at 2 MED 4 8 ok BR BR 4 www. sciencep . com LI 能 力 培养 型 生物 学 基础 课 系列 实验 教材 遗传 学 实验 教程 AF) XR Se 4 2k Bm 社 2304et7 Lrg 内 容 简 介 根据 遗传 学 的 学 科 发 展 和 研究 水 平 ,本 书 分 为 基础 性 实验 、 综 合 性 实验 和 研究 性 实验 三 部 分 。 第 一 部 分 基础 性 实验 , 共 5 章 ,20 个 实验 ;第 二 部 分 综合 性 实验 , 共 13 个 实验 ;第 三 部 分 研究 性 实验 , 共 6 个 实验 。 本 教程 附录 中 列 有 实验 室 工作 规程 .实验 室 一 般 溶液 的 配制 .组 织 和 细胞 培养 常用 的 培 养 基 各 种 染色 液 的 配制 .实验 常用 数据 、 消 毒 及 灭 菌 、 玻 璃 器 的 洗涤 ,为 基层 工作 的 同志 提供 了 必需 的 参考 资料 。 本 教程 可 供 高 等 院 校生 物 科 学 专业 及 农林 医药 院 校 等 相关 专业 师 生 使 用 ,也 可 供 中 学 生物 学 教师 作 教学 参考 书 。 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 遗传 学 实验 教程 / 郭 善 利 , 刘 林 德 主编 . 一 北京 : 科学 出 版 社 ， 2004 能 力 培 养 型 生物 学 基础 课 系列 实验 教材 ISBN 7-03-014203-9 T. 遗 ... I.@ 郭 ...@ 刘 ... 亚 . 遗传 学 -实验 = 高 等 学 校 = 教材 WW. Q3-33 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2004) 第 084865 号 责任 编辑 : 陈 露 张 天 /责任 校对 : ERE 责任 印 制 : 刘 学 / 封面 设计 : — 明 eek BK & MK 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 : 100717 http: //www. sciencep. com 南京 展望 文化 发 展 有 限 公 司 排版 江苏 省 句 容 市 排 印 厂 印刷 科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书 店 经 销 关 2004 年 9 月 第 一 版 FA: B5(720X1000) 2004 年 9 月 第 一 次 印刷 印张: 11 % ENA: 1 一 3 200 字数 : 225 000 定价 : 19. 00 元 +E R: 副 主 任 委员 : int pall 安利 国 KASS 孙 席 山 郭 善 利 AAR AE Sak ie 刘 a XI PAGE MASE 孙 席 山 安利 国 能 力 培养 型 生物 学 基础 课 系 列 实验 教材 编 委 会 : 〈 按 姓氏 笔画 为 序 ) (山东 师范 大 学 ) (山东 师范 大 学 ) (山东 师范 大 学 ) (烟台 师范 学 院 ) (曲阜 师范 大 学 ) (烟台 师范 学 院 ) (山东 师范 大 学 ) ( 曲 里 师范 大 学 ) (山东 师范 大 和 学) (山东 师范 大 学 ) (聊城 大 学 ) 《遗传 竺 实验 教程 》 编 写 人 员 = 编 : A 刘 林 德 副 主编 : 周 国 利 ” 赵 建 萍 ” 气 奉 同 编 者: ( 按 姓 氏 笔画 为 序 ) ERT 刘 文 xe MAA 张 爱 民 周 国 利 赵 建 萍 ” 贺 继 临 姚 志 刚 。” 郭 善 利 出 版 说 明 生物 科学 是 一 门 实验 性 学 科 , 实 验 教 学 在 其 专业 课 学 习 中 占有 十 分 重要 的 地 位 ,动手 能 力 、 综 合 分 析 能 力 和 创新 能 力 的 培养 主要 依靠 实验 教学 来 完成 。 受 传统 教育 思想 的 影响 , 几 十 年 来 我 国 高 等 师范 院 校生 物 科 学 专业 的 实验 教 学 以 学 科 知 识 为 体系 ,从 属于 理论 教学 ,以 验证 理论 知识 和 学 习 实验 技术 为 主要 目 的 ,忽视 了 能 力 的 培养 ,扼杀 了 学 生 的 创新 欲望 。 实 验 内 容 繁 琐 , 存 在 着 大 量 的 低 水 平 的 重复 , 远 远 不 能 适应 创新 型 人 才 培 养 的 要 求 。 近年 来 , 随 着 创新 人 才 教育 的 开展 ,能 力 培养 已 引起 国家 和 学 校 的 普遍 重视 。 高 教 部 下 发 的 (关于 加 强 高 等 学 校本 科教 学 工作 , 提高 教学 质量 的 若干 意见 》 中 特 别 强调 “进一步 加 强 实践 教学 ,注重 学 生 创 新 精神 和 实践 能 力 的 培养 ”, 指 出 : 实践 教学 对 于 提高 学 生 的 综合 素质 、 培 养 学 生 的 创新 精神 与 实践 能 力 具 有 特殊 作用 。 高 等 学 校 要 重视 本 科教 学 的 实验 环节 ,保证 实验 课 的 开 出 率 达 到 本 科教 学 合格 评 估 标 准 , 并 开 出 一 批 综合 性 .设计 性 实验 。 但 是 ,与 此 相 适 应 的 教材 却 很 少 ,尤其 是 针对 生物 科学 基础 实验 的 系列 教材 尚未 问世 。 本 套 能 力 培养 型 实验 教材 就 是 适应 我 国 高 等 教育 创新 性 人 才 培 养 的 需要 而 编写 的 。 本 套 教 材 将 实验 分 为 基础 性 实验 综合 性 实验 和 研究 性 实验 三 种 类 型 。 基础 性 实验 是 经 过 精 选 的 最 基本 的 、 最 代表 学 科 特 点 的 实验 方法 和 技术 ,通过 学 习 使 学 生 掌握 相应 学 科 的 基本 知识 与 基本 技能 ,为 综合 性 实验 黄 定 基础 。 综合 性 实验 由 多 种 实验 手段 与 技术 和 多 层次 的 实验 内 容 所 组 成 ,要 求学 生 独 立 完 成 预习 报告 .试剂 配制 仪器 安装 与 调试 .实验 记录 ,数据 处 理 和 总 结 报告 。 综 合 性 实验 主要 训练 学 生 对 所 学 知识 和 实验 技术 的 综合 运用 能 力 、 对 实验 的 独立 工 作 能 力 、 对 实验 结果 的 综合 分 析 能 力 ,为 研究 性 实验 的 顺利 开展 做 好 准备 。 研究 性 实验 是 在 完成 基础 性 实验 和 综合 性 实验 的 基础 上 , 以 相应 学 科 的 研究 为 主 结合 其 他 学 科 的 知识 与 技术 ,由 学 生 自己 设计 实验 方案 ,开展 科学 研究 ,撰写 程 研究 论文 ,使 学 生得 到 科学 研究 的 初步 训练 ,为 毕业 论文 研究 工作 的 开展 打下 基础 。 部 分 优秀 课程 研究 论文 可 进一步 深化 .充实 ,作为 毕业 论文 参加 答辩 。 三 种 类 型 实验 所 占 比例 根据 不 同年 级 .不 同 课程 而 确定 。 低 年 级 课程 以 基础 性 实验 为 主 ,基础 性 ,综合 性 和 研究 性 实验 的 比例 为 7 : 2 : 1。 随 年 级 升 高 ,逐渐 增加 综合 性 和 研究 性 实验 的 比例 ,基础 性 、 综 合 性 和 研究 性 实验 的 比例 达到 vive 遗传 学 实验 教程 DBZ. 本 套 教材 试图 从 下 述 几 个 方面 有 所 突破 和 创新 : 1. 以 能 力 培养 为 核心 ,通过 综合 性 实验 和 研究 性 实验 的 开设 ,启发 学 生 思 维 ， 引导 学 生 创新 。 2. 本 套 教 材 是 我 国 高校 第 一 套 生物 科学 基础 实验 课 系 列 性 教材 ,在 编 委 会 的 统一 领导 下 完成 ,避免 了 低层 次 重复 ,体现 了 实验 内 容 的 系统 性 。 3. 本 套 教材 特别 强调 实用 性 和 可 操作 性 ,实验 内 容 在 编写 单位 已 经 经 过 了 2 一 3 遍 的 试用 。 4. 本 套 教 材 充 分 体现 先进 性 , 尽 可 能 反映 生命 科学 的 最 新 进展 。 5. 每 本 教材 都 附 有 实验 报告 和 研究 论文 范文 ,为 学 生 提 供 了 实验 报告 的 规范 性 样板 ,对 培养 学 生 严 说、 仔细 的 学 风 具 有 一 定 的 指导 作用 。 6. 本 套 教 材 已 着 手 制作 电子 光盘 版 ,使 之 成 为 立体 化 教材 。 多 数 实验 将 配 有 录 相 和 多 媒体 课件 ,用 于 实验 之 前 播放 ,指导 学 生 的 实验 操作 。 尽管 各 位 主编 和 编 委 已 经 尽 了 最 大 努力 ,但 是 ,由 于 编者 水 平 所 限 , 肯 定 会 有 不 少 的 错误 ,恳请 各 位 同仁 不 音 赐 教 , 以 便 再 版 时 减少 廖 误 。 本 套 教材 得 到 国家 教育 部 (面向 二 十 一 世纪 ,我 国生 物 教育 专业 的 培养 目标 、 培养 方案 和 课程 体系 的 研究 》 和 山东 省 高 校生 物 科 学 (师范 类 ) 改 革 试 点 专业 专项 经 费 的 资助 , 夭 蒙 山东 师范 大 学 和 科学 出 版 社 的 领导 与 朋友 的 大 力 支 持 , 在 此 一 并 安利 国 2004 年 8 月 Ill} 前 遗传 学 是 生物 科学 专业 的 一 门 重要 专业 课 ,实验 课 是 理论 联系 实践 ,培养 和 训 练 学 生 掌握 科学 思维 方法 .实事 求 是 的 科学 态度 与 独立 的 科研 动手 能 力 的 重要 环 节 和 手段 。 本 书 是 根据 高 等 学 校 遗 传 学 教学 大 纲 .山东 省 实验 示范 中 心 的 要 求 ,为 更 好 地 培养 学 生 的 创新 意识 和 创新 能 力 而 编写 的 ,是 生命 科学 系列 实验 教程 的 一 本 。 除 教学 大 纲 规定 的 实验 内 容 外 ,本 教程 在 实验 原理 方面 作 了 必要 的 扩充 和 说 明 。 根据 遗传 学 的 学 科 发 展 和 研究 水 平 , 整 个 教程 分 为 三 部 分 : 第 一 部 分 基础 性 实验 , 共 5 章 ,20 个 实验 ;第 二 部 分 综合 性 实验 , 共 13 个 实验 ;第 三 部 分 研究 性 实 验 , 共 6 个 实验 。 有 的 实验 列 出 了 多 种 材料 和 方法 ,个 别 实验 内 容 较 多 ,教师 可 根 据 具体 情况 加 以 选择 。 此 外 ,本 教程 还 附 有 实验 室 工作 规程 .实验 室 一 般 溶液 的 配 制 、 组 织 和 细胞 培养 常用 的 培养 基 、 各 种 染色 液 的 配制 .实验 常用 数据 ,消毒 及 灭 菌 、 玻 璃 器 严 的 洗涤 ,为 基层 工作 的 同志 提供 了 必需 的 参考 资料 。 本 教程 还 列 有 实 验 研 究 性 报告 范文 ,可 供 学 生 参 考 。 在 编写 过 程 中 ,承蒙 山东 师范 大 学 生命 科学 学 院 、 聊 城 大 学 生命 科学 学 院 领 导 的 大 力 支持 ,同时 引用 了 国内 外 许多 作者 的 文献 资料 ,在 此 说 表 谢 意 。 由 于 水 平 有 限 ,时间 紧 迫 ,实验 设计 及 编写 中 的 缺点 ,错误 在 所 难免 ,希望 读者 批评 指正 。 编者 2004 年 7 月 7 4 4 4 4 a : 7 et > ir. the rT un “ir ; . ad 中 be 出 版 说 明 Hs 第 一 部 分 基础 性 实验 第 一 章 经 暴 遗 传 学 ooooooeoooooooooooooooooooooooooooooooooooososooeeooooooooooooooose。 KE 实验 1 细胞 分 裂 及 染色 体 行为 的 观察 ee ci kore 实验 2 果 蝇 的 观察 及 单 因子 杂交 oo (8 ) 实验 3 果 蝇 的 伴 性 遗传 oooosooooooooooovoooooooooooooooooooooooooooooooooooooo。 (14) 实验 4 果 蝇 的 两 对 因子 的 自 由 组 合 oooooooooosooooooooooooooooooooooooo。 BATS 实验 5 玉米 有 性 杂交 和 粒 色 遗传 ooooooooosoooosooosoooooooos 7 (19 ) 实验 6 植物 多 倍 体 的 诱发 和 鉴定 ooooooooooooooovosoooooosoesooooooooo。 ( 22) 第 二 章 细胞 遗传 学 ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo。 (25) 实验 7 果 蝇 唾 腺 染色 体 的 观察 oooooooooooososooooooosovooooooooiooooooooooo。 € 25 ) 实验 8 〈 人 类 与 两 栖 类 ) 外 周 血 淋巴 细胞 的 培养 和 染色 体 标本 制作 .ee (28 ) 实验 9 植物 姊妹 染色 单 体 区 分 染色 法 pp (33) 实验 10 “染色体 组 型 分 析 ee (36) ac Ky 11 植物 单 倍 体 的 诱发 oooooooooooooooooooooooooooooosoooooooooooosoooo。 ( 39 ) 实验 12 植物 组 织 的 培养 pp ( 43 ) BEBE 微 生物 和 遗传 学 (54) 实验 13 HUBERETU BEA IZRAS cee eeeeeeceeeeceeeecceeeseeaseceesseeeeeesaeseeeens (54) 实验 14 酵母 菌 的 杂交 coe eeeeeeeeeeececeeeeeeeerensceenescesesenseescseeenes (59 ) 实验 15 E. coli GUAR ceeccesseeeeccececceneecsenssecseceseesceeoteseeesecsseeenee (62) SEU 16 细菌 的 局 限 性 转 导 pe (65 ) 第 四 章 .， 数量 和 群体 遗传 学 .ee (69 ) Sc; 17 Hardy — Weinberg 遗传 平衡 定律 的 检验 PP ( 69 ) 实验 18 ”环境 因素 对 果 蝇 发 生 量 的 影响 pp KF) 第 再 章 . 分 子 般 传 学 .| (73) 实验 19 ”高 等 植物 总 DNA 的 提取 和 纯化 PP (73) > vill 实验 20 实验 21 实验 22 实验 23 实验 24 实验 25 实验 26 实验 27 实验 28 实验 29 实验 30 实验 31 实验 32 实验 33 实验 34 实验 35 实验 36 实验 37 实验 38 实验 39 附录 附录 1 附录 2 附录 3 附录 4 附录 5 遗传 学 实验 教程 聚合 酶 链 反 应 PCR ccccccccccccccccccccvccccccccsccccccccccscecs CTA) 第 二 部 分 综合 性 实验 三 点 测验 的 基因 定位 方法 oo (79) 植物 有 性 杂交 技术 oo (81) 互补 测验 ee (90 ) 人 体外 周 血 淋巴 细胞 姊妹 染色 单 体 区 分 染色 法 cee eeeteeeeeeee (94) | BBA ais AB HEL AS 8, RH BRS TR 8 fE, FEV sev ececeecerececeecereceeeececeeseeececeeeceseeeececeeeeseceenens (97) 植物 原生 质 体 的 分 离 再 生 pp (100) E. coli 的 转化 cerceececeeeeeececeeeecececsececseseeceeseeeaecseneaeens (103) 数量 性 状 的 遗传 参数 一 一 遗传 力 的 估算 pe (108) 果 晶 某 数 量 性 状 对 于 选择 的 反应 ee ee。 (114) SEE Ls PEA EE Pe GP STR ATE este eevee (119) Southern 印迹 杂交 ceececeeeceecececsccececeeseueceesesessceeseeeeeens (123) 质粒 DNA OE Oa iad) Ree (126) Fi A PEE SE KE) DNA .pe (128) 第 三 部 分 研究 性 实验 调查 人 和 群 中 革 一 或 革 几 种 性 状 pe (131) 观察 不 同 诱 变 因素 对 染色 体 结构 的 影响 (131) 染色 质 的 分 离 及 组 成 成 分 分 析 pe (134) 某 种 生物 的 染色 体 组 型 分 析 pp (139) DNA 重组 分 子 的 构建 与 鼻 选 pp (140) E. coli 营养 缺陷 型 菌株 的 诱发 和 盘 选 pp (142) 实验 室 工 作 规 程 .pe (147) 实验 室 一 般 溶 液 的 配制 pp (151) 组 织 和 细胞 培养 常用 的 培养 基 pe (154) 常用 染色 液 的 配制 pe (157) 实验 常用 数据 ee (158) 消毒 及 灭 菌 cece eee eceeeeeeececeeceseeceeeseseeeeeseseescesansaseeseeeees (165) BG FS BS UT AYE TR ee (167) 实验 报告 范文 secceeecccccesccecescceencececeseceeessseeuasesssenrocsees (168) { { ' I | | ] | 第 一 曹 实验 1 经 典 遗 传 学 细胞 分 裂 及 染色 体 行 为 的 观察 实验 1.1 植物 细胞 有 丝 分 裂 及 染色 体 行为 的 观察 【实验 目的 】 1. 观察 植物 细胞 有 丝 分 裂 过程 及 各 时 期 染色 体 的 特征 。 2, 学 习 并 掌握 植物 染色 体 玻 片 标本 的 制作 方法 。 【实验 原理 】 细胞 分 裂 是 细胞 繁殖 的 惟一 途 征 ， 一 般 分 为 直接 分 裂 和 间接 分 裂 。 直 接 分 裂 也 就 是 无 丝 分 裂 ,细胞 核 直接 地 一 分 为 二 。 间接 分 裂 又 可 分 为 有 丝 分 裂 (图 1- 1) 及 减 数 分 裂 两 种 。 对 有 些 染 色 体 数目 很 多 的 植物 材料 ， 采用 压 片 法 制备 标本 很 难 获得 分 散 而 平 整 的 染色 体 图 像 。20 世纪 50 年 代 后 ,在 哺乳 类 动物 细胞 染色 体 研 究 中 建立 的 一 套 完 整 的 低 渗 法 及 空气 干燥 技术 ,使 人 类 和 哺乳 类 动物 染色 体 的 研究 得 到 飞速 发 展 。 直 到 70 年 代 植 物 原生 质 体 技术 发 展 完善 以 后 ,Mouras(1978) 等 人 应 用 酶 解 和 低 渗 处 理 对 有 丝 分 裂 染色 体 标本 制备 方 法 提出 了 新 的 改进 。 自 此 ,经 过 国内 外 学 者 的 不 断 探 索 ,建立 了 去 壁 低 渗 火 焰 干 燥 技术 进行 植物 染色 体 标 本 的 制备 。 此 法 XNA 染色 体 排列 在 赤道 2, 100 - vay HF! A tek eta ae by, 末期 Cp ty ee 染色 质 重 新 形成 ;人 4 于 细胞 质 分 开 re 图 1= 1 有 丝 分 裂 示意 图 (修改 自 http: //www. accessexcellence. org/AB/GG/ mitosis2. html) 2 遗传 学 实验 教程 主要 由 前 处 理 、 酶 解 去 壁 、 低 渗 、 固 定 后 涂 片 或 制备 成 细胞 悬 液 滴 片 . 火 焰 于 燥 、 染色 等 步骤 组 成 。 实 验证 明 , 这 一 技术 可 以 显著 提高 染色 体 的 分 散 程 度 和 平整 性 ,现在 已 广泛 应 用 于 植物 染色 体 显 带 、 姊 妹 染 色 单 体 交 换 筹 研究 中 ,大 大 促进 了 植物 细胞 遗传 学 研究 的 发 展 。 植物 体 生 长 旺盛 的 分 生 组 织 ( 如 根 尖 ` 茎 尖 、 幼 叶 等 ) 都 在 进行 着 有 丝 分 裂 。 经 过 取材 固定 、 解 离 . 染 色 和 压 片 等 处 理 过 程 , 将 细胞 分 散在 装 片 中 ,在 显微镜 下 就 可 看 到 大 量 处 于 有 丝 分 裂 各 时 期 的 细胞 和 染色 体 。 有 丝 分 裂 中 期 的 染色 体 具 有 典 型 的 形态 特征 ,并 易于 计数 。 为 了 获得 更 多 的 中 期 染色 体 装 片 ,可 以 采用 药物 处 理 或 冰冻 处 理 的 方法 ,阻止 纺锤 体 的 形成 ,使 细胞 分 裂 停 止 在 中 期 。 同 时 ,通过 处 理 可 使 染色 体 缩短 变 粗 , 易 于 分 散 , 便 于 进行 观察 研究 。 另 外 ,通过 对 组 织 细胞 进行 酸性 水 解 或 酶 处 理 , 可 以 分 解 细胞 之 间 的 果 胶 层 并 使 细胞 壁 软化 ,细胞 容易 彼此 散 开 , 有 利于 染色 和 压 片 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 YEA (Allium cepa), Kg (Allium sativum ) 的 鳞 葵 ,玉米 (Zea mays ) , oa (Secale cereale) ,/\\# (Triticum aestivum) #22. (Vicia faba) HPF]. ASH VW Kiar AEA FB 2. 用 具 及 药品 (1) AA We 5a. TELUS FA HL OK BK A PT FOF 1/100 HOF FE i, 炉 Uk BET BY TD BRE TD AR ET RS BR UA PEAR a Te) EO ` 漏 5} BORE SEAR. = Fah SPP ASA RH a EET CS A 笔 、 胶 水 、 纱 布 等 。 (2) 药品 蒸馏 水 .无 水 乙醇 .95 儿 乙醇 二 甲 茶 、 冰 醋酸 、 醋 酸 钠 、 茉 酚 、 甲 醛 、 碱 性 品 红 、 山梨 醇 、 秋 水 仙 素 或 对 二 毛茶 或 0. 002 mol/L 的 8 -羟基 唆 啉 .中 性 树胶 (或 油 铂 胶 ) 卡 诺 氏 固定 液 .1mol/L 盐酸 、45%% 醋 酸 .1%% 龙 胆 紫 ,4%% 铁 胡 水 洲 液 .2 为 醋酸 洋红 染色 液 或 改良 苯酚 品 红 染色 液 .2.5%% 纤 维 素 酶 和 2.5% 果 胶 酶 混合 液 。 【实验 步骤 】 1. 材料 准备 与 取材 可 直接 从 田间 挖 取 刚 长 出 的 幼 嫩 根 尖 , 也 可 以 在 室内 培养 根 尖 。 本 实验 用 大 菏 根 尖 作 材料 ,取材 方便 ,而 且 能 够 获得 较 多 的 根 尖 , 可 供 多 人 使 用 。 FACE KK ae RE DE BZ ,然后 用 细 铁 丝 串 起 放 在 盛 清水 的 培养 四 内 ,使 根部 与 清 水 接触 ,在 20~25C 光 照 条 件 下 培养 2 一 3 d。 待 根 尖 长 到 1 一 2 cm 时 ,选择 健壮 根 尖 , 自 尖端 约 1 cm 处 剪 下 准备 预 处 理 用 。 剪 取 根 尖 的 时 间 以 上 午 10 时 左右 第 一 部 分 基础 性 实验 * 3° 为 好 。 2. 预 处 理 为 了 阻止 纺锤 体 的 活动 以 获得 较 多 的 中 期 分 裂 相 ,同时 使 染色 体 相 对 缩短 , 便 于 染色 体 分 散 和 计数 ,可 对 根 尖 进 行 预 处 理 。 如 果 只 是 为 了 观察 有 丝 分 裂 各 个 时 期 的 染色 体 动 态 变化 而 不 进行 染色 体 计 数 , 可 以 不 进行 预 处 理 。 预 处 理 的 方法 有 药物 和 冰冻 预 处 理 两 种 。 (1) 药物 处 理 将 材料 放 在 培养 耻 中 ,加 0. 05% ~0. 2%% 秋 水 仙 素 水 溶液 室温 下 处 理 2 一 4 h。 也 可 用 对 二 毛茶 饱和 水 溶液 或 0. 002 mol/L 的 8 -羟基 唆 啉 水 溶液 室温 下 处 理 3 一 4h。 这 些 药物 都 能 使 染色 体 缩 短 ,对 染色 体 有 破坏 作用 。 使 用 时 应 注意 处 理 的 时 间 ,小 麦 、. 黑 麦 ` 大 才 、 圆 萄 和 大 蒜 等 处 理 2 一 4h 为 宜 , 棉 花 和 水 稻 等 处 理 2 h 左 右 为 宜 。 处 理 时 间 长 短 与 温度 也 有 很 大 的 关系 。 (2) 冰冻 处 理 将 根 尖 浸泡 在 蒸馏 水 中 , 置 于 1 一 4C 冰 箱 内 或 盛 有 冰 块 的 保温 瓶 中 冰冻 24 h。 这 种 方法 对 染色 体 无 破坏 作用 ,染色 体 缩短 均匀 ,效果 良好 ,简便 易 行 ,各 种 作物 都 适用 ,但 常用 于 处 理 禾 本 科 植 物 材 料 。 3. 固定 或 前 低 渗 将 经 过 预 处 理 和 未 经 预 处 理 的 材料 (用 于 和 经 预 处 理 的 根 尖 进行 对 比 ) 用 蒸馏 水 冲洗 2 次 ,然后 转移 到 卡 诺 氏 固 定 液 (3 份 无 水 乙醇 、1 份 冰 醋酸 , 现 用 现 配 ) 中 ， 室温 下 固定 3 一 24 h。 或 者 将 根 尖 放 入 0. 075 mol/L KC] 溶液 中 低 渗 处 理 20 min, 然后 再 用 蒸馏 水 冲洗 2 一 3 次 。 注意 ,如 果 固 定 后 的 材料 不 立即 使 用 ,可 放 在 70% 乙 醇 中 , 置 冰箱 或 阴暗 处 保 存 。 用 时 再 用 固定 液 重 新 固定 一 下 (30 min 一 3 hb) 效 果 会 较 好 。 4. 解 离 常用 的 解 离 方 法 有 3 种 。 1) REAR FA AR TB KE 2 次 , 放 人 已 经 在 60C 水 浴 锅 中 预 热 的 1 mol/L 盐酸 中 ,在 60 恒温 条 件 下 处 理 5 一 10 min, 当 根 尖 的 伸 长 区 变 透 明 而 分 生 区 呈 米 黄 或 乳白 色 时 即 可 取出 。 