 贮存液 (TSS), 冰冷 含 20mmol/L 葡 萄糖的 LB 培养液 3. 试 剂配制 2X 转化 贮存液 (TSS) 将无菌 (高压 灭菌) 的 40% 聚 乙二醇 (PEG) 3350 用含 100mmol/L MgCl2 的 LB 培养基 稀释至 20%, 加入 DMSO 至 10% (W\〇, 并 调校至 pH6.5。 贮存于 4X:。 4. 操 作步骤 (1) 按 1:100 的比 例将过 夜培养 的菌液 加入到 新鲜的 LB 培 养液中 ,于 371C 培养至 〇〇6〇〇 为 0.3~0.4〇 (2) 加入等 体积的 2 XTSS 于菌 液中, 在冰上 温和地 混匀。 (3) 将 lOOpL 感受态 细菌和 1 〜 5;xLDNA (0.1 〜 lOOng) 加入 到一个 冰冷的 聚丙烯 管或玻 璃管中 ,于 4t: 放置 5~60min。 (4) 加入 〇.9mL 含 20mmol/L 葡 萄糖的 LB 培 养液, 37X: 温和振 荡培养 30 〜 60min, 在 合适的 平板上 挑选转 化体。 DNA 转 化效率 大约为 1〇7 〜 1〇8 转化体 /吨。 (三) 电穿 孔高效 转化法 1. 原理 高压电 转化是 目前效 率最高 的质粒 DNA 转化大 肠杆菌 和分枝 杆菌的 方法, 下述方 • 51 . 法可以 转化新 鲜制备 的细菌 或以前 培养并 冻存的 细菌。 当质粒 DNA 与受 体细胞 放入盛 有转入 缓冲液 (无盐 或低盐 的溶液 ) 的转移 电极杯 中, 在瞬间 通入高 电压时 ,受体 细胞处 于电休 克状态 ,此时 膜通透 性增加 ,在高 压下, 质粒 DNA 就易从 膜孔进 入受体 细胞中 。例如 BCG (卡 介菌) 的转化 ,取 80ptLBCG 和 2^L 穿 梭质粒 DNA 于电 转化池 (杯) 中 ,将 GenePulser (Bio-Rad 公司 产品) 设置 2. 5kV, 25pF, Gene controller 设置于 100〇n, 进行 电转化 (转 化时间 常数为 15 ~ 25ms)。 其后立 即加入 lmLM7H9-ADC 培养基 ,轻 轻混匀 ,转入 玻璃管 37X: 温育 2h。 取 O.lmL 涂于含 25mg/mL 卡那 霉素的 M7H9 培养 基平 板上, 37X: 温育。 耻垢分 枝杆菌 3 〜 5d 出现转 化子, BCG 的转化 子在电 转化后 6~8 周 出现。 2. 材料 大 肠杆菌 单菌落 LB 培养基 冰水 冰冷的 10% ( V/V) 甘油 SOC 培养液 (0.5% 酵母浸 出液, 2% 胰 蛋白, lOmmol/LNaCl, 2.5mmol/LKCl, 10mmol/L MgCU, l〇mmol/L MgS〇4, 20mmol/L 葡萄糖 ) 2x 电 转化及 贮存液 (TSS) (配制 见上法 ) 含 有适当 抗生素 LB 平板 (见本 章第一 节和表 1.1) Beckman JS-4. 2 转子或 相当的 转子, 和用于 50mL 的窄 底管的 配适器 电 转化仪 及脉冲 控制仪 预 冷的电 转化池 (电 极距离 0.2cm) 所有与 细菌接 触的材 料都应 该是无 菌的。 3. 操 作步骤 (1) 接种 一个单 菌落于 50mLLB 培 养液中 ,于 37X: 温和 振荡培 养过夜 (6h 以上) (250r/min)〇 (2) 将 2.5mL 的培养 物加入 到盛有 500mL LB 培 养液的 2L 烧瓶中 , 37t: 振摇 (300r/min) 培养至 OD6〇〇 为 0.5 〜 0.6。 (3) 细菌用 冰水浴 10~15min, 然后 转移到 预冷的 1L 离 心瓶中 。于 2X: 下, 5000X g 离心 20min, 沉淀用 5mL 预 冷的水 溶解。 (4) 加入 500mL 冰 冷的水 ,混匀 ,按 步骤 (3) 重 复离心 1 次 ,立即 将上清 倒掉, 用残 余的液 体重悬 细胞。 (5) 制备新 鲜的细 菌:将 悬浮液 加入到 预冷的 50mL 聚丙 烯管中 , 2X: 下 5000Xg 离心 lOrnin。 估计细 胞沉淀 的体积 (约 500fiL/500mL 培养液 ), 沉淀用 等体积 的冰冷 水重悬 (2X1011 细胞 /mL), 并按 50 〜 300ML 分装 于预 冷的微 量离心 管中。 新鲜制 备的细 菌其转 化效率 要高于 冻存的 细菌。 (6) 冻 存细菌 :加入 4mL 冰冷的 10% (V/V) 甘油 ,混合 ,然 后按 照步骤 (5) 离心 ,估 计沉淀 的体积 ,然后 加入等 体积的 冰冷的 10% 甘油 ,重 悬菌体 。按 50 〜 • 52 • 300;xL 分装于 预冷的 微量离 心管中 。于 干冰中 冷冻或 贮存于 - 80t: 。 (7) 将 电转化 仪调到 2.5kV、 25/uF, 脉 冲控制 器调到 200~400〇> (8) 将 lyL 质粒 DNA (5pg 〜 0.5Mg) 加入 到盛 有新鲜 制备的 细菌或 融化的 冻存细 菌的 小管中 混匀。 (9) 将转 化混合 物转移 到预冷 的电转 化池中 ,吸干 池的外 表面, 然后放 入样品 槽中。 (10) 进 行脉冲 电转化 (转化 时间常 数约为 5 〜 10ms), 然后取 出电转 化池, 马上加 入 lmLSOC 培养基 ,并 且用 巴斯德 吸管转 移到无 菌的培 养管中 ,于 371C, 中速 振荡培 养 30 〜 60min。 (11) 分小份 涂布于 含有抗 生素的 LB 平 板上。 DNA 转化效 率大于 109 转化体 /Mg。 (四) 方 法评注 1. 背 景知识 钙和一 步转化 : Madel 和 Higa 首先描 述了大 肠杆菌 的转化 。为 提高转 化效率 ,人 们提出 各种改 良方法 ,包 括延长 暴露于 CaCl2 的时间 ,用 其他阳 离子如 Rb+、 Mn2+ 和 K+, 并加入 另外的 化合物 如二甲 亚讽、 二硫苏 糖醇以 及氯化 钴六氨 (cobalt hexamine chroride) 来作 为钙的 替代物 。这里 给出的 CaCl2 转化 效率高 ,可 以长期 贮存感 受态细 胞, 并且相 对简单 。从 参考文 献中可 查到该 法的各 种改良 的方法 。另一 种方法 ,即 一步 制 备和转 化方法 ,要 快得多 。然而 ,这种 方法近 期才发 展起来 ,因此 ,它 的重复 性和可 靠性 还不如 CaCl2 转化 法那么 肯定。 电转 化:电 转化在 将核酸 导入真 核细胞 和原核 细胞方 面已成 为一种 很有价 值的技 术。 这种方 法可以 运用于 各种大 肠杆菌 和其他 G ( gram- negative) 和 G+ (gram-posi- tive) 细菌 。这 种技术 就是简 单地给 细胞加 一个高 压电场 ,使 得细胞 膜通透 性增加 ,质 粒 DNA 易穿 入细胞 。用 于哺乳 动物细 胞和植 物原生 质体的 高压电 场强度 一般是 0.5 〜 lkV/cm。 用于 高效转 化大肠 杆菌的 高压电 场强度 更大, 一般约 12.5kV/cm。 在 这些条 件下 ,曾 经报道 过质粒 DNA 的 转化效 率高达 101G 个 转化体 /pg。 近来 ,高达 8kV/cm 的高 压电场 强度也 被成功 地用于 哺乳细 胞及植 物原生 质体的 电转化 。典型 的电转 化仪的 电容放 电线圈 产生一 个呈指 数衰减 波形的 电脉冲 。电 极之间 的电压 快速升 至峰值 ,然后 按如 下公式 在一段 时间后 下降。 = V〇[e^/T] 式中: V, —— 在 电压后 某时点 〖的电 压; V〇 —— 起始 电压; t —— 时间 (s); T —— 脉冲时 间常数 T = i?C, 其中 R 为线圈 阻抗, C 为线圈 电容。 脉冲 时间常 数在大 肠杆菌 细胞的 电转化 大约是 5~10ms, 在 更高级 的真核 细胞从 5 〜 50ms〇 脉冲控 制器有 很多不 同大小 的电阻 ,任何 一个均 与样品 并联, 还有一 个固定 的阻抗 • 53 • (20f2) 与样 品串联 。与样 品并联 的电阻 一般是 200 或 40〇a 样品 的阻抗 对整个 的线圈 的阻抗 没有什 么影响 ,因此 ,电 容的总 电阻以 及电容 放电的 时间常 数都是 由这些 电阻决 定。 与样品 串联的 电阻保 护回路 以免短 路及电 容瞬时 放电。 当高电 压转化 脉冲被 传送到 窄小的 电极间 隙中的 高阻样 本上时 ,就需 要脉冲 控制器 了 。这时 ,洗 净的 大肠杆 菌盛在 0.2cm 的 小槽中 ,阻 抗高达 5000D; 当 样本电 阻低时 (5 位点由 X 蛋白质 识别, 在两个 c〇5 位点 间的 DNA 被从 多联体 上切除 。同 时它被 包装成 单个头 部前体 (将 DNA 线性化 ,并重 新 生成黏 性末端 )。 余 下的蛋 白质装 配上去 ,产生 具有黏 性末端 的线型 DNA 分子 ,再 与尾部 蛋白进 行装配 ,它 这时黏 到头部 ,形成 了完整 噬菌体 。位 于两个 〇« 位 点间的 DNA 是在 38~53kb 之间 (这是 选择适 当的载 体来构 建文库 时重要 的参数 ), 才 能包装 成可以 被注入 的形式 。最 后就是 宿主的 裂解。 噬菌体 编码的 蛋白质 破坏细 菌内膜 并降解 细 胞壁。 包装及 裂解的 必要条 件是① c〇5 位点: DNA 在这儿 被切割 ,位于 这些位 点间的 DNA 被 包装成 噬菌体 头部; ② Nul 和 A 蛋 白:在 aw 位点进 行切割 的“终 止酶” 成分; ③ B、 C、 D、 E 和 Nu3 蛋白: 与噬菌 体头部 的结构 和装配 有关; ④ G、 H、 I、 J、 K、 L、 M、 T、 U、 V 和 Z 蛋白 :与尾 部及尾 部纤维 的结构 和装配 有关; ⑤ R、 S 和 Rz 蛋 白: S 破坏 内膜, R 和 Rz 蛋白 协同 降解细 胞壁使 得细胞 裂解。 2. 溶 原生长 溶 原生长 (Lysogenic growth) 包括以 下过程 : 1) 基 因表达 入噬 菌体感 染宿主 细胞后 ,有时 野生型 X 噬菌体 关闭了 大部分 基因组 ,并整 合到细 菌染 色体上 ,这样 的噬菌 体叫原 噬菌体 ,含有 这种噬 菌体细 胞称为 溶原体 。噬菌 体进入 溶原 状态, 必须由 cJ、 cTn 基因产 物激活 Pe 和 Pi 启动 子的左 向转录 ,使 c/ 和 基 因的转 录分别 由/^ 和/ \ 启动子 控制。 cl 基 因产物 (X 抑制子 ) 对 溶原生 长必不 可少。 该蛋白 结合到 启动子 Ok 和 0Ri ,阻 碍早 期基因 的转录 (自 的转录 ) 并防止 溶解 性生长 。与 Or 的结合 同时激 发了从 PRM 的 转录, Prm 为转录 d 基因 的启 动子。 通过 抑制溶 解性生 长的必 需基因 ,同时 又激发 自身的 转录, X 抑制 子因而 使得噬 菌体保 持溶 原状态 。有一 类称为 hfr 的大 肠杆菌 突变株 ,这些 菌常用 来构建 Xgtio 文库 。野生 型噬 菌体在 这类菌 体里几 乎都呈 溶原性 生长。 噬 菌体整 合从黏 端连接 和基因 组环化 开始依 次发生 (就像 在溶解 性生长 期一样 )。 dl 蛋 白然后 结合至 Pint 启动 子并 启动其 转录。 im 蛋白是 该转录 的产物 。它 催化 噬菌体 序列 attP 和在 细菌染 色体上 的位点 attB 结合, 导致噬 菌体的 重组。 溶 原化的 必要条 件是① imm 区: 包含建 立以及 维持溶 原状态 所必需 的启动 子和基 因 (如 c/); ② dl 和 dll 蛋白: dl 为 int 蛋白 合成所 必需, cIII 防止 dl 被宿主 蛋白酶 降解; ③ im 蛋 白:与 宿主蛋 白一道 ,催化 噬菌体 在染色 体上的 整合; ④如? P 位点 :为 噬菌体 整合入 宿主染 色体所 必需; ⑤ cos 末端: 为感染 的分子 环化所 必需。 • 59 • 2) 免 疫区域 很多 噬菌体 ,包括 434、 21、 82 和 80 都与 X 噬菌 体有关 。通过 DNA 同源有 意义伸 展证实 了这点 。然而 ,对于 每种噬 菌体, 它的免 疫区域 (imm) 都是 独特的 。该 区域包 括 一组重 要的调 控位点 和基因 ,如 PL、 PR、 d、 cro 以及 Or、 Ol*Prm (图 1.17)。 一 个带有 特定的 X 噬菌体 ,呈 稳定溶 原状态 的宿主 细胞是 不会被 携有与 溶原体 相同的 imm 区域的 第二个 噬菌体 感染的 ,因为 后者的 和 尸!^的 转录被 抑制了 。但是 一个溶 原体仍 能被具 有不同 imm 区域 的噬菌 体感染 ,因为 由特定 免疫区 域编码 的抑制 只能专 一地识 别及抑 制它自 己的启 动子。 3) 诱导 当它们 从宿主 染色体 上被切 除时, X 溶原 体可以 转而呈 溶解性 生长。 切除需 要噬菌 体 hz 和: cb (excise) 基因 产物。 它们从 N- 抗终止 转录得 以合成 。当 cJ 产物 (入 抑 制子) 失活时 \ 转录 就可以 启动了 。在 X 溶 原体中 ,诱导 可以低 频地自 发产生 。但 是 ,由 于以下 原因这 种诱导 可以经 常发生 :①在 SOS 反 应期间 X 抑 制子被 切割; ②在 不合 适的温 度下, 热敏突 变抑制 子失去 稳定。 在实 验室里 ,经 常通过 DNA 损伤诱 发细胞 SOS 反应, 这种损 伤可由 紫外线 或者丝 裂霉素 C 引起。 在该反 应期间 ,一种 细菌抑 制蛋白 LexA 失活 ,各 种细菌 基因被 诱导, 入 及其相 关噬菌 体抑制 蛋白像 LexA —样也 被失活 。一 些克隆 载体在 d 基因 里含 有一个 温度敏 感突变 (cP), 抑 制子在 30X: 时稳定 ,作用 相当于 野生型 抑制子 ,但在 42X: 时 不稳定 。提 高溶原 体生长 温度, dts 突变体 很容易 被诱导 进入裂 解生长 状态。 溶 原体诱 导的必 要条件 是:① im 和 xis 蛋白 ,为 从宿主 染色体 上切除 噬菌体 DNA 所 必需; ②裂 解生 长条件 ,噬菌 体产物 破裂所 必需。 总之, X 噬菌 体在细 胞中有 溶菌或 溶原两 种途径 ,何去 何从, 取决于 宿主和 噬菌体 许多 因素对 噬菌体 DNA 上的 基因进 行精确 的调控 (图 1.18)。 二、 X 噬 菌体克 隆载体 (一) 应用 X 噬菌体 的优点 入噬菌 体基因 组中有 1/3 与裂 解性生 长无关 。位于 J 基因和 iV 基因之 间的这 一区域 是 裂解生 长的非 必需区 ,可 被外源 DNA 替换 。典型 的克隆 载体均 可应用 X 噬菌 体衍生 物的一 些基因 侧冀的 限制酶 切位点 。在体 外插入 DNA 并包 装成噬 菌体。 虽然包 装效率 只有 10%, 但是噬 菌体一 旦包装 成功, 它就能 100% 地形成 噬菌斑 。近年 ,随着 细菌质 粒转 化技术 的极大 改进, PBR322 质 粒最好 的得率 也只有 108 转化体 “g, 这意 味着在 1000 个质粒 中能被 转入细 咆的质 粒不到 1 个。 (二) 插入 DNA 的选择 有些 x 噬 菌体载 体对包 装基因 组大小 有最低 的要求 ,如 果插入 片段不 到一定 大小, 是不能 形成噬 菌体的 。其 他噬 菌体载 体利用 一些遗 传学方 法来识 别非重 组与重 组噬菌 • 60 • 体 。重组 体遗传 标志基 因可正 常表达 ,而 后者 的这些 基因已 被外源 DNA 替换。 由于对 插入片 段大小 的限制 ,这 些载体 可用来 克隆小 片段。 1. 大小 的选择 如 果基因 组小于 其野生 XDNA 长度的 78% 或 者大于 105%, XDNA 不 能被包 装成噬 菌 体头部 。当 选择好 载体后 ,切去 生长非 必需区 ,然后 纯化噬 菌体的 左右臂 ,并 在合适 的 条件下 与切好 的外源 DNA 连接 。那些 没有接 上外源 片段的 噬菌体 〇>5 位 点靠得 很近, 不能 被包装 成可存 活的噬 菌体。 不同的 噬菌体 能有效 包装的 外源片 段大小 有区别 ,因而 用单一 的噬菌 体载体 来克隆 所有大 小的片 段是不 可能的 。克 隆大片 段的噬 菌体不 能用来 克隆 小片段 。反之 亦然。 这里介 绍两种 特别的 大小选 择技巧 ,在噬 菌体克 隆当中 可能会 有用 :其一 ,以 EDTA 或其他 螯合剂 处理包 装的噬 菌体, 比野生 型基因 组短的 噬菌体 成 活数会 增加; 其二, 将噬菌 体铺在 pe 厂的大 肠杆菌 突变株 平板培 养基上 ,这 种菌株 允许 相当于 野生型 基因组 长度的 110% 的噬菌 体形成 噬菌斑 ,并极 大地抑 制小于 野生型 基因组 长度的 噬菌体 形成噬 菌斑。 2. spi_ 选择 red+gam+ 噬菌体 不能在 含噬菌 体 P2 的溶原 性宿主 中形成 噬菌斑 。这 些噬菌 体被称 为 spi+ ( 对 ?2干 扰敏感 )〇red— ganT 噬菌 体能在 P2 溶原体 上形成 噬菌斑 ,因此 ,被称 为 spi— 。 只有 称之为 old 的基因 为野生 型时, P2 才抑制 red+gam" 噬菌体 生长。 通常用 的 载体如 X2001 和 XEMBL3 携带 re-chiC 1 II » II S 1 cDlel IHuIvlGlJl h IklKl/I i ~ 1 1 ii ii i n mm 1 M|/V|||||〇|P| Id |S1R| | kb 0 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2i > 27 28 29 30 31 3 12 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 TJYS" Ml/M \\ I llixi II TyjVTMh l4ii IIP! 图 1.19 XEMBL3 2. 人 2001 X2001 载 体含有 多个克 隆位点 (X6a I、 Sac I、 X/io I、 BamH I、 Hhd III 和 £c〇RI), 可用来 克隆较 大片段 的外源 DNA (10~20kb)。 载 体上的 两个多 克隆位 点方向 相反。 破坏了 BamH I 位点或 Xb I 位点 的插 入片段 ,可以 用两侧 的限制 性酶切 位点切 出。 X 噬 菌体右 臂上的 £c〇RI 和 Hwdlll 位 点已发 生突变 。其右 臂带有 chiC 突变 ,有 利于在 rec+ 宿主菌 内生长 。由 于重组 体丢失 red gam 区域 ,故 可能在 P2 噬菌体 的溶菌 性 宿主菌 里进行 Spi 筛选 。其克 隆位点 序列为 : TCTAGAGCTCGAGGATCCAAGCTTGAATTCTAGA I II I I | Xba\ BamH I H/nd III Xba I Sac\ Xhol EcoR I l) 基因型 入 sbhIXl°bl89 〈多克 隆位点 srIX3°minL 44 bio 多克隆 位点〉 KH54 chiC srIX4°nin 5 shnd 1 11X6° srIX5° 2) 遗传 学特征 琥 珀突变 无 所需要 的琥珀 突变抑 制基因 不需 缺失 bl89, ninL144, KH54、 nin5 贤换 bio • 64 • 图 1.20 X2001 3. JlgtlO 载体 入 gtlO 载体是 专门为 在其免 疫区内 单一的 EcoR I 限制 酶切位 点上克 隆小的 cDNA 片 段 (约 6kb) 而设 计的。 当外源 DNA 的 量十分 有限时 ,常用 此载体 。该 载体克 隆效率 很高。 由于重 组后重 组体为 d' 很容 易用带 hflA150 突变的 宿主菌 筛选重 组体。 d+嗟 菌体在 hflA 菌株 溶原发 生效率 很高, 噬菌斑 形成被 抑制。 c 厂噬菌 体则可 在这种 菌株内 正常 生长。 重组体 仍保留 red 基因和 gam 基因, 可以在 1^〇八_宿 主菌内 生长。 1) 基因型 XsrUrb527srU3°imm434 (srI434+)srU4°srU5〇 2) 遗传 学特征 琥 珀突变 无 所需要 的琥珀 突变抑 制基因 不需 缺失 b527 置换 imm434 插入 无 载体 red/ gam 状态 red + gam + 重组体 red/ gam 状态 red + gam + 重组体 chi 位点存 在与否 不存在 在 recA- 宿主菌 中增殖 的能力 可以 Spi 筛选 不能 推荐使 用的宿 主菌用 C600 (BNN93) 增 殖载体 插入 无 载体 red/ gam 状态 red + gam 4 重组体 red/gam 状态 red gam 重组体 chi 位点存 在与否 存在 在 recA^ 宿主菌 中增殖 的能力 无 Spi 筛选 可以 推荐 使用的 宿主菌 NM539 A2001 p’R(continued) ^ W | D M II A II b I C blEMHUIVIGm H I ILfKlir Pre PlPrm I 严 I ^ I PbbA Pr Pr nt|| || | II 1 INI 1 IN 1 1 IdlllllOlPlIlQl |S|R| I kt> 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 3 2 33 34 35 36 3 7 38 39 40 41 42 43 44 45 46 T I 1 1 I 夏 1 M M、 1 i I % sill i UJ mn、、 , I Ml ftf 1^ ^ ill p| • Hill 图 1_22 Xgtll 5. Charon 4 A Charon 4A 是主 要用于 构建真 核基因 组文库 的置换 型载体 。典 型的克 隆过程 是:用 切点 频繁出 现的限 制酶对 外源的 基因组 DNA 进行部 分消化 ,加上 £〇>RI 接头, 再用它 来置换 载体中 的两个 £coRI 填 充片段 (6.9kb 和 7.8kb)。 这两个 £coRI 位点分 别位于 左臂的 hcZ 基 因内和 右臂的 bio 操纵 子内, 因此重 组体为 lac_ 和 BicT 表型 。由 于载体 是 SPi_ 表型 ,故 不能用 Spi 筛 选法来 筛选重 组体。 Char〇n4A 载体中 有一个 单一的 X6a I 位点 ,可 用来克 隆长达 6kb 的外源 DNA 片 段 。由于 A 基因和 B 基因 内有琥 珀突变 ,所 以在该 载体中 构建的 基因文 库可用 体内重 组的方 法对重 组体进 行筛选 。这 些琥 珀突变 需要在 supE 或 supF 的 宿主菌 内增殖 。由于 • 67 • 该 载体是 red ^ gam"" , 所 以它的 宿主还 必须是 recA '_ 。 1) 基因型 XAam32Bamllac5 bio256KH54srIX4°nin5 QSR 80 2) 遗传 学特征 琥 珀突变 所需要 的琥珀 突变抑 制基因 缺失 置换 插入 Aam32、 Bam I supE ^ supF KH54, nin5 lac5、 bio256、 QSR80 无 载体 red/ gam 状态 red — gam ' 重组体 red/ gam 状态 red _ gam 重组体 chi 位点存 在与否 可 能存在 在 recA •宿 主菌 中增殖 的能力 无 Spi 筛选 不能 推荐 使用的 宿主菌 LE392 3) 克 隆位点 长度 /kb 位点 插入 或置换 重组体 左臂 右臂 插 入片段 EcoR I 置换 19.5 11.0 7~20 lac ~ Bio ~ Xba I 插入 24.8 20.5 0 〜 6 lac + Bio ^ Charon 4a Pb«A Pre ^ PlPhe ii ^(continued) Aam32 Sami ^ ^ | W | | D M /oc5(tocZ) 1 PbaBKD bto2S6 ’ 1 Pr P*r QSR80 II A || B 1 C tllE | IIZlUlVlGlTj H ||l|k||| J ~l ^ 1lEa3llEa59l 1 iNimioiPii i i \ 1 : ' J kb , , L 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 1 1 1 i 1 1 in n i n\(w\ i h 1 ^(\\ (\ 1 1\ ^ 1 1 ipilll is|sp| | ii i iliii p|| ii 图 1 • 23 charon 4a 6. Charon 40 载体 Charon 40 载体是 专门设 计来容 纳大片 段外源 DNA (长 度可达 9. 2~24. 2kb) 的置 换型 载体。 该载体 的多填 充片段 两端各 有一个 方向互 为相反 的多克 隆位点 ,分 别含有 16 个可 用的限 制酶切 位点。 由多个 头尾相 接的小 DNA 片段 (235bp) 构 成的多 填充片 段非 常容易 除去, 因为用 单种酶 /Vael 可 将该片 段消化 成碎片 。这 些碎片 用聚乙 二醇沉 淀法 很容易 除尽。 重组体 仍保留 gaw 基因 ,可在 recA 宿 菌内 生长。 • 68 • 携 带双拷 贝填充 片段的 Charon 40 载体的 限制酶 切位点 已在图 中标出 。右臂 和右侧 多克隆 位点内 的限制 酶切位 点的位 置标于 括号内 ,因 为其具 体数字 取决于 实际存 在的填 充 片段的 数目。 1) 基因型 XsbhIXl°sapIXl° skIX2° ssmXl 〈多克 隆位点 一 多聚填 充片段 一 多克隆 位点〉 sslIX2AWL113KH54ssmIX3〇nin5 shndIIIX6〇srIX5〇 2) 遗传 学特征 琥 珀突变 所需要 的琥珀 突变抑 制基因 缺失 置换 插入 载体 red/gam 状态 重组体 red/ gam 状态 重组体 chi 位点存 在与否 在 recA_ 宿主菌 中增殖 的能力 Spi 筛选 推荐 使用的 宿主菌 3) 克 隆位点 无 不需 WL113、 KH54、 nin5 多聚填 充片段 (lac 操 纵基因 + 腺病毒 DNA 片段) 约 80 拷贝 无 red _ gam + red _ gam + 不存在 有 不能 LE392 长度 /kb 位点 • 插入 或置换 - 左臂 右臂 插 入片段 重组体 EcoR K Apa I Xba U Sfi I Sac K Avr II Sal K Spe I Hind IIK Xho I BamH K Nae I Kpn K Not I Sma K Xma I 置换 19.2 9.6 9.2 〜 24.2 大多数 噬菌斑 均为重 组体, 填充 片段很 容易被 除去。 a. 限制酶 切位点 并非像 表中所 列的那 样成对 应用, 每次可 用一或 两个位 点可和 任何其 他位点 联用。 Charon 40 p*R(contjnued) 史免 M E| |jZ|U|V|GlTl H |1l|KM J ~60 copies (lac operator ♦ adeno DNA) (235 bp) 女 ^ Cll riNinii〇ipi i〇i w 图 1.24 Charon 40 • 69 • 7.XZAP 载体 入 ZAP 载 体是一 个插入 型载体 ,在 其质粒 序列内 有一个 多克隆 位点, 进入宿 主菌后 其质粒 部分可 从载体 上切下 ,形 成质 粒载体 BluescriptSK (M13-)。 这个 质粒载 体多克 隆位点 两侧有 T7 噬 菌体和 T3 噬菌体 启动子 ,有 利于 DNA 序列 分析、 RNA 序 列分析 和 RNA 探 针合成 。还可 用这个 载体便 利地进 行单方 向缺失 、定点 诱变、 融合蛋 白的表 达 ,以及 加帽的 RNA 转 录物的 制备。 在 该载体 的单一 限制酶 切位点 I、 £c〇R I、 S/>e I、 I、 AW I 或 Sac I 上, 可插 入长达 lOkb 的 DNA 片段 。经 部分补 平黏端 ,带 Sa«3A、 M6〇I、 B 以 II、 BamHI 或 Hhd III 黏端的 DNA 片段 都可以 克隆。 多克隆 位点于 lacZ 氨基 端编码 区内, 重组体 在 含异丙 基硫代 -卩-D 半乳 糖苷和 Xgal 的培养 基内为 lacT 表型 。如 果插入 片段的 可读框 与 lacZ 的 可读框 相吻合 ,即可 表达融 合蛋白 ,并可 用抗体 筛选。 携带 克隆化 DNA 的 Bluescript (M13-) 载体在 fl 或 M13 辅助 噬菌体 存在时 可被切 出。 xzap 载 体带有 两个切 除信号 ,即起 始信号 (1) 和终 止信号 (t), n 噬菌 体正链 的合 成分别 起始和 终止于 这两个 部位。 XZAP/R 载体中 Bluescript 的方 向如图 所示。 入 ZAP/L 载体中 Bluescript 的 方向与 此相反 (图 1.25)。 入 ZAPII 载体的 SamlOO 突变被 除去, 其余与 XZAP 载体 相同。 这一改 变可使 噬菌体 长 势更好 而噬菌 斑变蓝 的速度 更快。 Dra II Acc I Hinc II 图 1.25 XZAP 载体 在 Bluescript SK (M13-) 中, Sac I 位点 紧接于 T3 噬菌体 启动子 下游而 K/m I 位点 紧接于 T7 噬菌体 启动子 下游; 在 Bluescript KS(M13-) 中, 多克隆 位点的 方向恰 恰相反 多克 隆位点 Kpn I Xho I Cla I EcoR V Psf I SamH I Xba\ Eagl Sacll I I I I 1 I __ I I • 70 • 8.XZAP/R 载体 图 1.26 入 ZAP/R 载体 1) 基因型 入 sbh IXl°chiA131 sr IX3〇cIts857 srIX4〇nin5 srIX5°Saml00 2) 遗传 学特征 琥 珀突变 所需要 的琥珀 突变抑 制基因 缺失 置换 插入 载体 red/ gam 状态 重组体 red/gam 状态 重组体 chi 位点存 在与否 在 recA_ 宿主菌 中增殖 的能力 Spi 筛选 推荐 使用的 宿主菌 3) 克 隆位点 Sami 00 supF nin5 T amprColEl ori lacZ' (T3 噬菌体 启动子 、多 克隆 位点、 T7 噬菌体 启动子 ) I 无 red + gam + red + gam + 存在 可以 不能 BB4 (XZAP, XZAPII ), XLl-Blue (XZAPII) 位点 插入 或置换 长度 /kb 左臂 右臂 插 入片段 重组体 Sac I Not I Xba I Spe I EcoR I Xho I 插入 21.8 18.1 0 〜 10 lac AZAP/R pR(contiued) II A II B I C ^ 、 Id 枚 aiEl IHuIvIgItTh" ^amp ^tac Co/ El ori - 丁 amp laC Z Pl Prm IlLlKlll II II I I I I III 1 1 IN I I lclini|〇|p|||Q[ M] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 liH -is = / 0) 0□ —— l/ o) OQ ff 111 iH = i n>d l/ o) CD _ — |昼 — / o) g 71 • 三 、影印 X 噬 菌体产 生空斑 为 了测定 X 噬菌体 的效价 ,即 测出 每毫升 溶液中 有多少 噬菌体 的数目 (pfu), — 般 采用 平板计 算法, 将噬菌 体与敏 感菌即 指示剂 (宿主 细胞) 相混合 在半固 体培养 基中, 再将 半固体 培养基 铺在已 有固体 培养基 (作为 下层) 的培养 皿中, 让其在 表面均 匀凝固 ( 为上层 )。 指 示菌就 在上层 半固体 培养基 中生长 ,使 表面长 出一层 菌苔而 变混浊 ,而每 个入噬 菌体又 在这一 层菌苔 上生长 ,形 成噬菌 体克隆 ,其结 果使大 量的细 菌裂解 ,在菌 苔表 面出现 一个个 透明的 区域, 这就是 X 噬 菌体斑 。因 为一个 X 噬菌体 形成一 个噬菌 斑 ,所以 计算出 噬菌斑 的数目 ,就 可以推 算出噬 菌体数 /mL。 为了 计算噬 菌斑数 ,必须 将噬菌 体稀释 成不同 浓度的 稀释液 (10_8~10 — 1G)。 (一) 系 列稀释 滴度法 分离单 个空斑 1. 原理 从单个 空斑分 离纯噬 菌体群 ,并提 供噬菌 体贮液 的滴度 。系列 稀释液 用噬菌 体裂解 物制得 。在各 试管里 ,每 份稀 释液与 大肠杆 菌混合 。让 噬菌体 吸附于 细胞, 然后细 胞 / 噬 菌体混 合液被 加温至 37X:, 使得噬 菌体将 DNA 注入 细胞。 在每管 中加入 顶层琼 脂 ,混合 物被倾 入丰富 培养物 平皿, 371C 培养 至空斑 出现, 每个空 斑含来 源于单 个感染 噬 菌体。 2. 材料 入 培养基 ,含 0.2% 麦 芽糖及 10mmol/L MgS04 入顶 层琼脂 SM 悬浮 培养基 新鲜 X 平板, 预温于 37X: 微波 炉或沸 水浴锅 45~50t: 水浴锅 8mm X 80mm 试管 37X: 水 浴锅或 加热块 (板) 毛细管 或牙签 所有与 细菌接 触的材 料都应 该是无 菌的。 3. 试 剂配制 悬浮 培养基 (SM) 5.8gNaCl, 2gMgS〇4.7H2〇, 50mLlmol/LTris-HClpH7.5, 0.01% 明胶 (Difco) 加水至 1L, 高压 灭菌。 4. 操 作步骤 (1) 使 大肠杆 菌在含 0.2% 麦 芽糖和 10mm〇l/L MgSC)4 的培 养基中 生长到 饱和。 • 72 • 在麦芽 糖中生 长可诱 导细胞 X 受体 (lamB 蛋白 ), 该 蛋白在 麦芽糖 转运时 是不可 少的。 Mg^ 离子 也 有助于 噬菌体 吸收。 (2) 在微波 炉中或 者在沸 水浴中 融化顶 层琼脂 ,置 瓶于 室温下 5min, 然后 将融化 了的琼 脂的瓶 子置于 45 〜 50X: 水浴。 在 放入微 波炉前 ,必须 将瓶盖 拧松! 注 意观察 ,切 实避免 顶层琼 脂沸出 。如琼 脂沸出 ,小 心将瓶 拿出来 ,旋转 ,看 是否还 有未融 的琼脂 块漂浮 。如有 ,重新 置于炉 中微波 激发更 长时间 ,不时 摇动一 下 ,直至 琼脂完 全融解 为止。 保证 顶层琼 脂置于 水浴中 足够长 时间以 冷却至 45 〜 50X:, 细胞 在高于 65X: 的琼脂 中很快 就会被 杀死。 (3) 加 0. 3mL 的大肠 杆菌培 养物至 8mm X 80mm 试 管中。 (4) 将噬 菌体裂 解物用 SM 进行系 列稀释 ( 见本章 第一节 第三部 分的连 续系列 稀释 )。 常要 稀释到 100 倍 ,标记 好各稀 释管, 以免混 淆了。 (5) 加入 O.lmL 首次 稀释液 至一支 大肠杆 菌管中 ,再从 中取出 O.lmL 至 下一管 中 ,以 此类推 。将大 肠杆菌 / 噬菌 体混合 物管 标记好 ,不 要弄混 。室 温培养 20min。 噬 菌体在 这一步 中吸附 至大肠 杆菌。 (6) 将试 管移于 37X: 水浴或 加热块 lOmin。 试管 水浴时 ,将 新鲜、 预温的 X 培养板 相对 应的试 管标签 ,做好 标记。 (7) 从水 浴中移 出试管 ,加 2. 5mL 顶 层琼脂 至一支 试管中 ,轻 摇混匀 ,将 试管内 容物倒 至一个 平皿内 ,稍稍 倾斜, 使琼脂 铺满整 个平皿 表面。 (8) 将 平皿置 37X: 培养箱 , X 噬 菌体空 斑会在 6 〜 8h 后出现 ,但 放置 12h 后 ,空斑 更容易 标记、 计数及 挑取。 (9) 从 一个噬 菌斑长 得不太 密的稀 释皿中 ,用一 无菌毛 细管和 牙签挑 取一单 个噬菌 斑 。为了 保存噬 菌斑将 来应用 (例如 制作平 皿贮存 ), 用一 毛细管 切取含 噬菌斑 的琼脂 块, 将其移 入盛有 ImLSM 的 试管中 (或将 牙签头 浸入液 体中轻 轻搅动 )。 如果 愿意的 话 ,对一 整块的 空斑进 行计数 ,用 它来 计算出 在起始 贮液中 活噬菌 体数。 5. 方 法评注 1) 背 景知识 噬菌体 浓度滴 度和从 单个空 斑分离 ,由 D’Herelle 在 1920 年首 次提出 。关于 噬菌体 生长 方案的 最好的 资料见 Stent 在 1971 年的 文献。 绝 大部分 X 衍 生克隆 载体的 尾蛋白 编码基 因来自 X 噬菌体 。带 有这 些尾蛋 白的载 体 ,即 “hX” (host range of X), 吸附 到细胞 lamB 蛋白上 ,这 种蛋白 跟麦牙 糖摄取 有关。 这些 载体的 空斑边 界明显 。有些 载体的 尾蛋白 来源于 噬菌体 80, 这些噬 菌体被 称之为 “h80”。 它们 吸附于 宿主的 t〇nA 蛋白 ,这种 蛋白与 离子转 运有关 。这 种载 体的空 斑稍大 些, 边缘较 模糊。 h80 噬菌体 贮液比 相应的 hX 噬菌 体滴度 要高。 2) 要领 有时 在处理 过程中 ,要 做两块 其他的 对照板 ,这 是很有 用的。 一块板 上的菌 苔来自 没有感 染噬菌 体的大 肠杆菌 ,另 一块板 的顶层 琼脂不 含任何 细胞。 当细菌 在培养 箱中逐 渐生 长变密 的时候 ,这两 块对照 板提供 了菌苔 生长情 况的参 照标准 。如果 细菌层 起皱, • 73 • 可能 是琼脂 / 大 肠杆菌 / 噬 菌体混 合物在 倒平板 时过冷 。如出 现这种 情况, 应在铺 板前将 平皿 预热于 37X:, 或 者把顶 层琼脂 加入大 肠杆菌 / 噬 菌体混 合物后 ,快速 铺皿; 如果顶 层 琼脂层 漂浮在 板面上 ,那就 是平皿 过湿了 ,换用 干燥的 平皿。 3) 时 间安排 37*C 下培 养需要 6 〜 8h 才能出 现空斑 ,形态 学上的 差异要 12 〜 14h 才 明显。 (二) 划线法 分离单 个空斑 1. 原理 在 预先铺 好大肠 杆菌的 平皿上 ,将噬 菌体划 线培养 ,这样 就可以 得到单 个空斑 。这 种方 法比连 续稀释 滴度法 容易。 如果只 需要获 得几个 分离的 噬菌体 ,推 荐采用 该法。 2. 材料 LB 培养基 入顶 层琼脂 富含营 养平皿 ,预温 37X: 32-G 铂丝接 种环或 1(1/2) x 1/8 in 灭 菌纸条 3. 操 作步骤 (1) 将 X 敏 感大肠 杆菌株 培养于 5mLLB 培养 基中, 生长至 饱和。 (2) 取 0.2mL 该饱 和培养 物加入 2mL 的融 化顶层 琼脂中 [冷却 至大约 45X:, 见上 法 的步骤 (2)], 均 匀地铺 在预温 的丰富 培养板 上面。 在顶 层琼脂 配方中 ,可用 6g 琼脂 糖代替 琼脂。 (3) 顶层琼 脂凝固 变硬后 ,将 平皿 置冰箱 中冷却 15min 以上。 (4) 滴 lOOpL 培 养贮液 (约 108 个 噬菌体 /mL) 于平板 一角。 (5) 用本 章第一 节第三 部分所 述方法 划出单 个细菌 克隆, 用一细 金属环 或灭菌 1(1/2) inxl/8in 纸 片轻轻 划开噬 菌体。 纸应 切成条 ,装 在螺口 瓶盖的 容器中 ,并 高压蒸 气灭菌 干燥。 (三) 噬 菌体转 染和体 外包装 通过 X 噬 菌体衍 生克隆 载体构 建成的 文库只 是一群 噬菌体 DNA 分子 。为了 将这些 分 子复制 ,需装 配成噬 菌体颗 粒后进 行感染 ,或是 用连接 酶环化 噬菌体 DNA 后 ,转染 感受态 细胞。 后者不 如前者 常用。 用噬菌 体感染 的大肠 杆菌裂 解物进 行体外 包装。 这种裂 解液称 为包装 提取物 ,含有 空 的噬菌 体头部 ,未 吸附的 噬菌体 尾部以 及噬菌 体编码 的包装 蛋白, 都需要 DNA 进行 包装。 如果有 ATP 存在, 串联体 噬菌体 DNA 与抽 提物混 合时, DNA 的 〇«位 点被末 端酶 ( 大概是 A 和 NuL 蛋白的 复合体 ) 切割 ,并载 入噬菌 体头部 ,其机 理尚不 明了。 DNA 继 续进入 噬菌体 ,直 到遇到 终止酶 并切断 下一个 位 点为止 。噬 菌体尾 部然后 • 74 • 黏附 到装满 DNA 的头部 上去。 高 效包装 提取物 制作不 太方便 ,现 在可从 供应商 处购买 冰冻的 提取物 。用市 售提取 物 每微克 串联体 噬菌体 DNA 可产生 (2X108) 〜 (2X109) 个噬菌 体颗粒 。噬 菌体 DNA 也 能通过 感受态 细胞的 转化而 导人大 肠杆菌 。在 这种方 法里, 将线性 或环状 噬菌体 DNA 与 感受态 大肠杆 菌混合 ,然后 细胞与 DNA 混合 物按本 章第二 节第四 部分所 述方法 处理 。在热 休克后 ,再将 这些细 胞与经 如下处 理的大 肠杆菌 混合: 按本节 第三部 分第一 个方 法所述 ,在 X 培养基 和麦芽 糖中培 养过夜 。然后 加入融 化的顶 层琼脂 ,将混 合物倾 入 X 平 板凝固 ,置 37X: 培 养至空 斑出现 。这 种方法 噬菌体 DNA — 般可产 生空斑 10 000 个 / 卩 g。 四、 X 噬 菌体衍 生质粒 的培养 从单 斑制备 X 噬菌体 原种常 用的方 法有两 种:① 平皿溶 解法, X 噬菌 体在软 琼脂上 生长的 细菌内 增殖; ② 液体裂 解法, X 噬菌体 在液体 培养的 细菌内 增殖。 前一种 方法制 备 X 噬菌 体原种 的优点 在于只 用肉眼 观察噬 菌斑的 融合程 度就可 知道噬 菌体是 否生长 良好。 通常需 要培养 大量的 噬菌体 来制备 X 载体 DNA。 以下 就是如 何通过 平板裂 解制备 噬菌体 原种的 基本方 法及如 何制备 液体裂 解物, 贮存噬 菌体裂 解物的 方法。 (一) 平皿溶 解法制 备噬菌 体原种 1. 原理 将 单个空 斑的噬 菌体与 细胞和 顶层琼 脂混合 、铺板 。开始 时细胞 数多于 噬菌体 ,但 噬菌体 数增长 得更快 ,最后 将大部 分细胞 裂解。 然后将 顶层琼 脂刮下 ,并 提取其 中的噬 菌体, 保存。 2. 材料 新鲜 X 顶 层琼脂 悬浮 培养基 (SM) (5.8gNaCl, 2gMgS04.7H20, 50mLlmol/LTris-HClpH7.5, 0.01% 明胶, 加水至 1L, 高压 灭菌) 入稀释 缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl pH8.0, 20mmol/L MgCl2) 氯仿 45 〜 50X: 水浴 毛细管 或牙签 Beckman JA-21 转 头或相 当转头 所有与 细菌接 触的材 料都应 该是无 菌的。 3. 操 作步骤 (1) 50 倍 稀释新 鲜过夜 培养的 X 敏 感大肠 杆菌株 ,置 37X: 滚动 培养。 • 75 • (2) 加 热融化 lOOmL 瓶 装新鲜 X 顶 层琼脂 ,融化 后放于 45~50t: 水浴中 温育。 (3) 当 细胞密 度达到 (2~3)xi〇8mLM (OD6C() = 0.4) 时 ,取 0.75 〜 lmL 细胞于 试管中 。用 毛细管 或牙签 挑一个 单个新 鲜空斑 ,放 入细胞 悬液中 ,轻 轻振荡 10s。 (4) 加 7. 5mL 顶 层琼脂 ,轻荡 ,将混 合物平 均倒入 3 个预温 的新鲜 X 平板。 如以琼 脂糖代 替琼脂 ,所提 DNA 可 用来作 酶切和 连接。 (5) 37X: 培养, 4 〜 6h 会出现 清晰可 见的空 斑并有 90%~100% 的菌 裂解。 (6) 吸 3mLSM 到 平皿上 。用 干净的 盖玻片 将顶层 琼脂从 3 个 平皿上 刮到一 个小离 心管内 ( 例如, 一 个 15mL 螺口 试管, Beckman JA-21 转 头离心 )。 (7) 加入 3 滴氯仿 ,剧 烈混匀 10s。 (8) 置室温 lOmin。 在另 一个方 法中, 从步骤 (6)~(8), 3mLSM 和 3 滴氯 仿可以 滴到平 板上, 然后置 4X: 过夜 ,液 体小心 倒入离 心管。 (9) 4X: 下 10 OOOr/min 离心 lOmin (JA-21 转头, 11 400 X 尽 )。 (10) 轻 轻倒出 并保存 上清。 (二) 液体 裂解物 的制备 1. 原理 培 养至饱 和的宿 主菌以 105~107 个 噬菌体 /mL 感染 。待噬 菌体被 吸收后 ,感 染混 合物 用富营 养培养 基稀释 ,剧烈 振摇到 细胞裂 解为止 ,所 有残 存的细 胞用氯 仿裂解 ,低 速 离心除 去细胞 残骸。 2. 增加 的材料 LB 培养基 入稀释 缓冲液 10mmol/L MgC^/lOmmol/L CaCl2 NZC 培养基 0.1 % 明胶 Beckman JA-20 或相 当转头 3. 操 作步骤 (1) 将大 肠杆菌 X 敏 感株在 LB 培 养基中 37X: 培养 过夜。 X 敏 感株支 持溶解 性生长 ,可 通过滴 裂解物 于菌苔 上检验 ,如 菌株对 X 敏感 ,在滴 加噬菌 体 的地方 将形成 空斑。 (2) 用无菌 牙签或 毛细管 ,挑 一个 单空斑 [见 上法 之步骤 (3)], 放入含 0.4mU 稀释缓 冲液的 试管中 ,置 4X: 下 2h, 以便 噬菌体 释出。 另外 ,也可 以从裂 解液或 平板原 种中取 1〇5~1〇8 个噬 菌体。 ( 3 ) 用 0 . 1 mL 洗脱 哩菌体 溶液与 0 . 1 mL 饱和培 养液和 0 . 1 mL 1 Ommol/L CaCU 溶 液混合 ,在 37C 水浴 中温育 15min。 • 76 • 温育时 Mg2— 和 Ca2+ 能使噬 菌体吸 附到细 菌上。 (4) 将该溶 液转入 50mL 的 NZC 培 养基中 ,在 37X: 剧烈摇 动培养 ,直 至溶菌 (通 常在 6~8h 之间 )。 良好的 通气有 助于高 产出。 (5) 培 养物在 6h 后应频 繁检査 ,并 在清亮 后立即 收获。 (6) 加几 滴氯仿 ,以裂 解剩下 的细胞 ,将溶 液转至 Co-rex 或 Nalgene 管 (小心 ,不 要带 出氯仿 ) 4X: 下 lOOOOr/min (12 100Xg) 离心 l〇min, 沉 降细胞 残骸。 (7) 尽 量保留 裂解物 ,转 至螺口 盖试管 ,加几 滴氯仿 ,旋涡 振荡, 4X: 贮存。 噬菌 体滴度 按本节 第三部 分所述 测定。 (三) 噬菌体 裂解物 的保存 噬菌体 原种应 保存于 SM 培养 基中, 并加几 滴氯仿 ,置 4*0。 虽然处 理过的 塑料试 管使 用起来 也不错 ,也 很好用 ,但较 常用螺 口盖玻 璃试管 ( 橡皮衬 里或聚 四氟乙 烯盖, 容 积至少 lmL)。 X 滴度 可维持 数年的 时间。 噬菌体 原种应 标明日 期并不 时检查 测定噬 菌体 滴度。 0.1% 的明 胶可以 减慢噬 菌体滴 度下降 的速度 。裂 解物也 能冰冻 贮存在 15% 的甘 油中。 (四) 方 法评注 1. 背 景知识 平板 裂解一 般用于 小量制 备噬菌 体原种 ,这 些原种 可间接 用于制 备提取 噬菌体 DNA 的大 量原种 。如果 在平板 和顶层 琼脂的 配方中 以琼脂 糖代替 琼脂, 从裂解 物的噬 菌体中 提取的 DNA 可 直接用 于限制 酶切及 连接。 液体裂 解物产 量稍低 于平皿 裂解。 但是当 需要大 量的噬 菌体时 ,工 作量明 显小得 多 ,并 且裂解 物中无 琼脂的 污染, 这使得 该方法 在分离 噬菌体 以制备 DNA 时 更获青 睐 。在液 体裂解 方法中 ,噬菌 体被吸 附后, 细胞用 NZC 培养 基稀释 。该 培养基 属丰富 培养基 ,含 氨基酸 ,但 没有葡 萄糖或 其他糖 。生长 于这种 培养基 细胞的 糖受体 ,如 lamB 蛋白, 少量地 被诱导 (这样 噬菌体 就能吸 附到细 胞上去 ), 但 细胞又 不致被 很多的 受 体覆盖 。否则 噬菌体 吸附于 细菌残 骸上面 ,从 裂解 物中获 得噬菌 体的量 相应地 就减少 了 。另外 ,生 长在 这种培 养基里 的细菌 看起来 可以引 起感染 噬菌体 呈裂解 型生长 ,这样 有 助于混 浊噬菌 体获得 较高的 滴度。 2. 方 法要领 在 平板溶 解法中 LB 培养基 和顶层 琼脂糖 能替代 X 平 板和顶 层琼脂 ,但产 量常较 低。 平板一 定要新 鲜铺制 ,顶层 琼脂即 时融化 。平板 不一定 要干燥 ,只要 平板不 倾斜, 苔 菌松动 也无妨 。如产 量比预 期要低 ,可 能是因 为平板 不新鲜 ,或 所用的 噬菌体 颗粒没 有 野生型 X 噬菌体 那么大 的迸发 。观 察单 个空斑 大小可 能会找 到原因 。如 对噬菌 体有疑 问 ,而且 所产生 的空斑 比有关 的噬菌 体要小 ,可 以减少 开始细 胞数目 ,或 者同时 多取几 • 77 • 个空斑 ,增 加开 始的噬 菌体数 ,并 延长培 养时间 直到菌 苔完全 裂解。 在 液体裂 解法中 ,良好 的通气 对于高 产出是 必要的 。三 角烧瓶 的盛物 不能超 过其总 容积的 1/5。 当 快接近 裂解时 ,注 意观察 培养物 ,待 裂解完 全后马 上收集 ,避免 释放的 噬菌体 再次感 染细胞 残骸。 裂解常 发生在 6~8h。 如果 8h 后没有 裂解的 征兆, 可能根 本就 不裂解 ,继 续加入 氯仿, 完成处 理过程 ,或 者放弃 ,重新 开始。 3. 预 期结果 平 板裂解 方法可 得到约 10mL 的噬菌 体原种 ,含 量为 101G 〜 1011 个 噬菌体 /mL, 液 体溶解 方法一 般得到 (5xl〇9)~(3xi〇1(>) 个 噬菌体 /mL 的 原种。 4. 时 间考虑 平 板溶解 方法通 常需要 8h 左右 。在液 体溶解 法空斑 释放噬 菌体需 2h, 从细 胞被感 染到收 获裂解 物需要 6~9h。 释 放噬菌 体的时 间弹性 很大。 2h 可以 保证 90% 以 上的噬 菌 体得到 释放; 时间 短了 ,释放 的噬菌 体也少 。通 常释 放时间 也可以 缩短至 30min, 但 裂解效 果不好 。可以 让噬菌 体释放 更长的 时间, 如过夜 ,这也 很方便 。一 旦宿主 细胞感 染后, 就要花 上大约 6 〜 9h 的时 间来 裂解及 制备裂 解物。 五、 从嗤菌 体裂解 物制备 XDNA 用于 亚克隆 DNA 的 X 衍生 载体主 要是黏 性质粒 或丝状 噬菌体 载体。 在这里 ,前两 种方 法描述 了从中 等及大 规模的 液体裂 解物中 分离出 噬菌体 DNA, 然后 用密度 梯度离 心或 者离子 交换色 谱来纯 化噬菌 体颗粒 。第三 种方法 是分离 噬菌体 DNA 的快速 方法, 适用于 小规模 液体裂 解物。 (一) 密度梯 度离心 法和平 衡梯度 离心法 1. 原理 大规模 的液体 裂解用 于制备 大量的 高纯度 噬菌体 DNA。 噬菌体 先通过 氯化铯 梯度、 然 后平衡 梯度离 心从细 胞残骸 中分离 。最后 ,有两 种提取 XDNA 的方法 供选择 :在第 一种方 法当中 ,氯化 铯靠透 析去掉 ,然 后用 酚和氯 仿抽提 DNA; 而 第二种 方法中 ,可 用高等 级甲酰 胺直接 从氯化 铯纯化 的噬菌 体颗粒 中提取 XDNA。 2. 材料 5X 聚乙二 醇溶液 悬浮 培养基 (SM) 氯化钾 氯化 铯溶液 低盐 缓冲液 (〇.〇5mol/LNaCl, 0.05mol/LTris-HClpH7.5, 0.01mmol/LMgS〇4) TM 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH7.5, 10mmol/L MgS()4) • 78 • 缓冲酌 ' (buffered phenol) 氯仿 2mol/LTris-HCl (pH8.5) /0.2mol/LEDTA (选择 ,供甲 酰胺提 取用) 甲酰胺 ( 非常高 的纯度 ,最好 重结晶 ) TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) BeckmanJA-10, JA-20, SW-28 及 VTi50 转头及 离心瓶 (管) 3mL 注射器 ,带 25-G 针头 Beckman VTi 50 快速 封闭管 制备噬 菌体裂 解物、 X 噬菌体 滴定及 DNA 定量 的材料 3. 试 剂配制 CsCl 溶液 d=1.3g/mL: 31 .24g CsCl + 68 . 76mL H20 d=1.5g/mL: 45 .41g CsCl + 54. 59mL H2O d=1.7g/mL: 56.24g CsCl + 43.76mL H20 制备 CsCl 溶液 的公式 : % WW= 137. 48 - 138. ll/d。 这种计 算方法 以假定 CsCl 中没 有水。 一般存 放时 间过长 的试剂 会从空 气中吸 收水分 ,这 些贮存 液的密 度将比 计算的 要低些 。然而 ,按我 们的经 验 ,噬菌 体带总 出现在 梯度中 间层。 5X 聚 乙二醇 (PEG) 溶液 600mL 207g 聚 乙二醇 (PEG 6000), 6g 硫酸葡 萄糖, 4.95gNaCl, 350mLH2O 悬浮 培养基 (SM) 5.8gNaCl,2gMgS04.7H20,50mLlmol/LTris-HClpH7•5,0.01%明胶,加水 至 1L, 高 压灭菌 4. 操 作步骤 制备 和浓缩 噬菌体 (1) 用 25mL 液 体裂解 物制作 1000mL 裂解物 (见 本章第 三节第 四部分 )。 (2) 裂 解物在 JA-10 离 心管中 ,以 10 000r/min (17 700Xg), 41C 离心 lOmin, 去 除细胞 残骸。 (3) 将上 清移至 lOOOmL 刻度 圆筒中 ,加入 5 x PEG 溶 液至终 浓度为 IX。 轻轻翻 转混合 ,置 4X: 过夜。 PEG 溶 液引起 噬菌体 沉淀。 (4) 移出约 50mL 的上 清并保 留以备 下步用 。弃 去剩余 上清, 小心不 要丢掉 任何白 色 沉淀。 (5) 将沉 淀移至 Nalgene 离心管 。用 保留的 上清洗 涤圆筒 ,并 加到离 心管中 ,于 4"C , JA-20 转头 5000r/min (3000 X g) 离心 l〇min。 (6) 将 离心管 置冰上 。去掉 上层, 小心不 要丢掉 任何白 颜色的 黏稠相 ,其 中含有 PEG 和噬 菌体。 (7) 以最小 体积的 SM 重悬 白色相 。转 入一个 125mL 的 锥形烧 瓶中。 • 79 • 加入悬 浮培养 基的体 积不应 超过白 色相的 3 倍。 (8) 配制 lmol/LKCl 溶液。 按相同 的量分 4 次加入 ,每次 加入后 混匀, 置冰上 15 〜 30min〇 加入 KC1 可慢 慢沉淀 PEG 溶液 ,而噬 菌体不 沉淀。 (9) 转移至 Nalgene 离 心管中 ,在 4X:, JA-20 转头 10 000r/min (12 10〇Xg) 条件 下离心 lOmin。 PEG 溶液 会被沉 降下来 ,而 噬菌体 留在上 清中。 (10) 测 定噬菌 体滴度 ,并 将上清 保存于 16mm 或 18mm 的 玻璃试 管中。 嗤菌 体滴度 应有约 (1X1012) 〜 (5X1013) pfu/mL。 分 离噬菌 体颗粒 (11) 将氯 化铯梯 度按以 下步骤 在一个 SW-28 离心管 中灌注 [图 1.27 (a)]: 第一层 : 3.5mLCsCl 溶液, cf = 1.7g/mL 第二层 : 2.5mLCsCl 溶液, d = 1.5g/mL 第二层 : 2.5mLCsCl 溶液, 10ng 的 DNA 条带 ,建议 使用新 鲜的裂 解物。 在层析 纯化中 ,裂 解物与 柱子大 小的比 率是 一个重 要变量 。一个 9mL 柱床 体积足 够用于 200mL 的裂 解液了 (101Gpfu/mL 水 平 ); 如 果裂解 液过多 (或者 ,如果 裂解物 的 细胞残 骸过浓 ), 柱床 体积应 当相应 提高, 如柱子 超负荷 ,细胞 DNA 及 RNA 可以连 同噬 菌体一 并洗脱 (欲要 检查是 否过载 ,用 琼脂 糖电泳 监测粗 裂物的 过柱子 滤液) 。如 果 DNA 被 污染了 ,将滤 液集中 在一起 ,在 有机 溶剂抽 提之前 ,用 DNase 和 RNase 处 理。 应按照 Whatman 的产品 说明, 小心制 备 、平衡 及包装 DEAE 纤维素 ,注意 DEAE 纤维 素型号 (WhatmannED52), 以及 pH S 1.28 X 嗤 菌体裂 解物的 琼脂麵 麵胶电 泳和离 子缓冲 液强度 (用 提供的 頂缓 冲液配 1 XDNA 用 /ihcl II 丨消化 方 ), 这 很重要 。氯仿 裂解培 养物常 含有很 2 未经 SDS 和 EDTA 处理的 20ML 裂解物 黏 稠的相 对分子 质量高 染色质 DNA, 有可 3 用 2%SDS 和 O.lmd/LEDTA 处理的 2〇ML 裂解 物能堵 塞〇£处柱 。这 样的裂 解物可 以在上 样前用 DNase 处理。 在有机 萃取后 ,先 透析, 再沉淀 噬菌体 DNA, 因为大 分子的 DNA 很 难重新 悬浮。 在 被分离 出来后 , XDNA 因相对 分子质 量大而 容易被 剪切。 如需要 完整的 DNA ( 例如, 当噬菌 体臂要 用来建 文库时 ), 应当特 别小心 地处理 DNA, 非 常轻柔 地摇动 、搅 动或旋 涡 振荡以 混合。 3. 预 期结果 每 种方法 得到的 XDNA 取决于 噬菌体 滴度和 初裂解 物体积 。如 果起 始裂解 物滴度 在 (l~2)xl〇1Gpfu/mL 左右 ,那么 lmL 裂 解物应 产出约 l^gDNA, 也就 是说, 2X1010 个噬菌 体颗粒 得到约 1吨 纯 噬菌体 DNA。 因此 ,大规 模的制 备方法 ,其 所用裂 解液多 是 lOOOmL, 那 么就应 得到约 lmg 的 噬菌体 DNA, DEAE 方法 (200mL 裂解液 ) 约得 到 200叫 DNA, 小规 模法 (50mL 裂解物 ) 约得到 50纯 DNA〇 4. 时 间安排 大 规模制 备到梯 度纯化 ,一般 至少要 3d 时 间:第 1 天约 30min 用来 PEG 沉淀; 第 2 天约 5h 的离 心沉 降和收 集沉淀 、梯 度及平 衡梯度 离心; 第 3 天约 30min 用以 收集和 酚 抽提噬 菌体带 ,然 后持续 8h 的 2 个透 析步骤 。噬 菌体裂 解液可 作为中 间产物 贮存于 4X: 数月而 不至滴 度下降 。小规 模制备 花费约 4 〜 6h, 可 一次处 理多个 样品。 从液 体裂解 物或平 板裂解 物开始 ,柱 纯化噬 菌体及 DNA 分 离可在 4h 完成 ,上柱 • 86 • 的 噬菌体 粗制液 的制备 花费约 2h。 装柱 、上样 、洗 脱及 DNA 抽提 还需要 2h, 通常可 以同 时处理 4 〜 5 个不同 的柱子 而毫无 问题。 DEAE 纤维素 泥可预 先做好 ,贮 存于 4X: 数月。 第 四节丝 状噬菌 体载体 一 、丝状 噬菌体 的分子 生物学 大肠 杆菌丝 状噬菌 体包括 M13 噬 菌体、 fl 噬 菌体和 fd 噬菌体 。这些 噬菌体 亲缘关 系密切 ,其 基因 组成形 式相同 、病毒 颗粒大 小与形 状相似 ,且同 源性在 98% 以上 。其 基 因组序 列已被 测定。 M13 噬菌体 是含有 6407 个核苷 酸的单 链闭环 DNA 分子 (图 1.29)。 它们在 作为克 隆载体 时有一 个共同 的优点 ,即可 以产生 大量含 有外源 DNA 某 一 条链的 DNA 分子 。这 种单链 DNA 分子可 作为以 下工作 的模板 :①用 于双脱 氧链终 止 法进行 DNA 序列 测定; ②制 备单条 链的放 射标记 的杂交 DNA 探针; ③利用 寡核苷 Sal\ Hincll EcoRl Sac I Kpnl Sma\ BamHl Xba\ Acc\ Pst l Sphl Hind III (Met) ThrMetlle ThrAsp- 1 6230 lacZ 6250 6270 6290 ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTG GCA CT Xba I Sal I Pst I Sph I Hin6 III EcoR I Ssf I Kpn I Xma\ BamH\ Sma I Sa/I Acc I Hinc II 图 1.29 野生型 M13 噬菌体 图中标 明基因 、主要 启动子 和转录 终止子 的位置 ,习 惯上将 噬菌体 基因组 称正链 ,它 按基因 2— 基因 4 的 方 向合成 。噬 菌体基 因组的 编码链 (有意 义链) 为负链 . 87 • 酸进 行定点 诱变。 丝 状噬菌 体的所 有基因 均为必 需基因 ,但 在基因 2 与基因 4 之间有 一个约 500 核苷 酸的区 域可供 插入外 源基因 区段。 这一非 编码区 包含一 个可对 包装及 DNA 在病 毒颗粒 中的定 向进行 调控的 顺式作 用元件 、正链 与负链 DNA 合成的 起始位 点与终 止位点 ,以 及 不依赖 p 因子 的转 录终止 信号。 Messing 及 其同事 建立的 M13 唾菌 体载体 mp 系列, 以基因 2 和基因 4 之间 的区域 作 为外源 DNA 插入区 。基因 8 和基因 3 之间 的较小 区域则 在另一 个不太 常用的 载体系 列中 作为克 隆位点 (图 1.30)。 由 此可知 mp 系 列都是 从同一 个重组 M13 噬菌体 (M13mpl) 改造而 来的。 M13mpl 在主要 基因间 隔区内 插入一 小段大 肠杆菌 DNA, 这 一区段 内带有 屮 半乳 糖苷 酶基因 (hcZ) 调控序 列及其 N 端头 146 个氨 基酸的 编码信 息。 借此可 以建立 一种简 单的颜 色试验 来鉴别 有外源 DNA 插入和 无外源 DNA 插入的 载体。 当没有 外源基 因插入 M13 时 ,采 用未经 置换的 载体感 染细胞 后产生 的卩- 半乳糖 Acc I 6090 图 1.30 野生型 M13 噬菌 体限制 酶切图 M13 噬 菌体基 因组的 90% 以上 都编码 蛋白质 , 10 个 基因中 大多数 均以数 个核苷 酸相隔 ,仅有 两个 较长的 基因间 隔区位 于基因 8 与基因 3 之间以 及基因 2 与基因 4 之间可 插入外 源基因 。这 些基 因间隔 区内含 有定向 调节的 顺式作 用元件 、正链 与负链 DNA 合成的 起始位 点以及 不依赖 于 P 因子的 转录终 止信号 (图 1.29) 苷酶 N 端片段 与宿主 F' 因子 产生的 缺陷型 P- 半乳糖 苷酶结 合后, 可形成 具有酶 活性的 蛋白 。这 种缺失 hcZ 操 纵基因 近邻区 段的突 变体与 p- 半乳 糖苷酶 阴性, 但操纵 基因近 邻区 完整的 突变体 之间的 互补作 用称为 ct 互补。 因此未 经置换 的载体 进入携 带相应 F' 附加 体的宿 主菌后 ,铺 于含有 IPTG (异 基硫代 -3-D- 半 乳糖苷 ,卩- 半乳糖 苷酶的 一种诱 • 88 • 导物) 与 Xgal (5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚-卩 -D- 半乳糖 苷,一 种生色 底物) 的培养 基上, 就会形 成蓝色 噬菌斑 。在 M13mpl 的 hcZ 区插 入外源 DNA 通常 会破坏 a 互 补作用 ,所 得重组 体形成 淡蓝色 或无色 噬菌斑 。由 于此法 在筛选 重组体 时简单 易行, 故把它 作为丝 状噬菌 体中进 行克隆 的常规 技术。 但由于 M13mpl 的间 隔区所 携带的 lacDNA 区 段中缺 少有用 的克隆 位点, Messing 及其同 事用化 学诱变 法和定 点诱变 法并举 ,在 M13mpllaCZ 序列 内导入 一系列 密集而 有用的 限制酶 切位点 ,建立 了噬菌 体载体 mp 系列 (M13mpl 〜 19)。 这 些多克 隆位点 的导入 ,几乎 不影响 (3- 半乳 糖苷酶 多肽的 《互 补作用 。但 当外源 DNA 插入 多克隆 位点时 ,一般 可破坏 《互 补作用 ,所 得重 组体在 IPTG 与 Xgal 存在下 可形 成无色 噬菌斑 ,从而 为其筛 选提供 了依据 。目前 ,进行 克隆一 般都用 M13mP18 和 M13mpl9 载体图 1 .31 不 M13mpl8 和 M13mpl9 载体的 限制酶 切图谱 ,图 中显 7K 了 一 • 些限 制酶在 M13mpl8 和 M13mpl9 双链 RF DNA 上的酶 切位点 ,两 种载 体仅在 多克隆 位点 的方向 上有所 不同。 它 们含有 13 个不同 的酶切 位点可 供各种 DNA 片 段插入 。基因 8 的产 物是噬 菌体颗 粒的主 要结构 蛋白, 大约由 2700 个亚 单位围 绕病毒 基因组 呈管状 排列, 形成丝 状病毒 颗粒 。病毒 颗粒只 能感染 具有性 纤毛的 细菌株 ,而 这种性 纤毛由 F 因子 所编码 ,每个 颗粒 含数个 拷贝的 次要衣 壳蛋白 (基因 3 产物 ), 位 于丝杆 的末端 ,参与 病毒颗 粒对细 菌性纤 毛末端 的吸附 。当杆 状病毒 穿过性 纤毛时 ,其 外层 衣壳蛋 白脱落 ,病毒 DNA 及 附着 于其上 的基因 蛋白进 入细菌 体内。 其感染 的单链 DNA, 即正链 ,在 细菌胞 内酶的 作用 下转变 为双链 DNA 称为 复制型 DNA (RFDNA)。 病 毒基因 的转录 可以从 许多启 动 子中的 任意一 个启动 子开始 ,单方 向地进 行至分 别紧接 于基因 8 和基因 4 下游 的两个 转录 终止子 之中的 任一个 而结束 。启动 子和终 止子的 这种组 织形式 使紧靠 终止位 点的基 因 ( 如基因 8) 比 其上游 更远处 的基因 ( 如基因 2) 转录更 频繁。 当基因 2 产物 在亲代 RFDNA 的正链 特定位 点上产 生一个 切口时 ,病 毒基 因组的 扩增即 告开始 ,首先 大肠杆 菌 DNA 聚 合酶将 单核苷 酸不断 地加至 游离的 3' 羟基 端上, 从环状 的负链 模板上 逐渐取 代原有 的正链 。当复 制叉环 绕模板 整整一 周时, 被取代 的正链 由基因 2 产 物切去 ,经环 化后 ,形 成单位 长度的 病毒基 因组。 感染后 15 〜 20min 内 产生了 足够量 的单链 DNA 结 合蛋白 (基因 5 产物 )。 此蛋白 有两个 作用, 一是抑 制基因 2 mRNA 的翻译 ,二 是与新 合成 的正链 DNA 结合, 阻止了 它们再 转变成 RFDNA。 从而 使感染 细胞内 RFDNA 分 子数 目与子 代正链 DNA 的产生 速率保 持适度 。丝 状噬 菌体组 装噬菌 体颗粒 ,并 不在细 胞内 ,而是 在基因 5 蛋白 -DNA 复合物 移动至 细胞膜 的同时 ,基因 5 产 物从正 链上脱 落 ,而 病毒基 因从感 染细胞 的细胞 膜上溢 出时被 衣壳蛋 白所包 被而成 噬菌体 颗粒。 现在使 用的很 多载体 都来源 于丝状 噬菌体 。这 些载 体的使 用是因 为插入 其中的 DNA 能以 单链环 状及双 链环状 两种形 式复制 。外源 DNA 被 插入双 链载体 DNA 中 ,然 后通 过转化 重新导 入细胞 。一 旦细胞 中双链 DNA 复制 ,就 从载体 的两条 链之一 产生了 新的双 链和单 链环状 DNA。 单 链环状 DNA 被包装 成噬菌 体颗粒 ,并 从细 咆中分 泌出来 ( 细胞没 有裂解 ), 受感染 细胞的 培养物 经离心 ,可得 到仅含 有单链 DNA 噬菌 体的上 清 。这 使得在 DNA 测序 、基 因突变 等其他 技术中 ,开 发出了 一种新 方法。 丝状 噬菌体 载体的 原型是 M13mP, 其 衍生载 体及其 多克隆 位点序 列见图 1.30 和 1.31。 这些 载体由 Toachim Messing 和 他的同 事构建 。他丨 I] 发展 并推 [ ■! 简单而 有效的 • 89 • M13mp19/pUC19 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 6 7 8 THR MET ILE THR pro ser leu his ala cys arg ser thr leu glu asp pro arg val pro ser ser ASN SER LEU ALA ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGGTCG ACT CTAGAG GAT CCCGGGGTA CCG AGC TCG AAT TCA CTGGCC H/nd III Sph\ Pst l Sa/I Xba\ BamH I ' Sst\ EcoR\ Hae III Acc I Hinc II M13mp18/pUC18 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 7 8 THR MET ILE THR ASN SER ser ser val pro gly asp pro leu glu ser thr cys arg his ala ser leu ala LEU ALA ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TTG GCA CTG GCC Xma I Sma I EcoR I Sst\ Kpn I ■* BamH I Xba I Sa/I Acc\ HincW Pst l Sph\ H/nd III Xma I Sma I M13mp11/pUC13 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 5 6 7 8 THR MET ILE THR pro ser leu gly cys arg ser thr leu glu asp pro arg ala ser ser ASN SER LEU ALA ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GGC TGC AGG TCG ACT CAT GAG GAT CCC CGG GCG AGC TCG AAT TCA CTG GCC Hae III H/nd III Pst\ Sa/I Acc I HincW Xba\ BamH I Xma I Sma I Sst\ EcoR\ Hae III M13mp10/pUC12 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 7 8 THR MET ILE THR ASN SER ser ser pro gly asp pro leu glu ser thr cys ser pro ser leu ala LEU ALA ATG ACC ATG ATT ACG ATT TCG AGC TCG CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGC CCA AGC TTG GCA CTG GCC » * ■ • » ■ » » > • t I Hae III EcoR I Sst\ Xba\ Sa/I Acc I HincW Pst\ Xma I SamH Sma I M13mp9/pUC9 1 2341 23456789 10 11 5678 THR MET ILE THR pro ser leu ala ala gly arg arg ile pro gly ASN SER LEU ALA ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GCT GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGG AAT TCA CTG GCC H/nd III Hin6 III Pst\ Sa/I Acc I HincW BamH 1 1 EcoR I Hae III Xma I Sma I M13mp8/pUC8 1234 5612 3456789 10 11 78 THR MET ILE THR ASN SER arg gly ser val asp leu gin pro ser leu ala LEU ALA ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC CTG CAG CCA AGC TTG GCA CTG GCC EcoR I SamH I Sa/I Acc I HincW Pst\ H/nd III Hae III Xma I Sma I M13mp7/pUC7 1 2 34 51 23 45 6 7 8 9 10 11 12 13 14 6 THR MET ILE THR ASN ser pro asp pro ser thr cys arg ser thr asp pro gly asn SER ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CCG GAT CCG TCG ACC TGC AGG TCG ACG GAT CCG GGG AAT TCA EcoR I SamH I Sa/I Acc I HincW Pst\ Sa/I Acc I HincW SamH I EcoR I 图 1.31 M13mp/pUC 系列载 体多克 隆位点 图 中列出 这两个 系列载 体中常 用的各 个载体 的多克 隆位点 序列和 限制酶 切位点 ,加入 基因 的多克 隆位点 所编 码的氨 基酸以 小写字 母表示 ,括号 表明了 多克隆 位点在 载体上 的位置 • 90 • 技 术来利 用这些 载体。 M13mp 载 体是有 活性的 噬菌体 。外源 DNA 被插入 位于基 因组中 非必 需区的 多克隆 位点中 (一 段含一 连串限 制酶切 位点的 DNA)。 多 克隆位 点嵌在 ZacZ 基因的 ct 片 段的阅 读框中 ,当 Xgal 和 IPTG 存 在时, M13mp 衍生 物在含 lacZco 的菌苔 上形 成蓝色 噬菌斑 。双链 DNA 从噬 菌体感 染细胞 中纯化 ,用限 制性酶 切割多 克隆位 点 ,然后 将外源 DNA 连接 到被切 割的载 体上。 插入了 DNA 的噬菌 体形成 白色噬 菌斑。 白 色噬菌 斑中心 的感染 细胞种 在液体 培养基 里培养 ,然 后离心 ,产 生的上 清中充 满了含 单链 DNA 的噬菌 体颗粒 。浓缩 噬菌体 颗粒, 从中提 取单链 DNA, 并用于 其他的 试验。 M13mp 噬菌 体有两 个缺陷 。首先 ,利用 这种噬 菌体不 容易获 得大量 的双链 DNA; 双链 DNA 靠 裂解感 染细胞 来获得 ,但是 感染细 胞生长 比未感 染细胞 慢得多 ,含 有噬菌 体 的细胞 容易被 淘汰; 其次 ,有些 子代噬 菌体中 的插入 DNA 被删除 ,这 可能是 因为感 染了 大噬菌 体的细 胞比感 染小噬 菌体的 细胞生 长得慢 ,这样 ,被删 除了部 分碱基 对噬菌 体的 细胞具 有生长 优势。 为了 克服这 些缺点 ,开 发了许 多载体 (如 pEMBL)。 它们带 有噬菌 体复制 的起始 点 ,同 时也含 有一个 pMBI 衍 生质粒 的复制 起始点 ,一个 p- 内 酰胺酶 ( 氨苄青 霉素抗 性) 基因 ,以 及一个 镶嵌在 hcZ 的 a 互 补片段 基因中 的多克 隆位点 。它 们都比 M13mp 噬菌体 小得多 。经 转化导 入细胞 ,用含 氨苄青 霉素的 培养基 选择。 因这些 载体不 编码噬 菌体 蛋白, 它们在 细胞中 可通过 pMBI 复制起 始点进 行复制 。然而 ,当含 有这些 载体的 细胞用 野生型 辅助噬 菌体超 感染时 ,噬 菌体复 制起始 子就被 活化, 单链子 代噬菌 体与子 代辅助 噬菌体 一并分 泌入培 养基中 。辅助 噬菌体 的污染 大多数 情况下 不会妨 碍应用 ,因 为辅 助噬菌 体既不 含编码 lacZ 或氨苄 青霉素 抗性的 基因, 也不含 用做杂 交探针 的核酸 片段。 甚至最 近推出 的载体 (例如 pUC118、pBluescribe) 也 被设计 成与稍 加改进 的辅助 噬菌体 共用, 并带有 SP6 或 T7 噬菌体 聚合酶 启动子 ,这些 启动子 可启动 多克隆 位点内 插 入基因 的转录 (图 1.31)。 丝 状噬菌 体具有 较为特 殊的生 活周期 。丝状 噬菌体 (fl、 M13 和 fd) 是单链 DNA 噬菌体 ,它 们具有 雄性专 一性, 就是说 ,它们 感染雄 性大肠 杆菌株 ,这 些菌 株含有 F 因子 (F+、 F' 或 Hfr)。 这 3 种噬菌 体是不 同来源 的相同 噬菌体 ,仅 有少 许的核 苷酸差 异 。噬 菌体颗 粒形状 好像一 根瘦长 的管子 。其包 膜主要 由几千 个基因 8 产物的 单体构 成。 基因组 包括一 个单链 DNA 和一 个环状 DNA 分子 ,含有 6407 个 核苷酸 ,贯 穿管道 全长 。除 了编码 10 种蛋白 质外, 基因组 在基因 4 和基因 2 之 间有一 个基因 间隔区 (IG) (图 1.30), IG 含有 正负链 DNA 的合成 起始点 、将 正链包 装成噬 菌体颗 粒的信 号及一 个转录 终止子 (图 1.29 示噬菌 体的基 因图谱 )。 丝状 噬菌体 是很有 用的克 隆载体 ,因为 其包装 不受大 小限制 ,如果 基因组 较长, 它们就 被包装 成更长 的噬菌 体颗粒 。噬 菌体颗 粒 含有约 27 000 个主要 包膜蛋 白单体 、基因 8 的产物 及几个 在末端 的小包 被蛋白 。其 中一 个小包 被蛋白 (基因 3 的产物 ) 黏 附到宿 主大肠 杆菌的 F 纤毛 顶端。 结合后 ,纤毛 收缩, 使噬菌 体与细 菌体表 面接触 ,包 被蛋白 脱落, 并插入 细胞膜 。在去 包膜后 ,具有 感染 性的环 状单链 DNA 通过一 个还不 甚清楚 的过程 进入细 胞质。 在被 感染细 胞中, 噬菌体 DNA 复 制包括 3 个阶段 。第 一阶段 X 噬菌体 DNA 的互补 链 ( - ) 的合成 。负链 的合成 起始于 ( - ) 链 起始点 (在 IG 内 ), 并且 由宿主 大肠杆 菌复制 酶执行 。该 合成 将感染 性的单 链环状 DNA (正链 ) 转变成 双链复 制形式 (RF) • 91 • DNA〇 第二 阶段, 细胞内 RFDNA 由于两 种复制 起点的 连续作 用而越 积越多 。从 (+ ) 链 起始点 的滚环 型复制 变为从 (-) 链起始 点开始 的复制 ,通 过这 种复制 ,子代 的单链 环状 DNA 变成 双链。 产生的 RFDNA 分 子是在 DNA 合成 及作为 合成噬 菌体编 码蛋白 质的转 录模板 之间的 中间体 。转 录与 (+ ) 链滚环 复制进 行的方 向相同 。在 (-) 链的 方向上 ,当 到达复 制叉时 ,转录 是否抑 制复制 ,就像 对大肠 杆菌染 色体复 制所作 的假设 那样, 这还不 能肯定 。虽 然这个 想法还 没有得 到严格 证明, 但确为 这两个 基本的 问题提 供了一 种解释 ,从 而引起 了关注 :为什 么某些 DNA 片 段不能 克隆? 并且 在亚克 隆试验 中, 为什么 偶然地 在插入 的两个 方向中 ,有时 仅有一 个能被 回收? 指 导滚环 复制的 (+ ) 链复 制起始 点有一 个双分 结构, 它由一 个基本 核心起 点结构 (约 50bP) 和 一毗邻 的富含 A+T 的“ 增强子 ”序列 (约 lOObp) 组成。 增强子 能提高 复制约 100 倍 。核心 起点结 合起始 子蛋白 (基因 2 蛋白 ), 增强子 结合大 肠杆菌 整合宿 主因子 (IHF)。 在 M13mp 系列 的克隆 载体上 ,多 克隆位 点打断 了复制 的增强 子的序 列, 但这些 载体获 得了位 于基因 2 的补 偿突变 ,从 而保持 了复制 的效率 。因此 ,任 何插 入多 克隆位 点中的 序列都 不妨碍 DNA 复制。 基因 2 蛋白 是一种 多功能 蛋白质 ,在 噬菌体 DNA 复制 中具有 几方面 的作用 ,它分 两 步协同 结合到 (+ ) 链起 始处, 使起点 DNA 弯曲 ,并在 RFDNA ( + ) 链上 引入一 特 定缺口 。缺口 3' 羟基 端作为 (+ ) 链滚环 复制的 引物发 挥作用 ,该 活性使 得基因 2 蛋 白 成为一 个很有 用的酶 ,在 体外, 该酶可 产生独 特的带 切口的 DNA 分子 。被切 割后, DNA 分子 依然需 要基因 2 蛋白 来解旋 及复制 。最后 ,直到 一轮合 成完成 ,基因 2 蛋白 切割 并环化 被置换 的单链 DNA (见 本节第 二部分 )。 第 三阶段 的复制 (单链 产物) 发生 在感染 的后期 。该 DNA 复制阶 段由于 (-) 链 起始 点回复 到低水 平起作 用而不 对称, 这样产 生的主 要就是 (+ ) 链了。 这些单 链环状 (+ ) 链被包 装成噬 菌体颗 粒输出 ,而 不是 转变成 RFDNA。 一 般来说 ,丝状 噬菌体 的感染 是非致 死性的 ,虽 然它 们的生 长速率 减慢了 2 倍 ,宿 主细 胞不会 裂解, 但宿主 细胞生 长速度 的降低 却解释 了为什 么丝状 噬菌体 在敏感 菌苔上 会形成 混浊噬 菌斑。 令人吃 惊的是 ,当复 制增强 (高拷 贝数) 质粒 表达时 ,有些 噬菌体 蛋白对 大肠杆 菌有致 死作用 。可见 ,在受 感染细 胞中的 DNA 复制 受到精 细调节 以防止 这种 致死性 。这种 调节的 机制还 没有完 全清楚 ,但它 需要噬 菌体编 码单链 DNA 结合蛋 白 (基因 5 蛋白 )。 在感染 稳定的 状态, RFDNA 以质 粒的形 式存在 ,拷 贝数约 20 〜 40, 噬 菌体以 100~200 个 /h 的 速率持 续排出 。感染 状态相 当稳定 ,每 一代 1〇〇〇 个细 胞中 只有约 1 个细胞 丢失噬 菌体。 二、 M13 噬 菌体衍 生载体 的制备 与应用 丝状噬 菌体衍 生克隆 载体非 常有用 ,用它 们可以 得到单 链和双 链形式 的克隆 DNA。 本节 介绍两 种形式 DNA 的制 备及在 M13 衍生载 体中进 行插入 的方法 。还 介绍了 一个用 于 辅助噬 菌体超 感染的 质粒制 备单链 DNA 的方法 。这种 方法的 优点是 ,它 允许 克隆的 DNA 以质粒 的形式 被保存 ,同时 又能分 离单链 DNA 用做 测序。 • 92 • (一) 单个 M13 噬菌体 的分离 1. 原理 一个 M13 噬 菌体的 病毒颗 粒感染 一个细 菌后形 成一个 噬菌斑 。从感 染细菌 释放出 来的 子代病 毒颗粒 感染邻 近细菌 ,后者 又可释 放下一 代病毒 颗粒。 如果细 菌在半 固体培 养基 (加含 琼脂或 琼脂糖 ) 上生长 ,子 代病 毒颗粒 的扩散 受到一 定限制 。诸如 M13 等 丝状噬 菌体, 并不杀 死感染 的细菌 ,但 却使感 染细菌 的生长 速度约 降低至 原来的 1/2。 在此 情况下 ,在琼 脂糖覆 盖层内 生长的 细菌形 成较为 混浊的 背景。 相对这 一背景 ,由生 长缓慢 的细菌 形成了 一个不 断扩大 的环带 ,最 后形成 肉眼可 见的噬 菌斑。 为保证 噬菌体 原种的 同源性 ,首先 通过原 始培养 原种的 连续稀 释铺板 来得到 单个感 染 细胞或 单个噬 菌斑。 2. 材料 M13 衍生 质粒感 染的大 肠杆菌 (如 M13mpl8 感染的 JM101) 2 x TY 培养基 20mg/mLIPTG 水溶液 (分装 贮存) 20mg/mLXgal 二甲酰 胺溶液 (分 装贮于 -20X:) 45t: 顶层 琼脂糖 H 平皿, 预温至 37X: 5mL 带 帽聚氟 乙烯管 或同等 塑料管 371: 培养箱 所有与 细菌接 触的材 料都应 该是无 菌的。 3. 操 作步骤 (1) 将感染 菌株或 噬菌体 原种用 2 x TY 的培 养基按 1 : 10 做系 列稀释 。取 稀释液 lOO^L 分 别放入 5mL 聚氟乙 烯带盖 的试管 ,做好 标记。 • 载体常 贮存在 感染的 宿主中 , -801C, 20% 甘 油保存 。载体 也能以 分离的 DNA 或 噬菌体 形式贮 存。 DNA 经转 染导入 细胞; 噬菌 体则可 直接感 染细菌 [如以 下步骤 (2)~(5) 所述] 。如 東载体 含有质 粒起 始点和 药物抗 性标记 ,含载 体的细 胞就能 在有抗 生素的 培养基 上分离 出单个 克隆。 如果载 体形成 活 性空斑 ,含载 体细胞 可以通 过将空 斑中央 的感染 细胞块 通过划 线也可 分离单 个克隆 。‘ 下面步 骤假设 载体是 M13mp 载体 ,含有 一编码 (3 •半乳 糖苷酶 a 片段的 DNA。 这些载 体在含 (3- 半 乳糖苷 酶〇〇 片段 的细胞 中可产 生蓝色 空斑。 在多克 隆位点 中插入 DNA 可使编 码《 片 段的基 因失活 , 这样载 体产生 的将是 无色的 空斑。 (2) 每支试 管加入 : 200PL 生长至 饱和的 非感染 细胞, IOmLIPTG, 40pLXgal, 3mL45t: 顶层 琼脂糖 (可预 先大批 准备这 3 种试剂 ,这样 用起来 很方便 ) (3) 颠倒试 管两次 ,快 速混匀 ,加 至单个 预温的 37TCH 平 皿上。 (4) 让顶 层琼脂 在室温 下固化 lOmin, 转移至 37X: 培 养箱。 (5) 过夜 生长后 ,仅 保存空 斑少于 1〇〇 个的 平皿。 需注意 问题: ①根据 噬菌斑 的颜色 来鉴别 重组体 是一种 行之有 效但并 非万无 一失的 • 93 • 方法 。尽管 非重组 噬菌体 总是形 成蓝斑 ,但并 非所有 蓝斑都 必须由 非重组 噬菌体 产生。 例如 ,重组 噬菌体 所携带 的外源 DNA 区段较 小而又 不改变 kcZ 序 列的阅 读框时 ,就会 编码出 一种融 合蛋白 ,这种 融合蛋 白仍具 备参与 a 互 补的部 分能力 。这种 重组噬 菌体至 少要 在培养 6h 后才出 现颜色 ,并最 终形成 淡蓝色 噬菌斑 。曾 有一 例报道 ,某一 重组噬 菌体可 产生一 种新的 a 供体 蛋白 ,它的 头几个 氨基酸 由外源 DNA 的 3' 端 所编码 ,而其 余部 分则来 自载体 中原有 a 供体蛋 白, 这种重 组体形 成的蓝 色噬菌 斑无异 于未经 取代的 载体所 形成的 蓝色噬 菌斑。 ②基本 培养基 (M9) 的琼 脂平板 可用做 M13 噬菌体 的噬菌 斑 的形成 ,其优 点是只 允许带 F' 因子 的细菌 生长。 从这种 培养基 的平板 挑取噬 菌斑, 感染 细菌后 所得的 培养液 中不会 含有大 量的雌 性细菌 。而 在丰富 培养基 (2XTY 或 LB) 上形成 的噬菌 斑则截 然不同 ,含有 相当一 部分营 养缺陷 型雌性 细菌, 这些细 菌不被 M13 噬菌体 感染。 若在有 限时间 内用丰 富培养 基进行 培养, F' 因 子自动 丢失的 频率尚 不会 太高, 不致引 起麻烦 。由 于噬菌 体在丰 富培养 基上形 成过快 ,我 们主张 M13 噬菌 体 常规平 板培养 还是用 TY 或 LB 培养基 为好。 (二) 从 M13 噬 菌体载 体中制 备单链 噬菌体 DNA 1. 原理 将含 M13 噬菌体 的细胞 在液体 培养基 中生长 。离 心收 集细胞 ,单链 DNA 就 可以从 上清 中的噬 菌体颗 粒制得 。详 见质粒 DNA 的制备 一节。 2. 材料 大肠 杆菌株 ( 雄性型 ,如 JM105) M13 衍 生载体 2 x TY 培养基 聚 乙二醇 (PEG) 溶液 (30% PEG 8000, 1.6mol/LNaCl, 存于 4"C) TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA) 缓冲酚 3mol/L 乙 酸钠, pH5.2 100% 乙 醇和冰 70% 乙醇 灭菌 牙签, 37X: 水 浴摇床 点样 缓冲液 (50% 甘油、 0.2mol/LEDTApH8_3, 0.05% 溴酚蓝 ) 另外, 用于琼 脂糖凝 胶电泳 的试剂 和仪器 3. 操 作步骤 (1) 取 0.5mL 过夜 培养的 大肠杆 菌加入 50mL 2 x TY 培养基 中培养 。该菌 应取自 不含脯 氨酸的 极限培 养基平 板上的 单菌落 ,以 2mL 分装于 10mL 的培养 试管中 ,用无 菌牙 签挑取 无色噬 菌斑培 养于每 管中。 很 多雄性 大肠杆 菌株可 用于繁 殖单链 噬菌体 (如 JM101 或 JM105, 见表 1.5), 它们被 去掉了 />r〇A 和 基因 ,但含 有携带 + 和 + 基因 的质粒 。从缺 少脯氨 酸的平 板上挑 取的克 隆保证 • 94 • 了细胞 都含有 F' 质粒 ,并 且能被 噬菌体 感染。 (2) 在 37t: 摇床 中培养 5~10h。 (3) 转移 1.5mL 培 养物至 微量离 心管内 ,室温 下离心 5min。 (4) 倾出 1.25mL 的上清 至另一 新鲜离 心管。 为了贮 存菌株 ,旋 涡振荡 ,重新 悬浮细 菌沉淀 ,加入 甘油至 30%, 冰冻于 -80*C。 (5) 加入 250fiLPEG 溶液 ,混匀 ,在 室温 下放置 15min。 (6) 离心 5min, 弃 上清。 在这步 可以看 得见噬 菌体沉 降物。 (7) 离心 5min, 用 拉长的 巴斯德 吸管小 心移出 所有的 PEG 残留。 (8) 加入 200fiLTE 缓冲液 。重 新完 全悬浮 沉降物 ,然 后加入 100/iL 缓 冲酚。 (9) 旋 祸振荡 lmin, 静置 5min, 再振荡 ,离心 5min。 (10) 移出 175;zL 上层 水相至 一个新 微量离 心管。 (11) 加入 20^L3mol/L 的乙 酸钠及 400/^L 100% 乙醇。 (12) 在 -20X: 放 置至少 lh 以沉淀 DNA, 或置 于干冰 / 乙 醇浴中 15min。 (13) 离心 5min, 倒 掉上清 ,加 lmL 冷 70% 的乙醇 ,再 离心, 弃上清 ,真 空干燥 器 中快速 干燥。 有些情 况下使 用单链 DNA 时, 如指导 寡核营 酸突变 (oligonucleotide-directed mutagenesis), DNA 必须非 常千净 。如 用做 这些用 途的话 ,在这 步当中 , 应用拉 长的巴 斯德吸 管吸净 上清。 (14) 25mL TE 缓冲 液溶解 沉淀。 单链 产量可 以高达 lO^g DNA/mL 培 养物。 (15) 取 l~2pL 在 1% 琼 脂糖凝 胶上电 泳分析 ,并 将剩下 的贮于 -20X:。 (三) 双链 复制型 DNA 的制备 1. 原理 从 感染噬 菌体后 期的细 菌中分 离双链 复制型 (RF) DNA 是不 利的, 因为这 时它的 丰 度最低 。下 述双链 DNA 的分 离方法 对细胞 用氯霉 素进行 处理: 感染后 不久即 加入低 浓度的 氯霉素 (b^g/mL) 可防 止噬菌 体基因 5 蛋 白质的 聚集, (-) 链 DNA 的 合成抑 制 。在 开始的 15min 内 ,可产 生足够 的基因 2 蛋白 ,使 RFDNA 得以累 积。. 2. 材料 F+ 或 Hfr 大 肠杆菌 2 x TY 培养基 重组 噬菌体 20% 葡萄糖 lmg/mL 氯 霉素乙 醇溶液 (新鲜 配制) Sorvall S534 转头 或相当 转头。 3. 操 作步骤 (1) 在 20mL2xTY 培养基 中加入 0.1mL20% 葡萄糖 ,接 种未感 染细菌 。在 37X: • 95 • 水 浴摇床 培养至 OD6〇〇 = 0.8 〜 1.0。 (2) 用 重组噬 菌体感 染细胞 ,感 染复数 (MOI) 为 20 〜 50, 培养于 37X: 15min。 (3) 加入 0.3mLlmg/mL 的氯霉 素于乙 醇溶液 ( 终浓度 lSpg/mL) 中 ,培养 2h。 (4) 400〇Xg (6000r/min) 离心 lOmin, 收 获细胞 。用分 离质粒 DNA 的常 用方法 (见本 章第二 节第二 、三 小节) 制 备双链 DNA。 (四) 利用辅 助噬菌 体从质 粒中制 备单链 DNA 1. 原理 含带有 丝状噬 菌体复 制起点 (常为 £1 复制 起点) 的质 粒的细 菌用辅 助噬菌 体感染 时 ,辅助 噬菌体 提供使 质粒按 fl 模式进 行复制 的基因 2 编码 蛋白、 DNA 包装和 运输等 功能 。单链 DNA 被包装 进噬菌 体外壳 蛋白中 并且分 泌到上 清液, 但是只 有正链 DNA 才能 被有效 地包装 。因此 对于正 链噬菌 体复制 起点, 只有按 5'— 3' 方向插 入外源 DNA 的正链 DNA 才能被 包装。 2. 材料 含 有质粒 (如 pUC118、 pBS 或相当 质粒) F+ 或 Hfr 大肠杆 菌菌株 (见表 1.5)。 2XTY 培养液 点样 缓冲液 : 50% 甘油、 0.2mol/LEDTApH8.3, 0.05% 溴酚蓝 Sorvall SS-34 转子或 相当的 转子。 3. 操 作步骤 (1) 将来自 一个单 菌落的 过夜培 养新鲜 菌液按 1:50 稀释 ,在含 有适当 抗生素 2X TY 培养液 (l~5mL) 中 ,于 371C 培养至 OD6(M) = 0.1。 (2) 按 1MOI、 10MOI、 20MOI、 50MOI 感 染细胞 ,于 37TC 剧 烈振荡 下培养 4.5h。 为了得 到高产 量的单 链质粒 应确定 使用尽 量少的 噬菌体 ,因 为加入 的一部 分噬菌 体总是 要被回 收的。 (3) 4000 x g 离心 l〇min, 收 集上清 液并于 65X: 加 热灭活 15min。 (4) 从上清 液中提 取单链 DNA, 在琼 脂糖凝 胶上分 析单链 DNA (见 本章第 二节第 二小节 ), 并用辅 助噬菌 体作为 对照。 (五) 噬菌体 DNA 转 化细胞 1. 原理 不论 单链还 是双链 DNA 都 能通过 转染导 入经过 CaCl2 处理的 感受态 细胞中 ,就像 质 粒载体 DNA 分 子一样 。单链 DNA 生 成的转 化子比 同等量 的双链 分子少 10 倍。 有些 特殊情 况下要 求宿主 菌株为 F' 既然 噬菌体 DNA 可通过 转化导 入细胞 ,利 用 宿主 繁殖噬 菌体是 可能的 。然而 ,通过 感染这 些细胞 而产生 的噬菌 体不能 感染相 邻 的细胞 。导入 细胞的 噬菌体 应携带 药物抗 性标记 ,这 样转化 的细胞 才能在 含抗生 • 96 • 素 的平板 上挑选 出来。 2. 操 作步骤 用 本章第 二节第 四节所 述的转 化方法 将载体 DNA 导入 细胞, 在有的 地方作 了适当 的 修改。 (1) 如果 含有一 个质粒 复制子 和一个 药物抗 性基因 ,那 么就可 在抗性 平板上 挑选转 化 细胞。 (2) 如 果载体 可以形 成空斑 ,加 200mL 未感染 的对数 生长晚 期细胞 (OD6W) = 0.6~ 0.8) 至铺板 混合物 。加 2. 5mLH 顶 层琼脂 ( 见本章 第一节 ), 将混 合物在 H 平板 上铺 制 ( 见本章 第三节 ), 在 37X: 培养 直至空 斑出现 ( 如本节 第二部 分介绍 的方法 ), 以空 斑为 标记筛 选转化 的阳性 细胞。 (六) 单 链载体 中插入 DNA 大小 的检测 1. 原理 该方法 不需纯 化单链 DNA 就可 以对大 量病毒 DNA 进 行快速 比较。 将含 插入的 噬菌体 DNA 和未 插入或 含已知 大小的 插入的 噬菌体 DNA 的移动 比较, 可 评估插 入片段 的大小 。这 种方法 可以比 较几千 个碱基 对长的 单环状 DNA 分 子的大 小 ,但是 ,插 入小于 300bP 长 的片段 该方法 比较不 出来。 2. 材料 2% 十 二烷基 磺酸钠 (SDS) 点样 缓冲液 (50% 甘油、 0.2mol/LEDTApH8.3, 0_05% 溴酚蓝 ) 3. 操 作步骤 (1) 吸取 1.5mL 的感染 培养物 放在微 量离心 管内。 (2) 离心 lmin, 去掉 20^L 上清 ,与 l/ixL2%SDS 及 3pL 点样 缓冲液 混合。 对不含 插入的 噬菌体 及其他 含有已 知大小 的插入 的噬菌 体培养 物上清 ,作 同样的 处理。 (3) 0.7% 的琼脂 糖凝胶 电泳, 用本书 (本 章第二 节第二 部分) 所述分 析结果 。如 果需要 ,可将 DNA 从胶 上转移 到膜上 ,用 放射活 性探针 评估, 检测大 小及序 列是否 正确。 (七) 插 入方向 的测定 1. 原理 插入 DNA 仅 有一条 链位于 噬菌体 (+ ) 链上 ,并 能装配 成噬菌 体颗粒 ,这 意味着 携带了 方向相 反的相 同插入 序列的 噬菌体 DNA 能够沿 着插入 片段相 互杂交 (图 1.32)。 因此 所形成 的复合 体的电 泳迁移 率与两 条不相 干的单 链病毒 DNA 不同。 单链噬 菌体载 体的 这种特 性能用 来检测 两种噬 菌体是 否携带 有一个 插入方 向相反 的片段 ,这种 噬菌体 • 97 • 能用于 DNA 片段 的双末 端序列 测定。 图 1.32 不 同方向 相同插 入序列 的两种 噬菌体 的杂交 2. 材料 5mol/L NaCl 20% SDS 点样 缓冲液 (50% 甘油、 0.2mol/LEDTApH8.3, 0.05% 溴酚蓝 ) 3. 操 作步骤 (1) 将 2(VL 两种 上清与 1ML20%SDS 在微量 离心管 中混匀 ,另 取两 只试管 ,分别 将 40pL 上清与 2/xL SDS 混合。 (2) 加 2^L 5mol/L NaCl 至每个 试管中 , 60X: 孵育 30min。 (3) 在 0.7% 的琼脂 糖凝胶 中电泳 ,按 本章 第二节 第二部 分所述 溴化乙 锭染色 ,观 察 条带的 结果。 如 果有很 多样品 要筛选 ,可 以在微 量滴定 板中培 养裂解 ,并处 理重组 的感染 细胞, 也可以 用纯化 的单链 DNA 检测插 入的相 对方向 。要 这样 做的话 ,则 从每种 DNA 样 品中取 5pL 与 0'.5nL5mol/L NaCl 混合 , 60X: 孵育 30min, 然后用 上述琼 脂糖凝 胶电泳 法进行 分析。 (八) 方 法评注 1. 背 景知识 在 M13 克隆 载体中 ,在大 肠杆菌 乳糖操 纵子的 部分基 因间隔 区含有 一个多 克隆位 点 ,上 面有许 多限制 酶识别 的连接 位点。 野生型 X 噬 菌体在 可合成 CO 片段的 宿主中 ,这 些载体 形成蓝 色空斑 ,而在 带有插 入片段 的载体 中则形 成白色 空斑。 空 斑是在 菌苔上 被感染 了的细 胞区域 。感 染细胞 比未感 染细胞 长得慢 。携带 插入的 噬菌 体形成 的空斑 常常比 野生型 形成的 空斑小 。这是 因为含 插入的 噬菌体 DNA 复制得 较慢 ,产 生子代 空斑要 花更长 的时间 。很多 人宁愿 以纯化 的单链 DNA 而 不是噬 菌斑的 形 式贮藏 重组噬 菌体。 • 98 • 其 他单链 克隆载 体同样 含有如 fl 的噬菌 体复制 起始点 。这 些载体 往往也 携带有 PBR322 质 粒复制 起始点 、一 个药物 抗性编 码基因 、一个 插入编 码《 肽的 hcZ 基 因阅读 框 的多克 隆位点 。这些 载体大 多数缺 乏基因 2 或 者其他 形成单 链噬菌 体颗粒 的必需 基因。 在 细胞中 ,这 些载体 呈双链 ,并以 PBR322 复制起 始点进 行复制 。但是 ,当 细胞被 野生型 辅助噬 菌体感 染时, 质粒以 噬菌体 复制起 始点进 行复制 ,并 且质粒 的单链 拷贝被 包裹成 丝状噬 菌体, 然后随 辅助噬 菌体拷 贝分泌 到培养 介质中 。辅 助噬菌 体在大 多数情 况 下不影 响应用 ,因为 它们不 含编码 lacZ 或 氨苄青 霉素抗 性基因 ,也不 含用于 杂交探 针的任 何核酸 片段。 也许这 些载体 最常见 的用途 在于双 脱氧核 糖核酸 测序法 ( 见后有 关章节 )。 在这种 方法中 ,从 质粒或 X 衍生载 体来的 小片段 DNA 被亚 克隆到 M13mp 载体中 。含 插入片 段的 载体可 通过空 斑的颜 色筛选 (见 本节第 一部分 )。 更 多的背 景知识 见丝状 噬菌体 的生活 史以及 列出的 主要参 考文献 2. 方 法要领 单个 M13 衍生载 体的分 离:平 板应在 空斑出 现后马 上使用 。每 次挑 单个空 斑来进 行 DNA 扩增时 ,噬 菌体 均应新 鲜铺制 。噬 菌体弥 散以及 使用旧 的平板 可导致 交叉感 染。 感染细 菌及这 种菌苔 必须在 371C 条件 上生长 。如果 培养温 度低于 341C, 则 不会形 成 性纤毛 ,不能 感染噬 菌体。 从 M13 衍生 载体制 备单链 噬菌体 DNA: 由于 微量的 PEG 能抑制 DNA 聚合 酶的活 性 ,从 制备物 中去除 PEG 非 常重要 。受 污染的 模板可 先于乙 醇沉淀 前用氯 仿抽提 。然 而 ,如 果步骤 (7) 以后 小心操 作的话 ,不 一定需 要氯仿 萃取。 复制型 DNA 的制备 :如果 重组噬 菌体生 长情况 良好, 经氯霉 素处理 后获得 的双链 DNA 量一 般是每 20mL 培养 物中有 50~200网。 过多 的氯霉 素会导 致产量 下降, 而太少 会 有单链 DNA 混 杂其中 。有时 ,在 氯化铯 梯度平 衡后, 第二条 带出现 在质粒 DNA (最 低) 与 基因组 DNA 带 (最高 ) 之间 ,这是 由单链 DNA 构成 ,应当 摒弃。 用辅 助噬菌 体从质 粒中制 备单链 DNA: 从单个 雄性大 肠杆菌 株克隆 开始。 该菌株 含有重 组质粒 ,质粒 含有丝 状噬菌 体复制 起始点 ,如 pUC118 或 pBluescribe。 所 用辅助 噬菌体 株必须 适合实 验用。 常用的 辅助噬 菌体有 IR-1、 R408、 M13K07 以及 VCSM13。 噬菌体 IR-1 和 R408 比 VCSH13 和 M13K07 更稳定 ,但后 者含有 卡那霉 素抗性 基因, 有助 于筛选 。辅助 噬菌体 VCSH13 和 R408 经特 意构建 而有助 于质粒 单链的 产生。 VCSM13 含有 噬菌体 (+ ) 链复 制起始 点一段 缺失的 复制“ 增强子 ”序列 。因此 ,它 不竞 争基因 2 蛋白质 ,从而 有利于 质粒单 链产物 。相反 ,辅助 噬菌体 R408 含有 一个不 完 全的包 装信号 (见 本章第 四节第 四部分 ), 可 引起质 粒单链 优先被 包装成 噬菌体 颗粒。 不论 使用哪 种辅助 噬菌体 ,从上 清制备 的单链 DNA, 都含 有一些 辅助噬 菌体的 DNA。 这对于 DNA 测 序不存 在问题 ,因为 可以选 择对质 粒单链 特异的 引物。 噬菌体 DNA 转化 细胞: 噬菌体 DNA 转化到 CaCl2 处 理的感 受态细 胞中按 ( 本章第 二节第 四部分 ) 所 述操作 ,如果 载体形 成空斑 ,不 需要表 达表型 ,热 休克后 ,细 胞马上 就可 以涂板 。用 F_ 感受 态菌是 一种常 见错误 ,因为 重组噬 菌体在 这种细 胞上不 形成噬 • 99 • 菌斑 。然而 ,如 果转 化后用 F+ 菌稀释 ,并一 起涂板 ,则 菌也可 以使用 。在这 种情况 下, F— 细菌会 产生噬 菌体, 并且在 混合的 细菌层 上生成 噬菌斑 。只要 F+ 细胞 足够 ,空 斑 就能看 得见。 在单链 载体上 插入片 段大小 的测定 : 噬菌体 颗粒抽 提后, 可以从 上清分 析单链 DNA。 用 SDS 与噬菌 体混匀 ,旋 涡振 荡以从 噬菌体 DNA 中 去除衣 壳蛋白 ,这很 重要。 否则 会导致 萃取不 完全以 及污染 DNA 带 。如 果培养 上清含 有细胞 或从裂 解细胞 来的染 色质 DNA, 噬菌体 DNA 会被 污染并 可看见 另外的 DNA 带 。如果 这种问 题反复 出现, 这些额 外带的 位置可 以通过 电泳未 感染的 培养上 清作为 对照来 确定。 3. 时 间安排 无色 噬菌斑 (由不 能进行 a 互补的 噬菌体 形成) 于 37t: 培养 4 〜 5h 即开始 出现。 在约 4h 后空 斑可凭 肉眼观 察到, 8h 以后最 好辨认 。当制 备单链 噬菌体 DNA 时 ,培养 和处 理样本 应在同 一天做 。惟一 的限制 因素是 在同一 时间里 所处理 的样本 数不宜 过多。 如果 太多, 可以在 41C 保 存上清 [第 一种方 法步骤 (5)] 24h, 然 后在进 行下一 步之前 重 新离心 。以 辅助噬 菌体制 备单链 DNA 在与 噬菌体 培养后 ,需 要一较 短的培 养间期 (约 4. 5h)。 用氯 霉素处 理细胞 后制备 RFDNA 可在培 养后一 天完成 。如 果样本 准备在 CsCl 梯度 上纯化 ,则 另需要 Id。 将 噬菌体 DNA 导入 细胞、 插入片 段大小 以及方 向的确 定 各需约 2h。 第 五节黏 粒载体 一、 黏粒载 体简介 黏粒 载体实 质就是 在质粒 DNA 上加上 X 噬 菌体的 两个黏 性末端 。出 于对转 化效率 的考虑 ,一 般质 粒载体 的容量 只能用 于克隆 10kb 以下的 DNA 片段 ,而 X 噬菌体 的克隆 极限 也只有 23kb, 否则很 难被包 装成新 的噬菌 体颗粒 ,大 多数 常用的 黏粒载 体约为 5kb 大小 ,它 们可以 克隆的 DNA 范围在 33~47kb。 这些载 体又称 COSmid, 由 Collin 和 Hohn 于 1978 年首 先推出 。这类 载体由 3 部分 组成: ①一个 抗药基 因及一 个质粒 复制起 始 位点; ②一 些单 一的限 制酶切 位点; ③ X 噬菌体 aw (带 黏端) 序列。 这种载 体有入 噬菌 体的包 装信号 ,但 没有噬 菌体复 制及裂 解等其 他功能 ,将它 及外源 DNA 以 相同的 限制 酶切割 ,再 用连接 酶连接 ,使 得外源 DNA 片段 被嵌入 两个黏 粒之间 ,这两 个黏粒 方 向一致 ,在它 们之间 ,除 插入 的外源 DNA 外, 还有组 成黏粒 的那个 质粒的 全部信 息 。以 此重组 DNA 分子 和含有 X 噬菌体 提取物 (含 X 噬菌 体头部 和尾部 蛋白及 A 蛋 白 ), 被包装 到衣壳 蛋白中 ,组 成成熟 的噬菌 体颗粒 ,这种 噬菌体 可以像 X 噬菌 体一样 感 染细菌 ,然后 ,在 细菌 体内像 质粒一 样复制 (见图 1.33)。 理论上 这种设 想是可 行的, 但由于 以下两 个原因 使最初 的应用 受到限 制:① 黏粒的 自我 连接, 降低了 阳性重 组率; ②两 个或多 个外源 DNA 片 段的同 时插入 ,使最 初在真 核 染色体 DNA 本来 不相连 的片段 连接起 来了, 这样使 得对基 因组的 分析发 生误差 。人 们提出 了很多 思路来 弥补这 些缺陷 ,最 成功的 解决办 法是由 Ish-Horowics 和 Burke 提出 • 100 • 体外包 装进入 X 噬菌 体颗粒 图 1.33 黏粒载 体的克 隆步骤 来的 (图 1.34)。 他们首 先用不 同限制 酶将载 体切割 成两种 类型, 然后用 碱性磷 酸酶分 别去掉 它们的 末端磷 酸基团 ,再用 一个限 制酶切 割外源 DNA 片段, 并去掉 5' 端 磷酸。 将载体 与外源 DNA 片 段混合 并连接 ,即 可得到 有两个 载体分 子间插 入了一 个外源 DNA 片段 的重组 DNA。 • 101 • BamH I Hin6 III BamH I Hin6 III Hind III j BAP 或 CIP on amf/ 用 ///ml III 消化 1 用 SW 丨消化 | 5.P、r 5* Pv ori amff ■ ori amff ^ Hin6 III Sa/I SamH^l 、5. P Sal 1 SamH 1 Hind III »5. P Sail I BAP 或 CIP I 〇ri ampH Sa/I BamH I BamH I Hind III I 用 Sfl/wH I 消化 、分离 大片段 I 用 SarnHl 消化 、分离 小片段 . 5'Ps _ ori amff I ^ :::::::.:::丨::丨::;.:: | Sal、 eamHI 5 P BamH I H/nd III 1 连 接到用 (或& «3A I) 部分 消化所 获得的 + 35~45kb 真核 DNA 片段上 ori ~ amff \ 真核 DNA | — ! I Sa/I Hind III I 体外包 装进入 A 噬菌体 颗粒中 图 1.34 在经 两种限 制酶消 化的黏 粒中进 行克隆 此 流程是 Ish-Horowicz 和 Burker 方法 的改良 ,用 Hhd I 丨丨或 1 消化 PJB8 DNA 并 灭活突 出端后 (如 用喊 性磷酸 酶处理 ), 用 Ba/«H 1 切割线 状载体 DNA, 分 离含有 序列的 两个载 体片段 并与经 Mw I 或 SanA I 部分 消化所 产生的 34~54kb 的真核 DNA 片段相 连接。 应注意 在两个 〇« 位点之 间含有 一段完 整的质 粒序列 。多 联体在 X 噬 菌体颗 粒体外 包装反 应中作 为底物 ,导 入大肠 杆菌后 ,黏粒 DNA 重新环 化并 以大质 粒的形 式复制 。该质 粒含有 P- 内酰胺 酶基因 ,后者 陚予宿 主菌氨 苄青霉 素抗性 102 • 第一个 用黏粒 载体克 隆真核 DNA 获得成 功的是 Royal 等 ,他 们构建 了鸡的 两个片 段的基 因库, DNA 大 小超过 46kb, 含有 卵白蛋 白基因 和类卵 白蛋白 基因; Moyerowits, Ish-Howes 和 Burker 等制 备了粗 植链胞 霉素的 黏粒基 因库; Cattaned 等构 建了黏 粒的鼠 DNA 基 因库; Croweld 等用黏 粒构建 了人的 基因库 ,其中 有一组 p- 球 蛋白基 因群和 球 蛋白 基因群 ,它 们能稳 定地在 细胞中 扩散。 目前 ,这类 载体用 途日益 广泛, 并且根 据不同 的需要 ,都进 行了一 些改良 ,这 些改 良后的 载体消 除了原 来的不 利因素 ,或 者分 别被赋 予了某 些特殊 的优点 ,因此 ,可 以根 据需要 来选择 特定的 载体, 下面将 介绍一 些常用 的黏粒 载体。 (一) 用于细 菌中增 殖真核 DNA 的黏 粒载体 1.PJB8 pJB8 含 一个氨 节青霉 素抗性 (am//) 基因 ,一个 ColEl 复制 起点, 一个单 一 的 c〇5 区 (来自 Charon 4A) 以及 4 个 限制酶 的多克 隆位点 (RzmH I、 £c〇R I、 C& I 和 f/fndlll)。 此载 体长约 5.4kb, 可插入 33~46.5kb 的外源 DNA 片段 。该 黏粒的 特点在 于其 BamH I 两侧各 有一个 £c〇R I 位点 ,可 利用这 一特点 很方便 地制备 探针以 筛选黏 粒文 库中重 叠片段 的克隆 。该 黏粒的 宿主菌 推荐为 recA — 株 (图 1.35)。 2. C2RB c2RB 为 6.8kb, 它含 2 个 ow 区, 一个氨 苄青霉 素抗性 (am,) 基 因和卡 那霉素 抗性 基因 ,一个 ColEl 起点和 4 个 限制酶 的多克 隆位点 (BamH I、 £coR I、 Chi 和 Hfnd III)。 由于该 载体带 有两个 aw 区, 从而简 化了在 黏粒载 体中的 定向克 隆, 载体的 卡那霉 素抗性 基因在 重组后 的黏粒 上将不 复存在 。该载 体上同 样具有 两个位 于说 mHI 两侧的 £c〇RI 位点。 其宿主 菌为大 肠杆菌 recA_ 株 (图 1.36, 图 1.37)。 3. pcoslEMBL pcoslEMBL 为 6.1kb, 含 单一的 aw 区 ,一 个四环 素抗性 (Wr) 基因 ,一 个卡那 霉 素抗性 基因及 一个复 制起点 (来自 R6k, 该质 粒与以 ColEl 起 点的质 粒无同 源性 ,但 起始点 却相容 )。 该 黏粒用 于筛选 体内重 组的黏 粒文库 (图 1.38)。 ' (二) 用于转 染哺乳 动物细 胞的黏 粒载体 这些载 体用于 穿梭运 载基因 进出哺 乳动物 细胞, 可通过 功能性 筛选的 方法分 离真核 基因 。它们 之间主 要的区 别在于 所携带 的原核 和真核 选择标 记以及 可用于 克隆的 限制酶 切 位点有 所不同 。目前 ,已 成功地 利用这 些载体 在真核 细胞中 表达了 很多真 核基因 ,包 括:人 (3- 珠蛋 白基因 、人 a- 蛋白 基因 、人 肿瘤坏 死因子 基因等 。还 可以利 用表面 标记或 可见表 型性状 获得对 含目标 重组黏 粒的转 化体进 行鉴定 。常 用的转 哺乳动 物细胞 的黏粒 载体在 此作一 简介。 . 103 • BamH I 图 1.35 pJB8 黏 粒载体 BamH I • 104 • BamH I EcoR I 用 8amH I 和 Srr?a I 消化 cos cos — ■ ^ I amfy ori _| BamH I BamH I 连接到 35 〜 45kb 的真核 DNA 片段上 , 后 者系用 I 进行部 分消化 并用碱 性磷酸 酶处理 而获得 cos cos \karrM I 真核 DNA \\ 1 ampr ori _1 体外包 装进入 A 噬菌体 颗粒中 图 1.37 使用双 位 点载体 c2RB 进行黏 粒克隆 黏粒 DNA 经用 BamHI 和 S 爪 a I 消化 后与 去磷酸 化的长 度适宜 (35~45kb) 的外源 DNA 区段相 连接, 后者 带有与 BamH I 黏端相 匹配的 末端, 这一个 DNA 多联体 随后被 包装到 X 噬菌体 颗粒中 ,后 者用于 感染大 肠杆菌 recA 株 • 105 . Hpa I 图 1 . 38 PcoslEMBL 黏 粒载体 1 .pHC79-2cos/tk pHC79-2cos/tk 的基 因型为 ampW tk+, 这个 黏粒含 有一个 ColEl 复制起 点及串 联 排列的 双拷贝 ow 序列。 c〇5 序列 的这种 排列方 式增加 了黏粒 DNA 在体 内被包 装到转 导性颗 粒中的 效率。 该载体 惟一可 用的克 隆位点 是单一 的(:^ I 位点 ,在 此位点 ,还能 与用 Tag I 部 分消化 的外源 DNA 相 连接。 2. pCV103、 pCV107、 pCV108 这是 PJB8 的 一些衍 生黏粒 ,在 pJB8 的 I 位点上 插入的 DNA 区 段带有 真核细 胞的选 择标记 ,它们 都携带 SV40 复制 起点。 pCV103 含来自 SV2-gpt 的 大肠杆 菌次黄 嘌呤- 鸟嘌呤 磷酸核 糖转移 酶基因 pCV107 含来自 SV2-dhfi ■的 小鼠二 氢叶酸 还原 酶基因 (办/r); pCV108 含来自 SV2-neo 的新霉 素抗性 基因。 3. pTM、 pMCS' pNNL PTM 是 pJB8 的衍生 黏粒, 带有来 自质粒 AG60 的 基因, PMCS 除了携 带一个 SV40 复制 起点外 ,其他 结构与 pTM 相同; pNNL 携带 基因, 但没有 基因, 其余与 pTM 相似。 4.pHSG274 该 载体含 有一个 无论在 原核还 是真核 细胞中 都能起 作用的 基因 及一个 ColEl • 106 • 复 制起点 ,在克 隆位点 侧翼尚 有可供 对外源 DNA 进行定 向克隆 的位点 (SaZ I 和 jEcoR I)。 5. cos 202 、 ow 203 这 2 种 黏粒长 度约为 10kb, 含有 EB 病毒 复制起 点和编 码抗原 EBNA-1 的基因 ,它 们能在 人源培 养细胞 中自主 复制; 含有一 个原核 潮霉素 B 抗性 基因 UM), 该 基因插 入在 真核启 动子和 poly (A) 信 号之间 。除 此之外 ,还带 有一个 am// 基因 、一个 ColEl 复 制起点 和一个 c〇5 区。 〇«203 不同于 aw202 的是 它含有 若干个 限制酶 切位点 (所 ndlll、 SW I、 I 和 BamHII), 可 供克隆 长度为 28~42kb 的真核 DNA 片段。 6. pWE15、 pWE16 它们是 PCV107 和 pCV108 的衍 生黏粒 ,多 克隆位 点含有 罕见的 Ato I 位点 。并在 两侧分 别含有 T3 和 T7 噬 菌体的 启动子 。外源 DNA 片段克 隆于两 个噬菌 体启动 子之间 的 BamH I 位点。 pWE15 带有 rW 基因, pWE16 则是办 /r 基因 ,它们 均带有 SV40 复制起 点及克 隆基因 表达的 增强子 信号。 (PWE15 见图 1.39) 它 们是为 了简化 黏粒克 隆的“ 步查” 流程而 设计的 。属 于这 些系列 的载体 还包括 pWE2、 pWE4、 pWE8 和 pWElO, 它们含 有多克 隆位点 ,而非 单一的 BamH I 位点 ,外源 DNA 自 这些载 体转录 出的 RNA 在 5' 端含有 来自多 克隆位 点序列 的至少 30 个核 苷酸。 BamH I 图 1.39 PWE15 . 107 • 7. 卡隆粒 9 (Charomid 9) 载 体系列 卡隆 (Charon) 粒是 为了扩 大黏粒 的克隆 范围而 设计的 。它含 有一个 ow 区、 am, 基因和 ColEl 复 制起点 。除此 之外, 还包括 9 种限制 酶的多 克隆位 点及一 个由四 环素抗 性 基因的 2kb 片段的 1 〜 23 个重 复单位 组成的 间隔区 。间隔 区长度 不同决 定了能 够插入 到 载体当 中并被 包装到 X 噬 菌体颗 粒中去 的外源 DNA 的大小 。由 于间隔 区由首 尾相接 的 重复单 元组成 ,因此 带有不 同大小 的间隔 区的各 种卡隆 粒载体 必须在 reCA_ 细 菌中增 殖 。当 转移到 recA+ 细胞中 去时, 可使间 隔区变 得不稳 定并导 致产生 大小从 5. 3kb (无 间隔区 ) 到 53kb ( 由相隔 2kb 的 23 个串联 重复单 元组成 ) 的卡隆 粒系列 。卡隆 粒系列 中 不同的 成员能 容纳不 同大小 的外源 DNA 片段。 卡隆粒 9 (Charomid9) 见图 1.40 所 7Jn〇 多克 隆位点 EcoR I Kpn I BamH I Apa \ Pst l Hind III I I I J I I I I I I I Sac I Sma I Xba I Sal I Spn I 多 克隆位 点中的 1 位点与 Aw 丨 丨位点 相毗邻 图 1.40 卡隆粒 9 载体 卡隆粒 载体系 列的构 建可以 用多种 限制酶 中的任 意一种 或几种 的组合 进行消 化哺乳 动物 DNA 的基因 组文库 及克隆 预先经 Southern 杂 交确定 的持定 基因组 DNA 片段。 卡隆黏 粒系列 除了在 基因组 DNA 片 段的克 隆和制 作图谱 方面的 用途外 ,还 可用于 . 108 • 其 他目的 ,如用 转染方 法将多 拷贝基 因导入 哺乳动 物细胞 。然而 ,在 卡隆 黏粒得 到更广 泛的应 用以前 ,它们 的特殊 用途以 及在稳 定增殖 基因组 DNA 片 段方面 的能力 仍不得 而知。 需要注 意的是 ,卡 隆粒在 其每一 个串联 重复序 列单元 中均含 有一个 SWI 位点 ,而 在 多克隆 位点中 远离克 隆位点 处亦含 有一个 Sd I 位点 ,故用 SW I 消化重 组卡隆 粒后, 随即 进行重 新环化 ,可 获得一 个含完 整外源 DNA 区 段但缺 乏间隔 区的具 复制能 力的质 粒 (带 有一个 氨苄青 霉素抗 性基因 )。 这种减 小重组 克隆大 小的策 略可大 大简化 诸如绘 制外源 DNA 限制 酶切图 等工作 。然而 ,此策 略只有 当外源 DNA 缺乏 SWI 位点 时方可 采用。 可幸由 SaZI 识 别的六 核苷酸 序列含 有一个 CpG 二 核苷酸 ,因此 ,此 酶切 割哺乳 动物 DNA 的 频率相 对较小 (大约 lOOkb —次 )。 卡隆 粒载体 在氨苄 青霉素 抗性基 因中含 有一个 单一的 Pm I 位点, 在来自 Charon 4A 的含有 aw 位 点的区 域中含 有一个 单一的 I 限 制酶切 位点。 I 和 MLu I 识 别 序列中 均含有 2 个 CpG 二 核苷酸 ,因而 ,这 两种酶 亦极少 切割哺 乳动物 DNA (频率 大约 分别为 300kb 和 500kb 切割 1 次 )。 这些 酶在卡 隆粒中 的位置 使外源 DNA 的 限制酶 切图 可通过 部分消 化而很 快地绘 制出来 ,例 如:用 ML« I 消化 重组 卡隆粒 ,可 产生一 个能 在两端 进行放 射性标 记的线 状分子 ,外源 DNA 紧 靠分子 的一端 ,另 一端则 由串联 排列 的间区 所占据 。因此 ,通过 测定用 不切割 间隔区 的酶部 分消化 线状卡 隆粒后 获得的 放射 性条带 的大小 ,即可 得到一 个粗略 的外源 DNA 限制酶 切图。 所有小 于间隔 区的放 射 性标记 片段必 定来源 于携带 有外源 DNA 的 卡隆粒 的末端 。在这 种图谱 绘制策 略的一 种变通 方案中 ,用 X 噬 菌体的 ter 功能 使重组 卡隆粒 线状化 ,并采 用一段 与黏端 互补的 放射 性标记 的寡核 苷酸作 为探针 ,即 可检测 部分消 化产物 与探针 形成杂 交体的 能力。 二 、应 用黏粒 载体构 建基因 组文库 半随 机地切 割真核 基因组 DNA, 得到大 小适合 黏粒载 体克隆 的片段 ,同样 切割黏 粒载体 。然后 将两者 用连接 酶连接 ,形 成许多 真核基 因片段 与载体 相间的 串联体 。在这 些串联 体上, 每相邻 2 个 区之 间均包 含一完 整的黏 粒载体 DNA 序列以 及插入 DNA 片段 。在 c〇5 区的引 导下, 2 个相邻 ow 区 之间的 DNA 被包装 入噬菌 体头部 蛋白中 ,形 成噬菌 体颗粒 。用 它们感 染细菌 ,注入 菌体的 DNA 将 被环化 。由 于载体 上带有 质粒的 复制子 ,它们 将可以 在细菌 体内像 质粒一 样复制 。但 是它们 不能产 生包装 蛋白, 也不会 裂 解细胞 。这样 ,就可 以得到 大量的 外源基 因片段 。真 核基 因组随 机断裂 后可产 生很多 的片段 。对于 一个单 拷贝的 DNA 序列, 要想有 99% 的可能 性被克 隆出来 ,假设 每个细 菌含有 的克隆 片段都 不同, 那么至 少需要 350 000 个 转化体 。可以 通过下 列公式 判断概 率与所 需重组 体数的 关系: N = ln(l - P)/ln(l - /) 式中: iV 为所 需重组 体数; P 为期望 概率; / 为单个 重组体 中的插 入片段 在基因 组中的 份额。 将所 有的转 化子作 为一个 细菌群 体保存 ,这就 构成了 一个黏 粒文库 ,也 可经 转导而 • 109 • 获 救并作 为转导 性噬菌 体颗粒 的原种 保存。 常用的 切割载 体酶是 BamH I, 作用 于真核 基因组 DNA 的 酶多用 M6o I 或 SaM3A I, 它 们的位 点大量 、随机 地分布 ,并能 产生与 载体匹 配的黏 性末端 。也 可以根 据切割 载 体的其 他酶进 行选择 (如 £〇>1^1及7^9 I)。 将载 体用磷 酸酶进 行处理 ,可抑 制载体 DNA 的自我 连接和 包装; 同 时用两 种酶处 理载体 ,不 仅避免 了载体 DNA 的自我 连接, 而且保 证了单 一片段 的插入 。近来 一种双 ow 区改良 载体的 应用大 大简化 了操作 步骤。 下面 将分别 介绍。 (一) 在 经磷酸 酶处理 过的黏 粒载体 中克隆 以 PJB8 黏粒为 例进行 介绍。 1. 原理 此 程序的 基本原 理如图 1.41 所示。 2. 材料 20# 制备好 的闭环 pJB8 DNA 限制 性内切 核酸酶 Bam H I 琼脂糖 凝胶电 泳系统 酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1) 无 水乙醇 10mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 10XCIP 去鱗酸 化反应 缓冲液 (10mmol/L ZnCL, 10mmol/L MgCL, lOOmmol/ LTris-HCl pH8.3) 牛小 肠碱性 磷酸酶 (CIP) 5mol/L EDTA pH8.0 10% SDS 2mg/mL 蛋白酶 K 3mol/L 乙酸钠 pH5.2 TE 缓冲液 (lOmmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) l〇X 连接 缓冲液 (〇.5mol/LTris-HClpH7.6, 100mmol/LMgCl2, lOOmmol/L 二 硫苏 糖醇, 500fig/mL 牛血清 白蛋白 ) 10mmol/L ATP 纯水 丁4 噬菌体 DNA 连接酶 SM 缓冲液 (5. 8g NaCl, 2g MgS04.7H20, 50mL lmol/L Tris-HCl pH7. 5, 0.01% 明胶, 加水至 1L, 高压 灭菌) 含 有氨苄 青霉素 (50/ig/mL) 的 TB 琼 脂平板 TB 培养基 (含 10mmol/L 的 MgCb 和 0.2% 麦芽糖 ) • 110 • 1 EcoR I 5' P 5. OH 用 Sa/wH I 消化 用 CIP 消化 ,去除 5' 末 端磷酸 ori amp' Hind III Sa/I 5' OH 连接到 35 〜 45kb 的真核 DNA 片段上 ,后者 系用減 I (或 3A 1) 进行部 分消化 而获得 ori amf/ 真核 DNA Hind III Sa/I Hind III Sa/I 体外包 装进入 A 噬菌体 颗粒中 图 1.41 在磷酸 酶处理 过的载 体中进 行克隆 黏粒 PJB8DNA 用 BamH I 消 化并用 碱性磷 酸酶去 磷酸化 ,以 获得一 个带有 5'20坤 闭环 PJB8 DNA 突 出端的 载体 。 这一 5' 突出端 可与经 M6o I 或 Sa«3A I 部分 消化后 产生的 35~45kb 真核 DNA 片 段相连 ,由 此构成 的多 联体在 X 噬菌 体颗粒 的体外 包装反 应中作 为底物 ,导 入大肠 杆菌后 ,黏粒 DNA 重 新环化 并以大 质粒的 形 式复制 。质 粒中含 有一个 p- 内酰胺 酶基因 ,使细 菌宿主 具有氨 苄青霉 素抗性 • 111 • 3. 操 作步骤 载体 DNA 的制备 (1) 按质粒 提取一 节中给 出的方 法制备 20吨 闭环 pJB8 DNA, 用 2 〜 3 倍 过量的 BamHI 消化 lh。 取 一小份 (0.3pg) 进行 0.8% 琼 脂糖凝 胶电泳 ,分析 消化的 程度, 采用 0.3# 未经 消化的 pJB8DNA 作为 标准参 照物。 如消化 不完全 ,则补 加限制 酶继续 温育。 (2) 待消化 完全后 ,用抽 提样品 ,并用 2 倍体积 乙醇于 0X: 沉淀 DNA15min。 用台 式 高速离 心机于 4X: 以 12 000 x g 离心 lOmin 以回收 DNA, 并于 180ML 的 10mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 中重 新溶解 。取出 4pL 的 一小份 (约 0.5叫) 于 -20X: 贮存。 (3) 在剩余 样品中 ,加 20/iL 的 10 XCIP 去 磷酸化 反应缓 冲液和 0.25 单位的 牛小肠 碱性 磷酸酶 (CIP), 于 371C 温育 30min。 (4) 加入 EDTA (pH8.0) 和 SDS 使其 终浓度 分别为 5mmol/L 和 0.5%, 加 蛋白酶 K 使其终 浓度为 50fzg/mL, 于 56X: 温育 30min。 (5) 将反应 温度降 至室温 ,用 酚和酚 / 氯仿 各抽提 1 次 。加 0.1 体积的 3mol/L 乙酸 钠 (PH7.0)。 混 匀后加 2 倍体 积的无 水乙醇 ,再 混匀, 然后于 Ot: 放置 15min。 用台式 高速离 心机于 0X: 以 12 000 x g 离心 l〇min 以回收 DNA, 用贮于 4X: 的 70% 乙醇 洗沉淀 并再次 离心。 (6) 将 DNA 重溶在 2(^LTE 中, 并按照 如下所 述进行 连接预 试验以 检测磷 酸酶处 理的 效果。 连接 预试验 (1) 配 制下面 3 种反应 混合液 : 0.5/xg 经 磷酸酶 处理的 BamH I-pJB8 DNA 0.5fxg 经 磷酸酶 处理的 BamH I-pJB8 DNA 加 0.5网 用 BamHI 完全 消化的 X 噬菌体 DNA 0.5叫 未经 磷酸酶 处理的 BamHI-pJB8DNA [即 载体 DNA 的制 备步骤 (2) 留下的 一小 份] (2) 在每 一种混 合液中 加入: 10 X 连接 缓冲液 lfxL 10mmol/L ATP 1 卩 L 加水至 10/ixL (3) 在每一 种混合 物中取 2/uL 小份 贮存于 4*C, 在 剩余的 混合液 中加入 0.5 Weiss 单位 ( 相当于 0.2 个 用外切 核酸酶 耐受试 验来定 义的单 位或者 60 个黏端 单位。 ) 的 T4 噬菌体 DNA 连接酶 ,于 16X: 温育 4 〜 8h。 在每 种反应 混合物 中另取 2ML 小份 ,所有 6 小份 样品一 起进行 0.7% 琼脂糖 凝胶电 泳分析 。剩余 的反应 混合物 贮存于 -20X:。 (4) 如果连 接预试 验的结 果令人 满意, 将去磷 酸化的 DNA 分装成 每小份 并于 -20X: 贮存。 用 或 Sa«3A I 对真核 DNA 进行部 分消化 用 或 Sa«3AI 进行部 分消化 ,以 制备用 于克隆 的真核 DNA。 由于在 大多数 • 112 • 黏粒载 体中进 行克隆 时要求 DNA 的片 段要大 ,因 而消化 前真核 DNA 的 大小必 须至少 为 200kb。 在 用限制 酶进行 部分消 化之后 ,按 照蔗糖 密度梯 度沉降 法选择 大小范 围与载 体相宜 ( 通常为 35 〜 45kb) 的 DNA。 可以 采用各 种大小 的完整 X 噬菌体 DNA 或者用 PBR322 多聚 体作为 标准参 照物。 连接 和包装 连接 反应中 DNA 的 总浓度 应大于 200/ig/mL 以利于 黏粒载 体双臂 和真核 DNA 之 间形 成混合 多联体 。由于 载体不 能自我 连接, 故连接 反应可 用摩尔 数过量 的载体 分子来 进行 。下面 的连接 反应中 ,载体 DNA 和真核 DNA 的摩 尔比为 9:1。 (1) 混合以 下样品 : 经 磷酸酶 处理过 的载体 DNA 3/ug 真核 DNA 片段 (35 〜 45kb) 3吨 10 x 连接 缓冲液 2ptL 1 0 mmol/ L ATP 2/mL 加水至 20fiL 取 一小份 (1/xL) 贮存于 4t:。 在剩 余反应 中加入 1~2 Weiss 单位的 T4 噬菌体 DNA 连接 酶并于 16t: 温育 过夜。 (2) 在连 接反应 结束时 ,另取 l^L 小份 与步骤 (1) 中 留下的 一份一 起进行 0.4% 琼脂糖 凝胶电 泳或脉 冲电场 凝胶电 泳进行 分析。 如果连 接成功 ,一 些真核 DNA 应转变 成相对 分子质 量高的 多联体 。大多 数载体 DNA 仍 应处于 未连接 状态。 (3) 将连 接好的 DNA 包装到 X 噬菌体 颗粒中 ,每一 包装反 应中, 多联体 DNA 的用 量 不超过 0.5fxg。 以包 装前连 接预试 验步骤 (3) 中留 下的样 品作为 对照。 (4) 包装 完成后 ,在每 一反应 中加入 0.5~1.0mL 的 SM 缓冲液 ,并 贮存于 4t:。 从每种 反应物 中取出 10/iL 小份与 0. lmL 的 SM 及 0.2mL 在 TB 培 养基中 生长过 夜的大 肠杆菌 recA— 株 (如 ED8767 或 DH1) 新 鲜培养 液混合 (TB 培养基 中加入 10mmol/L 的 1\^(:12和0.2% 麦芽糖 )。 将被感 染的培 养物在 37t: 温育 20min, 使噬菌 体颗粒 吸附。 然后 lmL TB 培 养液于 37X: 继 续温育 45min, 使 氨苄青 霉素抗 性基因 表达。 (5) 取 0.5mL 或 O.lmL 的 细菌培 养物涂 布在含 有氨苄 青霉素 (50fxg/mL) 的 TB 琼脂平 板上于 37X: 培养 过夜。 然后计 算细菌 菌落数 。每 微克已 连接好 的黏粒 -真核 DNA 应获得 (5xl〇4)~(5xi〇5) 的细菌 菌落。 (6) 挑 取一些 单菌落 。在含 50/zg/mL 氨苄青 霉素的 TB 培养基 中进行 小规模 (5mL) 过夜 培养。 用碱裂 解法自 4 〜 5mL 的各细 菌培养 物中分 离黏粒 DNA。 用 限制酶 消化 DNA 并通 过凝胶 电泳分 析所得 片段的 大小。 (二) 在经两 种限制 酶消化 并经磷 酸酶处 理的黏 粒载体 中克隆 1. 原理 按 Ish-Horowicz 和 Burker 报道 的用于 制备像 PJB8 那样携 带单一 aw 位点的 黏粒载 体的改 良程序 。此 程序可 极大地 减少获 得含有 多拷贝 载体的 重组克 隆的可 能性。 此法的 原理如 (图 1.37) 所示 。黏粒 载体分 成两份 ,每 份都用 切点分 别位于 aw 位点两 侧的限 • 113 . 制酶 (Hmd III 和&/ 1) 消化 。所得 分子的 单链突 出端经 用几种 酶促反 应中的 任何一 种进行 处理后 ( 碱性磷 酸酶是 最常用 的一种 ,但 S1 核酸 酶和绿 豆核酸 酶也能 奏效) 丧 失连 接能力 。正是 这种处 理抑制 了连接 过程中 载体自 身连接 形成多 联体的 反应, 并减少 含有 黏粒但 无插入 片段的 菌落数 。然后 ,用 SamHI 消 化线状 DNA 分子 并通过 凝胶电 泳分 离含有 序列 的片段 。这 些片段 再与经 I 或 Scz«3A I 部 分切割 所产生 的真核 DNA 片 段连接 ,形 成可在 包装反 应中作 为底物 的简单 多联体 。由 第一种 限制酶 产生的 单链 突出端 破坏后 ,可 防止形 成更复 杂的多 联体。 在最 初的程 序中, Ish-Horowicz 和 Burke 并未按 一 ■定大 小选择 DNA 片段插 入黏粒 载体, 而是用 从如 I 对相 对分子 质量高 的真核 DNA 进行消 化直至 消化产 物的平 均大小 为 35 〜 45kb。 随后 ,用 碱性磷 酸酶对 DNA 进 行去磷 酸化处 理以防 小片段 DNA 连接成 一个 足以被 包装到 X 噬菌 体颗粒 中去的 大分子 。在 大多数 情况下 ,我们 建议采 用筛分 DNA 大小的 步骤而 省去碱 性磷酸 酶处理 。这 些变更 提高了 连接效 率并减 少了产 生携带 有原 、真 核基因 组中的 不相邻 DNA 序列的 黏粒的 可能性 。如 果真核 DNA 量太少 ,不 能 按大小 进行分 级分离 ,则仍 可采用 Ish-Horowicz 和 Burke 最初 报道的 程序。 Ish-Horowicz 和 Burke 程序 的主要 缺点是 酶促反 应步骤 太多及 需经凝 胶电泳 纯化黏 粒载 体双臂 。为避 免此类 问题, Bates 和 Swift 以及 Poustka 等 已经构 建了一 些载体 (如: c2RB)。 此载 体可大 大简化 制备黏 粒载体 双臂的 过程, 他们的 方法概 括于图 1.37 并将在 第三种 方法中 做详细 叙述。 2. 材料 同上节 ,只 须增 加相应 的限制 酶如说 I、 Sa/ I、 JVf6o I 或 Sa«3A I DEAE- 纤 维素膜 电泳回 收系统 100mmol/L ZnCL 3. 操 作步骤 载体 DNA 的制备 (1) 取一份 (20叫) 制备好 的闭环 pJB8DNA, 用 2 〜 3 倍 过量的 f^dlll 消化 lh。 与 此同时 ,用 SaZ I 消化 另一份 (20Mg) pJB8 DNA。 自每一 反应中 各取出 1 份 (0.3叫) 进行 0.8% 琼脂 糖凝胶 电泳, 对消化 程序进 行分析 。采用 〇.3哗 未 消化的 pJB8 DNA 作标准 参照物 。如 消化 不完全 ,则补 加更多 的限制 酶继续 温育。 (2) 待消化 完全时 ,用酚 / 氯仿抽 提样品 ,并用 2 倍体积 乙醇于 0X: 沉淀 DNA 5mm,各样品DNA分别重新溶解在180ML的10mmOl/LTriS-HCl(pH8.3)中o自各 样品 中取出 VL 小份 (约 0.5叫) 贮存于 -20X:。 (3) 在剩余 的样品 中加入 20ML 的 10 x CIP 去 磷酸化 反应缓 冲液及 〇.25 单 位的牛 小 肠碱性 磷酸酶 (CIP), 于 37TC 温育 30min。 (4) 加入 EDTA (pH8.0) 和 SDS 使其 终浓度 分别为 5mmol/L 和 0.5%, 加 入蛋白 酶 K 使其终 浓度为 50^g/mL, 于 56X: 温育 30min。 (5) 将反应 温度降 至室温 ,用 酚及酚 / 氯仿 各抽提 1 次 ,加入 0.1 体积的 3mol/L 乙 酸钠 (pH7.0), 混匀, 再加入 2 倍体积 的乙醇 ,再 混匀后 ,于 01C 放置 15min。 用台式 • 114 • 高速离心机于4t:以 12 000xg离心10min回收DNA,用贮于4t:的70%乙醇洗沉淀并 再 离心。 (6) 将 两样品 DNA 分 别重新 溶解在 50pL 的 TE (pH7.6) 中 。为了 检验磷 酸酶处 理 的效果 ,进行 一系列 连接预 试验。 其余的 DNA 样品 贮存于 -20t:。 (7) 如果 连接预 试验的 结果令 人满意 ( 未检测 到载体 的连接 ), 则将 DNA 样品融 化并 在每一 样品中 加入: l〇xfiawH I 限制酶 缓冲液 lOfiL 水 40 卩 L BamH I 2 〜 3 倍过量 反 应物于 37t: 温育 lh, 从每一 种反应 物中取 出一小 份进行 0.8% 琼 脂糖凝 胶电泳 分析, 以检查 消化的 程度。 (8) 如消 化完全 ,通 过进行 0.8% 琼脂 糖凝胶 电泳的 方法将 剩余样 品中的 DNA 片 段分开 。用 DEAE- 纤维素 膜电泳 回收法 将两种 BamH I-Hhd III DNA 片 段中较 大的一 种和 两种技 zmH I-Sd I DNA 片段中 较小的 一种分 离回收 出来。 (9) 将 回收的 DNA 片 段重新 溶解在 20fiL 的 TE (pH8.0) 中 ,用溴 化乙锭 荧光法 估算 样品中 DNA 量。 用 碱性磷 酸酶处 理真核 DNA 真核 DNA 的 来源很 充足时 ,可按 部分消 化法及 根据大 小进行 分级分 离的方 法来制 备用 于克隆 的真核 DNA。 当 DNA 量有 限时, 则应避 免使用 密度梯 度离心 的方法 分级分 离 DNA, 因 为此法 回收的 DNA 量不足 。这些 情况下 ,最好 的方案 是消化 DNA 直至平 均大 小约为 35 〜 45kb, 然 后用碱 性磷酸 酶处理 。这 可抑制 小片段 DNA 连 接在一 起形成 大 小足以 使其能 包装到 X 噬 菌体颗 粒中去 的分子 。如 果省掉 去磷酸 化步骤 或去磷 酸化的 效率低 ,就会 有一个 很大的 危险性 ,即制 备过程 中产生 的较小 的真核 DNA 片段 相互之 间以 及与黏 粒载体 之间发 生连接 ,产生 含有来 自两个 或两个 以上原 来在基 因组上 并不相 邻的 区段的 序列的 重组体 。体外 包装反 应中所 产生的 抑制效 应仅能 部分地 降低这 种危险 性 。平均 大小为 42kb 的全部 DNA 片 段中将 含有许 多长度 在平均 值以下 的分子 ,显然 这些 较小分 子仅仅 构成总 DNA 重量的 一部分 ,但它 们在分 子集群 中所占 的分子 数则更 为显著 。由 于连接 的动力 学效应 取决于 DNA 的反应 性末端 的浓度 ,这些 较小的 分子将 优先结 合形成 多联体 。这种 情形只 能用去 磷酸化 的方法 防止。 (1) 用 M6〇I 或 Sa«3AI 对 30# 真核 DNA 进行部 分消化 ,使其 断裂成 45kb 标准 大小 的片段 。如下 所述, 采用碱 性鱗酸 酶处理 的方法 来去除 5' 磷酸基 ,以 代替 密度梯 度 离心分 级分离 DNA 的 方法。 (2) 将样 品温度 提高至 701C 并保持 15min 以灭活 限制酶 ,然 后加入 ZnCl2 使 其终浓 度为 lmmol/L, 并加入 2 单位 的牛小 肠碱性 磷酸酶 (CIP)。 将 1 小份 (1/ug) 反 应物加 入含有 0.3 吨线 状质粒 (如用 BamH I 切割的 pUC) 的 小微量 离心管 (〇.5mL) 中 ,设 一 对照管 ,即在 l〇ML 的 IX 限制 酶缓冲 液中含 0.3/zg 同 样的线 状质粒 ,所有 3 种样品 均于 37"C 温育 30min。 (3) 在大 反应管 中加入 SDS 和 EDTA (pH8.0) 使浓度 分别为 0.5% 和 5mmol/L, 加 蛋白酶 K 使其终 浓度为 50^g/mL。 于 56X: 温育 30min (75X: 温育 lOmin)。 . 115 . 将反应 温度降 至室温 ,小 心地用 酚和酚 /M 仿 分别抽 提一次 。加入 0.1 体积的 3md/L 乙酸钠 (pH7.0), 然后加 2 倍 体积的 乙醉于 01C 沉淀 DNA15min。 于 4X: 以 12 000><&离心1〇11^回收〇\八。 (4) 与 此同时 ,于 75X: 加热 较小的 (对照 ) 反应管 lOmin ( 以灭活 CIP)。 将反应 温度冷 却至室 温并用 酚和酚 / 氯 仿各抽 提一次 ,加 0.1 体积的 3mol/L 乙酸钠 (PH7.0) 和 2 倍 体积的 乙醇于 0X: 沉淀 DNA 15min。 于 4X: 以 12 OOOXg 离心 l〇min 回收 DNA。 用处于 4*C 的 70% 乙醇沉 淀并再 度离心 。用 lO^tLTE (pH7.6) 重溶 DNA。 (5) 按下 述方法 将真核 DNA (经去 磷酸化 处理的 或按大 小选择 好的) 连接 到黏粒 载 体的双 臂上。 连接 和包装 连 接反应 中的总 DNA 浓度 应大于 200;xg/mL, 这 有利于 黏粒载 体双臂 与真核 DNA 之间形 成混合 多联体 。由 于载体 不能自 我连接 ,故反 应可用 摩尔数 过量的 载体分 子来进 行 。下 面的连 接反应 中载体 DNA 与真核 DNA 的摩 尔比为 9:1。 (1) 建立 2 种反应 混合液 如下: 反应液 a 真核 DNA 片段 (35~45kb) l^g pJB8 的 Hhd III 〜 Bam H I 片段 lpg pJB8 的 Sa/ I 片段 lfig 10 X 连接 缓冲液 2pL lOmmol/L ATP 2fiL 加水至 20pL 反应液 b pJB8 的 Hfnd I 片段 lfxg pJB8 的 SaZ I 〜 BamH I 片段 lpg 10 X 连接 缓冲液 2pL 1 0 mmol/ L ATP 2/xL 加水至 20/liL 从每一 种反应 混合物 中取出 一小份 (2^L) 并 贮存于 4X:, 在每种 混合液 中加入 1~2 Weiss 单位的 T4 噬菌体 DNA 连接酶 ,于 16X: 温育 过夜。 (2) 在连接 反应结 束时, 从每种 反应物 中加取 2/iL 小份, 与步骤 (1) 中留 下的一 小份同 时进行 脉冲电 场凝胶 电泳或 0.4% 琼脂糖 凝胶电 泳分析 。如 果连接 已获得 成功, 则真核 DNA 应转变 成相对 分子质 量高的 多联体 ,而 黏粒 DNA 的 双臂应 转变成 同源双 体 或异源 双体。 (3) 进行对 照试验 ,以 査证 包装混 合液的 效率在 每微克 X 噬菌体 DNA 达 108pfu 以 上 。然 后将一 小份连 接好的 DNA 包装到 X 噬菌体 颗粒中 ,包 装反应 中所用 DNA 多联 体 的量不 得超过 〇.5纯。 作 为对照 ,对连 接预试 验步骤 (3) 所留 下的样 品进行 包装。 连接 混合液 中未用 的部分 贮存于 4X:。 (4) 包装 反应完 成后, 在包装 反应物 中加入 lmLSM 缓 冲液并 贮存于 4X:, 在每种 反应物 中各取 lpL 和 lO^L 小份与 0• lmL SM 缓 冲液和 0.2mL TB 培养基 中生长 过夜的 大 肠杆菌 recA— 株 (如 ED8767 或 DH1) 的 新鲜培 养液相 混合, TB 中含 10mm〇l/L • 116 • 1\^(:12和0.2%麦芽糖。将被感染的培养物在371[:温育2〇1^11,使噬菌体颗粒吸附,然 后加 lmL TB 培养基 ,在 371C 继 续温育 45mm, 使氨苄 青霉素 抗性基 因得到 表达。 铺平板 细菌被 X 噬菌 体有效 感染的 能力应 在用于 构建黏 粒文库 前予以 证实。 最好的 方法是 铺平板 细 菌上测 定已知 噬菌体 原种的 滴度。 (5) 取 0.5mL 和 O.lmL 细菌 培养物 涂布在 含氨苄 青霉素 (5(Vg/mL) 的 TB 琼脂 平 板上于 37T: 培养 过夜。 然后计 算细菌 菌落数 ,每 微克已 连接好 的黏粒 -真核 DNA 应 获得 (5 X104) 〜 (5 X105) 的细 菌菌落 。计 算原连 接混合 物中黏 粒的总 产量, 如果所 得到的 数目令 人满意 ,则对 剩余的 连接混 合物进 行包装 ,每一 次包装 反应中 所用的 DNA 浓度应 不大于 0.5哗。 将包 装好的 黏粒贮 存于含 有几滴 氯仿的 SM 缓 冲液中 ,用于 文库 扩增或 筛选。 (6) 与 此同时 ,挑 取一些 单菌落 ,在含 5(^g/mL 氨苄青 霉素的 TB 培养基 中进行 小规模 (5mL) 的过夜 培养。 用碱裂 解法自 4~5mL 的各细 菌培养 物中分 离黏粒 DNA。 用限制 酶消化 DNA 并通过 凝胶电 泳分析 获得各 种大小 片段。 (三) 含有双 C05 位点 的载体 的制备 1. 原理 仅含 有一个 位 点的黏 粒载体 (如 pJB8 和它 的衍生 黏粒) 可通过 几种限 制酶联 合消 化进行 制备, 并用碱 性磷酸 酶进行 去磷酸 化处理 。载 体片段 则经凝 胶电泳 进行纯 化 。由于 操作程 序复杂 ,黏 粒双臂 的总收 获量常 常低得 可怜。 为了避 免这些 问题, Bates 和 Swift 已经 介绍了 一种用 于制备 含有双 cos 位点 (见图 1.38) 的改 良黏粒 载体的 双臂 的简化 程序。 在这种 载体中 , 2 个 c〇5 位点 由产生 平端的 一种限 制酶识 别位点 隔开。 因此, 只要用 在克隆 位点和 2 个 c〇5 序 列之间 的位点 上进行 切割的 两种限 制酶进 行消化 就 能轻而 易举地 制备载 体双臂 。当 双臂混 合液在 高浓度 ATP (5mmol/L) 存在 下连接 到去 磷酸化 的真核 DNA 上时 ,平 端之间 重新连 接的概 率很低 。在 这些条 件下, 连接反 应的 主产物 是两端 与黏粒 臂相连 的真核 DNA 区段所 构成的 简单多 联体。 〇« 位 点多联 体 中以同 样一种 方向排 列的比 例约占 50%, 因而 能够被 包装到 X 噬菌体 颗粒中 。在下 面 给出的 方法中 ,用黏 粒载体 c2RB 作 为示例 。然而 ,此 程序同 样适合 于其他 含有双 〇«位 点的黏 粒载体 (如 pC〇s2EMBL), 只是应 采用与 此相适 应的限 制酶进 消化。 2. 材料 同上一 操作。 3. 操 作步骤 (1) 加 20fig C2RB DNA 到 20fiL 的 10 X Sma I 限 制酶缓 冲液中 (1 x Sma I 缓冲液 应含 20mmo/LKCl), 用水将 反应体 积调至 200mL, 加 40 单位的 SmaI, 于室温 下温育 3h〇 (2) 取出 2/iL (0.2Mg) 的反应 物进行 0.7% 琼脂糖 凝胶电 泳分析 ,以 鉴定限 制酶消 化的 程度。 用以下 DNA 作为 标准参 照物: ①未经 消化的 C2RBDNA; ②用 过量的 . 117 • BamHI 消化的 C2BRDNA。 如反应 不完全 (仍 出现超 螺旋的 或带切 口的环 状质粒 DNA 即 可证实 ), 补加 Sma I (20 单位 ), 于 室温继 续温育 2h。 在 补加第 二种限 制酶前 ,可酌 情用碱 性磷酸 酶对线 状载体 进行去 磷酸化 ,将 2fxL0.1mol/L 的 211(:丨2和0.25 单位 的牛小 肠碱性 磷酸酶 直接加 入到反 应中去 ,于 37X: 温育 30min, 加 SDS 和 EDTA (pH8.0) 使其 终浓度 分别为 0.5% 和 5mmol/L。 加入 蛋白酶 K 使其浓 度达到 50Mg/mL。 反 应液于 56t: 温育 30min, 用酚 / 氯 仿及滅 仿 各抽提 1 次 。用 180ML 10mmol/L Tris-HCl (pH7.6) 重溶 DNA, 并加 20ML 适合于 第二种 限制酶 反应的 10 X 缓 冲液。 Smal 位点 的去 磷酸化 是进一 步的保 险措施 ,是为 了防止 连接过 程中形 成载体 DNA 多联体 。然 而 ,在大 多数情 况下, 这种处 理并无 必要。 (3) 当消化 完全时 ,加 NaCl 使其终 浓度为 150mmol/L 并加 40 单位的 BamHI。 于 37X: 温育 3h 后 ,取 一小份 (5pL; 0.5吨) 进行 0.7% 琼脂糖 凝胶电 泳分析 。应 当只呈 现 两条电 泳条带 (1.7kb 和 5.1kb) 而无线 状黏粒 DNA 存留 。如 果消化 不完全 ,则可 补加 20 单位的 BamH I 并于 37X: 继 续温育 2h。 真核 DNA 也能在 c2RB 的 £c〇R 丨、 所 nd III 或 Ch I 位 点上进 行克隆 。如果 打算应 用这些 位点中 的任 何一个 ,则 根据第 二种限 制酶调 整消化 条件。 (4) 当消化 完全时 ,用酚 / 氯仿 及单用 氯仿分 别抽提 反应液 1 次 。用 2 倍体 积乙醇 于 0X: 沉淀 DNA 5min。 用台式 高速离 心机于 4X: 以 12 000 x g 离心 15min 回收 DNA 并 将 DNA 重溶在 40)uL 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 中。 (5) 进行连 接和包 装反应 。切 记连 接反应 中应当 含有终 浓度为 5mmol/L 的 ATP。 如果使 用去磷 酸化的 载体, 反应中 ATP 的浓度 可降至 0.5~lmmol/L。 三 、黏 粒文库 的扩增 和贮存 已 包装到 X 噬 菌体颗 粒中去 的黏粒 ,如贮 存在含 有几滴 氯仿的 SM 缓 冲液中 可于几 周内保 持稳定 。如 果在原 包装反 应中已 获得足 够的重 组黏粒 ,那么 在筛选 前就不 必再扩 增文库 。然而 ,大多 数研究 者并不 愿将它 们的全 部重组 黏粒贮 存液供 一次筛 选使用 。在 大多数 情况下 ,他 们宁 愿冒由 于黏粒 不均衡 生长而 致失真 的危险 ,也 要进行 文库的 扩增。 用于黏 粒文库 扩增和 贮存的 方法有 3 种: (1) 将 已包装 的黏粒 转导至 细菌中 ,并 让细菌 在铺于 TB 琼脂 平板上 的硝酸 纤维素 滤膜 上生长 (每张 138mm 滤 膜约有 5 X104 细 菌菌落 ), 再 将滤膜 上的文 库影印 到其他 的 滤膜上 ,以 供筛选 并用于 -70X: 贮存 ,此法 麻烦, 需要制 备和贮 存大量 的滤膜 (每个 文库 需多达 30 张滤膜 )。 而且有 时由于 原滤膜 的菌落 不再重 新生长 而丢失 ,影响 实验结 果 。然而 ,它 的优点 是可将 文库的 失真降 至最小 。在任 何一个 步骤中 ,含 有不同 重组黏 粒 的混合 菌群都 不会在 生长中 发生相 互竞争 。因此 ,也 就不 可能发 生由于 宿主菌 生长速 度的差 异而导 致严重 失衡。 (2) 将已 包装的 黏粒转 导至细 菌内, 再将细 菌接种 在选择 性培养 平板上 ,挑 取自平 板上长 出的菌 落转入 含适当 种类抗 生素的 TB 培 养基中 。混 合的细 菌菌群 生长数 代后, 其培 养物于 -70X: 贮存 。需 要时, 取一小 份融化 并接种 ,此 程序比 第一种 方法更 节省时 间, 也不必 贮存和 处理大 董滤膜 。然而 ,这会 带来一 些疑虑 ,即携 带有重 组黏粒 的某些 • 118 • 细 菌生长 得不如 其他细 菌旺盛 ,结 果导致 黏粒文 库中某 些特定 序列的 过多或 过少。 (3) 将 已包装 好的黏 粒转导 至细菌 ,将细 菌铺于 选择性 平板上 ,挑取 生长出 的菌落 转入 含适当 种类抗 生素的 TB 培养 基中, 当混合 的细菌 菌群生 长有限 代数后 ,用 重组缺 陷 (red—) 和裂 解功能 突变的 X 噬 菌体株 ( 通常是 Sam7) 进行超 感染, 在超感 染细菌 中潜 伏的黏 粒发生 体内包 装并出 现在噬 菌体颗 粒的收 获物中 ,后者 可贮存 很长时 间仍保 持存活 。这 是最复 杂的扩 增方法 ,它 包含几 个步骤 (细菌 生长、 超感染 及包装 )。 在这 些 步骤中 ,也许 有利或 不利于 单个重 组体的 选择。 上述方 法都不 理想, 它们需 投入大 量劳动 或因宿 主菌生 长缓慢 和黏粒 体内包 装不足 而引起 某些序 列的偏 向分布 。在 某些情 况下, 所用扩 增方法 取决于 怎样能 最大限 度地利 用文库 。例如 ,用 重组方 法筛选 黏粒文 库需要 产生能 将黏粒 转导至 具有重 组能力 的细菌 中的 噬菌体 颗粒。 在这种 情况下 ,第三 种方法 是最佳 选择。 用杂交 进行黏 粒文库 的常规 筛选时 ,我 们则推 荐第一 种方法 作为最 安全的 选择。 (一) 影 印滤膜 1. 原理 将 铺于含 适当种 类抗生 素的琼 脂平板 表面的 硝酸纤 维素滤 膜上生 长的细 菌菌落 ,按 Hanahan 和 Meselson 介绍 中的方 法进行 原位 冰冻。 一 张 138mm 的滤膜 上大约 可容纳 5 xi〇4 菌落 。因此 ,为获 得一个 能够反 映哺乳 动物基 因组重 叠片段 的文库 大约需 30 张 滤膜 。之后 ,便可 从一套 主滤膜 上制备 影印滤 膜用于 文库的 筛选和 增殖。 2. 材料 已包 装黏粒 的包装 混合物 大 肠杆菌 recA_ (如 ED8767 或 DH1) 无去污 剂的硝 酸纤维 素滤膜 (MUlipore HATF 或相当 产品) Whatman 3MM 滤纸 铝箔 密封 塑料袋 玻璃 涂布棒 丝 绒的影 印铺板 器或相 当的重 玻璃板 含适当 种类抗 生素的 TB 琼脂 平板。 含适当 种类抗 生素及 25 % 甘油的 TB 琼 脂平板 (冰 冻平板 )。 所有与 细菌接 触的材 料都应 该是无 菌的。 3. 滤膜 的准备 (1) 计算所 需滤膜 的数量 : 平 板的大 小是由 某些厂 家特别 指定的 ,平板 的实际 内径较 此为小 (如 90mm 的平板 的有效 直径为 82mm) 〇 • 119 • 平 板直径 滤 膜直径 菌落数 / 滤膜 90mm 82mm 1.5X104 150mm 138mm 5.0X104 (2) 用 软铅笔 或超细 圆珠笔 在干滤 膜上标 上编号 。分别 将每张 滤膜一 张叠一 张地漂 浮在一 盘水的 表面直 至其彻 底湿润 ,然 后浸没 数分钟 ,当所 有滤膜 按此法 处理后 ,将它 们一张 一张地 自水中 取出并 将每张 分别夹 在两张 干燥的 Whatman 3MM 滤纸中 。用 铝箔 将 它们包 在一起 ,在 15 1bf/in2 (1.034Xl〇5Pa) 高 压下蒸 汽灭菌 30min。 之后, 放入密 封 塑料袋 中于室 温存放 备用。 4. 操 作步骤 (1) 无菌镊 子夹出 1 张已标 好编号 的无菌 滤膜, 标有编 号的一 面向下 平放在 已制备 了 Id 的 琼脂平 板表面 。当滤 膜彻底 湿润后 ,将 其自 平板上 剥离并 将标号 朝上重 新放置 在同 一个平 板上。 (2) 将数 份含有 104 已 包装黏 粒的包 装混合 物分别 加入数 个含有 200 卩 L 在 10 111111〇1/[]^^(:12和0.2%麦芽糖的丁8培养基中生长过夜的、新鲜的大肠杆菌1^(^-(如 ED8767 或 DH1) 培 养物的 试管中 ,培 养物在 37X: 温育 20min。 大量 的包装 混合物 可抑制 噬菌体 颗粒吸 附到细 菌上并 能杀死 含黏粒 的细菌 。因此 , 如黏粒 浓度低 (每毫 升包装 混合物 <1〇4 黏粒 ), 则 应在更 大的体 积中用 更多的 细菌进 行感染 ( 如每毫 升包装 反应物 加 10mL 细菌 培养物 )。 步骤 (3) 之后 ,于 以 500〇xg 离心 l〇min 回 收细菌 。重悬 细菌于 TB 培 养基中 ,每毫 升初始 细菌培 养物用 lOOfxLTB 培养基 ,随后 继续进 行步骤 (4)。 (3) 在各试 管中加 0.5mLTB 培养基 ,在 37X: 继 续温育 45min, 使氨 苄青霉 素抗性 基因 表达。 (4) 在铺于 含适当 抗生素 TB 琼 脂平板 表面的 已标编 号滤膜 (138mm) 的中 央涂布 0.5mL 的感 染细胞 培养物 。用 一灭菌 玻璃涂 布棒, 将液体 均匀地 涂布在 滤膜的 表面。 在 滤膜的 边缘留 下一条 2 〜 3mm 宽的无 菌边界 。在涂 布接种 物后, 将平板 (不需 翻转) 半开 盖在层 流工作 台中放 置几分 钟以使 接种物 蒸发。 然后将 盖盖上 ,翻 转平板 ,在 37X: 温 育大约 8~10h 直至 小菌落 (直径 0.1 〜 0.2mm) 出现。 制备 2~3d 后的 平板吸 附接种 物的效 率较新 鲜制备 的平板 更高。 (5) 也 可酌情 在此时 制备影 印滤膜 [见 步骤 (7)], 否则, 将滤膜 (细 菌菌落 朝上) 转移至 含适当 种类抗 生素和 25% 甘油的 TB 琼脂 平板上 ,于 37X: 温育 2h。 (6) 用 Parafilm 膜 仔细封 好平板 ,放 置在封 闭的塑 料袋中 ,翻 转倒置 ,于 -70X: 贮 存。 使该平 板恢复 至室温 便可进 行影印 (仍处 于倒置 的位置 )。 (7) 制取复 制滤膜 的方法 如下: ① 预先制 备一叠 Whatman 3MM 滤纸 (每张 滤纸较 滤膜稍 大一些 )。 ② 自贮存 平板上 剥离原 硝酸纤 维素滤 膜并使 菌落向 上平放 在湿润 的无菌 3MM 滤 纸 垫上。 ③ 在 潮湿的 无菌硝 酸纤维 素滤膜 上标号 并将其 放置在 原硝酸 纤维素 滤膜上 。小心 避免 在两张 滤膜之 间滞留 气泡。 最好的 方法是 稍稍弯 曲第二 张滤膜 以使第 二张滤 膜的中 . 120 • 央首 先接触 第一张 滤膜。 一旦互 相接触 ,应小 心避免 滤膜间 的相对 移动。 尽量使 两张滤 膜不完 全重叠 ,以 便于两 张膜的 分离。 ④ 用 一丝绒 的影印 铺板器 (见图 1.42) 或一 块重玻 璃板将 两张滤 膜紧密 地压在 一起。 ⑤ 用 18 号针头 在每对 滤膜上 打一系 列孔使 两张滤 膜相对 定位。 ⑥ 剥 离滤膜 。将 影印滤 膜放置 在含适 当种类 抗生素 的新鲜 TB 琼脂 平板上 ,在 37X: 温育 直至出 现菌落 (通常 4~6h)。 ⑦ 将 原硝酸 纤维素 滤膜放 置在含 适当抗 生素和 25% 甘油 的新鲜 TB 琼脂平 板上, 在 37X: 温育 lh, 然后 如步骤 6) 所述 冻存。 复制的 滤膜可 用于再 次影印 ,也可 贮存于 -701C, 或用于 原位杂 交筛选 。为避 免污染 ,重 要文库 的滤 膜最好 在层流 通风橱 中进行 处理。 图 1.42 使用 影印铺 板器复 制在硝 酸纤维 素滤膜 上生长 的菌落 (二) 黏粒 文库在 液体培 养基中 的扩增 1. 原理 黏 粒文库 在液体 培养物 中培养 ,要 比硝酸 纤维素 滤膜上 细菌菌 落的系 列复制 更简单 也 更方便 。然而 ,因 为细 菌在液 体中以 混合菌 群的形 式生长 ,所以 有可能 由于含 有不同 黏粒的 细菌的 生长速 率不同 ,而 引起文 库成分 的改变 。在下 面的程 序中, 含黏粒 的细菌 起初 生长在 平板上 ,这既 使我们 可以精 确的计 算独立 的黏粒 克隆的 数目, 也可粗 略估计 单菌 落的生 长速率 的变化 。应小 心地限 制细菌 在液体 培养中 的继续 生长, 以便最 大限度 地减 少在扩 增后的 菌群中 克隆的 分布情 况发生 明显漂 移的可 能性。 2. 材料 已包 装黏粒 的包装 混合物 大 肠杆菌 recA_ 株 (如 ED8767 或 DH1) 含1〇11^1〇1/1^\^(:12和0.2%麦芽糖的丁8培养基 . 121 • 含 有适当 种类抗 生素的 TB 琼 脂平板 (150mm) 无 菌玻璃 涂布棒 无 菌甘油 所有与 细菌接 触的材 料都应 该是无 菌的。 3. 操 作步骤 (1) 将含有 104 已包装 黏粒的 数份包 装混合 物分别 加至数 个含有 lOOyL 在含 10mmol/L MgCl2 和 0.2% 麦 芽糖的 TB 培养基 中生长 过夜 的大肠 杆菌 recA— 株 (如 ED8767 或 DH1) 新鲜培 养物的 试管中 ,培 养物于 37X: 温育 20min。 大量 的包装 混合物 可抑制 噬菌体 颗粒吸 附到细 菌上并 能杀死 含黏粒 的细菌 。因此 ,如黏 粒浓度 低 ,则 应在更 大的体 积中用 更多的 细菌进 行感染 ,步骤 2) 之后 ,于 4X: 以 5000 xg, 离心 l〇min 回收 细菌 。重悬 细菌于 TB 培 养基中 ,每 104 个 已包装 黏粒用 100MLTB 培养基 ,随后 继续进 行步骤 3)。 (2) 在 每个含 104 包装黏 粒的感 染培养 物中分 别加入 0.5mL 的 TB 培养基 ,于 37t: 继 续温育 45min。 (3) 将 0.5mL 的感 染细菌 培养物 加在含 有适当 种类抗 生素的 TB 琼 脂平板 (150mm) 的中央 。用 一无 菌玻璃 涂布棒 ,将 液体均 匀地涂 布在琼 脂表面 。在琼 脂的边 缘留 下一条 2~3mm 宽 边的无 菌边界 。于 37X: 温 育菌落 (直径 0.2~0.3mm)。 (4) 估算 菌落数 ,然后 用玻璃 涂布棒 从每个 150mm 平板 中挑取 菌落加 入大约 10mL 的 TB 培 养基中 。另用 5mLTB 培养基 清洗平 板以保 证细菌 完全得 到回收 。合并 从不同 平板中 获得的 细菌悬 浮液。 (5) 振荡 合并的 细菌悬 液使细 菌团块 散开, 加至终 浓度为 15%, 充 分振荡 以混匀 之 ,将 数份细 菌悬液 分装到 50 〜 100mL 无菌小 瓶中。 (6) 分装后 将每小 份置于 -701C 贮存 。次日 ,取 1 小份在 37X: 迅 速融化 ,然 后滴定 活 细胞数 。文 库的滴 度将维 持至少 一年。 (7) 为筛 选文库 ,于 37X: 迅 速融化 一小份 并将适 当数量 的细菌 铺于硝 酸纤维 素滤膜 上 或直接 铺于含 适当抗 生素的 TB 琼脂平 板上。 (三) 包装 黏粒的 转导性 裂解物 的制备 1. 原理 因细 菌中携 带的环 状黏粒 分子含 有一个 位点 ,因此 它们可 被有效 地包装 到入噬 菌体颗 粒中。 当含有 黏粒的 细菌用 X 噬菌体 感染时 (或当 潜伏的 原噬菌 体受到 诱导时 ), 黏 粒中的 c〇5 位点被 X 噬 菌体的 ter 功 能切割 。随后 ,线状 的黏粒 DNA 被 包装到 新形成 的 X 噬菌 体颗粒 的头部 ,后者 极易分 离获得 并可用 于将黏 粒基因 组转导 到其他 细菌中 去 。以 噬菌体 颗粒的 形式拯 救黏粒 DNA 的能力 为扩增 黏粒文 库提供 了一个 简便的 方法。 在噬菌 体感染 过程中 ,黏粒 DNA 是 怎样被 精确地 包装到 X 噬 菌体颗 粒中这 一点尚 未知晓 。然而 ,这 一过 程要求 X 噬菌体 gaw 基 因产物 ( 宿主菌 recBC 核酸 酶的抑 制物) 的参与 ,提 示在感 染过程 中黏粒 可能经 历了滚 环复制 。影响 体内包 装效率 的其他 因素包 . 122 . 括以下 几点: (1) 超感染 噬菌体 携带的 遗传标 记普遍 性重组 可能导 致克隆 在黏粒 内的插 入片段 出现 不稳定 ,为了 降低这 种重组 的水平 ,可 以应用 recT 噬菌体 。此外 ,用 于对 含有黏 粒的细 菌进行 超感染 的超感 染噬菌 体常常 为裂解 缺陷型 ( 一般为 Sam7), 从而使 另一种 途径不 断延续 ,导 致在 感染细 胞中积 累大量 成熟的 噬菌体 颗粒。 (2) 黏粒 的结构 Lindenmaiei •等 已经 证明带 有成对 c〇i •位 点的 黏粒载 体的包 装效率 是只携 带一个 ow 位点的 载体的 2 〜 4 倍。 (3) 被包装 的黏粒 DNA 的大小 黏粒 文库所 含克隆 的大小 范围在 35~45kb 之间。 就我 们所知 道的所 有关于 包装方 面的知 识而言 ,不应 认为不 同大小 的黏粒 在体内 会以相 同的 效率得 到包装 。因而 ,黏 粒的 包装可 能使文 库的序 列分布 进一步 失真。 以 下方法 叙述了 X3169 (imm434 cits b2 red3 Sam7) 在 对含黏 粒的细 菌进行 超感染 时 的用途 。另一 种方法 是将最 初在体 外包装 的黏粒 转导到 溶原性 菌株, 然后诱 导溶原 菌 。然而 ,由 于这 种溶原 菌中的 重组黏 粒的收 获量波 动很大 ,因而 这种方 法并未 得到普 遍 应用。 2. 材料 已包 装黏粒 的包装 混合物 大 肠杆菌 recA— 株 (如 ED8767 或 DH1) 含10mmol/LMgCl2和0.2%麦芽糖的TB培养基 含 有适当 种类抗 生素的 TB 琼 脂平板 (150mm) 无 菌玻璃 涂布棒 SM 缓冲液 (5.8gNaCl, 2gMgS04.7H20, 50mLlmol/LTris-HClpH7.5, 0.01% 明胶, 加水至 1L, 高压 灭菌) 氯仿 3. 操 作步骤 (1) 将数 小份含 1〇5 已包 装黏粒 的包装 混合物 分别加 到含有 10mmol/L MgCl2 和 0.2% 麦 芽糖的 TB 培 养基中 生长过 夜的大 肠杆菌 recA— 株 (如 ED8767 或 DH1) 新鲜培 养物 的数个 试管中 ,于 371C 温育 20min。 (2) 在 每个含 105 包 装黏粒 的感染 培养物 中加入 3mLTB 培养基 ,于 37X: 继 续温育 45min〇 (3) 用含 适当抗 生素的 TB 培 养基稀 释已感 染培养 物使其 OD6()() = 0.05, 并于 371C 强烈振 摇培养 ,使 培养物 生长至 〇D6(K) = 0.3。 (4) 加 入大约 lxi〇1Gpfu 的 X3169, 并立 即将培 养温度 升高至 42X: 以 防止溶 原菌的 形成。 最好将 培养物 放置在 42t: 的 水浴中 并加以 摇动。 (5) 30min 后, 将培养 物转至 37X: 并继续 强烈振 摇培养 3h。 (6) 于 4X: 以 5000 X g 离心 l〇min 收获 细菌并 将细菌 重悬在 1/20 体积的 SM 缓冲液 中。 •加几 滴氯仿 ,于室 温下摇 动细菌 悬浮物 lOmin。 (7) 于 41C 以 5000 x g 离心 15min 以 去除细 菌碎片 。通 过感染 易感细 菌并计 算含适 • 123 • 当抗 生素的 TB 琼脂平 板上的 菌落数 ,以 确定上 清液中 转导性 噬菌体 的滴度 。每 毫升初 始的感 染培养 物中, 转导性 颗粒的 滴度可 望达到 109~101()。 (8) 用贮存 X 噬 菌体原 种的同 种方法 ,贮存 转导性 颗粒。 将单个 重组黏 粒克隆 包装到 X 噬菌体 的转导 性颗粒 中是制 备黏粒 DNA 的一 种简便 方法。 正常情 况下 ,黏粒 DNA 被 一同包 装到颗 粒中去 的辅助 噬菌体 的序列 所污染 。然而 ,如 果体内 包装的 成分由 携带 缺陷型 〇« 序列的 X 噬菌体 株提供 ,则可 获得一 种很纯 的黏粒 DMA, 足以建 立限制 酶切图 。已包 装黏 粒在此 aw 位点被 线状化 ,将 会十分 有利。 (四) 方 法评注 新型载 体的出 现解决 了在构 建黏粒 文库时 遇到的 两个主 要困难 :一是 载体分 子的自 我 连接; 二是一 个外源 DNA 片段 插入一 个载体 。即使 如此, 在黏粒 中构建 基因组 DNA 文库尚 不足以 作为常 规使用 的方法 。它仍 然要比 X 噬菌 体载体 中构建 文库更 为困难 ,常 常需 要进行 多次的 试验才 能获得 既大又 具有代 表性的 文库。 像在任 何复杂 的研究 中一样 ,应事 先检查 每一种 反应试 剂和构 建产物 ,只要 可能, 就 应在准 备进行 下一步 骤之前 ,先验 证刚完 成的这 个步骤 是否已 获成功 。最 常出 现的问 题来自 黏粒本 身及宿 主细菌 的生物 学特性 ,其 余的问 题简介 如下。 (1) 最常见 的失败 原因归 于构建 文库的 基因组 DNA 的质量 ,除非 开始时 DNA 长度 超过 200kb, 否则 经限制 酶部分 消化获 得的、 长度为 35~45kb 的 分子中 只有一 小部分 在其 两端携 带有限 制酶切 位点。 应通过 0.3% 琼脂糖 凝胶电 泳或脉 冲电场 凝胶电 泳检查 起始 DNA 的大小 。如果 DNA 的平 均大小 不超过 200kb, 则不 能构建 文库。 (2) 常常 难以获 得令人 满意的 高分子 量真核 DNA 部分消 化产物 。其 最普遍 的原因 是在 DNA 制备 过程中 出现了 抑制物 。当 制备高 分子量 DNA 时应 小心避 免混入 有机相 和水相 交界处 的物质 。如果 问题依 旧出现 ,可 用氯化 铯梯度 平衡离 心的方 法纯化 DNA。 (3) 在黏粒 载体中 构建的 文库常 常含有 不携带 外源插 入片段 的克隆 ,这 种克 隆的比 例依 所用载 体及制 备时的 小心程 度而有 所不同 。一般 情况下 ,在 使用 带单个 aw 位点的 黏粒 构建的 文库里 ,有 5% 的克隆 是空的 (即 它们不 含有插 入片段 )。 当使用 携带双 C05 位点的 载体时 ,该比 例就要 低得多 。但在 使用卡 隆粒构 建的文 库中该 比例则 相当高 (20% 或更高 )。 这 种不明 原因的 异常高 背景由 于两个 原因而 变得非 常棘手 :一是 它增加 了 必须筛 选的含 黏粒的 菌落的 总数; 二是由 于空克 隆可能 具有竞 争优势 ,在 文库 扩增过 程中 将带来 麻烦。 (4) 不 同重组 黏粒的 拷贝可 以有很 大变化 ,结果 导致收 获量相 差悬殊 。每当 从文库 中制 备一次 转导性 噬菌体 颗粒的 贮存液 ,这些 差异都 得到一 次放大 。引 起收获 M 变化原 因 尚未完 全明了 ,但可 能包括 : ①颠倒 的重复 序列也 许阻断 或妨碍 了复制 机制的 进行; ②由 偶尔出 现启动 子活性 的外源 DNA 序列起 始的转 录对复 制有所 干扰。 (5) 虽 然文库 似乎是 全面的 ,但也 许不能 获得目 的克隆 。引起 这种现 象的很 多因素 中包括 :外源 DNA 上限 制酶切 位点的 非随机 分布, 自某些 大肠杆 菌株中 制备的 包装抽 提物中 的限制 酶活性 ,重组 引起序 列缺失 ,以 及文库 扩增过 程中目 的克隆 的逐步 淘汰。 至少 可用三 种不同 的单位 来表示 T4 噬菌体 DNA 连接酶 的活性 。大 多数制 造厂商 • 124 • (除 New England Biolabs 公司外 ) 现 在都用 Weiss 单 位对该 酶进彳 了标 化。 1 个 Weiss 单位 是指在 37t: 下 20min 内催化 lmnd32P 从焦 磷酸根 置换到 [7, p-32P] ATP 所需 酶量。 1 个 Weiss 单位 相当于 0.2 个 用外切 核酸酶 耐受试 验来定 义的单 位或者 60 个黏 端单位 (如 New England Biolabs 公司 所定义 )。 因此, 0.015 Weiss 单位的 T4 噬菌体 DNA 连接 酶在 16X: 下 30min 内可使 50% 的 X 噬菌体 Hfndlll 片段 (5/zg) 得 以连接 。在本 书中, T4 噬菌体 DNA 连接酶 一律用 Weiss 单位 表示。 ED8767 和 DH1 是比 HB101 更难 以“渗 漏”的 recA_ 株 。因 而可更 有效地 抑制克 隆 化真核 DNA 重复序 列间的 重组。 能够在 黏粒中 克隆的 插入片 段的大 小受到 制备包 装提取 物所用 方法的 影响, 用于包 装黏粒 的提取 物应该 用含亚 精胺而 不是腐 胺的缓 冲液进 行制备 。当 自包装 提取物 和包装 反应 中省去 腐胺时 ,此系 统对被 包装的 DNA 分 子的大 小具有 选择性 ,长 度为野 生型入 噬菌体 DNA 的 80% 的 DNA, 其包装 效率为 野生型 X 噬菌体 DNA 的 1/200。 在 缺乏腐 胺的情 况下, 含有插 入大片 段的黏 粒被优 先包装 。由 于尚未 知晓的 原因, 也可能 是由于 缺乏 ter 功能, 一些对 X 噬菌体 DNA 作用良 好的包 装提取 物制剂 并不适 合包装 黏粒。 因此 ,建议 用黏粒 DNA 和选 定大小 的真核 DNA 间 的标准 化连接 反应产 物对每 批提取 物进行 试验。 首 先应确 证载体 DNA 和真核 DNA 两者均 已连接 ,如 果两种 反应尚 未连接 ,则应 考虑 在真核 DNA 制剂中 存在着 抑制物 ,在 这种情 况下, 应用酚 / 氯仿重 新抽提 DNA 并 用乙醇 沉淀。 如果载 体臂能 够连接 而真核 DNA 不能 ,则 很可能 是真核 DNA 中 带有正 确黏端 的片段 太少。 蛋白酶 K 用于 消化 CIP, 如果要 有效地 进行后 续的连 接反应 ,后 者应 被完全 去除。 另一 个灭活 CIP 的方法 则是在 5mmol/L EDTA 存 在的情 况下提 高反应 温度至 65X: [在 步骤 (3) 结 束时] 温育 lh (或于 75X: 温育 lOmin), 然 后用酚 / 氯 仿抽提 一次。 由于所 用黏粒 载体和 限制酶 的不同 ,也许 需要采 用其他 方法灭 活载体 的黏端 。例 如 ,当对 5' 磷酸凹 端的去 磷酸化 效率较 低时, 可应用 S1 核 酸酶或 绿豆核 酸酶消 化加以 去除 3' 突 出端。 铺平板 X 噬菌体 有效感 染细菌 的能力 应在用 于构建 黏粒文 库前予 以证实 。最 好的方 法 是在铺 平板细 菌上测 定已知 噬菌体 原种的 滴度。 在 连接预 试验时 ,经 磷酸酶 处理过 的样品 (a) 应不出 现连接 ,而大 多数未 经处理 的样品 (c) 中的线 状载体 DNA 应变成 多聚体 。由 于去 磷酸化 的单链 DNA 突出 端可与 携带 5' 磷酸的 匹配黏 端连接 ,经 磷酸酶 处理过 的黏粒 DNA 中 至少应 有一些 能与用 BamHI 切割的 X 噬菌体 DNA 片段 (b) 连接。 皇 甫永穆 郑 波 主要参 考文献 丁克清 ,李 璞主编 • 1992. 简明 英汉遗 传词典 .武汉 : 湖北科 学技术 出版社 • 冯作化 ,皇 甫永 穆主编 . 2000. 医学 分子生 物学. 第二版 .武汉 : 武汉出 版社. 金冬雁 ,黎孟 枫等译 . 1998. 分子克 隆实验 指南. 第二版 .北京 : 科学出 版社. 卢圣 栋主编 . 1999. 现代分 子生物 学实验 技术. 第二版 .北京 : 中国协 和医科 大学出 版社. 125 • 彭秀 玲等编 . 1997. 基因工 程实验 技术. 第二版 .长沙 : 湖南科 学技术 出版社 . 齐 义鹏著 . 1998. 基因 及其操 作原理 .武汉 :武汉 大学出 版社. 颜子颖 ,王 海林译 . 1998. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 : 科学出 版社. Ausubel, F. M. et al. 1996. Current Protocols in Molecular Biology 2nd ed. John Wiley&Sons, Inc. Ausubel, F. M. et al. 1995. Short Protocols in Molecular Biology 3rd ed. John Wiley&Sons, Inc. Bachman, B. J. 1983. Likage map of K-12。 edition 7. Microbid. Rev., 47: 180 〜 230. Celis, J. E. and Smith, J. D. 1979. Non- sense mutations and tRN A suppressors. Acadmic Press, London. Foster, T. J. 1983. Plasmid-determined resistance to antimicrobial drugs and toxic metalions in bacteria. Mi- crobiol. Rev., 47: 361 〜 409. Gottlieb, D. and Shaw, P. D. 1967. Antibiotics. I. Mechanism of Action. New York: Springer- Verlag. Moazed, D. and Noller, H. F. 1987. Interaction of antibiotics with functional sites in 16S ribosomal RNA. Nature, 327: 389 〜 394. • 126 • 第二章 DNA 的制备 与分析 引 言 应用 分子生 物学技 术分析 基因组 ,要求 制备纯 的相对 分子质 量高的 DNA。 本章主 要描述 从细菌 、植 物细胞 和哺乳 动物细 胞提纯 基因组 DNA 的方法 。这些 方法包 括两部 分: 温和裂 解细胞 和抽提 DNA 技术; 去除污 染的蛋 白质、 RNA 和 其他大 分子的 一些基 本的酶 学或化 学方法 。从 某种程 度上讲 ,所有 分子生 物学的 方法都 需要对 核酸进 行分级 分离 。层析 对双链 和单链 核酸的 分离是 适用的 ,可用 于质粒 的分离 和细胞 裂解物 中基因 组 DNA 的分离 。凝胶 电泳比 其他的 方法有 更高的 分离度 ,一 般情 况下是 分离的 首选方 法 。凝胶 电泳分 离既可 以是分 析型的 也可以 是制备 型的。 分离片 段的分 子质量 范围在 1~100 OOOkDa 之间。 .一 般而言 ,应 用电泳 技术分 离核酸 比分离 蛋白质 要简单 得多。 核酸分 子带负 电荷, 对双链 DNA 来讲, 基本不 存在影 响迁移 率的复 杂结构 。许 多重要 的变量 都会影 响到凝 胶中 核酸的 迁移率 ,包括 核酸的 构象、 凝胶孔 的大小 、所使 用的电 压梯度 以及缓 冲液盐 的浓度 。其中 ,最 基本的 变量是 凝胶孔 的大小 ,它决 定可被 分离的 片段的 大小。 在实际 操作中 ,这 意味 着分离 >500~1000bp 片段 需用较 大孔径 的琼脂 糖凝胶 ,分离 <1000bp 片段 需用较 小孔径 的聚丙 烯酰胺 凝胶或 筛分型 琼脂糖 凝胶。 本章第 二节和 第三节 描述了 分析型 和制备 型凝胶 的应用 。第 二节还 介绍了 利用脉 冲电场 凝胶电 泳技术 分离琼 脂糖凝 胶 中更大 DNA 片段的 方法。 通常需 要从凝 胶电泳 分离出 的复杂 混合物 中鉴别 出特定 的片段 ,这可 以采用 South- ern Blot 技术 来完成 。将凝 胶中的 片段转 移到尼 龙膜或 硝酸纤 维膜上 ,然 后用标 记的核 酸探针 杂交, 从而鉴 别出目 的片段 。本 章第四 节全面 叙述了 固定已 分离的 DNA 的方法 和相 关的杂 交技术 。这些 方法对 复杂的 基因组 中单拷 贝和多 拷贝序 列进行 定位作 图和鉴 别 起了极 其重要 的作用 ,并 且使最 初的真 核细胞 克隆实 验更加 便利。 其 他常见 的凝胶 电泳的 应用包 括单链 RNA 或 DNA 的分离 。含 有高 浓度尿 素变性 剂 的聚丙 烯酰胺 凝胶对 短片段 (<500bp) 单链 DNA 或 RNA 提供 一个强 有力的 分离系 统。 这样的 凝胶能 够分离 相差仅 1 个核苷 酸长度 的片段 ,是 各种 DNA 测序方 法的核 心 。这种 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 的详细 描述见 本章第 四节第 二部分 ,可 用于 需要分 离单链 片段 的操作 ,包括 用$ 核酸 酶作图 法分析 mRNA 结构 、核 酸酶保 护试验 或引物 延伸等 技术。 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 还可用 于制备 ,例 如小规 模纯化 放射标 记的单 链探针 和大规 模纯 化合成 的寡核 苷酸。 分离 相对较 大的单 链片段 (>500bp) 可 以用变 性琼脂 糖凝胶 来完成 。这 对于用 Northern blot 分析 mRNA 集群尤 为重要 。在 第三章 第二节 第四部 分描述 了用含 甲酵的 琼脂糖 凝胶分 离单链 RNA 的方法 。在 第三章 第二节 第一部 分描述 了用变 性碱性 琼脂糖 . 127 • 来纯 化标记 的单链 DNA 探针。 凝胶 和电路 凝胶电 泳装置 的电路 通常并 不复杂 ,可 以用两 个简单 的公式 来理解 。欧姆 定律, 表示电 压 1/ [以 伏特 (V) 计] 相当 于电流 J [以 毫安 (mA) 计] 与电阻 [以 欧姆 (0) 计] 的乘积 。当 一定 的电压 加于简 单电路 中时, 恒定的 电流通 过所有 的元件 ,通过 任何元 件点电 压的下 降是电 阻的直 接结果 。对 凝胶 装置的 某一部 分而言 ,电 阻与横 截面积 和缓冲 液的离 子强度 成反比 。往 往凝胶 本身提 供了电 流环路 中的几 乎所有 的电阻 ,加 在凝胶 上的电 压基本 上等于 加在电 路中的 电压。 对于给 定的电 流, 减少凝 胶和凝 胶之上 的缓冲 液的厚 度或缓 冲液的 离子强 度将增 加电阻 ,因此 增加通 过凝胶 的电压 梯度和 样本的 电泳迁 移率。 通常 实际应 用电压 上限的 设定取 决于凝 胶装置 的散热 能力。 第二个 有用的 公式是 P = 表示 该系 统产生 的功率 P [以 瓦特 (W) 计] 相 当于电 阻与电 流平方 的乘积 。所产 生的功 以热的 形式表 现。 任何凝 晈装置 都能够 消散一 定量的 热量而 不使凝 胶的温 度增高 。超过 这一功 率时, 电压的 轻微增 加都可 引起凝 胶的温 度增高 而造成 破坏性 的后果 。因此 ,一 定要知 道每一 种凝胶 装置能 够散多 少功率 的热 ,并 且仔细 监控凝 胶温度 不要超 过这一 水平。 有两个 实际的 例子可 以说明 这两个 公式的 应用。 第一个 例子是 ,在电 泳期间 ,随着 与聚合 作用相 关 的离子 跑出凝 胶之外 ,聚 丙烯酰 胺凝胶 的电阻 增加, 在固定 电流下 电泳时 ,电 压就会 随着时 间的延 长 而增加 ,功 率也明 显增加 。如 果聚丙 烯酰胺 凝胶在 高电压 下电泳 ,电 源应该 设定为 恒定的 输出功 率。 第二种 情况是 一个电 源带有 多个凝 胶装置 。第一 个公式 表明, 加到每 一个串 联凝胶 (一个 接着一 个连续 排列) 的分电 压和凝 胶电阻 在总电 阻中所 占的份 额呈成 正比。 两个相 同的凝 胶将如 各获得 50% 的分 电压和 功率。 最后 ,值得 注意的 是某些 电泳系 统采用 的是致 死性的 高电压 ,几 乎所 有系统 都存在 着潜在 的危险 性 。必须 使用具 有屏蔽 的装置 ,电 源应适 当接地 及调试 。最重 要的是 ,必 须具备 有进行 电泳实 验操作 的 常识。 第一节 DNA 溶液 的纯化 和浓缩 本单元 介绍纯 化和浓 缩单链 或双链 DNA 的基本 方法。 当需要 从溶液 中去除 蛋白质 或 可溶性 分子或 需要将 DNA 浓 缩以便 操作时 ,这些 技术是 有用的 。当从 小体积 (<0.4mL) 的 溶液中 纯化至 lmg/mL 浓度时 ,可 采用 本方法 。当 从大体 积的稀 释液中 提取 和沉淀 DNA 或为 了去除 相对分 子质量 低的寡 核苷酸 与三磷 酸盐时 则用附 加的方 法 。最后 , 介绍缓 冲酚用 于核酸 的纯化 ,作为 备用的 方法。 (一) DNA 的酚提 取与乙 醇沉淀 1. 原理 在进 一步进 行酶学 操作或 分析研 究之前 ,往往 必须对 DNA 溶 液进行 提取和 浓缩。 去除 DNA 中蛋 白质污 染最常 用的方 法是用 酚抽提 。酚能 有效地 使蛋白 质变性 ,并 可使 变性 的蛋白 质溶解 。氯仿 也是一 种有用 的蛋白 变性剂 ,其性 质与酶 有所不 同:它 能稳定 液相 和酚层 之间不 稳定的 分界线 。酚 / 氯仿 混合物 能减少 保留在 有机相 中液体 的体积 , ( 与纯酚 相对比 ), 最 大限度 地增加 DNA 的产 盤。 异戊醇 能防止 振荡混 合物时 产生泡 . 128 • 沫 ,并 有助于 有机相 与液相 的分离 。变 性蛋白 液相与 有机相 之间形 成分层 ,从而 与液相 中 大量的 DNA 分 离开来 。这 种方法 是快速 、廉价 并易于 操作。 乙醇 沉淀对 于浓缩 DNA 与去除 残留在 溶液中 的酚与 氯仿是 有用的 。在 有相 对较高 浓度阳 离子的 存在下 ,乙醇 使核酸 分子结 构改变 、聚集 ,使 之在溶 液中沉 淀下来 。由于 大多 数的盐 和小的 有机分 子溶于 70% 的乙醇 ,乙 醇沉 淀和洗 涤将有 效地将 DNA 中的盐 去除 。尽管 氯化钠 、乙 酸钠和 乙酸铵 均可引 起沉淀 ,但 去除氯 化钠较 为困难 ,因 为它在 70% 的乙醇 中溶解 度较低 ,易于 沉淀。 2. 材料 酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1) 3mol/L 醋酸钠 PH5.2 冰冷的 100% 乙醇 70% 乙醇 TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA) 纯水 旋涡 振荡器 台 式高速 离心机 真空 干燥器 Eppendorf 管 3. 试 剂配制 酚的缓 冲与酚 / 氯仿 / 异戊醇 的制备 在某些 情况下 ,新 鲜液 化的酚 (88% 酚) 不需 进一步 纯化即 可使用 。然而 ,当 所纯 化的 DNA 用于克 隆或其 他敏感 实验时 ,酚必 须重蒸 ,因为 酚的氧 化产物 能损伤 和断裂 核酸链 。商品 化的用 于核酸 纯化的 重蒸酚 ,不 管来 源如何 ,使用 前必须 缓冲。 注意事 项:酚 可引起 严重的 皮肤烧 伤并损 坏衣服 。操 作酚时 ,必须 戴手套 、防护 眼镜、 穿工作 眼 ,所 有的操 作须在 通风柜 中进行 。必须 备有玻 璃容器 以便装 使用过 的酚与 氯仿。 (1) 将 0.5g 的 8- 羟基 喹咛加 到有搅 拌棒的 2L 玻璃烧 杯中。 (2) 轻轻将 500mL 液化酚 或融化 的重蒸 酚结晶 (在 65X: 水溶液 中融化 ) 加入 其中。 8- 羟基 喹咛是 一种抗 氧化剂 ,酚 加入后 即变为 黄色。 (3) 加入 500mL 50mmol/L 的 Tris 碱 (pH 未调 ,约 10.5)。 (4) 用铝箔 纸盖住 烧杯, 磁力搅 拌器室 温下低 速搅拌 10mm。 (5) 使各相 于室温 下分开 ,轻轻 将上层 液相倒 入适当 的溶液 容器中 。用 25mL 玻璃 吸管 或吸球 吸除不 能倾倒 的上层 液相。 (6) 有机 相加入 500mL50mmol/L 的 Tris-HClpH8.0。 重复步 骤⑷〜 (6) 两次 (即 连续 两次用 500mL 50mmol/L 的 Tris-HCl pH8.0 来平衡 )。 酚相的 pH 可用 试纸来 检查, 应该是 8.0。 假如 不是这 个数字 ,需重 复步骤 (3)~(7), 直至 pH 达 到 8.0〇 (7) 加入 250mL 50mmol/L 的 Tris-HCl pH8.0, 或 TE 缓冲液 pH8.0, 置入 掠色玻 . 129 • 璃瓶 或用铝 箔纸包 裹的透 明玻璃 瓶中, 贮存在 4t: 冰 箱中。 (8) 如 果用于 DNA 的纯化 (基 本方法 ), 将 25 份体 积的酚 ( 贮存液 中底部 的黄色 相) 与 24 份 体积的 氯仿和 1 份 的异戊 醇混合 起来。 作 为抗氧 化剂的 8- 羟基喹 咛制备 的酚在 41C 下 可贮存 2 个月。 4. 操 作步骤 酚抽提 (1) 将等体 积的酚 / 氯仿 / 异戊醇 加到待 纯化的 DNA 溶液中 (小 试管中 0.1 〜 0.4mL)〇 可使 用含单 价阳离 子溶液 <0.5mol/L。 提取 50~100FL 体积是 困难的 。更小 的体积 可以进 行稀释 从而 达到这 一下限 。高浓 度的盐 可引起 液相与 有机相 的颠倒 。如果 这样, 可通过 黄色来 辨别有 机相。 (2) 剧 烈离心 10s。 (3) 室温 下离心 15s。 液相 与有机 相可很 好分开 。如果 DNA 溶液呈 黏稠状 或含有 大量的 蛋白质 ,应 离心到 l~2min。 (4) 用 200/zL 的吸管 仔细吸 取含有 DNA 的上 层液相 ,并移 入新的 试管。 如 果是纯 化小于 lfig 的 DNA, 可以用 lOOfzL 的 TE 缓 冲液再 次提取 有机相 ,以增 加回收 。此 时的 液相 可加入 到第一 次的液 相中。 (5) 如果在 液相与 有机相 交界处 有白色 的沉淀 ,重 复步骤 (1) 〜 (4)。 乙 醇沉淀 (6) 在装有 DNA 的 1.5mL 小离 心管中 ,加入 1/10 体积的 醋酸钠 ,短 暂振荡 混合, 或 用手指 轻弹离 心管若 干次。 如在酚 抽提前 ,溶 液中 含有高 浓度的 NaCl 或 醋酸钠 (0.3~0.5mol/L), 就 不必加 入其他 的盐。 为了使 NaCl 和 醋酸钠 的浓度 保持在 0.5md/L 以下 ,可 作适当 的稀释 。对 大量的 DNA (大于 50~ lOOfxg/mL), 必须 在室温 下即刻 沉淀。 假如乙 醇沉淀 不理想 ,残余 的有机 溶液可 用乙醚 提取。 在这种 情况 ,不 要加盐 ,参看 后面的 另一种 方法。 (7) 加入 盐后, 再加入 2 〜 2. 5 倍体 积的冰 预冷的 100% 乙醇。 振荡混 合后置 碾碎的 干冰中 5min 或更 长一些 时间。 这一沉 淀步骤 亦可在 -70X: 冰 箱中进 行至少 15min, 或在 -20X: 冰 箱中进 行至少 30min, 也可采 用 干冰粉 和乙醇 ,但 当使用 碾碎的 干冰时 ,试 管的标 记往往 丧失。 (8) 在固 定角的 离心机 中离心 5min。 (9) 对于小 的沉淀 ,用巴 斯德吸 管或吸 量管吸 弃乙醇 上清液 。从 DNA 沉淀 的对面 吸 取液相 ,就 可以做 得很好 。从液 相的顶 部开始 ,随着 液相的 下降, 吸管向 下移行 ,直 至液 相吸干 。对于 大量的 离心物 ,上 清液 可以简 单倾倒 出来。 (10) 加入 lmL 70% 乙醇 (室温 〉。 颠倒小 离心管 若干次 ,然 后离心 如前。 假如所 沉淀的 DNA 分子 非常少 (<200 碱基 ), 请使用 95% 的 乙醇。 (11) 吸除 上清液 如前。 用 70% 乙醇洗 涤后, DNA 沉淀 物不会 黏附在 试管壁 。必须 注意避 免将沉 淀从试 管中吸 除掉。 (12) 在真空 干燥器 中干燥 DNA 沉 淀物。 (13) 如 果需要 进一步 进行酶 学操作 ,应 将干燥 的沉淀 物溶液 在适量 的水中 。如果 用 于长期 的贮存 ,应 溶解在 TE 缓冲 液中。 . 130 • DNA 沉淀 物不能 溶解在 高盐缓 冲液中 。为了 便于重 新混悬 ,应将 DNA 溶 液的最 终浓度 保持在 lmg/mL 以下 ,通过 温和振 荡或轻 弹小离 心管, 将小量 (<25啤) 沉淀的 质粒或 片段迅 速溶解 。然 而, 大量的 DNA 则需 振荡并 加热至 65X: 5min, 以达 到混匀 。相对 分子质 量高的 基因组 DNA 需要一 至若干 天才能 溶解, 并需温 和振摇 (而不 是振荡 ) 以避免 DNA 被切断 。特 别是 如果用 于黏粒 克隆或 需 要相对 分子质 量高的 DNA 的其他 应用时 ,推 荐的 方法是 ,在转 动的平 台上或 振摇装 置温和 振摇。 (二) 异丙 醇沉淀 DNA 请注意 ,异 丙醇 的体积 是乙醇 沉淀量 的一半 ,即和 DNA 溶液 等体积 。这使 得一个 离心管 中的较 大体积 (如 0.7mL) 的 DNA 能 够沉淀 。异丙 醇与乙 醇相比 ,不易 挥发, 因 此要经 较长时 间才能 蒸发掉 。一 些盐易 溶于乙 醇而不 易溶于 异丙醇 ,因 此会与 核酸一 起沉淀 。为 了去除 这些污 染的盐 ,必 须进行 很好的 洗涤。 (三) 丁烯 醇浓缩 DNA 一般 而言, 操作大 体积的 DNA 溶液是 不太方 便的。 通过用 Sec- 丁烯 醇抽提 可将水 分子 ( 而不是 DNA 或其他 可溶性 分子) 从液体 中去除 。这 个方法 可用于 降低体 积或用 于基本 方法之 前浓缩 稀释的 溶液。 1. 材料 同 DNA 的酚提 取与乙 醇沉淀 ,需 添加 Sec- 丁烯醇 聚丙 烯试管 (不 要用聚 丙乙烯 试管) 2. 操 作步骤 (1) 假如 DNA 的相 对分子 质量高 ,将等 体积的 Sec- 丁烯 醇加到 样本中 ,通 过振荡 或颠倒 混匀。 在聚丙 烯试管 中抽提 ,因 为丁烯 醇会损 坏聚丙 乙烯。 (2) 室温下 , 120〇Xg (2500r/min) 离心 5min, 或小 离心机 中离心 10s。 (3) 吸除 上层相 Sec- 丁 烯醇。 (4) 在获 得期望 体积的 液相溶 液之前 ,重 复步骤 1 〜 3。 (5) 酚 提取和 乙醇沉 淀下层 的液相 ,或用 两次乙 醚抽提 来去除 Sec- 乙烯醇 / 加入 太多的 Sec- 丁烯 醇可使 Sec- 丁 烯醇层 水相完 全丧失 。如果 发生这 种情况 ,就加 1/2 体 积的水 到 Sec- 丁烯醇 ,混匀 后离心 。在这 一新的 液相中 ,可以 回收到 DNA, 并 可用较 少量的 Sec- 丁烯 醇进一 步浓缩 DNA。 随着盐 浓度的 增加, 体积将 减少。 DNA 可用 乙醇来 沉淀, 以便重 新调整 缓冲液 条件。 (四) 乙 醚浓缩 DNA 假如 用乙醚 抽提将 有机溶 剂去除 ,用酚 和氯仿 抽提纯 化或用 Sec- 丁烯醇 浓缩的 DNA, 经乙 醚抽提 后即可 用于酶 学操作 或用于 凝胶电 泳实验 ,而不 必用乙 醇沉淀 。微 量的乙 醚可以 通过蒸 发去除 。假 如原始 溶液中 的溶质 浓度与 以后步 骤中所 需要的 浓度一 . 131 • 致 ,这一 方法是 有用的 。在纯 化相对 分子质 量高的 DNA 中极 其有用 ,因 为在用 乙醇沉 淀中 ,大的 核酸分 子可发 生机械 断裂。 乙醚是 易燃品 ,其蒸 气可令 人昏睡 ,所 有有 关乙醚 的操作 应该在 通风良 好的通 风柜中 进行。 1. 材料 乙醚 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 聚丙 烯试管 旋涡 振荡器 台 式高速 离心机 2. 操 作步骤 (1) 用 等体积 的水或 TE 缓冲液 PH8.0 在聚丙 烯试管 中与乙 醚混合 。强 烈振荡 10s, 让各 相分开 。乙 醚在最 上层。 (2) 用等体 积的乙 醚加到 DNA 样本中 。假如 DNA 的相 对分子 质量高 ,用振 荡或温 和颠倒 混匀。 (3) 小 离心机 中离心 5s, 或将试 管垂直 放在试 管架上 ,让 各相 分开。 (4) 吸弃 最上层 ,即 乙醚层 。重 复步骤 (2) 和 (3)。 (5) 如量 <100fzL, 将试 管敞开 放在通 风柜里 15min, 若量大 ,则 置真空 15min, 以 去除 乙醚。 此时 DNA 溶液将 不含有 机溶液 ,所 含的盐 的浓度 大约相 当于酚 抽提之 前溶液 中盐的 3/4。 (在两 次酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提之后 ,溶 质的浓 度降低 了。) (五) 用玻璃 珠纯化 DNA 1. 原理 根据 Vogelstein 和 Gillespie (1979) 改良的 玻璃珠 方法, 为去除 DNA 中杂质 的污染 提供一 种简单 无毒的 方法。 在高盐 (碘 化钠) 存 在下, DNA 与小 玻璃颗 粒结合 。对形 成的 沉淀进 行洗涤 ,以去 除该溶 液中的 碘化钠 与杂质 。以 水或 TE 缓冲液 形成混 悬液, 使 DNA 与玻璃 珠分离 (洗脱 )。 由于所 需的操 作较少 ,这 种方法 与其他 有机抽 提方法 相比 ,要来 得更快 ,并 更易于 操作。 然而, DNA 产量要 来得少 , 一般相 当于原 先材料 的 50%~75%。 这种 方法对 >500bp 的 DNA 的抽提 最适合 ,能使 500 〜 5000bp 长度的 DNA 片段 有效地 结合到 玻璃珠 ,并易 于洗脱 。较小 片段的 DNA 与 玻璃珠 结合得 很紧并 不容 易与其 分离。 >3000~5000bp 的 DNA 片 段被玻 璃切断 。玻璃 珠悬液 的应用 ,使得 能够迅 速有效 地从有 蛋白、 RNA 污染或 有机物 的溶液 中纯化 DNA。 2. 材料 玻璃 珠悬液 6mol/L 碘化钠 (Nal) 溶液 . 132 • 50 〜 200pL 体积的 DNA 洗漆液 (20mmol/L Tris-HCl pH7.4, lmmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl, 加入等 体积 100% 乙醇, OX: 可保存 3~4 月) TE 缓冲液 (lOmmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 以上材 料也可 用商品 试剂盒 (如 Glas-Pac、 National Scientific Supply、 Gene Clean、 BiolOl 和 Qiaex Gel Extraction Kit Qiagen) 3. 试 剂配制 1) 玻璃 珠悬液 将 200 〜 300pL 200;xm 的 玻璃珠 (National Scientific Supply) 加到 1 . 5mL 的 离心管 中, 加入等 体积水 ,用前 混匀。 玻璃珠 未经酸 化的需 加以酸 化:在 浓硝酸 中浸泡 lh, 用 水洗净 ,烤干 ,于 4X: 备用。 2) 6mol/L 碘化钠 (Nal) 溶液 将 0.75gNa2SO3 溶解于 40mL 水中 ,加入 45gNaI, 搅拌 至溶解 (约 30min), 经 Whatman 滤纸或 硝酸纤 维素膜 过滤。 4. 操 作步骤 (1) 将 3 倍 体积的 Nal 溶液加 到装有 DNA 的 1.5mL 离 心管中 ,如下 法加入 玻璃珠 悬液 :如果 DNA<5/ig, 用 的 玻璃珠 悬液; 如果 DNA>5|ixg, 用 5pL 玻璃 珠悬液 后 ,再 按超过 5/ig 部分 ,每 0.5吨 再加 lfiL 玻璃 珠悬液 。室温 下孵育 5min。 例如 :如果 要纯化 4/^gDNA, 就加入 5fxL 玻璃珠 悬液; 如 果纯化 7MgDNA, 需加入 玻璃珠 悬液的 量是 5fiL + 4pL = 9/iL。 操作 较大量 DNA, 较 长时间 的孵育 ,同时 间歇加 以混合 ,将 使结合 的效率 提高。 (2) 将 DNA- 玻璃 珠复合 物离心 5s, 吸走上 清液。 为 了提高 DNA 产量, 将上清 液保留 ,同另 一玻璃 珠悬液 一起, 如步骤 (1) 再 孵育。 (3) 用 500fiL 洗涤 液洗涤 DNA- 玻璃珠 混悬物 3 次 ,轻轻 地振摇 混合物 使重新 混悬, 然后短 暂离心 ,使 玻璃珠 沉淀。 (4) 将 离心物 重新用 TE 缓冲液 混悬。 45X: 下孵育 2~3min, 将 DNA 从玻璃 珠上洗 脱 下来。 (5) 离心 lmin 后 ,将含 DNA 的上 清液转 移到新 的离心 管中, 41C 冰 箱贮存 备用。 (六) 稀释 DNA 溶液 的浓缩 当稀释 DNA 溶 液浓度 〈lO^g/mL 或当 DNA10mmol/L 氯化镁 或 磷酸根 离子的 溶液中 沉淀的 DNA 往 往很难 再溶解 ,必 须在乙 醇沉淀 之前将 此溶液 稀释。 对 于较大 体积的 DNA 溶液 (>0.4 〜 10mL), 可 以简单 地按照 乙醇沉 淀中使 用的各 种试剂 的用量 ,或者 用丁烯 醇沉淀 。酚 抽提时 [步骤 (1) 〜 (3)], 必须用 15mL 或 50mL 可紧紧 加盖的 聚丙烯 试管, 因为聚 丙乙烯 试管经 不起酚 / 氯仿 混合物 的腐蚀 。离 心必须 在 室温下 ,以 不超过 lOOOXg (2500r/min) 的速 度进行 5min。 乙醇 沉淀时 [步骤 (6)], 应该用 厚壁的 Corning 玻 璃试管 (15 或 30mL), 4t: 下 ,用 固定角 的转头 ,以 8000Xg (l〇〇〇〇r/min) 的速 度离心 15min。 玻璃试 管应该 是经硅 化过的 ,以便 能回收 小量的 DNA (<10Mg)〇 (七) 用乙醇 沉淀去 除相对 分子质 量低的 寡核苷 酸和三 磷酸盐 1. 原理 用醋酸 铵代替 醋酸钠 ,能使 较长的 DNA 分 子更容 易沉淀 。这样 ,在 醋酸 铵存在 下 ,通 过两次 的乙醇 沉淀, 可以有 效地将 小的单 链或双 链的寡 核苷酸 (<30bp) 及用于 放 射标记 或其他 DNA 修饰 反应的 、未掺 入的核 苷酸从 DNA 溶液 中清除 。这种 方法对 于完全 去除克 隆步骤 中使用 的大量 的接头 并不十 分有效 。由于 铵离子 可抑制 T4 聚核苷 酸激酶 ,假如 核酸要 进行磷 酸化, 则不用 此方案 。尽管 去除未 掺入的 核苷三 磷酸盐 、反 应产 物和小 的寡核 苷酸是 有效的 ,但 也不是 绝对的 。而且 ,对 小分子 DNA 的纯化 ,在 做出 详细的 生化研 究和分 析研究 之前, 也不应 该用此 方法。 2. 材料 4mol/L 乙酸铵 pH4.8 冰冷的 100% 乙醇 70% 乙醇 TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA) 旋涡 振荡器 台 式高速 离心机 真空 干燥器 Eppendorf 管 3. 操 作步骤 (1) 将等 体积的 4mol/LpH4.8 的乙酸 铵加到 DNA 溶液中 ,充分 混匀。 (2) 加入 2 倍体积 (加盐 后计) 冰冷的 100% (终 浓度为 67%) 乙醇 。旋涡 混合器 上振 荡混匀 ,将试 管置碎 干冰上 5min。 (3) 室 温下高 速离心 5min。 小心移 除上清 ,沉 淀物以 10(VLpH8.0 的 TE 缓 冲液重 . 134 • 新 溶解。 (4) 重 复步骤 (1)~(3), 然后进 行步骤 (5)。 必 须进行 再沉淀 ,持别 是步骤 1 后的 DNA 含有 Mg2— 或其 他二价 或多价 阳离子 ,这 些离子 将使寡 核苷 酸更易 沉淀。 (5) 加入 lmL 室温 70% 的乙醇 ,颠倒 若干次 ,室 温下高 速离心 5min。 (6) 弃 去乙醇 ,如 基本方 案干燥 沉淀。 (八) 方 法评注 1. 背 景资料 除了 上述谈 到的几 种纯化 、沉淀 和浓缩 DNA 溶液的 方法外 ,去除 DNA 中 的残余 蛋白 质的另 一种方 法是使 用树脂 ,一种 无毒的 羟基化 二氧化 硅浆状 颗粒。 树脂上 的酸性 羟 基与蛋 白结合 ,类 似于酚 羟基。 在中性 pH 或接 近中性 pH 情况下 ,树 脂与蛋 白质有 高度的 亲和性 ,而与 DNA 的亲和 性很低 。结 合到树 脂上的 蛋白质 可用离 心的方 法与溶 液 中的核 酸分离 。为了 完全去 除核酸 样本中 的蛋白 ,需 要用 树脂抽 提两到 三次。 Phase Lock 凝胶, 一种中 间密度 的不活 跃的二 氧化硅 混合物 ,可 以减少 交界处 样本的 损失, 从而提 高有机 抽提的 回收率 。离 心时, 正常模 糊的交 界面紧 紧地贴 在凝胶 的下面 或凝胶 中 。凝胶 - 交界逐 渐移到 有机相 和液相 之间, 从而产 生一个 紧密的 分隔面 ,把所 有的液 相分 开来。 2. 重 要参数 酚的 氧化产 物能损 伤核酸 ,因此 ,只 能用重 蒸的酚 。为 了完全 去除蛋 白质, 必须反 复抽提 ,直至 液相与 有机相 的交界 面不存 在蛋白 质沉淀 为止。 — 般而言 ,在 原始 液体中 ,至 少要有 O.lmol/L 的单价 阳离子 的存在 ,以便 乙醇沉 淀核酸 。沉淀 低浓度 的核酸 ,需 要冷却 到较低 温度, 才能获 得较好 的效果 。对较 高浓度 ( 加入乙 醇后, >0.25mg/mL) 的 DNA, 在室 温下沉 淀得也 很快, 加入乙 醇并充 分混合 后 ,形成 可见的 沉淀表 明完全 沉淀, 不必要 冷却或 进一步 孵育。 有机 抽提时 ,通 过将有 机相再 次抽提 ,而 把交界 面和有 机相中 核酸的 损失下 降到最 小限度 。为 了保障 用玻璃 珠方法 能获得 可观的 产物, 必须用 玻璃珠 将碘化 钠和洗 涤的上 清液抽 提两遍 。这 种方法 对大于 500bp mRNA 片 段的抽 提更为 有效。 3. 预 期结果 这 些方法 将能完 全去除 蛋白质 ,并获 得核酸 。然而 ,在 一系列 抽提与 沉淀过 程中, 需要小 心仔细 注意防 止每一 步骤中 的损失 ,哪怕 是微量 的丧失 ,累 积起来 ,也会 造成明 显 的丢失 。特 别重要 的是, 小心回 收水相 ,重 复抽提 有机相 ,以保 证从酚 / 氯仿 抽提中 完 全获得 少量的 DNA。 用玻璃 珠的方 法来获 取核酸 ,其产 量都可 以提高 甚至达 80%。 方法 有二: ①通过 增 加孵育 时间到 5 〜 lOmin (即 2 倍或 3 倍的孵 育时间 ); ② 将上清 液再用 玻璃珠 结合法 提取。 . 135 . 4. 时 间安排 酚抽提 和乙醇 沉淀中 ,对 离心 管中的 12 个 DNA 样本 从步骤 (1) 〜 (12), 大 约需要 90min。 酚 的缓冲 要进行 lh 以上 ,然后 需要平 衡浓度 。在酚 存在下 ,核酸 不应该 留下, 但是可 以无限 期地沉 淀在乙 醇中, 或沉淀 后干燥 。对 12 个标 本用玻 璃珠方 法需要 15~ 20min〇 第二节 基因组 DNA 的制备 此节描 述纯化 哺乳动 物组织 、植 物组织 和细菌 DNA 的三个 类似的 方法。 特别 注意: 重组噬 菌体或 质粒对 基因组 DNA 制备物 的污染 ,哪 怕是 极微量 的都将 是灾 难性的 。不知 多少人 、多少 年的时 间浪费 于重新 分离已 克隆的 序列, 这些序 列污染 了 用于建 立重组 DNA 文库的 DNA 制备物 。许 多研究 人员对 在他的 Southern blot 中发 现的额 外“基 因”感 到困惑 , 实际上 ,这些 是污染 的质粒 DNA。 用于制 备质粒 和噬菌 体 DNA 的所 有材料 应与用 于制备 基因组 DNA 的材料 分开。 尽可能 使用一 次性的 材料, 特别 注意避 免经常 使用的 转头的 污染。 一 、从 哺乳动 物组织 中制备 基因组 DNA 1. 原理 迅 速冷冻 组织并 捣碎成 可消化 的碎片 ,置入 蛋白酶 K 和 SDS 溶液中 ,孵育 到大部 分 的细胞 蛋白质 被降解 。被 消化物 通过连 续的酚 / 氯仿 / 异戊 醇抽提 ,去除 蛋白质 。通过 乙醇 沉淀获 取核酸 ,干燥 之并重 新混悬 在缓冲 液中。 2. 材料 液氮 消化 缓冲液 (l〇〇mmol/L Tris-HCl pH8.0, 25mmol/L EDTA, 0.5% SDS, O.lmg/mL 蛋白酶 K, 蛋白酶 K 不稳定 ,每 次使用 时必须 新鲜加 入。) 冰冷 的磷酸 缓冲盐 (PBS) ( 137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2P()4 • 7H20, 1 . 4mmol/L KH2P04 ) 25:24:1 酚 / 氯仿 / 异戊醇 7.5mol/L 醋酸铵 100% 和 70% 乙醇 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 〇_1 % 十 二烷基 磺酸钠 (SDS) lmg/mL 无 DNA 酶的 RNA 酶 有盖 的试管 台 式低速 离心机 . 136 . 3. 操 作步骤 细胞 的制备 从整 个组织 开始: (1) 切下 组织后 ,尽快 地切碎 组织并 冻存在 液氮中 。如果 是肝脏 ,要切 除胆囊 ,胆 囊中含 有高浓 度的降 解酶。 (2) 取 0.2 〜 lg 组织 ,用预 冷的研 钵研碎 。或用 榔头碾 碎成细 的粉末 (保持 组织碎 片 )。 (3) 混悬组 织粉末 ,比 例是每 lOOmg 组织用 1.2mL 消化 缓冲液 ,不 应该有 团块。 从组织 培养细 胞开始 : (1) 离心 悬浮培 养液, 去除含 上清的 培养液 。以 胰蛋白 酶处理 黏附的 细胞, 并收集 培 养瓶中 的细胞 ,以 500 Xg 速 度离心 5min, 弃去上 清液。 (2) 以 10mL 冰冷的 PBS 重 新混悬 细胞, 500Xg 离心 5min, 弃去上 清液。 重复混 悬 和离心 步骤。 (3) 以 等体积 的消化 缓冲液 重新混 悬细胞 。用 0.3mL 消 化缓冲 液混悬 3 X107 细胞。 对更多 的细胞 ,则用 lmL 消 化缓冲 液混悬 108 个 细胞。 细胞 的溶解 和消化 (4) 样本放 在紧密 加盖的 试管中 ,在 501C 下 ,振 摇孵育 12~18h。 样 本将变 得黏稠 。孵育 12h 后 ,组 织块几 乎消失 ,器 官样本 将出现 残渣, 组织培 养细胞 相对较 清亮。 核酸的 抽提: (5) 用等体 积的酚 / 氯仿 / 异 戊醇彻 底抽提 样本。 请注意 :酚的 腐蚀性 极强。 (6) 在悬空 吊桶的 转头中 ,以 1700X& 的速 度离心 lOmin。 如果各 相分辨 不清, 再加另 一体积 的消化 缓冲液 ,不用 蛋白酶 K, 重复 离心。 DNA 的纯化 (7) 将上 层液相 转入一 个新的 试管中 ,加入 1/2 体积的 7. 5mol/L 醋 酸铵和 2 倍体 积的 100% 的 乙醇。 DNA 将立 即形成 纤维样 的沉淀 。以 170〇Xg 的速 度离心 2min, 以 收获 DNA。 在高盐 存在下 ,这 一简单 的沉淀 可降低 DNA 中 RNA 的量 。为了 便于长 期保存 ,应把 DNA 放在 乙 醇中。 另外, 为了预 防相对 分子质 量高的 DNA 被切断 ,删 去步骤 (7)~(9), 并 将样本 以至少 100 倍体积 的 TE 缓冲 液透析 2 次以上 , 以去除 DNA 中的 有机溶 剂和盐 。由于 DNA 具有高 度的黏 稠性, 透析的 总 体时间 至少达 24h。 (8) 将离 心物以 70% 的乙 醇洗涤 。弃去 乙醇, 将离心 物空气 干燥。 重要的 是要充 分洗涤 ,以 去除残 余的盐 和酚。 (9) 将 DNA 以 TE 缓冲 液再混 悬直至 溶解, 可在室 温下或 65X: 下温 和振摇 DNA 若 干小时 ,以 使充分 溶解。 必要时 ,可 以加入 0.1% 的十 二烷基 硫酸钠 (SDS) 和 终浓度 1/ig/mL 的无 DNA 酶的 RNA 酶, 37X: 下孵育 lh, 然后 ,如上 述那样 ,进 行有机 相抽提 和乙醇 沉淀, 以去除 残余的 RNA。 • 137 • (10) 贮存在 4X:。 lmg/mLDNA 是合 适的工 作浓度 。从 lg 哺乳 类动物 细胞中 ,预 期可以 获得约 2mg 的 DNA。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 基因组 DNA 的制备 有许多 不同的 方法, 但都是 从某种 形式的 细胞溶 解开始 ,然后 是 DNA 的去 蛋白质 和收获 。不 同方法 间的主 要区别 是去蛋 白质的 程度和 所产生 DNA 的 相对分 子质量 。此处 描述的 分离方 法比较 简单, 取决于 蛋白酶 K 的强 有力的 溶解蛋 白能力 ,以及 去垢剂 SDS 的变性 能力。 Gross-Bellard (1972) 和 Enrietto 等 (1983) 描 述 了应用 蛋白酶 K 进行 DNA 的纯化 。消化 缓冲液 中包括 EDTA, 以抑制 DNA 酶。 2) 重 要参数 为了 将内源 性的核 酸酶的 活性下 降到最 低限度 ,必须 迅速地 分离、 碾碎和 冷冻组 织 。组 织培养 细胞必 须冷却 并迅速 洗涤。 一旦组 织冰冻 ,或 向组织 培养细 胞中加 入溶解 缓冲液 ,整个 过程中 ,可 以保护 DNA 不受 核酸酶 的作用 。重要 的是组 织要充 分地分 散, 不得留 下团块 ,以便 迅速有 效地与 蛋白酶 K 和 SDS 充分 接触。 极为关 键的是 产生相 对分子 质量非 常高的 DNA 以构建 噬菌体 或黏粒 基因库 。为了 使 相对分 子质量 达到最 大限度 ,必 须注意 两点: ①在抽 提时, 应温和 (但 都是彻 底地) 混合 ,以 把切割 力下降 到最低 程度; ②抽 提之后 ,去除 DNA 中的 有机溶 剂和盐 是通过 透析, 而不是 用乙醇 沉淀。 最重要 的是, 在最终 DNA 溶液中 ,应 不存在 细胞蛋 白质和 蛋白酶 K, 因为 基因组 DNA 对 限制性 酶的作 用敏感 。因此 ,在 去蛋 白质时 ,应 该注意 ,为 了完全 去除蛋 白质, 要 反复用 蛋白酶 K 消化 。一 般而言 ,高 纯度的 DNAOD260 与 OD28〇 的比率 应大于 1.8, 而 50% 蛋白与 50%DNA 的混 合物的 OD26〇 与 OD28 。比 率约为 1.5。 3) 问 题分析 有 机相与 液相不 能清晰 地分离 ,一般 是由于 DNA 的浓 度很高 ,和 / 或在液 相中有 细 胞碎片 。用更 多的消 化缓冲 液稀释 后再抽 提可解 决这一 问题。 当 将室温 的乙醇 加到被 抽提的 DNA 溶液 中时, DNA 应呈 长的、 纤维状 的沉淀 。假 如没有 沉淀, 或呈絮 状沉淀 ,则 DNA 被降解 ,或 含有细 胞碎片 。产生 这一问 题的原 因, 可能是 消化之 前组织 的操作 不恰当 ,或消 化反应 时组织 太多。 4) 预期结 果和时 间安排 lg 的 组织或 109 个细 胞大约 可提取 2mg 的 DNA。 DNA 的长度 至少是 100kb, 并且 可以用 限制酶 消化。 这 一方法 要进行 2d: 第一天 是组织 的制备 ,之后 是溶解 过夜; 第二 天是抽 提和沉 淀 。然而 ,每天 花费的 实际时 间不到 lh。 在乙 醇存在 下或在 -20X: 下, DNA 可 以无限 期 存放。 二 、从植 物组织 中制备 基因组 DNA 1. 原理 植物 细胞用 去垢剂 Sarkosyl 溶解, 然后溶 解物用 蛋白酶 K 消化 。去 除溶解 物中不 • 138 • 溶 性的碎 片之后 ,沉 淀核酸 ,用 氯化铯 密度梯 度纯化 DNA, 2. 材料 消毒 的冷水 液氮 抽提 缓冲液 (100mmol/LTris-HClpH8.0, lOOmmol/LEDTA, 250mmol/LNaCl, 临用 前加入 100/iig/mL 蛋白酶 K) 10% (m/\〇 氮-十 二烷酰 肌氨酸 (sarkosyl) 异丙醇 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 氯化铯 lOmg/mL 溴 化乙键 氯化铯 饱和的 异丙醇 乙醇 3mol/L 醋 酸钠, pH5.2 贝克曼 JA-14, JA-20 或 JA21, 和 VTi80 转头 (或类 似转头 ) 5mL 超速 离心管 15G 针 和针筒 3. 操 作步骤 组织 的制备 (1) 收集 10 〜 50g 新 鲜的植 物组织 。在收 集之前 ,将 植物 放置在 黑暗中 1 〜 2d, 以 降低 组织中 的淀粉 含量。 较年 轻的植 物是较 好的组 织来源 ,因为 其所含 的多糖 较低。 (2) 以 消毒的 冷水洗 涤组织 ,以去 除黏附 干燥的 碎片和 污迹。 (3) 将组 织用液 氮冰冻 ,用研 钵将组 织碾成 粉末。 整个过 程中, 保持组 织呈冰 冷状态 ,方法 是间断 地加入 液氮。 细胞 的溶解 与消化 (4) 将冰冻 的粉末 转移到 250mL 的离 心管中 ,并 立即加 入抽提 缓冲液 。一般 而言, 每克新 鲜的植 物组织 ,加 5~10mL 的抽提 缓冲液 。温 和搅拌 以分散 组织。 (5) 加 入大约 10% (WV) 体积的 氮-十 二烷酰 肌氨酸 ,使 其终 浓度为 1%。 在组织 以抽提 缓冲液 重新混 悬之后 ,加 入氮 -十二 烷酰肌 氨酸是 重要的 。如果 氮-十 二烷酰 肌氨酸 先 加入到 抽提缓 冲液中 ,植 物细胞 的不完 全溶解 会干扰 组织的 分散, 并导致 DNA 的 不必要 切断。 (6) 55X: 下孵育 1 〜 2h。 溶 解物应 该是清 亮透明 (或绿 色的) 和 微黏性 。根据 这一点 ,溶 液的操 作应该 温和, 以避免 DNA 被切断 ,不 能旋转 振荡或 以暴力 混合。 (7) 将溶 解物置 Beckman 转子 JA-14 中, 4*C 下 ,以 6000r/min (550〇Xg) 的速度 离心 lOmin, 收 获上清 。如 果有必 要去除 未消化 的碎片 ,再次 离心。 DNA 的沉淀 . 139 • (8) 上清液 中加入 0.6 体积的 异丙醇 ,温 和混匀 ,可见 到核酸 沉淀。 假如见 不到沉 淀, -20*C 下放置 30min。 (9) Beckman JA-14 转头中 4t: 下 ,以 8000r/min (7500 X g) 的速 度离心 15min。 去除上 清液。 不 要让核 酸沉淀 物干燥 ,否则 它将变 得很难 溶解。 DNA 的纯化 (10) 以 9mL 的 TE 缓冲液 重新混 悬沉淀 。必 要时 ,在 55X: 孵育 ,以帮 助混悬 。加 入 9. 7g 的固体 氯化铯 ,温 和混 合直至 溶解。 (11) 冰浴 中孵育 溶解物 30min。 在 JA-20 转 头中, 4X: 下以 8000r/min (750〇Xg) 的速 度离心 lOmin, 收获上 清液。 这一 情况离 心去除 溶解物 中一些 不溶性 的碎片 。此外 , 离心后 ,溶液 的上部 可形成 小的分 离相, 这 是由于 溶解物 中残留 Sarkosyl。 通过用 双层干 酪包布 过滤上 清液, 可以将 Sarkosy 丨去 除掉。 收集上 清液, 但去除 顶部的 Sarkosyl 相。 (12) 加入 0.5mL10mg/mL 的溴化 乙锭, 在冰浴 中孵育 30min。 请注意 :溴化 乙锭为 突变剂 ,应小 心并带 手套。 (13) 4*C 下, 以 8000r/min (7500 X g) 速 度离心 l〇min。 将形 成大的 RNA 沉淀物 ,就 这一 点而言 ,溶 解物中 的许多 不需要 的成分 (RNA、 蛋白和 碳水化 合物) 已经去 掉了。 (14) 将上清 液转移 到两个 5mL 的密封 超速离 心管中 , 封密离 心管。 要保 证这两 个离心 管是装 满了的 ,经过 了平衡 并密封 完好。 (15) 在 BeckmanVTi80 转 头中, 20X: 下以 80 000r/min (525 000Xg) 的速 度离心 4h, 或者 20X: 下以 60 000r/min (300 000xg) 的速 度离心 过夜。 (16) 用大 孔的针 (15G) 和针 筒收集 DNA 条带 。首先 在离心 管的顶 部用针 戳一个 洞 。然后 ,用 收集 DNA 的针 -针筒 直接在 DNA 条带 的下方 ,插 入离心 管壁, 以取出 DNA〇 这一方 法与质 粒纯化 时所使 用的方 法相同 ,所不 同的是 ,只见 到一个 条带。 必须 用紫外 灯显示 DNA。 如 果这样 ,要戴 防护眼 镜或防 护面罩 。在 任何情 况下, 要努力 将梯度 与可 见光的 接触下 降到最 低限度 ,从而 降低溴 化乙锭 引起的 DNA 切割 损伤。 (17) 以氯化 铯饱和 的水相 平衡异 丙醇, 再用异 丙醇反 复抽提 收集的 DNA, 以去除 溴化 乙锭。 (18) 向 DNA 溶液 中加入 2 倍体积 的水和 6 倍体积 的乙醇 ,混 匀。 -20t: 孵育 lh。 4X: 下以 8000r/min (750〇Xg) 的速 度离心 l〇min。 DNA 立即沉 淀成为 单一白 色的块 。这 DNA 可用顶 尖带有 钩的巴 斯德吸 管收集 ,也 可用简 单的离 心来 收集。 (19) 将沉淀 物重新 混悬在 TE 缓 冲液中 ,加入 1/10 体积的 3mol/L 的醋 酸钠和 2 倍 体积的 乙醇以 再沉淀 。如 果看不 见沉淀 ,在 20X: 下孵育 ,离 心收集 DNA。 (20) 将最后 的沉淀 在空气 中干燥 ,重新 混悬在 TE 缓冲 液中。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 此方 法是一 种改良 的常用 DNA 分离方 法:去 垢剂溶 解细咆 ,蛋白 酶处理 ,氯 化铯 . 140 • 梯度 纯化。 由于整 个细胞 被溶解 ,本方 法提纯 的是核 基因组 DNA 和胞浆 (线粒 体和叶 绿体) 基因组 DNA。 Watson 和 Thompson (1986) 描述了 提纯核 DNA 的方法 ,这种 DNA 没有 质粒和 线粒体 DNA 的污染 。此 外, Dellaporta 等 1983 年 描述了 小量分 离植物 总 DNA 的方法 。描 述的 这些方 法类似 于小量 DNA 的方法 ,所不 同的是 前者省 略了氯 化 铯梯度 提纯的 步骤。 2) 主 要参数 任何 基因组 DNA 制备的 目的是 分离高 分子高 纯度的 DNA。 两 个因素 会影响 到所分 离 DNA 的大 小:剪 切活性 和核酸 酶活性 。正如 本方法 提到的 ,处理 溶解物 要温和 ,以 把剪切 DNA 的力下 降到最 低限度 。植 物细 胞富含 核酸酶 ,为 了降低 核酸酶 的活性 ,要 在含去 垢剂和 高浓度 EDTA 的 抽提缓 冲液的 存在下 ,迅速 冰融。 用 这种方 法分离 的植物 DNA, 其长 度应在 50kb 范围。 这种长 度对大 多数应 用而言 是 完全可 接受的 。用这 种方法 分离的 DNA 容易 用限制 酶消化 ,并 能有效 地与克 隆载体 连接 。然而 ,在 某些情 况下, 为了减 少多糖 的污染 ,必须 修改这 一方法 。污 染问 题是影 响植物 DNA 纯度的 最常见 的问题 。这 些碳水 化合物 很难与 DNA 分离, 它可抑 制克隆 过 程中常 用的许 多酶类 。去除 多糖的 推荐方 法是在 10% 溴化十 六烷三 甲基铵 (cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB) 和 0.7mol/L 氯化钠 (1980 年由 Murray 和 Thompson 描述) 存在 下用氯 仿抽提 溶解物 。这 种方法 在细菌 DNA 提纯 的方法 中作了 描述。 3) 预期结 果和时 间安排 每克 新鲜植 物组织 可产生 10~40冲 的 DNA (50kb 长度 )。 分离的 DNA 用 限制性 酶容 易消化 ,并 能有效 地与克 隆载体 连接。 从开始 到溶解 到氯化 铯梯度 ,大 约需要 4~6h。 60 000r/min 梯 度离心 需过夜 ,或 者更快 的速度 (80 000r/min) 需 4h。 条带 DNA 的 处理大 约需要 3~4h。 三 、细菌 基因组 DNA 的制备 (一) 小量制 备细菌 基因组 DNA 1. 原理 溶解 饱和培 养液中 的细菌 ,用 蛋白酶 K 消化以 去除蛋 白质。 通过用 溴化十 六烷三 甲 基铵选 择性沉 淀以去 除细胞 壁碎片 、多糖 和残余 的蛋白 。产生 的上清 液经异 丙醇沉 淀 ,获 取相对 分子质 量高的 DNA。 2. 材料 TE 绿冲液 (l〇mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L ED7A) 10% 十 二烷基 硫酸钠 (SDS) 20mg/mL 蛋白酶 K (以小 量的一 次使用 的份额 贮存在 -20X: 冰箱) 5mol/L NaCl 溴化十 六烷三 甲基铵 / 氯化 钠溶液 (CTAB/NaCl 溶液, 10% CTAB, 0.7mol/L • 141 • NaCl) 24:1 氯仿 / 异戊醇 异丙醇 70% 乙醇 3. 操 作步骤 (1) 将 5mL 培养液 和所需 要的细 菌一起 孵育。 在与该 株细菌 相应的 条件下 (即相 应的 培养液 、药 物选择 、温度 ) 培养, 直至达 到饱和 。这可 能需要 几小时 到几天 ,取决 于细 菌生长 速度。 (2) 离心 2min, 直至 形成结 实的小 团球, 弃去上 清液。 (3) 加入 567fiL 的 TE 缓冲液 ,用吸 量管反 复吹打 以重新 混悬离 心团球 。加入 30pL 10% 的 SDS 和 3/iL 20mg/mL 蛋白酶 K, 使其 终浓度 分别为 0.5% 和 100pg/mL。 彻 底混匀 ,在 37X: 孵育 lh。 由于去 垢剂溶 解细菌 细胞壁 ,溶 液变 得黏稠 。不必 要用溶 菌酶预 先消化 细菌细 胞壁。 (4) 加入 100ML 5mol/L NaCl, 充分 混匀。 这 一步骤 是极其 重要的 ,因为 如果盐 的浓度 在室温 下下降 ,低于 〇.5mol/L, 将 会形成 CTAB 核 酸沉淀 (Murray and Thompson, 1980)。 在这 里的目 的是去 除细胞 壁碎片 、变性 的蛋白 以及与 CTAB 结合 的多糖 ,而 保留溶 液中的 核酸。 (5) 加入 80/iL 的 CTAB/ 氯化 钠溶液 。充分 混匀, 65X: 下孵育 lOmin。 (6) 加 入等体 积氯仿 / 异戊醇 (0.7 〜 0.8mL), 充 分混勻 ,离心 4 〜 5min。 这一 抽提步 骤去除 CTAB 的蛋白 / 多糖 复合物 ,离 心后可 见到白 色的分 界面。 (7) 将 黏稠的 上清移 入新的 离心管 ,留下 交界面 。上 清中加 入等体 积的酚 / 氯仿 / 异 戊醇 ,充 分抽提 ,离心 5min。 对某 些菌株 ,氯 仿抽提 之后形 成的交 界面不 够坚实 ,使得 收集上 清液较 为困难 。在 这种情 况下, 可以 用消毒 的牙签 挑除大 部分的 交界面 ,然后 再收集 上清液 。残 存的 CTAB 沉淀 可用酚 / 氯仿 / 异戊醇 抽提 去除。 (8) 将 上清液 转入新 的试管 ,加入 0.6 体积 的异丙 醇以沉 淀核酸 。没 有必要 加盐, 因为氯 化钠的 浓度已 经很高 。将试 管来回 振摇直 至可明 显见到 白色纤 维状的 DNA 沉 淀 。这时 ,可 以将离 心物转 入装有 70% 乙 醇的新 的试管 。具体 方法是 ,将 一根 细的吸 量管 的末端 加热加 以封口 ,然后 在煤气 灯火焰 上弯成 钩状。 就可以 用末端 的钩将 DNA 沉淀转 移到新 的装有 70% 乙醇的 试管里 。另外 ,也可 以在室 温下简 短离心 ,以 收集沉 淀物。 假 如以上 步骤并 不形成 DNA 沉淀, 这表明 DNA 被剪切 成相对 分子质 童 较低 的片段 。如果 基因组 DNA 用来作 限制性 酶切, 来进行 Southern Blot 分析, 则可以 通过简 单的离 心沉淀 DNA。 (9) 用 70% 的乙 醇洗涤 DNA, 以去除 残余的 CTAB, 然后 在室温 下再离 心沉淀 DNA。 小 心去除 上清液 ,在 冻干机 中短暂 干燥离 心物。 (10) 将离心 物重新 溶解在 lOOfxL 的 TE 缓冲 液中。 这 可能要 花费一 些时间 (可能 lh), 因 为这种 DNA 是相对 分子质 量高的 。一般 1〇 个 单位的 £coR 丨消化 15ML 的这种 DNA 要 lh。 . 142 • 基本 方法中 的步骤 (4)~(10) 可 以适用 于细菌 染色体 DNA 制备物 中多糖 和其他 大分 子污染 大分子 的去除 。将 DNA 溶液 中的氯 化钠浓 度调到 0.7mol/L; 加入 0.1 体积 的 CTAB/NaCl 溶液; CTAB 抽 提步骤 (5) 〜 (6) 可以重 复几次 ,直 至交界 面消失 为止。 这些措 施将更 有利于 基因组 DNA 制 备物中 多糖的 去除。 附 :细菌 基因组 DNA 的 快速小 量制备 (1.5mL) (1) 培养 细菌至 饱和。 ( 2) 取 1 . 5mL 离心 2min。 (3) 以 567/iL 的 TE 缓 冲液重 新混悬 ,加入 30piL20mg/mL 的 蛋白酶 K。 混匀 ,在 37X: 孵育 lh。 (4) 加入 lOOfxL 5mol/L 的 NaCl, 充分 混勻。 (5) 加入 80^L 的 CTAB/NaCl 溶液 ,混匀 ,在 65X: 孵育 lOmin。 (6) 用 等体积 的氯仿 / 异戊 醇抽提 ,离心 5min。 (7) 将 水相移 入一新 的试管 ,用酚 / 氯仿 / 异戊 醇抽提 ,离心 5min。 (8) 将 水相转 入一新 的试管 ,用 0.6 体积的 异丙醇 沉淀, 70% 乙醇洗 涤沉淀 。弃去 上清液 ,在冻 干机中 干燥沉 淀物。 (9) 将沉淀 物重新 混悬在 100/iL 的 TE 缓冲 液中。 (二) 氯 化铯法 大量制 备细菌 基因组 DNA 这一方 法基本 上是小 量制备 法中所 描述的 染色体 DNA 制 备的规 模扩大 ,然 后以氯 化铯梯 度提纯 。如 果需要 大量的 基因组 DNA, 比如用 于基因 组文库 的构建 ,可 以应用 这一 方法。 1. 材料 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 10% 十 二烷基 硫酸钠 (SDS) 20mg/mL 蛋白酶 K (以小 量的一 次使用 的份额 贮存在 - 20t: 冰箱) 5mol/L NaCl 溴化十 六烷三 甲基铵 / 氯化 钠溶液 (CTAB/NaCl 溶液, 10% CTAB, 0.7mol/L NaCl) 氯仿 / 异戊醇 24:1 异丙醇 氯化铯 10mg/mL 溴 化乙链 氯化铯 饱和异 丙醇或 水饱和 的丁醇 贝克曼 JA-20 转头或 同等物 50mL Oak Ridge 离心管 大孔 的吸管 . 143 . 4mL 可 封闭的 离心管 贝 克曼的 VTi80 转头 3mL 塑料 针管和 15 号 注射针 2. 操 作步骤 细胞 的制备 与溶解 (1) 将 lOOmL 含 有细菌 的培养 液培养 到饱和 状态。 (2) 以 400〇xg (6000r/min) 的 速度离 心细胞 lOmin, 弃去上 清液。 这一 步骤和 以下的 步骤用 50mL 的 Oak Ridge 离心管 操作很 方便。 (3) 将 细胞以 9.5mL 的 TE 缓 冲液温 和混悬 ,加入 0.5mL 10% 的 SDS 和 50^L20 mg/mL 的 蛋白酶 K。 充 分混匀 ,在 37X: 孵育 lh。 DNA 的沉淀 和纯化 (4) 加入 1.8mL 的 5mol/L 的氯化 钠溶液 ,充分 混匀。 (5) 加入 1.5mL 的 CTAB/NaCl 溶液 。充 分混匀 ,在 65X: 孵育 20min。 (6) 加入 等体积 的氯仿 / 异戊醇 ,充分 抽提。 室温下 ,以 6000Xg (JA-20 转 头则以 7000r/min) 的速 度离心 lOmin, 分离 各相。 (7) 用 大孔的 吸管将 液相转 入新的 试管。 如果 DNA 产量 很高, 上清液 可能十 分黏稠 。另外 的氯仿 / 异戊 醇抽提 ,或酚 / 氯仿 / 异戊醇 抽提是 可任意 选择的 ,如果 用氯化 铯梯度 已经将 DNA 提纯, 就没有 必要。 (8) 加入 0.6 体积的 异丙醇 ,混匀 到溶液 中出现 白色的 纤维状 DNA 沉淀, 并结成 致密 的团块 。用末 端封口 并弯曲 成钩的 巴斯德 吸管将 沉淀钩 入装有 lmL 70% 乙 醇的新 试 管中。 (9) 以 lOOOOXg (JA-20 转头以 9900r/min) 的速 度离心 5min。 弃去 上清液 ,并以 4mL 的 TE 缓冲液 重新混 悬沉淀 。这 一过程 可用几 小时甚 至过夜 ,如将 DNA 放置在 60t: 下, 可以缩 短这一 过程。 (10) 用分 光光度 计检测 DNA 的浓度 ,将浓 度调到 50 〜 lOOpg/mL。 这样 ,每 4mL 梯度 将产生 200 〜 400网 的 染色体 DNA。 用这样 一个小 的梯度 来离心 大董的 染色体 DNA 是不可 取的。 (11) 每 4mLTE 缓 冲液加 4.3g 氯化铯 ,使之 溶解, 再加入 200pL10mg/mL 的溴 化乙锭 。转入 4mL 可封 闭的离 心管, 用含氯 化铯的 TE 缓冲液 (1.05g/mL) 调 整体积 并平衡 离心管 。封闭 离心管 ,在 贝克曼 VTi80 转头中 15X: 下以 70 000r/min 的速 度离心 4h, 或 15t: 下以 55 000r/min 的速 度离心 过夜。 (12) 在长波 紫外灯 下显示 梯度, 可见单 一条带 。用 15 号 针头和 3mL 的塑 料针筒 取下 条带。 假如 DNA 是相对 分子质 董高的 染色体 DNA, 当 条带从 梯度取 下之后 ,它 是非常 黏稠的 。因此 , 重要的 是要用 大孔径 的针以 避免对 DNA 机械性 的切割 。假 如条带 出现在 梯度的 右上方 ,说明 梯度的 密度 太大, 应该减 少步骤 (11) 加入 的誠化 铯的量 。 (13) 用氯 化铯饱 和的异 丙醇或 水饱和 的丁醇 进行连 续抽提 ,以去 除溴化 乙锭。 (14) 用 2L 的 TE 缓冲 液透析 过夜以 去除氯 化铯。 • 144 . (15) 将 DNA 溶液转 入一新 的试管 。如 果必要 ,如上 面步骤 (8) 与 (9) 所述 ,加 入 1/10 体积的 3mol/L 的醋 酸钠和 0.6 体积的 异丙醇 ,以 沉淀 染色体 DNA, 然 后重新 溶解至 所需的 浓度。 附: 氯化铯 大量制 备细菌 基因组 DNA 的精 简方法 (1) 培养 100mL 的 菌液至 饱和。 (2) 以 400 x g 速度离 >L、。 (3) 将沉 淀重新 混悬在 9.5mL 的 TE 缓冲液 , 0.5mL 10% 的 SDS 和 50^L 20 mg/mL 的 蛋白酶 K 中 ,混匀 ,在 37X: 孵育 lh。 (4) 加入 1.8mL5mol/L 的 氯化钠 ,充分 混匀。 (5) 加入 1.5mL CTAB/NaCl 溶液 ,混匀 ,在 65X: 孵育 20min。 (6) 用 等体积 的氯仿 / 异戊 醇抽提 ,室 温下以 6000 xig ■速度 离心。 (7) 将水 相移入 一新的 试管, 如果必 要用酚 / 氯仿 / 异戊醇 抽提, 如步骤 (6) 离心。 (8) 将 水相转 入一新 的试管 ,用 0.6 体积 的异丙 醇沉淀 DNA, 用 70% 的乙 醇洗涤 沉淀物 。弃去 上清液 ,将 沉淀 物重新 混悬在 4mL 的 TE 缓冲 液中。 (9) 测量 DNA 浓度 。将浓 度调至 50~100^tg/mL。 每 4mLTE 缓冲 液加入 4.3g 的 氯化铯,加入200/^1011^/11^的溴化乙锭。转入可封闭的离心管,151〇下以70 000 r/min 的速 度离心 4h〇 (10) 以紫 外灯显 示梯度 ,取下 条带。 (11) 以氯 化铯饱 和的异 丙醇抽 提溴化 乙锭。 (12) 以 2L 的 TE 缓冲 液透析 过夜。 (三) 方 法评注 1. 背 景资料 制 备细菌 基因组 DNA 的最 常用的 方法是 溶菌酶 / 去垢 剂溶解 ,然后 用非特 异性的 蛋白 酶孵育 ,一系 列的酚 / 氯仿 / 异戊醇 抽提, 随后是 乙醇沉 淀核酸 。这样 的方法 可有效 地去除 污染的 蛋白质 ,但 不能有 效地去 除由许 多种类 细菌产 生并能 干扰诸 如限制 酶和连 接 酶活性 的外源 性多糖 。然而 ,蛋白 质孵育 之后用 CTAB 抽提, CTAB 与 多糖和 残余的 蛋白质 结合。 两种污 染的分 子可以 有效地 在而后 的氯仿 / 异 戊醇的 乳化和 抽提中 得以去 除 。多种 革兰氏 阴性菌 ,包 括假单 胞菌属 、大肠 杆菌属 、根瘤 菌属和 Brady 根瘤 菌属, 正常 情况下 都会产 生大量 的多糖 。以 上的方 法能够 从这些 细菌中 产生可 消化的 染色体 DNA。 假如 特别需 要大量 DNA, 这种方 法可以 扩大, 用氯化 铯梯度 可提纯 DNA。 这一 方法 也可以 抽提植 物组织 的相对 分子质 量高的 DNA。 2. 重 要参数 最重要 的参数 是加入 CTAB 之前 溶解细 菌的溶 液中盐 (氯 化钠) 的浓度 。如 果氯 化 钠的浓 度小于 0.5mol/L, 那么核 酸也可 以沉淀 。的确 ,这 一过 程中, CTAB 是最经 常使 用的。 . 145 • 同时重 要的是 ,所 有的 溶液要 维持在 15t: 以上, 因为低 于这一 温度, CTAB 将会 沉淀。 3. 预期结 果和时 间安排 不管是 小量制 备还是 大量制 备法, lOOmL 的原始 培养液 (108 〜 109 细胞 /mL) 所 产生的 DNA 量在 0.5 〜 2mg。 小量制 备法要 花费约 2h, 包括 lh 的孵 育时间 。大量 制备法 时间要 长一些 ,以 便形 成氯化 铯梯度 。而 后的 步骤是 1 〜 2d, 取决 于氯化 铯梯度 离心的 时间。 第三节 大片段 DNA 的分离 与回收 本节描 述琼脂 糖凝胶 电泳在 DNA 片段分 析和制 备中的 应用。 标准的 琼脂糖 凝胶分 离 0.5 〜 25kb 的 DNA 片段 ,而 脉冲电 场琼脂 糖凝胶 分离的 DNA 分 子则是 10~2000kb。 本节开 始介绍 了标准 琼脂糖 凝胶电 泳与脉 冲电场 琼脂糖 凝胶电 泳以及 影响大 DNA 片段 分离 的参数 。接下 来描述 了用琼 脂糖凝 胶分离 DNA 片 段的三 种不同 的方法 。凝 胶电路 的一 般描述 见本章 的引言 部分。 一 、琼 脂糖凝 胶电泳 琼脂 糖凝胶 电泳是 一种简 便高效 的分离 和纯化 0.5~25kb DNA 片段 的方法 。这种 方法可 分为三 个阶段 :①根 据所要 分离的 DNA 的大 小用相 应的琼 脂糖浓 度制备 凝胶; ② 将 DNA 样本点 样到样 本孔中 ,在一 定电压 下电泳 一定的 时间, 达到最 满意的 分离; ③ 给凝 胶染色 ,或者 溴化乙 锭已经 掺和到 凝胶和 电泳缓 冲液中 ,可直 接在紫 外灯下 显示。 (一) DNA 片段 在标准 琼脂糖 凝胶上 的分离 1. 原理 在 琼脂糖 凝胶两 端应用 的电压 产生一 个电场 ,其 强度与 凝胶的 长度和 两端的 电位差 有关 。电 场中的 DNA 分子 向着阳 极移动 ,因 为沿着 DNA 支 架的磷 酸盐是 带负电 荷的。 迁 移速度 受到凝 胶基质 产生的 摩擦力 的限制 。虽然 电荷和 / 或大小 可影响 大分子 通过凝 胶 的速度 ,对 于不同 长度的 DNA 分子 ,电荷 的集聚 比率是 相同的 。因此 ,正是 DNA 的大小 决定通 过凝胶 的速度 ,这样 通过电 泳能有 效地分 离不同 长度的 DNA 片段。 2. 材料 电泳 缓冲液 (TAE 或 TBE) 溴化乙 锭溶液 (1000X 贮存液 0.5mg/mL, 工作液 0.5/ig/mL, 避光 保存) 电泳级 琼脂糖 10X 加样 缓冲液 (20% Ficoll400, 0.1mol/LEDTA_Na2pH8, 1.0% SDS, 0.25% • 146 • — 23.13 — 9.42 6.56 — 4.36 — 2.32 — 1.93 1.37 = 1.26 — 0.70 — 0.22 — 0.12 琼脂 糖浓度 : 1% 电 泳电压 : lV/cm 2.32 2.03 0.56 0.13 1.86 1.06 0.93 0.38 0.12 电泳缓 冲液: TAE 电 泳时间 : 16h 图 2.1 常用的 DNA 相对 分子质 量标准 3. 电泳 缓冲液 的配制 (1) 25 x TAE 800mL 水 中溶解 121g Tris 碱 ,加入 28.55mL 冰 乙酸和 50mL 0.5mol/L EDTA, 定容至 1000 mL, 室温 保存。 (2) 10XTBE 800mL 水 中溶解 121g Tris 碱, 51.35g 硼酸和 3.72g EDTA, 定容 至 lOOOmL, 41C 保存。 4. 操 作步骤 凝胶 的制备 (1) 制备 足够量 的电泳 缓冲液 (TAE 或 TBE), 用 以灌满 电泳槽 ,制备 凝胶。 为了便 于在跑 电泳时 能见到 DNA 片段 ,可以 往电泳 缓冲液 中加入 溴化乙 锭溶液 , 使其终 浓度为 0.5Mg/mL。 假如 溴化乙 锭溶液 是分别 用来灌 满电泳 槽与制 备凝胶 ,要求 二者溴 化乙锭 的浓度 相等。 注意: 溴化乙 锭是突 变剂和 潜在的 致癌剂 。应 戴手套 ,操 作时应 小心。 (2) 称取 需要量 电泳级 的琼脂 糖于一 烧瓶中 ,量 取适当 量的电 泳缓冲 液加入 烧瓶中 (见表 2.1)。 在微 波炉或 高压锅 中融化 琼脂糖 ,旋摇 使之均 匀混合 。一般 凝胶所 含的琼 脂糖为 0.8% 至 1.5% ( 见评注 )。 溴 酚蓝或 0.25% 苯胺二 甲苯) DNA 相对分 子质量 标准品 (图 2.1) 55t: 水浴箱 凝胶电 泳装置 凝胶灌 制平板 凝胶 样孔梳 (狭槽 模具) 直 流电源 X X PSR322 BstE II (kb) Hind III (kb) BstN I (kb) 54 79228 .4 .2 .3 .6 09 .3 .6 8. 7. 6. 5. 4. 4. 3. 1 III I 二 • 147 • 表 2.1 分离不 同大小 DNA 片 段相应 的琼脂 糖浓度 琼脂糖 /% 分 离线性 DNA 片段 的范围 /kb 0.5 30 〜 1 0.7 12 〜 0.8 1.0 10 〜 0.5 1.2 7 〜 0.4 1.5 3 〜 0.2 (3) 融 化的琼 脂糖在 水浴中 冷却至 55X:, 然后倒 入已封 好并插 有样孔 梳的凝 胶灌制 平板上 。注 意及时 去除可 能产生 的气泡 。一般 而言, 凝胶的 厚度在 0.5~lcm。 样本孔 的 体积取 决于凝 胶的厚 度和样 孔梳的 大小。 融 化的琼 脂糖在 水浴中 冷却至 55t, 亦 可在此 时加入 溴化乙 锭溶液 ,混匀 ,使 其终 浓度为 0.5Mg/mL, 然 后灌制 平板。 如果 平板的 两端是 开的, 应用胶 纸封闭 。放 好凝胶 样孔梳 ,倒入 融化的 琼脂糖 ,需 保证在 梳的下 方不 留气泡 。凝胶 表面的 气泡要 在凝胶 凝固之 前将之 排除。 凝胶 的点样 和电泳 (4) 当凝 胶凝固 ,从 凝胶平 板上取 下封闭 的胶纸 ,取下 凝胶样 孔梳, 小心不 要撕裂 样 品孔。 大多 数的凝 胶平板 样孔梳 的底部 与凝胶 平板之 间相距 0.5~ 1mm, 这 样可保 证样品 孔完全 封住并 且预防 取下样 孔梳时 不会撕 裂琼脂 糖凝胶 。低 浓度的 凝胶和 较低温 度晈化 / 融化制 成的凝 胶应置 4X: 下冷却 ,以获 得额外 的硬度 并预防 撕裂。 (5) 将装 有凝胶 的平板 放在电 泳槽中 。加 入足量 的电泳 缓冲液 ,盖及 凝胶并 超过胶 高 1mm ( 或刚好 浸及整 个样孔 )。 需保 证样孔 中没有 气泡。 (6) 所制备 DNA 的量加 上加入 l〇x 加样 缓冲液 的量不 能溢出 凝胶孔 。用微 量吸量 管 将样本 点到凝 胶孔中 。要 小心孔 与孔之 间的样 本不要 混合。 注 意设立 适当的 DNA 相对分 子质量 标志物 (图 2.1)。 (7) 确保 导线正 确连接 ,使 DNA 在凝胶 中向阳 极移动 。将电 压设定 需要的 强度, 一般是 1 〜 lOV/cm, 开 始电泳 。通 过加样 缓冲液 中颜色 的迁移 ,可 以观察 DNA 分离的 过程。 注意: 应该为 凝胶装 置加盖 ,并 与之繁 忙使用 的工作 空间相 隔离。 (8) 当 加样缓 冲液中 的溴酚 蓝颜料 迁移的 距离足 以判别 DNA 片段的 分离时 ,关闭 电源。 假如溴 化乙锭 掺入到 凝胶中 ,可 以将凝 胶置于 紫外灯 下显示 DNA, 并 可直接 拍照。 (9) 不加溴 化乙锭 的凝胶 ,可以 将凝胶 浸泡在 稀释的 溴化乙 锭溶液 (〇.5pg/mL) 中 ,并温 和摇动 10~30min 进彳 了染色 。如果 必要, 可以将 凝胶放 在水中 再振摇 30min 进 行脱色 。这 样可以 去除过 多的溴 化乙锭 。过量 的溴化 乙锭可 造成荧 光背景 ,使 小量的 DNA 不易 显示。 • 148 . (二) 微型凝 胶和中 型凝胶 小 的凝胶 (微 型凝胶 和中型 凝胶) 一 般比大 型凝胶 跑得快 ,往往 用于快 速分析 。由 于 所用的 孔较窄 ,凝 胶较薄 ,故 对分离 的片段 所需的 DNA 的量也 较少。 除了缩 减缓冲 液的 量和凝 胶的体 积之外 ,微 型和中 型凝胶 电泳的 方法与 以上描 述的大 型凝胶 的相类 似 。同样 ,无 论是对 大胶还 是小胶 ,影响 DNA 片段迁 移的参 数是一 样的。 选择 微型凝 胶或中 型凝胶 装置需 要考虑 电泳槽 可装的 缓冲液 的体积 。一 般而言 ,较 小的 凝胶电 泳电压 较高, 电泳缓 冲液很 快消耗 。因此 ,最好 选择凝 胶装置 电泳槽 能够装 较多 的电泳 缓冲液 。用一 些简单 的材料 也很容 易制作 微型凝 胶槽。 而小的 ( 比如长 15cm、 宽 8cm、 高 4cm) 的塑 料盒装 上插头 和铂丝 电极就 可以作 为微型 电泳槽 (见 图 2.2)0 图 2.2 微型凝 胶装置 虽然灌 制小胶 的平板 可购得 ,胶 也可倒 在设有 边框的 玻璃片 上或其 他小的 支持物 上 。这样 的凝胶 靠表面 张力固 定在支 持物上 。铺 胶后 ( 比如用 10mL 铺成 5CmX8cm 的 胶 ), 样孔梳 直接放 在支持 物上, 并由放 置两旁 的金属 夹固定 。由 于梳孔 的底部 没有琼 脂糖 ,特 别注意 取梳时 ,避 免胶从 支持物 上脱离 下来。 (三) 琼脂糖 凝胶中 DNA 的摄像 可以在 紫外灯 (>2500 W/ cm2) 的 照亮下 ,对 用溴化 乙锭染 色的琼 脂糖凝 胶中的 DNA 进行 摄像。 商品化 设备更 方便于 DNA 的 显示与 摄像。 注意 :紫外 光线对 眼睛与 暴露的 皮肤造 成损害 ,当 用紫外 灯时始 终都要 戴防护 眼罩。 下面 一种照 相机装 备有偏 振片胶 卷支架 (图 2.3), 为 凝胶摄 像提供 一种方 便的方 法。 为了使 DNA 荧光 使胶卷 显像达 到满意 的程度 ,需要 使用橙 黄色的 滤光片 ,也 可以 用透明 的紫外 线阻挡 滤光片 (柯达 Wratten*2B)。 偏 振片型 667 胶卷 (ASA3000) 提供 了 理想的 敏感性 。在调 整了曝 光时间 之后, 在胶卷 上可以 检测到 少到几 微克的 DNA。 • 149 • 图 2.3 凝胶照 相装置 (四) 方 法评注 1. 背 景信息 实际上 ,涉及 核酸的 所有科 学研究 ,都 应用 琼脂糖 凝胶电 泳作为 基本的 工具。 Mc- Donell 等 (1977) 和 Southern (1979) 的两 篇论文 ,对这 一 技术 及其在 DNA 分 析中的 实际应 用作了 详细的 描述。 2. 重要 的参数 虽 然琼脂 糖凝胶 电泳易 于操作 ,但进 行电泳 分离之 前一些 因素应 该考虑 。应 注意一 些影响 DNA 迁移 的参数 ( 即所用 的电压 和琼脂 糖浓度 ), 以使所 需要的 DNA 片 段得到 最佳的 分离。 要设计 出方案 ,以 使电泳 分离的 过程可 以进行 监控, 以及对 结果能 够进行 精确的 解释。 这还包 括所使 用的一 些工具 如跟踪 染料和 相对分 子质量 标记物 。影响 DNA 在琼 脂糖凝 胶中迁 移的参 数介绍 如下: 琼脂糖 的浓度 : 线性、 双链的 DNA 分子 通过凝 胶基质 的速度 与其相 对分子 质量的 对数 成反比 (Helling etal., 1974)。 因此 ,目的 DNA 的相 对分子 质量可 以通过 将其迁 移 率与已 知相对 分子质 M DNA 标 准品的 迁移率 进行比 较而计 算出来 。这 是琼脂 糖凝胶 电泳最 有价值 的特点 ,因 为它 为鉴定 DNA 片段的 大小提 供了一 种可重 复的精 确的方 法。 . 150 . 琼 脂糖的 浓度在 电泳分 离中起 着重要 的作用 ,它 决定可 被充分 分离的 DNA 分子大 小 的范围 。对大 多数分 析而言 , 0.5% 〜 1.0% 的琼 脂糖浓 度适用 于分离 0.5 〜 30kb 的 DNA 片段 。低 浓度的 琼脂糖 (0.3% 〜 0.5%) 用于分 离大的 (20 〜 60kb) 的 DNA 片 段 ,高 浓度的 (1.0%~1.5%) 琼脂 糖可分 离小的 (0.2~0.5kb) DNA 片段。 所用 的电压 :一般 而言, DNA 片段 通过琼 脂糖的 速度与 所使用 的电压 成正比 。然 而 ,随 着电压 的增高 ,大的 DNA 分 子的迁 移率要 比小的 DNA 分子大 。因此 ,较 高的 电压 分离大 DNA 片 段的效 率要明 显降低 。对分 离大的 DNA 分子 ,跑电 泳时, 最好用 低浓 度的琼 脂糖和 低电压 (约 0.5% 琼 脂糖, lV/cm)。 电泳缓 冲液: 有两种 使用极 为广泛 的电泳 缓冲液 ,三羟 甲基氨 基甲烷 / 乙酸 盐缓冲 液 (Tris/acetate, TAE) 和 二轻甲 基氨苯 基甲焼 / 硼盐 缓冲液 (Tris/borate, TBE)。 虽 然这 两种缓 冲液对 DNA 的迁移 率的影 响有些 不同, 在选择 的时候 应考虑 的主要 因素是 它 们的相 对缓冲 能力。 TAE 是最 常用的 缓冲液 ,尽 管在延 长电泳 时间或 电压很 高时, 它 最易被 消耗。 TBE 的 缓冲能 力要明 显的大 ,但 从凝胶 中回收 DNA 时 ,应避 免使用 (见 凝胶回 收方法 )。 DNA 的构 象:相 对分子 质量相 同而构 象不同 ,如闭 合环状 (I 型 )、 带缺 口环状 (II 型) 和线 状双链 (III 型) 的 DNA, 其通 过琼脂 糖凝胶 的速度 不同。 无溴化 乙锭存 在下 ,闭合 环状超 螺旋的 DNA, 如质粒 ,迁 移率比 其线型 DNA 快。 超螺旋 构象中 DNA 分 子卷紧 ,其流 体动力 学的半 径变小 ,从 而使其 更容易 通过凝 胶基质 。裂 口或松 弛 环状的 DNA 分子失 去了超 螺旋性 ,其 迁移速 度要明 显的慢 于超螺 旋型或 线型的 DNA 分子 (Johnson and Grossman, 1977) 〇 添加 的染料 (溴化 乙锭) 通常是 掺和到 凝胶和 电泳缓 冲液中 。染料 降低线 状双链 DNA 的 迁移率 ,而 且特别 对闭合 环状的 DNA 迁移率 有明显 的影响 。溴化 乙锭通 过产生 阳性 的超螺 旋改变 闭合环 状分子 的超螺 旋密度 。随着 溴化乙 锭浓度 的增加 ,阴性 的超螺 旋 逐渐地 被去除 ,同 时引起 DNA 分 子迁移 率降低 。游 离染料 的浓度 达到一 临界值 (在 0.1 〜 0.5pg/mL 之间) 时 ,超 螺旋不 复存在 。当仍 有一些 溴化乙 锭被结 合时, 阳性超 螺旋 就形成 ,与阴 性超螺 旋相反 ,阳性 超螺旋 引起分 子电泳 迁移率 的增加 。因此 ,通过 用 不同浓 度溴化 乙锭跑 电泳, I 型 DNA 很 容易与 其他拓 扑异构 体区分 开来。 3. 琼脂 糖凝胶 电泳时 DNA 的监测 与分离 DNA 样本: 在选择 DNA 的点样 量时, 要考虑 点样孔 的宽度 ,凝 胶的深 度以及 DNA 片段的 数量和 大小。 5~200ng 的单个 DNA 片 段可以 点样到 0.5cm 宽、 0.2cm 深 的点样 孔中。 5ng 是用 溴化乙 锭染色 可检测 的一个 DNA 片 段的最 小量。 200ng 相当于 可 分离的 最大量 (对于 10kb 以上 DNA 片 段拖带 和涂布 变得更 为明显 )。 对于含 有几个 片段 的样本 DNA, 一 般每个 0.5cm 的 点样孔 ,可加 0.1~0.5/ixg 的 DNA。 对于 含有许 多有 不同大 小片段 的样本 (比如 基因组 DNA 的 限制酶 消化物 ), 可充 分分离 1〇吨 以上 的 DNA。 示踪染 料:监 测电泳 分离过 程的最 常见的 方法是 注意掺 和到加 样缓冲 液中的 示踪染 料 的迁移 。两种 广泛使 用的染 料是溴 酚蓝和 苯胺二 甲苯, 二者可 显示不 同的电 泳迁移 率 。苯 胺二甲 苯一般 与大约 5kb 的 DNA 片段一 起迁移 ,溴 酚蓝 与大约 〇.5kb 的 DNA . 151 . 片段一 起迁移 。因此 ,溴 酚蓝是 最快片 段迁移 的标志 ,并 在测定 DNA 分 离迁移 所在凝 胶 的长度 中特别 有价值 。苯 胺二甲 苯对监 测较长 电泳的 过程是 有用的 。两 种染料 都会干 扰 同其共 迁移的 DNA 片段的 显示。 溴化 乙锭: 溴化乙 锭常用 于直接 显示凝 胶中的 DNA。 染料掺 和到核 酸堆积 的碱基 之间 ,当用 紫外灯 (260 〜 360nm) 照射时 ,发出 橙红色 的荧光 (560nm), 可检 测到非 常 少量的 DNA (<5ng) (Sharp etal., 1974)0 在电 泳前, 溴化乙 锭往往 加入到 凝胶和 电泳缓 冲液中 ,虽 然这对 DNA 的迁 移率有 一点 影响, 但这样 就不必 要在电 泳分离 完毕时 ,给凝 胶染色 。将溴 化乙锭 加到电 泳胶中 的 优点是 ,在 电泳的 整个过 程中可 以观察 DNA 的迁移 ,一直 到分离 完毕。 相对分 子质量 标志物 :在点 到凝胶 中的样 本中, 至少有 一行应 含有已 知相对 分子质 量 大小的 一系列 DNA 片段, 以便能 做出标 准曲线 ,来计 算未知 DNA 片段 的大小 。最 常使用 的相对 分子质 量标志 物是噬 菌体的 限制酶 消化物 。如 果针对 较小的 片段, 则用质 粒 PBR322 的限 制酶消 化物。 所示是 XDNA 和 PBR322 限制 酶消化 物的迁 移情况 和片段 大小。 除了 上述限 制酶片 段之外 ,还有 许多商 品化的 相对分 子质量 标志物 。这 些产 物往往 覆盖大 范围的 DNA 大小 。某 些产家 也提供 超螺旋 (I 型) 的标 志物, 以计算 质粒的 大小。 4. 常见 问题及 其原因 琼脂糖 凝胶电 泳常见 的问题 ,以及 一些可 能的原 因介绍 如下。 1) DNA 片段分 离不良 DNA 分离不 良的最 常见原 因是琼 脂糖浓 度选择 不当。 应该用 低浓度 的琼脂 糖凝胶 来分 离相对 分子质 量高的 DNA 片段, 而用高 浓度的 凝胶分 离相对 分子质 量低的 DNA。 条带模 糊在分 离小的 DNA 片段时 ,尤 其常见 。这 是由于 DNA 通 过凝胶 时发生 弥散。 当用 低电压 长时间 凝胶电 泳时特 别容易 出现。 2) 条 带涂布 在分 离相对 分子质 量高的 DNA 片段时 ,最 常发生 DNA 条带 的拖带 和涂布 。最常 见的 原因是 DNA 样本 过量, 或电泳 的电压 过高。 DNA 样本 被点到 撕裂的 点样孔 中也会 引 起广泛 的涂布 ,因为 DNA 容易 在琼脂 糖与凝 胶支持 物之间 迁移。 3) 凝 胶融化 电泳 分离时 琼脂糖 凝胶融 化表明 ,在制 备凝胶 时没有 用电泳 缓冲液 ,或 者在 电泳过 程中电 泳缓冲 液耗尽 。在用 高电压 长时间 电泳时 ,应 该用 TBE 而 不是用 TAE, 因为 TBE 的 缓冲能 力更强 。而且 ,微 型凝胶 和中型 凝胶槽 只能装 少量的 缓冲液 ,比 较大的 凝胶槽 更容易 耗竭缓 冲液。 5. 预 期结果 用基本 方案可 以很好 地分离 0.5 〜 25kb 的 DNA 片段。 对分离 10 〜 2000kb 的 DNA 分子 ,请 见如下 有关脉 冲电场 的凝胶 电泳的 描述。 • 152 • 6. 时 间安排 对 完全电 泳分离 所需要 时间长 短的影 响最大 的参数 是所用 的电压 。在 l~1.5V/cm 之间, 大多数 大的琼 脂糖凝 胶电泳 需过夜 。虽然 凝胶可 以电泳 得更快 ,特 别在凝 胶是冷 的时候 ,但是 由于所 用的电 压较高 ,较 大的 DNA 片 段也可 能得不 到很好 的分离 。由于 分 离取决 于所要 DNA 片段的 相对相 对分子 质量, 充分分 离所需 的时间 主要取 决于经 验 。如 上所述 ,通 过将溴 化乙锭 加到凝 胶中, 用紫外 灯显示 直接观 察电泳 的过程 ,很容 易从经 验得出 电泳所 需要的 时间。 一 般而言 ,微 型凝胶 与中型 凝胶电 泳时所 用的电 压与凝 胶的大 小相关 (>10V/ cm), 往往 在不到 lh 跑完 。应该 记住高 电压电 泳的两 个结局 :第一 ,如 上所述 ,缓冲 液很 快耗尽 ,因此 ,应 该使用 TBE 缓冲液 ,或使 用大体 积的凝 胶槽; 第二 ,高 电压会 造 成相对 分子质 量高的 DNA 片段分 离不良 。如 果要分 离大的 DNA 片段 ,应该 使用较 大 的胶和 / 或使用 较低的 电压。 二 、脉冲 电场凝 胶电泳 DNA 分子 <25kb 就 很难用 标准的 琼脂糖 凝胶电 泳分离 。用一 些能周 期性改 变凝胶 电 场方向 的技术 ,可 将这些 较大的 分子进 行分离 。最 简单和 最常用 的脉冲 电场技 术是倒 转电 场电泳 ,这种 方法能 够分离 10 〜 2000kb 的分子 (如果 用特殊 的装置 ,可以 分离更 大的 DNA 分子 )。 为了 分离超 过倒转 电场电 泳范围 的分子 ,必须 使用某 种角度 电场的 电泳 ,例如 钳位均 匀电场 (CHEF), 要用 这种技 术分离 的相对 分子质 量高的 DNA 样本 和 相对分 子质量 标志物 可以包 埋在琼 脂糖模 子中。 (一) 倒转电 场电泳 1. 原理 见方 法评注 中背景 资料。 2. 材料 1 % 琼脂糖 ,标 准级 或脉冲 电场级 (如 SeakemFastlane, FMC Bioproducts) GTBE 缓 冲液或 0.5 x TBE 缓冲液 包 埋于琼 脂糖中 的样本 ,或液 体样本 竭动泵 ( Cole- Parmer Masterf lex 或等 同物) 可 进行编 程的开 关装置 (MJ Research PPI-200 或等 同物) 琼脂糖 凝胶电 泳的其 他试剂 与仪器 注意: 某些电 源是脉 冲性的 ,而不 是恒压 输出, 因此不 能适用 于脉冲 电场凝 胶电泳 。一般 可以辨 认这 一点, 因为其 输出是 固定的 ,或 在某步 骤可以 调节, 而不是 经常可 变的。 . 153 . 3. 试 剂配制 (1) GTBE 缓冲液 50mL10XTBE 缓 冲液, 50mL2mol/L 甘油 ( 终浓度 O.lmol/L), 900mL 水 ,贮存 在室 温中。 (2) 10XTBE 800mL 水 中溶解 121gTris 碱, 51.35g 硼酸和 3.72gEDTA, 定容 ,至 lOOOmL, 4X: 保存。 ' 4. 操 作步骤 (1) 用 GTBE 或 0.5XTBE 缓冲 液制备 1% 的 琼脂糖 凝胶。 琼脂糖 凝胶的 厚度应 根据样 本的需 要制备 ,这 样就 可以尽 可能小 地消耗 电源与 热量。 溴化 乙锭可 以加到 凝胶中 ,但 是只能 在分离 <100kb 的 DNA 片段时 使用。 (2) 让凝 胶凝固 ,然 后小心 取下梳 和封口 胶带, 将制备 在琼脂 糖模子 中的样 本放入 加样 孔中。 假如 样本块 对祥本 孔太紧 ,可以 将带有 0.4mm (或更 厚些) 载胶管 夹的吸 量管插 到样孔 底部, 排 除样本 块下面 的空气 ,这样 就可以 很容易 将祥本 块放进 样本孔 。假如 样本块 可以很 容易放 进样本 孔 ,加入 融化的 琼脂糖 (55X:) 于 凝胶缓 冲液中 ,维持 孔中样 本块于 适当的 位置。 (3) 凝 胶放进 电泳槽 ,将缓 冲液倒 入槽中 ,覆 盖胶 2 〜 3mm, 液体样 本此时 点样。 为了 避免把 >l〇〇kb 的 DNA 撕裂 ,用 剃须刀 刀片将 吸管尖 端切掉 5mm, 温 和吸移 ,至少 有一行 设置溴 酚蓝。 (4) 将管道 的末端 与电泳 槽的再 循环连 接起来 ,或 直接 放在电 泳槽里 。将蠕 动泵调 整 到适当 的流量 ,微型 胶调到 5 〜 lOmL/min, 大 胶调到 20~50mL/min。 (5) 注 意极性 ,将可 调开关 装置与 恒压电 源连接 起来, 并将凝 胶装置 与开关 装置连 接 。将开 关装置 适当设 定后, 才能打 开电源 ,开始 电泳。 见重要 参数, 包括表 2.3, 参考时 间间隔 ,电 压和其 他参数 。最 常用的 正向与 反向时 间比是 3:1。 (6) 让溴酚 蓝迁移 lcm, 然 后打开 开关装 置和蠕 动泵。 (7) 结 束电泳 ,用溴 化乙锭 对凝胶 染色, 与标准 琼脂糖 凝胶一 样进行 摄像。 (8) 可 以对凝 胶进行 Southern 印迹 ,注 意转膜 之前必 须进行 酸性脱 嘌呤。 (二) 钳位 均匀电 场电泳 通 过周期 性地改 变凝胶 中电场 的角度 ,能够 分离几 百万碱 基对的 DNA 分子 。基本 装置 有许多 不同, 但都需 要特殊 的昂贵 的凝胶 电泳槽 。此外 ,某些 类型的 多角度 电场电 泳装置 产生如 此之多 的热量 ,以至 需要特 殊的冷 却装置 ,又 增加了 费用。 在这里 描述的 CHEF 或 其他变 角度电 场电泳 ,与 倒转电 场电泳 相类似 。因此 ,在 倒转电 场电泳 方法中 要考虑 的因素 ,应用 本法时 ,也 应加以 考虑。 变角度 凝胶电 泳的最 佳 条件的 选择请 见重要 参数。 1. 原理 见方 法评注 中背景 资料。 • 154 . 2. 材料 CHEF 电 泳电压 分压器 电路和 电泳槽 1 % 琼脂糖 ,标 准级 或脉冲 电场级 (如 SeakemFastlane, FMC Bioproducts) GTBE 缓 冲液或 0 . 5 x TBE 缓冲液 包 埋于琼 脂糖中 的样本 ,或液 体样本 螺动泵 ( Cole-Parmer Masterf lex 或等 同物) 可进 行编程 序的开 关装置 (MJ Research PPI-200 或等 同物) CHEF 电 泳分压 环路和 凝胶槽 (图 2.4) 3. 试 剂配制 GTBE 缓冲液 : 50mL10 x TBE 缓 冲液, 50mL 2mol/L 甘油 ( 终浓度 O.lmol/L), 900mL 水 ,贮 存在室 温中。 10XTBE: 800mL 水 中溶解 121g Tris 碱, 51.35g 硼酸和 3.72g EDTA, 定容至 1000 mL, 4*C 保存。 4. 操 作步骤 (1) 用 GTBE 或 0.5XTBE 缓冲 液制备 1% 琼脂糖 凝胶。 (2) 让凝胶 凝固, 小心取 下梳子 。在 每一样 孔中放 置制备 成琼脂 糖块的 样本。 (3) 将凝胶 放在电 泳槽中 ,以缓 冲液盖 没凝胶 2~3mm。 调整 再循环 流量至 > lOOmL/min, 注 意缓冲 液温度 。在 缓冲液 达到所 需电泳 温度后 再等待 5min, 以保 证凝. 胶稳定 在所需 温度。 (4) 加 入液体 样本。 (5) 注意 极性, 将可调 开关装 置与恒 压电源 、电 压分压 电路、 以及凝 胶装置 连接起 图 2.4 CHEF 电泳分 压环路 . 155 • 来。 将开关 装置各 参数设 定适当 的位置 ,开始 电泳。 (6) 结 束电泳 ,用 溴化乙 锭将凝 胶染色 。摄像 同标准 琼脂糖 凝胶。 (三) 相对 分子质 量高的 DNA 样本和 相对分 子质量 标志物 的制备 1. 原理 非 常长的 DNA 分子 是极其 脆弱的 ,经 不起标 准分子 生物学 的操作 。然而 ,这 些分 子可 以很容 易地制 备在琼 脂糖块 中并进 行操作 。本方 法描述 相对分 子质量 极高的 DNA 的 制备。 2. 材料 1% 琼脂糖 要制备 的样本 (如: 组织培 养细胞 、线虫 、细 胞核 、酵母 、细 菌或噬 菌体, 表 2.2) 表 2.2 相对 分子质 量高的 DNA 样本与 相对分 子质量 标准品 的制备 起 始材料 制 备 重新混 悬细菌 或噬菌 体颗粒 至一定 的浓度 ,以 产生所 需要的 DNA 样本 。比如 :5x 108/mL 的 大肠杆 菌平均 产生约 lOOngDNA 从 浓缩的 X 噬菌 体颗粒 的贮存 液开始 。这一 方法中 用某些 商品化 XDNA 不一 定起作 用 。可 试将噬 菌体贮 存液稀 释成几 种浓度 ,找出 最适宜 的浓度 。第 二次 以溶解 缓冲液 孵育 的温度 应该是 25X: 而不是 37X: 。 孵 育期间 ,分 子的黏 着端将 退火, 产生不 同长度 的多 聚体。 凝胶在 <25t: 下电泳 , 这些多 联体将 会连接 在一起 用 lOmmol/L NaN3 重 新混悬 ,以麻 醉虫体 ,然后 放在琼 脂糖中 分离 细胞核 ,大约 105 哺乳动 物细狍 核含有 lpg DNA 以不含 血清的 培养液 洗涤细 咆几次 (血清 可抑制 蛋白酶 K) 发 面酵母 在包埋 到琼脂 糖中之 前必须 把它们 的细狍 壁去掉 细菌和 噬菌体 入 相对分 子质量 标准品 线虫 细胞核 组织培 养细胞 酵母 溶解 缓冲液 (l〇〇mmol/L EDTA pH8.0, 100mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1% 氮- 十二 烷酰肌 氨酸钠 ,室温 贮存; 使 用前从 20mg/mL 贮存 液加入 lOO^g/mL 蛋白酶 K) 贮存 缓冲液 (l〇mmol/L Tris-HCl pH8.0, lOmmol/LEDTA, 室温 贮存) 400mmol/L 苯基甲 基磺酰 (基) 氟化物 (于 乙醇中 ) (PMSF) 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 相 应的限 制酶和 缓冲液 封闭 模子或 培养皿 (图 2.5) 3. 操 作步骤 (1) 制备封 闭模子 (如图 2.5), 如果封 闭模子 不是现 成的, 可将样 本加到 琼脂糖 中 。琼脂 糖倒在 培养皿 的底部 ,作 为一 种泥浆 ,再用 剃刀刀 片切成 一定的 大小。 . 156 . 孔——大 小和形 状与灌 胶的梳 子一致 干净的 塑料模 图 2.5 制 备相对 分子质 量高的 DNA 的封 闭模子 (2) 在室 温下用 水或相 应的缓 冲液或 培养液 分两次 重新混 悬样本 ,达 到所需 要的终 浓度。 样本 也可以 重新混 悬在原 先用于 制备样 本的缓 冲液中 ,或 混悬在 TE 缓冲 液中。 (3) 加入 等体积 1% 的 琼脂糖 ,融化 ,并 冷却至 50X:。 迅速 混合, 加到封 闭模子 中 。让 琼脂糖 置冰中 凝固。 (4) 从模 子上取 下胶纸 ,小心 将变硬 了的样 本块放 到预装 有至少 20 倍体积 溶解缓 冲液的 50mL 的圆 锥形试 管中。 50X: 孵育 过夜, 最好一 边孵育 ,一 边温和 摇动。 (5) 倒 出溶解 缓冲液 ,加入 新鲜的 溶解缓 冲液, 37T: 孵育 过夜。 (6) 倒 出溶解 缓冲液 ,加入 20 倍 体积的 贮存缓 冲液, 41C 贮 存或用 限制酶 消化样 本, 从步骤 (7) 进行到 (9)。 (7) 洗 涤样本 3 次 ,室温 下每次 lh。 洗涤液 是至少 10 倍体 积的含 lmmol/L PMSF 的 贮存缓 冲液。 注意: PMSF 是 蛋白酶 强有力 的共价 抑制剂 。它 有毒并 易挥发 ,因此 应该在 通风柜 中操作 。在液 体中它 不稳定 ,因 此溶 液应新 鲜配制 ,于乙 醇中的 400mmd/L 的贮存 液应置 -20t 冰 箱中。 PMSF 于 - 20C 下 会沉淀 ,加 温后会 溶解。 (8) 用至少 10 倍 体积的 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 洗 涤样本 3 次, 于室温 下每次 30min〇 ' (9) 将样 本放在 1.5mL 的离 心管中 ,去 除过量 的液体 。加入 相当于 样本块 一半体 积的 3 x 限制酶 缓冲液 (含 限制酶 )。 适当 温度下 孵育。 对 某些特 殊的样 本和酶 ,必须 对酶的 量进行 滴定, 控制消 化时间 ,以将 DNA 的降 解下降 到最低 限度。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 在 DNA 凝胶 电泳中 ,带负 电荷的 DNA 分子由 于电场 作用通 过凝胶 。不同 的琼脂 糖 凝胶为 DNA 分子提 供一套 大小不 同的孔 。小分 子很容 易通过 大胶孔 ,很快 通过凝 胶 。较 大的分 子不得 不挤压 ,或改 变构象 ,以通 过较小 的胶孔 ,因 此大分 子比小 分子通 过 凝胶要 慢一些 。分 子的迁 移率与 通过胶 孔的难 易程度 有关。 这一过 程称之 为“分 子 筛”。 • 157 • 大 于一定 大小的 DNA 分子要 通过挤 压才能 通过最 大的孔 ,否 则就不 能被凝 胶筛滤 过 。这 种大小 范围的 分子都 以相同 的速度 迁移, 称之为 “限速 迁移” 。对 常规的 琼脂糖 凝胶 电泳, 限速迁 移一般 发生在 20 〜 40kb 之间 ,取 决于凝 胶电泳 的确切 条件。 Schwartz 和 Cantor 于 1984 年指出 ,通 过周期 性地改 变电泳 时凝胶 中电场 的方向 ,可以 将 限速迁 移的分 子分离 出来。 转 换角度 电泳的 原理不 太复杂 。当 大分子 挤过筛 孔时, 它被迫 延伸它 的构象 。花一 定 的时间 (从几 毫秒至 几分钟 ,取决 于分子 的大小 ) 挤过第 一个孔 ,但是 一旦构 型被延 伸 ,这分 子就能 继续迅 速地挤 过一系 列的孔 ,从 而变成 限速迁 移的运 动形式 。假 如由于 改变了 电场的 方向, 而突然 迫使大 分子通 过凝胶 ,它必 须首先 改变成 一个新 的构象 ,从 而使 它向一 新的方 向迁移 。分 子越大 ,它变 成新构 象所花 的时间 就越长 。可 以利 用这时 间的差 异来分 离不同 的分子 。例如 ,虽然 100kb 和 200kb 分 子均以 相同的 限速迁 移的稳 定状态 通过凝 胶基质 ,但 是每一 次改变 电场方 向时, 100kb 分子 将跑在 200kb 分子的 刖头。 有 一些改 变角度 电泳的 方法。 Schwartz 和 Cantor 1984 年最早 使用一 种产生 非均一 电场 的装置 。非均 匀电场 能使条 带集中 ,但 是不可 避免地 使条带 电泳成 各种弯 曲的形 状 。更实 用的系 统是使 用均匀 的电场 。这 种电 场跑出 来的凝 胶条带 呈直线 ,已经 发明了 一些 达到均 匀电场 的方法 ,包括 CHEF ( 钳位均 匀电场 ) (Chuetal., 1986) 和 在长方 形 电泳槽 中电泳 ,并 周期性 地旋转 电泳槽 。两个 电场之 间的角 度必须 略大于 90°, 也可 以大 很多。 在 CHEF 中 ,凝 胶周围 绕以一 套电极 ,电 极的电 压固定 ,以 在凝晈 中产生 均匀的 电场 。这种 CHEF 凝胶 需要两 种额外 的设备 :电压 分压器 电路以 设定电 极的电 压和多 极凝胶 电泳槽 ,二者 市场上 均有售 。如图 2.4 所示是 CHEF 电压 分压器 电路的 样本。 固 定时间 改变角 度电泳 ,在 单一大 小范围 内产生 最佳的 分离, 但所分 离这一 大小范 围 之外的 DNA 的分 离程度 降低了 (见重 要参数 )。 因此, 在电泳 时根据 情况设 定不同 的脉冲 时间。 倒转 电场电 泳利用 了两个 均匀电 场间的 角度, 180° 为极 限值。 倒转电 场电泳 比改变 角度电 泳要来 得复杂 ,因为 其在向 前和反 向方向 上使用 了不同 的脉冲 。像 改变角 度电泳 一样 ,倒 转电场 电泳利 用分子 构象改 变使呈 限速迁 移的分 子通过 凝胶孔 的速度 减慢。 两种 技术的 不同点 之一是 ,在倒 转电场 ,单 一脉 冲时间 分离的 是仅仅 相对狭 窄范围 的分子 。为了 获得广 泛范围 的分离 ,必须 改变反 向脉冲 。随 着时间 的进展 ,从下 限到上 限迅 速增加 前向和 反向间 隔时间 ,可以 达到这 一目的 。应该 反复地 改_脉 冲范围 ,而不 是使 用一种 固定的 时间。 假如反 向时间 不够长 ,大 分子不 能由于 反向# 分改 变构象 ,可 迁 移得比 较小的 分子快 。通 过使用 时间梯 度可以 完全达 到目的 ,最 长的反 向能够 破坏所 有 分子的 构象。 2. 重 要参数 脉冲电 场电泳 取决于 不同大 小的分 子构象 改变所 需时间 的差异 。这些 时间受 到一些 因素 的影响 ,讨论 如下。 电压: 电压的 度量是 V/cm。 最好 将电压 计的两 个探针 插入在 凝胶两 端的缓 冲液中 . 158 . 直接测 其电压 ,将 读数除 以凝胶 的长度 。大多 数水平 凝胶电 泳槽只 将电源 电压的 80% 加在 凝胶上 ,其余 部分丧 失在缓 冲液电 泳槽中 ,因此 将电源 电压读 数乘以 0.8, 并将结 果除 以凝胶 的长度 ,可计 算出凝 胶电压 。仅仅 通过改 变电压 就可以 广泛改 变脉冲 电场凝 胶分 离度。 较高的 电压可 增加分 离范围 ,但 是也造 成最大 的分子 不能被 分离。 一般而 言 ,脉 冲电场 凝胶以 5 〜 10V/Cm 电泳。 温 度:脉 冲电场 凝胶电 泳的温 度范围 比较宽 。在一 定的时 间内, 30X: 情况下 的分离 度比在 10X: 情况下 的分离 度大。 要根据 最佳分 离来选 择适宜 的温度 并调整 一定的 时间。 倒 转电场 凝胶分 离的上 限受其 影响。 8V/ctn 下, 4X: 可分离 2000kb, 30T: 可分离 1000kbo 虽然可 以使用 不同的 g 度 ,但是 整个凝 胶必须 严格维 持在同 一温度 ,防 止“ 微笑” 效应 (smile effect)。 用蠕动 泵将缓 冲液再 循环可 很好地 达到这 一目的 。在 许多情 况下, 脉冲 电场凝 胶电泳 往往在 冷房中 进行。 缓冲 液:由 于脉冲 电场凝 胶电泳 所用电 压往往 比标准 凝胶高 ,产 生大量 的热量 。因 此, 往往使 用的是 0.5 XTBE 缓冲液 ,这种 缓冲液 带的电 流很小 。对小 于几百 kb 的分 子 ,这 种缓冲 液特别 适用。 DNA 在 TAE 缓冲 液中有 较高的 迁移率 ,但是 TAE 电流很 大, 能增加 凝胶的 温度。 GTBE 缓冲 液则两 者兼顾 ,它是 0.5XTBE, 含有 100mmol/L 的 甘油。 GTBE 能增加 DNA 的迁 移率, 而不明 显增加 电流。 溴化 乙锭: 溴化乙 锭可使 DNA 变 得僵硬 ,而减 慢分子 的构象 改变。 向凝胶 中加入 溴化乙 锭能帮 助分离 <100kb 的分子 ,但对 较大的 分子则 不主张 使用。 琼脂糖 : 琼脂糖 的浓度 越低, 可分离 的分子 大小范 围越大 ,并 同时加 快所有 分子的 迁移率 。特 殊的脉 冲电场 级琼脂 糖可由 几家公 司购得 ,这些 琼脂糖 制备成 的凝胶 有较大 的孔 ,以 至能分 离较大 的分子 。由 于使用 高强度 的凝胶 ,因 此能够 使用较 低浓度 。用 1 % 脉 冲电场 级的琼 脂糖制 备的凝 胶所产 生的效 果与以 0.8% 常规 琼脂糖 制备的 凝胶的 效 果相似 ,但 却坚固 的多。 脉 冲时间 :对于 改变角 度电泳 ,为 了达到 最好的 分离, 所用的 脉冲时 间要足 以分离 最大的 分子。 脉 冲时间 对倒转 电场电 泳来说 是非常 重要的 ,因 为一定 的反向 脉冲时 间的分 离范围 是 较窄的 。所 使用的 反向时 间取决 于分离 所有目 的分子 。前 向与反 向时间 之间的 比率一 般介于 2. 5:1~3. 5:1 之间 。比 率越低 ,分离 的效果 越好, 但是电 泳越慢 。最常 用的比 率是 3:1。 以下 列出了 倒转电 场凝胶 电泳和 CHEF 分 离度和 电泳速 度的计 算公式 a、b 倒转电 场凝胶 : 分 离的最 大分子 (kb): 0.13X (了 + 40) X yUx (3-A)0 6x^875 分 离的最 小分子 (kb): 0.75 X 最 大分子 ■b 片 段的麵 (em/h) 0-00i6^x25)^x_yp CHEF 或其他 改变角 度凝胶 : 分 离的最 大分子 c (kb): 0.034X (了 + 40) x V11 x (3- A)° 6x 严875 分 离的最 小分子 (kb): 0.75 X 最 大分子 . 159 . lOkb 片段 的速度 (cm/h) 0.0012X (丁 + 25) x V16xcos (Q/2) A a. 公式假 如使用 0.5XTBE 缓冲液 ,对 GTBE 和 TAE 缓冲液 而言, 所分离 的大小 要大些 ,凝胶 . 电泳要 分别快 20 % 和 30%。 b. 变量 : 了 = 温度 (X:) V= 电 场强度 (V/cm) A = 琼脂糖 (%), 对脉冲 电场级 琼脂糖 要乘以 0.8 £ = 脉 冲时间 (s) (对 倒转电 场凝胶 ,是反 向时间 ) 尺 = 前向时 间与反 向时间 的比率 Q= 重 新方向 的角度 c. 倒转电 场不分 离此范 围之外 的片段 . 例如 :对倒 转电场 凝胶电 泳而言 ,在 0.8% 琼脂糖 凝胶中 , 12X: 下 ,以 8V/cm 电 泳 ,反 向脉冲 l〇s, 前 向脉冲 30s: 最 大分子 = 0.13x (12 + 40) x8Ux (3-〇.8)06xi〇0875 =0. 13X52X9. 85x 1.6X7. 5 = 800kb 最 小分子 = 0 . 75 x 800 = 600kb 、击 # 0.0016X (12 + 25) x816x (3-1) 述反- 0.8X (3 + 1) = lcm/h 因此, 此凝胶 可分离 600~800kb 的 片段, 10kb 片段 迁移速 度将是 lcm/h。 3. 问题 及解决 分离范 围太高 或太低 : 参考表 2.3, 将参 数调整 到适当 的位置 (一般 是调整 电压表 脉冲 时间, 从而改 变分离 的大小 )。 凝胶 出的条 带增宽 或消失 :增加 温度或 电压。 条带 分散: 延长样 本电泳 的时间 或降低 电压, 或两者 兼备。 过分 “微笑 ”: 产生过 多的热 ,可降 低电压 、凝 胶厚度 ,或缓 冲液的 深度以 减少产 热 ,或增 加缓冲 液的再 循环。 4. 预期结 果和时 间安排 目的 分子将 能很好 地以直 线条带 的方式 被分离 出来。 凝胶电 泳所需 要的时 间可以 根据表 2.3 进行 计算。 样本制 备需要 两个过 夜孵育 ,如 果需要 ,限 制酶消 化约需 Id。 三 、用 琼脂糖 凝胶分 离和回 收大的 DNA 片段 本节描 述从琼 脂糖凝 胶回收 与纯化 DNA 片段的 方法。 第一种 方法描 述了用 缓冲液 灌满 透析袋 ,从标 准琼脂 糖凝胶 中电洗 脱目的 片段, 然后用 Elutip 层析柱 进行浓 缩与纯 化 。这 一方法 可有效 地用于 50 〜 20 OOObp 的片段 。直 接在 NA-45 纸 上电泳 (第 二种方 • 160 • 法) 能为 <2000bp 的片 段提供 较高的 产量。 >1000bp 的片 段也能 在低熔 点的琼 脂糖胶 上进 行分离 ,然后 酚抽提 (第三 种方法 )。 卩- 琼脂糖 酶消化 凝胶或 用玻璃 珠抽提 可作为 替 代方法 。还讲 述层析 柱方法 ,随 后是 溶液中 DNA 浓度的 计算。 (一) 从琼脂 糖凝胶 中电洗 脱回收 DNA 片段 1. 原理 用适 当的限 制酶消 化目的 DNA 之后 ,在 琼脂糖 凝胶上 电泳。 然后用 物理的 方法从 凝胶上 切下待 纯化的 含有限 制性酶 切片段 的凝胶 。将 这块琼 脂糖置 于装有 缓冲液 的透析 袋 ,然后 再进行 电泳。 限制性 酶切片 段从凝 胶迁移 入缓冲 液中, DNA 用 Elutip-d 层析 柱进一 步纯化 和浓缩 。这一 方法对 50~20 OOObp 之 间的片 段是有 效的。 2. 材料 含目的 序列的 DNA 适当 的限制 性酶切 缓冲液 溴化乙 锭溶液 (1000X 贮存液 〇.5mg/mL, 工作液 0.5 吨 /mL, 避光 保存) TAE 缓冲液 (配制 见琼脂 糖凝胶 电泳) 2.5mol/L NaCl Elutip 商 盐溶液 (lmol/LNaCl, 20mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA, 过 滤除菌 ,室温 保存) Elutip 低 盐溶液 (0.2mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl pH7.5, lmmol/L EDTA, 过 滤除菌 ,室温 保存) 100 % 和 70% 乙醇 TE 缓冲液 ( 1 Ommol/ L Tris- HC1 pH8 . 0 , 1 mmol/ L EDTA) 透析袋 (直径 11.5mm) Elutip 层析柱 小针筒 (如 5mL) 用于限 制性酶 切消化 、琼 脂糖 凝胶电 泳和照 相的其 他试剂 和设备 3. 操 作步骤 DNA 的酶切 和电泳 : (1) 用适 当的限 制酶完 全消化 0.1~25fxgDNA。 电泳 能回收 DMA 片段的 量和将 要使用 这一片 段的量 ,是决 定要消 化多少 DNA 的最 重要的 因素。 对常 用的克 隆载体 和切口 平移片 段而言 ,要消 化足够 的样本 ,使 目的电 泳条带 中含有 lOfigDNA。 对 制备用 于单一 克隆实 验的片 段而言 ,目 标条 带中有 l^gDNA 就 足够了 。在大 量点样 电泳前 ,应 该用 小量的 DNA 消化 物在微 胶中进 行电泳 ,这 能够明 确消化 效率, 并且证 实相应 限制性 位点的 存在。 (2) 点样 电泳。 选择 凝胶的 大小和 浓度以 及电泳 速度时 ,应 该考虑 要分离 DNA 片段 的相对 分子质 量以及 样本中 其他片 段的相 对分子 质量。 当要分 离大的 DNA 片段, 或目的 DNA 片段较 难与其 他片段 分离时 ,最好 • 161 • 使 用大胶 (20cmX20cm) 宽孔 (如 4~5cm), 当要 分离的 是小的 DNA 片段时 , 最好使 用微胶 。最好 在制 备的凝 胶上只 电泳单 一样本 ,并尽 童少用 或不用 标志物 ,这 样就避 免目的 片段受 污染。 (3) 电 泳之后 ,以溴 化乙锭 溶液对 凝胶进 行染色 ,然后 照相。 在凝 胶上看 到多余 的条带 是不足 为奇的 。因为 凝胶中 有许许 多多的 DNA, 限制性 酶部分 消化产 物有时 可见。 如果电 泳得太 快或者 在凝胶 样本孔 中加的 DNA 太多 ,在条 带的背 后直至 点样孔 ,可以 看见 DNA 电泳 的“火 焰”。 当出现 “火焰 "时 ,也可 能是少 量的几 种具有 不同相 对分子 质量的 DNA 同 目标条 带一起 迁移。 DNA 的电 洗脱: (4) 用紫 外光线 显示条 带后, 用手术 刀片小 心地切 下目的 条带。 将凝 胶片尽 可能切 得窄些 ,假如 凝胶上 的目的 条带很 靠近另 一条带 ,宁 可只 切下目 标条带 的中心 部位 。需保 证尽可 能缩短 眼睛、 皮肤和 DNA 与紫 外光线 的接触 时间。 注意: 要戴安 全护目 镜或全 脸面罩 ,因为 紫外线 可灼伤 角膜, 哪怕是 短暂的 接触即 可发生 ,这可 引 起剧烈 的疼痛 ,并 可引起 感染甚 至失明 。强 的紫外 光线在 lkb 的片段 ,电洗 脱和纯 化后的 产量为 80% ~90%。 对于 较小的 片段, 一般的 产量是 50%~60%。 (二) NA-45 纸电 泳回收 DNA 片段 1. 原理 这种 方法比 上一方 法简单 ,它 不需要 操作凝 胶片和 透析袋 。这 种方法 特别适 用于小 的 DNA 片段 (即 <2000bp)。 在含有 溴化乙 锭的凝 胶中电 泳后, 将一张 NA-45 纸放在 凝胶 中目的 片段的 前面。 进一步 电泳后 ,目的 片段就 迁移到 纸上, 然后将 纸从凝 胶上取 下, 用高盐 将此片 段从纸 上洗脱 下来。 2. 材料 超纯 琼脂糖 (如 SeakemGTG 琼 脂糖, FMC 生物 产品) TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) NA-45 洗脱 缓冲液 (lmol/LNaCl, 0.05mol/L 精氨酸 ,过 滤除菌 ,室温 保存) 缓冲酚 (见 DNA 的酚提 取与乙 醇沉淀 ) 酚 / 氯仿 / 异戊醇 25:24:1 95 % 与 70 % 乙醇 ,冰冷 两把扁 平慑子 琼脂 糖凝胶 电泳和 DNA 抽提 、沉 淀的其 他试剂 和设备 3. 操 作步骤 (1) 用合 适的限 制酶将 DNA 样品完 全消化 ,点 样至 琼脂糖 凝胶。 EB 在凝胶 中的浓 度为 0 . 5 /ig/juL。 (2) 在合适 的电压 下电泳 ,并 用手 提紫外 灯观察 ,直到 目的片 段分离 出来。 (3) 停止 电泳, 用干净 的刀片 在目的 条带前 后方各 划出一 道口。 (4) 用 一把扁 平镊子 小心分 开切口 ,用镊 子将大 小与切 口对应 的小纸 片插到 两个切 口里。 NA-45 小纸片 剪成一 长方形 ,与目 的条带 一样长 ,与胶 同深。 不要用 手接触 NA-45 纸 ,用 干净镊 . 163 • 子 操作。 (5) 轻轻 推挤凝 胶两侧 ,确保 纸与胶 条接触 。用较 低的电 压进行 10mm 的电泳 ,使 DNA 转移到 纸上。 (6) 用镊 子将含 有目的 DNA 片段的 NA-45 纸条小 心取出 ,在 TE 缓 冲液中 温和地 洗 3 次。 (7) 将 洗过的 NA-45 纸转入 1.5mL 的塑料 离心管 ,加入 400/iL 的 NA-45 洗 脱缓冲 液, 70X: 温浴 ,对 <500bp 的片段 时间为 15min, 而 〉1500bp 的 片段为 lh。 (8) 用 400pL 的饱 和酚抽 提一次 ,水 相用酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提两次 ,最后 用氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (9) 加入 95% 乙醇 lmL, -20t: 沉淀 过夜。 (10) 离心 ,用 -20X: 预冷的 70% 乙醇 洗沉淀 ,最 后溶于 TE 缓冲 液中。 (三) 从低熔 点琼脂 糖凝胶 中回收 DNA 片段 1. 原理 从 电泳分 离好的 低熔点 琼脂糖 凝胶中 ,切出 含有目 的片段 的薄胶 。将 胶块熔 解进行 酚抽提 或者经 Elutip-d 纯化 。含有 DNA 片段 的琼脂 糖凝胶 熔解物 可直接 用于某 些反应 (如 限制性 内切核 酸酶消 化及连 接反应 ), 不需要 进一步 抽提或 Elutip-d 柱 纯化。 2. 材料 待 分离的 DNA 专用 的限制 性内切 核酸酶 及酶切 缓冲液 低熔 点琼脂 糖凝胶 (Sea Plaqu, FMC Bioproducts) 溴化乙 锭溶液 (1000X 贮存液 〇.5mg/mL, 工作液 0.5/ig/mL, 避光 保存) TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA) Tris-HCl 饱和酚 Elutip 高 盐溶液 (lmol/LNaCl, 20mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA, 过 滤除菌 ,室温 保存) Elutip 低 盐溶液 (0.2mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl pH7. 5, lmmol/L EDTA, 过 滤除菌 ,室温 保存) 手术刀 Elutip-d 柱 (Schleicher and Schuell) 贝克曼 JS-13 型水 平吊桶 式转头 (或 类似转 头及离 心机) 琼 脂糖凝 胶电泳 及乙醇 沉淀所 需试剂 及设备 3. 操 作步骤 (1) 以 相应的 限制性 内切核 酸酶完 全消化 DNA 样品, 纯化后 与加样 缓冲液 混合, 在 1% 低熔 点琼脂 糖凝胶 中电泳 ( 加入的 DNA 的量 在低熔 点琼脂 糖凝胶 中少于 标准琼 脂 糖凝胶 )。 • 164 • (2) 经溴 化乙锭 染色并 用手术 刀切下 靶条带 ,于 65C 熔解 胶条, 加入足 够量的 TE 缓冲液 ,使琼 脂糖含 量降至 0.4% 以下。 如果 DNA 样 本将用 于连接 、转 化或限 制性核 酸内切 酶消化 ,可直 接将卩 - 琼脂糖 /DNA 熔 化液用 于 反应。 . (3) 加入等 体积的 Tris-HCl 饱和酚 (非酚 / 氯仿 ), 剧 烈混合 5~10min。 15 80〇xg 室 温条件 下离心 lOmin ( 贝克曼 JS-B 转头为 lOOOr/min)。 (4) 吸 取水相 入新管 ,用等 体积的 TE 缓 冲液与 有机相 一起再 次抽提 ,离心 条件同 步骤 (3)。 (5) 吸取第 二次抽 提水相 。如果 仍然出 现较大 的界面 沉淀物 ,可 进行 第三次 抽提。 (6) 合 并水相 ,乙 醇沉淀 。经由 Elutip-d 柱进一 步纯化 DNA 或溶于 适当的 缓冲液 中直接 使用。 通 常最终 的沉淀 块较大 ,这 是由于 其中含 有丰富 的琼脂 糖所致 。如果 DNA 没有进 一 步纯化 ,在 样品中 加入终 浓度为 50(Vg/mL 牛血清 白蛋白 是很有 帮助的 ,这样 做可减 少酶 催化反 应的抑 制效应 ,这种 抑制效 应是含 琼脂糖 DNA 溶液所 具有的 特性。 (四) 用 P- 琼 脂糖酶 消化法 从低熔 点琼脂 糖凝胶 中回收 DNA 1. 原理 将含 有目的 DNA 的低熔 点琼脂 糖胶条 用卩- 琼脂糖 酶处理 ,它 把琼脂 糖中的 长链糖 消 化成单 糖和短 的寡糖 。于是 溶液中 剩下的 DNA 可以 直接进 行各种 处理, 如连接 、转 化 和限制 性核酸 内切酶 消化等 。乙醇 沉淀可 去除寡 糖样消 化产物 ,也 可通过 Elutip-d 柱 的 纯化。 2. 附 加材料 DNA 样品 低熔点 琼脂糖 凝胶电 泳试剂 及设备 溴化乙 锭溶液 (1000X 贮存液 〇.5mg/mL, 工作液 0.5/^g/mL, 避光 保存) (3- 琼 脂糖酶 I 琼 脂糖酶 缓冲液 (100mmol/L bis-Tris pH6.5, 10mmol/L EDTA, 过 滤除菌 ,室 温保存 ) 5mol/L NaCl 无 水乙醇 异丙醇 TE 缓冲液 (l〇mm〇l/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA) 刀片 3. 操 作步骤 (1) 消化 DNA 样品 ,在 1% 低熔点 琼脂糖 凝胶中 电泳, 溴化乙 锭染色 ,切 下目的 条带。 • 165 . (2) 将胶 条转入 一干净 试管中 ,在 冰上用 2 倍 体积的 1 x p- 琼 脂糖酶 缓冲液 洗涤两 次, 30min/ 次 ,加 入与胶 条体积 大致相 同的卩 -琼脂 糖酶缓 冲液。 (3) 65X: 水 浴加热 lOmin 使凝 胶完全 熔化。 (4) 将 熔化的 凝胶置 401C 平衡 lOmin, 每 200ML 的 1% 琼脂 糖加入 1U (3- 琼脂 糖酶, 继 续温育 lh。 DNA 溶液可 直接用 于连接 、转化 及限制 性消化 。对于 >50kb 的 DNA 片段可 采取透 析方式 除去酶 及糖 ,对于 <50kb 片 段依下 面步骤 进一步 纯化。 (5) 调节 P- 琼 脂糖酶 /DNA 溶液盐 浓度至 0. 5m〇l/LNaCl, 加 入等体 积无水 乙醇, 置冰上 15min 沉淀。 (6) 15 000 x g 离心 15min, 除 去未消 化的糖 类沉淀 ,上清 转入另 一 ■离心 管中。 (7) 加入 2~3 倍 体积的 异丙醇 ,混合 ,置 0t:30min。 (8) 15 000 Xg 离心 15min, 弃上清 ,干燥 沉淀块 ,用 TE 缓冲 液或其 他合适 的缓冲 液重新 溶解沉 淀块。 (五) 用破 璃珠从 低熔点 琼脂糖 中回收 DNA 1. 原理 将通过 低熔点 琼脂糖 凝胶电 泳分离 的含有 DNA 片 段的胶 条熔解 ,在 高盐浓 度下用 玻璃 / 硅胶 悬浮液 处理。 此时, DNA 吸 附于玻 璃球上 ,而凝 胶中的 污染物 可随后 洗去。 DNA 用 低盐缓 冲液进 行洗脱 ,并可 直接上 Elutip-d 柱 。此法 适用于 50bP 的片段 。此法 虽然比 标准电 洗脱或 有机提 取法快 ,但 产量 较低。 2. 材料 DNA 样品 低熔点 琼脂糖 凝胶电 泳试剂 及设备 溴化乙 锭溶液 (1000X 贮存液 〇.5mg/mL, 工作液 0.5pg/mL, 避光 保存) 6mol/L Nal 溶液 玻璃 珠悬液 15mL 聚丙烯 离心管 45~55t: 水浴 以上材 料亦可 用商品 试剂盒 (如 Glas-Pac、 National Scientific Supply、 Gene Clean、 Bio 101 和 Qiaex Gel Extraction Kit Qiagen)。 3. 操 作步骤 (1) 完 全消化 DNA 样品 ,纯 化后于 1% 低 熔点琼 脂糖凝 胶中进 行电泳 ,溴 化乙锭 染色 ,切 下含有 DNA 的 胶条。 (2) 将胶 条转至 15mL 聚丙烯 管中并 加入约 为胶条 2 〜 3 倍 体积的 Nal 溶液。 (3) 置 45 〜 55X: 温育 5min 以 熔解琼 脂糖。 (4) 加入 玻璃珠 悬液, DNA 含量 <5fig 时 ,加入 5;iL 玻璃珠 悬液; DNA 含量 >5/xg • 166 • 时, 每超出 〇.5吨 补加 lfiL 玻璃珠 悬液, 在室温 下温育 5min, 并且保 持混匀 状态。 (5) 按“ 玻璃珠 法纯化 DNA” 方 案进行 纯化。 (六) 溴 化乙锭 斑点定 量法快 速测定 DNA 浓度 1. 原理 将 DNA 样品与 溴化乙 锭混合 ,滴 在保鲜 膜上和 DNA 标准的 荧光比 较估测 得样品 中 DNA 的浓度 。这是 测定稀 溶液中 DNA 浓 度的快 速方法 ,对测 定分离 片段的 回收率 很 有用。 2. 材料 待测 DNA 样品 TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA) 已 知浓度 DNA 标准 溴化乙 锭溶液 (1/zg/mL, 避光 保存) 保鲜膜 紫 外透射 仪上照 相设备 3. 操 作步骤 (1) 用 TE 缓 冲液配 制下列 DNA 标准 : 0/ug/mL、 lpg/mL、 2.5;xg/mL、 5/^g/mL、 7 • 5/ug/mL、 10pg/mL 和 20pg/mL。 (2) 取 4;xL 各 DNA 标准 溶液及 4pL 各未知 浓度的 DNA 样品和 4pL lpg/mL 的溴化 乙 锭溶液 ,充分 混匀。 (3) 将标准 溶液和 DNA 样品 / 溴化乙 锭溶液 点到塑 料膜上 ,置 于紫 外透射 仪上照 相, 通过与 标准溶 液的荧 光进行 比较估 测未知 DNA 的 浓度。 (七) 方 法评注 1. 背 景资料 分 离纯化 DNA 片 段方法 很多。 20 世纪 70 年 代就成 功地从 琼脂糖 凝胶中 分离出 DNA 片段 ,其 中包括 冻挤法 (Thuringetal., 1975)、 用碘化 钾溶开 凝胶法 (Blinet al., 1975)、 电 洗脱法 (Weinandetal., 1978) 等 。最 显著的 纯化方 法是把 DNA 片段 结 合到玻 璃珠上 。由 于仅某 种类型 的玻璃 珠能用 ,也 因为原 因不甚 明了, 所以科 学家们 打破 各种玻 璃器皿 ,以 图得到 有效的 玻璃珠 。这 个难题 后来由 Vogeletein 和 Gillespie (1979) 解决了 。本文 所述的 电洗脱 /Elutip 法 (Weinandetal., 1978) 尤 其重复 可靠, 所获 DNA 适于 各种酶 反应以 及一些 生物学 应用。 电 洗脱的 主要对 象是需 要用镊 子处理 的一小 段凝胶 。把 它放到 袋中, 但有时 凝胶条 的位置 和电场 的方向 不一致 ,也 不知道 什么时 候才算 洗脱完 所有的 胶条, 这些都 会引起 回收 不足。 第二个 方法是 NA-45 纸电 泳法。 把纸放 到条带 的起点 和终点 ,去除 高分子 . 167 • 杂 物片段 。不 过片段 <2kb 时 ,产 童较低 。第三 个方法 是低熔 点琼脂 糖凝胶 的办法 ,它 对所有 大小的 DNA 片段都 有效。 它最大 的好处 是不必 提出凝 胶中的 DNA 片段 ,就可 以 进行嗣 后的连 接作用 。在低 熔点琼 脂糖凝 胶中的 DNA 片段还 可以用 p- 琼 脂糖酶 I 进 行处理 ,此酶 可消化 琼脂糖 ,由 PseudononasAtlanta 分 离出来 。因为 它分解 糖苷链 ,把 琼脂糖 降解为 单糖和 短链寡 糖的混 合物, 就再也 形成不 了凝胶 。在 此后可 进行许 多其他 酶反 应而无 糖残基 的干扰 。有一 相关化 合物, 琼脂糖 消化酶 混合物 (GEL 酶 ) (Epicen- 1打技 术公司 ), 它的 性能有 所不同 ,可 用于变 性凝胶 或常规 琼脂糖 凝胶以 及低熔 点琼脂 糖凝胶 的消化 , 可见厂 商的说 明书。 分离 较大的 DNA 片段 (>500bp) 的备选 方法是 用玻璃 珠法或 硅胶法 。最 初由 Vo- gelstein 和 Gillespie (1979) 报道。 这是一 个很快 的方法 ,便 于把从 琼脂糖 凝胶纯 化出来 的 DNA 进 行浓缩 而不必 进行乙 醇沉淀 。商 品试剂 盒已广 泛使用 (如 Biolog 的 Gene Clean, National Scientific Supply 的 Glas-Pac, Qiagern 白勺 Qiaex-Gel Extraction)。 2. 重要参 数和疑 难解答 对于 回收片 段的最 适产量 ,最要 紧的是 DNA 消化物 的质量 和制备 用凝胶 的分辨 率。 如果制 备型凝 胶超载 ,就 会产生 污染, 每个片 段的一 小部分 “陷入 ”到其 他条带 中 。如果 某片段 将用于 某些克 隆步骤 ,或 在杂 交中用 做探针 ,那么 这种小 量污染 就意义 重大了 。如 需获得 大量高 度纯化 的片段 ,第 一次的 制备物 要再电 泳和再 纯化。 在 电洗脱 或低熔 点琼脂 糖法中 ,用 Elutip 纯 化法的 要点是 DNA 溶液 要慢慢 地通过 柱子 ,让它 全部吸 附上去 。低熔 点琼脂 糖凝胶 提取法 纯化的 要点是 直接用 缓冲好 的酚, 不 是用酚 / 氯仿 / 异戊 醇的混 合液。 转移到 NA-45 纸上 的效果 是好的 。但要 把纸小 心地放 到目的 条带的 前面, 纸和凝 胶间没 有气泡 。在把 NA-45 纸取 出之前 ,可以 用一盏 手提紫 外灯检 查凝胶 ,以 保证片 段转 移到纸 上了。 低 熔点琼 脂糖凝 胶没有 一般琼 脂糖凝 胶坚固 ,当把 梳子从 凝胶中 取出时 ,要 特别小 心撕破 。为了 避免凝 胶过热 熔解, 要保持 电压在 6 〜 7V/cm。 在 4% 的 凝胶中 ,用 TAE 缓 冲系统 ,溴 酚蓝标 志在约 50bp 处。 (3- 琼 脂糖酶 处理简 捷可靠 。消化 不全时 ,大 多可 补加酶 (可以 用到两 倍量) 来补 救 。当用 Sephasyl 柱纯化 DNA 片段, 和小的 寡核苷 酸分开 有困难 ,就需 用质粒 DNA 来标定 此柱。 玻 璃珠纯 化法中 的关键 组分为 玻璃珠 。它 可以去 掉杂物 ,但很 小的片 段倾向 于不可 逆地 黏到玻 璃珠上 ,并 难以洗 脱下来 ,所以 对小片 段来说 ,此 法不 适用。 3. 预 期结果 电洗脱 虽然费 时费劲 ,但它 对高纯 DNA 的回收 率最好 。片段 >1000bp 时, 回收率 约 80%; 小片 段回收 50% 〜 60%。 NA-45 纸电 泳适用 于片段 <2000bp, 回 收率约 50% 〜 90%。 片段 <1000bP, 用一般 或低熔 点琼脂 糖凝胶 过筛的 回收法 ,回收 率常在 70%〇 对大的 DNA 片 段来讲 ,玻璃 珠纯化 的典型 产量为 60%~80%。 此 法似对 >5000bp . 168 • 的 DNA 片段最 有效。 DNA 片段 >3~5kb 时, 可被玻 璃切断 。不过 Qiaex 凝胶 提取盒 的悬 液由活 性胶颗 粒组成 ,可将 50bp~50kb 的 DNA 片 段有效 结合和 洗脱。 4. 时 间安排 目的 条带要 在凝胶 电泳完 后尽快 切下来 ,使 DNA 条带 的弥散 最小。 湿的凝 胶条可 用保鲜 膜包好 放在冰 箱里, 能保存 12h 或几天 。按 分离 的片段 的大小 ,电 洗脱要 2~ 4h。 DNA 溶 液放在 41C 冰箱里 ,可在 好几天 后再进 行电泳 。一 旦用 Elutip-d 柱纯化 ,就 要操作 到乙醇 沉淀。 Elutip-d 柱本身 的操作 ,只要 15min 即可。 NA-45 纸的 洗脱, <500bp 的 片段要 lh, 对于 >1500bp 的片段 ,约要 2 〜 3h。 用低 熔点 琼脂糖 凝胶分 离纯化 DNA 片段 ,并作 酚提取 或卩- 琼脂糖 酶消化 ,约需 lh, 用玻璃 珠 纯化要 20~40min。 用 Seplasyl S-300 去掉 连接物 ,约需 30min。 第四节 DNA 小片段 的分离 与回收 本章 讲述非 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳和 筛分型 琼脂糖 凝胶电 泳对小 的双链 DNA 片 段的分 析性或 制备性 分离。 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 有较好 的分辨 率和较 大的分 离体积 。筛 分 型琼脂 糖凝胶 电泳易 于制备 和操作 ,对 简单的 分析性 应用很 方便。 一、 非变性 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 大 量小的 DNA 片段 (<1000bp) 可以用 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 把它们 分开。 纯化出 来的片 段可用 于克隆 、序 列测定 和标记 。本 节简述 非变性 聚丙烯 酰胺凝 胶的制 备和电 泳 ,以 及用化 学溶解 法或电 洗脱法 把分离 出来的 DNA 片段 (标记 的或未 标记的 ) 从胶 上洗脱 下来。 (一) 非变 性聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳纯化 DNA 1. 原理 本 处描述 分离小 的双链 DNA 片 段的聚 丙烯酰 胺凝胶 的制备 。胶制 备好了 ,就上 DMA 样 品电泳 ,最 后从捣 碎的胶 条中洗 脱回收 DNA ( 参见背 景资料 )。 2. 材料 l〇x 或 1XTBE (或 TAE) 电泳 缓冲液 pH8.0 ( 试剂配 制见琼 脂糖凝 胶电泳 ) 29:1 (m/m) 丙 烯酰胺 / 亚 甲双丙 烯酰胺 TEMED 10% (m/V) 过 硫酸铵 10X 加样 缓冲液 (2〇〇/〇Ficoll400, 0.1mol/LEDTA.Na2pH8, 1_0%SDS, 0.25% 溴 酚蓝或 0.25 % 苯胺二 甲苯) DNA 相对分 子质量 标准, pBR322-HinfI 或 MB-HpaII 169 • 0.5pg/mL 溴 化乙锭 洗脱 缓冲液 (〇.5mol/LNH4Ac, lmmol/LEDTApH8.0) 100% 乙醇和 70% 乙醇 TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA) 3mol/L 醋酸钠 pH5.2 制 胶用的 玻璃板 ,间隔 片梳子 聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳槽及 电泳仪 装有 硅化玻 璃棉或 2pm 滤膜的 注射器 Beckman JA-20 离心转 头或相 应设备 3. 操 作步骤 制胶 (1) 将制胶 用的玻 璃板及 间隔片 组合安 装并封 好底。 (2) 配制 胶溶液 ,按 核苷酸 长度调 整聚丙 烯酰胺 的浓度 (表 2.3), 制 备一块 50cm x 20cm x 1.6mm 的胶块 ,准备 50mL 溶液 即可, 按下列 试剂配 制一份 浓度为 5% 的 聚丙烯 酰胺凝 胶液。 10XTBE 缓冲液 5mL 29:1 (m/m) 丙 烯酰胺 / 亚 甲双丙 烯酰胺 8.33mL H20 36.67mL (3) 置真 空抽气 装置中 抽真空 数分钟 ,去 除微小 气泡。 (4) 加入 25juL TEMED 和 250ML 10% 过硫 酸铵, 混匀。 (5) 将胶 溶液倒 入两块 玻板之 间并插 上合适 的梳子 ,室 温下放 置至少 30min 使凝胶 聚合。 (6) 在 电泳槽 的下槽 中灌注 lx TBE 缓 冲液。 (7) 聚合 完成后 ,拔 出梳子 ,用水 轻洗加 样孔, 去掉底 层封底 胶带。 (8) 将玻璃 板装到 凝胶电 泳槽上 ,用 一带 有弯头 的注射 器去除 胶底都 玻板之 间的气 泡, 在上槽 中灌注 lx TBE 缓 冲液使 之覆盖 加样孔 ,并用 合适的 加样注 射器冲 洗加样 孔 ,确 认孔中 无任何 气泡。 走胶 (9) 加入 10 x 加样 缓冲液 至每份 DNA 样品及 相对分 子质量 标准中 ,达到 1 x 终浓 度, 混合后 点样。 (10) 按 5V/cm 电压 降进行 电泳, 直至获 得所需 要的分 离度。 (11) 卸下 玻璃板 ,使 胶完整 地留在 一块玻 璃上。 (12) 将凝 胶置于 0.5fig/mL 溴 化乙锭 中染色 10 〜 30min, 如果 需要, 可在水 中浸泡 10 〜 30min 脱色 ,调整 本底。 (13) 在紫外 灯下照 相。. 回收 DNA (14) 用 手术刀 小心切 下目的 DNA 条带 ,移至 1.5mL 离心 管中, 并切碎 胶条。 (15) 加入 为胶块 体积约 两倍的 洗脱缓 冲液, 37X: 温育 2 〜 3h (<250bp 片段) 或过 . 170 • 夜 (>750bp 片段 )。 (16) 室温下 50〇xg 离心 l〇min, 移出 上清, 避免吸 取凝胶 碎片。 (17) 用少 量洗脱 缓冲液 洗涤凝 胶碎片 ,回收 残存的 DNA, 合并两 次上清 ,可 将上 清用 硅化玻 璃棉或 2pm 滤膜 的注射 器过滤 ,以除 去残存 的凝胶 碎片。 (18) 用 2 倍体 积无水 乙醇在 -20X: 条件 下冷冻 30min 沉淀 DNA, 12 OOOX g 离心 10min〇 (19) 沉 淀块以 100/zL TE 缓 冲液重 新溶解 ,加入 1/10 体积 3mol/L 乙酸钠 pH5.2, 2 倍体积 100% 乙醇重 新沉淀 DNA。 (20) 再 次离心 ,沉 淀物用 70% 乙 醇洗涤 ,真 空干燥 lOmin, 用 TE 缓冲 液重新 溶解。 表 2.3 DNA 片 段达最 高分辨 率时的 丙烯酰 胺浓度 丙 烯酰胺 /% 分 离片段 的大小 /bp 溴 酚蓝标 志电泳 /bP 3.5 100 〜 1000 100 5.0 100 〜 500 65 8.0 60 〜 400 4 12.0 50 〜 200 20 20.0 5 〜 100 12 取自 Maniatis 和 Ptashne (1973 a, b) 和 Maniatis 等 (1975)0 (二) 电洗脱 法从聚 丙烯酰 胺凝肢 中纯化 DNA 片段 如时 间很紧 ,洗 脱步骤 (15)~(20) 可以用 下述电 洗脱法 替代。 DNA 片段的 回收率 应与 上法差 不多。 1. 附 加材料 小 透析袋 琼脂糖 凝胶电 泳设备 2. 操 作步骤 (1) 将 切下的 含目的 DNA 片段的 聚丙烯 酰胺凝 胶块放 入含有 0.1 XTBE 电 泳缓冲 液的 小透析 袋中。 (2) 将透 析袋置 于含有 〇. 1 x TBE 缓冲 液的水 平电泳 槽中。 (3) 以 2V/ cm 电压强 度电泳 2h, 使 DNA 片 段走出 凝胶并 附于透 析袋内 表面。 (4) 冲洗 凝胶及 透析袋 内表面 ,回 收袋内 0.1XTBE 缓冲 液中的 DNA。 、、1/10 体积 3mol/L 乙 酸钠及 2 倍体积 100% 乙醇, -20t: 沉淀 ,回收 A〇 • 171 • 1. 原理 (三) 电 洗脱到 DEAE 膜上来 纯化标 记片段 聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳分离 出来的 放射性 标记的 DNA 片段 ,通 常量都 很小, 不能用 染色 法查出 ,但 用放射 自显影 法却可 以显示 ,其照 片可用 于胶上 目的带 的定位 。目 的带 的胶 条可切 下来, 固定到 琼脂糖 凝胶中 ,用电 洗脱法 把它们 分离到 DEAE 膜上 。下述 方 法可以 代替基 本方法 中显示 DNA 和分离 DNA 的步骤 。此 法特 别适用 于甲基 化干扰 分析。 2. 附 加材料 1% (m/V) 琼脂 糖凝胶 (1XTBE 缓冲液 配制) DEAE 膜 DEAE 洗脱 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA, lmol/L NaCl) 酚 / 氯仿 / 异戊醇 25:24:1 lOmg/mL tRNA 溶液 65t: 水浴 3. 操 作步骤 (1) 放射性 标记的 DNA 片段 在非变 性聚丙 烯酰胺 凝胶中 电泳后 ,小 心地用 保鲜膜 将贴有 凝胶的 玻璃板 包好。 (2) 在暗 室中剪 一块略 小于凝 胶块的 X 光底片 ,置于 保鲜膜 上与凝 胶重叠 ,用 记号 笔 依底片 四角的 位置在 保鲜膜 上做定 位记号 ,以便 标出底 片边缘 ,固 定夹好 它们后 ,于 图 2.6 标记的 DNA 从聚丙 烯酰胺 凝胶经 琼 脂糖凝 胶电泳 转移到 DEAE 膜 图示在 聚丙烯 酰胺周 围倒胶 及插入 DEAE 膜 的方法 4X: 放射 自显影 1 〜 2h。 (3) 将冲洗 出来的 放射显 影底片 与保鲜 膜 上的标 记对齐 ,切 下目的 条带。 (4) 用镊子 取出聚 丙烯酰 胺凝胶 胶条。 (5) 将胶条 放入微 型琼脂 糖凝胶 装置底 部 ,倒入 lx TBE 缓冲液 配制的 1 % 琼 脂糖, 使之 凝固。 (6) 在胶 条下游 4 〜 5mm 处切 一 细缝, 剪一块 略宽于 胶条的 DEAE 膜 ,于 1 x TBE 缓 冲液中 润湿后 再插入 细缝中 ,约 60mA 电 泳 10 〜 15min, 将 标记的 DNA 片 段转至 DEAE 膜上 (图 2.6)。 (7) 取出 DEAE 膜 ,于 1XTBE 缓冲液 中洗涤 ,并 置于 微型离 心管中 ,用约 20(VL DEAE 洗 膜缓冲 液览盖 浸泡, 60X: 加热 30min〇 • 172 • (8) 转移上 清至另 一离心 管中, 在原管 中用等 体积的 TE 缓冲液 PH7. 5 洗膜 ,将洗 膜液 合并到 原有上 清中。 (9) 将洗脱 液离心 5mm, 将 上清转 入另一 管中。 (10) 加入等 体积酚 / 氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (11) 将上 层水相 转移至 另一管 ,加入 lpL 10mg/mL tRNA 溶 液及二 倍体积 100% 乙醇, 于冰浴 中沉淀 l〇min, 离心 l〇min。 沉淀用 70% 乙 醇洗涤 后干燥 lOmin, 最后将 沉 淀溶于 TE 缓冲 液中。 附:凝 胶上样 用塑料 毛细管 的制备 可以用 lmL 塑料 (聚丙 乙烯) 吸管 ,很 容易地 制出一 些柔韧 耐用的 毛细管 ,以供 垂 直的聚 丙烯酰 胺凝胶 上样用 ,并 且可重 复使用 。在它 这种吸 管的中 间部位 ,用 煤气灯 加热 到刚刚 发软几 乎要熔 的样子 ,拿开 l~2s ,垂直 拿着, 很快地 拉成一 长的毛 细管。 等塑料 冷却后 ,从中 间切断 ,装到 微量进 样器上 ,可上 样用。 也可接 吸引器 的管子 。每 用一次 要冲洗 干净。 可以吸 lmL 的水 ,做好 标记标 定它。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 (PAGE) 为低相 对分子 质量核 酸提供 高分辨 率分离 。特别 是 <500bp 的 DNA 片段, 用一般 琼脂糖 凝胶很 难分离 ,而在 PAGE 上很 容易就 把它们 分开 来了。 随着凝 胶网眼 的大小 (3.5%~20% 聚丙 烯酰胺 ), 可以把 10~1000bp 的片 段区分 开来。 DNA 纯化 所达到 的最高 分辨率 时的丙 烯酰胺 浓度, 已被权 威性地 制定出 来 (表 2.3)。 聚丙 烯酰胺 凝胶上 的样品 可比在 琼脂糖 凝胶上 多些。 小片段 l^g 可加到 lmmXlcm 的槽中 。从 聚丙烯 酰胺凝 胶上洗 脱下来 的片段 ,一般 没有那 种克隆 、测序 或标记 时会干 扰 酶作用 的杂质 。这 两个优 点使聚 丙烯酰 胺凝胶 成为纯 化相当 量的小 片段的 DNA 片段 时 的首选 方法。 聚 丙烯胺 凝胶是 由丙烯 酰胺单 体聚合 成长链 ,再 由一交 联剂, 通常用 N, N'- 甲烯 - 双丙烯 酰胺, 把它们 进一步 共价结 合而成 。聚 丙烯酰 胺的聚 合作用 ,由 过硫酸 胺提供 的自由 基启动 ,并由 TEMED 进 行稳定 。反应 10 〜 20mm 完成 ,不 过反应 速度可 由调整 TEMED 和过 硫酸胺 的浓度 来进行 调整。 聚丙烯 酰胺凝 胶的网 眼大小 ,取 决于 丙烯酰 胺单体 和交联 剂浓度 ,以 %T 表示 。如 5%T 表示含 5% (m/\〇 的丙烯 酰胺和 亚甲丙 烯酰胺 。%丁 增高 ,网眼 就变小 。对 各种 不同 范围的 大小片 段来讲 ,其 适%丁 值 可见表 2.3。 要分离 相对分 子质量 范围甚 大的片 段 ,可用 梯度胶 。这 种胶 上面的 网眼比 下面的 网眼大 ,所以 当片段 从上面 泳动下 来时, 愈来愈 受限制 。梯度 胶比较 难做, 但也不 常用。 2. 重要参 数和疑 难解答 聚丙烯 酰胺凝 胶分离 DNA 片段最 重要的 参数是 聚合反 应本身 。重要 的是用 高质量 的电泳 级试剂 。丙 烯酰胺 和亚甲 丙烯酰 胺在溶 液中均 分解为 丙烯酸 。它通 过凝胶 基质影 • 173 • 响分子 动力学 。丙 烯酰 胺溶液 要避光 ,只 能保存 几个月 。过 硫酸铵 溶液在 4X: 时 ,约可 稳定 一周。 制晈时 ,玻 璃片必 须清洁 ,不要 有气泡 带入。 在聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳中 ,经 常出现 的一个 问题是 “笑脸 ”, 中间的 泳道跑 的比旁 边的快 ,这是 因为胶 的散热 不一致 ,边上 比中间 冷些, 样品在 较高温 度下跑 的快些 。有 几个办 法可以 避免“ 笑脸” 。最 简单的 办法是 用较低 的电压 来跑胶 。变通 的办法 是加一 个能使 凝胶均 匀散热 的附件 ,诸如 金属板 ,或 者有一 个活动 的冷却 机制。 电 洗脱到 DEAE 膜上 ,从膜 上回收 DNA 后 ,出现 大的、 不溶解 的颗粒 ,可 能是由 于丙烯 酰胺有 杂质。 在琼脂 糖微型 凝胶中 ,若有 0.1%SDS, 就可抑 制这种 杂质的 结合。 然而 SDS 对 DNA 结合到 DEAE 上 ,有 微弱的 竞争力 ,故 电洗脱 的时间 要短。 3. 预 期结果 聚丙烯 酰胺凝 胶比起 琼脂糖 凝胶来 ,有很 大的加 样体积 ,如在 lmmX2cm 的泳道 上, 〉250bp 的片段 ,可 以加到 2吨, 小片段 可以到 5/ig。 量再大 时可以 用厚胶 。洗脱 时 ,在 37X: 摇 几小时 ,产量 对大片 段来讲 ,应为 60% ~75%; 小 片段应 >85%。 过夜 洗脱 可以等 量回收 ,用 麻烦一 点的电 洗脱办 法也可 达到此 目的。 4. 时 间安排 尽管聚 丙烯酰 胺凝胶 比琼脂 糖凝胶 在安装 和聚合 上要麻 烦一些 ,要 差不多 lh。 但. 聚 合之后 ,它 能保留 过夜, 或者在 防止槽 变干的 情况下 ,可以 保存几 个星期 。一 般来 讲 ,梳子 要留在 凝胶中 ,上 面要 有保鲜 膜包着 。聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳的限 制因素 是凝胶 变热 ,导致 “笑脸 ”生成 。散 热机制 或活动 冷却可 以使问 题减少 ,并大 大缩短 电泳时 间。 如果用 同样方 法进行 片段的 电洗脱 ,那么 在制胶 后不到 8h 就可 以把片 段纯化 出来。 二 、筛 分型琼 脂糖凝 胶电泳 1. 原理 筛分 型琼脂 糖凝胶 使用高 浓度的 琼脂糖 ,并 经过特 殊处理 。在 制胶和 跑胶上 ,和一 般琼 脂糖凝 胶一样 ,但 它如非 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 一样可 以区分 小片段 DNA。 2. 材料 低熔点 筛分型 琼脂糖 TAE 电泳缓 冲液, PH8.0 ( 试剂配 制见琼 脂糖凝 胶电泳 ) 3. 操 作步骤 (1) 用 1XTAE 缓冲 液配制 2%~4% 低熔点 筛分型 琼脂糖 凝胶。 (2) 同普通 琼脂糖 凝胶一 样加样 和电泳 ,溴 酚蓝指 示剂在 2% 凝胶中 迁移位 置大约 在 50bp 左右。 (3) 按从低 熔点琼 脂糖凝 胶中回 收分离 DNA 片段 中的任 一方法 回收此 凝胶中 DNA 片段。 • 174 • 4. 方 法评注 1) 背 景资料 筛 分型琼 脂糖凝 胶有独 特大小 的网眼 ,它 能把一 般琼脂 糖凝胶 分不开 的很小 片段的 DNA 分离 开来。 2% 〜 4% 的筛 分型琼 脂糖凝 胶可把 10~1000bp 范 围内的 DNA 片段分 开 ,所 以它可 替代聚 丙烯酰 胺凝胶 。但是 筛分型 琼脂糖 凝胶的 条带较 为弥散 ,分 辨率较 差 ,但 筛分型 琼脂糖 凝胶制 作容易 ,跑 胶快速 ,在各 种应用 中仍很 有用处 ,如检 查连接 物单 体的连 接作用 。因 为它也 有独特 的性能 ,在 65X: 解聚, 29X: 保 持液态 ,也 可用于 纯化 DNA 片段 ,如 同低熔 点琼脂 糖凝胶 那样。 不过用 聚丙烯 酰胺凝 胶制备 出来的 DNA 片段, 一般比 较干净 ,凝胶 纯化后 ,用 做各种 酶的底 物时, 实验的 重复性 较好。 2) 重 要参数 低熔点 琼脂糖 凝胶比 一般琼 脂糖凝 胶要脆 ,筛分 型琼脂 糖凝胶 就更脆 。厂商 建议不 要用 <2% 的浓度 。在取 出梳子 时要特 别小心 ,因为 加样孔 极易被 撕破。 因为在 65X: 解 聚 ,所以 要保持 低电压 (6~7V/cm) 电泳 ,以免 过热。 4% 的胶用 TAE 缓冲液 系统, 溴酚蓝 标志泳 动在约 50bp 处。 3) 预期结 果和时 间安排 片段 <1000bP 时 ,产量 和低熔 点琼脂 糖凝胶 差不多 (>70% )。 这种 胶的最 佳分离 度在 <500bP 处 。本 法甚快 ,尤 其是用 微型凝 胶时, 一般在 2h 内完 成。 第五节 DNA 印 迹与杂 交分析 特 定序列 的单链 DNA 或 RNA 分子 (探针 ) 与 具互补 序列的 另一个 DNA 或 RNA 分子 (靶 分子) 进行碱 基配对 的过程 ,称 为杂交 。杂 交分子 的稳定 性与碱 基配对 的程度 有关 。杂交 分析通 常是将 靶核酸 分子固 定于支 持膜上 ,用标 记探针 来互补 结合。 此结合 很敏感 ,可 测出 复杂基 因组中 的单拷 贝基因 ,故 广泛应 用于分 子生物 学中。 本 实验的 第一步 ,是把 变性了 的核酸 固定在 合适的 固体支 持物上 ,然 后和标 记探针 一起放 入促进 杂交作 用的溶 液中。 保温后 ,将 膜进行 洗涤, 洗去非 特异性 结合的 探针, 留下 与靶碱 基配对 的探针 。只要 严格控 制洗涤 的条件 ,所 获条带 可以是 100% 互 补于探 针的 靶序列 ,或者 只有一 点误配 。所以 同源序 列也可 能测出 ,可用 来研究 单一基 因组或 不 止一个 基因组 的相关 序列。 最早 的杂交 分析是 用长的 (100 〜 1000 碱基对 ) 放射 标记的 DNA 探针 来做的 ,近 来发 展了其 他类型 的探针 (RNA、 寡 核苷酸 )。 同时 标记方 法及其 检测手 段也有 改进。 对 影响杂 交稳定 性和杂 交速度 的因素 ,有 了进一 步理解 ,从 而产生 了新的 试剂和 新的测 定方法 。通 过摸索 找到合 适的方 式是一 个艰巨 的工作 。尤其 是一个 方法它 可能只 对某个 探 针-靶 的组合 很适用 ,而 改变其 中任何 一方就 不行了 。这 里介绍 的方法 ,是用 放射标 记的 DNA 探 针进行 杂交分 析的基 本方法 。虽 然花样 不多, 但可在 硝酸纤 维素膜 和尼龙 膜 (无电 荷或有 电荷的 ) 上 ,通过 Southern 印迹或 斑点印 迹得到 满意的 结果。 此外, 用 RNA 探针测 DNA 印迹 的方法 也一并 述及。 至于非 标记探 针的制 备及其 应用、 固定相 RNA 的杂交 分析、 重组克 隆库的 杂交分 • 175 • 析 以及用 标记寡 核苷酸 作为杂 交探针 的应用 ,请见 各章。 这些杂 交方法 不能孤 立地看 ,方法 评注中 讲了可 能的各 种修改 ,诸如 杂交前 、杂交 时 的改变 ,洗涤 溶液的 配方改 变和保 温时间 、保温 条件的 改变。 注 意:检 査放射 性污染 ,按规 定处理 放射性 废物。 一 、 Southern 印迹 Southern 印 迹是将 DNA 片段从 电泳凝 胶中转 移到支 持膜上 的技木 。转 移或 其后的 处 理是把 DNA 片段在 膜上固 定起来 ,所 以膜 是凝胶 上的条 带的半 永久性 再生。 DNA 固 定之后 可作杂 交分析 ,从 而把 互补于 标记探 针的序 列显示 出来。 在做 Southern 印迹时 ,要 选择 不同类 型的膜 和转移 缓冲液 ,还要 选方法 。最 常用 的膜是 硝酸纤 维素膜 ,不 带电荷 或带正 电荷的 尼龙膜 。尽管 这三种 膜的性 质不同 ,但对 许 多应用 还是可 以彼此 代替的 。尼龙 膜的主 要优点 是结实 ,可 以重 复使用 十多次 。硝酸 纤维素 膜较脆 ,很 少能用 到三次 。然而 硝酸纤 维素膜 仍被广 泛使用 ,因为 它在某 些类型 的杂交 试验中 ,背 景较低 。有 关各种 膜的性 质和优 点详见 评注。 (一) 用高盐 溶液在 尼龙膜 或硝酸 纤维素 膜上作 Southern 印迹 m 1. 原理 此法是 特为把 琼脂糖 凝胶上 的目的 DNA 印迹到 无电荷 或带正 电荷的 尼龙膜 上而设 计的 ,略 加修改 即可用 于硝酸 纤维膜 。第 一步是 把琼脂 糖凝胶 在一系 列溶液 中浸泡 ,以 去嘌呤 、变性 、中和 DNA 和膜 基质。 第二步 是用高 盐转移 液通过 上行性 毛细管 作用促 使 DNA 在转移 中与膜 结合后 ,但 不是 永久固 定下来 。最 后是用 UV 照射 (尼 龙膜) 或 烘烤 (硝酸 纤维膜 ) 法 ,把 DNA 固定到 膜上。 2. 材料 待 分析的 DNA 样品 琼脂糖 凝胶电 泳试剂 及设备 0.25mol/L 盐酸 变性液 ( 1 . 5mol/ L NaCl, 0 • 5mol/ L NaOH ) 中和液 (1.5mol/LNaCl, 0.5mol/LTris-HClpH7.0) 2〇xSSC(3mol/LNaCl, 0.3mol/L 二水 柠檬酸 三钠, 盐酸调 pH 至 7.0) 2XSSC (0.3mol/L NaCl, 30mmol/L 二水 柠檬酸 三钠, 由 2〇x 稀释) 海绵 、滤纸 、吸 水纸 、紫 外灯及 保鲜膜 尼 龙膜或 硝酸纤 维素膜 ,见表 2.4 平 头镊子 小 心:操 作时应 戴手套 ,以免 手被酸 碱溶液 烧伤。 避免污 染滤膜 ,取用 滤膜时 用平头 镊子。 表 2.4 用 于固定 核酸的 各种膜 硝酸纤 维素膜 支撑 型硝酸 纤 维素膜 不带 电荷的 尼龙膜 带正 电荷的 尼龙膜 活化纸 应用 ssDNA, RNA ssDNA, RNA ssDNA, dsDNA ssDNA, dsDNA ssDNA, RNA 结 合能力 (核酸 )/(fzg/cm2) 80 〜 100 80 〜 100 400 〜 600 400 〜 600 2 〜 40 抗 张强度 差 好 好 好 好 结 合形式 非共价 非共价 共价 共价 共价 有效截 留核酸 的下限 /bp 500 500 50 50 5 重复 探测的 可行性 差 (易脆 ) 差 (信号 丢失) 好 好 好 本表以 Brown (1991) 为 基础。 3. 操 作步骤 (1) 用合 适的限 制性内 切核酸 酶消化 DNA 样品 ,连同 相对分 子质量 标准一 起进行 琼 脂糖凝 胶电泳 ,溴 化乙锭 染色。 在凝胶 旁放置 一直尺 ,在 紫外灯 下拍照 ,便于 以后识 别。 凝胶的 厚度应 <7mm, 且在 能有效 分离条 带的浓 度范围 内尽可 能降低 琼脂糖 浓度。 (2) 用蒸馏 水稍稍 冲洗凝 胶块, 将凝胶 置于约 10 倍胶 体积的 0.25mol/L HC1 中浸 泡 30min, 并 在室温 下不断 温和地 振摇。 (3) 倒 掉盐酸 并用蒸 馏水冲 洗凝胶 ,加入 10 倍体 积变性 液摇动 20mm, 并重复 一次。 (4) 倒掉 变性液 ,用蒸 馏水冲 洗凝胶 ,加入 10 倍体积 中和液 ,摇动 2Gmin, 并重复 一次。 (5) 如图 2.7 所示, 在一个 塑料或 玻璃器 皿中放 置一块 略大于 凝胶的 长方体 海绵, 注入 20 XSSC 溶 液约至 海绵高 度的一 半位置 (图 2. 7A), 用一张 Whatman 3MM 滤纸 搭桥 (图 2.7B)。 (6) 剪三 张与海 绵一样 大小的 Whatman 3MM 滤纸, 20 x SSC 湿润 后置海 绵上。 (7) 将凝 胶置于 滤纸上 ,并用 玻璃吸 管赶走 其间的 气泡。 (8) 用 4 张塑 料膜沿 凝胶边 缘铺好 ,以 防“短 路”。 (9) 剪一块 略大于 凝胶的 尼龙膜 ,浸 于蒸 馏水中 5min。 如用 硝酸纤 维素膜 ,则先 浸水 5min, 后浸于 20XSSC 中 lOmin。 (10) 将湿 膜盖在 凝胶上 ,用 玻璃吸 管小心 地滚动 ,去 除所有 气泡。 (11) 用 20 x SSC 溶 液浇于 膜表面 ,剪 5 张与 膜同样 大小的 Whatman 滤 纸置于 膜上。 (12) 将 剪成与 膜同样 大小的 吸水纸 叠放于 滤纸上 ,厚 度约为 4cm。 (13) 置一 块玻璃 板于叠 层之上 ,并 加一块 〇.5kg 的重 物放置 过夜。 (14) 移去 吸水纸 及滤纸 ,用铅 笔在膜 上标出 加样孔 的位置 ,并 切去 膜一角 标记。 (15) 用 2XSSC 溶液漂 洗膜后 ,将 其置于 滤纸上 干燥。 (16) 用 可透紫 外线的 塑料膜 包裹膜 ,将有 DNA 的一面 朝向紫 外光源 (254nm) 照 射 ,其 时间长 短确定 见辅助 方案。 . 177 . (17) 将 膜置于 2 张滤 纸之间 ,于 80X: 真 空干燥 2h, 干 燥后的 杂交膜 可在室 温下放 置 数月。 附: UV 照射器 的标定 如用 UV 交 联法将 DNA 固 定到尼 龙膜上 ,那么 照射强 度就很 重要。 强度不 够时固 定不够 ,照 射过量 则导致 DNA 降解 ,所以 UV 照射器 必须进 行标定 。因 为仪器 放出的 光 强随其 使用年 限会有 所改变 ,所 以要常 常进行 校正。 如能用 UV 曝光计 ,可用 它来对 所用 的膜进 行照射 的时间 标定。 现在 ,有为 交联作 用特别 设计的 UV 光盒 ,大多 都有自 动装置 ,按使 用年限 改变其 输出 ,但 经常标 定一下 也是很 好的。 1. 材料 放射比 活性为 lOMpm/fig ①的 DNA 探针 点有 一系列 DNA 斑 点的尼 龙膜条 可透紫 外光的 塑料膜 杂 交及放 射自显 影试剂 及设备 ① dpm 为非许 用单位 ,但 为实验 中惯用 ,因此 暂沿用 , ldpm=60Bq 图 2.7 上 行性毛 细转移 Southern 印迹的 转移金 字塔叠 层方法 . 178 . 2. 操 作步骤 (1) 准 备一式 5 份点有 一系列 DNA 斑 点的尼 龙膜条 ,每 条膜上 DNA 的 范围为 1 〜 100/Mgo (2) 干燥尼 龙膜条 ,用 可透紫 外光的 塑料膜 包好, DNA 面朝 向紫外 光源。 (3) 打开紫 外光源 ,在 照射 30s、 40s、 lmin、 2min 和 5min 时 各取出 1 张 膜条。 (4) 用比 活性为 lOMpm/^g 的合标 的标记 DNA 探针对 这些膜 条进行 杂交。 (5) 放射 自显影 ,确 定哪一 些尼龙 膜条的 杂交信 号最强 ,所用 的曝光 时间即 为最适 曝光 时间。 (二) 用碱性 缓冲液 在尼龙 膜上作 Southern 印迹 1. 原理 在 碱性条 件下, DNA 可以 和正电 荷尼龙 膜不可 逆地共 价结合 ,可免 去转移 后的固 定步骤 。此 法略 加修改 ,也 可用于 无电荷 尼龙膜 ,但 转移不 够完全 。中 性尼龙 膜也可 用 ,所 保留的 DNA 较少 。硝酸 纤维膜 不适用 ,因 为在 PH>9.0 时, DNA 固定 不住, 时间一 长就分 开了。 尼龙膜 对碱的 抗力要 在用前 检查好 ,因 为有的 尼龙膜 对碱的 抗性不 好。 2. 材料 (同高 盐缓冲 液转移 ) 0.4mol/L (对 带电荷 的膜) 或 0.25mol/L (对不 带电荷 的膜) NaOH 0.25mol/LNaOH, 1.5mol/LNaCl (对不 带电荷 的膜) 带电荷 或不带 电荷的 尼龙膜 3. 操 作步骤 (1) 按 高盐缓 冲液转 移方案 准备凝 胶及用 0.25mol/L 盐酸 处理。 (2) 蒸 馏水漂 洗凝胶 ,加入 10 倍 体积的 0.4mol/L (对 带电荷 的膜) 或 0.25mol/L (对不 带电荷 的膜) NaOH, 缓 慢摇动 20min。 (3) 用 0.4mol/L NaOH 代替 20 X SSC 溶液作 为转移 液进行 转印, 转印时 间大于 2h。 对不 带电荷 的膜用 〇.25mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl 作为转 移液。 (4) 取出膜 ,标记 ,用 2XSSC 溶液漂 洗膜, 将其置 于滤纸 上干燥 ,室温 保存。 (三) 下行 性毛细 转移的 Southern 印迹 1. 原理 上 行性毛 细转移 法是基 本方法 ,但 不方便 的是凝 胶可能 被压在 它上面 的滤纸 和重量 压破, 降低毛 细作用 。这 个问题 在纸巾 泡到转 移缓冲 液中时 就更糟 ,它增 加了凝 胶上的 压力 ,使印 迹进程 变慢, 以致要 16 〜 24h 才 能完成 。本法 所述为 一 简单的 下行性 毛细转 • 179 • 移系统 ,在 胶外没 有过多 的压力 。一个 4mm 厚、 1% 琼脂糖 凝胶只 lh 就 能转移 完毕。 本法 适用于 各种膜 ,而 且高盐 缓冲液 、碱性 转移缓 冲液都 可用。 2. 材料 用高 盐溶液 转移材 料或碱 性缓冲 液转移 材料。 3. 操 作步骤 (1) 按 高盐转 移或碱 转移方 案准备 和处理 凝胶。 (2) 如图 2. 8 安装转 移塔。 由下到 上依次 为:玻 璃平皿 ,吸 水纸巾 (l~3cm 高 ), 4 张 Whatman 3MM 滤纸, 1 张转移 缓冲液 浸湿的 Whatman 3MM 滤纸, 用蒸馏 水润湿 的尼龙 膜或用 20 XSSC 润 湿的硝 酸纤维 素滤膜 ,塑 料膜, 凝胶, 3 张 Whatman 3MM 滤 纸, 2 张大 的转移 缓冲液 浸湿的 Whatman 3MM 滤 纸做的 滤纸桥 (接 至转移 20 x SSC 缓 冲液槽 ), 轻质玻 璃板。 (3) 转移 lh, 取下膜 ,用 2XSSC 漂洗 ,晾干 。固定 DNA 并将膜 保存于 室温。 Whatman 3 MM 凝胶 膜 Whatman 纸塔 (2~3cm) 玻 璃平板 Whatman 3MM 滤纸桥 转移 缓冲液 贮槽 图 2.8 下行 性毛细 转移的 Southern 印迹 的转移 金字塔 的安装 (四) 从聚丙 烯酰胺 凝胶电 转印至 尼龙膜 1. 原理 毛细转 移虽然 可信又 无需特 殊仪器 ,但是 不能用 于聚丙 烯酰胺 凝胶, 因为聚 丙烯酰 胺凝胶 的网眼 太小, DNA 不能 进行有 效的反 向扩散 。所以 聚丙烯 酰胺凝 胶必须 用电泳 转 移来进 行印迹 ,要求 用低离 子强度 的转移 缓冲液 ,所以 一般用 尼龙膜 。无 电荷 的尼龙 膜比 带正电 荷的尼 龙膜好 用些。 把带 有目的 样品的 聚丙烯 酰胺凝 胶放在 适当处 理过的 膜上, 把它夹 在电印 迹装置 上 ,用 电流将 DNA 从凝胶 转移到 膜上, 膜用缓 冲液冲 洗后就 可用于 UV 交联。 此法可 转 移小的 DNA 片段 ,并 把它们 充分的 保留在 膜上。 完全的 转移和 固定对 许多实 验来讲 很重要 ,如 基因 组序列 测定、 PCR 定量 少见的 DNA 等。 2. 材料 聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳试剂 及设备 尼龙膜 Whatman 3 MM 滤纸 • 180 • 0.5XTBE 电泳 缓冲液 0.4mol/L NaOH 2XSSC (0.3mol/L NaCl, 30mmol/L 二水 柠檬酸 三钠, 由 2〇x 稀释) 电 转印仪 (BioRad 设备) 镊子 、玻棒 3. 操 作步骤 (1) 在非 变性或 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 中电泳 DNA 样品。 (2) 电泳 即将结 束时, 将一张 凝胶大 小的尼 龙膜在 蒸馏水 中浸泡 5min。 (3) 从 电泳装 置中取 去一块 玻璃板 ,染色 后照相 (如 果是非 变性胶 )。 在凝 胶的表 面 铺一张 Whatman 3MM 滤纸 ,用 玻棒赶 去气泡 ,揭 起滤纸 将凝胶 剥离玻 璃板。 (4) 将两块 Scotch-Brite 垫 浸泡于 0.5 x TBE 电泳 缓冲液 ,反 复挤压 以去除 气泡。 裁 7 张 与凝胶 等大的 Whatman 3MM 滤纸, 浸泡于 0. 5 X TBE 电泳缓 冲液中 15 ~ 30min〇 (5) 将一块 饱和的 Scotch-Brite 垫 置于电 转印仪 的凝胶 夹板上 ,将 3 张 润湿的 What- man 3MM 滤纸置 于其上 ,用玻 棒赶去 气泡。 (6) 将 凝胶用 0.5XTBE 电 泳缓冲 液浸湿 ,置 于上述 滤纸上 ,再次 用电泳 缓冲液 浸湿。 (7) 将 处理过 的膜置 于其上 ,赶去 气泡, 再加上 余下的 4 张 润湿的 Whatman 3MM 滤纸, 盖上另 一 ■块 饱和的 Scotch-Brite 垫, 锁好。 (8) 将 凝胶夹 置于电 转印室 (膜面 向阳极 ), 加满 0.5XTBE。 打开冷 却装置 ,在 30V (约 125mA) 电转印 4h。 (9) 取下膜 ,标 记。 DNA 面向 上放在 3 张用 0.4mol/L NaOH 浸 泡过的 Whatman 3MM 滤纸上 lOmin, 进行 变性。 (10) 用 2XSSC 漂洗 ,晾干 。固定 DNA 并将膜 保存于 室温。 P (五) 方 法评注 1. 背 景材料 自从 Southern 首次 描述他 的印迹 方法后 (1975), Southern 印 迹就是 DNA 分析中 的台柱 。把 DNA 结合 、固 定到硝 酸纤维 素粉末 或膜上 的方法 ,曾 被生物 化学和 分子生 物 学用了 好几年 (Hall and Spiegelman, 1961; Nygaard and Hall, 1963), 但是 Southern 第一 个指出 按大小 分布的 DNA 片段 如何可 靠有效 地固定 下来。 Southern 转移法 的出现 和随 之而来 的杂交 技术, 使复杂 基因组 中的单 一拷贝 序列和 多拷贝 序列的 物理性 组合信 息首次 有可能 去获得 ,促 进了用 真核基 因克隆 试验的 成功, 直接推 动了诸 如内含 子发现 (Doeletal., 1977) 这样突 破性的 工作。 近来用 Southern 转 移法和 杂交技 术研究 限制性 酶 切片段 长度的 多态性 (RFLP), 又开 辟了新 的领域 ,如基 因图谱 (Jeffrey。 etal., 1985) 和 遗传疾 病的产 前诊断 (Davies, 1986)。 现在 Southern 印 迹指任 何一种 DNA 从胶 转到膜 。最初 只是毛 细转移 到硝酸 纤维素 . 181 • 膜 ,因 为这种 膜很脆 ,便找 另外的 支持物 ,结 果在 20 世纪 80 年代初 找到了 尼龙膜 。它 对转 移缓冲 液的要 求不高 ,近来 设计了 一些新 的缓冲 液配方 ,最重 要的改 进是用 碱性转 移缓 冲液和 正电荷 尼龙膜 ,此时 DNA 立即以 共价键 结合到 膜上, 免去硝 酸纤维 素膜和 无 电荷尼 龙膜在 转移后 的固定 步骤。 2. 重 要参数 所需 上样的 DNA 量取 决于进 行杂交 的靶序 列的相 对长度 。放 射性探 针的比 活性为 108~109dpm/Vg 时 ,它的 检测极 限约为 0.5pgDNA。 10pg 人 基因组 DNA 相当于 1.5pg 500bP 长 的单拷 贝基因 ,这就 是所上 样品的 最低量 。其他 DNA 适用 量详述 于后。 影响 Southern 印迹的 各种参 数的调 整必须 配合杂 交分析 ,因 为转移 效果只 有在膜 进行 放射自 显影后 才看得 出来, 所以要 相当长 的时间 去肯定 某个转 移的最 适条件 。在达 到满意 之前, Southern 转移 的质量 控制不 能忽视 ,有 时简单 地用更 适合的 膜或转 移系统 可 得到戏 剧性的 改进。 1) 膜 的选择 尼龙 膜和硝 酸纤维 素膜的 性质截 然不同 (见表 2.4)。 一般认 为尼龙 膜的主 要优点 是它 有较大 的张力 ,而 且在用 UV 交联时 DNA 可以 共价结 合上去 (Li etal., 1987), 用正 电荷尼 龙膜时 ,可 用碱性 缓冲液 (Reed and Marm, 1985)。 尼 龙膜可 以重复 使用到 12 次不 会破、 不会失 去它所 结合的 DNA。 硝酸纤 维素膜 则相反 ,它脆 、不 能共 价结合 DNA, 用烘 烤的办 法固定 DNA 时 ,会丢 失水分 。大约 用它做 3 次 杂交就 都成了 碎片, 而且 DNA 大半都 滤掉了 (Haas etal., 1972)。 如果反 复测试 很重要 ,就 选用 尼龙膜 ( 有电荷 的或无 电荷的 )。 尼 龙膜不 管有没 有电荷 ,其 明显的 缺点是 杂交后 背景信 号重。 任何杂 交试验 都会遇 到这 个问题 ,尤其 是用某 些非放 射性探 针时特 别不好 。如果 背景信 号真成 问题, 只有换 用硝 酸纤维 素膜。 尼龙膜 结合的 DNA 量要比 硝酸纤 维素膜 大约高 5 倍 。但 这不是 Southern 印 迹要考 虑的 ,因为 从来没 有达到 过膜的 最大结 合量。 更为重 要的是 DNA 滞留 片段大 小的限 度 。尼龙 膜保留 DNA 片段可 以小到 50bp, 硝酸纤 维膜对 <500bP 的分子 无效。 PCR 产 物在 转到硝 酸纤维 膜后, <500bP 的片 段有杂 交信号 ,这是 条带中 有许多 DNA 所致。 对 限制性 消化的 基因组 DNA 来讲, 如果用 作杂交 试验的 靶条带 <500bp, 就不 要选硝 酸纤维 素膜。 在硝 酸纤维 素膜、 无电荷 尼龙膜 、正电 荷尼龙 膜之外 ,还 有一 些不常 用的转 移基质 (见表 2.4)。 为 了改进 硝酸纤 维素膜 的张力 ,把 基质架 在一种 较硬的 平台上 ,叫 做支撑 型 硝酸纤 维素膜 。这是 20 世纪 80 年代末 的有趣 的改进 。实 际上由 于这种 支持物 质的存 在 ,使 膜结合 DNA 的能力 下降, 而且背 景很深 。第 二种改 变是用 活化纤 维素纸 ,如 ABM 纸 (Noyes and Stark, 1975)、 APT 纸 (Seed, 1982)。 这种纸 的纤维 素基质 中含有 芳香基 ,在化 学激活 后能与 DNA 共价 结合。 这些纸 的结合 能力都 比较低 ,在常 规工作 中 ,不像 说的那 样比尼 龙膜好 ,但它 们可结 合短到 2bp 的寡 核苷酸 ,这比 尼龙膜 或硝酸 纤维 素膜的 低限低 得多。 . 182 • 2) 转移 缓冲液 用硝 酸纤维 素膜时 ,必须 用高离 子强度 的转移 缓冲液 ,以 促进 DNA 和膜 相结合 (Southern, 1975; Nagamineetal., 1980)。 建议用 20XSSC, 它容 易配制 ,室 温中可 保 存数月 ,用 前不必 过滤。 但它用 于配杂 交溶液 时要即 时过滤 。硝 酸纤维 素膜不 能用低 浓度 SSC (如 10X), 因为 低离子 强度会 在转移 时丢失 较小的 DNA 片段 。碱性 缓冲液 也不能 用于硝 酸纤维 素膜, 因为在 PH9.0 时 ,它保 留不住 DNA, 而且在 碱中的 时间一 长还会 掉下来 (Dyson, 1991)。 尼 龙膜可 以在各 种条件 下结合 DNA ( 如酸性 、中性 、碱性 、离 子强度 高或低 ), 但 是 高盐缓 冲液如 20 X 或 1〇 X SSC 有 其好处 (Khandjian, 1987)。 加 2mmol/L 的 iV- 十二 烷酸 肌氨酸 (Sarkosyl) 到缓冲 液中可 以促进 某特定 条带转 移到尼 龙膜上 (Chomcgyns- ki, 1992)。 在碱性 缓冲液 (0.4md/LNaOH) 中 转移后 ,这种 膜可共 价结合 DNA, 这 是其主 要优点 。如 果考 虑到高 盐转移 效率低 ,就可 以用这 个方法 。进 行碱 印迹的 惟一问 题是 ,用化 学发光 检测系 统时, 它的底 色太高 。碱转 移时, 无电荷 尼龙膜 比电荷 膜结合 的 DNA 少 (Dyson, 1991)。 3) 转 移时间 估计 转移时 间是很 难的。 在毛细 系统中 ,转移 速度与 DNA 大小 、胶 的厚度 和琼脂 糖的浓 度有关 。上 行性 毛细转 移很慢 ,因 为印迹 时胶可 被压碎 ,于是 DNA 的 扩散变 慢。 用高盐 缓冲液 ,从 5mm 厚、 0.7% 琼脂 糖凝胶 中获得 15kb 分 子的足 量转移 需要约 18h。 同一 胶中, lkb 分子在 2h 内可 转移 90%。 这个 问题在 去嘌呤 步骤中 可部分 缓解, 因 为它把 大分子 打破成 1 〜 2kb 长的小 分子, 从而减 少了转 移所需 的时间 。即便 这样, 印迹还 是约需 12h。 如若 凝胶比 5mm 还厚, 或琼脂 糖浓度 >1.0%, 则大 一点的 片段不 可能 有足够 的转移 ,在 12h 后, 还要延 长时间 (可至 24h)。 所需 的印迹 时间只 能从实 践 和教训 中取得 。对杂 交来讲 ,靶 带需 >10kb, 如若 看不到 清晰的 信号, 就要用 长一点 的时 间进行 重复。 碱性 印迹都 比较快 ,开始 2h 大多 数的 DNA 都会转 移过去 。如 需转 移大条 带时, 可以 用碱性 转移到 正电荷 尼龙膜 上来代 替高盐 印迹。 碱转移 >2h 看来 也没什 么坏处 (Chomcjynski, 1992), 而且 这种印 迹也常 过夜。 Chomcjynski 发展的 下行性 毛细印 迹速度 更快。 如需最 大转移 效率时 ,就用 下行性 印迹法 。如 果速度 比效率 更重要 ,如待 转移的 凝胶中 有限制 性消化 的质粒 ,有几 条带, 每条 都有相 当多的 DNA, 那就 可用任 何一种 快速印 迹技术 (Smith and Summers, 1980)。 这些技 术本文 未述及 ,因 为印 迹过夜 很方便 ,可以 合理安 排实验 时间。 4) 转 移方法 进行 Southern 印迹时 ,毛 细转移 仍是最 常用的 方法。 其优点 是简单 、可靠 、无需 特 殊设备 。电 印迹最 初用于 蛋白质 的转移 ,用高 盐缓冲 液无效 ,故 对硝酸 纤维素 膜不太 合适。 技术上 ,尼 龙膜和 活化纸 (Bittner etal., 1980; Stell wag and Dahlberg, 1980) 都可用 ,但过 热时常 出问题 ,可 引起夹 着的胶 中产生 气泡, 使转移 不均匀 。所以 电印迹 只用 于聚丙 烯酰胺 凝胶, 后者不 可能用 毛细转 移法。 毛细转 移的另 一 替代办 法是真 空印迹 ,它 最初用 于蛋白 质凝胶 (Peferoenetal., 1987)。 转 移缓冲 液由真 空压力 穿过胶 ,它 可以在 30mm 内把 5mm 厚的 1 % 琼脂 糖凝胶 • 183 • 印迹 到硝酸 纤维素 (用 20XSSC) 或 尼龙膜 (碱 溶液) 上去 。但要 小心控 制真空 压力, 以免 压住胶 。不过 一旦掌 握此技 术就非 常有效 。对比 起来, 真空印 迹胶的 杂交信 号往往 比毛细 印迹高 得多。 可靠的 真空印 迹器为 Sdratavac (Stratagene)、 Vacu Gene (Pharma- cia Biotech), Model 785 (Bio-Rad) 和 Traus Vac (Hoefer), 按其 厂家的 说明书 进行操 作 。如果 Southern 印迹是 研究程 序的限 速步骤 ,就 得考虑 用真空 印迹。 5) 固 定技术 固定的 目的是 把转移 过来的 DNA 尽 可能多 、尽 可能紧 地结合 到膜上 。常用 3 种方 法 ,硝酸 纤维素 膜用真 空烘烤 ( 引起较 弱的非 共价交 互作用 ), 无 电荷尼 龙膜用 UV 照 射 ( 导致共 价交联 ), 正 电荷尼 龙膜在 碱性转 移中就 固定了 (共 价结合 )。 烘烤和 碱转移 都是 一直进 行下去 ,无可 改进。 UV 交联 容易变 ,标定 UV 源就很 重要, 标定工 作要经 常进行 ,以校 准减弱 。每 批新的 膜来了 要校准 ,尤其 是换厂 家时。 照射前 尼龙膜 必须干 透, 有些厂 家建议 在空气 中干燥 ,有的 建议在 80X: 烘 30min。 在非 碱性转 移到正 电荷尼 龙膜 上后作 UV 交联时 ,要考 虑厂商 的建议 ,因为 有些条 带会因 UV 处理 而丢失 DNA。 3. 疑 难解答 Southern 印迹的 疑难解 答会很 困难和 累赘, 因为在 膜进行 杂交分 析之前 ,不 可能准 确 判断转 移效率 。凝 晈在进 行印迹 之后马 上用溴 化乙锭 再染色 ,以测 定是否 有大量 DNA 滞留在 胶中, 这是转 移的主 要问题 。但 是没有 DNA 并 不意味 着所有 DNA 都结合 到 膜上了 ,有时 结合的 DNA 可 用甲烯 蓝染膜 看出来 ,但是 这并不 可靠。 往往是 试验做 完之后 ,由 于放影 自显影 不够完 善才发 现问题 ,而且 难以确 定这究 竟是转 移的问 题还是 杂交的 问题。 问题的 早期警 告信号 可能来 自转移 前或转 移时膜 的表现 。所 取用的 膜和转 移后的 膜 ,一直 到固定 步骤都 应该是 白净的 。膜变 色了就 不要用 。如 膜不 易润湿 ,可用 Suspi- cion 处理 。硝 酸纤维 素膜在 转移后 有黄点 ,就表 示中和 的不好 。转移 后膜呈 微红色 ,它 由 DNA 用溴化 乙锭染 色而来 ,或 者有蓝 色标记 ,是 由于凝 胶的染 料标志 转移过 来了。 4. 时 间安排 进行 Southern 印迹的 时间是 可变的 ,如 参数中 所述。 高盐转 移可在 24h 内 完成, 限制 性内切 DNA 和 跑琼脂 糖凝胶 电泳要 1.4h, 制 备凝胶 2h, 安装 转移要 30min, 转移 过夜, 取出印 迹并使 干燥要 30min。 固 定方面 ,硝 酸纤维 素膜要 2h, 尼龙 膜只要 5min。 快速转 移系统 可以在 一个工 作日内 完成, 主要是 缩短了 转移的 时间。 二、 DNA 的 斑点印 迹和狭 线印迹 斑点印 迹和狭 线印迹 是固定 大量未 分离的 DNA 到硝酸 纤维素 膜或尼 龙膜的 简单技 术 。在 印迹的 DNA 中进行 杂交分 析可测 定靶序 列的相 对丰度 。斑 点印迹 和狭线 印迹只 是 印迹的 几何形 状不同 。系 列斑点 可用图 像扫描 来可靠 地进行 分析。 注意: 所有操 作都要 載手套 ,保 护手不 被酸碱 烧伤。 防止膜 被污染 ,用清 洁的平 头镊子 拿膜。 . 184 . (一) 斑点印 迹或狭 线印迹 DNA 到无电 荷尼龙 膜或硝 酸纤维 素膜上 1. 原理 把要 转移的 DNA 进行 热变性 ,在 盐缓冲 液中加 到膜上 ,即印 迹之后 ,膜作 变性和 中 和处理 ,用 UV 照射尼 龙膜或 用烘烤 法处理 硝酸纤 维素膜 ,将 DNA 固定。 斑 点印迹 和狭线 印迹通 常用多 个接头 连到抽 吸部件 # 春鲁 | 丨丨 进 行加样 。此法 比手操 作的印 迹要快 ,而 且重复 性好。 # # # III 如果 一次要 准备多 个印迹 ,就可 选此法 。许 多市 售品均 # # # Iff 可使用 ,大多 具有可 交换的 部件, 可任选 斑点印 迹或狭 二 线印 迹的几 何图形 (图 2.9)。 图 2.9 斑 点印迹 (左) 和狭线 2. 材料 印迹 (右) 的式样 20 x SSC 及 6 x SSC (试剂 配制见 Southern 印迹) 变性液 (1.5mol/LNaCl, 0.5mol/LNaOH) 中和液 (l.Omol/LNaCl, 0.5mol/LTris~HClpH7.0) 无 电荷尼 龙膜或 硝酸纤 维素膜 Whatman 3 MM 滤纸 斑点 / 狭线 印迹多 样抽滤 加样器 紫外 透射仪 3. 操 作步骤 (1) 裁一 张与多 样抽滤 加样器 一样大 小的膜 ,置 于缓冲 液表面 让其自 然浸没 ,放置 lOrnin。 无 电荷尼 龙膜用 6XSSC, 硝 酸纤维 素膜用 20XSSC。 (2) 裁一 张与多 样抽滤 加样器 一 样 大小的 Whatman 3MM 滤纸 ,也用 相应的 缓冲液 浸湿。 (3) 将 浸湿的 Whatman 3MM 滤纸置 于多样 抽滤加 样器上 ,再 将膜置 于其上 。接好 多 样抽滤 加样器 ,保证 装置不 漏气。 (4) 在 DNA 样品 中加入 20XSSC 使其终 浓度为 6XSSC, 体积为 200~400juL, 在 100X: 变性 lOmin, 然后置 于冰中 。对于 硝酸纤 维素膜 的样品 ,置 于冰中 后再加 等体积 的 20 x SSC。 (5) 连接 吸液装 置与多 样抽滤 加样器 ,每 孔加入 500ML 缓冲液 。无 电荷尼 龙膜用 6 x SSC, 硝 酸纤维 素膜用 20 x SSC。 不 用的孔 用胶带 封住。 (6) 将 DNA 样 品离心 5s, 将 样品加 于各孔 。小 心勿让 吸头接 触膜, 让样品 滤过。 (7) 将膜 除下, 置于一 浸过变 性液的 Whatman 3MM 滤纸上 lOmin。 (8) 将膜 转至一 浸过中 和液的 Whatman 3MM 滤纸上 ,放置 5min。 (9) 将膜 转至一 干燥的 Whatman 3MM 滤纸上 ,晾 干。 (10) 将尼 龙膜用 保鲜膜 包覆, 置于紫 外透射 仪上照 射交联 (有 DNA 的一 面向下 )。 硝酸 纤维素 膜则夹 于两张 Whatman 3MM 滤 纸之间 ,真空 80X: 烤 2h。 . 185 . (11) 将膜 置于两 张滤纸 之间, 室温下 可保存 数月。 (二) 斑点印 迹和狭 线印迹 DNA 到正 电荷尼 龙膜上 1. 原理 正电 荷尼龙 膜在高 pH 下可共 价结合 DNA, 样品可 以在碱 性溶液 中变性 ,然 后加 到做 斑点印 迹或狭 线印迹 的膜上 并与之 结合。 这要比 用盐溶 液进行 印迹快 ,而且 不必作 印迹后 的变性 、中和 和固定 操作。 2. 材料 2 X SSC (试剂 配制见 Southern 印迹) 0.4mol/L NaOH 及 lmol/L NaOH 蒸馏水 100mmol/L EDTA, pH8.2 带正 电荷的 尼龙膜 Whatman 3MM 滤纸 斑点 / 狭线 印迹多 样抽滤 加样器 3. 操 作步骤 (1) 裁一 张与多 样抽滤 加样器 一样大 小的膜 ,置 于蒸馏 水表面 让其自 然浸没 ,放置 10min〇 (2) 同上法 准备多 样抽滤 加样器 ,用 蒸馏 水代替 SSC。 (3) 各样品 中加入 lmol/L NaOH 和 100mmol/L EDTA pH8.2, 使其终 浓度为 0.4mol/L NaOH、 10mmol/L EDTA〇 (4) 在 100X: 变性 lOmin, 然后置 于冰中 ,将样 品离心 5s。 (5) 用 500/iL 蒸馏水 预洗膜 ,将样 品加于 膜上。 (6) 加样后 ,每 孔用 500pL0.4m〇l/LNa〇H 漂洗, 然后拆 除多样 抽滤加 样器。 (7) 将膜用 2 XSSC 漂洗后 晾干, 室温下 保存。 (三) 手工准 •备 DNA 斑 点印迹 斑 点印迹 可用手 工操作 ,就 是把小 量样品 点到膜 上待干 。重复 加样可 有足够 量的稀 DNA 样品进 行印迹 ,如 加到 30/uL 以上就 很累人 而且斑 点不紧 。事 实上手 工加样 很少达 到发表 的质量 ,只 有在没 有多样 抽滤加 样器时 才用手 工去做 。下面 详述用 无电荷 尼龙膜 的方法 。注 解中述 及用硝 酸纤维 素膜和 带正电 荷的尼 龙膜所 要做的 修改。 操 作步骤 (1) 裁 一条所 需大小 的不带 电荷的 尼龙膜 ,用 钝头铅 笔画出 0.5cmX〇. 5cm 的方格 网 。将 膜置于 6 XSSC 表面 让其自 然浸没 ,放置 lOmin。 • 186 • 硝 酸纤维 素膜用 20XSSC, 带 正电荷 的尼龙 膜用蒸 馏水。 (2) 在 DNA 样品 中加入 20XSSC 使其终 浓度为 6XSSC, 体积尽 可能小 。在 100X: 变性 lOmin, 然 后置于 冰中。 对带正 电荷的 尼龙膜 , 各样品 中加入 Imol/LNaOH 和 100mmol/LEDTApH8.2, 使其终 浓度为 0.4mol/LNaOH、 lOmmol/LEDTA。 对 硝酸纤 维素膜 ,样品 置于冰 中后再 力口等 体积的 20XSSC。 (3) 将浸 湿的膜 放置于 一打开 的塑料 盒上, 使膜的 大部分 悬空。 (4) 将样 品离心 5s, 用微 量移液 器吸头 点样于 膜的方 格内, 晾干。 加 样时吸 头不要 触及膜 ,一 次可点 2ML 样品。 (5) 变性 、中和 、固定 DNA 于膜上 。将膜 保存于 室温。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 斑 点或狭 线印迹 首先由 Kafatos 等 (1979) 发 展起来 ,用 此测定 一系列 DNA 样品 中靶序 列的相 对丰度 。如 用多样 抽滤加 样器一 下子可 以加许 多样品 ,在一 次杂交 试验中 可 以过筛 选许多 不同的 DNA 样品 。这些 年来, 本法应 用广泛 。如 基因组 分析时 ,常将 相关 种属制 备来的 DNA 做成斑 点印迹 ,用 杂交 探针去 寻找同 源序列 。大 多基因 在相关 生物体 内有其 同源物 ,譬如 人基因 组的转 录序列 可和各 种哺乳 动物的 DNA 斑点 印迹中 的相关 序列进 行杂交 。基因 间或内 含子区 在别的 种属体 内没有 同源物 ,不 表现 广泛杂 交 ,这就 叫“动 物图印 迹”。 2. 重 要参数 斑点 印迹的 关键是 DNA 在转录 后要完 全变性 ,至 少所 有样品 的变性 程度要 一致。 变性作 用的不 一致, 使不同 样品中 可用于 杂交的 DNA 的数量 不相同 ,这 样在杂 交后, 两个斑 点显示 的相对 强度就 不能代 表它们 各自所 含的靶 DNA 的量。 印迹 到无电 荷尼龙 膜和硝 酸纤维 素膜的 DNA 通过 两种变 性步骤 ,即 上膜以 前的热 变性和 上膜以 后的碱 变性来 保证完 全变性 。热 变性很 少合适 ,因为 DNA 在加到 膜上以 前 可以很 好的广 泛复性 ,即便 从保温 箱拿到 冰里也 可发生 。无 论手 操作还 是用多 样抽滤 加 样器进 行印迹 ,都要 花时间 ,即 使一 些样品 较早进 行印迹 ,也可 有不同 程度的 复性。 第二 种变性 法是把 膜放到 泡在碱 液中的 滤纸上 ,高 pH 值使 DNA 保 持在变 性状态 。所 以 碱印迹 到正电 荷尼龙 膜上时 ,不存 在变性 不一致 的问题 。要 想在 不同的 样品间 进行比 较, 就要选 DNA 的碱性 印迹法 ,斑 点式或 狭线式 均可。 第 二个参 数来自 DNA 样品 的纯度 。用 Southern 转移时 ,电泳 步骤有 利于把 杂质分 出去, 剩下要 转移的 DNA 就比 较干净 。大量 DNA 做斑点 / 狭线印 迹时, 没有凝 胶分离 步骤 ,一起 印迹过 来的杂 质可对 杂交产 生意想 不到的 作用, 可能阻 断杂交 位点而 减弱信 号, 或因探 针的滞 留而加 强信号 。如果 信号强 度是用 来测靶 DNA 的 绝对量 ,就 要考虑 到这些 ,或者 用一系 列稀释 对照进 行比较 。斑 点印迹 用来分 析拷贝 数尤应 慎重, 只有细 胞和 质粒的 DNA 都是 严格纯 化了的 才能在 其印迹 间进行 比较。 • 187 • 3. 时 间安排 不 管用多 样抽滤 加样器 加样还 是手工 加样都 可以在 15min 内完成 。用 硝酸纤 维素膜 时 要烘烤 3h 固定 ,用无 电荷尼 龙膜要 60min, 用正 电荷尼 龙膜要 30min。 限速步 骤是加 样 。用 多样抽 滤加样 器加清 亮样品 (无 阻塞) 只要 5mm。 如果样 品量大 ,要不 断地往 上加 ,那么 用手操 作也可 能要几 小时。 三、 DNA 印 迹的杂 交分析 (一) 放射性 同位素 标记的 DNA 探针作 DNA 印 迹的杂 交分析 1. 原理 此法 适用于 100~ lOOObp 长的、 放射性 标记的 DNA 探针 对通过 Southern 转 移和斑 点印迹 、狭线 印迹到 尼龙膜 (无电 荷或正 电荷) 上的杂 交分析 。如 按注译 修改, 亦适用 于 硝酸纤 维素膜 ( 参见方 法评注 )。 杂交 实验分 3 个步 骤:① 在含有 阻断非 特异性 DNA 结合位 点试剂 的预杂 交溶液 中, 将膜进 行保温 并处理 ,用以 降低杂 交背景 。本法 中的阻 断剂为 Denhardt 溶 液或变 性鲑精 DNA; ②换以 鲜的 标记探 针溶液 ,保 温过夜 ,让 探针与 固定相 DNA 的 靶序列 互 补结合 。在 此杂交 过程中 ,探针 不仅与 靶位点 (100% 和探针 互补) 配对 ,也 和同源 序 列配对 结合; ③用 一系 列溶液 洗涤膜 ,以逐 渐去掉 所结合 的探针 分子, 只保留 高度配 对 的杂交 分子。 2. 材料 * 用作 探针的 DNA ( 比活性 >lXl〇8dpm/|^g) 预杂交 / 杂交 水溶液 (APH) [5XSSC, 5xDenhardt 溶液, 1% (m/V) SDS, 临 用前 补加变 性鲑精 DNA 至 100pg/mL, 68t: 预热 使用] 2 x SSC/0.1% (m/V) SDS (0.3mol/L NaCl, 30mmol/L 二水 柠檬酸 三钠, 0.1%SDS, pH7.0) 0.2XSSC/0.1%SDS, 室温 配制, 42X: 预 热使用 0.1 x SSC/0.1 % SDS, 68X: 预热 2XSSC(0.3mol/LNaCl, 30mmd/L 二水 柠檬酸 三钠, PH7_0) 6XSSC 杂 交炉或 68X: 水浴 或温箱 杂交管 或杂交 袋及热 封口器 3. 试 剂配制 lOOXDenhardt 溶液 : 2% (m/V) Ficoll400, 2% (m/V) 聚乙 烯批略 烧酮, 20mg/mLBSA, 过滤 分装, - 20*T 保存 鲑精 DNA 的变 性:取 10mg Sigma III 型鲑精 DNA (钠盐 ) 溶于 lmL 水中 ,用 • 188 • 17G 注 射器针 头抽推 20 次剪切 DNA, 沸水 中加热 lOmin, 迅 速冷却 。立即 使用或 - 20X: 保存 。临 用时需 100X: 变性 5min 并 立即置 于冰上 速冷。 4. 操 作步骤 (1) 准 备探针 ,用 切口平 移法或 随机多 核苷酸 引物法 ,标记 DNA 探针至 比活性 〉lXl〇8dpm/Vg。 检测 其活性 ,分离 去掉未 标记的 核苷酸 。探针 为双链 DNA, 理 想长度 为 100~1000bp。 一般由 克隆片 段经限 制性内 切核酸 酶消化 ,与载 体分开 ,从琼 脂糖凝 胶 中进行 回收。 (2) 将带有 DNA 的膜于 6XSSC 溶液中 浸湿。 (3) 将膜放 在杂交 管中, DNA 面朝上 ,每 10cm2 膜加 lmL 预 杂交液 (APH)。 (4) 杂 交管在 68X: 杂交 炉中旋 转保温 3h。 如用杂 交袋, 可在适 当的保 温箱或 水浴中 轻轻摇 晃保温 。如用 尼龙膜 , •预杂 交时间 可减至 15min, 但要把 预杂交 / 杂交液 预热至 68X: 。 (5) 将探针 DNA 放在 loot: 的 水浴或 保温箱 中加热 lOmin 变性, 迅速置 冰中。 (6) 倾 出管中 APH 液 ,加入 等量预 热好的 681C APH 液。 加入变 性探针 ,于 68X: 旋 转保温 过夜。 如 果探针 的比活 性应为 108dpm/Fg, 相当于 每毫升 APH 液中加 10ng。 当比 活性为 109dPm/fxg 时, 探针 DNA 应为 2ng/mL。 (7) 倾 出管中 APH 液 ,加 入等量 2XSSC/0.1%SDS 液 。室 温下转 动保温 lOmin, 静置 5min〇 (8) 倾出 上液, 加等量 0.2XSSC/0.1%SDS 液 ,在室 温中转 动保温 lOmin, 静置 5min 后倾 出上液 。这 是低严 紧度的 洗涤。 (9) 中严 紧度的 洗涤。 用等量 421C 的 0.2XSSC/0.1%SDS 液 ,在 42X: 中转 动保温 15min, 静置 5min 后换 洗漆液 ,共 两遍。 (10) 高严 紧度的 洗涤。 用等量 68X: 的 0.1XSSC/0.1%SDS 液 ,在 68t: 中 转动保 温 15min, 静置 5min 后换 洗漆液 ,共 两遍。 (11) 弃去 洗涤液 。室 温下用 2XSSC 漂洗膜 ,吸 干多余 的液体 ,用保 鲜膜包 好进行 放射自 显影。 (二) 放射性 同位素 标记的 RNA 探针作 DNA 印 迹的杂 交分析 1. 原理 SP6、 T3 和 T7 等 RNA 聚 合酶可 以有效 的在体 外合成 RNA。 在 lOmin 内可从 lpg DNA 模板 中得到 lpg RNA。 如于 反应混 合物中 加一种 放射性 同位素 标记的 核苷酸 ,此 聚 合酶的 合成作 用可将 RNA 均匀 地标记 起来, 其比活 性可达 l〇9dpm/Vg 以上。 RNA 探 针的单 纯性使 它优于 DNA 探针 ,因为 RNA 探针加 入到杂 交溶液 中时无 需变性 ,在 保温 期中全 部可用 于杂交 作用。 而双链 DNA 探针在 杂交反 应中探 针与互 补链间 可再退 火 ,使和 靶基因 杂交的 探针量 减少。 RNA 探针 的杂交 方案和 DNA 探针 没有多 大区别 。通 常要在 预杂交 / 杂交溶 液中加 . 189 . 甲酰胺 ,因为 RNA/DNA 的杂交 物在有 甲酰胺 时比等 当量的 DNA/DNA 杂 交物更 稳定。 在甲酰 胺中杂 交可以 在较低 温度下 进行保 温而不 失其严 紧度。 把单链 特异性 RNA 酶加 到一个 或多个 洗涤液 中可去 除未杂 交的探 针分子 ,大 大降低 背景。 此杂交 方法也 可用硝 酸纤维 素膜或 尼龙膜 进行。 尼龙膜 的底色 深些。 2. 材料 TE 缓冲液 (lOmmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 标记 缓冲液 (200mmol/LTris-HClpH7.5, 30mmol/LMgCl2, lOmmol/L 亚精胺 ) 核苷酸 混合液 (2.5mmol/LATP, 2.5mmol/LCTP, 2.5mmol/LGTP, 20mmol/L Tris-HCl pH7.5, - 20t: 贮存) 200mmol/L 二硫 苏糖醇 (DTT), 新 鲜配制 20U/ 卩 L 人胎 盘核糖 核酸酶 抑制剂 [a-32P] UTP, 20mCi/mL (800Ci/mmol) 或 10mCi/mL (400Ci/mmol) SP6 或 T7 RNA 聚合酶 无 RNA 酶的 DNA 酶 I 0.25mol/L EDTA, pH8.0 甲酰胺 预杂交 / 杂交 (FPH) 溶液 (5XSSC, 5XDenhardt, 5% (m/\〇 甲 酰胺, 1% (m/V) SDS, 临用前 加入变 性鲑精 DNA 至 lOO^g/mL 终浓度 ) 含有 25pg/mL RNA 酶 A 和 10U/mL RNA 酶 T1 的 2 x SSC 注: SSC 溶液、 Denhardt 溶液 、变 性鲑精 DNA 的 配制见 DNA 探 针杂交 3. 操 作步骤 RNA 探 针制备 (1) 将 DNA 片段 克隆到 合适的 载体上 (见表 2.5) 作为 RNA 转录 模板。 (2) 用限制 性内切 核酸酶 消化使 之线性 化以便 于直接 转录。 表 2.5 能识别 噬菌体 RNA 聚合 酶启动 子的克 隆载体 载体 大小 (bp) 标志 启动子 pBLuescript 2950 amp, LacZ T3, T7 pGEmol/L 系列 2746 〜 3223 amp, lacZ SP6, T7 pGEmol/LEX-1 4200 amp SP6, T3, T7 pSELECT-1 3422 tet, lacZ' SP6, T7 pSP18, 19, 64, 65 2999 〜 3010 amp SP6 pSP70, 71, 72, 73 24 17 〜 2464 amp SP6, T7 pSPORTl 4109 amp, LacZ SP6, T7 pT3/T7 系列 2700, 2950 amp, Smol/LP, lacZ 丁 3, T7 pWE15 8800 amp, neo T3, T7 pWE16 8800 amp, dhfr T3, T7 注: amp, 氰苄 青霉素 抗性; dhfr, 二氢 叶酸还 原酶; p •半乳 糖苷酶 a- 狀; neo. 新 羝素转 磷酸酶 (卡那 霉 素抗性 h tet, 四环 素抗性 • 190 . (3) 用酚抽 提法纯 化模板 DNA, 并 用乙醇 沉淀, TE 溶解 ,终 浓度为 lmgDNA/ mL〇 (4) 室温下 混合下 例试剂 : 标记 缓冲液 4fiL 核苷酸 混合物 1.5ptL 200mmol/L 二硫 苏糖醇 (DTT) 1/^L 人胎 盘核糖 核酸酶 抑制剂 1/iL 由第 (3) 步 纯化来 的质粒 DNA 模板 2吨 a-32P UTP 100~200pCi 加水至 终体积 20/iL (5) 加入 5USP6 或 T7RNA 聚合酶 ,使用 SP6 聚 合酶在 401C 保温 lh, 使用 T7 RNA 聚合 酶则在 371C 保温 lh。 (6) 加入 2U 无 RNA 酶的 DNA 酶 I, 37X: 保温 lOmin。 加入 2fiL0.25mol/LEDTA pH8.0 溶 液终止 反应。 (7) 用 离心柱 法清除 未掺入 的核糖 核苷酸 ,测定 RNA 的放射 比活性 ,比活 性值应 不低于 TXloSdpm/^g, 最好 SlO^pm/pg。 标记的 RNA 探针 保存于 -2(VC 可放 两天。 .杂 交分析 (8) 预杂交 温育见 DNA 探针杂 交中第 2~4 步, 但要用 FPH 液并在 42X: 温育。 (9) 用等量 新鲜并 预热的 FPH 液更 换原有 FPH 液, 加入标 记探针 ,于 421C 转动温 育 过夜。 杂 交液中 探针浓 度应为 l~5ng/mL, 在甲酰 胺液中 杂交时 ,温 育温 度较低 。如若 有杂交 背景问 题 ,则 可提高 温度至 65X:。 (10) 洗膜 方法按 DNA 探针 杂交中 (7)~(8) 步 进行。 (11) 用等体 积含有 25吨/11^ RNase 和 10pg/mL RNase T1 的 2 X SSC 洗涤液 在室温 条 件下转 动洗膜 30min。 (12) 用 2XSSC 洗膜 ,并进 行中严 紧度和 高严紧 度条件 洗膜, 去除非 特异性 杂交。 (13) 放射 自显影 ,按 DNA 探针 杂交中 (9)~(12) 步 进行。 (三) 从杂交 膜上去 掉探针 1. 原理 若用 UV 交联 结合法 (对无 电荷尼 龙膜) 或碱性 转移法 (对正 电荷尼 龙膜) 把 DNA 固定 在膜上 ,基 质与靶 DNA 的相 互作用 (共 价结合 性质) 要 比靶与 探针的 相互作 用 (由氢 键形成 ) 要强 的多。 所以洗 涤可去 掉杂交 的探针 DNA 而不洗 去膜结 合的靶 DNA。 为此 ,尼 龙膜可 重复使 用几次 ,常 规可用 12 次 。杂交 的探针 DNA 也可 从硝酸 纤 维素膜 上去掉 ,但靶 DNA 与基 质的结 合是疏 水作用 ,结 合较弱 ,加上 硝酸纤 维素膜 的脆性 ,使它 最多只 能使用 3 次。 此处 描述了 3 种方法 。选择 何种处 理要看 探针和 靶结合 有多牢 ,这与 探针的 GC 含 量和 所形成 的碱基 配对数 目有关 。开始 用不太 严格的 处理, 将洗过 的膜作 放射自 显影来 • 191 • 观 察效果 ,如果 仍可见 到杂交 信号, 就再做 进一步 处理。 2. 材料 温和 洗脱液 (5mmo 丨 /L Tris-HCl pH8.0, 2mmol/L EDTA, 0. 1 X Denhardt 溶液) 中度 洗脱液 [200mmol/LTris-HClpH7.0, 0.1XSSC, 0.1% (m/\〇 SDS] 0.4mol/L NaOH 0.1% (w/V) SDS, 100t: 注意 :尽管 洗涤液 的放射 性不可 能很高 ,但 要按放 射废物 处理。 3. 操 作步骤 (la) 温 和处理 ,用几 百毫升 温和洗 涤液在 65X: 洗膜 2h。 (lb) 中 度处理 ,用 0.4mol/LNaOH, 在 45t: 洗膜 30min。 然 后用几 百毫升 中度洗 涤液 ,在室 温下将 膜冲洗 lOmin, 共 两次。 (lc) 严 格处理 ,将几 百毫升 煮沸的 0.1%SDS 倒 在膜上 ,冷至 室温。 如果膜 要再进 行测试 ,在 杂交和 洗涤之 间不能 让它干 ,如果 它干了 ,探针 就会结 合到基 质上。 (2) 将膜 放在一 张干的 Whatman 3MM 滤纸上 ,用 另一 滤纸吸 去多余 的液体 。用保 鲜膜 包起来 ,做 放射自 显影。 如在放 射自显 影后, 仍可见 到信号 ,要用 更严格 的条件 再洗。 (3) 此外 ,膜 可再用 来做杂 交实验 ,也 可以干 燥保存 ,留做 后用。 膜在 Whatman 3MM 滤 纸间可 以变干 ,并在 室温下 保存几 个月。 长期保 存时, 要将膜 放在干 燥器中 ,置于 室温或 4X:。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 互补 核苷酸 间的杂 交源于 DNA 结构的 Watson-Crick 模式 。最 初是通 过变性 动力学 作为 研究基 因组复 杂性的 方法而 应用的 。在这 些早期 应用中 ,两个 杂交的 分子都 存于溶 液中。 Denhardt (1966) 首先提 出把杂 交作用 中的一 个分子 固定在 一种固 体支持 物上, 此 方法成 为确定 基因组 DNA 中 特殊序 列和重 组体克 隆的主 要手段 (斑 点印迹 )。 后来 Southern (1975) 指出 ,凝 胶电泳 出来的 DNA 分子 可以转 到一种 膜上, 使每个 限制酶 切下 来的有 关遗传 丨目息 的片段 可以用 杂交方 法分析 。由于 Denhardt 和 Southern 的权威 性工作 ,使 膜杂交 的发展 呈技术 性而非 概念性 的了。 杂交 物的稳 定性以 熔解温 度或: Tm 示之 ,是探 针从靶 DNA 上解 离下来 的温度 。对 于 DNA/DNA 杂 交来讲 ,丁 m 可以由 Meinkoth-Wall 公式 (1984) 近似 地推断 出来: Tra = 81.5t: +16.6(mol/L) + 0.41(% GC)-0.61(% 甲 )-500/L 对于 RNA/DNA 杂交物 ,则从 Casey 和 Davids〇n(1977) 公式 得来: Tm = 79.8t: + 18.5(mol/L) +0.58(% GC) - 11.8(%GC) -0.56(% 甲 )-820/L 式中的 mol/L 为单 价阳离 子的摩 尔浓度 , %GC 为 DNA 中鸟 嘌呤和 胞嘧啶 核苷酸 的百分 • 192 . 率, % 甲 为杂交 溶液中 ,甲 酰胺 的百分 浓度, L 为杂 交物碱 基对的 长度。 此二公 式的实 际应用 上的建 议见表 2. 6A。 杂 交分析 中的第 二个重 要问题 为形成 杂交物 的速度 。在 两个分 子的互 补区排 列成线 之前是 不会有 杂交物 形成的 ,而 这种现 象的出 现完全 靠机遇 。一旦 有一小 段双链 核区形 成后, 其他剩 余序列 的碱基 对的形 成是比 较快的 。速度 就是探 针“找 到”靶 的时间 。它 受许 多因素 的影响 (见表 2. 6B), 所以 它是杂 交物形 成的限 速步骤 (Britten and David- son, 1985)。 在实际 工作中 ,杂交 速度比 起杂交 物的稳 定性来 讲是居 于次要 地位的 。现 在 的杂交 方案中 杂交作 用的时 间都放 的很长 ,那些 影响速 度的因 素也就 无足轻 重了。 表 2.6 影响 杂交分 子稳定 性及杂 交速度 的因素 因素 影响 A. 杂交分 子稳定 性11 离 子强度 在 0.01 〜 0.04mol/LNaCl 之间, 每增加 10 倍单价 阳离子 , :^值 就增加 16.6t 喊 基组成 在含有 NaCl 的水溶 液中, AT 碱 基对比 GC 碱基 对的稳 定性差 去 稳定剂 对于 DNA/DNA 杂 交分子 ,每 1% 甲酰胺 可降低 Tm 值大约 0.6T:。 6m〇l/L 尿 素可降 低 Tm 约 30t 碱 基错配 每 1% 的错配 ,使: 降低 IX: 双 链长度 B. 杂 交速度 探针 >500bp, 其影响 可忽略 温度 对于 DNA/DNA 杂交 分子, 最大杂 交速度 在温度 <20~25t: 时; 对 DNA/RNA 杂交 分子 ,为 <10~15t: 离 子强度 最 适杂交 速度在 1.5mol/L Na + 去 稳定剂 50% 甲酰胺 无影响 ,但 高或低 浓度可 降低杂 交速度 喊 基错配 每 10% 的错配 ,可使 杂交速 度降低 2 倍 双 链长度 杂交 率与双 链长度 成正比 黏度 增 加黏度 可增加 膜杂交 速度; 10% 琼 脂糖硫 酸酯可 增加杂 交速度 10 倍 探针 复杂度 重复性 序列可 增加杂 交速度 碱 基组成 影 响甚微 pH 值 在 pH5.0~9.0 之 间几乎 无影响 a. 本表以 Brown (1991) 为 基础。 b. 对于 影响瞋 杂交因 素的研 究相对 较少, 几个例 子是依 据溶液 杂交的 知识来 推测的 ,这 对于杂 交的稳 定性来 讲 可能是 可靠的 ,对 于杂交 速度则 不然。 2. 重 要参数 杂交 实验要 成功必 须具备 两个条 件:① 敏感性 ,要 有足够 的探针 DNA 去结 合靶, 以便 在放射 自显影 后有可 测得的 信号; ②特 异性 ,最后 一次洗 涤完后 ,探 针必 须是只 和所 希望的 靶序列 相结合 。影响 这两个 条件的 因素, 也就是 影响杂 交作用 的那些 因素。 1) 影响 敏感性 的因素 杂交分 析的敏 感性取 决于标 记探针 分子结 合到靶 DNA 上 的数量 。标 记探针 分子结 合的数 量愈多 ,放射 自显影 后所见 到的杂 交信号 也愈强 。影 响因 素主要 有以下 几个。 • 193 • (1) 探针的 比活性 。影 响敏感 性的诸 多因素 中常出 问题的 一个是 探针的 比活性 。现 代的卜 iUl!" 法尼 论足缺 :纟机 寡核苷 酸引物 u 外 RNA 合成法 ,常 规供 应的探 针的比 活性应 >l〇8dpm/ 冲, 这是 基因组 DNA 杂交分 析所需 的最低 比活性 ,即 使靶序 列是多 拷卩 丨也 应如此 。若 比活性 <1〇f1000bp), 因为 在高严 格度洗 涤时 会增加 不均一 双链保 持稳定 的机会 。探针 不要带 长的载 体序列 ,因为 它们可 以和自 己的 靶位点 杂交, 降低实 验的特 异性。 (5) 杂 交场所 。传统 的杂交 是在塑 料袋中 进行的 ,放射 性化合 物的污 染难以 避免, 而且 一个袋 子里装 有太多 的杂交 膜时会 导致有 害的接 触效应 。现在 有许多 公司的 杂交保 温器可 以应用 ,肯 定比杂 交袋要 好得多 。杂交 管使管 内物混 合良好 ,由气 泡和灰 尘引起 的热点 减少了 ,形 成很 均匀的 杂交膜 。尽管 在一个 8. 5x3.〇 寸的管 子中有 1〇个 或更多 的微 型膜进 行杂交 ,还 是可能 得到好 质量的 结果。 如果用 袋子, 就要用 硬塑料 ,以 防止四 面塌黏 到膜上 ,使背 景增高 。杂 交溶 液要充 满袋子 ,而且 一个袋 子中只 能放两 张膜。 3. 疑 难解答 在放 射自显 影中出 来之后 ,就 可以看 到印迹 和杂交 的结果 。表 2. 8 出 示了最 常见的 问题 及其解 决办法 (Dyson, 1991)。 ( 最 烦的问 题是幣 个膜的 背景信 号过高 ,这 是由于 探针结 合到膜 表面的 非特异 结合位 点。 仏预 杂交 / 杂交溶 液中加 入阻断 这些位 点的试 剂可使 背景杂 交减少 。最 常用 的阻断 削 b ^nhardt 洛 它含 3 种 高分子 化合物 (Fico 丨丨 、聚乙 烯吡咯 烷酮和 bsa), 它们和 核如兄 丨>_収 结合 k 点 。还可 用变性 鲑精〇!^六 (任 —复杂 DNA 与靶 DNA 无共同 之处就 = L; lij),. 匕丨彳 丨伙 1:H 膜上 的位点 。阻 断剂一 般放在 预杂交 溶液中 。当 用尼龙 膜时, 杂乂 液中 +能細 断剂, 目为它 会干扰 探针与 心财 的交 互作用 。在洗 漆膜时 , • 196 • Denhardt 液 和鲑精 DNA 由 SDS 取代 ,因为 SDS 大于 或等于 1% 时可 以作为 阻断剂 ,其 他 阻断剂 也可用 (表 2.9)。 表 2.8 DNA 印迹和 杂交分 祈的疑 难解答 问题 可能 的原因 a 解决 的方法 信号弱 探 针比活 性太低 比活性 <108dprn/fzg, 检查标 记方案 脱嗓呤 不充分 >5kb 的 DNA 转 移量少 ,检 査脱嗓 呤作用 用硝酸 纤维素 膜时小 DNA 片段 转移保 留不足 ,检 査所用 转 移缓冲 液不对 20 XSSC 转移液 。对 某些品 牌的尼 龙膜, 转移液 中可加 2mmd/L 十二 烷基肌 氨酸钠 ,试 用碱性 印迹法 ,转移 至 带正电 荷的尼 龙膜上 靶 DNA 不足 参考正 文中每 个印迹 所加靶 DNA 的建议 DNA 固定 效果差 见方法 评注中 的建议 转移时 间太短 见方法 评注中 的建议 转 移系统 效率低 考虑 用真空 印迹代 替毛细 管转移 检査标 记反应 中所用 DNA 的 量是否 正确; 检查除 去未掺 探针浓 度太低 入 的核苷 酸后探 针的回 收量; 杂交 液中用 10% 琼脂糖 硫 酸酯; 换成单 链探针 ,杂交 8h 后双链 探针因 重退火 , 使 其有效 浓度降 低至零 探针变 性不全 靶 DNA 变 性不全 阻断剂 干扰靶 - 探针交 互作用 最 后洗膜 的严格 度过高 用 RNA 探针时 杂交温 度太低 杂交时 间太短 膜 不适合 电转印 出问题 按各 方案中 所述进 行变性 用双变 性方法 做斑点 和狭线 印迹, 或用正 电荷的 尼龙膜 上进 行印迹 如用尼 龙膜, 杂交液 中不加 阻断剂 用较 低温度 和较高 盐浓度 ,需要 时测定 ^[^值 在 有甲酰 胺时将 杂交温 度增至 65t 如用 DNA 探 针有甲 酰胺时 ,将杂 交时间 延长至 24h 靶 分子是 否太短 ,不能 被所用 类型的 膜有效 地保留 确保滤 纸层中 无气泡 ,组装 印迹装 置前, 滤纸用 TBE 充 分浸泡 , 用不带 电荷的 尼龙膜 背景 有斑点 未掺 入的核 苷酸没 有从标 记探针 中除去 用 离心柱 法除去 杂 交液中 有颗粒 过滤有 关溶液 琼脂 糖残存 在膜上 印 迹后用 2XSSC 漂洗膜 膜含 有高盐 时进行 烘烤或 紫外线 交联 印 迹后用 2XSSC 漂洗膜 成 片的或 普遍性 高背景 阻断 剂不足 见 正文关 于额外 / 其他 阻断剂 的讨论 在杂 交或洗 膜过程 中部分 膜变干 需 要时可 增加溶 液体积 来避免 杂交 或洗膜 过程中 膜粘连 在一起 避 免一次 杂交过 多的膜 (杂交 管可装 1〇 张 微型凝 胶的印 迹膜, 杂交袋 最多装 2 张) 杂 交袋中 有气泡 如用 杂交袋 ,要装 满杂交 液使它 无气泡 杂交 袋塌陷 在膜上 用较 硬的塑 料袋, 或增加 杂交液 的体积 洗涤 液不足 将 洗涤液 的体积 增加至 2mL/10cm2 膜 用 RNA 探针时 杂交温 度太低 有甲 酰胺时 ,将 杂交温 度增至 65t . 197 . 续表 问 e 可能 的原因 • 甲酰 按需进 行去离 子处理 标记的 探针分 子太短 探针浓 度太高 预杂交 不恰当 探针 未变性 唭类型 不合适 杂交 液中有 琼脂糖 硫酸酯 解决 的方法 尽管市 售的甲 酰胺一 般可用 , 但在临 用之前 进行去 离子化 可降 低背景 32p 的 探针在 标记后 ,要尽 快使用 , 因为福 射可使 探针降 解; 减少切 口平移 中所用 DNA 酶 I 的量 检 査标记 反应中 ,所用 DNA 的量是 否正确 用硝酸 纤维素 瞋预杂 交至少 3h ,用尼 龙膜 15min 按 各方案 所述进 行变性 如用非 放射性 标记, 检查膜 与检测 系统是 否匹配 琼脂糖 硫酸酯 有时可 引起背 景杂交 ,可将 膜夹于5^1^1^1- er & Schuell no. 589 WH 滤纸 之间进 行杂交 ,并 增加杂 交液 (包含 琼脂糖 硫酸酯 ) 体积到 2.5% 洗 涤液中 SDS 不足 颉外的 杂交带 M 后一次 洗涤不 够严格 探针含 有非特 异序列 ( 如载体 DNA) 靶 DNA 的限制 性酶消 化不全 用 RNA 探针 时未用 甲酰胺 在 一条泳 道或多 条泳道 上有非 探 针中有 基因组 DNA 污染 特异 性背景 封阻 剂不足 瞋 经最后 的洗涤 ,尚 未达到 所要求 的 严格度 探 针太短 检査洗 涤液的 配制是 否正确 用较 高温度 和较低 盐浓度 ,如 果需要 ,测 Ttn 值 纯 化含有 所需序 列的最 短片段 检 査限制 性消化 RNA/DNA 杂交 分子结 合较强 ,但 杂交液 中含有 甲酰胺 时 .稳定 性降低 检査探 针的纯 化过程 , 用随机 引物标 记探针 时这个 问题更 严重。 改用切 口平移 法标记 见 正文关 于额外 / 其他 封阻剂 的讨论 用较高 温度和 较低盐 浓度, 需要时 ,测计 :^^值 有时由 随机引 物标记 引起, 改用切 口平移 法标记 杂 交后不 能除去 探针 杂交后 膜变干 在杂 交至除 去探针 之间, 瞋要保 持湿润 当 再次杂 交时信 号强 度降低 除去 探针时 ,钯 DNA 存 留不足 用紫外 光交联 在尼龙 膜上时 ,检査 紫外光 源的校 准用较 温和的 方法去 除探针 注:以 Dyson(1991) 为 基础。 a 每一栏 目中 ,可能 的原因 按可能 性递减 的序列 排列。 ./ 表 2.9 代替丨 )enharclt/ 变性鲑 精 DNA 用于 DNA 杂交中 的其他 阻断剂 a 阻断剂 组 成成分 贮存 和使用 BLOTTO 5%(m/V) 脱 脂奶粉 /0.02% 500mL 时 ,增 加碱性 溶细胞 缓冲液 的量, 可相应 的增加 溶细胞 作用的 效果。 3. 操 作步骤 (1) 分离 质粒、 黏粒或 X 噬菌体 ,从 有合 适载体 的品种 中制备 溶胞产 物分离 基因组 DNA。 从哺 乳动物 、植 物或细 菌培养 物中制 备溶胞 产物。 对于质 粒制备 物来讲 ,不必 用溶胞 酶处理 。质粒 和噬菌 体制备 物要用 RNA 酶处理 ,因 为长的 RNA 分 子可与 DNA 竞争 树脂上 的结合 位点。 在将样 品上到 Qiagen 柱上时 ,它的 盐浓度 必须在 750mm〇l/L, pH 在 7.0, 并 且没有 颗粒物 ,后者 会堵塞 柱子。 阴 离子去 污剂如 SDS 可抑制 DNA 与树脂 的结合 ,所以 尽可能 不用它 去制备 这些胞 溶产物 。如果 提取 缓冲液 或溶胞 缓冲液 中必须 含有阴 离子去 污剂时 ,可以 用酸性 乙酸钾 沉淀法 把它们 去掉。 • 205 . (2) 取一 合适的 Qiagen 柱 ,用 QBT 缓冲 液平衡 。可以 加两倍 体积的 缓冲液 ,然后 利用 重力流 下去。 缓冲液 液面到 达柱子 的上面 时为止 ,不要 强迫把 剩下的 缓冲液 流出。 (3) 把第一 步来的 溶胞产 物加到 平衡过 的柱上 ,让它 利用重 力流到 树脂内 ,收 集小 M 穿过 的样品 ( 按柱的 大小为 50 〜 500fiL/ 份 ), 需要时 ,作分 析性凝 胶电泳 ( 见方法 评注 )。 (4) 用 6 倍柱 体积的 QC 缓 冲液洗 柱两次 ,重 力流过 。取小 量流出 的样品 ,留 作分 析 性凝胶 电泳。 这一 步去掉 细胞污 染物和 残留的 RNA, 留下 DNA。 (5) 加 2 倍柱 体积的 QF 缓冲液 ,利 用重力 流动将 DNA 进行 洗脱, 取小量 洗脱样 品留 作分析 性凝胶 电泳。 (6) 在洗脱 液中加 0.7 体积的 异丙醇 ,立 即用 15 000 Xg (Beckman JS*13 中为 9500r/min), 在 4*C 离心 30min, 以沉淀 DNA。 弃去上 清液。 (7) 用冷的 70% 乙醇洗 沉淀块 ,空 气干燥 lOtnin, 重溶 于适量 TE 缓冲 液中。 沉淀块 干的太 厉害时 ,难以 再溶解 。在溶 解时不 要用吸 管吹打 ,因为 高分子 DNA 会被 切断。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 许 多分子 生物学 实验中 ,作 为起始 物质的 DNA 必 须很纯 。迄今 为止, 传统的 CsCl/ 溴 化乙锭 梯度法 (对 质粒和 噬菌体 DNA) 或有机 提取法 (对 基因组 DNA) 仍在 广 泛应用 。尽 管这些 方法能 提供高 度纯化 的产物 ,但 总是很 费时间 ,而且 要用危 险量的 毒 性试剂 。把 这些方 法朝省 时间的 、合理 的方向 改进, 又不牺 牲质量 ,就 是采用 离子交 换层 析法。 此法长 久以来 就用于 蛋白质 的纯化 ,近来 才用于 核酸的 分离。 此法还 用于从 哺乳动 物细胞 中回收 质粒和 病毒的 DNA。 离子交 换纯化 法的一 般原理 对核酸 的分离 也适用 ,即负 电荷的 核酸加 到相反 电荷的 层析基 质中, 利用吸 附力的 差异加 以分离 。最好 是用阴 离子交 换树脂 ,它 带有正 电荷基 团, 后者在 近中性 pH 值的 等离子 强度的 缓冲液 中吸附 负电荷 的分子 ,尤 其是阴 离子交 换 (DEAE) 基 的表面 浓度高 ,加 上市售 Qiagen 柱的 基质是 大网眼 树脂, 可吸附 并滞留 高度荷 电的核 酸分子 ,嗣后 的洗涤 可去掉 溶胞产 物中的 杂质, 于是得 到极高 纯度的 DNA。 常用的 核酸阴 离子交 换剂的 分离范 围仅到 〇.5mol/L 盐浓度 。因 为溶 胞产物 中各种 组分 的结合 和洗脱 所要求 的盐浓 度范围 很窄, 所以蛋 白质、 RNA 和 DNA 的洗脱 峰会彼 此重叠 ,于是 妨碍从 这些组 分中有 效分离 DNA。 因 为此处 所述的 Qiagen 树脂的 电荷密 度 特别高 ,单位 树脂面 积中的 DEAE 基要比 常用的 阴离子 交换树 脂高五 倍多, 所以本 文 所述的 树脂可 在很宽 范围的 盐浓度 中分离 各种不 同类型 的核酸 ,直到 1.6mol/L。 图 2.11 为双链 DNA 的 洗脱点 。由于 树脂的 电荷密 度与缓 冲液的 PH 值 呈反比 ,所 以其结 合 、洗 涤和洗 脱的形 式也深 受所用 缓冲液 pH 值 的影响 (图 2.12)。 2) 重要参 數和疑 难解答 对粗提 物来讲 ,纯化 和回收 的限制 因素是 柱子的 容量。 Qiagen 阴离 子交换 树脂对 • 206 • 双链 DNA 600- . \rRNA ~ I I I I I 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH 图 2. 12 各种 核酸从 Qiagen 树脂 上的洗 脱点随 pH 变 化而异 不同类 型的核 酸有不 同的结 合容量 ,如对 RNA 的 容量约 为质粒 DNA 的两倍 ,大的 DNA 分子 (如 噬菌体 、黏粒 、基 因组 DNA) 的 结合容 量都低 于质粒 DNA。 所以 对制备 溶胞产 物来讲 ,最 重要的 是选一 个对溶 胞液体 积有适 宜结合 容量的 柱子, 以免样 品加得 太多 (见表 2. 11)。 这点对 于质粒 、噬 菌体 的制备 物来说 ,小 心控制 培养条 件和用 RNA 酶 处理胞 溶产物 可避免 。丰 富培养 基如超 肉汤或 巨肉汤 ,对 培养黏 粒和低 拷贝数 的质粒 来讲, 有利于 获得合 理产量 ,对 高拷贝 数质粒 就大可 不必。 在这些 情况下 ,如果 用 了丰富 培养基 ,就 会发生 细胞密 度过高 ,由 于其大 量的核 酸和蛋 白质, 使溶胞 产物的 黏度相 应增高 。一 般来讲 ,在上 柱之前 ,溶 胞产物 要清亮 ,没有 颗粒物 ,把 样品 的体积 按表 2.11 所 述进行 调整。 用 于结合 、洗涤 和洗脱 的柱缓 冲液的 pH 也 很重要 (见表 2_12), 改变 pH 会丢失 DNA。 许 多因素 可导致 DNA 纯化 的产量 过低、 没有产 量或纯 化不全 。把 每个分 段液体 图 2.11 各种 盐梯度 对核酸 的洗脱 1600 - 1400 - o o o o o o 2 0 8 T/ o i/ « 崁 • 207 • 都在 分析胶 上检测 (图 2.13), 有助 于发现 问题出 在哪里 。表 2. 12 列出 了各种 可能出 现的 问题, 并提供 了如何 处理的 建议。 图 2.13 1% 琼 脂糖分 析凝胶 上比较 不同纯 化阶段 或不 同类型 DNAW Qiagen 柱上 洗脱下 来的各 部分的 DNA 组分 l.XDNAHhdIII 相对分 子质量 标准; 2. 纯化前 的清亮 溶胞液 ; 3. 过柱 部分; 4.~5., Q 柱第 一次和 第二次 洗脱; 6. 质粒 DNA 洗 脱液; 7. 含变性 DNA 超 螺旋的 部分; 8. 含各 种质粒 DNA 超 螺旋的 部分; 9. 含线 性质粒 DNA (C* pTZ19/EcoRI) 的 部分; 10. 含细菌 染色体 DNA 的 部分; 11. 第 10 部分经 EcoRI 消 化后; 12.XDNA Hhdm 相对 分子质 量标准 (Qiagen 1992) 表 2.12 阴离子 交换层 析纯化 DNA 的疑 难解答 问题 可能 的原因 解 决办法 上样前 溶胞产 物中无 DNA 质粒 未繁殖 寻找 质粒生 长的最 适条件 制备 过程操 作不当 检査 缓冲液 ,必 要时新 鲜配制 DNA 在过 柱液中 DNA 上 样过多 检査柱 子容量 ,将 过柱液 用新柱 子纯化 DNA 样 品中有 SDS 或 其他离 核实 溶胞产 物在上 柱前是 否用透 析或冷 乙酸钾 去掉了 子 去污剂 SDS 按表 2. 11 检査培 养体积 ,必 要时减 少体积 。检査 RNA 高分子 RNA 在过 柱液中 RNA 酶 A 消化 不全 酶 A 溶液是 否失效 ,用 RNA 酶 A 消化 过柱液 ,回 收 ,再 用新柱 子纯化 DNA 从 柱中被 洗走了 洗 涤缓冲 液不对 査 QC 缓 冲液的 pH 和盐 浓度, 用沉淀 法回收 DNA 并 用新柱 子纯化 洗脱 液中无 DNA 洗 脱缓冲 液不对 査 QC 缓 冲液的 pH 和盐 浓度, 用新缓 冲液洗 脱回收 DNA 沉淀 中很少 或没有 DNA DNA 沉淀 不下来 査异丙醉批号,核对沉淀离心为>15 00〇)<发,3〇111丨11, 需 要时提 高速率 、延 长时间 • 208 • 续表 问题 可能 的原因 解 决办法 沉 淀丢失 ( 异丙醇 沉淀透 离 心前把 沉淀应 在的位 置标记 ,使 DNA 完 全溶解 。从 明不 易看见 ),DNA 难 壁 上洗下 DNA 时 ,尤 其是玻 璃管壁 可以粘 去一半 ,用 以 重悬浮 甩臂 转头, 使沉淀 在管的 最底下 DNA 难以重 新悬浮 沉淀 块太干 空气干 燥沉淀 ,不要 用真空 ,将 DNA 液 微加热 以助溶 沉淀块 中异丙 醉太多 用 70% 乙醇 洗沉淀 沉 淀块中 盐太多 室温 F 使用 异丙醇 ,增加 TE 缓冲液 的用量 对着表 2.11 检査 培养液 的体积 ,必 要时减 少体积 ,增加 RNA 在洗 脱液中 RNA 酶 A 消化 不足 洗 涤缓冲 液的量 ,将洗 脱液进 行沉淀 , RNA 酶 消化并 纯化 洗 脱液中 基因组 DNA 有污染 (对 质粒制 备物) 溶胞作 用的时 间过长 核对溶 胞步骤 不超过 5min DNA 被平切 或降解 在 后来的 实验中 DNA 表 现不好 混合 太用力 宿主 有核酸 内切酶 有核酸 酶污染 裂解液 必须轻 轻摇动 , 以防止 DNA 切断; 摇时裂 解液太 稠 ,应 减少培 养体积 考 虑改变 大肠杆 菌的宿 主品种 査缓冲 液中的 核酸酶 污染, 必要时 换新的 ,用消 毒玻璃 仪 器和塑 料用品 ,戴手 套操作 将 DNA 重悬于 TE 缓冲液 (pH8.0), 抑制 核酸酶 活性, 并 在保存 时保持 恒定的 pH 小 心重悬 DNA, 不要旋 转混合 而要用 力吸取 检 査琼脂 糖凝胶 上切口 DNA 的 百分比 异丙醇 在室温 中沉淀 , 沉淀用 70% 乙 醇洗涤 对着表 2.11 检 査培养 液体积 ,必要 时减少 ,增加 洗涤缓 DNA 缓 冲不够 重悬时 被切断 DNA 被平切 盐太多 DNA 不纯 冲 液的量 3) 预期结 果和实 验时间 从 培养的 哺乳动 物细胞 中制备 基因组 DNA 的预期 产量为 30~4(^g/107 细胞 。细菌 在 LB 培养 基中生 长过夜 所得低 拷贝数 质粒和 黏粒制 备物为 0.2~ 1/ig DNA/mL 过夜培 养物中 ,高 拷贝数 质粒在 这种条 件下为 3 〜 5yg/mL。 在超培 养基中 生长时 ,黏粒 和低拷 贝质 粒的产 量可以 增加到 2.5~5^g DNA/mL, 而高拷 贝数质 粒可到 5~25Mg/mL。 对 大多数 细胞类 型来讲 ,制 备原始 DNA 样品 (即溶 胞产物 ) 的过程 (包 括平衡 时间、 上样 、洗涤 、洗脱 ), 按 溶胞产 物的体 积和相 应柱子 的大小 ,要 1.5 〜 4h。 林菊生 李 糸 主要参 考文献 冯作化 , 皇甫永 穆主编 . 2000. 医学 分子生 物学. 第二版 .武汉 : 武汉出 版社. 金冬雁 ,黎孟 枫等译 .1998. 分子克 隆实验 指南. 第二版 .北京 :科学 出版社 • 卢圣 栋主编 . 1999. 现代分 子生物 学实验 技术. 第二版 .北京 : 中国协 和医科 大学出 版社. 彭秀 玲等编 .1997 •基因 工程实 验技术 . 第二版 .长沙 : 湖南科 学出版 社. 齐义鹏 .1998. 基因 及其操 作原理 .武汉 :武汉 大学出 版社. 颜子颖 ,王 海林译 .1998. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 :科学 出版社 • . 209 • Applied Biosystems. 1984. Evaluation and Purification of Synthetic Oligonucleotides. User Bulletin, Issue ft 13. Foster City, Calif. Ausubel, F. M. etal. 1995 .Short Protocols in Molecular Biology 3rd ed. John Wiley&Sons, Inc. Ausubel, F. M.et al. 1996. Current Protocols in Molecular Biology 2nd ed. John Wiley&Sons Inc. Chrambach, A. and Rodbard, D. 1971. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science, 172: 440 〜 451. Deilaporta, S.L., Wcx>d, J. and Hicks, J.B. 1983. A plant DN A minipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Rep, 1(4): 19. Dyson, N.J. 1991. Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis. In Brown T. A. ed. Essential Molecular Biology: A Practical Approach. Vol. 2 Oxford: I RL Press, 111^156. Gross-Bellard, M., Ouder, P. and Chambon, P. 1972. Isolation of high-molecular- weight DNA from mam- malian cells. Eur. J. Bicxrhem, 36: 32. Marmur, J. 1961 . Aprocedure for the isolation of desoxyribonucleic acids from microorganisms. J. Mol. Biol, 3:208-218. Murray, M.G. and Thompson, W. 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FEBS Lett, 98: 319 〜 323. 第三章 RNA 的制备 与分析 引 园 对 基因克 隆而言 ,获 得完整 、无 污染的 RNA 具有十 分重要 的意义 ,并 且也 是进行 基因表 达分析 的关键 。来源 于任何 细胞的 RNA 都可经 拷贝形 成双链 DNA, 并最 终克隆 化而 获得与 某一细 胞类型 相应的 cDNA 文库 。但要 使这样 构成的 cDNA 文 库有最 大的使 用价值 ,在开 始进行 基因克 隆时必 须采用 全长的 RNA。 本章首 先介绍 了几种 常用的 RNA 分离 方法, 随后总 结了一 些用于 RNA 结构 分析及 合成的 方法。 RNA 分离 过程中 的难点 在于多 数核糖 核酸酶 (RNA 酶) 都 非常稳 定并且 活性很 高 ,不需 要任何 辅助因 子就能 进行酶 解反应 。因此 ,在 所有 RNA 分离提 取的操 作方案 中 ,第一 步都是 在能使 RNA 酶 失活的 化学环 境中裂 解细胞 ,然后 才是从 各种细 胞分子 中分 离提取 RNA。 本章 介绍了 3 种 基本的 RNA 分离 方法, 具体到 每一次 实验中 究竟采 用哪 种方法 最合适 ,取 决于所 分离的 RNA 来源 于何种 细胞或 组织及 所提取 RNA 的最 终 用途是 什么。 除用于 基因克 隆外, RNA 分 离的另 一主要 用途是 基因表 达情况 的分析 。为 了阐明 某一 基因调 控特性 ,需 要了解 从该基 因转录 产生的 RNA 的结构 、数 量等 。本章 的第二 部分 就着重 介绍了 RNA 分析 的技术 和方法 ,其中 S1 核酸酶 分析法 、核 糖核酸 酶保护 实 验可用 于进行 RNA 的 精细结 构作图 ,确定 RNA 的 5'、 3' 末端和 5'、 3' 剪切点 (即内 含 子边界 )。 此外, 上述这 两种方 法以及 Northern 杂 交法均 可用于 精确判 断任一 特定遗 传 信息表 达的稳 态水平 。而 在确定 了某种 遗传信 息表达 的稳态 水平后 ,有 时还需 要进一 步了 解这种 信息的 表达水 平是否 是由基 因的转 录速率 高低来 控制的 ,而一 种信息 表达稳 态 水平的 变化除 与基因 转录即 RNA 的合 成情况 有关外 ,还 可能与 RNA 稳定性 的改变 (降解 、转运 出细胞 核等) 有关 。本章 的最后 一部分 介绍了 “细胞 核失控 转录” 技术, 这 一技术 可确定 正在进 行转录 的某一 DNA 特定节 段活性 RNA 多聚 酶分子 的数目 ,用 这一 技术能 直接分 析当细 胞某种 生长状 况发生 改变时 ,其 对应的 基因转 录速率 的变化 情况。 第一节 真核细 胞和原 核细胞 RNA 的制备 从真 核细胞 中制备 RNA 的 3 种常用 方案本 节均做 了介绍 。前 两种 方案具 有速度 快 、可 同时制 备多个 RNA 样品 的优点 ,如 前所述 ,制 备出的 RNA 主 要用于 S1 核酸酶 或 核糖核 酸酶保 护分析 。每种 方案的 改良方 法也做 了介绍 ,如果 要获得 完整、 全长的 RNA 分子, 则应使 用改良 方案。 在 3 种方 案中, 前两种 方案需 要的操 作时间 都不多 。第 一种方 案采用 温和去 污剂裂 • 211 • 解细咆 ,其 主要优 点是不 需要高 速离心 ,因此 在不具 备各种 高速离 心转头 的条件 下就可 进 行多个 RNA 样品的 分离; 第二 种方案 即胍盐 法采用 4mol/L 异 硫氰酸 狐裂解 细胞, 此方案 所需的 操作步 骤较少 ,可 从多种 不同的 细胞或 组织来 源获取 纯净的 RNA, 是从 含 高水平 内源性 RNA 酶 的组织 中获取 RNA 的备选 方案, 但是这 种方案 需要高 速离心 过程, 因而限 制了同 时制备 RNA 样品 的数量 。第三 种方案 是用粉 /SDS 裂 解细胞 ,可 从大 M 的植物 细胞中 提取出 纯净、 全长的 RNA, 同 时也适 用于多 种哺乳 动物细 胞和组 织 。总之 ,上述 3 种方 案均适 用于较 高等真 核细胞 RNA 提取 ,此外 ,许 多实验 室也采 用狐盐 法从植 物组织 中制备 RNA。 采 用上述 3 种 方案获 得的总 RNA 中 ,含有 核糖体 RNA (rRNA) 和转运 RNA (tRNA), 而 许多分 子克隆 技术需 要没有 rRNA 和 tRNA 污染 的信使 RNA (mRNA)。 因此 ,本 节也介 绍了制 备富含 mRNA 的带 poly (A) + 的 RNA 的方案 。此外 ,本 节还介 绍了从 革兰氏 阴性和 阳性菌 中制备 RNA 的 方案。 制备 RNA 的实验 失败的 主要原 因就是 RNA 酶 的污染 。如前 所述, RNA 酶 非常稳 定并且 一般不 需要辅 助因子 就能进 行反应 ,因此 ,在 RNA 制备过 程中, 即使是 极少量 RNA 酶的污 染也会 产生严 重后果 。为 了避免 RNA 酶污染 ,应 严格采 取以下 措施。 1) 溶液 处理。 RNA 制备过 程中使 用的所 有溶液 (包 括水和 其他盐 溶液) 都 必须先 用焦 碳酸二 乙酸脂 (DEPC) 进行 处理, DEPC 可通过 共价结 合灭活 RNA 酶 。但 要注意 含 Tris 碱的 溶液用 DEPC 处理效 果不好 ,因为 Tris 碱可与 DEPC 发 生反应 并使之 失活。 具体处 理步骤 在后面 的试剂 与溶液 DEPC 处理 指导中 有详细 说明。 2) 玻璃 和塑料 器皿的 处理。 RNA 制备过 程中使 用的实 验器皿 应先进 行处理 以除去 残存的 RNA 酶活性 。高 压处理 不能完 全灭活 RNA 酶 ,因此 ,玻 璃器 皿应在 300X: 下干 烤 4h, 塑料 器皿则 应用氯 仿冲洗 ,可达 到灭活 RNA 酶 的目的 。如 果是从 完整包 装中新 取出 的塑料 制品, 一般无 RNA 酶污染 ,可 以直接 使用。 3) 实 验者的 双手是 RNA 酶的 重要污 染源, 因此务 必戴手 套进行 操作。 一 、组织 培养细 胞胞质 RNA 的制备 (一) 基 本方案 1. 原理 实验 中首先 用冰冷 磷酸盐 缓冲液 (PBS) 洗 涤细胞 ,将 收集的 细胞重 悬于裂 解缓冲 液 (含非 离子型 去污剂 NP-40) 中 ,细胞 质膜迅 速裂解 ,再 通过短 暂的离 心去除 完整的 细胞核 。回收 上清胞 质液, 并加入 SDS 使蛋白 质变性 ,加入 蛋白酶 消化后 , 再用酚 / 氯 仿和 氣仿二 次抽提 以除去 蛋白质 。最后 用乙醇 沉淀得 到胞质 RNA, 通 过测定 A26〇 和 A280 进行定 址。 注意 所有操 作始终 在冰上 (或冰 浴中) 进行。 2. 材料 焦碳酸 二乙酯 (DEPC) 冰冷的 PBS 缓冲液 (137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HP04. 212 • L. 7H2O, 1 .4mmol/L KH2PO4) 冰冷 的裂解 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH8.0, lOOmmol/L NaCl, 5mmol/L MgCl2, 0.5% (V/V) NP-40, 用 DEPC 处理的 水配制 ,过 滤灭菌 。如 制备的 RNA 是 用于 Northern 杂交分 析或细 胞富含 RNA 酶 ,则 在裂解 缓冲液 中加入 RNA 酶抑 制剂: lOOU/mL 胎 盘核糖 核酸酶 抑制剂 (如 RNAsin) 加 lmmol/LDTT 或 10mm〇l/L 氧钒核 苷 复合物 20 % 十 二烷基 硫酸钠 (SDS) 25:24:1 (V/V/VO 酚 / 氯仿 / 异戊醇 24:1 (V/V) 氯仿 / 异戊醇 3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 无 水乙醇 75% 乙醇 /25%0.1mol/L 乙酸钠 (pH5.2) Beckman JS~4. 2 或与 之相当 的转头 细 胞刮子 所用 的水和 乙酸钠 均应用 DEPC 处理 以灭活 RNA 酶 活性。 DEPC 处理 溶液时 ,每 100mL 待 处理溶 液加入 0.2mLDEPC, 剧烈振 荡混匀 ,让 DEPC 进 入溶液 中, 再经高 压灭活 DEPC。 最好 单独存 放用于 RNA 实验的 溶液, 以防止 污染。 注意: DEPC 为可疑 致癌物 , 应带手 套并在 通风橱 中小心 操作。 3. 操 作步骤 (1) 用 冰冷的 PBS 缓冲液 洗涤已 吸除培 养基的 细胞。 对单 层培养 细胞, 用冰冷 PBS 洗涤 3 次后, 用橡皮 刮子将 细胞刮 到小体 积冰冷 PBS 中 (直径 10cm 培 养皿用 lmL PBS, 直径 15cm 培 养皿用 3~5mL PBS), 再转移 至预冷 离心管 ,在 Beckman JS> 4.2 中以 1000r/min (300X&) 离心 5min 或 在台式 离心机 中离心 15s 收 集细胞 ,继续 冰浴。 对悬 浮培养 细胞, 1000r/mih(300 xg) X5min 离心 沉淀后 ,重悬 于原培 养液一 半体积 的冰冷 PBS 中, 再次离 心沉淀 ,继续 冰浴。 (2) 重悬 细胞于 375pL 裂解缓 冲液中 ,冰浴 5min。 悬液 应迅速 变清亮 ,提 示细胞 裂解 充分。 此 操作一 方面要 剧烈振 摇以使 细胞裂 解完全 ,一方 面又要 小心避 免出现 气泡。 (3) 如果细 胞不在 微量离 心管中 ,则将 细胞转 移至微 量离心 管中, 4X: 离心 2min。 (4) 转移上 清至含 4pL 20% SDS 的干净 试管中 ,立 即振荡 混匀。 上清即 为细胞 胞质提 取物, 一般略 呈云雾 状或为 黄白色 ( 因细胞 而不同 ); 沉淀为 细胞核 和一些 细 胞碎片 ,为白 色物, 量应少 于步骤 (1) 中总 细胞沉 淀量。 (5) 加入 2.5pL 蛋白酶 K (20mg/mL), 37X: 温育 15min。 (6) 加入 400ML 酚 / 氯仿 / 异戊 醇抽提 ,充 分振荡 lmin 以上 ,离心 5min( 或以上 )。 提取 和离心 过程在 常温下 完成。 经蛋 白酶处 理后再 抽提, 两相间 界面的 沉淀量 应很少 ,当然 这与细 胞类型 也有关 。对 某些 细胞可 以省 略蛋白 酶处理 一步, 此时界 面间的 白色沉 淀量可 能很多 ,这样 除去有 机相后 ,可回 收的水 相就很 少 。如出 现这种 情况, 首先可 试着再 离心数 分钟; 若白 色沉淀 物仍不 能压缩 至界面 ,就 从管底 吸除有 机相, 再吸入 4〇0ML 氯仿 / 异戊醇 ,充 分振荡 后离心 2min, 经此处 理可使 沉淀物 大部分 消失。 回收水 . 213 . 相再 进行以 下步骤 (7) 回收 上层水 相并转 移到一 干净试 管中, 注意不 要吸到 界面的 沉淀物 。加入 400ML 酚 / 氯仿 / 异戊醇 ,重 复抽提 一次。 (8) 同 样回收 占相并 转移到 一干净 试管中 ,加入 400^L 氯仿 / 异戊醇 ,振荡 15 〜 30s, 离心 lmin。 i 回收上 层水相 ,转 移到— 干净试 管中。 (9) 加入 VL 3mol/L 乙醇钠 (pH5.2) (即 1/10 体积 ,终 浓度为 0.3mol/L) 和 lmL 无水 乙醇, 上下颠 倒混匀 ,冰浴 15 〜 30min 或放在 -20X: 过夜。 (10) 4X: 离心 15min 回收 RNA。 (11) 用 lmL75% 乙醇 /25%0.1mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 洗涤 RNA 沉淀。 (12) 干 燥后用 l〇〇/iL DEPC 处 理过的 水重悬 RNA。 测定浓 度时取 10/^L 稀释于 lmL 水中 ,测 A260 和 A280 值 〇 -70X: 保存 RNA 备用。 本操作 适用于 2 xi〇7 细胞 (约 2 盘 10cm 培养皿 细胞或 20mL 悬浮培 养细胞 )。 如细 胞数量 更多, 可按比 例增加 各溶液 用量。 (二) 污染 DNA 的去除 用以上 方案从 瞬时转 染克隆 DNA 的细胞 中分离 得到的 RNA 中可能 污染有 大量的 模板 DNA, 并 会干扰 RNA 的分 析如核 酸酶保 护实验 ,尤其 是使用 均匀标 记的探 针时。 除 掉污染 DNA, 可 在基本 方案第 (10) 步后 接本方 案操作 步骤。 1. 附 加材料 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH7.4, lmmol/L EDTA) lOOmmol/L MgCl2/10mmol/L 二硫 苏糖醇 (DTT) 2. 5mg/mL 无 RNA 酶的 DNA 酶 I ( 可 用商业 化产品 。如 为粉剂 ,用含 50% 甘油的 TE 缓冲液 溶解, -20X: 贮存 备用) 眙 盘核糖 核酸酶 抑制剂 (如 Promag 公司的 RNAsin) 或氧 钒核苷 (vandyl-ribonu- cleoside) 复合物 DNA 酶反应 终止液 (50mmol/LEDTA, 1.5mol/L 乙 酸钠, 1%SDS, SDS 应在常 温 下配制 ,可从 溶液中 析出; 可稍加 热使之 再溶解 ) 2. 操 作步骤 (1) RNA 重新 溶解于 50pLTE 缓冲 液中。 (2) 在 冰上配 制下述 混合液 : lOpL 100mmol/L MgCl2/ 10mm〇l/L DTT, 0.2A 2.5mg/mL 无 RNA 酶的 DNA 酶 I, 0.1/xL 胎 盘核糖 核酸酶 抑制剂 (25~50U/pL) 和 39.7pLTE 缓 冲液。 (3) 每份 RNA 样品加 50/xL 混合液 ,混 勻, 37t 温育 15min。 (4) 加 25ML DNA 酶反 应终止 液终止 反应。 . (5) 先用酚 / 氣仿 / 异戊 醇抽提 一次后 ,再 用氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (6) 加入 325^乙无 水乙醇 ,置 于冰 上沉淀 15 〜 30min 或 -20X: 过夜。 • 214 • (7) 接 基本方 案步骤 (11)。 (三) 方 法评注 1. 背 景资料 多数从 真核细 胞分离 RNA 的方 案中都 包含裂 解和变 性细胞 以释放 出总核 酸的过 程, 其他步 骤则用 于去除 DNA。 这一 方法是 使用非 离子型 去污剂 裂解细 胞膜而 保存完 整 细胞核 ,然 后经短 暂离心 除去细 胞核和 DNA, 此方 法可迅 速制备 总的细 胞胞质 RNA。 以此 技术为 基础的 各种方 案被广 泛使用 ,其 确切起 源已很 难找到 。在 早期一 些核酸 酶作 图的论 文中可 发现类 似方案 。这里 介绍的 方案较 早期方 法简化 了很多 ,如省 略了经 蔗糖离 心除去 细胞核 的过程 ,因而 更快速 ,流 水线式 作业, 可从多 个培养 细胞样 品中制 备 总的细 胞胞质 RNA, 并同时 进行核 酸酶保 护实验 (提供 的方案 适用于 小量培 养物, 1 〜 2 个培养 皿贴壁 细胞或 10 〜 20mL 悬浮培 养细胞 ,对 更大 量细胞 ,应 按比例 增加所 用试 剂体积 )。 本基本 方案适 用于大 多数细 胞类型 ,但没 有针对 核酸酶 采取特 殊措施 ,因此 在某些 细胞 ,据 此方案 分离的 RNA 质量 可能不 能用于 Northern 杂交 。如 果要得 到全长 RNA, 裂解缓 冲液中 应加入 RNA 酶抑 制剂或 所采用 胍盐法 。此外 ,如果 RNA 是从瞬 时转染 DNA 的细胞 中进行 分离, 则应用 DNA 酶处理 以除去 转染的 DNA。 如果 RNA 要 用于采 用 均匀标 记的探 针进行 核酸酶 保护实 验分析 ,此过 程尤为 重要。 2. 问 题和解 决方法 操作应 迅速, 所有步 骤均在 冰上完 成直至 在胞质 提取物 中加入 SDS, 这样可 以很好 地避免 RNA 的降解 。对 于富含 RNA 酶 的细胞 ,应 在裂解 缓冲液 中加入 RNA 酶抑制 剂 ,但大 多数情 况下并 不需要 。对 部分 细胞可 以省略 蛋白酶 K 一步 ,而 在除掉 细胞核 和加入 SDS 后直 接进行 有机溶 剂抽提 过程。 DNA 的污染 问题只 有在进 行瞬时 表达分 析 ,从转 染克隆 DNA 的细 胞制备 RNA 时才 会遇到 ,这种 情况下 应增加 DNA 酶处理 步骤。 3. 预期结 果和时 间估计 RNA 产 量依据 细胞不 同有较 大变化 ,一个 10cm 培养 皿所收 获的大 多数纤 维细胞 系细胞 (完全 汇合) 或 107 淋 巴细胞 可得到 30 〜 100网 RNA。 A26〇/A28() 的比 值应在 1.7 〜 2.0, lmg/mLRNA 的 A260 值为 25。 依据 待处理 样品量 的不同 ,从 开始收 集细胞 到乙醇 沉淀, 约需时 1 〜 2h, 如 要暂停 实验 ,这时 是最佳 时间。 下面则 是回收 RNA、 再溶解 和定量 ,可 当日 或隔日 进行。 二、 胍盐法 制备总 RNA 本节 介绍了 3 种 用胍盐 法制备 RNA 的不 同方法 。第一 、第二 方案采 用氯化 铯梯度 . 215 • 离心 法分离 RNA, 第三种 方案通 过一步 法分离 RNA ,不 需要进 行氯化 铯梯度 离心。 (一) 氯 化铯纯 化培养 细胞的 RNA 1. 原理 洗 涤细胞 除去培 养基后 ,加入 4mol/L 胍 溶液裂 解细胞 。用 20G 针头 抽吸细 胞裂解 物可以 降低溶 液黏度 ,然后 经氯化 铯梯度 离沉淀 RNA。 仔细吸 除上清 ,将 DNA、 蛋白 质与沉 淀中的 RNA 完全 分离开 。沉 淀中的 RNA 溶解后 ,再 经乙 醇沉淀 ,最后 用分光 光度法 测 A26〇 进行 定量。 2. 材料 碟酸盐 缓冲液 (PBS) (137mmol/LNaCl, 2.7mmol/LKCl, 4.3mmol/LNa2HP04. 7H2〇, 1 .4mmol/L KH2PO4) 狐 盐溶液 [4mol/L 异硫氰 酸胍, 20mmol/L 乙酸钠 pH5.2, O.lmmol/L 二 硫苏糖 醇 , 0.5%Sark〇syl。 在水中 溶解异 硫氰酸 胍和适 当量的 乙酸钠 ,微 微加 热溶液 (65X:) 使胍盐溶解,接着加入〇1'7和531^〇吁1。测定溶液?只约5.5,否则用冰乙酸调节,补 足容 量后用 Nalgene 滤 器过滤 ,室温 下贮存 溶液] 5.7mol/L 氯化铯 (CsCl) (溶解 CsCl 于 0. lmol/L EDTA pH8.0。 加 0.002 体积 DEPC, 振摇 20~30min 后高压 。在 高压前 后称量 溶液, 并在高 压后用 DEPC 处 理水补 足至 原重量 ,确保 溶液终 浓度为 5.7mol/L) TES 溶液 (10mmol/LTris-HClpH7.4, 5mmol/LEDTA, 1%SDS) 3mol/L 乙 酸钠, pH5.2 无 水乙醇 Beckman JS*4.2 或 SW-55 转头 (或相 当转头 ) 细 胞刮子 6mL 注 射器和 20G 针头 13 X 51mm 硅化并 经高压 的同质 异晶聚 合超速 离心管 注意:乙酸钠、水和5.7〇1〇丨/1^(:5(:丨都应用0£?(:处理以灭活1^八酶。0£?(:可能有致癌作用, 操作应 当心。 3. 操 作步骤 (1) 〜 (4) 步均在 常温下 进行。 (la) 对单层 细胞, 室温下 每一培 养皿用 5mL PBS 缓冲 液洗涤 两次。 (lb) 对悬 浮培养 细胞, lOOOr/min (30〇Xg) X5min (JS4.2 转头) 离 心沉淀 (细 胞数 <108), 除 去上清 ,沉 淀重悬 于培养 液一半 体积的 PBS 中, 再次离 心沉淀 ,除去 上清。 (2a) 对 单层培 养细胞 ,每 1〇8 细胞加 3. 5mL 胍 盐溶液 (如有 多个培 养皿, 则均分 溶液 ), 培养 皿内细 胞应迅 速裂解 ,用 细胞刮 子将黏 稠的裂 解物刮 到培养 皿一边 ,再用 配 20G 针头的 注射器 回收裂 解物。 • 216 • (2b) 对 悬浮培 养细胞 ,在 离心管 中加入 3. 5mL 胍盐 溶液。 (3) 形 成的裂 解物非 常黏稠 ,使用 20G 针 头的注 射器上 下抽吸 4 次, 然后回 收到一 干净试 管中。 这一 步的目 的是反 复剪切 染色体 DNA, 降低 其黏度 ,这样 离心后 DNA 可完全 除去。 (4) 在硅 化并经 高压后 的同质 异晶超 速离心 管中加 1.5mL 5.7mol/L CsCl, 加 3. 5mL 的 细胞裂 解物至 CsCl 垫 层顶部 形成阶 梯梯度 ,界 面应能 看到。 试 管作硅 化处理 的目的 是减少 黏附在 试管壁 上的物 质的量 ,从而 减少对 RNA 的 污染。 (5) 用 Beckman 离 心机和 SW-55 转头 ,以 35 OOOr/min (150 000 x g) 在 18X: 离心 12 〜 20h〇 注意缓 慢加速 和减速 ,避 免破坏 梯度。 (6) 极小心 地除去 上清液 。将 巴斯 德吸管 的底部 伸进溶 液顶层 ,边吸 边随液 面的下 降而 下降, 剩下约 lOOpL 的时候 ,小 心倒 置试管 ,让残 余液体 流出。 界面 处应有 一层白 色物, 含细胞 DNA, 注 意要完 全除去 该层。 (7) 干 燥沉淀 5 〜 lOmin, 重悬于 360^LTES 溶液中 ,用 吸管反 复上下 吹吸; 然后 在室温 下放置 5 〜 lOmin, 以使沉 淀充分 溶解, 再转移 到一干 净离心 管中。 重悬沉 淀的时 间一定 要充分 ,否则 RNA 的产量 会大大 降低。 (8) 加 40pL 3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 和 lmL 无水 乙醇, 在干冰 / 乙醇 上沉淀 30min。 离心 10〜15min, 除去上 清液。 (9) 重悬 沉淀于 360^L 水中 ,重 复步骤 (8)。 (10) 干 燥沉淀 lOmin, 再溶 解于约 200斤 水中 。定 量时取 10/xL 稀释至 lmL, 测 八26〇 和 A28Q。 以 水溶液 或乙醇 沉淀物 -70X: 贮存。 用 此方案 得到的 RNA 可 以进行 Northern 杂交、 S1 和 SP6 分析 。如 果需要 纯度更 高的 RNA, 可 将步骤 (7) 进行以 下改进 :重悬 沉淀于 TES 缓冲 液中后 ,加 360fxL4:l (WV〇 氯仿 /I- 丁 烷抽提 ,回 收上清 ,剩 余氯仿 中再加 36(VLTES 溶液抽 提一次 。合 并上清 ,按 步骤 (8) 加 0.1 倍体积 3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 和无 水乙醇 沉淀。 (二) 氯化铯 纯化组 织中的 RNA 纯 化组织 来源的 RNA 时要特 别小心 ,因 为某些 组织如 胰腺、 脾中含 有非常 丰富的 RNA 酶 (肝 和肠的 RNA 酶水 平相对 低一些 )。 1. 附 加材料 液氮 组织 胍溶液 (1L 溶液 :在约 400mLDEPC 处理水 中溶解 590_8g 异硫 氰酸胍 ,加 25mL 2mol/L Tris-HCl pH7.4 和 20mL 0.5mol/L Na2EDTA pH8.0, 搅拌 过夜, 定容至 950mL, 然后 过滤, 最后加 50mL 二巯基 乙醇) 20% 十二 烷基肌 氨酸钠 (Sarkosyl) 氯化铯 组织 重悬液 (5mmol/LEDTA, 0.5% Sarkosyl, 5% 2-ME) . 217 . 25:24:1 酚 / 氣仿 / 异戊醇 24:1 (V/VO 氣仿 / 异戊醇 组织 匀浆器 Sorvall SS~34 和 Beckman SW-28 转头 (或相 当转头 ) SW-28 硅 化并经 高压的 同质异 晶聚合 离心管 2. 搡 作步骤 (1) 迅速从 动物体 内取出 组织冻 存于液 氮中。 样品应 切成重 2g 以下 的组织 块以便 于 下面的 操作。 组 织中的 RNA 在体外 非常不 稳定, 因此快 速冻存 组织非 常重要 。直 接将组 织放进 狐溶液 中然后 等 待碾碎 会导致 RNA 降解。 (2) 约每 2g 组织加 20mL 组织 胍溶液 (不含 Sarkosyl), 立即 用组织 匀浆器 完全碾 碎 组织。 组织 胍溶液 中不含 Sarkosyl 很重要 ,否则 会产生 气泡。 (3) 用 SS~34 转头 离心, 10 OOOr/minX l〇min (12 000 X 容 ), 12XD 〇 (4) 回收 上清液 ,加入 0.1 体积的 20% Sarkosyl, 65*C 加热 2min。 (5) 每 lmL 样 品液加 O.lgCsCl, 待 CsCl 溶解后 ,将 样品 细心加 在装有 9mL 5.7mol/L CsCl 的 SW-28 硅化 并经高 压消毒 的同质 异晶聚 合离心 管顶部 ,在 SW-28 转 头中以 25 OOOr/min (113 000Xg), 221C 离心 过夜。 (6) 按第 一方案 中步骤 (6) 描述的 方法小 心除去 上清液 ,倒 置试管 让残余 液体流 出。 切下试 管底部 (含 RNA 沉淀) 并 放入一 50mL 塑料试 管中。 (7) 加 3mL 组织 重悬缓 冲液, 4X: 放 置过夜 ,使 RNA 重悬。 重悬 RNA 沉淀非 常困难 ,有时 样品需 放置更 长时间 。重 悬过 程中高 浓度的 二巯基 乙醇和 Sarkosyl 可防止 RNA 降解 。 (8) 先后用 25:24:1 酚 / 氯仿 / 异 戊醇和 24:1 氯仿 / 异戊 醇抽提 二次。 (9) 加 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 和 2.5 体积 无水乙 醇沉淀 RNA, 再用水 重悬 。按 第一方 案步骤 (10) 进行 定量。 -70X: 贮存。 (三) 一步 法从培 养细胞 或组织 中分离 RNA 1. 原理 培养细 胞或组 织在含 4md/L 硫氰 酸狐的 变性液 中进行 匀浆, 匀浆液 依次与 2mol/L 乙酸钠 (PH4.0)、 酚 和氯仿 / 异戊醇 混合, 混合液 离心后 的上清 水相中 含有总 RNA, 而 交界面 和有机 相中分 别含蛋 白质和 DNA。 RNA 经异丙 醇沉淀 并重新 溶解于 变性液 (含 4mol/L 硫氰 酸胍) 中 ,然 后再用 异丙醇 沉淀, 最后用 75% 乙醇 洗涤。 2. 附 加材料 变性液 (4mol/L 硫氰 酸胍, 25mmol/L 柠 檬酸钠 pH7.0, 0.1mol/L 二巯基 乙醇, 0.5% Sarkosyl。 先 配制贮 存液 : 293mL 水、 17.6mL0.75mol/L 柠 檬酸钠 pH7.0 和 • 218 . 26.4〇^10%531^〇871溶液,加入25(^硫氰酸胍,60〜65<0搅拌溶解。贮存液室温下 可存放 3 个月 。使 用时取 50mL 贮存液 ,加 0.35mL2-ME 即为工 作液, 这种变 性工作 液可 在室温 下存放 1 个月) 2mol/L 乙 酸钠, pH4.0( 在 40mL 水和 35mL 冰乙 酸中加 16.42g 无水 乙酸钠 ,用 冰乙 酸调节 pH 到 4.0, 最 后用水 定容至 lOOmL。 最终 溶液的 钠离子 浓度为 2mol/L) 水 饱和酚 49:1 (V/V) 氯仿 / 异戊醇 100 % 异丙醇 75% 乙醇 (用 DEPC 处理水 制备) 0.5% SDS, DEPC 处理 • SorvallSS34 转头 (或相 当转头 ) 3. 操 作步骤 注意: 除特别 指出外 ,所 有步 骤均在 室温下 进行。 (la) 处理 组织时 ,每 lOOmg 组织加 lmL 变性液 ,用 玻璃 Teflon 匀浆 器撞击 数次匀 浆。 (lb) 处理培 养细胞 ,对 悬浮培 养细胞 ,离心 后除去 上清; 对 单层培 养细胞 ,吸除 培养液 。每 1〇7 细胞加 lmL 变性液 ,用 吸管上 下抽吸 裂解液 7 〜 10 次。 不要用 盐水洗 涤细胞 ,单 层培 养细胞 可以直 接在培 养皿或 培养瓶 中进行 裂解。 以下 操作使 用一次 性灭菌 、圆底 、有 盖聚丙 烯试管 ,试 管不需 进行其 他处理 ,但使 用前, 应检测 试管带 有变性 液和酚 / 氯 仿时能 否耐受 10 〇〇〇 x # 离心。 (2) 将 匀浆液 转入一 5mL 聚丙烯 试管中 ,加 0.1mL2mol/L 乙酸钠 (pH4.0), 上 下 颠倒充 分混合 。加 lmL 水 饱和酚 ,充 分混合 ,再加 0.2mL 49:1 氯仿 / 异戊醇 ,混合 充 分后, O — l'C 放置 15min。 混合时 注意旋 紧盖子 。上 面所给 出的溶 液体积 均为每 lmL 变性 液用量 ,如 果开始 所加的 变性液 容 量不同 ,则随 后的其 他溶液 容量也 要相应 变化。 (3) 使用 SS>34 转头, 4t:, 9000r/min (10 000xg) 离心 lOmin。 将 上层水 相转入 一新试 管中。 上 层水相 中含有 RNA, 而 DNA 和 蛋白质 分别在 界面和 下层有 机相中 。水相 体积约 lmL, 与开始 所 用变性 液体积 相同。 (4) 加 lmL (1 倍体积 ) 100% 异丙醇 ,置 - 201C 30min 沉淀 RNA, 然后 10 000 X g 4*C 离心 10min, 弃 上清。 从 含高浓 度糖原 的组织 如肝脏 中分离 RNA 时 ,建 议使用 改良的 一步法 方案以 减低糖 原污染 。在 异丙 醇沉淀 步骤后 ,加入 4m〇l/LLiCl, 剧烈 振荡将 糖原从 RNA 沉淀中 洗出, 500〇xg 离心 l〇min, 沉淀 不溶的 RNA, 然后将 RNA 重新 溶解于 变性液 中进行 后面的 操作。 (5) 加 0.3mL 变性 液溶解 RNA 沉淀 ,再 转移至 1.5mL 微 量离心 管中。 (6) 再加 〇.3mL(l 倍体积 ) 100% 异丙醇 ,置 -20t:30min 沉淀 RNA, 然后 4t: 离心, lOOOOXg l〇min, 弃 上清。 (7) 重悬 RNA 沉淀于 75% 乙醇中 ,振荡 ,室温 下温育 1〇 〜 15min 以溶解 残存的 狐盐。 • 219 • (8) 10 000Xg 离心 5min, 充上清 ,真 空干燥 RNA 沉淀 5 〜 15min。 (9) 依 据以后 RNA 用途 的不同 ,溶解 RNA 沉淀于 100 〜 200ML DEPC 处 理水或 DEPC 处理 0.5% SDS 中 。按 第一方 案步骤 (10) 进行 定量, 存或在 乙醇中 _ 20*C 1C 存。 (四) 方 法评注 1. 背 最资料 硫 氰酸胍 是已知 最有效 的使蛋 白质变 性的物 质之一 。最 后胍盐 被用于 纯化从 富含内 源性 RNA 酶的 细胞中 提取的 RNA。 根据 RNA 的密 度高于 DNA 和 蛋白质 的特点 ,第 — 方案在 用胍盐 裂解细 胞后经 CsCl 梯度 离心将 RNA 与其他 的细胞 大分子 物质分 离开, 后 来也有 人使用 热酚和 硫氰酸 胍提取 RNA。 第一方 案用含 4mol/L 狐盐和 温和去 污剂的 溶液裂 解细胞 ,裂解 过程非 常短暂 ,细 胞迅 速变性 ,接 着利用 RNA 密 度较高 的特点 将其与 DNA 和 蛋白质 分离开 。此 方案由 于 所需操 作较少 而被广 泛使用 ,其获 得完整 RNA 的 几率较 高而实 验者人 工操作 的时间 则减少 。缺 点是需 要超速 离心, 并使可 同时处 理的样 品量受 到限制 。在待 处理的 样品量 不多 而所需 RNA 质量 又较高 时应使 用基本 方案。 RNA 的 一步分 离方法 依据是 ,在酚 / 氯仿有 机相存 在的环 境中, RNA 在含 4mol/L 硫 氰酸胍 (PH4.0) 的溶 液中可 保持水 溶状态 。而在 此酸性 条件下 ,大 多数蛋 白质和 DNA 小分 子片段 (5 〜 10bp) 存在 于有机 相中, DNA 大分 子片段 和另一 些蛋白 质则在 交 界面中 。匀浆 过程使 DNA 剪切 成片段 有助于 从水相 中去除 DNA。 一 步法自 介绍以 来, 已成为 人们在 分离多 个样品 RNA 时广 泛使用 的方法 。此外 ,在 进行 基因表 达研究 时可 得到的 组织或 细胞量 常常很 有限, 而此方 法也可 以微量 组织或 细胞中 分离总 RNA, 因此适 用于作 基因表 达研究 。这里 介绍的 是最新 的一步 法方案 ,与 最早 的方案 相比, RNA 的 分离时 间大大 减少。 2. 关 键参数 进行任 何制备 RNA 的操作 ,都 必须 特别小 心并确 保所使 用的溶 液中无 RNA 酶。 在加入 胍盐溶 液后除 TES(Tris 灭活 DEPC) 外 ,所 有接触 RNA 的 溶液都 必须用 DEPC 处理 。此外 ,大多 数人认 为在进 行有关 RNA 的 实验时 应戴手 套操作 ,因 为双手 很可 能就是 RNA 酶的污 染源。 这里 介绍的 前两种 方案都 是根据 梯度离 心来完 全分离 RNA 与 DNA 和 蛋白质 ,其 要 点是使 用硅化 试管以 及在吸 取上清 时仔细 操作。 RNA 产 量较低 的原因 通常是 离心后 重悬 RNA 的 时间不 充分, RNA 沉淀溶 解有一 定困难 ,因此 应有足 够的时 间并充 分振荡 使 RNA 完全 溶解。 使 用一步 法分离 RNA 时应注 意两点 。首先 ,尽 可能使 用新鲜 的组织 ,否则 应立即 将组织 冻于液 氮中并 贮存于 -70X:。 后一种 情况在 处理时 应先将 组织在 液氮中 研成粉 末 ,然 后加入 变性液 ,在融 化前用 p〇lytron 或 Warign 混匀 器匀浆 。第二 ,不要 让最后 形成的 RNA 沉淀 完全千 燥这一 点也非 常重要 ,否则 其可溶 性会大 大降价 ,这一 点在所 • 220 • 有的 RNA 分 离方案 中都同 样重要 。部分 溶解的 RNA 其 A26G/A28() 比值为 1.6。 通过在 55~60t: 加 热和间 断振摇 或用移 液器吸 头抽吸 RNA 溶液可 以增加 RNA 的溶 解度。 3. 预期结 果和时 间估计 使 用第一 方案每 108 细胞可 得到约 200网 RNA, 获得的 RNA 应 完全无 DNA 污染。 使用一 步法分 离得到 的是所 有各种 片段的 RNA 分子 ,包括 小分子 RNA(4S~5S), 其 产量 根据分 离的组 织来源 不同而 有变化 ,每 l〇〇mg 肌肉 组织约 可获得 100 〜 UOpg。 分 离的 RNA A260/A280 比 值应在 1.8 以上。 对 于实验 的时间 ,收获 RNA 和设定 梯度耗 时很少 ,每 6 个 样品约 lh, 因此 可以在 晚上 开始实 验然后 进行高 速离心 过夜。 必要时 ,可 以将胍 盐细胞 裂解液 在干冰 / 乙醇中 迅 速冰冻 ,然后 贮存在 -70X:。 梯 度离心 后溶解 RNA 时, 可在任 何沉淀 步骤中 以乙醇 沉淀 物的形 式无限 期贮存 RNA。 整个方 案中每 6~12 个样品 人工操 作的时 间约需 2~3h〇 一步法 分离总 RNA 的全过 程可在 4h 以内 完成 ,实验 在异丙 醇沉淀 或乙醇 洗涤步 骤都 可暂时 终止。 如果需 暂时终 止的话 ,可在 -20t: 贮 存样品 ,但 是样品 在变性 液中的 时间不 要超过 30min。 三 、植物 RNA 的制备 (酚 /SDS 法) 1. 原理 这 里介绍 的方案 可用于 制备多 种真核 组织的 RNA。 从真 核组织 中分离 RNA 的关键 是灭活 内源性 RNA 酶和防 止外源 RNA 酶 的污染 。一般 ,从真 核生物 体分离 RNA 的方 案包 括用强 变性剂 (酚 /SDS) 裂 解细胞 以及用 去蛋白 剂抑制 DNA 酶和 分离蛋 白质与 RNA。 而后, 用高盐 (LiCl) 选择 性分离 RNA 和 DNA 与 其他不 纯物。 2. 材料 液氮 研磨 缓冲液 (0.18mol/LTris, 0.09mol/LLiCl, 4.5mmol/LEDTA, 1%SDS, 用 HC1 调 pH 至 8.2; 在 TLE 溶 液中加 1/10 体积的 10% SDS 即为该 缓冲液 ) TLE 溶液 (0.2mol/L Tris, O.lmol/L LiCl, 5mmol/L EDTA, 用 HC1 调 pH 至 8.2) TLE 溶液 平衡酚 [实验 当天用 TLE 溶液 平衡, 每制备 15g 组 织平衡 250mL 酚 。首 先用 等体积 TLE 溶液加 0.5mL15mol/LNaOH (可使 pH 接近 8.0) 抽提 一次, 然后再 用 TLE 溶 液抽提 两次] 氯仿 8mol/L 和 2mol/L LiCl 3mol/L 乙酸钠 无 水乙醇 polytron (Brinkmann PT 10/35) • 221 . Beckman JA-10, JA-20 和 JA-14, 或相 当的离 心转头 50mL Oak Ridge 试管和 Sarstedt 试管 注意: 乙酸钠 、水和 LiCl 溶 液应用 DEPC 处理。 3. 搡 作步骤 组织匀 浆和蛋 白抽提 (1) 将 少量液 氮淋到 研钵和 研棒表 面进行 预冷。 (2) 称量 15g 冻 存的植 物组织 ,如使 用新鲜 组织, 则应迅 速将其 冻于液 氮中。 称取 和冻存 组织之 间的时 间应尽 量减少 。如果 组织是 冻存的 ,提取 RNA 的操作 应迅速 ,以 避免 组织 融化。 (3) 在研 钵中用 研棒碾 碎组织 ,使其 成为细 粉末。 (4) 立即转 入装有 150mL 研磨缓 冲液和 50mL TLE 平 衡酚的 500mL 烧 杯中。 (5) 将混 合液用 polytron 以低速 度混合 均匀。 (6) 加 50mL 氯仿 ,用 polytron 以低速 度混合 均匀。 以下的 抽提过 程只使 用氯仿 ,不 需加异 戊醇。 (7) 将匀浆 液倒入 500mL Nalgene 离 心瓶, 50X: 加热 20min〇 所有涉 及包括 TLE 平衡 酚和氯 仿的抽 提步骤 都应使 用带螺 旋盖并 耐此类 化合物 腐蚀的 试管或 瓶子。 (8) 将匀 浆液在 41C 以 10 000r/min (17 700Xg) 离心 20min (JA-10 转头 )。 (9) 尽可能 多地吸 出上层 水相但 不要打 动界面 ,将其 转入一 干净的 500mL Nalgene 瓶中 ,加 50mLTLE 平衡酚 ,振荡 摇匀, 然后加 50mL 氯仿。 刚吸 出的水 层加入 TLE 平衡 酚和氯 仿可避 免在进 行步骤 (10) 和 (11) 时 RNA 的 降解。 (10) 从初次 的酚抽 提液中 吸出残 留的水 相以及 交界面 ,转入 50mL Oak Ridge 管, 在 4X: (JA-10 转头) 以 lOOOOr/min (17 70〇Xg) 离心 20min。 (11) 吸出水 相层并 与步骤 (9) 中分离 得到的 水相层 混合。 步骤 (10) 和 (11) 的目的 是为了 回收最 大量的 水相, 因为在 500mL 瓶内 进行操 作时难 以将水 层和 交界层 完全分 离开。 (12) 在 500mL 瓶内 剧烈振 摇两次 抽提所 得的水 相液体 ,使酚 、氯仿 和水层 充分混 合 ,混 合物于 4t: (JA-10 转头) 以 lOOOOr/min (17 70〇Xg) 离心 I5min, 转移 上层水 相到一 干净的 500mL 瓶中。 (13) 再次用 TLE 平 衡酚和 氯仿抽 提回收 的水层 ,必要 时再重 复进行 抽提直 到不再 有 交界面 (一 般共需 3 次抽提 )。 在 这些抽 提步骤 中交界 面量应 该较小 ,不需 按步骤 (10) 和 (11) 那样进 行再次 离心。 (14) 最 后得到 的水层 再用氯 仿抽提 一次。 因为 水层中 残留的 微量酚 会影响 LiCl 的沉淀 过程。 RNA 的选择 性沉淀 以 下步骤 用于去 除污染 DNA, 如果不 需要除 DNA, 例如 下一步 是选择 pdy(A)+RNA 时 ,则只 需简单 地用乙 醉沉淀 即可。 (15) 转移水 层到一 干净的 250mL Nalgene 瓶中 ,加 1/3 体积的 8mol/L LiCl, 使 UC1 的最终 浓度为 2m〇l/L, 4t: 沉淀 过夜。 • 222 • (16) 在 4t: 以 lOOOOr/min (15 300Xg) 离心 20min (JA-14 转头 ), 收集沉 淀并用 几毫升 2mol/L LiCl 洗涤 沉淀。 (17) 用 5mL 水重悬 沉淀并 转至一 15mL Sarstedt 试管中 ,加 8md/'L LiCl 使 终浓度 为 2mol/L, 4X: 沉淀 2h 以上。 (18) 在 4X: 以 10 000r/min (12 000Xg) 离心 20min (JA-20 转头) 以回收 RNA, 用 2mol/L LiCl 洗涤 沉淀。 (19) 用 2mL 水重悬 RNA 沉淀 ,加 200pL 3mol/L 乙 酸钠和 5.5mL 无水 乙醇, -20X: 沉淀 过夜或 在干冰 / 乙醇 上沉淀 30min。 (20) 再在 4t: (JA-20 转头) 以 10 000r/min (17 700 x g) 离心 15min 回收 RNA, 用 lmL DEPC 处理 水重悬 RNA, 取 lO^L 稀释到 lmL, 测 A260 和 A28〇 定量。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 使用 酚提取 RNA 源于 Kirby 介绍 的方法 (1968), 这 里所介 绍的酚 /SDS 提取 RNA 的方法 则是直 接采用 Palmiter(1974) 建立的 方法, 但是这 一方法 已经在 Palmiter 建立 的方 法的基 础上经 多个实 验室的 努力而 改进了 。最广 泛使用 的改进 方法由 Chirgwin 于 1979 年建立 ,它 使用异 硫氰胍 而非酚 /SDS 混 合物来 裂解细 胞和使 核酸酶 变性。 2) 关 键参数 从真 核组织 中制备 高质量 RNA 的 最关键 因素就 是去除 RNA 酶活性 。内 源性 RNA 酶在酚 /SDS 抽 提过程 中可迅 速失活 ,在 抽提过 程之后 ,最 重要的 是避免 外源性 RNA 酶的 进入。 从植物 中制备 RNA 还 需特别 注意要 充分磨 碎组织 。植 物组织 多纤维 并含有 一些有 机物质 ,这 使得新 鲜植物 组织很 难碾碎 ,因此 ,应 冻存组 织后再 用研钵 和研棒 磨碎。 3) 预期结 果和时 间估计 根 据植物 种类的 不同, RNA 的产 量变化 很大。 以制备 RNA 产量较 高的豌 豆苗为 例 ,每 15g 组织可 得到约 7mg 总 RNA。 而等量 的成熟 ArW 办如 5 植物仅 能得到 3mg 总 RNA。 根据植 物中碳 水化合 物及其 二级代 谢产物 水平的 不同, 得到的 RNA 质 量也有 差别 。这 一方案 很容易 通过改 变所使 用溶液 的容量 而改进 ,它 可较好 地用于 lg 以内的 组织的 RNA 提取。 处理 两个样 品到第 一次用 LiCl 沉 淀之前 约需时 2 〜 3h, 在经酚 抽提得 到的水 相中加 入 LiCl 后 ,可将 RNA 贮存于 4X: 数 天甚至 数周。 四 、细菌 RNA 的制备 从细菌 中分离 RNA 的过 程包括 裂解细 胞和随 后分离 RNA 并除去 污染的 DNA 和蛋 白质 。下 面介绍 的方法 裂解策 略各有 不同, 如在革 兰氏阴 性菌是 用蔗糖 / 去污剂 或溶菌 酶 进行化 学降解 ,而在 革兰氏 阳性菌 则是用 超声破 碎胞壁 。而 后采用 酶降解 、有 机溶剂 抽 提和乙 醇或盐 沉淀的 方法将 RNA 与其他 细胞成 分分离 ,同 时使 用一些 RNA 酶活性 抑制剂 (如 DEPC、 氧 银核昔 (Vandy-ribonucleoside) 复 合物和 aurintricarboxylic acid)。 . 223 . 如果需 要极高 质量的 RNA, 第 一方案 中采用 的氯化 铯梯度 离心方 法就可 去除所 有痕量 污染 DNAo 注 意所用 的水和 所有其 他溶液 均应用 DEPC 处理 以抑制 RNA 酶活 性。 DEPC 为可疑 致癌物 ,应 戴手 套仔细 操作。 ATA 如接触 到皮肤 、眼 睛或吸 入呼吸 道会产 生刺激 ,而 VRC 如不慎 吸入或 吞服也 会危害 人体, 因此均 应在良 好通风 环境下 I 操 作并避 免接触 皮肤。 (一) 从 革兰氏 阴性菌 中分离 高质量 RNA 1. 原理 采用本 方案可 以从大 肠杆菌 或蓝藻 目细菌 中获得 引物扩 增用的 高质量 RNA, 适于 Northern 杂交和 S1 作图 。首先 用蔗糖 /TritionX-100 溶液裂 解细胞 。而后 用有机 溶剂抽 提和 乙醇沉 淀得到 总核酸 。最 后经氯 化铯梯 度离心 过程去 除污染 DNA 和 蛋白质 ,得到 高质量 RNA。 使用 BeckmanTL-100 超速 离心机 (TLA-100.3 转头) 可减少 RNA 沉淀 时间, 但许多 实验室 没有配 该转头 ,因此 本方案 也给出 了使用 SW-41 转 头离心 的相应 条件 。此外 ,本方 案还需 要两种 RNA 酶 抑制剂 一 - 氧 钒核苷 (VRC) 复 合物和 aurin- tricarboxylicacid (ATA), 不需 要用溶 菌酶和 蛋白酶 进彳了 消化。 2. 材料 lOOmL 大肠 杆菌或 500mL 蓝藻 目细菌 培养物 终止 缓冲液 (200mmol/L Tris-HCl pH8.0, 20mmol/L EDTA, 20mmol/L NP-40, 20mmol/L A 丁 A。 如果 RNA 是用于 进行弓 I 物 延伸或 SI 核酸 酶作图 ,贝 ij 不要力 II ATA。 用棕色 瓶室温 下贮存 ) STET 裂解液 [8% 蔗糖, 5% (W\〇 TritonX-100, 50mmol/LEDTA, 50mmol/ L Tris-HCl pH7.0, 用 DEPC 处理的 贮备液 制备, 4X: 贮存] 缓冲酚 和氯仿 3mol/L 乙 酸钠, pH6.0 200mmol/L 和 10mmd/L 氧 钒核苷 复合物 (VRC, GIBCO/BRL) 1:1 缓冲酚 / 氯仿 CsCl, 固体 CsCl 垫 : 5 . 7mol/L CsCl (以 pH 7 . 0 的 100mol/mL EDTA 配制) 100% 乙醇和 70% 乙醇 ,冰冷 Beckman JA-14 和 JA-17 转头 15mL 聚丙 稀试管 (Sarstedt) Beckman TL-100 超速 离心机 ,带 TLA-100.3 转头和 13mm X 51mm 多聚 碳酸盐 (polycarbonate) 离 心管; 或 Beckman L5-65 超速 离心机 ,带 SW-41 转头和 14 X 89mm ultraclear 离心管 〇 • 224 • 3. 操 作步骤 裂解 细菌: (1) 培养 lOOmL 大肠 杆菌或 500mL 蓝藻 目细菌 至对数 生长期 ,加 1/20 体积 终止缓 冲液 终止其 生长, 将培养 物置于 冰上。 可以直 接把冰 块加到 培养液 里进行 降温。 终止 缓冲液 中含有 核酸酶 抑制剂 ATA, 此 抑制剂 可影响 一些特 定酶类 ,如果 分离的 RNA 是为了 进 行引物 延伸或 S1 核酸 酶分析 ,则不 应使用 (见方 法评注 )。 (2) 用 BeckmanJA-14 转头 ,在 4*0 以 6000r/min (550〇Xg) 离心 5min 收集 细胞。 用 2mLSTET 裂 解液重 悬沉淀 ,加入 100|uL 200mmol/LVRC, 然 后转至 15mL 聚丙试 管中。 (3) 加 lmL 缓冲酚 ,振摇 lmin 后加 lmL 氯仿, 再振摇 lmin。 用 JA-17 转头 ,在 4"C 以 8500r/min (lOOOOXg) 离心 l〇min, 沉淀用 2mL10mmol/LVRC 重悬。 离心后 ,细 胞碎片 在界面 处形成 一厚层 ,收 集上层 水相时 注意不 要打动 界面。 (4) 加 1/10 体积 3mol/L 乙 酸钠和 2 体积冰 冷无水 乙醇沉 淀核酸 。用 JA-17 转头, 在 4X: 以 8500r/min (10 000X g) 离心 lOmin, 沉淀用 2mL 10mmol/L VRC 重悬。 加入冰 乙醇后 ,核 酸会 立即形 成可见 沉淀物 ,不需 要把试 管置于 低温下 ,核 酸沉淀 的形成 提示细 胞裂解 完全。 (5) 用 1:1 酚 / 氯仿抽 提两次 ,再 按步骤 (4) 沉淀 核酸。 此步 骤主要 是降低 蛋白质 污染, 沉淀后 核酸体 积应小 于步骤 (4) 所见。 CsCl 梯度离 心纯化 RNA: (6a) 使用 TLA-100. 3 转 头:在 13 x 51mm TLA-100. 3 多聚 碳酸盐 (polycarbonate) 管中加0.7511^5.7111〇1/1^〇3(:1,同时用211^〇£?(:处理水重悬核酸沉淀,加入埝固体 CsCl 并 使其充 分溶解 ,然 后将此 2.25mL 溶 液加到 CsCl 垫上。 (6b) 使用 SW-41 转 头:在 14mmX 89mm ultraclear 离心 管中加 3mL CsCl 塾 ,同时 用 6mL DEPC 处理水 重悬核 酸沉淀 ,再 加入 4.5g 固体 CsCl, 用 DEPC 处 理水补 足体积 到 9mL, 然后 将此溶 液加到 CsCl 垫上。 不论 使用何 种转头 ,重 要的是 保证两 层分离 ,加 液体到 CsCl 垫 J: 时动作 要轻柔 。也 可以 使用其 他吊桶 式超速 离心机 ,但样 品体积 、转 速和离 心时间 都要进 行相应 调整。 (7a) 对 TLA-100.3 转头 : 80 000r/min (280 000Xg) 离心 lh, 20X:。 (7b) 对 SW-41 转头 : 30 000r/min (15 OOOXg) 离心 24h, 20*0。 回收 RNA: (8) 离心后 立即用 无菌巴 斯德吸 管从界 面小心 地吸除 DNA, 接 着再吸 除上层 CsCl 垫, 然后倒 掉残余 上清液 ,在 RNA 沉 淀处作 一标记 ,用薄 纸擦净 离心管 管壁。 注意离 心后要 立即开 始下面 操作, 否则时 间长后 RNA 会 变松散 ,使 从沉淀 中除掉 液体的 操作出 现 困难。 (9) 用 0.36mLDEPC 处理 水重悬 DNA 沉淀 ,使用 1CKKVL 移液 器转至 1.5mL 微量 离心 管中。 (10) 加1/10体积3111〇1/1^乙酸钠和2.5体积冰冷无水乙醇,-7(^[:沉淀2〇1^11,再 在 4"C 离心 5min 沉淀 RNA。 • 225 . (11) 加 lmL 冰冷的 70% 乙醇 ,在 41C 离心 5min。 (12) 空 气干燥 RNA, 溶于 200pL DEPC 处 理水中 。测 Amo 和 Ago 定量 ,调 整终浓 度为 4ptg/;zL。 _70t: 长 期贮存 或以乙 醇沉淀 的形式 _20200 5 80 〜 200 8 40 〜 100 12 10 〜 50 探针的 标记和 消化大 约需要 2~3h, 电 泳和分 离得到 的探针 又需要 7h, 当使 用双链 质粒作 为制备 探针的 模板时 ,建议 在进行 寡核苷 酸引物 的激酶 反应前 先进行 质粒 DNA 的变性 。完成 S1 杂交至 多需要 2h, 但一般 建议杂 交过夜 以确保 所有待 分析的 RNA 序 列都已 经与探 针杂交 。进行 S1 核 酸酶消 化需要 lh, 而后准 备样品 和变性 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 所需时 间总共 不超过 5h, 并且 需要手 工操作 的时间 很少。 二、 核糖核 酸酶保 护测定 (一) 核糖核 酸酶保 护测定 1. 原理 将目的 基因即 探针序 列克隆 到噬菌 体启动 子下游 多克隆 位点上 ,制备 具高特 异性和 高 比放射 活度的 RNA 杂 交探针 。先用 限制酶 酶切消 化质粒 ,然 后用 噬菌体 RNA 聚合 酶转 录质粒 DNA, 合成 高特异 性和高 比放射 活度的 RNA 分子。 获得的 RNA 探 针进行 纯化 ,用 DNA 酶除 去模板 DNA, 用酚 / 氯仿抽 提除去 蛋白质 ,再 在乙酸 铵存在 的条件 下 经乙醇 沉淀除 去未整 合的标 记物; 也可用 凝胶电 泳的方 法纯化 RNA 探针 。探针 RNA 与样品 RNA 进 行杂交 ,杂交 反应完 成后用 RNA 酶除去 未杂交 的探针 ,剩 下完 整的探 针 RNA 与样品 RNA 杂交 体片段 。经 乙醇沉 淀回收 杂交体 ,再在 序列胶 上电泳 进行分 析 ,如果 待检样 品中含 有目的 mRNA, 则可见 到与探 针长度 一致的 片段。 2. 材料 5X 转录 缓冲液 (T7、 T3RNA 聚合酶 : 200mmol/LTris-HClpH8.0, 40mmol/L MgCl2, 10mmol/L 亚精胺 , 250mmol/LNaCl, SP6RNA 聚合酶 : 200mmol/LTris-HCl pH8.0, 40mmol/LMgCl2, 10mm〇l/L 亚精胺 。应 使用由 DEPC 新处理 的水新 鲜制备 ) 200mmol/L DTT 3NTP 混合液 (ATP、 UTP 和 GTP 各 4mmol/L, 0.5mmol/LDETA, _20t: 贮存) [a-32P] CTP (lOmCi/mL, 400 〜 800Ci/mmol。 有以水 溶剂形 式出售 的商品 ,浓度 —般是 10mCi/mL, 使用 的比活 度应为 400 〜 800Ci/mmd, 更高比 活度产 生的探 针很不 稳定 。也 可以用 标记的 GTP 或 UTP 取代 ,但 相应地 要变更 NTP 混合液 中另外 3 种未 标记核 苷酸的 组成) * 胎盘 RNA 酶 抑制剂 (如 promega Biotec 公司的 RNAsin) 0 . 5mg/mL 模板 DNA • 240 • 噬菌体 RNA 聚合酶 (根据 探针序 列克隆 的载体 的不同 ,可 选用 SP6、 T3 或 T7, 其功 能基本 相同) 2 . 5mg/mL 无 RNA 酶的 DNA 酶 25:24:1 酚 / 氯仿 / 异戊醇 2.5mol/L 乙酸铵 无 水乙醇 75% 乙醇 /25%0.1mol/L 乙 酸钠, pH5.2 杂交 缓冲液 (5 X 贮存液 : 200mmol/L PIPES pH6.4, 2mol/L NaCl, 5mmol/L EDTA。 使用时 ,应用 冻存的 5 x 贮存液 1 份和新 经混合 树脂床 去离子 处理的 甲酰胺 4 份 (1:4) 配置新 鲜杂交 工作液 ,也 可将 工作液 分装成 小份在 -70*C 保存) RNA 酶消化 缓冲液 [10mmol/L Tris-HCl pH7.2, 300mmol/L NaCl, 5mmol/L EDTA, 力口 1/50 体积的 50 x RNA 酶 混合液 (2mg/mL RNA 酶 A, 0. lmg/mL RNA 酶 Tl)。 RNA 酶 消化缓 冲液应 在室温 下贮存 ,用时 加入需 要量的 RNA 酶冻 存液, 配制此 溶 液一定 要使用 一次性 试管] 20% (m/V) SDS 20mg/mL 蛋白酶 K (_20°C 贮存) RNA 加样 缓冲液 [80% (V/V) 甲 酰胺, lrmnol/LEDTApH8_0, 0.1% 溴 酚蓝, 0.1% 二 甲苯青 ,不 要使用 Maxam-Gilbert 加 样缓冲 液或任 何含有 NaOH 的缓 冲液] 酚抽 提和变 性聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳所需 的试剂 和装置 水和 乙酸钠 应在使 用前用 DEPC 新鲜 处理。 3. 操 作步骤 制备 探针: (1) 在一个 高压灭 菌的微 量离心 管中混 合下述 反应物 : 5 x 转录 缓冲液 4pL 200mmol/L DTT lpL 3NTP 混合液 2pL [a-32P] CTP (10mCi/mL, 400 〜 800Ci/mmol) 10/iL 胎盘 RNA 酶 抑制剂 (20~40U) 0.5mg/mL 模板 DNA ( 终浓度 25;ig/mL) 1/^L 噬菌体 RNA 聚合酶 (5 〜 10U) l^xL 加 样时应 在模板 DNA 加 入前先 加入前 4 种成分 ,以防 止转录 缓冲液 中含有 的亚精 胺沉淀 DNA。 (2) 如用 SP6RNA 聚合酶 ,在 40X: 温育; 如用 T7 和 T3RNA 聚合酶 ,则在 37X: 温育 ,时间 30~60min。 标 记的三 磷酸核 苷会迅 速消耗 ,因此 不必要 延长温 育时间 ,增 加酶 用量也 没有更 多帮助 。实际 上 ,存 在过多 的酶会 导致模 板的随 机转录 ,而 这些转 录物很 可能与 探针互 补结合 ,使 杂交时 的背景 增高。 (3) 加 5 吨或 10U 无 RNA 酶的 DNA 酶, 一般用 5000U/mL 或 2.5mg/mL 的贮备 液 2/iL, 37X: 温育 15min。 • 241 . 这一步 消化除 去模板 DNA, 对杂 交的成 功非常 关键。 (4) 加 2pL 10mg/mL tRNA 作为 载体, 然后加 水使终 体积为 50/^。 (5) 用酚 / 氣仿 / 异戊醇 抽提。 (6) 回 收水相 并加入 200/iL 2.5mol/L 乙 酸铵和 750;iL 无 水乙醇 ,混合 后冰浴 15min, 然后 4"C 离心 15min 沉 淀 RNA〇 如果 准备用 胶纯化 RNA 探针 ,则 下一步 接方案 (二 )。 (7) 用 50pL 水重 溶沉淀 ,加 200pL2.5mol/L 乙 酸铵和 750pL 无水 乙醇, 同样按 步骤 (6) 沉淀。 . (8) 重 复步骤 (7)。 三次沉 淀可去 除几乎 所有未 结合的 标记物 ,也可 以采用 其他分 离聚合 RNA 和游离 三磷酸 核苷的 方法 (如 离心柱 层析法 ), 但要 十分小 心避免 RNA 酶的 污染。 (9) 用 75 % 乙醇 / 25% 乙酸 钠洗涤 沉淀。 (10) 干燥 后溶于 l〇(VL 杂 交缓冲 液中。 (11) 取 1ML 进行液 体闪烁 计数。 探 针的比 活度约 有每分 钟计数 l〇9/Mg, 由 于放射 性衰减 ,其活 度迅速 降解, 因此在 制备当 天使用 效 果最佳 ,如在 4X: 贮存 ,也应 在几天 内使用 。一 周后 ,探针 大部分 降解。 探针 RNA 与模板 RNA 杂交: (12) 用 无水乙 醇沉淀 RNA 样品, 如果是 贮存于 水中的 RNA, 则 冻干。 对 细胞总 RNA 或胞质 RNA, 通常 10Mg 就携带 有大部 分信息 , 如目的 RNA 丰 度较高 ,用 量还可 以 少一些 。另外 , 应以含 tRNA 的 样品作 为对照 ,一方 面显示 杂交背 景强度 ,一方 面检验 RNA 酶消 化情况 ,一般 杂交反 应不会 产生探 针保护 现象。 (13) 重新 溶解于 含每分 钟计数 5 X 1〇5 RNA 探针的 3(VL 杂 交缓冲 液中。 注 意确保 RNA 沉淀完 全溶解 ,可用 吸管重 复抽吸 。杂 交缓冲 液中如 有一个 以上的 探针, 可对单 个样品 的多种 mRNA 进行 分析。 随缓冲 液中探 针含量 的增加 ,杂 交背景 也随之 增大, 因此不 必要过 多增 加探针 用量。 (14) 85X: 加热 5min 使 RNA 变性。 (15) 迅 速转至 设定的 理想杂 交温度 ,温 育过夜 (8h 以上 )。 由于在 S1 核酸酶 分析中 RNA 探 针不会 像双链 DNA 那样自 我退火 , 因此杂 交温度 的要求 不很严 格 ,但对 不同的 探针仍 有一最 佳杂交 温度, 原因可 能在于 探针二 级结构 的形成 。建 议温度 范围为 30~60*C, 可先试 45X: 杂交。 对某些 RNA, 杂交 可以在 4~6h 内 完成。 RNA 酶消化 : ( 16) 每一 杂交反 应体系 中加入 350pL 含 40/ig/mL RNA 酶 A 和 2/ig/mL RNA 酶 T1 的 RNA 酶 消化缓 冲液, 30X: 温育 30 〜 60min。 此次的 温育条 件对最 终杂交 信号的 强度影 响不大 ,但 如果怀 疑此步 有问题 ,则 应该从 15~37t: 温育 范围进 行检测 ,如 果发现 RNA 复合体 双链结 构内部 有断裂 ,则 去掉消 化缓冲 液中的 RNA 酶 A。 (17) 加 10pL20% SDS 和 2.5/iL20mg/mL 蛋白酶 K, 37X: 温育 15min。 (18) 用 400^[酚/ 氯仿 / 异戊 醇抽提 一次, 水相移 入含有 l^L 10mg/mL 酵母 tRNA 的微 撤离心 管中。 (19) 加 lmL 乙醇, 沉淀。 (20) 干燥沉 淀后, 重溶于 3 〜 5pLRNA 加 样缓冲 液中。 • 242 • (21) 85X: 温育 3min 变性。 (22) 在变性 的聚丙 烯酰胺 / 尿 素凝胶 (测 序胶) 中电 泳分析 结果。 在这种 凝胶中 RNA 的 电泳迁 移速率 较同样 大小的 DNA 慢 ,如 果使用 DNA 分子 量标准 来估计 RNA 片段 的长度 ,则 RNA 的 实际长 度要较 相当的 DNA 标 准带小 5%~10%。 例如 ,如果 RNA 片段 的迁移 速率与 lOObp 大小的 DNA 相当 ,则 RNA 片段 的实际 长度约 90~95bp。 (二) 凝 胶纯化 RNA 探针 某些 条件下 如需要 全长的 RNA 探针时 ,可 以使 用本方 案进行 纯化。 1. 附 加材料 TBE 缓冲液 (配 制参见 DNA 凝胶 电泳) 洗脱 缓冲液 (2mol/L 乙酸铵 , 1% SDS, 25^/g/mLtDNA) 2. 操 作步骤 (1) 在第一 次乙醇 沉淀后 ,晾干 ,重 溶于 lOfiLRNA 加样缓 冲液。 关 键在于 RNA 完 全干燥 ,然后 再充分 溶解。 (2) 85X: 加热 5min 使 RNA 变性。 (3) 加样至 TBE 缓冲液 制备的 6% 聚 丙烯酰 胺凝胶 (丙 烯酰胺 与亚甲 双丙烯 酰胺比 例为 29:1), 凝胶 一般厚 0. 4mm, 长 14cm (也 可以使 用测序 胶长度 ), 300V 电 压下电 泳 (如 胶更长 ,则 电压也 应增高 ), 直到 指示剂 溴酚蓝 泳动到 凝胶的 1/2~2/3 的 位置。 使用 非变性 胶在于 其泳动 速度快 ,但一 定要注 意在加 样前使 RNA 完 全变性 ,也可 以使用 含尿素 的变 性胶。 (4) 拆开凝 胶夹层 ,让凝 胶保留 在一面 玻板上 ,用 放射性 墨水作 好标记 ,再 用塑料 薄膜包 裹好, 感光胶 片曝光 30s, 以胶片 作对照 ,切下 全长的 RNA 带。 RNA 带在 凝胶上 所占实 际位置 较胶片 上显示 的带要 细很多 ,因此 ,不要 切下很 多凝胶 ,切 下的 凝胶 越小, 杂交越 干净。 (5) 加 400^L 洗脱缓 冲液, 37t: 摇动 2 〜 4h 洗脱 RNA。 洗脱 缓冲液 在室温 下常出 现沉淀 ,因 此在使 用前应 稍加热 。较小 的探针 (<200bp) 洗脱 90min, 较长 的核苷 酸应洗 脱更长 时间, 但一般 2h 应足 够。 (6) 将洗 脱液移 到一新 微量离 心管中 ,加 lmL 无水 乙醇。 (7) 冰浴 15min, 微 量离心 15min。 用探测 仪检测 洗脱液 和切下 的凝胶 , 前者的 计数应 高很多 ,且应 都被乙 醇沉淀 下来。 (8) 重溶 RNA 于 50pL 杂交缓 冲液中 ,取 1/iL 进行液 体闪烁 计数。 产量 会比未 用胶纯 化前低 一些, 但所得 探针足 以进行 50 次杂交 , 而背景 会减低 很多。 (三) 模板 DNA 的合成 模板 DNA 是通 过将目 的序列 插入到 含噬菌 体启动 子的质 粒载体 中来进 行制备 ,构 建 此类载 体的策 略将在 分析一 节中进 行讨论 ,含有 噬菌体 启动子 的载体 有商业 化产品 • 243 . 出! I 丨 用 限制性 内切核 酸酶在 目的探 针序列 的下游 处切断 ,这 样可以 产生均 一长度 的失控 转 录产物 。所选 用的内 切酶可 以在质 粒上有 多个酶 切位点 ,但 不能在 嗤菌体 启动子 、探 针 序列和 两者间 的载体 DNA 内。 选用的 限制性 内切核 酸酶以 能产生 5' 突出端 者为最 佳, 如采用 3' 突出端 产生的 限制酶 ,由于 3' 突 出端也 可作为 RNA 聚合酶 的起点 ,可导 致合成 与探针 互补的 RNA 链。 RNA 的消化 要彻底 ,但不 要过度 。用酌 / 氯仿抽 提酶切 后的 DNA, 乙醇 沉淀后 ,重 新溶于 〇.5mg/mL 无 RNA 酶的 TE 缓冲液 种,一 般少至 lOOng 的模板 DNA 就可以 产生相 当量的 探针。 (四) 方 法评注 r 1. 背 景资料 噬菌体 RNA 聚 合酶具 有的特 性使其 非常适 合用于 制备高 比活度 的探针 。首先 ,这 种 酶相对 比较稳 定且易 于纯化 ,而且 其基因 已经整 合到噬 菌体基 因组中 ,可 以更 直接地 在大 肠杆菌 中进行 克隆和 表达, 因此减 轻了纯 化难度 并提高 了效益 。其次 ,其 合成 RNA 的速度 非常快 ,可达 200 〜 300bp/min, 比大 肠杆菌 RNA 聚 合酶和 DNA 聚 合酶的 速 度约快 10 倍, 因此这 种酶可 用于合 成大量 的探针 。第三 ,此酶 识别的 启动子 序列很 长, 不可能 偶然地 与其他 DNA 结合, 作用的 特异性 非常强 。因此 ,用此 酶合成 的探针 与原 序列有 很好的 同源性 ,并 且纯化 简单。 制备 探针的 第一步 是将含 有目的 序列的 DNA 片 段亚克 隆到噬 菌体启 动子的 下游, 这样 噬菌体 RNA 聚合酶 合成的 RNA 与 待检测 RNA 互补, 这种重 组体最 好能够 用限制 性内 切核酸 酶消化 而产生 线性模 板分子 ,可转 录生成 200 〜 300bP 的 失控转 录产物 。例 如 ,如 果要分 析从启 动子处 产生的 初始转 录产物 的水平 ,应将 含有距 启动子 +150bp 的 目的序 列以及 - 100bP 的 序列克 隆到噬 菌体启 动子的 下游, + 150bp 的位 点靠近 噬菌体 启动子 ,在 靠近 -100bP 位点处 用限制 酶切割 ,这 样可 失控转 录生成 250bp 的探针 ,含 有分析 所需的 150bp 的 信息。 本 方案是 广 泛使 用的 S1 核酸 酶作图 法的一 种替代 方案, S. 嗤菌体 SP6 RNA 聚 合酶的 分离和 定性以 及噬菌 体启动 子的克 隆使得 采用本 方案成 为可能 ,随 后相 关的大 肠杆菌 噬菌体 T3 和 T7 RNA 聚 合酶也 被采用 。与 传统的 S1 核酸酶 作图法 相比 ,本方 案的优 点在于 :①容 易制备 探针, 一般不 需用凝 胶纯化 探针; ②与末 端标记 和切 口平移 (nick translated) 法制 备的探 针不同 ,这种 RNA 探针 的比活 度不是 由酶反 应 的效率 而是由 加入的 标记三 磷酸核 苷的比 活度决 定的; ③与传 统的末 端标记 S1 探针 相比 ,本方 案制备 的探针 产量大 、比 活度高 ,极 大地提 高了杂 交的敏 感性; ④所 得探针 是单 链结构 ,不 会复性 ,因而 产生的 杂交复 合体比 DNA 探针产 生的复 合体要 稳定; ⑤ 用 RNA 酶消化 RNA-RNA 复合 体比用 S1 核酸 酶消化 RNA-DNA 复合体 的反应 更可靠 , 重 复性也 更好, S1 核酸酶 受温度 和酶浓 度的影 响很大 。当然 ,如 果用 body-labeled 标记 的单链 DNA 探针 来进行 si 核酸 酶作图 也可以 获得上 述这些 优点。 在进行 斑点杂 交时, 也 可以用 DNA 探针 来取代 rna 探针。 2. 常见问 题及解 决方案 在 用此方 案制备 探针的 过程中 最常遇 到的问 题一是 不能得 到全长 RNA 探针 ,二是 杂交背 景太高 ( 比如在 tRNA 对 照组信 号过强 )。 产生非 全长转 录产物 的原因 可能是 RNA 酶污染 使探针 降解或 转录提 前终止 或暂停 。后 者是 因为序 列特异 性现象 ( 模板序 列 中存在 转录终 止信号 ), 在标记 的三磷 酸核苷 浓度较 低时, 这一现 象会被 进一步 放大, 而 选择相 对较短 的探针 (如 100~300bp) 可 以避免 其发生 。非全 长转录 产物的 产生也 与所 选择的 标记核 苷酸种 类有关 ,因此 选择其 他的核 苷酸标 记物可 能有助 于解决 这一问 题 。此外 ,增 加未 标记的 三磷酸 核苷浓 度以增 加反应 的绝对 浓度反 而可能 降低探 针的比 活度 。如 果问题 仍然不 能解决 ,可以 通过凝 胶纯化 而得到 全长的 RNA 探针 ,注 意一定 要避免 RNA 酶 的污染 。杂 交背景 一般是 由于转 录反应 中模板 DNA 消化不 完全引 起的, 残存的 DNA 片段可 以高效 地与探 针杂交 ,而 在所有 泳道上 产生一 些模糊 的带型 ,采用 新鲜 制备的 DNA 酶或 新制备 的模板 DNA 以及 用凝胶 纯化探 针可以 解决这 一问题 。本 方 案中列 举的杂 交和消 化条件 对大多 数探针 而言效 果都比 较理想 ,但为 了得到 最佳信 / 噪比, 应对杂 交温度 、探针 用量和 RNA 酶消化 条件等 进行适 当调整 。引 起背景 杂交的 另 外一个 原因是 探针中 含有痕 量的与 其互补 的正义 RNA, 其产生 原因可 能是转 录反应 体系 中加入 的酶量 过大, 或是使 用的限 制酶切 割模板 DNA 产生 3' 突出端 ,在 反义 RNA 探针中 ,即 使只有 很少量 的正义 RNA, 也会 产生极 高的杂 交背景 。在探 针中如 果存在 正义 RNA, 不论 其原因 是什么 ,都会 使背景 杂交问 题一直 存在, 通过凝 胶纯化 探针的 方法 可以很 好地解 决这一 问题。 另外一 个问题 偶尔也 会遇到 ,在用 RNA 酶消化 时出现 RNA 复合 体从内 部切断 ,这样 就会使 全长的 被检测 产物丢 失而产 生很多 小的亚 片段。 比如, 细菌的 CAT 基因 ,在 靠近其 5' 端 附近有 一长串 “A”, 在用 RNA 酶消化 过程中 能 “breath” 而被 RNA 酶 A 切断, 去掉消 化缓冲 液中的 RNA 酶 A 可以解 决这一 问题。 对大 多数反 应来讲 ,单用 Zpg/inL 的 RNA 酶 T1 就足 以进行 消化, 只是对 RNA 末端作 图可能 不能达 到最佳 效果。 3. 预期效 果及时 间安排 多数 情况下 ,在 转录反 应体系 中超过 一半以 上的标 记物都 能整合 入探针 ,如 果整合 量确实 很少, 尽管仍 能得到 比活度 很高的 的探针 ,但探 针最终 的产量 会降低 。而且 ,虽 然理论 上这种 探针的 效果与 从高效 率转录 反应体 系中获 得的探 针相似 ,但 在实际 使用中 其背景 却常常 很高。 通过凝 胶纯化 得到的 探针产 量也会 低一些 ,一般 为每分 钟计数 (2 Xl〇7)~(5Xl〇7), 但 足够用 于进行 40 次一 般的杂 交反应 。如 果检测 样品中 mRNA 的 丰度相 对较低 ,用 10网 的总 RNA 进 行检测 的话就 应采用 增感屏 并曝光 过夜以 获得杂 交信号 ,但一 般情况 下不需 使用增 感屏, 且曝光 时间也 可以短 一些。 合 成探针 的时间 约需要 3h, 其中 多数情 况下是 在温育 。用凝 胶纯化 探针花 费的时 间 (包 括探针 电泳和 洗脱) 约 6 〜 8h, 在 这段时 间内可 进行乙 醇沉淀 待检测 RNA 样品 的工作 。探针 最好在 合成当 天使用 ,因此 ,比 较合 适的安 排是第 一天进 行探针 制备和 RNA 杂交 ,第 二天进 行核酸 酶消化 和凝胶 电泳, 消化和 后面的 纯化过 程需时 2~3h。 • 245 • 三 、引 物延伸 1. 原理 本 方案用 于检测 RNA 的董和 5' 末 端长度 ,用 30 〜 40bp 末端 标记的 寡核苷 酸作为 引物 与待检 RNA 杂交 ,而后 加入脱 氧核苷 酸延伸 此引物 ,合成 与模板 RNA 互补的 cD- NA, 然 后对此 DNA 进行序 列胶电 泳分析 。延 伸引物 的长度 反映了 引物与 RNA 5' 末端 的距离 ,而延 伸引物 的量则 反映了 待检测 信息的 水平。 2. 材料 [y-32P] ATP (10mCi/mL, 6000Ci/mmol) 100pg/mL 寡核苷 酸引物 T4 多聚 核苷酸 激酶和 10 x 多 聚核苷 酸激酶 缓冲液 4mol/L 乙酸按 乙醇 0.3mol/L 乙酸钠 1 X 水性 杂交液 (lmol/L Naa,0.33mol/L HEPES pH 7.5,0.33mmol/L EDTA pH 8.0) SI 杂交液 (80% 去 离子甲 酰胺, 40mmol/LPIPESpH6.4, 400mmol/LNaCl, lmmol/L EDTA pH 8.0, 分装成 lmL/ 小份于 -70X: 贮存) 75% 乙醇 / 25% O.lmol/L 乙酸钠 4mmol/L 4dNTP 混合物 10 x 逆 转录酶 (RT) 缓冲液 胎盘 RNA 酶 抑制剂 (如 Promega Biotec 公司的 RNAsin) AMV 逆 转录酶 0.5mol/L EDTA lmg/mL 胰 RNA 酶 A 0.5mol/L 乙酸铵 25:24:1 酚 / 氯仿 / 异戊醇 70% 乙醇 /30% DEPC 处理水 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 甲酰 胺加样 缓冲液 (0.2mL0.5mol/LEDTApH8.0, lOmg 溴 酚蓝, l〇mg 二甲苯 青, 10mL 甲酸胺 ) 变 性聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳所需 的试剂 和设备 水和乙 酸钠同 祥应用 DEPC 处理 以灭活 RNA 酶。 3. 操 作步骤 寡核 苷酸的 标记: (1) 混 合以下 试剂, 37X: 温育 30min, 制备标 记的寡 核苷酸 : 20fiL ["y-32?] ATP (10mCi/mL, 共 20(VCi) • 246 • ltiL lOO^g/mL 寡核苷 酸引物 (lOOng, 特 异性针 对目的 RNA 序列) 2.5fiL 10X 多 聚核苷 酸激酶 缓冲液 4U T4 多聚 核苷 酸激酶 应采用 30 〜 40bP 的 寡核苷 酸引物 ,合成 的延伸 产物长 度应为 lOObp 左右。 如果使 用更短 的寡核 苷酸 ,应适 当放宽 杂交条 件如降 低杂交 温度或 在水溶 液中进 行杂交 。引物 延伸存 在的一 个主要 问题是 逆转录 酶会在 RNA 的 某一序 列处终 止合成 ,因 此预计 合成的 产物不 能太长 ,这 样危险 性就低 一些。 (2) 65X: 加热 5min 灭 活激酶 ,加 25^L 4mol/L 乙 酸铵和 250;iL 乙醇, 在干冰 / 乙醇 上沉淀 30min 或 - 20C 沉淀 过夜, 然后微 量离心 15min 得到标 记的寡 核苷酸 沉淀。 (3) 用 25/^L 水溶解 寡核苷 酸沉淀 ,再加 25;xL4m〇l/L 乙酸铵 ,重复 上述沉 淀过程 两次。 3 次 沉淀的 目的在 于从标 记的寡 核苷酸 中除掉 [7-32P] ATP。 (4) 用 lOOpL 0.3mol/L 乙酸钠 重溶寡 核苷酸 ,取 l^L 进行 Cerenkov 计数。 杂交: (5) 将 计数为 5 x 1〇4 的 标记寡 核苷酸 和最多 50啤 RNA 混合, 调节溶 液的盐 浓度至 终 浓度为 0.3mol/L 乙酸钠 ,再加 2.5 倍 体积的 乙醇进 行沉淀 。倒 转离心 管置于 Kimwipe 上干燥 30min, 重悬于 30/^LlX 水性杂 交液或 30^LS1 杂 交液中 ,用移 液器吸 头上下 抽吸液 体至少 50 次并充 分振摇 以确保 RNA 完全 溶解。 然后在 30X: 温育 过夜。 RNA 完全 干燥后 再进行 重悬非 常困难 ,因此 不要真 空干燥 RNA 沉淀 。杂交 条件应 根据引 物的长 度 和所含 G>C 量来定 ,较长 的引物 (>30bp) 应用 甲酰胺 杂交液 ,较 短的引 物则用 aqueous 杂 交液。 (6) 在杂交 反应体 系中依 次加入 170ptL 0.3mol/L 乙 酸钠和 500/uL 乙醇 ,沉淀 RNA 和寡 核苷酸 。用 75% 乙醇 / 25% O.lmol/L 乙酸钠 (PH5.2) 洗涤 沉淀, 倒置于 Kimwipe 上 干燥。 引物 延伸: (7) 在 冰上新 鲜制备 RT 混合液 (以 下量按 每一反 应计算 ): 3 . 5/^tL 4mmol/L dNTPs 2.5fiL 10XRT 缓冲液 1.25^L RNAsin 18/jlL 水 每 一样品 中加入 25pLRT 混合液 ,充 分重悬 ,通 过监测 放射比 活度可 以了解 RNA 和寡 核苷酸 的重悬 情况。 (8) 每一 反应体 系中加 2pL (40U) AMV 逆转 录酶, 42X: 温育 90min。 温 度低于 42t 时 ,逆转 录反应 更容易 终止。 (9) 每一反 应体系 中再加 l^L 0.5mol/L EDTA, 然后加 1/uL lmg/mL 胰 RNA 酶 A, 37C 温育 30min。 当待 分析的 RNA 样 品超过 lOjxg 时需用 RNA 酶进 行消化 ,目 的是防 止在用 序列胶 分析样 品时出 现 误差。 (10) 加 10(VL2.5mol/L 乙酸铵 ,用 125^L 酚 / 氯仿 / 异戊 醇抽提 ,将 上层水 相转至 一干 净管中 ,再加 300fxL 乙 醇沉淀 RNA。 加 500/iL70% 乙醇 /30% 水 (V/V) 洗涤 RNA 沉淀, 然后用 Speedvac 蒸发器 (Savant) 干燥 沉淀。 (11) 重悬 沉淀于 3MLTE 缓 冲液中 ,加 4;iL 甲酰 胺加样 缓冲液 ,煮沸 3min 然后置 . 247 • 于冰上 ,取 3~4ML 在适当 比例的 序列胶 上进行 分析。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 本方 案通常 用于同 时测定 RNA 的董 和大小 。逆 转录病 毒编码 的酶即 逆转录 酶的发 现为此 奠定了 基础, 此酶可 以转录 RNA 为 DNA, 因此 ,单链 DNA 与 RNA 杂 交后在 此 酶的作 用下就 可以沿 RNA 延伸 直到达 RNA 的 末端。 逆转录 酶的一 个重要 用途是 cDNA 文库 的建立 ,这 一技术 将在后 面介绍 ,这 里则主 要 讲述应 用逆转 录酶进 行引物 延伸在 RNA 分 析方面 的用途 。本方 案采用 一种特 异序列 的引物 来测定 相应的 特异靶 RNA 的量和 结构。 这种分 析方法 广泛用 于体内 、外 信息水 平 的检测 。引物 延伸、 S1 分析和 SP6 分析 3 种 方法都 能用于 RNA 水平和 末端结 构的分 析, 但引物 延伸与 后两种 方法有 一个重 要区别 ,引 物延伸 可以一 直达到 RNA 的 5' 末端 而 不受剪 接点和 RNA 与 基因组 DNA 间其 他不连 续位点 的影响 。对于 S1 或 SP6 分析, 由于 采用的 DNA 探 针将在 探针与 RNA 间的 任何不 连续处 被切断 ,因此 S1 分析 法得到 的单一 条带反 应的即 可能是 RNA 末端或 3' 剪 接点; 而逆 转录 酶可以 延伸产 物达到 RNA 的末端 ,与有 无剪接 点的存 在无关 。因此 ,引 物延伸 法可以 用于判 断通过 剪接点 两端的 序 列以及 确定转 录产物 5' 末 端结构 ,并 通过比 较判断 S1 分析法 得到的 究竟是 5' 末端还 是 3' 剪接点 结构。 2) 常见问 題及解 决方案 引物延 伸法的 主要困 难在于 逆转录 酶遇到 RNA 的某些 区域时 (二级 结构较 复杂的 区域) 会暂 停作用 或终止 ,在进 行凝胶 电泳时 就出现 一些低 相对分 子质量 的条带 ,导致 对结果 解释不 清并减 少合成 的全长 延伸引 物的量 。延 伸模 板链中 G-C 含 量和发 夹结构 较多 处可形 成这样 的终止 或暂停 位点。 本方案 增加了 所用核 苷酸的 浓度和 温育温 度以尽 量防止 此问题 出现。 使用的 引物起 始位点 应距待 分析信 息末端 lOObp 以内 ,使逆 转录酶 合 成距离 不长也 有助于 减少这 一问题 的发生 。由此 产生的 另一个 问题是 如果待 分析的 RNA 5' 末 端正好 是富含 G-C 的区域 ,实验 者就必 须判断 其结果 究竟是 真实的 5' 末端还 是由 于逆转 录酶不 能通过 该区域 而产生 的假象 ,这 时可联 合使用 5' 末端 标记的 探针进 行 S1 分析 法来对 5' 末端 定位。 3) 预期结 果和时 间安排 0. lMg 的 3-mer 寡核 苷酸 应整合 约每分 钟计数 (2 X 1〇7) 〜 (4 X 1〇7) 标记量 ,这 样的 引物 应能判 断占总 RNA 0.001% 〜 0.01 % 的 信息的 水平。 寡核苷 酸引物 的标记 约需要 2 〜 3h, 其中需 手工操 作的时 间很少 。标 记的寡 核苷酸 保 存时间 可长达 1 月 ,但 其敏感 性随时 间延长 而下降 。杂交 的准备 工作大 约需要 lh, 然后可 以温育 过夜。 制备序 列胶分 析样品 约需要 4h, 引物 延伸产 物应立 即进行 分析以 获 得最佳 结果。 四 、用 Northern 与狭线 印迹杂 交分析 RNA Northern 杂交 用于判 断完整 RNA 的童 和大小 。使 用变性 琼脂糖 凝胶电 泳分离 • 248 • RNA, 甲醛或 乙二醛 / 二甲 基亚砜 (DMSO) 均可 用作变 性剂。 分离的 RNA 转 至硝酸 纤维 素膜上 ,通过 特异性 标记的 DNA 探针 与转至 膜上的 RNA 进 行杂交 的方法 来判断 某 一特定 RNA 的量和 大小。 这种方 法对于 判断某 一特定 RNA 的 水平非 常敏感 ,但不 能用 于了解 RNA 的精确 结构。 (一) 用 琼脂糖 -甲醛 凝肢电 泳进行 RN A 的 Northern 杂交 1. 材料 10 x 和 1 x MOPS 电泳 缓冲液 甲 醛加样 缓冲液 (lmmol/LEDTA, 0.25% 溴酚蓝 , 0.25% 二甲 苯蓝, 50% 甘油) l〇x、 2〇x、 IX 和 0.25XSSC (20XSSC: 3mol/LNaCl, 0.3mol/L 二水柠 檬酸三 钠,‘ 盐酸调 pH 7.0) 10mg/mL 溴 化乙键 Northern 预杂 交液和 杂交液 0.1% (m/V) SDS 60X: 水浴 旋 转平台 硝 酸纤维 素滤膜 、层 析纸和 杂交袋 琼脂 糖凝胶 电泳和 放射自 显影需 要的其 他试剂 和设备 水应用 DEPC 处 理灭活 RNA 酶。 2. 试 剂配制 1) 10 x MOPS [3-(N- 吗啉代 ) 丙 磺酸] 电泳 缓冲液 在 800mLDEPC 处理 水中加 41.8gMOPS, 用 NaOH 或乙 酸调节 pH 到 7.0, 加入 16.6mL DEPC 处理水 配制的 pH5.2 的 3mol/L 乙酸钠 ,再 加入 20.0mL DEPC 处 理水配 制的 pH8.0 的 0.5mol/L EDTA, 加 DEPC 处理 水至终 体积为 1L, 然后 过滤。 MOPS 溶 液可以 在室温 下贮存 ,用铝 箔包裹 ,时 间长后 该溶液 可能会 变黄, 但不影 响 使用。 2) Northern 预杂交 缓冲液 配 500mL, 按以 下体积 混合各 成分: 12.5mL lmol/L K3PO4, pH7.4 125mL 20 X SSC 25mL 100 X Denhard’s 溶液 5mL 5mg/mL 緋鱼精 DNA 250mL 100% 甲酰胺 82.5mL 水 3 ) Northern 杂交 缓冲液 在预杂 交液中 加入硫 酸右旋 糖酐至 终浓度 10%。 按 预杂交 液配法 ,依 次加入 K3P04、 SSC、 Denhard’s 液、 鲱鱼精 DNA 和 甲酰胺 ,然 后再加 50g 硫酸右 旋糖酐 ,混 . 249 • 匀过夜 ,最 后用水 定容至 500mL。 长期 贮存时 ,杂交 液和预 杂交液 瓶底都 可能出 现沉淀 ,使 用前 应振摇 混匀。 3. 操 作步骤 制备琼 脂糖甲 醛凝胶 : (1) 制备 1.2% 的凝胶 :称取 4. 2g 琼脂糖 ,加 304. 5mL 水并煮 沸溶解 ,然 后将烧 瓶放入 601C 水 浴中。 上述 体积用 于制备 20cmX20cm 大小 的凝胶 ,实 验者可 根据所 1 用凝胶 大小对 ■用 量进行 调节。 (2) 在 烧瓶温 度降至 60X: 后 ,加 35mLl〇XMOPS 电泳缓 冲液和 10.5mL37% 甲 醛 ,混合 均匀后 再置于 60t: 水浴中 ,同时 准备制 胶盒。 甲醛的 PH 应在 4.0 以上 ,另外 注意甲 醛有毒 ,倒胶 和电泳 应在通 风橱中 进行。 (3) 将梳子 插入制 胶盒, 梳子底 部距离 制胶盒 表面约 lmm, 倒胶 后放置 3〇~45min 至 胶凝固 ,然后 小心拔 除梳子 并倒入 lx M〇ps 电泳 缓冲液 ,倒入 量以能 淹没凝 胶表面 为准。 梳 孔应有 l〇mm 宽, 1mm 深 ,这 样每孔 能加入 60/jL 样品。 RNA 电泳 和转膜 : (4) 对 每一待 分析的 RNA 样品 ,先准 备以下 混合物 (总量 38.75^L): 5/iL 10 x MOPS 电泳 缓冲液 8.75/^L 37% 甲醛 25^L 甲酰胺 (5) 在 混合物 中加入 RNA 样品 (最 大体积 11.25^L), 如不足 5(VL 则再加 水使终 体积为 50ML, 每份 样品至 少应准 备两份 以用作 染色。 样品 RNA 用 量可为 0.5~10Mg, 如 果待检 mRNA 在细 胞信使 RNA 中 所占比 例较高 ,则可 以使用 总 RNA 进 行检测 ,而如 果待检 mRNA 丰度较 低的话 ,则建 议使用 p〇ly(A) + RNA。 (6) 振荡混 匀样品 ,微 量离心 5 〜 10s, 55X: 温育 15min。 (7) 每一 样品加 10ML 加样 缓冲液 ,混 合均匀 ,短暂 离心将 液体甩 至管底 ,然 后加 样。 如 果可能 ,在 转至硝 酸纤维 素瞋的 祥品和 准备用 溴化乙 锭染色 进行观 察的对 照样品 之间留 一个空 白 泳道。 (8) 恒压 (约 5V/cm) 电泳 3h 左右 ,到溴 酚蓝迁 移至凝 胶长度 一半处 为止。 方案中 使用的 甲醛浓 度较低 ,因此 电泳速 度相对 较快; 如 果要电 泳过夜 ,则 凝胶中 的甲醛 用量应 增加 5~10 倍。 (9) 将 准备转 至硝酸 纤维素 膜上的 凝胶部 分小心 地切下 ,放入 一大托 盘中, 用水漂 洗数 次除掉 甲醛。 拟转 至纤维 素膜上 的凝胶 不应进 行染色 ,相反 ,作为 对照的 RNA 样 品以及 分子量 标准则 应染色 进 行观察 ( 见下面 的步骤 (20))。 (10) 倒掉 托盘中 的水, 再加入 500mL 10 XSSC, 然后 将托盘 放到一 旋转平 台上轻 轻摇动 45min。 (11) 把凝胶 放到一 张塑料 薄膜上 ,精 确测量 凝胶的 长度和 宽度, 再把凝 胶放回 10XSSC 的托 盘中。 • 250 • (12) 裁 剪一张 硝酸纤 维素膜 ,长 、宽较 凝胶小 3mm 左右 ,将 其在一 盛有水 的托盘 中 浸湿约 lmin, 再放 至盛有 20XSSC 的托盘 中浸泡 5~10min ( 尼龙膜 只需在 水中浸 湿 )。 操作 硝酸纤 维素膜 时应戴 手套, 手上的 油溃会 污染纤 维素膜 ,引 起转膜 后出现 假象。 (13) 裁剪 层析纸 ,每 张大小 比纤维 素膜小 7mm 左右 ,形成 lcm 或 2cm 厚的 纸堆。 (14) 准备毛 细转移 装置, 剪一张 层析纸 ,约比 凝胶宽 2cm, 长 30 〜 40cm。 在大托 盘中 放入数 百毫升 20 XSSC, 在 20 XSSC 中充分 湿润层 析纸; 将 一玻璃 板横置 于托盘 上 ,层 析纸放 到玻璃 板上面 其长端 浸入托 盘中的 20 XSSC 中形 成纸桥 ,用一 10mL 长的 玻璃吸 管小心 地在层 析纸上 来回滚 动赶走 气泡。 (15) 将 凝胶从 10XSSC 中取出 ,滴 干液体 ,置 于层析 纸上, 用上述 同样方 法赶走 凝 胶与层 析纸间 气泡; 再从 20 XSSC 的 托盘中 取出浸 泡的纤 维素膜 ,放到 凝胶上 ,确 定膜 四边均 没有超 过凝胶 ,同 样赶走 气泡。 (16) 在前面 裁好的 层析纸 堆中取 出一张 ,在 20 XSSC 中湿润 ,然后 放到一 张干的 层析纸 上除掉 多余的 SSC, 再将 其放到 纤维素 膜上, 同样赶 走气泡 并确定 纸的四 边没有 超 过纤维 素膜。 (17) 将裁好 的层析 纸堆放 到在第 一张层 析纸上 ,然 后再放 2~3cm 厚 的纸塔 。在纸 塔上面 放一块 玻板, 玻板上 再放一 个小瓶 ,以 压紧形 成的金 字塔。 整个毛 细转移 装置可 以参见 Southern 印迹 ,为避 免转移 不完全 的发生 ,有两 点应注 意:① 凝胶和 纤维 素膜之 间一定 不要有 气泡; ②金字 塔上面 部分的 大小一 定不能 超过其 下面的 部分。 (18) 用塑 料薄膜 覆盖住 托盘四 周以减 少转膜 时的水 分蒸发 ,转膜 6 〜 24h。 多数 情况下 转膜过 夜就足 够了, 薄的凝 胶转移 速度快 于较厚 的凝胶 ,同样 , 较小的 RNA 带其转 移 速度也 要快于 较大的 RNA 带。 (19) 转移 完成后 ,移走 转移装 置上面 的纸塔 ,而 让硝 酸纤维 素膜仍 留在凝 胶上, 在 对应凝 胶右上 角的位 置处作 一标记 ,然 后用钝 头镊子 取下纤 维素膜 ,置 于两张 层析纸 中间 ,在 80X: 干烤 2h。 (20) 对照样 品用溴 化乙锭 染色进 行观察 ,先将 留下的 凝胶用 水漂洗 数次, 然后放 入水 中浸泡 过夜。 第二日 ,倒 掉水再 加入溴 化乙锭 染色液 (每 500mL 水中加 25/iL 浓度 为 lOmg/mL 的溴 化乙锭 ), 染色 45min 后照相 ,照 相时在 凝胶边 缘放一 把尺子 。有时 染 色后需 要在水 中浸泡 lh 以除 掉多余 的溴化 乙锭。 照片上 应能见 到两条 细带: 分别为 28S 和 18S 核糖体 RNA 带。 如果在 泳道上 见到的 核糖体 RNA 带 并不细 ,则可 以推测 待分析 RNA 样 品可能 在制备 过程中 已大部 分降解 。但 是如果 RNA 是用 异硫氰 酸 胍法从 组织中 提取的 ,那 么见到 核糖体 RNA 污迹属 于正常 现象。 预杂交 、杂交 和洗膜 : (21) 将烤 过的膜 装入杂 交袋中 ,根据 膜的大 小加入 6 〜 10mL Northern 预杂 交液, 湿润 瞋然后 封口。 (22) 在合 适的温 度预杂 交过夜 ( 此步及 以下的 步骤中 均不需 要摇动 杂交袋 )。 使 用本方 案推荐 的杂交 和预杂 交液时 ,杂交 和预杂 交温度 一般在 37~42t 之间。 (23) 切口 平移制 备探针 ,每 lmL 杂交 液中应 有每分 钟计数 5000 探针 。将 探针煮 沸 5min, 然 后加到 Northern 杂 交液中 ,混合 均匀。 (24) 将杂交 袋一角 剪开, 移出预 杂交液 ,最好 是把杂 交袋平 放在一 平面上 ,然后 • 251 . 用一毛 细管从 袋上滚 动压出 液体。 (25) 加入 切口平 移探针 / 杂交液 ,将 液体 铺展覆 盖住膜 ,再 封口。 (26) 在 和预杂 交相同 的温度 下杂交 过夜。 (27) 第二日 ,剪开 杂交袋 并取出 杂交膜 ,按 以下步 骤洗膜 : 1XSSC 加 0.1%SDS, 室温 下洗涤 两次, 15min/ 次 0.25XSSC 加 0.1%SDS, 室温 下洗涤 两次, 15min/ 次 在高盐 洗膜后 ,用 Geiger ■计 数器检 査滤膜 ,如果 背景中 已能看 到大部 分滤膜 ,则 不需要 继续洗 瞋。 少数情 况下需 用更为 严格的 条件进 行洗膜 ,如用 <〇.25xSSC 的 液体和 更高的 温度。 (28) 用 X 光片进 行放射 自显影 ,根 据检测 样品中 mRNA 的丰 度和切 口平移 探针的 比活度 ,曝光 时间不 同,— 般曝光 一天后 就能看 到条带 ,但 有时需 7~10d。 (二) 用 乙二醛 和二甲 基亚砜 变性处 理进行 RNA 的 Northern 杂交 乙二醛 和二甲 基亚砜 (DMSO) 可以使 RNA 有 效变性 ,而且 一些学 者认为 与甲醛 凝胶电 泳相比 ,乙 二醛 /DMSO 凝 胶电泳 得到的 结果更 好一些 。但是 乙二醛 /DMSO 凝 胶电泳 比甲醛 凝胶电 泳所需 的时间 要长, 且需要 对电泳 缓冲液 进行再 循环。 1. 附 加材料 10mmol/LNaH2PO4, pH7.0 ( 电泳缓 冲液) 0 . 1 mol/ L NaH2 P04 , pH7 . 0 DMSO 6mol/L 去离子 乙二醛 (乙二 醛过小 型混合 床离子 交换树 脂柱如 Bio-Rad AG 501- X8, 分装 成小份 ,密 封好后 贮存于 -20X:, 每一 小份与 空气接 触后就 不能再 使用) 乙二 醛加样 缓冲液 (50% 甘油, 10mmol/LNaH2P04pH7.0, 0.4% 溴酚蓝 ) 2. 操 作步骤 (1) 制备1.2%的胶:称取4.28琼脂糖,加35〇1^1〇111111〇1/1^他味?04(?1~17.0) 电泳 缓冲液 ,煮 沸溶解 。冷却 5min 后倒胶 ,梳子 距胶盒 底部约 1mm, 倒胶 后放置 30~ 45min 让 胶凝固 ,然 后小心 拔出梳 子并在 电泳槽 中加入 电泳缓 冲液。 (2) 对每 一待分 析样品 均先配 以下混 合物, 总体积 33. 6^L: 22.5/^L DMSO 4.5/^L O.lmol/L NaH2P04, pH7.0 6.6^L 乙二醛 (3) 将 RNA 样 品加入 上面配 好的混 合物中 ,样 品最大 体积为 11. 4pL, 如终 体积不 足 45pL, 则加 水补足 。每 一待分 析样品 均应制 作双份 ,留 一份进 行染色 观察。 (4) 50TC 温育 lh。 (5) 反应混 合物置 于冰上 降温, 并加入 12/xL 乙二醛 加样缓 冲液。 (6) 加样然 后电泳 ,电压 4V/cm。 电泳约 30min 左右让 RNA 进入凝 胶后开 始电泳 • 252 • 缓 冲液的 再循环 ,然后 一直电 泳到溴 酚蓝带 迁移至 凝胶长 度的一 半位置 为止。 电泳 缓冲液 进行持 续再循 环的目 的在于 保证缓 冲液的 pH 在 7.0, 如 pH 升高到 8.0 或更高 ,则乙 二 醛将与 RNA 分离。 (7) 电泳结 束后应 立即进 行转膜 ,不 需要对 凝胶进 行特别 处理, 按方案 (一) 步骤 (12) ~ (18) 进行 转膜。 (8) 转膜 过夜后 ,在 80X: 干烤 硝酸纤 维素膜 2h。 (9) 按方案 (一) 进行 预杂交 、杂交 和洗膜 、曝 光。 (10) 按方案 (一) 对留出 的另一 份对照 样品用 溴化乙 锭染色 ,然 后照相 观察。 (三) 用 狭线印 迹对被 固定的 RNA 进行 Northern 杂交 RNA 狭线杂 交方法 不经过 凝胶电 泳分析 ,采用 带狭槽 的装置 直接将 RNA 样 品点在 尼龙 膜或硝 酸纤维 素膜上 ,然后 与标记 探针进 行杂交 ,可对 RNA 进行简 单的定 性或半 定量 分析。 1. 附 加材料 0.1mol/L NaOH 狭槽和 加样器 2. 操 作步骤 (1) 用 O.lmol/LNaOH 清洗 加样器 ,再用 DEPC 水充分 冲洗。 (2) 切 一张适 当大小 的尼龙 膜或硝 酸纤维 素滤膜 ,用 10 XSSC (尼 龙膜) 或 20 x SSC (硝酸 纤维素 滤膜) 浸润 10min〇 (3) 将膜 铺在加 样器上 ,按 所用加 样器使 用指南 装好加 样装置 ,并用 10 XSSC 清洗 各加 样孔。 (4a) 将 11/iLRNA 样品与 以下溶 液混合 : 5mL 10 x MOPS 电泳 缓冲液 8.75/mL 37% 甲醛 25j!xL 甲酰胺 样品于 65X: 保温 15min, 然 后置于 冰上。 (4b) 也可将 11/iL RNA 样品与 以下成 分混合 : 22.5/^L DMSO 4.5^L 0.1mol/L NaH2P04, pH7.0 6.6^L 乙二醛 样品于 50t: 保温 lh, 然后 也置于 冰上。 (5) 每一 RNA 样品加 2 倍 体积的 20 x SSC。 (6) 打开 加样器 ,先让 1〇 XSSC 滤过 ,再 开启抽 吸开关 ,加入 RNA 样品, 缓慢抽 吸使样 品滤过 ,每孔 再加入 lmL 10 XSSC, 继续抽 吸使之 滤过。 (7) 取 出滤膜 ,夹 在两张 Whatman 3MM 滤纸 中间, 室温干 燥后于 80X: 干烤 2h 固 . 253 . 定 RNA〇 (8) 按方案 (一) 进 行杂交 分析。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 原始 的和变 性后的 RNA 都能够 与硝酸 纤维素 膜结合 ,但 变性 RNA 的转膜 效率更 高, 因此必 须进行 RNA 的变性 。通 常使用 的变性 剂有甲 酰胺、 乙二醛 /DMSO 和氢氧 化 甲基汞 。根 据变性 RNA 相 对分子 质量的 log 对数 与其在 琼脂糖 凝胶上 的迁移 距离二 者间 的关系 可以推 断待检 RNA 的相对 分子质 量大小 。实 验中 ,采 用已知 相对分 子质量 的 RNA 作 为标准 参照物 ,以 RNA 片段 大小的 log 对数对 其迁移 距离作 图得到 标准曲 线 ,再根 据待检 RNA 电泳 的迁移 距离就 可知道 其相对 分子质 量大小 。最 常使用 的相对 分子质量标准参照物是核糖体1^^八的亚基:2881'1^^八(含4712 6口)和18灯1^1八(含 1869bp), 也 可以采 用末端 标记的 DNA 片 段作为 标准。 有 一 点十 分重要 ,在 Northern 杂交和 Southern 杂交中 ,目的 序列结 合到滤 膜上的 相对含 量是有 差别的 。在总 基因组 DNA 中 ,一条 3000bp 大小的 单拷贝 哺乳动 物细胞 基 因约有 lmg/kg, 也 就是说 ,在 lOpg 的总 基因组 DNA 中 ,一般 的单拷 贝基因 含量约 是 10pg。 与此 相比, 从单拷 贝哺乳 动物基 因转录 得到的 mRNA — 般占细 胞总信 息量的 5X10_2%, 或者是 总细胞 RNA 的 2X10-3%, 这样在 l〇Mg 细胞总 RNA 中, 一般的 mRNA 的含 量约是 200pg。 因此, 与通过 Southern 杂交 检测与 mRNA 相 对应的 单拷贝 基 因相比 ,用 Northern 杂 交的方 法更容 易检测 出目的 mRNA。 这里介 绍的两 种方案 , 变 性剂分 别使用 甲醛和 乙二醛 /DMSO, 效 率相同 ( 氢氧化 甲基汞 也是一 种很好 的变性 剂 ,但 这种化 合物毒 性很大 )。 使用低 浓度甲 醛琼脂 糖凝胶 电泳与 乙二醛 凝胶电 泳相比 有两 个优势 ,一是 电泳时 间较短 ,一是 缓冲液 不需要 再循环 。两种 方案都 应使用 硝酸纤 维 素滤膜 ,不推 荐使用 重氮苄 氧甲基 (DBM) 纸或 尼龙膜 (尽 管尼龙 膜在作 Southern 杂 交时优 势明显 )。 早在 20 世纪 70 年代末 ,有 学者 比较了 RNA 变性和 电泳分 离并借 此判断 RNA 相 对分 子质量 大小的 几种不 同方法 ,证实 甲醛是 RNA 的一 种有效 变性剂 ,而 琼脂糖 / 甲 醛凝胶 电泳可 以在较 大的相 对分子 质量许 可范围 内很好 地分离 RNA。 现 在进行 琼脂糖 / 甲醛 凝胶电 泳的条 件与当 时相比 已宽松 了很多 ,按 Brian Seed 的 建议采 用低浓 度甲醛 / 琼脂 糖凝胶 ,电 泳速度 (约 3h) 快而效 果更好 。此 后, Thomas 又证实 ,联 合使 用乙二 醛和 DMSO 也 可以使 RNA 有 效变性 ,并同 时证实 RNA 可 以高效 转膜至 硝酸纤 维素滤 膜上 ,从 而为今 天广泛 使用的 Northern 杂 交方法 奠定了 基础。 2. 常见问 题及解 决方法 Northern 杂交结 果不好 的最为 常见也 是可能 性最大 的原因 就是待 分析的 RNA 量极 低。 在进行 Northern 杂交前 ,应 先对待 分析的 RNA 作 普通琼 脂糖凝 胶电泳 ,形 成的核 糖体 RNA 带应为 一细带 ,否 则考虑 RNA 的质 量不佳 。如 果已知 RNA 的质 量很好 ,而 进行 Northern 转 膜时染 色的凝 胶上没 有显示 核糖体 RNA 细带 ,那 么最可 能的解 释是: • 254 • 配制 凝胶的 液体没 有混合 均匀或 者使用 的甲醛 pH 太低。 如果染 色凝胶 上有核 糖体细 带 ,而 放射自 显影结 果背景 很高, 可能的 原因有 :①转 膜的毛 细转移 装置中 有气泡 ,尤 其 是在凝 胶和纤 维素膜 之间; ②使 用的 探针不 理想; ③洗膜 不完全 ,应在 更严格 的条件 下 进行更 充分的 洗膜; ④没 有烤膜 ,如 不进行 烤膜则 洗膜时 RNA 也会 随之被 洗掉。 3. 预期结 果和时 间估计 这 里介绍 的两种 Northern 杂 交方法 都应得 到较好 的结果 ,通 过分析 经溴化 乙锭染 色的 凝胶上 显示的 rRNA 条带可 以进行 判断, 正常情 况下应 该表现 为纤细 的条带 。一般 占总 RNAHT4 的 RNA, 杂交 后的滤 膜曝光 l~2d 就能 显影。 制备 琼脂糖 / 甲 醛凝胶 其样品 约需要 lh, 随后进 行电泳 。电 泳约需 3h, 处 理凝胶 和 开始准 备转膜 又需要 1 〜 2h, 然后进 行转膜 ,一般 是转膜 过夜。 所有这 些步骤 均应依 次进行 ,中间 不能有 停顿, 但烤膜 一步后 ,可 以在室 温下存 放干烤 过的滤 膜数天 甚至数 周 直到进 行杂交 ,只是 注意在 预杂交 前应对 滤膜再 次进行 干烤。 五、 新转录 RNA 的鉴别 细胞核 失控转 录技术 是检测 特异性 基因转 录并了 解细胞 功能情 况的最 敏感的 一种方 法。 整个方 案分为 4 步: ①收集 细胞, 分离细 胞核并 用液氮 冷冻; ②融化 细胞核 ,再 与 32P 标记的 UTP 和 其他未 标记的 NTP — 起温育 ,以标 记新转 录出的 RNA 产物; ③ 32P 标记 RNA 的 纯化; ④用 32P 标记 RNA 与点 在硝酸 纤维素 滤膜上 相应的 cDNA 进行 杂交, 检出特 异性的 RNA 转录 产物。 方案 (一) 介 绍的分 离细胞 核的方 法对大 多数的 组织培 养细胞 都能获 得很好 的分离 效果 ,但不 一定适 用于所 有的细 胞系和 组织。 如果采 用方案 (一) 不能很 好地分 离细胞 核, 则应考 虑采用 Dmmce 匀浆 法或蔗 糖梯度 离心的 方法来 分离需 要的细 胞核。 (一) 分离哺 乳动物 细胞核 检测转 录功能 本方案 在从组 织培养 细胞中 分离细 胞核的 同时, 也可分 离出细 胞质的 RNA, 后者 可用 于进行 Northern 杂交。 1. 材料 冰冷和 新鲜的 PBS 缓冲液 Nonidet P-40 ( NP-40 ) 裂解 缓冲液 ( 缓冲液 A: 10mmol/L Tris-HCl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 3mmol/L MgCl2, 0.5% NP-40; 缓冲液 B: 10mmol/L Tris-HCl pH7.4, 3mmol/LCaCl2, 2mmol/LMgCl2, l%NP-40。 将前 3 种 成分高 压并冷 却后再 加入 NP-40) 甘 油贮存 缓冲液 (50mmol/L Tris-HC pH8.3, 40% 甘油, 5mmol/L MgCl2, 0 • lmmol/L EDTA) 氧钥* 核昔 夏合物 (PromegaBiotec) . 255 . 2XPK 缓冲液 (0.2mol/LTris-HClpH7.5, 0.44mol/LNaCl, 2%SDS, 25mol/L EDTA) 20mg/mL 蛋白酶 K 缓冲酚 24:1 氣仿 / 异戊醇 无 水乙醇 橡皮细 胞刮子 Beckman 2 或与 之相当 的转子 除 dNTP、 DTT、 DNasel 和 蛋白酶 K 以外 的所 有溶液 都应进 行高压 灭菌。 2. 操 作步骤 (1) 从 1~5 个 175cm2 的 培养瓶 [约有 (5xl〇6) ~ (50X 106) 细胞] 中吸 出培养 液 ,将细 胞置于 冰上。 (2) 用冰冷 PBS 洗涤细 胞两次 ,每 次用 5mL。 吸出 PBS, 再加入 5mL 新鲜 PBS, 用 细胞刮 子从培 养瓶的 塑料底 面上轻 柔地刮 下细胞 ,收集 刮下的 细胞, 500 xg (用 JS* 4.2 转子 , 1500r/min) 4C 离心 5min, 完 全去掉 上清。 (3) 用 中等大 小速度 振荡细 胞沉淀 5s 使其变 松散 ,然 后加入 4mLNP-40 裂 解缓冲 液 ,加 缓冲液 时仍继 续振荡 ,加完 后再以 中等速 度振荡 l〇s。 这一 步要充 分均匀 地重悬 细胞, 防止细 胞成团 ,下 面也要 使用同 样的方 法重悬 细胞核 。如 果使用 的不 是单层 而是悬 浮培养 细胞, 则先离 心收集 (5 xi〇7 数量即 足够) 细狍 ,用 5mLPBS 重悬 细胞, 加 45mLPBS, 再次 离心收 集细胞 ,照 此再洗 2 次 ,然 后按同 样方法 裂解。 (4) 细 胞裂解 液冰浴 5min, 4t:50〇xg (JS~4.2 转子 1500r/min) 离心 5min, 沉淀 为 细胞核 ,而上 清中含 有胞质 RNA。 如需回 收胞质 RNA 则 接步骤 (6)。 (5) 分离 细胞核 ,用 4mLNP-40 裂解 缓冲液 按步骤 (3) 重 悬上步 得到的 胞核沉 淀, 4t:50〇xg 离心 5min, 吸 弃上清 ,再用 100 〜 200^L 甘油贮 存缓冲 液轻轻 振荡重 悬沉淀 ,液 氮冻存 重悬后 的胞核 沉淀。 细胞核 沉淀可 以在液 氮中稳 定保存 1 年 以上。 (6) 分 离胞质 RNA, 步骤 (4) 得到 的上清 液中加 lOO^LOJmol/L 氧钒核 苷复合 物, 10 000 X g (Beckman JA-20 转子或 Sorvall SS*34 转子 9000r/min) 离心 10min〇 回收上 清液并 加入以 下液体 : 4mL2xPK 缓 冲液和 80/iL20mg/mL 蛋白酶 K。 (7) 胞质 RNA 在 37X: 温育 30min。 (8) 在 RNA 溶液 中加入 4mL 酚和 4mL 氯仿 / 异戊 醇终止 蛋白酶 K 消化 反应 。回收 上 层水相 并加入 2.5 倍体 积的乙 醇沉淀 RNA。 提取 得到的 RNA 为 Poly (A) RNA, 可用 于进行 Northern 杂交。 (二) Doimce 匀 浆分离 细胞核 对某 些类型 的细胞 ,在用 NP-40 裂 解缓冲 液进行 裂解后 不能得 到纯净 的细胞 核时, 可采用 Dounce 匀浆 的方法 来分离 细胞核 。如 果细胞 裂解过 程不能 完全将 细胞核 与胞膜 • 256 • 和胞质 成分分 离开来 ,其 结果 将导致 新生转 录产物 时也会 出现类 似问题 。因此 ,拟 进行 核转 录失控 分析前 ,应先 对所用 的细胞 进行裂 解实验 ,用 方案 (一) 分离 细胞核 并通过 相差 显微镜 观察。 镜下细 胞应均 匀裂解 ,胞核 中没有 混杂胞 质成分 ,否则 应采用 Dounce 匀 浆方法 ,通常 能克服 分离不 完全的 问题。 1. 附 加材料 裂解 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH7.4, 3mmol/LCaCl2, 2mmol/LMgCl2) NP-40 裂解 缓冲液 B ( 缓冲液 B: 10mmol/L Tris-HCl pH7.4, 3mmol/L CaCl2, 2mmol/LMgCl2, l%NP-40。 将前 3 种成分 高压并 冷却后 再加入 NP-40) Dounce 勻架器 除 dNTP、 DTT、 DNasel 和 蛋白酶 K 以外 的所 有溶液 都应进 行高压 灭菌。 2. 操 作步骤 (1) 收集细 胞:每 次胞核 失控转 录分析 约需要 5 Xl〇7 细胞, 整个过 程应保 持在冰 上 进行。 对黏 附细胞 ,去掉 培养基 ,用 5 〜 10mL 冰冷 PBS 洗涤细 胞两次 ,然 后用细 胞刮子 刮下 细胞至 一离心 管中, 4t: 500Xg (JS~4.2 转子 1500r/min) 离心 5min 收集 细胞; 对悬 浮细胞 ,首先 吹打重 悬细胞 , 500 Xg 离心 5min, 弃去 上清, 用冰冷 PBS 洗涤 细 胞两次 ,直接 从脏器 分离得 到的淋 巴细胞 用冰冷 PBS 洗 涤两次 后不需 要去除 红细胞 就可用 于制备 胞核。 (2) 弃 去上清 ,中 等速度 振荡细 胞沉淀 5s 使 其松散 ,用 40 倍 体积冰 冷裂解 缓冲液 重 悬细胞 沉淀。 先用 5 〜 10mL 冰冷裂 解缓冲 液重悬 细胞, 使细胞 沉淀形 成单细 胞悬液 ,然 后再加 入剩余 的裂解 液 ,来回 旋转试 管分散 细胞。 (3) 】5~4.2转子50〇\尽离心沉淀细胞,弃去上清,每5\1〇7细胞用111^裂解缓 冲液 轻轻振 荡重悬 沉淀. 离心后 ,沉 淀体 积应是 其初始 体积的 2~3 倍。 (4) 每 5X107 细胞加 lmLNP-40 裂解 缓冲液 ,轻轻 旋转试 管混合 均匀。 (5) 将 细胞转 至预冷 Dounce 匀 浆器内 ,用 “B” pestle 撞 击细胞 10 次 或撞击 直到在 相差 显微镜 下观察 胞核中 无胞膜 成分。 (6) 将 匀浆后 的细胞 转至一 50mL 塑料尖 底离心 管中, 4X: 500 离心 沉淀细 胞核。 沉淀应 呈不透 明白色 ,体 积应为 其初始 体积的 1/3—1/2。 (7) 小心弃 去上清 ,最 好是 用与真 空泵连 接的巴 斯德吸 管操作 。向一 边倾斜 试管, 使上清 从沉淀 上流下 ,尽量 吸掉管 壁上所 有液体 ,再 将试管 置于冰 桶中。 (8) 轻轻振 荡使沉 淀松散 ,每 5X107 细 胞核加 200pL 冰冷甘 油贮存 缓冲液 ,用吸 管上下 吹打重 悬沉淀 ,开始 吹打时 胞核成 团状, 经反复 吹打后 将分散 均匀。 吹 打动作 应有力 而连续 ,但 不要过 于激烈 使气泡 产生。 (9) 分装成 21〇fxL (约 5X107 细胞核 ) 小份 至预冷 EP 管中 ,并 立即将 EP 管放回 • 257 • 到干 冰上。 (10) -70X: 或在 液氮中 贮存细 胞核。 此 条件下 ,细胞 核可以 稳定存 放至少 1 年。 (三) 用细 胞核失 控转录 测定法 制备硝 酸纤维 素滤膜 1. 材料 不加核 苷酸的 2X 反应 缓冲液 ( 10mmol/L Tris-HCl pH8 . 0, 5mmol/L MgCl2, 0.3mol/L KC1) 加核 苷酸的 2x 反应 缓冲液 (lmL 不加核 苷酸的 2x 反应缓 冲液, lO^LlOOmmol/L ATP, lOpL 100mmol/L CTP, 10/xL 100mmol/L GTP, 5pL lmol/L DTT。 该溶 液应临 用前配制,核苷酸用0.5111〇1/1^〇丁八(?1^.0)溶解至浓度为100111111〇1/1,调节?只到 7~8 之间 ,分装 成小份 贮存于 -20t:) [a-32P] UTP (760Ci/mmol, lOmCi/mL) lmg/mL 无 RNase 的 DNasel [配制 O.lmol/L 碘乙酸 + O.15mol/L 乙酸钠 溶液, 过滤 除菌; 用此溶 液溶解 冻干的 DNasel (Worthington DPRF), 终浓度 lmg/mL, 调节 pH 为 5.3; 55X: 加 热溶液 40min, 冷却 后加入 lmol/L CaCl2 至终 浓度为 5mmol/L, 分 装成 0.3mL 的小份 冻存] DNasel 缓冲液 (20mmol/LHEPES pH7, 5, 5mmol/LMgCl2, lmmol/LCaCl2) HSB 缓冲液 (0.5mol/L NaCl, 50mmol/L MgCL, 2mmol/L CaCU, lOmmol/L Tris-HCl pH7.4) SDS/Tris 缓冲液 (5%SDS, 0.5mol/LTris-HClpH7.4, 0.125mol/LEDTA) 25:24:1 缓冲酚 / 氯仿 / 异戊醇 10% TCA / 60mmol/L 焦磷 酸钠和 5% TCA / 30mmol/L 焦 磷酸钠 lOmg/mL tRNA 0.5mol/L EDTA 洗脱 缓冲液 (1%SDS, 10mmol/LTris-HClpH7.5, 5mmol/LEDTA) 20mg/mL 蛋白酶 K lmol/L NaOH lmol/LHEPES (游 离酸) 3mol/L 乙酸钠 TES 溶液 (lOmmol/L TES 〔N- 二 轻甲基 -2- 氣基乙 横酸〕 pH7.4, lOmmol/L EDTA, 0.2% SDS) TES/NaCl 溶液 (lOmmol/L TES pH7.4, lOmmol/L EDTA, 0.2% SDS, 0.6 mol/L NaCl) 20 x 和 6 x SSC lOmg/mL RNase A 合适的 cDNA 质粒 合适 的限制 性内切 核酸酶 • 258 • Beckman JA-20 或 Sorvall SS-40 或与 之相当 的转子 0.45/im 的 HA 滤膜 (Millipore) 和 0.45/^m 硝 酸纤维 素滤膜 桂化的 30mL Corex 管 Whatman GF/F 玻 璃纤维 滤膜和 Whatman 3MM 滤纸 狭线印 迹装置 除 dNTP、 DTT、 DNasel 和 蛋白酶 K 以外 的所 有溶液 都应进 行高压 灭菌。 2. 操 作步骤 核转 录失控 分析: (1) 取 200;zL 冻存的 细胞核 ,在 室温下 融化后 转至一 15mL 聚丙烯 试管中 ,立 即加 入 20(^L2x 反应 缓冲液 (加有 核苷酸 ) 和 l〇^L[a-32p] UTP, 30X: 反应 30min, 其间 应持续 摇动。 反应应 在聚丙 烯试管 而不在 微量离 心管中 进行, 主要是 为了避 免放射 性物质 污染。 (2) 混合 40;iL lmg/mL 无 RNase 的 DNasel 和 lmL HSB 缓冲液 ,取 0.6mL 此种混 合液加 入上面 已标记 的细胞 核中, 30C 温育 5min。 温育前 用巴斯 德吸管 上下吹 打憙液 10~15 次。 (3) 反 应液中 再加入 200^L SDS/Tris 缓 冲液和 10/iL 20mg/mL 蛋白酶 K, 42X: 继 续温育 30min。 上 面两步 的关键 在于使 DNA 和蛋白 质充分 消化, 充分消 化后应 得到非 常均一 的溶液 ,如 果溶液 中仍可 见到许 多微粒 ,通 常说明 DNasel 或 蛋白酶 K 作用 不完全 ,应 重复进 行消化 。这种 情况下 ,首 先需 要用乙 醇沉淀 RNA, 再用 新鲜的 DNasel 和 蛋白酶 K 重复 消化。 (4) 用 lmL 酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提样品 , 80〇xg (JS-4.2 转子 2000r/min) 离心 ,回 收上层 水相。 (5) 在 上层水 相中依 次加入 : 2mL 水、 3mL 10% TCA / 60mmol/L 焦磷 酸钠和 10/iL10mg/mL£. cro/i tRNA 载体 。冰浴 30min。 (6) 用 Millipore 型 HA 滤膜 (0.45/im) 过滤 ,使 TCA 沉淀到 滤膜上 ,用 10mL5% TCA / 30mmol/L 焦磷 酸钠洗 涤滤膜 3 次。 如果 HA 滤膜 堵塞, 过滤非 常缓慢 ,也可 以换用 Whatman GF/A 玻 璃纤维 滤膜。 (7) 将滤 膜转至 一玻璃 闪烁计 数瓶中 ,力卩 1.5mLDNaseI 缓 冲液和 37.5;iL lmg/mL 无 RNase 的 DNasel, 37*C 温育 30min, 然后加 45/zL 0 . 5mol/L EDTA 和 68/^L 20 % SDS 终止 反应。 (8) 样品在 65X: 加热 lOmin 以洗脱 RNA, 转移 上清, 再在滤 膜中加 1.5mL 洗脱缓 冲液, 同样在 65t: 加热 lOmin, 转 移上清 并与前 次上清 合并。 此步 骤可以 从滤膜 中洗脱 95% 以上的 放射性 活性。 (9) 在 3mL 含 32P 标记 RNA 的上清 液中加 4.5pL20mg/mL 蛋白酶 K, 37X: 温育 30min (不需 要摇动 )。 _ (10) 用 3mL (等 体积) 缓冲酚 / 氯仿 / 异戊 醇抽提 3mLRNA 溶液 一次。 (11) 将上层 水相转 移至一 30mL 经 硅化的 Corex 试管中 ,加 0.75mL lmol/L NaOH, 冰浴 lOmin, 然后加 1.5mL lmol/L HEPES (游 离酸) 终止 反应。 (12) 加 0.53mL3mol/L 乙 酸钠和 14.5mL 无水乙 醇沉淀 RNA, 干冰 上放置 30min • 259 • 或 -20X: 放置 过夜。 (13) 4"C 10 000X# (JA-20 转子 9000r/min) 离心 30min, 弃去乙 醇并用 lmLTES 重悬 沉淀, 重悬沉 淀时应 在室温 下摇动 30min 以使 RNA 充分 溶解。 (14) 每份 样品取 相同的 2 个 5pL 小份 ,将 其点在 Whatman GF/F 玻 璃纤维 滤膜进 行计数 ,如 果需要 ,也 可以加 TES 溶液稀 释样品 来检测 2p 标记 RNA//mL 的每 分钟计 数值。 一 般每毫 升的每 分钟计 数值在 5 x 106 以上。 (15) 混合 lmL RNA 溶液和 lmL TES/NaCl 溶液。 (16) 将混 合好的 RNA 溶液与 固定在 硝酸纤 维素滤 膜上的 DNA 进 行杂交 (DNA 结 合到硝 酸纤维 素滤膜 上的方 法在下 面介绍 ), 杂交在 5mL 的 塑料小 闪烁计 数瓶中 进行, 于 65X: 摇 动温育 36h。 使用瓶 子比使 用塑料 袋的优 点在于 ,它可 以保证 实验中 每分钟 都有同 等数量 的标记 物与样 品进行 重 复大童 的杂交 ,滤膜 条应卷 曲后再 放入计 数瓶中 ,注 意滤 膜条应 完全浸 入杂交 液中。 ( 17) 杂 交后用 25mL 2 x SSC 于 65t: 洗膜 lh, 再 换新鲜 2 x SSC 重 复洗膜 一次。 (18) 在另一 玻璃闪 烁计数 瓶中加 SmL 2 X SSC 和 8ML 10mg/mL RNase A, 37X: 温 育 30min, 不需 摇动。 ( 19) 再用 25mL 2 x SSC 溶液于 371C 洗膜 lh, 将滤 膜放在 Whatman 3MM 滤 纸上干 燥后进 行曝光 质粒与 硝酸纤 维素滤 膜结合 : (1) 用合适 的限制 性内切 核酸酶 消化使 cDNA 质粒线 性化。 如果 限制酶 切消化 缓冲液 中没有 BSA 的话, 消化后 DNA 不需 用酚抽 提和乙 醇沉淀 处理。 如果使 用了 BSA, 则 变性前 应用酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提质粒 DNA 而后进 行乙醇 沉淀。 (2) 线性化 DNA (440/xL 体 积中含 200吨) 变性处 理:在 DNA 样 品中加 4%L lmol/L NaOH, 室 温放置 30mino (3) 加 4. 9mL 6 x SSC 中 和样品 DNA, 然后 放置在 冰上。 (4) 用狭 线印迹 装置将 DNA 点 至硝酸 纤维素 滤膜上 ,每一 狭线点 5吨 (125^L) DNA, 然 后再用 500fiL 6 x SSC 漂洗 一次。 在 由水吸 引装置 提供的 低真空 状态下 完成点 样和漂 洗过程 ,注 意从狭 线印迹 装置上 取下硝 酸纤维 素 滤膜时 应在含 DNA 的印 迹线处 用蓝色 钢笔作 一记号 ,否则 滤膜干 后就很 难判断 印迹线 的位置 。标 记 是最好 沿印迹 线周围 作记号 ,这样 在裁剪 滤膜条 时可以 更接近 印迹线 的边缘 。杂 交时 使用窄 滤膜条 可以 节省杂 交液。 (5) 让硝 酸纤维 素滤膜 条在空 气中干 燥过夜 ,然后 真空下 80X: 干烤 2h, 最 后存放 在真 空干燥 器中。 滤膜 应在进 行核转 录失控 实验前 制备好 ,其至 少可存 放时间 6 个月, 在用于 杂交反 应前应 将滤膜 裁成 小条, 每一条 含有一 感兴趣 的质粒 DNA。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 核转录 失控分 析方法 可用于 直接测 定和比 较细胞 在不同 生长时 期和不 同分化 状态下 • 260 • 某 一特定 基因的 转录合 成情况 。该 方法利 用了在 分离细 胞核中 新转录 合成的 RNA 可以 被 标记上 高比放 射活性 的特点 ,而这 在完整 细胞很 难完成 。这 里介 绍的方 案优点 在于可 以在单 次实验 中方便 地测定 多个不 同基因 的转录 水平。 在核失 控转录 系统中 ,一般 RNA 转录 不会被 启动, 但已经 启动的 RNA 转 录过程 则会忠 实的进 行下去 ,也就 是说该 方案 可以精 确地测 定细胞 在裂解 当时的 转录合 成情况 。核失 控转录 分析技 术通常 用于分 析 细胞在 某种状 态下某 一特定 基因在 mRNA 水平的 变化究 竟是由 于其合 成改变 所引起 还 是由于 mRNA 的降 解或是 mRNA 从胞核 转运至 胞质所 引起。 核 失控转 录分析 技术有 多种不 同方案 ,其 区别主 要在于 32P 标记 RNA 的分 离方法 不同 。这里 介绍的 方案优 点在于 背景转 录水平 极低, 其中部 分原因 是由于 TCA 沉淀一 步除去 了大部 分的未 整合的 32P, 同时 ,用 NaOH 限制 32P 标记 RNA 的降 解也使 杂交反 应更易 进行。 2. 关 键参数 在核失 控转录 分析方 案中最 关键的 步骤是 细胞核 的分离 。方案 (一) 对多数 组织培 养细 胞都能 获得很 好的分 离效果 ,但在 分离组 织或淋 巴细胞 的细胞 核时则 需对分 离方案 做一 些变动 ,即 采用介 绍的替 代方案 (Dounce 匀浆法 或蔗糖 梯度离 心方法 )。 如 分离细 胞核 32P 标记的 UTP 整合入 RNA 的量 很少, 说明细 胞核在 分离过 程中存 在损伤 或是分 离 得到的 细胞核 中仍混 合有胞 质和胞 膜成分 。如 我们已 经发现 淋巴细 胞核非 常脆弱 ,必 须采 用替代 方案分 离细胞 核以获 得较高 的放射 性同位 素整合 水平。 成功进 行核失 控转录 分析至 少需要 5 X 1〇6 个细 胞核, 随分离 细胞核 数目的 减少, 32P 标记 UTP 整合入 RNA 的水 平亦明 显下降 ,而需 要检测 的特定 基因的 转录水 平通常 也就很 难与放 射性背 景区别 开 。基于 RNA 合成 的总体 水平不 会随细 胞功能 状态的 改变而 变化的 假设, 实验中 ,在 每次 杂交之 前应对 每一样 品的放 射性计 数进行 平衡。 当在一 新的条 件下分 析基因 的转录 情况时 ,首 先应判 断这一 假设是 否合理 ,实验 中尤其 必须注 意确保 对每一 次待分 析的细 胞状态 采用的 细胞核 数目都 相同。 3. 预期结 果和时 间安排 采用 5 x 1〇6 个细 胞核和 i〇〇pCi 32P 标记 UTP, 则总 RNA 的放 射性整 合量在 (1 x 106) 〜 (10X106) 每 分钟计 数之间 ,而杂 交反应 中使用 lx 1〇6 每 分钟计 数就能 获得很 好的 结果。 细胞核 数目在 (5xi〇6)~(5〇xi〇6) 之间时 , 32p 标记 UTP 整合入 RNA 的 量 随细胞 核数目 的增加 而增加 。在每 一样品 中增加 32P 标记 UTP 的 量超过 100/iCi 以及 增加细 胞核与 32P 标记 UTP 的 温育时 间超过 30min 对增加 整合量 帮助均 不大。 在开始 进行核 失控转 录分析 实验前 ,首 先应 分离细 胞核并 贮存于 液氮中 ,随 后可立 即开始 10 〜 20 个样品 的转录 实验。 RNA 的标记 和分离 可以在 Id 内完成 ,然 后让 RNA 沉淀 过夜, 第一天 上午进 行滤膜 杂交。 江道文 王 红 • 261 • 主要参 考文献 冯作化 ,皇 甫永 穆主编 . 2000. 医学 分子生 物学. 第二版 .武汉 : 武汉出 版社. 金冬暧 .黎孟 枫等译 . 1998 •分子 克隆实 验指南 .第二 版北京 : 科学出 版社. 卢圣 栋主编 • 1999. 现代 分子生 物学实 验技术 .第二 版北京 : 中国协 和医科 大学出 版社. 彭秀 玲等编 . 1997. 基因工 程实验 技术第 二版长 沙:湖 南科学 出版社 . 齐义鹏 . 1998. 基因及 其操作 原理武 汉:武 汉大学 出版社 . 颜子颖 ,王 海林译 • 1998. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 : 科学出 版社. Ausubel, F. M. et al. 1995. Short Protocols in Molecular Biology 3rd ed. John Wiley* Sons, Inc. Ausubel, F. M. et al. 1996. Current Protocols in Molecular Biology 2nd ed. John Wiley & Sons Inc. Aviv; H. and Leder, P. 1972. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cell ulose. Pr IV, Sat/96 I AiM II TT^CGAA L 37 Bpul4 l9 Bsi c\9 Bsp 119 BstB I, Csp45 I, Lsp I, Nsp V, Sfu I Ava I C*PyCGPuG M 37 100 EcoSS I, Nsp III 45X: 活 性升高 Ava II G*G(A/T)CC M 37 65 Bmel8 1, Eco471, NspH U, Sin I 其 活性受 dcm 甲 基化 酶抑制 Ava III ATGCA*T H 37 EcoTll I, Nsi I Avi II TGC*GCA H 37 Aos I, Fsp I, Mst I, Fdi II Avr II C*CTAGG M 37 Bin I Ary I CC;TNAGG H(K) 37 Aoc I, Bse21 I, Bsu36 I, Cxm I, EcoSl I, Mst II, Sau I Bal I TGG;CCA L 37 65 Msc I 其 活性受 dcm 甲 基化 酶抑制 BamH I G*GATCC H 37 60 Bst I “星号 效应” Ban I G*GpyPuCC L 50 70 Eco 64 I Ban II GPuGCPy*C M 37 60 EcolA I Ban III AT*CGAT M 37 70 Bsc I,B5/)106 l9 BspD ly Bsul5 hCLa I Bbe I GGCGC*C L 37 Ehe I, Kas I, Nar I, Nun II Bbi II Cpu*CGPyC L 37 Acy I, Aha II, J3mH I, Hind I BbrP I CAC^GTG H 37 Ecoll l.PmaC l. Pm II gaagacn2* L 37 65 CTTCTGN^ Bbu I GCATG;C L 37 65 Pad I, Sph I • 265 . 续表 m 识 别序列 和切 割位点 • 盐 浓度 b 反应 温度 * 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d Bbv I GCAGCNg* L 37 65 CGTCGN12 , Beg I GCAN6TCGN12 f H 37 65 需 SAM CGTN6AGCN,〇 f Bel II • T*GATCA H(K) 50 100 Fba I 受 dam 甲 基化的 抑制 Ben I CC*(G/C)GG M 37 Net I Bfr I C*TTAAG M 37 Afi II Bgl I gccn4* nggc H 37 65 Bgl II A*GATCT H 37 100 Bln I C*CTAGG H 37 Avr II BmelS I G*G(A/T)(X M 37 60 Ava II, EcoAl I, NspH II, Sin I Bmy I G(A/G/T)GC(A/C/T)*C 菁 37 Bs/> 1286 l,Nsp U,Sdu I Bputi02 I GC*TNAGC 菁 37 Ce III, Esp I Bpul4 I TT*CGAA L 37 60 Asu II, BsiC I, Bspll9 I, BstB I Csp45 I, Lsp I, Nsp V, Sfu I Bsa I GGTCTCN* ccagagn/ M 55 Eco31 I 37亡具10%活性 BsaA I PyAC*GTPu H 37 BsaB I BsaH I gatn2 士 n2atc GPuCGPyC M * 60 37 Mam I Acy \,Aha II, II 受 dam 甲 基化酶 抑制 , 37X: 具 20 % 活性 60t: 活 性升高 Bsa] I c*cn2gg M 60 37 t 具 20% 的活 性 Bsc I AT*CGAT H 37 65 Ban III, Bs/>106 I, BspD I, BsulS I, Cla I Bse2l I CC*TNAGG L 37 60 Aoc \,Axy ltBsu6 lt Cvn I, Eco81 I, Msi II, Sau I Bsi Cl TT*CGAA L 65 Asu II, BstB I, Bpul4 I, Bps 119 I, Csp45 I, Lsp I, Nsp V, Sfu I • 266 • 续表 酶 识 别序列 和切割 位点' 盐 浓度 b 反应 温度 c 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d B«W I C*GTACG H 55 spl I 37 X: 具 50% 的活 性 BsiY I CCN5 * N2GG M 55 Bsl I Bsl I CCNj * N2GG H 55 BsiY I 37 t: 具 30% 的活 性 Bsm I GAATGCN* M 65 37 X: 具 20% 的活 性 GTTAC^G BsmA I GTCTCN1 H 50 Atw26 I 37 t: 具 10% 的活 性 cagagn/ 65 X: 具 30% 的活 性 Bsp 106 I AT*CGAT * 37 Ban III, Bsc I, Cla I, BspD I, Bsu Asu II, BstC I,B/>m14 I,Bs^B 37 X: 具 20% 的活 性 Bspll9 I TT*CGAA * 37 I, CspAS I, Lsp I, Nsp V, Sfu I BspUO I G*GGCCC L 37 Apa I Bs/)1286 I G(A/G/T)GC(A/C/T) ' L 30 Bmy I, Nsp II, Sdu I 受 dam 甲 基化酶 抑制 Bs/>50 I CG*CG * 37 65 Acc II, BstU I, Mvn I, Tha I, FnuD II Bsp6S I TCG*CGA 37 65 Nru I, Spo I Bsp A I *GATC 50 Dpn II, Kz09 I, Mbo I, Nae II, Sau3A I BspC I CGAT*CG * 37 Pvu I, Xor II BspD I AT*CGAT * 37 Ban \llt Bsc I,B5/)106 I, Bsm 15 h Cla I 受 dam 甲 基化酶 抑制 BspE I T*CCGGA H 37 Acc III.B5/.M U,Kpn2l,Mro I &/>H I T*CATGA H(K) 37 65 RspX I 受 dam 甲 基化酶 抑制 BspM I ACCTGCN4* H 37 TGGACGN8f Bs/)M II T*CCGGA H 60 Acc III, BspE I, Kpnl I, Mro I Bsr I ACTGGN* H(K) 65 37 X: 具 20% 活性 . 267 • 续表 m 识 别序列 和切 割位点 • 盐 浓度 b 反应 温度 [ 灭活 温度' 同裂酶 e 备注 d TGAC,C BssH II G*CGCGC L# 50 BssTl I C*C(A/T)(A/T)GG M 50 90 Ecol30 I, EcoT14 I, “ 星号效 应”; 37t Bst I G*GATCC H(K) 55 Bamh I 具 10% 的活 性 BstB I TT*CGAA M 65 Asu II.BsiC \,Bpul\9 I, 37t: 具 10% 的活 BspU I 性 Csp^S I, Lsp I, Nsp V, Sfu I BstE II G*GTNACC H 60 100 BstP l,Eco9l l,Eco065 I “ 星号效 应”; 37X: 具 10% 活性 “ 连接困 难”; 37t BstN I CC*(A/T)GG H 60 Apy I, EcoR II, Mva I 具 30% 的活 性 BstP I G*GTNACC H 60 BstE \\,Eco9\ II,£co065 I BstU I CG*CG M 60 Acc II. BspSO I, FnuD II, 37t 具 20% 的活 Mvnl, Tha1 性 BstVl C*TCGAG M 60 Ccr I, PaeRl I, Sla I, Xho I BstX I CCANj* NTGG H 50 65 BstY I Pu*GATCPy L 60 Mf U,Xh〇 II 37 t: 具 30% 的活 性 Bsul5 I AT*CGAT * 37 65 Ban III, B«r I,Bs/>106 I, Bi/>D hCla I Bsu36 I CC*TNAGG H 37 Aoc I, Axy I, Bse2l I, Cvn I, EcoSl I BsuR I GG*CC M(K) 37 Hae III, Pa II Ccr I C*TCGAG H 37 BstV l,PaeR71,SUi l, Xho I Ce III GC*TNAGC H 37 BpuU02 l.Esp l C/o I GCG*C L 37 Hha I, Hin6 I, HinP\ I Cfr I Py/GGCCPu Eae I C/r9 I C*CCGGG « 37 Sma 1, Xcy 1, Xma l C/rllO I Pu * CCGGPy L* 37 100 C/rl3 I G*GNCC M 37 100 Asu I, Nsp IV, Sau96 I C/r42 I CCGC*GG L 37 65 Kpn37S l9Ksp lt Mra l. Sac II S/r 303 I, Sst II • 268 • 续表 m 识 别序列 和切 割位点 • 盐 浓度 b 反应 温度 c 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d Cla I AT*CGAT M 37 65 Ban III f Bsc ItBspl06 I, BspD I, Bsu 15 I 受 dam 甲 基化酶 抑制 Cpo I CG*G(A/T)CCG H 30 60 Csp I, Rsr II Csp I CG*G(A/T)CCG H(K) 30 Cp〇 I, Rsr II Csp6 I G*TAC L 37 65 Afa I, Rsa I Csp45 I TT*CGAA M 37 65 Asu II, BsiC I, Bpu\4 I, Bs/>119 I BstB I, Lsp I, Nsp I, Sfu I Cvn I CC*TNAGG M 37 65 Aoc \y Axy l9 Bse 21 ly Bsu36 I £co81 I, Mst II, Sau I Dde I C*TNAG H 37 70 Dpn I GA*TC H 37 65 D/m II *GATC H 37 BspA I, Kzo9 I, Mbo I, Nde II Sau3A I 受 dam 甲 基化酶 抑制 Dr a I TTT* AAA M 37 65 Aha III Dra II PuG*GNCCPy H 37 £coO109 I, Pss I Dra III CACN3 * GTG H 37 65 “星号 效应" Dra I GACN4 * N2GTC M(K) 37 Dsa I C*CpuPyGG H 55 Dsa V *CCNGG H 60 ScrF I Eae I Py*GGCCPu M(K) 37 65 Cfr I 受 dcm 甲 基化酶 抑制 Eag I C*GGCCG H 37 65 EdX ltEco52 hXma III Earn 1104 CTCTTCN* 黃 37 65 Ear I, Ksp632 I GAGAAGN: Earn 1105 I GACNj* N2GTC * 37 Ear I CTCTTCN* L 37 Earn 1104 I, Ks/>632 I GAGAAGN: EclXl C*GGCCG H 37 Kag I, Eco52 I, Xma III Ec/ 136 II GAG*CTC * 37 65 Sac I, Sst I Eco 105 I TAC*GTA L 37 SmzB I Eco 130 I C*C(VT)(A/T)GG H 37 BssT I, £coT14 I, Sty I • 269 • 续表 酶 识 别序列 和切 割位点 • 盐 浓度 b 反应 祖度 c 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d EcolAl I AGG*CCT H 37 100 Aat I, Pme55 I, Stu I Eco24 I GPuGCPy*C L 37 65 Ban II Eco3l I GGTCTCN* M 37 65 Bsa I ccagagn/ Eco32 I GAT*ATC H(K) 37 65 EcoR V Eco47 I G‘G(A/T)CC M 37 65 Ava II, BmelS I, NspH II, Sin I EcoAl III AGC*GCT H 37 100 Eco52 I C*GGCCG H 37 80 EclX Eag Xma III EcoSl I ctgaagn,*6 L 37 65 gacttcnA £co 64 I G*GpyPu(X H(K) 37 Ban I Ecoll I CAC*GTG 37 65 BbrP l,PmaC 1, Pml I EcoSl I CC*TNAGG L 37 90 Aoc I, Axy I, Bse21 I, Bsu36 I, Cvn I Mst II, Sau I £co88 I C*PyCGPuG 菁 4 65 Nsp III, Ava I Eco9l I G*GTNACC H 37 65 Bs^E II.BrtP I,£c〇〇65 I EcoN I cctn2* n3agg M 37 “连接 困难” £co065 I G*GTNACC H 37 BstE U.BstP l,Eco9l I £coO109 I PuG*GNCCPy L 37 65 Dra II, Pss I 受 dem 甲 基化酶 抑制 EcoR I G*AATTC H 37 70 “星号 效应” EcoR II *CC(A/T)GG M 37 Apy I, BstN I, Mva I 受 dem 甲 基化酶 抑制 EcoR V GAT* ATC H 37 100 Eco32 I “ 星号 效应” EcoTU I C*C(VT)(A/T)GG H 37 BssT I,£c〇130 I, Sty I Ec〇m i ATGCA*T H 37 Ava III, Nsi I Ehe I GGC*GCC L 37 Bbe I, Kas I, Nar I, Nun II Esp I GC*TNAGC H 37 Ce III, 1102 I Esp3 I CGTCTCN * 菁 37 gcagagn/ Fba I TGATCA H 37 Be II Fdi II TGC*GCA H 50 Aos I, Avi II, Fsp I, Mst I “连接 困难” FnuAH I GC*NGC L 37 • 270 • 酶 识 别序列 盐 反应 灭活 同裂酶 和切 割位点 • 浓度 b 温度 e 温度 c FnuD II CG*CG L 37 Acc II, Bs/> 50 BstU I, Mvn I, Tha I FoH GGATGN,* CCTACN/j L(K) 37 65 Fsp I TGC*GCA M 37 65 Aos I, Avi II, Fd III, Mst I Hae II PuGCGC*Py M 37 Hae III GG*XX M 37 90 BsuR I, Pa II 续表 备注 d 很 稳定; 70T: 仍具 活性 Hap II Hga I HgiAl Hinl I Htn6 I C*CGG L 37 Hpa II, Msp I GACGCNj* M 37 65 CTGCGN/o G(A/T)GC(A/T)CN* H 37 65 Alw2 II, A5/>H I C(T/A)CG(T/A)GN5f GCG*C M 37 90 Cfo \tHin6 hHinP II GPu*CGPyC L 37 80 Acy ltAha lh Bb II.BsaH I G;CGC H(K) 65 Cfo hHha hHinP II Mine II GTPy^PuAC H 37 Hin III GTPy*PuAC M 37 Hind III A*AGCTT M 37 Hin II G*ANTC H 37 HinP I G*CGC M 37 Hin? II G*CGC L 37 Hpa I GTT* AAC M(K) 37 Hpa II C*CGG L(K) 37 Hph I GGTNANj* L(K)* 37 CCACTN, Kas I G*GCGCC M 37 Kpn I GGTAC*C L 37 Kpnl I T*CCGGA * 55 Kpn 378 I CCGC*GG M 37 70 Hind II Hinc II 90 “星号 效应” 80 “星号 效应” 65 Hha I, Hin6 I, Cfo I 90 识 别序列 内部的 90 Hap II, Msp I 胞嘧啶 甲 基化时 不能切 割 65 受 dam 甲 基化酶 抑制 65 Bbe I, Ehe I, Nar I, Nun II 位 点依赖 性活性 60 AdpllS I “星号 效应” Acc III, BspE I, Bspm II, Mro I C/r 42 I, Kpn378 I, Mra I, Sac S/r 303 I, Sst II • 271 • 续表 m 识 别序列 和切割 位点* 盐 浓度 b 反应 祖度 c 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d Ksp I CCGC*GG H 37 Eamll04 I, Ear I Ksp632 I CTCTTCN* H(K) 37 BspA I, Dpn II, Mbo I, Nde II GAGAAGN4* Sau3A I Kzo9 I *GATC M 37 60 Asu II, BspU I, Bspll9 I, BsiC I BstB I, Csp45 I, NspV, Sfu I Lsp I TT*CGAA M(K) 60 Rma I Mae I C*TAG H 45 Mae II A*CGT H 50 Mae III * GTNAC H 45 Mam I gatn2* n2atc H 37 BsaB I Mbo I *GATC H 37 65 BspA I,DonII,K2〇9 Nde II 受 dam 甲 基化酶 抑制 Saw 3 A I Mbo II GAAGANg* L(K) 37 65 受 dam 甲 基化酶 抑制 CTTCTN7f Mf II Pu*GATCPy L 37 BstY l,Xh〇ll Mlu I A*CGCGT H 37 100 Mn II cctcn7* M 37 65 Mphll I G*TATAC M 37 60 Mra I CCGCGG L 45 C/r 42 I, Kpn 378 l, Ksp l. Sac 37 t 保留约 80% II, S/r 303 I, Sst II 的活性 Mro I T*CCGGA L 37 Acc III,Bi/)E II, Kpn2 I Msc I TGG*CCA M 37 Ball “星号 效应” Mse I Msp I T*TAA M 37 65 识 别序列 5' 端的 C*CGG M 37 90 Hap II, Hpa II 抱嘧啶 甲基化 不 能切割 Mst I TGC*GCA H 37 Aos I, Aw II.F^z II.Fsp I Mst II CC*TNAGG H 37 65 Aoc \,Axy \%Bse2\ I, B5W36 I, Cvn I, Eco81 I, Sau I • 272 • 续表 酶 识 别序列 和切 割位点 • 盐 浓度 b 反应 温度 c 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d Mva I CC*(A/T)GG H 37 100 Apy I,B5^N I, EcoR II ^Avn I CG*CG M 37 Acc II, Bs/)50 I,B5/U FnuD II, Tha I Nae I GCC*GGC L 37 100 位 点依赖 性活性 37X: 可稳定 24h; Nar I GG^CGCC L 37 65 Bbe I, Ehe I, Kas I, Nun II 位点依 赖性活 性 “连接 困难” Nd I CC*(T/C)GG L 37 80 Ben I Nco I C*CATGG H 37 65 Nde I CA*TATG M 37 65 Nde II *GATC H 37 BspA I, Dpn II, Kzo9 I, Mbo I Sau3A I Nhe I G;CTAGC M 37 65 Nla III CATG* L* 37 65 Nla IV GGN*NCC L* 37 65 Not I GC*GGCCGC H 37 100 Nru I TCG;CGA H 37 80 Bsn6S I, Spo I 受 dam 甲 基化酶 抑制 Nsi I ATGCA*T H 37 Ava III, EcoTll I Nsp I PuCATG*Py L 50 NspH I Nsp II G(A/T/T)GC(A/C/T) ' L 37 Bmy I, Bspl2S6 I, Sdu I Nsp IV G*GNCC L 37 Asu I, C/rl3 I, Saw96 I Asu \\yBpu\A BsiC l9 Bspll9 Nsp V TT^CGAA L 50 I, BstB I, Csp45 I, Lsp I, Sfu I Ns/>7524 I PuCATG*Py M(K) 37 NspB II C(A/C)G*C(G/T)G M(K) 37 NspH I PuCATG*Py M(K) 37 Nsp I NspH II GG(A/T)CC Ava II,Bwel8 I, £co47 I, Sin I Nun II GG*CGCC M(K) 37 Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I Pac I TTAAT;TAA L 37 Pae I GCATG*C L 37 65 Bbu I, Sph I PaeRl I C*TCGAG L 37 Bst VI, Ccr I, Sla I, Xho I 位 点依赖 性活性 Pa II GG*CC M 37 BsuR I, Hae III • 273 • 续表 识 别序列 盐 反应 灭活 同裂酶 m 浓度 b 温度 < 备注 d 和切割 位点* 温度1 PflM I 65 Van 91 I 受 dem 甲 基化酶 CCAN4 1 NTGG M 37 抑制 PLE I GAGTCN«* ctcagn/ L 37 65 PmaQ I CAC*GTG L 37 60 BbrP I, Ecoll I, Pm II Pme55 I AGG*CCT L 37 Aat I, Eco 147 I, Stu I Pm II CAC*GTG M(K) 37 BbrP \, Ecoll l,PmaC I PpuM I PuG*G(A/T)CCPy M 37 受 dem 甲 基化酶 抑制 Pss I PuGGNC*CPy M 37 Dra II, £cool09 I Pst I CTGCA*G H 37 70 “星号 效应” Pvu I CGAT*CG H 37 100 BspClt Xor II Pvu II CAG*CTG M 37 95 “星号 效应” Rma I C*TAG M(K) 55 Mae I 37 t: 具 10% 的活 性 Rsa I GT*AC M 37 100 Afa I, Csp6 I RspX I T*CATGA H(K) 37 BspH. I Rsr II CGVG(A/T)CCG L 37 65 Cpo I, Csp I Sac I GAGCT*C L 37 60 Ecll36 II, Sst I Sac II CCGC*GG L 37 80 Cfr 42 I, Ksp I, Kpn378 I, Mra I 位 点依赖 性活性 S/r 303 I, Sst II Sa II G*TCGAC H 37 80 Aoc l,Axy l,Bse2l I, Bsu 36 I, “星号 效应" Sau I CC^TNAGG H 37 Cvn I Eco8l I, Mst II Sau3A I *GATC H 37 70 BspA. I, Dpn II, Kzo9 I, Mbo I, Nde II Sau96 I G*GNCC M 37 65 Asu I, C/rl3 ly Nsp IV 受 dem 甲 基化酶 抑制 Sea I AGT* ACT H 37 100 “连接 困难” SerF I CC*NGG M 37 65 Dsa V Sdu I G(A/G/T)GC(A/C/T) *C L 37 Bmy I,B5/>1286 U Nsp II SfaN I GCATCNj* H 37 65 CGTAGN, • 274 . 续表 酶 识 别序列 和切 割位点 4 盐 浓度 b 反应 温度 c 灭活 温度 c 同裂酶 备注 d Sfi I GGCCN4 * NGGCC M 50 C/r42 I, Kpn 37S I, Ksp I, Mra 37 t: 具 10% 的活 性 S/r 303 I CCGC^GG L 37 60 I Sac II, Sst II Asu BsiC ly Bpul4 \yBspll9 Sfu I TT*CGAA H 37 I BstB I, Csp45 I* Lsp I, Nsp V SgrAl CPu*CCGGPyG * 37 Sin I G*G(A/T)CC L 37 65 Ava V, BmelS I, EcoAl I, NspW V Sia I C^TCGAG L 37 60 Bst VI, Ccr I, Pae R7 I, Xho I Sma I CCC*GGG L(K)* 37 60 Cfr9 1, Xcy 1, Xma 1 SnaB I TAC*GTA M 37 Eco 105 I Sno I G*TGCAC L 37 AZtx;44 l9 Apab I, I Spe I A*CTAGT M 37 65 Sph I GCATG*C H 37 100 Bbu I, Pae I Sph II C*GTACG H 37 如 W I Sp〇 I TCG*CGA M(K) 37 Bsp68 1, Nru l Sse8387 I CCTGCA*GG M 37 60 Ssp I AAT* ATT H 37 65 Sst I GAGCT*C M 37 Eel 136 II, Sac I C/r 42 I, Kpn 37S I, Ks/> I, Mra Sst II CCGC;GG M I S/r 303 I, Sac II Stu I AGG*CCT H 37 Aat \yEco\Al Pme55 I 受 dem 甲 基化酶 抑制 Sty I C*C(A/T)(A/T)GG H 37 65 BssTl I,Ecol30 I, Eco T14 I Taq I T*CGA H 65 90 TthHBS I 受 dam 甲 基化酶 抑制 “ 星号效 应”; 3713 Tfi I GA(A/T)TC L 60 Aa* II, B">50 I, JB 对 U I, FnwD 具 10% 的活 性 Tha I CG*CG L 60 II Mx/7I I • 275 • 续表 m 识 别序列 盐 反应 灭活 同裂酶 备注 d 和切 割位点 • 浓度 b 温度 e 温度 c 37 t: 具 10% 的活 Tthin i gacn*n2gtc M 65 Asp I 性;“ 连接困 难” mHB8 I T*CGA H 65 Taq I Van91 I ^ ccan4* ntgg H(K) 65 PflM I Vne I G*TGCAC H 37 60 Apab I, Alw44 I, Sno I Vne II GT*CCGGAC M 37 60 Vsp I AT*TAAT H 37 Ase I, Asn I 受 dam 甲 基化酶 Xba I T*CTAGA M 37 70 抑制 Xcm I CCAN5' N4TGG M(K) 37 Xcy I C*CCGGG M(K) 37 C/r9 I, Sma I, Xma I Xho I C*TCGAG H 37 80 Bst VI, Ccr I, PaeRl I, Sla I Xho II Pu * GATCPy L 37 BstY hMfll Xma I C*CCGGG L 37 65 Cfr9 I, Sma I, Xcy I Xma III C*GGCCG L 25 Eag I, Eco52 I, Eel XI Xmn I GAAN2* N2TTC L 37 65 AsplOO I “星号 效应" Xor II CGAT*CG L 37 BspC I, Pvu I 注:由 U.S. Biochemical (1992) , BRL( 1991) , Boehringer Manncheim (1992) , New England Biolabs (1992) , Angilan Biotec (1991) , Stratagene (1992) ,Takara (1991) , pharmacia LKB (1991) , Promega (1992) 和 IBI (1991) 等公司 编辑。 a. 缩写 N 代表 G、A、T、C 任一核 苷酸; Pu 代 表嘌呤 (G 或 A) ;Py 代 表嘧啶 (C 或 T)。 b. 推荐的 NaCl 或 KC1 浓度, L 代表 低盐: <50mmol/L;M 代表 中盐 :50~ 100mmol/L;H 代表 高盐: >100 mmol/L。 c. 反应温 度指酶 切反应 时的摄 氏温度 (X:), 灭 活温度 指温育 15min 使酶灭 活的摄 氏温度 (t:)。 d. 缩写: dam 表不酶 活性受 dam 甲 基化酶 抑制; dcm 表不酶 活性受 dcm 甲 基化酶 抑制; difficult ligation (连接 困难) 表 示由该 酶消化 DNA 产生 的单个 碱基的 5' 黏端用 T4 DNA 连接 酶连接 困难; SAM 代表 S •腺苷 甲硫 氨酸; 位 点依赖 性活性 表示某 些特别 的限制 酶消化 DNA 时 ,在不 同位点 的切割 率存在 明显差 异;“ 星号效 应”是 指在通 常的 识别序 列之外 发生切 割反应 ,通常 发生在 非适当 反应条 件下, 如低离 子强度 、高 酶浓度 、高甘 油浓度 、高 pH 或用 Mn2’ 离 子替换 Mg2 + 离 子时。 截至 1994 年, 已发现 的限制 酶多达 800 种以上 。很 多细菌 都含有 特异的 限制酶 ,这 类酶与 相伴存 在的甲 基化酶 共同构 成细菌 的限制 / 修 饰体系 。限制 / 修饰体 系通过 限制酶 将外源 DNA 分 子降解 ,限制 其功能 ,但 细菌 本身的 DNA 则 由于特 异甲基 化酶催 化被甲 基 化修饰 而免于 被破坏 。因 此限制 / 修 饰体系 的功能 就是降 解外源 DNA, 保护 自身的 DNA, 对 细菌的 生存和 繁衍具 有重要 意义。 根据酶 的组成 、所 需辅 助因子 及裂解 DNA 方式 的不同 ,可 将限制 酶分为 3 种 类型。 第 I 类酶 ,由 3 种不 同的亚 基组成 ,需要 Mg2+ 、S- 腺苷甲 硫氨酸 (SAM) 及 ATP 为 辅助因 F, 这 类酶的 切割位 点和识 别位点 不一致 。它结 合于识 别位点 ,却 通常在 识别位 点周围 400 〜 700bp, 甚至更 远范围 内切割 DNA。 第 II 类酶由 相同亚 基组成 ,切割 DNA 时仅需 • 276 • TTAA Mse I Ase I TGCA Ava I i ApaL I TCGA O' G Xho I Ava I TATA * GTAC Csp 61 Rsa I — Bsi W I AspllS Ban I GGCC Hae III Stu I Eag I Eae I Gdi II BsiE I Bsp 120 I GCGC HinP I Hha I Eco47 III Kas I Ban I GATC Mbo Ia Sau3A Ia K a* Bgi II BstY I Hae II Pvu I BsiE I BamH I BstY I CTAG a Avr II Sty I Nhe I CGCG BstV I Mlu I Afl III Dsa I NspB II Sac II BssH II CCGG Hpa IIa Msp V A 炉 I BsrF I Xma I Ava I Sma I NgoM I BsrF I CATG Nia III Aff III Ns/>6524 Nco I Sty I Dsa I ATAT Nde I AGCT ALu I Hind III Pvu II i NsB 11 ACGT Mae II Pm II BsaA I AATT 4* EcoR I Apo I 本 本 本 本 本 本 本 ' 本 本 本 * 本 本 本 本 本 本 本 本 H * 本 木 本 < H 本 木 本 木 < H 本 本 本 本 < H 本 本 本 本 < H 本 本 本 本 < 〇 本 本 本 * O 〇 本 本 木 本 u 〇 本 本 本 本 u 〇 本 本 本 本 u 〇 本 本 本 傘 u u 本 本 本 本 o * fl w\ x ^ s〖l w\ 迕 〖 5R P4 溫趙埠 R -v»' « iH l 暌 ~4術 • 277 • 。昏尜 S 坦樂 V Z Q 哦刼 迤制 劫妲 S 湛忠 ITS 頷丨瓦 iff SI 联 。 fli lt 盂祕 f OR blssfrB 泜妒 fe 。斑骚 Im: <1286 HgiA I TCGA Acc I Hinc II BsrB I TATA Acc I Bsr 1107 I GTAC Kpn I 1 Apa I Ban II Bs/> 1286 Eae 1 Msc I GCGC Nar I BsaH I Bbe I Hae II i GATC i CTAG Xba I CGCG Nru I CCGG Nae I BspM II CATG Sph I N5/>7524 BspH I ATAT EcoR V AGCT Ed 136 II Sac I Ban II HglA I Bs/> 1286 ACGT BsaH I Aat II SnaB I BsaA I AATT U 拿 * 傘 拿 〇 U * 傘 * * o u 本 * 拿 章 r •» U 本 本 本 本 o < 本 本 本 本 H < * 本 本 本 H < 本 本 本 本 H < 本 本 本 本 H < 本 本 本 本 0 m • 278 • Mg2+ 为辅助 因子, DNA 的切 割位点 就在识 别位点 内或在 其旁侧 。第 ID 类 酶由两 种亚基 组成 ,切割 DNA 时需要 Mg2+ 及 ATP 为辅助 因子, DNA 的识 别位点 和切割 位点不 一致, DNA 的切割 发生在 识别位 点周围 25 〜 27bp 范 围内。 I 类酶与 III 类酶兼 具限制 和修饰 两 种功能 ,既含 有内切 酶活性 ,又有 甲基化 酶活性 ,属多 功能酶 。由 于这两 类酶识 别位点 复杂 ,特异 性差, 切割位 点与识 别位点 不一致 ,因 而这两 类酶在 分子克 隆中很 少应用 。在 分子克 隆中常 用的是 II 类酶, 这类酶 只有限 制作用 (内切 酶作用 ), 能在特 异的位 点识别 和切割 DNA。 人们通 常所指 的限制 酶就是 II 类限 制酶。 表 4.3 NaCI 浓 度对限 制性内 切核酸 酶活性 的影响 酶 Ommol/L 50mmol/ L 100mmol/L 150mmol/L NaCl NaCl NaCl NaCl 酶 Ommol/L 50mmol/ L lOOmmol/L NaCl NaCl NaCl 150mmol/L NaCl Aat III Acc I Aci I Afl II Aha II Alu I Alw I AlwN I Apa I ApaL I Asc I Ase I Ava I Ava II Avr II Bal I BamH I Ban I Ban II Bbv I Beg I Bel I Bgl I Bgl II BsaH I Bsm I Bs/> 1286 BspH I BspM I BspM II BssH II Bs^B I BstE II BstN I Bs^U I BstX I BstY I Bsu36 I Cla I Dde I Dpn I Dr a I Dra III Eae I Eag I £2^1105 I EcoN I EcoO109 Eco57 I EcoR I EcoR V Fnu4H I Fok I Fsp I Hae II Hae III HgiA I Hha I Hinc II Hind III Hini I HinP I Hpa I Hpa II Hph I Kas I Kpn I Mbo I Mbo II Mlu I Mnl I • 279 • Ommol/L 50mmol/L lOOmmol/L NaCI NaCI NaCl 150 mmol/ L NaCI Ommol/L 酶 , NaCI + Sau96 I + + + + + + Sea I + + SerF I + + + S/aN I + 十 Sma I + + + + SmiB I + + + + + + Spel + + + + Sph I + + Ssp I + + + Sac I + + + + + + Sac II + + + + + + Sal I + + + Sau3A I + + + + Stu I + + + + + Sty I + + Taq I + + + + mm I + + + + + + Xba I + + + + Xca I + + + + + + Xho I + + + + + Xma I + + + + Xmn I + + + 续表 50mmol/L lOOmmol/L 150mmol/L NaCI NaCI NaCI 注:所 列酶的 活性是 在特定 NaCI 浓 度下与 推荐反 应条件 下的活 性相比 较而言 ,在某 些情况 下两种 反应体 系中的 pH 和离子 强度不 相同。 本表只 反映出 NaCI 浓度的 不同。 所有的 反应条 件含有 10mm〇l/L Tris-HCl(pH7.5) 和 100Mg/mL 牛血清 白蛋白 ,所 有的温 育时间 是在最 适温度 下温育 60mm, 其中: + 号表示 与推荐 反应条 件相比 ,在此 条件下 可获得 < 10% 的 酶活性 + + 号表示 与推荐 反应条 件相比 ,在此 条件下 可获得 10% 〜 20% 的 酶活性 + + + 号表示 与推荐 反应条 件相比 ,在此 条件下 可获得 30% ~100% 的 酶活性 a. 由于 "星 号效应 ”而不 推荐采 用的工 作浓度 。星 号效应 是指在 通常的 识别序 列之外 发生切 割反应 ,通常 发生在 非适当 反应条 件下, 如低离 子强度 、高甘 油浓度 、高 pH, 或用 Mn2+ 替换 Mg2+ 时。 表 4.4 商品化 的甲基 化酶的 识别序 列和反 应体积 甲 基化酶 NaCI Tris-Clb EDTA MEC 识别序 列11 mmol/ L Alu I AGCraT0 50 10 5 BamH I GGATC"^ 50 10 10 5 Cla I ATCGAmT 0 50 10 5 CpG CmG 50 10 0.1 ld dam GAraTC 0 50 10 5 EcoR I GAAmTTC 100 100 1 0 FnuD II CmGCG 0 50 10 5 Hae II GGC^C 50 50 10 ID Hha I GCmGC 0 50 10 5 Hpa II CC"^ 0 50 10 5 Msp I CTGG 100 50 10 5 Pst I CTGCA"^ 0 50 10 5 Taq I TCGAm 100 10 0 6e 注: 所有的 反应条 件均含 SOjimol/L S- 腺苷 甲硫氨 酸和在 37t 温育。 a.m 表示 甲基化 核苷酸 b.PH7.5。 c.2- 巯基 乙醉或 二硫苏 糖醉。 d •反应 体系含 160Mmol/LS 腺 苷甲硫 氨酸。 e. 反应 体系含 6mm〇l/LMgCl2。 • 280 • II V 5 I NCI I 5 1 1 |紹| I i I ir ^1 一 、限制 性内切 核酸酶 的特性 限 制性内 切核酸 酶的特 性主要 有以下 几点。 (1) 各 种限制 性内切 核酸酶 具有专 一地识 别与切 割序列 (见表 4.1)。 (2) 识 别碱基 对数目 一般为 4bp、 5bp、 6bp 长 度范围 。但亦 有识别 序列为 8bp 或 8bp 以上者 ,如 I 和 S/f I 的识别 序列为 8bp, 可将 基因组 DNA 切割 为较大 DNA 片 段 ,对制 作真核 基因组 物理图 谱极为 有用。 (3) 识别 序列大 多为二 重对称 (即回 文结构 )。 (4) 多 数限制 性内切 核酸酶 的切割 位点就 在识别 位点内 ,但少 数限制 酶的切 割位点 不在 识别位 点之内 ,而 是在识 别位点 的旁侧 。例如 : 的识别 位点是 GACGC (5/ 10), 切 割位点 在两条 DNA 链 上分别 在距识 别位点 5 个和 10 个核苷 酸处。 5,-GACGCNNNNN + NNNNNN-y 3'-CTGCGNNNNNNNNNN; N-5' (5) 限 制性内 切核酸 酶对底 物的切 割有两 种方式 。一些 酶在二 重对称 轴处同 时切割 DNA 的两 条链, 产生带 平端的 DNA 片段 ,如: II 酶 切后的 DNA 为平端 。而 大多 数的 酶则在 对称轴 处的两 侧类似 的位置 切割产 生单链 的突出 DNA 黏 性末端 。如 £coR I 酶切 DNA 后产生 5'-P 端的 突出黏 性末端 ,而 Pw I 则产生 3'-OH 端的突 出黏性 末端。 (6) 有些限 制性内 切核酸 酶虽然 来源及 识别位 点不同 ,但 切割 DNA 后产生 相同匹 配的黏 性末端 ,这 些酶称 同裂酶 。如 BamHI 识别 位点为 5'-G+GATCC-3', 与 其相匹 配 的黏性 末端的 酶就有 I、 II、 I、 I。 (7) 限制性 内切核 酸酶一 般都以 Mg2+ 为惟 一的辅 助因子 ,并 要求有 一定的 盐离子 浓度。 (8) 限制性 内切核 酸酶极 易失活 ,要特 别注意 酶活力 的保存 ,酶保 存缓冲 液一般 为 : 10mmol/L Tris-HCl (pH7.4, 缓冲 pH)、 50 〜 100mmol/L NaCl 或 KC1 ( 盐离子 )、 lmmol/LDTT (还原 性保持 酶活性 )、 100 〜 200;xg/mL、 BSA (保 持蛋白 浓度, 使酶稳 定 )、 50% 甘油 (存于 -201C 不结冰 ,结 冰反复 解冻使 酶失活 )。 二 、限 制性内 切核酸 酶消化 DNA 的方法 (一) 单酶单 DNA 样品 的消化 此 法只需 简单地 将酶和 DNA 样品放 在合适 的反应 缓冲液 中温育 ,其中 DNA 和酶 的量 、缓冲 液的离 子强度 、温 育温 度和时 间都依 具体的 反应而 改变。 1. 材料 DNA 样品 ,溶于 H20 或 TE 缓冲液 10 x 酶切 缓冲液 限制 性内切 核酸酶 加样 缓冲液 . 281 . 0.5mol/LEDTA, pH8.0 ( 选用) 2. 试 剂配制 l〇x 酶切 缓冲液 : 100mmol/L Tris-HCl pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT, lmg/mL 牛血清 白蛋白 (BSA), 0、 0.5、 1_0 或 1.5mol/LNaCl。 各限制 酶所需 NaCl 浓 度见表 4. 3, 表中 提供的 4 种酶 切缓冲 液可满 足各限 制酶的 需要。 Sma I 需 KC1 缓 冲液。 l〇x 乙 酸钾为 基础的 缓冲液 : 660mmol/L 乙 酸钾, 330mmol/LTris- 乙酸 pH7.9, 100mmol/L 乙酸镁 , 5mmol/LDTT, lmg/mLBSA 2X 谷氨 酸钾为 基础的 缓冲液 : 200mmol/L 谷氨 酸钾, 50mm〇l/LTriS- 乙酸 pH7.5, 100^g/mL BSA, lmmol/L 2- ME 10 x Sma I 缓冲液 : 60mmol/L Tris-HCl pH8.0, 60mmol/L MgCl2, 200mmol/L KC1, 60mmol/L 2-ME, lmg/mLBSA 3. 操 作步骤 (1) 取 一只无 菌微量 离心管 ,加 入以下 溶液: 用于 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 或琼脂 糖凝胶 电泳分 析时, 20ML 的反应 体积就 足够了 。只 要反 应体系 中各成 分的比 例保持 一定, 可增减 DNA 量和 (或) 反应 条件。 (2) 加 入限制 性内切 核酸酶 (1 〜 5U/MgDNA), 在推荐 的温度 (一 般为 371C) 温 育 lh〇 在 推荐的 反应条 件下, 1U 限 制性内 切核酸 酶理论 上可在 60min 内完 全消化 lMg 纯化的 DNA 样 品 。然而 ,实际 操作中 粗制的 DNA 样品 常需要 使用较 多的酶 ,或 较长的 时间才 能完全 消化。 酶的体 积 应低于 反应总 体积的 1/10, 因为 酶液中 的甘油 可以干 扰酶切 反应。 (3) 加入 5/^电 泳加样 缓冲液 (20% 反应 体积) 终 止反应 ,进 行琼脂 糖凝胶 电泳或 聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳。 加入 0.5HL0.5niol/LEDTA (终 浓度为 12.5mmol/L) 也可终 止反应 ,因为 其可螯 合酶切 所需要 的 镁离子 。在 65t 温育 lOmin 很 多酶可 被不可 逆灭活 ,也可 用来终 止反应 。如果 酶具热 抗性, 则可通 过酚 抽提和 乙醇沉 淀或通 过硅基 质悬浮 法去除 酶蛋白 ,以 此来终 止酶切 ,纯化 DNA。 切割 DNA 样品 经常需 要用一 种以上 的限制 性内切 核酸酶 。如 果这些 酶具有 相同的 反应条 件和反 应温度 ,可 同时加 入同一 反应混 合物中 。许多 限制性 内切核 酸酶在 几种缓 冲液 中都具 有活性 ,对缓 冲液的 要求并 不十分 严格, 因而我 们可选 择一种 能保持 所需的 几种 酶活性 的缓冲 液来进 行实验 ,可 依照下 列步骤 进行。 (1) 首先加 入需要 低浓度 NaC 丨的 酶消化 DNA [见 方法 (一) 步骤 (1)、 (2)]。 大部 分需要 较高反 应温度 的酶在 37X: 仍 有活性 ,所 以不必 过多选 择酶切 反应的 温度。 DNA (0.1~4jng 溶于 H20 或 TE 缓冲液 ) 10 X 酶切 缓冲液 18 -X (/ixL) H20 (二) 多酶单 DNA 样品 的消化 • 282 • (2) 加入1~3/^1〇1〇1/1^仏(:1(20;1[反应体积),使他(31终浓度适合另一种酶消 化, 加入该 酶继续 温育。 (3) 终止 反应, 电泳分 析或进 一步酶 切处理 [见 方法 (一) 步骤 (3)]。 (三) 多个 DNA 样品 的消化 当 需要消 化多个 样品时 ,采用 以下方 案可以 减少取 吸次数 ,节 省时间 和减少 污染。 (1) 将各 个相同 体积的 DNA 样 品分别 加入至 不同微 量离心 管中。 为 避免交 叉污染 ,各 样品用 不同的 吸头。 (2) 准备 足量的 可以消 化所有 样品的 l〇x 反 应缓冲 液和水 ,置 于冰浴 ,作为 “预混 合 液”。 (3) 于“ 预混合 液”中 加入足 以消化 所有样 品的酶 ,轻 弹管壁 ,混匀 ,置于 冰浴。 (4) 各样品 管中加 入适量 上述混 合液, 在适当 的温度 下温育 lh。 (5) 终止 反应, 电泳分 析或进 一步酶 切处理 [见 方法 (一) 步骤 (3)]。 (四) DNA 样 品的部 分消化 与以 上所述 完全消 化的方 法不同 ,如 仅需在 DNA 片 断上部 分限制 性位点 进行切 j 100 HL DNA 1 X 缓 冲液置 于冰上 ① 在冰 上将样 品分装 体积 : 30叫 20 |iL 20 jiL 20 10 ② 加酶 \ (置于 冰上) 3 a JJ \JJ 体积 :2〇nL 20 |iL 20 |IL 20 |iiL 20 jiL HI: N N/3 N/9 N/27 N/54 ④ 37X: 温育 15min ③ 系 列稀释 (置于 冰上) 停止反 应凝胶 电泳分 析产品 图 4.1 系 列稀释 法进行 DNA 样 品的部 分消化 • 283 . 割, 以进行 克隆或 酶切图 谱分析 ,可以 进行部 分消化 。通过 改变酶 量或改 变消化 时间就 可以达 到部分 消化的 要求了 。改 变酶 量常用 的方法 是连续 稀释法 (图 4.D。 (1) 根据情 况准备 一 系列反 应管, 并配制 l〇0PL 含 DNA 和 lx 限制 酶缓冲 液的反 应混 合物。 (2) 将反应 混合物 加入反 应管中 ,其 中管 1 加 管 2 〜管 4 各加 20pL; 管 5 加 10/xL; 置于 冰浴。 (3) 加入所 选用的 酶至管 1 (3~l〇U/^gDNA), 轻弹管 壁混匀 ,置于 冰浴。 (4) 使 用不同 的吸头 ,从管 1 中取 l〇pL 加 入到管 2, 快 速混匀 ,置 于冰浴 。依次 连 续稀释 ,从管 2 到管 3, 管 3 到管 4, 管 4 到管 5, 最 后每个 管的体 积均为 20mL。 (5) 每个 小管在 合适温 度温育 15min 后终止 反应。 进行电 泳分析 ,或 进一步 酶切处 理 [见 方法 (一) 步骤 (3)]。 利用 连续稀 释方法 ,消化 每微克 DNA 所 使用的 酶量可 以相差 54 倍 ,酶切 效果可 用电 泳分析 。部分 消化的 产物可 通过改 变酶量 或改变 消化的 时间而 获得。 (五) DNA 的 甲基化 DNA 的 甲基化 虽不属 限制性 内切核 酸酶消 化的方 法之列 ,但 就许多 II 类限 制性内 切核酸 酶而言 ,已分 离到与 其相对 应的甲 基化酶 。甲 基化酶 可修饰 限制性 内切核 酸酶识 别序列 ,使之 不受相 应的限 制性内 切核酸 酶切割 ,是 影响限 制性内 切核酸 酶消化 DNA 的主 要因素 ,因此 我们将 其与限 制性内 切核酸 酶一同 介绍。 这些甲 基化酶 中已有 一些得 到 商品化 (表 4.4)。 它 们在分 子克隆 中的多 个方面 都有用 武之地 。例如 ,在构 建基因 组 DNA 文库时 ,用 限制酶 和 Haell 部 分消化 基因组 DNA 后所得 片段用 M.EcoRI 甲基化 酶处理 ,然 后加上 合成的 Ec〇RI 接头。 当再用 £c〇RI 来消 化接在 基因组 DNA 上 的接 头时, 基因组 DNA 上天然 £c〇RI 限制 酶切位 点则受 到保护 ,不 被切割 。当 制备克 隆用 的双链 cDNA 时可 用同样 策略去 除天然 存在的 一些限 制酶切 位点。 很多商 品化的 甲基化 酶可将 甲基供 价键合 到特异 靶序列 的腺嘌 呤或胞 嘧啶上 (见表 4.4), 这些位 点的甲 基化导 致它们 不能被 相应的 限制性 内切核 酸酶所 切割。 1. 材料 l〇x 甲 基化酶 缓冲液 (见表 4.4) 腺苷甲 硫氨酸 (SAM) 2. 操 作步骤 (1) 在 20沐 甲基 化酶缓 冲液中 ,加入 DNA( 终浓度 20 〜 200/ig/mL)。 (2) 加入 S •腺 苷甲硫 氨酸, 充当甲 基供体 ,终 浓度为 8(^m〇l/L。 (3) 加入足 够的甲 基化酶 ,完 全保护 DNA 免 受相应 的限制 性内切 核酸酶 切割。 1U 的甲 基化酶 在推荐 条件下 可保护 1 叫的 XDNA 不受 切割。 (4) 在合适 的温度 (通常 37X:) 下温育 lh。 • 284 • 三 、影响 酶切效 率的主 要因素 影响酶 切反应 的因素 有很多 ,主 要有 DNA 的 纯度、 DNA 甲基 化程度 、缓冲 液条件 和温 度等。 1.DNA 纯度 限制酶 酶切反 应的效 率很大 程度上 取决于 DNA 的 纯度。 DNA 制品中 的污染 (如蛋 白质 、酚 、氯仿 、乙 醇、 EDTA、 SDS、 高盐 浓度) 均能抑 制酶切 活性。 小量快 速提取 制备的 DNA 样品 往往存 在这种 情况。 这种抑 制可通 过增加 酶作用 单位数 (10~20UAxg DNA), 增大反 应体积 以稀释 可能的 抑制物 或延长 反应时 间来加 以克服 。有些 DNA 样 品被 DNase 污染 ,因 DNase 的活 性依赖 Mg2+, 所以 这样的 DNA 样品在 贮存的 缓冲液 (含 EDTA) 中是 稳定的 。但 一当加 入酶切 缓冲液 ,它们 迅速被 DNase 降解 ,因此 污染了 DNase 的 DNA 样 品必须 重新纯 化才能 使用。 消化 基因组 DNA 时, 加入终 浓度为 l~2.5mmol/L 多 聚阳离 子亚精 胺可改 善酶切 效果 ,其 作用是 结合带 负电的 污染物 。消化 超螺旋 或病毒 DNA 较线状 DNA 需 要更大 的酶量 (20 倍以上 )。 2.DNA 甲基 化程度 大肠 杆菌的 绝大多 数菌株 含有两 种甲基 化酶: dam 甲基 化酶和 dcm 甲基 化酶。 dam 甲基化 酶可在 5'-GATC-3' 序 列中的 腺嘌呤 N6 位置 上引入 甲基。 一些限 制性内 切 核酸酶 (Pum II、 仏 wH I、 %Z II、 II、 滕 〇 I、 Sai/3A I) 的识 别位点 内含有 5'-GAT03'。 另一 些限制 性内切 核酸酶 的识别 位点也 有一部 分含有 5'-GATC-3' 序列, 如 Qa I (1/4, 4 个识别 序列位 点中有 1 个含 5'-GAT03')、 I (1/16)、 了 叫 I (1/ 16)、 M6o II (1/16) 和 I (1/16)。 原核 DNA 被 M6〇 II 消 化时受 darn 甲基 化酶的 抑制, 这在实 际应用 中并无 大碍。 因为 Saw 3 A I 的识别 序列与 M6o II 完全 相同, 但其作 用不受 dam 甲 基化酶 的影响 ( 注:哺 乳动物 DNA 不 会在腺 嘌呤的 N6 位置 上发生 甲基化 ,因此 M6o II 和 Sa«3AI 均 可有效 地使用 )。 但是 ,当 需要在 C& I、 I、 I、 M6〇 II 及 I 的 每一个 位 点处切 割原核 DNA 或用 Be II 完全消 化原核 DNA 时 ,则 必须从 dam_ 的大肠 杆菌提 取 DNA〇 dcm 甲基 化酶可 在序列 5'-CCAGG-3' 或 5'-CCTGG-3' 中的 胞嘧啶 C5 位置上 引入甲 基 。受 dcm 甲基 化酶作 用影响 的酶是 £c〇R II。 大多数 情况下 ,用 BwNI 可避免 这一影 响。 BwNI 识别 序列与 £c〇RII 相同 (尽 管它在 识别序 列内的 另一位 置切割 DNA), 如 果 不能用 Bs^NI 代替 £C0RII, 那么 DNA 必 须从大 肠杆菌 dcnT 菌株 中制备 。其 他某些 酶的 识别序 列可能 与经过 修饰的 dcm 甲 基化酶 识别序 列部分 重叠。 哺 乳动物 DNA 偶尔含 5- 甲基化 嘧啶, 通常在 鸟嘌呤 残基的 5' 侧。 DNA 甲基 化的程 度与 细胞类 型有关 。真核 DNA 甲基化 方式可 用甲基 化敏感 性不同 的同裂 酶进行 研究。 例如, M5/)I 和 Hpall 的 酶切位 点都是 C+CGG, 当 CCGG 序列 内部的 胞嘧啶 甲基化 . 285 . 时, I 可 切割而 H/w II 则不能 切割, 原因是 Hpa II 对这 种甲基 化非常 敏感。 有时, 限制酶 对甲基 化的核 苷酸序 列失去 切割能 力是一 种好事 。甲基 化酶的 识别序 列与相 伴的限 制酶的 识别序 列接近 ,当 用合 成的接 头修饰 DNA 片段的 末端时 ,先将 DNA 片段甲 基化, 保护其 内部的 限制酶 切位点 ,再 用限制 酶切割 接头。 3. 缓冲 液条件 典 型的限 制酶缓 冲液成 分包括 MgCl2、 NaCl/KCl、 Tris-HCl、 2- 巯 基乙醇 (2-ME) 或二硫 苏糖醇 (DTT) 和 牛血清 白蛋白 (BSA)。 二价 阳离子 ( 一般为 Mg2。 对 于酶切 是必 需的; Tris-HCl 对维持 适当的 pH 是需 要的; 巯基 试剂 可稳定 限制酶 ,但也 可稳定 潜在的 污染物 。有些 酶类对 Na+ 和 K+ 浓度 敏感 ,而 有些酶 在较高 的离子 强度范 围内仍 然 有活性 (表 4.3)。 每 种限制 酶的最 佳缓冲 液见表 4.3。 许多 酶在几 种缓冲 液中均 能保留 大部分 活性。 许多厂 商为每 种限制 酶推荐 4 种 缓冲液 ,这些 缓冲液 购买酶 时由厂 商提供 ,也可 单独购 买或者 实验室 自配制 10 x 酶切缓 冲液于 - 20X: 贮存可 达一年 以上。 各厂商 推荐的 缓冲体 系不完 全相同 。我们 建议购 买哪家 公司的 酶就使 用该公 司与此 配 套的缓 冲液。 除上述 4 种缓冲 体系外 , 许多实 验用谷 氨酸钾 缓冲液 或乙酸 钾缓冲 液消化 DNA。 这 些缓冲 液的主 要特点 是用谷 氨酸钾 或乙酸 钾替代 NaCl, 用 Tris- 乙 酸取代 Tris-HCl。 虽 然有些 酶在这 些缓冲 液中活 性较低 ( 有时仅 20%), 但多 数限制 酶在这 些缓冲 液中具 有活性 。几种 DNA 修饰酶 在这些 缓冲液 中也具 有活性 ,如 T4 DNA 聚 合酶和 T4 DNA 连接酶 。上述 “通用 ”缓冲 液在多 种限制 酶消化 DNA 时是 有用的 ,尤其 是当几 种限制 酶在任 何一个 标准缓 冲液中 都不相 匹配时 ,通 用缓冲 液特别 有用。 在非适 当反应 条件下 ,如 低离 子强度 、高 酶浓度 、高甘 油浓度 、高 pH 或用 Mn2 + 替换 Mg2+B^ 有 些限制 酶特异 性降低 ,通 常在识 别序列 之外发 生切割 反应。 第二 节限制 性作图 标明 限制性 内切核 酸酶在 DNA 分 子上的 限制位 点数目 、限制 片段大 小及其 排列顺 序的图 谱称为 DNA 的物 理图谱 ,又称 限制性 作图。 组建物 理图谱 是基因 工程研 究的重 要程序 ,基因 的定位 、转录 、消化 、分离 、分 子杂交 、克隆 转化都 与物理 图谱有 直接关 系, 所以组 建物理 图谱具 有重要 意义。 为了 得到精 确的物 理图谱 ,在工 作之前 对限制 酶进行 选择是 必需的 ,最 好选 用那些 在 DNA 链上的 切点在 20 个左 右的酶 。切 点愈多 ,情况 愈复杂 ,误 差也 就愈大 。还要 避免选 择产生 双重带 的限制 性内切 核酸酶 。所谓 双重带 ,即 两个片 段的大 小正好 相同, 电泳时 ,它 们必然 位于同 一带位 。可 以通过 染色强 度判断 双重带 。正常 情况下 ,凝 胶上 的 DNA 片 段的染 色强度 随相对 分子质 量减小 而递减 。如果 某个下 带的颜 色强度 反常地 高 于上带 ,经 荧光比 色分析 ,其浓 度比单 一带高 出一倍 ,此 即为双 重带。 其次, DNA 分子 大小与 物理图 谱的精 确度也 有密切 关系。 太大的 DNA (如 染色体 DNA) 难 以得到 铕 确的物 理图谱 。第三 ,由 于几 种方法 都是以 DNA 片段 大小为 基础的 ,所以 在电泳 • 286 • 后 ,要尽 可能准 确地测 定各片 段的相 对分子 质量。 为了不 遗漏琼 脂糖凝 胶上的 小片段 (lkb 以下的 片段在 0.7% 的琼脂 糖上难 以观察 ), 最好 能同时 进行聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳。 即使 如此, 精确度 也总是 有限的 。有时 可产生 100 〜 200bp 的 误差。 为 了使组 建物理 图谱的 工作规 范化, Vlak 和 Smith 提出 了如下 原则: 1) 琼 脂糖凝 胶上的 DNA 片段用 英文大 写字母 ,从 A 起始 ,表 示片段 号由大 到小; 2) 如 果片段 数超过 26 个字母 ,可 用小 写字母 ,连续 排列; 3) 共移动 的片段 (即 双重带 ), 分 别用不 同的字 母表示 ,如 FGH 等, 而不用 F1、 F2 和 F3; 4) 对 于环状 DNA 物理图 谱需要 找一个 零点, 将整个 DNA 分为 100 等份, 每等份 为一 个图距 单位。 如果某 个限制 酶在该 DNA 上只有 一个识 别位点 ,即可 以作为 零点, 或随机 选某个 酶的一 个切点 为零点 。在 昆虫杆 状病毒 DNA 物理图 谱的组 建中, Vlak 等 建 议用多 角蛋白 基因的 片段为 零点; 5) 物理 图谱组 建之后 ,片 段顺序 的阅读 规定为 :环状 图谱按 顺时针 方向, 线状物 理 图谱从 左到右 阅读。 限 制性作 图常用 的方法 有多酶 消化法 、部 分消化 法和末 端标记 法等。 而末端 标记法 的 实质属 于部分 消化法 。现分 别介绍 如下。 一、 多种限 制性内 切核酸 酶消化 法作图 此法是 用几种 限制酶 分别或 同时消 化目的 DNA, 电泳 分离、 求出各 片段的 大小, 然后推 导出限 制性图 谱的一 种方法 。其 原理与 部分消 化法基 本相同 。单酶 消化时 的某些 片段 在双酶 消化时 可能仍 然保留 ,另一 些片段 可能消 失而出 现新的 片段, 说明一 个酶的 切点 可能正 好在另 一个酶 的片段 之内。 那么新 出现的 2 或 3 个片段 的相对 分子质 量之和 必然等 于那个 消失的 大片段 。根 据片段 的大小 找出消 失片段 与新生 片段的 关系, 通过它 们的 交错重 叠现象 ,确 定各片 段的邻 近位置 ,组 建出此 DNA 的 限制性 图谱。 用多种 核酸内 切酶消 化法作 图需注 意如下 几点: (1) 几 种酶不 管是单 独消化 还是混 合消化 ,都必 须充分 反应, 切忌部 分消化 ,否则 将 出现错 综复杂 的情况 ,难 以得到 准确的 结果。 (2) 当 DNA 完全消 化时, DNA 片段 则以等 摩尔数 存在。 此时用 溴化乙 锭染色 ,带 的强度 与片段 的长度 和含量 成正比 。例如 8kb 的 DNA 片段 ,其 带的强 度应是 4kb 的 2 倍 。若带 的强度 比预计 的暗淡 ,则 可能存 在部分 消化; 若带的 强度比 预计的 高许多 ,则 可 能存在 2 种或 2 种以 上类似 长度的 DNA 片段 。若是 等长的 DNA 片段 用溴化 乙锭染 色, DNA 的含量 愈多, 则染色 愈深。 (3) 限 制性片 段长度 的总和 应等于 DNA 分子的 总长度 。如 DNA 片段 长度的 总和低 于 DNA 分子的 总长度 ,其原 因有二 : 一为具 有相同 长度的 DNA 片段, 需认真 检测; 二为酶 切过程 中产生 了几种 非常小 的片段 ,电 泳时 难以观 察到。 (4) DNA 片段的 数量与 酶切次 数有关 。当 环状 DNA 用 2 种或 多种酶 进行消 化时, DNA 片段数 应是各 个酶消 化产生 DNA 片段 的总和 。例如 ,用酶 A 消化 一环状 DNA 分 子产生 3 个片段 ,用酶 B 消化 则产生 5 个片段 ,用酶 A 和酶 B 混 合消化 应产生 8 个片 . 287 • 段 如果 产生的 片段少 f 此数则 说明可 能存在 共移动 片段或 产生了 非常小 的片段 ,以致 不能观 测到。 (一) 基 本方法 1. 材料 纯化的 DNA 样本 限制 性内切 核酸酶 10 x 限制酶 缓冲液 2. 操 作步骤 (1) 用低 频率切 割的不 同限制 性内切 核酸酶 分别完 全消化 (长至 20kb 的) DNA。 这 些酶有 £coR I、 III、 Bam H I、 I、 I、 I、 SaZ I、 X/io I 等。 (2) 从每个 反应取 小份样 品作电 泳分析 ,用 已知 的相对 分子质 量标准 作对照 。剩余 的样 品置于 冰浴。 (3) 根 据相对 分子质 量标准 估算出 DNA 片段的 长度, 推导出 每种限 制性内 切核酸 酶的酶 切位点 数目。 (4) 从 (1) 的 每个样 品管中 取少许 置另外 的管中 ,用 第二种 内切酶 消化, 电泳分 析比 较酶切 结果① 两种酶 切割; ②第 一种 酶单独 切割; ③第 二种 酶单独 切割。 (5) 估算 DNA 片段 的长度 ,重复 此步骤 ,直到 明确一 致而且 相互不 矛盾的 限制性 内 切核酸 酶位点 被推导 出来, DNA 图 谱便告 完成。 (二) 未知结 构质粒 的限制 性作图 假设 有一个 9kb 的环 状质粒 DNApPROTO, 不知 限制性 图谱。 我们用 限制酶 A 或 酶 B 消化 产生 1 个 9kb 的线性 DNA, 说明 每种酶 在质粒 DNA pPROTO 中 只有单 一酶切 位点 。为了 确定酶 A 和酶 B 在此 DNA 中 酶切位 点的相 应位置 ,将 pPROTO 用 两种酶 混 合消化 ,得到 4kb 和 5kb 的两种 DNA 片段 ,因 此这两 个限制 酶切位 点相距 4kb。 限制酶 C 在 pPROTO 中有 3 个酶 切位点 ,消化 后产生 lkb, 2kb 和 6kb 的 3 个片 段 。用酶 A 和酶 C 消化 ,电 泳可见 4 条带 。酶 C 单独 消化时 产生的 6kb 的 DNA 片段消 失 ,产生 1.5kb 和 4.5kb 两个 新片段 ,而酶 C 单独 消化 产生的 lkb 和 2kb 的 DNA 片段 仍然 保留, 说明酶 A 的切 割位 点位于 6kb 的片段 之中。 这样 ,就有 4 种可能 的限制 性图谱 (图 4.2)。 在 6kb 的酶 C 片段内 ,酶 A 的切点 有两 种可能 的位置 ,即分 别在离 6kb 片 段两端 1.5kb 的 位置。 lkb 和 2kb 酶 C 片段与 6kb 的酶 C 片段 亦有 两种可 能的排 列顺序 ,因 而存在 4 种可能 的限制 性图谱 。为 了得到 准确 的图谱 ,我 们用酶 B 和酶 C 混合 消化此 DNA, 如得到 0.5kb, 1.5kb, 2kb 和 6kb 4 种 DNA 片段, 说明酶 B 的切 点在酶 C lkb 片 段之中 。据 此便可 得知第 4 种图 谱为此 DMA 的正 确限制 性图谱 (图 4.2)。 • 288 • 图 4 . 2 pPROTO 的限制 性图谱 (三) 已知 结构质 粒中克 隆外源 DNA 的限制 性作图 此法是 将外源 DNA 插入到 一已知 结构的 载体中 ,构 成重组 DNA 分子 ,再 用相同 的 限制酶 平行消 化重组 DNA 分子和 载体, 对目的 DNA 进 行限制 性作图 的一种 方法, 该法迅 速有效 。例如 PBR322 是大肠 杆菌质 粒载体 ,其 核苷 酸序列 和限制 性图谱 均已搞 清 。它由 4363bp 组成, 其上有 I 和 £coR I 的单 一酶切 位点, I 的 切点与 £coR I 的切 点相距 754bp。 我们用 Pw I 将此质 粒切开 ,插 入外源 cDNA, 即构成 pcDNA。 首 先用 I 分 别切割 pBR322 和 pcDNA, 结果 pBR322 切割 后产生 4363bp 的线状 DNA, 而 pcDNA 切割后 则产生 lOOObp 和 4363bp 的 2 个片段 ,说 明重 组质粒 pcDNA 中 已插入 的外源 DNA 为 lOOObp (图 4.3)。 再用 £coR I 分 别切割 pBR322 DNA 和 pcDNA, PBR322 切割 后产生 4363bp 的线状 DNA, pcDNA 切割 后产生 300bp、 900bp 和 4163bp 的 3 个片段 。根据 cDNA 与载体 £c〇R I 位点的 相应位 置可以 推导出 cDNA 插入 物中有 2 个 £c〇R I 切点, 这两个 切点分 别位于 CDNA —端 146bp 和 446bp 的 位置。 • 289 . EcoR I Pst\ cDNA insert j / 1 〇〇〇 bp Pst l 3609 bp 4363 bp 图 4.3 pcDNA 的限制 性图谱 二、 限制性 内切核 酸酶部 分消化 法作图 部分消 化法的 基本原 理是首 先以某 个酶对 DNA 进行完 全消化 ,水解 产物通 过凝胶 电 泳分离 ,测 定各片 段的相 对分子 质量。 另将此 DNA 分子 用同一 种酶部 分水解 ,将部 分水解 产物用 同样条 件的电 泳分离 和测定 相对分 子质量 。因为 就一个 DNA 分子 而言, 完全 水解所 产生的 DNA 片段 肯定多 于部分 水解。 但水解 样品中 DNA 样 品不可 能只有 一 个分子 ,在部 分水解 过程中 ,由 于水解 程度参 差不齐 ,所 以部分 水解产 物的电 泳条带 将多 于完全 水解产 物的电 泳条带 ,而 且在片 段的相 对分子 质量大 小上必 然存在 重叠现 象。 即某些 部分水 解片段 的相对 分子质 量等于 2 个或 2 个以 上完全 水解片 段之和 。根据 两 类消化 中片段 大小的 关系和 交错重 叠现象 ,找出 各片段 的邻近 位置, 排出它 们的顺 序 ,就得 到了某 DNA 的物 理图谱 。例如 ,用 AwII 消化 一个相 对分子 质量为 18.1kb 的线状 DNA, 完全消 化得到 8 个片段 ,部 分消 化产生 14 个片段 ,求 其物理 图谱。 完全消 化的片 段是: A (4.6kb)、 B (4.0kb)、 C (3.3kb)、 D (2.5kb)、 E (2.0kb)、 F (l.Okb)、 G (0.5kb)、 H (0.2kb)。 部分 消化的 片段是 : 6.6kb、 6.5kb、 5.3kb、 4.6kb、 4.2kb、 4.0kb、 3.8kb、 3.5kb、 3.3kb、 2.5kb、 l.Okb、 0.7kb、 0.5kb、 0.2kb〇 排除 两类消 化产物 中的共 有片段 ,剩下 7 个片段 6.6kb、 6.5kb、 5.3kb、 4.2kb、 3.8kb、 3.5kb、 0.7kb。 因为 部分消 化的大 片段是 完全消 化的几 个小片 段之和 。从相 对分子 质量大 小得到 : • 290 • 6.6kb = 4.6kb + 2kb (A+E) 6.5kb = 4.0kb + 2.5kb (B + D) 5.3kb = 3.3kb + 2kb (C + E) 3.8kb = 3.3kb + 0.5kb (C+G) 0.7kb = 0.5kb + 0.2kb (G+H) 片段 4. 2kb 有两种 可能的 组合: 4.2kb = 4.0kb + 0.2kb(B+H) 或 = 2.5kb+1.0kb + 0.5kb + 0.2kb(D+F + G+H) 片段 3.5kb 有 3 种可能 的组合 : 3.5kb = 2.5kb+ 1.0kb(D + F) 或 = 2.0kb+ 1.0kb + 0.5kb(E + F + G) 或 = 3.3kb + 0.2kb(C + H) 以上 述结果 为基础 ,再根 据它们 之间的 交错重 叠现象 ,即可 组建出 此线型 DNA 的 物 理图谱 (图 4.4)。 1 4.6 0.2 1 2.0 | 3.3 I 0.5 |^| 1.0 | 2.5 I 4.0 A 1 1 E C G H F D 1 1 1 1 1 1 B 1 1 0 10 20 1 1 30 40 50 60 70 80 基因 组图距 /% 1 通 1 1 祖 90 1 100 1 0 2 4 6 8 10 12 14 基因 组大小 /kb 16 18 图 4.4 18.1kbDNA 的 AuzII 物 理图谱 用完全 消化的 小片段 相加成 部分消 化的大 片段时 ,片段 4.2 有两 种可能 ,片段 3.5 有 3 种可能 ,但仅 分别以 第二种 和第一 种可能 为正确 答案。 三 、末 端标记 法作图 构建 DNA 物理图 谱的末 端标记 法实质 上就是 部分消 化法, 但它比 部分消 化法精 确 。在 用一个 酶对某 DNA 进行 部分消 化之前 ,首先 进行此 DNA 的 5' 和 (或 ) 3' 末端标 记 ,然后 对末端 标记的 DNA 进行部 分消化 ,进 行凝 胶电泳 并将凝 胶上的 DNA 带转到 硝酸 纤维素 薄膜上 ,压 X 光片 ,放射 自显影 。根据 DNA 的部 分消化 ,完 全消化 和放射 自显影 的结果 便可准 确构建 DNA 的物理 图谱。 1. 原理 用低频 率切割 的限制 酶消化 DNA, 电 泳分离 DNA 片段 ,用 32P 末端标 记消化 产物, 再用 高频率 切割的 限制酶 部分消 化末端 标记的 DNA 片段, 电泳分 离片段 并进行 放射自 显影 ,可确 定限制 性位点 离标记 末端的 位置。 2. 材料 纯化的 DNA 样本 限制 性内切 核酸酶 (限制 酶应在 -20X: 保存 ,不 要将酶 在冰浴 中放置 过久和 放在超 过 Ot: 以上的 环境里 ) . 291 • 10 X 限制酶 缓冲液 3. 操 作步骤 (1) 用低频 率切割 的不同 限制性 内切核 酸酶消 KDNA (如 : £coR 丨、 ni、 BawH I、 Psf I、 /C/w I、 I、 SaZ I 和 X/io I 等 )〇 (2) 用 32P 末端标 记消化 产物。 5' 末端可 先用小 牛肠碱 性磷酸 酶处理 ,再用 T4 多核 苷酸激 酶进行 标记。 3' 末端可 先用大 肠杆菌 DNA 聚合酶 1 Klenow 片段或 T4 DNA 聚合 酶来 标记。 (3) 用第二 种内切 酶消化 DNA 片段 。通 过凝胶 电泳分 离产物 ,纯化 那些仅 单末端 带 放射性 标记的 DNA 片段。 只有被 两种酶 消化的 片段才 带有一 端标记 ,得 自步骤 (1) 的 片段如 果不被 第二种 酶消化 将保留 两个末 端标记 ,它 们对后 继的分 析没有 用处。 (4) 用系 列稀释 酶法以 相对高 频度切 割的限 制酶部 分消化 分离的 DNA 片段 ,电泳 分 离片段 并进行 自显影 曝光。 (5) 用 放射性 标记的 DNA 相对分 子质量 标准, 估算出 片段的 长度。 末端 标记的 Ms/» I 切割的 pBR322 是 <650bp 片 段长度 的理想 相对分 子质量 标准。 4. 实例 末 端标记 DNA 的部 分消化 法作图 有 一质粒 pPROTO 为 9kb 的环状 DNA, 其 上有酶 A 和酶 B 的单 一切点 。经酶 A 消 化 ,产 生一个 9kb 的线型 DNA, 此 DNA 再用酶 B 消化, 则产生 4kb 和 5kb 两个 DNA 片段 。我们 通过电 泳回收 5kb 的 DNA 片段 ,用 32P 标记此 DNA 片段的 一端, 再用酶 D 部 分消化 DNA 片段, 电泳分 离其消 化产物 ,经 放射自 显影得 2.7kb, 4.0kb 和 5.0kb 的 3 条放射 性带。 说明酶 D 在 pPROTO DNA 上有两 个切点 ,分 别位 于离酶 A 切点 2.7kb 和 4kb 的位置 ,同时 也说明 32P 标 记在酶 A 切点 的一端 。如果 32P 标 记在酶 B 切 点的一端,则应产生1.0吐,2.3汕和5.0吐的3条放射性带(图4.5)。 A D D B * * * I 32P 2.7 kb 1.3 kb 1.0 kb 图 4.5 末 端标记 DNA 的部 分消化 法图谱 第三 节用于 修饰与 放射性 标记核 酸的酶 除限 制性内 切核酸 酶外, 用于核 酸操作 的还有 DNA 聚 合酶、 RNA 聚合酶 、核 酸外 切酶等 许多其 他酶类 ,了 解这些 酶的特 性与用 途对从 事分子 生物学 的工作 者来说 是十分 必要的 。厂 商提供 的酶制 剂一般 质量都 非常好 ,只要 维持酶 在反应 混合物 中的稳 定性, 提供合 适浓度 的底物 ,酶就 可发挥 最高的 活性。 . 292 • 用 于操作 核酸的 试剂和 放射性 同位素 (一) 贮 液 溶液应 用去离 子水配 制并分 成小份 保存。 大部分 贮液在 -20X: 可 保存数 年之久 ,如 果保持 无菌, 在室温 下可保 持数年 。二 硫苏糖 醇可在 -20X: 稳 定数月 ,它不 能高压 ,使 用 时应注 意置于 冰浴。 酸沉 淀溶液 10mg/mL 无菌 的明胶 10mg/mL 牛血清 白蛋白 (BSA), 缓冲酚 O_lmol/L 二硫 苏糖醇 (DTT) 10mg/mL 大 肠杆菌 tRNA 标准酶 稀释液 (SED) O.5mol/L EDTA, pH8.0 乙醇 V 甘油 1 mol/ L 氯化钾 0 . 2mol/ L 氯化儀 5mol/L 和 lmol/L 氯化钠 TE 缓冲液 lmol/L Tris-HCl, pH7.5 lmol/L Tris-HCl, pH8.0 lOmg/mL 和 500Mg/mL 鲑精 蛋白或 DNA (经超 声打断 ) (二 ) l〇x 酶 缓冲液 核苷 三磷酸 不应该 包含在 10X 或 5X 缓冲 液中, 因为高 浓度的 Mg2+ 会导致 不溶复 合物的 形成。 牛血清 白蛋白 (BSA) 或 明胶对 于酶活 性不是 必需的 ,但这 有助于 酶的稳 定。 lx 反应体 系见表 4.5。 表 4.5 酶反应 的通用 指南# 酶 反 应体积 / /iL DNA 量 /f^g 酶量 /U 每种 dNTP mmol/L 反 应温度 /■C 时间 / min 备注 DNA 连接酶 大 肠杆菌 DNA 连接酶 50 1 10 100 NAD 10 〜 25 2 〜 16h T4 DNA 连接酶 50 1 1 500 ATP 12 〜 30 卜 16h DNA 聚合峰 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 25 1 3 20 20 〜 37 15 — 30 a T4 DNA 聚合酶 50 2 5 100 11 20 T7 DNA 聚合酶 50 2 5 300 37 20 经 修饰的 T7 DNA 聚合酶 50 2 10 300 37 20 Tag DN A 聚合酶 100 0.1-1 2.5 200 94,55,72 1 〜 2 a, b 外切 核較酶 外切 核酸酶 VII 50 2 10 — 37 卜 30 外切 核酸酶 111 50 1 0.2 — 37 30 a • 293 . 续表 m 反 应体积 / fiL DNA 量 /网 酶量 /u 每种 dNTP mmol/L 反 应温度 /■C 时间 / min 备注 入外切 核酸酶 50 2 10 — 37 卜 30 T7 基因 6 外切 核酸酶 50 2 5 — 37 卜 30 激酶 T4 多核苷 酸激酶 5' 标记 (正向 反应) 30 1 〜 50pmolc 20 50d 37 60 a 寡 核苷酸 30 卜 10c 20 1000 ATP 37 60 a 5' 标记 (交换 反应) 30 1 〜 50pmolc 20 60d 37 60 a, e BaZ 3丨 核酸薄 50 2 10 — 30 卜 30 a 脱氧 核糖核 酸酶丨 (DNA 酶 I) 100 2 1 — 37 卜 30 a 绿豆 核酸酶 100 1 15 — 37 30 a SI 核酸酶 100 2 10 — 37 30 a 磷较酶 BAP 50 1 〜 20pmolf 0.1 — 60 30 a CIP 50 1 〜 20pmolf 0.1 — 37 30 a RNA 修饰酶 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 50 2g 10 300 NTP 37 30 h SP6, T7, T3RNA 聚合酶 50 2g 10 400 NTP 37 30 h Poly (A) 聚合酶 50 12.5 RNA 5 250 ATP 37 30 逆 转录酶 50 1 mRNA 40 40 37 30 i RNase H 100 2 RNA: DNA 1 — 37 20 a T4 RNA 连接酶 50 2g 1 2000 ATP 17 10h a 末端 转移酶 50 4f 10 20 37 30 * 很多反 应参数 如反应 体积、 dNTP 浓度 、反 应时间 和温度 依具体 的反应 而不同 。将 相应的 l〇x 或 5 x 缓冲液 (见本 节前面 的配方 ) 稀释成 IX, 并按 表中所 述建立 起各反 应体系 。除 非在本 表“备 注”栏 内另有 注明, 反 应的终 止是在 75t: 温育 lOmin 或加入 2ML 0.5mol/L EDTA。 a. 如下述 提示终 止反应 —— DNase I: 5ML 0.5mol/L EDTA; 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 丨: 75X: lOmin 或 lpL O.5mol/LEDTA; TagDNA 聚合酶 :置于 -20X:; 外切 核酸酶 VII: 酚抽提 和乙醉 沉淀; T4 多核 苷酸激 酶 : lML0.5mol/LEDTA, 接着 酚抽提 ,乙 醇沉淀 ; 核酸酶 : 75X: lOmin 或 5nL0.5mol/LEDTA; S1 核酸酶 、绿 豆核 酸酶和 RNaseH: lnL0.5mol/LEDTA; BAP: 加 SDS 至 0.1%、 蛋白酶 K 至 lOOfxg/mL, 37X: 温育 30min, 然后 酚抽提 2 次 ,乙醇 沉淀; CIP: 75C lOmin 或 酚抽提 后乙醉 沉淀; T4RNA 连接酶 : 2ML0.5mol/L EDTA。 b. DNA 为模板 , 加入寡 核苷酸 引物各 OJ—lpmol/L。 c. 正向反 应:脱 磷酸化 (5' 端 ); 寡核 苷酸: 接头; 交换 反应: 磷酸化 (5' 端 )。 d. pmol [y-32P] ATP, 比活性 >3000 Ci/mmol (正 向反应 : 15(VCi, 交 换反应 : 180fxCi)。 e. 加 5mmd/LADP 并以咪 唑代替 Tris。 f. BAP 和 CIP: pmolDNA 末端; 末端转 移酶: PmolDNA3' 端。 g. RNA 聚合薄 ,以 DNA 为启 动子; T4RNA 连接酶 :底物 为单链 DNA 或 RNA。 h. SP6 加 lmmol/L 亚 精胺。 i •加 lOOfxCi [a-J2P] dNTP, 比活 >400 Ci/mmol 和 lfig oligo (dT) 丨 2-18。 . 294 • 5 X 31 核酸酶 0 . 25mol/L Tris-HCl, pH8 . 0 50mmol/L MgC【2 3mol/L NaCl 0.25mg/mL BSA 或胶原 细 菌碱性 磷酸酶 (BAP) 0. 5mol/L Tris-HCl, pH8.0 lOmmol/L ZnCL T3 RNA 聚合酶 (见 SP6 噬菌体 RNA 聚合酶 ) 小牛 肠碱性 磷酸酶 (CIP) 0.2mol/L Tris-HCl, pH8.0 lOmmol/L MgC【2 lOmmol/L ZnCI, 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 脱 氧核糖 核酸酶 I (DNase 1} 0.5mol/L Tris-HCl, pH7.5 0.1mol/LMgCl2 ( 用于 单连) 或 0.1mol/LMnCl2 ( 用于 双连) 0 . 5 mg/ mL BSA 外切 核酸酶 VII (exoVII) 0 . 7mol/L Tris-HCl, pH8 . 0 80mmol/L EDTA O.lmol/L 2-ME 0.5mg/mLBSA 或胶原 入 噬菌 体外切 核酸酶 0.7mol/L 甘氨酸 -KOH, pH9.4 25mmol/L MgC【2 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 绿豆 核酸酶 0.3mol/L 乙酸钠 , pH5.0 0.5mol/L NaCl lOmmol/L 乙酸锌 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 大 肠杆菌 DNA 连接酶 400mmol/L Tris-HCl, pH8.0 O.lmol/L MgCl2 50mmol/L DTT 50mg/ mL BSA 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 或 Klenow 酶 0.5mol/L Tris-HCl, pH7.5 O.lmol/L MgCl2 lOmmol/L DTT 50mg/mL BSA 或胶原 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 0 . 4mol/L Tris-HCl, pH8 . 0 O.lmol/L MgCl2 50mmol/L DTT 0.5mol/L KC1 0.5mg/mL BSA 或胶原 外切 核酸酶 III (exo III) 0.5mol/L Tris-HCl, pH7.5 50mmol/L MgCL 50mmol/L DTT 0.5mg/mL BSA 或胶原 T4 DNA 连接酶 0.5mol/L Tris-HCl, pH7.5 50mmol/L MgCL 50mmol/L DTT 0.5mg/mL BSA 或胶原 T4 DNA 聚合酶 0.5mol/L Tris-HCl, pH8.0 50mmol/L MgC】2 50mmol/L DTT 0.5mg/mL BSA 或胶原 T4 多核苷 酸激酶 0.5mol/L Tris-HCl, pH7.5 (正向 反应) 或 0.5mol/L 咪唑盐 酸盐, pH6.6 (交换 反应) O.lmol/L MgCl2 50mmol/L DTT 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 poly (A) 聚合酶 0.4mol/L Tris-HCl, pH8.0 0. lmol/L Mg〇2 25mmol/L MnCl, 2 . 5mol/L NaCl • 295 . 0 • 5mg/mL BSA 逆 转录酶 O.5mol/L Tris-HCl, pH8.2 50mmol/L MgCl〗 50mmol/L DTT 0.5mol/L KC1 0.5mg/mL BSA 或胶原 核糖 核酸酶 H 0.2mol/L HEPES-KOH, pH8.0 0.5mol/L KC1 40mmol/L MgCl〗 1 0 mmol/ L DTT 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 核酸酶 SI 0.5mg/mL 乙 酸钠, pH4.5 lOmmol/L 乙酸梓 2. 5mol/L NaCl 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 SP6 噬菌体 RNA 聚合酶 0 . 4mol/L Tris-HCl, pH7 . 5 0• lmol/L MgCb 50mmol/L DTT 0.5mg/mLBSA 或胶原 T4 RNA 连接酶 0.5mol/L HEPES, pH8.3 0. lmol/L MgCl2 50mmol/L DTT 0.5 mg/ mL BSA T7DNA 聚合酶 (天然 和经修 饰的) 0.4mol/L Tris-HCl, pH8.0 0.1mol/LMgCl2 ( 天然或 化学修 饰) 50mmol/L MgCl〗 ( 遗传工 程修饰 ) 50mmol/L DTT 0.5mol/L NaCl 0 . 5mg/mL BSA 或胶原 T7 基因 6 核酸 外切酶 III (见 外切酶 III) T7 RNA 聚合酶 (见 SP6 聚合酶 ) Tag DNA 聚合酶 0. lmol/L Tris-HCl, pH8.4 15 mmol/ L 或 30 mmol/ L 或 45mmol/L MgCl〗 500mmol/L KC1 lmg/mL 胶原 末端 转移酶 lmol/L 二甲胂 酸钠, pH7.0 10mmol/L C0CI2 1 mmol/ L DTT 0.5mg/mLBSA 或胶原 (三) 酶反 应条件 及应用 表 4.5 给 出了酶 反应条 件的通 用指南 。因 酶的很 多反应 参数依 赖于它 的具体 应用, 故有 关进一 步的详 情可参 阅各种 工具酶 的分类 描述。 — 些核酸 修饰酶 类的应 用见表 4.6, 对于某 些应用 ,有 不止一 种的酶 可满足 要求。 表 4.6 核酸修 饰酶类 的应用 应用 酶 产 生平端 除去 3' 凸出端 T4 或 T7DNA 聚合酶 补平 3' 凹进端 T4 或 T7DNA 聚合酶 , Klenow 酶 • 296 • 续表 应 用 酶 cDNA 合成 从 RNA 出发 逆 转录酶 第二链 Klenow 酶 克隆 DNA 片段 CIP; T4DNA 连 接酶; Klenow 酶 和限制 性内切 核酸酶 降解 DNA 5、3, T7 基因 6 和 X 噬菌 体外切 核酸酶 3W 外切 核酸酶 III 5,— 3, 和 3、 5' BaZ 31 核酸酶 外切 核酸酶 ,单链 (3' 和 5') 外切 核酸酶 VII 内切 核酸酶 ,双链 非 特异性 DNase I 和 微球菌 核酸酶 特异性 限制 性内切 核酸酶 内切 核酸酶 ,单链 SI、 BaZ 31 和绿豆 核酸酶 降解 RNA 核糖 核酸酶 A 和 (或) T1; 微球菌 核酸酶 降解 RNA: DNA 双 链中的 RNA 核糖 核酸酶 H 双链体 BAP 和 CIP DNA 测序 经 修饰的 T7DNA 聚 合酶; TaqDNA 聚 合酶; Klenow 酶 内 含子定 位作图 T4 多核 苷酸 激酶; 逆 转录酶 外切 核酸酶 VII; S1 核酸酶 DNA 5' 端标记 T4 多核苷 酸激酶 DNA 3' 端标记 经 修饰的 T7DNA 聚 合酶; Klenow 酶; 逆转 录酶; 末端 转移酶 RNA 3' 端标记 Poly (A) 聚 合酶; T4 RNA 聚合酶 DNA 的连接 大肠 杆菌和 T4 DNA 连接酶 RNA 的连接 T4 RNA 连接酶 mRNA 5' 端定 位作图 S1 或 绿豆核 酸酶; 逆转 录酶; 核糖 核酸酶 A DNA 甲基化 甲 基化酶 构建 嵌套式 缺失体 BaZ 31 核酸酶 或外切 核酸酶 III + S1 或绿豆 核酸酶 切 口平移 DNasel; 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 寡核苷 酸延伸 T7 DNA 聚 合酶; Klenow 酶 磷酸化 T4 多核苷 酸激酶 RNA 的 poly (A) 加尾 Poly (A) 聚合酶 聚 合酶链 式反应 (PCR) DNA 聚合酶 引 物指导 的合成 Klenow 酶 置 换合成 T4 和 T7 DNA 聚合酶 限制 酶作图 限制 性内切 核酸酶 DNA 加尾 末端 转移酶 RNA 加尾 Poly (A) 聚合酶 转录 ,启动 子特异 大肠 肝菌或 SP6、 T3 和 T4 RNA 聚合酶 (四) 核苷 三磷酸 核苷 三磷酸 (NTP) (HPLC 纯) 在 溶液中 不稳定 ,应分 装小份 贮存于 - 20C, 这 • 297 • 样 可保存 1 年 。可从 Pharmacia 公 司购买 已配成 l〇〇mmol/L 溶 液形式 的核苷 三鱗酸 (NTP) 或脱 氧核苷 三磷酸 (dNTP)。 如果是 冻干粉 形式, 它们可 按如下 的步骤 溶于去 离子 水中。 (1) 溶于 水至约 30mmol/L 的浓度 ,用 Imol/LNaOH 调 pH 至 7.0。 使用表 4.7 提 供的消 光系数 ,用分 光光度 计测出 其实际 浓度。 (2) 用以 上母液 ,配制 5mmol/L 浓度 的各种 dNTP 或 NTP 工 作液。 (3) 配 制如下 的含等 摩尔的 4 种 DNA 或 RNA 前体的 dNTP 和 NTP 混合液 : 5mmol/L4NTP 混合液 : ATP、 UTP、 CTP、 GTP 各 5mmol/L 5mmd/L4dNTP 混合液 : dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP 各 5mmol/L 0.5mmol/L4dNTP 混合液 : dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP 各 0.5mmol/L (4) 用于 放射性 标记时 ,配 制的贮 液省去 了某种 特定的 dNTP 或 NTP, 但含 有等摩 尔量 的其余 3 种前体 。如: 5mmol/L3 种 NTP 混合液 (无 UTP): ATP、 GTP、 CTP 各 5mmol/L, 用 于以放 射性 标记的 UTP 来标记 RNA; 5mmol/L 和 0.5mmol/L 的 3 种 dNTP 混合液 (无 dATP): dTTP、 dCTP、 dGTP 各 5mmol/L 和 0.5mmol/L , 用于 以放射 标记的 dATP 来标记 DNA。 其他 3 种 NTP 或 dNTP 混合 液配制 时省去 放射性 标记所 选用的 前体。 表 4.7 核苷 三磷酸 的性质 核苷 三磷酸 A— (pH7.0) En^XlO"3 (PH7.0) 280/260 吸收比 (pH7.0) 碱基的 pK, 值 ATP 259 15.4 0.15 4.0 CTP 271 12. 8a 0.97 4.8 GTP 252 13.7 0.66 3.3 9.3 UTP 262 10.0 0.38 9.5 dATP 259 15.4 0.15 3.6 dCTP 280 13. la 0.98 4.3 dGTP 253 13.7 0.66 3.5 9.7 dTTP 267 9.6 0.73 9.3 a. 在 PH2.0 进行分 光光度 分析。 (五) 标记 核酸的 放射性 同位素 各种比 活度的 32P 标 记前体 NTP 或 dNTP 都 可购得 。一般 来说, 《位 标记放 射活度 为 400 〜 800Ci/mmol, 而 "y 位标记 的可达 3000~7000Ci/mmol〇32P 是制备 高比活 放射性 探针 和大多 数放射 自显影 方法所 优先选 用的同 位素。 35S 标记 的三磷 酸核苷 酸是以 巯基取 代与一 个磷酸 共价相 连的氧 ,这 对许多 酶的活 • 298 • 性具有 明显的 干扰。 35s 的放射 能量相 对较低 ,用 它制备 放射性 探针时 ,其 比活性 较低, 但由于 其低的 放射能 量一般 不会引 起较多 的核酸 损伤, 因而比 较稳定 。近 来的双 脱氧测 序反 应中, 35S 的低能 量使放 射自显 影的成 象更清 晰可辨 ,因 此它 已取代 32P 作 为首选 的同 位素。 3H 最基 本的应 用是对 核酸合 成和降 解的定 量分析 。尽管 其亦常 用于原 位杂交 ,但 对于大 多数放 射性自 显影方 法而言 ,其能 量过低 ,显影 不佳。 在某些 特定情 况下, 14c 和 1241 也 可用于 核酸的 放射性 标记。 注意: 在进行 放射性 同位素 的实验 时操作 者应注 意自身 和环境 的保护 。操作 者应当 戴手套 。为减 少暴露 机会, 直接接 触同位 素的实 验均应 在专用 的放射 防护屏 后进行 。同 时 ,应 经常用 手提微 型同位 素监测 仪测量 操作者 及工作 环境中 的同位 素情况 ,及 时发现 可能 的污染 。实验 完毕后 ,应将 同位素 污物倒 于指定 的位置 ,统一 处理。 (六) 酸沉淀 法测定 DNA 和 RNA 中的放 射活性 1. 原理 实验中 常需要 了解标 记核酸 的放射 活性。 已知量 DNA 的总 放射性 强度称 作比活 度 ,通 常表示 单位是 cpm/Vg 核酸 (cpm 即每分 钟计数 )。 在强酸 溶液中 ,大于 20 个核 苷酸 长度的 DNA 或 RNA 分子可 以被定 量沉淀 ,而 前体 dNTP 或 NTP 仍 留在液 相中, 基于此 ,可 用酸沉 淀法测 定核酸 中放射 强度。 2. 村料 500^g/mL 经超 声处理 的鲑精 DNA, 溶于 TE 缓 冲液中 冰冷 的酸沉 淀溶液 100% 乙醇 玻璃纤 维滤膜 (直径 2.4cm, Whatman GF/A) 过 滤装置 闪 烁液和 闪烁瓶 3. 操 作步骤 (1) 取一 次性玻 璃试管 ,加入 lOO^L 鲑精 DNA (500jug/mL) 和已 知体积 (通常 1/xL) 的 含放射 性前体 的反应 混合物 。取 lOpL 点加 至玻璃 纤维滤 膜上。 (2) 向 余下的 90/iL 混合物 中加入 lmL 冰冷 的酸沉 淀溶液 ,冰浴 5 〜 lOmin。 (3) 混合液 经玻璃 纤维滤 膜过滤 ,收 集沉淀 。再用 3mL 酸沉 淀液洗 涤玻璃 试管一 次 ,再 过滤, 滤膜用 3mL 酸沉 淀液重 复流洗 4 次以上 ,再用 3mL 乙醇洗 一次。 (4) 将两 张玻璃 纤维滤 膜烤干 ,分别 置于以 3mL 甲苯 为溶剂 的闪烁 液中, 用液体 闪烁计 数仪测 定放射 活度。 (5) 计 算第二 张滤膜 (测 量核酸 的放射 活性) 与第一 张滤膜 ( 测量样 品的总 放射活 度) 的 cpm 比例 ,确 定核酸 的放射 活性。 . 299 • (七) 柱层析 法分离 放射性 标记的 dna DNA 探针标 记后, 应除去 游离的 dNTP 前体, 以减少 杂交实 验背景 ,保护 研究人 员 免于接 触不必 要的放 射照射 。柱层 析是分 离放射 性标记 的 DNA 的最 有效的 方法。 分离 >100 个核 苷酸的 DNA, Sephadex G-50 和 BioGel P-60 是最常 使用的 两种凝 胶 。分 离寡核 苷酸, 则采用 BioGelP-2 凝胶 。进行 分离纯 化之前 ,将 30g 树 脂加入 300mLTE 缓冲 液中, 加热至 65X: 几小时 (或室 温过夜 ) 使 之溶胀 ,冷却 至室温 ,除去 缓冲液 ,再加 1/2 树脂体 积的新 TE 缓冲液 ,于 室温或 4X: 保存。 1. 材料 TE 缓冲液 6.5 英 寸巴斯 德吸管 硅化 玻璃棉 溶 胀树脂 (如 Bio Rad 公司 生产的 Sephadex G-50 或 Bio-Gel P-60) 2. 操 作步骤 (1) 将 一团灭 菌的少 量玻璃 棉置于 6.5 英 寸的巴 斯德吸 管底部 。最容 易的方 法是用 一支 9 英寸 的巴斯 德吸管 将玻璃 棉推入 6.5 英 寸巴斯 德吸管 的底部 ,以塞 住底部 。见图 4.6。 (2) 用 凝胶悬 浮液装 填吸管 ,随着 凝胶基 质在 重力作 用下沉 积和缓 冲液从 吸管内 滴出, 层析 柱很快 形成, 继续补 加凝胶 ,直至 吸管顶 部 ,但 需留加 200pL 样品 的空间 。整个 装柱过 程约需 5min。 (3) 将 层析柱 置于防 护屏后 避免放 射性照 射, 用移液 管从柱 顶吸去 过多的 缓冲液 ,随着 迅速将 放射性 标记的 DNA 样品加 到柱上 。一 旦样品 进入层 析柱, 立即将 200ML 的 TE 缓冲 液加入 吸管进 行洗柱 ,用 微量 离心管 分步收 集。 每 200ML 的 TE 缓冲液 经过层 析柱需 l~2min。 此 时 DNA 应靠 近柱底 ,而 dNTP 应靠 近柱顶 ,可 用手提 式小型 探测器 检测。 (4) 将 一支新 微量离 心管置 于层析 柱的下 面 ,加 200fiLTE 缓冲液 到柱顶 ,这 样反复 4 次, 共收集 5 管 ,每管 200PL。 (5) 用 一手提 式小型 探测器 检测每 管的放 射活性 。几 乎所有 DNA 都出 现在第 1 管 和第 2 管中, 其余几 管中存 在的放 射活性 是来自 DNA 的降 解产物 (常 见于含 有过多 V 图 4.6 柱层 析分离 标记的 DNA • 300 • DNase I 的 缺口平 移反应 )。 游离的 dNTP 仍留 在柱上 。将 符合要 求的组 分合并 起来。 (6) 对 许多实 验来说 标记的 DNA 探 针可直 接应用 。如 果需要 ,可用 乙醇沉 淀进行 纯化。 用 过的层 析柱和 废弃的 放射性 产物均 属放射 性废物 ,应进 行适当 处理。 (八) 柱离心 法分离 放射性 标记的 DNA 与常规 层析法 不同, 本方法 是通过 离心力 而不是 通过重 力作用 进行柱 子的填 充和流 洗的 。在 同时处 理较多 样品时 ,本法 更快 速适用 。然 而本方 法对未 掺入的 前体 dNTP 的去除 不是非 常有效 。现 已有商 品化的 旋离柱 (Spin-Column) 供应 ,自制 时可按 下述步 骤操作 : 注意 :离心 和工作 区域切 记不可 被同位 素污染 , 应在专 门的放 射线防 护屏后 处理样 品。 (1) 取一只 5mL —次 性注 射器, 将 其底部 出口用 硅化过 的玻璃 棉填塞 上 。然后 往注射 器中加 入均匀 悬浮的 树 脂悬液 ,并将 注射器 放入一 只合适 的 聚丙烯 管子中 ,使其 能在台 式离心 机 中离心 (见图 4.7)。 离心 2 〜 3min, 以填充 柱子。 (2) 将 放射性 样品用 IOOjuL TE 缓冲液 稀释, 加样至 柱子上 。将注 射器置 于一个 新的聚 丙烯离 心管内 ,离心 5min。 (3) 管子底 部的液 体即含 有标记 DNA, 保留 备用。 注意正 确处理 同位素 污物。 二 、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶 DNA 聚合 酶可在 带引物 的双链 DNA 分子的 3' 羟 基端加 上脱氧 核苷酸 ,以使 合成链 从 5' 端向 3' 端延伸 。此 合成反 应需要 4 种脱 氧核苷 三磷酸 (dNTP), 以 与模板 互补的 方式 加入。 另外, DNA 聚 合酶发 挥活性 还需要 镁离子 的参与 (见图 4.8)。 一些 DNA 聚合酶 还具有 3'— 5' 方向 的外切 酶活性 (见图 4.9), 在无 dNTP 时 ,可从 3' 羟 基端降 解单链 或双链 DNA 分子。 dNTP 存在时 ,聚 合酶 活性抑 制可其 对双链 DNA 分子 的外切 酶活性 。另 外一些 DNA 聚合酶 (如大 肠杆菌 DNA 聚合酶 1、 hgDNA 聚合酶 ) 还具 有 5'— 3' 外切 酶活性 (见图 4. 10), 可从 5' 羟 基端降 解双链 DNA。 这种外 切酶活 性可一 次移 去一个 到数个 核苷酸 ,生成 5'- 核苷 单磷酸 ,或 长度为 1〇 个核苷 酸的寡 核苷酸 。各 种 DNA 聚 合酶的 性质总 结于表 4.8。 图 4.7 制作 离心柱 装 有分离 介质的 5mL 注射器 口向下 置入聚 丙烯离 心管中 . 301 • 5. mm 3. 5, 4dNTP ( ^ 5' 3' 3*— ■— 5* dNTP 图 4.8 DNA 聚 合酶的 5'—3' 聚合 酶活性 图 4.9 DNA 聚 合酶的 3'—5' 外切 酶活性 实例: 302 • 图 4. 10 DNA 聚 合酶的 5'—3' 外切 酶活性 表 4.8 DNA 聚合酶 的性质 酶 3'—5' 外切 酶活性 外切 酶活性 聚 合速率 持续合 成能力 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 低 存在 中等 低 Klenow 酶 低 无 中等 低 逆 转录酶 无 无 慢 中等 T4 DNA 聚合酶 高 无 中等 低 天然 T7 DNA 聚合酶 高 无 快 高 化 学修饰 T7 DNA 聚合酶 低 无 快 高 遗 传修饰 T7 DNA 聚合酶 (A28) 无 无 快 高 Tag DNA 聚合酶 无 存在 快 高 (一) 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I DNA 聚合酶 I 最 先由美 国生物 化学家 Komberg 于 1956 年发现 。由 单条多 肽链组 成 ,分子 质量为 109kDa。 由大 肠杆菌 />〇ZA 基 因编码 ,具有 3 种 不同的 酶活性 ,即 5'— 3'DNA 聚合酶 活性、 5'— 3' 外切酶 活性和 3'-5' 外切酶 活性。 3'— 5' 外切酶 活性比 T4 或 T7DNA 聚合 酶活性 低得多 。同时 还具有 RNA 酶 H 的活 性, RNaseH 活 性是大 肠杆菌 生存所 必需的 ,但 在分子 克隆中 未用到 此活性 。在分 子克隆 中常用 此酶来 制备高 比活的 DNA 探针。 1. 反 应条件 25/mL 反 应体系 : 50mmol/L Tris-HCl pH7 . 5, 10mmol/L MgC^, lmmol/L DTT, 50Mg/mL BSA, 20/imol/L 4 种 dNTP 混合液 (其 中一种 或一种 以上为 a-32 P 标记的 dNTP), 1埤 DNA, 3U DNA 聚合酶 I。 反应 体积, 4 种 dNTP 的 浓度, DNA 的量依 具体实 验而变 。加入 l/xL0.5mol/L EDTA^75t: 加热 lOmin 终 止反应 。切口 平移反 应应在 15X: 进行 ( 一般为 l~3h)。 DNA 聚合酶 催化的 其他反 应应在 20~371C 进行 15~30min。 制备高 比活的 DNA 探针 ,一种 或几种 dNTP 的 浓度应 减少至 l~2Mmol/L。 例如, 在 25/xL 的 反应体 积中, 400 〜 800Ci/mmol 32P 标记的 dATP 25/iCi 或 3000Ci/mmol 32P 标记的 dATP lOOfiCi 可替代 2(Vmol dATP。 为了 DNA 的有 效合成 ,任 何一种 dNTP 的 浓 度都不 能低于 l^tnol/L, 这一 浓度接 近米氏 常数。 如采用 高比活 (3000~5000Ci/ mmol) dNTP 前体 ,反 应体积 应减少 ,或者 放射性 标记的 dNTP 的量 应增加 以维持 1/imol/L dNTP 的 浓度。 2. 用途 (1) 用切口 平移方 法标记 DNA。 在 所有聚 合酶中 只有大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 能用 于 此反应 ,因为 它具有 5'— 3' 外 切核酸 酶活性 ,可 以在聚 合酶沿 DNA 链推 进之前 ,从 • 303 • DNA 链上 去除核 苷酸。 (2) 此全酶 原用于 cDNA 克隆中 合成第 二链, 但后来 已让位 于逆转 录酶和 (或) 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段 )。 因 为后二 者不含 5'— 3' 外切 核酸酶 活性。 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 5'—3' 外切核 酸酶活 性可以 降解寡 核苷酸 ,而 后者常 作为合 成 cDNA 第 二链的 引物。 (3) 用于对 DNA 分子的 3' 突出尾 进行末 端标记 。此 反应包 括两步 ,首 先利用 3' — 5' 外切核 酸酶活 性去除 DNA 的 3' 突出尾 而产生 3' 凹端 。然后 ,在 高浓度 的放射 性标记 的 核苷酸 前体的 存在下 ,外 切降解 反应与 dNTP 掺入 3' 端的 反应达 到平衡 。上述 反应包 括 从凹端 或平端 DNA 上周 而复始 地去除 并置换 3' 端 核苷酸 ,故有 时称为 交换反 应或置 换反应 。如 果计划 用这类 反应进 行末端 标记, 丁4 噬菌体 DNA 聚合 酶是首 选的酶 。虽然 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 和 T4 噬菌体 DNA 聚合 酶都可 进行上 述反应 ,但 后者具 有更强 的 3'—5' 外切 核酸酶 活性。 许多 情况下 ,可 用单一 的一种 缓冲液 进行限 制酶切 割及其 后的末 端标记 。但 用于聚 合酶反 应的缓 冲液并 不适用 于所有 限制酶 。如果 DNA 聚合 酶缓冲 液不能 用于限 制酶消 化反应 , 那么就 必须将 限制酶 反应与 末端标 记分两 步进行 。这种 情况下 ,先 在适 当的限 制酶 缓冲液 中切割 DNA, 然 后用酚 / 氯仿 抽提以 去除限 制酶, 再用乙 醇沉淀 DNA 并重 溶于 TE, 最后 加适当 体积的 10 XDNA 聚 合酶缓 冲液。 3. 实例 切口平 移标记 DNA。 双链 DNA 分 子的一 条链有 切口时 ,大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 能 将核苷 酸残基 加到切 口处的 3' 羟基端 。且 由于此 酶具有 5'— 3' 外切 酶活性 ,它 可从切 口的 5' 端 除去核 苷酸。 5' 端核 苷酸的 去除与 3' 端核苷 酸的加 入同时 进行, 导致切 口沿着 DNA 链移动 ,即 切口 平移。 DNA 模板的 切口由 DNase I 催 化产生 。通过 用高放 射比活 性核 苷酸替 换原有 核苷酸 ,从而 制备出 具有高 比活性 (>108cpm) 的 32P 标记的 DNA (见图 4.11)。 具体方 法如下 : (1) 制备供 0.25MgDNA 用的 反应混 合液: 2.5^tL 0.5mmol/L3 种 dNTP 的 混合液 (不加 dATP) 2.5^L 10 x DNA 聚合酶 I 缓冲液 lO^tL 3000Ci/ mmol «-32P 标记的 dATP (lOOpCi) 1/iL DNase I (从 lmg/mL 存液 中按标 准稀释 法稀释 10 000 倍) lfiL DNA 聚合酶 I (5 〜 15U) 整 个操作 于冰浴 进行。 (2) 加入 8MLDNA (含 0.25pgDNA), 总 体积为 25pL, 立即于 12 〜 14X: 温育 15~ 45min〇 (3) 加入 1/iL 0.5mol/L EDTA (pH8.0), 3yL 10mg/mL tRNA 和 100pL TE 缓冲 液终止 反应。 (4) 酚提抽 反应物 ,将 液相转 入新的 EP 管。 (5) 用 柱层析 法分离 标记的 DNA 与 未掺入 DNA 的 放射性 前体。 用 SephadexG-50 或 Bi〇GdP-60 柱层 析分离 标记的 DNA。 亦可 采用乙 醉沉淀 法分离 ,但 在操作 • 304 • 中易 造成放 射性同 位素的 污染。 (6) 如需要 ,可取 lyL 测 32P 的放射 活性。 此方法 容易得 到每分 钟计数 108/# 高比 活性的 DNA。 现已有 商业化 切口平 移标记 DNA 探针 的试剂 盒供应 ,但它 们不能 得到高 比活的 DNA 探针 ,而且 昂贵。 5, TTTTTTTTTTTTTT 3, (1) (2) (4) OH P 双链 DNA DNA _ I 消化产 生的带 3' -OH 缺口的 双链 DNA £co/z DNA 聚合酶 15' — 3^ 切酶活 性切 去缺口 5' 端一 至数个 核苷酸 在五 .co/i'DNA 聚合酶 I 的 作用下 标记的 核苷 酸被加 至缺口 3' 端 3~4 步重复 作用导 致缺口 平移, 合成带 有 标记的 DNA 链 图 4.11 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 催化的 切口平 移反应 4. 方 法评注 (1) 切口 平移法 制备高 比活性 DNA 探针 ,不仅 取决于 dNTP 的 比活性 ,而 且取决 于模板 中核苷 酸置换 的程度 ,此程 度可通 过改变 反应混 合物中 DNase I 的 量和反 应时间 来控制 ,目的 在于建 立使约 30% 〜 40% 的 ct-32P dNTP 掺入 DNA 的条件 。如果 反应时 间 太短, DNase I 的 量过低 ,标记 反应则 不充分 。反之 ,如 果反 应时间 过长, DNase I 的量 过高, DNA 则 被降解 。因 此选择 最佳条 件尤为 重要。 (2) 凝 胶电泳 纯化的 DNA 片段或 不完整 DNA 分子 可进行 切口平 移反应 。在 筛选基 因组 文库或 cDNA 文库时 凝胶过 滤纯化 DNA 片段通 常是需 要的。 DNA 片 段的纯 度将影 响 高比活 度探针 的产生 ,有助 于增加 信号和 减少杂 交实验 的背景 。假 设有 lkb 的 DNA 片段 克隆在 4kb 的 质粒载 体上或 39kb 的 X 噬菌体 载体上 。未 纯化的 DNA 进行 切口平 移 ,只有 20% 或 25% 的标记 DNA 代 表目的 DNA。 相反 ,采用 纯化的 DNA 片段 ,则 100 % 的标记 DNA 代 表目的 DNA。 . 305 • (3) 为了使 大多数 DNA 至少 切口平 移一次 ,对非 常短的 DNA 片段 (<500bP), 需 增加 DNase I 的 董。 (4) 不用 凝胶过 滤纯化 DNA 时, 可用低 融点琼 脂糖通 过电泳 分离切 口平移 DNA 片 段 。此 法节省 时间, 但标记 DNA 不那么 有效。 (二) 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段 Klenow 片段 (Klenow 酶) 是大 肠杆菌 聚合酶 I 的羧基 端片段 ( 全酶的 7〇%), 分 子 质量为 76kDa。 它具有 DNA 聚合酶 活性和 3'— 5' 外切 酶活性 ,不含 5'— 3' 外 切酶活 性 。目前 ,作为 商品提 供的大 肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 酶是用 枯草杆 菌蛋白 酶裂解 完整的 DNA 聚合酶 I 而产 生或者 通过克 隆技术 而得到 的单一 多肽链 。其 详细的 反应条 件见表 4.5。 1. 用途 (1) 补 平限制 酶切割 DNA 产生的 3' 凹端 。在 许多情 况下, 用限制 酶消化 DNA 及随 后用 Klenow 酶补平 3' 凹端或 对带突 出端的 DNA 进行末 端标记 ( 见用途 3) 均可 在同一 种缓 冲液中 进行。 事实上 ,大 肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 酶在所 有限制 酶缓冲 液中均 能良 好地发 挥作用 。但并 非所有 限制酶 都能在 DNA 聚合酶 的缓冲 液中发 挥作用 。因此 建议 用手头 上特定 批次的 酶进行 预试验 。如果 DNA 聚 合酶缓 冲液不 适合于 限制酶 ,则 限制 酶消化 反应和 3' 凹端补 平反应 须分两 步进行 。在 这种 情况下 ,可先 在限制 酶缓冲 液 中消化 DNA, 然 后用酚 / 氯仿 抽提以 去除限 制酶, 再用乙 醇沉淀 ,干燥 DNA 并重溶 于 TE 中。 最后加 入适当 体积的 10 XDNA 聚 合酶缓 冲液。 (2) 用 32P dNTP 补平 3' 凹端 ,对 DNA 片段进 行末端 标记。 • (3) 对带 3' 突 出端的 DNA 进行末 端标记 。此反 应分两 步进行 。首先 ,利用 3'— 5' 外切核 酸酶活 性降解 DNA 的 3' 突出 尾造成 3' 凹端, 然后在 高浓度 的放射 性标记 核苷酸 前体 存在下 ,外 切降解 反应与 dNTP 掺入 3' 端的 反应达 到平衡 。上 述反应 包括从 凹端或 平端 DNA 上周 而复始 地去除 并置换 3' 核苷酸 ,故有 时称为 交换反 应或置 换反应 。如果 计划 用这类 反应进 行末端 标记, T4 噬菌体 DNA 聚合酶 是首选 的酶。 虽然大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 和 T4 噬菌体 DNA 聚合 酶都可 进行上 述反应 ,但后 者具有 更强的 3'— 5' 外切 核酸酶 活性。 (4) 在 cDNA 克隆中 ,用 于合成 cDNA 第 二链。 (5) 在体外 诱变中 ,用于 从单链 模板合 成双链 DNA。 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 丨 Klenow 酶可从 模板上 置换已 杂交的 寡核苷 酸引物 ,从 而导致 诱变率 下降。 应用不 会引起 链置换 反应的 丁4 噬菌体 DNA 聚合 酶可避 免这一 问题。 (6) 应用 Sanger 双脱 氧链末 端终止 法进行 DNA 测序。 (7) 过去曾 利用大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 酶的 外 切核酸 酶活性 来消化 某些 限制酶 作用后 产生的 3' 突出端 。近 来, T4 噬菌体 DNA 聚 合酶由 于具有 更强的 3' -5' 外切 核酸酶 活性, 因而已 经成为 这一用 途的首 选酶。 (8) 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 酶也可 用于聚 合酶链 式反应 ,以 体外 扩增基 • 306 • 因组 DNA 序列 。扩增 产物可 用作探 针或用 于直接 克隆已 知基因 的等位 突变体 。然而 hgDNA 聚合酶 现已成 为这一 用途的 首选酶 ,因为 它耐热 ,因而 不必在 每一轮 合成和 变性 后补加 新酶。 2. 实例 [实例 1] 标记 DNA 的 3' 末端 选 用本方 法可产 生用于 放射自 显影的 32P 末 端标记 相对分 子质量 标志物 。放 射自显 影 显带的 强度与 片段长 度无关 ,标记 DNA 可 稳定数 月之久 。通过 两种不 同的酶 切和用 互补于 2 个 5' 突 出端的 32P 标记的 dNTP 进行 标记, 可选择 性标记 DNA 的一个 末端。 (1) 在 20;iL 反应 体积中 ,用 可产生 5' 突出 端的限 制性内 切核酸 酶消化 0.1 〜 4# DNA〇 (2) 加入 20yCi 所需的 a-32P 标记 dNTP (400~ 800Ci/mmol) 和 lpL 5mmol/L 3dNTP 混合液 ,如需 要高比 活时, 可加入 80/iCi a-32P 标记的 dNTP。 加入 1U Klenow 酶, 30"C , 温育 15min。 由于 Klenow 酶 将核苷 酸掺入 于互补 的单链 5' 突出端 ,故 32P 标记的 dNTP 的 种类取 决于用 来切割 DNA 的 限制性 内切核 酸酶。 (3) 75t: 加热 lOmin 或加入 lpL0.5mol/LEDTA 以终 止反应 。如果 需要, 从标记 DNA 中去除 未掺入 的前体 dNTP。 [实例 2] 修复 3' 或 5' 突 出端产 生平端 许多 克隆实 验中, 需将限 制酶切 割后产 生的黏 性末端 (简称 黏端) 转换为 平端, Klenow 酶 具有此 功能。 (1) 在 20^L 反应体 积中, 用限制 酶消化 0.1 〜 4/xgDNA。 如果 需要, DNA 可用 外切酶 (如 Ba/3I, X 外切酶 , 外切酶 III) 或 内切酶 (如 S1 或绿豆 核酸酶 ) 处理。 (2) 加入 1/iL 0.5mmol/L 含多种 dNTP 的混 合液。 加 Klenow 酶之前 ,不 需灭活 限制酶 、更换 缓冲液 和纯化 DNA。 (3) 加入 1 〜 5U 的 Klenow 酶, 30*C 温育 15min。 Klenow 酶的聚 合酶活 性补平 5' 端, 3'—5' 外 切酶活 性修平 3' 端。 (4) 75X: 加热 lOmin, 或 者加入 l^L0.5mol/LEDTA 终止 反应。 用不 同限制 酶切割 产生的 DNA 片段, 可选择 性的修 复一端 。其 方法是 先用酶 I 切割 ,再用 Klenow 酶修 复末端 ,加热 75t: lOmin 灭活 Klenow 酶, 再用酶 II 消化。 [实例 3] 随机 寡核苷 酸引物 介导的 DNA 标记 。此法 是一种 用以产 生高放 射比活 度、 放射标 记均匀 分布的 DNA 片段的 切口平 移方法 。其 方法是 用限制 酶消化 DNA, 如 果需 要通过 凝胶电 泳纯化 DNA 片段, 煮沸使 DNA 变性; 与随机 寡核苷 酸引物 (一般 为 6 个碱基 ) 退 火互补 ,再 在各种 dNTP 存 在下与 Klenow 酶温育 ,结果 6 核苷 酸的引 物引导 合成均 一标记 的双链 DNA。 (1) 用合 适的限 制性内 切核酸 酶消化 DNA, DNA 片段经 电泳纯 化或乙 醇沉淀 ,用 TE 缓冲液 重悬。 从 DNA 中去除 酶切缓 冲液是 必需的 ,因为 Mgz+ 的存 在将使 DNA 不 易变性 。如果 使用低 融点琼 脂糖, 通常不 需纯化 DNA。 . 307 . (2) 在冰 浴中混 合下列 物质: 2.5fxL lOxKlenow 酶 缓冲液 5/iL 3000Ci/mmol a-32P 标记 dATP (50pCi) 1 卩 L Klenow 酶 (3~8U) 要产 生放射 比活性 稍低的 探针时 ,可用 2.5ML (25MCi) 800Ci/mmol a-32P 标记 dATP ( 另加入 2. 5ML 水补足 混合物 的体积 ), 低比活 性探针 适合于 大多数 用途, 成本也 较低。 (3) 将 30 〜 lOOngDNA 与随机 核苷酸 6 聚体 (1~5 叫) 混合至 14;xL, 煮沸 2 〜 3min, 置于 冰浴。 (4) 加入 11/iL 得 自步骤 (2) 的 混合物 ,立 即在室 温温育 2 〜 4h。 (5) 加入 lyL 0.5mol/JL EDTA 以终 止反应 ,加入 3pL 10mg/mL tRNA 和 100pL TE 缓冲液 。酚 抽提, 移上清 至一个 新离心 管中。 如果 DNA 是以 从低融 点凝胶 中切下 的小带 的形式 加入反 应的话 ,终止 反应的 混合物 必须在 7〇t: 温育 lOmin 使凝 胶重新 溶化。 (6) 用层 析法将 未掺入 的放射 性前体 dATP 从标记 DNA 中 去除。 (7) 取出 1ML 小份样 品确定 32P 的掺 入效率 。比活 性应为 108 每分 钟计数 /网。 3. 方 法评注 (1) 用大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 酶进 行末端 标记, 可替代 T4 噬菌体 多核苷 酸激酶 的方法 ,用 于制备 DNA 标记 片段, 以作为 凝胶电 泳的相 对分子 质量标 准参照 物 。由于 DNA 片段 标记的 强弱与 DNA 的摩 尔数而 非大小 成比例 ,因此 限制酶 切消化 中产生 的片段 与大片 段的标 记程度 相同。 用溴化 乙锭染 色不能 观察到 的过小 DNA 片段 可 用放射 自显影 确定其 条带的 位置。 (2) 用较为 粗制的 DNA (如小 量提取 的质粒 DNA) 进 行末端 补平及 标记反 应同样 可行。 (三) T4 DNA 聚合酶 T4DNA 聚合酶 来源于 T4 噬菌 体感 染的大 肠杆菌 ,由 T4 噬菌 体基因 43 编码 ,分 子 质量为 112kDa, 现已 通过基 因工程 生产。 T4DNA 聚 合酶与 Klenow 酶相似 ,具有 DNA 聚合酶 活性及 3'— 5' 外切 酶活性 ,缺少 5'— 3' 外切 酶活性 (表 4. 5)。 其 3'— 5' 外 切 酶活性 对单链 DNA 的 作用比 对双链 DNA 更强 。其 外切酶 活性比 Klenow 酶强 200 倍 。此外 ,该 酶还 具有催 化交换 反应的 能力。 交换 反应是 指反应 体系中 有一种 dNTP 时, T4 DNA 聚 合酶的 3'—5' 外切酶 活性将 从 dsDNA 的 3'-OH 端开始 降解直 到互补 于这个 dNTP 的碱 基出现 为止。 然后在 这个位 置发 生合成 和交换 (图 4.12)。 1. 反 应条件 50ML 反 应体系 : 50mmol/LTriS-HClpH8.0, 100pmol/L4dNTP 混 合液, 5mmol/L MgCl2, 50/ig/mLBSA, 5mmol/LDTT, 0.1UT4DNA 聚 合酶, 2/igDNA。 • 308 • 1 … pC pG pT pC pG pC 〇H 3 3> ... Gp Cp Ap Gp Cp Gp g. [a-32P]dTTP DNA 聚合 _ 5 • • . pC pG p 3 3* ... Gp Cp Ap Gp Cp Gp g 5 • • ■ pC pG pT q|_| 3 3' • • - Gp Cp Ap Gp Cp Gp 51 > 外 切核酸 酶活性 > DNA 聚合 酶活性 图 4.12 T4 DNA 聚 合酶催 化的交 换反应 lit: 温育 20min, 加入 2/^0.5111〇1/1^£0丁八或751::加热1〇111丨11以终止反应。反应 体积、 4 种 dNTP 的浓度 、反 应温度 可依具 体应用 而变。 2. 影 响因素 1) dNTP 浓度 的效应 高 浓度的 dNTP (lOOpmol/L) 在 通常实 验下可 以增加 聚合酶 活性对 外切酶 活性的 比值 。在 标记实 验中, dNTP 的浓度 可降至 l — Z^mol/L, 但标记 dNTP 不 能低于 lMm〇l/L 浓度, 否则当 dNTP 耗竭时 ,会 导致其 外切酶 活性对 DNA 的 降解。 2) 温度 的效应 用 T4DNA 聚合 酶标记 3' 末端时 ,反 应温度 保持在 lit:。 在较高 温度下 ,其 外切 酶活性 易降解 DNA 模板。 3) 缓冲 系统的 相容性 许多限 制性内 切核酸 酶能在 T4DNA 聚合酶 的缓冲 系统进 行切割 反应, 同时, T4 DNA 聚 合酶也 能直接 使用。 3. 用途 1) 补 平或标 记限制 酶消化 DNA 后 产生的 3' 凹端 标记 反应必 须在高 浓度的 dNTP 存在 下进行 ,以 使聚合 (补平 ) 反 应压倒 强劲的 3'-5' 外切 核酸酶 活性。 2) 对带有 3' 突 出端的 DNA 分子 进行末 端标记 此反 应分两 步进行 。首 先利用 强劲的 3'—5' 外切核 酸酶活 性切除 DNA 3' 突 出尾, 从 而产生 3' 凹端 ,然 后在高 浓度的 某一种 放射性 标记的 dNTP 前体的 存在下 ,外 切降解 反应与 dNTP 掺入 3' 端的 反应达 到平衡 。这 一从凹 端或平 端上循 环往复 地去除 和置换 . 309 . 3' 端核苷 酸的反 应又称 作交换 或置换 反应。 许多 情况下 ,可 用同一 种缓冲 液进行 DNA 的限制 酶消化 反应及 其后的 末端标 记反应 。在 常用的 所有限 制酶缓 冲液中 T4 噬菌体 DNA 聚 合酶都 可发挥 其最大 活性的 50 % 左右。 然而并 非所有 限制酶 都能在 DNA 聚合 酶缓冲 液中发 挥作用 。因此 建议采 用手头 上特定 批次的 酶进行 预试验 。如果 01^八聚 合酶缓 冲液不 适用于 限制酶 ,那么 限制酶 消化反 应和末 端标记 反应必 须分两 步进行 。这时 ,在 适当的 限制酶 缓冲液 中消化 DNA, 用酚 / 氯仿 抽提以 去除限 制酶, 经用乙 醇沉淀 DNA 后 ,使 其干燥 并重溶 于 TE 中 ,再加 入适当 体积的 1〇 XDNA 聚 合酶缓 冲液。 丁4 睡菌体 DNA 聚合酶 的补平 和末端 标记反 应可在 12*C 进行, 以使聚 合酶活 性与外 切核酸 酶活性 之比达 到最大 。然 而这些 反应在 室温或 371C 下 进行 也未尝 不可。 3) 标 记用做 探针的 DNA 片段 利用 此酶的 3' — 5' 外 切核酸 酶活性 部分消 化双链 DNA 后 产生的 3' 凹 端可用 32P dNTP 补平 (置 换合成 )。 与利用 切口平 移法得 到的探 针相比 ,用 这种技 术制备 的探针 有两 大优点 。首先 ,它不 会出现 平移时 可能产 生的发 夹结构 假象; 其次, 经适当 的限制 酶 切割后 很容易 转变成 链特异 性探针 。然而 与切口 平移法 截然不 同的是 ,它 不能 在整条 DNA 链上 形成均 匀标记 。而且 3' 外 切核酸 酶活性 对单链 DNA 的降 解要比 对双链 DNA 快得多 。所 以当一 个分子 被消化 到其中 点时, 它就一 分为二 断为两 条半长 的单链 ,并且 很快 被降解 。所 以在酶 作用到 DNA 链的中 点以前 就务必 终止外 切核酸 酶反应 。结 果, 这种置 换合成 法将产 生一组 末端完 全标记 ,而从 末端到 中点其 标记量 递减的 分子。 4) 将双链 DNA 的末 端转化 成平端 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 强劲的 3'— 5' 外切 核酸酶 活性可 将双链 DNA 的 突出端 去除。 在高 浓度的 dNTP 存在时 ,模 板中双 链区的 进一步 降解将 与合成 反应达 到平衡 。将 3' 突 出端转 化成平 端是一 种极有 价值的 反应。 制备加 入合成 接头的 DNA 时, 经常使 用这一 方法 。如 上所述 ,带 3' 凹端的 分子可 通过类 似由大 肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 酶所催 化的补 平反应 ,用 T4 噬菌体 DNA 聚 合酶进 行修补 。在 高浓度 dNTP 存在下 ,带 有混 合的 5' 及 3' 突 出端的 DNA (如以 RNA 为模 板合成 的双链 cDNA) 可由 T4 噬菌体 DNA 聚 合酶催 化转化 成平端 分子。 5) 使结合 于单链 DNA 模 板上的 诱变寡 核苷酸 引物得 到延伸 在 此反应 中选用 T4 噬菌体 DNA 聚 合酶比 选用大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 酶效 果更佳 。因为 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 不会置 换模板 上的小 段寡核 苷酸, 因此诱 变率约 提高 1 倍。 (四) 天然 T7 DNA 聚合酶 T7 噬菌体 感染大 肠杆菌 诱生的 DNA 聚合酶 是两种 紧密结 合的蛋 白质的 复合体 ,这 两种 蛋白质 一个是 T7 噬菌 体基因 5 蛋白 (分 子质量 80kDa), 另一 个是宿 主蛋白 的硫氧 还蛋白 (分子 质董为 12kDa)。 这 个复合 体是所 有已知 DNA 聚合 酶合成 能力最 强的一 个, T7 DNA 聚合酶 所催化 合成的 DNA 的平 均长度 比其他 DNA 聚合 酶催化 合成的 DNA 的平 均长度 大得多 。但纯 化后的 T7 基因 5 蛋 白仅具 3'—5' 外 切酶活 性和持 续合成 能力 较低的 DNA 聚合酶 活性。 硫氧还 蛋白可 充当辅 助蛋白 以增强 T7 基因 5 蛋 白对引 物 模板的 亲和力 ,使 DNA 的 合成可 延伸上 千个核 苷酸。 • 310 • T7DNA 聚合酶 (基因 5 蛋白 / 硫氧还 蛋白) 除 聚合酶 活性外 ,还具 有非常 强的对 单链 和双链 DNA 的 3' — 5' 外切 酶活性 ,其活 性约为 Klenow 酶的 1000 倍 。因此 ,在 DNA 序列分 析时, 往往采 用经修 饰了的 T7DNA 聚合酶 ,以将 这种活 性降至 最低。 1. 反 应条件 50pL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH7. 5, 2/jig DNA, lOmmol/L Mg〇2, 30(Vmol/L4dNTP 混合液 , 5mmol/LDTT, 50/ig/mLBSA, 50mmol/LNaCl, 5UT7 DNA 聚 合酶。 37*C 温育 20min。 加入 2/^0.5111〇1/1^£0丁八或75€加热1〇111丨11以终止反应。反应 体积、 dNTP 的浓度 及反应 温度可 依具体 应用而 改变。 2. 用途 (1) T7DNA 聚合 酶合成 DNA 的能 力很强 ,它可 用于延 伸很长 的模板 (如 M13 噬 菌体 )。 它可以 在同一 引物模 板上有 效地合 成数千 个核苷 酸且不 受二级 结构的 影响。 (2) T7 DNA 聚 合酶可 选用于 定点诱 变中互 补链的 合成。 (3) T7 DNA 聚 合酶可 以类似 T4 DNA 聚合酶 应用于 3' 末端 的标记 ( 简单延 伸或置 换合成 )。 (4) T7 DNA 聚 合酶可 以类似 T4 DNA 聚合酶 将双链 DNA 的黏 性末端 (5' 或 3' 末 端突出 ), 转变为 平端。 (五) 经 修饰的 T7DNA 聚合酶 天然 T7 DNA 聚合 酶具有 很强的 3'—5' 外切 酶活性 ,在经 修饰的 X7 DNA 聚合酶 (测 序酶) 中 ,这 种活性 已通过 化学反 应有选 择地降 低了, 或通过 基因工 程去除 外切酶 活 性域的 28 个氨基 酸残基 使之完 全失活 。外 切酶 活性的 丧失使 T7 DNA 聚合酶 活性增 加 3~9 倍 。经 修饰的 T7DNA 聚合酶 持续合 成能力 很强, 它是用 双脱氧 末端终 止法对 长段 DNA 进行 测序的 理想酶 ,因而 又称测 序酶。 1. 反 应条件 50pL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH7.5, 2吨 DNA, 5 或 10mmol/L MgCl2, 300Mmol/L4dNTP 混 合液, 5mmol/LDTT, 50pg/mLBSA, 50mmol/LNaCl, 10U 经 修饰的 T7 DNA 聚 合酶。 37X: 温育 20min, 加入 2/uL 0.5mol/L EDTA 或 75X: 加热 lOmin 以终 止反应 。反应 体积、 dNTP 的 浓度、 DNA 和酶量 、反 应温度 可依具 体应用 而改变 。基 因工程 改造的 T7 DNA 聚合酶 所需的 MgCl2 的 浓度为 5mmol/L, 低 于化学 修饰的 T7 DNA 聚合酶 (10mmol/L)。 2. 用途 (1) 经 修饰的 T7DNA 聚 合酶是 理想的 DNA 序列测 定用酶 。其 合成效 率较高 ,且 • 311 • 无 3'— 5' 末 端外切 酶活性 ,对 dNTP 的类 似物无 选择倾 向性。 (2) 经 修饰的 T7DNA 聚合 酶在低 dNTP 浓度下 (<〇.l^mol/L), 可有 效标记 DNA。 (3) 经 修饰的 T7 DNA 聚合酶 可应用 于标记 5' 末端 突出的 DNA 的 3' 末端。 由于它 会在 5' 端 留下一 个额外 的碱基 ,因 此不能 应用于 将黏性 DNA 末端 转变成 平端。 (六) T 叫 DNA 聚合酶 TmDNA 聚合酶 是一种 耐热的 依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶 (分 子质量 64kDa)。 它 最初 是从极 度嗜热 的栖热 水生菌 (Thermusaquaticus) 中纯 化而来 ,目前 已经以 基因工 程方式 生产并 出售。 该酶可 用于对 DNA 进行 测序及 通过聚 合酶链 式反应 (PCR) 对 DNA 分 子的特 定序列 进行体 外扩增 。天然 DNA 聚合酶 是双链 DNA 聚合酶 ,它催 化聚 合反应 的最适 温度为 75~801:, 于 60X: 时 聚合酶 活性仅 1/2, 于 37X: 时活 性仅剩 1/10。 此 酶仅具 5'— 3' 外切 酶活性 ,不具 3'-5' 外切 酶活性 ,因此 缺乏校 正功能 ,掺入 错误 率可达 0.1% 左右 。目前 出售的 Pfu DNA 聚 合酶和 Vent DNA 聚 合酶比 DNA 聚合酶 更耐热 ,并 具有 3'— 5' 外切 酶活性 ,因此 催化作 用的精 确度比 Ta9DNA 聚合酶 分别高 4 〜 12 倍 。它主 要有以 下两种 用途: (1) T^ DNA 聚合 酶在很 广的温 度范围 内都具 有活性 ,在高 温下活 性最高 ,使得 它在 PCR 中得 到充分 应用。 (2) Ta400 Ci/mmol), 5(Vg/mLBSA, 40U 逆转 录酶。 37t: 温育 30min。 加入 2^L0.5mol/LEDTA 或 75X: 加热 lOmin 终止 反应。 RNA 模 板在 10pL5md/LNaOH 中 37t: 温育 过夜即 被破坏 。反应 体积、 4 种 dNTP 的浓度 、反 应温 度依具 体实验 而定。 3. 用途 (1) 逆转录 酶主要 用于将 mRNA 转录 成双链 cDNA, 而后者 可再插 入到原 核载体 中。 在单链 DNA 或 RNA 模板 参与下 ,也可 用逆转 录酶制 备杂交 用探针 。在此 反应中 可用 3 种类型 的引物 : 寡脱氧 胸苷酸 12-18 聚体 (oligo dT12_18) 它结 合于哺 乳动物 mRNA 3' 端的 聚腺苷 酸 poly (A), 作 为合成 cDNA 第一链 的引物 。合 成时 ,模板 3' 端 的序列 有可能 被过量 拷贝, 从而在 cDNA 中 所占比 例过大 ,这取 决于逆 转录酶 的质量 及反应 条件。 随机序 列的寡 核苷酸 旨在 使用序 列极为 多样的 一个寡 核苷酸 集群, 以期至 少能有 一些 寡核苷 酸与模 板退火 并作为 逆转录 的引物 。由 于不同 寡核苷 酸结合 于不同 的序列 上 ,这 样在逆 转录酶 作用下 ,大部 分序列 都将得 到拷贝 ,而 且假 如所有 引物的 浓度相 同 ,则 模板的 所有序 列得到 拷贝的 频率也 相同。 注:随 机序列 的寡核 苷酸可 用自动 DNA 合成 仪合成 ,也 可以通 过水解 大分子 DNA 获得。 特定序 列的寡 核苷酸 它 可作为 合成与 某一段 特定的 mRNA 相 对应的 cDNA 的引 物。 由于新 合成的 DNA 与位 于引物 上游的 mRNA 序列 互补, 因此这 一方法 (引 物延伸 法) 可准 确测出 mRNA 上某 一固定 点与其 5' 端 之间的 距离。 (2) 标记带 5' 突 出端的 DNA 片段 (补 平反应 )。 (3) 当 其他酶 (如大 肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段或 测序酶 ) 的 使用结 果不理 想时, 逆转录 酶也可 用于双 脱氧链 终止法 测序。 4. 方 法评注 (1) 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 3'— 5' 外切 核酸酶 活性具 有校对 功能; 但逆 转录酶 没有 3'— 5' 外切 核酸酶 活性, 因此容 易出错 。在 高浓度 dNTP 和 Mn2+ 存在下 ,大 约每 500 个碱基 会出现 1 个碱 基的误 掺入。 (2) 逆转录 酶对其 dNTP 的 《^值 非常高 (在 毫摩尔 范围内 ), 为 防止新 合成的 DNA 的提前 终止, 有必要 在反应 体系中 加入高 浓度的 dNTP。 . 315 . (3) 以寡 核苷酸 作引物 ,逆转 录酶可 用于合 成1:^八 模 板的单 链拷贝 。但是 ,从 RNA 模板 合成的 cDNA 既 可是单 链也可 是双链 。以 自身序 列为引 物进行 合成时 ,效率 远不如 以外加 寡核苷 酸为引 物时高 。因此 ,自身 互补的 发夹型 分子在 所合成 的双链 cDNA 中 所占比 例往往 非常小 。如有 必要, 在反应 体系中 加入终 浓度为 50Mg/mL 的放 线菌素 D, 可同时 抑制沿 自身引 物及外 加引物 合成第 二链的 反应。 五 、依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 用于 核酸研 究有两 种依赖 DNA 的 RNA 聚合 酶:一 种为大 肠杆菌 RNA 聚合酶 ,这 是一种 由多个 亚基组 成的酶 ,它可 识别启 动子的 -10 区和 -35 区 ,此酶 最初用 于体外 转 录合成 ,但转 录过早 终止, 因而很 难得到 >5〇〇 个碱 基的转 录产物 ,且 特异性 较低, 常从其 他序列 ( 如模板 5' 端) 起始 转录; 另一 种是 噬菌体 RNA 聚合酶 ,包括 SP6、 T7 和 T3 RNA 聚 合酶。 噬菌体 RNA 聚合 酶与大 肠杆菌 RNA 聚 合酶相 比具有 如下优 点:① 持续合 成能力 很强 ,可 催化合 成数千 个碱基 的转录 产物; ②转录 既快速 又高效 ,以 2pgDNA 为 模板, 30min 可转录 60;xg 的转录 产物; ③ 对相应 的启动 子具有 高度特 异性; ④ T7 和 T3RNA 聚合 酶可通 过基因 工程方 式制备 ,因 而可得 既价廉 ,特 异活性 又高的 RNA 聚 合酶。 (一) 大 肠杆菌 RNA 聚合酶 大 肠杆菌 RNA 聚 合酶由 a2p(3'〇5 个亚单 位组成 ,分子 质量约 450kDa。 它以 天然的 或 变性的 DNA 为模板 ,以 NTP 为底物 ,催 化转 录合成 RNA。 优先 从具有 - 10 区和 -35 区 保守序 列的启 动子起 始转录 ,终止 于终止 子序列 。转 录的 特异性 和长度 取决于 DNA 的纯度 、启 动子和 终止子 的长度 、一价 阳离子 和二价 阳离子 的种类 和浓度 。缺少 〇 因 子的核 心酶不 能识别 启动子 ,因 此在模 板上随 机起始 转录。 1. 反 应条件 50pL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L MgCL, 5mmol/L DTT, 50mmol/LKCl, 2Mg 双链 DNA (含 启动子 ), 300pmol/L4NTP, 50/ug/mLBSA, 10U £. coh RNA 聚 合酶。 37X: 温育 30min, 加 2)^0.51^〇1/1^£0丁八或751加热10〇1丨11终止反应。反应体积、 DNA 浓度和 4 种 NTP 含 量依具 体实验 而变。 2. 用途 (1) 当 DNA 不能克 隆入带 噬菌体 RNA 聚合酶 启动子 载体时 ,可 用大 肠杆菌 RNA 聚合 酶催化 转录。 (2) 大 肠杆菌 RNA 聚 合酶全 酶可用 于测定 含大肠 杆菌表 达启动 子序列 的克隆 DNA。 (3) 缺少 〇 因子的 核心酶 在高浓 度随机 引物和 低浓度 NTP 存在时 ,以 DNA 为模板 • 316 • 合成短 的相对 一致的 转录物 。以 天然 DNA 为模板 比变性 DNA 为模板 合成的 转录物 要长。 (二) 噬菌体 RNA 聚合酶 : SP6、 T7、 T3 SP6 噬菌体 可合成 依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 ,该 酶识 别双链 DNA 模板上 相应的 噬 菌体特 异性的 启动子 ,并 沿此模 板起始 RNA 的合成 。利 用该酶 可以在 体外合 成大量 与外源 DNA —条链 互补的 RNA。 该外源 DNA 克隆 于专门 设计的 载体中 ,并位 于启动 子下游 。已 有一些 专用的 载体可 通过改 变外源 基因上 游的启 动子的 方向而 合成与 模板任 一条链 互补的 RNA。 T7 和 T3 RNA 聚合 酶由各 自噬菌 体基因 1 编码 ,能识 别双链 DNA 模 板上特 异性启 动子, 并沿模 板起始 RNA 合成。 T7 和 T3RNA 聚 合酶在 体外的 应用与 SP6RNA 聚合 酶完全 一样。 T7 和 T3RNA 聚合酶 已在大 肠杆菌 克隆和 表达。 T7RNA 聚合酶 也已在 酵 母中得 到克隆 和表达 。这样 ,带有 T7 噬菌 体启动 子的载 体就可 用于在 体内表 达克隆 化 基因。 3 种 嗤菌体 RNA 聚 合酶均 为单一 多肽链 ,分 子质量 90 〜 lOOkDa。 