2) 将 根 尖 放 和 人 2.5%% 纤 维 素 酶 和 2.5% 果 胶 酶 的 等 量 混合 液 中 (PH 5. 0 一 5. 5), 室温 下 处 理 3h 左右 。 3) 将 根 尖 放 和 人 95%% 乙 醇和 浓 盐 酸 (1 : 1) 混 合 液 中 处 理 2 一 10 miny; 或 将 根 兴 BLA 5 mol/L 盐酸 中 处 理 5 一 10 min, 5. 染色 与 压 片 将 解 离 好 的 材料 用 蒸馏 水 冲洗 以 后 , 转 人 45%% 醋 酸 中 软化 10 min AA. RL 1 一 2 根 软化 好 的 根 尖 放 在 载 玻 片 上 ,用 刀片 切 去 伸 长 区 ,只 留 下 1 一 2 mm 的 分 生 。4，。 遗传 学 实验 教程 区 (也 就 是 生长 点 )。 滴 一 滴 龙 胆 紫 染 色 液 染色 3 一 5 min, 也 可 用 改良 苯酚 品 红 染 色 液 染色 10 一 15 min, 或 用 酷 酸 洋 红 染色 液 染 色 30 min 左右 。 。 染色 完毕 加 上 盖 片 ,在 酒精 灯火 焰 上 过 3 一 4 次 ,以 手背 试 之 ,感觉 微波 为 宜 (如 果 室 内 气温 较 高 或 认为 染色 较 好 ,也 可 不 用 酒精 灯 烤 片 )。 在 盖 片 上 覆 以 吸 水 纸 ,用 左手 拇指 压 住 盖 片 的 一 角 ,用 右手 拿 铅笔 垂直 禹 盖 片 几 下 ,用 力 要 均匀 ， RZ mL ,把 材料 震 散 。 继 续 用 左手 拇指 压 住 盖 片 一 角 ,用 右手 拇指 用 力 下 压 盖 片 ,在 保证 两 玻 片 不 错 动 的 前 提 下 ,将 材料 压 成 薄 薄 一 层 , 即 可 放 在 显微镜 下 观察 。 6. 镜 检 压 好 的 片子 先 在 低 倍 镜 下 镜 检 ,找到 分 裂 细 胞 后 ,再 转换 成 高 倍 镜 观 察 染 色 体 的 动态 变化 。 注 意 比较 经 过 预 处 理 和 未 经 预 处 理 的 材料 的 不 同 之 处 。 如 果 染 色 体 分 散 良好 ,图 像 清 晰 ,就 可 以 脱水 封 片 , 制 成 永久 片 。 7. 永久 制 片 将 玻 片 标本 用 干冰 或 制冷 器 冷冻 数 分 钟 ,也 可 放 在 冰箱 中 冷冻 几 小 时 ,取出 后 用 薄 刀 片 掀 开 ,将 附着 材料 的 载 片 或 盖 片 置 于 37C 恒 温 箱 中 烘 于 ,然后 在 二 甲苯 中 透明 15 min 左右 ,中 性 树胶 封 片 ,干燥 后 即 可 长 久保 存 。 【实验 报告 】 1. 绘 出 在 显微镜 下 观察 到 的 有 丝 分 裂 各 时 期 的 图 像 并 注 明 时 期 。 2. 经 过 预 处 理 和 未 经 预 处 理 的 片子 有 何不 同 ?” 为 什么 ? 3. 制作 两 张 优良 的 有 丝 分 裂 玻 片 标 本 ,并 说 明 优 良 有 丝 分 裂 玻 片 标本 应 该 符 合 哪些 标准 。 4, 为 了 便于 观察 有 丝 分 裂 的 过 程 及 其 中 染色 体 的 动态 变化 ,最 好 应 该 选择 什 么 样 的 材料 ,为 什么 ? 5. 预 处 理 .固定 、 解 离 . 染 色 、 烤 片 . 压 片 的 作用 分 别 是 什么 ? 它们 各 自 对 时 间 有 什么 要 求 ? 〈 郭 善 利 ” 周 国 利 ) 实验 1.2 减 数 分 裂 及 染色 体 行 为 的 观察 【实验 目的 】 1. 了 解 高 等 动 ,植物 配子 形成 过 程 中 减 数 分 裂 的 细胞 学 特征 ,重点 掌握 染色 体 在 其 中 的 动态 变化 过 程 , 为 研究 遗传 学 的 基本 规律 商定 细胞 学 基础 。 2. 学 习 用 植物 花药 和 动物 精 巢 制备 减 数 分 裂 玻 片 标本 的 方法 。 第 一 部 分 基础 性 实验 «§- 【实验 原理 】 减 数 分 裂 是 在 配子 形成 过 程 中 发 生 的 一 种 特殊 的 细胞 分 裂 形 式 。 其 特点 是 : 细胞 连续 进行 两 次 分 裂 ,而 染色 体 只 在 减 数 分 裂 第 一 次 分 裂 前 复制 一 次 ,形成 的 性 细胞 只 含有 体 细胞 染色 体 数 的 一 半 。 在 减 数 分 裂 的 前 期 工 , 初 级 性 母 细 胞 中 的 同 源 染 色 体 配对 、 联 会 并 进行 染色 体 片 段 的 交换 。 中 期 工时 , 同 源 染色 体 成 对 排列 在 赤道 板 两 侧 。 后 期 工时 , 同 源 染 色 体 由 纺锤 丝 分 别 拉 向 两 极 ,而 每 条 染色 体 的 两 条 子 染 色 体 仍 由 着 丝 粒 连接 在 一 起 ,结果 形成 了 染色 体 数目 减 半 的 次 级 性 母 细 胞 。 次 级 性 母 细胞 接着 进行 减 数 分 裂 的 第 二 次 分 裂 。 在 中 期 开 时 ,染色 体 的 着 丝 粒 分 开 , 每 个 染色 单 体 所 形成 的 子 染色 体 分 别 分 配 到 子 细胞 中 去 ,结果 形成 单 倍数 的 性 细胞 (图 1-2 和 1-3)。 总 之 ,在 减 数 分 裂 的 整个 过 程 中 , 同 源 染 色 体 之 间 要 发 生 联 会 .交换 、 分 离 , 非 同 源 染 色 体 之 间 要 发 生 自由 组 合 。 通 过 染色 体 的 规律 性 变化 ， 使 最 终 产生 的 四 个 子 细胞 内 染色 体 数目 只 有 母 细 胞 的 一 半 。 高 等 植物 花粉 形成 过 程 中 ,花药 内 的 某 些 细胞 分 化 成 小 孢子 母 细 胞 ,小 孢子 母 细胞 经 过 减 数 分 裂 形成 四 个 单 倍 的 小 孢子 ( 单 核 花粉 )。 在 适当 的 时 机 采集 植物 的 AES AEP) ,进行 固定 、 染色、 压 片 ,可 以 在 显微镜 下 观察 到 小 孢子 母 细胞 减 数 分 裂 的 过 程 和 染色 体 的 动态 变化 。 性 成 熟 的 动物 精 梨 中 ,不断 地 进行 着 减 数 分 裂 。 将 动物 精 巢 固定 、 染 色 、 压 片 后 ,在 显微镜 下 可 以 看 各 个 时 期 的 分 裂 相 。 注 意 有 丝 分 裂 与 减 数 分 裂 染 色 体 行为 的 不 同 (图 1-4)。 BS (2") 母 细胞 十 BAB “第 一 次 分 裂 ) 一 图 1-2 减 数 分 裂 的 细胞 行为 示意 图 (修改 自 http: //www. accessexcellence. org/AB/GG/mitosis2. html) i Ga ii a, ‘hr 遗传 学 实验 教程 减 数 分 裂 = | 第 次 减 数 a: 裂 第 次 减 数 分 裂 后 期 图 1-3 减 数 分 裂 的 染色 体 行为 示意 图 图 1-4 减 数 分裂 与 有 丝 分 裂 的 比较 (修改 自 http: //www. accessexcellence. org/AB/GG/mitosis2. html) 【材料 与 用 品 】 1. 材料 (Allium fistulosum) , # FO HK, 小麦 、 水 稻 (COryza sativa), fi He HB (Gossypium hirsutum) , ®a ff BE AiR HEC Catantops brachycerus ), ¥4 HE (Oxya chinensis) . 9 W. KE (Locusta migratoria manilensis) |, AXIGWKAAA Ae Sh i Sy SEAT BY (1) 植物 Te Ba 4K) TE ARR EB BE HD SR EER. AN TLD YAK 材 时 期 有 所 不 同 。 DKA ”春季 花序 嫩绿 饱满 ,总 区 光滑 时 可 以 取材 固定 。 2) &E 从 现 蕾 开 始 ,可 选取 1 一 2 mm 大 小 的 花蕾 或 一 小 段 花 序 进 行 固定 。 3) 玉米 在 抽雄 前 2 周 左右 (大 喇叭 口 期 ) ,用 手指 从 喇叭 口 处 向 下 挤 捏 叶 鞘 , 触 到 有 松软 感 处 , 即 是 雄花 序 的 所 在 部 位 。 在 该 处 用 刀片 纵向 划一 切口 , 胜 第 一 部 分 基础 性 实验 本 子 取出 花序 分 枝 。 此 时 雄花 序 先 端 小 穗 颖 长 4 mm 左右 ,花药 长 2 一 3 mm, 每 一 分 支 中 上 部 小 穗 发 育 最 早 。 4) 小 麦 ” 在 旗 叶 挑 出 后 , 旗 叶 与 下 一 叶片 的 叶 耳 距 约 2 一 3 cm 时 取材 较 好 。 但 不 同 品种 间 稍 有 差异 。 5) 水 稻 以 旗 叶 叶 耳 低 于 下 一 叶 叶 耳 5 一 6 cm 开始 减 数 分 裂 , 两 叶 叶 耳 重 用 (间距 为 0) 时 为 减 数 分 裂 感 期 。 早 稻 、 晚 稻 减 数 分 裂 开 始 的 时 间 稍 有 差异 ,一 般 颖 花 长 度 为 3 mm 时 开始 ,4 mm 时 为 盛 期 ,6 mm 时 减 数 分 裂 则 已 终止 。 6) 棉花 ”棉花 现 蕾 后 即 进入 减 数 分 裂 时 期 。 由 于 其 花序 分 节 着 生 , 因 此 党 按 花 蔓 的 长 度 取材 。 如 陆地 棉 ,一 般 在 三 角 苞 长 到 1 cm HAE SERS KS 个 花蕾 长 3 一 5 mm 时 取材 较 好 。 (2) 蝗虫 的 采集 夏 未 秋 初 野外 捕捉 蝗虫 ( 短 角 斑 腿 蝗 、 稻 蝗 、 东 亚 飞 蝗 、 土 蝗 或 负 蝗 ) 雄 性 成 体 。 直接 用 卡 诺 氏 固定 液 固定 3 一 24 h, 换 入 70%% 乙 醇 中 保存 。 2. 用 具 及 药品 Set RET BBE A ER RL ee ,酒精 灯 、 量 简 、 吸 水 纸 和 显 微 镜 等 。 卡 诺 氏 固定 液 . 酷 酸 洋 红 ( 或 改良 苯酚 品 红 ) 染 色 液 .无 水 乙醇 . 冰 酝 酸 、 甘 油 、 松 香 、. 中 性 树胶 或 油 派 胶 (Eupral) . 4 Be 45% BERS 【实验 步骤 】 1. 大 稚 花 药 涂 片 观察 (1) 取材 和 国定 将 花序 总 苞 剥 去 ,用 卡 诺 氏 固定 液 固定 ,固定 Sh HRA 70%% 乙 醇 中 。 如 果 要 保存 较 长 时 间 , 可 放 在 70%% 乙 醇 与 甘油 的 等 量 (体积 比 ) 溶 液 中 保存 。 (2) 染色 与 涂 片 取 花 序 用 蒸馏 水 冲洗 后 , 取 上 中、 下 部 各 2 个 花蕾 放 在 载 玻 片上 ,用 解剖 针 草 HEME HY 2 一 3 个 花药 集中 在 一 起 ,加 1 滴 染 色 液 在 花药 上 ,用 解剖 针 反 复 挤 压 花 药 ,使 花粉 母 细胞 进入 染色 液 中 ,用 锰 子 去 净 药 壁 残 酒 ,再 加 1 滴 染 色 液 染色 10 min 左右 。 较 大 的 花药 可 以 先 用 刀片 切 碎 ,然后 挤 压 出 花粉 母 细胞 。 (3) 压 片 及 镜 检 加 上 盖 片 ,上 面 附 吸 水 纸 , 用 拇指 适当 ,均匀 地 加 压 , 将 周围 的 染色 液 吸 干 ( 展 片 )。 先 在 低 倍 镜 下 寻找 分 裂 相 ,然后 换 高 倍 镜 仔细 观察 。 2. 蝗虫 精 梨 的 观察 (1) RAS FAR Fe EE a EBB ed Yb, FR El] — a 7) 4 LE dg) Be £82 ER Pete Ae. GRA. BRA RRR AER Pe 2 h 左右 ,之 后 再 WA 70%% 乙 醇 中 保存 。 °G@- 遗传 学 实验 教程 (2) 染色 和 压 片 吻 除 精 集 上 的 其 他 组 织 , 用 刍 子 夹 取 一 小 段 管状 精 管 放 到 载 玻 片 上 ,加 适量 染 色 液 ,染色 15 min 以 上 。 在 酒精 灯火 焰 上 过 2~3 次 ,加 盖 片 , 覆 以 吸水 纸 压 片 。 (3) 镜 检 显微镜 下 可 观察 到 减 数 分 裂 各 时 期 的 分 裂 相 以 及 精子 的 形成 过 程 。 染色 良好 的 、 分 裂 相 较 多 的 片子 也 可 制作 成 永久 标本 。 亚 内 置 一 短 玻 棒 , 倒 信 约 2/3 的 固定 液 。 将 选 好 的 片子 翻 过 来 (有 材料 的 面向 下 ) ,一 端 搭 在 玻 棒 上 ,在 固 定 液 中 浸泡 。 待 盖 片 自然 脱落 后 ,与 载 玻 片 一 起 轻 轻 移 人 95%% 乙 醇 二 无 水 乙 醇 -> 无 水 乙醇 -2 加 Eupral 1 滴 , 封 片 , 贴 上 标签 。 【实验 报告 】 1. 根据 自己 的 观察 , 绘 出 下 列 各 期 的 图 像 ,并 简 述 粗 线 期 . 终 变 期 .中 期 工 .后 期 工 .中 期 I、 后 期 下 的 特点 。 2， 显 微 镜 下 区 分 花粉 母 细胞 和 药 壁 细胞 ,说 明 其 特点 。 3. 观察 蝗虫 精 母 细 胞 的 减 数 分 裂 和 精子 的 形成 过 程 。 4. 要 得 到 很 好 的 实验 结果 ,取材 应 该 注意 什么 ? 5. 结合 观察 减 数 分 裂 过 程 中 染色 体形 态 结构 的 变化 , 简 述 减 数 分 裂 过 程 中 有 哪些 重要 的 遗传 学 事件 发 生 ? 6， 比 较 动 、 植 物 减 数 分 裂 的 差异 。 ( 郭 善 利 “ 周 国 利 ) 实验 2“ 果 蝇 的 观察 及 单 因 子 杂交 【实验 目的 】 1. 了 解 果 蝇 生活 史 各 个 阶段 的 形态 特征 ,掌握 果 蝇 雌 、 雄 成 虫 和 几 种 常见 突 变性 状 的 主要 区 别 方 法 。 2. 学 习 实验 果 蝇 的 饲养 管理 .实验 操作 、 培 养 基 的 配制 等 方法 。 3. 掌握 果 蝇 单 因子 的 杂交 方法 和 杂交 结果 的 统计 处 理 方法 ,理解 分 离 定律 的 原理 。 【实验 原理 】 5B is Se (Drosophila zzelazogaster) 为 双 翅 目 昆 虫 ,有 具 完全 变态 。 用 作 实 验 材料 的 优点 是 : O 容易 饲养 ,生活 周期 短 (20C 左 右 , 约 15 d 一 代 );G@) 繁殖 能 力 较 强 ,每 只 受精 的 雌 虫 约 可 产 卵 400~ 600 粒 , 因 此 在 短 时 间 内 可 获得 较 大 的 子 代 群体 ,有 利于 遗传 学 分 析 ;G) 突变 类 型 多 ,研究 得 较 清 楚 的 突变 已 达 400 多 个 , 且 第 一 部 分 基础 性 实验 “全 1 多 数 是 形态 特征 的 变异 ,便于 观察 ;由 唾 腺 染色 体 较 大 。 因 此 , 果 蝇 在 遗传 学 研究 中 得 到 广泛 应 用 ,积累 了 许多 典型 材料 。 按照 孟 德 尔 第 一 定律 , 即 分 离 定 律 , 基 因 是 一 个 独立 的 单位 。 基 因 完 整地 从 一 代 传递 到 下 一 代 , 由 该 基因 的 显 隐 性 决定 其 在 下 一 代 的 性 状 表 现 。 一 对 杂 合 状态 的 等 位 基因 (如 A/a) 保 持 相对 的 独立 性 ,在 减 数 分 裂 形成 配子 时 ,等 位 基因 (A/a) 随 同 源 染色 体 的 分 离 而 分 配 到 不 同 的 配子 中 去 。 理 论 上 配子 的 分 离 比 是 1 : 1, 即 产生 带 人 A 和 a 基 因 的 配子 数 相等 ,因此 ,等 位 基 P 长 翅 (十 十 ) XK RM (ve ve) 因 杂 合体 的 自 交 后 代表 现 为 基因 型 分 离 | Kk AA: Aa? aafe# 1:2: 1,00 RES F, KM (十 vg) 全 ,其 表 型 分 离 比 为 3 : 1, 这 就 是 分 离 定 | 自 交 FI 互 交 ) 律 的 基本 内 容 。 通 过 果 蝇 一 对 因子 的 杂 Fe 长 运 C1 十 十 ?十 vg) PR (ve ve) 37 ’ > ay : : 交 实 验 , 即 可 以 验证 它 ( 图 1-5)。 图 1-5 果 蝇 单 因子 杂交 图 【材料 与 用 品 】 ( 周 国 利 做 ) 1. 材料 饲养 的 野生 型 和 几 种 常见 突变 型 果 蝇 。 单 因子 杂交 实验 可 选用 黑 腹 果 蝇 的 长 翅 ( 野 生 型 ) 纯 合体 、 残 翅 ( 突 变型 ) 纯 合体 作为 实验 材料 。 2. 用 有 具 及 药品 (1) AA WL fe) A el Be BE BE i FRSA SR. 2 i OE 笔 、. 棉 塞 、 软 木 塞 或 橡胶 塞 ,恒温 培养 箱 (最 好 是 生化 培养 箱 )、 小 滴 瓶 . 载 片 、 盖 片 、 (2) 药品 Sls RE Ca D.C A 乙酸)\ 丙 酸 (或 茶 甲 酸 )、 玉 米粉 .酵母 粉 (或 鲜 酵 母 )。 【实验 步骤 】 1. 果 蝇 的 观察 C1) 生活 史 果 蝇 生活 史 ( 图 1- 6) 包 括 受精 卵 、 幼 虫 . 晴 ;成虫 四 个 发 育 阶 段 。 果 蝇 生 活 周 期 的 长 短 与 培养 温度 直接 相关 ,30C 以 上 引起 果 蝇 不 育 和 死亡 ,低温 则 使 其 生活 周期 延 长 ,如 10C 左 右 时 ,生活 周期 长 达 约 57 d。 条 蝇 生长 的 最 适 温度 为 20 一 25C。20C 左 图 1-6 且 蝇 的 生活 史 右 时 ,整个 生活 周期 约 需 15 d。 各 发 育 阶段 Cl ELBE FF» PAE 9/1992) = GRO'+ 遗传 学 实验 教程 所 需 时 间 如 下 : 36h 6d 6d 12h 幼虫 一 ~ 晴 A AR 24 ~ 48h 用 放大 镜 从 培养 瓶 外 观察 果 蝇 生活 史 的 四 个 时 期 ,并 掌握 各 阶段 的 特点 及 其 FE FR MBAS SC SEBS ANY LE SAY Td 1) 58 羽化 后 的 雌 蝇 一 般 在 12 h 后 交配 。 果 蝇 杂 交 时 必须 用 处 女 蝇 , 因 此 选择 处 女 蝇 的 时 间 是 在 羽化 后 12 h 以 内 (为 保证 实验 准确 可 靠 ,选择 处 女 蝇 时 ， 以 选择 羽化 后 8h 以 内 的 肉 蝇 为 好 )。 雌 蝇 交配 后 两 天 开始 产 卵 , 卵 的 长 度 约 为 0. 5 mim, 为 椭圆 形 ,腹面 稍 局 平 ,在 背面 的 前 端 有 一 对 触 丝 。 2) 幼虫 ”幼虫 从 卵 中 孵化 出 来 后 即 为 一 龄 幼虫 ,一 龄 幼虫 经 两 次 赔 皮 成 为 三 龄 幼虫 。 一 龄 幼虫 很 小 ,在 培养 基 中 不 易 看 见 。 三 龄 幼虫 较 大 , 常 朴 在 培养 基 表 面 或 培养 瓶 壁 上 。 三 龄 幼虫 体内 前 端 有 一 对 半 透 明 的 唾 腺 ,就 是 做 唾 腺 染色 体 的 实验 材料 。 三 龄 幼虫 的 活动 力 强 而 贪 食 ,在 怜 过 的 培养 基 上 留 下 一 道 海 ,者 整个 培 养 基 被 幼虫 外 出 多 而 深 的 沟 ,表明 幼虫 生长 良好 。 3) 师 幼虫 生活 6 ~7 d 后 即 化 晴 , 化 晴 一 般 在 瓶 壁 上 , 呈 梭 形 , 起 初 颜色 淡 黄 , 以 后 逐 半 硬化 上 且 变 为 深 褐 色 , 深 褐 色 的 晴 就 是 即将 羽化 的 了 。 4) 成 虫 “” 刚 羽化 出 来 的 果 蝇 , 虫 体 较 长 , 翅 未 完全 展开 , 体 表 自 嫩 ; 以 后 会 逐步 几 丁 质 化 ,颜色 逐步 变 深 。 (2) 麻醉 果 蝇 1) 制备 麻醉 频 ”用 干净 培养 瓶 或 与 培养 瓶 口径 相同 的 玻璃 瓶 并 配备 相应 的 软 木 塞 或 橡胶 塞 ,在 软木 塞 的 下 面 钉 一 铁 钉 ,在 铁 杀 上 缠 一 小 团 棉花 。 或 可 在 软木 蹇 上 打 一 小 孔 , 塞 上 一 折 重 的 吸水 纸 。 或 可 在 橡胶 塞 上 划一 切口 , 夹 住 一 折 礁 的 吸水 纸 。 2) 引出 果 蝇 ”将 有 果 蝇 的 培养 瓶 用 手轻 拍 , 使 果 蝇 震 落 瓶 底 , 迅 速 拔 去 棉 塞 ,将 膝 醇 瓶 与 培养 瓶 的 两 口 相对 ,培养 瓶 在 下 、 麻 醇 瓶 在 上 并 朝向 灯光 处 ,双手 中 住 培 养 瓶 , 利 用 果 蝇 的 趋 光 性 和 向 上 性 ,将 果 蝇 引入 厅 醇 瓶 。 3) 有 麻醉。 FERRULE ERE KARE 滴 加 1 一 2 滴 乙 醚 或 氯仿 ,迅速 塞 人 麻醉 瓶 口 ， 0.5~1 min 左 右 大 部 分 果 蝇 即 被 及 醉 落 入 瓶 底 , 摇 动 麻醉 瓶 , 全 部 果 蝇 震 落 瓶 底 , 之 后 立即 将 果 蝇 倒 在 白 瓷 板 或 玻璃 板 上 ,用 毛笔 小 心 拨 动 观察 。 如 果 用 于 杂交 ,翅膀 外 展 的 果 蝇 不 能 使 用 。 (3) FEAR BE HEAR AS HR TE WT EE SHEA AR PE Fal) , ERR AS 3 FP 选择 处 女 蝇 的 关键 。 较 老化 的 雌雄 成 晶 区 别 很 交配 图 1-7 雌 、 雄 果 蝇 背 面 观 ( 引 自 梁 彦 生 等 ”1989) 第 一 部 分 基础 性 实验 - ll. 明显 ,可 以 用 放大 镜 、 解 剖 镜 或 肉眼 直接 观察 。 刚 刚 羽化 出 来 的 果 蝇 不 易 区 别 , 可 在 体 视 显微镜 下 观察 区 分 。 雌 、 雄 成 蝇 的 鉴别 特征 如 图 1- 7 一 1-9 和 表 1-1。 图 1-8 雌 、 雄 果 蝇 腹部 腹面 观 图 1-9 雄 果 蝇 右前 足 上 的 性 梳 ( 引 自 梁 彦 生 等 “1989) GIB REAS 1989) Fe 1-1 果 蝇 成 虫 .雌雄 特征 比较 表 雌 果 蝇 ME 果 aR K 小 Ore 未 端 尖 末端 印 腹部 背面 : 环 纹 5 节 , 无 黑 斑 背面 : 环 纹 7 节 、 延 续 到 末端 呈 黑 斑 腹面 : 腹 片 7 节 腹面 : 腹 片 5 节 第 一 对 足 PA ERB ACE Bit SA BE RERE BE (4) 果 晶 常见 突变 类 型 的 观察 野生 型 果 蝇 为 灰 体 ,长 翅 、 红 眼 、 直 刚毛 ,常见 的 突变 性 状 见 表 1- 2。 表 1-2 果 蝇 常见 突变 类 型 突变 名 称 基因 符号 性 状 特 征 在 染色 体 上 座位 HER (white) w 复眼 白色 X1.5 棒 眼 (bar) B 复眼 横 条 形 , 小 眼 数 少 X57. 0 黑 檀 体 (ebony) e 身体 成 乌木 色 , 黑 亮 II R70. 7 SAK (black) b 体 黑 色 , 比 黑 檀 体 深 II L48. 5 #4 1K (yellow) y 4a Be X0. 0 5K (vestigial) vg 30 BA GR (LPB A. AN BE K II R67. 0 FE E (singed) sn3 刚毛 卷曲 如 烧 焦 状 X21. 0 《5) 果 蝇 原 种 保存 为 了 保证 果 蝇 杂交 试验 材料 的 充分 供应 , 必须 保存 一 定数 量 和 种 类 的 果 蝇 1) 原 种 要 纯 。 每 次 转移 培养 基 都 要 严格 检查 有 无 混杂 ,如 发 现 同 一 原 种 群体 - i. 遗传 学 实验 教程 内 有 其 他 类 型 ,应 立即 丢 奔 ,以 保证 群体 的 纯度 。 2) 每 隔 2 一 3 周 换 一 次 新 鲜 的 培养 基 , 每 瓶 4 一 8 对 ,每 一 原 种 至 少 保留 两 套 ， 并 注 明 类 型 和 转移 日 期 。 3) 平时 保存 可 放 在 生化 培养 箱 内 或 恒温 培养 箱 内 ,温度 调 至 15 一 18 人 CC 。 扩 大 培养 和 实验 时 将 温度 调 至 20 一 25C ,以 便 加 快 生 长 繁殖 。 夏 季 高 温 时 ,最 好 用 可 制冷 的 生化 培养 箱 保 存 原 种 。 (6) 果 晶 培养 基 的 配制 实验 室内 最 常用 的 是 玉米 - 糖 - 琼 脂 培养 基 ( 表 1- 3)。 表 1-3， 果 蝇 培 养 基 成 分 表 Ac 水 /ml 琼脂 /g 蔗糖 (或 白 砂 糖 )/g 玉米 粉 /g “两 酸 /ml 酵母 粉 (或 鲜 酵 母 )/g ® 80 1.5 13 10 0.5 0.5 @ 100 1 10 10 0.9 0.5 配方 中 可 用 于 培养 条 交 果 蝇 , 因 培养 基 较 干 稠 ,可 避免 黏着 果 蝇 。 配 方 @ 可 用 “于 原 种 保存 , 因 培 养 基 较 稀 ,可 延长 培养 时 间 。 两 种 培养 基 也 可 都 用 葵 甲 酸 而 不 用 Am. 1) 按 配 方 称 量 好 各 种 成 分 。 2) 用 2/3 的 水 把 琼脂 调匀 ,加 热 熔化 ,再 把 蔗糖 (或 白 砂 糖 ) 加 入 溶解 ,用 剩余 的 1/3 水 把 玉米 粉 调 成 糊 状 , 倒 人 上 液 中 ,不 断 搅 拌 ,继续 煮沸 至 黏稠 均匀 为 止 ,最 后 倒 人 两 酸 搅 勾 后 ,将 培养 基 倒 入 干净 的 培养 瓶 ( 可 用 小 广 口 瓶 . 三 角 瓶 ` 粗 试管 .牛奶 瓶 等 ) ,培养 基 厚度 以 1. 5 一 2 cm 为 宜 ,最 后 用 纱布 包扎 的 棉 塞 塞 好 瓶 口 ,冷却 凝固 。 3) 用 前 1 一 2 d, 在 培养 基 表 面 撒 少 量 干 酵母 粉 ,或 用 玻璃 棒 接 种 鲜 酵 母 悬 液 ， 25C 左 右 培养 2 d, 使 培养 基 发 酵 , 另 将 一 张 无 菌 的 折 和 县 滤纸 片 放 人 瓶 内 ,以 利 果 蝇 FP" ON AER 2.