每 一种酶 都对相 应的 启动子 有高度 特异性 。转 录速度 非常快 (体 外为大 肠杆菌 RNA 聚 合酶的 10 倍 ), 持续合 成能力 很强。 1. 反 应条件 50/jiL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH7.5, 10mmol/L MgCU, 5mmol/L DTT, 2;igDNA 模板 ( 含相应 噬菌体 启动子 ), 400^mol/L4NTP, 50pg/mLBSA, lmmol/L 亚精胺 ( 仅用于 SP6 催化的 反应混 合液中 ), 10URNA 聚合酶 (T7、 T3 或 SP6)。 37X: 温育 30min。 加入 2^L0.5mol/LEDTA 或 75X: 加热 lOmin 终止 反应。 反应体 积、 DNA 浓度、 4 种 NTP 含量依 具体反 应而变 。上述 反应条 件可催 化合成 60Mg 以上 的转 录产物 。如 要制备 高比活 的标记 转录物 ,需将 标记的 NTP 浓 度降至 lOpmol/L。 亚 精胺 有助于 SP6RNA 聚合 酶的催 化反应 ,应 在室温 加入到 反应混 合液中 ,以免 DNA 发生 沉淀。 2. 用途 T7、 T3 和 SP6 噬菌体 RNA 聚合 酶可以 高效、 特异地 转录置 于相应 的启动 子下游 的 DNA 序列。 (1) 噬菌体 RNA 聚 合酶可 用于产 生均匀 标记的 高比活 度单链 RNA 探针 ,用于 DNA 或 RNA 序列的 同源性 分析。 (2) 均匀 标记的 RNA 转录 物可用 于分析 RNA 或 DNA 的末端 ,用于 基因组 DNA 的 序列测 定和研 究前体 RNA 的 剪接。 (3) RNA 转 录物可 用于体 外翻译 ,在放 射性标 记的氨 基酸存 在下, 合成放 射性纯 的蛋 白质。 (4) T7 RNA 聚合 酶可用 于体内 高效表 达克隆 化基因 (在 T7 RNA 聚 合酶启 动子的 • 317 . 严格 控制下 )。 六、 不依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 poly (A) 聚 合酶以 ATP 为前 体分子 ,催化 AMP 掺入至 RNA 游离的 3'- 轻基端 (图 4.16)。 ATP RNA ‘㈧ „ 3. 实例 ATP 图 4.16 poly (A) 聚合 酶活性 1. 反 应条件 50jiL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L MgC^, 2 . 5 mmol/ L MnCl2, 250mmol/L NaCl, 250^g/mL RNA, 250^mol/L ATP, 50fig/mL BSA, 5U poly (A) 聚 合酶。 2. 用途 (1) 用 a-32P ATP 标记 RNA 的 3' 末端。 用此法 标记的 RNA 可 作为杂 交探针 。但对 于克隆 化基因 ,用 噬菌体 RNA 聚合酶 标记的 RNA 探针更 有效且 比活高 得多。 用逆转 录酶 合成的 cDNA 是标 记细胞 RNA 的首选 方法。 (2) 克 隆缺少 poly (A) 尾的 RNA。 用 poly (A) 聚合酶 加尾, oligo (dT) 作为引 物合成 cDNA。 七、 磷酸酶 和激酶 (一) 碱性 磷酸酶 细 菌碱性 磷酸酶 (BAP) 和小牛 肠碱性 磷酸酶 (CIP) 都能催 化水解 DNA、 RNA、 dNTP 和 NTP 上的 5' 磷 酸残基 (图 4. 17)。 这 种具有 5'- 羟基端 的脱磷 酸化产 物可在 T4 多核苷 酸激酶 催化下 ,用 y-32PATP 进 行标记 (图 4.18)。 两种 磷酸酶 的活性 都依赖 Zn2+, 在大 多数情 况下, CIP 更常用 。因 为较 BAP 而言, 它可在 70X: 加热 lOmin 灭活 或通过 酚抽提 而灭活 ,此 外, CIP 的 活性比 BAP 高 10 〜 20 倍。 . 318 . 5' 突出 3' 突出 单链 或双链 DNA 或 RNA 实例 图 4.17 碱 性磷酸 酶催化 的脱磷 酸反应 5' 突出 3' 突出 5 •哔 -丨 QH3- 3' i〇H 5* ^ 3' 5' 单链 或双链 DNA 或 RNA 实例 图 4.18 T4 多核 苷酸激 酶催化 的磷酸 化反应 1. 细 菌碱性 磷酸酶 50/ixL 反 应体系 : 50mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LZnCl2, l~20pmolDNA 末 端, 0.1UBAP。 60X: 温育 30min。 加入 0 . 1 % SDS 和 lOO^g/mL 蛋白酶 K, 于 37X: 温育 30min 终止 反应 。用 酚提抽 2 次然 后用乙 醇沉淀 DNA。 2. 小牛 肠碱性 磷酸酶 反 应条件 (DNA 脱磷酸 ) 50fiL 反 应体系 : 20mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L MgCL, lmmol/L Z11CI2, l~20pmolDNA末端,0.1UCIP。 37X: 温育 30min。 75X: 加热 lOmin 或用酚 提抽终 止反应 ,然 后用乙 醇沉淀 DNA。 • 319 • 3. 用途 (1) 在用 y-32P ATP 和 T4 噬菌体 多核苷 酸激酶 标记前 ,用碱 性磷酸 酶脱去 5' 末端 的鱗 酸基团 , 5' 末端 32P 标记的 DNA 可 应用于 Maxam-Gilbert 化学 测序、 RNA 测 序和特 异性 DNA 或 RNA 片段 的图谱 构建。 (2) 载体 DNA 5' 末 端的去 磷酸化 可防止 载体的 自连。 (二) T4 多核苷 酸激酶 T4 多核苷 酸激酶 来源于 T4 噬菌 体感染 的大肠 杆菌, 现已通 过基因 工程的 方式生 产并 销售。 T4 多核苷 酸激酶 具有两 种活性 。正向 反应活 性是高 效率的 ,它 可催化 ATP 的 7 位磷酸 转移至 DNA 或 RNA 的 5' 端羟基 (图 4. 18), 是 标记或 磷酸化 5' 末端 的首选 方法 。交换 反应活 性是很 低的, 它催化 5' 端磷酸 的交换 ,在 过剩的 ADP 存 在下, T4 多 核 苷賅激 酶催化 DNA 的 5' 端磷酸 转移给 ADP, 然后 DNA 从 y-32P ATP 中获得 放射性 标记的 7- 磷酸 而重新 磷酸化 (图 4. 19)。 除 磷酸化 活性外 ,丁 4 多核苷 酸激酶 还具有 3' 磷酸酶 活性。 T4 多核 苷酸激 酶的特 性见表 4.9。 图 4.19 T4 多核 苷酸 激酶催 化的交 换反应 1 . 用途 (1) 用 化学降 解法测 DNA 序列。 (2) 通过 DNase I 足迹法 或检查 DNA 免受 化学物 质损伤 (如 二甲基 亚砜, 甲锭丙 • 320 • 基 EDTA) 的 情况而 确定特 异的蛋 白质和 DNA 相互 作用。 (3) 通过部 分消化 5' 末端 标记的 DNA 片段构 建物理 图谱; RNA 转录 物末端 分析和 DNA 中 内含子 的位置 确定。 (4) 合成用 于分析 DNA 和 RNA 连接酶 活性的 底物。 (5) 标 记寡核 苷酸以 利电泳 纯化。 (6) 将寡 核苷酸 连接至 DNA 载体上 。化学 合成的 寡核苷 酸具有 5' 羟 基末端 ,要进 行 克隆必 需先将 它们磷 酸化。 表 4.9 T4 多核苷 酸激酶 的特性 T4 噬菌体 多核苷 酸激酶 (正向 反应) T4 噬菌体 多核苷 酸激酶 (交换 反应) 核 酸底物 双链 DNA 双链 DNA 单链 RNA 或 DNA 单链 RNA 或 DNA 切口 或缺口 切口 或缺口 寡 核苷酸 寡 核苷酸 3'dNMP Km 双链 DNA: 7.6Fmol/L ADP: 300fimol/La 5,dNMP: 22~143fxmol/L ATP: 14~140,zmol/Lb ATP: lO^mol/L* 最佳 pH 7. 4-8.0 (Tris-HCl) 6.4 ( 咪唑) (在磷 酸盐缓 冲液中 ,只有 5% 活性) 对巯基 的要求 + + 对 Mg2— 的要求 + + 离 子强度 的影响 NaCl 和 KC1 可提髙 其活性 ,过量 KC1 抑制 所有 底物, 但单链 DNA 除外 无资料 抑制剂 (50% 抑制) (NH4)2S04: 7mmol/L Pi : 50mmol/ L Pi: 20mmol/L PPi: 5 mmol/ L 激活剂 多胺 : 2mmol/L, 300% 无资料 a. 这是 pH6. 4 时能 使酶活 性达最 高的底 物浓度 ,而 并不是 b. 对 ATP 的 Km 因 底物而 不同。 2. 实例 1) 正向反 应标记 5' 端 T4 多核 苷酸激 酶可催 化单链 DNA、 双链 DNA 及 RNA 的 5' 端羟基 磷酸化 ,从 而可 对 DNA 或 RNA 的 5' 端进 行标记 。但该 酶催化 5' 突出端 磷酸化 比催化 平端或 5' 凹端磷 酸化时 快得多 。然而 只要有 足够量 的酶和 ATP, 后两 种末端 也能得 到完全 磷酸化 。在 双链 DNA 切口或 缺口处 进行磷 酸化的 效率比 单链末 端磷酸 化的效 率要低 ,但用 足够浓 度 的酶及 ATP, 缺口 也能得 到完全 磷酸化 ,而切 口的磷 酸化程 度可达 70%。 . 321 • 30/iL 反 应体系 : 50mmol/L Tris-HCl pH7.5, lOmmol/L MgCl2, 5mmol/L DTT, l~50pmol 去碟 酸化的 DNA 5' 末端, 50pmol (150/iCi) "y-^P ATP ( 比活性 >3000Ci/ mmol), 50/ig/mL BSA, 20U T4 多核苷 酸激酶 。 37X: 温育 60min, 加 l^L0.5mol/LEDTA 或 75X: 加热 lOmin 终 止反应 。然 后用酚 / 氯 仿抽提 ,通过 Sephadex G-100 柱层析 或通过 Sephadex G-50 柱离 心分离 标记的 DNA。 反应 体积、 DNA 浓度、 y-32PATP 浓 度依具 体反应 而变。 2) 正向反 应使合 成的寡 核苷酸 磷酸化 30pL 反 应体系 : 50mmol/L Tris-HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl2, 5mmol/L DTT, lmmol/LATP, 5(WmLBSA, 20UT4 多 核苷酸 激酶。 37t: 温育 60min, 加入 1/iL 0.5mol/L EDTA 终止 反应。 3) 交换反 应标记 5' 端 含 5'- 磷 酸末端 的单链 DNA 得到标 记的效 率最高 (96%)。 用 足够的 酶量、 70% 的 5'- 磷酸凹 端能得 到标记 。切 口处的 5'- 磷酸的 标记仅 及单链 5'- 磷 酸末端 的标记 效率的 1/30。 30fiL 反 应体系 : 50mmol/L 咪 嗤盐酸 pH6.6, 10mmol/L MgCL, 5mmol/L DTT, l~50pmol 磷 酸化的 DNA 5' 末端, 60pmol (180/xCi) y-32P ATP ( 比活性 >3000Ci/ mmol), 50/ig/mL BSA, 20U T4 多 核昔酸 激酶。 37X: 温育 60min, 加入 lpLO^mol/LEDTA 终止 反应。 用缓冲 液饱和 酚抽提 ,通 过 Sephadex G-100 柱层析 或通过 Sephadex G-50 柱离 心分离 标记的 DNA。 反应 体积、 DNA 浓度和 y-32P ATP 的含 量依具 体反应 而变。 3. 重 要参数 (1) 正 向反应 ATP 浓度 应大于 或等于 lpmol/L; 交 换反应 ATP 浓度 应大于 或等于 2|umol/L〇 (2) 基因工 程方式 制备的 T4 多核 苷酸 激酶较 T4 噬菌 体感 染细胞 制备的 T4 多核苷 酸激酶 纯度高 、比活 性高、 浓度高 ,而且 价廉。 (3) 少 量寡核 苷酸或 tRNA 污 染明显 降低标 记效率 (原 因是寡 核苷酸 能提供 大量的 5' 末端 ), 因此 DNA 必须 纯化。 (4) 激酶活 性在低 浓度的 磷酸缓 冲液或 铵盐下 受抑制 。琼 脂糖 凝胶电 泳纯化 所获得 的 DNA 标记 物效果 不理想 ,标记 DNA 必须经 DEAE 纤维 素层析 进一步 纯化。 (5) 5' 凸 端对磷 酸化的 效率比 平端高 。标记 5' 凹 端很难 。对 5' 凹端或 平端可 采用煮 沸或加 NaOH 使 DNA 变性而 改善标 记反应 。尽 可能 避免用 T4 多核 苷酸激 酶标记 5' 凹端。 (6) PEG 8000 可大大 改善激 酶反应 的效率 ,可 使具有 5' 凹端的 Pst I 限制性 片段标 记增高 1000 倍 ,整 个标记 效率由 20% 增至 70%。 (7) 对 于线性 PBR322 载体, lpmol 的 5' 端 相当于 1.6捭 DNA。 • 322 • 八 、外切 核酸酶 (一) 单链 5'— 3'— 5' 外切 核酸酶 外切 核酸酶 VII (exo VII) 来自大 肠杆菌 的外切 核酸酶 VII 由 两个亚 基组成 ,由 XseA 和 基因 编码 。它 是作用 于单链 DNA3' 端和 5' 端 的外切 核酸酶 (图 4.20), 其降解 产物为 小的寡 核苷酸 ,此酶 的活性 不需要 Mg2+, 在 lOmmol/LEDTA 存 在时仍 保留 完全的 活性。 3' 图 4.20 外切 核酸酶 VII 活性 (催化 DNA 的降解 反应) 1. 反 应条件 50pL 反 应体系 : 70mmol/LTris-HClpH8.0, 8mmol/LEDTA, 10mmol/L(3- 巯基 乙醇, lfigDNA, 5pg/mLBSA, 20U 外切 核酸酶 VII。 37X: 温育 30min。 酚提抽 和乙醇 沉淀终 止反应 。外切 核酸酶 VII 活 性不被 EDTA 抑制。 2. 用途 (1) 基因组 DNA 中 内含子 的位置 作图。 (2) 切 除通过 poly (dA-dT) 加尾 插入到 质粒载 体中的 DNA 片段。 (二) 双链 5'— 3' 外切 核酸酶 X 噬菌 体外切 核酸酶 “ exo) 此 酶来自 X 噬菌 体感染 的大肠 杆菌, 它催化 从双链 DNA 5' 端 带磷酸 基团的 末端开 始的持 续水解 ,释放 5' 核苷 单磷酸 (图 4.21)。 但 不降解 5' 端为 羟基的 末端。 . 323 . 实例 图 4.21 5'— 3' 外 切核酸 酶活性 1. 反 应条件 50fiL 反 应体系 : 67mmol/L 甘氣酸 -KOHpH9.4, 2.5mmol/LMgCl2, 2pgDNA, 50pg/mL BSA, l〇m 噬菌体 外切核 酸酶。 37t: 温育 l~30min, 具 体温育 时间依 消化程 度而定 。加入 2/^L 0.5mol/L EDTA 或 75X: 加热 lOmin 终止 反应。 2. 用途 (1) 在应 用双脱 氧法测 序时, 将双链 DNA 转变 为单链 DNA。 (2) 去 掉双链 DNA 的 5' 突出端 ,便 于末端 转移酶 加尾。 T7 基因 6 外切 核酸酶 此酶由 T7 噬菌 体基因 6 编码 ,现 已通过 基因工 程克隆 表达及 纯化。 该酶催 化双链 DNA 的 5' 末 端的依 次水解 ,生成 5' 核苷单 磷酸。 它的作 用持续 性较低 ,对 5' 端 为磷酸 基团或 羟基的 DNA 链 都能起 作用。 1. 反 应条件 50fiL 反 应体系 : 50mmol/L Tris-HCl pH7.5, 5mmol/L MgCL, 5mmol/L DTT, 20mmol/L KC1, 2 卩 g DNA, 50/ig/mL BSA, 5U T7 基因 6 夕卜切 核酸酶 。 37*C 温育 l~30min, 具 体温育 时间依 消化程 度而定 。加入 2^L0.5mol/LEDTA 或 75X: 加热 lOmin 终止 反应。 2. 用途 与 X 噬菌 体外切 核酸酶 相比, 此酶的 优势在 于它从 5' 末端 的降解 均匀且 可控制 。此 外 ,它也 可降解 5' 端为 羟基的 末端。 • 324 . (三) 双链 3'— 5' 外切 核酸酶 外切 核酸酶 III (exo III) 外切 核酸酶 HI 来自大 肠杆菌 ,由 X 认 A 基因 编码 。此 酶可特 异性催 化双链 DNA 从 3' 羟基 末端开 ^水解 ,释放 5' 单 核苷酸 (图 4.22)。 它的外 切酶活 性是非 持续的 ,因 而 是用于 在双链 DNA 中产生 均匀的 单链区 的理想 工具酶 。水 解速 率受核 苷酸组 成影响 (C》A— T》G)〇 此外 该酶还 有以下 3 种活性 :对无 嘌呤或 无嘧啶 DNA 特异 的内切 核酸酶 活性, RNaseH 活性及 3' 磷酸酶 活性。 3' 磷酸 酶活性 可去除 3' 末端 磷酸, 但并不 切割核 酸内的 磷酸 二酯键 。外 切核酸 酶活性 并不降 解单链 DNA 及带 3' 突出端 的双链 DNA。 1. 反 应条件 50ptL 反 应体系 : 50mmol/L Tris-HCl pH7.5, 5mmol/L MgCL, 5mmol/L DTT, 2/xg DNA, 50/xg/mL BSA, 10U 外切 核酸酶 III。 37X: 温育 l~30min, 具体 温育时 间依消 化的程 度而定 。加入 2^L 0.5mol/L EDTA 或 75X: 加热 lOmin 终止 反应。 1U 的外切 核酸酶 III 为 37X:、 lOmin 内从 I^tg 5000bp 长 的线 性双链 DNA 的每个 3' 凹端 切除约 200 个核 苷酸的 酶量。 2. 用途 (1) 与 Klenow 酶联用 ,制 备链 特异性 的放射 性探针 ,类似 于利用 T4DNA 聚合酶 活性 进行交 换合成 反应。 (2) 制备 单链模 板用于 双脱氧 测定。 (3) 从 克隆化 DNA 片段的 特定位 置进行 非定向 缺失, 构建的 亚克隆 可不经 限制酶 定位直 接用于 DNA 序列 测定。 • 325 • 九 、内切 核酸酶 (一) 31 核酸酶 BaZ 31 既具有 单链特 异性的 DNA 内切 酶活性 ,又 具有外 切核酸 酶活性 。利 用其外 切酶活 性连续 去除线 状双链 DNA 分子 3' 端的单 核苷酸 后形成 的单链 DNA 可被 31 的内切 酶活性 所降解 。对 于双 链环状 DNA, 它 可特异 性地降 解双链 DNA 缺口或 DNA 超螺 旋上产 生的瞬 时单链 区域。 对于双 链线性 DNA, 它可从 DNA 的 3' 和 5' 端有 节制地 降 解产生 缩短的 DNA 分子 。该酶 亦可作 为核酸 酶水解 rRNA 和 tRNA (图 4.23)。 I. 在单链 DNA 或 RNA 上 的活性 03** 5' ► 5'dNMPsor5'rNMPs 单链 DNA 或 RNA II. 在双链 DNA 或 RNA 缺口上 的活性 Ca * S 3'— ^—5' ^ 3‘ -■■■■■- 5' 3,^^— 5, 有 缺口的 DNA 或 RNA IE. 在双链 DNA 片 段末端 的活性 图 4.23 Ba/ 31 核酸 酶活性 BaZ 31 的活 性依赖 Ca2+ 和 Mg2+ 的存在 。因 此可在 反应的 不同阶 段加入 螯合剂 ED- TA 而使反 应终止 。此酶 可在十 二烷基 硫酸钠 (SDS) 和尿素 中保持 活性。 1. 反 应条件 50/iL 反 应体系 : 50mmol/LTris-HClpH7.5, lOmmol/LCaCU, lOmmol/LMgCL, 600mmol/L NaCl2, 2吨 DNA, 50/ig/mL BSA, 10U 说 Z 31 核 酸酶。 30X: 温育 1 〜 30min, 温育 时间依 消化程 度而定 。加入 5^L0.5mol/LEDTA 或 75X: 加热 lOmin 终 止反应 。用琼 脂糖凝 胶电泳 分析降 解产物 ,用 乙醇沉 淀去掉 NaCl 便于后 续 的酶促 反应。 1U 的 31 核 酸酶在 30t: lOmin 内 ,在 50fzL 反应 体积和 SOpg/mL 的 DNA 浓度 下, 从线性 PBR322 的两 端降解 200 个碱 基对。 2. 重 要参数 (1) 因 31 核 酸酶的 活性受 RNA 污染物 的抑制 ,所用 DNA 必须 经氯化 铯超离 心纯化 或凝胶 纯化。 (2) Ba/ 31 核酸 酶的单 位数仅 供参考 ,对于 具体的 DNA 模板 ,消化 的程度 应以琼 脂糖凝 胶电泳 监测。 • 326 • (3) 31 核酸酶 活性受 DNA 组成的 影响, AT 丰富的 区域比 GC 丰富区 降解得 更快。 (4) 经 31 核酸酶 消化的 DNA 片 段可以 直接用 于连接 ,但效 率较低 。消 化的 DNA 经酚抽 提和乙 醇沉淀 后可提 高连接 效率。 消化后 DNA 末 端需用 Klenow 酶或 T4 DNA 聚合酶 补平后 ,再用 T4DNA 连接酶 连接。 3. 用途 (1) 在可 控条件 下产生 并克隆 不同大 小的缺 失体。 (2) DNA 片段 的限制 性位点 作图。 (3) 研究经 诱变剂 处理的 超螺旋 DNA 螺 旋区的 变化和 超螺旋 DNA 的二级 结构。 (二) S1 核酸酶 S1 核酸酶 是高度 特异性 的单链 内切酶 。它降 解单链 DNA 或 RNA, 产生带 5' 磷酸 基团的 单核苷 酸或寡 核苷酸 。该 酶需要 Zn2+, 最适 pH4.6。 双链 DNA、 双链 RNA 及 DNA:RNA 杂 交体都 对该酶 有抗性 。水 解单链 DNA 的效率 比双链 DNA 快 75 000 倍。 但在 酶量非 常大时 ,双 链核酸 可被完 全消化 ,中 等量的 S1 核酸酶 可在切 口或小 缺口处 切割双 链核酸 (图 4.24)。 在单链 DNA 或 RNA 上 的活性 单链 DNA 或 RNA Zn“ pH4.5 5'dNMPs orS'rNMPs 在 有缺口 的单链 DNA 或 RNA 上 的活性 有 缺口的 DNA 或 RNA ZrT pH4.5 图 4.24 S1 核酸 酶活性 S1 核 酸酶在 尿素、 SDS 和甲 酰胺中 稳定。 1. 反 应条件 lOOfiL 反 应体系 : 50mmol/L 乙酸钠 pH4.6, lmmol/L 乙酸锌 , 250mmol/LNaCl, 2MgDNA, 50^g/mLBSA, 10U SI 核 酸酶。 37X: 温育 30min, 加入 lfiL0.5mol/LEDTA 终 止反应 。反应 体积、 DNA 浓度 、酶 量、 反应温 度和时 间依具 体反应 而变。 2. 用途 (1) 分析抗 S1 核酸酶 降解的 RNA:DNA 杂合体 以定位 RNA 转 录物的 5' 和 3' 末端。 (2) 通过消 化成熟 mRNA 与 32P 标记的 基因组 DNA 杂交 形成的 杂合体 ,确 定内含 子的 位置。 S1 核 酸酶作 用于杂 合分子 中由内 含子产 生的单 链环。 • 327 . (3) 消 化在以 逆转录 酶合成 cDNA 时形成 的发夹 结构。 (4) 去掉 DNA 片段的 单链突 出末端 ,产 生用于 连接的 平端。 (5) 在限 制酶位 点处产 生小的 缺失。 (三) 绿豆 核酸酶 绿豆 核酸酶 (来 源于绿 豆芽) 是与 S1 核 酸酶类 似的高 度特异 性单链 内切酶 ,最适 pH5.0。 当 NaCl 的浓度 >200mmol/L, 其活 性明显 降低。 1U 酶 定义为 使用单 链鲑精 DNA 作 为底物 ,在 37t: lmin 内产生 lpg 酸溶性 物质的 酶量。 1. 反 应条件 100/mL 反 应体系 : 30mmol/L 乙酸钠 pH5.0, 50mmol/LNaCl, lmmol/L 乙 酸梓, 5% (WV) 甘油, lpgDNA, 50pg/mLBSA, 15U 绿豆核 酸酶。 37X: 温育 30min, 加入 l/uL0.5m〇l/LEDTA。 反应 体积、 DNA 的量 、酶量 、反应 温度和 反应时 间依具 体反应 而变。 2. 用途 (1) 在转 录物定 位作图 实验中 ,在 紧邻最 后一个 杂交配 对碱基 处作用 ,而不 移去任 何配 对的核 苷酸。 (2) 准确 切除经 限制性 内切核 酸酶消 化的不 配对突 出端。 (四) 微球菌 核酸酶 微 球菌核 酸酶来 源于金 黄色葡 萄球菌 ,是一 种非特 异性的 核酸酶 。它 能切割 单链和 双链 DNA 与 RNA, 生成带 3' 磷酸 基团的 寡核苷 酸和单 核苷酸 。此 酶对单 链核酸 作用更 强 ,它 优先在 DNA 或 RNA 的 AT 或 AU 丰富 区切割 ,其活 性可被 Ca2+ 的特异 螯合剂 EGTA 灭活。 1U 酶定 义为在 37X: 和 pH8.0 时 ,每 分钟催 化天然 DNA 产生 lpmol 酸溶性 寡核苷 酸的 酶量。 1. 反 应条件 典 型的消 化反应 条件是 10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L CaCl2。 但在高 pH 条 件下 ,活 性更高 。反 应体积 、核 酸的来 源与量 、酶量 、离子 强度、 反应温 度与时 间依具 体 反应而 有很大 的不同 。反 应可被 EDTA 或 EGTA 终止。 2. 用途 (1) 研究 染色体 结构。 (2) 从未 破坏酶 活性的 无细胞 粗提物 中去除 核酸。 . 328 . (五) 脱 氧核糖 核酸酶 I 脱 氧核糖 核酸酶 (DNase I) 来源 于牛胰 ,是一 种需二 阶阳离 子的内 切酶。 降解双 链 DNA 产生带 3' 羟 基的寡 核苷酸 。在 Mg2+ 存在下 ,在 双链 DNA 上产 生缺口 ,在 Mn2+存在下,断裂双链DNA(图4.25)。 有 Mg2+ 参与 的活性 5'_Li_L-3< 3’1 ~ H ~ 5’ 有 Mn2+ 参与 的活性 3' w 51* 3'OH P5,^^^"3,OH 5' 3诵5卞 + PS'^^S'OH P5'b»3' + OH3,,^"5,P +〇H3,""5, 图 4.25 脱 氧核糖 核酸酶 I (DNase I) 的催 化活性 P P P P =2=?: 1. 反 应条件 100pL 反 应体系 : 50mmol/LTris-HClpH7.5, 10mmol/LMgCl2 ( 用 于产生 单链缺 口, 使双链 DNA 断 裂时用 10mmol/L MnCl2 代替 ), 2/ug DNA, 50/ug/mL BSA, 1/iL DNase I (其 浓度依 具体反 应而定 )。 37X: 温育 1 〜 30min, 具体反 应时间 依需消 化的程 度而定 。加入 5^L0.5mol/LED- TA 终 止反应 。切口 平移反 应时, DNase I 的 反应与 DNA 聚合酶 I 的反 应同时 进行。 2. 制备 和贮存 DNase I 溶液 商 品化的 DNasel 是一 种冻干 的粉末 (2000~3000U/mg 蛋白质 ), 配成溶 液后保 存期 1 年以上 。用 lmL 含 20mmol/L Tris-HCl pH7.5 和 lmmol/L MgCl2 的 50% (m/ V) 甘 油溶解 lmgDNaseI( 不需振 荡助溶 ), -20"C 保存 。另外 ,也 可用 lmL 含 lmmol/L MgCl2 的 20mmol/L pH7. 5 的 Tris-HCl 缓冲 液溶解 lmg DNase I (不需 振荡助 溶 ), 以 lO^L 的小份 分装于 微量离 心管中 ,在 干冰 上迅速 冻结, -80X: 保存。 避免反 复 冻融。 3. 无 RNA 酶 活性的 DNase I 的制备 以 0.1mol/L 碘 乙酸、 0.15mol/L 乙酸 钠溶液 (PH5.3) 溶解 DNasel, 浓度为 lmg/mL。 55X: 加热 40min 后冷却 。加 lmol/L CaCl2 至 5mmol/L 终浓度 ,分 成小份 冻存。 4. 用途 (1) 切 口平移 。标 EDNA 探针时 ,可用 DNasel 在双链 DNA 上产 生随机 切口。 • 329 • (2) 在 Mn2+ 存 在时裂 解双链 DNA, 用 于随机 克隆。 十 、核糖 核酸酶 核糖 核酸酶 (RNase) 用于 RNA 测序、 RNA 作图及 RNA 定量等 。其 中核 糖核酸 ! 酶 A 用于 水解 DNA 样品中 污染的 RNA, 核糖 核酸酶 H 和核糖 核酸酶 T I 则 用其他 方面。 许多商 业化的 核糖核 酸酶都 是序列 特异性 的核酸 内切酶 。这 种性质 使得它 们用于 RNA 测序。 如上述 3 种核酸 酶与微 球菌核 酸酶结 合用于 RNA 测序。 (一) 核糖 核酸酶 A 核糖 核酸酶 A (RNase A) 来源 于牛胰 ,是在 C 和 U 残基 后特异 性水解 RNA 的内 切核糖 核酸酶 。切割 发生在 嘧啶核 苷酸的 3' 磷 酸基和 相邻核 苷酸的 5' 羟 基之间 。反应 终产物 为嘧啶 3' 磷酸 及末端 带嘧啶 3' 磷 酸的寡 核苷酸 。如: 5 ’ p ApGpGpCpCpGp ApGpUpGpCp ApGpG 3 ' 个个 个个 I RNase A 5’pApGpGpCp + Cp + GpApGpUp + GpCp + ApGpG 3' RNase A 的 活性可 被来源 于人类 胎盘的 特异性 抑制剂 RNasin 抑制。 1. 反 应条件 RNaseA的反应条件很广,且极难失活。在低盐浓度(0~100mmol/LNaCl)下 RNase A 切害 ij 单链 、双链 RNA, 也 能切割 RNA: DNA 杂合 体中的 RNA; 但 NaCl 浓度 为 0.3mol/L 或更 高时, RNase A 就特 异性切 割单链 RNA。 去除 反应溶 液中的 RNase A, 通 常需要 蛋白酶 K 处理 ,酚反 复抽提 和乙醇 沉淀。 2. 无 DNA 酶的 RNase A 的制备 用 TE 缓冲 液溶解 RNase A 至 lmg/mL, 煮沸 10 〜 30min 制备无 DNA 酶的 RNase A, 分成小 份存于 -20X:。 3. 用途 (1) 在核 糖核酸 酶保护 实验中 ,对 RNA 进 行定量 和作图 ,与 RNA 酶 TI 联合使 用 〇 (2) 降解 DNA 制备 物中的 RNA 分子。 (3) RNA 测序。 (4) 将双链 CDNA 的末 端修平 ,与 RNase H 联合 使用。 (5) 从 DNA:RNA 杂 交体中 去除未 杂交的 RNA 区。 (6) 确定 DNA 或 RNA 中单碱 基突变 的位置 。在 此方 法中, RNA: DNA 杂 交体上 • 330 . 的单 碱基错 配可被 RNase A 识别 并切割 。通 过凝胶 电泳分 析切割 产物的 大小即 可确定 错配的 位置。 (二) 核糖 核酸酶 H 核糖 核酸酶 H (RNase H) 是来自 大肠杆 菌的内 切酶, 它特异 地水解 RNA:DNA 杂 交体中 RNA 的磷酸 二酯键 ,产生 末端为 3' 羟基和 5' 磷酸的 产物, 它不降 解单链 或双链 的 DNA 或 RNA。 RNase H 的水解 可通过 用较短 的寡核 苷酸与 RNA 的杂 交而限 定于特 定的 位点。 1U 的酶定 义为在 37X:, 20min 内水解 polyA«poly (dT) 生成 lrnnol 的酸溶 性核苷 酸 所需的 酶量。 1. 反 应条件 100/uL 反 应体积 : 20mmol/LHEPES-KOHpH8.0, 2figRNA:DNA 异源双 链体, 50mmol/LKCl, 50fzg/mLBSA, lmmol/LDTT, 1U RNase H, 4mmol/LMgCl2〇 37X: 温育 20min, 用 l^L0.5mol/LEDTA 终 止反应 。反应 体积、 DNA 的总量 、酶 量 、温度 、时 间及终 止反应 的方法 可视具 体应用 而变。 2. 用途 (1) 降解 cDNA 第一链 合成时 产生的 RNA:DNA 双链 体中的 mRNA 分子, 以利于 双链 cDNA 的 合成。 (2) 通 过合成 脱氧核 糖核苷 酸产生 局部的 RNA:DNA 双链体 ,诱 发特 异性的 RNA 降解。 (三) 核糖 核酸酶 TI 核糖 核酸酶 TI (RNase TI) 是来 源于米 曲霉的 内切酶 ,它特 异地作 用于鸟 嘌呤核 苷酸 3' 端磷 酸并切 割与相 邻核苷 酸相连 的磷酸 二酯键 。反应 终产物 为鸟嘌 呤核苷 3' 鱗 酸 及末端 带鸟嘌 呤核苷 3' 磷酸 的寡核 苷酸。 5 ' pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGpC 3 ' I RNase TI 5'pApGp + Gp + CpCpGp + ApApGp + UpGp + CpApGp + C 3 1. 反 应条件 RNaseTI 的 反应条 件很广 ,且极 难失活 。在低 盐浓度 (0 〜 lOOmmol/LNaCl) 下 RNaseTI 切 割单链 、双链 RNA, 也 能切割 RNA:DNA 杂合 链中的 RNA; 但 NaCl 浓度 为 0.3mol/L 或更 高时, RNaseTI 就特 异性切 割单链 RNA。 去除 反应溶 液中的 RNase TI, 通 常需要 蛋白酶 K 处理 ,酚反 复抽提 和乙醇 沉淀。 . 331 • 2. 用途 (1) 在核糖 核酸酶 保护实 验中, 对尺^^八 进行 定量和 作图, 联合 使用。 (2) RNA 测序。 (3) 确定鸟 嗓呤含 量低的 DNA 模 板在体 外转录 中的转 录水平 。因为 RNaseTI 优先 水 解那些 非特异 的转录 产物。 (4) 去除 DNA: RNA 杂交 体中未 杂交的 RNA 区。 H 、 DNA 连接酶 用于 将两段 DNA 拼 接起来 的酶称 DNA 连接酶 。它催 化双链 DNA 中相邻 碱基的 5' 磷酸和 3' 羟 基间形 成磷酸 二酯键 。此 活性可 用于修 复双链 DNA 中的单 链缺口 (图 4.26), 连接 带平端 (图 4. 27) 或带同 源黏端 (图 4. 28) 的双链 DNA 限 制酶切 片段。 用 于核酸 研究的 有两种 DNA 连接酶 ,即 T4DNA 连接 酶和大 肠杆菌 DNA 连接酶 。这 两种 酶的性 质有两 点不同 :①所 用能源 不同, T4DNA 连 接酶以 ATP 为能源 ,大 肠杆 菌 DNA 连接 酶则以 NAD 为 能源; ②正 常反应 条件下 ,只有 T4DNA 连 接酶能 连接平 端 ,而大 肠杆菌 DNA 连接酶 则不起 作用。 因此分 子克隆 中最常 用的为 T4DNA 连 接酶。 实例 3' 5' 5, 3, (T4 连接酶 ) ATP ,r WWW ® P P ml 0 p HI [aH [1 0 g] 151 (e.cou mmm ) NAD (T4 连接酶 ) t)ATP I NAD AMP ^ Jr^AMP + PP, ▼ +NMN (£.co/i 连接酶 ) 图 4.26 DNA 连接酶 修复单 链缺口 的活性 •332 实例 5. 3' 3. D ATP (T4 连接酶 ) 5_ ^■■■■■■■■^^ 你冰辦 鑛 3. 3' 5. 3. 5. 图 4 . 27 DNA 连 接酶连 接平端 DNA 的活性 图 4.28 DNA 连 接酶连 接黏端 DNA 的活性 (一) T4 DNA 连接酶 T4 DNA 连接 酶是在 T4 噬菌 体感染 的大肠 杆菌中 发现和 分离的 ,它是 丁4 噬菌体 . 333 . 基因 30 的产物 。由 一条多 呔组成 ,分子 质量为 68kDa。 目 前已通 过基因 工程方 式制备 并销售 。该 酶能催 化两条 DNA 链的 3' 羟基和 5' 碟酸之 间形成 憐酸二 醋键而 把两个 DNA 分 子连接 在一起 。它不 但能把 两个具 有黏性 末端的 DNA 分子 连接在 一起或 把一个 DNA 分 子的两 个黏性 末端连 接起来 使之成 为环状 ,而 且也能 把具有 平端的 DNA 分子 连接起 来 。连 接两个 DNA 分子 的先决 条件是 它们的 末端必 须靠拢 在一起 ,所以 连接黏 性末端 的分 子比连 接平端 分子的 效率要 高得多 。目前 对平端 连接的 过程尚 不清楚 ,有人 认为平 端的连 接至少 需要两 个连接 酶分子 。其 中一 个分子 把握住 两个平 端使它 们维持 靠拢状 态 ,另一 分子催 化磷酸 二酯键 形成。 所以在 进行平 端连接 时需要 DNA 的 浓度更 高和更 多的 连接酶 。曾 报道用 8% ~ 16% 的 PEG 8000 可大大 提高平 端连接 和黏端 连接的 效率。 另 外加入 T4 RNA 连 接酶对 平端的 DNA 连接也 有促进 作用。 PEG 在这里 可起到 占据体 积 的作用 ,从 而有效 地提高 了平端 DNA 及酶 的浓度 ,可增 强水溶 液中大 分子间 的有效 作用。 T4DNA连接酶催化反应必须存在Mg2+和ATP,最适pH为7.5〜8.0。就酶活力 本身 而言, 温度在 37t: 时活力 最高, 5X: 以下活 力显著 降低。 由于必 须考虑 DNA 的稳 定性和 黏性末 端的退 火温度 ,黏 性末端 的连接 通常在 12 〜 15X: 进行 ,平 端的连 接通常 在室温 (<30t:) 进行 ,所 需酶量 是黏端 连接的 10~100 倍 。平端 连接反 应比黏 性末端 连接慢 得多, 但单价 阳离子 (低于 150mm〇l/LNaCl) 及低 浓度的 PEG 可 大大提 高平端 连接 的速率 。在 NaCl 浓 度高于 150mmol/L 时受 抑制。 1. 反 应条件 50pL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH7.5, 10mmol/L MgC^, l〇mmol/L DTT, 1/^gDNA, 0.5mmol/L ATP, 50^g/mL BSA, 1 “Weiss” U T4 DNA 连 接酶。 12 〜 30X: 温育 l~16h, 加入 2pL0.5mol/LEDTA 或 75X: 加热 lOmin 终 止反应 。反 应 体积、 DNA 浓度 、反 应温度 和反应 时间依 具体应 用而变 。在表 4.5 中酶的 单位为 Weiss 单位, 1 个 Weiss 单位 相当于 60 个黏 性末端 单位。 2. 用途 (1) 连接 带匹配 黏端的 DNA 分子。 (2) 使平端 的双链 DNA 分子 互相连 接或与 合成接 头相连 接。. (二) 大 肠杆菌 DNA 连接酶 大 肠杆菌 DNA 连 接酶是 基因编 码产物 ,现 已通过 基因工 程方式 克隆并 表达。 该 酶可修 复双链 DNA 中的 单链切 口并可 催化互 补黏性 末端的 连接。 PEG 8000 可增加 黏 端的连 接效率 ,亦 可促使 此酶有 效地连 接平端 。在正 常反应 条件下 ,它 不能 连接平 端, 但在聚 乙二醇 (PEG) 或 聚蔗糖 (Ficoll) 存在下 ,该 酶能催 化平端 连接。 聚乙二 醇和 聚蔗糖 在这里 起到占 据体积 的作用 ,从 而有效 地提高 了平端 DNA 及酶 的浓度 。由 于合成 cDNA 第 二链时 出现的 RNA 和 DNA 不 会被大 肠杆菌 DNA 连接酶 连接, 因此用 置换合 成法作 cDNA 克 隆时可 使用大 肠杆菌 DNA 连接酶 。但在 其他分 子克隆 操作时 , • 334 • 此酶并 不常用 ,这 是因为 T4 DNA 连 接酶在 没有体 积占据 剂时也 能有效 地连接 平端。 该酶 活性以 Modrich-Lehman 单位表 7K, 1 个 Modrich-Lehman 单位 相当于 6 个 Weiss 单位。 1. 反 应条件 50pL 反 应体系 : 40mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L MgCL, 5mmol/L DTT, ljugDNA, O.lmmol/LNAD, 50/zg/mLBSA, 10 “Modrich-Lehman” U 大 肠杆菌 DNA 连 接酶。 10~25t: 温育 2 〜 16h, 加入 24〇.5111〇1/1^£0丁八或751加热10〇^终止反应。反 应 体积、 DNA 浓度, 反应温 度和时 间依具 体应用 而变。 2. 用途 大 肠杆菌 DNA 连 接酶在 非平端 连接时 可代替 T4 DNA 连接酶 ,它产 生的背 景低, 准确 性高。 +二、 RNA 连接酶 T4RNA 连 接酶是 T4 噬菌 体基因 63 的编 码产物 。在 ATP 存在下 ,它催 化单链 DNA或RNA的5'端磷酸与单链DNA或RNA的3'端羟基共价连接(图4.29)。 图 4.29 RNA 连接 酶活性 1. 反 应条件 50fxL 反 应体系 : 50mmol/L HEPES pH8.3, 10mmol/L MgCL, 5mmol/L DTT, 2fxg DNA ^ RNA, 2mmol/L ATP, 50/ig/mL BSA, 1U 14 RNA 17X: 温育 10h, 加入 2ML 0 . 5mol/L EDTA 终止 反应。 . 335 . 2. 用途 (1) RNA3' 末端 的放射 性标记 。在 标记反 应中, RNA 为 受体, 5'-32p 标记的 3'5'- 二磷 酸核苷 (如 5'-32pGp) 为 供体, ATP 为能源 。反应 终产物 为含有 32P 标记的 3' 末端核 苷酸的 RNA 分子。 (2) 寡聚 DNA 和 RNA 分子 环化。 (3) 在寡 核苷酸 合成中 ,连 接寡聚 物产生 在特异 性位点 上带有 内部标 记的寡 聚体。 (4) 增加 T4 DNA 连接 酶的平 端连接 活性。 第四 节重组 DNA 分子 的构建 重组 DNA 的基本 过程是 DNA 克隆, 即获得 重组体 DNA 的无性 繁殖系 。它 包括载 体 及目的 DISJA 片段 的制备 、目的 DNA 片段 与载体 的连接 、重组 DNA 导 入受体 细胞及 重组 体的筛 选与鉴 定等。 ’ 目的 DNA 的 制备是 DNA 克隆的 第一步 。目前 获取目 的基因 常用的 方法有 基因的 化学 合成法 、酶促 合成法 、酶 切法及 PCR 扩增 法等。 PCR 方法 可以从 染色体 DNA 和 cDNA 模板 中扩增 得到目 的基因 ,但该 法只能 用于已 知序列 的基因 或与其 同源性 高的未 知序 列基因 ,且扩 增产物 DNA 序列 发生差 错的概 率高达 0.25%。 尽管 如此, PCR 扩增 方法 因其快 速简便 的优点 仍得到 广泛的 应用。 化学合 成目的 基因的 优点主 要是可 以任意 制 造并修 饰基因 ,在基 因两端 方便地 设立各 种接头 以及选 择各种 宿主生 物偏爱 的密码 子 ,但对 于大基 因而言 ,该法 的费用 偏高。 构建或 选择适 合于克 隆目的 基因的 载体是 DNA 克 隆技术 的关键 。目 的基因 只有与 适合 的载体 连接, 并由其 引入相 应的受 体细胞 ,才能 在新的 宿主细 胞中得 到扩增 。在构 建或 选择克 隆目的 基因的 载体时 ,要根 据目的 基因的 特性, 着重考 虑以下 几个条 件:① 有足 够的容 纳目的 基因的 幅度, 并使目 的基因 能够借 助于载 体的复 制与调 控系统 得到忠 实的 复制与 增殖; ②在非 必要的 DNA 克隆区 段有多 种限制 性酶的 单一识 别位点 ,易于 目的基 因片段 与载体 的连接 、重 组与 筛选; ③与 宿主 细胞有 一个或 多个利 于检测 的遗传 表型 (如 抗药性 、营 养缺陷 型或显 色表型 反应等 ); ④拷 贝数多 ,易 与宿主 细胞的 DNA 分开 ,便 于分离 提纯。 DNA 片段的 重组连 接是靠 DNA 连 接酶将 目的基 因与载 体共价 连接的 。连接 的方式 不外 乎两种 ,一 种是黏 端连接 ,另一 种是平 端连接 。在 这两 种连接 方式中 又有多 种酶连 技巧, 比如黏 端连接 可以用 同一种 限制酶 切割位 点连接 ,也 可以用 不同限 制酶切 割位点 连接 ,还 可以用 同裂酶 切割后 相连接 。平端 连接可 直接用 T4DNA 连接酶 相连接 ,但 更多 的是加 同聚尾 或人工 接头后 再进行 连接。 外 源基因 与载体 在体外 连接成 重组体 DNA 分子后 ,要 使其扩 增和表 达就必 须把重 组分子 引入受 体细胞 。受 体细胞 可以是 微生物 细胞、 动物细 胞或植 物细胞 。目前 应用最 广的微 生物受 体是大 肠杆菌 K-12 株的衍 生菌, 它是人 工改造 的安全 宿主菌 ,在 人的肠 道几无 存活率 或存活 率极低 。除 安全标 准外, 所采用 的衍生 菌应是 限制酶 缺陷型 ,即外 源 DNA 进 入受体 菌不致 被降解 。此外 ,还应 为重组 缺陷型 ,这 样可保 证外源 DNA 在 • 336 • 细菌内 的完整 、独 立存在 ,而 不与细 菌基因 组发生 重组。 重组 DNA 分 子导入 受体细 胞后能 在选择 性培养 基或抗 性平板 上生长 的细胞 是转化 体 。这些 转化体 是否含 有重组 DNA 还 需进一 步筛选 与鉴定 。尤其 是单位 点酶切 后进行 连接 ,存在 大量自 身环化 的载体 ,即使 双酶切 后进行 连接, 也有可 能因酶 切不彻 底而出 现自 身环化 的载体 。因此 必须从 转化菌 中筛选 出含有 DNA 重组体 的菌落 。常用 的方法 有 a- 互补、 营养缺 陷互补 、插入 失活、 酶切图 谱分析 、杂交 、序 列测 定等。 一、 DNA 片段的 亚克隆 (一) 基 本方法 1. 原理 此 法是利 用限制 酶切割 DNA ( 有必要 可用其 他修饰 酶修饰 ), 通过凝 胶电泳 纯化目 的 DNA, 在 DNA 连接酶 催化下 ,使 目的 DNA 与载体 连接。 连接产 物导入 受体菌 ,通 过 选择标 记筛选 转化子 ,小 量制备 DNA 作 限制酶 切图谱 鉴定转 化子中 是否含 有目的 DNA。 整个克 隆实验 按照下 述轮廓 进行。 2. 材料 小牛 肠碱性 磷酸酶 (CIP) 和 缓冲液 O.5mmol/L 4dNTP 混合液 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段或 T4 DNA 聚合酶 寡核苷 酸接头 10mmol/L ATP 0.2 mmol/ L DTT T4 DNA 连接酶 2 x T4 DNA 连接酶 缓冲液 3. 操 作步骤 (1) 在 20pL 反应 体积内 用合适 的酶完 全消化 DNA。 75*C 加热 15min, 灭活酶 。如 若无需 进一步 的酶促 处理, 接步骤 (6)。 (2) 如果 5' 磷酸需 要去除 ,加入 2ML10XCIP 缓 冲液和 1UCIP, 37X: 温育 30~ 60min, 75X: 加热 15tnin 终 止反应 。如无 进一步 的酶促 处理, 接步骤 (6)。 (3) 如果 限制酶 消化的 DNA 片 段的一 端或两 端需变 为平端 ,加入 1/uL 含 4 种 dNTP 混合液 (每种 〇.5mmol/L) 和适量 Klenow 酶或 T4DNA 聚合酶 ,温 育, 75"C 力口 热 15min 终 止反应 。如 果只需 1 个平端 ,可用 适当的 酶消化 。如无 进一步 的酶促 处理, 接步骤 (6)。 (4) 若 需加入 寡核苷 酸接头 ,加入 〇.1~1.〇网 的合 适的寡 核苷酸 接头, lpL 10mm〇l/LATP, lpL0.2m〇l/LDTT, 20 〜 100 黏 性末端 单位的 T4DNA 连接酶 , 15X: 过夜, 75X: 加热 lOmin 以终止 反应。 . 337 . (5) 用识别 接头的 限制性 内切核 酸酶切 割步骤 (4) 的产物 。如 果两 个末端 只有一 个含 有接头 ,产物 加入另 —种酶 切割。 (6) 用 琼脂糖 凝胶电 泳分离 所需的 DNA 片段 ,在紫 外灯下 ,切 下所 需条带 ,纯化 DNA。 必 须使用 长波紫 外光源 以防止 DNA 的 损伤。 (7) 建立以 下连接 反应: 9^L 10/iL l^tL T4 DNA 连接酶 15*C 温育 24h。 含 4 个 碱基的 3' 或 5' 突出的 两个片 段的简 单连接 需要的 连接酶 量较平 端或复 杂的连 接反应 要少得 多 ,而 DNA 的质 量也影 响连接 酶量。 (8) 取 1 〜 lOfxL 连 接产物 转化感 受态大 肠杆菌 ,利 用载体 上的遗 传标记 选择重 组子。 (9) 用小 量制备 法纯化 质粒或 噬菌体 DNA, 用 限制性 内切核 酸酶作 进一步 分析。 DNA 成分 (0.1 〜 5fig) 2 x 连接 缓冲液 10mmol/L ATP (20 〜 500 黏性末 端单位 ) (二) DNA 片 段的胶 内连接 1. 原理 DNA 的 胶内连 接是近 年新发 展起来 的一种 快速克 隆技术 。其 方法是 将目的 DNA 片 段 经过琼 脂糖凝 胶分离 ,再 用低熔 点琼脂 糖挖块 法回收 含目的 DNA 片段 的胶块 ,然后 直 接熔化 胶块与 先已制 备好的 2 倍连 接体系 ( 包括一 定比例 的载体 DNA) 进行 胶内连 接 。这 种胶内 连接方 法简便 快速, 对黏端 与平端 的连接 都可采 用此法 ,但 与常规 的方法 相比 ,该法 连接效 率较低 ,可以 通过增 加目的 DNA 片段 与载体 DNA 片段 的含量 ,以 及 连接酶 的量来 弥补。 2. 附 加材料 低熔 点琼脂 糖凝胶 (Seaplaque, FMC Marine Coloids) TAE 电泳 缓冲液 (配 制见琼 脂糖凝 胶电泳 一节) 2XT4 DNA 连接酶 缓冲液 100mmol/L Tris-HCl, pH 7.5 20mmol/L MgCl〗 20mmol/L DTT 3. 操 作步骤 (1) 重 复基本 方法中 的步骤 (1) 〜 (5)。 (2) 在高质 M 的低 熔点胶 中分离 DNA, 琼脂糖 浓度为 0.7%, 电泳缓 冲液为 TAE。 (3) 用刀 片切下 含有目 的条带 的胶块 。胶块 体积尽 可能小 (20 〜 50ML), 将 胶块置 . 338 . 于 小离心 管中。 (4) 于 70X: 熔化低 熔点胶 lOmin 以上。 每个连 接反应 在不同 的试管 中进行 。在 9^L 的体积 中混合 含适当 DNA 的 凝胶块 (需 要时用 水补足 )。 37X: 放置数 分钟。 (5) 加入 11/iL 冰冷的 含载体 DNA、 ATP、 T4DNA 连 接酶及 2X 缓冲 液的混 合液, 并于 15X: 温育 1 〜 48h。 当胶 重新凝 固时, DNA 片段同 样可被 连接。 (6) 73X: 重新 熔化胶 5 〜 lOmin, 取 5/iL 连接产 物加于 200pL 感 受态大 肠杆菌 ,然 后 通过选 择标记 ,筛 选出重 组子。 (7) 用小 量制备 法纯化 质粒或 噬菌体 DNA, 用 限制性 内切核 酸酶作 进一步 分析。 (三) 同源黏 性末端 DNA 片段的 亚克隆 用同一 种限制 酶去消 化载体 和外源 DNA 分子 ,以 产生相 同的黏 性末端 ,当 这样的 两个 DNA 片 段一起 退火时 ,黏性 末端单 链间进 行碱基 配对, 然后在 DNA 连接 酶催化 下 形成共 价结合 的重组 DNA 分子。 实际上 ,采用 这种方 法除了 得到少 数重组 分子外 ,大部 分可能 为载体 (质粒 ) 自我 环化 的产物 (单 体或两 个质粒 环化连 接生成 的双体 )。 外源 DNA 片段也 可黏接 生成二 聚体或 寡聚体 。重组 过程中 DNA (尤其 是质粒 DNA) 的自 我环化 不仅降 低了重 组和转 化效率 ,而且 给以后 的筛选 工作带 来困难 。为了 防止同 源粒端 DNA 分子 的自我 环化, 可用碱 性磷酸 酶处理 载体除 去切口 5' 末端 的磷酸 ,即可 防止载 体的自 我环化 ,而 能与 外源 DNA 重组, 生成重 组分子 。重组 分子存 在缺口 ,待 进入宿 主细胞 后再被 修复。 如 将一个 2kb 的 £c〇R I 酶切 片段插 入载体 。可用 £c〇R I 切割 载体。 载体切 割后用 小 牛肠碱 性磷酸 酶处理 (图 4.30), 以 减少自 我环化 。在 DNA 连接酶 催化下 ,载体 DNA 与 £〇?R I 切割 的外源 DNA 片段 连接形 成重组 DNA 分子。 为了保 证外源 DNA 能 载体 插 入片段 5,pAATTC^^^^G 3, 5, pAATTC G 3, 3' G™"^™™CTTAAp 5’ 3* G^®^^^CTTAAp 5' 图 4.30 用小 牛肠碱 性磷酸 酶修饰 切割后 的载体 • 339 • 与 载体有 效连接 ,必 须提供 足够量 的外源 dna。 因 为所有 EC0R I 末 端都是 等价的 ,外源 DNA 片 段可以 两个不 同的方 向插入 载体。 为了区 别这两 种方向 相连接 后产生 的重组 DNA 分子 ,我们 可用一 种限制 酶不对 称地切 割插入 DNA, 然 后进行 限制性 作图加 以区分 。此外 ,多 个外源 DNA 片段 可能插 入同一 载体 ,这种 情况一 般少见 。如果 发生这 种情况 ,所有 DNA 片段通 常必须 以相同 方向插 入才 能在大 肠杆菌 中复制 ,若以 相反方 向插入 则不能 在大肠 杆菌中 复制, 但少于 30bP 的 DNA 以相反 方向插 入则能 在大肠 杆菌中 复制。 由于以 上原因 ,同源 黏端的 克隆应 尽可能 避免。 (四) 异 源末端 DNA 片 段的定 向克隆 此法是 克隆最 有效的 方法。 它是利 用两种 限制酶 同时切 割载体 和外源 DNA 生成不 同 的末端 ,使两 种分子 不能自 我环化 ,只 能重组 。因 为它们 之间具 有相同 的黏性 末端, 即配 伍末端 ,因 而可进 行黏性 末端定 向连接 。如 EcoRI (G+AATTC) 和 BamHI (G + GATCC) 切割 DNA 后分 别产生 5' 突出的 AATT 和 GATC 黏 性末端 ,这样 ,载 体和外 源 DNA 不能自 我环化 ,但彼 此可相 互连接 。这 种连 接效率 非常高 ,几乎 所有的 转化子 中都 含有定 向克隆 的目的 DNA 片段。 2 个载体 DNA 片段的 连接产 物不能 在大肠 杆菌中 稳定 存在, 2 个目的 DNA 片段的 连接产 物不能 形成, 3 个目的 DNA 片段 的连接 产物很 少见。 定 向克隆 的主要 问题是 限制酶 不完全 消化所 产生的 错误的 DNA 片段 (尤其 是载体 的不完 全消化 )。 如载体 只有一 个位点 被切开 ,就 会产 生自我 连接的 DNA 分子 ,理论 上 ,通 过凝胶 电泳可 去除这 些不完 全消化 的产物 。实 际上, 当两种 酶切位 点紧密 连在一 起时 ,凝 胶电泳 就不可 能将不 完全消 化的产 物去除 。如 PUC 和 M13mp 载体中 的多接 头就 是如此 ,它们 的酶切 位点密 集排列 在一起 ,用两 种酶消 化后, 要将不 完全消 化的载 体 DNA 分 开是困 难的。 另外 3 个 片段以 上的自 连与互 连也是 定向克 隆存在 的问题 。一般 这种概 率较少 ,但 也有 。我们 通过控 制载体 DNA 与目的 DNA 的分 子比例 ,可 以影响 重组率 。一 般情况 下 ,对 分离片 段来讲 ,载体 DNA 的 摩尔数 与目的 基因的 摩尔数 之比为 1:5。 但 目的基 因的比 例太大 ,容易 产生基 因自连 后插入 载体的 多聚体 。连 接体 积太大 自连机 会多。 (五) 平端 DNA 连接 某 些限制 酶切割 DNA 后产 生平端 ,用化 学合成 、机 械修剪 及酶促 合成的 DNA 或 cDNA 片段也 没有黏 性末端 ,这 些不 带黏性 末端的 片段虽 然可用 T4 DNA 连接酶 连接, 但 效率低 。通 常采用 加接头 或加同 聚物尾 的方法 使平端 变成黏 性末端 再连接 。但 在下列 情况下 常采用 平端连 接:① 没有合 适的酶 切位点 ,如 没有合 适的酶 使目的 基因片 段产生 黏 性末端 ,那 么就可 用平端 连接; ②修改 阅读框 ,如 我们要 在目的 DNA 片段中 加上几 个 核苷酸 或者减 少几个 核苷酸 ,那么 就可采 用适当 的限制 酶把它 切成黏 性末端 ,再用 Klenow 酶 把它填 平或用 核酸外 切酶把 它切平 ,再 用连接 酶连接 。这样 在目的 DNA 片段 • 340 • 中 就增加 了几个 核苷酸 或减少 了几个 核苷酸 。如某 DNA 片段中 含£〇>1^ I 位点, 首先用 £c〇R I 切割该 DNA 产生黏 性末端 ,再用 Klenow 酶将其 填平, 最后用 T4 DNA 连接酶 连接 ,这样 在目的 DNA 中就 增加了 4 个 核苷酸 (图 4.31)。 同样 可采用 核酸外 切酶切 除黏 性末端 ,那 么就可 使目的 DNA 中减少 4 个 核苷酸 (图 4.31)。 5, CAATTC y 5; CTTAAG 5 , | £coR I 5' G AATTC 3' 3' CTTAA G 5, Klenow 酶 / GAATT AATTC V CTTAA TTAAG 5. I T4 DNA 连接酶 5, GAATTAATTC V CTTAATTAAG 5, \ 核酸 外切酶 5, G C 3, V C G 5, J T4 DNA 连接酶 5' GC 3, 3, CG —— 5' 图 4.31 平端连 接修改 阅读框 (六) 非互 补末端 DNA 片段 的连接 假设我 们要将 £c〇R I 消化 产生的 5' 突出端 (5'AATT) DNA 片段与 Sac I 消化产 生的 3' 突出端 (AGCT) DNA 片 段连接 。则 需将这 些非互 补的黏 性末端 转化为 平端才 能连接 (图 4.32)。 对于 5' 突出端 ,我们 可采用 Klenow 酶 ,在 4 种 dNTP 存在 时将其 填平 。对于 3' 突出端 ,我们 可采用 T4 DNA 聚 合酶或 Klenow 酶的 3'— 5' 外切酶 活性将 I 末端 G 3, 3 , CTTAA 5 , •Sac I 末端 5* C 3 ' 3’TCGAG 5 Klenow 片段 D DNA 聚合酶 I 4 dNTP T4 DNA 聚合酶 4 dNTP GAATT c C TT AA • _ '、贫 :; :•;• GAATT C CTTAAG 重新 形成的 I 位点 图 4.32 非互 补末端 DNA 片段 的连接 • 341 . 其切平 。由于 T4DNA 聚 合酶的 3' — 5' 外切酶 活性比 Klenow 酶强 得多’ 故首选 T4 DNA 聚合酶 。此反 应仍需 4 种 dNTP 的存在 ,其作 用是防 止更广 泛的外 $ 酶活性 。这 两种聚 合酶在 所有的 限制酶 缓冲液 中都能 起作用 ,因 而当限 制酶消 化后, 句直接 加入聚 合酶 ,但 需另加 4 种 dNTP。 相 关末端 一旦变 为平端 ,即可 按平端 连接的 方式进 行连接 。一般 情况下 ,非 互补末 端的连 接产物 不能再 被原产 生末端 的限制 酶消化 。其融 合点的 分子结 构可通 过 DNA 序 列 分析进 行测定 。有时 平端连 接产物 重新产 生一种 酶的识 别位点 ,其 融合 点的结 构可通 过限 制酶切 图谱进 行分析 。例如 , £c〇R I 酶切后 填平的 DNA 片 段具有 GAATT 末端序 列, 那么与 5' 末端是 胞嘧啶 核苷酸 (C) 的 DNA 片段 连接。 连接产 物则重 新产生 £r〇R I 位点 。这时 我们就 可以用 I 限制 酶来鉴 定连接 产物。 (七) 部 分消化 DNA 片段 的连接 同 一种酶 对某一 DNA 进行部 分消化 ,所得 产物有 一种以 上成分 ,通 过凝胶 电泳分 离目的 DNA 片段 。这些 DNA 片段 连接反 应可按 正常的 连接方 式进行 。部 分消化 DNA 片段的 连接要 克服的 主要困 难是获 得足够 的目的 DNA 片段 ,其办 法是在 凝胶电 泳前增 加 DNA 的量 (1 〜 5叫)。 为了 保证适 度的部 分消化 ,常 采用酶 系列稀 释法。 要从 部分消 化的产 物中纯 化目的 DNA 片段 往往是 困难的 。尤其 是同一 DNA 分子 中 含有多 个酶切 位点或 者切割 位点紧 密靠在 一起时 ,纯 化目的 DNA 片段 则更为 困难。 但这种 不纯的 DNA 片段的 连接产 物导入 受体细 胞后, 只会引 起较低 的背景 。例如 ,凝 胶 电泳后 一条带 中含有 4 种不 同的克 隆片段 ,它们 的连接 产物转 化大肠 杆菌后 ,就 约有 25% 的转化 子中含 有目的 DNA 片段 ,筛选 含目的 DNA 片 段的转 化子的 概率还 是很大 的。 而且在 一端部 分消化 和在另 一端由 另一种 酶完全 消化的 DNA 片段, 其中许 多不能 与载体 连接, 因而不 会产生 背景。 (八) 加接 头连接 对 于平端 DNA, 为了 提高连 接效率 ,可在 平头末 端接上 带某种 限制酶 切点的 接头, 使产生 新的酶 切位点 ,然 后用该 种限制 酶酶解 ,即可 得到黏 性末端 (图 4.33)。 用这种 方法可 以得到 两端带 不同酶 切口或 带同一 酶切口 的黏性 末端。 所谓 接头是 由人工 合成的 、连 接在目 的基因 两端的 、含 有某个 限制酶 切点的 寡聚核 苷 酸片段 ,长度 一般为 8~12bp。 由于在 目的基 因中也 可能含 有同样 的限制 酶切点 ,为 了保 护目的 基因不 受限制 酶破坏 ,先用 甲基化 酶修饰 。连接 接头后 ,再用 相应的 限制酶 切割 ,这时 切口就 只发生 在人工 接头上 ,而 不会 损及目 的基因 。由 此得到 连接所 必需的 黏 性末端 ,就 可以连 接到用 同样酶 切的载 体上。 例如 GGAATTCC 是一个 8bD 的 £c〇R I 接头 (划线 的核苷 酸代表 £〇>RI 的识 别位点 )。 要将此 接头加 到平端 DNA 两端。 加 接头分 3 步进行 。① 平端 DNA 与接 头连接 (图 4. 33)。 加入 0.1 〜 1 吨接头 ,摩 尔数超 过目的 DNA 片段的 1〇〇 〜 1〇〇〇 倍 。加 入高浓 度平端 DNA, 使这种 平端连 接比通 常更 有效。 一般接 头在连 接前需 磷酸化 ,连 接后, DNA 片 段的每 一端都 含有几 个这样 • 342 • 钝端 DNA £coR 1 接头 pGGAATTCC AATTCC GG CCTTAA 图 4.33 平端 DNA 与 EojR I 接 头连接 的接头 (即 多聚体 )。 有些连 接反应 ,需 加非磷 酸化的 接头, 这种连 接产物 DNA 片段 的每 一端只 含有一 个接头 。②加 热处理 使连接 酶失活 ,再 加限 制酶切 割接头 。由 于加入 接 头的摩 尔数大 ,因而 酶切位 点的浓 度就高 ,高浓 度的酶 切位点 ,温 育时 间一般 需几小 时, 而且酶 量要大 (20~50U)。 目的 DNA 中不 含限制 酶的识 别位点 是至关 重要的 ,因 而 在目的 DNA 与接头 连接前 ,用 与限 制酶相 应的甲 基化酶 对目的 DNA 进 行修饰 。如 有可能 ,连接 产物应 用第二 种限制 酶消化 ,使 之产生 异源末 端以适 合克隆 。③凝 胶电泳 纯化 DNA, 除去 未连接 的接头 。接 头亦可 采用其 他方法 除去, 如采用 Sephar〇seCL-4B 或 SephacylS^OO 柱层 析法除 去接头 。但 电泳方 法比这 些方法 更有效 ,它 不但可 除去接 头 ,还可 除去不 需要的 DNA 片段 。随 后的连 接反应 可按常 规方法 进行。 (九) 合成寡 核苷酸 的克隆 采用化 学方法 合成的 单链寡 核苷酸 ,经退 火形成 双链寡 核苷酸 。一般 单链寡 核苷酸 退 火前用 T4 多核 苷酸激 酶使之 磷酸化 。磷酸 化的双 链寡核 苷酸亦 可由单 链寡核 苷酸相 互引 导合成 。不同 方法所 获得的 双链寡 核苷酸 均可通 过标准 的黏端 连接或 平端连 接进行 克隆 。问题 是寡核 苷酸的 分子小 ,所加 的摩尔 数往往 过量, 因而往 往出现 多个寡 核苷酸 插入同 一载体 。处 理的 最好方 法是采 用寡核 苷酸的 10 倍系列 稀释法 ,用 各种浓 度的寡 核 苷酸作 平行连 接反应 。一 般来说 ,出 现单个 寡核苷 酸插入 转化子 的最佳 条件是 在连接 反应混 合物中 寡核苷 酸的摩 尔数超 过其他 DNA 片 段的摩 尔数的 5~20 倍。 二、 PCR 构建 重组的 DNA 分子 利用聚 合酶链 式反应 (PCR), 任 何两个 DNA 片段可 连接成 一个新 的重组 DNA 分 子。 通过在 PCR 引物中 引入额 外非同 源的核 苷酸, 可在连 接处产 生所需 要的读 码框架 或酶 切位点 ,可在 DNA 的 任意位 点替换 、删除 或插入 核苷酸 。用 该技术 并不需 要知道 待亚 克隆的 DNA 的核苷 酸序列 ,只 需要 知道两 小段伸 展于片 段两侧 的区段 (约 20bp) 作为扩 增反应 的引物 结合区 。此 技术可 用来产 生符合 读码框 架的融 合蛋白 (图 4.34), • 343 • y 与靶 DNA 同 源序列 I — I I L 1 引物 1 5' GCGCGAATTCAATGNNNNNNNNNNN ^ W I I y 与靶 DNA 同 源序列 I ^ I 弓 I 物 2 5* GCGCGGATCCNNNNNNNNNNNNNNN BamH I 靶 DNA E4 引, 1 弓 FSTVb 扩增 E B 用 £coR I 和 5amH I 消化 载体 DNA 用 £coR I 和 5a/wH I 消化 图 4.34 用 PCR 反 应引入 单一的 酶切位 点和产 生符合 读码框 架的融 合蛋白 序贯 PCR 扩增产 生重组 DNA 分子 (图 4. 35) 或 用反向 PCR 引入限 制性酶 切位点 (图 4.36)0 此 法最大 的不足 是要验 证克隆 的目的 DNA 有无 突变时 ,由于 所用的 DNA 聚 合 酶缺乏 3'-5' 外切 酶活性 ,因而 缺乏校 对功能 ,错误 率较高 。在 PCR 过程中 ,核苷 酸掺入 的错误 率可达 每循环 8.5 x l(T6 个 核苷酸 ,约比 使用大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片 段时高 4 倍 ,但 Klenow 酶对热 不稳定 。对 于一个 30 轮循 环的扩 增反应 来说, 这 一掺入 错误率 将导致 0.1% 〜 0.25% 的总错 误频率 。现已 有两种 具有校 对功能 的耐热 DNA 聚合 酶出售 ,即 Pfu DNA 聚 合酶和 Vent DNA 聚合酶 。这 两种 DNA 聚 合酶比 • 344 • 靶基因 I 靶基因 n E~| 引吟 la 基因 I 同源区 _ 引垮 lc 基因 n 同源区 引物 lb 在各 个独立 反应中 扩增每 一个靶 DNA 引 B 在其余 反应中 未显示 """"" "T T" '"' ■"'"■""fT"-"^-"r"-'-"iii-nii. B E 用 ra? DNA 聚合 酶延伸 B E B E , 外 侧引物 (la, Id) 退火 B E 基因 I 扩 增杂合 PCR 产物 ' 基因 II B 初始 靶基因 I 初始 靶基因 n PCRDNA, 靶基因 I PCRDNA, 靶基因 II 一 _PCRDNA, 杂 合基因 图 4.35 序贯 PCR 法构 建重组 DNA 分子 引物 lb 有 与基因 2 同 源区域 ,引物 lc 有 与基因 1 同 源区域 了 叫 DNA 聚合酶 更耐热 。其 催化产 物的精 确率, PfuDNA 聚 合酶比 TagDNA 聚合酶 高 12 倍, Vent DNA 聚合 酶比: T 叫 DNA 聚 合酶高 4 倍。 PCR 构 建重组 DNA 是 用合成 带新的 单酶切 位点的 寡核苷 酸扩增 DNA 片段 ,便于 将其 亚克隆 到含互 补末端 的酶切 位点的 载体。 • 345 • 51 除 去引物 ,用 R 消化 DNA; 连 接环化 R 1. 材料 模板 DNA ( 1 〜 10ng 质粒或 噬菌体 DNA, 20 ~ 30ng 基因组 DNA 或 cDNA) 寡核苷 酸引物 (0.6 — 1.0mmol/L) 矿物油 TE 缓冲 饱和酚 和氯仿 无 水乙醇 TE 缓冲液 ( 10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/LEDTA) Klenow 酶 载体 DNA 小牛 肠碱性 磷酸酶 (CIP) 磷酸 化合成 的寡核 苷酸、 PCR 扩增 DNA、 琼脂 糖和聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳、 DNA 的制备 与纯化 、限 制酶 消化、 DNA 片 段连接 、连 接产 物转化 大肠杆 菌所需 的试剂 与设备 图 4.36 用反向 PCR 插入酶 切位点 R 表示 限制性 内切核 酸酶, 目的质 粒上没 有该酶 的位点 2. 操 作步骤 (1) 制 备模板 DNA, 如 DNA 不 是经氯 化铯 梯度纯 化的, 100X: 煮沸 lOmin 以 灭活核 酸酶。 快速制 备或氯 化铯梯 度纯化 的质粒 DNA、 噬菌体 DNA、 基因组 DNA 或 cDNA 均可 作为靶 DNA。 (2) 制备 寡核苷 酸引物 ,若 PCR 产物要 进行平 端克隆 ,就 应该对 引物的 5' 端羟基 进行 磷酸化 处理。 需要 PCR 产物的 5' 端磷酸 与载体 DNA 的 3' 端 羟基形 成磷酸 二酯键 而连接 。如载 体经磷 酸酶处 理 ,此步 骤是必 需的。 (3) 建立标 准的扩 增反应 ,以矿 物油覆 盖表面 ,在以 下条件 下进行 20 〜 25 轮扩增 循环 : 94X: 变性 lmin, 50X: 退火 lmin, 72X: 延伸 3min, 最 后一个 循环在 72X: 延伸 lOmin, 尽可 能使扩 增产物 完整。 在扩增 反应中 ,具 3'-*5W 卜切 酶活性 的耐热 DNA 聚合酶 ,如 PfuDNA 聚合酶 (Stratagene 公司) 或 VentDNA 聚合酶 (NewEngland Biolab 公司) 可代替 Tag DNA 聚合酶 以减少 扩增过 程中核 苷酸的 错误 掺入。 (4) 取少 量反应 混合物 (4~8/iL), 用琼 脂糖凝 胶电泳 或聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳检测 扩增 效果。 (5) 吸 去矿物 油上层 ,用氯 仿抽提 1 次除去 残存的 矿物油 。用 饱和 酚抽提 1 次 ,然 后用 无水乙 醇沉淀 DNA。 (6) 4*C 高 速离心 lOmin, 沉淀用 20MLTE 缓冲 液溶解 。用玻 璃珠、 电洗脱 或低融 点胶的 酚抽提 法进一 步纯化 PCR 产物可 去除未 掺入的 dNTP、 引物、 无关的 PCR 产物 • 346 • 和模板 DNA。 (7) 对 于通过 平端连 接进行 的克隆 ,用 DNA 聚合酶 I ( 或 Klenow 酶) 修平 扩增片 段的 3' 端 。因: Tag DNA 聚合酶 通常在 PCR 产物的 3' 末 端加上 dA, 故此 步是需 要的。 对于 通过黏 端连接 进行的 克隆, 如引物 中含有 单一酶 切位点 ,则在 20pL 体 积用合 适 的酶消 化一半 PCR 产物 。用过 量的酶 消化数 小时。 (8) 用合 适的末 端互补 的酶在 20fiL 体积 内消化 0.2 〜 20网 载体 DNA, 用 CIP 去磷 酸化 ,以阻 止载体 自连。 (9) 用普 通琼脂 糖或低 融点琼 脂糖电 泳分离 线性化 的载体 。用玻 璃珠、 电洗脱 、或 酚抽提 法回收 线状的 载体。 (10) 连接 PCR 片段 和线状 载体。 (11) 取部 分连接 产物转 化大肠 杆菌。 从转化 体中以 小量制 备法提 取质粒 DNA。 (12) 用 合适的 酶消化 转化体 的质粒 DNA, 以 琼脂糖 凝胶电 泳分析 以确证 片段的 插入。 (13) 测 定质粒 DNA 中扩增 片段的 序列, 检查有 无突变 ,或者 用生物 化学或 遗传学 方 面的功 能分析 筛选转 化体。 第五节 非同位 素探针 标记及 其应用 一 、非同 位素探 针的标 记和比 色检测 近年 文献报 道了许 多非同 位素的 标记物 ,但最 常用和 商业化 的非同 位素标 记物是 生 物素和 地高辛 。它们 很容易 掺入到 DNA 中并通 过比色 法检测 。很 多荧 光染料 和碱性 磷酸酶 、辣 根过氧 化物酶 (产 生有颜 色的沉 淀物) 可直接 与抗地 高辛抗 体和亲 和素偶 连。 化学发 光检测 方法和 间接免 疫荧光 技术也 为许多 分子生 物学的 应用提 供了另 一灵敏 的检 测方法 。生 物素和 地高辛 标记的 探针有 效期长 ( >2 年 ), 而 且在一 次反应 中可标 记数 毫克的 DNA, 可提供 多次实 验所需 的高质 量恒定 的探针 ,并 可免除 放射性 污染和 对人体 的危害 ,因而 备受广 大科技 工作者 的欢迎 ,有 取代放 射性同 位素标 记探针 之势。 生 物素是 一种水 溶性的 维生素 。它通 过丙烯 胺接合 臂与嘧 啶核苷 酸中嘧 啶环的 C5 相连。 Langer 及其同 事证明 生物素 -11-dUTP 可取代 dTTP 作为大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的作 用底物 ,但比 dTTP 的掺入 效率低 。生 物素 酰化的 dNTP 有 生物素 -11-dUTP, 生 物素 -16-dUTP 和 生物素 -14-dATP, 它 们的丙 烯胺接 合臂的 长度有 所不同 ,如生 物素- 16-dUTP 比 生物素 -11-dUTP 多 5 个 CH2 烃基。 生物素 可通过 亲和素 或链亲 和素与 荧光染 料或酶 (如 碱性磷 酸酶、 辣根过 氧化物 酶) 偶联进 行检测 。亲 和素 是一种 糖蛋白 ,分子 质量为 68kDa, 与 生物素 有很强 的亲和 力 (kd=10_15)。 链亲和 素是一 种分子 质量为 60kDa 的 蛋白质 ,也与 生物素 有很高 的亲和 力 (kd=l(T15), 碱性 磷酸酶 与亲和 素-生 物素或 链亲和 素-生 物素复 合物作 用产生 有颜色 的 沉淀物 。生 物素和 地高辛 标记的 探针亦 可采用 抗生物 素抗体 或抗地 高辛抗 体检测 。生 物素 标记的 探针广 泛应用 于原位 杂交、 Southern 杂交和 Northern 杂交。 对原位 杂交而 言, 由于生 物素标 记的探 针接近 放射性 同位素 标记的 探针的 灵敏度 ,且 lkb 以内的 • 347 • DNA 探针 可在杂 交后几 小时检 测完成 ,而采 用同位 素标记 的探针 检测需 几天至 几周才 能完成 ,故现 多采用 生物素 或地高 辛标记 的探针 。对 杂交 而言 ,由于 放射性 同位素 标记的 探针灵 敏度高 ,故 多数学 者仍喜 欢采用 放射自 显影的 方法。 然而 ,生物 素标记 的探针 也有一 些不足 。其 一是 测定探 针是否 标记成 功相当 困难, 它与放 射性标 记的探 针不同 ,人 们不可 能用一 个小型 的检测 器或液 闪计数 器来快 速检测 生 物素酰 化反应 的成功 与否; 其 二是定 量困难 ,生物 素标记 的探针 不能通 过光密 度来估 算, 只能通 过系列 稀释法 与标准 比较来 定量; 其三, 生物素 标记的 探针不 能有效 测定含 量 极少的 mRNA。 (一) 切口平 移法制 备生物 素标记 的探针 1. 原理 为了把 生物素 酰化的 dNTP 掺入到 DNA 中, 就得先 用酶把 DNA 链打 开一个 缺口, 脱 氧核糖 核酸酶 I (DNase I) 是一 种内切 核酸酶 ,它 能够水 解单链 或双链 DNA, 使其 带有 5' 磷酸末 端的单 (寡) 核苷酸 ,当有 Mg2+ 存在条 件下, DNase I 对每条 DNA 链的 酶切位 点是独 立的, 即不是 同时对 互补链 的酶切 位点进 行酶切 。但在 Mn2+ 存 在情况 下 ,它 就会酶 切双链 DNA 的附 近相同 位点, 因此酶 切的结 果会含 有一个 到几个 核苷酸 的随机 分布的 混合物 ,见图 4.25。 控制 DNase I 的浓度 ,就 可以 在双链 DNA 分子的 一条链 的有限 位置上 (DNA 链的 长度) 打 开缺口 ,形成 3' 羟 基末端 (这条 DNA 链即成 为引物 )。 DNA 聚合酶 I 把一个 已 结合在 自己结 合位点 上的脱 氧核苷 三磷酸 (dNTP) 就 加在这 引物的 3' 羟基末 端上, 所加的 dNTP 必须 与模板 (双链 DNA 中未 被打开 缺口的 另一条 互补的 DNA 单链) 相 应位 置上的 碱基形 成配对 ,而新 嵌入的 dNTP 与引 物上的 3' 羟 基结合 成磷酸 二酯键 。此 外 ,由于 DNA 聚合酶 I 具有 5'— 3' 的核酸 外切酶 的活性 ,它 能将 缺口的 5' 单核 苷酸移 去 ,而依 次添加 新的核 苷酸到 3' 端 ,其结 果使缺 口沿着 DNA 链平移 ,这 就叫切 口平移 (Nick Translation)。 如果 添加的 脱氧核 苷酸是 生物素 酰化的 核苷酸 ,形成 一个完 整的互 补双链 DNA 分子 就带有 生物素 。在标 准的切 口平移 反应条 件下, 可掺入 生物素 分子约 50 个 /kb DNA。 通过比 色法或 化学发 光法检 测生物 素酰化 反应的 程度和 探针的 质量。 2. 材料 大 肠杆菌 DNase I 和 10 X 缓冲液 0.5mmol/L 3 种 dNTP 混合液 (不含 dTTP) 0.5mmol/L 生物素 -11-dUTP [用 20mmol/L Tris-HCl pH7.5 配制 ,如 pH<7.5, 则加 几微升 lmol/LTris-HCl (pH7_5) 调 pH 至 7.5, 于 -20X: 保存] 100mmol/L2- 巯 基乙醇 (2-ME) 待测 DNA lmg/mL DNase I 贮 液溶于 0.15mol/L NaCl/50% 甘油 DNA 相对 分子质 M 标准 0.5mol/L EDTA, pH8.0 • 348 • 10% (m/V) SDS 无 水乙醇 SDS 柱 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/LEDTA, 0.1%SDS, 高压灭 菌或过 滤除菌 ) lmL 注射器 3. 操 作步骤 (1) 混 合以下 物质于 lOO^L 反应 体积: 10 X 大 肠杆菌 DNase I 缓冲液 10 卩 L 0.5mmol/L 3dNTP 混合液 10ptL 0.5mmol/L 生物素 -11-dUTP 贮液 10/iL 100mmol/L 2-ME 10 卩 L DNA 2^g 大 肠杆菌 DNase I 20U 1 份 DNase I 贮存液 ,用 前用冷 水稀释 1000 倍 ,加入 适量。 加水到 lOO^L 15t: 温育 2 〜 2.5h。 (2) 取 6pL 反应液 ,煮沸 3min, 置 于冰浴 2min。 (3) 加 样于琼 脂糖微 型凝胶 ,同时 加相对 分子质 量标准 (0.1 ~10kb 范围 ), 以 15V/cm 电压 电泳。 (4) 消化的 DNA 大 小介于 100 〜 500bp 之间, 接步骤 (5) 继续 ,若 大小在 500 〜 1000bp 之间 ( 或更大 ), 加入 第二份 DNasel 继续 温育。 第二份 DNase I 的浓 度应较 第一次 为高, 以避免 反应体 积的显 著改变 ,但要 注意防 止探针 完全被 消化。 (5) 加入 2;iL0.5mol/L pH8.0 的 EDTA 和 l;xL 10% SDS, 68*0 加热 10min 以终止 反应 和灭活 DNase I。 (6) 在 lmL 注射器 中准备 S 印 hadex G-50 离心柱 。用 2mL 无 水乙醇 清洗注 射器和 硅化的 玻璃棉 ,接 着用 4mLH20 冲洗 。将 G-50 介质 装入注 射器至 lmL 刻度 ,用 lOOpLSDS 柱缓 冲液洗 3 〜 4 次, 上样。 (7) 分离 生物素 酰化的 探针。 探 针浓度 应约为 20叩/;^ (用于 2纯切 口平移 DNA)。 探针 可直接 使用, 也可在 -20t: 保 存数年 而 不丧失 活性。 生物素 酰化的 DNA 不能用 酚抽提 , 因为生 物素可 使探针 溶于酚 / 水 相之间 ,或完 全溶于 酚相。 (8) 用比 色法估 计生物 素酰化 反应的 程度和 探针的 质量或 进行化 学发光 检测。 在 推荐的 标准切 口平移 条件下 , lkb 的 DNA 可 掺入约 50 个 生物素 酰化的 分子。 4. 重 要参数 1) 脱 氣核糖 核酸酶 I (DNase I) 的稀释 购买 到的或 自制的 DNase I 都 是浓度 很高的 贮藏液 ,一 般含有 lmg/mL 或 0.5mg/ • 349 . 171[,贮藏在0.5|11〇1/1^(:1/50%甘油或者1〇111111〇1/1^1>丨5-1~1(:1(口1'17.5)/50%甘油溶 液中 ,并 保存在 -20X: 的冰 箱中。 要 在临用 前稀释 与分装 DNase I, 稀释 DNase I 的 缓冲液 有不同 的配方 。有 人采用 含有 50% 甘 油的切 口平移 缓冲液 或上述 亡 藏液 一 样 的配方 ,也有 人采用 l〇mmol/L Tris~HCl(pH7.5)。 也 有用如 下配方 : 50% 甘油, 150mmol/LNaCl, lOmmol/LTris- ?1(:1化1~17.5),11^/1111^5八。在分装〇他56 1时,最好使每次反应使用1支未启用过 的 DNase I 新小管 。所 以最好 分装成 5~l〇/iL/ 管, 这样可 以避免 反复冻 融使用 ,使酶 失活或 污染。 稀释的方法是取贮藏的〇^%1(0.51^/11^)溶液2^,加8/^〇1^%1稀释缓冲 液 ,摇匀 , 然后从 中取出 2/iLDNaseI 溶液 ,再加 198^L 缓冲液 ,再从 中取出 2/iL 酶 液 ,加 18ML 的缓 冲液, 结果使 酶的浓 度稀释 5000 倍。 2) DNA 纯度 CsCl 密度梯 度离心 制备的 DNA 比小量 质粒快 速提取 制备的 DNA 进 行切口 平移标 记时 更有效 。小 量快速 制备的 DNA 应用 RNase A 处理 ,然 后再用 酚抽提 和乙醇 沉淀。 生物素 酰化的 DNA 不能用 酚抽提 ,因 为生 物素可 使探针 溶于酚 / 水 相之间 ,或 完全溶 于酚相 。用 地高辛 标记的 DNA 也应 避免酚 抽提。 3) 探 针长度 对 原位杂 交而言 ,最适 的探针 长度为 100~500bp 范围。 这可通 过调整 DNase I 的 浓度 而达到 。因为 探针愈 长愈难 估算靶 DNA 的量 ,且 易增加 背景。 (二) 随机寡 核苷酸 引物合 成法制 备生物 素标记 的探针 1. 原理 DNA 聚 合酶可 利用寡 核苷酸 作引物 ,沿 单链模 板起始 DNA 的合成 。利用 5' 末端生 物素 酰化的 随机组 合八核 苷酸片 段混合 物作为 DNA 合成的 引物。 这些混 合的寡 核苷酸 总可在 DNA 模板上 找到能 够互补 配对的 区段。 基本上 适用于 所有的 DNA 模板 。于 100X: 使 DNA 模板 变性后 ,将模 板与引 物混合 。由 于引物 很短, 很容易 与模板 DNA 结 合 ,在 Klenow 酶的 存在下 ,合 成新的 DNA 链 。在此 过程中 ,生 物素 酰化的 dNTP 可 掺入到 探针内 。由于 引物为 5' 末端生 物素酰 化的八 聚体, 因而每 个探针 分子至 少含有 一个 生物素 。模板 DNA 需线 性化, 其长度 >200bP。 太短的 DNA 模板不 能与随 机寡核 苷酸 引物有 效结合 ,因 而不能 有效合 成探针 。此 法标记 的模板 DNA 在 25ng 〜 2/xg 范 围内。 2. 材料 线 性模板 DNA>200bp 5X 生物素 酰化随 机八聚 体贮液 (6〇〇D/mL) (250mmol/LTris-HClpH8.0, lmol/ LHEPESpH6.6, 25mmd/LMgCl2, 10mm〇l/LDTT, 置 -20X: 保存) dNTP/ 生物素 混合液 ( lmmol/L dATP, lmmol/L dCTP, lmmol/L dGTP, 0.6511^〇1/[(1丁丁?,0.35111111〇1/[生物素-16-〇11_1丁?(£〇20 8;〇{^111),-20<0保存) • 350 . 5U//iL Klenow 酶 TE 缓 冲液, pH7.5 (10mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA) 0.5mol/L EDTA, pH8.0 4mol/L LiCl 冰冷的 100% 和 70% 乙醇 3. 操 作步骤 (1) 在 1.5mL 离心管 中加入 500ng 〜 2fig 模板 DNA, 加 水至总 体积为 34pL。 (2) 在沸水 中变性 DNA5min, 置 于冰浴 5min, 稍加 旋离。 (3) 按顺序 加入下 列溶液 : 生 物素酰 化随机 多聚体 10pL dNTP/ 生物素 混合物 5 卩 L Klenow 酶 (5U) 1 卩 L 37X: 温育 lh。 如有 需要, 30min 后 再加入 2. 5U 的 K 丨 enow 酶, 温育时 间延至 6h, 可提高 产量。 (4) 加入 3^^0.5111〇1/[£0丁八口只8.0以终止反应。加入5^^4111〇1/[1^(:1和15(^[ 冰 冷的无 水乙醇 ,置 于冰浴 30min。 (5) 室温高 速离心 lOmin, 沉淀用 70% 乙醇 洗涤。 (6) DNA 用 20pL pH7.5 的 TE 缓冲 液重悬 。用 比色法 或化学 发光法 估价生 物素酰 化 反应的 效果。 (三) 比色检 测生物 素标记 的探针 1. 原理 此 法是将 生物素 标记的 DNA 点在硝 酸纤维 素膜上 。然 后与链 亲和素 碱性磷 酸酶交 联物 反应, 使链亲 和素碱 性磷酸 酶交联 物与生 物素牢 固结合 ,当 有酶作 用的底 物存在 时 ,就会 产生有 颜色的 沉淀物 ,可用 比色的 方法进 行检测 ,它 可检 出少至 2pg 生 物素标 记的 DNA。 2. 材料 生 物素酰 化标准 DNA 和待测 DNA DNA 稀释 缓冲液 (0.1/ig/iiL 鲑精 DNA 溶于 6XSSC, 置 4t: 保存 。如 需长期 保存, 可分装 ,置 -20T: 保存) 碱性磷 酸酶缓 冲液, pH7.5 (AP7.5) (0.1mol/LTris-HClpH7.5, O.lmol/LNa- Cl, 2mm〇l/LMgCl2 ,高压 灭 菌或过 滤除菌 ,室温 保存) 封阻液 [3% (m/V) 牛血 清白蛋 白组分 V, 溶于 AP7.5 缓 冲液] lmg/mL 亲和素 -碱性 磷酸酶 交联物 酸性磷 酸酶缓 冲液, PH9.5 (AP9.5) (0.1mol/L Tris-HCl pH9.5, O.lmol/L NaCl,50mmol/LMgCl2, 高压灭 菌或过 滤除菌 ,室 温保存 <1 年) . 351 . 75mg/mL 氮 蓝四唑 (NBT) 50mg/mL5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚磷酸 (BCIP) TE 缓冲液 (l〇mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 小片硝 酸纤维 素滤膜 或不带 电荷的 尼龙膜 (5cmX 3cm) 可 密封袋 注意 :处理 膜时为 避免非 特异性 背景须 戴手套 操作。 3. 操 作步骤 , (1) 用 DNA 稀释缓 冲液, 稀释生 物素酰 化标准 DNA, 浓度为 Opg〜L、 lpg/^L、 2pg/ML、 5pg/fiL、 lOpg/^L 和 2(^/化。 以 同样稀 释液处 理待测 DNA〇 (2a) 对于硝 酸纤维 素滤膜 ,每 个稀 释度取 点膜 ,在 80X: 烘干约 lh, 接步骤 (3)。 硝 酸纤维 素膜不 能用于 化学发 光待检 系统。 (2b) 对于尼 龙膜, 每个稀 释度取 lyL 点膜 ,晾 干后用 紫外照 射法将 DNA 交 联至膜 上, 接步骤 (3) 或化 学发光 检测。 若 使用化 学发光 检测法 ,测定 DNA 的稀释 度应为 lOd — KT5 倍 ,在 10~3 稀释度 应可见 ,否 则探 针的标 记效果 不佳。 (3) 用少 量体积 AP7.5 液洗膜 lmin, 在密 封袋中 ( 剪成合 适大小 ), 用 10mL 封阻 液, 37X: 封闭 lh, 注 意排出 气泡。 (4) 稀释 10/xL 亲和素 -AP 交 联物至 10mLAP7.5 ( 终浓度 lMg/mL)。 剪去 封闭袋 一 角挤出 封闭液 ,用 亲和素 -AP 交联 物代替 ,重新 封口, 在旋转 平台室 温摇荡 lOmin。 (5) 从袋 中取出 滤膜移 到一个 浅盘中 ,用 200mLAP7.5 洗 2 次 ,每次 15min。 再用 200mLAP9.5 洗 1 次, lOmin, 轻微 摇荡。 (6) 加入 33^L 75mg/mL 的 NBT 至 7.5mL AP9.5 液中 ,混匀 。再 加入 25pL 50mg/mLBCIP, 混匀。 (7) 在浅 盘中避 光温育 NBT/BCIP 溶液 ,不 时观察 直至发 色达到 满意程 度为止 (通 常 15~60min)〇 (8) 加 TEpH8.0 以终 止反应 ,比 较测定 DNA 样品 和标准 DNA 的颜 色强度 以确定 生物 素酰化 dUTP 的掺 入效率 。如果 该探针 至少有 一半标 准品的 强度, 它可作 为探针 用 于原位 杂交。 (四) 地高 辛标记 DNA 探针 的制备 与检测 地高辛 系统是 Boehringer Mannheim 提供 的另一 种非同 位素标 记方法 ,其检 测方法 是通过 偶联上 一种荧 光染料 或酶的 抗地高 辛抗体 ,共 同温育 进行比 色检测 或用间 接免疫 荧光 来测定 。生物 素和地 高辛标 记的探 针用不 同的荧 光染料 可同时 检测。 地高辛 -11- dUTP 可以通 过切口 平移或 随机引 物介导 DNA 合成而 掺入到 DNA 中。 (1) 建立一 个标准 100/iL 反 应体系 ,用 lOfxL l〇x 地高辛 -11-dUTP/dTTP 贮液 (〇.375mmol/LdTTP, 0.125mmol/L 地高辛 -11-dUTP, 20mmol/L Tris-HCl pH8.0, 置 -201:保存),〇1^货1酶量不变,15<〇温育211。 • 352 • (2) 取小 份在微 型胶中 进行电 泳以检 测探针 大小。 (3) 继 续反应 直到获 得大小 合适的 DNA 探针。 (4) 加入 2/iL O.5mol/L EDTA 和 1/iL 10% SDS, 68t: 加热 lOmin 以终止 反应。 (5) 用 Sephadex G-50 离心 柱分离 探针。 避免用 酚抽提 地高辛 标记的 探针。 (6) 用比 色法或 化学发 光法测 定地高 辛标记 的探针 。用 碱性磷 酸酶偶 联的抗 地高辛 抗体 代替链 亲和素 -碱性 磷酸酶 交联物 。利 用地高 辛标记 的标准 DNA (Genius 试 剂盒, Boehinger Mannheim) 或是 标好的 地商辛 探针作 为对照 检测地 高辛惨 入效率 。其 他步骤 与生 物素标 记的探 针的比 色检测 相同。 二 、非 同位素 探针的 化学发 光检测 化 学发光 检测已 应用于 Southern 印迹、 Northern 印迹、 DNA 序 列测定 、空 斑杂交 和菌 落杂交 ,免 疫印迹 及免疫 检测等 实验中 。其优 点是: ①具有 较高的 灵敏度 ,比 比色 检 测法高 5 X 1〇3 倍, 足以在 Southern 印迹 中测定 lpg 人类 基因组 DNA 中的单 拷贝基 因 ,在 Northern 印迹中 ,可 检测一 个中等 重复序 列的转 录物; ②所 用探 针稳定 ,易于 保存, 可一次 合成大 量探针 ,供多 次实验 应用; ③含 有探针 的缓冲 液可重 复使用 数次, 直 至信号 变弱; ④曝光 时间短 ,仅需 10 〜 20min; ⑤安全 ,对人 体无害 。但要 带护目 镜 ,避免 紫外线 直接照 射皮肤 。由 于上述 优越性 ,故 在杂交 实验中 ,使用 非同位 素标记 的探针 比使用 同位素 标记的 探针更 普遍。 (一) 生物 素标记 探针的 化学发 光检测 1. 原理 此法是 将转印 待测核 酸的尼 龙膜暴 露于紫 外光源 (254nm) 下 ,使核 酸与膜 交联; 底物 0 碱性 磷酸酶 切除化 学发光 底物中 的磷酸 基团, 产生不 稳定的 中间产 物很快 分解 ,并在 此过程 中发光 . 353 • 再用生 物素探 针与固 定在膜 上的核 酸杂交 ,加入 链亲和 素与掺 入探针 的生物 素结合 (链 亲和 素与生 物素有 多个结 合部位 ); 洗涤后 ,加 入生物 素醜化 的碱性 磷酸酶 ,依 次与链 亲和素 结合。 链亲和 素起着 连接碱 性磷酸 酶与生 物素探 针的桥 梁作用 。然 后加入 化学发 光底物 ,碱 性磷酸 酶切除 化学发 光底物 中的磷 酸基团 ,产 生不稳 定的中 间产物 很快分 解 ,并在 此过程 中发光 ,从而 可灵敏 地检测 到杂交 的耙01^六 (图 4.37)。 本方 法使用 的 许多试 剂都已 商品化 ,表 4.10 列 出了这 些试剂 盒的供 应商。 表 4.10 化学发 光检测 试剂盒 试剂盒 供应商 试剂盒 供应商 AmpliProbe I mClone Systems LightSmith Promega ECL Amersnam PhotoGene Life Technologies Flash Stratagene Phototope NEB Gene Images U. S. Biochemical SouthemLight Tropix Genius Beohringer Mannheim 2. 材料 带 DNA 或 RNA 印 迹的不 带电荷 尼龙膜 生 物素酰 化探针 封阻液 (5%SDS, 17mmol/LNa2HP04, 8mmol/LNaH2P04, 室 温保存 。如 需要, 可用 0.45/xm 的滤 膜过滤 除菌) 洗涤 缓冲液 I ( 临 用前以 1:10 的比例 稀释封 阻液) 10X 洗涤 缓冲液 II (l〇〇mmol/L Tris-HCl pH9 •糸 100mmol/L NaCl, 10mmol/L MgCl2, 4t: 保存 ,临 用前以 1:10 的比 例用水 稀释) lmg/mL 链 亲和素 ( 将链亲 和素溶 解于含 O.Olmol/L 磷 酸钠、 0.15mol/LNaCl、 0.05%NaN3 的缓冲 液中, pH7.2, 使 之成为 lmg/mL 的链 亲和素 溶液。 NaN3 是危险 品 ,操作 时要特 别小心 ) 0.38mg/mL 生 物素酰 化碱性 磷酸酶 [0.38mg/mL 生物素 , 3mol/LNaCl, lmmol/ LMgCl2, 0_lmmol/LZnCl2, 30mmol/L 三乙醇 胺乙酸 (TEA)pH7.5, 置 4X: 保存] 化学发 光底物 (表 4. 11) 底物 缓冲液 PH9.6 吸水纸 (Whatman 3mm 或相 当的) 紫外灯 可热 封口的 杂交袋 注意 :紫外 辐射有 害人体 健康, 应避免 皮肤直 接暴露 于紫外 灯下。 3. 操 作步骤 (1) 用夹 子固定 已转印 的尼龙 膜的边 角于一 小片干 的吸水 纸上, 样品面 朝上, 12 〜 80X: 温 箱内放 15 〜 30min 或室 温晾干 过夜。 • 354 . 硝酸纤 维素滤 膜因抑 制化学 发光反 应不能 使用。 (2) 将带核 酸的面 朝上暴 露于紫 外灯下 ,用 最适 的时间 交联。 表 4.11 检测非 同位素 探针的 化学发 光底物 二氧 杂环丁 燦底物 a 缓 冲 液8 供应商 ^ Lumigen-PPDb (0.33mmol/L) 2屬基-2甲基-1-丙醇(?册.6)/0.88111111〇1/1^1^<:12/75〇111111〇1/1 CTAB/1 . 13mmol/L 荧光 素表面 活性剂 BM, LT, LU, NEB Lumi-Phos 530b (0. 33mmol/L) 2 屬基 -2 甲基 -1- 丙醇 ( pH9.6 )/0.88mmol/L MgCl2/750mmol/L CTAB/1 • 13mmol/L 荧光 素表面 活性剂 BM, LT, LU AMPPD(0.25mmol/L) lmmol/L DEA/lmmol/L MgC^, pH10 TR CSPD(0.25mmol/L) lmmol/L DEA/lmmol/L MgCl〗, pHIO TR 3.缩写:_??〇,二钠3-(4-甲氧螺-(1,2二氧杂环丁烷-三环[3,3,1,1,3,7]癸烷)-4)苯基磷酸盐;05?〇,金刚环 链 上有氯 取代的 AMPPD;CTAB, 十六 烷基三 甲基溴 化铵; DEA, 二 乙胺; Lumigm-PPD 和 Lumi-Ph〇s,4- 甲氧基 - 4-4-(3- 磷 酸苯基 )- 螺 -(1,2- 二氧杂 环丁烷 -3,2-金刚烷)二钠盐。 b. Lumi-Phos 530 含焚光 增效剂 , Lumigen-PPD 不含。 c •缩写 : BM, Beohringer Mannheim; LT, Life Technologies; LU, Lumigen; NEB, New England Biolabs; TR, Tropix〇 (3) 用 生物素 探针与 膜杂交 ,用适 当强度 的洗液 洗涤。 使用 洗涤液 和检测 液的体 积据膜 大小而 变化。 1 体积 (V) = 膜 的面积 (cm2) X〇.〇5mL/ cm2。 (4) 杂交后 ,将膜 置杂交 袋中。 操作时 要带干 净的手 套避免 油污或 粉末污 染膜, 否则会 产生非 特异性 背景。 (5) 封口 ,在 一个角 留有一 小孔便 于加入 和排出 液体。 (6) 加入 1 体积的 封阻液 ,室 温作用 lmin, 轻 微摇动 ,倒干 溶液。 脱 脂奶含 有生物 素成分 ,不能 用作生 物素探 针的封 阻液。 (7) 加入 lmg/mL 链亲 和素至 1 体积 的封阻 液至终 浓度为 lpg/mL, 在杂交 袋中室 温温育 4min, 轻 微摇动 ,倒干 溶液。 (8) 加入 10 体 积洗液 I, 室 温洗膜 4min, 轻 微摇动 ,倒 干溶液 ,重复 1 次。 如果背 景太高 ,增 加洗涤 次数和 时间。 (9) 加 入生物 素酰化 碱性磷 酸酶至 1 体积的 封阻液 (终 浓度为 O/5/ug/mL), 室温作 用 4min, 轻 微摇动 ,倒干 溶液。 (10) 用 10 体 积洗液 II 洗膜 2 次, 同步骤 (8)。 (11) 用 0.5 体积底 物稀释 液稀释 化学发 光底物 ,在 杂交 袋中室 温作用 4min, 轻微 摇动 ,打开 杂交袋 ,尽可 能倒干 溶液。 (12) 压平杂 交袋上 的折皱 ,重 新封口 ,结 合核酸 的一面 向上, 用一张 X 光片 压好, 在暗盒 内曝光 10 〜 20min。 4. 疑 难解答 见表 4.12。 • 355 • 表 4.12 化 学发光 检测疑 难解答 问 题 可 能原因 解 决 信号 低或信 号不足 生物 素标记 不充分 ,通过 比 较系列 浠释的 样品和 对照进 行检査 交 联不足 如 果仅在 KT1 和 1(T2 稀释 液可见 ,重新 进行生 物素酰 化 反应; 如在 1(T3 或更 高稀释 度可见 ,考虑 其他原 因 在进行 交联前 ,滤 膜须完 全干燥 底物 pH 不当 检査 底物缓 冲液的 pH, 调 pH 至 9.6 均 匀或不 均匀的 高背景 洗涤 不充分 增加洗 涤次数 ,所 有检测 步骤须 保证膜 能自由 溧浮在 杂 交袋中 洗 液污染 洗液 丨可能 长霉导 致膜上 有斑点 ,用 0.45Mm 滤 膜过滤 无缓 冲力的 封阻液 和洗液 I 注意 SDS 溶液应 用磷酸 盐缓冲 液配制 (二) 地高 辛标记 探针的 化学发 光检测 地高辛 系统使 用的是 偶联碱 性磷酸 酶的抗 地高辛 抗体, 它可识 别已掺 入到探 针中的 地高辛-(111丁?。本方案选用于〇€11丨1^试剂盒(6〇6111"丨1^1'-]^1111116丨111见表4.10)。此试 剂盒 是目前 惟一的 检测地 高辛标 记探针 的化学 发光检 测系统 。除需 较长的 封阻时 间外, 其 他测定 步骤与 生物素 标记探 针的发 光检测 类似。 (三) 紫 外光源 的标化 经紫外 线照射 将核酸 交联到 尼龙膜 是检测 反应中 关键性 的一步 ,它可 显著影 响获得 数据 的质量 。不 充分的 交联将 导致结 合不足 ,洗涤 时核酸 将从膜 上脱落 ,过 分交 联使得 难 以与探 针杂交 ,因 此紫外 光源的 标化显 得尤为 重要。 紫 外线的 强度可 用放射 测定器 测定每 平方厘 米的放 射能量 bW/cm2)。 紫外 线光源 在 254nm 波长下 可产生 100pW/Cm2, 大 多数透 照式紫 外灯的 能量在 500 〜 lOOOpW/cm2 之间, 手提紫 外灯的 放射能 量稍低 。研 究所的 安全部 门可提 供用于 校正的 放射测 定器。 测 定前紫 外灯必 须预热 l~2min。 测定 过程只 需数分 钟便可 完成, 但每个 灯管在 它的寿 命期内 应重复 校正。 透照式 紫外灯 可测定 照射玻 璃表面 的能量 ,手 提紫外 灯可测 定一定 距离外 均匀照 射到整 个膜上 的能量 。一 旦测定 了照射 能量, 最适的 照射时 间可通 过以下 公式 推算: (33 000uW/cm2)(ls) — P/^W/cm2 式中 : TT 表示照 射时间 /s; P 表示紫 外灯的 照射能 量八/^评八!!!2)。 例如 ,放射 测定器 测定某 透照式 紫外灯 的照射 能董为 752MW/cm2, 那么交 联的时 间为: T = (33 OOOtiW/cm^ds) 752^W/cm2 • 356 • = 44s 最适 的照射 时间也 可凭经 验确定 ,转 印两排 相同的 核酸点 至膜上 ,在 紫外灯 下暴露 不同 的时间 ,时间 间隔为 lmin, 已暴露 的部分 要用铝 箔遮盖 ,这 样可检 出和可 杂交核 酸 的量会 有显著 差异。 戴五星 皇 甫永穆 主要参 考文献 冯作化 , 皇甫永 穆主编 . 1998. 医 学分子 生物学 .武汉 : 武汉出 版社. 黄培 堂等译 . 1999. PCR 技术实 验指南 .北京 : 科学出 版社. 金冬雁 ,黎孟 枫等译 . 1998. 分子克 隆实验 指南. 第二版 .北京 : 科学出 版社. 刘德 立等编 . 1990. DNA 克 隆技术 .武汉 : 华中师 范大学 出版社 . 卢圣 栋主编 . 1999. 现代分 子生物 学实验 技术. 第二版 .北京 :北京 中国协 和医科 大学出 版社. 彭秀 玲等编 . 1997. 基因工 程实验 技术. 第二版 .长沙 : 湖南# 学技术 出版社 . 齐 义鹏著 . 1998. 基因 及其操 作原理 .武汉 :武汉 大学出 版社. 颜子颖 ,王 海林译 . 1998. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 : 科学出 版社. Ausubel, F. M. et al. 1996. Current Protcxrols in Molecular Biology. 2rd. ed. John Viley & Sons, Inc. Ausubel, F. M. et al. 1995. Short Protocols in Molecular Biology 3rd. ed. John Viley & Sons Inc. • 357 • 第 五章聚 合酶链 式反应 引 言 核酸的 体外扩 增技术 是分子 生物学 研究的 一个重 要技术 体系。 目前在 体外已 经能够 大 量扩增 DNA 片段 ,也 可以大 量扩增 RNA。 这 些扩增 技术在 DNA 重组 与表达 中得到 了广泛 的应用 ,同 时在基 因分析 和检测 中也有 十分重 要的应 用价值 。而在 核酸体 外扩增 的 技术中 ,聚 合酶链 式反应 是一种 最重要 、最 有效的 技术。 聚 合酶链 式反应 (polymerase chain reaction, PCR), 是 一 种 体外扩 增特定 DNA 片 段的 技术。 此法操 作简便 ,可在 短时间 内在试 管中获 得特异 DNA 序列 的数百 万个拷 贝 。由于 PCR 技术具 有特异 、灵敏 、快速 等特点 ,在 分子 生物学 研究中 显示出 极大的 优势 。例如 ,从 生物材 料中获 得某一 特定的 DNA 顺 序或进 行其序 列分析 、鉴定 ,按传 统 的方法 要经过 DNA 酶切 、连接 、转化 等步骤 构建含 有目的 基因的 DNA 克隆 ,然后 导入 受体细 咆进行 扩增, 再经过 同位素 标记的 探针进 行筛选 等过程 ,虽然 技术上 已无难 点 ,但操 作复杂 ,一 般需 要数周 到数月 的时间 。而 PCR 技 术可在 数小时 内对仅 有几个 拷贝 的基因 放大百 万倍, 极大地 简化了 传统的 分子克 隆技术 ,从而 比较容 易对目 的基因 进行 分析、 鉴定。 PCR 的 应用似 乎是无 止境的 ,并正 在不断 地扩展 。作 为一种 检测稀 有序列 的最灵 敏 的方法 ,采用 PCR 可 以检出 稀有序 列并能 对其进 行定量 分析。 PCR 可用 于检测 mR- NA, 分 析它们 的结构 ,通 过扩增 而进行 cDNA 克隆和 (或) 序 列测序 。在 某些情 况下, 对目 的基因 只知道 一小部 分序列 (30 〜 40bp), 也 可以以 mRNA 为模板 ,通 过? CR 扩 增出 全长的 cDNA 序列。 PCR 技 术还有 助于序 列克隆 、序 列操作 、体外 诱变和 D^A 工 程 ,利用 PCR 技术 可以构 建重组 DNA 分子, 也可以 进行定 点诱变 。利用 PCR 技术, 还可 以进行 mRNA 的差异 显示, 这种技 术可以 在不知 道基因 序列的 前提下 ,对 差异表 达的 基因进 行鉴别 和亚序 列分离 。此外 ,利用 PCR 技术 可以从 基因组 DNA 和 cDNA 直 接 克隆目 的基因 、对 法医样 品进行 遗传指 纹鉴定 、传 染病病 原体的 分析、 遗传性 疾病的 产前 诊断、 基因的 等位序 列变异 分析、 RNA 转录物 结构的 分析、 基因组 足迹分 析以及 对 基因组 DNA 和 cDNA 直接进 行核苷 酸序列 测定。 第一节 PCR 的基 本原理 PCR 是 用于扩 增位于 两段已 知序列 之间的 DNA 区段的 一 种方法 ,实 际上是 在模板 DNA、 弓 丨物和 4 种 dNTP 存在 的条件 下依赖 DNA 聚合 酶的酶 促合成 反应。 在由 DNA 聚合 酶催化 的合成 反应中 ,使 用两段 寡核苷 酸作为 反应的 引物。 这两段 寡核 苷酸引 物的序 列互不 相同, 并分别 与模板 DNA 两条链 上的各 一段序 列互补 ,而这 • 358 • 两段 模板序 列又分 别位于 待扩增 DNA 区段 的两侧 。引物 和模板 DNA 结 合的特 异性决 定 PCR 的特 异性。 引物的 5' 末 端限定 了扩增 的目的 序列的 长度, PCR 反 应的主 要产物 是双链 DNA, 其长 度等于 两引物 5' 末端 之间的 距离。 PCR 是 3 个反应 的有序 组合和 循环, ①变性 (denaturation): 在摩尔 数大大 过量的 两 段寡核 苷酸及 4 种 dNTP 参与下 对模板 DNA 进行加 热变性 ,通过 加热使 DNA 双螺 旋的氢 键断裂 ,双链 解离形 成单链 DNA。 ②退火 (annealling): 将反应 混合液 冷却至 某一 温度, 这一温 度可使 引物与 它的靶 序列发 生退火 ,当温 度突然 降低时 ,由于 模板分 子结构 较引物 要复杂 得多, 而且反 应体系 中引物 DNA 量 大大多 于模板 DNA, 使 引物和 其互补 的模板 在局部 形成杂 交链, 而模板 DNA 双链之 间互补 的机会 较少。 ③延伸 (extension): 在 4 种 dNTP 底物及 Mg2+ 存 在的条 件下, DNA 聚合 酶催化 以引物 为起始 点的 DNA 链按 5'— 3' 方向 进行延 伸反应 。以上 3 步为一 个循环 ,如 此反 复进行 变性、 退 火和延 伸循环 ,而每 一轮扩 增的产 物又充 当下一 轮扩增 的模板 ,从 而使 产物迅 速得到 扩增 。几十 轮反应 仅需数 小时, 介于两 个引物 之间的 特异性 DNA 片段 可得到 大量复 制, 拷贝数 量可达 (2xl〇6)~(2xi〇7) 之多。 如图 5.1 所示, PCR 的 主要产 物是一 段双链 DNA, 它 的两个 末端由 寡核苷 酸引物 的 5' 端来 决定, 而长度 则取决 于两引 物之间 的距离 。此外 ,反应 过程当 中也会 产生更 长的 DNA 分子 。例如 ,成 功的首 轮扩增 ,其 产物是 大小不 均一的 DNA 分子。 它们的 长度 可以大 于模板 上两个 与引物 结合部 位之间 的距离 。在第 二个循 环中, 这些分 子则会 产生具 有确定 长度的 DNA, 后者 将在以 后的扩 增中以 指数方 式积累 ,构 成反应 的主要 产物。 尽管每 一循环 不断在 初始模 板上产 生过长 的分子 ,但 这些过 长分子 仅以线 性速度 增加 ,因此 在大量 的靶序 列终产 物中, 它们的 存在是 无足轻 重的。 模板 DNA 解链 和退火 引物延 伸形成 新拷贝 25 〜 30 个循环 图 5.1 PCR 原理 示意图 . 359 . 第二节 PCR 的基 本技术 一、 PCR 引物 的设计 (一) 设计引 物的基 本原理 待扩增 片段的 序列应 当是已 知的, 或者其 两端的 序列是 已知的 。一 般在设 计引物 时 ,只取 DNA 链中 的一条 作为设 计模板 ,在 涉及编 码区时 ,以含 有密码 子的一 条链作 为设 计模板 (在 每一个 基因的 cDNA 克隆后 ,都 会通 过论文 的发表 而公布 含有密 码子的 那一条 DNA 链的 序列, 可以直 接用这 一序列 作为设 计模板 )。 在 非编码 区部分 ,由于 所 研究的 DNA 序列 往往处 于一条 链上, 以这一 条链的 DNA 序列 作为设 计模板 即可。 设计 引物时 ,首 先确定 待扩增 DNA 区段 (如图 5.2 中下划 线部分 ), 然后 在片段 两侧 确定引 物顺序 。如图 5.2 所示, 5' 引物的 序列实 际上就 是设计 模板链 待扩増 片段的 5' 端 序列; 3' 引物的 序列则 与设计 模板链 待扩增 片段的 3' 端序 列互补 。在 PCR 反 应中, 5' 引物 是与设 计模板 链的互 补链退 火结合 ,引导 合成的 DNA 链与 设计模 板链的 序列相 同; 3' 引物 则是与 设计模 板链退 火结合 ,引导 合成的 DNA 链与设 计模板 链的互 补链的 序列 相同。 因此, 5' 引物和 3' 引 物引导 合成的 DNA 链正好 互补, 形成与 待扩增 片段序 列 相同的 DNA 片段。 5'TCCGGAGTCATAAGTCTACG 3. 5' ATAAATCCGGAGTCATAAGTCTACGATTCCATGC ATGCATGTCAGCATGCATTAGCCGTGATCGCTAGC 3' 3'CAGTCGTACGTAATCGGCAC 5' 5 •引物 : 5’ TCCGGAGTCATA AGTCTACG 3’ 3_ 引物 : 5’ CACGGCTAATGCATGCTGAC 3' 图 5.2 PCR 引物 序列所 在部位 当扩增 200~300bp 的 DNA 片 段用于 检测基 因表达 、利用 PCR 产物 分析点 突变、 微卫星 序列重 复次数 分析等 目的时 ,可 依据上 述方法 直接设 计引物 ,用于 PCR 扩增。 (二) 引物设 计的基 本原则 对整个 PCR 扩增 体系, 引物的 设计占 有十分 重要的 地位。 PCR 技 术在实 际应用 中 ,环境 和条件 是千差 万别的 。模板 的组成 、待 扩增 片段的 长度及 其不同 的使用 目的, 对引物 的要求 是不一 样的。 PCR 作为 一个体 外酶促 反应, 其效率 和特异 性取决 于两个 方 面:一 是引物 与模板 的特异 结合; 二是 聚合 酶对引 物的有 效延伸 (即 DNA 合成 )。 基因组 DNA 作为 模板时 ,由 于其数 量的庞 大及结 构复杂 ,除 了特异 扩增外 ,往 往很容 易产 生非特 异性扩 增产物 。引物 设计的 原则就 是提高 扩增的 效率和 特异性 。引物 设计一 • 360 . 般遵 循下列 原则: (1) 引 物长度 一般为 15 〜 30 个 核苷酸 ,也 可根据 需要设 计得更 长一些 ,但 最多到 50 个 核苷酸 左右。 (2) 引 物中碱 基的分 布最好 是随机 分布的 ,避 免出现 嘌呤、 嘧啶堆 积现象 。引物 G + C 含 量宜在 45%~55% 左右 。但有 时因为 待扩增 序列已 经确定 ,而 两侧 序列的 G+C 含 量过高 或过低 ,无 法更改 ,那就 只能通 过调整 PCR 反应 条件以 实现有 效扩增 。目前 已 有公司 研制出 试剂盒 ,能 够促进 (G+C) 高 含量的 DNA 区 段解链 ,从 而在很 大程度 上 减小了 引物设 计时对 G+C 含 量的限 制性。 (3) 引物内 部不应 形成二 级结构 ,避 免在 链内或 两个引 物之间 存在互 补序列 。一般 来说, 如果有 3 个连续 的碱基 有配对 的序列 ,即 认为 存在互 补序列 。如: 5, TCCGGAGTCATAAGTCTACG 3, III I II 3' CAGCCGTACGTAATCGGCAC 5' 在实 际设计 引物时 ,完 全避免 引物二 聚体的 形成是 很难的 ,大 部分情 况下都 会有少 数碱基 配对。 特别是 引物中 有酶切 位点时 ,就不 可避免 地会形 成引物 二聚体 。如: 5' TCCGGAGGATCCATAAGTCTACG 3' I min I 3' GCATCTGAATACCTAGGAGGCCT 5' 配对 的碱基 数越多 ,引物 就越容 易形成 二聚体 。一般 情况下 ,形 成引 物二聚 体对扩 增效果 影响不 是很大 。但 如果配 对碱基 数太多 ,引物 二聚体 形成能 力过强 ,就会 影响引 物与模 板的退 火结合 ,影 响扩增 效率。 如果配 对碱基 数很多 ,扩增 效果亦 很差, 就应当 考 虑这一 因素。 3' 末端在 链内或 另一引 物上有 互补序 列存在 的情况 是特别 应注意 避免的 。如: 5' TCCGGAGTCATAAGTCTACG 3' INI 3' CAGCCATGCGTAATCGGCAC 5' 出现这 样的互 补序列 ,在 PCR 反 应过程 中就会 出现引 物退火 和延伸 的反应 。只要 引物的 3' 端延伸 1 个或数 个碱基 ,引 物就不 能再与 模板退 火结合 和引导 DNA 链的合 成 。因此 ,如果 有一条 引物的 3' 端 出现链 内互补 或与另 一条引 物的序 列互补 ,在 PCR 反应中 ,引 物就会 大量地 被无效 消耗, 降低扩 增效率 ,甚 至不能 获得目 的序列 的扩增 产物。 (4) 引物 3' 末 端碱基 与模板 DNA —定要 配对。 (5) 引物 5' 末端 碱基并 无严格 限制, 5' 末 端碱基 可以不 与模板 DNA 匹配而 呈游离 状态 。因此 ,在 引物中 可以改 变碱基 (如引 入酶切 位点等 )。 但 引物的 5' 端碱基 最好是 G 或 C, 使 PCR 产 物的末 端结合 稳定。 (三) 在引 物中加 入酶切 位点或 引入突 变位点 PCR 产物的 末端为 平端, 可以用 T4 噬菌 体多核 苷酸激 酶将其 磷酸化 并用常 规技术 克隆到 通用载 体上; 但若在 引物中 引入适 当的酶 切位点 ,可 以使 PCR 产 物的克 隆效率 更高。 • 361 • 引物的 5' 端存 在不配 对碱基 ,并 不影响 它引导 DNA 合成 的能力 。当 引物与 模板结 合时 ,只要 引物的 3' 端有 15 个 碱基左 右的核 苷酸序 列能正 确配对 ,即 可引导 DNA 链 的合成 。在 引物 5' 末端 最多可 以游离 十几个 碱基而 不影响 PCR 反应 的进行 。因此 ,在 引物中 可改变 几个核 苷酸, 引入特 定酶切 位点。 在引 物中引 入酶切 位点时 ,引 物的序 列设计 与前面 提到的 方法略 有不同 。引 物序列 不是 完全取 自设计 模板链 ,而只 有一部 分与待 扩增序 列相同 或互补 。在引 物中引 入酶切 位点, 要注意 位点的 5' 端 上游不 能少于 3 个 核苷酸 ,否则 这个位 点是切 不开的 。有 些酶 (如所 nd III), 至 少需要 7 个核 苷酸。 如下面 设计的 引物中 引入了 Hhd III 位点, (AAGCTT), 在其 5' 端加了 8 个不配 对的核 苷酸: 5 ' GCCGGAGT AAGCTT AACTACGATTCCATGC 3 , 5, .•… GCAAATATCGTGACGTGACAACTACGATTCCATGC 如 有可能 ,特别 是有可 利用的 碱基时 ,可 以把位 点放在 引物的 中间。 如下面 设计的 引物中 引入了 H^d III 位点 (AAGCTT), 位点两 端各有 11 个核 苷酸与 设计模 板链相 同 ,可以 与互补 链配对 : 5 , C AGCATATCGTAAGCTT AACT ACGATTC 3 , 5, ..… ATGCAGCATATCGTGCGTGAAACTACGATTCCATGC 这样 设计的 引物, 扩增效 果及扩 增后的 PCR 产物 的酶切 效果都 很好。 在 PCR 的首轮 反应中 ,引物 与模板 并不完 全配对 。但 在后续 的扩增 循环中 ,这些 与初始 模板并 不配对 的序列 将被带 到双链 DMA (PCR 产物) 中去 ,因而 反应产 物既含 有目标 序列, 同时两 侧又有 新的限 制酶识 别位点 ,用相 应的限 制酶切 割这些 位点后 ,便 可将 DNA 扩增产 物高效 地插入 带有相 应末端 的载体 中去。 在引物 设计时 ,除了 可以在 5' 末端 加上限 制性内 切核酸 酶位点 ,还 可以加 入其他 短的 序列, 如起始 密码子 ATG、 终止密 码子或 错配碱 基造成 突变。 (四) PCR 引物 摩尔数 的计算 在 PCR 反应中 ,引 物的 量是以 pmol 数 表示的 ,而 合成引 物后, 引物的 量是以 OD 值 表示的 。因此 ,需 经适 当换算 ,才能 配制适 当浓度 的引物 溶液。 换算公 式如下 : OD 值为 1 时 ,引物 的量为 33#。 引物的 相对分 子质量 = 碱基数 x 330 引物 pmol 数 = OD 值 x 33 x 1 〇〇〇 〇〇〇 _ OD 值 x 1〇〇 〇〇〇 碱基数 X 330 ~ 碱基数 二 、模板 的制备 模板的 取材主 要依据 PCR 扩增对 象及各 学科的 专业知 识而定 。病 原体 标本有 病毒、 细菌 、霉菌 、分枝 杆菌、 螺旋体 、立 克次体 、支 原体等 。病 理生理 标本有 组织、 体外培 养 的细胞 、血液 、绒毛 、羊水 细胞、 口腔上 皮细胞 、尿样 ,还 有法医 学标本 如血斑 、精 . 362 . 斑等。 模 板制备 方法多 种多样 ,主 要是根 据模板 来源选 用适当 方法。 在制备 RNA 模板 时 ,要注 意防止 RNA 降解, DNA 模板的 制备相 对较容 易一些 。有的 样品直 接煮沸 lOmin 即 可用于 PCR; 有 的样品 需要经 SDS 和 蛋白酶 K 处理; 有 的难以 破碎的 菌则需 要加溶 菌酶和 EDTA 处理 。所得 DNA 常用酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提纯化 ,再 用乙醇 沉淀浓 缩。 1. 从培养 的细胞 中提取 DNA (1) 吸取 培养液 ,用 4X: 预冷的 Tris 缓冲 盐溶液 洗细胞 1 次。 (2) 胰酶 消化收 集细胞 ,或 用橡皮 刮把细 胞从培 养瓶壁 上刮下 。将细 胞悬浮 在少量 (约 0.5mL) 4X: 预冷的 TE 中。 (3) 加 10 倍体积 的破碎 细胞液 : O.5mol/L EDTA pH8.0, lOO^g/mL 蛋白酶 K, 0.5%SDS。 混匀后 , 37t: 过夜 ,或 50X: 水 浴保温 3h。 (4) 用等 体积的 酚抽提 一次。 250〇r/min 离心 ,收 集水相 ,用 1/2 体积的 TE 缓冲 液饱 和酚加 1/2 体积 的氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 2500r/min 离心 ,收 集水相 。等 体积氯 仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (5) 收 集水相 ,装入 透析袋 。(透 析袋 处理: 先放在 2% 碳酸 氢钠、 lmmol/LEDTA 溶液 中煮沸 lOmin, 重蒸 水冲洗 后再在 重蒸水 中煮沸 lOtnin。 存放在 50% 乙醇或 重蒸水 中 , 4t: 保存 。使 用前用 透析液 冲洗透 析袋内 壁。) 放入透 析液中 (50mmd/LTriS-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA, 10mmol/LNaCl), 4X: 过夜。 (6) 吸出 DNA 溶液 ,加入 RNase A 到终 浓度为 100Mg/mL, 置 37X: 温育 3h。 (7) 加 SDS 至终 浓度为 0.5%, 然后加 蛋白酶 K 至 100/ig/mL, 37t: 过夜 ,或 50t: 3h〇 (8) 酚 / 氯仿 / 异戊醇 、氯仿 / 异戊醇 各抽提 一次。 (9) 透析, 4X: 过夜 。换 1、 2 次 透析液 ,透 析液为 10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA〇 (10) 用分光 光度计 测定透 析液的 OD279 ,读 数要 <0.05, 否则 再换新 鲜透析 液进行 透析 ,以除 去酚等 杂质。 (11) 测定 DNA 溶液的 OD26Q 和 OD28〇 值, OD26D/OD28() 应 >1.8, 比值 偏低表 明制备 物中蛋 白质含 量偏高 。在 这种情 况下, 重复实 验步骤 (8) 〜 (11)。 (12) 计算 DNA 浓度 (OD26〇 = 1 时 ,溶 液所含 DNA 约为 50pg/mL), 通过 电泳分 析一小 份样品 。以 鉴定 DNA 有 无降解 ,初 步测定 DNA 的相 对分子 质量。 2. 从组织 中提取 DNA (1) 把组织 块剪碎 ,放 在液 氮中。 (2) 把冻 成硬粒 的组织 块放入 不锈钢 制的捣 碎器, 加液氮 ,把组 织块捣 碎成粉 末状。 (3) 待液氮 挥发后 ,加 入少量 预冷的 TE, 要防 止组织 碎块聚 结成团 ,尽可 能地制 成细胞 悬液。 . 363 • (4) 如果 是肝脏 等组织 ,可 直接用 匀浆器 (管) 制成 匀浆, 悬浮在 TE 中, 只是在 匀浆时 ,应 注意 将匀浆 器置于 冰内。 (5) 按 照从培 养细胞 中提取 DNA 方法 的步骤 (3)~(11) 提取 DNA。 3. 从 大置血 样的白 细胞中 分离高 相对分 子质量 DNA (1) 抽 20mL 血 ,肝素 抗凝。 (2) 加 20mL1.8%NaCl, 力 U20mL6% 葡聚糖 (Dextran), 直立 静置于 室温。 (3) 取上 清液, l〇〇〇r/min, 4t: 下离心 lOmin。 (4) 取沉 淀细胞 ,悬 浮打散 后加入 30mL 重蒸水 ,再加 10mL3.6%NaCl。 (5) lOOOr/min, 4*0 下离心 lOmin。 (6) 将沉淀 的细胞 悬浮在 l〇mL0.5mol/LEDTA 中 ,加入 20% SDS 至 终浓度 1%, 加入 10mg/mL 蛋白酶 K 至终 浓度 100pg/mL。 (7) 轻轻 摇动, 37X: 过夜。 (8) 用酚 、酚 / 氯仿 / 异戊醇 、氯仿 / 异戊醇 各抽提 一次。 (9) 加 NaCl 至终 浓度为 O.lmol/L, 混匀。 (10) 加二 倍体积 -20X: 预 冷的无 水乙醇 ,混匀 。置 -20X: 或 -70X: 过夜。 (11) 12 000r/min, 4*C 下离心 15min, 倒去 乙醇, 待乙醇 挥发后 ,将 DNA 沉淀溶 于 TE (5~10mL)〇 (12) 待 DNA 完全 溶解后 ,加 RNase A 至 lOOpg/mL, 置 37X: 温育 3h。 (13) 加 SDS 至 0.5%, 再加 蛋白酶 K 至 100/zg/mL, 371C 过夜。 (14) 用酚 、酚 / 氯仿 / 异戊醇 、氯仿 / 异戊醇 各抽提 一次。 (15) 取上层水相装入透析袋,透析液为1〇111111〇1/1^丁1^-1^(:1卩?18.0,1111111〇1/1^£0- TA, 于 4X: 透 析过夜 。换 1~2 次透 析液。 (16) 测 DNA 浓度。 4. 从 少量血 样的白 细胞中 分离高 分子量 DNA (1) 取 2mL 血用 EDTA 或 柠檬酸 抗凝。 (2) 加入6〇^155111111〇1/[>41^(:1,1〇111111〇1/1^1<;14(:03,0.1〇1111〇1/1^£0丁八,置于冰 中 lOmin, 使 红细胞 裂解。 (3) 1 OOOr/min, 4*C 下离心 lOmin。 白 细胞沉 淀重新 悬浮于 2mL 0.15mol/L NaCl, 0.015mol/L 柠檬 酸钠, 20mmol/L EDTA 中。 (4) 加入 蛋白酶 K 200/ig。 再加入 SDS 至终 浓度为 1%, 37t: 保温 2h。 (5) 用等体 积的酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提两次 ,氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (6) 加入 1/30 体积的 3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 和等 体积的 异丙醇 混勻, 10 OOOr/min 离心 15min。 沉淀用 70% 乙醇 洗一次 ,沉 淀溶于 3mL TE 缓冲 液中。 (7) 加入 RNaseA 至 终浓度 20/ig/mL, 37X: 保温 2h。 加入 蛋白酶 K 至终 浓度 100Mg/mL, 再加入 SDS 使终 浓度为 0.5%, 37X: 保温 2h。 (8) 加 入等体 积的酚 / 氯仿 / 异 戊醇抽 提两次 ,再 用氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (9) 取上 层水相 ,加 入等体 积的异 丙醇, 混匀。 15 OOOr/min 离心 lOmin。 沉 淀溶于 • 364 • 0.5mLTE 缓 冲液中 ,置 -20X: 冰箱中 备用。 5. 高 相对分 子质量 DNA 的 小量快 速制备 (1) 将 细胞悬 液浓度 调整成 IX lOVmL, 取 0.5mL 转入 Eppendorf 管内, 3000r/min 离心 5min, 弃 上清。 (2 ) 将细 胞悬于 0.5mL TES ( 150mmol/L NaCl, 10 mmol/ L Tris-HCl pH7.5, lmmol/LEDTA) 中 ,加入 10%SDS0.1mL, 置室温 5min。 (3) 加入等 体积酚 / 氯仿 / 异戊醇 ,抽提 一次。 然后再 用氯仿 / 异戊 醇抽提 一次。 (4) 将上层 水相转 入另一 Eppendorf 管 ,加入 1/10 体积的 3mol/L NaAc (pH5.2), 2 倍体 积的无 水乙醇 ,混匀 后即可 见团状 DNA 沉淀。 (5) 10 000r/min 离心 lmin, 弃 上清。 (6) 将 DNA 溶于 O.lmLTE 缓冲液 ,置 -20X: 保存。 6. 从 血液制 备模板 DNA ( 1 ) 取 200juL 血置 于含有 50/iL 5 % EDTA 的 Eppendorf 管中。 (2) 12 000r/min 离心 5s, 弃 上清。 (3) 将细 胞重新 悬浮于 50yL 溶液 (10mmol/L Tris-HCl pH7.6, 5mmol/L MgCl2, lOmmol/LNaCl) 中, 12 000r/min 离心 5s, 弃 上清。 (4) 重 复步骤 (3) 2 〜 3 次。 (5) 将细胞 悬浮于 100pL 重 蒸水中 ,置 沸水浴 5min。 (6) 12 000r/min 离心 5min, 除 去细胞 碎片。 (7) 取上清 2 〜 5^L 用于 PCR 扩增 反应。 7. 从 血斑制 备模板 DNA (1) 将血斑 剪碎, 置于试 管中。 (2 ) 试管 中加入 1 . 8mL 溶液 ( 0 . 15mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl pH7.5, lmmol/L EDTA), 将碎片 在溶液 中浸泡 lOmin。 (3) 加入 180^L10% SDS 和 25^L10mg/mL 蛋白酶 K, 于 50T: 温育 过夜。 (4) 用 TE 缓冲液 饱和酚 和氯仿 / 异戊醇 各抽提 两次。 (5) 将 水相转 入新的 Eppendorf 管 ,用乙 醇沉淀 DNA。 (6) 离 心回收 DNA 后 ,真 空抽干 DNA。 再将 DNA 溶于 TE 缓冲液 (pH8.0) 中。 (7) 取 适量样 品用于 PCR 扩增 反应。 8. 从 绒毛制 备模板 DNA 绒毛组 织主要 包括: 肠绒毛 、胎 盘绒毛 、腹膜 绒毛、 心包绒 毛等。 (1) 将域毛 样品用 100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDrA 洗 2 遍, 离心弃 上清。 (2) 加入 50扎 溶液 (O.lmd/LNaOH, 2m〇l/LNaCl, 0.5% SDS), 振 荡裂解 细胞。 . 365 . (3) 置 沸水浴 2min, 12 OOOr/min 离心 5min, 弃 沉淀。 (4) 取 2.5/iL 上 清用于 PCR 扩增 反应。 9. 从 羊水的 细胞制 备模板 DNA (1) 取 1.5mL 羊 水置于 Eppendorf 管中, 2000r/min 离心 5min。 (2) 弃上清 ,用 TE 缓 冲液将 细胞洗 2 遍, 离心弃 上清。 (3) 加入 50pL 裂解液 (O.lmol/LNaOH, 2mol/LNaCl), 振 荡裂解 细胞。 (4) 置 沸水浴 2min, 并再次 振荡。 (5) 12 OOOr/min 离心 5min, 除 去细胞 碎片。 (6) 取 2_5MLi 清用于 PCR 扩增 反应。 10. 从口 腔上皮 细胞制 备模板 DNA (1) 用 15mL0.85% NaCl 液漱口 10s, 置液 体于试 管中。 (2) 2000r/min 离心 lOmin, 弃 上清。 (3) 力口 lmL 溶液 (0.15mol/LNaCl, 10mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA) 重新悬 浮细胞 ,再 加入 100^L10%SDS。 (4) 置 55X: 温育 2h。 (5) 用 TE 缓冲液 饱和酚 和氯仿 / 异戊醇 各抽提 2 次。 (6) 用乙 醇沉淀 DNA。 离 心回收 DNA 后 ,真 空抽干 DNA, 再将 DNA 溶于 TE 缓 冲液 (pH8.0)。 (7) 取 适量样 品用于 PCR 反应。 11. 从尿 样制备 DNA (1) 取尿液 400pL, 12 OOOr/min 离心 5min。 上清转 入新的 Eppendorf 管 ,加入 10%SDS 至 终浓度 0.1%, 置 371C 温育 30min。 (2) 用 TE 缓冲液 饱和酚 、酚 / 氯仿 / 异戊醇 、氯仿 / 异戊醇 各抽提 一次。 (3) 将水相 (400/uL) 转 入新的 Eppendorf 管 ,加入 5^L 糖原 (10mg/mL)。 用乙醇 沉淀 DNA。 离 心回收 DNA 后 ,真 空抽干 DNA。 (4) 将 DNA 溶解于 TE 缓冲液 (pH8.0) 中 ,取 适量样 品用于 PCR 扩增 反应。 12. 从 精斑制 备模板 DN A (1) 将 精斑剪 碎放入 Eppendorf 管中。 (2) 加入 0.5mL 溶液 (0.15mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl pH7.5, lmmol/L EDTA), 将碎片 在溶液 中浸泡 5min。 (3) 加入 120fiL 10% SDS, 然 后加入 蛋白酶 K (lOmg/mL) 至浓度 50/ig/mL, 加入 lmol/L DTT 至 终浓度 40mmol/L〇 (4) 将混 合物置 50X: 温育 过夜。 (5) 用 TE 缓冲液 饱和酚 和氯仿 / 异戊醇 各抽提 2 次。 (6) 将 水相转 入新的 Eppendorf 管 ,用乙 醇沉淀 DNA。 离 心回收 DNA 后, 真空抽 • 366 • 干 DNA〇 (7) 将 DNA 溶于 TE 缓冲液 (pH8.0)。 取 适量样 品用于 PCR 扩增 反应。 三、 PCR 的基 本反应 1. 以 DNA 为模板 的反应 根据 多年来 的实践 经验, 已经有 了一个 标准的 PCR 反 应条件 。反应 体系一 般选用 50^L 或 100ML 体积 ,其中 含有: 50mmol/L KC1 10mmol/L Tris-HCl (pH8.3, 室温) 1 . 5mmol/L MgCU 100/zg/mL 明胶或 牛血清 白蛋白 (BSAh 2 个引物 ,各 0.25~1.0)ixmol/L 4 种底物 (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP), 各 200pimol/L 模板 DNA 0. lpg T 叫 DNA 聚合酶 2.5U 其 中模板 DNA 的用 量必须 根据相 对分子 质量的 大小加 以调整 ,一般 需要含 102~ 105 拷贝的 DNA, 封上矿 物油防 止高温 反应时 液体的 挥发, 即 可进行 PCR 反应。 反 应条件 一般为 94X: 变性 30 〜 60s, 55t: 退火 30 〜 60s, 70 〜 72X: 延伸 30 〜 60s, 共 进行 30 次左右 的循环 。末轮 循环在 721C 延伸 7min。 末轮循 环后不 再变性 ,将反 应物置 -20X: 保存。 2. 以 mRNA 为模板 的反应 以 mRNA 为模 板进行 PCR 反应 以扩增 DNA 时, 首先通 过逆转 录反应 ,以 mRNA 为模 板合成 cDNA。 逆转录 反应中 一般包 括下列 成分: mRNA、 Oligo (dT)12~18 (DNA 合成 弓丨物 )、 Tris-HCl (pH7.6)、 KC1、 MgCl2、 4 种 dNTP 混 合液、 DTT、 RNA 酶 抑制剂 。在加 入上述 试剂和 材料后 ,加 水将体 积调整 到 48^L。 然 后加入 2pL Moloney 鼠白血 病病毒 ( MMLV ) 逆 转录酶 ( Pharmacia, 200 000U/mL; 对于 其他厂 商产品 ,使 用与此 相当的 单位数 )。 将混 合物在 37X: 反应 lh。 即 可获得 cDNA, 作为 PCR 扩增 的模板 。随后 进行以 DNA 为 模板的 PCR 反应。 用于 PCR 扩 增反应 的上游 寡核苷 酸引物 (亦称 3' 引物或 向前合 成引物 ) 10 〜 50pmol 可代替 Oligo (dT) 作引物 。上 游引物 与初始 mRNA 互补 ,下 游引物 (亦称 5' 引物或 向后合 成引物 ) 与 cDNA 第一链 互补。 3. PCR 产 物的积 累规律 在 PCR 的 反应过 程中, DNA 扩增过 程遵循 酶的催 化动力 学原理 。在反 应初期 ,目 的 DNA 片段增 加呈指 数形式 。随 着目的 DNA 产 物的逐 渐积累 ,在 引物一 模板与 DNA 聚 合酶达 到一定 比例时 ,酶 的催化 反应趋 于饱和 ,此 时扩增 DNA 片段的 增加减 慢进入 . 367 . 相对稳 定状态 ,即 出现 “停滞 效应” ,这 种效应 称“平 台期” 。到 达平台 期所需 PCR 循 环 次数取 决于样 品中模 板的拷 贝数、 PCR 扩增 效率及 DNA 聚合酶 的种类 和活性 ,以及 非特异 性产物 的竞争 等因素 。一 般在到 达“停 滞”阶 段之前 ,用 Klenow 酶只 能进行 20 次左右 的循环 ,而用 Tag DNA 聚 合酶则 可进行 25 次以上 PCR 循环 。这 是因为 DNA 聚合 酶的高 特异性 ,减少 来自非 特异性 延伸产 物对聚 合酶的 竞争, 从而使 在“停 滞” 期到达 之前有 更多的 目的基 因片段 积累。 大多数 情况下 ,平 台期在 PCR 反应中 是不可 避免的 。但 一般在 此之前 ,合 成的目 的基因 片段的 数量足 可以满 足实验 的需要 。如 果产 物不够 ,可继 续扩增 ,将 产物 DNA 样 品稀释 1000~10 000 倍后 ,作为 模板进 行新的 PCR。 四、 PCR 反 应条件 的控制 与优化 1. 镁离 子浓度 Mg2+ 浓度可 影响引 物退火 、模 板和 PCR 产 物的解 链温度 ,从 而可影 响产物 的特异 性 和扩增 片段的 产率。 Mg2t 的浓度 一般为 0.5 〜 2.5mmol/L 之间 ,常用 1.5mmol/L (对应 dNTP 浓度为 200/imol/L 左右 )。 Mg2 + 过量, 会增加 非特异 性扩增 并影响 产率。 由于 Mg2+ 的 最佳作 用浓度 相当低 ,因此 所制备 的模板 DNA 中不应 含有高 浓度的 螯合剂 ,如 EDTA, 也 不含有 高浓度 尚带负 电荷离 子基团 ,如 磷酸根 。所以 ,用 做模板 的 DNA 应溶于 10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 0. lmmol/L EDTA。 在较为 广泛的 范围内 ,常 用的标 准缓冲 液对于 各种模 板的寡 核苷酸 引物都 行之有 效 。但并 非对于 模板与 引物的 任何一 种特定 组合都 是最佳 。因此 ,标 准缓 冲液的 条件常 常需 要进行 修饰和 改良。 每当首 次使用 一种靶 序列和 引物的 组合时 ,尤 其要将 Mg2+ 浓 度调至 最佳。 dNTP 是反应 中磷酸 根的主 要来源 ,其 浓度的 任何变 化都将 影响到 Mg2 + 的有 效浓度 。在 实验中 ,最好 设置一 组反应 ,其 中每一 反应的 Tris-HCl (10mm〇l/L) 和 KC1 ( 50mmol/L) 的浓度 固定, 而变化 MgCl2 的浓度 ( 0.05 ~ 5mmol/L, 以 0.5mmol/L 的浓 度递增 )。 反应 结束后 ,通过 琼脂糖 凝胶电 泳和溴 化乙锭 染色来 比较各 扩 增产物 的量。 2. 扩增 缓冲液 各 厂家都 有适合 于自己 生产的 Tag DNA 聚 合酶的 缓冲液 。一般 组成为 : 50 mmol/LKCl, 10mmol/L Tris-HCl ( 室温下 pH8.3, 72X: 下 pH7.2), 1.5mmol/L Mg- Cl2〇 在 PCR 的 反应中 , 10 〜 50mmol/L 的 Tris-HCl 主 要调节 pH, 使 DNA 聚合酶 的作 用环境 维持偏 碱性。 Tris 缓冲液 是一种 双极化 离子缓 冲液, pH 为 8.3 (251C), 于 72X: 温育时 ,反应 体系的 pH 降低 1 个 多单位 ,使缓 冲液的 pH 接近 7.2。 50 mmol/L KC1 能促 进引物 退火, 高于此 浓度将 会抑制 Ta9 DNA 聚 合酶的 活性。 3. dNTP dNTP 溶液具 有较强 的酸性 ,应以 NaOH 将 pH 调至 7.0 〜 7. 5, 分装 于小管 ,于 • 368 . -20t: 存放 ,过 多的冻 融会使 dNTP 产 生降解 。在 PCR 的反 应中, dNTP 浓 度应为 20 〜 20(^m〇l/L, dNTP 浓度过 高可加 快反应 速度, 但同时 还可增 加碱基 的错误 掺入率 和实 验成本 。反之 ,低 浓度的 dNTP 导致反 应速度 的下降 ,但可 提高实 验的精 确性。 4 种 dNTP 以等 当量浓 度配制 ,以减 少错配 误差和 提高使 用效率 。在 PCR 的反应 过程中 加温时 ,经 50 个循环 , 50% 的 dNTP 是稳 定的。 4. 引物 在 PCR 的 反应中 ,引 物浓度 一般为 0.05~0.1pmd/L, 引物 浓度偏 高会引 起错配 和非特 异性产 物扩增 ,且 可增加 引物之 间形成 二聚体 的概率 ,这 两者还 竞争使 用酶、 dNTP 和引物 ,这 一切 均会使 DNA 合 成产率 下降。 5. Tag DNA 聚合酶 T 叫 DNA 聚合酶 是一种 耐热的 DNA 聚合酶 。该 酶在 75 〜 80X: 时具 有最高 的生物 学 活性, 75 〜 80X: 条件下 每一个 酶蛋白 分子可 延伸约 150 个 核苷酸 /s; 70X: 时, 酶分子 延伸 速率在 60 个 核苷酸 /s 以上 。温度 降低时 , Tag DNA 聚合 酶延伸 DNA 链的 速度明 显 下降, 55X: 时为 22 个 核苷酸 /s, 而 37X: 和 22X: 时 分别为 1.5 个 核苷酸 /s 和 0.25 个 核苷酸 /s。 当温度 >80t: 时, 合成速 度也明 显下降 ,可能 与引物 或引物 - 模板的 稳定性 遭 到破坏 有关。 T^DNA 聚 合酶具 有良好 的热稳 定性。 92.5X:、 95X: 和 97.5X: 时, TagDNA 聚 合 酶的生 物活性 半衰期 分别为 130min、 40min 和 5 〜 6min。 在 100/xL 反应 体系中 ,一 般所需 Tag DNA 聚 合酶的 用量为 0.5~5U。 根据 扩增片 段 的长短 及其复 杂程度 (G+C 含量) 不 同而有 所区别 。使用 DNA 聚合酶 浓度过 高, 可引起 非特异 性产物 的扩增 ,浓 度过低 则合成 产物量 减少。 DNA 聚合酶 缺乏校 正功能 ,在 PCR 过 程中核 苷酸掺 入错误 率可达 每循环 2 x 1〇_4 个 核苷酸 ,约比 使用大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 酶时高 4 倍 。对 于一个 30 轮 循环的 扩增反 应来说 ,这 一掺入 错误率 将导致 0.1% 〜 0.25% 的总错 误频率 。这 一频 率随 dNTP 和 Mg2+ 浓度 的升高 而增大 。这些 错误的 掺入可 以发生 在扩增 产物的 任何位 置 ,既有 颠换也 有转换 (但 并无大 的缺失 、嵌合 或插入 )。 由于: H^DNA 聚合 酶没有 校正 功能, 错配的 结果是 DNA 合 成终止 ,但 也不能 完全排 除继续 合成的 可能性 。如果 将 扩增反 应的全 部产物 整体用 做杂交 探针或 DNA 直 接测序 的模板 ,那么 这种偶 然的错 误 是无关 紧要的 。但是 ,当 从一个 扩增反 应系统 中克隆 出单个 DNA 分子时 ,其 序列便 不是绝 对可靠 。由 这种方 式获得 的任何 序列, 都应当 通过对 多个重 组克隆 进行测 序而加 以确证 ,而且 这些克 隆最好 来自至 少两个 独立进 行的扩 增反应 ,或者 也可以 对来自 100 — 200 个重 组克隆 的单链 DNA 整体进 行测序 。这 种做法 排除了 这样一 种可能 ,即来 自特 定扩增 反应的 每一克 隆中都 带有在 扩增的 头几个 循环就 已发生 的掺入 错误。 6. 变 性时间 和温度 PCR 的一 个反应 开始时 ,首先 是使双 链模板 DNA 解离 为单链 ,使之 有利于 与引物 相结合 。这 个过 程可以 通过加 热完成 。在 90~95t: 条件下 ,即 使再 复杂的 DNA 分子, . 369 . 如人 基因组 DNA, 也可 变性成 为单链 。根 据模板 DNA 复杂 程度, 可以调 整变性 温度和 时间。 一 般情况 下选择 94 〜 95X: 下 30~60s, 可 使各种 复杂的 DNA 分子完 全变性 。温 度过 高且时 间过长 ,了叫 DNA 聚 合酶易 失活, dNTP 破 坏增多 。但是 ,如 果温 度过低 且时 间过短 ,变 性就不 完全。 7. 引物 的退火 将变 性后的 DNA 很快 冷却至 40 〜 60X:, 可 使引物 和模板 DNA 发 生结合 。模板 DNA 结构 比引物 要复杂 得多, 引物和 模板之 间碰撞 的机会 显著高 于模板 互补链 之间的 碰撞 。复 性温度 的选择 ,可以 根据引 物的长 度和其 G+C 含量 确定。 长度在 15 〜 25bP 之间时 ,引 物的退 火温度 可通过 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计 算得到 。引物 与模板 退火 的温度 一般在 45~55€。 温度低 ,容易 退火, 但特异 性低; 温度高 ,退火 较难, 但特 异性高 。在: Tm 允许的 范围内 ,选 择较高 的退火 温度可 大大减 少引物 和模板 之间的 非特 异结合 ,提高 PCR 的 特异性 。退 火时间 30s, 足以使 引物和 模板之 间完全 结合。 8. 引物 的延伸 PCR 反应的 延伸温 度一般 选择在 70~75t: 之间, 此时, T 叫 DNA 聚 合酶具 有最高 活性 。当 引物在 16 个 核苷酸 以下时 ,过高 的延伸 温度不 利于引 物和模 板结合 。此 时, 可 采用使 反应温 度缓慢 升高到 70 〜 75t: 的方法 。因 为最初 较低温 度下, 〔H^DNA 聚合 酶 已催化 延伸反 应开始 ,接 下来的 较高温 度不会 对这种 “延长 ”过的 引物和 DNA 模板 的结 合发生 影响。 PCR 延 伸反应 的时间 ,可 根据待 扩增片 段的长 度而定 。一般 lkb 时则需 增加延 伸时间 。在较 后的循 环中, 产物 浓度大 、酶 减少、 dNTP 减少 ,需适 当延长 扩增时 间较好 ,所 以最 后一轮 常定为 5 〜 7min〇 9. 循 环次数 其他 参数选 定后, PCR 循环 次数主 要取决 于模板 DNA 的浓度 。理 论上说 20~25 次循 环后, PCR 产物的 积累即 可达最 大值, 实际操 作中由 于每步 反应的 产率不 可能达 到 100%, 因此 ,不 管模板 浓度是 多少, 25 〜 30 次是 比较合 理的循 环次数 。循环 反应次 数过多 ,非 特异性 产物的 量亦会 增加。 反应循 环数取 决于反 应的效 率以及 反应中 的模板 DNA 的量 ,少至 lOOng 的 哺乳动 物细胞 基因组 DNA( 相当于 104 个细胞 ), 经 30 个 循环, 10% 的 反应物 应能够 在溴化 乙锭染 色的凝 胶上看 到一条 主要产 物条带 。使 用较大 量的模 板时, 循环数 可相应 减少; 如 果模板 量很少 ,可 能需要 增加至 45 个反应 循环。 五 、扩增 大片段 核酸的 PCR 条 件优化 普通 PCR 反应 体系很 难一次 性扩增 3 〜 5kb 长的核 酸片段 。如 果要 扩增大 片段核 酸 ,并 要求扩 增的片 段长而 精确, 则需要 特殊的 PCR 方法 ,称为 LA-PCR (long and ac- curate PCR)。 LA-PCR 方 法是从 1992 年开始 发展起 来的, 许多生 物技术 公司推 出了各 • 370 • 自的 LA-PCR 试剂盒 ,可 以一次 性扩增 30~50kb 的 DNA 片段。 (一) 影响大 片段核 酸扩增 的因素 影响 大片段 核酸扩 增的可 能机制 和因素 包括: 1. DNA 链 y 端错配 PCR 的基本 原理是 DNA 聚合酶 催化以 已有的 DNA 为模板 的核酸 片段从 5'—3' 的 合 成和延 伸过程 ,如 果新合 成核酸 片段的 3' 端 与模板 DNA 之 间出现 错配, DNA 聚合酶 的 催化作 用将因 此终止 。由 于普通 PCR 反应中 所用的 DNA 聚合 酶没有 3'— 5' 外 切核酸 酶作用 ,无 法消 除扩增 过程中 出现的 突变和 由此产 生的新 合成的 核酸链 3' 端与 模板链 的错配 ,这是 限制大 片段核 酸扩增 的机制 之一。 2. 模板 DNA 链 的损伤 PCR 的 反应系 统中的 许多成 分对热 不稳定 ,除了 DNA 聚合酶 在高温 下会丧 失部分 活性外 ,模板 DNA 链本 身也可 能受损 ,其 中之一 就是碱 基的脱 嘌呤和 脱嘧啶 ,而 Tag DNA 聚合 酶作用 时不能 通过已 发生脱 嘌呤的 部位。 PCR 的 反应也 可能因 此终止 。在 pH7.0、 100X: 条 件下, lOOkb 的 DNA 大约平 均每分 钟会出 现一个 脱嘌呤 部位。 随着环 境中 pH 的 降低, DNA 链 的脱嘌 呤速度 会更快 。普通 PCR 系统 (25X:, pH8.33) 的 pH 在 95X: 时 将降至 6.45, 如 此低的 pH 将使 DNA 链的脱 嘌呤速 度变为 20 〜 30kb/min 的 DNA 片段即 出现一 个脱嘌 呤部位 ,如 此低的 pH 还可 能使新 合成的 DNA 链中的 核苷酸 间 的连接 键断裂 ,形 成缺口 而阻止 DNA 链的 延伸, 这是限 制大片 段核酸 扩增的 另一机 制。 3. 其 他因素 影响 大片段 核酸扩 增的其 他因素 还包括 PCR 添加剂 (如 甘油、 DMSO 等 )、 PCR 循 环参数 ( 如变性 、退火 和延伸 的温度 和时间 、循 环数 、热启 动等) 以及 扩增模 板的完 整性等 。: HzgDNA 聚合 酶本身 有效的 作用时 间有限 ,反应 一定的 时间后 ,酶会 自动从 模板 DNA 链 上脱落 ,也 会影响 DNA 的 扩增。 (二) LA-PCR 条件 的优化 LA-PCR 方法是 在改变 、调整 上述影 响大片 段核酸 合成的 因素后 建立和 完善起 来的。 1.DNA 聚合酶 增 加具有 3'—5' 外切 核酸酶 活性的 DNA 聚合酶 (如 Pfu、 Vent 聚合酶 ), 以 双聚合 酶战 略消除 DNA 合成中 出现的 3' 端错配 ,或者 采用合 成能力 更强的 Tth 聚 合酶。 用于 PCR 的耐热 DNA 聚合 酶都有 很强的 5'— 3' 聚合酶 活性, 而没有 3'— 5' 外切核 • 371 • 酸 酶活性 ,也 就是没 有“校 正阅读 ” (Pro〇fread 丨 ng) 功能, 因此了 叫 聚合 酶催化 的反应 的碱 基错误 掺入率 可高达 1〇~4〇 个碱基 / 循环 。但生 物界也 存在一 些具有 3'—5' 外切酶 活性的DNA聚合酶,如Pfu酶、DeepVent酶、Tma酶和Vent酶等,它们催化DNA 合成 的忠实 性更高 。如 Pfu 酶的 错误掺 入率为 10 — 〜 1〇_6 个碱基 / 循环。 然而, Pfu 酶 催化 5'— 3'DNA 合成的 能力较 了叫 聚 合酶差 。两种 酶结合 后则可 以大大 提高合 成大片 段 DNA 的能力 。其他 的酶也 可以进 行组合 。两 种酶 的组合 通常都 要按照 适当的 比例, 如 klenT 叫 1 与 Pfu 聚 合酶按 15:1 混合 较佳; rTth 和 Vent 酶 混合时 ,每 2 〜 2.5UrTth 酶 中加入 0.015~0.15U 的 Vent 酶最为 合适。 2. 缓冲液 普通 PCR 系 统多以 20mm〇l/LTriS-HCl(pH8.3) 为 缓冲液 ,在 反应过 程中, pH 最 低 可降至 6.5 左右 。对 于扩增 大片段 核酸, Tris-HCl 或 Tris acetate 缓 冲液的 pH 最好为 8.9〜9.2。也可以用丁:^丨1^(三羟甲基甘氨酸)替代丁^5提高?0^系统的?只的稳定 性和缓 冲能力 以减少 碱基的 脱嘌呤 。与 Tris 相比, Tricine 能更 好地稳 定反应 系统的 pH, 因此, 20 〜 25mmol/LTricine (pH8.5 〜 8.7, 25X:) 更好。 3. Mg^ + 和 K + 在普通 PCR 系 统中, 1.5 〜 2.0mmol/LMg2+ 对 于促进 聚合酶 的催化 能力和 保证其 特 异性是 合适的 。但在 LA-PCR 系统中 ,由 于增加 了聚合 酶的“ 校读” 功能, Mg^ 浓 度 可降到 1.0~1.25mmol/L, 但 Mg (OAc)2 的终浓 度应较 dNTP( 终浓度 0.8mmol/L) 高 0 . 2 ~ 0 . 3mmol/ L〇 低浓度 KC1 可 增加聚 合酶在 DNA 链 上的行 进能力 和活性 ,在 LA-PCR 系 统中, K+ 浓度 通常为 50mmol/L(T 叫酶) 或 100mmol/L(rTth 酶 )。 亦 有实验 表明无 KC1 更 适合扩 增大片 段核酸 。但 降低 K+ 浓度会 降低聚 合酶的 特异性 ,用 KAc 代替 KC1 时 ,可 使非 特异性 扩增条 带大大 减少。 4. PCR 添加剂 常用的 添加剂 (additive) 为甘 油和二 甲亚砜 (DMSO), 它们都 能降低 DNA 模板熔 解和解 链温度 (10% 的 甘油和 DMSO 可分别 降低变 性温度 2.5~3t: 和 5.5 〜 6X:), 从 而减少 DNA 链 的损伤 。甘油 还能增 加聚合 酶的热 稳定性 (95 〜 97. 5X: 时 rTaq 酶 的稳定 性增加 2 倍 ), DMSO 能减少 碱基脱 嘌呤和 链剪断 。有实 验表明 ,扩增 25 〜 34kb 的 XDNA, 可加入 1%~3% 的 DMSO 和 8% 的甘油 ,或者 5% 的 DMSO 和 甘油; 扩增 35~ 42kb 片段时 , 5% 的 DMSO 和 6% 〜 7% 的甘 油更加 有效; 如果延 伸时间 缩短为 lOmin, 加入 3%DMSO 和 8% 甘油可 以扩增 34kb 片段; 加入 1 % DMSO 和 8% 甘油 可扩增 26kb 片段 。但单 独使用 DMSO 可降低 聚合酶 的热稳 定性, DMSO 和 甘油对 klenT^l 和 Pfu 酶也不 适合。 尽管 甲酰胺 能增加 PCR 扩增的 特异性 ,对 富含 G、 C 碱 基的短 序列扩 增有利 ,但 在 LA-PCR 系统 中使用 甲酰胺 是不合 适的。 • 372 • 5. 引物 扩增 大片段 核酸时 ,引 物的特 异性非 常重要 ,尤其 是富含 G、 C 碱基 和复杂 二级结 构 的模板 ,引物 与模板 DNA 特 异性匹 配是实 现大片 段扩增 的关键 。其次 是引物 的复性 温度应 >60t:, 使退火 和延伸 温度更 加接近 ,便 于反 应中采 用双温 循环以 提高扩 增的特 异性 和效率 。因此 ,引物 的长度 一般应 >20 个 碱基, (G+C) 比例应 >50%。 引物浓 度 一般为 0.4~0.5^mol/L (扩增 高拷贝 模板) 或 0.15 〜 0.2^md/L (扩 增低拷 贝模板 )。 有实 验表明 ,扩增 XDNA 时 ,引 物长度 <27 个碱基 没有扩 增产物 ,引物 长度为 27 〜 33 个 碱基时 ,扩增 产物量 随着引 物的长 度增加 而增大 。当然 ,扩 增不 同的靶 DNA 时 ,最 适的引 物长度 和碱基 组成仍 需实际 摸索。 6. 模板 模板 DNA 的完 整性是 决定大 片段核 酸扩增 的关键 ,尤其 是扩增 cDNA 时, 保证从 RNA 完整地 逆转录 cDNA 至关 重要。 有人比 较过不 同方法 提取的 DNA 模板 对扩增 20~ 30kb 片段 的影响 ,结 果高盐 (6mol/L 的 NaCl)、 大 孔透析 和阴离 子交换 树脂等 方法较 传 统的酚 提取方 法能更 好地保 持模板 DNA 的完 整性。 7. 温度循 环参数 PCR 中 模板的 变性非 常重要 ,但 变性温 度应尽 可能低 ,变性 时间不 能太长 ,一般 应 〈60s。 有人 在扩增 8.4~18kb 的 XDNA 时发现 , 95X: 变性 l~2min, 没有得 到相应 的扩 增片段 ,变 性时间 调整为 2 〜 20s 时 ,可 得到 8. 4kb 的扩增 条带; 选择 94T: 变性 20s、 60s 和 180s, 结果 随着变 性时间 延长, 扩增效 率明显 降低; 而在 扩增 35kb 片段 时 ,仅需 95X: 变性 5s。 当然 ,变性 温度和 时间的 选择, 还取决 于所扩 增的靶 DNA 和引 物 的特性 以及扩 增仪的 性能等 ,不 能一概 而论。 8. “ 双温 ”反应 LA-PCR 系统 多采用 退火和 延伸结 合的“ 双温” 反应, 当然也 可以将 退火和 延伸分 别设置 为不同 的温度 ,但延 伸温度 一般为 68X:。 典型 的反应 程序是 : 93~94t: 预变性 30 〜 60s, 每 一循环 93~94t: 变性 15 〜 60s, 60 〜 70T: 退火 / 延伸 5 〜 20min, 最后 72X: 延伸 SlOmin。 扩增 >10kb 的核酸 时还可 以在后 10 〜 20 个 循环中 ,每一 循环增 加延伸 时间 5 〜 15s, 比一开 始就用 每循环 >15min 要好, 非特异 性扩增 更少。 9. 其 他因素 PCR 扩增 仪是其 中之一 。由 于不同 厂家生 产的扩 增仪的 加热和 冷却机 制不同 、温 度升降 变化快 慢不一 、温 度控 制的敏 感性和 精确性 不同等 ,使扩 增效率 和效果 相差很 大 。有研 究表明 ,用 RoboCycler 扩增仪 能扩增 28kb 片段 ,而 相同条 件下用 〇mni- genecycler 扩增仪 则不能 。原 因是 RoboCycler 扩 增仪是 3 个水 浴缸分 别设置 为变性 、退 火 和延伸 3 个不 同温度 ,由 一个机 械臂控 制扩增 管循环 ,这 样能最 快实现 管内不 同温度 间 的变化 。此外 ,为了 加快热 的穿透 和平衡 ,用 薄壁 管扩增 的效果 较好。 • ^73 在高温 (70X: 左右) 下使酶 、模板 DNA 与引 物混合 ,称为 PCR 的热 启动。 热启动 可避免 PCR 反应中 引物与 模板的 非特异 性复性 和扩增 ,以 及形成 引物寡 聚体所 致的非 特异 性扩增 ,这在 扩增大 片段核 酸时是 非常重 要的。 六、 PCR 实验中 应注意 的事项 1. 防 止污染 PCR 技术 的敏感 性极高 ,如 实验中 出现交 叉污染 ,很 容易出 现假阳 性结果 。采取 如下措 施有利 于防止 污染: (1) 小量分 装所有 试剂。 (2) 尽可 能使用 一次性 吸头及 试管。 (3) 分开操 作区域 。在专 用超净 工作台 进行样 品制备 ,专 设工作 台进行 PCR 操作, 反 应后的 产物在 另一工 作台进 行结果 分析。 (4) 样品制 备应按 无菌操 作的原 则进行 ,避免 样品间 的互相 污染。 (5) 设 置专用 微量可 调加样 器用于 PCR, 这 套加样 器绝不 能用于 PCR 的反 应产物 分析。 2. 实验中 的对照 每 一次试 验都需 要设置 严格的 对照。 阳 性对照 :阳性 模板。 阴 性对照 :阴性 模板。 试剂对 照:除 模板外 的所有 组分。 3. 扩 增反应 总是阴 性结果 (无 产物) 时 应采取 的措施 (1) 取 lOpL 扩增 混合液 作模板 再进行 PCR 扩增。 (2) 增加 Tag DNA 聚 合酶的 浓度。 (3) 增加靶 DNA 量。 (4) 若 模板为 粗制品 ,提纯 样品。 (5) 增加扩 增循环 次数。 (6) 适当降 低退火 温度。 4. 出现非 特异性 产物时 应采取 的措施 (1) 提 高退火 温度。 (2) 降低 DNA 聚 合酶的 浓度。 (3) 缩 短退火 及延伸 时间。 (4) 降 低引物 浓度。 (5) 减少扩 增循环 次数。 m • 372 • 第三节 PCR 技术 的扩展 自 Mullis 建立 PCR 技 术以来 ,该 技术得 到了极 为广泛 的应用 。人们 也对其 进行了 不断 的革新 ,推出 了反向 PCR、 定量 PCR、 PCR 基 因克隆 技术等 。本节 介绍其 中一些 技术。 一 、多重 PCR 多重 PCR (multiple PCR) 是在 一次反 应中加 入多种 引物, 同时扩 增一份 DNA 样品 中不 同序列 。每 对引物 所扩增 的产物 序列长 短不同 。根 据不同 长短的 序列存 在与否 ,检 测是 否有某 些基因 片段的 缺失与 突变。 如杜兴 氏肌营 养不良 (Duchenne muscular dys- trophy, DMD), 是一种 致死性 X 连锁 遗传病 。在 男婴中 (达 1/3500) 位于 X 染 色体短 臂 Xp21 区的肌 营养不 良蛋白 (dystrophin) 基 因的突 变或部 分缺失 是导致 DMD 的原发 分 子病因 。多重 PCR 可用 于检测 该基因 的缺失 。该基 因全长 至少有 2000kb, 有 70 多 个 外显子 ,基 因缺失 集中于 9 个 易发热 点区域 ,位于 4、 8、 12、 17、 19、 44、 45、 48、 51 等 9 个外显 子内。 已有人 设计了 9 对引物 ,对应 于上述 9 个外 显子, 扩增产 物分别 为 196bp、 268bp、 288bp、 300bp、 331bp、 416bp、 459bp、 506bp、 547bp。 将 9 对引物 一 次加入 反应液 (多重 PCR) 中扩增 这些外 显子的 片段, 电泳观 察是否 有某一 区带缺 失, 在几个 小时内 就可完 成检测 ,比分 子杂交 更简单 也更快 。它可 检测出 80% 以上的 杜 兴氏肌 营养不 良症。 二、 筑巢式 PCR 筑巢式 PCR (nested-primer PCR) 是先用 一对外 侧引物 扩增获 得目的 基因的 一个大 片段, 再用一 对内侧 引物以 大片段 为模板 再扩增 。通常 先用外 侧引物 扩增若 干周期 ,再 加入内 侧引物 ,使 PCR 效率大 大增加 。在待 扩增的 基因拷 贝数很 少时, 筑巢法 PCR 可 以提高 PCR 的效 率和特 异性。 一般用 外侧引 物扩增 30 个循环 ,然 后取出 10% 的 反应产 物放入 新试管 ,加 入全套 反应液 和内侧 引物, 再扩增 30 个循环 。筑 巢法 可以不 用同位 素探 针检测 ,因 为反应 中模板 必须与 4 个寡核 苷酸引 物结合 才能获 得阳性 结果, 因此特 异性 很局。 三 、二次 PCR 二次 PCR 又称 BosterPCR, 是 分二期 执行的 PCR。 第一期 先扩增 DNA 模板 中少量 的拷贝 ,然后 再用同 一 对引物 做二次 PCR。 在需要 较多的 PCR 产 物做限 制酶酶 切分析 时 可采用 这种方 法进行 PCR 扩增 。取 5pL 第一次 PCR 的 反应液 ,加 入新反 应液中 ,用 同一对 引物做 30 个循环 的二次 PCR, 可获 得较多 的产物 ,用酚 / 氯仿抽 提后, 可进行 多次酶 切分析 。过 量的 引物可 能形成 二聚体 ,干扰 DNA 合成 ,可 以在第 二期先 加入少 . 375 . 量 的引物 ,反 应一段 时间后 再把引 物提高 到标准 浓度。 四、 中断性 PCR 中断性 PCR (interrupted PCR) 也 是一种 两期法 PCR。 第一期 PCR 的 产物用 做第二 期反应 的模板 。第 二期 PCR 的 引物包 括原来 的一条 引物和 互补于 扩增产 物中心 部位的 另 一条内 侧引物 。这种 PCR 特 异性强 ,可以 迅速获 得结果 ,不必 用同位 素探针 ,常用 于检测 重排的 基因。 这种 方法也 可以说 是一种 半巢式 PCR, 在 利用逆 转录酶 PCR (RT-PCR) 克隆 cD- NA 片段 时较为 适用。 在进行 RT-PCR 时 ,即 使在最 合适的 条件下 也可能 产生非 特异性 产物。 在进行 cDNA 克隆时 ,或 进行 cDNA 片段的 克隆时 ,往往 不容易 得到所 要的片 段 。采用 半巢式 PCR 可以 得到单 一片段 ,便 于克隆 。或 者利用 半巢式 PCR 的原理 ,以 一条 3' 端下游 引物进 行逆转 录反应 ,然 后用其 上游的 一对引 物进行 PCR 扩增, 可以大 大提高 特异性 ,得 到足 够量的 PCR 产物 ,用于 克隆。 五 、共 享引物 PCR 共 享引物 PCR (shared-primer PCR) 是利用 3 条引 物来扩 增两种 不同的 DNA 序列。 3 条引 物构成 两对, 分别扩 增两个 不同的 靶序列 。其 中引物 1 与两种 DNA 序列都 互补, 引物 2 和引物 3 则分别 与这两 种靶序 列互补 。引物 1 和引物 2 组成一 对引物 ,引物 1 和 引物 3 组 成另一 对引物 。这种 PCR 常用 于细菌 学鉴定 ,确定 同一种 属细菌 的不同 种类。 在基因 诊断中 ,可 以用这 种方法 检测基 因重排 。引物 1 与基因 内的序 列互补 ,引物 2 和引物 3 可以 取自不 同重排 位点的 基因外 序列。 六、 不对称 PCR 典型的 PCR 反应 产生一 个特定 的双链 DNA 拷贝 ,但在 基因分 析中, 常常需 要知道 目 的基因 的序列 是什么 ,因而 需要获 得单链 DNA 进行序 列测定 。采 用其 他方法 制备单 链 DNA 往往费 时费力 ,而 采用 不对称 PCR (asymmetric PCR) 更 为方便 、快速 。不对 称 PCR 是 在扩增 循环中 ,两条 引物采 用不同 的浓度 ,获 得单链 DNA。 一 般是将 PCR 反应 的两条 引物按 (50 〜 100) :1 比例 加入反 应液中 ,在 最初的 10~15 个循环 中主要 产物还 是双链 DNA, 但当低 浓度引 物被消 耗尽后 ,高浓 度引物 介导的 PCR 反应 就会产 生大 量单链 DNA。 分离 此扩增 产物中 的单链 DNA, 可用原 引物或 用一条 内部引 物直接 测序。 七 、反向 PCR PCR 可以扩 增位于 两引物 之间的 DNA 片段 ,但 用反向 PCR (inverse PCR) 可以扩 增已知 序列区 间以外 的序列 ,方 法如图 5.3 所示 。用限 制酶将 基因组 DNA 完全 消化, • 376 • 图 5.3 反向 PCR 原理 但目的 序列上 不应当 有这个 酶的切 割位点 ,目 的序 列的片 段通常 <2~3kb。 然 后稀释 DNA, 使其在 适当的 条件下 连接成 单环状 。由于 Tag DNA 聚合酶 对线状 DNA 的扩增 效 果较好 ,多 数实验 者选用 仅在已 知序列 区内存 在的一 个切点 ,用 酶消化 ,使单 环重新 线性化 。无 论线 状或环 状模板 ,都可 用与已 知序列 5' 末端 互补的 引物, 扩增已 知序列 以外 的区域 。扩增 反应的 主要产 物是线 状双链 DNA, 原先 的已知 序列分 别为扩 增产物 的头部 和尾部 的序列 。其上 、下游 序列顶 端的连 接点是 原先用 于消化 基因组 DNA 的限 制 酶的酶 切位点 。反向 PCR 用于快 速扩增 已知序 列以外 的未知 DNA 片段 ,因此 ,可用 于探索 邻接已 知序列 的其他 基因组 序列。 八 、彩色 PCR PCR 技术 可以用 于检测 DNA 序 列缺失 、染色 体易位 以及各 种病毒 感染等 。有 时需 要在一 次实验 中分析 多种基 因成分 ,用 多重 PCR 可以 解决这 一问题 。另外 ,为 使结果 更为 直观, 可以采 用彩色 PCR (color complementation assay) 技术 。彩色 PCR 可 直译为 “着色 互补性 检测” ,该 技术 是用荧 光标记 PCR 引物 (寡核 苷酸) 的 5' 末端 。荧 光染料 JOE 和 FAM 呈绿色 荧光、 TAMRA 呈红色 荧光、 COUM 呈蓝 色荧光 。不 同荧光 标记的 多种 引物同 时参加 反应, PCR 扩增待 检测的 DNA 后, 合成的 产物会 分别带 有引物 5' 端 的染料 ,很容 易发现 目的基 因存在 与否。 通过电 泳或离 心沉淀 ,肉 眼就可 以通过 不同荧 • 377 • 光的色 泽判断 扩增了 的基因 的类型 。通 常仅需 要两种 不同荧 光颜色 的引物 ,一种 作为基 因检测 引物, 另一种 作为控 制试验 条件的 内对照 ,即 可以诊 断某种 基因是 否缺失 、染色 体是 否易位 ,或 者是否 感染某 种病毒 。检测 多种点 突变时 ,可以 用更多 的彩色 。例 如, 白血病 细胞中 癌基因 会有 12、 13、 61 位点 突变, 用不同 的突变 点序列 ,不 同荧光 颜色的 引物同 时进行 PCR, 通过 彩色变 化分析 点突变 的位置 。多突 变点的 遗传病 、几 种可疑 的病毒 感染、 HLA 位点 分析等 都可以 用彩色 PCR 同时检 测各个 位点。 第 四节用 PCR 扩增 DNA 的基 本方法 1. 材料 一 、以 DNA 为模 板扩增 DNA 无菌 h2o l〇x 扩增 缓冲液 (不含 MgCl2) T^^DNA聚合酶,5U//zL 4 种 dNTP 混合液 :每种 dNTP 的浓 度均为 2.5mmol/L 引物, 两种引 物均用 无菌水 配制成 lOpmol/pL, 贮存于 -20t: MgCl2, 25mmol/L DNA 模 板:哺 乳动物 基因组 DNA 为 0.1/ug/pL, 质粒 DNA 为 O.lng/VL 矿物油 自动化 热循环 反应仪 操作 步骤 (1) 按以 下次序 ,将各 成分在 0.5mL 无菌的 PCR 反应管 内混合 : 无菌 %〇 30fL 10 x 扩增 缓冲液 lOfxL 4 种 dNTP 混合物 ,每种 浓度为 2.5mmd/L 8/iL 引物 1 (10pmol/pL) lOpL 引物 2 (10pmol//iL) lO^zL MgCl2 (25mmol/L) 6/iL 模板 DNA 0 . 1 〜 1 . Opg 加水至 终体积 \0〇txL 此 反应中 MgCl2 的终 浓度为 1.5mmol/L (2) 将溶液 混匀, 12 000r/min 离心 10s。 (3) 于 95X: 加 热反应 混合液 7min, 使 DNA 完全 变性。 (4) 将 OjpL 了叫 DNA 聚合酶 加入反 应混合 液中。 (5) 用 HKVL 矿物油 覆盖于 反应混 合液上 ,这样 可以防 止样品 在反复 加热、 冷却过 程中 蒸发。 (6) 按以下 方法进 行扩增 。典型 的变性 、退 火和聚 合条件 如下: • 378 • 循环 变性 退火 來口 首 轮循环 94*C , 5min 50*C , lmin 72 tZ , lmin 后 续循环 94*C , lmin 50*C , lmin 72*C , lmin 末 轮循环 94t:, lmin 50 1 , lmin 72*C , 7min (7) 末 轮循环 后不再 变性, 12 000r/min 离心 2min, 将反 应物转 入另一 小管中 ,置 -20X: 保存。 (8) 从反应 混合液 中取出 DNA 扩增 产物进 行凝胶 电泳、 Southern 杂交或 DNA 序列 测定 分析。 二 、以 mRNA 为模 板扩增 DNA 1. 材料 无菌 h2o l〇x 扩增 缓冲液 (不含 MgCl2) 7\29DNA 聚 合酶, 5U//xl 4 种 dNTP 混合液 :每种 dNTP 的浓 度均为 2.5mmol/L 弓丨物 , 两种引 物均用 无菌水 配制成 lOpmol/pL, 贮存于 -201C MgCl225mmol/ L DNA 模 板:哺 乳动物 基因组 DNA 为 O.lpg/pL, 质粒 DNA 为 O.lng/pL RNA 酶 抑制剂 DTT, O.lmol/L Oligo (dT)12~i8, lfig/mL 矿物油 自动化 热循环 反应仪 2. 操 作步骤 [方案 1] (1) 首先通 过逆转 录反应 ,以 mRNA 为模 板合成 cDNA。 将一个 无菌的 0.5mLPCR 反 应管置 于冰上 ,并 在其中 混合: mRNA (1/^g/^L) IOjmL Oligo (dT)12~i8 (lf/g/mL) lOpiL lmol/L Tris-HCl (pH7.6) 2.5^L lmol/L KC1 3.5fiL 25mmol/L MgC【2 2/lzL 4 种 dNTP 混合液 ,每 种均为 5mmol/L l〇f^L O.lmol/L DTT 2/iL RNA 酶 抑制剂 25U 加 水至总 体积为 48/iL • 379 • 可用 10~50pm〇 丨用于 PCR 扩 增反应 的上游 寡核苷 酸引物 (亦称 3' 引物或 向前合 成引物 ) 代替 Oligo (dT) 作引物 。上 游引物 与初始 mRNA 互补。 (2) 加入 2pL Moloney 鼠白血 病病毒 (MMLV) 逆 转录酶 (pharmacia, 200 000 U/xnL; 对于 其他厂 商产品 ,使用 与此相 当的单 位数。 轻轻振 荡混匀 ,尽 量避免 产生泡 沫 。逆 转录酶 贮存液 中含有 Triton X-100, 有时 很难避 免产生 气泡。 必要时 ,可 用台式 高速离 心机离 心片刻 ,去除 泡沫。 (3) 将 所有反 应成分 混匀后 ,将混 合物置 37X: 温育 lh, 进行 逆转录 反应。 (4) 逆转录 反应结 束后, 将反应 混合物 加热至 95X: 5min, 以 灭活逆 转录酶 。此步 骤可提 高扩增 效率和 产物的 “洁净 度”。 (5) 在一个 无菌的 〇.5mLPCR 反 应管中 ,按下 列顺序 混合: 无菌水 30mL 10 X 扩增 缓冲液 lOpL 4 种 dNTP 混合液 ,每 种浓 度均为 2.5mmol/L 8/mL 上 游引物 (10pmol//jtL) 10/iL 下 游引物 (10pmol/pL) 10/iL 逆转 录反应 混合液 5^L 加水至 总体积 100/ixL (6) 按照以 DNA 为 模板的 PCR 扩 增反应 步骤进 行扩增 反应。 [方案 2] (1) 设 置合成 cDNA 第一链 的反应 : l〇x 扩增 缓冲液 (PH8.3, 室温) 2/iL 4 种 dNTP 混合液 ,每种 浓度为 10mm〇l/L 2ML Oligo (dT)12~i8 (100/ig/mL) 1/iL 胎盘 RNA 酶 抑制剂 20U mRNA 1 〜 2/ig 50mmol/L MgCl〗 l^L 加水至 终体积 20/LtL 可用 10~50pmol 上游引 物代替 Oligo (dT) 作为 引物。 (2) 将 100 〜 200UMMLV 逆 转录酶 加入混 合物中 ,混匀 ,将 反应混 合物置 37X: 温 育 30min。 (3) 将反应 混合物 加热至 95X:, 5min, 以使逆 转录酶 灭活。 ⑷加入 : 上 游引物 10~50pmol 下 游引物 10 〜 50pmol 1 X 扩 增缓冲 液至总 体积为 lOO^L 了 叫 DNA 聚合酶 2.5U 扩增 反应中 上游引 物的总 量应为 10~50pm〇l。 这 包括用 于替代 Oligo (dT) 引 导合成 cDNA 第一 链的 任何上 游引物 。参与 反应的 寡核苷 酸引物 过多通 常导致 意外的 非靶序 列扩增 。因此 最好进 行预实 验 ,以确 定要取 得令人 满意的 扩增效 果所需 两引物 的最低 浓度。 • 380 • (5) 加 lOO^L 矿 物油覆 盖于反 应混合 液上。 (6) 按照以 DNA 为 模板的 PCR 扩 增反应 步骤进 行预定 循环数 的扩增 反应。 三 、筛 选最适 Mg2 + 离 子浓度 的方案 Mg^ 浓度 是影响 PCR 扩增产 物的特 异性和 扩增片 段的产 率的重 要因素 ,而 反应体 系 中影响 Mg2+ 离子有 效浓度 的因素 也较多 。目 前常 用的扩 增缓冲 液一般 都不含 Mg2 + 离子。 每当首 次使用 一种靶 序列和 引物的 组合时 ,有必 要选择 Mg2+ 的最 佳浓度 。下面 是筛选 Mg2+ 离 子最适 浓度的 方案。 在筛 选其他 因素时 ( 如选择 适当的 添加剂 和确定 其最适 浓度等 ), 也 可以参 照此方 案 进行。 . 1. 材料 无菌水 MgCl2 , 2 5 mmol/ L l〇x 扩增 缓冲液 (不含 MgCl2) 4 种 dNTP 混合物 ,每种 dNTP 的浓 度均为 2.5mmol/L 引物 ,两种 引物均 溶于无 菌水中 ,浓 度为 50pm〇lAxL, 贮存于 -20X: 模板 DNA, 0. lpg/^L 哺 乳动物 DNA 了 叫 DNA 聚 合酶, 2 . 5U/pL 矿物油 自动化 热循环 反应仪 2. 操 作步骤 (1) 在 7 个 PCR 反 应管中 加入无 菌水和 MgCl2 溶液: 管号 H20/^tL 25mmol/L MgC^/ftL 1 20 0 2 18 2 3 16 4 4 14 6 5 12 8 6 10 10 7 8 12 在 1~7 号管中 ,溶 液体 积均为 2(^L, 而 最后的 反应体 积将是 l〇〇pU 各 管中的 MgCl2 在 100PL 反应体 积中的 终浓度 依次为 〇~3mmol/L (以 0.5mmol/L 递增 )。 如 果各反 应管的 扩增效 果差别 不明显 ,而 且产物 的量都 非常少 ,可 以采用 lmmol/L 或 1.5 mmol/L 递 增浓度 ,将筛 选范围 扩大到 〇~6mmol/L 或 0~9mmol/L〇 (2) 准 备反应 混合液 ,按照 8 个反应 的体积 来准备 : • 381 . l〇x 扩增 缓冲液 (不含 MgCl2) 80/^L 4 种 dNTP 混合物 (每 种均为 2.5mmol/L) 80/iL 引物 1 (50pmol/fiL) 8^L 引物 2 (50pmol//iL) 8^L 模板 DNA, O.WpL 8(VL T 叫 DNA 聚合酶 , 2.5U/pL 8 卩 L 无菌 H20 376pL 上述 试剂混 合后的 体积为 8 个反应 总体积 (800FL) 的 80%。 模板 DNA 在每 个反应 中均为 l^g。 (3) 将上 述混合 液加入 到步骤 (1) 准备的 7 个反应 管中, 每管加 80pL。 此时 ,在 7 个反 应管中 ,除了 MgCl2 的浓 度不一 样以外 ,其他 条件均 相同。 (4) 将 100/iL 矿物油 覆盖在 反应混 合液上 。矿物 油应完 全盖住 反应混 合液的 表面以 防止 蒸发。 (5) 按以下 方法进 行扩增 。典型 的变性 、退 火和聚 合条件 如下: 循环 变性 退火 聚合 首 轮循环 94*C , 2min 50 "C , lmin 12X1 , lmin 后 续循环 94*C , lmin 50 1 , lmin 12X1 , lmin 末 轮循环 94*C , lmin 50t , lmin 72t 7min 第一步 必须变 性完全 。为 了确 定管内 液体是 否达到 92t 以上 ,可 以另设 一个管 ,内装 100pL 水, 用温 度计测 定管内 液体的 温度。 (6) 末 轮循环 后不再 变性, 12 000r/min 离心 2min, 将反 应物转 入另一 小管中 ,置 -20TC 保存。 (7) 从 各反应 混合液 中取出 10pL 扩 增产物 进行琼 脂糖凝 胶电泳 。比较 PCR 产物的 电 泳条带 ,确 定最佳 MgCl2 浓度。 (8) 根据 上面实 验确定 的最佳 MgCl2 浓度, 按照前 面“以 DNA 为模 板扩增 DNA” 的方 案进行 PCR 反应 ,以 确定选 择结果 的可靠 性和重 复性。 四 、方 法评注 在第三 节中, 我们已 经介绍 了影响 PCR 反应的 因素及 反应条 件优化 。许多 影响因 素 不能像 MgCl2 浓 度那样 可以很 方便地 选定最 佳条件 ,但 在进行 PCR 反 应时也 必须予 以考虑 ,尽 可能采 用最优 条件。 在进行 PCR 反应时 ,尤其 是在扩 增稀有 序列时 ,确保 试剂的 纯度、 防止污 染是极 为 重要的 。试剂 不能用 DEPC 处理 。极 微量的 DEPC 也 能影响 PCR 扩增 效果。 当 扩增的 DNA 产 物不止 一种时 ,通常 与以下 几种情 况有关 。① 背景 DNA 有与引 物同 源性高 的其他 位点。 可通过 在两个 引物的 内侧序 列上再 使用另 外一对 或一条 引物对 扩增 的产物 DNA 再做 PCR 扩增 。② 退火温 度太低 。引物 与模板 的配对 是一个 动态过 程 ,分 子的热 运动使 引物与 模板结 合与解 离而达 到最佳 配对位 点上。 退火温 度太低 ,造 • 382 • 成引 物与模 板的非 特异性 位点部 分配对 而不解 离下来 ,这种 不正确 的配对 ,进入 PCR 反应过 程就可 扩增出 非特异 的产物 DNA, 提高反 应的退 火温度 ( 有时比 7„值 高出几 度) 将可改 善结果 。③过 量的酶 、引 物和 dNTP 可使 PCR 反应造 成混乱 ,强行 扩增出 非特 异产物 DNA。 适 当降低 这些试 剂的量 有助于 问题的 解决。 在实验 中偶尔 会出现 PCR 反应扩 增不出 DNA 条带 的情况 ,一 般有以 下几种 原因。 ①引物 3' 端与 5' 端书 写错误 ,造 成引物 合成的 错误, 此时应 重新合 成引物 。② 引物溶 液反复 冻融或 污染了 DNA 酶类, 造成引 物降解 ,应 换一份 引物解 决该类 问题。 ③模板 DNA 制备 时模板 已降解 。这时 应尽量 找一些 指标来 检测模 板质量 。④ Tag 酶有 失活或 有杂 酶污染 ,重新 换一份 酶即可 。⑤ 缓冲 液条件 不当。 第 五节用 PCR 定量分 析微量 DNA PCR 是检测 DNA 存在的 一项十 分灵敏 的技术 ,从理 论上讲 ,在 反应 体系中 有一个 模板 分子时 ,也 可以检 测到。 在设置 合适对 照的情 况下, PCR 可在 1~20 000 个 分子的 范围内 ,从 样品中 测定某 一特定 DNA 序列 的分子 数量。 进 行这种 定量分 析的基 础除了 PCR 反应 的灵敏 性以外 ,还需 要有含 有目的 序列的 DNA 样品 ,该 样品已 经准确 地定量 。此外 ,在 PCR 反 应中将 使用两 对引物 。一 对是目 的序列 特异性 的引物 ,在 反应中 扩增目 的序列 。另一 对引物 是针对 细胞中 某一单 拷贝基 因序列 的引物 。在 反应中 扩增该 单拷贝 基因的 序列, 作为内 对照。 在 PCR 反应中 ,对目 的序列 的扩增 是十分 有限的 ,其 扩增产 物在琼 脂糖凝 胶中不 一定能 形成可 见条带 。将 扩增产 物进行 电泳后 ,将 DNA 转 印到尼 龙膜上 ,以针 对目的 序列的 特异性 探针进 行杂交 ,通 过密度 扫描记 录信号 强度, 与标准 对照进 行比较 ,即可 以确 定待测 样品中 含目的 序列的 DNA 分子 数目。 在扩增 目的序 列的同 时扩增 内对照 序列主 要起两 个作用 :一是 分析各 扩增管 内扩增 反应的 效率; 二是作 为对照 校正目 的序列 杂交后 的密度 扫描信 号强度 。在 目的序 列杂交 并 扫描后 ,除 去探针 ,再 用对照 序列的 探针进 行杂交 ,同样 进行密 度扫描 记录。 如果各 管的扩 增效率 不同, 则杂交 信号强 度也会 有变化 ,以 各管的 对照序 列杂交 信号强 度校正 目的 序列的 杂交信 号强度 ,可 以获得 较准确 的数据 ,在 计算样 品管中 含目的 序列的 DNA 分 子数时 ,数据 也将* 更 准确。 为简 便起见 ,本节 介绍针 对宿主 细胞内 的病毒 DNA 的定 量分析 。在 平均每 100~ 1000 个细胞 含有一 个病毒 DNA 拷 贝的情 况下也 可以检 测到。 本方法 可方便 地改用 于其他 途径。 一 、基 本方法 1. 材料 细 胞或组 织样品 两对 PCR 引物 ,一 对是目 的序列 的引物 ,另一 对是针 对细胞 内某个 单拷贝 基因的 引物 (用无 菌蒸馏 水配成 50pm〇l/;iL, 贮存于 -20X:) • 383 . 蛋白 酶消化 缓冲液 (20mmol/LTris-HClpH7.4, 20mmol/LEDTA, 0.5% SDS, 贮存于 室温) 20mg/mL 蛋白酶 K ( 贮存于 -20X:) 用 50mmd/L Tris-HCl、 10mm〇l/L EDTA pH7.4 缓 冲的酚 (贮存 于室温 ) 24:1, 氯仿 / 异戊醇 10mol/L 乙酸铵 用冰 预冷的 100% 乙醇 70% 乙醇 TE 缓 冲液, pH7.5 矿物油 0.8U/VL 了叫 DNA 聚合酶 用于 杂交的 寡核苷 酸引物 (用无 菌蒸馏 水配成 50pm〇l//xL, 贮存于 -20C) 螺 口微量 离心管 (高压 灭菌) 毛 细吸管 94t:、 72X: 和 55X: 水浴 或者自 动化热 循环仪 【注】 所有 试剂用 无菌的 蒸馏水 配制, 不要用 DEPC 处理 试剂。 为了避 免污染 其他无 关核酸 ,单 独配 制用于 本实验 的所有 试剂。 操作时 戴一次 性手套 ,并 且频繁 更换。 2. 操 作步骤 制备 DNA 样品: (1) 将细 胞或组 织样品 放入带 螺口的 微量离 心管中 ,每 2X106 细 胞加入 l〇〇pL 蛋 白酶 消化缓 冲液, 并加入 20mg/mL 蛋白酶 K 至终 浓度为 100/ag/mL, 将样品 放置于 50X: 过夜。 通常需 要设置 几个不 含病毒 序列的 样品作 为阴性 对照。 先处理 阴性对 照样品 ,再处 理含目 的序列 可能 性最小 的样品 ,然 后按照 含目的 序列的 可能性 递增的 次序处 理样品 。抽提 应在远 离处理 PCR 产 物和其 他大量 DNA 质粒 的地方 进行。 戴上一 次性处 理手套 ,勤换 手套。 (2) 用微量 加样器 ,轻 轻抽吸 ,混 匀样品 。将 100pL 缓冲液 平衡酚 加入到 消化混 合物中 ,轻轻 混匀, 再加入 lOOyL 24:1 氯仿 / 异戊醇 ,轻轻 混匀。 (3) 在 室温高 速离心 5min, 将水相 (含有 DNA) 转移 入另外 一个新 的离心 管中。 螺口微 量离心 管和毛 细吸管 头可以 减少来 自离心 管和自 动移液 器造成 的气溶 胶污染 ,吸取 每种试 剂均 需换新 的吸头 。尽管 带一次 性可弃 吸头和 塞子的 正压移 液器较 昂贵, 但比毛 细吸管 更容易 使用。 应避 免使用 已装过 PCR 产 物或大 量质粒 DNA 的离 心管。 (4) 再用蛋 白酶消 化缓冲 液抽提 有机相 ( 约为原 体积的 1/2)。 (5) 在 室温高 速离心 5min, 水相转 移合并 到步骤 (3) 所得 到的水 相中。 (6) 用等 体积的 24:1 氯仿 / 异 戊醇抽 提水相 2 次, 每次在 室温高 速离心 5min。 (7) 水 相加入 10md/L 乙酸 铵至终 浓度为 2.5mol/L, 再加入 2.5 倍 体积预 冷的无 水乙醇 ,混匀 ,干冰 上放置 30min, 4X: 高 速离心 15min, 弃 上清。 (8) 沉淀用 70% 乙醇洗 1 次 ,离心 ,在真 空干燥 器内或 旋转蒸 发器内 干燥。 乙 醉沉淀 时加入 乙酸铵 对以后 有效的 扩增十 分重要 ,应避 免使用 曾用于 PCR 产物 或其他 大童质 粒制备 的干燥 器或蒸 发器。 . 384 . (9) 沉淀用 pH7.5 的 TE 溶解, 贮存于 4t:。 对于从 2X106 细胞 提取的 DNA, 溶于 lOOfxLTE 中 ,使终 浓度约 5~100叫/;^, 此 DNA 需要数 小 时甚至 过夜才 能完全 溶解。 (10) 取小 份溶液 和标准 DNA 同 时在琼 脂糖凝 胶电泳 ,估计 DNA 的 含量。 这一步 很重要 。在 随后 的定量 过程中 ,使用 >lMg 或者 0.1pmol/pL (1000~2000bp 的片段 ,约为 50 〜 100ng/fiL)。 (6) 吸取 0. lpmol 纯化的 PCR 产物 于一个 微量离 心管中 ,用 pH8.0 的 0.1 XTE 缓 冲 液调整 体积至 9fzL。 (7) 95t: 加热 2min, 变 性模板 ,然后 迅速置 于干冰 / 乙醇 溶液中 lmin。 迅 速加入 1/iL 测序 引物和 2ML 5X 变性 缓冲液 于冰冻 DNA 样 品中。 (8) 稍 加离心 ,使管 中的反 应混合 物融化 并混合 。模板 和引物 在室温 下温育 30min〇 最 好使用 摩尔数 5 倍 过量于 模板的 引物。 (9) 进 行双脱 氧测序 反应。 • 394 • 五 、标记 PCR 产物 进行化 学测序 1. 材料 5 〜 lOpmol 引物 1 ( 用于末 端标记 ) 6000Ci/mmoi [y-32P] ATP T4 多核苷 酸激酶 20~40pmol 寡核苷 酸引物 2 10 X 扩增 缓冲液 4dNTP 混合液 ,每种 dNTP 浓 度均为 2.5mmol/L DNA 模板 (真 核细胞 DNA 为 20 〜 lOOOng、 细菌 DNA 为 10~ 1000ng、 克隆化 DNA 片段为 1 〜 20ng) 了叫 DNA 聚合酶 矿物油 用于 DNA 纯化 的一次 性层析 柱或者 透析袋 2. 操 作步骤 (1) 在 10pL 反应 体积中 ,用 T4 多核 苷酸 激酶和 [y-32P] ATP 对 5~10pmol 寡核 苷 酸引物 1 进行末 端标记 ,反应 30min 后 ,在 65X: 温育 lOmin 灭活 T4 多核 苷酸 激酶。 [7-32P] ATP 的 比放射 性最好 >6000Ci/mmol, 如 果在放 射自显 影时可 以采用 48h 以上的 曝光时 间, 使用较 低比放 射性的 [7-32P] ATP 也是可 以的。 (2) 按 以下成 分在一 个微量 离心管 中准备 PCR 反应 体系: 1〇 X 扩增 缓冲液 l〇pL 2 . 5mmol/L 4dNTP 混合液 8/zL 寡核苷 酸引物 2 ( 未标记 ) 20 〜 40pmol (3) 在反应 混合物 表面覆 盖一层 lOOpL 矿物油 ,在最 适条件 下进行 5~10 个 循环的 护增, 最后一 个循环 的延伸 时间为 5~7min。 (4) 吸弃矿 物油。 (5) 以琼脂 糖凝胶 电泳或 者非变 性聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳分离 PCR 产物 ,使 未参加 反 应的引 物和核 苷酸跑 出凝胶 ,进入 电泳槽 的下槽 , PCR 产 物放射 自显影 1〇 〜 60min, 以 便确定 PCR 产物 条带的 位置。 (6) 从 凝晈上 切下含 有所需 的标记 PCR 产物 的胶块 ,回收 其中的 DNA 片段 (详细 方法 见有关 DNA 片 段回收 的章节 ), 重悬于 30~5(^1^ 水中。 扩增的 DNA 可用一 次性层 析柱进 行纯化 。不 经凝胶 或者柱 层析纯 化也可 进行化 学测序 ,这时 PCR 产物应 进行酚 抽提, 然后乙 醇沉淀 。只有 在已知 PCR 扩增得 到单一 产物的 前提下 ,才可 用层析 DNA 模板 7^ DNA 聚合酶 激酶反 应溶液 (步骤 1 产物, 即引物 1) 加水至 1.5~2.5U 10/^tL lOO^tL • 395 • 柱 或抽提 的方法 代替制 备性凝 胶电泳 分离。 (7) 用 8%~10% 的 产物进 行化学 测序的 每种测 序反应 。电泳 完毕, 用保鲜 膜包好 测序胶 ,在 -20X: 放射 自显影 2 〜 48h。 六、 PCR 产物的 基因组 测序法 这是 PCR 和基因 组测序 法的一 个组合 。在 进行 PCR 反 应之后 ,将 扩增的 DNA 进 行化 学测序 ,进行 测序胶 电泳, 然后通 过电泳 转印的 方法将 凝胶中 的电泳 条带转 印到一 张尼 龙膜上 ,采用 紫外线 照射将 DNA 交 联到尼 龙膜上 ,此 转印膜 即可用 于分子 杂交。 采用 引物后 的一小 段序列 制备寡 核苷酸 探针。 将此探 针标记 后与上 述尼龙 膜上的 DNA 进行 杂交, 放射自 显影后 ,所有 与此标 记探针 杂交的 条带都 被显现 出来, 形成测 序“ 阶梯” 。用一 个探针 杂交, 显现出 来的就 是一段 DNA 的序列 阶梯。 当 PCR 反应扩 增的不 是单一 产物时 ,或者 有意识 地利用 PCR 依次 扩增多 个产物 时 ,可 以不必 分离扩 增产物 ,直接 进行化 学测序 ,将 测序 反应产 物在一 组泳道 进行电 泳 。电 泳条带 转印到 尼龙膜 上后, 可以先 与一个 探针进 行杂交 ,进行 放射自 显影后 ,洗 脱探针 ,将尼 龙膜再 用于同 下一个 探针进 行杂交 。如 此进行 ,与不 同的探 针依次 进行杂 交 。即可 将不同 扩增产 物的序 列依次 读出。 在这种 方法中 ,混合 DNA 片 段同时 进行测 序反应 ,探 针的作 用是通 过杂交 显现出 一个 DNA 片段 的序列 。一个 探针显 现一个 DNA 片段 的序列 ,不 同探针 就可以 将不同 DNA 片段 的序列 逐个显 现出来 。尼 龙膜可 反复进 行杂交 、显迹 、洗脱 、再 杂交 ,最好 的情 况下, 可以重 复杂交 40 次 以上。 1. 材料 准备 PCR、 化学 测序和 Southern 杂 交所需 的试剂 2. 操 作步骤 (1) 用 20 〜 lOOOng 真核 基因组 DNA、 10~100ng 细菌 DNA 或 1 〜 2ng 克隆化 DNA 插入 片段, 在最适 的条件 下进行 PCR 反应 ,最 后结束 于一个 长的延 伸步骤 。反 应完毕 后, 吸弃矿 物油。 (2) 产物经酚抽提后,加入0.1倍体积3〇1〇1/1^乙酸钠({)1^5.2)和2.5倍体积 100% 乙醇 沉淀, 在干冰 / 乙 醇溶液 中放置 20min, 离心 5min, 用 70% 乙醇洗 2 次 ,然 后真空 干燥。 (3) 沉淀 重悬于 30~50ML 水 ,取 10% 样 品在琼 脂糖凝 胶或者 聚丙烯 酰胺凝 胶上进 行电泳 以确定 产物的 产量及 纯度。 (4) 取 8% 〜 10% 的扩增 产物进 行化学 测序的 每种测 序反应 ,在 变性 聚丙烯 酰胺测 序胶 上进行 电泳。 (5) 电 泳完毕 ,小心 地移去 一块玻 璃平板 ,将滤 纸放于 胶上, 注意凝 胶和滤 纸间不 要引 入气泡 ,将凝 胶同滤 纸一道 放置于 一 合适的 转移装 置中。 (6) 用 TBE 电 泳液湿 润凝胶 ,然 后在胶 上放置 一同样 大小的 尼龙膜 ,注意 尼龙膜 • 396 • 和 凝胶间 不要引 入气泡 。将 DNA 电转 印到滤 膜上, 并通过 紫外线 照射将 DNA 固定在 膜上。 (7) 用 合适的 探针进 行杂交 ,尼 龙膜可 反复进 行杂交 、显迹 、洗脱 、再 杂交 40 次 以上。 使用 PCR 寡核苷 酸引物 作为探 针可得 到最佳 的结果 ,并保 证只有 完整的 PCR 产物 才能被 显迹。 但是在 有多种 扩增产 物的情 况下, 则需要 使用扩 增片段 内部序 列探针 。可 以通过 利用脱 氧核苷 酸末端 转 移酶对 3~6pmol 探针 进行加 尾而得 到的高 比活度 探针。 第 八节连 接介导 PCR 与基 因组足 迹分析 和测序 一 、连 接介导 PCR 的基 本原理 PCR 是扩增 位于两 个特定 引物结 合位点 之间的 DNA 片段。 而在连 接介导 PCR (LMPCR) 中, 只有一 个特异 性引物 ,模板 DNA 是经过 预处理 断裂的 DNA 片段 。在 LMPCR 反应中 ,只 有一 个引物 与模板 DNA 的结合 具有基 因序列 特异性 ,第二 个引物 是 通过连 接反应 在模板 DNA 链的另 一端加 上的单 一接头 。这 个接 头和基 因序列 特异性 引物构 成一对 PCR 引物 ,一起 对任何 DNA 片段 进行指 数级的 扩增。 在连 接介导 PCR 中 ,扩增 出来的 产物实 际上不 是一个 片段, 而是一 套长短 不同的 片段 。片段 的一端 是一个 固定的 起点, 是由基 因序列 特异性 引物与 基因组 DNA 的特异 性序列 结合所 决定的 。而 另一端 的引物 则是一 个通用 序列, 是通过 连接反 应而连 接到模 板 DNA 上的 ,扩 增序列 的终止 位点是 由模板 DNA 的断裂 位点决 定的。 连 接介导 PCR 主要包 括模板 DNA ( 基因组 DNA) 制备 、第一 链合成 、连接 反应、 PCR 扩增 、末端 标记等 几个大 步骤。 1. 模板 DNA 制备 连 接介导 PCR 主 要是从 基因组 DNA 中扩 增特定 的片段 。而 基因组 DNA 用 做连接 介导 PCR 的模 板时, 必须预 先处理 ,使 DNA 链断裂 。可 以采用 DNA 酶 I、 位 点特异 性 的限制 酶切割 DNA。 在进行 基因组 DNA 足迹分 析时, 是采用 DMS 修 饰和哌 啶处理 的 方法随 机断裂 DNA。 在进行 基因组 DNA 直接 测序时 ,则 是采用 化学测 序反应 处理基 因组 DNA 后 进行连 接介导 PCR。 不 论采用 哪种方 法断裂 DNA, DNA 链必 须带有 5' 端 磷酸基 团以进 行连接 反应。 在 足迹分 析和序 列测定 反应中 ,模板 DNA 是一 组随机 断裂的 DNA 链 。而且 DNA 均经 过哌啶 处理, 因此都 是单链 DNA 片段 。对于 一个特 定的基 因序列 ( 可被特 异性引 物识别 的序列 ) 来埦 ,其上 游片段 (DNA 链 5' 末端到 该序列 的距离 ) 的 长度在 不同的 DNA 模板链 中是不 同的, 因此扩 增出来 的产物 将是一 组长短 不同的 片段。 在解 释下面 各步骤 原理时 ,只 以一条 模板链 为例介 绍反应 过程。 2. 第一 链合成 模板 DNA 是随机 断裂的 ,在 反应中 ,使 用一个 对目的 基因序 列特异 的引物 (引物 • 397 • 1) 首先与 目的基 因的片 段退火 。随 后在 DNA 聚合酶 的作用 下延伸 ,进行 第一链 合成, 第一链 一直延 伸到模 板链的 断裂点 ,形成 双链平 末端。 5, ; 3’ (模 板链) 3, (合成 第一链 ) 引物 1 3. 连 接反应 5* GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC 3* (LMPCR-1) , 3, CTAGACTTAAG 5' (LMPCR-2) — 连接 反应中 所用的 连接头 是一小 段双链 DNA。 两条互 补链一 长一短 ,末端 对齐, 形成 平端。 连 接头的 平末端 可在连 接酶的 作用下 与双链 DNA 的平末 端连接 。由 于连 接头的 DNA 链的 5' 端 没有磷 酸基团 ,只能 通过其 3' 端 与带有 5' 末 端磷酸 基团的 基因组 DNA 链 相连接 。在 连接反 应中, 连接头 中长链 (LMPCR-1) 与 基因组 DNA 连接 ,短 链由于 其 5' 端 没有磷 酸基团 而不能 与引物 1 引导 合成的 DNA 链的末 端连接 。连 接头的 另一端 是错 开的, 突出的 5' 末端亦 没有磷 酸基团 ,不能 进行连 接反应 。所以 ,连 接头 是单向 连 接的。 连接反 应的结 果是, 基因组 DNA 模板 (单链 ) 链的 5' 末端连 接了一 段通用 的寡核 苷 酸片段 。这就 是下一 步进行 PCR 反应的 模板。 4.PCR 反应 PCR 反 应是以 LMPCR-1 和引物 2 作为 一对引 物进行 扩增的 。引物 2 首 先引导 DNA 链合成 ,延 伸到 模板的 末端时 ,即 完成了 LMPCR-1 的互补 序列的 合成。 因此, LMPCR-1 即可 与引物 2 配 对进行 PCR 扩增 。扩 增的片 段就是 从引物 2 到 基因组 DNA 断裂点 之间的 DNA 序列。 引物 1 识 别序列 引物 2 引物 2 的序 列可以 与引物 1 部 分重叠 ,也可 以完全 在引物 1 的 3' 下游 。理论 上讲, 此反 应中也 可以使 用引物 1, 但 此时采 用引物 2 将可 以大大 提高特 异性。 5. 末 端标记 在最 后两轮 延伸反 应中, 加入第 三个基 因序列 特异性 的引物 (引物 3)。 引物 3 与 引物 2 的序 列有部 分重叠 ,并且 已经用 同位素 进行末 端标记 。这种 末端标 记引物 延伸的 产物可 在测序 胶中进 行电泳 ,曝 光后形 成可见 的序列 阶梯。 不管 是用于 序列测 定也好 ,用于 足迹分 析也好 ,连 接介导 PCR 的原 始模板 中已经 含有序 列或足 迹信息 ,已经 形成了 一套长 短不同 的片段 ,只 是其数 量微乎 其微。 连接介 导 PCR 反应则 将这一 套片段 合成出 1〇4 〜 1〇5 拷贝 。在测 序胶中 电泳后 进行适 当的曝 光 ,即 可以形 成可见 的序列 阶梯。 • 398 • 在进行 DMS 足迹 分析时 ,可以 通过控 制温度 和反应 时间, 控制在 大约每 150 个鸟 嘌 呤中有 1 个 被修饰 。这样 ,哌 啶断 裂形成 的片段 大约为 600 碱 基的单 链片段 ( 哌啶同 时使 DNA 变性 )。 这是 对一个 DNA 分子 的反应 。实际 反应中 ,有 许多 UNA 分子 (许 多 基因组 DNA), 对于 一个基 因来说 ,在 不同的 DNA 分子上 ,被 修饰的 鸟嘌呤 可以是 任何 一个, DNA 可以 在任何 一个鸟 嘌呤位 点断裂 。对 于一个 选定的 引物识 别位点 来说, 从 DNA 链的 5' 末端 到该序 列之间 就会有 一套长 短不一 的片段 (图 5.4)。 5' — □ 3 5. □ 3 5, □ 3 5' □ 3 5_ □ 3 5' □- 3 5, □ 3 5, □ —— 3 图 5.4 连 接介导 PCR 扩增 出来的 片段是 一套长 短不一 的片段 。在测 序胶中 电泳后 就形成 “阶 梯”, 亦即形 成了“ 足迹” ,对 于不同 的个体 来说, 在一段 DNA 片段中 ,只要 1 个 鸟嘌呤 的位置 有差异 ,在 序列 阶梯中 就会有 1 个条带 的位置 移动, 因此就 可以鉴 定两个 样品是 否来自 同一个 个体, 或分析 两个物 种的亲 缘关系 远近。 如果 上述长 短不一 的片段 是采用 化学测 序反应 制备的 4 个反 应产物 ,经连 接介导 PCR 扩增后 直接进 行测序 胶电泳 、曝光 ,就 可以直 接读出 序列。 序列阶 梯中的 每一个 条带都 会增大 ,这 是因 为加入 了连接 头序列 。因此 ,考 虑扩增 产物的 大小时 ,除 了考 虑标记 引物的 长度外 ,还 应考虑 连接头 序列。 连 接介导 PCR 的特 异性是 很高的 。引物 1 进 行了第 1 轮选择 ,从 DNA 混合 物中选 择 出特定 的基因 ,引 导合成 一套第 1 链 。但 仍然难 免会有 一些非 特异性 扩增。 在进行 PCR 时使 用引物 2, 则进 一步提 高了特 异性, 消除了 由引物 1 非 特异性 引导的 合成。 使 用引物 1 和引物 2 进行两 次选择 ,可以 获得很 高的特 异性。 在进行 基因组 足迹分 析、 基因组 DNA 测序 、体 内分析 胞嘧啶 甲基化 、克隆 启动子 元件等 实验中 ,都 可以获 得区 分单个 碱基的 效果。 在 仅知道 mRNA 5' 端序 列的情 况下, 利用连 接介导 PCR 可以 将上游 的启动 子未知 区 域扩增 出来。 比较 DMS 对 细胞内 DNA (结 合了蛋 白质) 和 细胞外 DNA (除去 了结合 DNA 的蛋 白质) 修 饰位点 ,可 以分析 DNA 的蛋白 质结合 位点。 二 、连 接介导 PCR 从 6xi〇5 个 基因组 (3xl05 个双倍 体细胞 ) 出发 可得到 高质量 、重 复性好 的足迹 . 399 . 分 析及测 序反应 。这 相当于 2/ig 小鼠 (哺乳 动物) 基因组 DNA。 对 于其他 的物种 ,一 般单 倍体基 因组数 至少为 6 x 1〇5, 但是 不同的 基因组 大小会 导致相 对应的 DNA 绝对量 不同。 1. 材料 经 打断的 基因组 DNA, 0.4/ig//iL, 溶于 pH7.5 的 TE 缓冲液 (可通 过后面 3 个方 案之 一进行 制备) 第一 链合成 混合物 (含有 寡核苷 酸引物 1 和 Vent DNA 聚合酶 ) 20/xmol/L 单向 接头 混合物 连接酶 稀释液 连接 酶反应 混合物 T4 DNA 连接酶 , 2000 〜 3000 Weiss U/mL 盐 混合物 (沉 淀用) 75% 和 100% 乙醇 扩增 反应混 合物, 含有接 头引物 和引物 2 Vent DNA 聚合酶 混合物 矿物油 末端 标记混 合物, 含有末 端标记 的引物 3 Vent DNA 聚合酶 终止液 酚 / 氯仿 / 异戊醇 25:24:1 加样 缓冲液 [80% (V/V) 去 离子甲 酰胺, 45mmol/L Tris, 45mmol/L 硼酸, lmmol/LEDTA, 0.05% 溴 酚蓝, 0.05% 二 甲苯青 ,分 装后置 -20t: 保存 ,最 多保存 3 个月] 1.5mL 硅化 微量离 心管, 带管扣 4X: 和 17X: 水浴 自动热 循环仪 本节中 所有使 用的试 剂都应 该是新 鲜配制 的高纯 度试剂 ,而且 所有的 溶液均 需用在 玻璃蒸 发器中 获得的 蒸馏水 配制。 2. 试 剂配制 (1) 5X 第一 链合成 缓冲液 (200mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-HCl 室温 pH8.9, 25mmol/LMgS04, 0.05% 明胶, 贮存于 -20X:) (2) 第一 链合成 混合物 (每 个反应 25^L) 5 x 第一 链合成 缓冲液 6pL lpmol/^L 寡核昔 酸引物 1 0.3/iL 4 种 dNTP 混合物 ,每 种浓 度均为 25mmol/L 0.24^L H20 18.21/iL Thermocuccus Litoralis DNA 聚合酶 (Vent, 2U/yL) 0.25/^L 临用 时配制 ,先将 Vem DNA 聚合酶 以外的 所有成 分混合 并置冰 上冷却 ,然后 再加入 Vent DNA • 400 • 聚合酶 ,放置 于冰上 。引物 1 应以 >10pm〇l/^L 浓度 保存在 硅化的 试管中 ,临 用时用 TE 缓冲液 (PH7. 5) 稀释 ,这 样可以 减少因 引物粘 在试管 壁上而 造成的 损失。 (3) 单向 连接头 混合物 (20/imol/L 寡 核苷酸 LMPCR-1, 20/umol/L 寡 核苷酸乙]^- PCR-2, 250mmol/L Tris-HCl pH7.7) 按下面 步骤预 先将此 混合物 配制好 :①用 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 纯化寡 核苷酸 片段; ②将 两种寡 核苷酸 片段与 Tris-HCl 混合 ,在 95X: 加热 5min; ③ 转移到 70X: 并逐 渐冷却 约 lh 至 室温; ④置 室温约 lh, 然 后逐渐 冷却至 41C; ⑤置 4X: 约 12h, 然 后分装 ,置 -20X: 保存。 临用时 ,置冰 上解冻 融化。 上述过 程是使 两个互 补的寡 核苷酸 片段退 火形成 连接头 ,两个 片段间 的退火 比上述 过程要 快得多 ,但按 上述过 程操作 ,结果 的重复 性最好 。因 为在 退火时 用的缓 冲液是 Tris-HCl, 很难计 算寡核 苷酸退 火的动 力学, 而且也 未对这 种情况 进行过 详细的 研究。 用 Tris-HCl 代替 常用的 单价盐 (如 NaCl) 是因为 单价盐 会抑制 T4 连接酶 的活性 。此 外, T4 连接 酶需要 Tris-HCl。 (4) 连接酶 稀释液 (每 个反应 20pL) lmol/LTris-HCl, 室温 pH7.5 2 . 2/jlL ( 终浓度 llOmmol/L) lmol/L Mg〇2 0 . 35fiL ( 终浓度 17.5mmol/L ) lmol/L DTT lfiL ( 终浓度 50mmol/L ) lOmg/mL BSA (无 DNA 酶) 0.25/iL ( 终浓度 125Mg/mL) h2o 16.2/xL 临用 时配制 ,并 置冰上 冷却。 (5) 连接酶 混合物 (每 个反应 25^L) lmol/L MgCl2 0.25/^L ( 终浓度 lOmmol/L) lmol/L DTT 0 . 5^tL ( 终浓度 20mmol/L) lOOmmol/L ATP, pH7.0 0.75/iL ( 终浓度 3mmol/L) lOmg/mL BSA (无 DNA 酶) 0.125^xL ( 终浓度 50/xg/mL) h2o 17.375^L 20 pmol/L 单向 连接头 混合物 5/iL (终 浓度为 连接头 4/umol/L, T4 连接酶 (3 “Weiss” U/yL) l^L Tris-HCl pH7.7, 50mmol/L) 临用 时配制 。首先 ,混合 MgCl2、 DTT 、 ATP、 BSA 和 H20, 并 置冰上 冷却; 然后 再 加冰上 预冷的 单向连 接头混 合物和 T4 DNA 连 接酶。 (6) 盐 混合物 ( 沉淀用 ,每 个连接 反应加 9. 4pL) 3mol/L 乙 酸钠, pH7.0 8 . 3fxL ( 终浓度 2.7mol/L) 10mg/mL 酵母 tRNA 1/iL (终浓 度约为 lmg/mL ) 配制 后立即 使用。 (7) 5X 扩增 缓冲液 [2〇〇mmol/LNaCl, 100mmol/LTris-HClpH8.9, 25mmol/L MgS04, 0.05% 明胶, 0.5% (V/V) Triton X-100, 贮存于 -20t:] (8) 扩 增反应 混合物 (每 个反应 30juL) 5 x 扩增 缓冲液 20mL • 401 . lOpmol/pL 寡 核苷酸 LMPCR-1 (接头 引物) lOpmol/pL 寡核苷 酸引物 2 4 种 dNTP 混合物 ,每 种均为 25mmol/L h2o 临用 前配制 ,冰浴 冷却。 (9) VentDNA 聚合酶 混合物 (每 个反应 3/iL) 将 0.6^L5x 扩增缓 冲液与 1.9MLH20 混合 ,冰 浴冷却 几分种 ,加入 0.5/iL (10U) Thermococcus litoralisDNA 聚合酶 (Vent), 轻轻混 匀后置 冰浴。 临用时 配制。 (10) 末 端标记 混合物 (每 个反应 5^L) 5 x 扩增 缓冲液 l^L lpmol/pL 末端标 记引物 3 2 . 3}ih 4 种 dNTP 混合物 ,每 种均为 25mmol/L 0A{xL H20 0.8^L Thermococcus litoralisDNA 聚合酶 (Vent, 2U/pL) 0.5/zL 临用时 配制, 先将前 4 种充 分混合 并置冰 上冷却 ,然后 再加入 Vent DNA 聚 合酶。 5' 末端标 记引物 3 可 按正向 反应方 案制备 ,仅做 以下修 改:用 标记级 (即不 昂贵) 〇-32P] ATP (6000Ci/mmoL) 末 端标记 20~100pmol 弓丨物 3; 于 37X: 温育 30min, 通 过 凝胶纯 化去除 未参与 标记的 [7-32P] ATP, 洗脱引 物时用 50% 乙醇 。用 TE (pH7.5) 重 溶引物 3, 浓度为 lpmol/^L; 比活 性应为 (4X106) 〜 (9X106) 每 分钟计 数 /pmol0 (11) Vent DNA 聚合酶 终止液 (每 个反应 295yL) 3mol/L 乙 酸钠, pH7.0 25/mL ( 终浓度 260mmol/L) TE 缓 冲液, pH7.5 266 卩 L ( 终浓度 lOmmol/L Tris-HCl pH7.5) 0.5mol/L EDTA 2+ ( 终浓度 4mmol/L) lOmg/mL 酵母 tRNA 2fiL ( 终浓度 68/xg/mL) 3. 操 作步骤 第一链 合成: (1) 将 5pL (2网) 打 断了的 基因组 DNA 加入 到一个 硅化的 1.5mL 微 量离心 管中, 置冰 水浴数 分钟, 冷却。 这 些经过 断裂的 DNA 样品 必须具 有较高 的纯度 ,如果 DNA 有 残余的 污染物 ( 如哌啶 ), 将会干 扰 反应。 (2) 准备 含引物 1 的第一 链合成 混合物 ,并 于冰水 浴冷却 数分钟 。取 25;xL 加入 DNA 样品中 ,用移 液器轻 轻混匀 ,样 品再置 于冰水 浴中, 样品管 加上管 扣以防 止加热 变性 时管子 爆开。 (3) 将 DNA 在 95X: 变性 5min, 引物在 60X: 退火 30min, 然后在 76X: 延伸 lOmin。 第一 链的合 成在自 动热循 环仪上 能很容 易地自 动进行 ,也可 以手工 在不同 的水浴 间移动 。为 了降 低背景 , 应该使 退火温 度高于 左右, 并且在 76t 进 行延伸 。延 伸步骤 可以产 生一个 用于以 后连接 反应的 平端。 l^tL l{iL 0 . 8/[jtL 7.2{iL • 402 • (4) 当步骤 (3) 中的延 伸反应 完成时 ,立 即将样 品放至 冰浴, 4t: 稍 加离心 以收集 冷 凝液滴 ,再 置于冰 水浴。 进行连 接反应 : (5) 在 合成第 一链时 ,可以 准备下 列溶液 :融化 2(^m〇l/L 的 单向接 头混合 物并立 即 置于冰 水浴; 配制连 接酶稀 释液; 配制 不完全 连接酶 混合物 ( 即不加 接头及 连接酶 )。 所有液 体均放 置于冰 水浴。 (6) 完成 第一链 合成后 ,将准 备好的 不完全 连接酶 混合物 中加入 连接酶 ,混匀 ,再 加 入接头 ,混匀 ,即 成为 完全的 连接酶 混合物 ,放 置于冰 水浴。 (7) 往样品 中加入 20pL 冰冷的 连接酶 稀释液 ,用移 液器轻 轻混匀 ,放置 于冰水 浴 。加入 20^L 完全的 连接酶 混合物 ,用移 液器轻 轻混匀 ,再 放置于 冰上。 4X: 稍加离 心 ,置 17t: 水浴 ,温育 过夜。 (8) 温育样 品置于 冰水浴 数分钟 , 4X: 稍 加离心 ,再 置于冰 水浴。 (9) 准备好 沉淀用 盐溶液 并在冰 上预冷 。往 连接反 应样品 中加入 9. 4fxL 用 于沉淀 的盐混 合物和 220pL 冰上 预冷的 100% 乙醇 ,颠倒 混匀, -20X: 至 少放置 2h。 如果 需要, 实验可 在这一 步暂停 ,在乙 醇中的 样品在 -20X: 可 以贮存 数周。 进行 PCR 反应: (10) 4X: 离心 15min 沉 淀连接 反应物 ,弃 上清。 (11) 加入 50(^L 室温的 75% 乙醇 ,颠 倒几次 ,清 洗管壁 及沉淀 ,室温 下离心 5min, 弃上清 。用 移液 器吸去 痕量乙 醇液滴 ,晾干 或者用 Speedvac 真空 旋转蒸 发器蒸 发 残存的 乙醇。 (12) 加入 70fzL 水并将 样品置 于室温 ,溶 解沉淀 ,偶 尔在旋 涡混合 器上振 荡以促 进溶解 。每 次振荡 完毕, 可离心 2 〜 3s, 当 沉淀溶 解之后 (通常 <30min), 将样 品置于 冰水浴 上冷却 。当溶 解沉淀 的时候 ,可 以准备 和预冷 含有接 头引物 和引物 2 的扩 增反应 液 〇 (13) 往样品 中加入 30ML 预冷 的扩增 反应液 ,用移 液器轻 轻混匀 。样 品再 置于冰 水浴。 (14) 往样品 中加入 3/uL Vent DNA 聚合酶 (1U) 混合物 ,用移 液器小 心混匀 。样 品再 置于冰 水浴。 该 反应对 所用的 Vent DNA 聚合 酶的用 量十分 敏感, 过量的 聚合酶 会导致 很高的 背景。 (15) 加入 90ptL 矿物 油覆盖 样品, 4t: 稍加 离心, 样品再 置于冰 水浴。 (16) 进行 18 个 PCR 循环。 第一步 变性为 951C 下 3~4min, 随后的 变性为 95X: 下 lmin; 弓丨 物退火 温度应 高于了 „1值〇 〜 2X: ( 如 果引物 2 和接头 引物: ^ 值不同 ,取 较低 的丁 „值); 第一 循环在 761C 延伸 3min, 以 后每个 循环的 延伸步 骤增加 5s; 最后 一步延 伸 lOmin。 反 应完毕 ,将样 品置于 冰水浴 ,取 下管扣 (如 果有使 用的话 ), 4X: 稍 加离心 收集冷 凝液滴 ,将 样品 置于冰 水浴。 本步 骤中最 重要的 参数就 是变性 温度。 如果温 度太低 ,会导 致在测 序后没 有信号 或序列 梯缩短 , 如果温 度太高 就会使 聚合酶 失活。 进行末 端标记 : (17) 准备 含有标 记引物 3 的末 端标记 混合物 ,置于 冰水浴 中预冷 数分钟 。取恥 L • 403 . 加入 样品中 ,再用 移液器 将水相 温和地 混匀时 ,样 品管 应尽可 能保持 在冰水 浴中, 4*C 稍 加离心 ,再 置于冰 水浴。 标记混 合物中 有相当 大量的 32P, 操作和 弃置样 品及混 合物时 应分外 小心。 (18) 进 行两轮 PCR 以合成 带标记 末端的 DNA, 第 1 次 变性为 95X: 下 3 〜 4min; 第 2 次 变性为 95t: 下 lmin。 末端标 记引物 3 的退火 温度应 高于其 计算的 Tm 值 0~2t: , 退火 2min; 76X: 延伸 lOmin。 当第 2 个延 伸反应 结束后 ,将 样品放 置于冰 水浴。 (19) 将样 品置于 室温, 然后迅 速加入 295^L Vent DNA 聚合酶 终止液 ,在 旋涡混 合 器上振 荡混合 ,稍 加离心 ,以 收集粘 于管壁 和顶部 的放射 性液滴 。加入 500/^酚/氯 仿 / 异戊醇 ,用力 摇匀或 振荡混 合均匀 ,室 温离心 3 〜 5min。 将上 层水相 (约 40(VL, 避免混 入界面 物质) 转移到 一个干 净的经 硅化的 1.5mL 微量离 心管中 ,充 分混匀 ,稍 加 离心以 收集管 壁上的 液滴。 (20) 准备 4 个干 净的经 硅化的 1.5mL 微量 离心管 ,每管 中加入 235^L 室温 100% 乙醇, 再加入 酚抽提 后收集 的水相 94^丄, 在旋涡 混合器 上振荡 以充分 混匀, -20X: 放 置至少 2h。 将所 有剩余 的水相 弃之。 (21) 将乙醇 沉淀的 样品在 4X: 离心 15min, 弃 上清。 (22) 加入 500/ixL 室温 75% 乙醇, 在旋涡 混合器 上振荡 。样 品在室 温离心 5min, 弃上清 。用移 液器吸 去痕量 乙醇, 然后晾 干或用 Speedvac 蒸发 器蒸发 残余的 乙醇。 (23) 每管 中加入 7pL 加样 缓冲液 ,室温 放置, 偶尔在 旋涡混 合器上 振荡以 帮助溶 解沉淀 ,每次 振荡后 ,可稍 加离心 2 〜 3s, 以收集 管壁上 的液滴 。样 品一 般很快 就溶解 (5min 以内 )。 可用 一根吸 管从中 吸出液 体以检 查样品 是否完 全溶解 ,并 用盖革 计数器 确定 放射性 是在样 品里而 不是留 在管里 ,将样 品再放 回原管 。如果 仍有大 于总放 射量的 10% 留 在管里 ,振荡 ,离心 ,重 复上述 操作。 测序胶 电泳: 将 样品在 85~90t: 变性 5min 后 ,将每 管中全 部样品 加样于 6% (0.35 〜 0.56mm 厚) 的测序 胶上进 行电泳 ,电 泳完毕 后固定 并干燥 凝胶, 然后不 加增感 屏放射 自显影 6 〜 24h〇 因为 加入了 25bP 的接头 ,序 列阶梯 比原始 的足迹 或测序 产物长 25bp。 三 、从 单层细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足 迹分析 下 面的方 法是从 单层细 胞中制 备经细 胞内或 细胞外 DMS 处理的 基因组 DNA, 与连 接介导 PCR 联合应 用进行 基因组 DNA 足迹 分析。 DMS 可以 使鸟嘌 呤碱基 N7 位甲 基化 ,从 而使其 对哌啶 敏感。 DNA 在用于 连接介 导 PCR 之前经 哌啶处 理而被 切开。 DMS 常被用 于体内 (细 胞内) 足 迹分析 ,因为 DMS 可 以自由 出入细 胞膜。 DMS 无 论在细 胞内还 是在细 胞外对 DNA 的 处理都 要适当 限制, 大约使 150 个鸟嘌 呤中有 1 个被 甲基化 。另一 方面, 哌啶处 理则是 定量的 ,可以 使所 有甲基 化的鸟 嘌呤位 点都被 切断。 DNA 的 抽提和 纯化一 定要十 分彻底 ,除 去所有 的蛋 白质和 试剂, 然后将 DNA 用于连 接介导 PCR。 本方法 每组实 验用约 5 xi〇7 细胞 较合适 (对成 纤维细 胞来说 ,是 在一个 15cm 培养 • 404 • 皿 生长至 70% 汇片 时的细 胞数目 )。 通 过按比 例增加 提取过 程中所 用的试 剂体积 ,可以 从更多 的细胞 中提取 DNA。 如果 在沉淀 和操作 DNA 时 格外小 心的话 ,也 可用于 < IX 107 细胞 / 组。 本方法 经适当 修改, 可以从 悬浮细 胞制备 DNA (见后 面的“ 从悬浮 细胞制 备基因 组 DNA 进行 DMS 足迹法 ”)。 以本 方法制 备不经 DMS 处理的 DNA 时, 可获得 高质量 的 DNA, 适合用 于基因 组测序 ( 见后面 的“用 于化学 测序的 基因组 DNA 的制备 ”)。 1. 材料 磷酸盐 缓冲液 (PBS) 适用 于样品 细胞的 培养液 裂解液 在 15cm 培 养皿的 单层培 养细胞 ,双份 样品- 100 % 硫酸 二甲酯 (DMS) TE 缓冲液 平衡酚 酚 / 氯仿 / 异戊醇 25:24:1 氯仿 / 异戊醇 24:1 乙醚 异丙醇 TE 缓 冲液, pH7.5 (10mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA) 3mol/L 乙 酸钠, pH7.0 100% 和 75% 乙醇 冰冷的 DMS 终止 缓冲液 哌啶 8mol/L 乙酸铵 50mL 和 15mL —次性 使用的 聚丙烯 离心管 ,带 螺口盖 带废液 瓶的抽 气装置 — 次性细 胞刮子 台式 离心机 (普通 水平式 离心机 ) 经硅化 并带有 管扣的 1.5mL 微量 离心管 巴斯 德吸管 细 玻璃棒 注意: DMS 和哌啶 都是剧 毒物质 ,所以 ,所 有使用 DMS 和哌 啶的操 作都应 在合适 的通风 橱里进 行 ,并 且进行 操作前 ,应 仔细回 顾使用 DMS 和哌 啶及废 物弃置 的注意 事项。 2. 操 作步骤 用 DMS 处理单 层细胞 (细胞 内处理 ), 裂解 DMS 处理和 未处理 的细胞 : (1) 在 处理细 胞前先 准备好 以下溶 液:在 置于通 风橱的 37X: 水浴中 预热的 PBS (约 75mL/15cm 培养皿 ); 将每份 24mL 细胞 培养液 加入到 50mL 聚 丙烯离 心管中 ,与 PBS —样在 37X: 水浴 预热。 配制裂 解液。 • 405 • (2) 对于对 照细胞 (不用 DMS 处理 ): 弃 去培养 皿中的 培养液 ,迅速 加入约 25mL 预热的 PBS, 轻轻晃 动几次 ,倒掉 PBS, 立即进 行步骤 (5)。 (3) 对于 准备用 DMS 处 理的细 胞:弃 去培养 皿中的 培养液 。取 24ML100% DMS 加至 每份预 热的培 养液中 (DMS 终 浓度为 0.1%), 旋 上盖子 ,倒 转几次 以混匀 ,然后 将全部 液体加 入到组 织培养 皿中, 让此含 0.1 % DMS 的培 养液与 细胞接 触恰好 2min。 临用前 才加入 DMS, 培 养液中 的水会 很快使 之失活 。可通 过调整 温育的 时间和 (或) DMS 的浓 度, 以得到 最适的 DMS 足迹。 (4) 用 带废液 瓶的抽 气装置 吸去含 〇_l%DMS 的培 养液。 轻轻地 加入约 25mL 预 热的 PBS 于细 胞培养 皿中, 轻轻混 合几次 ,然 后吸去 PBS。 用 预热的 PBS 如此 反复洗 培养皿 3 次 ,每次 PBS 在 细胞上 应停留 30s 左右。 (5) 对于经 DMS 处理的 和未处 理的细 胞:尽 量吸尽 PBS, 然 后加入 1.5mL 裂解 液, 轻轻摇 动使裂 解液均 匀地布 满整个 细胞层 的表面 ,室温 放置约 5min。 (6) 倾斜培 养皿, 用一次 性细胞 刮子将 DNA/ 细 胞裂解 物刮下 ,用吸 管尽可 能将裂 解 物全部 转移至 1 个 15mL 聚丙 烯离心 管中。 收集 、纯化 DNA: (7) 将 细胞裂 解物在 37t: 温育 3 〜 5h, 每隔 30 〜 60min 取出离 心管颠 倒几次 ,将管 内液体 混匀。 在温育 过程中 , 蛋白酶 K 消化 细胞 蛋白质 ,温育 结束后 ,样 品可在 -20X: 长 期贮存 ,在使 用之前 应 先融化 并暖至 室温。 (8) 加入 1.25 倍 体积的 缓冲液 平衡酚 ,轻 轻颠倒 30 次, 使之充 分混匀 。在 台式离 心机上 室温下 130〇xg ( 普通的 水平式 离心机 ,约为 2500r/min) 离心 lOmin。 用巴斯 德吸 管穿过 水相和 界面插 至管底 ,将 底层的 酚吸弃 。如果 黏性的 DNA 被 带至有 机相, 可用吸 头吹出 空气气 泡而使 其分离 。不 要触动 界面, 因为在 界面处 有许多 DNA。 用酚 重 复抽提 一次。 (9) 加入 1 倍 体积酚 / 氯仿 / 异戊醇 ,轻轻 颠倒约 30 次 ,使 之充分 混匀。 室温下 500Xg ( 普通的 水平式 离心机 ,约为 1500r/min) 离心 lOmin, 用 巴斯德 吸管从 底部吸 走酚 / 氯仿 / 异戊醇 。勿触 动界面 ,重 复此抽 提步骤 (1) 次。 (10) 加入 1 倍体积 的氯仿 / 异戊醇 ,轻轻 颠倒约 30 次 ,充分 混匀。 室温下 200 ( 普通的 水平式 离心机 ,约为 lOOOr/min) 离心 5min, 用 巴斯德 吸管从 底部吸 走氯仿 / 异 戊醇 溶液。 (11) 加入 1 倍体 积乙醚 ,轻轻 颠倒约 30 次 ,充 分混匀 。使离 心管垂 直静置 1 〜 2min, 通 过重力 作用使 其分层 ,用 巴斯德 吸管吸 弃乙醚 (上相 ), 在通风 橱中使 所有残 余的 乙醚完 全挥发 (约 5min)。 注 意:乙 醚是易 燃物质 ,应 在通风 橱中小 心进行 操作。 (12) 加入 1 倍体积 异丙醇 ,轻轻 颠倒约 30 次使 其混合 完全。 DNA 会迅速 沉淀, 形 成白色 絮状沉 淀物。 (13) 用一 根细玻 璃棒轻 轻搅动 DNA, 使 黏性的 DNA 缠绕在 细玻璃 棒上, 小心地 将缠 绕着的 DNA 从异 丙醇溶 液中带 出来, 轻碰试 管内壁 以使多 余液体 流走。 (14) 将缠有 DNA 的玻 璃棒在 3mLPH7.5 的 TE 缓冲 液中轻 轻扭转 或摆动 ,使 • 406 • DNA 脱落 到缓冲 液中, 室温下 轻轻摇 数小时 至过夜 ,使 DNA 重新 溶解。 基因组 DNA 很难 溶解, 但绝不 能振荡 或吹打 ,这样 会剪切 DNA。 (15) 加入 330/ML3mol/L 乙 酸钠和 6.7mL 冰冷的 100% 乙醇 ,轻轻 颠倒约 30 次, 充分 混匀。 如步骤 (12)、 (13), 重 新沉淀 和缠绕 DNA。 (16) 将 缠绕的 DNA 脱落入 200~500pLpH7.5 的 TE 缓冲液 ,室 温放置 过夜或 4X: 放 置数天 ,使 DNA 重 新溶解 ,在 此过程 中可不 时地轻 轻颠倒 几次。 溶解完 全后, 用分 光光度 计测定 DNA 浓度 ,并 将其浓 度调为 0.5~lmg/mL, 贮存于 4X:。 DNA 在 4t 贮存 数年之 内是很 稳定的 。溶 液中可 能含有 大量的 RNA, RNA 可在随 后的哌 啶处理 过 程中被 除去。 对照 DNA ( 没有用 DMS 处理) 质 量很高 ,此 时可用 于基因 组测序 ( 见后面 的“用 于化学 测序的 基因组 DNA 的制备 ”) 和 基因组 胞嘧啶 甲基化 分析。 用 DMS 体 外处理 DNA: (17) 将约 75~175fig 对照 DNA 加入 到一个 硅化的 1.5mL 微量离 心管中 ,加入 TE 缓 冲液至 175^L。 DNA 溶液很 黏稠, 在分装 时应格 外小心 。最好 用大口 的加样 器吸头 (将 lmL 吸头剪 去一截 ,形 成较 大的口 )。 (18) 在 495pL 水 中加入 5^L100% DMS 得到 1% DMS 溶液 ,振荡 25s 充分 混匀, 稍 加离心 以收集 液滴。 DMS 应试 几个不 同的浓 度以确 定与用 于细胞 内处理 (前面 部分) 条 件最为 匹配的 条件。 1%DMS 溶液一 旦配制 ,就 要立 即使用 ,因为 DMS 在水中 会迅速 失活。 (19) 加入 25^L1%DMS 溶液 于对照 DNA (175/^L) 中 ,轻轻 颠倒约 25s 充分混 匀。 避免使 DMS 溶 液黏于 管盖上 ,如 有黏性 ,可稍 加离心 。室 温温 育恰好 2min, 然后 加入 50^L 冰冷的 DMS 终止 缓冲液 。立 即加入 750pL 冰冷的 100% 乙醇, 剧烈摇 动使其 混合, 将管子 插入碎 干冰中 ,让 样品在 干冰上 放置约 30min。 (20) 与体外 DMS 处 理的样 品平行 ,制 备体内 处理的 DNA, 待哌 啶处理 。将 200fiLDNA (得自 DMS 处理的 细胞) 与 50fiL 冰冷的 DMS 终 止缓冲 液混合 ,在 旋涡混 合 器上稍 加振荡 (3s)。 加入 750fxL 冰冷的 100% 乙醇 ,剧 烈摇动 混合。 将管子 插入干 冰中 ,让 样品在 干冰上 放置约 30min。 用哌 啶裂解 DNA: (21) 将 上面两 种沉淀 DNA 样品 (一 种是从 DMS 处理 的细胞 分离的 ,一种 是从细 胞分 离后用 DMS 体外 处理的 ) 4X: 离心 lOmin, 弃上清 。沉 淀加入 lmL 室温的 75% 乙 醇 ,在旋 涡混合 器上稍 加振荡 (约 5s) 直至沉 淀离开 管壁。 4t: 离心 l〇mm, 弃 上清。 (22) 用水按 1:10 稀释哌 啶至终 浓度为 lmol/L, 往每种 DNA 沉淀 中加入 200fiL。 室温 下温育 以重溶 DNA 并间或 在旋涡 混合器 上振荡 。仔 细观 察样品 以确认 DNA 已完 全溶解 ,没有 溶解的 DNA 在 lmol/L 的 哌啶中 将会形 成清晰 的漂浮 状的小 透镜。 注意 :应在 通风橱 中分装 及吸取 哌啶。 (23) 当沉淀 已完全 溶解, 稍加离 心以收 集液滴 。扣 上管扣 ,在通 风橱中 90X: 加热 30min〇 用 哌啶加 热处理 可以使 基因组 DNA 在甲 基化的 鸟嘌呤 处断裂 ,使 DNA 变性 并破坏 污染的 RNA。 (24) 打 开管扣 ,稍加 离心以 收集冷 凝液滴 。置 样品 于干冰 上冷却 lOmin, 用 • 407 • Speedvac 真空旋 转蒸发 器在室 温蒸发 l~2h, 除去 哌啶。 在干冰 上冷却 样品, 可以加 速哌啶 的蒸发 ,并可 减少哌 啶在将 其放入 蒸发器 过程中 蒸发。 (25) 沉淀用 36(VLpH7.5 的 TE 缓冲 液重悬 。加入 40pL3mol/LpH7.0 的乙 酸钠, 在旋涡 混合器 上振荡 混匀; 加入 ImL 冰冷的 100% 乙醇 ,剧 烈摇动 以充分 混匀, - 20*C 至 少放置 2h 以上。 (26) 样品在 4X: 离心 15min, 弃上清 。沉 淀用 PH7.5 的 TE 缓冲液 500^L 重悬, 加入 170pL8mol/L 乙酸铵 ,在 旋涡 混合器 上振荡 混匀; 加入 670/xL 异丙醇 ,剧 烈摇动 以充分 混匀, -20X: 放 置至少 2h 以上。 (27) 样品在 41: 离心 15min, 弃上清 。加入 500fiL 室温的 75% 乙醇 ,在旋 涡混合 器上 振荡, 然后在 4X: 离心 15min, 弃上清 ,并用 吸管吸 去残余 的痕量 乙醇。 (28) 沉淀用 50ML 水重悬 ,然 后在 Speedvac 蒸发器 中干燥 lh。 用 TE 缓冲 液重新 溶 解沉淀 ,使 DNA 终浓 度约为 l^g/mL。 (29) 样 品在室 温离心 10mm, 将上 清转移 至一个 新的经 硅化的 微量离 心管中 ,如 有 胶状沉 淀存在 ,将 胶状沉 淀弃之 。用 分光光 度计对 DNA 定 量并用 pH7_5 的 TE 缓冲 液将浓 度调至 0.4/ig/pL, 此时的 样品可 用于连 接介导 PCR。 由 于用哌 啶处理 DNA 大部分 是单链 ,所 以估计 A26〇 = l 时 DNA 浓度为 4(Vg/mL。 DNA 可 稳定保 存于 4X: 数年。 四 、从 悬浮细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足 迹分析 下 面的方 法是从 悬浮培 养的细 胞制备 基因组 DNA。 采用 0.5xi〇8~i.〇xi〇8 细胞 可以获 得理想 的结果 。在此 只叙述 与“从 单层细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足迹分 析” 中不同 的步骤 ,与 DNA 足迹有 关的其 他步骤 ( 如收集 DNA、 体 内对照 的处理 、哌 啶处 理等) 可以按 照“从 单层细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足 迹分析 ”中的 有关步 骤 进行。 1. 材料 悬浮培 养细胞 PBS 裂解液 (300mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 25mmol/L EDTA, 0.2% SDS, 新 鲜配制 ,临用 时加入 0.2mg/mL 蛋白酶 K) 100% 硫酸 二甲酯 (DMS) 100% 乙醇 ,室温 50mL 聚丙烯 离心管 ,带 螺口盖 台式 离心机 (普通 水平式 离心机 ) 注意: DMS 和哌啶 都是剧 毒物质 ,所 有使用 DMS 和哌啶 的操作 都应在 合适的 通风橱 里进行 ,并 且进行 操作前 ,应 仔细回 顾使用 DMS 和哌 啶及废 物弃置 的注意 事项。 2. 操 作步骤 (1) 在 50mL 聚丙 烯离心 管中分 别准备 3 份 49mL PBS, 用 前置于 冰上预 冷至少 • 408 • 30min。 配好 裂解液 并且在 15mL 带螺 口的聚 丙烯管 中准备 3 份 2 . 7mL 裂 解液。 (2) 将 2 份含有 (0.5xi〇8)~(lxi〇8) 细胞的 培养液 转移至 50mL 聚丙烯 管中, 在台式 离心机 上室温 500Xg (150〇r/min) 离心 5min, 吸 弃上清 。留下 lmL 体 积的培 养液 ,用手 指弹击 管底部 或用移 液器轻 轻地上 下抽吸 以重悬 细胞。 2 份 细胞, 1 份用 DMS 处理 ,另 1 份为 不处理 的对照 细胞。 (3) 对于对 照细胞 (不用 DMS 处理 ), 将 lmL 重 悬细胞 加入到 冰冷的 一小份 PBS 溶液中 ,轻 轻颠 倒以充 分混合 ,于 4t: 500Xg 离心 5min, 然后进 行步骤 (8)。 (4) 对 于将用 DMS 处 理的细 胞:将 lmL 重 悬细胞 转移到 1.5mL 微 量离心 管中, 然后 将其放 入通风 橱中的 37X: 水 浴中。 (5) 将 10/iL 室温 100% DMS 加入到 90^L 100% 乙醇, 配制成 10% 的 DMS 溶液。 在旋涡 混合器 上振荡 25s 以充 分混匀 ,稍 加离心 以收集 液滴。 10% DMS 用乙醇 配制是 由于该 浓度的 DMS 不溶于 永 中。 (6) 将 10/uLlO% 的 DMS 溶液 加入到 保温的 细胞中 ,轻轻 颠倒以 混匀, 37X: 温育 lmin。 立即将 细胞加 入到一 份冰冷 49mLPBS 溶液中 ,轻 轻颠倒 以混匀 ,于 4X: 下 500 X g 离心 5min。 此处所 列出的 DMS 的用量 及温育 时间是 适用作 为预试 验的出 发条件 ,为 得到 最佳的 DMS 足迹, 可 能有必 要对它 们进行 修正。 (7) 吸弃 上清。 然后从 第三份 冰冷的 PBS 溶液 (49mL) 中取 l~5mL 将细 胞迅速 重悬 ,立即 将剩余 的冰冷 PBS 也加入 到装有 细胞悬 液的离 心管中 ,轻轻 颠倒以 混合。 于 4X3 下 500 X g •离心 5min。 (8) 对 于对照 细胞和 DMS 处理的 细胞, 吸出并 弃上清 ,细胞 重悬于 300 卩 L 冰冷的 PBS, 然 后转移 到独立 的每份 2. 7mL 的裂 解液中 ,轻 轻颠倒 以混合 。继续 DNA 提取步 骤 ,并进 行对照 DNA 的 DMS 处理, 以及哌 啶断裂 (按 照“从 单层细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足 迹分析 ”中的 有关步 骤进行 )。 五、 基因组 DNA 的 化学测 序反应 下 面的方 法是将 基因组 DNA 直 接用于 化学测 序反应 ( 也就是 不经过 中间克 隆和扩 增步骤 而直接 进行测 序反应 ), 测序反 应的量 非常少 ,不能 直接进 行测序 胶电泳 并读取 序列, 但测序 反应产 物可以 通过连 接介导 PCR 而产生 足够量 ,用 于测序 胶电泳 及读取 序列。 本法也 可分析 体内胞 嘧啶的 甲基化 情况, 因为在 C5 位置甲 基化的 胞嘧啶 不参与 C+T 和 C 反应。 1. 材料 未经 DMS 处理的 基因组 DNA (即 上面两 个方法 中制备 的对照 DNA, 溶于 pH7.5 的 TE 缓冲液 , 0.5 〜 1.0Mg/ML) TE 缓 冲液, pH7.5 (10mmol/LTris-HClpH7.5, lmmol/LEDTA) 3mol/L 乙 酸钠, pH7.0 • 409 • 100% 和 75% 乙醇 88% 甲酸 G+A 终止液 (360mmol/L 乙酸钠 pH7_5, 0.14mmol/LEDTApH8.0, 临 用时配 制并 置冰浴 冷却) 肼, 98%, 无水 C+T/C 终止液 (400 mmol/L 乙酸钠 pH7.5, 0.14mmol/LEDTApH8.0, 临用前 新 鲜配制 ,冰浴 冷却) 5mol/L NaCl 注意: DMS、 甲 酸和肼 都是有 毒物质 ,所有 使用这 些试剂 的操作 都应在 合适的 通风橱 里进行 ,并 且进行 操作前 ,应 仔细回 顾使用 DMS 和 肼及废 物弃置 的注意 事项。 2. 操 作步骤 G 反应: (1) 将约 50~175吨 对照 DNA 加入 到一个 1.5mL 微量离 心管中 ,加 足量 pH7.5 的 TE 缓冲 液至总 体积为 175pL, 将此管 标记为 G。 (2) 在 495pL 水 中加入 5ML100% DMS 得到 1% DMS 溶液 ,振荡 25s 充分 混匀, 稍 加离心 以收集 液滴。 (3) 加入 25^L1% DMS 溶液 于对照 DNA (175;iL) 中 ,轻轻 颠倒约 25s 充分混 匀。 避免使 DMS 溶 液黏于 管盖上 ,如 有黏性 ,可稍 加离心 。室 温温 育恰好 2min, 然后 加入 50/iL 冰冷的 DMS 终止 缓冲液 。立 即加入 750/iL 冰冷的 100% 乙醇, 剧烈摇 动使其 混合, 将管子 插入碎 干冰中 ,让 样品在 干冰上 放置约 30min。 (4) 进 行用哌 啶裂解 DNA。 G+A、 C + T 和 C 反应: (5) 将 20~40纯 对照 DNA 分别 加入到 3 个 1.5mL 微量离 心管中 ,加 足量 TE 缓 冲 液至总 体积为 lOOfiL, 将其分 别标为 G+A、 C+T 和 C。 (6) 分 别加入 ll^LSmol/L 乙 酸钠和 222pL 室温的 100% 乙醇 ,反复 颠倒数 次以充 分 混合。 (7) 室 温下以 最大速 度离心 5min 以沉淀 样品, 弃上清 。每管 中加入 500pL 室温的 75% 乙醇 ,颠 倒混合 直至沉 淀从管 壁脱下 ,以 最大速 度离心 3min, 弃 上清。 (8) 按以下 步骤用 水溶解 样品: G+A 管加 18fiL; C+T 管加 40pL; C 管加 10/xL, 4X: 温育 过夜, 然后让 溶解的 DNA 暖化至 室温。 (9a) 处理 G + A 样品 ① 加入 54^L 88% 甲酸, 在旋涡 混合器 上振荡 25s 以充 分混合 ,稍加 离心以 收集管 壁上 的液滴 ,室 温温育 7min。 ② 加入 164pL 冰冷的 G+ A 终止液 ,在旋 涡混合 器上稍 加振荡 (约 3s)。 ③ 加入 750^L 置于 干冰上 预冷的 i〇0% 乙醇, 剧烈摇 动以充 分混合 ,并将 管子插 入碎干 冰中, 让样品 置于干 冰中约 30min, 然后进 行步骤 (7)。 可以通 过变化 温育时 间而改 变反应 的程度 ,哌啶 剪切后 所产生 片段的 平均大 小会随 着温育 时间的 增加而 减小。 • 410 • (%) 处理 C+T 样品 ① 加入 60pL 肼, 在旋涡 混合器 上振荡 25s 充分混 合, 稍加离 心以收 集液滴 ,室温 温育 3min。 ② 加入 150pL 冰冷的 C+T/C 终止液 ,在旋 涡混合 器上稍 加振荡 (约 3s)。 ③ 加入 750pL 干冰上 预冷的 100% 乙醇, 剧烈摇 动以充 分混合 ,并 将管子 插入碎 干冰中 ,让 样品 置于干 冰中约 30min, 然后进 行步骤 (7)。 (9c) 处理 C 样品 ① 加入 30^L5mol/LNaCl, 在旋涡 混合器 上振荡 25s 以充分 混合, 稍加离 心以收 集液滴 。加入 60pL 肼, 在旋涡 混合器 上振荡 25s 以充分 混合 ,稍 加离心 以收集 液滴, 室 温温育 3min。 ② 加入 150^L 冰冷的 C+T/C 终止液 ,稍 加振荡 (约 3s)。 ③ 加入 750pL 干冰上 预冷的 100% 乙醇, 剧烈摇 动以充 分混合 ,并 将管子 插入碎 干冰中 ,让 样品 置于干 冰中约 30min, 然后进 行步骤 (7)。 用哌 啶裂解 DNA: 4 个反应 均用哌 啶处理 ,按 照“从 单层细 胞制备 基因组 DNA 进行 DMS 足迹 分析” 方法中 的用哌 啶裂解 DNA 操 作过程 (含 9 个小 步骤) 进行。 连 接介导 PCR: 哌啶处 理后, 进行连 接介导 PCR。 六 、方 法评注 1. 反应 特异性 的控制 PCR 反应的 特异性 一般是 很高的 。但 在反 应中难 免会有 一些非 特异性 扩增的 条带。 而连 接介导 PCR 的产 物是通 过同位 素曝光 检测的 ,灵敏 度更高 。因此 ,需 要进 一步增 加特 异性, 将背景 条带降 至最低 的限度 。在众 多的因 素中, 有两条 是必须 着重强 调的。 (1) 引 物与模 板杂交 及延伸 应在尽 可能高 的温度 下进行 。杂交 一般在 引物的 溶解温 度 (:Tm) 或 比溶解 温度高 2X: 的温度 下进行 。延 伸则用 VentDNA 聚 合酶在 76X: 进行。 (2) 通 过使用 多重引 物提高 特异性 ,减少 非特异 性条带 。引物 1、 引物 2、 引物 3 可以是 结合模 板的同 一部位 ,但 有一定 的错开 ,每一 个引物 末端都 是在前 一个引 物末端 的 3' 侧 ,既保 证能够 依次用 于扩增 ,又使 3' 末 端的碱 基不同 ,这 样可以 极大地 提高特 异性。 即使 采用上 述措施 ,在 正式实 验前最 好还是 先进行 预实验 。采 用几份 完全一 样的样 品进 行实验 ,经测 序胶电 泳并曝 光后, 几份样 品的结 果应该 是完全 一样的 。进行 预实验 也 是对整 个反应 系统的 检验。 2. 基 因特异 性引物 在连 接介导 PCR 中 ,有 3 个 针对同 一特定 基因的 引物和 1 个通 用引物 ,如下 所述。 引物 1: 又 称为第 一链合 成引物 ,是 用来引 导合成 第一链 ,形成 平末端 ,以 便与连 接头 连接; . 411 • 通用 引物: 即连接 头中的 LMPCR-1 链, 在扩增 反应中 作为两 个引物 之一; 引物 2: 又 称为扩 增引物 ,与通 用引物 共同用 于扩增 反应; 引物 3: 又称 为标记 引物, 是已经 用同位 素标记 、用 于引导 合成出 带标记 的扩增 片段。 1) 引物 的位置 引物 1 和引物 2 如果 不重叠 ,引物 2 必须是 在引物 1 的 3' 端, 如果它 们是重 叠的, 重 叠部分 不能超 过它们 长度的 50%。 引物 3 和引物 2 可以完 全重叠 ,但在 3' 端 应该多 几 个碱基 ,以 使引物 3 的 3' 末端 碱基是 在引物 2 的序 列之外 。引物 3 与引物 2 至 少应有 一半序 列重叠 ,如 果引物 3 和引物 2 完全 不重叠 ,末 端延伸 反应就 不能有 效进行 ,因为 这 些引物 必须结 合在同 一 位点 ,其原 因尚不 清楚。 基因组 DNA * 引物 1 * 引物 2 ' 引物 3 基因组 DNA * 引物 1 * 引物 2 引物 3 2) 引物 碱基组 成和溶 解温度 3 个引 物的溶 解温度 (Tm) 是不 同的 ,一 般说来 ,引 物的: Tm 值应该 是引物 1<引 物 2< 引物 3。 这样 ,引 导第一 链合成 的引物 1 在扩 增条件 下就没 有引物 2 与模 板的结 合能 力强。 而在标 记延伸 反应中 ,引物 2 则没 有引物 3 与 模板结 合的能 力强。 引物的 ^。值 可以通 过改变 GC 含 量和引 物长度 两个因 素来加 以调整 。引物 1 ( 第 一链合 成引物 ) 的 7\„值 一般应 >60X:, 一般为 20 碱基 (约 60%GC 含 量)〜 25 碱基 (约 50%GC 含量 ); 连 接头引 物一般 是含有 25 碱基、 60%GC 含量; 引物 2 ( 扩增 引物) 最 好与连 接头引 物匹配 ,便于 共同用 于扩增 反应; 引物 3 ( 标记 引物) 最 好具有 较高的 Tm 值。 在连 接介导 PCR 中, 3 个 引物之 间的关 系以及 引物同 反应温 度的对 应关系 是很重 要的 。引物 必须有 足够的 长度, 以形成 对目的 基因的 较高的 特异性 ,但 引物也 不能太 长, 其7^ 值不 能超过 761C (这样 会导致 非特异 性结合 )。 下列公 式可用 于估算 引物的 Tm 值: Tm = 81.5 + 16.6(logM) + 0.41(GC%) - (500/n) 其中, n = 引物的 长度, M = 缓冲 液中 盐的摩 尔浓度 。在计 算盐的 摩尔浓 度时, 不用考 虑 Mg2+ 的浓度 ,而将 Tris 的浓 度乘以 0.67 即可 。但是 ,对 于扩增 缓冲液 ,摩 尔浓度 将会是 0.04 (NaCl) +0.67X0.02 (Tris) =0.053mol/L。 以此计 算出: 值, 则杂交 在 高于此 :Tm 值 2X: 时效果 最好。 例如 1 个 引物为 25 碱基, GC 含量为 60%。 其 值为: Tm = 81.5 + 16. 6( logO. 053) + 0.41(60) - (500/25) = 65X: 用此 引物进 行的杂 交应在 65~67t: 进行 。这 是一个 近似计 算方法 ,尚不 能说是 绝对准 确 。因此 ,对于 每个具 体的引 物来说 ,依 靠实 验经验 确定最 适杂交 条件也 是很重 要的。 3. 单向 连接头 寡核 苷酸连 接头虽 然由两 个互补 片段退 火而成 ,但在 与模板 DNA 连接时 ,只 能是 • 412 • 单 向连接 ,这是 因为连 接头的 两个互 补片段 是错开 排列的 。连 接头的 一端是 平末端 ,另 一 端则是 5' 突出、 3' 凹进; 两个 片段的 5' 端都没 有磷酸 基团, 在连接 反应中 ,不 会发生 自 身连接 ,而只 能通过 平端连 接反应 ,使连 接头的 长片段 与模板 DNA 连接 ,短 片段则 不能 连接。 连 接头由 长短不 同的两 个互补 片段退 火而成 ,就 是为了 保证这 种单向 连接。 短片段 (LMPCR-2) 所起 的作用 就是与 长片段 (LMPCR-1) 形 成双链 平末端 ,使 T4 连接 酶能 够将 LMPCR-1 与 基因组 DNA 连接。 5 ' GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC 3 , (LMPCR-1) 3 ' CTAGACTTAAG 5 , (LMPCR-2) LMPCR-1 与 基因组 DNA 连接后 ,在 扩增反 应中复 制成为 双链。 LMPCR-1 在扩增 中也是 作为引 物使用 ,它不 是针对 特定基 因的, 而是通 过连接 反应形 成的引 物序列 ,因 而是通 用引物 ,可用 于扩增 各种基 因片段 。在用 于测序 或足迹 分析时 ,它 只是作 为引物 使用。 需要进 行片段 克隆时 ,它本 身所含 的限制 酶位点 (BwE II, Sma I, II, £c〇R I 等) 则 为克隆 扩增片 段提供 很大的 方便。 在 考虑连 接头设 计时主 要考虑 4 个问题 : ①两个 互补片 段不含 5' 端磷 酸基团 ,长短 不一 、只在 一端形 成双链 平末端 ,以防 止自身 连接、 保证与 基因组 DNA 进行 单向连 接; ②两 个互 补片段 形成的 双链结 构能够 与其他 片段的 平末端 连接; ③两 个互补 片段形 成 的双链 结构在 连接反 应的条 件下是 稳定的 ,而在 PCR 扩 增反应 条件下 是不稳 定的, 这 就要求 LMPCR-2 不能 太长; ④ LMPCR-1 在 Vent DNA 聚合酶 缓冲液 中的了 m 值与连 接介导 PCR 的引物 2 在 Vent DNA 聚合酶 缓冲液 中的: Tm 值很 接近。 4. 连 接反应 的温度 和时间 第 一链合 成反应 产物在 15t: 进行 45min 连 接反应 ,大 部分产 物都可 以完成 连接。 但有一 部分产 物需要 较长的 反应时 间才能 达到最 好的连 接效果 。因此 ,在 15~171C 温 育 6~15h 进行连 接反应 ,会取 得较好 的结果 。在较 高的温 度进行 连接反 应可以 缩短连 接反 应时间 ,但在 较高的 温度下 Vent DNA 聚合酶 的活性 较高, 有可能 会干扰 连接反 应 。在 连接反 应之前 ,如 果没有 除去在 合成第 一链时 使用的 Vent DNA 聚合酶 ,那 么在 连接 反应中 ,若 Vent DNA 聚 合酶具 有较高 的活性 ,就有 可能会 是连接 头中的 LMPCR-2 延伸 ,使连 接头的 另一端 也形成 平末端 ,因 而连接 头就不 再是单 向连接 。在 15 〜 17X: 进行 连接反 应不会 出现这 个问题 。在没 有灭活 Vent DNA 聚 合酶的 情况下 ,最 好不要 随意升 高连接 反应的 温度。 5. Vent DN A 聚合酶 在早期 研究连 接介导 PCR 时 ,是 在第一 链合成 和扩增 / 标记反 应中分 别使用 测序酶 和 "Tag DNA 聚合酶 。现 在是用 Thermococcus litoralis DNA 聚含酶 (Vent DNA 聚合酶 ) 替代 了这两 种酶。 在使用 测序酶 /Tag DNA 聚 合酶时 ,效果 不够好 ,有时 会出现 一些可 疑条带 ,使用 VemDNA 聚合酶 则消除 了这些 现象, 测序胶 曝光时 的信号 强度也 增加了 3 倍 左右。 连 接介导 PCR 反应对 Vent DNA 聚 合酶的 量是很 敏感的 。增 加一倍 的酶量 ,就会 . 413 • 使 测序胶 曝光的 背景强 度大幅 度增加 。产 生这种 现象的 原因还 不清楚 ,但 这表明 使用此 酶 时一定 要小心 。如果 实验中 遇到背 景过强 (或突 然出现 此问题 ), 就应 该通过 稀释来 确定 Vent DNA 聚合酶 的适当 用量。 在连 接介导 PCR 中 使用的 Vent DNA 聚合 酶缓冲 液是通 过经验 确定的 ,与 厂商推 荐的缓 冲液有 所不同 : (1) 采用 NaCl 替代了 KC1, 在延 伸反应 需通过 一些富 含鸟嘌 呤的区 域时, 使用含 NaCl 的缓冲 液效果 较好; (2) BSA 也被明 胶替代 ,这 样可以 减少酚 / 氯 仿抽提 时界面 沉积物 的量; (3) 删去了 (NHJ S04, 这样 可以减 少背景 ,并有 助于避 免乙醇 沉淀的 DNA 中 含 有太多 的盐; (4) 增加了 MgS04 的浓度 ,这 可以增 加测序 胶曝光 的信号 强度。 在某些 特定的 实验中 ,上述 条件可 能还需 要调整 ,但大 多数引 物在这 些条件 下进行 连 接介导 PCR, 都可 以取得 很好的 结果。 第一 链合成 缓冲液 与扩增 / 标记缓 冲液略 有不同 (Tris 较少 ,没有 Triton X-100), 这 种差别 使得第 一链合 成缓冲 液较容 易转换 成连接 缓冲液 ,而 不影响 Vent DNA 聚合酶 在第 一链合 成时的 活性。 Vent DNA 聚合 酶总是 最后加 入样品 ,一 定要在 所有成 分已经 混合好 ,并已 在冰上 预冷后 再加入 Vent DNA 聚合酶 。有报 告表明 , Vent DNA 聚合酶 有一定 的核酸 外切酶 活性 ,此 活性在 低温和 dNTP 存在 时可被 抑制。 6.DMS 足 迹分析 基 因组的 DMS 足 迹分析 可以比 较在细 狍内与 蛋白质 结合的 DNA 对 DMS 的 敏感性 和 除去蛋 白质后 的裸露 DNA 对 DMS 的 敏感性 。这就 需要高 质量的 DNA (无论 是细胞 内还是 细胞外 )。 为获 得最好 的效果 ,实 验中须 用同一 份细胞 ,在平 行的条 件下将 DMS 在细胞 内和细 胞外与 DNA 反应, 其他所 有试剂 及反应 条件均 相同。 DMS 和哌啶 也必须 使用 高质量 的试剂 ,开瓶 后须在 9~12 个月内 使用, 不要使 用过期 的试剂 。最后 制备得 到的 DNA —定 要除净 污染物 (特别 是哌啶 ), 浓 度定量 一定要 准确。 在 使用贴 壁培养 细胞时 ,细 胞须生 长良好 ,并具 有良好 的贴壁 能力。 如果细 胞贴壁 能 力很弱 ,则 需要继 续培养 、调整 培养条 件使之 恢复, 否则最 后改用 悬浮生 长细胞 。有 些 细胞系 在制备 DNA 时需要 较剧烈 的条件 才能除 净杂质 。在 这种 情况下 ,有必 要使用 Chaotropic 试剂 (如 guanidinium) 处理, 以提高 DNA 的 纯度。 第九节 用锚式 PCR 扩增 cDNA 本节描 述了一 种被称 为锚式 PCR 的方法 ,它可 在仅已 知小量 序列信 息的情 况下, 扩增出 全长的 cDNA。 常规逆 转录酶 PCR (RT-PCR) 扩增 cDNA 时 ,必 须知道 所要扩 增片段 两侧的 序列, 而锚式 PCR 只需 事先知 道位于 mRNA 内一 小段序 列就可 进行。 锚式 PCR 扩增 只是利 用一小 段已知 序列, 扩增出 一段序 列未知 的片段 。在 这个方 法中, PCR 扩增 反应是 由针对 已知序 列区的 一个引 物“锚 定”的 。另一 个引物 是非特 • 414 • 异性的 ,实 际上 是针对 一个通 用序列 ,一 个常用 的通用 序列就 是大部 分成熟 mRNA 都 具有的 poly (A) 尾 。另 一方面 ,靶序 列也可 以通过 酶促修 饰而加 上一个 可由第 二引物 用于 退火的 序列。 这种修 饰包括 通过末 端转移 酶加上 同聚尾 ,也可 以像连 接介导 PCR 的模 板那样 连接一 个特定 的通用 片段。 一 、铺式 PCR 的基 本原理 对于一 个特定 基因的 mRNA, 如果 只知道 其中一 小段序 列信息 ,则 可能需 要扩增 已知 序列的 3' 端下 游的未 知序列 (下 游锚式 PCR), 也可能 需要扩 增已知 序列的 5' 端上 游的未 知序列 (上 游锚式 PCR)。 这就 需要两 套方案 来分别 扩增。 (一) 下 游锚式 PCR 下 游锚式 PCR 是利用 已知序 列设计 引物, 扩增已 知序列 3' 端下 游的未 知序列 。扩 增反 应实际 上需要 3 个引物 ,进 行一 个逆转 录反应 和两轮 PCR 扩增。 3 个 引物是 : 1 个 oligo (dT) 引物、 2 个是利 用已知 序列设 计的序 列特异 性引物 (引物 1 和引物 2)。 引物 序列就 是已知 序列的 一部分 。引物 1 的序 列尽可 能选在 已知序 列的 5' 上游区 ,引物 2 在已知 序列的 下游区 。引物 2 可以紧 靠引物 1 的 3' 端 ,也 可以与 引物 1 部 分重叠 。引物 1 用 于第一 轮扩增 ,引物 2 用于 第二轮 扩增。 锚式 PCR 包括逆 转录、 第一轮 PCR 扩增和 第二轮 PCR 扩增 3 个 部分。 1. 逆转录 锚式 PCR 所用 的最初 模板是 mRNA, 因 而第一 步即是 逆转录 反应。 逆转 录是用 oligo (dT) 作 为引物 ,合成 cDNA 第一链 。第 一链中 即包括 了引物 1 能互补 结合的 序列。 5, AAAAAAn 3' mRNA 3. 寺 5' (cDNA) 第一链 T2〇 2. 第一轮 PCR 在 第一轮 PCR 反应中 ,用 引物 1 和 oligo (dT) 引 物进行 扩增, oligo (dT) 是非特 异性的 ,对靶 序列扩 增的特 异性是 靠引物 1 来控 制的。 引物 1 5. c--. ) 3' 5' (cDNA 第一链 ) T2〇 3. 第二轮 PCR 第一轮 PCR 结束后 ,取 第一 轮扩增 产物作 为模板 ,进行 第二轮 PCR 扩增。 在第二 轮 PCR 反应中 ,用 引物 2 和 oligo (dT) 引 物进行 扩增, 〇Kg〇 (dT) 是非特 异性的 ,对 靶 序列扩 增的特 异性是 靠引物 2 来 控制的 。在 第二轮 扩增中 ,不仅 放大产 物的量 ,而且 • 415 • 通过使 用引物 2 进一步 提高扩 增的特 异性。 引物 2 Tm (第一 轮扩增 产物) (二) 上 游锚式 PCR 上 游锚式 PCR 是利用 已知序 列设计 引物, 扩增已 知序列 5' 端上 游的未 知序列 。扩 增反庳 也需要 3 个引物 ,进 行一 个逆转 录反应 、一 个加尾 (或 连接) 反应 和两轮 PCR 扩增。 3 个 引物是 : 1 个 oligo (dT) 引物、 2 个是利 用已知 序列设 计的序 列特异 性引物 (引物 3 和引物 4)。 引物 序列与 已知序 列互补 。引物 3 的序 列尽可 能选择 与已知 序列的 3' 下游 区互补 ,引物 4 与已知 序列的 5' 上游 区互补 。引物 4 可以紧 靠引物 3 的 3' 端 ,也 可以 与引物 3 部 分重叠 。引物 3 用 于第一 轮扩增 ,引物 4 用于 第二轮 扩增。 与下 游锚式 PCR 的方案 不同, 本方案 是利用 序列特 异性引 物起始 cDNA 链的 合成。 所得 cDNA 链加上 poly (A) 尾 ,通过 两个序 列特异 性引物 (引物 3 和引物 4) 及与新 加的 poly (A) 尾 互补的 oligo (dT)2G 引物 介导的 PCR 扩增, 可得到 所需要 的独特 产物。 锚式 PCR 包括 逆转录 、加尾 反应、 第一轮 PCR 扩增和 第二轮 PCR 扩增 4 个部分 : 1. 逆转录 〜 锚式 PCR 所用 的最初 模板是 mRNA, 因 而第一 步即是 逆转录 反应。 逆 转录是 用引物 3 作 为引物 ,合成 cDNA 第 一链。 5' AAAAAAn 3' mRNA 3'-*- 5' (cDNA 第一链 > 引物 3 2. 加 poly (A) 第一链 合成后 ,在 末端转 移酶的 作用下 ,在 cDNA 的 3' 末端 加上腺 嘌呤同 聚尾。 3' AAAAn 5' (cDNA H) 引物 3 3. 第一轮 PCR 在 第一轮 PCR 反应中 ,用 引物 3 和 oligo (dT) 引物进 行扩增 , oligo (dT) 与 cD- NA3' 末端 的同聚 A 互补 结合, 虽然也 可以与 mRNA 中的 poly (A) 尾结合 ,但在 PCR 反应 中不能 进行逆 转录, 因而不 会影响 PCR 反应。 oligo (dT) 与引物 3 作 为一对 引物, 扩增 目的序 列片段 ,扩增 反应的 特异性 由引物 3 决定。 V 「丁20 5 +3, 3'AAAAn 5, (cDNA 第一链 ) 引物 3 • 416 • 4. 第二轮 PCR 第一轮 PCR 结束后 , 取第一 轮扩增 产物作 为模板 ,进行 第二轮 PCR 扩增。 在第二 轮 PCR 反应中 ,用 引物 4 和 oligo (dT) 引 物进行 扩增, oligo (dT) 是非特 异性的 ,对 靶 序列扩 增的特 异性是 靠引物 4 来 控制的 。在 第二轮 扩增中 ,不仅 放大产 物的量 ,而且 通过使 用引物 4 进一步 提高扩 增的特 异性。 T 5, I--」。---」 (第一 轮扩增 产物) 3' nmnmn 5' 引物 4 二 、扩 增已知 序列的 3' 端下 游区段 (下 游锚式 PCR) 本 方法可 用于扩 增所有 来源的 poly(A) + RNA。 尽管所 需要的 poly (A) + RNA 的量 取 决于所 研究的 生物体 基因组 的复杂 度及靶 mRNA 的相 对丰度 ,一 般来说 ,来 自于脊 椎动物 组织总 RNA 量为 100 〜 300ng 已 足够。 1, 材料 RNA 5xMoloney 鼠白血 病病毒 (MMLV) 逆 转录酶 缓冲液 (250mmol/L Tris-HCl pH8.3, 375mmol/LKCl, 50mmol/LDTT, 15mmol/LMgCl2, 贮存在 -20X:, 3 个月 内使用 ) BSA, 5ptg/ fj-L 4dNTP 混合液 (每种 dNTP 浓 度均为 10mmol/L, 贮存于 -20X:) 放 线菌素 D, 500ng/pL 200U/;iL MMLV 逆 转录酶 oligo (dT) 2〇 引物, 10pmol/;xL 序 列特异 性引物 1 和引物 2, 浓 度均为 lOpmol/juL TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 4dNTP 混合液 (每种 dNTP 浓 度均为 2.5mmol/L, 贮存于 -20X:) 10X扩增缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/LTris-HClpH8.8,15mmol/LMg- Cl2, 30mmol/LDTT, lmg/mlBSA, 贮存在 — 20X:, 3 个月内 使用) 2.5U〜L 了 叫 DNA 聚合酶 矿物油 2. 操 作步骤 (1) 取 100ng poly (A) + RNA OlOOng/pL) 加入 于一个 1.5mL 微量离 心管中 〇 RNA 样品 应具有 较高的 浓度, 因为下 面进行 的逆转 录反应 的体积 应尽可 能的小 ,最后 <1(VL。 如果 poly(A) + RNA 易 于得到 ,也 可以用 iFg。 RNA 量 1200Ci/mmol) 随机十 聚体, 2pmol/L T^DNA 聚 合酶, 5U/yL 矿物油 甲酰 胺加样 缓冲液 糖原 (不含 DNA), 10mg/mL 65X: 、 80t: 、 95X: 和 100t: 水浴 热 循环仪 Whatman 3 MM 滤纸 注 意:本 方法只 能在允 许进行 同位素 操作的 实验室 由经过 训练正 确使用 35S 同 位素的 人操作 ,任 何时候 都应避 免过多 暴露于 同位素 ,更 应避 免人和 设备的 放射性 污染。 所 有有关 RNA 的操作 都应十 分小心 以避免 RNA 的 降解。 2. 操 作步骤 纯 化处理 RNA, 从 RNA 中除去 污染的 染色体 DNA: (1) 混合下 面试剂 以消化 细胞总 RNA 或 poly (A) + RNA 中的 DNA RNA (l^g/pL) 50 卩 L 人胎盘 RNA 酶 抑制剂 (lU/pL) 10/iL 不含 RNA 酶的 DNA 酶 I (lOU/pL) l^L 0. lmol/L Tris-HCl, pH8.3 5/iL 0.5mol/L KC1 5^L 15 mmol/ L MgCl2 5^L •426 37"C 温育 30min 从 RNA 样 品中消 除任何 基因组 DNA 污染 是十分 关键的 。通过 这一步 可净化 总量为 15 〜 100叫 的 RNA〇 (2) 加入 50/xL 酚 / 氯仿 (3:1), 在旋涡 混合器 上振荡 ,最 大速度 下离心 2min 分相。 这一步 是要在 cDNA 合成之 前除去 DNA 酶 I, 剧烈振 荡混匀 对于完 全除去 DNA 酶 I 是很重 要的。 (3) 将上层 水相移 至一个 干净的 微量离 心管中 ,加入 5^L 3mol/L 乙 酸钠、 200ML 100% 乙醇。 -70X: 放置 30min 以沉淀 RNA。 (4) 高 速离心 lOmin, 弃上清 。用 500^L70% 乙醇 洗沉淀 ( 沉淀的 RNA)。 (5) 用 20/iL 经 DEPC 处理 的水溶 解沉淀 ,用分 光光度 计测定 A26Q 吸光度 ,准 确定 量 RNA 的 浓度。 (6) 取 3纯 纯化处 理过的 RNA 在 变性琼 脂糖凝 胶上进 行电泳 以检查 用于差 异展示 的 RNA 的 完整性 。用于 差异展 示之前 ,不含 DNA 的 RNA 可 贮存于 -80t:。 如果 RNA 没 有降解 , 28S 和 18S 核糖体 RNA 在溴 化乙锭 染色的 条件下 应该形 成清楚 可见的 条带。 逆转录 RNA: (7) 对应 于每个 RNA 样品 ,分 别标好 4 个微量 离心管 G、 A、 T、 C。 每个 离心管 对 应一套 简并的 oligo (dT) 锚定 引物。 (8) 取 l^g 纯化处 理过的 RNA, 用经 DEPC 处 理的水 稀释至 O.l/ixg/丨止, 并置于 冰浴。 (9) 以 4 套不同 的简并 oligo (dT) 锚定 引物: T12MG、 T12MA、 T12MT、 T12MC (其中 M 为 G、 A、 或 C), 按下列 方法建 立对总 RNA 或 poly (A) + RNA 的逆转 录反应 体系: 5 x MMLV 逆 转录酶 缓冲液 4/iL 0.1 mol/L DTT 2fiL 250fimol/L 4dNTP 混合液 1 . 6fxL 总 RNA 或者 0. 1/ig poly (A) + RNA 0.2叫 1 套简 并引物 (T12MN, 10pm〇l/L) 2fxL 加水至 总体积 19fiL —共 4 个反 应体系 (每个 RNA 样 品进行 4 个反应 ), 每套 反应体 系使用 4 套 简并引 物中的 一套。 (10) 将各反 应管置 65X: 温育 5min 使 mRNA 二级结 构变性 。然 后在 37X: 温育 lOmin 使引物 退火。 (11) 每 管加入 1/iLMMLV 逆 转录酶 UOOU/pL), 37X: 温育 50min。 (12) 95"C 温育 5min 灭活逆 转录酶 ,稍 加离 心以收 集液滴 。将反 应管置 于冰上 ,立 即用于 PCR 扩增 ,或 贮存于 -20X: 用 于以后 的实验 (至少 6 个月是 稳定的 )。 PCR 扩增: (13) 对于 每一套 引物按 以下方 案准备 20ML 反应液 : 水 9.2/^tL 10 x 扩增 缓冲液 2^L 25pmol/L 4dNTP 混合液 1 .6pL (终 浓度为 2pmol/L ) . 427 . 10MCi/^L [a-35S] dATP 1 套 简并锚 定引物 (T12MN, 10/xmol/L) 2/xL (终 浓度为 lptmol/L ) cDNA (得自 前面的 逆转录 反应) 2[iL 7 '叫 DNA 聚合酶 (5U/yL) 0.2/^L 随 机十聚 核苷酸 (2jumol/L) 2/iL (终 浓度为 0.2/^nol/L) 为 了避免 加样器 每次抽 吸造成 的差异 ,可以 事先准 备未加 随机十 聚核苷 酸的足 够多的 PCR 反应 液 ,然 后分成 5~10 个反应 ,每 份加入 18^L 反应液 ,然 后在每 个反应 中加入 机十聚 核苷酸 , 否 则要准 确吸取 〇.2^L Ta9 DNA 聚合酶 是很困 难的。 (14) 用 加样器 上下抽 吸混匀 ,覆盖 25/iL 矿 物油。 (15) 按照以 下扩增 循环在 PCR 仪 上进行 PCR 反应 : 94C 下 30s (变性 ); 40X: 下 211^(退火);721:下3〇5(延伸);共进行40个循环,最后1个循环,721〇下51^11 (延伸 )。 冷却至 4t: 贮存。 在 40X: 退火 2min, 可 以使短 引物充 分与模 板退火 并且开 始延伸 。在 72X: 延伸较 短时间 (30s), 是 因为只 扩增短 DNA 片段 (<600bp), 较小的 片段才 能在变 性聚丙 烯酰胺 凝胶上 分离。 (16) 取 3.5yLPCR 产物和 2pL 甲 酰胺加 样缓冲 液混合 , 80X: 温育 2min。 将 样品上 样于 6% 变 性聚丙 烯酰胺 凝胶, 60W 电泳 3h, 至二甲 基苯青 迁移至 离凝胶 底部约 10cm 处。 回收差 异显示 扩增的 DNA 片段: (17) 小心地 揭开其 中的一 块凝胶 玻璃板 ,将 一张 Whatman 3MM 滤 纸覆盖 于凝胶 上, 注意不 要在滤 纸和凝 胶间引 入气泡 。室 温干燥 lh, 不需 在甲醇 / 乙酸中 固定。 (18) 用放 射性墨 汁或细 针扎孔 以标明 X 光胶片 和凝胶 的方向 ,然后 将凝胶 在室温 对 X 光 片放射 自显影 24 〜 48h。 (19) 冲洗 X 光片 。从 X 光片 上可以 辨别差 异显示 的条带 。选 定需要 回收、 扩增的 条带。 将 X 光片 和凝胶 对齐, 用一干 净铅笔 标记在 X 光片下 或者直 接切开 X 光片 ,标 记好拟 回收的 DNA 条带 (那些 不同泳 道上差 异展示 的条带 )。 (20) 将 对应位 置的凝 胶及贴 附着的 Whatman 3MM 滤 纸用剃 须刀片 切下放 入微量 离 心管中 ,加入 100pL 水 ,室 温放置 lOmin。 如 果拟回 收的条 带不只 1 条 ,应 将每个 条带分 别回收 处理。 (21) 盖紧 盖子, 置沸水 浴煮沸 15min。 在 管子上 加一个 管扣以 防煮沸 时管盖 爆开。 (22) 高 速离心 2min 以沉淀 凝胶条 和碎纸 ,将 上清 转移至 一个干 净的管 子中。 (23) 往上清 中加入 10/iL3mol/L 乙酸钠 (终 浓度为 0.3mol/L) 和 5ML10mg/mL 糖原 (作 为担体 ), 再加入 400PL100% 乙醇。 -70t: 放置 30min, 4X: 高 速离心 lOmin。 (24) 弃上清 。用 500)uL85% 乙醇 洗沉淀 ,空气 中干燥 , 沉淀用 lO^L 水 溶解。 再扩增 DNA: (25) 取 4FLW 凝胶中 回收的 DNA, 在 40pL 反应体 积中重 新扩增 ,使 用与 PCR 扩 增过程 中相同 的简并 oligo(dT) 锚定引 物套及 PCR 反 应条件 ,即 片段来 自哪一 套引物 的扩增 产物, 仍用那 一套引 物进行 再扩增 。反 应体系 中只做 如下改 变:用 1.6pL 250Pmol/L 4dNTP 混合液 ( 终浓度 20Mm〇l/L) 代替 1.6jiL 25/imol/L 4dNTP 混 合液。 • 428 • 不 使用同 位素。 剩下 的回收 DNA 可以 贮存于 -20X: 作为 将来进 一步扩 增时用 ( 可长期 地保存 )。 (26) 取 30pL 每种 PCR 反应 样品在 1.5% 的琼 脂糖凝 胶上电 泳并用 0.5/ig/mL 溴化 乙锭 染色。 剩下的 PCR 样品可 贮存于 -201C (可保 存数年 )。 经过一 次重新 扩增后 ,绝大 多数的 DNA 都 能看见 。重 扩增后 片段的 相对分 子质量 应与在 变性凝 胶上 电泳的 条带进 行比较 ,二者 应该是 一致的 。如 果第一 次再扩 增看不 到条带 ,可以 用水将 PCR 产 物按 1:100 稀释, 然后取 4ML 再进行 40 个循环 扩增。 (27) 从琼脂 糖凝胶 中抽提 出所需 DNA, 以此 作为探 针用于 Norhtern 杂交 分析及 cDNA 文库 筛选。 (28) 也 可以将 剩下的 PCR 产物亚 克隆或 者进行 测序。 三 、方 法评注 1. RNA 的质量 在差 异显示 PCR 中, RNA 的 质量是 决定实 验结果 的十分 关键的 因素。 RNA 的质 量 包括两 个方面 :一是 RNA 的完 整性; 二是 染色体 DNA 污染的 程度。 总 RNA 的完 整性可 以通过 琼脂糖 / 甲醛 凝胶电 泳很方 便地进 行检测 。但 poly (A) + RNA 的完整 性则不 易检测 ,必须 用一个 已知相 对分子 质量的 mRNA 作为检 测指标 ,用 cDNA 探针 进彳了 Norther 杂交, 以鉴定 mRNA 分 子是否 完整。 不 经逆转 录反应 ,直 接将样 品进行 PCR, 可以鉴 定样品 是否有 染色体 DNA 污染。 如果 染色体 DNA 污染程 度较高 ,就可 以扩增 出条带 。如 果不 能扩增 出条带 ,则 可以认 为没有 染色体 DNA 污染。 实 验表明 ,用总 RNA 或 纯化的 mRNA 作模 板的差 异显示 结果基 本一致 ,用 oligo (dT) 法 纯化的 mRNA 含有 少量的 oligo (dT) 片段, 反而增 加了差 异表达 的背景 。因 此 ,在众 多的实 验中均 应用总 RNA 作模板 。差异 表达技 术对总 RNA 的 提取方 法没有 严格 的要求 ,所 采用的 方法因 实验室 而异。 DNA 污染 对差异 表达有 明显的 影响。 无论用 哪种方 法提取 RNA, 均 避免不 了有少 量 染色体 DNA 的存在 。所以 ,在 进行差 异显示 之前, 必须用 DNA 酶 I 处 理样品 ,然后 再 进行逆 转录。 2. + 聚寡核 苷酸随 机引物 的设计 通过 理论推 算及实 验验证 ,现在 一般认 为差异 PCR 中的 5' 端引物 的最佳 长度为 10bP。 一 般来说 ,任 意一个 十聚寡 核苷酸 ,只 要不含 有回文 顺序、 G+C 含量在 50% 〜 70%, 都 可以用 于差异 PCR 反应。 在实际 实验中 ,聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳所 分离的 cDNA 片段 的长度 <500bp, 所分辨 的带数 最多为 50 〜 100 条 ,不可 能分离 、分辨 所有的 mRNA 差 异表达 。因此 ,随 机引 物的设 计一般 是遵照 引物设 计的基 本原则 ,设计 20 〜 30 条随 机引物 ,同 12 种 T12MN 随 机组合 ,即可 满足分 析差异 表达的 需要。 引物与 模板是 不均一 性结合 。引 物的 3' 末端 必须与 模板紧 密结合 ,而 引物的 5' 则 • 429 • 允许 有一定 的错配 。在 引物的 5' 端可 以达到 4 个碱 基错配 。因此 ,随 机引 物的设 计常采 用将 5' 端的 4 个碱 基固定 、而将 3' 端序列 进行随 机组合 。其 G+C 含量也 可以根 据基因 组中 G+ C 含董的 特点进 行适当 调整。 现 在已有 一些不 同的十 聚寡核 苷酸随 机引物 的组合 ,在实 验中可 以适当 选用。 3. Mg2* 浓 度对差 异显示 PCR 反应 的影响 Mg2 + 浓度 是影响 PCR 反 应的重 要因素 。对 于不同 的随机 引物和 不同的 dNTP 浓 度, Mg2* 的 最佳浓 度有一 定差异 。在扩 增效果 不好时 ,可 以考 虑调整 Mg2" 浓度。 4. 复性温 度对差 异显示 PCR 反应 的影响 因 随机引 物只有 10 个碱基 ,差 异显示 PCR 的复 性温度 同常规 PCR 有 所不同 。当 复 性温度 >42t: 时, 电泳条 带明显 减少; <40t: 时, 电泳条 带呈弥 散分布 。因而 差异显 示 PCR 的复 性温度 多选在 40 〜 42X: 之间。 5. 同 位素标 记物对 差异显 示条带 的影响 差 异显示 PCR 常 用的同 位素标 记物有 35S、32P 及 T 叫 标记的 碱基或 T12MN, 3 种同 位 素标记 各有优 缺点。 35S 标记 dATP 分 辨力高 ,敏 感性好 ,但 高温下 易分解 、挥发 ,污 染 环境; 32P 标记的 dCTP 较稳定 ,曝光 时间短 ,但 分辨 力低; Tag 标记的 dATP 离子强 度及半 衰期介 于二者 之间, 兼二者 之优点 ,是 一种比 较好的 同位素 标记。 碱基标 记利于 长片 段显示 ,引物 末端标 记利于 短片段 检测, 二者联 合应用 有希望 展示更 多的电 泳带, 但引 物标记 的半衰 期及批 间差异 可能影 响该方 法的重 复性。 6. Tag DNA 聚 合酶对 差异显 示条带 的影响 以不同 来源的 DNA 聚合酶 进行差 异显示 PCR 时 ,约有 5% 的产物 有差异 。因 此 ,在差 异显示 实验中 最好选 用一种 来源的 DNA 聚合酶 ,以减 少实验 误差。 冯作化 主要参 考文献 从玉文 • 19%. mRNA 差别 显示技 术的研 究进展 .国外 医学分 子生物 学分册 , 18 (4): 153 〜 157. 冯作化 、皇 甫永 穆主编 . 1998. 医 学分子 生物学 .武汉 : 武汉出 版社. 金冬雁 ,黎孟 枫等译 . 1992. 分子 克隆实 验指南 .北京 : 科学出 版社. 卢圣 栋主编 . 1993. 现代 分子生 物学实 验技术 .北京 :高等 教育出 版社. 彭秀玲 , 袁汉英 ,谢毅 ,王洪 海主编 . 1997. 基因 工程实 验技术 .湖南 : 湖南科 学技术 出版社 . 颜子颖 ,王 海林译 . 1998. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 : 科学出 版社. Ausubel F. M., et al. 1996. Current Protocols in Molecular Biology. 2rd. John Viley & Sons* Inc. • 430 • 第六章 DNA 导入 哺乳动 物细胞 引 言 在 分子生 物学实 验和基 因工程 研究中 ,基 因的克 隆常只 是一个 初步的 工作。 大家所 需要 的常是 此基因 在真核 细胞中 的表达 产物, 以便分 析其生 化特性 ,或大 规模生 产其产 物以作 药用; 或者 是为了 阐明基 因表达 的调控 机理, 基因对 细胞生 物学行 为的影 响等。 为此 ,经常 需要将 所构建 的重组 DNA 导 入哺乳 动物细 胞或其 他类型 的真核 细胞中 。近 些年 来兴起 的基因 治疗技 术中, 其核心 问题及 关键步 骤即是 如何通 过适当 的方法 将外源 基因导 入人体 细胞中 ,并 使其得 到可控 的适量 表达。 这些研 究在一 定程度 上促进 了人们 对外 源基因 在哺乳 动物细 胞中的 表达等 方面上 的认识 ,并在 方法学 上促进 了该领 域及相 关 领域的 发展。 为使某 特定的 外源基 因能够 在哺乳 动物细 胞中进 行有效 的表达 ,需要 在以下 几方面 进行 准备和 研究: 将外源 基因克 隆到合 适的载 体中; 将外源 基因重 组子采 用适当 的方法 导 入合适 的哺乳 动物细 胞中; 报告 基因 或外源 基因的 表达的 检测; 外源基 因产物 的一级 结构 (N 端及 C 端的 特性) 及 可能的 空间结 构及其 特性等 。本章 节将主 要介绍 以下三 个方 面的内 容:① DNA 转 染真核 细胞的 方法; ② DNA 转 染后报 告基因 的表达 检测; ③用 逆转录 病毒载 体转导 基因。 (一) 转 染方法 的选择 将外源 DNA 导入哺 乳动物 细胞的 方法原 则上可 大致分 为两大 类:即 生物方 法和物 理化 学方法 。物理 化学方 法中又 可分为 物理方 法和化 学方法 。在化 学方法 中最常 用的有 磷酸钙 沉淀法 , DEAE 葡聚糖 转染法 ,脂 质体转 染法; 在物 理方法 中有电 穿孔法 ,此外 尚有其 他用于 较为特 殊的情 况下的 方法, 如基因 枪粒子 轰击法 ,受 体介导 的基因 导入法 等 。在 生物方 法中, 目前主 要是把 病毒作 为外源 DNA 导入 的工具 ,通过 病毒感 染将外 源 DNA 导入 细胞中 。这 种方法 的优点 在于它 具有较 高的转 染效率 ,并能 在一定 的条件 下实现 对特定 细胞的 靶向性 ,目 前主 要用于 基因治 疗的研 究中。 根据不 同的实 验目的 ,外源 DNA 导入 哺乳动 物细胞 又可分 为瞬时 转染和 稳定转 染。 瞬时转 染一般 是外源 DNA 导 入细胞 1 〜 4d 后收 获转染 细胞, 对转染 基因的 转录和 复 制进行 分析; 而稳 定转 染则需 要使外 源基因 整合于 细胞染 色体从 而得到 稳定的 转染细 胞株。 以上各 种方法 均可用 于瞬时 转染; 除 DEAE 葡聚糖 转染方 法外, 其他各 种方法 均可 用于稳 定转染 。本章 主要介 绍以上 各种转 染方法 的基本 技术和 条件。 各种转 染方法 都 存在条 件优化 的问题 ,每 种细胞 对外源 DNA 的最 佳导入 条件都 有特定 的要求 ,对于 • 431 . 不同 类型的 细咆, 有效的 转染条 件有很 大不同 。在优 化转染 效率中 最重要 的因素 是选择 合适 的转染 方案。 常常在 DEAE- 葡 聚糖介 导的基 因转移 、磷 酸钙介 导的基 因转移 、电 穿孔或 脂质体 介导的 转染方 法中进 行选择 。对 于贴壁 细胞系 ,可用 DEAE- 葡聚糖 、磷 酸钙 及脂质 体介导 的转染 方法试 验其转 染效率 。对于 非贴壁 细咆系 ,可用 电穿孔 或脂质 体 介导的 转染方 法进行 转染。 (二) 病 毒载体 如前 所述, 用病毒 作载体 也能将 DNA 导 入真核 细胞中 。病毒 载体具 有较高 的转染 效率 ,几 乎能将 DNA 导 入所有 的细胞 。某些 病毒系 统可导 致蛋白 质的超 量表达 (例如 杆状病 毒和痘 苗病毒 ), 或获 得待表 达基因 的单拷 贝稳定 整合子 (例如 逆转录 病毒载 体 )。 因此 ,病毒 载体系 统较转 染系统 有更大 的优势 。但是 ,自行 构建一 个重组 病毒及 病毒包 装系统 是非常 复杂和 困难的 ,需 要投入 大量的 研究和 精力。 好在现 在已有 多家公 司有商 品化的 病毒载 体系统 供使用 ,确定 需要构 建重组 病毒时 ,应 首先选 择现有 的商品 化病 毒载体 系统, 然后考 虑是否 加以改 造或自 行重新 构建。 最早开 始使用 也是最 常用的 病毒载 体就是 逆转录 病毒, 它一般 不是用 来超量 产生某 一蛋 白质的 ,而是 用以将 一个基 因稳定 导入一 个细胞 系或动 物体细 胞中。 因而这 类载体 可用来 在一系 列细胞 中表达 某一基 因产物 ,或 表达一 个标记 基因, 后者使 我们能 识别被 感染的 细胞及 其子代 细胞。 在本章 第三节 ,简 单综述 了逆转 录病毒 的生活 周期, 并介绍 了构 建逆转 录病毒 载体的 标准克 隆方案 。重 组体构 建好后 ,还必 须建立 一个包 装细胞 系, 转染后 ,用来 包装产 生大量 的感染 性的重 组逆转 录病毒 。然而 ,包装 细胞系 也可能 产生野 生型的 “辅助 ”逆转 录病毒 ,这 些辅助 病毒具 有复制 活性, 能够在 某些实 验中产 生严重 的干扰 。因 此必须 检测包 装制备 的重组 逆转录 病毒中 是否含 有辅助 病毒, 本章第 三节 亦介绍 了相关 的检测 方法。 (三) 哺乳 动物细 胞培养 许多用 于哺乳 动物细 胞培养 的技术 在本章 中未作 讨论。 我们特 别地假 定细胞 系的生 长和 传代的 最佳条 件已被 确定。 为了有 效地进 行转染 ,受体 细胞必 须状态 良好。 不同于 大 肠杆菌 ,哺 乳动物 细胞对 于生长 条件极 为敏感 。另外 ,由 于其倍 增时间 通常是 12 〜 24h, 它们对 于细菌 及真菌 的污染 很易感 。因 此在涉 及细胞 生长的 实验过 程中保 持无菌 状态 绝对不 能忽视 。本章 介绍的 4 种转染 方案对 细胞均 有损伤 ,因此 ,如 果在转 染前细 胞状 态不好 ,将会 导致大 量细胞 的死亡 。这意 味着那 些勉强 能维持 细咆生 长和传 代的培 养条 件可能 不能满 足转染 的要求 。下列 预防措 施及培 养液成 分对哺 乳动物 细胞转 染的成 功至关 重要: 1) 玻璃器 瓜 许多实 验室常 用溶液 即使痕 董都对 细胞具 有毒性 。因此 许多实 验室将 组织培 养用的 玻璃 器皿隔 离放置 。这种 玻璃器 皿千万 不可与 实验室 用的其 他玻璃 器皿混 在一起 。组织 • 432 • 培养用 的玻璃 器皿用 过之后 应浸泡 在水中 ,以防 止残余 的化学 物质干 涸在玻 璃壁上 。由 于这 些原因 ,在 组织培 养中常 常用塑 料制品 来移液 和贮存 试剂。 2) 水 只有蒸 馏水及 去离子 水才能 用于配 制组织 培养用 的溶液 。有些 实验室 用玻璃 蒸馏器 生产蒸 馏水, 而有些 新的研 究单位 ,其室 内的纯 水系统 足可供 利用。 3) 培养液 可 以购买 无菌的 培养液 。或购 买包装 好的预 先混合 了各种 成分的 培养粉 。在 实验室 里可一 批配制 10 〜 20L 培养液 。配 制的 培养液 必须过 滤除菌 。最 方便的 做法是 用高流 量的茱 (500mL/min) 及过 滤装置 进行。 培养 液在用 前不久 才加入 血清。 常用眙 牛血清 (FBS; 也 可写做 FCS), 但 对于某 些用 途也可 用更便 宜一些 的血清 ( 见下面 )。 其 他的添 加成分 包括谷 氨酰胺 、非 必需氨 基酸、 2- 巯 基乙醇 (2-ME)、 青霉素 及硫酸 链霉素 ,构 成“ 完全” 培养液 的配方 。然 而 ,对 于不同 的细胞 ,其 具体配 方有所 不同。 本书中 提到的 培养液 一词指 的是基 本培养 液 以及血 清的百 分含量 。如“ 完全的 DMEM-10” 指的是 DMEM 加 10% 血清及 上述其 他 成分。 4) 血清 可购 买马、 牛及胎 牛血清 。应用 血清时 ,据 认为 是利用 了其中 的一种 尚未完 全确定 的物质 ,该 物质维 持特定 细胞生 长的能 力变化 相当大 。因此 ,对于 每种培 养用途 ,应 “筛 选”血 清以确 定它是 否能支 持所要 培养的 细胞的 生长。 这种筛 选也能 用来测 定血清 是否过 度刺激 所培养 的细胞 的生长 ,从而 导致背 景反应 的增高 。没 有一种 简单的 办法可 用来筛 选大批 的血清 ,因 为某一 特定批 次的血 清是否 合适只 有在具 体应用 时才能 确定。 我们建 议为了 对某一 给定的 细胞群 进行深 入研究 ,可 以从一 家或多 家厂商 获取少 量的不 同批次 的血清 ,但 其先决 条件是 厂商同 意保存 大量的 这些批 次的血 清以履 行可能 的订货 合约 。这些 不同批 次的血 清即用 来在所 要进行 的实验 (如增 殖实验 ,短暂 转染实 验等) 中进行 试验, 从而决 定哪一 批次活 性最高 而背景 值最低 (背 景是指 不加特 殊刺激 物时的 反应 )。 据此 ,对具 有这种 特性的 批次就 可大量 地买进 ,而其 他批次 则予以 “释放 ” ( 允 许 卖给其 他买家 )。 一 般来说 ,用于 维持长 期培养 物的血 清要进 行灭活 (561C, lh)。 有 的实验 室认为 热处理 是为了 减少病 毒及其 他可能 的污染 ,另 一些实 验室则 认为是 为了灭 活补体 。因 此 ,这 形成了 在应用 某一特 定批次 的血清 前的一 种标准 的做法 ,尽 管据称 这样做 也具有 不 利影响 (即灭 活了某 些生长 因子及 产生对 细胞具 有毒性 的热不 稳定血 清成分 )。 可酌 情试 验某一 定批次 的血清 不加热 灭活是 否能提 高其促 进生长 的功能 。尤其 是在培 养难以 培 养的细 胞时。 由于血 清的价 钱昂贵 ,在一 些短时 间的操 作如洗 细胞时 ,可 用低百 分含量 (5%) 血清的 培养液 。另外 ,小 牛血清 的价格 较胎牛 血清便 宜大约 10 倍 。有时 可用来 代替胎 牛 血清进 行短期 的实验 。所有 血清均 保存于 -20X:。 5) 添 加成分 许多研 究者在 哺乳动 物细胞 培养液 中加抗 生素以 防污染 ,最有 效的添 加物是 硫酸庆 大霉素 ,购 买时为 50mg/mL 溶液 。工作 浓度为 20~5(Vg/mL。 稍 微便宜 一些的 (但稳 • 433 • 定性和 效果也 稍差) 的抗 生素是 青霉素 (50 〜 lOOU/mL) 及硫酸 链霉素 (100Mg/mL) 的混 合物。 要注意 ,在培 养液中 加抗生 素可能 掩盖组 织培养 技术中 的草率 。草率 的技术 操作可 能会导 致培养 液被对 抗生素 不敏感 的生物 体污染 ,如 支原体 。有些 实验室 因此不 使用抗 生素, 以保证 严格的 无菌性 。一 些实验 还需要 在培养 液中加 入其他 成分, 如核苷 酸 或药物 。这 些溶液 应该用 组织培 养专用 的玻璃 器皿或 塑料器 皿配制 。应 小心避 免使用 搅拌棒 或有可 能污染 痕量的 实验室 化学物 质的其 他物品 。溶 液应用 Nalgene 滤 器过滤 除菌。 在 培养液 中常加 2- 巯 基乙醇 ,但 其确切 的作用 方式尚 未阐明 。对于 已建株 的细胞 系的 生长, 2- 巯基 乙醇似 乎并不 重要, 但已证 明对于 原代培 养则是 一种很 重要的 成分。 2- 巯基 乙醇必 须在临 用前加 入培养 液中, 因为其 活性在 稀释状 况下很 快下降 。因此 ,将 浓的 2- 巯 基乙醇 (14.3mol/L) 用 HBSS 或 PBS 稀释至 50mmol/L, 此溶 液在加 入培养 基 时的终 浓度为 50pmol/L。 50mmol/L 的贮液 置于约 4X: 保存, 4 个月后 更换。 其 他试剂 均在用 前加入 培养液 。它 们常以 100 X 或 200 X 的浓 度大批 配制, 适量分 装 保存直 到应用 。含有 L- 谷 氨酰胺 、非必 需氨基 酸及抗 生素的 贮液应 保存于 -201C。 含有 HEPES 贮液应 存放在 室温。 6) 胰 蛋白酶 /EDTA 含有 0.5% (m/V〇 胰蛋 白酶及 0.2% (m/V) EDTA 的缓 冲盐溶 液被用 来从培 养皿上 消化分 离贴壁 生长的 细胞。 这种溶 液可购 买到。 第一节 DNA 转染真 核细胞 一、 磷酸钙 转染法 有 两种以 磷酸钙 为基础 的真核 细胞转 染方法 ,可用 于短暂 的和稳 定的转 染方案 。在 这两种 方案中 ,质粒 DNA 通过 一个沉 淀过程 黏附于 细胞表 面并被 导入到 单层培 养的细 胞中 。一 种方案 是使用 HEPES 缓 冲液形 成一种 能直接 沉积在 细胞上 的磷酸 钙沉淀 。在 另一种 高效的 方法中 ,使用 BES 缓冲 液可使 沉淀在 培养基 中逐步 形成并 沉积在 细胞表 面 。这 种方法 对于环 状质粒 DNA 进行 稳定转 化尤其 有效。 对于转 化线状 DNA、 基因组 DNA 或进 行瞬时 表达, 这两种 方法效 率无明 显差异 。两种 方法均 需要高 质量的 DNA。 (一) 用 HEPES 中形成 磷酸钙 -DNA 沉 淀转染 1. 原理 HEPES 缓冲 盐水与 含有氯 化钙及 DNA 的溶液 缓慢混 合可形 成含磷 酸钙和 DNA 的 沉淀。 依据不 同的细 胞类型 ,平 皿上最 多能有 10% 的细胞 能吸收 DNA 沉淀 。用 甘油或 二甲基 亚砜进 行休克 ,可增 加某些 类型的 细胞对 DNA 的 吸收。 2. 材料 呈 指数生 长的真 核细胞 (如 HeLa, BALB/c3T3, NIH3T3, CHO, 或鼠胚 眙成纤 • 434 • 维细胞 ) 完全 培养液 (依 所用的 细胞系 而定) 氯化 铯纯化 的质粒 DNA(5 〜 lOpg/ 次转染 ,二次 纯化) 2.5m〇l/LCaCl2 ( 过滤 除菌, 10mL 分装 , -20X: 分装 贮存) 2XHEPES 缓 冲盐水 (HeBS) ( 16.4g NaCl, 11 .9g HEPES 酸 , 0.21g Na2HP04, 80〇11111^20,用5111〇1/1^1^01^滴定至?幵7.05,检测转染效率,5〇11^-201:分装 贮存) 磷酸 缓冲液 (PBS) 37t:, 5%C〇2 的加湿 培养箱 10cm 组织培 养平板 15mL 锥形管 , 乙 醇沉淀 的试剂 和材料 3. 操 作步骤 (1) 在转 染前一 天将细 胞分入 10cm 组 织培养 平板中 。当 被转染 的细胞 是贴壁 细胞, 倍增 时间为 18~24h 时, 一般按 1:15 从长满 的培养 皿中分 细胞效 果较好 。转 染的 当天, 细胞应 在培养 皿中很 好地分 散分布 ,在 加入 沉淀前 2~4h, 用 9mL 完 全培养 液培养 细胞。 在 细胞培 养皿中 进行转 染所需 的细胞 密度因 细胞类 型和转 染目的 的不同 而不同 。最 佳细胞 密度是 当 在细胞 被收获 或被分 入到选 择性培 养基时 为接近 长满的 密度。 (2) 将要 转染的 DNA 用乙 醇沉淀 (10 〜 5(Vg/10cm 平板 ), 空 气中晾 干沉淀 。将 DNA 沉淀 重悬于 450/iL 无 菌水中 ,加 50^L 2.5mol/L CaCl2。 要进行 转染的 DNA 需用 CsCl 梯度离 心纯化 两次。 超螺旋 DNA 的转 染效果 最好。 DNA 中 杂质能 减低转 染效率 。乙 醇沉 淀同时 为转染 DNA 进 行灭菌 。转染 所需的 DNA 在进行 3~4d 的 沉淀后 收集, 但这 个过程 并不是 必需的 。对于 瞬时转 染实验 ,许 多研究 者直接 使用含 DNA 的 水溶液 450HL, 并不 经过乙 醇沉淀 。使 用这种 方法时 ,需小 心保持 溶液中 Tris 的量 在极低 的水平 。因为 Tris 可改变 沉淀的 pH, 因此降 低转染 效率。 (3) 加 50(VL2XHeBS 于一 无菌的 15mL 锥形 管中, 将机械 式移液 器安上 lmL 或 2mL 吸头 ,一 边吹打 2xHeBS, 一边用 巴斯德 吸管逐 滴加入 DNA/CaCl2 溶液, 随即在 旋涡 混合器 上振荡 5s。 将其 在室温 下静置 20min 以形成 沉淀。 如果没 有机械 移液器 ,可用 经一个 滤器与 一个移 液管相 连的橡 皮管进 行吹打 ,滤器 要保证 无菌。 但这 种方法 不能与 机械移 液器产 生一样 的重复 结果。 (4) 用 一支巴 斯德移 液管将 沉淀均 匀加入 10cm 平板的 细胞中 ,轻 轻晃动 混合。 (5) 在标准 生长条 件下培 养细胞 4 〜 16h。 除去 培养液 ,用 5mL lx PBS 洗细胞 2 次 ,加 10mL 完 全培养 液培养 细胞。 沉 淀加入 到细胞 中的时 间因细 胞类型 的不同 而不同 。对 于易于 培养的 细胞如 HeLa、 NIH3T3 及 BALB/c3T3, 沉淀 可保留 I6h。 而其 他细胞 在这么 长的混 合时间 下不能 存活。 (6) 对于 短暂分 析实验 ,可在 既定的 时刻收 集细胞 。对 于稳定 转化, 让细胞 生长两 个 倍增时 间后分 入培养 皿中进 行选择 培养。 • 435 . (二) 用甘油 和二甲 基亚砜 使哺乳 动物细 胞休克 附加 材料: 用完全 培养液 配制的 灭菌的 10% (V/V) 甘 油溶液 或二甲 基亚砜 溶液。 对于细 咆株如 HeLa、 NIH3T3 及 BALB/C3T3 和小 鼠的 胚胎纤 维细胞 ,上 个方案 是有 效的。 有些细 胞系如 CHODUKX 以甘油 或二甲 基亚砜 进行休 克处理 ,转染 效率可 急剧 增高。 DNA/ 磷酸钙 沉淀仅 在细胞 中保留 4 〜 6h, 移去沉 淀后立 即对细 胞进行 休克。 如 果需要 ,上 个方案 的步骤 (5) 可用以 下步骤 替代: (5a) 培 养细胞 4 〜 6h 后弃去 培养液 。加入 2mL 10% 甘油 溶液, 在室温 下静置 3min〇 可 选择用 10% 或 20% 的二甲 基亚砜 。二 甲基 亚砜一 般对细 胞的损 害较小 ,但同 时可能 效果也 稍差。 (5b) 加 5mLlxPBS 至细 胞的甘 油液中 ,混合 ,弃 去溶液 。用 5mLlxPBS 洗细 胞 2 次 ,加 培养液 培养。 在移去 甘油溶 液前用 PBS 稀释 的步骤 很重要 ,因为 它可避 免细胞 过长时 间地置 于甘油 中而被 杀死。 (三) 用 BES 中 形成的 磷酸钙 -DNA 沉淀高 效转染 1. 原理 将一 种含有 CaCl2 、质粒 DNA 和 BES 缓 冲液, pH 为 6.95 的 溶液加 入到含 有培养 液的 细胞培 养板中 ,这些 平板在 3% 的 C〇2 的环 境下孵 育过夜 ,同时 磷酸钙 -DNA 复合 体在 此条件 下逐渐 生成。 用这 种方法 , 10%~50% 的细胞 可稳定 地整合 和表达 转染的 DNA。 在这种 情况下 的短 暂表达 与第一 个方案 中的结 果近似 。甘油 或二甲 基亚砜 的休克 不能增 加转化 细胞的 数量。 2. 材料 指数 生长的 哺乳动 物细咆 完全 培养液 (DMEM, 1% 的胎牛 血清) CsCl 纯化 的质粒 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH 8.0, lmmol/L EDTA) 2.5mol/LCaCl2( 过 滤除菌 , lOmL 分装, -20C 分装 贮存) 磷酸盐 缓冲液 (PBS) 2XBES 缓冲液 (BBS) [50mmol/LBES, 280mmol/LNaCl, 1.5mmol/LNa2HP04’ 调 至 pH 6.95, 过滤 灭菌, -20X: 分装 贮存] 10on 组织培 养平板 35X: 3% C〇2 的加湿 培养箱 • 436 • 35 〜 37X: 5% C02 的加湿 培养箱 FYTITE 空气 分析仪 (可 选择) 3. 操 作步骤 (1) 转染前 一天接 种呈指 数生长 的细胞 ,密 度为 5xi〇5/l〇cm 平板 。加 l〇mL 完全 培养液 。在 开始转 染时细 胞数应 <106/ 平板 ,以留 足够供 细胞扩 增至少 2 倍的表 面积。 (2) 用 TE 缓 冲液稀 释质粒 DNA 至 l;ig/pL, 4X: 保存。 质粒 DNA 的 纯度非 常重要 ,应进 行质粒 纯化以 得到具 有适合 纯度的 DNA。 分别用 lO^g、 20吨、 30fig 质粒 DNA 转染 3 个 培养皿 的细胞 ,培养 过夜, 决定所 用质粒 DNA 的 最适量 。用 l〇〇x 放大 倍数的 显微镜 检査培 养皿, DNA 浓 度合适 时将形 成均匀 的颗粒 状沉淀 。当 DNA 浓度过 低时, 沉淀呈 粉碎状 。当 DNA 高 于最佳 浓度时 ,形成 微量的 沉淀。 (3) 将 最适量 的质粒 DNA 与 500/iL 0.25mol/ll CaCl2 混合 ,加入 500pL 2 x BES 中 ,混匀 ,室温 下温育 10 〜 20min。 (4) 将 磷酸钙 -DNA 溶液逐 滴加入 含有培 养液的 培养皿 细胞中 ,同时 晃动培 养皿。 在 35X: 3% C02 培养箱 中温育 15~24min。 CO: 的水平 很关键 。在 细胞 温育之 前可用 Fyrite 气 体分析 仪检测 CCb 的百分 含量。 (5) 用 5mLPBS 洗细 胞两次 ,加入 10mL 完全培 养液。 对于稳 定转化 ,在 35 〜 37t:5%C〇2 培养箱 中培养 过夜; 对于短 暂表达 ,加入 DNA 后培 养细胞 48 〜 72h。 (6) 在 开始选 择稳定 的转化 细胞前 ,根据 宿主细 胞的生 长率按 1:10~1:30 分传细 胞 。于 35 〜 37X: 5% C〇2 培养箱 中培养 过夜。 (7) 将培 养液换 成选择 培养液 ,或 在适当 的选择 条件下 培养细 胞进行 选择稳 定的转 化子。 (四) 质粒 DNA 的纯化 1. 原理 质粒 DNA 的 质量非 常重要 。用简 单或快 速提取 法得到 的质粒 DNA 在本方 案下效 果不好 。当 毒性 出现时 ,通 常是因 为质粒 DNA 的准备 不恰当 ,例 如质粒 DNA 通过含 有 对细胞 培养具 有毒性 杂质的 DOWEX 柱。 按下述 改良的 溶菌酶 -Triton 方法进 行质粒 DNA 的制备 ,用 以上 方案进 行转染 ,均 可获 得稳定 且较高 的效率 。该方 法的产 量约为 lmg 质粒 DNA/L 培 养液。 2. 材料 含 有质粒 DNA 的 大肠杆 菌菌株 10mg/mL 氯霉素 蔗糖 /Tris/EDTA 溶液 (25% 蔗糖, 50mmol/LTris-HClpH8.0, 40mmol/LEDTA pH 8.0) 10mg/mL 鸡蛋清 溶菌酶 (Sigma; 用蔗糖 /Tris/EDTA 溶液新 鲜配制 ) • 437 . Triton 裂解 混合液 (2% Triton - 100, 50mmol/L Tris-HCl pH 8_0, 40mmol/L EDTA pH 8.0) 氯化铯 lOmg/mL 溴 化乙键 氯化铯 /TE 溶液 : lOOmLTE 缓冲液 /100g 氯化铯 ,加 或不加 0.2mg/mL 溴 化乙锭 (可选 ) 1:1 (V/V) 酚 / 氯仿 0.5% (V/\〇 SDS (TE 缓冲 液中) 无 水乙醇 Beckman J-6B 低 速离也 、机及 1L 谷量的 离也 、瓶。 Beckman 35 型, VTi65 型及 S5-34 型转子 或相当 转子。 5mL 快速封 口超速 离心管 37X: 水浴箱 ,附 加乙醇 沉淀的 试剂和 设备。 3. 操 作步骤 (1) 培养 1L 含有质 粒的大 肠杆菌 菌株至 OD6eQ 为 1.0, 加入 固体氯 霉素至 150#/ mL, 培 养过夜 。在 1L 离 心瓶中 4t:, 130〇xg 离心 30min。 (2) 将细菌 重悬于 10mL 蔗糖 /Tris/EDTA 溶液中 。力卩 2mL 新鲜 配制的 10mg/mL 溶菌酶 ,轻 轻混合 ,室温 下温育 不超过 30min。 (3) 加入 4mL Triton 裂解混 合液, 37*C 温育 不超过 30min, 间 或轻摇 一 下。 69 000 Xg 离心 30min。 倾出 上清并 测量其 体积, 不要有 任何胶 状物。 (4) 每毫升 上清加 0.95g 氯化铯 ,完 全溶 解并加 O.lmL 10mg/mL 溴 化乙锭 溶液。 用 Sorvall SS-34 转子 7000r/min 离心 20min。 (5) 将 上清移 入一个 5mL 超离 心管中 ,必 要时, 在其上 覆盖以 CsCl/TE 溶液 ,并 封口。 260 000 xg 离 心过夜 ,分离 质粒。 (6) 吸 出质粒 (较下 ) 区带 ,加 入另一 个超离 心管中 ,上 面覆盖 以含有 0.2mg/mL 溴化 乙锭的 CsCl/TE 溶液, 封口。 260 000xg 离心 过夜。 (7) 取 出质粒 (较下 ) 区带 。用 1:1 酚 / 氯 仿抽提 2 次 ,上层 是酚相 ,含有 溴化乙 锭。 除去上 层液相 ,注意 不要吸 掉界面 上含有 DNA 的 白色层 。测 量下层 液相的 体积并 移至干 净管中 ,加入 2 倍 体积水 ,混合 ,然 后加 6 倍体 积的无 水乙醇 (66% 终浓度 )。 置于 -201C 沉淀 过夜。 (8) 4t: 300〇xg 离心 20min。 弃 去上清 ,用 真空干 燥器或 SPEEDVAC 蒸发 器晾干 沉淀。 (9) 将沉 淀溶于 lmL 0.5% SDS (TE 缓冲 液中) 中。 重复酚 / 氯 仿抽提 ,这 一次要 保留上 层液相 ,将 白色层 留在界 面不要 吸去。 (10) 用乙 醇沉淀 2 次 ,将沉 淀溶于 TE 缓冲 液中, 4X: 保存。 • 438 . (五) 方 法评注 1. 背 景资料 磷酸钙 转染法 最初被 Graham 和 van. Daeb (1973) 用于将 腺病毒 DNA 转入 哺乳动 物细胞 ,后来 研究发 现此种 技术能 将外源 基因导 入动物 细胞。 磷酸钙 介导的 转染比 DEAE- 葡聚 糖介导 的转染 在产生 稳定细 胞株的 方面更 有效, 可能是 因为磷 酸钙转 染中的 细胞比 DEAE- 葡聚 糖介导 的转染 的细胞 能更多 地摄取 DNA。 磷酸 钙转染 的另一 主要优 势是转 染后的 细胞通 常是只 含有沉 淀中不 同质粒 的一种 ,因此 ,当 两种 质粒以 10:1 被 转染时 ,所得 到的含 两种质 粒的转 染细胞 的比例 也会为 10:1。 这种以 HEPES 为基 础的方 法以前 被用来 分析和 复制启 动子。 它曾是 现代使 用最为 广泛的 瞬时转 染方案 ,在 转染 48 〜 60h 后 即可收 获细胞 ,产 生稳定 转染的 细胞株 。以 BES 为 基础的 高效磷 酸钙转 染是对 标准磷 酸钙方 法的优 化得来 。此 种方法 使用的 缓冲系 统最 初是为 噬菌体 微粒介 导基因 转移而 研究出 来的。 使用这 种缓冲 体系, 15~24h 内可 在培养 基中逐 渐形成 磷酸钙 -DNA 沉淀 ,并依 附于细 胞表面 。这种 方法在 用于稳 定转染 最 常见的 哺乳动 物成纤 维细胞 和内皮 细胞时 ,比 其他方 法高出 10~100 倍的 效率。 2. 重 要参数 磷 酸钙转 染非常 不稳定 ,即使 操作熟 练者也 经常没 有理想 的结果 。最 常见的 失败的 原因是 2 XHeBS 的 pH 不准确 ,转染 所需的 pH 范围 很窄, 在贮存 过程中 pH 可能 改变, 所 以旧的 2xHeBS 溶 液不能 产生好 的效果 。许多 学者还 发现, 长时间 放置的 2.5md/L CaCl2 溶液会 变质。 如果转 染效果 不好时 ,这两 种溶液 应重新 配制。 第二个 问题是 当转染 进行时 ,培 养基的 pH 可能 会转成 酸性。 在出现 大量沉 淀时这 种情况 会出现 (培 养基为 橘红色 ), 通常 会导致 细胞的 死亡。 应小心 地保持 pH 在 7. 2 〜 7.4, 以及 适当的 C02 的浓度 。仅 仅有 适宜细 胞生长 的温箱 和培养 条件并 不能满 足磷酸 钙 转染的 需要。 使用 BES 方案可 取得高 效率, 有几个 参数非 常重要 : 2 XBES 的 pH、 沉淀 形成时 的 C02 浓度 、使用 DNA 的 形态和 数量。 因为 2 x 的中 小的变 化就能 极大的 影响转 染效率 ,所 以应该 做一张 2 XBES 缓冲液 的 pH 曲线。 用不同 pH 的缓 冲液做 预实验 ,得出 的最佳 pH 在一个 很窄的 范围内 (6. 95 〜 6. 98)。 一 旦发现 最佳的 缓冲液 ,以它 作为参 照配制 缓冲液 贮存液 。如果 没有沉 淀形成 ,可能 〇3(:12或2\8£5 有缺陷 。把 两种溶 液滴入 DNA 中 之前必 须完全 混合, 加入 CaCl2 后 出现结 晶显示 CaCl2 的浓度 不对, 这种情 况下必 须重做 转染。 最 初的孵 育过夜 需要在 3% (:02浓 度下, C〇2 浓 度可有 0.5% 上下的 波动? 经过此 步孵 育后, 培养基 为碱性 (pH 7.6)。 使用前 要测量 C02 水平。 使用 BES 方案进 行基因 转入, 只有使 用质粒 DNA 才能 得到高 效率, 而且还 要依靠 DNA 的浓度 和纯度 。依照 上述方 案制备 的质粒 DNA 对 细胞少 有毒性 。但 在普通 纤维细 胞和内 皮细胞 中发生 毒性是 由于质 粒不纯 导致的 ,而 不是 磷酸钙 引起的 。不同 DNA 提 取方法 、培 养基 、细胞 株所需 的最佳 DNA 浓度值 也不同 ,所 以每 种新的 质粒的 抽提法 • 439 • 均需要 进行最 佳转染 DNA 浓度的 测试。 如果怀 疑—种 特别的 质粒抽 提方法 有毒性 ,使 用对 照质粒 —— 一种已 知无毒 质粒来 验证 其毒性 。如 果质粒 DNA 有毒性 ,则 用上述 方案制 备新的 DNA。 当使用 cDNA 文库 做 转染时 ,应 包括酚 / 氯仿 抽提前 SDS 处理 和乙醇 沉淀。 使用 BES 方法进 行共转 染的效 率是使 用基础 方法的 1〇 〜 20 倍 。尽管 因使用 质粒和 标记 基因的 不同, 转染效 率不同 ,这 里推荐 可选择 标记和 不可选 择标记 基因的 比例为 1:10。 转染 效率是 由最佳 DNA 浓度 决定的 ,使 用这种 方法时 ,甘油 休克和 DMSO 处理 并不 能提高 转染细 胞数。 对于 生长在 10% 胎 牛血清 (FCS) 的 DMEM 培 养基的 细胞, BES 方 案效果 较佳。 RPMI 和 a- 少量必 需培养 基效果 也挺好 。使用 前至少 需在两 个细胞 株中对 FCS 进行生 长 、铺 板率和 转化率 的检测 ( 血清不 经过加 热灭活 )。 由于 FCS 价格 昂贵, 为代替 10% 的 FCS 可 在培养 基中加 10% 新生牛 血清和 5% 的胎 牛血清 (血清 总量为 75mL/500mL 培养基 ), 稳定转 染效果 不变。 新生牛 血清的 促生长 作用因 产品批 次不同 而不同 ,使用 前需进 行检测 。如 果用马 血清或 其他动 物血清 ,或 其他培 养基, 需对其 最佳条 件进行 检测。 对于大 多数已 建立的 单层细 胞株, 如小鼠 、大鼠 、仓鼠 、猴 和人类 细胞株 ,使用 BES 方案的 效果好 。对于 神经细 胞效果 不好。 这也许 是因为 Ca2+ 对神经 细胞的 有害影 响所致 。对 于悬 浮细胞 ,使用 BES 方案的 转染效 率很差 ,但 它的 稳定转 染效率 比基础 方案好 ,几 乎与电 穿孔法 持平。 3. 预 期结果 因细 胞株和 其他参 数不同 ,磷 酸钙介 导的转 染效率 也不同 。使用 HEPES 为 基础的 方法 ,将 含有显 性可选 择基因 的质粒 1# 转入 106 个 细胞中 ,最多 可得到 103 个 克隆。 使用 BES 为基础 的方法 ,稳 定转 染的效 果通常 可提高 10 〜 100 倍 ,有 10% 〜 50% 的平 板细胞 被整合 。瞬时 转染的 效率两 种方法 近似。 4. 时 间安排 制备 12 次 DNA 沉淀, 并将沉 淀加入 到细胞 中需要 1 〜 2h, 此 段时间 在没有 乙醇沉 淀的 情况下 可减到 。 (3) 吸去 培养液 ,用 l〇mL 1 x PBS 洗涤 培养皿 ,再用 4mL 完全 DMEM-10 NS 洗 1 次。 NuSerum 比小牛 或胎牛 血清更 能使细 胞耐受 DEAE- 葡聚 糖混合 物的作 用时间 ,从 而增加 转染效 率3 使用小 牛或胎 牛血清 ,过 度大量 的沉淀 可导致 细胞大 片死亡 。所用 WANS 的体积 因培养 容器大 小而异 ,见 下表 [无论 容器大 小如何 ,在 转染 时细胞 应达到 30% ~50% 汇片, 见步骤 (1)]。 容器 10 % NuSerum (mL) 150cm2 培养瓶 1〇 10cm2 培养皿 4 60mm2 培养皿 2 35mm2 培养皿 1.5 (4) 将 DNA 缓慢地 (同时 不断晃 动试管 ) 加入 80/xL 预热的 lOmg/mLDEAE- 葡聚 糖 /TBS 中 。用 200ML 的 移液器 逐滴加 120^LDNA/DEAE- 葡 聚糖至 每个培 养皿中 ,使 其 均匀地 覆盖整 个培养 皿表面 。当 液滴撞 击培养 液时, 可见一 黄色的 小圆环 。轻 轻旋动 使之均 匀一致 ,直到 获得一 致的红 颜色。 这种现 象表明 DNA/DEAE 葡聚 糖被均 匀地加 入到 细胞中 。在 加湿的 C〇2 培养箱 中培养 4h ( 对某些 类型的 细胞可 短一些 )。 DEAE- 葡 聚糖在 培养液 中的终 浓度是 20(Vg/mL。 然而 对于转 染某种 特定的 细胞, 其最适 浓度必 须 经过试 验而定 。修改 DEAE- 葡聚糖 的浓度 ( 假定在 10cm 培 养皿中 4mL NuSerum), 可根据 如下样 板缩放 其体积 : DEAE- 葡聚糖 在培养 液中的 终浓度 / (fxg/mL) DNA/TBS 10mg/mL /pL DEAE- 葡聚糖 / fjL 总体积 /^tL 400 80 160 240 200 40 80 120 100 20 40 60 50 10 20 30 当 DNA 与 10mg/mL 的 DEAE 葡 聚糖的 总体积 <60mL, 不要 将其逐 滴加入 到平板 的培养 液中。 相反 ,将 DEAE- 葡 聚糖加 入到一 个含有 4mL 完全 DEME-10NS 的无 菌管中 ,吹 打数次 ,再滴 加到细 胞中 。为了 DEAE- 葡 聚糖的 终浓度 <50Mg/mL。 使用 lmg/mL 的 DEAE-DEXTRANS 贮 存液。 37X: 组织培 养箱放 置平板 4h。 一 般需要 4h, 有些类 型的细 胞在较 短的时 间时效 果更好 ,有 些可 短到 30min。 (5) 从培 养皿中 吸去含 DNA/DEAE- 葡 聚糖的 培养液 。力卩 5mL 10%DMSO/PBS 冲 击细胞 。室温 下放置 lmin。 吸去 DMSO, 用 5mL 1 XPBS 洗 1 次 ,吸去 。每个 培养皿 中加 10mL 完全培 养液。 (6) 培 养细胞 ,在适 当的时 间进行 分析。 转 染基因 表达的 起始和 周期在 各种类 型的细 胞间是 不同的 。对 于许多 细胞, DMSO 休克后 数小时 便 能产生 RNA, 很快蛋 白质开 始聚集 , 分泌蛋 白质在 转染后 24h 内出 现在培 养液中 。相反 , 一些细 胞在 DMSO 休克 数天后 开始表 达转染 基因; 同理 ,表 达周期 也是从 一天到 几周。 • 442 • (二) DEAE- 葡 聚糖整 批转染 1. 原理 在这种 方案中 ,一个 25cmX25cm 的 培养皿 中的大 量细胞 被转染 。第 二天, 将细胞 用 胰酶消 化下来 ,并分 别种到 6 个 相同的 10cm 培 养皿中 。这 6 个皿 可分为 3 组 ,每组 2 个皿 。一 个进行 处理, 另一个 为对照 。这种 方法可 保证板 间差异 最小。 2. 操 作步骤 (1) 在 25cmX25cm 培养皿 中接种 3X106 小鼠 L 型成纤 维细胞 ,加 60mL 完 全培养 液。 培养 3d 至细胞 30% ~50% 汇片 。共需 60mL 完全培 养液维 持细胞 生长。 (2) 乙 醇沉淀 DNA, 重悬于 360pL TBS 中 。将 DNA 加入 720^L 预热的 10mg/mL DEAE- 葡聚糖 /TBS 中 。将 DNA/DEAE- 葡聚 糖加入 36mL 完全 DMEM-10NS 中。 (3) 吸 去细胞 培养液 ,加入 DNA/DEAE- 葡聚糖 混合液 ,在 加湿 5%C〇2 培养 箱中, 37t: 培养 。皿必 须平放 ,以 防止部 分区域 没有被 混合液 覆盖。 (4) 吸去培 养液, 细胞加 30mL10%DMSO/PBS 休克 lmin。 吸去 DMSO, 用 30mL lx PBS 洗 培养皿 ,吸去 ,加入 60mL 完全培 养液。 37X: 培养 过夜。 (5) 吸去 培养液 ,用 35mL lx PBS 洗 2 次 。将细 胞分入 6 个 10cm 培 养皿中 ,收集 细胞, 并进行 分析。 对于小 鼠淋巴 细胞, 分种细 胞需用 25mL 的胰酶 消化。 如果需 要延长 胰酶孵 育时间 ,每隔 几分钟 振动培 养皿以 确保细 胞与胰 酶接触 ,坚持 避免细 胞团块 以保证 所有平 板所得 的细胞 相同。 6 个 10cm 皿的 总面积 是一个 25cmX 25cm 皿 面积的 75%。 如果细 胞经过 长时间 的恢复 ,可 将其进 一步的 稀释以 避 免长满 。这种 方法使 细胞分 为几组 ,每 组接 受不同 的处理 ,这可 以消除 任何皿 间因转 染效率 不同而 得到 的变化 ,并 特别适 用于各 时段的 实验, 2 个或 3 个皿 接受相 同的处 理结果 无明显 差异。 (三) 悬浮细 胞的转 染 _ 本 方案已 成功地 用于转 染悬浮 培养的 淋巴细 胞系。 1. 附 加材料 悬浮 TBS (STBS) 溶液 (25mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 137mmol/L NaCl, 5mmol/ LKC1, 0.6mmol/LNa2HPO4, 0.7mmol/LCaCl2, 0.5mmol/LMgCl2, 使用蒸 馏水配 制 ,过 滤除菌 ,亦 可配制 10 x STBS, 使用 时用水 稀释至 IX 的工 作液) 10mg/mL DEAE- 葡聚糖 ,用 STBS 配制 无血清 培养液 灭菌 50mL 聚丙 烯试管 Beckman JS*4. 2 转 子或相 当转子 • 443 • 2. 操 作步骤 (1) 用乙 醇沉淀 DNA (约 l(Vg/2xl〇7 细胞 ), 晾干 ,沉淀 重悬于 0.5mLSTBS 溶 液中。 2X107 个细 胞需转 染大约 10/ig 的 DNA。 其他 与转染 有关的 参数, 需根据 细胞类 型优化 。转染 时细胞 应处于 对数生 长期。 (2) 将 2X107 细 胞置于 无菌的 50mL 聚丙烯 管中, 64〇xg 室温 下离心 5min, 细胞 用 5mL 预热的 STBS 溶 液洗涤 ,再次 离心。 (3) 用 STBS 溶 液配制 0.5mL 2XDEAE- 葡聚糖 ,将 其加入 0.5mL DNA 溶液中 [见 步骤 (1)], 混合。 将细胞 重悬于 l.OmLDEAE- 葡聚糖 /DNA 溶液中 ,温育 30 〜 90min。 每隔 30min 弹击管 子外侧 1 次以分 散细胞 ,防止 其聚集 成团。 细胞株 不同, 最适的 DEAE- 葡聚糖 浓度在 100~500Mg/mL 之 间变化 。使用 时可即 时稀释 10mg/ mL 的 DEAE- 葡聚糖 贮存液 。温育 的具体 时间视 细胞系 而定, 并应进 行条件 优化。 (4) 逐 滴加入 DMSO, 直至终 浓度为 10%, 不断 旋动以 确保迅 速混合 。室温 下温育 2 〜 3min〇 (5) 加 15mL STBS 溶液, 300 x g 离心 5min。 加入 STBS 稀释 DMSO 以使 DMSO 休克 不长于 2~3min。 (6) 细胞 重悬于 lOmLSTBS 溶液中 ,再 次离心 。用 无血清 培养液 10mL 洗 细胞。 (7) 细胞以 (2X105) ~ (l〇Xl〇5) /mL 的密度 重悬于 完全培 养液中 ,培 养至可 收集细 胞及进 行分析 ,一 般在 转染后 48h。 应 重悬细 胞至一 个使它 们再收 集前可 以生长 的浓度 。通 常转染 DNA 的 高峰表 达大约 在转染 48h 后。 (四) 用 氯喹处 理细胞 有 些研究 者声称 ,氯 喹二磷 酸盐可 明显提 高转染 效率。 但另一 部分人 则认为 其弊多 利少 。细胞 在氯喹 二磷酸 盐中时 需要严 密观察 ,因 为它 具有极 大的细 胞毒性 。如 果细胞 的状况 恶化时 , 必须立 即更换 培养液 。对 标准方 案进行 修改, 在步骤 (4) 加 DNA/ DEAE- 葡聚 糖之后 ,立刻 将氯喹 加入培 养液: (4a) 在培 养液中 加入氯 喹二磷 酸盐至 终浓度 l〇〇Hm〇l/L, 立 即混合 ,温育 不超过 4h。 按标准 方案继 续进行 后面的 操作。 (五) 方 法评注 1. 背 最倌息 哺 乳动物 细胞经 DEAE- 葡聚糖 处理后 , 可摄取 DNA 并将 其运输 到核内 。这 种现象 的 机制还 不清楚 ,通 常假设 为含有 DNA 和 DEAE- 葡 聚糖的 大复合 体黏附 于细胞 表面, 后经内 吞入胞 。尽 管机 制不清 ,但可 以确定 ,葡 聚糖 介导的 DNA 转染具 有很高 的重复 性 (高于 磷酸钙 转染法 ), 是 一种研 究不同 类型细 胞中基 因表达 的有效 方法。 瞬时转 染后细 胞的基 因表达 根据以 下方法 进行分 析:① 收集细 胞提取 物进行 报告蛋 • 444 • 白 的分析 ,如 CAT; ② 分析转 染后细 胞的培 养基以 发现分 泌蛋白 (如 人类的 生长因 子 ); ③收集 细胞的 RNA; ④ 收集细 胞核进 行转录 分析; ⑤免疫 组化。 一 旦质粒 进入经 DEAE- 葡聚糖 转染的 细胞后 ,它 将很 快聚集 到含有 微染色 体的核 小体中 。使用 DEAE- 葡聚糖 方案, 几乎所 有质粒 DNA 均表 现为微 染色体 。使用 磷酸钙 方案, 许多质 粒表现 为聚集 体或沉 淀物。 2. 重 要参数 对于给 定类型 的细胞 ,优化 方案非 常重要 。转染 DNA 浓度、 DEAE- 葡聚糖 浓度、 转 染周期 以及转 染后基 因表达 的时间 ,这些 变量均 需要细 心确定 。必 须进行 DMSO 休 克 ,否 则转染 率低。 3. 时 间安排 一 旦细胞 接种, 1 〜 3d 后可进 行转染 。准备 DNA/DEAE- 葡聚 糖混合 物并将 其加入 到细胞 中需要 1 〜 2h。 一旦混 合物加 入到细 胞中, 必须完 成转染 ,并 细心监 控细胞 活性。 三、 用电穿 孔转染 电 穿孔法 是一种 目前大 受好评 的方法 。它适 用于多 数类型 的细胞 ,既 可产生 高频率 的稳 定转染 ,又可 产生短 暂的基 因表达 。并且 ,由 于其 所需步 骤甚少 ,因 而比其 他技术 更容易 。细 胞悬浮 于电穿 孔液中 ,置 于电穿 孔槽中 ,加入 DNA, 将 槽与电 源相连 。细 胞膜 像一个 电容器 ,阻碍 带电离 子通过 ,在 确定强 度和时 间的高 电压脉 冲下, 胞膜断 裂 ,出 现能够 让大分 子进出 细胞的 孔路。 Ot: 低温可 延缓小 孔自然 闭合。 当小孔 出现, 核苷酸 可进入 细胞内 ,最 后进 入核内 。有 游离端 的线状 DNA 易于 结合并 整合于 宿主染 色体 中产生 稳定转 染子。 超螺旋 DNA 更易于 形成染 色小体 ,能更 有效地 表达。 本单元 提供了 哺乳动 物细胞 的电穿 孔法和 制备转 染植物 原生质 的改良 方法。 1. 材料 (一) 哺 乳动物 细胞的 电穿孔 待 转染的 哺乳动 物细胞 不含 及含有 选择剂 的完全 培养液 电穿孔 缓冲液 ,冰冷 线 状或超 螺旋的 纯化的 DNA 制品 Beckman JS~4. 2 转 子或相 当转子 电穿 孔用的 电击池 (Bio- Rad) 及电源 其 他供选 择培养 液中稳 定转染 和收集 转染细 胞所需 的试剂 和设备 • 445 • 2. 试 剂配制 电穿孔 缓冲液 根 据实验 所需使 用的细 胞选择 电穿孔 缓冲液 ,可选 用以下 缓冲液 : (1) PBS (无 Ca2+ 或 Mg2+) (2) HEPES ■缓冲 盐溶液 (3) 无 FBS 的组织 培养基 (4) 磷 酸缓冲 蔗糖液 : 272mmol/L 蔗糖, 7mmol/LK2HP04 ( 用 磷酸将 pH 调至 7.4), lmmol/L MgCU (5) 植 物电穿 孔缓冲 液:用 PBS 配制 0.4md/L 甘 露醇, 5mm〇l/LCaCl2, 4t: 保存 3. 操 作步骤 (1) 在 完全培 养液中 培养待 转染细 胞至对 数生长 晚期, 4X: 640 Xg 离心 5min 收集 细胞。 通 常每次 稳定转 染需要 5 xi〇6 个细 胞以获 得合理 数量的 转染子 。每 个瞬时 转染子 根据启 动子的 不同 ,需 (lxio7) ~ (4X107) 个细胞 。贴 壁细 胞要先 用胰蛋 白酶消 化及用 血清灭 活胰蛋 白酶。 (2) 将 细胞沉 淀用其 半量体 积的预 冷电穿 孔缓冲 液重悬 洗涤, 4X: 640 xg 离心 5min〇 (3) 对于稳 定转染 ,将 细胞以 lxl〇7/mL 的密度 重悬于 Ot: 的电 穿孔缓 冲液中 。对 于短暂 表达, 可用更 高密度 的细胞 (高达 8xl〇7/mL)。 (4) 在冰上 放置所 需数量 的电穿 孔用的 电击池 ,每池 中移入 0.5mL 细胞 悬液。 (5) 将 DNA 加入 冰上各 电击池 的细胞 悬液中 。握 住电击 池两侧 的“窗 口”, 晃动其 底部 以混匀 DNA/ 细 胞悬液 ,在冰 上放置 5min。 对于稳 定转染 ,取 1 〜 lOyg DNA, 用限 制性内 切核酸 酶切割 成线状 ,切 点在非 必需区 ,用 酚抽提 纯 化及乙 醇沉淀 。对 于短暂 表达, DNA (10~40纯) 可保 持超螺 旋状态 。这 两种情 况中, DNA 都应 经过 2 次 制备性 氯化铯 / 溴化乙 锭平衡 梯度离 心纯化 ,随后 酚抽提 及乙醇 沉淀。 DNA 溶 液可用 乙醚抽 提 1 次 以灭菌 ,移去 (上层 ) 乙醚相 ,晾干 几分钟 以蒸发 残余的 乙醚。 10~40Hg 的 DNA 最 适宜瞬 时转染 ,而稳 定转染 lOOpg 已 是足够 。共 转染尽 管因其 需要选 择和测 定而不 被提倡 , 但也能 被完成 。只 需加入 lpg 可 选择的 marker 和 lOfig 目的 DNA。 (6) 将电 击池放 入电穿 孔装置 的架上 (室温 ), 用所设 定的电 压及电 容值电 击一次 或 多次。 电击的 次数及 电压和 电容设 定值随 细胞类 型而异 . 并应进 行条件 优化。 (7) 将电 击池置 于冰上 lOmin。 (8) 用 非选择 性完全 培养液 20 倍稀释 被转染 的细胞 ,并 用该 液洗电 击池以 移出所 有的 被转染 细胞。 (9a) 对于稳 定转染 ,在 非选 择培养 液中培 养细胞 48h (大约 2 代 ), 然后转 入含有 抗生素 的培养 液中。 选择条 件随细 胞类型 而异。 例如, 选择常 用含约 400Mg/mLG418 的培 养液。 XGPRT 选择需 用含 lfxg/mL 霉 酚酸、 250叫/‘ 黄 嘌呤、 15Mg/mL 次黄 嘌呤的 培养液 。通常 电击后 ,立 即将 其以一 限定稀 释浓度 接种贴 壁细狍 , 或假如 抗生素 时悬浮 细胞。 • 446 • (9b) 对于短 暂表达 ,培 养细胞 50~60h 后 ,收 集细胞 进行短 暂表达 分析, 转染细 胞 可见。 附 :植物 细胞的 电穿孔 1. 原理 这是 一种改 良的, 用于植 物细胞 的方法 。去 除植物 细胞的 细胞壁 ,将 DNA 导入获 得的原 生质。 2. 附 加材料 5mm 条状 (干重 lg) 无菌植 物材料 原生质 体溶液 (2% 纤 维素酶 , 1% 软 化酶, 0.01% 果胶酶 , 0.4mol/L 甘 露醇, 40mmol/LCaCl2, 10mmol/LMESpH5.5, 使用 前临时 配制) 植物 电穿孔 缓冲液 (用 PBS 配制, 0.4mol/L 甘 露醇, 5mmd/LCaCl2, 41C 保存) 80/Lim 尼 龙筛网 灭菌的 15mL 锥形 离心管 3. 操 作步骤 (1) 将小 心切成 5mm 的条 状无菌 植物材 料置于 8mL 原生质 体溶液 中混育 ,置于 30T: 旋转 摇床上 3~6h, 从中 获取原 生质体 细胞。 (2) 经 80/zm 的尼 龙筛网 滤过除 去沉渣 ,用 4mL 电 穿孔缓 冲液淋 洗筛网 。将 原生质 体 细胞并 入一个 无菌的 15mL 锥 形离心 管中。 (3) 300\6离心5111丨11,弃上清。加511^植物电穿孔缓冲液,重复洗涤步骤。按 (1.5 xi〇6) 〜 (2 xl〇6) 细胞 /mL 的密 度将原 生质体 细胞重 悬于植 物电穿 孔缓冲 液中。 (4) 同 哺乳动 物细胞 一样进 行电穿 孔转染 。开始 时可用 1 〜 2kV 电压及 3~25MFi 容进行 1 次 或几次 电冲击 ,然 后可在 此基础 上继续 优化该 体系。 如果电 穿孔缓 冲液中 的磷酸 盐减至 终浓度 10mm〇l/L, 也可用 200~300V 电压及 500~ 1000fiF 电容。 (5) 培养 48h 后收 集细胞 ,提取 RNA, 进 行短暂 基因表 达分析 ,或 选择稳 定转化 的 细胞。 (二) 方 法评注 1. 背 景信息 Wong 和 Nnemanm 于 1987 年首次 使用高 压电击 成纤维 细胞将 DNA 转入细 胞内, 随 后此技 术被推 广到所 有类型 的细胞 ,甚 至那些 不能用 其他转 染方法 的细胞 ,如 淋巴细 胞 。尽管 有报道 整个植 物或叶 片组织 可以用 电穿孔 法进行 转染。 为了使 DNA 转入 ,在 转入 DNA 前 要将其 处理为 原生质 ,与 哺乳动 物细胞 相似, 植物原 生质可 在多种 电情况 下 被穿孔 ,高 压低容 或低压 高容均 可产生 成功的 转染。 电穿孔 法的普 及要依 赖于低 价仪器 的出现 ,它们 也可产 生高度 重复性 的结果 。这些 • 447 . 机器 的设计 有很大 差别, 但根据 控制脉 冲周期 电压的 方法可 分为两 种:一 种是使 用产生 指数逐 渐电流 脉冲的 电容放 电器; 另一 种则产 生正方 形波动 。电容 放电设 备是将 它的内 置电 容充电 至一定 的电压 ,再 放电通 过细胞 DNA 悬浮液 ,电 容量 和电压 均不同 。因为 电流 脉冲是 指数递 减功能 ,改 变电容 量以贮 存更多 (更少 ) 的电荷 以产生 电压导 致更长 (更短 ) 的递 减时间 ,进而 产生不 同的有 效电脉 冲周期 。相反 ,方 波放电 通过固 相转换 ‘ 设备 控制电 压和脉 冲时间 ,它 们也可 产生快 速重复 脉冲。 电穿孔 实验所 用的大 部分电 容放电 设备是 BIO-RAD 基因 脉冲器 ,但 也可直 接使用 其他的 电容放 电设备 。电 容放 电设备 也可从 GIBCO/BRL、 BTX、 HEFFER SCIENTIFIC 等公司 购买到 。这 些机器 无论是 单式还 是复合 式均能 产生用 于不同 用途的 多 种电穿 孔环境 。方 波放电 机可从 BTX、 BACKON 购买 ,它们 可对脉 冲长短 进行控 制 ,产生 多种快 脉冲, 并对难 以转染 的细胞 和敏感 细胞效 果很好 ,这 种机器 更昂贵 。经 验 得出约 100kHz 的 交流电 脉冲对 电穿孔 和电融 合最佳 ,但 使用这 种波长 的完美 的电穿 孔设备 很贵重 ,而且 必须由 同类产 品改造 而成。 电穿 孔技术 比其他 技术更 易操作 ,这也 是它普 遍使用 的原因 。对 于瞬 时转染 ,它的 缺点是 几乎比 使用磷 酸盐或 DEAE- 葡聚 糖技术 需要多 5 倍 以上的 细胞和 DNA。 电穿孔 法 和磷酸 盐共沉 淀法的 主要区 别是细 胞经选 择培养 基筛选 后的整 合状态 。使用 磷酸盐 法 ,被 摄取并 且整合 入每个 细胞基 因组的 DNA 的大小 范围约 3 xi〇6kb, 其转染 结果是 携 带许多 拷贝转 染后的 DNA 以大 小的前 后排列 的数列 的形式 被整合 。在 将基因 组转染 到 细胞内 ,或是 选择表 现变化 (如恶 性转化 ) 时 ,这种 方法效 果很好 。因 为此时 每个细 胞 必须有 大量的 DNA 被整合 。相反 电穿孔 法常产 生每个 受体细 胞接收 一到多 个插入 DNA, 而有利 于对基 因表达 的研究 ,因 为这 种方法 可控制 某一特 殊拷贝 对基因 表达的 作用。 2. 重 要参数 如 上所述 ,电 穿孔法 中两个 重要的 参数是 电击时 的高压 和脉冲 周期。 对于某 种类型 的细胞 ,电 压和电 容必须 被优化 ,电脉 冲缓冲 液的电 阻也是 挑选初 始设置 的主要 参数。 本单元 提出的 指南是 根据制 造商的 提示和 研究个 体的需 要特别 制定的 。同 一设备 可产生 最 佳的稳 定和瞬 时转染 ,所 以可应 用瞬时 表达来 对新的 细胞进 行条件 优化。 使 用低阻 (高盐 ) 的 缓冲液 ,如 PBS、 HeBS 或组织 培养基 ,可 以用 25pF 电容和 1.2kV 电压在 OX: 4cm 工作 池中开 始实验 ,逐 渐提高 电容并 降低电 压以达 到最佳 转染。 对于许 多类型 的细胞 ,这 3 种缓冲 液的选 择是规 定的, 但对于 一些易 被杀死 的细胞 (原 代细胞 ), 在 PBS/HeBS 电穿 孔缓冲 液高压 穿孔效 果很差 。尽 管培养 基中的 Ca2+ 会降低 电穿孔 的效率 ,但 许多特 殊敏感 细胞更 适合用 组织培 养基。 磷酸缓 冲蔗糖 液具有 低电压 的优点 。另外 发现在 HeBS 系统运 用低电 压高容 的设备 ,至少 10 倍 延长脉 冲周期 ,对 于许 多敏感 细胞效 果好。 在这种 使用中 ,以 250V/960piF 为起始 ,在 350 〜 110V 中改 变电 压以确 定最佳 设备。 保持细 胞冰上 操作不 仅能提 高细胞 存活率 ,还能 得到更 高的转 染率, 特别是 在高压 产热时 更明显 。然 而, Chu 等发现 ,运用 高容低 压的电 容环境 ,许 多细胞 株在室 温下用 电穿 孔法效 果更高 。因此 ,哺乳 动物细 胞方案 中步骤 (6) 〜 (10) 应在 不同的 温度下 • 448 • 分别 进行, 以确定 针对某 一菌株 的最佳 温度。 电极 周围的 电分解 可导致 pH 变化 ,这是 细胞死 亡的另 一原因 。这个 问题可 用别的 缓冲液 (20mmol/LHEPES) 替 换高离 子度的 PBS 而得到 解决。 对 于植物 电穿孔 的参数 优化同 植物细 胞是否 被制成 原生质 而不同 ,尤 其是对 于新制 备的原 生质。 PBS 的盐成 分对其 有害, 电穿孔 法中用 135mmol/L LiCl 替代 PBS 中的 NaCl 可提高 CAT 瞬时基 因表达 4~70 倍 。另 外叶细 胞电穿 孔缓冲 液中的 0.6mol/L 甘 露醇 /25mmol/L HC1 较适合 ,而 对根 、干 细胞则 0.7md/L 甘露醇 /40mmol/L KC1/ 4mmol/LMES (pH 5.7) /lmmol/L2-ME 为最佳 (Sheen, 1990)。 可在 原生质 分离液 中加入 0. 1 %BSA/15mmol/L 2-ME/lmmol/L MgCl2, 并将 CaCl2 终浓度 降为 lmmol/L。 电穿孔 缓冲液 中低浓 度盐将 最佳电 容降至 200fiF。 3. 预 期结果 电穿孔 转染法 效果取 决与细 胞类型 。对 于用磷 酸钙或 DEAE- 葡聚糖 共沉淀 法转染 效果 好的纤 维细胞 ,用电 穿孔法 可得到 103 〜 104 个 细胞中 一个稳 定转染 细胞的 频率, 与上述 传统方 法相似 。