， 果 蝇 的 单 因子 杂交 实验 (1) 选择 处 女 晶 将 长 翅 果 蝇 和 残 翅 果 蝇 培 养 瓶 内 已 羽化 的 成 蝇 全 部 杀 死 ,此 后 凡 羽 化 后 未 超 过 8h 的 雌 蝇 即 是 处 女 蝇 。 例 如 ,可 于 6:00 处 死 已 羽化 成 蝇 ,14:00 采集 第 一 次 处 CM 22:00 第 二 次 采集 ,次 日 6:00 和 采集 第 三 次 。 (2) 杂交 正 交 : KDR S X PE RHAS ; 反 交 : RRM PS XRD. 瓶 , 每 瓶 新 培养 基 中 各 移 人 3 一 5 OR. ME EBA ARICA A ARIS ARE 验 者 姓名 。 (3) 移 去 亲本 7 一 8 d 后 移 去 亲本 。 第 一 部 分 基础 性 实验 » iB (4) WEF, 4~5 dJa Fi 成 虫 出 现 ,观察 其 翅膀 形态 后 处 死 。 连 续 观 察 记录 3 d, 各 自 记录 正 \ 反 交 ( 表 iT 4) ° 表 1-4 KF 、 孔 观察 结果 记录 表 IE 反 x 观察 结果 统计 日 期 二 下 二 FE ti etee | the Ta 2 er es aoe 长 翅 数 FRA 长 翅 数 残 翅 数 月 日 rey (5) Fi ZR 在 新 培养 瓶 内 ,每 瓶 各 放 入 3~5 OF, 果 晶 (无 需 处 女 蝇 ) ,培养 。 (6) HH F, 7~8 d Ja BHA Fi BUG. PR ER BSE LA aE PE (7) 观察 F。 4~5d 后 ,FE; 成 蝇 出 现 , 观 察 翅 膀 形态 后 处 死 , 隔 天 记录 一 次 ,连续 观察 统计 4 次 正 \ 反 交 的 结果 并 记录 ( 表 1- 4)。 (8) 数据 处 理 及 闪 测验 式 中 ,O 是 观察 值 , 正 是 预期 值 。 Ey’ 值 和 自由 度 (df = 1) , AR.APSSYK, 说 明 观 察 值 与 理论 值 相符 合 , 也 就 是 说 ,可 以 认为 观察 值 是 符合 分 离 定 律 的 ( 表 1-5)。 表 1-5 LF 测 验 结果 统计 表 ( 正 反 交合 并 统计 ) Kk 翅 残 翅 mp it 观察 值 (O) 预期 值 CE)(3 : 1) (O—E)?/E 【实验 报告 】 1. 如 何 区 分 果 蝇 成 蝇 的 峻 、 雄 个 体 ? 2. 统计 分 析 果 蝇 单 因子 实验 结果 ,并 用 X 太 测验 验证 实验 结果 是 否 与 分 离 定 律 相符 。 3. 有 果 蝇 杂交 时 ,为 什么 要 选择 处 女 蝇 ? 4. 在 做 杂交 时 会 出 现 表 型 分 离 比 不 符合 3: 1 的 比例 ,为 什么 ? 5. 有 果 蝇 及 醉 时 的 注意 事项 有 哪些 ? 。14。 遗传 学 实验 教程 6. 在 进行 亲本 杂交 和 Ri 自 交 后 一 定时 间 为 什么 要 倒 去 杂交 亲本 ? 7. 根据 你 的 实验 结果 记录 ,对 所 做 杂交 过 程 作 一 遗传 分 析 , 对 所 研究 的 性 状 及 基因 可 得 出 哪些 结论 ?〈 提 示 : 首先 判断 是 染色 体 遗 传 还 是 核 外 遗传 ,再 判定 是 否 是 伴 性 遗传 ,然后 确定 是 显 性 还 是 隐 性 遗传 ) 〈 姚 志 刚 ) 实验 3 条 晶 的 伴 性 遗传 【实验 目的 】 1 了解 伴 性 基因 、 非 伴 性 基因 在 遗传 方式 上 的 区 别 , 验 证 并 加 深 理解 伴 性 遗 传 规律 。 2 观察 伴 性 性 状 在 正 \ 反 交 时 后 代表 现 的 差别 。 【实验 原理 】 位 于 性 染色 体 上 的 基因 叫做 伴 性 基因 ,其 遗传 方式 与 位 于 常 染 色 体 上 的 基因 有 一 定 差别 , 它 在 末代 与 子 代 之 间 的 传递 方式 与 雌雄 性 别 有 关 。 伴 性 基因 的 这 种 遗传 方式 就 称 为 伴 性 遗传 。 果 蝇 的 性 别 决定 类 型 是 XY 型 ,具有 X 和 YY 两 种 性 染色 体 , 雌 性 是 XX, 为 同 配 性 别 ; 雄 性 是 XY ,为 异 配 性 别 。 伴 性 基因 主要 位 于 和 染色 体 上 ,而 工 染 色 体 上 基本 没有 相应 的 等 位 基因 。 所 以 这 类 遗传 也 叫 X 连锁 遗传 。 控制 果 蝇 红眼 和 白眼 性 状 的 基因 位 于 染色体 上 ,在 立 染 色 体 上 没有 相应 的 等 位 基因 ,它们 随 着 又 染色 体 而 传 给 下 一 代 。 如 以 纯 合 红眼 峻 蝇 和 纯 合 白眼 雄 蝇 和 杂交, 子 代 均 为 红眼 ,F; 中 雌 蝇 均 为 红眼 , 雄 蝇 中 半数 为 红眼 ,半数 为 白眼 。 以 纯 合 白眼 峻 蝇 与 纯 合 红眼 雄 蝇 杂交 ,Fi 雌 蝇 均 为 红眼 , 雄 蝇 均 为 白眼 ,Fz 中 无 论 峻 蝇 和 雄 蝇 均 有 半数 为 红眼 ,半数 为 白眼 (图 1 - 10)。 正 反 交 结 果 不 同 ,这 是 伴 性 遗传 的 典型 特点 。 A: 野生 型 ?x 突变 型 cz B: 突变 型 9 X 野生 型 cy Pan * x*y OK XY’ FL xx’ x'y | Lexx" | |@ 1@ Be o {KE 离心 固定 一 一 一 一 一 一 一 a ————— 固定 液 2 ml MRK 6 ~ 7 mi, 1 000 r/min ? : een do FARE: 冰 栈 酸 37° CALF 15 min 离心 5 min 4:1 AAI 15 min 离心 固定 离心 fal Fe psi ' (同上 ) 4 空 固定 液 mi, te ge 甲醇 : 冰 栈 酸 火焰 干燥 3:1 处 理 15 min ps 20 min BERRY Aj 1-17 oot ia a, a ana Ne ( 引 自 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 1987) or 遗传 学 实验 教程 8. 固定 (1) 预 固定 在 低 渗 的 同时 ,可 加 以 1 一 2 ml 固定 液 进行 预 固定 ,以 防止 离心 时 细胞 结 团 。 (2) Bes 1000 r/min,5 min, ## FPR. WEA. (3) 固定 固定 液 为 甲醇 : OKRA =3:° 1. BRED MAR ER 2~4 ml, FA 用 滴 管 轻 轻 冲 打 成 细 胞 悬 液 ,在 室温 中 固定 15 min 后 ,离心 , 吸 去 上 清 液 , 留 下 白 细胞 。 (4) 再 固定 加 入 固定 液 2 ml, 用 吸管 轻 轻 打 散 , 室 温 下 继续 固定 15 min, 离心 ,除去 上 清 液 , 留 下 白细胞 。 (5) 第 三 次 国定、 离心 操作 同上 。 9. 滴 片 向 上 述 离心 管 中 滴 人 固定 液 0. 5 ml, 用 滴 管 小 心 冲 打 成 悬 液 , 从 冰箱 的 冰 格 中 或 冰 水 中 取出 载 玻 片 , 每 片 滴 加 细胞 悬 液 1 一 3 滴 , 用 嘴 轻 轻 吹 散 , 用 电 吹 风 吹 于 ,或 自然 干燥 备用 。 10. 镜 检 FAR YK (pH 7. 4) 稀 释 后 的 吉姆 萨 染色 液 扣 染 20 min, 然后 倒 去 染 液 ， 用 蒸馏水 轻 轻 冲洗 。 待 稍 干 后 ,在 显微镜 下 检查 。 先 在 低 售 饥 下 寻找 良好 的 分 裂 . 相 , 然 后 用 油 镜 观 察 ( 图 1- 17)。 【注意 事项 】 1. 接种 的 血样 愈 新 鲜 愈 好 ,最 好 是 在 采血 后 24 h 内 进行 培养 。 如 果 不 能 立 刻 培养 ,应 置 于 4C 存 放 , 避 免 保存 时 间 过 久 ,会 影响 细胞 的 活力 。 2. 培养 中 成 败 的 关键 ,除了 至 为 重要 的 PHA 的 效 价 外 ,培养 的 温度 和 培养 液 的 酸碱度 也 十 分 重要 。 人 的 外 周 血 淋巴 细胞 培养 最 适 温度 为 37 士 0. 5C。 培 养 液 的 最 适 pH 为 7. 2 一 7. 4。 3. 培养 过 程 中 如 发 现 血 样 凝集 ,可 将 培养 瓶 轻 轻 振荡 ,使 凝 块 散 开 , 继 续 放 回 37C 恒 温 箱 内 培养 。 4. 制 片 过 程 中 如 发 现 细胞 膨胀 得 不 大 ,细胞 膜 没 有 破裂 ,染色 体 聚 集 一 团 伸 展 不 开 , 可 将 固定 时 间 延 长 数 小 时 或 过 夜 。 5. 用 两 栖 类 动物 淋巴 细胞 培养 时 ,培养 基 除 RPMI 1640 外 ,还 应 补充 一 定量 的 水 解 乳 和 蛋白 ,培养 基 的 pH 为 7. 0 一 7. 2,55 FR IEA 26°C 。 第 一 部 分 基础 性 实验 = 33 « 【实验 报告 】 1, 培养 基 中 各 种 成 分 的 作用 如 何 ? 2. 总 结 一 下 微量 全 血 培 养 过 程 的 要 点 ,有 哪些 方面 需要 特别 注意 ? 3. 在 低 倍 和 中 倍 镜 下 ,观察 制 片 中 分 裂 相 的 多 少 和 染色 体制 片 的 质量 , 寻 找 分 散 适 宜 .不 重 亚 收缩 适中 染色体 不 过 度 分 开 、 形 态 清晰 的 分 裂 相 。 然 后 在 油 镜 下 仔细 观察 染色 体 的 数目 和 形态 。 注 意 区 分 观察 男性 和 女性 的 正常 染 色 体 制 片 。 选 择 一 有 代表 性 分 裂 相 进行 显 微 摄 影 以 供 做 核 型 等 进一步 的 分 析 。 (5 A) 实验 9 植物 姊妹 染色 单 体 区 分 染色 法 【实验 目的 】 学 习 植 物 姊妹 染色 单 体 区 分 染色 的 原理 ,探索 Feulgen 法 染色 技术 ,观察 植物 ”细胞 染色 单 体 。 【实验 原理 】 姊妹 染色 单 体 区 分 染色 法 (sister chromatid differential staining，SCD) 是 20 世纪 70 年 代 中 期 发 展 起 来 的 一 种 染色 处 理 技 术 。 通 过 这 种 技术 ,可 以 在 光学 显 微 镜 下 清晰 地 区 分 DNA 复制 后 的 染色 单 体 。 植 物 根 尖 分 生 组 织 是 细胞 旺盛 分 裂 的 部 位 ,在 细胞 分 裂 间 期 DNA 复制 过 程 中 , 碱 基 类 似 物 5 -省 脱氧 尿 喀 啶 (5 - Bromodeoxy uridine , BrdU) 或 5 — fi Abi a be WR RE (5 - Iodo - 2 - deoxy uridine, IdU) 可 以 代替 胸腺 喀 喧 (Thymidine，T) 挫 人 新 合成 的 DNA 链 中 。 在 适当 浓度 5 -省 脱氧 尿 喀 啶 中 培养 的 植物 根 尖 , 经 过 两 个 细胞 分 裂 周 期 后 ,一 条 染色 体 的 两 条 染色 单 体 的 DNA 双 链 在 化 学 组 成 上 出 现 了 差别 : 其 中 一 条 染色 单 体 的 两 条 DNA 单 链 中 的 工 位 均 由 5 -省 脱氧 尿 喀 啶 所 代替 ( 称 为 BB 染色 单 体 ) ;而 另 一 条 染色 单 体 的 两 条 DNA 双 链 中 的 一 条 单 链 含 5 -省 脱氧 尿 喀 啶 核 苷 , 另 一 条 单 链 (原始 母 链 ) 则 不 含 5 -省 脱氧 尿 喀 啶 核 苷 ( 称 为 BT 染色 单 体 )。 用 改良 的 BrdU - Feulgen 法 染色 时 ,采用 的 盐酸 浓度 大 ,又 加 长 了 酸 解 的 时 间 ,在 这 样 的 条 件 下 ,两 条 染色 单 体 对 酸 解 的 反应 出 现 了 差异 。BB 染色 单 体 比 BT 单 体 耐 水 解 , 当 用 席 夫 试剂 染色 时 ,BB 单 体 呈 深 色 ,BT 单 体 呈 浅 色 ,从 而 形成 鲜明 MHL. 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 恰 豆 ,也 可 选择 详 痪 或 大 蒜 。 . 34 . 遗传 学 实验 教程 2. 用 具 及 药品 (1) 用 具 水 浴 锅 、 显 微 镜 、 载 玻 片 、 盖 玻 片 .吸水 纸 、 解 剖 针 。 (2) 试剂 1) 500 pmol/L 5 - 溴 尿 喀 啶 15. 4 mg 5 - 溴 尿 喀 啶 定 容 于 100 ml WHE 7K 中 , 避 光 (棕色 瓶 盛 放 , 外 加 包 黑 纸 ) 保 存 于 4C 冰 箱 中 。 2) 0. 05 % BK7K AA HR OL AR 7K Bic till) 45 % DK RAR 3) 3.5 mol/L HCl 比重 1.18 g/ml 盐酸 288. 8 ml, 加 蒸馏 水 定 容 至 1 000 ml。 或 根据 公式 算出 : 所 需 液 体 的 体积 (ml) = 一 4) 改良 席 夫 试剂 ”0. 