对 于传统 方法效 果不好 的细胞 ,电 穿孔法 可得到 1/ (104~105) 个 稳定转 化频率 。有时 候某些 细胞株 转染效 果不好 (1/106), 但这 样的频 率也能 得到足 够的转 染子。 通常稳 定转染 效果好 的细胞 瞬时转 染的效 果也好 ,增 加电穿 孔转染 时的细 胞 DNA 数可在 瞬时基 因表达 时克服 低转染 率和低 启动子 / 增 强子的 问题。 对于植 物原生 质的电 穿孔, 稳定转 染率为 1/102 〜 1/103 单个 细胞。 4. 时 间安排 哺 乳动物 细胞的 整个电 穿孔过 程不到 lh。 植物 细胞准 备原生 质不到 6h, 实 际穿孔 过程 也不到 lh。 转染 1 〜 2d 便可 按计 划收集 和分种 细胞。 四 、脂质 体介导 的转染 (一) 用 脂质体 介导暂 时表达 1. 材料 指数期 生长的 哺乳动 物细胞 质粒 DNA (小量 制备或 氯化铯 纯化) 完全 Dulbeccos 极 限基本 培养液 ,不 含血清 (DMEM 或其他 合适的 培养液 ) 含 10% 及 20% 胎牛 血清的 DMEM 完全 培养液 (DMEM-10 及 DMEM-20, 或其他 合适的 完全培 养液) 脂质 体悬液 (Lipofectin 或 Transfect ACE; Life Technologies; 表 6.1) 35mm 6 孔组织 培养皿 5%C〇2, 37X: 的加湿 培养箱 聚本 乙缔管 (Folcon 或 Corning) • 449 • 表 6.1 脂质体 介导的 转染中 DNA 与 脂质体 的用置 8 细 咆类型 质粒 DNA/Mgb 脂质 体悬液 /ML BHK-21 CXJS-7 CV-1 HeLa 0.5 0.5 1.0 2.0 5 5 10 10 a. 转染各 类细胞 所需的 DNA 与脂质 体悬液 的推荐 用量, 细胞在 35mm 六孔板 中用总 体积为 1 〜 1.5mL 的 DMEM-SF 培养。 b. 质粒 DNA 可用 小量制 备方案 制备或 氯化铯 / 溴化 乙锭平 衡离心 纯化。 2. 试 剂配制 完全 DMEM: 包含有 5%、 10% 或 20%FBS, 56t: lh 热灭活 ( 可选择 ), 1% 非必 需氨 基酸, 2mmol/LL- 谷氨 酰胺, 50pmol/L2-ME, 100U/mL 青 霉素, lOO^g/mL 硫 酸 霉素。 3. 操 作步骤 (1) 按 5xl〇5 细胞 / 孔 的量在 6 孔 板中接 种指数 期生长 的细胞 。在 37X: 5%C〇2 培 养 箱中培 养过夜 ,直 至细胞 80% 汇片。 如果用 100mm 培养 皿代替 6 孔板, 则培养 细胞至 80% 汇片 ,将 所有数 量扩大 8 倍。 (2) 在聚苯 乙烯管 中配制 DNA/ 脂 质体复 合物如 下:稀 释质粒 DNA 至 lmLDMEM- SF 中, 在旋涡 混合器 上振荡 Is, 然后加 入脂质 体悬液 ,再 次旋起 混匀。 在室温 下温育 5 〜 lOmin, 使 DNA 与 阳离子 脂质体 结合。 对各 种类型 的细胞 参见表 6.1 中 DNA 及 脂质体 的用量 。相对 少量的 DNA 便 能有效 地到达 这些细 胞的 核内。 对于其 他类型 的细胞 ,需 进行系 统检测 所需的 DNA 和 脂质体 悬液的 量以获 得最佳 的转染 效率 和表达 。使用 聚苯乙 烯管而 不是聚 丙烯管 很重要 ,因为 DNA/ 脂质体 复合物 可明显 地吸附 在聚丙 烯管上 。尽管 DNA/ 脂质 体形成 迅速, 应孵育 5min 以保证 质量。 (3) 吸去 DMEM-10 培养液 ,用 lmL 的完全 DMEM-SF 洗 1 次 ,吸去 DMEM-SF。 对每个 35mm 孔中 ,直 接在细 胞上加 lmLDNA/ 脂质体 复合物 。在 37t:C〇2 培 养箱中 温育 3 〜 5h。 (4) 往每 孔细胞 中加入 lmL 的 DMEM-20 完全 培养液 。在 37t:C〇2 培养箱 中继续 温育 16 〜 24h。 (5) 吸 去完全 DMEM/DNA/ 脂质体 复合物 ,每 孔加入 2mL 新的 DMEM-10 完全培 养液 ,继 续温育 24~48h。 (6) 收集 细胞: 用细胞 刮子刮 下细胞 ,或胰 蛋白酶 消化或 冻融裂 解细胞 。进 行适当 的表 达分析 。可用 荧光显 微镜、 流式细 胞仪或 放射性 标记后 的免疫 沉淀来 检测细 胞的表 达 ,可用 RT-PCR 方 法分析 RNA。 (二) 用脂 质体稳 定转化 转 染复苏 后的细 胞被接 种到选 择性培 养液中 表达所 需标记 蛋白质 。除 此之外 ,用脂 • 450 • 质体 进行稳 定和瞬 时转染 的方案 相同。 (1) 接 种细胞 ,长至 50% 汇片。 (2) 制备 DNA/ 脂质体 混合物 ,转染 细胞。 (3) 每孔细 胞加入 lmL DMEM-20 完全培 养液, 37t:C02 培养 箱培养 48h。 (4) 吸去 DMEM, 稀 释细胞 分传于 选择培 养液中 。将 细胞培 养适当 时间以 选择真 正 被转染 的细胞 克隆。 (三) 方 法评注 1. 背 景资料 含有阳 性和中 性脂质 的脂质 体介导 DNA 进 入动物 细胞的 机制还 不明了 。据 推测是 DNA 以阴 性磷酸 基团与 脂质体 阳性表 面结合 ,然后 剩阳 性电荷 与细胞 表面带 阴性电 荷的唾 液酸残 基结合 。高 浓度 DNA 转染 率下降 也可归 因于正 电荷被 饱和。 Feigner 等 (1987) 提出证 据提示 脂质体 和细胞 膜融合 。另 一种 可能是 脂质体 通过胞 吞作用 进入细 胞 ,而 一部分 DNA 是以 一种不 明机制 释入细 胞质。 用不同 种正电 荷脂质 对于不 同的细 胞进行 转染效 率实验 ,在 这些 测试中 ,两 种脂质 体 Lipofectin 和 Transfectace 对于 广泛细 胞均有 较高转 染率。 和 VaClinia/T7 胞质基 因表达 系统共 用时, Liposome 转染 效率被 提高至 95%。 在这 个 系统中 ,先 被带有 噬菌体 T7RNA 聚合酶 基因复 合感染 ,然 后用 含有以 T7 启动 子控 制的目 的基因 的质粒 DNA 进 行转染 。拷贝 基因被 T7RNA 聚 合酶高 效转录 ,并 提供了 产 物的高 效表达 ,另外 ,当 DNA 被导 入到常 规表达 T7RNA 聚合 酶的细 胞中时 ,高效 表达 需进行 野生型 Vauina 病 毒转染 ,原因 不明。 脂 质体介 导的转 染有利 于研究 质膜糖 蛋白、 CD4 和膜 连接蛋 白酪氨 酸激酶 、病毒 复合 体以及 人类免 疫缺陷 病毒对 糖蛋白 GP160 和 CD4 的相互 作用。 2. 重 要参数 根 据需要 转染细 胞的类 型选择 特定的 脂质体 复合物 ,有两 种物美 价廉的 脂质体 : Lipofectin 和 Transfectace。 Transfectace 价格是 Lipofectin 的 一 ■半, 但并不 适用于 所有细 胞 。另外 ,可在 实验室 制备。 Transfectace 和 其他带 阳离子 的脂质 ,可根 据转染 效率进 行测试 ,并可 改变其 成分。 Lipofectin 不便于 在实验 室制备 。因 为阳 性脂质 Dotma 价格 昂贵。 DNA/ 脂 质体复 合物在 无血清 DMEM 中而 不是在 HeBS 中制备 。因 为在 HeBS 中, 37X: 孵育单 层细胞 3h, 可使细 胞变圆 ,脱落 。对 于绝大 多数细 胞而言 ,转 染后需 复苏, 在 无血清 培养基 中初期 生长。 Feigner 观察到 含血清 的生长 培养基 能抑制 脂质介 导的对 小鼠 L 细胞的 转染。 优化 参数以 确定最 适脂质 浓度, DNA 浓 度和转 染时间 。如 这些方 案所示 ,微量 DNA 已足够 得到高 的转染 频率; 另一 方面, 高浓度 DNA 或 脂质体 有毒性 。细胞 转染不 需要有 丝分裂 ,因为 90% 的细 胞可在 不同培 养基中 被转染 。对于 某一种 细胞, 应对所 需 DNA 和 脂质体 混合物 的量进 行检测 ,以获 得最大 转染频 率和最 佳表达 水平。 • 451 • 3. 预 期结果 使用 脂质体 比使用 其他方 法在瞬 时转染 的效率 上提高 5 〜 1〇〇 倍 ,很多 实验有 60% 〜 80% 的转染 后细胞 表达目 的蛋白 。脂 质体介 导的转 染更具 有较好 重复性 ,因为 它更少 被污染 物污染 , 盐浓度 变化和 PH 变化的 影响小 。当和 Vauina/T7 胞质表 达系统 结合 使用时 ,表 达效率 可超过 90%。 在 1〇4 克隆 /VgDNA 的范围 ,此方 法比其 他的转 染频 率高出 3~20 倍。 4. 时 间安排 需 3~5h 进行 转染, 转染后 细胞再 需生长 2~3d 才可收 集以进 行瞬时 核表达 分析, 稳定 转染需 要克隆 在选择 培养基 上生长 ,因而 需要更 多时间 。一旦 筛选出 转化子 ,可立 即进 行表达 分析。 五、 基因稳 定转入 哺乳动 物细胞 (一) 基 本方法 1. 原理 进行基 因功能 分析时 ,常 需要 目的基 因的稳 定表达 ,因 此外源 基因应 稳定整 合入转 染的 哺乳动 物细胞 系中。 然而在 转染中 稳定整 合外源 DNA 的概率 非常低 ,大 约只有 1/104 细胞 ,因 而必须 用显性 (正向 ) 选择标 记来分 离稳定 的转化 细胞, 使之成 为优势 生长 ,而 未稳定 整合的 细胞则 被淘汰 。为 确保转 染成功 ,最 好采用 可高效 转染的 细胞系 如 HeLa、 ChoDukx 及 NIH3T3 等 。在单 克隆被 挑选前 ,细胞 应能进 行大约 10 倍的增 殖 。同 时应建 立合适 的对照 ,以确 定目的 基因对 细胞没 有毒性 。首 先确定 亲代细 胞株适 宜的选 择环境 ,需 要转染 细胞株 中的基 因表达 另一种 选择性 标记。 2. 材料 完全 培养液 选择 培养液 (见 下面) 挑 取用于 克隆的 圆柱体 3. 操 作步骤 (1) 所要转 染的细 胞系应 能呈独 立集落 生长。 对于贴 壁细胞 ,在 10cm 组织 培养培 养皿中 接种约 100 个细胞 ,培养 l〇~12d, 每 4d 换液 1 次 。亚甲 蓝染色 后对成 活的细 胞集 落进行 计数。 选择单 克隆稳 定转染 的细胞 需要细 胞单个 生长, 不能单 个生长 的细咆 株不能 用来稳 定转染 。确定 组织 培养皿 中有多 少克隆 的最简 单的方 法是美 蓝染色 。吸去 培养液 ,加入 2mL 2% 的美蓝 (用 50% 的 乙辞 配制) 等待 2min, 倒掉 美蓝, 用大量 冷水冲 去残余 美蓝。 (2) 确定 母代细 胞的选 择条件 :将一 培养皿 上生长 汇片的 细胞按 不小于 1:15 的比 • 452 • 例分 传于含 有不同 药物浓 度的培 养液中 ,培养 l〇d。 用 合适的 选择培 养液每 4d 换液 1 次 ,并 检查活 细胞。 哺乳 动物在 被选择 性培养 液杀死 前还可 以分裂 1~2 次 。例如 ,选 择培 养液中 DHFR 缺陷 细胞可 保持 分裂直 到细胞 内的核 苷消失 。因此 ,当测 试选择 环境时 ,必 须以 1:15 的比 例分种 细胞, 否则细 胞将 在选择 开始前 长满。 (3) 确 定转染 母代细 胞的最 有效的 方法。 磷酸钙 转染和 电穿孔 法均能 将大量 DNA 导入到 能摄取 DNA 的 细胞内 ,所以 常被选 择为产 生稳定 转染子 的方法 。然而 ,大量 DNA 的导入 增加了 其中一 部分被 整合的 可能性 。对 于产生 稳定细 胞株, DEAE 葡聚糖 介导转 染法效 果不好 。对 于磷酸 钙转染 ,在加 DNA 的前 Id, 将母代 细胞按 1:15 分传于 完全培 养液中 。还 可选 用脂质 体介导 的转染 方法。 (4) 用目 的基因 转染母 代细胞 。含 目的基 因的质 粒与含 标记基 因的质 粒的摩 尔比例 不小于 5:1。 用对照 DNA (如 PUC13) 替代含 有目的 基因的 质粒作 为对照 ,分别 进行几 次 转染。 如果用 5:1 的比例 ,没 有必 要在转 染前将 选择标 记基因 与目的 基因连 接起来 。如果 选择需 要用大 量的 选择性 质粒, 有时无 法保证 5:1 比例 ,故 要将选 择标记 基因及 所要研 究的目 的基因 构建在 同一个 质粒中 。如 果用 含有所 研究的 基因进 行转染 没有形 成克隆 ,而 在含有 PUC13 的对 照中却 可产生 克隆, 则所研 究的基 因可能 有细胞 毒性。 (5) 在无选 择条件 下让细 胞倍增 2 次 。将 细胞按 1:15 分 传于选 择培养 液中。 (6) 在选择 培养液 中接种 5 个以上 培养皿 ,以得 到尽可 能多的 能挑取 和扩增 成细胞 系 的细胞 集落数 。每 4d 用选 择培养 液换液 ,培养 10 〜 12d, 将培 养皿对 着光成 一角度 观察其 中的细 胞克隆 。其中 的一只 培养皿 可进行 染色以 便于计 算细胞 集落数 。挑 取大 的 、生 长良好 的细胞 集落。 染色可 以杀死 细胞。 挑 取时一 个集落 应有约 500~1000 个 细胞。 (二) 哺乳 动物细 胞选择 标记物 对于许 多选择 条件, 一种或 多种的 药物浓 度是依 靠特定 的细胞 株对药 物的敏 感性而 设定的 。这 些药物 的大致 所需的 剂量范 围如下 ,其精 确浓度 通过对 某一特 定细胞 在不同 药物浓 度下的 存活率 确定。 1. 腺苷 脱氨酶 (ADA) 1) 选 择条件 培养 液中加 10pg/mL 胸腺嘧 啶脱氧 核苷, 15fig/mL 次黄 嘌呤, 4pm〇l/L 腺嘌呤 -9- P-D- 呋喃 木糖苷 (Xyl-A), 及 0.01 〜 0.3pm〇l/L2'- 脱 氧助间 型霉素 (dCF)。 胎 牛血清 中含有 ADA, 可解除 培养液 的毒性 ,所 以在用 前才加 入培养 液中。 2) 选 择原理 Xyl-A 可 转化成 Xyl-ATP 并掺入 核酸中 ,从 而导 致细胞 死亡。 Xyl-A 被 ADA 解毒 成为其 肌苷衍 生物。 dCF 是 ADA 过渡态 类似物 ,因而 可以灭 活母代 细胞内 源性的 ADA。 内源性 ADA 的 水平因 细胞不 同而异 ,因此 dCF 的 合适选 择浓度 也随之 变化。 • 453 • 3) 说明 对于 内源性 ADA 水平高 的细胞 ,转 染的 ADA 基因必 须高表 达才行 。现 已有 ADA 缺陷的 CHO 细胞可 供应用 。通 过提高 dCF 的 水平, ADA 可用 于扩增 系统。 2. 氨基 糖磷酸 转移酶 (neo、 G418、 ApH) 1) 选 择条件 含 100 〜 800/ig/mLG418 的 完全培 养液。 G418 应 配制于 高缓冲 能力的 溶液中 (如 lOOmmol/LHEPES, pH7.3), 以使 加入该 药物后 不至于 改变培 养液的 pH。 2) 选 择原理 G418 通过干 扰核糖 体的功 能而阻 断哺乳 动物细 胞的蛋 白合成 。它 是一 种氨基 糖苷, 在结 构上与 新霉素 、庆大 霉素及 卡那霉 素相似 。在 哺乳动 物细胞 中表达 细菌的 基 因 ( 来源于 tn5) 可解除 G418 的 毒性。 3) 说明 应试 验不同 浓度的 0418, 因 为各种 细胞被 G418 杀死 的敏感 性不同 。许多 研究者 购买大 量同一 批号的 G418, 因为不 同批号 药物之 间的药 效可能 不同。 在致死 剂量的 G418 存在下 , 细胞还 能分裂 1~2 次, 因此该 药的效 果需要 几天才 能变得 明显。 3. 二 氢叶酸 还原酶 (DHFR) 1) 选 择条件 a- 培养 液中加 0.01~300;imol/L 氨 甲蝶呤 (MTX) 及 透析过 的胎牛 血清。 2) 选 择原理 DHFR 对于嘌 呤的生 物合成 是必不 可少的 。因此 ,在无 外源性 嘌呤在 时它对 细胞生 长是 必需的 。透 析血清 以除去 内源性 的核苷 ,并 采用无 核苷的 培养液 ,这 些对于 选择都 是必 要的。 MTX 是 DHFR 的 竞争性 抑制剂 ,因 此增加 MTX 的 浓度可 以选择 DHFR 的 高 表达。 3) 说明 对于 内源性 DHFR 水平高 的细胞 ,需 要极 高水平 地表达 被转染 的正常 基因 才能进 行选择 。已 有一种 突变的 DHFR 基因, 其编码 的酶对 MTX 有抗性 ,因 而在大 多 数细胞 中能用 来做显 性选择 。采用 DHFR 缺陷的 CHO 细 胞时, DHFR 可用来 扩增被 转染的 基因。 4. 潮霉素 B 磷酸 转移酶 (HpH) 1) 选 择条件 含有 10 〜 40(Vg/mL 潮霉素 B 的完 全培 养液。 2) 选 择原理 潮霉素 B 是 一 种氨基 环多醇 (aminocyclitol), 通 过破坏 转位及 促进错 译而抑 制蛋白 质的 合成。 基因 (从 大肠杆 菌质粒 pJR225 中分离 ) 通过 磷酸 化作用 而解除 潮霉素 B 的 毒性。 • 454 • 3) 说明 HpH 基 因只是 近几年 来才用 于哺乳 动物细 胞系统 ,能 有效表 达该基 因的载 体尚未 广 泛使用 。虽 然用于 选择的 潮霉素 B 浓度 可在 10~400pg/mL 之间 变化, 但许多 细胞需 用的 浓度为 200;ig/mL。 5. 胸 苷激酶 (TK) 1) 选 择条件 正 向选择 (由 TK— 至 TK+): 完 全培养 液中加 100mm〇l/L 次黄 嘌呤, 0.4^mol/L 氨基 蝶呤, 16jumol/L 胸 苷及扣 m〇l/L 甘氨酸 (HAT 培养液 )。. 反 向选择 (由 TK+ 至 TK_): 完 全培养 液中加 30/ixg/mL5- 溴脱 氧尿苷 (BUdr)。 2) 选 择原理 > 在正 常生长 条件下 ,细 胞并不 需要胸 苷激酶 ,因 为合成 dTTP 的通 常途径 是通过 dCDP。 在培养 液中加 BUdr 将杀死 TK+ 细胞 。因为 BUdr 被磷酸 化之后 可掺入 DNA 中 。用 HAT 培养 液选择 TK+ 细胞 主要是 由于氨 基蝶呤 的存在 能阻断 dCDP 变成 dTDP。 这样, 细胞就 需要胸 苷激酶 从胸苷 来合成 dTTP。 3) 说明 因为有 正向及 反向选 择条件 ,胸 苷激 酶得到 了广泛 的应用 。与 ADA 及 DHFR 不同 的是, 无法对 不同的 TK 表达 水平的 细胞进 行选择 ,因 此该基 因不能 用于基 因扩增 。与 ADA 及 DHFR 相同 的是, 许多哺 乳动物 细胞都 能表达 TK, 使得 在这些 细胞中 不能用 该标记 基因, 除非用 BUdr 选择出 TK_ 突 变株。 6. 黄嘌 呤-鸟 嘌呤磷 酸核糖 转移酶 (XGPRT、 gpt) 1) 选 择条件 培养液 中含有 透析过 的胎牛 血清, ZSOjtig/mL 黄 嘌呤, 15/Lxg/mL 次黄 嘌呤, 10#/ mL 胸苷, 2jug/mL 氣基 蝶呤, 25jug/mL 霉酌 ■酸及 150/ng/mLL- 谷氨 醜胺。 2) 选 择原理 氨 基蝶呤 及霉酚 酸都可 以阻断 GMP 合成的 全途径 (从 头合成 GMP 的途径 )。 XG- PRT 的 表达使 细胞能 从黄嘌 呤合成 GMP, 因 而细胞 能在含 有黄嘌 呤但不 含鸟嘌 呤的培 养液 中生长 。有 必要用 透析过 的胎牛 血清及 无鸟嘌 呤的培 养液。 3) 说明 XGPRT 是在哺 乳动物 中无同 源物的 细菌来 源的酶 ,因 而可在 哺乳动 物细胞 中用作 显性选 择标记 。用 于选择 的霉酚 酸的用 量因细 胞而异 ,能通 过有鸟 嘌呤存 在或无 其存在 时进行 滴定而 测定。 (三) 方 法评注 1. 背 景资料 TK 基因 是第一 个被广 泛用于 选择的 基因。 BUdr 的使 用提供 了一个 筛选细 胞的简 便方法 ,并 成功 地建立 了几个 细胞株 。其中 一个已 被证实 ,如 用磷 酸钙介 导的转 染方法 • 455 . 将病毒 TK 基 因导入 TK_ 细胞株 ,得到 稳定整 合的细 胞株。 这个进 展使利 用表达 TK 的质粒 将外源 基因导 入哺乳 动物细 胞成为 可能。 使用 TK 的难 点在于 ,作为 一 个选择 性标记 ,许 多哺 乳动物 均表达 TK+ 且 只需低 表达 即可在 HAT 培养液 中存活 。所 以必 须使用 TFT 细胞。 这就促 进了能 在哺乳 动物细 胞 内表达 抗菌素 的载体 的发展 。这些 基因可 在几乎 每种类 型的细 胞种作 为显性 选择标 记 ,因 为哺乳 动物的 内源基 因不能 表达抗 药性。 此类基 因种有 3 种最为 常用: (常指 neo), XGPKT (g#) 和 潮霉素 B。 这 些基因 可允许 将外源 基因导 入到所 有可被 转 染的细 胞中。 菌源性 标记易 于将基 因导入 到哺乳 动物细 胞内, 它们不 适用于 多种筛 选环境 。在 > 1000 倍 的药物 浓度下 ,因 表达抗 药性而 被筛选 ,所以 能高效 表达外 源基因 。动 物细胞 抗药 性不断 增强通 常是因 为细胞 导入的 抗药性 基因拷 贝数扩 增增加 。任何 一个与 标记基 因 共转染 的基因 ,将 整合到 标记基 因附近 ,也 同时被 扩增。 使用过 量的甲 氨嘌呤 来扩增 DHFR 的方法 被广泛 应用来 表达外 源基因 。增加 DCF 的浓度 也可使 ADA 基因 得到扩 增。 2. 重 要参数 选择 标记的 表达水 平能决 定是否 产生一 个稳定 细胞株 。同时 ,要 谨慎 地考虑 亲代细 胞 株是否 符合研 究的最 终目的 。制备 稳定细 胞株至 少需要 一个月 ,而 许多 科学家 认为如 果对 最初转 染制定 更详细 的计划 ,所得 的细胞 株会更 有用处 。最初 转染应 包括一 个分化 好的亲 代细胞 株和一 个内源 参考启 动子。 为了 产生稳 定的细 胞株, 标记基 因的表 达最好 能适当 水解选 择药物 。如 在使用 77( 作为 标记基 因转染 TK_ 细胞 ,或 用其他 药物基 因作为 显性选 择标记 XGRRT、 HpH) 时很容 易达到 ,因 为受体 细胞不 含有可 水解药 物的内 源基因 ,所 以低水 平表达 转染基 因便可 使它们 优于亲 代细胞 。但 这个结 果在用 DHFi? 或 ADA 转染 正常细 胞表型 时很难 达到。 哺乳动 物具有 相当高 的内源 ADA 和 DHFR 水平 ,所 以在选 择条件 下需要 细胞 超量表 达转染 基因。 尽管用 ADA、 DHFR 的方 法获得 稳定转 化子是 可行的 ,但很 难 达到理 想结果 。如果 使用这 种方法 ,使用 ADA_ 或 DHFR— 的细 胞株将 大大提 高转染 子的 产量, 因为选 择水平 相对大 大降低 。如 果需要 扩增转 染基因 ,建议 使用缺 陷细咆 株 ,因 为当施 加选择 强度时 ,不 会有内 源基因 扩增。 如果 一个细 胞株不 能被高 效转染 ,又很 难用任 何标记 基因取 得稳定 细胞株 ,就 必须 有一个 能高效 转染亲 代细胞 的方案 。优 化的瞬 时转染 方法通 常在稳 定转染 时效果 较好。 但也 有例外 ,如 DEAE- 葡 聚糖介 导转染 ,它比 磷酸钙 和电穿 孔法转 染产生 稳定的 细胞株 的 效果差 ,即便 是这种 细胞株 已被证 实可较 好地进 行瞬时 转染。 最后 ,当建 立一个 稳定的 转染细 胞株时 ,在 2 周 内发现 能不能 得到转 染结果 非常重 要 。如果 没有进 行备份 ,发 现转染 失败将 非常令 人沮丧 。许 多科学 家在试 图获得 某一特 殊细 胞株时 ,他们 通常会 2 份或 3 份地 进行实 验以确 保至少 有一组 得到成 功的转 染子。 3. 预期结 果和时 间安排 将 lFg 的质粒 (表达 选择性 标记) 导入到 IX 1〇6 细胞中 (易 于转染 ), 至少 可得到 • 456 • 大约 IX 103 个克隆 。大约 10% 的克 隆大且 有活力 ,可 迅速发 展为一 细胞株 。因 为细胞 类 型和标 记基因 表达效 率不同 ,实 际获得 的稳定 转化子 将差距 很大。 准备 DNA 和完 成最初 转染需 Id。 细 胞在被 分种到 选择培 养基前 应进行 2 次 倍增, 被 接种到 选择性 培养基 后需经 10~12d 才能形 成克隆 。大约 需要一 周使克 隆扩增 成细胞 株 ,全过 程需一 个月。 第二节 DNA 转染 哺乳动 物细胞 的检测 一 、融合 报道基 因概述 分 析哺乳 动物基 因体内 表达最 常见的 方法就 是转染 。先 后曾发 展了多 种方法 用于研 究基因 表达, 最初主 要采用 构建含 所需启 动子的 细胞株 的方法 ,但非 常费时 。后 来发 现 ,启动 子所处 的位置 对基因 的表达 有明显 的影响 ,基 于此 ,又发 展了短 暂表达 分析系 统。 将所要 研究的 启动子 激活蛋 白结合 位点或 增强子 序列与 报道基 因相连 ,组成 融合基 因 。同 时假定 在各种 条件下 报道分 子合成 的量可 以反映 所插入 的序列 指导和 (或) 促进 转录 的能力 。将完 整的基 因导入 细胞, 48h 后在 转录水 平检测 RNA, 确 定基因 表达水 平 。与构 建含目 的启动 子细胞 株的方 法相比 ,该方 法直接 ,但 灵敏 度较低 。为达 到比较 好 的效果 ,一个 有用的 短暂表 达系统 应该建 立在能 合成一 个易于 分析的 蛋白的 基础之 上 ,且这 种蛋白 对于转 染细胞 的生理 活动没 有或只 有很小 的影响 。而且 ,对 该报 道分子 的 分析方 法应极 为灵敏 ,以 取得满 意效果 。另 一方面 也必须 明确, 无论是 在动力 学上还 是在 反应的 程度上 ,用融 合基因 所观察 到的所 有调控 事件也 会影响 特定基 因在体 内的表 达。 真 核基因 的表达 调控主 要取决 于顺式 作用的 DNA 序 列与反 式作用 的因子 协同控 制, 而这些 相互作 用是由 转录因 子或转 录因子 复合物 特异结 合到增 强子或 启动子 元件上 所 介导的 。一 般顺式 作用的 DNA 序列多 转录起 始位点 的上游 ,以 调控 下游基 因的转 录。 基因转 录的量 的变化 可以用 Northern 杂 交或核 酸酶保 护实验 来检测 ,但这 些方法 操作均 很复杂 ,对 实验条 件要求 较高, 并不总 是很方 便实用 。特别 是这些 检测方 法一般 需要对 所分析 的基因 进行某 种方式 的修饰 ,以 便将 其与转 染细胞 中的天 然基因 区别开 来 ,因此 容易影 响实验 的精确 分析。 新发展 起来的 一个简 便方法 就是, 将所要 研究的 基因中 假定的 顺式作 用序列 (启动 子序列 ) 与一 个无关 的报道 基因的 编码序 列相连 ,构 建融合 基因。 可选择 一缺乏 内源性 启动 子活性 的载体 ,将 DNA 片 段直接 置于报 道基因 的上游 ,以检 测完整 的启动 子的活 性 (图 6.1)。 与 此类似 ,为了 测定转 录激活 物的结 合位点 ,可将 异源序 列置于 载体中 最接 近基础 启动子 的部位 ,该 启动子 含有被 基础转 录机制 (如 RNA 聚合酶 II) 识别的 序列 。嵌合 的报道 基因构 建好后 ,导入 适当的 细胞或 动物后 ,可以 测定报 道基因 产物, 以间接 估计在 调控序 列指导 下对基 因表达 的诱导 作用。 值得注 意的是 ,这 些分析 方法采 用报道 基因构 建体来 检测蛋 白水平 或活性 ,而 不是在 RNA 水平 。尽管 蛋白和 RNA 水 平 大多是 一致的 ,但并 非绝对 。在对 细胞或 提取物 进行任 何可能 影响信 息翻译 的处理 时, 都会改 变对报 道基因 构建体 测定的 精确性 。此外 ,当涉 及一个 可诱导 系统时 ,必须 • 457 • 考 虑报道 分子的 稳定性 。例如 ,如 果报 道基因 产物稳 定表达 ,可能 在诱导 之前细 胞内就 会 有高水 平的蛋 白积累 。当 加效应 物进行 诱导时 ,蛋 白的水 平可能 也进一 步增高 ,但细 咆内积 累的报 道分子 的基础 水平已 经很高 ,实 验就观 察不到 显著的 增高倍 数了。 因此 ,一个 理想的 报道基 因应可 较好的 用来鉴 定细胞 、组 织或 顺式作 用元件 的短暂 特性 或对外 来刺激 如激素 的反应 。此外 ,通过 改变序 列的方 向及通 过定点 诱变, 还可通 过构建 一系列 的缺失 突变体 (图 6.1), 可以分 析顺式 作用元 件的功 能特征 。更进 一步, 通过 观察不 同细胞 和生物 体内报 道基因 构建体 的表达 差异, 或用生 物化学 的方法 控制反 式作用 因子, 可以了 解这些 反式作 用因子 的作用 。例如 ,用 蛋白质 合成抑 制剂进 行的动 力学 研究可 用于了 解报道 基因的 诱导是 否需要 合成新 蛋白。 通过用 蛋白质 磷酸化 、糖基 化或脂 酰化抑 制剂和 (或) 激 活剂处 理细胞 ,可观 察应答 外来刺 激的特 定信号 转导途 径。 A 目 的基因 B 克隆到 带基本 启动子 载体的 DNA 片段 增强子 启动子 报道分 子检测 的预 期结果 克 隆到不 含真核 细 胞启动 子载体 < 子的 DNA 片段 □ + 无 _ 图 6.1 启动 子及增 强子定 义实验 示意图 A: —个假 设的真 核基因 ,其启 动子和 增强子 元件用 空心圆 表示。 B: — 系列可 克 隆至报 道载体 的多克 隆位点 中去的 DNA 片段, 其中含 有一个 基础启 动子用 以 识别增 强子的 位置。 C: 将 DNA 克隆 至一个 无启动 子的报 道载体 中以识 别启动 子的 最小功 能单位 。对于 这些构 建体的 随后进 行报道 基因分 析的预 期结果 显示在 相应 DNA 片段的 右侧。 + 及 + + + + + 表 示较低 和较高 的表达 , - 表示无 表达 —个理 想的报 道基因 应具备 以下特 点:① 报道分 子应不 存在于 宿主中 或易于 和内源 性基因 区别; ②应 该有一 个简单 、快速 、灵敏 及经济 的分析 方法检 测报道 分子; ③报道 分子 的分析 结果应 具有很 宽的线 性范围 ,以 便于分 析启动 子活性 的大变 化及小 变化; ④该基 因的表 达必须 不改变 受体细 胞或生 物的生 理活动 。在 选择一 个报道 基因系 统来解 决 研究中 的特定 问题时 应注意 ,每一 报道基 因及其 相应的 分析系 统都各 具特色 及局限 性 。例如 ,报 道分子 可能在 细胞内 表达, 或从细 胞中分 泌出来 而在培 养液中 检测到 。报 道 分子可 以进行 体外活 性分析 或免疫 学分析 ,也可 利用体 内组织 化学方 法分析 。各 种常 用的报 道分子 相对稳 定性变 化很大 ,在 研究可 诱导的 报道基 因构建 体时尤 应考虑 。适于 某一 特定的 报道系 统的细 胞类型 可能因 其表达 水平低 或因有 内源性 活性而 导致高 背景而 • 458 • 受 到限制 。下 面我们 将介绍 报道基 因载体 的设计 和几种 常用报 道基因 表达的 检测。 (一) 报 道载体 的设计 “pGENERIC” 就是 一个经 典的报 道载体 (见图 6.2), 我们以 此为例 介绍报 道载体 的基本 结构。 一个典 型的载 体骨架 包括一 个噬菌 体的复 制起点 (fl 〇r〇, 以产 生单链 DNA 产物 便于测 序和诱 变研究 ,以 及一个 细菌复 制起点 (常 来源于 pBR322 或 pUC 衍 生质粒 ), 以 便载体 在大肠 杆菌中 的扩增 。载 体中也 常常加 入其他 的复制 起点以 使得其 在其 他宿主 中能稳 定扩增 。载体 在细菌 中的制 备也要 利用抗 生素抗 性基因 ,大多 数情况 下 是编码 内 酰胺酶 的基因 ,该 酶使转 化了载 体的大 肠杆菌 、细 胞获得 氨苄青 霉素抗 性。 在报道 基因下 游的聚 腺苷酸 化信号 保证了 真核细 胞报道 基因转 录产物 的正确 及有效 加工。 在报道 基因的 上游可 放置第 2 个聚 腺苷酸 化位点 ,以防 由旁侧 DNA 中潜 含的启 动子 引起背 景转录 。为 了便于 进行基 因克隆 ,在 报道基 因的上 游设置 了多克 隆位点 (MCS), 它含有 5 〜 7 个紧密 相邻的 单一限 制性内 切核酸 酶位点 ,以 便插 入带有 启动子 和 (或) 增 强子元 件的外 源基因 。除了 MCS 外 ,有 时还在 报道基 因的下 游插入 一个或 多 个单酶 切位点 ,以 检测可 能的增 强子元 件或用 于报道 基因的 切除。 MCS 图 6 . 2 报 道载体 pGENERIC 的 质粒图 MCS 表 示用来 将外源 DNA 插 入报道 载体的 多克隆 位点。 poly A+ 代表 聚腺 苷酸化 信号的 位置。 〇n_ 代 表细菌 噬菌体 (fl) 和细 菌质粒 复制起 点 。箭 头表示 报道基 因和抗 生素抗 性基因 (ApO 的转 录方向 另外有 些载体 在紧靠 报道基 因的上 游已有 一个病 毒来源 的基础 启动子 ,能理 想地在 众多类 型的细 胞中提 供组成 型的转 录水平 。这 些报道 载体可 以用来 识别及 鉴定激 活物结 合位点 及增强 子序列 ,同时 也被用 来研究 转录激 活过程 。为 了反映 实验中 的报道 基因构 建体 的正常 的转染 效率, 实验中 还可用 一个含 有基础 启动子 及可能 的上游 增强子 的报道 • 459 • 载体作 为阳性 对照。 (二) 体 外报道 分子分 析方法 报 道基因 转染后 ,下 面就要 开始检 测报道 分子了 。提取 含有报 道分子 的细胞 或组织 裂解液 ( 对于表 达于胞 内的报 道分子 ), 或被转 染细胞 的培养 上清液 (对 于分泌 出来的 报 道分子 ), 通过 酶学或 免疫学 方法可 以直接 定量报 道分子 ,从而 间接估 计报道 载体编 码的报 道分子 的转录 活性。 对比研 究不同 的启动 子和增 强子时 ,使 用这样 的分析 方法能 获得定 量数据 ,并 且对细 胞类型 的要求 也更容 易达到 。下面 主要介 绍几种 常用的 体外报 道分 子分析 方法。 i .氯霉 素乙酰 转移酶 氯霉 素乙酷 转移酶 (chloramphenicol acetyltransferase, CAT) 作为被 广泛应 用的报 告性酶 ,符合 上述许 多作为 遗传报 道分子 的标准 。它 的主要 优点是 准确性 ,且可 用作检 测启动 子活性 。该 系统的 缺点是 CAT mRNA 的水 平较低 ,但目 前尚不 明确其 具体原 因 ,用其 描述启 动子在 合适位 置的起 始转录 就会造 成一定 困难。 CAT 是一种 原核生 物来源 的酶, 催化乙 酰辅酶 A 的乙 酰基转 移至氯 霉素。 由于其 在许多 真核生 物细胞 中都很 少有竞 争活性 ,这 样对 报道分 子的分 析可达 到很高 的信噪 比 。一般 采用同 位素方 法分析 CAT 活性 ,价 钱相对 昂贵, 并且分 析操作 很费时 ,其灵 敏性也 比新近 发展起 来的非 同位素 报道系 统要低 。然而 CAT 相当 稳定, 在哺乳 动物细 胞 中的半 寿期达 50h, 使之 十分适 合作为 短暂转 染实验 中的报 道分子 ,但 对于稳 定表达 分 析则不 太理想 。另一 方面, CAT 的稳 定性在 可诱导 系统中 (如可 诱导的 增强子 ) 也 是 不利的 ,报 道分子 的累积 可能掩 盖由加 入效应 物而引 起的诱 导作用 。进 行这方 面的研 究时 ,应 采用萤 火虫荧 光素酶 等半寿 期较短 的报道 分子。 过去一 般用同 位素方 法分析 CAT。 将 14C 标记的 氯霉素 与从被 转染细 胞制备 的细胞 裂 解物一 起温育 ,在硅 化的玻 璃板上 进行薄 层色谱 ,分 离乙酰 化和非 乙酰化 氯霉素 ,将 玻 璃板对 X 光片进 行曝光 ,从 而定 性估计 CAT 的活性 。为 了获得 更量化 的数据 ,可从 玻璃 板上刮 下相应 于单乙 酰化及 二乙酰 化形式 的氯霉 素位置 的斑点 ,置于 液闪计 数仪中 进 行计数 。这种 方法在 有多个 样品时 显得特 别繁琐 ,而 且由 于出现 两种产 物而难 以解释 结果 。现在 发展的 差异提 取技术 可以定 量分离 氯霉素 与其乙 酰化形 式的衍 生物, 从而不 需要进 行费时 的色谱 分离。 在这种 方法中 ,乙 酰辅酶 A 被放射 标记, 3H 可代替 14C, 使 分析在 某种程 度上危 害更小 ,价钱 更低廉 。还 有其他 的溶剂 系统可 供选用 ,它们 可改进 信 噪比而 提高灵 敏度。 现 已发展 了一些 非同位 素检测 方法定 量分析 CAT。 一 种方法 是采用 一个经 单乙酰 化 反应而 生成的 氯霉素 衍生物 ( 来源于 Molecular Probes)。 由于用 该底物 只能产 生单一 的产物 ,因而 较用铽 霉素作 底物定 量分析 CAT 更可靠 。不 仅如此 ,这种 方法比 用同位 素底物 的方法 更灵敏 ,并且 具有更 宽的线 性范围 。另 一种方 法是在 96 孔 微量滴 定板上 进行的 CAI ELISA 分析 。可直 接用抗 CAT 的抗体 (Boehringer Mannheim 公司) 对 CAT 进行定 M。 这 种方法 的优点 在于直 接测定 CAT 蛋 白水平 而不是 CAT 的 活性。 • 460 • 2. 萤 火虫荧 光素酶 第 一 个非 同位素 遗传报 道系统 是从一 种名为 的萤火 虫中克 隆到的 /«c 基因, 表达荧 光素酶 ,已被 广泛应 用于哺 乳动物 细胞。 荧光素 酶催化 的生物 发光反 应需要 荧光素 ( 作底物 )、 ATP、 Mg2+ 及 氧分子 。将 这些试 剂与含 有荧光 素酶的 细胞裂 解液 混合即 会产生 一种迅 速衰减 (在 Is 内) 的闪光 。这种 光信号 可用一 种专门 的发光 计进 行检测 ,它配 备了便 于迅速 混合反 应物的 自动注 射装置 。另外 ,也可 用液闪 计数仪 记录 光信号 。发光 量的总 值与样 品的荧 光素酶 活性成 正比, 因而可 对荧光 素酶报 道基因 的转录 进行间 接估计 。荧光 素酶易 被蛋白 酶降解 ,因 而在转 染的哺 乳动物 细胞中 的半寿 期约为 3h。 由于荧 光素酶 蛋白具 有这种 迅速转 换更新 的特点 ,而 可诱导 系统需 要最大 限度 地增高 在基础 表达水 平之上 的表达 ,因而 荧光素 酶就成 为研究 可诱导 系统的 一种理 想的候 选报道 分子。 早 期的荧 光素酶 分析方 法虽有 较好的 灵敏度 ,是 CAT 的放 射检测 方法的 10 〜 1000 倍 ,但是 操作比 较复杂 ,并 且在 样品之 间缺乏 重复性 ,这主 要是由 于光子 发射过 程的快 速“ 闪光” 动力学 变化。 现已发 展起来 一种改 进方法 ,在 反应混 合物中 加辅酶 A, 可与 荧光素 酶之间 发生优 先反应 ,产 生更为 持久的 光信号 ,光信 号的延 长也使 发光强 度增加 了 10 倍, 从而使 荧光素 酶分析 方法更 为灵敏 。如果 对荧光 素酶进 行一些 修饰, 可使发 射波 长迁移 ,通过 检测不 同颜色 的光, 使得在 同一细 胞群体 中能同 时分析 两个或 更多个 的遗 传报道 基因。 3. P •半乳 糖苷酶 大 肠杆菌 基因 编码的 卩-半 乳糖苷 酶能催 化各种 (3- 半 乳糖苷 类物质 的水解 ,现 已 是用途 最广泛 的遗传 报道分 子之一 ,有 各种不 同的底 物可供 进行体 外及体 内分析 ,包 括几种 专为不 同分析 方法而 特制的 底物。 卩-半 乳糖苷 酶可用 作未知 特性的 顺式调 控序列 的报道 分子, 在确定 的启动 子控制 下表达 ,也 可作为 校正其 他报道 分子分 析结果 的内对 照 。卩 -半乳 糖苷酶 对校正 CAT 及萤火 虫荧光 素酶尤 其有用 ,因为 这些报 道分子 分析方 法中 所制备 的细胞 裂解物 同样适 于用来 检测卩 -半乳 糖苷酶 的活性 。起初 使用邻 硝基苯 - P-D- 半乳呋 喃糖苷 (ONPG) 进行比 色分析 ,或用 4- 甲基 荧光素 -(3-D- 半 乳糖苷 (MUG) 进行荧 光分析 ,但 这些 方法灵 敏度低 ,因而 应用很 有限。 用化学 发光的 1, 2- 二 氧杂环 丁烷 (1, 2-dioxetane) 底物 来检测 (3- 半 乳糖苷 酶活性 ,分析 的灵敏 度增加 ,检 测的线 性范 围扩大 ,极大 扩展了 hcZ 作为转 录报道 基因的 应用。 当用发 光计来 检测化 学发光 信号时 ,该 分析 办法较 比色法 要灵敏 50 000 倍以上 。如 果实 验中减 小真核 细胞的 (3- 半 乳糖 苷酶引 起的内 源性酶 活性, 灵敏度 也可以 提高。 4. 分泌型 的碱性 磷酸酶 (SEAP) 与上述 报道分 子有所 不同, 分泌型 的碱性 磷酸酶 (SEAP) 基 因编码 人胎盘 碱性磷 酸酶 (PLAP) 的一 个片段 ,它 缺乏一 个重要 的膜锚 定区域 ,因此 SEAP 蛋白可 从被转 染的细 胞中分 泌至培 养液中 。少 量培养 液就可 以分析 SEAP 的活性 ,而且 培养液 中检测 到的 SEAP 的活性 水平与 细胞内 SEAP mRNA 及 其蛋白 质的浓 度变化 直接成 正比。 • 461 • SEAP 的另 一个特 点是具 有极大 的热稳 定性, 而且对 磷酸酶 抑制剂 L- 同 型精氨 酸有抗 性 。因此 ,可用 65X: 预处 理样品 及加抑 制剂共 温育, 除去内 源性碱 性磷酸 酶活性 。作 为遗 传报道 基因, SEAP 的这 种分泌 特性具 有几个 优点: ①不需 要制备 细胞裂 解物; ②通过 反复收 集同一 培养细 胞的培 养液很 容易进 行基因 表达的 动力学 研究; ③被 转染的 细狍 在检测 SEAP 时不 受影响 ,并保 持完好 以备进 一步研 究用; ④ 培养液 中几乎 没有由 ' 内 源性碱 性磷酸 酶活性 引起的 背景; ⑤样 品的收 集和分 析能在 96 孔微量 滴定板 上自动 进行。 在早 期采用 一种比 色分析 法检测 SEAP 活性 ,用 碱性磷 酸酶的 底物加 上硝基 苯磷酸 进行 反应。 这种方 法快速 ,操 作简单 ,且十 分便宜 ,但 是灵 敏度差 ,动 力学线 性范围 窄。 有一种 SEAP 两步生 物发光 测定法 能提高 灵敏度 。以 D- 荧光素 -0- 磷 酸盐的 水解为 基础, SEAP 催化 的去磷 酸化反 应产生 游离的 荧光素 ,后 者作为 萤火虫 荧光素 酶的底 物。 这种方 法的灵 敏度约 等于分 析荧光 素酶的 传统生 物发光 分析法 。最 灵敏的 SEAP 分 析方法 是用化 学发光 的碱性 磷酸酶 底物如 1, 2- 二氧杂 环丁烷 CSPD。 CSPD 的去 磷酸化 产生一 种持续 的“增 长”型 荧光, 可持续 60min 之久 ,易 于用发 光计或 闪烁计 数仪检 测。 SEAP 的化学 发光分 析不仅 提高了 灵敏度 ,检 测的动 力学线 性范围 也大大 增加。 5. 人生 长激素 (hGH) 正 常情况 下人生 长激素 (hGH) 表达范 围局限 ,仅 由垂 体前叶 的促生 长细胞 分泌。 这一特 点也使 hGH 可作 为大多 数哺乳 动物细 胞的遗 传报道 基因。 hGH 报 道分子 有许多 与 SEAP 相同 的优点 ,但由 于该方 法需要 用有害 的放射 免疫分 析方法 来定量 hGH, 而 且灵敏 度相对 较低, 因而不 够理想 。现 hGH 的测定 一般被 用来作 为内部 对照, 以校正 转染效 率和其 他报道 基因构 建物的 表达。 6. p •葡 萄糖 醛酸酶 (GUS) 因为大 多数种 类的植 物中都 不含内 源性的 葡萄糖 醛酸酶 (GUS) 活性 ,用 GUS 转 化的 高等植 物能健 康生长 ,正常 发育, 因而微 生物的 (3- 葡萄 糖醛酸 酶基因 已发展 为研究 植 物基因 表达的 主要报 道基因 。虽然 GUS 在 植物及 哺乳动 物细胞 中都可 以用作 报道基 因 ,但 在高等 植物中 更常用 。同 屮 半乳 糖苷酶 一样, GUS 作为报 道基因 的主要 优点之 一是有 多种分 析该酶 的方法 ,用各 种不同 的卩- 葡萄糖 醛酸类 物质作 底物进 行比色 分析。 其中 最普遍 的是用 X-Gluc, 这种 底物也 能用来 对表达 GUS 活性的 组织和 细胞进 行组织 化 学染色 。一 种更为 灵敏的 GUS 荧 光分析 方法用 4-MUG 作 为底物 。现 已建立 GUS 化 学 发光分 析方法 ,它 很类似 于用来 定量卩 -半乳 糖苷酶 的方法 ,其底 物是金 刚烷基 1, 2- 二 氧杂环 丁烷芳 基葡萄 糖醛酸 。与用 4-MUG 为底物 的荧光 分析方 法相比 ,这 种分析 方法灵 敏度提 高大约 100 倍 ,并且 有很宽 的动力 学线性 范围。 GUS 除了 用作报 道基因 外 ,研 究植物 及动物 蛋白定 位及转 运也广 泛应用 GUS 融合 蛋白。 (三) 体 内报道 分子分 析方法 有时 还需在 活细胞 或组织 (如 转基因 动物) 中, 或在已 经过组 织化学 固定的 细胞或 • 462 • 组织中 分析报 道分子 ,这就 需要采 用体内 报道分 子分析 方法。 分泌型 蛋白如 SEAP 及 hGH 较 少用作 体内报 道基因 ,因 为本方 法的关 键在于 将报道 分子固 定在其 产生的 部位, 用可 析出的 底物或 能发光 或产生 荧光的 底物来 进行报 道分子 的分析 。与体 外报道 系统相 比 ,本方 法提供 的数据 定量性 较差, 但可为 启动子 / 增强子 的细胞 特异性 及特异 转录因 子 的组织 分布提 供重要 信息。 1 •绿 色荧 光蛋白 (GFP) 绿色荧 光蛋白 (GFP) 早期在 生物发 光水母 中发现 。有 一种 来源于 维多利 亚水母 的 绿色焚 光蛋白 ,在 接受了 Ca2f 激活 的光蛋 白水母 素的能 量后, 可在 体内产 生荧光 。这个 过程的 发生不 需要底 物或辅 助因子 ,而是 通过两 个蛋白 之间的 能量直 接转移 进行的 。纯 化的 GFP 与体 内表达 的该蛋 白有相 似的发 光谱, 可吸收 蓝光, 激 发绿光 ,后者 用荧光 显微镜 、紫外 光箱或 荧光激 活细胞 分选仪 (FACS) 可检 测到。 GFP 的吸 收及发 射波长 与荧光 素相似 ,因此 ,用 来检测 荧光素 的各种 条件也 适合于 GFP。 GFP 发射荧 光依赖 于其全 长序列 ,现 在认为 该蛋白 的一个 六肽是 与发光 有关的 最小 生色团 。这个 区域包 含了一 个丝氨 酸-脱 氢酪氨 酸-甘 氨酸三 聚体, 它可以 环化生 成 一个发 光的生 色团。 维 多利亚 水母的 GFP 基因全 序列已 明确, 并构建 了许多 GFP 克隆。 无论是 导入其 他异源 的原核 或真核 细胞中 ,该蛋 白均能 够表达 。当 用蓝光 或紫外 光激发 细胞时 ,都能 产生一 种很亮 的绿色 荧光。 GFP 发生荧 光是种 属非依 赖性的 ,不 需要维 多利亚 水母中 的其 他基因 产物。 GFP 也 在酵母 、哺乳 动物细 胞及果 蝇中得 到表达 。更引 人注意 的是, 将外源 基因与 GFP 的 N 端序 列或 C 端序 列融合 ,所构 建的融 合蛋白 都保留 了天然 GFP 的荧光 活性, 进一步 扩展了 GFP 的应用 范围。 GFP 作为 体内基 因表达 的报道 基因, 最早是 用于秀 丽新小 杆线虫 的研究 。将 GFP 基 因置于 一个神 经元特 异性的 启动子 控制下 ,利用 GFP 荧 光来监 测线虫 发育过 程中神 经形 成的具 体时间 。实 验的成 功提示 ,以 GFP 为基 础的报 道系统 在监测 转录变 化的具 体发 生时间 方面具 有很大 的优势 。作为 一个遗 传报道 基因, GFP 荧光信 号的强 度还可 进 一步进 行改进 ,使 之增加 ,从 而提高 检测的 灵敏度 ,降 低重复 样品之 间信号 的变异 性 。同萤 火虫荧 光素酶 一样, GFP 具有发 射波长 迁移的 变异体 ,该 报道 基因能 用来研 究同 一细胞 群体中 两个或 多个转 录事件 。另 外因为 GFP 融合蛋 白保留 了天然 GFP 的荧 光活性 ,因此 还可用 GFP 融合 蛋白对 蛋白质 转运活 动进行 分析。 2. 萤 火虫荧 光素酶 一些可 溶性的 荧光素 酶底物 可穿过 质膜, 因而可 在活细 胞内检 测到萤 火虫荧 光素酶 的活性 。这 些化 合物一 般是不 带电荷 的荧光 素酯类 ,很 容易穿 过脂质 双层膜 。一 旦进入 细胞中 ,这 些底物 即被内 源性的 酯酶转 变成萤 火虫荧 光素, 后者即 成为报 道基因 所编码 的荧光 素酶的 底物。 有一种 可光解 的“笼 型”荧 光素化 合物据 认为更 容易进 入细胞 。这 种化合 物能被 内源性 的酯酶 或可见 光水解 而产生 游离的 荧光素 。然 而用现 有的可 溶性荧 光素 酶底物 进行体 内的荧 光素酶 分析, 方法的 灵敏度 还不佳 ,并且 不能向 GFP 那样可 以进 行实时 分析。 要使荧 光素酶 能成为 一种方 便实用 的体内 分析报 道系统 ,尚需 进一步 • 463 • 开发 出其他 有更高 的董子 产率的 荧光素 酶底物 ,以及 更灵敏 的检测 仪器。 3. P •半乳 糖苷酶 在原核 或真核 细胞中 、在 组织 切片或 完整的 胚胎中 ,用 可沉淀 性底物 X-gal 可检测 体内 3 •半 乳糖 苷酶报 道分子 的水平 。与 X-gal 的 反应产 生一种 深蓝色 ,许 多情况 下相对 于背景 很容易 检测到 。在 酶学分 析之前 ,需 要对细 胞或组 织进行 固定, 然后用 X-gal 进 行 组织化 学染色 。在活 体培养 的细胞 中检测 半乳 糖苷酶 的活性 ,可用 底物荧 光素二 - P-D- 半乳吡 喃糖苷 (FDG) 进行。 FDG 在 低渗条 件下加 入而被 送入活 细胞内 ,被 卜 半乳 糖苷 酶切割 后因反 应产物 的疏水 结构而 被“困 ”在细 胞内, 表达该 种报道 分子的 细胞即 通过底 物代谢 物的荧 光成分 发出的 荧光而 被检测 。检 测全 胚胎中 hcZ 的表达 ,对 于分 析发 育早期 的组织 特异性 基因表 达特别 有用。 体 内表达 半乳 糖苷 酶有多 种应用 ,比较 有代表 性的就 是所谓 的“增 强子捕 捉”研 究 。报道 基因整 合到转 基因生 物的染 色体内 ,其 位置 效应被 用来定 位增强 子序列 。有一 种 方法是 将一个 直接由 基 因上游 克隆得 到的弱 基础启 动子导 入小鼠 卵细胞 ,并整 合进 小鼠基 因组中 。从产 生的成 年动物 的子代 中可获 得稳定 的转基 因动物 。应选 择足够 弱的启 动子, 使只有 当启动 子与整 合位点 附近的 某一增 强子临 近时才 能表达 半 乳糖苷 酶基因 。转基 因动物 品系中 (3- 半 乳糖苷 酶的表 达形式 可间接 地反映 附近增 强子的 组织特 异性 及强度 。在这 样的实 验中, 新基因 及其旁 侧的调 控序列 就可用 报道基 因来进 行识别 了。 二 、氯霉 素乙酰 转移酶 (CAT) 的收获 和测定 (一) CAT 的收 获和层 析分析 1. 原理 细胞 转染含 CAT 基 因的表 达载体 ,48 〜 72h 后收 获细胞 ,制备 裂解液 ,裂 解液中 就含 有已表 达出的 CAT; 将裂解 液同带 放射性 的氯霉 素和乙 酰辅酶 A 孵育 ,氯 霉素被 乙 酰化; 通过 薄层 层析的 方法将 未标记 同位素 的乙酰 氯霉素 除去。 2. 材料 用 CAT 表达质 粒转染 的细胞 • TEN (Tris/EDTA/NaCl) 溶液 (40mmol/LTris-HClpH7.5, Immol/LEDTApH 8.0, 150mmol/L NaCl) 磷酸缓 冲盐水 (PBS) lmol/L 及 冰冷的 0.25mol/L Tris-HCl, pH7.5 200pCi/mL [14C] 氣霉素 (35~55mCi/mmol) 4rmn〇l/L 乙 酰辅酶 A ( 保存于 -20X: 不超过 两周) 乙 酸乙酯 19:1 (V/V) 氣仿 / 甲醇 • 464 • 橡 胶细胞 刮子或 相当物 薄 层层析 (TLC) 缸 Whatman 3 MM 滤纸 薄 层层析 (TCL) 平板 ( 背衬为 塑料的 ,硅胶 IB; J.T.Baker) 装有放 射性墨 水的笔 Speedvac 蒸发器 3. 操 作步骤 (1) 100mm 培养 皿中的 转染了 CAT 表达质 粒的贴 壁细胞 ,用 5mLPBS 洗两次 。每 培养 皿加入 lmLTEN 溶液 ,将 细胞置 于冰浴 5rnin。 如果 转染的 细胞是 悬浮生 长的, 则用离 心法用 PBS 和 TEN 洗涤 细胞后 按步骤 (3) 继续 进行。 (2) 用橡胶 细胞刮 子将细 胞从培 养皿上 刮下来 ,将 其转 入一只 1.5mL 的微 量离心 管中 ,置 于冰浴 5min。 (3) 在 4X: 以最 大离心 速度离 心细胞 lrnin。 离心 时间不 宜过长 ,否 则细胞 会聚集 成团。 (4) 每 107 细胞 沉淀用 lOO^L 冰冷的 0.25mol/L pH 7.5 的 Tris-HCl 缓冲液 重悬。 (5) 在干冰 / 乙 醇中冻 结细胞 5min, 移至 37X: 融解 5min。 重 复这种 冻融过 程两次 以上。 (6) 在冰 中冷却 细胞裂 解液, 然后, 4X: 以最大 离心速 度离心 5min。 移出并 保留上 清 (细胞 提取物 ), 置于 -20X: 冻存。 上清 是胞质 提取物 ,含 CAT 酶 ,可溶 于干冰 / 乙醇中 贮存于 -20X:。 上清需 迅速冷 冻以保 持酶的 活性。 (7) 在下面 混合液 中分析 20必 细胞 提取液 ( 每反应 13(^L): 2[iL 20(VCi/mL [14C] 氯霉素 (35~55mCi/mmol) 20fiL 4mmol/L 乙 醜辅酶 A 32.5/zL lmol/L Tris-HCl, pH 7.5 75.5^L H20 当分析 不同量 (直至 50ML) 的提 取物时 ,只需 调节反 应液至 Tris-HC 丨终 浓度为 0.25mol/L, 终体 积为 150pL。 (8) 对于每 组分析 ,在微 量离心 管中加 13(^L 上述混 合液和 20pL 提取液 ,轻 轻混 匀。 37X: 温育 lh。 当上 清中酶 的活性 极低时 ,可 适当延 长孵育 时间至 几小时 。同 时因乙 酰辅酶 A 在该 反应条 件下极 不稳定 ,需用 40mmol/L 乙 醜辅酶 A 替代 4mmol/L 乙 酸辅酶 A。 另外 ,反应 时间应 设在线 性关系 的时间 范围内 ,可 通过 在不同 时段从 600FL 反应体 系取出 145fxL 混合液 ,利用 (9)~ (14) 步骤检 测氯霉 素的乙 酰化来 确证。 (9) 加 lmL 乙酸乙 酯至反 应液中 ,在 旋涡 混合器 上混匀 。离心 lmin, 移取 上层液 相 (乙 酸乙酯 )。 (10) 在 Speedvac 蒸 发器中 蒸干乙 酸乙醋 45min。 (11) 将每 个样品 重悬于 30/iL 乙酸乙 酯中。 (12) 在 TLC 薄 板边缘 之上约 2cm 处点样 ,每个 样品恥 L。 • 465 • (13) 簿层 层析缸 的平衡 :在缸 中加入 19〇mL 氯仿, lOmL 甲醇 ,及 一张与 TLC 薄 层 平板大 小大致 相等的 Whatman 3MM 滤纸 ,静置 2h。 甲酵 和氣仿 的比例 对样品 的分离 有极大 的影响 ,而 甲醇易 挥发, 所以试 剂需现 用现配 ,最 多存放 24h0 上 行层析 〇 ] 二乙酰 氣霉素 ◦ 乙酰 氣霉素 〇 〇] 氛霉素 • 加样点 图 6.3 CAT 分 析结果 示意图 (14) 在盛有 200mL 19:1 氯仿 / 甲醇的 平衡过 的层析 缸中展 开色谱 ,进行 2h 或至 溶剂的 前沿接 近薄 板的顶 部为止 。取下 TLC 薄板 ,在空 气中晾 干 。用 放射性 墨水笔 做上标 记后, 用塑料 薄膜包 裹 ,置于 感光片 上进行 放射自 显影。 最终的 自显影 图中, 每样品 将可能 有多至 5 个 曝光斑 点 ,自下 而上分 别为: 在加样 点位置 的一个 弱点、 非乙酰 化的氯 霉素、 两种形 式的乙 酰氯霉 素以及 二乙酰 氯霉素 (图 6.3)。 如果 出现了 二乙酰 氯霉素 ,说明 分析超 出了线 性范围 ( 乙酰氯 霉素的 转化率 不小于 20% 〜 30%)。 这种 情况下 ,应将 样品稀 释或减 少分析 时间。 (15) 切出各 显影点 相应的 薄层块 放入闪 烁液中 计数, 先测定 出各单 乙酰氯 霉素的 计数值 所占的 百分数 而计算 提取物 的活性 。按 下列公 式计算 CAT 的活性 (%): 7酤仆奄 乙酰 化物的 计数值 Vinn(v 乙酰 化物的 计数值 + 非乙酰 化物的 计数值 X 100/6 (二) CAT 测定的 细胞原 位溶解 该方法 建立在 Brian Seed 的方法 的基础 之上。 较冻融 法简便 、快速 ,但 结果 不易重 复, 常发生 变动。 1. 附 加材料 低渗液 (25mmol/LTris-HClpH7.5, 2mmol/LMgCl2) Triton 甘氨酰 甘氨酸 裂解液 1% (V/\〇 Triton X-100, 25mmol/L 甘氨酰 甘氨酸 (pH7.8), 15mmol/LMgS04, 4mmol/LEGTA, lmmol/LDTT (每 次临用 前加入 ), 于 4X: 保存 2. 操 作步骤 (1) 60mm 培 养皿中 转染了 CAT 表 达质粒 的细胞 ,用 2mL PBS 洗 1 次。 (2) 每培养 皿加入 2mL 低渗缓 冲液, 在室温 下温育 2 〜 5min。 该过 程中细 胞明显 膨胀。 (3) 吸 去低渗 缓冲液 ,加入 400/ixLTriton 裂 解液。 (4) 用 橡胶刮 子将细 胞刮离 培养皿 ,用 lOOOpL 移液器 将裂解 物移入 1.5mL 微 M 离 心 管中。 (5) 离心 lmin, 除 去细胞 核及不 可溶性 蛋白。 (6) 将 上清转 入一个 干净的 微量离 心管中 ,进行 CAT 活 性分析 • 466 • (三) 简单 相-抽 提测定 CAT 活性 1. 原理 细胞裂 解液同 3H 或 14C 标记 的氯霉 素和丁 酰辅酶 A 孵育 。通 过简单 的抽提 法将丁 酰氯 霉素同 未修饰 的氯霉 素分开 。该方 案简单 、快速 ( 仅需几 个小时 )、 经济。 2. 附 加材料 0.01/^Ci/fiL [3H] 氯霉 素溶液 5mg/mL 丁 酰辅酶 A ( - 201C 保存 不超过 4 个月) 100mg/mL 未 标记的 氯霉素 2mol/L Tris-Cl, pH 8.0 2:1 (V/V) 四甲基 十五烷 (TMPD) / 二 甲苯或 100% 二甲苯 液体 闪烁仪 3. 试 剂配制 用于相 - 抽提的 3H 氯霉素 溶液: 将 960^L 100% 乙醇, 40ML 100mg/mL 未标记 的氯霉 素加入 250^L3H 氯 霉素中 (250/iCi/250ML, 溶于乙 醇中; 42.0 〜 58.2Ci/mmol), 以制备 0.2fxCi//xL [3H] 氯霉素 贮 存液。 首先用 20 倍的 水稀释 OJ/iCi/VLpH] 氯霉素 贮存液 ,然后 用等体 积的二 甲苯混 合 ,剧 烈振荡 。室 温离心 2min, 或微量 离心使 之分相 ,弃 去上层 二甲苯 有机相 。水相 重 复萃取 1 次以上 ,离心 弃上层 有机相 。从 而制备 〇.〇lpCi/VL 的 [3H] 氯霉 素工作 液。 用 3H 而不用 14C 标 记的氯 霉素时 ,二甲 苯预萃 取对于 降低背 景是必 须的。 4. 操 作步骤 来源于 哺乳动 物细胞 : (la) 按冻融 法步骤 (1) 〜 (5) 或按原 位裂解 法制备 哺乳动 物细胞 提取物 。如 果用胰 蛋 白酶消 化或刮 细胞方 法来收 集细胞 ,则 将原位 裂解法 的步骤 (1)~ (4) 用以下 的步骤 (2a) 〜 (4a) 代替。 (2a) 室 温下, 300r/min 离心 5min, 弃去 上清。 (3a) 每 107 细 胞加入 2mL 低渗 缓冲液 ,离心 ,弃 上清。 (4a) 然后每 107 细胞加 Triton 裂解液 200pL。 来源于 植物原 生质体 : (lb) 室温下 , 2000 〜 4000r/min 离心 5min, 将植物 原生质 体细胞 (1〇' 个细胞 ) 收 集于 1.5mL 的 微量离 心管中 ,弃去 上清。 (2b) 往 细狍沉 淀中加 50/^L 低渗缓 冲液, 在旋涡 混合器 上剧烈 振荡。 (3b) 将离心 管置于 -70t:15min 以上 ,或置 于干冰 / 乙 醇浴中 5min, 以冻结 样品。 • 467 • (4b) 融 解样品 ,在 室温下 13 000r/min 离心 2min, 将上清 (含 CAT 提取物 ) 移入 一 个干净 管中。 65T: 处理 lOmin 能 灭活抑 制物的 活性。 (5) 对 于分析 50pL 细胞 提取液 ,配 制如下 CAT 分析 混合液 (每 个反应 50pL): 2〇ijlL O.OlpCi/^L [3H] 氯霉 素溶液 5piL 5mg/mL 丁 酰辅酶 A 5/iL 2mol/L Tris-Cl, pH 8.0 20^tL H20 每个 反应用 〇.2MCi/ML [3H] 氯霉素 溶液, 如果用 14C 氯霉素 ,用量 不变。 (6) 对每 组分析 ,将 50/iLCAT 分 析混合 液加入 50/iL 细 胞提取 液中。 37X: 温育 30~90min〇 反 应所取 的时间 和活性 都必须 使分析 结果处 在线性 范围内 (<20% ~30% 转化率 )。 对于 活性更 高的提 取液, 则要稀 释样品 或缩短 分析时 间或在 反应混 合物中 加入额 外底物 (未 标记的 氯霉素 和丁酰 辅酶 A)。 (7) 用 200pL 2:1 的 TMPD/ 二甲 苯剧烈 振荡提 取乙酰 化的氯 霉素。 离心并 移出上 层液相 (有 机相) 至一 只闪烁 瓶中。 2:1 的 TMPD/ 二甲苯 既可有 效萃取 , 又可降 低背景 。另外 ,亦 可用 200fxL100% 的 二甲苯 。此 时 ,在将 有机相 转入闪 烁仪前 ,用 二甲 苯萃取 2 次是 必须的 。无 back-extraction 时 ,背景 将很高 。步 骤如下 :加入 lOO^L 水或 TE 缓 冲液到 200fiL 含乙酰 化氯霉 素的二 甲苯中 ,剧 烈震荡 ,离心 , 将二甲 苯相 移入干 净离心 管中。 (8) 样 品中加 3 〜 5mL 闪烁液 ,计 数测定 CAT 的 活性。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 CAT 是一细 菌来源 的抗药 性基因 ,它 通过 使氯霉 素的两 个羟基 (一个 或两个 ) 乙 酰化 而使该 抗生素 失活。 真核细 胞中无 该基因 ,因 而在正 常的哺 乳动物 细胞无 背景活 性 。同时 CAT 活性检 测简单 、灵 敏度高 ,使 CAT 基 因被广 泛应用 于真核 基因表 达的研 究 。能与 之抗衡 、灵敏 度更高 的萤火 虫荧光 素酶报 告系统 将随后 讨论。 CAT 首次由 Gorman 等于 1982 年应 用于哺 乳动物 系统。 该细菌 基因同 SV40 splice 和 Poly A 信号融 合形成 一个可 在哺乳 动物中 表达的 系统。 最初的 载体中 用于插 入启动 子的 限制酶 位点是 H^d III 或 Sma I, 修 饰后的 载体如 pUC-CAT 则含一 用于启 动子插 入 的多聚 接头。 有许 多证据 表明, CAT RNA 含 量极微 ,因 而不易 用于直 接检测 ,然 而利用 转染策 略 将一非 复制性 质粒导 入细胞 ,在 30h 以 内通过 S1 分析法 ,可以 正确探 测到同 CAT 基 因融 合的真 核启动 子中起 始转录 作用。 另外也 可以将 一待测 启动子 同一哺 乳动物 基因如 hGH 融合, 从而得 到一易 于分析 的融合 RNA。 而且对 于许多 研究项 目而言 ,若 要取 得成功 ,需 解决报 告基因 的水平 是否真 正反映 r 起始信 号的数 M 的问题 。因此 对融合 基因最 初产生 的融合 RNA 进行定 性是必 要的。 第一个 方案由 于需要 14C 氯霉 素和薄 层扫描 ,使 该方案 较昂贵 ,而在 简单相 抽提法 • 468 • 中利 用低特 异性的 CAT, 使丁酰 CoA 代替 了乙酰 CoA 作为 乙酰基 的供体 ,然后 利用丁 酰基 氯霉素 的高疏 水性, 经过一 次简单 的萃取 即可将 游离的 氯霉素 同丁酰 氯霉素 完全分 离。 同时用 3H 氯霉 素代替 了价格 高于其 10 倍的 14C 氯霉素 ,使该 法相比 于基本 方法容 易 承担。 在反应 前对标 记好的 氯霉素 预萃取 ,及 TMPD/ 二甲苯 或二甲 苯相的 back-extraction 的应用 ,可 通过降 低背景 来大大 提高灵 敏度约 25 倍。 而且该 方法在 酶的浓 度高于 2 〜 3 个数 量级时 ,不用 对酶浓 度进行 稀释或 调整孵 育时间 ,也 有很好 的线性 关系。 2. 常 见问题 及对策 当细 胞提取 物中检 测不到 CAT 活性时 ,主要 原因有 3 个: (1) 转染细 胞中融 合基因 未被转 录激活 ,可用 能产生 CAT 的 pSVE-CAT 作 为阳性 对照。 (2) 个别试 剂失效 ,可 通过 使用事 先已知 的有高 度活性 的细胞 提取物 或市场 上购买 的 CAT 酶 (SIGMA) 作 为阳性 对照。 (3) 最常见 的原因 是转染 效率低 ,应 重新 制备转 染试剂 或用一 有功能 的表达 载体来 检 验转染 效率。 有报道 表明, 某些细 胞系中 有一些 未知的 CAT 抑 制因子 ,可 通过在 75X: 加热 20min 使 之失活 ,然 后离心 lmin 除去 变性蛋 白形成 的沉淀 ,完全 活性的 CAT 则 在上清 液中。 3. 预期结 果和时 间安排 转染后 CAT 酶 的数量 由转染 效率和 特定的 融合结 构而定 ,因 此需要 为不同 的启动 子和 细胞类 型的结 合建立 一个标 准反应 条件。 层析法 和简单 相抽提 法在灵 敏度上 大致相 同。 用 最基本 的冻融 法收集 12 个样 本及制 备抽提 物需要 l~2h。 细胞原 位溶解 则要大 约 30tnin。 层 析实验 要准备 lh。 对 许多转 染系统 而言, lh 的 孵育时 间即可 检测到 CAT 的活性 。如果 孵育时 间延长 ,则 反应混 合物中 的乙酰 CoA 的量 需增加 10 倍 。孵 育完成 后 ,需 3 〜 4h 完成 TLC。 然后经 24h 的曝 光后即 可检测 到信号 。从 CAT 反 应终止 ,简 单相 抽提法 需大约 30min 即 可得到 12 个样品 的定量 结果。 三 、萤 火虫荧 光素酶 报道系 统分析 (一) Triton 裂解 细胞的 荧光素 酶测定 1. 原理 萤火虫 荧光素 酶是一 种可诱 导发光 的酶。 它通过 两个步 骤使底 物荧光 素发生 氧化作 用 ,而 产生发 光反应 ,此 反应是 ATP 依 赖性的 。杂 环荧光 素首先 腺苷化 ,然后 通过氧 化脱 羧作用 ,产生 AMP、 C〇2, 并通 过激活 的荧光 素中间 产物发 射光, 其最大 发射光 波在 562mn。 荧光素 加入后 ,在 几秒钟 内即可 产生大 量的光 输出。 当底物 过量时 ,光输 • 469 • 出童和 酶浓度 成正比 。萤 火虫荧 光素酶 系统为 启动子 活性的 检测提 供了一 个敏感 、快 速 、非 放射性 的检测 方法。 2. 材料 转染了 荧光素 酶表达 质粒的 细胞, 培养在 60mm 培 养皿上 (见图 6.4) 荧光酶分析缓冲液(25111111〇1/1^甘氨酰甘氨酸0117.8,15111111〇1/1^磷酸钾缓冲液 pH7.8, 15mmol/L MgS〇4, 4mmol/L EGTA, 2mmol/L ATP, 用 时加入 lmmol/L DTT, 4X: 保存) 荧光素 贮存液 (lmmol/L D- 荧 光素, 25mmol/L 甘氨酰 甘氨酸 pH 7.8, 10mm〇l/L DTT, -70X: 避光 ,可保 存数月 ) Triton/ 甘氨醜 甘氨酸 缓冲液 (1% Triton X-100, 25mmol/L 甘氨醜 甘氨酸 pH 7.8, 15mmol/LMgS〇4, 4mmol/LEGTA, 用 时加入 lmmol/L DTT, 4C 保存) 冰冷的 PBS 25mmol/L 甘 氨醜甘 氨酸, pH7.8 ( 游离碱 ,结 晶; Sigma #G2265) 已知活 性的作 为标准 品的萤 火虫荧 光素酶 (Sigma #L5256 ) 橡 胶细胞 刮子或 相当物 带 打印机 或绘图 仪及比 色杯的 发光计 (手工 或自动 ) 图 6.4 荧光 素酶表 达载体 A: pOLUC 是一个 含有荧 光素酶 基因的 无启动 子载体 。它 是从 pGEM3 衍生 而来的 一个高 拷贝氨 苄抗性 质粒, 其多克 隆位点 两侧是 SP6 启动子 / 引 物序列 (SP6P/P) 和 T7 启动子 / 引 物序列 (T7P/P)。 插入目 的片段 所用的 单酶切 位点用 * 标出。 B: PSV2LUC 含有 SV40 的真 核细胞 启动子 / 增强子 序列, 被插入 pOLUC 中用作 荧光素 _ 表达 的阳性 对照, 或用作 各次转 染之间 校正的 标准。 SV40ENH 代表 SV40 增 强子的 72bp 重复 序列, G+C 盒 是 SV40 启 动子的 SP1 结合 位点。 EES 代表 早早期 转录起 始位点 3. 操 作步骤 (1) 用 冰冷的 PBS 洗涤在 3 个 60mm 培养 皿中的 转染了 荧光素 酶表达 质粒的 细胞各 3 次, 每次用 4mLPBS, 洗 后吸去 洗液。 荧光素 酶的酶 促反应 会被痕 M 的钙 所抑制 。因 而收集 细胞前 ,含 钙介质 应从皿 中除去 。为 便于统 • 470 . 计分析 ,用 3 个样 品是必 需的。 (2) 每个 培养皿 中加入 350pL Triton/ 甘氨酰 甘氨酸 裂解液 。用 橡皮刮 子刮下 细胞。 (3) 将溶 解的细 胞转入 1.5mL 微量离 心管中 , 4X: 以最大 速度微 量离心 5min。 将上 清 (细胞 裂解液 ) 转 入一个 干净的 微量离 心管中 ,置于 冰上以 备分析 。荧 光素酶 活性通 过 Triton 裂 解检测 ,离 心后, 仍有约 <10% 的酶活 性以不 可溶沉 淀形式 存在。 (4) 在 旋涡混 合器上 轻轻振 荡细胞 裂解液 ,取 100/iL 置 于发光 计的比 色杯中 。加入 360/iL 荧光素 酶分析 缓冲液 。将比 色杯放 入发光 计的杯 箱中。 (5) 用 25mmol/L, pH 7.8 的甘氨 酰甘氨 酸稀释 荧光素 贮液至 200/^mol/L。 荧光 素见光 易氧化 ,已 稀释未 用的荧 光素应 弃之。 (6) 往 发光计 里的样 品注入 20(^L 稀释的 荧光素 溶液, 25X: 测量 20s 内的光 输出 量 ,减 去仪器 的背景 (背景 为比色 杯中不 加细胞 裂解液 时的光 输出量 测定值 ), 以及比 较每 个样品 的生物 发光值 与商品 荧光素 酶标准 品的值 而进行 定量。 注: 当样品 中酶的 活性超 过线性 范围时 ,可用 甘氨酰 甘氨酸 稀释后 重测。 (二) 冻 融裂解 细胞的 荧光素 酶测定 1. 附 加材料 提取缓冲液(100〇1111〇1/1^磷酸钾缓冲液91^7.8,用时加入1〇1111〇1/1^01'1',室温 保存) 2. 操 作步骤 (1) 用 PBS 分别洗 3 个 60mm 培养皿 中的转 染了荧 光素酶 质粒的 细胞。 (2) 每 只培养 皿中加 lmL 提取缓 冲液, 立即用 橡胶刮 子刮下 细胞。 (3) 移至 1.5mL 微量离 心管中 ,离心 15~30s, 弃 上清。 (4) 在 细胞沉 淀中加 100/^L 提取缓 冲液。 (5) 经 3 次冻融 裂解细 胞膜。 (6) 将 裂解的 细胞在 41C 以 最大速 度离心 5min, 移 出上清 ,分 析其荧 光素酶 的活性 [见基 本方案 ,步骤 (4) 〜 (6)]。 (三) 方 法评注 1. 背 景资料 Wet 等于 1987 年 首先将 荧光素 酶克隆 ,并使 其得以 表达。 荧光素 cDNA 克隆至 pSV2 载体的 衍生物 pSVOALA5' 中 。该质 粒中无 启动子 ,含 有载体 PBR322 部 分序列 和荧 光素酶 5' 非 翻译区 ,无上 游起始 密码子 ATG 的 5' 缺失 cDNA 和一串 联重复 多聚腺 苷 酸信号 。由 于供插 入的单 酶切位 点过少 ,实验 者已将 MCS 导入 相同或 其他载 体中。 Nordeen 等于 1988 年对 pSV2 载体进 行修饰 ,得 到一系 列含 MCS 的载体 pXP-(l 〜 2)。 Brasier 等于 1989 年构 建了一 无启动 子载体 pLOUC, 含 pGEM3 衍生 质粒的 LA5' 序列。 PGEM3 衍 生质粒 的一大 优点是 高拷贝 ,可 产生大 量质粒 DNA 用于 转染实 验研究 。同 时一潜 在的问 题是在 报告载 体中可 能存在 隐蔽的 启动子 可激活 荧光素 酶基因 。因 而对一 • 471 • 新启 动子的 mRNA 起 始位点 做图是 最明智 的选择 。将 PGEM3 导入 HepG2 细胞 ,未发 现血 管紧张 素肽原 的启动 子上游 有任何 转录子 编码。 2. 重 要参数 1) 细 胞类型 哺 乳动物 转染细 胞中的 荧光素 酶靶向 性到达 过氧化 物酶体 ,因 而观察 其在不 同的细 胞类 型中的 表达比 较混乱 。如将 SV40 增强 / 启 动子调 控的荧 光素酶 载体瞬 时转染 HepG2 细胞, 48h 可 检测到 稳定的 CAT 活性。 而在转 染鼠肝 癌细胞 H42E 和小鼠 RIN- L056A 时, 转染后 12 〜 24h 时 可观察 到荧光 素酶报 告基因 的表达 。因而 ,在这 些细胞 类型 中不适 用于该 报告基 因系统 。目前 ,能 成功转 染该报 告基因 系统的 细胞株 包括: HepG2、 JEG、 Hela、 BHK、 COS、 鼠淋巴 细胞、 C04 和 Jurkat〇 2) 细胞裂 解过程 荧 光素酶 作为分 析试剂 ,可在 市场中 购得。 细胞裂 解液中 ATP 浓度是 一重要 参数。 因为不 同的生 物样本 ATP 的 水平是 不同的 。在 HepG2 细胞中 ,发 光反应 中优化 浓度为 l~2mmol/L, 浓 度高于 2mmol/LB 寸 ,就会 抑制酶 的活性 。利用 Triton 裂 解制备 的裂解 液 和冻融 法制备 的裂解 液相比 ,较 不稳定 ,因 而需立 即用于 测试或 保存于 -70X:, 以保 持 其足够 活性。 3) 激 素的调 节作用 荧光素 酶系统 已被用 于受不 同启动 子调控 的多种 激素的 调节效 应研究 ,包括 糖皮质 激素和 甲状腺 激素等 。然而 ,在 转染 pOLUC 的 HepG2 细胞中 ,发 现通 过加入 丁基环 代 AMP 可造成 2 〜 5 倍 的荧光 素酶活 性的人 为提高 。因而 该系统 不适应 隐蔽性 AMP 反 应 元件的 研究。 4) 同对照 载体的 共转染 利用荧 光素酶 测试载 体和内 部对照 质粒来 检验转 染效率 ,可 利用 3 组实验 避免误 差 ,且使 检验弱 启动子 的活性 具有可 重复性 。共 转染报 告系统 的存在 ,需 选择不 同的裂 解 方式。 CAT 酶 活性用 Triton 裂解方 案时是 可检测 得到的 。和荧 光素酶 裂解过 程中所 用裂解 物浓度 相比, CAT 系统得 灵敏度 则降低 10 倍以上 。低 浓度 裂解液 ,如 0.5% 即 可裂解 细胞, 如果共 转染的 CAT 活性较 弱时, 则需考 虑用冻 融法。 CAT 系统同 磷酸钾 盐裂解 缓冲液 相适应 ,两 种酶在 此液中 的最佳 pH 是 相同的 。表达 碱性磷 酸酶的 共转染 质粒也 可用荧 光素酶 Triton 裂解 步骤。 在该裂 解液中 ,碱 性磷酸 酶的分 光光度 计的测 定是 线性的 。但是 ,空白 的和碱 性磷酸 酶阳性 对照结 果在用 Triton 裂解 _ 时浓 度测定 值是 相同的 。当用 hGH 系统时 ,则 可避 免选择 相同裂 解液的 步骤。 5) 仪器 生物 荧光定 量仪器 的选择 需注意 以下几 个变量 。在 1 〜 16s 内 ,荧光 素酶活 性同光 输出 最高峰 或集合 光输出 是成比 例的。 Intra-assay variation 变 异低于 平均值 integrated value, 但 有些配 备绘图 记录仪 的手动 荧光定 量仪仅 给出最 高发光 。尽管 自动仪 器普遍 比 手动仪 价格高 ,但 对于主 要依赖 于由转 染而得 数据的 实验室 而言是 划算的 。对 于荧光 检验 ,瞬时 灵敏度 是比较 重要的 。在 接收 一台较 昂贵的 仪器时 ,最明 智的是 ,以 说明书 的 模式来 检验某 次转染 结果。 • 472 . 3. 预 期结果 荧 光素酶 活性在 细胞裂 解液中 ,可直 线上升 200Mg 蛋白 。在用 integrated 光输 出时, intra-assay variation 应在 5 % 左右 。在 — 具代表 性的实 验中, pOLUC HepG2 细 胞平行 进行 3 个皿 ,在 应用基 本检测 方案时 ,检 测值为 1572 ±60 ILU; pSV2 转染 细胞时 ,则 为 83 040±1400 ILU。 荧 光仪的 背景为 100ILU。 荧 光素酶 报告系 统的灵 敏度比 CAT 报告 系统高 10 〜 1000 倍。 4. 时 间安排 收获 12 个样 本制备 裂解液 ,需时 30min。 每个测 试点在 加入荧 光素后 ,仅需 20min。 利用自 动荧光 计数仪 , 24 点计 数可在 12min 内完成 ,数据 处理需 lh。 四 、人生 长激素 报道系 统测定 1. 原理 生 长激素 作为报 告基因 ,可 通过两 步放射 免疫的 方法来 检测。 2. 材料 转染了 hGH 表 达质粒 (图 6.5) 的细胞 人生 长激素 放射免 疫分析 试剂盒 (Allegro Human Growth Hormone, Nichols Insti- tute Diagnostics), 包括 : 125 1- 标记 的抗体 溶液、 洗漆液 、人生 长激素 (hGH) 标 准品, 亲和素 包被珠 12mm X 75mm 圆 底试管 y 计数仪 Hind III Sal \ Hinc II Xba I 图 6.5 人生 长激素 (hGH) 表 达载体 3. 操 作步骤 (1) 取 转染了 hGH 表达质 粒的哺 乳动物 细胞的 培养液 1〇〇 〜 500pL。 培养 液中的 hGH 在 -20X: 可保存 数月, 4*C 时可保 存数天 , 忌样品 的反复 冻融。 • 473 • (2) 加 lOOpL 培养 液或标 准品至 12mm x 75mm 圆底试 管中。 (3) 加入 100pL125I- 标记 的抗体 溶液, 混合。 (4) 加入 1 颗 亲和素 包被珠 。盖 上试管 盖或用 Parafilm 膜封口 ,室温 下在一 水平旋 转器 上以约 170r/min 摇动 下温育 90min, 或室 温静置 4h。 (5) 加 2mL 洗涤液 洗磁珠 2 次 。完全 吸干洗 涤液。 (6) 将试 管置于 7 计数仪 上计数 Imin。 (7) 用试剂 盒中的 hGH 标准 品测得 的数据 绘制标 准曲线 。用 这个标 准曲线 来计算 未知 样品的 hGH 含量。 当 hGH 值 >50ng/mL 时分析 结果在 线性范 围之外 。样 品中 hGH 含量 >50ng/mL 时 则应稀 释后重 测。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 人生 长激素 hGH 瞬 时检测 系统是 通过简 单的免 疫学方 法检测 转染细 胞分泌 于培养 基中的 hGH。 人 生长激 素是由 191 氨 基酸的 多肽。 hGH 基 因含有 5 个 外显子 ,是 hGH 基因家 族中研 究的最 清楚的 一个。 hGH 在 转染后 24h 分 泌于培 养基中 。但最 终的时 间根据 细胞类 型而定 。在 一些细 胞类 型中, 分泌的 hGH 水 平于胞 质内的 hGH mRNA 成比例 。因而 分泌过 程不是 hGH 在培养 基中出 现时间 的限速 步骤。 hGH 作为 报告蛋 白有许 多优点 :①转 染细胞 的培养 基中能 检测到 分泌的 hGH, 因为细 胞并未 被破坏 ,因 而可 以持续 观察其 他转染 细胞的 瞬 时表达 情况; ② hGH 的 mRNA 在许 多转染 细胞中 是相当 稳定的 ,与目 的蛋白 mRNA 的变 化是相 关的; ③ hGH 系 统快捷 、稳定 、敏感 、易 于操作 ,许 多细胞 类型均 可分泌 hGH, 包括 ATT-20、 CO-1、 HELA、 BALB/C、 3T3、 REF52、 鼠胚 胎或纤 维细胞 、人 表皮或 成纤维 细胞、 GC、 GH4、 H35、 JEG、 L 和原 代垂体 细胞。 以 下介绍 hGH 这些特 征的实 际运用 : ① hGH 作为 分析基 因表达 的报告 基因, 类似于 CAT 分 析系统 ,含有 hGH 基因的 载体 含有启 动子插 入的紧 邻基因 的多聚 接头: CPOGH, 图 6.5。 ② 已知 特化的 hGH 融合 基因如 PXGH5 ( 图 6.5), 可 用于检 测或优 化转染 效率。 ③ 已知 特征的 hGH 融 合基因 ,可使 不同转 染样本 间的转 染效率 统一化 。在 一个单 个 的转染 实验中 ,不 同平皿 的转染 效率也 会不同 ,因 而有必 要将一 个内置 标准的 、稳定 表达的 质粒做 参照, 利用该 质粒的 表达水 平使转 染效率 统一化 。例 如:在 分析一 系列和 CAT 融合 在一起 的一系 列突变 载体和 启动子 活性时 ,可用 hGH 融合基 因活化 转染效 率 。和其 他瞬时 分析系 统不同 的是, hGH 是哺乳 动物结 构基因 ,这就 解释了 为什么 hGH 的 mRNA 非 常稳定 的原因 ,而该 特征在 分析启 动子表 达时极 为有用 。然而 ,需要 指 出的是 ,编 码该基 因的序 列在调 控信号 存在时 ,并未 完全“ 沉默” 。尤 其是 hGH 编码 序 列在某 些融合 基因中 ,可 对糖皮 质激素 反应。 2) 重 要参数 和其 他系统 相似, 结果在 线性范 围内时 才有效 。生 长激素 试剂盒 中标准 浓度为 0.5~5.(Vg/tnL。 一般 的来说 ,分 析样品 均在此 范围内 。在 每次实 验中均 要用标 准品, • 474 • 以确 保实验 所分析 数据在 线性范 围内。 3) 预期结 果和时 间安排 转染后 ,生长 激素的 数量因 构建的 融合基 因和转 染的细 胞类型 而定。 Ca3(P04)2 介 导的 PXGH5 对 HeLa 或 BALB/C3T3 细胞的 转染, 48h 后 ,培养 基中产 生的激 素的数 量为 50/ig /mL。 该系 统迅速 ,几乎 不需要 过多操 作时间 。收 集时只 需要取 出部分 培养基 ,因 而仅需 几分钟 。检 测几十 个样本 ,手工 操作时 间不足 30min, 完成需 2h。 五、 P- 半乳 糖苷酶 报道系 统测定 1. 材料 表达 卜半乳 糖苷酶 的质粒 转染的 细胞, 培养在 60mm 培 养皿上 (见图 6.6) 模拟转 染的对 照细胞 ,培 养在 60mm 培 养皿上 PBS Triton 裂解液 (100mmol/L 磷酸钾 pH 7.8, 0.2% Titron X-100, 4X: 保存 ,用时 加入 lmmol/L DTT) 半 乳糖苷 酶检测 试剂盒 光发射 加速液 [10%(V/\〇Emerald 发光增 效剂, 0.2mol/LNaOH, 于保 存可达 一年] 橡 胶细胞 刮子或 相当物 带有绘 图记录 仪及测 试管的 发光计 或闪烁 计数仪 1 10 20 30 40 50 CCCGGGAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCTCGAGATCTAAGTAAGCTT Sma I Asp 7181 Nhe\ Xho\ BglW Hind III Xma I Kpn I 图 6.6 p- 半乳糖 苷酶表 达载体 • 475 • 2. 操 作步骤 (1) 取于 60mm 培养 M 中的 转染好 卩-半 乳糖苷 酶表达 质粒的 细胞及 对照转 染的细 胞 ,用 PBS 分 别洗涤 两次。 (2) 加入 250FL Triton 裂解液 ,用一 橡胶细 胞刮子 将细胞 刮下来 。将细 胞提取 物转, 移至 1 个 1.5mL 微量离 心管中 。在 4X: 以 最大速 度离心 2min, 将 上清转 移至一 个干净 的 微量离 心管中 。注 意细胞 提取液 必须马 上使用 ,如 不立即 分析, 可置于 冻存, 可保 持达几 个月。 (3) 取一只 发光计 测试管 ,加 2~20ML 细胞 提取液 。再加 200/xLp- 半 乳糖苷 酶反应 缓冲液 ,在 室温 下温育 60min。 一次分 析一个 样品的 活性, 延迟一 个完整 测定所 需的时 间再加 下一个 反应缓 冲液。 (4) 将 测试管 放入发 光计中 ,注入 30(VL 光发射 加速液 。注 入后等 2 〜 5s, 然后测 定 5s。 六、 转染后 RNA 的直 接分析 目的基 因转染 哺乳动 物细胞 24 〜 48h 后 ,就 可观察 瞬时表 达效果 ,可 直接检 测由该 基 因转录 而来的 RNA。 这 样不必 构建融 合基因 ,但 很费时 。无需 进行启 动子的 亚克隆 就可直 接检测 RNA, 因而 可对一 个完整 基因的 突变和 功能进 行分析 。同时 ,这 种技术 也可 用于分 析融合 基因。 由一个 融合基 因产生 的报道 分子的 水平一 般都能 精确反 应被研 究的 启动子 所正确 转录的 RNA 水平 ,然 而仍有 必要检 测融合 基因的 mRNA 的 量及其 5' 末端 。如 果进行 RNA 分析 ,就 可直接 证明报 道分子 表达的 水平是 启动子 活性的 量度。 然而 ,以 现有的 技术对 RNA 进行直 接分析 ,检 测的灵 敏度还 很低。 要使整 个实验 能有 较好的 结果, 对转染 方案、 RNA 的 制备及 RNA 的 分析都 有很高 的要求 。所 用的细 胞类 型必须 是容易 转染的 ,所研 究的启 动子必 须相对 有效地 表达, 不然其 产生的 RNA 的 量将检 测不到 。与 常用的 报道基 因系统 相比, RNA 直接 分析法 的灵敏 度要低 几个数 量级 。转染 后进行 RNA 直接 分析要 注意一 下几个 方面: 1. 转染 的效率 应绝对 保证所 选的细 胞类型 是易于 转染的 ,所 选的转 染方案 也是有 效的。 HeLa、 BALB/c3T3、 NIH3T3 细胞 由磷 酸钙介 导短暂 转染后 ,其 转染效 率都足 以进行 RNA 表 达的直 接分析 。对 被转染 基因的 RNA 分析进 行之前 ,应 对转染 条件进 行优化 。即使 条件 优化后 ,转 染效率 也是不 固定的 ,随时 间改变 而改变 。如 果在 转染中 采用一 个容易 分析 的报道 基因做 为转染 效率的 指示, 可以及 时发现 低转染 效率所 致的实 验失败 ,从而 避免对 实验进 行全面 原因的 检查。 2. RNA 的制备 制备的 RNA 必须 保证其 完整性 。可 选用细 胞质总 RNA 提取 法或异 硫氰酸 胍法。 除 非是特 别扁平 的细胞 ,两个 10cm 培 养皿的 贴壁细 胞一般 可提取 100网 总 RNA。 分析 • 476 • 40# 的总 RNA 即 可检测 到转染 基因的 RNA 表达 ,用 poly (A) RNA 可 增加灵 敏度, 但 操作要 复杂。 3. RNA 的分析 单链探 针进行 S1 核 酸酶作 图分析 和核糖 核酸酶 保护分 析两种 方法的 灵敏度 都比较 高 ,足 以用于 检测转 染后短 时间内 的基因 表达。 S1 分析法 的背景 更低, 曝光时 间可以 延长。 核糖核 酸酶保 护分析 法所用 的探针 的特异 性更高 ,因 此在优 化的条 件下其 灵敏度 显 著增高 。为了 始终获 得稳定 的表达 ,可 进行 较繁琐 的优化 试验。 4. 启动子 的强度 如果所 用的启 动子强 度较低 ,甚 至比 HeLa 细 胞中的 SV40 早 期启动 子低一 个数量 级 ,此 时分析 RNA 就比较 困难。 可考虑 使用全 长标记 的探针 或使用 poly (A) 选择制 备 mRNA0 七 、转 染方法 的优化 不同的 细胞类 型对导 入外源 DNA 的最佳 条件要 求可能 不同, 即使细 胞类型 具有很 多 相似性 ,不同 细胞转 染的具 体条件 也有很 大变化 。现 已探 索出一 种用短 暂分析 系统直 接而又 系统地 对转染 效率进 行优化 的方法 。由于 样品的 收获和 分析只 需很短 的时间 ,人 生 长激素 (hGH) 分析系 统在这 方面有 较大的 优势。 在优化 转染效 率中最 重要的 因素是 选择合 适的转 染方案 。常 常是在 DEAE- 葡萄 聚糖介 导的基 因转移 、磷酸 钙介导 的基因 转移 、电 穿孔及 脂质体 介导的 转染方 法中进 行选择 。也可 考虑融 合技术 ( 如原生 质体融 合 )。 一般 而言, 对于任 何贴壁 细胞系 ,可用 DEAE- 葡 萄聚糖 、磷 酸钙及 脂质体 介导的 转染 方法试 验其转 染效率 。对于 非贴壁 细胞系 ,可用 电穿孔 及脂质 体介导 的转染 方法进 行 转染。 1.DEAE- 葡聚糖 转染法 用 DEAE- 葡聚糖 法进行 转染时 ,加 入培 养皿中 的细胞 数量、 DNA 浓度及 DEAE- 葡 聚糖 的浓度 是影响 转染效 率最为 重要的 因素。 对于许 多能用 DEAE- 葡聚 糖转染 的细胞 类型 ,一般 大约用 1 〜 lOpgDNA/lOcm 培养皿 , 100~400/MgDEAE- 葡聚糖 /mL 培 养液。 在一项 优化方 案中如 何选择 各培养 皿的转 化条件 ,可 参见表 6.2。 如果 采用如 pXGH5 等 hGH 表 达载体 ,在 各种条 件下, 转染后 2d、 4d 和 7d 分别取 lOO^L 小 份培养 上清进 行测定 (4d 的上 清取出 后换液 ), 可了解 表达的 动态。 在这 些初步 的实验 资料获 得之后 ,可 尝试使 用范围 更宽的 DNA 剂量 和浓度 范围更 窄的 DEAE- 葡聚 糖进行 。例如 在预试 验中, 如果用 100Mg/mLDEAE- 葡 聚糖比 用更高 浓度时 细胞所 表达的 hGH 更多 ,在 第二期 实验中 DEAE- 葡聚 糖的浓 度范围 可调至 25 〜 150fig/mL。 由于 DEAE- 葡 聚糖对 于某些 细胞是 有毒的 ,因 此最好 是以小 浓度及 较短作 用 时间进 行转化 。这 个实验 中所加 DNA 的宽 范围在 两个方 面是很 关键的 。第一 ,有必 要 了解能 产生易 于检测 到的信 号所需 的被转 染报道 基因的 最小量 。第二 , DNA 剂量与 • 477 • 报道 基因表 达的线 性关系 随大童 dna 的加入 而下降 。当在 转染实 验中用 过量的 (即非 线性 关系) DNA 时 ,观 察到的 效应有 可能不 是所要 研究的 现象, 而是量 效关系 。如果 小 心地作 如上的 DNA 量效 曲线, 一般可 以排除 这种严 重而又 常见的 问题。 表 6.2 DEAE- 葡 聚糖转 染条件 的优化 5 x 1〇5 细胞 /10cm 培养皿 2X106 细胞 /l〇cm 培养皿 培养皿 /cm pXGH5 / (fig/mL) DEAE- 葡聚糖 / (/ig/mL) 培养皿 /cm pXGH5 / (^tg/mL) DEAE- 葡聚糖 / (fig/mL) 1 1 400 11 1 400 2 1 200 12 1 200 3 1 100 13 1 100 4 4 400 14 4 400 5 4 200 15 4 200 6 4 100 16 4 100 7 10 400 17 10 400 8 10 200 18 10 200 9 10 100 19 10 100 10 0 200 20 0 200 2. 磷酸钙 转染法 有以 下几个 因素可 以影响 磷酸钙 转染法 的转染 效率: 沉淀中 DNA 的量 ,沉 淀停留 在细胞 上的时 间长短 ,是 用甘油 还是用 DMSO 休 克以及 休克时 间长短 。表 6.3 总结了 磷 酸钙优 化方案 。用磷 酸钙介 导的转 染中, 沉淀中 DNA 的总浓 度对于 DNA 的 摄取效 率 有极大 的影响 。一 般而言 ,磷 酸钙转 染中要 用较高 浓度的 DNA (10~50/xg)。 对于某 些 细胞系 ,如原 代细胞 ,要使 DNA 能进 入细胞 ,沉 淀中必 须有高 浓度的 DNA。 对于其 他细 胞类型 ,在 10cm 培 养皿中 加入的 DNA 多于 10 〜 15/ig 时会导 致过多 的细胞 死亡及 很少的 DNA 摄入。 表 6.3 磷 酸钙转 染法条 件优化 培养皿 /10cm3 pXGH5 pUC13 细胞与 沉淀接 触时间 /h 甘油休 克时间 / min 1 5 5 6 — 2 5 15 6 — 3 5 35 6 4 5 5 16 — 5 5 15 16 — 6 5 3 16 — 7 5 5 6 3 8 5 15 6 3 9 5 35 6 3 10 5 5 16 3 11 5 15 16 3 12 5 35 16 3 • 478 • 细胞类 型不同 ,沉淀 在细胞 上保留 的最适 时间也 不同。 甘油或 DMSO 休克 可极大 地提 高某些 细胞类 型的转 染效率 。该细 胞类型 是否能 耐受长 时间暴 露于磷 酸钙沉 淀及是 否 能用甘 油休克 ,可 参考表 6.3 列出的 预试验 。一 旦找到 最适转 染条件 ,就 可如同 DEAE- 葡聚糖 转染技 术一样 ,通过 变化报 道质粒 的量来 制作广 范围的 DNA 曲线 。应保 持被 转染的 DNA 总 量恒定 ,用担 体质粒 来补足 差额。 3. 电 穿孔法 与 DEAE- 葡聚糖 或磷酸 钙介导 的化学 转染方 法相比 ,电穿 孔法受 DNA 浓度 的影响 较小 。一般 DNA 的量在 10~40Mg/107 细胞的 范围内 效果好 ,而且 DNA 的用量 与摄入 量之 间有较 好的线 性关系 。一般 通过改 变电脉 冲的强 度和长 度来优 化电穿 孔方法 的转染 效率 ,后者 由电源 的电容 量决定 。目标 是找到 能杀死 J0%~60% 细胞的 电脉冲 (一般 是 1.5kV, 25MF)。 如果 过多的 细胞发 生死亡 ,可 通过调 低电容 (3^F 及 25/iF) 来降低 脉冲的 长度。 4. 脂质 体介导 的转染 影 响阳离 子脂质 体转染 DNA 成功主 要有以 下三个 参数。 为获得 最适转 染效率 ,应 逐一优 化这些 参数: 1) 脂质体 的浓度 虽然 增加脂 质体的 浓度可 增加转 染效率 ,但是 高水平 (>10(Vg) 的 脂质体 可能有 毒性。 可按表 6.4 调整 各种特 定的脂 质体混 合物的 用量。 表 6.4 脂质体 介导转 染的条 件优化 培养皿 /35mm PSV2CAT /^g 脂质体 / /xL 培养皿 /35mm PSV2CAT /吨 脂质体 /pL 1 0.1 1 11 5 5 2 0.1 2 12 5 10 3 0.1 4 13 5 15 4 0.1 8 14 5 20 5 0.1 12 15 5 30 6 0.5 1 16 10 5 7 0.5 2 17 10 10 8 0.5 4 18 10 15 9 0.5 8 19 10 20 10 0.5 12 20 10 30 2) DNA 的浓度 并不是 DNA 的浓 度越高 ,转 进去的 DNA 就越多 。事 实上, 在用某 些脂质 体制剂 时 ,高 水平的 DNA 对某 些细胞 类型可 以有抑 制作用 。许 多细胞 类型中 ,相对 小量的 DNA 可被有 效摄取 和表达 。另外 ,表 6.4 中的报 道载体 PSV2CAT 也可 以改用 其他易 于监测 表达的 质粒。 3) 温 育时间 脂质体 -DNA 复合物 作用于 细胞的 时间也 很重要 。有 研究认 为温育 时间如 果超过 • 479 • 8h, 就可能 产生毒 性作用 。但一 般而言 ,细胞 暴露于 脂质体 -DNA 复合物 的时间 越长, 转 染效率 越髙。 第三节 用逆转 录病毒 载体转 导基因 一 、逆转 录病毒 转导系 统概述 逆转录 病毒载 体是一 种人工 改建的 感染性 病毒, 可以将 非病毒 基因导 入体内 或体外 有丝分 裂细胞 。这 些载体 来源于 从啮齿 类或禽 类分离 得到的 有复制 活性的 病毒, 并进行 了 多方面 的改造 。逆 转录病 毒天然 存在着 高效精 确的整 合机制 ,可 将单拷 贝的病 毒基因 组整 合于有 丝分裂 期宿主 细胞。 对于用 那些常 规方法 不容易 被转染 的细胞 ,如原 代细胞 及体内 细胞, 用逆转 录病毒 载体 可将一 个或数 个基因 稳定而 有效地 转导至 其中。 如果当 被转染 的细胞 是在体 外进行 短暂表 达研究 ,或要 转导的 DNA 片 段较大 (>8kb) 时, 则不宜 选用逆 转录病 毒转导 系统 。而且 ,它不 能转导 有丝分 裂后的 细胞, 因为整 个逆转 录过程 及病毒 的整合 可能都 与细 胞的有 丝分裂 有关。 本节 首先简 要介绍 了逆转 录病毒 的生活 周期、 逆转录 病毒载 体的结 构和包 装细胞 系, 接着详 细说明 了逆转 录病毒 载体转 染包装 细胞系 、滴 定和分 析病毒 上清的 实验方 案。 另外还 简单介 绍了病 毒的大 量生产 ,病 毒上清 的浓缩 和上清 中辅助 病毒污 染的检 测。 最后介 绍了逆 转录病 毒体内 外感染 细胞的 方法。 1. 逆 转录病 毒的生 活周期 逆转 录病毒 是一种 RNA 基因 组病毒 。感 染宿主 细胞后 ,病毒 颗粒中 />〇/ 基因 表达 出逆 转录酶 。在 逆转录 酶的作 用下, 以单链 RNA 基因组 为模板 ,立 即逆 转录出 一份其 基因 组的线 性双链 DNA 复本 (见图 6.7)。 然后 在病毒 基因的 介导下 ,病 毒双链 DNA 复本 整合到 宿主基 因组中 。整合 在宿主 基因组 中的病 毒称为 前病毒 ,许多 逆转录 病毒载 体序列 都是从 前病毒 序列中 克隆出 来的。 逆 转录病 毒载体 一般都 是构建 于细菌 质粒的 基础上 ,包装 前并无 感染性 。对 于无复 制能力 的载体 ,需 先将其 转染到 包装细 胞系中 包装, 然后才 能产生 有感染 能力的 逆转录 病毒 (见图 6.8)。 对 于有复 制能力 的载体 ,转 染到能 支持其 复制的 宿主细 胞系后 ,由 质 粒编码 的病毒 LTR 启 动子进 行转录 ,产 生一个 RNA 病毒 基因组 。然 后病毒 基因组 被病毒 结构蛋 白包裹 ,通 过从细 胞表面 出芽而 产生感 染性病 毒颗粒 (见图 6.8)。 这样 的细胞 产生的 上清就 是含有 感染性 病毒颗 粒的病 毒原液 。病 毒原液 产生后 ,就需 要检测 其中 的病毒 含量, 称为“ 滴定” 。就 是向人 工培养 的易感 细胞株 (见表 6.5) 中 加入此 种病毒 原液, 观察空 斑数目 ,以 此判断 原液中 的病毒 浓度。 每毫升 病毒原 液中感 染性病 毒颗粒 的数董 ,称做 集落形 成单位 / 毫升 (CFU/mL)。 经滴 定的病 毒即可 用于感 染体内 及体外 的细胞 。一 旦整合 到宿主 细胞中 ,载体 前病毒 就会转 录目的 基因的 mRNA, 表 达目的 蛋白。 • 480 • 5' 3* LTR T gag pol env LTR 图 6.7 有 复制能 力的逆 转录病 毒的生 活周期 逆 转录病 毒感染 宿主细 胞依赖 于病毒 颗粒与 宿主细 胞表面 特异受 体之间 的相互 作用 。病毒 进入到 宿主细 胞的细 胞质后 ,病 毒颗粒 中含有 的逆转 录酶开 始逆转 录病毒 基因组 RNA。 合成病 毒基因 组的线 性双链 DNA 拷贝后 ,病毒 DNA 整合 到 宿主基 因组中 。整 合是由 病毒的 t •扣基 因产物 介导的 (在 />〇/ 区的 3' 端) ,并 通 常发生 在病毒 基因组 的末端 。在宿 主基因 组中, 整合发 生在相 当多的 染色体 位置上 ,却 很少或 不具有 明显的 特异性 。一 个感染 性病毒 毒颗粒 产生一 拷贝的 整 合病毒 基因组 。这 种“前 病毒” 随后与 宿主的 DNA — 同复制 并传给 所有子 代细胞 。整 合后 病毒基 因组的 5' 末端的 LTR 启动子 通常具 有活性 ,能 指导合 成病毒 基因组 全长的 (非 剪接的 )、 终止于 3'LTR 的病毒 基因组 拷贝。 有复制 能 力的病 毒需要 病毒基 因组编 码的病 毒蛋白 gag、 pol 和 env 来产 生病毒 颗粒。 全长 的病毒 转录物 具有几 种功能 ,它 同时是 gag 蛋白 ( 病毒毒 粒的主 要成分 )、 逆转 录酶和 基因 产物的 mRNA, 也是剪 接产生 env (存在 于毒粒 的表面 ) 蛋白的 mRNA 的前体 , 同时编 码衣壳 化的识 别序列 “平” 。由于 此未经 剪接的 RNA 中含 屯序列 ,它 可为病 毒蛋白 所识别 并被包 装进病 毒颗粒 。为此 ,它也 被 称为“ 基因组 RNA”。 有复 制能力 的病毒 的感染 导致产 生与原 感染颗 粒相同 的感 染性逆 转录病 毒颗粒 ,从 宿主细 胞出芽 的这些 颗粒能 继续对 其他宿 主细胞 进 行几轮 的感染 • 481 . 图 6.8 无 复制能 力的逆 转录病 毒的生 活周期 从 编码逆 转录病 毒基因 组的细 菌质粒 生产感 染性逆 转录病 毒颗粒 ,需要 将细菌 质粒 导入哺 乳动物 或鸟类 细胞中 。对 于有复 制能力 和无复 制能力 的载体 都是如 此 。在 这里所 列举的 例子中 ,编码 及 一个目 标基因 (X) 的 无复制 能力的 载体 ,通 过磷酸 钙转染 法导入 包装细 胞系中 。包装 细胞系 是编码 产病毒 颗粒所 需蛋白 (即 gag、 pd 和 env) 的小鼠 或鹌鹑 细胞系 (见表 10.5)。 病毒基 因组可 从非 整合的 细菌质 粒分子 (转染 后几天 ) 短 暂转录 ,或从 整合的 质粒分 子稳定 转录。 病毒的 转录由 5’ 端 LTR 起始至 3'LTR 终止 ,因此 ,是一 个全长 的病毒 转录子 。它包 含包装 信号平 , 可被衣 壳蛋白 识别并 将其包 入病毒 颗粒中 。含载 体 基因组 的完整 的感染 性毒粒 从包装 细胞出 芽释放 。将细 咆的培 养上清 移出, 用作 以后的 实验中 (见图 10.9) 病毒 的来源 本图还 显示了 另外一 种起始 于内部 启动子 (pro) 并编码 neo 基因 的转录 物的产 生过程 。由 内部 启动子 产生的 基因转 录物不 含有少 ,因 此不能 被包装 。然 而它 可作为 基因的 mRNA, 因此能 够使这 些细胞 在选择 性药物 G418 中生 长 。这种 抗药性 能够用 来选择 被逆转 录病毒 质粒稳 定转染 的细咆 2. 无 复制活 性载体 自然界 中一些 啮齿类 和禽类 动物细 胞感染 了逆转 录病毒 ,其 基因组 中整合 有前病 毒 ,无 复制活 性的逆 转录病 毒载体 即是从 中克隆 出来的 。载 体中删 除了产 生感染 性病毒 颗 粒所必 需的病 毒产物 ,保留 了转导 所必需 的顺式 作用病 毒序列 。这些 序列包 括平包 装序列 (为识 别病毒 RNA 而将之 衣壳化 并装配 到病毒 颗粒中 所必需 )、 逆转录 信号、 整 合信号 、病毒 启动子 、增强 子及聚 腺苷酸 化序列 ,缺 乏病毒 复制所 需要的 序列。 • 482 • 表 6.5 用于包 装及滴 定逆转 录病毒 原液的 细胞系 细胞系 来源 产生辅 助病毒 特 性 用于 包装的 细胞系 小鼠- 亲嗜性 Mann et al. , 1983 是 最 易产生 高滴度 ^CRE Danos and Mulligan, 1988 否 GP+E-86 Markowitz et al. , 1988 否 OE Morgenstemand Land, 1990 否 小鼠双 嗜性 ^am Cone and Mulligan, 1984 是 PA12 Miller etal., 1985 是 PA317 Miller and Buttimore, 1986 很少 易产生 高滴度 屯 CRIP Danos and Mulligan, 1988 否 易产生 高滴度 鸟类 Q2bn Qzbn Stoker and Bissel, 1988 是 短暂表 达效果 良好, 但稳定 转染的 细胞系 不 能产生 高滴度 病毒; 用 A 亚群的 A env 从稳定 转染的 细胞系 可产生 较高的 滴度; Isolde Isolde Cossett et al. , 1990 否 用 A 亚群的 env 用于 滴定的 细胞系 鼠 NIH3T3 ( 小鼠成 纤维细 一 般途径 未分析 已建细 胞系; 容 易生长 咆) 鸟类 QT6 ( 日本 鹌鹑细 胞系) Moscovici et al. , 1977 末分析 已建细 胞系; 滴度于 CEF CEF (鸡胚 成纤维 细胞) Hunter, 1979 未分析 非细 胞系; 原代细 胞必须 从鸡胚 制备; 比 QT6 细胞 生长困 难得多 3. 有 复制活 性载体 逆转录 病毒载 体来源 于从啮 齿类或 禽类分 离得到 的有复 制活性 的病毒 ,并进 行了多 方面 的改造 。这种 感染性 病毒可 将非病 毒基因 导入体 内或体 外有丝 分裂细 胞中。 逆转录 病毒 天然存 在着高 效精确 的整合 机制, 可将单 拷贝的 病毒基 因组整 合于有 丝分裂 期宿主 细胞。 对于用 那些常 规方法 不容易 被转染 的细胞 ,如原 代细胞 及体内 细胞, 用逆转 录病毒 载体 可将一 个或数 个基因 稳定而 有效地 转导至 其中。 如果当 被转染 的细胞 是在体 外进行 短暂表 达研究 ,或要 转导的 DNA 片 段较大 (>8kb) 时, 则不宜 选用逆 转录病 毒转导 系统 。而且 ,它不 能转导 有丝分 裂后的 细胞, 因为整 个逆转 录过程 及病毒 的整合 可能都 与细 胞的有 丝分裂 有关。 4. 包装 细胞株 与病毒 的产生 无复制 能力的 逆转录 病毒载 体不编 码构成 病毒颗 粒的结 构基因 的产物 (见图 6.9)。 . 483 • 为 了使逆 转录病 毒质粒 产生有 感染能 力的病 毒颗粒 ,包装 细胞将 提供职 g、 及 基因编 码的病 毒结构 蛋白。 这些细 胞系由 稳定的 小鼠成 纤维细 胞系或 QT6 鹌鹑 细胞系 衍 生而来 ,其中 含有通 过转染 导入的 病毒的 炉^、 和纟 及 ent; 基因 。然而 ,编码 结构蛋 白 的病毒 RNA 不 含有包 装序列 平 ,因此 包装 细胞系 不能有 效地包 装编码 及 eni 基因的 RNA。 但是 细胞的 RNA 可被 随机地 包入病 毒外壳 蛋白中 ,并 如正常 的病毒 颗粒 般出芽 ,形 成无效 病毒。 为了产 生含有 载体基 因组的 有感染 性的病 毒颗粒 ,载体 DNA 通过 转染或 感染导 入包装 细胞后 ,载体 RNA 因为含 有事先 设计好 的包装 序列平 (见图 6.8), 因而可 被优先 包装。 3, LTR V gene x pro neo | ljr | 图 6.9 无复制 能力的 逆转录 病毒载 体感染 靶细胞 无 复制能 力的逆 转录病 毒载体 感染靶 细胞并 表达依 赖于与 宿主细 胞之间 的相互 作用 。病 毒载体 与有复 制活性 的病毒 一样进 行逆转 录并整 合至宿 主基因 组中。 与 有复制 活性的 病毒完 全一样 ,全 长的病 毒转录 也能从 5'LTR 起始至 3'LTR 终止 。然 而这种 病毒转 录物不 编码任 何产生 病毒外 壳所需 的蛋白 ,它通 常编码 目 标基因 (;c), 另外, 许多无 复制能 力的载 体编码 另一个 启动子 (/^〇), 它在 病毒基 因组内 合成另 一 个基因 (例如 neo) 的 mRNA。 由 于无复 制能力 的载体 不编码 病毒衣 壳蛋白 ,所以 它感染 靶细胞 后不能 产生另 外的病 毒颗粒 。因此 , 病毒基 因组不 会从一 个被感 染的细 胞播散 至其他 的细狍 。但是 , 随宿主 基因的 正常复 制遗传 ,病 毒基因 组也可 传至所 有的子 代细咆 基因组 5. 小 鼠逆转 录病毒 不同 的逆转 录病毒 的糖蛋 白类型 也不同 ,具有 特异的 亲嗜性 。通 常应 用的逆 转录病 毒 载体的 糖蛋白 仅易与 大鼠和 小鼠细 胞表面 的受体 相结合 ,因 而并不 感染人 类细胞 ,用 于基因 转移安 全性相 对较高 。早 期广泛 应用的 包装细 胞系是 Mann 等 建立的 % 系。 它 编 码亲嗜 性基因 enr;, 和 其他包 装细胞 系相比 ,产生 的病毒 滴度高 。然而 ,平 2 系能产 • 484 • 生辅 助病毒 ,一 种复制 型病毒 ,促进 标志病 毒的水 平移位 。迄今 为止, Danos 和 Mulli- gan 等 1988 年建 立的平 CRE 系及 Markowitz 等 建立的 GP+E-86 系 ,未见 有产生 辅助病 毒 的报道 。最近 ,第 三代“ 无辅助 系统” 的包装 细胞系 -DE 已由 Morgenstem 和 Land 建 立, 较前几 种包装 细胞系 有很大 改进。 6. 鸟逆转 录病毒 根据 mt; 的不 同表达 ,鸟逆 转录病 毒可分 为六种 不同的 亚型: A、 B、 C、 D、 E、 F。 起初 认为不 同的亚 型可能 有不同 的受体 ,但目 前尚不 清楚每 种亚型 与其受 体的关 系 。为产 生无复 制活性 的鸟逆 转录病 毒载体 ,采 用和 构建平 2 和平 CRE 相同的 策略, 已 构建出 Q2bn 和 Isolde 两种鸟 白血病 病毒包 装系。 这些包 装系有 A 型被膜 ,无 法感染 哺乳动 物细胞 。一 般认 为二者 产生的 病毒是 相对安 全的。 7. 安 全问题 生物学 上的安 全性问 题是应 用逆转 录病毒 载体进 行实验 时必须 认真考 虑的。 具体不 同的 实验将 有各不 相同的 问题, 开展前 应将实 验的详 细方案 递交给 相关的 生物安 全性委 员会 和伦理 委员会 讨论。 使用双 嗜性的 病毒时 尤应特 别注意 ,必须 建立专 门的实 验室, 采 用严格 的预防 及限制 等级。 二、 特异逆 转录病 毒产生 细胞株 的制备 建 立一个 能产生 高水平 逆转录 病毒构 建体的 细胞系 需要进 行反复 的实验 和探索 。首 先要筛 选出一 种合适 的包装 细胞系 。通 过转染 将逆转 录病毒 构建体 稳定地 导入待 选包装 细 胞系后 ,产生 瞬时的 病毒系 ,然 后将此 病毒系 交叉感 染不同 的包装 细胞系 ,从 中筛选 出能稳 定生产 病毒的 细胞系 ,然后 对之进 行鉴定 ,看 是否能 产生具 有正确 结构的 高滴度 的病毒 。如果 病毒能 够编码 一种报 告基因 ,能 用组织 化学方 法简便 、直接 检测, 此时工 作就 要方便 得多。 如逆转 录病毒 载体中 构建有 报 告基因 ,被 感染细 胞能被 X-gal 染色, 说明感 染成功 。与此 相似, 如要快 速评估 产毒克 隆的产 毒水平 ,我 们可以 直接测 定产 毒克隆 所产生 病毒的 特异基 因产物 ,如 特异的 RNA 或 蛋白。 (一) 逆转 录病毒 载体转 入包装 细胞株 1. 原理 基于细 菌质粒 的逆转 录病毒 载体本 身并不 具有感 染性, 采用修 改的磷 酸钙转 染方案 将该质 粒导入 包装细 胞后, 获得病 毒的结 构蛋白 ,然 后才能 包装出 具有感 染性的 病毒。 稳定 的产毒 细胞系 可从稳 定转染 的细胞 中选出 ,或通 过交叉 感染而 产生, 即用从 一个类 型的包 装细胞 短暂产 生的病 毒感染 另一个 不同包 膜类别 的包装 细胞系 (见图 6.10)。 包 装细 胞系平 2、 氺 CRE、 氺 CRIP、 PA317、 Q2bn 及 Isolde 均可用 此法。 . 485 . A 药 物选择 已感染 的细胞 B 药 物选择 良好稳 定转染 的细胞 图 6.10 无复制 能力载 体的稳 定产毒 细胞系 的产生 要获得 高滴度 病毒原 液的持 续来源 , 可通过 将病毒 基因组 稳定地 转染至 包装细 胞而产 生稳定 的产毒 细胞系 。可 采用 两种基 本的转 染 方法中 的一种 。两种 方法的 初始步 骤都是 将编码 该载体 的细菌 质粒导 入包装 细胞中 , 然后收 集由被 转染的 细胞短 暂产生 的病毒 ,用 来感染 带有不 同类别 erw 蛋白 (见 正文) 的包 装细胞 ,如 A 所示 。另 一种方 法是如 B 所示 ,选 择整合 了细菌 质粒的 被转染 的包装 细胞 。在 这两种 方法中 ,都 用药物 (如用 G418 选择这 里所示 的病毒 ) 选 择那些 稳定整 合了病 毒序列 的细胞 ,然 后通过 筛选具 有药物 抗性的 克隆, 用以产 生高滴 度的病 毒原液 2. 材料 合适的 包装细 胞系及 培养液 逆 转录病 毒质粒 DNA HEPES 缓 冲盐水 (HeBS)(137mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,0.7mmol/L Na2HP04, 6mmol/L 葡 萄糖, 21mmol/L HEPES, 仔 细调整 pH 至 7.05, ) 2mol/L CaCl2 含有及 不含有 血清的 培养液 含有15%甘油的出85(?1出5/甘油) 800fxg/mL (100X) polybrene (双蒸 水配制 ), 滤 过除菌 (-20X: 保存) • 486 . 10%~15%二甲基亚砜(0\^0) 10cm 或 6cm 培养皿 24 孔或 6 孔组织 培养板 用于挑 克隆的 圆柱体 (cloning cylinder) 注意: 除了另 有注明 ,所 有组织 细胞培 养均在 有一定 湿度的 5% C〇2 的培 养箱中 进行。 3. 操 作步骤 (1) 在 转染前 Id, 在 10cm 培养 皿中接 种包装 细胞, 接神密 度大约 相当于 10% ~ 20% 汇片的 细胞数 (1:10 或 1:5 分传 )。 通 常使用 10cm 培养皿 ,也 可以用 6cm 培养皿 ,只 是所加 DNA 的量 和其他 试剂体 积减少 为此处 的 1/3。 (2) 将 lOpg 含 有药物 抗性基 因的逆 转录病 毒质粒 DNA 加入 0.5mL HeBS 中 (盛于 5mL Falcon 管 ) 〇 DNA 不必 消毒。 Falcon 管 (5mL) 能很 好地观 察沉淀 。如 果要得 到稳定 的包装 细胞系 ,必 须使用 选择性 药物抗 性基因 ,此药 物标记 可以在 载体上 ,也 可以在 与载体 质粒无 关的、 能共转 染的非 逆转录 病毒 质粒上 。如 果采用 共转染 ,则 病毒和 非病毒 (或药 物标记 ) 质 粒的摩 尔比为 10:1, 并把 它们在 HeBS 中混匀 (参 见选择 性标记 的讨论 )。 (3) 加入 32ML2m〇l/LCaCl2 ,并同 时轻 轻摇晃 。用 手指轻 弹试管 外壁约 30s, 然后 在室温 下温育 45min。 细小的 淡蓝色 沉淀逐 渐形成 。大的 、块 状沉 淀则不 正常。 (4) 移 去包装 细胞的 培养液 ,吸取 HeB&DNA 沉淀轻 轻加在 培养皿 的中央 。在 组织 培养 操作橱 内让细 胞接触 DNA20min; 大约 lOmin 后, 轻轻转 动培养 皿以均 匀分散 DNA 溶液。 (5) 加 10mL 培养液 ,将细 胞置于 37X: 温育 4h。 (6) 吸尽 培养液 ,轻 轻加入 2. 5mL 室温的 HeBS/ 甘油 溶液。 将培养 皿放回 培养箱 中温育 3.5min 或 90s (Q2bn 细胞 ), 或 对于特 定细胞 经测定 的合适 的温育 时间。 在 HeBS/ 甘油 中温育 3.5min 对一 些细胞 (平 2、 平 CRE、 ■'fCRIP、 PA317 细胞) 是适 宜的; 但对 于 一些禽 类细胞 (如 Q2bn) 9〇5是 合适的 。如 果遇到 甘油过 度作用 的问题 如在漂 洗过程 中细胞 从培养 皿 中吸出 ,则 要测定 细胞在 HeBS/ 甘油 中的总 时间。 (7) 快 速弃除 HeBS/ 甘油 溶液, 细胞用 10mL 培 养液轻 轻清洗 。重复 用培养 液清洗 1 次 ,加 5mL 含有 血清的 培养液 ,培养 18 〜 24h。 (8) 移出 培养液 ,用 0.45pm 的滤器 (可以 容易地 接上注 射器) 过滤 ,获得 的上清 含 有短暂 产生的 病毒。 将其 贮存于 -70X: 或 -80X:, 或者 立即用 于感染 另一个 带有不 同类别 的包膜 基因的 包装细 胞系, 以产 生一个 被感染 的产生 病毒的 细胞系 [见以 下步骤 (10) 〜 (12)]。 如果为 了其他 一些目 的而生 成短暂 产生 的病毒 ,实验 到此可 以结束 ,最初 的转染 细胞系 可以被 丢弃。 如果转 染的目 的是为 了生成 稳定的 产病毒 细胞系 ,有两 种选择 。第一 种选择 [步骤 (9) 之后 接步骤 (13) ~(16)] 是从 那些已 经稳定 整合了 载体质 粒的转 染细胞 中进行 选择。 这些细 胞可置 于药物 选择之 下 ,对 产生的 药物抗 性细狍 进行产 毒筛选 。第 二种选 择是用 “交叉 感染” 的包装 细胞系 。上 述步骤 (8) 中 收集到 的短暂 产生的 病毒可 用来感 染另一 个包装 细胞系 , 如步骤 (10) ~ (12)。 其 后被感 染的包 装细狍 • 487 • 可置于 药物选 择之下 [步骤 (13)~(16)]。 无论 用哪种 方法, 目的都 是为了 分离稳 定整合 了病毒 基因组 并 产生可 能的最 高滴度 的包装 细胞。 (9) 短暂 产生的 病毒被 收集后 ,在转 染的细 胞中加 l〇mL 培养液 ,培养 2 〜 3d, 然 后继 续步骤 (13)。 这个 路线只 适用于 那些带 有选择 性标记 的病毒 。这 个方法 较用转 染的细 胞方法 可能更 受欢迎 ,因 为由 感染而 产生的 前病毒 常常是 与宿主 基因组 稳定地 联系并 在整合 后不发 生重排 或丢失 。用这 种方法 时必须 用表达 不同类 别的病 毒糖蛋 白的两 种包装 细胞系 ,当 一个 包装细 胞系产 生一种 特定的 env 糖蛋 白 (如 小鼠双 嗜性的 env) 时 ,该 包装细 胞表面 的受体 就被那 种病毒 糖蛋白 结合而 被阻断 。那 么这时 用 有相同 类别的 env 糖蛋 白的病 毒粒子 感染该 细胞系 ,由于 该细胞 表面没 有游离 的受体 ,则病 毒粒子 无法进 入细胞 ,只有 用不同 类别的 env 类型的 包装细 胞系才 能被交 叉感染 。当用 交叉感 染时, 两种包 装 细胞系 必须是 同源的 ( 即都是 鼠源性 的或禽 源性的 )。 (10) 在 感染前 ld, 将包装 细胞系 [与 步骤 (1) 所 用的细 胞系的 env 类型 不同] 按 1:10 — 1:20 传代。 (11) 移去 将要感 染的包 装细胞 系的培 养液。 加病毒 [得 自步骤 (8)] 如下 :用于 感 染一个 10cm 的培 养皿上 的细胞 ,稀释 0.1 〜 l.OmL 病毒 原液至 终体积 3 〜 5mL, 并 加 800pg/mL 的 polybrene 至 8/jig/mL; 如感 染一个 6cm 的 培养皿 ,稀释 0.1 〜 l.OmL 病 毒 原液至 终体积 2mL, 并加 800/xg/mL 的 polybrene 至 终浓度 8;ig/mL。 温育 lh 以上。 如果 载体是 异常的 构建体 ,病毒 原液的 用量不 好确定 。可 用几种 量的病 毒原液 (例如 O.lmL、 0.4mL、 l.OmL) 感 染几只 培养皿 ,确 保至少 有一个 培养皿 能在选 择过程 后产生 足够的 克隆。 如果是 已公布 的载体 ,则 采用 以前实 验所推 荐的病 毒原液 用量。 对 于小鼠 病毒和 鸟类的 E 亚群 需包括 polybrene, 对 于鸟类 的其他 亚群则 不需要 polybrene。 如果细 胞对于 polybrene 不敏感 (大多 数包装 细胞都 如此) 则 更长时 间的温 育也不 会损害 细胞。 (12) 对于 10cm 培养皿 ,加培 养液至 终体积 10mL; 对于 6cm 培养 皿则加 4mL。 培 养 2~3d〇 如果 细胞对 polybrene 不敏感 ,同 时培养 液和血 清也加 入到病 毒接种 体中, 则让病 毒留在 细胞上 并 加培养 液以增 加体积 。否则 ,弃 除病 毒接种 体并用 合适体 积的普 通培养 液和血 清培养 细胞。 (13) 在 转染或 感染后 2 〜 3d, 将 转染的 [步骤 (9)] 或 感染的 [步骤 (12)] 细胞 按 1:10 或 1:20 传代, 加选择 培养液 ,培养 3d。 换新的 选择培 养液, 再培养 4 〜 7d 直 至可见 到细胞 克隆。 (14) 用克 隆圆柱 体挑取 分隔良 好的细 胞克隆 ,每 个克隆 转移至 2 个 24 孔培 养板或 6 孔培养 板的培 养孔中 。生 长至 50% ~90% 汇片。 多数 克隆能 被汇集 在一起 ,胜 于作为 独立的 细胞系 。如果 不需要 高滴度 的病毒 ,则 汇集的 产毒细 胞 能够令 人满意 。但如 要得到 稳定的 产毒细 胞克隆 , 就必须 一个个 地挑取 和筛选 细胞克 隆以获 得高滴 度 的病毒 。当采 用交叉 感染时 ,通常 汇集的 产毒细 胞能和 单个的 克隆产 生相似 的病毒 滴度。 (15) 移去 培养液 ,换成 1/2 体积的 培养液 。视包 装细胞 系不同 而培养 1 〜 3d。 移出 培养液 ,立 即对其 进行直 接滴定 ,或 贮存于 -70X: 或 -80X:。 培 养时间 长短由 细胞类 型决定 。根据 经验屯 2 需要 2 〜 3d 而拾 度里第 亿或屯 CRIP 需要 l~2d。 (16) 继续传 代各产 病毒细 胞克隆 ,直 至其 可冻存 ,和 (或) 直至鉴 别出最 好的产 病 毒细胞 。当 鉴定出 一个好 的产病 毒细胞 克隆时 ,细胞 分装在 20 〜 25 支 冻存管 (1 〜 2mL 每支) 中 ,培 养液含 10% 〜 15%DMSO, 在 液氮中 冻存。 细胞传 代采用 特定的 包装细 胞系建 立者所 建议的 方案。 细胞分 装多管 冻存是 为了预 防一些 风险诸 . 488 . 如重 组所产 生的辅 助病毒 或作为 细胞贮 备以防 病毒滴 度降低 (一些 克隆随 着时间 的过去 会减少 病毒的 产生 ,原 因未知 )。 (二) 病 毒滴度 的检测 :高滴 度病毒 生产细 胞克隆 的鉴别 1. 原理 分离出 产病毒 克隆, 或产生 了产病 毒混合 细胞后 ,就需 要鉴别 出产生 高滴度 病毒的 细胞 。虽 然粗略 的定量 分析也 可用产 病毒细 胞进行 ,如对 其载体 RNA 或蛋白 进行定 量 ,但 常规的 方法是 如这里 所述的 ,用 病毒感 染靶细 胞进行 生物学 分析。 确定被 滴定的 病毒 没有发 生重排 或丢失 也是必 要的。 2. 附 加材料 病 毒原液 (见上 方案) 靶 细胞系 (如 NIH3T3 成纤维 细胞) G418 或 其他选 择药物 3. 操 作步骤 (1) 感 染的前 Id 按 1:10~ 1:20 将 靶细胞 分传于 6cm 培养 皿中。 NIH3T3 是鼠 成纤 维细胞 ,用于 鼠源性 逆转录 病毒的 感染; 如 果是用 禽源性 的病毒 ,可代 之以鸡 胚成纤 维细胞 ,按 1:4 或 1:5 分传; 或采 用鹌鹑 细胞系 QT6, 按 1:6 分传。 (2) 进 行感染 的当天 ,移 去靶细 胞的培 养液, 加入含 有病毒 原液的 培养液 。用 1~ 2mL 含有 O.OlpL 〜 0. lmL 病 毒原液 的培养 液感染 6cm 培 养皿中 的细胞 ,或 3~5mL 感 染 10cm 培 养皿中 的细胞 。对于 鼠源性 的或禽 源性的 E 亚群 ,加 800ptg/mL 的 polybrene 至 终浓度 8/xg/mL, 在 37X: 温 育细胞 1 〜 3h。 至少 要滴定 2 个相差 10 倍的稀 释度以 获得可 计数的 克隆数 (20~100 个 )。 一些细 胞能耐 受高浓 度的 polybrene (8Mg/mL) 过夜 ,而有 些细胞 则不能 。由 于鼠源 性病毒 的半衰 期只有 4h, 因此 并不总 是温 育时间 越长, 感染效 果越好 。病毒 的吸收 发生的 相当快 ,仅 仅在 lh 内 。(对 禽源 性病毒 而言, polybrene 仅仅 对其 E 亚群 是必须 的。) 如果 细胞对 polybrene 不敏感 ,病毒 原液中 的培养 液和血 清可以 和 病毒一 起留在 细胞上 ,然后 简单的 用培养 液稀释 polybrene 的终 浓度为 2pg/mL。 否 则须弃 除含有 polybrene 的培 养液及 病毒, 然后加 入合适 体积的 普通培 养液和 血清以 让细胞 生长。 (3) 用培养 液稀释 polybrene 至 2pg/mL, 并培 养至少 2 或 3 个细 胞周期 这段 时间病 毒基因 会整合 、表达 。对于 NIH 3T3 和 QT6 细胞为 2~3d, 而对于 一般的 CEF 细胞, 时间 会较短 (1.5~2d)。 (4a) 如果病 毒携带 了一个 组织化 学标记 基因如 hcZ, 则感 染的细 胞可用 Xgal 染 色, 不需要 进行药 物选择 。计 数蓝染 的细胞 ,接着 按步骤 (6) 计算 滴度。 (4b) 如 果病毒 携带了 药物抗 性基因 ,将 感染的 细胞分 传入选 择培养 液中。 如果抗 性 基因是 neo, 将 细胞按 1:1〇~1:20 传代, 分传入 2 个 各含有 G418 的 10cm 的 培养皿 中 ,培养 3d。 G418 的用量 取决于 被选择 的细胞 。对 鼠成纤 维细胞 (如 NIH3T3) 使用 lmg/mL 的 G418 (5) 换液 ( 内含适 当的选 择药物 )。 共培养 7 〜 10d, 届 时应可 见到细 胞克隆 。在克 • 489 . 隆 扩散之 前计数 其数目 (常 在选择 12d 之前 )。 (6) 按如下 公式计 算滴度 (RCFU 表 示抗性 CFU): 克隆数 G418 抗性 CFU/mL: 病毒原 液体积 (mL) X 复 制因子 x 稀释度 Xgal+ 阳性 克隆数 或, 如果病 毒携带 tocZ 基因, Xgal CRJ/ml 病毒原 液体积 (mL) 和许 多多步 骤生物 检测方 法一样 ,上述 方法的 重现性 不好。 粗略的 估计是 ,病 毒滴度 的变化 >3 倍即 为有显 著差异 ,在 3 倍之内 则可以 当作相 同病毒 使用。 如果需 要更准 确地测 定滴度 ,检测 多次并 取数次 结果的 平均值 ,当比 较两种 病毒原 液的滴 度很重 要时, 测定滴 度时并 排进行 同样的 实验。 不同实 验室对 滴度的 计算也 不相同 ,部分 原因在 于很难 计算病 毒整合 后和细 胞改用 选择培 养液培 养 之间细 胞分裂 的次数 。例如 ,当在 整合和 G418 选 择之间 细胞分 裂两次 ,单 个的病 毒粒子 能产生 2~4 个 G418 抗 性克隆 。近来 , 随着新 的筛选 标记如 的出现 ,我 们可以 通过计 算接种 NIH3T3 细 胞 2d 后的 Xgal+ 克隆 数来直 接测定 CFU。 这种 直接的 方法不 需要在 感染后 、估 计克隆 数之前 对细胞 的次 培养。 这就避 免了由 分裂次 数所带 来的含 糊不清 ,有一 个克隆 就加上 一个, 不必理 会每个 克隆中 的细 胞数。 BAG 病毒既 能编码 ne〇, 也能 编码仏 cZ, 可以被 用来对 上述两 种方法 做直接 的比较 。用多 种不同 病 毒原液 同时感 染平行 的培养 M, 在 这种情 况下, G418 抗性的 CFU/mL 能 被校正 ,因 为细胞 分裂次 数可以 由每个 Xgal+ 克隆 的细胞 平均数 目确定 ,此数 字即为 CFU 计 算公式 中的复 制因子 。当此 种修正 进行后 ,两 种方法 计算的 CFU/mL 就 会一致 ,相差 不超过 2 倍。 而当被 滴定的 载体不 含有组 织化学 标记时 ,则需 要估计 复制因 子的值 ,如果 转染后 、选 择前有 2~3 个细胞 周期的 时间, 则合理 的估计 是 2~4。 (7) 用一 种分析 方法证 明产病 毒克隆 所产生 的病毒 没有发 生重排 或丢失 ,病 毒有预 期的 结构。 通 常我们 希望载 体上有 我们感 兴趣的 基因并 在转染 后表达 ,而 病毒滴 度的测 定只能 证明载 体转入 并表 达了标 记基因 (如 Z&Z)。 因此 我们必 须检测 我们所 感兴趣 的基因 是否进 入细胞 并表达 。如 果不能 直接进 行这样 的分析 ,至少 应检査 病毒基 因组的 结构, 及病毒 RNA 的产生 。可 用从产 病毒细 胞克隆 产生的 病毒感 染细胞 ,并对 其进行 Southern 或 Northern 杂 交分析 。或 者进行 RNase 保 护分析 ( 当目的 基因的 mRNA 为亚 基因组 RNA 时 )。 (三) 产 病毒菌 落的快 速评价 除了滴 定病毒 原液的 活力外 ,也 可对 产毒克 隆存在 的病毒 RNA 或蛋 白进行 定量分 析 ,产毒 细胞中 病毒产 物的量 与上清 的病毒 载体的 量常常 (尽管 不一定 总是) 存 在相关 性 。例如 ,带有 ZcuZ 载 体的产 毒细胞 系中的 p- 半乳 糖苷酶 蛋白的 量就直 接相关 于上清 中的 /%Z 病 毒的数 M, 而且 每个克 隆可用 ONPG 裂 解法或 Xgal 染 色法筛 选出来 。相应 地, RNA 点 印迹分 析也能 迅速评 估载体 RNA 的量 ,而且 这种方 法也和 被滴定 的董有 关 。由于 RNA 分析 方法和 Xgal 染色一 样是侵 害性和 致死的 ,必须 留有挑 出的抗 药性克 隆 的复孔 。直接 滴定培 养上清 是筛选 产毒克 隆的典 型方法 ,但 需要 较长的 时间及 更多的 产 毒细胞 系的次 培养。 • 490 • 1. 原理 (四) 培养 细胞的 Xgal 染色 本 方案可 用于被 感染细 胞的染 色以获 得对滴 度的直 接测度 ,也 可以直 接染色 产毒细 胞 ,以鉴 定表达 高水平 (3- 半 乳糖苷 酶的产 毒克隆 。培 养细胞 可选用 两种固 定剂之 一进行 Xgal 染色。 固定剂 的选择 由方便 性决定 ,但是 使用戊 二醛通 常使细 胞染色 较浅。 2. 附 加材料 感染或 转染带 /acZ 基 因病毒 的细胞 磷酸缓 冲盐水 (PBS) 固定液 : 0.05 % 戊 二酵或 2 % 低 聚甲酵 (paraformaldehyde) Xgal 溶液 3. 试 剂配制 . 戊二醛 固定剂 (0.05%): 戊 二醛通 常配成 25% 的溶液 ,分装 后贮于 -201C。 分装 的戊二 醛可反 复冻融 多次。 在即将 使用前 融化一 个分装 管并用 PBS 稀释 500 倍 至终浓 度为 0.05%。 注意 :戊二 醛是致 癌物质 ,并能 引起过 敏反应 。应在 通风橱 中使用 ,并按 照规定 弃置废 弃物。 低聚甲醛(2%):将28甲醛溶于10011^0.1111〇1/1^?16.9的?1?£3缓冲液中(每 升有 30.24g N, AT- 二 (2- 乙基 磺酸) 哌嗪 ), 加入 MgCl2 至终 浓度为 2mmol/L (200fxL lmol/L 溶液 ), 力口入 EGTA 至终 浓度为 1.25mmol/L (0.5mol/L pH 8.0 溶液 250 pL。 在通 风橱中 边搅拌 边加热 5 〜 lOmin, 不要 使溶液 沸腾, 冷却至 4t:。 使 用甲醛 溶液必 须有较 好的缓 冲容量 ,且 其贮存 不超过 一周。 Xgal 溶 液:用 PBS 配制 5~35mmol/L K3Fe(CN)6 5~35mmol/L K4Fe(CN)6.3H20 1 〜 2mmol/L MgCL 或 MgS〇4 在临用 前加入 40 X Xgal 的 IV, AT- 二甲 基甲酰 胺溶液 ,至终 浓度为 lmg/mL。 注 意:避 免接触 和吸入 氰化物 ,并按 照规定 弃置废 弃物。 使用的 铁和亚 铁氰化 物的量 对获得 最佳结 果十分 关键。 量越多 引起吲 哚的沉 淀越快 ,这样 可减少 扩散 。然而 ,尽 管在 细胞系 中不经 常出现 ,但 在某些 组织中 延长温 育时间 (过夜 或更长 时间) 可能会 产 生绿色 背景。 前 3 个成分 (包括 Xgal) 在室温 至少可 保存几 个月, 40XXgal 二甲基 甲酰胺 溶液可 在玻璃 容器中 用锡 纸包裹 -20T: 保存。 4. 操 作步骤 (1) 弃 培养上 清并加 固定液 (6cm 培 养皿加 2mL, l〇cm 培 养皿加 5mL), 全 温下, 与 2% 低聚甲 醛共育 60min, 或与 0.05% 戊二 醛共育 5 〜 15min。 包含 固定剂 的操作 最好在 通风橱 中进行 。过长 的温育 时间会 在后续 步骤中 抑制酶 活性。 . 491 • (2) 根据 实验室 化学物 弃置规 程弃去 固定液 ,室 温下用 PBS 充分洗 涤细胞 3 次 ,第 1 次和第 3 次是快 速洗涤 ,第 2 次洗 涤时, 可保留 PBS 于 细胞上 lOmin。 残留 的固定 液会抑 制酶促 反应。 (3) 加入 能覆盖 细胞的 最小量 Xgal 溶液 (Xgal 非 常昂贵 ), 37X: 温育 lh 或 过夜。 阳性 细胞被 染蓝。 培养 皿可在 4X: 长期 贮存。 (五) 方 法评注 1. 背 景信息 和参数 将载 体导入 包装细 胞系可 通过质 粒载体 的转染 ,或通 过某个 细胞系 产生的 病毒对 其他 细胞系 的感染 (交叉 感染) 来完成 。转 染是非 特异性 的介导 DNA 进 入一些 类型细 胞的 技术。 转染的 DNA 在转 染后数 小时或 数天内 的一段 时间内 ,能在 10% 的包 装细胞 系中瞬 时转录 。但 仅有 1/5000 的细 胞能稳 定地整 合转染 DNA, 虽 然其携 带有逆 转录病 毒准 确整合 的序列 ,不 能准确 并有效 的整合 。转染 的逆转 录病毒 DNA 和 其他的 质粒一 样 ,整 合是非 特异性 和低效 率的。 很明显 ,病 毒结构 的重要 特点或 是某些 酶活性 仅在其 感染宿 主后表 现出来 ,而 在转染 的质粒 DNA 中 则无法 表现。 瞬 时或稳 定产生 的载体 RNA 能被 有效地 包装并 能在包 装细胞 表面出 芽生长 。因此 感染 的逆转 录病毒 载体可 通过去 除上清 中的包 装细胞 而收集 。已稳 定整合 了病毒 的细胞 系可 无限产 生大量 病毒。 稳定整 合了病 毒基因 组的细 胞通常 能通过 病毒编 码的基 因经药 物筛 选得到 。如果 病毒不 含合适 的选择 基因, 可通过 共转染 带有选 择基因 的非病 毒质粒 来进行 筛选。 在病毒 质粒和 非病毒 质粒的 摩尔比 10:1 时, 可以筛 选出同 时整合 了两种 质粒 的细胞 。当一 个产毒 系由交 叉感染 得到时 ,感染 时需用 很小量 的病毒 。如果 是高度 多样 性感染 (MOI), 就 可能转 移缺失 基因组 或野生 型辅助 重组体 。在采 用某些 载体的 实例中 ,交叉 感染得 到的产 毒克隆 对特定 载体有 很高的 产生最 大滴度 的概率 。转 染得到 的产 毒克隆 产生的 病毒滴 度差别 很大, 这是因 为转染 后转染 DNA 的 配置各 不相同 。另 一方面 ,感 染能可 靠的产 生单拷 贝的前 病毒。 包装 细胞系 产生的 病毒感 染同一 包装细 胞系的 效率是 极低的 (尽管 不是完 全没有 ), 包装细 咆系产 生的病 毒糖蛋 白明显 能和宿 主受体 编码 的糖蛋 白结合 。带 有相同 的病毒 粒子不 能进入 。但由 于不同 病毒糖 蛋白和 不同的 细咆受 体作用 ,对某 包装细 胞系转 染产生 的病毒 粒子能 交叉感 染其他 的包装 细胞系 (如少 CRE 产生 的病毒 可有效 感染平 CRIP)。 由 包装细 胞系产 生的病 毒粒子 对相同 包装细 胞的感 染也可 以实现 。糖基 化的 抑制剂 ,如 Tunicamycin, 能 用来瞬 时封闭 env 糖蛋白 的产生 。在使 用该试 剂封闭 糖蛋白 产生后 ,细胞 能被携 带相同 env 糖蛋白 类型的 病毒粒 子感染 ,然 后可去 除该试 剂。 这个方 法需要 小心确 定试剂 的参数 ( 如时间 和剂量 ), 因 为这类 试剂具 有细胞 毒性。 由于 采用标 准的转 染方法 能很容 易导入 病毒基 因组, 所以这 些方法 在本节 被简要 概述。 2. 疑 难解答 病 毒滴度 (由 每毫升 群落形 成单位 表示的 浓度, CFU/mL) 变 化很大 ,并由 多种因 • 492 • 素共 同决定 。载体 、插 入序列 、包装 细胞系 、收获 方法都 对最后 的滴度 有影响 。尽 管稳 定的 产毒系 的滴度 可达到 108CFU/mL, 106CFU/mL 对鼠 Ecotropic 病毒、 105CFU/mL 对 鸟复制 不完全 病毒都 可令人 满意了 。瞬 时产毒 的病毒 ( 如转染 18~24h 后从包 装细胞 系收集 得到的 病毒) 滴度通 常较低 ,在 10~104CFU/mL 之间。 如果在 产毒克 隆中鉴 定不出 高滴度 产毒系 ,则可 能是由 于转染 过程、 包装细 胞产生 较少 的病毒 粒子或 是细胞 被感染 的效果 以及病 毒在传 输或表 达方面 的困难 。除了 最后一 项, 其余可 通过转 染并滴 定已知 产生高 滴度的 对照载 体控制 。如果 对照载 体结果 正常, 但新载 体结果 不正常 ,问 题就出 在新载 体的设 计上而 且很难 解决。 可以尝 试用其 他载体 表达 感兴趣 的基因 。载 体重要 的变化 包括载 体所携 带的病 毒基因 (如 越多 ,效果 越好 )、 所用的 启动子 、用 于检 测的标 记基因 以及目 的基因 在载体 的位置 。在目 的基因 序列 中存在 的接合 和多聚 腺苷化 位点会 在病毒 的转录 或转移 中引起 问题。 插入基 因被修 减到只 有蛋白 编码区 序列能 减少一 些问题 。试 用不同 的载体 有时会 改变这 种情况 。但有 的基因 用任何 已有的 载体都 不能高 水平的 表达或 转移, 其原因 不明。 但试 图分离 得到稳 定的产 毒系通 常会遇 到一些 困难, 特别是 马上要 处理大 量的克 隆, 而后才 是鉴定 高滴度 的克隆 。如果 RNA 或其 他载体 基因产 物能采 用短期 方法检 测 ,则 在丢弃 不好的 产毒系 前减少 次培养 的数目 是肯定 有益的 。在 获得稳 定产毒 系过程 中会 遇到的 其他困 难还有 本已证 明为高 滴度的 产毒克 隆的滴 度丢失 和辅助 病毒的 污染。 对 于滴度 的丢失 ,两 种解释 很类似 。第一 种认为 是由于 包装细 胞失去 产生衣 壳的能 力 ,有 时是某 些产毒 系失去 产生病 毒粒子 的能力 。在 这样的 情况下 ,建议 包装细 胞系和 产 毒克隆 进行药 物选择 以保留 ent;、 基因。 另一种 导致滴 度丢失 是载体 RNA 产生 能力的 丢失, 可能是 由于对 LTR 启动子 活性的 调节。 原来被 Xgal 100% 蓝 染的克 隆经 过一段 短时间 (数周 ) 的 次培养 后变成 蓝色和 白色的 混合物 ,甚至 100% 白色 。当 用 Northern Blot 检测 hcZ RNA 水平时 发现, 白色克 隆或混 合染色 的亚克 隆有低 水平的 ZacZ RNA。 这一 现象在 其他的 许多启 动子和 非逆转 录病毒 构建物 中都被 观察到 。遗憾 的是 现在尚 无法使 启动子 重新发 挥作用 。即使 某启动 子能被 药物抗 性基因 选择, 也不能 以 此选择 LTR 的活性 。因 此产 生大量 白色细 胞的产 毒克隆 并不能 产生高 的病毒 滴度。 其他 不编码 的载体 也存在 类似丢 失滴度 现象。 当用逆 转录的 方法检 测这些 克隆产 生 的病毒 粒子时 ,病毒 粒子的 产生并 未减少 而载体 RNA 的产生 减少, 这实际 是同一 问题。 3. 预 期结果 使 用好的 鼠载体 ,由平 2 或平 CRIP 瞬时 产生的 病毒原 液的滴 度应在 1〇3 〜 l〇4CFU/ mL 之间。 较低的 滴度如 10 〜 100CFU/mL 通 常表明 稳定的 滴度也 会很低 。而由 Q2bn 产生 的瞬时 滴度在 104 为好; Isolde 不能 产生好 的瞬时 滴度, 通常为 l〇~l〇〇CFU/mL。 当选择 稳定克 隆时, 大多数 包装系 转染效 果好。 10cm 皿中有 30 〜 100 个克隆 ,药 物 选择中 1:20 会裂解 。对平 2 原液而 言好的 滴度为 106CFU/mL, 对其 他的包 装细胞 系 ,未得 到如平 2 那样 的稳定 高滴度 。但有 些研究 组报道 用其他 载体, 他们得 到如平 2 那样高 的滴度 。如果 用稳定 的转染 以获得 产毒系 ,可 期望 25% 的 产毒克 隆有合 适的滴 度 。如果 用交叉 感染, 25%~100% 的克 隆会得 到满意 的滴度 。如 果产毒 细胞由 交叉感 • 493 • 染的细 咆汇集 得到, 汇集的 产毒细 胞会产 生合适 的滴度 。对 Is°lde, 稳定的 滴度为 105CFU/mL, Q2bn 可得到 10 倍 低的稳 定滴度 。有 复制能 力的鸟 载体有 >l〇6CFU/mL 的稳定 滴度。 4. 时 间安排 转 染头两 周的工 作较少 。但 在分离 克隆、 滴定上 清和冷 冻产毒 克隆的 过程中 ,有持 续的 组织培 养工作 。总的 工作量 取决于 被分离 的克隆 数目。 三、 逆转录 病毒原 种的大 量制备 与浓缩 对于 某些用 途来说 (如 体内感 染细胞 ), 有 必要浓 缩反转 录病毒 原液以 增加其 滴度。 如果 想要用 不编码 可选择 标记的 病毒感 染一群 细胞, 必须用 高滴度 的病毒 。操作 中需用 几百毫 升至几 升的产 毒细胞 上清。 注意 :逆转 录病毒 颗粒很 容易受 损害, 即使在 优化的 条件下 ,它的 半寿期 也很短 。重 悬沉 淀及其 他 过程都 必须轻 轻操作 ,实验 材料必 须保持 低温。 (一) 病毒原 株的制 备与离 心浓缩 1. 材料 已鉴 定的高 滴度平 2 产毒细 胞系, 50% ~90% 汇片 含有 10% 小 牛血清 的完全 DMEM 培养基 (DMEM-10, 用小牛 血清代 替胎牛 血清) NIH 3T3 细胞 800^xg/ mL polybrene 大 容量的 0.45pm 的滤器 (如 Nalgene 115mL 或 500mL 滤器) Beckman JA-14 转子及 250mL 离心瓶 (当 进彳了 大体积 离心时 ) 或 Beckman SW-27 或 SW-41Ti 转子 (当 进行小 体积离 心时) 注意: 除非另 有说明 ,所 有的 组织细 胞培养 均应在 有一定 湿度的 5% COz 培 养箱中 , 371C 进行。 2. 操 作步骤 病毒 原液的 制备: (1) 将 产病毒 细胞按 1:10 或 1:20 从刚生 长汇片 的细胞 分传至 20~50 个 10cm 培养 皿中 ,培养 细胞至 50% 〜 90% 汇片 。弃去 培养液 ,轻 轻加入 半量的 培养液 ,注 意培养 液 碱性不 要过大 。培养 2~3d。 对于 不同的 包装细 胞系, 其优化 条件可 能不同 。如上 清可能 在细胞 刚长满 时收获 ,或 在长 满前一 天换 培养液 至半量 ,随后 的一天 收获。 (2) 收 取上清 ,用 0.45pm 的滤器 过滤, 贮存于 -70t: 或 -80X:, 或 马上进 行滴定 和浓缩 [步骤 (3) 〜 (5)]。 至收集 上清时 ,细 胞将极 密挤满 ,培 养液呈 黄色。 (3) 滴定病 毒原液 (了 解浓缩 病毒之 前病毒 的起始 滴度是 必要的 )。 • 494 • 病毒 原液的 浓缩: (4) 对于大 体积病 毒原液 ,用 无菌的 250mL 离 心瓶和 JA-14 转子在 4X: , 25 OOOXg 离心 20min。 对 于小体 积的病 毒原液 ,用 SW-27 或 SW-4]Ti 转子 20 OOOr/ min 离心 lOmin。 用前用 70% 乙醇 淋洗离 心管以 防细菌 污染。 (5) 将上 清直接 倒入消 毒的离 心瓶中 ,用 JA-14 转子 14 000r/min 离心 5 〜 16h, 或 用 SW-27 或 SW-41Ti 转子 20 OOOr/min 离心 2h, 离心在 4X: 进行。 小心除 去上清 ,用 原病 毒体积 0.1%~1% 的 DMEM-10 重悬 沉淀。 需留取 小量的 上清用 于滴定 以判定 病毒是 否被沉 淀下来 。重悬 时用吸 管吹打 ,如 果相 当黏稠 ,可 能需要 2h。 在组 织培养 超净台 将培养 瓶置于 冰袋上 ,用同 一吸管 (避免 损失) 吹 打重悬 物约每 15min 吹打 1 次。 避免产 生气泡 ,不然 会使病 毒蛋白 变性。 浓缩 病毒的 滴定和 冻存: (6) 将病毒 分装成 5~50/iL 的小份 ,贮 存于 -70$ 或 -80T:。 滴定经 浓缩的 或未经 浓缩的 病毒各 1 份。 (二) 聚乙 二醇沉 淀浓缩 和层析 1. 附 加材料 5mol/L NaCl, 过 滤除菌 聚 乙二醇 (PEG) 6000, 过 滤除菌 NTE 缓冲液 (100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl pH 7.4, lmmol/L EDTA, 过滤 除菌) Sepharose CL-4B 或 CL-2B (Pharmacia) Savant 高速离 心机或 Beckman SW-41Ti 转子 其他 Sepharose 层 析所需 的设备 2. 操 作步骤 (1) 制备病 毒原液 。加 5mol/LNaCl 至 病毒原 液中, 4X: 不断 搅拌, 至终浓 度达到 0.4111〇1/[。缓慢加入?£0 6000 至终浓度8.5%(;«/\〇,410持续搅拌1~1.511。 (2) 7000X g •离心 l〇min (对于 SW-41Ti 转子用 7500r/min, 对于 Savant 高 速离心 机用 lOOOOr/min)。 用原病 毒体积 1% 的 NTE 缓 冲液溶 解沉淀 。直接 使用或 贮存于 - 70X: 或 - 80X: 。 (3) 准备好 Sepharose CL-4B 或 CL-2B 柱子 ,用 NTE 缓冲 液平衡 。对 于来自 lOOmL 病毒 原液的 沉淀用 10mL Econo- 柱 (Bio-Rad)。 (4) 加病毒 ,用 NTE 缓 冲液以 lmL/min 进 行层析 ,以 0.3~0.5mL 为单位 收集各 组分 。测定 280mn 或 260nm 的光 吸收或 逆转录 酶分析 法分析 各组分 。将 适当的 组分合 并进行 滴定。 (三) 用 相对分 子质量 截留滤 膜浓缩 此方法 是浓缩 小至中 量体积 的逆转 录病毒 原液的 最简单 的方法 。将 制备的 上清用 • 495 • Amicon 的 Centricon-30 微量浓 缩器或 Polysciences 的 CentriCel 160 进行离 心过滤 ,基本 上按厂 家说明 书操作 。这 些滤膜 可让相 对分子 质量远 小于逆 转录病 毒的分 子通过 (如 Cemricon 30 滤 器可让 < 30kDa 的分 子通过 )。 上 清可在 Sorvall SS*34 离心 机中以 5000 xg 离心通 过这些 滤膜中 的一种 。将 那些 不能流 过滤膜 的物质 移出作 为浓缩 的病毒 原液 (离 心时间 越长, 病毒原 液越浓 )。 (四) 方 法评注 1. 参 数和疑 难解答 单独离 心后或 PEG 作用后 离心的 沉淀在 被重新 悬浮后 ,完 全溶 解是不 可能的 。不 管如 何努力 ,有些 病毒中 始终有 小的块 状物, 这些块 状物很 可能由 病毒组 分和细 胞碎片 组成。 不要过 分吹打 ,因为 溶液含 有很高 的蛋白 质浓度 ,并 会退化 到全是 泡沫的 状态, 使病 毒失活 。病毒 并不是 很耐受 ,如 果操 作不当 会很快 丧失感 染活性 。如 果重新 悬浮的 颗粒成 块较多 ,可 低速旋 转以粉 碎结块 ,如在 台式离 心机中 lOOOr/min 离心 5min 或在 微型离 心机中 lOOOr/min 离心 lmin。 将上清 保存在 -701C 或 - 80X:, 然 后当需 要得到 更多的 病毒时 ,再试 图悬浮 剩在管 中的块 状物。 PEG 方案对 鼠类病 毒工作 良好。 正如上 面所表 明的, PEG 能 明显改 变病毒 颗粒的 溶解性 ,并在 颗粒的 重新溶 解中带 来困难 。改变 PEG 的用量 ,减 少病毒 原液的 血清可 能会 解决这 一问题 。产 毒细胞 通常在 10% 的血清 中生长 ,直 到达到 特定的 汇片度 。可 改变 血清浓 度以减 少蛋白 的产生 ,如用 2% 血清或 10% 无血清 培养基 (NUSERUM), 直到 2 〜 3d 后上 清被 收集。 如果 浓缩的 病毒被 用于在 体外感 染细胞 ,就会 在感染 12h 内遇 到毒性 的问题 。明显 地 ,有些 细胞在 和高浓 度的病 毒粒子 孵育时 ,融 合并形 成多核 Syncitia。 这可能 是由于 病毒 粒子在 两或多 个细胞 的质膜 产生的 膜融合 ,这种 融合推 测是通 过病毒 粒子自 身的膜 上受体 和细胞 膜的相 互作用 完成的 。要 减少这 个问题 ,有必 要稀释 病毒, 减少细 胞暴露 在 接种体 的时间 ,并使 靶细胞 平铺开 ,以 使细胞 之间不 能互相 接触。 2. 预 期结果 用离 心法对 病毒的 回收率 达不到 100%, 尽管在 某些情 况下会 很高。 通常回 收率在 10% 〜 30%。 如果体 积减少 100 倍 ,则 回收率 10%, 而滴 度增加 10 倍, 这对很 多实验 都是 有用的 。如 果需要 滴度增 加更多 的倍数 ,则在 离心方 案中重 新悬浮 颗粒时 ,用 少于 1/200 的 病毒原 液体积 来悬浮 。也可 以尝试 离心第 一次浓 缩的原 液并用 1/10 体 积悬浮 颗粒。 但这样 得到的 病毒黏 性很大 ,块状 物很多 ,很难 用于大 多数的 实验。 当 PEG 沉 淀法被 采用时 (假 如没有 悬浮中 的问题 ), 该方 法容易 ,工 作良好 ,能产 生 高感染 l〇〇x 浓度 的病毒 。这 是比离 心更简 单快速 的方法 ,特 别是在 使用了 柱层析 后 ,能 较离心 法产生 较少块 状物。 3. 时 间安排 颗粒 V 离心法 兀成# t) 要 3 〜 仆, 包括标 记 试管、 Aliquoting 等。 PEG 法 从沉淀 病毒到 • 496 • 重新 悬浮病 毒颗粒 ,需要 2h, 柱层 析的建 立和运 行需要 lh, 检测层 析组分 如果用 RT 法需要 2h, 而 生物活 性的检 测需要 2~14d, 如 Xgal 染色或 G418 确 定病毒 滴度。 四、 逆转录 病毒原 株中辅 助病毒 的检测 辅 助病毒 是一种 有时存 在于无 复制能 力病毒 原液中 的有复 制能力 的病毒 。辅 助病毒 的存在 在动物 的感染 及谱系 分析中 会成为 问题。 (一) 通 过抗药 性的水 平传播 检测辅 助病毒 1. 原理 以下是 一种十 分敏感 的方法 ,用于 检测病 毒上清 促使病 毒基因 组从一 个感染 细胞水 平传播 至邻近 的非同 宗细胞 的能力 。有能 传播标 记基因 [新 霉素抗 性基因 Ueo)] 存 在 ,即表 明病毒 原液中 含有辅 助病毒 。要 用无 辅助病 毒的病 毒原液 (以 前已证 明的) 及 含 有辅助 病毒的 病毒原 液为该 实验的 对照。 2. 材料 NIH3T3 细胞 (仅用 于用鼠 源性病 毒时) 3 种 已滴定 了的病 毒原液 :含有 标记基 因的测 试细胞 ,含有 ne〇 标记基 因的无 辅助病 毒对照 (阴 性对照 ), 及野 生型辅 助病毒 800/^ig/mLpolybrene, 过 滤除菌 (Cl 存于 - 20*C) 含有 10% 小 牛血清 的完全 DMEM (DMEM-10, 用小牛 血清代 替胎牛 血清) 6cm 培养皿 0 • 45pm 滤膜 注意: 除非另 行注明 ,所有 的组织 细胞培 养应在 371C 有一定 湿度的 5%C〇2 培 养箱中 进行。 3. 操 作步骤 (1) 在 开始分 析的前 Id, 按 1:50 将 NIH3T3 细胞 分传于 3 个 6cm 培 养皿中 。将 1 个培养 皿标记 为阳性 对照, 1 个 为阴性 对照, 1 个 用于待 测病毒 原液。 (2) 含 有选择 标记的 待测病 毒的制 备:加 O.OlmL 800/^g/mL polybrene ( 终浓度 %g/mL) 至 lmL 待测病 毒上清 (或 1 〜 30pL 浓 缩的病 毒原液 稀释至 lmL) 中 ,通过 0.45/im 滤器 过滤。 (3) 含有 选择标 记的阳 性对照 的制备 :制备 lmL 无辅 助病毒 的病毒 原液与 1〇 〜 1000?11辅助病毒原液的混合液。加0.011111^ 800/^/1111^〇171^116(终浓度8纯/111[), 通过 0.45^x111 滤器过 滤除菌 。无 辅助 病毒的 病毒量 (CFU) 应与 待测病 毒的量 (CFU) 相等。 (4) 阴性 对照病 毒原液 的制备 :制备 lmL 无 辅助病 毒的病 毒原液 ,加 O.OlmL 800/ixg/mLpolybrene ( 终浓度 8fig/mL), 通过 0.45pm 滤 器过滤 除菌。 (5) 用各病 毒原液 感染培 养皿上 的细胞 [步骤 (1)]。 将感 染后的 3 个培养 皿置于 . 497 . 37t:C〇2 培养箱 中温育 1 〜 3h 以利 于吸收 。加 4mLDMEM-10 培 养至细 胞汇片 (约 3 〜 4d)〇 polybrene 的 浓度在 分析期 间必须 保持在 2Mg/mL, 以便 于辅助 病毒及 含标记 基因的 病毒的 扩散。 (6) 将 细胞按 1:50 分传 于新的 6cm 培养 皿中。 3 个培养 皿中每 次仅传 一个培 养皿, 弃去原 来感染 的细胞 的无用 的部分 。使 Polybrene 的终 浓度在 2pg/mL。 培 养至细 胞长到 50% 〜 90% 汇片。 在 分传细 胞之前 保留一 些上清 (如 取出约 2mL 保存于 -80X:)。 如果 存在辅 助病毒 ,这些 原始的 上清 和最终 的上清 [步骤 (8)] 的相 对滴度 将对于 病毒原 液中辅 助病毒 存在的 量有所 提示。 (7) 弃去培 养液换 以半量 的新鲜 DMEM-10。 再培养 2~3d。 (8) 收获生 长汇片 的细胞 的最终 的上清 。经 0.45/um 滤 膜过滤 ,加 polybrene 至终浓 度 8;ig/mL。 保存于 _ 70 , 或 即 用于滴 定及分 析标记 抗性。 (9) 在上清 滴定前 ld, 将新鲜 的未经 感染的 NIH 3T3 细胞按 1 : 10 或 1 :20 分传于 3 个 6cm 培 养皿中 。用各 种上清 [步骤 (8)] lmL 感染 NIH3T3 细胞 ,并 进行滴 定的各 步操作 。如果 出现了 几千个 抗性的 克隆就 说明原 始的待 测病毒 原液中 污染了 辅助病 毒。 对于 禽源性 无复制 活性病 毒要用 CEF 细胞。 在步骤 (1) 和步骤 (6) 按 1:10 分 传细胞 。除了 E 亚群外 ,对于 禽源性 病毒不 需要用 polybrene。 (二) 用逆 转录酶 分析法 检测辅 助病毒 1. 原理 上 述方案 [步骤 (8)] 中产 生的病 毒上清 能用放 射活性 dTTP 掺入进 行监测 。这 可用于 分析逆 转录酶 的活性 ,仅 当原 始的病 毒原液 中有辅 助病毒 时才能 测出该 酶的活 性 。本分 析方法 也可用 于其他 目的, 如检测 包装细 胞系是 否维持 产病毒 作用。 2. 附 加材料 逆 转录酶 (RT) 反 应系统 病毒 上清: 待测的 及对照 的样品 [抗药 性方案 ,步骤 (8)] 2XSSC (0.3mol/L NaCl, 30mmol/L 二水 柠檬酸 三钠, 盐酸调 pH 7.0) 95% 乙醇 % 孔微量 滴定板 Whatman DE52 或 DE81 滤纸 ,预 先切成 2.5cm 的圆 形或长 条形。 3. 试 剂配制 逆转录 酶反应 混合物 (见 下页表 )。 4. 操 作步骤 (1) 加 50ML RT 反应混 合物于 96 孔 微量滴 定板的 各孔中 。每 个待测 或对照 样品占 一孔 。加 10/xL 病 毒上清 ,盖 上平板 ,置于 37t:C()2 培养箱 中温育 1 〜 2h。 • 498 • (2) 将各 反应液 10;xL 点 于一张 2.5cm 直径 的圆形 DE52 或 DE81 滤纸上 ,其 上盖 一张塑 料薄膜 。用 2 号 铅笔做 标记。 试剂 “L 检 测数目 20 40 60 80 lmol/L Tris-HCl, pH 8.3 50 100 200 250 0.2mol/L DTT 100 200 400 500 0.02mol/L Mn〇2 30 60 120 150 3 mol/L NaCl 20 40 80 100 100/^tg/ mL oligo ( dT) 50 100 200 250 100fig/mL poly (ra) 100 200 400 500 0.2mmol/L dTTP 50 100 200 250 1% NP-40 50 100 200 250 [a-32P] dTTP/^Ci 100 200 400 500 总体积 (加水 ) /mL 1 2 4 5 (3) 将滤纸 置于一 个盘中 ,加 2XSSC 覆盖 。室 温下在 摇床上 轻轻摇 动洗涤 20min。 弃去 SSC, 重复洗 涤步骤 2 次 。在 95% 的乙醇 中浸泡 lmin, 空气中 晾干约 lOmin。 (4) 在闪 烁计数 仪中计 数或用 感光片 曝光。 (三) 方 法评注 1. 背 景资料 包装细 胞系产 生的野 生型、 有复制 能力的 辅助病 毒被用 于无复 制能力 的载体 。当此 载体用 于系谱 分析时 ,病毒 原液中 必须去 除辅助 病毒。 同样的 ,在 对年幼 动物感 染时, 野生型 病毒能 引起白 血病, 因此也 必须去 除辅助 病毒。 在 平2、 N^am、 PA12、 PA317 和 Q2bn 等 包装细 胞系中 ,编码 gag、 em />〇/ 的基 因组 不含编 码平的 序列, 但仍能 被包装 ,只 是频率 很低。 如果辅 助病毒 基因组 和病毒 基因 组一起 被包裹 ,在 下一次 逆转录 中会发 生重组 。如果 重组使 辅助病 毒基因 组接受 平序列 ,那 结果就 是重组 体能自 主复制 ,这 个重组 体就会 扩散到 整个培 养基中 。一旦 这种情 况发生 ,只有 丢掉产 毒克隆 ,因为 没有可 靠的方 法消灭 野生型 病毒。 我们可 以想像 ,辅 助病毒 的污染 在高滴 度的病 毒原液 中发生 的频率 更高。 PA317 包 装细咆 系较平 2、 氺 am、 PA12 和 Q2bn 安全 ,而氺 CRE、 GP + E-86、 "^CRIP、 DE 和 Isolide 系可 能设计 得更好 ,因为 他们不 需要产 生辅助 病毒。 重组对 辅助病 毒的作 用未在 平 CRE、 GP+E-86、 VCRIP、 DE 和 Isolide 中 观察到 ,但我 们必须 注意并 检测这 些细咆 系产生 的病毒 原液。 这些方 案可用 于确定 辅助病 毒作用 的宿主 范围, 这可通 过对不 同种类 细胞的 感染而 检测 ,如 狗细胞 (D17) 和 人细胞 (HeLa) 不能被 Ecotropic 病毒 感染, 而能被 Amophotropic 病毒 感染。 检 测辅助 病毒的 其他方 案包括 XC Plaque 检测和 S+ L 检测。 这些检 测方法 需要其 • 499 • 他的 细胞系 。这 里列出 的检测 水平散 布的方 法是很 灵敏的 ,但 非常花 时间。 RT 检测的 方法也 很灵敏 ,但有 时检测 不出削 弱的辅 助病毒 ,此 时辅助 病毒能 复制, 但发生 突变且 复 制能力 较野生 型有所 下降。 2. 疑 难解答 如 果用选 择性标 记检测 上清并 观察到 大量标 记抗性 的克隆 ,则 最初检 测的病 毒原液 包含野 生型辅 助病毒 。一旦 这种情 况发生 ,最好 丢弃产 毒克隆 ,因 为没有 可靠的 方法灭 活辅 助病毒 。如 果仅有 少量克 隆产生 ,有可 能是以 下情况 : 可能在 待测的 病毒中 发生不 完全 重组, 产生削 弱的辅 助病毒 。而在 大多数 应用时 ,消弱 的辅助 病毒并 无影响 。或者 一 些平基 因组能 在辅助 病毒未 污染时 转移到 转染的 NIH 3T3 细胞 上并 产生低 滴度。 包含野 生型辅 助病毒 的病毒 原液能 在抗药 性方案 的步骤 9 的检 测皿中 产生数 千个带 有 neo 标记 (G418 抗性) 的克隆 。如 采用 RT 检测法 ,被 测上 清液的 RT 活性需 和对照 加以 比较。 对照包 括已知 不含辅 助病毒 的病毒 原液感 染的细 胞和已 知的野 生辅助 病毒感 染 的细胞 。被 辅助病 毒污染 的病毒 原液的 RT 活性 较之没 有辅助 病毒的 会增加 1000 倍。 一个真 正不含 辅助病 毒的病 毒原液 会和不 含辅助 病毒的 对照的 RT 活性 一样。 病 毒上清 液的产 生需要 10d, 滴定病 毒以检 测其携 带有标 记基因 又需要 10~13d, 检测 上清中 RT 活性, 50 个样 品需要 2~3h。 五、 体外与 体内细 胞的逆 转录病 毒感染 用 逆转录 病毒载 体导入 外源基 因有广 泛的应 用范围 。但 具体到 不同的 实验, 感染方 案都可 能不同 ,有 必要针 对性地 进行条 件优化 。因为 难以具 体说明 ,下面 介绍的 只是一 些典型 的体内 及体外 感染细 胞实验 的准则 。如 果用易 于检测 效果的 载体优 化感染 某一特 定类型 的细胞 ,工 作将 要方便 得多。 注 意:在 操作人 的血液 、细胞 等生物 样本或 感染性 试剂时 应小心 ,必 须严格 遵守生 物安全 规程, 避 免个人 感染和 环境的 污染。 (一) 体 外细胞 的感染 用 逆转录 病毒载 体在体 外感染 靶细胞 很简单 ,如病 毒滴度 检测方 案一样 ,将 病毒与 靶细胞 一起培 养即可 。如果 使用的 是鼠源 性病毒 ,为 提高感 染效率 ,可用 一种多 价阳离 子例如 polybrene 来 帮助病 毒感染 。当 将病毒 在体外 与细胞 进行培 养时, 有时也 会有一 些问题 。例如 将未稀 释的高 滴度病 毒直接 用于某 些细胞 类型, 靶细胞 可能发 生融合 ,而 融 合细胞 的生命 力很低 ,大 多数会 在感染 后几天 死亡。 另 一种方 法是共 培养法 ,将细 胞与产 生所需 载体的 包装细 胞系一 起培养 。该 方法被 用于 感染造 血细胞 ,而且 证明可 大大提 高感染 效率。 在某些 情况下 ,如果 希望能 在共转 染期间 或之后 允许病 毒产生 ,但防 止产病 毒细胞 的分裂 ,可 采用一 些特殊 的处理 方法。 例如 ,在 共培养 之前, 可用丝 裂霉素 C (lO^g/mL 培养液 ) 或射线 (2800rad) 处理铺 满 的或接 近铺满 的产病 毒细胞 3h, 之 后用培 养液淋 洗几遍 。经过 这种处 理之后 ,将待 • 500 • 转染的 细胞接 种于产 病毒细 胞之上 ,靶细 胞可继 续生长 ,但 受损的 产病毒 细胞将 不再分 裂 ,最终 死亡。 如果靶 细胞是 血细胞 等非贴 壁细胞 ,在共 培养约 48h 后, 轻轻洗 涤产病 毒单 层细胞 ,靶 细胞就 可被洗 出了。 逆转录 病毒载 体在体 外感染 靶细胞 一 般效率 都很高 ,可 接近 100%。 但不同 的靶细 胞其 被感染 能力也 不同, 除受体 因素外 ,还有 许多未 知因素 的影响 。由于 逆转录 病毒载 体只 能整合 入有丝 分裂期 的细胞 ,如 果靶细 胞的有 丝分裂 越活跃 ,感染 的效果 就越理 想。 感染后 2 或 3 个细 胞周期 后就可 分析病 毒基因 产物的 表达了 。以 hcZ 基因在 NIH 3T3 细胞 中的表 达为例 ,用 X-gal 染色 分析时 ,克 隆数目 的高峰 在感染 后大约 48h(3 个细胞 周期) 出现 。然而 ,在 24h 内 ,部 分被感 染的细 胞中即 所见到 X-gal 染色 阳性, 说 明早期 即有部 分病毒 基因产 物开始 表达。 对组 织植块 或培养 的胚胎 的感染 也可用 上述方 法进行 L 将组织 植块置 于一单 层产病 毒 细胞系 上培养 ,或 浸浴于 所需量 的病毒 原液中 几小时 (用 鼠源性 病毒或 禽源性 E 亚 群 命毒时 ,加 polybrene 至 终浓度 8jug/mL)〇 (二) 啮 齿类动 物的体 内感染 本单元 介绍了 用逆转 录病毒 载体在 体内感 染啮齿 类动物 的方法 ,这些 方法也 可参照 用 于禽类 、灵 长类等 动物。 1. 原位感 染出生 后动物 1) 病毒原 液的体 秩 和滴度 用于体 内动物 组织中 的病毒 原液体 积是相 当小的 ,一般 0.1 ~l/iL 才能保 证其安 全 。因 此需要 制备浓 缩的高 滴度病 毒原液 ,需达 106~108CFU/mL。 由 于使用 的病毒 原液体 积极小 ,只 有将病 毒直接 送递至 包含有 丝分裂 靶细胞 的百分 数最高 的区域 才能得 到有效 的感染 ,发 挥效果 。在组 织液中 还可能 含有抑 制或破 坏病毒 感染性 的因子 ,如机 体的 局部免 疫等, 也会降 低感染 效果。 2) 病毒 的导入 可 直接将 病毒注 射到出 生后动 物的靶 组织内 。在 出生后 几天内 ,动物 的皮肤 甚至颅 骨 都很软 ,能 直接注 射到组 织中。 可以用 手动的 Hamilton 注 射器和 33-G 的针头 ,或用 玻璃吸 液管。 对于年 龄较大 的动物 ,注 射部位 较硬, 可能需 要在插 入一个 更纤细 的注射 针之前 ,先 用一硬 的针刺 一个孔 。用 染料如 0.05% (m/V) 台 盼蓝或 0.025% 快绿共 注射不 损害病 毒的感 染性, 可以起 到示踪 的作用 ,帮 助检测 注射的 精确性 。最好 是先作 预试验 ,单独 用染料 作一系 列注射 ,然后 马上解 剖动物 检查注 射位点 。注射 成功后 ,可 在任何 时候检 查其病 毒感染 的迹象 ,判断 效果。 3) 预实验 优化感 染条件 如果是 初次进 行组织 感染, 或不知 道靶细 胞的感 染和表 达效率 ,可先 用携带 报告基 因的 逆转录 病毒载 体进行 预试验 。如 按拟定 的实验 方案, 将携带 hcZ 的 逆转录 病毒载 体注 射入动 物的靶 组织内 ,几 天后取 特定的 组织, 用已优 化好的 X-gal 染 色条件 进行检 . 501 . 测, 就可直 接判断 转染及 表达效 果了。 • 有 一种方 法可同 时检测 注射部 位的准 确性和 X-gal 组织 化学染 色是否 有效: 注射含 有 kcZ 基 因的细 胞如平 2BAG 产病毒 细胞, 用荧光 染料如 二乙酸 琥珀酰 亚胺酯 羧基荧 光素 (CFSE, Molecular Probes 公司; 用 DMSO 配制成 lOmmol/LUt 液 。用铝 箔包裹 4X: 保存) 对 这些细 胞进行 预标记 (Bromier-Fraser, 1985)。 如果 X-gal 组 织化学 染色正 常 ,则 不应该 看到荧 光细胞 ,因为 X-gal 染色 的细胞 常充满 了靛青 色以至 于所有 的荧光 都被 吸收。 注射和 X-gal 组织 化学染 色方法 $ 化之后 ,就将 BAG 病毒注 射到靶 位点, 几天后 检测病 毒感染 。如果 X-gal 组织 化学感 色方法 不佳, 则可以 看见荧 光细胞 。这 时 ,要改 变固定 和组织 制备方 法直至 X-gal 染色试 验良好 为止。 2. 出 生前啮 齿类动 物子宫 内感染 在啮齿 类动物 出生前 ,可 以直 接在子 宫内对 其进行 逆转录 病毒载 体感染 。动 物用氯 胺酮 (ketamine; 20~40mg/kg) 及 赛拉嗓 (xylazine; 3~5mg/kg) 混合 麻醉, 沿中线 切开 ,观 察胚胎 的方向 。选 择合适 的玻璃 吸管进 行注射 ,穿 过子宫 壁注射 O.lfxLi 所 需部位 ,然后 缝合母 体动物 。被 注射的 动物可 在出生 前取出 ,或让 其完成 妊娠期 。在进 行正式 实验前 ,也应 反复用 染料和 报告基 因进行 预试验 ,摸索 出最佳 的实验 条件。 3. 出生前 啮齿动 物的宫 外感染 要 使逆转 录病毒 载体有 效感染 ,必 须注射 到有丝 分裂区 带中。 然而在 啮齿类 动物出 生前, 穿过子 宫壁很 难精确 地定向 注射到 所需要 的部位 。如果 直接对 鼠胚进 行操作 ,效 果可 能要好 得多。 1986 年, Muneoka 等就报 道了一 种方法 。他们 建议选 择远交 繁殖的 鼠 品系如 CD-1 或 Swiss Webster, 挑选健 康状况 良好的 母体。 将胚龄 11 〜 19d 的 鼠胚通 过切开 子宫壁 取出, 但保持 与胎盘 的联系 。母鼠 的腹腔 中灌注 生理盐 水以保 护胚胎 。可 在包 绕胚胎 的外胎 膜上作 切口, 以便胚 胎被直 接操作 或注射 。随后 ,用细 缝线缝 合外胎 膜 ,将 胚胎放 回腹腔 ,用剖 腹产术 接生。 屈 伸 程元桥 主要参 考文献 Austin, C. P. and Cepko, C. L. 1990 . Cellular migration patterns in the developing mouse cerebral cortex. Development, 110: 713 〜 732. Ausubel. F. M. et al. 1996. Current Protcxrols in Molecular Biology 2nd. John Wiley& Sons Inc. Brasier, A. R. , Tate, J. E. Habener, J. F. 1989. Optimized use of the firefly luciferase assay as a reporter gene in mam- malian cell lines. Biotechniques, 7: 1116 〜 11 22. Bronner- Fraser, M. E. 1985. Alterations in neural crest migration by a monoclonal antibody that affects cell adhesion. J. Cell Biol. 101: 610 〜 617. Cepko, 1989. Lineage analysis and immortalization of neural cells via retrovirus vectors. In: Boulton, A. A.* Baker, G. B , Campagnoni, A. I.» ed. Neuromethods, Vol. 16: Molecule Neurobiological Techniques. Clifton, NJ: Humana Press, 177-129 C hu, (r. 1989. Pulsed field elect rophresis in contour- clamped homogenous electric field for the resolution of DNA by size or topology. Electrophoresis, 10: 290 〜 295. Cone, R. D. and Mulligan, R. C. 1984. 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Lineage- independent determination of cell type in the em- bryonic mouse retina. Neuron, 4: 833 ~ 845. Williams, D. A., Lemischka, I. R. , Nathan, D. G. and Mulligan, R. C. 1984. Introduction of a new genetic material into pluripotent haematopoietic stem cells of the mouse. Nature 310: 476 〜 480. Wong and Nneman, E. 1982. Electric field mediated gene transfer. Biochem. Biophys. Res Commun., 107: 584 〜 587. • 503 • 第七章 蛋白质 的表达 引 言 蛋白质 的表达 ,简言 之就是 有目的 地合成 外源基 因产物 。它包 括转录 、翻译 、加工 等过程 ,首 先是使 目的基 因编码 序列在 RNA 聚合酶 催化下 转录成 mRNA, mRNA 与核 糖 体结合 ,由 tRNA 将氨基 酸引入 ,按 mRNA 的 遗传信 息翻译 为多肽 。在 多数情 况下, 新生多 肽需经 过翻译 后加工 ,如 糖基化 、磷 酸化等 才能成 为有功 能的蛋 白质。 本章将 介绍有 关蛋白 质表达 的方法 。所有 的方法 都需要 将编码 目的蛋 白的基 因插入 质 粒或其 他载体 ,然 后再将 该载体 导入受 体细胞 。因此 ,载 体是 蛋白质 表达的 关键要 素 。典型 的表达 载体包 含指导 大量合 成与目 的基因 相应的 mRNA 的 启动子 、允 许其在 宿主 体内自 主复制 的序列 、筛 选标记 以及能 够增强 mRNA 翻译 效率的 序列。 本 章第一 节介绍 在大肠 杆菌中 表达蛋 白质的 技术; 第二 节介绍 利用杆 状病毒 在昆虫 细咆中 表达蛋 白质的 技术。 所有的 表达载 体均各 有利弊 ,应 根据 实验需 要加以 选择。 第一节 蛋白质 在大肠 杆菌中 的表达 一 、表 达策略 大 肠杆菌 是自然 界中最 为人们 所熟识 的生物 体之一 。大 肠杆菌 具有两 个特征 ,即操 作简易 和能在 廉价的 培养基 中迅速 生长。 这些特 征加上 30 年来用 其表达 外源基 因的经 验, 使大肠 杆菌在 大多数 的科学 研究及 应用开 发中成 为蛋白 质表达 的首选 宿主。 尽管利 用大肠 杆菌从 克隆化 基因表 达出其 编码蛋 白质的 文献层 出不穷 ,但是 每种基 因都 有其独 特的表 达难度 ,一本 试验手 册不可 能提供 一套能 确保成 功表达 每一种 蛋白质 的方法 。本 节仅介 绍一般 策略以 及用于 解决某 些特定 问题的 步骤。 (一) 用 大肠杆 菌进行 基因表 达的一 般策略 在 大肠杆 菌里表 达外源 基因通 常利用 质粒作 为载体 。载体 应具有 的几种 元件是 : ①复制 起始区 ,如 pUC 载体 等带有 PMB1 复 制子; ②选 择标 记的编 码序列 ,它 可供筛 选 以确定 载体是 否进入 了细胞 ,最 常用的 选择标 记是抗 生素抗 性基因 ,所 涉及的 抗生素 包 括氨苄 青霉素 、卡 那霉素 (或 新霉素 )、 四环 素等; ③控制 转录的 启动子 ,如 Me、 或 启动 子以及 T7、 SP6 噬菌 体启动 子等, 经诱导 后从克 隆化基 因产生 大童的 mRNA; ④多克 隆位点 ,亦 即多 限制酶 切位点 ,方便 外源基 因以正 确方向 插入载 体中; • 504 • ⑤转 录调控 序列, 如一个 合适的 核糖体 结合位 点和起 始密码 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 / 启 动子 系统、 ATG 等。 将 待表达 基因插 入载体 ,成 功构建 表达载 体后, 经过转 化导入 大肠杆 菌某一 合适的 菌株中 ,然后 培养大 肠杆菌 ,表 达目的 蛋白。 (二) 根据表 达蛋白 的用途 选择特 定的表 达策略 利用大 肠杆菌 进行基 因表达 的具体 过程差 异很大 ,必须 根据表 达蛋白 的最终 用途选 择合 适的具 体表达 策略。 1. 生物化 学和分 子生物 学研究 如果表 达的蛋 白质是 用于生 物化学 等研究 ,那 么此 时不必 过分强 调蛋白 质表达 、纯 化方 法的简 易与否 ,而更 应考虑 如何保 持蛋白 质原有 的功能 (如酶 的高比 活性等 ) 不 变 。具 体表达 策略有 :①表 达出带 有特异 性的蛋 白酶位 点的融 合蛋白 ,利 用蛋白 酶去掉 N 末端的 多肽尾 ,留下 天然的 氨基酸 序列; ②直接 表达天 然蛋白 ,表 达出 的蛋白 质如果 是可 溶并且 具有活 性的, 可以直 接使用 ,如 果不溶 ,则需 要分离 包涵体 ,可用 变性剂 (如 8mol/L 尿素) 溶解蛋 白质在 然后再 将蛋白 质复性 。对 于中等 大小的 蛋白质 来说, 复性通 常并不 困难。 2. 表达蛋 白质用 做抗原 如 果表达 的蛋白 质是用 做抗原 ,那 么有几 种方法 都能够 有效地 获得蛋 白质、 快捷地 提 纯抗原 。最 佳方案 有两个 ,一 是合成 天然蛋 白或其 片段, 并在一 定的条 件下使 其形成 不溶 性的包 涵体。 包涵体 可以极 为方便 地经过 低速离 心纯化 ,或经 过变性 聚丙烯 酰胺凝 胶制备 型电泳 产生一 条孤立 的条带 ,切割 、电 洗脱 后制成 抗原; 二是 采用 融合蛋 白表达 策略 ,即合 成带有 特异性 纯化标 签序列 (如 His6 等) 的融 合蛋白 ,经过 亲和层 析回收 目 的蛋白 ,不 用裂解 去除标 签蛋白 ,直接 用来注 射动物 。融合 蛋白易 于纯化 ,能 够诱发 抗体 反应。 3. 结 构研究 如果表 达的蛋 白质是 用于结 构研究 ,那么 就必须 特别谨 慎地选 择表达 系统。 研究者 不可能 知道一 种不知 其结构 的蛋白 质经变 性后是 否能被 准确地 重折叠 ,因此 ,蛋 白质必 须以可 溶性形 式产生 ,纯 化时不 用变性 / 复 性步骤 。可溶 性蛋白 ,无 论是 细胞内 的或是 分 泌型的 ,一 般都需 要在特 定菌株 中以诱 导表达 的方法 来制备 ,最 大限度 地减少 蛋白质 降解。 许多蛋 白的高 水平表 达最终 都会导 致形成 包涵体 ,它是 致密的 不溶性 蛋白和 RNA 的 凝聚体 ,含 有大部 分的表 达蛋白 。蛋 白质沉 淀形成 包涵体 有时有 其有利 的一面 :①利 用包涵 体的不 溶性和 致密性 ,通 过离 心就能 相对容 易地对 其进行 纯化; ②以 可溶 性蛋白 形式 表达时 ,往往 易被降 解的蛋 白质在 以包涵 体形式 表达时 却可以 很稳定 ,纯化 时可以 用 盐酸胍 或尿素 变性溶 解包涵 体中的 蛋白质 ,透析 除去变 性剂后 , 蛋白质 可以重 新折叠 • 505 . 复性。 但是这 种方法 的弊端 也不小 ,经 由鸾性 / 复性 后正确 折叠的 蛋白质 产量不 稳定, 有时 会很低 ,而 且有些 蛋白尤 其是大 蛋白基 本上不 能正确 进行重 折叠。 若某一 表达策 略产生 的是不 溶性的 聚合物 ,而所 需的是 可溶性 蛋白时 ,有多 种解决 方法可 以尝试 。其中 一个重 要的变 量就是 温度, 虽然目 前还不 明机理 ,但是 在高温 (37X: 和 42X:) 会促进 包涵体 的形成 ,低温 (30X:) 会 抑制其 形成; 另一 个变量 是表达 水平 ,有 时降低 表达水 平可以 增加可 溶蛋白 比例; 第三 个变 量是携 带表达 载体的 细胞株 背景, 不同的 受体菌 株表达 出的特 定蛋白 的可溶 性有显 著差异 ,但 是各株 之间究 竟是何 种遗 传差异 决定了 溶解性 的差异 还有待 研究。 大多数 蛋白可 以通过 诱导合 成系统 获得可 溶性表 达蛋白 ,比如 可诱导 启动子 的转录 ,通 过测 试在不 同菌株 、温 度下的 表达, 优化 出获得 最大量 的可溶 性蛋白 的最佳 条件。 二、 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 / 启 动子表 达系统 1. 原理 Studiei •等在 1986 年及 Tabor 等在 1985 年分 别利用 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 / 启动子 系 统提出 了一个 新的表 达系统 。与 依赖大 肠杆菌 RNA 聚合酶 表达系 统相比 ,本 系统有 许多优 越之处 : (1) T7 噬菌体 RNA 聚合 酶合成 RNA 的速度 高于大 肠杆菌 5 倍; (2) T7 噬菌体 RNA 聚 合酶只 识别自 己的启 动序列 ,不 启动大 肠杆菌 DNA 任何序 列的 转录, 可以使 T7 噬菌体 启动子 (PT7) 控 制下的 基因得 到充分 表达; (3) T7 噬菌体 RNA 聚 合酶对 抑制大 肠杆菌 RNA 聚 合酶的 抗生素 (如利 福平等 ) 有抗性 ,能 转录 某些不 能被大 肠杆菌 RNA 聚 合酶有 效转录 的序列 ,高水 平地表 达一些 在其他 表达系 统中不 能有效 表达的 基因。 在适 宜的条 件下, T7 噬菌体 RNA 聚合酶 / 启动 子表达 系统表 达的基 因产物 可以占 细胞总 蛋白的 25 % 以上。 对于 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 / 启动子 表达系 统来说 ,有 两个 组分是 必需的 : T7 噬 菌体 RNA 聚 合酶和 T7 噬菌体 启动子 。和 其他 RNA 聚合酶 相比, T7 噬菌体 RNA 聚合 酶相 对简单 、高效 ,分 子质 量约为 96 000 kDa, 它 和一段 特殊的 23 个核 苷酸的 T7 噬菌 体启动 子区结 合并起 始转录 ,这 段序列 不存在 于大肠 杆菌基 因组。 T7 噬菌体 RNA 聚 合酶是 T7 噬菌 体基因 1 的产物 ,既 可以由 感染性 X 噬 菌体载 体提供 ,也 可以由 已经插 入整合 进大肠 杆菌染 色体的 基因所 产生。 pET 表达 系统是 目前最 常用的 、高 效的大 肠杆菌 表达系 统之一 ,其 表达蛋 白质甚 至可以 高达细 胞总蛋 白量的 50% 以上 。它有 一系列 大同小 异的表 达载体 ,如 pET15、 pET16、 pET28、 PET30 等 ,每 套均由 a、 b、 c3 个载体 组成, 以方便 外源基 因以与 His6 序 列同框 的方式 插入。 pET28a 如图 7.1 所示。 载体 PET28a 的主要 构成 元件有 T7 噬菌体 启动子 、乳糖 操纵子 、核糖 体结合 位点、 His6 标 签序列 、凝血 酶切割 位点、 多克隆 位点、 T7 噬菌体 终止子 以及乳 糖阻遏 子序列 (/a/)、 PBR322 复 制子、 fl 噬菌体 复制子 、卡 那霉素 筛选标 记序列 等等。 T7 噬 菌体启 动子、 核糖体 结合位 点等引 导外源 基因高 效转录 和翻译 。乳 糖操纵 子和乳 糖阻遏 子序列 • 506 • BpuM02 1(80) Dra 111(5127) Xho 1(158) Not 1(166) Eag 1(166) Hind 111(173) Sa/ 1(179) Sac 1(190) EcoR 1(192) BamH 1(198) Nhe 1(231) Nde 1(238) Nco 1(296) Xba 1(335) Sg/ 11(401) SgrA 1(442) Sph 1(598) Pvu 1(4426) Sgf 1(4426) Sma 1(4300) C/a 1(4117) Nru 1(4083) £c〇57 1(3772) /\/wN 1(3640) /W/ty 1(1123) Sc/ 1(1137) BstE 11(1304) Apa 1(1334) SssH 11(1534) EcoR V(1573) Hpa 1(1629) BssS 1(3397) BspLUII 1(3224) Sap 1(3108) BsM107 1(2995) 1(2969) PsA?A 1(1968) Bgl 1(2187) Fsp 1(2205) Psp5 11(2230) 图 7.1 pET28 结 构简图 (Zac〇 的存在 主要意 义在于 :当目 的蛋白 对大肠 杆菌有 毒性时 ,可 以通过 添加阻 遏物, 控制 目的蛋 白以较 低水平 表达。 His6 标 签序列 、凝 血酶切 割位点 存在的 意义主 要在于 方便利 用针对 His6 的螯 和层析 (His. BindTM 树脂) 分离纯 化蛋白 ,然后 利用凝 血酶切 割 去除标 签蛋白 。多 克隆位 点处的 X/io I、 BamHI 等位点 在该载 体上只 有单一 切点, 方便 用作外 源基因 的插入 位点。 pET 表达 系统中 的受体 菌为能 够产生 T7 RNA 聚 合酶的 大肠杆 菌菌株 。常 用菌株 为 BL21 (DE3) 和 BL21 (DE3) pLysS。 BL21 菌缺损 Ion 和 ompT 蛋白酶 ,使 目的蛋 白更 稳定, 表达水 平大大 提高。 DE3 菌株的 细菌基 因组上 以溶原 形式携 带一个 克隆的 T7RNA 聚合 酶基因 ,异丙 基硫代 (3-D- 半 乳糖苷 (IPTG) 可 以诱导 T7RNA 聚 合酶大 量合成 ,外 源基 因高效 表达。 (DE3) pLysS 菌株能 够产生 T7 RNA 聚合酶 的抑制 剂 —— T7 溶菌酶 ,使目 的基因 的表达 处于严 谨的控 制之下 ,同 时由于 T7 溶菌 酶的破 细胞 壁作用 ,该菌 株很容 易通过 冻融或 0.1%TrotinX-100 处 理而破 裂细胞 ,分 离纯化 • 507 • 目的 蛋白。 pRSET 表达 系统也 是最为 常用的 原核表 达系统 ,质粒 pRSETa 如图 7.2。 其 基本构 造与 pET 类似 ,在这 里不再 赘述。 Bgl\ (1183) (2.94 kb) 图 7.2 质粒 pRSETa 结 构简图 2. 材料 pET28a 重组体 受体菌 BL21 (DE3) LB/ 卡 那霉素 / IPTG 平板 (见大 肠杆菌 一章) LB/5{^g/mL 卡 那霉素 / lmm〇l/L IPTG 培养基 (卡那 霉素贮 存水溶 液浓度 10mg/mL, IPTG 贮 存水溶 液浓度 l〇〇mm〇l/L, LB 培养 基见大 肠杆菌 一章) lx SDS 凝 胶加样 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH 6.8, 100mmol/L DTT, 2% SDS, 0.1% 溴 酚蓝, 10% 甘油 。不含 DTT 的 1XSDS 凝胶 加样缓 冲液可 贮存于 室温, DTT 可以从 lm〇l/L 贮存液 中现加 现用) 细 菌转化 、培 养所需 的材料 和设备 质粒制 备及酶 切所需 的材料 和设备 SDS^ 聚丙烯 酰胺凝 胶所需 的材料 和设备 3. 操 作步骤 以载体 pET28a 、受 体菌 BL21 (DE3) 为例, 简述蛋 白质表 达与鉴 定的基 本实验 步骤。 (1) 目 的基因 片段与 用同样 的限制 酶消化 的载体 pET28a 大片段 连接 ,转化 大肠杆 菌 BL21 (DE3) 株。 (2) 转化 物涂布 f LB/ 卡 那霉素 /iptg 平板, 37t: 温 育培养 过夜。 (3) 挑选 几个单 菌落于 LB/ 卡 那霉素 /iptg 培养 基中, 37X: 培养至 OD6〇〇 约 0.6 〜 • 508 • 0 • 8〇 (4) 通过小 量制备 方法获 得质粒 DNA。 以 限制性 酶切分 析确定 基因正 确插入 与否。 必要时 可利用 T7 噬菌体 启动子 引物和 T7 噬 菌体终 止子引 物进行 PCR 扩增 、测序 ,以 确证克 隆的正 确性。 (5) 选 择正确 的克隆 ,进行 诱导时 间的确 定和适 度规模 (如 500mL 三角烧 瓶等) 的表达 。诱导 时间的 确定及 对蛋白 产物定 量的方 法如下 : ① 100/iL 饱和 培养物 接种于 10mL 含卡那 霉素的 LB 培 养基中 ,于 37X: 培 养两小 时。 ② 取 lmL 未诱导 的培养 物转移 至一个 微量离 心管中 ,作 为对照 。其 余加入 IPTG 至终 浓度为 lmmol/L, 对培养 物进行 诱导。 ③ 以 0.5h 或 lh 为时间 间隔, 分别在 诱导后 0.5h、 lh、 2h、 3h …… 取出 lmL 经过 诱导的 培养物 ,迅 速在室 温下以 12 OOOg 离心 lmin, 弃去上 清液。 ④ 将每 一沉淀 重悬于 lOOpL 的 1XSDS 凝胶加 样缓冲 液中, -20X: 冻存。 当所有 时间点 的样品 都收集 齐后, 701C 加热 5min, 以备在 凝胶上 加样。 ⑤ 融 化样品 ,于 室温以 12 OOOg 离心 lmin, 每种 悬液取 15;xL 加样 于适当 浓度的 SDS 聚丙 烯酰胺 凝胶上 ,用只 含空白 载体的 细菌的 悬液作 对照。 一 般来说 ,经过 诱导, 总蛋白 产量约 0.5~lmg/mL。 对 于常规 小型垂 直板凝 胶电泳 、考 马斯亮 蓝染色 ,每 个点样 孔需要 10Fg 总蛋白 。因此 ,每 种悬液 点样量 10~20fxL。 ⑥ 用考 马斯亮 蓝或银 染液进 行染色 ,如 有抗体 存在可 以使用 Western 印迹 法鉴定 所 诱导的 蛋白。 4. 方 法评注 (1) 有 些蛋白 的表达 ,可 以将卡 那霉素 提高到 15(^g/mL 以筛 选仍然 保留有 表达质 粒的 细菌。 (2) 本例 蛋白质 表达时 ,细 菌培养 温度为 37T:, 此时 易形成 包涵体 (inclusion body), 当温 度降低 (一般 不低于 22X:, 如 30t:) 时 ,容易 形成可 溶的、 有活性 的蛋白 质。 (3) 为有效 通氧, 培养液 体积最 大不超 过培养 容器总 容积的 10%。 三 、融合 蛋白表 达系统 一般地 ,融合 表达是 将克隆 化基因 引入某 表达载 体编码 的高表 达蛋白 (担体 蛋白) 氨基末 端的一 段序列 (担体 序列) 的 3' 末端 。担体 序列通 常是大 肠杆菌 的一段 序列, 也可以 是任意 可以在 大肠杆 菌中高 效表达 的基因 ,它 能提杂 良好表 达所需 的信号 ,而表 达出 的融合 蛋白的 N 末端 含有由 担体序 列编码 的片段 。担 体序列 所编码 的可能 是整个 功能 蛋白的 部分或 者是整 个蛋白 ,如表 达硫氧 还蛋白 (Trx) 融合 蛋白、 p- 半乳 糖苷酶 融 合蛋白 以及谷 胱甘肽 S ■转 移酶 (GST) 融合 蛋白等 。对于 这些担 体区段 ,可以 利用担 体蛋白 的特有 的物理 学特性 (如热 稳定性 ) 进 行选择 性的融 合蛋白 纯化; 或者采 用基于 . 509 . 对 担体蛋 白特异 抗体的 亲和层 析进行 融合蛋 白的分 离提纯 。另外 ,一 些担体 蛋白如 Trx, 可以 经冻融 步骤或 渗透压 休克从 完整细 胞中释 放出来 ,这一 特性通 常可用 于从细 胞中分 离与担 体融合 的融合 蛋白。 在大 肠杆菌 中表达 外源蛋 白尤其 是真核 蛋白时 ,经 常会遇 到关于 稳定性 的问题 ,担 体蛋 白的存 在于大 多数情 况下均 可以稳 定融合 蛋白的 表达。 但有时 目的蛋 白会被 降解而 担 体蛋白 则不会 ,或者 融合蛋 白在体 内从担 体和目 的蛋白 的融汇 点断开 ,这 种断 裂在需 要利 用担体 的特点 进行纯 化时, 自然给 纯化工 作带来 了一定 的困难 。这种 情况可 能是由 于担体 蛋白可 正确折 叠而表 达蛋白 则不能 ( 并且被 降解了 ), 或者 虽然两 个区域 都能正 确折叠 ,但两 者的联 接区对 一种或 多种大 肠杆菌 蛋白酶 敏感。 用于稳 定融合 蛋白的 方法有 : ①将融 合蛋白 以不溶 性的聚 集物形 式表达 。② 采用 缺失 抑制蛋 白酶的 大肠杆 菌株作 为宿主 。缺失 数种蛋 白酶的 l〇n htpR 双 突变株 可减少 不 稳定蛋 白质的 降解, degP 突 变株可 以稳定 胞质中 的融合 蛋白, ompT 突 变株被 证实在 蛋白 质的粗 提过程 中能避 免一些 非融合 蛋白中 暴露的 碱性氨 基酸残 基之间 的肽键 发生断 裂 (如 Arg-Arg)。 ③试用 不同的 野生型 菌株。 对于某 一特定 融合蛋 白来说 ,在 不同的 野生 型试验 株内其 稳定性 也有着 差异, 可能归 因于不 同株内 蛋白酶 的水平 不同。 融合 蛋白表 达系统 已用于 表达不 同种类 的蛋白 ,其中 包括酶 、生 长因子 、膜 受体以 及 DNA 结合 蛋白等 。使 用基因 融合表 达系统 在大肠 杆菌中 表达外 源基因 已经越 来越受 欢迎 。这在 很大程 度上应 归因于 融合系 统能够 产生大 量的可 溶性融 合蛋白 。谷 胱甘肽 & 转移酶 (GST)、 硫氧 还蛋白 (Trx) 以及麦 芽糖结 合蛋白 (MBP) 都能 很成功 地生成 折 叠正确 、有 生物活 性的蛋 白质。 其中每 一种都 具有方 便的纯 化方法 ,可 以将融 合蛋白 同细 胞污染 物分开 。所产 生的蛋 白适用 于进行 其生物 学活性 或其相 互作用 的研究 。融合 蛋 白可以 直接用 作抗原 ,诱 导抗体 反应。 通常将 N 端的担 体蛋白 部分从 C 端的 目的蛋 白中裂 解出来 ,有利 于对目 的蛋白 进行生 物化学 研究以 及功能 分析。 目前已 经建立 了数种 对融合 蛋白进 行位点 特异性 裂解的 方法。 方法的 选择常 由特定 蛋白 的组成 、序 列以及 物理性 质决定 。基本 方法有 :①化 学裂解 。可采 用诸如 溴化氰 (Met!)、 BNPS-3- 甲基 口 引味 (Trp|)、 经胺 (AsnlGly) 等试 剂或低 pH (Asp + Pro) 来进行 融合蛋 白的化 学裂解 。化 学裂解 的方法 比较便 宜而且 有效, 甚至常 常可以 在变性 条件 下裂解 非变性 不能溶 解的蛋 白质。 但有时 因目的 蛋白中 存在裂 解位点 ,或者 因为发 生了副 反应而 导致对 蛋白质 进行了 不需要 的修饰 ,从 而阻碍 了它们 的应用 。② 酶解。 酶解 的方法 相对来 说反应 条件比 较温和 ,更重 要的是 ,普遍 用于此 用途的 蛋白酶 都具有 高度 专一性 ,酶处 理法可 以大大 降低发 生意外 切割的 可能性 。其 中有用 的酶有 :凝血 酶 、肠 激酶、 Xa 因子、 凝乳酶 、胶 原酶等 。所有 这些酶 都具有 较长的 底物识 别序列 (比如 在凝乳 酶中为 7 个 氨基酸 ), 从 而降低 了蛋白 质中其 他无关 部位发 生断裂 的可能 性 。在上 面所提 及的各 种酶中 ,肠激 酶和凝 血酶应 用最多 ,因 为它 们切割 各自的 识别序 列的 羧基端 ,就使 带有天 然氨基 端的被 融合部 分得以 释放。 GST 融合系 统的载 体含有 凝血 酶裂解 位点、 Xa 因子裂 解位点 或是天 冬氨酸 -脯氨 酸裂解 位点。 Trx 融合系 统采用 的是肠 激酶裂 解位点 。下 面重 点介绍 GS 丁融合 系统、 Trx 融合 系统。 • 510 • (一) 谷 胱甘肽 S- 转移酶 (GST) 融 合蛋白 的表达 及纯化 1. 原理 谷 胱甘肽 S- 转移酶 (GST) 融合蛋 白表达 系统的 载体为 pGEX 载体 (如图 7.3), 受体 为普通 大肠杆 菌感受 态细胞 。每个 pGEX 载体都 有一个 编码谷 胱甘肽 S- 转移酶 (GST) 的开放 阅读框 ,后 面带有 BamHI、 Sma I、 £C〇RI 的单 一限制 性内切 核酸酶 位点 ,在 此处插 入外源 基因, 然后是 相应于 3 个 阅读框 的终止 密码子 。必 须选择 能恰好 使 外源多 肽以及 GST 得以同 框表达 的载体 。用 pGEXl 生 产的融 合蛋白 可在低 pH 条件 下通过 化学裂 解进行 切割。 若选用 PGEX2T 或 pGEX3X, GST 担 体最终 可经位 点特异 性 蛋白酶 (凝 血酶、 Xa 因子) 水解 除去。 基 因编码 lac 阻 遏蛋白 ,该 蛋白与 启动 子结合 ,阻遏 GST 融 合蛋白 的表达 。经过 IPTG 诱导后 ,发 生脱阻 遏作用 ,使 GST 融合蛋 白得以 表达。 BamY\ I Sma I EcoR 1(^920) Pro Lys Ser Asp Pro Arg Glu Phe lie Val Thr Asp STOP pGEXl CCA AAA TCG GAT CCC CGG GAA TTC ATC GTC ACT GAC TGA CGA TCT G BamH I Sma I EcoR I thrombin Pro Lys Ser Asp 丨 Leu Val Pro Arg^Gly Ser' Pro Gly He His Arg Asp STOP pGEX2T CCA AAA TCG GAT CTG GTT CCG CGTGGATCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGACTG BamH I Sma I EcoR I factor Xa Pro Lys Ser Asp Leu lie Glu Gly Arg 丄 Gly lie Pro Gly Asn Ser Ser STOP pGEX3X CCA AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG • I I 1 BamH I Sma I EcoR I 图 7.3 pGEX 载体结 构简图 • 511 • 2. 材料 pGEX2T 载体及 重组体 普通大 肠杆菌 含 50Mg/mL 氨苄青 霉素的 LB 平皿 及液体 培养基 100mm〇l/L 异丙 基硫代 -3-D- 半 乳糖苷 (IPTG) (过滤 除菌, -20X: 保存) 预冷的 PBS 液 (137mmol/LNaCl, 2.7mmol/LKCl, 4.3mmol/LNa2HP〇4.7H2〇, 1.4mmol/L KH2PO4) 50% 谷胱甘 肽-琼 脂糖珠 混悬液 (谷 胱甘肽 -琼脂 糖珠于 l〇 倍 体积的 PBS 中 预溶胀 lh, 用 PBS 洗涤 2 次 ,配成 50% 的 PBS 混 悬液, 4X: 可保存 1 月) lx SDS 样品 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH6.8, 100mmol/L DTT, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝 , 10% 甘油 。不含 DTT 的 1XSDS 凝胶 加样缓 冲液可 贮存于 室温, DTT 可 以从 lmol/L 贮存液 中现加 现用) 甘油 10 % 的 Triton X- 100 GST 洗脱 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 5mmol/L 还原 型谷胱 甘肽) 凝血 酶裂解 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH7.5, 150mmol/L NaCl, 2.5mmol/L CaCl2) 凝血酶 (人, 比活性 >3000U/mg; Sigma) GST 清洗 缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl pH7. 5, 150mmol/LNaCl) 带微量 探头的 超声波 破碎器 细菌 培养、 SDS- 聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳所需 的试剂 和设备 3. 操 作步骤 以载体 PGEX2T 为例 ,介 绍利用 GST 系统进 行融合 蛋白的 表达、 纯化及 SDSPAGE 鉴定 的方案 与 步骤。 融合蛋 白微量 表达与 鉴定: (1) 按 正确阅 读框将 外源基 因片段 克隆入 pGEX2 丁载体 (Pharmacia LKB Biotech 公 司) 中 ,转化 大肠杆 菌感受 态细胞 ,涂 布含 50pg/mL 氨苄青 霉素的 LB 平皿, 以不插 入外源 DNA 的自连 载体作 为对照 ,平 皿置于 37X: 培 养过夜 (12~15h)。 筛选出 正确的 重 组体。 (2) 挑选转 化菌落 接种于 2mL LB/ 氨苄 青霉素 液体培 养基, 接种含 空载体 pGEX2T 的转 化菌为 对照。 同时在 LB/ 氨苄青 霉素平 皿上划 线培养 。液 体培 养物在 37X: 摇床中 振 荡培养 3 〜 5h, 直至 混浊。 平板在 371C 培养 12 〜 15h。 (3) 在 液体培 养物中 ,加入 l〇〇mm〇l/L 异丙 基硫代 -P-D- 半 乳糖苷 (IPTG) (过滤 除菌) 至 终浓度 0.1mm〇l/L, 诱导融 合蛋白 表达, 继续保 温培养 1 〜 2h。 (4) 将液 体培养 物转移 入一个 微量离 心管中 ,室 温下以 最高速 度离心 5s。 弃 去上清 液 ,将 沉淀用 300^L 冰浴 预冷的 PBS 液重悬 。取 lO^L 加入另 一个离 心管中 [步骤 (7)]。 • 512 • (5) 用带微 量探头 的超声 波破碎 器裂解 细胞约 10s, 调 节超声 频率及 强度以 尽量避 免产生 泡沫, 当细胞 悬液由 混浊变 成半透 明时裂 解就完 成了。 4t: 下高 速离心 5min, 将 上清 液移入 一个新 的离心 管中。 (6) 每管上 清液加 50FL 50% 谷胱甘 肽-琼 脂糖珠 混悬液 ,室温 下轻轻 摇动, 混匀。 加 lmLPBS, 用漩涡 混合器 短暂振 荡悬起 ,高 速离心 5s, 收集琼 脂糖珠 ,弃 去上 清液。 用 PBS 洗涤琼 脂糖珠 两次。 (7) 向洗 过的琼 脂糖珠 中加等 体积的 1XSDS 样品缓 冲液, 另加入 30/iLlxSDS 样 品缓 冲液于 lOpL 的 全细胞 重悬液 [来 自步骤 (4)] 中, 100t: 加热 3min, 用漩 涡混合 器短暂 振荡悬 起后, 加样于 10% SDS- 聚丙烯 酰胺凝 胶上, 电泳适 当时间 ,用考 马斯亮 蓝 染色使 GST 蛋白 ( 来自含 空载体 pGEX2T 的转化 菌对照 ) 和融 合蛋白 显色。 根据相 对分子 质量大 小进行 鉴定, 若有目 的蛋白 的抗体 ,可 以进行 Western Blot 确证。 常量诱 导表达 (8) 从划线 培养的 平皿上 ,挑取 一个经 过鉴定 的转化 菌落, 接种于 lOOmLLB/ 氨苄 青 霉素培 养基中 ,在 37X: 摇 床中培 养过夜 (12~15h)。 (9) 以 1:10 比 例将此 培养物 稀释于 1L 新鲜的 LB/ 氨苄青 霉素培 养基中 ,分 入两个 2L 的瓶 中, 37X: 下培养 lh。 (10) 加入 100mmol/L IPTG 至 终浓度 0.1mmol/L, 继 续培养 3~7h。 (11) 室温下 5000Xg 离心 l〇min 收 集细胞 ,弃去 上清液 。沉淀 重悬于 l〇~20mL 冰浴 预冷的 PBS 中。 (12) 将离心 管置于 冰浴, 用超声 波破碎 器裂解 细胞约 30s。 调节超 声频率 及强度 以尽量 避免产 生泡沫 , 当细胞 悬液由 混浊变 成半透 明时裂 解就完 成了。 (13) 加入 10% 的 Triton X-100 至终 浓度为 1%, 并混匀 。室 温下 10 000 Xg 离心 5min, 除去 不溶性 成分和 未裂解 的细胞 ,收集 上清液 (小心 避免吸 入沉淀 )。 (14) 上清 液加入 lmL 50% 的谷胱 甘肽- 琼脂糖 珠混悬 液中, 室温下 轻轻混 勻超过 2min。 加 50mL 冰浴 预冷的 PBS 液洗漆 ,混 匀, 500X& 离心 l〇s。 用 PBS 液洗涤 2 次, 用 1 〜 2mL 冰冷的 PBS 重悬琼 脂糖珠 ,并移 入一个 1.5mL 微 量离心 管中。 (15) 室温下 500 Xg 离心 l〇s, 收集琼 脂糖珠 ,弃 上清液 。加 lmLGST 洗 脱缓冲 液 洗脱融 合蛋白 。混匀 2min, 500 Xg 离心 l〇s, 收集 上清液 。重 复洗脱 2~3 次 ,经 SDS^PAGE 分 析各分 布收集 的样品 。洗 脱的蛋 白质分 成小份 ,加 甘油至 终浓度 10%, 贮存于 -70X:。 测量 280mn 下 的吸光 度确定 融合蛋 白产量 。对 GST 载体 来说, A28〇 = l 相当于 蛋白质 浓度为 0.5mg/mL。 酶解 (16) 同上 ,收 集经过 GST 洗脱 缓冲液 洗涤的 结合有 GST 融 合蛋白 的琼脂 糖珠, 重悬于 20 倍体积 的凝血 酶裂解 缓冲液 ,再 离心 重悬于 不超过 lmL 的凝血 酶裂解 缓冲液 中。 (17) 以 1% (m/m) 的比例 加入凝 血酶, 25t: 下保 温反应 lh。 用 1 柱床 体积的 GST 清洗缓 冲液洗 脱已裂 解释放 的蛋白 。离心 沉淀琼 脂糖珠 ,收 集上清 ,重复 数次。 SDS~ PAGE 鉴定。 • 513 • (二) 硫氧还 蛋白融 合蛋白 的表达 与纯化 1. 原理 硫氧 还蛋白 是大肠 杆菌^ *xA 基因 产物, 以其作 为担体 蛋白的 融合表 达系统 特别适 合于 在大肠 杆菌胞 质中表 达高产 量的可 溶性融 合蛋白 。硫氧 还蛋白 与外源 蛋白的 融合蛋 白 ,多 可正确 地折叠 ,并表 现出全 部生物 学活性 。大 多数的 硫氧还 蛋白融 合蛋白 的产物 水 平占细 胞总蛋 白量的 5% 〜 20% 不等。 硫 氧还蛋 白基因 融合表 达载体 pTRXFUS 如图 7.4。 ... TGGTGC^GTCCGTGCAAA … W C Gsa P34 C K pALtrxA-781 : Sff I Xba I Sal I Pst\ ^ •MCCTGGCCTAG^GCCAT|cTAGAG[rCGACCTGCA|G* • • 硫氧 还蛋白 pTRXFUS: aspA 终止子 Kpn I BamH I Xba I Sal I Pst\ ...MCCTGGCCGGnCTGGTTCTGGTGATGACGATGACMGGTAdcCGG^GATCCTlciAGAGlrCGACCTGCA|G". NLAGSGSGDDDD K t 融合点 aspA 终止子 硫氧 还蛋白 连接肽 肠激 _ 位点 图 7 . 4 pTRXFUS 结 构简图 Pl 为噬 菌体主 要左向 启动子 ,它 启动融 合蛋白 的表达 ,活性 特别强 ,在不 需表达 时保 持非诱 导状态 。对 于常用 受体菌 GI724 来说, 一般在 30X: 使菌体 生长, 37X: 诱导 表达 。在 kxA 基 因和多 克隆位 点之间 有肠激 酶的切 割位点 。硫氧 还蛋白 活性位 点环附 近 的序列 具有一 个单一 KvII 位点, 可用于 插入编 码短肽 (10 〜 30 个氨 基酸) 的 序列。 AspA 为大肠 杆菌天 冬氨酸 转移酶 转录终 止子。 有多种 方法可 用于分 离纯化 硫氧还 蛋白融 合蛋白 。野生 型硫氧 还蛋白 可抵抗 80X: 的长时 间保温 ,多 种硫氧 还蛋白 融合蛋 白也显 示出相 应的热 稳定性 ,杂蛋 白则经 过热变 性而沉 淀下来 ,由 此实现 分离。 也可能 通过简 单的渗 透压休 克或冻 融步骤 ,将硫 氧还蛋 白 和某些 硫氧还 蛋白融 合蛋白 从大肠 杆菌胞 质中释 放出来 ,离心 收集上 清即可 。硫 氧还 蛋白 融合蛋 白表达 载体上 带肠激 酶的切 割位点 ,表达 出的融 合蛋白 与肠激 酶共育 后即可 • 514 • 释放 出硫氧 还蛋白 ,留下 目的蛋 白的天 然氨基 酸序列 。下面 重点介 绍用肠 激酶进 行融合 蛋 白的酶 解方案 ,该 方案也 可用于 其他含 肠激酶 切割位 点的表 达系统 ,如 pRSET 表达 系 统等。 肠激酶 也称为 肠肽酶 ,是哺 乳动物 胰蛋白 酶样的 丝氨酸 蛋白酶 ,对 (Asp)4-Lys 序列 有 很高的 特异性 ,在识 别序列 LysS 基的羧 基端裂 解蛋白 。肠 激酶 可以在 PH4.5~9.5、 温度 4 〜 45X: 的很宽 范围的 反应条 件下裂 解融合 蛋白。 2. 材料 含 pTRXFUS 重 组体的 GI724 菌 含 lOOpg/mL 氨苄青 霉素的 IMC 培养基 10mg/mL 色氨酸 冰冷的 20mmol/L Tris-HCl pH8.0 / 2.5mmol/L EDTA / 20% 蔗糖 冰冷的 20mmol/L Tris-HCl pH8.0 / 2.5mmol/L EDTA 重组牛 肠激酶 rEK (Invitrogen) SDS-PAGE 所需 的试剂 及设备 3. 操 作步骤 硫氧还 蛋白融 合蛋白 的诱导 表达: (1) 接 种转化 有重组 体的单 菌落于 5mLIMC 培养 基中, 30X: 培养 过夜。 (2) 取 0.5mL 过夜培 养物于 50mLIMC 培养 基中, 30X: 培养充 分通气 ,直至 OD55〇 达到 0.4 〜 0.6 ( 约 3. 5h)。 (3) 培养物 中加入 0.5mL10mg/mL 色氨酸 (终 浓度为 lO^g/mL), 37X: 培养 4h, 诱导 表达。 每隔一 段时间 可取出 lmL, 离心后 -80X: 冻存, SDS-PAGE 鉴 定表达 时效。 (4) 4X: 下 3,000rpm 离心 lOmin, 收获 细菌, - 80X: 冻 存或立 即纯化 蛋白。 (5) 需要时 可挑出 适量细 菌团块 ,以 1XSDS 加样 缓冲液 悬浮, 701C 温浴 5min。 SDS-PAGE 鉴定。 渗透 性释放 纯化硫 氧还蛋 白融合 蛋白: (6) 收获 的细菌 团块以 50D55〇/mL 密度 重悬于 冰冷的 20mmol/L Tris-HCl pH8.0 / 2.5〇^〇1/1^£〇丁八/20%蔗糖,冰浴放置101^11。 (7) 于 4t: 以 最大速 度离心 30s, 回 收细胞 ,用 等体积 冰冷的 20mmol/L Tris-HCl pH8.0 / 2.5mmol/L EDTA 轻 轻重悬 。冰浴 lOmin, 不 时倒转 离心管 混匀。 (8) 于 4t: 以 最大速 度离心 30s, 回 收上清 (含 渗透物 )。 细胞沉 淀用等 体积的 20mmol/L Tris-HCl pH8.0 / 2. 5mmol/L EDTA 再次 重悬。 (9) 真 空冻干 渗透物 ,进行 SDS-PAGE 分析。 用肠 激酶进 行融合 蛋白的 酶解: (10) 肠激酶 与融合 蛋白按 不同比 例混合 ,进行 预试验 检测裂 解效率 。准备 5 个反 应 体系。 反应 1 〜 4: 20fiL lmg/mL 溶解在 50mmol/L Tris-HCl pH8.0 / lmmol/L CaC!2 中的 . 515 • 硫氧 还融合 蛋白; 分 别加入 〇.2U、 0.5U、 1U 和 2U 的重 组牛 肠激酶 rEK (Invitro- gen), 再加 50mmol/L Tris-HCl pH8.0 / lmmol/L CaCl2 至 总体积 30fiLo 反应 5: 20/iL lmg/mL 融合 蛋白; 10/iL 50riimol/L Tris-HCl pH8.0 / lmmol/L CaCl2 〇 (11) 样品于 37t: 温育 16h。 (12) 样品 中加入 30pL2xSDS 样品缓 冲液终 止反应 ,煮沸 lOmin。 在大规 模试验 中 ,可 以加入 肠道丝 氨酸蛋 白酶的 竞争性 抑制剂 对氨基 苯甲酸 (PABA) 至 5mmol/L 终 止 反应。 (13) 每个 样品取 1〇4, 用 SDS-PAGE 分 析它们 的裂解 程度。 若裂解 的融合 蛋白发 生降解 , 在反应 体系中 略去钙 盐并加 5mtnol/L EDTA 即可解 决这一 问题。 (14) 调整 肠激酶 浓度和 温育时 间以得 到完全 消化。 (15) 按 比例扩 大反应 ,消化 更大量 的融合 蛋白。 四 、疑 难分析 在重组 DNA 技 术发展 的早期 ,人 们认为 在基因 的前端 具有一 个强启 动子和 一个起 始密 码子就 足以在 大肠杆 菌中获 得良好 的表达 。随后 ,人们 意识到 获得有 效的翻 译所需 的条件 要复杂 的多, 除了要 有强启 动子和 起始密 码子外 ,良 好的表 达尚需 要编码 待表达 蛋白的 mRNA 中 含有一 个不被 其二级 结构封 阻的核 糖体结 合位点 (RBS)。 此外 ,表达 水平 也受密 码子喜 好程度 的影响 ,还受 到编码 序列中 其他目 前尚不 明了的 因素的 影响。 在蛋 白质表 达中, 常见的 问题是 蛋白质 的表达 量较少 或不溶 ,或 者兼而 有之。 1. 蛋 白质产 里不足 当蛋 白质的 表达量 较少时 ,可从 以下方 面考虑 : (1) mRNA 中是 否有不 为其二 级结构 封阻的 RBS。 在保 留编码 蛋白的 序列的 同时重 新构建 基因的 5' 端 ,使其 A+T 含量增 加到最 大限度 。这 将减少 mRNA 的二级 结构, 或改变 反应中 一个尚 未确定 的参数 ,如 改变起 始密码 子前端 的序列 ,增 加翻译 效率。 (2) 确定转 录终止 子的存 在与否 。如 果载体 插入基 因的下 游无转 录终止 子存在 ,应 插 入一个 。转录 终止子 的存在 增强了 mRNA 稳定性 并减少 了核苷 酸在细 胞中的 消耗, 从而 有助于 表达。 (3) 检查 克隆基 因序列 的密码 子是否 为大肠 杆菌不 常用者 。如 果多个 稀有密 码子存 在 ,可导 致核糖 体停滞 ,引起 翻译与 转录的 解偶联 ,导致 转录信 息的提 前终止 。即 使转 录 能够正 常进行 ,停滞 于核糖 体上的 mRNA 3' 端可暴 露出来 ,被宿 主的核 酸降解 ,降 低了稳 定性。 一旦发 现使用 了稀有 密码子 (尤其 是在基 因的第 二个密 码子处 ), 应更换 成大肠 杆菌偏 爱的密 码子以 提高表 达产量 ,即 通过利 用密码 子的简 并性在 不改变 蛋白质 序列 的条件 下改变 5' 末端编 码序列 来加以 解决。 2. 表达产 物不溶 当需 要表达 可溶、 有活性 的蛋白 质却出 现产量 大但却 不溶的 产物时 ,可采 用以下 • 516 • 措施。 (1) 改变培 养温度 。大 肠杆 菌可在 10 — 43T: 范围 内合成 蛋白质 。许多 蛋白质 在低温 下 比在高 温下更 易溶解 ,某些 酶在温 度高于 371C 时具有 更高的 比活性 。尝 试不同 温度, 尤其 是在较 低温度 下培养 ,可 以表达 出可溶 、有活 性的蛋 白质。 (2) 测试 不同培 养基和 金属添 加剂。 许多蛋 白质含 有金属 ,并 以之作 为结构 或催化 反应的 辅基。 当蛋白 质生物 合成的 速率快 于往细 胞转运 金属的 速率时 ,引 起不含 金属辅 基的脱 辅蛋白 的堆积 。这 些蛋白 不能正 确折叠 ,常 呈不溶 的状态 。此时 ,可 测试 不同培 养基和 金属添 加剂, 合理补 充金属 辅基。 (3) 使用 低拷贝 数质粒 。采用 低拷贝 数质粒 ,常常 降低表 达水平 。但是 ,降 低表达 水平有 时可能 有利于 增加可 溶性蛋 白比例 ,得到 可溶性 的表达 产物。 第二 节杆状 病毒表 达系统 世界上 大约有 1200 种 分属不 同科的 可以感 染昆虫 的病毒 ,但 主要有 4 个科 :杆状 病毒科 (Baculoviridae)、 呼肠孤 病毒科 (Reoviridae)、 虹彩 病毒科 (Iridoviridae) 以及 痘 病毒科 (Poxviridae), 其 中杆状 病毒科 大约有 600 种 。近 年来, 杆状病 毒的地 位日益 受到 人们的 重视。 1983 年, Smith 等首 次报道 利用苜 蓿银纹 夜蛾核 型多角 体病毒 (AcMNPV) 在草地 贪夜蛾 (Sodopterafrugierda) 细 胞系中 成功 地表达 了人 [3- 干扰 素后, 杆状病 毒表达 载体系 统研究 就作为 一个新 的研究 领域迅 速发展 。目 前杆状 病毒已 被证明 是 最有效 的真核 基因表 达载体 ,已经 有超过 500 种的 外源基 因利用 杆状病 毒表达 ,来源 遍 及动物 、植物 、真菌 、细菌 和病毒 。在 疫苗 、酶活 性诊断 试剂以 及其他 生物活 性物质 的制备 方面它 可以作 为生产 系统; 在基 因表达 调控、 蛋白质 与核酸 的相互 作用以 及蛋白 质的 结构与 功能方 面的研 究工作 领域它 可以作 为研究 工具, 具有很 重要的 价值。 杆状 病毒的 外形为 圆杆状 ,其 病毒体 (virion) 由壳体 (capsid)、 其中 的核心 (core) 和 壳体外 的包膜 (envelop) 组成 。壳体 两端的 结构存 在差异 ,其长 度可以 延伸, 于是可 以容纳 更大的 DNA 分子。 核心由 浓缩的 DNA 分子 与蛋白 质结合 而成的 核蛋白 构成 ,与 DNA 结 合的主 要蛋白 质是一 种分子 质量为 6. 9kDa 的碱 性蛋白 P6. 9。 包膜中 含有 丰富的 类脂质 ,其 内有一 个或多 个杆状 的核壳 ,核 壳中含 有病毒 基因组 。病 毒基因 组为共 价闭合 环状超 螺旋的 DNA 分子, 大小为 88~200kb。 病毒 DNA 与 一种碱 性蛋白 密 切联结 ,并被 泮缠在 一 ■个蛋 白鞘内 ,排成 核衣壳 (nucleocapside)。 目 前应用 最广泛 的杆状 病毒表 达系统 利用了 以苜蓿 银纹夜 蛾多核 型多角 体病毒 (Autogragha californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV; 以下 称杆状 病毒) 的溶原 性病毒 为代表 的核型 多角体 病毒。 一 、杆状 病毒表 达系统 的特点 和原理 在 20 世纪 70 年代, 研究杆 状病毒 的复制 周期时 发现了 这类病 毒在复 制过程 中产生 芽殖 病毒体 (budded virion, BV) 和多角 体源性 病毒体 (polyhedron-derived virion, PDV) 两种 不同的 病毒体 类型。 其后对 AcMNPV 的 少多角 体空斑 突变体 的研究 过程中 • 517 . 又发现 这种突 变体产 生的多 角体数 目减少 是由于 病毒的 包埋出 现障碍 ,且 多角体 产量的 减少与 BV 数目 的增加 相对应 。同期 研究结 果表明 ,杆 状病 毒基因 组是一 个很大 的共价 结合的 双链闭 合环状 DNA 分子; 多角 体蛋白 是多角 体基质 的主要 组分, 亦是量 最大的 病毒 组分; 多角体 病毒在 病毒复 制的极 晚期大 量合成 。据上 理论, 1981 年 Lois K. Miller 首次提 出了用 外源基 因取代 多角体 蛋白编 码序列 ,利 用杆状 病毒在 昆虫细 胞中表 达外源 基因的 设想。 1983 年, Smith 率先用 AcMNPV 作为 载体在 草地贪 夜蛾细 胞系中 成 功的表 达了人 干扰素 ,自 此杆状 病毒表 达载体 系统完 成了从 理论到 实践的 转化。 (一) 杆状 病毒表 达系统 的特点 1. 杆状 病毒表 达系统 的优点 (1) 非必 需基因 的存在 使感染 性完整 :杆状 病毒载 体的两 个主要 基因是 OCM 和 />川, 它们 对病毒 DNA 复 制是非 必需的 ,可 用外源 基因取 代其编 码区, 所得重 组病毒 具有完 整的感 染性, 在重组 病毒的 复制表 达过程 中也不 需要帮 助病毒 。非 必需基 因的存 在为外 源基因 在杆状 病毒基 因组中 提供了 插入位 点和启 动子。 (2) 高 容量基 因提供 了高克 隆容量 :杆状 病毒基 因组在 核衣壳 中的包 装和在 多角体 蛋白中 的包埋 是可以 大幅度 延伸的 ,所 以杆状 病毒载 体的克 隆容量 很高, 杆状病 毒科的 不同 成员的 基因组 的大小 范围为 88~230kbp。 现在已 在一个 载体中 可以同 时克隆 5 个 外 源基因 ,表达 5 种 不同的 蛋白。 (3) 强启动 子高效 表达靶 基因: 超量表 达基因 〇cM 和/ >10 有着很 强大的 启动子 ,能 驱动 靶基因 的高水 平表达 ,其表 达时间 从病毒 复制周 期的基 因表达 晚期延 续到极 晚期。 外源 基因的 表达水 平比其 他真核 表达系 统高出 很多, 感染晚 期能占 细胞蛋 白总量 的一半 以上。 (4) 时序 效应: 杆状病 毒基因 表达具 时序调 节性质 ,不 同基因 在病毒 感染的 不同时 相表达 。重 组杆状 病毒中 的外源 基因与 它们所 替代的 亲本病 毒原有 的基因 表达的 时序是 一致的 。杆 状病毒 具有双 向复制 周期, 复制晚 期产生 BVs, 极晚 期产生 PDVs 和多角 体。 oc« 和 都 是极晚 期基因 ,当其 启动子 驱动外 源基因 表达时 ,有感 染性的 病毒离 子 已形成 。故表 达的外 源基因 产物不 会影响 BVs, 不 会引起 导致外 源基因 丢失或 失活的 变异 ,在极 晚期表 达产生 的外源 基因产 物对宿 主细胞 功能的 影响也 不大。 (5) 宿 主特异 性产生 的安全 性:杆 状病毒 的宿主 范围仅 限于昆 虫和少 数其他 无脊椎 动物 ,其专 一性使 其对人 和哺乳 动物是 安全的 。现有 研究表 明其启 动子在 哺乳动 物细胞 中无 活性, 故在表 达癌基 因或有 潜在毒 性的蛋 白时可 能较优 于其他 系统。 (6) 真核细 胞环境 下能表 达具有 生物活 性的表 达蛋白 :杆状 病毒在 昆虫细 胞内复 制 ,昆虫 细胞的 蛋白质 的后加 工系统 与哺乳 动物细 胞接近 ,能 识别 和切除 信号肽 ,能对 表达蛋 白进行 切割、 磷酸化 等反应 ,还 可发生 C 端酰 胺化 、脂 肪酰化 、自 然折叠 、蛋 白 酶降解 ,能 使蛋白 质正确 定位和 形成高 级结构 。所以 ,在 昆虫细 胞中表 达的外 源蛋白 接近天 然蛋白 ,表 达产 物的生 物活性 、结 构与功 能特点 、抗 原型和 免疫原 型等与 天然外 源 基因产 物极其 相似。 (7) RNA 的剪接 作用: RNA 的剪接 作用是 真核基 因普遍 存在的 的生物 学现象 ,杆 . 518 • 状病 毒中除 极个别 基因外 ,绝大 多数基 因无剪 接作用 。一般 采用杆 状病毒 载体的 cDNA 在昆 虫细胞 中表达 的外源 基因, 主要基 于杆状 病毒大 多数基 因自身 不存在 基因剪 接机制 的考虑 ,但 是这不 表明杆 状病毒 表达载 体系统 不存在 基因剪 接机制 。其实 ,已有 AcM- NPV 介 导表达 的外源 基因涉 及基因 剪接。 1987 年 Jeang 等利用 AcMNPV 载体在 昆虫细 胞中表 达了含 有内含 子的外 源基因 ,结 果发现 产生的 mRNA 是经 过剪接 加工的 ,同时 还 检测到 成熟的 蛋白质 产物。 (8) 噬 菌斑鉴 定简便 。缺失 多角体 蛋白基 因的病 毒与含 有该基 因的病 毒具有 不同的 蚀斑 形态, 重组杆 状病毒 是由外 源基因 通过同 源重组 取代了 多角体 蛋白基 因而产 生的, 在该 系统中 ,不 同的噬 斑形态 提供了 一个用 裸眼筛 选鉴定 重组子 的简单 方法。 (9) 细胞 的大规 模悬浮 培养。 在用昆 虫细胞 做表达 系统的 情况下 ,细 胞的大 规模悬 浮培养 是工业 化生产 的关键 性因素 ,目 前已 有可喜 成就。 2. 杆状 病毒表 达系统 的缺点 1) 不利 于连续 性表达 杆状病 毒的感 染最终 导致宿 主细胞 的死亡 ,所以 每轮次 表达靶 基因都 要使用 重组病 毒再 次感染 新鲜培 养的昆 虫细胞 ,不 利于实 现连续 发酵。 2) 表 达蛋白 糖基化 的差异 昆虫细 胞中蛋 白质糖 基化的 形成主 要是甘 露糖型 ,缺 乏存在 于哺乳 动物中 的唾液 酸 、半 乳糖和 岩藻糖 型糖基 转移酶 ,故糖 基主要 组成是 甘露糖 ,无半 乳糖和 岩藻糖 ,糖 基侧链 也较短 。糖 极化的 差异使 在昆虫 细胞和 哺乳动 物细胞 中表达 的外源 蛋白的 相对分 子 质量有 时不完 全相同 。不过 ,对 于糖 基化要 求不严 、侧链 不长的 蛋白质 ,是可 以用昆 虫 细胞合 成有生 物活性 的蛋白 质的。 3 ) 成 本较南 培养昆 虫细胞 时要加 胎牛血 清或小 牛血清 ,所 以在 培养时 ,尤 其是在 大规模 悬浮培 养时, 成本较 之其他 表达系 统要高 。但是 ,若 用昆虫 幼虫表 达系统 ,由于 词料的 价格较 低 ,生产 成本远 低于昆 虫细胞 系统。 (二) 构 建重组 杆状病 毒的原 理和技 术路线 杆状病 毒作为 外源基 因表达 载体的 基础是 其基因 组的结 构组成 特点、 病毒复 制特征 以 及基因 表达调 控机制 。构 建表达 外源基 因的重 组杆状 病毒的 过程可 以归纳 成以下 3 步 (图 7.5)0 (1) 构建杆 状病毒 的外源 基因转 移载体 ,即将 某个包 含非必 需基因 区的杆 状病毒 DNA 片段 克隆到 细菌质 粒上, 再将外 源目的 基因插 入重组 质粒的 杆状病 毒非必 需基因 启动子 的下游 ,并 删除 此杆状 病毒非 必需基 因的部 分或全 部编码 序列以 及做必 要的修 饰 。为产 生表达 目的基 因的重 组病毒 ,首先 需将该 基因克 隆至一 个转移 载体中 。大 多数 杆状 病毒转 移载体 含有多 角体蛋 白的启 动子, 其后接 一个或 多个供 外源基 因插入 的限制 性酶识 别位点 。一旦 外源基 因克隆 至表达 载体上 ,该 基因的 5' 和 3' 旁侧 均为病 毒特异 的序列 。接着 ,重 组载体 与野生 型病毒 DNA —起转 染昆虫 细胞, 通过体 内同源 重组, • 519 • 重 组质粒 含 完整多 角蛋白 基因的 野生型 线性 化病毒 DNA 图 7.5 重组杆 状病毒 的产生 和纯化 外 源基因 (X, 描成黑 色的) 插入 到合适 质粒载 体中病 毒多角 体蛋白 启动子 (Pr) 的下游 。外 源 基因的 5' 和 3' 旁侧 均匀为 多角体 蛋白基 因特异 的序列 (带 影线的 )。 重 组质粒 然后与 购自商 家的线 性病毒 DNA 共转染 Sf9 细咆。 2~3d 后 ,收 集既含 野生型 (圆圈 ) 又 含重组 (X) 病毒 的 培养液 。通过 一轮或 多轮噬 斑纯化 ,纯化 出无野 生型病 毒的重 组病毒 外源基 因插入 病毒基 因组, 而多角 体蛋白 体基因 被切出 。重 组病毒 失去了 多角体 蛋白体 基因, 在该位 置为处 于多角 体蛋白 的启动 子控制 下表达 的插入 基因所 取代。 (2) 用纯 化的杆 状病毒 DNA 与构 建的携 带外源 目的基 因的转 移载体 质粒共 同转染 杆 状病毒 的受纳 细胞系 ,亲 本病毒 DNA 和转 移载体 质粒在 受染细 胞内通 过同源 重组产 生获得 外源目 的基因 的重组 病毒; 野生 型病毒 的环状 DNA 和重 组质粒 DNA 之 间发生 同源重 组的频 率很低 ( 多处于 0.2% 〜 0.5%), 但若在 与质粒 DNA 共转 染之前 将野生 • 520 • 型杆 状病毒 线性化 ,就能 够使重 组病毒 的比例 增加到 30% 左右。 假如通 过缺失 多角体 蛋白基 因下游 1629 可读框 (ORF) 的 必需部 分而使 DNA 线性化 ,那 么与 缺失部 分互补 的质 粒载体 共转染 所得到 的病毒 中将有 85% ~99% 表 达异源 基因。 3) 共转 染后, 获得的 病毒原 种必须 根据选 择标记 ,通 过噬菌 斑试验 或其他 方法筛 选和 纯化重 组病毒 。获得 重组病 毒后, 再对其 进行鉴 定分析 ,可采 用有限 稀释法 。该表 达 系统的 一个优 点是可 通过裸 眼筛选 鉴别重 组病毒 。包涵 体约为 15/im, 存在于 感染极 晚期 细胞的 胞核中 ,具 有高度 折光性 ,带 有明亮 、耀眼 的外观 ,可 在光 学显微 镜下辨 认, 而重组 病毒感 染的细 胞没有 包涵体 。如此 ,当 病毒在 Sf9 ( 草地 夜蛾) 细胞 上形成 噬斑时 ,可通 过包涵 体存在 (指示 野生型 病毒) 或 不存在 (指 示重组 病毒) 来筛选 。也 可采用 DNA 杂 交或聚 合酶链 式反应 (PCR) 来鉴 定重组 病毒。 二 、杆状 病毒转 移载体 (一) 杆状 病毒转 移载体 的结构 利用 质粒或 噬菌体 作为载 体表达 外源基 因时, 一般用 合适的 限制酶 将质粒 ( 或噬菌 体) DNA 切开 ,然后 用连接 酶直接 将外源 基因片 断接连 到质粒 (或噬 菌体) DNA 上。 但是 对于杆 状病毒 基因组 ,该法 将很难 插入外 源基因 ,因为 :①杆 状病毒 基因组 的庞大 使外 源基因 的直接 插入有 困难; ②杆 状病 毒基因 组的限 制酶位 点虽多 ,但 要找到 单一限 制 酶切位 点很难 ,用任 何一种 内切酶 处理都 可能造 成一部 分必需 基因的 丢失; ③ 杆状病 毒的 DNA 扩增 和纯化 都不及 质粒在 细菌中 的扩增 方便。 鉴于以 上几点 ,实际 操作时 将外源 基因导 入杆状 病毒基 因组的 方法是 将杆状 病毒的 基因 组的一 段序列 克隆到 细菌质 粒上, 然后将 外源目 的基因 插入重 组质粒 上的杆 状病毒 基因序 列中间 ,最 后用 这种携 带外源 目的基 因的质 粒与杆 状病毒 DNA 共 同感染 受纳昆 虫细 胞系。 在昆虫 细胞内 ,存在 于质粒 上的杆 状病毒 基因序 列有可 能与亲 本病毒 基因组 的相对 应序列 发生同 源重组 。在此 过程中 ,外 源目的 基因有 可能与 其两侧 的杆状 病毒基 因序列 一起进 入病毒 基因组 。这 一类含 有杆状 病毒基 因的序 列并能 将外源 基因转 载到杆 状病 毒基因 组的质 粒就叫 做杆状 病毒的 基因转 移载体 ,简称 为杆状 病毒转 移载体 (bac- ulovirus transfer vector)。 杆状病 毒转移 载体的 组成元 件包括 细菌质 粒序列 、插 入质 粒的杆 状病毒 DNA 序 列 、用 于控制 外源基 因的启 动子和 启动子 下游的 供外源 基因插 入的克 隆位点 。此外 ,在 外 源基因 插入位 点的下 游还需 要有一 个转录 终止信 号序列 。下面 分别予 以介绍 : (1) 细菌质 粒序列 : 细菌质 粒序列 是作为 外源基 因与杆 状病毒 DNA 序列连 接以及 与此相 关的基 因操作 的介质 。转 移载体 中的细 菌质粒 序列必 须包括 在大肠 杆菌中 能够工 作的 复制子 和便于 筛选含 重组质 粒细菌 的抗生 素抗性 基因。 (2) 杆 状病毒 DNA 序列: 外源基 因是通 过转移 载体与 亲本病 毒基因 组发生 同源重 组而 导入病 毒基因 组的, 故此转 移载体 中的杆 状病毒 DNA 序列应 是亲本 病毒基 因组的 外源 基因插 入位点 两侧序 列的同 源序列 。也就 是说, 转移载 体上用 于控制 外源插 入基因 的启 动子两 侧的杆 状病毒 DNA 序列决 定了所 携带的 外源基 因在重 组病毒 基因组 中插入 • 521 • 的位置 。目前 ,大 多数的 杆状病 毒转移 载体所 含的杆 状病毒 DNA 序列是 基 因 两侧的 序列。 (3) 用于控 制外源 基因的 启动子 : 用于控 制外源 基因的 启动子 既可是 杆状病 毒基因 序列中 原有的 启动子 ,也 可以是 另一杆 状病毒 的某种 启动子 或是其 他真核 生物基 因启动 子 。在 前一种 情况下 ,杆 状病毒 基因启 动子下 游的编 码序列 会被部 分或全 部删除 ,取代 其的是 供外源 基因插 入的克 隆位点 ,而 这种被 删除的 基因只 可以是 杆状病 毒的非 必需基 因 。而在 后一种 情况下 ,另 一复 制启动 子连同 克隆位 点和转 录终止 信号一 同被插 入到杆 状病毒 非必需 基因的 可读框 ,它 们的插 入是不 会对病 毒体的 复制产 生不利 影响的 。在同 一种 细胞内 ,被转 移载体 转移到 杆状病 毒基因 组中的 外源基 因的表 达时间 和相对 表达量 是由启 动子的 性质决 定的。 (4) 克 隆位点 :为了 便于外 源基因 的插入 ,需要 在启动 子下游 建立一 . 个单一 限制性 酶切位 点作为 外源基 因的插 入位点 ,这 种单一 限制酶 切位点 称为克 隆位点 。有的 转移载 体的插 入位点 含有多 个这样 的单一 限制酶 切位点 ,即称 为多克 隆位点 。相 比与单 一的克 隆位 点来说 ,多 克隆位 点更便 于外源 基因的 插入。 (5) 转录终 止信号 :转移 载体上 用于控 制外源 基因的 启动子 若是处 于它的 自然位 置, 原有的 转录终 止信号 序列仍 可作为 外源基 因的转 录终止 信号; 但是若 启动子 是插在 另一 个位点 ,同时 还需要 在外源 基因插 入位点 的下游 插入一 段转录 终止信 号序列 ,以免 外源 基因转 录过头 ,影响 在其下 游的和 相反方 向的其 他基因 。大多 数的真 核基因 转录终 止信 号序列 也是适 用于杆 状病毒 系统的 。在杆 状病毒 转移载 体中, 常采取 SV40 病毒的 转录终 止信号 序列。 重 组杆状 病毒现 已被广 泛用作 表达培 养的昆 虫细胞 或昆虫 幼体异 种基因 的载体 。放 置于 AcNPV 的 多面体 蛋白启 动子转 录调控 下的异 种基因 常常在 转染晚 期得到 大量表 达 。多数 情况下 ,重 组蛋 白质应 被处理 ,修饰 , 并被靶 准于合 适的细 胞位置 ,即 它们功 能上的 对应相 似处。 通常 状况下 ,采取 这样的 方法构 建杆状 病毒转 移载体 : 首先将 预定的 外源基 因插入 位点两 侧的亲 本病毒 DNA 序 列克隆 到合适 的大肠 杆菌质 粒上; 然后 ,在 预定的 外源基 因 插入位 点插入 适当的 启动子 和转录 终止信 号序列 ,并 构建克 隆位点 ,或 是直接 删除杆 状病毒 DNA 序列 中某个 原有基 因的部 分或全 部编码 序列并 构建克 隆位点 。现在 一般无 须自己 构建转 移载体 ,多可 从公司 购得。 (二) 杆状 病毒转 移载体 的类型 早 期构建 的转移 载体都 是含有 oc« 基 因的杆 状病毒 DNA 片 段插入 细菌质 粒构成 的, 外源基 因位于 〇c« 启动子 下游, oc„ 的 全部或 部分编 码序列 被删除 。后来 , 人们发 现 基 因也是 杆状病 毒复制 的非必 需基因 ,于 是又产 生了以 基因 区为基 础构建 的转 移载体 。研究 表明, 不删除 病毒基 因任何 部分的 情况下 ,仅将 另一复 制启动 子及与 之 相连的 克隆位 点序列 插入到 OCM 基因或 基 因附近 ,由 此构建 的转移 载体也 能把外 源基因 介导到 杆状病 毒基因 组中并 获得良 好的表 达效果 。在 这个基 础上, 用另一 克隆位 点取代 原有的 〇c« 或/^0 编码序 列即可 使同一 转移载 体同时 转移两 个外源 基因。 目前已 • 522 . 出 现了可 以转移 5 个基 因的杆 状病毒 的转移 载体。 在 杆状病 毒转移 载体中 ,用 于控制 外源基 因的启 动子除 〇〇«和/>川 启 动子外 ,还有 其他 一些杆 状病毒 基因的 启动子 ,如壳 体蛋白 (cap)、 碱 性蛋白 (/>6.9)、 和 g/>67 基因启 动子等 。有些 转移载 体在启 动子与 克隆位 点之间 (或在 多克隆 位点内 ) 含有 ATG。 这 类转移 载体适 用于转 载其本 身不含 ATG 的外 源基因 ,但 插入的 外源基 因与此 ATG 必须 位于同 一可读 框内。 另外一 些转移 载体在 克隆位 点与启 动子之 间不含 ATG, 准备插 入的外 源基因 本身必 须具备 ATG。 如今 ,杆 状病毒 表达载 体发展 的主要 方向是 开发新 的病毒 启动子 ,提 高表达 效率, 构建多 功能表 达载体 ,实 现多基 因表达 ,以及 简化重 组病毒 的筛选 。目 前以 AcNPV 多 角体 蛋白基 因启动 子构件 的转移 载体就 有许多 。表 达非融 合蛋白 的单基 因转移 载体有 pAcYMl、 pAcRP23、 pEV55、 pVL941、 pAcSGl、 pVL1392、 pVL1393、 pAcUWl、 pAcEP106、 pAcUW2、 PAcUW21 等; 表达融 合蛋白 的单基 因转移 载体有 PAc360、 pAc700、 pAc701、 pAc702 等; 具有 形成单 链功能 的转移 载体有 pAcCL29、 pAcCL29-l、 pAcCL29-8 等; 多基 因转移 载体有 pAcUW4 1 、 PAcUW42 和 pAcUW43 等; 可供 选择 使用。 1. 由 ocu 启动 子控制 外源基 因的转 移载体 〇〇/ 基 因是杆 状病毒 的非必 需基因 ,而且 〇c« 启动子 是一强 启动子 。在 病毒 复制晚 期受感 染细胞 内的多 角体蛋 白量达 蛋白质 总量的 50% 。 现 在应用 最广泛 的转移 载体是 以 oc« 基因启 动子控 制外源 插入基 因的转 移载体 。早 期构 建的一 些载体 存在着 各种缺 陷, 表达的 融合蛋 白要比 非融合 蛋白高 ,但是 很多情 况下融 合蛋白 并不是 所需要 的表达 产物 ,所 以目前 广泛应 用的以 启动 子控制 外源插 入基因 的转移 载体都 具有一 些很好 的机制 ,保 证所转 载基因 的表达 产物为 非融合 蛋白, 或使以 融合蛋 白的形 式产生 的表达 初产 物的非 目的基 因编码 的部分 能够被 简单的 除去。 1) 表达非 融合蛋 白的转 移载体 (1) pAcYMl、 pAcRP23、 pEV55。 pAcYMl 是以 pUC8 和 AcMNPV DNA 的 £r〇RI-I 片段 为基础 构建的 转移载 体质粒 。其 〇CM 编码 序列的 nt + 2~ + 751bp 被 也 mHl 克隆位 点取代 。与 pAcYMl 类似的 转移载 体还有 pAcRP23 和 pEV55 等。 pAcRP23 长 9.8kb, 编码 序列从 nt+l~ + 172bp 缺失 ,也 有一个 单一说 mHl 克隆位 点; PEV55 长 6.2kb, 编码 区缺失 nt+1 〜 +629bp, 含有一 多克隆 位点, 并且在 多克隆 位 点序列 中还存 在一个 ATG。 MCS 上存在 BamHl、 X/u) I、 EcoRI、 I、 C& I、 A#718 等酶 切位点 ,对 于转载 缺少翻 译起始 密码的 外源基 因比较 方便。 (2) pVL941、 pAcSGl。 pVL941 长 9.3kb, 编码 序列从 nt + 36 〜 + 629bp 缺失, ATG 突变成 ATT, 具有 S5/>I、 Bs/>M I、 BamH I 或 Sma I 插入 位点。 pAcSGl (PharMingen) 是在 PVL941 的 基础上 改建的 转移载 体质粒 ,所含 AcMNPV DNA 的 EcoRl-I 片段被 截短, 其中的 ORF603 和 ocm 可读框 的的非 必需部 分以及 大部分 编码基 因被 删除。 因此, pAcSGl 比较小 ,便 于操作 及转载 较大的 基因。 pAcSGl 的多 克隆位 点 紧接着 oc« 启 动子。 (3) pVL1392、 PVL1393 pVL1392 和 pVL1393 是 pVL941 的衍 生质粒 ,具 有完整 . 523 • 的 OCM 基因启 动子和 5' 非编码 序列和 编码序 列的头 35 个 核苷酸 ,但是 第一个 密码子 ATG 被 改为了 ATT, 以避免 表达时 在外源 目的基 因编码 序列上 游起始 翻译。 pVL1392 在 n+35bP 处插入 一个多 聚接头 片段, 适用于 外源基 因克隆 。单一 限制性 位点从 5' 〜 3' 包括: BgHI、 朽《1、 Noil、 Xma I、 EcoRI、 I、 Swa I、 Xma I、 Bam HI〇 pVL1393 由 PVL1392 构建, 它们的 区别在 于两者 的多克 隆位点 的顺序 相反。 2) 表达 融合蛋 白的转 移载体 有 实验在 基因转 移载体 中保留 ATG 下游一 端编码 序列, 再插入 耙基因 ,使其 在昆虫 细胞中 表达融 合蛋白 ,其 N 端 为多角 体蛋白 的几个 氨基酸 ,接着 是外源 蛋白。 研 究表明 ,此 时表达 量比非 融合蛋 白显著 提局。 Luckow 等在 pAc360 的 n+34bp 处插 入标 记基因 CAT, 合成了 N 端由 69 个 多角体 蛋白氨 基酸组 成的融 合蛋白 ,表 达水平 接近于 天然多 角体蛋 白的表 达水平 ,这 类转移 载体包 括以下 几种。 (1) pAc360。 此载 体包含 完整的 基因启 动子和 5' 前 导序列 ,具有 单一的 BamHI 位点 ,靶基 因可于 n+34bp 处 插入。 (2) pAc700、 pAc701、 pAc702。 pAc700 从 〇«4 基因 5' 前 导序列 开始有 8bp 缺失, 可在 n + 3bp 处的 BamHI 位点插 入外源 基因; pAc701 从 ocm 基因 5' 前 导序列 开始有 8bp 缺失 ,可在 n + 4bp 处的 BamHI 位点插 入外源 基因; pAc702 从 ocm 基因 5' 前导序 列 开始有 8bp 缺失 ,可在 n+5bp 处的 BamHI 位点 插入外 源基因 。这 3 种转移 载体组 成一套 系统, 不管是 编码序 列的状 态如何 的靶基 因与它 们连接 ,总能 筛选到 1/3 的同框 重组子 ,实 现融 合蛋白 的正确 表达。 3) 具 有形成 单链功 能的转 移载体 为了修 饰表达 蛋白, 就需要 对载体 DNA 进行定 点诱变 ,若能 直接由 转移载 体得到 诱 变所需 要的单 链模板 ,则亚 克隆至 M13 噬 菌体或 其他克 隆载体 上的许 多步骤 可以省 去了。 pAcCL29 是 这类能 形成单 链的新 型转移 载体。 pAcCL29 是 来自于 pAcYMl 的改 进型 ,是 在含有 PAcCL29 这类 载体的 病毒基 因序列 以外的 部分含 有一段 M13 噬 菌体的 形 成单链 DNA 的必 需区域 (复制 起始区 )。 这段序 列的存 在使这 类载体 扩增时 ,用 M13 辅助噬 菌体共 感染后 ,能形 成单链 DNA, 便于 进行核 苷酸序 列测定 。有时 候外源 基因 插入转 移载体 后还需 要通过 定点突 变进行 修饰, 这时需 要通过 测定载 体质粒 的核苷 酸序列 ,验 证突 变修饰 的结果 。这类 载体有 PAcCL29、 pAcCL29-l、 PAcCL29-8 等。 2. p/0 启动 子控制 外源基 因的转 移载体 基因 也是杆 状病毒 复制的 非必需 基因, 在复制 晚期大 量表达 ,编 码序列 可以被 删除而 代之以 外源基 因序列 ,借 启动子 控制外 源基因 的表达 。这样 的重组 病毒仍 具有包 涵体。 有人认 为缺失 基因 的病毒 包涵体 不及野 生型病 毒包涵 体稳定 ,若将 一拷贝 启动 子插在 0CM 基因 区用 于控制 外源插 入基因 的表达 ,原 有的/ >10 基因就 可 以保留 下来。 W0/FG 表达 盒可被 整合在 〇〇/或/)川 基 因相位 ,得到 ocu 或 P10 表型 重 组病毒 。两 种重组 病毒都 能正常 复制和 装配。 为便于 筛选重 组病毒 ,可在 基因 转 移载体 中导入 一个标 记基因 。带 有标记 基因的 基因转 移载 体也是 杆状病 毒基因 工程 的重要 工具。 . 524 . 1) 整合在 基因位 相的转 移载体 (1) pAcUWl。 pAcUWl 是将 AcNPV 的 基 因片断 克隆在 pUC 质粒 DNA 中而 成。 基因的 启动子 完整但 是编码 序列从 n + 2 〜 + 151bp 区 段缺失 。载 体全长 4.7kb, 带有 ATG 的外源 基因可 在编码 序列的 365 位 BgZII 或 446 位 Hhcl III 处 插入。 转录 起始在 293 位 ,可能 的终止 位点在 692 位 。当此 载体与 wt-AcNPVDNA 共转染 Sf9 细胞后 ,外源 基因被 整合在 病毒基 因组的 />川 基 因位相 (plO_ 表型 ), 没 有筛选 标记, 只能用 空斑原 位杂交 筛选阳 性重组 病毒。 (2) PAcEP106。 本转移 载体是 首先从 AcNPV 切 下含有 />10 基因的 Hhd III-Q 片 断 (2.0kb) 并克隆 到质粒 pUC19 中, 得到重 组质粒 pAcPIO。 用所 nc II 消化 pAcPIO DNA 并自连 ,则含 基 因编码 序列的 O.lSkbfifndlll-f^cII 片 断留在 质粒上 ,成 为 基因探 针载体 pAcHP102; 以 £c〇R I 消化 pAcPIO DNA 并自连 ,则含 有完整 基因的 0.42kb III-£c〇R I 留 在质粒 上成为 piO 基因转 移载体 pAcEP106。 转 移载体 pAcEP106 的 基因 ATG 下游 n + 60bp 和 + 151bp 处有 两个单 一限制 性位点 HhcII 和 BgZII, 适 用于外 源基因 的克隆 ,重组 病毒为 pl(T 表型。 2) 整合在 〇c« 基因位 相的转 移载体 106pAcUW2、pAcUW21 PAcUW2 是以 AcMNPV DNA 的含 有多角 体蛋白 基因的 片 断插入 PUC8/6/8 构建的 。在其 5' 段调 控序列 上游的 £c〇RV 位点 插入由 基因启 动子 控制的 hcZ 基因和 SV40 终 止信号 ,两种 不同的 插入方 向成为 两种转 移载体 pAcUW2(A) 和 pAcUW2(B), 用此 载体和 AcMNPV DNA 共 转染昆 虫细胞 ,表达 盒被整 合在 ocM 基因 ,重 组病毒 表型为 〇(^ +如1()+/13(:+,可用产生多角体的病毒筛选阳性重组 病毒。 PAcUW21(PharMingene) 是 pAcUW2(B) 的衍 生质粒 。与 pAcUW2(B) 不 同的是 pAcUW21 具有形 成单链 DNA 的 能力。 3. 多 基因转 移载体 pAcUW41、pAcUW42 和 PAqUW43、pAcUW41、PAcUW42 和 PAcUW43(PharMin- gene) 是以 AcMNPV 户10 基因区 作为外 源基因 插入位 点的转 移载体 。一 拷贝 ocm 启动子 被 同向插 在正常 />10 启动子 的下游 ,在 两者之 间插入 了一段 SV40 转录终 止子。 p 川编 码 序列的 nt + 2~ + 151 被 删除。 ocw 启动子 下游有 一 ■个 BawHI 克 隆为点 。这 3 种转移 载体 质粒都 具有形 成单链 DNA 的能力 。他 们的 区别是 pAcUW41 的 启动子 的下游 只连 接一个 B 以 II 克隆 位点。 另外两 个转移 载体的 川启动 子的下 游各连 接一个 阅读方 向 相反的 多克隆 位点。 三、 构建重 组病毒 的策略 重组转 移载体 的构建 包括了 “转移 载体” 、“亲 本病毒 ”和“ 重组介 体”这 几个要 素, 三者缺 一不可 。各种 不同的 转移载 体质粒 、亲本 病毒和 介体系 统具有 不同的 性质, 在构 建重组 病毒表 达外源 基因的 同时, 要根据 表达外 源基因 的目的 和外源 基因产 物的性 质进 行合理 的选择 和搭配 ,这样 才能保 证有效 地构建 高质量 的重组 病毒。 • 525 • (一) 转 移载体 的选择 转 移载体 决定外 源基因 在病毒 基因组 中的插 入位点 、表达 的时序 和产量 ,有 的情况 下还会 影响基 因产物 的性质 ,所以 有以下 几点要 注意。 1. 待表 达产物 是融合 蛋白还 是非融 合蛋白 有些 转移载 体在克 隆位点 之前还 含有一 段其他 基因编 码序列 ,所以 ,外 源基 因表达 产物也 相应含 有一段 N 端附加 序列, 这种融 合蛋白 的性质 与外源 基因自 然产物 的性质 有可 能不同 。但在 某些情 况下, N 端附加 序列使 融合蛋 白更容 易分离 和纯化 。譬如 PAcSGHlSNT-A/B/C 在 〇c« 启动 子与多 克隆位 点之间 含有一 段多组 氨酸编 码序列 ,因 此, 由这类 转移载 体转移 外源基 因到病 毒基因 组中时 ,构建 的重组 病毒表 达的外 源基因 产物其 N 端含有 一段多 组氨酸 末端附 加序列 ,这一 段多组 氨酸末 端附加 系列对 金属鳌 合剂具 有着高 亲和力 ,因 此使这 种融合 蛋白便 于通过 亲和层 析分离 。融合 蛋白所 包含的 末端附 加序列 有可能 通过适 当方法 除去。 2. 外源基 因表达 产物是 否要被 分泌到 细胞外 自然 情况下 ,有 的蛋白 质是分 泌型的 ,有些 是非分 泌型的 。在 细胞培 养中, 分泌到 细胞 外的培 养基中 的蛋白 质更容 易纯化 。蛋白 质的分 泌依赖 于信号 肽的引 导作用 ,若要 求 外源基 因表达 产物被 分泌到 细胞外 ,它 自己本 身又不 具有分 泌蛋白 的性质 ,可 以选择 在外 源基因 插入位 点之前 含有适 当的信 号肽编 码序列 的转移 载体。 3. 选择 合适的 启动子 目前已 构建的 转移载 体中, 用于控 制外源 基因的 启动子 包括了 杆状病 毒极晚 期启动 子 (如 〇c« 和 piO 启动子 )、 晚期 启动子 ( 如碱性 蛋白启 动子和 />39 启动子 ) 以 及人工 合成 启动子 (如 和 和 以及 人工合 成启动 子等都 是强启 动子, 可 以指导 它们控 制的基 因的大 量表达 ,活 性一直 从病毒 复制晚 期延续 到最后 。但 是也有 些 外源基 因产物 存在复 杂的翻 译后修 饰过程 ,而在 病毒复 制的最 后过程 ,大 多数 细胞已 经死亡 ,可供 基因表 达产物 进行翻 译后修 饰的细 胞和其 他原料 的量必 然减少 。所 以在这 种 情况下 ,最好 选用以 晚期启 动子控 制外源 基因表 达的转 移载体 ,如 pAcJP 和 pAcMP 系 列等。 4. 单基 因或多 基因转 移载体 的选择 单 基因表 达载体 适合于 单个活 性多肽 的基因 的表达 。在 蛋白质 由多个 不同亚 单位构 成的 情况下 ,若要 得到完 整的蛋 白质, 抑或是 在某种 结构由 多个不 同蛋白 质分子 构成的 情况下 ,如果 需要这 种结构 ,则 需要选 择多基 因转移 载体。 已经有 可以转 移五个 外源基 因 的转移 载体构 建成功 。多 基因的 转移载 体在对 于不同 蛋白质 (或 多肽) 的相互 作用关 系 的研究 中很有 价值。 • 526 • (二) 亲 本病毒 的选择 利 用杆状 病毒表 达载体 系统表 达外源 基因时 ,一 般是先 将外源 基因克 隆到合 适的转 移载体 质粒上 ,再 用携 带外源 基因的 转移载 体与杆 状病毒 DNA 共 转染昆 虫细胞 ,通过 质粒 DNA 与病毒 DNA 的体 内重组 ,使 外源基 因插入 到病毒 DNA 中 。这 种获得 了外源 基因 的病毒 称为重 组病毒 ( 重组表 达载体 ), 用于插 入外源 基因、 构建重 组病毒 的病毒 则 称为亲 本病毒 。理 论上任 何野生 型的杆 状病毒 都可以 作为亲 本病毒 ,用 外源基 因取代 天然的 oc« 基因 。由 启动 子控制 的转移 载体与 相对应 的野生 型病毒 DNA 进 行重组 时 ,获得 的重组 病毒是 OCC_ 表型 ,可 以通过 噬菌斑 分析与 OCC+ 表型的 野生病 毒区分 开 。但 在实际 操作中 ,区 分重组 病毒和 野生型 病毒的 工作并 不简单 。因为 嵌合载 体与病 毒 DNA 在共 转染的 昆虫细 胞中的 重组频 率仅为 0.1 % 左右, 进行噬 菌斑分 析时, OCC_ 表型的 空斑很 容易被 漏检; 而且野 生型病 毒空斑 在形成 早期时 OCC+ 表 型并不 十分清 楚, 常被误 认为是 OCCT 表型 的重组 病毒; 再次 ,以/ >10 基因区 为基础 构建的 转移载 体携带 外源基 因与亲 本病毒 DNA 重组时 ,获得 的重组 病毒是 OCC+ 表型的 ,如 果用野 生 型病毒 作为亲 本病毒 ,两者 的表型 实际是 相同的 。为 了便 于研究 ,已改 造构建 出若干 专门用 于共转 染时产 生重组 表达载 体的亲 本病毒 。改 良的方 面有: 某些亲 本病毒 共转染 获得的 子代病 毒中, 重组病 毒的比 例大大 提高; 增加表 型标记 ,使 重组病 毒与亲 本病毒 更容易 通过表 型筛选 区分。 与 ocm 位点型 转移载 体匹配 使用的 亲本病 毒有: vDA26Z、AcRP6.SC、AcRP23.1acZ、 vSynv-gal 和 AcPAK6 等; 与 />10 位点型 转移载 体匹配 使用的 亲本病 毒有: AcUW.lacZ、 AcAS3 和 AcUWl-PH 等。 确定使 用某种 转移载 体后, 要选择 适当的 亲本病 毒与之 匹配以 构建重 组病毒 。转移 载体 的性质 决定了 外源基 因在重 组病寨 基因组 中插入 的位置 和表达 的特征 ,选择 与转移 载体相 匹配的 亲本病 毒的目 的是要 建立最 有效的 筛选和 分离重 组病毒 的机制 ,也 就是要 亲 本病毒 与重组 病毒之 间产生 显而易 见的表 型差异 。有以 下几种 方法可 以进行 匹配。 1) OCC+/OCCT 表 型匹配 若转 移载体 含有完 整的多 角体蛋 白基因 (OCC+), 应选 用多角 体蛋白 缺陷型 (OCC_) 的亲本 病毒; 如 果转移 载体是 OCC_ 表型的 ,则 应选用 OCC+ 表型 的亲本 病毒。 2) 蓝 色空地 / 白色 空斑表 型匹配 若 转移载 体含有 基因 (如 pJVNhel), 由它 所构建 的重组 病毒从 转移载 体获得 了 hcZ 基因 ,在 Xgal 存在的 情况下 就可以 形成蓝 色空斑 ,因 此就 应选用 不含有 hcZ 基 因的亲 本病毒 ,即 可通过 挑选蓝 色空斑 筛选重 组病毒 。同 理反之 ,若转 移载体 不含有 ZacZ 基因 (如 pAcYMl), 就应选 用含有 &Z 基 因的亲 本病毒 ,通 过挑选 白色空 斑筛选 重组 病毒。 3) 线 状病毒 DNA 的选用 如 AcRP6.SC 和其 他含有 hcZ 基因的 AcMNPV 变异株 可以用 Bsu361 酶切成 线状, 用线 状病毒 DNA 与 转移载 体共转 染可以 使子代 病毒的 重组病 毒的比 例大大 的提高 。不 . 527 . 过 ,线 状病毒 DNA 不能 与转移 载体随 意匹配 (三) 重 组介体 对 于重组 病毒杆 状病毒 的构建 ,重 组介体 是必不 可少的 。现在 主要有 以下几 种重组 介 体应用 较多。 1) 昆虫细 胞系统 昆虫细 胞介体 是应用 最广泛 的杆状 病毒重 组介体 。因 为它们 是杆状 病毒的 天然宿 主 ,能 够为杆 状病毒 和转移 载体质 粒提供 理想的 同源重 组环境 ,重 组病毒 可以在 其中迅 速复 制增殖 。只 要是某 种病毒 的受纳 细胞系 统就可 以作为 该病毒 的重组 介体。 2) P1 噬菌体 Cre 重组 酶系统 详见 “杆状 病毒克 隆表达 的新策 略”。 3) 细菌 Tn7 转座 子系统 详见 “杆状 病毒克 隆表达 的新策 略”。 4) 酵 母系统 以昆虫 细胞作 为杆状 病毒重 组介体 的传统 方法, 用于筛 选和纯 化重组 病毒的 时间比 较长, 2)~4) 的新 重组介 体系统 ,尤其 是酵母 和大肠 杆菌系 统大大 简化了 重组病 毒的筛 选和纯 化过程 ,节 约了操 作时间 ,为 杆状病 毒表达 载体的 系统的 发展开 辟了新 途径。 四、 杆状病 毒克隆 表达的 新策略 Smith 等于 1983 年建 立的杆 状病毒 体内同 源重组 策略推 动了整 个基因 工程的 发展, 总结 1983 年以来 杆状病 毒基因 工程的 发展, 除了昆 虫细胞 内的同 源重组 策略为 经典式 策略外 ,还有 以下几 点克隆 表达策 略使用 较多: 昆虫细 胞内的 高频重 组策略 (线 性化技 术 )、 酵母 细胞内 YAC 介 导的重 组策略 (酵 母策略 )、 体 外酶促 定位重 组策略 ( 噬菌体 Lox 转 导策略 ), 以 及大肠 杆菌细 胞内转 座子介 导的重 组策略 (BactoBac 系统 )。 下文 主要 介绍后 两种。 (一) 体 外酶促 定位重 组策略 ( 噬菌体 Lox 转导 策略) Cre-Lox 系统由 Sternberg 等最 早详细 论述。 嗤菌体 P1 包含 一 重 组位点 Zox (locus of Crossover) 和一个 cre 酶基因 ,其 产物 (CRE 酶) 为重组 必需。 CRE 酶已被 克隆纯 化; /or 序列已 被测定 ,它由 34 个核苷 酸组成 ,其 两端为 13bp 的 反向重 复序列 ,中间 为 8bp 的 非回文 序列。 • ATAACTTCGTATAATGTATrTCTATAr/;AArTTTATTATTr;AArTC:ATATTA CATACGATATGCTTCAATA 将此序 列引入 AcNPV 基 因组即 vAclox, 转移载 体引入 Zojt 即 vAclox 和/ 在 cre 酶 存在下 37X: 保温 lh, 两者即 可发生 体外定 点重组 ,将载 体上的 相应序 列转到 病 毒的基 因组上 。此为 一 可逆酶 促反应 ,将反 应混合 物转染 Sf 细 胞即可 得到较 高比例 • 528 • 的重 组子代 病毒。 此法 特点是 在体外 进行杆 状病毒 载体的 重组, 重组率 可达到 50%, 并且此 结果并 非是降 低了亲 本病毒 的背景 造成的 ,而 是绝对 重组子 数大量 增加的 结果。 (二) 大肠 杆菌细 胞内转 座子介 导的重 组策略 (Bac to Bac 系统) 1. 原理 近来 ,一种 快速且 有效的 产生重 组杆状 病毒方 法被发 展起来 。它 的基 础建立 在使一 个特 异位置 表达片 断的转 座子传 送入大 肠杆菌 的杆状 病毒穿 梭载体 质粒中 。杆状 病毒质 粒 (bMON14272) 包含 了低拷 贝微小 F 复制子 、卡那 霉素抗 性基因 以及一 个编码 lacZ- a 的 DNA 片段。 lacZ-ct 基因的 5' 端, 是一个 含细菌 转座子 Tn7 (mini-attTn7) 结 合点的 短片段 ,后 者的 插入不 会中断 lacZ-a 肽的 阅读框 ,杆 状病毒 质粒于 E. coliDHIOBac™ 中 繁殖。 重组 杆状病 毒质粒 (有时 指的是 组成杆 状病毒 的质粒 ) 是将供 体质粒 (PFastBacTMl) mini-Tn7 转座至 其杆状 病毒质 粒上的 结合点 ,此时 Tn7 的 转座功 能由一 辅 助质粒 (PMON7124) 完成 。在 pFastBacl 中的 mini-Tn7 包含有 Gm7 基 因的表 达盒、 AcNPV 的多面 体蛋白 启动子 、多克 隆位点 ,以及 一个在 Tn7 左右臂 之间的 SV40P〇ly (A) 信号 插入点 。待 表达基 因被插 入多角 体蛋白 启动子 下游的 pFastBacl 的多 克隆位 点 。在 杆状病 毒质粒 的结合 位点上 mini-Tn7 对 mini-attTn7 的插入 中断了 lacZ-a 肽的表 达, 所以在 未转化 杆状病 毒质粒 的蓝色 菌落的 背景下 ,含有 重组杆 状病毒 质粒的 菌落是 白色的 。重组 杆状病 毒质粒 DNA 能由 培养基 中迅速 分离出 ,继而 用于转 染昆虫 细胞。 从转染 过的细 胞中获 得的病 毒贮液 (>107PFU/mL) 可再用 于转染 新鲜昆 虫细胞 ,以 便于 蛋白质 表达、 纯化及 分析。 使用 特异性 位点的 转座插 入外源 基因至 £. c〇h 的杆状 病毒质 粒中, 十分利 于在昆 虫细胞 中通过 同源重 组传代 重组杆 状病毒 。筛 选出 的菌落 DNA 是 未与亲 代未重 组病毒 混合的 ,降低 了复合 提纯的 难度, 也大大 缩短了 鉴定和 提纯重 组病毒 的时间 ,由 通常的 4 〜 6 周降成 7 〜 10d。 也 许这种 方法最 大的优 点是它 允许快 速同时 分离复 合重组 病毒。 而且 ,它 尤其适 合为研 究结构 和功能 而做的 蛋白质 分析。 2. 材料 Bac-toBac 杆状 病毒表 达系统 的组分 (GIBCOBRL) (见下 ) 限制 内切核 酸酶、 T4DNA 连 接酶、 RNaseA •E. coh_ 感受 态细胞 氨苄 青霉素 或其他 所需的 抗生素 Blou-gal 异丙醇 B- 硫代半 乳糖苷 Luria 琼脂 (50/ig/mL 卡那 霉素, 7/iig/mL 庆大 霉素, l〇pg/mL 四环素 , 300fjtg/mL Blou-gal 以及 4〇fxg/mL 异丙醇 B- 硫代半 乳糖苷 ) LB 培 养基和 LB 琼 脂板、 S. O. C. 培养基 • 529 . 高 压消毒 蒸馏水 42TC 水浴 高 压消毒 微离心 试管和 15mL 试管 细菌 培养所 需设备 质粒 提取所 需试剂 和设备 细胞培养所需材料(草地贪夜蛾细胞3〖9八丁0%0^-1711,5{-900 11无血清培养 基, 6 孔和 24 孔组 织培养 板等) 大规模 生产蛋 白所需 的材料 (1 〜 15L 旋转 培养瓶 及其配 套的两 孔塞, 3/16in 内径、 5/16in 外径和 l/16in 壁厚 的硅氧 烷管, 〇.2pm 过 滤器, 4in 管索, 张力器 ,多旋 转瓶搅 拌台, 供气泵 ) (Bellco 和 Cole-Palmer 供应) 3. 试 剂制备 Bac to Bac 杆状病 毒表达 系统的 组分如 下表所 75。 — Is* 组分能 足够在 pFastBacl 中 产生 10 〜 20 个克 隆反应 ,在 DH10BAC 感受 态细胞 中产生 5 个重组 反应, 以及对 CELL- FECTIN 反应物 产生约 200 个转染 反应。 成 分 加入量 贮 存条件 pFastBacl 质粒 (0.5;ig//xL) 20fiL -2〇r 高效 DH10BAC 受 体细狍 0. 5mL -70t: CELLFECTIN 试剂 lmL 4t: 对 照质粒 pFastBacl-gus (0.2ng/;xL) 20^tL -20t 4. 操 作步骤 以下是 Bac to Bac 杆 状病毒 表达系 统步骤 的简要 图例。 pFastBacl + 克隆所 需基因 pFastBacl 重组 I 重组 入高效 DH10BAC 细胞 (包含 杆状病 毒质粒 和助手 质粒) £. 菌落 与重组 杆状病 毒质粒 士 Restreak (选作 ) 鉴定 £. c〇h 菌落 与重组 杆状病 毒质粒 +培 养过夜 ,分 离重组 杆状病 毒质粒 DNA 重组 杆状病 毒质粒 DNA i 用 CellFECTIN 试剂 转染昆 虫细胞 重组杆 状病毒 的贮备 (>107pfu/mL) I 昆 虫细胞 的转染 蛋白 质表达 克隆入 pFastBac 1 (1) 在合 适的条 件下, 利用选 择的限 制内切 核酸酶 ,通 过消化 500ng 〜 l^gDNA 来 制备 pFastBac 1 及外源 DNA 片段 。若媒 介仅有 一个部 位被选 择为克 隆部位 ,则 需在合 • 530 • 适 条件下 对其脱 磷酸。 DNA 片 段通过 琼脂糖 凝胶电 泳纯化 回收目 的片段 。在合 适条件 下 连接准 备好的 媒介体 和待插 片段。 供 体媒介 pFastBac 1, Ba/wHI 前有 mcspo/yiec/rin 启动子 ,自 Bam H I (4032) 到 ffirzd II (4137) 是 MCS, BamHI 部位 是多角 体基因 ,下游 37 bp 的初始 ATG 已被 替换为 ATT。 因此 ,欲成 功表达 一个外 源基因 , 其外源 DNA 片段必 须包含 其自身 ATG, 并 有一个 可读框 (ORF) 跟随 。外源 DNA 片段 亦需被 克隆入 pFastBac 1 的正 确位点 ,要 考虑到 多角体 启动子 ( 基因的 5' 端必须 被插入 MCS 的 首 选位置 )。 (2) 连接混 合物转 化感受 态细菌 ,将 含有 10(WmL 氨 苄青霉 素的待 转化混 合物铺 到 LB 琼脂 板上。 对于此 最开始 的克隆 ,不要 在系统 中使用 DH10BAC 细胞。 可使用 DH5a 或 DH10B 感受态 细胞。 (3) 筛选重 组体。 为分析 一个定 向的克 隆试验 ,噬 菌斑 实验最 少需有 6 个 菌落; 对于一 不定向 的克隆 计划, 要分析 12 个 甚至更 多个。 (4) 使 用一小 量准备 步骤准 备过夜 培养的 DNA 质粒, 并通过 限制内 切核酸 酶分解 或 PCR 分 析来鉴 定所需 基因的 正确插 入点。 转位 (5) 准备 Luria 琼脂板 ,包含 : 50^g/mL 卡那 霉素, 7^g/mL 庆 大霉素 , lO^g/mL 四环素 , 300ptg/mL Blou-gal 以及 40Mg/mL 异丙醇 B- 硫 代半乳 糖苷。 (6) 在冰 上融解 DH10BAC 感受态 细胞。 (7) 在 15mL polypropylene 试管 中施加 100pL 此 细胞。 (8) 加 入大约 lng (5^L) 重组供 体质粒 ,轻 叩试 管壁使 DNA 与细 胞充分 混合。 (9) 在冰上 培育此 混合物 30min。 (10) 移至 42X: 水浴 45s, 热 休克。 (11) 在冰上 冷却此 混合物 2min。 (12) 向 混合物 中加入 900pgS. O. C. 培 养基。 (13) 放 置混合 物及培 养基于 37X: 振荡培 育器中 ,振动 4h。 (14) 使用 S. O. C. 培 养基逐 渐稀释 细胞至 KT1、 10_2、 10_3 倍 例如 , 100必 转位混 合物加 900^LS. 0. C. 媒介为 10M 倍稀释 ,再用 此稀释 10 倍至 10_2 稀释 倍数, 同理可 稀释至 1(T3 稀释 倍数。 (15) 将每 个混合 物平铺 至板上 ,将表 面处理 平整。 (16) 在 37X: 下培育 24h。 短于 24h 则蓝色 菌落不 可见。 重组 杆状病 毒质粒 DNA 的分离 白 色菌落 包含着 重组的 杆状病 毒质粒 ,因此 可利用 白色菌 落来分 离重组 杆状病 毒质粒 DNA。 于 分离 之前, 候选菌 落应先 划线培 养以保 证他们 的确是 白色。 (17) 在 大约有 100~200 个菌落 的平板 上选择 出白色 菌落。 如 上数据 易于区 分白色 与蓝色 菌落。 (18) 挑 选出约 10 个 白色候 选菌落 ,划 线培养 到新的 平板上 以鉴定 表型。 37X: 下过 夜 保存。 (19) 从一个 已证实 了在有 Bluogal 及 异丙醇 B- 硫代半 乳糖苷 的平板 上含有 白色表 . 531 . 现型 单个菌 落中, 建立起 一为分 离重组 杆状病 毒质粒 DNA 的 液体培 养基。 以 下的草 案是专 为分离 大相对 分子质 童质粒 (>l〇〇kb) 和 为分离 杆状病 毒质粒 DNA 而 改编。 (20) 使 用一无 菌牙签 ,接种 一个单 个的、 已分离 的细菌 菌落入 2mLLB (含 50pL/ mL 卡 那霉素 )。 37X: 培养 过夜。 (21) 将 lmL 培养基 转入一 1.5mL 微 离心管 ,在 14 00〇Xg 离心 lmin。 (22) 用真空 吸器吸 出上清 ,每 个沉淀 悬浮于 〇.3mL 试剂 I 中 (15mm〇l/LTris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA, 100pg/mL RNase A)。 加入 0.3mL 试剂 II (0.2mol/L NaOH, 1% SDS), 轻轻混 合均匀 。室温 下作用 5min。 悬 液必须 由高度 混浊转 变为几 乎清澈 透明。 (23) 缓 慢加入 〇.3mL 的 3mol/L 醋酸钾 (pH5.5), 加入过 程中轻 轻混匀 ,会 形成 一 •块 由蛋 白质及 £• cof DNA 基 因组组 成的厚 白沉淀 。将样 品在冰 上放置 5 〜 lOmin。 (24) 在 14 000 xg 下离心 lOmin。 离心过 程中, 处理另 一支微 离心管 并向其 中加入 0.8mL 纯异 丙醇。 (25) 将 表面悬 浮物轻 轻转移 至含有 异丙醇 的试管 ,注 意避免 混有白 色沉淀 。反复 上下翻 转以混 合充分 ,然 后在冰 上放置 5 〜 lOmin。 在 此时期 ,样 品可于 -20X: 下保存 过夜。 (26) 室 温下于 14 000 Xg 离心 样品。 (27) 除去 上清液 并在每 个试管 中加入 0.5mL 70% 乙醇 。翻转 试管几 次洗去 沉淀。 室 温下于 14 000 x g 离 心样品 5min。 (28) 选 做:重 复步骤 (8) 〜 (11)。 (29) 除去 尽可能 多的上 清液。 沉 淀可能 已离开 试管底 ,所以 最好是 吸出上 清液而 非倾倒 出来。 (30) 在室温 下将沉 淀于空 气中简 单晾干 5~10min, 于 40pLTE 中溶解 DNA。 不 时 轻敲试 管底。 (31) -20X: 下保存 DNA。 避免重 复冻融 ,否 则转染 效率可 大幅度 降低。 利 用重组 杆状病 毒质粒 DNA 转染 Sf9 细胞 (32) 6 孔 板上每 孔加入 2mL Sf-900 II 无血清 培养基 (含 50U/mL 青 霉素, 50冲/ mL 链霉素 ) 每 孔接种 9xl〇5Sf9 细胞。 (33) 27C 下让 细胞吸 附至少 lh。 (34) 在 12mmX 75mm 无菌试 管中准 备以下 试剂: 试剂 A, 对于每 个转染 ,稀 释约扣 L 的杆 状病 毒质粒 DNA 入 lOOpL 不含抗 生素的 Sf-900 II 无血清 培养基 (SFM); 试剂 B, 对于每 个转染 ,稀 释约 6 卩 L 的 CellFECTIN 试剂入 lOO^L 不含抗 生素的 Sf-900 II SFM〇 (35) 混合 两试剂 ,轻 摇均匀 ,并 于室温 下培育 15 〜 45min。 (36) 用 2mL 不含抗 生素的 Sf-900 II SFM 洗 涤细胞 一次。 (37) 对于每 个转染 ,向每 一含有 脂质体 -DNA 复合物 的试管 中加入 0.8mL Sf-900 II SFM, 混 合均匀 。从细 胞吸去 洗涤剂 ,并 在细胞 上覆盖 lmL 的稀释 脂质体 -DNA 复 合物。 • 532 • (38) 细菌培 养器中 27X: 下培 育细胞 5h。 (39) 移 去转染 混合物 ,加入 2mL 含抗 生素的 Sf-900 II SFM。 细菌培 养器中 27*C 下培 育细胞 48h。 (40) 转染 开始后 48 〜 72h, 分析 细胞的 蛋白质 活性; 72h 时收获 病毒。 重组杆 状病毒 的收获 / 贮存 (41) 收获 转染过 的杆状 病毒时 ,转 移表面 悬浮物 (2mL) 至一 无菌带 盖的试 管中。 500 x g 下离心 5min 使 之澄清 ,转 移含菌 的表面 悬浮物 至一新 试管。 从开始 转染起 , 病毒的 滴度值 可达到 (2xi〇7) — (4xi〇7)pfu/mL。 (42) 4X: 下避 光保存 病毒。 若要长 期贮存 ,推 荐在最 终收集 物中加 入至少 2% 的 FBS (胎 牛血清 ); 亦 推荐于 -70X: 下冻存 病毒原 贮液。 (43) 为确定 病毒的 滴度, 可进行 噬菌斑 试验。 (44) 为扩增 病毒原 1C 液 ,在感 染复数 (multiplicity of infection, MOI) 在 0.01 〜 0.1 时转 染一悬 浮或单 层细胞 培养。 感染后 48h 收 获病毒 ,可扩 增病毒 100 倍。 利 用重组 杆状病 毒片断 转染昆 虫细胞 转染 昆虫细 胞的最 佳状态 是可变 化的。 转染的 一个启 始点是 5~10MOI。 建 议在每 个蛋白 质被表 达 前先进 行一系 列相关 试验。 M0I 最优化 : 利用不 同量的 M0I (如 1、 2、 5、 10) 转 染大量 的细胞 ,收集 细胞时 分析蛋 白质表 达 ( 若蛋白 质是分 泌性的 ,收集 培养基 )。 时间 过程: 用恒量 M0I 转 染细胞 。在如 下时间 区间收 集细胞 (或 培养基 ): 24h、 72h 及 96h 分析 其 表达。 重组 蛋白质 的大规 模生产 (45) 在悬浮 培养液 中培养 Sf9 细胞 ,并使 之适应 Sf-900 II 无 血清培 养液。 (46) 准 备旋转 培养瓶 ,用于 按比例 扩增的 Sf9 细胞。 将合适 大小的 两孔盖 连接在 转 瓶的一 个侧壁 ,另用 一瓶盖 接在另 一侧壁 。将一 段短管 (约 6 英寸或 15cm) 装在通 气孔中 ,末 端连接 一滤器 。借 助张力 器用管 索将管 子与通 气孔和 滤器固 牢固。 (47) 将一 段长管 (30~60cm) 连接至 进气孔 ,并 在末端 连接一 滤器, 用管索 加固。 另一 端管子 连接于 滤器的 另一端 ,用管 索固牢 。管 子末端 用铝箔 封好。 (48) 将 两孔装 置相对 的侧壁 上的盖 子旋转 90° 以松开 ,高 压灭菌 培养瓶 lh。 (49) 将适 应了无 血清培 养液的 Sf9 细胞 (来自 于步骤 1) 接种 于经高 压灭菌 的培养 瓶中 ,将 培养瓶 装至半 满至全 满之间 ( 例如在 3L 瓶中 装入 1.5 〜 3L), 加 入足够 无血清 培 养液以 是细胞 最终浓 度达到 (5X105) 〜 (1.5X105) /mL。 (50) 将培养 瓶放在 27*C 培养 箱中的 磁力搅 拌器上 。将搅 拌速度 设置在 8〇r/min。 从进气 管的末 端移去 铝箔, 并将其 连接到 供气泵 。接 通泵的 电源, 使其流 量达到 500 〜 700mL/ min〇 (51) 让细胞 生长至 密度约 1.5xl〇6/mL。 在 层流室 中将感 染复数 (MOI) 为 1 〜 2 的 病毒通 过侧壁 直接加 到培养 瓶中。 (52) 于 27X: 将培养 瓶至于 磁力振 荡器上 并通气 。温 育培 养物。 (53) 处 理上清 得到分 泌蛋白 或处理 细胞得 到胞内 蛋白。 肖庚富 彭茂宇 . 533 . 主要参 考文献 金冬雁 ,黎孟 枫等译 . 1998. 分子 克隆实 验指南 .第二 版北京 : 科学出 版社. 卢圣 栋主编 . 1999. 现代分 子生物 学实验 技术第 二版 .北京 :中国 协和医 科大学 出版社 • 彭秀 玲等编 • 1997. 基因 工程实 验技术 •第二 版长沙 : 湖南科 学出版 社- 齐义 鼷 著 . 1998. 基因及 其操作 原理武 汉:武 汉大学 出版社 • 颜子颖 ,王 海林译 . 1998. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 : 科学出 版社. 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Expression of preprosomatostatin in heterologous cells: biosynthesis, posttransla- tional processing, and secretion of mature somatostatin. Cell, 39 (3): 547 〜 555. • 534 • 第八 章蛋白 质分析 引 蛋白质 是生命 活动的 主要体 现者, 构成生 命现象 的各种 活动主 要是通 过蛋白 质来体 现的。 近年来 ,蛋白 质化学 的研究 进展十 分迅速 ,尤 其是 分子生 物学这 一新学 科的发 展, 使蛋白 质的研 究达到 了前所 未有的 新水平 。随着 人类基 因组结 构框架 草图的 完成和 后基 因组研 究计划 的启动 ,基 因组功 能的研 究将成 为主流 ,蛋 白质组 学由此 而诞生 。与 此 相对应 ,蛋白 质芯片 、缩微 实验室 芯片、 毛细管 电泳芯 片等新 技术不 断问世 。在 21 世纪 ,蛋白 质研究 即将揭 开新的 篇章。 本 章从基 础理论 、基 础知识 和基本 实验技 术的角 度出发 ,介绍 和归纳 了近年 在蛋白 质研 究中所 采用的 一些新 技术和 新方法 ,以期 折射出 当前蛋 白质研 究领域 的活跃 程度。 所介 绍的内 容包括 :①蛋 白质的 生物化 学定量 方法。 ②蛋白 质的电 泳分离 ,其中 包括一 维 分离和 二维分 离方法 。在一 维分离 中重点 介绍了 SDSPAGE 电泳 、浓度 梯度胶 电泳、 微型胶 电泳; 在二维 分离方 法中重 点介绍 的是等 点聚焦 电泳。 ③蛋白 质的检 测方法 ,诸 如 凝胶中 蛋白质 的染色 、被转 移到膜 上的蛋 白质的 检测、 蛋白质 的免疫 印迹和 免疫检 测 。④各 种蛋白 质纯化 的方法 ,如 常规层 析法、 HPLC 法 、免疫 标记和 免疫沉 淀法。 ⑤蛋白 质的生 物合成 标记法 。⑥ 蛋白 质的微 序列分 析法等 。特别 值得一 提的是 ,我 们还 增加 了有关 蛋白质 的金属 螯合层 析及通 过克隆 基因的 转录与 翻译在 体外合 成蛋白 质等有 关分子 生物学 研究领 域的新 技术。 在 本章的 编写中 ,除了 介绍国 外的新 仪器、 设备和 方法外 ,还 根据具 体情况 介绍了 国内 目前使 用得较 普遍的 、有效 的技术 和方法 。我们 希望本 章的内 容对涉 足蛋白 质研究 领 域的新 、老工 作者都 能有所 帮助。 第 一节蛋 白质的 光吸收 法和生 物化学 法定量 蛋 白质的 含量可 以从它 们的理 化性质 ,如 比重、 折射率 、紫外 吸收等 测定而 得知; 或用化 学方法 ,如 定氮、 双缩脲 反应、 Folin- 酚试剂 反应等 方法来 测定。 后两种 是实验 室常用 的方法 。后 来又建 立蛋白 质和染 料结合 来定量 蛋白质 的方法 ,以其 简便、 快速而 受到广 泛应用 ,并有 试剂盒 出售。 本节将 择取最 灵敏的 Folin- 酚方 法和最 简便的 考马斯 亮蓝 染色法 及紫外 光吸收 法做一 介绍。 > 紫外光 吸收法 1. 原理 由 于蛋白 质中的 芳香族 氨基酸 (Trp 和 Tyr) 在 280nm 具有光 吸收性 ,因此 可以用 • 535 . 280mn 的吸 光值来 测定溶 液中的 蛋白质 。一 般以在 280mn 时的光 吸收为 1 时, 蛋白质 的 含量为 lmg/mL 计算 。每 种蛋白 质中芳 香族氨 基酸含 量不同 ,差别 也较大 ,上 述假 设 (lmg/mL) 有不 足之处 ,但 该法测 定迅速 ,故仍 被广泛 采用。 为排 除蛋白 质样品 中少量 核酸的 干扰, 一般同 时测定 28〇nm 和 260nm 的光 吸收, 按下式 计算: 蛋白 质浓度 (mg/mL) = 1.45A28〇_ 〇.74A260 2. 材料 待测蛋 白溶液 蛋 白质标 准溶液 紫 外分光 光度计 试管及 试管架 3. 试 剂配制 蛋白质 标准溶 液:蛋 白质纯 化后, 对水充 分透析 ,冻干 ,在 105X: 下恒重 。精 确称 量 ,并 定量配 成一定 浓度的 溶液, 通常为 lmg/mL; 或称取 经凯氏 定氮法 校正的 标准蛋 白质, 配制成 lmg/lmL 浓度的 溶液。 4. 操 作步骤 (1) 按表 格加入 试剂: 编 号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋 白溶液 /mL 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 对应蛋 白浓度 /(mg/mL) 0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.00 蒸馏水 /mL 4.0 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 (2) 取 光程为 lcm 的石英 比色杯 ,依次 加入各 管溶液 ,在紫 外分光 光度计 中测定 280nm 下 的光吸 收值。 (3) 取待 测溶液 lmL, 加入 蒸馏水 3mL, 摇匀 。按上 法测定 280nm 处的吸 光值。 从标 准曲线 上查出 待测蛋 白质的 浓度。 需 要注意 pH 对蛋白 质紫外 吸收峰 的影响 ,待测 溶液的 PH 最好 与标准 pH 保持 一致。 二、 Lowry 氏 比色法 1. 原理 Lowry 等于 1951 年建立 的比色 法是蛋 白质定 量的经 典方法 ,准 确而 且稳定 。未知 蛋 白质样 品中的 酪氨酸 残基在 碱性条 件下与 Folin- Ciocalteu phenol 试剂产 生颜色 反应, 将分光 光度计 比色后 读出的 OD 值 与标准 蛋白的 〇D 值 相比较 ,或 从标准 曲线上 査找, • 536 • 从而 对未知 蛋白质 定量。 以后几 经改良 ,变 得更加 方便和 实用, 以下介 绍一种 改良的 Lowry 氏测 定法。 2. 材料 0.5mg/mL 牛血清 白蛋白 (BSA) 试剂甲 、试 剂乙 (Folin-Ciocalteu Phenol reagent 试剂盒 ) 紫 外分光 光度计 恒 温水浴 3. 试 剂配制 (1) 试 剂甲。 A 液 : lg Na2C03 溶于 50mL 0. lmol/L NaOH 溶 液中。 B 液:分 别配制 1%CuS04*5H20 溶液和 2% 酒石 酸钾钠 溶液, 临用前 1:1 混合, 即得 B 液。 将 A 液与 B 液以 50:1 的比例 混合, 即为试 剂甲。 (2) 试剂 乙:在 2mL 的 磨口回 流装置 内加入 100g 钨酸钠 (Na2W(V2H20), 25g 钼酸钠 (Na2MoCV2H20), 700mL 蒸馏水 ,再加 50mL85% 磷酸及 100mL 浓盐酸 ,充 分 混合后 ,小 火回流 10h。 再加入 150g 硫酸锂 (Li2S04), 50mL 蒸 馏水及 数滴液 体溴。 然后, 开口继 续沸腾 15min, 以便驱 逐过量 的溴。 冷却后 定容到 1L。 过滤 ,滤 液呈微 绿色, 置于棕 色玻璃 瓶中冰 箱保存 ,即为 储存液 。使 用时 用标准 Imol/LNaOH 溶液滴 定 ,以酚 酞为指 示剂, 而后适 当稀释 (约 1 倍 ), 溶液 最后酸 度约为 lmol/L, 此为 Folin- 酚试剂 应用液 ( 试剂乙 )。 储存于 冰箱中 可长期 保存。 4. 操 作步骤 (1) 样品测 定:取 lmL 样 品溶液 (约含 20 〜 250pg 多肽或 蛋白质 ), 加入 5mL 试剂 甲 ,混匀 ,于 20~25t: 放置 lOmin。 再加入 0.5mL 试剂乙 (Folin 氏试剂 ), 立 即震荡 摇匀 ,在 20 〜 25X: 保温 30min, 然后于 500nm 处比色 。以 lmL 水代替 样品作 为空白 对照。 若用 0.5cm 光程 的比色 杯进行 比色, 可将样 品溶液 、试 剂甲、 试剂乙 的量均 减少至 1/5 的 量进行 反应 。若多 呔或蛋 白质的 浓度在 5~25fxg, 则 波长用 755nm, 25fig 以上 则采用 500nm 比色 为宜。 (2) 标准曲 线的制 定:取 14 只 试管分 成两组 ,分 别加入 0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.OmL 标 准蛋白 质溶液 (500/^g/mL), 用水 补足到 lmL, 然 后按上 述方法 进行操 作 ,测 定光密 度值。 取两组 测定的 平均值 ,以 蛋白质 浓度为 横坐标 ,光 密度值 为纵坐 标 ,绘制 标准曲 线作为 定量的 依据。 5. 方 法评注 (1) 含有下 述去污 剂的未 知蛋白 质样品 ,用 本法 测定浓 度将受 到干扰 。这些 去污剂 包括 : l%TritonX-l〇〇、 1% Tween-20、 1% NonidetP-40、 0.75% cetyltrimenthyl-am- . 537 • monium bromide 等 。此时 ,加入 4% SDS 可 以防止 Folin 试 剂产生 沉淀。 (2) 含有干 扰物质 的蛋白 质样品 可用脱 氧胆酸 / 三氯乙 酸沉淀 ,去除 干扰物 质后再 进行 测定。 (3) 尽管用 BSA 作标 准曲线 ,其线 性关系 不是特 别理想 ,但 考虑到 其简便 、灵敏 和重现 性好, 故依然 采用。 (4) Folin 试剂和 蛋白质 反应后 ,颜 色的 稳定性 较好, A75()nJI 在室温 下仅以 每小时 1%~2% 的速率 降低。 三 、考马 斯亮蓝 染色法 1. 原理 本方法 又称为 Bradford 法 ,主要 依赖于 蛋白质 和考马 斯亮蓝 ( Coomassie brilliant blue) 染料 的结合 ,并与 不同浓 度的标 准蛋白 (常用 BSA) 的结合 相比较 。考马 斯亮蓝 和蛋 白质通 过范德 瓦尔键 (Van derWaals’ bond) 结合 ,在一 定蛋白 质浓度 范围内 ,蛋 白质 的染色 符合比 尔定律 。在 2 〜 5min 即呈 现最大 光吸收 ,至 少稳定 lh。 该法 定量蛋 白质 的浓度 范围为 1 〜 10pg。 2. 材料 0.5mg/mL 牛血清 白蛋白 (BSA) 0.15mol/L NaCl 考马 斯亮蓝 G-250 染 料溶液 紫 外分光 光度计 3. 试 剂配制 考马 斯亮蓝 G-250 染 料溶液 在 1L 的容 量瓶中 ,用 50mL95% 乙 醇溶解 lOOmg 考马 斯亮蓝 G-250 染料。 再加入 100〇1185%磷酸,加水至10001^。用\\0^11^11从).1滤纸过滤后,储于41:。现有配 制好 的试剂 盒出售 (Pierce, #23200 或 Bio^Rad, #500-0006)。 4. 操 作步骤 (1) 取 8 个 空试管 ,分 别加入 5^L、 10ML、 15/iL、 20;xL 的 0.5mg/mLBSA 标准溶 液 ,用 0.15mol/LNaCl 调节 体积至 100mL。 另 取两只 空试管 ,加入 100pL 的 0.15mol/L NaCl 溶液 ,作 为空白 对照。 (2) 加 lmL 考 马斯亮 蓝溶液 ,旋 涡震荡 ,室温 下放置 2min。 (3) 取 lcm 光径 的微量 比色杯 (lmL), 测定 595mn 的光 吸收值 (A595 ), 并以 A595 对蛋白 质浓度 作图绘 制标准 曲线。 未知蛋 白的浓 度将可 在标准 曲线上 査出。 如果未 知蛋白 的浓度 过高, 可以将 蛋白质 稀释后 ,取一 部分进 行测定 。也可 以用较 高浓度 的标准 蛋白 (如 10 〜 100/ig) 绘 制标准 曲线。 • 538 • 5. 方 法评注 蛋白质 的存在 ,影响 酸碱滴 定中所 用某些 指示剂 的颜色 变化, 从而改 变这些 染料的 光吸收 。在 此基础 上发展 蛋白质 染色测 定方法 ,涉及 的指示 剂有甲 基橙、 考马斯 亮蓝、 溴 甲酚绿 、溴甲 酚紫等 ,目 前用的 最多的 染料是 考马斯 亮蓝。 干扰 蛋白质 与考马 斯亮蓝 染料结 合的物 质很多 ,包 括甘油 、去 污剂、 2- 巯基 乙醇、 乙酸、 硫酸、 Tris 碱和某 些碱性 缓冲液 ,此时 需要对 蛋白质 样品作 相应的 处理。 第二 节蛋白 质的电 泳分离 一 、蛋 白质的 一维电 泳分离 以下 将介绍 几种类 型的蛋 白质电 泳方法 ,如: 变性不 连续凝 胶电泳 (SD&PAGE)、 非 变性不 连续凝 胶电泳 (PAGE)、 变性 凝胶梯 度电泳 (SDS-PAGGE)、 非 变性凝 胶梯度 电泳 (PAGGE)、 微型梯 度胶或 单一胶 电泳, 以适应 不同的 蛋白质 分离和 分析的 需要。 蛋白质 的一维 凝胶电 泳分离 方法能 提供许 多有用 的信息 。例如 ,用非 变性梯 度胶或 单 一胶可 以了解 蛋白质 的纯度 、大 小和相 对分子 质量; 只要 在蛋白 质样品 中加入 还原剂 (2- 巯基 乙醇或 DTT) 便可了 解到蛋 白质中 各亚基 的数目 及其分 子大小 。此外 ,通 过分 析蛋白 质在糖 基化前 后的电 泳行为 ,即可 以了解 到有关 碳水化 合物的 信息; 借助 放射性 标 记技术 的配合 ,我 们还可 进一步 了解蛋 白质磺 基化、 磷酸化 、糖 基化的 情况。 借助蛋 白质 电泳分 离技术 和电洗 脱技术 ,我们 还可回 收特定 的蛋白 质条带 ,进 行后续 研究之 用 。下 面我们 将逐个 介绍。 (一) SDS 变性不 连续凝 肢电泳 1. 原理 十 二烷基 硫酸钠 (SDS) 是一种 去污剂 ,能 打开 蛋白质 的氢键 、疏 水键, 并结合 到 蛋白质 分子上 ,形成 蛋白质 -SDS 复合物 ,在 一定条 件下, 结合的 比例为 1.4gSDS/ lg 蛋白质 。由 于十二 烷基硫 酸根带 负电荷 ,使 蛋白质 -SDS 复合物 都带上 相同密 度的、 数量很 大的负 电荷, 因而掩 盖了不 同种类 蛋白质 间原有 的电荷 差别。 SDS 与蛋白 质结合 后, 还引起 了蛋白 质构象 的改变 ,它 们在水 溶液中 的形状 ,近 似于长 椭圆棒 ,不 同蛋白 质的 SDS 复合 物的短 轴长度 都一样 ,而 长轴则 随蛋白 质的相 对分子 质量成 正比地 变化, 椭 圆棒的 长度也 就是蛋 白质相 对分子 质量的 函数。 这里 介绍的 变性条 件下的 一维凝 胶电泳 是指在 0.1% SDS 存在的 条件下 ,当 蛋白质 通过 聚丙烯 酰胺凝 胶介质 向正极 移动时 ,其分 辨率或 泳动率 完全取 决于蛋 白质分 子的大 小 ,与蛋 白质自 身所带 的电荷 数无关 。该 电泳 又称为 SDS- 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 (SDS^PAGE)。 所 谓不连 续凝胶 电泳指 的是电 泳中采 取了电 泳基质 的不连 续体系 ,即指 凝胶层 的不连 续性、 pH 的不连 续性、 缓冲液 成分的 不连续 性及电 位梯度 的不连 续性, 其目 的是使 蛋白样 品在不 连续的 两相间 积聚浓 缩成很 薄的电 泳起始 区带, 然后再 进行电 泳 分离。 . 539 . SDS^PAGE 的另 一个特 点是蛋 白质样 品在加 到凝胶 样品孔 之前, 先在含 SDS 的样 品 缓冲液 中煮沸 至蛋白 质完全 溶解; 样品缓 冲液中 还含有 还原剂 2- 巯 基乙醇 (2-ME) 或 二巯基 苏糖醇 (DTT), 它们 能还原 二硫键 ,使蛋 白质以 亚单位 的形式 存在。 因此, 在用 SD&PAGE 测 定具有 四级结 构的蛋 白质相 对分子 质量时 ,得 到的将 是蛋白 质每一 个亚 基的相 对分子 质量, 而不是 整个同 源或异 源聚合 体的相 对分子 质量。 2. 材料 A 液 (凝胶 储液) B 液 (浓 缩胶缓 冲液) C 液 (分 离胶缓 冲液) D 液 (电极 缓冲液 储液) E 液 (10% SDS 溶液) F 液 (10% 过 硫酸铵 溶液, AP) G 液 (N, N, N', N'- 四甲基 乙二胺 原液, TEMED) H 液 (样品 缓冲液 ) 垂直 平板电 泳槽和 电泳仪 (如北 京六一 仪器厂 生产的 DYY-III 型电泳 装置) 3. 试 剂配制 A 液 :称取 29.0g 丙 烯酰胺 (acr) 和 lgiV, IV- 亚甲 叉双丙 烯酰胺 (bis), 力 HdH20 至 lOOmL, 过 滤去除 沉淀后 ,储 于棕色 瓶内, 4X: 避光 保存。 溶液的 pH 不 得小于 7.0, 使用期 不超过 两个月 。注 意, acr 在聚合 前 有毒性 ,称量 时应带 口罩。 B 液 : 6g Tris 碱溶于 40mL dH20 中 ,用 lmol/L HC1 (约 48mL) 调节至 pH6.8, 再加水 稀释到 100mL 的 终体积 ,即成 pH6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液 。过 滤后于 4t: 保存。 C 液 : 36.6gTris 碱和 lmol/LHCl (约 48mL) 混合后 ,调 节至 pH8.8, 加 水稀释 到 100mL 的 终体积 ,即成 pH8.8 的 3.0mol/L Tris-HCl 缓冲液 。过 滤后于 4X: 保存。 D 液 : 30.3gTris 碱、 144.0g 甘 氨酸、 lO.OgSDS, 用 dH20 稀释至 lOOOmL, 即得 PH8.3 的 0.25mol/L Tris/1.92mol/L 甘氨酸 电极缓 冲储液 。临用 前稀释 10 倍。 E 液 : O.lgSDS 溶于 lmL 蒸 馏水中 ,即成 10%SDS 溶液。 F 液 : 10% 过 硫酸铵 (AP), 宜当 天配制 ,最多 不超过 一周。 !4液:811^0.5111〇1/1^?1~16.8丁1^-^^1缓冲液、6.411^甘油、12.811^10%505溶 液、 3.2mL 巯基 乙醇、 1.6mL0.05% 溴 酚蓝、 32.0mL 蒸馏 水混合 备用。 然后以 1:1 或 1:2 的比 例与蛋 白质样 品混合 ,在沸 水中煮 l〇min, 混匀后 ,加入 样品孔 。待分 离蛋白 质样品 的浓度 一 般为 2~5mg/mL, 常用 lmg/mL。 4. 操 作步骤 制胶 、封口 和灌胶 : 按下 列比例 配制浓 缩胶和 分离胶 (见 下页表 )。 常 用的电 泳槽分 为管型 (disc) 和垂 直板型 (plate)。 下 面介绍 常用的 DYY-DI 型垂 直板电 泳系统 ,见图 8.1。 • 540 • 10% 分离胶 (15mL) 5% 浓缩胶 (6mL) A 液 5 . OOmL 1 . OOmL B 液 0 • OOmL 0.75mL C 液 1 . 90mL 0 • OOmL E 液 0. 15mL 0.06mL 如有 条件, 可抽气 lOmin F 液 8 0. 63mL 0.06mL 0.015mL 0.015mL h2o 7 • 30mL 4. lOmL a. 在临 灌胶前 加入。 AP 加量 可视聚 合时间 长短而 调整。 图 8.1 DYY-III 型垂直 电泳系 统和凝 胶模具 凝胶 模具由 3 部分 组成: ①一个 压制成 “U” 形 的硅橡 胶带; ②两 块长 短不同 的玻璃 板; ③样品 孔模板 ( 样品梳 )。 胶带内 侧有两 条凹槽 ,将大 小不同 的两块 玻璃板 分别嵌 入各 自的凹 槽后, 玻璃板 之间形 成一个 2~3mm 的间隙 ,制 好的凝 胶即灌 入其中 。灌 胶前 ,先 把玻璃 板洗净 ,不 挂水珠 ,干 燥后装 入胶带 凹槽内 ,并 安装在 电泳槽 具上, 拧紧 外部的 螺丝夹 。注意 , 此时长 玻璃板 的底部 与橡胶 带底部 之间有 2 〜 3mm 的空隙 , 灌入的 凝胶通 过此狭 缝与一 侧电极 槽相通 。为 避免 灌胶时 胶液由 此狭缝 中漏出 ,可先 用 1% 的琼脂 糖溶液 (电极 缓冲液 配制) 将狭缝 口封住 , 凝固后 ,再灌 胶时就 不会漏 出, 通电后 又可作 为盐桥 。封 口时, 也应用 热琼脂 糖同时 将两侧 玻璃与 橡胶带 间的缝 隙封住 。将 另一 较短的 玻璃板 的三边 也嵌入 胶带中 ,其上 端略低 ,可使 另一侧 的电极 槽缓 冲液没 过顶部 而又不 超过长 玻璃板 的顶部 。这样 ,凝 胶的顶 部也与 另一侧 电泳槽 及电 极相通 灌胶时 ,用滴 管沿着 两片玻 璃之间 的空隙 先加入 分离胶 ,不 要产生 气泡。 将胶液 加至离 顶部约 3cm 处, 改加入 蒸馏水 ,直 到顶部 。待 15 〜 30min 后 ,可 看到水 相和凝 胶相 之间出 现界面 ,说明 分离胶 已聚合 。可将 水吸出 ,再 把滤纸 条插入 狭缝, 吸干水 分。 随后用 滴管将 配好的 浓缩胶 液加入 ,胶面 离顶部 lcm 时 ,即将 梳子插 入胶液 。待 浓缩胶 聚合后 ,将整 个凝胶 模具放 入电泳 槽中, 组装好 ,拧 紧螺旋 ,倒入 电极缓 冲液, 然后拔 去梳子 ,顶部 便形成 加样孔 。电 泳前, 将标准 相对分 子质量 蛋白和 处理过 的样品 液分 别加在 样品梳 孔中。 制胶 关键是 胶的聚 合时间 ,最好 控制在 20~30min 之间 。可 通过调 节过硫 酸铵和 TEMED 的加入 量 来控制 。过 硫酸铵 (AP) 最 好临用 前新鲜 配制。 • 541 . 加样: 目前 PAGE 已不再 采用样 品胶, 而以样 品缓冲 液代替 。在行 SDS^PAGE 电 泳时, 样品 缓冲液 中含有 SDS、 巯 基乙醇 (或 DTT), 与样品 混合后 (视蛋 白质样 品浓度 ,以 1:1 或 1:2 的比 例混合 ), 沸 水中煮 5~10min, 冷却后 使用。 加样时 ,标准 相对分 子质量 蛋白按 lMg/bL 的比 例配制 。一 般加入 l〇~3(^L。 蛋 白质样 品加入 量 视其浓 度而定 ,一般 每孔加 l〇~6〇fxL 为宜。 电泳: 电 极缓冲 液中含 0.1%SDS (见 D 液 ), 电压约 100 〜 200V, 蛋白质 是从负 极向正 极方向 泳动。 电泳约 5 〜 6h, 直至溴 酚蓝染 料指示 剂前沿 移至凝 胶末端 lcm 处, 即停止 电泳。 电泳 过程中 ,保 持电流 恒定, 电压可 有改变 。如果 是管胶 ,电 流则按 4~5mA/ 管计 ,如 果是板 胶 ,电 流则按 1〇~ 15mA/ 板计 (指 10cm 长 X 7. 0cm 宽的 凝胶片 )。 电极 缓冲液 可以反 复使用 2~3 次 ,但 注意上 、下 槽的缓 冲液不 能混合 和互换 ,因 下槽液 中混入 了催化 剂和氯 离子。 固定和 染色: 电泳结 束后, 取出凝 胶模具 ,用一 只带长 针头的 注射器 (针 头约长 8cm), 吸满水 后将针 头缓慢 插入凝 胶和玻 璃板壁 之间, 一边注 入水分 ,一 边推针 前进, 靠水流 压力和 润 滑力将 凝胶与 玻璃内 壁分开 。胶的 另一面 的剥离 也可同 样操作 ,但 不必 将针头 全部插 入 ,只要 将凝胶 的一端 剥离后 ,可 用双手 轻轻地 提起这 端胶面 ,由 下至上 即可将 胶全部 掀起。 将胶 块放在 10% 三 氯乙酸 溶液中 或放在 固定液 中浸泡 lh (57. 0g 三 氯乙酸 , 17. 0g 磺基水 杨酸, 150mL 甲醇, 加水至 500mL), 防止 已分离 的蛋白 质条带 扩散。 染 色液的 染料可 用考马 斯亮蓝 R250 或 G250。 两者的 配方略 有不同 ,见下 (仅供 参考 )。 由于染 料中含 有甲醇 ,也 可以 不经固 定步骤 直接将 电泳后 剥离下 来的胶 块放入 染 色液中 ,兼 有染色 和固定 的双重 作用。 考马 斯亮蓝 G250: 0.5g 考马 斯亮蓝 G250 加入 12.5%三氯乙酸溶液50〇1111^中,染色2~3卜。 考马 斯亮蓝 R250: 0.25g 考马 斯亮蓝 R250 加入 230mL 甲醇中 ,再 加入 46mL 冰 乙酸和 230mL H20( 如 有沉淀 可过滤 ), 染色 2~4h 左右。 脱色: 一般用 5% 甲醇和 7. 5% 乙酸 混合液 ,经 常振摇 和更换 新的脱 色液。 可在容 器一角 放置一 块海绵 ,轻轻 振荡, 有助于 染料的 吸收。 干胶: 最 好放在 干胶仪 上干燥 。如 果没有 干胶仪 ,可使 用一种 简单的 方法: ①将完 成染色 和 脱色的 凝胶用 30% 甲醇、 7% 乙酸、 2%~5% 甘油混 合液震 荡处理 lh; ②取两 张乙酸 纤 维素膜 并在水 中浸泡 lmin, 把第一 张膜平 铺于干 胶架平 板上, 将甘油 处理过 的凝胶 平 铺于第 一张膜 上后加 盖第二 层膜; ③用 一根移 液管在 膜上滚 动以除 去气泡 ,将 干胶框 压 在干胶 平板上 ,并 用夹子 将四周 夹紧; ④放置 在通风 处干燥 12h 以上。 5. 方 法评注 (1) SDS-PAGE 电泳主 要用于 测定蛋 白质的 相对分 子质量 。已 知蛋白 质在聚 丙烯酰 • 542 • 胺 凝胶中 电泳时 ,它 的迁移 率取决 于它所 带的净 电荷以 及分子 的大小 和形状 等因素 ,如 果在聚 丙烯酰 胺凝胶 系统中 加入十 二烷基 硫酸钠 (SDS), 则蛋白 质分子 的电泳 迁移率 主 要取决 于它的 相对分 子质量 而与所 带的电 荷和形 状无关 。在此 条件下 , 蛋白质 的相对 分子质 量与电 泳迁移 率之间 的关系 ,可 用下式 表示: MW= K(10"6m) lg MW = lgK - bm = Kj — bm 式中: MW 为蛋白 质的相 对分子 质量; K, &为 常数; 6 为 斜率; m 为迁 移率。 (2) 在用 SDS-PAGE 方法 测定相 对分子 质量时 ,必 须达到 1.4gSDS/lg 蛋 白质的 结 合比率 ,否 则得不 到准确 的结果 。为此 ,还 应注意 以下几 个问题 。①蛋 白质分 子中的 二 硫键是 否完全 被还原 ,只有 彻底打 开分子 中的二 硫键, SDS 才能 完全定 量结合 ,一般 使用 巯基乙 醇作为 还原剂 。在有 些情况 下还需 进一部 将形成 的巯基 烷基化 ,以免 在电泳 的 过程中 重新氧 化形成 蛋白质 聚合体 。② 溶液中 SDS 的 总量至 少要比 蛋白质 的量高 3 〜 10 倍 。③溶 液的离 子强度 应较低 ,最 高不 能超过 0.26, 以使 SDS 单体具 有较高 的平衡 浓度。 (3) 有许 多蛋白 质是由 两个以 上亚基 (如血 红蛋白 ) 或 两条以 上肽链 (如 a- 胰凝乳 蛋白酶 ) 组成的 ,在 SDS 和巯 基乙醇 作用下 ,解离 成亚基 或单条 肽链。 因此, SDS- 凝 胶 电泳测 定的只 是它们 的亚基 或单条 肽链的 相对分 子质量 ,而不 是完整 的相对 分子质 量 。为 了得到 更全面 的资料 ,还 必须用 其他方 法测定 其相对 分子质 量及分 子中肽 链的数 目 ,与 SDS* 凝胶电 泳的结 果相互 参照。 也不是 所有的 蛋白质 都能用 SDS- 凝胶电 泳法测 定其相 对分子 质量, 已发现 有些电 荷异常 (如 带有大 量正电 荷的组 蛋白) 或构象 异常的 蛋白质 ,带 有较大 辅基的 蛋白质 (如 某些糖 蛋白) 以及一 些结构 蛋白如 胶原蛋 白等用 这种方 法测出 的相对 分子质 量是不 可靠的 ,必须 用两种 以上的 方法相 互印证 。为 了判断 待测样 品是否 可以用 SDS 凝胶电 泳方法 来测定 相对分 子质量 ,可 以将 SDS- 蛋白 质复合 物在不 同浓度 (交联 度相同 ) 的 SDS •凝胶 中电泳 ,得 到的 结果按 Ferguson 公式 •作图 。如 果待 测样品 的自由 迁移率 与 标准蛋 白质的 mQ 基本交 于一点 ,而且 在不同 浓度的 SDS- 凝胶 中测得 的相对 分子质 量 都相同 ,则表 示此蛋 白质在 SDS- 凝胶电 泳中的 行为是 正常的 ,可 以用 SDS ■凝 胶电泳 法测 定其相 对分子 质量。 (4) 不同 凝胶浓 度适用 于不同 的相对 分子质 量范围 ,在 5% 的 凝胶中 ,分子 质量为 25~200kDa 的 蛋白质 ,其相 对分子 质量的 对数与 迁移率 呈直线 关系; 在 10% 的凝胶 中, 10 〜 70kDa 分子 质量的 蛋白质 呈直线 关系; 在 15% 的凝 胶中, 1〇 〜 50kDa 分 子质量 • Ferguson 公式 : lgW = lgwl()-Ki?C。 其中 m 是蛋白 质在 一定浓 度凝胶 (C) 中的迁 移率; m ◦是当 凝胶浓 度 外推到 零时的 迁移率 即自由 迁移率 ,它 与蛋白 质的净 电荷量 (9) 成正比 .与 蛋白质 在溶液 中的摩 擦系数 (/) 成 反比; KR 是阻 滞系数 ,它 与蛋白 质相对 分子质 量成线 性关系 。因此 ,不 同的 蛋白质 分子有 不同的 w、 m〇、 KJ? 值。 . 543 • 的蛋白 质直线 关系; 3. 33% 的凝胶 可用于 相对分 子质量 更大的 蛋白质 (以 上各种 浓度的 凝胶, 其交联 度都为 2.6%)。 多 数蛋白 质在含 5%~20% 的 acr 和含 0.2% 〜 0.5% 的 bis 的 凝胶溶 液中都 能得到 较好的 分离。 在凝胶 电泳中 ,影 响迁移 率的因 素很多 ,而 在制胶 和电泳 过程中 ,很 难每次 都将各 项 条件控 制得完 全一致 。因此 ,用 SDS •凝胶 电泳测 定分子 质量, 每次测 定样品 必须同 时作标 准曲线 ,不得 利用另 一次电 泳的标 准曲线 。表 8.1 列 出用于 凝胶电 泳的标 准蛋白 质 的分子 质量。 可根据 分子质 量范围 选择最 适凝胶 浓度, 并尽量 选择分 子质量 范围和 性质与 待测样 品相 近的蛋 白质作 为标准 。标准 蛋白质 的相对 迁移率 (蛋白 质的电 泳迁移 距离除 以染料 的迁移 距离即 为相对 迁移率 ) 最好 0.2 〜 0.8 之间 分布。 表 8.1 标 准蛋白 质的分 子质量 蛋白质 分 子质量 /Da 细 胞色素 C 11 700 a- 乳 清蛋白 14 200 溶菌酶 (鸡 卵白) 14 300 肌 球蛋白 (抹 香鲸) 16 800 P- 乳 球蛋白 18 400 胰酶 抑制剂 (大豆 ) 20 100 胰蛋 白酶元 (PMSF 处理) 24 000 碳 酸酐酶 (牛红 细胞) 29 000 3- 磷酸 甘油醛 脱氢酶 (兔肌 ) 36 000 乳酸 脱氢酶 (猪心 ) 36 000 醛缩酶 40 000 卵 清蛋白 45 000 过氧 化氢酶 57 500 牛血清 白蛋白 66 000 磷 酸化酶 b (兔肌 ) 97 400 P- 半乳 糖苷酶 116 600 RNA 聚合酶 (£. co/〇 160 000 肌 球蛋白 ,重链 (兔肌 ) 205 000 注 :可从 Pharmacia LKB、 GIBCO/BRL、 Hoefer、 Bio- rad、 Sigma 等生 物公司 购买。 (5) 为了 达到最 好的分 辨效果 ,特推 荐下述 样品处 理方法 : 在加入 样品缓 冲液之 前 ,样品 保留在 01C, 也即直 接将已 与室温 平衡的 SDS/ 样品缓 冲液加 到置于 冰上的 0X: 的 样品中 ,混 匀后立 即放入 loot: 的水 浴中煮 3~5min 以失活 蛋白酶 。在 此之前 ,千万 勿让样 品加到 SDS •样品 缓冲液 中后在 室温下 放置时 间超过 2 〜 3min, 因 为很多 内源性 蛋白 水解酶 的活性 很强, 即使在 SDS- 样品缓 冲液中 ,在 室温 下也易 将样品 蛋白质 降解。 如果 样品是 免疫沉 淀物, 则可于 100X: 加 热前在 56X: 溶解 lh。 (6) 如 果电泳 条带出 现弯曲 ,两头 向上翘 ,俗称 “微笑 ”现象 (smUing)。 此时可 • 544 • 向缓冲 下槽添 加新的 缓冲液 ,尽量 升高缓 冲液面 ,搅 拌均匀 ,目的 是加速 与凝胶 的热转 移; 同时 将电 流降低 ,电 泳温度 维持在 10 〜 20X: 之间。 当分 离的蛋 白质条 带不很 平整时 ,可 能是由 于浓缩 胶聚合 不充分 ,这 时可适 当增加 AP 和 TEMED 的量; 还可能 是由于 蛋白质 样品中 含过多 的盐类 ,可通 过透析 除去。 如 果电泳 条带出 现倾斜 ,可能 是由于 浓缩胶 和分离 胶之间 的界面 不平整 ,在 分离胶 面 上加水 或水饱 和异丁 醇时尽 量不扰 乱凝胶 界面。 (7) 如果 想获得 好的电 泳结果 ,所用 试剂的 纯度相 当重要 。现 介绍 acr、 bis、 SDS 的储存 或纯化 方法。 acr 和 bis 的储液 ,会由 于水解 作用而 形成丙 烯酸和 NH3 。溶 液装 在棕 色瓶中 ,储于 4X:, 能部 分地防 止水解 ,但也 只能放 1 〜 2 个月 。可 通过测 pH (4. 9 〜 5. 2) 来 检测是 否失效 ,失效 溶液不 能聚合 。若 pH 变化 不大于 0.4 个单位 ,就 可以继 续使用 。固体 acr 和 bis 需储存 于棕色 瓶子中 ,保持 干燥和 较低的 温度是 相当稳 定的 。如保 存不当 ,超 声波、 7 射线、 日光照 射时, acr 自身 能聚合 成长链 (烯 基间反 应 )。 酰胺基 也会进 行缩合 ,形成 亚胺桥 而交联 ,试剂 失效。 aci •的重 结晶方 法:将 acr 溶于 50X: 氯仿中 (60g/L), 热过滤 。冷 却到 -20t: 结晶, 再用冷 的布氏 漏斗过 滤收集 结晶。 用冷氯 仿淋洗 ,真空 干燥。 acr 的 熔点是 (84.5 土 0.3)t:o bis 的重 结晶方 法:将 12g bis 溶于 40 〜 50X: 的 1L 丙酮中 ,热 过滤 。慢慢 冷却到 - 20X:, 过滤或 离心收 集结晶 。用 冷丙酮 洗涤后 ,真空 干燥。 bis 的 熔点是 185X:。 SDS 的 纯化方 法:加 lOOgSDS 到 450mL 乙醇中 ,加 热到 551C。 边搅拌 ,边 加入 50~7511^热吐0,直到303全部溶解。加1(^活性炭到溶液中,1〇1^11后,用评1^- manNo.5 滤 纸过滤 ,去除 活性炭 。分 别在 4X: 放置 24h 和在 -20t: 放置 24h。 然 后用烧 结玻璃 漏斗过 滤并用 800mL-20lC 的冰乙 醇洗涤 。不加 活性炭 ,反 复重结 晶几次 。室 温下 ,抽真 空过夜 ,干 燥重 结晶的 SDS。 用 P205 干燥 法保存 在棕色 瓶中。 (二) 非 变性不 连续凝 胶电泳 (PAGE) 1. 原理 在不含 0.1% SDS 的 条件下 进行非 变性不 连续胶 电泳分 离蛋白 质的原 理是基 于蛋白 质的 大小、 形状和 电荷等 分子特 征的综 合考虑 。聚 丙烯酰 胺煢胶 本身就 具有分 子筛作 用 ,当分 子质量 或分子 大小和 形状不 同的蛋 白质即 使它们 的净电 荷相似 ,在 通过 一定孔 径的分 离胶时 ,受阻 的程度 不同, 表现出 不同的 迁移率 。即 使净电 荷相似 ,也就 是说自 由迁移 率相等 的蛋白 质分子 ,也 会由 于分子 筛效应 在分离 胶中被 分开。 所谓的 不连续 凝胶电 泳体系 是:① 凝胶层 的不连 续性。 指整块 凝胶由 三个不 同的孔 径 的凝胶 层组成 ,即 样品胶 (现 已用样 品缓冲 液代替 )、 浓缩胶 、分 离胶 。蛋白 质分子 在大 孔浓缩 晈中, 受到的 阻力小 ,移动 速度快 。进入 小孔的 分离胶 中遇到 的阻力 突然变 大 ,速 度减慢 ,从而 在大孔 凝胶和 小孔凝 胶的界 面处就 会使样 品浓缩 ,区 带变窄 。②缓 冲液 离子成 分的不 连续性 。是指 在电泳 缓冲系 统中加 入有效 迁移率 大小不 同的两 种离子 ( 快离子 cr 和 慢离子 nh2ch2coo_ ), 并使 这两种 离子在 缓冲系 统中组 成不连 续的两 相 ,使 蛋白质 样品的 有效迁 移率介 于快离 子和慢 离子的 界面处 ,电 泳幵始 后不久 ,蛋白 • 545 . 质就 在浓缩 晈内被 压缩为 极窄的 区带; 当样 品达到 浓缩胶 (大 孔径) 与 分离胶 (小孔 径) 界面时 ,由于 小孔胶 的阻力 ,尽 管离子 界面继 续前进 ,蛋 白质被 却被留 在后面 ,进 入分离 胶后, 分成许 多区带 。③ 电位梯 度的不 连续性 。是由 于快离 子和慢 离子有 效迁移 率的 不同而 在电泳 过程中 自动形 成的。 在稳态 建立后 ,蛋白 质样品 的有效 迁移率 恰好介 于快 、慢离 子之间 ,也即 高电位 梯度区 和低电 位梯度 区之间 ,因而 被浓缩 形成一 个狭小 的 中间层 。④ pH 的不 连续性 。是指 浓缩胶 、分 离胶和 电极缓 冲液的 pH 不同, 分别为 6.8、 8.9 和 8.3, 以 控制慢 离子的 解离度 。在浓 缩胶中 ,低 pH 使 慢离子 较所有 被分离 样品的 有效迁 移率低 ,以 使样品 夹在快 、慢离 子界面 之间, 使样品 浓缩; 而在 分离胶 中 ,高 pH 使甘氨 酸解离 增加, 慢离子 较所有 被分离 样品的 有效迁 移率高 ,加之 快离子 已基 本泳入 电极缓 冲液中 ,这样 蛋白质 样品不 再受离 子界面 的影响 而自由 分离。 总之, 建立 电泳不 连续体 系的目 的是为 了使被 分离的 蛋白质 样品在 进入分 离胶中 有效分 离前, 能在 浓缩胶 和分离 胶的界 面压缩 为极窄 的区带 ,有 利于分 辨率的 提高; 而蛋 白质 样品一 旦 进入分 离胶后 ,蛋白 质的分 离又在 单一的 pH、 电位 梯度、 凝胶浓 度中进 行分离 ,电 泳迁 移率只 受蛋白 质分子 的大小 、形状 、电荷 和凝胶 分子筛 效应的 影响。 2. 材料 除 了不含 SDS、 不含 还原剂 (2-ME 或 DTT) 的 样品缓 冲液以 及不含 SDS 的 电极缓 冲液外 ,其 余的 材料和 试剂及 溶液配 制均同 SDS^PAGE 所介 绍的。 3. 操 作步骤 按 SDS^PAGE 所介绍 的进行 ,只 是样 品缓冲 液中千 万勿加 SDS 和 还原剂 (2-ME 或 DTT); 加 样之前 切勿在 1001C 煮样品 。需 要时 ,可在 10 000 Xg 下离心 15min 以移去 样品 中的不 溶物。 (三) 非变 性聚丙 烯酰胺 梯度凝 胶电泳 1. 原理 该电 泳方法 (PAGGE) 又称 凝胶浓 度梯度 电泳或 孔径梯 度电泳 。实 践证明 蛋白质 样 品在梯 度凝胶 中电泳 ,其分 辨率高 于均一 凝胶浓 度中的 电泳。 1968 年以来 Margolis 和 Slater 等人先 后采用 广凝胶 浓度梯 度电泳 (gel concentration gradient electrophoresis) 或称 孔径梯 度电泳 (pore gradient electrophoresis) 作为 分离和 鉴定蛋 白质的 方法。 Slater 等 人采用 梯度凝 胶电泳 发现所 试验的 13 种已 知蛋白 质中有 12 种蛋 白质的 迁移率 与其相 对 分子质 董的对 数成线 性关系 。目前 ,这 一实 验技术 用于测 定相对 分子质 量已较 成熟。 梯度凝 胶电泳 又可分 为线性 浓度梯 度和非 线性浓 度梯度 。如果 以离开 原点的 垂直距 离为 横坐标 ,以凝 胶浓度 为纵坐 标作图 ,可见 在线性 浓度梯 度凝胶 电泳中 ,二者 之间呈 直线 关系, 故称线 性梯度 (linear gradient); 在非线 性浓度 梯度凝 胶中, 二者间 表现为 台阶 式变化 的关系 (step gradient), 见图 8.2。 在线 性梯度 凝胶电 泳中, 蛋白质 在电场 中向着 凝胶浓 度逐渐 增高的 方向即 孔径逐 渐减少 的方向 迁移, 随着电 泳的继 续进行 ,蛋白 质受到 孔径的 阻力越 来越大 。起初 ,蛋 • 546 • 图 8.2 浓度梯 度凝胶 中胶浓 度和距 离之间 的关系 白质 在凝胶 中的迁 移率受 到两个 因素的 影响: 蛋白质 的电荷 密度和 蛋白质 分子的 大小。 电荷密 度越大 ,相对 分子质 量越小 ,迁移 率越快 。但是 ,当 蛋白质 迁移时 所受到 的阻力 大 到足以 阻挡它 前进时 ,低电 荷密度 的蛋白 质将“ 赶上” 与它大 小相似 ,但 具有 较高电 荷 密度的 蛋白质 。因此 ,在梯 度凝胶 电泳中 ,蛋 白质 的最终 迁移位 置仅决 定于它 本身分 子 的大小 ,而与 蛋白质 本身的 电荷密 度无关 。梯 度凝 胶电泳 的情况 可用图 8.3 来 表示。 1 _ 丨丨丨 a ” Mill r4 1 丨 1 丨 1 丨 u L H . r 多 u 1 3 丨 1 丨 1丨 丨丨 -WiV i i 1 j ' ' . ] ; 1 1 i .rrri n TTTTT i? T:T : 1 1 i ; l l i l i 图 8.3 浓 度梯度 凝胶电 泳原理 示意图 2. 材料 贮液 (a) 〜 (e) 电极 缓冲液 (TBE) (90mmol/L Tris-HCl, 80mmol/L 硼酸, 2.5mmol/L EDTA pH8.4) 0.1 % 溴酚蓝 指示剂 25% 乙醇 7% 乙酸 蛋白 质相对 分子质 量标准 固定液 (10% 磺基水 杨酸) 染色液 (称取 lg 考马 斯亮蓝 R250, 溶于 250mL 甲醇, 再加入 l〇〇mL 冰乙酸 ,用 水 定容至 lOOOmL) 脱色液 (取 250mL 甲醇, lOOmL 冰乙酸 加水至 l〇〇〇mL) • 547 • 电泳槽 (国产 垂直板 电泳槽 dyy-iii) 电磁搅 拌器和 蠕动泵 梯度 混合器 (梯 度混合 仪的容 积不等 ,从 15 〜 lOOmL 的规格 均有, 可根据 需要添 置 。如 果采用 DYY-III 型电 泳夹槽 ,至 少需要 容量为 15mL 的 梯度仪 ,具 体还可 根据需 要选择 调整) 微型 蠕动栗 ( 参照图 8.4, 用聚乙 烯管将 梯度混 合仪、 蠕动泵 、电泳 凝胶模 相连) 图 8.4 梯 度胶灌 胶装置 示意图 3. 试 剂配制 (1) 贮液 a: 称取 10.75g Tris、5.04g 硼酸、 0.93g EDTA(Na2EDTA*2H20), 溶 于蒸馏 水中,检查?^^为8.3后,定容到1000〇^。 (2) 贮液 b: 称取 57. 6g 丙烯 酰胺、 2. 4g 甲 叉双丙 烯酰胺 ,溶 于贮液 a 中 ,定 容至 lOOmL 后 过滤。 (3) 贮液 c: 称取 7. 68g 丙烯酰 胺、 0.32g 甲 叉双丙 烯酰胺 ,溶 于贮液 a 中 ,定 容至 lOOmLo (4) 贮液 d: 取 0.3mL 四甲基 乙二胺 (TEMED), 溶 于贮液 a 中, 定容至 lOOmL。 (5) 贮液 e: 称取 0.3g 过 硫酸胺 (PA), 溶 于贮液 a 中 ,定 容至 lOOmL, 临用前 配制。 4. 操 作步骤 (1) 制备 4% 〜 30% 浓度 的凝胶 ( 见下表 )。 注意 ,在配 4% 低浓 度胶时 ,贮液 c、 • 548 • d、 e 的体 积比为 2:1:1; 配 30% 高浓 度胶时 ,贮液 b、 d、 e 的体积 比也为 2:1:1。 表中 列出的 是配制 7mL 凝胶的 加样量 。可 根据实 际需要 按比例 扩大。 表 8.2 4% 〜 30% 浓度凝 胶配制 贮存液 4% 低浓 度胶液 /mL 贮存液 30% 高浓 度胶液 /mL C 3.50 b 3.50 d 1.75 d 1.75 混合 后抽气 e 1.75 e 1.75 贮液 e 必 须抽气 后单独 再加入 ,并在 临灌胶 前加入 , 以免胶 液过早 聚合。 (2) 以灌制 7mL 凝胶 为例。 参见图 8. 4 的灌 胶装置 ,将 7mL4% 的胶 液加入 贮液瓶 A, 7mL 30% 的胶 液加入 混合瓶 B。 打 开电磁 搅拌器 及梯度 混合器 的开关 ,接着 启动蠕 动泵, 将梯度 混合器 中的溶 液缓缓 输入凝 胶模中 。随 着凝胶 模内液 面的升 高逐渐 提高输 液管 ,使管 口始终 接近液 面而不 伸进液 体内部 。控 制流速 l~2mL/min, 约 lOmin 灌胶 完毕。 (3) 于梯度 胶上小 心加入 25% 乙醇约 3mm 商 。静置 30min 后即可 聚合。 (4) 待胶聚 合后, 倒出上 面含醇 的水层 ,取 2mL 4% 胶液 洗梯度 胶面, 吸出后 ,再 加 3mL 4% 胶 液于梯 度胶上 。于 此胶液 中插入 梳子, 使其下 沿刚好 接触梯 度胶面 而不要 伸 进胶内 。再 于此胶 液上小 心加入 2~3mL 高 的水层 ,静置 ,待 聚合后 ,于室 温放置 30min 后方可 使用。 (5) 小心取 出梳子 ,用 滤纸 吸去加 样孔内 的水分 。于 两个电 极槽内 加入电 极缓冲 液 ,接 通电源 ,注意 勿颠倒 正负极 方向。 接通冷 却水管 。在 70V 电压下 ,预 电泳 20min〇 (6) 加入 标准蛋 白质样 品和待 测样品 。标 准蛋白 质样品 可以从 生物技 术公司 购买, 也 可以自 己制备 (见评 注部分 )。 无 论是待 测样品 还是标 准蛋白 质均按 lmg/mL 的浓度 溶 f 含 20% 蔗糖的 电极缓 冲液中 ,加入 0.1% 溴酚 蓝溶液 5pL 作指 示染料 ,混合 后加入 加' _ 孔内。 '在 测定相 对分子 质量时 ,待 测样品 和标准 样品要 在同一 凝胶片 上进行 电泳。 (7) 接 通电源 ,将电 压调至 70V, 电泳 15min 后样品 缓缓进 入胶内 。此时 ,将 电压 升高到 150V, 恒压 下电泳 15~16h。 电泳 至少要 2000V.h, 若冷却 条件好 ,可 缩短电 泳 时间。 (8) 电泳 结束后 ,取 出胶片 ,置 于培养 皿内, 用固定 液浸泡 30min, 然后将 固定好 的 凝胶片 放入染 色液中 ,染色 l~2h。 (9) 脱色 。分电 泳脱色 和扩散 脱色。 电泳 脱色时 可将染 色后的 胶片夹 在两片 塑料纱 之间, 垂直放 在装满 7% 乙酸 的电泳 槽内, 电极位 于塑料 纱两侧 ,维 持电压 24V, 电泳 45min。 扩散脱 色时, 将胶片 浸于脱 色液中 ,轻轻 振摇, 经常更 换 脱色液 ,直 到凝胶 片背景 无色透 并明显 出清晰 的条带 。若 同时采 用低于 50X: 的水浴 加温, 可缩短 脱色 时间。 (10) 蛋白 质相对 分子质 量测定 。首先 制作标 准曲线 ,以 凝胶 片的前 沿或迁 移距离 • 549 . 最大的 标准蛋 白质为 参考点 ,计 算每 种标准 蛋白质 的相对 迁移率 (Mr)。 蛋白 质从原 点迁移 的距离 从 原点到 参考点 的距离 以 Mi •值为 横坐标 , 标准蛋 白质相 对分子 质童为 纵坐标 ,在 半对数 纸上制 作标准 曲线。 测定 出未知 蛋白质 的相对 迁移率 ,利 用标准 曲线便 可以计 算出相 对分子 质量。 (四) 变 性聚丙 烯酰胺 梯度凝 胶电泳 1. 原理 变 性聚丙 烯酰胺 梯度凝 胶电泳 (SDS-PAGGE) 是通过 逐步增 加胶中 聚丙烯 酰胺的 浓 度梯度 ,与 单一浓 度的凝 胶比较 ,可使 更大的 蛋白质 分子得 到分离 ,但 又不影 响低相 对分 子质量 蛋白质 的分辨 。分子 质量在 1〇 〜 200kDa 范围 内的蛋 白质均 可得到 线性分 离 ,有 利于蛋 白质的 相对分 子质量 测定。 2. 材料 基本与 SD&PAGE 相同 ,溶 液配制 也参见 SDS~PAGE 部分, 尚需补 充的有 :低浓 度胶液 、高 浓度 胶液。 3. 试 剂配制 配 制方法 列在表 8.3 和表 8.4 中 ,以供 参考。 表 8.3 梯 度胶电 泳中低 浓度胶 液配方 贮液 低浓 度胶液 的浓度 /% /mL 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A 液 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 C 液 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 h2o 10.63 10.13 9.63 9.13 8.63 8.13 7.63 7.13 6.63 6.13 F 液 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 表 8.4 梯 度胶电 泳中高 浓度胶 液配方 贮液 高浓 度胶液 的浓度 /% /mL 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A 液 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 C 液 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 1.88 h2o 6.88 6.38 5.88 5.38 4.88 4.38 3.88 3.38 2.88 2.38 1.88 蔗糖 /g 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 F 液 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 4. 操 作步骤 (1) 梯度仪 和灌胶 装置的 组装可 参见上 法和图 8.4。 我 们推荐 的梯度 范围为 5%~ • 550 • 20 % 为宜。 (2) 先将 低浓度 胶液加 入梯度 仪的相 应贮槽 ,并 把连接 两个凝 胶贮槽 的阀门 打开, 先让 20(^L 左右的 低浓度 胶进入 混合槽 ,以防 止混合 时管道 中形成 气泡阻 断液流 ,然 后关 上阀门 。将 高浓度 胶加入 混合槽 (未加 入之前 ,高 浓度胶 液应置 于冰上 ,防 止胶液 中的过 硫酸铵 引起的 缓慢聚 合作用 )。 (3) 向每个 凝胶贮 槽中加 入适量 TEMED (约 2.3^L/7mL 胶液 ), 用玻 棒搅拌 混匀。 (4) 打 开阀门 和混合 槽下方 的磁力 搅拌器 。缓慢 打开梯 度仪的 出口, 控制蠕 动泵的 流速为 2mL/min。 凝胶液 将沿着 一 块玻璃 板壁从 上而下 流入凝 胶夹层 ,待 液面 达到所 需 高度后 ,加入 水饱和 异丁醇 (或水 ), 等待 聚合。 (5) 倒去胶 面上层 液体, 用分离 胶缓冲 液洗涤 ,吸 干残液 。然后 制备浓 缩胶。 (6) 其余 步骤同 SDS-PAGE。 5. 方 法评注 上面 所介绍 的梯度 胶制备 方法适 用于较 大的凝 胶片。 如果手 头只有 30mL 的梯度 仪 ,又想 制备微 型胶时 ,很 不方便 。此 时可采 取同时 制备多 块凝胶 的办法 。但要 注意, 在同时 灌多个 胶槽时 ,低 浓度凝 胶液必 须放入 混合贮 槽中, 而高浓 度凝胶 液则加 入另一 贮槽; 在 灌胶时 ,胶 液是从 凝胶夹 层的底 部进入 ,把 胶面从 下朝上 推进, 但最终 形成的 梯度 仍然是 从上到 下逐渐 增加。 (五) 微型凝 肢电泳 目前 ,微 型凝胶 电泳十 分流行 ,从 多肽分 离到常 规蛋白 质分离 ,从单 一浓度 胶到梯 度胶 、一维 SDS^PAGE 分离等 ,使 用范 围广泛 。微 型胶电 泳最大 的优点 还在于 它将快 速 和高分 辨率融 为一体 。微型 胶电泳 的原理 和步骤 与常规 大胶完 全相同 。在此 ,我 们将 介绍两 种制备 微型胶 的办法 : 国产简 易微型 凝胶电 泳和进 口微型 垂直平 板电泳 系统。 国 产简易 微型凝 胶电泳 1. 材料 微 型垂直 平板凝 胶电泳 装置槽 [华泳 (HY) PAGE-2001, 中 国科学 院上海 生物化 学研 究所华 泳公司 生产] 或其 他厂家 生产的 微型电 泳装置 (见图 8.5)。 其 余均同 SDS-PAGE 或 非变性 PAGE。 2. 操 作步骤 本部 分拟以 HY-PAGE-2001 电泳系 统为例 说明。 (1) 装配 :将上 槽立于 下槽内 ,齿 槽位较 低的一 面瓷板 II 安上 玻璃板 ,再用 长尾夹 固定 ,底 部套以 橡胶或 塑料套 构成灌 胶夹层 。另一 面瓷板 II 如法 安置, 若进行 单板电 泳 ,只 要在瓷 板底部 套上相 应的橡 胶或塑 料套, 以保持 水平。 (2) 封底: 以不连 续电泳 为例, 按每板 8mL 体积配 制含过 硫酸铵 (AP) 的 分离胶 • 551 • 溶液, 先定容 7.985mL; 在 容量约 3mL 的小管 中预加 5/iL TEMED, 取 995yL 分 离胶液 与之混 匀并立 即沿两 边的 夹条- 玻璃接 合处, 自上而 下注入 凝胶夹 层中, 等待其 聚合。 (3) 灌 胶:在 分离胶 中加入 10/uL TEMED, 混匀 后缓慢 加入凝 胶夹层 中 ,在凝 胶液面 上加水 以隔绝 空气, 约 30min 左右聚 合完成 ,将 上槽侧 倾 ,倒去 蒸馏水 ,并用 滤纸吸 干残余 水分。 (4) 同时按 1.5mL/ 板的 比例配 制含 AP 的 浓缩胶 ,加 5/iL TEMED, 混 匀后加 入分离 胶上层 ,随即 插入样 品梳, 梳齿正 好遮闭 小槽; 放置 0.5~lh, 若样 品就绪 ,用平 钢勺在 封底套 与玻、 瓷板之 间划动 ,取下 套; 两边下 角安上 塑料绝 缘撑套 ,把 凝 胶装置 放入含 lOOmL 电极 缓冲液 的下槽 ,左 右大致 对称; 板 I 比板 II 更靠近 相邻的 下槽长 边沿, 其差约 0.5cm。 (5) 加 样:将 llOmL 电 极液倒 入上槽 ,抽出 样品梳 。用微 量注射 器伸入 ,接 近样 品梳孔 底部, 依次加 入样品 。接 通电源 ,常规 条件进 行电泳 •,进 行 SDS-PAGE 电泳, 一 次约需 1 ~2h 完成。 (6) 取胶 :卸下 长尾夹 ,用不 锈钢平 勺或刀 片在两 边胶与 间条之 间划开 ,仔 细地自 上而下 将胶剥 入固定 液或染 色液中 。以 下步骤 见前。 3. 方 法评注 HY PAGE-2001 微型 胶电泳 系统为 我国中 科院上 海生物 化学研 究所邹 永水先 生研制 的全 瓷电泳 装置, 经过笔 者使用 及与其 他各种 型号的 电泳装 置比较 ,该电 泳系统 具有下 列优点 :①装 配便捷 ,不必 涂油脂 ,可 用分 离胶或 1% 琼脂 糖封底 防漏; ②瓷质 板及间 条 散热快 、匀; ③和全 玻璃板 电泳装 置相比 ,它 可容许 通过较 大电流 ,组分 分辨好 ,电 泳完 成快; ④如 有必要 ,只需 200~500^L 胶液, 即可做 1~2 个蛋 白样品 的等电 聚焦, 既可 节约特 殊试剂 ,又能 事半功 倍地进 行双相 电泳。 进口微 型垂直 平板电 泳系统 1. 材料 微型 胶垂直 平板电 泳装置 ,包括 玻璃板 、长 尾夹、 缓冲液 贮槽等 (Bio-Rad Mini- Protein II 或 Hoefer Mighty Small SE250/280 型) 0 . 75mm 衬型 多重 凝胶片 灌胶盒 (Bio-Rad Mini-Proteanll 或 Hoefer SE250/295 multicasting chamber) 丙烯 塑料板 (acrylic plate, Hoefer SE-217 或 Bio-Rad 165-1, 957) 或聚 碳酸酯 分离片 (Hoefer SE-213 或 Bio-Rad 165-1,958) 10mL、 20mL 微量 注射器 各一只 梳子 (Hoefer SE-211A 或 BioRad Mini-Protean II) 剃须刀 其余 试剂或 设备见 SDS^PAGE 部分 2. 操 作步骤 (1) 按照所 购仪器 厂家的 说明书 和操作 指南装 配好每 一块凝 胶夹层 ,并 将多 块凝胶 夹 层装入 多重凝 胶片灌 胶盒中 。可 参见图 8.6, Hoefer 灌胶 系统。 (2) 捆 紧灌胶 盒中的 众多凝 胶夹层 。可将 丙烯塑 料板或 聚碳酸 酯片插 入凝胶 夹层间 有 松动的 地方。 (3) 放上灌 胶盒的 面板并 扣紧之 ,然 后将胶 盒竖立 放置。 (4) 按照 SDS-PAGE 中所 介绍的 方法配 制分离 胶和浓 缩晈液 ,在 灌胶开 始之前 ,切 勿加入 AP 和 TEMED。 所 需配制 的分离 胶总体 积为凝 胶面积 (如 7.3cmX8.3cm)x 凝 胶厚度 (如 0.75cm) X 制 胶数目 。在此 基础上 再增加 几毫升 备用。 (5) 用 50mL 注射器 吸取分 离胶液 ,向 灌胶 盒入口 处灌胶 。分 离胶高 度可达 6cm, 加 水饱和 异丁醇 后静置 ,待 聚合。 (6) 加浓缩 胶时, 可以个 别加入 ,也 可以用 l〇mL 注射 器从灌 晈盒中 一次灌 多个胶 . 553 . 片。 浓缩胶 高度为 1.5cm。 灌浓 缩胶后 ,立即 插入样 品梳。 (7) 聚合后 ,立 即打开 灌胶盒 ,将各 个凝胶 夹层分 别取出 。如暂 时不用 ,可 将各凝 胶夹层 用塑料 袋密封 后保存 一周。 (8) 加样 、电 泳和染 色等步 骤参见 SDS-PAGE, 在此 省略。 微型 梯度胶 的制备 由 于微型 梯度胶 所需的 胶液体 积很少 ,配 制和操 作不便 。常采 用一次 同时灌 注多重 胶片 的办法 。该法 与前面 介绍的 灌注多 重单一 胶方法 的最大 的区别 在于: 灌注梯 度胶多 重 胶片时 ,应从 灌胶盒 的底部 首先灌 入低浓 度胶液 ,然 后逐渐 增加胶 液浓度 ,溶 液从下 朝 上流动 ,把低 浓度胶 液顶向 上方。 1. 增 补材料 plug 溶液 (50% 蔗糖, 0.001% 溴 酚蓝, lxTris-HClpH8.8) 2. 操 作步骤 (1) 控制 流速为 3~4mL/min。 速度 太快, 易产生 气泡。 (2) 当 混合储 槽内尚 留有少 量胶液 ,气泡 尚未进 入梯度 仪的出 管时, 立即关 闭出口 阀 。将 plug 溶液倒 入两个 储槽内 ,然后 再打开 出口阀 ,让 plug 溶 液推动 剩余的 胶液前 进 ,当 plug 溶液到 达灌胶 盒面板 底部时 ,立 即关闭 梯度仪 出口。 (3) 于每块 凝胶液 面上迅 速加入 lOO^L 水饱和 异丁醇 ,等待 胶聚合 ,约 lh。 然后 按照微 型凝胶 电泳方 法中介 绍的加 浓缩胶 等步骤 操作。 二 、蛋 白质的 二维电 泳分离 (双 相凝胶 电泳) 1. 原理 1975 年 O’Farrell 首先建 立了等 电聚焦 /SDS 聚丙 烯酰胺 双相凝 胶电泳 (IEF/SDS> PAGE) 分离和 分析生 物大分 子蛋白 质组分 的技术 。双 相凝 胶电泳 的分离 原理充 分利用 了蛋 白质两 性电介 质荷电 特征及 等电点 的不同 对蛋白 质进行 分离。 第一相 是根据 不同蛋 白质荷 电量的 不同, 用等电 (pi) 聚 焦技术 分离蛋 白质; 第二相 则根据 SDS 和 蛋白质 结合 以后, 改变了 蛋白质 表面电 荷和分 子构象 ,使其 电泳迁 移率只 与蛋白 质分子 质量大 小成 正比, 从而达 到分离 蛋白质 的目的 (见前 SDS-PAGE 部分 )。 IEF 电泳系 统中含 有高浓 度的尿 素和非 离子型 去污剂 NP-40, 而且加 样缓冲 液中除 了含 尿素和 NP-40 外 ,还含 有二硫 苏糖醇 (DTT), 以破坏 蛋白质 分子内 部的二 硫键, 使蛋 白质充 分变性 。这些 试剂本 身不带 电荷, 不影响 蛋白质 原有的 电荷和 等电点 。第一 相多采 用盘状 等电聚 焦电泳 。电 泳结束 后带有 蛋白质 的凝胶 从玻璃 管中脱 出后, 必须经 过 第二相 SDS 凝胶 电泳分 离系统 的溶液 平衡约 3〇min, 使等 电聚焦 中的两 性电解 质和高 浓 度的尿 素扩散 出胶。 2. 实 验材料 (1) 基本 材料: 聚丙缔 醜胺 、甲叉 双丙稀 酰胺、 TEMED、 过 硫酸铵 、两性 电解质 (ampholytes)、 甘油 、磷酸 、氢氧 化钠、 SDS、 尿素、 Tris 碱、 p- 巯基 乙醇、 DTT、 NP-40、 溴 酚蓝、 琼脂糖 、考马 斯亮蓝 玻璃管 (4Xll〇mm)、 医 用穿刺 长针头 (5 1/2 号 ,长 100mm) 及 注射器 (20mL)、 蜡膜 (parafilm) 盘状等 电聚焦 电泳槽 (disc IEF) 及高 压电源 (3000V, 恒压; 300mA, 400W 恒功 率) (2) 第 一相等 电聚焦 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 (IEF/PAGE) 储存 液和缓 冲液: 裂解 缓冲液 (lysisbuffer) (9.8mol/L 尿素, 2% (m/V〇 NP-40, 2% 两性 电解质 (ampholyte) pH3 〜 10, 100 mmol/ L DTT, — 80"C 保存) 覆盖 缓冲液 (overlay buffer) (8.0mol/L 尿素, 5% ( m/ V) NP-40、 1 % 两 性电解 质 (ampholyte) pH3 〜 10, 5% p- 巯基 乙醇, -80"C 保存) 平衡 缓冲液 (equilibration buffer) (2 % SDS, 5 % J3- 琉基 乙醇或 lOOmmol/L DTT, 10% 甘油 ,室温 保存) 丙烯酰 胺溶液 (29. 2% 丙烯 酰胺、 0.8% 甲叉 双丙烯 酰胺, 过滤后 4t: 保存 。使用 不超过 两周) NP-40 溶液 (10% (m/V) NP-40 溶 于水中 ,室温 保存) H3P04 溶液 ( 浓度为 lmol/L, 室温 保存) NaOH 溶液 ( 浓度为 lmol/L, 室温 保存) 10X 蛋 白质样 品溶液I(lmg/mLDNaseI,500^xg/mLRNaseA,0•5mol/LTris- HClpH7.0, 50mmol/LMgCl2, -80T: 保存 。