5 g 碱 性 品 红 加 入 100 ml 沸水 中 ,继续 煮沸 5 min, 并 不 断 搅拌 ,使 之 溶解 ,冷却 至 50C 时 过 滤 至 棕色 瓶 中 ,加 1 mol/L HCl 30 ml, 冷却 到 25C 时 再 加 偏重 亚硫酸钠 3 g, 塞 紧 瓶 口 ,充分 振 划 , 包 上 黑 纸 贮 存 于 冷 凉 处 。 此 液 最 好 在 2 INS» RAAF. 【实验 步骤 】 1. 水 培根 尖 将 蚕豆 种 子 埋 人 潮湿 的 木屑 中 , 待 初生 根 长 至 3 一 5 cm 时 , 剪 去 根 尖 生 长 点 和 胚芽 端 ,促使 侧根 生长 。 然 后 将 乍 豆 换 用 青霉素 小 瓶 水 培 , 培 养 温度 为 25 人 CC 左右 。 MEARE AK or ABB HICH SR. 于 小 烧杯 中 水 培 至 根 尖 长 Ss 2. BA 5 RR ME 将 培养 的 根 尖 材 料 移 至 500 pmol/L 5 -省 尿 喀 啶 溶液 中 ,继续 严格 地 避 光 培 养 34 一 36 h, 此 时 分 裂 细 胞 经 过 了 两 个 DNA 复制 期 , 5 -省 尿 喀 啶 挫 人 到 了 DNA 中 。 3. 预 处 理 剪 取 根 尖 , 浸 人 0. 05% 秋 水 仙 碱 溶液 中 3. 5 一 4 h。 4. 国定 将 根 在 清水 中 冲洗 5 min, 移 人 卡 诺 氏 固定 液 中 固定 2 一 3 h。 5. 染色 一 一 改良 的 孕 尔 根 染 色 法 (1) 水 解 严格 的 40°C (恒温 水 浴 ) 条 件 下 ,用 3. 5 mol/L HCl 水解 40 一 55 min, (2) 染色 从 40 min 起 每 隔 5 min 取 部 分 根 尖 , 放 人 改良 的 席 夫 试剂 中 染色 ,直至 根 尖 第 一 部 分 基础 性 实验 - 35 。 呈现 深 紫 红色 ( 约 45 min WE). 6. 压 片 观察 材料 染色 后 ,可 不 经 漂洗 直接 压 片 观察 。 将 染色 后 的 根 尖 放 在 干净 的 载 玻 片 上 ,用 吸水 纸 吸 去 外 面 附着 的 席 夫 试剂 , 切 去 根 尖 伸 长 区 (未 着 色 部 分 )， 用 狠 子 和 解剖 针 将 根 尖 捣 碎 拨 散 (或 用 另 一 载 片 将 材料 夹 散 ) ,加 一 小 滴 45 妨 醋酸 (注意 加 45%% 醋 酸 不 宜 太 多 ,否则 压 片 时 材料 易 随 醋酸 液 逸 出 玻 片 外 )， mhmh ,以 左手 食指 和 中 指 压 住 盖 玻 片 边缘 ,防止 盖 片 错 动 ,右手 持 解剖 针 以 针尖 轻 轻 贡 击 盖 玻 片 , 赶 去 盖 片 下 的 小 气泡 ,同时 使 材料 均匀 分 散 。 然 后 ， 履 两 层 吸水 纸 ,以 用 铅笔 的 平头 端 敲 击 ,使 细胞 进一步 分 散 铺展 ,染色 体 分 散 开 。 显 微 镜 下 观察 。 【注意 事项 】 选择 染色 体 分 散 开 的 离散 细胞 进行 观察 ,在 高 倍 镜 下 即 能 看 清 姊妹 染色 单 体 间 呈 现 的 浓淡 差别 。 部 分 染色 体 上 出 现 自发 的 姊妹 染色 单 体 互 换 , 凡 在 染色 单 体 端 部 出 现 的 互 换 计 为 一 个 SCE, 在 中 部 出 现 的 互 换 计 为 两 个 SCE。 1. BrdU HBA SCD 的 重要 基础 。 由 于 植物 种 子 萌发 过 程 中 自身 合 成 的 胸 苷 与 外 来 的 BrdU 发 生 竞争 性 矛盾 ,所 以 若 处 理 不 当 往 往 会 造成 挫 人 不 进 ， 导致 试验 失败 。 因 此 ,要 注意 选择 饱满 ,发 芽 势 强 的 蚕豆 种 子 。 并 要 注意 抓 住 挫 人 的 时 机 ,一 定 要 在 大 多 数 侧根 长 0. 5 一 1. 5 cm 时 开始 挫 人 ,因为 此 时 侧根 和 幼 芽 的 生长 是 最 旺盛 时 期 , BrdU BABA. 2. 温 稀 酸 的 延长 水 解 是 本 实验 的 关键 步骤 ,水 解 的 温度 和 时 间 要 由 专人 管 理 , 严 格 控制 ,温差 不 能 超过 十 0. 5C 。 通 常 较 明 显 的 区 分 染色 效果 出 现在 水 解 45~50 min 处 理 中 。 水 解 处 理 后 不 必用 水 洗 , 可 直接 转 人 席 夫 试剂 染色 。 3. 本 实验 所 采用 的 席 夫 试剂 配方 , 比 常 规 加 大 了 偏重 亚硫酸钠 和 盐酸 的 用 量 ,这 样 有 助 于 加 强 区 分 染色 的 对 比 反 差 。 如 果 镜 检 感 觉 颜 色 仍 较 淡 ,还 可 用 本 酸 -乳酸 -地 衣 红 复 染 ,增强 染色 效果 。 4. 如 果 仅 进行 临时 封 片 镜 检 时 ,可 在 45%% 醋 酸 中 加 入 5%% 的 甘油 ,能 减缓 片 中 的 水 分 干燥 。 对 于 染色 效果 特别 好 的 玻 片 标本 ,可 用 冰冻 法 脱 去 盖 片 ,再 以 中 性 树胶 封 固 制 成 永久 片 。 【实验 报告 】 1. 绘制 在 含有 BrdU 的 培养 液 中 连续 生长 2 个 以 上 周期 的 细胞 分 裂 期 相 ,并 绘制 其 模式 图 。 2. 计算 SCE 的 频率 。 观 察 时 以 一 个 染色 体 的 染色 单 体 为 依据 ,每 一 个 深 染 区 界面 为 一 次 交换 。 中 部 出 现 的 互 换 计 为 两 个 SCE, 端 部 出 现 互 换 为 一 个 SCE， 着 丝 点 的 互 换 单独 计算 。 3. 本 实验 的 材料 挫 和 人 BrdU 时 为 什么 要 在 全 黑 的 条 件 下 培养 ? - 36 ° 遗传 学 实验 教程 4 用 大 蒜 、 洋 葱 作 试验 材料 ,试验 结果 与 大 豆 有 何 区 别 ? 为 什么 ? (SRA) 实验 10 ”染色 体 组 型 分 析 【实验 目的 】 学 习 和 掌握 植物 染色 体 组 型 分 析 的 方法 ,了 解 染 色 体 组 型 分 析 的 意义 ,为 进行 “ 细胞 遗传 学 和 遗传 育种 学 的 研究 商定 基础 。 【实验 原理 】 | | 各 种 生物 染色 体 的 形态 结构 和 数目 都 是 恒定 的 。 大 多 数 高 等 动 植物 是 二 倍 体 (diploid) 。 一 个 二 倍 体 生物 中 配子 所 含有 的 全 套 染 色 体 , 称 为 二 个 染色 体 组 (genome) 。 而 染色 体 组 在 细胞 分 裂 中 期 的 表 型 称 为 染色 体 组 型 或 称 核 型 (karyo- type) ,包括 染色 体 数 目 ( 即 基数 ) .形态 大小、 着 丝 点 位 置 及 副 弱 痕 、 随 体 的 有 无 等 特征 。 染色 体 组 型 分 析 就 是 通过 对 染色 体 标 本 和 其 照片 进行 测量 对 比分 析 \` 配 对 、 分 组 排列 ,对 组 内 各 染色 体 的 形态 进行 测量 .描述 ,从 而 阐明 生物 染色 体 组 成 的 过 ” 程 。 它 在 细胞 遗传 学 、 现 代 分 类 学 .生物 进化 以 及 遗传 育种 学 等 研究 中 ,是 十 分 重 要 的 研究 手段 。 进行 染色 体 组 型 分 析 可 以 利用 体 细 胞 有 丝 分 裂 中 期 的 染色 体 ,也 可 以 利用 性 “ 母 细胞 减 数 分 裂 期 的 染色 体 。 以 利用 前 者 的 较 多 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 大 麦 ( 2” = 14 )、 黑 麦 ( 2n = 14 ) .玉米 (2 = 20)、 圆 葱 (22 = 16) BS (2m =8,) 。 2. 用 具 及 药品 (1) 用 具 显微镜 、 显 微 照相 和 冲洗 放大 的 全 套 设备 ,目镜 测 微 尺 . 镜 台 测 微 尺 .计算 器 、 EWA BIT) PEFR .圆规 .铅笔 .坐标 纸 、 绘 图 纸 .胶水 以 及 制作 染色 体 玻 片 标本 所 需要 的 其 他 用 品 。 (2) 药品 暗室 冲印 扩 所 需 药 品 。 【实验 步骤 】 L. 有丝分裂 时 期 的 染色 体 组 型 分 析 第 一 部 分 基础 性 实验 - 37 + (1) 制作 染色 体 玻 片 标本 利用 有 丝 分 裂 中 的 染色 体 进行 组 型 分 析 , 通 常 是 采用 根 尖 细胞 有 丝 分 裂 中 期 的 染色 体 。 因 为 这 一 时 期 的 染色 体 具 有 明显 的 形态 特征 ,便于 进行 分 析 。 获 得 有 丝 分 裂 中 期 染色 体 玻 片 标本 的 方法 ,可 参照 实验 1 进行 。 (2) 选材 与 显 微 摄影 当 染 色 体 玻 片 标 本 制 好 后 ， 于 显微镜 下 选 出 10 个 中 期 分 裂 相 中 染色 体 数目 完 整 、 分 散 良 好 、 无 重 至 、 各 条 染色 体 处 于 同一 平面 ,并 且 着 色 鲜 明 ,形态 清晰 着 丝 粒 明显 (如 果 染 色 体 带 有 随 体 ) , 随 体 能 明显 可 见 的 细胞 ， 进行 显 微 照相 。 取 清 楚 的 底 片 放大 成 8 cmX10 cm 左右 的 照片 。 (3) Me 测量 每 条 染色 体 的 总 长 度 及 长 臂 长 度 和 短 臂 长 度 。 可 采用 两 种 方式 ; 一 是 利 用 显微镜 和 测 微 太 对 染色 体制 片 标本 进行 直接 测量 ,但 事先 要 用 台 微 尺 对 目 微 斥 的 单位 长 度 进 行 标定 , 且 仅 对 染色 体 长 度 较 大 的 标本 适合 。 二 是 对 放大 后 的 照片 进行 测量 , 先 在 每 条 染色 体 旁 边 用 笔 作 临时 标记 , 随 测量 随 记 录 ,包括 每 条 染色 体 的 绝对 长 度 ,长 臂 长 度 \ 短 臂 长 度 . 随 体 有 无 等 ;对 于 有 随 体 的 染色 体 , 随 体 的 长 度 可 以 记 和 信也 可 不 记 和 染色体 长 度 之 内 ,但 应 注 明 。 对 于 每 条 染色 体 的 着 丝 粒 应 平 分 为 二 , 记 人 两 臂 长 度 之 内 。 如 果 染 色 体 弯 曲 不 能 用 直 尺 测量 时 ,可 以 先 用 细 线 量 取 与 染色 体 等 长 的 长 度 , 再 用 尺子 量 出 线 的 相应 长 度 。 通 常 在 显微镜 下 测量 以 Am 为 单位 ,在 照片 上 测量 以 mm 为 单位 。 (4) 计算 根据 测量 结果 ,计算 出 每 条 染色 体 的 相对 长 度 . 臂 比 和 着 丝 粒 指数 。 ce 某 染 色 体 的 长 度 相对 长 度 一 薪 色 体 组 内 全 部 染 分 体 六 长 度 义 100 长 臂 长 度 (9) eK EECp) A 2 eB 元 国生 卫生 xi (5) 配对 根据 测量 数据 ,比较 染色 体 的 形状 大小、 相对 长 度 . 臂 比 、. 着 丝 粒 指数 、 副 弱 痕 的 有 无 及 位 置 、 随 体 的 有 无 等 特征 ,对 照片 上 的 染色 体 进 行 粗 剪 (即将 各 个 染色 体 ” 分 别 剪 下 ) 和 同 源 染 色 体 的 配对 。 (6) 排列 将 配对 的 染色 体 按 由 大 到 小 的 顺序 进行 排列 并 编号 。 对 于 等 长 的 染色 体 , 以 ` 短 臂 长 的 在 前 ;有 特殊 标记 (如 随 体 ) 的 染色 体 及 性 染色 体 排 在 最 后 。 排 列 时 ,把 各 *, 38)» 遗传 学 实验 教程 对 染色 体 的 着 丝 粒 排 在 一 条 直线 上 , 短 臂 在 上 ,长 臂 在 下 。 (7) 分 类 根据 臂 比 值 确定 各 染色 体 着 丝 粒 位 置 ,进而 依照 着 丝 粒 的 位 置 将 染色 体 分 为 poze (#2 1-13). 表 1-13 根据 臂 比 对 染色 体 的 分 类 时、 “于 染色 体 类 型 代表 符号 1,.0~1.7 中 部 着 丝 粒 染色 体 M 1.7~3.0 近 中 着 丝 粒 染色 体 SM 3. 0~7.0 近 端 着 丝 粒 染色 体 ST 7.0 WE 端 部 着 丝 粒 染 色 体 = (8) 剪贴 将 已 经 粗 剪 过 的 每 条 染色 体 进 行 细 剪 EE £8 PJ] FT BS 图 像 清 晰 可 以 不 留 余 边 , 然 后 按 排列 顺序 整齐 地 贴 在 硬 纸板 上 。 一 般 是 硬 纸板 的 上 方 贴 一 张 未 剪 的 完整 照片 ,中 间 贴 上 已 经 剪 出 且 按 顺序 配对 排列 的 染色 体 , 下 方 列表 ,最 后 写 出 实验 材料 及 核 型 公式 。 核 型 公式 是 以 公式 的 形式 将 核 型 分 析 的 结果 和 核 型 的 主要 特征 予以 表示 , 简 明 扼 要 ,便于 记忆 和 进行 比较 。 其 书写 格式 如 下 例 : Aj 24 (Paeonia eacti ora): 天 一 20 王 27z 一 10 王 622 十 2s72 十 27z 编 号 ”绝对 长 度 ”相对 长 度 © 臂 长 臂 F 率 着 丝 粒 指数 随 hk x 再 oF WH KF (9) 翻拍 及 绘图 将 剪贴 排列 好 的 染色 体 组 型 图 进行 翻拍 或 描 图 成 为 染色 体 组 型 图 。 