用于 原核或 真核生 物蛋白 质样品 的制备 ) 琼脂 糖溶液 (1% 琼 脂糖、 0.002% 溴 酚蓝的 平衡缓 冲液, 4t: 保存) 第二相 SDS- 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 (SDS/PAGE) 贮存 液和缓 冲液: 溶液 A ( 分离胶 ) (29. 2% 丙烯 酰胺、 0.8% 甲叉 双丙烯 酰胺, 过滤后 4t: 保存 ,一 般不超 过两周 ) 溶液 B( 分离胶 缓冲液 ) (1.5m〇l/LTriS-HClpH8_8, 4X: 保存) 溶液 C( 浓缩胶 缓冲液 ) (l.Omol/LTris 碱 ,用 6mol/L 的 HC1 滴定至 pH6.8, 配 制 lOOOmL, 41C 保存) 5X 电泳 缓冲液 (30.3gTris 碱, 144g 甘氨酸 ,溶于 lOOOmL。 稀释 使用时 ,加 SDS 终 浓度为 0.1%, 室温 保存) (一) 第一 相聚丙 烯酰胺 等电聚 焦电泳 蛋 白质样 品制备 微生 物或动 物细胞 / 组织蛋 白质样 品用含 29mmol/L Tris-HCl pH8.8 和 2mmol/L CaCl2 的溶 液在冰 浴上悬 浮细胞 ,加 SDS (终 浓度为 0.3%) 和相当 于细胞 悬浮液 1/10 体积的 10X 蛋 白质样 品溶液 I。 将 样品移 至室温 ,待蛋 白质溶 液不再 粘稠时 ,将 样品 • 555 . 再悬浮 于裂解 缓冲液 后直接 上样或 _7〇亡 保存。 所悬浮 的细胞 浓度可 根据需 要适当 调整。 制 备植物 胚蛋白 样品时 ,可取 适量的 种子, 4X: 浸泡约 24h, 剥取种 子胚, 用冷丙 酮浸泡 3~4h 脱脂, 待丙酮 挥发后 ,将胚 芽在研 钵中磨 成粉末 。加 入样品 裂解液 使之溶 解, 10 000r/min 离心 2min, 上清即 为蛋白 抽提液 ,直接 上样或 -70X3 保存。 第一 相聚丙 烯酰胺 等电聚 焦电泳 (IEF/PAGE) (1) 根据 电泳槽 ( 参见图 8.7) 设备 要求, IEF 管长 110mm, 内径 3mm。 先 用水洗 净 ,再用 O.lmol/LHCl 煮 30min, 最后 用重蒸 水冲至 中性, 60t: 烘干。 在玻璃 管的底 部用 3 层蜡 膜紧紧 封住, 保证灌 胶时不 会漏胶 ,然 后垂直 插入灌 胶架上 备用。 图 8.7 盘状 电泳槽 (2) IEF 凝胶 的配制 。加 入以下 试剂: 14. 4g 尿素 2.0mL 10% NP-40 5.0mL 丙烯酰 胺溶液 0.9mL 两性 电解质 pH5 〜 7 0.45mL 两性 电解质 pH3. 5 〜 10 9.3mL 甘油液 (25.5 水 + 5.5mL 甘油) 2 . OmL 水 抽气 15min 后 ,加入 : lO.OfxL TEMED 40.0^L 10 % 过 硫酸铵 轻轻 摇动混 合均匀 ,将凝 胶液灌 入准备 好的玻 璃管内 ,直 到所 需高度 。用 50ML 尿 素 (3mol/L) 小心钽 盖于胶 面上, 以隔绝 空气, 2h 后凝 胶完 全聚合 ,移 去胶面 尿素溶 液 和管底 的蜡膜 ,再在 管底包 扎上尼 龙绸。 (3) 预电泳 。将聚 合好的 IEF 凝胶 管小心 插入电 泳槽上 槽硅胶 塞孔中 ,管底 放于电 泳槽的 下槽, 离底部 2cm 左右。 下槽加 i〇mm〇l/LH3P04 正极电 极液, 液面浸 过胶管 2 〜 3cm。 管 上端胶 面覆盖 1(VL 裂解缓 冲液; 裂解 缓冲液 上面加 lOpL 覆盖缓 冲液; 覆 • 556 • 盖缓 冲液表 面再加 20mmol/LNaOH 电极液 ,一 直充满 管口。 注意勿 搅混各 层液面 。上 槽加 20mmol/LNaOH 的负极 电极液 液面浸 过胶管 2 〜 3cm。 预 电泳依 次加压 ,为 200V, 15min; 300V, 30min; 400V, 60min 或更 长时间 。每次 加压时 ,电 流都 应该相 应 下降; 如果 电流增 加则应 重新检 查电极 液和电 泳槽。 (4) IEF 电泳。 预电泳 结束后 ,将 上槽电 极液及 凝胶管 内的液 体一并 移去, 用蒸馏 水洗涤 2~3 次 。用 滤纸吸 干水, 然后加 20pL 需分离 的蛋白 质样品 ( 总蛋白 浓度约 5~ 7.5/ug/ziL); 样品 表面加 lOfiL 的覆 盖液, 小心地 再加入 20mmol/LNaOH 至管口 。上 槽重 新加入 20mmol/LNaOH 电极液 并高出 胶管口 2 〜 3cm, 继 续电泳 400V, 18h。 (5) 剥胶 。等 电聚焦 结束后 ,取 下胶管 ,充去 表面的 电极液 。注射 器装上 100mm 长的 5 1/2 号穿 刺针头 ,吸满 蒸馏水 ,将 针头紧 贴管壁 插入凝 胶柱与 管壁间 ,一 面向管 内注水 ,一 面转 动管子 ,凝 胶很容 易从管 内脱出 。将 胶的正 极和负 极做好 标记。 (6) 平衡 凝胶。 将凝胶 转移至 50mL 平衡 缓冲液 中平衡 20min (<30min), 以除去 大量 的尿素 和两性 电解质 ,以免 蛋白质 损失。 平衡后 的凝胶 可直接 进行第 二相的 SDS/ PAGE 或 -20t: 冻 融后进 行第二 相电泳 。平衡 缓冲液 中含有 SDS, 它可破 坏蛋白 质分子 间的共 价键。 (二) 第二相 SDS- 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 目前国 内外有 各种型 号的电 泳槽, 制胶方 式各异 ,前面 有关章 节已经 介绍。 但是作 为 第二相 SDS 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 (SDS-PAGE), 需要注 意的是 凝胶的 厚度必 须和第 一相 IEF 管 胶的直 径和长 度相符 。上面 介绍的 IEF/PAGE 中 凝胶的 直径为 3mm, 长度 为 110mm, 因 此第二 相电泳 的制胶 玻璃板 一 块为 16mm X 16cm, 另一块 为顶端 有一凹 陷 ,见图 8.8, 凹型的 中间宽 12cm, 两 边各宽 2cm, 凹型的 深度为 1.5cm。 (1) 凝胶玻 璃夹层 的组装 。两 块玻 璃板的 左右两 侧和底 部各用 l〇mm 宽、 3.0mm 厚、 180mm 长 的塑料 条垫入 ,然后 用长尾 夹夹住 。培 1% 的融化 琼脂糖 封边, 防止灌 胶时 泄漏。 (2) 配胶 。分 别配制 100mL 分离胶 溶液和 20mL 浓缩 胶液, 参见表 8. 5, 也 可根据 蛋白 质的一 维电泳 分离中 介绍的 SDS-PAGE 方 法进行 推算。 (3) 制胶 。按 SDS-PAGE 介绍 的操作 进行。 分离胶 高度为 11cm。 浓缩胶 高度为 3cm。 聚合时 间约需 2h。 (4) 上样 。将 IEF 后 经平衡 缓冲液 平衡的 凝胶条 (或 -80t: 取 出室温 融化后 立即使 用) 横 卧紧贴 于浓缩 胶表面 ,靠 近凝胶 条的酸 性端或 碱性端 可放置 蛋白相 对分子 质量标 准 样品胶 (即标 准蛋白 可预先 SDS 变性处 理后聚 合于与 ffiF 胶相 同浓度 的聚丙 烯酰胺 凝胶中 )。 配制 1% 琼脂 糖溶液 (lg 琼脂 糖溶于 0.002% 的 溴酚蓝 平衡缓 冲液中 ), 7〇t: 左右 时加入 凹形玻 璃板的 凹槽中 ,使 IEF 胶 和标准 蛋白质 样品胶 固定于 浓缩胶 表面。 琼脂糖 溶液加 入后的 胶面要 很平, 而且完 全不带 气泡。 . 557 . 蛋白 质相对 分子质 量标准 (琼脂 糖中) 凝胶方 向标记 图 8.8 第二相 SDS 聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳装置 表 8. S 分 离胶和 浓缩胶 的配制 分离胶 胶浓度 溶液 A 10 % SDS 溶液 B ddH20 TEMED 10% AP /% / mL /mL /mL /mL / ftL / mL 7.5 25 1 25 48.5 20 0.5 9.0 30 1 25 43.5 20 0.5 12 40 1 25 33.5 20 0.5 15 50 1 25 23.5 20 0.5 18 60 1 25 13.5 20 0.5 浓缩胶 胶浓度 溶液 D 10 % SDS 溶液 c ddH20 TEMED 10% AP /% /mL /mL /mL /mL / ftL / mL 4 2.6 0.2 2.5 14.6 8 0.1 5 3.2 0.2 2.5 14.0 8 0.1 注意: TEMED 和 AP 应在 临灌胶 前加入 。加 前凝胶 溶液最 好抽气 5min (5) 电泳 。将凝 胶玻璃 夹层安 装于电 泳槽上 ,在上 、下 槽中 灌入含 0.1% SDS 的 . 558 • Tris- 甘氨酸 电泳缓 冲液, 赶去胶 板下部 气泡后 ,接通 电源, 室温下 ,恒流 40mA, 电泳 约 5h。 当溴酚 蓝移至 离底部 0.5cm 时 ,停 止电泳 ,取 下玻璃 夹层, 剥出凝 胶片。 (6) 染色 、脱 色和凝 胶保存 。染 色方法 可见前 面有关 介绍。 (三) 酸性和 碱性蛋 白质的 二维凝 胶电泳 正常 分离的 蛋白质 pi 范围在 3. 8~8.0 之间 ,若遇 到酸性 蛋白质 或碱性 蛋白质 ,第 一维 IEF 将进 行若干 改良。 碱性蛋 白质: (1) 凝胶 溶液中 两性电 解质的 范围为 pH2 〜 11。 (2) 将 2〇mmd/L NaOH 加到 下槽中 ,而上 槽充以 脱气处 理过的 10mm〇l/L 的磷 酸 ,因而 正极导 线将与 上槽相 连而负 极导线 与下槽 相连。 (3) 无需预 聚焦。 用脱气 处理的 4mol/L 尿素覆 盖在样 品层上 ,以保 护蛋白 质与磷 酸直接 接触。 (4) 常规 IEF 的 电泳条 件进行 电泳。 极酸性 蛋白质 : (1) 制备凝 胶溶液 14. 4g 尿素 2.0mL 10% NP-40 5.0mL 丙烯酰 胺溶液 0.9mL 两性 电解质 pH2.5~4 0.45mL 两性 电解质 pH2~ll 9.3mL 甘油液 (25.5 水 + 5.5mL 甘油) 2 . OmL 水 抽气 15min 后 ,加入 : 10.0/iL TEMED 40.0/iL 10 % 过 硫酸铵 (2) 下槽缓 冲液为 3mL 浓硫 酸溶于 2L 水中; 上槽缓 冲液为 lmLpH2 〜 11 的两性 电解 质加入 40mL 脱气 水中。 (3) 按常规 IEF 电泳 。电泳 完毕后 ,可 通过不 同的染 色方法 或标记 蛋白质 的放射 自显 影等方 法观察 凝胶片 上的蛋 白质分 离斑点 ,甚至 ^1^3的 溶液中 ,室温 保存。 4. 操 作步骤 凝胶 处理: (1) 室温下 ,于 摇床上 轻轻摇 动浸泡 于染色 液中的 SDS-PAGE 后 的凝胶 ,约 15 〜 20min〇 (2) 将染 好的凝 胶再浸 泡于脱 色液中 ,在 4X: 再继 续浸泡 2 〜 3h。 可 在脱色 盒的一 角 放一块 海绵用 于吸附 染料。 (3) 用 小刀切 下凝胶 上所需 的蛋白 条带。 (4) 将 切下的 胶条置 4X: 水中, 2 〜 3h, 并换水 若干次 。胶 条也 可以放 在密封 的塑料 袋中 保存。 (5) 将胶 条放入 塑料或 玻璃培 养皿中 ,加 10mL 水淹 末胶面 。然 后将胶 条切成 1mm3 大小的 碎片, 并将碎 片集中 在一起 。用 毛细管 吸去胶 周围的 水分及 胶粒。 注意不 要把 含蛋白 质的凝 胶碎片 吸走。 蛋白 质的电 洗脱: 此步骤 一 般可以 在室温 进行。 若有特 殊需要 ,可用 Tris- 醋酸缓 冲液在 4X: 进 行洗脱 ,以防 止微量 蛋白 水解酶 的降解 作用。 (1) 用透 析膜将 洗脱池 两端小 孔的底 部封住 ,并拧 紧孔帽 (见图 8. 9)。 透析 膜孔径 H 5.1cm H 图 8.9 凝 胶中蛋 白质洗 脱装置 • 561 • 以略小 于或等 于待分 析蛋白 质或其 片段的 相对分 子质量 为宜。 (2) 仔细将 凝胶碎 片转移 至洗脱 池的加 样孔中 (见图 8.9)。 加 入浸泡 缓冲液 ,刚好 遮住 胶面。 如果需 要在还 原状态 下洗脱 蛋白质 ,则可 以加入 0.1% DTT 溶液。 然后, 再加 入洗脱 缓冲液 ,直 到没过 洗脱池 的水平 连通管 (见图 8.9)。 注意清 除其中 的任何 气泡。 (3) 将 洗脱池 装到洗 脱槽中 ,见图 8.9。 (4) 加洗 脱缓冲 液至洗 脱槽中 ,直 到将两 侧电极 上的排 液孔淹 没为止 。将混 合槽中 也充满 洗脱缓 冲液。 (5) 用 双通道 蠕动泵 将洗脱 槽和混 合槽连 接起来 ,并进 行缓冲 液循环 。蠕动 速度必 需很慢 ,使 循环的 液体一 滴一滴 地流出 ,切忌 成线状 流出。 仔细移 去洗脱 池透析 膜下面 附着 的气泡 ,注 意勿刺 破透析 膜面。 (6) 在浸泡 碎胶片 3~5min 后 ,打开 电源。 注意含 有胶片 的一侧 为负极 。在 50V 恒 压下 ,洗脱 12 〜 16h。 切勿使 用恒流 ,以防 止电压 升高。 (7) 关 闭电源 ,拆除 电极, 停止蠕 动泵。 洗脱蛋 白质的 透析: (1) 将透析 缓冲液 加入洗 脱槽中 ,以替 换洗脱 缓冲液 ,并重 复电洗 脱步骤 (5)。 (2) 接通 电极, 同电洗 脱步骤 (6) 中 的操作 。调节 电压至 80V, 透析 20 〜 24h。 (3) 关 闭电源 ,拆 除电极 ,停止 蠕动泵 ,取 下洗 脱池。 收集 和浓缩 电洗脱 后的蛋 白质: (1) 收集 液合并 ,终体 积约为 200pL 左右。 (2) 冷 冻干燥 混合后 的蛋白 质溶液 ,储于 -201C 或进行 下一步 操作。 (3) 加入 lOOpL 水 ,重新 溶解蛋 白质, 再加入 900ML 乙腈 或丙酮 ,沉淀 蛋白质 ,放 入 -20X: 过夜 。离心 ,收 集蛋白 质沉淀 。如 果蛋白 质沉淀 不充分 ,则必 须保留 上清。 分析洗 脱的蛋 白质: (1) 如需确 定洗脱 蛋白质 的含量 、分子 质量和 回收率 ,可取 5%~10% 的沉 淀蛋白 质 进行微 型胶电 泳分析 。如 果用考 马斯亮 蓝染色 ,灵 敏度为 200~300ng; 如用 银染, 则 可检出 2 〜 5ng 的蛋 白质。 (2) 将其余 的蛋白 质样品 加入到 序列分 析仪中 ,进 行序列 分析; 或将 蛋白质 片段进 行化 学裂解 或酶促 裂解后 ,再 用反相 高效液 相层析 纯化后 ,再对 肽段进 行序列 分析。 第三节 蛋白质 的检测 待测蛋 白质经 过一维 或二维 电泳分 离后, 再采用 本节所 介绍的 方法进 行检测 。本节 主 要介绍 三类检 测方法 ,一为 用染料 对凝胶 中的蛋 白条带 染色; 二 是先将 凝胶中 的蛋白 质转移 到膜上 ,然后 再用印 度墨水 、胶 体金或 Western 方法 检测; 最后要 介绍的 方法是 用 [35S] - 甲硫 氨酸生 物标记 蛋白质 后再用 放射自 显影技 术进行 检测。 ^ • 562 • 一、 凝胶中 蛋白质 的染色 (一) 考马 斯亮蓝 染色法 1. 原理 本方 法取决 与考马 斯亮蓝 R (Coomassie brilliant blue R) 染料 与蛋白 质的非 特异性 结合, 检测灵 敏度为 0.3 〜 1/zg。 蛋白质 经聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳分离 ,在 含甲醇 和乙酸 的固定 液中固 定后, 用考马 斯亮蓝 R 染色被 固定的 蛋白质 。起初 ,整个 凝胶片 都被染 成蓝色 ,经过 脱色后 ,在 透明 的凝胶 (凝 胶并不 与染料 结合) 背景 上呈现 蓝色的 蛋白质 条带。 2. 材料 聚丙 烯酰胺 凝胶片 固定液 (50% 甲醇, 10% 醋酸 , 40% H20, 室温下 可放置 1 个月) 考马 斯亮蓝 R 染色液 (50% 甲醇, 0.05% 考马 斯亮蓝 R-250, 10% 醋酸, 40% H20。 先将染 料溶于 甲醇中 ,再 加醋酸 和水。 该染液 室温下 可放置 6 个月 ,如有 沉淀出 现 ,过 滤后再 使用) 脱色液 (5% 甲醇, 7% 醋酸, 88% H20, 室温下 可放置 1 个月) 7% (WV〇 醋 酸溶液 Whatman 3 MM 滤纸 去 离子水 3. 操 作步骤 (1) 将电 泳完毕 后剥离 下来的 聚丙烯 酰胺凝 胶片放 入塑料 容器中 ,加 3 〜 5 倍胶体 积 的固定 液覆盖 ,缓 慢振摇 1 〜 2h。 (2) 弃去 固定液 。加入 染色液 ,覆盖 胶面, 缓慢振 摇染色 1 〜 4h。 也 可以省 去固定 步骤, 直接将 凝胶片 放入染 色液中 ,固 定和染 色同时 进行。 (3) 弃 去染液 ,用 50mL 固定 液洗涤 一下。 (4) 弃去 固定液 ,加入 脱色液 ,覆盖 胶面, 缓慢振 摇染色 1 〜 2h。 (5) 弃去 脱色液 ,加入 新鲜的 脱色液 ,继 续脱 色直到 获得清 晰的背 景及蓝 色的条 带 。将 胶贮于 7% 乙酸 或水中 ,切勿 贮于固 定液中 ,它 会使蛋 白条带 消失。 (6) 照相或 将胶夹 在两张 Whatman 3MM 滤纸间 ,上 面覆盖 塑料膜 ,放在 干胶仪 上 ,于 80X: 烘干 1 〜 2h。 (二) 快 速考马 斯亮蓝 染色法 1. 原理 用该 法仅需 5 或 lOmin 就能染 出蛋白 质条带 。本 法降低 了考马 斯亮蓝 染料的 浓度, . 563 . 因 此凝胶 背景不 会被染 得太深 ,在 染液中 就能看 出蛋白 质条带 。此外 ,本 法用异 丙醇代 替 了固定 液及脱 色液中 的甲醇 。但是 ,该 法的 灵敏度 略低于 传统的 考马斯 亮蓝染 色法。 2. 材料 基本上 与考马 斯亮蓝 染色法 中介绍 的相同 ,仅有 的改变 如下: 异丙醇 固定液 (25% 异 丙醇, 10% 乙酸 ,室温 下长期 保存) 快速考 马斯亮 蓝染液 (10% 乙酸, 〇.〇〇6% 考马 斯亮蓝 G-250, 室温 下长期 保存) 10% 乙酸 3. 操 作步骤 (1) 将 聚丙烯 酰胺凝 胶片放 入塑料 容器中 ,加 异丙醇 固定液 覆盖, 室温下 缓慢振 摇。 一 般对 0.7mm 厚 的凝胶 ,振摇 10~15min; 1.5mm 厚 的凝胶 ,振摇 30~60min。 (2) 弃去固 定液。 加入快 速考马 斯亮蓝 染色液 ,覆 盖胶面 ,缓 慢振摇 ,直到 理想的 强度, 一 般需 2h~ 过夜 。但是 ,在 5~30min 后 ,蛋白 染色条 带就可 见了。 (3) 弃 去染液 ,加入 10% 乙 酸脱色 ,覆 盖胶面 ,室 温下缓 慢振摇 >2h, 直 到背景 清晰。 (4) 必要时 ,弃去 前一次 用过的 10% 乙酸 脱色液 ,加入 更多的 新鲜的 脱色液 ,继续 脱色 直到获 得清晰 的背景 。将 胶贮于 7% 乙酸 或水中 ,或 贮于塑 料袋中 ,在 4X: 保存, 没必要 加入额 外的脱 色液。 (5) 必要时 ,照相 或将凝 胶片夹 在两张 Whatman 3MM 滤纸间 ,上面 覆盖塑 料膜, 放在干 胶仪上 ,于 80X: 烘干 l~2h。 照相时 ,为增 加反差 ,最好 用深黄 或橘黄 色的滤 光片。 (三) 银染法 1. 原理 银染的 原理是 取决银 离子还 原性的 差别及 银和蛋 白质中 的巯基 、羧基 等化学 基团结 合能力 。每 条蛋白 条带的 检测灵 敏度为 2~5ng。 经 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 分离后 ,凝胶 中蛋白 质条带 经甲醇 / 醋酸 和戊二 醛固定 ,与 硝酸银 作用后 ,再 用显影 剂显示 条带。 2. 材料 脱色液 (5% 甲醇, 7% 乙酸, 88% H20。 室温下 可放置 1 个月) 固定液 (50% 甲醇, 10% 乙酸, 40% H20。 室温下 可放置 1 个月) 10% 戊二 醛溶液 (从 50% 的贮存 液中新 鲜配制 ) 硝酸 银溶液 显影液 (〇.5g 柠檬 酸钠, 〇.5mL37% 甲醛 溶液, 加水到 lOOmL, 室温 下贮存 1 个月) Kodak 快速 固定液 ( Kodak rapid fix solution A) 去 离子水 ^ • 564 • 3. 试 剂配制 硝 酸银溶 液:加 3.5mL 浓 NH4OH (约 30%) 到 42mL 0.36% 的 NaOH 中 ,用 H20 调节总 体积为 200mL。 用磁力 搅拌器 搅拌, 同时缓 慢滴入 8mL19.4%(1.6g/8mL) 的 硝酸银 。如 果溶液 浑浊, 小心加 入新鲜 NH4〇H (<3 个月 ), 直到溶 液清晰 ,但 必须 在 20min 内 用完。 4. 操 作步骤 (1) 将聚丙 烯酰胺 凝胶放 入塑料 容器内 ,加 5 倍凝 胶体积 的固定 液覆盖 ,缓 慢振摇 ^30min〇 (2) 弃去 固定液 ,加 5 倍 凝胶体 积的脱 色液覆 盖凝胶 ,缓 慢振摇 >60min, 继续起 固定 作用。 (3) 弃去 脱色液 ,加 5 倍凝胶 体积的 10% 的戊二 醛溶液 ,在通 风柜内 ,缓 慢振摇 30min〇 (4) 倒掉戊 二醛, 用水振 摇洗涤 4 次以上 ,每次 >30rnin, 最后一 次最好 过夜。 (5) 倒掉水 ,用 5 倍 凝胶体 积的硝 酸银溶 液染色 15min, 并用力 振摇。 (6) 再将 聚丙烯 酰胺凝 胶放入 另一个 塑料容 器内, 用去离 子水振 摇洗涤 5 次 ,每次 lmin〇 (7) 转 移凝胶 至另一 个塑料 容器内 ,用 500mL 水稀释 25mL 显 影液后 ,加到 容器中 覆 盖胶面 ,并不 断搅动 ,直至 条带达 到理想 的强度 。一般 ,当 凝胶背 景开始 显色时 ,立 即停 止显影 。显影 液变成 棕色后 ,应 弃去 ,换 新鲜的 使用。 (8) 将胶 转移至 Kodak 快速固 定液中 5min。 必要时 ,用 湿棉 球擦去 胶表面 的残余 的银 颗粒。 (9) 倒掉固 定液, 彻底洗 涤凝胶 4~5 次。 (10) 照相, 可使用 蓝绿色 滤光片 。尽可 能早地 照相, 因为时 间太久 颜色强 度会发 生改变 ,非 特异性 背景也 会增加 。一般 情况下 ,银 染条 带保存 18h 依 然清晰 可见。 (11) 将胶夹 在两张 Whatman 3MM 滤纸间 ,上面 覆盖塑 料膜, 放在干 胶仪上 ,于 80X: 烘干 l~2h。 (四) 无氨 银染法 该 方法中 使用的 溶液更 加稳定 ,还 能检测 出用一 般银染 法不能 染色的 蛋白质 条带。 1. 附 加材料 固定液 (50% 甲醇, 10% 乙酸, 40% H20。 室温下 可放置 1 个月 )。 脱色液 (5% 甲醇, 7% 乙酸, 88% H20。 室温下 可放置 1 个月) 5fxg/mL 二巯基 苏糖醇 (DTT) 0.1% 硝酸银 (棕 色瓶中 可贮存 1 个月) 碳酸盐 - 显影液 [每 lOOOrnL 的 3% (m/V〇 碳 酸钠溶 液中含 〇.5mL 的 37% 甲醛] • 565 . 3% (m/\〇 碳酸钠 2.3mol/L 柠檬酸 2. 操 作步骤 (1) 将凝 胶片放 入玻璃 或塑料 容器中 ,加 l〇〇mL 固定液 ,轻 轻振摇 30min。 (2) 弃去 固定液 。将胶 浸在脱 色液中 ,继 续缓 慢振摇 3〇min。 (3) 倒掉 脱色液 。用 50mL 的 10% 戊二醛 溶液覆 盖胶面 ,在通 风柜内 ,缓 慢振摇 30min〇 这一 步的目 的是防 止凝胶 被漂白 ,以便 保留和 检测十 分少量 的蛋白 条带。 (4) 倒 掉戊二 醛溶液 。用 流水或 新鲜水 彻底洗 涤凝胶 2h, 以 确保凝 胶具有 很低的 背景。 (5) 倒 掉清水 ,将 胶浸在 l〇〇mL5;ig/mL 二巯基 苏糖醇 (DTT) 溶液中 30min。 这 样做可 增加银 染的特 异性。 (6) 倒掉 DTT, 不经 洗涤直 接加入 lOOmLO.l% 硝酸银 ,缓 慢搅动 30min。 (7) 倒掉硝 酸银, 用少量 水快速 洗涤凝 胶一次 ,然后 用少量 碳酸盐 - 显影液 快速洗 涤 两次。 (8) 将凝 胶浸泡 在碳酸 盐-显 影液中 ,缓慢 搅动, 直到达 到理想 的显色 水平。 (9) 每 100mL 碳酸盐 - 显影液 中加入 5mL2.3md/L 柠檬 酸以停 止显色 ,缓 慢搅动 10min〇 注 意这步 反应的 pH 必须为 中性。 若偏酸 ,凝 胶将被 漂白; 若偏碱 , 反应会 停止。 (10) 倒 掉溶液 ,用水 洗涤若 干次, 并不停 地搅动 30min。 (11) 照 相或在 0.03% 的 碳酸钠 中浸泡 lOmin, 然后密 封在塑 料袋中 保存。 (五) 快 速银染 法之一 该法 也是一 种无氨 银染法 。由 于操作 中省去 了戊二 醛固定 的步骤 ,因 此在检 测微量 蛋白质 条带方 面不够 灵敏。 但是该 法的优 点是快 速和背 景低。 1. 附 加材料 甲醛 固定液 (每 1000mL40% 甲醇溶 液中含 0.5mL 的 37% 甲醛 ,室 温下可 贮存一 个月) 0.2g/L 硫代 硫酸钠 (Na2S2〇3) 硫代硫 酸钠- 显影液 (3% 碳 酸钠, 0.0004% 硫代硫 酸钠, 临用前 每升溶 液中加 0.5mL 37% 甲酵) 干胶液 (10% 乙醇, 4% 甘油 ,室温 下可贮 存一个 月。) 浸泡在 50% 甲 醇中的 透析膜 2. 操 作步骤 (1) 将凝 胶片放 入塑料 容器中 ,加 50mL 甲醛 固定液 ,轻 轻振摇 10mm。 振 摇时间 • 566 • 可随凝 胶厚度 而适当 改变。 (2) 倒掉 固定液 ,用 水洗涤 凝胶片 2 次 ,每次 5min, 并 不断地 搅动。 (3) 倒掉水 ,在 50mL 的硫 代硫酸 钠溶液 (0.2g/L) 中浸泡 lmin, 缓慢 搅动。 (4) 倒掉硫 代硫酸 钠溶液 ,用 水洗 涤凝胶 2 次, 20s/ 次。 (5) 倒掉水 ,在 50mL0.1% 的硝酸 银溶液 中浸泡 lOmin, 缓慢 搅动。 (6) 倒掉 硝酸银 溶液, 用水洗 涤凝胶 ,然后 用少量 硫代硫 酸钠- 显影液 洗胶。 (7) 将凝胶 浸泡在 50mL 新 鲜的硫 代硫酸 钠-显 影液中 ,缓 慢搅动 ,直 到条带 强度满 意为止 (约 lmin)。 由于在 下一步 (第 8 步) 终止 显影后 ,显 影还会 继续一 段时间 ,故 此步不 要过度 显影。 (8) 每 lOOmL 硫代 硫酸钠 -显影 液中加 5mL2.3mol/L 梓檬酸 ,轻 轻振摇 lOmin。 同 样要 注意混 合液的 pH。 (9) 倒 掉溶液 ,将 凝胶放 在水中 ,缓 慢搅动 lOmin。 (10) 倒掉水 ,在 50mL 干 胶溶液 中浸泡 lOmin。 (11) 用两片 湿的透 析膜夹 住凝胶 ,然后 放在两 块玻璃 板之间 ,用 夹子 夹紧玻 璃板, 在室温 下干燥 过夜。 (六) 快 速银染 法之二 1. 附 加试剂 固定液 (10% 乙醇, 0.5% 冰乙酸 ) 染色液 (0.2% 硝酸银 ) 显色液 (0.4% 甲醛, 1.5% NaOH) 2. 操 作步骤 (1) 将凝胶 片放入 固定液 中固定 30min, 然后用 去离子 水洗涤 2 次 ,每次 6min。 (2) 倒去水 ,将凝 胶片放 入染色 液中染 15min 左右。 具体染 色时间 的长短 , 要视染 色液的 新鲜程 度而定 ,可从 3~15min 不等。 (3) 倒去 染色液 ,用高 纯水彻 底冲洗 胶片。 (4) 将 凝胶片 放入显 色液中 ,显 色适度 。注意 勿过度 显色。 (5) 用 水冲洗 干净后 ,将凝 胶片放 入固定 液中终 止显色 。用来 终止反 应的固 定液中 可以不 加乙醇 ,并 将醋 酸浓度 提高到 1%。 (6) 其 余步骤 见前。 (七) 方 法评注 银 染法的 灵敏度 比考马 斯亮蓝 染色法 高出了 100 倍 ,从理 论上说 ,可 以检出 2ng 含 量的 蛋白质 ,但 实际上 ,灵 敏度随 着不同 的实验 条件会 有变化 。由 于灵敏 度高, 使得银 染法 对溶液 或凝胶 中的不 纯物特 别敏感 ,容易 形成干 扰条带 ,因此 要求银 染试剂 全部要 用 双蒸水 配制; 要求 使用 高质量 的不含 丙烯酸 和金属 的聚丙 烯酰胺 和甲叉 双丙烯 酰胺; . 567 . 必须充 分洗去 干扰建 立氧化 / 还原 电位和 银还原 的物质 (如 两性电 介质、 去污剂 、还原 性试剂 、引 发剂和 催化剂 、甘氨 酸及氯 离子等 ); 所用的 器皿也 必须保 持洁净 ,最 好用 5% 〜 10% 的 硝酸处 理一下 。凝胶 的表面 要用蜡 膜覆盖 ,以 保持整 个胶面 湿度的 均匀; 接 触凝胶 时必须 戴手套 ,以 免染上 指纹。 二、 印迹到 膜上的 蛋白质 的检测 印迹技 术是生 物化学 、免 疫学 、分 子生物 学常用 的实验 技术, 它比凝 胶中蛋 白质的 检测更 为方便 和实用 。由 于凝 胶很容 易肿胀 或收缩 ,容易 影响结 果的重 叠比较 。蛋 白质 电泳分 离后, 电转移 到膜上 ,一般 将膜分 为两半 ,一 半进 行染色 ,以确 定电转 移的效 率; 另一 半作 免疫印 迹检测 (即 Western blotting)。 这部分 所介绍 的几种 检测方 法各有 一 定的灵 敏度范 围和适 宜范围 ,可 供大家 参考。 (一) 印 度墨水 染色法 1. 原理 印 度墨水 可将转 移到膜 上的蛋 白质染 成黑色 ,而 背景则 为灰色 。一般 可检出 >50ng 的 蛋白质 条带。 2. 材料 转移 到硝酸 纤维素 (NC) 薄膜或 PVDF 上 的印迹 蛋白质 吐温 20 (Tween-20) 溶液 (0.3% 吐温 20 溶于 pH7. 4 的磷酸 盐缓冲 盐水中 ) 印度墨 水溶液 (0.1 % 印 度墨水 ,如 Pelikan 17 black, 溶 于吐温 20 溶液) 塑料盒 去 离子水 磷 酸盐缓 冲盐水 (PBS) (137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HP04-7H20, 1 .4mmol/L KH2P04, pH7.3) 3. 操 作步骤 (1) 如果需 要的话 ,可将 转移至 NC 膜上的 蛋白质 用碱处 理一下 (见方 法评注 部分 )。 (2) 将 转移膜 放入塑 料盒中 ,于 37X: 在吐温 20 溶液中 缓慢振 摇洗涤 3 次, 30min/ 次。 (3) 继续在 室温下 ,在 吐温 20 溶液 中洗膜 2 次, 30min/ 次。 (4) 在 印度墨 水溶液 中染膜 3h 或过 夜。 (5) 在吐温 20 溶液 中洗膜 2 次 ,并 在吐温 20 溶 液中脱 色直到 灰色背 景上出 现黑色 条带 为止, 然后在 空气中 干燥。 (二) 胶体金 染色法 1. 原理 胶体金 可在近 乎白色 的背景 上将蛋 白质条 带染成 红色。 蛋白质 中带阳 性的电 荷与带 负电荷 的胶体 金颗粒 通过静 电间的 相互作 用或者 两者之 间的疏 水作用 而结合 。该 法非常 容易 操作。 2. 材料 膜 用胶体 金溶液 (membragold colloidal gold solution, Diversified Biotech) 耐 热塑料 3. 操 作步骤 (1) 如果需 要的话 ,可将 转移至 NC 膜上的 蛋白质 用碱处 理一下 (见评 注部分 )。 (2) 将 转移膜 放入塑 料盒中 ,于 371C 在吐温 20 溶液中 缓慢振 摇洗涤 3 次, 30min/ 次。 注 意:此 步骤不 适于尼 龙膜。 (3) 继续在 室温下 ,在 吐温 20 溶液 中洗膜 2 次, 5min/ 次。 (4) 继续用 水洗。 (5) 室温 下在膜 用胶体 金溶液 中染色 0.5 〜 lh, 并不断 振摇。 可以 将膜放 在密封 的塑料 袋中进 行此步 操作。 (6) 用水简 单地洗 一下膜 ,然 后置于 滤纸上 ,在 空气中 干燥。 (三) 方 法评注 (1) 用于电 转移的 膜有硝 酸纤维 素薄膜 、尼 龙膜和 PVDF (polyvinyiidene difluo- ride), 所采 用的染 色方法 必须考 虑这些 差异及 其他实 验条件 的不同 ,可参 考下面 的表格 (表 8.6)。 尼龙 膜本身 带阳性 电荷, 故不能 用于胶 体金方 法检测 膜上的 多肽。 表 8.6 膜 印迹蛋 白染色 的特性 和选择 染色 灵敏度 /ng 转移 膜类型 凝 胶类型 NC Nylon PVDF SDS-PAGE PAGE 印 度墨水 50 + - + 十 + 胶体金 3 + - + + 未确定 (2) 膜 上的蛋 白质经 碱处理 后可增 加蛋白 质与膜 的滞留 ,在洗 膜时不 易丢失 。处理 方法介 绍如下 : 将含有 印迹蛋 白质的 NC 膜放 入盛有 1% KOH 溶 液的玻 璃或塑 料盘子 中 ,在 201 浸泡 5min, 然后用 PBS 冲洗 lOmin。 (3) 由于染 色方法 的灵敏 度很高 ,实验 器材和 试剂要 求清洁 和纯净 。操 作时 必须戴 手套 ,取胶 时要用 镊子。 . 569 • 三、 蛋白质 的免疫 印迹和 免疫检 测技术 蛋 白质的 免疫印 迹技术 ( 常称为 Western blotting) 是一 种利用 抗原- 抗体反 应的特 异性 ,快速 、灵敏 地检测 和鉴定 蛋白质 的技术 ,它将 蛋白质 的电泳 分离和 免疫学 鉴定结 合 在一起 ,该技 术有效 克服了 免疫沉 淀技术 中的某 些不足 (如 抗原须 用同位 素标记 、紧 密 相关大 分子的 共沉淀 、抗 原的溶 解度等 ), 非 常实用 而被广 泛接受 。该 技术主 要由三 个 部分组 成:大 分子的 增溶、 SDSPAGE/Urea-PAGE 电泳 分离、 定量转 移及不 可逆地 与硝 酸纤维 素薄膜 (尼 龙膜或 PVDF 膜) 结合或 者将蛋 白质转 移结合 到甲氧 重氮苯 (DBM) 纸上 。该 技术还 可以用 单克隆 或多克 隆抗体 对印迹 到膜上 的蛋白 质进行 鉴定, 小于 lng 的抗 原都能 被灵敏 地检测 出来。 本 部分内 容将作 以下介 绍:① 经典的 Western blotting 技术及 其简易 操作; ②广义 概念 上的免 疫印迹 技术及 其操作 ,其中 又分槽 式操作 和半干 式操作 两种; ③几种 常用的 免疫检 测方法 ,如 辣根过 氧化酶 (horseradish peroxidase, HRPO) 或碱性 碟酸酶 偶联的 抗 IgG 抗体 。酶联 的方式 分别介 绍直接 酶联的 或经由 亲和素 - 生物素 搭桥的 两种; 在显 示 方法上 除了上 面所提 的生色 底物外 ,还引 进了化 学发光 底物。 (一) Western blotting 技术 1. 原理 用 SDS、 尿素和 / 或 还原剂 (2- 巯基乙 醇等) 增溶 抗原混 合物后 ,进行 SD&PAGE, 然后将 被分离 的蛋白 质电转 移至硝 酸纤维 素薄膜 ,并 与之不 可逆地 结合。 随后封 闭薄膜 上非特 异性的 抗体结 合位点 ,再与 靶抗体 特异性 结合, 最终与 HRPO-Ig 偶联物 保温, 从 颜色反 应的深 度探测 膜上印 迹蛋白 抗原的 存在与 含量。 2. 材料 (全 部溶液 均用去 离子水 配制) 磷酸缓 冲盐水 (PBS) 0.1%SDSPBS 溶液 (SDS 溶解在 pH7.2 的 PBS 中) 电印迹 缓冲液 (20mmol/LTris, 150mmol/L 甘 氨酸, pH8.0。 将 14.5gTris 碱和 67.0g 甘氨 酸加到 4L H20 中, 调节到 pH8.0, 再加 1200mL 甲醇 ,用 H20 调至 终体积 为 6L) 丽春红 S 溶液 (0.5% 丽春红 S, 1% 乙酸) 封闭液 (lg 新鲜 脱脂奶 粉溶于 lOOmLPBS 中) 特 异性第 一抗体 辣 根过氧 化物酶 (HRPO) - 抗 Ig 偶联物 (酶标 二抗) 磷酸缓 冲盐水 (PBS) — 氧基 •联 本胺 (3, 3 -diaminobenzidine DAB) 底 物溶液 (50mg 3, 3'-4 盐 酸联苯 胺, 2mLl% 氯 化钴水 溶液, 98mLPBS, 临用 前加入 0.1mL30% H2〇2。 注意, DBA 是强致 癌剂) • 570 • Whatman 3 MM 滤纸 Scotch-Brite 垫 (3M) 或 海绵垫 0.45pm 硝 酸纤维 素薄膜 (NC) 电 转移仪 (E. C. Apparatus 或 Bio-Rad 产品或 其他类 似产品 ) 可热 封闭的 塑料袋 塑料盒 照 相设备 3. 操 作步骤 蛋白质 样品的 SD&PAGE 分离 : ( 参见 本章第 二节) Western 印 迹夹层 的组装 (1) 裁 一 片 Whatman 3MM 滤纸 ,和 凝胶一 样大小 ,用转 移缓冲 液湿润 ,置于 Scotch-Brite 垫 (3M) 或海绵 塾上。 (2) 用转 移缓冲 液湿润 凝胶表 面后, 将凝胶 轻放在 滤纸上 ,赶 走凝胶 和滤纸 之间的 任 何气泡 ,必要 时可将 胶提起 ,驱赶 气泡。 注意 ,操作 时必须 戴手套 ,以防 止手上 的油迹 阻碍转 移过程 。凝 胶和 滤纸接 触的这 一侧面 ,在安 放 在转移 槽中时 ,将 面对负 电极。 (3) 将一片 裁好的 ,做了 标记的 并和凝 胶一样 大小的 NC 膜用 转移缓 冲液湿 润后直 接贴 在凝胶 上面。 凝胶和 NC 膜接触 的这面 ,在 安放在 转移槽 中时, 将面对 正电极 ,见 图 8.10。 垫层 塑 料夹板 滤纸 凝胶 硝酸 纤维膜 蛋 白质转 移方向 图 8.10 利用 转印槽 进行免 疫印迹 (4) 将 另一片 润湿的 Whatman 3MM 滤 纸贴在 NC 膜 的上面 (即靠 正电极 的一侧 ), 排 除气泡 。这 张滤纸 的上面 再放上 另一块 Scotch-Brite 垫 (3M) 或海 绵垫。 (5) 将组装 好的凝 胶三明 治夹层 放入塑 料夹中 ,再按 正确的 方向插 入转移 槽中。 电泳 转移: (6) 转移槽 中装满 转移缓 冲液。 连接好 转移槽 和电泳 仪与正 、负极 之间的 导线。 (7) 在 4X: 及 14V 恒压下 (低 压大电 流转移 ), 电泳 lh 到过夜 ,使蛋 白质从 凝胶中 . 571 . 转移到 NC 薄 膜上。 转移时 间取决 于凝胶 厚度及 蛋白质 的大小 ,一般 l~6h 足够了 ,对高 相对分 子质量 的蛋白 质适当 延长 ,电泳 过夜是 比较好 的办法 。可用 银染来 监视转 移完全 程度。 转移 蛋白质 的可逆 染色: (8) 将 电转移 完毕的 NC 膜直 接放入 丽春红 S 溶液 中染色 5min。 (9) 在水 中脱色 2min。 用印度 墨水标 出蛋白 质条带 的位置 。必 要时, 可照相 。然 后在 水中彻 底脱色 ,振摇 l〇min。 封闭 非特异 性结合 位点: (10) 将 NC 膜放 入盛有 封闭液 的塑料 袋内, 密封好 。一般 ,每 2~3 张 lOcmX 15cm 大小的 NC 膜 ,需加 5mL 封闭液 。置振 荡器上 , 室温缓 慢振摇 密封袋 lh。 取出 后, 倒掉封 闭液。 第一 抗体鉴 定印迹 蛋白: (11) 用 封闭液 适当稀 释一抗 。通常 ,对 来自腹 水的单 克隆抗 体稀释 >1:1000 倍; 杂 交瘤上 清稀释 1:10~1:100 倍; 多克 隆抗 体稀释 1:1000 倍。 (12) 将 NC 膜放入 盛有稀 释好的 一抗溶 液的塑 料袋内 ,密 封好 。每 2 〜 3 张 lOcmX 15cm 大小的 NC 膜加 5mL — 抗溶液 。置振 荡器上 ,室 温缓 慢振摇 密封袋 lh, 时 间可灵 活 掌握。 洗膜: (13) 取出 NC 膜 ,放入 200mLPBS 中 ,振 摇洗涤 ,共 4 次 ,每次 15min, 均用新 鲜的缓 冲液。 酶标二 抗的呈 色反应 : (14) 用封 闭缓冲 液稀释 HRPO-Ig 偶联物 。然后 ,重 复操 作步骤 (12) 和 (13)。 (15) 于一塑 料盒中 ,倒入 100mL 新鲜 制备的 DAB 溶液 ,覆盖 NC 膜 ,显色 2 〜 3min, 通常几 秒钟就 会出现 颜色。 (16) 在水中 洗涤, 以终止 反应。 照相: (17) 永 久保存 ,否则 曝光几 小时后 ,颜 色将 消失。 附: Western blotting 的 简易操 作步骤 (1) 制备 样品和 SDS^PAGE 分离。 (2) 转移 夹层的 组装和 安置, NC 膜 面朝向 正极。 (3) 电 转移。 4t:, 14V 恒压下 ,电泳 lh 或 过夜。 (4) 丽春红 S 溶液 中染色 5min, 观察印 迹条带 。水 中脱色 2min。 (5) 用印 度墨水 标记条 带的位 置后, 继续水 中脱色 ,振摇 lOmin。 (6) 封闭 NC 膜 ,室 温振摇 lh。 (7) 用 封闭液 适当稀 释一抗 ,室 温下振 摇保温 lh。 (8) 洗膜 4 次 ,每 次均用 200mL 新鲜的 PBS。 (9) 用封闭 液稀释 HRPO-Ig 偶联物 。室 温下振 摇保温 NC 膜 lh。 (10) 用 新鲜的 PBS 洗膜 4 次 ,每次 200mLPBS, 15min。 . 572 • (11) 加 DAB 溶液和 显色。 (12) 用 水洗涤 ,终止 反应。 (13) 照 相永久 保存。 4. 方 法评注 (1) Western blotting 技术 还存在 一 ■些 问题 ,如某 些抗原 增溶后 ,在 SDS 或 尿素等 变 性剂存 在的条 件下电 泳分离 ,但 是有些 抗体并 不能识 别这些 转移到 NC 膜上的 变性的 印迹 抗原; 此外 ,某 些抗原 并不能 定量地 转移到 NC 膜上; 最后, 所观察 到的结 果将受 到所使 用的变 性和转 移系统 的影响 ,如 已知兼 性离子 去污剂 可恢复 Western blotting 中 外膜蛋 白的抗 原性。 (2) 为防止 抗体的 非特异 性结合 ,实 验中应 设立抗 原或抗 体的平 行对照 。抗 体的非 特异 性结合 会引起 NC 膜出 现灰色 的背景 ,此时 ,可 设法降 低抗原 或抗体 的浓度 ,或减 少保温 时间。 (3) 必 须注意 凝胶和 NC 膜的电 极朝向 ,蛋 白质 的印迹 转移方 向是从 负极到 正极。 (4) 如果, 印迹塑 料夹或 Scotch-Brite 垫 、海绵 垫没有 安紧, 会引起 印迹蛋 白条带 的扩散 。尽 量避免 凝胶和 NC 膜之间 的气泡 ,否则 印迹和 染色后 ,有 气泡 的地方 ,蛋白 质转移 不过来 ,将 会变成 白色的 斑点。 (二) 槽式 转移印 迹系统 1. 原理 该转移 系统的 特点是 由凝胶 和薄膜 所组装 的夹层 垂直插 入转移 槽中, 并完全 浸没在 两组电 极板之 间的转 移缓冲 液中。 它比较 适用于 >100kDa 的大分 子蛋白 或疏水 蛋白如 肌 球蛋白 等的较 长时间 的分离 ,缓冲 液不至 于干涸 。本 法的 主要缺 点是转 移缓冲 液的用 量大。 2. 材料 待分 析的抗 原样品 预染 过的或 生物素 化的蛋 白相对 分子质 量标准 转移 缓冲液 Whatman 3MM 滤纸 Scotch-Brite 垫 (3M) 或 海绵垫 0.45^m 硝 酸纤维 素薄膜 (NC)、 尼 龙膜或 PVDF 膜 电 转移仪 (E. C. Apparatus 或 Bio-Rad 产品或 其他类 似产品 ) 塑料盒 手套 不 褪色的 记号笔 其余 有关蛋 白质一 维或二 维电泳 或染色 的设备 和试剂 注 :全部 溶液用 去离子 水配制 . 573 . 3. 试 剂配制 转 移缓冲 液:将 18.2gTris 碱和 86.5g 甘氨 酸加到 4LH20 中 ,再加 1200mL 甲醇, 调节到 pH8.3 〜 8.4, 加 H20 至终 体积为 6L。 如使用 PVDF 膜 ,甲醇 浓度应 减少至 15%, 如用尼 龙膜, 则不用 甲醇。 4. 操 作步骤 (1) 一 维或二 维电泳 分离抗 原样品 ,同时 分离预 染过的 或生物 素化的 相对分 子质量 标 准蛋白 ,作为 对照。 (2) 电泳 完毕后 ,取出 凝胶片 ,放在 转移缓 冲液中 ,室温 下平衡 30min。 平衡 步骤可 以防止 转移过 程中凝 胶体积 的不均 匀改变 。注意 ,不同 的转移 膜使用 不同的 转移缓 冲液。 (3) 组 装转移 夹层时 ,衬垫 、滤纸 、凝胶 、转 移膜 、滤纸 、衬 垫的安 装顺序 和方向 见 Western blotting。 所不 同的是 ,用 水或转 移缓冲 液润湿 NC 膜或尼 龙膜; 而用 PVDF 膜时 ,先将 它放入 100% 的甲 醇中浸 l~2s ,然后 在转移 缓冲液 中平衡 10 〜 15min, 千 万别使 PVDF 膜干燥 ,否则 ,再重 复上述 过程。 参见图 8. 11。 ©_ 经缓冲 液浸润 的滤纸 转 移塔层 转 移塔层 © 阳极 图 8.11 利用 半干转 移系统 进行免 疫印迹 (4) 转移 槽中充 满转移 缓冲液 ,在 100V 时转移 0.5~lh; 或在 4X:、 14V 恒 压下转 移 过夜。 (5) 电转移 过程的 操作和 Western blotting 相同。 (6) 电转移 完毕后 ,将 膜从塑 料夹中 取出, 剪去一 角或用 不褪色 的笔做 好记号 。印 迹 上蛋白 质的膜 干燥后 ,密 封在塑 料袋中 可保存 1 年以上 。在进 一步处 理之前 , 干燥过 的 PVDF 膜必须 先放在 100% 甲醇中 ,然 后再 移到水 中冲掉 甲醇。 (7) 用 考马斯 亮蓝染 色凝胶 ,以 观察凝 胶中的 蛋白质 转移的 效率。 同时用 丽春红 S • 574 • 溶液 可逆地 染色膜 上的印 迹蛋白 。将 NC 和 PVDF 膜放在 丽春红 S 溶液中 ,室温 下染色 5min, 然 后在水 中脱色 2min。 需要时 ,可照 相记录 。用不 褪色的 墨水在 蛋白质 相对分 子 质量标 准处做 好记号 。最后 ,在水 中浸泡 lOmin, 则 可完全 脱色。 如 果用考 马斯亮 蓝染料 、印度 墨水、 胶体金 、萘酚 蓝等染 色膜, 将是不 可逆的 。上 面的染 色步骤 均不适 用于尼 龙膜。 (8) 进行免 疫学的 检测, 具体步 骤下面 将进行 介绍。 (三) 半干式 转移印 迹系统 1. 原理 用半干 式转移 印迹系 统代替 传统的 槽式转 移印迹 系统, 同样可 以获得 有效的 蛋白质 转移。 在传统 的转移 系统中 ,转 移组合 夹层垂 直地插 入充满 缓冲液 的转移 槽内, 而在半 干 式转移 系统中 ,凝胶 水平地 夹在被 缓冲液 饱和过 的印迹 膜之间 ,如 此组 合的转 移夹层 直 接与上 下两边 的电极 相接触 ,极大 地减少 了对缓 冲液的 需要量 。又 由于 两个电 极之间 的 距离十 分靠近 ,所 形成的 高电场 ,加快 了转移 的速度 ,在 lh 内 ,基本 都能完 成转移 过程。 2. 附 加材料 6 张 Whatman 3MM 滤纸, 裁成和 凝胶一 样大小 ,并 用转移 缓冲液 饱和。 半干式 转移印 迹系统 (进口 或国产 ) 环己 基氨丙 基横酸 (CAPS, cyclohexylaminopropane sulfonic acid) 转移液 3. 试 剂配制 CAPS 转移 液:加 2.21g CAPS, 0.5g DTT, 150mL 甲醇及 水至终 体积为 1L。 用 NaOH 调节至 pH10.5, 冷却到 4X:。 如果蛋 白质的 相对分 子质量 >60kDa, 甲醇 含量可 降至 1%。 4. 操 作步骤 (1) 制备 抗原样 品和电 泳分离 蛋白质 。电泳 完毕后 ,取 出凝胶 ,切除 浓缩胶 ,一般 不 需要将 分离胶 与转移 缓冲液 平衡。 (2) 制备转 移膜。 将膜裁 成一定 的大小 ,每 边均比 凝胶大 l~2mm, 慢慢放 入蒸馏 水中 ,润 湿整个 表面, 防止速 度太快 ,使 气泡陷 入其中 。然后 , 在转移 缓冲液 中平衡 10 〜 15min。 用 PVDF 膜时, 应先将 它放入 100% 的甲 醇中浸 l~2s, 然后 在转移 缓冲液 中平衡 10 〜 15min, 千 万别使 PVDF 膜干燥 ,否则 ,再 重复上 述过程 一次。 (3) 将 3 张用转 移缓冲 液饱和 的滤纸 (注 意:滤 纸的大 小必须 与凝胶 的大小 完全一 样) 贴放在 正极电 极上面 。带负 电荷的 蛋白质 转移方 向是由 上朝下 至铂电 极或石 墨电极 上 (正极 )。 此时 ,转移 缓冲液 可采用 CAPS 缓冲液 ,以 代替 Tris、 甘氨酸 、甲 醇转移 缓冲液 。特 别是 需要直 接在膜 上进行 蛋白质 测序时 ,甘氨 酸将妨 碍反应 进行。 . 575 • (4) 在 3 张滤纸 的顶部 放上平 衡过的 转移膜 。用 玻璃试 管滚动 ,移去 滤纸间 或膜与 滤纸间 的所有 气泡。 (5) 将凝胶 片放在 转移膜 的顶部 ,并 移去可 能存在 的任何 气泡。 (6) 将 3 张湿 滤纸放 在凝胶 的上面 ,移去 气泡, 作为一 个单元 ,转移 三明治 夹层组 装便 完成。 在半干 式转移 系统中 ,好几 个转移 单元可 以叠在 一起, 同时进 行转移 ,每个 转移单 元之间 用透析 膜隔开 。这样 做时, 各单元 的转移 效率并 不相同 ,以靠 近正极 的转移 单元效 率最高 。但 是要注 意凝胶 两侧的 滤纸层 不要相 互接触 ,以 免通 电时引 起短路 ,影响 转移。 (7) 在转移 夹层的 上面, 放上顶 部电极 。一 旦组装 完毕, 印迹过 程实际 已开始 ,不 能 再移动 电极。 (8) 接 通电源 ,恒流 下进行 转移约 lh 左右 。转移 过程中 ,温 度不 >45*0。 (9) 停止 转移后 ,取出 转移膜 ,做好 标记, 然后进 行染色 和免疫 检测。 5. 方 法评注 所谓“ 半干” 是指仅 用有限 的缓冲 液湿透 滤纸。 所用的 缓冲液 大大少 于“罐 法”。 此法容 易建立 ,也 可在 两电极 的滤纸 用不同 的缓冲 液湿润 ,转移 也较快 ,但是 难以冷 却。 实际上 ,两种 方法的 转移效 率均高 ,可任 意选择 。下面 我们将 介绍几 种转移 缓冲液 系统 ,以供 参考。 (1) Towbin buffer: 25mmol/L Tris, 192mmol/L glycine, 20% (V/V) MeOH, pH8 . 3〇 (2) Towbin buffer 力口 SDS: 25mmol/L Tris, 192mmol/L glycine, 20% ( V/ V ) MeOH, 0.1% SDS。 这个系 统便于 洗脱高 相对分 子质量 蛋白。 (3) Dunn carbonate buffer: 10mmol/L NaHC〇3, 3mmol/L Na2C〇3, 20% (V/V) MeOH, PH9. 9。 该缓冲 液系统 利于增 强免疫 化学识 别作用 ,对保 留小分 子蛋白 及大分 子蛋白 的复性 有利。 (4) Bjerrum & Schafer-Nielson buffer: 40mmol/L Tris, 39mmol/L glycine, 20% (V/\〇 MeOH, pH9.2。 这是高 pH 低电导 缓冲液 系统, 较适宜 进行半 干印迹 转移。 (5) 均 不含甲 醇的所 有上述 5 种缓冲 液系统 ,此时 SD&PAGE 的带 负电荷 SDS 仍 然 结合着 蛋白质 ,一起 转移到 带正电 荷的载 体尼龙 膜上。 (四) 用直 接偶联 酶的第 二抗体 (酶标 二抗) 进行免 疫检测 1. 原理 蛋白 质转移 完毕后 ,应立 即对膜 上的印 迹蛋白 进行免 疫鉴定 ,以 确定抗 原的含 董。 在电 转移完 毕后, 首先将 膜取出 并浸入 由非反 应性蛋 白或去 污剂组 成的封 闭液中 ,然后 与第 一抗体 反应。 洗涤后 ,继续 与直接 针对第 一抗的 酶标第 二抗体 (如羊 抗兔或 兔抗人 IgG 等 )。 最后 ,通过 生色反 应或化 学发光 方法检 测结合 到膜上 的抗原 、一抗 、二 抗、 酶复 合物。 • 576 • 2. 材料 含印迹 蛋白的 转移膜 : 封闭液 (blocking solusion)。 注意, 不同的 膜使用 不同的 封闭液 。对 NC 和 PVDF 膜, 可采用 0.1% (V7V) Tween-20 的 TBS 或 TTBS 溶液; 对尼 龙膜以 使用含 10% 脱 脂 奶粉的 TBS 溶 液为好 。所 有的封 闭液均 在临用 前配制 ,可在 4X: 贮藏, 一周内 使用。 针对 印迹抗 原的特 异性第 一抗体 Tris- 缓 冲盐水 (TBS) (0.9%NaCl, 100mmol/LTris-HClpH7.5, 可在 4X: 贮藏几 个月) Tweer>Tris- 缓 冲盐水 (TTBS) (0. 1 % Tween-20 的 Tris- 缓 冲盐水 ,可在 4X: 贮藏 几个月 ) 辣根过 氧化酶 (HRPO) 或碱性 憐酸酶 (alkaline phosphatase, AP) 标记的 抗免疫 球蛋白 偶联物 热封 塑料袋 塑料盒 3. 操 作步骤 (1) 将印迹 膜放入 热封塑 料袋中 ,加入 室 温下轻 轻振摇 0.5~lh。 (2) 用 封闭液 稀释第 一抗体 。对 多克隆 抗体 ,一 般稀释 1:100~1:1000 倍; 杂交瘤 上 清的稀 释度为 1:10 〜 1:100; 含单 克隆抗 体的 鼠腹水 则稀释 1:1000 倍以上 。如 果采 用 碱性磷 酸酶或 化学发 光体系 ,则稀 释度还 可以 再增高 。抗 体稀释 度对获 得良好 的实验 结果十 分重要 ,见图 8. 12。 (3) 打开塑 料袋口 ,倒出 封闭液 。加入 5mL 上 述稀释 好的一 抗溶液 ,封口 。室温 下轻 轻振摇 0.5~lh, 确切的 保温时 间将随 不同的 偶联物 而异。 (4) 戴上 手套, 取出膜 ,放入 塑料盒 中 ,用 200mL TTBS (NC 或 PVDF 瞋) 或 TBS ( nylon 膜) 振 摇洗漆 4 次, 10 ~ 15min/ 次。 (5) 用封闭 液稀释 HRPO-Ig 或 AP-Ig 偶联物 。一 般市售 酶标二 抗的稀 释度为 1 : 200 或 1:2000 0 (6) 将膜放 入一个 新的塑 料袋中 ,加入 稀释好 的酶标 二抗, 室温下 轻轻振 摇保温 5mL 封闭液 ( 可封闭 2 〜 3 张膜 ), 封口 血清 稀释度 〇 8 8 8 8 i - i 8.12 以 系列稀 释的第 一抗体 检测植 物细狍 质膜 ATP 酶 97kDa 催 化亚基 的结果 • 577 • 0.5 〜 lh〇 (7) 取出膜 ,放 入塑 料盒中 ,用 200mLTTBS (NC 或 PVDF 膜) 或 TBS (nylon 膜) 振 摇洗涤 4 次, 10 〜 15min/ 次 。然后 ,按下 面方法 (六) 或方法 (七) 介绍 的检测 方法进 行呈色 反应。 (五) 用亲 和素- 生物素 偶联酶 标二抗 进行免 疫检测 1. 原理 该免疫 检测法 的原理 是基于 Vector Laboratories 的 Vectastain ABC 试 剂盒的 反应原 理 。该 法借助 亲和素 -生物 素的结 合将与 HRPO 或 AP 连接 到生物 素化的 第二抗 体上。 由于复 合物中 ,每 一个生 物素化 的第二 抗体能 同时与 多重报 告酶体 相连, 故起到 信号放 大 的作用 ,从 而赋予 亲和素 -生物 素检测 体系极 高的灵 敏度。 2. 材料 封闭液 [见 方法 (四) 酶标 二抗] TTBS/TBS 溶液 [见 方法 (四) 酶标 二抗] VectstainABC (过 氧化 物酶) 或 ABC-AP (喊性 鱗酸酶 ) 试剂盒 (VectorLaborato- ries) [该试 剂盒包 括试剂 A (avidin), 试剂 B (生物 素化的 HRPO 或 AP), 生物 素化的 第二 抗体] 3. 操 作步骤 (1) 用相应 的封闭 液平衡 转移膜 。对 NC 和 PVDF 膜 ,室温 下平衡 30 〜 50min 足够 了; 对尼 龙膜, 则需在 37X: 平衡 2h 以上 。平衡 时需要 不断地 振摇。 在此 亲和素 -生物 素反应 体系中 ,我 们推荐 使用不 含脱脂 奶粉的 Tween-20/TTBS 系统作 为平衡 液, 因为脱 脂奶粉 中含有 残余的 生物素 ,会 干扰免 疫检测 ,只 能在封 闭步骤 中使用 ,不 能用于 平衡。 (2) 用 TTBS (对 NC 或 PVDF 膜) 或 TBS (对 nylon 膜) 稀释第 一抗体 。由 于亲 和素- 生物素 检测体 系的高 灵敏度 ,第 一抗 体的稀 释度可 提高到 1:1 000 〜 1:10 000。 具 体稀释 度的决 定可参 见方法 评注。 (3) 取出膜 ,放 入足够 的一抗 溶液中 ,将膜 面覆盖 。轻 轻摇动 ,室温 下保温 30min〇 (4) 在 15min 内 ,用 TTBS (对 NC 或 PVDF 膜) 或 TBS (对 nylon 膜) 洗膜 3 次。 (5) 用 50~100mL 的 TTBS (对 NC 或 PVDF 膜) 或 TBS (对 nylon 膜) 稀释 2 滴 生物素 化的第 二抗体 。这 样我们 就获得 了足够 体积的 高灵敏 度生物 素化二 抗抗体 ,完全 可 以複盖 14cm x 16cm 大小 的膜。 (6) 将 膜转移 至上述 稀释好 的二抗 溶液中 。室温 下保温 30min, 轻轻 摇动。 然后按 步骤 (4) 进行 洗涤。 (7) 在膜与 生物素 化的二 抗保温 的同时 ,制备 Avidin-Biotin-HRPO 或 -AP 复 合物。 先将 2 滴 Vectastain 试剂 A 和 2 滴试剂 B 滴入 10mL TTBS (NC 或 PDVF 膜) 中或 TBS (nylon 膜) 中 ,充 分混合 。室温 下孵育 30min, 然 后用进 一步用 TTBS 或 TBS 稀释到 • 578 • 50mL〇 (8) 将步骤 (6) 反应 完的膜 转移到 Avidin-Biotin- 酶 溶液中 ,室温 下保温 30min, 轻轻 摇动。 然后在 30min 内 ,用 TTBS (对 NC 或 PVDF 膜) 或 TBS (对 nylon 膜) 洗 膜 3 次。 (9) 按下 面方法 (六) 或方法 (七) 介绍 的检测 方法进 行呈色 反应。 (六) 用生色 底物的 颜色反 应显示 免疫检 测结果 1. 原理 用生 色底物 的颜色 反应显 示免疫 检测结 果是最 常用的 方法。 适用于 HRPO 标记免 疫 检测的 底物有 4CN (4-chloro-l-nathol)、 DAB、 NiCl2 和 TMB (3, 3', 5, 5'-tetram- ethylbenzidine), 而适合 于喊性 憐酸酶 标记 检测的 底物为 BC1P、 NBT (niitrobluetetra- zolium)。 在 与相应 的一抗 和二抗 保温后 ,将 膜放入 底物溶 液中, 几分钟 内即可 显现蛋 白质 条带。 2. 材料 具有 印迹蛋 白并已 经标记 了抗体 -酶复 合物的 转移膜 TBS 溶液 (0.9%NaCl, 100mmol/LTris-HClpH7.5, 可在 4X: 贮藏几 个月) 生色底 物缓冲 液或显 色溶液 3. 试 剂配制 生色底 物缓冲 液或显 色溶液 ,包括 有下列 几种: (1) 碱性磷 酸底物 缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH9,5, 100mmol/L NaCl, 5mmol/L MgCL (2) BCIP/NBT 混合 33yL NBT 贮存液 (lOOmg NBT 溶于 2mL 70% DMF, 置于 4t:, 不超过 一年) 和 5mL 碱性磷 酸底物 缓冲液 (见上 ), 混合 后加入 n^LBCIP (5-bromo4-chloro-3-indolyl phosphate) It 存液 (100mg BCIP 溶于 2mL 100% DMF, 4t: 放置 ,不超 过一年 )。 室温 下稳定 lh。 (3) 4CN 20mL60mg4CN, 60^L 30% H202, lOOmL TBS (4) DAB/NiCl2 5mL lOOmmol/L Tris-HCl pH7.5, 100pL DAB 贮存液 (40mg/mL, 以 lOOpL 的量 分装, 贮存在 -20t:), 25;^沌(:12 (80mg/mL, 以 lOO^L 的 量分装 ,贮 存在 -20X:), 15pL3%H202 ,临用 前混合 使用。 注意, DAB 是致癌 物质。 4. 操 作步骤 (1) 室 温下用 50mLTBS 洗膜 15min, 移去过 量的磷 酸盐和 Tween-20。 前 者抑制 AP 活性 ,而后 者干扰 4CN 显色。 (2) 将膜 放入底 物显色 液中, 蛋白条 带将在 15 〜 30min 内 显现。 (3) 用蒸馏 水洗膜 以终止 反应。 于空气 中干燥 和照相 ,永久 保存。 • 579 . (七) 用化学 发光底 物显示 免疫检 测结果 . 1. 原理 用化学 发光底 物显示 免疫检 测结果 ,其灵 敏度及 反应速 度均高 于生色 反应和 同位素 标 记的反 应强度 。在最 后一次 洗膜后 ,将 膜浸 入底物 溶液中 。该溶 液含有 鲁米那 (lu- minol, 用于 HRPO 体系) 或二 氧戊环 憐酸盐 (dioxetane phosphate, 用于 碱性憐 酸酶系 统 ), 并 封闭在 薄的塑 料袋中 ,紧 贴在发 光检测 胶片上 。曝 光时间 约几秒 钟到几 小时不 等 ,一 般典型 的强信 号在几 分钟之 内就可 以了。 2. 材料 化学发 光底物 缓冲液 化学 发光显 像溶液 清 洁的塑 料袋其 余试剂 或设备 请见放 射自显 影部分 3. 试 剂配制 ( 各种溶 液全部 用去离 子蒸馏 水配制 ) 化学发 光底物 缓冲液 : HRPO 系统 采用发 光底物 缓冲液 50mmol/L Tris-HCl, pH7.5。 * AP 系统则 Dioxetane 憐酸 盐底物 缓冲液 lmmol/L MgCL, 0 . lmol/L 二 乙醇胺 (diethanolamine), 0.02% 叠氮钠 ,用 盐酸 调节至 pHlO.O, 临用 前新鲜 配制。 * 传统 使用的 AMPPD (disodium 3- (4-methoxyspiro |1, 2-dioxetane-3, 2'-tricyclo [3.3.1 .13'7] decani -4-yl) phenyl phosphate) 底物缓 冲液 :含有 lmmol/LMgCL 和 pH9. 6 50mmol/L 的碳酸 氢钠缓 冲液。 * 也可 采用含 100 mmol/L Tris-HCl pH9.5, 100mmol/L NaCl, 5mmol/L MgCl2。 化学发 光显像 溶液: 分为 下面两 种情况 : 1) 基于 HRPO 的 Luminol 显 像溶液 0.5mLl〇xLuminol|C 存液 (40mg 溶于 10mL DMSO 中 ), 0.5mL l〇X p-i〇d〇phenol 存液 (10mg 溶于 10mL DMSO 中 ), 2.5mL 100mmol/L Tris-HCl pH7.5, 25/uL 3% H2〇2, 力 Q H20 到 5mL, 临 用 前配制 。其中 ,两 种贮存 液可在 -20X: 下放置 6 个月。 p-iodophenol 为 光学增 强剂, 可 增加光 输出。 2) 基于 AP 的 Dioxetane 憐 酸盐显 像溶液 临 用前将 0 . lmg/mL 的 AMPPD 或 CSPD 或 Lumi-Phos 530 溶于 Dioxetane 磷酸盐 底物缓 冲液中 。其中 AMPPD 的浓度 (240Mmol/L) 为推荐 的最小 浓度。 如果浓 度再低 ,则 需要延 长曝光 时间。 4. 操 作步骤 (1) 用 相应的 50mL 底物缓 冲液洗 涤转移 好的膜 ,共洗 2 次, 15min/ 次。 (2) 将膜 转入显 色液中 ,浸泡 〇.5~lmin。 (3) 取出膜 ,排 去水分 ,含有 印迹蛋 白的膜 面朝下 ,贴 在清洁 的塑料 面上, 再将塑 料的四 角朝膜 上折叠 把膜封 闭起来 ,或 将膜放 入塑料 袋中封 闭起来 。注意 ,膜与 胶片之 间 必须隔 有一层 干燥的 无水气 的塑料 薄膜。 • 580 • (4) 在 暗室内 ,将膜 面朝下 紧贴在 胶片上 。一 次贴稳 ,不 再移动 ,否 则易形 成双重 影像。 如果膜 与胶片 之间贴 的不紧 ,也 容易造 成影像 模糊。 (5) 曝 光几秒 到几分 钟不等 。通常 ,免疫 印迹可 产生强 信号, 曝光时 间为几 秒或几 分钟; 而较弱 的信号 往往需 要几小 时甚至 过夜。 (6) 需 要的话 ,在 50mL 的 TBS 中洗涤 膜两次 , 15min/ 次, 然后按 照方法 (六) 介 绍的 步骤进 行呈色 反应。 膜蛋白 经过鲁 米那显 像后可 以再进 行生色 反应。 (八) 方 法评注 (1) 表 8.7 列出常 用的呈 色系统 和化学 发光呈 像系统 的组成 、检 测原 理及灵 敏度。 表 8.7 生色 底物呈 色系统 和化学 发光呈 像系统 系 统 .试剂 反应 / 检测 注 解 生 色反应 氧化产 物为紫 色沉淀 灵敏 性较差 (吐温 20 抑 制反应 ), HRPO 系统 4CN 见光 后褪色 致癌剂 ,较 4CN 灵敏 ,结 果易于 暗棕 色沉淀 DAB/NiClz 扫描 毒性小 , 较稳定 和灵敏 ,适 用类型 暗紫色 TMB 的膜多 AP 系统 BCIP/NBT BCIP 水 解物被 NBT 氧化 比其他 AP- 沉 淀底物 灵敏和 稳定; 为靛 蓝色; 最后 染为 暗 蓝灰色 磷酸 盐抑制 AP 活性 化学发 光反应 HRPO 系统 鲁米那 /H2〇2/p」〇dophe- nol 底物氧 化后为 亮蓝色 高灵敏 体系; 几秒至 lh 可 得结果 AP 系统 1 , 2-dioxetane Phosphates p-iodophenol, 增 加光输 灵敏 度较好 适宜所 有的膜 的 置换物 ,如 CSPD、 出底物 脱磷酸 后发光 Lumi-Phos 530、 AMPPD (2) 采用化 学发光 检测方 法时, 强信号 将会遮 盖附近 较弱的 信号; 而过 度的 曝光会 引 起胶片 上出现 较宽的 扩散的 影像; 过强 的信 号也会 使感光 胶片达 到饱和 ,信号 强度与 影像 强度之 间不再 呈线性 关系; 上面 这些情 况都必 须加以 考虑。 (3) 在 采用碱 性磷酸 酶底物 AMPPD 时, 使用硝 酸纤维 素膜、 PVDF、 尼龙 膜分别 需要 2 〜 12、 4 〜 12h、 8 〜 12h 才 能达到 最大的 光发射 。有报 道认为 PVDF 膜产 生的信 号比 NC 膜强。 对尼龙 膜而言 需要特 殊的封 闭步骤 ,例 如封闭 液和一 抗溶液 中含有 6% 酪蛋白 1% 的 PVP-40 (polyvinylpyrrolidone-40)、 3mmol/L NaN〗、 l〇mmol/L ED1A 和 PH6. 8 的 PBS。 临用前 ,必 须加热 酪蛋白 ,以灭 活酪蛋 白中含 有的碱 性磷酸 酶活性 。此 外 ,用亲 合素- 琼脂糖 预处理 酪蛋白 ,以 除去游 离的生 物素或 生物素 化的蛋 白质后 ,将 可 达到最 大的灵 敏度。 . 581 . 第四 节蛋白 质的常 规层析 法纯化 蛋白质 的常规 层析法 纯化通 常要结 合使用 几种层 析方法 ,包 括凝胶 过滤、 离子交 换 、疏 水作用 、染 色作用 、亲和 以及免 疫亲和 层析法 。图 8.13 显 示所有 这些方 法的基 本实验 流程。 选择适 当的分 离介质 选择 适当的 缓冲液 用缓 冲液平 衡介质 并装柱 I 安装下 列设备 •梯度 混合器 •蠕 动泵 • uv 检测器 •记 录仪 •分部 收集器 I 用缓冲 液平衡 层析柱 I 加样 I 洗脱 未吸附 和非特 异吸附 的物质 I 洗脱 吸附的 蛋白质 优化纯 化条件 I 收集 蛋白质 I 去盐 I 分析 纯化物 图 8.13 蛋白 质纯化 的常规 层析法 流程图 1. 原理 、 凝胶过 滤层析 凝 胶过滤 (gel-filtraticm, GF) 层 析法是 按分子 从大至 小的顺 序分离 蛋白质 。蛋白 质混合 物加样 于装有 一定孔 径凝胶 固定相 的凝胶 过滤层 析柱中 ,用亲 水缓冲 液洗脱 ,混 合物随 缓冲液 流经层 析柱时 ,各 种物质 在柱内 同时进 行着垂 直向下 的运动 和无定 向的扩 散运动 ,混 合物中 各物质 因分子 大小不 同而被 分离。 在洗脱 过程中 ,相对 分子质 量最大 的物质 因完全 不能进 入凝胶 网孔而 沿凝胶 颗粒的 空隙最 先流出 柱外; 相对 分子质 量居中 的 物质能 进入凝 胶网孔 ,并占 据一定 的空间 ,在 层析 柱中向 下移动 的速度 较慢; 相对分 子质 量最小 的物质 在凝胶 颗粒内 部占据 的空间 最大, 因此受 到阻滞 ,流速 最慢, 最后流 出 柱外。 凝胶 过滤可 根据分 子大小 的不同 分离蛋 白质, 或用于 使蛋白 质脱盐 (如 除去盐 、氨 基酸和 多肽等 低相对 分子质 M 杂质 )。 • 582 • 2. 材料 GF 凝 胶介质 (见 方法评 注和表 8.8) 表 8.8 常用凝 胶过滤 介质的 分离范 _a 凝胶类 型>> 分 离范围 (分 子质量 /Da) Sephadex G-1 <700 Bio-Gel P-4 800 〜 4000 Sephadex G-25 1000 〜 5000 Bio-Gel P-6 1000 〜 6000 Bio-Gel P-10 1500 〜 20 000 Sephadex G- 50 1500 〜 30 000 Bio-Gel P-30 2500 〜 40 000 Bio-Gel P-60 3000 〜 60 000 Sephadex G- 7 5 3000 〜 70 000 Ultrogel AcA 54 5000 〜 70 000 Sephadex G-1 00 4000- 1 X 1〇5 Bio-Gel P-100 5000-1 x 1〇5 Ultrogel AcA 44 10 000-1.3 X 10s Sephadex G-200 5000-2.5 x 1〇5 Sephacryl S-200 Superfine 5000-2.5 X 1〇5 Bio-Gel A-0.5m <10 000~5xl〇5 Ultrogel AcA 34 20 000-3.5 x l〇5 Bio-Gel P-200 30 000-2 x l〇5 Bio-Gel A-l . 5m <10 000~1.5xi〇6 Sephacryl S-300 10 000-1.5 x i〇6 Sepharose 6B 10 000-4 x l〇6 Ultrogel AcA 22 lx l〇5~l.2x i〇6 Bio-Gel A- 15m 40 000-15X 106 Sepharose 4B 60 000-20 x l〇6 Sepharose 2B 70 000-40 X l〇6 Bio-Gel A-50m 10〇xl〇s~5〇xl〇6 a. 分 离范围 显示将 在相当 于柱床 体积中 被洗脱 出的蛋 白质的 相对分 子质量 (左边 数值) 和将出 现在排 阻体积 中的蛋 白质的 相对分 子质量 (右 边数值 )。 给 出的分 离范围 是对应 于一般 的缓冲 液而言 ,不同 于在变 性条件 下 (如 6M 盐酸狐 , 8M 尿素或 去垢剂 ) 进行的 分离。 b. Sephadex, Sephacryl 和 Sepharose 均由 Pharmacia 供应, Bio-Gel P 和 Bio~Gel A 由 BioRad 供应, Ultrogel AcA 由 Sepracor 供应。 GF 缓冲液 GF 蛋白 质标准 (见表 8.9) 脱 盐溶液 90X: 恒 温水浴 . 583 . 表 8.9 凝 胶过滤 所用蛋 白质标 准的分 子质量 蛋白质 分 子质量 /Da 细 抱色素 C 11 700 肌 红蛋白 (抹 香鲸) 16 800 胰蛋 白酶原 (PMSF 处理) 24 000 碳 酸酐酶 29 000 卵 清蛋白 45 000 血 红蛋白 64 500 牛血清 白蛋白 66 000 转 铁蛋白 74 000 免疫 球蛋白 G 158 000 血纤 蛋白原 341 000 铁蛋白 470 000 甲状腺 球蛋白 670 000 布氏漏 斗或砂 芯漏斗 GF 层析柱 (见方 法评注 ) 缓冲 液贮槽 蠕动泵 UV 检测器 记录仪 分部 收集器 脱 盐溶液 3. 试 剂配制 脱盐溶 液:用 0.05md/L 氨 水或乙 酸处理 ,因其 易挥发 ,可 通过冷 冻干燥 完全除 去 。 GF 缓冲液 : 可有多 种选择 ,但 不同 pH 的 Tris 磷酸盐 和醋酸 盐缓冲 液最为 常用。 建议 使用离 子强度 不低于 0.05mol/L 的 缓冲液 ,以 降低待 分离蛋 白质与 层析介 质之间 的非 特异相 互作用 。若 有必要 ,可在 GF 缓冲 液和样 品溶液 中加入 NaCl、 尿素 、盐酸 胍等 ,以使 样品混 合物中 的蛋白 质完全 溶解。 GF 蛋白 质标准 :商品 供应的 试剂盒 包括适 宜相对 分子质 量范围 的系列 蛋白质 。也 可购买 单个的 蛋白质 来组合 (见表 8.9)。 4. 操 作步骤 用于分 离蛋白 质的凝 胶过滤 : 1) 凝胶 的溶胀 (1) 若 购买的 GF 凝胶 介质为 干粉, 则必须 在装柱 前将其 悬浮在 GF 缓冲液 中使充 分溶胀 ( 凝胶介 质的选 择见方 法评注 )。 待胶 沉淀后 ,吸走 或倒掉 未沉下 的细小 颗粒。 重 悬凝胶 于等体 积的缓 冲液中 ,形成 较稠的 混悬液 ,倒 入抽滤 瓶中脱 气以除 去气泡 ,并 使凝 晈达到 柱操作 温度。 根 据凝胶 类型确 定溶胀 凝胶所 需缓冲 液的体 积和溶 胀时间 。干 胶颗粒 应慢慢 加入缓 冲液中 ,同时 • 584 • 图 8.14 凝胶过 滤层析 示意图 用 玻棒轻 轻搅拌 (注意 :不能 用磁力 搅拌器 ,以免 打碎凝 胶颗粒 )。 凝胶 混悬后 ,不再 搅拌, 让其溶 胀 。常 规用大 约两倍 床体积 (床体 积指溶 胀后凝 胶的毫 升数) 混悬 凝胶。 每克干 胶的大 约床体 积由厂 家说明 书确定 。用 90t 水浴加 热干胶 混悬液 5h, 可使 凝胶迅 速溶胀 。室温 下的溶 胀缓慢 ,特 别是大 孔 径的凝 胶溶胀 更慢。 (2) 若 购买的 GF 凝胶 已预先 溶胀好 ,则 应在布 氏漏斗 或砂芯 漏斗中 用过量 的缓冲 液 洗去贮 存缓冲 液中的 防腐剂 。再用 GF 缓 冲液混 悬凝胶 ,脱气 ,并 让凝 胶达到 柱操作 温度。 2) 装柱 和洗柱 (1) 将柱 垂直安 装在稳 固的实 验台上 ( 柱的选 择见方 法评注 )。 不能 将层析 柱置于 实验室 拥挤处 、开 着的窗 户旁或 阳光直 射处。 (2) 用注 射器从 柱出液 管口将 GF 缓 冲液逆 向注入 层析柱 ,直 至缓冲 液刚好 充盈至 柱 底分隔 筛之上 。保 留注射 器于原 位以堵 住柱出 液管口 。此 操作可 除去柱 分隔筛 下部的 气泡。 (3) 倒 入适当 体积的 凝胶混 悬液以 得到所 需的柱 床高度 。凝胶 应沿末 端紧靠 柱内壁 的玻 棒倒入 ,这 样可使 凝胶混 悬液顺 畅流入 ,并防 止气泡 产生。 柱子 装得不 好通常 是由于 分次不 连续灌 胶或凝 胶混悬 液太稀 所致。 (4) 待凝胶 达到所 需柱床 高度后 ,在其 顶部小 心加入 lcm 厚的缓 冲液层 。将 缓冲 液完全 充满进 液管和 端托后 ,将 端托和 层析柱 相连。 • 585 • (5) 从出液 管口拿 开注射 器之前 ,调 节缓冲 液贮槽 的高度 使产生 合适的 操作压 (即 所谓静 水压) 或 用蠕动 泵控制 流速。 对于硬 度不高 的凝胶 (如 SephadexCV75, (M00 和 G-200 或 Sepharose), 操 作压不 宜超过 厂家的 限定。 对于硬 度较高 的凝胶 (如 SephadexG-10 到 G*50 或 Sephacryl), 可 用蠕动 泵在高 流速下 操作。 (6) 移 去出液 管口的 注射器 ,使缓 冲液开 始流出 。用 2 〜 3 倍床 体积的 缓冲液 洗柱, 以 压紧柱 床和平 衡柱子 。洗 柱时的 流速可 稍高于 层析分 离时的 流速。 (7) 关闭 出液管 ,检查 柱子。 可从后 面用手 电筒照 ,观 察是否 有断层 现象或 气泡。 3) 測定 柱的排 阻体积 (1) 关闭出 液管并 吸去柱 床上的 大部分 缓冲液 。打开 出液管 ,使 剩余 缓冲液 渗入凝 胶 ,注意 不要使 凝胶中 心干涸 。关 闭出 液管。 不要使 凝胶中 心变干 很重要 ,需 要在 胶顶部 和柱壁 之间仍 留有弯 月形液 面的缓 冲液。 (2) 取蛋白 质样品 (0.2 〜 0.5mg/mL), 其相对 分子质 量已知 并大于 所使用 GF 凝 胶介 质的排 阻体积 ,溶于 相当于 1% 〜 5% 总 柱床体 积的缓 冲液中 ,用 滴管加 于凝胶 顶部。 (3) 打开 出液管 ,使 样品渗 入凝胶 床内。 (4) 用滴管 加入少 量缓冲 液洗涤 残留在 柱壁的 样品。 (5) 加样完 毕后, 在凝胶 顶部小 心加入 lcm 厚的缓 冲液层 。用 缓冲 液完全 充满进 液管和 端托后 ,将端 托与柱 相连。 (6) 在适 当的静 水压或 流速下 ( 如步骤 2) 中的 (5) 步操作 ) 进行 洗脱。 (7) 用 自动分 部收集 器收集 洗脱液 。可分 100 管, 每管收 集大约 1 % 总柱床 体积的 洗脱液 。测定 每管洗 脱液在 280nm 处的 吸收值 A28Q, 然后 将每管 的体积 乘以含 有最大 吸 收值蛋 白质的 管数计 算出排 阻体积 。排阻 体积应 大约占 总柱床 体积的 1/3。 组分收 集可按 时间或 按滴数 进行, 但最好 按滴数 ,因为 流速改 变会使 各组分 的体积 不同。 尽管这 种改变 在凝胶 过滤中 不出现 ,因 为在整 个分离 过程中 只使用 一种缓 冲液, 而在离 子交换 层析中 (使用 梯 度洗脱 ), 层 析介质 在高盐 中不断 收缩导 致流速 加大。 4) 样 品 的溶解 和加样 (1) 蛋白 质混合 物样品 溶解于 GF 缓 冲液中 。要 得到最 大的分 辨率, 样品体 积应为 柱床 体积的 1% 〜 5%。 用滴管 将样品 溶液加 于凝胶 顶部。 (2) 重 复步骤 3) 中的 (3) 〜 (6)。 5) 收集 洗脱液 :重复 步骤; 3) 中的 (7) 6) 检测各 洗脱组 分中的 蛋白质 (1) 测定 各洗脱 组分的 A28e 来检测 蛋白质 (含 有酪氨 酸或色 氨酸残 基的蛋 白质在 280mn 处 有吸收 )。 (2) 可以 检测各 洗脱组 分的生 物活性 或免疫 活性。 (3) 各 洗脱组 分脱盐 处理后 (见 用于脱 盐的凝 胶过滤 ), 可进行 单向凝 胶电泳 ,并 与蛋 白质标 准比较 ,以 确定含 生物活 性蛋白 质组分 中的蛋 白质或 其亚单 位的相 对分子 质量。 (4) 其 活性可 通过生 物分析 测定的 天然蛋 白质的 相对分 子质量 可通过 将其洗 脱体积 与 GF 蛋白 质标准 ( 其相对 分子质 童已知 ,且 洗脱体 积已被 测定, 将其相 对分子 质量以 • 586 • 10 为底 的对数 值对洗 脱体积 作图) 的洗脱 体积相 比较来 推算。 用于蛋 白质脱 盐的凝 胶过滤 : (1) 重复 操作上 一步骤 1) ~3) 中的 (7) 和 6) 中的 (1), 步骤 3) 中的 (2) 改 为待脱 盐蛋白 质溶液 的体积 可增至 总柱床 体积的 25%。 SephadexG-25 或 BioGelP-6 可用于 脱盐的 GF 凝 胶介质 。需用 脱盐溶 液洗脱 柱子。 被脱盐 的蛋白 质将 出现于 排阻体 积中, 而低相 对分子 质量的 杂质将 出现于 相当于 柱床体 积处。 (2) 用 冷冻干 燥法浓 缩被脱 盐的蛋 白质。 5. 方 法评注 1) 背 景资料 凝胶过 滤层析 是根据 溶液中 各物质 相对分 子质量 的大小 不同进 行分离 的一种 层析技 术 ,由 Porath 和 Flodin (1959) 首创 。此后 ,凝 胶介 质的迅 速发展 ,促进 了凝胶 过滤层 析的 发展。 特别是 YoshioKato 合成了 TSKSW 系列的 介质, 成功地 分离了 蛋白质 ,使 得 凝胶过 滤层析 得到了 更广泛 的应用 。此法 可用于 使蛋白 质脱盐 ,估 算蛋 白质相 对分子 质量和 分离蛋 白质。 在所有 常规层 析法中 ,凝胶 过滤层 析是惟 一能根 据待分 离物质 的理化 性质, 具体来 说就 是其分 子大小 ,来准 确预言 该物质 色谱行 为的层 析方法 。凝胶 过滤层 析法较 其他层 析法容 易掌握 。它无 需过多 考虑洗 脱缓冲 液对分 离效果 的影响 ,更 没有必 要使用 梯度洗 脱 ,缓 冲液所 起的惟 一作用 就是作 为溶剂 。由 于凝胶 过滤层 析法具 有简单 、快速 、条件 温和 等优点 ,它是 蛋白质 分析的 一个有 力工具 。尽 管如此 ,它在 蛋白质 分析当 中的应 用 ,特别 是在蛋 白质的 制备中 ,仍 然不很 普遍, 其关键 问题是 GF 凝胶介 质价格 昂贵。 2) GF 凝胶 介质和 层析柱 的选择 若 待分离 蛋白质 的相对 分子质 量已知 ,选 择一种 将使蛋 白质在 被分离 范围中 间洗脱 出 来的凝 胶介质 (例如 ,要 从蛋 白质混 合物中 分离一 种分子 质量为 100 OOODa 的蛋白 质 ,选 择分离 范围为 5000 〜 250 OOODa 的凝胶 介质; 见表 8.8)。 若 待分离 蛋白质 的相对 分子质 量未知 ,需 先选择 分离范 围较宽 的凝胶 介质。 若目标 蛋白 质洗脱 在排阻 体积中 ,则应 选择具 更高排 阻界限 的介质 (见表 8.8, 角注 a); 若蛋 白质洗 脱在接 近柱床 体积处 ,则应 选择分 离较低 相对分 子质量 蛋白质 的凝胶 介质。 层析柱 大小的 选择取 决于所 加样品 的体积 (即样 品体积 不应超 过柱床 体积的 5%) 和样 品溶液 的黏度 ( 即样品 黏度不 应超过 洗脱液 黏度的 2 倍 )。 通常 ,柱 子越长 ,分离 效 果越好 。基 本分离 中采用 的层析 柱一般 直径为 1~2. 5cm, 长 度大于 50cm。 脱 盐柱通 常比分 离柱更 粗更短 ,若 小体积 少量的 蛋白质 去盐, 应选用 较小的 层析柱 (如 lcmX 10cm) 〇 3) GF 缓冲液 、流 速及样 品容量 的影响 缓冲液 的离子 强度不 应低于 0.05mol/L, pH 不应 超出提 供介质 的厂家 规定的 范围。 显然 ,蛋 白质必 须溶于 缓冲液 ,如 有必要 ,蛋 白质可 溶于含 促溶剂 (低浓 度有机 溶剂和 去垢剂 ) 的缓 冲液中 。但 凝胶介 质必须 在这种 缓冲液 中稳定 。去盐 操作应 选用挥 发性缓 冲液 (如 0.03mol/LNH4OH 或 0.05mol/L 乙酸 )。 要得 到最好 的分离 效果, 应保持 2 〜 l〇Cm/h 的线 性流速 。相 应的以 mL/h 表 示的流 速可通 过计算 线性流 速和柱 截面积 . 587 • (cm2) 的乘 积求得 。加样 体积和 样品的 浓度也 将明显 影响分 离效果 ,加 入样品 的浓度 范围 一般在 0.01% 〜 0.5%, 不 应高于 1%。 样品溶 液的黏 度必须 不超过 洗脱缓 冲液的 2 倍 。样品 体积应 为柱床 体积的 1%~5%。 但 在脱盐 处理中 ,样品 体积可 增至总 柱床体 积的 25%。 4) 常见问 题及解 决措施 表 8.10 列出 了凝胶 过滤层 析常见 的问题 ,原因 及处理 办法。 表 8.10 常规 层析法 常见问 题的排 除指南 问题 原因 解 决办法 凝胶中 有气泡 凝胶装 柱前未 脱气; 柱温 升高 重 新装柱 凝胶中 有裂隙 柱 流干了 重 装柱并 检査进 、出 液管和 端托是 否漏气 柱 中液体 不流出 柱底 分隔筛 ,端 托或进 、出液 管堵塞 检 査是否 胶粒堵 塞或气 泡堵塞 液体流 速减慢 见 “柱中 液体不 流出” 原因; 样品中 有不 溶颗粒 加 样前将 样品溶 液过滤 或离心 柱床 被压缩 在较低 静水压 下重新 装柱或 长期使 用后重 新装柱 微生 物污染 将柱 贮存于 0.02% 叠 氮化钠 溶液中 被 细小胶 粒阻塞 重悬凝 胶介质 ,沉积 后吸去 上层细 小颗粒 凝 胶断层 柱 底分隔 筛松了 或破裂 拆开 柱子并 检査分 隔筛; 重装柱 回 收率低 特异性 吸附或 不吸附 选用不 同的层 析介质 微生 物污染 将柱 贮存于 0.02% 叠 氮化钠 溶液中 蛋白质 沉淀; 由于丢 失亚基 或辅基 而失活 在分离 过程中 使用蛋 白质能 溶解的 缓冲液 分离 效果差 微生 物污染 将柱 贮存于 0.02% 叠 氮化钠 溶液中 蛋 白质或 脂类物 质析出 从 胶床顶 部除去 1cm 厚 的胶层 样品 黏度高 样品黏 度不应 超过缓 冲液的 2 倍 加样 体积太 样品体 积应小 于总床 体积的 5% 柱太短 按厂家 说明加 以优化 流 速太快 保持 2 〜 10cm/h 的线 性流速 装 柱质量 太差; 柱不 垂直 重 新装柱 凝胶颗 粒太大 较细 的凝胶 颗粒, 更换凝 胶型号 a •资料 来源: Gel Filtration: Theory and Practice from Pharmacia 二、 离子交 换层析 i. 原理 离 子交换 (Ion-exchange, IEX) 层 析分离 蛋白质 的过程 ,主 要是利 用蛋白 质具有 彼此 不同的 电荷而 进行选 择性的 分离。 蛋白质 是多价 可解离 的分子 ,不同 蛋白质 所带电 荷数 目不同 ,因此 ,它们 与离子 交换层 析介质 的相互 作用也 不同。 将蛋白 质混合 物加到 带有相 反电荷 的层析 介质上 ,不同 的蛋白 质通过 静电作 用可逆 地与介 质结合 。吸 附的蛋 白质 将按照 结合力 由弱到 强的次 序被洗 脱下来 (通过 逐渐增 加洗脱 液的离 子强度 或改变 洗 脱液的 pH)。 2. 材料 IEX 缓冲液 • 588 • IEX 凝 胶介质 IEX 层析柱 梯度 混合器 (图 8.15) 电导仪 常规层 析的其 他设备 (见凝 胶过滤 层析) 3. 试 剂配制 IEX 缓冲液 表 8. 11 列 出了阴 、阳 离子交 换层析 常用的 缓冲液 。选 用挥发 性或非 挥发性 缓冲液 依据下 一步的 分离程 序或分 析方法 。若需 要尿素 、乙醇 、乙腈 、去 垢剂等 助溶蛋 白质, 可将 其加入 梯度缓 冲液中 ,但 要注意 这些添 加物不 可使缓 冲液中 的盐类 析出。 4. 操 作步骤 1) 凝胶 的溶胀 2) 装柱 1)、 2) 步操 作同凝 胶过滤 层析操 作步骤 1) 中的 (1) 〜 2) 中的 (7), 所不同 的是用 IEX 缓冲 液替代 GF 缓 冲液。 3 ) 样品 的溶解 和上样 (1) 用起 始梯度 缓冲液 溶解待 分离蛋 白质。 (2) 关闭 出液管 ,吸 出柱床 顶部的 大部分 缓冲液 。打开 出液管 ,让剩 余的少 量缓冲 液渗 入凝胶 ,但 要注意 勿使凝 胶中心 干涸。 关闭出 液管。 (3) 用滴管 将蛋白 质样品 加样。 只要样 品的离 子强度 不超过 起始缓 冲液的 离子强 度 ,样 品的体 积不限 。如 有必要 ,可稀 释样品 溶液。 (4) 打开 出液管 ,使 样品溶 液渗入 柱床。 (5) 用滴管 加入少 量缓冲 液洗涤 残留在 柱壁的 样品。 4) 梯 度洗脱 (1) 上样完 毕后, 在凝胶 顶部小 心滴加 lcm 厚的 起始缓 冲液, 将梯度 泥合 器连上 进液管 ,用起 始缓冲 液完全 充满进 液管和 端托后 ,将端 托与柱 相连。 图 8.15 离子交 换层析 中的梯 度混和 器装置 . 589 . (2) 打开梯 度混合 器的两 个阀门 ,打开 出液管 ,让 梯度 洗脱液 如凝胶 过滤操 作步骤 2.5 所 述在适 当的静 水压或 流速下 洗脱。 5) 收集 洗脱液 用 自动分 布收集 器收集 洗脱液 。可分 1〇〇 管 ,每管 收集大 约相当 于总洗 脱体积 1 % 的体积 。测定 每管洗 脱液的 A280。 建 议按滴 数而不 是按时 间收集 洗脱液 。因为 在离子 交换层 析中使 用梯度 洗脱液 ,层 析介质 在较高 的盐浓 度下不 断收缩 导致流 速加大 ,使每 管收集 的体积 不同。 6) 检 測洗脱 液中的 蛋白质 参见凝 胶过滤 层析操 作步骤 6.1。 7) 測定离 子强度 可 用电导 仪测定 每管洗 脱液的 离子强 度以确 定梯度 曲线。 表 8. 11 离子交 换层析 中常用 的梯度 洗脱缓 冲液1 阴离 子交换 阳离 子交换 pH 缓冲液 及梯度 pH 缓冲液 及梯度 挥发性 b 2.3 ~ 3.5 吡啶 / 甲酸 2.0 甲酸 3.0 - 5.0 三甲胺 / 甲酸 3.0 〜 6.0 吡啶 / 乙酸 7.9 碳 酸氢铵 7.0 〜 8.5 氨 / 甲酸 8.9 碳酸铵 8.0 〜 9.5 氨 / 碳酸铵 8.5 〜 10.0 氨 / 乙酸 7.0 〜 12.0 三甲胺 /C〇2 7.0 〜 12.0 三乙胺 /co2 非 挥发性 “d 6.0 〜 7.5 0 • 01 〜 0 • 025mol/L bis-Tris 3.5 0.06mol/L 甲酸钠 ±0.3 〜 lmol/L NaCl ± 0 • 95 mol/L NaCl 6.5 0.1mol/L 磷酸 钠或钾 5.7 0.01mol/L 丙 二酸盐 ±0.3 mol/L 磷酸 钠或钾 ± 0• 3mol/L LiCl 7.6 〜 8.6 0.5mol/L Tris-HCl 6.0 0.025~0.05mol/L MES ± 0 • 75 ~ 1 • Omol/L NaCl 或 KC1 ±0.35-1. Omol/L NaCl 7.8 0 . 05mol/L 二 乙醇胺 + 7.2mol/L 尿素 ±0.5~1.0mol/LNaa或KCI 10.4 0.1mol/L CAPS ±0.5mol/L 乙酸钠 a. 缩写: bis-Tris, 2- 双 (2- 羟乙基 ) 氨基 -2- ( 羟甲基 ) -1 , 3- 丙 二醉; CAPS, (环 己氨基 ) -1- 丙 磺酸; MES, 2-N- 吗啉基 - 乙磺酸 -NaOH。 b. 挥 发性缓 冲液常 用线性 梯度为 〇.〇l~〇.5mol/L。 c. 离 子交换 层析可 使用非 离子型 去垢剂 。阴 离子交 换介质 不可使 用去氧 胆盐。 可用两 性离子 去垢剂 ,但有 pH 依赖性 。用含 去垢剂 的悌度 洗脱液 洗脱前 ,应 先用去 垢剂溶 液平衡 层析柱 。含乙 腈和乙 醉的有 机溶剂 使用浓 度应小 于 90%t 离 子交换 层析也 可使用 尿素。 d. “± "指缓 冲液 在相同 PH 下 ,含 有表中 所列浓 度的盐 (+ ) 或 不含盐 (-)。 5. 方 法评注 1) 背 景资料 离子 交换层 析是最 早应用 的层析 技术之 一, 它主 要根据 不同化 合物带 电荷性 质和多 • 590 • AG 50W Bie-Rex 70 CM- 纤维素 CM-Sephadex (C-25 或 C~50) SP-Sephadex (C*25 或 C-50) CM-Sepharose CL-6B M-Sepharose (fast flow) 聚 苯乙烯 AG 1 AG 2 Bio- Rex 5 AG 3-X4A Bio-Rex MSZ 1-X8 纤维素 氨乙基 纤维素 DEAE- 纤维素 苄基 DEAE- 纤维素 ECTEOLA- 纤维素 PEI- 纤维素 QAE- 纤维素 TEAE- 纤维素 DEAE-Sephacel Sephadex DEAE-Sephadex (A-25 或 A-50) QAE-Sephadex (A-25 或 A-50) Sepharose DEAE-Sepharose CL-6B DEAE -Sepharose (fast flow) Q Sepharose (fast flow) a •缩写 : CM, 羧 甲基; DEAE, 二乙 基氨基 乙基; ECTEOLA, 3- 諷 -1, 2- 环氧丙 烷三乙 醇氨; PEI, 聚 乙烯亚 胺; Q, 季胺; QAE, 二乙基 - (2- 轻 基丙基 ) - 氣基 乙基; S, 磺 酸盐; SP, 磺 丙基; TEAE, 三乙 基氨基 乙基。 • 591 • 少而进 行分离 。用纤 维素离 子交换 剂进行 蛋白质 的离子 交换层 析是由 Peterson 和 Sober 于 1956 年首 创的。 随着生 命科学 的进一 步发展 ,离 子交换 层析法 在分离 和制备 蛋白质 上 将得到 更广泛 的应用 。在离 子交换 层析中 ,被 分离 的化合 物除通 过静电 作用与 离子交 换 剂的带 电基团 结合外 ,还有 其他因 素影响 着化合 物的滞 留行为 ,因 此在 离子交 换层析 中很难 根据化 合物的 带电性 质准确 预言它 们的色 谱行为 。与 反相色 谱分离 蛋白质 相比, 离 子交换 层析的 一个优 点是可 以完全 不用有 机溶剂 ,并使 用中性 pH, 在 这样的 条件下 蛋白质 发生变 性的可 能性比 反相色 谱中要 小得多 。离 子交换 层析法 适合于 成分不 是很复 杂的 蛋白质 粗品的 分离。 若样品 较简单 (如已 初步纯 化过) 或待分 离蛋白 质与杂 质的电 荷差别 足够大 ,常可 取得满 意的分 离效果 。蛋 白质 的回收 率一般 可超过 80%, 但一些 疏水性 很强的 蛋白质 回收率 较差。 2) 离子交 换凝胶 介质和 层析柱 的选择 蛋白 质具有 带正电 荷和带 负电荷 的基团 ,蛋 白质的 净电荷 取决于 pH。 在其 等电点 (isoelectric point, pi), 蛋白质 的净电 荷为零 ,不 能结 合任何 类型的 IEX 凝胶。 ffiX 凝 胶 的选择 ,取 决于以 下几点 ,①使 被分离 蛋白质 稳定的 pH 范围 。若蛋 白质在 高于其 pi 的 pH 下 最稳定 ,则 选用阴 离子交 换剂; 若蛋 白质在 低于其 pi 的 pH 下最 稳定, 则选用 阳离子 交换剂 。② 被分离 蛋白质 的分子 大小。 IEX 凝胶的 多孔性 会影响 凝胶的 结合能 力。 对于相 对分子 质量为 10 〇〇〇 ~ 100 OOODa 的 蛋白质 ,选择 DEAE-Sephacel 和 DEAE- Sepharose (Pharmacia) 较好 。对于 相对分 子质量 更大的 蛋白质 ,选 用凝 胶表面 具有最 高电荷 密度的 Sephadex A-25 或 C-25 较合适 (见表 8.12)。 表 8.12 用于 蛋白质 分离的 离子交 换介质 a 阴 离子交 换介质 阴 离子交 换类型 阳 离子交 换介质 阳 离子交 换类型 强弱 弱 弱强 弱弱强 强强_ 强强 弱弱 弱弱弱 强弱弱 弱强 弱弱强 对于 易碎的 凝胶, 操作压 力不应 超过厂 商规定 的限度 。对于 硬性胶 ,装 柱时 可用蠕 动 泵在较 高流速 下进行 。预装 Pharmacia FPLC 柱有确 定的压 力限制 (见表 8. 13)。 层析 柱大小 的选择 取决于 IEX 凝胶 介质的 结合力 。常 用的柱 直径为 lcm, 2cm 和 2.5cm。 柱的 长度通 常小于 20cm。 若蛋 白质混 合物过 于复杂 ,应使 用较长 的柱子 。两 种类 型的离 子交换 FPLC 预装柱 , MonoQ (阴离 子交换 ) 和 MonoS (阳离 子交换 ) 均 可购自 Pharmacia 公司 ,有 3 种型号 (5mm x 5cm 可上样 25mg、 lcm X l〇cm 可上样 200mg、 1.6cm X l〇cm 可上样 500mg)。 表 8.13 FPLC 离 子交换 柱:规 格和操 作条件 流速 /(mL/ min) 时间‘ / min 压 力限制 /bars 柱大小 八 直径 / 长度; mm) 床体积 / mL 载样量 b /mg 1 10 〜 30 100 5/50 1 25 4 30 〜 40 50 10/100 8 200 10 30 〜 40 30 16/100 20 500 a. 时间 是指一 次分离 的典型 时间。 b. 载样 量是指 一个典 型的蛋 白质混 合物上 样量。 3) 蛋白质 吸附条 件的经 验确定 将少量 蛋白质 溶液分 别加样 于两个 不同的 小层析 柱中, 一个含 阴离子 交换剂 ,另一 个含 阳离子 交换剂 。通过 测定洗 脱液的 活性或 是否出 现该蛋 白质来 确定目 标蛋白 质是否 被吸附 , 从而确 定洗脱 条件。 (1) 若在 pH6.5 的 CM 柱中或 PH8.0 的 DEAE 柱中 无吸收 ,可 分别在 PH7.0 的两 种 柱上重 新加样 。若仍 无吸收 ,重新 加样至 pH<6.0 的 CM 柱中, pH8.5 的 DEAE 柱 中 ,或 pH>9.0 的 QAE 柱中。 (2) 若在 pH6. 5 的 CM 柱中 无吸附 ,而在 pH8.0 的 DEAE 柱中 有吸附 ,则在 pH6.0 或 pH8.0 + 0.1mol/L NaCl 条件的 DEAE 柱 上重新 加样。 (3) 若在 pH8.0 的 DEAE 柱中 无吸附 ,而在 pH6. 5 的 CM 柱中 有吸附 ,则在 pH7.0 或 pH6.5 + 0.05mol/L NaCl 条件的 CM 柱 上重新 加样。 (4) 若在 pH6. 5 的 CM 柱中和 pH8.0 的 DEAE 柱中都 有吸附 ,从其 中一个 柱子洗 脱出 蛋白质 ,换成 另一个 柱子的 缓冲液 ,重 新加 样于另 一个层 析柱。 目标 蛋白质 的离子 交换层 析必须 在蛋白 质能被 吸附的 一定的 离子交 换介质 和一定 pH 的 缓冲液 中进行 。蛋 白质用 线性梯 度盐溶 液洗脱 下来。 三、 免疫亲 和层析 1. 原理 这部分 介绍来 自细胞 或匀浆 组织的 可溶性 或膜结 合蛋白 质抗原 的分离 。将 抗体与 Sepharose (— 种大孔 径层析 介质) 偶联 ,高相 对分子 质量的 抗原可 从孔中 自由出 入并与 共 价结合 在介质 上的抗 体结合 ,而其 他不能 结合的 生物大 分子便 很快通 过层析 柱而流 出 。在高 pH 或低 pH 的缓 冲液中 抗原- 抗体的 结合被 解离, 亲和层 析介质 上结合 的抗原 • 592 • 就会 被洗脱 下来。 另外还 介绍一 种抗原 的单柱 纯化法 ,可缩 短柱负 载时间 。在后 面还将 介 绍到金 属螯和 亲和层 析法。 2. 材料 抗体 (antibody, Ab) -Sepharose 活 化后被 泮灭处 理用做 对照的 Sepharose, 制备同 Ab-Sepharose, 但不 加抗体 或偶联 了 不相关 抗体细 胞或匀 浆组织 Tris/ 盐 / 叠氮盐 ( Tris/ saline/ azide, TSA ) 溶液 ( 2mmol/L Tris-HCl pH8 . 0, 0.14mol/LNaCl, 0.025%NaN3。 注意 :叠氮 钠有毒 ,应戴 手套) 裂解缓 冲液, 冰预冷 (TSA 溶 液含有 : 2% TritonX-100, 5mmol/L 碘乙 酰胺, 0.2U/mL 抑蛋 白酶肽 ,临用 前加入 PMSF 至 lmmol/L。 注 意:碘 乙酰胺 是一种 蛋白酶 抑制剂 ,可 防止 半胱氨 酸氧化 成二硫 键型半 胱氨酸 。对于 需要半 胱氨酸 活性的 酶应不 添加) 5% 去氧 胆酸钠 (过 滤除菌 ,室温 贮存) 洗涤液 (0.01mol/L Tris-HCl pH8.0, 0.14mol/L NaCl, 0.025% NaN3, 0.5% Triton X-100, 0.5 % 去氧胆 酸钠) Tris 缓 冲液, pH8.0 和 pH9.0, 冰预冷 (50mmol/L Tris-HCl, pH8.0 或 pH9.0, 0.1% Triton X- 100, 0.5mol/L NaCl) 三乙醇 胺溶液 ,冰 预冷 (50mmol/L 三 乙醇胺 pH11.5, 0.1% TritonX-100, 0.15mol/L NaCl) lmol/LTris-HCl, pH6.7, 冰预冷 柱贮 存液, 冰预冷 (TSA 溶 液含有 : lmmol/LEDTA + 20/ig/mL 庆大 霉素或 0.01% 乙基汞 硫代水 杨酸钠 ) 层析柱 离心管 (Beckman) 鱗 酸钠缓 冲液, pH6.3 (50mmol/L 磷酸钠 pH6.3, 0.1% Triton X-100, 0.5mol/L NaCl) 甘氨酸 缓冲液 (50mmol/L 甘氨酸 -盐酸 pH2. 5, 0.1% Triton X-100, 0.15mol/L NaCl) lmol/L Tris-HCl, pH9.0 其他用 于制备 Ab-Sepharose、 柱 层析、 SDS-PAGE、 银染和 免疫共 沉淀的 试剂和 设备 注意: 所有涉 及抗原 的操作 均应在 4t: 或 在冰上 进行。 3. 操 作步骤 可溶性 或膜结 合抗原 的分离 一套 有两个 不同的 Sepharose 柱:一 个预处 理柱除 去非特 异结合 的物质 ,一 个特异 柱用来 从细胞 或组 织裂解 物中分 离抗原 。层析 组分用 SDS^PAGE 和 银染分 析检测 抗原。 • 593 • 1) 层析柱 的制备 制备 一只活 化后被 淬灭的 Sepharose 预 处理柱 (5mL 充填床 体积) 和一只 Ab- Sepharose 免疫 亲和柱 ( 5mL; 每毫升 Sepharose 充 填体积 5mg 抗体 ), 将它 们串联 起来 (见图 8.16)。 预处理 柱中, Sepharose 可偶联 不相关 抗体。 柱的 大小可 改变; 调节 Sepharose 的量 和细胞 的 比例。 2) 裂解物 的制备 (1) 将 50g 细 胞悬浮 于用冰 预冷的 TSA 溶液中 ,使 浓度为 (1X108) 〜 (5X108) 细 胞 /mL, 或每 体积的 细胞或 匀浆组 织加入 1 〜 5 倍体 积用冰 预冷的 TSA。 加入 等体积 的 冰预冷 的裂解 缓冲液 ,在 4X: 搅拌 lh。 ( 2 ) 4000 X g 离心 l〇min 除去细 胞核。 倒出 上清并 保存。 图 8.16 免疫亲 和层析 装置图 若纯化 胞质内 (可溶 ) 的抗原 , 不必添 加去垢 剂 及其后 用到的 缓冲液 。去 垢剂只 用于细 胞裂解 和溶解 完整膜 蛋白。 (3) 若纯化 膜抗原 ,加 0.2 体积 5% 的 去氧胆 酸钠于 去细胞 核的上 清中, 41C 或冰上 放置10〇1丨11。转移至离心管100 000\€离心111。小心取上清并保存。 3) 安装 并洗柱 (1) 连接预 处理柱 和免疫 亲和柱 (见图 8.16)。 (2) 用 10 倍 柱体积 洗涤液 洗两个 柱子。 (3) 用 5 倍 柱体积 Tris 缓 冲液, pH8.0 洗柱。 ⑷用 5 倍 柱体积 Tris 缓 冲液, pH9.0 洗柱。 (5) 用 5 倍 柱体积 三乙醇 胺溶液 洗柱。 (6) 用 5 倍 柱体积 洗涤液 洗柱。 4) 抗原 的分离 (1) 将步骤 2) 中的 (2) 或 (3) 所 得上清 (保存 少量用 于分析 ) 加 样于预 处理柱 上 ,以 5 个 柱体积 /h 的 流速流 过预处 理柱和 相连的 特异柱 。收集 流出液 ,每管 相当于 所 加上清 体积的 1/10 〜 1/100。 装入 Sepharose 高 度约为 柱直径 2 倍的 “胖” 层析柱 ,可加 大流速 。一个 10~20mL 的注射 器可装 5mL Sepharose。 通 常载样 时间达 2d 而无不 良影响 , 但如果 载样时 间延长 ,可能 是由于 柱子堵 塞或裂 解液 太黏, 后者常 常是由 于存在 DNA 引 起的。 (2) 用 5 倍 柱体积 的洗涤 液洗柱 ,然后 关闭两 个柱子 的活塞 ,拆 开预 处理柱 和亲和 柱 的连接 。打开 亲和柱 的活塞 ,让 柱上 的液体 流至柱 床平面 。保存 所有洗 出液。 Sepharose 有一 定弹性 ,可排 干液体 至柱床 上端无 缓冲液 , 但要避 免胶干 涸导致 Sepharose 产生 裂隙。 • 594 • (3) 改变 缓冲液 的每一 步之间 [步骤 4) 的 (4) 〜 (8)], 按 如下方 法洗涤 免疫亲 和柱。 关闭 活塞并 拆下柱 的端托 。将注 射器连 到缓冲 液贮槽 上的出 液管口 ,吸出 所有管 中缓冲 液 ,将 管放入 另一缓 冲液的 贮槽中 ,用 注射器 抽吸使 缓冲液 充满出 液管后 ,拿 掉注射 器。 用缓冲 液洗涤 柱内壁 ,打 开活塞 ,使缓 冲液流 尽至柱 床平面 。将端 托松套 上层析 柱, 让缓冲 液流进 柱子使 液面高 于柱床 几厘米 。套 紧端托 并开始 洗涤或 洗脱。 (4) 用 5 倍柱 体积的 洗涤液 洗柱。 (5) 用 5 倍柱 体积的 Tris 缓冲液 (pH8.0) 洗柱。 (6) 用 5 倍柱 体积的 Tris 缓冲液 (pH9.0) 洗柱。 一些非 特异结 合的蛋 白质可 能在这 一步被 洗脱。 (7) 用 5 倍柱体 积的三 乙醇胺 溶液洗 脱抗原 。将每 一柱体 积的洗 脱液收 集于含 0.2 体积 lmol/LTris-HCl (pH6.7) 的 管子中 ,以 中和洗 脱液。 在某些 情况下 ,降 低三 乙醇胺 溶液的 pH 是为了 保护配 体的功 能活性 。理 想的 PH 应能完 全释放 配体 ,可用 SDS^PAGE 证 实洗脱 的彻底 程度。 (8) 用 5 倍柱 体积的 TSA 溶液 洗柱。 一 个柱子 可重复 使用多 次且在 TSA 溶液中 贮存于 4t 几年后 仍保 持活性 。贮 存期间 应注意 勿使柱 子变干 。使 用柱 贮存液 可防止 微生物 生长。 5) 检測洗 脱液中 的抗原 每份洗 脱液取 50fzL 进行 SDS-PAGE 和银 染分析 以检测 洗脱组 分中是 否含有 抗原。 再取 0.5~lmL 的加样 样品、 上样流 出物的 一部分 及洗脱 组分用 Ab-Sepharose 免 疫共沉 淀分析 和银染 检测以 确定柱 子是否 饱和。 若抗体 在洗脱 时脱落 ,可通 过蛋白 A-Sepharose 柱除 去抗体 。即 使是结 合力较 弱的鼠 IgGl 亚类也 可在 pH8 时 被大量 去除。 抗 原的低 pH 洗脱: 当 使用低 pH 缓 冲液时 ,一 些蛋白 质可被 洗脱得 更完全 且保留 更大的 天然活 性和含 较少的 杂质。 (1) 按上面 抗原分 离的操 作步骤 1) 的 (1) 〜 (5) 操作。 酸洗 脱前一 定要除 去去氧 胆酸钠 ,因为 它在由 酸性到 中性过 程中会 沉淀或 生成胶 状物。 (2) 用 5 倍柱 体积的 磷酸钠 缓冲液 洗柱。 (3) 用 5 倍柱 体积的 甘氨酸 缓冲液 洗脱。 将洗脱 组分收 集于含 0.2 倍体积 lmol/L Tris-HCl (pH9.0) 的管中 。收 集后立 即混匀 各管洗 脱液。 (4) 按上面 抗原分 离的操 作步骤 5) 分析 各洗脱 组分。 抗原 的单柱 纯化: 用 这种方 法可缩 短柱负 载时间 。由 于缩短 了操作 时间, 这种技 术适合 于上柱 时间太 长的黏 性裂解 物和 易于被 蛋白酶 水解的 蛋白质 。不需 要预处 理柱, 因为上 清是与 Ab-Sepharose 混合后 装柱的 。抗原 按上 面抗原 分离一 样洗脱 。此法 的缺点 是需要 操作者 更多的 观察等 待时间 和未通 过预处 理柱除 去非特 异 结合的 物质。 (1) 按 上面抗 原分离 法步骤 2) 的 (1) 〜 (3) 操作 ,得 到去细 胞核的 上清。 (2) 在烧瓶 中混悬 Ab-Sepharose 于 上清中 ,在摇 床上轻 缓振摇 3h 后静置 。倒 去大 部分 上清, 打开层 析柱活 塞并将 Ab-Sepharose 和 剩余的 上清倒 入柱子 ,加完 Sepharose 后, 将液面 放至柱 床平面 ,关闭 活塞。 (3) 按 上面抗 原分离 法步骤 4) 的 (3)~(5) 操作。 • 595 . 4. 方 法评注 1) 方 法特点 传统的 膜蛋白 纯化方 法是从 纯化膜 开始的 ,在 某些情 况下, 现在仍 然沿用 。但是 这种方 法很难 使膜纯 化超过 5 倍 ,且 产率通 常只有 10% 〜 40%。 免疫亲 和层析 法省去 了膜 的纯化 ,具 有简单 、快 速且回 收率高 的特点 。抗原 产率通 常可达 40% 〜 70%, 纯 度 可达起 始物的 1000 〜 10 〇〇〇 倍 。经过 再一次 的免疫 亲和层 析可进 一步提 高纯度 。使 用单克 隆抗体 最方便 ,但 经亲和 纯化的 多克隆 IgG 也 可使用 。本 法适用 于膜结 合抗原 蛋白和 胞内抗 原蛋白 的分离 ,对 于可溶 性蛋白 ,勿 需去垢 剂就能 完成。 2) 操 作条件 Ab-Sepharose 柱 (结 合比为 l〇mg 单克 隆抗体 /mLSepharose) 的实际 结合力 仅为理 论值的 2% ~20%。 对相 对分子 质量为 150 000 和 18 OOODa 的抗原 分别有 最低和 最高的 结 合力值 ,这 说明抗 原分子 大小可 能限制 着能否 进入亲 和介质 的孔隙 内与抗 体结合 。用 亲和 常数为 (2X107)~(4X108)M-1 的 单抗可 得到满 意的纯 化效果 。上样 时应多 加一点 抗原使 柱饱和 ,这 样能得 到较高 的抗原 纯度和 产量, 并减少 抗体从 柱上脱 落随抗 原一起 洗脱 下来。 使用 去氧胆 酸钠是 由于它 溶解膜 蛋白比 Triton X-100 更有效 。但是 ,由 于去 氧胆酸 钠能 使细胞 核释放 DNA, 所以 它必须 在去细 胞核之 后加入 裂解液 。尽管 去氧胆 酸钠在 高 pH 洗脱时 能取代 Triton X-100, 去 氧胆酸 盐在低 pH 和高盐 中能变 成胶状 。去 氧胆 酸钠和 非离子 去垢剂 都可溶 解能与 膜相互 作用的 蛋白质 亚单位 。添 加磷脂 、低 浓度的 Triton X-100 和温和 的去垢 剂都曾 被用于 保护膜 蛋白。 用 酸或碱 洗脱下 来的蛋 白质抗 原通常 中和后 可复性 ,但 也有一 些蛋白 质抗原 不可逆 地变 性了。 某些抗 原的结 构用酸 而不是 用碱洗 脱可不 被破坏 ,而另 一些抗 原的结 构用碱 而不是 用酸洗 脱可不 被破坏 。有 些抗 原在低 pH 而 不是高 pH 被洗 脱下来 ,而另 一些抗 原情 况则刚 好相反 。对每 种抗原 -抗体 结合物 ,洗脱 特定抗 原和杂 质蛋白 的最优 pH, 必 须通 过实验 确定。 3) 常见问 題及解 决措施 免疫亲 和层析 是先洗 脱下其 他所有 非特异 结合的 蛋白质 之后再 从免疫 亲和柱 上洗脱 所需 的单一 蛋白质 。因此 目标蛋 白质抗 原可能 会混有 其他蛋 白质, 这取决 于恰当 的洗脱 条件。 如果蛋 白质要 进行氨 基酸组 成分析 或测序 ,必 须要明 确是否 有杂质 混入。 可采用 单向 凝胶电 泳在杂 蛋白的 洗脱过 程中进 行跟踪 分析以 及分析 目标蛋 白质的 纯度。 若蛋白 质不纯 ,需优 化洗脱 条件, 以保证 除去杂 蛋白。 四 、金属 螯合亲 和层析 氨基 或羧基 端含有 6 个 连续组 氨酸的 基因工 程重组 蛋白可 借助于 用氮基 三乙酸 (NTA, —tic acid) 共 价固定 的含镍 (Ni2+) 树月旨 来纯化 。该技 术又称 为金属 整含亲 和层析 (metal-chelate affinity chromatography, MCAC), 能 很容易 地纯化 变性蛋 白或天 然蛋白 。本 单元的 安排如 下:原 理和设 计部分 介绍如 何构建 含有组 氨酸尾 部的融 • 596 • 合 蛋白; 接着 介绍 天然含 组氨酸 尾融合 蛋白的 表达和 MCAC 纯化 步骤; 其余两 部分将 介 绍变性 组氨酸 尾融合 蛋白的 MCAC 纯化步 骤及透 析复性 和固相 复性的 办法; 最后介 绍纯化 蛋白的 鉴定和 NTA 树脂 的再生 。上述 纯化步 骤适用 于任何 蛋白表 达体系 。在大 规模制 备前, 应该先 了解蛋 白是否 表达为 可溶性 形式; 如果多 数以包 涵体形 式存在 ,少 量 的可溶 性部分 依然可 以按上 述步骤 纯化; 即便 全部都 是不溶 性蛋白 ,也 可按变 性蛋白 的纯 化步骤 进行。 全部实 验器皿 、试剂 、设 备均 应用适 宜的方 式无菌 消毒。 (一) 原理 和设计 MCAC 只用 于已知 cDNA 序列的 蛋白质 ,将 cDNA 插 入相应 的表达 载体中 ,要求 此 cDNA 编 码的氨 基或羧 基端必 须编码 6 个以 上的组 氨酸, 起始甲 硫氨酸 必须位 于氨基 端, 终止密 码位于 羧基端 。为此 ,可在 PCR 引物的 5' 端引 进特殊 的限制 性酶切 位点。 设计 引物时 ,注 意勿使 cDNA 的插 入和表 达引起 阅读框 的改变 。例如 ,引物 (A): 5'-GGGNNNNNNATGCATCATCATCATCATCAT … N15~ _ 30- 3' , 其中 GGG 可 促进亚 克隆前 PCR 产物 的酶切 消化, NNNNNN 代表 与所选 载体相 宜的特 殊限制 性酶切 位点, N15~3〇 是 针对第 二个起 始密码 子后的 cDNA 序 列的。 3' 端引 物应该 包括另 一个酶 切位点 和含有 终止密 码子的 cDNA 序列 的最后 5 〜 10 个密码 子序列 。引物 (B): 5'-GGGNNNNNNTTAATGATGATGATGATGATG". N15 _ 30-3' , 为 3, 端反义 弓丨物 ,可 将组 氨酸尾 引入羧 基端, 此时所 采用的 5' 端引物 也应该 包括另 一个酶 切位点 和含有 cD- NA 序列 的最初 5~ 10 个 密码子 序列。 另外 ,还可 以先将 cDNA 亚克隆 至表达 载体后 ,再 合成一 个带有 6 个 组氨酸 序列和 合适限 制性酶 切位点 突出序 列的对 应互补 寡核苷 酸片段 ,插入 亚克隆 cDNA 的任 一末端 附近, 而不改 变阅读 框架。 某 些公司 (如 Qiagen、 Novagen、 Invitreogen) 出 售的表 达系统 ,载 体上已 含有寡 聚组 氨酸尾 序列及 附近的 蛋白水 解酶裂 解位点 ,以便 纯化后 及时切 除组氨 酸尾部 。使用 时 ,只需 直接将 cDNA 亚克隆 插入载 体即可 。现在 ,已 发展了 一批可 在细菌 、酵母 、杆 状病毒 、痘苗 (vaccinia) 中表达 的含不 同真核 启动子 的组氨 酸融合 蛋白表 达载体 。本 节我们 介绍的 操作步 骤适于 NovagenpET 载体 的表达 和纯化 (图 8.17), 稍 加改良 ,同 样 适于其 他载体 系统。 (二) 可溶性 组氨酸 尾融合 蛋白的 MCAC i. 原理 现 以组氨 酸融合 蛋白在 £. 中的表 达和纯 化为例 。所 需的蛋 白诱导 表达后 ,收 集细菌 裂解物 ,直接 加入含 Ni2 + -NTA 树 脂柱上 ,用 含咪唑 (imidazole) 的 MCAC 缓冲 液洗脱 ,可 收集到 近乎纯 化的蛋 白质。 • 597 • 图 8.17 pET 结构 示意图 2. 材料 M9ZB 培养基 ,含 50pg/mL 青 霉素和 25^g/mL 氯霉素 pET (表 达组氨 酸尾融 合蛋白 的质粒 ) /pLysS 转化的 £. coh BL21 (DE3) 或其他 适宜的 宿主菌 (Novagen) O.lmol/LIPTG, 过 滤除菌 NTA 树脂悬 液:按 50% (m/V〇 的比例 悬浮于 20% (V/V) 的乙醇 (Qiagen) 中 50mmol/L NiS〇4.6H2〇 MCAC 缓冲液 (包括 MCAC-0、 MCAO20、 MCAO40、 MCAC-60、 MCAO80、 MCAC-100、 MCAC-200、 MCAC4000) MCACEDTA 缓冲液 (20mm〇VL Tris-HCl pH7.9, 0.5mol/L NaCl, lmmol/L PMSF, 4X: 贮存期 <6 个月) 1 50 cm x 混合 蛋白酶 抑制剂 10% (V/V) Triton X- 100 1. 5cm X l〇cm 玻璃或 聚丙烯 层析柱 Beckman JA-10 和 Ti-7〇 转 头或其 他相当 的转头 • 598 • 液体 培养基 中细菌 生长所 需的其 他试剂 和设备 3. 试 剂配制 MCAC 缓冲液 (4*C 贮存期 <6 个月 ): MCAC-0 缓冲 液包括 20mmol/L Tris-HCl pH7.9, O.5mol/L NaCl, lmmol/L PMSF〇 MCACM000 缓冲 液包括 20mmoI/L Tris-HCl pH7. 9, 0.5mol/L NaCl, lmmol/L PMSF, lmol/L 咪唑。 临 用前加 PMSF。 PMSF 贮 存液为 0.2mol/L 的乙 醇溶液 ,可 置于室 温下。 所 有用于 Ni2 + -NTA 树脂的 缓冲液 均含有 较高的 盐浓度 ,以降 低蛋白 质和树 脂之间 的 静电相 互作用 。当较 低的盐 浓度被 使用时 ,将 导致 不想要 的蛋白 质与树 脂的非 特异性 结合。 MCAO20、 MCAC-40、 MCAC-60、 MCAC-80、 MCAC-100、 MCAC-200 缓冲液 : 上 述含有 不同咪 唑浓度 的缓冲 液的制 备是按 不同的 比例将 MCAC0 和 MCAC-1000 混 合 ,如对 MCAO40, 则为 96:4(W\〇, MCAC-0、 MCACM000。 15〇x 蛋白酶 抑制剂 混合物 : Pt 存 液包括 2mg/mL 的抑蛋 白酶肽 (aprotinin) 水 溶液, lmg/mL 的 局抑蛋 白酶肽 (leupeptin) 水 溶液, lmg/mL 的胃酶 抑制剂 (pepstatin)A 甲醇 溶液。 临用时 ,将 1.5 份贮 存液与 5.5 份无 菌水混 合即可 。蛋白 酶抑制 剂可从 Sigma 或 U. S. Biochemical 公 司购得 。贮存 液和工 作液在 -201C 稳定 >6 个月。 4. 操 作步骤 融合 蛋白的 表达: (1) 在 10mLM9ZB 培养基 中接种 pET 转 化的宿 主菌, 37t: 振 摇培养 过夜。 (2) 取上 述过夜 培养物 lmL 接种入 100mLM9ZB 培养 基中, 37X: 振摇 培养至 OD6〇() = 0.7— 1 .0〇 (3) 加入 lmL 0.1mol/L IPTG ( 终浓度 lmmol/L), 继续在 37X: 振 摇培养 1 〜 3h。 培养 时间视 表达蛋 白的溶 解状态 而定, lh 时以可 溶蛋白 为主, 3h 时主 要为 不溶性 蛋白。 (4) 在 4t:, 4400 X g (相当 于使用 Beckman JA-10 转 头时的 500〇r/min) 离心 lOmin。 弃上清 ,洗 涤后于 -70X: 冻 存沉淀 (大约 0.5g 湿重 )。 亲和层 析柱的 制备: (5) 将 5mL NTA 树脂悬 液加到 1.5cmX l〇cm 玻 璃或聚 丙烯层 析柱中 ,排掉 液体, 注意 勿使柱 床变干 (柱床 体积约 2. 5mL)。 (6) 用 7.5mL (约 3 倍柱床 体积) 的去 离子水 洗涤层 析柱。 (7) 用 12.5mL (约 5 倍柱 床体积 ) 50mmol/LNiSCV6H2O 洗涤 层析柱 ,使 之荷电 (NTA 树 脂实际 上是与 NTA 共价 稱联的 SepharoseCL-6B, 呈白色 ,与镜 离子结 合后, 变为浅 蓝绿色 )。 荷电后 的树脂 ,用 10 倍柱床 体积的 20% 的乙醇 洗涤, 再保留 1 倍体 积的 20% 的乙醇 ,密 封后 ,可于 4X: 下贮存 Id 以上。 (8) 用 12.5mLMCAC-0 缓冲液 洗涤层 析柱。 • 599 . 细菌匀 浆及抽 提物的 制备: (9) 将上 面制备 的表达 菌沉淀 置于冰 上融化 ,加 5mL MCAOO 缓 冲液和 33pL 的 150X 混合蛋 白酶抑 制剂, 反复吹 打混匀 、超声 或匀浆 ,所有 操作均 于冰上 进行。 注意, pLysS 质粒可 以编码 内源性 溶菌酶 ,故 可免加 外源性 溶菌酶 。细胞 裂解后 ,黏 度逐渐 增加。 操 作中由 于全部 MCAC 缓冲液 都含有 PMSF, 故昂贵 的混合 蛋白酶 抑制剂 仅在粗 提液中 使用。 禁止 使用离 子型去 污剂, 它们会 阻断蛋 白质与 树脂的 结合。 (10) 加0.0511^10%(饥/\〇的丁出〇11父-100(终浓度0.1%),彻底混合,静置 — 70*C 10min〇 (11) 置 于冰上 ,再融 化菌体 裂解液 ,在 4t:, 260 000 Xg ( 相当于 Beckman Ti 转 头的 50 000r/min) 下离心 60min。 弃沉淀 ,收 集上清 ,置 于冰上 或贮于 -70X: 待用。 同时 ,吸出 10/xL 贮于 -701C, 留 待进行 SDS~PAGE 分 析用。 禁止 使用离 子型去 污剂, 它们会 阻断蛋 白质与 树脂的 结合。 注意: Triton X-100 的加入 ,在 较低 的离心 速度时 ,会影 响沉淀 效果或 使蛋白 质失活 ,如 果这种 情 况发生 ,可 采用反 复冻融 3 次的办 法制备 细菌裂 解物, 然后在 4X: 下 低速短 时离心 ,如 27 000 下离心 60min ( 相当于 Beckman JA-20 转头的 15 000r/min)。 蛋白质 的纯化 : (12) 在冰 上融化 细菌抽 提物, 加样至 Ni2 + -NTA 层析 柱上, 流速为 10 〜 15mL/h, 收集流 出液, 保留做 SDS-PAGE 分析用 。荷电 NTA 树脂 的交换 容量为 5 〜 10mg 可溶性 组 氨酸融 合蛋白 /lmL 充填树 脂床。 (13) 用 25mLMCAC-0 缓冲液 洗涤层 析柱, 流速为 10~15mL/h, 弃洗 脱液。 (14) 以 10 〜 15mL/h 的 流速, 用 MCA(^20、 MCAC>40、 MCAO60、 MCAO80、 MCAC-100、 MCAC-200 和 MCAC-1000 缓冲 液连续 洗脱, 每种用 25mL。 每个组 分收集 2.5mL 的 洗脱液 ,用于 SDSPAGE 分析。 多数 杂蛋白 将集中 于第二 和第三 组分中 被洗脱 下来; 而多数 组氨酸 尾融合 蛋白主 要在含 100~ 200mmol/L 咪哇的 MCAC 中 (即 MCA0100~MCA0200) 被洗 脱下来 。含有 较长组 氨酸尾 (>10) 的融合 蛋白与 Ni2 + -NTA 的亲和 力更大 ,须 用较 大的咪 唑浓度 才能洗 脱下来 。有条 件的话 ,可用 50mL 含 0~400mmol/L 咪 唑的线 性梯度 MCAC 液 ,进 行线性 洗脱。 每种 融合蛋 白的最 佳洗涤 和洗脱 条件均 不相同 ,需 要摸索 。一 旦条件 确定, 以后完 全可以 只需用 一种缓 冲液就 能加样 、洗脱 和分离 抽提物 ,即 使用能 保持融 合蛋白 依然与 Ni2+-NTA 结 合的咪 唑浓度 最高的 MCAC 缓冲液 (MCAC-40 或 MCAC*60), 这 将大大 简化操 作步骤 ,并减 少非特 异性结 合蛋白 的量。 (15) 用 15mL 的 MCACEDTA 缓冲 液洗脱 ,收集 2.5mL 组分, 流速为 10~ 15mL/h〇 这个组 分中可 能还含 有结合 比较紧 密的蛋 白组分 。当 镍被 EDTA 移除后 ,柱 子的 蓝绿色 随之消 失 ,若再 使用时 ,必 须对树 脂再生 ,重 新荷电 (见亲 和层析 柱的制 备步骤 2~4)。 如果蛋 白质已 被咪唑 充分洗 涤下来 , EDTA 的洗涤 步骤便 可省去 。柱 子用 MCAC-0 缓冲液 重新平 衡后再 使用。 一般在 EDTA 洗涤前 ,柱子 可使用 3~5 次 ,然后 再荷电 。一 根柱 子只适 于一种 蛋白的 分离。 (16) 组 分中洗 脱蛋白 的分析 。可在 280nm 波长 处自动 连续紫 外监测 洗脱液 中的蛋 白含 M •,也 可 个别测 定每个 样品收 集液的 〇D28〇 值 。注意 ,在 280nm 波长处 ,咪 唑也有 吸 收值。 • 600 • 现介绍 一种简 便的测 定办法 ,取 2ML 未稀释 的浓缩 的蛋白 染料测 定试剂 (BioRad) 滴在蜡 膜上, 再与 8FL 待测洗 脱液充 分混合 ,若立 即出现 蓝色, 说明蛋 白存在 。但是 Triton X-100 也 能产生 很强的 蓝色 ,故 必须从 洗涤和 洗脱缓 冲液中 除去。 (17) 收集 所有含 蛋白质 的组分 ,混 合后取 10pL 留待 SDS-PAGE 分析。 余者放 -70X: 或液氮 中保存 。如果 另一种 缓冲液 更适用 ( 有利于 组氨酸 尾的水 解去除 ), 可在 贮 存前对 所选择 的缓冲 液透析 ,移除 MCAC 缓 冲液。 (18) 融合 蛋白质 SDS-PAGE 分析 和水解 处理, 见后。 (三) 不溶 性组氨 酸尾融 合蛋白 的变性 MCAC 1. 原理 外源蛋 白在细 菌或细 胞中的 高表达 必将导 致表达 蛋白的 溶解度 降低, 在细菌 中不溶 性蛋 白形成 包涵体 ,常用 一些促 溶剂如 胍盐、 尿素、 SDS 去溶 解它们 。但 是这些 试剂能 使蛋 白质变 性并破 坏对亲 和层析 至关重 要的蛋 白质二 级结构 (如麦 芽糖结 合蛋白 或谷胱 甘肽 巯基转 移酶等 )。 MCAC 方 法的一 个重要 优点是 不管蛋 白质是 否变性 ,它的 寡聚组 氨酸尾 总能与 Ni2+-NTA 树脂 结合。 在变性 MACA 中 ,用 6mol/L 的胍盐 溶解蛋 白质, 而 且全部 亲和层 析过程 都是在 胍盐中 进行的 。而 后通过 透析使 蛋白质 复性。 2. 补 充材料 GuMCAC-0^ GuMCAC-20^ GuMCAC-40, GuMCAC-60^ GuMCAC-80. GuMCAC- 100, GuMCAC%500 缓冲液 (见上 一方法 ) GuMCAOEDTA 缓冲液 (20mmol/LTris-HClpH7.9, 0.5mol/LNaCl, 6mol/L 盐 酸胍, 0.1mol/LEDTApH7.9, 4*C 贮存期 <6 个月) 适于 融合蛋 白裂解 或长期 贮存的 缓冲液 Beckman JA-20 转 头或其 他相当 的转头 透 析所需 的试剂 和设备 3. 试 剂配制 GuMCAC 缓冲液 (41C 贮存期 <6 个月 ): GuMCAGO 缓冲 液包括 20mmol/L Tris-HCl pH7.9, 0.5mol/L NaCl, 6mol/L 盐 酸胍。 GuMCAO500 缓冲 液包括 20mmol/L Tris-HCl pH7.9, 0.5mol/L NaCl, 6mol/L 盐 酸胍, 0.5mol/L 咪唑。 含不 同咪唑 浓度的 GuMCAC-20 及其他 GuMCAC 缓冲 液:以 不同的 比例将 GuM- CAOO 和 GuMCAC500 混合 。如对 GuMCAC-20, 则为 96 : 4 ( V7 V), GuMCAC-0、 GuMCAC-500〇 4. 操 作步骤 融合 蛋白的 表达: • 601 • 按前面 可溶性 组氨酸 尾融合 蛋白的 MCAC 方法制 备表达 组氨酸 尾融合 蛋白的 co/t 的沉淀 。如' 果暂时 不用, 可将沉 淀贮于 -70C。 亲和层 析柱的 制备: 按前面 方法制 备亲和 层析柱 。用 12. 5mLGuMCAC-0 缓冲液 洗涤层 析柱。 注意勿 使柱床 面液体 排干。 制备 细菌抽 提物: (1) 置冰上 解冻细 菌沉淀 ,重新 悬浮于 5mLGuMCAC-0 缓 冲液中 ,反 复吹打 、超 声或 匀浆。 (2) -70X: 冻存 lOmin, 然后 于室温 下解冻 ,以 确保菌 体裂解 完全。 可 以不加 蛋白酶 抑制剂 ,因为 狐盐可 使蛋白 酶失活 。此 步操 作也不 需要加 Triton X-100。 随后的 步骤可 在室温 下进行 。如采 用固相 复性法 ,保持 低温操 作比较 有利。 (3) 使 用玻棒 、离心 或磁力 搅拌器 轻轻混 合样品 。在 4*C、 27 00〇xg 下离心 30min ( 相当于 Beckman JA-20 转头的 15 OOOr/min)。 弃沉淀 ,将 上清收 集到一 干净容 器中, 吸出 1(VL 贮于 -70X:, 留 待进行 SDS-PAGE 分析用 。若不 立即进 行实验 ,可将 上清贮 于 -70t: 备用。 蛋白质 的纯化 : (4) 融化 冰冻之 上清, 加样至 Ni2 + -NTA 柱 的顶部 ,以 10~15mL/h 的流速 通过柱 子 。收集 流出液 ,保留 10/iL 为 SDSPAGE 分 析用。 (5) 用 25mLGuMCAC-0 缓冲 液洗涤 柱子, 流速为 20~30mL/h。 弃流出 液体。 (6) 以 10 〜 15mL/h 的流速 ,每 次用 25mL 的〇1^0八〇20、〇111\^八〇40、〇1_^- CAC60、 GuMCAC-100、 GuMCAC-500 缓冲 液连续 洗脱。 每个组 分收集 2.5mL 的洗脱 液 ,留做 SDS-PAGE 分析。 多数未 结合的 杂蛋白 将集中 于第二 和第三 组分中 被洗脱 下来。 在变性 条件下 ,组氨 酸尾的 结合稍 差 ,故洗 涤和洗 脱缓冲 液中咪 唑的浓 度勿需 太高。 (7) 用 15mLGuMCAC-EDTA 缓冲液 洗脱, 流速为 20~30mL/h, 并收集 2.5mL 的 洗脱液 组分。 (8) 鉴定含 有蛋白 质的洗 脱组分 ,将它 们收集 在一起 ,转入 透析袋 ,密封 。暂 不使 用的 组分, 可放入 -70t: 保存, 待用。 在 SDS 存在时 ,胍 盐将沉 淀出来 。因此 , 在进行 SDS-PAGE 前必须 将其透 析除去 。或者 采用另 — 种办法 ,即 在用缓 冲液洗 涤层析 柱时, 逐渐将 6mol/L 的胍盐 转变为 8mol/L 的尿素 。这 样获 得的含 尿 素组分 ,不需 透析, 就可直 接进行 SDSPAGE 分析, 或注射 到动物 体内诱 导抗体 产生。 纯化蛋 白的透 析复性 : (9) 配制 另一种 缓冲液 更适宜 于组氨 酸尾的 水解去 除或长 期贮存 ,并 加入足 够的胍 盐至终 浓度为 4mol/L。 (10) 将制 备的蛋 白质在 4t:, 对着 lOOOmL 含 4mol/L 胍盐 的缓冲 液透析 2h 以上。 透 析膜的 分子质 量栽留 (MWCO) 值必 须小于 融合蛋 白的分 子质量 ,一般 12 〜 14kDa 的 MWCO 就足 够了。 (11) 移去 500mL 含 4m〇l/L 胍盐 的透析 缓冲液 ,加入 500mL 无 胍盐的 缓冲液 ,继 续透析 2h 以上。 再重复 一次。 有 些蛋白 质的透 析复性 斋要较 长时间 ,缓 冲液中 胍盐的 浓度也 须慢慢 地降低 。不同 蛋白质 处理的 . 602 • 条件 必须在 实践中 摸索。 (12) 将透析 袋取出 ,移 入另一 个含有 lOOOmL、 4X: 的无 胍盐新 鲜缓冲 液的容 器中, 再继 续透析 2h 或过 夜。 (13) 取出透 析袋中 的液体 ,分装 成几份 ,贮于 -70X: 冰 箱或液 氮中。 如透析 过程中 ,蛋白 质发生 沉淀, 则必须 采用固 相复性 的方法 ,即蛋 白质从 柱上洗 脱之前 先进行 复性 (见后 )。 (14) 融 合蛋白 质洗脱 组分的 SD&PAGE 分析 和水解 处理, 见后。 (四) MCAC 纯化蛋 白的固 相复性 1. 原理 如 前所述 ,在 透析移 除变性 物时偶 尔会出 现蛋白 质沉淀 ,可能 是由于 蛋白质 重折叠 时分 子间产 生缠绕 和凝聚 。为 防止蛋 白沉淀 的出现 ,可采 用固相 复性法 。蛋 白质 的抽提 物 在变性 条件下 与层析 柱结合 ,先通 过一系 列的洗 涤去除 变性剂 而保留 靶蛋白 ,最 后在 天然条 件下, 将复性 的靶蛋 白从柱 上洗脱 下来。 2. 补 充材料 1:1 (WV〇 MCAC~20、 GuMCAC~20 缓冲液 3:1 (WV) MCAC~20、 GuMCAC~20 缓冲液 7:1 (V7V〇 MCAC*20、 GuMCAC-20 缓冲液 3. 操 作步骤 按上 面不溶 性组氨 酸尾融 合蛋白 的变性 MCAC 的操 作步骤 进行蛋 白表达 、制 备柱、 裂 解细菌 。蛋白 纯化第 二步开 始按以 下操作 : (1) 用 25mL 的 1:1 (V/V) MCAO20、 GuMCAO20 缓冲液 洗涤层 析柱, 注意勿 使柱床 面液体 排干。 (2) 用 25mL 的 3:1 (V/V) MCAO20、 GuMCAO20 缓冲液 洗涤层 析柱。 (3) 用 25mL 的 7:1 (V/V) MCAC-20、 GuMCAC-20 缓冲液 洗涤层 析柱。 (4) 用 25mL 的 MCAC-20 缓冲液 洗涤层 析柱。 再接着 上法介 绍的蛋 白纯化 操作步 骤的第 三步进 行操作 。如 果有条 件采用 50mL 从 (100%GuMCAC-20) ~ (10096MCAC-20) 的线性 梯度缓 冲液缓 慢洗脱 l~2h, 同样 可获得 充分复 性的蛋 白质。 (五) 纯化 融合蛋 白的分 析和水 解处理 1. 原理 各 种纯化 操作是 否成功 ,可 在每一 阶段操 作完成 后进行 SDSPAGE 分析。 如果融 合蛋白 含有蛋 白酶水 解位点 ,也可 对其进 行水解 处理, 以移去 组氨酸 尾部。 • 603 • 2. 材料 经 MCAC 柱纯化 的各收 集组分 (如粗 抽提液 、加 样后的 流出液 、纯 化蛋白 、变性 或复 性的等 关键步 骤的流 出液) MCAOO 缓冲液 . SDS*PAGE、 Xa 因子或 凝血酶 (thombin) 水解融 合蛋白 、透 析等操 作中所 需的试 剂 和设备 3. 操 作步骤 (1) 将 各收集 组分置 于冰上 ,融化 待分析 的组分 。将下 列样品 ,即恥 L 粗抽 提液、 5ML 粗 样品流 出液、 10/xL 第二 次洗脱 组分及 10/^L 第三 次洗脱 组分分 别与等 体积的 2 x SDS 样品 缓冲液 混合。 (2) 加样 并进行 SDS^PAG 电泳 ( 标准胶 尺寸为 limnXl4CmXl6Cm)。 鉴定 纯化蛋 白 条带。 注意, 样品中 的胍盐 事先必 须透析 除去。 (3) 融 化其余 待分析 的含融 合蛋白 的组分 ,对所 选择的 蛋白水 解缓冲 液透析 和进行 水 解反应 。必 要的话 ,水 解反应 后再对 贮存缓 冲液进 行透析 ,然 后冰冻 贮存。 (4) 被水 解下来 的组氨 酸尾可 通过透 析去除 ,也 可以借 助超滤 (还 可以浓 缩蛋白 质 )、 排阻 层析、 第二次 MACA ( 见前面 可溶性 组氨酸 尾融合 蛋白的 MCAC 蛋 白纯化 (1) 〜 (6) 步) 去除。 第二次 MACA 的优点 是组氨 酸尾及 任何未 裂解的 融合蛋 白都将 与层析 柱结合 ,只 有水解 后的蛋 白才出 现在蛋 白纯化 第一步 的洗脱 液中。 充分回 收每一 组分 中的蛋 白质。 如果实 验中采 用其他 载体, 而且融 合蛋白 不含有 Xa 因子 或凝血 酶水解 位点; 或者 组氨酸 尾并不 干扰 随后的 研究, 则可以 省去水 解步骤 。组 氨酸尾 的存在 一般不 会影响 蛋白质 的生物 学功能 ( 见方法 评注 )。 (六) NTA 树脂 的再生 1. 原理 NTA 树脂 可以反 复结合 或去除 Ni2+, 长 期使用 后某些 蛋白质 会堆积 在柱上 ,降低 树脂的 效率, 导致流 速减低 或结合 Ni2+ 离子后 不出现 蓝绿色 。定 期清洗 和再生 树脂, 有 利于树 脂的长 期循环 使用。 2. 材料 去离 子溶液 (stripping solution): 0.2mol/L 乙酸 /6mol/L 盐酸胍 2% (m/V) SDS 20%、 25%、 50%、 75%、 1〇〇9(> 乙醇 0. lmol/L EDTA, pH8.0 • 604 • 3. 操 作步骤 (1) 用 5mL 去离子 溶液洗 涤树脂 。注意 勿使树 脂顶端 干涸。 (2) 用 5mL H20 洗涤。 (3) 用 2.5mL2% SDS 溶液 洗涤。 (4) 依次用 25%、 50%、 75% 和 100% 乙醇 溶液各 2. 5mL 洗涤。 (5) 再 依次用 75%、 50%、 25% 乙醇 溶液各 2. 5mU 先涤。 (6) 用 2.5mL H20 洗涤。 (7) 用 12.5mL pH8.0 的 0.1mol/L EDTA 洗涤。 (8) 用 7.5mLH20 洗涤, 然后进 行荷电 (Ni2+) 步骤 (见 亲和层 析柱的 制备) 或 者下面 的步骤 (9) 反应。 (9) 加 2.5mL 的 20% 乙醇溶 液到树 脂中, 4X: 贮存。 (七) 方 法评注 1) 背 景知识 金属 螯合亲 和层析 MCAC 又称 固相金 属亲和 层析或 IMAC, 1975 年 首先用 于蛋白 质 的纯化 。其 工作原 理是基 于蛋白 质表面 的某些 氨基酸 ,如组 氨酸、 色氨酸 、酪 氨酸、 苯 丙氨酸 ,能 可逆地 与某些 可转移 金属离 子结合 ,而 这些金 属离子 事先已 借助一 些螯合 基 团共价 结合到 固相支 持物上 。特 别是组 氨酸, 在溶液 中存在 过量游 离金属 离子时 ,也 能 选择性 地与固 相化的 金属离 子结合 。铜 和镍与 组氨酸 的亲和 力最大 。含 有磷酸 化氨基 酸 (如磷 酸化丝 氨酸、 磷酸化 苏氨酸 、磷 酸化酪 氨酸) 的蛋白 质和肽 ,也 可通过 末端磷 酸基 团选择 性地与 Fe3+ 结 合而用 MCAC 方法 纯化。 在 MCAC 中 经常使 用的螯 合基团 是亚氨 二乙酸 (iminodiacetic acid, IDA)。 二价配 位体 ( tridentate ) 或 IDA 都 能与铜 、镇 、梓、 钴等二 价离子 配位球 ( coordination sphere) 内的 3 个位 点结合 。但是 ,铜与 IDA 结合时 ,仅 剩有 1 个 位点能 与蛋白 质相互 作用; 与镍结 合时, 3 个位点 都能与 蛋白质 作用。 因此, Cu2 + -IDA 复合 物在柱 上很稳 定 ,但 与蛋白 质结合 的能力 较低。 相反, Ni2+-IDA 复 合物能 有效地 与蛋白 质结合 ,而 Ni2 + - 蛋 白质复 合物更 容易从 固相物 上解离 下来。 另一 种五价 配位体 (pentadentate) 的螯合 基团也 常用于 MCAC 中, 即三羟 甲基乙 — 胺 ( iV, iV, N'-tris carboxymethyl ethylenediamide) 或 TED 基团 ,它能 与金属 离子的 5 个配位 键结合 成高稳 定的金 属离子 -TED 复合物 。然而 ,对有 6 个 配位键 的金属 离子而 言, 只剩下 1 个位点 能与蛋 白质结 合了。 —种新 的金属 螯合物 —— 氮基 三乙酸 (nitrilotriaceticaad, NTA) 已问世 ,并 发展 为方便 、价 廉的 组氨酸 残基纯 化蛋白 的工具 。四价 配位体 (quadridemate) NAT 经由连 接臂与 Sepharose CL-6B 共价偶 联结合 ,与配 位数为 6 的金 属离子 结合形 成极稳 定的化 合物 。与 NTA 结 合后, Ni2+ 的 八面体 配位球 (octahedral coordination sphere) 内 还有两 个位点 可与蛋 白质表 面的电 子供体 (如组 氨酸) 结合。 因此, NTA 比 IDA 的优 越性在 于 Ni2+ 有 4 个 ( 而不是 3 个) 配位点 。这就 使金属 离子从 固相支 持物上 脱离下 来的可 • 605 • 能性减 到最小 ,同时 也使纯 化条件 变得更 严厉。 NTA 也能与 Cu2+ 离 子高亲 和结合 ,但 占据了 所有的 配位点 ,而使 MCAC 失效。 组 氨酸残 基能与 固相化 Ni2+ 离子 结合的 特点可 用于纯 化表面 组氨酸 残基含 量高的 蛋白质 。固 相化 Ni2+ 或 Cu2+ 与天 然蛋白 结合的 Kd 约 (1 x 1〇_5 ) 〜 (17xl〇_5)m〇l/L。 如 果在蛋 白质的 裸露端 ,如氨 基或羧 基端, 用重组 DNA 技术 ,引 进组 氨酸的 短片段 (6 〜 10 个组氨 酸残基 ), 还可 使亲和 力进一 步增加 。组氨 酸尾与 Ni24-NTA 复 合物的 Kd 值 ,在 pH8.0 时为 10_13mol 数量级 ,即使 存在去 污剂、 乙醇、 2mol/LKCl、 6m〇VL 胍盐、 8mol/L 尿素 也不受 影响。 组氨 酸尾与 Ni2 + -NTA 树 脂结合 是通过 组氨酸 残基的 咪唑环 的侧链 。在 pH>7.0 时 ,咪唑 侧链去 质子带 有净负 电荷; 在 pH5. 97 时, 50% 的组 氨酸质 子化; pH<4. 5 时 ,全部 组氨酸 质子化 ,不与 Ni2+-NTA 起反应 。故 有两 种办法 使组氨 酸尾从 Ni2 + -NTA 树脂 上解离 下来。 一是在 固定的 pH 下, 逐渐增 加咪唑 的浓度 ,将组 氨酸尾 从 Ni2 + -NTA 树 脂上置 换下来 。这种 方法有 较大的 通用性 ,即 对天然 和变性 MCAC 均 适用 ,缓 冲液的 制备也 较容易 。第 二种方 法不断 增加缓 冲液的 pH 洗脱组 氨酸尾 ,所得 的 蛋白纯 度很高 ,其 主要缺 点是必 须在不 同的温 度下维 持准确 pH, 而且 某些蛋 白质不 可 能耐受 极端的 pH 变化。 本文采 用的是 第一种 方法。 相对 与其他 融合蛋 白体系 ,设计 有关小 的组氨 酸尾有 其优点 ,如 加入 6 个组 氨酸仅 增加 0.72kDa 的蛋 白质的 质量; 而其 他融合 蛋白体 系连接 的是很 大的亲 和基团 (巯基 - S- 转 移酶、 A 蛋白 、麦芽 糖结合 蛋白、 lacZ, 它 们的分 子质量 分别为 26kDa、 30kDa、 40kDa 和 116kDa), 必须 将它们 去除后 才能恢 复正常 蛋白质 的功能 。小的 组氨酸 尾无免 疫源性 ,在 用纯化 蛋白注 射到动 物体内 制备抗 体时, 无需将 其去除 。组氨 酸尾融 合蛋白 保 持了它 们的正 常生物 学活性 ,如二 氢叶酸 还原酶 、腺 苷酸环 化酶的 活性; TFIID 依然 保留 它的转 录调节 功能。 这种加 尾技术 同样适 用于膜 、胞质 、核 蛋白 的纯化 。如 果去了 组 氨酸尾 ,所得 的纯化 蛋白足 以进行 X- 晶体图 分析。 本单元 所介绍 的操作 步骤是 纯化细 菌中表 达的蛋 白质。 该技术 同样可 纯化用 瞬间转 染技 术导入 HeLa 细胞中 表达的 、疫苗 表达系 统中和 杆状病 毒感染 的昆虫 细咆内 所产生 的蛋 白质。 总之, MCAC 技术 可用于 现时任 何可得 的表达 系统。 该技术 同样可 用于制 备免疫 亲和层 析柱。 组氨酸 尾事先 共价连 接到单 克隆抗 体的寡 糖组 分上, 随后与 Ni2+-NTA 柱结合 。此 法优 于传统 抗体固 相化技 术的地 方是固 相化抗 体依然 保留较 强的抗 原结合 的能力 ,易于 从柱上 回收。 2) 关 键参数 NTA 可根 据参考 文献提 供的方 法自己 合成, 也可从 Qiagen 公 司购买 。蛋 白质与 Ni2 + -NTA 树脂的 结合和 洗脱取 决于蛋 白中组 氨酸的 含量。 每一种 蛋白质 都有略 微不同 的组 氨酸含 量及从 Ni2 + -NTA 树 脂上洗 脱的最 佳方案 。其中 ,了解 缓冲液 咪唑浓 度是关 键 。在大 规模梯 度洗脱 制备前 必须进 行小规 模的预 备实验 。也可 以进行 批纯化 ,即 将荷 电 树脂加 入含抽 提物的 试管中 ,混合 lh, 加样 到层析 柱上再 洗涤和 洗脱。 3) 问 题分析 及解决 蛋 白质表 达效率 先可 将粗提 液进行 SDS-PAGE 分析 ,核 对一下 在所选 择的系 统中 靶蛋白 是否表 达充分 。在 某些细 胞的粗 提液中 ,表达 蛋白质 可能严 重降解 。因 此使 • 606 • 用 PMSF、 减少冻 融次数 、实验 过程保 持低温 、使 用混 合蛋白 酶抑制 剂等措 施十分 重要。 蛋 白质结 合不良 如果发 现蛋白 质不与 柱结合 ,可 能是 蛋白质 不含组 氨酸尾 、层析 柱 没有充 分荷以 镍离子 、或 组氨酸 尾埋在 蛋白质 内部, 不能与 树脂充 分接触 。因 而在表 达和 纯化之 前先确 证一下 组氨酸 尾和附 近蛋白 质的编 码序列 是否都 在阅读 框内、 起始或 终 止密码 子是否 都存在 。若组 氨酸尾 位于氨 基末端 ,可 以尝 试缺失 起始甲 硫氨酸 的密码 子, 翻译将 在其下 游起始 ,产生 无组氨 酸尾的 全长蛋 白质。 将组氨 酸尾置 于羧基 末端的 优 点是只 有全长 蛋白质 才能与 Ni2+-NTA 树脂 结合, 但是它 的缺点 是组氨 酸尾不 易接近 树脂 。所 有的溶 液中严 禁存在 螯合剂 ,如 EDTA 和 EGTA, 因 为它们 可以使 Ni2+ 从亲 和 柱上脱 落下来 。避免 使用强 还原剂 ,如 二巯基 苏糖醇 (DTT), 它 们可将 Ni2+ 还原为 金属镍 ,产 生棕 色沉淀 。如 果某些 蛋白质 确需要 还原剂 以维持 其结构 ,可与 Ni2 + -NTA 树脂 一 '起 加入 1 ~ 10mmol/L 的 2- 琉基 乙醇。 整 个纯化 过程中 Ni2 + -NTA 应该为 蓝绿色 ,直 到加入 EDTA。 若发现 树脂变 白或充 以 Ni2+ 后蓝 绿色变 浅时, 必须核 对所有 的缓冲 液是否 存在还 原剂或 螯合剂 。重 新使树 脂荷以 Ni2+, 如果 颜色依 然很浅 或无色 ,则要 进行树 脂再生 和充荷 Ni2+ 的步骤 。这样 做后 ,树 脂依然 是白的 ,最 好丢弃 树脂, 采用新 的批号 。如果 蛋白质 确有组 氨酸尾 ,但 又不 能与树 脂结合 的话, 可试着 做变性 MCAC, 增加 组氨酸 尾与树 脂的接 近机会 。也 可 以尝试 将组氨 酸尾置 于蛋白 质相反 的一端 ,或 许会有 好处。 洗脱不 佳如果 发现结 合在柱 上的蛋 白质洗 脱不良 ,可 用含 EDTA 的缓冲 液做最 终 的洗脱 ,此时 ,任 何与 Ni2+-NTA 结合的 蛋白质 都将被 EDTA 移除。 如果发 现被结 合的蛋 白质出 现沉淀 而不被 洗脱, 可在变 性条件 下纯化 蛋白质 ,并作 SDS-PAGE 分析 洗脱 组分中 的蛋白 质是否 存在。 4) 预期结 果和时 间安排 Ni2+-NTA 柱的最 大结合 能力是 5 〜 10mg/lmL 充 填树脂 。理 想情况 下蛋白 质的回 收率为 80%。 它的 限制因 素是蛋 白质的 加样量 ,而 这又取 决于蛋 白表达 系统。 蛋白 质表达 和粗提 液的制 备约需 Id, Ni2+-NTA 层 析柱的 准备需 30 〜 60min, 加 样 、洗涤 、洗 脱约需 4 〜 6h。 第五 节高效 液相色 谱分离 和纯化 蛋白质 色 谱法是 对复杂 混合物 的分离 和纯化 效率极 高的方 法之一 。对 于与生 命过程 密切相 关 的大分 子物质 蛋白质 的分离 和纯化 ,高 效液 相色谱 ( high-performance liquid chromatography, HPLC) 是 一种十 分有效 的方法 。由于 高效液 相色谱 一 ■般 多在 室温下 进行 ,其 分离环 境十分 温和, 流动相 为液体 ,如有 机溶剂 、水 和与 体液组 成相似 的各种 缓 冲液体 系等; 固定 相的 表面经 各种化 学修饰 ,为生 物大分 子的分 离提供 了不同 的相互 作 用界面 ,这对 保持生 物大分 子的生 物学活 性非常 重要; 按 分离要 求不同 可选用 不同孔 体 积的多 孔填料 ,以 适应相 对分子 质量从 几千到 数百万 不同大 小分子 的分离 。因此 ,高 效液相 色谱不 仅是一 种快速 、高 效和灵 敏的分 析方法 ,而 且作为 一种高 效和理 想的制 备 、分离 和纯化 蛋白质 、多 肽及 核酸等 与生命 科学有 着密切 联系的 大分子 物质的 方法, • 607 . 在生 物化学 、分子 生物学 、细 胞分子 生物学 等研究 领域中 也有着 广泛的 应用。 用 HPLC 法 分离蛋 白质或 多肽是 基于使 用刚性 、小颗 粒介质 和较高 的操作 压力。 本节将 主要介 绍以下 HPLC 技术 :反相 色谱、 离子交 换色谱 、体 积排阻 色谱、 高效聚 焦 色谱和 疏水作 用色谱 。与 常规的 层析法 不同, HPLC 最适 宜于快 速分离 和纯化 小组分 中 的少量 蛋白质 和多肽 ,这 主要是 因为受 到一般 分析型 HPLC 柱载 量很小 的限制 所致。 通常情 况下, HPLC 常用于 蛋白质 纯化的 最后几 个步骤 ,而 在此之 前可先 采用常 规层析 法将 待分离 组分中 的大部 分杂蛋 白除去 。实际 上在适 宜的条 件下, 分离和 纯化蛋 白质的 每 一个步 骤都可 以使用 HPLC。 一 、反相 高效液 相色谱 1. 原理 反相 高效液 相色谱 (reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP- HPLC) 分 离蛋白 质和多 肽的原 理是基 于待分 离物质 与柱介 质非极 性烷基 固定相 表面疏 水作 用的强 度和流 动相中 有机溶 剂洗脱 强度而 建立的 一种色 谱模式 。任何 一种有 机分子 的结构 中都含 有非极 性的疏 水部分 ,一 般疏水 性越强 ,其保 留值就 越高。 在高效 液相色 谱中这 是应用 最为广 泛的一 种分离 模式。 在 RP-HPLC 分离过 程中, 离子对 在流动 相中的 存在十 分重要 ,它可 使蛋白 质和多 肽在 分离时 的疏水 性增大 ,二 氟乙酸 (trifluoroaceticacid, TFA) 是较为 理想和 常用的 离子 对试剂 。此外 ,在有 机溶液 浓度增 大时, 多肽或 蛋白质 与柱介 质之间 的相互 作用减 小 ,极 性蛋白 先于非 极性蛋 白被洗 脱下来 。被 吸附于 含有疏 水特性 基质的 反相柱 中的多 肽或 蛋白质 混合物 ,在依 次增加 洗脱液 中有机 溶剂浓 度而依 照结合 力从弱 到最强 的顺序 洗 脱下来 ,收集 与各洗 脱峰相 对应的 洗脱液 并用于 分析。 2. 材料 脱气 处理的 HPLC 级水 (双蒸 水和去 离子水 经处理 后也可 使用) 三 氟乙酸 (TFA) 缓冲液 [0.1% (V/V) TFA 的水 溶液] TFA、 乙腈 缓冲液 [0.085% (WV) TFA, 70% (V/V) 乙腈 (CH3CN) 的水 溶液] TFA、 狐盐 缓冲液 [6mol/L 盐酸胍 (CH5N3*HC1) 的 TFA 缓 冲液] RP 肽标准 RP 蛋白 质标准 RP-HPLC 柱 (超过 48h 不使用 ,应 保存于 有机溶 剂中) 真 空泵或 冻干机 4L 的锥形 过滤器 橡 胶软管 (用于 连接过 滤器和 真空泵 ) 带可 拆式不 锈钢支 持筛网 的硅化 硼玻璃 滤膜架 ,直径 47mm 尼龙 -66 滤膜 ,直径 47mm, 孔径 0.45/um HPLC 梯度仪 • 608 • HPLC 紫外 检测器 HPLC 进样器 5mL (12mm X 75mm) 聚丙 稀试管 1.5mL 带螺盖 的微量 离心管 3. 试 剂配制 1) 水、 缓冲液 和溶剂 的脱气 由于水 、缓 冲液 和溶剂 中存在 有空气 ,这些 空气在 流动池 内将形 成气泡 ,可 对检测 结果产 生影响 。因此 ,在 使用前 应对其 进行脱 气处理 。溶 液中的 气泡在 20 〜 601b/ft2 的 负压下 即可被 除去。 <2L 的 水可在 4L 锥形过 滤瓶中 通过真 空泵进 行脱气 ,当观 察不到 气泡 产生时 ,水即 被脱气 完毕。 挥发性 缓冲液 必须在 脱气之 后加入 。含有 非挥发 性缓冲 盐 的缓冲 液必须 先经过 0.45/zm 的尼 龙滤膜 过滤后 ,再 进行脱 气处理 。所 有的溶 剂也均 需 进行脱 气处理 。在 脱气处 理过程 中要注 意避免 将溶液 吸入真 空泵。 另外 还有一 种方法 ,即用 氦气充 入待脱 气的水 、缓冲 液和溶 剂中, 以取代 其中的 空气。 2) 缓冲液 的制备 所有缓 冲溶液 、有 机溶剂 和水必 须使用 HPLC 纯度级 。乙腈 或丙醇 的紫外 吸收峰 应最低 。实 验用 水应在 添加挥 发性缓 冲液之 前先用 0.45pm 的尼龙 滤膜过 滤后再 进行脱 气 ,而非 挥发性 缓冲液 则在加 入后再 过滤和 脱气。 用于 RP-HPLC 的 有些化 学物质 有较高 的毒性 ,特别 是乙腈 、甲酸 、七 氟丁酸 (heptafluorobutyricacid, HFBA) 和 TFA 等。 使用时 应保持 实验室 有良好 的通风 条件, 配制试 剂时最 好在通 风柜内 进行。 3) 蛋白 质和肽 的制备 必须使 蛋白质 和肽完 全溶解 。在制 备过程 中若存 在可见 的混浊 或微粒 ,可 使用 TFA、 狐盐缓 冲液来 溶解其 大部分 的蛋白 质碎片 。溶 解低于 毫克水 平的小 量蛋白 质样品 时 ,有 必要用 10~20 倍 的放大 镜来观 察其样 品的溶 解情况 。所有 制备的 蛋白质 和肽样 品在使 用前均 应进行 离心, 以去除 不溶性 杂质。 4) RP 肽标准 称取 lmg 的 a- 乳 球蛋白 A 溶于 lmL O.lmol/L 的碳 酸氢铵 溶液中 ,然 后加入 lmg/mL 的 胰蛋白 酶溶液 20pL, 在室温 下孵育 l~24h, 再加入 lOpLTFA 缓冲 液终止 酶 的消化 ,当 C02 小气泡 停止产 生之后 ,用 pH 试纸 检查其 pH 是否 <3。 5) RP 蛋白 质标准 称取 胰岛素 、细 胞色素 C、 a- 乳 清蛋白 、碳 酸野酶 和卵清 蛋白各 lmg, 装入 一清洁 干燥的 小瓶中 ,加入 lmLTFA 缓冲液 ,轻轻 摇动使 其溶解 混合。 4. 操 作步骤 肽的 分离: 1) RP 柱中 有机相 的去除 由于 RP 柱常用 甲醇、 丙醇和 乙腈等 有机溶 剂保存 ,因 此在使 用前应 先洗去 其中的 • 609 • 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 时间 /min 图 8.18 a- 乳球 蛋白 (200pmol) 的 RP-HPLC 图 分离朴.采用八9113()〇比1^>-300柱(〇8,内径2.1111111乂3〇1111«,7/^111 傲粒 , 30mn 孔径 ), 洗 脱步骤 、所用 缓冲液 、梯 度等如 前所述 • 610 • 有机相 。方法 为:用 经脱气 处理过 的水, 按照从 100% 有机 溶液至 100% 水的顺 序进行 梯度 洗脱, 流速为 lmL/min, 持 续时间 15min 以上。 2) RP 柱 的平衡 RP 柱用 100%TFA、 乙 腈缓冲 液来进 行平衡 ,流速 lmL/min, 当压 力显示 和检测 器吸收 恒定时 ,柱子 就平衡 好了。 尽管多 肽和蛋 白质的 HPLC 分 离通常 在室温 下进行 。但 有研究 证实升 高温度 有助于 提高蛋 白质的 回收率 3 3) 空 白对照 在测 定样品 前先做 1 〜 2 个平 衡柱的 空白样 品分离 。进样 并开始 记录, 流速为 lmL/min, 线性 梯度从 〇% 〜 100%TFA、 乙腈缓 冲液, 时间应 不少于 45min, 然 后保持 等 浓度条 件即在 100% TFA、 乙 腈缓冲 液中继 续流动 5min。 再使 用线性 梯度, 在至少 15min 后 回复到 TFA 缓冲液 ,并在 TFA 缓冲 液条件 下平衡 15min。 整个 过程即 从梯度 开始至 重新平 衡总需 时约为 80min。 检测器 波长可 根据分 离的样 品情况 ,设 置在 210 〜 220nm 处, 满量程 0.1 个 吸收单 位 ,约 相当于 50 〜 200pmol/L 的 狀含量 。常用 的量程 设置为 0.3 对 500pmol/L, 0.5 对 lnmol/L 和 1.0 对 2nmol/L。 常 用记录 纸速为 0.5cm/min。 分 离肽的 改良方 法是在 120~180mm 内 ,用 0%~100%TFA、 乙腈 缓冲液 线性梯 度完成 洗脱。 4) RP 肽标准 的离心 和进样 用 胰蛋白 酶消化 乳 球蛋白 的产物 或是目 的蛋白 质的消 化产物 —— 肽段, 在 500〇Xg •离心 5min。 进样时 取其上 清液。 使用经 TFA 缓 冲液或 TFA、 胍 盐缓冲 液彻底 清洗的 HPLC 专 用进样 注射器 (用尖 的 针头较 易损坏 进样阀 ), 吸取 一定量 (如 10/uL) 的 肽样品 ,将其 加入定 量环中 ,操作 时 应小心 切勿注 入空气 。加 样的同 时打开 记录仪 记录分 离的起 始点和 时间。 若为蛋 白质消 化产物 , 可加大 进样量 。当 样品含 量较低 而容量 较大时 ,可使 用临时 与柱相 连的辅 助 泵或三 通将样 品吸入 泵系统 。低浓 度肽样 品的含 盐溶液 可直接 送入分 离柱中 , 必要时 盐溶液 的浓度 可 用水稀 释至约 O.lmd/L。 进入 PR 柱中的 盐类可 被迅速 洗脱掉 ,而 肽则 被滞留 。当样 品全部 进入柱 中后 ,即可 进行梯 度分离 。其 分离层 析的结 果应与 RP 肽的 标准品 相类似 ,如图 8. 18 所示。 EU093V 〇 r ’ I I 1 ~~~1 ~~~ I I I I I l_ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 时间 /min 图 8.19 蛋 白质的 RP-HPLC 图 各 洗脱峰 按先后 顺序为 : 1. 胰岛素 , 2. 细 抱色素 C, 3. a- 乳清 蛋白, 4. 碳 酸酐酶 , 5. 卵 清蛋白 。分 离柱和 洗脱条 件同图 8. 18 (2) 对于 待分离 蛋白质 ,则 重复肽 分离中 的步骤 1)~6)。 5. 方 法评注 用 RP-HPLC 分离 肽和蛋 白质最 早始于 20 世纪 70 年代 中期, 目前已 成为很 好的分 离和纯 化这些 物质的 方法。 就总体 说来, RP-HPLC 最 适合于 不超过 30 〜 40 个氨 基酸的 肽 的分离 ,且有 很高的 回收率 。而蛋 白质在 RP-HPLC 分离 条件下 较易发 生变性 并使其 生物学 活性受 到一定 影响, 同时还 可使部 分蛋白 质不可 再生地 沉积于 RP 柱上, 使回收 率 降低。 1) RP 柱 的选择 就柱 基质本 身而言 ,侧 链烷烃 的长度 和数目 、微 粒直径 、孔径 大小等 均会影 响肽和 蛋白质 的分离 。评价 一个新 柱子的 好坏时 ,应 首先用 于分离 蛋白质 标准, 再做肽 标准, 以 观察分 离效果 。一 般经常 使用含 Q、 C4 、苯 基、 Q 和 C18 结合相 的柱子 (见表 8.14)。 对来 源于高 相对分 子质量 蛋白质 酶消化 或化学 裂解产 生的肽 ,最 好使用 Q 或 5) 洗脱峰 的收集 采用手 动收集 的方法 ,将每 一个洗 脱峰收 集于聚 丙烯微 量离心 管或试 管中。 注意不 要使用 聚苯乙 烯试管 。层析 开始处 的大峰 含有盐 酸胍、 缓冲液 盐类和 低相对 分子质 量等一 些 未被柱 滞留的 物质。 6) 洗脱 样品的 再分离 即 便该峰 的对称 性很好 ,一个 洗脱峰 内也常 常含有 多个肽 。因此 ,若 要用上 述分离 获得的 肽来进 行氨基 酸测序 ,则需 进一步 层析纯 化以获 取单组 分的肽 。可 将层析 主峰中 收集 的肽重 新溶于 TFA、 胍盐缓 冲液中 , 500〇xg 离心 5min。 然后 取样进 行再次 HPLC, 收集 各层析 峰样品 。此后 即可将 其用于 氨基酸 序列分 析或者 氨基酸 分析。 蛋白质 分离: (1) 对于 RP 蛋白 质标准 (用量 10fiL) 的分 离重复 上述肽 分离中 的步骤 1) 〜 4)。 RP 蛋白质 标准的 分离层 析结果 应与图 8.19 相似。 8 6 4 2 o o <5 o 0. 0. 0. 0. lul rvl v • 611 • c18 烷烃结 合相的 柱子。 对于在 Q 或 C18 柱 中产生 宽峰或 拖尾峰 的疏水 蛋白质 ,应在 〇3 或 c4 柱中 重新进 行分离 。实验 证明肽 或蛋白 质分离 时的损 失量与 柱基质 的量成 正比, 且柱基 质粒度 较小的 柱子效 果较好 。因此 ,应 选用柱 体积较 小的柱 子来进 行肽和 蛋白质 的分离 ,如 2mm 内径 xlOcm 或 15cm 的柱子 ,用 lmm 内径 的柱子 更好。 表 8.14 肽和蛋 白质的 RP-HPLC 分 离条件 变 量 肽 蛋白质 固相支 持基质 键合相 〇3 〜 C18 ,苯基 Ci~Ci8, 苯基 微 粒大小 //um 3 〜 10 3 〜 10 孔径 /nm 10 〜 30 30 柱规格 长度 /cm 卜 25 卜 25 内径 /mm 1 〜 5 卜 25 分 离条件 温度 室温 5-40X: 流速 / (mL/min) 0.025 〜 2 0.025-2 注:由 于可选 用产品 很多, 这里不 可能列 出所有 柱基质 、规格 和分离 条件。 主要可 参考有 关专业 公司提 供的产 品 指南。 2) 柱 的处理 先用 HPLC 级水冲 去所有 盐分后 ,再用 有机溶 剂冲洗 以去除 水分, 并将柱 子贮存 于有机 溶剂中 。注意 不可使 柱子中 有机溶 剂流干 。如 果在使 用中柱 压不断 增加, 说明柱 子进口 处的多 孔滤片 有堵塞 ,可 将柱 子拆下 ,倒立 过来, 用梯度 液冲洗 。另外 ,也 可将 该柱子 拆开, 把多孔 滤片先 后放入 20% 的硝 酸溶液 和水溶 液中进 行超声 清洗, 如仍无 法 洗净则 应更换 一个。 3) 缓冲液 的选择 正确选 择缓冲 液对肽 和蛋白 质的分 离十分 重要。 肽或蛋 白质的 洗脱顺 序可由 缓冲液 的 pH 和有 机溶剂 ( 如甲醇 、乙 腈或丙 醇等) 逐渐增 加的线 性梯度 来决定 。常用 的挥发 性和 非挥发 性缓冲 液见表 8.15。 TFA 是 肽和蛋 白质分 离时最 常用的 ,因为 TFA 可提供 氨基酸 侧链质 子化所 需的低 pH 条件 ,并可 用于挥 发性的 缓冲液 ,以 便于 最后用 冷冻干 燥法 去除样 品中的 挥发性 物质。 特别在 制备毫 克级的 肽或蛋 白质时 ,挥发 性缓冲 液的应 用就更 为重要 。另外 ,在 分离过 程中可 先用非 挥发性 缓冲液 ,然 后再用 挥发性 缓冲液 (如 TFA 或碳酸 氢胺等 ) 洗 去盐分 。脱 盐后的 肽再用 50% 甲 醇水溶 液洗脱 ,收 集后在 Savam 浓缩 、蒸 发器上 千燥 。有机 相最常 用乙腈 。对 于疏水 肽或蛋 白质, 可使用 浓度为 50% 〜 70% 的 丙酮或 异丙醇 ,但其 缓冲盐 的含盐 应与亲 水缓冲 液一样 。也 可用混 合有机 相 如乙腈 、丙醇 、丙醇 、丁醇 或乙腈 、丁 醇等。 • 612 • 表 8.15 肽和蛋 白质的 RP-HPLC 分离用 缓冲液 酸 性 (pH2~3) 0.1% TFA# 0.1% h3po4 0.1% 七 氟丁酸 (FHBAK 10mmol/L HC1* 5% 〜 60% 甲酸 * 20mmol/L 二乙铵 - 憐酸盐 , pH3.0 酸 性 (pH4~6) 10mmol/L 乙酸铵 (CH3COONH4r, PH4~6 10mmol/L 二乙按 - 碟酸盐 **, pH4.5 100mmol/L NH4H2P04, pH4.5 中 性 (pH>6) lOOmmol/L 乙酸钠 , pH7.5 lOmmol/L KH2PO4, pH6~8 20mmol/LTris-HCl, pH7 〜 8 50mmol/L NaH2P04, pH7.0 50mmol/L NH4HCO3 * , pH8 . 0 * 代表 挥发性 缓冲液 4) 检测 肽或蛋 白质的 吸收值 与其所 含的肽 键数目 成正比 ,一 般检测 波长在 210 〜 220mn 处。 如果在 280nm 处有吸 收值, 则说明 被检测 的肽或 蛋白质 含有增 色物质 。检 测可使 用 固定或 可变波 长的检 测器。 210 〜 220nm 的 固定波 长检测 器适合 于大多 数肽和 蛋白质 的分离 。如 打算 进行蛋 白序列 分析以 提供一 些有关 DNA 探针 的信息 ,也 可采用 二极管 阵列 检测器 来检测 。光电 二极管 阵列检 测器的 优点是 可以记 录每一 个时间 点上完 整的波 谱 ,但灵 敏度比 常规检 测器小 10%。 另外, 在正常 情况下 ,当 RP 柱在 等浓度 洗脱条 件下平 衡后, 其柱压 和检测 器的紫 外吸 收不应 有变化 。若柱 压不稳 ,问题 通常与 泵有关 ,应检 查泵的 密封是 否完好 ,泵中 有无 气泡。 若紫外 检测器 信号不 稳并快 速波动 ,说明 流动池 有气泡 存在或 检测用 紫外灯 的 输出已 减小到 使用范 围之外 ,应排 除气泡 或更换 灯泡后 再进行 测试。 5) 单 一或梯 度洗脱 虽然单 一洗脱 (可用 TFA、 乙腈百 分比恒 定的缓 冲液) 也能产 生很好 的分离 效果, 但实 验样品 需经反 复多次 的分离 ,较 为耗时 和繁琐 ,而且 对于许 多微量 存在的 生化样 品 ,多次 进样也 不具有 可能性 。可 使用 梯度为 0.5% 〜 0.8%TFA、 乙腈 溶液, 流动速 度为 l~2mL/min 进 行洗脱 。如 有必要 ,梯度 分离后 的肽或 蛋白质 再用单 一缓冲 液进行 洗脱 。总之 ,应 尽量使 用线性 梯度。 最常用 的是从 0.1%TFA 水溶 液开始 ,在 60 〜 80min 内形成 0% 〜 100%TFA、 乙腈 缓冲液 梯度。 6) 假 层析峰 由 于许多 有机和 无机化 合物在 210 〜 220nm 的远紫 外区都 有吸收 ,因 此必须 使用高 纯度 的溶剂 和缓冲 液以减 少杂质 的影响 。用 于制备 和贮存 HPLC 缓冲液 的玻璃 器具必 须无 去垢剂 ,因为 微量去 垢剂的 存在就 可导致 明显的 污染。 如果在 空白实 验中出 现一些 明显的 吸收峰 ,则 可能是 由来自 于水、 缓冲液 或柱子 中存在 的杂质 所引起 。这时 用水代 . 613 • 替 TFA 溶液, 用纯乙 腈代替 TFA、 乙腈 缓冲液 ,若杂 峰消失 ,可 确定污 染物来 自于缓 冲盐; 若杂峰 不消失 ,可 用市售 HPLC 级水代 替实验 用水, 此时若 峰消失 ,即 为实验 用水 所致, 若峰仍 不消失 ,则只 采用纯 乙腈, 若还有 噪音或 高背景 值出现 ,污染 物则来 自于有 机溶剂 。再 用未 开封的 低紫外 吸收的 乙腈代 替原先 使用的 TFA、 乙腈缓 冲液, 若 假峰还 不消失 ,则可 能是由 于柱子 被污染 所引起 。更 换柱子 ,杂 峰即可 消除。 个别情 况下, 杂质也 可能来 自于蛋 白质在 酶消化 之前所 使用的 去垢剂 。如 Triton X-100 和 Lubrol 可 导致多 重污染 ,两性 去垢剂 Zwittergent 3-14 和十 二烧基 磺酸钠 (SDS) 相 对不影 响紫外 吸收值 。因此 ,若 在样 品处理 过程中 使用了 去垢剂 ,则 一定要 用一 个非常 适宜的 对照来 消除其 对实验 结果的 影响。 7) 回收率 对于肽 和相对 分子质 量较小 的疏水 蛋白质 ,大多 数回收 率可达 50% ~80%。 随着 相对 分子质 量和疏 水性的 增加, 回收率 可逐渐 减小且 可低于 20%。 若要 达到一 个高的 回收率 ,必须 努力探 索最优 化的回 收条件 。当 然更换 另一种 层析方 法如疏 水作用 色谱或 离子交 换色谱 ,可 能会 提高回 收率。 二 、离 子交换 高效液 相色谱 1. 原理 离 子交换 局效液 相色谱 ( ion-exchange high-performance liquid chromatography, IEX-HPLC) 对蛋白 质的分 离过程 ,主 要是基 于蛋白 质分子 彼此之 间具有 不同的 电荷而 进行 选择性 分离的 。蛋白 质是一 种多价 并可解 离的大 分子, 不同蛋 白质所 带电荷 数目是 不同的 ,因此 ,其与 离子交 换填料 的相互 作用也 不相同 。离 子交换 介质和 各种蛋 白质通 过相 反的静 电作用 结合在 一起, 被吸附 的蛋白 质通过 离子强 度依次 由低到 高的洗 脱顺序 即结合 力由弱 至强的 顺序被 交换洗 脱下来 ,收 集各个 层析峰 的溶液 即可用 之进行 分析。 IEX-HPLC 又分 为阴离 子交换 (anion-exchange, AEX) 和阳离 子交换 (cation-ex- change, CEX) HPLC 两种 类型。 2. 材料 脱气的 HPLC 级水 IEX 蛋白 质标准 0 . 02mol/L Tris-HCl, pH7 . 5 Tris/NaCl 缓冲液 (0.02mol/L Tris-HCl pH7.5, 0.5mol/L NaCl) 磷酸钠 /NaCl 缓冲液 (〇.〇2mol/L 磷酸钠 pH6.0, 0.5mol/LNaCl) 阴离子 (AEX) HPLC 柱 阳离子 (CEX) HPLC 柱 真 空泵或 冻干机 4L 的锥形 过滤器 橡 胶软管 (用于 连接过 滤器和 真空泵 ) 带可 拆式不 锈钢支 持筛网 的硅化 硼玻璃 滤膜架 ,直径 47mm • 614 • 尼龙 -66 滤膜 ,直径 47mm, 孔径 0.45pm HPLC 梯度仪 HPLC 紫外 检测器 HPLC 进样器 5mL (12mm X 75mm) 聚丙 錄试管 1.5mL 带螺盖 的微量 离心管 3. 试 剂配制 1) 缓冲 液制备 所有 缓冲盐 、有机 溶剂、 去垢剂 和水必 须为高 纯度的 HPLC 级 。缓 冲液的 pH 必须 仔细 调节至 0.1 范围内 以保证 IEX 层 析柱的 再生。 pH 的调 节必须 在所有 的成分 溶解和 溶液过 滤之后 。为 减小 IEX 缓冲液 中细菌 的生长 ,必 须在 每一种 缓冲液 中添加 2% 〜 5% 的 甲醇。 IEX 柱 在不使 用时应 保存于 冰箱中 。实 验用水 应过滤 并脱气 ( 见第一 节试剂 和溶液 的配制 )。 实验时 ,缓 冲液 最好当 天新鲜 配制。 含有 缓冲盐 的试剂 必须经 0.45pm 尼龙滤 膜过滤 。若使 用有机 溶剂, 必须过 滤之后 再 添加。 2) 蛋白 质样品 的制备 蛋白 质必须 完全溶 解于与 起始梯 度相同 pH 而离 子强度 低于起 始分离 时采用 的离子 强 度的缓 冲液中 。若 有可见 不溶物 ,可 加入脲 (NH2CONH2)、 有 机溶剂 甲醇或 丙醇、 去垢剂 SDS 或 CHAPS 等助溶 。若 只有毫 克水平 的小量 蛋白样 品溶解 ,最 好使用 10 〜 20 倍的 放大镜 观察样 品的溶 解情况 。所有 样品进 样前必 须进行 离心, 以除去 不溶性 的杂质 成分。 3) IEX 蛋 白标准 称取各 5mg 的卵清 蛋白、 a- 糜蛋 白酶原 、核糖 核酸酶 A 和溶 菌酶 ,放入 1.5mL 微 量离 心管中 ,再加 2. 5mga- 乳 清蛋白 ,并用 lmL 蒸 馏水溶 解蛋白 。室温 下孵育 lh, 将 所得 溶液用 PH7.5 的 0.02mol/LTris-HCl 或者是 pH6.0 的 0.02mol/L 磷酸 钠等量 稀释, 以分别 用于阴 离子或 阳离子 交换的 HPLC。 4. 操 作步骤 阴离 子交换 HPLC: (1) 在使用 IEX 柱前, 应先洗 掉原先 吸附在 柱上的 蛋白质 。如为 阴离子 交换柱 ,先 以 10 倍 柱体积 的已脱 气水洗 去残留 的溶剂 ,然 后再用 10 倍于柱 体积的 PH8.0 〜 10.0 的高盐 缓冲液 (约 0.5 〜 lmol/L) 冲洗 聚合体 IEX 柱 ,对于 硅胶类 IEX 柱 ,则用 PH7.0 〜 8.0 的高 盐缓冲 液进行 洗涤。 (2) 在室温 下平衡 IEX 柱 (也 有一些 分离是 在高温 下进行 ), 以 相应的 流速用 0.02mol/L pH7.5 的 Tris-HCl 缓 冲液和 Tris/NaCl 缓 冲液的 50% 混合 液洗涤 IEX 柱 20min。 对于 内径为 4mm、 2mm 和 1mm 的柱子 ,其 干衡 时的适 宜流速 分别为 〇 • 5 ~ 1 .OmL/min、 0. 12 〜 0.25mL/min 和 0.05 ~ 0.10mL/mino (3) 用 10 倍 柱体积 以上的 〇.〇2mol/L pH7.5 的 Tris-HCl 缓冲 液冲洗 柱子。 . 615 • (4) 先 进行空 白洗脱 ,用 〇% ~75% 的 Tris/NaCl 缓冲液 线性梯 度洗脱 20min 以上, 然后用 75% 缓冲 液洗脱 5min, 再用 5min 以上 的时间 回复到 0%, 保持 0% 缓冲 液洗脱 15min。 调整 好记录 纸的起 始位置 ,然 后才进 行下一 次进样 。检测 波长用 210~220nm, 根 据待测 蛋白质 分离时 的初始 浓度在 0.1 〜 1.0 间调整 满量程 的吸收 比单位 ,常 规设置 为 :蛋白 质浓度 lOOpmol, 量程 0.1; 500pmol, 0.3; lnmol, 0.5; 2nmol, 1.0。 记录 速度 一般为 〇.5cm/min。 如 有超过 5% 量程的 峰出现 ,则说 明有污 染物残 留于柱 上或缓 冲液中 。应 对缓 冲液进 行检査 ,并 须继续 进行空 白洗脱 过程。 如峰还 不消失 ,可依 次用各 1〇 倍 于柱体 积的蒸 馏水、 50% 甲醇和 0.02mol/L PH7.5 的 Tris-HCl 等溶 液冲洗 IEX 柱 ,以 消除其 污染。 (5) 进样 lO^L 〇.〇2mol/L pH7.5 的 Tris-HCl 缓冲液 , 进行一 次空白 样品的 层析。 排除 进样器 针管和 针头内 的空气 ,将样 加入进 样口, 按步骤 (4) 的梯 度进行 洗脱。 (6) IEX 蛋白 标准或 多肽混 合物在 5000X g 离心 5min, 用经 0.02mol/L pH7.5 的 Tris-HCl 缓 冲液清 洗过的 HPLC 进样 器吸取 5ML 上清液 ,注入 样品后 ,按 步骤 (4) 开 始梯度 洗脱。 线性梯 度可分 成不同 的阶段 ,可在 梯度范 围内通 过调节 的斜率 而获得 ,可 以提 高蛋白 质混合 液的分 辨率。 TEX 蛋白 标准的 洗脱梯 度可按 如下程 序进行 : 0mm 处 Tris/NaCl 缓冲液 , 5min 处 30 % 缓 冲液, 保持5111丨11,返回10%缓冲液5111丨11以上, 图 8.20 AEX-HPLC 分离 蛋白质 标准的 色谱图 色 谱柱为 AquapereAX-300 阴离子 交换柱 。柱 内径 2.1mm X 柱长 100mm, 用 〇.〇2mol/L Tris-HCl (PH7.5) 和 Tris/NaCl 缓冲 液洗脱 。起 始洗脱 条件为 10% Tris/NaCl 缓冲液 。梯 度为: Tris/NaCl 缓 冲液在 5mm, 15min 和 20min, 浓度分 别达到 30%, 55% 和 75%。 峰 1 为 a- 乳 淸蛋白 (1.25Mg), 峰 2 为卵 清蛋白 (2.5坤)。 流速为 0.25mL/min 15〇1丨11处55%缓冲液,2〇111丨11处75%缓冲液, 保持等 浓度的 10 % Tris/NaCl 缓冲液 15min 直 至 下一次 加样。 层析 结果必 须与图 8.20 类似 。峰 1 和峰 2 分 别为 《- 乳 清蛋白 和卵清 蛋白。 若峰 高低于 预期值 ,须再 次进行 IEX 蛋 白标准 的 层析直 至峰高 达到预 期值。 HPLC 柱可不 断地吸 附蛋白 直至其 所有位 点被蛋 白结合 为止, 这也是 HPLC 分离时 会损失 大量蛋 白的主 要原因 , 因此不 推荐 使用保 护柱。 (7) 对研究 用样品 的分离 ,按 步骤 (4) 加样 (可 用较大 体积) 和 线性梯 度洗脱 ,手 动收集 各洗脱 峰于不 同的聚 丙烯试 管中备 用 。勿 使用聚 苯乙烯 试管。 经上 述过程 获得的 洗脱峰 溶液, 可先用 RP-HPLC 或 凝胶过 滤层析 脱盐后 ,再用 Speedvae 蒸发器 除去每 个收集 管中的 溶剂。 蛋白 质的脱 盐可用 HPLC 进 样器加 入小于 2mL 的小 量样品 ,或 用辅助 泵加入 含小量 蛋白的 大体积 盐溶液 ,但 若是 盐的起 始浓度 >0.1mol/L, 必须 用水将 其浓度 稀释成 <0.1mol/L。 盐 可被迅 速洗脱 ,而蛋 白质被 滞留。 被滞留 的蛋白 质可用 0%~10% 的线 性梯 度洗脱 lOmin, 将 层析峰 对应的 溶液手 动收集 于聚丙 烯试管 。蛋 白质 也可通 过体积 • 616 • 排阻 HPLC、 透 析或沉 淀等方 法除盐 。有 时 ,在一 个洗脱 峰甚至 是对称 的峰内 会含有 两个 或更多 蛋白质 。这 种情况 可通过 凝胶电 泳来进 行检测 。如 果分 离的蛋 白要用 于氨基 酸序 列分析 ,就 需进一 步进行 层析分 离以完 全纯化 ,可 考虑使 用反相 、排 阻或疏 水作用 色 谱等其 他层析 方法。 阳离 子交换 HPLC: (1) 使用 ffiX 柱前 ,必须 除去吸 附的蛋 白, 柱基质 必须完 全膨胀 。因此 ,对 于阳离 子交 换柱, 首先用 10 倍柱体 积的已 脱气的 水洗去 贮存在 柱子中 的溶剂 ,再以 10 倍柱 体积 的高盐 缓冲液 (约 0.5mol/L) 在低 pH (PH3.0 〜 5.0) 条件下 洗涤硅 胶类或 聚合体 IEX 柱。 (2) 除了 使用磷 酸钠和 磷酸钠 /NaCl 缓色 谱柱为 Aquap〇recx-3〇o 阳离子 交换柱 。柱 内径 冲液外 ,其 他步 骤同前 述阴离 子交换 2.lmmX 柱长 1〇〇mm ’洗 脱液为 0.02m〇1/L 碟酸纳 正 描 此 (PH6.0) 和 隣酸纳 /NaCl 缓冲液 。起 始洗脱 条件为 HPLC。 采用以 下梯度 洗脱: 在步骤 ⑷ 〜跳鱗 酸纳則 缓冲液 。线 性梯度 为:鱗 酸纳細 (7) 使用 20min 以上的 0%~80% 憐敎钠 / 缓 冲液在 15min*2〇min 分别麵 6〇% 和 8〇% 。峰 i NaCl 缓冲 液线性 梯度; 在步骤 (6) 中 ,用 2、 3 分别为 a- 糜蛋 白酶原 (2. 5jxg)、 核糖 核酸酶 A 复 合梯度 Omin 时 10% 鱗酸钠 /NaCl, 15min (1辟) 和 溶菌酶 (2.5网)。 流速为 0.25mL/min 时 60%, 20min 时 80%, 并保持 5min, 然 后在 5min 以上 的时间 回复到 10%, 在 按步骤 (6) 进行 下次进 样前, 10% 缓冲 液保持 15min〇 其层析 结果必 须与图 8.21 相似。 5. 方 法评注 离 子交换 色谱是 最早应 用的色 谱技术 之一。 20 世纪 20 年代初 ,离子 交换剂 作为水 的 软化和 处理介 质开始 受到人 们的广 泛关注 。合成 离子交 换树脂 出现于 30 年代, 60 年 代早期 Petersen 开始用 DEAE- 纤维素 (DEAE-cellulose) 来纯 化血浆 蛋白质 ,此 后又发 展了更 多的合 成树脂 。随 着在生 命科学 中的应 用和生 命科学 的不断 发展, 离子交 换色谱 在分 离肽和 蛋白质 方面显 示出越 来越多 的优点 ,已 成为一 种重要 的蛋白 质纯化 工具。 IEX-HPLC 不同于 RP-HPLC 之处 在于, 蛋白质 与层析 基质之 间的离 子作用 大于疏 水作用 。盐 浓度梯 度被用 来增加 流动相 的离子 强度并 减小其 蛋白质 与分离 介质间 静电作 用的 强度。 它们也 可用于 置换被 柱基质 滞留的 蛋白质 上的荷 电残基 。不同 的盐其 置换能 力 也不同 ,双 价盐通 常比单 价盐强 。除 盐梯度 之外, 也可用 pH 梯 度洗脱 。蛋白 质所带 电荷 在不同 pH 环境 下会发 生变化 ,如 溶液的 PH 降低 则蛋白 质所带 负电荷 下降, 相反, 增 加溶液 pH 则正电 荷降低 。因此 ,带 负电 荷蛋白 质可在 AEX 柱中 用降低 pH 梯 度来洗 脱, 而带正 电荷蛋 白可在 CEX 柱中 用增加 pH 梯度 来洗脱 。由于 pH 线性 梯度不 能很容 • 617 • 易地 产生且 分离效 能不高 ,盐浓 度梯度 就成为 IEX 分离 蛋白质 的标准 洗脱液 。所谓 pH 梯 度洗脱 (pH gracHent) 是指 在洗脱 过程中 逐渐变 更溶液 pH 的过程 ,而 盐梯 度洗脱 (Salt concemradon gradient) 是指逐 渐改变 缓冲液 的浓度 但溶液 pH 维 持不变 的洗脱 过程。 1) IEX 柱 及填料 表8.16蛋白质丨£乂-11?1^:的柱特性和分离条件11 基 质 弱 强 b 多聚 阴离子 交换利 WAX SAX 键合相 DEA QAE 粒度 /pm 5 〜 15 5 〜 15 孔径 /nm 10 〜 50 10 〜 50 柱规格 内径 /mm 4 〜 8 4 〜 8 长度 /cm 5 〜 30 5 〜 30 流速 / (mL/min) 0.2 〜 2.0 0.2 〜 2.0 硅胶类 阴离子 交换荆 WAX SAX 键合相 PEI Me- PEI 粒度 /pm 5 〜 10 5 〜 10 孔径 /nm 10 — 30 10 〜 30 柱规格 内径 /mm 卜 10 1 〜 10 长度 /cm 5 〜 25 5 〜 25 流速 / (mL/min) 0.02 〜 2.0 0.02-2.0 多聚类 阳离子 交换剂 WCX SCX 键合相 CM SP 粒度 /^tm 5 〜 15 5 〜 15 孔径 /nm 10 〜 50 10 〜 50 柱规格 内径 /mm 4 〜 8 4 〜 8 长度 /cm 5 〜 30 5 〜 30 流速 / (mL/min) 0.02 〜 2.0 0.02 〜 2.0 硅胶类 阳离子 交换剂 WCX SCX 键合相 CM SP 粒度 /;im 5-10 5 〜 10 孔径 /nm 10 〜 30 10 〜 30 柱规格 内径 /mm 卜 10 卜 10 长度 /cm 5 〜 25 5 〜 25 流速 /mL/min 0.02 〜 2.0 0.02 〜 2.0 温 度范围 5~4〇r 5-40X: a •缩写 : WAX, 弱 阴离子 交换; SAX, 强 阴离子 交换; DEA, 二 乙胺; QAE, 季铵 乙基; PE 丨, 聚乙烯 亚胺; Me*PE 丨 ,甲基 聚乙妹 亚胺; WCX, 弱 阳离子 交换; SCX, 强 阳离子 交换; CM, 羧 甲基; SP, 硫 丙基。 b •强和 弱是指 交换基 质的离 f 化程度 ,而 不是指 截留的 强度。 • 618 • 在 多肽和 蛋白质 的制备 分离中 ,理 想的填 料应该 具备下 面几个 特点: ①表面 完全亲 水; ②流 速在 lcm/s 以 下机械 性能应 稳定; ③离 子交 换容量 要高; ④在 较宽 pH 范围内 化学 性质应 稳定; ⑤形 状为 球形; ⑥有 效颗 粒度为 5 〜 10 卩 m, 孔径在 30 〜 lOOnm; ⑦填 料孔 体积在 0.5~1.0mL/g 之间; ⑧易于 填充; ⑨价格 便宜。 目前 蛋白质 的离子 交换填 料分为 3 种类 型:① 有机树 脂类; ②无机 - 有机复 合型材 料; ③无 机载 体表面 覆盖一 层很薄 (2~3nm) 的有机 键合相 。其 各种基 质的物 理性状 和化 学结合 基团的 特性总 结于表 8. 16。 大多数 ffiX 柱的 寿命比 RP 柱短。 KX 柱的 长短和 粗细均 对分离 效果产 生影响 ,过 于细长 ,分 离效果 虽好, 但耗时 较长; 过于 粗短 ,分 离快, 但效果 不甚好 。由于 5cm、 10cm、 15cm 或 25cm 的柱 效相似 ,但使 用短柱 较经济 。因此 ,在 保证分 离效果 的前提 下 应当采 用较短 的柱子 。一 个内径 4.6mmX 25cm 的 HPLC 柱的载 样量约 10mg 蛋 白质。 2) 缓冲液 的选择 缓冲液 和盐的 选择可 直接影 响蛋白 质的分 离效果 ,因此 ,对其 进行正 确的选 择就极 为重要 。原 则上 ,缓冲 液含有 的离子 不应和 IEX 柱中 的吸附 载体发 生作用 ,即 缓冲液 中的 带电荷 部分应 和柱填 料所带 电荷符 号相同 ,否则 IEX 柱中 pH 的变化 就难以 预料也 无法 控制。 表 8.17 不同蛋 白质等 电点的 离子交 换条件 等电点 (pi) 离子交 换种类 缓 冲液的 pH 8.5 阳离子 <7.0 7.0 阳离子 <6.0 阴离子 >8.0 5.5 阴离子 >6.5 注:酶 蛋白在 pH5.5~8.5 范围 内性质 稳定。 根据蛋 白质的 等电点 (isoelectric point, pi) 可 初步选 择分离 该蛋白 质的离 子交换 的适 宜条件 (见表 8.17)。 蛋 白质的 PI<7, 适 用阴离 子交换 层析; 若 PI>7, 则 使用阳 离子交 换层析 。但 这个条 件只是 在实验 开始前 的粗略 估计, 最后还 要根据 实验的 具体情 况 随时加 以修正 。为简 化分离 方法和 便于柱 与柱的 重复性 ,推荐 使用通 用缓冲 液和在 阴、 阳离子 色谱中 使用的 盐离子 (见表 8. 18)。 表 8. 18 中列出 了适用 缓冲液 / 盐 系统以 及和 变性剂 / 去垢剂 相一致 的对于 可溶性 膜蛋白 或其他 疏水蛋 白所需 的有机 缓冲液 。因 高纯 度的氯 化钠易 于获得 ,且在 210 〜 220nm 处对 阳离子 和阴离 子两种 类型的 IEX 都无 杂峰 ,而成 为一种 理想的 盐类。 但缺点 是卤化 物与不 锈钢的 HPLC 泵、 连接管 、加样 器 和柱等 长期接 触可产 生腐蚀 。在蛋 白质的 分离中 ,阴 离子交 换应从 pH7. 0 — 8.0 的氯 化钠 缓冲液 开始, 而阳离 子则从 PH5.0 〜 6.0 的 氯化钠 缓冲液 开始。 3) 柱 的处理 柱 中缓冲 盐在用 水冲洗 完后应 贮存于 50% 甲醇中 ,勿使 柱流干 。如 果在使 用中柱 压不 断增大 ,应 检查分 离柱是 否存在 有阻塞 。如果 存在, 则可按 RP-HPLC 中叙 述的方 法处理 。应 避免将 玻璃珠 (200 〜 400 目) 或 剩余的 装柱填 料重新 去充填 分离柱 顶部的 • 619 • 空隙处 。可以 使用保 护柱或 预备柱 。值 得注 意的是 ,由于 HPLC 设备易 受盐溶 液的腐 蚀, 若第二 天不用 ,最好 用蒸馏 水冲洗 干净。 表 8.18 蛋白质 IEX-HPLC 的 缓冲液 及其组 成成分 1EX 类型 缓冲液 ( 10 〜 50mmol/L) 钠盐 (0.2~0.8mol/L) 变性剂 / 去垢剂 ^ 有机溶 剂*> 阴离 子交换 Tris-HCl 盐酸盐 尿素 (4 〜 7mol/L) 甲醇 (40%) Bis-Tris 乙酸盐 CHAPS 乙腈 (30%) 磷酸盐 丙醇 (20%) 阳离 子交换 磷酸钠 盐酸盐 尿素 (4 〜 7mol/L) 甲醉 (40%) 乙酸盐 CHAPS (0.05%) 乙腈 (30%) 磷酸盐 SDS (0.02%) 丙醇 (20%) a. 缩写: SDS, 十二 烷基磺 酸钠; CHAPS, 3 [ (3- 胆酰胺 丙基- 二乙胺 )] - 丙 磺酸; Bis-Tris, 2- 双 (2- 羟乙基 ) 氨基 -2- 羟甲基 -1, 3- 丙 二醇。 b. 加 入溶剂 最大强 度的百 分比。 4) 梯 度洗脱 由 于许多 被分离 生化样 品的数 量是很 有限的 ,不 可能通 过多次 层析来 确定分 离的最 优 化条件 。因此 ,在预 实验中 即应确 定一个 较窄的 线性梯 度和适 宜于柱 内径的 流速。 5) 检测 应在有 肽吸附 发生的 210 〜 220nm 波长处 检测。 吸附与 肽或蛋 白质的 结合数 目成正 比。 280nm 检测值 有助于 判断肽 或蛋白 质是否 含有增 色物质 。检 测可使 用固定 、可变 波 长或光 电二极 管阵列 检测器 。固定 波长检 测器比 可变波 长检测 器便宜 ,固 定波 长检测 器在 214mn 处将满 足大多 数蛋白 质样品 的分离 。光 电二极 管阵列 检测器 的优点 是可记 录整个 波谱, 但比常 规检测 器的灵 敏度低 10%。 若峰高 超过记 录纸的 宽度即 吸收超 过量程 ,应 适当 降低记 录的扩 大倍数 。因 为通过 层析 峰的顶 部形状 可估计 分离所 得产物 的纯度 ,故必 须记录 到峰顶 的形状 。计算 机数据 提取系 统可自 动通过 洗脱后 的设置 量程和 数据绘 图来解 决这一 问题。 6) 假 层析峰 见 RP-HPLC 中的 叙述。 7) 回收率 疏水蛋 白质量 和生物 活性的 回收率 通常在 70% 〜 90% 之间。 疏水蛋 白质常 需使用 去 垢剂和 / 或有 机溶剂 (见表 8. 18) 来助溶 ,这 样会使 其回收 率下降 。若 为减低 蛋白与 蛋白之 间的连 接而在 缓冲液 中加入 了离液 序列高 的试剂 ( chaotropic agent ) , 则 蛋白质 的回收 率也可 产生较 大变动 且倾向 于变低 。一般 说来, 尿素比 chaotropic 试剂更 适合于 IEX-HPLC 的分离 ,但 若尿素 (或盐 酸胍) 使 用的是 2 〜 4mol/L 的 高浓度 ,加样 前使用 名为“ 硅饱和 ” (silica saturator) 的 保护柱 可延长 ffiX 柱 的寿命 。但 应注意 ,不 管缓冲 液的 pH 是多少 ,长时 间接触 chaotropic 促 溶盐能 溶解桂 土类柱 基质。 • 620 . 三 、体 积排阻 高效液 相色谱 1. 原理 体 积排阻 高效液 相色谱 (size-exclusion high-performance liquid chromatography, SE- HPLC) 分 离蛋白 质是根 据其相 对分子 质量的 大小进 行分离 的一种 液相色 谱技术 。在体 积排阻 色谱中 ,蛋 白质的 保留是 由于其 小分子 蛋白进 入了充 满溶剂 的填料 的微孔 ,而较 大 的分子 ,则 根据它 们的体 积大小 被排阻 ,大 分子先 于小分 子被洗 脱出来 。在蛋 白质分 离时 ,样品 加入含 确定孔 径层析 基质的 SE 柱中 ,然后 用缓冲 液洗脱 ,收 集各层 析峰即 可用之 分析。 2. 材料 已 脱气的 HPLC 级水 SE 缓冲液 (20mmol/L 乙酸钠 pH5.6, 150mmol/LNaCl) SE 蛋白 质标准 0 . 75cm x 30cm TSK G3000SW 的 SE 柱 真 空泵或 冻干机 4L 的锥形 过滤器 橡 胶软管 (用于 连接过 滤器和 真空泵 ) 带可 拆式不 锈钢支 持筛网 的硅化 硼玻璃 滤膜架 ,直径 47mm 尼龙 -66 滤膜 ,直径 47mm, 孔径 0.45fim HPLC 梯度仪 HPLC 紫外 检测器 HPLC 进样器 塑料 闪烁瓶 5mL (12mm x 75mm) 聚丙婦 试管 1 . 5mL 带螺盖 的微量 离心管 3. 试 剂配制 (1) 所有用 于制备 缓冲液 的水和 盐应是 HPLC 级 ,用 于制备 和贮存 缓冲液 的玻璃 制品 必须彻 底清洗 干净。 因为任 何杂质 的存在 都会使 蛋白检 测时的 背景值 增加。 (2) SE 蛋 白标准 :称取 2.0mg 甲状腺 球蛋白 (thyroglobulin)、 4.0mg 过 氧化氢 酶、 3. Omg 牛 血清白 蛋白、 3. Omg 卵清 蛋白和 4. Omg 核糖 核酸酶 A 于塑 料闪烁 瓶中, 加入 6. OmLSE 缓 冲液轻 轻摇动 ,以使 其溶解 混合。 在配制 过程中 ,必须 保证蛋 白质完 全溶解 。样 品在 加样前 需先进 行离心 ,以 除去不 溶性 杂质。 4. 操 作步骤 (1) 使用前 ,先 用已 脱气的 HPLC 级 水洗净 SE 柱内 贮存的 甲醇, 流速为 lmL/min, . 621 . 时间 30min。 SE 柱使 用完后 ,应 用水以 lmL/min 的流 速冲洗 30min 以除 去柱内 的缓冲 盐 ,然 后再用 100% 的 甲醇以 ImL/min 冲洗 30min, 并 PC 存于 100% 甲 醇中。 (2) 在 室温下 ,用 经脱气 处理的 SE 缓 冲液以 lmL/min 的流 速平衡 SE 柱 30min 直 至基 线稳定 。可以 通过串 联两个 SE 柱来 增加蛋 白质储 层析的 分辨率 ,这 种方法 可使分 辨率 增加约 40%, 但其 分离的 时间将 会延长 一倍。 (3) 进样 100/iL SE 缓冲液 进行一 次空白 样品的 层析。 进样时 要注意 排除注 射器和 针管中 的气泡 ,不可 使用尖 的针头 ,以防 进样阀 被损坏 。进 样后立 即在记 录图上 标记加 样时间 。根据 被分离 蛋白质 的含量 设定检 测器在 210 〜 220nm 处的 满量程 吸收比 单位, 一般在 0.1 〜 1.0 之间 。通 常的设 置为: 蛋白质 l〇〇pm〇l/L, 0.1; 500pmol/L, 0.3; lnmol/L, 0.5; 2nmol/L, 1.0。 记录 纸速为 0.5cm/min〇 在 排除了 由于旋 转进样 阀引起 的压力 波动所 造成的 影响后 ,若 仍有明 显的峰 出现, 可以肯 定是由 于分 离系统 中杂质 的存在 所致。 若杂质 峰超过 量程的 20%, 则应 更换分 离柱或 缓冲液 ,或者 同时更 换分离 柱和缓 冲液。 (4) SE 蛋 白标准 溶液在 200〇xg 离心 5min 后 ,取 100/zL 上清 液进样 ,重复 上述步 骤 (3) 进 行分离 。其层 析结果 应与图 8.22 类似 。若 峰高超 过记录 纸高度 ,应适 当降低 量程 的放大 倍数。 (5) 测 定每个 峰的洗 脱体积 。以 每一个 蛋白相 对分子 质量的 对数值 (loglO) 与对应 的洗 脱体积 (mL) 作图, 其图形 应与图 8.23 相似。 图 8.22 蛋白 质混合 物的体 积排阻 HPLC 层 析柱为 0.75cm x 30cm TSK G3000SW。 各蛋 白层析 *1 为 : 1. 甲状腺 球蛋白 (669kDa); 2 •过氧 化氢酶 (232KDa); 3. 牛血淸 白蛋白 (67kDa); 4 •卵 清蛋白 (43kDa) 和 5 •核糖 核酸酶 A (13.4kDa) 图 8.23 蛋 白质相 对分子 质量的 对数值 对 洗脱体 积作图 . 622 • (6) 对于研 究样品 ,重 复步骤 (3) 并手 动收集 层析峰 于聚丙 烯微量 离心管 或试管 中, 不可使 用聚苯 乙烯管 。对 收集的 每个峰 溶液脱 盐并用 Speedvac 蒸发 器除去 溶剂。 蛋白质 的脱盐 方法见 AEX-HPLC 操 作步骤 (7)。 5. 方 法评注 SE-HPLC 分离蛋 白质是 依据其 相对分 子质量 的大小 不同来 实现的 。大 于层 析基质 孔径 的蛋白 质将不 被滞留 或延迟 即被排 阻并被 直接从 柱内洗 脱出来 。而小 于层析 基质孔 径的 蛋白质 将渗入 孔内, 需要流 过较长 的路径 ,依分 子由大 到小的 顺序逐 渐洗脱 出来。 如 SE 柱的 基质与 蛋白质 之间无 静电或 疏水等 其他的 作用, 那么各 种蛋白 的洗脱 体积与 其相 对分子 质量的 对数值 有关。 使 用含氯 化钠的 pH5. 6 乙酸钠 缓冲液 ,可 以为 降低硅 土类基 质和质 子化氨 基酸侧 链 间的相 互作用 提供必 要的离 子强度 。各种 蛋白质 基团与 SE 柱 基质之 间如无 静电作 用 ,则 其蛋白 相对分 子质量 的对数 值与其 洗脱体 积应呈 现出线 性关系 。但 这种线 性关系 并不是 对于所 有的蛋 白质都 存在。 当 被分离 物质被 SE 柱基质 表面的 静电或 疏水作 用所延 迟时, 其洗脱 体积就 不再直 接反应 该物质 相对分 子质量 的大小 ,这种 情况下 ,对 其相对 分子质 量的估 计常常 偏低。 当使用 硅土类 基质时 ,低 离子强 度缓冲 液可引 起离子 排斥, 使样品 出现提 早洗脱 并高估 其 相对分 子质量 。为了 克服这 些作用 的影响 ,层 析最 好在减 小这些 作用的 条件下 操作。 添加有 机溶剂 ,如 10% (WV) 甲醇; 增加离 子强度 ,加 入铵盐 ,如 0.01% 的三乙 铵; 以及 改变 pH 以减少 正电荷 等都将 降低这 些作用 。当 SE-HPLC 操作中 存在盐 酸胍、 尿 素或十 二烧基 磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 等变性 剂或去 垢剂时 ,蛋 白质将 发 生变性 ,其 分子大 小也不 同于未 添加这 些物质 时在亲 和缓冲 液中的 测定值 。但 若蛋白 质 样品和 标准品 的烷基 化作用 减少并 保持可 溶状态 ,在变 性条件 下进行 SE-HPLC 分析 更能 精确地 确定蛋 白质的 相对分 子质量 大小。 1) SE 柱和 流动相 柱 的选择 主要是 基于蛋 白质混 合物的 相对分 子质量 。分 离度和 蛋白质 的分离 范围以 及 最小分 离相对 分子质 量之比 是选择 SE 柱填料 需要首 先考虑 的问题 。目前 TSK 系列 凝 胶柱被 认为是 蛋白质 最好的 分离柱 ,分 离度高 和吸附 性小是 TSK 柱系列 的特点 ,表 8.19 列出了 TSK 柱分离 蛋白质 的相对 分子质 量范围 。在用 TSK SW 柱和 常用缓 冲液系 统来分 离球蛋 白时, 建议分 子质量 <30 OOODa 的选 择使用 G2000SW SE 柱; 分子 质量 在 30 000 〜 500 OOODa 之间 的选用 G3000SW 柱 ,分 子质量 >500 000 的用 G4000SW 柱。 由于 分子大 小是通 过滞留 体积来 测定的 ,因此 ,使用 一套精 确和稳 定的泵 系统就 显得极 为重要 。无 论是偶 然的或 持续性 的泵液 的不精 确或液 体泄漏 ,半对 数作图 就不能 真实地 反 映出分 离系统 的流体 动力学 体积。 表 8. 19 常 规洗脱 液中球 蛋白在 TSKSW 柱上 的分离 柱填料 分子 质量分 离范围 /Da 最佳分 离范围 /Da G2 000SW 500 〜 100 000 < 30 000 G3 OOOSW 10 000 〜 500 000 30 000 〜 500 000 G4 000SW 20 000 〜 7 000 000 >500 000 • 623 . 体积排 阻色谱 的分离 度与柱 长度的 平方根 成正比 ,一般 柱长在 60~ 120cm 对蛋白 质的分 离效果 较好, 30cm 长的柱 子常用 于快速 分离。 以硅胶 为基质 的填料 ,其 使用的 流动相 pH 应在 2.5 〜 7. 5 的 范围内 ,如超 过此范 围 ,则键 合相的 有机层 溶解速 率增加 ,将加 快柱子 的恶化 ,减 少其使 用寿命 。另外 ,某 些蛋白 质在低 pH 的 情况下 ,其 回收率 会降低 很多, 因此, pH 接近 中性较 为理想 。一 般 pH 在 6.5~7.5 的含盐 (0.1 〜 〇.4mol/L) 缓冲液 用于洗 脱较为 适宜。 SE 柱 的流速 变动 一般在 0.1 〜 2.0mL/min 之间 ,一 般来说 ,降低 流速可 增加分 辨率。 具体的 分离条 件见表 8.20。 在 蛋白质 的分离 过程中 ,分离 条件可 通过改 变流速 或缓冲 液的成 分而进 一步进 行优化 。样品 应使用 〇.〇1%~〇. 5% 的稀溶 液且体 积不应 超过柱 体积的 1%。 最 后一 个洗脱 峰的滞 留时间 不应超 过第一 个峰的 2 倍 ,否 则应在 流动相 中添加 5% 〜 20% 的甲醇 以抑制 蛋白与 柱之间 的疏水 作用。 表 8.20 蛋白质 SE-HPLC 的柱特 性及分 离条件 变 量 选 择 支持体 材料 硅胶, 聚合物 键合相 亲水 (-OH) 颗 粒大小 //im 5 〜 25 孔径 /nm 10 — 50 柱尺寸 长度 /cm 25 〜 90 直径 /mm 4.6 〜 21. 5 分 离条件 温度 根据 产品的 要求进 行调节 流速 / (mL/min) 缓冲液 , 0.10-2.0 20 ~ 100mmol/L 乙 酸钠或 磷酸钠 (pH5~8) 含 NaCl (0.1 〜 0.4mol/L), 测 定变性 分子大 小时加 变性剂 (如 8mol/L 尿素 , 6mol/L 盐 酸狐或 0.196SDS)。 由于 膜蛋白 一般 不溶于 水相, 应使用 SDS 助溶 注:由 于可选 用产品 很多, 这里不 可能列 出所有 柱基质 、规格 和分离 条件。 主要可 参考有 关专业 公司提 供的产 品 指南。 2) 回收率 SE-HPLC 适用 于测定 可溶和 膜球蛋 白的分 子大小 。当 一种蛋 白质的 大小与 混合物 中 的其他 成分有 2 倍或以 上的差 别时, SE-HPLC 即 可用于 其分离 纯化。 SE-HPLC 也可 用于 稀释血 清或胞 质样品 的分离 。由于 蛋白质 分解或 其相互 间作用 而引起 分子大 小的变 化 也可用 此方法 进行分 离研究 。在流 动相中 未使用 变性剂 、去垢 剂或有 机溶剂 的情况 下 ,该 方法对 蛋白质 和其生 物活性 的收率 较高。 3) 其 他问題 其他 一些常 见和应 该注意 的问题 ,见 RP-HPLC。 • 624 • 四、 高效聚 焦色谱 1. 原理 高效聚 焦色谱 (high-performance chromatofocusing, HPCF) 分离蛋 白质是 基于两 性 电解质 在离子 交换柱 上形成 pH 梯度 而导致 蛋白质 表面所 带电荷 性质的 不同而 进行分 离的 。蛋 白分子 在某一 pH 时 ,带 有的正 电荷数 目和负 电荷数 目相等 ,这一 pH 即为等 电点 (isoelectric point, pi) 的 pH。 待 分离蛋 白的混 合物在 加样前 ,先在 高于其 pi 的 pH 中预 平衡。 分离时 ,稀 释的多 聚缓冲 液流经 分离柱 并形成 一定的 pH 梯度, 当缓冲 液 pH 达到待 分离蛋 白质的 pi 时 ,该 蛋白就 可被洗 脱下来 ,收集 各洗脱 峰的溶 液即可 用于进 一步的 分析。 本节以 类固醇 激素受 体的分 离为例 ,介 绍蛋白 质的高 效聚焦 色谱。 2. 材料 雌 激素受 体来源 的组织 17(3-1251 碘标 雌激素 (125I-E2) 17p-3H 标 雌激素 (3H-E2) 己 烯雌酚 (DES) 葡聚糖 包被炭 (DCC) Tris/DTT 溶液 (25mmol/L Tris-HCl pH8 • 1 ~ 8 . 3, lmmol/L DTT, 20 % 甘油) 1>^^0丁八溶液(1〇111111〇1/1^丁1^-只(:1口1^7.4,1.5111111〇1/1^£0丁八,10%甘油, 10mmol/L 一 ■硫 代丙 二醇或 lmmol/L DTT) 钼酸钠/丁1^/01'1'溶液(含有10〇1111〇1/[钼酸钠的丁1^/01'1'溶液,?册.1〜8.3) 钼酸钠 /Tris/EDTA 溶液 (含有 10mm〇l/L 钼 酸钠的 Tris/EDTA 溶液, pH7.4) 脱气的 HPLC 级水 Polybuffer 74 溶液 [Polybuffer 74 用 20% 甘油以 1:15 (WV) 稀释, pH3. 5] Polybuffer 96/74 溶液 [Polybuffer 96 和 Polybuffer 74 按 30 : 70 ( V"/ V") 的 比例混 合 ,并用 20% 甘油按 1:20 稀释 。调节 pH 至 4. 0~5.0 之间] 钼酸钠 /Polybuffer 96/74 溶液 [以 30:70 (W\〇 混合的 Polybuffer 96 和 Poly- buffer 74, 与含 10mmol/L 钼 酸钠的 20% 甘油以 1:10 (V/V) 稀释 ,调节 pH 至 5.0] HIC 溶液 I(10mmol/L KH2P04/K2HP04pH7. 4, 1.5mmol/LEDTA, lmmol/L DTT, 10 % 甘油) HIC 溶液 il [在 HIC 溶液 I 中加入 2mol/L 的 (NH4)2S04, pH7.4] HIC 溶液 III [在 HIC 溶液 I 中加入 3~4mol/L 的 (NH4)2S04, pH7.4] HIC 溶液 IV (500mmol/L KH2P04/K2HP04 pH7.4, 1.5mmol/LEDTA, lmmol/L DTT, 10 % 甘油) HIC 溶液 V (在 HIC 溶液 I 中加入 5% ~20% 的有机 溶剂, 如甲醇 、丙醇 或乙腈 等 。在 混合有 机溶剂 和含高 浓度盐 的水溶 液时, 可能会 导致盐 的沉淀 。因此 ,使 用前应 各取少 量的这 两种溶 液混合 ,以观 察盐的 溶解性 ) . 625 . HIC 溶液 VI (在 HIC 溶液 IV 中加入 5% 〜 20% 有机 溶剂, 卯甲醇 、丙 醇或乙 腈等) 匀浆机 Beckman Ti-70. 1 或 TL-100.2 转头 Beckman L8-70M 或 TL-100 超速 离心机 AX-500 HPLC 柱 HP LC 梯 度设备 7 计数器 pH 电极和 pH 计 电导仪 馏分 收集器 Bradford 色 度分析 仪及其 他试剂 3. 试 剂配制 葡聚糖 包被炭 (DCC): 于 lOOmL Tris/EDTA 内加入 lg Norit A 和 0.5g 葡聚糖 T70, 室 温下混 合过夜 ,使 DCC 沉积 。去 掉上清 ,重新 混悬于 100mLTris/EDTA, 反 复几次 ,即 可获得 洗净的 DCC。 以 混悬液 贮存于 4X: 备用。 雌激素 受体来 源的组 织:大 鼠产后 14~21d 的乳腺 组织; 人 的子宫 组织或 250g 的 Sprague-Dawley 大 鼠子宫 组织; 人的乳 腺瘤活 检组织 。待 分的 受体或 蛋白质 ,其 他组织 来源或 特别纯 化的蛋 白混合 物也可 使用。 在 上述整 个试剂 和溶剂 的制备 过程中 ,均 应使用 HPLC 级的水 、盐 和有 机溶剂 。所 有缓冲 液均应 采用 0.45Mm 的滤膜 过滤并 进行脱 气处理 ,脱气 方法见 前述。 因为缓 冲液较 易长菌 ,在 2d 内就 可腐 败 ,所 以应在 使用当 天新鲜 配制。 4. 操 作步骤 在 下述操 作过程 中如果 没有特 别说明 ,所有 的操作 均应在 4X: 进行 。因为 , 类固醇 激素受 体和大 多数 调节蛋 白都不 稳定, 在低温 下操作 可以降 低配体 受体的 解聚以 及蛋白 质变性 剂和去 垢剂所 产生的 作用。 (1) 称取 一定量 新鲜的 授乳大 鼠的乳 腺组织 ,剪碎 ,按约 200mg 组织加 lmLTris/ EDTA 溶 液的比 例加入 缓冲液 (人乳 腺瘤或 子宫组 织可按 200~400mg 加入 lmL Tris/ EDTA 溶液 ), 然后用 Brinkman Polytron 匀架 机进行 匀架, 一 般 2 次, 10/s 次。 句架則 应尽可 能去除 组织中 的脂肪 ,因为 脂类可 干扰类 固醇受 体的分 析并可 导致层 析柱的 阻塞。 这 一操作 是将可 溶性蛋 白受体 从组织 中抽提 入缓冲 液即匀 浆液中 。也 可用组 织培养 的人乳 腺癌细 胞 (如 MCF-7 或 T47-D 细胞系 ) 来代替 , 在这种 情况下 ,培 养细胞 (约 108 个) 须 用聚四 M 乙烯、 玻璃 匀浆器 破碎, 上下来 回匀浆 6~10 次 即可。 在上述 操作中 ,如 果使用 人体的 组织时 要特别 注意潜 在生物 性危害 ,如 肝炎和 A 丨 DS。 所 有盛放 和 接触过 这些组 织的试 管和设 备都应 在消毒 液中浸 泡过夜 ,在重 用和丢 弃之前 均应进 行高压 消毒。 (2) 在 Beckman L8-70M 超速离 心机上 ,采用 Ti70.1 转头 ,在 4X: 40 OOOr/min (即 147 00〇xg) 条件下 将匀浆 液离心 30 〜 6〇min ,制备 胞溶物 。也 可在 BeckmanTL- 100 台式离 心机上 ,用 TL-100.2 的转头 ,在 70 000r/min 下离心 匀浆液 15min。 • 626 • (3) 离心 完毕后 ,小心 移取含 有胞质 组分的 上清液 ,注 意避 开顶层 飘浮的 脂层。 (4) 用 Bradford 和 比色试 剂监测 胞溶物 浓度。 (5) 用 2~3nmol/L 的 1 500~2 000Ci/mmol125I-E2, 在 有或无 200 倍 克分子 数过量 的竞争 性配体 DES 时 , 4X: 下孵育 3~4h, 标记胞 溶物。 也可用 其他配 体如氚 (3H) 来标记 ,这 主要 取决于 待纯化 的受体 。被 分离的 蛋白质 ,可通 过分析 层析组 分中的 功能活 性来进 行鉴定 。注意 按操作 规程小 心处理 放射性 材料。 (6) 用活 性炭从 DCC 混 悬液中 除去未 结合的 类固醇 。先 吸取等 量的在 Tris/EDTA 中 制备的 DCC 混悬 液加入 一玻璃 试管中 ,用 lOOOXg 离心 5min 以收集 DCC 混 悬液中 的 炭活性 ,吸出 上清液 并加入 等量的 含放射 性配体 (包 括未与 或已与 受体连 接的) 的胞 溶 物于活 性炭中 ,重 新混悬 ,并在 4*C 静置 5min, 再次以 100〇Xg 离心 5min 去 除重悬 浮的 DCC, 所 得上清 (胞 溶物) 中 即仅含 与类固 醇受体 结合的 放射性 配体。 (7) 将经 DCC 处 理过的 胞溶物 0.1~0.2mL 注入 预先用 Tris/DTT 溶 液预平 衡好的 AX-500 柱 (见图 8.24)。 图 8.24 高效液 相色谱 装置图 装置由 带有进 样器和 分析型 柱及其 附置的 滤器或 保护柱 组成。 检测系 统由 紫外检 测器, pH 计和 电导仪 ,放射 性同位 素检测 器组成 。用 馏分 收集 器收集 洗脱液 。所 有仪器 操作须 同样在 3~4t: 的低温 下进行 柱的处 理:在 使用前 ,先用 10 倍柱体 积的水 去除柱 中的贮 存溶剂 ,再用 1〇 倍柱 体积的 Tris/ DTT 溶液进 行平衡 。在 完成分 离之后 ,用 3~5 倍柱体 积的低 pH (<3) 和高盐 (约 lmd/L) 缓冲液 洗柱以 除去剩 余物, 最后用 HPLC 级水冲 洗柱和 HPLC 系统 并将柱 贮存于 1〇〇% 的有 机溶剂 ( 如乙腈 或甲醇 ) 中。 (8) 将 Polybuffer 96/74 溶 液泵入 HPLC 柱流经 固定相 ,流速 lmL/ min, 时间 lOOrnin, 以产生 pH 梯度, 同时进 行层析 馏分的 收集。 在 层析时 ,用配 套的紫 外检测 器监测 蛋白质 ,用 配套的 pH 计测 pH, 用配套 的电导 仪测电 导即缓 . 627 . 冲 液的离 子强度 ,用配 套的放 射性检 测仪监 测层析 峰结合 或游离 的放射 性标记 的配体 。这 种柱 系统可 形成 (0.05±0. 01) U/mL 的逐渐 降低的 pH 梯度。 可以通 过改变 多聚缓 冲液的 成分和 浓度来 改变其 梯度。 若多 聚缓冲 液中使 用了能 与许多 配体结 合的蛋 白质稳 定剂钼 酸钠, 由于其 在低于 pH5.〇 时 不溶, 因此, 必须在 此之前 将其从 梯度中 去除。 (9) 手动 测定各 馏分的 PH, 用 y 放射 性同位 素检测 器或液 体闪烁 计数器 (使用 3H- E2 标记胞 溶物时 ) 测量 放射性 活性, 用以被 结合的 配体量 对层析 的馏分 数作图 (见图 8.25A) (10) 按步骤 (7) 再生 HPCF 柱。 (11) 重 复步骤 (7) 和 (8) 的操作 ,在 DES 存在 下标记 (用 125I-E2) 胞溶物 ,将 结果 按步骤 (9) 作图。 DES 是 雌激素 配体的 竞争性 抑制剂 。在 抑制剂 DES 存在下 ,结 合配 体的缺 乏表明 在步骤 (9) 中 检测 到的洗 脱蛋白 质与配 体的结 合是特 异的。 (12) 按步骤 (7) 再生 HPCF 柱 ,并在 游离配 体的条 件下再 进行一 次层析 操作。 监 测游离 配体的 洗脱液 很重要 ,因 为与蛋 白质结 合的配 体和游 离配体 的色谱 行为的 表现是 不一致 的 ,据 此可将 其区分 开来。 x |20 想 轚 龚 10 0 A pH= 6.6 9 30 B - pH= =5.0 ■ pH=6.15 j 8 7 20 \pH=5.3 ' 6 - pH=3.6 ' A 'pHy i 5 10 4 0 jj 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 120 馏分数 〇. 图 8.25 钼酸 钠对用 HPCF 分 离雌激 素受体 同类物 的影响 雌激 素受体 的同系 物在无 (A) 和有 (B) lOmmol/L 钼 酸钠存 在下的 图形显 示其多 态性。 注意 第二个 洗脱在 PH6.0 处 (见 B 图的箭 头处) 避 免钼酸 钠沉淀 以上介 绍的是 聚焦色 谱的基 本方法 。可 以通过 在流动 相中添 加缓冲 液成分 或非离 子去垢 剂来稍 做改良 ,改 良后的 HPCF 适用 于更广 泛的蛋 白或膜 蛋白的 分离。 下面介 绍 在流动 相中存 在受体 稳定剂 (l〇mmol/L 钼酸钠 ) 的改良 HPCF 的 操作。 (1) 〜 (6) 同前述 基本方 法操作 步骤的 (1) 〜 (6) 步, 只是在 其中用 钼酸钠 / Tris/EDTA 溶液 替代了 Tris/EDTA 溶液。 (7) 将 DCC 处理过 的胞溶 液注入 预先用 钼酸钠 /Tris/DTT 平 衡过的 AX-500 柱 。也 即用 钼酸钠 /Tris/DTT 替代了 Tris/DTT。 (8) 通 过泵送 钼酸钠 /Polybuffer %/74 溶 液产生 pH 梯度 ,流速 lmL/min, 持续 . 628 • 60min (见图 8.25B, 进行至 箭头处 )。 (9) 通过栗入?〇1>^1^6174产生余下的卩1'1梯度,11111/111丨11,再持续6〇111丨11(见图 8.25B, 箭头 后部分 )。 (10) 按前 述基本 方法操 作步骤 的步骤 (9)~(12) 进行 。在操 作步骤 要求重 复步骤 (8) 处, 用未改 良方法 的步骤 (8) 和 (9) 取代。 5. 方 法评注 聚焦色 谱是由 Sluyterman 和 Eligerma 于 1978 年 在研究 中性缓 冲液的 交换能 力时发 现的。 它是一 种能产 生聚焦 效应的 相关层 析技术 ,由 在离子 交换柱 上产生 pH 梯 度来实 现 。这 种技术 分离不 同蛋白 质的原 理在于 ,很 小的如 0.1 个 pH 的 改变即 可引起 蛋白质 离子基 团电荷 的变化 ,从而 使分离 柱能将 它们分 离开来 。它 的优点 是能够 很方便 地使用 不连续 的方式 构成多 pH 梯度 来优化 蛋白质 分离的 条件。 HPCF 可用 于分离 和纯化 激素- 蛋白受 体和其 他固醇 类受体 ,也 可用于 从可溶 的粗蛋 白或去 垢剂助 溶的膜 蛋白中 分离出 蛋白质 。本处 所述的 HPCF 方 法更有 利于研 究和分 离类固 醇激素 类受体 。在操 作步骤 中使 用阴离 子交换 柱进行 的高效 液相聚 焦层析 可迅速 、高效 地分离 极少量 (ng 级) 的 类 固醇激 素受体 。在 改良的 方法中 ,由 于将广 泛用于 类固醇 受体的 稳定剂 钼酸钠 加入到 缓 冲液中 并用于 HPCF, 从 而改善 了受体 分离的 效果。 1) 分离柱 及填料 聚焦色 谱分离 蛋白质 需使用 弱离子 交换柱 ,常使 用的有 两大类 : SynchromAX 和 Pharmacia Mono P。 前 者采用 孔径为 10 ~ 100nm 的 一 种与聚 乙稀胺 结合的 桂材料 ,后者 采 用的专 用材料 。原 如上应 该在考 虑了待 分蛋白 质的大 小之后 ,再 决定选 用孔径 足够大 的 HPCF 柱基质 ,以 避免 产生体 积排阻 效应。 2) 缓冲液 选择 HPCF 的缓 冲液十 分重要 。所 选缓冲 液应能 产生可 重复的 、与 待分蛋 白质相 匹配的 pH 范围 的线性 梯度, 通常为 pH8.0 〜 3.0, 而 pH 的变化 精度为 0.05 〜 0.1U/ mL。 由 于该方 法涉及 pH 的变化 ,因此 ,应 特别注 意防止 流动相 中的一 些成分 (如钼 酸钠) 产 生沉淀 。这 种沉淀 用肉眼 可能观 察不到 ,但 若层析 时的背 景压力 明显增 加了, 则不 能再继 续进行 操作, 而要用 HPLC 级 水来冲 洗系统 。为避 免沉淀 的产生 ,在 梯度 达到 PH5.0 之前 ,应用 不含钼 酸盐的 缓冲液 取代含 有钼酸 盐的缓 冲液。 若要获 得一个 连续平 滑的蛋 白质洗 脱梯度 ,则要 求仔细 选择多 聚缓冲 液的组 成和稀 释度。 3) 回收率 对于 雌激素 和孕激 素受体 ,该方 法的回 收率通 常可达 85% 〜 100%。 但是对 其他一 些受体 或蛋白 质而言 ,其 回收 率可能 偏低。 其他有 关参数 和相关 问题, 可参见 RP-HPLC 中的 讨论。 五 、高效 疏水作 用色谱 1. 原理 咼效 疏水作 用色谱 ( high-performance hydrophobic-interaction chromatography, • 629 • HPHIC) 分离蛋 白质, 是基于 蛋白质 表面的 疏水性 残基在 HIC 基 质上亲 和力的 差异, 当用 流动相 洗脱时 ,其 各组分 在基质 上移动 速率不 同而达 到分离 目的。 HIC 基质 上的配 基 是具有 一定疏 水功能 的基团 ,如 甲基、 苯基等 ,而 蛋白质 分子表 面的疏 水基团 则是含 有非极 性侧链 的氨基 酸残基 ,如 丙氨酸 、色 氨酸、 脯氨酸 、苯 丙氨酸 等疏水 性基团 。在 不同介 质中, 疏水基 团暴露 的多少 就存在 差异, HPHIC 正是 利用盐 -水体 系中蛋 白质组 分的 疏水基 团和柱 基质疏 水配基 之间的 结合力 的不同 ,而使 样品组 分得以 分离的 。在高 盐溶 液的条 件下, 蛋白质 疏水基 团和柱 基质配 基之间 的结合 力增强 ,随着 洗脱过 程中逐 渐降低 流动相 中的盐 浓度, 蛋白质 与基质 的作用 减弱即 洗脱强 度增加 ,这 样蛋白 质就按 其疏 水性由 大到小 的顺序 被有选 择的洗 脱下来 ,并保 持其生 物活性 。洗脱 下的蛋 白质即 可 被分别 收集和 分析。 本 节将讨 论类固 醇激素 受体和 其他蛋 白质的 高效疏 水作用 色谱。 2. 材料 雌 激素受 体来源 的组织 Tris/EDTA 溶液 17|3-1251 碘标 雌激素 (125I-E2) 17(3-3H 标 雌激素 (3H-E2) 己 烯雌酚 (DES) 葡聚糖 包被炭 (DCC) HIC 溶液 I 〜 VI 脱气的 HPLC 级水 Beckman CAA-H 1C 柱 Beckman Ti-70. 1 或 TL-100.2 转头 Beckman L8-70M 或 TL-100 超速 离心机 HPLC 梯 度设备 y 计数器 pH 电极和 pH 计 电导仪 馏分 收集器 3. 试 剂配制 葡聚糖 包被炭 (DCC): 于 lOOmLHIC 溶液 I 中加入 IgNoritA 和 0.5g 葡聚糖 T70, 室 温下混 合过夜 ,使 DCC 沉积 。去 掉上清 ,重新 混悬于 lOOmLHIC 溶液 I, 反 复几次 ,即 可获得 洗净的 DCC。 以 混悬液 贮存于 4t: 备用。 其他试 剂和溶 液的配 制及其 应注意 的问题 ,参 见上 HPCF。 4. 操 作步骤 (1) 〜 (6) 同上聚 焦色谱 (HPCF) 操 作步骤 的步骤 (1) 〜 (6), 其中所 有使用 Tris/ED- TA 溶 液的地 方均用 HIC 溶液 I 代替。 • 630 • (7) 用 HIC 溶液 II 平衡 好带有 保护柱 的 CAA-HIC 柱后 ,将 0.1~0.2mL 用 DCC 处 理的胞 溶物与 等量的 HIC 溶液 III 混合, 然 后用该 混合物 加样。 HIC 柱 使用前 ,用 10 倍 柱体积 的水冲 洗柱中 的 贮存液 ,再用 10 倍柱 体积的 HIC 溶液 II 平衡。 完成 HPLC 后, 除去所 有用于 HPHIC 的残 留硫酸 铵和其 他盐类 , 以防止 腐蚀不 锈钢管 、老化 泵密封 圈和沉 积于管 道和流 动池内 。应用 HPLC 级 的水洗 去 这些盐 。若 2~3d 内 不再使 用该柱 ,还应 将其贮 存于 100% 的 乙腈或 甲醇等 有机溶 剂中。 对 于其他 HPHIC 分离, HIC 溶液 I 和 II 的成 分可 以改变 。但 在起始 时必须 使用高 离子强 度的流 动相 ,因 为高盐 增强了 蛋白质 和柱基 质之间 的疏水 作用。 (8) 注入 0.2~0.4mL 样品 ,在 30min 内形成 一个从 100% HIC 溶液 II 到 100% HIC 溶液 I 的梯度 ,流 速为 lmL/min。 再泵 入 100% HIC 溶液 I, 流速 lmL/min, 30mm。 然后 用溶液 II 重新平 衡柱子 ,重做 一 次同样 的层析 ,用 以分离 DCC 处 理过的 胞溶物 。该胞 溶物在 DES 存在下 ,用 125I-E2 0 10 20 30 40 50 60 馏分数 图 8.26 用高 效疏水 作用色 谱从大 鼠子宫 胞溶 物中分 离雌激 素受体 的典型 层析图 »素 受体含 有结合 np125! 碘标雌 激素。 流动相 A: 2mol/L ( NH4 )2S04, 10mmol/L KH2P04/K2HP04, 动相 B: 除缺 2n»l/L (NH4)2S04 外, 其余同 流动相 A〇 标 记过。 疏水 作用色 谱分离 雌激素 受体的 层析图 见图 8.26。 (9) 可 直接用 HPLC 附带 的放射 性检测 梯度为 3〇min 内 0%~100%B。 流速为 lmL/min。 收率为 器 (如 流程检 测器测 或高 (3 射线) 检测蛋 %%。闭环 显 示了雌 激素受 体结合 ,而快 速下降 线显示 白洗 脱液的 放射性 配体。 若使用 氚标记 ,也 可 用常规 y 计数器 或液体 闪烁计 数器检 测每管 lmL 洗 脱液的 放射性 。若纯 化需要 ,必 须用紫 外吸收 或蛋白 质定量 分析来 监测层 析分离 并与相 应的对 照相进 行比较 。用 经标准 离 子强度 校正的 电导仪 检测洗 脱峰溶 液的盐 浓度。 (10) 按步骤 (8), 用标记 的配体 进行一 次层析 操作, 以证实 已与蛋 白结合 的放射 性 配体的 洗脱组 分与未 结合的 游离配 体的洗 脱组分 是不相 同的。 也可采 用比上 述疏水 性强的 Propyl-500 柱 (0.46cmX25cm) 来进行 蛋白质 和类固 醇激 素受体 的层析 分离, 但其缓 冲液同 上述有 所不同 。其 具体方 法为: U) 〜 (6) 按聚焦 色谱操 作步骤 (1)~(6) 步骤所 述进行 ,以 HIC 溶液 I 或 IV 代替 Tris/EDTA 溶液。 受 体可被 HIC 溶液 I 或 IV 抽 提出来 。若用 HIC 溶液 I 抽提胞 质受体 ,在样 品进样 前盐浓 度必须 调节到 HIC 溶液 IV 的盐 浓度。 若使用 HIC 溶液 IV, 则 胞质和 核受体 两者将 被同时 抽提。 (7) 调节 DCC 处理 过的胞 质成分 (0.1~0.2mL) 的离子 强度与 HIC 溶液 IV 的离 . 631 . 子强 度相等 ,用 HIC 溶液 VI 平衡 带有保 护柱的 Propyl-500 柱 ,然后 注入混 合物。 柱 使用前 ,用 10 倍柱体 积水冲 洗柱中 的贮存 缓冲液 ,再用 10 倍柱 体积的 HIC 溶液 VI 平衡。 对 于其他 HPHIC, HIC 溶液 V 和 VI 的成分 可改变 。在 有或无 有机溶 剂时, 其他盐 和不同 的盐浓 度也 可使用 。有关 HPHIC 柱的贮 存等见 前述操 作步骤 (7)。 (8) 注入 0.2 〜 0.4mL 样品 ,在 30min 内产生 一个从 100%HIC 溶液 VI 至 100% HIC 溶液 V 的梯度 ,流 速为 lmL/min。 再以 lmL/min 的流 速泵入 100% 溶液 V, 30mm。 用溶液 VI 重新平 衡柱子 , 用含有 DCC 处理 的胞质 (在 DES 存 在下用 125I-E2 标 记过) 进行一 次同样 的层析 分离。 (9) 按操 作步骤 (9) 检 测疏水 作用色 谱层析 的洗脱 蛋白。 (10) 再 按步骤 (8) 用标记 的配体 进行一 次层析 操作, 以证实 游离配 体的洗 脱位置 不同 于与蛋 白质结 合配体 的洗脱 位置。 5. 方 法评注 HPHIC 分离 蛋白质 是基于 其疏水 性的不 同而得 以实现 。近 年来, HPHIC 使 用较低 疏水性 的基质 ,就 避免了 使用含 高浓度 有机溶 剂的流 动相来 洗脱蛋 白质, 高浓度 有机溶 剂在流 动相中 的存在 易导致 蛋白质 变性。 HPHIC 通 过低盐 梯度来 洗脱时 已降低 了起始 时的高 盐浓度 ,这 种低盐 浓度减 弱了疏 水作用 并能在 非变性 条件下 洗脱和 分离蛋 白质。 硫 酸铵是 HPHIC 流动 相中最 常用的 盐类, 主要是 因为它 不改变 许多蛋 白质的 生物活 性 。其他 盐类如 磷酸盐 、柠 檬酸盐 、硫 酸盐和 盐酸盐 等也都 可使用 ,但要 选择适 宜的条 件 。合适 的去垢 剂和有 机溶剂 加入流 动相中 ,可产 生较好 的分离 效果和 较高的 收率。 用 HPHIC 分离未 知蛋白 时应采 用的层 析条件 没有一 个固定 的标准 ,应 通过 实验对 分离条 件进行 优化, 建立这 些条件 时应遵 循一般 的原则 ,层 析前的 样品制 备应当 尽量避 免被 污染, 要保证 待分蛋 白质的 稳定性 并使其 在分析 期间保 持恒定 ,以使 每一种 蛋白质 或蛋白 质混合 物都能 得到充 分的分 离和有 很高的 收率。 HPHIC 方法可 回收到 80%~100% 的类 固醇结 合活性 (被雌 激素受 体结合 )。 但其 他蛋 白质的 收率不 尽相同 。使用 疏水性 更强的 HIC 柱基质 和含有 可减少 疏水作 用的有 机 溶剂可 以提高 收率。 其他有 关参数 和注意 的问题 ,可 参见前 几节中 的相关 部分。 第六 节用免 疫沉淀 法纯化 蛋白质 免疫 沉淀法 一般由 6 个相关 步骤组 成:① 去污剂 裂解细 胞膜, 以分离 膜结合 抗原; ②抗原 与特异 性抗体 结合; ③沉淀 抗原- 抗体复 合物; ④洗涤 复合物 沉淀; ⑤抗 原从复 合物中 分离; ⑥ 电泳分 析抗原 。图 8.27 概括 了以上 步骤。 本节 所介绍 的主要 方法, 是用与 Sepharose 共价 交联的 特异性 单克隆 抗体或 多克隆 抗 体与放 射性标 记抗原 之间的 免疫沉 淀反应 ,达 到分离 抗原的 目的; 此外, 还介绍 Sepharose 交 联抗体 与未标 记抗原 的免疫 共沉淀 。以 下列举 5 种不 同的免 疫沉淀 分离方 法供 选择。 • 632 • 含未标 记或放 射性标 记蛋白 质抗原 的细胞 ①裂解 (去 污剂) I ②免疫 共沉淀 ② 抗原 特异性 单克隆 (或多 克隆) 抗体 -Sepharose ③ ④ 抗 ig 抗体 抗原 特异性 单克 隆抗体 ③洗涤 ④解离 抗 Ig- Sepharose 或蛋白 A/G-Sepliarose 或 ▲黄 葡萄球 菌细胞 ③ ④ 一 、用 Sepharose 交联 抗体免 疫共沉 淀放射 性标记 的抗原 1. 材料 125I- 表面 标记细 胞或生 物合成 标记的 35s-、 3H- 或 14C- 标 记细胞 裂解 缓冲液 [1% TritonX-100, 1% 牛血红 蛋白, lmmol/L 碘乙 酸铵, Aprotinin (0.2 膜蛋 白酶抑 制单位 /mL)、 lmmol/L PMSF (100mmol/L PMSF 无水乙 醇溶液 存 ,临时 新鲜加 入稀释 )。 所有成 分均用 TSA 稀 释溶液 配制] 缓冲液 (0.1%TritonX-100, 0.1% 牛血 红蛋白 ,均用 TSA 溶液 配制) 抗体 - Sepharose . 633 • Tris/Saline/ Azide (TSA) 溶液 (O.Olmol/L Tris-HCl pH8.0, 0.14mol/L NaCl, 0.025% NaN3) 0. 05 mol/ L Tris-HCl, pH6.8 不含 抗体或 仅含无 关抗体 的活化 的对照 Sepharose 2XSDS 样品 缓冲液 2. 操 作步骤 所有实 验均在 4*C 的冷 库或 冰浴上 进行。 裂解 细胞: (1) 将 标记同 位素的 细胞悬 浮于裂 解液中 (5xl〇7/mL), 于 4X: 放置 lh。 (2) 300〇xg 离心 裂解物 lOmin, 移去 细胞核 ,收集 上清。 (3) 再于 100 000 x g 离心 lh, 弃沉淀 ,收集 上清。 上清 液可立 即使用 或贮于 -701C。 贮 存时间 受标记 同位素 的半衰 期制约 。避 免反复 冻融以 免破坏 抗原决 定族结 构或使 某些非 共价结 合蛋白 复合物 解聚。 (4) 每 200pL 上 清加入 10/iL 活化 的对照 Sepharose, 室温 下振摇 2h 或 4t3 过夜。 (5) 以 1400r/min (约 20〇Xg) 离心 lmin, 保 留上清 。 此步 旨在去 除上清 中非特 异性吸 附的蛋 白质。 对照 Sepharose 的制备 方法, 可参见 免疫亲 和层析 部分有 关抗体 -Sepharose 的制 备方法 ,惟 不加抗 体或仅 加无关 抗体或 IgG, 但均 不应与 待分离 的抗原 起交叉 反应。 免疫沉 淀抗原 : (6) 用裂解 液包被 1.5mLEp 管 ,防 止试管 壁非特 异性吸 附抗原 。室温 下放置 lOmin, 然 后吸去 溶液。 (7) 将含有 1251 或 35S 标记 的抗原 上清加 入预处 理过的 Ep 管中 (105 〜 106 每 分钟计 数 / 管 ), 然后 用稀释 液将体 积调至 200fzL。 (8) 加入 lOOpL 1:1 混 合的抗 原特异 性抗体 -Sepharose, 稀释缓 冲液, 41C 振摇 1 . 5h, 尽量使 Sepharose 保持 悬浮。 加 入一定 量标记 抗原的 每分钟 计数值 (cPm) 值的确 定办法 是:假 设每个 真核细 胞含有 >1000 个 抗 原分子 ,才能 达到检 测的灵 敏度。 洗涤 、解聚 和分析 免疫沉 淀物: (9) 按下述 步骤洗 涤抗体 -Sepharose, 共 4 次 ,每次 缓冲液 用量为 lmL。 第 一次和 第二 次用稀 释缓冲 液洗; 第三 次用 TSA 溶液; 第 四次用 pH6.8 0.05mol/L Tris-HCl 缓 冲液。 每次洗 完后, 1400r/min 离心 lmin 或用微 型离心 机离心 5s。 每次 洗涤后 ,仔细 吸 取上清 ,并在 沉淀上 方留下 l〇ML 上清。 毛细吸 管的尖 端尽量 尖细。 (10) 加入 20 〜 50pLSDS 样品 缓冲液 ,盖上 管帽, 100X: 保温 5min。 振荡混 匀后, 1400r/min 离心 lmin 或微 型离心 机离心 5s。 加 样品缓 冲液时 ,样 品缓冲 液比重 较大, 易渗入 Sepharose 中。 切忌旋 涡振荡 ,以免 Sepharose 粘 在管壁 ,造 成样品 损失。 (11) 吸上 清进行 SDS^PAGE 分析 。注 意别将 Separose 带入。 用增感 屏进行 1251 放 射 自显影 或通过 荧光谱 (35S、 14C、 3H 等) 分 析进行 检测。 • 634 • 二、 Sepharose 偶 联抗体 的制备 Sepharose 为一 类不 溶性大 孔径层 析介质 ,本 处介绍 的是溴 化氰活 化法将 Sepharose 和抗 体交联 在一起 。目 前已可 从商业 途径购 买被溴 化氰活 化好的 Sepharose, 使 实验变 得十分 简单。 1. 补 充材料 1~ 30mg/mL 抗原特 异性的 单克隆 或多克 隆抗体 O.lmol/L NaHC〇3/ 0.5mol/L NaCl SepharoseCL-4B (商相 对分子 质量抗 原可用 SepharoseCL-2B, pharmacia) 0.2mol/L Na2〇〇3 溴化氰 (CNBr) / 乙腈 (acetonitrile) lmmol/L 和 0. lmmol/L HC1 ( 冰冷的 ) 0.05mol/L 甘氨 酸或乙 醇胺, pH8.0 Whatman No. 1 滤纸 透析袋 ( 截留分 子质量 >10 000Da) 布 氏漏斗 滤瓶及 水泵等 2. 操 作步骤 抗体的 制备: (1) 在 4X: 对着 0_lmol/L NaHCO3/0.5mol/L NaCl 透析 1 〜 30 mg/mL 抗体 24h, 其 中换液 3 次 。使 用的透 析液的 体积至 少为抗 体溶液 体积的 500 倍。 (2) 在 4X: 100 000 离心 lh, 移去 聚合物 ,保留 上清。 因为聚 合物将 直接与 Sepharose 偶联 ,干扰 抗体的 偶联。 (3) 取 一部分 抗体溶 液测定 A28〇 值以决 定抗体 的浓度 (mg/mLlgG=A28()/1.44)0 用 0. lmol/L NaHCO3/0.5mol/L NaCl 溶液 将抗体 稀释到 5mg/mL 或视情 况而定 ,保存 在 4X:。 同 时测定 稀释好 的抗体 溶液的 A28〇。 Sepharose 的制备 与活化 : (4) 沉淀 Sepharose 悬液 ,倾 去上清 ,称 取所需 要的量 (假 设悬液 密度为 1.0)。 (5) 将 Whatman No. 1 滤纸装 在布氏 漏斗中 ,连接 好滤瓶 及水泵 ,用 1〇 倍体 积的水 洗漆 转移至 布氏漏 斗上的 Sepharose。 (6) 将 Sepharose 转移到 50mL 的烧 杯中, 加入等 体积的 〇.2mol/L Na2C〇3。 (7) 每 l〇〇mL 的 Sepharose 中加入 3. 2mL 漠化氛 (CNBr) / 乙睛 (acetonitrile), 逐 滴缓慢 (lmin 以上) 加入 ,并用 磁力搅 拌器轻 轻搅动 ,加 完后 ,继 续搅动 5mm。 过 分激烈 地搅动 将毁坏 Sepharose 珠结构 。活化 过程必 须在通 风橱中 进行。 这里介 绍的是 2g CNBr / 100mL Sepharose, 有时 也可用 2〜4g CNBr/lOOmL Sepharose 的比 例去偶 联 1 ~ 20mg 抗体 /lmL Sepharose。 • 635 • (8) 按 上述快 速过滤 CNBr 活化的 Sepharose, 抽 至半干 ,即 Sepharose 架变得 干裂, 失 去光泽 。先用 10 倍体积 冰冷的 Immol/LHCl 洗涤; 再用 2 倍 体积的 O.lmmol/LHCl (冰冷 ) 洗 。然 后再加 入足够 的冰冷 O.lmmol/.LHCl 湿润 Sepharose, 使 其重新 恢复光 泽, 但是不 能保留 过量的 液体。 CNBr 活化的 S 印 harose 在 碱性条 件下极 不稳定 ,在 HC1 洗涤 的条件 下是稳 定的。 抗体与 CNBr- 活化 Sepharose 的偶联 : (9) 称取 所需量 的活化 Sepharose (假设 密度为 1.0), 立即转 移到玻 璃杯中 ,加入 等体 积的已 溶解在 〇.lmol/L NaHC03/ 0.5mol/L NaCl 中的抗 体溶液 (见前 ), 在室温 下 磁力搅 拌或颠 倒混匀 2h, 也可于 4X: 过夜。 (10) 加入 0.05mol/L 甘 氣酸或 乙醇胺 pH8.0 去饱和 Sepharose 表面 残余的 活性基 团, 然后让 Sepharose 沉 淀下来 。吸 出并保 留上清 ,再离 心一次 ,移 去任何 残存的 Sepharose。 测定 A28Q 吸收值 ,并与 未偶联 的抗体 溶液的 A28D 值比较 ,求 出偶联 的百分 比。 (11) 将抗体 -Sepharose 存于 TSA 溶 液中。 三 、用抗 Ig 血清免 疫共沉 淀放射 性标记 的抗原 1. 补 充材料 正 常血清 、抗 Ig 血清 抗原特 异性的 抗血清 / 纯化的 McAb/ 骨髓瘤 细胞培 养上清 其余材 料同方 案一。 2. 操 作步骤 参 见方案 一的操 作步骤 ,仅在 下面几 处进行 改动。 (1) 按每毫 升放射 性标记 抗原加 2 卩 L 正常 血清的 比例进 行预吸 收试验 。再加 适量的 抗 Ig 血清 ,在 4X: 放置 12~18h, 然后 lOOOXg 离心 l〇min, 收集 上清。 正常血 清是载 体 Ig 的主要 来源, 加入抗 Ig 血 清的量 ,最 好通过 实验, 用放射 性标记 抗原或 Ig 进行滴 定其准 确含量 。参 见方 案一裂 解细胞 部分。 (2) 加 1ML 抗原特 异的抗 血清或 3# 抗 原特异 的纯化 McAb 或 抗原特 异的杂 交瘤细 胞培 养上清 [30pL (来 自克隆 化细胞 系)〜 100/iL ( 来自非 克隆化 细胞系 )]。 旋 涡振荡 混匀后 , 4X: 放置 2h。 然 后加入 适量抗 Ig 血清 ,旋涡 振荡后 , 4X: 放置 12 〜 18h。 如果 抗 Ig 血清 的滴度 很高, 它的加 入体积 应是抗 原特异 性血清 体积的 20 〜 40 倍; 或每 微克 纯化的 McAb 需加 2 〜 4pL; 或杂交 瘤培养 上清加 入量的 1/3 体积 。参见 方案一 免疫沉 淀抗原 部分。 (3) 洗涤 免疫沉 淀物, l〇〇〇Xg 离心 7min, 其 余步骤 同方法 一洗涤 、解聚 免疫沉 淀物。 (4) 加 20~50ML 的 2XSDS 样品缓 冲液, 切忌旋 涡振荡 ,防 止免疫 沉淀物 粘在液 面以 上的管 壁周围 。盖 上管帽 ,先在 56X: 保温 lh, 以防止 沉淀物 的聚集 ,然 后在 100"0 保温 5min, 最后进 行电泳 分析。 • 636 • 四 、 用抗 Ig-Sepharose、 A 蛋白 -/G 蛋白 -Sepharose 或 金葡菌 菌体免 疫共沉 淀放射 性标记 的抗原 如果抗 原和抗 原特异 性的抗 体之间 形成可 溶性免 疫复合 物时, 则可选 用这种 方法, 以 进一步 形成抗 原-抗 体与抗 Ig 抗体 -Sepharose, 或与 A 蛋白 -/G 蛋白 -Sepharose, 或与 金葡 菌菌体 的免疫 沉淀物 ,再进 行标记 抗原的 分离。 1. 补 充材料 抗 Ig-Sepharose 稀释 缓冲液 (10mg Sepharose/mL) 1:1 (V7V) 的 A 蛋白 -/G 蛋白 -Sepharose 稀释 缓冲液 金葡菌 Cowan I 株的 10% 细 菌悬液 其 余材料 同方案 一或三 2. 操 作步骤 基 本方法 同前述 方法一 ,仅在 下面几 处进行 改动。 (1) 预吸收 以去除 非特异 吸附的 蛋白质 。可 选择 1:1 的抗 Ig-Sepharose/ 稀释 缓冲液 或 1:1 的 A 蛋白 -/G 蛋白 -Sepharose/ 稀释 缓冲液 ,或 10% 金葡菌 Cowan I 悬浮液 (10% 的 该菌悬 浮于裂 解液中 ,经低 速离心 沉淀后 ,弃 上清 ,再以 10% 的浓度 悬浮于 稀释缓 冲液中 ), 并加入 到放射 性标记 的抗原 溶液中 ,进行 预处理 。参 见方 案一裂 解细胞 部分。 (2) 加 1/iL 抗原 特异的 抗血清 ,或如 g 抗原 特异 的纯化 McAb, 或抗 原特异 的杂交 瘤 细胞培 养上清 (30/iL 克隆 化细胞 系分泌 上清或 100/iL 未克 隆化细 胞系分 泌上清 ), 4t: 保温 1.5h, 再选 择下列 步骤的 任何一 种进行 操作: ① 加入 1:1 抗 Ig-Sepharose/ 稀释缓 冲液。 ② 再加入 1:1 A 蛋白 -/G 蛋白 -Sepharose/ 稀释缓 冲液。 加入量 大约是 抗血清 体积的 20~40 倍 ,或 每微克 McAb 加入 2 〜 4fiL, 或杂 交瘤细 胞培养 上清的 1/3 体积。 然后于 4X: 振摇 1.5h。 参见 方案一 免疫沉 淀抗原 部分。 ③ 或加入50^xL10%悬浮液,4t:振摇10min。 细 菌悬浮 液的制 备是将 金葡菌 Cowan I 以 10% 的比例 悬浮在 裂解缓 冲液中 , 低速离 心得到 的膜沉 淀再以 10% 的浓度 悬浮于 稀释缓 冲液中 ,该菌 的膜表 面含有 A 蛋白。 (3) 洗 漆免疫 沉淀物 ,同 方法一 ,只 是在操 作步骤 (9) 采用 1400r/min 离心 lmin, 对步骤 (10), 则在 100〇Xg 下 ,离心 7min。 (4) 加入 20 〜 50fiLSDS 样品缓 冲液, 切勿旋 涡振荡 ,以防 Sepharose 和细菌 粘附在 管 壁上部 。盖上 管帽, 100X: 加热 5min, 再旋涡 振荡, 离心及 PAGE 分析。 五 、 使用 强力裂 解液和 洗涤缓 冲液进 行免疫 共沉淀 如 果根据 方法一 、三或 四进行 免疫共 沉淀后 ,怀 疑有抗 原仍与 其他蛋 白质非 特异性 结合, 可根据 本法所 介绍的 步骤进 行解聚 处理。 • 637 • 1. 补 充试剂 10% SDS 10% 脱氧 胆酸钠 (Na-DOC) RIPA 缓冲液 ,含 1% Na-DOCO.l% SDS (用裂 解缓冲 液配制 ) 其余的 试剂见 方法一 、三 或四 2. 操 作步骤 (1) 在方法 一裂解 细胞操 作所获 得的上 清液中 ,加入 1/10 体积的 10% Na-DOC 和 1/100 体积的 10% SDS。 (2) 按方 法一中 操作步 骤免疫 沉淀抗 原进行 操作。 (3) 按方法 一中操 作步骤 洗涤解 聚免疫 复合物 ,仅 将洗 涤抗体 -Sepharose 这 一步骤 改用 RIPA 缓 冲液。 六、 Sepharose 交 联抗体 与未标 记抗原 的免疫 共沉淀 如果 每一个 真核细 胞所含 的蛋白 抗原量 >1〇4 拷贝 ,就 可以采 用未标 记抗原 的免疫 共 沉淀法 。蛋 白电泳 后的条 带用银 染显示 。本 法省去 了免疫 共沉淀 操作中 最繁琐 、最昂 贵的 步骤。 1. 补 充材料 改良 的裂解 缓冲液 [0.5% Triton X-100, 5mmol/L 碘乙 酸铵, 0.2 胰蛋白 酶抑制 单位 /mL 的 Aprotinin, lmmol/L PMSF (100mmol/L PMSF 无水乙 醇溶液 1C 存 ,临时 稀释 ), 上述成 分均用 TSA 溶液 配制] 0. 1 % Triton X-100 的 TSA 溶液 不含 2-ME 的 SDS 样品 缓冲液 2. 操 作步骤 (1) 以 5X107 细胞 /mL 的密度 将细胞 悬浮在 改良的 裂解缓 冲液中 ,于 4t: 保温 lh。 (2) 在 3000 xg 下离心 裂解物 I5min, 去除 细胞核 。再在 100 000 下离 心上清 lh, 保留 上清。 (3) 每毫 升抗原 (胞 溶物) 加 50^L 活化 的对照 Sepharose 或者无 关抗体 -Sepharose, 于 4X: 轻 轻震摇 lhr, 进行 预吸收 ,以移 去非特 异性结 合的蛋 白质。 20〇Xg 离心 5min, 保留 上清。 (4) 每毫升 胞溶物 中加入 25fxL 的 1 : 1 Ab-Sepharose/TSA 溶 液混合 ,于 4t: 轻轻震 摇 lh, 或颠倒 混合若 干次。 同时 应设立 2 个对照 , 一 是 与模拟 胞溶物 混合的 Ab_SePhar〇se 对照; 另 一个是 胞溶物 与无关 Ab* Sepharose 混合的 对照。 (5) 按方 法一中 步骤进 行洗涤 ,只 是改用 下列缓 冲液: 第一次 和第二 次洗用 0.1% • 638 • Triton X-100 的 TSA 溶液; 第三 次洗用 TSA 溶液; 第四 次洗用 0.05mol/L 的 Tris-HCl pH7.8〇 (6) 加入 25 〜 50^L 的不含 2-ME 的 SDS 样品缓 冲液, 不要震 动以免 Sepharose 溅到 管壁上 。盖上 管帽, l〇〇*C 加热 5min。 微型 离心机 上离心 5s, 以沉淀 Sepharose。 收集 上清 ,直 接加样 (非还 原的蛋 白样品 ), 进行 SDSPAGE 分析; 或者与 5%2-ME 在 37X: 保温 (还原 ), 加混 合物到 SDS-PAG 的样 品孔中 ,进行 电泳, 用银染 法检测 抗原。 从理 论上讲 ,一个 IgG 抗 体分子 4 条 链中仅 1 条能 共价与 Sepharose 相连 ,但 是在非 还原条 件下, 完整 的分子 内二硫 键确保 4 条链 均能与 Sepharose 连接。 抗原从 Sepharose 上洗脱 必须在 非还原 条件下 进行 ,因 为发现 在还原 条件下 洗脱的 抗体将 导致凝 胶背景 染色。 七 、方 法评注 利 用抗原 -抗体 作用的 特异性 ,可 从细胞 裂解液 中分离 出含量 极少的 特异性 抗原分 子 。但 分离膜 蛋白之 前必须 用去污 剂增溶 。采 用非离 子去污 剂胜于 胆盐, 因为后 者在酸 性 pH 及 二价阳 离子存 在的条 件下易 于沉淀 。在 低抗原 浓度时 ,它 们与单 克隆抗 体或多 克 隆抗体 的复合 物一般 是不会 沉淀的 ,故常 采用“ 夹心” 的办法 ,即 将抗 Ig 血清 、亲 和纯化 的或单 克隆的 抗体、 A-/G- 蛋白与 Sepharose 偶联后 作为“ 夹心” 试剂; 也可用 金葡 球菌菌 体参与 免疫复 合物的 沉淀。 附表 (表 8.21) 列出 A-/G- 蛋白 与不同 IgG 亚类的 亲和力 ,供 参考。 表 8.21 A-/G •蛋白 与不同 IgG 亚类的 亲和力 抗 体 与 A- 的 亲和力 与 G- 的 亲和力 人 IgGl + + + + + + + + 人 IgG2 + + + + + + + + 人 IgG3 - + + 人 IgG4 + + + + + + + + 鼠 IgGl + $+ + + 鼠 IgG2a - + + + + 鼠 IgG2b - + + 鼠 IgG2c + + 或 + + + + + + 小鼠 IgGl + + + + + 小鼠 IgG2a + + + + + + + + 小鼠 IgG2b + + + + + + 小鼠 IgG3 + + + + + 第 七节专 门应用 一 、通过 克隆基 因的转 录和翻 译在体 外合成 蛋白质 1. 原理 克隆基 因技术 的发展 ,使 得体 外转录 和翻译 合成蛋 白质成 为可能 。这 种体外 合成的 . 639 • 蛋白 质有好 多用途 ,包 括分析 dna- 蛋 白质之 间的相 互作用 。该方 法的主 要步骤 是将编 码蛋 白质的 序列克 隆至含 T7 或 SP6 RNA 聚 合酶启 动子的 载体中 ,这 两种聚 合酶以 DNA 为模板 转录出 mRNA, 再通 过这种 xnRNA 的 体外翻 译合成 需要的 蛋白质 (通 常是 35S 标记 的 )。 该法的 主要优 点是只 要改变 DNA 模板, 任何所 希望的 突变蛋 白都能 得到。 2. 材料 含 T7 或 SP6 启动子 的质粒 DNA 含克隆 基因的 DNA 或编 码目的 蛋白的 cDNA 相应 的限制 性内切 核酸酶 TE 缓冲液 (l〇mmol/L Tris-HCl pH8.0, lmmol/L EDTA) 5XNTP 混合液 [5mmol/LATP、 UTP、 CTP, 0.5mmol/LGTP, 5mmol/L (G-5' PPP5'-G) TP ( 二鸟嘌 呤三磷 酸核苷 )] 10 x SP6/T7 RNA 聚合酶 缓冲液 10mmol/L 娃鱼精 (Spermidine), 只用于 SP6 RNA 聚合酶 胰 核酸酶 抑制剂 ,即 RNasin SP6 或 T7 RNA 聚合酶 缓冲酚 (缓 冲液饱 和酚) 异丁醇 10mol/L 乙酸铵 100% 乙醇 体 外翻译 试剂盒 (麦胚 提取物 或网织 细胞提 取物) 35S 标记甲 硫氨酸 O.lmol/L NaOH 10% 三 氯乙酸 (TAC) EN3HANCE 其余 的材料 包括: 亚克隆 DNA 片段 、制备 高纯度 的质粒 DNA、 限 制性内 切核酸 酶 、消化 DNA、 酚抽提 和乙醇 沉淀、 琼脂糖 电泳和 PAG 电泳 、玻 璃纤维 中酸沉 淀物的 放射 活性的 定量、 SDS-PAGE、 放 射自显 影所需 的材料 3. 操 作步骤 DNA 模板 制备: (1) 将编码 目标蛋 白质的 DNA 片 段亚克 隆至含 T7 或 SP6 RNA 聚合 酶启动 子的质 粒 载体中 (即 Psp64), 位于 启动子 下游。 (2) 用 CsCl/ 溴 乙锭离 心法或 PEG 沉 淀法制 备质粒 DNA, 该 质粒在 噬菌体 启动子 下游 含有编 码蛋白 序列。 用标 准的微 M 制备 法所 获得的 DNA 质量不 够高, 所得的 DNA 不能有 核酸酶 活性。 (3) 用限 制性内 切核酸 酶消化 lO^g DNA, 刚好 切开终 止密码 子下游 50 〜 200bp 处, 取出少 M 做琼脂 糖电泳 ,确定 酶水解 效率。 这步 骤使转 录物不 会太长 ,保证 mRNA 的高 效合成 。但是 终止密 码子下 游的碱 基数如 <50bP, • 640 • 则 翻译效 率将会 降低。 (4) 用 酚抽和 乙醇沉 淀纯化 DNA, 并重新 悬浮于 50MLTE 缓 冲液中 。该 DNA 量应 足够 10 次体 外转录 和翻译 反应。 体外转 录制备 mRNA (5) 按 下列步 骤操作 ,建立 25PL 的 反应混 合体系 。可 在室温 操作, 以避免 DNA 模 板被 鲑鱼精 沉淀。 H20 8.0^L DNA (总量 1即) 5.0/iL 5XNTP 混合物 5.0/iL 10XSP6/T7 RNA 聚合酶 缓冲液 2.5pL lOmmol/L 鲑鱼精 ( 只用于 SP6 RNA 聚合酶 ) 2.5/xL Rnasin (30 〜 60 U) 1 . O^L SP6 或 T7 RNA 聚合酶 (5~20U) l.O^L 在 40X: 保温 60min。 在用 T7 RNA 聚合 酶时, 可不用 鲑鱼精 ,以 2. 5fxL 水替代 。转录 效率可 用甲醛 凝胶电 泳核对 ,或 在反应 混合物 中采用 少量标 记核苷 酸进行 监视。 (6) 加 25/iL 的 缓冲酚 ,震荡 ,立即 抽提。 将液相 转移至 新的离 心管中 ,用 异丁醇 抽提 2 次 ,再加 6^L10mol/L 乙 酸铵和 70^L 乙醇。 RNA 沉淀 后再用 乙醇洗 一次。 (7) 加 24^L TE 缓冲 液悬浮 RNA, 再加 6/^L 10mol/L 乙 酸铵和 70fxL 乙 醇沉淀 ,再 用乙醇 洗一次 。重 新悬浮 RNA 在 lOpLTE 缓 冲液中 。立 即进行 下一步 实验或 快速冰 冻 ,贮于 -70X: 保存。 体外翻 译制备 蛋白质 (8) 加 l~10ptLRNA 到体 外翻译 试剂盒 的相应 试剂中 ,按 操作指 南进行 。加 15;iCi 的 35S •甲 硫氨酸 (MOO^Ci/mmol) 以放射 性标记 蛋白质 。反应 体系为 30fiL, 室 温下进 行 30 〜 60min。 反应 完成后 ,蛋白 质应立 即使用 ,在 O — AC 只能! C 存 一 '周。 (9) 取 lpL 翻 译产物 ,加到 50/uL 的 0.1mol/L NaOH 中, 37t: 保温 15min。 再加 lmLIO% 的 TAC, 置 于冰上 ,继 续反应 15min。 (10) 收集沉 淀于玻 璃纤维 滤膜上 ,液 闪计数 35S- 甲硫氨 酸的掺 入值。 为 计算蛋 白质的 合成量 ,可将 样品中 35S •甲硫 氨酸的 掺入量 与不加 RNA 的 对照的 掺入量 进行比 较 。麦胚 抽提物 不含内 源性甲 硫氨酸 ,计 算比 较直接 ,网 织细胞 裂解物 含内源 性甲硫 氨酸。 (11) 取 3/iL 翻 译后的 反应液 ,进行 SDS-PAGE 分析 ,并与 相对分 子质量 标准对 照 。从带 EN3HANCE 的荧 光图或 发射自 显影图 上可见 35S 蛋白。 一般在 1 〜 4h 内可出 现单独 的蛋白 条带。 3. 方 法评注 1) 背 景资料 该 合成方 法可分 解为几 个阶段 ,首先 将蛋白 编码序 列克隆 至含有 T7 或 SP6 RNA 聚合酶 启动子 的质粒 载体中 。蛋白 编码序 列可从 cDNA 克隆 中获得 ,也可 来源于 无内含 子的基 因片段 ,取 之于 克隆的 基因组 DNA。 有时, 必须修 改一下 原来的 cDNA 或基因 • 641 • 组克隆 ,使得 蛋白编 码序列 邻近的 3' 或 5' 端的 非编码 序列的 长度最 佳化。 第二, 编码蛋 白质的 mRNA 的转录 。操作 步骤见 前面有 关部分 的介绍 ,只 是反应 混 合液中 90% 的 GTP 被二鸟 嘌呤三 磷酸核 苷取代 。这 样, 90% 合成的 RNA 含 有真核 细胞 中正常 存在的 5' 端帽 结构; 这对 体外的 有效翻 译十分 重要。 T7 或 SP6RNA 聚合酶 能 识别它 们同类 启动子 ,起始 转录有 极高的 特异性 。反 应中 只合成 一种靶 蛋白的 RNA。 第三, 用麦胚 抽提物 或网织 细胞裂 解物体 外翻译 蛋白质 。由 于反应 体系中 mRNA 非常纯 ,故产 生的含 35 孓蛋 白基本 上是放 射化学 纯的, SDS-PAGE 时只有 一条带 。体外 合成的 蛋白质 并不是 生物化 学纯的 ,因 为翻译 体系中 ,大量 存在其 他的蛋 白质。 但是, 多数 情况下 ,无 须进一 步纯化 ,便 可直接 应用。 本 方法的 最大优 点是只 要改变 DNA 模 板的碱 基结构 ,便可 产生突 变蛋白 ,以 进行 结构 和功能 的实验 研究。 35S- 蛋白 对涉及 蛋白水 解酶的 研究、 蛋白质 -蛋白 质间相 互作用 的研究 、或 作为 底物研 究影响 蛋白质 结构和 / 或 活性的 因素都 是十分 重要的 工具。 2) 重 要参数 离 mRNA 的 5' 端 最近的 AUG 密 码子才 能作为 正确的 起始密 码子有 效启动 翻译。 起始 密码子 AUG 离 mRNA 的 5' 端的 距离在 25~ 100bp 是最 理想的 。如果 这个距 离不是 很 理想或 AUG 真 正处在 mRNA 的二 级结构 中而不 易接近 ,蛋 白质将 不能有 效翻译 。为 避免 这些问 题出现 ,可采 用突变 的方法 用能够 有效翻 译蛋白 质的对 应区域 替代原 克隆中 正常的 5' 端非翻 译序列 ,甚至 于替代 最初的 几个密 码子。 为 了合成 mRNA, DNA 的质 量相当 重要。 RNA 的合成 反应极 易被高 浓度的 RNA 所抑制 ,转 录反应 也极易 被污染 的核酸 酶破坏 。不能 用标准 的微量 法制备 DNA, 最好 用 CsCl 梯度 离心或 PEG 沉淀 法制备 DNA。 有了 高质量 DNA, 全长 mRNA 的合 成几乎 不会有 问题。 RNA 合成的 质量可 通过甲 醛凝胶 电泳来 核查。 虽 然两个 体外翻 译系统 都有效 ,但 是对某 些蛋白 质的合 成而言 ,总有 一个更 为有效 的系统 。一 般认为 ,麦胚 抽提物 其起始 翻译过 程较为 有效, 但也会 引起成 熟前的 终止或 mRNA 模板 的降解 。因此 麦胚系 统适宜 较短的 蛋白质 的合成 ,而 长蛋白 质的合 成最好 用网 织细胞 裂解物 体外翻 译系统 。麦胚 系统不 含内源 性甲硫 氨酸, 合成效 率高于 网织细 胞裂解 物系统 。所 有的体 外翻译 产物都 必须用 SD&PAGE 鉴定。 体 外翻译 体系合 成的蛋 白质也 可能没 有活性 ,一 方面是 由于它 的结构 与天然 蛋白质 的结 构不同 ,另一 方面是 由于缺 乏某些 关键性 的辅助 因子。 鉴于这 些原因 ,有可 能体外 合 成的完 全是另 一种蛋 白质。 3) 预 期结果 满意 的结果 应该在 SDS-PAGE 分 析后出 现一条 清晰的 、含量 丰富的 预期相 对分子 质量 的蛋白 质条带 。有时 ,合成 蛋白质 的泳动 率比预 期的慢 ,而且 ,蛋白 质的表 观相对 分子 质量容 易受到 众多因 素影响 。为解 决这个 问题, 可以尝 试在蛋 白质编 码序列 之外或 之内 的不同 位置打 开模板 DNA 链 ,然 后检查 合成的 蛋白质 。有时 ,即便 蛋白质 的合成 很成功 ,但 也会发 现一些 电泳杂 带出现 。如果 条带的 相对分 子质量 较低, 通常是 由于翻 译过程 成熟前 终止、 内部的 AUG 密码 子的不 正常起 始翻译 过程、 蛋白质 的水解 作用。 很少出 现相对 分子质 M 高的 条带, 它的出 现可能 由于合 成不能 在终止 密码子 处停止 ,蛋 白质 翻译后 的修饰 也可解 释为什 么体外 合成反 应常产 生同一 蛋白质 的不同 形式。 • 642 • 亮氨酸 ,10 丝氨酸 8 谷 氨酸盐 7 赖氨酸 7 丙氨酸 7 缬氨酸 6 甘氨酸 5 苏氨酸 5 精氨酸 5 天 冬氨酸 4 脯氨酸 4 谷氨酸 4 苯 丙氨酸 4 酪氨酸 3 天 冬酰胺 3 半 胱氨酸 3 异 亮氨酸 2 组氨酸 2 蛋氨酸 色氨酸 25 〜 190 55 〜 30 155 〜 50 155 〜 110 305 〜 120 55 〜 65 105 〜 60 55 〜 25 155 〜 70 155 〜 40 15 〜 130 205 〜 60 155 〜 130 255 〜 100 T, I T, I E T E T, I E E T, I T, >600 305 〜 120 105 〜 60 >800 25 〜 60 注释: E, 必需氨 基酸; T, 由 于氨基 酸转移 作用使 其蛋白 掺入量 极大地 减少; I, 可转 化为其 他氨基 酸的氨 基酸。 1. 材料 所 有的试 剂均需 无菌操 作配制 短时 程标记 培养液 悬 浮生长 的细胞 (在 37X:, 5%C02 温箱中 ) 35S- 甲 硫氨酸 (L 型, 800~1200Ci/mmol) 一个 标准合 成反应 可产生 l~l〇ng 的放 射化学 纯的蛋 白质, 比放射 活性在 1〇8~1〇9 每分 钟计数 /Mg。 由 于合成 材料不 受限制 ,体外 合成体 系原则 上可产 生至少 kg 的蛋 白质。 二、 蛋白质 的生物 合成标 记技术 在研 究蛋白 质的生 化特性 、生 物合成 、加 工处理 、细胞 内转运 、分泌 和降解 等过程 时, 往往需 要采用 蛋白质 的生物 合成标 记技术 。以下 介绍培 养的细 胞系和 从脾脏 或胸腺 分 离的细 胞中分 泌型的 或膜结 合型的 蛋白质 的标记 方法。 (一 ) 35S- 甲硫 氨酸短 时程标 记悬浮 细胞的 蛋白质 35s •甲 硫氨酸 常用作 蛋白质 生物合 成的标 志物, 它具有 较高的 比活性 (800Ci/mmol/L), 而且容 易检测 。但 由于在 蛋白质 中甲硫 氨酸的 丰度相 对较低 ,约为 0 〜 1.8%。 若其含 量过低 或缺乏 。则 需要 更换其 他的放 射性标 记含量 较高的 氨基酸 (见 表 8.22)0 表 8.22 蛋 由质生 物合成 标记技 术中使 用的放 射标记 氨基酸 氨基酸 掺 入频率 / % 同位素 比活性 / (Ci/mmol) 注释 5s h h 5s h • 643 • 冰冷的 20mmol/L PBS pH7.2 15mL 或 50mL 带 帽的无 菌塑料 离心管 注意 :所有 的试剂 均需无 菌操作 配制。 2. 试 剂配制 短 时程标 记培养 液:是 一种缺 乏特定 氨基酸 ( 甲硫氨 酸或半 胱氨酸 、亮氨 酸等) 的 完全 无血清 RPMI-1640 培养液 ,仅含 5% 眙 牛血清 ( 胎牛血 清事先 必须对 缓冲液 透析, 以去 除未标 记的氨 基酸, 它们存 在将会 降低标 记效率 )。 培 养液中 还含有 30Mg/mL 的庆 大霉素 。放在 4X: 贮 存备用 。如果 细胞在 C〇2 培养箱 外处理 的时间 太长, 则需要 在上述 培养液 中加入 HEPES (终 浓度为 25mmol/L), 调节至 pH7.4。 使 用前在 37X: 水 浴中预 热平衡 。完全 无血清 RPMI-1640 培养液 : RPMI-1640 培养液 (Gibco/BRL # 320- 1870A) 中添加 2mmol/LL- 谷氨 酰胺、 100U/mL 青 霉素、 lOOpg/mL 链 霉素。 3. 操 作步骤 (1) 收集悬 浮培养 的对数 生长期 细胞, 室温下 1500r/min 离心 5min。 若用脾 或胸腺 制 备的单 个核细 胞悬液 ,也 同样按 此操作 进行。 (2) 按每 2 X107 细胞加 lOmL 短期标 记培养 液的比 例洗涤 细胞, 然后在 室温下 1 500r/min 离心 5min, 弃上清 ,再悬 浮细胞 ,反 复洗漆 数次。 (3) 细胞以 5xi〇8/mL 的浓 度再 悬浮于 37T: 的短期 标记培 养液中 ,置 37C 保温 15min, 以消耗 掉细胞 内的甲 硫氨酸 。定 期摇动 细胞。 (4) 用 37X: 的 短期标 记培养 液稀释 和配制 浓度为 0.1 〜 0.2mCi/mL 的 35S •甲 硫氨酸 工作液 ,拧紧 试管帽 ,置于 37t: 水浴中 待用。 临用 前新鲜 配制, 不可在 37X: 水 浴中放 置太久 ( 不超过 30min), 以防止 挥发性 35S •化 合物 释放。 (5) 室温 下离心 细胞, 1500r/min 离心 5min, 弃 上清。 (6) 重新悬 浮细胞 ,用 35S •甲硫 氨酸工 作液调 整细胞 浓度为 5xl〇6/mL, 置 37T 水 浴保温 0.5~3h, 其间不 时摇动 细胞。 注意 维持在 37X: , 温度偏 低将明 显降低 35S •甲 硫氨 酸的掺 入率。 (7) 4t: 下, 1500r/min 离心 5min, 弃上清 。将 细胞 再轻轻 悬浮于 10mL 冰冷的 PBS 中 ,反 复离心 洗涤。 此步骤 应严格 按含放 射性标 本的操 作规则 进行。 如果 需要, 可用三 氯乙酸 (TCA) 沉淀 蛋白, 测定标 记物的 掺入量 (见下 )。 也可 根据不 同的需 要 ,用 免疫沉 淀反应 、免 疫亲和 层析、 单向或 双向凝 胶电泳 、制 备淋巴 细胞的 可溶性 或膜结 合蛋白 等 ,分别 处理标 记好的 细胞。 如细胞 不能立 即处理 或分析 ,可 在冰浴 上放置 若干小 时或于 -80t: 放 置数天 。使用 前再融 化冰冻 的细 胞沉淀 ,这不 会影响 分析蛋 白的生 化特性 。需要 注意的 是如果 细胞蛋 白质已 被去污 剂增溶 和抽提 出来, 那么冻 、融抽 提液的 过程将 可能造 成蛋白 多聚体 的解聚 和标记 蛋白质 的降解 3 (二 ) 35S- 甲硫 氨酸短 时程标 记贴壁 细胞的 蛋白质 基本过 程与悬 浮细胞 的标记 相同, 只是增 加了将 贴壁细 胞刮铲 收集的 步骤。 (1) 细胞 在直径 100mm 的培养 皿上生 长至铺 满皿底 80%, 大 约含有 (0.5X107) 〜 • 644 • (2X107) 个细胞 ,随 细胞类 型略有 差异。 (2) 吸 去培养 皿中的 培养液 ,用 10mL 在 37X: 平 衡过夜 的短期 标记培 养液轻 轻洗涤 细胞 2 次 ,最 后一次 吸去洗 涤的培 养液。 (3) 再加 入短时 程标记 培养液 ,在 37X:, 5%C02 温箱 中保温 15min, 以耗 尽细胞 内 的甲硫 氨酸。 (4) 制备 35S- 甲 硫氨酸 工作液 ,方法 同前。 (5) 每 个培养 皿加入 4mL35S- 甲 硫氨酸 工作液 ,在 37*0、 5% C02 温箱 中放置 0.5〜3h〇 视需要 每个培 养皿可 以只加 2mL35S 甲 硫氨酸 工作液 ,但注 意一定 要放平 培养皿 , 避免倾 斜而使 部 分细胞 干涸。 (6) 吸 去含同 位素的 工作液 ,并用 10mL 冰冷的 PBS 洗涤 一次并 弃之。 (7) 加入 10mL 冰冷的 PBS, 用一 次性塑 料刮刀 或橡皮 擦刮下 细胞。 (8) 将刮下 的细胞 转移至 15mL 带 帽离心 管中, 4t:、 1500r/miri 离心 5min, 弃 上清。 (9) 按不同 需要处 理或分 析细胞 。如 果在同 35S •甲 硫氨酸 保温时 ,发 现细胞 已经部 分从 培养皿 底部脱 落下来 ,则 可在进 行步骤 (6)、 (7) 之前, 先将细 胞刮至 15mL 带帽 的塑 料离心 管中。 (三 ) 35S- 甲硫 氨酸长 时程标 记细胞 蛋白质 如果所 研究的 蛋白质 生物合 成速率 较低或 该蛋白 质的合 成处于 稳定状 态时, 则需采 用长 时程标 记技术 。此时 ,未 标记 的甲硫 氨酸也 需要加 入到培 养液中 ,以 维持细 胞的活 性 。未标 记甲硫 氨酸加 入量则 取决于 细胞浓 度和标 记时程 的长短 ,一 般加 入量为 正常培 养液中 甲硫氨 酸量的 5% ~10%, 下面介 绍的用 量适用 于过夜 标记。 1. 补 充材料 长时 程标记 培养液 150mm3 的 培养瓶 其余 材料同 前短时 程标记 2. 试 剂配制 长时 程标记 培养液 无甲 硫氨酸 的完全 RPMI-6140 培养液 ,其 中含 10% 胎牛 血清和 30pg/mL 庆大霉 素, 4X: 贮 存可达 2 周 。可 根据需 要使用 无半胱 氨酸或 亮氨酸 的完全 RPMI-1640 培养 液 。无 特殊氨 基酸的 RPMI-1640 培养 液可从 GIBCO/BRL 公 司订购 。临 用前在 37T: 水 浴 中预热 平衡。 3. 操 作步骤 (1) 制备 35S- 甲 硫氨酸 工作液 ,方法 见前。 • 645 • (2) 用 长时程 培养液 洗涤细 胞两次 (分别 参照悬 浮细胞 或贴壁 细胞处 理方式 )。 (3) 将细 胞悬浮 于盛有 50mL35S 甲硫 氨酸工 作液的 150mm3 细胞培 养瓶中 ,细 胞总 数为 (lx 1〇7) 〜 (2. 5X107) 个。 对于贴 壁细胞 ,则 可将细 胞刮到 150mm3 的培 养瓶中 ,约 (1X107) 〜 (2.5X107) 个 ,加入 50mL35S •甲 硫氨酸 工作液 ,置 37t:、5%C〇2 温箱 中培养 16h〇 (4) 后 续的操 作分别 见悬浮 细胞标 记步骤 (6) 和 (7), 或贴壁 细胞标 记步骤 (6) 〜 (9)。 (四 ) 35S- 甲硫氨 酸脉冲 - 追加标 记细胞 蛋白质 脉冲 -追加 (pulse-chase labeling) 实 验一般 用于分 析依赖 于时间 的过程 ,如 新合成 的 蛋白质 的翻译 后修饰 、转运 、分 泌或 降解; 此法同 样也可 用于标 记生物 合成的 前体蛋 白 。实验 中采用 2 个阶 段进行 ,第一 阶段中 ,需 要的标 记时间 (脉冲 时间) 比前 面提到 的标 记时间 还要短 ,而紧 随标记 之后的 追加步 骤就是 在含过 量未标 记氨基 酸的完 全培养 液中继 续保温 。现将 标记过 程介绍 如下。 1. 补 充材料 追加 培养液 (chase medium) (含有 15mg/mL 过 量的未 标记甲 硫氨酸 或其氨 基酸替 代物 ,使 用前于 37X: 中预热 ) 其余试 剂同前 2. 操 作步骤 (1) 按悬 浮细胞 标记法 中步骤 (1)~(6) 或贴 壁细胞 标记法 中步骤 (1)~ (5) 步 操作, 制 备和标 记细胞 。此时 细胞用 0.2~1.0Ci/mL 的 35S •甲硫 氨酸脉 冲标记 5~30min。 需 要时,悬浮细胞的浓度可增加至(1\1〇7)~(2\1〇7)„^_1。每个样品(每个时间点)使用 (1X107) 〜 (2X107) 个 细胞。 (2) 脉冲 标记后 ,移去 35S- 甲 硫氨酸 。用 10mL37t: 预 热的追 加培养 液洗涤 细胞一 次, 再加入 10mL 37C 的 追加培 养液。 由 于标记 时间短 ,而且 使用的 同位素 浓度高 ,因 而脉冲 标记后 ,会剩 余许多 放射性 标记氨 基酸, 可以回 收后再 使用。 收集含 35S •甲硫 氨酸的 标记液 ,用 0.45Fm 孔 径的滤 膜过滤 ,测定 标记细 胞前、 后标记 混合液 中放射 活性, 可以计 算出未 掺入的 (即剩 余的) 放射 活性。 然后于 -20t 冰冻 保存。 如 要快速 终止标 记反应 ,可 按下述 步骤进 行:将 2 倍体积 的追加 培养液 (含 过量未 标记的 甲硫氨 酸 , 15mg/mL) 直接 加入标 记混合 物中。 但此时 ,标记 液不能 再回收 使用。 (3) 根据 需要在 37T: 保 温不同 的时间 。如仍 需要保 留细胞 ,则将 塑料管 帽拧紧 ,并 不时 摇动。 若为贴 壁细胞 , 则放在 37X:, 5%C〇2 温箱中 。一般 而言, 如果追 加时间 <2h, 细 胞的终 浓度应 为 lxioVmL; 若 追加时 间超过 2h 时 ,细 胞终浓 度应为 2Xl〇8/mL。 若 使用贴 壁细咆 ,则 每一个 100mm 直径的 培养皿 中加入 lOmL 含非标 记甲硫 氨酸的 追踪培 养液。 (4) 在 4X:, 1500r/min 离心 5min, 弃上清 。刮 下贴壁 细胞, 转移至 15mL 带帽离 心管中 1500r/min 离心 5min, 弃上清 。用 冰冷的 l〇mLPBS 洗一次 。根据 需要处 理和分 • 646 • 析 细胞。 (五) 用其他 氨基酸 进行蛋 白质的 生物合 成标记 如果 待研究 的蛋白 质含量 很少或 几乎不 含甲硫 氨酸时 ,可用 35S- 半胱 氨酸或 3H- 亮氨 酸进 行标记 。蛋白 质中半 胱氨酸 和甲硫 氨酸的 含量之 比约为 3.4% :1. 8%, 用半 胱氨酸 也可获 得较高 的放射 比活性 (>600Ci/mmd/L)。 亮氨酸 在蛋白 质中含 量最高 ,可达 10.4%, 并且 3H- 亮 氨酸的 放射比 活性在 3H 标记 的氨基 酸中也 属最高 (25 〜 190Ci/ mmol/L)。 如 果有特 殊需要 ,其他 3H- 或 14C- 标 记的氨 基酸也 可使用 。用其 他标记 氨基酸 时 ,操作 步骤同 35S ■甲 硫氨酸 ,只 是标记 氨基酸 的浓度 要高些 ,以 达到与 35S •甲 硫氨酸 标记 相同的 效果。 (六) 三氯乙 酸沉淀 法测定 标记物 掺入率 1. 材料 O.lmg/mL 牛血清 白蛋白 (BSA), 含 0.02%NaN3 防腐 20% 和 10% 冰 冷的三 氯乙酸 (TCA) 100% 乙醇 真空 抽滤器 直径 2.5cm 的 玻璃纤 维滤膜 2. 操 作步骤 (1) 在 10~50/iL 标记好 的细胞 内加入 0.5jixLBSA 溶液, 置于冰 浴中。 (2) 加入 0.5mL 冰冷的 20%TCA, 激烈 振荡, 放冰浴 30min。 再将 细胞抽 滤至玻 璃 纤维滤 膜上。 (3) 用 5mL 冰冷的 TCA 洗 涤滤膜 2 次 ,再用 无水乙 醇洗涤 两次后 ,空 气干燥 30min〇 (4) 将 冰冷过 的玻璃 纤维膜 转至闪 烁瓶中 ,加 入闪烁 液后, 计数脉 冲值。 (七) 方 法评注 (1) 蛋 白质生 物合成 标记的 方法主 要用于 追踪细 胞蛋白 质的合 成过程 和代谢 过程; 如 果外源 性标记 对活性 有明显 的影响 ,也可 用生物 合成标 记的方 法代替 , 用于分 泌蛋白 质 的标记 和研究 ,如细 胞因子 、抗体 或病毒 颗粒的 标记。 加入到 培养液 中的标 记氨基 酸 ,通 过细胞 膜载体 介导的 体系被 摄取到 细胞内 ,在掺 入到新 合成的 蛋白质 中之前 ,先 与 胞质的 tRNA 结合 。细胞 的蛋白 质生物 合成机 器能正 常地利 用这些 标记氨 基酸。 (2) 在选择 标记氨 基酸时 ,必 须考虑 下列问 题:① 必需氨 基酸和 非必需 氨基酸 。由 于 细胞能 利用其 他化合 物合成 非必需 氨基酸 ,因 此标记 的非必 需氨基 酸进入 细胞后 ,会 被内源 合成的 同类氨 基酸所 稀释, 使标记 的比活 性减少 ,故 一般不 选择非 必需氨 基酸标 • 647 • 记 。②标 记氨基 酸可由 于转氨 酶的作 用而脱 去氨基 ,可 在细 胞饥饿 和标记 期间加 入转氨 酶的抑 制剂加 以克服 。③ 细胞内 标记氨 基酸转 化为其 他物质 ,这对 需要了 解氨基 酸组成 的 合成蛋 白质显 得特别 重要。 (3) 本 方法由 于使用 放射标 记物质 ,因此 必须严 格按照 有关规 则进行 操作, 否则对 人体和 环境都 将造成 危害。 三、 用于微 序列分 析的蛋 白质分 离方法 使用本 方法可 测定蛋 白质或 多肽的 氨基酸 顺序, 特别适 合于不 溶性或 疏水性 蛋白质 或纯度 <90% 的蛋白 质的测 序分析 。尽 管影响 分离效 率的因 素很多 ,但只 要不到 50pmol 的蛋 白质就 可以获 得有益 的序列 信息。 如果被 分析的 蛋白质 的氨基 末端被 掩盖, 则 先需经 过化学 降解或 部分酶 解后才 能进行 分离。 (一) SDS-PAGE 和 PVDF 膜 转移测 定氨基 酸顺序 1. 原理 制备 微型胶 ,并 进行预 电泳后 ,将 含有待 测蛋白 质的样 品加到 微型胶 梳孔中 ,在中 性 pH 下 进彳了 SDS-PAGE 分离; 然 后电泳 转移到 PVDF (polyvinylidene difluoride) 膜 上 ,并 用考马 斯亮蓝 染色; 剪下 所需要 的条带 ,在自 动蛋白 质序列 分析仪 上进行 分析。 实验 中采用 PVDF 膜与其 他的膜 相比, 它能更 有效地 吸附印 迹蛋白 ,甚 至可用 于低相 对分子 质量肽 的分析 。用 它进行 长时间 的转移 ,也 不会导 致不良 后果。 2. 材料 4 x 凝胶 缓冲液 10 x 下槽 缓冲液 10 x 上槽 缓冲液 转移 缓冲液 样品 缓冲液 (50mmol/LTris-HClpH6.8, 5%2- 巯基 乙醇, 10% 甘油, 1%SDS, 分 装冰 冻贮存 <2 个月) 浓 缩胶和 分离胶 还 原型谷 胱甘肽 琉 基丙酸 (mercap-topropionic acid, MPA) 蛋 白样品 (在样 品缓冲 液中) 甲醇 含 0.1% (m/V) 考马斯 亮蓝的 50% (V/V) 甲 醇溶液 含 10% (V/V) 冰 乙酸的 50% (V7V) 甲 醇溶液 垂直微 型胶电 泳装置 PVDF 膜 微型 转移槽 . 648 • 蛋白 质自动 测序仪 3. 试 剂配制 4X 凝胶 缓冲液 : 41.24gTris (0.493mol/L), 7.08mL37.5% HC1, 加 H20 到 400mL。 该溶液 pH6.61, 可在 - 20X: 贮存 ,或 4t: 放置 2 个月 以上。 10X 下槽 缓冲液 : 52.4g Tris (0.626mol/L), 12.2mL 37.5% HC1, 加 H20 到 400mL。 该 溶液为 pH5.90, 可在 -2(TC 贮存 ,或 4X: 放置 2 个月 以上。 10 X 上槽 缓冲液 : 40. 28g N-tris- (hydroxymethyl) -methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES, 0.439mol/L)、 94.64g Tris (1.131mol/L), 4.0g SDS, 加 H20 到 400mL。 该溶液 PH7.25, 可在 -20t: 贮存 ,或 4t: 放置 2 个月 以上。 转移 缓冲液 : 2. 21g cyclohexylaminopropane sulfonic acid (CAPS), 0.5g DTT, 150mL 甲醇 ,加 H20 到 lOOOmL, 用 NaOH 调节到 pH10.5, 冷却至 4X:, 临用前 配制。 如蛋 白质分 子质量 >60kDa, 甲 醇用量 可减至 1%。 分 离胶配 方见表 8.23 所示。 表 8.23 分离 胶配方 Acr 终浓度 /% 试 剂 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 30% 凝 胶贮液 /mL 3.33 4.00 4.67 5.33 6.00 6.60 7.30 8.00 8.67 9.33 (Acr:Bis= 37.5:1) H20/mL 11.49 10.83 10.16 9.50 8.84 8.10 7.10 6.^4 6.18 5.51 TEMED* 0.040 0.033 0.029 0.027 0.025 0.020 0.018 0.017 0.015 0.014 * 用于加 速反应 , 使用量 可酌情 处理。 将上述 成分与 5mL 4X 凝胶缓 冲液、 〇.14mL 5% 过硫 酸钾或 70fiL 10% 过硫 酸铵溶 液混合 ,即可 灌胶。 浓缩 胶配方 : 0.666mL30% 凝胶 贮液, 3.033mLH2O, 0.25mL10% 过硫 酸铵或 0.05mL5% 过硫 酸钾, 0.025mLTEMED* 4. 操 作步骤 (1) 灌胶和 预电泳 : 安装好 微型电 泳装置 ,稀释 凝胶缓 冲液为 IX 凝胶 缓冲液 ,量 取 200mL 倒入上 电泳槽 。将若 干还原 型谷胱 甘肽干 粉加入 到另外 180mL 的 1 X 凝胶缓 冲液中 ,使 其终 浓度为 1.0mm〇l/L, 然后 倒入电 泳下槽 。接 通电源 ,在 l〇mA 电 流下, 预电泳 45min。 关 闭电源 ,放 置过夜 。此时 ,凝 胶可以 贮存若 干天。 谷胱甘 肽可防 止丙烯 酰胺聚 合过程 中产生 的副反 应产物 。预 电泳时 间过长 ,可能 影响凝 胶的分 辨率。 (2) 加样和 电泳: 倒掉凝 胶缓冲 液后, 用滤纸 条吸干 加样孔 。将 200mL 稀 释好的 IX 下槽缓 冲液倒 入下槽 ,同 时加入 10^l 巯 基丙酸 (MPA) 到 150mLlx 上槽 缓冲液 中 ,并倒 入上槽 。根 据经验 ,用 5 孔及 0.75mm 梳子, 每孔样 品体积 <30^L, 效果最 • 649 • 佳 。最 好能同 时电泳 一个已 知蛋白 ,如 乳球 蛋白作 为对照 。样品 制备的 方法见 SDS> PAGE 部分 。在 10mA 下电泳 ,直 利染料 ( 哌咯宁 Y, PyroninY) 达到胶 的底部 ,关闭 电源。 电泳在 60~80min 内 完成。 用 MPA 代替谷 胱甘肽 是因为 后者会 干扰以 后的序 列分析 。哌 咯宁 Y 染料和 PVDF 膜结合 十分紧 密 ,可 作为印 迹标志 ,故以 它代替 溴酚蓝 染料。 (3) 电 泳条带 转移至 PVDF 膜: 以下操 作必须 戴手套 ,以 防指 纹将电 泳条带 污染。 用甲醇 将两张 PVDF 膜润 湿后, 浸泡在 转移缓 冲液中 。将微 型电泳 槽拆开 ,轻轻 取出玻 璃平板 和胶片 ,按 照塑 料框夹 -衬垫 -滤纸 -凝胶 -两张 PVDF 膜- 滤纸- 衬垫- 塑料框 夹 的顺序 ,安 装印迹 装置; 也可 将两张 PVDF 膜分放 在凝胶 的两侧 ,以 防止万 一电极 连错引 起蛋白 丢失。 组装时 防止气 泡出现 , 可在盛 转移缓 冲液的 盘中装 配上述 组件。 组装完 毕后, 向转移 槽内灌 满转移 缓冲液 ,接 通电源 ,按 6V/cm 的 电压降 进行电 泳 ,总电 压约为 50V。 电泳 完毕后 ,关闭 电源。 根 据经验 ,转 移时按 6V/cm 电压降 计算所 使用的 总电压 。对 20~50kDa 的 蛋白质 ,在 15% 的胶中 需转移 30 ~ 40min ; 对 50 ~ lOOkDa 的 蛋白质 ,在 10 % ~ 12 % 的 胶中需 60 〜 70min ; 150 ~ 200kDa 的蛋白 质在 7% 的 胶中需 90min; 当蛋 白质分 子质量 >60kDa 时, 需将转 移缓冲 液中甲 醇的量 减少至 1%。 (4) 染 色和剪 带:转 移完毕 后取出 转移夹 ,将 PVDF 膜浸入 0.1% 考马斯 亮蓝的 50% 甲醇 溶液中 ,搅动 5min。 在含 10% 冰 乙酸的 50% 甲醇 溶液中 脱色约 5~10min, 直 到条 带清晰 。取 出膜后 ,置 于水中 清洗, 并照相 。用 刀片切 下条带 ,每切 一条带 更换一 把刀片 ,将条 带放入 微型离 心管中 ,室 温下空 气干燥 ,也 可放在 -20X: 贮存 待用。 (5) 蛋白质 序列分 析:按 照序列 分析仪 的要求 ,将条 带放入 序列分 析仪反 应柱中 , 进 行测序 分析。 (二) 制备 SDS-PAGE 的蛋白 质样品 1. 原理 主要的 制备过 程是先 将样品 浓缩并 除去干 扰电泳 结果的 杂质, 然后溶 解在含 SDS 的样 品缓冲 液中。 2. 附 加材料 蛋白 质样品 lmol/L NaHC03 100% 冰冷的 的乙醇 (不含 任何变 性剂) 样品 缓冲液 2_1% (w/V) 呢右吁 -Y ( pyronin Y) 超滤 浓缩器 (Amico) 或真 空离心 蒸发器 (Savant) 加样器 及吸头 沸水浴 . 650 . 3. 操 作步骤 (1) 如 果需要 ,用 lm〇l/LNaHC03 调节蛋 白质样 品的盐 浓度〉 100mmd/L。 (2) 通过超 滤浓缩 器或真 空离心 蒸发器 将蛋白 质样品 浓缩至 50 〜 lOOyL, 转移到 1.5mL 微 型离心 管中。 (3) 加 9 倍体积 的冰冷 乙醇到 样品中 ,在 干冰 上放置 lh 或在 -201C 过夜。 (4) 置于微 型离心 机中以 最大速 度离心 15min, 保留 沉淀。 此 步使用 水平转 头的离 心效果 优于角 转头。 (5) 加 10/xL 样品缓 冲液到 微型离 心管中 ,反 复吹打 混匀, 在沸水 浴中煮 3mm。 (6) 加 l^LO.l% 哌若咛 -Y (示踪 染料) 到 样品中 ,加样 至微型 胶的样 品孔内 ,进 行 电泳。 (三) 蛋白 质电泳 分离后 内部氨 基酸序 列的分 析测定 1. 原理 高达 50% 的真核 细胞蛋 白质的 N- 末 端常常 被封闭 ,使 得完整 蛋白质 的序列 测定变 的十 分困难 。本方 法将目 的蛋白 质经过 电泳分 离后, 转移到 NC 膜上 ,用 丽春红 S 显带 后 ,剪下 所需的 条带。 脱色后 ,用聚 乙烯卩 比略 焼酮 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 处理 NC 膜 ,防 止加入 的蛋白 水解酶 吸附及 失活。 最终将 被蛋白 水解酶 分解的 肽片段 从膜上 洗脱 下来, 进一步 用反相 HPLC 技术 分离, 然后用 微序列 分析仪 测定每 一个肽 段的氨 基 酸序列 。本 方法可 从电泳 和膜转 移分离 后的蛋 白质中 获得若 干个氨 基酸序 列片段 。大 约 只需要 200pm〇l 的 蛋白质 量就足 够分析 之用。 2. 材料 ^ 蛋白 质样品 0.1% (m/V〇 丽春红 S (溶于 1% 乙酸中 ) 1% 乙酸 0.2mmol/L NaOH 0.5% (m/V) PVP (溶于 1% 乙酸) 消化 缓冲液 (0.1mol/LTris-HClpH8.0, lmol/LCaCl2, 10% 乙腈 ,冻存 ) lmg/mL 测 序级胰 蛋白酶 (Promega #V511A) 层 析溶剂 A (5% 乙腈, 0.1% 三氟 乙酸) 层 析溶剂 B (70% 乙腈, 0.085% 三氟 乙酸) 0.22pm 硝酸纤 维素膜 蛋 白结合 力低的 0.22pm 滤膜 (如 Millipore # UFC3-OGV-00) 酸清洗 过的玻 璃板或 培养皿 乳 胶手套 尖 头镊子 0.5mL 微型 离心管 . 651 . 水浴 超声器 (如 Bransonic 12) 离 心式过 滤装置 反相 HPIX 柱 (如 Vydac # 214TP52)、 UV 监视器 、记 录纸 柱 加热器 ( Col umn oven ) 3. 操 作步骤 1 ) 蛋白质 的电泳 和转移 电泳分 离目的 蛋白并 转移至 NC 膜上 ,具体 步骤参 照有关 章节。 从这 一步起 ,以 后永远 保持膜 湿润。 2) 染色和 剪下被 分离的 蛋白质 (1) 将 NC 膜 放入已 用酸清 洗过的 玻璃培 养皿中 ( 可放下 8cmX l〇cm 的凝胶 ,培养 皿中 已盛有 50mL 左右含 0.1% 丽春红 S 的 1% 乙 酸溶液 ), 轻 轻振摇 lmin。 (2) 将 NC 膜转入 1 % 乙酸 溶液中 lmin。 (3) 戴 上手套 ,用 一把新 的刀片 切下所 感兴趣 的条带 ,放入 1.5mL 微 型离心 管中。 注 意:尽 量少把 空白的 NC 膜剪下 ,以 减少 对随后 步骤中 加入的 蛋白水 解酶的 吸收。 此 步骤的 关键是 保持一 切可能 使用到 的器械 、物品 、溶液 的清洁 ,防 止任何 其他蛋 白质的 污染。 同时剪 下一片 空白的 NC 膜 ,放入 微型离 心管中 , 作为以 后鉴定 其他蛋 白质污 染时的 对照。 如果不 立即进 行下一 步操作 ,也可 将剪下 的膜放 入盛有 0.5mL 的微型 管中, 贮存于 -20X:。 3) 脱色 将膜片 转移到 lmL0.2mmol/LNaOH 溶液中 ,旋 涡震荡 lmin, 吸去 NaOH, 立即 进行下 一步。 由 于在碱 性条件 下蛋白 质比在 酸性条 件下容 易丢失 ,故 此步脱 色的时 间不能 太长, 残余的 染料不 会干扰 以后的 反应。 4) 封闭膜 (1) 加 lmL 含 0.5% PVP-40 的 0.1mol/L 乙 酸溶液 ,室 温下轻 轻振摇 30min。 (2) 吸去 PVP-40, 用 lmL 水洗膜 5min。 附 ,在 管帽上 的液滴 也必须 洗掉。 (3) 使用清 洁慑子 ,将 剪下的 条带转 移到干 净的酸 洗过的 玻璃表 面上, 切割成 1 〜 2cm 的 碎片。 (4) 用镊 子收集 碎片, 用力挤 出水分 ,进行 下一步 操作。 5) 蛋白质 的酶解 将碎片 转移到 0.5mL 的含 25yL 消化缓 冲液的 微型离 心管中 ,加入 1/iL 胰酶 (lmg/mL), 充分 混合, 室温下 过夜。 6) 洗脱肽 (1) 室 温下高 速离心 样品管 Is, 收 集所有 粘在管 壁和管 帽上的 液体。 (2) 室 温下超 ^ 样品 5min。 (3) 室温下 高速离 也、 lmin。 (4) 将上清 转移到 离心式 滤器中 ,用 lOOpL 的消 化缓冲 液洗涤 膜碎片 ,上清 一并收 集到 滤器中 ,高 速离心 20~30s, 以 除去可 能干扰 HPLC 柱 NC 碎颗粒 。除 非立 即进行 组 分的分 级分离 ,否 则置于 -20X: 贮存。 . 652 . 7 ) 样品 的层析 和加工 (1) 用 95% 的层 析溶剂 A/5% 层 析溶剂 B 的混合 液平衡 2.1mm x 250mm 的反相 HPLC 柱子, 流速为 1.5mL/min。 如 果有柱 加热器 ,最好 在柱温 60X: 时进 行分离 ,效 果 最佳。 (2) 注射 样品, 继续用 95% 的层 析溶剂 A/5% 层 析溶剂 B 的混合 液洗柱 10 〜 15min〇 (3) 用梯 度液洗 脱肽, 其浓度 范围是 :最初 lh 用 浓度从 5% 〜 40% 的层 析溶剂 A 洗脱; 然后用 40%~75% 的层 析溶剂 B 洗脱 30min; 最 后用从 75% 〜 100% 的层 析溶剂 B 洗脱 15min。 在 UV215nm 波长下 监视肽 的洗脱 过程。 TFA 与洗脱 物应有 相同的 UV 吸 收波长 (同在 215nm), 含有 氨和有 UV 吸 收的不 纯杂质 的缓冲 液 应弃去 不用。 胰酶在 60% 层 析溶剂 B 的浓度 下洗脱 ,因此 可以用 做内参 。它 的洗脱 峰比多 数肽的 洗脱峰 都宽。 (4) 记录 和监视 洗脱肽 的峰形 ,调节 至最佳 量程。 (5) 当记录 笔刚开 始偏斜 ,指示 峰将出 现时, 即开始 用微型 离心管 ,收集 组分。 注意戴 手套和 所有器 皿的清 洁度。 (6) 收 集完后 ,立 即盖上 管帽, 置于干 冰上。 快速冰 冻的目 的是防 止分离 出来的 肽粘在 管壁上 ,也可 将离心 管贮于 -80C。 (7) 用 事先经 polybrene 循 环过的 玻璃杯 (glass support disks) 按微序 列分析 仪的要 求进行 测序。 对 照样品 和空白 NC 膜的层 析图谱 有助于 发现和 鉴定感 兴趣的 肽序列 。仪器 自动分 析的过 程中, 对 UV 吸收有 干扰的 杂质可 能来自 残留的 PVP-40、 污 染的玻 璃器皿 、蛋 白水解 酶的自 身裂解 片段, 可 以通过 与对照 相比而 排除。 (四) 方 法评注 进行 蛋白质 序列分 析的关 键是待 分析样 品不含 污染的 蛋白或 非蛋白 质杂质 ,因此 SD&PAGE 是十分 重要的 分离纯 化手段 。 1986 年 Aebersdd 等又提 出电泳 后的印 迹步骤 可被 用于制 备能直 接进行 微序列 分析的 样品, 但存在 接收的 信号十 分微弱 的缺点 。后来 经 过用“ 清道夫 ”式的 预电泳 ,可 以提高 各种参 数的灵 敏度, 获得良 好效果 。例 如:用 谷胱甘 肽或巯 基乙酸 来进行 预电泳 可消除 聚丙烯 酰胺聚 合过程 中副产 物的反 应性; 通过 降 低分离 过程的 pH 也 可降低 N- 末端 氨基的 反应性 。最近 流行的 Tris-Tricine ( 三羟甲 基甲基 甘甲酸 ) 凝 胶对分 离低相 对分子 质量蛋 白及肽 类效果 很好。 杨渝珍 殷斌志 李 龙 主要参 考文献 郭尧 君主编 . 1999. 蛋白质 电泳实 验技术 . 第一版 .北京 :科学 出版社 , 262~282. 卢圣 栋主编 . 1Q99. 现代分 子生物 学实验 技术. 第二版 .北京 :中国 协和医 科大学 出版社 • 李发 美主编 • 1999 •医 药高等 液相色 谱技术 .北 京:人 民卫生 出版社 , 3~76. 李建武 ,肖 能庚, 余瑞元 等主编 . 1994. 生物 化学实 验原理 和方法 .北京 :北京 大学出 版社. • 653 . 牛玉杰 .石年 . 李龙等 . 1999 •拟 除虫菊 酯对大 鼠脑组 织谷氨 酸和天 门冬氣 酸含量 的影响 •河北 医科大 学学报 . 20 (1): 1 一 3. 师治贤 ,王俊 德编著 . 1992. 生物大 分子的 液相色 谱分离 和制备 . 61~103. 师治贤 ,胡 风祖, 焦庆才 .色谱 , 8, 38 (1990). 沈关 心主编 . 1998 •免疫 学实验 技术. 第一版 .湖北 : 湖北科 技出版 社_ 汪 谦主编 . 1997 •现代 医学实 验方法 .北京 :人民 卫生出 版社, 850 〜 855. 赵永 芳主编 . 1994. 生物化 学技术 原理及 其应用 •第 一版 .武汉 : 武汉大 学出版 社_ 夏其 昌主编 . 1997. 蛋白质 化学研 究技术 和进展 . 第一版 .北京 : 科学出 版社. 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测定在 DNA 多个位 点结合 的蛋白 质之间 的合作 反应。 在检 测并初 步鉴定 到一个 DNA 结合蛋 白后, 人们通 常希望 能得到 此蛋白 的结晶 体。 通常通 过色谱 层析法 可得到 较纯的 蛋白质 ,并 且用电 泳迁移 率改变 试验检 测法或 DNasel 保护 印迹法 可鉴别 此蛋白 的存在 。在 纯化的 方案中 ,另一 种十分 有效的 纯化方 法即 是亲和 层析柱 ,该柱 结合有 大量可 同此蛋 白特异 性结合 的特异 DNA。 其原 理即是 利用某 种蛋白 具有同 源的特 异性结 合位点 的特点 。这样 ,即 使溶液 中含有 大量的 高浓度 的 、竞 争性非 特异性 DNA, 只 要蛋白 质特异 结合的 DNA 被结 合于亲 和层析 柱上, DNA 结合蛋 白仍可 结合到 亲和层 析柱上 。现在 ,人 们通常 先将预 纯化的 蛋白质 溶液用 普通的 非 特异性 DNA 纤 维素柱 进行初 步纯化 ,然后 ,在高 盐的条 件下过 特异性 亲和层 析柱。 由 于特异 性蛋白 -DNA 复合 物在适 度的盐 浓度下 是十分 稳定的 ,而 非特异 性的蛋 白质- DNA 复合物 在高盐 条件下 会裂解 ,因 此用 普通的 DNA 纤维 素柱和 DNA 亲和层 析柱串 联在 一起后 可得到 高纯度 的纯化 产物。 还有一 种方法 可以得 到相同 级别纯 度的纯 化产物 :即通 过用含 有蛋白 质结合 位点的 生 物素化 DNA 片段及 包被链 霉素的 柱基质 。在 此法中 ,当 含有特 异性结 合位点 的生物 素化 DNA 片 段同原 始或部 分纯化 的蛋白 质提取 物以及 超量的 竞争性 DNA 混合后 ,如 同 亲和层 析柱法 所描述 的那样 ,特 异性蛋 白将同 有结合 位点的 DNA 片段 结合, 此时, 用包 被有链 霉素的 某种柱 基质即 可将特 异性的 DNA 片段连 同结合 的蛋白 质一起 从混合 物中分 离出来 。然后 ,将 蛋白质 用高盐 溶液洗 脱下来 。人们 现在用 电泳迁 移率改 变试验 检测纯 化的每 一步是 否成功 。另外 ,该 法的应 用十分 普及: 这是由 于单一 的柱基 质可同 任何 的生物 素化的 DNA 相结合 ,因此 该法被 用来纯 化多种 不同的 DNA 结合 蛋白。 为了确 定该蛋 白的纯 化纯度 ,知 道其分 子质量 大小是 十分重 要的; 同样 ,由 于调节 蛋白 在细胞 内由于 环境的 不同或 者第二 信号而 被修饰 ,因 此知道 在不同 条件下 DNA 结 合蛋白 的分子 质量大 小也是 十分重 要的。 此信息 可提供 对蛋白 调节状 况充分 了解。 Southern-Western 印 迹法则 提 供了此 种可 能:将 Western 印 迹法得 到的 核蛋白 区带同 ''—P 标记的 DNA 探 针杂交 ,如 果核蛋 白中含 有与此 DNA 探针 特异性 结合的 蛋白质 ,则经 放射 性自显 影后在 相应的 位子会 形成自 显影带 。该 法可初 步显示 DNA 结 合蛋白 的分子 质量 ,为 DNA 结 合蛋白 的提取 与纯化 提供某 些信息 。但是 ,由于 DNA、 蛋白质 结合反 应受 反应体 系中多 种因素 的影响 (如盐 浓度等 ), 该 实验较 难重复 ,所得 到的分 子质量 也不 是十分 准确。 现在人 们通常 用蛋白 质-核 酸紫外 交联法 (UV-crosslinking) 来确定 DNA 结 合蛋白 的分子 质量。 该法用 紫外线 使蛋白 质共价 交联到 DNA 的调节 序列上 ,在 SDS- 聚 丙烯酰 胺凝 胶上电 泳分辨 蛋白复 合体, 通过放 射自显 影技术 即可得 到该蛋 白的分 子质量 。该法 甚至可 用于在 原始提 取物中 不纯的 蛋白质 。该 法纯 化蛋白 质时通 常先将 DNA 片 段用放 . 657 • 射 性同位 素标记 ,然后 再使蛋 白质和 标记的 dna 在 紫外光 的作用 下发生 交联从 而得到 纯化 的特异 性蛋白 。一般 通常先 用电泳 迁移率 改变试 验分离 DNA 与蛋白 质的复 合体, 再用 紫外光 照射。 证实这 两种方 法中交 联的蛋 白质可 特异性 结合于 同一种 已知的 DNA 序列 是十分 关键的 ,这 可用非 标记的 DNA 片段 进行竞 争实验 来得到 证实。 在很多 情况下 ,人 们的 目标通 常是得 到编码 DNA 结合蛋 白的基 因克隆 ,从 而详细 研究并 了解此 蛋白质 的遗传 学特征 ,以 便可纯 化蛋白 、测序 、并 用此序 列分离 、鉴定 cDNA 克隆 来完成 。不过 ,尽管 最近几 年在纯 化方法 上有了 长足的 进步, 但用上 述方法 得到某 种编码 DNA 结合蛋 白的基 因克隆 是十分 耗时的 ,特 别是当 样品中 DNA 结合蛋 白含量 很低时 。一 种改 进的方 法则是 用已知 的可被 蛋白质 识别的 DNA 序 列直接 分离并 鉴定 cDNA 克隆 。该 法实际 上即是 Southern-Western 印迹 法的一 种应用 。在 此法中 ,通 常将表 达库铺 成平板 ,并 将重 组噬菌 体产生 的蚀斑 中的蛋 白质用 Western 印迹法 转至硝 酸纤维 素膜上 ,然 后将此 膜同某 种特异 性的已 标记的 DNA 序 列杂交 ,从 而可检 测到表 达有 DNA 结合 蛋白的 cDNA 克隆 。该 法成功 的关键 在于该 库中含 有可特 异性结 合已知 DNA 序列的 DNA 结合 蛋白。 但假如 此蛋白 是作为 一个杂 二聚体 DNA 结 合蛋白 的一部 分, 或者在 其结合 位点上 需要一 种特别 的共价 修饰时 ,则 用此法 将不能 检测并 分离到 DNA 结合 蛋白的 cDNA 克隆。 用以 上方法 ,人们 可以很 容易地 分离、 鉴定并 纯化到 DNA 结合调 节蛋白 。当 人们 已得到 纯化的 DNA 结 合调节 蛋白后 ,人们 通常需 要鉴定 它们同 DNA 反应 的能力 。而 用 于鉴定 它们同 DNA 反应 能力的 方法中 ,最为 简单的 是滤膜 结合法 。该 法的原 理是当 双链 DNA 通过硝 酸纤维 素膜时 ,蛋白 或蛋白 -DNA 复合物 被保留 下来。 滤膜结 合实验 为鉴定 纯化的 DNA 结合 蛋白同 已知的 DNA 调节序 列间的 反应提 供了一 个十分 简单并 且灵敏 的方法 。而且 如果用 滤膜结 合法来 进行竞 争实验 ,则 其可进 行在最 为苛刻 的条件 下 所作的 相关联 的多种 DNA 序列 与一种 DNA 结 合蛋白 的亲和 力测定 。另外 ,动 力测 定能够 估计任 何已知 的蛋白 -DNA 结 合反应 中结合 的稳定 性及离 解率。 滤 膜结合 反应也 是一种 测定未 知功能 的纯化 蛋白同 DNA 结合 反应特 征的一 种十分 有效 的方案 。目前 ,许多 生物中 十分重 要的基 因产物 (如 某种发 育基因 或某些 癌基因 ), 仅 仅已知 位于细 胞核内 ,但其 功能却 不清楚 ,滤 膜结 合反应 则可用 于鉴定 并分离 同这些 蛋白 反应的 DNA 序列 。当 用滤膜 结合法 初步鉴 定并分 离得到 DNA 序列后 ,则 可用更 精确 的实验 (如 DNase I 保护 印迹法 或甲基 化干扰 实验) 来 进一步 分析鉴 定结合 位点。 一 旦编码 DNA 结合 蛋白的 基因克 隆被筛 选得到 ,则可 用体外 转录与 翻译合 成放射 性标 记的蛋 白质, 此标记 的蛋白 质可用 于检测 并分析 DNA- 蛋白结 合反应 。此法 最为显 著的优 点是使 得构建 能影响 DNA 结 合特性 的基因 的突变 体成为 可能。 本章 所有的 操作方 案均可 用于检 测并鉴 定特异 DNA- 蛋白 质的结 合反应 、纯 化特异 的 DNA 结合 蛋白并 克隆这 些蛋白 的基因 。用 以上的 方法, 人们可 以从某 个已知 的基本 调控序 列开始 ,鉴 定并分 离同此 调控序 列作用 的因子 的基因 。同样 ,用以 上的方 法也可 测定 DNA 调 控蛋白 的特性 ,分析 调控基 因克隆 ,分 析并了 解调控 蛋白的 有关功 能区。 由于传 统的遗 传学方 法不能 用于分 析基因 的调控 ,因 此以上 方法已 被广泛 用于哺 乳动物 调控 基因的 研究中 ,并且 已经发 展到在 分子水 平分析 复杂的 调控环 ,虽然 这在目 前来说 还属 于十分 困难的 事情。 • 658 • 第一 节哺乳 动物细 胞核或 细胞质 内蛋白 的提取 从培 养的细 胞中提 取蛋白 是研究 DNA 结 合蛋白 性质及 核酸与 蛋白质 相互作 用的先 决条件 。从细 胞中提 取的蛋 白质必 须要能 直接用 于功能 性研究 ( 如细胞 外转录 、翻译 等 或者可 用作提 纯蛋白 质的基 本原料 。在 本节中 ,我 们将以 Hela 细胞 为例, 讲述如 何 从培养 的细胞 中提取 蛋白质 。另外 ,我 们也 将详细 地讨论 两种改 进的方 法:第 一种方 法适 用于不 同的细 胞类型 ,提取 某些特 殊的蛋 白质; 第二种 方法则 适用于 提取细 胞质中 的 成分。 一、 细胞核 中提取 蛋白质 (一) 基 本方法 1. 原理 为了从 细胞核 中得到 蛋白质 ,首先 必须收 集培养 的细胞 ,洗涤 细胞, 将细胞 重悬于 低渗 溶液中 。肿 胀的细 胞被均 一化后 ,细胞 核即被 离心沉 淀下来 ,弃 去细胞 质部分 ,将 细胞 核重悬 于低盐 溶液中 。缓慢 滴加高 盐溶液 可以使 蛋白质 从细胞 核中释 放出来 而不用 破碎细 胞核。 通过离 心即可 将细胞 核除去 ,上清 (即细 胞核提 取物) 用中 等浓度 的盐溶 液透析 ,将沉 淀的蛋 白质用 离心法 除去。 2. 材料 培养 的单层 哺乳动 物细胞 (如 Hela 细胞) 或者培 养的悬 浮细胞 磷酸盐 缓冲液 (PBS) 低渗 缓冲液 (10 mmol/L HEPES, 4t: 时 pH7.9, 1.5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L KC1, 0.2mmol/LEDTA, 临用 前加入 0.2mmol/LPMSF 和 0.5mmol/LDTT) 低盐 缓冲液 (20 mmol/L HEPES, 4X: 时 pH7.9, 25% 甘油, 100 mmol/L MgCl2, 0.02 mol/L KC1, 0.2 mmol/L EDTA, 临用 前加入 0.2 mmol/L PMSF 和 0.5 mmol/L DTT) 高盐 缓冲液 (20mmol/LHEPES, 4t: 时 pH7.9, 25% 甘油, l〇〇mmol/LMgCl2, 1.2 mol/L KC1, 0.2 mmol/L EDTA, 临用 前加入 0.2 mmol/L PMSF 和 0.5 mmol/L DTT) 透析 缓冲液 (20 mmol/L HEPES, 4t: 时 pH7.9, 20% 甘油, 100 mmol/L KC1, 0-2 mmol/L EDTA, 临用 前加入 0.2 mmol/L PMSF 和 0.5 mmol/L DTT) 液氮 50mL 或 15mL 圆锥 形刻度 聚丙烯 离心管 透析袋 磁力 搅拌器 . 659 • 玻璃 匀浆器 Bechman 离心机 及相应 的转头 3. 试 剂配制 注意 :所有 的溶液 均可在 4t: 下保 存数周 。但是 ,二硫 苏糖醇 (DTT) 及苯 甲基磺 酰氟 (PMSF) 必须在 临用前 加入。 PMSF (相 对分子 质量为 174.2) 可先 用无水 异丙醇 溶解成 0.2 mol/L 的母液 贮存, 它可稳 定贮存 9 个月 以上。 值得注 意的是 PMSF 在水溶 液中 是极不 稳定的 ,因此 在加入 PMSF 时应一 滴一滴 地加入 ,并 且在滴 加时应 不断地 剧 烈搅动 。在长 时间的 透析后 应补加 PMSF。 可代替 HEPES 的缓 冲液是 Tris 缓冲液 。但是 要注意 的是, Tris 缓 冲液的 pH 是随 着 时间而 改变的 。例如 ,在 4t: 时 pH 为 7.9 的 Tris 缓冲 液在室 温时会 下降为 7.3。 因 此 如果用 Tris 缓冲液 作为功 能研究 (如 转录或 拼接) 时的 提取缓 冲液, 那么则 有必要 在 30X: 时加入 HEPES ( 室温时 pH 为 8.4) 至终 浓度为 40mmol/L。 4. 操 作步骤 以 下各步 均应在 0~41C 下进行 , 溶液与 使用的 仪器均 应预冷 ,并且 所有的 离心均 应用预 冷的离 心 转头。 (1) 收 获细胞 。单 层细胞 ,将 培养的 单层细 胞弃去 培养基 ,用 预冷的 PBS 洗涤。 弃去 PBS, 刮 棒刮下 并转入 一个刻 度离心 管中。 悬 浮细胞 ,将细 胞悬液 [细胞 浓度为 (5X108) 〜 (l〇xi〇8) /L] 于 4T: 下 185〇Xg 离心约 20min, 弃 去上清 并将细 胞转至 50mL 的 圆锥底 刻度离 心管中 (每管 可转入 2 〜 3mL 培 养液中 的细胞 )。 (2) 4X: 下 185〇Xg 离心约 l〇min, 弃 去上清 ,分别 进行以 下操作 : 单 层细胞 ,弃 去上清 ,利用 离心管 上的刻 度估计 细胞的 总体积 (pcv)。 腰 浮细胞 ,弃 去上清 ,利用 离心管 上的刻 度估计 细胞的 总体积 ,将 细胞重 悬于约 5 倍 pcv 体积的 PBS 缓冲 液中, 41C 下 185〇Xg 离心约 lOmin, 弃去 上清。 (3) 将细 胞很快 重悬于 5 倍 pcv 体积的 低渗溶 液中, 41C 下 185〇Xg 离心约 5min, 弃去 上清。 此 步的目 的是将 PBS 溶 液中的 盐除掉 ,以 便下一 步的细 胞膨胀 可以有 效发生 。然而 ,在此 步中有 部 分细胞 已经发 生涨大 。因此 , 操作时 应迅速 ,否则 ,细胞 中的蛋 白质会 被释放 出来并 与上清 一起被 去掉。 (4) 用 3 倍 于细胞 pcv 体积 的低渗 溶液重 悬细胞 ,于冰 上冰浴 l〇min 使细胞 膨胀。 (5) 将细胞 转入勻 浆器中 匀浆。 匀浆时 应缓慢 , 匀浆后 ,取少 董加入 等体积 的台盼 蓝染料 ,此 染料可 使裂解 的细胞 中的细 胞核着 色而 完整的 细胞不 受影响 。注意 :裂解 的细胞 要达到 80% ~90% 以上 才能进 行以下 操作。 (6) 将细胞 转入离 心管中 ,在 3300 Xg 条件 下离心 15min 收集 细胞核 。移 去的上 清 可作为 细胞质 提取的 原料。 (7) 利用离 心管上 的刻度 估计细 胞核的 总体积 (pcv)。 用 1/2 倍 pcv 体积的 低盐溶 • 660 • 液 重悬细 胞核。 (8) 滴加 1/2 倍 pcv 体 积的高 盐溶液 ,使 其充分 混匀。 滴加 高盐溶 液时, 速度不 应过快 ,且 每次均 要使其 混匀, 并且应 防止细 胞核聚 集成块 。氯 化钾的 终浓 度应为 300 mmol/ L。 (9) 缓慢搅 动溶液 30miri 使 其充分 混匀。 (10) 在 25 000 Xg 条件 下离心 30mm 沉淀 细胞核 ,弃去 上清即 得到细 胞核提 取物。 测 量其传 导率。 5 〜 10ML 提 取物用 蒸馏水 稀释至 lmL, 用传导 率仪检 测其传 导率, 并同相 同稀释 度的透 析液比 较 ,直 至相同 即可。 (11) 透析并 保存细 胞核提 取物。 ① 将细 胞核提 取物置 于一透 析带中 ,透 析带 的一头 用透析 夹夹好 (便 于随时 比较透 析物与 透析液 的成分 ,决 定是 否需要 继续进 行透析 )。 用 50 倍体积 的透析 液进行 透析直 至提 取物与 透析液 的传导 率相同 为止。 或者说 ,提 取物中 KC1 的浓 度也为 100 mmol/L 即可。 透 析到所 需盐浓 度的最 短时间 : 75~100mL 细胞核 提取物 约需要 5h, 而 2mL 细胞 核提取 物则只 需 要不到 lh。 为了 减少透 析时间 ,对 于相同 体积的 提取物 ,往往 用表面 积较大 的透析 带从而 达到较 好 的效果 。当然 , 也有人 用不含 KC1 的透析 液进行 透析也 可同样 减少透 析时间 。这时 ,由 于盐 浓度下 降很 快因此 需要频 繁地检 测提取 物的传 导率, 当传导 率等于 100 mmol/L KC1 透 析液的 传导率 时应立 停 止透析 ,以 防盐浓 度低于 100 mmol/L KC1 ( 若盐浓 度低于 100 mmol/L KC1 会导 致蛋白 质沉淀 )。 ② 将提 取物从 透析带 中转移 至离心 管中, 再检测 一次传 导率以 确定透 析完全 ,于 25 000 X g •条件 下离心 20min, 弃去 沉淀。 此步 用于除 去在透 析时当 KC1 浓度 较低时 蛋白质 与核酸 形成的 沉淀。 ③ 测定 上清液 中的蛋 白浓度 ,分 装至小 管中, 并立即 冻存于 液氮中 ,于 -80X: 保存 提 取物。 蛋白浓 度可用 Bradford 反应 来确定 。注意 :如果 提取物 并不是 一次即 可用完 ,一定 要将其 分装到 小 管中后 再冻存 ,以 免不必 要的反 复冻融 。提 取物反 复冻融 5 次以 上即会 造成某 些特异 蛋白的 分解。 另外 ,在 解冻冻 存的提 取物时 应置于 冰上。 上 面介绍 的细胞 核提取 法是一 种经典 的方法 ,其 得到的 细胞核 提取物 可用于 所有的 实验 ( 如转录 、拼接 、电 泳迁 移率改 变试验 ), 但 该法比 较繁琐 。在此 ,我 们介 绍另一 种改进 的方法 , 其特点 是快速 、简单 ,但 必须 根据不 同的实 验及不 同的细 胞而选 用其最 佳盐 浓度。 1. 附 加材料 高盐 缓冲液 (20 mmol/L HEPES, 4X: 时 pH7.9, 25% 甘油, 100 mmol/L MgCl2, 一 定浓度 KC1, 0.2 mmol/L EDTA, 临用 前加入 0.2 mmol/L PMSF 和 0.5 mmol/L DTT) 分别含 0.8mol/L、 1.0mol/L、 1.2mol/L、 1.4mol/L 及 1.6mol/LKCl 的 高盐缓 • 661 • 冲液。 2. 操 作步骤 (1) 按基 本方法 (1 ) 〜 (8) 操作。 (2) 在步骤 (8) 中 ,用 1/2 倍 pcv 体积的 低盐溶 液重悬 细胞核 ,将 悬浮 液分成 5 等份后 分装于 5 管中。 悬液 应充分 悬浮。 如有必 要的话 ,可 用匀浆 器使其 均化。 (3) 在不断 揽拌的 情况下 ,分 别滴加 1/3 倍 pcv 体 积的含 0.8 mol/L、 1.0 mol/L、 1.2mol/L、 1.4mol/L 及 1.6mol/LKCl 的 高盐缓 冲液于 5 管中 ,并使 其充分 混匀。 (4) 将管 盖盖上 ,倾 斜摇动 30min 使其 混匀。 (5) 25 000><€离心3〇111丨11去除细胞核。 (6) 移出 提取物 (上清 ) 并用 透析液 透析。 透析 所有的 提取物 直至含 有最高 KC 丨浓 度的一 管的传 导率与 透析液 的传导 率相同 为止; 25 000 x g 离心 20min, 弃去 沉淀。 (7) 检测 所有管 中提取 物的传 导率, 并测定 上清液 中的蛋 白浓度 ,分装 至管中 ,立 即 冻存于 液氮中 ,于 -80t: 保存提 取物。 二 、细胞 质部分 的提取 下面的 方法提 供了从 细胞质 中提取 人们感 兴趣的 蛋白质 (如 RNA 聚合酶 in 转录因 子) 的基 本步骤 。该 方案描 述了从 细胞质 提取物 中获得 S-100 片段 的方法 。它 可同时 得到 并透析 S -100 片 段和细 胞核提 取物。 1. 材料 10X 细胞 质提取 缓冲液 (0.3 mol/L HEPES, 在 4X: 时 pH7.9, 1.4 mol/L KC1, 0.03 mol/L MgCl2) Bechman 离 心转头 2. 操 作步骤 (1) 将从 细胞核 提取法 的步骤 (6) 中 得到的 上清准 确测量 其体积 ,加入 0.11 倍体 积的 l〇x 细胞 质提取 缓冲液 并混匀 ( 所有的 操作步 骤同细 胞核提 取一样 ,需在 4X: 下 进行 )。 (2) 在 100 〇〇〇 Xg 体积 下离心 lh。 (3) 将 含有胞 质片段 (S-i〇0) 的上清 移出并 对其进 行透析 ,直 至提 取物的 传导率 与透析 液的相 同为止 (l〇〇mm〇l/LKCl)。 (4) 将透 析后的 溶液从 透析管 中取出 ,转 至离心 管中在 25 000 Xg 条件 下离心 20min〇 (5) 弃沉淀 ,取 上清 检测其 传导率 ,蛋白 质浓度 ,并 将其 分装至 小管中 ,立 即冻存 于 液氮中 ,于 -80t: 保存提 取物。 • 662 • 三 、方 法评注 1) 背 景资料 在 RNA 多聚 酶的作 用下, 从培养 细胞中 得到的 非细胞 系统作 为系统 可以精 确确定 纯化 基因的 起始位 点与终 止位点 ,因此 ,从培 养的哺 乳动物 细胞中 提取的 提取物 最先用 于证实 转录的 起始位 点与终 止位点 。其系 统包括 1979 年 Weil 等 建立的 补充有 纯化的 RNA 多聚酶 II 的从细 胞低盐 提取物 中的高 速离心 上清液 ,以 及由 1980 年 Manley 等建 立的 包括有 内源性 聚合酶 II 的高盐 细胞提 取物。 为了 确定假 设的转 录复合 物所在 的核酸 位子, Dlgnam 等 (1983a, b) 建立 了一种 从 分离的 哺乳动 物细胞 核中制 备可溶 性细胞 提取物 的方法 。此法 可利用 内源性 RNA 聚 合酶 II 及其辅 助因子 对数个 II 类 基因进 行转录 起始位 点的精 确定位 。虽然 RNA 聚合 酶 III 在转录 5S 基因时 需要辅 助因子 (细胞 质片段 S-100 或基 因特异 性因子 TFIIIA), 但是这 些提取 物对于 RNA 聚合酶 III 参 与的从 tRNA 及 腺病毒 VA 基因的 精确转 录来说 是 足够的 。进 一步研 究表明 ,这 些提取 物同样 是细胞 外前体 mRNA 拼接 时的复 合物。 这里的 步骤实 质上是 Dignam 等 的方法 的改进 。仅 仅是将 KC1 代替了 NaCl, 并且在 细胞 核提取 过程中 使用了 标准的 盐浓度 。这是 通过在 细胞核 提取过 程中根 据细胞 核沉淀 的体 积来调 整溶液 的体积 。当 进行了 这些改 进后, 该法可 适用于 不同细 胞的细 胞核的 提取。 用此 法可从 HeLa 细胞 中得到 细胞核 提取物 ,在 RNA 多聚酶 II 及 RNA 多聚酶 III 的作用 下可从 纯化的 克隆的 启动子 进行精 确的转 录起始 。进一 步来说 ,体 内的调 节启动 子元素 同样在 细胞核 提取物 中起调 节转录 的作用 。在 这些提 取物中 ,同启 动子结 合的蛋 白质 可通过 电泳迁 移率改 变试验 、甲 基化保 护实验 及体外 DNase I 保护 实验来 得到验 证。 这些提 取物同 样可以 精确地 将前体 mRNA 拼接成 成熟的 mRNA 产物 。另外 ,该提 取 物除了 提供启 动子因 子快速 功能性 反应和 RNA 过程中 所需的 序列外 ,它 们还 可提供 纯化的 起始物 及其转 录和拼 接中的 蛋白质 的机械 分析。 2) 重 要参数 在 提取细 胞核提 取物时 ,必 须要避 免蛋白 质的变 性及其 水解, 以防止 其蛋白 质活性 的丢失 。为了 尽量减 少这些 可能性 ,我们 推荐在 0 〜 4*C 时进 行操作 ,当 然最好 在冷库 中进行 操作。 在进行 提取前 ,加入 新鲜的 PMSF (终 浓度为 0.2 mol/L) 可以预 防提取 的蛋白 质潜在 的水解 。虽 然这些 措施对 于大多 数的哺 乳动物 细胞而 言是足 够的, 但是对 于 某些细 胞来说 ,还应 加入一 些蛋白 质酶的 抑制物 。例如 ,从 酵母 细胞中 提取有 转录活 性的细 胞核提 取物时 ,应在 1 mmol/L PMSF, 2 pmol/L 抑肽素 (pepstatin) A, 及 0.6 pmol/L 亮 狀素。 此方 法重复 性较好 ,可用 于不同 的培养 细胞; 然 而对于 不同的 细胞或 者在不 同时间 及条 件下得 到的细 胞核提 取物的 活力仍 有不同 。这种 情况的 产生的 原因是 多种多 样的, 如细胞 的体积 与密度 ,离心 后的细 胞及细 胞核的 体积; 每一 步所需 的时间 和整个 提取过 程所用 的时间 。将 这些因 素准确 的记录 下来, 可以比 较每次 提取时 的情况 ,从而 得到与 其 活力相 关的因 素的改 变情况 。后 面附有 一表格 (表 9.1), 可供记 录提取 操作。 • 663 • 细胞核 提取物 的提取 过程有 两个很 普遍的 缺陷: 从细胞 核中提 取相关 蛋白的 效率较 低, 或者非 特异性 的抑制 蛋白浓 度过量 。这 些问题 的解决 取决于 实验者 所用的 提取方 法 。例如 ,如 果实验 者准备 提取的 特异性 DNA- 结合 蛋白在 高盐浓 度下具 有较高 的提取 效率, 则不需 要的蛋 白可提 供下面 的色谱 法除去 。当然 ,如 果人们 所感兴 趣的蛋 白在低 浓度的 KC1 中可以 有效溶 解的话 ,那么 则可避 免用高 盐溶液 抽提。 如果 提取物 是被直 接用来 作为功 能研究 ( 如转录 或拼接 ), 由 于此过 程有多 种蛋白 质 的参与 ,因此 必须使 用可使 提取物 中的蛋 白活力 到达最 高的最 适条件 。在 提取 HeLa 细胞的 细胞核 时增加 KC1 的浓度 ,会 导致在 进行转 录研究 时细胞 核裂解 ,而细 胞核裂 解后会 释放出 染色体 蛋白, 从而非 特异性 结合于 DNA 上 ,抑 制转录 。这 里给出 的提取 条件 则可避 免细胞 核易脆 及裂解 。这些 条件可 使人们 得到高 活力的 提取物 。值得 注意的 是 ,即使 在这种 条件下 ,得到 的提取 物仍然 含有一 些非特 异性的 DNA 结 合蛋白 ,这些 蛋白可 在模板 浓度较 低时抑 制转录 ,通过 过量的 模板或 者非特 异性的 DNA 滴定 可消除 其 影响。 3) 预测结 果和时 间安排 使用 上述方 法得到 的提取 物的蛋 白浓度 一般是 8~12mg/mL。 此提取 物中包 括转录 因子及 一些非 特异性 DNA 结合 蛋白。 整个 操作过 程应在 Id 之 内完成 。在 透析之 前约需 3~5h, 具 体时间 则由细 胞的体 积及离 心的时 间而定 。透 析约需 4~6h, 要注 意的是 必须在 当天完 成透析 ,而不 能透析 过夜。 可用无 KC1 的 透析液 透析以 减少透 析时间 。当提 取物与 100 mmol/L KC1 的传导 率时 ,应 立即停 止透析 。透析 完成后 ,离心 、冻存 则可在 45min 内 完成。 表 9.1 细胞质 及细胞 核提取 物的实 验记录 核酸 及细胞 质提取 时间: 细胞 种类: 来源: 细咆 计数: 培养液 体积: 细胞 总数: 开始 时间: 收集 并离心 悬浮培 养细胞 185〇xg, 20min。 用 PBS 洗涤单 层细胞 ,并 收集 于圆锥 形离心 管中。 1850 x g 离心 l〇min。 细胞的 总体积 (pcv): 用 5 倍 pcv 体积的 PBS 洗涤 悬浮细 胞并于 1850 x g 离心 l〇min 重悬于 5 倍 pcv 体积的 低渗溶 液中。 1850 X g 离心 5min。 重悬于 3 倍 pcv 体积的 低渗溶 液中。 于冰 上冰浴 10mm 使细胞 膨胀。 将细胞 转入匀 浆器中 匀浆约 10 次。 3300 离心 15mm 收集 细胞核 移去细 胞质提 取物。 细胞 祛提取 细 胞核的 总体积 15〇bp, <600bp。 (8) 用琼 脂糖凝 胶电泳 法纯化 已标记 的结合 DNA, 电洗脱 并离子 交换层 析纯化 探针。 由于 DNA 片段已 被标记 ,因 此在 电泳时 可不用 EB 染色 。仅 需电泳 完后, 放射自 显影约 5 〜 15min, 即可 确定带 的位置 。另外 ,离 子交 换纯化 标记的 DNA 是十分 必要的 ,它 可除去 不纯物 ,从而 可获得 高质童 的实验 效果。 (9) 同步骤 (2) 乙 醇沉淀 并洗涤 DNA。 溶解 沉淀于 lOOpLTE 中 。于 贮存, 注 意不要 冻存。 (10) 取 1/iL 用 液体闪 烁计数 器测量 Cerenkov 值。 用 DNA 平衡蛋 白质: (11) 在一个 10mL 的 塑料管 中加入 (n+2) X180^L 的反应 缓冲液 (n 为 实验中 准备做 的结合 反应数 )。 加入 32P 标记的 DNA 探针 至反应 液中, 混匀。 (12) 将 溶液按 180pL/ 管分成 n + 1 份于 1.5mL 的离 心管中 ,另外 一管用 做不加 DNase I 的 对照。 (13) 将蛋 白质稀 释成一 系列的 稀释度 ,以 覆盖所 要分析 的浓度 范围。 (14) 每种稀 释度的 蛋白质 分别加 2~20ML 至各 个管中 。加 入反应 缓冲液 (不含 32P 标记的 DNA) 至终 体积为 200/xL/ 管。 (15) 混匀 并离心 下来。 在所需 的温度 下水浴 30~45min。 进行 DNase I 足迹法 的滴定 : (16) 准备干 冰冰浴 。将试 管架放 于其上 。准备 DNase I 终止液 (每 管约需 700+) 并放于 其上。 (17) 准 备大于 500/iL/ 管的 DNasel 稀释 缓冲液 (无 BSA 及小 牛胸腺 DNA)。 将其 同样品 一起置 于水浴 中使其 饱和。 (18) 加入 5pL 稀 释后的 DNase I 于第 一管中 ,涡 旋混匀 ,水浴 2miri。 此处的 时间不 宜过长 ,否则 ,会造 成缺口 DNA 量的 增多。 (19) 2min 后 ,立 即加入 700ML 终止 缓冲液 于管中 ,涡旋 混匀。 立即将 其置于 乙醇 / 干冰 浴上。 (20) 每管均 按步骤 (18)、 (19) 进行 操作。 (21) 在 所剩的 对照管 中加入 700fiL 终止缓 冲液。 (22) 在乙醇 / 干冰浴 上冰浴 15minW 上沉淀 DNA。 注意 ,在 最后一 管加入 终止缓 冲液 后进行 计时。 (23) 离心 15min, 弃 去上清 ,用 70% 乙醇洗 涤沉淀 两次。 (24) 在 Speedvac T •燥仪 中干燥 沉淀约 1〇 〜 I5min。 (25) 重悬 DNA 于 甲酰胺 上样缓 冲液中 ,混 匀。 • 678 . (26) 此 时可在 -70X3 过夜 保存此 样品。 分离及 放射自 显影变 性水解 产物: (27) 制备 DNA 序列分 析用聚 丙烯酰 胺凝胶 ,并预 电泳。 聚丙烯 酰胺凝 胶的浓 度一般 由片段 的长度 所决定 。在 一般 情况下 ,聚丙 烯酰胺 凝胶的 浓度用 6%~8%, 厚度用 0.4~1.2mm 即可。 (28) 在预 电泳时 ,将 样品于 90X: 加热 5 〜 lOmin, 并立 即冰浴 。当凝 胶的温 度达到 50~55t: 时 ,断 开电源 。用针 头加入 样品。 (29) 电 泳直至 蛋白质 结合位 点迁移 至凝胶 的中间 ,干燥 凝胶。 (30) 于 -70 〜 -85X: 放射 自显影 24h 以上。 每块 凝胶做 2~3 张 自显影 的胶片 。胶片 应小心 保存以 备定量 分析用 。可将 其夹入 纸中, 注意不 要 有擦痕 、手 指印及 灰尘。 二 、光密 度及数 值分析 法对蛋 白结合 滴定 进行定 量分析 1. 原理 该法从 放射自 显影中 得到滴 定曲线 ,并 通过 数值分 析曲线 获得结 合常数 。该 法包括 以下步 骤:① 使放射 自显影 数据数 字化; ②对应 于结合 位点的 条带的 光密度 积分; ③ 校 正积分 光密度 ,消除 背景的 积分光 密度; ④标定 每个泳 道中校 正后的 积分光 密度及 总量 DNA; ⑤计算 片段保 护位点 ,片 段的饱 和度。 精 确的光 密度分 析对于 获得热 力学方 面有效 的单个 位点结 合曲线 是十分 重要的 。而 普 通的从 放射自 显影中 估计滴 定半点 的方法 是不可 采用的 ,其原 因在于 : 首先, 眼睛反 映的是 光强度 ,而 光密度 —— 即 其量与 标记的 DNA 在每条 带中的 浓度成 正比, 是强度 的 对数值 ,这样 估计的 滴定半 点会存 在系统 错误; 第二 ,放 射自显 影显示 的是饱 和的暗 带 ,因此 ,假如 在线性 光密度 范围内 的胶片 表现出 亮带或 被洗掉 了的话 ,这 将会 对强度 差 异的估 计造成 一定的 困难; 第三 ,实 验中定 量分析 时若采 用估计 的话, 这本身 就违反 定量 分析的 原则; 第四 ,估 计本身 会造成 人为的 差异; 最后 ,根据 Ackers 等人 (1982) 的结果 ,滴 定的 半点同 单一的 平衡结 合常数 无关。 所 需的硬 件包括 一个二 维的光 扫描仪 器及一 个具有 高清晰 度图像 处理的 微电脑 。虽 然, 有些研 究人员 通过不 同胶片 的每一 泳道的 一维类 似物足 迹来获 得相似 的数据 ,我们 仍推 荐用二 维的光 扫描仪 器以获 得精确 的定量 。二 维的光 扫描可 避免一 维中的 系统错 误 ,二 维的光 扫描同 样可减 少电泳 时造成 的影响 ,如电 泳带的 歪斜及 失真。 目前 ,较好 的扫描 系统有 flat bed 扫 描仪、 flying spot 检 测仪、 charge coupled de- vices (CCD) 及 数码相 机等等 。它应 可精确 得到每 一条带 / 其分辨 率应为 250 〜 200;im, 可贮 存至少 256 种 灰度; 对于 flat bed 扫 描仪、 flying spot 检测 仪而言 ,它还 可分辨 〇 〜 1.60D 值 的光强 。而照 相机, 其测量 的是发 射强度 (/), 而不是 光密度 。其 换算是 OD=log(l/JQ), JQ 即入 射光强 ,可 在无任 何胶片 存在时 测得。 在进行 分析时 ,虽 然较 低的分 辨率与 色彩的 图像分 析系统 也可用 ,但 我们推 荐使用 的 图像分 析系统 的分辨 率应在 1024X 1024 以上 ,其 显示色 彩应在 256 色以上 。计 算机 . 679 • 的软件 系统应 包括在 PC/DOS 和 VAX/VMS 计算机 上可用 的扫描 及分析 系统。 2. 操 作步骤 (1) 用胶 片扫描 仪获得 一个有 关胶片 的二维 数字化 信息。 (2) 对每一 个泳道 中每一 个结合 位点的 被保护 DNA 带的光 密度进 行积分 。积 分光 密 度是每 条带的 不同像 素的光 密度的 总和。 最 好是将 连续的 条带作 为单独 的一组 来分析 。可 在所有 的泳道 上密度 最大且 密度相 似的条 带之间 的最 低密度 处画出 边界以 确定各 个方块 的两端 。注意 ,最关 键的是 ,胶片 中的各 个泳道 中各方 块内应 均含 有完全 相同的 条带。 (3) 校正 积分光 密度, 亦即消 除背景 的积分 光密度 ,这 可通过 某些图 像分析 软件进 行 以下的 操作来 完成。 ① 在带间 位置定 义数个 长方形 的空白 区域。 ② 计 算每个 矩形图 位置中 的像素 光密度 ,作 直方图 ,将 概率最 高的像 素光密 度定义 为局部 背景。 ③ 对于每 一区域 及每一 条泳道 ,分 别计算 泳道两 侧的背 景值, 求其平 均值。 ④ 将 该平均 值乘以 区域中 的像素 数目即 为背景 积分光 密度。 ⑤ 在该 区域内 将样品 的积分 光密度 减去背 景积分 光密度 ,即为 该区域 光密度 积分校 正值。 (4) 校正后 ,标 定每个 泳道中 校正后 的积分 光密度 及总量 DNA。 ① 选择一 个或多 个区域 ,除 去滴定 点或非 常高敏 感带, 代表在 一个泳 道中的 DNA 总 浓度。 ② 进 行步骤 (2) 及 (3) 的 操作以 确定这 些标准 区域中 的光密 度积分 (Dstd) 校正 值。 ③ 计算每 个结合 位点区 域的光 密度率 (Dslte/L>std)。 如果 选择了 多个标 准区域 ,那 么则将 其值之 和作为 Dstd。 选择 2 个 较大的 标准区 域即可 ,一 个离电 泳起始 位置比 结合位 点较近 ,另一 个则离 电泳起 始位置 较远 。注 意每一 个标准 的系统 、配体 浓度依 赖性系 统误差 ,这种 误差可 导致结 果无效 。当 结合 位点被 饱 和及保 护后或 者由于 实验技 术较差 ,变异 会表现 出非特 异性的 蛋白质 结合, DNase I 在 DNA 片段上 的重 分布。 (5) 将 OD 率 转成片 段保护 (/)。 r _ 1 _ ( . site/ . std ) (Dr,site/Dr,std) 其中, n 代表 任何泳 道中有 限的蛋 白配体 浓度; r 代表 空白对 照泳道 (无 蛋白配 体加入 到 反应缓 冲液中 );/ 对 蛋白质 浓度的 对数值 即可得 到结合 曲线。 假如按 以上操 作进行 并且由 对照实 验证实 DNase I 对 DNA- 蛋 白质复 合物平 衡无任 何作用 ,那 么由 / 可 推出片 段饱和 分数值 (y)。 观察 / 的值 ,我 们可以 看到其 值往往 会偏出 〇~1 范 围之外 。其原 因在于 : 在加入 DNasel 之 前无法 计算出 DNA 的切口 (亦 即即使 在饱和 配体浓 度下, D„,site>0)。 因此, 在分析 数据时 ,我们 建议将 / 值定义 为与结 合曲线 成正比 的转换 曲线, 将此两 条曲线 的 极限值 (《 和 I •分别 为上限 值和下 限值) 作 为可调 参数。 • 680 • 三 、粗 制品的 DNase I 足迹法 1. 原理 该 法常被 用来检 测粗制 品中的 蛋白质 ,因而 ,其 也可 用于纯 化过程 。通过 改变条 件, 如在反 应体系 中加入 大量的 竞争性 DNA, 或增 加反应 中的盐 浓度, 即可抑 制非特 异性 DNA 结 合蛋白 结合于 标记的 DNA 上。 2. 操 作步骤 (1) 按前面 DNase I 足迹法 制备单 一末端 32P 标记的 DNA 探针操 作步骤 (1)~(9) 制 备 标记的 探针。 (2) 找出 可产生 50% 无切口 DNA 的 DNasel 的浓度 。如 上建 立一个 200/iL 的反应 体系 (不含 蛋白质 )。 加入 5/iL 稀释的 DNase I, 混匀。 (3) 温浴 2min, 按上 法中分 离及放 射自显 影变性 水解产 物步骤 (28) 终止 反应。 乙 醇沉淀 ,测 序胶上 电泳分 析反应 产物。 (4) 按表 9.2 所示, 用一定 体积含 有活性 蛋白的 粗组分 代替不 同量的 蛋白质 进行足 迹反应 ,以寻 找合适 的反应 条件。 表 9.2 足 迹法分 析粗组 分的分 析条件 ** 反 应序号 l〇x 分析 缓冲液 //xL 探针 /cpm 粗组分 / fjiL Poly (dl-dC) /^g DNA 酶 I /ftLb 1 20 10 〜 20k 0 0.4 5 (lx) 2 20 10 〜 20k 12 0.1 5 (lx) 3 20 10 〜 20k 12 0.4 5 (lx) 4 20 10 〜 20k 12 2.0 5 (lx) 5 20 10 〜 20k 12 10.0 5 (lx) 6 20 10 〜 20k 0 0.4 5 (4x) 7 20 10 〜 20k 12 0.1 5 (4x) 8 20 10 〜 20k 12 0.4 5 (4x) 9 20 10 〜 20k 12 2.0 5 (4X) 10 20 10 〜 20k 12 10.0 5 (4X) 11 20 10 〜 20k 0 0.4 5 (16X) 12 20 10 〜 20k 12 0.1 5 (16X) 13 20 10 〜 20k 12 0.4 5 (16X) 14 20 10 〜 20k 12 2.0 5 (16x) 15 20 10 〜 20k 12 10.0 5 (16x) a •反应 体积为 200;iL。 b •括号 内为稀 释度。 lx 指的 是保留 50% 无切口 DNA 时的稀 释度, 4X 及 16X 表 示更高 浓度的 DNA 酶 I。 cpm: 每分钟 计数。 • 681 • 四 、方 法评注 1) 背 景材料 在真 核细胞 及原核 细胞中 ,均 存在特 异性的 DNA 序列结 合蛋白 ,它 们在许 多细胞 的 调控中 ( 如转录 、复制 ,以及 重组等 ) 起着 重要的 作用。 而弄清 楚这些 调控机 制的关 键在 于准确 测量蛋 白质同 DNA 结合 能以及 多种蛋 白质同 DNA 相互作 用的自 由能。 用 DNase I 足 迹法以 及定量 分析可 以获得 DNA 特异性 结合位 点的结 合曲线 ,甚至 可以得 到多个 结合位 点的结 合曲线 ,并不 受结合 位点数 目以及 蛋白质 数量的 限制。 DNase I 保 护实验 ,又称 足迹法 ,最 先是由 Galas 和 Schmitz 于 1978 年作为 定性检 测 DNA 上特 异性蛋 白质结 合位点 而建立 起来的 方法。 Johnson 等 (1979) 将其 改进后 可检测 多重结 合位点 。自从 Ackers 等人 (1983) 建立 了单一 结合位 点曲线 理论后 ,该 理论 即用于 DNase I 足 迹法中 用于定 量测定 DNA 结 合位点 同蛋白 质的结 合曲线 ,从而 形成 现今的 DNase I 足 迹法的 雏形。 2) 实验参 数及注 意事项 (1) 蛋白 质纯度 :蛋白 质必须 纯化, 并且其 结合位 点必须 已知。 (2) DNA 结 合位点 的浓度 :在该 实验中 ,一 般说来 ,反 应中的 DNA 结合位 点的浓 度是十 分低的 ,这样 我们就 可认为 游离的 蛋白质 浓度即 为蛋白 总浓度 。当然 ,如 果在反 应中 DNA 结合位 点的总 浓度已 知或可 以被精 确测定 ,那么 按以下 公式即 可得到 结合有 DNA 的蛋 白质的 浓度: [P-DNA] = Yx [DNA]t 其中, 〔P-DiVA〕 为结合 DNA 的蛋白 浓度; 〔DNA〕t 为含有 DNA 结合 位点的 DNA 浓 度; y 为结 合位点 饱和度 ,随 着实验 条件的 不同而 不同。 (3) 非特异 性载体 DNA: — 般说来 ,非 特异 性载体 DNA (如小 牛胸腺 DNA) 是十 分必 要的, 但要注 意的是 ,非 特异性 的载体 DNA 的 量不能 使反应 中产生 非特异 性的结 合 。另外 ,合 成的 多聚核 苷酸如 poly (dl-dC) 也 可用做 非特异 性载体 DNA。 (4) 反应缓 冲液的 条件: DNase I 足 迹法的 反应条 件很广 ,其限 制主要 在以下 2 点:蛋 白位点 的亲和 力以及 DNase I 的活力 。在 毫克分 子量的 Ca2+ 和 Mg2+ 存在 的条件 下, DNasel 在 pH5~9、 温度 4~37t: 以及 50~200 mmol/LKCl 下均表 现出较 高的酶 活力。 3) 实 验时间 除了末 端标记 DNA 外 ,足 迹法滴 定一般 需要约 6 〜 8h, 制备样 品约需 3 〜 4h, 电 泳则需 2~3h。 第 五节蛋 白质与 核酸的 紫外交 联反应 蛋白质 与核酸 的复合 物在紫 外线的 照射下 ,会形 成共价 的结合 ,从而 使核酸 与蛋白 质结 合的更 为紧密 。因此 ,可 用紫外 线照射 来特异 性标记 DNA 结合 蛋白质 。如此 ,可 很快提 取混合 物中的 DNA 结 合蛋白 ,并 且其相 对分子 质量可 被精确 测定。 • 682 • 其基本 原理是 DNA 与 蛋白质 之间的 结合一 般是非 共价键 的结合 ,如 果用紫 外线照 射其复 合物, DNA 中 的嘧啶 碱基会 与蛋白 质分子 中的许 多氨基 酸残基 ( 如苯丙 氨酸、 甲 硫氨酸 、半 胱氨酸 、丝 氨酸、 赖氨酸 、精 氨酸、 组氨酸 、色氨 酸及酪 氨酸) 之 间形成 共 价交联 。而当 用溴脱 氧尿嘧 啶替代 DNA 链中 的胸腺 嘧啶时 ,可 使交联 反应对 紫外线 的敏感 程度提 高几倍 甚至几 十倍。 本方法 可分为 3 步:① 提取人 们所感 兴趣的 DNA 结合 蛋白, 这可通 过同已 标记的 与该蛋 白高亲 和力的 DNA 片 段共同 孵育来 得到; ②用 紫外 线照射 DNA- 蛋白质 的复合 物使 其交联 ,并且 用核酸 酶消化 ,仅 留下 那些同 DNA 结合 蛋白结 合十分 紧密的 已标记 DNA 片段; ③用 SDS- 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 并放射 自显影 。