高 等 植物 属 异 源 多 倍 体 的 种 类 较 多 ,进行 组 型 分 析 时 ,不 完全 根据 染色 体 的 大 小 进行 排列 ,而 应 根据 系统 发 育 的 来 源 进行 分 组 ,然后 各 组 按 大 小 进行 编排 。 例 如 ,普通 小 麦 是 异 源 六 倍 体 , 由 三 个 物种 的 染色 体 在 系统 发 育 过 程 中 组 合 形成 。 已 “ 知 其 染色 体 组 为 AABBDD, 因 此 应 分 成 AA.BB、DD 几 组 进行 分 析 。 2. 减 数 分 裂 时 期 的 染色 体 组 型 分 析 利用 减 数 分 裂 时 期 的 染色 体 进 行 组 型 分 析 ,通常 是 选择 终 变 期 或 中 期 工 细 胞 ， 第 一 部 分 基础 性 实验 > GBi » 因为 这 时 同 源 染 色 体 已 经 联 会 ,每 一 条 染色 体 包含 着 4 条 染色 单 体 即 成 为 二 价 体 ， 染色 体 个 体形 态 明 显 ,分 散 度 好 ,具有 稳定 的 测量 长 度 、 着 丝 粒 位 置 ,: 有 无 随 体 等 特 点 ;是 染色 体 组 型 分 析 的 良好 时 期 。 此 外 ,许多 植物 在 减 数 分 裂 时 ,在 同一 个 花药 中 的 细胞 具有 比较 好 的 细胞 分 裂 同 步 性 ,给 染色 体 组 型 分 析 带 来 了 方便 。 玉米 百合、 鸭 踊 草 的 花药 ,是 利用 减 数 分 裂 研究 染色 体 组 型 较 好 的 材料 。 新 鲜 固 定 的 蚕豆 、 葛 豆 的 花蕾 也 可 以 利用 。 本 实验 请 同学 们 自选 一 种 材料 进行 ,其 取 材 和 制 片 方法 参见 “植物 花粉 母 细 胞 减 数 分 裂 " 实 验 , 其 他 步骤 同上 。 【实验 报告 】 1， 完 成 一 种 作物 的 染色 体 组 型 分 析 图 ,包括 染色 体 组 型 图 ,数据 表 和 核 型 公式 。 2. 通过 查阅 资料 , 谈 谈 染色 体 组 型 分 析 的 意义 。 3. 为 什么 要 用 相对 长 度 来 表示 染色 体 的 长 度 ? (REF KKK) 实验 11 “植物 单 倍 体 的 诱发 【实验 目的 】 通过 烟草 花药 培养 了 解 和 掌握 花药 培养 诱导 单 倍 体 的 原理 和 方法 ,了 解 单 倍 体育 种 的 意义 ,培养 学 生 无 菌 操 作 的 能 力 和 意识 。 【实验 原理 】 随 着 植物 组 织 培养 技术 的 发 展 , 大 量 的 实验 已 证 实 了 植物 细胞 具有 全 能 性 (totipotency) 。 所 谓 全 能 性 是 指 植物 体 的 任何 一 个 细胞 ,在 适当 的 条 件 下 都 具有 发 育成 完整 植株 的 能 力 。 植 物 花粉 是 由 花粉 母 细 胞 经 过 减 数 分 裂 形成 的 单 倍 体 细 胞 , 仍 具 有 一 套 完整 的 染色 体 及 控制 所 有 性 状 发 育 的 每 一 种 基因 ,因此 也 可 以 发 育 成 一 个 完整 植株 。 花 药 培养 就 是 利用 植物 组 织 培养 技术 ,把 发 育 到 一 定 阶段 的 花 药 经 过 无 菌 操作 接种 在 人 工 培养 基 上 ,以 改变 花药 内 花粉 粒 的 发 育 程序 ,诱导 其 脱 分 化 ,并 继续 进行 有 丝 分 裂 ,然后 经 过 胚 状 体 或 愈 伤 组 织 途 径 再 分 化 为 完整 的 单 倍 体 植 株 。 通 过 这 种 诱发 单 性 生殖 的 方法 ,使 植物 或 其 杂交 后 的 异 质 花 粉 粒 长 成 单 倍 体 植株 ,再 经 染色 体 加 倍 成 纯 系 , 然 后 选 育 新 品种 ,这 就 是 单 倍 体育 种 的 理论 根 据 。 这 种 方法 能 够 加 快 育种 速度 ,提高 选择 效率 ,快速 建立 自 交 系 。 此 外 , 单 倍 体 诱导 对 于 研究 植物 个 体形 态 发 生 、 遗 传 及 变异 规律 等 一 系列 问题 都 具有 重要 意义 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 (1) 培养 基 成 分 及 其 母液 配制 普通 烟草 花药 培养 常用 也 培养 基 , 其 成 分 较 多 ,含量 要 求 严格 。 为 了 节省 称 a 遗传 学 实验 教程 量 时 间 ,避免 混乱 ,将 培养 基 母 液 配制 及 其 培养 基 制 备 列 成 表 1= 14。 表 1-=-14 再 培养 基 (Bourgin 和 Nitsch 1967) KNO3 NH, NO; 720 烟 酸 5 MgSO, + 7H20 185 HAR 2 KH2PO, 68 盐酸 硫 胺 素 0.5 CaClz。2H2O 166 盐酸 吡 多 素 0.5 MnSO, * 4H2,O0 25 叶酸 0.5 ZnSO, * 7H20 10 生物 素 0. 05 H;BO;_ 10 蔗糖 20 000 NaMoOi。2H2?O 0. 25 琼脂 8 000 CuSO, * 5H20 铁 盐 7.45 g NasEDTA( 乙 二 胺 四 乙酸 二 钠 ) 和 5. 57 g FeSO, * 7H20 & 解 于 1 工 水 中 ,每 志 培 养 基 取 此 液 5 ml, 注意 ,各 种 成 分 称 量 要 准确 ,同一 母液 内 的 诸 成 分 要 分 别 溶 解 , 依 次 混合 ,最 后 定 容 。 各 种 母液 必须 严格 地 单 瓶 分 装 , 贴 上 标签 , 写 明 药品 名 称 、 稀 释 倍 数 和 配制 日 期 , 放 入 冰箱 内 保存 备用 。 (2) 培养 基 配 制 1) 按 表 中 顺序 和 吸取 量 , 分 别 吸取 母液 混合 于 容量 瓶 中 ,然后 将 蔗糖 加 适量 “ 水 溶解 后 倒 人 ,琼脂 须 加 水 加 热 溶解 后 倒 人 ,用 1 mol/L HCl 或 1moML NaOH ~ 调 p 互 ,最 后 加 水 定 容 到 所 需 容积 ,加 热 至 沸 。 2) 用 量 简 和 漏斗 将 培养 基 趁 热 分 装 到 培养 瓶 中 ,分 装 量 根据 培养 瓶 大 小 而 定 , 一 般 50 ml 培养 瓶装 15 一 20 ml,100 ml 培养 瓶装 30 一 35 ml。 塞 上 棉 塞 ,用 牛 皮 纸 包 好 封口 ,用 橡皮 筋 扎 紧 ,0. 105 MPa 高 压 蒸气 灭 菌 20 min, 然后 平 放 冷 却 备用 。 (3) 器 具 包 装 灭 菌 1) 所 用 玻璃 器 严 ( 如 烧杯 .培养 下、 三角 瓶 . 广 口 瓶 等 ) 应 彻底 清洗 后 用 蒸馏 水 冲 一 次 晾 干 或 烤 干 , 用 牛皮 纸 包扎 两 层 , 同 时 用 大 三 角 瓶 装 适 量 蒸馏 水 和 未 包 棉 球 ,0.105 MPa 高 压 灭 菌 20 min, 2) 金属 器 械 (如 角 子 \ 刀 片 等 ) 可 在 用 前 浸 在 70% 乙 醇 中 ,再 在 酒精 灯火 焰 二 灭 菌 , 也 可 包扎 后 同 玻璃 器 亚 一 起 进行 高 压 灭 苗 。 3) 超 净 工作 台 应 擦 干净 ,最 后 用 新 洁 尔 灭 擦洗 一 次 台面 ,用 前 打开 紫外 灯 照 射 30 min。 如 用 接种 箱 ,擦洗 干净 后 ,应 在 箱 内 用 甲醛 高 锰 酸 钾 ( 向 甲醛 内 加 入 高 锰 酸 钾 ) 玩 蒸 ,用 前 再 用 紫外 灯 照 射 30 min, 第 一 部 分 基础 性 实验 - 41 > (4) 实验 材料 的 选择 烟草 盛 花期 选取 花 苯 与 花冠 等 长 的 花蕾 较 好 ,此 时 的 花药 处 于 单 核 靠边 期 ,是 烟草 花粉 培养 的 适宜 时 期 。 为 比较 准确 确定 花粉 发 育 时 期 ,可 在 接种 前 用 改良 葵 酚 品 红 染 色 压 片 法 镜 检 , 以 确定 花粉 发 育 时 期 与 其 相对 应 的 花 蓄 外 部 形态 。 2. 用 具 及 药品 (1) 仪器 用 有 具 超 净 工作 台 ( 或 无 菌 接种 箱 ) 恒温 培养 室 ( 或 可 带 光照 的 培养 箱 ) 显微镜、 高 压 无 菌 器 、 分 析 天 平 、 药 物 天 平 、 剪 刀 、 角 子 .容量 瓶 、 移 液 管 三角 瓶 (50 ml 或 100 ml) 、 试 剂 瓶 、 酒 精 灯 、 烧 杯 、 培 养 四 、 纱 布 、. 脱 脂 棉 ` 牛 皮 纸 .橡皮 筋 .广泛 试纸 、 磁力 搅拌 器 、 小 型 喷雾 器 。 (2) 药品 及 试剂 70% 乙 醇 .0.1% 升 示 水 溶液 .1 mol/L HCl.1 mol/L NaOH HIER, Bh 酸 钾 .甲醛 .蒸馏 水 、 秋 水 仙 素 .培养 基 诸 成 分 ( 表 1- 14)。 【实验 步骤 】 1. 花粉 植株 的 诱导 (1) 灭 菌 消 毒 1) 将 已 准备 好 的 培养 基 用 喉头 喷雾 器 在 瓶 壁 表面 喷洒 70% 乙 醇 , 然 后 放 人 超 净 工 作 台 或 接种 箱 ,将 已 灭 菌 的 器 具 用 70%% 乙 醇 喷 酒 后 ,去 掉 第 一 层 包装 纸 , 放 于 超 净 工作 台 上 ,打开 紫外 灯 , 照 射 30 min, 2) 实验 者 要 修剪 指甲 ,肥皂 水 反复 洗手 ,最 后 将 手 浸 泡 在 0. 1%% 新 洁 尔 灭 溶液 中 3 一 5 min, 方 能 上 台 操 作 。 (2) 花药 消毒 将 花蕾 剥 去 苯 片 , 放 在 灭 菌 的 烧杯 中 ,加 入 70%% 乙 醇 消 毒 10 min, 再 换 0. 2% Ft RYE BUR 3 8 min, 用 无 菌 水 冲洗 2 次 ,把 花蕾 移 人 另 一 灭 菌 锅 中 ,再 用 无 菌 水 冲 洗 2 次 , 倒 去 无 菌 水 。 (3) 接种 FARRER POR EEN 1/3 部 分 去 掉 , 用 手轻 抢 下 部 ,花药 即 露出 ,小 心 用 枪 式 狠 子 将 花药 接种 在 培养 基 上 ,每 瓶 10 一 15 个 花药 ,分 布 要 均匀 。 然 后 包扎 好 ,在 包 装 纸 上 写 上 接种 花药 的 品种 名 称 、 接 种 日 期 及 实验 者 姓名 。 (4) 花药 的 培养 将 花药 瓶 放 于 27 一 28C 的 恒温 培养 室内 ,并 给 以 适当 的 光照 (1 000 一 1 500 Ix), (5) 观察 记录 实验 者 应 按 一 定时 间 间 隔 观 察 记 录 培 养 花药 的 变化 情况 : 最 初 几 天 花药 由 绿 渐变 黄 至 褐色 ,体积 稍 增 大 ,3 周 后 药 室 开 裂 ,在 裂 开 处 可 见 乳 黄色 的 胚 状 体 出 现 ， 见 光 后 很 快 变 绿 ,而 后 逐渐 发 育成 单 倍 体 幼苗 。 中 和 = 遗传 学 实验 教程 2. 烟草 单 倍 体 胚 状 体 发 育 过 程 的 观察 (1) 实验 时 期 待 花药 培养 初 见 黄色 胚 状 体 后 , 即 可 取材 压 片 观察 。 (2) BH 在 无 菌 条 件 下 , 取 一 花药 培养 物 ( 其 余 的 可 继续 培养 ) 置 载 玻 片上 ,加 一 滴 改 良 苯酚 品 红 溶液 ,用 狠 子 反复 压 挤 花药 ,然后 去 净 药 壁 残 酒 , 履 一 盖 片 ,用 拇指 轻 轻 压 片 。 (3) 观察 在 显微镜 下 寻找 两 细胞 期 .四 细胞 期 `, 八 细胞 期 ,多 细胞 期 ,球形 胚 , 心 形 胚 、 鱼 雷 形 豚 和 具有 明显 子叶 和 胚 根 分 化 的 豚 状 体 。 3. 单 倍 体 小 苗 的 移 瓶 、 壮 苗 待 花 粉 植株 大 量 出 现 后 ,由 于 小 苗 很 弱 , 须 进 一 步 壮 苗 培养 。 (1) 壮 苗 培 养 基 ( 工 培 养 基 ) 的 配制 工 培养 基 的 配制 方法 同 再 培养 基 , 只 是 成 分 有 所 变化 。 其 成 分 及 含量 如 下 - (mg/L), FARK (NH, NO; ) 1 900 BULB (CaCle « 2H2O) 440 TAR BFR OCKNO; ) 1650 蔗糖 10 000 磷酸 二 氢 钾 (KH2PO, ) 370 琼脂 8 000 微量 元 素 、 铁 盐 浓度 与 H 培养 基 相 同 , 有 机 成 分 省 去 ,pH 6. 0。 (2) ABH eH SFr dé EA Ba BA T FREE. BE PR FES I SS AN RES FE 至 小 苗 长 出 大 量 根系 ,植株 健壮 , 真 叶 长 出 3 一 4 片 为 宜 ( 约 20~25 d). A. 单 倍 体 植株 的 鉴定 与 移 栽 壮 苗 培 养 基 中 生长 的 单 倍 体 小 苗 长 出 3 一 4 片 真 叶 , 形 成 一 定 根 系 时 , 即 可 移 人 花 盆 或 培养 土壤 中 生长 。 