该法 最大的 优点即 是可以 将同 DNA 特 异性结 合的蛋 白质与 那些非 特异性 结合的 蛋白质 分开。 一 、用溴 脱氧尿 嘧啶核 苷替代 的探针 进行 紫外交 联反应 1. 原理 如 DNA 分子 中包含 有胸腺 嘧啶的 卤化物 ,则其 对紫外 线的敏 感度大 大增加 ,溴脱 氧尿嘧 啶的掺 入还允 许使用 长波的 紫外线 ,从 而对 蛋白质 的伤害 减少; 并且 由于 DNA .结合 蛋白同 溴脱氧 尿嘧啶 替代后 的核酸 的结合 能力远 远大于 未修饰 的核酸 ,因此 可用溴 脱氧 尿嘧啶 核苷替 代的探 针进行 紫外交 联反应 。但是 要注意 的是, 由于溴 脱氧尿 嘧啶核 苷不能 掺入到 RNA 中去 ,因此 RNA 的交联 方法通 常是采 用标记 SP6 转录 并进行 交联。 2. 材料 含有结 合位点 的单链 M13 载体 17bp 的 M13 通 用引物 IX 及 l〇X 限制 性内切 核酸酶 缓冲液 (分 别具有 50 mmol/L NaCl 及 500 mmol/L NaCl) 3000Ci/mmol a-32P dCTP 50 x dNTP/BrdU 溶液 (2.5 mmol/L dATP, 2.5 mmol/L dGTP, 250/m mol/L dCTP, 2.5 mmol/L BrdU) 0.1 mol/L 二硫 苏糖醇 (DTT) 25U £. DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段 乙酸铵 100% 乙醇 TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L EDTA) 含有 DNA 结 合蛋白 的提取 缓冲液 大量 的载体 DNA, 如 poly (dl-dC) .poly (dl-dC) 0.5 mol/L CaCl2 DNase I 1U 微球菌 核酸酶 14c 标记 的蛋白 质相对 分子质 量标准 . 683 • DEAE 膜 1.5mL 圆底螺 旋帽管 16X:、 37X:、 68X:、 90C 及 lOOt: 水浴 紫外线 透射仪 (305mn, 7000pW/Cm2); 限制 性内切 核酸酶 消化、 Klenow 片 段标记 、琼 脂糖凝 胶电泳 、电泳 迁移率 改变试 验 检测法 、溴化 乙锭点 定量、 SDS 聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳以及 放射自 显影所 需的试 剂及设 备 3. 操 作步骤 制备溴 脱氧尿 嘧啶核 苷替代 的探针 : (1) 加入 10Mg 含有与 所需蛋 白质具 有高亲 和性结 合位点 的单链 M13 载体, 以及相 同量的 17bpM13 通 用引物 。用 IX 限制 性内切 核酸酶 缓冲液 (50mmol/LNaCl) 调节 体积至 100/iL。 在 90X: 孵育 5min, 然后 室温下 过夜。 (2) 加入下 列杂交 混合缓 冲液: 在 16X: 孵育 90min。 在交 联并且 DNaser 消化后 ,结 合位 点附近 会留下 10~20bp 的片段 ,因此 放射性 标记的 dNTP 应 在蛋白 质结合 位点的 DNA 序 列附近 。一 般来说 ,在 结合位 点经常 出现的 核苷应 作为首 选的放 射性核 苷 (除了 胸腺嘧 啶以外 ), 所选 择的链 则应该 是结合 位点序 列所在 的那条 序列, 假如结 合位点 所在的 那条 链富含 胸腺嘧 啶和胞 嘧啶残 基的话 ,那 么该链 应用溴 脱氧尿 嘧啶及 a-32PdCTP 标记 ,当然 ,非标 记的 dNTP 溶液也 应进行 适当的 修饰。 (3) 在 68*C lOmin 灭活 Klenow 片段。 (4) 加入 40U 限 制性内 切核酸 酶消化 DNA 片段 ,使其 产生的 DNA 片段在 20 〜 60bp 之间。 (5) 加入乙 酸铵至 0.3 mol/L, 用 2 倍体积 100% 的无 水乙醇 沉淀, 重悬于 TE 缓冲 液中。 (6) 在含有 0.5 pg/mL 溴 化乙锭 的琼脂 糖凝胶 上电泳 以分离 所需的 DNA 片段 ,用 DEAE 膜 纯化。 (7) 液体闪 烁计数 器测量 Cerenkov 值 并用溴 化乙锭 点定量 法测定 DNA 的 浓度。 其比 活应在 108cpm/Hg 以上 ,该探 针应在 3~6d 内 使用。 DNA 与蛋白 质结合 反应: (8) 在 l_5mL 管中 进行结 合反应 ,总 体积为 SOpL: 1〇5 每 分钟计 数标记 的探针 含 有结合 蛋白的 提取物 10~20pg 载体 DNA, 如 poly (dl-dC) .poly (dl-dC) 用 Parafilm 膜封闭 管口。 a-32P dCTP (3000Ci/mmol) 50 x dNTP/BrdU 溶液 0.1 mol/L DTT 50/iL 3 . 5^tL • 75fiL l〇x 限制 性内切 核酸酶 缓冲液 (NaCl 终 浓度为 50mmol/I^).5pL h2o (25U) Klenow 片段 7fiL 5 卩 L . 684 . 紫外线 交联结 合反应 并消化 非保护 DNA (9) 在透 射紫外 仪上用 305nm 的紫外 线照射 5 〜 60min 进行交 联反应 。注意 反应物 应在离 照射约 5cm 处, 紫外光 强应为 7000/uW/cm2。 假如 用较低 能量的 紫外线 或其照 射距离 >5cm, 则照射 时间应 增加。 (10) 在每个 结合反 应中加 入以下 试剂: 0 • 5 mol/ L CaCl〗 1/iL DNase I Vg 微球菌 核酸酶 1U 在 37t: 消化约 30min。 电泳及 放射自 显影: (11) 加入等 体积的 2 XSDS 上样缓 冲液至 结合反 应物中 ,在 100X: 沸水浴 5min。 (12) 在 SDS 不连 续的聚 丙烯酰 胺凝胶 上电泳 ,注意 其中一 个泳道 应加入 14C 标记 的 相对分 子质量 标准。 (13) 电 泳完后 ,切除 同染料 部分的 凝胶。 (14) 干燥 凝胶, 用增感 屏放射 自显影 l~3d。 二、 用非溴 脱氧尿 嘧啶核 苷替代 的探针 进行 紫外交 联反应 1. 原理 如 DNA 结合 位点中 不含胸 腺嘧啶 ,则溴 脱氧尿 嘧啶无 法掺入 到序列 中去, 并且溴 脱氧尿 嘧啶无 法用于 RNA 同蛋 白质的 交联反 应中。 因此可 采用非 溴脱氧 尿嘧啶 核苷替 代的探 针进行 紫外交 联反应 来弥补 此不足 。该 方法 仅几个 步骤与 方案一 ( 溴脱氧 尿嘧啶 核苷法 ) 不同。 2. 附 加材料 50 x dNTP/TTP 溶液 (2.5 mmol/L dATP, 2.5 mmol/L dGTP, 250 卩 mol/L dCTP, 2.5 mmol/L TTP) 紫外线 透射仪 (254nm) 3. 操 作步骤 (1) 按 上法的 制备标 记探针 ,将 50 x dNTP/BrdU 溶液用 50 x dNTP/TTP 溶液 代替。 (2) 在紫 外交联 步骤用 254nm 波长 的紫外 光代替 305mn 波长的 紫外光 ,并 且照射 时 间应为 0.5~3h。 三、 原位紫 外线交 联反应 1. 原理 Wu 等于 1987 年建 立了一 种方法 ,可在 电泳迁 移率改 变试验 后直接 进行紫 外线的 • 685 . 交 联反应 。该 法的优 点是当 探针上 结合有 多种蛋 白质时 ,其 不同的 结合物 可以明 显被区 分 。该法 与溴脱 氧尿嘧 啶核苷 法不同 之处在 于结合 反应后 ,混 合物 是被加 入低熔 点的琼 脂 糖凝胶 中电泳 、照射 。复合 物通过 放射自 显影显 示出来 ,溶于 SDS 凝胶 溶液中 ,样 品 按溴脱 氧尿嘧 啶核苷 法进行 SDS 聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳。 2. 附 加材料 低熔点 琼脂糖 1XTBE 缓冲液 SDS 凝 胶溶液 (0.3 mol/L Tris-HCl pH6.8, 6% SDS, 15% 甘油, 70 mmol/L DTT, 在 -20X: 贮存) 3. 操 作步骤 (1) 注 意由于 DNA 在 交联后 不再进 行消化 ,因此 DNA 探针 的长度 应减小 ,应在 50bp 左右 。按 溴脱氧 尿嘧啶 核苷法 步骤制 备溴脱 氧尿嘧 啶核苷 替代的 探针。 (2) 进行标 准的结 合反应 ( 体积为 50pL, 按溴 脱氧尿 嘧啶核 苷法进 行操作 ,或按 电 泳迁移 率改变 试验中 的操作 步骤进 行也可 )。 (3) 将 结合反 应物在 1% 的低 熔点琼 脂糖凝 胶上以 4V/cm 电泳 2 〜 3h, 电泳 缓冲液 用 1XTBE 缓冲液 ,注意 温度不 能过高 ,最 好在 冷库中 进行。 (4) 将 凝胶在 305mn 的 紫外线 下照射 5 〜 30min。 (冷库 中进行 ) (5) 在冰箱 内放射 自显影 1 〜 3h。 切下特 异性的 蛋白质 DNA 复合 物带。 (6) 每 50/xL 的凝胶 中加入 1(VL 的 SDS 凝胶 溶液。 沸水浴 2min。 (7) 将 热的样 品加入 到非连 续性的 SDS 聚 丙烯酰 胺凝胶 上电泳 ,按 溴脱氧 尿嘧啶 核苷 法进行 电泳与 放射自 显影。 四 、方 法评注 1) 背 景材料 蛋白 质与核 酸的紫 外交联 反应是 一种十 分有效 、迅速 的从蛋 白质原 始提取 物检测 DNA 结合蛋 白分子 的方法 。光复 合物的 特异性 可通过 检测非 标记的 竞争性 DNA 同特异 性 DNA 竞争 结合的 能力来 确定。 蛋白质 与核酸 的紫外 交联反 应的目 的是将 DNA 放射性 标记转 至蛋白 质上, 因此需 要蛋 白质中 含有可 同嘧啶 交联的 氨基酸 (如苯 丙氨酸 、甲 硫氨酸 、半 胱氨酸 、丝 氨酸、 赖氨酸 、精 氨酸 、组 氨酸、 色氨酸 及酪氨 酸等等 )。 另外, 人们还 发现, DNA 分 子中如 包含 有胸腺 嘧啶的 卤化物 (如 溴脱氧 尿嘧啶 ), 则其 对紫外 线的敏 感度大 大增加 ,这是 由于 胸腺嘧 啶中的 甲基基 团被溴 原子替 代后产 生的分 子在紫 外线的 作用下 很易使 其他基 团 掺入; 溴脱 氧尿 嘧啶的 掺入还 允许人 们使用 长波的 紫外线 ,从 而对蛋 白质的 伤害减 少; 并且 由于 DNA 结合 蛋白同 溴脱氧 尿嘧啶 替代后 的核酸 的结合 能力远 远大于 未修饰 的核酸 ,因此 人们往 往用溴 脱氧尿 嘧啶核 苷替代 的探针 进行紫 外交联 反应。 蛋 白质与 核酸的 紫外交 联反应 早就被 用来研 究数种 DNA 结合 蛋白同 识别位 点间的 • 686 • 反应 。在 1972 年, Markowitz 发现, 紫外线 增加了 DNA 聚合酶 -DNA 复 合物在 高浓度 的 盐溶液 、酚 、热及 0;lmol/LNaOH 溶 液中的 稳定性 。他 认为, 可能在 DNA 与蛋白 质之中 有一种 稳定的 共价键 形成; Lin 与 Riggs 等于 1974 年也 发现, lac 调控子 在紫外 线的 作用下 ,可与 溴脱氧 尿嘧啶 替代的 lac 操纵子 DNA 交联; Hillel 与 Wu 等在 1978 年, 用光化 学交联 法证实 ,非特 异性的 T7DNA-£. co^RNA 聚 合酶复 合物, a、 及 矿 亚单 位可同 DNA 交联; 然而 ,特 异性的 T7DNA-£.c〇h_RNA 聚合酶 复合物 ,仅有 a 和 (3 亚单 位可同 DNA 交联; 最近 ,蛋 白质与 核酸的 紫外交 联反应 被用来 分离真 核细胞 原始 提取物 中序列 特异性 DNA 结合 蛋白。 2) 实验重 要参数 用电泳 迁移率 改变实 验可很 容易将 本实验 中的参 数调整 到最佳 。假如 探针可 在电泳 迁 移率改 变实验 中被检 测出来 ,那么 ,同样 可用于 本实验 。当 然照 射时间 、溴脱 氧尿嘧 啶浓度 、结合 反应条 件以及 放射性 探针的 强度等 均需另 外确定 。另 外要注 意的是 ,某些 DNA- 蛋 白质复 合物对 DNase 很敏感 ,因 此应 尽量避 免使用 DNase 消化。 3) 实 验的关 键条件 (1) 蛋白质 - 核酸紫 外交联 实验中 DNA 探 针的质 量是该 实验成 败的重 要因素 ,因此 在进行 DNA 探针标 记时应 注意: 应使放 射性同 位素均 匀地掺 入到探 针的不 同位置 ,切 忌仅在 探针末 端标记 (因为 在进行 DNase I 消化 时易将 末端标 记核苷 酸删除 )。 最好首 先 将双链 DNA 从 两侧的 3' 端 向内删 除一定 距离后 ,再用 Klenow 酶补齐 ,同时 将放射 性同位 素掺入 到链内 。如此 ,可 保证 探针经 DNase I 消化后 仍有足 够的放 射性进 行自显 影分析 。另外 ,标 记的 DNA 探针放 射性比 活性至 少应在 1X108 每分 钟计数 〜gDNA 以上。 (2) 应根据 不同的 DNA 探针和 蛋白质 所形成 的复合 物的特 点选择 DNase I 的用量 与作 用时间 ,否则 ,水 解过 度会导 致应有 条带模 糊不清 ,水 解不足 则会导 致背景 纷杂。 (3) 应设计 特异性 实验, 即在反 应体系 中既含 有放射 性标记 DNA, 又含有 500 〜 1000 倍过量 的同一 种未经 放射性 同位素 标记的 DNA 片段 ( 俗称“ 冷探针 ”)。 通 过放射 自显 影分析 ,如果 加入冷 探针后 , 某一条 带消失 ,说 明该条 带为目 的探针 及其特 异性结 合 蛋白质 所共同 形成的 ,否则 即为无 意义的 非特异 性条带 ,还 需进 一步加 大非特 异性竞 争物的 比例。 4) 时 间安排 基本操 作步骤 需要约 7 〜 10h。 放 射自显 影需要 12h 乃至 3d, 这要看 探针的 强度。 第 六节用 生物素 / 链亲 和素亲 和系统 纯化 DNA 结合蛋 & 一 、基 本方案 1. 原理 许多 较短的 DNA 片段 (包 括天然 的或合 成的寡 聚多核 苷酸) 包 含有对 DNA 结合 蛋 白有高 亲和性 的位点 ,可提 供纯化 DNA 结合 蛋白的 强有力 的工具 。用 生物素 / 链亲 . 687 . 蛋白质 X 结 合位点 生物索 -1 丨-dUTP 末端 标记的 DNA 蛋白质 X §§链 亲和素 四聚体 —A-M ♦ 和素 亲和系 统纯化 DNA 结 合蛋白 依据的 原理是 生物素 同链亲 和素可 形 成小的 、不 可逆的 复合物 。具体 实 验基本 操作步 骤如图 9.3 所示。 首先, 选择并 制备对 DNA 结合蛋 白具 有高亲 和性的 DNA 片段 。同 时 ,生 物素标 记的核 苷酸被 掺入至 该 DNA 片段 的末端 。将蛋 白同该 片 段结合 ,四 聚体的 链亲和 素同生 物素 标记的 DNA 片 段同时 结合; 然后 蛋白质 / 生 物素标 记片段 / 链亲 和素四 聚体复 合物可 用生物 素树脂 分 离出来 。在 这中间 ,链亲 和素四 聚 体起着 一个桥 梁作用 ,它 连接生 物素 标记的 DNA 片 段与生 物素树 脂。 在上清 中的蛋 白质被 洗脱除 去 ,最后 ,相 关的蛋 白质被 从树脂 中用高 盐洗脱 下来。 图 9.3 用 生物素 / 链 亲和素 亲和系 统纯化 DNA 结 合蛋白 2. 材料 含有所 研究结 合位点 的质粒 DNA 合适 的限制 性内切 核酸酶 0.5 mmoI/L 生物素 -lldUTP 标记的 (3000 — 6000Ci/mmol) 及非 标记的 2 mmol/L dNTP 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L EDTA) 生物素 - 纤维素 生物素 -纤维 素结合 缓冲液 (12% 甘油, 12 mmol/L HEPES~NaOH pH7.9, 4 mmol/L Tris-HCl pH7.9, 60 mmol/L KC1, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, - 201 保存) 生物素 -纤维 素洗脱 缓冲液 (12 % 甘油, 20 mmol/L Tris-HCl pH6. 8, 1 mol/L KC1, 5mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 200 fig/mL BSA, _20t: 保存) 20mg/mL 牛血清 白蛋白 (BSA) 2mg/mL 大分 子载体 DNA 〔如 poly (dl-dC)、 鲑精 DNA 或大 肠杆菌 DNA〕 蛋白 质溶液 链 亲和素 (5mg/mL 贮液可 保存约 2 个月) DEAE 膜 (Scheleicher&SchuellNA45) 0.025/zm 滤膜 (Millipore VS) 琼 脂糖凝 胶电泳 、电泳 迁移率 改变实 验以及 溴化乙 锭点定 量所需 的试剂 及设备 • 688 • 3. 操 作步骤 制备 生物素 标记的 DNA 片段: (1) 用一个 或多个 限制性 内切核 酸酶在 lOOpL 体积 内消化 50ng 具有 蛋白结 合位点 的质粒 DNA。 (2) 在探针 混合液 中加入 下列反 应物: 0.5 mmol/L 生物素 -11-dUTP 至 终浓度 20fi mol/L 0 . 5/^ mol/L 的 3000 ~ 6000Ci/mmol 放射性 dNTP (用 以掺入 5 ' 突出 末端) 摩 尔数为 标记的 dNTP 的 摩尔数 100 倍的 相应的 2 mmol/L 非 标记的 dNTP (终 浓度 50 卩 mol/L) 其余 两种非 标记的 dNTP 至 终浓度 200卩 mmol/L 5U Klenow 酶 37"C 温育 30 〜 60min。 (3) 用乙 醇沉淀 DNA, 经琼 脂糖凝 胶电泳 ,用 DEAE 膜分 离探针 。’ (4) 探针 重悬于 TE 缓 冲液中 ,取 1 小份进 行计数 ,用 溴化乙 锭点定 量确定 DNA 浓度。 检测生 物素酰 化的探 针结合 蛋白的 能力。 (5) 将 200/iL 生物 素-纤 维素介 质离心 30s。 在沉淀 中加下 列物质 : l.OmL 生物素 -纤维 素结合 缓冲液 20mg/mL BSA 至 终浓度 500 pg/mL 2mg/mL 载体 DNA 至 终含量 200 jug/mL 在转 轮上轻 轻混合 5min。 制备生 物素化 的纤维 素树脂 (生 物素- 纤维素 ): (6) 在 1.5mL 的管 中加入 200pL 生物素 化的纤 维素。 离心除 去上清 。在沉 淀中加 入以下 试剂: l.OmL 生物素 化纤维 素结合 缓冲液 500 pg/mL BSA 200pg 的载体 DNA 祸 I 旋 混勻约 5min。 (7) 离心 ,沉淀 重悬于 l.OmL 生物素 - 纤维素 洗脱缓 冲液中 。在转 轮上轻 轻混合 5min。 重复 洗涤, 用生物 素-纤 维素洗 脱缓冲 液淋洗 (不 加悬振 ) 2 次。 这种 1:6 稀释 液可预 先配好 备用, 可保存 数月。 结合 反应: (8) 用迁移 率变动 分析法 测定将 所要纯 化的蛋 白质的 浓度。 (9) 建 立如下 标准结 合反应 (用蛋 白质与 其识别 位点结 合的最 适条件 ) 待纯化 的蛋白 载体 DNA 摩尔数 相对于 蛋白质 10 倍过量 的生物 素酰化 DNA 片段 温育 15min。 再加摩 尔数相 对于生 物素酰 化片段 5 倍过量 的链亲 和素。 30C 温育 5min〇 • 689 • (10) 将 蛋白质 / 生 物素标 记片段 / 链亲 和素四 聚体复 合物结 合至生 物素化 纤维素 树脂。 (11) 在 另外的 管中加 生物素 -纤维 素介质 ,结 合反应 中的每 pmol 生物 素酰化 DNA 片段加 hL 预处理 了的生 物素- 纤维素 (12^L 1:6 稀释液 )。 离心 ,弃去 上清。 (12) 将结 合反应 混合液 加入生 物素- 纤维素 介质中 。将介 质重悬 起来, 4X: 或室温 下涡 旋温育 30min 。 洗涤 树脂: 离心 并保留 上清液 。将沉 淀重悬 500pL 生物素 -纤维 素结合 液中。 来回颠 倒晃动 l~2min, 离心 ,洗 涤介质 2 次 。最 后一次 洗涤时 转移至 1 个 干净的 小管中 。用迁 移率变 动 分析法 测定从 上清液 中移去 的生物 素酰化 DNA 片段 和蛋白 质的百 分数。 洗 脱相关 蛋白质 将沉淀 重悬于 等体积 的生物 素-纤 维素洗 脱液中 。在 转轮 上混合 20min。 离 心并分 析上 清的结 合能力 (可在 0.02pm 滤 膜上进 行透析 )。 二 、用微 型柱进 行纯化 1. 原理 虽然 基本方 法可迅 速并有 效纯化 相关的 DNA 结合 蛋白质 ,但 本法有 利于应 用大体 积的生 物素- 纤维素 介质。 蛋白质 也能够 以尽可 能小的 体积和 尽可能 高的浓 度洗脱 下来。 2. 附 加材料 硅 化过的 玻璃棉 l.OmL 尖 头移液 器吸头 3. 操 作步骤 (1) 制 备生物 素酰化 DNA 片段及 生物素 - 纤维素 介质, 建立结 合反应 (见基 本方案 标记 DNA 片段 和生物 素化树 脂步骤 )。 (2) 将一个 lmL 移液 器吸头 的顶部 (即 尖部) 用硅 化过的 玻璃棉 (预 先在生 物素- 纤维素 结合液 中浸湿 ) 塞住 ,固 定于一 环形支 架上。 在微型 柱上加 50(VL 结合液 ,并 保 持流量 恒定。 (3) 加 >40pL 的 1:1 生物 素-纤 维素悬 液至微 型柱中 ,用 3 倍柱 体积的 生物素 -纤维 素结 合液平 衡已预 处理过 的介质 [基 本方案 ,标记 DNA 片 段步骤 (5), 生物素 化树脂 步骤 (6)]。 对于未 经处理 的介质 ,依次 用下列 溶液各 3 倍柱体 积清洗 和平衡 柱子: 生物 素-纤 维素结 合液; 含有 500 pg/mLBSA 及 200pg/mLpoly (dl-dC) .poly (dl-dC) 的生物 素-纤 维素结 合液。 (4) 在微 型柱上 加上结 合反应 混合液 (见基 本方案 结合反 应步骤 ), 收集流 出液。 (5) 用 4 倍柱体 积的生 物素- 纤维素 结合液 洗柱, 弃去流 出液。 (6) 用 3 倍柱体 积的生 物素- 纤维素 洗脱液 洗柱子 。收集 2 滴 / 组用于 分析。 • 690 • 三 、用 链亲和 素-琼 脂糖进 行纯化 1. 原理 在没 有高质 量的链 亲和素 情况下 或者纤 维素不 适用时 ,采用 此方案 。生物 素酰化 DNA 片段 直接用 亲和素 -琼脂 糖从溶 液中移 去 (图 9.4)。 蛋白质 x 结 合位点 2. 附 加材料 链 亲和素 琼脂糖 3. 操 作步骤 生物素 -11-dUTP 末端 标记的 DNA 丨 蛋白质 X —— 链亲 和素琼 脂糖珠 (1) 制 备生物 素酰化 DNA 片段及 链亲和 素- 琼脂糖 介质, 建立结 合反应 (见基 本方案 标记 DNA 片段和 结合反 应步骤 )。 (2) 在另一 试管中 加预处 理好的 链亲和 素-琼 脂糖, 结合反 应中每 pmol 生物 素酰化 DNA 片段 加链亲 和素- 琼脂糖 50^L (300pL 1:6 稀释液 )。 (3) 将结合 混合液 加到链 亲和素 - 琼脂糖 中 。重悬 介质, 在转轮 上温育 0.5~2h (链亲 和素- 琼脂糖 也能在 微型柱 中应用 )。 (4) 洗柱子 ,洗 脱蛋白 (见基 本方案 洗柱和 洗脱蛋 白步骤 )。 蛋白质 XI 图 9.4 用链 亲和素 -琼脂 糖纯化 DNA 结 合蛋白 四 、方 法评注 1) 背 景资料 生物素 / 链亲 和素亲 和系统 在纯化 DNA 结合蛋 白以及 其他蛋 白时相 对于其 他方法 而言 是一种 十分有 效的纯 化方法 ,其优 点如下 :①生 物素- 抗生物 素蛋白 系统是 一种十 分有 效的非 共价结 合反应 ,生物 素-链 亲和素 复合物 中仅有 l(T15mol/L 为游离 状态; ② 抗生物 素蛋白 (从 鸡蛋清 中提取 )、 或链 亲和素 (从 Streptomycesavidinii 获得 ), 均 是四聚 体蛋白 ,有 结合生 物素的 4 个 高亲和 性位点 。由 于链亲 和素是 多价的 ,因 此它可 作为 生物素 标记的 DNA 片段 与生物 素化的 树脂间 的桥梁 。由于 带有链 亲和素 / 生物素 的 DNA 亲 和柱在 较广的 范围内 (2mol/LKCl 和 1%SDS) 均 很稳定 ,因 此它被 广泛用 来纯化 DNA 结合 蛋白。 相对 于抗生 物素蛋 白来说 ,链亲 和素更 加适合 DNA 结 合蛋白 的纯化 ,其 原因在 于: 第一, 链亲和 素不是 一个糖 蛋白; 第二 ,链亲 和素为 微酸性 ,而 抗生 物素蛋 白为中 性 。由于 以上两 种原因 ,链亲 和素同 纤维素 的非特 异性反 应很弱 ,远 远低 于抗生 物素蛋 白 同纤维 素的非 特异性 反应。 Haeuptle 等人 (1983) 已 相继用 生物素 / 链 亲和素 亲和系 统纯化 了多种 DNA 结合蛋 • 691 • 白, 如激素 受体、 mRNA 拼接复 合物的 组成、 RNA 多聚酶 II 及 RNA 多聚酶 III 转录因 子 等等。 2) 实验参 数及注 意事项 在本 实验中 ,我 们要注 意的是 仅应有 DNA 片段一 个末端 用生物 素标记 ,如 果两个 末 端同时 被标记 的话, DNA 片段 会结合 于树脂 ,从而 造成蛋 白质无 法结合 。在 实际应 用中 ,我们 一般用 Ec〇R I 与所 nc II 酶 切获得 DNA 片段 ,这样 得到的 DNA 片段, £coR I 酶切 端可进 行标记 ,而 Hfnc II 酶切后 ,产 生的 是平端 ,因此 不会被 标记。 另外, 值得注 意的是 ,链亲 和素四 聚体会 离解成 单体, 而离解 后的单 体可同 DNA 平 端结合 ,但 不能结 合于生 物素化 的纤维 素树脂 ,因 此会对 纯化造 成某些 影响。 因此, 链亲 和素的 保存时 间不宜 过长。 3) 预期结 果和时 间安排 25nm〇l 的 生物素 标记的 DNA 片 段可同 lmL 生物素 化的纤 维素树 脂反应 ,可 获得 1.5mg 的分子 质量为 60kda 的多肽 。如果 条件合 适的话 ,甚至 可获得 50 倍乃至 250 倍 的 DNA 结合 蛋白复 合物。 从标 记生物 素化的 DNA 片 段开始 ,基本 操作步 骤约需 1.5h。 而用微 型柱进 行纯化 则需 2.5h。 第七 节编码 DNA 结 合蛋白 cDNA 克隆的 检测 、纯化 和鉴定 一个 DNA 位点 结合探 针可被 用于从 表达文 库中检 测出合 适的重 组克隆 ,并 对之加 以纯化 ,验证 其中具 有编码 序列特 异性的 DNA 结合域 的克隆 。这 样可排 除为分 离其基 因而 对序列 特异性 DNA 结 合蛋白 的进行 纯化的 过程; 只需 一个 合适的 构建于 Xgtll 载 体中的 cDNA 文库和 DNA 识别 位点的 探针。 在 本节中 我们将 介绍用 DNA 识 别位点 的探针 在表达 文库中 检测并 纯化特 异性的 DNA 结合 蛋白基 因克隆 。该法 通常需 要一个 DNA 表 达文库 (载体 通常用 Xgtll) 及一 个识别 位点处 DNA 的探针 。本 节中我 们将介 绍三种 方法: 第一种 方法即 是本节 的最基 本方法 ,它 通常用 于检测 与纯化 序列特 异性的 结合蛋 白质的 克隆; 第二种 是一种 改进方 法, 它通过 引入变 性与复 性步骤 从而增 加了特 异性克 隆的检 测率; 第三种 方法则 提供了 一种快 速鉴定 DNA 结 合蛋白 活力的 方法。 一 、用 识别位 点处的 DNA 探 针筛选 Xgtll 表 达文库 1. 原理 由 于重组 的蛋白 质可特 异性结 合于放 射性标 记的位 点识别 DNA 探针 ,因此 ,可从 入 gtll 表达文 库中检 测出编 码序列 特异性 蛋白质 的克隆 。在裂 解细胞 状态下 ,将 Xgtll 噬菌体 库铺于 平板上 ,当 噬菌斑 出现后 ,在 平板上 平铺一 张已被 IPTG 饱 和的硝 酸纤维 素膜, 从而使 得重组 的噬菌 体表达 P- 半乳糖 苷酶融 合蛋白 ,并 且其 蛋白也 同时被 转移至 硝 酸纤维 素膜上 。经过 封闭后 ,在 过童的 非特异 性竞争 DNA 存在下 ,同 放射性 标记的 • 692 • 位 点识别 DNA 进行结 合反应 ,洗去 非特异 性结合 的探针 ,并进 行放射 自显影 。如 此, 通过数 轮筛选 ,即可 在原始 库中检 测出单 个阳性 克隆。 筛选成 功的关 键在于 DNA 文 库的质 量及所 采用的 识别位 点探针 。用 随机引 物构建 的重组 DNA 文库 及识别 多位点 的探针 是优选 的材料 。合成 的探针 在用于 筛选前 应先于 所要 研究的 蛋白进 行结合 试验。 如果可 能的话 ,多位 点探针 的构建 应选择 在一系 列相关 位 点中亲 和力最 高的位 点处来 进行。 2. 材料 含有多 个串联 拷贝识 别位点 DNA 的 pUC 重 组质粒 DNA 无识 别位点 DNA 的 pUC 重 组质粒 DNA £coR I 及 Hind III 限制酶 lmol/L Tris-HCl, pH 7.5 5mmol/LdCTP、 dGTP、 dTTP 及 dATP 5000Ci/mmol a-32P dATP £ . coG DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段 500mmol/L EDTA, pH8.0 25:24:1 酚 / 氯仿 / 异戊醇 24:1 氯仿 / 异戊醇 3mol/L 乙 酸铵, pH5.2 100 % 无 水乙醇 洗脱 缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, 室 温贮存 ) E. coli Y1090 入 gtll cDNA 文库 LB 培养基 (含有 0.2% 麦 芽糖及 50 pg/mL 氨苄青 霉素) 0.7% 顶层 琼脂, 47X: 熔解 并保温 100mm 及 150mmLB 平板 (含有 50/ig/mL 氨苄 青霉素 ,在 37X: 干燥并 保温) lOmmol/LIPTG (用 无菌水 配制成 lmol/L 的 贮存液 ,在 -20X: 保存) 结合 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7.5, 50 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L DTT) BLOTTO (5% 脱月旨 牛奶, 50 mmol/L Tris-HCl pH7.5, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 在 4"C 下可 贮存卜 2 星期) lmg/mL 用超 声波断 裂的小 牛胸腺 DNA (约为 lkb 左右) 氯仿 Elutip-d 柱 37X: 及 42X: 孵育箱 132mm 及 82mm 硝酸纤 维素膜 限制 性内切 核酸酶 消化、 电泳迁 移率改 变试验 检测法 、酚抽 提及乙 醇沉淀 、非 变性 聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳、 Elutip-d 层析法 、噬 菌体 的滴定 与铺板 、放射 自显影 、纯 化与贮 • 693 • 存 噬菌体 单克隆 所需的 试剂及 设备。 3. 操 作步骤 制备与 分析放 射性标 记的识 别位点 DNA 探针: (1) 在 lOO^L 体 积中用 £c〇R I 及 III 消化 含有多 个串联 拷贝识 别位点 DNA 的 pUC 重组 质粒, 从而得 到含有 蛋白结 合位点 的插入 片段。 一般用 2~10 个多 重蛋白 质结合 位点的 探针, 其长度 <200bP。 如太 长则会 造成有 太多的 非特异 性 信号。 (2) 加入以 下的限 制性内 切核酸 酶消化 试剂: 1 mol/L Tris-HCl pH7.5, 终 浓度为 50 mmol/L 5 mmol/L dCTP、 dGTP、 dTTP 及 dATP, 终浓度 为每种 100 mmol/L 200/^Ci a-32P dATP (5000Ci/mmol) 10U Klenow 酶 在室温 下孵育 30min。 加入 预冷的 5 mmol/L dATP 至 lOOp mol/L。 继续 孵育约 30min〇 (3) 加入 500 mmol/L EDTA 至终 浓度为 20 mmol/L 以终止 末端标 记反应 。用 25: 24:1 酚 / 氯仿 / 异 戊醇及 24:1 氯仿 / 异戊 醇抽提 DNA, 用 3 mol/L pH5.2 乙酸铵 调节盐 浓度至 0.3 mol/L, 用 2 倍体积 100% 无 水乙醇 沉淀。 (4) 重悬 沉淀于 200pL 蒸 馏水中 ,加入 22/!xL3mol/LpH5.2 乙酸铵 ,用 2 倍体积 100% 无水乙 醇重新 沉淀。 (5) 在 5%, 0.75mm 宽 的非变 性聚丙 烯酰胺 凝胶上 电泳分 离标记 探针。 (6) 放射 自显影 以确定 标记的 片段, 将其切 割下来 ,用 1.5mL 的洗脱 缓冲液 浸泡, 在 41C 下过 夜摇动 以洗脱 探针。 (7) 取 出上清 ,用 Elutip-d 层 析柱纯 化探针 。用 液体闪 烁计数 器测量 Cerenkov 值, 在 4X: 下 贮存。 上 述反应 可产生 (2xi〇7) 〜 (4xi〇7) 每分 钟计数 /pm〇l 特异 活性的 DNA 探针, 每个平 板约需 106 每分钟 计数的 DNA 探针 。本反 应产生 的探针 足以用 于筛选 20 张滤膜 ,每张 滤膜约 106 个 噬斑。 制备硝 酸纤维 素膜复 印膜: (8) 用 LB 培养基 (含有 0.2% 麦 芽糖及 50;xg/mL 氨苄 青霉素 ) 37X: 培养 £. Y1090 菌。 (9) 每 个平板 用培养 过夜的 Y1090 菌 0.5mL 混匀 ,将 Xgtll 文库 (3X104) 〜 (5X 104 噬斑 / 平板) 涂于平 板上。 (10) 37X: 孵育 15min 使 噬菌体 吸附于 细菌。 (11) 加入 9mL 上层 琼脂于 每管中 。混匀 ,铺于 150mm LB/ 氨苄平 板中。 (12) 42X: 培养 3h 直至噬 斑出现 。将 其转入 37t: 孵 育箱中 。不 能低于 37X:。 (13) 将 132mm 的硝酸 纤维素 膜浸入 1〇 mm〇i/L IPTG 中约 30min, 室温空 气干燥 60min〇 (14) 将浸过 IPTG 的硝 酸纤维 素膜覆 盖于平 板上, 37x: 继 续孵育 6h。 (15) 4X: 冷 却平板 lOmin, 用针扎 硝酸纤 维素膜 作标记 ,将 膜转入 BLOTTO 中, • 694 • 室温下 浸泡约 60min, 缓慢 摇动。 用 Parafilm 膜封好 主平皿 ,保 存于 4t: 。 (16) 将膜转 入足量 结合缓 冲液中 (500mL/10 张膜 ), 室温 下孵育 5min, 缓慢摇 动。 用新鲜 的结合 缓冲液 洗涤膜 两次。 在筛 选前滤 膜可在 41C 保存 于结合 缓冲液 中长达 24h。 杂交硝 酸纤维 素膜影 印膜: (17) 在 lOOt: 加热 lmg/mL 的小 牛胸腺 DNA lOmin 使 其变性 ,迅速 冰浴, 加入到 结合 缓冲液 中至终 浓度为 Sfig/mL (终 体积按 25mL/lO 张 膜计算 )。 加入 32P 标记的 DNA 结 合位点 探针至 1X106 〜 2X106 每分 钟计数 /mL。 将 膜放入 结合反 应液中 ,室温 下摇动 60min。 (18) 室温 下洗膜 4 次 ,每次 7.5min, 洗膜液 体积为 500mL 结合 缓冲液 八0 张膜。 (19) 干燥膜 ,用 保鲜膜 覆盖, X 光 胶片在 -70X: 下 放射自 显影。 分离并 纯化序 列特异 性克隆 (20) 将自 显影胶 片同平 板对照 ,挑选 阳性斑 ,准 备进行 第二次 筛选。 真正 的阳性 信号呈 光晕状 。可 做多张 自显影 片以排 除那些 不能重 复的信 号点。 (21) 按制 备硝酸 纤维素 膜复印 膜步骤 (8 )~(11) 制备 再生噬 菌体液 ,亦 即第二 次噬 菌体液 (约 5000 噬斑 /100mm 平板 )。 用 0.2mL 的 Y1090 培 养菌及 3mL 顶层 琼脂。 (22) 用 82mm 膜按制 备硝酸 纤维素 膜复印 膜步骤 (12) 到分 离并纯 化序列 特异性 克隆 1 制备 第二次 硝酸纤 维素膜 ,准备 第二次 筛选。 (23) 按制 备硝酸 纤维素 膜复印 膜步骤 (8) 〜 (14) 标 记无识 别位点 DNA 的 PUC 重 组质粒 DNA 作 为对照 ,用 此标记 探针筛 选以除 去非特 异性的 假阳性 克隆。 (24) 挑选、 纯化并 贮存单 个阳性 噬菌斑 ,加入 氯仿在 41C 下 贮存。 二 、盐 酸胍对 干燥的 影印膜 进行反 复变性 与复性 1988 年, Vinson 等用 6 mol/L 盐酸 胍对干 燥的影 印膜进 行反复 变性与 复性, 发现这 可 增加特 异性克 隆的检 测率。 1. 附 加材料 HEPES 结合 缓冲液 (25 mmol/L HEPES pH7.9, 25 mmol/L NaCl, 5 mmol/L Mg- Cl2, 0.5 mm〇l/L DTT, 分别制 备含有 6 mol/L 盐 酸胍及 不含盐 酸胍的 HEPES 结 合缓冲 液 ,注意 ,每次 用时该 液应新 鲜配制 ,在 41C 下贮存 ) 2. 操 作步骤 (1) 按上 述方法 (用 识别位 点处的 DNA 探 针筛选 Xgtll 表达 文库) 标记探 针步骤 (1) 〜 (7) 和制 备复印 膜步骤 (8) 〜 (14) 进行 操作。 (2) 在 4X: 下冷 却平板 lOmin。 用针 在每张 膜上做 标记。 移开膜 在室温 下干燥 15min〇 • 695 • (3) 将 膜浸入 HEPES 结合 缓冲液 /6mol/L 盐 酸胍中 4t: 下孵育 lOmin, 缓慢 摇动。 再用 新鲜的 HEPES 结合 缓冲液 /6 mol/L 盐酸 胍洗涤 一次。 (4) 在 4X: 下用 HEPES 结合 缓冲液 /3mol/L 盐酸胍 (50mL/10 张膜) 洗涤膜 1 次, 5min。 重 复洗涤 4 次 ,每次 所用的 盐酸胍 的浓度 比上一 次减少 一半。 (5) 在 4X: 用 HEPES 结合 缓冲液 孵育膜 5min (50mL/10 张膜 ), 用 新鲜的 HEPES 结合 缓冲液 再洗涤 一次。 (6) 按上 方案制 备复印 膜步骤 (15 )~(16) 中的 操作用 BLOTTO 封 闭膜。 (7) 按上方 案影印 膜和进 行筛选 操作。 三 、从 Xgtll 重 组的溶 原性细 菌的粗 提取物 鉴定融 合蛋白 DNA 结 合活性 本法是 一种快 速鉴定 DNA 结合蛋 白活力 的方法 ,它可 从溶原 性细菌 的粗提 取物中 快速 鉴定融 合蛋白 DNA 结合 活力, 它同样 也可鉴 定非融 合蛋白 或重组 蛋白的 DNA 结 合 活力。 1. 附 加材料 E. coli Y1089 hflA150 两种 LB 培养基 (含有 10 mmol/L MgCl2 及不含 10 mmol/L MgCl2) 101G 噬菌斑 /mL Xgtll 重组 噬菌体 贮存液 1 mol/L IPTG 提取 缓冲液 (50 mmol/L Tris-HCl pH7.5, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 1 mmol/L PMSF, 在 -20t: 贮存) 5mg/mL 溶菌酶 4 mol/L NaCl 32X: 孵育箱 无 菌牙签 0.025/zm 滤膜 2. 操 作步骤 分离重 组的溶 原性噬 菌体: (1) LB 培养基 (含有 0.2% 麦 芽糖及 50 pg/mL 氨苄 青霉素 ) 371C 培养 £. coG Y1089 hflA150 细菌。 (2) 用 LB/MgCl2 培 养基稀 释细菌 1〇〇 倍 。每 lOOpL 细菌悬 浮液同 5ML 101() 噬菌 斑 /mL Xgtll 重组噬 菌体贮 存液在 32t: 孵育 20min。 (3) 用 LB 培 养基稀 释感染 的细菌 1000 倍 。平分 100/止/ 板 ,涂板 (LB/ 氨苄 ), 在 32X: 孵育 过夜, 每个平 板约有 1〇〇 个 克隆。 U) 将单 个克隆 进行温 度敏感 性生长 测试。 将每个 克隆分 别挑入 2 个 LB/ 氨苄 平板 中 ,分 别置于 42X: 与 32X: 培养 。能在 32X: 而 不能在 42X: 生长的 克隆为 溶原菌 。其 出现 • 6% • 频 率应为 10 % ~ 80 %。 制备 Xgtll 重组 的溶原 性细菌 的粗提 取物: (5) 在 32X: 用 LB/ 氨 苄培养 基过夜 培养重 组的溶 原性噬 菌体。 (6) 每 2mLLB/ 氨 苄培养 基加入 2(^L 过夜 培养物 。在 32X: 孵育 ,注 意通风 条件要 好。 (7) 培养至 OD6()C) = 0.5 ( 约需 3h), 将 其移至 44X: 的孵 育箱内 ,孵育 20mm (温度 应严格 控制在 44X:)。 (8) 加入 lmol/LIPTG 至终 浓度为 10mm〇l/L, 将其 孵育温 度降为 37X:, 继续孵 育 lh〇 (9) 在室温 下离心 45s。 (10) 用 100pL 的提 取缓冲 液重悬 细菌, 用干冰 / 乙醇迅 速冷却 。如 有必要 的话, 在 -70X: 贮 存细菌 悬液。 (11) 解冻细 菌悬液 ,加入 5mg/mL 溶菌 酶至终 浓度为 0.5mg/mL, 在冰 上孵育 15min〇 (12) 加入 4mol/LNaCl 至终 浓度为 lmd/L, 混匀。 4X: 时在 旋转式 混合仪 上孵育 15min〇 (13) 在 4X: 离心 裂解液 ,弃去 上清。 (14) 在皮 氏培养 皿加入 100mL 提取 缓冲液 ,将 0.025pm 的滤 膜悬浮 于其上 ,将 样 品加到 滤膜上 ,在 4X: 透析 60min, 立 即干冰 / 乙醇迅 速冷却 ,在 - 70t: 贮存。 四 、方 法评注 1) 背 景资料 序列 特异性 DNA 结 合蛋白 的功能 是多种 多样的 :包括 DNA 复制 、重 组及转 录等。 在高 等真核 生物中 一般用 生化法 鉴定此 蛋白质 ,在 1988 年 Singh 等 建立克 隆步骤 之前, 基因 编码蛋 白的纯 化与分 离一般 是采用 Weinberger 等与 Kadonaga 等 (1987) 建 立的普 通 生物化 学方法 。而 筛库法 可以得 到较为 稀有的 调节蛋 白分子 。•应 注意 要得到 稀有的 DNA 调节 蛋白, 筛库成 功的关 键在于 DNA 文库的 质量以 及探针 。一 般推 荐使用 随机引 物构建 的重组 DNA 文库及 识别多 位点的 探针。 如果使 用合成 的探针 ,那 么在用 于筛选 前应先 进行结 合试验 。如果 有可能 ,应 选择在 一系列 相关位 点中亲 和力最 高的位 点来构 建 多位点 探针。 本法 类似于 用抗体 进行筛 库得到 相应的 克隆, 因此对 于建立 的准备 做抗体 筛选的 入 gtll 噬菌体 库同样 可用于 本实验 。用基 本方法 ,已 经克 隆得到 MBP-1、 Oct-2、 E12、 XBP、 IRF-1、 CREB 等一 系列的 DNA 结 合蛋白 。盐 酸胍对 干燥的 影印膜 进行反 复变性 与复 性可增 加了特 异性克 隆的检 测率。 2) 关 键因素 本实验 方法有 3 个关 键处: ①序列 特异性 DNA 结合 蛋白的 功能性 表达; ②具有 特 异性结 合位点 DNA 片段; ③ DNA 结合位 点的高 表达。 如果整 个实验 过程满 足以上 3 个条件 ,则 一般可 获得高 质量的 DNA 结 合蛋白 的克隆 。但 是要注 意的是 如果某 个蛋白 • 697 • 具有亚 单位, 则用该 法无法 获得。 3) 预期结 果和时 间安排 对于 106 个克隆 ,应 得到 1~ 1〇 个阳 性克隆 。对于 l〇〇mm 与 15〇mm 的平板 来说, 其上 的噬菌 斑应为 2 x 1〇4 及 5 X 1〇5。 筛 选总时 间约为 3d 左右 。可在 第一天 的上午 铺噬菌 体平板 , 感染后 3h 准备 硝酸纤 维素膜 ,孵育 6h 后, 封闭膜 lh, 在 4X: 保存 过夜。 第二天 进行筛 选以及 放射自 显影, 曝光 12 〜 24h 后 ,即可 筛到阳 性克隆 。如 果增 加变性 / 非变 性步骤 ,那么 在膜干 燥后即 应放置 起来。 第八节 滤膜分 离游离 DNA 及与 蛋白质 结合的 DNA 一 、蛋白 质结合 DNA 的定 量测定 1. 原理 硝酸 纤维素 滤膜可 以结合 蛋白但 不能结 合双链 DNA, 如果 蛋白质 与双链 DNA 片段 相结合 ,则这 一结合 物仍可 结合在 滤膜上 。因 此采 用放射 性核素 标记的 DNA 片 段作为 检测 目标, 能够在 不同的 时间和 条件下 对蛋白 质结合 DNA 进行定 量分析 ,并 可进行 DNA 结合反 应动力 学及平 衡方面 的研究 。这是 研究基 因表达 调控的 重要方 法之一 ,同 时也 是研究 DNA 结合 反应的 动力学 过程中 最重要 的研究 方法。 该实验 过程是 先将纯 化的蛋 白质同 双链的 DNA 在适当 的缓冲 液中同 时孵育 ,孵育 完后 ,将 混合液 通过滤 膜进行 抽滤, 使得非 结合的 DNA 可通 过滤膜 ,而已 结合的 DNA 与蛋白 质则被 留在滤 膜上。 2. 材料 2XDNA 结合 缓冲液 (40mmol/LTris-HClpH7.5, 20% 甘油 ,临用 前加入 100 mmol/L DTT 和 0.2 mmol/L PMSF (贮 液溶于 异丙醇 )) 用 32P 标记 的双链 DNA 蛋白 质样品 牛血清 白蛋白 (BSA) 0.45fim 的滤膜 (13mm、 24mm、 24mm 直径) 真空仪 3. 操 作步骤 材料 准备: (1) 准备 30mL 新鲜的 2XDNA 结合 缓冲液 ,加入 DTT 与 PMSF, 混匀 。取出 0.5mL 备用, 剩余的 29.5mL 用 蒸馏水 稀释至 IX。 30mL 的 2XDNA 结合 缓冲液 足够做 10 次反应 。本实 验反应 缓冲液 可供普 遍使用 ,但并 非最佳 , 不 同的结 合反应 所用的 最佳的 反应缓 冲液应 分别进 行优化 。另外 , 应注意 PMSF 有 剧毒。 (2) 滤膜 浸泡于 30mLlXDNA 结合缓 冲液中 30min 以上 。保留 IX 缓冲液 l〇mL • 698 • 在以后 过滤时 使用。 蛋白质 -DNA 与滤膜 的结合 反应: (3) 对于 每一种 样品, 准备一 个微量 离心管 。在 微量离 心管中 加入: 2 x DNA 结合 缓冲液 25/xL 32P 标记 DNA 2~10ng (>10 000 每分钟 计数) 加水至 50/zL 涡 旋混悬 ,瞬时 离心。 DNA 片 段的大 小一般 为数百 bp, 含有 特异性 的结合 位点。 DNA 片段 可通过 Klenow 片段 进行末 端标记 ,或 用激 酶标记 。标记 后的探 针可用 电洗脱 法或其 他方法 纯化。 (4) 加入 蛋白质 溶液, 轻缓颠 倒混匀 4 次 ,离心 l~2s, 30t: 保温约 25min。 孵育 的时间 和温度 应随不 同的蛋 白而异 。一般 来说, 20min 已经 足够使 DNA 与蛋 白质的 结合达 到平衡 。当温 度高于 371C 时 ,会影 响蛋白 质的稳 定性。 检测特 异性结 合所需 的蛋白 质的浓 度可通 过滴定 来确定 ,一 般而言 ,蛋 白的浓 度应在 1(T8~ 10_14mol/L 之间。 较低的 蛋白浓 度在反 应中会 使蛋白 不稳定 ,因此 可加入 一些无 DNA 结合位 点的蛋 白质 , 一 般 可加入 lOOmg/mLBSA, 这样 可以对 低浓度 的蛋白 起稳定 作用。 (5) 在 孵育时 ,将每 一管做 好记号 ,并 准备真 空仪。 (6) 保温前 5min, 将 浸泡过 的滤膜 逐一放 入负压 抽滤装 置的不 锈钢上 ,上 面压上 重 物以固 定滤膜 ,在第 4 步保 温完毕 后接通 真空泵 ,将反 应液迅 速倒入 滤膜上 ,调 节负 压使流 速保持 lmL/min。 (7) 液体 抽干后 每片滤 膜再用 0.5mL IX DNA 结 合缓冲 液洗涤 2 次。 (8) 对 每片滤 膜计数 ,保留 的每分 钟计数 百分率 = 滤膜上 的每分 钟计数 / 总 每分钟 计数 ( 即滤液 和滤膜 上计数 的总和 ) x 1〇〇。 二、 DNA 结合 特异性 的检测 1. 原理 当蛋 白质的 结合位 点不知 道时, 可将纯 化的蛋 白质同 DNA 片段一 起混匀 ,以 确定 其同 哪一种 DNA 可特异 性结合 。当然 ,结合 同缓冲 液以及 其他因 素有关 。本方 案是将 上 方案进 行改进 ,可使 非特异 性的结 合降低 ,而 特异 性的结 合增高 。本检 测与“ 蛋白质 结合 DNA 的定 量测定 ”的区 别是使 用了混 合片段 标记的 DNA 探 针和较 强烈的 冲洗条 件, 目的是 消除蛋 白质与 DNA 的 非特异 性结合 ,从 而增加 结合的 特异性 。本改 进方案 使用 的结合 缓冲液 同上方 案一样 ,仅将 结合缓 冲液中 KC1 的 终浓度 增加至 150 mmol/L, 从而增 加了特 异性结 合的检 测率。 2. 操 作步骤 (1) 准备 40mL2xDNA 结合 缓冲液 ,取出 3mL 备用, 剩余的 37mL 用蒸馏 水稀释 成 ix0 (2) 滤膜浸 泡在约 l〇mL lx DNA 结合缓 冲液中 ,留 60mL lx DNA 结合缓 冲液待 过滤 时用。 • 699 • (3) 将约 100 〇〇〇 每分 钟计数 32 p 标 记双链 DNA (2〇 〜 100ng 片段混 合物) 加到 250ptL2xDNA 结合缓 冲液中 ,加 水至 500^L, 涡 旋混匀 ,离心 1 〜 2s。 (4) 加入 蛋白质 液并按 上方案 结合反 应步骤 (4) 〜 (5) 操作。 (5) 每张 滤膜用 2mLlxDNA 结 合缓冲 液洗涤 3 次 。按 上方案 结合反 应步骤 (6) 〜 (8) 操作。 三 、结合 DNA 的洗脱 在某些 情况下 ,仅 定量是 不够的 。本方 案是将 DNA 从滤 膜中洗 脱下来 ,使 其可进 行电泳 、扩 增或 克隆等 操作。 1. 材料 结合 有蛋白 -DNA 的滤膜 . 滤 膜洗脱 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH7.8, 0.2%SDS, 0.3mol/L 乙酸钠 ) tRNA 核 酸载体 乙醇 液闪 计数杯 3〇r 水浴 电 泳和放 射自显 影试剂 及设备 2. 操 作步骤 (1) 取出 滤膜, 结合有 DNA 的一面 朝下放 到含有 450pL 滤膜 洗脱缓 冲液的 液闪计 数杯中 ,间断 摇晃, 30X: 保温 2h。 (2) 洗脱液 转入微 量离心 管中, 每管加 lpL 核 酸载体 后混匀 ,加 lmL 无水 乙醇, -201C 沉淀 过夜。 (3) 用电泳 和放射 自显影 方法确 定哪种 DNA 被 蛋白质 结合。 四 、方 法评注 1) 背 景材料 滤膜结 合反应 主要用 于鉴定 纯化的 DNA 结合蛋 白或用 来分离 其特异 性结合 位点。 其原 理在于 在反应 中的动 态平衡 使得结 合后的 DNA 可与 游离的 DNA 分离 。该 方案相 对于 电泳迁 移率改 变实验 以及免 疫沉淀 法而言 ,具 有迅速 、简便 的特点 ,但 电泳 迁移率 改变实 验以及 免疫沉 淀法可 从原始 的蛋白 质提取 物中直 接纯化 蛋白质 。滤 膜结合 反应通 常 用于甲 基化干 扰实验 中分离 结合的 DNA 与 游离的 DNA。 当然, 它也可 用在电 泳迁移 率 改变实 验中。 2) 实验参 数及注 意事项 应注 意的是 ,不 同的蛋 白质其 结合滤 膜的最 佳条件 不同的 ,这应 在实验 中进行 摸索。 单价盐 (如 NaCl、 KC1): 低盐会 使结合 更紧密 ,而高 盐则会 造成离 解加剧 。一般 • 700 • 来说 ,反应 通常在 50 mmol/L 的盐 浓度下 进行; 而如 果要去 除非特 异性的 影响, 则可采 用 150 mmol/L 的盐浓 度甚至 更高。 但要注 意的是 ,若盐 浓度太 高的话 ,会 造成 所有的 结 合反应 失效。 pH: 低 pH 促进结 合反应 ,高 pH 促进离 解反应 。一般 说来, 反应的 pH 应在 7. 2~7. 5 之间。 如果为 了提高 结合的 特异性 ,可适 当提高 PH, 但要 注意不 能过高 ,否 则会影 响结合 反应。 二 价离子 (如 Mg2+): 根 据不同 的蛋白 ,二价 离子所 起的作 用不同 。对于 某些蛋 白 质而言 ,二 价离子 可提高 其结合 能力; 而对 于另一 部分的 蛋白质 而言, 二价离 子却会 降 低其结 合能力 。因此 ,一般 最好分 别进行 滴定。 温度: 在结合 反应中 温度的 效应是 很小的 ,一 般可在 25 〜 30t: 之 间进行 反应。 时间 :孵育 时间一 般可在 10min~lh 之内。 体积 :一般 可用较 大的反 应体积 (在 50/uL 以上 )。 混匀: 尽量避 免机械 混匀, 尤其是 涡旋。 过滤 :过滤 速度一 般可在 l~15mL/min 之间。 洗涤: 洗涤可 用较小 的量。 3) 实 验时间 滤膜结 合实验 所需的 时间是 很少的 。在 Id 之内 ,即 可进行 10 个 样品的 2 次 实验。 第 九节体 外合成 克隆基 因蛋白 质分析 DNA- 蛋白 质反应 1. 原理 当克隆 到一个 DNA 结合蛋 白后, 可通过 在体外 的蛋白 质转录 和翻译 ,得到 完整的 蛋白质 。通常 步骤是 将分离 的基因 克隆进 包含有 SP6 或 T7 RNA 聚合酶 启动子 的载体 中, 通过转 录产生 mRNA, 在体 外翻译 所需的 蛋白质 ,用 35S 标记该 蛋白质 。体 外合成 的 蛋白质 对于检 测某个 克隆的 基因是 否编码 DNA 结合 蛋白以 及分析 DNA 与蛋 白质相 互作用 是十分 重要的 。如果 要检测 DNA 的结 合活力 ,可 以把标 记的蛋 白质同 特异性 DNA 片段一 起孵育 ,蛋 白质与 DNA 结 合的复 合物在 非变性 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 上可同 游离 的蛋白 质分开 。同电 泳迁移 率改变 实验不 同的是 ,本实 验是用 35S 标 记蛋白 质而不 标记 DNA, 而 电泳迁 移率实 验是用 32P 标记 DNA, 而不是 标记蛋 白质。 任何突 变蛋白 质 ,只 要改变 DNA 模板 就可以 测定其 DNA 结合 性质, 同时可 以检测 其亚单 位结构 (如一 聚体、 四聚体 )。 2. 材料 含有 所需结 合位点 的质粒 DNA 合适的 限制酶 体外翻 译出的 35S 标记 的蛋白 5X 结合 缓冲液 (100mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 250mmol/L KC1, 15mmol/L MgCl2, 5mmol/LEDTA, 500fxg/mL 白明胶 ) . 701 . lOmg/mL poly (dl-dC) .poly (dl-dC) 或其他 的大分 子载体 DNA 加样 缓冲液 (lx 结合缓 冲液, 20% 甘油, 溴盼 蓝,1 mg/mL 二甲苯 青蓝) 45% 甲醇 / 10% 乙酸 EN3HANCE (Du Pont NEN) 进行 DNA 末 端标记 所用的 T4 多聚 核酸激 酶以及 Klenow 片段 、限制 酶消化 、酚 / 氯仿 抽提、 无水乙 醇沉淀 、琼 脂糖凝 胶电泳 、非 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳以 及放 射自显 影 所需的 试剂和 材料。 3. 操 作步骤 (1) 用合 适的限 制酶酶 切消化 含有结 合位点 的质粒 DNA, 产生一 个长为 150~ 700 bp 片段 ,并且 该片段 与载体 DNA 及 其他的 限制性 酶切片 段可完 全分离 的片段 。用 酚 抽提及 乙醇沉 淀纯化 ,如 有必要 ,可 用琼脂 糖凝胶 电泳或 非变性 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 分离 纯化该 片段。 一 般说来 ,对于 5kb 大 小左右 的质粒 ,取约 0.5pg 进行 酶切消 化或得 到的量 即可满 足以 下的实 验要求 。标记 DNA 方法可 参照电 泳迁移 率改变 实验。 (2) 进 行以下 15^L 的结合 反应: H20 5pL 5 x 结合 缓冲液 3^L DNA (DNA 片段各 9 nmol/L) 5^L lOmg/mL poly (dl-Dc) . poly (di-dC) \[iL 体外 翻译的 35S 标记 的蛋白 1必 室温 下温育 20min。 本实 验一定 要设立 不含有 DNA 及 含有非 特异性 DNA (即缺 乏结合 位点) 的对 照反应 。由 于结合 条件 是多种 多样的 ,特别 是载体 DNA 的量 、离 子强度 、二 价阳离 子以及 温度, 因此最 好要先 做预实 验以确 定结合 条件。 (3) 加 5/iL 加样 缓冲液 。在 5% 的非 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 上进行 电泳约 1 〜 4h, 直 至 溴酚蓝 接近胶 的底部 。注 意胶的 温度不 能高于 室温。 胶的 组成及 缓冲液 的离子 强度可 进行适 当改变 ,如 聚丙烯 酰胺凝 胶可用 普通的 (30:0.8 丙烯酰 胺、 双丙烯 酰胺用 90 mmo 丨 /LTBE 缓冲液 , PH8. 3) 或低离 子强度 的凝胶 也可。 这些改 变对于 检测蛋 白 -DNA 的相互 作用可 能会很 重要。 (4) 电 泳完后 ,将凝 胶置于 45% 甲醇 /10% 乙酸 中室温 下固定 lh。 用 EN3HANCE 处理胶 lh, 干 燥凝胶 ,然 后进行 放射自 显影。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 本 节中所 介绍的 分析蛋 白质与 DNA 结 合反应 的方法 最初是 Hope 与 Struhl 于 1985 年 用于研 究酵母 转录活 化蛋白 。它同 以往的 传统的 生物化 学法不 同的是 ,用 于研 究的蛋 白 并非是 从细胞 中得到 ,而是 在细胞 外转录 并翻译 克隆基 因得到 的蛋白 。一 旦蛋 白质被 合成 出来, 许多用 于分析 特异性 DNA 蛋白质 结合反 应的标 准步骤 仅需稍 做修改 即可用 • 702 • 于分析 该蛋白 。另外 ,本 方法对 于分析 任何突 变蛋白 或亚单 位结构 (如 一聚体 、四聚 体) 是 十分有 效的。 2) 实验 参数及 实验注 意事项 在本 实验中 ,翻译 时可以 不用纯 化分离 标记的 蛋白质 。在 整个 实验中 ,标记 蛋白、 特异性 DNA 片段 、非 特异性 DNA 以 及载体 DNA 之间 的比例 是十分 重要的 。如 果在反 应过 程中使 用多种 特异性 DNA 片段 ,那么 DNA 的 相对分 子质量 应该有 较大的 区别, 这样, 反应复 合物在 电泳中 才能完 全分开 。当 然电泳 条件也 是十分 重要的 。包括 对照反 应在内 ,应 一次 进行约 20 ~ 50 个 DNA 蛋白 质结合 反应。 3) 预 期结果 在无 DNA 的 条件下 ,标记 的蛋白 质不会 形成带 ,这是 由于它 们在电 泳时的 方向与 反 应复合 物不同 。但 是要注 意的是 其他非 标记的 自由蛋 白质会 形成带 。在 有高亲 和性的 DNA 存 在时, DNA 蛋 白质复 合物会 形成明 显的带 ,对于 那些突 变蛋白 ,也 会观 察到明 显的 DNA 蛋 白质复 合物带 ,但其 带应比 特异性 DNA 蛋 白质复 合物带 要弱。 4) 实 验时间 预 先检测 DNA 的结 合力是 十分重 要的。 一旦标 记的蛋 白质已 经合成 ,并且 DNA 片 段也制 备好了 ,只需 lh 进行 DNA 结 合反应 ,数 小时进 行非变 性聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳 ,数 小时进 行放射 自显影 ( 放射自 显影过 夜可得 到较好 的结果 )。 第十 节序列 特异性 DNA 结合 蛋白的 亲和层 析纯化 许多 生物学 现象, 如重组 、复制 及转录 ,均涉 及序列 特异性 DNA 结合蛋 白的作 用 ,这些 蛋白质 的含量 通常小 于细胞 蛋白总 含量的 0.01%, 用普 通的方 法不易 纯化得 到该 种蛋白 。因此 ,人 们发 展了许 多方法 去纯化 该蛋白 ,而 现在发 展起来 的亲和 层析则 是针 对其的 一种十 分有效 的纯化 蛋白的 方法, 其原理 是基于 该蛋白 的序列 特异性 DNA 的结合 特性。 一 、基 本方案 1. 原理 正确选 择寡聚 核苷酸 以及树 脂的亲 和性强 度对于 本实验 来说是 十分重 要的, 亲和介 质的制 备包括 4 个步骤 : ①制备 寡聚核 苷酸; ② 溴化氰 活化琼 脂糖; ③将 DNA 结合 于树 脂上; ④封 闭未 反应的 CNBr。 第一步 需要纯 化有蛋 白质识 别位点 的寡聚 核苷酸 ,然 后用 T4 多聚 核酸激 酶磷酸 化 ,用 T4DNA 连 接酶将 其连接 成长链 。将 SepharoseCL-2B 用 CNBr 活化 ,同 连接后 的 DNA 孵 育过夜 即可。 2. 材料 两种有 结合位 点的合 成寡聚 核苷酸 (440fig) TE 缓冲液 (l〇mm〇l/LTris-HClpHpH7.8, lmmol/LEDTA) 10U/fxLT4 多 聚核苷 酸激酶 • 703 • 10 x T4 多 聚核苷 酸激酶 缓冲液 (500 mmol/L Tris-HCl pH7.6, 100 mmol/L Mg- Cl2, 5〇mmol/LDTT, lmmol/L 亚 精胺, lmmol/LEDTApH8.0, 在 -20*0 保存 ,在 用 前补加 DTT 50 mmol/L) 20 mmol/L ATP (Na+Sfc), pH7.0 150mCi/mLy-32P ATP (6000Ci/mmol) 10 mol/L 乙酸铵 酚及 25:24:1 酚 / 氯仿 / 异 戊醇, 24:1 氯仿 / 异戊醇 3 mol/L 乙酸钠 100% 乙醇、 75% 乙醇及 异丙醇 6000U/mL T4 DNA 连接酶 10 x 连接 / 激酶 缓冲液 (660 mmol/L Tris-HCl pH7. 6, 100 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L 亚精胺 ,在 _20t: 保存 ,使用 前另加 DTT 至 10 mmol/L) Sepharose CL-2B 溴化氰 (CNBr) (CNBr 有剧毒 ) /V, N- 二甲基 甲酰胺 5 mol/L NaOH 及固体 NaOH 颗粒 10mm〇l/L 以及 lmol/L 磷 酸钾缓 冲液, pH8.0 ( 等浓度 K2HP04 和 KH2P04 的混 合液) 甘氨酸 1 mol/L KC1 柱贮存 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7. 8, 1 mmol/L EDTApH8.0, 0.3 mol/L NaCl, 室 温保存 。临用 前加入 0.04% 叠氮钠 ) 1 mol/L 乙 醇胺, 8.0 (1 mol/L 乙 醇胺, 用 HC1 调至 pH8.0。 滤膜过 滤除菌 ,室温 保存。 ) 可调 水浴锅 琼脂糖 DNA 凝胶电 泳以及 DNA 纯 化所需 的试剂 及设备 3. 操 作步骤 寡聚 核苷酸 5'- 磷酸化 : (1) 在 1 个 1.5mL 的微 量离心 管中混 合下列 物质: 寡聚 核苷酸 ( 每种为 440Mg, 在总 体积为 130ML 的 TE 缓冲 液中) 20pL 10XT4 多核苷 酸激酶 缓冲液 88X: 孵育 2min, 65t:10min, 37t:10min, 室温 5min。 (2) 将上 述混合 物均分 为两份 于两个 微量离 心管中 ,每管 加入: 20 mmol/L ATP (pH7.0) 15/xL 7-32P ATP 约 5/zCi 10U//xLT4 多 聚核苷 酸激酶 (100U) 1〇mL 37X: 温育 2h。 (3) 每 管加入 50fxL10m〇VL 乙酸铵 及100/止 水, 65X: 加热 15min 灭 活激酶 。室温 • 704 • 下 冷却。 纯化磷 酸化的 寡聚核 苷酸: (4) 加入无 水乙醇 750pL, 混匀 ,室温 离心约 15min 以沉淀 DNA, 弃去 上清。 (5) 将沉淀 重悬于 225fiLTE 缓冲 液中。 (6) 加入 250/xL 酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1), 涡 旋振荡 ,离心 5min。 将水相 (上 层) 移 至一新 管中。 (7) 加 250pL24:l 氯仿 / 异戊 醇至水 相中, 在旋涡 混合器 上振荡 lmin。 高 速离心 5min 分离两 液相。 将水相 (上层 ) 移至 一个新 管中。 (8) 加 25^L3mol/L 乙 酸钠至 水相中 ,振 荡混匀 。然 后加入 750pL10096 乙醇 ,上 下颠 倒混匀 。高 速离心 15min 沉淀 DNA, 弃去 上清。 (9) 用 800pL75% 乙醇洗 涤沉淀 ,在旋 涡混合 器上振 荡混匀 。高 速离心 5min, 弃 去上 清。 (10) 在真 空旋转 蒸发器 (如 Speedvac) 中抽干 DNA 沉淀。 连接 寡聚核 苷酸: (11) 加 65pL 水及 10/xLlOx 接头 / 激酶 缓冲液 至每管 沉淀中 ,在旋 涡混合 器上振 荡使 DNA 溶解 。加 20^L20mmol/LATP (pH7.0) 及 5fiL 6000U/mLT4DNA 连接酶 (30Weiss 单位 )。 在室温 下温育 >2h, 或者 15X: 过夜。 (12) 用琼脂 糖凝胶 电泳监 测连接 反应, 每道加 0.5pL 连接反 应液, 并同时 带分子 量标 记物。 用溴化 乙锭染 色并在 紫外灯 下观察 DNA。 纯化 寡聚核 苷酸多 聚体: (13) 加 lOOfiL 缓冲平 衡酚至 lOOfiL 连接反 应液中 ,在 旋涡 混合器 上振荡 lmin。 室 温高 速离心 5min, 将水相 (上层 ) 移 至一新 管中。 (14) 加 100pL 24:1 氯仿 / 异戊 醇至水 相中, 在旋涡 混合器 上振荡 lmin。 室 温高速 离心 5min, 将水相 (上层 ) 移 至一新 管中。 (15) 加 33/^LlOmol/L 乙 酸铵至 水相中 ,在旋 涡混合 器振荡 lmin。 (16) 加 133pL 异丙醇 ,上 下颠倒 混匀, -20X: 放置 20min。 室 温下高 速离心 15mirT 沉淀 DNA, 弃去 上清。 (17) 加 225/iL TE 缓冲液 ,在旋 涡混合 器上振 荡使沉 淀溶解 。加 25;xL 3 mol/L 乙 酸钠 ,在旋 涡混合 器上振 荡混匀 。加 750 卩 L100% 乙醇, 上下颠 倒混匀 。高 速离心 15min 沉淀 DNA, 弃去 上清。 (18) 用 75 % 乙 醇洗涤 DNA 2 次, 在真空 蒸发器 (如 Speedvac) 中抽干 DNA 沉淀。 (19) 将 DNA 溶解于 50pL 水中, -20X: 保存。 不要用 TE 溶解 DNA, 因 TE 会对后 面的反 应造成 影响。 制备 CNBr 激活的 Sepharose : (20) 将 10~ 15mL (稳定 后的柱 床体积 ) Sepharose CL-2B 置于 一 ■个 60mL 粗烧结 玻璃 漏斗中 ,用 500mL 水充分 洗涤。 (21) 将湿的 Sepharose 介 质移至 1 个 25mL 量筒中 ,大 约有 l〇mL 介质 。加 水至终 体积 20mL, 将所得 的混悬 液移至 1 个 150mL 的玻璃 烧杯中 ,内 有磁 力搅棒 。将 烧杯置 于 水浴中 平衡至 15mL, 在 通风橱 内放在 磁力搅 拌器上 ,将搅 拌器开 至中慢 速度。 . 705 . (22) 在通 风橱内 ,称量 l.lg 溴 化氰装 入一个 251111的 二角锥 形瓶中 ,用 Paramm 瞋或磨 砂玻璃 盖尽可 能地盖 住瓶口 (稍 多于1 .ig 比稍 少为好 )。 加 2mLN, N_ 二甲基 甲酰胺 (溴化 氰将立 即溶解 ), 在1 min 内 ,将溴 化氰溶 液逐滴 加入搅 拌中的 Sepharose 液中。 (23) 立即 按以下 方法加 5m〇l/LNaOH: 每 10s 加 30pL 至搅拌 中的混 合物中 ,加 lOmin 直至 1 .8mL NaOH 加完。 (24) 马上加 l〇〇mL 冰冷 的水至 瓶中, 并将混 合物倒 入一个 60mL 粗烧结 玻璃漏 斗中。 (25) 仍 在通风 橱中进 行操作 ,用 l〇〇mL 冰 冷的水 (<4t:) 在 漏斗中 洗介质 4 次。 接着用 100mL 冰冷的 10mm〇l/L 磷酸钾 (pH8.0) 洗 2 次。 (26) 立 即将介 质移入 1 个 15mL 聚 丙稀螺 口盖的 管子中 ,加 4mL10mmol/L 隣酸 钾 (pH8.0) 直至介 质成为 均匀的 稠浆。 将寡聚 核苷酸 多聚物 连接上 CNBr-SqDharose: (27) 立即加 入步骤 (19) 中的 2 份 50pLDNA 水溶液 ,室温 下置于 转轮上 温育过 夜 (>8h)〇 (28) 在通 风橱内 ,将介 质移入 1 个 60mL 粗烧 结玻璃 漏斗中 ,用 100mL 水各洗 2 次 ,再用 100mL 1 mol/L pH8.0 的 盐酸乙 醇胺洗 1 次。 (29) 在通 风橱内 ,将介 质移入 1 个 15mL 的带 螺口盖 的聚丙 烯管中 ,加 lmol/L 盐 酸 乙醇胺 (PH8.0) 至混 合物成 为平滑 的浆状 。室 温下将 该管置 于转轮 上温育 2 〜 4h。 (30) 在 60mL 粗烧结 玻璃漏 斗中, 依次用 100mL10mmol/L 磷酸钾 (pH8.0)、 100mL lmol/L 碟酸钾 (pH8.0)、 100mL lmol/L 氯 化钾、 100mL 水及 lOOmL 柱忙 存缓 冲液洗 介质。 (31) 将介质 保存于 41C ( 至少 可稳定 1 年 ,不 要冻结 )。 二 、将 DNA 偶联于 溴化氰 活化琼 脂糖上 本方 案可不 用自己 制备的 CNBr 活化的 Sepharose。 1. 附 加材料 1 mol/L HC1, 临用 前配制 CNBr 活化的 Sepharose 2. 操 作步骤 (1) 制备标 记的被 连接的 寡核苷 酸探针 [基 本方 案步骤 (1) 〜 (4)] (2) 称出 3g 溴化 氰 活化的 Sepharose 4B (lg 冻干 介质可 得到终 体积约 3. 5mL 的凝 胶体积 )。 (3) 将介 质置于 1 个 15mL 的锥 形聚丙 烯管中 ,用 l〇mLlmm〇l/L 盐 酸水化 介质, 弹击及 来回颠 倒管子 以轻轻 混匀。 lmin 后 ,将 浆状介 质移入 1 个 60mL 粗烧结 玻璃漏 斗中 ,缓 缓倒入 500mLlmmol/L 盐 酸流过 漏斗以 洗涤和 溶胀介 质颗粒 ( 这个过 程将花 • 706 • 费约 15min)。 (4) 用 lOOmL 水洗涤 介质, 然后用 lOOmL 10mm〇l/L pH8.0 的 磷酸钾 洗涤。 (5) 将 寡核苷 酸偶联 于溴化 氰活化 Sephar〇se4B 上 [基本 方 案步骤 (6)]。 三 、用制 备性凝 胶电泳 纯化寡 核苷酸 1. 附 加材料 甲酰 胺上样 缓冲液 (90mL 去 离子甲 酰胺, lOmLIOXTBE 缓 冲液, 40mg 二甲苯 青蓝 , 40mg 溴酚蓝 ,在 -20t: 保存) 2- 丁醇 二乙 基乙醚 1 mol/L MgCl2 16% 聚 丙烯酰 胺-尿 素凝胶 (50mL40%19:l 丙 烯酰胺 / 双丙烯 酰胺, 12.5mLl〇x TBE, 62.5g 尿素, 7mLH20, 混匀。 再加入 750/zLlO% 过硫 酸铵, 20/uLTEMED) 保鲜膜 硅 化过的 玻璃棉 手 提式短 波长紫 外光源 变性聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳、 DNA 浓缩 沉淀纯 化所需 的试剂 及设备 2. 操 作步骤 用凝胶 电泳分 离寡聚 核苷酸 : (1) 制 备一块 20cmX40cmXl.5mm 的 变性胶 ,带有 4 个样 品孔, 孔宽为 3cm。 对 于分 离大约 10 〜 45 个碱基 长的寡 核苷酸 ,用 16% 的聚丙 烯酰胺 / 尿素胶 (对于 更长的 寡核 苷酸用 8% 或 6% 的聚丙 烯酰胺 / 尿素胶 )。 让 胶聚合 30min 以上 ,然后 30W 预电泳 >lh〇 (2) 将各寡 核苷酸 溶于甲 酰胺加 样缓冲 液中至 终体积 200/iL。 65t: 加热 15min 以去 除 DNA 二级 结构。 各孔中 分别加 50/uL 样品 ,在 30W 电泳约 4h, 直至溴 酚蓝移 至胶下 的 3/4 处。 用 UV 确定 DNA 在凝 胶上的 位置: (3) 移去 其中一 块凝胶 玻璃板 ,用保 鲜膜覆 盖凝胶 。将 凝胶剥 离并移 去另一 块凝胶 玻璃板 ,使 凝胶平 放在保 鲜膜上 。用 保鲜膜 覆盖凝 胶的另 一面。 (4) 在 暗室内 ,将凝 胶置于 一增感 屏上, 用一手 提式短 波长紫 外光源 直接照 于胶上 以观察 DNA。 辨明主 要的核 苷酸带 ,用 标记笔 直接在 保鲜膜 上标记 其位置 ,要 确保光 源直接 照在该 带上。 (5) 用剃 刀片小 心切下 该条带 ,尽 量不要 弄皱凝 胶或将 凝胶条 弄碎。 从凝胶 上纯化 寡聚核 苷酸: (6) 将 凝胶块 置于一 15mL 聚丙烯 管内, 浸泡于 5mLTE 缓冲 液中, 37X: 振荡 过夜。 (7) 在一支 巴斯德 吸管中 塞上一 些硅化 过的玻 璃棉, 并用约 5mL 水 预淋洗 ,将含 • 707 • 有 DNA 的上清 流过玻 璃棉。 (8) 反复用 仲丁醇 抽提将 DNA 浓 缩到约 180fxL。 (9) 用乙 醚抽提 DNA 1 次 ,并 将其置 于真空 蒸发器 (如 Speedvac) 中到所 有的乙 醚都被 除掉。 (10) 用 TE 缓 冲液将 液体体 积调到 180pL。 加 2(VL3mol/L 乙 酸钠及 2;zLlm〇l/L MgCl2。 在旋涡 混合器 中振荡 混合。 (11) 加 600^L 的 100% 乙醇 ,来 回颠倒 混合, 在干冰 / 乙醇 中冷冻 l〇min。 置于室 温 5min, 室 温下以 最大速 度离心 15min, 沉淀 DNA, 弃去上 清液。 (12) 加 180^LTE 缓冲液 ,在 旋涡混 合器中 振荡使 DNA 溶解 。加 20;iL3mol/L 乙 酸钠及 2ML 1 mol/L MgCl2, 在旋涡 混合器 中振荡 混合。 (13) 加 600yL 的 100% 乙醇 ,来 回颠倒 混合。 在干冰 / 乙醇 中冷冻 lOmin, 置于室 温 5min。 室 温下以 最大速 度离心 15min, 沉淀 DNA, 弃去上 清液。 (14) 加 800fiL 75% 的乙醇 ,在旋 涡混合 器中振 荡混合 。室 温下以 最大速 度离心 15min, 沉淀 DNA, 弃去上 清液。 (15) 在真 空蒸发 器中小 心抽干 DNA 沉淀块 ( 有时静 电会将 沉淀崩 出管子 )。 (16) 将 DNA 溶解于 20(VLTE 缓 冲液中 ,测定 A26〇 及 A28Q。 对于 序列特 异性的 DNA亲和介质,假定lA26() = 40 ^Jtg/mLDNA。DNA可无限期地保存于-20t:。 四、 DNA 亲和 层析法 1. 原理 亲 和层析 法被用 于纯化 特异性 结合某 一确定 DNA 序列的 蛋白质 。它 可将特 异性结 合的 蛋白质 与非特 异性结 合的蛋 白质分 离开来 。当蛋 白质溶 液通过 DNA 亲和 层析柱 时 ,可同 DNA 特异性 结合的 蛋白质 就被结 合上去 ,而 非特 异性蛋 白质即 使结合 后也会 被洗 脱下来 。如此 ,蛋 白质就 被纯化 (见图 9.5)。 如果用 两个特 异性的 DNA 亲 和层析 柱, 某种蛋 白质可 被纯化 500 倍乃至 1000 倍, 而其得 率则在 30% 以上。 2. 材料 制 备性的 DNA 亲 和树脂 Z 系列 缓冲液 或其他 柱系列 缓冲液 (如 Ze 或 TM) (KC1 的浓 度不同 ,从 0.1~1 mol/L) 用 Z/0.1 m〇l/L KC1 溶解的 欲纯化 的蛋白 质片段 非特异 性竞争 DNA 柱再生 缓冲液 (10mm〇l/LTris-HClpH7.8, lmmol/LEDTApH8.0, 2.5mol/L NaCl, l%NP-4〇, 室 温保存 。由 于本溶 液会分 成两层 ,因此 ,在 使用前 一定要 混匀) 柱贮存 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7.8, 1 mmol/L EDTA pH8.0, 0.3 mol/L NaCl, 室 温保存 。临用 前加入 〇.〇4% 叠氮钠 ) 层析柱 液氮 • 708 . 合 成寡核 苷 酸粗品 已纯 化的寡 核苷酸 经 丙烯酰 胺凝胶 或 HPLC 纯化 寡 核苷酸 A 寡 核苷酸 B 磷酸化 连接 □□□□□□□□□□□□ 介质 蛋白质 粗提物 常规层 析分离 部 分纯化 的 提取物 加 入竞争 DNA 亲 和柱起 始材料 加 样于亲 和介质 增加 盐浓度 收 集组分 分析 DNA 结 合活性 用 SDS-PAGE 检 査纯度 图 9.5 用 DNA 亲和层 析纯化 序列特 异性的 DNA 结 合蛋白 图 中所示 为本章 所述的 各种层 析方法 DNA 结合 反应及 SDS-PAGE、 银 染所需 的试剂 及设备 3. 试 剂配制 Z 缓冲液 : 25mmol/LHEPES (K+ 盐) pH7.6, O_lmol/L 或 lmol/LKCl, 12.5 〇1111〇1/1^^(:12,1111111〇1/1^丁丁(用前力口入),20%甘油,〇.1%仰-400 用1<;01'1调节 pH 至 7.6。 TM 缓冲液 : 50 mmol/ L Tris-HCl pH7 . 9 , 0 . 1 mol/ L 或 1 mol/ L KC1 , 1 2 • 5 mmol/ L • 709 • MgCl2, lrmnol/LDTT (用 前加入 ), 20% 甘油, 0.1% NP-40。 Ze 缓冲液 : 25 mmol/L HEPES (K’ 盐) pH7.6, 0.1 mol/L 或 1 mol/L KC1, 1 mmol/LDTT (用 前加入 ), 20% 甘油, 0.1% NP-40〇 用 KOH 调节 pH 至 7.6。 以上 3 种溶液 均不能 配制成 l〇 x 缓冲液 。为 了得 到不同 浓度的 KC1, 可先分 别配制 500mL 不含 KC1 与含 lmol/LKCl 的溶液 ,用时 ,按一 定比例 混勻, 并加入 DTT。 4. 操 作步骤 (1) 上清在 重力作 用下加 于柱上 (如 15mL/h 每 Sepharose.CL-2B 柱 )。 一 般说来 , lmL 的 柱足以 进行普 通的核 酸提取 ( 可提取 12L 的 HeLa 细胞或 150g 组织 ), 如果需 进行大 量提取 ,可 考虑用 多个的 lmL 柱 。每 lmL 的 柱可上 50mL 的蛋白 样品。 (2) 加样 完毕后 ,用 缓冲液 Z/0.1m〇l/LKCl 流洗 4 次 ,每次 2mL, 要淋洗 柱的内 侧壁。 (3) 从柱子 上洗脱 蛋白, 依次加 lmL 缓冲液 Z / 0.2mol/L KC1、 Z / 0.3mol/L KC1、 Z / 0.4mol/L KC1、 Z / 0.5mol/L KC1、 Z / 0.6mol/L KC1、 Z / 0.7mol/L KC1、 Z/O.8mol/LKC1、 Z/O.9mol/LKC1, 之后加 lmL 缓冲液 Z/ lmol/LKCl 洗 3 次 。与 所加的 lmL/ 份缓冲 液相应 ,收 集各 lmL 级分 。将这 些蛋白 样品在 液氮中 速冻, 保存于 - 80t: 。 样品一 般可保 存至少 2 年。 (4) 用 DNA 结合分 析法分 析各蛋 白组分 中序列 特异性 DNA 结 合活性 。用 SDS- PAGE 电 泳及银 染观察 蛋白估 计蛋白 组分的 纯度。 (5) 按如下 方法再 生亲和 介质: 室温下 ,停止 柱流洗 ,在 柱上加 2mL 柱再 生缓冲 液。 用一支 硅化了 的细玻 璃棒搅 拌介质 ,使介 质与再 生缓冲 液混合 ,让 缓冲液 流出柱 子 。重复 1 次。 (6) 要保 存柱子 ,则加 10mL 柱保存 缓冲, 让其缓 慢流过 。重 复此步 洗涤, 然后封 闭柱 的下端 ,再加 5mL 缓冲液 。封 闭柱 的上端 ,置于 4T: 可保存 1 年。 五 、非 同位素 竞争性 DNA 的选择 和制备 在某一 个给定 实验中 ,竞争 物的量 及种类 都必须 经实验 来确定 。有一 种经典 的方案 是蛋 白质样 品与各 种量的 不竞争 DNA 混合 ,用 诸如凝 胶迁移 率变动 分析或 DNA 酶 I 足迹 分析方 案测定 DNA 的结合 。然 后将对 DNA 结合 性抑制 最小的 竞争性 DNA 应用于 DNA 亲和 层析。 首先 ,测定 DNA 结 合反应 中不干 扰序列 特异性 因子的 结合所 能加入 的最大 量的竞 争性 DNA。 最适量 竞争性 DNA 的 确定将 随部分 纯化的 蛋白样 品的纯 度而有 所不同 。含 非 特异性 DNA 结合蛋 白的组 分越多 ,一般 需要的 竞争性 DNA 就越多 ,所 以用 于各蛋 白 组分的 DNA 的最适 量必须 由实验 来测定 。其次 ,竞 争性 DNA 的 量是用 每体积 (mL) 蛋白 组分加 DNA 的质量 (mg) 来估 算的; 这是 由于 竞争性 DNA 可能通 过与粗 提物 中的高 亲和性 、非 特异性 DNA 结 合蛋白 形成复 合物而 起作用 。由初 步实验 扩大到 完 全规模 的实验 ,若 结合反 应体积 扩大, 可使用 所需要 量的五 分之一 。例如 ,在 足迹法 实验中 4f/L 的反 应体积 中需要 poly(dA-dT) 的量为 2@, 而进行 纯化时 溶液的 体积为 • 710 • 4mL, 则反应 所需的 非特异 性竞争 DNA 的量为 2 X l〇〇〇/5 = 400吨。 不同的 竞争性 DNA 可 被用在 同一个 实验中 。在实 验中所 需的非 特异性 竞争性 DNA 量是 由欲纯 化的溶 液中所 含的非 特异性 蛋白质 的量所 决定的 ,一般 说来, 溶液中 非特异 性 蛋白质 的量大 ,其所 需的非 特异性 竞争性 DNA 量也 就多。 制备 poly (dA-dT)、 poly (dG-dC) 及 poly (dl-dC) 时 ,可将 所需的 竞争性 DNA 溶于 TE 缓冲液 /lOOmmol/LNaCl 到浓度 10A26G 单位 。再 将样品 加热到 90X:, 在 30 〜 60min 内缓 慢冷却 到室温 。如果 DNA 的平 均长度 >lkb, 则 用超声 法降解 。用琼 脂糖凝 胶电泳 来估计 DNA 的 长度。 六 、方 法评注 1) 背 景资料 纯 化序列 特异性 DNA 结合 蛋白一 直是一 个难题 ,这 是由于 其在细 胞内的 含量极 低 。现在 已能够 快速简 便有效 地利用 合成的 含有结 合位点 的寡聚 核苷酸 来得到 相应的 DNA 结合 蛋白。 本节所 描述的 方法现 已发展 成为一 种常规 的方法 ,用该 方法, 人们已 纯 化得到 50 余 种序列 特异性 DNA 结合 蛋白。 一 般说来 ,在制 备亲和 介质时 ,用 CNBi •活化 是十分 重要的 ,它可 增加介 质的亲 和性。 2) 实验参 数及注 意事项 在进 行亲和 层析纯 化所需 的蛋白 质之前 ,先用 DNase I 足迹法 粗略估 计所需 的蛋白 质 的结合 位点; 再测 定结 合的最 适条件 ( 如温度 、离子 强度、 pH 及 Mg2+ 浓度 ); 另 外 ,还 需测定 非特异 性竞争 DNA 的 浓度; 最后 ,也是 最重要 的是要 制备一 个不含 DNA 结合位 点的阴 性对照 介质。 3) 预期结 果和实 验时间 在进 行两轮 亲和层 析后, 一般可 将蛋白 质纯化 500 〜 1000 倍 ,其得 率高达 30%, 浓度为 5 〜 50/jtg/mL。 而足 迹法实 验仅需 0.2~lpL 的 蛋白质 。亲和 介质在 4C 下可保 存 1 年以上 。纯化 后的蛋 白质在 -80t: 下 可贮存 2 年以上 。值 得注 意的是 ,蛋白 质样品 应 在液氮 内速冷 ,融解 时应在 室温中 水浴使 其迅速 解冻。 制备 DNA 亲和 介质需 2d, 亲和层 析则需 4~8h。 朱帆 部金荣 主要参 考文献 Abmayr, S.M., Workman, J.L. and Roeder, R.G. 1988. 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Krebs 里程 碑式的 阐明了 磷酸化 在糖代 谢中的 重要调 控作用 ,二 人被授 予诺贝 尔医学 与生理 学奖。 蛋白质 磷酸化 的过程 很简单 ,就 是蛋 白或多 肽底物 在合适 的蛋白 激酶的 催化下 ,将 ATP 的 磷酸基 转移到 丝氨酸 、苏氨 酸或酪 氨酸残 基的羟 基上来 。磷 酸化 的蛋白 质也可 以在 蛋白磷 酸酶的 作用下 水解而 脱磷酸 。磷酸 化与脱 磷酸反 应迅速 ,蛋白 质的构 象和活 性因此 得以可 逆的快 速改变 。组 氨酸 、半胱 氨酸、 天冬氨 酸等氨 基酸也 可以发 生磷酸 化 ,其 对于蛋 白功能 的调节 作用目 前研究 甚少。 蛋 白质磷 酸化是 蛋白功 能可逆 调节的 最重要 最常见 的机制 。经研 究发现 ,在 哺乳动 物细胞 中约有 1/3 的蛋白 质受磷 酸化共 价修饰 。在多 种生命 过程中 ,蛋白 质磷酸 化与去 磷酸化 起着非 常重要 的作用 。信号 转导途 径中对 于激素 、神 经递 质和生 长因子 等的刺 激, 相关蛋 白质的 反应是 发生磷 酸化与 去磷酸 化的快 速变化 。以下 所举就 是这种 蛋白质 功 能调节 方式的 最常见 的例子 。① 大多数 多肽生 长因子 ( 如血小 板生长 因子和 表皮生 长因子 ) 和细 胞因子 (如 IL-2、 CSF-1 和 y-IFN) 在 结合上 它们的 受体时 激活受 体发生 磷 酸化; 而受 体的 磷酸化 反过来 又激活 细胞质 内的蛋 白激酶 (如 raf、 MEK 和 MAP Ki- nases)。 ②细 胞周期 进程由 CDK 磷酸化 及去磷 酸化调 节 GVS 和 G2/M 的转变 。③细 胞分 化和发 育也由 磷酸化 调控。 如果蝇 视网膜 R7 细胞 的发 育和秀 丽新小 杆线虫 阴门的 发育 ,都依 赖于受 体和细 胞蛋白 激酶的 功能。 ④代谢 。如 葡萄糖 和糖原 的互变 及葡萄 • 716 • 糖 的运输 ,也 是由磷 酸化调 节的。 蛋白 质磷酸 化目前 仍是信 号传导 研究中 的热点 ,一 些经典 的方法 仍然沿 用至今 。本 章第一 节叙述 了活体 培养细 胞摄取 32P 标记的 无机磷 酸盐, 而对磷 酸化蛋 白质进 行生物 合成 放射性 标记, 以及如 何从培 养细胞 或组织 中提取 含目的 蛋白的 细胞裂 解产物 。裂解 产物 可以直 接电泳 ,放射 自显影 观察目 的条带 的磷酸 化情况 ,或对 目的蛋 白进行 进一步 分析 。可以 利用特 异性的 抗体从 细胞裂 解产物 中以免 疫沉淀 的方法 检测目 的蛋白 ,或提 取有 活性的 酶成分 ,此方 法在第 二节中 说明。 研究中 常常需 要了解 磷酸化 的残基 ,第二 节还 介绍了 酸水解 结合双 向薄层 电泳鉴 定磷酸 氨基酸 。未进 行放射 性标记 的细胞 裂解产 物电泳 分离各 组分后 ,转移 至膜介 质上, 可以用 Western Blot 检测 磷酸化 蛋白质 ,第三 节分别 介绍了 非放射 的增强 化学发 光法和 125I- 蛋白 A 放射性 检测两 种方法 。蛋白 质脱磷 酸 后等电 点改变 ,影响 其电泳 迁移率 ,可 以通 过比较 磷酸酶 水解前 后的电 泳迁移 率来推 断 蛋白质 磷酸化 ,此种 方法适 用于未 标记的 磷酸化 蛋白质 ,也于 第三节 中介绍 。第 四节 描述 了用人 工合成 的小肽 检测蛋 白激酶 活性的 方法, 以单位 时间内 小肽磷 酸化的 情况反 映激酶 的活性 ,同样 的方法 也可用 于磷酸 酶活性 的检测 。另外 ,本章 在最后 (第 五节) 还 概述了 一些新 的需要 特殊仪 器的蛋 白磷酸 化检测 方法。 第一节 磷酸化 蛋白质 的标记 和制备 一、 32P 标记培 养细胞 1. 原理 培养 细胞在 体外具 有良好 的活性 ,能 进行正 常的生 理活动 。其 在体外 生存、 生长、 繁殖的 过程中 ,需 要从培 养液中 摄取各 种成分 。同样 ,细胞 内蛋白 质在磷 酸化过 程中需 要从外 界摄取 磷酸盐 。如果 在培养 液中以 32p〇r 代替 一般的 磷酸盐 ,则 32p 可被 培养细 胞摄取 并被合 成至蛋 白质上 ,因 此可以 对蛋白 质进行 胞内的 32p 生 物合成 标记。 2. 材料 待标 记的培 养细胞 标记 培养液 :不含 磷酸盐 的细胞 培养液 (如 DMEM) 未对 磷酸盐 透析过 的血清 混于 HC1 中的 ICi/mL H332P04 C02 培养箱 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 带橡 皮塞的 普通玻 璃试管 塞有 脱脂棉 的一次 性吸管 低速 离心机 . 717 . 3. 操 作步骤 (1) 培养待 标记的 细胞至 对数生 长期。 对数生 长期的 细胞最 有活力 ,细胞 中磷酸 盐的转 运达到 最高峰 ,除非 研究静 止期细 胞的蛋 白质磷 酸化 ,一般 待标记 的贴壁 细胞不 能汇合 ,非贴 壁细胞 不要达 到最大 密度。 (2) 标记前 3 〜 18h 换 新鲜的 培养液 1 次, 以利于 标记。 (3) 用适量 不加标 记物的 37X: 预热 的标记 培养液 (含 10% 血清) 洗涤培 养细胞 1 次。 贴壁细 胞直接 吸去原 培养液 ,加 入适量 上述标 记培养 液洗净 残存的 原含磷 酸盐培 养液, 然后吸 净。 非贴壁 细胞须 先转至 试管中 , 18〇〇xg 离心 lmin, 吸去培 养上清 ,再 加入适 量上述 标记培 养液重 新悬浮 ,再次 离心吸 去该培 养液。 (4) 加 入适量 37t: 预 热的含 10% 血清的 标记培 养液。 贴 壁细胞 液体加 入量为 : 35mm 培 养板加 0.75mL, 50mm 培 养板加 2~2.5mL, 100mm 培 养板加 2.5~5mL。 非贴壁 细胞每 107 细 胞加入 2mL, 悬浮 后再转 至合适 的培养 皿中。 (5) 加入 HfP04, 使终 浓度为 0.1 〜 2mCi/mL, 摇匀。 在放射 防护屏 后操作 ,使 用塞有 脱脂棉 的防气 溶胶的 Tip 头 ,根据 放射衰 减情况 ,每 lmL 培养液 加 0.1 〜 10fxL 左右标 记物。 (6) 将培养 皿放入 37X: 预 热的可 防放射 线的有 机玻璃 盒子中 ,转至 C〇2 培 养箱中 培 养合适 时间。 (7) 标记结 束后, 连盒子 取出培 养细胞 ,放在 4t: 冰 箱里。 4. 方 法评注 本方 法采用 32P 体外 标记培 养细胞 ,可以 标记任 何含磷 的细胞 成分, 可用于 各种贴 壁 和非贴 壁培养 的昆虫 、禽类 和哺乳 类细胞 。方 法简单 ,标记 效率高 ,放 射污 染小。 多数情 况下, 蛋白质 中的磷 总在不 断得到 与丢失 。因此 ,在 32P 加进 去之后 ,早期 和新 合成的 蛋白都 很快被 32P 标记 ,而 RNA 和 DNA 则需过 夜才被 标记上 ,这一 点对蛋 白标记 来说非 常有利 。而且 ,酪 氨酸蛋 白激酶 、磷酸 化酪氨 酸的这 种磷的 流动比 磷酸丝 氨酸 、磷酸 苏氨酸 的更快 。因此 ,在 短暂标 记中这 些蛋白 将被优 先标记 。如果 要在蛋 白、 脂质或 RNA 中有大 量稳定 的标记 ,最 好标 记过夜 。在 这种条 件下, 细胞中 有活性 ATP 和高相 对分子 质量的 磷酸盐 的水平 接近培 养基中 磷酸盐 的水平 。而且 ,蛋白 、脂 质或 RNA 中 标记物 (32P) 的量能 反映出 磷酸盐 的总量 ,而不 是磷酸 盐的流 动速率 。还 有一 点也值 得注意 ,放射 性损伤 能影响 p53 致使细 胞周期 停止。 如果用 32P 标记 了过长 时间再 去收获 ,细 胞可 能已停 止生长 广。 细胞 一 ■般 可耐受 2mCi/mL 6h, 耐受 0. 1 ~ 0.5mCi/mL 18h。 Mike Weber 和 Doc Edlin 很早 就发现 6h 左右 胞内的 ATP 和培 养基中 的磷 酸盐就 达到了 平衡。 因此, 32P 标记 没有必 要超过 6h。 本实验 一 般标记 l~2h 已 足够。 注意 :同位 素操作 应严密 注意放 射性防 护和环 境污染 。无 屏蔽的 32P 可穿透 进体内 lcm 深处 ,暴露 于皮肤 和眼睛 是十分 危险的 。处理 32P 时须 戴手套 和防护 眼罩, 且须在 放射防 护有机 玻璃屏 后操作 。实验 废弃物 按同位 素废物 处理。 细胞 培养应 注意无 菌操作 ,相关 试剂及 器材应 灭菌。 • 718 • 二 、制 备细胞 裂解物 标记好 的细胞 内即含 有目的 磷酸化 蛋白质 ,需用 细胞裂 解液进 行裂解 ,制 备含有 32P 标记目 的蛋白 质的可 溶细胞 裂解物 ,以便 对目的 蛋白进 行凝胶 电泳、 免疫沉 淀等分 析或进 行蛋白 纯化。 1. 材料 标记 好的培 养细胞 预冷的 PBS, pH7.4 RIPA 裂解 缓冲液 (l%NP-40, 1% 脱氧胆 酸钠, 0.1%SDS, 0.15mmol/LNaCl, 0.01 mmol/L Na3P〇4 pH7.2, 2mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaF, 0.2 mmol/L Na3V〇4, lOOU/mL PMSF) 温 和裂解 缓冲液 (10 mmol/L NaCl, 20 mmol/L PIPES pH7.0, 0.5% NP-40, 0.05% 2- 巯基 乙醇, 5 mmol/L EDTA) 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 带橡 皮塞的 普通玻 璃试管 一次 性吸管 塞有 脱脂棉 的防气 溶胶的 Tip 头 带螺 口盖的 1 . 5mL Eppendorf 管 橡皮细 胞刮子 低速 离心机 4X: 冷 冻高速 离心机 2. 操 作步骤 (1) 取出 标记好 的培养 细胞, 放在放 射防护 屏后。 (2) 用 预冷的 PBS 洗涤 标记好 的细胞 2 次。 贴壁 细胞直 接吸去 培养液 ,加入 2~10mL 预冷的 PBS 洗涤 ,同 样吸去 。非 贴壁细 胞须先 转至试 管中, 1800 xg 离心 lmin, 吸去培 养上清 ,再加 入适量 预冷的 PBS 重 新悬浮 ,再 次离心 吸去该 上清。 (3) 加入适 量预冷 的裂解 缓冲液 41C 裂解 20min。 贴壁 细胞加 入裂解 缓冲液 (0.3mL/35mm 培 养皿, 0.6mL/50mm 培养皿 , l.OmL/lOOmm 培养 皿 ), 用橡皮 细胞刮 子刮下 细胞, 41C 放置 20min。 非贴壁 细胞每 107 细胞加 〇.5~1.0mL 裂解 缓冲液 悬浮 ,轻轻 混匀, 4X: 放置 20min。 放 置过程 中每隔 数分钟 即振荡 ,以促 进裂解 , 且使之 均质。 (4) 将裂 解物转 入带螺 口盖的 l_5mL Eppendorf 管中 ,以 26G 针头反 复抽吸 几次, 打散大 的沉淀 。低 温离 心机中 4X: 以 16 000 X g 离心 30min。 管内液 体不要 太满, 以防溅 出污染 。用 RIPA 缓冲 液制备 裂解时 ,由 于细胞 核的溶 解常使 裂解物 很黏稠 ,此时 可将离 心时间 延长至 90min 或 在离心 前加入 50fiL 固 相化金 黄色葡 萄球菌 ,以 使核酸 沉淀。 (5) 所得 上清即 为细胞 裂解物 ,即可 用于凝 胶电泳 ,免 疫沉淀 或蛋白 质纯化 。也可 . 719 . 于 -70X: 保存, 避免反 复冻融 。贮存 的时间 取决于 自动辐 射分解 和同位 素的半 衰期。 3. 方 法评注 对于 大部分 标记细 胞而言 ,经本 方法处 理后可 有效得 到可溶 的细胞 裂解物 ,以 用于 对细 胞成分 的进一 步分析 。所得 的细胞 裂解物 上清可 用于多 种分析 ,如可 以直接 电泳, 放射自 显影观 察目的 条带的 磷酸化 情况; 或利 用特异 性的抗 体以免 疫沉淀 的方法 检测目 的蛋白 ,提 取有活 性的酶 成分。 实验中 应根据 不同的 要求选 择不同 的裂解 缓冲液 。如果 需要降 低由非 特异杂 质造成 的非特 异背景 ,可 使用 RIPA 裂解 缓冲液 。如 果要求 保持酶 的活性 或蛋白 质复合 物的结 构 ,可 使用含 NP-40 的温 和裂解 缓冲液 。要完 全溶解 细胞和 使蛋白 质变性 ,应 采用 SDS 裂解 方案。 三、 SDS 煮 沸法裂 解细胞 有些蛋 白质在 RIPA 裂 解缓冲 液或温 和裂解 缓冲液 中很难 溶解; 有些 抗体只 能识别 蛋白质 变性后 暴露出 的表位 。在 这种情 况下, 需要用 SDS 完全溶 解标记 的细胞 。同 时, 需要调 整裂解 缓冲液 的成分 以适应 后续的 免疫沉 淀反应 ,可 加入 RIPA 校正液 。为 避免 二硫键 的错配 ,裂 解缓 冲液中 可加入 lmmol/L 的 DTT。 某 些细胞 (如血 小板) 裂解产 物 直接以 SDSPAGE 和 放射自 显影观 察磷酸 化结果 ,可直 接加入 2 x SDS~PAGE 加样缓 冲液, 沸水浴 5min 后上样 电泳。 1. 材料 预冷的 PBS, pH7.4 SDS 裂解 缓冲液 (0.5 % SDS, 0.05 mol/1 Tris-HClpH8.0, 1 mmol/1 DJT) RIPA 校正液 (1.25%NP-40, 1.25% 脱氧 胆酸钠 , 12.5 mmol/LNa3P04pH7.2, 2mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaF, 0.2 mmol/L Na3V04, lOOU/mL PMSF) 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 带橡 皮塞的 普通玻 璃试管 —次 性吸管 塞有 脱脂棉 的防气 溶胶的 Tip 头 带螺 口盖的 1 . 5mL Eppendorf 管 橡皮细 胞刮子 沸水浴 低速 离心机 4X: 冷 冻高速 离心机 2. 操 作步骤 (1) 取出 标记好 的培养 细胞, 放在放 射防护 屏后。 • 720 • (2) 用 预冷的 PBS 洗涤 标记好 的细胞 2 次。 贴壁 细胞直 接吸去 培养液 ,加入 2~10mL 预冷的 PBS 洗涤 ,同 样吸去 。非 贴壁细 胞须先 转至试 管中 , 1800 离心 lmin, 吸去培 养上清 ,再加 入适量 预冷的 PBS 重新 悬浮, 再次离 心吸去 上清。 (3) 加入 适量的 SDS 裂解缓 冲液。 贴壁 细胞加 入裂解 缓冲液 (0.1mL/35mm 培养皿 , 0.25mL/50mm 培养皿 , 0.5mL/100mm 培养 皿 ), 立即 用橡皮 细胞刮 子刮下 细胞。 非贴壁 细胞每 5X107 细胞加 l.〇mL 裂 解缓冲 液悬浮 ,旋 涡振荡 器 上短暂 混匀。 (4) 转 至带螺 口盖的 1.5mLEppendorf 管 ,煮沸 2~5min。 (5) 加入 4 倍 体积的 RIPA 校正液 ,充分 混匀。 (6) 低温离 心机中 4X: 以 16 000Xg 离心 90min, 所得上 清即为 细胞裂 解物。 四、 免疫沉 淀法制 备分析 磷酸化 蛋白质 1. 原理 所要制 备的磷 酸化蛋 白质或 激酶以 液相的 形式存 在于细 胞裂解 物中, 它可与 相应的 抗体相 结合形 成可溶 的抗原 抗体复 合物。 抗原抗 体复合 物则可 和蛋白 A-Sepharose 混合 物 发生非 特异性 的结合 (主要 是抗体 和蛋白 A 的作用 ), 在 免疫沉 淀缓冲 液的作 用下形 成不溶 的沉淀 ,可 以通 过离心 而分离 出来。 2. 材料 制备好 的细胞 裂解物 可溶 性抗体 ( 如抗磷 酸酪氨 酸抗体 ,抗蛋 白激酶 抗体等 ,单克 隆多克 隆抗体 均可) 免 疫沉淀 缓冲液 (1% Triton X-100, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH7.4, lmmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA pH8.0, 0.2 mmol/L Na3V〇4, 0.2mmol/L PMSF, 0.5% NP-40) 蛋白 A-Sepharose 混合物 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 摇 摆平台 带橡 皮塞的 普通玻 璃试管 一次 性吸管 塞有 脱脂棉 的防气 溶胶的 Tip 头 带螺 口盖的 1 . 5mL Eppendorf 管 3. 操 作步骤 (1) 2 〜 5吨 可溶 性的抗 体加至 0.2mL 细胞 裂解物 (约含 〇.2 〜 l.Omg 蛋白) 中。 (2) 4X: 下缓 慢振荡 lh。 (3) 如果使 用可溶 的单克 隆抗体 ,再 加入等 量的二 抗如兔 抗鼠。 4X: 下 再保温 30min, 缓慢 振荡。 . 721 . (4) 取适 M 的蛋白 A-Sepharose 混合物 ,以免 疫沉淀 缓冲液 洗涤, 4X: 下 16 000Xg 离心 4min, 用免 疫沉淀 缓冲液 把蛋白 A-Sepharose 混合 物配成 50% 的 悬液。 (5) 加入 20~50pL 50% 的蛋白 A-Sepharose 悬 液至第 2 或第 3 步的免 疫复合 物中, 41C 下继 续振荡 90min, 保持 Sepharose 呈混 悬状。 (6) 以1〇^免疫沉淀缓冲液洗涤复合物,4^:下16 000 \$离心4111丨11,至少洗涤 3 次。 (7) 4t: 下 16 000Xg 离心 3min, 收集沉 淀。- 4. 方 法评注 免疫沉 淀法可 用于复 杂蛋白 质混合 物中靶 抗原的 定性与 定量, 整个实 验均在 液相中 进行 ,可以 较好的 保持目 的蛋白 的结构 、功能 和活性 。方 法特异 、敏感 ,具有 高选择 性 。本 实验与 SDS^PAGE 结合 ,经过 放射自 显影, 可用于 32P 标记 的磷酸 化蛋白 质的检 测与 定量, 可检测 出低至 l〇〇pg 的放射 性标记 蛋白。 也可用 于非标 记的蛋 白激酶 、磷酸 酶的 制备。 所得的 沉淀即 可用于 SDSPAGE 分析。 向沉淀 中加入 20 〜 50^L 1XSDS 加 样缓冲 液 ,先不 用旋涡 振荡器 ,以免 使沉淀 黏附在 管壁。 l〇〇t: 水浴 5min, 旋涡 振荡, 高速离 心数秒 ,取 上清点 样电泳 。电泳 完毕后 ,置 胶于滤 纸上, 以保鲜 膜包裹 ,真空 干燥凝 晈 ,使 用增感 屏进行 放射自 显影。 如果以 蛋白激 酶抗体 进行免 疫沉淀 ,则 可用 此法制 得有活 性的蛋 白激酶 。使 用前须 在 4t: 下 用激酶 缓冲液 (10mmol/LTrispH7.4, 150mmol/LNaCl, 10mmol/LMgCl2, 0.5mmol/LDTT) 洗涤免 疫复合 物沉淀 3 次。 实验中 ,如 需建 立对照 ,细 胞裂解 物中不 加抗体 或加入 不相关 的抗体 ,然后 进行后 续处理 即可。 第二节 标记的 磷酸化 蛋白质 的检测 一、 SDS-PAGE 检测 SD&PAGE 检测 是一种 比较粗 略的检 测方法 。细 胞裂解 物中的 各蛋白 组分在 SDS 和 2-ME、 DTT 的作用 下分解 为一系 列大小 不等的 亚基, 在合适 浓度的 SDS-PAG 上电 泳时 按相对 分子质 量大小 分开为 迁移率 不同的 条带。 32P 标 记的磷 酸化蛋 白组分 亚基也 按其相 对分子 质量大 小而位 于其中 的一个 条带上 ,通 过放射 自显影 而确认 其存在 。与相 对分子 质量标 准比较 ,就可 以判断 磷酸化 蛋白亚 基的相 对分子 质量。 反过来 ,也 可以证 实样本 细胞中 某一相 对分子 质量的 蛋白被 磷酸化 。可 以看出 ,这 种检测 方法不 是很确 切 。但 方法简 单易行 ,可 用于初 步分析 。如果 结合免 疫沉淀 方法, 从细胞 裂解物 中制备 出目 的蛋白 ,则 可通过 SDS-PAGE 进一 步验证 ,或检 测其相 对分子 质量。 SDS-PAGE 检测方 法简单 ,易 于操作 。首先 要制备 合适浓 度的聚 丙烯酰 胺凝胶 ,通 过预 实验确 认在该 浓度下 目的蛋 白可以 较容易 的分开 。将 32P 标记 好的细 胞制备 成可溶 的细咆 裂解物 ,取适 M 加入 2XSDSPAGE 加样缓 冲液, 沸水浴 5min 后上 样电泳 。同 • 722 • 时加 入合适 的相对 分子质 量标准 。电泳 完毕后 ,置 胶于 滤纸上 ,以 保鲜膜 包裹, 真空干 燥凝胶 ,使 用增 感屏进 行放射 自显影 。凝 胶染色 ,标 出相对 分子质 量标准 ,与放 射自显 影结 果比较 ,判断 目的蛋 白的相 对分子 质量。 对于 免疫沉 淀制备 的磷酸 化蛋白 ,所制 得的沉 淀可直 接用于 SDS-PAGE 分析 。向 沉淀 中加入 20 〜 5(VL1XSDS 加样 缓冲液 ,先不 用旋涡 振荡器 ,以 免使 沉淀黏 附在管 壁。 100X: 水浴 5min, 旋涡 振荡, 高速离 心数秒 ,取 上清点 样电泳 ,结 果直接 染色观 察 。如 果经过 32P 标记 ,则可 行放射 自显影 ,可 检测 出低至 100pg 的放射 性标记 蛋白。 二 、磷 酸氨基 酸分析 1. 原理 蛋白质 磷酸化 作用多 发生于 丝氨酸 、苏 氨酸和 酪氨酸 残基, 常常需 要对其 进行鉴 定。 Immobilon-P 转移膜 是一种 聚偏二 氟乙烯 (PVDF) 膜 ,蛋白 电泳后 电转移 至此膜 上 ,可以 用做磷 酸化蛋 白中磷 酸氨基 酸分析 的基质 。结 合在 膜上的 32P 标记的 蛋白经 5.7mmol/LHCl 作 用后, 90% 的 32P 以 Pi、 磷酸 氨基酸 、磷 酸肽的 形式水 解下来 。水解 下 的磷酸 氨基酸 经双向 电泳后 ,和同 时电泳 的标准 磷酸氨 基酸条 带比较 ,就 可以 判断目 的 蛋白中 是否含 有磷酸 丝氨酸 、磷酸 苏氨酸 或磷酸 酪氨酸 。结 合于 Immobilon-P 膜上的 蛋白经 1.0m〇l/LKOH55t: 下处理 2h 后 , 32P 标记 的磷酸 酪氨酸 很容易 被检测 ,而且 丢失蛋 白的量 不超过 10%, 对膜的 大小也 不会产 生很大 影响。 2. 材料 32P 标记 的磷酸 化蛋白 质样品 印度墨 汁染液 (lmg/mLPelicon 印 度墨汁 , 0.2% Tween-20, TBS) 5.7 mol/L HC1 标 准磷酸 氨基酸 混合物 ( 含磷酸 丝氨酸 、磷酸 苏氨酸 和磷酸 酪氨酸 ) ?只1.9电泳缓冲液(88%蚁酸50〇^,乙酸15611^,吆〇 179411^;不要使用98% 的蚁酸 ,无 需调整 pH) pH3.5 电泳 缓冲液 (嘧啶 lOmL, 乙酸 lOOmL, lOOmmol/LEDTAlOmL, H20 1880mL; 无 需调整 pH) 0.25% 茚 三酮丙 酮溶液 ,盛于 喷壶中 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 Immobilon-P 转移膜 [聚 偏二 氟乙烯 (PVDF) 膜 ,不夢 使用硝 酸纤维 素膜] 110X: 烤箱和 60X: 烤箱 带螺 口盖的 1 . 5mL Eppendorf 管 一次 性吸管 镊子 旋涡 振荡器 20cm x 2〇cm X lOO^m 纤维 素薄层 色谱板 . 723 . 25cm x 25cm 的 Whatman 3MM 滤纸 大玻 璃平皿 薄层电 泳装置 电吹风 透 明的投 影胶片 SDS^PAGE 所需 的试剂 和设备 3. 操 作步骤 (1) 32P 标记 蛋白质 ,将 蛋白质 样品以 SDSPAGE 分开 ,电 转移至 Immobilon-P 膜。 用水洗 膜数次 ,不 要让膜 变干。 (2) 用 30~50mL 印度 墨汁染 液染膜 5 〜 lOmin, 轻摇 至条带 出现。 或用放 射性墨 水 标记后 ,用 保鲜膜 包裹膜 ,作 放射自 显影。 (3) 剪下目 的条带 ,甲醇 润湿膜 lmin, 蒸馏水 漂洗。 (4) 放 入带螺 口盖的 1.5mLEppendorf 管中 ,加 入至少 ISOpiLSjmol/LHCl, 让 条带没 入液面 以下。 (5) 置于 110°C 烤 箱温育 6C min。 (6) 冷却后 , 15 000r/min 离 心至少 lmin。 (7) 上清转 入新管 ,冷冻 干燥。 (8) 以 6 — 10/uL 蒸溜 水悬浮 ,剧 烈旋祸 振荡, 15 000r/min 离心 5min。 (9) 取 25%~50% 的样品 点样于 20cmX20cmXl〇〇pm 纤维 素薄层 色谱板 (如图 10.1)。 分 次点样 ,每 次点加 0.25 〜 0.5/iL, 每次点 加后均 以一次 性吸管 吹干。 (10) 点 准磷酸 氨基酸 混合物 ( 含磷酸 丝氨酸 、磷 酸苏 氨酸和 磷酸酪 氨酸各 0.3#) 至每 个样 品之上 。如 上分次 点样。 (11) 2 层 Whatmann3MM 滤纸 叠起来 ,剪的 比色谱 板略大 ,在 点样点 对应的 位置剪 一直径 2cm 的圆 形小孔 ,可以 用软木 塞钻孔 器打孔 。以 PH1. 9 的电 泳缓冲 液浸湿 ,对 应的覆 盖至平 板上, 使色谱 板上的 4 个点样 点位于 滤纸的 4 个洞 中间。 图 10.1 纤维 素薄层 色谱板 加样点 完全润 湿平板 ,移去 滤纸。 (12) 将色谱 板置于 电泳装 置内, 在色谱 板的左 右两侧 0.5cm 边缘用 PH1. 9 的电泳 缓冲液 浸湿的 Whatmann 3MM 滤 纸搭接 ,排除 气泡。 (13) 第 一个方 向的电 泳使用 pH1.9 的 电泳缓 冲液, 1.5kV 电泳 20min。 (14) 取出色 谱板, 电吹风 吹干。 (15) 把 3 张叠起 来的长 方形的 Whatmann 3MM 滤纸用 pH3. 5 的缓冲 液浸湿 。先 润 湿下面 2 个点样 点底部 的平板 ,注 意让 吸水纸 距离样 品至少 lcm。 然 后润湿 4 个点样 点中间 的部分 。最 后润湿 色谱板 的顶部 。注 意不要 让吸水 纸过湿 ,以免 滴沥。 (16) 逆时 针旋转 色谱板 90。, 在 PH3.5 的缓冲 液中以 1.6kV 再电泳 13min。 以上电 泳时间 适宜于 Salk/TVL/MBVL 的电 泳设备 (CBS scientific 有售 ), 如 用其他 的设备 ,须摸 . 724 . 索最 佳电泳 时间。 (17) 60X: 烤箱中 烤干色 谱板。 (18) 往色谱 板上喷 0.25% 茚 三酮丙 酮溶液 ,再 置入烤 箱中, 直至标 准磷酸 氨基酸 显出紫 色斑点 。一 般须烤 15min 左右。 (19) 用放 射性墨 水标记 色谱板 ,便于 推断点 样点的 位置及 色谱板 、标 准鱗 酸氨基 酸的 位置。 (20) 将色 谱板在 -70X: 下使 用增感 屏放射 自显影 ,时间 2~10d。 推 荐使用 放射成 像仪 ,很 少的情 况下需 要定量 ,也 可以使 用放射 成像仪 (如图 10.2)。 (21) 在显影 完毕后 ,在一 张透明 的投影 胶片上 描记下 标准磷 酸氨基 酸和放 射性墨 水标记 的位点 ,以便 于和感 光片进 行比较 ,鉴 定放射 活性的 磷酸氨 基酸。 图 10.2 磷酸氨 基_ 酸双向 电泳放 射自显 影结果 4. 方 法评注 一 般而言 ,水 解后生 成的磷 酸化氨 基酸经 双向电 泳后其 放射自 显影的 图像很 清晰, 条带 锐利而 不弥散 ,而且 结果非 常稳定 ,产量 不受蛋 白分子 大小的 影响。 在 PH3. 5 的缓 冲液中 电泳时 ,标准 磷酸氨 基酸偶 尔会呈 严重的 涂抹状 ,可 能是由 于毛细 作用带 走了某 种物质 ,使 标准磷 酸氨基 酸相对 不可溶 。此 种物质 可能是 Al3+ 或 Ca2+。 出 现这种 情况时 ,可向 pH3.5 的 缓冲液 中加入 EDTA, 终 浓度为 〇.5mmol/L, 以螯和 金属阳 离子, 使条带 清晰。 由于 磷酸苏 氨酸和 磷酸酪 氨酸比 RNA 或磷酸 丝氨酸 更耐受 碱水解 ,转 移至 滤膜上 的样 品用温 和的碱 水解常 常能增 加含磷 酸苏氨 酸和磷 酸酪氨 酸的蛋 白质的 检测。 碱水解 反应不 妨碍随 后的磷 酸氨基 酸分析 ,经 碱水 解的条 带可从 滤膜上 切下来 进行酸 水解反 应 。方法 很简单 : 在第一 步和第 二步之 间把印 记好的 滤膜用 l〇〇〇mL 水充 分洗涤 2min, 连续 3 次后 ,放入 l.〇m〇l/LKOH 中, 551C 下温育 2h。 之 后洗涤 : 500mLTN 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl) 洗涤 5min; 500mL 1 mol/L Tris-HCl 口1^7.0洗涤51114;50〇1^水洗涤2次,每次5111111。接着染色显影,后续酸水解处理同前。 • 725 • 第 三节未 标记的 磷酸化 蛋白质 的检测 一、 Western Blot 检测未 标记的 磷酸化 蛋白质 (ECL 法) 1. 原理 抗磷酸 氨基酸 抗体可 以和磷 酸化蛋 白质中 的磷酸 氨基酸 表位相 结合。 未标记 的蛋白 质以 SDS*PAGE 分离后 转移至 硝酸纤 维素滤 膜上, 可以用 Western Blot 检 测蛋白 质中是 否含 有磷酸 氨基酸 ,以此 确定蛋 白质的 磷酸化 情况。 结合于 目的蛋 白上的 HRP 标记二 抗 可使检 测试剂 着色。 2. 材料 蛋白 质样品 (培 养细胞 、组织 、细胞 裂解物 ) 转移 缓冲液 ( 甘氨酸 57.6g, Tris 碱 12.0g, SDS3.0g, Na3VO4 370mg, 甲 '醇 800 mL, 加 H20 至 4L) 封闭 缓冲液 (5% BSA, 10 mmol/L Tris-HCl pH7_4, 0.15 mol/L NaCl) 清洗 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7.4, 0_ 15 mol/L NaCl) NP-40 清洗液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7. 4, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% NP-40 或 0.2% Tween-20) 抗磷 酸氨基 酸抗体 ECL 检测 试剂盒 (含 HRP 标记 的第二 抗体, HRP 检 测试剂 A 和 B) 沸水浴 垂直平 板电泳 设备和 转移电 泳设备 镊子 干 净的塑 料盒子 吸管 透明的 醋酸纤 维素膜 (可用 投影胶 片代替 ) 3. 操 作步骤 (1) 蛋白质 样品中 加入等 体积的 2XSDS 加样 缓冲液 ,煮沸 5min。 加入 50 mmol/L NaF 可 以抑制 丝氨酸 / 苏氨酸 磷酸酶 的活性 , 0.2 mmol/L Na3V04 可以抑 制酪氨 酸 磷酸酶 的活性 , 2 mmo 丨 /LEDTA 可以抑 制激酶 的活性 ,可 以避 免细胞 裂解后 发生磷 酸化或 去磷酸 作用。 (2) 加样做 SDSPAGE。 (3) 在跑 完胶前 ,对 转移缓 冲液进 行脱气 处理。 用转移 缓冲液 浸泡硝 酸纤维 素膜。 如 果使用 PVDF 膜 ,首 先用甲 醇将其 润湿, 稍后立 即用转 移缓冲 液洗去 甲醇。 (4) 电 泳完毕 ,准备 一 个大的 广口皿 ,盛 足量的 转移缓 冲液, 要求各 层材料 都浸没 f 其中。 同时确 定电极 的方向 。按图 8. 10 装配 ,在各 层之间 避免有 气泡。 (5) 60V 转移 60mm。 蛋白 向阳极 泳动, 从胶转 移至滤 膜上。 • 726 • 如果 电泳时 间过长 ,一些 小的蛋 白将透 过滤膜 。出 现这种 情况时 ,应 缩短电 泳时间 。相反 ,一些 大分子 的蛋白 如果达 不到电 泳时间 ,则 转移效 果不好 ,需延 长电泳 时间。 (6) 结 束电泳 ,预 杂交。 用清 洗缓冲 液或直 接用水 漂洗膜 ,取 出晾干 。取适 量封闭 缓冲液 ,把 膜置于 其中, 室温温 育至少 30min, 间 或摇动 ,以封 闭非特 异性结 合位点 。此种 封闭缓 冲液可 以重复 使用。 如果用 BLOTTO、 脱 脂 奶粉和 Tween-20 封 闭的话 ,封闭 时间可 以缩短 ,且 对大多 数实验 不会影 响效果 。但 对抗磷 酸酪氨 酸抗体 而言, 最好用 BSA, 否则 会造成 很深的 背景。 如果用 ECL 法检测 ,不 要加 叠氮钠 ,叠 氮钠能 抑制 HRP, 影 响显色 检测。 (7) 换新的 封闭缓 冲液, 加入适 当稀释 的抗体 ,室 温温育 lh, 间或 摇动。 如果 没有用 抗体做 Western blotting 的经验 ,应将 抗体按 1:200、 1:500、 和 1:1000 稀释, 比较各 自的 效果。 (8) 按如下 步骤洗 涤膜: 清 洗缓冲 液洗漆 2 次 ,每次 lOmin; NP-40 清洗 液洗涤 lOmin; 再用清 洗缓冲 液洗涤 2 次 ,每次 5min。 洗涤 太久, 则减弱 信号; 太短, 则背景 加深。 (9) 换新 的封闭 缓冲液 ,加入 适当稀 释的针 对第一 抗体的 HRP 偶联 的第二 抗体, 室 温温育 lh, 间或 摇动。 一般 ,抗 鼠抗体 稀释为 1:5000; 抗 兔抗体 稀释为 1:10 000; HRP- 蛋白 A 稀释为 1:20 000。 (10) 按前述 步骤洗 涤膜。 (11) 准 备一个 与膜等 大的塑 料平皿 ,于其 中混合 等量的 ECL 试剂 A 和试剂 B。 一 般每平 方厘米 膜须加 0.125mLECL 显 色试剂 。如 膜较大 ,可适 当减少 试剂的 用量。 (12) 将膜 (含蛋 白质样 品的一 面向上 ) 浸入 HRP* 显色 试剂中 ,轻摇 60s。 注意让 膜始终 浸在液 面下。 (13) 取出膜 ,沥干 多余液 _ 。把膜 放在 一张透 明的醋 酸纤维 素膜上 ,使蛋 白面向 上, 在上面 再覆盖 一张醋 酸纤维 '素膜 。照相 保存。 4. 方 法评注 这种方 法很快 ,仅需 几分钟 的自显 影时间 ,操作 者也不 会接受 放射性 。但是 ,应注 意到此 方法的 局限性 。它不 能定量 ,而 且当样 品中含 大量蛋 白时容 易产生 伪信号 。条带 很 弱而不 易从背 景中区 分出来 ,尤其 是分析 细胞裂 物中酪 氨酸磷 酸化时 。未 处理 的正常 细胞酪 氨酸磷 酸化水 平很低 ,当用 ECL (增强 化学发 光法) 分析时 ,由 于裂解 物含大 量蛋白 ,信 号常 很微弱 。如 T 细胞或 B 细胞 活化时 微弱的 信号就 不易被 检测出 。建议 使用硝 酸纤维 素滤膜 ,此 膜的背 景要比 Immobilon-P 膜略浅 。叠 氮钠 能抑制 HRP, 在用 HRP 检测时 ,试剂 中不要 使用叠 氮钠。 二、 Western Blot 检测未 标记的 鱗酸化 蛋白质 (12SI- 蛋白 A 法) 1. 原理 未标 记的蛋 白质以 3DS-PAGE 分离 后转移 至硝酸 纤维素 滤膜或 Immobilon-P 膜上, • 727 . 抗磷 酸氨基 酸抗体 可以和 磷酸化 蛋白质 中的磷 酸氨基 酸表位 特异性 的结合 。放射 性碘标 记 的蛋白 A 可以 非特 异的结 合抗体 ,通过 放射自 显影使 X 光 片曝光 ,确 定样品 中的磷 酸化蛋 白质。 2. 材料 已印 记上样 品蛋白 的硝酸 纤维素 滤膜或 Immobilon-P 膜 封闭 缓冲液 (5% BSA, 10mmol/LTris-HClpH7.4, 0.15mol/LNaCl, 0.01% NaN3) 清洗 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7.4, 0. 15 mol/L NaCl) NP40 清洗液 (10 mmol/L Tris-HCl pH7.4, 0.15mol/l NaCl, 0.05% NP-40 或 0.2% Tween-20) 抗磷 酸氨基 酸抗体 (单克 隆抗体 、多克 隆抗体 均可) 125 1- 蛋白 A 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 一次 性吸管 镊子 干 净的塑 料盒子 吸管 Whatman 3 MM 滤纸 保鲜膜 • 3. 操 作步骤 (1) 用清 洗缓冲 液或直 接用水 漂洗膜 ,取 出晾干 。取适 量封闭 缓冲液 ,把膜 置于其 中, 室温温 育至少 30min, 间或 摇动, 以封闭 非特异 性结合 位点。 此 种封闭 缓冲液 可以重 复使用 。对抗 磷酸酪 氨酸抗 体而言 , 最好用 BSA 封闭液 , 因抗酪 氨酸抗 体可结 合牛奶 中很多 成分, 如果用 BLOTTO、 脱脂 奶粉和 Tween-20 封闭 的话, 会造成 很深的 背景。 (2) 换封闭 缓冲液 ,加 入适 当稀释 的抗体 ,室 温温育 lh, 间或 摇动。 抗 体溶液 可以反 复使用 5~10 次, 处理时 注意避 免丢失 ,于 4X: 保存。 (3) 按如下 步骤洗 涤膜: 清 洗缓冲 液洗漆 2 次 ,每次 10min; NP-40 清洗 液洗漆 l〇min; 再用清 洗缓冲 液洗涤 2 次 ,每次 5min。 (4) 将 125I- 蛋白 A 加至 封闭 缓冲液 。膜放 入其中 ,室 温温育 lh, 间或 摇动。 此时 缓冲液 可用封 闭时用 过的。 30~35mL 封 闭液中 约加入 10ML125I- 蛋白 A, 放 射量约 12 〜 14mCi。 此溶 液至少 可使用 3 次 ,但 只能用 于被同 一种抗 体处理 的印记 ,以 免交差 污染。 (5) 用 上述方 法再洗 涤膜。 (6) 用 Whatman 3MM 滤 纸吸干 ,放在 另一张 滤纸上 ,挺以 保鲜膜 ,用 增感 屏放射 自显影 ,或 以放射 成像仪 显影。 > • 728 • 4. 方 法评注 用 放射性 碘标记 的蛋白 A 去检测 抗体是 一种非 常先进 的方法 。它 能弥补 ECL 的一 些不足 。一 些低丰 度的蛋 白用二 抗进行 ECL 分 析效果 总很差 ,抗 体和杂 蛋白的 污染使 背 景很深 。蛋白 A 与抗体 的结合 相对要 比二抗 与抗体 结合要 少的多 ,样 品中杂 蛋白污 染很少 ,背 景较浅 。而对 样品进 行一系 列稀释 后处理 ,再用 放射成 像仪分 析可以 得到较 好 的定量 的结果 。碘 化蛋白 A 印记仍 可使胶 片曝光 ,还可 获得一 个较好 的图像 。如果 使用新 制的碘 化蛋白 A 印记 ,用放 射成像 仪可在 60min 内 得到可 定量和 加工的 图像。 黏附在 膜上的 蛋白可 以在放 射自显 影前进 行染色 。用 染液 (lmg/mLPelicon 印度 墨汁, 0.2% Tween-20, TBS) 染色 20~60min。 水漂洗 lh, 平 放晾干 。含 Tween-20 的缓 冲液能 洗脱抗 酪氨酸 抗体, 操作须 小心。 如果 需要进 行相对 分子质 量测定 ,则蛋 白电泳 时需加 上相对 分子质 量标准 。除 了肌 球 蛋白外 ,几 乎所有 的蛋白 都可以 被转移 并被印 度墨汁 染色。 转至膜 上以后 ,相 对分子 质量标 准条带 可以和 样品一 起收缩 或扩张 ,便 于准确 测定。 而且还 助于确 定转移 方向和 剪 下目的 条带。 第四节 蛋白激 酶活性 的检测 一 、合成 肽检测 蛋白激 酶活性 1. 原理 在检 测胞内 蛋白激 酶或研 究酶动 力学时 ,人 工合成 的小肽 底物特 别适用 。虽 然已经 有许 多不同 的方法 可以把 磷酸化 的肽段 从其他 的成分 中分离 出来, 但最常 用的方 法还是 使用含 基本残 基的合 成肽段 。这些 人工合 成的小 肽多为 6 〜 11 个氨基 酸残基 ,含 丝氨 酸、 苏氨酸 和酪氨 酸位点 ,能 被多种 蛋白激 酶识别 ,通 用性好 。以 单位时 间内底 物肽的 磷 酸化程 度来反 映激酶 的活性 。方 法简单 、敏感 ,还 可用于 酶动力 学研究 。同样 ,利用 磷酸 化的小 肽作为 底物也 可检测 磷酸酶 的活性 ,通过 检测磷 酸化的 小肽释 放出的 放射性 磷 酸基而 测定蛋 白质磷 酸酶的 活性。 2. 材料 蛋 白激酶 (免疫 沉淀制 备的蛋 白激酶 或细胞 裂解粗 提物) 人工 合成的 底物肽 (10mm〇l/L 贮存液 ) 5x 激酶 缓冲液 (5mg/mL BSA, 100 mmol/L Tris-HCLpH7.5, 50 mmol/L MgC^, 750mM NaCl, 2.5 mmol/L DTT) 1.0 mmol/L ATP 0.5 〜 lmCi/mL 32P-ATP 蒸馏水 2 x SDS-PAGE 加样 缓冲液 考马 斯亮蓝 染色液 (0.25% 考马斯 亮蓝, 45% 甲醇, 10% 乙酸) 729 • 脱色液 (40% 甲醇 , 10% 乙酸) 放射防 护有机 玻璃屏 可防 射线的 有机玻 璃盒子 带螺 口盖的 Eppendorf 管 37X: 水浴 沸水浴 SDSPAGE 凝 胶系统 放 射自显 影设备 3. 操 作步骤 (1) 4X: 下用 IX 激 酶缓冲 液洗涤 免疫沉 淀激酶 复合物 3 次。 (2) 准备一 个干净 的带螺 口盖的 Eppendorf 管, 加入以 下物质 ,以进 行酶促 反应: 5 x 激酶 缓冲液 5;xL 1.0 mmol/L ATP (终 浓度为 0.2 mmol/L) 5/iL 0. 5 〜 lmCi/mL 32P-ATP 5fiL 10 mmol/L 底物肤 (终 浓度为 1 .2 mmol/L) 3pL 蛋 白激酶 加水至 25 所用 的蛋白 激酶如 果是免 疫沉淀 所得, 使用之 前应在 4t: 下用 IX 激 酶缓冲 液洗涤 免疫沉 淀复合 物 3 次 ,真 空干燥 弃上清 。如果 是细胞 裂解粗 提物, 应在反 应体系 中加入 磷酸酶 抑制剂 (如终 浓度为 100 mmol/L 的轨 酸钠 )。 起始的 反应中 ,底 物肽 的浓度 一般为 0.7 〜 1.5 mmol/L; 探索 底物肽 最佳浓 度时, 可将底 物肽稀 释成一 系列浓 度梯度 ,分别 加至不 同的管 反应。 — 些酪氨 酸激酶 (如胰 岛素, IGF-1, 和 PDGF 受体 激酶) 需要 MnCl2, 或同 时需要 MgCl2。 一 般 二 价阳离 子的浓 度需要 靠经验 确定。 (3) 37^0 温育 15min。 (4) 加入 等体积 2 x SDS-PAGE 加样 缓冲液 以终止 反应, 沸水浴 5min。 (5) 10 000r/min 离心 lmin, 取上清 电泳。 (6) 固 定并染 色凝胶 ,脱色 ,晾 干。 (7) 以保鲜 膜包裹 凝胶, 使用增 感屏对 X 光片 放射自 显影。 激酶活 性以底 物肽磷 酸化 的程度 显示。 二 、快 速检测 蛋白激 酶活性 因为小 分子狀 底物和 标记的 ATP 在低 pH 的情 况下能 与磷酸 纤维素 滤膜结 合而难 以洗掉 。如 果条 件允许 ,可以 采用一 种快速 的检测 方法。 1. 附 加材料 预冷的 10% 三 氣乙酸 • 730 • Whatman P81 磷 酸纤维 素滤膜 (直径 2. lcm) 预冷的 0.5% 磷酸 盖革 记数器 丙酮 Scintillation 检测瓶 2. 操 作步骤 (1) 酶促反 应一定 时间后 ,每 管加入 45/uL 预冷的 10% 三 氯乙酸 ,振荡 ,以 终止 反应。 (2) 10 000r/min 离心 2min〇 (3) 取 35/mL 上清 点样至 2 . lcm 直径的 Whatman P81 憐酸纤 维素滤 膜上。 (4) 室温 下自然 晾干。 (5) 用 500mL 预冷的 0.5% 磷 酸洗膜 3 次 ,每次 5~10min。 洗涤时 可以用 盖革记 数 器加以 检测。 (6) 室 温下用 200mL 丙 酮洗膜 5min。 (7) 室温 下自然 晾干。 (8) 把 膜放入 Scintillation 检测 瓶中用 Scintillation 计数 器检测 放射性 。所得 的结果 减 去对照 的结果 即为底 物肽的 32P 标记 情况。 3. 方 法评注 用此 方法可 以了解 磷酸化 的进程 ,可 采取时 间点法 。准备 一个较 大的反 应体系 (如 150pL), 在到达 一个时 间点时 ,取出 25^L 反应物 至一含 45^L 预冷 10% 的三氯 乙酸的 EP 管中 ,用以 上方法 检测。 激酶反 应中每 个时间 点的计 量结果 (减去 对照) 可 以反应 生成的 磷酸盐 的量的 变化。 此外 ,通过 使用梯 度浓度 的底物 肽和改 变酶的 用量可 以进行 肽磷酸 化的动 力学分 析, 动力学 常数可 通过作 图和计 算机数 据分析 (NFIT, Island Products, Galveston, TX) 来 求得。 . 同样 ,利 用磷酸 化的小 肽作为 底物也 可检测 磷酸酶 的活性 ,通 过检测 磷酸化 的小肽 释 放出的 放射性 磷酸基 而测定 蛋白质 磷酸酶 的活性 ,并可 测定磷 酸酶的 动力学 参数。 第五节 需要特 殊仪器 的蛋白 质磷酸 化分析 放射性 同位素 标记法 分析蛋 白质磷 酸化是 人们广 泛应用 .的经 典方法 ,但 因为 涉及放 射 性操作 ,使 得它的 应用在 一些实 验室受 到限制 。而 且在某 一专一 蛋白激 酶或者 蛋白质 体外磷 酸化条 件还不 清楚的 情况下 ,放 射性方 法就不 适用了 。从 80 年代起 ,人 们开始 研究 蛋白质 磷酸化 分析的 非放射 性方法 。随着 一些特 殊分析 仪器的 研制成 功和应 用范围 的扩展 ,使 得非 放射性 方法分 析蛋白 质磷酸 化成为 可能。 因为这 些方法 需要比 较特殊 的仪器 ,操 作也比 较专业 ,非 本章内 容所及 ,在 此只介 绍其 基本原 理和应 用范围 ,以为 读者选 择方法 时提供 参考。 • 731 • 一 、毛细 管电泳 法 磷酸 化的蛋 白质或 多肽在 强酸性 条件下 可水解 为游离 的磷酸 氨基酸 ,在 PITC (苯 异硫氰 酸酯) 的 作用下 游离的 磷酸氨 基酸可 衍生为 氨基酸 。经 过毛细 管电泳 ,几 种 PTH- 氨基酸 可以几 乎无干 扰的分 离开, 以波长 261nm 的紫 外检测 器可检 测出来 。所 得 的峰与 PTH- 氨基酸 标准品 对照, 即可判 断出为 何种氨 基酸。 此方法 可用于 蛋白质 磷酸化 的检测 、磷酸 氨基酸 的分析 ,以 及激 酶活性 的检测 。灵 敏度高 ,检 测限达 到^1110! 水平 ,每次 需要的 样品量 极少, 而且可 以进彳 了定量 检测。 二、 电喷雾 质谱法 电 喷雾电 离利用 毛细管 和质谱 仪进口 间的电 势差生 成离子 ,在 电场的 作用下 产生以 喷雾 形式存 在的带 电液滴 ,当 使用干 燥气或 加热时 ,溶 剂蒸发 ,液 体体积 缩小, 最终生 成去 溶剂化 离子。 生成的 离子高 度带电 而不发 生碎裂 ,这样 可将质 荷比降 低到各 种不同 类型的 质量分 析仪都 能检测 的程度 。在 正离子 MALDI-TOF 质谱 图中, [MH-H3P04] + 碎片 离子和 [MH-HP03] + 碎片离 子的存 在标志 着含有 磷酸肽 。对于 含 有单个 磷酸基 团的肽 ,可以 区分酪 氨酸的 磷酸化 与丝氨 酸和苏 氨酸的 鱗酸化 。和 HPLC 联 用可以 在蛋白 质水解 液中检 测出以 fniol 级 存在于 丝氨酸 、苏氨 酸和酪 氨酸位 置 上磷酸 化的肽 。并可 用于蛋 白质和 肽段分 子量的 测定和 肽谱的 分析。 三、 HPLC 法 蛋白 质在蛋 白激酶 的催化 下发生 磷酸化 ,需 要消耗 ATP, 同时水 解生成 ADP 和 AMP, 单位 时间内 ATP 的消耗 量与蛋 白激酶 的活力 成正比 。反相 离子对 高效液 相色谱 能将 一个体 系中的 ATP、 ADP 和 AMP 较好的 分离检 测出来 ,通 过与对 照进行 比较, 去除 ATP 的降 解和其 他因素 引起的 消耗, 生成的 ADP 和 AMP 就 可以间 接的反 映出蛋 白 激酶的 活力。 黎培员 李凌云 林菊生 主要参 考文献 车发云 , 邵晓霞 ,徐 来根等 . 1997. 毛细 管电泳 非放射 分析蛋 白质和 多肽磷 酸化. 生物化 学与生 物物理 学报 , 29(4):363~370. 陈沙 力和刘 树诤. 蛋白质 酪氨酸 磷酸化 -免疫 沉淀及 Western 印迹两 种方法 的比较 . 1997. 白求 恩医科 大 学学报 ,23(6):678~680. 颜子 颖和王 海林译 • 1"8. 精编 分子生 物学实 验指南 .北京 : 科学出 版社. Carrey, E.A., Hardie, D.G. 1986. Mapping of radiolabeled peptides derived from proteolysis of polypeptides bound to nitrocellulose after ** Western" blotting. Anal. Biochem., 158(2) :431 ~435. Enz A. , Shapiro, G., Chappuis. A., et al. 1994. Nonradioactive assay for protein phosphatase 2B (cal- cineurin)activity using a partial sequence of the subunit of c AMP- dependent protein kinase as substrate. • 732 • Anal Biochem., 216(1): 147 〜 153. Ferry, G. , Emould, A.P., Genton, A., et al. 1990. Assay of tyrosine protein kinase activity from HL-60 by high-performance liquid chromatography for specificity studies. Anal. Bicx:hem., 190(1) :32 〜 38. Hardie^ D.G. 1989. Protein phosphorylation and dephosphorylation. Curr. Opin. Cell Biol., (2): 220 〜 226. Hardie, D.G. 1990. Roles of protein kinases and phosphatases in signal transduction. Symp. Soc. Exp. Biol., 44:241 〜 255. Hardie, D.G. 1999. Protein Phosphorylation : A Practical Approach. Oxford University Press. Hunger, H.D., Schmidt, G., Flachmeier, C. 1994. Quantitative western blotting using [gamma- 32 P] ATP and the ultrasensitive bio- imaging analyzer. Anal. Biochem., 217(1) :98 〜 102. Hunter, T” Sefton, B.M. 1980. Transforming gene product of Rous sarcoma virus phosphorylates tyrosine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77(3): 1311. Kameshita, I. , Fujisawa, H. 1996. Detection of protein kinase activities toward oligopeptides in sodium do- decyl sulfate- polyacrylamide gel. Anal. Biochem . , 237(2) : 198 〜 203 • Kamps, M.P., Sefton, B.M. 1988. Identification of multiple novel polypeptide substrates of the v-src, v- yes, v-fps, v-ros, and v-erb-B oncogenic tyrosine protein kinases utilizing antisera against pht^photyros Oncogene, 2(4): 305 〜 315. Kamps, M.P., Sefton, B.M. 1989. Acid and base hydrolysis of phosphoproteins bound to immobilon facili- tates analysis of phosphoamino acids in gel- fractionated proteins. Anal. Bicx:hem. , 176(1) :22 〜 27. Oda, Y. , Huang, K. , Cross, F.R., et al. 1999. Accurate quantitation of protein expression and site- specific phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. , 96(12) : 6591 〜 6596. Oda, Y. , Nagasu, T., Chait, B. T. 2001 . Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for prob- ing the phosphoproteome. Nat. Biotechnol., 19(4) :379 〜 382. Valtorta. F., Schiebler. W., Jahn. R., et al. 1986. A solid-phase assay for the phosphorylation of proteins blotted on nitrocellulose membrane filters. Anal. Biochem., 158(1) : 130 〜 137. Volonte, C., Nichols, R.A., Greene, L.A. 1992. Rapid measurement of protein kinase and phosphatase activities by slot-filtration. Biotechniques, 12(6) :854 〜 858, 860 〜 863. Wind M, Edler M, Jakubowski N. Analysis of protein phosphorylation by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry with 32 P detection and to electrospray mass spectrometry. Anal. Chem., 73(1):29 〜 35. • 733 • 第十 一章糖 复合物 的制备 与分析 引言 I 一、 糖复合 物分析 的概述 DNA、 RNA 和蛋白 质操作 与分析 技术的 进步, 一定程 度上促 进了现 代分子 生物学 的革命 。然而 同样是 细胞内 的大分 子物质 ,多 糖的分 析技术 则进展 缓慢。 这主要 在于多 糖的 分子结 构更为 复杂。 DNA、 RNA 和蛋白 质均属 线型多 聚物; 多糖则 具有分 支及异 聚 体构象 U 和卩链 )。 3 种氨 基酸或 核苷酸 可组成 6 种系列 ,而 3 种单 个己糖 (单糖 ) 则 理论上 能产生 1056 种多糖 ( 寡聚糖 )。 另外, DNA、 RNA 和蛋 白质的 合成为 模板依 赖性, 而多糖 的合成 (亦称 糖基化 ) 则相当 复杂, 不依赖 于模板 ,因细 胞类型 不同而 异, 不能用 简单的 规则来 推测。 多糖的 结构多 样化, 然而结 合到其 他大分 子物质 上将会 影响后 者合成 、包装 、稳定 性、 可溶性 、胞 内运输 、转 运及其 半衰期 。这一 切对细 胞生物 学家、 蛋白质 化学家 、生 物技术 工作者 及药学 工作者 具有重 要意义 。另 一方面 ,永生 性组织 培养细 胞系能 产生一 些糖基 化突变 ,而 不影响 培养皿 特异环 境中单 个细胞 的生长 和活性 ,因此 许多分 子生物 学工作 者在进 行单细 胞体外 研究时 常忽略 了多糖 的存在 。随 着个体 发生中 单细胞 相互作 用、 组织形 态发生 、免疫 反应以 及癌症 、炎症 的病理 学等研 究深入 ,多糖 结构及 生物合 成的 研究显 得非常 重要。 “糖生 物学” 一词泛 指对简 单或复 杂体系 中糖复 合物的 生物学 研究。 很多寡 糖分析 技术 的进步 ,使 这一研 究已较 为深入 ,这包 括有一 些敏感 、特 异的 分析法 ,许多 高度特 异性的 纯化酶 (糖 苷酶) 应用 。已有 必要将 寡糖纳 入分子 生物学 范畴。 尽 管如此 ,许 多糖生 物学分 析技术 仅局限 于少数 专门从 事寡糖 研究的 实验室 ,一些 已出 版的糖 分析技 术纲要 也仅供 专业人 员所用 。本章 力图使 这方面 技术得 到推广 ,使具 有生化 或分子 生物学 技术基 础者容 易接受 。其 中包括 由来已 久的传 统方法 和已广 泛应用 的 新方法 。主 要为将 从事寡 糖结构 、生 物合成 及生物 学方面 研究的 初步工 作者提 供一个 基 本知识 ,而 未作详 尽描述 。深入 的研究 ,将 有赖于 更复杂 的技术 。普通 分子生 物学工 作者 可根据 需要进 行适当 的选择 。许多 商品性 糖复合 物分析 试剂盒 的出现 已使许 多实验 室 对糖生 物学产 生兴趣 ,它们 也为本 章介绍 的方法 提供了 有用的 帮助。 寡 糖同脂 质或蛋 白质的 连接区 决定了 糖基化 的类型 。尽管 这种连 接区各 不相同 ,然 而糖 链常常 具有相 同的外 侧系列 。本 章主要 讨论高 等动物 糖复合 物糖基 化几种 主要类 型: N- 乙 酰氨基 葡萄糖 (N-acetylgluosamine, GlcNAC) -N-ASn 连 接、; V- 乙酰 半乳糖 胺 丝氨酸 / 苏 氨酸连 接媒糖 (存在 于多糖 蛋白上 )。 木糖 丝 氨酸连 接葡萄 糖胺聚 糖 ( 存在于 蛋白多 糖表面 ), 以 及酰基 (神经 ) 鞘氨 醇连 接的糖 (神经 ) 鞘脂、 磷脂酰 • 734 • 肌 醇连接 的糖磷 脂锚和 〇- 连接的 N- 乙 酰氨基 葡萄糖 。此外 还有许 多少见 的糖基 化形式 需 要考虑 。这些 少见糖 链包括 有:① 〇- 连接的 葡萄糖 、甘露 糖和岩 藻糖; ② IV- 连接 的羧赖 氨酸; ③ 乙酰氨 基葡糖 -P- 丝氨酸 (磷酸 糖基化 )。 同样, 本章只 讨论最 常见的 寡糖相 同的外 侧系列 (例如 涎酸化 和岩藻 糖化乳 糖胺、 多乳 糖胺、 〇- 葡 糖胺聚 糖链等 ), 而不讨 论少见 的系列 ( 例如分 支木糖 残基、 iV- 连接葡 糖胺 聚糖、 N- 连接的 寡糖上 卩连接 乙酰半 乳糖胺 )。 二 、技 术选择 对 于从事 糖复合 物分析 的初期 实验者 ,最 大的困 难在于 解决实 际问题 时将选 择哪种 技术 方法更 为敏感 ,预期 结果更 为理想 。应 根据具 体问题 (如糖 复合物 的检测 量和类 型) 选择可 能最为 有效的 方法, 并需参 照相应 技术方 法的评 注部分 ,考虑 特殊实 验条件 下的可 行性和 实用性 。技 术选择 过程中 还要考 虑到糖 复合物 是采用 放射性 示踪还 是化学 分 析法进 行检测 ,以及 将对预 纯化样 本哪一 部分进 行寡糖 分析。 再次强 调这些 方法并 不具有 全面性 ,不能 充分地 说明寡 糖的完 整结构 ,可能 尚需采 甩 更先进 的技术 。当 高度纯 化的样 本大量 存在时 ,进 行破坏 性分析 之前应 考虑采 用非破 坏性实 验方法 ,例 如核 磁共振 (NMR)。 另外 ,实验 者应明 确采用 本章的 技术方 法能否 解决所 关心的 生物学 问题。 三、 单糖及 寡糖的 立体化 学和图 解表示 1. 单糖 基本立 体化学 甘油醛 是最简 单的单 糖形式 ,仅有 一个不 对称的 碳原子 ,因 此它 是不对 称分子 ,具 有光 学异构 现象, 存在两 种非重 叠性镜 面影像 称镜像 异构体 。这些 镜像异 构体具 有相同 的物 理特性 ,除 外极光 偏转方 向不同 (-, 左手; +, 右手 )。 长期 以来, 习惯上 (+ ) 甘 油醛加 上前缀 D, ( - ) 甘油醛 加前缀 L, 分 表示两 种不同 的旋光 异构体 。此对 镜像异 构 体同样 具有相 同的化 学性质 (图 H.1)。 单糖 的构象 由其内 部最多 元不对 称碳原 子决定 。后 者同甘 油醛相 比较, 如果与 D- 甘油 醛构象 相同, 则给碳 单糖加 上前缀 D; 如果与 L- 甘油 醛构象 相同, 则给该 单糖加 上前缀 L。 复合物 的极光 偏转方 面需要 实验检 测 ,然 后在前 缀后面 用圆括 号标上 + 或 -, 例如 D-( + )- 葡萄糖 。立 体化 学特性 决定了 分 子的生 物活性 。例如 D 型分 子具有 活性, L 型却 完全 无活性 ,或 者相反 情况。 动物细 咆 内目前 已知道 自然存 在的单 糖除外 岩藻糖 、艾 杜糖甘 酸呈现 L 构型 ,其 他均为 D 构 型。 醛糖 常呈环 状结构 (见图 11.2), C-1 位 醛基同 C-5 羧基反 应形成 半缩醛 ,为 六元 环结构 ,称 为吡 喃糖; C-1 位 醛基同 C-4 羧基反 应形成 五元环 ,则 称为呋 喃糖。 己糖通 常形成 吡喃环 ,戊糖 则形成 呋喃环 。也 有相反 的情况 。同样 ,酮糖 (例如 唾液酸 ) 也可 Ch1° CHO H — HO ~~~ CH2OH D-(+)- 甘油醛 CH2〇H L-(— )- 甘油酵 图 11.1 甘 油醛的 对映体 • 735 • 以通过 C-2 酮基与 C-6 位 羧基反 应形成 半缩醛 。这些 环状结 构在完 整寡糖 内常见 ,在 C*1 位 ( 酮糖在 02 位) 产 生另一 个不对 称碳原 子中心 ,而出 现另两 种异构 体分子 ,若 半 缩醛基 碳原子 上的一 OH (称 半缩醛 羟基) 与单糖 C5 上的 羟基 在同一 侧称为 a 型半乳 糖 ,不在 同一侧 的称为 P 型半 乳糖。 H0. H0- H- ,0H OH D CH2OH HO HO- y/ — OH — OH ch2oh : — r 0 H0 ~ - -I HL. “ D CH.OH 半乳糖 III 半乳糖 III 图 11.2 环 状结构 的形成 (半乳 糖的开 链结构 和环状 结构) 单 糖传统 地采用 fisher 投影和 Haworth 描 述两种 方式表 不 (见图 11.3)。 1) Fisher 投影法 单糖 的碳链 采用垂 直形式 书写, 第一个 C 原子位 于上端 。水 平线段 代表突 出纸面 的 化学键 ,垂直 线段代 表指向 纸内的 化学键 。最 高数 目位不 对称碳 原子上 ,羧基 位于右 侧 ,表示 单糖为 D 旋系列 ,位于 左侧, 则属于 L 旋系 列。 2) Haworth 描绘法 六 元环中 O 原 子位于 右上角 ,整 个环大 致相当 于纸面 垂直位 ,其基 团位于 环的上 或 下方。 Fisher 投影 法右 侧基团 相当于 Haworth 描述 的下面 基团。 D 旋己 糖的 C-6 位环 上方 有一羧 甲基, L 旋则位 置相反 。而 己糖 ct、 p 异头 物的区 别在于 01 位一 0H 或一 H 的相 对位置 不同。 《 异头物 , 一H 位于 D- 型环 下方, L- 型 环上方 ,而 p 异头 物的一 H 则 位于 D 型环 上方, L 型环 下方。 2. 溶液 中单糖 的构象 Haworth 描绘 法不能 描述出 这些分 子的真 正构象 。溶液 中六元 环单糖 的构象 可能呈 现为椅 式结构 。不同 基团呈 水平或 垂直位 。存 在有 两种平 衡的椅 式构象 称着构 象异构 体 。这 种平衡 位点因 不同单 糖各异 ,依 赖于一 OH 或 其他基 团的相 对位置 ,最可 能的构 象趋 于中轴 方向大 基团数 目最少 (见图 11.4)。 . 736 . Fisher 投影式 Haworth 描绘法 2- 乙酰胺 -2 •脱氧 -D •葡 萄糖 ^乙酰 -D •葡 糖胺 CHO HO- • — 1 \ | • ■NHAc •OH OH ,rCH25^ H, OH NHAc CH2OH 开 链形式 吡 喃糖苷 半缩醛 (ot 与 P 异构 体的混 合物) HO 图 11.3 单糖的 Fisher 投 影式和 Haworth 描绘式 OH 图 11.4 D- 甘 露糖椅 式构象 3. 单糖 链的表 示形式 完 全正确 地表示 寡糖链 的结构 需要标 出各个 单糖的 完整立 体化学 。因此 常称为 Sia- lyl-laris 简单的 四聚糖 ,应书 写如下 : a-D-Neup5Ac2, 3)3-D-.Galpl,4(a-L-Fucpl.4) D-GlcpNAoR。 更多 情况下 ,环状 结构构 象和性 质是一 种推测 ,可 按下列 之一的 方式书 写: Neu5Aca2, 3Galpi91, 4 ( Fuccrl, 3 ) GlcNAc/3-K 或 Neu5Aca〇02-3Galp)91- 4GlcNAci9-R 4. 寡链的 高度顺 序结构 寡 糖和多 聚糖中 各种单 糖以不 同糖苷 链相连 ,形 成更为 复杂的 化合物 ,分子 内部将 • 737 • 存在各 次级和 区域性 结构。 溶液中 特定糖 链的大 致构象 可由糖 苷链类 型决定 。高 度顺序 结构对 糖复合 物的生 物学功 能非常 重要。 四 、术 语汇编 下面 介绍本 书中最 常见的 词语。 醛糖 (aldose) 单糖 的碳链 末端带 有羧基 (醛基 ); 羧基 位于最 低数位 C 原子上 (即 C-l)〇 碳水 化合物 (carbohydrate) 多 竣酵或 多竣酮 ,或 者能水 解成两 者的化 合物。 非 立体异 构物具 有相同 的组成 ,却 具有不 同的原 子分布 ( 例如半 乳糖和 甘露糖 )。 镜 像异构 体任何 具有非 重叠性 的镜面 影像。 差向 (立体 ) 异 构体两 个单糖 仅一个 不对称 碳原子 的构象 不同。 岩 藻糖脱 氧己糖 ( 参见单 糖类型 )。 半乳糖 己糖类 ( 参见单 糖类型 )。 乙 酰氨基 半乳糖 己 糖氨类 ( 参见单 糖类型 )。 神经 节苷脂 (gangUoside) 是一类 含有唾 液酸的 阴离子 糖脂。 葡 萄糖一 种己糖 ( 参见单 糖类型 )。 乙 醜氨基 葡萄糖 (GlcNAc, acetyl-D-glucosamine) —种 己糖氨 ( 参见单 糖类型 )。 甘油醛 (glyceraldehyde) 最简单 的单糖 (一种 丙醛糖 ,即含 3 个 碳原子 )。 糖 复合物 (glucoconjugate) —种 天然化 学物, 一种或 几种单 糖或寡 糖共价 结合到 非碳水 化合物 部分。 葡萄 糖酵酸 (G1UA 或 G1A, CD-glucuronic acid) — ■种 糖酵酸 (参见 单糖类 )。 搪 脂或糖 (神经 ) 銷脂 (glycolipid 或 glucosphing olipid) 寡 糖通过 葡萄糖 或半乳 糖附着 于酰基 (神经 ) 鞘氨醇 的末端 首位一 0H 基上 ,后 者由一 长链碱 (即神 经鞘氨 醇) 和脂肪 酸组成 。糖 脂可以 是中性 或带负 电荷。 糖 磷脂锚 (glycophospholipid anchor) 以酰 胺键连 接某一 蛋白质 C 末端时 , 憐脂醜 肌醇 同磷酸 乙醇胺 之间的 聚糖桥 ,构成 膜的蛋 白锚。 搪蛋白 糖复 合物中 核心蛋 白的多 肽骨架 上通过 N- 乙酰 氨基葡 萄糖或 O- 乙 酰氨基 半 乳糖共 价连接 一个或 多个寡 糖链。 糖 胺聚糖 由二糖 重复单 位形成 的线性 聚合物 。每 个单 位包括 一个己 糖胺和 一个己 糖或己 糖醛酸 。这 些寡糖 链将组 成蛋白 多糖的 结构。 根据二 糖单位 决定糖 胺聚糖 有:硫 酸 软骨素 (chondroitin) 和 皮肤素 (dermatan)、 肝素 (heparan) 或硫 酸肝素 (heperisu- fat)、 透 明质酸 (hyaluronic acid) 以 及硫酸 角质素 (keratane sulfate), 除透 明质酸 夕卜其 • 738 • 余 均含有 硫酸酯 ,代 替了一 OH 基 或氨基 (iV-X 或 D- 硫酸基 )。 糖苷 连接一 个单糖 同另一 个残基 通过异 头物一 OH 基 相连。 艾杜 糖酵酸 [IduA 或 IDA (L-iduronilacid)] —种糖 酵酸。 酮糖 (ketose) — 种单糖 ,在其 内部某 一碳原 子上存 在有碳 酰基; 这 一碳酰 基可位 于 最低位 C 原子上 (即 02)。 甘露糖 (manD-mannose) —种 己糖。 单糖 (monosaccharide) 不 能水解 成更多 单位的 糖水化 合物。 黏蛋白 (mucin) 大的 糖蛋白 ,含 有很多 O- 乙酰氨 基半乳 糖连接 的寡糖 , 后者相 隔 紧密。 iV- 连 接寡糖 (AMinked oligosaccharide) 寡糖共 价结合 到一多 肽链的 天冬氨 酸残基 上 ,按照 ASn-X-Ser/Thr — 致系列 。尽 管存在 有很多 种不同 N- 连 接寡糖 ,但均 有共同 的特征 :①具 有相同 五聚糖 核心, 2 个甘露 糖残基 a 连接到 第三个 甘露糖 残基上 ,后 者再 # 连接 到一 个壳二 糖上; ②壳二 糖基团 连 接到天 冬氨酰 的酰氨 N 原子 上。 iV- 连 接 型寡糖 可分为 3 型 :高甘 露糖型 、复合 型和杂 交型。 N- 乙酰 -D- 神经氨 酸一种 唾液酸 (参 见单糖 )。 0- 连 接寡糖 寡 糖通过 iV- 乙酰氨 基半乳 糖连接 到多肽 的丝氨 酸或苏 氨酸上 。注 意 ,还存 在其他 类型的 O- 连 接寡糖 (例如 O-GlcNAC), O-GlucNAc 连 接反管 最为常 见 ,但 通常不 做特别 描述。 寡糖 (低 聚糖) 单 糖通过 糖苷键 相互连 接形成 分支或 线型链 ( 参见多 糖部分 )。 多乳糖 氨基聚 糖二糖 /3-Gal(l-4)-GlcNAC 重复 单位形 成长链 。可能 涎酸化 、岩藻 糖化 ,或形 成分支 。当 硫酸 化时称 着硫酸 角质素 ( 参见糖 氨聚糖 )。 多糖 (polysaccharide) 单糖 通过糖 苷链相 互连接 ,形 成一具 有重复 系列的 分支或 线性链 。区 分于寡 糖的单 糖数目 不定。 一种糖 蛋白内 存在有 岩藻糖 化及硫 酸化的 四触角 碳 水化合 物单元 ,称 着寡糖 。另一 方面于 植物浸 出物中 存在有 8 个葡萄 糖残基 #-(1-4) 连接 的碳水 化合物 ,则 认为是 多糖。 多涎 酸选择 性表达 于一些 脊椎动 物蛋白 表面或 某些致 病细菌 的荚膜 多糖上 ,唾液 酸同 聚体。 蛋 白聚糖 一种糖 复合物 ,具 有一个 或多个 D- 木 糖连接 的糖氨 聚糖链 (不是 N- GlcNAC 或 O-GalNAc- 连接的 寡糖) 连 接到蛋 白质上 。同糖 蛋白的 区别带 主观性 ,因为 有 些蛋白 聚糖既 有糖氨 聚糖链 ,又有 IV- 或 0- 连接 的寡糖 连接。 还原糖 能发生 典型醛 基反应 的糖类 (例如 能还原 Ag+ 或 Gu2+)。 单糖、 寡糖或 多糖, 只要末 端单糖 残基上 的醛基 不参与 糖苷链 ,便可 形成还 原糖。 糖修饰 (saccharide modification) 不同 单糖的 一 0H 基可 以被碑 酸化 、乙 酷化、 硫酸化 、甲 基化或 脂酰化 。氨基 可以是 自由的 或者被 N- 乙 酰化或 硫酸化 。羧基 常与附 • 739 • 近 一OH 基形成 内酯。 唾液酸 (sia, sialic acid) 酸性 九碳单 糖家族 的通称 (例如 Neu5Ac)。 单糖类 型单糖 可能含 有羧基 ,在 碳链的 末端称 为醛基 ,链内 碳原子 上称着 酮基。 羧基常 分布于 最低位 C 原子上 。例 如醛 基位于 C>1 位 ,大 多数酮 基位于 02 位。 这两型 分别称 着醛糖 和酮糖 。最简 单的单 糖是甘 油醛, 为一种 丙醛糖 ( 即含有 3 个 碳原子 )。 天 然醛糖 根据其 碳链中 碳原子 数目不 同而相 应命名 ( 如己醛 糖含有 6 个 碳原子 )。 两种 单 糖的不 同仅在 于单个 不对称 C 原子 的构 象差别 ,称 着差向 (立体 ) 异构体 。如 葡萄 糖和半 乳糖为 04 位差向 异构体 。动 物糖复 合物中 常见的 单糖为 :①脱 氧己糖 (如 L-Fuc); ② 己糖胺 ,常伴 N- 乙酰化 (如 D-GalNAc 和 D-GlcNAc); ③己糖 (如 D-Glc, D"Gal 和 D-Man); ④戊糖 (如 D-xyl); ⑤ 唾液酸 (sia, 如 Neu5AC); ⑥糖 酵酸类 (如 D-GIA 和 L-IdA)。 木糖 (xyl, D-xylose) 戊糖类 (见单 糖部分 )。 第一 节糖复 合物及 其纯化 由于糖 复合物 具有独 特的组 成和结 构特征 ,可 以不 加纯化 ,在 混合物 状态下 直接进 行研究 , 然而像 Arthur kornberg 所说 ,回答 生物学 问题最 好的办 法常是 “纯化 、纯化 再 纯化” 。的确 ,要完 全阐明 一个涉 及糖复 合物的 生物体 系结构 和功能 特征, _也 必须对 其进行 纯化。 这 一部分 主要讨 论纯化 3 大类 主要糖 复合物 ( 糖蛋白 、糖脂 和蛋白 聚糖) 的 一般原 则 。这些 分子已 于前言 和术语 汇编部 分描述 ,每一 类均为 一 类具有 广泛结 构和功 能特征 的分 子家族 。许多 其他大 分子的 传统纯 化方法 (例如 体积分 离和选 择性沉 淀反应 ) 适用 于糖 复合物 的分离 。本单 元根据 糖复合 物中特 别基团 的性质 提出各 类糖复 合物的 一些切 实 可行的 简便纯 化方法 。糖 蛋白中 常含有 能被植 物凝集 素识别 的糖链 。因 此利用 凝集素 的固 定作用 ,进行 亲和层 析将是 一种有 效方法 。蛋白 聚糖常 有高密 度负电 荷并常 具有很 轻的 密度和 沉淀作 用特性 ,可用 于纯化 。糖脂 较其他 糖复合 物具有 更强的 疏水性 ,具有 双歧 (极) 特性 ,借 此可同 其他脂 质纯化 分离。 3 类分 子的选 择性纯 化有利 于进一 步的分 离和最 后定性 分析。 然而应 考虑到 一些例 外情况 ( 例如糖 蛋白偶 有带高 负电荷 、糖 脂具有 极强的 亲水性 )。 寡糖结 构的细 微异质 性 将可能 使某一 糖复合 物呈现 出广泛 的特性 。例如 :来自 单细胞 型的一 种糖蛋 白具有 iV- 连接寡 糖加工 的差异 ,在小 麦胚凝 集素- 琼脂糖 [wheat germ agglutinin (WGA)- Sepharose] 亲和 层析中 ,部 分目的 蛋白可 以得到 回收。 目前尚 没有综 合性的 纯化方 法能从 同一样 本中分 离到较 高产量 的所有 3 类 糖复合 物。 例如用 于糖脂 分析的 有机浸 出物中 ,大 多数蛋 白和蛋 白聚糖 已不可 逆变性 。相反 , 用 于膜结 合性糖 蛋白分 析的去 污剂浸 出物中 ,糖脂 常不可 逆变性 。因此 ,如 果有 必要从 同一细 胞或组 织中分 离得到 3 类大分 子物质 ,最 好备有 3 等 份原始 的样本 材料。 在 进行特 异分子 研究时 ,常 有必要 首先进 行分组 (基团 ) 特异 性纯化 。例如 进行特 异性的 双涎酸 神经节 苷脂纯 化之前 ,抽 提胞内 总脂质 。如果 研究的 糖复合 物已被 放射标 • 740 • 记 ,利用 放射均 一性的 纯化足 以进行 很多类 型分析 。因此 ,如果 一个糖 蛋白分 子已被 [2-3H] 甘 露糖代 谢标记 ,并 且要研 究的是 N- 连 接寡糖 ,因 此就不 用担心 其他各 种未标 记的蛋 白或脂 质会影 响最后 的制备 。最 后的 分析中 ,研 究者应 根据具 体条件 进行。 一 、糖 蛋白及 其纯化 糖蛋 白含有 许多不 同糖链 ,一些 糖蛋白 含多条 长糖链 ,带 很强 的电荷 ,而另 一些只 有一 条中性 糖残基 ,很容 易忽略 。由于 种类繁 多使糖 蛋白的 纯化不 可能采 取任何 一种方 法。 大多数 用于纯 化非糖 基化蛋 白的方 法用于 糖蛋白 纯化同 样有效 。然而 由于糖 蛋白表 面大 量碳水 化合物 的存在 ,使 其带电 荷增强 ,密 度增加 ,体 积增大 ,可溶 性增强 。几十 年来 ,利 用这些 物理特 性进行 了许多 糖蛋白 的纯化 和特征 性研究 。最近 ,随 着对 碳水化 合物结 构和生 物合成 的进一 步了解 ,根据 碳水化 合物更 为细微 、特 殊的结 构创建 了一些 新的 方法, 可用于 推测微 量蛋白 表面的 单个糖 分子。 这 一单元 首先描 述糖蛋 白的一 些特性 ,例如 胞内的 定位和 溶解性 。这有 利于确 定用. 哪种纯 化方法 。接 着描述 采用植 物凝集 素亲和 层析进 行预备 性糖蛋 白纯化 ,以及 一种小 规 模预实 验过程 ,用 以检测 植物凝 集素结 合和洗 脱条件 。植 物凝集 素用以 纯化糖 蛋白, 在于 它能识 别一系 列的糖 残基形 成的三 维结构 。在利 用植物 凝集素 亲和层 析之前 ,常规 进 行传统 的纯化 措施。 (一) 糖蛋白 的特性 1. 糖基 化蛋白 的亚细 胞定位 大多 数蛋白 的糖基 化发生 在内质 网膜和 高尔基 体内, 但有些 糖基化 也发生 在胞质 内 。分 泌蛋白 、膜 蛋白以 及溶酶 体内的 蛋白可 能含有 一些碳 水化合 物成分 。最常 见的糖 链 是通过 IV- 或 〇- 连接 于蛋白 ,并且 作为糖 磷脂锚 的成分 ,这 些糖 基化可 单独或 同时出 现 。它 们具有 的物理 特性可 有效地 用于一 些纯化 。了 解糖基 化的类 型有利 于选择 理想的 纯 化方法 ,下 面介绍 一些方 法有利 于明确 糖基化 类型。 分泌性 糖蛋白 通过 分析细 胞培养 的条件 培养基 相对较 容易了 解一种 蛋白是 否是分 泌 性蛋白 。这 需要透 析和浓 缩条件 培养基 。如 果细胞 必须生 长在加 有血浆 成分的 环境中 才能分 泌蛋白 ,将难 以采用 任何有 效的糖 蛋白纯 化方法 来浓缩 得到所 需蛋白 。因 为可能 存 在大量 竞争性 的血浆 糖蛋白 。因此 ,重 要的 是确定 是否靶 分子能 够分泌 于无血 浆培养 基中。 胞质 糖蛋白 如果 蛋白未 能分泌 ,细胞 可能会 在等渗 邊养基 中破裂 (例 如蔗糖 ), 从 而能够 从可溶 性的胞 质成分 中离心 分离得 到不溶 性的膜 和囊泡 ( 糖蛋白 在可溶 性部分 不 常见到 )。 如果所 要的蛋 白在可 溶性部 分能检 测到, 然后被 糖基化 ,则 可能是 从膜上 蛋白水 解而来 。这是 N- 连 接的糖 蛋白在 可溶性 部分能 发现的 最可能 的解释 。也 有可能 这 一蛋白 是最近 所描述 的胞质 或核内 的一种 糖蛋白 ,后 者含有 0- 连接 乙酰氨 基葡萄 糖 ,可 以结合 小麦胚 凝集素 (WGA)。 • 741 • 细 胞器锆 丨如果 所关心 的蛋白 不出现 在可溶 性的胞 质部分 ,膜和 囊泡沉 淀物再 悬浮于 蛋白酶 抑制剂 ,并 暴露 于低渗 培养基 (或反 复冻融 )。 溶解 敏感的 细胞器 ,释放 可溶性 成分。 膜离心 再沉淀 。通 过这些 处理所 得的可 溶性糖 蛋白常 伴有溶 酶体酶 。采用 蛋白 酶抑制 将可缩 小或消 除溶酶 体酶的 影响。 各种内 源或外 源性的 糖苷酶 也可能 存在, 但因为 浓度低 ,不 至于降 解其他 糖蛋白 表面的 糖链。 膜结合 frt 磷脂锚 着蛋白 如果所 关心的 蛋白采 用上述 的方式 均不能 溶解, 可能是 一 外周或 整合性 膜蛋白 ,或 者是锚 着于糖 磷脂上 。可 采用不 同种非 离子性 去污剂 ,或提 高某 一去污 剂浓度 来溶解 这些蛋 白质。 最好采 用具有 高临界 微胶浓 度且容 易透析 的去垢 剂 。例如 ,己基 、庚 基和 辛基葡 萄糖苷 或葡萄 糖酰胺 去垢剂 (MEGA-8)。 然而 以葡萄 糖为基 础的去 垢剂如 辛基葡 萄糖苷 ,可以 阻止蛋 白质结 合到植 物凝集 素柱上 ,例 如刀豆 凝集素 (ConA)-Sephar〇Se, 或者产 生很强 的背景 ,即 使是 在广泛 透析后 进行糖 直接分 析 。如 果研究 的是糖 磷脂锚 着蛋白 ,脂质 成分将 使其在 Triton X-114/ 水 两相系 统中分 离进 入去垢 剂相, 并与疏 水基质 如苯基 琼脂糖 发生强 烈的相 互反应 。一些 情况下 ,锚的 脂质部 分可以 被磷脂 酰肌醇 特异性 磷脂酶 C 消化 分离 。剩 下的碳 水化合 物部分 与蛋白 质相连 ,并 转移到 可溶性 、亲水 性更强 的蛋白 质中。 磷脂酶 的消化 作用可 降低蛋 白质对 疏水 基质的 亲和性 ,而从 Triton X-114/ 水 混合物 的水相 中抽提 出来。 2. 可溶 性特征 含有少 量碳水 化合物 的糖蛋 白的可 溶性特 征受其 糖的成 分影响 较小, 如果碳 水化合 物 是糖磷 脂锚的 一部分 ,有 必要采 用去污 垢溶解 。对 很多糖 蛋白来 说标准 硫酸铵 或乙醇 沉 淀较好 ,那些 高糖含 量的糖 蛋白则 仍然可 溶解, 甚至在 相对高 浓度的 乙醇下 也是如 此 。带有 丰富的 涎酸或 硫酸脂 的阴离 子蛋白 质可能 对三氯 乙酸和 高氯酸 的沉淀 反应无 效 。这 一特异 的溶解 性有时 可用着 纯化的 一步骤 ,因 为多数 其他蛋 白质在 这些情 况下会 发 生沉淀 。然而 10% 三氯 乙酸和 2% 磷钨 酸配合 将能沉 淀甚至 带丰富 电荷的 蛋白质 。长 期暴 露于低 pH 条件 下将引 起涎酸 的部分 丢失和 ASn、 Gin 的脱氨 基作用 ,导致 蛋白质 的异 型性。 要避免 pH 太 大悬殊 ,防止 一些不 稳定的 基团例 如磷酸 脂或乙 酰脂的 水解。 非 糖基化 蛋白在 氯化铯 梯度中 位于约 1.3g/mL, 多 糖位于 1.6~2.0g/mL, 这样大 的密 度差别 可用以 将高度 糖基化 的蛋白 同碳水 化合物 含量较 少的蛋 白质分 离开。 这些处 理可能 会永久 地变性 或灭活 一些蛋 白质, 因此只 适用于 稳定的 、在 GsC12 中呈 活性状 态 ,或 CsCl2 除去后 能复性 的一类 物质。 3. 层 析和染 色特性 凝胶过 滤柱和 SDSPAGE (SDS- 聚丙烯 酰胺凝 胶电泳 )。 同样 大小的 蛋白质 ,碳水 化合物 高含量 的在凝 胶过滤 柱中较 非糖基 化的更 早洗脱 ,如果 碳水化 合物含 量不定 ,收 集峰 也较宽 。在 SDS^PAGE 中蛋白 质的迁 移也受 糖基化 的影响 ,一 种蛋 白质带 有多阴 离子的 糖链, 分别为 不同数 tt 的涎酸 或硫酸 ,在 凝胶 上将会 使单一 蛋白条 带变的 模糊不 清 。紧 密束集 的短的 〇- 连接糖 链可使 一种蛋 白质的 相对分 子质量 增加十 几倍。 阴 离子糖 蛋白利 用普通 的考马 斯亮蓝 和银紫 色处理 可能不 能染色 ,有 些糖蛋 白甚至 • 742 • 在银 染胶的 棕色背 景下呈 现阴性 条带。 其他的 染色法 ,如 以考马 斯为基 础普鲁 士染色 (联 合分离 系统) 或阳离 子染色 (toluidineblue, alcianblue) 常用于 蛋白聚 糖和其 他带大 量负 电荷的 蛋白的 染色。 离子交 换和等 电聚焦 层析。 涎酸和 硫酸脂 的存在 使一些 糖蛋白 能较好 地结合 到离子 交 换柱上 (例如 DEAE- 纤维素 S 印 hadexDEAE-S 印 hacel)。 大多数 其他蛋 白已被 脱离后 浓盐 液能较 好地将 这些糖 蛋白洗 脱下来 。所带 电荷的 不恒定 也会产 生多单 峰或很 宽的峰 和很难 肯定的 蛋白峰 。等电 聚焦时 也会碰 到多峰 或宽带 。涎 酸酶或 内糖苷 酶通过 去负电 荷 作用有 时可使 图像简 单化。 如果是 黏蛋白 ( 带大量 电荷的 糖蛋白 ,伴 有紧密 束集或 延伸性 O- 连接 GalNAc 链) 或者蛋 白聚糖 ,离 子交换 柱可能 需要用 6 mol/L 尿素冲 洗以防 蛋白的 聚集。 4. 蛋白样 本制备 以及碳 水化合 物分析 碳水 化合物 的污染 高度 纯化的 蛋白质 ,通过 SDS-PAGE 分析 只有单 一条带 ,可 能仍 不适于 碳水化 合物的 分析。 葡萄糖 在蛋白 质的糖 链上非 常少见 ,然而 它总是 最容易 产 生的污 染物。 DEAE- 纤 维素和 CM- 纤维素 、琼 脂糖 (agarose)、 高 联葡聚 糖纸巾 (Sephadexkimwipes)、 鹿 糖甘油 (sucrose glycerol)、 淀粉 (starch powder) (用于 乳胶手 套) 和葡萄 糖苷为 基础的 去垢剂 ,都 是碳水 化合物 ,将 会大大 地增加 样本的 糖含量 。当 然这依 赖于材 料是如 何进行 分析的 ,如 果蛋白 质是蔗 糖梯度 纯化, 用葡萄 糖为基 础的去 垢剂 抽提或 正常贮 存于甘 油中, 这些糖 污染物 首先必 须通过 透析的 方法彻 底清除 。凝胶 过 滤多用 丙烯酰 胺凝胶 ,而不 用葡聚 糖凝胶 (Sephadex), 因 为后者 容易形 成颗粒 碎片, 可溶 ,但不 能透析 。最 后一个 方式就 是将含 蛋白的 溶液用 0.2pm 的滤纸 过滤, 清除来 自离 子交换 或亲和 柱的任 何微粒 。如 果采取 这些措 施之后 ,进行 成分分 析发现 有葡萄 糖 ,很 可能还 是一种 污染物 ,而 不是糖 蛋白的 成分。 植物凝 集素亲 和层析 植物凝 集素亲 和层析 是最常 用的糖 蛋白特 异性纯 化方法 。已 发 现有许 多植物 凝集素 ,并 且了解 到很多 特定情 况下它 们的糖 特异性 。这 些糖特 异性是 本章提 出的进 行寡糖 和糖肽 分离和 结构分 析以及 植物凝 集素结 合糖蛋 白鉴定 的基础 。糖 蛋白常 常含有 特定的 多条链 ,能 与固定 的植物 凝集素 发生多 种相互 作用, 使一些 蛋白质 难以 从植物 凝集素 柱中洗 脱下来 。单个 糖链可 能为低 亲和性 ,但是 低亲和 糖链便 可与植 物 凝集素 发生很 强的相 互作用 ,因 此不能 用以解 释糖链 的结构 。植 物凝集 素亲和 层析可 用于糖 蛋白部 分纯化 ,有关 碳水化 合物性 质的提 示有限 。在 进行植 物凝集 素亲和 层析之 前 ,通常 进行一 些预备 性纯化 步骤, 例如铵 盐沉淀 、凝胶 过滤和 离子交 换层析 。但 这也 不是必 需的。 很多植 物凝集 素以固 定形式 在市面 上可售 ,适于 糖蛋白 的纯化 ,但 是相当 昂贵。 ConA-Sepharose 是最 常用于 糖蛋白 纯化的 植物凝 集素, '相对 较便宜 、稳定 ,且可 结合 很多种 不同的 葡聚糖 。结合 蛋白可 用 a -甲基 -D- 甘 露糖苷 UMM) 进行 洗脱。 WGA 是 另一种 常用的 植物凝 集素。 其他可 用来纯 化糖蛋 白植物 凝集素 Ridnus Communis 凝集素 (RCAI) 用 于带有 Gal 末端的 糖链的 纯化, Pea 或 Lentil 凝集素 用于那 些二壳 糖苷核 心区域 带有岩 藻糖残 基的 N- 连 接寡糖 的纯化 。利用 植物凝 集素进 行糖肽 的特征 化分析 将于后 面部分 进行描 • 743 . 述 。应 用有限 、高 价格、 轨道记 录有限 ,有时 还需要 外源性 糖用以 洗脱结 合蛋白 ,使这 些 凝集素 不太适 合常规 应用于 糖蛋白 的纯化 。然而 ConA-Sepharose 和 WGA-agarose (琼 脂糖) 凝集 素亲和 层析的 原则也 适合于 这些凝 集素。 很多固 定的凝 集素可 从下列 地方获 得: E-Ylaboratries、 pharmacia Biotech、 vector labs 和 Sigma。 下面列 出的方 案描述 了凝集 素用以 糖蛋白 预备性 纯化。 ConA-Sepharose 和 WGR- agarose 因 为方便 、实用 而选用 。另外 还描述 了小规 模预实 验程序 ,以 检测 凝集素 结合, 确定洗 脱条件 。关于 基本方 法文选 报道差 别很大 ,但 都应用 同样的 原则, 通过糖 链将蛋 白 结合到 固相凝 集素上 ,冲 洗未结 合蛋白 ,再 用类似 结合蛋 白的糖 配体的 一种简 单的糖 洗脱结 合蛋白 ,因为 很多蛋 白具有 可结合 特异性 凝集素 的糖链 ,这 一处理 过程很 少产生 纯 净的蛋 白质。 (二) ConA-Sepharose 亲 和层析 ConA-Sepharose 层析 用于部 分纯化 末端含 有甘露 糖或葡 萄糖残 基的糖 蛋白。 尽管许 多 方法已 被利用 ,下 面列出 的是这 种层析 的典型 条件。 在这一 方案中 ,首 先冲洗 掉柱子 里的未 结合和 弱结合 的蛋白 ,再用 a -甲基 -D 甘露 糖苷洗 脱结合 糖蛋白 。在 做这些 之前, 最 好进行 一次预 实验检 测所关 心的蛋 白质同 凝集素 的结合 及洗脱 条件。 1. 材料 10mg/mL ConA-Sepharose (pharmacia Biotechor Sigma) 柱 缓冲液 (0.01 mol/L Tris-HCl pH7.5, 0.15 mol/L NaCl, 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/LMnCl2, 无限期 保存在 室温) 0.5 mol/L aMM 于柱缓 冲液中 蛋白 样本溶 于柱缓 冲液中 玻璃棉 1. 5cm X 30cm 玻璃杯 ,或一 次性的 析层柱 酚-磺 酸分析 糖和特 异分析 检测目 的蛋白 注 意:如 果要分 离的蛋 白质能 耐受这 些条件 ,这些 实验程 序应在 室温下 进行。 如果不 能耐受 ,应 在 冷室里 ,并 将所有 溶液预 冷保持 温度。 2. 操 作步骤 (1) 轻轻 地将已 配好的 ConA-Sepharose (10mg 植物 凝集素 /mL 树脂 ) 50mL 再悬 浮于 50mL 的柱缓 冲液中 ,形 成泥浆 ,然后 排气。 植 物凝集 素颗粒 体积应 足以结 合大约 lOOmg 糖蛋白 。如 果没有 1.5cmX 30cm 柱, 那么柱 的大小 或者 树脂的 总量可 以加以 调整。 l.〇cmx 30cm 柱可结 合大约 50mg 总 糖蛋白 。如 果柱中 糖蛋白 的总童 明 显少于 50~100mg, 相应 减小柱 的体积 。只要 柱没有 超载, 放入蛋 白同凝 集素的 比率似 乎并不 重要。 (2) 在柱的 底部的 一 层透明 的玻璃 或聚丙 烯釉料 上装上 玻璃棉 充填剂 ,再向 柱内加 入已 排气的 泥浆。 玻璃棉 很重要 ,用 于防止 颗粒阻 塞釉料 ,减慢 流速。 • 744 • (3) 继 续装柱 ,直 到达到 理想的 水平。 50mL 体积 ,大约 28cm。 再用 2 〜 3 倍柱体 积的 柱缓冲 液冲洗 凝胶, 除去任 何结合 松散或 降解的 ConA。 (4) 用 2 〜 3 个 柱体积 0.5 md/L 的 aMM 柱 缓冲液 或最高 浓度的 aMM 缓 冲液再 冲洗。 (5) 用 >5 柱 体积柱 缓冲液 (不含 aMM) 冲洗 ,再 平衡。 用洗脱 糖预先 冲洗柱 很重要 ,然后 再平衡 ,去除 任何可 能结合 到柱上 的物质 。采用 酚-磺 酸分析 法检査 冲洗是 否完全 。用 aMM 作为标 准估计 残余糖 的含量 。可保 持水平 <0.1 mmol/L 或大约 20 fig/mL0 (6) 缓慢地 将蛋白 样本加 到柱中 ,让 其结合 到表面 ,但不 要拌动 。流 速约 lmL/min. [0.5mL/ (min.cm2)] 较 理想。 (7) 用柱 缓冲液 冲洗柱 ,并检 测流出 液和随 后的冲 洗部分 ,测定 A28〇, 直到基 线值。 如果 A28〇 不能 迅速降 到基线 ,可能 说明一 些蛋白 同凝集 素作用 弱或柱 超载。 (8) 鉴 定流出 液和冲 洗部分 中所含 目的蛋 白质。 明 确柱是 否超载 ,将 少量的 流出液 (1%) 加到小 体积的 颗粒上 。如 果根据 适当的 分析方 法证实 有样本 结合到 颗粒上 ,说 明有 原始柱 的超载 。这种 情况下 , 第一轮 的结合 蛋白用 aMM 洗 脱之后 ,将 带有过 量的糖 蛋白的 流出液 ,再加 到一较 大的层 析柱中 ,并 重新 平衡层 析柱。 (9) 用 0.5mol/LaMM 的 柱缓冲 液洗脱 层析柱 ,检 测各洗 脱部分 A28Q 值和活 性。 将各活 性峰部 分汇在 一起。 如果 蛋白分 离很慢 ,用 糖进行 洗脱时 会导致 宽峰的 出现。 出现这 种情况 ,可用 0.5 mol/LaMM 的柱缓 冲液注 满柱, 并让柱 静放几 个小时 ,可改 善样本 的回收 。这 可有利 于结合 物质的 分离; 当再次 洗脱, 应该可 得到一 个尖峰 。其 他的校 正办法 有:给 柱加温 到室温 (在 aMM 存在 条件下 )、 将 aMM 浓度 提高到 lmol/L, 或者将 NaCl 浓度 增加到 lmol/L。 要 洗脱紧 密结合 的蛋白 ,需要 这些方 式结合 起来。 (10) 再生柱 ,用 10 倍体积 柱缓冲 液冲洗 ,或直 浓度 <20 pg/mL。 柱还 可再用 ,或 4t: 贮 存于含 0.02% NaN3 的柱缓 冲液中 。使 用之前 用柱缓 冲液再 平衡。 (三) 小麦胚 凝集素 (WGA)- 琼 脂糖亲 和层析 WGA- 琼 脂糖层 析用于 纯化含 AT- 乙酰氨 酸葡萄 糖末端 或涎酸 残基的 蛋白质 。蛋白 样本加 入柱中 ,冲 洗柱, 除去未 结合或 弱结合 的蛋白 。结 合糖蛋 白再用 GlcNAc 洗脱。 ConA 柱纯化 糖蛋白 的原则 同样适 合于含 有固定 WGA 的 相同柱 。用 GlcNAc 代替 JMM 过 柱之前 ,像 ConA —样 ,要先 做一预 备实验 ,检验 目的蛋 白同凝 集素的 结合。 1. 附 加材料 5mg/mL WGA (小 麦胚 凝集素 )- 琼 月旨糖 (E-Y Laboratories、 pharmacia Botech、 Sigma) 磷酸盐 缓冲盐 (PBS) O.lmol/LN- 乙 酰氨基 葡萄糖 (GlcNAc) 于 PBS 缓冲液 蛋白 样本于 PBS 液中 lOcmX i〇cm 玻璃或 一次 性的柱 • 745 • 2. 操 作步骤 (1) 将 1 体积 WGA- 琼 脂糖再 悬浮于 2 〜 3 个 体积的 PBS 液中形 成泥浆 状物。 lmL 凝晈 应足以 结合卜 2mg 糖蛋白 。为安 全起见 ,确 保约 5%~10% 总细胞 裂解物 被结合 。如 果蛋 白需要 去垢剂 溶解, WGA 应在 25mmol/LTris-HCl(pH7.5) /I% LubrolPX/0.1% 去氧胆 酸钠中 仍保 持活性 。也 可采用 TritonX-100 或 NP-4 (2%~3% 终浓度 )。 (2) 在柱 底部的 釉料上 加放入 玻璃棉 填料, 长度为 直径的 1〇 倍 。将 泥浆物 倒入柱 内 ,再用 2 倍柱 体积的 PBS 冲洗柱 。除去 任何未 结合或 降解的 WGA。 然 后用一 个柱体 积含 0. 1 mol/L GlcNAc 的 PBS 液冲洗 ,最 后用 5 倍 柱体积 PBS 冲洗。 柱长应 该大约 是直径 10 倍左右 ,以 便在无 任何竞 争性糖 存在的 情况下 ,能用 较多的 PBS 冲洗, 洗脱弱 结合的 蛋白质 。这可 将它们 同那些 根本不 结合的 蛋白质 分离, 这不同 于采用 ConA 的层析 ,后 者在无 的 情况下 ,持 续缓冲 液冲洗 ,常 不能洗 脱弱结 合蛋白 。对于 WGA 和大多 数其他 植物凝 集素 来说柱 大小的 选择决 定进行 系列凝 集素层 析各个 糖蛋白 的成功 分离。 (3) 以大约 2mL/cm2/h 的流速 ,加 入大约 0.1 柱体 积的蛋 白样本 ,再用 PBS 冲洗 柱 ,直到 A28Q 回到 基线。 用小 样本量 较容易 检测到 不结合 蛋白质 ,迅 速洗脱 ,流出 液呈现 一尖峰 。弱 结合 到柱上 的蛋白 质 ,可单 独应用 PBS 连续冲 洗洗脱 ,这 些蛋白 质呈现 为一不 清晰的 尾峰。 如果目 的蛋白 预实验 显示能 较 强地结 合到凝 集素上 ,或者 柱子没 有超载 ,柱 内的样 本量可 以加大 。流 速可以 不同。 将装载 的凝胶 倒入柱 中之前 , 首先同 样本目 的蛋白 混合几 个小时 ,目的 蛋白可 以较容 易地吸 附到凝 集素上 。然 后根 据 预实验 确定冲 洗方式 ,可以 洗脱蛋 白质。 (4) 用 2 〜 3 个柱 体积的 0.1 mol/L GlcNAc 的 PBS 缓冲液 洗脱柱 ,并 分析含 有目的 蛋白 部分。 — 般来说 , 0.1 mol/L GlcNAc 足 以洗脱 蛋白质 。如 果不行 ,可 试用较 高浓度 GlcNAc (如 0.25 mol/L)、 短暂 性开柱 ,或提 高温度 就如同 ConA 部分 。通过 在含有 GlcNAc 的洗脱 缓冲液 中加入 0.5 mol/L NaCl, 有时 也可以 提高回 收率, 预实验 确定洗 脱条件 ,同 ConA。 (四) 检测植 物凝集 素结合 和洗脱 条件的 预实验 1. 原理 如果 目的蛋 白很容 易检测 ,在将 全部标 本加入 一个大 柱中时 ,有 必要 先做一 小规模 实验 ,确 定结合 和洗脱 条件。 最简单 的方法 是在一 系列的 (超速 ) 离心管 中将少 量的样 本同 检测量 ConA-Sepharose 颗 粒混合 ,如果 样本中 的材料 结合了 ,可以 用不同 量的竞 争性 aMM 冲 洗颗粒 ,进 行洗脱 ,确定 什么时 候活性 物质洗 脱进入 了上清 液中。 这显示 是否发 生结合 ,需 要多大 浓度竞 争性糖 才能将 目的蛋 白洗脱 下来。 一个简 易的方 法就是 用 一个样 本决定 蛋白是 否结合 ,是否 能仅用 一 种浓度 (0.75 mol/L) 的 aMM 进行洗 脱 。保 持恒温 很重要 ,因 为湿度 的变化 会影响 配体的 结合与 分离。 2. 附 加材料 Sepharose 4B (Pharmacia Biotech) 或 其他颗 粒凝胶 (用来 填充试 管内的 空隙) • 746 • 3. 操 作步骤 (1) 制 备一含 ConA-Sepharose 泥架 50% 的柱 缓冲液 。切 去一只 1000/ixL 吸管 头的尖 端 2 〜 3mm。 每次吸 取之前 重浮悬 泥浆, 采用去 尖端的 tip 头 给一排 7 个 超离心 管各分 加 200;xL 的泥浆 。其 中一管 为无凝 集素的 对照管 ,加入 等体积 50% 的 Sephar〇Se4B 泥 浆液 。让凝 胶静置 观察分 装是否 准确。 对照管 需要凝 胶材料 用以解 决因添 加凝胶 而引起 的体积 变化, 其他非 离子颗 粒凝胶 ,如 Sephadex (pharmaan biotech) 或 Bio Gel (Bio Rad) 可以用 以代替 使用。 (2) 加入 含蛋白 样本的 50/iL 柱 缓冲液 ,间 歇摇动 试管让 其结合 15min, 10〇xg 离 心凝 胶颗粒 lmin, 沉淀 。移去 上清液 ,并保 存供第 6 步 分析。 (3) 采用适 当的方 法分析 目的蛋 白是否 结合到 ConA-Sepharose 而没 有结合 到对照 颗 粒上。 (4) 反复 1 .4mL 柱 缓冲液 冲洗凝 胶颗粒 3 次 ,每次 冲洗后 ,按第 2 步方 式离心 颗粒。 (5) 在 7 支含 ConA-Sepharose 管内 ,用 分别含 0 mol/L、 0.1 mol/L、 0.2 mol/L、 0.4mol/L、 0.8mol/L、 1.0mol/L 或 1.5mol/L aMM 的缓 冲液各 200/^L, 再悬 浮凝胶 颗粒 。加同 样体积 的柱缓 冲液或 1.5 mol/L aMM 的 柱缓冲 液于对 照组。 (6) 孵育 15min, 并按第 2 步 离心凝 胶颗粒 。采 用适当 的检测 法分析 确定蛋 白质是 否已 被洗脱 ,竞争 性糖需 要多大 浓度。 提高 aMM 浓度应 该能从 ConA-Sepharose 中洗 脱目的 蛋白, 如果没 有洗脱 ,则 可在有 〇MM 时延 长 孵育时 间或提 高温度 。尽 管整个 过程可 在低温 下完成 ,但低 温时结 合很紧 ,洗 脱比较 困难。 (7) 用 >10 个柱 体积的 PBS 液冲洗 ,再 生柱, 直到糖 含量在 2 pg/mL 以下 。这时 候柱 可以立 即再用 ,或 4t: 保 存于含 0.02% NaN3的 柱缓冲 液中。 (五) 方 法评注 1) 重 要参数 像大 多蛋白 纯化过 程一样 ,成 功的凝 集素亲 和层析 很重要 。然而 ,重 要的是 首先要 做预 试验确 立结合 和洗脱 条件。 盲目向 柱中加 载样本 ,然后 尝试不 同的洗 脱条件 ,会因 为蛋白 质被灭 活或特 殊条件 下蛋白 质不能 被洗脱 ,而 导致可 能得到 的产物 很少。 通常蛋 白 质很容 易结合 到柱上 ,但 洗脱较 困难。 可采用 一些办 法解决 紧密结 合蛋白 的洗脱 ,如 增加洗 脱缓冲 液中糖 的浓度 、提 高温度 、增加 盐浓度 、延长 糖洗脱 柱滞留 时间。 有必要 时 ,可 联合采 用这些 方法。 这些措 施可使 某一种 蛋白质 从相同 的柱中 洗脱结 果不同 。因 此 ,有必 要采用 两种不 同的洗 脱条件 进行二 次洗脱 ,以从 不同的 污染物 中分离 目的蛋 白。 Ketcham 和 Kornfeld 指出用 WGA 纯化很 少得到 糖基化 转移酶 ,而用 单纯凝 集素亲 和层析 可得到 160 倍之多 的纯化 产物。 另外环 境的污 染可能 会大大 增加碳 水化合 物的总 量 。采 用一定 方法可 将这种 影响降 到最低 限度。 2) 预期结 果和时 间预计 植 物凝集 素层析 可得到 2~100 倍之 多的糖 蛋白纯 化产物 ,具 体依赖 于样本 的来源 和洗脱 条件。 如果目 的蛋白 在高盐 浓度和 室温条 件下相 当稳定 ,可 以采取 特异的 洗脱条 • 747 • 件 ,产生 较多的 产物。 Id 内可以 确立结 合和洗 脱条件 ,说 明目 的蛋白 的检测 是快而 简单的 。一旦 洗脱条 件 已知道 ,进行 洗脱所 需的时 间可以 根据样 本和柱 的大小 ,以 及是 否需要 糖的长 期孵育 而决定 。即 使样本 过多和 洗脱条 件过于 复杂, 一次洗 脱过柱 也应在 2 〜 3d 内完 成。 二 、蛋 白聚糖 、糖胺 聚糖及 其纯化 蛋 白聚糖 (PG) 含 有长的 线型糖 胺聚糖 (GAG) 链, 后者由 二糖重 复单位 构成, 因此不 同于糖 蛋白和 糖脂中 含有短 而分支 的寡糖 。动物 组织的 PG 中 主要的 • GAG 有硫 酸 软骨素 、硫酸 皮肤素 、硫 酸肝素 和硫酸 角质素 。而 常用的 抗凝剂 肝素, 以高度 修饰的 硫酸 肝素形 式存在 ,仅 由结缔 组织肥 大细胞 所形成 。由葡 糖醛酸 (GIUA) 或艾 杜糖醛 酸 (IdUA) 与 乙酰 氨基己 糖残基 (GlcNAc 或 GalNAc) 组成的 重复二 糖单位 形成大 多数 GAG 的骨架 ,硫酸 角质素 则含有 Gal 和 GlcNAc 二糖。 所有的 GAG, 除透 明质酸 外 ,均 含有大 量硫酸 残基, 加之有 糖醛酸 使链中 带有大 量的负 电荷。 GAG 高密 度的负 电荷 使这些 多糖能 同糖蛋 白和糖 脂中的 寡糖区 别开来 ,这一 特性使 GAG 和 PG 能够通 过离子 交换层 析以及 氯化酰 基嘧啶 (CPC) 和 乙醇沉 淀的方 法进行 纯化。 GAG 合成时 将附着 到核心 蛋白上 ,然而 因为蛋 白酶的 水解和 内源性 糖苷酶 裂解, 可出现 大量的 自由链 。例如 在一个 被称为 Serglycin 的核心 蛋白上 ,肝素 链逐步 合成, 肝素 蛋白聚 糖合成 不久, 蛋白酶 将降解 Serglydn 的核心 ,内 源性 葡糖苷 酸酶作 用产生 短的肝 素寡糖 ,其 后加工 为分泌 颗粒。 大多数 细胞向 胞外液 和基质 中固定 分泌特 异性的 PG, 它 们也表 达一些 膜插入 PG, 可在 蛋白溶 解酶作 用下从 细胞表 面脱落 。基质 中常可 见 PG 碎片 ,有 GAG 链 附着于 短肽上 。透明 质酸, 一种非 硫酸化 GAG 连 接到蛋 白质上 后不再 聚集, 但可同 带有特 异性结 合域的 PG 非共价 结合。 一 般说来 ,纯化 PG 的 过程中 碰到的 问题类 似于其 他蛋白 糖复合 物纯化 。纯 化方法 应 确保组 织或细 胞的有 效抽提 、高 效分离 、纯 化回收 ,以及 避免发 生降解 。这一 单元介 绍两种 简单的 PG 和 GAG 抽 提方法 ,一种 为浓盐 / 去垢剂 抽提; 另 一种为 碱处理 。另外 还有 两种有 效方法 浓缩样 本可产 生有效 的纯化 ,阴离 子交换 层析和 CPC 沉淀。 (一) 浓盐 / 去垢 剂抽提 蛋白聚 糖和糖 胺聚糖 PG 的有 效抽提 需要用 到适当 chaotropic 盐的缓 冲液, 去垢剂 的应用 可确保 膜插入 PG 的抽提 ,防止 聚集, 降低玻 璃器皿 的吸附 。样本 (组织 、条件 培养基 、生物 液体和 培养 细胞) 经浓盐 / 去垢剂 [盐 酸狐 / 两 性离子 去污剂 (Zwittergent)3-12] 抽 提缓冲 液处理 抽提 PG 和自由 GAG 链以及 带有短 肽链的 GAG。 抽提的 物质可 通过离 子交换 层析或 CPC 和乙 醇沉淀 方法浓 缩和部 分纯化 。涉及 PG 的实 验均在 4X: 进行 ,并 同时加 入蛋白 酶抑 制剂, 使核心 蛋白降 解减少 到最低 限度; 涉及 GAG 的 实验则 可以在 室温下 进行。 1. 材料 组 织样本 、条件 培养基 、生 物液 体或培 养细胞 • 748 • 盐酸狐 / 两 性离子 去污剂 3-12 抽提 缓冲液 (4 mol/L 盐 酸胍, 0.2% 两 性离子 去污剂 3-12, 50 mmol/L 乙 酸钠, 10 mmol/L EDTA, 10 mmol/L NEM, 1 mmol/L PMSF C 存 液, lpg/mL 胃 酶抑素 A, 0.5pg/mL 亮肽素 。使 用之前 加入蛋 白酶抑 制剂, pH 调到 6.0) Triton X-100 抽提缓 冲液, 41C (可选 ) (0.5% Triton X-100, 0. 15 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, 10 mmol/L NEM, 1 mmol/L PMSF jC 存液, lptg/mL 胃 酶抑素 A, 0.5pg/mL 亮肽素 。使 用之前 加入蛋 白酶抑 制剂, pH 调至 7.40) 2000X 蛋白酶 抑制剂 贮存液 [抑 制组织 蛋白酶 B 0.1mg/mL 亮肽素 ,抑制 硫醇蛋 白酶 2mol/LNEM, 抑 制组织 蛋白酶 D 0.2mg/mL 胃 酶抑素 A; 抑制 丝氨酸 蛋白酶 0.2 mol/L PMSF (溶 于乙醇 )。 以 上贮存 液均于 -20t: 分装 贮存] 离心机 和转子 (例如 SorvallSS-34) 或 超速离 心机, 4X: 检测 艾杜糖 醛酸和 代谢性 放射标 记的附 加试剂 和设备 2. 操 作步骤 (la) 抽提组 织样本 :冷冻 、剁碎 ,每 克组织 (湿重 ) 加入 5 〜 10 体积 4X: 盐酸胍 / 两 性离子 去污剂 3-12 抽提 缓冲液 ,混合 。搅拌 样本, 4X: 过夜。 (lb) 条 件培养 基或生 物液体 的抽提 :冷却 标本到 4t:, 并将 固体的 盐酸胍 溶解到 4 mol/L 终浓度 ,两 性离子 去污剂 3-12 去垢剂 稀释成 0.2% 的终 浓度, EDTA 溶 解成为 10 mmol/L 的 终浓度 。加 入贮存 液中的 蛋白酶 抑制剂 ,得 到最终 浓度为 10mmol/LNEM/l mmol/L PMSF/1 卩 g/mL 胃 酶抑素 A/0.5 pg/mL 売肽素 ,这 种方 式增力 口试剂 ,确 保体积 的增加 最小。 (lc) 抽提培 养细胞 :加入 盐酸狐 / 两 性离子 去污剂 3-12 或抽提 缓冲液 ,每 107 细胞 (大约111^细胞团)或每7.5£:〇12单房细胞加3~511^。细胞团或单层细胞将于4^:下111 内溶解 。培 养细胞 、条 件培养 基或生 物液中 PG 也 可溶于 Triton X-100 抽提 缓冲液 ,但 是抽提 效率应 该检验 。如 使用 TritonX-100 抽提 缓冲液 ,进 一步纯 化之前 就不必 要除去 盐 酸胍。 (2) 4X: 下 12 000Xg (1〇 〇〇〇r/min, Sorvall SS-34 转子) 离心 20min, 或 4X: 最大 速度超 速离心 lOmin, 除 去不溶 的残渣 ,并 收集上 清液。 如果有 必要, 用新鲜 的抽提 缓冲液 再次抽 提残渣 ,离心 ,并将 上清液 汇并。 对 于条件 培养基 、生 物液和 培养液 ,用抽 提缓冲 液一次 处理通 常足够 。组织 样本需 要再次 抽提。 (3) 用离子 交换层 析或用 CPC 和 乙醇处 理纯化 GAG (见后 )。 (4) 利 用化学 方法检 测糖醛 酸含量 ,或 者如果 起始材 料已被 35S04 或 3H-GlcN 放射 标记 ,检测 放射性 物质的 含量, 从而定 量检测 GAG 含量。 . (二) 碱抽提 蛋白聚 糖和糖 胺聚糖 如 果首要 的目的 是简要 描述样 本中是 否含有 PG 或 GAG, 可 用碱抽 提一份 样本。 碱的抽 提会导 致一些 链从核 心蛋白 中脱去 ,以 及核心 的裂解 ,因此 这一技 术不适 用于分 离 完整的 PG。 碱抽 提的样 本常易 于使蛋 白彻底 溶解或 p 完全 消除而 释放出 GAG 链。 • 749 • GAG 然后通 过阴离 子交换 层析或 CPC 和 乙醇沉 淀纯化 ,再 进行化 学性或 放射化 学性定 量 。这一 方法适 于培养 细胞、 条件培 养基或 生物液 ,组织 样本应 用浓盐 / 去垢剂 的方法 抽提。 1. 附 加材料 0. 1 mol/L 或 10 mol/L 氢 氧化钠 (NaOH) 10 mol/L 乙酸 附加 P 消除 (P-elimination) 试剂 和设备 2. 操 作步骤 (1) 室温下将样本溶解于〇.11^1/1^他0仏25<0孵育1〇111丨11。一般来说,每107 细 胞相当 于一个 细胞团 ,应用 〇.5mL0.1md/LNaOH, 每 7.5cm2 的细 胞单层 ,用 2mL 0. 1 mol/L NaOH 足够。 悬浮于 培养基 中的细 胞可通 过每毫 升培养 基加入 10pL 的 10 mol/L NaOH 进行 抽提。 (2) 每毫升 样本用 10/uL 10 mol/L 乙 酸中和 。在 12 000 X g (1〇 〇〇〇r/min Sorvall SS~34 转子 ) 4X: 下离心 20min 或 4X: 最大 速度超 速离心 lOmin, 除去所 得的沉 淀物。 (3) 用非特 异性的 蛋白酶 ,例如 Pronase 或 蛋白酶 K 处理 中和 的样本 ,或者 将样本 置于易 (3 消除的 条件下 ,释放 单个的 GAG 链。 (4) 用离子 交换层 析或用 CPC 和 乙醇处 理纯化 GAG。 (5) 利用 化学方 法检测 糖醛酸 含量; 如果 起始材 料已被 35304或3只-01(^ 放射 标记, 检测 放射性 物质的 含量, 从而定 量检测 GAG 的量。 (三) 蛋白 聚糖和 糖胺聚 糖的阴 离子交 换层析 PG 和 GAG 可于弱 的离子 交换树 脂中进 行离子 交换层 析纯化 。这一 步适合 从大量 的 溶液中 收集非 常少量 的物质 ,因此 要浓缩 样本。 阴离子 交换层 析可分 离各种 不同型 GAG, 但是 低盐洗 脱时, 不管成 分怎样 ,会产 生一个 含所有 GAG 和 PG 混 合物。 1. 材料 PG-GAG 抽提物 尿素 / 两 性离子 去污剂 3-12 缓冲液 (4 mol/L 超纯级 尿素, 0.2% 两 性离子 去污剂 3-12, 50 mmol/L 乙 酸钠, 10 mmol/L EDTA, 10 mmol/L NEM, 1 mmol/L PMSF 贮存 液 , lMg/mL 胃 酶抑素 A, 0.5/ig/mL 亮肽素 。使 用之前 加入蛋 白酶抑 制剂, pH 调到 6.0) 20mg/mL 硫酸软 骨素或 肝素于 20 mmol/L Tris-HCl pH7.0 DEAE-Sephacel (pharmacia Biotech) 0.2 mol/L NaCl/50 mmol/L 乙 酸钠, pH6.0 DEAE 冲洗 缓冲液 (将 11.7gNaCl 加入 1L 尿素 /zwittergent3-12 缓 冲液, 4*C 保存 几个月 ) • 750 • DEAE 洗脱 缓冲液 (将 58.5g NaCl 加入 1L 尿素 /zwittergent 3-12 缓 冲液, 4t: 保存 几个月 ) Sephadex G-25 (pharmacia Bietech) 10% 乙醇 20 mmol/L Tris-HCl, pH7.4 离心机 和转子 (例如 SS-34) 或 超速离 心机, 41C 供透析 、凝 胶过 滤和离 子交换 层析所 用的附 加试剂 和设备 2. 操 作步骤 (1) 如果 抽提物 中含有 盐酸胍 / 两 性离子 去污剂 3-12, 用尿素 / 两 性离子 去污剂 3-12 缓冲液 进彳了 透析。 12 000 X g (1〇 〇〇〇r/min, Sorvall SS-34 转子 ) 4*C 离心 20min, 或 4X: 最大 速度超 速离心 lOmin, 除去 沉淀。 也 可用凝 胶过滤 层析或 超过滤 来改变 缓冲液 。在 Triton X-100 抽提缓 冲液中 制备的 抽提物 层析不 用进一 步处理 。只 要不 明显增 加样本 液的离 子电荷 ,可 加入蛋 白酶抑 制剂。 (2) 如果 样本总 GAG 含量 <100吨, 并不影 响随后 的分析 ,可 加入 1 〜 2mg 硫酸软 骨 素作为 载体。 如果 PG 或 GAG 通过 检测糖 醛酸可 以定量 ,可 以不用 GAG 载体 。选 择硫酸 软骨素 ,因为 它较肝 素或硫 酸肝素 更便宜 。肝 素能 抑制软 骨素酶 ,可 用来确 定硫酸 软骨素 链的存 在及其 组成。 (3) 制备 DEAE-Sephacel 柱:用 0.2 mol/L NaCl/50 mmol/L 乙酸钠 pH6.0 反复冲 洗树脂 3 次 ,用 一小块 玻璃棉 堵塞一 聚丙烯 吸管头 (P-1000), 然 后加入 0.5 〜 lmL 树 脂 ,制 成一个 小柱。 轻轻切 掉顶端 (1 〜 2mm), 加 宽出口 ,提高 流速。 再去掉 另一吸 管 头底部 1/3, 插入 第一个 吸管头 。这 在树脂 床上提 供大约 2. 5mL 附加 空间。 (4) 用大约 5 个柱 体积的 DEAE 冲洗缓 冲液再 平衡柱 (5) 向 平衡柱 添加样 本:用 20~30 个柱 体积的 DEAE 冲洗缓 冲液, 洗脱污 染物。 用 5 个柱 体积的 DEAE 洗 脱缓冲 液洗脱 PG 和 GAG, 并收 集为一 部分。 要避免 树脂的 结合能 力过强 ( 大约每 毫升树 脂结合 5mg 硫酸 软骨素 、硫酸 肝素或 肝素) 如 果这些 试剂影 响随后 的分析 ,可 以制备 无尿素 、去垢 剂和蛋 白酶抑 制剂的 缓冲液 来代替 (例如 用多 糖裂解 酶进行 酶消化 )。 自由 GAGs 层析 不需要 尿素或 蛋白酶 抑制剂 ,但是 应该应 用去垢 剂来提 高回 收率。 可加快 流速。 (6) 用 Sephadex G-25 凝胶过 滤柱, 10% 乙醇 给样本 去盐。 如果样 本体积 <2. 5mL, 可用 一次性 PD-10 柱 (pharmacia Biotoch)。 (7) 冻 干样本 ,并用 20 mmol/L Tris-HCl pH7. 4 或 其他合 适的缓 冲液再 水化, 40.1mg/mL CPC 沉淀反 应要求 GAG 浓度 >0.1mg/mL, 以便高 效回收 。如 果加入 了载体 ,就不 能通过 检测糖 醛酸浓 度来定 量分析 GAG。 (3) 每 4mL 样本 中加入 lmL3% 的 CPC, 37X: 孵育 lh。 (4) 12 000 X g (1〇 〇〇〇r/min, Sorvall SS~34 转子) 离心 20min 或室 温下最 大速度 超 速离心 lOmin。 弃去上 清液, 用少量 0.5 mol/L 乙酸 钠重新 悬浮沉 淀物, 使最终 GAG 浓度 大约在 10mg/mL。 离心应 在室温 下进行 ,否则 CPC 会发 生沉淀 。如果 有必要 ,可 将样 本短暂 沸水浴 ,溶解 沉淀。 (5) 加入 4 个体 积冷冻 95% 乙醇, 混合, 4t: 孵育 >2h 乙醇沉 淀需要 加入盐 ,并 且量 要充足 ,以获 得高回 收率。 样本中 应含有 0.1~0. 5 mol/L 盐, O.lmg/mLGAG。 如果材 料不足 ,可 加入硫 酸软骨 素作为 载体。 (6) 12 000 X g ( 1〇 〇〇〇r/min Sorvall SS~34 转子) 离心 20min, 或最 大速度 超速离 心 'lOmin, 让形成 的白色 沉淀集 成团。 除去上 清液。 (7) 小量 0.5md/L 乙酸钠 /10% 乙醇溶 解沉淀 ,使最 终浓度 为大约 lmg/mL。 重复 乙醇 沉淀。 (8) 真 空干燥 沉淀物 ,重 悬浮于 pH7.4 的 20 mmol/L Tris-HCl 或其 他适当 的缓冲 液中。 4X: 保 存以便 再用。 (五) 方 法评注 1) 背 景知识 PG 抽 提方法 首先是 从软骨 PG 的研究 中发展 起来的 ,这 些方 法采用 浓盐和 盐酸狐 来破坏 离子相 互作用 ,将 PG 从含 有透明 质酸和 基质蛋 白的聚 集物中 分离。 PG 和 GAG 在其他 组织、 生物液 、培 养细胞 中结构 和组成 上同软 骨明显 不同, 但起先 的抽提 方法仍 然有效 。很多 PG 通过疏 水区或 糖基化 磷酯酰 肌醇锚 同细胞 膜相连 , 膜上的 PG 需要去 垢剂 破坏疏 水作用 ,而产 生微团 分散体 。本 部分抽 提和纯 化方法 应用了 变性剂 和去垢 剂。 2) 重要 参数及 相关问 题处理 (1) 抽提 效率。 盐酸狐 / 两 性离子 去污剂 3-12 抽 提缓冲 液能使 大多数 大分子 物质溶 解, 然而一 些组织 (如主 动脉) 可能不 分散, 使一些 PG 存于 不溶的 残渣中 。样 本于抽 提缓冲 液中机 械搅匀 ,可 提高回 收率。 要明确 总的抽 提效率 ,推测 PG 的整 个释放 ,可 将样 本分装 于抽提 缓冲液 中孵育 ,间歇 性地采 用阴离 子交换 层析或 CPS 和乙醇 沉淀方 法将 PG 从 其他成 分中分 离出来 。如 果样本 量充足 ( 糖醛酸 >50mg), 测 定糖醛 酸的量 便 可检测 PG 和 GAG 的释放 。另 外如 果培养 细胞用 35S04或3H-GlcN 生 物合成 标记, PG 的抽提 物可根 据放射 化学法 容易进 行检测 。任 何不 溶性残 渣可用 0.1 mol/L NaOH 溶 解 ,然 后测定 残余的 GAG。 如果 10% 的材料 存在于 残渣中 ,可用 不同的 去垢剂 (例如 1% TritonX-100 或 1% 去氧胆 酸盐) 或 增加盐 (例如 LiCl)、 用胶 原酶处 理样本 、改变 pH 或增加 还原剂 (例 如巯基 乙醇) 等改 变抽提 条件。 Kimura 等 (1981 年) 指 出依次 加 入去垢 剂和盐 酸胍较 同时加 入二者 能从软 骨中抽 提更多 的蛋白 聚糖。 (2) 回收 。如同 其他纯 化方法 一样, 恰当的 准备材 料是确 保高效 回收所 必需的 。根 据糖醛 酸量进 行检测 ,样本 的理想 状态是 至少含 O.lmg 的 GAG。 因为细 胞培养 常常产 生少 量的材 料物质 (0.1 〜 lfig GAG 糖醛 酸八06 个细胞 ), 应该加 入载体 GAG。 商业生 产硫酸 软骨素 较便宜 ,为 PG 和 GAG 的纯 化提供 了合适 的载体 。然而 ,加 入了 载体就 不能 通过化 学检测 糖醛酸 而来监 测回收 的情况 。因此 ,载 体的 添加只 适合于 35304或3凡 GlcN 生物合 成标记 的样本 。充 足的 样本量 对有效 CPC 和乙醇 沉淀很 重要。 蛋白酶 抑制剂 的应用 对维持 PG 核 心蛋白 完整性 很重要 。在这 些方法 中应用 的缓冲 液 包括有 亮肽素 (抑 制组织 蛋白酶 B)、 NEM (抑制 蛋白酶 并阻止 非特异 性二硫 化物交 换 )、 胃 酶抑素 A (抑 制组织 蛋白酶 D)、 PMSF (抑制 丝氨酸 蛋白酶 ) 以及 EDTA (抑 制金属 蛋白酶 )。 另外 ,样本 应速冻 ,快速 处理, pH 应 保持在 6.0, 以消 除酸性 溶酶体 蛋白酶 和中性 组织蛋 白酶的 作用。 如 果在方 法中所 描述的 条件下 ,出现 核心蛋 白降解 (这可 反映在 回收率 的不同 ), 应采用 其他的 抑制剂 。例如 ,盐 酸苯 甲酰胺 lmmol/L 可 抑制丝 氨酸蛋 白酶; 6- 氨基己 酸在 0.1 mol/L 能抑 制组织 蛋白酶 D; 磷 酸酰胺 0.5 mmol/L 能抑制 胶原酶 、金属 蛋白内 切酶 以及基 质溶解 蛋白; 0.1mg/mL 大豆胰 蛋白酶 抑制剂 能抑制 胰蛋白 酶类蛋 白酶; 0. 1 mmol/L bestat in 能抑制 一 ■些氨 基肤酶 。十 二焼基 磺酸钠 (SDS) 能抑 制蛋白 酶是因 为它能 使蛋白 质变性 。然而 , SDS 很 难除去 ,它 同阴离 子交换 层析和 CPC 沉淀不 相容, 使进一 步纯化 步骤更 复杂。 不过, SDS 能维持 聚集蛋 白质的 可溶性 ,应 作为 CPC 沉淀 和阴离 子交换 层析之 后进行 纯化的 一个辅 助剂。 两 性离子 ( 例如两 性离子 去污剂 3-12) 和 非离子 去垢剂 (例如 TritonX-100) 有助 于 溶解膜 PG 和阻止 非特异 性结合 和聚集 而提高 回收率 。这 些去垢 剂在浓 盐和低 温条件 下仍 然可溶 。同 大多数 纯化方 法是一 致的。 (3) 纯度。 PG 纯化 到化学 同质性 ( 单一种 PG 不伴 污染) 尚 很困难 。因为 很少有 大分 子物质 具有多 阴离子 GAG 链所赋 予的带 电特性 ,本 部分介 绍的方 法能获 得富含 . 753 • PG 的材料 。核酸 容易同 PG 和 GAG 共 同纯化 ,但是 核酸、 弱带电 或中性 寡糖和 多糖不 能被 CPC 有 效沉淀 。如果 有必要 ,样本 可以用 DNA 酶、 RNA 酶处理 减少 核酸的 含量。 一些污 染物与 GAG 链通 过离子 相互作 用而与 PG 相连, 可以试 用其他 的纯化 方法, 包括 CsCl 密度梯 度离心 ,浓 盐凝胶 层析或 盐酸胍 于辛基 向层析 ,以 及单克 隆抗体 的亲和 层析。 除外亲 和层析 使用固 定蛋白 或抗体 ,这 些方法 大多同 分离条 件是一 致的。 一些 蛋白质 污染物 通过链 内的二 硫键相 互作用 而与核 心蛋白 聚集。 如果一 些基质 PG 通过二 硫键同 不溶的 基质蛋 白相连 ,可 能不 能有效 地抽提 。在温 度升高 情况下 ,应 用 10 mmol/L dithiothreitol 进行还 原反应 ,再 碱化 (例如 iodoacetamide), 应该 有助于 分 离这些 蛋白。 上 述的纯 化方法 不能从 PG 中分 离自由 GAG 链 。自 由链较 PG 常有 不同的 斯托克 斯半径 ,凝 胶过 滤层析 常能从 PG 中 分离出 GAG。 材料 经卩消 除或蛋 白溶解 ,能 分离成 更 多的组 分证实 原始样 本中有 PG 存在。 如果材 料充足 ,蛋白 比色定 量有助 于区分 PG 和 GAG。 但是 蛋白污 染可能 使分析 复杂化 ,利 用放射 活性氨 基酸和 35304或3化〇1(^ 进 行 PG 生物 合成标 记提供 了另一 种监测 PG 和 GAG 洗脱 方法。 3) 预期结 果和时 间估计 浓盐 / 去 垢剂和 碱抽提 方法很 容易从 大多数 组织和 细胞中 抽提出 PG。 离子交 换层析 和 CPC、 乙醇 沉淀可 以生产 制备出 足够量 和相当 纯度的 PG 或 GAG, 供成分 分析。 组织常 需要隔 夜抽提 ,但是 培养细 胞的抽 提很快 ,常在 lh 内 可完成 。完成 透析需 要几 种缓冲 液交换 ,得 24~48h。 阴离 子交换 层析和 CPC 沉淀在 Id 左右可 完成。 因此, 花 3 〜 4d 时间 可从生 物样本 中抽提 、部 分纯化 和浓缩 PG 和 GAG。 三、 糖脂及 其纯化 . 。 “糖脂 ”指一 大类来 源不同 和定义 不明确 的由糖 和脂组 成的复 合物。 它们包 括从大 的寡糖 复合物 (细 菌细胞 壁多糖 、动 物细胞 糖蛋白 生物合 成的中 间物) 到植物 、酵 母、 分 支杆菌 、动物 细胞的 膜成分 。本 部分 主要介 绍研究 最普遍 的糖鞘 脂的制 备方法 。这些 研究用 以比较 不同细 胞和细 胞系的 糖鞘脂 或比较 实验和 对照细 胞或细 胞系。 首先介 绍所有 糖鞘脂 的抽提 ,包括 那些来 自组织 或培养 细胞的 少量糖 鞘脂和 含有大 分子 寡糖的 糖鞘脂 。根 据它们 在极性 和非极 性溶剂 中的相 对可溶 性可进 行随后 的分离 (Folch 分离 )。 接着介 绍用于 这一方 法中的 Sep-PakC18 萃取柱 (Cartridge) 的制 备和使 用 。随 后介绍 从前一 方法的 终产品 (Folch 分离 上相) 中制 备神经 节苷脂 ,以 及通过 DEAE-Sephadex 层析将 其分离 为单、 双和多 涎酸化 的神经 节苷脂 。最后 介绍一 种从总 脂质抽 提物中 分离神 经节苷 脂的更 快速的 方法, 是由第 一种方 法所产 生的新 途径。 无论糖 脂是涉 及其他 糖复合 物的生 物合成 ,还是 涉及特 异性寡 糖或蛋 白质在 细胞膜 上 的锚点 ,它 们独特 的亲水 和疏水 特性也 为其分 离和纯 化提供 了特有 的途径 。由 于种类 的 多样性 ,没 有一种 方法适 合于各 种糖脂 的纯化 。方 法的选 择依赖 于目的 糖脂的 种类, 但由 于物理 性质的 相似性 ,使 不同种 类糖脂 纯化可 采用许 多相同 或相关 技术。 大多数 研究工 作集中 在动物 细胞表 面糖脂 ,特 别是 糖鞘脂 和糖基 化磷脂 酰肌醇 • 754 • (GPI) 膜锚 。糖鞘 脂是神 经酰胺 (ceramkie) ( 长链碱 鞘氨醇 的一种 脂肪酰 衍生物 ) 糖 基化连 接于一 种单糖 ,常 是葡 萄糖或 半乳糖 ,然后 再由另 外的糖 分子加 以修饰 。由 于脂 肪酸和 / 或神 经酰胺 成分的 鞘氨醇 结构不 同以及 寡糖成 分的多 样性, 糖鞘酯 的性质 各异。 例如 ,含短 链脂肪 酸的神 经酰胺 和长寡 糖链组 成的糖 鞘酯与 含长链 脂肪酸 的神经 酰胺与 短 寡糖链 组成的 糖鞘脂 相比较 ,前 者在极 性溶液 中可溶 性更好 。另外 ,寡 糖表面 的带电 残 基会降 低其疏 水性。 这一部 分讨论 了两种 糖鞘脂 : ①中性 糖鞘脂 ,包 括从 单己糖 化神经 酰胺到 多糖基 化神 经酰胺 的大分 子中性 糖脂; ②带 负电 荷鞘脂 ,主要 是神经 节苷脂 ,是 含有 带负电 涎酸 残基的 一种糖 鞘脂。 第 一种方 法将脂 质抽提 物分离 为:非 极性下 相部分 ,包 括有较 四己糖 化神经 酰胺要 小的中 性糖脂 和污染 的中性 及两性 离子的 脂质; 极性 的上相 部分, 包括有 神经节 苷脂和 一般较 四己糖 化神经 酰胺大 的中性 糖脂。 上相部 分通过 Sep-Pak C18 萃取 柱进行 洗脱去 盐 。下相 部分采 用不受 污染中 性脂质 和磷脂 影响的 方法进 行分离 。如 果采 用了放 射活性 糖 前体物 质标记 ,这些 下相的 分离物 不会受 中性脂 质和磷 脂污染 物影响 , 因为只 有糖才 能通 过分离 技术得 以检测 。如果 用做原 始材料 的细胞 已被代 谢性放 射标记 ,污染 的下相 也可 以采用 碳水化 合物特 异性试 剂进行 分析。 薄层层 析结合 放射自 显影可 用以分 离和检 测 极少量 的糖脂 ,不需 要贵重 的设备 ,单 个放 射标记 细胞培 养皿就 可获得 足够的 有关纯 化 、放 射标记 糖鞘脂 的资料 。另外 ,可采 用高效 液相色 谱或用 125I- 标记碳 水化合 物结合 蛋白进 行薄层 层析。 上相可 按第二 种方法 处理纯 化神经 节苷脂 ,只 要神经 节苷脂 (并不 是中性 糖鞘酯 ) 是 所研究 的对象 ,这些 程序可 以简化 ,完 成第 一个方 法的前 九步后 ,再 接着选 择快速 神经节 苷脂抽 提方法 。两 种纯化 神经节 苷脂的 方法均 适于放 射标记 糖复合 物 的分析 ,这些 方法同 随后从 相同的 样本进 行抽提 和分析 总的膜 糖肽或 糖蛋白 是一致 的 。图 11.5 表 示了分 离过程 及各个 方案的 关系。 警告 :如果 采用的 细胞进 行了代 谢性放 射标记 ,应 采取适 当的方 法处理 和处置 放射性 样本。 组 织或培 养细胞 用 有机溶 剂提取 (第一 种方法 ,步骤 1~8) 总脂 质抽提 Folch 分离 (第一 种方法 ,步骤 9~13) 上相 糖鞘脂 含 >4 个 糖残基 通过 Sep-Pak 萃取 柱纯化 (第一 种方法 ,步骤 14~17) 非脂 污染物 中性 糖鞘脂 和神经 节苷脂 中性 糖鞘脂 神经 节苷脂 下相 糖鞘脂 含 1~4 个 糖残基 快速 DEAE-Sephadex 柱 层析法 图 11.5 从细 胞全脂 提取物 中分离 糖鞘脂 流式图 注意 :整个 实验采 用了去 离子、 蒸馏水 . 755 . (一) 细胞 或组织 中糖脂 的抽提 和纯化 1. 原理 因 为糖鞘 脂含有 寡糖和 神经酰 胺成分 ,所 以具有 双歧性 —— 即 表现有 亲水和 疏水的 对立性 。根据 极性、 非极性 (中 性糖) 和带电 成分基 团的相 对含量 ,糖鞘 脂在水 溶性和 非水 溶性溶 剂中表 现不同 。因此 ,根 据可溶 性已建 立了许 多抽提 和分离 这些物 质的方 法 。这部 分详细 介绍了 一种不 仅抽提 非极性 糖鞘脂 而且抽 提来自 培养细 胞或少 量组织 (<0.5g) 的 带电和 高度糖 基化的 衍生物 的方法 。首 先用有 机溶剂 抽提总 的细胞 脂质, 然后用 Folch 分 离方法 再分离 成各个 部分。 2. 材料 组织样 本或来 自一个 或几个 培养板 的细胞 培养基 甲醇 (HPLC 级) 氯仿 (HPLC 级) 4:8:3 氯仿 / 甲醇 / 水 1:1 和 2:1 氯仿 / 甲醇 100% 乙醇 0.1 mol/L KC1 1:1 甲醇 /0.1 mol/L KC1 1:1 甲醇 /H20 Sep-Pak Cw 萃取柱 搅拌器 (waring) 尖顶声 处理器 (Branson) 或组织 混匀器 (Tekmar), 带有 一个适 当大小 的探头 ,浴 式声 处理器 旋 转式蒸 发器、 Speedvac (savant)、 润式 蒸发器 (Labanco) 或氮 干燥器 1.5mL 耐氯 仿聚丙 烯超速 离心管 ,或 12mL 柱 状玻璃 离心管 蛋 白质定 量分析 和蛋白 电泳所 需的其 他试剂 和设备 3. 操 作步骤 有机溶 剂抽提 样本: (1) 如果采 用培养 细胞, 可根据 各细胞 类型的 常规程 序离心 去上清 ,再用 PBS 或 合适 的等张 液重悬 浮沉淀 ,再 离心去 上清。 这样便 获得样 本并得 以冲洗 ( 除去了 浆液成 分, 在有代 谢标记 实验中 ,也除 去了未 结合的 放射活 性前体 )。 将组织 或细胞 团溶于 2 〜 4t: 水中 ,每 克组织 (湿重 ) 采用 2 〜 3mL 水 ,或足 够量水 ,以 形成细 胞悬液 ,含 0.1 〜 6mg/mL 蛋白质 。用搅 拌器、 声处理 器或组 织混匀 器进行 混匀。 从冻 干的细 胞样本 中有效 抽提糖 脂是很 困难的 ,应 该避免 。对培 养细胞 ,在 1.5mL 超速 离心管 内 ,将 来自一 到几个 60rmn 培 养板的 细胞团 悬浮于 〇.24mL 水中。 然后采 用浴式 声处理 器进行 混匀。 样本量 较大时 , 可采用 12mL 柱式玻 璃离心 管3 • 756 • 样本 在匀化 和抽提 期间应 保存于 冰面, 以防内 源性糖 苷酶对 碳水化 合物的 消化。 (2) 形成 3 倍体 积细胞 匀浆后 ,加入 8 倍体 积甲醇 ,再立 即加入 4 倍 体积的 氯仿, 并不断 地混合 。因小 量体积 ,这 一步 可于浴 式声处 理器内 进行。 如果样 本起先 悬浮于 〇.24mL 液体中 ,应 加入 0.64mL 甲醇, 再加入 0.32mL 氯仿 ,达到 总抽提 体 积大约 1 .2mL。 (3) 20 〜 30X:, 于浴式 声处理 器中孵 育样本 30min。 20~30t: 的温 度可以 破坏不 稳定的 O- 乙酰 化基团 ,和 / 或诱 导涎酸 O- 乙酰 化衍生 物的转 酰基作 用。 如果涎 酸乙酰 化对后 面的分 析较重 要的话 ,可采 用低温 。这种 情况下 ,溶剂 使用之 前应冷 却到适 当的 温度。 可通过 向浴式 声处理 器内加 入冰块 ,以维 持温度 在室温 或室温 以下。 (4) 880〇Xg (ll〇〇〇r/min) 离 心样本 lmin 并 收集上 清液。 (5) 将第 4 步的 沉淀物 ,用 大致相 当于第 2 步的 总抽提 体积的 4:8:3 氯仿 / 甲醇 / 水 再 抽提。 8800 x g 离 心样本 lmin, 收集 上清液 并与第 4 步的 汇总。 (6) 分别用 1:1 氯仿 / 甲醇, 2:1 氯仿 / 甲醇和 100% 乙 醇按第 4 步方 法反复 抽提第 5 步 的沉淀 3 次; 将上清 液同第 4、 5 步 汇总。 (7) 如果 有必要 ,可 利用乙 醇冲洗 沉淀物 ( 主要含 有无脂 蛋白和 糖蛋白 ), 再进行 一维或 二维凝 胶电泳 分析总 蛋白, 或蛋白 酶消化 分离总 糖蛋白 。不要 让沉淀 物干燥 ,重 新悬 浮于含 SDS 的缓 冲液中 。如 果必要 的话, -20X: 或 -80X: 保 存以便 再用。 两 次氯仿 / 甲醇 冲洗, 采用较 样本更 高浓度 的非极 性溶剂 ,确 保抽提 物为极 性较弱 的糖脂 (神经 酰胺的 单糖或 双糖衍 生物较 含有大 寡糖成 分的糖 脂具有 更强的 疏水性 )。 乙醇冲 洗可以 除去氯 仿和甲 醇, 避免这 些溶剂 对随后 的细胞 团处理 的破坏 作用。 (8) 采用旋 转式蒸 发器、 涡式蒸 发器、 Speedvac 或氮 干燥器 将步骤 (4) ~ (6) 的上 清 液蒸发 干燥。 采 用氮蒸 气干燥 ,要 较其他 3 种方法 花更长 时间除 去最后 少量水 。干 燥的 粗略脂 质抽提 物可于 -20X: 保持 干燥贮 存以供 再用。 进行 糖鞘脂 Folch 分离: (9) 将第 8 步 粗略脂 质抽提 物溶于 l.OmL 的 2:1 氯仿 / 甲醇 (或如 果样本 〉lmL, 则加入 10% 〜 25% 最初悬 浮样本 的体积 )。 (10) 加入0.1〇1〇1/1^1^10.211^(或0.2体积)并剧烈振荡混合,8800\尽离心 lmin (将 会分离 成两相 )。 如果 是小规 模制备 ,可于 1.5mL 聚丙烯 超速离 心管内 进行。 如果是 大体积 ,可让 混合物 室温放 置 ,即 可得到 相分离 (或者 4X: 于 分离漏 斗过夜 )。 (11) 用一 巴氏吸 管小心 移去上 相部分 (大约 50% 总体积 )。 用与移 去的上 相部分 等 体积的 1:1 甲醇 /O.lmol/LKCl 冲 洗下相 ,混合 ,于 880〇Xg 离心 lmin 分 离各相 (这 便于移 去污染 的上相 )。 (12) 收集上 相并与 第一个 上相部 分汇总 。再 一次用 1:1 甲醇 /O.lmd/LKCl 冲洗 下相 ,同第 11 步上相 汇总。 (13) 用 0.5 体积 2:1 氯仿 / 甲醇冲 洗汇总 的上相 。然 后将冲 洗液的 下相同 (12) 步 的汇总 下相再 汇总。 结合 的下相 部分含 带寡糖 的中性 糖脂, 比四糖 、中性 脂和磷 脂均小 。四糖 —— 神经 酰胺常 分离在 两相 ,引 起轻度 污染。 结合的 上相部 分含有 许多神 经节苷 脂和大 多数较 大的中 性糖脂 (> 四己 糖酰神 . 757 . 经胺酸 ) 以及来 自原始 抽提物 和下相 冲洗过 程中的 无机盐 等水溶 性物质 。当采 用了代 谢性放 射标记 , 上相 还含有 放射性 糖前体 及其中 间物。 结合的 下相部 分可采 用不受 污染的 中性脂 和磷脂 影响的 方法进 行分析 ,例如 TLC 和糖脂 的放射 自显影 (如果 细胞已 被单糖 前体放 射标记 ), 1251 标 记碳水 化合物 结合蛋 白的薄 层层析 ,或 HPLC( 高效液 相色谱 )。 结 合的上 相部分 可按下 面的步 骤处理 ,及 按最后 两种方 法进行 纯化。 处理 结合的 上相部 分以供 分析: (14) 用 5 〜 10mL 的 1:1 甲醇 / 水溶液 稀释结 合的上 相部分 ,然 后加入 Sep-PakC18 萃取柱 。用 一支试 管收集 流出物 ,再加 入萃取 柱重复 一次。 液体应 该按要 求加入 seP-PakC18 萃取柱 ,让 上相部 分流经 萃取柱 除去盐 和其他 非脂性 污染物 ,将 流 出物收 集并再 次加入 萃取柱 ,确 保样本 中所有 含脂成 分完全 吸收。 (15) 用 10mL — ■份 的水反 复冲洗 萃取柱 5 次, 确保除 去所有 极性污 染物。 (16) 用 1:1 氯仿 / 甲醇 冲洗柱 5 次, 4:8:3 氯仿 / 甲醇 / 水冲洗 3 次, 洗脱神 经节苷 脂和高 相对分 子质量 的中性 糖脂。 最后一 次用极 性更强 的溶剂 洗脱含 大分子 寡糖的 糖脂, 后者用 1:1 氯仿 / 甲 醇不能 洗脱。 (17) 将 各种溶 剂冲洗 物汇并 后蒸发 干燥。 (二) Sep-PakC18 萃取 柱制备 1. 原理 这一 方法详 细介绍 Sep-Pak C18 萃取柱 的制备 ,以 用于 Folch 分 离的上 相糖脂 部分清 除盐 和其他 非脂的 污染物 。所 有含有 脂的成 分将会 滞留于 Sep-PakC 18 萃取柱 ,水 溶性 的污染 物可用 极性溶 剂洗脱 ,含脂 的物质 用非极 性溶剂 洗脱。 2. 附 加材料 O.lmol/L 乙酸铵 ,于 1:1 甲醇 / 水中 Sep-Pak Cw 萃取柱 (Waters) lOmL 带有 固定轴 的玻璃 注射器 (例如 Becton Dickinson Luer-Lok) 3. 操 作步骤 (1) 从 注射器 管中拿 出活塞 ,将 Luer-Lok 轴 连结到 Sep-Pak C18 萃取柱 长末端 ,通 过向 注射器 管加入 液体, 并将活 塞插入 注射器 ,慢慢 推动液 体而通 过萃取 柱泵出 10mL 甲醇。 将洗脱 的甲醇 收集于 一烧杯 或其他 适当的 容器中 。从 注射器 撤去萃 取柱, 然后撤 去活塞 ,然 后再 连接萃 取柱。 (2) 按同 样方法 ,进一 步冲洗 (每次 l〇mL) 用 1:1 氯仿 / 甲 醇冲洗 3 次 用 0.1 mol/L 乙酸 /1:1 甲醇 / 水冲洗 2 次 Sep-Pak 018萃 取柱可 至少用 5 次。 用空气 将最后 的甲醉 / 水冲洗 干净, 室温干 燥保存 ,每 次使用 前应重 复准备 步骤。 • 758 • (三) 神经 节苷脂 的制备 通过 Fdch 分 离将带 电的糖 脂同上 相部分 中性糖 脂分开 ,继而 很容易 地将糖 脂抽提 物 分级分 离为中 性糖脂 和神经 节苷脂 ,这儿 介绍一 种简单 的柱层 析过程 , 也可用 包括阴 离子 交换高 效液相 色谱等 更复杂 的方法 。这 一方法 最先是 用于从 50g 组织 抽提物 上相中 分离 神经节 苷脂, 也较好 地适用 于从代 谢性放 射标记 的培养 细胞抽 提物上 相中抽 提神经 节 昔脂。 1. 材料 甲醇 0£^-56?113(^平衡于100%甲醇,形成50%泥浆(51111^) 纯化的 Folch 上 相部分 (第一 种方法 ) 0.01、 0.2 和 0.5 md/L 乙 酸铵于 甲醇中 玻璃棉 (glass wool) 2. 操 作步骤 (1) 用一 5 英 寸巴斯 德吸管 建立一 DEAE-Sephadex 柱 :将巴 斯德吸 管安全 地安装 于一带 小夹钳 的环上 ,使 柱流 出物能 收集于 烧杯或 放在试 管架的 试管内 ,用一 9 英寸的 吸管 将一小 球形玻 璃棉放 入巴斯 德吸管 的狭窄 部位。 如果玻 璃棉的 量太大 ,或者 在吸管 头塞得 太紧, 将会限 制流速 。另外 ,可应 用带有 适当的 耐溶剂 装置的 层析柱 , 伴有自 动样本 成分收 集器。 (2) 用甲醇 冲洗玻 璃棉塞 ,确 定空 柱的适 当流速 (这 也可清 除玻璃 棉的任 何污染 物 )。 如果流 速慢于 1 滴 /min •,重 新填塞 玻璃棉 ,确 保柱 子装上 DEAE-Sephadex 后有一 合适的 流速。 (3) 加入 足够的 DEAE-Sephadex 于 甲醇的 50% 泥浆于 吸管中 ,得 到一个 2 〜 4cm 高的树 脂柱。 4cm 的柱 有大约 lmL 的柱床 ,一 半体积 一般足 以供放 射标记 物质。 (4) 用 2~3 倍柱 体积的 甲醇冲 洗柱。 (5) 用 0.1 〜 lmL 甲醇 溶解上 相部分 ,加入 DEAE-Sephadex 柱。 上 相部分 没有盐 和其他 非脂质 污染物 ,因 为带电 的脂质 (神经 节苷脂 ) 在 这些情 况下会 被柱滞 留, 一般样 本量不 重要。 (6) 用 5 倍柱体 积甲醇 洗柱, 洗脱上 相中中 性糖脂 。蒸 发干燥 洗脱液 (例如 用氮干 燥器 )。 这一 部分含 去盐中 性糖脂 ,较三 己糖神 经酰胺 分子大 。这 些去 盐中性 糖脂能 同下相 中中性 糖脂的 剩 余部分 相结合 。这是 部分便 于多种 分析, 包括薄 层层析 (TLC) 和 TLC 重叠 分析。 (7) 用 5 倍柱 体积的 0.01 md/L 乙酸铵 / 甲醇溶 液从柱 中洗脱 含有单 涎酸的 神经节 苷脂。 如果洗 脱结果 很重要 ,可将 洗脱液 等分分 装收集 , 或收集 于单个 容器内 。浓 缩单涎 酸神经 节苷脂 ( 例如用 氮蒸发 )。 如果 这一部 分用于 TLC 分析 ,必须 去盐, 可通过 加水到 50% 并将材 料加入 Sep-Pak C18 萃取柱 处理。 . 759 . (8) 用 5 倍 柱体积 0.2 mol/L 乙酸铵 / 甲 醇溶液 洗脱每 个寡糖 含有两 个涎酸 的神经 节 苷脂。 (9) 用 5 柱体积 0.5 mol/L 乙酸铵 / 甲 醇溶液 洗脱多 涎神经 节苷脂 ( 三和四 涎神经 节苷脂 )。 这些 成分可 以按第 7 步单 涎神经 节苷脂 一样于 Sep-PakC18 萃取 柱中进 行浓缩 (或) 和 去盐。 如 果样本 含有硫 酸搪脂 ,有 必要用 0.8~1.0 mol/L 乙 酸铵于 甲醇溶 液进行 洗脱。 (四) 神 经节苷 脂的快 速纯化 为了 集中分 析神经 节苷脂 ,强极 性溶剂 平衡的 离子交 换柱抽 提出细 胞总脂 质抽提 物, 本方案 可从其 中快速 制备总 神经节 苷脂。 1. 附 加材料 DEAE-Sephadex 平衡于 60:30:8 甲醇 / 氯仿 / 水 溶液中 总脂质 抽提物 (第 一种方 法的第 8 步) 60:30:8 甲醇 / 氯仿 / 水 60:30:8 甲醇 / 氯仿 / 水 /0.8 mol/L KC1 2. 操 作步骤 (1) 按第 二种方 法的第 1 步制备 DEAE-Sephadex 柱 ,但将 DEAE-Sephadex 平衡于 60:30:8 甲醇 / 氯仿 / 水中。 (2) 将 第一种 方法第 8 步 的细胞 或组织 的总脂 质抽提 物溶于 60:30:8 甲醇 / 氯仿 / 水 中。 冲洗量 不重要 , 一般原 始抽提 物等体 积比较 合适。 (3) 将总脂 质抽提 物缓慢 (10mL, 或将 0.22pm 滤膜直 接安置 到一次 性消毒 注射器 (两者 均带有 Luer-Lok 装置) 顶部 ,供 较小体 积用。 采用另 外的培 养基冲 洗初始 贮存器 ,并 将 流出液 通过滤 膜过滤 (最大 限度回 收放射 标记物 )。 注 意:要 适当地 处理好 放射性 滤膜和 / 或注 射器。 无菌液 相培养 基中含 有放射 活性前 体物质 ,可 供使用 。然而 ,这 样制备 很昂贵 ,并 且反复 幵放密 闭系统 ,为 确保持 续无菌 ,需要 过滤。 (3) 另 外添加 培养基 ,使容 积达到 实验所 需的量 。温热 培养基 ,在恒 温箱或 水浴中 将进行 标记。 (4) 采用 无菌的 吸管头 ,移 出少量 放射性 培养基 ,供第 8 步 闪烁记 数用。 (5) 根据标 准方法 (例如 ,胰蛋 白酶消 化分离 ) 分 离细胞 ,再 悬浮于 放射性 培养基 中 ,并铺 板到组 织培养 平皿上 。对于 悬浮培 养来说 ,直接 用放射 性培养 基稀释 , 或浓缩 如 下:将 培养物 置于适 当大小 的带螺 旋盖离 心管中 ,在 台式离 心管中 ,大约 50〇xg 离 心 5min。 除去 上清液 ,将 细胞团 再次悬 浮于放 射性培 养基中 ,让 细胞系 于标准 条件下 孵育。 细咆数 M, 培养容 器和培 养基的 体积将 根据特 异性培 养细胞 系的生 长特性 决定。 (6) 将细胞 达到最 大生长 ( 接近汇 合或后 停滞期 ), 冰面冷 冻培养 ,并收 获细胞 , 用橡胶 细胞刮 子从平 皿上刮 取单层 细胞, 4t: 大约 500Xg 离心 5min, 使细 胞成团 。移 去标记 培养基 ,并 保留一 份供第 8 步闪烁 计数。 如 果要研 究条件 培养基 上的糖 复合物 ,培养 基应用 〇.22pm 滤 膜过滤 ,除去 离心后 残存的 破碎的 细胞 残渣。 • 764 • (7) 用 >50 倍过量 的冰冻 PBS 反 复冲洗 细胞团 2 次。 这一 阶段标 记细胞 团可于 -20t:~ -80X: 冻存供 后面分 析用。 (8) 使用 闪烁计 数仪, 检测一 小份细 胞和第 6 步 中的条 件培养 基样本 中放射 性物质 的掺入 ,以了 解掺入 的效率 。测 定第 4 步的无 菌放射 活性培 养基样 本的放 射活性 ,作为 控制对 照组。 有必要 时稀释 培养基 ,达 到准确 计量。 (二) 放 射活性 前体物 脉冲或 脉冲追 加标记 如果稳 态标记 不能够 使标记 物充足 掺入目 的糖复 合物, 最好在 不存在 或没有 足够量 的 非标记 前体物 情况下 ,提 供标记 前体物 。按 下面的 步骤, 于加有 放射活 性前体 物的不 全 培养基 中进行 脉冲式 细胞短 暂培养 。还可 以扩展 到脉冲 追加式 ,即 通过 追加非 放射活 性介质 ,使目 的糖复 合物短 暂标记 ,以建 立前体 、产 物相互 关系。 这些方 式有利 于标记 能 同葡萄 糖竞争 性摄取 的单糖 ,如半 乳糖、 葡萄糖 、甘 露醇和 GlcNH2 (参看 评注部 分 )。 一 般对于 那些通 常细胞 不能有 效摄取 的单糖 ,如 GlcNAc、 GalNAc、 ManNac、 Neu5Ac、 Fuc、 xyl 和 GlcA 价 值不大 ,除 非非常 大量的 这种标 记分子 用于脉 冲标记 。因 为脉 冲标记 只是短 暂时间 (如几 分钟或 几小时 ), 细胞 常处于 接近汇 合状态 ,使 摄取掺 入程度 最大。 应做预 实验确 定标记 的理想 条件。 1) 检测 放射性 前体物 质掺入 水平和 葡萄糖 的影响 MDM 培养基 (适于 目的细 胞系生 长培养 ) 应重 新配制 ,除放 射标记 的前体 或竞争 性分子 (例如 ,葡 萄糖) 外 其他成 分予以 100% 水平 。根据 细胞生 长需要 ,可适 当加入 透 析血浆 。最 后加入 放射标 记的前 体物质 。应 该做小 规模预 实验, 将细胞 培养于 标记培 养基 。并 检测标 记物掺 入大分 子或整 个细胞 糖蛋白 的情况 。如果 放射标 记前体 物是单 糖 ,葡 萄糖对 放射标 记前体 物的掺 入就应 该通过 预实验 来监测 ,可 采用一 份按上 述方式 制 备的培 养基和 另一份 同样方 式制备 但不含 有葡萄 糖的培 养基。 2) 确立放 射标记 前体物 质的理 想浓度 预实验 应制备 足够的 MDM 培养基 ,除 放射标 记前体 物外其 他成分 均予以 100% 水 平 。加入 放射标 记前体 物质, 将培养 基分成 几组 ,每组 内再加 入相同 前体物 未标记 100 x 贮存液 ,得 到一 系列含 不同浓 度未标 记前体 浓度的 培养基 ( 例如, 0%、 5%、 10%、 20%、 50% 和 100% 正常培 养基中 的浓度 )。 这些 培养基 用于细 胞系小 规模的 预标记 ,一 定时 间后, 再按上 面方法 监测标 记物的 掺入。 掺 入情况 受总前 体物浓 度影响 。图 11.6 曲线 中 断点表 示进一 步增力 n 未标 记的成 分日寸 ,标 硫酸盐 缺乏培 养基中 掺人放 射活性 硫酸盐 ,标记 记物掺 入百分 比会明 显下降 ,这一 点说明 前 _ 大分子 物质, 以及加 入未标 记麵盐 的影响 图 11.6 • 765 • 体物浓 度不再 影响生 物合成 反应。 理想的 未标记 前体物 浓度将 稍高于 曲线的 中断点 ,这 时候未 标记前 体物不 再限制 生物合 成反应 ,但 掺入仍 较好。 3) 理悉 前体物 浓度时 检測细 胞生长 重建 MDM 培养基 ,其中 含有放 射活性 前体物 和理想 浓度的 未标记 前体物 ,细 胞在 这种 培养基 上培养 适当的 时间, 检测放 射活性 前体物 的掺入 ,并确 定摄取 和掺入 与时间 的线 形关系 。检 测细胞 的生长 、稳定 和总体 生物合 成能力 (例如 ,细 胞计数 、台 盼蓝排 泌和放 射活性 氨基酸 的掺入 ), 以确定 在这一 范围降 低前体 物的浓 度是否 对细胞 有不利 影响 。有时 有必要 兼顾到 降低浓 度的不 利因素 、标记 时间和 细胞活 力之间 的关系 。应在 不 影响细 胞生长 、活力 和大分 子物质 总的生 物合成 情况下 ,确 立未 标记前 体物最 低浓度 并能够 供细胞 使用一 定时间 。应 注意到 ,部分 不全培 养基的 应用可 以选择 性地改 变糖复 合 物组成 ,例如 ,硫 酸盐浓 度降低 太多将 会导致 一些类 型细胞 中糖胺 聚糖的 硫酸化 不足。 1. 附 加材料 多缺乏 培养基 (MDM) ( 可适当 添加胎 牛血清 ,用 无菌的 0.15mol/LNaCl 透析直 到葡萄 糖浓度 达大约 270p mol/L, 除去一 些可能 稀释放 射活性 的小分 子物质 ) 2. 操 作步骤 (1) 确立标 记的理 想条件 ,在 完全培 养基上 ,单层 细胞生 长至融 合状态 ,或 悬浮生 长 到后停 滞期。 (2) 根据 预实验 ,重组 MDM, 制备一 种只缺 乏目的 前体物 的部分 缺乏培 养基。 (3) 增加适 当量的 放射性 前体物 ,根 据细胞 的生长 需要, 可增加 透析小 牛血清 。过 滤消毒 ,将 培养基 加温到 37X:。 保存 一份放 射性培 养基。 (4) 单 层细胞 ,从培 养皿中 吸取培 养基; 悬浮 培养细 胞经短 暂超速 离心或 普通离 心 ,除 去上清 培养基 。加入 适当量 放射活 性标记 培养基 (第 3 步 ), 将细 胞孵育 一定时 间。 标记时 间应根 据细胞 在不全 培养中 能存活 的时间 决定, 后者可 由预实 验确定 。如有 必要, 保存放 射活 性培养 基以供 分析。 (5) 第 6 步之前 ,脉冲 标记。 脉冲追 加标记 ,按第 4 步除去 培养基 ,加 入无 放射活 性的全 培养基 ,并孵 育一段 时间。 对 脉冲追 加实验 ,每个 细胞培 养物应 建立几 个容器 ,分 别追加 不同的 时间。 (6) 收 获并冲 洗细胞 ,测 定掺入 效率。 (S) 重新使 用放射 活性标 记培养 基进行 序贯脉 冲或脉 冲-追 加标记 —些 情况下 ,标 记物掺 入目的 糖复合 物是不 充足的 ,甚 至在选 择性不 全培养 基的特 定 条件下 亦如此 。而且 ,长 期不全 培养基 的暴露 ,可 能会导 致蛋白 或其他 大分子 物质合 成 的改变 。这峡 情况下 ,可将 ~ 系列的 细胞培 养皿依 次暴露 于含高 浓度标 记物的 少量的 • 766 • 培 养基中 。这种 方式也 可能节 省了昂 贵的放 射标记 前体物 。一 套培 养皿于 标记培 养基中 孵育脉 冲时间 ,然 后移 去标记 培养基 ,并 加到下 一套培 养皿。 对于脉 冲实验 (只 希望获 得大量 的高水 平掺入 的物质 ), 细胞 就此可 以收获 。对 脉冲追 加实验 ,追 加非放 射性完 全培 养基于 第一套 培养物 。这一 过程反 复进行 ,直 到所有 细胞已 被标记 (图 11.7)。 因 为 孵育时 间较短 ( 例如几 个小时 ), 估 计每一 标记循 环只有 很少部 分放射 标记前 体物被 消耗, 并且其 他基础 成分的 浓度变 化不大 。为 更好保 存标记 培养基 ,一些 研究者 在短期 应用之 后将其 冻存, 再次应 用时将 其融解 (使 用之前 应调整 融化培 养基的 pH)。 当再次 用培 养基时 ,实验 结果应 仔细地 分析, 特别是 关于标 记产物 的特异 性活性 ,可能 受分泌 性分 子代谢 影响。 时间 脉冲 | 追踪 脉冲 | 追踪 *♦ | 脉冲 1 追踪 — ~~H I 脉冲 1 图 11.7 再利用 放射性 培养基 序贯脉 冲标记 细胞图 * 将 标记培 养基转 移到另 一盘中 ,将完 整培养 基加到 受标记 细胞上 1. 附 加材料 多缺乏 培养基 (MDM), 适当补 充小牛 血清, 用无菌 0.15mol/LNaCl 透析 直到葡 萄糖浓 度大约 270 pmol/L, 除去 稀释放 射活性 的小分 子物质 2. 操 作步骤 (1) 按前 一方法 确立标 记的理 想条件 ,建 立几组 相同系 列的单 层或悬 浮细胞 进行系 列标记 ,并 生长 到汇合 或后停 滞期。 对悬浮 培养, 可采用 <8 树脂 (Cl— 型) 至 体积为 1L, 于 4t: 下贮藏 6~12 个月) 闪 烁合剂 2. 操 作步骤 准备 试剂: (1) 将 60/iL 的 4 mmol/L UDP- 半 乳糖和 2 〜 5fxCi UDP-3H 半 乳糖放 入一个 1.5mL 微离心 管中, 用一个 Speedva 蒸 发器或 冻干器 使之干 '燥 (不 能用加 热法使 其干燥 ), 将 此 UDP- 半乳 糖混合 物重新 悬浮在 60^L 水中 ,在冰 上保存 ,以 备步骤 (5) 用。 未 标记的 UDP- 半 乳糖贮 存溶液 保存在 70% 乙醇中 ,因 为其在 水中将 分解成 UDP 和 半乳糖 -1- 磷 酸盐 。乙醇 也能降 低放射 性裂解 ,因此 UDP- 半乳 糖必须 干燥并 仅在使 用前不 久重新 悬浮于 水中。 (2) 当 UDP- 半乳 糖混合 物在干 燥时, 用半乳 糖转移 酶贮藏 缓冲剂 建立一 系列的 4~5 倍稀释 的半乳 糖转移 酶溶液 ,再加 稀释剂 将各管 的体积 增加到 15pL。 如果自 身半乳 糖糖基 化的半 乳糖转 移酶的 活性是 50U/mL, 那么 0.013ML 的 酶可在 15min 内将 50% 起 始量的 UDP- 半乳糖 转移到 GlcNAc 上 。合 理的配 制为: 各管分 别加入 l.O^L、 0.2ML、 0.04HL、 O.OSfxL 的 50U/mL 半乳糖 转移酶 ,再 分别 用半乳 糖转移 酶贮存 缓冲剂 稀释到 15mL。 (3) 于 10 个微离 心管中 均加入 25mL 的 2 x 半乳糖 转移酶 检测缓 冲剂和 5pL 的水, 并置于 冰上。 (4) 其中 5 管加入 8斤水 ,另 5 管加 8/iL 的 0.5mol/LGlcNAc。 分别在 GlcNAc 受体 存在和 不存在 的条件 下进行 各管的 测定, 转移的 半乳糖 基摩尔 数与转 移放射 活性 差异成 正比。 (5) 加入 5^LUDP- 半乳糖 混合物 [来 自步骤 (1) 中] 于每 个管中 。取未 用部分 进 行分析 (第 14 步) (6) 加 2ML 1 mol/L MnCl2 到 5 个含 半乳 糖转移 酶测定 缓冲液 管中。 因 Mn2+ 能使 UDP- 半乳 糖沉淀 ,加速 其分解 ,故 只有在 引发转 移反应 之前方 才加入 MnCl2。 进行转 移反应 : (7) 加入 5pL 各种 浓度半 乳糖转 移酶稀 释液于 一系列 配对的 各管中 ,配对 管:一 管含 GlcNAc 受体 ,一管 装水。 无酶对 照组加 入半乳 糖贮存 缓冲液 。在 37X: 条件 下孵育 15min〇 部分 MnCl2 在 15min 孵育 期间可 能沉淀 ,但不 明显影 响测量 结果。 (8) 加 lmL 冰冻的 lOmmol/LEDTA 到每 个反应 管中, 放入冰 面孵育 5min, 以结 束 反应。 (9) 最大速 度离心 5min, 除 去任何 沉淀物 ,将上 清液移 到干净 的管中 ,冰冻 ,直 到 装载于 Dowex 柱上 [步骤 (11)]。 分离被 标记的 产物: (10) 对于 每个转 移反应 ,备 好一个 5% 四硼酸 钠平衡 的含有 lmL Dowex 1X8 树脂 的 色谱柱 ,用 10mL 水洗 涤柱。 备 Dowex 1X8 柱方法 :用玻 璃棉塞 住一个 巴斯德 移液管 ,加入 iX8 树脂直 到固定 体积为 lmL〇 准备 Dowex 1X8 柱时间 ••转 移反应 之前立 即做, 或在第 7 步 转移反 应过程 中做。 (11) 将每 个反应 混合物 上清液 加入各 柱中, 将流出 液收集 在一个 20mL 闪 光小瓶 • 782 • 中 ,用 0.5mL 的 lOmmol/LEDTA 洗 涤柱子 ,洗涤 液亦收 集于以 上同一 闪光小 瓶中。 (12) 再另用 4 份 1.5mL 的 10 mmol/L EDTA 洗柱 ,每次 洗液分 别用闪 光小瓶 收集。 UDP-3H- 半 乳糖与 产生的 3H- 半乳糖 -1- 磷酸 将与带 正电的 Dowex 1X8 树脂 结合, 游离的 3H- 半乳 糖保留 在柱中 ,与 树脂中 络合的 硼酸盐 结合。 3H-Gal^-4GlCNAc 是较易 通过柱 子的惟 一的放 射性产 物。 (13) 每 个小瓶 中加入 15mL 闪 光合剂 ,通 过液体 闪光计 数测定 每部分 的放射 活性。 对于每 个半乳 糖转移 酶样品 ,其 通过柱 子的放 射活性 总量是 5 个 部分放 射活性 量的总 和; 对于 每个酶 稀释液 ,通过 从加入 GlcNAc 进行反 应后通 过柱子 的放射 活性量 减去未 加入 GlcNAc 时 通过柱 子放射 活性量 ,可 计算其 特异性 转移的 放射活 性量。 (14) 加入 5pL 未用的 UDP- 半乳糖 混合物 [从 步骤 (5) 中]、 1.5mL10mmol/L EDTA 和 15mL 闪 光合剂 至一个 20mL 闪光 小瓶中 ,通 过闪光 计数测 定总放 射活性 。这 代 表可用 于转移 的总放 射活性 。确定 转移的 摩尔数 ,计算 如下: CP M - GlcNAc ~ CP M + GlcNAc 总 CPM X 20 nmol CPM-acNAc 是无 GlcNAc 受 体时从 柱子中 得到的 放射活 性量。 CPM + GlcNAc 是加入 GlcNAc 受体时 从柱子 中得到 的放射 活性量 [步骤 (13)]。 一个单 位活性 (U) 为在 37t: 条 件下每 分钟有 1/imol/L 半乳糖 转移到 GlcNAc 上。 半乳 糖转移 酶最初 命名为 乳糖合 成酶, 因为在 a- 乳清蛋 白存条 件下, 它以葡 萄糖而 不是以 GlcNAc 为受体 ,因此 计算结 果在以 a- 乳 清蛋白 为半乳 糖转移 酶的辅 助因子 、葡 萄糖为 受体时 会有所 不同。 (四) 用 a2-6 涎酸转 移酶标 记末端 Gal /31-4 GlcNAc 残基 1. 原理 纯化的 a2-6 涎酸转 移酶已 被用于 ) 人 CMP-3H-Neu5Ac 上 将放射 标记的 乙 酰神经 氨酸 转移到 活细胞 表面的 Gal 外-4 GlcNAc 受体上 ,合成 生物相 关寡糖 。受体 Gal 01-4 GlcNAc 在分 泌性和 膜性蛋 白上的 iV 连接寡 糖上最 为常见 ,也 可见于 O 连接寡 糖上和 糖脂上 。本 试验介 绍运用 a2-6 涎 酸转移 酶去标 记含有 Gal /?1-4 GlcNAc 末 端寡糖 纯化蛋 白质 。转 移反应 的效率 依赖于 反应时 间和单 糖核苷 、受体 (样 品中) 和转 移酶的 浓度。 这些 参数在 每个样 品中必 须优化 。在饱 和量的 酶和糖 核苷酸 供体条 件下进 行转移 反应, 以使受 体位点 的数目 可通过 糖核苷 酸特异 活性及 转移的 放射活 性量来 计算。 2. 材料 纯化 蛋白或 细胞抽 提样品 0.1mol/L 二甲脾 酸钠, pH7.0 50/iCi CMP-3H-Neu5Ac (10 〜 20Ci/mmol) 10mg/mL 无 诞酸胎 球蛋白 5mU a2-6 涎酸 转移酶 10 mmol/L CMP-NeuAc 透析、 凝胶过 滤色谱 、蛋白 定量、 TCA 沉淀 、一维 蛋白凝 胶电泳 、放 射自 显影、 . 783 . 肽 N/ 糖苷酸 酸消化 等所需 的附加 的试剂 和设备 3. 操 作步骤 (1) 标记之 前通过 透析或 凝胶过 滤色谱 ,用 〇.1 mol/L 二甲胂 酸钠溶 液平衡 标本, pH7.0, 最 终的蛋 白质浓 度须为 〜 5mg/mL 左右。 (2) 加 50^CiCMP-3H-Neu5Ac 于 1.5mL 微离 心管, 用一个 Speedvac 蒸发器 或冻干 器无 热干燥 ,重新 悬浮在 25^L 水中 ,冰面 贮存备 于步骤 (5) 中用。 该 剂量的 UDP-3H-Neu5Ac 足 够完成 5 个转移 反应。 (3) 如 下准备 4 个反 应管。 ① 样 品反应 管:将 35^L 样品放 入一个 1.5mL 微离心 管中; ② 阳 性对照 管:加 35ML 样品和 5;iL10mg/mL 无涎 酸胎球 蛋白; ③ 第一 个阴性 对照管 (Nl): 35/zL 样品; ④ 第二 个阴性 对照管 (N2): 无 样品。 阳性 对照管 中无涎 酸基胎 球蛋白 ,有 3 种复 杂型; V- 连 接寡糖 。大多 数无涎 酸基胎 球蛋白 寡糖含 有末端 Gal #1-4 GlcNAc 残基 。阴 性对照 用于测 定内源 性涎酸 转移酶 活性。 (4) 加入 5mU (10ML) 的〇2-6 涎酸转 移酶于 样品管 、阳性 对照管 和第二 个阴性 (N2) 管中。 (5) 从步骤 (2) 中加入 5^L (10/iCi) CMP-3H-Neu5Ac 于每个 反应, 以引发 反应, 在 37X: 的浴槽 中孵育 30~90min。 样本中 受体位 点数量 准确测 定要求 糖核苷 酸充足 。这样 ,进行 定量还 需加非 放射性 CMP-NeU5Ac (最终 浓度为 2 mmol/L) 于 反应混 合物中 。然而 这样的 条件下 ,糖 核苷酸 的特异 性和此 测量方 法的检 测范 围将会 降低。 根据实 验经验 确定每 个样品 标记结 合达到 最大限 度所需 的确切 时间。 (6) 90X: 下加 热各管 lOmin, 结束 反应。 煮 沸可导 致样品 沉淀。 (7) 通过 凝胶过 滤色谱 分析、 TCA 沉淀 或一维 蛋白凝 胶电泳 和放射 自显影 测定样 品中 3H-Neu5Ac 是否 已被转 移到受 体上。 阴性结 果提示 但不能 证实样 本中缺 乏受体 。如 果没有 NeU5Ac 转到受 体上, 含无涎 酸基胎 球蛋白 阳性 对照将 提示在 样品中 可能有 〇2-6 涎酸转 移酶的 抑制剂 存在。 (8) 如果 在步骤 (7) 中 3H-Neu5Ac 已被转 移到受 体上, 通过肽 N/ 糖 苷酶消 化释放 实验 来确定 受体的 性质。 如果 受体是 Gal/31-4 GlcNAc, 即 N- 连接寡 糖上最 常见的 结构, 标记便 能被肽 N/ 糖苷酶 F 消化所 释放 。另外 , 'H-Neu5Ac 能被 节杆菌 Arthrobacterureaffacients 神经 氨酸酶 所释放 ,而 不能被 Newcastle 病毒 神经氨 酸酶所 释放。 (五) 方 法评注 1) 背 景资料 起延长 寡聚糖 链作用 的糖基 转移酶 催化的 反应为 :从高 能量糖 核苷酸 供体上 将特异 单 糖基转 移至寡 糖链上 。几 种“末 端”糖 基转移 酶已被 纯化, 其底物 的特异 性明确 ,每 种 转移酶 只能形 成一种 特定异 构体的 糖苷链 。此种 特异性 ,使 糖基 转移酶 成为极 好的末 • 784 • 端和整 个寡糖 结构的 探针。 纯化的 糖基转 移酶与 放射标 记的糖 核苷酸 已被用 于检测 蛋白质 、细胞 器以及 完整细 胞上特 异的糖 基结构 。放 射标记 的糖基 转移到 大分子 物质上 提示该 大分子 物质中 存在该 转移酶 的受体 。因 为糖核 苷酸的 特异活 性已知 ,故可 估计出 受体数 目的最 小值。 末端糖 基的 有关知 识可用 于测定 寡糖结 构和估 计寡糖 在生物 合成途 径中的 部位。 糖 基转移 酶作为 寡糖结 构的探 针有一 些优点 。尽 管结构 分析之 前寡糖 可用单 糖前体 进行代 谢性放 射标记 ,但 是单 糖特异 活性可 被内源 池稀释 而降低 。另外 ,放 射标 记单糖 可被 细胞转 化为其 他单糖 ,使产 物鉴定 复杂化 。另一 方面, 糖基转 移酶只 从加入 的放射 标记的 糖核苷 酸中转 移单糖 ,因 此保持 高度的 特异性 和放射 性化学 纯度。 糖基转 移酶较 植 物凝集 素有更 具体更 明确的 特异性 ,而且 ,放射 标记单 糖的掺 入是共 价结合 ,故 利用 糖核 苷酸的 高度特 异活性 使产物 具有敏 感性。 只有 少数的 糖基转 移酶被 克隆, 3 种已能 市售, 一个是 NeuACa2-3Galj91-3 GalNAca2-3 唾液酸 转移酶 (或称 a2-3 唾液酸 转移酶 ), 能将 Neu5Ac 转移到 半乳糖 C-3 位置上 ,条 件是半 乳糖有 一个与 N- 乙酰半 乳糖胺 (GalNAc) 连接的 外-3 键。 这些结 构 常见于 O- 连 接寡糖 和糖脂 ,二 者均是 a2-3 唾液酸 转移酶 的底物 。另两 种酶, 半乳糖 转移酶 和〇2-6 唾液酸 转移酶 ,在本 部分的 实验中 用到, 下面将 评述。 半 乳糖转 移酶, Gal^lWGlcNAc 半乳糖 转移酶 (叫 半乳糖 转移酶 ), 不管 GlcNAc 连接方 式如何 , 此酶催 化半乳 糖基从 UDP- 半乳糖 上转移 到末端 GlcNAc 残基 C~4 位上。 半 乳糖转 移酶已 广泛用 于对糖 类结构 、生 物合成 及代谢 的研究 。例 如胞质 型和核 型糖基 化, O-GkNAc 可通 过用半 乳糖转 移酶和 UDP-3H- 半 乳糖同 完整的 或去垢 剂溶解 的淋巴 细胞共 同孵育 。对 反应产 物进行 特征化 分析时 ,将 发现几 种独特 蛋白质 被放射 标记及 3H- 半 乳糖被 转移至 多糖和 O- 多糖上 。通过 p 消除释 放的一 种寡糖 显示为 3H Gal /?1- 4GlcNAcitol, 证实了 O-GlcNAc 的 存在。 N- 连 接寡糖 的生物 合成也 可用半 乳糖转 移酶进 行研究 。备好 鼠肝超 薄切片 ,用从 普 通蓖麻 PCA I 中提出 的半乳 糖特异 性植物 凝集素 与胶体 金共价 结合将 含有末 端半乳 糖 的糖蛋 白固定 在高尔 基器的 反式区 。预 先用半 乳糖转 移酶和 UDP- 半乳 糖处理 切片, 使另 外的植 物凝集 素结合 在高尔 基器的 顺式区 。用肽 N/ 糖苷酶 F ( —种 从糖蛋 白上释 放 大多数 N- 连寡糖 的酶) 处 理切片 ,使凝 集素结 合大大 减少。 这些结 果提示 GlcNAc 在半乳 糖之前 加于] V- 连接寡 糖上, 并且发 生在高 尔基器 的不同 分隔区 间内。 半乳糖 转移酶 也用于 研究膜 蛋白再 循环。 完整的 细胞与 半乳糖 转移酶 一起孵 育且用 UDP-3H- 半乳糖 标记。 标记在 4T: 下进行 ,以阻 止膜的 再循环 。因 为转移 酶和糖 核苷酸 不 能通过 细胞膜 ,仅 表面的 蛋白质 被标记 。在 41C 下 与细胞 结合的 3H- 半 乳糖对 /?- 半乳 糖苷 酶敏感 ,但 如果温 度升至 37T:, 一部分 标记对 乳糖 苷酶产 生耐受 。士 半乳糖 苷酶耐 受性标 记是由 于胞吞 作用而 内化的 缘故。 半乳 糖转移 酶最后 一个用 途在于 生物学 相关寡 糖的合 成以及 制定放 射标记 寡糖标 准 。此 标准可 用于外 糖苷酶 消化的 对照, 或用于 标定层 析柱。 a2-6 唾液酶 转移酶 : NeuAca2-6 Gal/31-4 GlcNAca2-6 唾液酸 转移酶 U2-6 唾液酸 转移酶 ) 催 化反应 为:从 CMP-NeuAc 上将 NeuAc 转移 到末端 半乳糖 残基的 C-6 位上, 其条 件为半 乳糖与 GlcNAc — 定是以 /31-4 链相连 。这种 结构在 iV- 寡 糖中最 为常见 ,从 • 785 • 而 此结构 使该转 移酶对 N- 寡糖 有相对 特异性 。运用 此酶的 许多方 法与半 乳糖转 移酶相 似。 a2-6 唾 液酸转 移酶已 被用做 细胞表 面寡糖 结构的 非渗透 性探针 。类 似于半 乳糖基 转 移酶, a2-6 唾液 酸转移 酶已被 用于研 究膜再 循环和 合成生 物相关 寡糖。 2) 重 要参数 影响糖 基转移 酶催化 作用的 参数在 每个样 品中需 优化。 每个样 品需确 定合适 的孵育 时间、 合适的 蛋白质 、转 移酶、 糖核苷 酸浓度 。单糖 没能转 移到生 物样品 上不一 定能证 实缺乏 转移酶 的受体 ,有几 个因素 可能导 致即使 有受体 也难以 测定转 移发生 。比 如在样 品中可 能含有 蛋白酶 降解转 移酶或 者降解 受体, 样品中 可能含 有外切 糖苷酶 ,将 已经转 移的单 糖从寡 糖上释 放出来 ,也 可能含 有水解 酶而降 解糖核 苷酸; 通过转 移反应 产生的 或通 过糖核 苷酸降 解的高 浓度的 核苷酸 磷酸可 能抑制 糖基转 移酶; 最后, 由于一 系列原 因受体 可能“ 躲避” 转移酶 。例 如, IgG 分子 的寡糖 由于被 埋在折 叠的蛋 白质内 而得不 到充分 的唾液 酸基化 。蛋 白质在 溶液中 可能形 成聚合 物从而 对酶形 成空间 阻隔。 如果受 体 被附近 的蛋白 质或其 他的寡 糖掩盖 ,则 细胞表 面的寡 糖标记 可能被 阻断。 对生 物样品 (完 整细胞 、纯化 蛋白质 或寡糖 ) 能进行 有效单 糖转移 提示受 体的存 在 。尽管 糖基转 移酶有 很明确 的底物 特异性 ,仍 可能 存在预 先未知 的结构 被转移 酶发生 了修饰 。另外 ,在 样品中 可能存 在内源 性糖基 转移酶 ,对结 果的确 切的解 释要通 过一种 或多种 方法得 知产物 的特征 。外 切糖苷 酶可用 于测定 转移的 单糖的 连接键 。内切 糖苷酶 或卢消 除可用 于测定 受体是 N- 或 O- 连寡糖 。可 用各 种方法 进一步 确定释 放的寡 糖的性 质, 如离子 交换法 、凝 胶过滤 色谱法 或植物 凝集素 亲和色 谱法。 3) 预期结 果和时 间估计 单 糖从糖 核苷酸 上转移 到受体 上依赖 转移酶 、受 体和糖 核苷酸 的浓度 ,孵育 时间。 由 于某些 原因即 使在合 适的条 件下转 移反应 可能不 能完成 ,例如 不能接 触底物 、产 物核 苷酸 磷酸抑 制了转 移酶等 。因此 ,糖基 转移酶 能有效 探查寡 糖受体 的存在 ,但依 赖糖核 苷酸特 异性活 性和转 移的放 射标记 总量进 行定量 所得结 果是受 体位点 数量的 最低估 计值。 半 乳糖转 移酶自 身半乳 糖化及 接之而 来的酶 活性测 定约需 1.5 〜 2d, 由于自 身半乳 糖 化的半 乳糖转 移酶在 - 201C 条 件能保 持稳定 6 个月 ,故无 需每一 次分析 都进行 酶活性 测定 。转移 反应最 好进行 2~3d, 将大 大利于 结果的 解释。 实 际的转 移反应 只用几 分钟就 能建立 。孵育 时间差 异很大 ,只 测末 端糖基 结构则 30min 就够了 。对受 体数目 进行定 量则需 16h。 探测 转移反 应产物 所需时 间依所 选择方 法而定 。酸 沉淀法 或凝胶 过滤法 预期花 l~4h, 而凝 胶电泳 (在放 射自显 影后) 可能需 进行 1 〜 10d, 其 依曝光 所需时 间而定 。转移 产物定 性时间 也依赖 于所选 择方法 。内切 糖苷酶 消化或 (3- 消除 (在凝 胶过滤 之后) 预期花 l~2d 完成 ,而糖 自身结 构特征 分析可 能 花几天 时间。 四、 蛋白质 表面糖 磷脂锚 的检测 很 多真核 生物蛋 白质均 被糖基 化磷脂 酰肌醇 (GPI) 膜锚 着物锚 着在细 胞膜上 ,图 11.10 描述 了常见 的各种 GPI 蛋白 锚定物 的细微 的核心 结构。 • 786 • N 蛋白质 C EtnN \—\ P |— I Vlan | ~ | Man | ~ | Man |— f GlcN I * flag PA DAG HONO GPI-PLD PI-PLC GPI-PLC 图 11.10 糖磷 脂锚通 用多糖 核心结 构图解 磷脂酶 C (PI-PLC, GPI-PLC)、 磷脂酶 D (GPI-PLD)、 亚硝酸 (HONO) 如 上作用 于不同 裂解位 点得到 不同脂 类产物 : PI (磷脂 酰肌醇 )、 PA ( 磷脂酸 )、 DAG (二酰 基甘油 )。 磷脂酶 C 处理 糖磷 脂锚生 成肌醇 环磷酸 ,后者 作为主 要表位 组成交 叉反应 决定簇 , 得到何 种脂类 产物取 决于锚 的特性 (见背 景资料 ) 简写: Man 甘露糖 GlcN 葡糖胺 EthN 乙醇胺 P 磷酸 盐基团 这一部 分介绍 了检测 GPI 锚着蛋 白的一 般方法 ,根 据不 同类型 GPI 连 接的特 异性, 目的蛋 白去垢 剂分离 相不同 。首先 介绍了 Triton X-114 抽提 和分离 细胞内 总蛋白 。蛋白 质可 能也易 受特异 性酶或 化学裂 解而从 GPI 锚定物 上释放 出来, 可采用 磷脂酶 裂解法 和亚硝 酸化学 裂解法 。如果 GPI 锚定 蛋白采 用脂肪 酸放射 标记, 可有利 于检测 裂解反 应 产生的 GPI 蛋 白产物 ,故 此部分 还介绍 了脂质 部分分 离和蛋 白质的 碱水解 。图 11.11 是各 个方法 间的流 程表。 图 11.11 糖磷 脂锚蛋 白检测 流程图 策略: 下面介 绍的技 术要求 鉴定目 的蛋白 的方法 可行。 蛋白质 可通过 一维蛋 白凝胶 • 787 • 电泳 、考马 斯亮蓝 或银染 色显示 ,或者 通过免 疫沉淀 ,特 异抗 体免疫 印迹进 行鉴定 。也 可以通 过已知 活性检 测酶的 存在。 采用 GPI 前体物 ,例如 脂肪酸 、乙 醇胺 、肌醇 和某些 单糖前 体放射 标记蛋 白的作 用在 于提示 GPI 锚 的存在 。因为 GPI- 锚 着蛋白 常只代 表一小 部分真 核性糖 复合物 ,代 谢性放 射标记 可能不 太有效 。可用 衣霉素 (tunicamycin) 提高单 糖前体 物掺入 GPI。 (一) 用 Triton X-114 抽提 和分离 细胞或 膜上的 总蛋白 1. 原理 细 胞或组 织中双 歧蛋白 ,包括 膜整合 蛋白和 GPI 锚 定蛋白 ,通过 去垢剂 Triton X- 114 抽提可 得到一 个总体 纯化。 Triton X-114 低温时 形成一 种澄清 的胶体 溶液, 加热到 20X:, 由于 去垢剂 微团的 聚集, 溶液分 成两相 。当 细胞基 质于低 温时用 Triton X-114 抽 提 ,溶液 含有可 溶蛋白 、膜 整合 蛋白和 GPI 锚 定蛋白 。离心 沉淀含 有一些 GPI 锚定类 物质 及不溶 于非离 子去垢 剂的细 胞成分 。当 去垢溶 液加温 ,两 性蛋白 (包括 GPI 锚定 蛋白) 将进 入富含 去垢剂 一相, 而亲水 蛋白质 将进入 无去垢 剂一相 ,一些 GPI 锚定蛋 白合 成后不 久即表 现为去 垢剂不 溶解性 ,这 可能因 为带有 糖鞘酯 的锚定 蛋白聚 集之缘 故 。一旦 GPI 上蛋白 质同锚 上脂质 成分分 离出来 ,将 不再进 入富含 去垢剂 分离相 。这 种分离 现象的 改变可 快速判 定一锚 定物是 否存在 ,也 可用于 检测蛋 白质其 他过程 中发生 的 变化。 在 这一方 法部分 ,细 胞或膜 首先再 悬浮于 TBS, 然后用 Triton X-114 于冰 浴中抽 提 。由 于去垢 剂微团 的聚集 ,混合 物加热 后将分 隔成两 个含蛋 白质的 分离相 。上相 (缺 乏去 垢剂) 含 有亲水 蛋白质 ,下相 (富含 去垢剂 ) 含有 两性蛋 白分子 (包 括带有 GPI 锚定物 )。 两相进 行分析 ,确 定各个 蛋白质 属于哪 一相。 2. 材料 细胞 、膜部 分或其 他蛋白 质来源 冰冷的 Tris- 缓 冲盐液 (TBS) (10 mmol/L Tris-HCl pH7.5, 150 mmol/L NaCl) 预 缩合的 Triton X-114 贮 存液于 TBS 中 ,冰冷 15mL 聚丙烯 离心管 离心机 :低速 (台式 ) 装有合 适转子 (例如 SS-34), 4X: 和室温 3. 操 作步骤 (1) 在一支 15mL 试管 内重悬 浮细胞 (或膜 ) 于 冰冷的 TBS 液中, 至最终 蛋白浓 度 <4mg/mL。 所需 要的蛋 白量, 依赖于 实验系 统以及 实验结 束后必 须达到 可检测 水平。 (2) 加入 1/5 体积 的预先 缩合的 Triton X-114 贮存液 (大约 2% 最 终浓度 )。 (3) 冰浴中 ,间断 性混合 ,孵育 15min 抽提 细胞。 此 时只有 一相。 (4) 4X: lOOOOXg (9〇〇〇r/min 于 SS_34 转子) 离 心细胞 混合物 lOmin, 将 上清液 . 788 • 转移到 另一支 新鲜试 管中。 用冰冷 TBS 液重悬 浮沉淀 物保存 于冰浴 中供第 7 步分 析用。 冷的上 清液部 分含有 可溶性 及去垢 剂抽提 蛋白质 ,后 一部分 包括有 GPI 结构 锚着蛋 白或跨 膜多肽 域 。沉 淀部分 包含有 GPI 另 外部分 ,以 及非离 子去垢 剂中不 溶的其 他细胞 成分。 (5) 水浴 中加热 上清液 部分到 371C, 直到 溶液变 浑浊。 (6) 台式 离心机 1000 Xg 室温离 心溶液 lOmin, 分 别用不 同试管 收集上 、下 两相。 上相 (无去 垢剂) 含 有可溶 蛋白质 ,下相 (富含 去垢剂 ) 含有 GPI 结构锚 着蛋白 或跨膜 区域。 (7) 分析第 4 步沉淀 物重悬 浮液, 以及第 6 步 每一相 ,了 解目的 蛋白。 如同策 略部分 所讨论 ,可 采用活 性分析 ,一 维凝胶 电泳和 蛋白质 染色, 或者免 疫沉淀 ,或 者采用 特 异性抗 体免疫 印迹。 (二) TritonX-114 分 离蛋白 不同于 Triton X-114 抽提 细胞或 膜上总 蛋白, 此部分 则是分 离抽提 后的蛋 白质。 (1) 在 15mL 超 速离心 管内用 lmL 冰冷 TBS 液稀释 或溶解 蛋白质 ,加入 0.2mL Triton X-1 14 并 混合。 (2) 37t: 水 浴中加 热蛋白 混合物 15min (至溶 液浑浊 ), 最大 速度超 速离心 5min。 (3) 收集上 、下相 ,分析 每一相 ,了 解目的 蛋白。 (三) Triton X-114 去 垢剂的 预缩合 Triton X-114 常含有 亲水的 污染物 ,使 用前 必须经 过几轮 相分离 进行预 缩合。 1. 材料 Triton X-1 14 去垢剂 Tris- 缓 冲盐液 (TBS) (10mmol/LTris-HClpH7.5, 150mmol/LNaCl) 50mL 离心管 台式 离心机 2. 操 作步骤 (1) 溶解 1.5gTritonX-114 于 50mLTBS 液中, 置于一 50mL 离心管 ,然后 冰浴中 置冷。 这一 步溶液 将是清 净的。 (2) 37X: 水浴加 热溶液 ,溶 液将变 浑浊。 (3) 室温 ,台式 离心机 lOOOXg 离 心溶液 lOmin (4) 除 去上相 (不含 去垢剂 ), 下相 (富含 去垢剂 ) 再 溶解于 等量的 冰冷的 TBS 液中。 亲水 的污染 物将分 隔进入 上相。 (5) 反 复分离 (第 2 〜 4 步 ) 3 次。 最终 富含去 垢剂相 含大约 12% 去垢剂 ,常 规使用 ,可 4X: 保 存或冰 冻长期 贮存。 • 789 • (四) 用 PI-PLC 消化完 整细胞 以鉴别 GPI 锚定 的蛋白 1. 原理 磷脂酶 C(PLC) 能于 糖蛋白 GPI 膜锚 定物内 切割, 引起蛋 白质从 细胞膜 上 释放。 在这一 方法内 ,完整 细胞采 用磷脂 酰肌醇 特异性 磷脂酶 C(PI-PLC) 进行 消化, 同酶进 行孵 育后, 细胞混 合物进 行离心 ,沉淀 物和上 清液均 进行目 的蛋白 分析。 GPI 锚 定物中 释 放的蛋 白质呈 现于上 清液中 ,未见 释放反 应提示 GPI 锚定物 缺乏、 GPI 蛋白 修饰或 其他 因素。 2. 材料 细胞 (或 制备好 的膜) 细 菌碟脂 酸肌醇 特异性 憐脂酶 C (PI-PLC; Oxford Glycosystems) Hanks 平衡 盐溶液 (HBSS, GIBCO/BRL)、 缓 冲液或 培养基 台式离 心机和 相应的 离心管 3. 操 作步骤 (1) 分 散的悬 浮液中 获得目 的细胞 (或膜 ): 用 HBSS 缓冲盐 液或培 养基冲 洗双份 材 料两次 ,然 后用任 何一种 溶液再 悬浮。 样本最 终的蛋 白浓度 (典 型的是 0.1 〜 0.5mg/ mL) 应根 据使用 的酶的 规格。 (2) 其中 一份加 入细菌 PI-PLC, 另一份 不加酶 (对照 ), 37X: 孵育 lh。 酶 量应由 供应商 的说明 决定。 (3) 台式 离心机 1000 xg 离 心细胞 5min。 移上清 液于新 鲜试管 ,保 存供第 4 步分 析 ,用 移去的 上清液 等量的 缓冲盐 溶液再 悬浮沉 淀物。 (4) 分 析上清 液和沉 淀部分 ,了 解目的 蛋白。 蛋 白质分 析通过 Triton X-114 去垢剂 分离, 一维凝 胶电泳 ,接着 考马斯 亮蓝或 银染色 ,免 疫沉 淀 ,或 者免疫 印迹。 (五) 用磷 脂酶处 理分离 的蛋白 以鉴别 GPI 锚定物 1. 原理 一些特 异性磷 脂酶只 能有效 地降解 GPI 类蛋白 ,可 用以分 析分离 蛋白的 GPI 锚基 ( 参见背 景资料 )。 本 方法中 ,几 个组分 蛋白质 并行通 过下列 磷脂酶 消化: 细菌磷 脂酰肌 醇 特异性 磷脂酶 C (PI-PLC), GPI- 特异性 磷脂酶 C (GPI-PLC) (来自 Trypanosoma brucei), GPI 特异性 鱗脂酶 D (GPI-PLD) (来 自哺乳 动物, 如大鼠 、大 白兔或 人的血 清 )。 蛋白 质通过 Triton X-114 抽提然 后分析 ,蛋 白质 能被磷 脂酶特 异性裂 解提示 GPI 锚基的 存在。 2. 材料 分离的 蛋白质 • 790 • 丙酮, -20X: 适 当的酶 缓冲液 (GPI-PLD 缓 冲液, GPI-PLC 缓 冲液和 PI-PLC 缓冲液 ) GPI-PLC 缓冲液 (0.5mol/LTris-HClpH8.0, 5mmol/LEDTA, 196NP-40, 4X: 保存) GPI-PLD 缓冲液 (50 mmol/L Tris-HCl pH7. 4, 10 mmol/L NaCl, 2.5mmol/LCa- Cl2, 0.1% NP-40, 4X: 保存) PI-PLC 缓冲液 [25 mmol/L Tris-HCl pH7. 4, 0.1% 去氧 胆酸钠 (Na-DOC), 4X: 长期 1C 存, 供苏石 金杆菌 酶] 磷脂酶 GPI-PLD (来 自大鼠 、大白 兔和人 类血清 ) GPI-PLC ( Oxford Glycosystems ) 或 PI-PLC ( Oxford Glycosystem ) 来自 B . thuringiensis cereus (Boehringer Mannheim Sigma) Tris- 缓 冲盐液 (TBS) (10 mmol/L Tris-HCl pH7. 5, 150 mmol/L NaCl) 预缩合 Triton X-114 溶液 (见 方法三 Triton X-114 去垢 剂的预 缩合) 离心机 和转子 (例如 SS-34) 3. 操 作步骤 (1) 如 果蛋白 质样本 已被冻 干或浓 缩于一 种类似 于磷脂 酶缓冲 液的缓 冲液中 ,从第 3 步开始 。否则 ,加于 8 体积 (-201C) 冰冷的 丙酮于 蛋白质 溶液中 ,并于 -20X: 孵育 >3h, 丙酬 沉淀蛋 白质。 参 见重要 参数部 分总蛋 白量使 用指南 。对 于低丰 度材料 ,加入 15fxg 载 体蛋白 ( 例如细 胞色素 C 或牛血 清蛋白 ) 可提高 沉淀的 效率。 (2) 4t:, 15 000Xg (大约 llOOOr/min, 用 SS-34 转子) 离 心样本 20min。 吸取上 清液, 让沉淀 物空气 干燥。 (3) 对于 每一实 验酶, 在超速 离心管 内加入 100pL 适 当的酶 缓冲液 ,然后 各溶解 两份蛋 白质。 (4) 每 一对中 ,其 中一管 加入适 当的酶 ,另 一管内 加入等 体积适 当的酶 缓冲液 (对 照 ), 混合 试管, 37X: 孵育 lh。 加入 的酶量 应根据 脂肪酶 的活性 和估计 目的蛋 白的量 。酶滴 定较为 合适, 使用不 同剂量 平行反 应 ,确 保所有 敏感蛋 白完全 消化。 GPI-PLD 不 常使用 ,但 全血清 (大鼠 、大 白兔或 人类) 可能 是这一 酶活性 的一个 来源, 分析时 ,于 100ML 反应液 中加入 2/^全 血清。 (5) 用 200ML 冰冷 TBS 液稀 释反应 ,然 后加入 60/iLTrit〇nX-114, 冰浴 中置冷 15min〇 (6) 按 Triton X-114 分离 蛋白方 法的第 2、 3 步 分离蛋 白质。 对照反 应中, GH 锚着 蛋白分 离进入 Triton X-114 去垢剂 富含相 , GPI 锚定 物经过 磷脂酶 裂解后 将进入 无去垢 剂相。 • (7) 按 Triton X-114 抽 提和分 离细胞 和膜上 总蛋白 方法第 7 步分析 每一相 ,了 解目 的蛋白 的存在 与否。 裂解 产物可 通过与 a-CRD 抗 体反应 而检测 。如 果锚定 物被脂 肪酸放 射标记 ,可通 过放射 性脂质 产 物分离 检测。 磷脂酶 消化蛋 白质于 凝胶电 泳中的 迁移不 确定, 不可单 独用于 评价裂 解情况 ,不迁 移或向 另一个 . 791 . 方 向迁移 (同未 裂解蛋 白迁移 相比) 可见于 GPI 锚定物 除去后 ,依 赖于蛋 白质的 性质。 (六) 利 用与抗 CRD 抗体的 反应性 以检测 磷脂酶 处理后 的产物 GPI 结构被 磷脂酶 C 裂解后 将暴露 隐蔽的 抗原, 称为交 叉反应 决定族 (CRD)。 CRD 的重要 表位是 磷脂酶 C 裂解 过程 中形成 的肌醇 1,2-( 环) 单磷酸 ,其 他的结 构特征 亦有 利于其 抗原特 异性。 磷脂酶 C 溶解 后蛋白 质同抗 CRD 抗 体反应 ,提示 GPI 锚着物 的存在 。磷 脂酶 C 处理后 ,可以 使用抗 CRD 抗体进 行目的 蛋白免 疫沉淀 或免疫 印迹, 应注意 磷脂酶 D 裂解不 能产生 a-CRD 反应的 表位。 (七) 亚硝 酸裂解 GPI 锚 定蛋白 1. 原理 所有 GPI 结构普 遍存在 的一种 异常特 征是存 在非乙 酰化葡 萄糖胺 ,后 者糖 苷化连 接 到肌醇 。当 葡萄糖 胺经亚 硝酸脱 氨后糖 苷键将 特异性 地被切 割断裂 ,因此 可切下 GPI 锚定物 。因 为除 GPI 外很少 有非乙 酰化葡 萄糖胺 ,亚硝 酸脱氨 可用以 鉴定蛋 白质上 GPI 连接 的存在 。由于 负反应 的存在 ,脱 氨不 能定量 ,重复 性差, 但是可 作为一 种较好 的判 断方法 。这一 方法内 ,蛋 白质 于亚硝 酸内孵 育裂解 GPI 锚定物 ,切 割和未 切割蛋 白质 然后用 Triton X-114 进行 分离。 2. 材料 蛋白 质样品 O.lmol/L 乙酸缓 冲液, pH3.5 0.5mol/LNaNO2, 新 鲜制备 0.5 mol/ L NaCl 3. 操 作步骤 (1) 超速离 心管内 干燥两 份目的 蛋白质 ,再用 O.lmL O.lmol/L 乙酸 缓冲液 溶解。 参见参 数部分 蛋白质 总量使 用指南 , 可加入 NP-40 去垢剂 (0.1% 终浓度 ) 辅助 溶解。 (2) —管 内加入 O.lmL 0.5 mol/L NaN〇2, 另一 管加入 O.lmL 0.5 mol/L NaCl (对照 ), 室 温孵育 3h。 (3) 分离 检测从 GPI 锚 定物上 释放的 蛋白质 ,按前 述方法 分析反 应产物 (Triton X-114 分 离蛋白 )。 如果锚 定物已 用脂肪 酸放射 标记, 可采用 脂质部 分分离 方法。 (八) 分离脂 质成分 以检测 GPI 锚 定蛋白 的裂解 1. 原理 如果 GPI 锚 定蛋白 由脂肪 酸放射 标记, gpi 锚 定物裂 解效率 可通过 检测释 放的放 • 792 • 射标 记脂质 产物进 行评定 。这一 方法中 ,磷 脂酶 或亚硝 酸处理 裂解的 放射标 记蛋白 ,再 采用丁 烷抽提 ,释 放的 脂质部 分进入 丁烷相 ,然 后进行 分析和 定量。 2. 材料 放 射标记 蛋白质 ,由磷 脂酶裂 解或亚 硝酸处 理所得 水饱和 n- 丁烷 (将 等体积 水和丁 烷混合 ,盖上 瓶盖强 力振荡 ,静置 分层, 上相为 丁烷 ,室 温长期 保存) 3. 操 作步骤 (1) 两个 1.5mL 超速 离心管 各加入 lOO^L 水 ,第一 管加入 lOOpL 裂 解的放 射标记 蛋白 ,第二 管加入 lOO^L 对照 蛋白 ( 未裂解 )。 (2) 每一 管加入 200^L 水饱和 心丁烷 ,强力 振荡。 (3) 室 温最大 速度超 速离心 30s, 分离成 两相。 (4) 将上相 (丁烷 ) 移到 另一管 ,放 置一边 ,在原 始管内 再加入 20(^L 水 饱和的 丁烷。 (5) 按 上面第 2、 3 步 振荡和 离心。 (6) 移去 第二丁 烷相, 同第一 管汇集 ,保 留下相 (水相 ) 用以 分析。 (7) 通 过对丁 烷和水 相液体 闪烁计 数可定 量分析 裂解反 应所释 放的脂 质部分 的百分 比。 通过比 较裂解 蛋白材 料和对 照组丁 烷相的 回收计 算比值 ,可 以评价 特异性 释放。 通过 薄层层 析检测 丁烷抽 提产物 ,同 标准对 照可以 完全确 定释放 产物的 特性。 磷脂酶 C 消化 产物 包括有 二酰基 甘油、 碱性酰 基甘油 或酰基 鞘氨醇 ,依赖 于其原 始结构 。磷酯 酰肌醇 ( 来自亚 硝酸处 理) 或 磷酯酸 ( 磷脂酶 D 所释放 ) 也可以 分析和 定量。 这一分 析方法 已用于 磷脂酶 活性的 纯化。 (九) 碱 水解放 射标记 的蛋白 1. 原理 对于 脂肪酸 放射标 记蛋白 ,有必 要确定 掺入的 脂肪酸 是否是 GPI 结 构的一 部分, 是 出现在 酰胺键 (IV- 肉豆蔻 酯酰化 ) 还是 硫酯键 (半胱 氨酸软 脂酰化 ) 中 ,这 一点可 以通过 分析脂 肪酸键 对各种 化学处 理的不 稳定性 而确定 其特性 。这一 方法里 ,放 射标记 蛋白各 组分进 行电泳 ,并 且各 泳道用 KOH 的 甲醇溶 液或羟 胺处理 ,对照 泳道用 甲醇和 Tris 缓冲液 处理, 然后各 泳道进 行荧光 X 线照相 。如 果蛋 白质里 化学键 易受这 些处理 影响 ,在 目的蛋 白条带 就不再 产生放 射标记 信号。 2. 材料 脂 肪酸放 射标记 蛋白质 0.2 mol/L KOH 于甲醇 甲醇 _ 1 mol/L 盐酸 羟胺, PH7. 5, 新 鲜制备 1 mol/L Tris-HCl pH7.5 793 • 一维凝 胶电泳 ,凝胶 染色和 放射自 显影所 需的附 加试剂 和设备 3. 操 作步骤 (1) 取 5 份相同 的脂肪 酸放射 标记蛋 白样本 ,进行 SDS^PAGE, 包 括有适 当的标 记。 (2) 切取各 个泳道 ,将 泳道 1 染 色观看 蛋白和 标记。 (3) 将其他 4 个泳 道分别 用下列 溶液室 温浸泡 lh。 第 1 泳道 : O.2mol/LKOH 的甲 醇溶液 第 2 泳道 :甲醇 第 3 泳道 : lmol/L 盐酸 羟胺, pH7.5 第 4 泳道 : 1 mol/L Tris-HCl pH7 • 5 (4) 将 处理的 凝胶片 用水冲 洗浸泡 3 次 ,每次 lOmin。 (5) 处理好 的凝胶 片进行 放射自 显影。 如果 化学键 易受上 面的处 理影响 ,在 目的蛋 白相应 的位置 将不再 有脂肪 酸放射 标记的 信号。 KOH 的 甲醇溶 液可以 裂解硫 和氧酯 ,但不 作用于 酰胺键 。羟 胺处理 只能裂 解硫酯 。脂肪 酸作为 GPI 成分一 部 分可被 KOH 的 甲醇溶 液释放 ,而不 被羟胺 处理所 释放。 甲醇和 Tris-HCl 处理作 为对照 。 含酰基 (神经 ) 鞘氨 醇的锚 定物对 温和碱 处理不 敏感。 (十) 方 法评注 1) 背 景资料 糖基化 磷酯酰 肌醇膜 锚定物 是细胞 表面锚 定蛋白 的一个 模型, 这些结 构由磷 酯酰肌 醇和磷 酸乙醇 胺之间 的聚糖 桥组成 。磷 酸乙醇 胺以酰 胺键连 接到蛋 白质的 C 末端。 GPI 尽管在 很多细 胞类型 中通过 加入侧 链而被 修饰, 但在整 修进化 过程中 GPI 的聚 糖核心 相 当保守 。然而 GPI 的脂 质部分 则各不 相同。 这一部 分包括 有二酰 基甘油 ,碱 性酰基 甘油, lyso- 酰基 复合物 或酰基 鞘氨醇 。烃 链长度 和饱和 度可能 也不同 ,并 且可能 是多种 混 合物。 通过 对锥虫 (trypanosome) 变异型 表面糖 蛋白的 研究, 较好地 理解了 GPI 锚定物 的结构 。早 期的研 究显示 这一糖 蛋白是 通过一 含有肉 豆蔻酰 基磷酯 酰肌醇 的脂质 部分而 同细 胞膜相 连接, 其他的 研究显 示细胞 磷脂酶 C 能从 细胞 膜上释 放某些 蛋白质 。这些 研究明 确了一 类带有 C 末端糖 酯锚定 物的蛋 白质。 这一领 域深入 的研究 阐明了 GPI 生 物 合成的 途径, GPI- 特异性 磷脂酶 C (GPI-PLC) 的纯化 ,以 及抗交 叉反应 决定簇 (ami-CRD) 抗 体作为 GPI 标 志探针 的建立 ,磷酯 酰肌醇 特异性 磷脂酶 (GPI-PLC) 和 GPI 特异性 磷脂酶 D(GPI-PLD) 的应用 ,鉴 定了 GPI 锚定 蛋白的 存在。 2) 重 要参数 起 始材料 未做特 别定量 ,因 为检测 方法的 不同敏 感性大 不相同 。另外 ,活性 分析、 每一 步的条 件及每 一处理 后是否 影响活 性均要 考虑。 根据材 料的来 源以适 应检测 需要, 一 般准备 2 〜 10 倍的 蛋白质 M, 要考 虑到操 作中的 丢失。 尽 管跨膜 域也缩 合在去 垢剂分 离相, Triton X-114 分离 可提示 GPI 锚基 的存在 。例 • 794 • 如, 如果已 知一个 蛋白质 不具有 跨膜域 ,在 Triton X-114 去 垢剂相 能够检 测提示 存在有 脂质 的修饰 。一般 说来, 通过分 离现象 的改变 ,这一 方法能 最有效 地推测 蛋白质 从锚定 物 的释放 。许多 其他特 异性方 法从锚 定物上 释放蛋 白质, 能提示 GPI- 连 接存在 (例如 : 亚硝 酸脱氨 或磷脂 酶消化 ), Triton X-114 是 评价释 放反应 最有效 工具。 Triton X-114 常 含有 亲水污 染物, 使用之 前应通 过几轮 相分离 进行预 缩合。 细 菌磷酯 酰肌醇 特异性 磷脂酶 C (PI-PLC) 能有效 地切割 GPI 锚定物 ,释 放蛋白 质于 水相, 也能切 割磷酯 酰肌醇 (PI)、 cyso^PI 和 PI- 连接 聚糖。 PI-PLC 特异性 释放的 蛋白是 GPI 锚 定成分 ,提 示这是 一个可 靠的分 析模型 。其他 特异性 磷脂酶 ,只 能有效 降解 GPI 类物质 ,也 可用于 分析。 这些酶 一般较 PI-PLC 更贵 ,最先 纯化的 是来自 Try- panosoma brucei, 是一种 GPI 特异性 憐脂酶 (GPI-PLC)。 另一种 存在于 哺乳动 物血清 (大鼠 、大 白兔或 人类) 的是 GPI 特异性 磷脂酶 D (GPI-PLD)。 这些酶 是鉴定 GPI 锚 定 物存在 的有效 工具。 蛋 白质从 GPI 锚 定物中 释放后 ,接着 采用适 当的蛋 白质检 测方法 。例如 : 酶活性 检测、 电泳分 离后蛋 白染色 ,如 果有特 异性抗 体可用 ,可采 用免疫 沉淀或 免疫印 迹法。 另外 ,被处 理细胞 可用免 疫荧光 检测法 包括荧 光活化 细胞分 类来研 究特异 蛋白的 丢失。 由于 PLC 释放 反应后 ,特异 性表位 (交叉 反应决 定簇或 CRD) 的暴露 ,可 利用 针对特 异性 表位抗 体鉴定 PLC 处理后 的裂解 产物。 尽管要 注意排 除假阴 性结果 ,释放 缺如可 能提示 GPI 锚 定物的 不存在 。一些 GPI 分 子肌醇 上带有 另外的 脂肪酸 ,不易 被细菌 PI-PLC 或锥虫 GPI-PLC 所切割 。一 些蛋白 质部分 敏感提 示这些 多肽只 有一部 分带有 含酰基 -肌醇 锚定物 。血清 磷脂酶 D (GPI- PLD) 可 裂解含 酰基化 肌醇的 GPI 结构 ,有利 于鉴别 ,然而 ,无去 垢剂的 情况下 ,对 膜 结合蛋 白无效 。当完 整细胞 用磷脂 酶处理 ,可表 现有部 分或完 全抗裂 解反应 ,因 为酶 同蛋 白质不 能接近 ,后者 可以是 GPI- 锚定和 跨膜锚 定蛋白 ,或者 同细胞 表面非 敏感蛋 白紧密 相连。 细菌 PI-PLC 因为价 格相对 便宜, 效率高 ,而成 为最佳 、首 选酶 。尽管 GPI-PLC 特 异性 更强, 但一般 更昂贵 。一些 GPI 锚定物 不易受 磷脂酶 C 切割 ,这些 结构内 具有另 外的 脂肪酸 ,共 价结合 在锚定 物的肌 醇上。 因为这 一原因 PLC 不 能切割 (裂解 ) 并不 一定排 除某一 蛋白质 就不是 GPI 锚定物 。这种 情况下 ,可 采用 GPI-PLD, 尽管 这种酶 不会 暴露抗 CRD 检测的 表位。 从磷脂 酶消化 液中抽 提和分 析放射 标记脂 质产物 ,可快 速鉴定 裂解的 存在。 标记目 的蛋白 很有用 ,可节 省材料 和试剂 ,特 别是蛋 白质由 脂肪酸 放射 标记, 碱水解 是一有 效的分 析方法 。尤其 怀疑存 在有脂 质修饰 ,而其 他方法 产生阴 性 结果。 3) 预期结 果和时 间估计 不具有 酰基化 肌醇的 GPI 结 构锚定 蛋白需 要有去 垢剂才 能溶解 ,可 以通过 Triton X-114 抽提; 由 于蛋白 质的溶 解特性 ,抽提 后也可 能仍存 在于细 胞团中 。加 温的 Triton X-114 溶液中 ,锚 定蛋白 进入富 含去垢 剂相, 这些蛋 白质可 通过亚 硝酸脱 氨化学 裂解, 以 及通过 GPI-PLC、 PI-PLC 或 GPI-PLD 等处 理进行 酶催化 水解。 PLC 裂 解蛋白 质将同 a-CRD 抗 体反应 ,并且 所有裂 解反应 将可产 生相应 的脂质 产物。 如 果脂肪 酸是以 羟酯化 连接到 甘油上 (如 二酰基 或碱性 酰基锚 ), 以 脂肪酸 形式掺 • 795 . 入到 锚定物 内的放 射标记 可通过 KOH 的甲 醇溶液 处理释 放出来 ,羟胺 处理则 不能。 一 些对 PI-PLC 和亚硝 酸敏感 的锚定 物含有 酰基鞘 氨醇而 不含二 酰基或 碱性酰 基甘油 (例 如酵母 ), 这些锚 定物对 弱碱无 反应, 但对水 解酰胺 的条件 敏感。 如果 GPI 锚 定物含 有酰基 化肌醇 ,上述 特征仍 存在, PLC 处 理不能 裂解锚 定物, 此时 可采用 亚硝酸 脱氨, GPI-PLD 消化和 放射标 记研究 ,以 了解 连接的 特征。 总 体来看 ,上述 方法非 常快速 , 酶孵育 或化学 反应和 随后分 离需要 1 〜 2h。 这些分 析 所需时 间主要 依赖于 检测目 的蛋白 所采用 的方法 。例如 ,如 果蛋 白质采 用锚定 物脂肪 酸 部分放 射标记 ,可 通过脂 质抽提 和闪烁 记数来 鉴定裂 解反应 ,可在 内完成 。如 果采用 免疫沉 淀或免 疫印迹 进行产 物检测 ,分 析将花 更长的 时间。 五 、酚- 硫酸测 定己糖 与戊糖 1. 原理 碳水化 合物在 强酸存 在情况 下加热 ,会通 过氧化 、还原 和浓缩 加工转 化为糠 醛及其 类似物 。这 些产物 能同有 机物质 ,例如 ,酚反 应而形 成有色 复合物 ,可以 通过比 色法定 量检测 。利用 已知浓 度的单 糖样本 ( 己糖或 / 和戊糖 ) 建立 标准对 照曲线 ,检测 实验样 本中单 糖总体 水平。 这一分 析法比 较适合 于小量 样本。 注 意:这 一过程 中要用 到蒸馏 水或去 离子水 以及优 质硫酸 ,试剂 污染可 能会导 致假阳 性结果 。在 使用这 些试剂 进行分 析之前 ,可 按第 2~8 步的 方法检 査每一 瓶硫酸 和水。 两种试 剂的吸 收率应 <0.05 ( 以未做 分析用 的水进 行比较 )。 2. 材料 待分析 的样本 单 糖标准 :例如 D-( + )- 半乳糖 (Sigma 林 G0625 纯 化级无 水晶体 ,参 见重要 参数) 5% (m/V〇 酚 (室温 下暗瓶 内贮存 ,溶 液应是 无色的 ,否则 说明开 始氧化 ) 浓硫酸 (ACS 试剂类 ) 玻 璃吸管 ,为增 加流速 已除去 尖部, 适用于 浓硫酸 16mm x 25mm 厚壁耐 热试管 ,薪 新并 且蒸馏 水洗过 或者酸 冲洗过 l.OmL 玻 璃小杯 (lcm 周长) 可见 光分光 光度计 3. 操 作步骤 (1) 用水 或适当 浓度缓 冲液溶 解样本 ,最终 体积为 300 〜 450/iL (分 别准备 2 或 3 个 分样本 )。 样本应 溶于新 的或酸 冲洗过 的试管 。溶解 样本量 应确保 糖浓度 >10ng/mL。 如果有 可能估 计样本 糖浓度 ,可 配制 两份浓 度至少 10 倍 之差的 样本液 。根据 其结果 ,再增 加或降 低浓度 , 以获得 分析的 线型范 _ 内的 吸收率 。只 要按说 明试剂 部分保 持不变 ,总 体积董 可根据 所用材 料董而 不同。 (2) 转移 2 份 150^L 的溶 解样本 (如 可能或 3 份) 于新的 或者酸 冲洗了 的16〇11„>< • 796 • 25mm 耐热试 管中。 如 果样本 要增加 或减少 ,所 用试管 应明显 大于反 应混合 物的最 终体积 ,以免 浓硫酸 溅出。 使用广 口 试管可 以散热 (硫 酸同水 接触发 热反应 ), 便 于颜色 形成。 (3) 准备 3 个空 白试管 ,每管 内加入 150^L 相 同的样 本溶剂 (水或 缓冲液 ,见第 1 步 )。 (4) 一式 3 份 ,准备 一系列 试管, 制备样 本溶剂 的单糖 标准液 ,分别 含单糖 标准为 10ng/mL、 20ng/mL、 30ng/mL、 40ng/mL、 50ng/mL、 60ng/mL、 70ng/mL 和 80ng/ mL, 加水 体积到 150^L。 为减 少误差 到最低 限度, 制备标 准贮存 液作系 列稀释 , -20t: 保存贮 存液。 (5) 每一管 内加入 150pL 5% 的 酚溶液 ,短 暂振荡 混合。 注意: 进行第 6~8 步, 带橡皮 手套和 眼保护 ,因 涉及浓 硫酸的 应用和 产热。 (6) 利 用去尖 顶的玻 璃吸管 每管快 速加入 750/iL 浓硫酸 ,确 保硫酸 流线直 接接触 液面 ,快 速混合 散热, 室温试 管静置 lOmin。 (7) 再 短暂振 荡混合 ,室 温静置 30min, 此时颜 色形成 ,可稳 定几个 小时。 (8) 从每 一管中 将溶液 转移到 l.OmL (lcm 周长) 玻璃 小杯中 ,用 分光光 度计于 480nm 和 / 或 490nm 处 读出每 管的吸 收率。 转移溶 液过程 中一定 要小心 ,以 免液 体溅到 分光光 度计上 ,腐蚀 性硫酸 会损害 仪器。 480nm 处检 测戊糖 、糖 醛酸和 其他甲 基化衍 生物; 490nm 处检 测己糖 及其甲 基化衍 生物。 (9) 求出每 一标准 3 管 的平均 吸光率 ,再 减去空 白管的 吸光率 ,制出 一吸光 率和浓 度 (ng/ptL) 标 准曲线 (包括 A480 或 / 和 A490)。 (10) 求 2 或 3 份 样本管 的平均 吸光率 ,减去 空白管 吸光率 ,根 据标 准曲线 可求出 样本 中糖的 含量。 4. 方 法评注 1) 背 景资料 自从 Dubois 等首 次应用 以来, 酚-硫 酸分析 法检测 糖已广 泛应用 。本方 法简单 、快 捷 、敏感 、准确 ,具 有碳水 化合物 特异性 。大 多数糖 (除外 己糖胺 )、 糖 衍生物 、寡糖 和 多糖能 与这些 试剂发 生反应 。反 应产物 的类型 及比例 因碳水 化合物 种类不 同而异 ,也 受试剂 的浓度 、温 度和 加热时 间影响 。尽 管有色 产物的 准确成 分不定 ,但 分析方 法是规 范的, 每种碳 水化合 物实验 结果重 复性好 。试 剂便宜 ,容 易得到 ,并 且稳定 性好。 2) 重要 参数及 有关问 题处理 因为不 同的单 糖产生 的结果 不同, 建立标 准曲线 所选用 的单糖 应和样 本中所 期望的 成分 相对应 。动物 来源的 糖蛋白 ,一般 用半乳 糖作为 标准, 分析结 果能提 示碳水 化合物 的存 在及其 百分比 (定量 )。 然而分 析未知 的复杂 碳水化 合物时 ,不 能选 择正确 的对应 单糖 ,得到 的实验 结果只 能是近 似的。 要获得 准确的 可重复 的结果 ,采用 3 份样本 检测可 将误差 降到最 低限度 。使 用新试 管 ,并用 蒸馏水 冲洗除 去绒布 和纸屑 ,或 使用酸 清洁冲 洗试管 很重要 。偶 尔有绒 布屑的 污染等 使吸光 率读数 值很高 ,但 是使用 3 份试管 ,可 以鉴别 并排除 假阳性 结果。 如果 是用洗 脱柱检 测含碳 水化合 物样本 ,首先 要检查 缓冲液 和柱洗 脱液的 阳性反 • 797 • 应。 如果柱 装载使 用糖为 基础的 多聚物 (如 Sephade Pharmacia), 装载材 料的分 解将引 起分 析物的 颜色明 显改变 。洗脱 缓冲液 也可能 含有糖 污染物 ,如 细菌 。此时 ,最 好检测 前新 鲜配制 。空 白管应 采用柱 缓冲液 ,如 果有有 机溶剂 污染, 在进行 分析前 ,应 通过蒸 发 除去。 3) 预期结 果和时 间估计 酚- 硫酸分 析法能 定量分 析检测 样本中 戊糖和 / 或己糖 及它们 衍生物 的总量 。以 标准 单糖作 为比较 (如 半乳糖 ), 如 果一式 3 份实验 ,分 析结构 准确度 ±2%。 一 般可在 lh 内完 成分析 ,然 而有许 多样本 要分析 (如 检测柱 流出物 ), 所花 时间会 长。 六、 连接 糖基化 的抑制 (一) 基 本方法 采用 N- 连接寡 糖链合 成酶抑 制剂处 理可导 致糖蛋 白合成 过程中 糖链的 丢失或 改变。 这一 方法用 于检测 特异性 蛋白或 完整细 胞表面 这类寡 糖的潜 在功能 。表 11.3 列出每 一 抑制 剂抑制 的酶及 其影响 。图 11. 12 图解 N- 连接寡 糖组装 早期加 工步骤 ,标出 除衣霉 素外 (影响 更早期 ) 每个抑 制剂抑 制的酶 。这 里描述 应用这 些抑制 剂抑制 培养细 胞蛋白 质 N- 连接 糖基化 。首先 ,抑制 剂的理 想浓度 (即最 高无毒 性浓度 ) 是根 据检测 35S- 甲 硫氨 酸掺入 (代 表蛋白 质生物 合成) 而 决定的 。通过 TCA 沉淀或 EndoH 消 化分析 3H- 标记 细胞, 可检测 抑制剂 抑制寡 糖加工 的能力 。进一 步介绍 了怎样 分析特 异性糖 蛋白和 检测抑 制剂对 连接 寡糖的 影响。 表 11.3 N •连 接寡糖 合成酶 抑制剂 抑制 剂类型 靶 酶 对寡 糖结构 的影响 有效浓 度范围 糖基化 抑制荆 T unicaxnycin 加工 抑制荆 GlcNAc 转移酶 抑制 GlcNAc-PP-dolichol 及 G3M9GlcNAC2-PP-dolichol 形成; Asn 残 基糖基 化不能 发生; 蛋白于 SDSPAGE 迁 移加快 并很少 大小异 质性; PNGaseF 处理后 ,于 SDSPAGE 迁移不 加快。 0 . 5 〜 10;xg/mL Deoxynoj irimy cin Castanospermine 糖苷酶 I 和 (或 )II 抑制第 一 个葡萄 糖残基 的脱落 , 因此抑 制寡糖 链的进 一步 加工; 蛋白 质同正 常加工 程度相 比较于 SDS> PAGE 上迁 移表现 较大或 更小; 对 Endo H 敏感。 0 • 5 〜 200mmol/ L 1 〜 50 pg/mL Deoxymanix^j irimy cin a- 甘露 糖苷酶 I 抑制 高甘露 糖结构 al-3 臂上甘 露糖的 脱落, 因此抑 制 GlcNAcTI 和 甘露 糖苷酶 丨丨的 活性; 同 正常寡 糖大小 相比较 , 蛋白于 SDS PAGE 上 更小; 结构对 Endo H 敏感。 1 〜 5 mmol/ L Swainsonine a- 甘露 糖苷酶 II 抑制 高甘露 糖结构 <»1-6 臂上甘 露糖的 脱落, 因此抑 制 GlcNAcT II 和 V (将 GlcNAc 加入到 al-6 甘露糖 残基上 ) 的 活性; 尽管 仍对 Endo H 消 化敏感 ,仍能 正 常地将 GlcNAc, 半乳糖 ,涎酸 加入到 al-3 甘露糖 上。 1 〜 10 pg/mL • 798 • Man a l-2Man a 1 Glc a l-2Glc a l-3Glc a l-3Man a 1-2M- Man a 1 l-2Man a 1 葡萄 糖苷酶 I 葡萄 糖苷酶 II Man a l-2Man a .6 Man a Man a l-2Man a 1 ^ Man a l-2Man a l-2Man a 甘露 糖苷酶 I Man a 1 Man a 1 Man a Man a 1 GlcNAc 转移酶 I + UDP-GlcNAc Man a : Man a 1 -3 Man a Man P 1 -4GlcNac P 1 -4GlcNac- Asn 能被 castanospermine, deoxynojirimydn 阻断 Man p MGlcNac P l-4GlcNac-Asn 能被 deoxymannojirimycin 抑制 _ 6 Man p MGlcNac )3 l-4GlcNac-Asn •3 GlcNAc P l-2Man a 1 一 ^ 甘露 糖苷薄 II Man a 1 GlcNAc P l-2Man a 1 GalcNAc 转移 _ II + UDP-GlcNAc Gal 芦 1-4 转移酶 + UDP-Gal Gal P l-4GlcNAc P l-2Man a 1 Gal p l-4GlcNAc P l-2Man a 1 " 图 11.12 N- 连 接寡糖 合成过 程中早 期加工 重要酶 及对应 抑制剂 Man p 1 -4GlcNac j3 1 -4GlcNac- Asn 能被 swainsonine 抑制 Man p 1 -4GlcNac p 1 -4GlcNac- Asn Man p MGlcNac P l-4GlcNac-Asn i. 材料 黏 附或悬 浮培养 细胞系 完全 培养基 N- 连接 糖基化 抑制剂 (下列 一种或 多种: tunicamycin、 deoxynojirimycin、 cas- tanosper-mine、 deoxymannojirimycin、 或 swainsonine, 见表 11.3) 配 制抑制 剂溶液 的溶剂 • 799 • 多缺乏 培养基 (MDM), 不含 葡萄糖 3H- 甘露糖 (5~20Ci/mmol) 磷酸盐 缓冲液 (PBS), 冰冷 溶解 缓冲液 ,不含 1% 牛血 红蛋白 0.5U/mL 内切 糖苷酶 H (EndoH) Endo H 消化 缓冲液 (15pL 0.5 mol/L 枸 橡酸钠 pH5.5, 75;xL 水 , 5/xL 10% PMSF 于异 丙醇, 5ML0.5U/mLEndoH。 PMSF 阻止 蛋白质 溶解, 非离子 去垢剂 不需要 。使 用之 前临时 配制, PMSF 在水中 不稳定 ) 20% (m/V) SDS Sephacryi S-200 柱 25mmol/L 甲酸胺 /0.1% (w/V) SDS 24 孔组织 培养板 100mm 组织 培养板 一 次性塑 料刮刀 ,或橡 胶淀帚 1.5mL、 15mL 或 50mL 柱形 聚丙烯 离心管 组织 培养、 活细胞 计数、 35S- 甲硫氨 酸短期 标记悬 浮或黏 附细胞 、糖 复合物 的代谢 性放 射标记 、细 胞溶解 (免疫 沉淀法 )、 TCA 沉淀法 、内切 糖苷酶 H 消化 、凝胶 过滤层 析和 蛋白质 一维凝 胶电泳 等所需 的试剂 和设备 注意: 所有培 养基和 溶液应 采用去 离子水 、蒸馏 水配制 ,所有 与细胞 接触的 培养基 和设备 应是无 菌的, 细胞孵 育应在 37X:, 潮湿的 5% CCb 培 养箱中 进行。 2. 抑制剂 贮存液 的配制 溶解 Castanospermine ( mol. wt. 189.2 ), 1 -deoxymanno-j irimycin ( mol. wt. 199.6 ) 或 1-deoxynojirimycin (mol.wt.163.2) 于 水中到 400 mmol/L; 溶解 Swainsonine (mol.wt.173.2) 于 水中到 lmg/mL。 通过 0.2pm 滤 膜过滤 消毒。 -20t^ 冻存 ( 长期稳 定 )。 溶解 tunicamycin (mol.wt.840) 于二 甲亚讽 (DMSO)、 二甲基 甲醜胺 (DMF), 95% 乙醇或 25mmol/LNaOH 到 lmg/mL。 -20X: 冻存 ( 大约稳 定一年 )。 如 果用了 NaOH, 将贮存 液贮存 于一密 封的小 试管内 ,防 止二 氧化碳 的吸收 。后者 会降低 pH, tunicamycin 于中 性水溶 液中的 溶解度 < lmg/mL (易产 生沉淀 )。 3. 操 作步骤 确定 理想的 抑制剂 浓度: (1) 对每个 抑制剂 ,通 过细 胞分离 (黏附 细胞用 胰蛋白 酶作用 ,或悬 浮细胞 稀释) 在 24 孔组织 培养板 上建立 15 孔细胞 ,每孔 含完全 培养基 1.8mL。 孵育 24h。 分 离比率 应适当 ,使 第三天 (即 分离后 48h) 细 胞融合 而不至 于过度 生长。 (2) 细胞孵 育期间 ,按 下面方 法配制 一系列 1:1 (V/V) 抑制剂 稀释液 。将表 11.4 中 所规定 体积的 抑制剂 贮存液 置于一 无菌离 心管内 ,再 用完全 培养基 稀释到 80(^L 终体积 。吸取 4〇(^L 到第 2 管 ,再用 400ML 完 全培养 基稀释 。如此 重复共 7 管。 • 800 • 将用于 配制抑 制剂溶 液的溶 剂同样 进行系 列稀释 ,作为 对照。 (3) 首 先从第 一次稀 释后每 管中取 200pL 加入 含细胞 的组织 培养板 孔中, 最终体 积 2mL。 加 20(^L 单纯 完全培 养基到 剩余孔 (作为 无抑制 剂对照 )。 孵育 培养板 24h, 4t: 贮存 于不含 抑制剂 的培养 基中。 如果抑 制剂是 tunicamycin, 应每天 新鲜配 制稀释 ,因 为贮存 期间可 能发生 沉淀。 (4) 用 0.2mCi/mL35S- 甲硫氨 酸标记 物进行 短期细 胞标记 ,保持 每孔最 终体积 1 .8mL〇 表 11.4 抑制剂 系列稀 释的浓 度范围 抑制剂 贮存液 第 i 次稀 释用量 浓 度范围 Tunicarnycin lmg/mL 80^L 0• 15 〜 10 pg/mL Swainsonine lmg/mL 80pL 0• 15 〜 10 卩 g/mL Deoxynoj irimycin 400 mmol/ L 200^tL 0 • 15 〜 10 mmol/L Deoxymannoj irimycin 400 mmol/ L 200^tL 0 • 15 〜 10 mmol/L Castanospermine 400 mmol/ L 200/xL 0 . 15 〜 10 mmol/L (5) 将抑制 剂稀释 液每步 剩下的 200/xL (从第 2 步来) 加入 孔内, 再孵育 4h。 (6) 收 集细胞 ,利用 TCA 沉淀 法检测 35S- 甲硫 氨酸掺 入大分 子物质 内的量 。以标 记物掺 入量为 纵坐标 ,抑 制剂 浓度为 横坐标 制图。 注 意:应 采取处 置放射 活性废 物的防 护措施 。比 较加和 不加抑 制剂孵 育的细 胞掺入 情况, 可以发 现不 抑制蛋 白质合 成的最 大抑制 剂浓度 ,这 便是后 面步骤 的理想 浓度。 在 N- 连接 糖基化 抑制剂 存在条 件下标 记细胞 (7) 分 离新的 细胞样 本加到 100mm 组织培 养板的 完全培 养基上 ,孵育 24h。 (8) 加入理 想浓度 (上面 检测的 ) 的 抑制剂 。建 立一含 有等量 的贮存 液溶剂 的对照 板 ,但无 抑制剂 。孵育 24h。 (9) 按标记 (第 4 步) 时采 用的方 式冲洗 细胞, 并给每 一板加 入充足 的无葡 萄糖的 MDM 来覆 盖细胞 (100mm 板 内加入 5mL)。 按第 8 步加入 抑制剂 或溶剂 。加入 3H- 甘 露糖到 0.02 〜 0. lmCi/mL, 解育 4 〜 12h。 孵育时 间决定 于细胞 3H- 甘露糖 标记的 好坏。 3H- 甘 露糖的 用量依 赖于检 测细胞 系种类 。然 而对大 多数细 胞来说 ,单 一含有 5mL 培 养基的 100mm 板 ,加有 0.02m Ci/mL3H- 甘露糖 6h, 能产生 足够量 的放 射性物 质供后 面分析 。应 避免在 无葡萄 糖标记 培养基 上过久 孵育。 (10) 收 获细胞 。贴壁 培养时 ,用 一次 性刮刀 ,或橡 胶淀帚 刮取; 悬浮 培养时 ,采 用离心 方法, 后放入 冰冷的 PBS 液中。 注 意:应 采取处 理放射 活性废 物的安 全防护 措施。 检测已 掺入大 分子放 射活性 : (11) 如 果采用 tunicarnycin 作为抑 制剂, 可采用 TCA 沉淀法 检测标 记大分 子的放 射 活性量 ,并 继续进 行进第 18 步 。如 果是另 外的抑 制剂, 进行第 12~17 步。 放射活 性掺入 大分子 的反应 量影响 抑制剂 对寡糖 的生物 合成, 抑制剂 的存在 应阻止 3H- 甘 露糖掺 入大分 子中。 (12) 通过 冰冷的 PBS 重悬浮 ,离心 和除上 清液, 反复冲 洗细胞 2 次 。将细 胞团重 . 801 • 新悬浮 于不含 牛血红 蛋白的 裂解缓 冲液中 ,进行 裂解。 (13) 将 每份样 本分成 2 等份 ,加入 柱形聚 丙烯离 心管内 ,再 用丙酮 沉淀蛋 白质。 依据样 本董大 小采用 1.5mL、 15mL 或 50mL 离心管 , 应加入 8 倍体积 丙酮。 (14) 用 EndoH 消化 缓冲液 (20~40/iL/107 细胞) 再悬浮 细胞团 ,煮沸 lOmin, 灭活内 源性水 解酶。 (15) 加入 EndoH (5^L/10(VL 样本) 于每个 样本对 ,两 者均 37X: 孵育 过夜。 (16) 给每 个样本 内加入 1/1〇 体积 20%SDS, 煮沸 3~5min 结束 消化。 (17) 事先用 25mmol/L 甲酸胺 /0.1%SDS 平衡有 刻度的 SephacrylS>200 柱 ,每次 加一个 样本于 其内, 样本量 <5% 柱 床容量 。收集 洗脱液 ,用闪 烁计数 仪检测 糖蛋白 (柱 真空容 积洗脱 部分, V〇) 和自 由寡糖 (V〇 之后 洗脱) 的 相关放 射活性 ,每 4 个样本 一次 。每 2 次样 本应用 之间用 2 〜 4 体积 25mmol/L 甲酸胺 /0.1% SDS 冲 洗柱。 未用 EndoH 消化时 ,或未 用抑制 剂处理 样本, 所有放 射活性 物应在 Vo 处洗 脱。 乂 之后 存在有 放射 活性物 的洗脱 可能表 明丙酮 沉淀后 的冲洗 步骤未 能完全 除去细 胞裂解 物中低 相对分 子质量 的污染 物。 采用 Endo H 消化的 样本, 洗脱结 果应显 示抑制 剂处理 细胞较 未处理 的细胞 内源性 H 释放 的放射 活性明 显增加 。对 于未进 行抑制 剂处理 样本, 寡糖从 肽骨架 中脱落 表明不 成熟寡 糖仍正 在高尔 基器内 加工; 在 一些成 熟糖蛋 白表面 发现有 Endo H 敏感的 一小部 分结构 。因为 抑制剂 阻止寡 糖加工 进入成 熟的寡 糖结构 ,并 且未加 工寡糖 较加工 寡糖含 有更多 甘露糖 残基, 所以对 于抑制 剂处理 的样本 ,应有 更 高比例 的总放 射活性 被稀释 。理论 上来说 ,抑 制剂处 理样本 10% 的放 射活性 应能由 Endo H 消化释 放 (见重 要参数 ), 然 而实际 上抑制 是不完 全的。 为了节 省时间 ,只用 同样方 式分析 第一和 最后一 管对照 细胞, 即那些 根本未 做处理 和只用 高浓度 抑 制剂溶 剂处理 的样本 (从第 2 步而来 )。 如果这 两组细 胞的结 果相同 ,可 能用 低浓度 抑制剂 溶剂处 理的 细胞会 产生相 同结果 。然而 ,如果 发现溶 剂有毒 ,应该 检测细 胞暴露 于不同 浓度的 情况, 以确定 抑 制剂溶 剂的最 大耐受 浓度。 (18) 如果有 必要, 并且从 35S- 甲 硫氨酸 放射标 记细胞 中纯化 和鉴定 特异糖 蛋白的 方法 可行, 可采用 SD&PAGE 和放 射自显 影检测 特定抑 制剂的 影响。 每 一 ■ 连接碳 水化合 物链将 增加蛋 白质的 分子质 量大约 2000~4000Da, 因此在 tunicamycin 存在 条件下 ,蛋白 质合成 将导致 SDSPAGE 流 动较快 。其他 抑制剂 的影响 可能表 现在对 Endo H 消 化敏感 性增加 ,也 可以从 SDSPAGE 中迁移 率增加 中检测 出来。 (二) 丙 酮沉淀 丙酮 沉淀是 浓缩蛋 白质和 蛋白质 从一种 缓冲液 交换到 另一种 缓冲液 的一种 有用步 骤 。小到 10ng 的蛋 白质也 可以被 成功地 沉淀。 1. 附 加材料 100% 丙酮 (HPLC 或 ACS 级 ), -20X: 1.5mL、 15mL 或 50mL 柱形 聚丙烯 或其他 离心管 2. 操 作步骤 (1) 将 蛋白质 溶液置 于冰上 ,加入 8 体 积丙酮 (-20X:) 轻 轻混匀 ,并于 -20X: 隔 • 802 • 夜 沉淀。 如 果样本 量太大 而不能 有效用 8 体积 稀释 ,冻 干浓缩 并用较 小容量 再悬浮 。如 果样本 中含有 NP- 40 或 Triton X-100 等去 垢剂, 浓缩程 度有限 ,因为 高浓度 去垢剂 (例如 >1%) 会从丙 酮溶液 中分离 出来 ,离心 后表现 为一油 性团块 (第 2 步 )。 如果有 大量的 蛋白质 ( 即加入 丙酮后 ,沉 淀物易 肉眼可 见 ), 在 -20X: 静置几 个小时 ,而 不必 过夜即 可以沉 淀下来 。应避 免让样 本物质 在丙酮 中超过 Id 时 间 ,因 为这样 蛋白质 再溶解 会发生 困难。 (2) 3000Xg4t: 离心 Umin, 收集 奸淀 (应 可见一 小团块 ), 小心将 丙酮倒 入另一 干净试 管内。 如果因 为去垢 剂存在 ,团块 呈油性 ,应 该加入 85% (V/V) 丙酮 (-20t:) -20X: 孵育 >lh, 然后 再离心 抽提。 (3) 将含有 团块的 试管短 暂离心 ,浓 缩剩下 的丙酮 ,并 用微量 移液管 移去。 让团块 干 燥至潮 湿而不 至干燥 为粉末 。用 适当量 的理想 溶剂再 悬浮。 要 小心地 干燥沉 淀团块 ,如 果完全 干燥, 再悬浮 时将会 碰到很 大困难 。这种 不可溶 性依赖 于单个 蛋 白质和 总量。 (三) 方 法评注 1) 背 景资料 iV- 连接寡 糖链的 组装涉 及一些 糖苷酶 、糖 苷转移 酶的系 列作用 。细 胞在这 些酶的 抑制 剂存在 条件下 生长, 会产生 一些糖 蛋白加 工不全 或寡糖 链缺失 。根据 蛋白质 不同, 这些变 化可能 会改变 生物学 功能和 / 或运输 、分泌 及转运 速率。 iV- 连接 糖基化 开始组 装于脂 质连接 前体物 葡萄糖 3 甘露糖 9iV- 乙酰氨 基葡萄 糖2 -焦 磷酸盐 -长醇 (Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol, 同 结构图 11.12A)。 此前体 物的组 装要有 iV- 乙酰氧 基葡萄 糖-焦 憐酸盐 -长醇 (GlcNAc-PP-dolichol), 后 者可被 tumicamycin 阻止。 因此, tunicamycin 的应用 会导致 一些或 所有蛋 白质的 iV- 连接侧 链丢失 ,然 而那 些不全 抑制 可正常 加工。 Tunicamycin 也可能 抑制蛋 白质的 合成, 不是所 有蛋白 质会受 同等程 度 影响。 Tunicamycin 也 能抑制 II 型 硫酸角 质素链 的组装 ,因 为这类 聚糖也 要利用 GlcNAc-PP-dolichd。 糖脂生 物合成 也会受 到抑制 ,潜 在的 机制尚 不明。 糖苷酶 抑制齐 ij Castanosperminc、 deoxynojirimycin、 deoxymanojirimycin 和 swainso- nine 的毒性 明显较 tunicamycin 小。 Castanosperimine 抑制 糖苷酶 I, deoxynojirimycin 能 抑制 糖苷酶 I 和 II。 一些 实验研 究显示 ,这两 种酶代 谢阻止 是不完 全的, 会产生 一种正 常加工 和加工 不全的 混和物 。最 近发 现四糖 Glq-Mam 能被 内源性 -a-D 甘露糖 苷酶从 Glc3Man9GlcNAc2 中分解 下来, 而不受 糖苷酶 抑制剂 的阻止 。这 一点尚 未完全 清楚。 各 种细胞 内这种 内源性 -a-D 甘 露糖苷 酶水平 不同。 Deoxymannojirimycin 和 Swainsonine 分别是 糖苷酶 I 和 II 的抑 制剂。 通过抑 制甘露 糖苷酶 I, deoxymannojirimycin 能阻止 apiV- 乙 醜氨基 葡萄糖 的加入 ,后 者是甘 露糖酶 II 作 用所需 的结构 D 形成所 必需的 。然而 不能阻 止单个 GlcNAc 残 基被半 乳糖苷 化和涎 酸化导 致杂合 结构的 产生。 一些糖 苷酶抑 制剂也 对溶酶 体酶发 挥作用 ,在组 织培养 细胞中 其意义 尚知道 很少。 Deoxynojirimycin 能抑制 无细胞 抽提物 中脂质 连接前 体物的 合成, 但在完 整细胞 中尚未 • 803 • 深 入研究 。这 些抑制 剂在培 养细胞 内代谢 或半衰 期尚不 清楚。 2) 重要参 数及相 关问題 的处理 两个重 要参数 是暴露 时间和 抑制剂 浓度。 这里提 示的处 理时间 (24h) 能让 细胞在 抑制 剂存在 情况下 合成的 糖蛋白 代替大 多数内 源性糖 蛋白。 对于转 运较慢 或较快 的蛋白 质 ,更 长或更 短孵育 时间才 较合适 。如 果采用 放射标 记糖或 氨基酸 前体物 进行脉 冲追加 研究 ,必 须在标 记之前 ,将细 胞于抑 制剂存 在条件 下孵育 l~2h。 N- 连 接糖基 化抑制 剂可能 对细胞 有毒性 。表 现为细 胞活性 下降和 / 或蛋白 合成减 少。 umicamycin 的 使用浓 度一般 受其毒 性限制 ,在 一些细 胞中毒 性很强 (肿瘤 细胞更 强 )。 其 他糖苷 酶抑制 剂在表 11.4 提示 的浓度 范围内 一般是 无毒的 (列出 的最高 浓度是 大 多数研 究中所 采用的 )。 重要 的是应 注意到 特定细 胞中, 不是所 有的糖 蛋白同 等程度 受特定 抑制剂 的影响 。而且 ,同 种糖蛋 白中不 是所有 的位点 受同样 影响。 分析应 用这些 抑制剂 进行研 究的结 果时应 注意到 这几个 方面。 未能 发现抑 制剂的 影响可 能表明 抑制剂 的浓度 太低和 / 或 暴露时 间太短 。细 胞系对 这些 物质的 敏感性 不同。 其他有 关安全 防护和 标记实 验参数 (包 括标记 时间、 标记浓 度 、特 异活性 、细 胞密度 和培养 条件) 将在有 关章节 讨论。 3) 预期结 果和时 间估计 这 些实验 将通过 分析蛋 白合成 ,显示 备选抑 制剂的 毒性; 通过 分析总 3H- 甘 露糖掺 入 (对 tunicamycin) 或 EndoH 对寡糖 的释放 (表 11.3 列出的 其他抑 制剂) 而 显示抑 制剂 改变寡 糖生物 合成。 完成第 一轮细 胞培养 ,检 测理想 抑制剂 浓度花 2h, 然 后孵育 24h。 第二天 ,完 成含 抑制 剂的培 养基系 列稀释 ,细 胞转移 到这些 培养基 (90a -95/>90c >90d 未提供 PH7.0 时 >70a 不定 / - 40c -30d 未提供 a. 于 O.lmol/LTris/maleic 缓冲液 和乙酸 钠中。 b. 于 0. 1 mol/L 乙酸 钠中。 c. 于 0.1mol/L 枸嫁酸 钠中。 d. 于 0.1 mol/L 乙酸 钠缓冲 液中。 表 11.6 涎 酸酶作 用的涎 酸类型 涎 酸 相对 敏感性 类 型 链 霍 乱弧菌 产气荚 膜扦菌 产豚节 杆菌纽 卡斯尔 病病毒 Neu5Ac a2-3 + + + + + + + + ++ + + + + a2-6 + + + + + + + + + + R a2-8 + + + + + + + + + + • 805 • 续表 涎 酸 相对 敏感性 类 型 链 霍 乱弧菌 产气荚 膜杆菌 产脲 节杆菌 纽 卡斯尔 病病毒 Neu5Gc a2-3 + + + + + + + + + + + + a2-6 + + + + + + + + + + R a2-8 + + + + + + + + + 7 (9) 单 -0- 乙酰化 a2-3 + + + + + + + + + + + + a2-6 + + + + + + + + R a2-8 + + + + + + + + + 4- 单 乙酰化 a2-3 R R R R a2-6 R R R R a2-8 R R R R 7 (8) 9 双 -0- 乙酰化 a2-3 R? R? + + ? a2-6 R? R? + + + + R a2-8 R? R? + + + ? 7, 8, 9 三 •0- 乙酰化 a2-3 R? R? + +? ? a2-6 R? R? + +? R a2-8 R? R? + +? ? 过碘酸 盐氧化 a 2-3 + + + R? ? a2-6 + + + R? ? Neu5Ac-7 (8) a2-8 ? ? R? ? 〇- 甲基 , 〇- 硫酸盐 , a2-3 ? ? ? ? 结合型 a2-6 ? ? ? ? a2-8 ? ? ? ? 注: Neu5Ac, 乙 酰神经 氨酸; Neu5Gc, N- 轻乙 酰神经 氨酸; R, 抗性。 (一) 涎酸 酶处理 纯化的 糖蛋白 1. 原理 纯化糖 蛋白样 本用消 化缓冲 液溶解 ,并用 涎酸酶 消化, 同时制 备单纯 的样本 和单纯 酶 的对照 。神经 节苷脂 的消化 (带有 涎酸的 糖脂) 需要 去垢剂 (例 如去氧 胆酸盐 、胆盐 或牛磺 胆酸盐 )。 消化后 ,终 止反 应并检 测去涎 酸化。 2. 材料 含涎酸 的样本 涎酸 酶消化 缓冲液 涎酸酶 • 3. 操 作步骤 (1) 将含涎 酸的样 本溶解 于涎酸 酶消化 缓冲液 ,最 终至 0.1 〜 lmm〇l/L 涎酸 浓度。 如 果涎酸 M 不清楚 ,可通 过酸水 解或者 增加涎 酸酶董 , 计算释 放涎酸 量而进 行估计 。如果 涎酸酶 • 806 • 量 不理想 ,随着 涎酸酶 量增加 ,通过 TBA 或 DMB 分 析会发 现自由 涎酸会 增加。 如果 样本含 有神经 节苷酯 ,加入 1/50 体积 10% 去氧 胆酸钠 (0.2% 终浓度 ), 并将 试管置 入超声 发生器 (sonicator) 中 l~2min, 确保完 全分散 。如 果有大 量神经 节苷脂 存在, 样本中 去垢剂 量应保 持等于 或大小 神经节 苷脂量 。如 果不大 清楚神 经节苷 脂的量 ,应 采用不 同量的 去垢剂 (例如 0.1%、 0. 3. 或 1.0%) 进行系 列消化 。过 多的 去垢剂 实际上 会抑制 消化。 Arthrobacter Ureafaciens 诞 酸酶对 神经 节苷脂 最有效 。去氧 胆酸盐 溶液在 有盐存 在的情 况下会 混浊。 (2) 加入 l~20mU 涎酸 酶于样 本和酶 对照管 ,混 合好。 选择适 当的酶 ,酶的 用量根 据样本 中释放 的涎酸 的可能 量决定 。最先 用大约 ImU/mmol 涎酸。 下一 步实验 可能提 示要用 更大或 更小量 的酶。 (3) 制备 空白管 ,只 含有样 本或酶 (在涎 酸酶消 化的缓 冲液里 )。 可替代 的对照 包括用 无活性 涎酸酶 (煮沸 5min 制备) 孵育或 用活性 的涎酸 酶加入 1 mmd/L 2.3- 脱氢 -2- 脱氧 -N- 乙酰神 经氨酸 (一种 涎酸酶 抑制剂 ) 孵育。 (4) 37X: 孵育 3 〜 4h。 消化神 经节苷 脂需要 24 〜 48h。 利用 Newcastle Disease 病毒 涎酸酶 ,选择 性消化 以2-3)和 《(2-8) 连接 ,可于 2 5~50扎 反 应体积 内加入 l~5mU,37t: 孵育 15~30min。 此酶对 a(2-6) 连接链 活性低 ,延长 孵育时 更明显 。如果 大量涎 酸存在 (例如 >lnm〇l), 将有必 要滴定 这一酶 。这 需要建 立标准 消化液 ,含有 a(2-3) 或 a(2-6) 连 接涎酸 并同未 知样本 具有相 同浓度 。并且 要确定 Newcastaldisease 病 毒涎酸 酶的量 ,后者 能释放 >90%a(2-3) 连接, <5% 的 a(2-6) 连 接糖。 (5) 煮沸 5min 结 束反应 。通过 下列检 测来判 断涎酸 的释放 : ① 直 接检测 涎酸; ② 通过等 电聚焦 改变糖 蛋白的 pi; ③ 糖脂的 TLC 的结果 改变; ④ SDS-PAGE 明显 的相对 分子质 量改变 (一般 一些诞 酸残基 的损失 将可于 SDS- PAGE 上见 到明显 的相对 分子质 量减小 或增大 ) ; ⑤ 可见 到一些 凝集素 结合形 式发生 改变; ⑥ 分 离的寡 糖或糖 脂所带 负电荷 改变。 (二) 涎 酸酶处 理完整 的细胞 1. 原理 尽管 细菌和 病毒涎 酸酶的 pH 理想 范围是 4. 5~5. 5, 这 些酶在 PH7.0 时可 用于处 理完整 活细胞 。细胞 用等离 子无血 清缓冲 液冲洗 ,再 悬浮 ,然后 用涎酸 酶处理 。反 应用 离心 和冲洗 的办法 终止。 2. 附 加材料 细胞 ,制 备单细 胞悬液 HEPES 缓 冲盐液 (HeBS) (20 mmol/L HEPES, 140 mmol/L NaCl, HC1 调 pH 到 7.0, 4X: 可保存 1 年) 带有血 清的适 合细胞 培养的 培养基 • 807 . 3. 操 作步骤 (1) 反复用 HeBS 悬浮 、冲 洗细胞 悬浮液 ,再 500X 尽离心 lOmin, 共 2 次 ,以除 去血清 培养基 。最后 一次冲 洗之后 ,再 悬浮于 HeBS, 调 浓度至 (0.2 Xl〇7) 〜 (IX 107) mL_1。 将细 胞分为 2 管。 如果用 Vibrio Cholerae 涎酸酶 ,采 用含 1 mmol/L CaCl2 的 HeBS 细胞 计数, 根据台 盼蓝排 除实验 进行 检测。 (2) —管 内加入 涎酸酶 ,另 一管不 加酶, 371C 孵育 30min。 根据表 16.5 的特性 选择酶 ,先用 过量的 涎酸酶 , 例如以 l〇〇mU/mL 加入 107 细胞 /mL (假定 107 个细 胞会产 生大约 lnmol 涎酸 ), 然 后少量 滴定以 达到理 想量。 选择 对照包 括用无 活性涎 酸酶孵 育反应 (煮沸 5min 制备) 或 用活性 的涎酸 酶加入 1 mmol/L 2-3- 脱氢 -2- 脱氧 -N- 乙酰神 经胺酸 (一种 涎酸酶 抑制剂 )。 (3a) 分析从 细胞中 释放的 涎酸分 子特征 : 将反应 冷却到 4X:, 然后 4t: 2000 xg 离心 lOmin, 收集 上清液 。煮沸 5min, 灭活涎 酸酶, 再进行 释放涎 酸特征 分析。 灭活涎 酸酶很 重要, 否则在 30min 孵育时 将会继 续作用 于任何 糖蛋白 ,分 泌或流 入培养 基中。 (3b) 分析细 胞表面 糖复合 物特征 :在进 行生物 化学或 功能分 析之前 ,要反 复用含 血 清的培 养基冲 洗细胞 3 次 (除 去自由 涎酸酶 )。 . (三) 方 法评注 1) 背 景资料 有很 多病毒 和细菌 来源的 涎酸酶 ,总 体来说 ,细 菌酶具 有最广 泛活性 ,而病 毒酶具 有特异 性限制 ,有利 于某些 分析。 涎酸以 a(2-3) 或〃(2-6) 连接于 中性糖 ,(如 半 乳糖, 乙酰 氨基半 乳糖, N- 乙 酰氨基 葡萄糖 ) 或以 a(2-8) 连接 于另一 涎酸。 a(2-3) 和以2-6) 连接涎 酸残基 见于糖 蛋白 (包括 IV- 和 0- 连接) 和糖脂 。 a(2-8) 连接残 基见于 糖脂, Cobminic 酸 ( 来自大 肠杆菌 ) 和 一些哺 乳动物 糖蛋白 (例 如中性 细胞黏 附分子 )。 如表 11.6 所列出 ,不 是所 有 涎酸酶 对所有 连接均 有活性 ,这些 不同可 用于结 构分析 。涎酸 酶只对 a- 连接 涎酸具 有活性 ,仅有 的天然 的少连 接涎酸 存在于 CMP ( 单磷酸 胞嘧啶 )- 涎酸 。常见 的涎酸 乙酰神 经胺酸 (Neu5AC) 以 修饰形 式存在 ( 主要为 O- 乙酰化 ,但 也可为 糖基化 、硫 酸化和 甲基化 )。 涎酸酶 对这些 修饰涎 酸的活 性不同 。这些 修饰涎 酸在大 多哺乳 动物系 中的 分布尚 不完全 清楚。 2) 重 要参数 (1) 裂解 。不 同酶针 对不同 连接形 式发生 作用, a(2-3)、 〇(2-6) 和 a(2-8) 的催 化速 率在大 多数情 况影响 不大。 因为酶 常是过 量使用 ,重 要的例 外:① Newcastle dis- ease 病毒涎 酸酶优 先裂解 a(2-3) 和〇(2-8) 连接, 然而如 果酶过 量使用 或者孵 育时间 超过 30min, a(2-6) 连 接涎酸 会慢慢 水解; ② Vibri〇Ch〇lerae 酶 不能裂 解延长 的神经 节苷酯 (例如 GMJ 内部 涎酸, 但如果 除去神 经酰胺 ,它 将对寡 糖发挥 作用; ③ 《(2-8) 连接的 Colommic 酸和 b 类神经 节苷脂 相对较 难释放 ,涎 酸酶同 内涎酸 酶联合 • 808 • 应 用于含 5 个 涎酸以 上的多 涎酸; ④同 神经 节苷脂 相结合 的涎酸 需要加 用去垢 剂才能 完全 释放, 脱氧胆 酸和胆 酸盐最 有效。 (2) 取代 反应。 如同表 11.6 所总结 ,不同 的酶取 代反应 对释放 会产生 不同的 影响, 乙酰化 修饰引 起速率 下降与 所使用 的酶关 系不大 。除外 Vibrio 酶, 9- 或 7- 单 -0- 乙酰 化取代 引起速 率下降 实际也 不相关 ,特 别是 对神经 节苷脂 。另一 方面, 4- 单 -0- 乙酰化 替代将 引起对 所有的 涎酸酶 完全无 反应。 双乙酰 和三乙 酰反应 的影响 尚未深 入研究 ,单 纯从单 -0- 乙酰 化分子 的数据 进行推 测是不 可靠的 。联 合取代 (例如 N •乙 酰化和 O- 乙 酰化) 也未 进行深 入研究 ,对少 见类型 涎酸也 不了解 (例如 O- 甲 基化和 O- 硫 酸化替 代 )。 如果是 O- 乙酰化 ,用 碱预处 理糖复 合物会 引起去 O- 乙酰化 ,提 高释放 反应。 (3) 对照 。只要 有可能 的话, 设置无 酶样本 和单纯 酶作为 对照并 行研究 ,确 保被检 测涎酸 确实已 从样本 中释放 。当采 用超敏 感方法 (例如 TBA 法采用 HPLC 检测或 DMB 诱导 ), 这 一点特 别重要 。这些 方法非 常敏感 ,以 致涎 酸的环 境污染 是一大 困难。 (4) 结 果分析 。有必 要比较 涎酸酶 所释放 的涎酸 量同弱 酸水解 所释放 的量。 如果涎 酸 释放量 明显少 于弱酸 释放量 ,那么 涎酸残 基的抵 抗性可 能有以 下原因 :①涎 酸酶选 择不 正确; ②涎酸 残基的 修饰; ③立体 结构的 阻碍; ④消 化条件 不理想 。要证 实采用 涎 酸酶处 理后所 观察到 的结果 (例 如聚焦 凝胶上 等电点 改变或 功能性 反应) 确实 是由于 酶的 活性所 产生, 可采用 热处理 灭活酶 (煮沸 5min), 或加入 lmmol/L2.3- 脱氢 -2- 脱 氧 -N- 乙酰神 经胺酸 (一种 特异性 涎酸酶 抑制剂 ) 孵育 。反应 应该滴 定进行 ,以 便刚好 使用 足够的 涎酸酶 达到预 期结果 。然后 分析抑 制剂的 影响。 (5) 涎酸酶 抑制剂 。涎 酸酶抑 制剂确 实存在 。硫酸 葡聚糖 能抑制 Vibrio Cholerae 涎 酸酶。 其他多 阴离子 (例如 DNA、 RNA 和蛋 白 聚糖) 可能 也能抑 制这种 或其他 类涎酸 酶 。自由 诞酸也 能抑制 Vibrio cholerae 酶, Ki 大约 5 mmol/L。 (6) 凝 集反应 。采用 newcastle disease 病毒 处理完 整细胞 可引起 细胞凝 集反应 。这 一结果 不要同 细胞死 亡引起 的结块 现象相 混淆。 (7) 缓冲 液系统 。涎酸 酶可同 几种不 同缓冲 液系统 相配伍 。但 其理想 pH 有 差别。 \^1)1>丨〇(^11〇16泣6诞酸酶在乙酸钠和丁145/111316&16液91^5.0〜6.0能较好发挥作用,但是 在 pH〉5.0 Tris/maleate 液中具 有更强 活性。 Clostridium Perfringens 涎酸 酶在乙 酸钠中 理想。1^是4.5,但在枸橡酸盐磷酸盐中理想01^为5.5。^\11;111'〇^3(^1'1^63{3(^115诞酸 酶消化 ,在 pH5. 5 时 发挥最 大活性 ,而在 PH4. 5 或 7.0 时 ,发 挥不到 50% 活性 。对所 有的涎 酸酶, 供选择 的缓冲 系统有 乙酸钠 、乙 酸铵、 Tris、 HEPES 磷酸盐 、二 甲脾酸 盐。 乙酸盐 会干扰 AX-5 树脂的 HPLC 和 己 糖胺酶 消化。 未能完 全消化 涎糖复 合物, 可能因 为涎酸 酶加入 不充足 ,使用 的是一 种陈旧 、配方 不当和 / 或贮 存较久 的酶, 或者因 为酶加 入后即 被灭活 。如 果样本 未知, 但可能 释放的 涎 酸含量 >lnmol, 采取滴 定法更 有效。 稀释成 测定混 合液后 ,很快 (例如 Met 标记 细胞和 PNGase F 消 化样本 中沉淀 未处理 (1 泳道 ), 5min (2 泳道 ), 20min (3 泳道 ), 45min (4 泳道 ), 24h (5 泳道) 部分 消化分 子梯度 ( 以一个 N- 连接 糖链为 区别) 形成来 推算。 一维聚 丙烯酰 胺凝胶 (去糖 基化蛋 白无明 显条带 ) 单个 条带数 可估计 N- 连 接糖链 数 。产 生部分 去糖基 化蛋白 条件必 须由每 个蛋白 决定 ,因 为即使 通过变 性所有 链均完 全暴露 ,但 各 链的敏 感性各 不相同 。本 方法产 生部分 消化梯 度 ,各酶 量及孵 育时间 不相同 。如图 11.13, 常常 采集 5~6 个数据 点以充 分推算 。当然 ,要 采用足 够的酶 量获得 完全去 糖基化 ,以 确定缺 乏任何 N- 连接链 的蛋白 质位置 。最 好检测 PNGase F 对 35S~ Met 脉冲标 记新合 成蛋白 的影响 ,后 者刚 合成时 尚未 有任何 N- 连接寡 糖的加 工处理 。这一 方法也 可以 通过系 列消化 ,先用 EndoH ( 高甘露 糖型寡 糖 特异性 ), 再用 PNGase F (基本 上能除 去所有 /V- 连接链 ), 计 数高甘 露糖和 复合链 的数量 。每步 消化应 建立合 适条件 ,用 35S-Met 脉 冲标记 蛋白质 lOmin, 接着 EndoH 消化是 确保所 有链除 去的最 好方法 。同样 标记的 分子长 时间追 加可较 好地用 以系 列消化 ,以估 计不同 类型链 数量。 2. 操 作步骤 (1) 加 入适量 2-ME/SDS 溶液 于蛋白 样本。 100X: 孵育加 热变性 3~5min, 将样本 分装成 许多管 ,使 浓度 范围在 0.01~lmU/mL 或孵育 时间在 5 〜 60min。 另加一 管为不 消化对 照管。 (2) 加入 适量反 应混合 物进行 酶消化 (同前 面方法 )。 (3) 301C 孵育。 最高 酶浓度 (25mU/mL) 和 最长孵 育时间 (16h) 应在 规定的 条件内 ,确保 有一最 大去糖 基化数 据点。 (4) 100X: 加热 5min 灭 活酶。 (5) 通过 SDS-PAGE 分析每 个浓度 / 时间点 处样本 ,包 括未消 化样本 。通过 放射自 显影 或免疫 印迹法 检测。 大多数 连接链 Mr 范围在 1500~3000。 一 个 糖链的 丢失将 足以改 变一个 蛋白质 的迁移 ,这一 程序 可以计 算到一 个分子 18 个 连 接位点 ,图 11.13 描述了 一样本 结果。 (五) 释放的 N- 连接 寡糖链 的消化 和回收 1. 原理 释放的 寡糖链 可通过 凝胶过 滤层析 同蛋白 质分离 ,然 后进 行回收 和分析 。如 果糖链 披标记 ,可 通过闪 烁计数 检测; 如果未 标记, 而材料 量充足 ,可采 用其他 化学方 法检测 • 814 • 糖 的存在 。图 11. 14 描绘了 这一过 程的各 个步骤 。如 果样本 含有糖 蛋白和 低相对 分子质 量碳水 化合物 复合物 (如 可见于 细胞裂 解或膜 制备时 ), 一 定要通 过凝胶 过滤层 析除去 低 相对分 子质量 污染物 ,防止 寡糖链 释放后 被污染 。只 要样本 除去了 污染物 ,就 可以进 行消化 ,然 后通过 凝胶过 滤层析 将蛋白 质同释 放寡糖 分离。 如果样 本是一 纯化蛋 白质, 可以省 略前面 8 个步骤 。这 一方 法的成 功要求 样本中 内源性 蛋白酶 被灭活 (通 过变性 ), 且 避免接 触内切 糖苷酶 或糖酰 胺酶。 进行凝 胶过滤 T 丙 酮沉淀 丄 T SDS _ 厂 再溶解 1 用 酶处理 95%~99% 样本 1 1%~5% 样本 用 作对照 1 ▼ 进行凝 胶过滤 ▼ 进行凝 胶过滤 未释放 已释放 图 11.14 N- 连接 寡糖链 酶消化 释放及 凝胶过 滤回收 流程图 I. 凝胶过 滤将大 分子物 质同低 相对分 子质量 污染物 分离。 II. 丙酮 沉淀蛋 白质, 并且用 SDS 再溶解 , 95%~99% 样 本用于 酶消化 , 1%~5% 样 本用做 对照。 III. 2 份样本 再次用 同样的 柱进行 凝胶过 滤以定 位释放 寡糖链 。对 照组应 基本没 有释放 ,如果 有释放 , 说明可 能存在 样本蛋 白溶解 , 且释放 物质为 糖肽而 非寡糖 。如果 对照组 没有释 放物质 ,可 将样本 释放组 分合并 、浓缩 、去盐 ,以 备进 一步分 析用。 2. 附 加材料 0.1% 〜 1.0% (m/V) SDS 凝胶 过滤柱 牛血 清蛋白 (BSA) 100%丙酮(-20〇 0.1111〇1/1^2-巯基乙醇(2-]^£)/0.2%(;71/\〇305 0.1% (m/\〇 SDS/0.05mol/LTris-HCl (pH7.0) 或 HEPES 缓冲液 (pH7.0) 饱和 KC1 . 815 . Biobeads SM2 (Bio- Rad) 饱和 AgN03 ( 贮存于 暗处) 50mL 柱式 聚丙烯 离心管 15mL 厚壁柱 型玻璃 离心管 26G 针 浴式声 处理器 (Bransom 超声波 ) 或带 一小尖 头超声 处理器 (直径 3mm, Kontes 玻璃) 祸式 蒸发器 (Labconco), 冻干器 ,或 Speedvac 蒸发器 95C 水浴 3. 操 作步骤 除去 低相对 分子质 量的污 染物: (1) 加 0.1% 〜 1.0% SDS 于蛋 白样本 (保持 总体积 2h。 (5) IEC 临床用 台式离 心机以 175〇Xg (最大 速度) 离心 l〇min。 试管底 部可见 一松散 的细小 沉淀物 。上 清液中 应没有 或几乎 没有漂 浮物。 吸取少 量的上 清液于 Pasteur 滴管, 检査上 清液。 如果在 50mL 试管 底部难 以见到 沉淀物 。用 Pastear 吸 管吸去 上清液 ,保留 2~3mL, 并轻 轻地重 悬 浮柱顶 部剩余 2~3mL 内的 材料。 将这一 溶液转 移一个 15mL 厚 壁柱型 干净玻 璃管内 。用 l~2mL -20t: 9% 丙酮 ,冲洗 聚丙烯 试管顶 及侧壁 ,并加 入其内 。玻 璃管内 将见有 很细的 沉淀物 。像 上面一 样 离心沉 淀大分 子物质 ,试管 内很容 易见到 10~20fxL 沉淀物 。不 要振荡 试管, 否则会 将沉淀 物溅到 管壁, 导致明 显样本 丢失。 (6) 用 Pasteur 吸管 除去 大部分 上清液 ,戴上 手套, 用一张 Kimwipe 纸巾制 作一纱 条 。仔细 地沿管 壁放下 ,置 于沉 淀物上 方液相 交界面 ,吸干 大部分 溶剂。 不要完 全风干 沉淀物 ,否则 很难重 悬浮。 (7) 采用 浴式声 处理器 声处理 悬浮沉 淀物于 o.i — OjmL 水中 几分钟 (不 要振荡 ), 或用 3mm 直 径的小 型声处 理探针 ,处理 1 〜 2min。 (8) 加 0.1 mol/L 2-ME/0.2% SDS 溶解 沉淀物 ,保持 总体积 <0.3mL。 37X: 孵育 10min, 95X3 畔育 5min〇 孵育 将能蒸 发丙酮 ,并渐 渐溶解 沉淀物 , 大量的 材料将 需要更 多水和 / 或 SDS 才 能完全 溶解。 • 816 • 进行酶 消化: (9) 将 95% ~99% 的 样本置 于超速 离心管 ,用 Endo H、 Endo F2 或 PNGase F 进行 消化 (按前 面方法 )。 将剩余 的样本 (对 照组) 放于 另一试 管内, 同样方 法孵育 ,但不 加酶。 (10) 消化 完全后 ,用 0.1% SDS/0.05mol/LTris-HCl (PH7.0) 或 HEPES 缓冲液 (pH7.0) 将样本 稀释到 0.3mL。 分离释 放寡糖 : (11) 将 样本加 入到第 2 步 带刻度 的凝胶 过滤层 析柱中 ,再用 0.1% SDS/0. 05 m〇l/LTris-HClpH7.0 洗脱柱 。以 柱最大 可能流 速洗脱 ,每 0.5mL 分装 收集各 部分。 (12) 计 算每部 分份数 ,检测 柱各部 分释放 寡糖链 。将 消化和 对照样 本的洗 脱情况 进行 比较, 确定哪 些部分 消化组 所含释 放寡糖 量至少 是对照 组同一 部分的 10 倍 。将这 些部分 合并, 并加入 一厚壁 12mL 玻璃柱 型管。 如果 是未标 记样本 ,只要 样本量 充足, 可以进 行适当 的比色 分析。 在 SephadexG>50 中 ,大 多数释 放寡糖 链将在 % 后洗脱 ,只 有很 大或带 高负电 荷的糖 链将在 VQ 及其附 近洗脱 。如 果没 有检测 到明显 的释放 可能释 放链在 VQ 处 已洗脱 。要 检验这 种可能 ,可 将对照 组 和消化 组样本 置于有 刻度的 SephacrylS~200 柱中 ,用同 样缓冲 液过柱 。在 SephadexG-50 中于 VQ 处 洗 脱的释 放寡糖 链将在 Sephaeryl S200 柱 中保留 于相同 的位置 。对 照组于 VQ 外应 该很少 有释放 物质。 如 果整个 柱看到 了宽峰 、尾峰 或模糊 ,可 能样 本被酶 (蛋 白酶) 分解 。然而 在这些 消化条 件下很 少见。 (13) 加入 0.01 体 积饱和 KC1, 从 汇并的 各部分 中除去 SDS, 于冰 面孵育 2h, 让 SDS 最 大限度 地沉淀 ( 寡糖将 保持溶 解状态 )。 (14) 用 IEC 临床用 离心机 175〇Xg (最高 速度) 离心 5min, 除去 沉淀的 SDS 钾 盐 ,汇并 寡糖。 柱式 玻璃管 应是厚 壁的, 能耐受 离心。 (15) 将汇 并的寡 糖慢慢 地加入 连接有 26G 针 限速的 lmL Biobead SM2 柱中 ,使不 需 要的残 余的非 离子去 垢剂从 Endo F2 或 PNGase F 消化液 中除去 。用 5 倍柱体 积水冲 洗 ,将 含寡糖 的各冲 洗部分 汇总。 (16) 用涡式 蒸发器 或冻干 器干燥 汇并的 冲洗液 ,取 小部 分汇并 液检测 回收率 ,应 该基 本完全 回收。 样本 去盐: (17) 将 冻干寡 糖样本 于超速 离心管 中溶于 0.3~0.5mL 冰冷 水中, 最大速 度超速 离心 2min, 去 除残存 SDS 钾盐。 (18) 于 0.5cmX4.0cmSephadexG25 柱中 ,给样 本水洗 脱去盐 ,每 lmL 分 装收集 各 部分。 (19) 检测 或分析 各部分 ,确 定寡糖 的位置 。取 10ML 同 10pL 饱和 AgN03 于玻璃 载玻 片上混 合分析 (SDS 沉淀 残余的 KC1)。 注 意沉淀 的形成 (AgCl), 这表 明盐的 存在。 (20) 将无 盐的含 寡糖的 各部分 合并。 寡 糖无盐 很重要 ,因为 随后的 处理, 如糖苷 酶消化 ,常 在小量 (<50PL) 进行 ,此 时来自 各部分 的少量 残余盐 浓缩了 很多倍 ,大部 分寡糖 同盐洗 脱分离 。然 而很少 一部分 寡糖会 同盐一 起洗脱 。根据 这一点 ,任 何残余 SDS 浓度应 低于临 界微团 浓度, 且不会 同寡糖 一起于 V〇 处 洗脱。 • 817 . (21) 冻 干合并 的寡糖 ,用 涡式蒸 发器或 Speedvac 蒸发 器干燥 ,溶解 游离寡 糖于水 中 ,并于 -201C 冰冻 (如果 没有盐 和其他 污染物 ,将长 期稳定 )。 最后干 燥或冻 干的材 料应完 全干燥 。如果 呈黏性 或油性 ,可 能含 有残余 去垢剂 ,应 将材料 物质按 第 15 步于 lmL Biobeads 51^2柱 中过柱 ,除去 这些去 垢剂。 进行少 量寡糖 纯化时 (例 如放射 标记) ,从 Sephadex G*50 或 Sephacyl S200 柱 中过柱 所得大 容量合 并液可 能含有 非离子 去垢剂 ,后 者会干 扰随后 的寡 糖处理 ,例 如干扰 HPLC 分析 或外切 糖苷酶 消化。 这 一过程 可以得 到改进 ,利用 各个酶 进行各 糖链序 列分离 。首 先用 EndoH 切割敏 感的链 ,可通 过 凝胶过 滤层析 收集到 释放的 高甘露 型和杂 交型链 。蛋 白结合 物质可 通过丙 酮沉淀 ,然 后再从 真空容 积 部分分 离出来 ,除去 丙酮, 蛋白再 溶解于 SDS。 EndoF2 重复消 化可 释放双 触角链 ,接 着分离 、沉 淀 、回收 、再 溶解 。最后 样本用 PNGase 消化 、释放 3 和 4 触角链 , 再通过 凝胶过 滤层析 分离。 (六) 方 法评注 1) 背 景资料 (1) 内切 糖苷酶 H: EndoH 能切割 N- 连接 寡糖核 心两个 GlcNAc 残 基之间 的连接 键 ,一个 GlcNAc 残 基附着 于蛋白 或肽上 ,剩余 链部分 将完整 释放。 EndoH 的 底物包 括所 有高苷 露糖型 和某些 杂交型 寡糖, 不包括 2、 3、 4 或 5 触 角糖链 ( 复合型 )。 Endo H 还 能切割 具有同 还原性 (蛋白 同碳水 化合物 连接) GlcNAc 残基相 连接的 al, 6 岩藻 糖残基 的寡糖 。酶 通过 除去一 具有完 整二壳 糖核心 的还原 性糖链 的末端 GlcNAc (itol) 而 作用于 还原性 和非还 原性自 由寡糖 (例如 PNGaseF 切 割释放 的寡糖 ), 或从 完整的 糖蛋白 、糖肽 或只带 有天冬 酰胺的 肽上切 割下来 糖链。 通过 跟踪新 合成糖 蛋白通 过内质 网和高 尔基器 的运动 ,已 广泛地 研究了 Endo H 的 特异性 。蛋白 质于内 质网和 早期高 尔基体 的顺式 部分对 EndoH 敏感 ,被 中期高 尔基体 内酶 加工之 后将对 Endo H 产生 耐受性 。只要 连接寡 糖未被 高尔基 体甘露 糖苷酶 II 作 用丢失 一个甘 露糖, EndoH 就 能将其 从蛋白 质上切 割下来 。只要 切割了 一个甘 露糖, 寡糖将 会抵抗 EndoH 的切割 。进入 中期高 尔基体 (只于 一个分 隔间) 后 很快加 入第一 个 GlcNAc 残基 。除去 另两个 甘露糖 残基, 再加入 第二个 GlcNAc 残基 (然而 ,关 于高 尔基 体结构 与糖蛋 白加工 有另一 种看法 ,认 为这些 分隔间 不清晰 )。 尽管 高尔基 体结构 是 细胞内 运输的 一个关 键点, Endo H 的敏感 性和耐 受性并 不依赖 于对其 深入的 了解。 实际 上通过 35S4 示记氨 基酸进 行新合 成蛋白 质的脉 冲标记 ,接 着进 行一维 或二维 凝胶电 泳和 放射自 显影检 测迁移 率变化 ,便可 以得到 了解。 (2) 内切 糖苷酶 F 和肽 /N- 糖苷酶 F ( 产黄菌 属脑膜 败血病 ): Eldei •和 Alexandex 于 产黄菌 属脑膜 败血病 细菌培 养滤液 中发现 一种酶 ,能 从糖蛋 白中切 割下来 N- 连接寡 糖 ,具 有广泛 的底物 特异性 。并发 现这一 制备中 ,内 糖苷 酶活性 (Endo F) 实际 上是由 —系 列底物 范围更 有限的 酶的共 同作用 。如同 EndoH, 这 些酶能 切割两 个核心 GlcNAc 残 基之间 的糖链 。直到 最近, Endo F 才认为 是单一 类酶, 并且较 清楚至 少包含 3 种不 同酶 ,每种 具有不 同的特 异性。 Endo Ft 很 类似于 EndoH 特异性 ,而 Endo F2 主 要作用 于 2 触 角链, Endo F3 切割 2、 3 触角 ,但 不切割 4 触角链 。这 些酶在 鉴别不 同类型 连接链 方面很 有用。 然后, 〖― j 則只有 EndoFp 市 场有售 (Genzyme)。 随后, Plummer 等深入 研究这 一细菌 培养液 ,发 现至少 2 种不 同活性 。再就 是糖酰 . 818 • 胺酶 ,具有 广泛底 物范围 ,通过 切割天 冬酰胺 -GlcNAc 键而 从蛋白 质上释 放完整 碳水化 合物 。这一 酶有多 种名称 , 包括肽 /N- 糖苷酶 F (PNGaseF), 糖肽酶 F 和 聚糖酶 (Genzyme), 较合 适的名 称为肽 -AM (iV- 乙酰基 | 葡萄糖 氨基) 天 冬酰胺 酰胺酶 。因 为 天冬酰 胺残基 羟基和 氨基一 定要存 在于肽 链内, PNGase F 消化 能从蛋 白质和 胰或糜 蛋白 多肽上 释放敏 感的寡 糖链, 而不能 作用于 蛋白酶 ,如 pronase 或 蛋白酶 K 消化 的蛋 白 。此 酶对以 al,3 连接于 天冬酰 胺肽链 上的岩 藻糖的 寡糖不 能切割 。这 一结构 在植物 糖蛋 白上非 常普遍 ,也发 现于一 种昆虫 ,但 于高 等动物 中未见 。如果 PNGaseF 消化未 引起 蛋白质 相对分 子质量 的改变 ,未引 起放射 标记糖 链释放 ,这可 能表明 蛋白质 含有这 种岩 藻糖残 基或者 其他阻 止切割 的尚不 清楚的 成分。 (3) 其他酶 :内切 糖苷酶 D (EndoD) 和 糖肽酶 A 也有 市售 (ICN Biomedicals)。 EndoD 特异性 很有限 ,并不 常用。 糖肽酶 A 对大的 完整糖 蛋白作 用较差 ,但能 切割很 多胰蛋 白糖肽 上的寡 糖链, 包括植 物糖肽 ,含有 岩藻糖 ,以 al, 3 连接 于内核 GlcNAc 上 。它还 能释放 EndoH 或 匕切 割后保 留于肽 表面的 GlcNAc。 由于 底物范 围有限 、价 值高昂 ,此 酶不 如其他 酶受到 青睐。 2) 重 要参数 商品 “EndoF” 酶是 EndoFb EndoF2 和 EndoF3 的 混合物 。除非 已明确 其特异 性, EndoF 不能用 于常规 去糖基 化作用 , 也不能 用以推 知释放 寡糖的 结构。 EndoH 释 放 高甘露 糖型和 杂交型 糖链; End0F2优 先释放 2 触角 糖链; PNGaseF 能 释放所 有这些 外 ,还 能释放 3、 4 和 5 触角 糖链。 可以依 次使用 EndoH、 EndoF2 和 PNGaseF 而释放 不同寡 糖链。 PNGase 是从变 性蛋白 完全释 放完整 JV- 连 接寡糖 的最佳 选择。 对 所有的 酶消化 ,样本 变性是 最关键 的一步 。原始 样本中 存在有 降解酶 ,如 糖苷酶 和 蛋白酶 ,可 能会引 起蛋白 或碳水 化合物 的不同 程度不 必要的 降解。 SDS 变性灭 活这些 酶 ,可 以阻止 它们对 样本的 裂解, 以免发 生混淆 。采 用任何 一种酶 对糖蛋 白进行 最大限 度地 去糖基 化作用 ,必 须彻底 变性糖 蛋白。 SDS 是最佳 变性剂 ,但 是必 须加入 5 〜 10 倍 重量的 非离子 去垢剂 以阻止 SDS 对 Endo F2 和 PNGase F 的灭活 。非 离子 去垢剂 的选择 依赖于 消化样 本的分 析方法 。心 辛基 -,D- 葡萄 糖苷和 CHAPS 可 以透析 ,然而 NP-40 和 Triton X-100 则不 能透析 。每 种去垢 剂均能 于大约 lmL Biobeads SM2 柱中缓 慢通过 消化 液除去 。另外 ,可 采用 2.5 mol/L 尿素 371: 变性 糖蛋白 ,这一 酶可于 尿素中 24h 保 持部 分活性 。丙酮 沉淀样 本应长 时间加 热挥发 丙酮, 以便用 SDS 溶解。 推荐的 酶量应 是大大 过量, 应足以 裂解大 部分敏 感的寡 糖链。 (1) Endo H。 Endo H 具 有广泛 的理想 pH 范围 (5. 5~6. 5), 可以用 磷酸盐 或枸橼 酸盐 / 磷 酸盐缓 冲液代 替枸橼 酸盐。 Endo H 对蛋白 酶冷冻 、融化 和长时 间孵育 均很稳 定, 长期保 存不需 添加剂 。于 5~10fig/mL (200 〜 400mU/mL) 浓度 范围, EndoH 会 结合到 玻璃上 ,因此 应贮存 在塑料 小瓶内 ( 例如带 螺旋帽 的超速 离心管 )。 孵育 混合物 中应 避免使 用甘油 。因为 Endo H 会将 甘油转 移到刚 释放糖 链的游 离的还 原末端 。如果 裂解的 寡糖将 于还原 末端用 硼氚化 钠标记 ,这 一点很 重要。 PMSF 于反应 混合物 中将能 灭活 微量的 丝氨酸 蛋白酶 ,后者 于天然 Endo H 制 备中伴 随存在 ,可能 会引起 错误的 结果。 (2) Endo F2。 Endo F2 也具有 广泛的 pH 范围 (4.0 〜 6.0), pH7.0 时, 保持有 . 819 • 60% 的活性 。像 PNGaseF —样 ,该 酶只对 SDS 敏感 。但 是加入 非离子 去垢剂 会阻止 SDS 对酶 的变性 作用。 Genzyme 提供 Endo F2 是置于 10 mmol/L 乙酸钠 缓冲液 (PH4. 5), 于干 冰表面 。此酶 4X: 可稳 定数月 。也 可整份 _7〇t: 冰 冻于螺 旋帽超 速离心 管中 ,但要 避免反 复冰冻 / 融化 交替。 i,10- 邻 二氮杂 菲可用 以抑制 一种锌 金属蛋 白酶, 后者 可能是 酶制备 过程中 一种微 量的污 染物。 EndoF2 只是 近来可 市售, 其活性 尚未能 完 全肯定 。因 此实验 结果一 定要仔 细分析 ,这一 酶可用 以证实 双触角 寡糖链 的存在 。同 其他酶 比较相 当昂贵 ,但同 2 触 角链的 亲和性 大约是 高甘露 糖链的 20 倍 。因此 , Endo H 和 PNGase F 是广泛 区别高 甘露糖 同复合 型链的 更好的 选择。 (3) PNGaseF。 PNGaseF 具 有广泛 的理想 pH 范围 (6. 5~9.0), 但 最好于 7.0 左 右 ,以避 免涎酸 表面不 稳定糖 取代基 的丢失 ,如 〇- 乙酰酯 。商 品化 PNGaseF 不含 EndoF,4t: 可保存 6 个月 ,或 -70t: 长期 保存 ,然而 应小量 分装, 避免反 复冷冻 / 融 化。 PNGaseF 会结合 到玻璃 和塑料 表面, 不应于 <0.1mU/mL 的 稀释液 保存。 SDS 可 灭活 PNGase F, 但 是加入 5~10 倍重 量的非 离子去 垢剂可 以保护 PNGase F。 (4) 凝胶过 滤基质 。用 凝胶 过滤从 母体蛋 白上分 离释放 的寡糖 链依赖 于蛋白 质大小 和释 放寡糖 链的拟 似大小 。关键 一点是 ,寡 糖一 旦释放 就必须 同去糖 基化蛋 白分离 ,寡 糖应于 相应的 容积部 分洗脱 , 而蛋白 原则于 VQ 处洗脱 。很 大或高 阴离子 寡糖链 可能仍 于 SephadexG50 柱真空 容积部 分洗脱 ,不包 括大于 50kDa 的 蛋白质 。这 些释放 糖链似 乎 仍同蛋 白结合 ,然而 这些不 常见的 糖链于 SePhaCryS~200 仍 可与蛋 白分离 ,不 包括大 于 200kDa 蛋白质 。另 一方面 ,小糖 蛋白分 子可于 SephodexG50 柱的真 空容积 部分洗 脱 ,但 不能于 SePhacrylS*200 的真空 容积部 分洗脱 。一 旦寡 糖释放 ,可 能不能 完全同 蛋 白分离 。通常 ,任 何一种 基质足 以使大 部分释 放寡糖 同大多 数糖蛋 白分离 。因 为很多 蛋白 质分子 质量在 50〜200kDa 之间, 因此, SephaerylS-200 是 较好的 选择。 (5) 凝胶 过滤柱 。根据 供应商 的说明 (SephacrylS-200 已水合 ) 水合 SephadexG25 和 SephadexG50 (Pharmacia Biotech), 于柱 底釉料 上方加 入一小 玻璃棉 塞防止 阻塞。 用 Sephadex G25 灌大约 0.5cm X 40cm 柱, Sephadex G-50 或 Sephacryl S~200 灌大约 0.5cmx 50cm 柱 。标定 过滤柱 ,用葡 聚糖蓝 标志真 空容积 部分, 葡萄糖 标识柱 的所有 空间 和使用 范围。 采用酚 硫酸试 验检测 葡萄糖 。另外 ,任 何氚化 单糖可 用以代 替葡萄 糖 ,并通 过液相 闪烁计 数检测 ,过 滤柱 可反复 使用很 多次。 3) 预期结 果和时 间估计 大多 数已知 iV- 连接 寡糖至 少可被 一种酶 切割, 但是一 种酶不 能去糖 基化作 用并不 能肯 定蛋白 质没有 N- 连 接寡糖 。像 上面讨 论那样 ,以 al,3 连接 到寡糖 第一个 GlcNAc 残基 上的岩 藻糖可 使寡糖 完全对 PNGase F 无反应 。尽 管这 一结构 目前只 发现存 在于植 物 和一种 昆虫中 ,在高 等动物 中尚未 有发现 ,但 可能也 有存在 。核 心区域 硫酸酯 的存在 也可 引起部 分酶的 抵抗。 消化反 应可于 Id 内完成 ,顺利 的话一 夜时间 即足够 。释 放的放 射标记 寡糖链 的分离 和 样本去 盐需要 Id 时间 ,释 放寡糖 的回收 中的限 速步骤 是来自 Sephadex G-50 或 SephaCrylS>200 柱样 本材料 的冻干 ,满式 蒸发器 (Labconco) 可 最为节 省时间 ,但不 常用。 • 820 • 吴金明 孙 明 林菊生 主要参 考文献 Alexander, S. and Elder, J.H. 1989. 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Biochem. , 163:123 〜 135. • 822 • 免疫 学技术 引 免疫 学理论 和技术 的发展 极大地 促进了 生命科 学技术 的发展 。免疫 学技术 亦已应 用 于纯化 蛋白质 和证实 特异性 cDNA 克隆 。抗体 (antibody Ab) 是 免疫学 实验中 常用的 试剂, 对于抗 原的分 析鉴定 和定量 检测非 常重要 ,因此 ,抗 体分子 成为医 学及生 物学领 域中 用途最 为广泛 的蛋白 质分子 。特 异性抗 体亦可 用于筛 选所需 cDNA 克隆 的互补 DNA 文库 和所需 蛋白质 翻译的 mRNA, 以及 免疫亲 和层析 ,从复 合物中 提取纯 化特定 的蛋白 质等。 免 疫学技 术已广 泛应用 于基因 工程产 物的检 测及临 床疾病 的诊断 。本 章着重 介绍常 用 免疫学 技术的 基本原 理和主 要方法 ,内 容包括 酶免疫 (EIA) 测定 、荧 光免疫 (FIA) 测定和 发光免 疫分析 (LIA) 等免 疫标记 和检测 技术, 生物素 -亲合 素系统 (BAS) 在免 疫学 试验中 的应用 ,以及 抗体的 制备和 纯化。 第一节 荧光免 疫技术 荧光免 疫技术 是最早 建立的 一种免 疫标记 技术。 此项技 术的基 本原理 是将抗 原抗体 反 应的高 度特异 性与荧 光的敏 感可测 性有机 地结合 ,以荧 光物质 作为示 踪剂标 记抗体 (或 抗原) 制成 特异性 试剂, 用于检 测或鉴 定相应 的抗原 ( 或抗体 )。 当抗 原抗体 结合物 中的荧 光物质 受到紫 外光或 蓝紫光 照射时 ,能够 吸收光 能进入 激发态 。当 其从激 发态回 复到基 态时, 能够以 电磁辐 射形式 放射出 所吸收 的光能 ,并产 生荧光 。这 种特异 性荧光 可通 过荧光 显微镜 直接加 以观察 ,或者 用荧光 分光光 度计和 流式细 胞分析 仪进行 定量检 测 ,能 够准确 、特异 、灵敏 、快 速地检 出和定 位某些 未知的 微量和 超微量 物质, 广泛应 用 于分子 生物学 、医学 和药学 等多个 领域。 本节重 点介绍 荧光免 疫测定 (fluorescence immunoassay, FIA) 的试 验原理 和主要 方法。 一、 荧光标 记技术 将 荧光物 质与抗 体或抗 原结合 ,制 备高质 量的特 异性荧 光试剂 ,是荧 光免疫 技术的 一 项基本 和重要 的工作 。荧 光素是 一种能 吸收激 发光的 光能产 生荧光 ,并 且可作 为染料 使用的 有机化 合物, 亦称荧 光色素 。适用 于抗体 (或 抗原) 标记的 荧光素 应符合 以下要 求: ①应具 有能与 蛋白质 分子形 成稳定 共价键 的化学 基团, 或易于 转变成 这类反 应形式 而 不破坏 其荧光 结构; ②标 记后, 荧光素 与抗体 (或 抗原) 各自的 化学结 构和性 质均不 发生 改变; ③荧光 效率高 ,与 蛋白质 结合的 需要量 很少; ④荧 光素 与蛋白 质结合 的过程 • 823 • 简单, 快速; 游离 的荧光 素及其 降解产 物容易 去除; ⑤结合 物在一 般贮存 条件下 性能稳 定, 可保存 使用较 长时间 。此外 ,用于 免疫组 化染色 的荧光 抗体要 求其荧 光颜色 与背景 组织 的自发 荧光对 比鲜明 ,便 于清晰 地判断 结果。 (一) 常 用的荧 光色素 1. 异 硫氰酸 荧光黄 异 硫氣酸 焚光黄 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 纯品 为黄色 、澄 黄色或 褐黄色 结 晶粉末 。相 对分子 质量为 389.6。 性质 稳定, 低温干 燥环境 中可保 存多年 。易 溶于水 和酒精 等溶剂 。本品 有两种 异构体 ,都能 与蛋白 质良好 地结合 ,但 异构体 I 的荧 光效率 较高 ,与蛋 白质的 结合更 稳定。 FITC 的最 大吸收 光谱为 490 〜 495mn, 最大发 射光谱 为 520~530mn, 呈现 明亮的 黄绿色 荧光。 在碱性 条件下 ( 溶液的 pH>8.5), FITC 分 子 中的异 硫氰基 (N = C=S) 容易 与蛋白 质分子 ( 如抗体 IgG) 上的自 由氨基 ( 主要是 赖氨酸 的^ 氨基) 经碳酰 胺化形 成硫碳 氨基键 而牢固 结合。 FITC 是标记 抗体最 常用的 荧 光素。 2. 四乙基 罗丹明 四乙基 罗丹明 (rh〇damineB200, RB200) 纯品 为褐红 色粉末 。相 对分子 质量为 580。 性 质稳定 ,可长 期保存 。不 溶于水 ,易溶 于酒精 和丙酮 。最 大吸收 光谱为 570 〜 575nm, 最 大发射 光谱为 595 〜 600nm, 呈现 橙红色 荧光。 RB200 为磺酸 钠盐, 其磺酸 基团不 能直接 与蛋白 质结合 ,需先 经过五 氯化磷 (PC15) 作用, 转变为 磺酰氯 (-SO2C0。 后者在 碱性条 件下, 易与蛋 白质的 e- 氨 基形成 硫氨键 而结合 。由于 RB200 的 荧光效 率较低 ,一般 不单独 使用, 多用于 FITC 的衬比 染色或 双标记 示踪。 3. 四 甲基异 硫氰酸 罗丹明 四 甲基异 硫氰酸 罗丹明 (tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC) 亦 为罗丹 明的 衍生物 ,纯品 为紫红 色粉末 。相 对分子 质量为 443。 性 质稳定 ,可长 期保存 。微溶 于水 ,易溶 于丙酮 和二甲 基甲酰 胺等有 机溶剂 。最 大吸收 光谱为 550nm, 最大发 射光谱 为 600~620mn, 呈 现橙红 色荧光 。由于 其激发 峰与荧 光峰距 离较大 ,有 利于选 择滤光 系统 。如同 FITC —样, 在碱性 条件下 ,通过 TRITC 自 身分子 中的异 硫氰基 (一 NCS) 容易与 蛋白质 结合, 因此较 RB200 使 用方便 ,较 多地用 于双标 记示踪 技术。 近年 来在焚 光免疫 技术中 使用的 其他新 型荧光 素有藻 红蛋白 (phycoerythrin, PE), 它是 从红藻 (redalgate) 中提 取的藻 胆蛋白 (phycobiliprotein), 系 一种天 然荧光 色素。 最 大吸收 光谱为 490 〜 560nm, 荧光 波长为 595nm, 呈红色 荧光。 PE 可和 FITC 同时用 于对各 种抗体 或配体 进行双 标记, 在流式 细胞术 (FCM) 中 较常用 。此外 , 7- 氨基- 4- 甲基 香豆素 (7-amino-4—methyl coumarin, AMC) 是一种 蓝色荧 光素。 最大吸 收光谱 为 354mn, 荧光 波长为 43〇nm, 可用于 双标记 或多标 记示踪 技术。 某些三 价稀土 镧系元 素如铕 (Eu3+)、 钐 (Sm3+)、 铽 (Tb3+) 等 通过具 有双功 能基团 的螯合 剂一端 与镧系 元 素螯合 ,另一 端同抗 体或抗 原分子 中的酪 氨酸或 组氨酸 的氨基 连接。 . 824 • 1. 抗体 (二) 荧 光素标 记的基 本原则 用于 标记荧 光物质 的抗体 ,要 求其特 异性强 、效 价高, 而且亲 和力强 。抗血 清和单 克隆抗 体一般 需先经 过纯化 ,提取 IgG 再用于 标记。 标记时 ,可 以直接 将特异 性抗体 与 荧光物 质结合 ,用 于直接 荧光免 疫法; 或者是 用抗人 ( 或抗其 他动物 ) IgG 的抗体 (第二 抗体) 标记荧 光物质 ,用 于间接 荧光免 疫法。 虽然单 克隆抗 体的特 异性强 、效价 高 ,但与 荧光素 结合后 ,理 论活性 仅为标 记前的 50% 左右 。因此 常采用 标记羊 (或兔 ) 抗小鼠 Ig 的方法 ,以弥 补单抗 标记的 缺点。 2. 抗原 用于标 记的抗 原要求 纯度高 、抗原 性完整 。蛋白 质抗原 的标记 方法基 本上与 抗体相 同 。小分 子半抗 原物质 需先与 载体蛋 白连接 ,然 后再进 行标记 。由 于抗原 的种类 繁多, 理化特 性差别 甚大, 不易高 效标记 ,因 此在实 际应用 中远较 标记抗 体少。 3. 荧光 免疫试 剂的制 备过程 包 括抗原 的制备 与纯化 、抗体 (多 克隆或 单克隆 抗体) 的制备 、抗体 的提纯 、荧光 物质 标记、 标记物 (结 合物) 的 提纯及 其性能 (质量 ) 鉴定 等步骤 。操 作方法 较为复 杂 ,技术 要求高 ,一般 实验室 难以独 自完成 。目 前国 内外的 一些专 业生物 试剂公 司和生 物制品 研究单 位已可 提供各 种荧光 免疫试 剂和供 专项荧 光免疫 检测的 试剂盒 ,各 实验室 可根 据工作 需要选 购使用 。如因 开展特 殊检测 项目, 需自行 制备相 应的荧 光免疫 试剂。 镧 系元素 的标记 方法分 为两种 ,一为 螯合剂 先螯合 Eu3+, 再连接 蛋白质 (一步 法 ); 二为先 连接蛋 白质, 再螯合 Eu3+ ( 二步法 )。 当 标记抗 体与抗 原结合 ,镧 系元素 螯 合物在 紫外光 (340nm) 激发下 ,不仅 发射出 高强度 的荧光 (613nm), 而且 衰变时 间 也较长 (10 〜 1000#)。 利用 时间分 辨荧光 分析仪 延缓测 量时间 ,待样 品池和 检品中 蛋白 质等自 发产生 的非特 异荧光 全部衰 变后, 再测量 免疫复 合物中 镧系元 素螯合 物的特 异荧光 ,可 以完全 排除非 特异本 底荧光 的干扰 ,显 著地提 高检测 方法的 特异性 和灵敏 度 。据此 建立一 种新型 的时间 分辨荧 光免疫 分析法 (TR-FIA)。 多 荧光标 记法是 Diamandis 等于 1989 年 对镧系 元素的 标记技 术做了 进一步 改进, 采用 多焚光 标记法 (multiple fluorescence labelling) 制备 一 ■种 新型 的标记 结合物 。先将 BCPDA ( 螯合剂 ) -Eu3+ 标记在 甲状腺 球蛋白 (Tg) 上 ,再将 Tg 与链霉 亲和素 (SA) 共价 偶联。 每一个 Tg 分 子上可 以标记 160 个 BCPDA-Eu3+, 既 不影响 SA 与生 物素化 抗体 结合, 又无荧 光猝灭 现象。 Diamandis 用这种 多荧光 标记物 建立了 TSH 与 AFP 等 的 TR-FIA 检测 方法, 并与直 接标记 抗体或 SA 方法进 行比较 ,发 现用于 AFP 的 检测, 多荧光 标记物 较直接 标记抗 体法可 使灵敏 度提高 25 倍。 二、 荧光免 疫测定 20 世纪 70 年代 以来, 在传统 的荧光 免疫显 微术的 基础上 ,发 展建立 了各种 荧光免 . 825 . 疫测 定方法 (fluorescence inmnmoassay, FIA), 用于 检测血 •清和 其他 体液 标本中 的各种 微量和 超微量 的物质 ,如某 些特殊 的血清 (浆) 蛋白、 激素和 药物等 。此 类方法 具有特 异性强 、灵 敏度高 、适用 于自动 化测定 ,以及 无放射 性污染 等优点 ,因 此受到 普遍重 视。 FIA 如同 酶免疫 测定技 术一样 ,可分 为非均 相法和 均相法 两类。 (一) 非均相 荧光免 疫测定 非均相 焚光免 疫测定 (heterogeneous fluorescence immunoassay) 是在 抗原抗 体反应 后 ,需 将结合 的和游 离的标 记物加 以分离 ,然 后进行 测定。 较常用 的方法 有以下 几种。 1. 竞争 性可磁 性固相 荧光免 疫测定 此法 的试验 原理与 放射免 疫分析 (RIA) 相似, 在反应 体系中 同时加 入荧光 素标记 的 抗原和 非标记 的样品 ( 或抗原 标准品 ), 使 二者与 限量的 特异性 固相抗 体竞争 结合。 反应完 成后经 过分离 ,测 定结合 物的荧 光强度 ,计算 样品中 待测抗 原含量 。基本 操作如 下 所述。 (1) 将特 异性抗 体偶联 在经过 溴化氰 (CNBr) 活化的 可磁性 纤维素 (含氧 化铁) 固相载 体上。 (2) 用 FITC 标 记已知 抗原。 (3) 将待 测样品 (或 抗原标 准品) 与一定 量的标 记抗原 加入反 应管内 混合, 同时加 入适量 的可磁 性固相 抗体, 混匀后 37X: 温育 30min。 (4) 将反 应管置 于多极 磁场中 ,使抗 原抗体 结合物 随可磁 性固相 载体迅 速沉淀 ,与 液相 分离。 (5) 弃去 含游离 成分的 上清。 用磷酸 盐缓冲 液洗涤 沉淀物 ,再 用甲醇 使抗原 抗体结 合物 从固相 载体上 解离。 (6) 吸出 上清, 放入比 色杯内 ,用荧 光分光 光度计 测量荧 光强度 。荧 光强度 与非标 记 的抗原 浓度呈 负相关 。根 据检品 的荧光 强度, 从标准 曲线上 即可求 得待测 抗原的 含量。 2. 非 竞争法 荧光免 疫测定 此法是 先将待 测样品 (或 抗原标 准品) 与 固相抗 体混合 ,反应 一定时 间后, 再加入 荧光素 标记的 抗原; 再次 温育后 ,分离 结合物 与游离 成分, 然后进 行测定 。基本 操作如 下 所述。 (1) 同 上法制 备可磁 性固相 抗体和 FITC 标记的 抗原。 (2) 先 将检品 (或 抗原标 准品) 与过量 的可磁 性固相 抗体在 反应管 内混合 , 37X: 温 育 30min。 (3) 将反应 管置于 多极磁 场中, 快速沉 淀固相 抗体与 待测抗 原的结 合物。 (4) 弃上清 ,在沉 淀物内 加入一 定量的 FITC 标记 抗原, 混匀。 (5) 再次 温育后 ,置 多极磁 场中分 离固相 结合物 和游离 成分。 (6) 取上 清液, 测址荧 光强度 。所测 荧光强 度与待 测抗原 (非标 记抗原 ) 的浓 度呈 正 相关。 • 826 • 3. 粒 子浓缩 荧光免 疫测定 粒 子浓缩 突光免 疫测定 (particle concentration fluorescence immunoassay, PCFI A ) 是在免 疫微球 荧光测 定法的 基础上 ,配 合膜过 滤技术 建立的 用于检 测抗体 的方法 。将特 异性抗 原吸附 于聚苯 乙烯胶 乳微球 (直径 〇.%m), 制 备固相 化抗原 。同 时特制 一种有 漏 斗状孔 (底部 直径为 2.0mm) 的 反应板 。使用 时先在 反应板 下贴以 规格为 〇.2fim 的 醋酸纤 维滤膜 ,再于 孔内加 入含待 测抗体 的样品 液及荧 光素标 记的第 二抗体 (抗 抗体) 和固 相抗原 。经 过结合 反应后 ,抽滤 除去未 结合的 反应液 ,使 免疫 微球平 铺在孔 底的滤 膜上 ,相 当于将 反应物 浓缩了 100 倍 ,并且 减少了 非特异 性干扰 ,提 高检 测的灵 敏度。 整 个反应 操作相 当迅速 ,可在 lOmin 内 完成全 部实验 ,适用 于高度 自动化 检测。 (二) 均相 荧光免 疫测定 均相 荧光免 疫测定 ( homogeneous fluorescence immunoassay ) 在抗原 抗体反 应完成 后 ,无需 将已结 合和游 离的标 记物加 以分离 ,可以 直接进 行测定 。均 相法 常利用 荧光的 某些 特性, 如荧光 的激发 、吸收 、猝灭 等来设 计试验 。其中 抗原抗 体双标 记法, 亦称荧 光 激发传 递免疫 测定法 (fluorescence excitation transfer immunoassay) 是较 常用的 方法。 此法 已用于 吗啡和 IgG 等的定 量测定 。检测 试剂为 FITC 标记的 抗原和 罗丹明 (TRITC 或 RB200) 标 记的相 应抗体 。当二 者特异 结合后 ,使 两种 荧光物 质靠近 (距离 缩短至 5~10nm 以内 )。 经过 激发光 照射后 ,由 FITC 发射 的光谱 (520 〜 530nm) 能被 罗丹明 有效 地吸收 ( 正好在 罗丹明 吸收光 谱附近 ), 因而 FITC 的 特异荧 光明显 减弱。 测 定时将 样品与 一定量 的两种 标记试 剂一起 加入反 应管内 ,使 样品中 的待测 抗原和 FITC 标记抗 原竞争 与罗丹 明标记 的抗体 结合, 反应后 游离的 FITC 标记 抗原量 与样品 中待测 抗原量 成正比 ,进行 FITC 荧光强 度测量 ,根 据标准 曲线即 可推算 出样品 待测抗 原 含量。 其他 如荧光 粹灭免 疫测定 (fluorescence quenching immunoassay) 也是 一 * 种均相 FIA 方法 。试验 原理是 根据荧 光素标 记的抗 原与相 应抗体 结合后 ,可使 荧光强 度减弱 ,即荧 光猝灭 作用。 当样品 中待测 抗原含 量高时 ,竞 争与抗 体结合 ,使游 离的标 记抗原 增多, 荧光 强度不 受影响 。以 检测血 浆中皮 质醇含 量为例 ,将皮 质醇与 FITC 结 合制成 标记抗 原 。当抗 皮质醇 抗体与 标记抗 原结合 ,发 生猝 灭作用 ,使 FITC 的荧 光减弱 。如 样品中 皮 质醇浓 度高时 ,竞争 与抗体 结合, 结果使 游离的 FITC 标 记皮质 醇增多 ,经紫 外光激 发后荧 光增强 ,二 者呈 正相关 。据此 可以定 量测定 样品中 皮质醇 含量。 (三) 荧光 偏振免 疫测定 焚光 偏振免 疫测定 (fluorescence polarization immunoassay, FPIA) 是 利用荣 光素经 单 一波长 ( 蓝光, 485nm) 的 偏振光 照射后 ,能 吸收光 能并发 射出相 应的偏 振荧光 (绿 光, 525nm), 其强 弱程度 与荧光 分子的 大小呈 正相关 ,据 此而建 立的一 种定量 免疫分 析 技术。 . 827 . 当 FPIA 用 于测定 半抗原 药物的 浓度时 ,反应 系统内 除待测 药物外 ,同 时加 入一定 量荧光 素标记 的药物 ( 小分子 ), 使 二者与 有限量 的特异 性抗体 (大 分子) 进行 竞争结 合 。当 待测药 物浓度 高时, 经过竞 争反应 ,大 部分抗 体被其 结合, 而荧光 素标记 的药物 多呈 游离的 小分子 状态。 由于其 分子小 ,在液 相中转 动速度 较快, 荧光发 射分散 ,测量 到 的荧光 偏振程 度较低 。反之 ,如 待测 药物浓 度低时 ,大部 分荧光 素标记 的药物 与抗体 结合 ,形成 大分子 的标记 抗原- 抗体复 合物, 转动速 度减慢 ,检测 到的荧 光偏振 程度也 较高 ,根据 荧光偏 振程度 与待测 药物浓 度呈负 相关, 以药物 (标 准品) 浓 度为横 坐标, 相应 的荧光 偏振程 度为纵 坐标, 绘制竞 争结合 抑制标 准曲线 。通过 测量反 应系统 的偏振 光大小 ,从 标准曲 线上就 可精确 地得知 样品中 待测药 物的相 应含量 。此法 用于地 高辛测 定时 ,灵敏 度可达 〇.2pg/ml。 采 用美国 Abbott 公司的 TDX 检测 系统在 10 多分 钟内可 测定 20 个样品 。目 前已有 数十种 药物、 激素和 常规生 化项目 可以用 FPIA 进行 分析和 定量 测定。 (四) 荧 光酶免 疫测定 突 光酶免 疫测定 (fluorescence enzyme immunoassay, FEIA) 的试验 原理是 利用具 有潜 在荧光 的底物 作为酶 标抗体 (或 抗原) 的显 示手段 。当 此类底 物被酶 分解后 ,其裂 解产物 可发生 荧光, 据此可 以进行 荧光免 疫分析 。此 法综合 利用了 酶免疫 技术中 酶解产 物测 定所具 有的累 积放大 性和荧 光测量 的高度 敏感性 ,大大 提高了 分析方 法的灵 敏度。 目 前用于 FEIA 的 标记酶 主要有 : /?- 半乳 糖苷酶 (p-Gal)、 碱性 磷酸酶 (AP) 和辣 根过氧 化物酶 (HRP), 其作用 底物和 分解产 物见表 12.1。 表 12.1 FE1A 应用的 酶及荧 光底物 酶 底物 分 解产物 激发光 发射光 相应 的信号 p-G MUG MU 360nm 450nm 10 AP MUP MU 360nm 450nm 10 HRP HPA 二聚体 317nm 414nm 0.03 MUG: 4- 甲基 伞形酮 -芦-D- 半乳 糖苷; MUP: 4- 甲基伞 形酮磷 酸盐。 HPA: 对 羟基苯 丙酸; MU: 4- 甲基伞 形酮。 除上 表所列 酶及其 底物外 ,还可 利用还 原型吡 啶核苷 类辅酶 I, NADH 和 NADPH 等 作为辅 酶的脱 氢酶类 标记抗 体进行 FEIA 测定 ,其灵 敏度可 比一般 光吸收 法提高 2 个 数 量级。 FEIA 在实 际应用 中由于 血清及 其他生 物样品 的背景 荧光易 干扰测 量结果 ,因此 FEIA 方法仅 限于非 均相反 应系统 ,尤 其是使 用固相 抗体分 离体系 的效果 较好。 (五) 底 物标记 荧光免 疫测定 底物 t 不记 焚光免 疫测疋 (substrate-labelled fluorescent immunoaassay, SLFIA) 的试 • 828 • 验 原理与 FEIA 方 法类似 ,利 用具有 潜在荧 光的酶 的底物 ,如 4- 甲基 伞形酮 j-D- 半乳 糖苷标 记药物 ,在 相应 的酶如 /3-D- 半乳 糖苷酶 作用下 ,底 物被酶 分解发 生荧光 。如果 将底 物标记 的药物 与特异 性抗体 结合, 由于大 分子的 空间位 阻现象 ,酶对 其中的 底物失 去催 化作用 ,使 荧光的 产生量 减少。 SLFIA 属于均 相荧光 免疫测 定技术 。测定 时将底 物标记 的药物 ,含 待测药 物的样 品和 特异性 抗体同 时加入 进行竞 争结合 反应。 如果样 品中待 测药物 浓度高 ,竞争 与抗体 结合, 使游离 的底物 标记药 物增多 。加 入相应 的酶作 用于底 物后, 产生的 裂解产 物多, 发 出的荧 光就强 。反 之若样 品中待 测药物 含量少 ,则 底物标 记的药 物与抗 体结合 就多, 酶解反 应受到 抑制, 裂解产 物减少 ,荧 光强度 也随之 减弱。 根据待 测药物 浓度与 荧光强 度成正 比关系 ,以 不同浓 度的药 物标准 品为横 坐标, 相应的 荧光强 度为纵 坐标绘 制竞争 抑制标 准曲线 ,通 过测量 反应液 的荧光 强度, 即可推 算样品 中待测 药物的 含量。 SLFIA 已 应用于 检测庆 大霉素 、卡 那霉素 等数十 种小分 子半抗 原药物 ,灵 敏度可 达 〈Zpg/ml 水平 ,并 且具有 较高的 精确性 和可重 复性。 (六) 时 间分辨 荧光免 疫测定 时 间分辨 荧光免 疫测定 (time-resolved fluoroimmunoassay, TR-FIA) 的试验 原理和 方 法与其 他荧光 免疫测 定技术 不相同 ,所用 的示踪 剂不是 一般荧 光色素 ,而 是以 稀土镧 系 元素铕 (Eu3+)、 钐 (Sm3+)、 铽 (Tb3+) 等通过 具有双 功能基 团的螯 合剂与 抗体或 抗 原分子 以共轭 双键结 合制成 标记物 。此 类荧光 物质受 紫外光 激发后 ,不 仅发射 出高强 度 的荧光 ,其衰 变时间 也较长 (10 〜 1000/is)。 利用时 间分辨 荧光分 析仪延 缓测量 时间, 待 样品池 和检品 中蛋白 质等自 然发生 的短寿 命荧光 (l~10ns) 全部衰 变后, 再测量 Eu3+ 等螯合 物的特 异荧光 ,从 而可以 完全排 除非特 异性本 底荧光 对检测 的干扰 。此外 , 铕 (Eu3+) 等 镧系元 素的吸 收光与 发射光 之间有 较大的 Stokes 位移 (约 270nm), 而且 激发 光的谱 带较宽 ,有利 于增高 激发能 ,增加 镧系标 记物的 比活性 。发射 荧光的 谱带很 窄 ,有 助于降 低本底 。因 此最大 限度地 提高了 TR-FIA 方法 的特异 性和灵 敏度, 成为目 前 超微量 物质免 疫分析 最有发 展前途 的一项 技术。 第二 节酶免 疫技术 酶免疫 技术是 继荧光 免疫技 术和放 射免疫 分析之 后建立 的一种 非放射 性免疫 标记技 术, 其主要 特点是 以酶作 为示踪 剂标记 的抗体 (或 抗原) 用 于免疫 学检测 ,并以 相应的 底物 被酶分 解的显 色反应 ,来 对细胞 和组织 标本中 的抗原 (或 抗体) 进 行定位 分析和 鉴定; 亦可 根据酶 催化底 物显色 的深浅 程度, 定量测 定样品 中待测 抗原或 抗体的 含量。 因此 ,按照 酶免疫 技术的 实际应 用目的 ,分为 酶免疫 组织化 学技术 (enzyme imrmrno- histochemistry, EIH) 和酶免 疫测定 (enzyme immunoassay, EIA) 两大类 。后 者根据 抗 原抗体 反应后 ,是否 需要将 结合的 和游离 的酶标 记物加 以分离 ,再进 行测定 ,又 可分 为均相 酶免疫 测定和 非均相 酶免疫 测定两 种类型 。可概 括如下 : • 829 . 酶免 疫技术 酶免疫 组织化 学技术 f 非均 相酶免 疫测定 { 酶免 疫测定 1 均 相酶免 疫测定 液 相酶免 疫测定 固 相酶免 疫测定 本节内 容着重 介绍酶 免疫技 术常用 的示踪 酶及其 底物和 各种酶 免疫测 定的试 验原理 与主要 方法。 一、 酶免疫 技术常 用的示 踪酶及 其底物 根据实 验目的 和要求 ,选 用合 适的酶 对抗体 ( 或抗原 ). 进 行标记 ,制 备高质 量的试 剂是 酶免疫 测定的 重要技 术之一 。用于 标记的 抗体要 求特异 性强, 效价高 ,并具 有高亲 和力; 抗血 清和单 克隆抗 体一般 需要经 过纯化 ,提取 IgG 再用于 标记。 抗原则 要求其 纯度高 ,抗原 性完整 。供 免疫 标记用 的酶应 符合以 下要求 :①酶 的纯度 及催化 反应的 转 化率高 ,作 用专一 性强, 且价廉 易得; ②性 质稳定 ,容易 与抗体 (或 抗原) 偶联, 两 者活性 均不受 影响; ③受检 组织和 体液标 本中不 存在与 标记酶 相同的 内源性 酶或抑 制物; ④酶 的底物 对人体 健康无 危害, 其分解 产物易 于测定 ,灵 敏度高 ,比色 方便。 酶免 疫测定 常用示 踪酶的 来源和 理化特 性见表 12.2。 表 12.2 酶免疫 测定常 用示踪 酶的来 源和理 化特性 酶 来 源 最适 pH 酶活性 (U/n«,37t:) 分 子质量 ’ 色原底 物及检 测方法 主 要用于 非均相 酶免疫 測定的 示踪酶 辣 根过氧 化物酶 辣根 5 〜 7 4500 40kDa H2〇2/2.2^r 嗪 -2(3- 乙 基-苯 并噻牲 啉磺酸 -6) 铵盐 (ABTS),X=405nm H2(V3, 3', 5, 5'- 四甲基 联苯胺 ( TMB) , X = 450nm H2〇2/ 邻 苯二胺 (〇PD),X=492nm H2〇2/3,3'- 二氨基 联苯胺 (DAB),X = 450nm 喊性 磷酸酶 牛肠 9 〜 10 1000 100 kDa 3, 3'- 对- 硝基苯 磷酸盐 ( PNP), 入 = 405nm /?-1> 半乳 糖苷酶 大 肠杆菌 6 〜 8 600 540kDa 吼 硝基苯 •半 乳糖 吡喃苷 (ONPG), 入 =420nm 氯酚红 |D- 半乳糖 吡喃苷 ( CPRG ) , X = 574nm 葡萄 糖氧化 81/ 过 曲霉菌 4 〜 7 200 186kDa 偶联 酶反应 氧 化物酶 葡萄糖 + HRP 色 原底物 脲酶 / 过氧 化物酶 Jack 豆 葡萄糖 +HRP 色 原底物 Jack 豆属 6.5 〜 7.5 10 000 483kDa 尿素 / 溴 甲酚黄 ,X=588ran 主要用 于均相 酶免疫 測定的 示踪酶 &磷 酸葡糖 脱氢薄 肠 系膜明 串珠菌 7.8 400 104kDa N ADP-6- 磷酸葡 萄糖, X=340nm 溶菌 K 鸡蛋淸 4.5 〜 5. 5 14.5kDa 藤 黄微球 菌细胞 壁碎片 ,X=450mn 苹果酸 脱氢醻 猪心 线粒体 8.5 〜 9. 5 1000 70kDa NAD/ 苹 果酸盐 , 340nm • 830 • 1. 辣 根过氧 化物酶 过 氧化物 酶广泛 存在于 各种动 、植物 ,辣 根过氧 化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 因在辣 根中含 量最多 而得名 。由 无色的 酶蛋白 和深棕 色的辅 基亚铁 血红素 组成。 酶蛋 白为含 18% 碳水化 合物的 糖蛋白 ,最大 吸收光 波长为 275nm; 辅基 亚铁血 红素是 酶的活 性基团 ,在 403nm 波长 呈现最 大光吸 收值。 HRP 的 纯度以 OD4e3nm/OD275nm 的比 值 来衡量 ,用 RZ (ReinhartZahl, 即纯 度值) 表示。 高纯度 HRP 的 RZ 值应 >3.0。 HRP 质量的 另一重 要指标 是酶的 活力, 以单位 (U) 表示 。按经 典方法 测定, 以能在 2CTC、 pH6.0、 20s 时 间内催 化底物 焦培酸 (pyrogallol) 产生 lmg 红培酣 (purpuro- gallin) 作 为酶的 1 个活 力单位 。用于 标记的 HRP 比 活性应 〉250U/mg。 HRP- 抗体结 合物的 制备一 般常采 用改良 过碘酸 钠法。 HRP 分 子中与 酶活性 无关的 糖 基被过 碘酸纳 (NaI04) 氧化 为醛基 ,再 与抗体 蛋白的 氨基结 合形成 Schiff 碱 。为了 防止 酶蛋白 的氨基 与醛基 反应发 生自身 偶联, 在标记 前先用 2, 4- 二硝 基氟苯 (DNFB) 封闭酶 蛋白中 残存的 氨基和 e- 氨基 。酶 与抗体 结合后 ,再 加入硼 氢化钠 (NaHB4) 还原成 稳定的 化合物 。其 反应式 如下: NaI04 NHz-IgG NaBH, HRP-OH ►HRP-CHO ^HRP-CH = N-IgG ^HRP-CH2-NH-IgG 操作步 骤如下 : (1) 取 5mg HRP 溶于 lmL 0.3mol/L NaHC03 pH8.1, 加入 1% DNHP 无水 乙醇溶 液 O.lmL, 室温下 轻微搅 拌作用 lh。 (2) 加入 lmL0.06mol/LNaI04, 室温下 轻微搅 拌作用 30min, 溶 液呈黄 绿色。 (3) 加入 lmL0.16mol/L 乙二醇 ,室 温下轻 微搅拌 lh, 终 止氧化 反应。 (4) 装入 透析袋 ,对 0.01mol/LpH9.5 碳酸盐 缓冲液 1000mL4t: 透 析过夜 ,换液 3 次。 (5) 在 3mL 醛化 HRP 溶液中 加入含 5mg IgG 的 碳酸盐 缓冲液 /mL, 室温下 避光轻 微搅 拌结合 2~3h。 (6) 加入 5mgNaBH4, 置 4X: 下 3h 或过夜 (亦 可加入 0.2mL2mol/LpH9_5 乙醇 胺 , 41C 放置 7h)。 (7) 装入透析袋,对0.01111〇1/1^?63?只7.2 41:透析2411,换水3次。 (8) 3000r/min 离心 30min, 去除沉 淀物。 上清液 再通过 SephadexG-200 凝 胶柱层 析, PBS 洗脱 ,收集 第一峰 洗脱液 。最 后在 结合物 内加入 BSA 至最 终蛋白 浓度为 lOmg/mL, 小 量分装 ,低 温保存 备用。 HRP 的作用 底物为 H202 ,催化 反应还 原成稳 定的化 合物。 HRP _ DH2 + H2〇2 + 2H20 上式中 DH2S 供氢体 (一般 常被称 为底物 ), H202 为受 氢体。 HRP 对受氢 体的作 用专一 性很强 ,除 H202 外 ,仅 作用于 小分子 醇的过 氧化物 和尿素 的过氧 化物, 后者为 固体 ,作为 试剂较 H202 使用 方便 。在 酶免疫 测定中 常用的 供氢体 有:邻 苯二胺 (O-phenylenediamine, OPD), 四甲基 联苯胺 (tetramethylbenzidine, TMB) 及其 硫酸盐 • 831 . (tetramethylbenzine sulphate, TMBS), 2 , 2 - 口丨嚷 - — *(3- 乙基 -本并 嚷嗤琳 确酸盐 -6) 、 [2, 2'-azinod(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonate), ABTS] 等。 其中以 OPD 应 用最为 广泛, 灵 敏度高 ,检测 方便, 但其缺 点是配 成应用 液后稳 定性差 ,且具 有致突 变性。 TMB 无 此缺点 ,经 酶作用 后由无 色变为 蓝色, 目测对 比鲜明 ,加酸 终止反 应后变 成黄色 ,可用 比色 计定量 测定, 应用也 较多。 ABTS 作为 底物的 灵敏度 虽不如 OPD 和 TMB, 但其空 白值 很低。 ABTS 亦 可用于 HRP 与 GOD 的偶联 酶反应 。此 外, HRP 还 可用具 有潜在 荧光 的底物 3-(4- 羟基 )- 苯丙酸 (HPA), 酶 作用后 底物显 示荧光 ,可用 荧光光 度计测 量 ,用 于酶联 免疫吸 附试验 (ELISA) 有加宽 定量测 定线性 范围的 优点。 2. 碱性 磷酸酶 碱性 鱗酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 是一 种磷酸 脂的水 解酶。 从大肠 杆菌中 提取的 ALP 分子 质量为 80kDa, 酶作用 的最适 pH 为 8.0; 从小牛 肠黏膜 提取的 ALP 分 子 质量为 lOOkDa, 最适 pH 为 9 〜 10, 酶的活 力高于 前者。 ALP 的 活力单 位测定 以对硝 基苯 磷酸盐 (PNP) 作 为底物 ,有两 种表示 方式: DEA 单位 和甘氨 酸单位 ,系 分别以 1.0mol/L 二 乙醇胺 (DEA) 和 0.1mol/L 甘氨酸 作为缓 冲液系 统测得 的活力 单位。 1 个 DEA 单位 约等于 2 个甘氨 酸单位 。用 做示 踪酶的 ALP 活 性应在 1000U/mg 以上。 ALP- 抗体结 合物的 制备一 般采用 戊二醛 作为交 联剂的 一步法 ,使酶 和抗体 蛋白的 氨基分 别与戊 二醛的 两个醛 基结合 。操 作步骤 如下: (1) 取抗体 IgG (2 〜 5mg/mL) lmL, 加入 ALP5mg 溶解 ,装入 透析袋 ,用 0.01〇1〇1/1^1^7.2?83 41:透析18氏换液3次。 (2) 加入2.5%戊二醛20^,室温下放置211。41对?63透析过夜,换液3次。 ⑶ 再移入 0.05mol/LpH8.0Tris-HCl 缓冲 液中, 4X: 对 PBS 透 析过夜 ,换液 3 次。 (4) 取出标 记抗体 ,用含 1%BSA 和 0.02%NaN3 的 Tris-HCl 缓冲液 稀释至 4mL, 即 为标记 物原液 。加入 1/3 量 纯甘油 ,小量 分装, 低温保 存备用 。使 用前以 PH7. 4 PBS - 吐 温溶液 将结合 物适当 稀释。 ALP 常 用的底 物为对 硝基苯 磷酸盐 (NPP), 降解产 物为黄 色的对 硝基酚 。经 NaOH 终止酶 反应后 ,颜色 维持比 较稳定 。近年 来使用 具有潜 在荧光 的物质 —— 4- 甲基 伞形酮 磷酸盐 (MUP) 作为 ALP 底物 建立荧 光测定 酶免疫 分析。 MUP 的酶 解产物 4- 甲 基伞形 酮产生 强荧光 ,可 用荧光 光度计 测量, 大大提 高了酶 免疫测 定的敏 感性。 ALP 检测系 统的敏 感性一 般高于 HRP 系统, 空白值 (本底 ) 也较低 。但 由于 ALP 较 难得到 高纯度 的制剂 ,稳 定性较 HRP 低 ,价 格则较 HRP 高 ,制 备的酶 标记物 获得率 亦较 HRP 低 等原因 ,目 前国内 在酶免 疫测定 中仍较 多使用 HRP。 3. 脲酶 脲酶 (urease) 与抗体 (IgG) 的结 合使用 m- 马来 酰亚胺 苯甲酰 -N- 羟基琥 珀酰亚 胺酯 (MBS) 作为 交联剂 。第一 步先通 过氧化 作用使 抗体的 氨基苯 甲酰化 ,然 后由脲 酶的 硫氮基 (-SH) 与马来 酰胺部 分发生 硫化反 应而形 成脲酶 -抗体 结合物 ,操作 步骤如 下: • 832 • (1) 将纯 化的抗 体溶液 (IgG lmg/mL) 置透 析袋内 ,对 2L O.lmol/L pH6.8 PB 4X: 透 析过夜 ,轻 微搅拌 (抗 体的蛋 白含量 测定: A28Q/1.44 = mgIgG/mL)。 (2) 取 0.25mL 浓度为 20mg/mL 的脲酶 ( 溶解于 O.lmol/LPB) 置透 析袋内 ,对 2L0.1mol/LPB4t: 透 析过夜 ,轻 微搅拌 。于次 日更换 PB, 继 续透析 2h。 (3) 从透析 袋内取 出抗体 和脲酶 溶液, 分别盛 于玻璃 试管内 ,测 定抗体 溶液的 A28〇 值 ,并用 PB 稀释至 0.5mg/mL。 (4) 在 1.5mL 浓度为 0.5mg/mL 经过透 析的抗 体溶液 内加入 〇.〇75mL MBS/DMF 溶液 (MBS/ 抗 体的摩 尔比为 120:1)。 在试管 内放置 1 支磁性 搅拌棒 ,室 温下电 磁缓慢 揽梓 30min。 (5) 将反应 物加至 PD-10 层析柱 ( 预先用 lOOmL PB 平衡 ); 用 PB 洗脱 ,按 0.6mL/ 管分 部收集 。测 定各管 A28〇 值, 收集第 一峰洗 脱液。 (6) 合 并第一 峰各管 洗脱液 (通常 大约为 2.5 〜 3mL) 加入 1.5mL20mg/mL 脲酶 溶液 (脲酶 / 抗 体的重 量比为 4:1)。 (7) 充 入氮气 (N2), 室温 下搅拌 1.5h, 或 直至溶 液出现 混浊。 (8) 加入 0.143mol/L2- 巯 基乙醇 (2-ME) 至终 浓度为 2mmol/L (每 毫升脲 酶-抗 体 结合物 内加入 0.014mL 2-ME), 室温 下搅拌 30min。 (9) 将 结合物 装入透 析袋内 ,对 2L PBS 于 41C 透 析过夜 。次日 晨更换 PBS, 继续 透析 4h。 (10) 加入等 量甘油 ,小量 分装, -20X: 保 存备用 (活性 保持稳 定一年 )。 脲酶的 底物为 尿素, 被酶分 解后生 成的氨 (NH;) 改变反 应液的 pH, 可用 指示剂 溴甲酚 黄显示 (黄色 —紫色 )。 脲酶 -抗体 结合物 适用于 ELISA, 但 不适用 于蛋白 质免疫 印 迹技术 (Western blot) 和 酶免疫 组织化 学技术 (EIH)。 在酶 免疫技 术中, 由于酶 标抗体 存在一 些缺点 ,例如 :①酶 与抗体 间的共 价连接 可 损害部 分抗体 和酶的 活性; ②抗血 清中的 非特异 性抗体 被酶标 记后, 可与样 品中其 他成 分结合 ,使 比色测 定的本 底增高 。为此 ,近 年来 在酶标 记法的 基础上 ,发展 建立了 非 标记酶 抗体法 ,其中 以酶抗 酶复合 物法最 为常用 。它 是以 酶与其 相应抗 体形成 的免疫 复 合物代 替酶和 抗体的 结合物 ,由于 不用任 何化学 交联剂 处理酶 和抗体 ,二 者活 性不受 化学耦 联反应 的改变 或损伤 ,因此 可使酶 免疫方 法的灵 敏度大 为提高 。目 前广泛 用于酶 免 疫细胞 (组织 ) 化学染 色技术 和酶免 疫测定 的有过 氧化物 酶-抗 过氧化 物酶法 (简称 PAP 法) 和碱 性磷酸 酶-抗 碱性磷 酸酶法 (简称 APAAP 法 )。 目前 在制备 各种酶 标抗体 (或 抗原) 和非标 记酶抗 体方面 ,已 有很多 成熟的 方法。 但由于 需要制 备高纯 度的抗 原和特 异性强 、效 价高的 抗体; 使用质 量纯, 活性高 的酶进 行 标记; 以及 酶结合 物的纯 化与质 量鉴定 等工作 ,不 仅燁作 过程比 较复杂 、繁琐 费时、 技术 性很强 ,而且 有时常 因标记 物的质 量问题 影响实 验结果 。近年 来大多 数实验 室均采 用专 业性生 物试剂 公司的 产品或 供专项 酶免疫 检测的 试剂盒 。这类 酶免疫 试剂的 标准化 程度 较高, 操作方 法规范 ,实验 结果较 为均一 ,使用 方便。 各实验 室可根 据工作 需要选 购 使用。 • 833 . 二 、酶免 疫测定 酶免 疫测定 (enzyme immunoassay, EIA) 是将 抗原抗 体反应 的高度 特异性 和酶的 高效催 化作用 相结合 ,发 展建立 的一种 非放射 性标记 免疫分 析方法 。由于 EIA 具有灵 敏度高 ,特 异性强 ,酶免 疫标试 剂的性 质比较 稳定, 操作方 法简便 、快速 ,无放 射性污 染 以及应 用范围 广等很 多优点 ,因此 在医学 基础理 论研究 ,临 床病 毒学和 生物化 学检验 等工 作中应 用十分 广泛。 EIA 如同 荧光免 疫分析 一样, 根据抗 原抗体 反应后 ,是 否需要 分 离结合 的与游 离的酶 标记物 ,分为 非均相 (或 异相) EIA 和均相 EIA 两 种方法 类型。 本单元 常用试 剂与溶 液介绍 如下: (1) 硼酸盐 缓冲液 (BBS): 0.17mol/LH3BO4, 0.12mol/LNaCl, 用 NaOH 调节至 pH8.5〇 (2) 封 闭缓冲 液:用 BBS 配制 ,内 含下列 成分, 0.05% 吐温 80、 lmmol/LEDTA、 0.25%BSA 和 0.05%NaN3, 贮存于 4X:。 明胶 可代替 BSA, 5% 速溶奶 粉也成 功地用 于试验 ,但能 非特异 性地干 扰抗体 结合。 (3) 细菌 重混悬 缓冲液 (lOmmol/LHEPES): HEPES2.38g 加水 溶解至 lOOOmL。 (4) 溶菌 酶溶液 : 5mg 鸡蛋清 溶菌酶 (Sigma VI 级, 2879), lmL TEN 缓 冲液, 用前新 鲜配制 ,立即 使用。 (5) MUP 底 物溶液 : 0.2mmol/LMUP (4- 甲基伞 形酮磷 酸盐, Sigma#M8883), 0.05 mol/L Na2C〇3, 〇.〇5mmol/L MgCU, 室温 It 存 〇 (6) NPP 底 物溶液 : 3mmol/LNPP ( 对-硝 基酚磷 酸盐, Sigma#i〇4-0), 0.05mol/ LNa2C03, 0.05mmol/LMgCl2, 贮存于 4t:〇 (7) 待测 抗体溶 液:杂 交瘤培 养上清 通常用 封闭缓 冲液做 1:5 稀释, 腹水和 抗血清 1:500 稀释, 仍可出 现强阳 性反应 。同 时应将 未免疫 的小鼠 腹水或 血清稀 释液作 为阴性 对照 。先配 制抗体 稀释液 ,再将 其加至 抗原包 被的反 应板。 (8) 待测抗 原溶液 :纯化 或部分 纯化的 抗原用 PBSN 配成 0.2~10^g/mL 溶液, 4X: 保存。 (9) 洗涤液 : Hanks 平衡 盐溶液 (HBSS), 56t: 60min 加热 灭活的 1% 眙 牛血清 (FCS), 0.05%NaN3, 贮存于 41C。 (一) 非均相 EIA 非均相 EIA (heterogeneous enzyme immunoassay) 是目 前使用 最多的 一 ■类免 疫学检 测方法 。试验 原理与 放射免 疫分析 (RIA) 相似 ,在 抗原抗 体反应 达到平 衡后, 需采用 适当 方式将 游离的 和与抗 原或抗 体结合 的酶标 记物加 以分离 ,再 通过底 物显色 进行测 定 。根据 试验中 是否使 用固相 支持物 作为吸 附免疫 试剂的 载体, 又可分 为液相 EIA 和 固相 EIA 两种 方法。 1. 非 均相液 相酶免 疫测定 主要用 于测定 小分子 的半抗 原物质 ,如体 液中的 微量激 素和某 些药物 。在检 测过程 • 834 • 中, 根据待 测抗原 、抗体 及酶标 抗原加 入的顺 序和温 育阶段 不同, 又分为 非平衡 法和平 衡法。 1) 非 平衡法 又 称连续 饱和法 。本法 是将待 测样品 (或 标准品 ) (Ag) 与特异 性抗体 (Ab) 混 合 ,先 温育一 定时间 ,然后 加入酶 标抗原 (E-Ag); 待反 应达到 平衡后 ,再加 入分离 剂, 去除未 结合的 成分; 最后 加入底 物显色 测定。 (1) 将 待测样 品经过 561C 加热 30min, 灭 活内源 性酶。 (2) 将待测 样品、 标准品 (Ag) 分别 与抗体 (Ab) 置 反应管 内混勻 ,放室 温反应 1 〜 2h〇 (3) 加入一 定量的 E-Ag, 置 室温或 41C 过夜。 (4) 加 入抗同 种动物 IgG 的第 二抗体 ,混匀 ,置室 温反应 3h。 (5) 在 室温下 ,以 3000r/min 离心 15min; 弃 上清液 ,沉 淀物用 PBS 洗 2 次。 (6) 将反应 管移置 冰浴内 ,加入 底物液 ,快 速旋 转混合 ,置 37X: 水 浴温育 显色, 然后 加入终 止剂。 (7) 在特定 波长下 测定光 吸收值 。以标 准品管 吸收值 (B) 和最高 结合管 (BO) 的 百 分比值 (B/BOX 1〇〇) 为 纵坐标 ,标 准品浓 度为横 坐标, 在半对 数坐标 纸上绘 制标准 抑 制曲线 。按 同样方 法计算 出待测 样品的 B/BO%, 从标准 抑制曲 线上即 可得知 待测物 的 浓度。 2) 平衡法 本法 是将待 测样品 (或 标准品 ) (Ag)、 酶 标抗原 (E-Ag) 及特异 性抗体 (Ab) 相 继加入 ,混匀 ,进行 一次性 温育; 待反应 达到平 衡后, 再加入 分离剂 ,将 已结合 的和游 离的成 分加以 分离; 然后 加入底 物显色 测定。 (1) 将待 测样品 (或 标准品 )、 酶标 抗原及 抗体同 时置反 应管内 ,混匀 ,放 室温 (或 41C) 温育 过夜。 (2) 加入第 二抗体 混匀, 4X: 过夜 ( 或室温 3h)。 (3) 离心 沉淀, 去除上 清中未 结合的 成分; 沉淀 物用 PBS 洗 2 次。 (4) 在沉淀 物内加 入底物 液催化 显色; 加入终 止剂后 ,同 上法 测量光 吸收值 ,并计 算 B/BO%。 最后 从标准 抑制曲 线上查 出待测 物质的 浓度。 2. 非 均相固 相酶免 疫测定 非 均相固 相酶免 疫测定 的原理 与固相 RIA 相似 。将已 知的抗 体或抗 原吸附 在某种 固相 支持物 (载体 ) 上 ,加 入待测 样品进 行温育 ,使 抗原抗 体结合 反应在 固相载 体上完 成 。采用 洗涤方 法分离 已结合 和游离 的成分 。然 后加 入酶标 记物及 底物催 化显色 ,根据 显色 反应的 深浅, 对样品 中的待 测抗原 或抗体 进行定 性或定 量测定 。目前 最常用 的固相 EIA 方法 是以聚 苯乙稀 制品作 为载体 的酶联 免疫吸 附试验 (enzyme linked immunosor- bent assay, ELISA) 〇 ELISA 的应用 范围十 分广泛 ,既可 用于检 测各种 抗原和 半抗原 ,也 可用于 检测抗 体 。根 据检测 目的和 操作步 骤不同 ,可分 为不同 的方法 (表 12.3)。 • 835 • 表 12.3 ELISA 分类 方 法 应 用 所 需试剂 说 明 间接法 Ab 筛选 表 位分析 纯化 或初提 Ag 含 Ab 的待 测标本 针对免 疫动物 Ig 的酶 标二抗 抗原的 用量相 对较多 不需 要已知 的特异 性抗体 双抗体 夹心法 Ab 筛选 表 位分析 捕获 Ab (特 异性针 对免疫 动物的 Ig) 含 Ag 的待 测标本 针对 Ag 的酶 标抗体 不要 求纯化 Ag 试验 时间相 对较长 (5 步) 抗体 夹心法 Ag 筛选 可溶性 Ag 的测定 捕获 Ab ( 纯化或 初提的 特异性 Ab) 含 Ag 的待 测标本 针对 Ag 的酶 标抗体 测定 Ag 的最敏 感方法 所需 纯化或 初提的 特异性 Ab (捕获 Ab) 量较大 直接 竞争法 Ag 筛选 可溶性 Ag 的测定 纯化 或初提 Ag 含 Ag 的待 测标本 针对 Ag 的酶 标抗体 测定方 法快速 (只需 2 步) 适 用于测 定抗原 的交叉 反应性 直 接细咆 ELISA 筛 选表达 Ag 的细胞 测定细 胞表面 Ag 表达 Ag 的细胞 针对细 胞表面 Ag 的特 异性酶 标抗体 大量筛 选的敏 感方法 对混合 细胞群 表达的 异质性 Ag 不敏感 间 接细胞 ELISA 筛选 针对细 胞表面 Ag 的 Ab 免疫用 的细胞 含待测 Ab 的标本 针对免 疫动物 Ig 的酶 标二抗 不 适用于 测定针 对细胞 表面低 密度 Ag 的 Ab 1) 间接法 此法是 检测抗 体常用 的方法 ,其 原理为 利用酶 标记的 抗抗体 (第二 抗体) 检 测已与 固相 抗原结 合的待 测抗体 ,故 称为间 接法。 (1) 将 特异性 抗原与 固相载 体连接 ,形 成固相 抗原; 洗涤 除去未 结合的 抗原。 (2) 加入 适当稀 释的受 检血清 ,经 过温育 ,使检 品中的 待测抗 体与固 相抗原 结合; 洗涤 ,除去 未参与 反应的 物质。 (3) 加入 酶标抗 抗体, 如酶标 记的羊 (或兔 ) 抗人 IgG 抗体; 再次 温育, 使之与 固相 免疫复 合物中 的抗体 结合; 洗涤, 除去未 结合的 酶标抗 抗体。 (4) 加入底 物显色 ,显色 深浅代 表检品 中待测 抗体的 含量。 此法 只需更 换不同 的固相 抗原, 可以用 同一种 酶标抗 抗体检 测各种 与抗原 相应的 抗体。 2) 双抗体 夹心法 此法适 用于检 测样品 中少量 的特异 性抗体 和不能 得到纯 抗原时 。此外 ,亦可 用于针 对同一 抗原不 同表位 的单克 隆抗体 分析。 (1) 用 抗同种 Ig 的抗体 (抗 抗体) 包被固 相载体 ,作 为捕获 抗体。 (2) 加 入含待 测抗体 的检品 ,经过 温育使 之与捕 获抗体 结合; 洗涤, 除去未 参与反 应的 物质。 (3) 加 入已知 的抗原 ,经过 温育使 之与待 测抗体 结合; 洗涤, 除去未 结合的 抗原。 (4) 加入针 对抗原 的特异 性酶标 抗体, 经过温 育使之 与抗原 结合; 洗涤 ,除 去未结 合 的酶标 抗体。 (5) 加入底 物显色 。根据 显色反 应的深 浅程度 ,对 检品 中的待 测抗体 进行定 性或定 M 测定, 或表位 分析。 • 836 • 3) 抗体 夹心法 此法是 检测抗 原常用 的方法 。但仅 适用于 二价或 二价以 上抗原 的检测 ,而不 能用于 小分子 半抗原 物质的 测定。 (1) 将 特异性 抗体与 固相载 体连接 ,形 成固相 抗体; 洗涤 除去未 结合的 抗体。 (2) 加 入含待 测抗原 的检品 ,经过 温育使 之与固 相抗体 结合; 洗涤, 除去未 参与反 应的 物质。 (3) 加 入酶标 记的另 一特异 性抗体 ,再次 温育, 使酶标 抗体与 固相免 疫复合 物中的 抗原 结合; 洗涤 ,除 去未结 合的游 离酶标 抗体。 (4) 加入底 物显色 。根据 显色反 应的深 浅程度 ,对 检品 中的待 测抗原 进行定 性或定 量 测定。 双位点 一步法 :此法 是在抗 体夹心 法的基 础上, 改为应 用针对 抗原分 子上两 个不同 决定簇 的两种 McAb, 分别 作为固 相抗体 和酶标 抗体。 测定时 ,将 含待测 抗原的 检品和 酶标 抗体同 时加入 固相抗 体孔内 进行结 合反应 ,两种 抗体互 不干扰 。经过 一次温 育和洗 涤后, 即可加 入底物 进行显 色测定 。双位 点一步 法简化 了操作 ,缩 短了反 应时间 ,如使 用高亲 和力的 McAb, 测定的 敏感性 和特异 性可显 著提高 。但 是当 检品中 待测抗 原浓度 相 当高时 ,应 注意钩 状效应 (hook effect), 即 过量的 抗原可 以分别 同固相 抗体及 酶标抗 体结合 ,而不 再形成 大分子 的夹心 复合物 ,出 现类似 沉淀反 应中抗 原过剩 时的“ 后带” 现象 ,阳性 反应反 而减弱 。钩状 效应严 重时甚 至可出 现假阴 性结果 。必要 时可将 检测样 品 经过适 当稀释 后重复 测定。 此外 根据同 样原理 ,可 以将两 种抗原 分别用 于制备 固相抗 原和酶 标抗原 ,利 用双抗 原夹心 法检测 标本中 的相应 抗体。 4) 竞争法 此 法可用 于检测 抗原和 小分子 半抗原 ,也可 用于测 定抗体 。以 测定抗 原为例 ,使待 测抗 原和酶 标抗原 竞争与 固相抗 体结合 ,结果 检品中 待测抗 原含量 越多, 与固相 抗体结 合的酶 标抗原 就越少 ,二 者呈负 相关。 (1) 将特 异性抗 体与固 相载体 连接, 形成固 相抗体 。洗涤 除去未 结合的 抗体。 (2) 测定管 内加入 待检品 和一定 量的酶 标抗原 ,使 二者 与固相 抗体竞 争结合 。参考 管 内只加 入一定 量的酶 标抗原 ,使之 与固相 抗体直 接结合 。温 育后 ,分别 洗涤, 除去未 结合的 成分。 (3) 加底物 显色, 参考管 由于酶 标抗原 与固相 抗体充 分结合 ,故催 化底物 显色较 深 。测 定管的 显色程 度则随 两种抗 原与固 相抗体 竞争结 合的结 果而异 。显 色深浅 与待测 抗原 量呈负 相关。 根据参 考管与 测定管 OD 值之差 ,计 算检 品中待 测抗原 含量。 5) 直 接细胞 ELISA 此 法应用 针对细 胞表面 分子的 已知特 异性抗 体或其 他配体 (ligand) 检测细 胞表面 抗原或 受体。 (1) 将 不同数 量的阳 性和阴 性对照 细胞与 不同浓 度的标 记抗体 进行十 字交叉 系列稀 释滴定 ,以 确定每 孔的最 适细胞 数和标 记抗体 的工作 浓度。 (2) 将待 检细胞 悬液于 4t:, 1500r/min (45〇Xg) 离心 5min。 再将 细胞重 混悬于 冰冷的 洗涤缓 冲液内 ,计 数细胞 并调节 浓度为 (1X106) 〜 (5X106) 个细胞 /mL。 . 837 . (3) 将 细胞悬 液分装 于微量 滴定板 的锥形 或原形 凹孔内 ,每孔 10(VL[(lxl〇5) 〜 (5><1〇(5) 个细 咆]。 4t:, 1500r/min 离心 lmin。 吸去 上清液 ,将 微量滴 定板置 混合器 上短时 振摇, 使沉积 的细胞 分散。 (4) 孔 内加入 l〇(VL 最适 工作浓 度的酶 标抗体 ,将 细胞重 新混匀 。于 4X: 孵育 1.5h, 间隔 15min 轻轻摇 动一次 ,将 细胞 混匀。 (5) 4t:, 1500r/min 离心 lmin, 吸去 上清液 ,将细 胞混匀 。每孔 内加入 20(VL 冰 冷 的洗涤 缓冲液 将细胞 重混悬 。同 上离心 洗涤共 3 次。 (6) 每孔 内加入 lOOfiL 底 物溶液 ,混匀 ,室 温孵育 lh。 间隔 15min 轻轻摇 动将细 胞 混匀。 (7) 肉 眼观察 或用酶 标仪测 定显色 程度。 6) 间 接细胞 ELISA 此法用 于筛选 针对细 胞表面 抗原的 特异性 抗体。 先将细 胞与含 待测抗 体的溶 液进行 孵育 ,经过 洗涤后 ,再加 入酶标 抗抗体 ,孵 育后再 次洗涤 ,然后 加入底 物显色 。细 胞表 面结合 的抗体 量与底 物被酶 水解的 程度成 正比。 (1) 在 预试时 ,用阳 性和阴 性对照 抗体代 替待测 抗体, 通过十 字交叉 系列稀 释法测 定每孔 的最适 细胞数 和酶标 抗抗体 的工作 浓度。 (2) 每孔 内加入 lOO^L 细 胞悬液 [(1X1〇5)~(5x1〇5) 个细 胞]。 4t:, 1500r/min 离心 lmin。 吸去 上清液 ,轻 轻振动 使细胞 分散。 (3) 每 孔加入 lOOpL 待测 抗体或 对照抗 体溶液 ,将 细胞再 混悬。 4t: 孵育 1.5h, 间 隔 15min 轻 轻振动 将细胞 混匀。 (4) 4X:, 1500r/miri 离心 lmin, 吸去 上清液 。每 孔加入 200/ixL 冰冷 的洗涤 缓冲液 将细 胞混悬 。同上 重复离 心洗涤 2 次。 (5) 每 孔加入 lOOpL 酶标抗 抗体或 F (ab) 2- 酶 结合物 ,将细 胞重新 混悬。 4X: 孵 育 1.5h, 间隔 15min 轻 轻振动 将细胞 混匀。 (6) 同 上述将 细胞离 心洗涤 3 次。 (7) 每 孔加入 lOOpL 底 物溶液 ,混匀 ,待酶 解反应 达到所 需程度 ,其 间每隔 15min 轻轻振 动混匀 细胞。 (8) 肉 眼观察 或用酶 标仪测 定显色 程度。 7) ELISA 结 果分析 常用以 下几种 方法: (1) 目测 定性法 。加 入底物 经酶解 和终止 反应后 ,肉 眼观察 阳性孔 颜色明 显深于 ( 或浅于 ,竞 争法) 阴 性对照 。与阴 性对照 的颜色 接近者 ,判 定为 阴性。 (2) 以样 品孔的 OD 值〉 阴性 对照 OD 值 + 2~3S, 作 为阳性 结果的 阈值。 (3) 以 P/N 值 ( 阳性孔 〇d 值 / 阴性孔 OD 值) >2.1 为 阳性。 P/N 值 <2.1, 但 >1.5 为 可疑。 P/N<1.5 为 阴性。 (4) 定量测 定结果 根据标 准曲线 计算样 品中待 测物的 含量。 8) ELISA 操作 中的注 意事项 目前 ELISA 方 法已在 国内广 泛使用 ,在 各种临 床标本 的实际 检测中 ,各实 验室多 使用 商品化 试剂盒 。一 般说来 ,在高 质量试 剂的前 提下, 只要严 格按试 剂盒说 明书操 . 838 . 作 ,应 不难得 出正确 的结果 。但 ELISA 方法 虽看似 简单, 然而毕 竟是一 种步骤 较多, 操作较 为繁琐 ,且有 相当技 术要求 的测定 方法。 无论是 定性试 验或定 量测定 ,都 必须按 照标准 化的规 程操作 ,才能 在常规 检测中 获得准 确和稳 定可靠 的数据 。以 下扼要 介绍主 要 操作步 骤的技 术要求 和注意 事项。 (1) 试剂 的准备 。应 严格按 试剂盒 使用说 明书的 要求或 统一制 定的操 作规程 准备试 验所需 的各种 试剂。 放冰箱 内保存 的试剂 ,在使 用前应 先回复 至室温 ,并 仔细检 查是否 变质 。浓缩 的洗涤 液和稀 释液须 用新鲜 的重蒸 水或去 离子水 按要求 稀释。 使用不 合格的 蒸馏 水会使 空白值 增高。 (2) 加样 。在 ELISA 中 ,除 固相包 被外, 一般还 需进行 4 〜 5 次加样 。定性 试验可 用相 同口径 的滴管 ,并保 持一定 的手法 ,使 每滴 液体的 体积基 本相同 。在 定量测 定中则 加样量 应力求 准确。 使用的 微量加 液器应 注意保 养并定 期校正 。加 样前应 将溶液 充分混 匀 ,并将 液体加 在孔底 ,避免 加在管 (孔) 壁上部 。注 意不 可出现 气泡。 (3) 保温。 保温亦 称温育 。在 ELISA 中一般 有两次 抗原抗 体反应 ,即 在加 标本和 加 酶标记 物后需 进行两 次温育 。此 时应按 规定的 要求掌 握好温 度和加 温时间 。保 温容器 最好 是恒温 水浴箱 ,可使 温度很 快达到 平衡。 ELISA 板 不可重 叠放置 ,以 免传热 不均。 为避免 孔内液 体蒸发 ,板面 应加盖 。或用 塑料黏 胶纸将 ELISA 板面 密封后 ,将 其漂浮 在 水面上 。如用 保温箱 ,应将 ELISA 板平放 在底部 垫有纱 布的湿 盒中, 并将湿 盒预先 放 于保温 箱内平 衡温度 ,这在 室温较 低时尤 为重要 。加入 底物后 ,反 应的 时间和 温度一 般 不做严 格要求 。如室 温高于 201C, 可将 ELISA 板避光 放在实 验台上 ,以便 不时观 察 ,待阳 性对照 孔显色 充分时 ,即 可终 止酶促 反应。 (4) 洗涤 。洗涤 虽不是 ELISA 的反 应步骤 ,但是 却决定 着实验 的成败 ,因 作为非 均相 EIA 的 ELISA 就是 通过洗 涤来分 离与固 相抗原 或抗体 结合的 和游离 的物质 ,并且 可减 少检品 中与反 应无关 的蛋白 质和其 他杂质 的非特 异吸附 。尤其 是在加 入酶标 记物进 行反 应后, 洗涤如 不彻底 ,非 特异吸 附的残 留酶标 记物, 将使本 底增高 。因此 ,洗 涤是 ELISA 测定过 程中不 可忽视 的关键 性操作 。洗 涤次数 一般为 3~4 次, 有时甚 至需洗 5~6 次。 最常用 的洗涤 液是在 0.02mol/L pH7.4 的 PBS 内 加入终 浓度为 0.05% 的吐温 20, 洗涤效 果较好 ,并 具有 减少非 特异性 吸附和 增强抗 原抗体 结合的 作用。 洗涤方 式可采 用手工 操作或 专用的 洗涤装 置自动 洗涤。 (5) 比色。 ELISA 定性试 验时, 如阴性 对照显 色极浅 ,一般 可采用 目测比 色判定 结果 。定量 测定时 ,使 用特定 波长的 分光光 度计或 ELISA 测读仪 (简称 酶标仪 ) 测定 反应管 (孔) 的 吸光值 。为 保证能 取得准 确的测 读结果 ,入 射光必 须对准 反应管 (孔) 底中央 ,试 管架或 酶标板 移动位 置应保 持准确 ,移 动后复 位时测 读结果 应具重 复性。 9) ELISA 试剂最 适浓度 的十字 交叉系 列稀释 测定法 系列稀 释滴定 法常用 于测定 ELISA 使用试 剂的最 适浓度 。在 下述方 案中, 采用三 步 ELISA 法 ,包 括以第 一试剂 用于固 相包被 ,第二 试剂与 包被试 剂结合 ,再将 与酶结 合的第 三试剂 (显色 ) 和 第二试 剂结合 。先将 3 种试 剂分别 进行系 列稀释 ,再用 十字交 叉 (criss-cross) 方阵分 析法进 行测定 (见表 12.4)。 在特定 的试验 条件下 使用的 试剂最 适 浓度一 旦确定 ,各次 试验应 保持恒 定不变 。原定 方案如 需进一 步优化 ,可 以调整 (改 变) 有关 试剂的 浓度。 • 839 . 表 12.4 抗 体夹心 ELISA 法 测定抗 原的十 字交叉 系列分 析结果 / (ng/mL) 第 二试剂 同 种抗原 异 种抗原 ng/mL 200 50 12.5 3.12 0.78 0 200 50 12.5 3.12 0.78 0 A 500 过度 过度 过度 3200 1000 0 500 120 40 20 10 B 250 过度 过度 过度 2060 560 0 300 80 20 0 0 C 125 过度 过度 3650 1370 360 0 195 40 10 10 0 D 62.5 3600 4000 2270 790 240 0 120 30 10 10 10 E 31.25 2700 2100 1200 410 120 0 60 10 10 10 0 F 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 纵 列 表 12.4 抗 体夹心 ELISA 法 测定抗 原的十 字交叉 系列分 析结果 (用于 优选第 二和第 三试剂 的浓度 )。 纵列 1~11 和横排 B 〜 G 中的数 字代表 96 孔微量 滴定板 各孔测 得的相 对荧光 单位。 滴定 板用捕 获抗体 (2pg/rnL) 包 被过夜 。第二 试剂为 4 倍系 列稀释 的同种 抗原和 交叉反 应的异 种抗原 ,分 别加入 包被板 各孔内 ,孵育 2h。 第三 试剂为 2 倍系列 稀释的 特异 性抗体 -碱性 磷酸酶 结合物 ,分 别加入 各孔内 ,孵育 2h。 加 入底物 MUP 孵育 lh 后, 用荧光 分光光 度计测 定各孔 的荧光 强度。 各种 试剂的 浓度可 根据研 究者设 定的不 同试验 而变动 。如果 底物水 解的时 间定为 lh, 相对的 荧光强 度约为 1〇〇〇 相对荧 光单位 ,对 同种抗 原的敏 感性为 780Pg/mL, 此 时用于 ELISA 中的酶 - 抗体结 合物浓 度应为 500pg/mL。 如 果该项 试验检 测同种 抗原仅 为 3.12ng/mL, 则 所用结 合物的 浓度可 减少为 125ng/mL。 应 当指出 ,根 据同种 抗原与 异 种抗原 检测结 果比较 (B5 孔对 B11 和 D4 对 D10), 试验 的特异 性和信 / 噪比可 判定为 优良。 包被 试剂稀 释液的 配制: (1) 排列 4 支 17mmXl〇〇mm 试管, 在后面 3 管 中加入 6mLPBSN。 在第 1 管内用 PBSN 配置 12mL 浓度为 10Mg/mL 的 包被试 剂溶液 。从第 1 管转移 6mL 溶 液至第 2 管。 用 吸管上 下吸吹 5 次混勻 。重复 转移和 混合第 3~4 管 ,各 管内包 被试剂 的浓度 分别为 10 /ig/mL、 5 pig/mL、 2 . 5 pg/mL 和 1 . 25 /ig/mL。 (2) 用多头 吸液器 ,分装 50pL 包 被液于 4 块微量 滴定板 各孔内 ( 即每块 板分装 1 种包被 稀释液 ), 室 温孵育 过夜或 37t:2h。 (3) 按 ELISA 常规方 法进行 洗涤和 封闭。 试剂稀 释液的 配置: 第 三试剂 (抗体 - 碱性 磷黢 酶 结合物 ) • 840 • (4) 排列 5 支 12mmX 75mm 试管, 在后面 试管中 各加入 3mL 封闭 缓冲液 。在第 1 管内用 PBSN 配置 4mL 浓度为 200ng/mL 的 第二试 剂溶液 。从第 1 管转移 lmL 溶液至 第 2 管 。上 下吸吹 5 次混匀 。重复 转移和 混合第 3 〜 5 管, 各管内 第二试 剂的浓 度分别 为 200ng/mL、 50ng/mL、 12.5ng/mL、 3.125ng/mL 和 0.78ng/mL。 如 果可能 ,配制 无交叉 反应的 异种第 二试剂 系列稀 释液进 行对比 试验。 如 果试验 的敏感 性很低 ,应增 加第二 试剂的 浓度, 如将第 1 管溶 液改为 lOOOng/mL。 (5) 将 第二试 剂溶液 分装于 4 块反应 板的前 5 个纵列 ,每孔 50pL。 先将稀 释度最 高的 溶液分 装于第 5 列各孔 ,再 将浓 度递增 的溶液 依次分 装于第 4、 3、 2、 1 孔。 因此, 第 5 列 各孔的 浓度为 0.78ng/mL, 第 1 列 各孔为 200ng/mL。 室温 下孵育 2h。 (6) 按 ELISA 常规方 法进行 洗涤。 酶标 (显色 ) 试剂的 配制: (7) 排列 5 支 17mmX 100mm 试管, 在后面 试管中 各加入 3mL 封闭 缓冲液 。在第 1 管 内用封 闭缓冲 液配制 6mL 浓度为 500g/mL 的酶标 (显色 ) 试剂 。从第 1 管转移 3mL 溶 液至第 2 管 并混匀 。重复 转移和 混合第 3~5 管 ,各 管内酶 标试剂 的浓度 分别为 500ng/mL、 250ng/mL、 125ng/mL、 62.5ng/mL 和 31.25ng/mL〇 (8) 将 酶标试 剂溶液 分装于 每块反 应板的 2~6 横排 (B 〜 F) 各孔 ,每孔 50^L。 先将 稀释度 最高的 溶液分 装于第 6 排各孔 ,再 将浓 度递增 的溶液 依次分 装于第 5、 4、 3、 2 排各孔 。室温 下孵育 2h。 (9) 按 ELISA 常规方 法进行 洗涤。 酶解 产物的 测定: (10) 每 孔加入 75^LMUP 或 NPP 底 物溶液 ,室温 下孵育 lh。 肉眼 观察或 用荧光 光度 计测定 底物被 水解显 色程度 。适 当的试 验组合 结果为 :使用 NPP 作为 底物在 405nm 波长测 定时为 0.5 吸收 光单位 /h, 用 MUP 作为底 物时为 1000~1500 荧 光单位 /h。 以上 结果可 以用于 调整基 本试验 方案和 替代方 案的试 剂最适 浓度。 10) 细菌细 胞溶解 物抗原 的制备 将 含有克 隆基因 表达蛋 白的大 肠埃希 菌培养 物裂解 ,作为 抗原用 于前述 3 种 ELISA (间 接法、 竞争法 及抗体 夹心法 )。 应准 备的实 验材料 如下: 大肠 埃希菌 的肉汤 或琼脂 培养物 细菌 重混悬 缓冲液 溶菌 酶溶液 Tris/EDTA/NaCl (TEN) 缓冲液 10% SDS 8mol/L 尿素 (可 任选) 尼龙 棉拭子 (Falconp2069) 具体操 作步骤 如下: (1) 取 5mL 液体培 养物, 2500r/min 离心 lOmin, 去上清 。将 细菌沉 集物再 混悬于 5mL 重混 悬缓冲 液中, 低速旋 涡混匀 。如为 琼脂培 养物, 用尼龙 棉拭子 从琼脂 平皿上 取大约 10 个菌落 ,混 悬于 2mL 重 混悬缓 冲液中 ,并将 棉拭子 在管壁 上挤压 ,尽 可能挤 • 841 . 出更多 液体。 表达蛋 白的产 童随细 菌生长 期而异 。应 在不同 的生长 阶段取 样分析 (例如 ,对 数生 长中期 和稳定 期 )。 如果从 琼脂平 板取样 ,应在 37X: 培养 过夜。 (2) 取 lmL 重 混悬的 细菌加 入放置 冰上的 小离心 管内。 (3) 加 0.2mL 溶菌 酶溶液 ,放 置冰上 5min。 (4) 离 心沉淀 5min, 收集 上清液 。将 沉积的 细菌再 混悬于 1.2mL TEN 缓冲 液中。 由于许 多表达 蛋白不 能溶解 ,因 此最好 是同时 检测细 菌沉积 物和上 清液的 活性。 (5) 每份 样品加 0.065mL10% SDS, 37X: 孵育 lOmin。 该 样品即 可用于 ELISA; 如在数 小时内 不使用 ,应 冷冻 保存。 另 一方法 是加尿 素至终 浓度为 8mol/L (4_8g 尿素加 至最终 体积为 10mL), 使蛋白 质 变性和 溶解。 (二) 均 相酶免 疫测定 均 相酶免 疫测定 (homogeneous enzyme immunoassay, HEI) 和其他 非均相 酶免疫 测定方 法不同 ,只 需将待 测样品 、酶标 试剂和 底物溶 液加在 一起, 待抗原 -抗体 结合反 应达到 平衡后 ,即可 直接测 定结果 ,无 需分离 和洗涤 步骤, 整个试 验过程 都在均 匀的液 相中 进行。 因此, HEI 的 操作过 程简便 、快速 ,适合 于自动 化分析 。近 年来, HEI 有 很 大改进 和发展 ,已建 立竞争 结合免 疫测定 和非竞 争结合 免疫测 定两类 10 余 种方法 (图 12.1)。 HEI 不仅可 用于测 定激素 、药物 、毒品 等半抗 原物质 ,也能 检测大 分子蛋 白 质抗原 和病毒 、细菌 等颗粒 及细胞 性抗原 成分。 图 12.1 均相 酶免疫 测定法 的分类 HEI 的方 法虽多 种多样 、原 理各异 ,且颇 为复杂 ,但其 基本原 则是设 计引发 改变酶 活性的 抗原抗 体反应 ,通 过测定 改变的 酶活性 来推算 样品中 待测物 的含量 。以下 简要介 绍几种 具有代 表性的 HEI 方法。 • 842 • 1. 酶放大 免疫测 定技术 酶放大 免疫测 定技术 (enzyme-multiplied immunoassay technique, EMIT) 是 最早形 成实 际检测 系统的 HEI 方法, 由美国 Syva 公司研 究成功 ,商品 名称为 EMIT。 主要用 于检 测小分 子抗原 或半抗 原物质 ,在药 物检测 中应用 较多。 EMIT 的 基本原 理是将 半抗原 (或 小分子 抗原) 与 酶结合 成酶标 半抗原 ,仍 保留半 抗 原和酶 的活性 。此法 最初用 于吗啡 的检测 ,是 将溶 菌酶与 吗啡的 衍生物 (半 抗原) 共 价结合 ,标记 物中吗 啡与抗 体结合 的能力 和溶菌 酶的活 性仍保 持不变 (或稍 有下降 )。 当标 记物与 抗吗啡 抗体结 合后, 由于抗 体分子 在酶的 活性部 位与底 物分子 之间形 成空间 位阻 (sterichinderance), 使溶 菌酶的 活性明 显受到 抑制, 失去裂 解藤黄 微球菌 (天然 固相 底物) 的能力 。当样 品中待 测抗原 (吗啡 ) 浓度 增加时 ,与标 记的半 抗原竞 争结合 抗体, 使游离 的标记 半抗原 量增多 ,酶的 活性得 以发挥 。细 菌被裂 解后浊 度降低 ,可以 通过比 浊测定 (OD45enm)。 酶活 性的增 加与样 品中待 测抗原 含量呈 正相关 。根据 剂量反 应标 准曲线 即可得 知样品 中吗啡 含量。 本法 检测半 抗原物 质的最 低限为 1 x l(T9m〇l/L。 检测 尿样中 吗啡的 敏感性 <0.5 pg/mL0 EMIT 的另一 种类型 是抗体 增强酶 的活性 。用 苹果酸 脱氢酶 (MDH) 标记 甲状腺 素 (T4) 用 于测定 T4 的 EMIT 试剂 盒是这 一原理 的代表 性试验 。将 厘011与丁4 通过双 功能 交联剂 N- 羟 基丁二 酰亚胺 (NHS) 共价 结合后 ,标记 物中的 T4 仍保 持与相 应抗体 结合 的能力 ,但 其中的 MDH 活性却 受到强 烈抑制 。当抗 丁4抗 体与标 记物结 合后, MDH 失去的 活性大 部分得 以恢复 。此时 ,抗体 似乎起 到增强 MDH 酶活性 的作用 ,但 实质上 只不过 是帮助 恢复了 MDH 本 身原有 的活性 。对 这一现 象的解 释是在 MDH 与 T4 交联过 程中, T4 分子除 了在酶 活性位 点附近 形成牢 固的共 价结合 键外, 还可能 跨越活 性中心 ,形成 一个比 较弱的 非共价 结合键 。当 抗体与 T4 结合 ,可以 解除这 一非共 价键, 从而使 MDH 恢复 活性。 2. 辅基标 记免疫 测定法 辅基标 记免疫 测定法 (prosthetic group-labelled immunoassay, PGLIA) 或称 为酶阮 活化 (重组 ) 免疫 测定法 (apoenzyme reactivation immunoassay, ARIA)。 PGLIA 或 ARIA 是用 无酶活 性的辅 基代替 全酶分 子作为 标记物 。将 葡萄糖 氧化酶 (GOD) 在酸性 条件 下水解 为酶朊 (apoenzyme) 和 黄素腺 嘌呤二 核苷酸 (FAD, 辅基) 两 种成分 ,二 者单 独均无 GOD 酶活性 ,但可 重组成 具有酶 活性的 GOD。 在均相 酶免疫 测定中 ,用 FAD 标记 半抗原 ,当此 种标记 物处于 游离状 态时, 其中的 FAD 仍保持 与酶朊 重组成 GOD 的性能 。但 标记物 与特异 性抗体 结合后 ,可完 全抑制 FAD 重组为 GOD 的 能力。 因此在 待测抗 原和标 记抗原 与抗体 竞争结 合反应 完成后 ,加 入酶朊 ,测定 重组为 GOD 的活性 (通过 GOD/HRP 偶联 酶反应 系统, 见前述 ), 就可 判定样 品中待 测抗原 含量。 待测 抗原含 量越多 ,最终 形成的 GOD 酶活 性越高 ,二 者呈正 相关。 本法对 半抗原 , 如各种 药物的 检测最 低限为 (1X10_8) 〜 (1X1(T9) m〇l/L, 检测 . 843 • 茶 碱的敏 感性为 <10;xg/mL。 PGLIA 利 用偶联 酶反应 进行测 定虽比 较复杂 ,但 由于有 以下 几个特 点:① FAD 已有 两种人 工合成 的产品 ,使 用方便 ,标记 试剂于 4X: 可保存 —年 以上; ②此法 亦适用 于检测 大分子 蛋白质 抗原; ③ 已建立 纸片比 色法的 PGLIA, 使用更 为方便 ,故 本法具 有一定 的发展 前途。 3. 克 隆酶供 体免疫 测定法 克 隆酶供 体免疫 测定法 (cloned enzymedonor immunoassay, CEDI A) 是近年 来建立 的一 种在概 念和技 术上较 新的均 相酶免 疫测定 方法。 其基本 原理是 根据大 肠杆菌 P- 半乳 糖苷 酶是由 4 个相 同亚基 组成的 四聚体 。将 大肠杆 菌乳糖 操纵子 上编码 (3- 半乳糖 苷酶亚 基的 Z 基因 用限制 性内切 酶切成 一大一 小两个 片段, 应用基 因工程 技术获 得相应 的大、 小两个 肽段。 按基端 的大肽 段称为 酶受体 (enzyme acceptor, EA), 氨基 端的小 肽段称 为 酶供体 (enzymedonor, ED)。 两者本 身均无 酶活性 ,但 EA 和 ED 可以 互补自 动装配 成亚基 ,并 聚合成 具有酶 活性的 四聚体 。用 ED 标记 小分子 半抗原 (或 抗原大 分子) 后 ,不影 响其与 EA 的自动 装配及 聚合。 但当相 应抗体 存在时 ,标 记抗原 与抗体 结合后 所致的 空间位 阻使得 酶装配 受阻。 因此利 用样品 中待测 抗原与 ED 标记抗 原和特 异性抗 体竞 争结合 ,在 反应平 衡后, 游离的 ED 标 记抗原 仍可与 EA 结合 ,形 成具有 活性的 酶 。加入 底物如 氯酚红 半乳糖 吡喃苷 测定酶 的活性 。酶 活性的 强弱与 样品中 待测抗 原含 量呈正 相关。 CEDIA 由于 试剂来 源稳定 、均一 ,制备 简单, 而且敏 感性高 ,剂量 反应曲 线线性 化, 因而为 HEI 在临床 检验中 的应用 开辟了 一条新 的途径 。目前 国外已 制成多 种商品 化 试剂盒 ,用于 T4、 T3 、皮质 醇、 地高辛 、苯巴 比妥及 维生素 B12 等小分 子激素 、药物 的定量 测定。 4. 脂质 体均相 酶免疫 测定法 脂 质体是 由磷脂 、胆固 醇和带 负电的 不饱和 脂肪酸 组成的 封闭膜 性微球 。其 结构类 似生 物膜。 脂质体 内含有 亲水性 极性基 ,可 以将辣 根过氧 化物酶 (HRP) 或碱性 磷酸酶 (ALP) 包入 其微球 膜内, 组成脂 质体膜 性结构 的磷脂 。胆固 醇等分 子上含 有氨基 ,可 用戊 二醛作 为交联 剂将特 异性抗 体连接 在脂质 体膜上 。以上 述方式 制备的 免疫脂 质体可 用于均 相酶免 疫测定 。当检 品中的 待测抗 原与脂 质体膜 上的抗 体结合 ,脂 质体的 膜性结 构遭 到破坏 ,脂 质体内 的酶便 被释放 出来, 催化底 物显色 ,即可 进行比 色测定 。若 检品 中不 含相应 的抗原 ,脂质 体膜性 结构保 持稳定 ,酶不 能释放 出来, 底物未 被裂解 ,结果 不显色 。由于 每个脂 质体内 可包含 许多酶 分子, 每个酶 分子又 可催化 许多底 物分子 ,起 到 累积放 大作用 。因此 ,脂质 体均相 酶免疫 测定法 (liposome homogeneous enzyme im- munoassay) 的灵敏 度很高 ,已 超过了 放射免 疫测定 (RIA)。 第三 节发光 免疫测 定技术 发光免 疫测定 技术是 将发光 分析和 抗原抗 体结合 而建立 的一种 新型免 疫分析 技术。 这种方 法兼具 有发光 分析的 高度灵 敏性和 抗原抗 体反应 的高度 特异性 。自从 Schroder • 844 • 和 Halman 在 20 世纪 70 年代末 期分别 用化学 发光免 疫分析 测定甲 状腺素 (T4) 以来, 发光免 疫分析 技术发 展很快 。随着 氨基酞 肼及其 衍生物 对抗原 (或 抗体) 标记方 法的建 立 ,吖啶 酯类等 发光剂 的合成 ,荧 光素酶 纯化结 晶状体 的获得 ,以 及某些 发光酶 技术、 超微 弱光检 测技术 及电化 学免疫 技术的 发展, 进一步 推动了 发光免 疫分析 技术的 发展, 使 之成为 生命科 学研究 领域中 一种新 的手段 。发光 免疫分 析技术 有下述 3 种 类型。 一 、化学 发光免 疫测定 化学发 光是指 伴随化 学反应 过程所 产生的 光的发 射现象 。某些 物质在 进行化 学反应 时, 吸收了 反应过 程中所 产生的 化学能 ,使反 应产物 分子激 发到激 发态。 当电子 从激发 态的最 低振动 能级回 到基态 的各个 振动能 级时产 生辐射 ,多 余的能 量以光 子的形 式释放 出来 ,这一 现象称 为化学 发光。 在化学 发光反 应中参 与能量 转移并 最终以 发射光 子的形 式释放 能量的 化合物 ,称为 化 学发光 剂或发 光底物 。在 发光免 疫测定 (chemiluminescence immunoassay, CLIA) 中 常用 的化学 发光剂 有:氨 基苯二 酰肼类 (主要 是鲁米 诺及异 鲁米诺 衍生物 )、 咪 唑类化 合物 (较常 用的是 2 ,4,5- 三苯 基咪唑 ,俗称 洛酚碱 ) 及吖 啶酯类 (其中 iV-N- 二甲基 吖啶 硝酸盐 ,俗称 光泽精 ,是一 种理想 的发光 标记物 )。 化 学发光 反应参 与的免 疫测定 分为两 种类型 。第 一种是 以发光 剂作为 酶免疫 测定的 底物 ,通过 发光反 应增强 测定的 敏感性 。第二 种是以 发光剂 作为抗 体或抗 原的标 记物, 直 接通过 发光反 应检测 标本中 抗原或 抗体的 含量。 化学发 光酶免 疫测定 (chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA): 其 测定过 程中 2 次 抗原抗 体反应 的步骤 与酶免 疫测定 (EIA) 相同, 仅最后 一步酶 解反应 所用底 物为 发光剂 ,通过 化学发 光反应 发出的 光在特 定仪器 上进行 测定。 CLEIA 常用 的标记 酶有辣 根过氧 化物酶 (HRP)、 碱性 磷酸酶 (ALP) 及 葡萄糖 氧化酶 (glucose oxidase, GOD) 等。 HRP 的常用 底物为 鲁米诺 或其衍 生物。 鲁米诺 的氧化 反应在 碱性条 件下进 行, 通常以 0.1111〇1/1^?18.6丁1^缓冲液作为底物液,鲁米诺和$02的工作浓度分别 为 60mmol/L 和 2mm〇l/L。 由于这 2 种试 剂在无 HRP 催化 时也能 缓慢自 发发光 ,干扰 测 定本底 ,因此 应新鲜 配制, 在使用 前即刻 混合。 ALP 应用的 底物为 磷酸盐 (adamantyldioxitase phosphate), 亦可用 ATP 作为 底物, 运用突 光素酶 -ATP 生 物体系 进行 测定。 GOD 能催化 葡萄糖 氧化为 葡萄糖 酸并形 成吒〇2, 可以 通过加 入鲁米 诺或双 (2, 4, 6- 三氯 苯基) 草酸酯 (TCPO) 和适 量的催 化剂加 以检测 。现以 CLEIA 检 测血清 标本中 T3 的含量 为例。 1. 原理 采用 TCPO 发光 体系和 GOD 标记的 T3 (三碘 甲状腺 原氨酸 ) 抗 原进行 CLEIA 竞 争 结合法 ,通 过发光 强度测 定反映 标本中 T3 含量。 葡 萄糖一 T3:(jUD> 葡 萄糖酸 + H2〇2 • 845 • H2〇2 + TCPO— C l〇 C (分子 激发态 ) ( 1 , 2-dioxetandione) + F (荧光 物质) F* (荧 光物质 激发态 ) + CQj F* + 光 (激 发态) (基态 ) 2. 操 作步骤 管 号 T3 标准品 /ng 样品管 卜 2 3 〜 4 5 〜 6 7-8 9 〜 10 1 卜 12 13 t3 抗血清 /ml 200 200 200 200 200 200 200 包 被过夜 ,去 除上清 封闭液 200 200 200 200 200 200 200 室温 30 〜 60min, 去 除上清 丁3 标准品 //iL 50 50 50 50 50 50 Tj-GOD/fiL 100 100 100 100 100 100 100 样品 /pL 50 a. 封闭液 (0.9% NaCl 含 1% BSA, pH7.0)。 旋涡 混匀, 371C 水 浴温育 3h, 去 除上清 I 生理 盐水洗 3 次 (2mL/ 次 ), 去 除上清 加入 0.5mol/L 葡萄 糖溶液 200^x17 管, 4X: 过夜 I 次日, TCPO-ANS[8-( 苯氨基 )-1- 萘 磺酸] 体 系测定 发光值 ( 取试液 100心、 ANSlOO/xL、 TCPO20CVL, 摇 匀后, 置 发光仪 中测定 30s 内的发 光积 分值) I 以发光 强度为 纵坐标 , T3 标准 品含量 (ng) 为 横坐标 ,绘 制标准 曲线。 根 据样品 管所测 得的发 光强度 ,从 标准曲 线上即 可查得 相应的 T3 含量。 3. 方 法评注 化学 发光免 疫测定 (CLIA) 亦称化 学发光 标记免 疫测定 ,是 用化学 发光剂 直接标 记抗原 或抗体 的一类 免疫测 定方法 。鲁 米诺类 和吖啶 酯类等 发光剂 均是常 用的标 记发光 剂 。魯 米诺的 发光反 应须有 催化剂 (例如 过氧化 物酶) 催化 ,且与 蛋白质 或多肽 结合后 • 846 • 其 发光作 用减弱 ,因 此鲁米 诺类在 CLEIA 中是 良好的 底物, 但已较 少用于 CLIA 的标 记 。在 CLIA 中 ,吖啶 酯类作 为抗原 或抗体 的标记 物更为 适用。 其优点 是:① 氧化反 应不需 催化剂 ,只 要在碱 性环境 中即可 进行; 反应物 在加入 H2〇2 后再加 NaOH 溶液, 发光反 应迅速 ,本 底低; ②在氧 化反应 过程中 ,结 合物被 分解, 因此游 离的吖 啶酯的 发 光不受 抑制; ③试剂 的稳定 性好。 二 、生物 发光免 疫测定 生物发 光是指 发生在 生物体 内的发 光现象 ,如萤 火虫和 细菌的 发光。 过去将 化学发 光和生 物发光 视为彼 此独立 的过程 ,随着 这一领 域研究 的深入 ,逐 渐加深 了对各 种生物 发光反 应机理 的认识 。实 际上, 生物体 内各种 发光现 象都与 化学反 应有关 ,生物 发光的 本质 是发生 在生物 体内的 一种化 学发光 。生物 发光反 应有两 种主要 类型: 1. 荧光素 •荧光 素酶发 光体系 荧光素 和荧光 素酶在 ATP、 Mg2+ 和 〇2 存在的 条件下 发生发 光反应 。其 反应式 如下: E+LH2 + ATP-^E-LH2-AMP + PPi (焦 磷酸) (1) E-LH2-AMP + 〇2 — ^ 氧化型 荧光素 ( 激发态 ) + C〇2 + AMP (2) — - 氧化型 荧光素 (基态 )+ 光 上述 反应过 程中, 萤火虫 荧光素 (LH2)、 荧 光素酶 (E) 在 ATP、Mg2+ 存在时 ,先 形成 E-LH2-AMP 复合物 。然 后与 氧作用 ,被 氧化脱 羧产生 激发态 氧化型 荧光素 。当其 从激发 态回到 基态时 ,多余 的能量 以光子 的形式 释放出 。发 光光谱 范围为 500 〜 650nm, 峰值为 562nm〇 2. 发光细 菌的发 光体系 细菌发 光是由 细菌荧 光素酶 (E) 所催化 ,需要 黄素单 核苷酸 (FMN)、 氧 和直链 脂肪醛 (RCHO) 参与的 一个复 杂过程 。细菌 发光的 反应过 程大致 如下: E + FMN . H2 • FMNH2 . FMNH2 • 〇2 RCHO r _ , ► E • FMN • 〇2 — K ^ + FMN + RCOOH + H20 + hr RCHO 发光 细菌的 发光光 谱范围 均在可 见光范 围内, 420~670mn 之间。 峰值在 475 〜 485mn 左右 ,光呈 黄绿色 ,图谱 呈单一 发射峰 ,没 有精细 结构。 生物 发光免 疫测定 ( bioluminescence immunoassay , BLIA) 是利用 生物发 光物质 或参与 生物 发光反 应的辅 助因子 (如 NAD、ATP 等) 标 记抗原 或抗体 。抗原 抗体反 应后, 运用生 物 发光反 应进行 检测。 . 847 . 三、 电化学 发光免 疫测定 电化 学发光 (ECL) 与 一般化 学发光 (CL) 不同 ,是一 种在电 极表面 ,由 电化学 引发的 特异性 化学发 光反应 ,实 际上包 括了电 化学和 化学发 光两个 过程, ECL 和 CL 的 差 异在于 ECL 是电启 动的发 光反应 ,而 CL 是通 过化合 物启动 的发光 反应。 因此, ECL 反应 更易精 确控制 ,更 具有灵 活性。 ECL 的 发光剂 为三联 吡啶钌 [RU(bpy)i+], 电子 供体为 三丙胺 (TPA)。 在阳 电极表 面 ,两种 化学物 质可同 时各失 去一个 电子发 生氧化 反应。 二价的 RU(bpy)〗+ 被氧 化成三 价的 RU(bpy)〗+ , 后 者是一 种强氧 化剂。 TPA 被 氧化成 阳离子 自由基 TPA+ •,其 性质很 不稳定 ,可 自发地 失去一 个质子 (H+), 成为 自由基 TPA •,这 是 一种非 常强的 还原剂 ,可 将 一个电 子递给 三价的 RU(bpy)〗+ , 使其 形成激 发态的 RU(bPy)!+ •,而 TPA 自 身被氧 化成氧 化产物 二丙胺 和丙醛 。激 发态的 RU(bpy)〗+ , 在衰减 时发射 波长为 620nm 的光 子 ,重 新生成 基态的 RU(bpy)〗+。 这 一过程 在电极 表面周 而复始 地进行 ,产 生许多 光子, 使信 号得以 放大。 在 电化学 发光免 疫测定 (electro-chemiluminescence immunoassay, ECLIA) 中 ,使 用 活化的 RU(bpy)〗+ 羟基琥 珀酰胺 (NHS) 衍生 物作为 标记物 ,可与 抗体及 不同结 构 的抗原 分子稳 定结合 ,制成 标记的 抗体或 抗原。 ECLIA 的测定 模式与 ELISA 相似, 可 根据待 测分子 的大小 设计成 多种反 应模式 ,如 竞争法 、抗 体夹心 法等。 以抗体 夹心法 测定抗 原为例 ,反 应分 两个步 骤进行 。第 一步将 RU(bPy)〗+-NHS 标记的 抗体、 吸附在 磁性微 球上的 固相抗 体以及 含待测 抗原的 标本在 试管内 混合进 行温育 ,其 反应式 如下: 固 相抗体 + RU(bPy)〗 + -NHS 标记 的抗体 + 待测抗 原—抗 原抗体 复合物 + 游离 的抗体 第 二步通 过蠕动 泵将反 应液注 入检测 仪器的 流动反 应室内 ,含 磁性微 球的抗 原抗体 复合物 和游离 的固相 抗体被 反应室 下面的 磁铁吸 附于电 极表面 。紧 接着由 蠕动泵 输入含 三丙胺 (TPA) 的 缓冲液 ,将游 离的标 记抗体 和未参 与反应 的其他 物质随 冲洗液 从反应 室流出 。同时 通过增 加电极 的电压 启动电 化学发 光反应 。发 出的光 由光电 倍增管 转换为 电信号 , 通过电 信号的 测定反 映标本 中待测 抗原的 含量。 第四 节生物 素与亲 和素标 记技术 生物素 -亲和 素系统 (biotin-avidin system, BAS〉 是 20 世纪 70 年代 后期应 用于免 疫学 并得到 迅速发 展的一 种新型 生物反 应放大 技术。 BAS 除具有 生物素 与亲和 素之间 高度 的亲和 力和特 异性结 合外, 二者均 可偶联 抗体等 一系列 大分子 生物活 性物质 ,又可 被 荧光素 、酶 、放 射性同 位素、 胶体金 等各种 示踪物 所标记 。同 时由于 1 个亲和 素分子 可与 4 个生 物素分 子牢固 地结合 ,从而 产生多 级放大 效应, 使各种 示踪免 疫测定 技术的 特异性 和敏感 度进一 步提高 。因 此, BAS 被广 泛应用 于生物 学和医 学的各 个领域 ,既 可 用于微 tt 抗原 、抗体 及受体 的定量 、定 性检 测及定 位分析 ,亦可 制成亲 和介质 用于各 类反 应物的 分离和 纯化。 • 848 . 1. 生物素 生 物素与 亲和素 的生物 学特性 生物素 (biotin, B) 广泛分 布于动 、植物 组织中 ,常 从含 量较高 的卵黄 (a 型) 及 肝组织 (P 型) 中 提取, a、 (3 两型 的生物 活性基 本相同 ,现 已能人 工合成 。生物 素在机 体内以 辅酶形 式参与 各种羧 化反应 ,故 又称 为辅酶 R 或维 生素 H。 分子 质量为 244.31, 分 子式为 C1QH1603N2S, 有 两个环 形结构 ,其中 I 环为咪 唑酮环 (亦称 ureido 环 ), 是与 亲和 素结合 的主要 部位。 II 环为 噻吩环 ,带有 一个戊 酸侧链 ,其末 端羧基 是结合 抗体和 其 他生物 大分子 的惟一 结构。 生物素 戊酸侧 链的羧 基经过 化学修 饰可以 合成带 有各种 活性基 团的衍 生物, 称为活 化 生物素 ,以适 合与各 种生物 大分子 结合的 需要。 主要 用于标 记蛋白 质氨基 的生物 素衍生 物有: 生物素 JV- 羟基 丁二酰 亚胺酯 (BNHS)、 生物 素对硝 基酚酯 (PBNP) 和活 化长臂 生物素 (BCNHS), 后 者是在 生物素 与 N- 羟基 丁二酰 亚胺之 间添加 2 分子 6- 氨基己 酸甲酯 ,犹 如给生 物素增 添一只 手臂, 使 其与抗 体或酶 结合后 ,不受 空间位 阻效应 的影响 ,更易 与亲和 素结合 ,从 而增 加检测 方法 的灵敏 度和特 异性。 用于 标记蛋 白质醛 基的生 物素衍 生物有 :生物 素酰肼 (BHZ) 和 肼化生 物胞素 (BCHZ), 由 于在生 物素的 羧基侧 链上带 有肼基 (hydrazme) 能与带 醛基的 蛋白质 结合, • 主要 用于标 记偏酸 性的糖 蛋白。 BCHZ 能 与蛋白 质的醛 基和氨 基结合 ,优 于只能 与醛基 结合的 BHZ。 标记蛋 白质巯 基的有 赖氨酸 生物素 -丙氨 -iV- 顺丁 烯二酰 亚胺。 上述 BNHS、 BCNHS 和 BHZ 均 可标记 DNA, 与 胞嘧啶 4 位结合 。此外 ,常 用光敏 生物素 ,在其 一端连 接有一 个芳香 基叠氮 化合物 的光敏 基团。 在一定 波长的 光照下 ,该 光敏 基团可 转变为 芳香基 硝基苯 ,可与 腺嘌呤 N-7 位结合 ,得 以标记 DNA 和 RNA。 2. 亲和素 亲和素 (avidin, A) 亦称抗 生物素 蛋白、 卵白素 ,是 从卵白 蛋白中 提取的 一种碱 性糖 蛋白。 等电点 (pi) 为 10 〜 10. 5, 含 碳水化 合物约 10%, 分子 质量为 68kDa。 纯 品为白 色粉末 ,易 溶于水 ,在 PH9 〜 13 的碱 性溶液 中保持 稳定。 耐热并 耐受多 种蛋白 酶 的水解 作用; 80X: 加热 2mm 仍保持 活性, 特别是 和生物 素结合 后十分 稳定; 但对强 光和 Fe2+ 比 较敏感 。亲 和素由 4 个相同 的亚基 组成, 能结合 4 个 分子的 生物素 。亲和 素 与生物 素之间 的亲和 力极强 (KazlxK^mor1), 比 抗原与 抗体的 亲和力 [Ka = (lXlOq — dxiO11) mor1] 高 1〇 万〜 1〇〇 万倍。 因此二 者能快 速结合 ,而且 反应不 受外 界干扰 ,具有 高度特 异性和 稳定性 。亲和 素富含 色氨酸 (约占 6%), 与其 生物活 性密 切相关 ,即借 助色氨 酸残基 与生物 素的咪 唑酮环 结合。 以结合 l/xg 生 物素所 需的亲 和素 量作为 其活性 单位, lmg 纯 的亲和 素约含 13~15 个活性 单位。 3. 链霉 亲和素 链霉 亲和素 (streptavidin, SA) 是 链霉菌 Streptomycesavidini 在培养 过程中 分泌的 . 849 . —种 蛋白质 产物, 1L 培养液 中约含 SA10 〜 60mg, 主 要通过 a- 亚 氨基生 物素琼 脂糖凝 胶亲和 层析法 提纯。 SA 的分子 质量为 60kDa, 由 4 条 序列相 同的肽 链组成 ,如 同亲和 素 一样, 1 个 SA 分子也 能结合 4 个生物 素分子 ,亲 和常数 (Ka) 亦为 lXl〇15m〇l - 、 SA 的 酸性氨 基酸含 董较多 ,是一 种稍偏 酸性的 蛋白质 ,其 PI = 6.0, 并 且不带 任何糖 基 。而亲 和素的 碳水化 合物含 量高达 10%, Pi 为 1〇 〜 10.5。 因此, SA 在检测 应用中 表现 出的非 特异性 吸附远 低于亲 和素, 故而逐 渐取代 后者。 SA 的 活性单 位也是 以结合 l^tg 生 物素所 需的量 来表示 , lmg SA 的 最高活 性可达 18 个 单位。 近年来 SA 的克 隆基因 在大肠 杆菌中 的表达 已获得 成功。 Sano 等将构 建的重 组质粒 转染大 肠杆菌 ,在加 入适量 外源生 物素维 持细菌 生长的 条件下 ,诱导 5h, SA 基 因的表 达蛋 白占整 个菌体 蛋白的 35% 以上 ,用 6mol/L 盐酸 胍透析 (pHl. 5), 可以获 得近似 均质 的纯化 SA, 产量为 3.9~6.5mg/100mL 培养液 ,且 活性 良好。 二、 生物素 与亲和 素标记 (一) 生物素 结合物 的制备 1. 生物素 化抗体 的制备 (1) 用; V,iV- 二甲基 甲酰胺 (DMF) 将 BNHS 配成 lmg/mL 溶液。 (2) 用 0.1mol/L pH9.0 NaHC03 将纯化 的抗体 IgG 稀释为 1 〜 2mg/mL。 (3) 按 BNHS 与 IgG 的容 积比为 1:8 〜 1:15 ( 或重 量比为 1:7 左右) 混合, 室温搅 拌 下反应 2 〜 4h。 (4) 装入透析袋,对0.05mOl/LpH7.2PBS4t:透析过夜。结合物内加等体积甘 油 ,小量 分装, -30X: 冻存 备用。 2. 生物素 化抗原 的制备 标记偏 酸性的 蛋白抗 原常用 BHZ。 以标记 HBsAg (pl = 4.0~4.4) 为例: (1) 取纯化 HBsAg lmg 溶于 0.01mol/L pH7.2 PBS 0_5mL。 (2) 加入60mmol/LNaI040.1mL,4 酸盐 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC, 发散橘 红色荣 光 ), 得克 萨斯红 (Texas red, 发散 粉红色 荧光) 和 太平蓝 (Pacific blue, 发散 海蓝色 荧光) 等。 2. 免疫 酶技术 即将抗 体与某 种生物 酶结合 ,然 后与 组织细 胞温浴 ,最 后用生 物酶的 底物和 显色剂 显示抗 原部位 。因 为反应 产物具 有颜色 ,故可 用普通 显微镜 观察。 目前常 用的生 物酶有 竦 根过氧 化物酶 (免 疫过氧 化物酶 技术) 和碱性 磷酸酶 ( 免疫碱 性磷酸 酶技术 ), 见图 13. 1 (a) 〜 (d)〇 • 858 • 3. 免疫胶 体金和 免疫金 银技术 指 将胶体 金与抗 体结合 ,然 后与组 织细胞 反应, 胶体金 颗粒具 有很高 的电子 密度, 故 标记后 的标本 可以直 接用电 子显微 镜观察 。但是 如果需 要用光 学显微 镜观察 ,则 需要 做银增 强反应 ,即 所谓 免疫金 银技术 ,见图 13.1(e)。 4. 免 疫铁蛋 白技术 是 最早的 免疫电 镜技术 ,目前 已很少 使用。 图 13.1 常 用免疫 组化染 色方法 (a) 直 接免疫 酶标染 色法; (b) 间 接免疫 酶标染 色法; (c)PAP 免疫酶 标法; (d) ABC 免疫酶 标法; (e) 免疫 金银染 色法。 Ag: 抗原; HRP: 辣根 过氧化 物酶; RAH: 兔抗人 抗体; GAR: 羊抗兔 抗体; HRP-R-PAP: 辣 根过氧 化物 酶标兔 PAP 复 合物; ABC: 卵 白素生 物素复 合物; A: 卵 白素; B: 生 物素; B-GAR: 生物 素标记 羊抗兔 抗体; Silverlayer: 金属 银层; Gold-GAR: 金 标羊抗 兔抗体 二 、按 染色步 骤分类 1. 直接法 指 将标记 物直接 标记在 针对特 定抗原 的抗体 (或称 一抗) 上。 其优点 是方法 简便, • 859 . 节 省时间 ,而且 没有其 他抗体 的参与 ,故特 异性强 。缺点 是信号 没有得 到放大 ,故 敏感 度较低 ,见图 13.1 (a)。 2. 间接法 指将标 记物标 记在针 对一抗 的抗体 (或 称二抗 、抗 抗体) 上, 让没有 标记的 一抗与 组织 细胞反 应之后 ,再让 有标记 物的二 抗与组 织细胞 反应。 其优点 是不需 要标记 特定的 一抗 ,而 且敏感 度提高 ,见图 13.1(b)。 3. 非 标记抗 体酶复 合物法 非 标记抗 体酶复 合物法 (unlabelled antibody enzyme complex method) 指将 生物酶 免 疫动物 ,来获 取针对 生物酶 的抗体 。然 后将 此抗体 与生物 酶结合 制备成 可溶性 酶-抗 酶复 合物, 然后将 此复合 物在二 抗之后 ,加入 组织细 胞反应 。如果 用辣根 过氧化 物酶作 为 免疫原 ,则复 合物称 为过氧 化物酶 - 抗过氧 化物酶 复合物 ( peroxidase-antiproxidase complex, PAP)。 使用 此复合 物的染 色技术 则称为 PAP 法 。如用 碱性磷 酸酶作 为免疫 原 ,则复 合物称 为碱性 磷酸酶 - 抗碱性 磷酸酶 复合物 (alkaline phosphatase- anti-alkaline phosphatase complex, APAAP), 使用此 复合物 的技术 则称为 APAAP 法。 非标记 抗体酶 复合 物法虽 然步骤 复杂, 但比上 述两种 方法更 为敏感 ,因此 使用更 为广泛 ,见图 13.1 (c)〇 4. 亲和素 -生物 素系统 亲和素 -生物 素系统 (avidin-biotin system) 方法 基于卵 白中的 糖蛋白 ,即亲 和素与 生 物素的 极高亲 和性发 展而来 。亲 和素由 4 个 亚单位 组成三 级结构 ,分子 中具有 4 个生 物素结 合部位 。生 物素则 为一相 对分子 质量很 小的维 生素, 极易与 抗体和 生物酶 结合。 亲和素 -生物 素系统 中的主 要方法 是用保 留有亲 和素结 合部位 、并 且标记 有生物 酶的所 谓 ABC 复合物 (avidin-biotin complex, ABC), 作 为第二 层试剂 ( 即在用 标记有 生物素 的二抗 之后) 与 组织细 胞反应 。因 为一个 抗体分 子上能 结合多 个生物 素分子 ,所 以此方 法 的敏感 度极高 ,因而 使用最 为普遍 ,见图 13.1(d)。 5. A 蛋 白技术 此 技术基 于葡萄 球菌甲 种蛋白 与抗体 免疫球 蛋白的 高度亲 和性。 A 蛋白 上可 以标记 上 述任何 标记物 。一般 将有标 记物的 A 蛋白取 代二抗 ,作 为第二 层试剂 使用。 此技术 的 优点是 A 蛋白 对大鼠 、小鼠 、兔和 羊的免 疫球蛋 白均有 亲和性 ,故可 用于多 种一抗 的免疫 染色。 6. 其 他方法 如 非标记 酶桥法 (unlabelled antibody bridge method)、 标记 抗原法 (labelled antigen method) 、 金 标抗原 测法 (g〇ld-labelled antigen detection, GLAD)、 杂交 抗体法 (hy- l)rid antibody method)、 混合凝 集免疫 组化法 (mixed agglutination immunohistochemical staining, MAGIC method) 等0 但使 用均不 普遍。 • 860 • 此外, 免疫组 化技术 还可以 按标记 组织细 胞中抗 原的多 少分为 :单标 (single la- belling), 即 只在切 片或细 胞中显 7K —种 抗原; 双标 (double labelling), 即 同时显 7K 两种 抗原; 三标 (triple labelling), 即 同时显 7K 3 种抗原 。免疫 电镜技 术中还 可依染 色步骤 分 为包埋 前染色 (pre-embedding staining) 和包埋 后染色 (post-embedding staining), 包 埋是 指制作 供电镜 观察用 的切片 时的树 脂包埋 过程。 第二节 原位杂 交技术 的分类 按标记 物分类 1. 放 射性原 位杂交 一 般用氰 、磷或 硫的同 位素标 记探针 。标 记过程 简单, 但需要 接触放 射线和 使用感 光乳胶 。曝光 时间长 ,且 分辨率 较低。 2. 非放 射性原 位杂交 常用 的标记 物有荧 光素, 即所谓 Fish 法 (fluorescein-labelled in situ hybridization); 生 物素; HRP 或洋地 黄毒苷 (digoxigenin)。 无论 使用放 射性或 非放射 性技术 ,均可 使用以 下几种 探针: (1) 寡核苷 酸探针 ,指在 试管内 合成的 20~30 碱 基单股 DNA 序列 。一般 用末端 标记 法制备 探针。 (2) 单链 RNA 探针 ,一般 用体外 转录法 制备。 (3) 双链 DNA 探针 ,一般 用切口 平移法 (nick translation)、 随机引 物法或 聚合酶 链 式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 制备 探针。 二 、按 标记方 式分类 1. 直接 原位杂 交技术 指将显 微镜下 可见的 标记物 (marker 或 reporter) 直接 与探针 相结合 ,杂交 后在显 微镜 下直接 检测标 记物。 能够用 来作为 直接标 记的标 记物包 括放射 性同位 素或荧 光素。 此方 法的优 点是简 单快速 ,但如 果使用 的是非 放射性 标记物 ,则往 往因为 杂交中 的组织 处理 会丢失 或破坏 标记物 ,从而 影响敏 感度。 2. 间接 原位杂 交技术 指使用 在显微 镜下不 可见的 标记物 来标记 探针, 然后使 用亲和 细胞化 学或免 疫组化 技术来 检测标 记物。 目前常 用的此 类标记 物有生 物素和 Borhringer Mannheim 公 司专利 产品地 高辛。 . 861 . 第 三节免 疫组化 染色和 原位杂 交技术 中的组 织处理 免 疫组化 染色技 术的基 本要求 有两点 :一是 需要保 存组织 细胞的 形态学 特性; 二是 要 保存蛋 白质的 抗原性 。组织 细胞形 态学特 性的保 存首先 需要将 其固定 ,其 次是 需要用 包 埋剂包 埋后制 成切片 (细 胞标本 尚可制 备成细 胞涂片 )。 但是大 多数蛋 白质抗 原在经 过供 普通形 态学研 究的所 谓常规 固定包 埋之后 ,会失 去其抗 原性而 不能用 免疫染 色显示 出来 。一般 认为, 蛋白质 抗原在 普通固 定液固 定以及 其后的 组织处 理之后 ,其分 子结构 及 其抗原 决定部 位并未 被破坏 ,而 是固定 剂造成 的蛋白 质交联 (cross-linking) 妨碍了 抗体对 其抗原 结合部 位的结 合所致 。对 这一问 题的解 决方法 有以下 几点。 (1) 避 免使用 固定剂 。这种 情况仅 用于对 细胞表 面抗原 的标记 ,尤 其是 对一些 CD 抗原 的染色 。适用 于细胞 涂片, 细胞在 染色之 后进行 固定。 (2) 使用不 易导致 蛋白质 交联的 固定剂 ,如 丙酮 、甲醇 、乙 醇等 。组 织学技 术中常 用的 Zenker 氏液 中含有 酸和重 金属汞 ,也是 一种较 好的固 定剂。 (3) 如果 对形态 学要求 较高, 必须选 择交联 性较弱 的醛类 固定剂 。如 甲醛要 比戊二 醛 交联性 要弱。 (4) 使用冰 冻切片 。但是 冰冻切 片的形 态学特 性的保 持显然 差于石 蜡切片 或塑料 切片。 (5) 在染色 之前进 行蛋白 酶消化 ,以 打开蛋 白质的 交联, 暴露抗 原决定 部位。 (6) 在染色 之前进 行所谓 抗原抽 提处理 (antigen retrieval)。 一般是 将切片 置于弱 酸中 ,于 微波炉 内煮沸 数分钟 。其 目的亦 是破坏 其蛋白 质交联 ,暴露 抗原决 定簇。 原 位杂交 技术的 组织处 理和免 疫组化 技术略 有不同 。研 究表明 ,蛋白 质沉淀 剂如醇 类 不适合 DNA 或 RNA 的保存 。故 应选 用醛类 固定剂 为主。 第四节 常用的 免疫组 化技术 一 、培养 细胞的 免疫荧 光染色 1. 原理 荧光是 指某些 特殊原 子吸收 特定波 长的光 ,再 经过一 个短暂 的荧光 生命期 (fluo- rescence lifetime) 之后 ,发放 出波长 比吸收 光更长 些的光 。一 种荧 光分子 只能吸 收某一 特定波 长的入 射光, 称为吸 收光带 (absorption bands)。 焚光 的发散 亦有其 特定的 波长。 荧光分 子吸能 的过程 发生于 不同原 子轨迹 中多个 紧密相 连的振 荡和旋 转的受 激状态 。就 其 物理性 能来看 ,光 的吸收 过程发 生很快 ( 大约为 l〇~15s), 此 过程相 当于荧 光染料 (fluorophore) 从基态 (ground state) 转 变为激 化状态 (excited state) 的受 激过程 。在 此 后大约 10 〜 11s 以内 ,荧光 分子恢 复到最 低的激 化状态 (S1)。 当 荧光分 子再从 S1 弹 回基态 时则伴 有光子 的发散 ,即物 理上所 谓荧光 的产生 。虽 然市面 上有数 百种荧 光染料 可 供选择 ,它 们的发 光强度 、吸收 和发散 光谱彼 此不同 。常 用的荧 光染料 大致为 3~4 种 。如 果只是 标记一 种抗原 ,最常 用的荧 光素为 FITC (发绿 色荧光 )。 如 果需要 标记两 • 862 . 种抗原 ,则 可以考 虑加四 异硫氰 酸盐或 得克萨 斯红。 如果要 进行三 重标记 ,则还 可以加 入太 平蓝。 文献上 还常常 使用碘 化丙铤 (propidium iodide) ( 激发光 波长为 536nm, 发 散光 波长为 617nm) 或者 DAPI ( 激发光 波长为 358nm, 发散光 波长为 461nm) 来复染 细胞核 ,因 为此 两种荧 光素不 需抗体 即可以 特异性 与细胞 核内的 DNA 结合 (图 13.2a, b)〇 图 13.2 免疫 荧光多 重标记 a: 培养 猪肺血 管内皮 细胞; b: 同 一切片 ,激 光共轭 显微镜 图像。 细胞内 纤维肌 动蛋白 较普通 荧光显 微镜照 片更为 清晰。 如 前所述 ,免 疫荧光 染色中 使用某 种荧光 素来标 记抗体 ,然后 与组织 细胞起 反应。 染色 后的标 本检测 需要使 用荧光 显微镜 或者使 用以激 光照明 的激光 共聚焦 显微镜 。共聚 焦显 微镜使 用光电 管直接 成像于 电视监 测器。 2. 材料 生 长有细 胞的玻 片或细 胞涂片 、细胞 离心片 固定剂 (-20X: 甲醇、 2%~4% 多 聚甲醛 /PBS 或 0.5% 戊二醛 /0.5% TritonX- 100/PBS) PBS 缓冲液 非特异 性着色 封闭剂 (一 般使用 来自第 二抗体 种属的 3% 的 血清或 1% 卵白 蛋白, 均用 PBS 配制) 细胞膜 通透剂 (0.05% Triton X-100、 NP-40 或 0.05% 〜 0.1% 毛地 黄皂苷 或皂角 苷) 适当浓 度的第 一抗体 、标记 有荧光 素的第 二抗体 染 色湿盒 封固剂 (如 缓冲 甘油、 Vectorshield 等) 盖玻片 37X: 温箱 或烤箱 ( 虽然染 色可以 在室温 下完成 ,但 是使用 烤箱可 以节约 时间) 染色缸 (立式 或卧式 均可) 荧光显 微镜或 共聚焦 显微镜 . 863 . 3. 操 作步骤 (1) 用 PBS 稍洗 细胞。 (2) 固定 细胞。 ① 如果 要显示 膜抗原 ,则 细胞可 不进行 固定直 接染色 或选用 2% 多 聚甲醛 (用 PBS 稀释 4% 多聚 甲醛) 在室温 下或冰 上固定 5min, 以保 证细胞 膜的完 整性。 ② 如果显 示细胞 胞质或 细胞核 内抗原 ,则 可以用 2% 多聚甲 醛加上 0.1% Triton X-100 固定 30min, 或者用 -20X: 的 纯甲醇 内固定 5min, 然后于 -20X: 丙酮 内固定 30s, 以进一 步增加 膜的通 透性。 ③ 如 果细胞 内抗原 量很少 或者需 要保持 较好的 形态学 特性, 则可以 选用戊 二醛固 定 。但是 用戊二 酸固定 后需要 所谓萍 灭过程 (quenching), — 般是在 lmg/mL 硼 酸钠溶 液 内处理 30min。 (3) PBS 稍洗。 (4) 封闭 非特性 染色: 可以用 1% 卵蛋白 /PBS 作用 10 〜 30min, 也可 用免疫 前血清 ( 一般是 3% 正常羊 血清) 封闭 30min。 (5) 吸除 封闭剂 (但 不洗涤 )。 (6) 一 抗温浴 : 一 般用 封闭剂 稀释, 在室温 下反应 45min~2h。 (7) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5 〜 lOmin。 (8) 有荧光 素标记 的二抗 温浴。 条件同 一抗。 (9) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5 〜 lOmin。 (10) 封 片:用 缓冲甘 油或者 Vector Shield。 (11) 荧光 显微镜 观察。 免疫荧 光染色 后的切 片应放 置于冰 箱内避 光保存 。因为 荧光素 在紫外 线照射 下迅速 淬灭。 目前市 面 上可以 购买能 延缓洋 灭的化 学物质 ,如 丙基没 食子酸 (propylgallate)、 氢酿 (hydroquionone)、 对苯 二胺 (p-phenylenediamine) 等。 据认为 ,这些 化学物 质延缓 荧光淬 灭的原 理是减 少染液 中的氧 分子。 Vector 公司的 Vector Shield 封片 剂即含 有上述 物质。 4. 方 法评注 培 养细胞 一般依 其是否 贴附培 养器皿 分为贴 附细胞 (adherent cell) 或悬 浮细胞 (suspension cell)。 贴附 于载玻 片或盖 玻片的 细胞与 组织细 胞的切 片一样 在染色 缸内染 色。 而悬浮 细胞的 染色则 可选用 两种方 法:一 是直接 在试管 内染色 ,最后 将染好 了的细 胞滴附 在载玻 片上, 显微镜 观察; 另外也 可以将 细胞制 成细胞 离心片 (cytospin) 后进 行免疫 染色。 细胞的 固定因 所要检 测的抗 原而异 ,如 仅对膜 表面抗 原进行 染色, 用低浓 度的 多聚甲 醛即可 。对 固定剂 敏感的 抗原染 色可以 在染色 之后进 行固定 (染 色应在 4X: 下进行 )。 如对细 胞内或 细胞核 内抗原 染色, 还需要 增加细 胞膜对 染色剂 通透性 的处理 ( 如使用 去污剂 )。 就方 法而言 ,一 般使用 直接法 ,因为 能迅速 获取染 色结果 。如 果信号 过 于微弱 ,则可 以考虑 使用更 为敏感 的间接 法或者 其他信 号放大 方法。 • 864 . 1. 原理 二 、组织 切片的 免疫荧 光染色 在组织 切片上 进行免 疫荧光 染色的 原理与 细胞染 色相同 ,不同 的是进 行免疫 荧光染 色 时多是 使用组 织的冰 冻切片 ,且一 般不需 要使用 细胞通 透剂。 2. 附 加材料 冰冻 切片机 冰冻 包埋模 冰冻 包埋剂 (OCT compound) 3. 操 作步骤 (1) 组 织的冰 冻:将 新鲜组 织切成 <1.0(:1«\1.〇〇11\〇.5£:111的组织块,平置于冰 冻包埋 模底部 (亦 可用铝 箔自制 )。 然后用 OCT 包埋 剂包埋 组织, 立即置 于干冰 冷却的 异戊焼 (isopentane) 内冰冻 (- 70 80*C )。 一般 3~5min 即可。 (2) 冰冻切 片机上 切片。 一般是 5~10/um 厚。 (3) 快 速空气 干燥。 此 步骤十 分重要 ,否则 切片易 脱离。 (4) 固定: 一般用 丙酮或 4% 多聚甲 酵固定 ,室 温下 lOmin。 (5) PBS 稍洗。 (6) 封闭非 特异性 染色: 可以用 1% 卵蛋白 /PBS 作用 10~30min 或 者用第 二抗体 制 备动物 的免疫 前血清 ( 一般是 3% 正常羊 血清) 封闭 30min。 (7) —抗 温浴: 一般用 封闭剂 稀释, 在室温 下反应 45min 〜 2h。 (8) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5 〜 lOmin。 (9) 用有荧 光素标 记的二 抗温浴 。条 件同 一抗。 (10) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5~10min。 (11) 封片 。一般 用缓冲 甘油或 其他水 性封闭 介质。 (12) 荧光 显微镜 观察。 4. 方 法评注 因为组 织的切 片过程 基本上 暴露了 细胞和 细胞核 内结构 ,故一 般不需 要使用 细胞通 透剂 (有人 仍然在 洗涤缓 冲液内 加入少 量此类 物质以 降低背 景染色 )。 进 行免疫 荧光染 色时一 般是使 用组织 的冰冻 切片。 其原因 是冰冻 切片过 程简单 、快速 ,能 够很快 获取实 验结果 。而石 蜡包埋 后的组 织切片 内往往 存在较 多的自 发荧光 ,并 且因为 包埋过 程掩盖 较多的 抗原决 定部位 ,所 以需 要使用 较为敏 感的染 色技术 ,如免 疫酶标 技术。 • 865 • 1. 原理 三 、组 织石蜡 切片的 PAP 过氧化 物酶染 色技术 如 前所述 ,免 疫酶标 技术是 将某种 生物酶 作为标 记物与 抗体相 结合, 在组织 细胞内 检 测抗原 的技术 。生 物酶与 抗体的 结合一 般是通 过某种 交联化 学物质 ,如 戊二醛 ,将生 物酶与 抗体相 互交联 。标 记有生 物酶的 抗体结 合到抗 原部位 之后, 需要通 过显色 反应才 能 被检测 。其 基本原 理是, 在加入 特定的 酶底物 (如 HRP 的特 定底物 为过氧 化氢) 的 同时 ,加入 一种显 色剂, 此种显 色剂将 生物酶 与底物 作用而 产生的 反应产 物捕捉 (cap- ture) 之后, 形成某 种不溶 性的有 色沉淀 。例如 ,当 HRP 与其底 物过氧 化氢反 应时, 首先是 酶与底 物形成 复合物 ,并 伴有其 分子上 血红素 辅基的 氧化。 但是如 果在此 反应中 加入电 子供体 ,则 反应继 续进行 而形成 第二种 复合物 。反应 的第三 个阶段 是此种 复合物 解体, 生物酶 恢复其 还原状 态并释 放被氧 化的电 子供体 。目前 供显示 HRP 的显 色剂如 DAB 正是在 HRP 与底 物过氧 化氢的 反应中 起电子 供体的 作用。 DAB 在反 应中被 氧化而 通过 自身分 子间的 游离键 彼此反 应而转 变成具 有高度 电子共 振的聚 合物。 此聚合 物不仅 具 有颜色 、不溶 ,而 且在 锇酸螯 合之后 具有很 高的电 子密度 ,故也 可用于 电子显 微镜水 平下 的免疫 染色。 如图 13.1 所示, PAP 过氧 化物酶 染色技 术在将 组织细 胞与第 一抗体 和第二 抗体反 应之后 ,在 切片 中加入 PAP 复 合物。 PAP 复合物 的制备 是将动 物接种 HRP, 然 后提取 免疫动 物的抗 HRP 抗体 ,在体 外再与 HRP 结 合而成 。染色 过程中 的第二 抗体一 方面与 第一抗 体结合 ,另 一方 面也与 PAP 复合物 中的抗 体结合 。故 起到将 一抗和 PAP 复合物 相连 的桥梁 作用, 从而将 HRP 结 合到抗 原部位 ,见图 13.1(c)。 2. 附 加材料 0.3% 双氧水 / 甲醇 适 当浓度 PAP 复合物 •• 苏木 素染液 石蜡切 片设备 DAB 显 色液或 AEC 显色液 3. 试 剂配制 联苯 一 胺 ( 3 , 3'-diaminobenzidine tetrachloride, DAB) 显色 液:将 5mg DAB 溶于 10mL0.05mol/LTBSPH7.6, 待 到完全 溶解后 ,加入 O.lmL 新鲜 配制的 1% 双 氧水。 使用 前过滤 ,并立 即使用 。此试 剂被认 为有致 癌作用 ,故应 注意个 人防护 和环境 污染。 3- 氨基- 乙咔唑 (3-amino*9-ethy 丨 carbazole, AEC) 显色 液:将 lOmgAEC 溶 于二甲 基亚砜 ( dimethyl sulphoxide, DMSO), 然 后加入 50mL 0.02mol/L 乙酸 缓冲液 (pH5.0~5.2)。 最 后加入 0.4mL0.3% 双氧水 ,立即 使用。 • 866 • 4. 操 作步骤 (1) 切 片脱蜡 至水。 (2) 封闭内 源性过 氧化物 酶:一 般是将 切片在 0.3% 双氧水 / 甲醇内 在室温 下处理 lOmin, 以彻底 消耗其 活性。 正 常组织 细胞内 含有过 氧化物 酶活性 ,如 果不进 行处理 ,则影 响染色 结果的 分析。 (3) PBS 洗涤。 (4) 封闭 非特异 性染色 。可以 选用卵 蛋白或 正常动 物血清 ,室 温下 l〇~30min。 (5) —抗 温浴, 室温下 45min~2h。 PAP 复合物 的选择 取决于 制备一 抗的动 物种属 。一般 常用的 PAP 复合 物是抗 家兔的 复合物 ,故 第 一抗体 应使用 家兔的 多克隆 抗体。 (6) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (7) 加抗家 兔免疫 球蛋白 IgG 的二抗 (一 般来自 羊或猪 ), 室温 下反应 45min。 (8) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (9) PAP 复合物 温浴, 室温下 45min。 其 浓度按 厂家的 说明书 而定。 (10) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (11) 显色 ,一 般反应 时间是 lOmin 左右。 首次 染色应 在显微 镜下经 常检査 ,以 确定最 佳显色 时间。 DAB 的反应 产物呈 棕色, 并能耐 受乙醇 脱水和 二甲苯 透明。 AEC 的反应 产物为 紫红色 ,但 溶于 乙醇和 二甲苯 ,故 显色后 的切片 不能用 乙醇脱 水 和二甲 苯透明 。切片 应用水 溶性封 固介质 封片。 (12) 自来 水洗。 (13) 复 染:一 般是用 苏木素 复染细 胞核。 (14) 如果用 DAB 显色 ,则 切片可 用乙醇 脱水, 二甲苯 透明。 (15) 封片 ,普 通光学 显微镜 观察。 5. 方 法评注 石蜡切 片的制 备按常 规步骤 ,只是 应考虑 固定剂 的使用 以保存 抗原性 。切片 一般在 S — Spm 厚度 。切 片在脱 蜡之前 应置于 56X: 烤箱内 30min, 以 促进脱 蜡过程 。彻 底脱蜡 对于 后面的 染色成 功十分 重要。 生 物酶与 抗体的 结合一 般是通 过某种 交联化 学物质 ,如 戊二醛 ,将生 物酶与 抗体相 互交联 。此 种反应 一般分 为两步 :首先 让生物 酶与过 量的交 联化学 物质起 反应, 然后再 加 入抗体 蛋白质 。一 般此种 反应极 难控制 。目 前市面 上基本 上能买 到来自 不同动 物种属 抗体的 生物酶 结合物 ,一 般不需 自制, 建议直 接购买 。如果 研究者 需要对 某种新 的一抗 进 行标记 ,请 参阅有 关免疫 化学书 籍中关 于用生 物酶标 记抗体 的方法 步骤。 四 、组 织石蜡 切片的 ABC 碱性磷 酸酶染 色技术 1. 原理 如前 所述, ABC 染 色技术 是利用 生物素 与亲和 素的高 度亲和 性发展 而来的 免疫染 • 867 • 色技术 。亲 和素来 自蛋清 ,具有 4 个生 物素结 合部位 。生 物素的 羟基 琥珀酰 胺衍生 物 (N-hydroxysuccinimide derivative) 能 够与蛋 白质上 的氛基 起反应 而不影 响其 与亲和 素 的结合 特性。 ABC 染色 技术由 3 步组成 : 首先让 未标记 的第一 抗体与 组织细 胞其反 应, 然后加 入结合 有生物 素的第 二抗体 ,最 后加入 ABC 复 合物。 ABC 复 合物在 使用前 配制 ,即 将亲和 素与结 合有生 物素的 HRP (或 ALP) 按一 定比例 混合。 由于生 物素和 亲和素 的高度 亲和力 ,故反 应迅速 。由 于一 个亲和 素分子 能够与 3 个 结合有 HRP 的生 物素 起反应 ,故显 著提高 了抗原 部位的 HRP 分 子数量 ,因此 染色敏 感度大 为提高 。市 面上 出售的 ABC 复 合物中 有的是 标记有 HRP 的 ,也 有标记 ALP。 而 ALP 标记 的复合 物的使 用较为 普遍。 石 蜡切片 ABC 染色 技术的 染色前 处理同 PAP 法 。在 ALP 的 显色反 应中, ALP 将 某些 含萘酚 基的磷 酸盐水 解而产 生奈酚 (nathphols)。 如果 在反应 中加入 一种重 氮化合 物 (diazoium compound), 则可以 将蔡酌 ■偶联 而形成 一 ■种有 色产物 。对 内源性 ALP 的封 闭是 使用左 旋咪唑 (levamisole), 一般 是将此 物质加 入显色 剂之中 。组织 细胞中 的内源 性生 物素活 性的封 闭是用 0.1% 亲和 素加上 随后的 〇.〇1% 生物素 ,在 染色 前处理 切片。 2. 附 加材料 ABC 复合物 (在 使用前 lh 按厂 家说明 书配制 ,室温 下静置 lh) 显色剂 3. 试 剂配制 目 前一般 能在市 面上买 到已经 配制好 的各种 显色剂 ,使 用前只 需将几 种成分 加以混 合即可 。但是 如果研 究者无 此种现 成试剂 ,则 可以按 以下方 法自行 配制。 固红 TR: 将 2mg 萘酚 -AS-MX- 磷酸 (Naphthol-AS-MX phosphate) 溶于 0.2mL 二 甲基 甲酰胺 (dimethyl-formamide, DMF) 内 ,然 后加入 9.8mL0.1mol/LTris 缓冲液 pH8.2, 2.4mg 左旋 咪唑和 10mg 固红 TR (fastredTRsalt)。 使用 前配制 ,过滤 后立即 使用。 新复红 (newfuchsin): 取 5mg 蔡酔 -AS-BI- 憐酸 (Naphthol-AS*BIphosphate), 溶 于60^二甲基甲酰胺,然后加入1011^0.05111〇1/1^丁1^缓冲液?1~18.7,1041111〇1/[左 旋咪挫 , 50/iL4% 亚 硝酸钠 (sodiurrmitrite), 以及 20/xL 用 2mol/L 盐酸 配制的 5% 新复 红 。使用 前配制 ,过滤 后立即 使用。 4. 操 作步骤 (1) 切 片脱蜡 至水。 (2) PBS 洗涤。 (3) 封闭非 特异性 染色: 可以选 用卵蛋 白或正 常动物 血清, 室温下 30min 〜 2h。 (4) — 抗 温浴, 4’. 温 F 45min 〜 2h。 (5) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (6) 加入 标记有 生物素 的二抗 。按 厂家说 明稀释 ,室温 下反应 45min。 (7) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 • 868 (8) 加入 ABC 复合物 温浴, 室温下 45min。 (9) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (10) 显色: ① 固红 TR, 显 色时间 一般为 10 〜 20min。 反应 产物为 鲜红色 ,溶于 乙醇, 故应用 水溶 性封片 剂封片 。如果 将固红 TR 用 2. lmg 固蓝 BB (fast blue BB) 替代 ,则 反应产 物为 蓝色。 ② 新复红 ,显 色时间 一般为 l〇~20min。 反应 产物为 鲜红色 ,不溶 于乙醇 ,故 可以 用永久 封片剂 封片。 (11) 用 苏木素 复染细 胞核。 (12) 脱水、 封片。 五、 组织石 蜡切片 的免疫 金银染 色技术 1. 原理 将四 氯金酸 (tetrachloroauricacid) 用 梓朦酸 或辕酸 还原而 制备成 直径为 3~20nm 的胶 体颗粒 ,抗体 可与其 通过静 电吸附 而结合 于金颗 粒表面 。用胶 体金标 记后的 抗原部 位 仅显示 微弱的 淡红色 ,在光 学显微 镜下极 难分辨 。使 用照 相显影 剂使金 颗粒发 生成核 反应 (nucleation) 导致金 属银在 其表面 沉积。 免疫金 银染色 技术一 般使用 间接染 色步骤 。也就 是说在 染色时 ,先使 用未标 记的一 抗, 然后使 用标记 有胶体 金的第 二抗体 ,最后 用银增 强液增 强染色 效果。 如果将 二抗用 A 蛋 白替代 ,则 染色反 应称为 PAGS (ProteinA-gold silver staining)。 因为 标记在 二抗上 的胶 体金对 组织细 胞成分 还有一 定程度 上的非 特异性 结合, 故一般 在加入 二抗之 前还需 要进行 第二次 封闭。 2. 附 加材料 一抗 和胶体 金标记 的二抗 银增强 反应液 2mol/L 梓檬酸 缓冲液 (23.5g 梓檬 酸钠, 25.5g 梓檬酸 , 100mL 蒸溜水 ) 3. 试 剂配制 银增强 反应液 :目前 市面上 有配制 好的银 增强反 应液可 以购买 。但是 亦可按 下面的 配 方配制 ,只 是较为 烦琐。 贮液 (1): 2mol/L 柠檬酸 缓冲液 (23.5g 柠檬 酸钠, 25.5g 柠 檬酸, 100mL 蒸 馏水) 贮液 (2): 银溶液 (llOmg 乳酸银 , 15mL 蒸馏水 ) 贮液 (3): 氢醌液 (950mg 氢醌, 15mL 蒸馏水 ) 贮液 (4): 7mL 50% 阿 拉伯胶 水溶液 最终 反应液 包括: 银溶液 15mL . 869 . 氢醌液 15mL 柠檬酸 缓冲液 10mL 蒸溜水 60mL 阿 拉伯胶 7mL 国内 曾有人 对此配 方进行 过改良 ,其 中的阿 拉伯胶 用明胶 (gelatin) 替代, 也获得 较好的 结果。 4. 操 作步骤 (1) 切 片脱蜡 至水。 (2) PBS 洗涤。 (3) 封闭 非特异 性染色 。可 以选用 1% 卵 蛋白或 2.5% 正常动 物血清 (均用 PBS 配 制 ), 室温下 30min 〜 2h。 (4) 加一抗 温浴, 室温下 45min 〜 2h。 (5) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (6) 第二 次封闭 非特异 性染色 。同上 用卵蛋 白或正 常动物 血清, 室温下 〇.5~2h。 (7) 加胶体 金标记 的二抗 ,室温 下反应 60min。 (8) PBS 洗涤 3 次 ,每次 5min。 (9) 蒸溜 水洗漆 3 次 ,每次 5min。 (10) 银增强 反应: ① 将 切片于 2mol/L 柠 檬酸缓 冲液内 稍洗。 ② 切片 在上述 银增强 液内在 室温下 反应约 3min, 反应时 应绝对 避光。 ③ 切片在 1:10 稀释的 定影液 内定影 2min (亦 可直接 入水终 止反应 )。 ④ 自来 水洗。 (11) 苏木素 复染。 (12) 脱水、 封片。 5. 方 法评注 —般 认为是 Faulk 和 Tayler 二人首 先在免 疫组化 中使用 胶体金 ,他 们在 1971 年首 次 将胶体 金与抗 体结合 ,成功 地用电 子显微 镜在超 微水平 显示了 细菌表 面抗原 。虽 然胶 体金 颗粒具 有很高 的电子 密度, 但是用 胶体金 标记后 的抗原 部位仅 显示微 弱的淡 红色, 在光学 显微镜 下极难 分辨。 1981 年 Danscher 介绍几 种利用 光化学 原理将 胶体金 进行银 增强 的方法 ,即使 用照相 显影剂 使金颗 粒发生 成核反 应导致 金属银 在其表 面沉积 。此种 显影液 内含有 银离子 (一 般用乳 酸银) 和 还原剂 (一般 为氢醌 )。 显影液 中一般 还含有 一种胶 体物质 ,如阿 拉伯胶 ,以防 止银离 子与还 原剂之 间发生 自行催 化反应 。显 影液必 须 在使用 前配制 ,并 且要避 光保存 ,银增 强反应 亦需要 在黑暗 中进行 。此 技术的 优点是 不需 封闭内 源性生 物酶, 而且比 较敏感 。据称 其敏感 性高于 PAP 法 ,可与 ABC 法接 近 。但是 染色最 后的银 增强反 应较难 控制, 往往造 成较深 的染色 背景。 . 870 • 1 六 、组织 石蜡切 片的酪 酰胺信 号放大 系统染 色技术 如 前所述 ,目 前在免 疫组化 染色技 术中的 进展大 多是在 对抗原 的暴露 、抽提 ,以及 对最 终染色 信号的 增强放 大方面 。这些 方法既 可用于 免疫组 化染色 ,也可 用于原 位杂交 技术。 因为抗 原的暴 露或抽 提技术 一般比 较简单 ,即 将切片 置于某 种弱酸 中在微 波炉内 煮沸 数分钟 即可。 读者可 参考本 章后附 的文献 ,选 择合适 的抽提 配方。 事实上 ,本章 介绍各 种比较 繁琐的 染色方 法的最 终目的 ,是为 了通过 增加局 部的含 标记物 的分子 数量而 增强最 终的染 色信号 。方法 之一是 增加染 色试剂 的数量 或层次 (如 间接染 色法、 PAP 法 )。 从理 论上讲 ,人们 可以无 限制的 增加染 色层次 ,从 而提 高染色 敏感度 。比 如可以 在使用 来自家 兔的一 抗之后 ,使用 小鼠抗 家兔的 抗抗体 ,然后 再使用 兔抗鼠 、鼠 抗兔 ,如 此反复 下去。 但是在 实践中 ,上 述方法 一是费 时费力 ,而且 会因为 抗原抗 体的非 特异性 结合而 导致过 强的染 色背景 。一 般染 色的层 次多在 3 层以下 。方法 之二是 使用能 结合较 多标记 物分子 的物质 ,如 ABC 技术中 使用的 亲和素 。因为 亲和素 可 以结合 4 个生物 素分子 ,除了 其中一 个结合 部位与 标记在 二抗上 的生物 素结合 之外, 其余 3 个部位 均可和 结合有 标记物 (如 酶或荧 光素) 的生物 素分子 结合, 故一个 亲和素 分子 能携带 3 个 标记物 分子。 PAP 分子 中也有 3 个过 氧化物 酶分子 ,故 二者的 敏感度 相当。 DAKO 公司 的所谓 EnVision 系统 ,其 原理也 是如此 。此公 司合成 的酶标 多聚物 为结 合有近 20 个抗体 分子、 100 个酶分 子的多 糖骨架 ,因 而敏感 度大为 提高。 这里主 要介绍 Bobrow 等人在 1989 年推 出的一 种新的 信号放 大方法 ,即 酪醜胺 (tyromide) 信 号放 大系统 ,或 称催化 信号放 大系统 (catalyzed signa lamplification system)。 1. 原理 利用过 氧化物 酶的催 化能力 ,将 大量生 物素化 的酪酰 胺分子 ( 即标记 有生物 素的酪 酰 胺分子 ), 转变成 反应性 的生物 素并沉 积在过 氧化物 酶附近 。然 后在切 片上再 加入标 记有过 氧化物 酶的亲 和素与 生物素 结合, 从而在 抗原局 部介入 大量的 酶标记 物分子 ,极 大地 提高了 染色的 敏感度 (图 13.3)。 2. 附 加材料 酪酰胺 信号放 大系统 试剂盒 3. 操 作步骤 (1) 切 片脱蜡 至水。 (2) 缓冲 液洗涤 (一般 使用试 剂盒中 提供的 缓冲液 )。 (3) 封闭 非特异 性染色 。可 以选用 1% 卵 蛋白或 2. 5% 正常动 物血清 (均用 PBS 配 制 ), 室温 下反应 0.5 〜 2h。 (4) 用一抗 温浴, 室温下 45min~2h。 (5) 缓冲 液洗漆 3 次 ,每次 5min。 (6) 用生物 素标记 的二抗 温浴, 室温下 45min。 或 用直接 标记有 HRP 的二抗 温浴。 . 871 . 图 13.3 酪酰胺 增强法 (7) 缓冲 液洗漆 3 次 ,每次 5min。 (8) 亲和素 -HRP 温浴, 室温下 45min。 (9) 生物素 标记的 酪酰胺 (按厂 家说明 书配制 ) 温浴, 室温下 3~10min。 (10) 缓冲 液洗漆 3 次 ,每次 5min。 (11) 切片 中加入 亲和素 -HRP, 室温下 30min。 (12) 缓冲 液洗漆 3 次 ,每次 5min。 (13) DAB 或 AEC 显色 (同 PAP 法 )。 (14) 苏木素 复染。 (15) 脱水、 封片。 第五 节原位 杂交技 术中分 子探针 的制备 原 位杂交 技术中 的分子 探针既 可以用 DNA 制备 ,也 可以用 RNA 制备 。一 般使用 的序列 长度为 50 〜 300bP, 目前应 用比较 普遍的 寡核苷 酸探针 一般长 20bP。 较短 的探针 有利于 掺入组 织细胞 。但是 如果在 染色体 标本上 进行原 位杂交 ,则 应使用 较长的 探针, 否则 易出现 非特异 性杂交 结果。 探针的 标记物 可以用 放射性 同位素 或非放 射性标 记物。 丨! 前 II: •收 射性标 记 物较兑 财性同 位素在 原位杂 交技术 中的使 用更为 普遍, 其原因 是放射 性同位 素受到 以下因 素限制 ,如 对人 体的辐 射损伤 、探针 有限的 使用期 、使 用同 位素的 • 872 • 特殊 条件和 费用等 。而非 放射性 标记物 具有分 辨率高 、染 色快等 优点。 放射性 同位素 中, 通常使 用的有 3H、 35S、 33P 或 32P。 同位素 的辐射 能愈大 ,反 应产物 的颗粒 愈大, 则染色 的分辨 率愈低 。另外 ,感光 乳胶的 曝光时 间与同 位素的 半衰期 成正比 ,即 同位素 的半衰 期愈长 ,所 需的曝 光时间 愈长。 32P 需要较 短的曝 光时间 ,但 分辨 率较差 。用 3h 做的 探针可 以得到 较高的 分辨率 ,但需 要长时 间的曝 光过程 。而 35s 居中 ,因而 使用最 为普遍 。非放 射性标 记物中 ,常 用的有 生物素 、地 高辛、 荧光素 、光 生物素 (photobi- otin) 标 记后的 核苷酸 ,或者 具有某 种特殊 化学基 团的核 苷酸, 如溴化 dUTP (bromo- dUTP), 以及通 过某种 化学反 应以改 变核酸 探针的 抗原性 (如 将探针 进行硫 化反应 )。 杂 交之后 ,对 标记物 的检测 则可以 使用免 疫组化 技术中 的各种 手段, 放大杂 交信号 ,以 提 高杂交 染色的 敏感度 。本篇 将对各 种分子 探针的 制备进 行简要 介绍。 一、 DNA 探针 (一) 双链 DNA 探针 双链 DNA 探针使 用广泛 。其 优点 是双链 DNA 十分 稳定, 因为其 水解酶 ,即 DNA 酶 (DNase), 很 容易用 EDTA 抑制 。缺 点是使 用前要 经过加 热变性 ,以 裂解成 单链。 因 而不太 适用于 用生物 素作为 标记物 ,因为 加热可 能破坏 其活性 。双链 DNA 探 针的制 备一般 用切口 平移法 或随机 引物法 合成。 1. 切 □平 移法 切口 平移法 是将有 标记物 的脱氧 核苷三 磷酸有 效地整 和到作 为探针 的双链 DNA 序 列中 。此 反应需 要两种 酶:胰 DNA 酶 ,即 DNasel; 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 ,即 DNA poll 的同 时作用 。其中 DNase I 在双链 DNA 上随机 制造多 个缺口 ,暴露 游离的 3' 羟基 和 5' 磷 酸基团 。大 肠杆菌 DNA 聚合 酶则以 互补链 为模板 ,将有 标记物 的核苷 酸加到 3' 羟基上 。探针 的延长 依靠此 酶的外 切核酸 酶活性 。此技 术需要 较多的 DNA (lpg); 但 反应 时间短 (lh), 需 要较严 格地控 制反应 温度。 ( 1 ) 在一 Eppendorf 管混合 : DNA l^g dNTP 混合物 5 卩 L 4U/mL DNA pol I 5/xL 标记物 核苷酸 加 h2o 至 50{iL 标 记脱氧 核苷酸 : 0.3mmoI/L 生物素 -dUTP, 或 地高辛 -dUTP, 或 5(VCia-35SdATP。 dNTP 混合物 : 4 种 单脱氧 核苷酸 (艮 P dCTP, dGTP, dTTP, dATP), 每 一种的 浓度为 0.2 mmol/L, 溶于 500mmol/L Tris-HCl pH 7.8/50mmol/L MgCb/lOOmmol/L 2- 琉 基乙醇 /100fig/mL 无核 酸酶 活性的 BSA。 (2) 混 合后在 15X: 反应 lh。 (3) 探针的 沉淀和 纯化: 在试管 中加入 1/10 体积的 乙酸钠 (3mol/L, pH5. 2), 3 • 873 • 倍 体积的 冷乙醇 (-20X:), lpLlOmg/mLtRNA, 混匀 ,在 -20X: 冰箱 内沉淀 过夜或 者在 -80X: 冰箱 内沉淀 30miri 〜 lh, 离心 (lOOOOr/min) 30min。 去除上 清液, 将沉淀 的 探针用 70% 冷乙醇 稍洗, 再离心 15min。 去 除乙醇 ,真空 干燥。 最后将 探针溶 于适量 蒸馏 水或缓 冲液中 ,低 温冰箱 内保存 备用。 2. 随机 引物法 此 标记法 是首先 将双链 DNA 加热变 性为单 链序列 ,然 后加 入数种 6 〜 12bp 的 DNA 随 机引物 (primer) 退火 。大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I 中 的所谓 Klenow 片段 以单链 DNA 为模板 ,以 上述 引物为 起始点 ,以单 脱氧核 糖核酸 为原料 ,从 3' 端 合成一 条新的 DNA 探针。 此技术 的优点 是能用 少量的 DNA 制备 探针, 但探针 的合成 量甚小 ,原位 杂交技 术中一 般较少 使用。 (二) 单链 DNA 探针 单链 DNA 探针 包括在 实验室 DNA 合 成仪上 人工合 成的寡 核苷酸 DNA 序列 或来源 于 M13 载体 的单链 DNA 插入 序列, 以及以 从双链 DNA 得到 的单链 DNA 为模板 ,加 入标 记后的 核苷酸 通过聚 合酶链 式反应 (PCR) 后 而合成 的单链 DNA 探针 。对 于此种 单链 DNA, 一般使 用末端 标记法 (terminal labelling) 将标 记物整 合到探 针内。 PCR 技 术的 原理是 利用一 种能耐 受高温 的细菌 DNA 聚合酶 (Tag polymerase), 在多次 反复的 高温 裂解- 退火反 应中, 利用寡 核苷酸 引物为 起始点 ,以单 脱氧核 糖核酸 为原料 ,将某 — DNA 序列 反复复 制成大 量新的 DNA 序列 。据 认为, 通过近 30 次的循 环反应 可以将 DNA 模板复 制近一 百万倍 ,因 而能制 备大量 的单链 DNA 探针 。此 技术亦 可直接 在组织 切片 上进行 ,称 为原位 PCR 技术 (后详 )。 1. 寡 核苷酸 DNA 的 生物素 -dUTP 3' 末 端标记 此技术 使用实 验室制 备的寡 核苷酸 ,一 般为 20~30bp。 用 末端脱 氧核酸 转化酶 (TdT), 将带有 标记物 的脱氧 核苷酸 转移到 寡核苷 酸链的 3' 末端。 带有标 记物的 脱氧核 苷酸除 了使用 生物素 -dUTP 之外 ,还 可以选 用溴化 dUTP (bromo-dUTP)、 地高辛 -11- dUTP, 或 35S^dATP〇 ( 1 ) 在 一 Eppendorf 管混合 : 寡 核苷酸 DNA 单链 lOpmol 10 x CoCl2 5 x 末 端标记 缓冲液 8/^L 生物素 -dUTP 500pmol 末端 转化酶 (TdT) 25U 加 h2o 至 卿 L (2) 37X: 温浴 2h。 加入 lOO^L 10mmol/L EDTA 以终止 反应。 (3) 探针的 沉淀和 纯化: 在试管 中加入 1/1〇 体积的 乙酸钠 (3m〇l/L, pH4. 8), 3 倍 体积的 k 乙醇 (-ZOt ), fV. - 80"C 冰箱 内沉淀 30min, 离心 (10 000r/min) 20min。 • 874 . 去除 上清液 ,将 沉淀的 探针真 空干燥 ,溶于 适量蒸 馏水中 ,低 温冰箱 内保存 备用。 二、 RNA 探针 单链 RNA 探针 或称核 糖探针 (riboprobe), 是指将 特定的 DNA 序列 插入到 特别的 体外转 录载体 (in vitro transcription vector), 如 Promega 公司的 pSP 或 pGEM 系 列载体 上之后 ,利用 RNA 聚 合酶从 载体上 特定的 启动子 部位以 DNA 双链中 的任意 一条链 (有 意义链 和无意 义链, sense and anti-sense strand) 为模板 ,以 核糖 核苷酸 为原料 ,合 成 的单链 RNA 序列 。如前 所述, RNA 探针具 有高敏 感度、 高杂交 效率和 高的杂 交体稳 定性等 优点, 因此和 寡核苷 酸探针 一样使 用普遍 。本 文仅介 绍从已 经插入 有特定 DNA 序列 的体外 转录载 体中制 备单链 RNA 探针。 1. 体外转 录模板 的制备 首先是 将模板 线性化 (linearization), 即 使用相 应的限 制性内 切核酸 酶将含 有特定 DNA 插入 序列从 环形的 体外转 录载体 切断。 限制性 内切核 酸酶的 选择以 载体制 备时使 用的酶 为基础 ,一 般使用 能切出 3' 端的内 切酶。 插入序 列的一 端要保 存某一 RNA 聚合 酶特 定的启 动子序 列部位 ,以便 RNA 聚 合酶发 挥作用 。为 了保证 杂交染 色的特 异性, 一般同 时合成 有意义 链和无 意义链 。因 此需 要用两 种不同 限制性 内切核 酸酶分 别切下 DNA 插 入序列 ,从 而从不 同方向 合成两 条序列 不同的 RNA 单链。 染色时 用无意 义链为 实 验探针 ,用有 意义链 作为阴 性对照 。模 板线性 化后用 酚和氯 仿抽提 ,真 空干燥 ,溶于 蒸 馏水中 备用。 2. 核 糖核苷 酸探针 的合成 (1) 将下列 试剂在 室温下 按顺序 混合: 5 x 体 外转录 缓冲液 4/iL 100mmol/L DTT 2{jlL RNA 酶 抑制剂 20U 含 标记物 的单核 糖核酸 混合物 2pL 0.2 〜 lmg/mL DNA 模板 水溶液 1/iL 15 〜 20U/VL SP6、 T3 或 T7 RNA 聚合酶 lyL 加蒸 馏水到 20/xL 10X 含标记 物的单 核糖核 酸混合 物:含 lOnimd/LATP、 CTP、 GTP, 65mmol/LUTP, 3.5mmol/L 生物素 -16-UTP 生物素 (biotin-16-UTP) 或 地高辛 -11-UTP, pH7.5。 (2) 37~40t: 下温浴 lh。 (3) 探针 水解。 一般认 为探针 愈短, 则更易 于掺入 ,信 号愈强 。故 人们往 往将新 合成的 RNA 探针 进行碱 性水解 到大约 150bP 片段 。其 做法是 :将新 合成的 RNA 溶于 50ML 蒸 馏水内 ,然 后加入 等体积 的新鲜 配制的 0.2mol/L 碳酸钠 缓冲液 , PH10.2 ( 含 80mmol/LNaHCO3, 120mmol/LNa2CO3), 在 60X: 下温 浴一定 时间 (r)。 r 由下 列公式 求得: • 875 . t = (.L〇~L(^/ kL〇L( 式中的 f 为时间 , 单位为 分钟。 Lo 为 RNA 水解 前长度 ,以 kbp 为 单位。 为所需 RNA 长度 ,亦以 kbp 为 单位。 A 为反应 速度, 大约为 0.11 次剪切 / (kbp*min)。 反应完 毕后, 在样品 中加入 3ML 的 3md/L 乙酸钠 (PH6.0) 和 5ML 的 10% (V/V) 冰乙酸 ,以 终 止水解 反应。 (4) 乙醇沉 淀探针 : ① 加入 1/4 样品 体积的 0.5mol/L 乙酸铵 ,混 匀。 ② 加入 3 倍体 积的冷 乙醇, 混匀, -70X: 下沉淀 30min。 ③ 12 000 x g 离心 5min, 去除上 清液。 ④ 将 RNA 探 针溶于 10(VL 的 lmd/L 乙酸铵 ,重复 2) 和 3) 乙醇 沉淀。 ⑤ 最 后将探 针溶于 10~20pL 的 TE 缓冲液 (10mmol/LTris-HCl pH8.0, 1 mmol/L EDTA) 内 ,于 -70X: 保存 备用。 第六 节常用 原位杂 交技术 一、 冰冻切 片上的 原位杂 交技术 1. 原理 原 位杂交 技术是 在组织 细胞内 进行分 子杂交 ,即 使用结 合有标 记物的 DNA 或 RNA 探 针在冰 冻切片 上检测 组织细 胞内的 DNA 或 RNA (多 为检测 mRNA)。 本书其 他章节 已对 分子杂 交的原 理有详 细讨论 ,在 此将不 予赘述 。一 般说来 ,冰 冻切片 原位杂 交对所 要 检测的 DNA 或 RNA 检测阳 性率要 高于石 蜡切片 。这是 因为冰 冻切片 避免了 对组织 细胞的 核酸保 存不利 的处理 ,而 石蜡切 片的对 组织细 胞处理 往往会 破坏核 糖核酸 。但是 冰冻切 片的组 织细胞 形态学 特性的 保存则 大大逊 色于石 蜡切片 。因 此在选 择使用 何种切 片方法 时要权 衡考虑 。一 般先 试用石 蜡切片 ,如果 要检测 的靶核 酸量少 ,石 蜡切 片时染 色弱, 则应采 用冰冻 切片。 为了 最大限 度的保 存核酸 ,尤 其是核 糖核酸 (RNA), 原位杂 交时的 冰冻切 片组织 处理一 般是先 固定组 织细胞 ,然 后进行 冰冻。 最好是 使用灌 注固定 ,固 定液一 般使用 4% 多聚甲 醛或者 4% 多聚甲 醛加上 0.1% 戊二醛 ,至 少固定 2h 以上 。固 定后的 组织在 用液氮 冷却到 -60X: 的 异戊烷 中冰冻 。冰冻 切片制 备后即 可立即 染色, 也可于 -70X: 保 存 备用。 2. 材料 PBS 缓冲液 4%多聚甲醛(48多聚甲醛溶于1〇〇11^〇.1111〇1/1^83,0只7.2) O.lmol/LTEA 缓冲液 (将 18.57g 三乙醇 胺溶于 900mL 双蒸水 ,用 NaOH 调至 pH8.0, 加水至 1000mL) 0.25% 乙酐 (取 250fxL 乙 酐溶于 lOOmL 的 TEA 缓冲液 ) 20XSSC (3m〇l/LNaCl, 0.3md/L 柠檬酸 ) • 876 • 蛋白酶 消化液 (0.1mol/LTris-HClpH8.0, 50mmol/LEDTA, 0.5~1.0fig/mL 蛋 白酶 K) 链霉 蛋白酶 (Pronase)(50mmol/L Tris-HCl pH7.5, 5mmol/L EDTA, 0.05 〜 O.lmg/mL 链霉蛋 白酶) 甘氨酸 (glycine) 溶液 (用 PBS 配制 2mg/mL 甘氨酸 溶液) 杂交 缓冲液 基本分 子生物 学实验 室设备 : 水浴箱 、核 酸电 泳装置 、低温 冰箱、 台式离 心机等 基本切 片和染 色设备 : 冰冻切 片机、 染色缸 、玻片 、温浴 湿盒、 温箱等 3. 实 验准备 1) 原 位杂交 载玻片 的准备 载玻 片在使 用前应 进行适 当处理 ,以防 止切片 在染色 中脱落 。常 用的 方法有 铬明矾 明胶 ( chrome alum gelatine) 、 多聚 -L- 赖氧酸 ( poly-L-lysine ), 以及 APES ( amino- propyhriethoxysilane)。 作者的 经验是 APES 效 果较好 ,具体 做法为 : (1) 切片 用去污 剂浸泡 ,蒸 馏水洗 。最后 用纯乙 醇洗涤 ,空气 干燥。 (2) 将 切片放 入新鲜 配制的 2% APES (用 纯丙酮 配制) 内 5s。 然 后转入 DEPC 处 理 过的蒸 馏水中 2 次, lmin/ 次。 (3) 玻片于 37X: 烤箱 内干燥 过夜。 2) 原位杂 交中水 的处理 在实 验室对 RNA 进行原 位杂交 ,对研 究者实 验操作 的清洁 程度要 求甚高 。即 使是 研究 者指头 上来自 人体的 或者蒸 馏水内 来自污 染细菌 的微量 RNA 酶即可 将组织 细胞内 的待测 RNA 降解 。因此 ,除 了对 使用的 玻璃器 皿要彻 底洗涤 、高 温消毒 之外, 实验中 使用 的所有 试剂均 应避免 R&A 酶 的污染 。实验 中使用 的水应 进行特 殊处理 。一 般使用 RNA 酶抑制 剂二乙 焦碳酸 (diethyl pyrocarbonate, DEPC) 处理蒸 溜水, 然后用 处理后 的 水来配 制其他 溶液。 DEPC 处理 方法如 下:先 用纯乙 醇配制 10% (V7V) 的 DEPC, 然 后量取 10mL 上 述溶液 ,加 入到 990mL 蒸 馏水中 (最终 浓度为 0.1%), 于室 温下放 置过夜 。次 日高压 高温 处理, 120X:, 151b/in2 ( 相当于 1.055kg/cm2), 30min, 冷却 ,室温 下保存 备用。 3) 杂交 缓冲液 探针用 以下杂 交缓冲 液配制 : 成 分 贮存 液浓度 最 终浓度 SSC 20 x 4X 去离子 甲酰胺 100% 50% 硫酸 葡聚糖 (dext ran sulfate) 50% 10% Denhardt 液 50 x lx tDNA lOmg/mL 250/^tg/ mL 鲑精 DNA (salmonsperm DNA) lOmg/mL 400^ig/ mL • 877 • 4. 操 作步骤 (1) 设如下 对照: A. 有意义 链对照 (如 果待测 核酸为 RNA); B. 无探针 对照; C. 用 RNA 酶处理 切片后 再染色 (如 果使用 核糖核 酸探针 ); D. 阳 性对照 ,即选 用已知 含 有待査 DNA 或 RNA 的 组织细 胞切片 。如 果检测 细胞内 mRNA, 则使 用能与 细胞内 所有 mRNA 起 反应的 poly-dT 寡核苷 酸探针 ,以确 定染色 程序是 否工作 。或者 使用肌 动蛋 白探针 ,因为 几乎所 有哺乳 动物细 胞内均 含此种 蛋白的 mRNA; E. 阴性组 织细胞 对照 ,即 选用已 知不含 待测核 酸的组 织细胞 切片。 (2) 预处理 : 供原位 杂交用 的组织 切片或 细胞制 片一般 需要做 一些预 处理, 包括蛋 白酶 的消化 、盐 酸处理 以暴露 靶核酸 ,或者 乙酰化 (acetylation) 以饱和 非特异 结合部 位而降 低背景 染色。 是否 使用蛋 白酶消 化取决 于需要 检测的 耙核酸 的多寡 。冰 冻切片 一般不 需蛋白 酶消化 。但 是如果 染色 过浅, 则可考 虑用酶 进行短 暂消化 。如用 〇.5~l.〇/ig/mL 蛋白酶 K 或者 0.05~0.1mg/mL 链霉 蛋白酶 ,在 37*C 下温浴 10 〜 30min。 (3) 切片在 甘氨酸 /PBS 溶液 中洗涤 数秒至 lmin, 然后在 PBS 中洗涤 2 次 ,每次 2min, 以 终止酶 反应。 (4) 乙酰化 :切片 置于新 配制的 TEA 缓冲液 内温浴 5min, 然 后在含 乙酐的 TEA 缓 冲液内 lOmin。 此步骤 对于减 低背景 染色十 分重要 。乙 酐可 以中和 切片中 氨基的 正电荷 ,从 而防止 探针非 特异性 的静电 吸附。 (5) 切片于 2XSSC 中洗涤 2 次 ,每次 5min。 (6) 切 片于系 列乙醇 中脱水 ,空气 干燥。 (7) 切片中 DNA 变性: 如果待 测的靶 核酸是 DNA, 则应在 杂交之 前将切 片置于 95% 甲酰胺 /0.1XSSC 中 ,于 65X: 变性 15min。 也有 人将切 片置于 0.1XSSC 内煮沸 (100X:) 5min, 以裂 解双链 DNA。 然后于 系列乙 醇脱水 ,空气 干燥。 (8) 准备探 针:探 针的浓 度取决 于探针 的类别 (如 DNA、 RNA)、 标记物 的性质 ( 如放射 性或非 放射性 ), 以 及切片 的方式 ( 如是冰 冻切片 还是石 蜡切片 )。 如果 用冰冻 切片 ,放射 性探针 的浓度 ~ ■般为 2pmol/L/mL, 非 放射性 探针的 浓度为 10pmol/L/mL; 如 果用石 蜡切片 ,则用 20pmol/L/mL 放射性 探针, 100pmol/L/mL, 或 者高达 300ng/mL 非 放射性 探针; 如果使 用双链 DNA 探针, 使用前 要煮沸 3 〜 5min, 以裂解 双链 ,然 后于冰 上淬灭 。探 针用上 述杂交 缓冲液 配制。 (9) 预杂交 : 一般是 将上述 杂交混 合液覆 盖切片 (每 张切片 300/iL), 在 湿盒内 37t: 温浴 30min 〜 lh。 (10) 杂 交:将 探针按 OJpg/mL/kb 加入 混合液 。如果 使用放 射性同 位素标 记的探 针, 则将探 针按每 微升含 lx l〇5cpm (每分 钟计数 ) 溶于上 述混合 液中。 如果使 用的探 针是 DNA, 则 应将探 针混合 液煮沸 2min, 冰上 淬冷。 如果使 用的是 RNA 探针 ,则应 将探针 混合液 加热至 80t: 3min, 然后 维持在 50X: 备用 。使用 时每张 切片加 入大约 20ML, 然后 于湿盒 内温浴 。如 果使用 DNA 探针 ,杂交 温度为 37X:。 如 果使用 RNA 探 针, 杂交温 度可以 略高些 。杂 交时间 一般为 4h。 有 人将切 片上放 置一盖 玻片以 避免探 • 878 • 针挥发 ,一 般需 要用指 甲油或 者橡胶 水将四 周封固 。有人 在更高 的温度 下杂交 ,如在 55C, 而且杂 交更长 的时间 ,如 超过 10h, 这 需要按 个别实 验条件 而定。 (11) 杂交后 洗涤: 同杂交 一样, 杂交后 的洗涤 亦因不 同的实 验条件 ,如探 针的类 别 、长短 、探 针中 GC 的比例 等而异 。标 准的步 骤介绍 如下。 对于 放射性 同位素 探针: 4XSSC 稍洗。 2 x SSC 室 温下或 37C 洗涤 30min。 1 x SSC 室温 下洗漆 30min。 0 . 5 x SSC 室温 下洗涤 30min。 对于非 放射性 探针: 4 x SSC 稍洗。 2XSSC 37X: 洗涤 30min〇 2 x SSC 室温 下洗涤 30min lx SSC 室温 下洗涤 lh。 0.5 x SSC 室温 下洗涤 lh。 (12) 显影或 显色。 放射自 显影: ① 制备 感光乳 胶:选 用柯达 (NTB2)、 IlfordK5 或者 Amersham 公司的 LM1。 使 用前 将乳胶 加温至 45X:, 用 45X: 的蒸 馏水将 乳胶适 当稀释 (KodakNTB2, 1:1; AmershamLMl, 1:2; IlfordK5, 1:3), 然 后倒入 染色缸 ,置于 45X: 水 浴箱中 备用。 ② 将 已洗涤 好的切 片于升 级乙醇 中脱水 ,空 气干燥 。然 后将切 片放入 盛有乳 胶的染 色缸中 5s, 室温 下干燥 ,于 4X: 曝光。 曝 光的时 间依同 位素的 强度、 it 类以 及探针 的量多 少有关 。如 果使用 32P 或 35S, 一 般曝光 l~2d。 如果信 号微弱 ,则 可以延 长曝光 时间。 ③ 切片 显影: 可选用 D19, 18X:, 2min; 或 Dektol 显 影液, 2min。 ④ 水洗 ,然 后定影 。于 30% 硫代 硫酸钠 (sodiumthiosulfate) 内定 影至少 2min。 ⑤ 水洗 。如 果需要 观察组 织细胞 结构, 可以做 复染。 ⑥ 切 片脱水 ,封固 。显 微镜 观察。 显色: 如 果使用 的探针 是用非 放射性 标记的 ,则 按前述 的免疫 组化方 法进行 染色。 5. 方 法评注 原位 杂交能 否成功 ,取 决于多 方面的 因素。 比如待 测的靶 DNA 或 RNA 的 多寡及 其保存 、探针 的质量 、杂交 反应及 其后洗 涤的严 格程度 ( 即所谓 strigency)。 后 者主要 指杂交 的温度 和反应 中使用 的缓冲 液的离 子浓度 ,因 为这些 因素直 接影响 探针和 靶核酸 杂 交体的 稳定性 。杂 交反应 的温度 愈高, 离子浓 度愈低 ,则杂 交体愈 不稳定 ,愈 趋于裂 解 。反之 ,杂交 时温度 太低, 离子浓 度过高 ,则出 现非特 异杂交 ,即所 谓误配 杂交体 (mismatch) 趋 于稳定 ,导致 杂交背 景深或 出现假 阳性。 一般用 所谓解 链温度 (melting temperature, Tm) 来 决定杂 交的温 度和离 子浓度 。解 链温度 是指当 50% 的双链 DNA . 879 • 裂 解为单 链时所 需的加 温温度 。此 温度取 决于下 列因素 :探针 序列中 G + c 碱基 对的多 少 (和 A+T 碱基对 的比例 ), 反 应溶液 中单价 阳离子 ( 通常指 SSC 缓 冲液中 Na+) 的 浓度 (M), 以及反 应液中 甲酰胺 (起 降低核 酸杂交 体的稳 定性的 作用) 的含量 (F%)。 对 于长于 lOObp 的 DNA 探针用 于检测 细胞中 DNA, 即 DNA:DNA 杂 交体来 说 ,解链 温度由 下列方 程求得 : 7m(X: ) = 81 .5 + 16.6 x loglOM + 0.41x(G + C)% - 0.63 x F% -600/L 其中 L 为探 针碱 基长度 。由此 可见, 在反应 液中离 子浓度 M 不变的 情况下 ,探针 中 GC 对 愈多或 者探针 愈长, 则愈高 。反之 ,探 针中的 GC 对 愈少或 者探针 愈短, 如使用 寡核苷 酸探针 ( 见下述 ), 则 Tm 愈低。 如果探 针不变 ,反应 离子浓 度愈低 ,则 Tm 愈低, 杂交体 愈趋于 裂解。 而使用 RNA 探针 来检测 细胞内 RNA 时 ,即 RNA:RNA 杂交体 ,: Tm 则为: Tm(<850/0.1%305洗涤2次,5111丨11/次。 (18) 免疫 检测标 记物, 同前原 位杂交 技术。 4. 方 法评注 虽然 近十年 来人们 对原位 杂交和 PCR 技术广 泛使用 ,但 将此 两种方 法合并 起来并 非易事 。其原 因甚多 :首先 ,在 切片上 进行原 位聚合 酶链式 反应时 需要加 温以使 DNA 变性 ,而此 种处理 一般会 破坏组 织细胞 形态学 特性; 其次 ,对于 反应中 的引物 、镁 离子 和 DNA 聚合 酶的浓 度较难 确定; 另外, PCR 反应涉 及将切 片反复 加温, 切片往 往容易 脱落, 故需要 进行特 殊处理 。但 是由于 此方法 的高度 敏感性 ,目前 已广泛 应用于 对细胞 内病毒 DNA 或 RNA (如 艾滋病 病毒) 的检测 、细胞 特异性 基因的 表达, 以及肿 瘤基因 的检测 等重要 领域。 常用的 原位聚 合酶链 式反应 方法也 可按标 记方法 分为直 接法和 间接法 。直接 法桌指 将用标 记物标 记后的 单核苷 酸加入 PCR 反应液 ,让 含标记 物的单 核苷酸 直接整 和到复 制的 DNA 链中。 但是此 方法较 易导致 非特异 性复制 。间接 法是在 使用未 标记的 单核苷 酸进行 PCR 之后 ,用 常规原 位杂交 方法来 检测放 大后的 DNA 序列。 如果按 操作方 法来分 ,又可 以分为 :①如 果使用 细胞, 则细胞 的固定 、酶 消化, 以及 PCR 反应均 在试管 中进行 ,在 反应 结束后 ,使 用细胞 离心机 制备成 细胞离 心片, 然 后进行 常规原 位杂交 染色; ②全 部反应 在组织 细胞载 玻片上 进行; ③有 人将 附有细 胞的 盖玻片 裁剪为 细条, 然后放 入试管 中进行 PCR 反应。 本节介 绍的是 在切片 上进行 的 原位聚 合酶链 式反应 技术。 一般 认为, 就敏感 度而言 ,分 子生物 学中普 遍使用 的所谓 Southern 杂交法 能够在 . 883 • 每 50 个细胞 中检测 出一个 拷贝的 DNA。 而目 前普遍 采用的 原位杂 交技术 ,其敏 感度则 只能检 测出每 细胞中 10 〜 20 拷贝的 核酸, 如果低 于此数 ,则不 能检出 。而 如果 使用原 位 PCR, 从理论 上将, 其敏感 度可以 提高到 检测每 百万细 胞中一 个拷贝 的核酸 ,但在 实 际操作 中往往 难以达 到如此 的理想 效果。 徐玉会 沈士亮 主要参 考文献 Darby, I. A. 2000. In Situ Hybridization Protocols. 2nd ed. Totowa: Humana Press. Erobinson, G. , EllisIO, MacLennan. 1990. Immunocjrtochemistry. In: Bancroft, J. D. , Stenvens, A. eds. Theory and Practice of Histological Techniques. Edinburgh: Churchill Linvingstone, 413^436. Javois, L.C. 1999. Immunocytochemical Methods and Protocols. 2nd ed. Totowa: Humana Press. Stemberger, L. A. 1986. Immunocytochemistry. 3rd ed. New York: John Wiley & Sons. Xu, Y. H. , Zhou, X. J. , Shen, S. L. and Wu, Z. B. 1987. Immunohistochemical localization of fibronectin and laminin in murine liver using protein A- gold technique at the light microscopic level: A methodological study. J. Tongji Med. Univ. , 7 :74 〜 79. Xu, Y. H. and Slayter, H. S. 1994. Immunocytochemical localization of endogenous antithrombin III in the vas- culature of rat tissue reveals locations of anticoagulantly active heparan sulfate proteoglycans. J. Histcxrhem. Cytochem. , 42: 1365. • 884 • 第 十四章 生物芯 片技术 引 言 生物 芯片技 术是随 着人类 基因组 研究的 深入在 20 世纪 90 年代初 期应运 而生的 。作 为 一项生 命科学 研究领 域的高 新技术 ,近 年来它 已显示 出强劲 的发展 势头。 早在 20 世纪 80 年代, Bains W 等人就 将短的 DNA 片断固 定到支 持物上 ,借 助杂 交方式 进行序 列测定 。探 针固相 原位合 成技术 和照相 平版印 刷技术 的有机 结合, 以及激 光共 聚焦显 微技术 的引入 ,直接 促使基 因芯片 从实验 室走向 工业化 。它使 得合成 、固定 高密 度的数 以万计 的探针 分子切 实可行 ,而且 借助激 光共聚 焦显微 扫描等 技术可 以对杂 交 信号进 行实时 、灵敏 、准 确的 检测和 分析。 生 物芯片 是将生 命科学 研究中 所涉及 的不连 续的分 析过程 (如样 品制备 、化 学反应 和分 析检测 ), 利用微 电子、 微机械 、化学 、物理 、计算 机技术 在硅片 、玻 璃片 或陶片 等 固相载 体表面 构建微 流体分 析单元 和系统 ,使之 连续化 、集 成化、 微型化 。生 物芯片 技术是 一种高 通量检 测技术 ,它 包括基 因芯片 (gene chip)、 蛋 白芯片 (protein chip)、 组 织芯片 (tissue chip) 及芯片 实验室 (lab-on-a-chip) 四大 领域。 本章将 对各种 芯片进 行简要 介绍。 第 一节基 因芯片 一 、基 因芯片 的概念 基 因芯片 ,又称 DNA 芯片 ,是指 将大量 靶基因 或寡核 苷酸片 段有序 地高密 度排列 图 14.1 基因芯 片的基 本原理 . 885 • 固定于 玻璃、 硅片等 载体上 ,然 后与待 测的标 记样品 的基因 按碱基 配对原 理进行 杂交, 再通 过激光 共聚焦 荧光检 测系统 等对芯 片进行 扫描, 并配以 计算机 系统对 每一探 针上的 荧光信 号进行 比较和 检测, 从而迅 速得出 大量所 需的生 物信息 。其 基本原 理见图 14.1。 基 因芯片 是生物 芯片研 究中最 先实现 商品化 的产品 。目 前比较 成熟的 产品有 检测基 因突变 的芯片 ,检测 细胞基 因表达 水平的 表达基 因芯片 等等。 二 、基因 芯片技 术的基 本过程 基 因芯片 技术主 要包括 4 个 基本要 点:芯 片方阵 的构建 、样品 的制备 、固相 杂交反 应 和芯片 信号的 检测。 (一) 芯 片方阵 的构建 目前 已有多 种方法 可以将 DNA 或寡 核苷酸 固定到 固相支 持物上 。这 些方法 总体上 有两种 ,即原 位合成 (in situ synthesis) 与 合成点 样两种 。支 持物一 般选择 玻璃片 、硅 片 、聚丙 烯膜、 硝酸纤 维素膜 、尼 龙膜等 ,但 需经特 殊处理 。做原 位合成 的支持 物在聚 合反应 前要先 使其表 面衍生 出羟基 ,与保 护基建 立共价 连接; 做点 样用的 支持物 为使其 表面 带上正 电荷以 吸附带 负电荷 的探针 分子, 通常需 包被以 氨基硅 烷或多 聚赖氨 酸等。 1. 原位 合成法 主要 包括光 引导聚 合技术 (light-directed synthesis)、 打 印原位 合成。 1) 光 引导聚 合技术 光引导 聚合技 术作为 常用的 原位合 成方法 ,不仅 可用于 寡聚核 苷酸的 合成, 也可用 于 合成寡 肽分子 。光引 导聚合 技术是 以往用 于半导 体制作 的照相 平版印 刷技术 (pho- tolithography) 与传统 的核酸 、多肽 固相合 成技术 相结合 的产物 。原 理见图 14.2。 首先 ,根 据所要 合成的 寡核苷 酸的序 列及矩 阵位置 ,利 用计算 机运算 法则, 设计照 相平版 印刷模 板即蔽 光掩膜 (mask)。 然后利 用连续 地照相 平版印 刷模板 来确定 芯片的 暴 露位点 ,遵循 特殊的 化学合 成步骤 ,构 建高 密度的 寡核苷 酸矩阵 ,每个 探针在 矩阵上 有预 先确定 的位置 。这 个平行 的过程 提高了 重复性 ,从而 达到测 量的经 济化。 固相 合成技 术是当 前多肽 、核酸 人工合 成中普 遍使用 的方法 ,技 术成 熟且已 实现自 动化 。二 者的结 合为合 成高密 度核酸 探针及 短肽阵 列提供 了一条 快捷的 途径。 以合 成寡核 苷酸探 针为例 ,该技 术主要 步骤为 : 首先使 支持物 羟基化 ,并用 光敏保 护基团 将其保 护起来 。每 次选择 适当的 蔽光掩 膜使需 要聚合 的部位 透光, 其他部 位不透 光 。这样 ,光 通过蔽 光膜照 射到支 持物上 ,受 光部位 的羟基 解保护 。因为 合成所 用的单 体分 子一端 按传统 固相合 成方法 活化, 另一端 受光敏 保护基 的保护 ,所以 发生偶 联的部 位反 应后仍 旧带有 光敏保 护基团 。因此 ,每 次通 过控制 蔽光膜 的图案 (透 光与不 透光) 决定 哪些区 域应被 活化, 以及所 用单体 的种类 和反应 次序就 可以实 现在待 定位点 合成大 量预定 序列寡 聚体的 目的。 该 方法的 主要优 点是可 以用很 少的步 骤合成 极其大 量的探 针阵列 。例如 ,合成 . 886 . 结合在 载体上 的碱基 图 14.2 光引导 聚合技 术的制 作原理 65 536 个 探针的 8 聚 体寡核 苷酸序 列仅需 4X8 = 32 步 操作, 8h 就可 以完成 。而 如果用 传 统方法 先合成 ,然 后点样 ,那么 工作量 之大将 是不可 思议的 。同时 ,用 该方法 合成的 探 针阵列 密度可 高达到 106/cm2。 不过 ,尽管 该方法 看来比 较简单 ,实际 上并非 如此。 主要 原因是 ,合成 反应每 步产率 比较低 ,不到 95%; 而通 常固相 合成反 应每步 的产率 在 99% 以上, 因此探 针的长 度受到 了限制 。而 且由于 每步去 保护不 很彻底 ,致 使杂交 信号比 较模糊 ,信噪 比降低 。为 此有人 将光引 导合成 技术与 半异体 工业所 用的光 敏抗蚀 技术 相结合 ,以酸 作为去 保护剂 ,使 # 步产率 增加到 98%, 原因 是光敏 抗蚀剂 的解离 对照 度的依 赖是非 线性的 ,当 照度达 到特定 的阈值 以上保 护剂就 会解离 。所以 ,该 方法 同时 也解决 了由于 蔽光膜 透光孔 间距离 缩小而 引起的 光衍射 问题, 有效地 提高了 聚合点 阵的 密度。 另据 报道, 利用波 长更短 的物质 波如电 子射线 去除保 护可使 点阵密 度达到 101(7 cm2。 2) 打印原 位合成 除 了光引 导原位 合成技 术外, 一 些公司 如美国 Incyte Pharmaceuticals 等使用 压电打 印法 (piezoelectric printing) 进行原 位合成 。压 电打 印原位 合成的 方式类 似于喷 墨打印 机, 只是将 墨盒中 的墨汁 分别用 4 种碱基 合成试 剂所替 代, 合成原 理与传 统的核 酸或寡 肽固相 合成技 术相同 。合 成过程 为:合 成前以 与光引 导原位 合成类 似的方 式对芯 片片基 进行 预处理 ,使 其带有 反应活 性基团 ,例如 伯氨基 。同时 ,将合 成用前 体分子 (DNA 合成 碱基) 放 入打印 墨盒内 ,由电 脑依据 预定的 程序在 X、 3;、 Z 方向自 动控制 打印喷 头在 芯片支 持物上 移动, 并根据 芯片不 同位点 探针序 列需要 将特定 的碱基 合成前 体试剂 [不 足纳升 (nL)] 喷印 到特定 位点。 喷印上 去的试 剂即以 固相合 成原理 与该处 支持物 发生耦 联反应 ,冲洗 、去 保护 、耦联 等则同 于一般 的固相 原位合 成技术 。由 于脱 保护方 . 887 . 式为酸 去保护 ,所 以每 步延伸 的合成 产率可 以高达 99%, 合成 的探针 长度可 以达到 40~50 核苷酸 。以 后每 轮耦联 反应依 据同样 的方式 将需要 连接的 分子喷 印到预 定位点 进行后 续的耦 联反应 。类 似地重 复此操 作可以 在特定 位点按 照每个 位点预 定的序 列合成 出大 量的寡 核苷酸 探针。 2. 合成 点样法 由于 原位合 成方法 仍然比 较复杂 ,除 了在基 因芯片 研究方 面享有 盛誉的 Affymetrix 等 公司使 用该技 术合成 探针外 ,其 他中小 型公司 大多使 用合成 点样法 。后 一方法 在多聚 物的 设计方 面与前 者相似 ,合成 工作用 传统的 DNA 或 多肽固 相合成 仪完成 ,只 是合成 后用 特殊的 自动化 微量点 样装置 将其以 比较高 的密度 涂布于 硝酸纤 维膜、 尼龙膜 或玻片 上 (图 14.3)。 支持物 应事先 进行特 定处理 ,例 如包 被以带 正电荷 的多聚 赖氨酸 或氨基 硅烷 。现 在已有 比较成 型的点 样装置 出售, 如美国 Biodot 公司的 点膜产 品以及 Carte- sian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系 列产品 。前 者产生 的点阵 密度可 以达到 400/ cm2, 后者则 可达到 2500/cm2。 图 14.3 合成 点样法 (二) 样品 的准备 生 物样品 往往是 非常复 杂的生 物分子 混合体 ,除少 数特殊 样品外 ,一 般不能 直接与 芯 片反应 。可 将样品 进行生 物处理 ,获取 其中的 DNA 或 RNA, 并且加 以标记 。目 前, 由 于灵敏 度所限 ,多数 方法需 要在标 记和分 析前对 样品进 行适当 程序的 扩增。 Mosaic Technologies 公司发 展了一 种固相 PCR 系统。 该系统 包含两 套特异 性引物 ,每套 引物都 可 以从靶 基因两 头延伸 。当 引物和 DNA 样品及 PCR 试剂 相混时 ,如 果样品 DNA 包含 靶序列 , DNA 就 从引物 两头开 始合成 ,并 在引物 之间形 成双链 DNA 环或 “桥” 。由于 上述 反应在 固相中 产生, 因而避 免了引 物竞争 ,减少 交叉污 染并且 省去了 液相处 理的繁 琐; Lynx Therapeutics 公司引 入的大 规模并 行固相 克隆法 (massively parallel solid-phase cloning), 可在一 个样品 中同时 对数以 万计的 DNA 片段进 行克隆 ,且 无需 单独处 理和分 离每 个克隆 ,使样 品扩增 更为有 效快速 。样 品的 标记一 般应用 RNA 逆 转录为 DNA 过 程中掺 入荧光 染料如 Cy3 或 Cy5 等。 . 888 • (三) 固相杂 交反应 杂 交反应 的条件 类似于 传统的 Southern 或 Northern 杂交 ,具 体的选 择视研 究目的 而定 。例如 ,进 行多态 性分析 或杂交 测序时 ,要 求能够 区分单 个碱基 的变异 ,所 以需要 较高的 杂交严 谨性; 而用于 表达谱 检测的 芯片为 了提高 检测的 特异性 、保证 较高的 灵敏. 度, 需要较 长的杂 交时间 ,高的 严谨性 、高 的样 品浓度 、较低 的杂交 温度等 。同时 ,杂 交 反应还 必须考 虑反应 液中的 盐浓度 、探针 序列的 G+C 含量 、探针 所带电 荷情况 、探 针与 芯片片 基间连 接臂的 长度及 种类以 及靶序 列二级 结构等 因素。 固定于 芯片表 面的探 针 与位于 液相的 靶分子 进行生 化反应 (作用 ) 的 过程不 完全与 液相中 生化反 应相同 。其 原因 在于, 生物大 分子与 固相支 持物的 结合导 致了溶 液中的 靶分子 与其不 能迅速 地发生 作用 ,延 长了反 应时间 ,必 要时还 必须提 高靶分 子的浓 度以加 快反应 。而 且固相 化的大 分子, 特别是 空间体 积较小 的分子 ,很容 易受到 支持物 对生化 反应的 空间阻 碍作用 。如 何 解决以 上问题 是生物 芯片技 术应用 中的关 键之一 。有研 究表明 ,在 探针 分子与 片基间 加入适 当长度 的连接 臂可使 杂交效 率提高 上百倍 ,连 接臂将 固相化 的探针 分子与 支持物 隔开 一定的 距离, 减少空 间阻碍 作用。 DNA 分 子中任 何带正 电或负 电的残 基都会 影响杂 交效率 。另外 ,在 有利于 杂交双 链形 成的条 件下, 探针分 子本身 也有利 于形成 自身双 链的二 级结构 甚至三 级结构 ,使靶 序列 不易被 探测到 。解决 杂交中 诸多问 题的最 好方法 就是用 PNA 代替 DNA 制作 芯片。 PNA 是丹麦 科学家 Nielsen 于 1991 年首先 合成。 PNA 是 一类以 酰胺键 (假 肽键) 替代 DNA 中的 糖-磷 酸二酯 键骨架 ,并以 基本相 同的间 距保留 DNA 中 的碱基 部位。 PNA 的结构 规定了 它有两 个基本 特性: ①它既 非典型 的多肽 ,也非 DNA, 因而 能抵御 蛋白酶 和核酸 酶的降 解作用 ,有很 高的稳 定性; ②它不 仅可以 与天然 DNA 碱基 配对, 而且与 DNA 单链分 子形成 稳定的 DNA (PNA)2的 三股螺 旋结构 。由于 PNA 不像 DNA 那样在 核酸磷 酸骨架 中存在 带负电 荷的磷 酸基团 ,因 而杂交 时不需 盐离子 以抵消 DNA 链之 间的静 电排斥 。这样 DNA 和 PNA 更易 靠近而 形成杂 交分子 ,不会 因静电 斥力形 成自 身二级 、三 级结构 。因此 ,即 使只有 10 个碱 基链长 ,就 可以在 合适的 变性- 复性条 件下 “入侵 ”双链 DNA, 形成 局部的 p-loop 结构。 PNA-DNA 杂 交体比 DNA-DNA 或 DNA-RNA 杂 交体更 为稳定 ,而 且可防 止核酸 二级结 构对杂 交反应 的影响 ,所以 适合进 行 单个碱 基错配 的分析 。目前 已试用 DNA 合成 仪合成 PNA, 展现 出制造 PNA 芯片的 诱人 前景。 现在的 主要问 题是有 机合成 PNA 的 方法有 待进一 步改进 、简化 和定型 ,便 于规模 生产。 (四) 芯 片信号 的检测 目前 芯片检 测主要 应用荧 光法, 其重复 性较好 ,不 足的是 灵敏度 仍较低 。正 在发展 的 方法有 质谱法 、化学 发光法 、光 导纤维 法等。 以荧光 法为例 ,荧光 标记的 DNA 碱基 在不同 波长下 吸收和 发射光 ,其 荧光信 号强度 与其含 量呈一 定线性 关系。 由于完 全正常 的 Watson-Crick 配 对双链 要比具 有错配 (mismatch) 碱基的 双链具 有较高 的热力 学稳定 • 889 • 性, 所以前 者的荧 光强度 要比后 者强出 5 〜 35 倍 。从 这一点 来说, 该检测 方法具 有一定 特异性 。应用 激光共 聚焦显 微技术 ,由 计算机 收集荧 光信号 ,并对 每点荧 光强度 数字化 处 理后进 行分析 。在 微阵列 分析中 ,多 色荧光 标记可 以在一 个分析 中同时 对两个 或多个 生物 样品进 行多重 分析, 多重分 析能大 大提高 基因表 达和突 变检测 结果的 准确性 ,排除 芯片与 芯片间 的人为 因素。 三、 基因芯 片技术 的应用 (一) 杂 交测序 杂 交测序 (SBH) 是发展 基因芯 片技术 的初衷 ,这 种快 速的测 序方法 具有十 分诱人 的应用 前景。 SBH 技 术包括 :未知 序列的 DNA 与大 量的寡 核苷酸 集合的 杂交; 形成完 整的 双链体 (包 含目标 DNA) 的寡 聚物的 鉴定与 分析; 重建 DNA 序列。 Mark chee 等 用含 135 000 个 寡核苷 酸探针 的阵列 测定了 全长为 16. 6kb 的人线 粒体基 因序列 ,准 确率 达到 99.9%。 但 是正确 用于大 规模的 DNA 测序 ,必 须使用 很大的 确定长 度的组 合寡核 苷酸, 现行方 法尚难 以制作 。即 便如此 ,由于 高密度 的寡核 苷酸探 针点阵 所含的 丰富信 息 ,在 DNA 测 序方面 仍有广 阔发展 及应用 前景。 (二) 基因表 达水平 的检测 用基 因芯片 进行的 表达水 平检测 可自动 、快速 地检测 出成千 上万个 基因的 表达情 况。 Schena 等 采用拟 南芥基 因组共 45 个 基因的 cDNA 微阵列 ,检 测该植 物的根 、叶组 织内 这些基 因的表 达水平 。结果 发现该 植物根 、叶 组织 中存在 26 个基因 的表达 差异, 而参与 叶绿素 合成的 CAB] 基 因在叶 组织较 根组织 表达高 500 倍。 Peer M 应用 微矩阵 检测 拟南芥 2375 条 防御和 调控相 关基因 EST 的表达 协同性 ,以揭 示拟南 芥的协 同防御 反 应机制 。不难 想像, HGP 完成 之后, 用于检 测在不 同生理 、病 理条件 下的人 类所有 相关 基因表 达变化 的基因 组织芯 片的出 现将很 快应运 而生。 (三) 基 因诊断 医 学诊断 学的发 展历经 3 个阶段 : 生化指 标检查 、免 疫学或 血清学 诊断、 基因诊 断 。伴 随着人 类基因 组计划 的实施 ,越 来越多 的与疾 病相关 基因被 克隆, 基因突 变可引 起 多种遗 传疾病 、肿 瘤和遗 传易感 性疾病 等已被 医学界 所公认 。基 因突变 检测的 核心技 术是 DNA 分子杂 交和聚 合酶链 式反应 ,近年 来在这 两种核 心技术 的基础 上又衍 生出许 多新 的检测 手段, 尤其是 DNA 芯 片的出 现使突 变检测 变得规 模化和 程序化 。核 酸突变 的 检测及 基因组 多态性 的分析 ,例 如对人 B 尺 CAJ 基因 外显子 11、 CFTR 基因、 (3- 地中 海 贫血病 基因、 HIV- 逆转 酶基因 及蛋白 酶基因 等的突 变检测 ,对 人类基 因单核 苷酸多 态性 的鉴定 、作图 和分型 ,以 及人 线粒体 16. 6kb 基 因组多 态性的 研究等 。将生 物传感 器与芯 片技术 相结合 ,通过 改变探 针阵列 区域的 电场强 度以检 测基因 (如 Ras) 等的单 . 890 • 碱 基突变 。另外 ,基因 芯片在 基因诊 断的其 他方面 亦有广 泛应用 。如 Heller 等构 建炎症 相关 基因的 cDNA 微阵 列以检 测分析 RA。 现在 ,肝 炎病毒 检测诊 断芯片 、结核 杆菌耐 药性检 测芯片 、致 病菌检 测芯片 、多种 恶性肿 瘤相关 病毒基 因芯片 一系列 诊断芯 片相继 问 世并投 入市场 ,基 因诊断 是基因 芯片中 最具有 商业化 价值的 应用。 (四) 在药物 研究中 的应用 在此领 域中主 要分为 两个方 面:其 一是新 药开发 筛选; 其二是 指导临 床合理 用药及 给药个 性化。 1. 新药开 发筛选 当 今工业 化规模 的新药 开发有 3 大技 术支柱 ,即组 合化学 、遗 传学和 高通量 筛选。 组合化 学技术 为新药 开发提 供新化 合物; 遗 传学技 术提供 新的作 用靶标 •,高 通量 筛选技 术 提供有 效的筛 选方法 。后 二者相 辅相成 ,构成 较为完 整的筛 选体系 ,即 基于 疾病机 理, 选择特 定生物 分子作 为靶标 的高通 量筛选 。基因 芯片作 为一种 高度集 成化的 分析手 段, 能够有 效地解 决提供 、确定 靶标及 药物筛 选的这 两个关 键问题 。利用 基因芯 片分析 用药前 后机体 的不同 组织、 器官基 因表达 的差异 。如 果再用 mRNA 构建 cDNA 表达文 库 ,然 后用得 到的肽 库制作 芯片, 则可以 从众多 的药物 成分中 筛选出 起作用 的物质 。或 者利用 RNA、 单链 DNA 固定在 芯片上 ,然后 与靶蛋 白孵育 ,形成 蛋白质 -RNA 或蛋白 质 -DNA 复合物 ,可以 筛选特 异的药 物蛋白 或核酸 ,因 此芯片 技术和 RNA 库的 结合在 药物筛 选中将 得到广 泛应用 。在 寻找抗 HIV 药 物的过 程中, Jellis 等用组 合化学 合成及 DNA 芯 片技术 筛选了 654 536 种 硫代磷 酸八聚 核苷酸 ,并从 中确定 了具有 XXG4XX 样 结构的 抑制物 ,实验 表明, 这种筛 选物对 HIV 感染 细胞有 明显阻 断作用 。生物 芯片技 术 使得药 物筛选 、靶基 因鉴别 和新药 测试的 速度大 大提高 ,成 本大 大降低 。基因 芯片药 物筛 选技术 工作目 前刚刚 起步, 美国很 多制药 公司已 开始前 期工作 ,即正 在建立 表达谱 数据库 ,从 而为药 物筛选 技术提 供各种 靶基因 及分析 手段。 这一技 术具有 很大潜 在应用 价值。 2. 给药 个性化 临床上 ,在 药物 疗效与 不良反 应方面 ,不 同患者 之间存 在较大 差异。 这主要 是由于 不同 个体之 间基因 (如肝 脏代谢 酶相关 基因等 ) 的差 异所致 。目 前运用 生物芯 片分析 SNP 如火 如荼, 一方面 可以大 规模筛 选新的 SNP, 更重要 的是药 物遗传 SNP 的 研究有 助于新 药开发 ,还 可以针 对不同 基因型 的个体 采取不 同的治 疗方法 和用药 ,以获 得最佳 疗效 ,这就 是所谓 的个性 化医疗 。另一 方面, 在治疗 中很多 同种疾 病的具 体病因 因人而 异, 用药亦 应该因 人而异 。例 如乙肝 有较多 亚型, HBV 基因 的多个 位点如 S、 P 及 C 基因 区易发 生变异 。若用 乙肝病 毒基因 多态性 检测芯 片每隔 一段时 间就检 测一次 ,这对 指导用 药防止 乙肝病 毒耐药 性很有 意义。 . 891 . 第二 节蛋白 质芯片 随着人 类基因 组草图 的初步 完成, 生命科 学已经 跨入“ 蛋白组 学”的 新时代 ,蛋白 质的 研究将 成为生 命科学 领域继 人类基 因组之 后的最 重要、 最前沿 的课题 。酵母 大规模 双杂 交自动 筛选及 二维凝 胶电泳 偶联质 谱检测 仍是目 前常用 的蛋白 组学的 研究方 法和技 术。 为了创 造新的 工具研 究蛋白 的表达 和相互 间作用 ,迫 切需 要研发 高通量 、空 间容量 大的 蛋白质 芯片。 但是蛋 白质和 DNA 的化学 性质截 然不同 ,成功 的平台 设计必 须适应 蛋白质 的复杂 结构和 相对较 低的细 胞丰量 。蛋 白质不 能用扩 增法提 高拷贝 数来达 到要求 的 敏感度 ,因 此灵敏 的检测 方法非 常重要 。许 多蛋白 质间的 相互作 用是发 生在折 叠的具 有 三维结 构的多 肽表面 ,不像 核酸杂 交反应 只发生 在线性 序列间 。保 持蛋 白质天 然折叠 结构至 关重要 ,但是 芯片制 备中所 用试剂 、热 处理、 干燥等 难免影 响到蛋 白质的 活性。 另外蛋 白质- 蛋白质 间的特 异作用 主要是 抗原- 抗体反 应或与 受体的 反应, 没有序 列特异 性 ,只有 专一性 ,这加 大了芯 片平行 分析的 难度。 MacBeath 和 Schreiber 首先 报道了 利用蛋 白质微 型方阵 研究蛋 白质相 互作用 及与小 分 子作用 的研究 。他们 在点样 液中用 40% 甘油 使蛋白 质保持 亲水性 ,从 而有效 保持蛋 白质天 然活性 。大 部分蛋 白质在 缺乏甘 油的条 件下保 持活性 。如果 有甘油 ,效 果会更 佳 。对 于大多 数抗体 ,甘 油是非 必需的 ,其他 蛋白域 仍需要 甘油的 介入。 芯片载 体亦需 相 应处理 ,采用 玻片作 为载体 ,用化 学法修 饰玻片 ,使之 保持醛 基基团 , 具有亲 水性。 而且后 者可被 BSA 蛋白封 闭钝化 ,这 样能非 常有效 降低与 其他蛋 白的非 特异性 结合。 由于硅 的高活 性使硅 表面无 法直接 与蛋白 质相连 ,有人 研制出 一种固 相薄膜 ,置 于硅表 面和 活性基 团之间 ,从而 从空间 上解决 硅片表 面的活 性基团 配对区 问题。 芯片检 测采用 类似于 DNA 芯片的 荧光法 ,但 是荧光 染料会 影响蛋 白质天 然活性 。因此 目前蛋 白质芯 片检测 的发展 方向是 质谱法 、物理 方法等 。代 表技术 分别为 SELDI 技术、 BIACORE 技 术 以及光 学蛋白 质芯片 。另外 构象性 蛋白质 芯片也 是时下 研究的 热点。 一、 SELDI 技术 电 子喷射 离子化 (electrospray ionization, ESI) 及基 质辅助 解吸附 离子化 (matrix- assisted laser desorption /ionization, MALDI) 的出 现扩大 r 质谱分 析在复 杂生物 系统蛋 白 质研究 中的应 用范围 。然 而复杂 的生物 物质, 如血液 、血清 、血浆 、淋巴 、脑 脊液、 尿液 、完 整细胞 、细胞 裂解液 体及细 胞分泌 产物等 ,包 括数 百种生 物分子 以及有 机物、 无机盐 ,这 些都使 得不能 直接质 谱分析 ,于是 对于质 谱分析 来说, 样品预 处理和 纯化是 必需的 ,然而 传统的 样品纯 化如液 相色谱 、免 疫沉淀 、电泳 不仅劳 神费力 ,而且 因为非 特异 性结合 和稀释 效应会 对样品 检测产 生影响 。因此 研发一 种直接 、简便 的质谱 分析方 法非常 迫切。 1993 年 Hutchens 和 Yip 提出 表面增 强激光 解吸附 离子化 (surface-en- hanced laser desorption /ionization, SELDI) 这 一概念 。相对 于传统 的激光 解吸附 离子化 (laser desorption /ionization , LDI) 或 MALDI 技术, 这一薪 新的大 分子质 谱分析 方法简 • 892 • 化了 样品预 处理。 SELDI 包括 3 个方面 的技术 :表面 增强亲 和捕捉 (surface-enhanced affinity capture, SE AC)、 表面 增强全 解吸附 (surface- enhanced neat desorption, SEND) 及 表面增 强光敏 吸附 和释放 (surface-enhanced photolabile attachment and release, SEPAR)。 在 SEND 技 术中, 待测物 (包括 生物大 分子) 不需基 质辅助 可以解 吸附和 离子化 ,而 MALDI 必须 借助 吸能基 质以传 导激光 能量。 SEND 的实 现依赖 于共价 结合于 探针表 面的吸 能化合 物。 SEPAR 是 SEAC 和 SEND 的混合 ,此 时探 针不仅 可以表 面亲和 捕捉检 测样品 ,而 且能 吸收传 导激光 能量以 实现样 品解吸 附和离 子化。 到目前 为止, SELDI 应用中 SEAC 最具发 展前景 。芯 片表面 探针通 过特异 结合待 测物相 应蛋白 质即表 面亲和 捕捉, 对样品 分 离纯化 、传送 、结构 修饰和 (或) 扩增起 着积极 作用。 检 测样品 加于芯 片表面 ,探 针与待 测样品 中相应 物质特 异结合 ,经严 格洗涤 ,洗脱 非特异 结合的 蛋白质 或污染 物质, 从而完 成对样 品的原 位纯化 。然后 经过原 位酶解 、洗 涤或直 接将芯 片插入 检测装 置即配 备有激 光解吸 附离子 化激光 源的飞 行时间 质谱仪 (time of flight- mass spectrometry, TOF-MS)。 一 般选用 氮激光 ( X = 337nm) , 其 尾迹简 单 、价 格相对 便宜。 SEAC 时需 要基质 溶液以 增强传 递激光 能量、 促进待 测物解 吸附和 离 子化。 SEND 和 SEPAR 则不 需基质 溶液可 以直接 检测。 结合于 芯片表 面的待 测蛋白 质或 肽于真 空条件 下被激 光照射 ,蛋白 质或肽 被激发 获得质 子而离 子化, 再被一 稳压电 场加速 ,经 离子 镜偏转 ,其飞 行时间 (time of flight, TOF) 被检 测记录 ,经计 算机处 理得到 质谱图 。其过 程见图 14.4。 TOF 和离子 化的待 测蛋白 或肽的 质荷比 (mass to charge ratios, m/z) 相关 ,其 关系解 释见图 14.5。 质谱图 (如图 14.6) 不 仅可以 定量, 而且根 据质谱 峰的质 荷比相 对强度 ,还 可以进 行结构 分析。 Ciphergen 公司 实现了 SELDI 的商 品化, 其主要 产品为 ProteinChip® 微矩阵 系统, 已经广 泛应用 于许多 临床和 基础问 题研究 ,如生 物标志 物的寻 找等。 激光 光学椅 图 14.4 SELDI 检 测的基 本过程 • 893 • Ion Drift Region Ion Acceleration Region 2500 5000 7500 10 000 12 500 in 图 14.6 质谱图 二、 Biacore 技术 Biacore 技术 是瑞典 Pharmacia Biacore 公 司开发 出的检 测生物 分子相 互作用 (biomolecular interaction analysis, BIA) 的分 析技术 。该技 术测定 原理基 于物理 光学现 象表面 等电子 体共振 。以 镀有 金或银 薄层的 玻璃片 为载体 ,固定 上探针 或配体 ,制 成生 物芯片 。被选 择探针 或配位 体的专 一性能 确保生 物分子 的特异 性结合 ,对 血清、 组织培 养上 清液、 细胞提 取液等 进行直 接分析 而不需 预处理 ,可提 供生物 分子结 合或离 解的动 力 学常数 ,空 间结构 及异位 效应等 。可 在数分 钟内完 成传统 技术需 数小时 甚至数 日的复 杂体系 中的分 子作用 分析。 1. 表 面等离 子体共 振原理 光激发 表面等 离子体 共振以 满足全 内反射 条件的 入射光 作为激 发光。 当一束 光线照 射入两 个不同 折射率 的透明 介质, 如果入 射角小 到一临 界角时 ,折射 光消失 ,反 射光等 于入射 光能量 ,称 为全 内反射 。全内 反射时 ,入 射光 线并非 完全不 能进入 折射率 较小的 光疏 介质中 ,而 是将掺 入光疏 介质中 ,其 电磁场 强度随 掺入深 度呈指 数衰减 ,这 一衰减 电磁 波称为 消失波 。如果 在上面 体系中 以金或 银薄膜 作为光 疏介质 ,以玻 璃支持 体作为 光密 介质, 消失波 电磁场 将导致 金属的 自由电 子振荡 ,该振 荡电荷 以向量 形式沿 表面运 动 ,称 之为等 离子体 。当 在以合 适入射 角或用 某一特 定波长 的入射 角时, 发生表 面等离 子体 共振, 能量从 入射光 光子传 递到等 离子体 ,反射 光消失 。消失 波电磁 场激发 金属薄 膜表面 等离子 体运动 ,而 消失波 电磁场 受其掺 入介质 折射率 的影响 。因此 ,金属 薄膜及 其表面 液体折 射率的 变化将 导致等 离子体 运动矢 量大小 变化。 Biacore 技术 就是 基于表 面等 离子体 共振时 入射光 角度与 金属薄 膜表面 液体折 射率的 关系来 探测生 物分子 间即时 (realtime) 的相 互作用 (图 14.7)。 • 895 . 2.BiaC〇re 技术 分析 生物分 子间的 相互作 用原理 Biacore 系统中 金属薄 膜的厚 度约为 50nm, 因而 消失波 可以透 过金属 薄膜探 测在其 表 面发生 的结合 、配位 等反应 。相 互作 用分子 之中的 一方必 须先固 定在金 属薄膜 表面, 制成生 物芯片 ,利 用一个 集成微 射卡盘 IFC (integrated micro-fluidies cartridge) 将样品 缓 冲输送 到生物 芯片上 。样品 与所固 定探针 作用时 ,即点 蛋白质 浓度发 生变化 ,折 射率 发生 变化, 等离子 体共振 信号相 应改变 。通过 收集分 析共振 信号可 随时监 测样品 与所固 定探针 的作用 情况, 因而能 真实地 反映生 物分子 间的作 用过程 。共 振信号 的改变 以单位 RU 表示, 100RU 表示 0.1° 的入射 角变化 ,相 当于 lng/mm2 的蛋白 质浓度 变化。 3.Biacore 产品 及应用 Pharmacia Biacore 公司 开发的 Biacore 系列产 品有: BIACORE 3000、 BIACORE 2000、 BIACOREX、 BIACOREprobe, 以及配 套软件 、芯 片和试 剂等。 BIACORE 技术 可探 测生物 分子相 互作用 类别包 括抗原 / 抗体相 互作用 、溶 液或 脂膜表 面配体 / 受 体相互 作用 、多肽 / 蛋白 质相互 作用、 DNA/ 蛋 白相互 作用、 DNA/DNA 相互 作用及 RNA/ 蛋白 质相互 作用等 。可 广泛应 用于新 药开发 、免 疫分析 、基 因工程 、信 号传导 、蛋白 组学等 领域。 三 、构象 性蛋白 质芯片 基 于活性 蛋白质 对构象 的高度 依赖性 ,已有 科学家 开始研 发构象 性蛋白 质芯片 。这 种芯 片将更 适于模 具的制 备和终 端产品 的大规 模生产 ,特别 是更易 与计算 机偶联 ,最终 在蛋 白组学 研究上 代替或 淘汰现 有的二 维凝胶 电泳偶 联生物 质谱通 用方法 。其技 术原理 依据 于模板 印迹纳 米级结 构表面 可特异 性识别 蛋白质 ,见图 14.8。 选用 云母作 为蛋白 质吸 附固相 基质。 这是因 为云母 表面达 到原子 级平滑 ,从而 保证印 迹膜表 面准确 反映模 板 分子的 空间拓 扑结构 ,避 免自身 表面的 起伏噪 声影响 。而 且由于 其表面 天然的 亲水性 和 电负性 ,有 利于保 持蛋白 构象。 根据事 先的设 计定位 和排阵 ,分 别将不 同蛋白 点加吸 • 896 . 图 14.8 构象性 蛋白质 芯片制 作原理 附于云 母片上 。再将 二糖包 被在吸 附蛋白 表面, 形成一 层糖壳 ,防 止蛋白 质变性 ,使模 板分 子结构 信息真 实完整 保留。 然后运 用等离 子体喷 镀处理 (radiofrequecy glow-dis- charge plasma deposition) 技术 ,壳 上喷镀 〇3F6 ,与二 糖交联 成膜, 达一定 厚度则 剥离。 用碱性 溶液处 理等离 子体膜 -云母 界面, 洗脱包 被的吸 附蛋白 ,暴 露在有 蛋白印 迹的纳 米穴位 种最恰 似的模 板蛋白 的镜像 。它 与待测 样品中 配体的 识别和 结合是 高度特 异的。 上述 方法是 从实际 蛋白质 (天然 蛋白质 、基 因工程 蛋白) 出发 的表面 印迹法 。实际 上 ,还有 一种“ 虚拟” 制作方 法更具 吸引力 。它 是一 种基于 蛋白质 数据库 中蛋白 质三维 构象 信息的 芯片表 面蚀刻 微处理 技术。 整个芯 片制作 过程不 涉及生 物分子 的实际 参与, 完全 是根据 数据库 中的蛋 白质的 结构信 息由计 算机控 制在云 母光滑 的纳米 表面“ 雕琢” 出蛋 白印迹 。此 方法可 以制作 已知蛋 白的三 维印迹 ,而 且可以 引入人 为的结 构信息 ,就 像 寡核苷 酸设计 和基因 工程对 核酸序 列一级 结构重 构一样 ,实现 蛋白质 结构的 人工改 造 。尤其 在探索 蛋白质 的折叠 、蛋白 质间的 动态作 用上有 着莫大 的优势 。因 此构 象性蛋 白质芯 片将在 另一个 层面上 融合纳 米技术 、半 导体、 计算机 和分子 生物学 技术。 结 果的检 测首选 原子力 显微镜 (atomaticforce microscopy, AFM) 表 面扫描 技术。 触 击模式 (tapping-mode) 的 AFM 使其 针尖在 印迹表 面移动 ,在 原子级 分辨率 水平上 可 直接绘 出印迹 膜的表 面信息 ,从 而了解 目的蛋 白与印 迹穴的 精确结 合信息 ,作 为定性 定量 获得蛋 白表达 情况的 基础。 也可以 应用灵 敏的荧 光染色 。以 Biacore 为代 表的生 物 传感技 术也可 以用来 感知蛋 白质芯 片上特 定“穴 位”与 样品混 合物中 目标蛋 白的结 合细节 ,而且 可以实 现实时 监控。 表面增 强激光 解吸附 / 离 子化技 术亦可 应用于 检测。 第三 节组织 微阵列 组织 微阵列 (tissue microarray) 是 1998 年由 Kononen 等在 cDNA 微 阵列的 基础上 发明的 。将少 量组织 高密度 地固定 于固相 载体上 ,然后 用不同 的基因 、寡 核苷酸 或抗体 与之进 行杂交 ,以 研究目 的基因 在不同 组织之 间的差 异表达 情况。 组织微 阵列制 作有; r 套独特 的方法 。首 先根据 HE 染色 结果确 定肿瘤 的大小 、类 型 、分级 ,再 确定 预计取 样组织 的位置 ,然后 用不锈 钢针进 行穿刺 ( 内径为 0.6mm), 穿刺针 附有特 制支架 ,以 确定 X、 Y 轴方向 ,保证 穿刺的 准确性 。穿刺 位置的 确定以 选定的 HE 染色结 果定位 ,一 般恶 性肿瘤 组织在 2~3mm 之内 结构变 化不大 ,但 正常组 织 、良 性肿瘤 、早期 原位癌 则可能 有变化 。因此 ,每 隔一段 距离要 重新做 HE 染 色以确 定取 材位置 。一 般取材 深度为 2~3mm, 将此 柱状物 固定于 适当的 模具上 ,每个 标本间 隔 0.1mm, 以 0. 4;xrn 的 厚库进 行切片 ,将 此薄片 黏附于 M 龙膜或 玻片等 固相载 体上, 就制成 了组织 微阵列 。每 个模具 可以连 续做出 许多个 组织微 阵列。 但为保 证取材 的准确 性, 一般每 40 张切片 就重新 做一次 HE 染 色以矫 正取材 位置。 探针 标记上 同位素 (32P、 33P)、 生物素 或荧光 染料后 ,再与 微阵列 进行严 格条件 下的 杂交。 探针通 常是特 异性的 。同位 素标记 的探针 可通过 放射自 显影来 检测; 生物素 标记 探针简 便易行 ,可 直接在 光学显 微镜下 检测; 荧光 标记 的探针 片段结 合到相 应的位 • 897 • 置后 ,可通 过氩离 子激光 共聚焦 显微镜 检测。 由于荧 光标记 有实时 、分辨 率好、 无放射 性污染 等优点 ,现 已基本 取代了 同位素 标记。 组织微 阵列技 术可以 同时对 阵列上 每一个 标本原 位检测 DNA、 RNA 和 蛋白质 ,而 且因其 在一个 模具上 可以制 作许多 微阵列 ,所 以对临 床研究 中的大 规模初 筛具有 很大意 义 。组织 微阵列 技术还 扩展了 FISH 和免 疫组织 化学技 术的应 用范围 ,并 使两者 效率更 高 。 组织微 阵列应 用范围 很广, 可用于 基因表 达检测 、验证 新基因 的特异 表达、 突变体 与 多态性 的检测 、药 物筛选 及疾病 诊断等 方面。 其 发展和 应用主 要受到 3 个 主要方 面的制 约:是 否能够 得到大 量组织 标本; 是否能 够制 作出高 密度的 微阵列 系统; 荧光标 记技术 的改进 、免疫 组织技 术的提 高和计 算机系 统 的优化 。另外 ,如何 确定同 一标准 、如 何分析 和判断 结果也 是有待 解决的 重要问 题。 组 织微阵 列技术 的迅速 发展已 经引起 了各方 面的广 泛关注 。许多 实验室 、专 业公司 和制药 公司都 在大力 开发与 此相关 技术。 Affymetrix、 Incyte、 Synteni、 Clontech、 Gene 等公 司均已 研制出 产业相 关产品 。如供 肿瘤诊 断用的 P53 微阵列 、供 肿瘤 与正常 组织对 比研 究的微 阵列等 。另 外某些 公司还 可根据 需要定 制各种 微阵列 系统。 第四 节芯片 实验室 生物 分析仪 器及过 程的微 型化和 集成化 已成为 20 世纪 90 年代生 命科学 、化 学和微 电 子学等 领域和 开发的 重要方 向之一 。通 过在玻 璃或硅 片上光 刻印刷 制作各 种微泵 、微 阀、 加热器 、温度 传感器 以及迷 宫般的 微流路 ,则可 将整个 实验室 的分析 功能浓 缩固化 在 芯片上 (lab-on-a-chip), 此 谓芯片 实验室 。见图 14.9。 图 14.9 芯片 实验室 生物芯 片的微 加工制 作是应 用微电 子工业 和半导 体制造 业中一 些比较 精细的 加工工 艺 ,如 光学平 版印刷 技术、 反应离 子刻蚀 、微注 入模塑 和聚合 膜浇注 术法等 ,在 玻璃、 . 898 • 塑料 、硅片 等材料 上加工 出用于 生物样 品分离 、反 应的 微米尺 寸的精 细结构 ,如 样品过 滤器 、微量 反应室 、微泵 、微 阀门等 。在上 述结构 表面进 行必要 的化学 处理后 ,可 在其 上 进行生 物化学 反应和 分析。 下 面简要 介绍一 下光刻 平版印 刷技术 在生物 芯片的 微加工 制作中 的应用 。光 刻平版 印刷 技术主 要用于 在硅片 上需增 厚或刻 蚀部分 的图案 的刻制 。一般 先将光 敏感聚 合物涂 在硅 片上, 待溶剂 蒸干后 ,硅片 的光敏 层上覆 有掩膜 (类 似于照 片的正 / 反片) 暴露在 紫 外光下 ,就能 选择性 将光敏 层刻制 成相应 的图案 ,在 此图 案上再 用化学 刻蚀的 方法可 以在 硅片上 刻制相 应凹槽 ,完成 后去除 光敏层 。增厚 的结构 则可以 通过沉 积完成 ,然后 再 进行下 一个循 环工序 。光敏 层涂溃 、光刻 、刻蚀 组成了 工序的 3 个基本 步骤。 对于某 些集成 的微型 化器件 ,这 样的工 序可能 要重复 25 次 或更多 ,每一 次沉积 可采用 不同的 材料 和不同 图案的 掩膜。 通过特 定形状 的模板 在硅片 的基质 上或沉 积层上 进行增 厚或刻 蚀 ,最 终制得 一个具 有三维 结构的 芯片。 生物样 品的分 析通常 包括样 品制备 、生 物化 学和分 子生物 学反应 、结 果检测 和数据 处理 等过程 。将其 中一个 步骤或 几个步 骤微型 化集成 到同一 芯片上 ,就能 够获得 具有特 殊功 能的生 物芯片 :如用 于样品 制备的 过滤分 离芯片 、介 电电泳 芯片和 细柱式 DNA 萃 取 芯片; 用于 生物化 学反应 的生物 芯片, 主要是 应用大 量扩增 、复制 样品的 PCR 技术, 包 括帕尔 帖电热 PCR 芯片 、薄膜 多晶硅 加热套 内置式 PCR 芯片 、恒 温区间 连续流 PCR 芯片; 将样品 制备和 扩增反 应集成 的坝式 微过滤 芯片; 用于 基因突 变检测 和基因 表达的 毛 细管电 泳芯片 、寡核 苷酸探 针芯片 、杂 交测序 芯片、 DNA 微阵 列芯片 和用于 药物筛 选的 高通量 微米反 应池芯 片等。 缩微芯 片实验 室的核 心技术 是在芯 片上含 有样品 制备、 纯化与 检测等 微电子 结构。 由于其 具有精 密的微 电子制 备和检 测系统 ,不仅 所需样 品量大 为减少 ,而 且灵 敏度提 高, 因而可 以快速 、精确 地完成 从样品 制备到 测试结 果的全 部分析 过程, 可以有 效克服 人工操 作的实 验误差 ,系 统稳定 性极佳 。目前 ,含有 加热器 、微 泵微阀 、微流 量控制 器、 电子化 学和电 子发光 探测器 的芯片 已经研 制出来 ,同时 也出现 了将样 品制备 、化学 反应 和分析 检测部 分结合 的芯片 。相 信包含 全部实 验过程 的缩微 芯片实 验室将 很快出 现 ,人 们可以 在一个 封闭的 系统内 快速完 成从原 始样品 到测试 结果的 全部实 验步骤 ,再 进 一步结 合卫星 传输和 网络生 物信息 学的技 术资源 ,真 正实现 高通量 、一 体化、 移动性 的“未 来性掌 上实验 室”的 构想。 黄海涛 林菊生 主要参 考文献 Kononen, J. , Bubendorf L. , Kallioniemi A. , et al. 1998. Tissue microarrays for high-throughput molecular pro- filing of tumor specimens. Nat. Med. , 4(7) : 844 〜 847. MacBeath, G. and Schreber, S. L. 2000. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determi- nation. Science, 289: 1760 〜 1763. McGall, G. , Labadie, J. , Brock, P. , et al. 1996. Light-directed synthesis of high-density olignucleotide arrays using semiconductor photoresists Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 93 : 13555 〜 13560 • • 899 • Merchant, M.and Weinberger, S. R. 2000. Recent advancements in surface- enhanced laser desorption/ ioniza- tion-time of flight-mass spectrometry. Electrophoresis, 21 : 1164 〜 1167. Shi, H. , Tsai, W. B. , Garrison, M. D. , Ferrari, S. and Ratner, B. D. 1999. Template-imprinting nanostruc- tured surfaces for protein recognition. Nature, 398: 593 〜 597. Schena, M. 1999. DNA microarrays, a practical approach. 1st ed. England: Oxford University Press, 93: 10614 〜 10619. • 900 • 第 十五章 细胞培 养技术 引 言 组织细 胞培养 作为一 门基本 的生物 技术, 广泛地 运用于 现代生 命科学 研究和 现代生 物产 业的各 个方面 。细胞 培养具 有一系 列优点 :培养 条件易 于改变 和严格 控制, 便于进 行各 种物理 、化学 、生 物因 素对活 体细胞 影响的 研究; 通过 在体外 环境下 长期存 活和传 代, 便于研 究和观 察在体 外环境 变化中 的遗传 性状的 改变; 便于运 用各种 技术和 方法研 究 细胞结 构和功 能变化 的特点 。此外 ,还 由于 可批量 提供生 物性状 相同的 细胞作 为研究 对象 ,因此 ,它成 为现代 生命科 学研究 的一个 最基本 的技术 ,并由 此推动 着生命 科学以 及现代 生物产 业的迅 速发展 。例如 ,细胞 是分离 病毒的 最好和 最方便 的基质 ,体 外培养 的 细胞无 抗体及 特异性 的拮抗 物存在 ,较 之活体 内更易 于获得 病毒; 体外 培养的 细胞易 于进 行病毒 的感染 或转染 ,便于 病毒感 染的观 察等。 所以在 一定程 度上说 ,现代 病毒学 的发展 ,是 建立在 细胞培 养的基 础上的 。细胞 培养还 应用于 许多化 学物质 、物理 环境对 活体影 响的毒 性实验 和安全 性检测 ,是 研究药 物对活 体影响 的重要 工具, 为现代 药学研 究的 发展做 出了突 出贡献 。因此 ,组织 细胞培 养技术 在生命 科学的 研究和 生产中 均具有 极其 重要的 作用, 是生命 科学研 究的基 本技术 之一。 组织细 胞的培 养源自 1885 年 德国人 Roux 首次 尝试用 温生理 盐水培 育鸡胚 神经板 组织 的研究 。经过 100 多年的 发展, 特别自 20 世纪 50 年代 以来, 伴随着 现代生 物技术 的进步 ,以及 生物工 程发展 的需要 ,细胞 培养技 术与现 代生物 技术共 同发展 ,相 互促 进, 成为生 物学领 域最基 本的一 项技术 。由于 细胞培 养技术 涉及范 围广, 几乎涉 及生命 科 学的各 个领域 ,同 时也是 现代生 命科学 研究及 现代生 物产业 的基石 ,其内 容之广 ,非 本章所 能表述 。在此 ,我 们仅对 细胞培 养相关 的一些 基本概 念和有 关细胞 培养具 体方法 和 操作加 以介绍 ,重点 是一些 常用的 哺乳动 物细胞 ,特 别是 医学上 常用的 一些哺 乳动物 细 胞培养 方法。 第一节 细胞培 养的基 本概念 组 织培养 (tissue culture) 是指从 体内取 出组织 并在体 外人工 模拟体 内生理 环境, 使之在 体外生 存并保 持其组 织结构 及部分 生理功 能的一 种技术 和方法 。而细 胞培养 (cell culture) 则是指 在体外 模拟体 内的生 理环境 ,使 细胞 能在体 外生存 、生长 和繁殖 , 并保持 其结构 和功能 的方法 。前者 主要从 组织水 平上对 生物组 织细胞 进行体 外培养 ,而 后者则 更侧重 于在单 个细胞 水平上 。器 官培养 (organ culture) 则是 在器官 水平上 ,将 器官 的原基 、器官 的一部 分甚至 全部器 官在体 外培养 ,使其 在体外 环境下 生存、 生长并 保持 其特定 功能的 方法。 我们在 此所指 的细胞 培养是 以单个 细胞为 培养单 位的狭 义的细 • 901 . 胞 培养。 体外培 养细胞 的生存 环境是 培养瓶 、皿 或其 他容器 ,无 论是其 生存空 间还是 其营养 成 分的提 供均是 有限的 。当 细胞增 殖达到 一定密 度或培 养一定 时间后 ,由 于营养 成分的 缺 乏及细 胞的接 触抑制 ,均 将影响 到细胞 的进一 步生长 。因此 ,培 养细胞 必须要 取出一 部分重 新放到 新的培 养液中 ,以便 细胞能 继续正 常生长 。在 细胞生 物学上 将这一 过程谓 之传代 (passage 或 subculture)。 值得注 意的是 ,细 胞培养 时的“ 传代” 与细胞 增殖过 程中细 胞分裂 的遗传 学“传 代”是 两个完 全不同 的概念 ,遗 传学传 代是指 细胞以 二分裂 方 式完成 一次细 胞分裂 ,产生 两个子 代细胞 的过程 。而在 细胞培 养中的 “传代 ”过程 中 ,常 有数次 细胞的 分裂或 遗传学 的“传 代”。 1) 原 代培养 (primary culture) 也称初 代培养 ,即从 体内取 出组织 细胞进 行接种 到第一 次传代 的这一 阶段, 一般持 续 1~4 周。 初代培 养细胞 与体内 原组织 的形态 和结构 上相似 ,多 呈二倍 体核型 和高度 的 异质性 (heterogeneous)。 在细胞 培养中 ,多 种细 胞相互 依赖共 同生长 ,此时 细胞虽 有分裂 ,但 不旺盛 。此外 ,移动 活跃则 是其另 一特点 。此时 将细胞 稀释分 散培养 ,不易 形成细 胞克隆 。由 于此期 培养细 胞多呈 二倍体 ,且其 与体内 细胞性 状相似 性大, 因此可 以 作为药 物筛选 和检测 模型。 2) 传 代培养 (passage) 与 细胞系 原代 培养细 胞一经 传代, 便改称 细胞系 (cell line)。 此 期细胞 在生命 期中持 续时间 最长 ,在培 养条件 较好的 情况下 ,细 胞增殖 旺盛, 并可保 持二倍 体核型 ,但反 复传代 后, 细胞有 可能丧 失其二 倍体核 型而发 生转化 。一 般传代 30~50 代后, 细胞增 殖逐渐 变缓 ,以至 完全停 止进入 衰退期 。因此 ,为 了保 持二倍 体性质 或长期 保存该 细胞系 ,宜 在原 代培养 期或传 代早期 进行冻 存保种 。目 前世界 上常用 的保存 细胞系 均不出 10 代。 3) 衰退期 此期 细胞虽 然生存 ,但 突出特 点是增 殖缓慢 甚至不 增殖, 并在最 后衰退 凋亡。 在细 胞培养 的上述 3 个 生命期 中的任 何一点 ,由 于某种 因素的 影响, 致使细 胞遗传 学和 表型发 生改变 ,无 论是自 发性转 化还是 人工诱 导转化 ,使细 胞获得 持久的 增殖能 力 ,使这 一细胞 系变成 永生性 (immorality) 或 恶性化 (malignancy)。 这 样的细 胞系被 称为 “无限 细胞系 ” (infinite cell line) 或连续 细胞系 (continuous cell line)。 虽然 在二期 中均 可发生 ,但多 发生在 第二期 末期或 第三期 初期。 一旦发 生转化 ,细胞 的模型 多由二 倍体转 化为多 倍体或 异倍体 (heteroploid), 多 具有恶 性性质 。从原 细胞系 中分离 出来, 但与 原系不 同的细 胞群体 称亚系 (subline)。 用一 定方法 (如克 隆法) 从 原代细 胞或细 胞 系筛选 出一个 或一群 具有某 些特征 或标记 (如 稳定的 染色体 组型、 同工酶 、生 化特性 或对病 毒敏感 性等) 的细胞 并在其 子代中 保持稳 定不变 者称“ 细胞株 ” (cell strain), 再 次 克隆形 成的细 胞群体 称亚株 (sub strain)。 第 二节细 胞培养 的类型 与细胞 生物学 细胞 在体外 培养时 ,如果 条件适 宜便可 进行系 列的生 命活动 ,如 代谢 、运动 、生 长 、分裂 增殖等 。体 外培养 的细胞 源自活 体细胞 ,其 基本的 细胞生 物学规 律遵循 原有的 . 902 . 细胞 生物学 规律, 如其表 型特点 、形 态结构 、分裂 增殖等 。但 由于 体外培 养与在 体内环 境毕竟 有许多 的不同 ,目前 尚不具 备完全 模拟体 内环境 的能力 ,因 此由于 环境的 变化, 培养 细胞在 生物学 的许多 方面又 有很多 的变化 和区别 ,并具 有相应 的体外 细胞培 养的特 点 和规律 。在此 ,我们 将进行 简单的 阐述。 一 、培 养细胞 的体内 外差异 和分化 体 外培养 的细胞 与体细 胞存在 明显的 差异和 分化上 的不同 。尽 管人工 模拟生 理环境 的能 力已经 很强, 并可在 体外控 制细胞 的分裂 ,但与 活体环 境相比 ,毕 竟相 去甚远 。因 此 ,由 于环境 的差异 ,经过 长时间 体外培 养的细 胞将出 现许多 分化上 的差异 ,并 表现为 表型 的众多 变化, 如失去 原有组 织的结 构和细 胞形态 、分化 能力的 减弱和 消失、 返祖现 象 的出现 及恶性 化等。 二 、培 养细胞 的形态 和分类 培 养细胞 在体外 环境中 ,由于 细胞分 化和表 型改变 ,细 胞的 形态会 发生显 著的改 变 。特 别是锚 着依赖 性细胞 (anchorage-dependent cell), 在 失去贴 附的支 持物后 ,失去 其体 内原有 的特征 ,表 现出细 胞分化 不显著 、形 态单一 ,并 反映其 胚层的 起源等 。如内 外胚 层的细 胞多呈 上皮型 ,而 中胚层 的细胞 则多表 现为成 纤维细 胞形态 。因此 ,在 判断 培养 细胞形 成时, 很难用 体细胞 的标准 来判定 。仅能 做一大 致的分 类:按 细胞在 体外培 养时 是否能 贴附在 支持物 上生长 ,分 为贴附 型和悬 浮型两 大类; 前者 又大 致分为 成纤维 细胞型 、上皮 细胞型 、游 走型 细胞和 多形型 细胞。 三、 培养细 胞的生 长和增 殖过程 体外培 养的细 胞生长 增殖过 程具有 明显的 规律性 ,特别 是正常 核型的 细胞, 均有一 定的 生命期 (lifespan)。 所谓生 命期是 指细胞 在培养 中持续 增殖和 生长的 时间。 通俗的 理解 是在培 养条件 适宜, 经不断 的传代 ,细胞 所能生 存的最 长时间 。其实 质与体 内细胞 的 衰老死 亡基本 相一致 。一般 而言, 人胚二 倍体成 纤维细 胞培养 ,可连 续传代 30 〜 50 代, 相当于 150~300 个 细胞分 裂周期 ,维 持大约 一年的 时间。 体 外培养 细胞在 一个生 命期内 ,一般 都经过 原代培 养期、 传代培 养期和 衰退期 3 个 时期 ,称为 培养细 胞的生 命分期 。细胞 从体内 取出进 行接种 培养到 第一次 传代为 原代培 养期 或初代 培养期 。此期 细胞与 体内原 代组织 在形态 结构及 功能上 相似性 很大, 细胞多 呈二倍 体核型 。培养 细胞经 第一次 传代后 ,持续 生长直 到衰退 的阶段 为传代 培养期 。此 期在培 养条件 适宜时 ,生 长增 殖旺盛 ,并常 维持二 倍体的 核型。 为长期 保存这 些细胞 系 ,常 在此期 早期进 行细胞 冻存以 保存其 细胞系 。随 着培养 时间的 延长, 细胞虽 仍能生 存但 增殖速 度明显 减慢或 不增殖 ,细胞 轮廓增 强直至 凋亡, 此期为 衰退期 。除细 胞发生 转化, 形成永 生型细 胞系或 提前冻 存保存 ,该细 胞系将 在最后 衰老凋 亡不复 存在。 在细 胞培养 过程中 ,还需 注意的 是培养 细胞每 一代的 生存期 。我们 在前面 已强调 . 903 • 过, 细胞培 养中的 “一代 ”是指 细胞接 种到一 定时期 ,常是 细胞生 长至汇 合后, 再次进 行接种 的这一 段时间 。它 与细咆 在遗传 学上分 裂一次 或细胞 培养时 细胞倍 增一次 (一 代) 的 “代” 具有完 全不同 的含义 。细 胞每一 次传代 ,一般 需经过 3 〜 6 次倍增 或遗传 学传代 。细 胞学的 每一次 传代, 一般经 过以下 3 个阶段 : 潜伏期 (latent phase)、 指数 增生期 (logarithmic growth phase) 和 停滞期 (stagnate phase)。 四 、 培 养细胞 的增殖 动力学 与 在体细 胞一样 ,体外 培养细 胞亦有 相同的 细胞增 殖周期 ,即细 胞周期 = 间期 ((^期 + S 期 + G2 期) +M 期 。按 细胞的 功能状 态又分 为增殖 态和功 能态。 (1) 细胞的 增殖态 (proliferation state) 是 细胞增 殖或自 我复制 的阶段 ,为 细胞有 丝 分裂期 。其基 本条件 或前提 为细胞 质和细 胞核的 复制, 并在二 者完成 后细胞 进行分 裂 。一 般包括 Q、 S、 G2 和 M 期。 (2) 细胞的 功能态 (functional state) 是指细 胞进行 特定功 能活动 如分泌 、传 导、 吞噬 、收 缩等, 是细胞 的第二 种生存 状态。 细 胞的增 殖态和 功能态 是相对 的状态 ,能 互相转 化并相 互依存 。一般 将功能 态细胞 分 为功能 I 型细胞 和功能 II 型细胞 。前者 以完成 功能活 动为主 ,其 G〇 期 是完成 功能活 动的主 要阶段 ,故 此型 细胞的 G〇 期 可称为 G〇f (G〇 of function), 如 各种腺 体细胞 、结 缔组 织细胞 、淋巴 细胞等 。在 一定 条件下 ,本 型细胞 可重返 增殖态 。功能 II 型 细胞多 是 终末分 化细胞 ,如心 肌细胞 、神 经细胞 、骨 骼肌细 胞等。 它们长 期处于 G〇 期 进行功 能活动 ,少见 或不进 行细胞 增殖, 此型细 胞在体 外难以 培养和 存活。 五 、 培 养细胞 的遗传 学特征 组织 细胞培 养是进 行细胞 遗传学 研究的 重要方 法和基 本技术 。同时 ,细 胞遗 传学特 征的 检测也 是培养 细胞的 一项极 其重要 的指标 。与在 体细胞 的细胞 遗传学 特征相 对稳定 不同 ,离体 细胞在 培养过 程中极 易发生 细胞遗 传学的 改变。 因此掌 握培养 细胞的 细胞遗 传学 动向, 是了解 细胞性 状的一 个极为 重要的 方面。 培养 细胞遗 传学的 重要改 变通常 有核型 的变化 、细 胞的恶 变或永 生细胞 系的形 成等。 染色体 、染 色质和 脱氧核 糖核酸 是细胞 中同一 遗传物 质在不 同时期 的不同 存在形 式 。每 一细胞 染色体 (染 色质) 的 构成和 结构均 有固定 的表现 ,人 们常用 核型来 描述细 胞遗 传物质 的特点 。正常 的人体 细胞具 有二倍 体核型 。在组 织细胞 培养过 程中, 呈二倍 体核 型的细 胞群称 为二倍 体细胞 。细胞 在培养 过程中 ,由于 环境的 改变, 细胞的 遗传学 性状 和基因 表达也 会发生 相应的 改变。 在原代 培养的 细胞中 ,细胞 大多呈 二倍体 细胞, 这 种保持 二倍体 状态的 培养方 法称二 倍体细 胞培养 。随着 培养环 境的改 变或时 间的延 长, 细胞发 生转化 、恶 变而失 去其二 倍体核 型形态 转化为 多倍体 (polyploid)、 异倍体 (heteoploid) 细胞 ,细胞 失去其 原有的 细胞学 特性成 为恶变 的细胞 ,并失 去原有 细胞的 接触性 抑制及 传代数 的限制 ,成 为永 生性细 胞系。 • 904 • 第三节 培养细 胞的生 存条件 细胞培 养是一 种人工 模拟体 内环境 ,使 细胞在 体外正 常存活 并维持 一定的 形态结 构, 表现一 定的细 胞功能 ,从而 达到一 定的研 究和生 产目的 的技术 和方法 。因此 ,体外 生 存环境 与其原 始的在 体生存 环境应 尽可能 的一致 。同时 ,由 于体 外培养 的环境 缺乏活 体 内细胞 间的相 互影响 和作用 ,因此 常需要 较体内 更高甚 至更苛 刻的生 存条件 。在 此, 我们 对培养 细胞的 一些基 本生存 条件做 一简单 介绍。 一 、无污 染环境 机体内 存在强 大的免 疫系统 和解毒 器官, 能对入 侵机体 的病原 体进行 有效的 清除, 对有 毒物进 行降解 ,使 细胞免 受危害 。而 体外培 养的哺 乳动物 细胞则 没有免 疫功能 ,缺 乏对微 生物和 有害物 质的防 御能力 ,一 旦污染 ,将导 致细胞 的死亡 甚至整 个实验 室全部 细胞 的损害 。因此 无污染 环境是 活体细 胞体外 培养的 最重要 的一环 ,其要 求远高 于无菌 手术时 的无污 染要求 ,其具 体操作 我们将 在下节 详述。 二 、温 度 细胞的 代谢生 长和增 殖必须 有适宜 的温度 。正常 情况下 ,人体 和哺乳 动物细 胞的适 宜生长 温度为 37t: 左右。 当温度 显著偏 离这一 尺度时 ,细 胞的正 常代谢 过程将 受到影 响 ,可 导致细 胞代谢 停止甚 至死亡 。温 度对细 胞代谢 的影响 ,在一 定温度 范围内 其高低 与细胞 代谢的 活性成 正比, 当温度 升高时 ,代 谢活动 增加。 而其耐 受能力 一般来 讲是对 低温 的耐受 能力比 高温强 ,在 39~40t: 下 lh, 培养细 胞即受 损伤, 但尚能 恢复; 41~ 42X: 下 2h, 细 胞将严 重受损 ,大部 分细胞 死亡; 43X: 以上达 lh, 细胞全 部死亡 。相 反, 在加入 一定量 保护剂 (如 二甲基 亚砜或 甘油) ,在 -1961C 液 氮中冻 存的细 胞经解 冻复苏 后仍 能保持 原有的 生物学 性状。 细胞在 25~35t: 时 ,虽 仍能生 长但生 长速度 减缓。 三 、气体 环境和 氢离子 浓度、 渗透压 适宜 的细胞 外化学 环境是 细胞生 存的又 一必备 条件。 气体的 浓度与 构成、 pH 的高 低 、渗 透压的 高低等 ,都 会直接 影响体 外培养 细胞的 生长和 代谢。 气体 是细胞 生存的 必需条 件之一 ,主要 的气体 成分有 〇2 和 co2, 前者 的主 要作用 是参 与能量 代谢, 如三羧 酸循环 ,提供 细胞新 陈代谢 和生命 过程所 需要的 能量。 除少数 细咆能 在无氧 条件下 借糖酵 解获得 能量外 ,多数 细胞在 缺氧条 件下不 能生存 。但 培养环 境中 氧分压 超过大 气中氧 含量时 ,也 会对细 胞会产 生毒害 作用。 〇32既 是细胞 代谢产 物 ,也是 细胞所 需成分 ,它在 维持和 调节培 养基的 pH 上起 着重要 作用。 由以下 的化学 方程式 可知: co2 + h2o— H2C〇3^H+ + hco3" • 905 • 当 C〇2 浓度增 高时, H+ 浓度 增加, pH 降低; 反之, H+ 浓度 减少, pH 上升 。在 细胞 培养中 ,常用 的气体 环境是 95% 02与 5% C02 的混合 气体。 pH 环境 是细胞 生存的 另一重 要因素 。尽管 不同的 细胞对 pH 环 境的要 求有所 不同, 但 pH 过 度偏离 ,轻则 影响细 胞代谢 ,重则 导致细 胞死亡 。因 此确保 适宜的 pH 环境是 细胞 体外培 养的关 键之一 。由于 细胞不 断代谢 ,产生 大量的 代谢物 ,影 响培养 基中的 pH。 因此 在保持 C02 浓度 的同时 ,在培 养基中 常加入 碳酸缓 冲液, 其中的 NaHC03 可 供给 C〇2, 但 C〇2 易逸出 ,故 只适宜 封闭式 培养。 Hank’s 平衡 液中, 当打开 Hank’s 液 培养 瓶时, C02 能迅 速逸出 而导致 pH 上升, Hank’s 液变碱 ,酚红 指示剂 变红。 因此在 开放 式培养 环境中 ,给予 5% C02 气体环 境可使 培养液 pH 维持在 适宜的 范围内 。为了 克服用 NaHC〇3 调节 pH 的麻烦 ,也 可使用 HEPES (iV-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2- ethanesulfonicacid, N-2- 羟乙 基哌嗓 -AT-2- 乙磺酸 ), 它对细 胞无毒 ,缓冲 作用好 ,能防 止 pH 迅 速波动 ,其最 大优点 是在开 放通气 培养或 活细胞 观察时 能维持 pH 恒定。 适宜的 渗透压 环境是 细胞生 长代谢 的又一 重要环 境因素 。尽管 大多数 培养细 胞对渗 透压 有一定 耐受性 ,但适 宜的渗 透压更 有助于 细胞的 生长和 代谢。 一般认 为人血 浆渗透 压 (290mOsm/kg) 是较 理想的 渗透压 环境。 四 、营 养物质 凡能进 入细胞 中被细 胞利用 ,参与 细胞代 谢和维 持细胞 生命的 物质均 属营养 物质。 体外 培养的 细胞与 体内时 所需的 营养物 质基本 相同, 但需求 的量和 代谢方 式略有 不同, 一 般要满 足以下 条件。 (1) 所 有细胞 均需要 12 种必需 氨基酸 ,即 精氨酸 、胱 氨酸、 亮氨酸 、异亮 氨酸、 赖氨酸 、蛋 氨酸 、苯丙 氨酸、 苏氨酸 、色 氨酸、 组氨酸 、酪 氨酸和 缬氨酸 。这些 氨基酸 是合成 蛋白质 的基本 原料, 但不由 细胞自 身合成 ,必须 由培养 基提供 。此外 ,谷 氨酰胺 也必 须补充 ,它 既能促 进氨基 酸进入 细胞膜 ,又 是核酸 中嘌呤 和嘧啶 的氮源 ,也 是合成 磷 酸腺苷 的必需 物质。 • (2) 糖类也 是必需 营养物 质之一 。六 碳糖 特别是 葡萄糖 ,是细 胞能源 的主要 来源。 通 过糖酵 解和有 氧代谢 途径产 生能量 。此外 ,糖还 是合成 氨基酸 、脂 肪和 核酸的 必需原 料。 (3) 必需的 维生素 ,如 生物素 、叶酸 、烟 酰胺 、泛酸 、吡 哆醇、 核黄素 、硫 胺素及 维生素 B12 等 。这些 物质是 细胞代 谢过程 中的必 需物质 ,在 许多培 养基中 ,这些 物质均 是其固 定成分 。此外 ,细 胞培养 还需要 适量的 无机盐 、微量 元素如 Fe、 Zn、 Se 等。 (4) 促生长 因子。 除上述 成分外 ,体 外细胞 培养同 样也需 要激素 类物质 ,如 一般细 胞培养 均需要 胰岛素 、乳腺 上皮培 养需黄 体酮等 ,特别 是生长 因子如 EGF、 FGF、 NGF、 PDGF 等 。这 些物质 在保证 细胞生 长分化 、保持 细胞生 长表型 、促 进细胞 生长增 殖等 方面均 有重要 的生理 作用。 除上述 物质外 ,细胞 培养中 还需大 量已知 或未知 的物质 。常 用灭 活补体 的眙牛 、小 牛 、马 、人血 清作为 补充。 其确切 的功能 并不十 分明确 ,可 能与之 提供细 胞生长 所需的 多种 微量成 分有关 。此外 ,在 进行 体外活 体细胞 培养时 ,为 防止污 染常加 入适量 的抗生 • 906 • 素 (如青 、链 霉素等 )。 五、 培养基 细胞 在体外 的生存 环境是 人工模 拟的, 除上述 的温度 、气体 环境外 ,其 余大 部分物 质 均由培 养基提 供或添 加至培 养基中 。它提 供细胞 生长所 需的营 养物质 及其他 物质基 础, 也是细 胞的生 存环境 。培养 基的种 类很多 ,按其 物质状 态可分 为固体 和液体 培养基 两 大类; 按其 来源分 为天然 和合成 两大类 。天 然培养 基使用 最早也 最有效 ,主要 来自动 物体液 或从组 织中分 离提取 。其 营养成 分较高 ,但成 分复杂 ,差异 性大, 来源也 受到一 定 的限制 。合 成培养 基是根 据天然 培养基 的成分 ,用 化学物 质模拟 合成的 ,具有 一定的 组成 ,是一 种较为 理想的 培养基 。但对 动物细 胞来说 ,它 只能维 持细胞 的生存 ,要 想使细 胞生长 和繁殖 ,还 需补 充天然 培养基 ,即 两者混 合在一 起使用 ,才 能获得 更好的 效果。 (1) 天然 培养基 (natural media): 包 括血清 ,组 织提取 液等。 其中血 清是一 种广泛 应用 的天然 培养基 ,市场 有产品 出售。 血浆类 组织提 取液应 用较少 ,需 要自己 制备。 (2) 合成 培养基 (synthetic media): 是根 据细胞 所需物 质的已 知成分 和其数 量严格 配制 而成的 培养基 。其成 分清楚 ,通过 调节各 种成分 的组成 和数量 ,可以 观察细 胞的生 物 学反应 ,借以 了解细 胞的生 存条件 ,并 可诱导 细胞进 行定向 分化等 。合 成培养 基的应 用 ,推动 了组织 培养的 发展。 常用的 合成培 养基有 Eagle 培 养液、 BME 培 养基、 MEM 培 养基、 RPMI1640、 199 培养 基等。 (3) 无血清 培养基 (serum-free media): 现在人 们对细 胞所需 成分虽 已基本 掌握, 但尚 未完全 搞清, 因此绝 大多数 培养基 中均需 加入一 定的天 然成分 ,如 人或动 物的血 清 、血 浆等, 以补充 一些未 知的必 需成分 ,其 中最常 用的就 是血清 。随着 对细胞 培养成 分的深 入了解 ,现 在人们 已能在 培养基 中不加 入血清 这一天 然成分 ,而加 入一些 化学物 质 (最主 要的是 细胞生 长因子 ) 以 代替之 ,这 就是无 血清培 养基。 六 、 附 着底物 除少数 悬浮型 细胞外 ,绝 大多 数体外 培养细 胞需附 着在适 宜的底 物上才 能生长 。原 则上讲 ,凡对 细胞无 毒性的 物质都 可作为 底物。 但不同 的细胞 ,对底 物有不 同要求 ,没 有适宜 的底物 ,常使 相应的 细胞生 长不良 。常用 的底物 有玻璃 、一次 性塑料 、聚 苯乙烯 小体 、细 胞外基 质和词 养层细 胞等。 七 、 培 养用液 培 养用液 是维护 细胞生 存和生 长的基 本溶液 。主要 有平衡 盐溶液 (balanced salt so- lution, BSS)、 三蒸水 、消 化液和 pH 调 节液。 (一) 平衡 盐溶液 主要用 于维持 细胞培 养液的 渗透压 ,调 控酸碱 平衡, 提供细 胞生存 所需的 无机离 • 907 • 子 。此外 ,还可 用于洗 涤组织 ,作为 基础溶 液配制 各种培 养用液 。常 用的 BSS 有 Hank’s 液、 Eagle’s 液、 PBS 溶液 以及其 他一些 BSS〇 —般 先配制 成浓缩 的母液 ,如 20 倍 (20X)、 1〇 倍 (l〇x) 等 浓缩液 ,用 前经无 菌细胞 培养用 水稀释 而成。 1 .Hank’s 液 为了便 于保存 和减少 有关成 分的化 学反应 ,此液 可配成 2〇x、 i〇x 和 5X 浓 缩的母 液 。现以 10 x 为例 ,将其 配制方 法介绍 如下。 1) 10 x 母液 配制法 甲 液:取 450mL 三蒸水 依次溶 解下列 试剂: NaCl 80g KC1 4g MgS04-7H20 2g CaCl2 1.4g (2H20 者 1.85g) 待完全 溶解后 ,补 足三 蒸水至 500mL。 乙 液:取 450mL 三蒸水 依次溶 解下列 试剂: Na2HP04 0.6g (12H20 者 1.52g) kh2po4 0.6g 葡萄糖 l〇g 0.4% 酚红 50mL 2) Hank’s 使用液 配制法 取 上述甲 、乙 液等量 用三蒸 水稀释 10 倍即成 使用液 ,用 前高压 灭菌。 例 如配制 lOOOmL Hank’s 使用液 ,则取 三蒸水 900mL 加 入甲液 50mL、 乙液 50mL 混匀 ,用 67.6kPa 高 压灭菌 15min。 临用时 ,用 7.5% NaHC03 调 至所需 pH。 附 :为配 制上述 Hank’s 液 ,应 先配好 0.4% 酚红溶 液待用 。配 制方 法如下 :称取 〇.4g 酚红 ,置玻 璃研钵 中细研 ,逐 渐加入 O.lmol/LNaOH, 边 滴边研 至酚红 完全溶 解。 记好加 NaOH 的量, 共加至 11. 28mL 为止 ,将 研好的 酚红液 用吸管 移入烧 瓶中, 加 三蒸水 88.72mL, 高 压高温 (55kPa, 113X:) 灭菌 15min。 2. Earle’s 液 一 般认为 Earle’s 液比 Hank’s 液缓冲 能力强 ,但 Earle’s 液在不 加橡皮 塞的容 器中需 加 C〇2 平衡 (利用 5%C〇2 气 体平衡 ), 其配法 如下: 1) 母液 A (10 X) 配法 NaCl (AR) 68. Og KC1 (AR) 4.0g MgS04.7H20 (AR) 2.0g NaH2P04-H20 (AR) 1.4g 葡萄糖 (AR) 10. 〇g 双蒸水 800mL • 908 • lOOmL 酚红 (0.4%) 将其混 合即为 l〇X 母液 A (900mL)。 2) 母液 B (l〇x ) 配法 CaCl2 (AR) 2.0g 双蒸水 lOOmL 将母液 A 和 B 经 67.6kPa 灭菌 15min。 待 冷却后 ,将 B 液徐 徐倒入 A 液中 ,分装 置 4X: 保存 (称 Earle’s 贮存液 )。 3) 使用液 (IX) 配制法 取 一份贮 存液加 9 份 双蒸水 稀释后 ,塞 紧瓶塞 ,写 明标记 ,经 67. 6kPa 灭菌 151^11,置室温或4七保存备用〇临用时用7.5%(或5.6%)的仏1'10)3调至所需卩只0 3.PBS 液 可配成含0.85%仏(:1,?117.2的?63(简称?爪.2?83)。 1) PBS 贮存液 (l〇x) 配法 NaCl (AR) KC1 (AR) Na2HP04 • 12H20 kh2po4 溶于 lOOmL 双蒸 水中。 2) PBS 应用 液配法 取 贮存液 50mL 加 双蒸水 450mL 即成 ,经 103kPa(121.3t:) 15min 灭菌, 置室温 或 4X: 保存 备用。 . 除上述 3 种常 用的平 衡盐溶 液外, 尚有其 他几种 次常用 的平衡 盐溶液 ,如低 钙镁的 Dulbecco 液和无 钙镁的 D-Hank’s 液等 。可 用于配 制消化 液和洗 涤细胞 (可 防止细 胞凝聚 或抑制 酶活性 )。 其成 分见表 15.1, 其 配制可 参照上 述几种 平衡盐 溶液配 制方法 进行。 表 15.1 几种 常用的 BSS 配方 /g/L 成 分 Ringer’s PBS Earle’s Hank's Dulbecco D- Hank’s NaCl 8.00 8.00 6.80 8.00 8.00 8.00 KC1 0.42 0.20 0.40 0.40 0.20 0.40 CaCl2 0.25 0.20 0.14 0.10 MgCl2-6H20 0.10 MgS04*7H20 0.20 0.20 Na2HP04-H20 1.56 0.06 0.06 Na2H2P04.2H20 > 0.14 1.42 kh2po4 0.20 0.06 0.20 0.06 NaHC03 2.20 0.35 葡萄糖 1.00 1.00 酚红 0.02 0.02 0.02 0.02 8.5g 〇.2g 2.85g (或 Na2HP04.2H20 1.13g) 〇.27g . 909 . (二) 细胞培 养用水 水是细 胞的主 要成分 ,也 是细胞 赖以生 存的主 要环境 ,营 养物质 、代 谢产物 均溶解 于水中 后再分 别被细 胞摄取 或排出 。由 于体外 培养的 细胞没 有活体 细胞自 身调节 水平衡 和清 除有毒 物质的 功能, 即使细 胞中仅 含有少 量的有 害物质 ,也可 引起细 胞生长 不良甚 至死亡 。因此 ,细 胞培养 用水的 要求非 常严格 。所有 的培养 液和各 种与细 胞接触 的溶液 均 要使用 细胞培 养级用 水配制 ,如 用玻璃 蒸馏器 制备的 三蒸水 。双 蒸水只 能用于 清洗器 皿 或配制 一般的 洗液。 , (三) 消化液 常 用的消 化液有 EDTA、 胰蛋 白酶、 胶原酶 溶液等 。它 们在制 备原代 培养细 胞时消 化组织 、分散 细胞; 在细胞 传代时 ,使 细胞 脱离生 长表面 (如 瓶壁) 和使 细胞组 织团块 分 离成单 个细胞 。它们 既可单 独使用 ,也可 根据需 要混合 使用。 1) 胰 蛋白酶 一 种淡黄 色粉末 ,易 潮解, 应置于 阴凉黑 暗处干 燥保存 。具有 水解酪 蛋白的 能力, 在细胞 培养中 主要用 于细胞 间蛋白 的水解 ,从 而使细 胞离散 。常用 的胰蛋 白酶溶 液因细 胞不同 、生产 厂家不 同及批 号不同 而不同 ,但 多使用 1:125 和 1:250 两种 浓度。 使用时 需要注 意的是 ,不 同细胞 系对胰 蛋白酶 的作用 条件, 如温度 、浓度 及时间 要求有 很大的 不同 。一 般而言 ,浓 度大、 温度高 、作 用时间 长对细 胞的分 离作用 越大, 但同时 也会引 起细胞 的损伤 。因 此胰蛋 白酶消 化液的 配制除 依据经 验外, 一定要 先进行 预消化 实验, 选 用最适 宜的浓 度和作 用条件 。此外 , 其作用 时一般 需要无 Ca2+、 Mg2+ 的条件 。因上 述离子 的存在 可降低 其活性 。常 用终 止消化 的溶液 是血清 或含血 清的培 养液。 2) EDTA EDTA 是 一种化 学离子 螯合剂 ,对细 胞有一 定的解 离作用 。其 毒性小 、价格 低廉、 使用方 是细胞 培养中 应用较 为广泛 的溶液 之一。 一 般使用 0.02% 的浓度 。常 用无 钙无 镁溶液 溶解后 ,高 压灭菌 ,小瓶 分装后 4X: 保存。 3) 胰 蛋白酶 -EDTA 消化液 是两 者按一 定比例 的混合 溶液。 两者混 合使用 ,可 提高细 胞的分 离效果 。常 用无钙 无 镁溶液 配制成 0.02% 或 0.25% 的浓 度使用 。一般 用滤过 法除菌 ,批量 制备, 分装于 -201C 冻存 ,使用 时一次 用完。 4 ) 股原峰 是从溶 组织牙 胞梭菌 (clostridium histolyticum) 细菌 培养液 中分离 得到的 一 组对胶 原蛋白 有较强 水解作 用的酶 ,常 用其对 富含甘 氨酸、 羟脯氨 酸的组 织细胞 的分离 。胶原 酶一般 配制成 10X 贮存 液保存 ,作用 终浓度 一般为 l~5mg/mL。 具体要 求参照 产品说 明书并 结合实 验结果 确定。 由于酶 作用的 影响因 素众多 ,因 此最好 是批量 制备, 分装保 存, 先通过 预实验 确定最 适的作 用浓度 和作用 条件。 • 910 • (四) pH 调整液 合成 的培养 基大都 呈酸性 ,而细 胞生长 的适宜 pH 是在 7.0 〜 7. 2, 过高或 过低的 pH 环境 均不适 宜细胞 的生长 。常用 pH 调整 液对培 养基进 行调节 ,以使 其保持 适宜的 pH 环境 。常用 的有碳 酸氢钠 溶液和 HEPES (iV-2-hydroxyethyl piperazine N'-2-ethane- sulfonic acid, iV-2- 轻乙 基呢嗪 -iV’-2- 乙横酸 )。 NaHC03溶 液:常 用的是 7.4%、 5.6%、 3. 7% 浓度的 溶液。 为延长 培养基 的保存 时间 ,在配 制培养 基时, 一般先 不加入 NaHC03 而是将 >^1"1(:03单 独配制 ,过滤 灭菌, 在 培养基 使用前 加入。 HEPES: HEPES 的 缓冲能 力较强 。使 用的终 浓度是 10~50mmd/L, 具体 的应用 根据 缓冲要 求而定 。常先 配制成 100X 的 贮存液 ,即 23.8gHEPES 溶于 100mL 双蒸水 中 ,用 lmmol/L 的 NaOH 调至 pH7.0~7.2, 滤 过除菌 ,分装 贮存在 4T: 或 -20X:。 用 前取 lmL 贮 备液加 99mL 培养用 水混匀 即成工 作液。 (五) 抗 生素液 为了 防止细 胞培养 过程中 的污染 ,细 胞培养 基中常 规放入 适量的 抗生素 ,以 消除由 于操 作不慎 而产生 的污染 。常用 的有青 霉素、 链霉素 、卡 那霉素 、庆 大霉素 、两 性霉素 等 。常 配制成 100 x~20〇x 的贮存 液保存 ,见表 15.2。 表 15.2 常 用抗生 素用量 和效用 抗生素 浓度 (量 /mL) 效用 贮存 使用 真菌 细菌 支原体 青霉素 G 10 000U/mL 100U/mL + + + 链霉素 10 000/ig/mL lOO^tg/ mL + + + 庆 大霉素 10 000U/mL 50U/mL + + + 卡 那霉素 5000^tg/ mL 50 fig/ mL + + + 多 黏霉素 5000/ig/mL 50 fig/ mL + + 四环素 lOOO^tg/ mL 10pg/mL 十+ + + 红霉素 5000fig/ mL 50fig/ mL + + 两 性霉素 B 500fxg/mL 5^tg/mL + + + + 制 霉素菌 5000 U/mL 25U/mL + + + + 金霉素 10 OOO^ig/ mL 50 fig/ mL + + + + 第四 节细胞 培养的 常用操 作技术 哺乳 动物细 胞培养 已经能 够以分 化组织 为材料 ,对多 种细胞 进行体 外培养 ,并 成功 传代 。啮齿 类动物 细胞在 体外有 很高的 转化率 ,并 易形成 稳定的 细胞系 。此外 ,以 人和 • 911 • 啮齿类 动物的 肿瘤细 胞为材 料或用 SV40 感染 后对细 胞进行 转化, 以及用 化学药 品进行 诱导均 可获得 特定的 细胞系 。在 美国已 建立了 商业化 细胞库 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland), 保存 广 大量 的几乎 现有所 有的细 胞系, 可以购 买 。非转 化细胞 (特别 是成纤 维细胞 和淋巴 细胞) 在体外 培养时 极易获 得成功 。其 他类 型的 原代培 养或建 立永久 的细胞 系时, 常需要 特定的 培养基 。人皮 肤成纤 维细胞 体外培 养 有固定 的寿命 ,经 50~70 次分 裂后就 丧失分 裂能力 ,但 仍能在 体外保 持一定 的代谢 能力 而存活 2~3 年 。因此 ,无论 是原代 还是传 代培养 ,为 了能较 长时间 保存某 一特定 的 细胞系 ,必须 了解细 胞总的 分裂次 数和细 胞的生 长速率 ,适 时进 行传代 (subcul- ture), 并 将其处 于不同 时期的 细胞冰 冻保存 。为此 ,针对 细胞培 养工作 的需要 ,以下 将 介绍有 关的主 要操作 技术。 一、 细胞系 的接种 和传代 细胞 的接种 (seed) 是 将分离 或纯化 的细胞 按一定 的密度 ,将 其种植 到某一 适宜的 培养基 (液) 中进行 培养的 操作或 过程。 而传代 (passage, subculture) 则是指 将培养 的细胞 从一个 培养瓶 (皿) 转 移到另 一新的 培养瓶 (皿) 的过程 。细 胞的 接种和 传代是 细胞培 养的基 本操作 技术。 1. 悬浮培 养细胞 的接种 和传代 淋巴细 胞是最 常见的 用混悬 法进行 培养的 细胞系 , 常用含 10% —15% 胎牛 血清的 RPMI1640 进 行培养 。因 细胞系 的不同 ,接种 细胞的 数量和 密度也 有很大 的不同 。由于 细胞 株要适 应实验 室培养 环境, 因此要 选好每 株细胞 的最好 培养接 种条件 ,接种 细胞的 数量以 (5xi〇4)~(8xl〇5) mL—1 不等 。在对 一个新 的细胞 株进行 培养时 ,先按 1:2 〜 1:4 的比 例对细 胞进行 接种, 然后在 3 〜 4d 时间里 对培养 细胞进 行计数 ,以 了解 适宜的 接 种密度 。传代 后的细 胞可在 24~36h 倍增 。细胞 传代时 接种密 度太低 , 可导致 部分细 胞死亡 ,并 在开 始增殖 时间内 出现一 较长的 滞后期 。定期 检查培 养基的 酸碱度 ,当 将培 养 液滴到 pH 试纸上 ,试纸 变黄时 ,常 提示细 胞密度 已过大 ,需要 更换培 养基或 进行传 代 培养。 悬浮培 养的传 代常可 通过简 单的稀 释过程 而完成 。如 果需 要更换 所有的 培养基 ,可 将细 胞在温 和的条 件下进 行离心 ,再用 适当的 培养基 再次悬 浮细胞 。其 具体培 养步骤 如下: (1) 如果不 是旋转 培养, 部分细 胞将贴 壁生长 ,可通 过震荡 、搔 刮或 胰蛋白 酶消化 将细 胞从培 养瓶表 面分离 下来。 (2) 用吸管 反复吹 打使细 胞团块 分散。 (3) 取 lmL 细 胞悬液 进行细 胞计数 ,在 取样时 ,轻微 晃动培 养瓶, 以保持 细胞呈 混悬状 ,不 可让细 胞沉淀 于培养 瓶底。 (4) 用培养 基稀释 细胞至 密度为 (2X105) 〜 (4Xl〇5) mLM。 (5) 用 台盼蓝 (trypan blue) 染色检 测细胞 活性。 . 912 . 2. 单层培 养细胞 的接种 和传代 在 培养瓶 中细胞 可沿瓶 壁生长 ,汇合 形成单 层细胞 。有 些细胞 株可通 过不断 补充营 养物质 ,而保 持在平 台期生 长数天 到数周 。但有 些细胞 株系常 需先用 胰蛋白 酶消化 、机 械性 刮离等 ,使贴 壁生长 的细胞 脱落以 利传代 培养。 也有一 些细胞 系常不 表现出 接触性 抑 制而持 续性生 长增殖 ,最后 ,它 们离开 培养瓶 的表面 而难以 分散开 和再贴 壁生长 。具 体的 接种步 骤如下 所述。 (1) 将 细胞进 行洗脱 ,收集 (详 见细胞 洗脱方 法部分 )。 (2) 用培养 基悬浮 细胞。 此时可 进行细 胞计数 或以按 适当比 例稀释 后进行 传代。 (3) 将 部分细 胞上清 液接种 于预放 有合适 培养基 的培养 瓶或培 养皿中 ,培 养基的 pH 必须预 先调好 。培 养基的 pH 和 培养瓶 (皿) 内的 C02 浓度要 在接种 细胞前 进行平 衡, 具体方 法是将 培养瓶 盖拧松 ,并 在接种 细胞前 先放入 0〇2培 养箱中 10 〜 15min。 由于 传代细 胞在贴 壁和再 次开始 代谢前 几个小 时不能 调节培 养基的 pH, 因此传 代时培 养基的 PH 尤显 重要。 (4) 在 预装培 养基的 烧瓶和 培养皿 中将细 胞分散 ,将细 胞混悬 液均匀 地涂布 接种到 培养瓶 (皿) 上 。细胞 的贴壁 过程需 8 〜 10h。 人 二倍体 成纤维 细胞按 1:4 分 散率可 每周传 代一次 ,如按 1:2 分散率 ,分裂 一次后 就受到 接触抑 制影响 ,而 1 :4 分散率 则可使 培养细 胞分裂 2 次细 胞才能 汇合。 二 、细 胞的洗 脱方法 细胞 传代前 ,特 别是单 层培养 细胞, 常需对 生长的 细胞进 行洗脱 和分散 ,才 能更进 一 步地用 于传代 。洗脱 细胞的 方法有 几种, 常用的 有胰蛋 白酶消 化法、 EDTA 和 EGTA 分离法 、机 械性 刮离法 。有些 细胞株 与培养 支撑物 间贴壁 较疏松 ,用 二价 阳离子 的螯合 剂如 EDTA、 EGTA 去除培 养基中 的二价 阳离子 Ca2+ 和 Mg2 + 后, 就能使 细胞脱 落和黏 附的细 胞彼此 分开。 但有些 细胞与 培养器 皿间黏 附紧密 ,如 人二倍 体成纤 维细胞 ,常需 要 用胰蛋 白酶进 行消化 ,才 能使细 胞分散 或脱落 。此外 ,年 轻细胞 与衰老 细胞间 也有显 著差异 ,衰 老的成 纤维细 胞常牢 固地贴 附在培 养瓶的 表面而 需长时 间的胰 蛋白酶 消化。 有 些细胞 株消化 时胰蛋 白酶浓 度甚至 要达到 0.25%。 然而 过度胰 酶消化 可导致 细胞的 溶解 和失活 ,因此 为了克 隆细胞 或细胞 计数, 这类细 胞常要 在低密 度条件 下传代 几次并 在相 互汇合 前进行 收集。 另有相 当少的 一部分 细胞株 可用机 械性的 方法刮 离细胞 ,但这 种方法 常使绝 大多数 细胞 活性严 重下降 。但 少数细 胞在用 EDTA 螯合阳 离子后 ,可 使细 胞变圆 ,降 低与贴 附面 的结合 ,再 用刮离 法使细 胞分离 ,其效 果甚至 好于胰 蛋白酶 消化法 。许 多检查 ,特 别是 为提取 细胞内 容物时 ,在加 入适当 蛋白酶 和核酸 酶抑制 剂的缓 冲液中 ,刮离 法分离 细 胞有助 于细胞 的裂解 。这 种方法 有利于 细胞快 速刮离 到小量 裂解缓 冲液中 ,加 速细胞 的裂解 ,细 胞核的 分离常 首选刮 离法。 此处主 要详细 地介绍 单层生 长细胞 的胰蛋 白酶消 化 法洗脱 步骤。 . 913 . 以下的 步骤适 用于细 胞的传 代培养 和收集 ,以每 周为传 代周期 的细胞 培养方 式最为 方便, 常在传 代前一 天更换 培养液 ,但 有些细 胞系则 需更短 的传代 周期。 所有的 细胞系 都要在 无菌环 境中单 独传代 ,不要 同时对 两种以 上的细 胞系进 行操作 ,以 防交叉 污染。 1. 试 剂配制 1) 胰 蛋白酶 /EDTA l〇x 贮存液 胰 蛋白酶 (1:250) 5.〇g EDTA 四钠 2.0g NaCl 0.85g h2o lOOmL 2) IX 胰 蛋白酶 / 工作液 (0.05%) 胰 蛋白酶 /EDTA (10 x 贮备液 ) lOOmL NaCl 7.1g KC1 0.4g 葡萄糖 l.Og NaHC03 0.35g 1% 酚红 lmL h2o 900mL 调至 pH7.2。 -20X: 保存 l〇x 或 lx 胰 蛋白酶 /EDTA 贮存液 ,亦可 分装在 4X: 下贮存 1 〜 2 周, 工 作液在 37C 时的时 间应尽 可能短 ,因 为胰 蛋白酶 易降解 ,活性 下降。 3) 洗液 EDTA 四钠 2.0g NaCl 8.0g KC1 0.4 g 葡萄糖 l.Og NaHC03 0.35g 1% 酚红 lmL h2o 900mL 调至 pH7.2。 操 作步骤 (1) 从单层 培养的 培养瓶 (皿) 中 吸出培 养基。 (2) 加入 0.05% 胰 蛋白酶 工作液 (F25 培 养瓶为 lmL, F75 为 3mL, 10X 或 IX 胰 蛋白酶 /EDTA 可 以商品 化购买 或按配 方配制 )。 (3) 快速前 后摇晃 4 〜 5 次 ,以便 胰蛋白 酶与细 胞混匀 ,使指 示剂和 血清同 时得以 稀释。 (4) 检査细 胞是否 已脱落 ,吸 出胰 蛋白酶 溶液。 • 914 • (5) 再加入 l~3mL 胰蛋 白酶液 ,摇动 培养瓶 4~5 次。 (6) 检查脱 落细胞 ,吸 出胰 蛋白酶 溶液。 (7) 将 培养瓶 盖拧松 ,放入 37C (:02培 养箱中 2 〜 5min。 具 体时间 要仔细 摸索。 (8) 轻弹 培养瓶 ,少量 的液体 可将脱 落的细 胞洗脱 。如 没有细 胞脱落 ,再将 培养瓶 放回到 37X: 数分钟 ,弹动 培养瓶 , 直到细 胞完全 脱落。 (9) 用 培养基 再次悬 浮细胞 (T25 培 养瓶约 2 〜 5mL)。 (10) 轻轻 地分散 细胞块 ,并按 需要重 新接种 涂板。 注 意:如 用于传 代培养 ,可先 用无胰 蛋白酶 EDTA 螯合剂 预处理 ,减 少胰 蛋白酶 用量。 以下是 一种对 胰蛋白 酶不太 敏感的 细胞的 胰蛋白 酶处理 方法: (1) 用 PBS 洗涤单 层生长 细胞。 (2) 加 入适量 体积的 IX 胰蛋 白酶工 作液以 覆盖细 胞层, 37X: 孵育 5min。 (3) 检查脱 落情况 ,吸 出胰 蛋白酶 中的脱 落细胞 ,用培 养液稀 释细胞 至传代 所需的 细胞 浓度。 三 、培 养血清 的测试 每 一批血 清支持 细胞生 长的能 力不同 ,特 别是细 胞克隆 增殖时 常会有 很大的 不同, 有些血 清中甚 至含有 毒性或 生长抑 制成分 。因此 在培养 前应对 血清进 行检测 ,最 好能一 次批量 购进, 一则可 降低培 养成本 ,更 重要的 是可保 持培养 条件的 一致。 (1) 选 择几家 供应商 ,由每 家提供 100mL 实验 血清。 (2) 用 2 〜 3 个 实验室 中常用 的细胞 系对血 清进行 检测。 (3) 将含 20% 血清的 培养基 加入到 9 只培 养皿中 ,每 培养皿 lmL, 每一份 血清均 用 9 只细 胞培养 皿进行 检测。 (4) 按每皿 500、 1000、 2000 个细 胞数的 细胞浓 度接种 3 只培 养皿。 如果细 胞生长 能力 特强, 加入细 胞数可 以减少 ,这些 细胞不 会汇合 ,但 在足 够低的 浓度下 ,可 形成单 个克隆 。细 胞的 稀释要 用培养 液而不 是血清 ,这样 将没有 残留的 血清留 给细胞 。这 些细 胞 中加入 lmL 培养基 ,这 样每培 养皿中 血清浓 度就是 10%。 (5) 将 每份待 测血清 配制成 10% 测试 浓度至 80mL, 用 此配制 的培养 基每周 2 次连 续向培 养皿中 添加培 养基, 2 周后肉 眼可见 到细胞 克隆。 (6) 将培 养皿中 的克隆 染色, 比较不 同血清 的细胞 克隆数 。具 体染色 过程如 下:先 用 PBS 洗 涤一次 ,吸取 PBS, 加入 2mLWrights (瑞氏 ) 染液 ,室温 下染色 8min, 加 入 2mL 水于 每个有 瑞氏染 液的培 养皿中 ,室温 下放置 lOmin, 用 水冲洗 ,观察 细胞克 隆 的数量 和克隆 大小。 四 、细 胞计数 细胞计 数可用 改良的 血细胞 计数法 进行人 工计数 或用细 胞计数 仪自动 化检测 。最简 单 、常用 的生长 细胞计 数方法 是计数 几个视 野中的 细胞数 ,再与 已知的 标准数 进行比 较, 但此法 的准确 性较差 。在此 以红细 胞计数 仪计数 法为例 ,介绍 一下活 性细胞 计数的 • 915 • 染色 方法。 红 细胞计 数仪有 2 个室 ,每室 在有盖 玻片时 ,加 注液 体后的 容积是 9 xi(T3mL, 每 室分为 9 块 ,这样 每块区 域的容 积就是 lx l(T4mL。 用 于检查 活细胞 用的染 料台盼 蓝可以 Sigma 公司 购到。 (1) 前述 经用胰 蛋白酶 处理细 胞再用 培养液 悬浮。 (2) 用 巴斯德 吸管取 2 份样 本进行 计数, 用毛细 管虹吸 方法将 样本加 入到盖 有盖玻 片 的计数 器两侧 的区域 ,液体 以刚好 填满计 数室而 不会溢 出为宜 。第 一份 标本加 入到一 室, 另一份 标本加 入到另 一室。 (3) 计数 9 格中 5 格的细 胞数, 这样两 室共计 10 格 。计 数时在 10 X 物镜和 1〇 x 目 镜的 条件下 ,正好 可以将 两室均 置于视 野之下 。压 迹的 细胞只 计数其 中两边 的细胞 ,而 另两 边的细 胞不计 在其中 。如果 最初的 稀释结 果多于 50 000 个细胞 / 格, 则需进 一步稀 释 ,以增 加计数 准确性 和提高 计数的 效率。 (4) 将 10 格内 的细胞 数累加 (每边 5 格 ), 得 出的总 数乘以 1000[(lxi(T4mL/ 格 ) xl〇 格 ,其 体积为 lxi(T3mL] 即为每 毫升样 品的细 胞数。 如果 原始细 胞悬液 已进行 了稀释 ,那么 还应乘 上其稀 释倍数 。例 : lmL 的细胞 悬液用 4mL 的培 养 基稀释 ,用 巴斯德 吸管吸 两次分 别放在 红细胞 计数器 的两室 计数, 每室的 5 格细胞 计数值 分别为 45 个 / 格、 37 个 / 格、 52 个 / 格、 40 个 / 格、 60 个 / 格、 48 个 / 格、 54 个 / 格、 70 个 / 格、 58 个 / 格和 60 个 / 格 ,总 计数为 : 524。 稀 释倍数 : (1 + 4)/1 = 5 细胞数 /mL (原 始悬液 ) = 524 x 1〇3 X 5 = 2 . 62 X l〇6/mL (5) 计 数完后 ,用 蒸馏水 冲洗盖 玻片和 红细胞 计数器 ,再用 70% 乙醇 冲洗, 用镜头 纸 吸干。 切勿让 细胞悬 液在红 细胞计 数仪上 晾干。 注意 :有以 下一些 原因, 可能导 致红细 胞计数 的误差 ,应予 注意。 (1) 细胞 悬液原 液中取 样误差 。在 取样前 应将悬 液震荡 ,混匀 ,以免 细胞沉 入容器 底部。 (2) 红 细胞计 数器的 计数室 充盈不 够或充 盈过度 。计数 室的体 积是基 于盖玻 片盖在 红细胞 计数器 上缘形 成体积 ,过 度充盈 将增加 计数的 体积。 (3) 细 胞结块 ,大的 细胞团 块因体 积过大 不能进 入计数 室而排 除在细 胞计数 之外, 小的细 胞可进 入室内 ,但 不能准 确计数 。因此 ,为 了计 数准确 ,必 须使细 胞完全 分开并 使 之完全 混匀。 五、 细胞活 性检测 许 多操作 如传代 、冻存 ,以 及从组 织中分 离细胞 均可导 致细胞 损伤甚 至死亡 。为判 断 存活细 胞数董 ,可 用台盼 蓝排斥 法来进 行检测 。正 常细胞 能排斥 台盼蓝 ,但在 细胞膜 受 损细胞 ,则因 台盼蓝 可弥散 进细胞 而使细 胞蓝染 ,因 此运 用染料 排斥法 可粗略 估算出 细胞 活性。 但仍有 10% 〜 20% 不能有 效区分 。此外 ,具黏 附性、 长期存 活以及 增生的 细咆 不一定 都对染 料进行 排斥。 • 916 • (1) 将胰蛋 白酶消 化洗脱 的细胞 用无菌 PBS 稀释至 0.5mL, 至 (2xi〇5)~(4x 105) 个 /mL。 (2) 在无菌 条件下 ,将 0.5mLPBS 细胞 悬液转 入分离 管中, 再加入 0.5mL0.4% (m/\〇 台盼蓝 溶液。 (3) 将细胞 在染液 中放置 3~10min, 用 吸管吸 出细胞 ,置于 红细胞 计数器 中进行 计数。 (4) 计 数至少 500 细胞 ,分别 记录总 细胞数 和蓝染 细胞的 数目。 (5) 计 算活细 胞的百 分比。 例:经 胰蛋白 酶消化 洗脱的 单层培 养细胞 ,再用 5mL 培养 液悬浮 。取 0.5inL, 加 4.5mLPBS 混 合稀释 , 从稀释 液中取 0.5mL 转 入预装 0.5mL 台 盼蓝的 试管中 ,在红 细胞计 数器上 ,计数 540 细胞, 其中 62 个细胞 被蓝染 ,活细 胞率为 (540-62) /540 = 88. 5%。 六 、细 胞的低 温冻存 和复苏 1. 细 胞的低 温冻存 在 -135~-175t: 液氮中 活体细 胞可保 存数年 ,而在 -80X: 亦可贮 藏数月 ,将 克隆 或细胞 系冻存 是细胞 培养工 作中十 分重要 的一环 。冻 存细胞 可避免 因实验 室意外 而导致 细胞株 (系) 的丢失 ,还 可避 免因长 期体外 培养而 导致细 胞株遗 传漂移 (变异 )。 事实 上 ,长期 的体外 传代培 养中, 随着时 间推移 ,细胞 系中会 衍生出 现其他 的克隆 ,并 可导 致该克 隆的过 度生长 。而非 永生型 细胞株 ,如二 倍体成 纤维细 胞株、 WI-38 和其 他非转 化型细 胞均面 临衰老 的问题 ,无 一例 外地只 能进行 有限的 分裂增 殖传代 。因此 ,无 论是 对 转化型 还是非 转化型 细胞系 ,在 体外进 行细胞 的冻存 对研究 工作均 有重大 意义。 低温保 存研究 本身就 是一门 科学, 所用的 保存液 、保存 方法均 因细胞 不同而 不同, 但它们 应适于 绝大多 数细胞 。如果 细胞复 苏时存 活率低 (<50% ), 那么 必须保 存相当 数量 的细胞 。一般 情况下 ,保 种的 冻存管 数应为 10 支 。其 冻存后 如果只 有百分 之几细 胞复苏 ,那就 有必要 对该细 胞株进 行重新 建株以 利达到 能持续 表达、 传代的 目的。 细胞 冻存操 作过程 就是使 细胞株 (系) 逐步冷 冻达到 最适冷 藏温度 的过程 。为 防止 细 胞体内 冰晶形 成和水 分外泄 ,以 保证获 得最大 存活率 ,现 已有专 门的程 序化控 制的逐 步 降温设 备出售 (NANC 公司 ), 其主 要的作 用和目 的就是 以大约 的速 率逐步 降温 。少 数更好 的设备 包括带 盖的液 氮冻藏 设备, 允许装 有细胞 的冻存 管中上 部为气 相 。将 冻存细 胞的冻 存管放 于聚丙 乙烯中 ,可使 细胞逐 步冷冻 ,达 到逐步 降温的 目的, 其降 温的速 率取决 于安瓿 在液氮 罐中的 深度, 有经验 的研究 人员知 道要将 安瓿放 多深而 达 到目的 。没 有液氮 贮存设 备时, 也可用 -80X: 深低温 冰箱冻 存细胞 株达数 月之久 。也 有许 多实验 室先用 -80X: 冰箱 冻存后 再将细 胞株转 入液氮 中保存 ,但在 -80X: 冰 箱冰冻 时 ,隔离 层的厚 度也需 凭经验 确定。 细胞贮 藏于液 氮的气 相中时 ,可用 带盖小 瓶贮存 细胞而 不使液 氮漏入 瓶中。 由于液 氮漏进 冻存细 胞的冻 存管后 ,会使 细胞复 苏率显 著降低 ,有 些公司 制造了 能将一 半没入 液氮中 的安瓿 以供贮 存细胞 之用。 • 917 • 2. 细 胞冻存 的步骤 在细胞 汇合前 用胰蛋 白酶进 行处理 ,离心 ,再 用细 胞冻存 液悬浮 。常 用的冻 存液有 甘油和 DMSO, 这两种 物质都 具有保 护细胞 、使之 不易形 成冰晶 的特点 。在冻 存时, 血清浓 度一般 应加至 20%。 (1) 在细胞 汇合前 ,将 细胞 同培养 基一同 吸出。 不可使 细胞密 度过高 ,且在 冻存前 24h 内 更换培 养基。 (2) 加入 2mL 胰蛋白 酶溶液 (T25 培养瓶 ) 进行 消化。 (3) 摇晃 4 〜 5 次 ,使 胰酶溶 液与细 胞充分 接触。 (4) 吸 出胰蛋 白酶。 (5) 重 复步骤 (2 ) 〜 (4)。 (6) 置 37X: 3~5min。 (7) 将细胞 在生长 面洗脱 ,并用 3 〜 5mL 培养 基再次 悬浮。 (8) 200><尽离心51^11,再用1〇^冻存液悬浮细胞。 冻存液 配方: 生长 培养基 (液 ) (RPMI, DEME 等) 7mL FBS (胎牛 血清) 2mL 甘油或 DMSO lmL 注意: 甘油或 DMSO 浓 度可从 5% ~20% 不等 ,培 养基液 的量视 冻存液 量的不 同而适 当加入 ,以 利于保 存即可 。如为 了冻存 混悬培 养细胞 ,则 选对 数生长 期细胞 (5xi〇6)~(i〇xi〇6) 细胞 进行离 心 ,再用 lmL 冻存液 悬浮。 (9) 将 lmL 细胞 [在单 层培养 细胞约 (3X106) 〜 (5X106) 个; 混悬 培养 细胞约 (5xi〇6)~(i〇xi〇6) 个] 移 至冻存 安瓿中 ,标明 细胞系 、日 期及 生长培 养基。 (10) 将安瓿 放入专 用冻存 设备如 程序化 控制的 逐步降 温设备 (冰箱 ) 中 ,至 -80X:。 (11) 次日快 速将安 瓿转入 液氮中 贮存。 3. 冻 存细胞 的复苏 为了 尽可能 减少复 苏过程 中细胞 的损伤 ,常需 要使细 胞快速 地解冻 。用 适宜 温度的 流水 冲洗冻 存管, 使冻存 细胞快 速融解 ,然后 迅速转 到培养 基中是 最常用 的方法 。在操 作过程 中应带 护目镜 和手套 。如 果液 氮漏于 安瓿中 ,当温 度迅速 上升时 ,还 可能 会引起 爆炸, 应特别 小心。 (1) 将 自来水 加热至 40X:。 (2) 将 冻存的 安瓿从 液氮中 取出。 (3) 将安 瓿放入 盛有自 来水的 烧杯中 ,用 40X: 自来水 流水使 冻存细 胞融化 。当冻 块消 失瞬间 ,马上 将安瓿 从温水 中取出 或将其 存放在 冻存介 质中。 其目的 是使细 胞尽快 融化, 但又不 能使冻 存细胞 的温度 >3713。 (4) 用 70% 乙醇擦 洗贮存 有细胞 的安瓿 以减少 污染。 (5) 在无菌 条件下 ,将细 胞转入 T25 培养 瓶或培 养皿中 ,缓 慢加入 4mL 的 生长培 养基, 在加入 过程中 混匀。 • 918 • (6) 37t: 培养 .24h, 24h 后 更换培 养基。 注意 事项: (1) 有些细 胞株在 细胞融 化过程 中就加 入生长 培养基 可使细 胞恢复 得更快 。然 后, 可经缓 和离心 后再加 入新的 生长培 养基中 培养。 (2) 将 复苏后 的细胞 转入培 养瓶的 过程中 ,是否 先离心 去除冻 存液取 决于细 胞状态 和工 作习惯 。一般 情况下 ,直 接将 复苏细 胞直接 转入培 养瓶中 ,有 助于减 少污染 和细胞 的损伤 。但在 贴壁后 的次日 ,应 更换 新的培 养基。 , (3) 对冻 存细胞 系建立 一个准 确的冻 存记录 是十分 重要的 。细 胞的生 长传代 史相当 重要 ,细胞 株名、 传代数 、冻 存时间 、融 化次数 、生 长培养 基冻存 的位置 等均应 有详细 记录。 (4) 在生长 培养基 中加入 10%~20% 胎 牛血清 (FBS) 和 10% 甘油或 DMSO, 许多混 悬培养 的细胞 冻存在 DMSO 中 ,适当 的冻存 液因细 胞不同 ,在 这三 者的比 例可有 不同。 七、 培养基 的配制 研究和 确定细 胞培养 所需的 营养成 分本身 就是一 门科学 ,许多 教科书 和文章 均载有 许多 细胞系 的培养 基质和 确定重 要的营 养成分 ,表 15.3 中 列举了 系列常 用细胞 系的细 胞类型 、来 源和适 宜的培 养基。 除 少数培 养基是 以直接 可用的 形式提 供的外 ,多 数培养 基是以 浓缩粉 或浓缩 液的方 式提供 ,需要 研究者 本人在 用前进 行稀释 和消毒 ,有 些甚至 没有现 成的按 比例配 好的浓 缩粉 (液 ), 需要 研究人 员自选 配制。 浓缩的 培养粉 价格相 对而言 最便宜 ,用前 要用液 体稀释 ,消毒 。常用 真空过 滤法或 用一次 性的正 压过滤 装置进 行消毒 ,选择 0.22pm 孔 径的 滤膜才 能保证 消毒的 效果。 注意这 些过滤 消毒不 适用于 蛋白浓 度很高 或加有 血清的 培养基 的消毒 。因为 高浓度 的蛋白 易产生 大量的 泡沫, 并可导 致蛋白 的变性 。胎 牛血清 或 马血清 一般在 滤过灭 菌后再 行加入 。配 制后的 培养基 应置于 4X: 冰箱中 保存, 有些对 光 敏感的 培养基 还应避 光保存 。配 制培养 基的全 过程, 从过滤 开始到 结束都 要取样 ,在 配 制完后 ,所配 制的培 养基应 进行无 菌检测 。将 所取 各阶段 的标本 在不加 入抗生 素的情 况下于 37X: 的 C02 培养箱 中培养 72h, 以确保 培养基 无污染 。同时 ,还 要检测 有无厌 氧菌的 生长。 表 15. 3 常用 的细胞 系及其 培养基 细胞名 细 胞类型 来 源 核 型 培养基 种 系:犬 MDCK 上 皮细胞 肾 、公 鸡脊髓 非 整倍型 78 MEM + NEAA 10%FBS 种系 :大鼠 BHK-21 成纤 维细胞 肾 非 整倍型 44~45 MEM+NEAA+ 10%FBS CHO-K1 上 皮源性 卵 非 整倍体 20 Hanis F12+ 10% FBS 种 系:人 A431 上 皮源性 上皮 细胞癌 非 整倍体 76, XX DMEM+ 10%FBS • 919 . 续表 细胞名 细 胞类型 来 源 核 型 培养基 BwWo 上 皮源性 促增生 绒毛膜 细胞癌 非 整倍体 84~86 F12K 改良 Hamis 培养基 + 15%FBS Caco-2 上 皮源性 结 肠腺癌 非 整倍体 S6-101 MEM + NEAA + 20 % FBS Daudi 淋 巴源性 Bukitts 淋巴瘤 非 整倍体 45 〜 47, xy RPMI1640 + 20%FBS EB-3 淋 巴源性 Bukitts 淋巴瘤 非 整倍体 46 〜 47, xy RPMI1640+ 10%FBS Hela 上 皮源性 宫颈癌 非 整倍体 81 〜 83, xx ME M + NEAA + 1 0 % FBS HepG2 上 皮源性 肝 细胞癌 非 整倍体 55, xy MEM+ NEAA+ 10%FBS HUT78 淋巴 皮肤 T 淋巴 细胞癌 n. d RPMI1640+10%FBS IMR-90 成 纤维细 胞源性 肺 二倍体 46xx MEM+NEAA+ 10%FBS Jurkat 淋 巴源性 T- 细胞 白血病 n. d RPMI1640+ 10%FBS MOLT-4 淋 巴源性 淋巴 母细胞 白血病 非 整倍体 95, xy RPMI1640+ 10%FBS Raji 淋 巴源性 Burkiffs 淋巴瘤 非 整倍体 46 〜 47, xy RPMI1640+ 10% 〜 20% FBS Saos-2 上 皮源性 骨肉瘤 非 整倍体 54 〜 56, xx McCoys 5a + 15 % FBS U937 淋巴至 单细胞 组 织细胞 淋巴瘤 非 整倍体 58, xy RPMI1640+ 10%FBS WI-38 成纤 维细胞 胚胎肺 、妊娠 3 个月 二倍体 46, xx MEM + 10 % FBS 种系 :城猴 B95-8 淋巴 EBV 感染 的白细 n. d RPMI1640+ 10%FBS 种 系:猴 COS-7 成纤 维细胞 SV- 40 转 化的非 洲绿猴 肾细胞 未定 DMEM+ 10 % FBS CV-1 成纤 维细胞 非 洲绿猴 肾细胞 非 整倍体 58~60 MEM + l〇 % FBS Vero 成纤 维细胞 非 洲绿猴 肾细胞 非 整倍体 57~59 199 培养基 + 5% FBS 种 系:鼠 A9 APRI-HPRI 结 缔组织 L 细胞的 克隆衍 生物 非 整倍体 49~52 DMEM+ 10%FBS-»-6- 硫- 鸟嚷吟 c30;ig/mL + 2.6 二氨 基嘌呤 C2C12 肌源 性成纤 维细胞 肌内肌 母细胞 未定 DMEM+ 10%FBS C3H/10T1/2/ 克隆 8 成纤 维细胞 胚胎 非 整倍体 80MEM+ 10%FBS ES-D3 胚芽 多 能胚胎 干细胞 二倍体 DMEM+15%FBS F9 胚芽至 内胚层 精睾丸 畸胎瘤 未定 DMEM+ 15%FBS L-M 结 缔组织 NCTC929 克隆衍 生物 非 整倍体 59~64 199 培养基 + 0.5% 胰酶 L-MCTK-1 结 缔组织 L-M 的 BrdU 耐 性株 非 整倍体 42 〜 46 DMEM+ 10%FBS + 30fig/ mL BrdU MDPC-31c 淋巴 浆 细胞瘤 非 整倍体 43~85 Leibovitz- 15 + 20 % FBS 第五 节细胞 外基质 在组织 和细胞 培养中 的作用 自从细 胞体外 培养的 方法发 明之后 ,为促 进细胞 在体外 的存活 、增殖 、分化 ,广大 的研究 者尝试 了不少 的技术 和方法 ,并使 细胞体 外培养 技术日 趋成熟 。人 们发现 ,许多 细胞在 体外培 养时需 要贴附 在一定 物体的 表面才 能较好 地生长 、分化 和增殖 。尽 管有些 . 920 • 细 胞能在 塑料和 / 或聚赖 氨酸表 面上呈 现较好 的黏附 性及增 殖能力 ,但对 绝大多 数细胞 来说 ,在 这些物 体的表 面却黏 附性差 ,生 长不良 ,甚 至引起 表型的 缺失或 改变, 这不得 不 促使科 学工作 者应用 生物基 质来进 行细胞 培养。 30 年前, Elsdale 和 Bard (1972) 首 先用胶 原基质 研究细 胞行为 。在 这些早 期研究 中 ,逐 步证实 了这些 细胞外 基质成 分在细 胞培养 中的可 行性与 有效性 。随 着研究 工作的 进展 ,人们 对细胞 外基质 的成分 及其作 用的认 识有了 显著的 提高, 并逐步 了解了 细胞是 如何与 细胞外 基质成 分相互 作用的 。现在 ,细 胞外基 质已被 广泛地 应用于 细胞的 体外培 养, 促进了 细胞生 物学的 进步。 一 、细胞 外基质 成分及 其来源 常用 的细胞 外基质 (extracellular matrix, ECM) 成 分包括 I 型 胶原、 III 型 胶原、 IV 型 胶原、 V 型胶原 、血浆 、细胞 表面纤 连蛋白 (fibronectin)、 板层素 1、 腱 生蛋白 (tenascin)、 血 栓蛋白 (thrombospondin) 及玻 连蛋白 (vitronectin)。 这些 细胞外 基质成 分既可 以在实 验室中 自行提 取纯化 ,也可 从市场 上直接 购买。 二 、细胞 外间质 的包被 在进 行细胞 培养前 ,还必 须经过 一定的 步骤将 制备或 购置的 ECM 包被 (coating) 在 组织培 养器皿 的表面 。具体 的方法 取决于 细胞培 养所需 的细胞 外基质 的成分 ,培 养器 皿的组 成和所 需形态 。例 如:细 胞培养 时需用 明胶进 行包被 ,那么 I 型胶 原就必 须先进 行加 热并使 之变性 ,当 然也可 直接购 买明胶 ,然后 配制成 1% 明胶的 PBS 溶液, 再经高 压灭菌 。如 果需用 细胞外 基质的 天然成 分包被 ,则可 用几种 包被缓 冲液进 行包被 ,如 K2C03 缓冲 液成功 地包被 ELISA 板 (O.lmol/L 碳酸缓 冲液, pH9.3) 及 pH7.4 的 PBS 等 。此外 ,在用 氨水处 理并晾 干的培 养器皿 ,则细 胞外基 质可用 稀释的 乙酸溶 液进行 包被。 经过 这些程 序进行 包被后 ,应将 培养皿 用灭菌 PBS 冲洗 ,再 用通过 加热灭 活的含 1%BSA 的 PBS 缓冲 液作用 lh, 以封闭 塑料板 上其他 未结合 的位点 。最后 用灭菌 PBS 洗涤 6 次后用 于接种 细胞。 三 、包 被的细 胞外基 质成分 的特征 包被后 ,黏 附的细 胞外基 质成分 的数量 和构象 (天然 或变性 ) 均可能 改变。 其结合 在 培养管 上的数 量可用 ELISA 法竞争 抑制试 验定量 检测, 或者用 1251 标 记或生 物素标 记基 质成分 方法来 检测, 而结合 的细胞 外基质 的空间 构象则 可用构 象特异 性抗体 或蛋白 降解 易感性 方法来 检定。 细胞基 质成分 结合组 织培养 器皿的 饱和性 及包被 过程的 可重复 性进行 测试, 可生成 一 个天然 分子的 饱和性 >结 合曲线 ,空 气晾 干常导 致基质 包被物 失去天 然构象 ,反 复的洗 涤又会 导致其 被洗脱 。氨 水包被 法对胶 原的包 被是一 个较好 的包被 方法, 常可产 生较好 . 921 . 的效果 ,但 该方 法却使 板层素 和纤连 蛋白丧 失天然 构象。 四 、在 EMC 成分 上培养 的细胞 的特异 性反应 特定的 EMC 成分 对细胞 的作用 效果取 决于细 胞以及 它们的 传代数 、生 长因子 (表 15.4)、 生 长因子 受体谱 的数量 、转化 状态和 培养基 。以 血管内 皮细胞 (BAEC 和 RFC)、 平滑 肌细胞 (BSMC) 和结肠 癌细胞 (Caco~2) 为例 (表 15.5), 可 见不同 EMC 成分与 细胞间 的相互 作用的 不同。 表 15.4 多聚肽 生长因 子的主 要特性 生 长因子 结构 和特性 来 源 靶部位 受 体 EGF( epidermal growth factor) TGF-a( transformal growth factor) GGF 与 TGF-a 有 40% 同源性 ,分子 质 量多为 6kDa ; 常 以膜结 合前体 合成 ,经处 理后成 为可溶 性形式 EGF 主要来 自颌下 腺, 也可从 人尿中 提取; TGF-a 胚胎 组 织许多 转化型 细胞 所 有三胚 层细胞 ,包 括成纤 维细胞 、上 皮细胞 、神 经胶质 细胞 、内 皮细胞 分子 质量为 170 ~ 175kDa 酪 氨酸蛋 白激酶 受体是 EGF、 TGF-a 和牛 痘病 毒生长 因子、 v-erb B 、c-err B/new 产 物属同 — 家族 PDGF( platelet- derived growth factor) 由 A、B 两链 经二硫 键 连接的 二聚体 (AA、AB、BB)B 链 为 Osis 产物 血小板 、巨噬 细胞、 成纤 维细胞 、平滑 肌细胞 、内 皮细胞 间叶 源性细 胞包括 成纤 维细胞 、平滑 肌细胞 、胶 质细胞 a 受体 :分子 质量为 170kDa p 受体 :分子 质量为 180kDa 均为 酪氨酸 蛋白激 酶 IGF- 1 ( insulin- like growth factor I 或 somatomedin C) 分子 质量为 7 ~ 7.6kDa, 与 胰岛素 原有 48% 同源性 , 血 清中有 特异性 结 合蛋白 肝 、肺 、许多 培养细 胞 间 叶源性 性细胞 分子 质量为 130kDa 和分子 质量为 90kDa 的 二链二 聚体 ,酪氨 酸蛋白 激酶 IGF-II Somatomedin A MSA 分子 质量为 7 ~ 7.5kDa; 与 IGF-I、 胰 岛素有 50% 同 源性 ,血清 中有特 异性结 合蛋白 间 叶细胞 ,分 泌可受 发 育调控 间叶 源性细 胞刺激 胎 儿发育 分子 质量为 250kDa 受 体仅与 IGF-II 结合 识别甘 露醉- 6- 磷 酸受体 表 15.5 ECM 对 培养细 胞的细 胞行为 的影响 基 质成分 细 胞类型 黏附性 分布 增生 游走 I 型胶原 BAEC 高 中度 高 高 III 型胶原 BAEC 高 中度 高 IV 型胶原 BAEC 高 中度 高 中 板层素 1 BAEC 中 低 高 中 纤维连 接蛋白 BAEC 高 高 低 低 I 型胶原 RFC 中 IV 型胶原 RFC 低 板层素 1 RFC 高 . 922 . 续表 基 质成分 细 胞类型 黏附性 分布 增生 游走 纤维连 接蛋白 RFC 低 I 型胶原 BSMC 中 低 IV 型胶原 BSMC 中 板层素 1 BSMC 高 纤维连 接蛋白 BSMC 低 高 I、 III 型胶原 Caco-2 高 高 高 IV、 V 型胶原 Caco-2 高 高 高 板层素 1 Caco-2 高 高 低 纤维连 接蛋白 Caco-2 低 低 低 纤维 蛋白原 Caco-2 低 低 低 五 、三维 细胞外 基质对 细胞培 养的细 胞特异 性反应 除 在常规 的二维 培养中 观察到 ECM 对细 胞行为 的调节 之外, 如将细 胞置于 由一种 或多种 ECM 组成 的三维 空间结 构中, 无论是 细胞和 组织的 组成还 是细胞 的分化 、迁 移、 侵袭甚 至凋亡 等表型 ,均 可产生 显著的 改变。 现在, 用纤维 蛋白原 / 纤维素 、间 质胶原 (I 型、 III 型 )、 基 膜胶原 (IV 型胶原 )、 板层素 1、 纤连 蛋白等 制成的 凝胶均 已用于 培养基 质来进 行相应 细胞的 培养。 在制 备三维 细胞外 基质时 ,常把 经由胃 蛋白酶 降解的 I 型胶原 制备成 浓度约 5 〜 2.5mg/mL 的 I 型胶原 凝胶。 再在冰 浴中用 灭菌的 lmol/L NaOH 中和 ,并用 10 X DMEM 配 制为终 浓度为 IX 的 使用液 。待 培养的 微小血 管内皮 细胞以 (0.5 xi〇5)~ (2 X106) 细胞 /mL 的 密度加 入到冰 浴上的 已中和 的胶原 溶液中 ,然 后轻晃 试管以 使细胞 分散 到胶原 溶液中 ,最 后将此 混合物 用吸管 吸出到 细菌培 养皿中 ,以 0.1~0.5mL/s 的 速 度滴在 37t:、 足 够湿度 的培养 箱中形 成凝胶 。培养 5min 后 三维凝 胶形成 ,这 时便可 加入 生长培 养基进 行培养 。该水 滴状凝 胶可黏 附在培 养皿底 ,也 可浮 在培养 液表面 。其 他的细 胞外基 质成分 (板层 、纤 维连 接蛋白 、蛋白 多糖等 ) 可与间 质胶原 混合后 组成混 合 培养基 。当然 ,也 可用 其他细 胞外基 质成分 (如板 层素、 IV 型胶原 ) 构建三 维细胞 培养 环境。 一些 科学家 对大量 细胞在 ECM 构 建的三 维凝胶 中细胞 的迁移 、侵袭 、组 织化 、分 化等行 为进行 了研究 ,发 现三维 ECM 凝 胶的作 用取决 于所研 究的细 胞类型 ,它 们传代 的数量 、生长 因子与 生长因 子受体 的密度 、转化 状态、 培养的 培养液 。其 影响以 小血管 内 皮细胞 (RFC) 为 例列表 15.6, 该表 描述了 ECM 组织 对细胞 行为调 节的复 杂性。 RFC 在高密 度的三 维胶原 凝胶中 ,增殖 速率、 蛋白酶 抑制剂 和基质 合成速 率及生 长因子 受体表 达均受 到影响 。相反 ,调节 生长因 子受体 表达, 通过影 响基质 、蛋 白酶、 蛋白 酶抑制 剂代谢 进而影 响细胞 行为, 并由此 可引起 细胞对 几种生 长因子 的不同 反应。 总之 ,单一 或多种 ECM 成 分在体 外细胞 培养中 ,具有 促进细 胞黏附 、增 生的作 用 。随着 更多的 ECM 成分 被纯化 和鉴定 ,将 逐步明 确它们 作为基 质对某 一特定 细胞的 • 923 . 表 15.6 在 I 型胶原 包被的 二维或 三维基 质中微 血管上 皮细胞 对 TGF pi 和 PDGF 的反应 性以及 与表面 TGF p 和 PDGF 受体 表达间 的关系 影 响因素 二 维基质 主 维基质 Id 5d Id 5d 增生 -TGFpl 高 高 低 低 增生 +TGFpl 降低 降低 无变化 无变化 FN 合成 + + + + + + + + uPA 活性 无变化 无变化 + + 无变化 PAI 活性 无变化 无变化 + + 无变化 TGF 卩1 型受体 无变化 无变化 TGF p2 型受体 无变化 降低 TGFp2/l 型 受体比 5.0 1.0 增生 + PDGF 增加 增加 无变化 无变化 PDGF- ct 链受体 存在 存在 缺如 缺如 PDGF -p 链受体 存在 存在 缺如 缺如 作用 。现已 证实, ECM 还是以 往经验 性培养 系统中 多细胞 组织分 化的必 需组分 。因 此, ECM 无论是 作为工 具还是 作为基 本成分 ,在 复杂的 多细胞 和细胞 行为研 究中起 着十分 重要的 作用。 第 六节培 养细胞 的生物 学污染 及其预 防检测 和排除 由于单 个培养 的细胞 没有完 善的解 毒和抵 抗微生 物感染 的能力 ,培养 细胞在 感染这 些微 生物后 ,会 导致生 长不良 、分 裂减少 、细胞 变粗糙 、细 胞轮廓 增强, 甚至细 胞增殖 停止 ,分裂 相消失 ,细 胞株 系死亡 。此外 ,细胞 污染后 的排除 ,一 般也比 较困难 。因 此 ,预防 细胞培 养环境 中的生 物污染 ,包括 培养细 胞的交 叉污染 ,是 细胞 培养中 的最基 础和最 重要的 工作。 良好的 操作习 惯和严 格的操 作规程 ,是 细胞培 养成功 的第一 要素。 一 、工 作环境 的无菌 早 期的研 究者常 凭借自 己娴熟 的技巧 ,在 酒精灯 边细心 的操作 ,使培 养免受 污染。 机械 性设备 的发展 也为环 境状态 的改善 、污染 的减少 提供了 有益的 帮助。 层流装 置是保 持环 境中物 品表面 无菌的 最经济 最有效 的设备 。更精 致而昂 贵的设 施包括 独立封 闭的室 内空气 循环灭 菌系统 ,它可 使污染 降至更 低水平 。顶 吹式换 气方式 的超净 装置使 我们能 将实 验室的 一角变 为组织 培养区 。在进 行组织 和细胞 培养的 地方应 尽量减 少空气 流动, 这 将有助 于降低 污染。 导 致空气 污染的 主要原 因是气 流紊乱 或气雾 状污染 物进入 培养瓶 (皿 ), 因 此保持 “无菌 室”表 面清洁 ,使污 染物不 易积聚 ,也 是日常 工作中 的重要 环节。 超净台 提供了 一个狭 窄但可 靠的易 保持清 洁的洁 净空间 ,顶 吹的空 气流在 操作者 前面形 成了一 个下吹 的空 气屏障 ,在正 常工作 条件下 ,下吹 的空气 可先于 外来污 染空气 进入无 菌区。 • 924 • 二 、器皿 的灭菌 许多细 胞培养 的器皿 ,包 括吸管 、组 织培养 瓶等均 有一次 性用品 。在 进行细 胞培养 前 ,组织 培养瓶 (皿) 为了 增加细 胞的黏 附能力 ,常 需要进 行某些 特定的 处理。 一般而 言 ,分 层培养 的细胞 在塑料 培养瓶 (皿) 中 要比在 玻璃瓶 (皿) 中生 长的好 ,塑 料制品 有更好 的惰性 ,适 于在 4X: 贮存 溶液。 而冻存 的贮备 液则应 放在玻 璃瓶中 保存。 尽管塑 料制品 比能重 复使用 的玻璃 制品昂 贵许多 ,但塑 料制品 有很多 好处, 如没有 复 杂的处 理程序 、方便 简单等 ,在 经济 许可时 ,仍不 失为一 种好的 选择。 高压蒸 气灭菌 是进行 组织培 养物品 灭菌的 最常用 的方法 。玻 璃制品 常选用 高压灭 菌, 但高压 灭菌后 还要用 快干设 施使玻 璃表面 的冷凝 水干燥 。在进 行高压 蒸气消 毒时, 玻 璃瓶盖 应松开 或将瓶 口用铝 箔盖住 ,瓶 盖另放 在烧杯 中消毒 ,待 冷却后 再在无 菌条件 下将瓶 盖盖上 。玻 璃吸管 消毒前 应用棉 花塞住 ,消毒 后再在 烤箱中 烤干, 按生产 商推荐 的 方法监 测消毒 的效果 。许 多溶液 (如 Tris 缓冲液 、细胞 培养基 ) 不能进 行高压 消毒, 则应过 滤除菌 。盖玻 片和其 他不能 用高压 蒸气消 毒的器 械可用 70% 乙醇浸 泡消毒 ,然 后置于 无菌的 环境中 晾干。 三 、无 菌技术 无菌技 术的原 则就是 保持细 胞培养 环境、 细胞培 养器皿 ( 如细胞 培养瓶 、吸 管等) 内 部的干 净无菌 。细 胞培养 要有极 强的无 菌观念 ,其 要求高 于外科 手术。 细胞培 养的操 作一定 要在超 净工作 台中或 层流室 内进行 ,培 养基或 其他溶 液一旦 开封, 应一次 用完, 并 切勿在 操作区 外开封 。即使 是最后 没用完 ,下次 使用时 也应再 次消毒 。吸 管的 使用也 要 遵循此 原则。 操作 者在操 作时应 戴一次 性手套 ,这 是一种 良好的 自我保 护习惯 。所 有的吸 液操作 都要 用机械 装置来 进行, 用嘴吸 取液体 既是最 大的污 染途径 ,又对 人体健 康构成 莫大的 威胁。 瓶盖只 能在超 净台上 打开, 且要倒 置于工 作台上 ,否则 瓶盖的 边缘就 会被污 染并可 通过 接触瓶 口导致 吸管及 培养液 的污染 。用过 的吸管 、培养 瓶等, 必须弃 置在带 封口的 垃圾 容器中 。为了 安全, 所有进 行过生 物学操 作的物 品均要 焚烧和 / 或高 压灭菌 ,以防 可 能意想 不到的 生物学 危害。 潮 湿的培 养箱是 常见的 污染源 。为 了保证 培养时 所需的 湿度, 常用盛 水盘盛 水后置 于其中 ,但这 会导致 大量细 菌和霉 菌在盘 中生长 。此外 ,细 菌也可 通过送 气的管 壁进入 培养室 中生长 ,引 起污染 。因此 应对培 养箱定 期消毒 。加热 能有效 地杀灭 细菌、 真菌甚 至真 菌孢子 ,如果 培养箱 具有自 动加热 的功能 ,则将 细胞取 出放入 另一无 菌培养 箱中, 启动 加热装 置即可 完成消 毒过程 。此外 ,应 经常用 70% 乙醇擦 拭表面 ,定 期更换 C〇2 送气管 ,送 气管 可用活 性氯消 毒浸泡 。用过 饱和的 Na2HP04 溶 液装在 盘中为 C〇2 培养 箱提供 湿度是 一种很 好的预 防微生 物污染 的方法 ,因 为在如 此高浓 度的盐 环境中 ,微生 物基 本上不 能生长 ,但 在培养 时应在 盛液盘 中定期 (每周 ) 加入双 蒸水, 使没有 固体盐 . 925 . 析出 为宜。 在进行 细胞培 养时, 不同细 胞系要 单独进 行操作 ,以避 免交叉 污染。 理想的 情况是 培养 应分二 瓶同时 培养, 即使其 中一瓶 污染亦 不至于 使细胞 株在本 室失传 ,这对 以前细 胞系 的变异 株或新 建立的 细胞系 而尚未 培养到 足够数 量进行 冻存备 份的细 胞来说 就尤为 重要。 超净台 上应尽 可能地 减少非 培养用 的器皿 ,从 而减少 污染。 在 超净台 中可将 培养瓶 盖打开 ,由 于空气 在进入 工作区 前进行 了过滤 ,进入 瓶中的 空 气都是 过滤后 的空气 。即 使这样 ,瓶 盖应尽 量盖好 ,仅在 进行操 作时才 打开以 尽可能 减少污 染空气 和瓶盖 误放等 导致的 污染。 培 养箱中 的细胞 应定期 在显微 镜下进 行检查 ,至 少每周 二次, 以确定 细胞是 否在如 期生长 或是否 已污染 。用完 的细胞 株应立 即丢掉 ,不 要长时 间放在 C〇2 培养 箱中。 观察细 胞培养 专家存 放和拿 取操作 物品的 部位和 路径, 对于细 胞培养 是相当 有帮助 的 ,现 在已有 这样的 录像带 出售。 四 、细菌 和真菌 的污染 细菌和 真菌的 污染最 为常见 ,其中 尤以真 菌为著 。常见 的真菌 有烟曲 霉菌、 黑曲霉 菌 、毛 霉菌、 孢子霉 、白色 念珠菌 和酵母 菌等。 细菌主 要是革 兰氏阴 性菌如 大肠杆 菌等。 细菌和 真菌污 染后, 一般不 难发现 。肉 眼可观 察到培 养液变 浑浊, 某些真 菌感染 后 ,可 在培养 基中发 现白色 絮状或 浅黄色 小点状 漂浮物 。显 微镜下 涂片可 见到呈 丝状、 管状 或树枝 状菌丝 ,纵横 交错穿 行于细 胞间。 细菌按 其污染 的种类 ,可成 簇或单 个分散 存在各 细胞培 养液中 ,很 容易被 观察到 。此外 ,培养 的细胞 亦有不 同程度 的改变 、如生 长不 良等。 一旦 发现细 菌和真 菌污染 ,应 及时查 明污染 的原因 。如 无特殊 原因, 应将污 染的细 胞完 全清除 或经严 格的灭 菌后再 次培养 。如确 系细胞 珍贵或 其他原 因需要 ,也可 试用抗 真 菌和抗 细菌的 药物予 以杀灭 。但此 法常难 以根除 ,最终 多以无 功而返 。因此 ,预 防污 染 是细胞 培养中 的第一 需要。 五、 支原体 的检测 和清除 支原体 是一类 没有细 胞核结 构的原 核生物 ,常 常污染 培养的 细胞。 由于其 生长缓 慢 ,在 感染后 好长时 间都不 易査出 。此 外它体 积微小 ,常规 培养基 中预防 细菌和 霉菌的 抗生素 对它没 有作用 。尽 管它不 像细菌 或霉菌 那样在 培养基 中易于 形成优 势菌群 ,但它 可以抑 制细胞 的代谢 和生长 ,改 变核 酸合成 、影响 细胞的 抗原性 、导 致染色 体改变 、干 扰 病毒的 复制并 模拟病 毒作用 。当 实验室 中某一 细胞株 (系) 感染支 原体后 ,极 有可能 感 染其他 细胞株 (系 ), 甚至危 及整个 实验室 的所有 细胞系 (株 )。 因此, 防治支 原体的 污染 是十分 重要的 。在此 ,我 们重 点介绍 用荧光 显微镜 检测支 原体的 方法。 支原 体主要 有两种 不同检 测方法 。其一 ,用 H〇echst 33258 荧光染 料染色 DNA。 通 过对细 胞核周 、细胞 表面或 细咆质 的特定 DNA 物质的 显色而 确定有 无支原 体污染 。其 • 926 • 二 ,用 DNA 探针法 。通 过识 别支原 体特定 序列的 DNA 探针 ,检 测细胞 中是否 存在支 原体 DNA 而达 到检测 目的。 1. 试 剂配制 配制以 下溶液 ,灭 菌后置 冰箱中 保存。 不含 酚红的 HBSS: NaCl 8g KC1 〇.4g CaCl2 〇.14g MgS04.7H20 O.lg MgCl2.6H20 O.lg Na2HP04-2H20 0.06g kh2po4 0.06g 葡萄糖 l.Og NaHC03 加 双蒸水 1000mL。 0.35g Hoechst 1000 X 贮备液 : 5mg Hoechst 33258 溶于 lOOmL HBSS, 终 浓度为 50炖/ mL〇 Hoechst 对光 敏感; 务必避 光保存 , 常铝箔 包装。 Hoechst 工作液 ( 每次新 鲜配制 ): O.lmL Hoechst 贮备 液加入 10mL HBSS 中 (0.5/ng/mL), 再 将上液 0.5mL 于 5mL HBSS 中 (0.5pg/mL) 或将 50^tL Hoechst 1000 X 贮 备液于 50mLHBSS 中 ,用染 色缸装 40mL 工 作液。 柠檬酸 、磷酸 缓冲液 (2X): 0.1mol/L 梓樣酸 22.2mL 0.2 mol/ L NaH2P04 27.8mL 用柠 檬酸或 NaH2P04 调至 pH5.5。 Carnoys 固定液 : 3 份甲醇 , 1 份冰 乙酸。 2. 操 作步骤 (1) 将胰 蛋白酶 处理过 的培养 细胞滴 1 〜 2 滴至 预放在 带盖培 养皿中 的载玻 片或盖 玻 片上。 (2) 加入 1 〜 2mL 生长 培养基 覆盖玻 片表面 以使细 胞生长 2~3d。 (3) 配制 Camoys 固定液 (每次 用前新 鲜配制 )。 (4) 吸弃培 养液, 直接将 5mL 固定 液加入 Labtek 玻片 的片室 或培养 皿中, 室温下 2min〇 • (5) 弃除固 定液, 再次加 入新鲜 固定液 5min。 (6) 重 复步骤 (5)。 (7) 弃去 固定液 ,将生 长有细 胞的盖 玻片或 玻片取 出空气 中晾干 30min 或 更长。 (8) 配制 Hoechst 工 作液。 • 927 • (9) 将 细胞的 玻片置 于上述 Hoechst 工作液 (0.05 吨 /mL) 中室温 下染色 10min〇 (10) 双蒸 水冲洗 2 遍。 (11) 用 等份甘 油与磷 酸柠檬 酸缓冲 液混合 制备封 片液。 (12) 将 封片液 滴加两 滴至载 玻片上 ,用 盖玻片 封片。 (13) 在 330nm/380nm 激 发光和 LP40nm 滤 镜下用 荧光显 微镜检 测染色 情况。 支 原体的 清除较 为困难 。可利 用其对 热耐受 性差的 特点, 进行加 温除菌 。将 受污染 的细 胞置于 41X: 中作用 5 〜 10h 或动物 体内接 种等, 但均难 以完全 清除。 第七 节成纤 维细胞 的分离 与培养 由于 成纤维 细胞极 易在体 外培养 ,生存 时间长 ,易于 进行各 种生物 学操作 ,因 此被 广泛 应用于 从基因 的转染 到显微 注射等 各种细 胞和分 子生物 学研究 领域中 。此外 ,还可 应用 于免疫 荧光染 色技术 研究细 胞结构 。成纤 维细胞 在形态 学上呈 梭形, 其生长 受密度 调控 。成 纤维细 胞合成 许多生 物分子 ,如 I 型 胶原等 ,这些 生物分 子常被 用做鉴 别成纤 维细 胞是来 自全胚 层或组 织成纤 维细胞 的标记 。制备 成纤维 细胞的 组织来 源极其 丰富, 所有 的胚层 、器 官或组 织均可 作为制 备成纤 维细胞 的材料 。此外 ,还 有许 多现存 的成纤 维细 胞株, 如广泛 使用的 3T3 ( 鼠) 和 BHK-21 ( 幼年大 鼠肾) 细胞株 ,可 应用 于所需 的科学 研究。 成纤维 细胞是 研究原 代培养 的初期 分期和 外源性 因子影 响细胞 系选择 性的最 理想的 细 胞模型 。一 般而言 ,用于 原代培 养的细 胞是由 机械或 酶消化 等方法 分离后 ,仍 存活并 能贴附 于容器 (单层 培养) 或悬 浮于上 清的多 种细胞 组成的 。因此 如果细 胞需要 增殖, 必须经 过传代 才能较 好进行 。当 培养细 胞发生 汇合后 ,由于 两细胞 间营养 缺乏导 致细胞 的密度 抑制, 细胞停 止分裂 。为保 持在适 宜的密 度条件 下生长 和保持 其正常 的表型 ,细 胞 必须不 断地进 行传代 。如果 任何细 胞失去 接触抑 制和密 度抑制 ,细 胞将 持续地 进行分 裂 ,形成 永生性 细胞系 。正常 的二倍 体细胞 在体外 只能进 行有限 的传代 ,经 过一 定数量 传代后 ,除非 产生了 永生性 细胞系 ,否则 均要衰 老死亡 。成 纤维细 胞在体 外呈典 型的有 限传 代的生 命特征 ,极 少产生 永生性 细胞系 。但是 ,鼠 成纤 维细胞 则与一 般成纤 维细胞 相反 ,极易 形成永 生性细 胞系。 这种永 生性细 胞系能 在培养 基中过 度生长 ,产生 高密度 的细胞 。细 胞的这 些转化 或永生 性细胞 系的形 成可自 发产生 ,也可 通过化 学或病 毒方法 诱生。 在大量 的细胞 生物学 研究中 ,批量 培养的 成纤维 细胞均 来自相 对未分 化的全 胚或特 定组织 (如皮 肤成纤 维细胞 源自新 生儿和 / 或胚 胎皮肤 )。 经 过蛋白 酶消化 (如 胰蛋白 酶) 制备组 织匀浆 ,再 将其 上清进 行培养 而获得 。在 一般情 况下, 制备成 纤维细 胞的组 织经过 2 〜 3 次传代 培养后 ,仅成 纤维细 胞样细 胞才能 成活。 1. 材料 10 〜 13d 孕龄 的孕鼠 或鸡胚 • 胰蛋白 酶溶液 (配 制见第 四节细 胞的洗 脱方法 部分) 胶原 酶溶液 (1 〜 5mg/mL, 由过滤 除菌的 10X 贮液稀 释而来 ) . 928 • HBSS 溶液 (配制 见第四 节支原 体的检 测和清 除部分 ) DMEM 培养基 (含 10%FCS 的 MEM, 100U/mL 青 霉素, 100mg/mL 链霉素 ) 70 % 乙醇 1% 乙酸 0 . 53 mmol/L EDTA 的 PBS 溶液 0.05% 的胰 蛋白酶 -EDTA 溶液 (配 制见第 三节培 养用液 部分) 无菌手 术器械 无菌 盘和无 菌带盖 培养皿 带 磁力棒 的烧杯 和电磁 搅拌器 2. 操 作步骤 成纤 维细胞 的分离 下述方 法适用 于大鼠 、小鼠 以及鸡 胚分离 成纤维 细胞, 一般选 10~13d 孕龄 的胚胎 ,该孕 龄的胚 胎中 含有适 宜数量 的未分 化成纤 维细胞 样间质 细胞。 哺 乳动物 (大鼠 、小鼠 ) 胚胎: (1) 用乙 醚麻醉 妊娠的 啮齿类 动物。 (2) 用 70% 乙 醇将超 净台擦 洗消毒 ,然后 置于紫 外灯下 5min。 (3) 用无菌 镊和剪 刀沿腹 正中线 剪开, 将皮肤 用灭菌 镊拉至 后肢。 (4) 更换 无菌慑 和剪刀 ,打 开腹腔 ,取 出子宫 ,并置 于无菌 盘中。 (5) 从子宫 中取出 胚胎, 放在另 一加有 PBS 的 无菌烧 瓶中。 (6) 冲 洗胚胎 ,弃去 PBS, 反 复洗涤 ,直至 PBS 变 清亮。 鸡胚的 分离: (1) 70% 乙 醇擦拭 蛋壳。 (2) 在鸡 卵的圆 顶端用 无菌剪 刀将蛋 壳敲破 ,慢 慢剥离 蛋壳, 露出空 气囊。 (3) 用灭菌 镊去除 薄膜。 (4) 用 弯头镊 子夹住 鸡胚颈 将鸡胚 取出。 (5) 去除 鸡胚头 ,将断 头的鸡 胚放入 灭菌烧 杯中, 用另一 把剪刀 将其组 织剪碎 ,用 PBS 冲洗。 细胞的 分离和 培养: (1) 将 6~8 只胚 胎放入 一灭菌 平皿中 ,用 无菌剪 刀剪碎 ,再在 PBS 中 磨碎。 (2) 在无菌 条件下 ,将制 成匀浆 的胚胎 移入到 500mL 灭菌烧 瓶中, 放入灭 菌搅拌 棒, 并加入 200~300mL 灭菌的 含胰蛋 白酶的 HBSS。 (3) 在 较高的 室温或 37X: 消化 15min, 并轻微 振动。 _ (4) 在 组织块 沉淀后 ,将 含有细 胞的上 清倒入 另一灭 菌的大 容量离 心管中 ,每 10mL 液 体加入 lmL 小牛血 清以灭 活胰蛋 白酶。 (5) 在 未消化 的组织 中加入 新鲜的 胰蛋白 酶溶液 ,重 复步骤 (4) 〜 (5)。 (6) 1200r/min 离心 5min, 弃 上清。 (7) 用灭菌 PBS 将细胞 悬浮, 如步骤 (6), 再次 离心。 (8) 用 PBS 洗 涤细胞 ,直 到上清 液清亮 为止。 . 929 . (9) 用 lOmL 含 10% 小牛 血清和 抗生素 (如青 霉素和 链霉素 ) 的 DMEM (GIBCO/ BRL) 溶液悬 浮细胞 ,并 将终体 积加至 100mL。 (10) 将大的 未消化 完的组 织弃去 ,亦可 通过数 层纱布 过滤以 去除组 织碎片 以获取 上清。 (11) 将 0.2mL 细 胞上清 加入到 1.8mLl% 乙酸中 ,在溶 解掉红 细胞后 ,用 血球计 数 仪计数 ,以确 定现有 细胞液 的细胞 浓度。 (12) 将 细胞按 (1X107) 〜 (4Xl〇7) /l〇mL 培养 基的比 例接种 ,在 37X: 的 C〇2 培 养箱 中培养 ,直 到细胞 长好。 (13) 培 养好后 ,去除 培养基 ,用 10mL 的 0.53mmol/LEDTA 的 PBS 溶液洗 2 次。 (14) 去除 EDTA 并用 等体积 的预温 0.05 % 的胰 蛋白酶 -EDTA 溶液 替换。 (15) 37T: 培养 5min。 (16) 用 灭菌的 吸管将 细胞轻 轻移入 预置有 l~2mL 小 牛血清 的灭菌 试管中 以中和 胰蛋 白酶。 (17) 1200r/min 离心 5min, 弃 上清。 (18) 用 5mL 培养液 悬浮细 胞块, 另加入 15mL 培养液 ,均 分入 2 个 100mm 直径 的培养 皿中。 (19) 置 37t: 的 C02 培养箱 中培养 ,直 到细 胞长好 。重 复步骤 (13) 〜 (18) 进 行次培 养。 经本方 法培养 的细胞 可很好 地传代 。再经 过最初 几次传 代后, 仅有成 纤维细 胞样细 胞留存 ,此 时再 将细胞 冻存。 第 八节上 皮细胞 的培养 上皮细 胞覆盖 在人体 体表和 人体内 的腔道 表面, 具有保 护机体 免受有 害物质 侵袭、 吸收营 养物质 及分泌 一些机 体生命 活动必 需的物 质等多 种功能 。由 于上 皮细胞 分布广 泛 、功 能繁多 ,运 用培养 上皮细 胞进行 的研究 也日趋 增多。 上 皮细胞 的原代 培养较 为困难 ,主 要是因 为相应 的上皮 细胞组 织不易 获得, 制备的 组织中 常有细 菌和真 菌感染 ,使 分离获 取的上 皮细胞 数量相 对较少 (如以 新生鼠 皮肤为 例, 每只新 生鼠仅 能获取 2 xl〇6 个上 皮细胞 ), 而且 细胞原 代培养 与传代 培养时 遗传学 性 状也容 易改变 。因此 ,如 无特 殊需要 ,多 不直接 进行原 代培养 ,可以 直接从 ATCC 索要 。现在 ATCC 细胞 库中贮 存有多 种动物 的几丰 所有上 皮细胞 组织来 源的细 胞系, 且 该库中 的所有 细胞系 均经过 了严格 的检验 ,已 排除可 能的生 物污染 ,并 提供详 尽的该 细 胞的培 养条件 与方法 ,具 有很好 的操作 性与安 全性。 上皮细 胞的原 代培养 受到多 种因素 的影响 ,如 适当的 培养基 、特 定的生 长因子 、适 宜 的细胞 基质等 。本节 详细介 绍了两 种上皮 细胞的 原代培 养方法 : 新生鼠 角化上 皮细胞 和 小牛角 膜上皮 细胞的 培养。 新生动 物较之 成年动 物的上 皮组织 更易在 体外生 长和培 养成功 ,因此 ,上皮 细胞多 取 材于新 生和幼 年动物 。通 过机械 性方法 获得的 小块上 皮组织 ,经 酶消化 后获取 单个的 上 皮细胞 。经接 种后, 在适宜 的培养 条件下 获得原 代培养 的上皮 细胞。 • 930 • 1. 材料 HBSS 溶液 (配制 见第四 节支原 体的检 测和清 除部分 ) 胰蛋白 酶溶液 (配 制见第 四节细 胞的洗 脱方法 部分) 胶原 酶溶液 (1 〜 5mg/mL, 由过滤 除菌的 10X 贮液稀 释而来 ) 普通 培养基 (含 10% FCSMEM, 100U/mL 青 霉素, 100mg/mL 链 霉素, 2〜 4mmol/L L- 谷氨 酰氨) 相 对分子 质量为 10 万的聚 赖氨酸 低钙 培养基 [MEM, 含螯 合剂的 10%FCS (ChelexlOO: 40g/100mLFCS), 100U/ mL 青 霉素、 100mg/mL 链 霉素] 1 % 的 聚烯丙 酮碘和 70% 乙醇 10% DMSO 无菌手 术器械 无 菌带盖 培养皿 电磁 搅拌器 Nitex 过 滤纱布 2. 操 作步骤 新生鼠 角化上 皮细胞 的分离 与培养 : (1) 运用 窒息方 法处死 1 〜 2d 龄的 无毛 新生鼠 ,放 入有盖 平皿中 ,用 1% 的 聚烯丙 酮碘 (povidone iodine) 溶 液消毒 ,经流 水冲洗 后再用 70% 乙 醇消毒 2 次 。处死 后的新 生小 鼠应立 即处理 ,如批 量较大 ,应将 其放在 冰上, 30min 内处理 完毕。 (2) 去 除四肢 和尾巴 ,将 皮肤由 头至尾 剪开, 并用带 齿镊子 将皮肤 剥离。 (3) 将 取出的 皮肤组 织按皮 面向下 ,放入 带盖灭 菌平皿 表面, 然后放 上冰块 ,直到 将皮 肤收集 完全。 (4) 用 带齿慑 子将皮 肤展开 ,放 入盛有 0.25% 胰 蛋白酶 -HBSS 的带盖 无菌平 皿中, 使其皮 肤面向 下并漂 浮在液 面上, 4t: 过夜 。注 意表皮 不要沉 入胰蛋 白酶溶 液中。 (5) 取出 处理后 的皮肤 ,将 其置入 另一干 燥的灭 菌带盖 平皿中 ,表 皮贴附 于塑料 上 ,而真 皮可用 带齿镊 子去除 。鼠龄 大小影 响其剔 除的难 易程度 ,鼠 龄越大 ,真 皮则越 难 清除。 (6) 用剪 刀仔细 修剪去 上皮上 残留的 真皮, 将修剪 后的上 皮剪碎 ,在 371C 与普通 培养基 (按每 5 块皮肤 组织块 10mL 培养基 的比例 ) 充 分混合 ,并 装入一 带磁力 搅拌棒 的 烧瓶中 ,搅拌 45min。 (7) 将 溶液用 4 层 16 孔灭菌 Nitex 纱 布过滤 ,也 可离心 (800 xg, l〇min), 再将 沉淀用 10% DMSO 悬浮 ,放入 液氮中 冻存。 (8) 将 分离出 的细胞 按约每 块皮肤 10mL 培养基 的量加 入组织 瓶中, 37X: 培养 4 〜 12h, 可以看 到小片 的细胞 生长。 (9) 将这些 细胞转 入低钙 培养基 中继续 培养, 这时角 化细胞 增殖。 这 些细胞 转入低 钙培养 基中继 续培养 ,这一 转运过 程可阻 止细胞 的分层 。在 低钙培 养基中 ,鼠角 • 931 . 化 上皮细 胞可保 持一周 左右。 GIBCO/BRL 和 Cbnetics 公司 现已提 供数种 商品化 的低钙 培养基 ,在这 些培 养基中 ,鼠角 化上皮 细胞可 保持更 长时间 。最 好使 用一次 性塑料 培养板 而不是 玻璃培 养瓶。 牛角 膜上皮 细胞的 分离与 培养: 本文 介绍方 法基于 Ebato 等的培 养方法 ,经过 适当的 改进后 ,也可 用于其 他类型 上皮组 织细胞 培养。 (1) 从 屠宰场 中取小 牛角膜 ,并立 即放置 于冰上 ,带 回实验 室进行 下一步 处理。 (2) 用 1% 的聚烯 丙酮碘 (povidone iodine) 溶液冲 洗牛眼 ,后 用清 水冲洗 ,再经 70% 乙醇 消毒。 (3) 用 3.5mm 的活检 针套取 小块的 上皮。 (4) 将取出 的组织 放在一 干燥的 以聚赖 氨酸覆 盖的平 皿表面 lOmin 以利 黏附。 将相对 分子质 量大于 10 万的 聚赖氨 酸制成 lmg/mL 溶液 ,用 0.22/im 孔径 的滤膜 灭菌, 再将该 溶液 滴到相 应物体 的表面 (有盖 的培养 皿或玻 璃盖上 ), 5min 后 用灭菌 双蒸水 冲洗。 (5) 加入 培养基 (含 10% FCS 的 MEM, 100U/mL 青 霉素, 100mg/mL 链 霉素, 2~4mm〇l/LL- 谷 氨酰氨 ) 37t: 培养 2d。 2d 后可 以见到 长出的 上皮细 胞索。 上皮 细胞的 培养容 易受到 成纤维 细胞的 污染, 因此鉴 定与去 除污染 就显得 十分重 要 。成纤 维细胞 与上皮 细胞可 通过免 疫荧光 双标记 染色进 行鉴别 ,前 者波 形蛋白 (vi- mentin) 阳性 而后者 角蛋白 (keratin) 阳性。 去除黏 附在上 皮细胞 上的成 纤维细 胞可通 过胰 蛋白酶 消化的 方法来 达到: ( 1 ) 用含 0 . 05 % 胰蛋 白酶和 0 . 53 mmol/L EDTA 的 HBSS 洗涤 1 次。 (2) 室 温下用 含有同 浓度的 胰蛋白 酶消化 4min。 (3) 用步骤 (1) 中溶 液洗涤 ,并 用吸管 反复吹 打冲洗 ,可将 成纤维 细胞吸 出而留 下 仍黏附 的上皮 细胞。 (4) 用新 鲜的含 小牛血 清的培 养基灭 活残留 的胰蛋 白酶。 在 上述培 养液中 ,也可 加入杀 真菌药 物如两 性霉素 B 2. 5mg/mL, 但 这些药 物会延 缓上皮 细胞生 长过程 ,因 此尽量 不加。 第九 节人毛 细血管 内皮细 胞分离 血管内 皮细胞 分离培 养技术 的成功 ,直 接促进 了对正 常组织 和实体 肿瘤的 血管发 生、 炎性细 胞的移 动和游 走及其 他血管 生物学 的了解 。一般 来说, 内皮细 胞可分 为两大 类: 大血管 内皮细 胞和微 小血管 (毛细 血管) 内 皮细胞 。毛 细血管 内皮细 胞在所 有的组 织和 部位均 存在, 除了提 供营养 带走机 体代谢 产物外 ,毛细 血管内 皮细胞 在不同 器官中 起 着不同 的作用 ,并表 现出形 态上细 小差异 。例如 ,在 颅内 起血脑 屏障作 用的毛 细血管 内皮 细胞和 眼内毛 细血管 内皮细 胞间没 有任何 孔隙; 而在 血流丰 富物质 交换频 繁的器 官 ,如 肠纤毛 、内 分泌腺 、肾小 球等处 的毛细 血管内 皮细胞 间则存 在着许 多小孔 ,而这 些细胞 间小孔 的形态 也不同 。本 文中分 离的毛 细血管 内皮细 胞来自 腹壁脂 肪组织 ,如果 是要 研究这 些细胞 的特征 ,则 任何源 性的组 织均可 使用。 过去, 毛细血 管内皮 细胞的 分离技 术曾落 后于大 血管内 皮细胞 的分离 ,主要 是由于 大 血管容 易处理 ,内皮 细胞易 f 用 酶消化 法洗脱 。这一 技术重 复性好 ,除 要注意 内皮下 . 932 . 平滑肌 细胞的 污染外 ,常 可获 得高纯 度的内 皮细胞 。目前 ,这 一分 离技术 被广泛 应用于 人脐 静脉内 皮细胞 、牛大 动脉内 皮细胞 、回肠 动脉、 回肠静 脉等的 内皮细 胞分离 ,如果 大 血管细 胞被非 内皮细 胞污染 ,则 应在内 皮细胞 传代时 进行人 工选择 ,予以 排除。 毛细血 管内皮 细胞的 分离和 培养需 要严格 的操作 技术和 条件, 应用分 离纯化 技术予 以 排除混 杂的其 他细胞 ,以避 免非内 皮细胞 的污染 。此 处介 绍选用 脂肪组 织作为 材料来 制 备毛细 血管内 皮细胞 。脂肪 组织主 要由脂 肪细胞 、毛 细血 管内皮 细胞和 成纤维 细胞构 成 ,较其 他组织 的细胞 类型少 且单一 ,样 本易于 在整形 外科医 师处大 量获得 。而 且脂肪 细胞 与其他 细胞的 生物物 理学性 状差异 显著, 可以很 简单地 与他们 区分开 。当然 ,其他 组 织也可 用于制 备毛细 血管内 皮细胞 ,但有 以下几 个需注 意的地 方:细 胞活性 ( 手术后 时间 )、 异常病 理组织 (导 致切除 的原因 ), 以 及酶消 化前复 杂的组 织切碎 步骤。 毛细血 管内皮 细胞分 离技术 利用了 内皮细 胞特异 的性质 : 细胞在 BSA 中分层 沉淀; 内皮细 胞选择 性地摄 取偶联 于乙酰 化低密 度脂蛋 白的荧 光染料 ,便 于进 行细胞 计数; 内 皮细胞 的卵圆 形形态 ,便于 进行物 理性“ 除杂” 。现 在常利 用小磁 珠对内 皮细胞 特异性 抗原的 选择性 结合而 进行主 动的分 离纯化 。利 用这些 技术及 细胞特 性可以 使我们 分离到 不 同组织 来源的 人毛细 血管内 皮细胞 ,包括 肾上腺 皮质、 网膜脂 肪组织 、脑 、心 脏等。 以下 具体介 绍用偶 联有抗 PECAM 抗 体的小 磁珠分 离内皮 细胞的 方法。 1. 原理 CD31 是一 个分子 质量为 130kDa 的 结构性 表达的 整合型 膜蛋白 ,属 细胞黏 附分子 超家族 。除 骨髓系 的几个 亚型外 ,它的 表达基 本上限 于内皮 细胞和 血小板 。该技 术以血 小 板内皮 细胞黏 附分子 (PECAM 或 CD31) 为靶 抗原, 运用偶 联有抗 PECAM 抗体的 小磁 珠能与 CD31 抗 原特异 性结合 的特性 ,简 单而有 效地分 离和纯 化人毛 细血管 内皮细 胞 。现已 有几种 商品化 的抗人 CD31 单克 隆抗体 ,使 其分离 方法更 为简便 。需要 指出的 是 上皮细 胞的任 何标记 ,无 论是结 构性的 还是非 结构性 的均可 用磁珠 方法进 行分离 。另 一 个被利 用的内 皮细胞 标记是 H 抗原结 合位点 UEA (I 型植物 血凝素 )。 UEA 是一种 肿瘤和 正常组 织血管 内皮的 标志物 ,其 特异性 不强, 但在选 择性分 离血管 内皮细 胞时还 是可以 使用的 。使 用时 需要注 意的是 H 抗原 在最初 几次传 代的毛 细血管 内皮细 胞中没 有 表达。 2. 材料 脂 肪组织 Amac 磁珠 ( 珠数量 : 2.5X108 粒 /mg ; 结合力 : 50pg IgG/mg 磁珠; 浓度 : 10mg/mL。 Paramagratic 磁 珠用羊 抗鼠 IgG 包被) 抗人 CD31 单抗 (DADK 公司 ) (15_2mg/mL) 鼠抗人 IgG (260fig/mL) 培养基 (M199 培 养基, 20% FCS, 9(Vg/mL 肝素, 75pg/mL 内皮 细胞生 长添加 剂, 100U/mL 青 霉素, 100/ug/mL 链霉素 ) 选 择一次 性用品 或高压 消毒以 下器械 (2 把大 剪刀, 2 〜 3 根压 舌板, 胰蛋白 酶消化 用烧 杯:每 30g 样本 一个带 盛盘的 250pm 不锈 钢筛, 15mL 和 50mL 离心管 ) . 933 . 除脂肪 组织外 , 所有的 材料均 可商品 化购置 。脂 肪组织 常可在 当地整 形外科 医师处 获得。 以吸脂 术获 得的脂 肪组织 更便于 处理, 其他方 法获得 的脂肪 组织常 需经剪 碎等处 理后才 能使用 ,且脂 肪细胞 数 量较少 。由 于吸脂 术获得 的脂肪 组织血 液成分 较多, 应注意 血源性 病原。 3. 操 作步骤 脂肪 组织的 处理: (la) 用成 块的脂 肪组织 进行样 本分离 (从 腹部整 形标本 中制备 )。 ① 整理 组织: 只取脂 肪而清 除皮肤 、肌肉 、靭带 等组织 ,然 后按 10g 每份将 脂肪组 织 等分。 如果标 本过大 ,可置 4C 冰箱 中存放 24h, 虽这 将导致 毛细血 管内皮 活性有 显著的 损伤, 但尚可 继续 使用。 最好使 用新鲜 的脂肪 组织。 ② 在灭菌 盘中剪 碎标本 ,使 其尽可 能小。 ③ 将切碎 的标本 放入一 60mL 的不带 针头注 射器中 ,将 标本 至针头 处挤出 ,重复 3 次 ,直 到样本 液化。 ④ 将 20mL 组织 移于一 50mL 的 锥形离 心管中 ,加入 20mLPBS 混匀, 700Xg 离心 5min, 用吸头 吸弃液 / 血层, 重复以 上过程 直至将 血清除 干净。 在去 除脂肪 层之前 (见后 ) 所有操 作均在 室温下 进行, 以保持 脂肪的 液态。 (lb) 用吸 脂术获 得的标 本进行 制备。 ① 将 吸取的 脂肪过 筛并用 PBS 反 复冲洗 ,用压 舌板边 振荡边 冲洗。 ② 取 20mL 脂肪组 织放入 50mL 离 心管中 ,加入 20mL PBS 混匀, 700r/min 离心 5min, 用吸管 吸弃液 / 血层。 大约每 10mL 脂肪 组织样 本可制 备获得 10mL 溶液。 (2) 将 BSA 按 4mg/mL 浓 度溶于 PBS 中 (BSA/PBS), 过滤法 灭菌; 将胶 原酶和 DNasel 分别按 4.0mg/mL 和 0.02mg/mL 溶于 BSA/PBS 中 ,用 0.2/im 滤 膜过滤 ,配 制 胶原酶 溶液。 (3) 将步骤 (1) 中获取 的脂肪 组织用 灭菌压 舌板挑 到胰蛋 白酶消 化瓶中 ,加 入胶 原酶 溶液, lmL 组织样 本加入 lmL。 (4) 37*C 用 旋转振 荡器以 80r/min 消化 30min。 消 化时间 取决于 组织消 化程度 ,如 30min 后仅 少量组 织残存 ,则 可进行 下一步 ,否 则再次 进行消 化 ,并每 5min 观 察一次 ,直到 消化好 ,但总 的消化 时间不 要超过 45~50rnin。 (5) 在进行 消化时 ,将 4.0mg/mL BSA 的 PBS 溶液稀 释至终 浓度为 0.2mg/mL BSA/PBS〇 注意 :消化 时间正 好可用 于制备 磁珠。 (6) 将消化 后的样 本倒入 50mL 的离 心管中 (约 20mL/ 管 ), 室 温下以 1500r/min 离心 5min〇 (7) 将液 体脂肪 / 乳 汁和水 化层倒 入另一 50mL 灭 菌离心 管中。 在用 另一离 心管时 最好选 带套的 离心管 ,以 替代废 物容器 。因 为细胞 极易凝 固沉淀 ,细胞 沉淀常 略带 红色极 易看见 。如 果样本 过度消 化或胶 原酶中 混有胰 蛋白酶 ,则 液化部 分由于 DNA 从核 中逸出 而使 之显得 黏稠, 在消化 缓冲液 中加入 DNA 酶就是 帮助消 化这些 溢出的 DNA。 如果样 本过于 黏稠, 可 以进行 离心。 . 934 • (8) 用5〇^0.211^/11^63八/?83悬浮细胞块,150〇1*/11^离心511^,弃上清,再 用 lmL 含 5.% FCS 的 PBS (PBS/FCS) 悬浮 沉淀。 这 样的样 本准备 用于内 皮细胞 的主动 性选择 。如 有结缔 组织、 韧带或 其他块 状物质 混在消 化样本 中, 应在磁 珠分离 纯化前 用吸管 吸除。 抗 CD31 偶联 磁珠的 制备: (9) 震 荡混合 Amac 磁珠溶 液直至 均一。 (10) 将 BSA/PBS (4.0mg/mLBSA) 稀释至 终浓度 0.2mg/mLBSA/PBS。 (11) 取出 100/^L 磁珠 (lmg) 加入到 2mL0.2mg/mLBSA/PBS 中 ,混匀 ,用钴 - 铬磁 铁进行 分离。 (12) 弃上清 ,再用 2mL0.2mg/mLBSA/PBS 悬浮 磁珠。 (13) 抗 CD31 抗体 与磁珠 偶联。 (14) 用磁铁 在上清 中分离 磁珠, 然后弃 上清。 lmg 磁 珠加入 3mL0.2mg/mL BSA/PBS, 再用磁 铁进行 分离。 (15) 重 复步骤 (14)。 (16) 用 0.2mg/mLBSA/PBS 悬 浮磁珠 ,并 贮存于 41C, 最长 可达数 星期。 偶联抗 体的磁 珠可稳 定地存 放数周 ,但 最好 是在初 次选择 时制备 ,这 样在其 后的传 代中, 没有用 完 的磁珠 还可用 于再次 选择。 用抗体 偶联的 磁珠分 离纯化 细胞: (17) 前面获 取的细 胞样本 中加入 30;xL 偶联有 CD31 抗体 的磁珠 ,反应 15min。 (18) 将 磁铁放 在试管 的一侧 5mm, 并将 选定的 标本用 磁铁吸 至该侧 ,吸弃 上清, 然后再 将磁铁 拿走。 磁铁 的磁力 既要能 将磁珠 吸往试 管一侧 ,又不 要磁力 过大使 磁珠在 很短时 间全部 吸过来 ,最 好的 磁铁是 钴-铬 磁铁, 它会在 5min 左 右时间 将样本 分离。 (19) 加入 2mLBSA/PBS 至磁珠 沉淀中 ,轻 轻混匀 ,注意 将块状 物捣碎 ,再 用磁 铁进行 选择。 (20) 重 复步骤 (18) 和 (19)。 (21) 再用 ltnL 培 养基悬 浮最终 的磁珠 沉淀。 (22) 在明胶 包被的 T25 板上接 种悬浮 的细胞 ,每 10g 脂肪 分离物 用一个 T25 板, 在带 摇床的 水浴中 或带摇 床的培 养箱中 37X: 培养。 T25 烧瓶的 预包被 : 1% 明胶的 PBS37X: 2h。 (23) 当细 胞达到 足够的 密度后 ,再 按上述 2 种 方法传 代以确 保内皮 细胞的 纯度。 第 十节人 淋巴细 胞的分 离与转 化培养 单个 核细胞 可以直 接从外 周血中 分离, 在加入 IL-2、 EB 病毒 、美洲 商陆、 刀豆素 A 等刺 激物后 ,通过 相应的 受体接 受刺激 信号, 然后在 3~5d 内在 体外发 生转化 (transformation) 增殖 ,形 成淋巴 母细胞 。例如 ,在 EB 病毒的 作用下 ,淋 巴细 胞还可 以 形成永 生性细 胞系; 在 IL-2 的长期 作用下 ,淋巴 细胞则 可以形 成自然 杀伤细 胞和特 定的 淋巴细 胞亚型 。因此 ,淋巴 细胞的 分离与 转化被 广泛应 用于核 型分析 、细胞 融合研 • 935 • 究 等理论 研究和 临床工 作中。 1. 材料 抗凝 外周血 Ficoll-Hypaque 淋 巴细胞 分离液 6% 的低 分子右 旋糖酐 PBS (配 制见第 三节培 养用液 部分) 培养基 (RPMI 1640, 10% 胎牛 血清, 10mg/mL 庆大 霉素, 2mmol/LL- 精 氨酸, lmmol/L 丙酮 酸钠) 丝裂原 (lmg/mLPHA 或 0.4mg/mL 刀豆素 A, RPMI 1640 配制, - 20X: 保存) Histopaquel〇77 培养基 含 0.2^g/mL 环 孢霉素 A 的 RPMI1640 培养基 EB 病毒 [美 洲绒猴 B95-8 细胞株 (可从 ATCC 获得) 在条件 培养基 中可产 生大量 含 EB 病毒的 上清液 ,再由 22pm 灭菌滤 膜过滤 制得] 无菌 试管和 离心管 2. 操 作步骤 淋巴 细胞的 分离和 刺激: 淋 巴细胞 的分离 主要选 用抗凝 外周血 ,运用 Ficoll-Hypaque 液进 行离心 法分离 ,然 后再用 含多种 丝裂原 的培养 基进行 悬浮, 在丝裂 原作用 下生长 。全过 程必须 无菌。 (1) 无菌条 件下取 10mL 全血, 放入盛 有肝素 (0.2mL/10mL 全血) 的无 菌试管 中, 混匀。 (2) 加入 lmL 6% 的低分 子右旋 糖酐于 15mL 的离心 管中, 在室温 下放置 20 〜 30min, 使 红细胞 沉淀。 用 低分子 右旋糖 酐将白 细胞与 红细胞 分层时 ,时 间不宜 过长。 (3) 仔细 收集红 细胞上 面分层 的富含 白细胞 的血浆 ,于 30〇xg 离心 8min。 (4) 弃上清 ,并小 心地用 lmL PBS 悬浮沉 淀的白 细胞。 (5) 室温下 ,将 细胞悬 液细心 地加在 5mL Ficoll-Hypaque 液上 ,保持 血浆与 Ficoll 液 间良好 分层。 (6) 400Xg 低 温离心 (4X:) 30min。 (7) 小心吸 取位于 血浆和 Ficol 丨液之 间分层 的云雾 状的淋 巴细胞 ,弃去 红细胞 沉淀。 (8) 用 5mLPBS 洗涤细 胞一次 。室 温下 25〇Xg 离心 5min, 再将沉 淀的淋 巴细胞 用 3~5mL 的 培养液 悬浮。 (9) 将 所得的 细胞悬 液放入 T-25 组织培 养瓶中 ,加 入适 量的丝 裂原。 EB 病毒转 化淋巴 母细胞 : (10) 将 10mL 全血与 l〇mL RPMI1460 培养基 混合。 (11) 将上述 4mL 稀 释血液 加入到 预放有 3mL Histopaquel077 培 养基的 15mL 灭菌 离心 管中。 (12) 室温 f 30〇Xg •离心 3〇min, 弃 去顶层 血装。 . 936 . (13) 将不透 明的淋 巴细胞 悬浮液 (约 lOmL) 倒入 50mL 灭 菌离心 管中。 ( 14) 用 20mL RPMI 1640 培养 基洗涤 2 次 ,然后 300 x g 室温 下离心 lOmin。 (15) 用 lmL 含 EB 病毒 的上清 液将所 获取的 淋巴细 胞悬浮 ,放入 25cm2 组 织培养 瓶中 ,并 将瓶垂 直放在 5%0)2培 养箱于 37T 培养 l~3h。 (16) 经 培养后 ,加入 3mL 含 0.2^g/mL 环 孢霉素 A 的 RPMI 1640 培养基 ,并将 培养 瓶平放 ,以 使细胞 流过正 常的生 长面。 每隔 几天就 要观察 一次培 养情况 ,如 有聚集 型生长 ,则 表明已 获得了 永生性 细胞。 (17) 每隔 一周加 入含环 孢霉素 A 的 RPMI 1640 培养基 lmL, 原 有培养 基不用 倒出。 第 十一节 鼠胚干 细胞的 体外培 养与体 外分化 鼠胚 干细胞 (mouse embryonic stem cell, MESC) 是由 鼠受精 卵着床 前的胚 芽团块 制备的 ,能 在以鼠 胚成纤 维细胞 (mouse embryonic fibroblast cell, MEFC) 作为 词养细 胞 (feeder cell) 的 条件下 ,表现 出一种 未分化 、多 潜能的 干细胞 特性。 在去除 MEFC 后, MESC 可在 其培养 上清中 形成细 胞团。 MESC 团进 一步分 化时形 成胚体 ,尽 管其组 织结 构紊乱 ,但 和正常 胚胎分 化过程 一样, 能形成 包括心 肌细胞 、神经 元细胞 、红细 胞、 黑色素 细胞以 及其他 类型的 细胞。 MESC 的培养 为研究 人员提 供了一 个体外 培养分 化多种 细胞系 的实验 模型。 MESC 分化 培养是 一个发 育迅速 、可 稳定转 染的细 胞系统 。由 于细胞 类型和 细胞数 量的动 态变化 ,可 导致 不同的 黏附异 质性; 此外 ,单个 MESC 系 统分化 传代计 数亦相 当困难 ,建 立分化 MESC 的黏 附培养 以利于 用显微 镜追踪 其细胞 系的发 展是其 研究进 展之一 。在此 ,将对 非分化 MESC 的 体外黏 附培养 和基因 转化做 一具体 介绍。 组织 培养液 的用水 应是用 过滤法 (0.22fxm) 灭菌 的高质 量的细 胞培养 级用水 。可 以购置 直接使 用的 或需要 配制的 培养基 。玻 璃器皿 需要特 别清洗 液洗涤 ,冲 洗干净 ,最 后用细 胞培养 级的水 冲洗。 保护 MESC 生长的 FCS 可从 GIBCO/BRL 购买 。所 有的培 养均在 5%C〇z 的 环境下 进行。 一 、鼠胚 基成纤 维细胞 的制备 和保存 鼠胚 基成纤 维细胞 (MEFC) 作为词 养细胞 ,以 保持 MESC 多能 干细胞 的特性 。这 种 MEFC 对 MESC 分 化的抑 制作用 可能与 MEFC 分 泌的白 血病抑 制因子 (leukemia in- hibitory factor, LIF) 有关。 MEFC 常从 胚胎细 胞中一 次分离 ,大 批量培 养后, 进行分 装 、冻存 ,在 日后 需要时 融化后 培养。 MEFC 可由任 一株系 鼠制备 ,每 次用 1~2 只孕 鼠 ,约可 获得约 10 个 胚胎。 1. 材料 14— 16d 孕 龄大鼠 无钙 、镁 离子的 PBS 胰蛋白 酶溶液 (用 0.53 mmol/L EDTA 配制成 〇.〇5%胰蛋白酶溶液) • 937 • DNA 酶溶液 (含 50% 甘油的 0.3 mol/L NaCl 将粗制 DNA 酶 配制成 lOmg/mL 浓 度, -20X: 贮存) MEFC 生长 培养基 (DMEM 高葡 萄糖, 10% FCS) MEFC 的 冻存液 (培养 基中含 10%DMS(), 新鲜 配制) 灭菌手 术器械 (镊子 、剪刀 、刀 片等) 1mm 直径的 网筛, 不锈钢 收集盘 125mL 灭 菌胰蛋 白酶消 化用烧 瓶并带 搅拌棒 直径 150mm 和 100mm 组织 培养盘 配有 摇床的 培养箱 2mL 冻存管 2. 操 作步骤 (1) 于妊娠 14~16d 时处 死孕鼠 ,取 出子宫 中胚胎 ,置 于装有 PBS 的 100mm 组织 培 养皿中 ,冲 洗胚胎 以清除 血液。 (2) 用 灭菌镊 子将胚 胎断头 ,取出 内脏。 (3) 将 胚胎体 放到预 先留有 40mLPBS 的 锥形离 心管中 ,翻转 2 次以洗 涤胚胎 。倒 出 PBS 后再 另加入 40mL PBS, 重 复洗涤 ,最后 只倒出 10mL PBS, 将另 30mL PBS 连 同鼠胚 体倒入 100mm 培养 皿中。 (4) 将胚 体用刀 片切碎 ,用镊 子在灭 菌的筛 子上挤 压过筛 ,再用 15mL 胰蛋 白酶清 洗筛子 2 次 ,将胚 胎混合 物转到 125mL 三角瓶 中进行 胰蛋白 酶消化 ,加入 40mL 粗制 DNA 酶以防 溶液因 DNA 外泄而 黏稠。 (5) 37X: 带 摇床的 5% C02 培养箱 中培养 30min。 (6) 将 细胞上 清倒入 预装有 10mL MEFC 生长培 养基的 50mL 离 心管中 ,离 心收集 细胞。 (7) 重复用 50mL MEFC 生 长培养 基悬浮 、离 心洗涤 2 次。 (8) 再用 15mL MEFC 生长 培养基 悬浮细 胞沉淀 ,用红 细胞计 数器对 活细胞 计数。 —般每 个胚胎 可获取 (5X107) 〜 (1X108) 个 细胞。 (9) 接种 6 x 1〇6 个细胞 到装有 25mL MEFC 生长培 养基的 150mm 直 径培养 皿中。 (10) 24h 后 更换培 养液。 (11) 经 2 〜 4d 培养 ,细胞 能长满 培养皿 ,此 时应 准备按 1:5 比率进 行传代 ,冻 存。 二 、鼠胚 干细胞 的培养 鼠胚 干细胞 MESC 可在相 当长时 间内保 持未分 化状态 ,它们 在词养 层细胞 存在的 条件下 可进行 高密度 的培养 ,也 可在 MESC 培养 基中加 入重组 LIF 蛋白 以保持 其多能 干 细胞的 特性。 MESC 常用 60mm 直 径的有 MEF 词养 细胞的 培养板 上生长 ,每 2 〜 3d 传代 1 次。 以下是 我们推 荐的以 一周为 周期的 MESC 培养时 间表。 MESC: • 938 • 第 1 天 (周一 ) 按 2 X 1〇6 个细胞 /60mm 培 养板传 代接种 第 3 天 (周三 ) 按 2X106 个细胞 /60mm 培 养板传 代接种 第 5 天 (周五 ) 按 2 X 1〇6 个细胞 /60mm 培 养板传 代接种 每 天更新 培养液 MEFC 词料细 胞制备 : 第 1 天 (周一 ) 融 化冻存 的原代 MEFC 第 4 天 (周四 ) 用 丝裂霉 素处理 和制备 MEFC 饲 养细胞 培养板 1. 材料 MESC-D3 细胞系 60mm MEFC 词养 细胞板 ( 制备时 间应在 7d 内) 灭菌 的吸管 无钙 、镁 离子的 PBS MESC 生长 培养基 ( 高浓度 葡萄糖 DMEM, 15% FCS, O.lmmol/Lp- 巯基 乙醇, 1000U/mL 重组 LIF) 胰蛋白 酶溶液 (用 0 . 53 mmol/L EDTA 配制成 0 • 05 % 胰蛋白 酶溶液 ) P- 巯 基乙醇 (70mL 巯 基乙醇 加入到 100mL 组织培 养液中 ,制成 100X 的贮 备液, 过 滤法除 菌后置 4X: 贮存 ,每 2 周配 制一次 ,以保 持新鲜 ) 2. 操 作步骤 (1) 用 PBS 洗涤 MESC, 用 吸管加 入胰蛋 白酶以 覆盖培 养皿底 (60mm 培 养皿加 2mL)〇 (2) 371C 消化 5min 使细 胞从培 养皿上 脱落。 (3) 用吸管 吹打分 散经胰 蛋白酶 消化的 MESC, 将 分散的 MESC 转入 到一个 15mL 锥形离 心管中 ,离 心管中 预装有 预温的 (371C) MESC 培 养基。 (4) 离 心收集 MESC, 吸 弃上清 ,但 保留约 2 倍于沉 淀体积 的上清 ,弹 动离 心管, 使沉 淀悬浮 ,加入 10mL MESC 培养基 并用吸 管吹打 以混匀 细胞。 (5) 计数 细胞, MESC 体积小 ,且呈 圆形, 易于与 MEFC 区别。 一 般每个 60mm 培养皿 MESC 数是 (lxi〇7)~(2xi〇7) 个。 (6) 将 MESC 接 种到有 MEFC 词养层 细胞的 60mm 培 养皿中 ,吸弃 MEFC 培养 液, 再加入 5mL MESC 生长培 养基。 一般情 况下, MESC 按 2X106 个 /60mm 培 养皿接 种, 2d 后传代 。为了 方便, 可于周 末时按 IX 1〇6 密度 接种。 (7) 每 天更换 MESC 培养基 ,用 显微镜 观察细 胞生长 情况。 3. 方 法评注 (1) 因 MESC 系不一 而培养 条件有 所不同 ,本 方法是 MESC-D3 细 胞系的 培养方 法 。有些 MESC 系可用 STO 细胞 作为词 养细胞 ,甚 至可直 接在用 明胶包 被的板 上进行 培养 而不需 MEFC。 (2) MEFC 产生 LIF, 故可使 其保持 未分化 状态。 LIF 也可 从带有 L/F 基因 的转基 • 939 • 因 细胞系 的条件 培养基 中获得 。此外 ,有 些研 究人员 亦在他 们的培 养基中 加重组 LIF 蛋 白达到 目的。 (3) 确定 MESC 的传代 数至关 重要, 适用于 配子系 (germ-line) 嵌合体 形成的 MESC 系不 适于体 外分化 。有 研究证 实体外 分化在 CMESC 极 为广泛 ,而 在配子 系嵌合 体 形成中 效果不 理想。 (4) 低传 代数的 MESC 应 冻存于 液氮中 ,冻存 时一般 lmL 含 5X106 个细胞 ,用含 有 10% DMSO 的 培养基 冻存。 MESC 复 苏并接 种到有 MEFC 词养层 细胞的 60mm 培养 皿中 ,以进 行培养 传代。 三 、鼠 胚干细 胞的分 化培养 在没有 MEFC 词养 细胞和 LIF 时, MESC 可以出 现分化 ,悬 滴培养 提供了 规格一 致的细 胞集聚 的体积 ,然 后在 培养上 清中继 续生长 ,胚 体更进 一步地 分化。 一种 方便实 用的用 于体外 分化培 养的一 周日程 安排表 如下: 第 1 天 (周三 ) 悬滴 第 3 天 (周五 ) 带盖培 养皿分 化培养 (胚体 聚集) 第 6 天 (周一 ) 胚体标 本接种 保 养:前 2 周每 周更换 2 次 培养基 ,以 后按需 要每周 3 次 或更多 次更换 培养基 (当 培 养基变 黄时就 要更换 )。 1. 材料 未分化 MESC 无钙 、镁 离子的 PBS MESC 分化 培养基 ( 高浓度 葡萄糖 DMEM, 20% FCS, 0.1mmol/L(3- 巯基 乙醇, 1000U/mL 重组 LIF) 8 通道吸 液器和 灭菌的 多通道 吸管盒 无菌培 养器皿 6 孔组织 培养板 吸 管和灭 菌镊子 明胶 包被的 盖玻片 2. 操 作步骤 悬滴 培养: (1) 收集未 分化的 MESC (如 前所述 )。 (2) 将 lOmLPBS 加入 100mm 培养 皿中, 放好。 (3) 在 灭菌盘 (皿) 中将 5 X 1〇4 个未 分化的 MESC 与 5mL MESC 分化 培养基 混匀。 (4) 用多 通道的 吸液器 ,在培 养皿加 盖的里 面制成 3 排悬滴 ,每滴 30/uL 约 300 个 细胞。 • 940 • (5) 揭开盖 ,小心 反转, 将其放 在盘顶 ,盘 中含有 lOmL PBS。 (6) 小心地 将培养 皿培养 2d。 悬液中 聚集细 胞叫简 单胚体 ,但用 此法聚 集形成 的胚体 大小差 异很大 ,而 且分化 也很不 一致。 带 盖培养 皿的细 胞聚集 (7) 将 lOmL 预 温的分 化培养 基倒入 100mm 的培养 皿中。 (8) 从培养 箱中取 出培养 2d 的悬滴 ,小 心反 转盖子 ,用 吸管小 心收集 悬滴。 (9) 将 MESC 的 聚集体 (简单 胚体) 转入带 盖培养 皿中。 (1〇) 将 简单胚 体培养 3d。 尽管 带盖培 养皿延 长简单 胚体在 上清中 的潴留 ,但 时间长 后培养 板上仍 有细胞 贴附。 贴壁接 种胚体 : (11) 制备 明胶包 被的盖 玻片。 ① 选 3 只 100mm 培养皿 ,分别 装入组 织培养 级水、 100% 乙醇或 0.1% 明胶。 ② 用灭 菌镊将 玻片一 片一片 地依次 放入乙 醇盘中 ,再 转到 盛水培 养皿中 ,最 后在明 胶 培养皿 中放置 lOmin。 ③ 将盖玻 片置于 6 孔培养 板上空 气晾干 ,将 盖玻片 在每孔 上盖好 ,再加 盖培养 板盖。 晾干 的盖玻 片可在 40X: 贮存 2 个月。 (12) 将培养 板和包 被的玻 片置紫 外线消 毒橱中 ,消毒 5min, 以去 除可能 的细菌 污染。 (13) 用 吸管从 MESC 上 清中将 一个简 单胚体 移送到 盖玻片 中间。 也可直 接将胚 体接种 到明胶 包被的 组织培 养孔里 ,将其 接种到 盖玻片 上有利 于用免 疫组化 染色或 其他 检査。 (14) 孵育 4 〜 5h 以使 简单 胚体附 着到明 胶表面 ,注意 勿让培 养液滴 干涸。 胚体 在最初 贴附到 孔中央 ,这 有助于 借助显 微镜观 察细胞 分化因 为胚体 在孔边 时很难 观察。 (15) 贴附后 ,慢 慢加入 2mL 分化 培养基 ( 预热到 37X:) 到孔中 ,注 意避 免将细 胞从盖 片表面 弄掉。 . (16) 培养基 在变黄 后应及 时更换 ,至 少每 周更换 一次。 (17) 在第 7 天可 见到心 肌细胞 的自发 性收缩 运动。 分化 能力随 传代数 的增加 而减弱 ,因 此一定 要监测 MESC 传代数 ,以 便确定 其体外 分化的 能力。 在分 化能力 下降时 ,应 用最初 几代的 MESC 来 替代。 四 、未分 化的鼠 胚干细 胞的基 因转导 未 分化的 MESC 可 用于外 源性基 因的表 达分析 。表 .达重 组子与 选择重 组子按 10:1 比例同 时进行 电穿孔 ,线状 DNA 分子可 被导入 细胞内 。通 过多通 道微量 吸液器 ,可使 多种 克隆在 96 孔板 中扩增 ,耐 药性克 隆可在 96 孔培养 板中用 新霉素 抗性进 行分离 。在 体外 分化后 ,经 检定如 有转基 因的稳 定表达 ,可用 96 孔板形 式直接 冻存。 1. 材料 用于 转基因 的线性 DNA (lmg/mL 于灭菌 TE 缓冲 液中) . 941 . 未 分化的 MESC 细胞 100mm 新 霉素抗 性的词 养细胞 培养板 ( 新霉素 耐药的 MEFC 可用带 有新霉 素表达 质粒的 转基因 鼠制备 ) MESC 生长 培养基 ( 高浓度 葡萄糖 DMEM, 15% FCS, 0.1mm〇l/L(3- 巯基 乙醇, 1000U/mL 重组 LIF) 含 300ptg/mL G418 的 MESC 生长 培养基 含 30(Vg/mL G418 和 青霉素 / 链 霉素的 MESC 生长 培养基 胰蛋白 酶溶液 (53mmol/LEDTA 含 0.05% 胰蛋 白酶) (FCS+20% DMSO) 无钙 、镁 离子的 PBS Bio-Rad 公 司的电 穿孔仪 和电穿 孔玻管 96 孔平底 含新霉 素抗性 MEFC 的 培养板 96 孔 U 底培 养板 平底 96 孔板 24 孔 含词养 细胞的 培养板 灭 菌吸头 (细 、尖 、圆形 ) 可 调微量 加样器 (10~100/iL) 灭菌 8 通 道微量 加样器 2. 操 作步骤 MESC 的电 击穿孔 (详 见第十 章电穿 孔技术 ): (1) 收集未 分化的 MESC, 并用 MESC 生 长培养 基悬浮 ,其 密度约 1X107 个 /mL。 (2) 将无菌 DNA 吸 入电穿 孔杯中 ,加入 0.8mLMESC, 并 轻轻用 吸管吹 打以混 匀 ,不 要产生 气泡。 (3) 室温下 ,以 25(VF0.3kV 的 条件对 DNA/ 细胞 混合液 进行电 穿孔。 不同的 电穿孔 仪基因 转化效 率不一 ,如 使用其 他品牌 的电穿 孔仪, 则要重 新设定 适宜的 条件。 (4) 用 MESC 生长培 养基按 10:1 比 例稀释 MESC, 并以 IX 1〇6 个细胞 /100mm 词 养 板浓度 接种于 新霉素 抗性的 词养层 细胞培 养板中 ,在 37X: 的 5% 032培 养箱中 培养。 (5) 48h 后 ,用含 300Mg/mLG418 的培 养基更 换原培 养基。 G418 的 浓度取 决于新 霉素抗 性基因 和是否 使用新 霉素抗 性饲养 细胞。 G418 浓 度可在 50 〜 400纯/ mL 间 ,适 宜的浓 度可用 有效杀 死选择 细胞的 试验来 决定。 (6) 以后隔 日用含 G418 的培 养基进 行更换 ,在 应用选 择培养 基后约 一周即 可见到 耐 药克隆 出现。 挑拣 MESC 克隆至 96 孔培 养板: 克隆细 胞的挑 拣常用 加聚丙 烯酰胺 凝胶小 圆形吸 头来进 行操作 。这种 吸头长 ,其孔 径可以 加工变 小, 使其孔 径适宜 于挑拣 克隆。 (7) 加入 150pL 含 G418、 青霉素 、链 霉素的 MESC 培养 基到有 词养层 细胞的 96 孔平底 板中, 放在培 养箱中 备用。 (8) 在 U 形孔 96 孔培养 板中用 多通道 微量加 样器每 孔加入 25mL 胰蛋 白酶。 • 942 • (9) 用 PBS 冲 洗含有 MESC 克隆的 100mm 培养板 2 次 ,加入 PBS 仅盖住 板底。 (10) 倒 置显微 镜下用 超细吸 头的吸 液器挑 拣克隆 细胞。 挑 拣时吸 送液量 要小于 10~20ML, 不要将 MESC 外的 MEFC 吸入。 (11) 将挑 取的克 隆细胞 放入装 有胰蛋 白酶的 96 孔 板中。 在挑 拣其他 克隆时 ,可将 板置于 室温下 ,但胰 酶作用 时间不 要超过 30min。 (12) 取出 含新霉 素抗性 词养细 胞的培 养板, 用多通 道吸液 器吹打 4 次以使 之解除 聚集 ,再将 MESC 转入 96 孔 带词养 细胞的 培养板 中过夜 培养。 不需 去除胰 蛋白酶 ,克 隆将解 体为单 个细胞 和小块 细胞团 。如 果克隆 胰蛋白 酶消化 不好, 培养细 胞可 重新消 化数日 ,重 新接种 于相同 的表面 以进行 增殖。 (13) 次 日用含 G418 和 青霉素 / 链 霉素的 MESC 培养基 更换原 培养基 ,继续 培养。 (14) 每 天更新 培养基 ,在 大约第 5 天 可用于 传代。 分散 % 孔培 养板以 备冻存 和进行 体外分 化实验 在准 备进行 传代前 ,取 96 孔板 中一半 细胞于 -80X: 冻存 ,另一 半用于 分化培 养研究 ,常 用悬滴 法。 在找到 了在分 化过程 中希望 的表达 类型的 转基因 克隆后 ,取出 冻存的 克隆细 胞进行 扩增以 进行更 进一步 研究。 (15) 每孔用 200/iL PBS 冲洗 96 孔 MESC 培 养板。 (16) 每 孔加入 40pL 胰 蛋白酶 37C 消化 5min, 在显 微镜下 检查细 胞的胶 型分离 情况。 如果分 离不全 ,再 消化 5min。 (17) 在 胰酶消 化期间 ,准备 2X 冻存液 (FCS+20%DMSO)。 (18) 每 孔加入 60fiL 培养 基至胰 酶消化 细胞, 用吸管 吹打分 散小细 胞团。 (19) 将 50/ixL 胰 蛋白酶 消化的 MESC 加至 等体积 冻存液 ,用 吸管吹 打一次 ,再转 入 -80X: 冻存, 直到找 到表达 转基因 的克隆 细胞。 冻存 混合液 浓度是 20%DMSO, 终 浓度为 10%DMSO。 由于 DMSO 是 有毒的 ,因此 在室温 下细胞 与 DMSO 混存时 间不宜 太长。 (20) 用 MESC 分化 培养基 对剩余 MESC 以 1 :200~ 1 : 1000 进 行稀释 ,悬滴 培养。 G418 选 择是间 断的。 (21) 鉴 定具有 表达转 基因的 克隆。 96 孔板的 融化: 在一 个板上 的克隆 必须同 时融化 ,单 培养板 融化后 ,一般 不能再 次冻存 。每 一克隆 均需每 天进行 观察 ,以 决定传 代的时 间及怎 样分离 。一 般说来 ,按 1:5 比 例分离 。在计 算分散 比例时 必须考 虑孔中 被 MESC 覆盖的 比例, 因为细 胞融化 后常有 不完全 生长。 (22) 在培养 箱中用 塑料盆 将灭菌 水加热 ,水 深度约 0.8cm, 这样 96 孔板放 入后不 至于 漂起。 (23) 从 -80X: 冰 箱中取 出冻存 MESC 的 96 孔板。 (24) 每 孔加入 lOO^L 预热 (371C) MESC 生长培 养基, 将盖子 更换。 (25) 将 培养板 放至培 养箱中 的盆中 ,大约 2mm 以促进 融化。 (26) 将融 化细胞 加到用 2mL MESC 培养液 灌满的 24 孔 MEFC 词养 细胞的 培养板 中。 (27) 培养 3 〜 5h 让 MESC 贴壁, 更新培 养液。 • 943 • (28) 在第 3 天可 以见到 MESC 克隆。 (29) 每 l~2d 更换 1 次 MESC 培养基 ,生 长至 足够密 度后按 1:5 比 例分散 传代。 第 十二节 原代神 经细胞 的分离 和培养 外 周和中 枢神经 细胞的 体外培 养成功 ,使 得神经 科学工 作者又 获得了 一种有 效的科 研方法 ,神经 细胞的 原代培 养技术 现已成 为神经 生物学 研究的 一个基 础技术 和工具 。在 过去几 十年中 ,神 经细胞 原代培 养技术 广泛地 应用于 观察神 经元形 态发生 、突触 发生和 轴突 形成, 相关蛋 白分离 、鉴定 等领域 。尽管 神经元 可在移 植物中 生长, 但分离 培养具 有更多 的优点 :获得 同源的 大量神 经元; 在密度 适宜的 条件下 ,可 观察到 单个神 经元的 全貌; 在 中枢神 经系统 不同部 位分离 获得的 神经元 ,在 培养时 可建立 其极性 ,轴 突和树 突再 现形态 和功能 特征。 这些培 养的最 大不足 之处就 是难以 获得足 量的物 质进行 生化和 分子 生物学 分析。 无论培 养的神 经元类 型如何 ,神 经元细 胞培养 技术均 由以下 3 个主 要步骤 构成: ①切碎 选定的 组织; ② 分散组 织以获 得含单 个神经 元的细 胞上清 ,常 用酶消 化法获 得; ③将 分离得 到的神 经元接 种到预 处理过 的培养 物上。 本节介 绍获取 两种神 经元细 胞的方 法:海 马锥体 神经兀 (hippocampal pyramidal neuron) 和 鸡胚脊 根兴奋 中心神 经元。 一 、海 马锥体 神经元 的分离 和培养 海马 锥体神 经元从 鼠胚脑 中获取 ,接 种至单 层胶质 细胞培 养物上 ,由 神经胶 质细胞 提供营 养因子 以保障 神经元 的存活 和分化 。应 用此法 或略做 改进, 已被几 个实验 室成功 地应 用于其 他部位 脑组织 神经元 的培养 ,如 小脑、 下丘脑 和大脑 皮层。 1. 材料 18d 孕龄鼠 无钙 、镁 离子的 PBS 0.25% 胰 蛋白酶 (新制 ) 多聚 赖氨酸 平板 培养基 接种 培养基 (MEM86mL, 马血清 10mL, 20% 葡萄糖 3mL, 10 000U/10mg/mL 青霉素 / 链霉素 lmL) 保持 培养液 (MEM79mL, 1% 卵 清蛋白 10mL, N2 补充液 10mL, 100mmol/L 丙 酮酸 lmL) 灭菌的 Paraplast lmg/mL 聚赖氨 酸溶液 /0. lm〇l/L PH8.5 硼酸 缓冲液 (过滤 灭菌) 无菌手 术器械 解剖 显微镜 • 944 • 带盖 培养皿 2. 试 剂配制 N2 补充液 : 胰岛素 贮备液 (50mg/10mL, 0.01 mol/LHCl 配制) lmL 黄体酮 备液 (63mg/100mL, 无水乙 醇配制 ) lmL 腐胺! C 备液 (161mg/10mL) lmL Se〇2 贮备液 (330/igA00mL) lmL 转 铁蛋白 100mg MEM 96mL 过滤 法灭菌 ,贮备 液可在 -20X: 贮存 6 个月。 3. 操 作步骤 盖玻片 的处理 : (1) 将 盖玻片 置于搪 瓷染色 架中用 蒸馏水 冲洗。 很多情 况下, 最好用 12mm 直径的 圆形盖 玻片。 (2) 将 支架放 于盛有 浓硝酸 的玻璃 容器中 48h。 (3) 用超纯 水冲洗 盖玻片 lh, 重 复至少 3 次。 (4) 干热法 (200X:) 灭菌 8h。 (5) 在超 净台上 用融化 的灭菌 Paraplast 滴 2 滴至盖 玻片上 ,再将 其放入 60mm 带 盖培养 皿中。 所滴的 Paraplast 的 量决定 了盖玻 片与单 层胶质 细胞的 距离。 (6) 加入 5mL 过滤法 灭菌的 lmg/mL 聚赖氨 酸溶液 / 0.1mol/LpH8.5 硼酸 缓冲液 室温下 过夜。 (7) 用灭菌 水冲洗 lh, 重复 3 次 以上。 (8) 加 50mL 平板 培养基 (含 10% 马 血清的 MEM) 在 37X: 5% C02 条件 下培养 24h 以上。 为 进行生 化研究 ,可用 2mL 的聚赖 氨酸溶 液覆盖 60mm 组 织培养 皿进行 处理。 单层胶 质细胞 的制备 : (1) 处死 1 〜 3d 的幼 鼠。 (2) 在 超净工 作台中 ,取出 脑组织 ,置 于有 PBS 的培养 皿中。 (3) 在解 剖显微 镜下, 将脑半 球切开 ,剔 除脑膜 ,将脑 组织切 成小片 ,放 在盛有 25mL 0.25% 胰蛋 白酶的 锥形组 织培养 瓶中。 (4) 在 37X: 水浴 中孵育 30min。 (5) 用 25mL PBS 替换 胰蛋白 酶溶液 ,并用 吸管吹 打分散 细胞。 (6) 离 心法收 集细胞 (lOOOr/min 离心 lOmin), 并 用培养 液悬浮 沉淀的 细胞。 (7) 用红 细胞计 数器确 定细胞 的浓度 ,将细 胞悬液 稀释至 200 000 细胞 /mL, 再取 4mL 悬液 接种于 60mm 组 织培养 皿中。 (8) 24h 后 ,完 全去除 培养基 ,加入 5mL 新鲜培 养基。 • 945 • (9) 每周 更新胶 质细胞 培养液 1 次, 当培养 胶质细 胞达到 70% 结合后 ,即 可用于 神经元 培养。 (10) 在 制备培 养用神 经元前 1 天 ,将准 备做培 养的单 层胶质 细胞培 养板上 的培养 基去除 ,加入 6mL 保存培 养基并 放入培 养箱中 备用。 分散的 单个神 经元的 制备: (1) 处死 18d 孕龄鼠 (常 用过量 CCb 法 ), 用无菌 器械取 出胚胎 ,置 于无菌 的带盖 培养 皿中。 取用 鼠的孕 龄取决 于所需 培养的 脑细胞 所在部 位:海 马锥细 胞培养 选妊娠 18d 鼠; 下丘脑 和脑皮 质 选妊娠 17d (15d) 鼠, 小脑巨 神经元 选妊娠 15d (14d) 鼠。 (2) 将 鼠胚断 头并将 头置于 4mL 无钙 、镁 离子的 PBS 中。 (3) 从颅内 取出大 脑组织 ,置于 35mm 带盖 培养皿 中滴状 PBS 上。 (4) 在解 剖显微 镜下去 除脑膜 ,取出 海马回 并切碎 ,在含 PBS 的 培养皿 中收集 组织。 (5) 用新 配制的 0.25% 胰 蛋白酶 371C 消化 15min。 (6) 细 心弃除 胰蛋白 酶溶液 ,加入 5mLPBS, 在 超净台 中静置 5min。 (7) 重复以 上过程 2~3 次 ,最 后加入 2mLPBS, 用吸管 吹打, 分散神 经元。 (8) 计 数细胞 密度。 (9) 将希 望的细 胞接种 于多聚 赖氨酸 处理的 平板中 ,如 做生化 试验, 则直接 接种于 聚赖氨 酸处理 的培养 皿中。 (10) 2~4h 后, 将盖玻 片转至 含保持 培养液 的单层 胶质细 胞培养 皿中。 (11) 每 周更换 3mL 培 养液。 神经元 培养成 功的两 个关键 是处理 盖玻片 和制备 用于神 经元培 养的单 层胶质 细胞。 4. 方 法评注 神 经突生 长不良 和分化 不好常 提示培 养中存 在问题 ,应 予纠正 。总的 说来, 主要有 3 种 因素影 响神经 培养。 胶质细 胞培养 物:胶 质细胞 培养物 常是导 致神经 元细胞 培养失 败的主 要原因 ,单层 胶质 细胞汇 合时密 度过高 (100%) 或过低 (40%) 均 不利于 神经元 的生长 。此外 ,在 有些 情况下 ,马 血清质 量不好 ,单 层胶质 细胞中 混有大 量成纤 维细胞 ,亦 是导致 神经元 生 长不良 的因素 之一。 培养 基:培 养基常 是神经 元生长 ,特别 是树突 生长不 良的主 要原因 ,因 此严 格按无 菌 要求制 备培养 基至关 重要。 分离时 间:过 长的分 离时间 ,使 神经元 活性严 重受损 ,从而 影响神 经元的 生长。 二 、鸡胚 脊根神 经细胞 的分离 和培养 鸡胚脊 根神经 (DRG) 细胞的 培养是 一种广 泛应用 的神经 元培养 技术。 DRG 起源 于神 经顶根 ,并 由多能 前体细 胞分化 、运动 而来, 沿成纤 维细胞 和神经 膜细胞 生长。 DRG 分为两 大类: 一类对 神经生 长因子 敏感; 另一 类对脑 源性生 长因子 敏感。 本方法 主要针 对前一 类细胞 。由 于从 DRG 中 分离的 神经元 细胞易 于保存 ,体 积适中 (10 〜 • 946 • 35/im), 适宜 于低密 度培养 ,因 此广泛 应用在 突起形 态发生 、黏附 分子、 细胞器 转运、 神经 分化髓 鞘形成 以及细 胞骨架 研究。 鸡胚用 做神经 细胞研 究有以 下好处 : 受精卵 胚获得 时无需 处死母 体动物 、便宜 、易 于获得 、比 动物的 喂养更 省事, 只需适 宜的温 度和湿 度即可 获得; 此外, 鸡胚发 育时间 可准 确确定 ,分离 获取神 经元快 ,常在 2h 内获得 。受精 鸡卵在 37X: 和适 宜湿度 中培养 至所需 的时间 ,取 出鸡 胚进行 DRG 分离 ,神 经节经 木瓜蛋 白酶胶 原酶消 化膜囊 ,分离 细胞, 再在含 NGF 的 完全培 养基中 培养。 1. 材料 无钙 、镁 离子的 PBS 培养基 (500mL 50:50 DMEM/F12 ,并 加入 FBS 50mL, 200 mmol/L L- 谷氨酸 5mL, 100 mmol/L 丙 酮酸钠 5mL, 需要时 可加入 10ng/mL NGF-p) 酶溶液 (无钙 、镁 PBS6.8mL, 10mg/mL 木瓜 蛋白酶 0.8mL, 5mg/mL 胶原酶 0.4mL, 0.5mg/mL 半 腕氨酸 l.OmL) 一 ■次 性带盖 培养皿 (35mm 和 100mm) 和 一次性 15mL 离心管 圆形盖 玻片, 并按要 求灭菌 分 离工具 (弯 头慑子 、钝 头剪刀 、小剪 刀等) 灭 菌吸管 解剖 显微镜 2. 操 作步骤 (1) 在 即将开 始分离 细胞前 ,用 15mL 灭菌 离心管 配制酶 溶液, 371C 水浴中 存放至 用时。 (2) 将鸡 胚处死 ,去掉 鸡胚腿 ,并 将鸡 胚置于 100mm 培养 皿中。 (3) 用 钝头剪 沿腹中 线剪开 ,分 开去掉 内脏。 (4) 用 PBS 冲洗鸡 胚腹腔 ,仔细 用小镊 子或用 PBS 冲去 脊索上 的黏附 组织。 (5) 在 解剖显 微镜下 ,剔 除脊膜 ,除去 DRG 上 两边的 交感神 经节。 (6) 用镊 子将神 经节从 神经干 上切开 ,置 于一个 35mm 盛有 lmLPBS 的带 盖培养 皿中 。在 分离到 足够的 DRG 后 ( 最好在 45min 内完成 ), 再次检 查其上 有无黏 附组织 或 神经节 ,如 有应予 清除。 分离 鸡胚时 注意全 过程必 须保持 鸡胚的 湿润。 (7) 将 DRG 连同 PBS 倒 入预热 的酶溶 液中, 37t: 水浴 8 〜 13min (8d 龄鸡胚 12min; 13d 龄鸡胚 18min) , 且每 3min 倒转 一 ■次离 心管。 胚 龄越小 ,神经 节包膜 发育越 不完整 ,因 此所 用时间 越短。 (8) 加入 lmLFBS 终止 酶消化 反应, 800r/min 离心 5min, 用 PBS 轻 轻洗涤 ,再次 离心。 (9) 用加有 NGF (37C) 的完全 培养基 lmL 悬浮 DRG, 用只 有巴斯 德吸管 一半孔 径 (可 用火烧 后自己 制作) 的 吸管将 DRG 捣碎, 如仍有 组织块 ,则将 上清倒 入另一 15mL 离心管 中后再 重复上 次过程 ,最后 放入一 支离心 管中。 • 947 • (10) 对细 胞计数 ,然后 按所需 密度进 行接种 培养。 3. 方 法评注 — 般而言 ,一个 10d 龄 鸡胚的 DRG 中有 7000 神 经元和 35 000 个其 他细胞 ,最好 是在培 养皿中 加入带 NGF 的培 养基前 ,将 细胞沉 积到盖 玻片上 (约 5min), 完全的 贴附过 程需要 4h。 如果 接种密 度适宜 ,且每 4d 更换 一次 培养基 ,该细 胞培养 可持续 3 〜 4 周。 第 十三节 鸡胚肌 母细胞 的分离 和培养 鸡胚肌 源性细 胞原代 培养产 生大量 的具有 自主收 缩性的 、带条 纹的多 细胞核 的肌小 管, 这些肌 纤维的 结构及 其组成 成分均 与肌细 胞无异 。这一 培养方 法简单 易行, 并可持 续培 养数月 。经超 微结构 和生化 分析, 除了生 长在基 质凝胶 (matrigel) 胶 原上的 C2C12 细胞 系外, 如此成 熟的体 外培养 的肌细 胞在其 他非永 生性细 胞系中 均不能 见到。 此外 ,在原 代培养 中不需 阻断增 殖和诱 导分化 ,只需 通过丝 裂原丰 富和丝 裂原贫 乏的培 养 基之间 互相转 换即可 阻断其 增殖或 诱导其 分化。 常用 10 〜 lid 胚龄的 鸡胚胸 肌细胞 来进行 培养。 在体内 ,这些 肌肉有 诸多优 点:由 长 细的多 核肌管 构成; 有丝 分裂后 的单核 肌母细 胞虽未 融合, 但已开 始产生 结蛋白 (demesin) 及其他 肌纤维 蛋白; 在肌源 性细胞 系的不 同间隔 区存在 大量的 增殖细 胞以及 成纤维 细胞、 神经膜 细胞等 。因此 ,这 一组织 是进行 肌母细 胞培养 的理想 组织。 常用胰 蛋白 酶进行 消化以 获得单 个细胞 的上清 来进行 培养。 在开始 接种时 ,分裂 后的单 核肌母 细 胞约占 10%~15%, 分 裂中的 肌母细 胞约占 40% 〜 50%, 成纤维 细胞约 45%~ 50%, 其他 尚有神 经膜细 胞等。 在 最初的 3 天 培养中 ,大约 80% 细胞进 行一至 多次的 增殖, 结蛋白 (+ ) 和肌纤 蛋白 (+ ) 的 单个核 肌母细 胞在第 2~5 天开 始融合 ,在 3d 后 ,大约 50% 细胞 均是分 裂后的 肌母细 胞或融 合的肌 小管。 由于成 纤维细 胞和分 化的多 种细胞 (目 前尚难 以在显 微镜 下进行 区分) 的持 续增殖 ,在培 养的第 5 天或 5d 以后 ,将形 成一束 富含胶 原和细 胞外基 质的具 有三维 结构的 肌束。 成纤维 细胞和 肌母细 胞增殖 和分化 易受阿 糖胞苷 (lmg/mL) 的影响 ,在培 养的第 3~5 天中 加入阿 糖胞苷 ,将获 得相当 高比率 的肌细 胞 ,这 样可用 于生化 研究用 。由 于细胞 类型以 及肌源 性细胞 的传代 和成熟 的非同 步性, 原代肌 母细胞 培养异 核性相 当明显 。因此 ,各 种细胞 的大批 量分析 只能给 出每个 细胞的 平均值 ,不 能区分 大多数 只有少 量肌特 异性标 记的肌 母细胞 和有大 量肌特 异性标 记的少 数细胞 。在 许多 研究中 ,检 查单个 细胞的 同时, 还要进 行批量 分析。 同时需 要强调 的是, 在原代 、第 2 代 、第 3 代 甚至第 4 代 培养中 ,都 有大量 “新生 的”有 丝分裂 后的单 核肌母 细胞。 在有丝 分裂后 6~10h, 这些分 裂后的 肌母细 胞有如 下特 点:① 成为分 裂后单 核肌母 细胞; ②富 含主要 的肌纤 维蛋白 (如 MHC、 MLC1- 3、 a- 肌 动蛋白 、肌 凝蛋白 、肌钙 蛋白等 ); ③没能 开始合 成肌纤 维蛋白 的肌母 细胞极 少 融合形 成肌管 ,如果 Go 期的 肌母 细胞在 20 〜 30h 后仍没 有融合 ,它们 将组装 成小线 状 肌纤维 ,在 形态学 上很难 使它们 与幼年 鸡中的 细胞鉴 别开来 。结 蛋白存 在于所 有新生 的 分裂后 的肌母 细胞中 ,但 似乎在 Z 带形成 或长轴 新生的 肌纤维 形成中 不起特 别重要 • 948 • 的 作用。 1. 材料 70% 乙醇 无钙 、镁 离子的 HBSS 2. 5% 胰蛋白 酶溶液 ( 用无钙 、镁 离子的 HBSS 配制) 肌纤维 母细胞 培养液 (配制 见下) 解剖 显微镜 盛有 70% 乙醇的 带盖的 深的不 锈钢盘 ,以 备消毒 至少 2 个 镊子、 2 个 解剖刀 打蛋 用烧杯 100mm X 20mm 带盖 培养皿 带毛 巾垫的 带盖不 锈钢盘 容 器包括 离心管 、吸管 ( 塞有棉 花或不 塞棉花 ), 25mL 的烧瓶 lmL、 5mL、 10mL 的带包 装的血 清吸管 所 有的玻 璃器皿 必须是 新的和 限于组 织培养 用途的 。在塑 料桶中 用自来 水冲洗 并用洗 液浸泡 ,如 果是人 工清洗 ,再 用软刷 在自来 水中洗 3 遍, 用去离 子水洗 3 遍 ,然 后再晾 干备用 。塑 料制品 可购买 已灭菌 的器皿 , 胶原包 被板应 在紫外 线下消 毒至少 20min 甚至 过夜。 器 械可用 70% 乙醇浸 泡灭菌 ,但浸 泡时间 应适宜 ,过 长会腐 蚀损坏 器械。 带盖不 锈钢盘 、塑料 吸头 等也可 用高压 锅消毒 ,将高 压锅保 险打开 的“快 干法” 使消毒 用品快 速干燥 ,水、 盐溶液 以及其 他液 体在高 压消毒 后用慢 慢降压 的“慢 干法” 干燥后 备用。 2. 试剂配 制及胶 原包被 肌纤维 母细胞 培养液 的配方 (8:1:1): 含 Earle’s 盐的 MEM lOOmL 马血清 12.5mL 鸡胚 提取液 12.5mL 青霉素 / 链霉素 (1 OOOU/ mL, 10 OOOmg/mL) 1.5mL L- 谷氨酸 (200mmol/L) 1 . 5mL 抗 真菌药 Fangazone (250mg/mL) 1 . 5mL 过滤 器滤纸 (用 Dexter Hunt-free 组织 10 级) 的装配 : (1) 按过 滤器的 大小先 将滤纸 (镜 头纸) 剪成 2crnX2. 5cm 长 方形块 ,再剪 成适宜 安装 的圆形 纸片。 (2) 用乙 醚洗涤 2~3 次 ,共约 2h。 (3) 用 无水乙 醇洗涤 2 〜 3 次 ,共约 2h。 (4) 用双蒸 水洗涤 5~ 10 遍, 并浸泡 过夜。 (5) 将上 述处理 好的滤 纸干燥 ,并置 于带盖 培养皿 中或将 其密封 在培养 皿中。 (6) 在需 要时, 将滤纸 装在过 滤器中 ,装上 18 号或比 之更大 的针头 ,高压 消毒。 组织培 养器皿 的胶原 包被: • 949 . (1) 在 37X: 水浴中 15min 或在 4X: 过夜, 使胶原 融化。 (2) 将玻 璃棒在 酒精灯 下烧软 ,弯曲 ,制备 一个涂 布器。 (3) 加入 胶原, 35mm 培 养皿加 1~2 滴, 100mm 培 养皿加 3~4 滴。 (4) 用涂布 器将胶 原涂匀 ,注 意不 要留下 死角。 (5) 包被的 培养皿 可置放 在干净 的橱窗 内干燥 3~4d, 或者在 超净台 中干燥 ,置于 紫 外线灯 下过夜 ,其 平皿盖 要揭开 ,平 皿盖也 要口朝 上放置 在超净 台上, 紫外光 照射。 (6) 如果包 被培养 板置于 紫外线 光下时 间过长 (忘 了收回 ), 其颜 色变黄 后不能 使用。 贮藏 于干净 橱窗中 的培养 皿在使 用前应 将其置 放在超 净台中 ,紫 外消毒 20 〜 30min。 3. 操 作步骤 鸡胚的 收集和 分离: (1) 用 70% 乙 醇擦拭 实验台 ,装 好显微 镜及其 光源。 (2) 将纸巾 铺开, 并将培 养皿一 字排开 ,一个 用于收 集胚胎 ,其他 用于装 敲破的 鸡蛋。 (3) 将打 蛋用的 烧杯放 在易于 拿取的 地方。 (4) 打开 盛有器 械的带 盖的不 锈钢盘 ,将手 术器械 放好。 (5) 将孵育 lid 的 鸡蛋用 70% 乙 醇消毒 ,敲碎 鸡蛋, 将鸡胚 放入无 菌培养 皿中, 用镊 子将鸡 颈夹住 ,转至 另一培 养皿。 如 果鸡胚 已死亡 ,应 将鸡胚 、培养 皿及接 触的器 械一同 弃去, 切勿使 其与其 他物品 接触。 (6) 在显微 镜下, 用镊子 将胸部 的皮肤 剥开。 (7) 固定鸡 胚及剥 离皮肤 ,用 剪刀剪 取肌肉 ,在 胸骨附 近平行 于胸骨 处切开 ,然后 沿 胸骨剪 至鸡翅 ,将剪 下的肌 肉置于 35mm 盛有 HBSS 的培养 皿中。 (8) 将收集 的肌肉 在解剖 显微镜 下检查 ,去 除所 有韧带 、结缔 组织及 皮肤, 并将其 放入另 一 盘中。 (9) 清理 完肌肉 ,将 培养皿 放于解 剖显微 镜载物 台上, 用解剖 刀将肌 肉切成 lmmXlmmXlmm 左右的 组织块 ,用 HBSS 吹打 洗漆。 (10) 将切碎 的肌肉 组织转 入盛有 0.25% 胰蛋 白酶的 10mL 烧瓶中 ,用 铝箔 封口, 并在 37t: 5% C02 培养箱 中培养 20~30min。 胰蛋白 酶消化 细胞: (11) 将 肌组织 转入离 心管中 ,离心 2 〜 3min, 使肌肉 沉于管 底即可 ,不要 时间过 长形成 密实的 沉淀。 (12) 轻轻将 胰蛋白 酶溶液 倒入灭 菌盘中 。由于 有可能 带有肌 肉组织 ,必要 时还可 再次 离心。 (13) 加入 2mL 肌 母细胞 培养液 (8:1:1) 至离心 管中。 (14) 检 査吸管 管头是 否平滑 。吸 取少量 培养基 使吸管 湿润, 将吸头 插入离 心管底 轻 轻吹打 ,在 培养基 成乳白 色后, 并没有 可见的 组织块 ,说明 细胞已 分散。 (15) 加入 3mL8:l:l 的 培养基 ,用 吸管分 散细胞 ,用滤 器过滤 ,滤 液放入 另一试 管中。 (16) 细胞 计数, 较好的 结果每 个鸡胚 可获取 8 xl〇6 细胞。 • 950 • (17) 按 3X105 个 mLM 密 度接种 ,每 35mm 培养 皿接种 1.5mL。 批量培 养时, 100mm 培养 板加入 5 X 1〇6 个细 胞进行 培养。 (18) 在 37X: 的 5% C〇2 培养箱 中培养 ,在 开始 3d, 每 天更换 培养基 ,其 后隔日 1 次 更换培 养基。 (19) 用吸 管吸出 培养基 ,但应 注意不 要接触 到细胞 ,否则 导致细 胞死亡 ,慢 慢地 倾斜培 养皿, 可吸得 更彻底 ,但 不要过 度倾斜 ,使培 养基接 触培养 皿边缘 ,导致 污染。 (20) 缓慢 地沿着 培养皿 壁加入 培养液 ,而 不是直 接加在 细胞上 ,同样 应注意 污染。 第十四 节新生 小鼠心 肌细胞 的分离 和培养 哺 乳动物 心脏由 多种细 胞构成 ,其 中大约 75% 为非心 肌细胞 ,只有 25% 是 心肌细 胞 。心肌 细胞的 增生发 生在早 期的胚 胎发育 过程中 ,在 出生后 不久, DNA 合成 和细胞 的有丝 分裂完 全停止 ,心 肌细胞 的数量 一般不 再增加 。出生 后心脏 的增大 主要是 心肌细 胞 体积增 加所致 。尽 管心肌 细胞数 量上不 占优势 ,但 在体积 和重量 上却构 成了心 脏的绝 大部分 。许 多研究 人员应 用培养 的心肌 细胞研 究心脏 的增长 和体液 因素对 增长的 影响, 或药物 治疗对 心肌肥 大的影 响等。 与 其他线 性肌细 胞一样 ,心 肌的收 缩是以 一系列 收缩蛋 白作为 物质基 础的, 这些蛋 白质组 成具有 明暗相 间条带 的肌丝 。在 培养的 心肌细 胞中, 心肌细 胞的结 构和功 能绝大 部分得 以保存 ,如 新生胚 胎的心 肌在含 血清的 培养基 中能够 自主地 收缩, 从而为 心脏的 分子 机制研 究提供 一个很 好的体 外模型 。由于 体外培 养的心 肌细胞 能自发 的同步 收缩, 人们 也常用 它来研 究和测 试影响 收缩的 因素以 及心肌 肥大对 心脏收 缩性的 影响。 本方法 是改进 Speicher 和 McCarl 的 方法而 成的。 尽 管体外 心肌培 养有许 多优点 ,但一 些因素 会使心 肌细胞 功能受 到限制 。新 生动物 的心肌 细胞缺 乏增殖 能力, 因此培 养的细 胞就不 能传代 ,只能 进行原 代培养 。原 代培养 的心肌 细胞似 乎对培 养和处 理反应 更敏感 ,如 新生心 脏组织 对酶消 化相当 敏感, 过度的 消化或 消化酶 的误用 将导致 心肌细 胞贴壁 生长和 / 或收 缩能力 的丧失 。这 一敏感 性似乎 是 时间依 赖性的 ,在出 生前后 的短暂 时间内 , 心脏细 胞外基 质发生 了戏剧 性变化 ,导致 了这 一酶消 化特性 改变。 心 肌细胞 培养的 另一常 见问题 是成纤 维细胞 的污染 ,增 生的成 纤维细 胞可迅 速占据 整个 培养皿 而影响 心肌细 胞分化 。这一 问题可 通过接 种前细 胞上清 暂时存 放的方 法得以 部分 解决: 成纤维 细胞较 心肌细 胞更易 贴附于 试管壁 ,且贴 壁牢固 。这样 处理后 ,使得 在 上清中 心肌细 胞占绝 对优势 。但如 果培养 保存相 当时间 ,则 需要 用化学 方法进 行处理 ( 如加入 BrdU)。 此外亦 有应用 分化血 清如小 牛血清 降低成 纤维细 胞的增 殖率以 及提高 心肌收 缩性的 报告。 还需要 关注的 问题是 保持形 态正常 、具有 收缩功 能的心 肌细胞 的接种 密度。 培养的 心肌 细胞似 乎依赖 于细胞 与细胞 间接触 ,但由 于它们 体积大 小不一 ,形态 各异, 贴附细 胞 间的空 间又不 足以使 另一细 胞贴附 ,.因 此形 成一个 彼此接 触的单 层心肌 细胞是 相当困 难的 。此外 ,心肌 细胞收 缩需要 更多的 空间, 在单个 细胞研 究及鉴 别心肌 与非心 肌细胞 时 ,密度 增加均 使相应 研究更 困难。 . 951 . 1. 材料 70% 乙醇 乙醚 胰 蛋白酶 消化液 (配制 见下) 新的培 养基和 接种液 (配制 见下) 无 菌纱布 2 把显 微解剖 剪刀、 刀片、 5 号镊子 25mL 带瓶塞 的烧瓶 ,内 带磁力 搅拌棒 600mL 烧杯 各种规 格无菌 培养皿 2. 试 剂配制 胰蛋 白酶消 化液: 溶液 A (137 mmol/L NaCl, 5.4 mmol/L KC1, 4.2 mmol/L NaHC〇3, 5.5 mmol/ L 葡萄糖 ) 90mL 1:300 的 1 % 胰蛋白 酶溶液 lOmL 新的培 养基和 接种液 配方: 90 % 含 Earle’s 盐的 MEM 10 % 小 牛血清 100U/mL 青霉素 , lOOpg/mL 链霉素 3. 操 作步骤 (1) 在 组织培 养箱中 ,放 入一个 600mL 容量 的烧杯 ,内置 lOOmL 灭菌水 ,在 水中 放 入一个 搅拌棒 ,并 将培养 箱温度 设置为 37C。 (2) 配制胰 蛋白酶 消化液 ,用培 养箱或 水浴使 该溶液 保持在 37t:。 (3) 准备一 个冰盘 ,用培 养皿盖 反转后 放置冰 块即可 ,用 70% 的乙 醇擦拭 后置于 超 净台中 。另将 3 个 60mm 的一 次性培 养皿分 别放入 5mL 的溶液 A, 分 别标上 1、 2、 3 的标号 ,置 于冰 盘上。 (4) 将 0 〜 Id 龄 的新生 SD 大鼠 麻醉。 (5) 每 次取出 1 只新 生鼠, 并盖好 麻醉用 烧杯盖 。将 取出的 新生鼠 置于无 菌纱布 上 ,用 70% 乙 醇消毒 。切 开胸腔 ,取 出心脏 ,放 入相应 1 号培养 皿中。 (6) 重复上 述过程 ,将所 有新生 鼠心脏 取出, 均放入 1 号培养 皿中。 (7) 在 1 号盘 中洗净 血液, 去净结 缔组织 ,转入 2 号盘中 ,再 次洗涤 和去除 结缔组 织 。经上 述处理 后转入 3 号培养 皿中。 (8) 用 无菌吸 管轻轻 将溶液 A 吸出 ,加入 2mL 预热的 胰蛋白 酶溶液 ,用另 一把剪 刀将 心脏剪 碎成细 砂粒状 大小。 (9) 将剪 碎的心 脏组织 和胰蛋 白酶溶 液转入 带有搅 拌棒的 烧杯中 ,用 3mL 新鲜胰 蛋白 酶冲洗 培养板 和剪刀 ,并 将上液 倒入烧 杯中, 再加入 胰蛋白 酶至总 体积为 10mL。 . 952 . 更换 瓶塞, 37X: 水浴 ,打开 搅拌器 ,使 搅拌棒 速度为 6〇r/min, 消化 15min。 注意: 水浴温 度应为 37X: 恒温 ,消化 时间不 要超过 15min。 (10) 取 出烧杯 ,将 上清倒 出弃去 (其中 主要是 红细胞 ), 加入 10mL 新鲜的 胰蛋白 酶重新 在水浴 中消化 15min。 (11) 倒 弃上清 ,重 新加入 10mL 新鲜胰 蛋白酶 ,用吸 头轻轻 吹打机 械分散 组织, 消化 lOmin。 注意: 不要过 度吹打 ,这 可能导 致细胞 被过度 消化。 (12) 在消 化组织 过程中 ,加入 10mL 冷 接种培 养液至 50mL 无菌 的一次 性锥形 管中。 (13) 消化后 ,小心 取出上 清并加 入到装 有接种 培养液 的锥形 管中。 收集第 一次分 离的 细胞, 再加入 10mL 新鲜胰 蛋白酶 至心脏 组织中 ,再 次进行 消化。 (14) 消化 过程中 ,将 锥形管 离心, 1200r/min 离心 4mm, 小心吸 弃上清 ,再 用冷 的接种 培养液 5mL 悬 浮细胞 沉淀。 (15) 重 复步骤 (11) 〜 (14), 共进行 4 个周期 的消化 或直到 只有极 少量的 组织残 留 ,收 集所有 上清至 1 个锥形 管中。 (16) 将最 后一次 上清收 集完后 ,将 接种培 养基倒 入细胞 中至终 体积为 10mL, 用 吸 管吹打 ,使 之不留 任何细 胞块。 (17) 将 10mL 细 胞悬液 接种至 100mm 灭菌 组织培 养皿中 ,放在 37X: 的 25% C02、 高 湿度培 养箱中 ,培养 l~1.5h 以减少 污染的 成纤维 细胞。 如 果细胞 准备持 续培养 3d 以上 ,应在 培养液 中加入 0. 1 mmol/L BrdU 以更 好抑制 成纤维 细胞的 增生。 (18) 培养后 ,收集 含非黏 附细胞 (主 要是心 肌细胞 ), 用 10mL 预热 的接种 培养液 冲洗 各个培 养皿并 收集之 ,测定 其最终 的体积 。取 标本 用台盼 蓝染色 后进彳 f 计数 ,一般 情况下 可收集 (5X107) 〜 (1X108) 个细胞 ,其中 85% 存活。 (19) 用接 种培养 液稀释 至接种 浓度为 (5X105)~(6X105) 个 mL_1。 (20) 用上 述细胞 悬液接 种至无 菌培养 皿中, 35mm 培养 皿接种 2mL, 60mm 培养皿 接种 5mL, 培养 4~6h。 接种的 培养皿 应带盖 , 且其盖 应用聚 赖氨酸 (相 对分子 质量为 30 000~70 000) 进 行处理 。一般 用 O.lmg/mL 聚赖氨 酸包被 5min, 再用灭 菌双蒸 水冲洗 ,空 气晾干 ,用前 用紫外 线消毒 。另 一种方 法 是将培 养皿盖 在含有 10%FBS 的 培养基 中孵育 l~2h, 用时 取出。 (21) 4~6h 后, 用培养 基或预 热溶液 A 冲洗 培养皿 2 次 ,重新 更换新 培养基 ,培 养过夜 。一 般第 2 天可见 到心肌 收缩。 (22) 用培养 基或预 热溶液 A 冲洗 培养皿 2 次, 更新培 养基继 续培养 ,每 2d 更换 1 次培 养基。 不用 BrdU 处理 的心肌 细胞只 能保持 1 周, 而用其 处理后 可释持 2 周。 第十五 节成年 鼠心室 肌细胞 的分离 和培养 成年 鼠心室 肌细胞 (adult rat ventricular myocyte, ARVM) 的 分离和 培养意 味着对 这 种细咆 类型和 心脏的 生物学 知识有 了长足 的了解 ,其基 本的分 离方法 利用了 19 世纪 由 Langenclorff 建 立的离 体心脏 逆梯度 (retrograde) 动脉灌 流方法 。为 r 从心脏 中获取 • 953 . 单 个心肌 细胞, Berry 等 对这一 灌流技 术进行 了改进 ,使用 冠状动 脉进行 灌流来 分离心 肌细胞 。在获 得纯的 心肌细 胞之后 ,一 般用于 3 个方 面:即 时研究 、无血 清培养 和长期 的加血 清培养 。尽管 基本的 分离技 术相同 ,但分 离后的 保持技 术则有 相当的 不同。 “即时 研究” 是指在 心肌细 胞在分 离后, 在细胞 外基质 预处理 过的玻 片或培 养皿上 贴壁 ,并 在数小 时内进 行分析 、检测 。采 用分 子生物 学的有 关方法 可在分 离细胞 最后一 次洗 涤后就 直接进 行研究 ,如急 性干涉 性试验 或非干 涉性试 验对活 体细胞 表型影 响的研 究。 需要指 出的是 尽管心 脏重量 (体积 ) 的 90% 由 ARVM 构成, 但心肌 细胞占 心脏细 胞总数 却少于 50%, 这一点 在分子 实验中 ,是 从全 心脏还 是从分 离的心 肌细胞 中分离 心 脏特异 性因子 时尤其 重要。 “长期 培养” 将导致 心肌细 胞表型 从棒、 杆状变 成扁平 、宽阔 的形状 (spread shape)。 •这 一形态 学的改 变同时 伴有分 子表型 和电生 理性状 的改变 。在适 应长期 的含血 清培养 过程中 ,心 室肌细 胞常有 大量胚 胎或新 生儿期 的基因 表达。 这些基 因的表 达与活 体心脏 在病理 性心肌 肥厚时 观察到 的结果 一致。 为了用 离体心 脏研究 心脏的 功能和 / 或基 因表达 而进行 长期含 血清培 养时, 常因大 量的 胚胎和 新生儿 期的基 因表达 而受限 。因此 人们试 图建立 无血清 培养, 尤其是 在需要 基本保 持活体 表型时 ,这一 方法尤 为重要 。尽 管心肌 收缩功 能参数 在体外 培养的 数小时 内有 所改变 ,但其 他参数 (包 括某些 分子水 平功能 ), 仍与 在体时 一样, 如用无 血清培 养的 心室肌 细胞进 行体外 电起搏 刺激、 培养心 肌细胞 的心肌 收缩性 就与其 在体时 极其相 近。 Volz 及其同 事证实 培养基 中加入 白蛋白 、肉 毒碱 、肌酐 、胰 岛素和 牛磺酸 (taurine) (AUIT) 可 使心肌 细胞保 持杆状 形态达 2 周之久 。肉 毒碱和 肌酐在 毫摩尔 浓度时 ,有助 于磷 酸肌酐 的代谢 贮存。 牛磺酸 包含哺 乳动物 心肌细 胞大约 50% 的 游离氨 基酸库 ,在 培养基 中加入 牛磺酸 ,可 减少核 酸和磷 酸肌酐 的丢失 。胰岛 素有助 于防止 细胞的 萎缩。 在上述 物质基 础上加 入丁3 ,使 丁3浓 度高于 10 〜 12mol/L, 或 者加入 谷氨酸 ,可 促进细 胞 变杆状 。如果 最终目 的是研 究细胞 形态学 ,则 T3 和谷 氨酸不 能加入 。加入 T3 能促进 肌球蛋 白重链 同构体 表达, 因此在 体外保 持收缩 功能。 由于体 积大易 碎而易 受损伤 及缺乏 有丝分 裂能力 ,限制 了获得 大量心 肌细胞 进行研 究。 现在的 分离技 术已克 服了上 述不足 ,如无 钙离子 分离液 减少了 细胞间 的聚积 ,而大 的 ARVM 细胞 的快速 沉淀则 显著提 高了心 肌细胞 的纯度 ,在 BSA 中进行 沉淀亦 可进一 步 增加心 肌细胞 的纯度 。此外 ,用阿 糖胞苷 处理可 清除污 染细胞 的增生 ,且 不对 ARVM 产 生损害 。本节 介绍的 分离方 法取自 一系列 不同研 究者的 报道, 并进行 了适当 的改进 ,以 利成 功分离 ARVM。 本方法 亦适用 其他种 属成年 动物心 肌细胞 的分离 ,在 本方 法中, 用冠脉 的直接 插管取 代了经 主动脉 插管的 方法。 1. 材料 乙醚 70% 乙醇 Krebs^Henesleit (KH) 培养基 (118mmol/LNaCl, 4.7mmol/LKCl, 1.2mmol/L MgS()4, 1.25mmol/L KH2P()4, 2.5 mmol/L NaHC()3, 11 mmol/L 葡萄糖 ) II 型 胶原酶 、透 明质酸 酶和胰 蛋白酶 干粉剂 • 954 . 洗涤液 (3 份氧合 的无钙 KH 缓 冲液, 1 份 DMEM+ 10% FCS) 含 6% BSA 的 DMEM 无血清 培养基 (含 或不含 Earle’s 盐的 M199 培养基 , 2.2mg/mL NaHC03, 25mmol/LHEPES, 2mg/mL BSA, 2 mmol/L L- 肉毒喊 , 5 mmol/L 肌軒, 0.1 卩 mol/L 膜岛素 , 5 mmol/L faurine, lOOU/mL 青 霉素, 100;ig/mL 链霉素 ) 含血清 培养基 (含 Earle’s 盐的 DMEM, 2.2mg/mL NaHC03, 10% FCS, 10;xm〇l/L 阿糖 胞苷, lOOU/mL 青霉素 , lOO^g/mL 链霉素 ) 手 术器械 ( 组织镊 ,大 剪刀, 2 把小弯 头镊, 小剪刀 ,缝 合线) 25mm swinner 过滤 器盘及 250/im 的尼 龙网筛 250mL 烧杯 (3 只 ), 400mL 烧杯, 250mL 带 塞烧瓶 2 个 硅化的 玻璃管 50mL 带塞 的烧瓶 ,瓶 中放有 搅拌棒 一 次性 带盖培 养皿、 吸管, 60mL 注射器 , 15mL 和 50mL 离心管 Langendorff 灌 流系统 2. 操 作步骤 实 验准备 (1) 在 层流室 中装配 Langendorff 系统。 (2) 在 无菌区 中装配 好经高 压消毒 的上述 设备或 直接使 用一次 性灭菌 材料。 (3) 配 制不带 0&(:12的1<^ 培养基 ,过滤 消毒并 加热至 37X:。 (4) 氧合 KH 培养基 ,调至 pH7.4。 氧合好 后取出 150mL, 转至 250mL 带 盖烧瓶 中 ,将烧 瓶盖好 ,置于 371C 水 浴中。 (5) 在上述 氧合的 KH 缓冲液 中加入 75mgII 型胶 原酶和 45mg 透明 质酸酶 ,配制 成 酶溶液 I。 (6) 取出 20mL 酶溶液 I 至新的 试管中 ,加入 2mg 胰蛋 白酶和 20pL 灭菌的 lmol/L CaCl2 制成 酶溶液 II。 (7) 将上述 两种酶 溶液过 滤灭菌 ,将 酶溶液 I 置于一 250mL 烧瓶中 , 酶溶液 II 置 于 50mL 烧 瓶中。 (8) 将 150mLKH 缓冲 液加入 第一只 250mL 烧 杯中并 灌满灌 洗系统 ,注意 灌装时 不要形 成气泡 。检 查流过 管道的 溶液的 pH, 再经 95% 〇2 和 5% C〇2 交换 回调至 pH7.4, 用 400mL 烧杯 收集流 出液。 (9) 将 预热的 KH 缓冲 液倒入 带盖培 养皿中 ,刚 盖住其 底部。 (10) 将第 1 只鼠加 入乙醚 麻醉室 中麻醉 ,手术 取心脏 ,插 管。 心脏 的灌流 (1) 动物深 麻醉后 ,放在 灌流装 置附近 ,仰 卧位固 定胸部 ,用 70% 乙 醇消毒 ,在 胸腹部 位切开 毛皮。 (2) 沿 一侧胸 廓下缘 紧贴肋 骨下方 横向剪 开胸腔 ,剪开 隔肌。 (3) 提起剑 下软骨 ,分 别沿两 侧肋骨 中线向 上剪断 肋骨, 做长约 2cm 的纵向 切口, 暴 露心脏 。注意 别伤及 心脏。 • 955 . (4) 用镊子 提起心 脏和胸 腺组织 ,从后 纵隔切 断取出 心脏, 将其浸 入盛有 KH 培养 液的 带盖培 养皿中 ,并 置入灌 流操作 台上。 (5) 将心 脏移到 培养皿 边缘, 提起胸 腺组织 ,以暴 露出主 动脉弓 ,用 小剪刀 剪去胸 腺组织 ,并 剪开主 动脉弓 顶端。 (6) 打开 灌流泵 ,调节 流速到 1 滴 /s。 用 2 把镊 子将灌 流管套 入主动 脉并送 到主动 -脉 根部。 (7) 用 镊子托 住主动 脉根部 ,在主 动脉弓 的顶端 ,以蚊 氏钳与 主动脉 垂直的 角度, 用蚊 氏钳夹 住主动 脉及插 入的灌 流管。 (8) 在 蚊氏钳 的下方 ,用 手术线 将主动 脉绑扎 在灌流 管上, 并灌流 3 〜 5min, 直到 心 脏中的 血液完 全清除 。这时 ,如果 冠脉得 到良好 的灌流 ,就有 良好的 跳动。 (9) 剪除心 脏周边 多余的 组织, 保留肺 动脉和 心耳。 灌瘅 管不要 插入过 深进入 心脏。 如果灌 流管跨 过了主 动脉瓣 ,冠 状动脉 就得不 到有效 的灌注 。检 査灌 流管是 否误入 心腔的 方法很 简单, 轻轻推 动心脏 ,使灌 流管紧 贴心壁 或主动 脉壁, 便可看 清灌流 管顶端 的位置 。此外 ,要确 .保灌 流管被 绑扎于 主动脉 腔内, 不可让 灌流管 滑出主 动脉腔 面仅将 主动脉 予 以结扎 。将心 脏从大 鼠体内 取到开 始冠脉 灌流的 时间不 应超过 l~2min。 (10) 将 氧合的 KH 缓冲液 加入第 2 只 250mL 灭菌 烧杯中 ,增加 流量至 5.5mL/ min, 灌流 6min〇 (11) 将 酶溶液 I 加 入到第 3 只 250mL 烧杯中 ,将蠕 动泵的 输液速 度调至 8mL/ min, 心 脏灌流 5min, 将 250mL 烧杯放 在心脏 下再持 续灌流 15min, 经 20min 灌 流后心 脏肿胀 苍白。 心 肌组织 的分离 (1) 在酶 I 灌注 的最后 2min, 检查流 出液的 pH 和氧 合度。 (2) 从 插管处 剪下心 室并将 其切成 ImmXimmX 1mm 见方的 组织块 ,将组 织块放 入 盛有酶 II 的 50mL 烧瓶中 ,在 37C 振 荡水浴 中消化 15min, 振动 频率约 100r/min。 (3) 在 50mL 锥形 离心管 中装上 20mL 洗涤液 ,再 用吸 管将样 本吸出 放入锥 形离心 管中。 . (4) 将 细胞悬 液置于 过滤器 中过滤 ,滤液 放入另 一离心 管中。 (5) 5〇Xg 离心 30min, 弃上清 ,再用 10mL 新 鲜的洗 涤液悬 浮细胞 沉淀。 (6) 置放 20min 使 杆状细 胞沉淀 ,小 心地弃 去上清 ,再用 10mL 新 鲜洗涤 液悬浮 细胞。 (7) 让细 胞沉淀 15mm, 弃上清 ,再用 10mL 洗 涤液悬 浮细胞 沉淀。 (8) 经反 复洗涤 4 次后, 最后弃 去上清 ,用 5mL 洗涤 液悬浮 细胞。 (9) 将 上述悬 液取出 ,细心 地分层 将悬液 加入含 6% BSA 的 DMEM 中 ,使 心肌细 胞沉淀 l〇~15min。 (10) 最 终的沉 淀中应 含有高 纯度的 活的杆 状心室 肌细胞 ,其 产量约 3 xl〇6 个细 胞 / 心脏。 ARVM 的培养 (1) 在上 述洗涤 心室肌 细胞时 ,在室 温下用 l(Vg/mL 板层 素包被 培养板 / 盖玻片 / 载玻片 30min。 (2) 用 适当的 培养基 (无血 清培养 基或含 血清培 养基) 与 细胞沉 淀混合 ,以 IX • 956 • 106 个细胞 /100mm 培养 皿的细 胞密度 接种到 预包被 的培养 皿中。 (3) 让细 胞贴壁 lh, 然后用 新鲜培 养基继 续培养 。用 无血清 培养基 一般培 养一周 而含 血清培 养基约 2 周。 (4) 每天 更换培 养基。 第十六 节肝星 状细胞 的培养 肝! It 脂细胞 (fat-store cell) 又 叫肝星 状细胞 (hepatic stellate cell)、 Ito 细胞 。它存 在于 肝窦内 ,在不 同的功 能时期 ,具 有不同 的细胞 表型。 它能表 达一种 或多种 细胞间 质 ,如 结蛋白 、波 形蛋白 (vimentin) 和 a 平滑 肌肌 动蛋白 (actin)。 在正常 肝脏中 ,具 有参与 维生素 A 代谢 、分泌 细胞因 子和调 节肝血 流等多 种作用 。在 肝纤 维化过 程中, 该细胞 激活并 分泌大 量的间 质成分 ,是肝 纤维化 病理过 程的中 心环节 。有 关肝星 状细胞 的研 究日益 为广大 肝病研 究者所 重视。 由于该 细胞相 对于肝 实质细 胞而言 相对数 量较少 ,因此 常在对 肝组织 细胞进 行消化 分离 的同时 ,应用 旋转震 荡方法 使肝实 质细胞 破坏, 经单层 泛影葡 胺密度 梯度离 心去除 肝实质 细胞及 其碎片 ,留 下的间 质细胞 是多种 细胞的 混合物 ,经培 养后再 利用肝 星状细 胞没有 Fc 受体 的特性 ,进行 阴性选 择纯化 ,从而 获得高 纯度的 肝星状 细胞。 1. 材料 8 周龄 A/J 小鼠或 BALB/C 小鼠 含 0.05% 胶原酶 的无钙 培养基 HBSS Eagle’s 培养基 绵羊 红细胞 IgG 抗体 泛 影葡胺 (30%) (m/V) 无菌手 术器械 和无菌 培养皿 、试管 、烧杯 蠕动泵 和旋转 振荡器 2. 操 作步骤 (1) 取 8 周龄 A/J 小鼠或 BALB/C 小鼠 ,断头 处死。 (2) 在无 菌条件 下切开 腹腔, 暴露门 静脉。 (3) 从门 静脉主 干插管 ,用含 0.05% 胶 原酶的 无钙培 养基以 5mL/mm 的流 速原位 肝脏 灌注。 (4) 取 出肝脏 ,用 HBSS 洗 涤后再 剪碎。 (5) 将剪碎 的肝组 织用含 0.05% 胶 原酶的 HBSS 以 280r/min 旋 转水浴 中消化 45min〇 (6) 用 单层泛 影葡胺 进行密 度梯度 离心。 (7) 用含 20% 胎牛 血清的 Eagle’s 培养 基悬浮 沉淀。 悬浮后 的细胞 密度约 (5 X • 957 . 106 )~(8X106) 个 mL—1。 (8) 按 1.5X106 个 /mL 的密度 接种于 25mm 的 Falcon 组织 培养瓶 ,再在 5% C〇2 培 养箱中 培养。 (9) 48h 后更换 培养基 ,以 后每 5d 更换 一次。 上 述方法 分离的 细胞为 肝星形 细胞和 Kupffer 细胞的 混合物 。上述 细胞经 24h 培养后 ,培 养细胞 中仅约 3% ~5% 的肝星 形细胞 ,经连 续培养 15d 后, 肝星形 细胞约 占细胞 总数的 50%, 但仍 需进一 步 的纯化 ,才 能获得 单一的 肝星形 细胞。 (10) 取第 15 天的培 养细胞 ,用 0.15% 胰 蛋白酶 / 0.015% EDTA 溶 液对培 养细胞 进行分 离洗脱 ,时 间约 15min。 (11) 收集脱 落细胞 至离心 管中, 300 Xg 离心 5min。 (12) 弃上清 ,用 HBSS 悬浮 沉淀。 (13) 加 入过量 IgG 包被 的绵羊 红细胞 ,并在 371C 孵育 20min。 (14) 30〇Xg 离心 5min。 (15) 弃上清 ,用 6mLHBSS 悬 浮沉淀 ,加入 3.5mL 泛 影葡胺 (30% m/\〇, 终浓 度约 11% (m/V)。 (16) 上清 中加入 18% 泛 影葡胺 ,形 成双层 密度的 锋面。 (17) MOOXg 离心 20min, FSC 浮在上 清中, 而其他 细胞则 因形成 玫瑰花 结而沉 淀 下来。 (18) 收集 上层中 的肝星 形细胞 ,用 HBSS 洗涤细 胞。. (19) 按 (IX 1〇6)~ (1.5 Xl〇6) 个 mL-1 的密度 接种到 75cm2 Falcon’s 培养 瓶中, 用含 10 % 胎牛 血清的 Eagle’s 培养基 培养。 (20) — 般说来 ,约 62h 完成 细胞的 倍增, 1 〜 2d 后细 胞汇合 。再经 1 次传 代培养 后 ,肝 星形细 胞约占 90%, 2 次 传代后 即可达 100% 纯度。 宋家武 陈蔚梅 林菊生 主要参 考文献 鄂征 . 1995 . 组织培 养和分 子细胞 学技术 .北京 : 北京出 版社. Boyum, A. 1968. Isolation of leucocytes form human blood. A two phase system for removal of red cells with methylcellulose as erythrocyte aggregative agent. Scand. J. Clin. Lab. Invest, (suppl. 97), 21 :9 〜 29. Caputo, J . , Thompson P. , Mcclintock, Y. , et al. 1991 . An effective method for establishing human B lym- phoblastic cell lines using Epstein-Barr virus. J. Tiss. Cult. Methods. , 13: 39 〜 44. Cohen, P. , Kin, D. , Fowlr, R., et al. 1993. Use of interleukin-7, interleukin-2 and interferon gamma to progagate CD4 + T cells in culture with maintained antigen specificity. J. Immunother. , 14:242 〜 252. Gillis, S. and Watson, J . 1981 . Interleukin-2 dependent culture of cytolytic T cell lines. Immunol. Rev. , 54: 81 〜 109. Tohda, H. , Oikawa, A. , Kudo, T. , et al. 1978. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblas- toid cell lines. Cancer Res. , 38: 3560 〜 3562. Wall, F. , Henkel, R. ,Stem, M. , et al. An efficient method for routine Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim, 31: 156 〜 159. • 958 • 第十 K 章流式 细胞术 引 B 流式 细胞术 (flow cytometry, FCM) 是以 激光为 基础的 测量生 物粒子 特性的 技术。 这种技 术既可 用于对 整个细 胞进行 测量, 也可以 用来测 量细胞 的结构 元件如 细胞核 、细 胞 器或组 成细胞 的生物 活性分 子等。 FCM 的 基本原 理是基 于激发 光源遇 到移动 的粒子 或对粒 子进行 扫描时 ,光 就会发 生散射 或带有 荧光标 记的细 胞就会 被激发 出荧光 ,经计 算 机收集 、过滤 、显示 、存贮 、分 析这 些散射 光或荧 光资料 则可测 定有关 粒子的 生化、 生 理和分 子方面 的特性 ,从而 在许多 方面为 研究生 命科学 提供重 要的技 术支持 。由于 FCM 能够定 性和定 量测定 细胞和 标记有 荧光染 料的细 胞元件 ,所以 FCM 对于生 物学的 研 究尤为 重要。 用于 FCM 的样本 首先必 须制作 为单细 胞悬液 ,以 便检 测对象 能够经 液体媒 介或液 流包 裹后逐 一通过 激光束 。激光 束遇单 个细胞 后将产 生有关 细胞信 息的两 种典型 的物理 现象, 即光散 射和荧 光激发 。光散 射直接 反映细 胞的结 构和形 态特征 ,对 于标记 有荧光 探针 的细胞 或细胞 元件来 说则可 激发出 荧光。 荧光探 针是标 记有荧 光素的 单克隆 抗体或 其他非 标记抗 体的荧 光染料 。结 合有 荧光探 针的细 胞通过 FCM 光源时 ,激 发的 荧光量 与细胞 或细胞 元件所 结合的 荧光探 针的量 成适当 的比例 。因此 ,收 集通过 光源的 每个细 胞的 光散射 和荧光 激发量 ,然后 经专用 的计算 机软件 分析, 就可以 得到有 关细胞 的诸多 方面 的信息 。由于 FCM 能在几 秒钟内 处理成 千上万 个细胞 ,所以 目前已 广泛应 用于科 研和 临床。 FCM 不仅可 以用于 细胞结 构的测 量包括 细胞膜 、细 胞质 和细胞 核抗原 ,测 定整 个细胞 或细胞 元件如 细胞器 、细 胞核、 DNA、 RNA、 染色体 、细胞 因子、 激素和 蛋白 质含量 ,而且 还可以 对细胞 的许多 功能方 面进行 研究如 钙流量 、膜 电位 、细 胞增生 率、 DNA 合成和 DNA 细胞周 期研究 。从理 论上讲 ,只 要利 用适当 的探针 ,那么 就可以 检测细 胞的任 何功能 结构。 细胞 分选是 FCM 的另 一个重 要功能 。通 过流式 细胞仪 喷嘴的 细胞被 获取和 分析以 后再形 成液滴 ,若其 特性与 预先设 定的分 选条件 相符, 则由计 算机控 制给细 胞充电 ,带 电荷 的细胞 液滴以 一定的 速度通 过高压 静电场 ,细胞 的运动 方向则 随其所 带的电 荷性质 发生不 同方向 或不同 程度的 偏转。 带不同 电荷的 细胞液 滴分别 落入不 同的收 集器中 ,在 不同方 位收集 到的细 胞群则 代表相 同特性 的细胞 ,从 而完成 细胞的 分选。 一 般来说 ,一台 流式细 胞仪由 4 个密切 相关联 的系统 组成: 一是液 流系统 (fluidic system), 将样品 管中经 荧光染 料染色 或标记 后的单 细胞悬 液借助 气体的 压力送 入流动 室 ,在流 动室内 ,经鞘 液包裹 的细胞 呈单个 排列而 由喷嘴 喷形成 样本流 ,样 本流 向垂直 激光束 ,以便 对逐一 经过的 单个细 胞进行 扫描; 二是光 源系统 (illumination system), 发出稳 定的且 与样本 流呈垂 直方向 的激光 光束; 三是光 学和电 子系统 (optical and elec- • 959 • tronics system), 负 责收集 、过滤 、光散 射和荧 光信号 ,并 将这些 信号转 变为电 信号; 四是 资料存 C 和计 算机控 制系统 (data storage and computer control system), 保 存获得 的资 料和为 操作者 提供控 制流式 细胞仪 的操作 界面。 本章着 重介绍 用于流 式细胞 术的样 本的处 理以及 流式细 胞仪在 医学领 域的基 本使用 方法。 第一 节用于 流式细 胞术检 测的单 细胞悬 液制备 流式细 胞术检 测细胞 的结构 和功能 时都是 基于单 个分散 的细胞 或单个 细胞核 悬液, 因此不 论是贴 壁培养 的单层 细胞, 还是实 体组织 (穿 刺活检 ,手术 取样等 ) 或石 蜡包埋 固 定组织 ,在 进行流 式细胞 术之前 都要首 先制备 为单细 胞悬液 或单个 的细胞 核悬液 。制 备 单细胞 悬液的 过程实 际上也 是将黏 附在一 起的细 胞进行 分散为 一个一 个单细 胞的过 程。 实现这 一过程 所采用 的方法 的选择 应遵循 一些原 则如不 破坏细 胞原有 的形态 结构和 功 能特征 、保持 细胞群 或组织 中的细 胞亚群 的比值 、能 获得 较高的 细胞产 额而又 不能有 太多碎 片等。 一 、贴壁 培养细 胞的单 细胞悬 液制备 1. 材料 单 层贴壁 培养的 单层细 胞样本 0.25% 胰蛋白 酶溶液 (双蒸 水稀释 ) 无钙 、镁 离子的 PBS, pH7.2~7.4 -20X: 冷乙醇 (75%~80%) 细 胞固定 保存液 吸管, 注射器 倒置 显微镜 2. 操 作步骤 (1) 将单层 贴壁培 养的单 层细胞 培养至 对数生 长期后 ,倒掉 培养基 。加入 2mL 0. 25% 胰蛋白 酶溶液 ,以 刚好 覆盖单 层细胞 为宜。 (2) 在倒置 显微镜 下观察 培养瓶 内细胞 的变化 ,约 2 〜 5min 后 细胞变 圆并有 脱落趋 势时, 立即将 培养瓶 竖起来 ,吸 弃胰蛋 白酶消 化液。 (3) 加入适 量无钙 、镁 离子的 PBS 缓冲液 ,用 吸管反 复吹打 使贴壁 细胞脱 落下来 而 成为细 胞悬液 ,移 入离心 管中。 (4) 50〇xg 离心 5min, 去上清 ,约留 0.5mL 细胞悬 液振荡 使细胞 分散。 (5) 向离心 管加入 -20X: 冷乙 醇约 lmL, 混匀 ,再加 入适量 冷乙醇 调整细 胞浓度 约为 (5xi〇5)~(8xi〇5) 个 ml,1 固定, 保存于 -20t: 冰箱 备用。 二 、机械 法制备 新鲜实 体组织 的单细 胞悬液 1 . 材料 样本 组织块 • 960 • 无钙 、镁 离子的 PBS 0.9% 的生 理盐水 -20t: 95% 的 冷乙醇 吸管, 注射器 眼 科剪、 21# 手术刀 培养皿 80 〜 200 目 (500^m) 滤网, 35pm 孔 径的尼 龙滤网 及其配 套滤器 振荡器 低速 离心机 2. 操 作步骤 (1) 取 样本组 织块约 lg, 用冷 PBS 洗涤 一次, 将样本 转移至 60mmXl5mm 的培养 皿中 ,加入 5~10mL 新鲜 的冷细 胞培养 基或冷 PBS。 (2) 于冰 上用眼 科剪剪 碎并用 21# 手 术刀尽 量剁碎 ,经 孔径为 80 〜 200 目 的不锈 钢滤网 过滤。 (3) 收集滤 液即细 胞悬液 ,在经 孔径为 35pm 的 尼龙网 过滤到 灭菌后 的离心 管中。 50〇Xg 离心 5min, 去 上清。 (4) 加入 3~5mLPBS, 反复吹 打或振 荡混匀 、悬浮 、洗 涤。 500 Xg 离心 5min, 去 上清。 (5) 重复洗 涤一次 后加入 3mLPBS 混匀 ,用 孔径为 35pm 的尼龙 网重复 过滤, 500 X g 离心 5min, 去 上清。 (6) 加入 lmL 0.9% 的生 理盐水 ,轻 摇混匀 ,然后 再加入 95% 的 冷乙醇 2. 5mL, 摇匀 ,样 本细胞 悬液置 保存于 -20t: 冰箱 过夜后 ,即 可进行 染色。 单纯机 械法制 备实体 组织单 细胞悬 液对于 有些组 织如肝 、乳腺 、肿瘤 等来说 ,可以 获得较 高的细 胞产额 ,而 对于另 一些组 织则获 得的细 胞产额 较低, 往往需 要配合 使用其 他的细 胞分离 的方法 如酶消 化法 或化学 试剂分 散法等 。至于 选择哪 种消化 酶或化 学试剂 ,则应 根据分 离对象 的组织 学类型 。最常 用的 消化酶 有胰蛋 白酶、 胶原酶 、胃 蛋白酶 、透 明质酸 酶等; 常用 的化学 试剂有 EDTA 和 EGTA 等。 三 、石蜡 包埋组 织的单 细胞悬 液制备 1. 材料 石蜡包 埋组织 二甲苯 枸橼酸 缓冲液 [3mmol/L 枸橼酸 三钠, 0.1% (V/V) NP-40, 1.5mmol/L 四氯精 胺, 0.5mmol/L Tris-HCl pH7.6] 0.25% 胰 蛋白酶 (枸橼 酸缓冲 液稀释 ) 100%、 95%、 75%、 50% 梯 度乙醇 显微 切片机 网眼 直径约 50pm 的细胞 过滤器 • 961 • 离心管 、振 荡器 2. 操 作步骤 (1) 将石 蜡包埋 的组织 块用显 微切片 机切成 厚度为 3(Vm 的切片 ,并 将切片 组织移 入玻 璃离心 管中。 (2) 加入 二甲苯 3 〜 5mL 于常 温下脱 蜡处理 2 次, 500 Xg 离心去 二甲苯 ,每 次约 20 〜 30min〇 (3) 室温下 依次用 100%、 95%、 75%、 50% 梯度乙 醇洗涤 复水, 50〇xg 离心去 乙醇 ,共 30min。 (4) 加入 含胰蛋 白酶的 枸橼酸 缓冲液 3mL, 37X: 恒温 过夜。 (5) 样品 经振荡 20min, 用 细胞过 滤器过 滤后待 检测。 第 二节非 同步化 细胞的 细胞周 期分析 非同步 化细胞 的细胞 周期研 究要求 定量测 定细胞 DNA 含量 。碘 化丙锭 (propidium iodide, PI) 是利用 FCM 分 析细胞 DNA 过程 中最为 常用的 染料。 PI 可 使细胞 DNA 和 RNA 同 时染色 ,但 它却不 能通过 完整的 细胞膜 。因 此使用 PI 染色 之前, 细胞必 须经过 固 定处理 ,让 PI 能 顺利通 过固定 后的细 胞膜使 DNA 和 RNA 染色 。乙醇 是最理 想的细 胞 固定剂 ,经 75% ~80% 冷乙醇 固定的 细胞于 4X: 存放 几天或 几周后 再进行 DNA 染色 分析也 不会影 响分析 结果。 细胞经 DNA 结合 染料如 PI 染色后 ,以 FCM 分析 可获得 DNA 直方图 。在 这一直 方图上 可显示 细胞周 期中各 期细胞 (Go/q、 S、 G2/M 期) 百 分比 。以 5'- 溴脱 氧脲嘧 啶核苷 (BrdUrd) 代替 胸腺嘧 啶核苷 掺和到 DNA 中, 则可利 用 FCM 检 测细胞 周期进 展的动 力参数 。检测 BrdUrd 的 DNA 掺 入率则 可获得 S 期细胞 百分率 。如 果样 本取自 细胞周 期的不 同时相 ,则可 获得细 胞周期 的动力 学信息 。另 外, 应 用脉冲 标记抗 BrdUrd 的单克 隆抗体 ,则 可研究 S 期细胞 在细胞 周期中 的运动 。还有 利用 BrdUrd 抑制 Hoechst33342 与 DNA 结合 或是脉 冲标记 细胞经 Hoechst33258 和光神 霉素 (mithramycin) 联 合染色 等其他 方法。 1. 材料 细 胞样本 10 mmol/ L BrdUrd 液 ,冰 冻保存 100/ig/mL PI 贮液 lOOfig/mL EB 贮液 Hoechst33258 染色液 (l〇〇mmol/L Tris-HCl pH7.4, 154mmol/L NaCl, lmmol/L CaCl2, 0.5mmol/L MgCl2, 0.1% NP-40, 0.2% BSA, 1.2/ug/mL Hoechst33258) 2. 操 作步骤 (1) 细胞经 放射线 、化 学药物 或物理 因素等 处理。 (2) 经处 理后的 细胞立 即与适 当浓度 的预温 BrdUrd 共 培养。 • 962 • (3) 定 时收获 细胞, 1000 Xg 离心 ,重新 悬浮于 500/ixL 的冰 冻染色 液中, 振荡后 置冰上 15min。 (4) 加入 10/iLPI 染液 ,振荡 混匀后 置冰上 ,上 FCM 分析。 第三节 单个细 胞细胞 周期素 的检测 细 胞通过 细胞周 期及细 胞周期 检测点 (cell cycle checkpoint) 时 ,其 受到细 胞周期 素依赖 性激酶 (CDK) 及其配 体细胞 周期素 (cyclin) 的精确 调控。 cyclinBl、 cyclinA、 cyclinE、 cyclinD 在 细胞周 期中呈 时相性 表达。 cyclinBl 激活 CDK1 (以 前称为 CDC2), 其激酶 活性对 于02 期细胞 进入 M 期极为 重要。 cyclinBl 在 细胞从 S 期退 出时 开始积 聚 ,进入 分裂期 达高峰 ,过 渡到 分裂后 期下降 为零。 cyclinA 激活 CDC2 或 CDK2, 其复 合物 激酶活 性使细 胞通过 S 期和 G2 期, CyclinA 的细胞 积聚在 S 早期或 中期及 G2 后期 达高峰 ,分 裂前 期快速 降解。 cyclinE 与 CDK2 结合, 其复合 物激酶 活性使 细胞从 &期 进入 S 期, (^化11£在01 中期开 始合 成积聚 ,进入 S 期达 高峰 ,细 胞通过 S 期后 快速降 解。 cyclinD 家族不 同成员 (cyclinDl、 D2、 D3) 的 表达具 有组织 和细胞 类型特 异性。 1. 材料 培养 细胞系 (Molt-4 细胞或 HL-60 细胞) cyclin 抗体 FITC 标记的 羊抗鼠 IgG 鼠 IgGi 同 质对照 80% 的乙醇 lmg/mL 的 RNase A (用 PBS 稀释) 1% 小 牛血清 白蛋白 (用 PBS 稀释) 0.25% Triton X -100 (用 PBS 稀释) PI (用 PBS 稀释 ,贮存 浓度为 lmgPI/mLPBS) 注: cyclin 抗 体多系 鼠单克 隆抗体 (PharMingen, San Diego, CA)。 根 据不问 的研究 需要选 择相应 的抗体 ,如抗 cyclinBl 抗体 (克隆 GNS-1), 抗 cyclinA 抗体 (克隆 BF-683), 抗 cyclinDl 抗体 (克隆 G124-326), 抗 cyclinD3 抗体 (克隆 G107-565), 抗 cyclinE (克隆 HE12) 2. 操 作步骤 (1) 将 Molt-4 细胞 培养至 对数生 长期, 细胞浓 度约为 (2X105) 〜 (8X 1〇5) 个 /mL,S 期细 胞约占 30%。 (2) 细胞固 定:取 lmL 细胞 悬液以 800Xg 离心 5min (下同 ), 去上清 。将 余下的 少许上 清与细 胞混匀 ,加入 lmL-20t: 预冷的 80% 乙醇 ,轻 轻振荡 后加入 9mL 的乙 醇 ,置 -20 40X3 2 ~24h, 可用于 cyclinBl、 cyclinA 和 cyclinE 的检测 。用于 cyclinD 检 测的样 本应用 100% 的冰甲 醇固定 ,方法 同上。 (3) 取 出固定 的细胞 300Xg 离心 5min, 去 上清。 (4) 5mLPBS 缓冲 液洗涤 2 次, 细胞沉 淀加入 〇.5mL 含小牛 血清的 PBS, 振荡。 . 963 . (5) 加入 1% 的 Triton X-100 (PBS 配制 ) 0.25mL, 使 Triton X-100 的终 浓度为 0.25%, 然 后冰上 (冰浴 ) 5min。 (6) 离心去 上清留 lmL, 加 5mLPBS 洗涤。 (7) 加一抗 : 抗体用 1% 的 BSA 稀释 ,参考 浓度为 1:400。 每个 样本加 入含有 . 0.5 叫抗体 的抗体 稀释液 ,室 温下轻 轻振荡 60min 或置于 4X: 冰箱 过夜。 (8) 同 质对照 组样本 需要同 时同方 法处理 ,只 是用同 质对照 抗体代 替一抗 加入样 本中。 (9) 1% (4t:) BSA5mL 洗涤 细胞, 300Xg 离心 5min, 吸干 上清。 (10) 加入 1:10 〜 1:40 的 FITC 标记的 羊抗鼠 IgG 抗体 (第 二抗体 ,稀释 同前) 50~100pL, 室温下 暗处轻 轻振荡 30min 以上。 (11) 1% BSA 洗涤 离心。 (12) 加入 PI 300 〜 500/uL, 使终 浓度为 10/ig/mL, 同 时加入 lmg/mL 的 RNase A 50~100 卩 L, 室温下 暗处轻 轻振荡 30min。 (13) FCM 分析, 用蓝色 光激发 测定细 胞的绿 色荧光 (530±20nm; FITC) 和红色 荧光 (>590nm; PI) 3. 方 法评注 利 用细胞 DNA 含 量和单 个细胞 cyclin 表达 的双变 量参数 ,在 正常增 生的淋 巴细胞 可测得 cyclinBl、 cyclinA、 cyclinE 表达的 典型细 胞周期 时相性 特征; 在增 生的成 纤维细 胞也 可测得 cydinDl 的这一 特征。 cyclinBl 的表达 基本上 限于晚 S 期细胞 ,此时 相的细 胞含有 G2/M 期的 DNA, 在早 、中 S 期细 胞仅 有极低 水平的 cyclinBl 的 表达; cyclinA 的 表达随 S 期的 进展 而升高 ,在 G2/M 期的 表达达 到高峰 ,大多 数& 期细胞 cyclinA 的 表 达呈阴 性或表 达水平 极低; cyclinE 在&/5 期 转换时 达高峰 ,随 S 期的 进展而 表达的 水平逐 渐下降 ,于 G2/M 期基 本上呈 阴性。 cycUnDl 在对数 增长期 正常成 纤维细 胞的表 达 紧限于 以/^期 ,大 多数 细胞于 S 期和 G2/M 期为 阴性; 〇¥〇1丨1〇02在1;2 -骨肉 瘤细胞 系和 C28 杂交瘤 细胞系 的表达 特点基 本上与 cyclinDl 在成 纤维细 胞的表 达特点 相似; 有丝分 裂原刺 激的对 数生长 期的人 淋巴细 胞中的 cyclinD3 表达特 点亦与 cyclinDl 在成纤 维 细胞中 的表达 相似。 大多数 细胞的 cyclin 呈 有规律 的时相 性表达 ,而有 少部分 的肿瘤 细胞呈 cyclin 的非 时相性 表达, 这一特 点可能 是由于 肿瘤细 胞的细 胞周期 调控发 生紊乱 所致。 并 不是所 有的厂 家生产 的细胞 周期素 抗体都 适合于 FCM, 有 的厂家 生产的 抗体仅 仅适 用于免 疫组化 ,有的 却适用 于蛋白 质凝胶 电泳, 而本文 标示的 克隆号 为细胞 周期素 检测 的推荐 抗体, 已经过 我们实 验室的 检验。 第四节 评估肿 瘤细胞 对化疗 药物的 耐药性 一 般认为 ,肿 瘤细胞 是通过 增加药 物的代 谢或加 快向细 胞外排 泄药物 而提高 其自身 对化疗 药物的 耐药性 。药物 的这种 排泄与 肿瘤细 胞本身 存在的 几种排 泄泵如 MDR1 (P- 糖蛋白 /P170) 和 MRP 等有 较密切 的关系 。它 们都是 蛋白质 家族的 成员, MDR1 能 • 964 • 够 以消耗 ATP 的主 动转运 过程将 细胞质 中的中 性分子 和带正 电荷的 离子移 出到细 胞外; MRP 则可 移出中 性分子 和带负 电荷的 离子。 FCM 可 用于检 测这些 排泄泵 的活性 特征。 首先 是用结 合排泄 泵的荧 光底物 如道诺 红菌素 (daunorubicin) 或 罗丹明 123 (rho- damine123, R123) 孵育肿 瘤细胞 ,然后 ,用抗 体标记 法通过 FCM 检测 排泄栗 蛋白的 表 达来评 估肿瘤 细胞对 化疗药 物的耐 药性。 1. 材料 30mg/mL 丙磺舒 ,用 DMSO 稀释 10mmol/L 戊脉安 ,用 DMSO 稀释 20mmol/L 金雀 异黄素 ,用 DMSO 稀释 100pg/mL 道诺 红菌素 ,用 DMSO 稀释 5(Vnol/L 钙 黄绿素 -AM, 用 DMSO 稀释 lmg/mL 环 孢霉素 A, 用 DMSO 稀释 10mg/mL 氟 桂利嗪 ,用 DMSO 稀释 2.6mmol/L (lpg/mL) 的 罗丹明 123, 用乙 醇稀释 小鼠抗 MDR1 的单克 隆抗体 MRK-16 (Signet, Dedham, MA) FITC 标记 的抗鼠 IgG 鼠抗 MRP 的单克 隆抗体 MRPPrl FITC 标记的 抗小鼠 Ig 2. 操 作步骤 MRP 泵的活 性阻滞 检测: (1) 收集 MRP 表达细 胞和亲 代细胞 (使 用或不 使用胰 酶消化 ), 以 5 X 1〇5 个 mL— 1 悬 浮于无 酚红培 养基中 2 〜 5min。 (2) 亲代 细胞和 MRP 表达 细胞经 阻滞剂 、溶媒 、阳 性对照 处理或 不处理 。阻滞 MRP 活性的 阳性对 照可使 用以下 任何一 种药物 : 丙磺舒 (100~300;xg/mL)、 戊脉安 (10pg/mL) 或金雀 异黄素 (20pmol/L), 脾育 10~20min。 (3) 加 入道诺 红菌素 0.3/ixg/mL 或钙 黄绿素 -AM 250nm〇l/L, 22X: 或 37X: 暗处孵 育 lh。 细 胞离心 去上清 ,暗 处存放 lh, 待流式 细胞仪 检测。 (4) 上流式 细胞仪 ,获得 单参数 直方图 (钙 黄绿素 : 525~335nm [FL1]; 道诺红 菌素 : 565~605nm [FL2]), 检测 3000 〜 10 000 个 细胞。 (5) 通过比 较未处 理亲代 细胞和 药物处 理后的 MRP 细 胞相对 荧光百 分数而 评价一 种特 殊化合 物阻滞 活性。 MDR1 泵的活 性阻滞 检测: (1) 收集 MDR1 表达细 胞和亲 代细胞 (使 用或不 使南胰 酶消化 ), 以 5X105 个 mL-1 悬 浮于无 酚红培 养基中 2 〜 5min。 (2) 亲代 细胞和 MDR1 表达细 胞均经 阻滞剂 、溶媒 、阳 性对照 处理或 不处理 。阻 滞 MDR1 活性 的阳性 对照可 使用以 下任何 一种药 物:环 孢霉素 A (1/ug/mL)、 氟桂利 嗪 (5pmol/L), 畔育 l〇min。 • 965 • (3) 加入 罗丹明 123 (5.2ptmol/L), 37t: 暗 处孵育 20min。 细 胞离心 去上清 ,暗处 存放 lh, 待流式 细胞仪 检测。 (4) 上流式 细胞仪 ,于 FITC 道获得 10 000 个细 胞的单 参数直 方图。 (5) 通过比 较未处 理亲代 细胞和 药物处 理后的 MDR1 细胞相 对荧光 百分数 而评价 一种特 殊化合 物阻滞 活性。 MDR1 表 达检测 (P- 糖蛋白 ): (1) 每管至 少收集 1X105 个细胞 ,离 心后 悬浮于 lOO^L 的 PBS 中。 同时准 备同质 对照。 (2) 加 2^L 浓度为 0.5mg/mL 的 小鼠抗 MDR1 的单克 隆抗体 MRK-16, 或 同等剂 量的 MRK-16-FITC, 混匀 ,冰 上孵育 20~30min。 (3) 如果使 用的是 未标记 的抗体 ,则用 lmL 冰冷 PBS 洗涤, 离心后 细胞沉 淀悬浮 于 100/iL 的冷 PBS 中; 加知 L FITC 标记的 抗小鼠 IgG, 混匀 ,冰 上孵育 20~30min。 如果使 用的是 已经标 记的抗 体则可 直接进 行下一 步骤。 (4) 所有抗 体标记 步骤完 成以后 ,再用 PBS 洗 涤细胞 2 次, 重悬于 0.5mL 的 PBS 中。 (5) FCM 收集 10 000 个 细胞的 单参数 直方图 ,与 同质对 照对比 ,以 荧光数 增加则 评 估标记 效果。 MRP 表 达检测 (1) 5X105 个细胞 离心后 悬浮于 lmL 的 FACS 渗透性 贮液中 ,室温 lOmin。 (2) 力卩 1.5pg 鼠抗 MRP 的单克 隆抗体 MRPPrl, 室温 60min。 (3) PBS 洗 涤细胞 1 次, 重悬于 lmL 的 PBS 中。 (4) 加 lOfiL FITC 标记的 抗小鼠 IgG, 混匀 ,冰 上孵育 20~30min。 (5) PBS 洗 涤细胞 2 次, 重悬于 0.5mL 的 PBS 中。 (6) 收集 10 000 个 细胞得 单参数 直方图 ,与同 质对照 对比, 以荧光 数增加 则评估 标记 效果。 3. 方 法评注 (1) 由于 MDR1 和 MRP 两个 泵的活 动都是 耗能的 过程, 所以建 议使用 含高能 ATP 的 培养基 ,一 些非糖 培养基 (如 1640) 的使 用将会 导致它 们流出 活性的 丢失。 (2) 细 胞洗涤 或底物 与抗体 孵育时 间超过 60min, 获 得的荧 光可能 没有生 物学意 义 ,所以 孵育时 间不可 太长。 (3) 实验 对照应 使用非 MDR1/MRP 表达 细胞或 使用很 强的阻 滞剂处 理后的 细胞。 第五节 单细胞 内细胞 因子产 物检测 流式细 胞仪不 仅可以 联合检 测细胞 内的细 胞因子 的水平 和细胞 表面的 标志物 ,而且 还可以 在单细 胞水平 同时分 析多种 细胞因 子产物 。检 测原理 是使细 胞内的 细胞因 子产物 与荧 光标记 的抗体 结合, 同时对 细胞表 面的标 志物进 行染色 ,然后 ,经流 式细胞 仪检测 获 得分析 资料。 • 966 • 1. 材料 人外周 血单个 核细胞 (PBMC) 细胞 培养基 无钙 、镁 离子的 PBS 4% 多聚甲 醛固定 缓冲液 渗透 缓冲液 (permeabilization buffer, PB) (5.0% 脱脂 奶粉, 0.5% 阜 角试, PBS 配制) 待 检测的 细胞因 子抗体 (一抗 ) 或 直接用 荧光标 记的抗 细胞因 子抗体 荧光素 标记的 抗抗体 (二抗 ) 细胞表 面标志 物抗体 为了在 培养过 程中刺 激细胞 产生细 胞因子 ,可根 据研究 的需要 向培养 基中加 入以下 任何一 种或多 种 分裂原 刺激物 共培养 5~24h, 如 5fig/mLPHA、 10ng/mLPMA、 lfig/mLionomycin、 5/ixg/mLLPS。 在培养 的最后 5~6h 还需 要向培 养基中 加入胞 外蛋白 质转运 抑制剂 ,使细 胞因子 在细胞 内积聚 以便检 测, 这种抑 制剂通 常为莫 能星素 (monensin), 终 浓度为 3pmol/L 可 获得较 满意的 效果。 2. 操 作步骤 使用 直接标 记抗体 的染色 步骤: (1) 取 (5 X 105 ) 〜 (10 x 105) 个 细胞用 3mL PBS 中洗涤 1 次, 重悬于 100/xL PBS 中。 (2) 加入 适量抗 带检测 的表面 标志物 的单克 隆抗体 (MAB), 使细胞 / 抗体于 4X: 暗 处孵 育结合 15~30min。 (3) 细胞用 3mL PBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200pL 固定缓 冲液中 ,常 温暗 处孵育 10min〇 (4) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200/uLPB 中, 常温暗 处孵育 lOmin, 加 入 细胞内 细胞因 子抗体 (0.5~2.0^g/mL)。 (5) 使细胞 / 抗体 于室温 暗处孵 育结合 30min。 (6) 用 PB 洗 涤细胞 3 次, 去除未 结合的 抗体。 (7) 细胞 重悬于 0.5 〜 lmL 的 PBS 中 ,上 FCM 检测。 使用未 标记的 抗体检 测表面 标志物 : (1) 取 (5X105) 〜 (l〇xi〇5) 细胞 ,用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200)iiL PBS 中。 (2) 加入 2 〜 5# 未标记 的抗待 检测的 表面标 志物的 抗体后 ,使 细胞 / 抗体于 4X: 暗 处孵 育结合 15 〜 30min。 (3) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200/iLPBS 中。 (4) 加入 2~5 吨荧光 素标记 的二抗 ,使 之与一 抗特异 性结合 。细胞 / 抗体于 4X: 暗 处孵 育结合 15~30min。 - (5) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 20(VLPBS 中。 (6) 加 入至少 1〇 倍量 的未标 记抗体 和同质 未标记 抗体, 4X: 暗处孵 育结合 30min。 • 967 . (7) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200/tzL 固定缓 冲液中 ,常 温暗处 lOmin。 (8) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200pLPB 中, 常温暗 处孵育 lOmin。 (9) 加入 荧光素 标记的 细胞内 细胞因 子抗体 (0.5~2.0pg/mL), 使细胞 / 抗 体于室 温 暗处孵 育结合 30min。 (10) 用 PB 洗 涤细胞 3 次, 去除未 结合的 抗体。 (11) 细胞 重悬于 0.5~lmL 的 PBS 中 ,上 FCM 检测。 使用未 标记抗 体直接 检测胞 内细胞 因子: (1) 取 (5xl〇5) 〜 (l〇xl〇5) 细胞 ,用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200;iL 固定 缓冲 液中, 室温暗 处孵育 lOmin。 (2) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200/uLPB 中 ,加入 未标记 的胞内 细胞因 子抗体 (0.5 — 2. O^g/mL), 使细胞 / 抗体 于室温 暗处孵 育结合 30min。 (3) 细胞用 3mLPBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200pLPB 中 ,加 入至少 10 倍量 的未标 记抗体 和同质 未标记 抗体, 4t: 暗处孵 育结合 30min。 (4) 细胞用 3mL PB 洗涤 2 次, 重悬于 200fxL PB 中 ,然 后再用 3mL PBS 中洗涤 1 次, 重悬于 200pLPB 中 ,加 入荧光 素标记 的胞内 细胞因 子抗体 (0.5~2.(Vg/mL), 使细胞 / 抗体 于室温 暗处孵 育结合 30min。 (5) 细胞用 3mL PB 洗涤 1 次, 重悬于 200/iL PBS 中 ,再用 3mL PBS 中洗涤 1 次, 重悬于 lOO^L PBS 中。 (6) 加入 适量荧 光素标 记的抗 待检测 的表面 标志物 的单克 隆抗体 (MAB) 后 ,使 细胞 / 抗体 于室温 暗处孵 育结合 15~30min。 (7) 用 PBS 洗 涤细胞 3 次 ,去除 未结合 的抗体 。细胞 重悬于 0.5~lmL 的 PBS 中, 上 FCM 检测。 3. 方 法评注 由 于长期 受分裂 原刺激 的细胞 (如 PBMC 与 PHA 共培养 24~48h) 的光散 射特性 发生 改变, 所以在 使用流 式细胞 仪研究 PBMC 的细胞 内细胞 因子时 ,分 析流式 细胞仪 获得 的散点 图时必 须使用 2 个门 ,即 传统上 使用的 FWD 对 SSC 的 光散射 门和免 疫散射 1 1 ( immunoscatter gating ) 〇 实验中 必须合 理地设 计阳性 对照和 同质对 照组。 龚建平 陈义发 主要参 考文献 Darzynkiewicz,Z., Gong, J., Juan, G. 1996. Cytometry of cyclin proteins. Cytometry, 25:1 〜 13. Gong, J.,Traganos, F. , Darzynkiewicz, Z. 1993. Expression of cyclins B and E in individual MOLT-4 cells and in stimulated human lymphcxrytes during their progression through the cell cycle. Int. J. Oncol., 3: 1037 〜 1042. • 968 • 第 十七章 细胞凋 亡的研 究方法 引 言 细 胞调亡 (apoptosis) 或程 序性细 胞死亡 (programmed cell death, PCD) 与 坏死是 两 种完全 不同的 细胞死 亡形式 。根 据死亡 细胞在 形态学 、生 物化学 和分子 生物学 上的差 别 ,可 以将这 两种细 胞死亡 形式区 别开来 。细 胞凋亡 是一种 生理性 细胞死 亡形式 ,以消 除损伤 、衰老 或突变 的细胞 。在多 细胞生 物的发 生和维 持细胞 平衡中 起着重 要作用 。凋 亡具有 其独特 的生物 学特性 ,在形 态上表 现为细 胞皱缩 、体 积缩小 、胞质 凝缩、 染色质 凝聚 、胞 质出芽 发泡并 形成由 胞膜包 裹的凋 亡小体 (apoptosis body)。 凋 亡的生 化特性 则主要 表现为 胞核内 染色质 DNA 恰好在 核小体 与核小 体的连 接部位 被切断 而降解 ,产 生不 同长度 但均为 180~200bp 整倍数 的寡聚 核小体 片段。 人们在 研究细 胞凋亡 的过程 中 ,正是 根据凋 亡细胞 的结构 与功能 的改变 ,或是 形态学 、生 物化 学和分 子生物 学等方 面 的改变 ,借助 于显微 镜观察 、流 式细胞 术或生 物化学 、免 疫化学 、组织 化学和 分子生 物学 的技术 ,总结 出了许 多种检 测细胞 凋亡的 方法。 下面将 分别介 绍常用 于细胞 凋亡研 究 的测定 方法。 第 一节细 胞凋亡 的形态 学研究 根 据凋亡 细胞固 有的形 态特征 ,人 们已经 设计了 许多不 同的细 胞凋亡 形态学 检测方 法 。使 用普通 光学显 微镜可 以直接 观察细 胞的大 小和凋 亡小体 ,也 可用带 电荷的 染料台 盼蓝 (Tryanblue) 使死细 胞着色 而活细 胞拒染 ,或用 染核的 吉姆萨 (Giemsa’s) 染色 后再 在光学 显微镜 下进行 观察。 使用透 射电镜 或扫描 电镜则 可以直 接观察 到凋亡 细胞出 芽发泡 、染色 质浓缩 、核靠 边现象 和凋亡 小体等 。非荧 光的酯 酶底物 ( 如二乙 基荧光 素, fluorescein diacetate) 和 Hoechst33342/Hoechst 33258 (HO) 等可被 活细胞 或凋亡 细胞 吸收, 前者水 解后能 产生很 强的绿 色荧光 ,后者 在紫外 光的激 发下可 以产生 蓝色荧 光 。碘 化丙锭 (propidiumiodide, PI) 只染死 细胞, 并在紫 外光下 呈红色 荧光。 PI 和 HO 双染后 ,通 过流式 细胞仪 分析, 就可以 把凋亡 细胞和 坏死细 胞区别 开来。 一、 普通光 学显微 镜观察 (一) 吉姆萨 染色法 1. 材料 细胞悬 液样本 • 969 • PBS ( 137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HP04 • 7H20, 1.4 mmol/L KH2P〇4) 吉姆 萨染料 组 织切片 脱水透 明的系 列试剂 普 通光学 显微镜 甩片机 2. 试 剂配制 吉姆 萨染色 液:称 取吉姆 萨染料 800mg, 加入 50mL 甲醇, 加温至 58X:, 搅拌约 2h 待染 料彻底 溶解后 ,缓 慢加入 50mL 甘油 ,充 分摇匀 ,置 37X: 温箱 中保温 8 〜 12h。 然后 置棕色 瓶中密 封保存 ,即为 吉姆萨 贮存液 ,一 般在 12 〜 24h 后即 可使用 。临 用时, 取 lmL 吉姆萨 原液与 10mL PBS 混合, 即为吉 姆萨工 作液。 3. 操 作步骤 (1) 细胞 悬液于 4t: 800Xg 离心 5~10min, 去上清 ,将 细胞 重悬于 PBS 中 ,调整 细胞 浓度为 (5Xl〇5)~(8xi〇5) 个 mL—1。 (2) 取 100~20(VL 细胞悬 液离心 甩片, 室温晾 干后甲 醇固定 lmin, 晾干。 (3) 在细胞 上滴加 1~2 滴吉姆 萨染色 工作液 覆盖玻 片中心 细胞区 ,室 温染色 5min〇 (4) 用低 压流水 轻轻洗 去染液 ,室 温过夜 。然后 用二甲 苯浸泡 3min, 去除 杂质, 载玻片 透明后 用树脂 封片。 (5) 在普 通光学 显微镜 下观察 细胞核 形态。 4. 方 法评注 可 观察到 凋亡细 胞的染 色质浓 缩并靠 近核膜 ,出 现核着 边现象 。也可 观察到 核膜裂 解 、染 色质分 割成块 状和凋 亡小体 等典型 的凋亡 形态。 (二) 苏木精 染色法 1. 附 加材料 苏木 精染液 (配 制同吉 姆萨染 色液) 含 1% (V/V) 盐酸的 80% 乙醇 2. 操 作步骤 (1) 细 胞悬液 800 Xg 离心 5min, 去上清 ,用 PBS 调 整细胞 浓度为 1X106 个 mL_1〇 (2) 取 100~200ML 细胞 悬液离 心甩片 ,室 温晾干 后用甲 醇固定 5min。 (3) 在玻片 上滴加 1 〜 2 滴苏木 精染液 覆盖玻 片中心 细胞区 ,室 温染色 lmin 后用低 压 流水轻 轻洗去 染液。 • 970 • (4) 在含 1% (W\〇 盐酸的 80% 酒精 中分化 10s, 低压流 水冲洗 lmin 后 晾干即 可 在普通 光学显 微镜下 观察。 3. 方 法评注 凋亡细 胞染色 质浓缩 、明 显呈 嗜碱性 而染成 深蓝色 ,并附 着在核 膜周边 ,有 时细胞 核固 缩碎裂 为数个 圆形的 颗粒状 结构。 二、 倒置显 微镜直 接观察 1. 材料 细胞悬 液样本 甩片机 倒 置显微 镜和普 通光学 显微镜 2. 操 作步骤 将含有 细胞的 24 孔 培养板 直接置 于倒置 显微镜 下观察 ,或者 将从外 周血、 组织中 分离 的细胞 悬液滴 甩片后 直接置 于倒置 显微镜 下观察 。观察 比较经 过诱导 的和未 诱导的 细胞 形态、 大小和 细胞凋 亡小体 的出现 。得 到满意 结果后 ,照 相并记 录实验 结果。 3. 方 法评注 凋亡 细胞体 积变小 、变形 ,细 胞膜 完整但 出现发 泡现象 ,细胞 凋亡晚 期可见 凋亡小 体 。而 坏死细 胞的体 积胀大 ,细胞 膜损坏 或裂解 成碎片 ,有时 可见呈 网状的 染色质 结构。 三 、电 子显微 镜观察 1. 材料 细胞悬 液样本 冰冷 PBS (137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HP04.7H20, 1.4mmol/L KH2P04) 包埋剂 、固 定剂 (戊 二醛) 锇酸 (1% 和 25%) 系列 丙酮梯 度溶液 组织 切片机 透 射电子 显微镜 2. 操 作步骤 (1) 于 4X: 80〇xg 离 心收集 (5xi〇5)~(8xi〇5) 个细胞 ,冷 PBS 洗涤 2 次。 (2) 将细胞 悬浮于 25% 锇酸中 ,固定 30min 以上, 再用冷 PBS 洗涤 2 次。 . 971 . (3) 将细胞 悬浮于 1% 锇酸中 ,固定 l~2h 后以 丙酮梯 度脱水 ,再 将细胞 置于丙 酮 / 包埋剂 (1:1) 中置换 30min。 (4) 用包埋 剂浸润 2h 后按常 规将细 胞包埋 、超 薄切片 、铀铅 染色。 (5) 在透射 电子显 微镜上 观察细 胞形态 、细 胞质及 细胞核 的变化 ,照 相并记 录实验 结果。 3. 方 法评注 凋亡 细胞体 积变小 ,细胞 质凝缩 ,细胞 核变小 ,染 色质浓 缩并凝 结成块 ,出 现染色 质沿核 膜内侧 排列的 现象。 内质网 稀疏并 与胞膜 融合形 成空泡 。杂细 胞凋亡 的晚期 ,细 胞 核裂解 为碎块 ,产 生凋亡 小体。 四、 凋亡细 胞的碘 化丙锭 (PI) 排斥 分析法 1. 原理 细 胞凋亡 过程中 ,由于 胞质和 核染色 质浓缩 、核 裂解, 产生凋 亡小体 ,使细 胞的光 散射 性质发 生相应 的变化 。因此 ,测定 光散射 的变化 是非常 简单的 凋亡分 析方法 。在细 胞凋亡 的早期 ,细 胞对前 向角光 散射的 能力显 著降低 ,而对 90° 角 光散射 的能力 增加或 没 有变化 。前向 角与细 胞大小 有关, 90° 角散 射与细 胞内部 结构, 特别是 染色质 的浓缩 而引 起的折 射率变 化有关 。在细 胞凋亡 的晚期 ,前向 角和右 向角光 散射的 信号均 降低。 因此, 可通过 流式细 胞仪测 定细胞 光散射 的变化 测定凋 亡细胞 。这 个方法 的显著 特点是 可与免 疫荧光 技术相 结合, 测定凋 亡细胞 的表型 •,也 可与细 胞的功 能分析 相结合 ,测定 线粒体 的电势 、溶 酶体质 子泵、 PI 排斥 或细胞 质膜对 HO 等染料 的渗透 能力。 但是, 前角光 散射降 低并不 是凋亡 细胞十 分特异 的标志 。细 胞的机 械损伤 、分离 的细胞 核以及 坏 死细胞 的前角 光散射 能力也 都会有 所降低 。而 且细胞 凋亡时 ,特 别是在 凋亡细 胞的晚 期, 一些细 胞表面 抗原可 能丢失 ,从而 使光散 射与免 疫荧光 技术相 结合测 定凋亡 细胞表 型 复杂化 。因 此必须 同时使 用至少 2 种以 上的细 胞凋亡 分析法 ,才 能准确 地鉴定 出凋亡 细胞 。带 有电荷 的染料 PI 不能 使活细 胞着色 ,只 能使坏 死细胞 着色; 而 HO 可 渗透过 细 胞质膜 ,使 活细胞 和凋亡 细胞的 DNA 染色 。经适 当波长 的紫外 光激发 , PI 和 HO 可 分别产 生红色 和蓝色 荧光。 下述方 法先用 PI 染色 ,再用 HO 染色 ,这样 ,坏死 细胞呈 PI 强阳 性染色 ,而 凋亡细 胞或活 细胞呈 HO 阳 性染色 。通 过流式 细胞仪 的分析 ,根据 各种细 胞光散 射的性 质不同 ,即 可把坏 死细胞 、凋 亡细胞 和活细 胞定量 地区分 开来。 2. 材料 细胞悬 液样本 细胞 固定液 (以 PBS 配制 25% 的乙醇 ) PI 贮液 (lmg/mL, 蒸馏水 溶解) PI 染色液 (用 PBS 将 PI 贮液 稀释至 2(Vg/mL) HOPt 液 (lmmol/L, 蒸溜水 溶解) HO 染色液 ( 用无钙 、镁 离子的 PBS 按 1:4 稀释 HO 贮液) . 972 • 流式 细胞仪 3. 操 作步骤 (1) 细胞离 心去上 清后, 将细胞 悬浮于 50/xLPI 中。 (2) 加入 lOOpLHO 染色液 ,混匀 ,置冰 中染色 30min。 (3) 加入 1.85mLHO 染色液 ,混 匀。 (4) 加入 50pLHO 染色液 ,混匀 ,置 冰中染 色至少 30min。 细胞 可在此 溶液中 保存 一周。 (5) 进 行流式 细胞仪 分析。 PI 和 H ◦均 可使用 340nm 紫外 光激发 ,其荧 光分别 为红色 (>620nm) 和蓝色 (480 ±20nm)。 因此, 可使用 适当的 滤光片 和二色 镜测定 HO 的蓝色 荧光, 使用长 程滤光 片测定 PI 的红色 荧光。 4. 方 法评注 对照活 细胞的 HO 蓝 色荧光 最强; 早期凋 亡细胞 由于其 DNA 降解 和丢失 ,其 HO 蓝色荧 光较弱 ,也有 很弱的 PI 红 色荧光 。晚 期凋亡 细胞的 PI 红色荧 光加强 。坏 死细胞 PI 红色荧 光最强 ,而 HO 蓝色荧 光较弱 。应 注意本 方法不 能将凋 亡细胞 与坏死 细胞和 受 机械损 伤的细 胞严格 地区别 开来。 可使用 不加染 料的正 常培育 细胞作 为阴性 对照, 地塞米 松处理 (1 卩 mol/L, 3~4h) 的 小鼠胸 腺细胞 作为阳 性对照 。先固 定细胞 ,再 进行 PI 染色 ,然后 根据凋 亡细胞 、坏 死细胞 和活细 胞光散 射性质 的不同 ,鉴 定凋亡 细胞。 第 二节细 胞凋亡 的生物 化学研 究方法 细胞 凋亡的 主要生 物化学 特征是 其染色 质发生 浓缩, 染色质 DNA 在 核小体 之间的 连接 处断裂 ,形成 50 〜 300kb 长的 DNA 片段或 180~200bp 整 数倍的 寡核苷 酸片段 ,在 凝胶 电泳上 表现为 梯形电 泳图谱 (DNA Ladder)。 细胞经 处理后 ,采 用常 规方法 分离提 纯 DNA 后 ,进行 琼脂糖 凝胶电 泳和溴 化乙锭 染色, 在凋亡 细胞群 中则可 观察到 典型的 DNA Ladder。 琼脂糖 凝胶电 泳检测 DNA 梯带 是用来 检测凋 亡最常 用的生 化方法 ,被认 为是 凋亡领 域里的 生化里 程碑。 一 、凋亡 细胞 DNA 片段 的检测 (一) 分离 DNA 的琼 脂糖凝 胶电泳 1. 材料 待检 测的细 胞样本 Tris- 缓 冲盐液 (TBS) (10mm〇l/LTris-HClpH7.5, 150mmol/LNaCl) 提取 缓冲液 (10mmol/LTris-HClpH8.0, 0.1mmol/LEDTApH8.0, 2(Vg/mL RNA 酶, 0.5% SDS) . 973 . 25mg/mL 蛋白酶 K 水溶液 氯 仿和酚 / 氯仿 (1:1 V/V, 贮存于 41C) 纯 乙醇和 70% 乙醇 3mol/L 乙 酸钠, pH5.2 TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L EDTA) Lambda d III 消化产 物 Marker (600ng/pL) 和 123bp Ladder 梯带 Marker (ijig/ fiL) 漠 化乙锭 (EB) (50/xg/lOOmL, ddH20) 无菌去 离子水 5XTBE (Tris54g, 硼酸 27.5g, EDTA4.65g, 力 口水至 1L) 琼脂糖 凝胶电 泳所需 的试剂 和设备 2. 操 作步骤 DNA 提取: (1) 取 20X 106 个细胞 1 500r/min 离心, 去上清 后重新 悬浮于 与原培 养基体 积相当 的 1XTBS 中 ,再 次离心 去上清 ,加人 0.5mL 提取 缓冲液 ,移入 EP 管。 (2) 37X: 孵育 lh, 加 4/iL 蛋白酶 K 溶液 /mL, 50T: 孵育 3h。 (3) 加入 0.5mL 酚 / 氯仿, 快速来 回颠倒 几次。 (4) 13 OOOr/min 离心 lmin。 小 心取上 面含有 DNA 的 液相。 (5) 估计 体积, 加等体 积的酚 / 氯仿, 快速来 回颠倒 几次。 (6) 重复第 4、 5 步 , 13 OOOr/min 离心 lmin。 小 心取上 面含有 DNA 的 液相。 (7) 加 等体积 的氯仿 于液相 样本中 ,颠倒 混合, 13 OOOr/min 离心 lmin。 (8) 取液相 ,加 入两倍 体积冰 冷的纯 乙醇和 1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠 ,冰浴 I 30min〇 (9) 4亡13 00〇17111丨11离心1〇111丨11,取上清重浮于111^的70%乙醇中。 (10) 4'^ 13 00〇1'/111丨11离心1〇111丨11,尽可能取上清。 (11) 常 温干燥 30min 左右, 重浮于 50;xL 的 1XTE。 (12) 于 260nm 和 280nm 测定 DNA 含量。 凝胶 电泳: (1) 制备 1.8% 的琼脂 糖凝胶 ,将 胶转 移到含 1XTBE 缓冲液 的电泳 槽中。 (2) 将 lfiL 的 123bpLadder 与 ll^L 的 1XTE 混合 ,加 5/^L 加样缓 冲液后 点在第 1 泳道; 将 2^1^^如伟>2〇1111与1〇4的1\丁£混合,加5/^的加样缓冲液后点在第 2 泳道。 (3) 取 10网 的 DNA 样品加 2/iL 上样 缓冲液 ,力卩 1XTE 使 体积达 2(VL。 (4) 依 次点样 ,以 lOV/cm 电泳 2 〜 3h。 (5) 用溴 化乙锭 (50^g/100mL, ddH20) 对 胶染色 30min, 用 ddH20 使 胶脱色 3h 就可 照相。 • 974 • 1. 附 加材料 (二) 全细 胞的琼 脂糖凝 胶电泳 RNase 溶液 (50mg/mL RNase, 10mmol/L Tris-HCl pH7.5, 15mmol/L NaCl, 95X: 加热 15min 灭活 DNase, - 20X: 冻存) 含 25% SDS 的 1XTBE 50^L/mL 蛋白酶 K 溶液 手术刀 2. 操 作步骤 (1) 依实验 要求处 理细胞 ,取 IX 1〇6 细胞 离心, 去除全 部上清 ,细 胞可立 即使用 或 保存于 4X:。 (2) 细胞 重悬于 15/iL 的无 菌去离 子水中 ,振荡 Is, 力卩 9/止 点样缓 冲液和 6|iiLRNase 溶液 ,常温 留置约 30min。 (3) 同时准 备凝胶 : ① 制备 1.8% 的琼脂 糖凝胶 ,将 胶转 移到含 1XTBE 缓冲液 的电泳 槽中。 ② 用手 术刀切 除样本 孔上方 的凝胶 部分。 ③ 用含 25%SDS 的 1XTBE 制备 0.8% 的琼脂 糖溶液 ,加 热达 55X: 溶解 ,加入 5(VL/mL 的 蛋白酶 K 溶液, 倒入凝 胶上被 切除的 间隙。 ④ 将凝 胶置入 电泳槽 并倒入 1 x TBE。 (4) 将 1/iL 的 123bp Ladder 与 ll^L 的 1 x TE 混合 ,加 5pL 的加样 缓冲液 后点在 标准 1 泳道; 将 2pL Lambda Hind III 与 lOpL 的 1 x TE 混合 ,加 5pL 的 加样缓 冲液后 点 在标准 2 泳道。 (5) 点样 25/^L, 以 2V/cm 电泳 lh, 然后以 lOV/cm 再电泳 3h。 (6) 用溴 化乙锭 (50;ig/100mL, ddH20) 对 胶染色 30min, 用 ddH20 使 胶脱色 3h 就可 照相。 二、 细胞群 染色体 DNA 断裂 的测定 (一) 细胞群 染色体 DNA 断裂 的测定 方法一 1. 材料 待检 测的细 胞样本 PBS ( 137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HP04 • 7H20, 1.4 mmol/L KH2P〇4, pH7.4) 细胞 裂解液 (lOmmol/L Tris-HCl pH8.0, lOmmol/L NaCl, lOmmol/L EDTA, 100/ig/mL 蛋白酶 K, 1%SDS) 苯酚 / 氯仿 (1:1)、 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1)、 氯仿 • 975 • 3mol/L 乙 酸钠, pH5.2 -20X: 冰冻无 水乙醇 10mg/mL RNase TE 缓冲液 (10mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L EDTA) lOObp Ladder 梯带 Marker 无菌去 离子水 50 x TAE 电泳 缓冲液 ( Tris 242g, 冰乙酸 57. lmL, 0.5mol/L EDTA pH8.0 lOOmL, 加 蒸馏水 定容到 1L) 37X: 水浴 台 式高速 离心机 琼脂糖 凝胶电 泳所需 的试剂 和设备 2. 操 作步骤 (1) 细胞经 PBS 洗涤 1 次 ,用 1.5mL 微量 离心管 80〇xg 离心 5min, 去除 上清, 沉淀为 (5X105) 〜 (2X105) 个 细胞。 (2) 加入 50ML 细胞 裂解液 ,混匀 ,于 37X: 水浴至 混合物 清亮, 室温下 12 000 r/min 离心 5min, 将上清 转移至 另一微 量离心 管中。 (3) 以 等体积 的苯酚 / 氯仿 (1:1)、 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1) 和氯仿 各抽提 一次 。 (4) 在上清 中加入 1/10 体积 3mol/L 乙 酸钠和 2 倍体积 冷乙醇 ,于 - 20X: 沉淀 过夜。 (5) 于 -10X: 12 000r/min 离心 10min, 收 集沉淀 。将沉 淀溶于 20pLTE 缓 冲液, 加入 lpL RNase, 37X: 保温 lh。 (6) 加入 4^L 加样 缓冲液 ,混匀 , 立即加 到含有 0.4/ig/mL 溴化 乙锭的 1%~2% 的 琼 脂糖凝 胶的样 品孔中 ,室温 、恒流 75mA, 于 1XTAE 缓冲液 中电泳 1 〜 2h, 紫外灯 下照 相和记 录实验 结果。 3. 方 法评注 实验过 程中, 应防止 DNase 的 作用和 剧烈震 荡造成 DNA 断裂 。本实 验在细 胞裂解 后进 行离心 ,因而 一些大 分子核 蛋白被 除去。 若需要 保留全 部细胞 DNA, 则可 采用后 面 的方法 进行。 (二) 细胞群 染色体 DNA 断裂 的测定 方法二 1. 附 加材料 含 0 • 03mol/ L Tris 的 PBS, pH7 . 4 细胞 裂解液 (50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 0.5% SDS, 0.5mol/L EDTA) 0.5mg/mL RNase lOmmol/L EDTA, pH8.0 • 976 • 内切酶 Ms/> I 水解的 pBR322 DNA 相对分 子质量 标准品 2. 操 作步骤 (1) 用含 0.03mol/LTris-HCl 的 PBS (pH7.4) 将待测 细胞洗 3 次 。在 1.5mL 微 量离心 管中离 心沉淀 (5X105) 〜 (2X106) 个细胞 ,去 上清。 (2) 加入 20^L 细胞 裂解液 ,混匀 ,于 50t: 水 浴水解 lh。 加 lO^LRNase, 混匀, 于 50X: 水浴 再水解 lh。 (3) 将 DNA 提取物 加热到 70X:, 加 lOpL 已融化 的样品 缓冲液 (含 0.8% 琼脂 糖 ), 混匀, 立即加 入已制 备好的 1% 琼 脂糖凝 胶样品 孔中。 (4) 待凝胶 凝固后 ,置 1XTAE 电泳缓 冲液中 ,室温 、恒流 75mA, 电泳 1 〜 2h, 以 Ms/> I 水解的 pBR322 DNA 为 相对分 子质量 标准。 (5) 电泳 结束后 ,将 凝胶浸 入溴化 乙锭溶 液染色 5min, 以蒸馏 水脱色 2 次, 5min/ 次 。然后 于紫外 灯下照 相并记 录实验 结果。 (三) 大分子 染色体 DNA 断裂 的测定 1. 附 加材料 lOmg/mL 蛋白酶 K 10% SDS 4mg/mL PMSF 全套脉 冲电场 凝胶电 泳装置 2. 操 作步骤 (1) 用冰 预冷的 PBS 将 5X107 个 细胞洗 3 次 ,重悬 浮于细 胞裂解 液中。 (2) 用细胞 裂解液 配制等 体积的 1% 琼脂糖 凝胶, 将熔化 的琼脂 糖凝胶 冷却至 421C。 (3) 将细胞 悬液温 热到同 样温度 ,立 即与熔 化的琼 脂糖凝 胶混合 ,用 玻璃棒 搅拌均 匀 。将溶 化的混 合物吸 到准备 好的凝 胶模中 (50 〜 100/zL) 中 。置 4t: 中 使琼脂 糖凝胶 凝固。 (4) 将已凝 固的琼 脂糖块 从模块 中取出 ,置于 平皿上 ,用刀 片切成 lcmx lcm 的小 块 (约 45/iL, 含 1.5X106 个细胞 ,可 获得 5 〜 10/ig 的 DNA)。 (5) 将凝胶 转移至 50 倍 体积含 lmg/mL 蛋白酶 K 和 1% SDS 的 细胞裂 解液中 ,于 50X: 继 续温育 4h。 (6) 将凝胶 块置于 50 倍 体积含 40/zg/mLPMSF 的 TE (pH7.6) 中 ,于 50X: 温育 lh 后 ,用 等体积 的缓冲 液替换 原来的 缓冲液 ,于 50X: 继 续温育 lh。 (7) 用一 次性吸 头直接 将凝胶 块塞入 脉冲电 场凝胶 的加样 孔中。 如 所使用 的脉冲 电场凝 胶装置 难以将 凝胶块 塞入加 样孔中 ,可将 凝胶块 加热至 65X: 熔化 ,再将 熔化 后的琼 脂糖沿 着一次 性的吸 头外壁 倒进凝 胶加样 孔中。 (8) 按所 使用的 脉冲电 场凝胶 电泳装 置及其 操作指 南进行 电泳。 电泳后 ,凝 胶以溴 • 977 • 化乙 锭染色 ,水 脱色。 在紫外 灯下照 相并记 录实验 结果。 第 三节细 胞凋亡 的免疫 化学分 析方法 凋亡细 胞染色 体双链 DNA 可与核 组蛋白 H2A、 H2B、 H3 和 H4 紧密 结合, 形成复 合物, 保护其 DNA 不被核 酸内切 酶降解 。在细 胞凋亡 的早期 ,只 有少数 细胞的 DNA 发 生断裂 ,用生 物化学 方法很 难测出 DNALadder。 现介绍 凋亡细 胞断裂 核小体 DNA 的 酶 联免疫 吸附法 测定。 1. 原理 采 用抗组 蛋白抗 体和抗 DNA 抗体 夹心法 (sandwich ELISA) 进 行测定 ,其 原理与 常规 ELISA —致 。测 定时首 先用抗 组蛋白 抗体包 被酶标 测定板 ,接 着用封 闭试剂 封闭, 然后 加入含 有核小 体和寡 聚核小 体的凋 亡细胞 裂解物 ,核 小体则 可与抗 组蛋白 抗体结 合 。最后 ,加 入过氧 化物酶 (POD) 标 记的抗 DNA 抗体, 此抗体 可与已 固定在 酶标板 上的核 小体或 寡聚核 小体中 DNA 结合 ,在 POD 底物 ( 二氨基 联苯, DAB) 存在下 ,产 生颜色 反应, 通过酶 标测定 仪分析 ,即可 定量测 定凋亡 细胞。 抗组蛋 白抗体 可与人 、小 鼠 、大鼠 、仓鼠 、牛 、猪和 果蝇的 组蛋白 结合, POD 标 记的抗 DNA 抗体 可与单 链的和 双链的 DNA 结合 。据此 设计的 抗体夹 心酶联 免疫吸 附分析 法可以 测定核 小体单 体和各 种不同 大小的 核小体 聚合物 ,因 而可以 测定许 多不同 的培养 细胞株 或从动 物组织 中分离 细胞的 调亡。 目前, Boehringer Mannheim 公 司已经 有试剂 盒供应 ,下面 以此试 剂盒为 例, 介绍这 一测定 方法。 2. 材料 待测细 胞样本 抗组蛋 白抗体 ( 在冻干 粉中加 lmL 双蒸 水彻底 溶解) POD- 抗 DNA 抗体 ( 在冻干 粉中加 lmL 双蒸 水彻底 溶解) O.lmol/L 碳酸钠 缓冲液 ( 碳酸钠 13.6g, 碳 酸氢钠 7.35g, ddH2O 950mL, 调节至 pH9.2, 加 蒸馏水 定容到 lOOOmL) 包被 缓冲液 (1/xL 抗 组蛋白 抗体加 9fiL 碳酸钠 缓冲液 ,临用 前配制 ) 洗涤 缓冲液 (含 0.05% 叠 氮钠的 PBS) 封闭 缓冲液 (0.05% Tween-20, lmmol/LEDTA, 0.25% BSA 或 5% 脱脂 奶粉, 0.05% 叠氮钠 ) 酶 联抗体 复合物 工作液 (1/iLPOD- 抗 DNA 抗体加 9fiL 封闭 缓冲液 ,临用 前制备 ) 底物 缓冲液 (50~75mgDAB 溶于 100mL0.05mol/LTris-HClpH7.4 中 ,在 室温暗 处震荡 溶解, 用滤纸 过滤后 ,于 4X: 暗 处保存 。临 用前加 0.003% 〜 0.010% H2〇2) lpg/mL、 2;ig/mL、 4fig/mL 的喜树 碱溶液 (称量 400pg 喜树 碱溶于 100mL 培养基 为 4pg/mL, 再用培 养基分 别稀释 2 倍为 2pg/mL 和 4 倍为 lpg/mL ) 细胞 裂解液 (50mmol/LTris-HClpH8.0, 0_5%SDS, 0.5mol/LEDTA) 96 孔或 24 孔酶标 测定板 • 978 . 酶标 分析仪 平台 震荡器 3. 操 作步骤 待测样 品制备 : (1) 以 HL60 细胞 (髓性 白血病 细胞株 ) 为例 。将 对数生 长期的 HL-60 细胞 用培养 基 稀释至 lXl〇5/mL, 装于 Eppendorf 管中 ,每 管加入 0.5mL 细胞 (5><1〇4)。 (2) 每 管中分 别加入 500/uL 含有 O^g/mL、 lpg/mL、 2^g/mL 和 4/ng/mL 的 喜树碱 备用, 其中含 〇# 的为阴 性对照 (活 细胞、 未处理 的细胞 )。 (3) 置 37X: 的 C〇2 孵箱 中培养 4h。 (4) 于 1500r/min (200〇xg) 离心 5min, 收 集细胞 ,除去 上清。 将细胞 重悬于 lmL 培 养基中 ,同法 离心后 ,将细 胞重新 悬浮于 细胞裂 解液中 ,于 4X: 裂解 30min。 (5) 于 1500r/min (2000Xg) 离心 lOmin, 小 心吸出 400/xL 上清 ( 避免吸 出细胞 核 ,其中 含有未 降解的 DNA), 与 3. 6mL 细 胞裂解 液混合 (1:10 稀释, lmL 相当于 1X104 个细胞 ), 立即用 于核小 体的酶 标测定 ,或 分装 贮存于 -201C 备用。 抗 体夹心 ELISA: (1) 在酶 标板中 ,每 孔加入 100/iL 包被缓 冲液, 置室温 lh, 或 4t: 过夜。 (2) 除 去包被 缓冲液 ,每 孔加入 200;xL 细 胞裂解 缓冲液 ,室 温封闭 30min。 (3) 除 去裂解 缓冲液 ,每 孔加入 250pL 封闭缓 冲液, 再于室 温封闭 3〇min。 (4) 每 孔加入 250pL 洗涤 缓冲液 ,反 复洗涤 3 次。 (5) 每 孔加入 100/uL 待测样 品溶液 ,另设 2 孔 只加细 胞裂解 缓冲液 ,作为 测定本 底的空 白对照 ,室 温孵育 90min 后 如步骤 (4) 洗涤 3 次。 (6) 每 孔加入 lOO^L 酶标抗 DNA 抗 体溶液 (空 白对照 孔不加 ), 室 温孵育 90min 后 如步骤 (4) 洗涤 3 次。 (7) 每 孔加入 lOOpL 底物 缓冲液 ,置室 温暗处 反应约 10 〜 20min 后 ,以底 物缓冲 液 为对照 ,使用 酶标分 析仪, 于波长 405nm 处 测定各 孔光密 度值。 如果样 品孔光 密度值 超过了 仪器测 量范围 ,则 要将 其稀释 后再测 。相 当于活 细胞的 阴性对 照孔也 必须稀 释相同 的倍数 。减少 底物反 应时间 ,也 可使光 密度值 降低。 4. 方 法评注 待测 样品光 密度值 等于从 3 个 待测样 品平行 孔的光 密度值 中减去 本底光 密度值 ,代 表正在 死亡和 已经死 亡的细 胞数目 。凋 亡细 胞以富 集系数 (enrichment factor, EF) 表 示, EF 值 的高低 代表释 放到胞 质中的 核小体 单体或 寡聚物 的多少 ,等于 待测样 品光密 度值 除以阴 性对照 孔的光 密度值 。计 算公式 如下: 待测样 品光密 度值- 本底光 密度值 (死 细胞) 阴性对 照管光 密度值 (活 细胞) 在 使用不 同的细 胞和不 同的凋 亡诱导 剂时, ELISA 所 需要的 细胞数 目不同 ,因此 细 胞数目 应当通 过预实 验确定 。实 验中本 底的光 密度值 因实验 条件不 同会有 所变化 ,在 一般条 件下, 加入底 物反应 15min 后 ,本 底光密 度值应 小于样 品光密 度值的 1/10。 阴 • 979 • 性对 照细胞 (不加 凋亡诱 导剂的 细胞) 因不同 的细胞 培养条 件会有 所不同 ,通常 在达到 对数 生长期 的培养 细胞中 ,约有 3%~8% 的死 亡细胞 。在 ELISA 中这些 死细胞 会使光 密度值 增加, 因此要 严格控 制培养 细胞中 死细胞 的数目 。由 于阴性 对照细 胞会引 起光密 度值 增加, 因此一 般不需 要另设 阳性对 照细胞 。本实 验的影 响因素 主要包 括细胞 凋亡的 动力学 、凋 亡诱导 剂和所 实验的 全部细 胞中凋 亡细胞 的数量 。在 HL-60/CAM 标 准系统 中 ,抗 体夹心 ELISA 最低 可测定 5 X 1〇2 个细胞 /mL 中 的凋亡 细胞。 第四 节细胞 凋亡的 分子生 物学研 究方法 凋 亡细胞 染色体 DNA 的断裂 是个渐 进的分 阶段的 过程。 染色体 DNA 首先 在内源 性的 核酸水 解酶的 作用下 降解为 50~300kb 的 大片段 ,然 后大约 30% 的 染色质 DNA 在 Ca2 + 和 Mg2+ 依赖 的核酸 内切酶 作用下 ,在 核小体 单位之 间被随 机切断 ,形成 180 〜 200bp 核小体 DNA 多 聚体。 DNA 双链断 裂或只 要一条 链上出 现缺口 ,就 产生的 一系列 DNA 的 3'-OH 末端 。在 脱氧核 糖核苷 酸末端 转移酶 (TdT) 的作 用下, 脱氧核 糖核苷 酸和 荧光素 、过氧 化物酶 、碱 性磷酸 化酶或 生物素 形成的 衍生物 标记到 DNA 的 3'- 末 端 ,从 而可检 测细胞 的凋亡 。这 类方法 一般称 为脱氧 核糖核 苷酸末 端转移 酶介导 的缺口 末端标 i 己法 ( terminal- deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling, TUNEL)。 由于 正常的 或正在 增值的 细胞几 乎没有 DNA 的断裂 ,因 而没有 3'-OH 形成 ,很 少能够 被染色 。低相 对分子 质量的 DNA 分离后 ,也 可使用 DNA 聚合酶 进行缺 口翻译 (nick translation), 使低相 对分子 质量的 DNA 标记或 染色, 然后分 析调亡 细胞。 TUNEL 或 缺口 翻译法 实际上 是分子 生物学 与形态 学相结 合的研 究方法 ,对完 整的单 个凋亡 细胞核 或凋 亡小体 进行原 位染色 ,能准 确的反 应细胞 凋亡最 典型的 生物化 学和形 态特征 。它可 用于石 蜡包埋 组织切 片、‘ 冰冻组 织切片 、培养 细胞和 从组织 中分离 的细胞 的凋亡 测定, 并 可检测 出极少 量的凋 亡细胞 ,灵 敏度远 比一般 的组织 化学和 生物化 学测定 法要高 ,因 而在 细胞凋 亡的研 究中已 被广泛 采用。 ―、 过 氧化物 酶标记 测定法 1. 原理 脱 氧核糖 核苷酸 地高辛 衍生物 (digoxigenin-11-dUTP) 在 TdT 酶的 作用下 ,可以 掺入到 凋亡细 胞双链 或单链 DNA 的 3'-OH 末端 ,与 DNA 形 成异多 聚体; 并可 与连接 了 报告酶 (过氧 化物酶 或碱性 磷酸酶 ) 的抗地 高辛抗 体结合 。在 合适 底物的 存在下 ,过 氧化物 酶可产 生很强 的颜色 反应, 特异准 确的定 位出正 在凋亡 的细胞 ,因 而可在 普通光 学显微 镜下进 行观察 。本 方法可 以用于 福尔马 林固定 的石蜡 包埋组 织切片 、冰冻 切片和 培 养的或 从组织 中分离 的细胞 的凋亡 测定。 2. 材料 待测细 胞样本 PBS ( 137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HPQ4 * 7H20, 1.4 • 980 • mmol/L KH2P04, pH7.4) 蛋白酶 K (PBS 稀释至 200;xg/mL) 含 2% 过 氧化氢 的磷酸 缓冲液 (30% 过 氧化氢 2. OmL, PBS 98mL) 10 x TdT 酶 缓冲液 ( lmol/L 二甲脾 酸钠, 10mmol/L CoCl2, lmmol/L DTT, 500pg/mlBSA, 新鲜 配制) TdT 酶 反应液 (l〇xTdT 酶 缓冲液 10pL, 200pmol/Ldigoxigenin-ll-dUTPl(VL, 20U 末端 转移酶 ,补 H20 至 lOO^L。 新 鲜配制 ,置 于冰上 备用) 洗 涤与终 止反应 缓冲液 ( 氯化钠 17.4g、 柠 檬酸钠 8.82g、 加蒸 馏水至 lOOOmL) 0.05% 二氨 基联苯 (DAB) 溶液 (DAB 5mg, PBS 10mL, 临用前 过滤后 ,加 过氧 化氢至 0.02%) 0.5%甲基绿(甲基绿0.58,0.1111〇1/1^乙酸钠1001111,?只4.0) 100% 丁醇, 100%、 95%、 90%、 80% 和 70% 梯 度乙醇 ,二 甲苯, 10% 中 性甲醛 溶液 ,乙酸 ,松 香水 过氧 化物酶 标记的 抗地高 辛抗体 (ONCOR) 染色缸 ,湿盒 ,恒温 水浴, 恒温箱 ,光学 显微镜 3. 操 作步骤 标本预 处理: (1) 石蜡包 埋的组 织切片 预处理 :将组 织切片 置于染 色缸中 ,用二 甲苯洗 2 次 ,每 次 5min。 用无水 乙醇洗 2 次 ,每次 3min。 用 PBS 洗 5min。 加入 蛋白酶 K 溶液 (2(Vg/mL), 于室 温水解 15rnin, 去除组 织蛋白 。用蒸 馏水洗 4 次 ,每次 2min 后 备用。 (2) 冰 冻组织 预处理 :将冰 冻组织 切片置 10% 中性 甲醛中 ,于室 温固定 lOmin, 去 除多 余液体 。用 PBS 洗 2 次 ,每次 5min。 置乙醇 / 乙酸 (2:1) 的 溶液中 ,于 -20X: 处 理 5min, 去除多 余液体 。用 PBS 洗 2 次 ,每次 5min 后 备用。 (3) 培 养的或 从组织 分离的 细胞的 预处理 :将约 5 X107 个 /mL 细胞于 4% 中性甲 醛室温 中固定 lOmin。 在 载玻片 上滴加 50 〜 lOOfiL 细胞悬 液并使 之干燥 。用 PBS 洗 2 次 ,每次 5min 后 备用。 预处 理后标 本检测 方法: (4) 在染 色缸中 加入含 2% 过氧 化氢的 PBS, 于室 温反应 5min。 用 PBS 洗 2 次 ,每 次 5min。 用滤 纸小心 吸去载 玻片上 组织周 围的多 余液体 ,立 即在切 片上加 2 滴 TdT 酶 缓冲液 ,置 室温 l~5min。 (5) 用 滤纸小 心吸去 切片周 围的多 余液体 ,立即 在切片 上滴加 54;xL TdT 酶反应 液 ,置湿 盒中于 37X: 反应 lh (注 意:阴 性对照 加不含 TdT 酶的 反应液 )。 (6) 将切片 置于染 色缸中 ,加 入已 预热到 37T: 的洗 涤与终 止反应 缓冲液 ,于 37t: 保温 30min, 每 lOmin 将载 玻片轻 轻提起 和放下 1 次 ,使液 体轻微 搅动。 (7) 组织 切片用 PBS 洗 3 次 ,每次 5min。 直接 在切片 上滴加 2 滴过 氧化物 酶标记 的 抗地高 辛抗体 ,于湿 盒中室 温反应 30min。 用 PBS 洗 4 次 ,每次 5min。 (8) 在组织 切片上 直接滴 加新鲜 配制的 0.05% DAB 溶液 ,室 温显色 3 〜 6min。 用 蒸 馏水洗 4 次 ,前 3 次每次 lmin, 最后 1 次 5min。 . 981 . (9) 于室 温用甲 基绿进 行负染 lOmin。 用蒸 馏水洗 3 次 ,前 2 次将载 玻片提 起放下 10 次 ,最后 1 次静置 30s。 依 同样方 法再用 100% 正 丁醇洗 3 次。 用二甲 苯脱水 3 次, 每次 2min, 封片、 干燥后 ,在光 学显微 镜下观 察并记 录实验 结果。 4. 方 法评注 毛地黄 植物是 地高辛 的惟一 来源, 在所有 动物组 织中几 乎不存 在能与 抗地高 辛抗体 结合 的配体 ,因而 非特异 性反应 很低。 抗地高 辛的特 异性抗 体与脊 椎动物 留体激 素的交 叉反 应不到 1%。 若此 抗体的 Fc 部分通 过蛋白 酶水解 除去后 ,则可 完全排 除细胞 Fc 受 体 非特异 性的吸 附作用 。本 方法可 以用于 福尔马 林固定 的石蜡 包埋组 织切片 、冰 冻切片 和培 养的或 从组织 中分离 的细胞 的凋亡 测定。 一定 要设立 阳性和 阴性细 胞对照 。阳 性对照 的切片 可使用 DNase I 部分降 解的标 本 ,阳 性细胞 对照可 使用地 塞米松 (lpmol/L) 处理 3 〜 4h 的大、 小鼠胸 腺细胞 或人外 周血淋 巴细胞 。阴 性对 照不加 TdT 酶 ,其余 步骤与 实验组 相同。 二 、荧光 素标记 测定法 1. 原理 脱 氧核糖 核酸地 高辛衍 生物在 TdT 酶的 作用下 ,可以 掺入到 凋亡细 胞双链 或单链 DNA 的 3'-OH 末端 ,与 DNA 形成异 多聚体 ,与 荧光 素连接 的抗地 高辛抗 体可与 反应部 位结合 。当 遇到 波长为 494nm 的激 发光时 ,荧光 素产生 波长为 523nm 的 发射光 ,从而 可在 荧光显 微镜下 观察计 数或使 用流式 细胞仪 进行定 量测定 。本法 可用于 福尔马 林固定 的石蜡 包埋组 织切片 、冰 冻组织 切片、 培养的 细胞和 从组织 中分离 的细胞 的凋亡 测定。 2. 附 加材料 含 1% 副 甲醛的 PBS, pH7.4 荧光素 (FITC) 标 记的抗 地高辛 抗体工 作溶液 (含 1%BSA 的 PBS56^L, 荧光素 标记的 抗地高 辛抗体 49pL, 置于冰 上备用 ) 含 0.1% Triton X-100 的 PBS (Triton X-100 1.3mL, PBS 128.7mL, 41C 保 存可用 1 个月) PI 染色液 (PI50pg, RNase0.5mg, PBSlOmL) 荧 光显微 镜或流 式细胞 分析仪 3. 操 作步骤 (1) 将 (1X106) 〜 (2X106) 细胞 悬浮于 0.5mLPBS 中 ,用 吸管将 此细胞 悬液加 到含 1% 副 甲醛的 PBS 中 ,混匀 ,置冰 上固定 15min。 (2) 4t: lOOOr/min 离心 5min, 沉 淀重新 悬浮于 lOmLPBS 中 ,再以 同样速 度离心 5min, 去 上清。 (3) 将细胞 悬浮于 70% 冷 乙醇中 ,置 -20X: 保 存备用 。细 胞可在 此条件 下保存 5min〇 • 982 • (4) 细胞 悬液于 4X: lOOOr/min 离心 5min, 去上清 ,加 lmLPBS 使细 胞悬浮 。将 此细 胞悬液 转移到 1.5mL 的 微量离 心管中 ,以同 样速度 离心, 去上清 。如此 再重复 一 遍 ,彻底 洗涤已 固定的 细胞。 (5) 将细胞 悬浮于 2 滴 TdT 酶缓 冲液中 ,离 心细胞 ,除去 上清。 将细胞 悬浮于 50/ixLTdT 酶反 应液中 ,于 371C 水 浴保温 30min。 在 反应达 15min 时 ,将 已沉到 管底的 细胞悬 浮起来 1 次。 (6) 细 胞悬液 中加入 l.OmL 洗涤 与终止 反应缓 冲液, 离心沉 淀细胞 ,除去 上清, 再 将细胞 悬浮于 l.OmL 洗涤 与终止 反应缓 冲液。 (7) 离心 ,除去 上清, 将细胞 悬浮于 lOOpL 荧 光素标 记的抗 地高辛 抗体工 作液, 于室 温反应 30min。 在 反应到 15min 时 ,将 已沉到 管底的 细胞悬 浮起来 1 次。 (8) 在细胞 悬液中 ,直 接加含 l%TritonX-100 的 PBSlmL, 离心 ,除 去上清 。重 复 此过程 1 次。 (9) 加 l.OmLPI 染色液 ,于 室温暗 处染色 15min。 (10) 使用流 式荧光 细胞分 析仪进 行测定 。在 波长为 510~550nm 处 测定荧 光素标 记的 抗地高 辛抗体 -FITC 产生 的绿色 荧光, 代表凋 亡细胞 的数目 。在波 长大于 620nm 处测定 PI 产生 的红色 荧光, 代表其 余全部 细胞的 数目。 4. 方 法评注 本 方法与 第一节 中描述 的细胞 化学染 色和流 式细胞 仪测定 细胞凋 亡的方 法比较 ,可 以 测定早 期的凋 亡细胞 ,并且 可测定 在细胞 周期中 DNA 发生断 裂的具 体时相 。本 实验 采用的 DNA 末 端标记 法要比 DNA 缺口翻 译标记 法灵敏 10 倍以上 。使用 Dutp- 地高辛 / 抗地高 辛标记 系统具 有很低 的非特 异染色 ,凋 亡细胞 产生的 信号强 度至少 比非凋 亡细胞 高 38 倍以上 ,测 定凋亡 细胞的 灵敏度 要比测 定坏死 细胞高 10 倍以上 。本 法可用 于福尔 马林 固定的 石蜡包 埋组织 切片、 冰冻组 织切片 、培养 细胞和 从组织 中分离 的细胞 的凋亡 测定。 实验中 必须设 立阳性 和阴性 对照。 三、 生物素 -dUTP/ 酶标 亲和素 测定法 1. 原理 生物素 (biotin) 标记的 dUTP 在 TdT 酶的 作用下 ,可 以掺入 到凋亡 细胞的 双链或 单链 DNA 的 3'-OH 末端; 并可 与连接 了过氧 化物酶 (POD) 的链 亲和素 (streptavidin) 特 异结合 。在 POD 底物 (DAB) 存在下 ,可 产生很 强的颜 色反应 ,特异 准确地 定位正 在凋亡 的细胞 。在 普通光 学显微 镜下, 即可观 察和计 数凋亡 的细胞 。与前 述方法 类似, 此方法 可用于 石蜡包 埋的组 织切片 、冰 冻组 织切片 和培养 的凋亡 研究。 2. 附 加材料 2% 过 氧化氢 丁打酶/生物素-〇11;丁?混合液(1父丁〇1丁缓冲液168|^,5111/1^丁£1丁酶14,生 物素 -dUTP lpL) . 983 • 链亲 和素- 过氧化 物酶工 作溶液 (用含 1%BSA 或 HAS 的 PBS 将链亲 和素- 过氧化 物 酶稀释 80 〜 100 倍) HE 染液 光学 显微镜 3. 操 作步骤 标本的 预处理 : (1) 石蜡包 埋组织 切片预 处理: 组织切 片用二 甲苯洗 2 次 ,每次 5min。 100% 乙醇 洗 2 次 ,每次 3min。 95% 和 90% 乙 醇各洗 1 次 ,每次 3min。 蒸 馏水洗 2 次后 备用。 (2) 冰冻 组织切 片预处 理:冰 冻切片 置空气 中干燥 lh。 丙 醛固定 7min。 空 气干燥 20min, 备用。 (3) 培养的 细胞的 预处理 :将约 5xl〇7/mL 细胞于 4% 中性甲 醛室温 中固定 lOmin。 在 载玻片 上滴加 50 〜 lOO^L 细胞悬 液并使 之干燥 。用 PBS 洗 2 次 ,每次 5min 后, 备用。 检测 操作: (4) 将组织 切片置 蛋白酶 K 溶液 中, 37X: 保温 15min。 蒸 馏水洗 3 次 。置 2% 过氧 化氢中 5min。 (5) 蒸 馏水洗 3 次。 TdT 缓 冲液洗 1 次 。置 TdT 酶 / 生物素 -dUTP 混 合液中 ,于 37X: 保温 过夜。 (6) 将切片 转移至 终止缓 冲液中 ,于 室温 15min 终 止反应 。蒸 馏水洗 3 次 。置 2% BSA 或 HAS 中 ,室 温封闭 lOmin。 (7) 蒸馏 水洗涤 1 次。 PBS 洗涤 1 次, 5min。 置 1:80 稀 释的链 亲和素 -过氧 化物酶 溶液中 , 37t:, 30min。 蒸馏 水洗涤 1 次 。再用 PBS 洗涤 1 次, 5min。 (8) 置 1:80 稀释的 链亲和 素-过 氧化物 酶中, 37X:, 30min。 蒸馏 水洗涤 1 次 。再 用 PBS 洗涤 1 次, 5min。 置 DAB 工作 溶液中 ,室 温反应 5min。 蒸 馏水洗 2 次。 (9) 用 HE 染液染 5min。 蒸 馏水洗 3 次 。依次 分别用 70%、 95%、 100% 乙 醇脱水 2 次, 每次将 切片提 起放下 10 次 。二 甲苯洗 4 次 ,每次 lmin。 封片 干燥后 ,于 光学显 微 镜下观 察实验 结果。 4. 方 法评注 本 方法较 前面的 方法更 为灵敏 ,同 样需设 置必要 的阳性 和阴性 对照。 第五节 流式细 胞仪检 测凋亡 细胞的 几种常 用方法 — N Annexin V 法 1. 原理 Annexin V 是鉴定 凋亡细 胞的敏 感探针 。它 是一 种分子 质量为 35~36kDa 的 Ca2 + 依赖性 磷酸结 合蛋白 ,可 与凋亡 早期细 胞的质 膜结合 。细胞 表面质 膜的改 变是凋 亡细胞 . 984 • 的最 早现象 之一。 在凋亡 细胞中 ,膜 磷脂酰 丝氨酸 (PS) 由质膜 的内表 面转移 到外表 面 ,从 而暴露 于胞外 环境; 且 PS 的外化 现象的 出现要 比与凋 亡相关 的核改 变早。 An- nexinV 对 PS 具有 亲和性 ,可与 PS 暴 露于胞 外的细 胞结合 ,故 ArmexinV 可用 于鉴定 凋 亡早期 阶段的 细胞。 Annexin V 可 用于流 式细胞 术和荧 光显微 镜对凋 亡进行 分析。 2. 材料 待测细 胞样本 纯化 的重组 Annexin V-FITC PI (用 lx PBS 配成 50 pg/mL 的 PI 贮液, 2 〜 8X: 保存) PBS ( 137mmol/L NaCl, 2 . 7mmol/L KC1, 4 . 3 mmol/ L Na2HP04 . 7H2〇, 1 . 4mmol/L KH2P04 , pH7 . 2 ) 结合 缓冲液 (lOmmol/L Hepes-NaOH pH 7.4, 140mmol/L NaCl, 2.5mmol/L CaCl2, 保存于 2 〜 8X:) 流式 细胞仪 3. 操 作步骤 (1) 用冰 PBS 洗 涤细胞 ,并用 1XPBS 调细胞 浓度为 lxi〇5mL_1。 (2) 取 100pL 上 述细胞 (1X105) 置于 5mL 试管中 ,加 5pLAnnexinV-FITC 和 10ptL PI〇 (3) 置室温 (20~25t:) 避 光孵育 15min, 每管加 400/^L 结合缓 冲液。 (4) 对照组 : 末标记 的细胞 ,仅用 Annexin V-FITC 标记 的细胞 ,仅用 PI 染色的 细胞。 (5) 尽快于 lh 内 上流式 细胞仪 检测。 4. 方 法评注 缓 冲液中 Ca2+ 是 必需的 ,因为 ArmexinV 与 PS 结合有 Ca2+ 依赖性 ,上机 分析时 应保 证鞘液 不稀释 Ca2+ 浓度 。事实 上操作 中若样 本运转 1 〜 2 次则不 会发生 Ca2+ 稀释 问题。 样品不 得固定 ,因 固定细 胞在操 作过程 中可使 Annexin V 与胞内 PS 结合, 如有必 要 可在染 色后用 结合缓 冲液洗 涤细胞 ,再 固定于 PBS 中 。分析 200/zL 样 品时应 加入足 量 Hepes Buffer 稀释。 由于细 胞坏死 期间也 可出现 PS 的 外露, Annexin V 应与检 测细胞 活性的 染料如 PI 或 7-AAD 联合 后用来 区分凋 亡细胞 (Annexin V+ , 活性染 料着色 - ), 坏 死细胞 (Annexin V- , 活性染 料着色 +), 及不经 凋亡而 已死亡 的细胞 (Annexin V+ , 活性染 料着色 + )。 二、 TdT 法 1. 原理 核酸 内切酶 水解导 致大量 DNA 断裂 ,可对 DNA 缺口的 3'-OH 末端进 行检测 。在 . 985 . 外源 TdT 的催化 作用下 (末端 标记) 或 DNA 聚合酶 作用下 (缺 口翻译 ), 在 3'-OH 连 接上生 物素或 地高辛 标记的 核苷酸 。用 抗体与 之反应 ,从 而进行 检测。 2. 材料 待 测细胞 固定剂 (1% 甲 醛或多 聚甲醛 ,用 PBS 配制) 5xTdT 反应 缓冲液 (lmol/L 二甲胂 酸钾, 10mmol/L 氯化钴 , 125mmol/LTris- HC1 pH6 .6, 1 . 25mg/ mL BSA) TdT 贮液 (0.2mol/L 二甲脾 酸钾, lmmol/LEDTA, 4mmd/L2- 巯基 乙醇, 50% 甘油, 25U/;xLTdT, pH6.6) lnmol/ ^tL Biotin- 16-dU'i P 反应缓冲液(4><35(:,25网/11^荧光素标记亲和素,0.1%丁1^〇11\-100,5%奶粉) 洗涤 缓冲液 (在 HBSS 中溶入 0.1 % Triton X-100 和 0.5 % BSA) ?1缓冲液(在册53中溶入5吨/1^?1和0.1%不含〇、八酶的1^仏酶) 流式 细胞仪 3. 操 作步骤 (1) 待测细 胞的预 处理: 1) 用 对数生 长期的 HL-60 或 Molt-4 进 行实验 :以含 10% FBS 的 RPMI 1640、 100U/mLPG、 100;ig/mLSM、 2mmol/L 谷 氨酰胺 的培养 基培养 ,隔天 换液, 实验前 1:1 稀释 至细胞 密度为 5xi〇5mL_1。 2) CML 病人化 疗前及 化疗期 的外周 血分离 出单核 细胞。 3) 针吸活 检乳腺 癌细胞 ,反 复抽 吸分散 细胞。 (2) 必要时 细胞用 药物处 理至少 6h。 对照 培养用 DSMO 处理 ,最高 浓度为 0.1%。 CAM 溶于 DSMO 中, 浓度为 3mmd/L, 保存于 - 20X: ; TN 溶于 DSMO 中 ,浓度 5mmol/L, 保 存于 4t:; m-AmSA 溶于 DSMO 中 ,浓度 0.3mmol/L, 保存于 -20X:; FST 溶于 2mLHank’s 液中, 浓度 5mmol/L( 贮存液 ), 使 用时用 RPMI 1640 稀释。 (3) 将 细胞用 1% 甲醛冰 浴固定 15min, 沉 淀细胞 ,将 细胞团 块重新 悬浮在 5mL HBSS 溶液中 , 800 x 尽 离心 5min。 (4) 重新 将细胞 悬浮在 70% 冰 乙醇中 (-20X: 可保存 3 周以上 )。 在进 行原位 NT 和 TdT 分析 前置于 -20X: 至少 l~3d。 提取组 蛋白的 实验中 ,细 胞先于 70% 冰乙 醉 中固定 lh, 然后用 0. lmol/L HC1 于冰上 处理。 (5) 用 HBSS 洗 涤细胞 ,将细 胞团块 (<106) 用 1.5mLEP 管 悬浮在 50^L 下述溶 液中: 反应 缓冲液 生物素 -16-dUTP TdT 双蒸水 IfJiL (lFg) 0.2 卩 L (5U) 38 • 8/iL lO^tL 上述试 剂在实 验前可 根据样 本数严 格按比 例混合 ,将混 合溶液 按每管 50/iL 分装。 • 986 • (6) 37t: 孵育 30min, 然 后加入 1.3mL 洗涤 缓冲液 ,离心 ,并 将细 胞重新 悬浮在 lOOpL 含荧 光素标 记的亲 和素柠 檬酸盐 缓冲液 (反应 缓冲液 ) 中 ,室 温孵育 30min。 (7) 加入 1.3mL 洗涤 缓冲液 ,离心 ,再 洗涤 1 次。 将细胞 悬浮在 lmL PI 溶 液中, 室 温醉育 30min。 (8) 上机 检测细 胞绿色 (荧光 素标记 亲和素 ) 和红色 (PI) 荧光。 三、 F-Actin 法 1. 原理 许多类 型的细 胞凋亡 期间, 胞核及 质膜发 生改变 ,同时 伴随膜 表面结 构如伪 足及微 绒毛 的快速 丢失。 F 肌动 蛋白 (F-actin) 是伪 足的主 要组分 。环状 毒肽家 族成员 之一的 鬼笔 毒环肽 (phalloidin), 可专一 性地与 F-actin 结合 ,阻止 F-actin 解聚 。用扫 描电镜 及共聚 焦激光 扫描荧 光显微 镜研究 发现, HL-60 细胞在 凋亡期 间存在 F-actin 丢失。 2. 材料 待 测的培 养细胞 2% PFA 含 0.1% Triton X 的 PBS 含 0.1% 硼氢 化钠的 PBS, pH8.0 FITC-pholloidin PI 缓冲液 (在 HBSS 中溶入 5~5(Vg/mL PI 和 100pg/mL RNA 酶) 371C 水浴 流式 细胞仪 3. 操 作步骤 (1) 细 胞固定 :培养 瓶中轻 轻加入 2% PFA (1:1), 使 PFA 终 浓度为 1%。 轻摇, 低 温放置 30min。 固 定的细 胞悬液 200Xg 离心 5min, 弃上清 。加入 1%PFA, 4X: 放置 30min 或 更长。 (2) 用含 0. 1 % Triton X 的 PBS 洗涤 1 次。 (3) 用含 0.1% 硼氢 化钠的 PBS 处理 30min, 以 降低细 胞自发 荧光。 (4) 20〇Xg 离心 5min, 弃 上清。 4t: 冰箱 内放置 lh 或 过夜。 (5) 力 U20fxL FITC-pholloidin (浓度 0.01~l(Vg/mL) 对 F-Actin 染色, PBS 洗涤。 (6) 加 lmLPI 缓 冲液, 37X: 温育 30min ( 冰箱中 可放置 24h)。 (7) 流式 细胞仪 检测。 四、 Caspase-3 法 1. 原理 Caspase-3 是半 胱氨酸 蛋白酶 ,在 凋亡早 期可被 激活而 且仅在 凋亡细 胞发现 有激活 . 987 • 的 Caspase-3。 它是由 32kDa 的原酶 (pro-Caspase-3) 经多个 天冬氨 酸位点 剪切而 形成的 17kDa 和 12kDa 的亚单 位组成 。激 活的 Caspase-3 似乎 与几种 重要分 子的蛋 白水解 有关, 其中包 括多型 ADP 核糖 多聚酶 (PARP)。 PARP 是 一种与 DNA 复 制和维 持基因 组稳定 性有关 的酶, 激活的 Caspase-3 能将 116kDa 的 PARP 切割为 85kDa 的残 基片段 。这一 切 割可将 PARP 的 N 端 DNA 结合结 构域与 C 端的催 化结构 域分开 ,最 终使 PARP 失去 正常的 功能。 PARP 中的 切割位 点是自 C 端到 216 位 的天冬 氨酸, PARP 切割位 点的上 游序列 DEVP (Asp-Glu-Val- Asp) 是 Caspase-3 识别 结合的 耙点。 Caspase-3 底物 Ac- DEVD-AMC 及 Caspase-3 醛 抑制物 Ac-DEVD-CHO 都可与 Caspase-3 高度 特异性 结合。 Ac-DEVD-AMC 是一 种人工 合成的 四肽荧 光底物 ,分 子质量 694Da, Caspase-3 能将 Ac- DEVD-AMC 在 D 与 AMC 之间切 断释放 荧光素 AMC, AMC 可通 过流式 细胞仪 定量测 量, 可用于 定性及 定量测 量凋亡 细胞中 Caspase-3 的 活性。 Ac-DEVD-CHO 是一 种有效 的人工 合成的 四肽抑 制剂, 能抑制 Caspase-3 的 活性, Ac-DEVD-CHO 分子 质量为 502. 5Da。 凋亡 细胞与 Ac-DEVD-CHO 和 Ac-DEVD-AMC 共 孵育时 Caspase-3 的 活性受 Ac-DEVD-CHO 抑制 ,使 Ac-DEVD-AMC 不 能释放 AMC, 也不发 出荧光 。该法 除可检 测凋亡 细胞外 ,也 可用 于检测 在某些 凋亡途 径中是 否包含 Caspase-3 的 活化。 2. 材料 待 测细胞 [诱导 凋亡的 原代细 胞或细 胞株, 在不同 时点收 获细胞 (2 Xl〇6/mL), 加 lmL PBS 洗涤, 重悬于 lmL PBS 中] PBS ( 137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, 4.3mmol/L Na2HP04 • 7H20, 1.4mmol/L KH2P04, pH 7.5) 1 x 细 胞裂解 缓冲液 (l〇mm〇l/L Tris-HCl pH7.5, lOmmol/L NaH2P04/Na2HP04, 130mmol/L NaCl, 1 % Triton X- 100, lOmmol/L NaPPi) Ac-DEVD-AMC 反应 混合液 (-20X: 保存的 5 支 200Mg 底物 PBS 溶液 冻干粉 ,使 用前用 200/iL 双蒸水 溶解至 lpg/VL, -20X: 保存 ,避 免反复 冻融) Ac-DEAD-CHO 反应 混合液 (-20X: 保存的 5 支 20吨 抑制剂 PBS 溶液 冻干粉 ,使 用前用 200;xL 双蒸水 溶解至 0.1Mg/pL, -20X: 保存 ,避 免反复 冻融) 流式 细胞仪 3. 操 作步骤 (1) 取 10(VL 细 胞悬液 (2 x 1〇5), 加入 400pL PBS 和 10pL (10/ig) Ac-DEVD- AMC 反应混 合液。 (2) 样 本细胞 加不含 Ac-DEVD-AMC 的反应 混合液 (PBS) 作 为阴性 对照。 (3) 取未诱 导细胞 加反应 混合液 ,用 于检测 细胞群 基础凋 亡水平 ,也 即自发 凋亡。 (4) 37X: 反应 lh。 用流 式细胞 仪检测 Ac-DEVD-AMC 的 AMC 释出。 (5) 用紫外 光激发 (380nm), 发 射波长 范围为 430~460mn。 与非凋 亡细胞 对照相 比, 含活性 Caspase-3 的 凋亡细 胞会产 生明显 的发射 光谱。 五、 Sub-Gl 法 1. 原理 该法是 在染色 前用去 垢剂对 细胞做 通透处 理或用 沉淀性 固定剂 如乙醇 或丙酮 对细胞 进行预 固定后 ,对 低相 对分子 质量的 DNA 进 行抽提 ,测 定细胞 DNA 的含量 。因 为凋 亡细胞 经通透 性处理 或乙醇 固定后 不能完 全保留 细胞内 降解的 180 〜 200bp 整数倍 DNA 片段, 这部分 DNA 片段 在随后 的洗涤 和染色 期间由 胞内渗 出丢失 ,导 致凋亡 细胞与 & 期细 胞相比 DNA 含量明 显降低 。因 此在对 细胞内 DNA 进行染 色时其 DNA 荧光 染料结 合量 下降, DNA 直方 图上于 &期 峰前出 现“亚 G/’ 峰 ,而被 识别。 2. 材料 待测细 胞样本 70% 冰乙醇 HBSS 缓冲液 PC 缓冲液 (lmol/LNa2HP04, lmol/LNaH2P04, 0.3mol/L 枸橼 酸钠, pH7.4) PI 缓冲液 (在 HBSS 中溶入 20/tzg/mL PI 和 100pg/mL RNase) 染色液 (0.1% Triton X-100, 2mmol/LMgCl2, O.lmol/LNaCl, lOmmol/L PIPES pH6.8, lyg/mLDAPI, 2(^g/mL 罗丹明 101) 流式 细胞仪 3. 操 作步骤 方法一 : (1) 将 (1X106) 〜 (1X107) 细胞 悬浮于 l〇mL 70% 冰 乙醇中 ,至 少固定 4h 或- 20X: 保存 数周。 (2) lOOOXg 离心 5min, 去 尽乙醇 ,加 10mL HBSS 洗涤。 (3) 将细 胞团块 悬浮在 40;zLPC 缓 冲液中 ,室温 下至少 30min, 并不时 振动。 (4) 1500Xg 离心 5min, 可 将上清 转移至 EP 管用 于电泳 检测。 (5) 细 胞团块 悬浮在 lmLPBS 中 ,加入 20|uLPI 缓冲液 ,室 温避光 30min, 上机 检测。 方法二 : (1) 106 细胞 悬浮于 lmLHBSS, 加 70% 冰乙醇 9mL 固 定至少 4h, 固定细 胞至少 可在 -20X: 保存 一周。 (2) 离心 ,去 尽乙醇 ,加 lOmLHBSS, 离心。 (3) 用 lmLHBSS 悬 浮细胞 ,力口 0.2~1.0mLPC 缓冲液 ,室 温放置 5min。 在凋亡 DNA 降解 广泛或 DNA 抽提有 效的情 况下, PC 缓 冲液加 〇.2mL 或不加 。在 DNA 断裂不 明 显或对 凋亡细 胞分离 存在问 题时, PC 缓 冲液加 lmL 或 更多。 (4) 加 lmL 染色液 染色。 (5) 离心 ,加 lmLPI 缓冲液 ,室 温作用 30min。 流式 细胞仪 检测。 • 989 . 4. 方 法评注 DNA 降 解程度 根据凋 亡发生 的阶段 、细 胞类型 及凋亡 诱导剂 的性能 不同而 发生改 变 ,染 色期间 DNA 抽 提能力 也会发 生改变 。在 洗液中 加入高 浓度磷 酸盐- 枸橼酸 盐缓冲 液可增 强降解 DNA 的提 取能力 。该 法可用 于控制 凋亡细 胞降解 DNA 的抽 提程度 ,以 获得 流式细 胞术对 凋亡的 最佳分 离效果 。一般 认为, DNA 抽提法 检测凋 亡的局 限是专 一性低 ,“亚 Gi ”峰除 可代表 凋亡细 胞外, 还可以 是机械 损伤的 细胞、 DNA 含 量较低 的细胞 ( 如含有 DNA 指数不 同的细 胞群的 样本) 或不 同染色 质结构 的细胞 (如 正在分 化中的 红细胞 ), 这 是因为 在这些 细胞中 DNA 对荧 光染料 的饱和 度降低 的缘故 。值得 注意 的是当 细胞不 经固定 而用低 渗溶液 裂解时 ,可分 离得到 多种核 片段, 因此这 种样本 中的“ 亚& ”细胞 数量代 表的是 核碎片 的数量 ,不能 反映凋 亡细胞 的数量 。另外 ,除 核 碎片外 ,有 丝分裂 细胞游 离出的 染色体 、细 胞碎片 及微核 都可被 错误地 识别为 凋亡细 胞。 陈义发 龚建平 主要参 考文献 Darzynkiewicz, Z. , Gong, J., Juan, G. 1996. Cytometry of cyclin proteins. Cytometry, 25 : 1 〜 13. Gong, J . , Traganos, F. , Darzynkiewicz, Z. 1993. Expression of cyclins B and E in individual MOLT-4 cells and in stimulated human lymphocytes during their progression through the cell cycle. Int. J. Oncol” 3: 1037 〜 1042. • 990 • 第十八 章转基 因动物 引 目 所 谓转基 因动物 ,是指 通过实 验方法 将外源 基因导 入受体 动物染 色体基 因组内 ,外 源 基因稳 定整合 并能遗 传给后 代的一 类动物 ,是人 类按自 己的主 观意愿 有目的 、有计 划 、有 根据、 有预见 地改变 动物遗 传组成 的结果 。转基 因动物 的研究 历史可 上溯至 20 世纪 70 年代 ,其 研究初 衷旨在 建立一 种胚胎 基因表 达调控 的研究 方法。 1974 年, Jaenisch 等人以 鼠莫氏 白血病 毒感染 着床前 的小鼠 桑葚胎 (4 〜 8 细胞 ), 在世界 上首次 得到整 合外源 基因的 转基因 小鼠; 此后, Gordon 和 Brinster 采用显 微注射 法将带 有人胸 苷激 酶基因 的重组 质粒注 入小鼠 受精卵 原核中 ,出生 小鼠的 DNA 通过 Southern 印迹证 实 ,转 移至小 鼠胚胎 中的外 源基因 ,在 其基因 组中持 续存在 ,并可 整合到 单个或 多个染 色体中 。尽 管由 于条件 限制, Gordon 和 Brinster 当时 并未得 到活的 转基因 小鼠, 但这一 伟大 的尝试 及其所 获得的 研究结 果无疑 为以后 的研究 工作开 辟了一 条新的 途径。 1982 年, Palmiter 等人用 显微注 射方法 ,成 功地将 大鼠生 长激素 重组基 因导入 小鼠受 精卵原 核中 ,研 制出生 长速度 比正常 小白鼠 快一倍 的转基 因“超 级鼠” ,从 而引起 了世界 轰动。 “超 级鼠” 问世后 不久, Hammer 等于 1984 〜 1985 年相 继研制 成功转 基因兔 、羊 和猪; 朱作 言等将 人生长 激素基 因导入 鲫鱼受 精卵, 获得具 有快速 生长效 应的转 基因鱼 ,使转 基因 动物研 究拓展 至非哺 乳动物 领域。 上述经 典性试 验奠定 了转基 因动物 研究的 良好基 础 。由 于转基 因动物 能够克 服物种 之间固 有的生 殖隔离 ,实 现物种 之间、 动物与 植物之 间及 微生物 之间遗 传物质 的交换 ,因 此转基 因动物 不仅可 以有效 研究胚 胎基因 表达调 控 ,而 且对于 更深入 探索基 因结构 和功能 ,培育 高产、 优质和 抗逆动 物品种 ,开 发动物 体作 为活的 生物反 应器生 产珍稀 蛋白质 ,以及 建立人 类疾病 模型与 人类疾 病的基 因治疗 等 ,均显 示出极 大的应 用潜力 。目前 ,转 基因动 物研究 正在蓬 勃兴起 ,并 发展成 为一项 引 人瞩目 的高新 技术。 1997 年, 结合体 细胞克 隆技术 ,携 带有可 治疗人 类血友 病的血 液凝 聚因子 基因的 转基因 克隆羊 —— Dolly 的问世 ,标 志着一 个新的 里程碑 在转基 因动 物研究 领域的 产生。 第 一节转 基因技 术的基 本原理 一 、概 述 转基 因动物 系统由 外源目 的基因 、转 移载体 、受 体细胞 构成, 其研制 过程从 方法学 角度 考虑可 谓一项 “系统 工程” ,涵盖 了基因 工程的 “上游 、中游 、下 游” 技术。 进行基 因克隆 、改造 和载体 构建是 制备转 基因动 物的首 要步骤 。外源 基因一 般由调 • 991 • 控元件 的侧翼 序列、 可表达 的结构 基因序 列和转 录终止 信号等 3 部 分组成 。为 方便检 测 ,构 建载体 时常引 入报告 基因如 半乳糖 苷酶仏 cZ 基因 (p-galactosidase)、 绿 色荧光 蛋 白基因 (green fluorescent protein, GFP)、 蓝色 荧光蛋 白基因 (blue fluorescent pro- tein, BFP) 等 。此外 ,在 基因改 造和载 体构建 过程中 尤为重 要的是 ,将 外源基 因的天 然启动 子删除 ,以 强启动 子序列 甚至增 强子序 列与目 的基因 拼接, 形成融 合基因 。此即 转 基因动 物研制 过程所 涉及的 基因工 程的“ 上游” 技术。 转基因 动物研 制过程 所涉及 的基因 工程“ 中游” 技术包 括基因 转移、 胚胎移 植与建 系等。 在基因 改造和 载体系 统构建 完成后 ,外 源基因 需以某 种方式 通过细 胞膜导 入受体 细胞 ,除 天然的 DNA 转 移系统 如动植 物病毒 、土壤 农杆菌 等外, 外源基 因常以 各种物 理、 化学和 生物方 式导入 。受体 细胞和 胚胎移 植是转 基因动 物研制 的重要 环节, 决定细 胞 水平筛 选和外 源基因 传递。 转基因 动物研 制过程 所涉及 的基因 工程“ 下游” 技术指 外源基 因整合 、表达 检测和 细胞 筛选等 ,是转 基因动 物研制 成功与 否的直 接证明 。转植 基因在 受体的 整合与 表达检 测 通常在 染色体 水平、 DNA 水平 、转 录水平 和蛋白 质水平 进行, 所采用 的技术 手段包 括聚 合酶链 式反应 (polymerase chain reaction, PCR)、 斑 点印迹 (dot/blot)、 原位杂 交 、原位 PCR、 Southern 印迹、 Northern 印迹及 Western 印 迹等等 ,是常 规分子 生物学 技术 在研究 领域和 研究层 次上的 拓展和 延伸。 从前述 转基因 动物技 术概要 特点不 难看出 ,转基 因动物 的基本 方法和 原理建 立的基 础 是基因 片段交 换重组 、染色 体外基 因转移 、转 移基 因特异 性表达 及动物 胚眙工 程等, 其 理论依 据包括 经典遗 传学和 现代分 子遗传 学等。 二 、转 基因技 术的理 论依据 1. 经典 遗传学 以 孟德尔 遗传定 律和摩 尔根基 因学说 为代表 的经典 遗传学 ,认 为生物 个体表 型体现 为物 种内全 套基因 不同等 位基因 的组合 ,揭示 了遗传 基因的 染色体 几何位 点与生 物表型 性状 间的对 应关系 。染色 体交换 和同源 重组的 发现, 更使得 借助于 重组构 建新的 遗传变 种 ,进而 研制转 基因动 物成为 可能。 2. 分子 遗传学 DNA 双 螺旋结 构的发 现堪称 划时代 的成就 ,使 一直很 神秘的 分子生 物学成 为了解 所有 生命的 基础, 标志着 分子遗 传学的 诞生。 McClintock 通 过对玉 米遗传 现象的 细微研 究 ,首 次发现 了能在 基因组 内不同 区域转 移的控 制成分 —— 转座子 (transposon), 使人 们 更多地 认识到 DNA 结构的 可变性 , 并因此 对基因 交流与 进化有 了初步 认识。 1961 年, Jocob 和 Monod 提出 并证实 了揭示 基因表 达调节 规律的 操纵子 (operon) 模 型及控 制基 因理论 。从此 ,人们 在认识 生命基 本现象 的实质 方面不 仅有了 基因的 调节与 控制的 概念, 有了基 因调控 的思想 ,而 且分子 遗传学 开始从 分子水 平逐步 揭示出 遗传密 码的复 制 、转录 、转译 、突变 、调节 与控制 的奥秘 。随着 生命科 学各门 学科的 发展和 互相渗 透 ,从 基因认 识开始 ,基因 一 细胞 —— 发育 构成了 生命科 学研究 的一条 主线, 以贯穿 • 992 • 于这 条主线 的理论 为指导 ,转 基因动 物也因 此应运 而生。 第二 节转基 因动物 常用制 备方法 一 、转 基因动 物常用 制备方 法简介 从 第一例 转基因 动物问 世至今 ,转 基因动 物制备 的方法 因外源 基因导 入途径 不同而 有 所不同 ,外源 基因转 移方法 的发展 和完善 始终是 转基因 动物研 究的重 点之一 。受 精卵 期胚 胎的显 微注射 法是转 基因动 物制备 最经典 、最常 用也是 最有效 的方法 。目前 较成熟 的 、被 研究者 广泛采 用的其 他制备 方法还 有精子 载体法 、电脉 冲法、 胚胎干 细胞法 、逆 转录 病毒载 体法; 此外 ,原 生殖细 胞法、 微细胞 介导法 、原生 质体介 导法、 DEAE- 葡聚 糖法 、激 光处理 、脉 冲场转 移等基 因转移 (化) 的方法 也在发 展探索 之中。 1. 显微 注射法 自从 1980 年 Gordon 等人 首次采 用显微 注射技 术培育 出真正 意义上 的转基 因鼠以 来 ,按 照显微 注射法 研制转 基因鼠 的思路 ,转 基因兔 、猪 、绵羊 、牛、 山羊及 转基因 鱼、 鸡等诸 多举世 瞩目转 基因动 物的陆 续问世 ,无不 说明显 微注射 法在培 育转基 因动物 上的广 阔前景 。显 微注射 技术是 直接对 基因进 行操作 ,具有 可大量 、准 确地 将外源 基因导 入受 精卵内 、整合 率较高 、实验 周期短 ,容易 得到纯 系动物 等优点 ,因此 从其诞 生至今 ,一 直是研 制转基 因动物 最经典 、蕞 有效 的途径 。为此 ,本 章随后 将详述 该研制 方法。 2. 精子 载体法 精子 载体法 的探索 起源于 20 世纪 70 年代 Bracket 及其 合作者 的先驱 工作, 将精子 暴露于 纯化的 、经 3H 标记腺 嘌呤的 SV40-DNA 后 ,在 精子头 部检测 到放射 性物质 ,表 明 异源的 DNA 分子可 以结合 进入哺 乳动物 的精子 ,并 且外 源基因 能随受 精作用 进入卵 细胞。 1989 年 ,意大 利学者 Lavitano 等人 将小鼠 精子与 线状或 环状的 pSV2CAT 质粒孵 育 15mm 后, 再与成 熟卵子 进行体 外受精 ,得到 的胚胎 植入受 体鼠输 卵管后 ,受 体鼠产 出的 250 只小 鼠中有 30% 为转基 因阳性 。这 证明转 植基因 不仅可 以遗传 给后代 ,而且 后代鼠 尾组织 和肌肉 组织外 源基因 的表达 也十分 可观。 尽管在 随后的 研究中 ,由 于其他 一 些实验 室未能 重复出 Lavitano 等的实 验结果 ,精子 作为载 体介导 外源基 因转移 的技术 也 因此而 一度受 到质疑 ,使 人们对 精子载 体法也 变得尤 为谨慎 。然而 ,由 于其在 生物学 上所 具有的 重要价 值及应 用潜力 ,许多 学者围 绕精子 载体法 在不同 物种上 开展了 大量的 研究 工作, 并取得 了许多 富有意 义的研 究成果 ,目前 精子作 为载体 可以介 导外源 基因的 转移已 为大家 所公认 。不 仅如此 ,许 多学者 将最初 Lavitano 等 报道的 、在 受精前 将精子 与外源 DNA 进行简 单的混 合温育 处理的 精子载 体法加 以改进 ,发 展为精 子载体 结合电 脉冲和 (或) 脂质 体介导 的新的 精子介 导外源 基因转 移技术 。将精 子与外 源基因 孵育一 段时 间后经 电脉冲 处理再 行授精 ,得到 阳性率 分别为 5% ~ 10% 的转基 因大马 哈鱼、 50% 的转基 因大珠 母贝及 65% 的转基 因鲍鱼 。若将 外源基 因在与 精子共 同孵育 之前用 脂 质体包 埋处理 ,则脂 质体与 DNA 相互作 用形成 脂质体 -DNA 复合体 ,此 复合 体易和 . 993 • 精子细 胞膜融 合而进 入细胞 内部。 采用这 种脂质 体介导 的精子 载体法 ,甚 至得到 阳性率 高达 92% 的转 基因鸡 。然而 ,精子 载体法 仍存在 转移率 不稳定 等缺憾 ,目 前的 重点集 中在 探索精 子介导 外源基 因进入 卵子的 机理, 以及影 响精子 载体法 转移效 率的影 响因子 等方 面的研 究上。 一旦明 晰了这 种机制 ,精子 载体法 将有望 成为一 种大规 模研制 转基因 动物 的重要 方法。 3. 电 脉冲法 电脉冲 技术最 初运用 于原生 质体的 电融合 研究, 后来人 们运用 这一技 术将外 源基因 导入 培养的 植物细 胞和动 物细胞 ,进而 发展成 为一种 研制转 基因动 物的基 因转移 技术。 谢 岳峰等 应用电 脉冲法 成功地 将质粒 pMhGH 导入泥 鳅受精 卵并获 得转基 因鱼。 在最适 条件下 ,泥鳅 、红 鲫等 的基因 转移效 率可达 62.5%, 个 别个体 可整合 100 多个 拷贝。 此外 ,转基 因青鏘 、斑 马鱼 、鲤鱼 、鲇 鱼和玫 瑰无须 鈀等也 通过电 脉冲技 术制作 得到。 采用电 脉冲法 研制转 基因动 物的优 点是操 作简单 ,可一 次处理 大量受 精卵; 其缺 点是外 源基因 导入无 定向性 ,针对 不同的 生物需 要建立 相应的 电脉冲 条件等 。外 源基因 在脉冲 电流 作用下 进入受 精卵的 机制尚 不十分 清楚, 采用该 技术研 制转基 因动物 的成功 报道只 有转基 因鱼类 ,推 测是在 鱼类受 精卵膜 上天然 存在一 些小孔 ,在 较低的 脉冲电 压作用 下 ,外源 基因就 通过这 些小孔 进入受 精卵。 4. 胚 胎干细 胞技术 胚胎 干细胞 (embryonic stem cell, ESC) 由 早期胚 胎细胞 分离培 养而得 ,既 可在体 外培 养扩增 ,保持 未分化 状态, 同时也 可在体 外诱导 分化为 多种类 型细胞 。它具 有与早 期胚 胎细胞 相似的 分化潜 能和正 常整倍 体核型 ,将其 注入早 期胚泡 ,可参 与胚胎 发育并 形 成生殖 嵌合体 ,还 可在体 外进行 遗传操 作而不 改变其 多能性 ,是 研究动 物个体 发育、 胚 胎分化 及性状 遗传机 制的理 想模型 。在转 基因动 物研究 领域, ESC 已成 为基因 转移、 基因 定点整 合的重 要实验 材料。 ESC 首先由 Evans 和 Kaufman 于 1981 年 从着床 前的小 鼠 囊胚内 细胞团 中分离 得到。 1986 年, Robertson 等 将整合 有外源 基因的 ESC 植 入小鼠 囊胚期 胚胎囊 胚腔, 得到的 21 只小 鼠中, 20 只小鼠 体细胞 和生殖 细胞中 含有外 源基因 序列。 1992 年, Lin 等把 有色斑 马鱼囊 胚注入 白化种 囊胚, 得到有 色素细 胞的嵌 合体, 嵌 合体与 白化鱼 交配得 到有色 后代; 移植 转移 hcZ 基因囊 胚细胞 也得到 嵌合体 ,转基 因性 状可以 传递给 后代。 Wakamatsu 等 1993 年进行 青鏘囊 胚细胞 转移获 得了嵌 合体, 嵌合 体具有 种系嵌 合特征 ,可以 遗传。 Nilsson 和 Cl〇ud 进 行虹鳟 囊胚细 胞转移 获得嵌 合体。 基因打 靶技术 (gene targeting) 作为近 年来发 展起来 的基因 定点整 合技术 ,其所 以成 功的关 键之一 就是以 ESC 为 基础。 ESC 转染后 ,经 分离 、筛选 ,再 通过嵌 合体或 核移植 途径, 即获得 定点整 合转基 因动物 。通过 ESC 途径制 作转基 因动物 ,为 得到稳 定遗 传的动 物新品 系开拓 了新的 前景。 5. 逆转 录病毒 载体法 逆转录 病毒载 体系统 由两部 分组成 : 用于携 带目的 基因和 (或) 标记基 因的逆 转录病 毒重组 载体; 对逆 转录病 毒提供 反式作 用蛋白 的包装 细胞系 。该技 术主要 包括以 下几个 • 994 • 步 骤:① 构建逆 转录病 毒载体 ,将目 的基因 替换病 毒与致 病或致 癌有关 的基因 ,使该 病毒成 为缺陷 病毒; ②选 择和培 养组装 细胞系 ,该 细胞系 含有所 需辅助 病毒, 重组病 毒载 体在该 细胞中 能组装 成重组 病毒; ③用 此重组 病毒载 体感染 靶细胞 。逆转 录病毒 介导 基因转 移技术 具有可 大量感 染细胞 、单拷 贝整合 和转化 频率高 (可达 100%) 等优 点 ,适于 研制转 基因动 物研究 ,世 界上 首只整 合了外 源基因 的转基 因小鼠 即是通 过该技 术而得 到的。 其不足 之处在 于插入 外源基 因的大 小有限 ,逆转 录病毒 DNA 序列 可能会 影 响外源 基因的 表达。 二、 原核期 胚胎的 显微注 射技术 (一) 显微操 作设备 和试剂 1. 显微操 作设备 (1) 解剖 显微镜 、倒置 显微镜 [40 ( 物镜 ) x 1〇 ( 目镜 )] 和长 聚光镜 ( 物镜为 2〇x 或 4〇x )。 (2) 烧针器 、拉 针器 、磨 针仪。 (3) 显微操 作装置 。目 前已 有多个 厂家生 产显微 注射仪 ,而且 同一厂 家也不 断更新 其产品 。较 常用 的显微 操作系 统有尼 康公司 、德国 Leitz 公司及 Leica 公 司等生 产的显 微 操作仪 ,操作 显微注 射仪之 前需认 真阅读 仪器说 明书。 2. 试剂 (1) 灭菌 的平衡 盐溶液 (如 Hank 氏液 )。 (2) 孕马血 清促性 腺激素 (PMSG), 人绒毛 膜促性 腺激素 (hCG), 分别在 灭菌的 平衡盐 溶液中 稀释到 50U/mL, 分装 贮存于 -20X:。 (3) 戊巴 比妥钠 ,用 双蒸水 配制成 2mg/mL。 (4) 各种 DNA 制 备及纯 化试剂 (略 )。 (5) 鱼类 受精卵 培养液 Holtfreter 液的 配制。 Holtfreter 氏 备液 ( 10 X ) : NaCl 35g CaCl2 lg KC1 0.5g 加双 蒸水至 1000mL。 Holtfreter 氏工 作液: 将贮液 用双蒸 水稀释 10 倍 ,加 热煮沸 ,充气 泵充气 ,分别 加链霉 素和青 霉素至 50 000U/L 和 100 000U/L, NaHC03 调 pH 为 7.0 左右, 待用。 (6) 鼠卵培 养液的 配制与 保存。 M2&M16 培养液 贮备液 : 按表 18.1 配方 ,分别 称取适 量试剂 ,配 制贮液 A、 B、 C、 D、 E。 其中 ,贮液 E 需 用0.2mol/LNaOH溶液调pH为7.4。用0.2^[m的滤器过滤除菌各贮液,分装后 . 995 • 置 -201C, 可贮 存半年 以上。 表 18.1 >12及\116 培养 液贮备 液配方 贮 液 成 分 浓度 / (g/100mL) 贮液 A (l〇x) NaCl 5.534 KC1 0.356 kh2po4 0.162 MgS04-7H20 0.293 Na Lactate 2.610 ( 或 4.349g60% 的浆) Glucose 1.000 青霉素 0.060 链霉素 0.050 贮液 B (l〇x ) NaHC03 2.101 酚红 0.010 贮液 C (100X ) 丙 酮酸钠 0.036g/10mL 贮液 D (100X) CaCl2-2H20 0.252g/10mL 贮液 E (10X ) Hepes 5.958 酚红 0.010 M2&M16 培养液 工作液 : 根据所 需体积 ,按表 18.2、 18.3 所给 定体积 稀释各 贮液分 别配制 M2*M16 工作 液 ,然 后过滤 除菌。 M2 直接置 4t: 保存, M16 工作液 需用含 5%C〇2 的空 气充气 ,以使 表 18.2 M2 工作 液配制 贮 液 M2 工作液 /mL 10 50 100 A (10X ) 1.00 5.0 10.0 B (l〇x ) 0.16 0.8 1.6 C (100 x ) 0.10 0.5 1.0 D (100 x ) 0.10 0.5 1.0 E (l〇x) 0.84 4.2 8.4 BSA 40mg 200mg 400mg 双蒸水 7.80 39.0 78.0 表 18.3 M16 工作 液配制 贮 液 M16 工作液 /mL 10 50 100 A (l〇x ) 1.00 5.0 10.0 B (l〇x ) 1.00 5.0 10.0 C ( 100 x ) 0.10 0.5 1.0 D (100 x ) 0.10 0.5 1.0 BSA 40mg 200mg 400mg 双蒸水 7.80 39.0 78.0 • 996 • 其 pH 保持在 7. 2~7. 4 范围内 ,封 紧瓶盖 ,在 4t: 可贮存 2 周, 使用前 1 天 ,放入 5% CCb 培 养箱中 平衡。 (7) 矿物 油处理 。在转 基因鼠 实验中 ,矿 物油的 质量是 影响胚 胎操作 成功与 否的关 键之一 。高 纯度 的矿物 油在用 于转基 因鼠实 验前需 进行如 下处理 :将矿 物油用 2 倍体积 双 蒸水充 分混匀 ,静置 ,去 除水相 ,重复 2 〜 3 次 。室 温放置 数天后 ,转 入培养 瓶中, 160t: 灭菌 2h。 加入约 1/10 〜 1/5 的不含 BSA 的 M16 培养液 ,用含 5%(:02的 空气吹 气 ,使 两者充 分混合 平衡。 放置数 天以除 去水相 ,按每 lmL 平 衡的矿 物油加 1/zL 的抗 生素 ( 青霉素 l〇〇〇〇U/mL; 链霉素 50mg/mL), 贮存 于密封 的灭菌 容器中 备用。 (二) 显 微注射 DNA 的制备 与纯化 DNA 的制 备和纯 化方法 详见前 面章节 。线性 与环状 DNA 都可 用于显 微注射 ,但研 究表明 ,线性 DNA 分 子比环 状分子 容易整 合到染 色体上 ,而 线性化 DNA 的末 端结构 (平末 端或黏 末端) 对整 合效率 与整合 分子的 结构影 响不大 。因此 ,显微 注射用 DNA 通常 限制酶 消化成 线性。 原核克 隆序列 不影响 转移基 因的整 合效率 ,但载 体序列 可能会 抑制 植入的 真核基 因在转 基因动 物中的 表达, 故显微 注射前 ,应尽 可能去 除载体 序列部 分 。尤 其对于 某些基 因如珠 蛋白基 因而言 ,只 有显微 注射前 除去载 体序列 部分才 能得到 组织 特异性 表达。 DNA 样品的 纯度对 于通过 显微注 射制作 转基因 动物成 功与否 至关重 要 ,应完 全去除 注射用 DNA 样品中 可能存 在的酚 、乙 醇及其 他有机 溶剂和 酶类。 纯 化后的 DNA 样品 因转基 因动物 制作对 象的不 同而溶 于不同 的缓冲 液中。 对于制 作 转基因 鱼而言 ,显微 注射用 缓冲液 通常为 ST 缓冲液 (88mmol/LNaCl, 10mmd/L Tris-HClpH7.5); 对 于制作 转基因 鼠来说 ,显微 注射用 缓冲液 一般含 0.1 〜 0.25 mmol/L EDTA 和 5 〜 10 mmol/L Tris-HCl pH7.4〇 注射用 DNA 样品经 0.22 卩 m 滤膜除 菌, -20X: 保存 备用。 (三) 显微注 射用持 卵管和 注射针 、胚 胎移植 用 移卵管 及发圈 的制备 1. 持 卵管和 注射针 的制备 显微 注射过 程中, 需要固 定胚胎 用的持 卵管和 DNA 注 射用的 注射针 都可以 用口径 约 lmm 左右的 毛细玻 璃管通 过烧针 器和拉 针器自 行制作 ,如图 18.1 所示 。注射 针拉制 后 一般直 接使用 ,也可 用磨针 仪将前 端磨尖 ,研磨 角度约 30°, 针尖 内径约 lpm 以下。 此外 ,持 卵管和 注射针 在显微 注射前 需消毒 处理, 并在消 毒环境 存放。 2. 移卵管 的制备 除持卵 管和注 射针外 ,’转 基 因鼠的 制备还 需胚胎 移植用 移卵管 。移卵 管一般 用巴斯 德 吸管或 BDH 硬毛细 玻璃管 拉制成 。移卵 管内径 150~200fzm, 外径 300 〜 400pm, 大 于 1 个 (鼠) 卵 而小于 2 个 (鼠) 卵。 开口部 在火上 略烧使 其光滑 。输卵 管移卵 用移卵 管前段 较细部 分长约 2~3cm; 子宫移 卵用移 卵管长 8 〜 10cm, 为 便于掌 握插入 子宫的 • 997 • 图 18.1 显微 注射用 注射针 (A)、 持卵管 (B) 深度, 常在距 开口端 lcm 处做 一弯曲 (图 18.2)。 移 卵管同 样需消 毒处理 ,并存 放在消 毒 环境。 3. 发圈 的制备 在玻 璃吸管 前端, 插入新 生婴儿 的胎发 ,石 蜡固定 ,制备 成如图 18.3 所示 发圈, 供鱼类 显微注 射时拨 卵用。 (四) 外源 基因向 鱼类受 精卵的 显微注 射技术 鱼类具 有产卵 量大、 体外受 精和体 外发育 等特点 ,因此 外源基 因向鱼 类受精 卵的显 微注射 技术操 作相对 哺乳类 而言较 为简单 。其 主要程 序如图 18.4 所示。 (1) 受精卵 的获得 。模式 动物斑 马鱼受 精卵的 获得: 按养 殖规范 ,将 斑马鱼 词养在 28t: 恒温及 14h:10h 光暗比 条件下 。显 微注 射的前 1 天 ,将 1 尾 雌性和 1 尾雄 性斑马 鱼放入 1 只繁 殖盒中 ,但 用隔离 板隔开 。注 射当天 ,将 隔离板 抽去, 雄雌鱼 开始追 逐并于 数分钟 内产卵 。从第 1 枚卵 产下约 lOmin 后, 收集受 精卵。 经济 型养殖 鱼类受 精卵的 获得: 亲 鱼选择 ,亲鱼 必须是 体质健 壮和无 伤的成 熟个体 。选 择雌性 亲鱼时 ,最好 选择腹 部较大 ,特 别是下 腹部比 较柔软 的个体 。选 择雄性 亲鱼时 ,只 要轻压 腹部精 巢部位 ,有 精液从 泄殖孔 流出者 即可。 图 18.2 鼠 类胚胎 移植用 移卵管 A: 输卵管 移卵用 移卵管 B: 子宫 移卵用 移卵管 图 18.3 鱼类 显微注 射拨卵 用发圈 • 998 • 图 18.4 鱼类受 精卵显 微注射 模式图 a. 鱼卵人 工授精 b. 用胰蛋 白酶去 除卵壳 c. 受精 卵移至 Holtfreter 氏液中 d. 显微注 射法将 外源基 因引 入鱼卵 胚盘中 人 工催青 ,人工 催产剂 主要是 鲤鱼垂 体悬液 和绒毛 膜促性 腺激素 2 种 。按雌 性亲鱼 体重,鲤鱼垂体剂量一般为2.5〜4.5个/1^,线毛膜激素剂量范围是500~220011/1^, 雄性 亲鱼剂 量减半 。采用 体腔注 射或背 部肌肉 注射法 ,将用 生理盐 水配制 好的垂 体悬液 和绒 毛膜促 性腺激 素注射 液徐徐 注入亲 鱼体内 ,注 射后用 手按住 注射口 片刻。 人 工授精 ,分 别收集 卵子和 精液, 体外人 工授精 。精 、卵 混合后 ,即 用干净 的家禽 羽毛轻 轻搅拌 ,约 30 〜 60s 后 ,徐徐 注入清 水洗卵 ,将 多余 的精液 、血液 或卵液 洗出, 3 〜 5min 后 收集受 精卵。 (2) 用 0.25% 胰 蛋白酶 消化受 精卵去 除卵壳 ,将 裸卵移 入盛有 Holtfreter 氏 液平皿 中, 平皿底 部水平 覆盖约 1.5% 的琼脂 。或 者制 作如图 18.5 所示覆 盖琼脂 的平皿 ,直 接对 未脱膜 受精卵 按以下 操作进 行显微 注射。 (3) 将溶于 ST 溶液中 的外源 基因装 入显微 注射针 ,检 查注射 针是否 堵塞。 图 18.5 鱼 类未脱 膜受精 卵的显 微注射 模式图 (4) 将上述 Holtfreter 氏液平 皿中的 受精卵 用发圈 拨至胚 盘向上 ,在解 剖镜下 注射。 由于看 不清受 精卵的 细胞核 ,将外 源基因 直接注 入动物 极的细 胞质中 ,注 射通常 在胚胎 第一次 卵裂之 前进行 ,为 便于显 微注射 ,一 般每次 转移并 注射约 200 枚卵。 (5) 将注 射针慢 慢接近 受精卵 动物极 正中心 ,轻 轻插入 受精卵 ,一旦 观察到 DNA 注射液 在受精 卵中迅 速扩散 则说明 DNA 已注入 ,随 即小 心抽出 注射针 。每卵 注射约 . 999 • 1 〜 2nL 的 DNA 溶液 ,约含 1X106 外源基 因拷贝 。然 后按 同样方 法注射 Holtfreter 氏液 平 皿中的 其余受 精卵。 (6) 显微 注射后 ,将受 体卵置 于盛有 Hdtfreter 氏培养 液平皿 中发育 。胚胎 发育至 原 肠期后 ,将 培养液 逐渐用 曝气的 冷开水 稀释; 发育 至心跳 期后, 将胚胎 转移到 曝气的 冷开 水中。 (7) 在胚 胎发育 过程中 ,需精 心管理 ,及 时去除 各种畸 形胚和 死胚, 直至形 成鱼苗 后按 常规养 殖方式 管理。 上 述方法 主要适 用于卵 壳较软 ,易 被胰蛋 白酶消 化的淡 水鲤科 鱼类。 对于一 些冷水 性的鲑 、鳟鱼 类来说 ,胰 蛋白 酶消化 难以去 除卵壳 。因此 发展了 3 种变通 的显微 注射方 法。 一是从 受精孔 将外源 DNA 溶液注 入卵中 ,简称 MP 法; 二是 在虹鳟 受精卵 刚受精 后卵壳 尚未变 硬时直 接注射 ,简称 EI 法; 三是 先用 硬金属 针在卵 壳上打 一个孔 ,再实 施显 微注射 ,简称 LI 法。 (五) 外源 基因向 哺乳类 (鼠) 受 精卵的 显微注 射技术 通过 显微注 射技术 制作转 基因鼠 的一般 实验流 程如图 18.6 所示。 细胞 或质粒 目的基 因片段 I 注射用 外源基 因制备 雄鼠 激素 诱导供 体母鼠 受精卵 显 微注射 准备 注射持 卵管、 注射针 解 剖出卵 、选择 ,置 显微镜 下凹载 玻片上 ,注射 到雄性 原核中 冻 存的胎 鼠组织 I 冻 存的幼 鼠血液 I 制 备转基 因鼠的 DNA' 蛋白质 1 表达水 平检测 取出 鼠胚胎 假 孕母鼠 ( 等待约 20d) I 或待娩 出幼鼠 胎鼠 组织或 2cm 幼 鼠尾巴 制备 基因组 DNA I 外 源基因 的整合 确定转 基因鼠 I 转基因 鼠传代 图 18.6 转基 因鼠的 显微注 射技术 流程图 • 1000 . 1. 各类鼠 的选择 〜对鱼 类而言 ,鼠排 卵数微 乎其微 ,而且 需体内 发育。 因此需 要定期 提供相 当数量 母鼠作 为卵供 体和假 孕母鼠 ,以 及一批 相对稳 定的正 常公鼠 和结扎 公鼠, 保证转 基因实 验顺 利进行 。对于 仅以导 入外源 基因为 目的的 转基因 鼠实验 ,一般 选用杂 交子一 代鼠, 这种鼠 具杂交 优势, 产卵多 ,外源 基因注 射后卵 裂率高 ,产 仔较好 。如需 特殊的 遗传标 志则 选用纯 系鼠。 所需各 类鼠及 有关要 求如表 18.4 所示。 表 18.4 显微 注射实 验所需 各类鼠 鼠 类 供 体母鼠 配 种公鼠 受 体母鼠 结 扎公鼠 鼠 龄 4 〜 6 周 >6 周 >6 周 >6 周 用 途 受精 卵供体 与 供体母 鼠交配 注射 卵受体 与 供体母 鼠交配 更 换频率 每次 6~8 个月 每次 6 〜 8 个月 饲 养条件 每笼 5~6只 每笼 1 只 2~3 只放 1 个 结扎 公鼠笼 每笼 1 只 备 注 体重 >20g, 产过仔 的更好 结扎后 2 周用 2. 受精卵 的准备 有两种 途径可 以得到 供体卵 : 供体发 情期自 发排卵 ,但 排卵数 有限; 人工注 射激素 诱 导排卵 ,这一 现象称 为“超 排卵” ,其所 得到的 卵数量 远远超 过自发 排卵数 。转 基因 鼠 实验通 常采用 超排卵 获得供 体卵。 4 〜 6 周 龄母鼠 在具明 暗周期 (照明 14h 和黑暗 10h) 的 动物房 内词养 3~5d, 即可 用于超 排卵。 向供体 母鼠腹 腔注射 5 〜 10U 的 孕马血 (PMSG) 约 44 〜 48h 后, 再注射 5~10U 的人 绒毛膜 促性腺 激素。 注射后 ,将每 只雌鼠 与 1 只配种 雄鼠置 同一笼 中过夜 。次日 亮周期 开始后 3h 内选 择有 阴栓的 雌性鼠 ,处死 后取出 输卵管 并移到 无菌培 养皿的 M2 液滴中 。用 无齿慑 子拨开 壶腹部 ( 输卵管 的透明 膨出部 ), 取出 被丘状 卵膜环 绕的卵 泡细胞 。将 上述卵 泡细胞 置入含 透明质 酸酶的 M2 溶液中 ,在 解剖 镜下观 察卵丘 的解体 。在卵 丘解体 完成后 ,等待 5min 让 卵的黏 附性降 低 。在最 小体积 内将卵 移入不 含透明 质酸酶 的]^2 溶液中 ,洗涤 4 次 ,每 次转移 时要让 卵散开 ,以 洗去透 明质酸 酶和其 他杂质 。将洗 净的卵 移入事 先置入 C〇2 培 养箱的 M16 培 养液中 待用。 取卵过 程应尽 快完成 ,以 减少暴 露对卵 的不利 影响, 雌性鼠 内生殖 器官如 图 18.7 所示。 3. 显 微注射 显 微注射 在显微 操作仪 上进行 ,其主 要程序 如下: (1) 将 外源基 因注射 液注入 注射针 并确证 注射针 畅通后 ,滴 1 大滴 M2 培养 液在注 射 槽中心 ,上面 覆盖矿 物油。 (2) 从 M16 培养液 中取出 20~30 个卵移 入1^2 液滴中 ,通 过连 接注射 器的持 卵管所 给予 的稍许 负压吸 住一个 受精卵 ,调整 ,显 现雄 性原核 (雄性 原核一 般位于 周边部 ,体 • 1001 • 图 18.7 雌性 鼠内生 殖器官 A: 周 围脂肪 B: 肾 C: 周 围脂肪 D: 卵巢 E: 输卵管 F: 卵 巢系膜 G: 子 宫血管 H: 子宫 积较大 )。 (3) 将注射 针尖定 位于原 核上方 ,成 直线。 (4) 将注射 针尖慢 慢指向 受精卵 ,插入 ,穿过 透明带 、质 膜并进 入原核 ,由于 DNA 被持 续从针 尖排出 ,此时 可见原 核胀大 , 一旦观 察到这 种膨胀 ,即 刻小心 抽出注 射针 。注射 DNA 的流 量可通 过调节 空气压 力而调 整。. (5) 将已 注射的 卵移至 M2 液滴 另一侧 ,同样 操作再 注射另 一个卵 。当 注射 槽中的 卵完全 注射后 ,将其 转入另 一只含 M16 培养 液的培 养皿中 ,置 37C 的 (:02培 养箱中 培养。 (6) 按上述 操作再 转移一 批受精 卵到注 射槽上 进行显 微注射 。每 次移 至注射 槽上的 卵可供 30 〜 60min 注射 ,卵如 在室温 置 M2 液中时 间过长 则对其 有害。 (7) 所 有卵注 射完毕 ,将 健康胚 移入另 一只含 M16 培养 液的培 养皿中 ,置 37X: 的 co2 培养箱 中培养 。健康 胚可在 解剖镜 下挑选 ,其轮 廓清晰 且在透 明带与 卵之间 有卵周 隙 ,而溶 解的卵 将全部 充满透 明带。 4. 胚 胎移植 胚胎 移植是 用人工 方法把 哺乳动 物的胚 胎由一 个个体 (供体 ) 移植到 同一或 另一个 个体 (受体 ) 的体内 ,使 其继续 发育的 技术。 从单细 胞到囊 胚的卵 ( 受精后 0.5 〜 3. 5d) 都 可以转 移至假 孕母鼠 的生殖 管道完 成发育 ,对于 转基因 鼠而言 , 显微注 射后的 卵可以 对当天 的假孕 母鼠进 行输卵 管移卵 ,或体 外培养 过夜后 ,在 次日用 分裂成 两细胞 的 卵进行 输卵管 移植; 也可 体外培 养至胚 泡期后 ,对第 3 日的 假孕母 鼠做子 宫移卵 。前 两种 方法因 产仔较 多而使 用相对 较广。 1) 假 孕母鼠 的诱导 假孕 母鼠作 为显微 注射后 受精卵 的受体 及其后 的养母 ,常通 过注射 PMSG 和 hCG 以及与 结扎公 鼠交配 来诱导 。选择 鼠龄在 6周~5 个月 、体重 >20g 的母鼠 (曾 产过仔 • 1002 • 并 成功抚 育过幼 鼠的母 鼠更佳 ), 腹 腔注射 5 〜 10U 的 PMSG, 12h 后, 再注射 5 〜 10U 的 hCG。 将结 扎公鼠 放入雌 鼠笼内 ,次 日检查 有精栓 母鼠者 即为假 孕母鼠 。一 次实验 常需 准备较 多的假 孕母鼠 以防胚 胎移植 失败, 未使用 的假孕 母鼠可 在精栓 产生两 周后再 与结 扎公鼠 交配。 2) 公 鼠结扎 选 择鼠龄 6 周以上 的公鼠 ,按 常规 外科手 术将公 鼠输精 管结扎 ,手术 后使动 物恢复 健康 至少需 2 周 ,方 可用于 交配。 每只结 扎公鼠 至少需 先后使 3 只 母鼠产 生精栓 且所有 产生 精栓的 母鼠均 不怀孕 ,此 结扎公 鼠才能 用于正 式实验 。结扎 公鼠可 每晚与 母鼠交 配, 但最好 是隔日 1 次 。如经 4 〜 6 次都 不能使 母鼠产 生精栓 ,则 必须更 换结扎 公鼠。 3) 胚 胎移植 (1) 输 卵管移 卵:按 0.6mg/kg 剂 量用戊 巴比妥 麻醉假 孕母鼠 ,采用 外科手 术在动 物背 部剪开 1 个小口 ,暴露 输卵管 。开 口处 位于脊 柱左侧 lcm, 约 与最后 1 根 肋骨平 齐 。轻 轻将卵 巢和输 卵管整 理成形 ,用细 镊子在 卵巢囊 上压一 小印迹 。从 C〇2 培养箱 中取 出显微 注射卵 并转入 M2 培养液 ,用移 卵管吸 一小段 矿物油 和1^2 ,吸 2 个小 气泡, 再逐 个吸卵 使其尽 可能少 占体积 。一般 2 细 胞卵吸 15 个, 单细胞 卵吸约 20 个后 ,再吸 一小段 M2 (图 18. 2A)。 在解剖 镜下卵 巢略下 方找到 输卵管 腹壶开 口处, 用移卵 管将卵 轻 轻注入 开口内 。输 卵管移 卵中鼠 的方位 、手术 切口及 暴露组 织如图 18.8 所示。 图 18. 8 输卵 管移卵 中鼠的 方位、 手术切 口及暴 露组织 (2) 子 宫移卵 :按常 规外科 手术暴 露子宫 ,用 25 号针 头在子 宫上端 数毫米 处刺穿 子宫 角壁, 注意避 开血管 。将 子宫移 卵管沿 该针刺 孔插入 子宫约 5mm, 轻 轻注入 胚泡。 子 宫移卵 暴露的 组织及 针刺部 位如图 18.9 所示。 移卵 完毕, 将子宫 、输 卵管、 卵巢等 重新置 入体腔 ,缝 合体壁 和皮肤 。手术 后将假 孕 母鼠回 复到正 常词养 ,约在 20d 后产下 幼鼠。 值得注 意的是 ,胚 胎移植 实验需 在无菌 条件下 进行, 且实验 用动物 及器具 均需在 35t: 左右 保温。 • 1003 • 图 18.9 子宫 移卵暴 露的组 织及针 刺部位 (六) 转 基因动 物阳性 的检测 转基因 动物阳 性的检 测可用 PCR、 斑点 印迹及 Southern 印迹等 多种方 法分析 确定。 PCR 检 测灵敏 、迅捷 ,但 容易 产生假 阳性; 某些条 件下斑 点印迹 可能会 出现假 阴性; 而 Southern 印迹可 给出一 定长度 的区带 ,不仅 提供了 外源基 因结构 与整合 的信息 ,同 时 可克服 PCR 及 斑点印 迹技术 的不足 。因此 ,转基 因动物 阳性的 检测一 般先用 PCR 快 速筛选 ,再用 Southern 印迹得 出结论 ,所 用探 针需高 度特异 。对 转基因 鱼而言 ,一般 取不 同发育 时期的 胚胎、 鱼的尾 鳍组织 或血液 等提取 DNA 样品进 行检测 。对转 基因鼠 来说, 假孕母 鼠产出 幼仔后 ,可用 幼鼠尾 巴提取 DNA 或者 处死受 体母鼠 取出胚 胎组织 提取 DNA 并冻存 不同组 织后, 再进行 检测。 1 . 鱼类胚 胎或尾 鳍组织 DNA 的提取 鱼类受 精卵经 显微注 射后, 随机取 样固定 不同发 育时期 的胚胎 样品或 幼鱼的 少许尾 鳍组织 。取出 的胚胎 或尾鳍 组织在 蒸馏水 中洗涤 2 次后 直接按 以下方 法提取 DNA, 也 可置 液氮或 -20X: 冰箱 中保存 。将 胚胎或 尾鳍组 织用预 冷的玻 璃匀浆 棒捣碎 ,迅 速加入 400pLDNA 抽提液 (10mmol/LTris-HClpH7.5, 10mmol/LEDTApH8.0, 300mmol/L NaCl, 2%SDS) 及 5/iL 蛋白酶 K (10mg/mL), 37T: 保温 3~4h; 消 化完毕 ,用 RNase 37«C 处理约 30min; 酚 、氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽 提至不 见变性 蛋白; 2 倍体 积无 水乙醇 沉淀, 70% 乙醇 洗涤。 干燥后 溶于双 蒸水或 TE (10mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/L EDTApH8.0), 取 l^L 电泳及 紫外比 色检测 ,其 余置 -20X: 保存 备用。 2. 鼠肌 肉或幼 鼠尾巴 DNA 的提取 取 2 周胎鼠 一 侧臀部 肌肉或 2 〜 3 周 幼鼠的 2cm 左右 尾巴置 试管中 ,剪刀 剪碎组 织; 加入 lmL DNA 裂解液 (50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 100mmol/L EDTA pH8.0, lOOmmol/LNaCl, 1%SDS), 100 卩 L 蛋白酶 K (100mg/mL), 55X: 保温 过夜; 消化完 毕 ,用 RNaseSTt: 处理约 1 〜 2h; 酚 、氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽 提至不 见变性 蛋白; 2 • 1004 • 倍 体积无 水乙醇 沉淀, 70% 乙 醇洗涤 。干燥 后溶于 TE, 取 lpL 电 泳及紫 外比色 检测, 其余置 -201C 保存 备用。 3. PCR、 斑点 印迹及 Southern 印 迹分析 PCR、 斑点 印迹及 Southern 印迹 分析参 见前面 章节。 (七) 转 移基因 的特征 转基 因鱼模 型认为 ,外源 基因被 注入受 体卵后 , 在受体 鱼胚胎 发育过 程中普 遍经历 了一个 从复制 、部 分降解 、变构 、多 聚化 和逐渐 与基因 组整合 的过程 。注 入的线 型 GH 基因, 不论携 带质粒 载体序 列与否 ,均 可以线 形单体 、超 环和松 散环状 分子及 多 聚体形 式存在 ,其 中多聚 体为主 要存在 形式。 以线性 二聚体 、多 聚体形 式注入 的外源 GHDNA 则是 以更大 分子量 的多聚 体存在 ,而 注入的 环状分 子构型 则未发 生变化 。注 入不 同物理 构型的 GH DNA, 在 受体鱼 的胚胎 发育过 程中均 经历不 同形式 的复制 扩增, 至原肠 末期达 到峰值 后逐渐 降解。 GH DNA 复制 量与注 入外源 GH 基因 拷贝数 在一定 范围内 [ (IX 1〇5) 〜 (IX 1〇7) / 卵] 呈正 相关, 与线性 DNA 分子片 断长短 也有关 ,线 性外源 GHDNA 的最大 扩增倍 数可达 100/ 细胞 以上。 在淡水 鱼类胚 胎发育 过程中 ,外 源 GH 基因 的整合 是一个 渐进的 过程, 整合开 始的时 间大约 在器官 开始分 化之后 (最 近亦 发现极 个别囊 胚期开 始整合 的例子 ), 由 此形成 的转基 因鱼是 携带外 源基因 的嵌合 体 ,即 不同组 织或器 官之间 、同 一器官 的不同 细胞之 间所整 合的外 源基因 在数量 和质量 (整合 位点) 是不均 一的。 转移基 因的表 达既受 转移表 达载体 启动调 控顺序 的控制 ,又 受整合 部位侧 翼顺序 的影响 ,可能 存在“ 有效整 合”、 “沉默 整合” 和“毒 性整合 ” 3 种 状态 。其中 ,只有 那些不 扰乱受 体“管 家基因 ”和在 发育阶 段表达 的“旺 势”基 因的功 能 与结构 ,并于 成体中 正常表 达的适 宜位点 的整合 才是有 效的。 转基因 鱼携带 的外源 GH 基 因可以 通过性 腺传递 到子代 ,但 子代鱼 个体间 外源基 因的拷 贝数存 在很大 差异, 部分拷 贝丢失 ,不完 全按孟 德尔方 式传递 。值 得注 意的是 ,随 着世代 的传递 ,转 移基因 的阳 性率逐 代提高 和稳定 (表 18.5)。 表 18.5 PCR 技术 检测转 AfTfcGif 基因红 鲤各世 代的转 移基因 阳性率 检 测世代 P〇 代 &代 込代 f3R 匕代 繁 殖方式 阳性 P〇 群 体繁殖 阳性 R 群 体繁殖 阳性 f2 群 体繁殖 阳性 f3 群 体繁殖 检 测鱼数 12 24 22 20 35 阳 性鱼数 7 17 17 18 33 阳性率 58.3% 70.8% 77.3% 90% 94.3% 第三 节转基 因动物 的应用 随 着转基 因技术 的发展 ,转 基因动 物在许 多研究 领域基 因实现 了重大 突破, 展现出 良 好的应 用前景 。如 基因表 达调控 、基因 结构和 功能, 生物发 育调控 作用; 高产 、优质 • 1005 • 和抗 逆动物 品种的 培育; 作为 “生物 反应器 ”生产 珍稀蛋 白质; 人类 疾病 及基因 治疗模 型的 建立; 人体器 官移植 的动物 器官生 产以及 药理学 和环境 科学等 领域。 一、 基因表 达调控 、基 因功能 及发育 调控作 用研究 基因表 达调控 、基因 功能及 发育调 控作用 研究, 一直是 分子遗 传学家 所关注 的焦点 之一 。但在 一个相 当长的 时期内 ,人们 对基因 表达调 控的知 识主要 来源于 培养细 胞的基 因转移 等实验 。如 果能在 活体生 物这一 高度复 杂和精 巧的系 统中主 动实施 对基因 表达的 调 控操纵 ,那么 人们将 能够深 入了解 基因在 生物体 发育过 程的表 达调控 和功能 。回 顾转 基因动 物的发 展历史 ,一 方面对 基因表 达与调 控的探 索研究 促进了 转基因 动物的 诞生; 另 一方面 ,在 多种基 因表达 与调控 的研究 方法中 ,也 只有转 基因动 物实验 可以将 分子、 细 胞和整 体动物 水平的 研究统 一起来 ,从四 维时空 中综合 研究基 因的表 达特性 、调 控作 用 和基因 功能。 中 国科学 院水生 生物研 究所的 科研人 员采用 转移基 因和细 胞核移 植相结 合技术 ,以 绿色 荧光蛋 白基因 为报告 基因, 从四维 时空的 角度追 踪了外 源基因 在鱼类 胚胎中 表达与 整合 的时序 。结 果发现 ,外 源基因 在鱼类 胚胎中 ,从 原肠胚 期开始 表达, 与鱼类 胚胎分 化时期 相吻合 ,表达 效率与 基因构 型有关 。外 源基因 从囊胚 期即开 始整合 ,并持 续相当 长 的时间 。两 种不同 结构的 基因共 转移时 ,其 整合与 表达不 存在一 致性。 同 源异形 盒基因 (homeobox gene) 是一组 古老的 、保 留下来 的模式 基因, 存在所 有 两侧对 称动物 (bilaterian animal) 体内, 反映两 侧对称 动物门 (bilaterian phylum) 的 系统发 育关系 与胚胎 发育和 细胞分 化调节 相关; 可揭 示发育 调节潜 力的早 期演化 ,如控 制体节 的特征 、调节 中枢神 经系统 、确 定前后 分化关 系等。 一般情 况下, Hot 基因都 有 各自的 5' 端调 控区, 但在一 个连锁 群中, War 基 因间距 离很近 ,基因 转录调 节的一 些重要 区可分 散在整 个基因 内或作 为远距 离增强 子定位 于基因 的一侧 。因 此, Hor 基 因表 达的时 空性非 常复杂 。例如 在果蝇 的早期 发育中 ,由母 型基因 (maternal gene)、 分 节基因 (gap gene) 及 For 基因构 成了一 个多层 次的复 杂的基 因调控 网络, Hor 基因 在其 中起重 要作用 。对 于这种 多层次 、复杂 而又精 巧的基 因调控 网络机 制研究 ,转 基因 动物显 示其得 天独厚 的技术 优势。 Hora5 基因 的表达 至少受 2 个 启动子 的控制 ,在脊 髓、 原脊椎 (prevertebrate)、 肺、 肾和肠 中产生 4 种 不同的 转录表 达模式 。在采 用原位 杂交、 Northern 印 迹等技 术研究 Ho:ca5 基 因的表 达调控 出现矛 盾的结 果时, Nowling 等人将 基 因的侧 翼调控 区与报 告基因 hcZ 重组 ,通过 转基因 鼠途径 研究了 H〇xa5 基因 的表达 调控, ll~13d 的 胚胎中 即观察 到基因 表达在 组织和 时间上 的特异 性, 其中空 间表达 的特异 性受一 个含有 增强子 特性的 604bP 的调控 区指导 ,并获 得了具 有位置 特异性 表达增 强子的 详细图 谱等。 人 类基因 组计划 (human genome project) 正致 力于最 终完全 测定约 10 万个 人类基 因序列 及建立 精确物 理图谱 ,但 我们仅 知道其 中极少 数基因 的功能 。一个 基因的 特殊序 列对 应一个 特殊的 蛋白质 ,要了 解这个 特殊蛋 白质的 序列在 其作用 的细胞 中担负 何种使 命 ,仅知 道其核 苷酸序 列是不 足以揭 示出该 蛋白质 在整个 生命过 程中的 功能的 。传 统的 遗传学 方法和 体外生 物化学 方法研 究基因 表达产 物生理 功能受 到了诸 多限制 ,结 合基因 • 1006 • 同源重 组与胚 胎干细 胞技术 ,通 过基 因敲除 (gene knockout) 建立 突变的 转基因 动物则 使我们 可以在 深层次 上了解 基因及 其相应 蛋白质 的结构 与功能 的关系 ,从 而提供 了一个 十分有 效的手 段来研 究人类 庞大基 因组中 某一特 殊基因 的功能 。所 谓基因 敲除, 就是利 用 活细胞 染色体 DNA 可与 外源性 DNA 同源 序列发 生同源 重组的 性质, 在体外 进行目 的 基因的 功能缺 失突变 ,突变 基因通 过靶位 基因操 作方法 导入染 色体基 因组中 ,并 整合 在预定 位点上 使特定 的靶基 因失活 ,实现 功能缺 失突变 。采 用基因 敲除技 术建立 转基因 动物 ,目前 已在某 些疾病 基因、 学习与 记忆基 因及生 理周期 基因的 相关功 能等研 究领域 取得 了重大 进展。 二 、基因 工程定 向育种 向动 物体转 移外源 基因并 使之在 动物体 内表达 ,能够 克服物 种之间 固有的 生殖隔 离 ,实 现动物 物种之 间遗传 物质的 交换。 基因工 程定向 育种的 实质是 ,将 基因转 移与传 统 育种方 法结合 ,各取 其精华 ,快速 创造新 的目的 变异和 固定扩 展变异 ,从 而快 速培育 出高产 、优 质和 抗逆动 物品种 。如 转基因 羊可以 增加羊 毛产量 、提 高羊毛 光泽亮 丽程度 及羊毛 脂含量 ,转基 因猪增 加瘦肉 含量, 转基因 草鱼和 鸡抗病 育种等 。快 速生长 转基因 鱼 的培育 ,即是 转基因 动物研 究在基 因工程 定向育 种方面 的代表 之一。 鱼类是 地球上 现存脊 椎动物 中的大 家族, 几乎占 其种数 的一半 。其在 满足人 类蛋白 质需求 等方面 起着重 要作用 ,此外 ,作为 一种重 要的食 用蛋白 ,“ 食之有 鱼”历 来是我 国 人民生 活质量 高低的 重要标 志之一 。然而 近年来 ,随 着工业 的发展 、人 口的剧 增和渔 业捕 捞技术 的进步 ,超负 荷投放 、盲 目施肥 投饵等 破坏生 态环境 的不合 理养殖 措施及 “竭 泽而渔 ”的索 取方式 ,一方 面使得 水资源 匮乏的 矛盾日 益显著 ,鱼类 资源也 大幅度 减少; 另 一方面 ,人们 对水产 品的数 量和质 量却提 出了日 益增长 的需求 。因而 ,欲 求得 水体生 态环境 优化, 同时又 获得最 高的渔 业产量 ,以 求水体 的持续 利用, 培育适 于大水 面养 殖的、 有利于 优化环 境并能 获得高 产值的 快速生 长和具 有抗逆 的优良 品种实 为当务 之急 。而且 ,节水 型集约 化的水 产养殖 业是将 来的发 展模式 。集约 化养殖 由于自 身养殖 方式 的特点 ,更需 要有与 其相适 应的养 殖品种 。而传 统的选 育种技 术存在 育种周 期长, 优良性 状遗传 不稳定 等不足 。基 于此, 中国科 学院水 生生物 研究所 的科研 人员在 世界上 率先 开展了 转基因 鱼的基 因工程 定向育 种研究 。在 培育出 分别比 对照鱼 生长快 2.3 倍、 2.7 倍和 4.3 倍的转 MTTiGH 基因 鲤鱼、 鲫鱼和 泥鳅的 基础上 ,考 虑到转 MTTiGH 基 因鱼可 能会引 起的伦 理道德 、消 费安全 、遗传 安全及 生态安 全等诸 多问题 ,该研 究小组 首次 提出了 构建“ 全鱼” GH 基因重 组体的 设想, 将鲤鱼 (3- 肌 动蛋白 (CA) 基因 5' 端 启动调 控区与 草鱼生 长激素 (gGH) 基因精 确重组 ,构建 了全部 由我国 鲤科鱼 类基因 组成的 、具 自主 知识产 权的“ 全鱼” GH 基因 重组体 pCAgcGH。 将“全 鱼”基 因显微 注射导 入红鲤 和银鲫 受精卵 ,获得 转“全 鱼”基 因红鲤 和银鲫 ,随机 抽样后 ,经 DNA 斑点 杂交或 PCR 检测 ,转移 阳性率 分别为 52% 和 56.2%。 转基因 阳性的 PG 代 红鲤词 养至 420d, 最大个 体体重 2500g, 37% 的个体 大于对 照组最 大个体 (1800g)。 以 具快速 生长 效应的 P〇 代红鲤 (早) 为亲本 与镜鲤 ($) 杂交 ,小 规模生 产实验 表明, 在中原 地区, 当年的 转基因 杂交鲤 鱼可以 词养成 商品鱼 (平 均体重 658g), 其生 长比相 应的非 • 1007 . 转基因 杂交对 照组快 10%, 比普通 鲤鱼快 26%。 由具快 速生长 效应的 P〇 代阳性 红鲤, 繁殖出 转“全 鱼”基 因红鲤 &代 数万尾 ,子 代生长 速度较 对照快 18%、 22. 8% 和 71.2% (三 批不同 阶段实 验结果 )。 此外, 210d 龄生长 实验结 果显示 ,转 />CAgcGHc 银 鲫 生长平 均比对 照组快 29.2%。 综合 以上情 况说明 ,快速 生长转 GH 基因鱼 的匕 代仍 具有 20% 以上的 快速生 长效应 。黄河 鲤是我 国四大 淡水名 鱼之一 ,历史 上就曾 有“洛 鲤河鲂 ,贵于 牛羊” 的美誉 。鲤 鱼作 为我国 淡水养 殖业的 主养品 种之一 ,总占 有量为 10%。 但在我 国大部 分地区 ,黄 河鲤 商品鱼 的生产 周期为 2 年 ,严 重制约 了黄河 鲤生产 的发展 。将 “全鱼 ”基因 />CAgcGH 显微注 射导入 黄河鲤 受精卵 ,研制 出转基 因黄河 鲤 ,经 5 个 月词养 的最大 个体为 2.75kg, 平均 体重达 1.5kg 以上; 17 月龄时 ,有 的阳 性 个体体 重竟达 7.5kg 以上 ,成为 名副其 实的“ 中国超 级鱼” 。此外 ,对转 基因鱼 生长 、营养 和能量 学的深 入研究 发现, 与对照 鱼相比 ,转 GH 基 因鱼的 摄食率 降低, 而 其湿重 、干重 、能量 和蛋白 质等的 特定生 长率和 转换效 率均显 著提高 ,即转 GH 基 因鱼具 有“少 食快长 ”的生 理特性 。代 谢能耗 分配的 降低和 蛋白合 成能量 积累的 增加是 其 快速生 长的主 要原因 。同时 ,对转 基 因鲤鱼 的研究 还发现 ,其肌 肉蛋白 质含量 显 著高于 对照鱼 ,不 但未付 出以“ 产量” 换“质 量”的 代价, 反而转 GH 基因 鲤鱼的 品 质得到 了提高 。转 GH 基因 鲤鱼的 食物转 化效率 也显著 高于对 照鱼, 在生产 实践中 可以节 约饵料 ,因 而在渔 业生长 中可以 大幅度 节省饵 料成本 ,提 高水产 养殖业 的经济 效益。 三、 转基因 动物生 物反应 器研制 动 物生物 反应器 (animal bioreactor) 又 称动物 个体表 达系统 (whole animal expres- sion system), 是转基 因动物 应用最 为活跃 、同 时也 是竞争 最为激 烈的研 究领域 之一。 所谓动 物生物 反应器 ,就 是将具 有某种 重要应 用价值 的生物 活性蛋 白基因 导入动 物受精 卵或早 期胚胎 ,培育 转基因 动物, 使外源 基因在 动物的 特定组 织内高 效表达 ,再 从这些 组织的 分泌液 、浸出 液或血 清中分 离提取 目的基 因产物 。泌 乳是动 物的一 种生理 活动, 对动物 健康及 其他正 常生理 活动没 有干扰 。乳 腺提取 、合成 、分泌 蛋白质 的能力 很强, 不仅 能对重 组蛋白 进行多 种翻译 后加工 ,如 羟基化 、糖 基化、 y- 羟 基化等 ,而 且还能 将重组 蛋白质 折叠成 有功能 的构象 ,其生 化活性 、生物 学活性 与天然 蛋白完 全相同 ,产 品 无毒性 、无 副作用 。因此 ,转 基因动 物的乳 腺组织 是目前 公认的 动物生 物反应 器的理 想器官 。以 该系 统生产 外源蛋 白如多 肽药物 、蛋白 质疫苗 、酶 类等 ,尤其 生产那 些在质 和量上 难以应 用常规 技术获 得的重 要生物 活性物 质时, 投资少 、成 本低、 对环境 没有任 何污染 ,具 有原核 系统、 酵母及 离体真 核细胞 生产系 统所不 可比拟 的优点 。与 大肠杆 菌 、培养 细胞中 的基因 工程产 品相比 ,更 易为使 用者所 接受, 具有非 常明显 的社会 效益。 转 基因动 物乳腺 生物反 应器成 功的关 键是外 源基因 在乳腺 组织中 的特异 性表达 ,包 括 外源基 因是否 在活体 动物乳 汁中分 泌表达 ,表达 是否具 有组织 特异性 ,表 达水 平及其 蛋白质 是否具 有全部 的生物 学活性 。目 前使用 的乳汁 蛋白基 因及其 表达元 件主要 有:乳 清蛋 白基因 (whey acid protein gene)、 P •乳 球蛋 白基因 (P-lactoglobulin gene)、 酷蛋白 • 1008 • 基因 (casein gene) 及其表 达元件 。这些 基因的 5' 侧 冀区都 有一段 与乳腺 组织特 异性表 达 有关的 “milk box” 保 守序列 ,有效 指导外 源基因 在乳腺 组织中 的表达 。目前 已有多 种具有 生物活 性的人 类蛋白 质可以 从转基 因动物 的乳汁 中获得 。其中 ,转 基因动 物包括 小鼠 、大鼠 、家兔 、猪 、绵羊 、山羊 、牛 等; 具有生 物活性 的人类 蛋白质 大致有 以下几 类:血 栓治疗 药物如 组织型 纤溶酶 原激活 因子、 尿激酶 原及抗 凝血酶 III 等; 出血 性疾 病 治疗药 物如凝 血因子 VIII 和 IX 等; 免疫 增强 剂或免 疫治疗 药物如 干扰素 、白 细胞介 素 及肿瘤 坏死因 子等; 肺气 肿治疗 药物如 al- 抗 胰蛋白 酶等; 营养制 剂如人 乳铁蛋 白等。 据美国 红十字 学会和 遗传学 会预测 ,到 2005 年 ,仅美 国的乳 腺生物 反应器 生产的 药物, 其年 销售额 将达到 350 亿 美元; 到 2010 年, 所有基 因工程 药物中 利用乳 腺生物 反应器 生产 的份额 将达到 95%。 曾有 学者推 算过, 如果能 使组织 型纤溶 酶原激 活因子 在牛奶 中的 表达水 平达到 10mg/mL 以上 ,那 么只要 培育十 几头至 几十头 奶牛就 能满足 全世界 血栓病 人治疗 的需求 。一 个以转 基因动 物为基 础的新 兴制药 业正在 崛起, 并将极 大地造 福于 人类。 四 、人类 疾病模 型与基 因治疗 人类作 为医学 研究对 象有其 不可克 服的局 限性, 如环境 因素与 遗传背 景无法 严格控 制 、难 以有效 观察到 胚胎发 育发展 的变化 、对 于累及 人类重 要脏器 的疾病 无法直 接取材 研究等 。因此 ,利用 转基因 技术建 立人类 疾病转 基因动 物模型 ,进 而研究 疾病的 发病机 理 、分 子病理 机理十 分重要 。而在 转基因 动物问 世以前 ,发 现自然 突变体 几乎是 遗传学 家获 得人类 遗传疾 病模型 的惟一 途径。 近年来 ,通过 转基因 技术及 基因敲 除技术 精确地 失 活某些 基因或 增强某 些基因 的表达 ,目 前已建 立了模 仿人体 各种癌 症发生 、心 血管类 疾病 、早老 性痴呆 、肥 胖病 、衰老 、乙型 肝炎病 毒感染 、胰 岛素依 赖性糖 尿病、 甲状腺 素 失调疾 病及人 类免疫 缺陷病 毒感染 等多种 复杂疾 病的转 基因动 物模型 。例如 ,癌 症成 为 人类杀 手的原 因之一 ,就在 于人类 一直无 法理解 恶性肿 瘤发生 的机理 。转 基因 动物模 型 的建立 ,无疑 为人类 剖析并 最终攻 克癌症 提供了 强有力 的工具 。肺 癌是 美国致 死率最 高 的一种 癌症, Morris 等人研 制出肺 泡末梢 上皮细 胞中/ >53 功能缺 陷的转 基因鼠 ,借 助于该 动物模 型研究 发现, />53 基 因突变 与肺恶 性肿瘤 的发生 存在强 烈的相 关性。 人类 的遗传 病据报 道有近 5000 种 ,基本 上不可 能用常 规的治 疗方法 治愈, 基因治 疗 (gene therapy) 可 能是惟 一有效 的手段 。基 因治疗 是通过 调控目 的基因 的表达 ,抑 制、 替代或 补偿缺 陷基因 ,从而 恢复受 累细胞 、组织 或器官 的生理 功能, 达到疾 病治疗 目的 的一种 方法。 基因治 疗的临 床实施 有赖于 人类疾 病转基 因动物 模型的 建立。 1980 年, Cline 首次对 2 名 严重的 |3- 地中海 贫血病 人进行 基因治 疗试验 ,由 于当时 P- 珠蛋白 基因 还从未 在培养 细胞中 表达, 把基因 治疗从 实验室 超时代 地应用 到临床 ,其结 果以失 败告终 ,并 导致对 基因治 疗的众 多争议 。为此 ,美 国国 家卫生 研究院 (NIH) 重组 DNA 咨询 委员会 (RAC) 在评 审有关 开展基 因治疗 临床实 验的申 请书时 ,首先 要求申 请者提 供的报 告便是 “临床 实施方 案在转 基因动 物或细 胞模型 中的应 用情况 ,它 的安全 性 、有效 性及可 行性” ,并 要求“ 解释选 择该模 型的理 由”。 我国的 基因治 疗临床 试验始 于 1991 年 ,国 家卫生 部在评 审该类 申请时 也有类 似要求 。由于 目前已 获批准 实施的 • 1009 • 120 多 项临床 基因治 疗方案 均未取 得令人 满意的 结果, NIH、 RAC 及许多 学者建 议基因 治 疗的重 点必须 回到解 决基本 问题的 起点上 ,即 研究基 因结构 与功能 、基 因表达 与调控 及 基因载 体构建 、建 立良好 的动物 模型等 。相 信转基 因动物 模型在 上述基 本问题 的研究 上 ,在 探索疾 病异质 性和环 境因素 对基因 治疗效 果的影 响上发 挥其重 要作用 ,为 临床运 用基 因治疗 提供更 可靠的 数据。 五 、药理 学研究 人类疾 病转基 因动物 模型的 建立, 使得人 们在洞 察各种 复杂疾 病的发 病机理 和掌握 分子 病理机 理知识 的同时 ,加快 了新药 的筛选 和评价 及对内 源性物 质的药 理学特 性认识 的研 究进程 。胰岛 素依赖 性糖尿 病是一 种自身 免疫性 疾病。 Harlan 等 人发现 ,胰腺 p 细 胞表 达小鼠 B7-1 的转基 因小鼠 对链尿 佐菌素 (STZ) 诱发糖 尿病非 常敏感 ,经过 26 〜 100d 的 潜伏期 ,较低 剂量的 STZ 即可 使之发 展成糖 尿病, 原因是 T 淋巴 细胞介 导的胰 腺 (3 细胞的 破坏。 该转基 因小鼠 模型为 用于治 疗糖尿 病药物 的筛选 和评价 提供了 有力工 具。 阿霉素 (doxorubicin) 是一种 对各种 实验性 肿瘤都 有抑制 作用的 广谱性 抗生素 ,但 其 可能会 引起心 率失常 、急 性或迟 发性心 功能不 全乃至 心力衰 竭等心 脏毒性 。有 学者推 测 ,金属 硫蛋白 (metallothionein, MT) 可能 会保护 心脏免 受阿霉 素造成 的毒性 损伤, 但这一 推测正 确与否 ,一直 缺乏确 实的实 验依据 。为 此, Kang YJ 研制出 心脏特 异性表 达人类 MT-JJ 基 因的转 基因鼠 ,并施 以阿霉 素作用 ,与 对照 鼠比较 ,转 基因鼠 及其离 体心房 对阿霉 素诱导 的心脏 功能损 伤表现 出极大 的抗性 ,从 而通过 转基因 动物途 径首次 证明 金属硫 蛋白在 阿霉素 诱导心 脏毒性 中的保 护作用 。临 床研究 表明, P 糖蛋白 与一些 肿瘤 多药耐 药有关 ,体外 细胞培 养确认 其是内 源性或 获得性 多药耐 药的原 因之一 。基因 敲除 小鼠模 型研究 进一步 发现, P 糖蛋 白不仅 对包括 肿瘤药 物在内 的一些 药物的 分布、 消 除和排 泄有明 显作用 ,而 且吗啡 、地 塞米松 等药物 也是其 底物, P 糖蛋 白的活 性显著 影响这 些药物 的组织 分布和 消除。 六 、器 官移植 器官移 植的临 床研究 与应用 一直受 世界范 围内供 体器官 短缺的 困扰, 异源器 官移植 可 能是解 决供体 器官短 缺的有 效途径 。猪 具有与 人相似 性较高 的优点 ,如 不同发 育时期 的猪 其心脏 、肾等 与不同 年龄的 人的相 应器官 在大小 上比较 接近, 因而猪 是目前 人类临 床异源 器官移 植的首 选供体 。然 而异源 器官移 植时受 体对异 种外源 器官的 超急性 排斥反 应 (hyperacute rejection, HAR) 极大 地阻碍 广 这 一 进程, 克服这 一障碍 便成为 异源器 官移 植成功 的关键 。超急 性排斥 反应的 机理是 :供体 (猪) 组织血 管内皮 细胞表 面存在 糖类表 面抗原 ,而 受体 (人) 血 清中有 抗此抗 原的天 然抗体 ,器官 移植后 ,二者 发生特 异性 结合形 成免疫 复合物 ,从而 导致补 体激活 。目 前针对 HAR 的 常规治 疗方法 都是基 于对补 体激活 的阻断 ,但存 在着重 大缺陷 ,如 免疫抑 制的危 险性等 。转基 因动物 技术为 克服这 一 障碍发 挥了重 要作用 。人 类补 体激活 受一系 列被称 为补体 活性调 节因子 的负调 节 ,这 些因子 包括膜 辅助蛋 白因子 (MCP), 衰退促 进因子 (human decay-accelerating • 1010 • factor, hDAF) 和 hCD59。 目前 ,这些 人补体 活性调 节因子 已通过 转基因 技术转 入动物 生殖 细胞或 体细胞 ,获得 永久性 表达人 补体活 性调节 因子的 转基因 猪品系 或细胞 系并用 于器 官移植 研究。 1997 年, Cozzi 等人进 行了转 ADAF 基 因猪与 猕猴间 的心脏 移植试 验 。结 果表明 ,所有 8 头转基 因猪心 脏移植 后均未 出现超 急性排 斥反应 ,移 植心 脏的工 作时间 平均为 5. Id (97 〜 126h); 而所有 10 头对照 组猪心 脏移植 后都出 现超急 性排斥 反应, 移植心 脏的工 作时间 平均为 1.6d (0.4 〜 101h)。 1998 年, Zaidi 等人 通过转 ZiDAF 基因 猪与猕 猴间的 肾脏移 植试验 发现, 转基因 试验组 中无一 例发生 超急性 排斥反 应 ,其平 均存活 时间为 13d; 而对 照组中 ,除 一例发 生超急 性排斥 反应外 ,其余 均显示 有急 性脉管 排斥反 应发生 ,平 均存活 时间为 6. 5d。 通过改 变或降 低供体 表面抗 原的表 达是 阻止超 急性排 斥反应 的另一 种策略 ,目 前已取 得一定 进展。 因此在 异源器 官移植 中 ,通 过将人 类免疫 系统有 关的基 因如补 体激活 调节基 因转移 至供体 动物中 、从 供体动 物中 敲除与 人类免 疫系统 不相容 的基因 或将上 述技术 结合, 就可能 进一步 抑制排 斥反应 发生。 1999 年底 ,中国 科学院 发育生 物学研 究所现 为中国 科学院 遗传与 发育生 物学研 究所、 武汉同 济医院 等单位 合作完 成了国 内首例 成功的 转基因 器官移 植实验 。心 电图显 示, 接受了 携带人 体基因 的猪心 的猕猴 心率及 波形均 很正常 ,标志 着我国 解决器 官移植 中 供体缺 乏的研 究已进 入实质 性阶段 。可 以预言 ,人 类器官 移植治 疗的组 织器官 库建立 和异 源器官 移植的 成功, 将更多 地得益 于转基 因动物 技术及 其未来 发展。 七、 环境科 学研究 在以 宏观生 态为主 要研究 对象的 环境科 学领域 ,转基 因动物 技术也 得到了 有效应 用 。转基 因试验 不仅可 以转入 各种功 能基因 或标志 基因, 还可转 入代表 毒性终 点的基 因 ,既 可以从 动物整 体水平 判断毒 性作用 ,从而 通过一 个试验 完成所 有组织 的测定 ,又 能研究 环境胁 迫因子 作用于 靶器官 的高度 组织特 异性等 。转 基因动 物试验 与传统 的毒理 学试 验相比 ,可在 低剂量 下检测 ,一 般只需 1% 或 1% 以下的 50% 致 死浓度 (lethal con- centration, LC5〇) 剂量, 就可在 转基因 动物试 验中测 得结果 ,因此 在研究 慢性或 低剂量 接触条 件下的 DNA 损伤 时尤为 有效。 最能反 映生物 圈中某 一给定 污染物 对环境 影响的 测试 指标是 生物可 利用性 (bioavailability), 而生物 可利用 性的分 析只能 在活体 生物中 进行 ,这 一点是 即使传 统的毒 理学和 最敏感 、精确 的分析 化学相 结合也 难以逾 越的障 碍 。采 用转基 因技术 ,可以 在基因 表达与 调控网 络系统 中鉴别 毒物特 异信号 ,即 时监测 环境 可疑毒 物与遗 传变异 的关系 ,从而 提供了 一种可 靠的生 态风险 早期预 警系统 。毒理 学和 基因组 学的深 入发展 ,已交 叉融合 成一门 新的分 支学科 —— 毒理基 因组学 (toxi- cogenomics)。 Stringham 和 Candido 将热休 克蛋白 (heat shock protein, HSP) H5RI6 基 因与 hcZ 基 因重组 ,研制 出转基 因线虫 ,经 标准参 比毒物 Cd2+、 Cu2+、 Hg2+、 Pb2+、 Zn2+、 As02_ 和 除草剂 百叶枯 (paraquat) 的胁迫 试验, 的 诱导总 是在亚 致死水 平发生 ,而 且诱导 组织特 异性和 胁迫因 子的特 异性。 转基因 线虫模 型不仅 从分子 水平如 实反映 生物体 所受环 境胁迫 ,而 且就其 所转基 因而言 ,热休 克蛋白 质是迄 今进化 上最保 守的蛋 白质, 作为生 物标志 (biomarker) 能运 用于不 同门类 的生物 。转 基因线 虫模型 的试 验结果 可据此 客观地 外推至 其他门 类生物 ,并因 此而成 为有效 用于生 态风险 评价的 • 1011 • 早期预 警系统 。近 年来 , USEPA 提 出了“ 环境基 因组学 (environment genomics)” 的 概念 ,这 必将进 一步增 强转基 因动物 在环境 科学中 的研究 应用。 第 四节转 基因技 术展望 转 基因动 物的研 制是一 个艰辛 、复 杂的系 统工程 ,历经 10 余 年的迅 速发展 ,目前 已 建立了 较为完 善的转 基因动 物模型 ,转基 因动物 在众多 领域实 现了重 大突破 。正 因为 于此 ,转 基因动 物研究 已引起 从事遗 传育种 、生物 工程和 生物技 术企业 家们的 浓厚兴 趣 。展 望未来 ,随 着外源 基因转 移方式 的不断 完善, 各种有 用基因 及有效 调控元 件的开 发利用 ,对转 基因动 物形成 机制及 其安全 性的深 入认识 ,以 及转基 因技术 与动物 克隆技 术 的重组 、综合 和优化 实现技 术结合 效应的 膨胀等 ,转 基因 技术不 论在理 论还是 应用上 都将创 造新的 辉煌。 1. 外源 基因转 移方法 的完善 如 前所述 ,目 前制备 转基因 动物最 常用的 方法仍 是显微 注射法 ,而通 过显微 注射方 法进行 基因转 移时, 制作转 基因鼠 的效率 因实验 室和转 移基因 构建体 的不同 而不同 。一 则统 计资料 表明, 通常转 基因首 建的阳 性率在 10% 〜 20%, 有时甚 至低于 1%。 因此, 外源 基因转 移方法 的完善 是转基 因动物 研究的 关键。 2. 有用 基因及 有效调 控元件 的开发 对有利 于改善 动物养 殖品种 产量、 品质及 抗逆性 的基因 和有益 于人类 健康及 疾病治 疗因 子的基 因分离 ,并 对其表 达调控 机制的 深入研 究是转 基因动 物研制 的重要 前提。 3. 转基因 动物形 成机制 的研究 转移基 因的镶 嵌性是 转基因 动物研 究中的 一个普 遍现象 ,外源 基因多 以随机 方式整 合到 受体基 因组中 ,被转 移的外 源基因 片段并 不包含 完整表 达所必 需的全 部调节 区域, 这是 导致产 生镶嵌 性的主 要原因 。转移 基因的 镶嵌性 整合使 得转移 基因在 宿主基 因组中 的 行为难 以控制 ,一方 面导致 宿主细 胞基因 的突变 ,既 可能 破坏或 失活内 源基因 ,也可 能激 活正常 情况下 处于关 闭状态 的基因 ,从而 造成转 基因动 物出现 不育、 畸形发 育乃至 死亡 等异常 现象; 另一方 面/转 移基因 自身可 能会因 此而出 现混乱 表达, 主要包 括:不 在预期 的组织 中表达 、子 代中的 表达情 况不同 、同一 启动子 在不同 的个体 或不同 的动物 中表达 行为不 同等。 如何克 服这种 镶嵌性 ,即 建立定 点整合 的转基 因动物 纯合子 已成为 转基因 动物的 一个研 究热点 。在转 基因鱼 研究中 ,现 已分离 出鲤鱼 肌动蛋 白基因 两侧远 端的有 关片段 ,且已 依据“ 基因打 靶”原 理构建 定点整 合载体 ,以 期引导 外源基 因在鲤 鱼 基因组 内的定 点整合 。在 转基因 山羊的 研究中 ,也 已克隆 能隔绝 整合位 点附近 染色质 对转 移基因 产生位 置效应 的有关 DNA 片段 ,用以 消除位 置效应 对转移 基因表 达的影 响。 虽然逆 转录病 毒载体 和胚胎 干细胞 方法在 很大程 度上克 服了定 点整合 的困难 ,但逆 转录 病毒载 体携带 基因片 段的大 小受到 限制。 胚胎干 细胞方 法中基 因打靶 技术存 在实际 困难 ,加之 绝大多 数动物 缺乏成 熟的胚 胎干细 胞系统 ,使 这一方 法的应 用也存 在局限 • 1012 • 性。 人工染 色体型 载体可 能是解 决上述 困难的 可行途 径之一 。近年 来已发 展了一 些微生 物 染色体 型载体 ,酵 母人工 染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)、 细菌人 工染色 体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 转 基因也 开始见 诸报道 。染色 体型载 体转基 因技术 不仅保 证巨大 基因的 完整性 ,保 证所有 顺式因 子的完 整并与 结构基 因的位 置关系 不变 ,而 且目的 基因上 下游的 侧翼序 列可以 作为缓 冲区域 ,消除 或减弱 基因整 合后的 “位置 效应” ,使外 源基因 在转基 因动物 中的表 达更接 近真实 情况, 并为基 因功能 的研究 提 供便利 。此外 ,基 因表 达的特 异性及 通过传 统质粒 载体制 作转基 因动物 所无法 避免的 镶嵌 性整合 等均得 到明显 改善。 4. 转基因 技术与 动物克 隆技术 的结合 以 核移植 为技术 核心的 动物克 隆研究 已历经 近半个 世纪。 1997 年 2 月 ,英国 Roslin 研 究所的 Wilmut 等宣布 他们用 培养的 成年绵 羊乳腺 上皮细 胞进行 核移植 ,成功 地克隆 出体细 胞克隆 绵羊“ 多利” ,以 雄辩的 事实推 翻了长 期以来 一直认 为分化 的动物 体细胞 不具 备发育 全能性 的观点 ,从而 获得了 发育生 物学研 究的理 论突破 和生物 工程领 域的技 术突破 。同年 ,结 合体细 胞克隆 技术, 携带有 可治疗 人类血 友病的 血液凝 聚因子 IX 基 因的 转基因 克隆羊 —— Polly 的问世 ,标 志着 一个新 的里程 碑在转 基因动 物研究 领域的 出现 。尽 管通过 体细胞 (甚 至胚胎 细胞) 克隆蛙 、克 隆鱼、 克隆羊 等都普 遍存在 效率极 低 、早 夭和早 衰现象 ,克 隆动物 的分子 机制尚 不为人 所知, 而且动 物克隆 技术理 论尚待 建立 ,但人 们已经 意识到 克隆技 术的发 展为转 基因动 物的研 究应用 带来了 契机。 可以断 言 ,转 基因动 物克隆 研究, 将掀起 21 世纪生 命科学 和生物 技术研 究的竞 争热点 。而转 基 因技术 通过与 动物克 隆技术 相结合 ,创 建高效 、稳定 表达的 转基因 动物群 ,有 望成为 基因 工程定 向育种 的主导 性技术 途径。 5. 转基 因动物 的安全 性研究 随着 转基因 动物从 理论研 究逐步 转向开 发应用 ,转基 因动物 开始从 实验室 走向户 外 ,但至 今尚未 诞生在 农艺性 状上发 生改良 、可 资畜牧 生产应 用的转 基因家 畜品系 。与 此同时 ,转 基因 生物的 安全性 问题引 起了公 众的广 泛重视 。归 纳起来 ,转 基因动 物的生 物安 全性问 题包括 3 个方面 :生态 安全、 遗传安 全和食 品安全 。我 们现在 虽然无 法预见 转基因 动物将 对自然 环境和 生态造 成多大 的影响 ,但 对这一 问题的 关注是 转基因 动物研 究健康 发展、 并为全 社会所 接受的 前提条 件之一 。中 国科学 院水生 生物研 究所的 研究者 们正 严格依 照国际 国内有 关方法 和规范 ,对转 基因鱼 的安全 性进行 认真、 全面和 系统的 研究 与评价 。从 目前已 有的资 料分析 ,转“ 全鱼” GH 基因 黄河鲤 有望成 为我国 乃至世 界上 第一个 市场许 可的转 基因动 物养殖 品系。 胡 炜 朱作言 主要参 考文献 胡炜 ,喻 达辉, 汪亚平 ,吴 开畅, 朱作言 . 2000. 大珠 母贝精 子介导 外源基 因转移 研究. 生物工 程学报 , 23 (2):56~60. • 1013 • 卢圣 栋主编 .1993. 现代 分子生 物学实 验技术 .北京 :高等 教育出 版社. 姚志 建等译 .1993. 分子生 物学实 验技术 .北京 :科学 出版社 • 赵浩斌 ,陈 尚萍, 孙永华 ,汪 亚平, 朱作言 . 1999. 外源基 因在鱼 类胚胎 中表达 与整合 的时序 .科学 通报, 44(22):2414 〜 2418. 朱作言 , 许克圣 ,谢 岳峰, 李国华 ,何玲 • 1989. 转基因 鱼模型 的建立 •中 国科学 B 辑, (2) :147 〜 155. 朱作言 , 曾志强 . 2000. 转基因 鱼离市 场还有 多远. 生物技 术通报 ,(1):1 〜 7. 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Ichthyol. 1985, 1 :31 〜 34. • 1015 • 附 录 附录 1 细胞 分子生 物学常 用缩写 和数据 常 用缩写 八260 A Ab ABTS acetyl CoA AcMNPV ADA ADP AEX Ag AMP AMV AP site APH ARS ATP AUFS P-Gal BAC BAP BBS BFP BHI biotin- 11-dUTP bis, bisacrylamide bis-Tris bp BrdU absorbance at 260nm adenine or denosine; one- letter code for alanine 腺嘌呤 、腺苷 、丙 氨酸 的单字 母记号 antibody 抗体 [2, 2 -azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonate) ] 2, 2' 连 氣-双 -(3- 乙 基苯并 噻嗅淋 磺酸) acetyl coenzyme A 乙 醜辅酶 A Autographa califomica multiply nuclear polyhedrosis virus 苜 蓿银纹 夜蛾多 (核 壳体) 核 型多角 体病毒 adenosine deaminase 腺苷 脱氨酶 adenosine diphosphate 腺苷 二碟酸 anion excharge 阴离 子交换 antigen 抗原 adenosine monophosphate 腺昔 ( 一 * 鱗) 酸 avian myeloblastosis virus 禽成 髓细胞 瘤病毒 apyrimidinic site 脱腺 昔位点 aminoglycoside phosphotransferase 氨基糖 苷鱗酸 转移酶 autonomously replicating sequence 自主复 制序列 adenosine triphosphate 腺昔 二憐酸 absorbance units full scale 满量 程吸光 度单位 (3-galactosidase 卩- 半乳 糖昔酶 bacterial artificial chromosome 细 菌人工 染色体 bacterial alkaline phosphatase 细 菌喊性 鱗酸酶 BESbuffered solution or borate-buffered saline BES [N, N - 双 (2- 轻乙基 )-2- 氨基乙 磺酸] 缓冲溶 液或硼 酸盐缓 冲盐水 blue fluorescent protein 蓝色 突光蛋 白基因 brain heart infusion( medium) 脑 心浸液 (培 养基) 8-(2, 4-dinitrophenyl-2, 6-aminohexyl) aminoadenosine-5 -triphosphate or 2 -dexyuri- dine-5, triphosphate-5 allylamine biotin 8-(2, 4- 二硝 基苯基 -2, 6- 氨基 己基) 気基 腺嘌 呤核苷 -5'- 三 磷酸或 2' •脱氧 尿嘧啶 -5'- 三磷酸 -5' •丙 烯氨基 生物素 N , N -methylene- bisacrylamide iV, N - 亚 甲双丙 稀醜胺 2-bis[ 2hydroxyethyl ] amino2- [ hydroxymethyl ] 1 , 3-propanedio 2- 双 (2- 经乙基 ) 気 基 -2- 羟甲基 -1,3- 丙二醇 base pair 喊基对 5-bromodeoxyuridine 5 •漠 脱氧 尿味陡 • 1016 • BSA BV C cAMP CAPS CAT cDNA CDP CEX CHAPS Ci CIP CM CMP cpm CTAB CTP CWS dA Da DAB dAMP DAPI d(A-T) dATP DBM dC DCA DCC dCF dCMP dCTP ddATP ddCTP ddGTP ddNTP ddTTP DEA DEAE DEPC DES bovine serum albumin 牛血清 白蛋白 budded virion 芽殖 病毒体 cytosine or cytidine; one- letter code for cytidine; one- letter code for cysteine 胞咳? S , 胞苷 ,或半 胱氨酸 的单字 母记号 adenosine3', 5'-cyclic-monophohate 腺昔 3', 5 - 环- 单鱗酸 ,环 腺昔酸 3- [ cyclohexylamino] - 1 -propanesulfonic acid 3-( 环 己氧基 )-l - 丙横酸 chloramphenicol acetyltransferase 氣霉 素乙醜 转移酶 complementary deoxyribonucleic acid 互补 DNA cytidine diphosphate 胞啼 陡核苷 二鱗酸 cat ion exchange 阳离 子交换 3- [ ( 3-cholamidopropyl ) -dimethyammonic ] - 1 -propane- sulfonate [ (3- 胆醜 胺丙基 )- 二 乙铵] -1- 丙磺酸 curie 居 (里) calf intestinal alkaline phosphatase 牛小 肠减性 鱗酸酶 complete minimal ( medium ); carboxymethy 完 全极限 ( 培养基 ), 竣甲基 cytidine monophosphate 胞昔 ( 一 '鱗) 酸 counts per minute 每分 钟计数 cetyltriethylammonium bromide 十六 焼基二 乙基溴 化按, 鍊错基 二乙基 溴化按 cytidine triphosphate 胞昔 二鱗酸 cell wall skeleton 细胞 壁骨架 deoxyadenosine 脱氧 腺昔酸 dalton 道尔顿 3, 3 -diamionbenzidene 3, 3 - 二氨基 联苯胺 deoxyadenosine monophosphate 脱 氧腺苷 ^ 一 * 鱗) 酸 4, 6-diamino2-phenylindole 4, 6- 二氧基 -2- 苯基 卩引味 deoxyadenylate-deoxythmidylate 脱氧 腺昔酸 -脱氧 胸昔酸 deoxyadenosine triphosphate 脱 氧腺苷 1 二鱗酸 diazobenzyloxymethl 重氮节 氧甲基 deoxycytidine 脱 氧胞苷 dichloroacetic acid 二 氯乙酸 dextran-coated charcoal 葡 聚糖包 补充的 活性炭 2 ' - deoxycoformycin 2'- 脱 氧助间 型霉素 deoxycytidine monophosphate 脱 氧胞昔 ( 一 * 鱗) 酸 deoxycytidine triphosphate 脱 氧胞昔 二鱗酸 dideoxyadenosine triphosphate 双脱 氧腺苷 二憐酸 dideoxycytidine triphosphate 双脱 氧胞苦 二鱗酸 dideoxyguanosine triphosphate 双脱 氧鸟昔 二鱗酸 dideoxyribonucleosine triphosphate 双脱 氧核苷 二鱗酸 dideoxythymidine triphosphate 双脱 氧胸昔 二憐酸 diethylamine 二乙胺 diethyl aminoethl 二 乙基氨 基乙基 diethylphrocarbonate 焦碳酸 二乙醋 diethylstilbestrol 二 乙基己 烯雌酚 • 1017 • dG dGTP DHFR dITP DMEM DMF DMS DMSO DMT DNA DNase dNTP ds dT DTT dTTP dUMP dUTP ECTEOLA ECV EDTA EGTA ELISA EMBL EMS ESC exo F FCM FCS FITC FOA FPLC g G GDP GF GFP GlcNAc GMP GST deoxyguanosine 脱 氧鸟苷 deoxyguanosine triphosphate 脱 氧鸟昔 二鱗酸 dihydrofolate reductase 二 氛叶酸 还原酶 deoxyinosine triphosphate 脱 氧肌苷 二鱗酸 Dulbecoo’s minimum essential (or modified Eagle) medium Duibecco 极 限必需 培养基 dimethyformamide 二甲基 甲醜胺 dimethyl sulfate 硫酸 二甲酯 dimethyl sulfoxide 二甲 基亚讽 dimethoxytrityl 二甲 氧基二 苯甲基 deoxyribonucleic acid 脱氧核 糖核酸 deoxyribonuclease 脱氧 核糖核 酸酶, DNA 酶 deoxyribonucleoside triphosphate 脱 氧核昔 二鱗酸 double strand 双链 deoxythymidine 脱 氧胸苷 dithiothreitol 二硫 苏糖醇 deoxythymidine triphosphate 脱 氧胸苷 二鱗酸 deoxyuridine monophosphate 脱 氧尿苷 ( 一 * 鱗) 酸 deoxyuridine triphosphate 脱 氧尿昔 二碟酸 epichlorohydrin triethanolamine 环氧氯 丙焼二 乙醇胺 extracellular virus 胞外 病毒体 ethlene diaminetetraacetic acid 乙二胺 四乙酸 ethylen^lycx)lbis (2-aminoethyl-ether) tetraacetic acid 乙 二醇双 (2- 氨基 乙酸) 四乙酸 enzyme~ linked immunosorbent assay 酶联 免疫吸 附测定 European Molecular Biology Laboratory 欧 洲分子 生物学 实验室 ethyl met hane sulphonate 乙基甲 横酸, 甲基磺 酸乙酯 embryonic stem cell 胚胎 干细胞 exonuclese 外切 核酸酶 Farad 法 (法 拉第) flow cytometry 流式 细胞术 ,流式 细胞仪 fetal calf serum 胎 牛血清 fluorescein isothiocyanate 异 硫氣酸 焚光素 fluoroorotic acid 氟代 乳清酸 fast protein, peptide, and polynucleotide liquid chromatography 快速 (蛋 白质、 多肤、 核酸) 液 相层析 gravity 重力 gauge; guanine or guanosine; one~ let ter code for glycine 注 射针尺 寸型号 ,鸟 嘌呤、 鸟苷、 甘氨酸 的单字 母代号 guanosine diphosphate 鸟苷 (二鱗 ) 酸 gel filtration 凝 胶过滤 (层析 ) green fluorescent protein 绿色 焚光蛋 白基因 N-acetylgluosamine N- 乙酰 氨基葡 萄糖, AT- 乙酰 葡糖胺 guanosine monophosphate 鸟苷 ( 一 鱗) 酸 glutathione S^transferase 谷 脫昔 狀 S •转移 酶 •1018 GTP guanosine triphosphate 鸟苷 二鱗酸 HAT hypoxanthine/ aminopterin/ thymidine ( medium ) 次 黄嘌呤 / 氨 基蝶呤 / 胸昔 (培养 基) HeBS HEPES-buffered saline HEPES 缓 冲盐水 HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N -2-ethanesulfonic acid iV-2- 轻乙基 呢嗓- 7V -2- 乙横 酸 hGH human growth hormone 人生 长激素 ,人促 生长素 HGPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase 次黄 嗓呤鸟 嘌呤鱗 酸核糖 转移酶 HIC hydrophobic interaction chromatography 疏水作 用层析 HO Hoechst33342 或 33258 双 苯并咪 唑染料 HPCF HPT high-performance chromatofocusing 高效层 析聚焦 hygromycin B phosphotransferase 潮霉素 B 鱗酸 转移酶 HPHIC high-performance hydrophobic interaction chromatography 高效 疏水作 用层析 HPLC high-performance liquid chromatography 高效液 相层析 HRP horseradish peroxidase 辣 根过氧 化物酶 HSV herpex simplex virus 单纯痕 疼病毒 IAA 3-P indoleacetic acid; indole-3-acetic acid 3-(3 B 引採 丙稀 酸; P 引噪 乙酸 IEF isoelectric focusing 等 电聚焦 IEX ion exchange 离子交 换作用 Ig IODOGEN immunoglobulin 免疫 球蛋白 1, 3, 4, 6-tetrachloro-3a-6a-diphenylglycouril 1, 3, 4, 6- 四氯 -3a-6a- 二苯 基苷脉 IPTG isopropyl thi〇P-D-galactoside 异丙 基硫代 - (3»D •半 乳糖苷 Km Michaelis constant 米 氏常数 KLH keyhole limpet hemocyanin 匙孔 M 血蓝 蛋白 mAb monoclonal antibody 单克 隆抗体 MBP maltose- binding protein 麦 芽糖结 合蛋白 MBS m -maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester 间马来 酸亚胺 苯甲酸 -iV •轻 基 琥珀酰 亚胺酯 MES 2- ( N -morpholino) ethanesulfonic acid 2-(N- 吗琳代 ) 乙横酸 MMT m.o. i monomet hoxyt rityl 单甲 氧基二 苯甲基 multiplicity of infection 感 染复数 MoMuLV moloney murine leukemia virus Moloney 鼠白血 病病毒 MOPS 3- (N-morpholino) propane sulphonic acid 3-(N- 吗咐代 ) 丙横酸 mp Mr melting point 熔点 relative molecular weight 相对 分子量 mRNA messenge ribonucleic acid 信使核 糖核酸 ,信使 RN A MTX methotrexate 氨 甲蝶呤 MWCO molecular weight cutoff 分子量 截留值 NAD nicotinamide adenine dinucleotide 烟醜胺 腺嗓呤 一 核昔酸 NIH National Institutes of Health (美国 ) 国 立卫生 研究院 NOV nonoccluded virion 非 包埋型 病毒体 NTP nucleoside triphosphate 核苷 二鱗酸 〇〇26〇 optical density at 260nm 吸光度 • 1019 • oligo oligo( dT ) ONPG ORF ori PAGE PAP par PB PBS PCD PCR PDV PE PEG PEI PFA PFU pi PI PIB PIPES PMSF P〇ly(A) poly(A+ ) P〇ly(A' ) poly(dA-dT) P〇ly(U) PPO pristane Pth PVA PVC PVDF rA RE RF RFLP RIA RNA RNase RP r/min oligonucleotide 寡 核昔酸 oligodeoxythymidylic acid 寡 聚脱氧 胸昔酸 o - ni t rophenyl- , D~ galactopyranside 邻硝 基苯基 j-D •半 乳卩比 喃糖昔 open reading frame 开放读 码框架 orgin of relication 复 制起点 polycrylamide gel electrophoresis 聚丙稀 醜胺凝 胶电泳 peroxidase-anti-peroxidase 过氧化 物酶- 抗过氧 化物酶 partition loci on plasmid DNA 质粒 (DN A) 中 的分配 基因座 phosphate buffer 鱗酸盐 缓冲液 phosphate-buffered saline 鱗酸缓 冲盐水 programmed cell death 程 序性细 胞死亡 polymerase chain reaction 聚 合酶链 式反应 polyhedra-derived virius 多角 体源性 病毒体 ,多 角体衍 生病毒 polyhedron envelope 或 calyx 多 角体膜 polyethylene glycol 聚 乙二醇 polyethyllenimine 聚乙 餘亚胺 paraformaldehyde 低 聚甲酸 plaque-forming unit 嗤斑 (蚀斑 ) 形 成单位 isoelectric point 等电点 propidium iodine 澳 化丙键 polyhedrial inclusion body 多角体 piperazine- N, N -bis( 2-ethane sulfonic acid) 呢嗓 -N-JV - 双 (2- 乙横酸 ) phenylmethylsulfonyl fluoride 苯甲基 横醜氟 polyadenylic acid or polyadenylate 多聚 腺苷酸 polyadenylated (mRNA) 带多 聚腺昔 酸尾的 mRN A nonpolyadenylated( mRNA) 无多 聚腺昔 酸尾的 mRN A poly(deoxyadenylic acid-deoxythymidylic acid) 多聚 (脱 氧腺苷 1 酸- 脱氧胸 苦酸) polyuridylic acid or polyuridylate 多聚 尿昔酸 2, 5-diphenyloxazole 2, 5- 二苯基 嗯口坐 2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane 降植焼 , 2, 6, 10, 14- 四甲基 十五焼 3-phenyl-2-thiohydantoin 3- 苯基 -2- 乙内 醜硫脈 polyvinyl alcohol 聚 乙稀醇 polyvinyl chloride 聚 氯乙稀 polyvinylidene difluoride 聚偏二 氟乙烯 riboadenylate 核糖 腺苷酸 restriction endonuclease 限制性 内切酶 replicative form 复制型 restriction fragment length polymorphism 限制酶 片段 长度 多态性 radioimmunoassay 放射免 疫测定 ribonucleic acid 核 糖核酸 ribonuclease 核糖 核酸酶 reversed phase (HPLC) 反相 ( HPLC) round per minute 转 / 分钟 • 1020 • rRNA ribosomal ribonucleic acid 核 糖体核 糖核酸 RT reverse transcriptase SAM S-adenosylmethionine S- 腺苷甲 硫氨酸 Sarkosyl SAX N - lauroy lsarcosine TV - 十二 焼基肌 氨酸納 strong anion-exchange 强阴离 子交换 sex strong cation- exchange 强阳离 子交换 SDS sodium dodecyl sulfate 十 二焼基 硫酸钠 SE size exclusion HPLC 分 子排阻 (层析 ) SED standard enzyme diluent 标准酶 稀释液 SM suspension medium 悬浮 培养基 SNPV ss SSC singly embedded nuclear polyhedrosis virus 单粒 包埋核 型多角 体病毒 single stranded 单链 sodium chloride/ sodium citrate( buffer) 氯化钠 / 梓 檬酸钠 (缓 冲液) STBS suspension Tris-buffered saline Tris 缓 冲盐水 悬池液 T thymine or thymidine; one>letter code for threonine 胸 腺喃陡 、胸苷 、苏 氦酸 的单字 母记号 TAE Tris/ acetate/ (buffer) Tris/ 乙 酸电泳 缓冲液 Taq TBE buffer Thermus aquaticus DN A (polymerase) 栖热 水生菌 DNA 聚合酶 Tris/ borate electrophoresis buffer Tris/ 硼 酸电泳 缓冲液 TBS Tris-buffered saline Tris 缓 冲盐水 TCA trichloracetic acid 二 氯乙酸 TDM trehalose dimycolate 海藻 糖二分 枝菌酸 TE Tris/ EDTA( buffer) Tris/ EDTA (缓 冲液) TEAE triethy laminoethyl 二乙基 氨乙基 TEMED N, N 9 N\ N -tetramethylethylenediamine iV, TV, N’, iV - 四 甲基乙 一 •胺 TES N-tris( hydroxymethyl) methyl-2-aminoethansulfonic acid 二 (经 甲基) 甲基 -2- 氨 基 乙磺酸 TFA trifluoroacetic acid 二 氣乙酸 THF tetrahydrofuran 四 氢呋喃 TK trymidine kinase 胸 昔激酶 TLC thin- layer chromatography 薄 层层析 Tm melting(or midpoint) temperature, thermal denaturation (热 变性) 解 链温度 TMAC tetramethylammonium chloride 四甲铵 盐酸盐 TMP iV-trimethylphosphate; thymidine monophosphate 二甲基 鱗酸; 胸昔 二鱗酸 TONPG orthonitrophenyl-/3-D- thiogalactoside 正硝 基苯基 硫代半 乳糖背 Tris Tris( hydroxymethyl ) aminomethane 二 (轻 甲基) 氧 基甲焼 Tirs Cl Tris hydrochloride Tris 盐酸盐 TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate 四 甲基异 硫氛酸 罗丹明 tRNA transfer ribonucleic acid 转移核 糖核酸 ,转移 RN A TTP thymidine triphosphate 胸昔 二鱗酸 TUNEL terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling 脱氧 核糖核 昔酸末 端转 移酶介 导的缺 口末端 标记法 U unit, uracil or uridine 单位 ,尿喃 陡或尿 哲 的单字 母代号 • 1021 • UDP uridine diphosphate 尿昔 二鱗酸 UMP uridine monophosphate 尿苷 ( 一 * 鱗) 酸 UTP uridine triphosphate 尿昔 二鱗酸 UV ultraviolet 紫外线 UWGCG University of Wisconsin Genetics Computer Group 威 斯康星 大学遗 传学计 算机组 WAX weak anion exchange 弱阴离 子交换 WCX weak cation exchange 弱阳离 子交换 Xgal 5-bromo4-chloro-3-indolyl-P-D-galactoside 5- 溴 -4- 氯 -3- 卩引味 -(3 •硫 代半 乳糖苷 XGPRT xanthine~guanine>phosphoribosyl trans ferase 黄嗓呤 -鸟嘌 呤鱗酸 转移酶 Xyl-A 9-)9-D-xylofuranosyl adenine 腺嘌呤 -9-/9-D •咲喃 木糖苷 YAC yeast artificial chromosome 酵 母人工 染色体 YCp yeast centromeric plasmid 酵 母着丝 粒质粒 YEp yeast episomal plasmid 酵 母附加 子质粒 Yip yeast integrating plasmid 酵 母整合 型质粒 YNB-AA/AS yeast nitrogen base without amino acids or ammonium sulfate 无氨基 酸及硫 酸铵的 酵 母氮源 YPD yeast/ peptone/ dextrose( medium) 酵母 提取物 / 蛋白胨 / 葡萄糖 (培 养基) TRp yeast replicating plasmid 酵 母复制 型质粒 DNA 碱 基对的 平均分 子质量 : 649Da 氨基酸 平均分 子质量 :110Da lfxg/mL DNA:3.08;xmol/L 磷酸根 lpg/mL lkb DNA:3.08nmol 5' 末端 lfimol pBR322(463bp):2.83 lpmol 线 性化的 pBR322 5' 末端 :1.4;xg 1A260 双链 DNA:50;ig/mL 1A260 单链 DNA:37Mg/mL 附表 1 常用换 算因子 lkb DNA: 编 码容量 333 个 氨基酸 ,约 36 OOODa 6.5 x l〇5Da 双链 DNA (钠盐 ) 3 • 3 x l〇5Da 单链 DN A (钠盐 ) 3.4 x l〇5Da 单链 RNA (钠盐 ) 10 kDa 蛋白质 :91 个 氨基酸 :273 个 核苷酸 附表 2 氨基 酸的物 理特性 氨基酸 三字 母记号 单字 母记号 摩 尔质量 氨基酸 三字 母记号 单字 母记号 摩 尔质量 丙氨酸 Ala A 89.1 亮氨酸 Leu L 131.2 精氨酸 Arg R 174.2 赖氨酸 Lys K 146.2 天 冬酰胺 Asn N 132.1 甲 硫氨酸 Met M 149.2 天 冬氨酸 Asp D 133.1 苯 丙氨酸 Phe F 165.2 半 胱氨酸 Cys C 121.2 脯氨酸 Pro P 115.1 谷氨酸 Glu E 147.1 丝氨酸 Ser S 105.1 谷 氨酰胺 Gin Q 146.2 苏氨酸 Thr T 119.1 甘氨酸 Gly G 75.1 色氨酸 Tip W 204.2 缓氨酸 His H 155.2 酪氨酸 Tyr Y 181.2 异 亮氨酸 He I 131.2 缬氨酸 Val V 117.1 • 1022 • 附图 1 遗传 密码子 氨基酸 和链终 止密码 子的名 称在环 的外围 。密码 子的第 一 个碱基 在环的 中央, 第 二个碱 基在中 间的环 ,第三 个碱基 在外环 附表 3 常用放 射性核 素的物 理特性 核素 半寿期 射线 最 大能量 /MeV 辐 射范围 最大 在 100 % 富 集时的 大 约比活 /(Ci/mg) 衰变 后得到 的原子 粑器官 3h 12.43a p 0.0186 0.42cm (空气 ) 9.6 委 He 全身 14c 5370a p 0.156 21 .8cm (空气 ) 4 • 4mCi/mg ^4N 骨 、脂肪 32 pa 14.3d p 1.71 610( 空气) 285 lls 骨 0 • 8cm (水) 0.76cm (有机 玻璃) 33 pa 25. 4d p 0.249 49cm 156 lls 骨 35s 87. 4d p 0.167 24. 4cm (空气 ) 43 和 睾丸 125 jb 60d 7 0.27 〜 0.035 0.2mm (铅) 14.2 WTe 甲状腺 131 jb 8.04d p 0.606 165cm (空气 ) 123 \l°Xe 甲状腺 y 0.364 2.4cm (铅) 注:数 据来自 〈精 编分子 生物学 实验指 南〉。 a. 推荐屏 蔽物是 Plexlglas 有机 玻璃, 半值层 厚度是 lcm。 b •推荐 屏蔽物 是铅, 半值层 厚度是 0.02cm。 • 1023 • 附表 4 放射 性辐射 的屏蔽 p 射线 同位素 能量 降低 50% 强度的 降低 50% 强度 的厚度 /cm /MeV 质量 /(mg/ cm2) 水 玻璃 铅 Plexiglas 0.1 1.3 0.013 0.005 0.0011 0.0125 1.0 48 0.48 0.192 0.042 0.38 2.0 130 1.3 0.52 0.115 1.1 5.0 400 4.0 1.6 0.35 4.2 7 射线 同位素 能 量 使 Y 射线的 宽束减 1〇 倍的材 料厚度 /run /MeV 水 铝 铁 铅 0.5 54.6 20.3 6.1 1.8 1.0 70.0 24.4 8.2 3.8 2.0 76.0 32.0 11.0 5.9 3.0 89.0 37.0 12.0 6.4 注:数 据来自 〈精 编分子 生物学 实验指 南〉。 附表 5 用 于计算 经一定 天数后 放射活 性的衰 减因子 如一 小瓶含 1.85MBq(50fxCi) 的 35S 标记 化合物 ,在经 33d 后的放 射性的 量将是 : 1.85 x 〇.77 = 1.42MBq;5〇x〇.77 = 38.5^tCi 12S1 半衰期 60.0d 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 1.000 0.977 0.955 0.933 0.912 0.891 0.871 0.851 0.831 0.812 20 0.794 0.776 0.758 0.741 0.724 0.707 0.691 0.675 0.660 0.645 40 0.630 0.616 0.602 0.588 0.574 0.561 0.548 0.536 0.524 0.512 60 0.500 0.489 0.477 0.467 0.456 0.445 0.435 0.425 0.416 0.406 80 0.397 0.388 0.379 0.370 0.362 0.354 0.345 0.338 0.330 0.322 100 0.315 0.308 0.301 0.294 0.287 0.281 0.274 0.268 0.262 0.256 120 0.250 0.244 0.239 0.233 0.228 0.223 0.218 0.213 0.208 0.203 140 0.198 0.194 0.189 0.185 0.181 0.177 0.173 0.169 0.165 0.161 160 0.157 0.154 0.150 0.147 0.144 0.140 0.137 0.134 0.131 0.128 180 0.125 0.122 0.119 0.117 0.114 0.111 0.109 0.106 0.104 0.102 200 0.099 0.097 0.095 0.093 0.090 0.088 0.086 0.084 0.082 0.081 220 0.079 0.077 0.075 0.073 0.072 0.070 0.069 0.067 0.065 0.064 240 0.063 0.061 0.060 0.058 0.057 0.056 0.054 0.053 0.052 0.051 • 1024 • 32P 半衰期 14.3d 0 12 24 36 48 60 72 84 0 1.000 0.976 0.953 0.930 0.908 0.886 0.865 0.844 4 0.824 0.804 0.785 0.766 0.748 0.730 0.712 0.695 8 0.679 0.662 0.646 0.631 0.616 0.601 0.587 0.573 12 0.559 0.546 0.533 0.520 0.507 0.495 0.483 0.472 16 0.460 0.449 0.439 0.428 0.418 0.408 0.398 0.389 20 0.379 0.370 0.361 0.353 0.344 0.336 0.328 0.320 24 0.312 0.305 0.298 0.291 0.284 0.277 0.270 0.264 28 0.257 0.251 0.245 0.239 0.234 0.228 0.223 0.217 32 0.212 0.207 0.202 0.197 0.192 0.188 0.183 0.176 36 0.175 0.170 0.166 0.162 0.159 0.155 0.151 0.147 40 0.144 0.140 0.137 0.134 0.131 0.127 0.124 0.121 44 0.119 0.116 0.113 0.110 0.108 0.105 0.102 0.100 48 0.098 0.095 0.093 0.091 0.098 0.086 0.084 0.082 52 0.080 0.078 0.077 0.075 0.073 0.071 0.070 0.068 131I 半衰期 8.04d 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 0 1.000 0.979 0.958 0.937 0.917 0.898 0.879 0.860 0.842 0.824 0.806 0.789 3 0.772 0.756 0.740 0.724 0.708 0.693 0.678 0.664 0.650 0.636 0.622 0.609 6 0.596 0.583 0.571 0.559 0.547 0.533 0.524 0.513 0.502 0.491 0.481 0.470 9 0.460 0.450 0.441 0.431 0.422 0.413 0.405 0.396 0.387 0.379 0.371 0.363 12 0.355 0.348 0.340 0.333 0.326 0.319 0.312 0.306 0.299 0.293 0.286 0.280 15 0.274 0.269 0.263 0.257 0.252 0.246 0.241 0.236 0.231 0.226 0.221 0.216 18 0.212 0.207 0.203 0.199 0.194 0.190 0.186 0.182 0.178 0.175 0.171 0.167 21 0.164 0.160 0.157 0.153 0.150 0.147 0.144 0.141 0.138 0.135 0.132 0.129 24 0.126 0.124 0.121 0.118 0.116 0.113 0.111 0.109 0.106 0.104 0.102 0.100 27 0.098 0.095 0.093 0.091 0.089 0.088 0.086 0.084 0.082 0.080 0.079 0.077 30 0.075 0.074 0.072 0.071 0.069 0.068 0.066 0.065 0.064 0.063 0.061 0.059 33 0.058 0.057 0.056 0.054 0.053 0.052 0.051 0.050 0.049 0.048 0.047 0.046 36 0.045 0.044 0.043 0.042 0.041 0.040 0.039 0.039 0.038 0.037 0.036 0.035 • 1025 • 3SS 半衰期 87.5d 0 1 2 3 4 5 6 0 1.000 0.992 0.984 0.976 0.969 0.961 0.954 1 0.946 0.939 0.931 0.924 0.916 0.909 0.902 2 0.895 0.888 0.881 0.874 0.867 0.860 0.853 3 0.847 0.840 0.833 0.827 0.820 0.814 0.807 4 0.801 0.795 0.788 0.782 0.776 0.770 0.764 5 0.758 0.752 0.746 0.740 0.734 0.728 0.722 6 0.717 0.711 0.705 0.700 0.694 0.689 0.683 7 0.678 0.673 0.667 0.662 0.657 0.652 0.646 8 0.641 0.636 0.631 0.626 0.621 0.616 0.612 9 0.607 0.602 0.597 0.592 0.588 0.583 0.579 10 0.574 0.569 0.565 0.560 0.556 0.552 0.547 11 0.543 0.539 0.534 0.530 0.526 0.522 0.518 12 0.514 0.510 0.506 0.502 0.498 0.494 0.490 33P 半衰期 25.4d X 0 1 2 3 4 5 泰 6 7 8 9 0 1.000 0.973 0.947 0.921 0.897 0.872 0.849 0.826 0.804 0.782 10 0.761 0.741 0.721 0.701 0.683 0.664 0.646 0.629 0.612 0.595 20 0.579 0.564 0.549 0.534 0.520 0.506 0.492 0.479 0.466 0.453 30 0.441 0.429 0.418 0.406 0.395 0.385 0.374 0.364 0.355 0.345 40 0.336 0.327 0.318 0.309 0.301 0.293 0.285 0.277 0.270 0.263 50 0.256 0.249 0.242 0.236 0.229 0.223 0.217 0.211 0.205 0.200 60 0.195 0.189 0.184 0.179 0.174 0.170 0.165 0.161 0.156 0.152 70 0.148 0.144 0.140 0.136 0.133 0.129 0.126 0.122 0.119 0.116 80 0.113 0.110 0.107 0.104 0.101 0.098 0.096 0.093 0.091 0.088 90 0.086 0.084 0.081 0.079 0.077 0.075 0.073 0.071 0.069 0.067 100 0.065 0.064 0.062 0.060 0.059 0.057 0.055 0.054 0.053 0.051 110 0.050 0.048 0.047 0.046 0.045 0.043 0.042 0.041 0.040 0.039 120 0.038 0.037 0.036 0.035 0.034 0.033 0.032 0.031 0.030 0.030 • 1026 • 180丁 150-- 100 —— 90 ■■ 80 -■ 70 ■■ 60 -- 50 — 40 -- 90 000 50 000 21 OOO-i- 20 000- 15 000- 10 000 —— 10000—— -• 5000 -- - 5000—— 1000 —— 500 —— 200—— 2000—— 100 —— 25 丄 径 向距离 /mm 50 •• 40 -■ 〇a 1000 — 20 -• 15.7 丄 750 丄 相 对离心 ⑶) 场 /Xg 转 子速度 /(r/min) 附图 2 低 速转子 的相对 离心力 列线图 要确定 某一列 上的未 知值时 ,用尺 子排列 其他两 列的已 知值, 所需值 落在尺 子与第 三列的 交切处 • 1027 • 10- 径 向距离 /nun 3000 -- 2000 —— 1000 丄 相 对离心 CW 场 /Xg 10 000 丄 转 子速度 /(r/min) 附图 3 高 速转子 的相对 离心力 列线图 要确定 某一列 上的未 知值时 ,用尺 子排列 其他两 列的已 知值, 所需值 落在尺 子与第 三列的 交切处 i ooo ooo ooo ooo 80 75 70 65 60 l-i 二二 二二二 ■ ooo i ooo ooo ooo i gsgs oo oo oo oo oo ^^60765 4 3 2 1 二二二 二二二 . § | 90 % 60 50 40 30 20 §_§ 000 =_ 09876 5 4 I 圭圭二 二壬 -r 三二 I I 二 二 00 80 60 40 20 00 90 80 70 60 50 40 • 1028 • 附录 2 实 验室常 用仪器 和设备 烧杯 50mL, lOOmL, 200mL, 500mL, lOOOmL, 4000mL 试管和 试管架 培 养皿和 培养瓶 各 种大小 和规格 试剂瓶 lOOmL, 200mL, 500mL, lOOOmL 透明 和棕色 微量 离心管 和管架 5mL、 1 • 5mL、0 • 5mL、0 • 2mL 天平 分析天 平和制 备天平 旋涡 混合器 研钵 和研杵 pH 计 高 压设备 冷冻 和冷藏 冰柜, 液氮罐 4X: 、 - 20X: 和 - 70X: 孵育 或贮存 超净 工作台 细菌接 种和细 胞培养 各一台 可调 恒温箱 / 摇床 离心机 低速 (20 OOOr/min) 冷冻 离心机 超速 (20 000 〜 80 000r/min) 离 心机, 带垂直 超速离 心转头 可离心 1.5mL 微量离 心管的 微型离 心机 大容量 、低 速度的 离心机 带 配适器 的台式 吊桶式 离心机 水浴箱 至少 2 台可 调温至 80X: 放射操 作设备 放射线 保护屏 (Lucite 或 Plexiglas) 放射性 废料收 集箱液 体和固 体废料 防 护眼罩 液体 闲烁仪 放射 性墨水 放 射自显 影系统 盖革氏 计数器 量筒 20mL, lOOmL, 200mL, 500mL, lOOOmL 吸 管和橡 皮吸头 5mL、10mL 刻 度吸管 和巴斯 德吸管 三 角烧瓶 200mL, 500mL, lOOOmL 规格 移液 器和相 应吸头 10pL、4(VL、200/^L、100(VL 可 调式移 液器 各一只 ,每 一位研 究人员 最好配 备一套 _ 纯 水仪或 玻璃蒸 馏装置 磁力 搅拌器 (最好 带加热 功能) pH 试纸 裁纸刀 过 滤装置 用 于在硝 酸纤维 滤膜或 其他膜 上收集 酸沉淀 烤箱 401000 a 用预曝 光的感 光片在 -70X: 进 行曝光 ,并 比较用 Kodirex 感 光片进 行的直 接曝光 (Laskey 1980)。 (三) 感光 片成像 的定量 用上述 任一放 射自显 影方法 在感光 片上得 到的影 像都可 用微量 光密度 计进行 定量。 如果 感光片 已经合 适的预 曝光, 感光片 上成像 的光吸 收与凝 胶上的 放射活 度的董 应成正 • 1032 • 比 。如 果预曝 光过量 (>0.2A54() 预曝光 / 未 经处理 ), 较少 量的放 射活度 会产生 密度不 成比例 的成像 。光吸 收超过 1.4 (A54〇) 的放 射自显 影图像 ,因所 有的溴 化银晶 体均已 饱和 而不能 得到定 量值。 用微量 光密度 计的定 量可以 通过在 液体闪 烁计数 仪中对 样品的 放射活 性进行 计数来 确证。 二 、玻 璃器皿 的硅化 玻璃器 皿的硅 化是为 了防止 溶液被 吸附于 玻璃表 面或增 强其疏 水性。 这在操 作低浓 度的特 殊“黏 ”溶液 如单链 核酸或 蛋白质 时尤为 重要。 1. 材料 一氯三 甲基硅 烷或二 氯二甲 基硅烷 真空泵 带 阀门的 干燥器 2. 操 作步骤 (1) 在 通风橱 中操作 ,在干 燥器中 放置一 个烧杯 ,内盛 l~3mL —氯 三甲基 硅烷或 二氯 二甲基 硅烷。 小心: 一氯三 甲基硅 烷和二 氯二甲 基硅烷 蒸汽有 毒并极 易燃。 如果 器皿太 大不能 装进干 燥器时 ,也可 以通过 用溶于 不同的 挥发性 有机溶 剂如氯 仿或庚 烷中的 5% 二 氯二甲 基硅烷 溶液短 促淋洗 ,或 浸泡于 这种溶 液中进 行硅化 。有机 溶剂通 过蒸发 加去除 ,剩下 二氯二 甲基硅 烷沉积 于器皿 的表面 。本 方法特 别适用 于处理 用于变 性聚丙 烯酰胺 测序胶 的玻璃 平板。 (2) 接通真 空泵和 干燥器 ,直 至硅 烷开始 沸腾后 ,关 闭与泵 的连接 ( 保持干 燥器的 真空 )。 撤去 真空泵 ,干燥 器一直 关闭至 硅烷全 部挥发 (大约 1 〜 3h)。 在 此过程 中硅烷 将蒸发 沉积在 玻璃器 皿表面 并聚合 。勿 将干燥 器与真 空泵相 连以免 将硅烷 吸走并 导 致沉积 减少和 真空泵 损坏。 (3) 在通 风橱中 打开干 燥器, 保持开 放几分 钟以使 硅烷蒸 发掉。 (4) 需要时 ,干 烤或 高压处 理玻璃 器具或 装置。 高 压或水 洗可除 去二氯 二甲基 硅烷产 生的二 甲基硅 酮聚合 物中具 有反应 活性的 氯硅烷 末端。 小 心:如 使用易 燃溶剂 ,在 溶剂完 全蒸发 以前, 不要干 烤玻璃 器皿。 三 、透 析 常 规的透 析是通 过仅让 小分子 扩散的 选择性 透过膜 ,将 小分子 从大分 子中分 离出去 的技术 ,透 析常用 于改换 大分子 溶液的 盐成分 ( 小分子 )。 小分子 溶质的 跨膜移 动伴随 着 溶剂分 子以相 反方向 的运动 ,这 样导致 了样品 被稀释 (一般 <50% )。 (一) 选择 及准备 透析膜 有多种 不同厚 度和孔 径的透 析膜可 供使用 。厚 的比 较结实 ,但 限制了 溶质的 流动, • 1033 • 很慢才 能达到 平衡。 孔径由 分子量 截留值 “MWCO” (即不 能穿透 膜的最 小分子 颗粒) 所定义 。使用 的膜的 孔径应 远远小 于目的 大分子 ,对 于大多 数质粒 和蛋白 质适用 12 000 〜 14 000 MWCO 的膜。 大多数 透析膜 是由纤 维素衍 生物制 成的。 它们有 很宽的 MWCO 值, 范围从 500 〜 500 000, 其洁 净度、 无菌性 及成本 都很不 一样。 Spectrum 公司的 产品用 的较多 ,最便 宜的 膜是成 卷供应 的干膜 ,它们 含有甘 油以保 持柔顺 ,亦会 有生产 时残留 的硫化 物和重 金属 。对 于大多 数应用 ,如从 梯度离 心纯化 的样品 中去除 CsCl 或 电洗脱 ,这些 透析膜 用水 润湿或 冲洗后 即可直 接使用 。如果 甘油、 硫化物 及小量 的重金 属会产 生问题 ,应购 买 干净的 膜或按 如下方 法处理 。蛋白 质透析 必须使 用干净 的膜。 1. 材料 10mmol/L 碳 酸氢钠 10mmol/L Na2EDTA, pH8.0 20% 〜 50% (WV) 乙醇 透析膜 2. 操 作步骤 (1) 从成卷 的透析 膜中剪 下适用 的长度 (一般 20 〜 30cm)。 由于 透析膜 易于被 可分解 纤维素 的微生 物污染 ,操作 时必须 一直戴 手套。 膜也有 以片状 或管状 供 应的。 (2) 在 过量的 10mm〇l/L 碳酸 氢钠中 湿润透 析膜并 煮沸几 分钟。 (3) 在 10mm〇l/L 碳 酸氢钠 中煮沸 几分钟 ,重复 1 次。 煮 沸可以 加快处 理过程 ,但并 非必需 ,在稍 加搅拌 下浸泡 30min 可以替 代煮沸 步骤。 (4) 用蒸 馏水洗 数次。 (5) 于 20% ~50% 乙醇 溶液中 贮存于 4X:, 以防能 分解纤 维素的 微生物 生长。 此外 ,也 可用有 毒性的 缓冲液 (如 加入叠 氮钠或 二甲砷 酸钠) 贮存 透析膜 。然而 ,因其 简单方 便, 一般都 倾向于 采用乙 醇贮存 )。 (二) 大体 积透析 本 方案述 及使用 按上方 案准备 的透件 膜透析 较大而 较易操 作体积 的样品 的方法 ,一 般处 理量为 0.1~500mL。 1. 材料 待透析 的大分 子样品 合适 的透析 缓冲液 透析膜 2. 操 作步骤 (1) 用蒸馏 水冲洗 透析膜 以除去 乙醇贮 存液, 用夹子 夹住膜 的一端 或把一 端捆扎 • 1034 • 起来。 因为膜 易于被 分解纤 维素的 微生物 污染, 操作时 必须一 直戴着 手套。 (2) 用水或 缓冲液 充满透 析膜, 抓牢未 夹紧的 一端使 之密封 ,挤压 透析膜 ,如 果有 小的液 流喷出 ,说明 膜上有 孔眼, 弃去并 取新膜 试漏。 (3) 用含大 分子的 样品替 代膜中 的水或 缓冲液 ,用 夹子夹 紧开放 的一端 ,再 次挤压 膜 以检查 膜和夹 子的完 好性。 如果要 透析高 浓度的 或高盐 的样品 ,夹紧 的膜应 预留一 定空间 。由 于将发 生水向 样品中 的净流 入 ,如 果压力 过大时 ,会 撑破透 析膜。 (4) 将透析 膜浸泡 于盛放 于烧杯 或锥形 瓶内的 所需的 大体积 溶液中 ,在 所需 温度及 轻缓 搅拌下 透析数 小时。 透析速 度取决 于膜孔 的大小 、样品 的黏度 、样品 体积与 膜表面 积之比 。温 度对透 析速度 没有影 响 ,但 常选择 低温以 增加大 分子的 稳定性 。普通 的盐对 15 000 MWCO 的膜 在搅拌 下透析 3h 将达到 平衡。 (5) 必要 时更换 透析液 2 次或更 多次。 (6) 从液体 中取出 透析膜 ,让 膜保 持垂直 ,吸去 上边夹 子外膜 的一端 上残留 的多余 的 缓冲液 。松 开上边 的夹子 ,用巴 斯德吸 管吸出 样品。 (三) 小体 积样品 的透析 本方案 能方便 地透析 10~100pL 体积 的样品 1. 附 加材料 0.5 或 1.5mL 微量 离心管 木塞钻 2. 操 作步骤 (1) 用木 塞钻在 0.5 或 1.5mL 微量离 心管的 盖子上 扎一个 小孔。 注意 在盖子 的内面 不要留 有粗糙 的边缘 (它将 与透析 膜接触 )。 (2) 将样品 加入微 量离心 管中, 在盖子 的开口 处盖上 透析膜 ,并紧 压上已 钻孔的 管盖。 (3) 在 台式离 心机上 将离心 管翻转 过来轻 轻地离 心一下 ,让 样品与 透析膜 接触。 (4) 将管子 倒置淹 没于透 析液中 ,并 将它 固定以 保持倒 置及被 淹没的 状态。 (5) 用弯嘴 巴斯德 吸管吹 出管盖 与膜之 间所有 的气泡 ,让 透析 液与膜 接触。 (6) 搅拌透 析液并 在适宜 的温度 下透析 至少数 小时。 (7) 取出 微量离 心管, 稍加旋 离回收 样品。 除本方 案外, 也有商 品化的 材料可 以利用 ,包 括使用 Spectrum 的单个 中空纤 维滤器 (样 品容积 l~140fiL, 见超滤 ), 及许 多不同 的微量 透析仪 ,可供 处理单 个或多 个样品 (Spectrum, Cole*Parmer, Hoefer 或其 他来源 )。 四 、超 滤 超滤是 一种在 压力推 动下的 膜过滤 技术, 它利用 了半透 膜的跨 膜压力 差从而 从含大 分子 的溶液 中除去 小分子 溶质及 溶剂, MWCO 为 1000~ 1 000 000 的膜最 常用, 压力差 常来源 于真空 、加压 惰性气 体或离 心力。 超滤常 用于浓 缩蛋白 质溶液 ,由 于缓冲 液的浓 度不发 生变化 ,它 是最温 和的蛋 白质浓 缩方法 之一。 超滤也 用于分 离分子 量差异 较大的 物质 (如将 质粒或 PCR 产物与 dNTP 或引 物分开 )。 超滤 的主要 技术难 题是浓 差极化 。不 能通过 的大分 子在膜 上形成 凝胶状 的一层 ,阻 碍了膜 的透性 。剧烈 搅拌和 抽进气 体可以 保持溶 液切向 流过膜 ,并 搅乱凝 胶层。 超 滤也可 以粗略 分成真 空透析 、离 心浓缩 、搅拌 透析及 切向流 系统等 。不同 系统的 选 择取决 于溶液 的性质 ( 即体积 、黏度 、有 无颗粒 、剪 切稳定 性等) 以及 所需的 浓缩速 度 和成本 。一 般而言 ,真空 透析是 成本最 低的, 但也是 最慢的 ,且液 体容量 最少; 离心 浓缩也 是相当 便宜的 ( 从每次 使用费 用考虑 ), 流 速中等 ,体 积限于 20mL 以内; 搅拌 透析 能增加 液体容 量及浓 缩速度 ,但搅 拌室将 使其成 本随之 增加; 切向流 系统可 以迅速 浓 缩大体 积液体 ,但 成本相 当高。 使用普 通的实 验室设 备就能 进行真 空透析 ,离 心浓 缩器是 一次性 使用的 ,其 他类型 的超滤 都需要 商品化 仪器。 这些仪 器有多 种多样 ,由于 其设计 及商品 供应变 化很快 ,下 面的讨 论仅仅 是对方 法的一 般性指 导原则 。应 注意 到大多 数超滤 仪器均 可用于 大体积 透析。 在真空 透析中 ,真 空置于 透析缓 冲液下 而样品 保持大 气压力 。它是 用于浓 缩体积 < (一) 用 真空透 析法进 行超滤 20mL 稀样品 的十分 温和的 方法。 1. 材料 样 品溶液 合适 的透析 缓冲液 真空 过滤瓶 及单孔 软木塞 巴斯 德吸管 所需 MWCO 的 透析膜 2. 操 作步骤 (1) 将 真空过 滤瓶的 开口处 接于真 空管道 或 抽气机 ( 见附图 5)。 (2) 制 作或购 买一个 单孔的 软木塞 ,巴斯 德吸管 的粗端 可以紧 贴地插 入孔中 ,孔 中涂上 润滑油 。切 下巴斯 德吸管 的细端 ,用本 生灯的 • 1036 • 附图 5 真空透 析装置 火焰 将末端 烧平。 (3) 准备好 透析膜 ,夹 紧一端 ,把 另一端 穿过塞 子的孔 。从透 析管的 开口端 插入巴 斯德 吸管, 必要时 用甘油 作为润 滑剂。 6.4mm 直 径的膜 能紧贴 巴斯德 吸管。 (4) 将巴斯 德吸管 连同透 析膜一 起塞入 塞子的 孔中直 至紧密 固定, 一直保 持膜的 湿润。 (5) 将塞子 / 巴斯 德吸管 / 透析膜 一起装 入盛有 缓冲液 的真空 滤瓶的 开口处 ,并 抽以 中 度真空 ,这时 透析膜 将是扁 平的。 (6) 如果没 有漏气 ,通过 巴斯德 吸管将 样品加 入膜中 ,在 真空 下透析 至达到 所需体 积 ,连续 加入样 品或在 透析过 程中间 歇加入 样品。 由于 真空泵 可能使 膜破裂 ,推 荐用吸 气机在 41C 搅拌下 过夜, 这可使 10~15mL 相 当稀的 蛋白质 溶液 浓缩至 0.5mL。 真空 度小于 2.06xi〇4pa 很少会 破坏膜 ,但 3.43Xl〇4pa 会使孔 径有所 变化。 (二) 用 离心浓 缩管进 行超滤 离心浓 缩管利 用离心 产生的 离心力 迫使溶 剂透过 滤膜, 它们比 土制的 真空透 析器昂 贵 ,但更 快且更 便于处 理小样 品及多 个样品 。离 心浓 缩管一 般可处 理样品 体积在 0.05 〜 20mL 之间 ,有很 大的分 子量截 留范围 , MWCO 从 100 〜 500 000。 用固 定角转 头离心 可 因膜与 离心力 不成直 角而避 免极化 的问题 ,所形 成的任 何凝胶 状物将 被推到 膜的一 边, 这种设 计也避 免样品 被完全 甩干。 Amicon Corning、 Millipore 和 Spectrum 公 司均生 产 离心浓 缩管。 (三) 用带搅 拌室的 设备进 行超滤 搅拌室 超滤器 (Amicon 或 Spectrum) 是 用以浓 缩中等 体积的 无颗粒 稀溶液 相对便 宜 的工具 。它 们利用 压缩惰 性气体 (一般 用氮气 ) 来迫 使溶剂 透过滤 膜圆盘 。在 圆盘上 悬有一 个搅棒 保持液 体被搅 动以扰 乱所有 凝胶层 。滤膜 圆盘有 不同的 MWCO 和 成分。 用搅 拌室可 以浓缩 3~400mL 液体 ,它们 比切向 流过滤 器便宜 ,但 浓缩速 度较慢 并更倾 向于形 成极化 ,然 而极 化程度 没有真 空透析 厉害。 (四) 用 切向流 系统进 行超滤 有一种 称为薄 通道或 扁平板 的设计 ,采用 一种扁 平的超 滤膜。 The Thin Channel Sys-ter (Amicon) 及 Minitan System (Millipore) 均 有生产 。用 栗使溶 液透过 一 螺线通 道 或一系 列线性 通道而 抽向膜 的一面 。这 种设计 具有与 搅拌室 相似的 表面积 ,但 能处理 更大 的体积 (约 200 〜 2000mL)。 该技 术使浓 缩过程 中极化 问题的 产生大 大降低 ,因而 能 处理高 度浓缩 的溶液 。浓 缩的速 度大大 超过用 搅拌室 的速度 。因 为在浓 缩极化 问题出 现之 前可达 到的压 力更高 。切 向系统 比下面 所述的 高容量 系统稍 微便宜 和简单 一些。 层叠 扁平板 、螺 线盘及 真空纤 维系统 (如 Amicon、 Millipore、 Spectrum) 是 为大体 积样品 (1 〜 1000L) 及高 浓缩速 度而设 计的。 这种需 要经常 在工业 化设备 中遇到 。在 它 们之间 进行选 择一般 是更取 决于样 品的特 性而不 是成分 ( 见下述 )。 同样 ,纤 维柱体 亦 不便宜 ,因 此防止 样品交 叉污染 常包括 更广泛 地清洗 ,而 不只是 用搅拌 室或低 容量切 向流系 统时简 单地更 换滤膜 即可。 层 叠扁平 板系统 (如 Pillicon 系统; Millipore) 的实际 应用并 没有厂 家所述 的那样 好 。系 统的表 面积是 有限的 ,并且 这种装 置难以 清洗。 螺 线盘系 统由一 张大膜 盘绕在 一核心 上组成 ,膜的 两面用 一种筛 网隔开 ,因 而产生 两个非 相通的 通道。 在装有 进入液 的通道 中加压 ,滤出 液则从 另一通 道收集 。这 种设计 可 达到非 常高的 表面积 / 体积比 ,因 此具 有高浓 缩速率 。这 样的系 统很容 易阻塞 ,故建 议 仅用于 无颗粒 溶液。 真空纤 维系统 是由许 多超滤 膜真空 纤维束 组成的 ,将 样品 加压使 之泵过 纤维束 。这 种设 计具有 处理特 殊样品 (如细 胞材料 ) 和沉淀 的优势 。它 们也易 于清洗 ,但达 不到较 高压力 ,因 此比螺 线通道 系统的 浓缩速 率低。 (五) 用 液相或 浆状吸 附剂进 行浓缩 用液相 或浆状 吸附剂 进行浓 缩是一 种价钱 便宜、 技术要 求低的 可替代 透析和 超滤的 方法 。此 方法中 ,样品 置于透 析膜上 ,周围 以干的 基质或 浸入吸 附浆中 ,其 中的 水和可 溶 性小分 子被抽 出样品 。这种 技术较 费时并 需要持 续监视 ,另外 ,可 能发 生完全 干燥而 可能损 坏样品 。常用 的吸附 剂是聚 乙二醇 (PEG) 及 羧甲基 纤维素 (Aqucides; Cal- biochem)、 葡聚 糖颗粒 及聚丙 稀酰胺 衍生物 (Spectra/ Gel, Spectrum)。 五、 吸收光 谱和焚 光分光 法定量 DNA 和 RNA 分子生 物学实 验中经 常需要 准确定 量溶液 中纳克 量和微 克量的 DNA 和 RNA, 除了 传 统的在 260nm 测其吸 光度外 ,还 有另外 两种敏 感的荧 光技术 。这 3 个 方法定 量测定 的 范围从 5~10ng DNA/mL 到 50pg DNA/mL。 吸光 度测定 可直接 完成, 但要把 杂质和 缓冲液 的组分 等都考 虑进去 。与 A26e 测定法 相比较 ,荧 光分析 法不易 受干扰 ,且操 作简单 。和 吸光度 的测定 一样, 要在加 DNA 之 前, 先有空 白试剂 的读数 。在机 器里面 ,可以 把读数 定义为 浓度, 并用已 知浓度 进行标 定 ,之 后的读 数就是 ng/mL 或 /ig/mL 的 DNA 了。 (一) 吸收光 谱法检 测核酸 在 几个不 同的波 长测定 样品的 吸光度 ,可得 知核酸 的纯度 和浓度 。 A26〇 的测 定对于 相对纯 的微克 M 核酸 制备 物有定 量意义 ,但吸 光度的 读数对 DNA 和 RNA 无所 区分。 但是 260nm 和 280mn 的 吸光度 比值可 用以表 示核酸 的纯度 ,如蛋 白质在 280nm 有吸收 峰 ,它 可降低 A26〇/A28〇 的比值 。在 325mn 处 的吸光 度表示 溶液中 有微粒 或者是 比色杯 不 干净; 在约 230mn 处 的吸光 度表示 有肽键 或芳香 族部分 ,如 蛋白质 和酚的 污染。 • 1038 • 本法是 为单束 紫外光 到可见 光范围 (UV-VIS) 的分光 光度计 进行设 计的。 如有可 能 ,双光 束分光 光度计 可简化 测定法 ,因 为它会 自动地 把样品 杯和空 白杯进 行比较 ,更 复 杂的双 光束仪 器可以 用各种 波长进 行扫描 ,并自 动报告 结果。 1. 材料 10XTNE 缓冲液 (100mmol/LTris-HCl, lOmmol/LEDTA, 2.0mol/LNaCl, 用浓 HC1 调 pH 至 7.0) 1XTNE 缓冲液 DNA 标 准溶液 (10、 100、 250、 50(Vg/mL 小 牛胸腺 DNA 标准 ,可从 Hoser 或 Sigma 购买) 待 测的核 酸样品 2 个配 对的石 英半微 量分光 光度计 比色杯 (lcm 厚) 单 束或双 束分光 光度计 (紫外 光到可 见光) 核酸的 量可以 用单位 表示, 在分光 光度计 测定中 lmL 缓冲液 ,用 lcm 厚的 比色杯 ,在 A26Q 处的 度数为 1.0 单位。 1 单 位双链 DNA 在 lmL 缓冲 液中, 浓度为 5(Vg/mL。 2. 操 作步骤 (1) 吸取 l.OmLlxTNE 缓冲液 到一石 英杯中 ,读取 325nm 的数值 (需要 时以蒸 馏水 为对照 ,读空 白溶液 的数值 ), 调零点 。在 双束 仪器中 就用此 空白液 作对照 ,对于 单束分 光光度 计来讲 ,就要 检查此 空白。 放入含 DNA 的 样品杯 ,或 者放入 标准杯 ,后 者是 将标准 DNA 溶于 和空白 一样的 溶液中 。读取 其数值 ,并于 280、 260、 230mn 重复 操作。 把 DNA 溶于和 空白一 样的溶 液中很 重要。 (2) 用 A26() 确定 DNA 含量。 读数为 1.0 单位的 A26G 表示 50^g/mL 的双链 DNA, 约为 37pg/mL 的单链 DNA, 或 者约为 40/ng/mL 的单链 RNA。 已知 序列的 短链寡 核苷酸 的浓度 也可用 A26() 来测定 。但 是寡 核苷酸 中碱基 的组成 对吸光 度有明 显的 影响, 这是因 为总吸 光度为 每个碱 基所具 吸光度 的总和 。计算 浓度的 公式为 c (pmol/^tL) =A26〇x 100/1. 5Na + 〇.71Nc+1.2Ng + 0.84Nt Na、 No Nf;、 Nt 分别 为寡核 苷酸中 对应的 4 种 碱基的 数目。 (3) 用 A260/A28。 的 比值和 八230、 A325 估 计核酸 样品的 纯度。 比值在 1.8 〜 1.9 和 1.9~2.0 分 别表示 DNA 和 RNA 的 高纯度 ,在 280nm 处的杂 质吸收 ( 如蛋白 附表 7 纯品 DNA8 的 分光光 度测定 波长 /nm 吸光度 A26〇/ A28O 浓度 / (pg/mL) 325 0.10 — — 280 0.28 — — 260 . 0.56 2.0 28 230 0.30 — 一 .高 纯度小 牛胸腺 DNA 悬浮于 1XTNE 缓 冲液中 的典型 吸光度 读数, DNA 的 浓度是 25fzg/mL。 • 1039 • 质) 会降低 比值。 230nm 处的吸 光度表 示样品 被酚、 尿素等 污染。 325nm 处的吸 光度被 认为是 微粒污 染和 杯子不 干净。 325nm 处 的轻微 散射在 260mn 处可 被扩大 5 倍。 高度 纯化制 品中, 4 个波 段的典 型数据 见附表 7。 (二) 用荧 光染料 Hoechst 33258 检测 DNA 用荧 光测定 法检测 DNA 浓度 近来已 得到广 泛应用 ,因 为此法 较简单 ,并且 比分光 光 度测定 法灵敏 得多。 Hoechst 33258 荧 光染料 可与纳 克量的 DNA 特异 性结合 ,与 RNA 的亲和 性甚小 ,对 全细胞 匀浆或 纯化的 DNA 制 品的检 测效果 同样好 。由于 荧光染 料易于 结合在 AT 丰富区 ,因 而它对 DNA 组 成的变 化十分 敏感。 1. 附 加材料 lmg/mL 荧 光染料 H33258 (lmg/mL 溶 于水, 4X: 可稳 定保存 6 个月) H33258 分析液 (lOmLIOXTNE 加至 90mL 水中 ,通过 0.45pm 滤器后 ,加 lmg/ mL 的荧 光染料 H33258 10/iL, 因为 H33258 可结合 到大多 数的过 滤膜上 ,所以 要在过 滤后 加入) DNA 标 准溶液 (10、 100、 250、 500/ug/mL 小 牛胸腺 DNA 标准 ,可从 Hoser 或 Sigma 购买) 待测 DNA 样品 荧 光测定 的方形 玻璃比 色杯或 一次性 聚丙烯 比色杯 (Sarstedt #67.755) 0 〜 2mL 吸管和 0 〜 3pL 序列测 定针管 和小内 径头子 限 定滤片 荧光计 (HoeferTKOlOO) 或 扫描荧 光分光 光度计 (ShimadzuRF-5000 型 ,或 Perkin-Elmer LS~5B 或 LS~3B) 2. 操 作步骤 (1) 需要时 ,用 A26G 测定 法定量 DNA 标准 ( 见上法 )。 (2) 把 激动波 长定在 365nm, 发射波 长定在 450~460nm 处 ( 限定滤 片荧光 计的波 长 固定在 365 和 460nm, 不用调 )。 (3) 吸取 2mL Hoechst 33258 分析 液于比 色杯中 ,并将 它放入 荧光计 的样品 室中。 记 录不加 DNA 样品 的读数 ,把 它作为 本底。 如果 荧光计 有浓度 读出功 能或能 作出标 准曲线 ,就把 空白溶 液的读 数调为 0, 否则 记录其 相对荧 光单位 。切 记读 取每个 用过的 比色杯 的本底 ,因 为微小 的变动 会引起 本底读 数很大 改变。 (4) 比色 杯留在 样品室 ,加 2;zLDNA 标准 于空白 Hoechst 33258 分 析液中 ,用 Teflon 搅 棒混匀 或盖上 盖子翻 转混匀 。读 取相对 荧光单 位或将 浓度读 数定为 DNA 的最 终浓度 。用 新的 分析液 重复测 量其他 DNA 标 准样品 (需 要时记 录本底 读数或 将仪器 调零 )。 使用为 序列测 定时凝 胶加样 用的小 细头子 ,可减 少加小 体积时 的误差 。用 样品先 洗一下 头子, 确定在 吸取样 品后没 有液体 沾在头 子外面 。样 品读 2 次或 3 次 ,每次 要有空 白读数 ,空 白读数 异常, 表明 比色杯 脏了; 空白 读数不 稳定, 表明溶 液中有 小颗粒 物质。 (5) 将待测 样品重 复步骤 (4)。 染料 浓度为 O.lHg/mL 时 ,适 于终浓 度高到 500fxg/mL 的 DNA 测定 。把 H33258 染 料的浓 度增加 到 lpg/mL 时, 可将检 测范围 扩展到 lMg/mLDNA, 但对 低浓度 (5~10ng/mL) 测定的 灵敏度 有所限 制。 样品体 积多到 l〇FL 时 ,可加 2.0mL 分析 用染料 溶液。 (三) 溴化 乙锭荧 光检测 DNA 和 RNA 与荧 光染料 Hoechst 33258 相反 ,溴化 乙锭相 对不受 DNA 碱 基组成 差异的 影响。 溴化乙 锭不如 Hoechst 33258 灵敏 ,尽管 它能检 测纳克 水平的 DNA, 但它亦 能结合 RNA。 在制备 DNA 而 有少量 RNA 污染时 ,或 DNA 样品 中的鸟 嘌呤和 胞嘧啶 (GC) 的含 量异常 高时, Hoechst 33258 的信号 相当低 ,溴 化乙锭 则可提 供相对 灵敏的 方法来 代 替它。 1. 附 加材料 溴 化乙锭 分析液 (将 lOmLIOXTNE 加到 89.5mL 水中 ,通过 0.45pm 滤器后 ,加 lmg/mL 的荧 光染料 H33258 0.5mL) 2. 操 作步骤 * (1) 吸取 2. OmL 溴化乙 锭分析 液至比 色杯中 ,将它 放入样 品室里 。将 激动 波长调 至 302nm 或 546nm, 发射波 长调至 590nm。 读 取不加 DNA 的发射 光读数 ,作 为本 底值。 如果 荧光计 有浓度 读出功 能或能 作出标 准曲线 ,就将 仪器对 空白溶 液的读 数调为 0。 否则 记录其 相对荧 光单位 。这 种分 析法的 激发波 长可以 在紫外 光范围 (约 302mn), 此时 要用石 英杯; 或在 可见 光范围 (546mn), 此时 可用玻 璃杯。 两种情 况下的 发射波 长均为 590nm。 (2) 如 Hoechst 33258 分析法 的步骤 (4) 所述 ,读取 和标定 DNA。 (3) 如 Hoechst 33258 分析法 的步骤 (5), 读取待 测样品 的发射 光值。 溴化 乙锭分 析液中 5/^g/mL 的染 料浓度 ,适合 于终浓 度高达 lOOOng/mLDNA 的检测 。溴 化乙锭 分 析液中 10Mg/tnL 溴化 乙锭, 可使分 析的范 围延至 KVg/mLDNA, 但只 适用于 DNA 的 终浓度 >lfig/mL 时 。样 品体积 <10必 时, 可加至 2.0mL 溴化乙 锭分析 液中。 (四) 方 法评注 1. 背 景资料 在决 定采用 哪个核 酸测定 方法最 合适时 ,有 3 个重 要问题 要考虑 ,即 特异性 、敏感 性和干 扰物质 。本 文所述 3 个 分析法 的特点 见附表 8。 传 统的方 法是用 260nm 处 的吸光 度 来测定 溶液中 DNA 的含量 。因为 DNA 和 RNA 制 品中有 很多重 要污染 物在紫 外范围 也有其 光吸收 ,所 以吸光 性分光 计是一 个取得 DNA 或 RNA 样品 纯度和 数量的 可靠方 法。 但吸光 光度计 有严重 的限制 ,如 需要较 大量的 DNA 才会有 较准确 的读数 , 500ng/ mL DNA 只等于 0.01 A26Q 单位 。而 且此法 分不开 DNA 和 RNA, 污染物 如蛋白 质的紫 外吸收 会引起 误差。 • 1041 • 附表 8 DNA 和 RNA 的吸光 和荧光 分光光 度分析 的特性 特 性 吸光度 (Am) H33258 溴 化乙锭 敏感度 / (ftg/mL) DNA 卜 50 0.01-15 0.1-10 RNA 卜 40 未分析 0.2 〜 10 信号比 (DNA/RNA) 0.8 400 2.2 H33258 染料 分析法 常用, 是测定 DNA 的惟 一方法 (即它 不测定 RNA)。 此 法为快 速测 定低量 DNA 的首 选方法 。检测 极限为 IngDNA。 粗的细 胞溶解 物中的 DNA 浓度 和纯 化制品 浓度都 能够进 行测定 。此分 析法可 定量大 范围的 DNA 浓度 ,从 lOng/mL 到 15^g/mL, 所以 对小量 和大量 DNA 的测定 都有用 ( 如在进 行电泳 分离和 Southern 印迹 之前, 要改变 DNA 的 浓度时 )。 H33258 分 析法亦 可用于 聚合酶 链反应 (PCR) 合成产 物的 测定。 当 H33258 与 DNA 结合时 ,它 的荧 光性质 一下子 就变了 ,在约 458nm 处有 一大的 发 射峰。 H33258 似与 DNA 的小 沟结合 ,尤其 倾向于 AT 序列 。荧 光染料 DAPI (2-6- 二脒基 -2- 苯基 吲哚) 也适于 DNA 定量, 但不如 H33258 用的 广泛。 DAPI 的激 动峰在 344tim, 发射检 测在约 466nm 处 ,与 H33258 相似 。溴化 乙锭常 用于电 泳分离 DNA 和 RNA 的常 规染色 ,它也 可用于 溶液中 DNA 和 RNA 的定量 。和 H33258 不一样 的是, 高 GC 含量 不明显 影响溴 化乙锭 的荧光 ,溴 化乙锭 分析法 (在 546nm 的消 光度) 要比 H33258 分析法 的敏感 性约小 20 倍。 2. 重 要参数 在所有 分光光 度法中 ,要小 心对待 样品比 色杯。 荧光计 所用的 比色杯 要四面 光洁。 因为激 动光和 发射光 进出比 色杯都 要直接 通过相 邻的面 。所 以荧光 法的比 色杯只 能拿它 上 面的边 。与 此相反 ,通透 分光光 度计所 用的比 色杯只 有相对 两面的 光线窗 ,旁 边有两 个 糙面便 于操作 。故检 查比色 杯的光 面有没 有指印 和划痕 很重要 。此外 ,为 了准 确读取 吸光度 ,分 光光 度计的 比色杯 要完全 匹配。 在等 重量的 基础上 ,蛋 白质在 A28 。的读 数要 大大低 于核酸 。所 以即使 A28Q 比起 A260 有小 量增加 (即 A26Q/A28 。的值 降低) 就表明 有严重 的蛋白 质污染 。其他 常用缓 冲剂的 组分在 260nm 也 有强的 吸光性 ,在浓 度够高 时可引 起干扰 ,如 EDTA 就不 能超过 10mmol/L〇 H33258 荧光分 析的灵 敏度随 核酸的 降解、 GC 含量的 增加或 DNA 的 变性而 降低。 分 析液的 温度增 高和溴 化乙锭 的污染 也降低 H33258 的信号 。十 二烷基 硫酸钠 ( 终浓度 >0.01%) 也 干扰准 确读数 。分 析液的 pH 对敏感 性也很 重要, 要在约 PH7. 4。 pH<6 或 >8 时, 底色变 得很深 ,同时 失去荧 光增强 作用。 要用 高质量 的双链 DNA, 虽 然单链 DNA 用此 分析法 也很好 。线形 和环形 DNA 的 荧光水 平差不 多一样 。在 准备 DNA 标准时 ,标准 DNA 中的 GC 含量 和样品 DNA 中的 GC 含 量尽可 能一样 。大多 情况下 ,鲑精 DNA 和小 牛胸腺 DNA 就合适 。真核 细胞的 • 1042 • GC 含量有 所变化 ,但一 般都在 39% 〜 46% 范围内 。在此 范围内 每毫克 DNA 的 荧光实 际上没 有变化 。与 此相反 ,原核 细胞的 GC 含量 可以从 26% 变到 77%, 使荧光 信号有 相当大 的改变 。在 这种 情况下 ,样品 DNA 首先 要用透 光分光 计定量 ,并 与准备 好的标 准 (即小 牛胸腺 DNA) 进 行对比 。然 后用小 牛胸腺 作为标 准进行 进一步 测定, 不过两 种不同 类型的 DNA 所生 成的荧 光的差 别要用 校正因 子进行 调整。 在溴化 乙锭分 析法中 ,单链 DNA 的信 号约为 小牛胸 腺双链 DNA 的一半 ,核 糖体 RNA 的 荧光信 号也约 为双链 DNA 的 一半。 RNA 酶和 DNA 酶的污 染都会 严重降 低此信 号 。闭环 DNA 结合 的溴化 乙锭也 比缺口 或线性 DNA 结合 的少。 3. 预期结 果和时 间安排 吸光分 光光度 法的检 测极限 取决于 分光光 度计的 灵敏度 和可能 存在的 任何有 紫外吸 收的 杂质, 上限一 般约在 0.5~l/ig 核酸。 所述 3 个测 定方法 都可在 短时间 内完成 。在计 划好的 系列测 定中, 50 个样 品可以 在 lh 内轻 松地做 好准备 和进行 读数。 尽管可 能有些 误差, DNA 样 品可以 依次加 入含有 染料溶 液的同 一比色 杯中; 记下每 个样品 所增加 的荧光 ,并减 去前一 个读数 ,得 出新样 品的相 对荧光 或浓度 ,免得 每个样 品都要 换溶液 。要 确定 DNA 的 最终量 不能超 过分析 法 的线性 部分。 黎培员 李 东 主要参 考文献 Ausubel F. M. et al. 1995. Short Protocols in Molecular Biology 3rd. John Wiley & Sons, Inc. Ausubel F. M. et al. 1996. Current Protocols in Molecular Biology 2nd. John Wiley & Sons Inc. Craig, L.C. 1967. Techniques for the study of peptides and proteins by dialysis and diffusion. Methods Enzy- mol., 11: 870 〜 905. Dawson, R.M.C., Elliont. D.C., Elliott, W.H. and Jones, K.M.,eds. 1986. Data for Biochemical Re- sarch. London: Alden Press. Labarca, C. and Paigen, K. 1980. Asimple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Anal. Biochem. 102: 344 〜 352. Laskey, R. A. 1980. The use of intensifying screens of organic scintillators for visualizing radioactive molecules resolved by gel electro-phoresis. Methods Enzymol. , 65: 363 〜 371. Laskey, R. A. and Mills, A.D. 1975. Quantitative film detection of H and 14C in polyacrylamide gels by flu- orography. Eur. J. Biochem., 56: 335 〜 341. Le Pecq, J.-B. 1971 . 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Methods Enzymol •, 152 : 432 〜 442 • 中科 院植物 » 图书馆 圓 圓圓酾 III S0003875 • 1044 • 收 到期知 书价 单据号 〇?咏 仏 r , - 作 者简介 林菊 生同济 医科大 学博士 ,美 国耶鲁 大学博 士后。 美国哈 佛 大学、 MIT、 威 斯康辛 医学院 、目 本东京 医科齿 科大学 与顺天 堂大学 高级访 问学者 。现 为华 中科技 大学同 济医学 院附属 同济医 院内科 学教授 、主 任医师 、博士 生导师 ,肝 病研究 所所长 。主持 国家自 然科学 基金重 点项目 1 项 、面上 项目 5 项, “十五 ”国家 重大科 技专项 (863)1 项 、卫 生部基 金课题 1 项 。研 究方向 有:消 化系统 内科学 、肝 脏病学 、分 子 肿瘤学 、功能 基因组 学和生 物芯片 、肝病 的基因 治疗等 。曾获 国家教 委科技 进步奖 ,联合 国技术 信息促 进系统 (UN TIPS) 发明创 新科技 之星奖 。在国 内申请 专 利一项 ,在国 内外发 表论文 80 多篇 ,其中 SCI 收录 20 多篇 。参编 《基因 分析和 生物 芯片技 术》、 《癌症 的基因 治疗》 、《肝 脏病 学》、 《临床 消化病 学》、 《门 静脉高 压症》 等 。现为 《世界 消化杂 志》、 《中华 肝病杂 志》、 《华 中科 技大学 学报医 学版》 (英 文版) 等杂 志编委 ,国家 自然科 学基金 项目评 审专家 ,中 华医学 科技奖 和中华 医学青 年奖评 审专家 ,中 华医学 会肝病 学会全 国委员 (肝癌 学组 副组长 ), 湖北 省肝病 学会主 任委员 ,美国 癌症研 究学会 (AACR) 会员 ,美 洲华人 生物技 术学会 (SCBA) 会员 ,国 务院颁 发的政 府特殊 津贴获 得者与 湖北省 突 出贡献 的中青 年专家 。已培 养硕士 研究生 28 名 、博士 研究生 15 名。 ISBN 7-03-011103-6 111036 分努让 议:生 物技术 / 细胞 生物学 / 分子 生物学 > 'V … X . 生 命科学 编辑部 联 系电话 : 010-64012501 http://www.lifescience.com.cn e-mail:in fo@lifescience.com.cn ^SBN 7-03-011103-6^ L 定价: 148.00 7C~j