人 花 盆 时 ,可 剪 取 幼 嫩 根 尖 进 行 固定 , 按 实验 2 的 方法 压 片 鉴定 染色 体 数 目 , 同 时 与 正常 二 倍 体 植 株 的 形态 比较 ,其 主要 区 别 特征 如 下 。 稍 短 | 罕 短 72 | 花丝 比 柱头 短 较 少 短 7g 二 倍 体 | 稍 长 | 疯 长 He | 花丝 比 柱头 长 较 大 长 宽 【实验 报告 】 1. 详细 记录 整个 花药 培养 的 过 程 。 第 一 部 分 基础 性 实验 。 43。 2. 绘 出 胚 状 体 发 生 的 各 个 时 期 的 图 像 。 3. 比较 单 倍 体 植 株 与 二 倍 体 植 株 的 形态 学 和 细胞 学 特征 。 ( 张 爱 民 ) 实验 12 植物 组 织 的 培养 【实验 目的 】 1. 学 习 和 掌握 不 同 植物 组 织 的 培养 方法 和 技术 2 了解 植物 组 织 培养 在 生产 实践 中 的 意义 【实验 原理 】 植物 体 细胞 组 织 培养 具有 理论 上 和 应 用 上 的 意义 。 它 是 运用 培养 技术 进 行 作物 品种 改良 的 新 途径 ,同时 又 丰富 了 基础 遗传 学 的 内 容 。 在 体 细胞 杂交 、 染色 体 移植 .DNA 注射 以 及 DNA 重组 技术 成 为 育种 过 程 的 常用 手段 之 前 , 必 须 阑 明 离 体 培养 的 单 细胞 再 生 为 有 重要 经 济 价值 的 单子 叶 植物 的 遗传 控制 机 理 。 体 细胞 克隆 变异 是 借助 于 离 体 培养 细胞 发 生 的 随机 遗传 变异 得 到 的 。 随 机 遗传 变异 以 及 染色 体 总 量 的 变化 ( 非 整体 .多 倍 体 等 ) 在 培养 细胞 中 常 有 发 生 。 现 在 ,微量 遗传 变化 也 在 培养 细胞 中 发 现 。 总 之 ,作物 品种 可 以 通过 上 述 遗传 变化 而 得 以 改良 。 培养 细胞 必须 通过 诸如 愈 伤 组 织 培养 或 悬浮 培养 , 打 乱 细胞 的 生长 周期 ， 诱导 体 细 胞 克隆 变异 。 培 养 植物 所 表现 出 的 体 细 胞 克隆 变异 与 诱 变 时 间 呈 正 相关 。 水 稳 的 任何 部 位 几乎 都 可 用 来 诱导 愈 伤 组 织 。 外 植 体 可 以 是 胚乳 \ 胚 成 熟 的 WF NFR BR ARMA, Ri FA) BABES. DAMA SE HAG ARCRRE 葵 尖 分 生 组 织 通常 位 于 茎 的 最 尖端 ,是 直径 约 0. 1 mm 长 度 约 0. 25~0. 3 mm 的 圆 形 组 织 。 葵 尖 分 生 组 织 最 早 在 胚胎 发 育 时 期 形成 ,并 在 植物 整个 营养 生长 时 期 保持 旺盛 的 细胞 分 裂 功能 。 茎 尖 分 生 细胞 的 全 能 性 是 分 生 组 织 培养 技术 的 基 础 。 葵 尖 分 生 组 织 培养 为 植物 的 快速 繁殖 与 传代 提供 了 一 条 有 效 途 径 。 重 建 植株 在 遗传 成 分 上 几乎 完全 等 同 于 供 体 植株 。 因 而 , 葵 尖 分 生 组 织 培养 广泛 应 用 于 有 花 植物 (如 菊花 等 ) 的 繁殖 上 , 葵 尖 分 生 组 织 培养 在 生产 无 病 植 株 尤 其 是 脱 病毒 植 株 方面 也 具有 重要 意义 。 茎 尖 分 生 组 织 培养 步骤 可 以 以 种 子 繁殖 作物 与 营养 繁殖 作物 两 种 类 型 分 别 进行 实验 。 植物 的 组 织 培养 能 够 使 根茎 、 叶 等 器 官 再 次 发 生 , 例 如 萌 攻 的 叶柄 培养 。 胚 胎 不 被 看 作 是 器 官 ,因为 这 种 结构 是 独立 的 ,如 它 与 亲本 没有 维 管束 的 联系 。 9 遗传 学 实验 教程 愈 伤 组 织 的 器 官 发 生 或 离 体 培 养 下 的 器 官 形 成 , 均 由 一 群 分 生 细胞 的 产生 所 诱导 。 这 和 群 分 生 细胞 在 组 织 内 部 的 因子 影响 下 能 够 形成 原 基 。 激 素 能 够 诱导 根 、 ZW RAIN AA. 根 的 诱导 是 在 芽 形 成 后 进行 的 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 小 麦 未 成 熟 胚 . 玉 米 的 玉米 穗 .小 麦 种 子 和 小 穗 、 种 子 繁殖 植物 (如 短 豆 、 吏 豆 、 KE) NAR AFR HS DRE AS WSR, Awa 叶 ) FR ap GR OD) HY A a A BA EN AEA ARS. 2. 用 具 及 药品 (1) AB Ta BK Bal tt GRE SR AB ZS TJ W/V RSE TD KA RTP 培养 四 、 吸 水 纸 , 超 净 工 作 台 、 立 体 显 微 镜 、 显 微 镜 、 解 剖 显 微 镜 、 解 剖 针 、 手 术 刀 . 杀 子 , 小 试管 、. 铝 稍 、 蜡 带 、 三 角 瓶 和 烧杯 等 。 (2) 药品 0.52% 1. 2% .2.5%.3% 50% BIR RRNA ZEB OK SRE GES A SA ee et MS.B5,SH - NAA, KS7951, BRVS, 等 ) 贮存 液 、 激 素 贮存 液 .Hoag- land 营养 液 . 卡 诺 氏 固 定 液 .70%% 乙 醇 、 醋 酸 洋 红 和 95%% 乙 醇 等 。 注意 : 应 该 灭 菌 的 用 具 和 药品 都 应 严格 高 压 灭 菌 。 【实验 步骤 】 1. 小 麦 未 成 熟 胚 培养 1) 取 4 一 6 种 受精 (开花 ) 后 12 一 15 d 的 不 同 基因 型 的 颖 果 , 用 0. S2%KAR 钠 表面 灭 菌 5 min ,无 菌 蒸 馏 水 冲洗 。 2) 调 药 刀 将 胚 从 种 子 中 挤 出 ,连同 颖 片 一 起 接种 在 初始 培养 基 的 表面 。 幼 胚 ， 通常 不 形成 愈 伤 组 织 ,而 成 熟 胚 将 在 此 培养 基 中 萌发 。 3) 愈 伤 组 织 诱导 。 诱 导 愈 伤 组 织 培养 基 的 组 成 成 分 如 下 。 大 量 元 素 (mg/ 卫 ) NH,NO3 = CaClz *2H20 FeSO, "7H2O Naz + EDTA KNO; MgSO, + 7H20 ~KH2PQ, 1 650. 0 440, 0 ‘ 27.8 3/.3 1 900. 0 370. 0 170. 0 (UH To (mg/L) CuSO, * 5H2z0 MnSO; * 4H2O ZnSO, + 7H2z0 H3BO3; CoCle *6H20 NazMoO, + 2H20 © KI 0. 025 La. 8 8.6 6. 2 0. 025 0. 25 0. 83 第 一 部 分 基础 性 实验 ~ 25 A PLAST (g/L) ne 糖 Bi 脂 20.0 6.0 ARR PATA (mg/L) 2,4-D TUE L -天 冬 酰胺 1 0.5 150 培养 基调 到 pH 5. 8,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 4) 种 进去 的 胚 在 27" ,16 h 光照 (1 500 lx) 的 培养 室 中 培养 ,直到 长 出 愈 伤 组 织 。 然 后 将 愈 伤 组 织 转 接 到 附加 0.5 mg/L 2,4= 二 毛茶 氧 乙酸 (2,4=D) 的 同 种 培 养 基 中 ,每 20 d 继 代 培养 一 次 。 5) 记录 每 种 培养 基 诱 导出 的 愈 伤 组 织 的 数目 ,并 观察 愈 伤 组 织 的 大 小 和 颜 色 , 如 了 一 (小 ,褐色 ) IT( 小 , 半 透 明 ).5B( 大 ,褐色 )、.5T( 大 , 半 透 明 )。 6) 将 愈 伤 组 织 分 成 三 组 : 第 一 组 : 愈 伤 组 织 在 诱导 培养 基 中 培养 20 d; 第 二 组 : 愈 伤 组 织 在 诱导 培养 基 中 培养 45 d; 第 三 组 : 愈 伤 组 织 在 诱导 培养 基 中 培养 90 d。 7) 将 以 上 各 组 愈 伤 组 织 转 人 分 化 培养 基 中 ,分 化 培养 基 的 成 分 与 愈 伤 组 织 诱 导 培 养 基 成 分 基本 相同 ,只 是 2,4-D 浓 度 降 低 到 0. 1 mg/L. {RACE AY 2.4-D fe HAM AA ARN AA 8) 将 带 有 绿 点 和 幼 芽 的 愈 伤 组 织 转 人 不 含 2,4-D 的 愈 伤 组 织 诱导 培养 基 HH, ZE 22°C ,12h 光 照 (5 000 1x) 下 培养 。 9) 4AM AR Ka (AKA 21 d) ,用 自来水 冲 去 再 生 植株 上 的 琼脂 ,然后 移 栽 到 装 有 碎 石 的 小 钵 中 。 必 要 时 用 Hoagland 营养 液 浇灌 。 将 小 钵 放 和 人 有 盖 的 塑料 盒 内 2 d 以 保持 较 高 的 温度 ,在 以 后 的 3 d 逐 渐 打 开 盖 子 以 适应 自然 生长 环境 。 10) 生长 30 d 后 , 取 下 每 个 再 生 植 株 的 根 尖 , 固 定 , 检 查 染 色 体 的 数目 和 可 能 出 现 的 畸变 。 然 后 将 植株 转 人 装 有 土壤 的 小 钵 中 ,在 温室 中 培养 。 11) 以 种 子 发 生 的 苗 作 对 照 , 观 察 记 录 再 生 植 株 的 各 种 形态 变异 ,比较 这 三 组 材料 以 及 每 种 基因 型 在 形态 和 细胞 学 变异 的 频率 和 类 型 。 作 出 结论 。 12) 收集 表现 有 体 细胞 克隆 变异 的 再 生 植株 的 种 子 , 播 种 得 到 下 一 代 (R; 或 SC, 世代 ) 。 观 察 是 否 有 同样 的 变异 出 现 。 2. 玉米 的 幼 胚 培 养 146" 遗传 学 实验 教程 1) 田间 或 温室 培养 的 玉米 品系 授粉 后 14 一 18 d 的 玉米 穗 取 下 , 切 成 5 一 8 cm 的 小 段 。 用 2. 5 为 次 氧 酸 钠 溶液 消毒 , 灭 菌 蒸馏 水 冲洗 。 将 幼 胚 迅速 切 出 ,在 4C 下 存放 12 h。 2) 将 玉米 粒 从 玉米 穗 上 取 下 ,取出 其 内 的 幼 豚 ,用 罕 刀 片 乔 去 胚乳 。 将 位 于 玉米 粒 基部 的 胚 接种 于 固体 培养 基 上 , 圆 的 盾 片 朝 上 , 较 平 的 豚 轴 面 接触 在 愈 伤 组 织 诱导 培养 基 上 。 愈 伤 组 织 诱导 培养 基 组 成 成 分 中 ,大 量 元 素 、 微 量 元素 和 有 机 成 分 同 小 麦 , 维 生 素 和 激素 (mg/L) 如 下 。 培养 基调 到 pH 5. 8,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 3) EAP AN SHARE 28°C ,16 Ph 光照 下 发 育 。 盾 片 的 反应 以 及 胚 的 最 佳 大 小 随 基 因 型 的 不 同 有 显著 的 差别 。 在 合适 的 培养 条 件 下 ,3 周 后 愈 伤 组 织 即 可 诱导 出 。 第 三 或 第 四 周 可 将 愈 伤 组 织 继 代 培 养 在 同 种 培养 基 上 ,以 保存 愈 伤 组 织 。 4) 2,4-D 的 量 减少 到 0. 5 mg/L, 0. 1 mg/L.O mg/L, 将 愈 伤 组 织 逐 步 转移 到 2,4-D 水 平 降低 的 同 种 培养 基 上 ,以 诱导 芽 的 形成 与 幼苗 的 形态 发 生 。 5) 当 根 长 出 ,幼苗 长 到 4~5 cm 高 时 , 洗 去 根部 的 琼脂 ,将 幼苗 转 人 装 有 土壤 的 花 盆 中 。 第 一 周 用 烧杯 或 塑料 袋 单 住 幼 苗 ,以 后 可 逐渐 移 去 。 6) 在 幼苗 移入 土壤 之 前 ,收集 根 尖 ,在 4C 用 饱和 8 -羟基 唑 啉 预 处 理 4h 后 ， 转 和 人 新 鲜 卡 诺 氏 A 液 (3 份 95% 乙 醇 ,1 份 冰 醋酸 ) 在 24C 下 固定 24 hs 根 尖 在 ， —10°C .70%% 乙 醇 中 保存 ,用 醋酸 洋红 染色 ,用 压 片 法 制 片 。 统 计 中 期 细胞 染色 体 数目 。 7) 统计 每 种 基因 型 诱导 出 的 愈 伤 组 织 块 数目 以 及 再 生 苗 数目 ,记录 幼苗 的 形 态 变异 ,并 作出 结论 。 8) 将 表现 出 形态 变异 或 细胞 学 变异 的 植株 自 交 。 把 种 子 播种 下 去 得 到 下 二 FRCRi 或 SC: 代 ) ,这 些 变异 能 和 否 传递 给 后 代 ? 3. 水 稻 的 体 细胞 组 织 培养 1) 收集 几 个 品种 的 成 熟 种 子 , 除 去 谷 壳 。 选 择 健 康 植 株 的 幼 嫩 小 穗 , 从 距 地 面 5 一 10 cm 高 处 切 下 。 2) 将 谷 粒 用 95%% 乙 醇 漂 洗 3 s 以 除去 种 子 外 表 的 蜡 脂 层 。 如 果 漂 洗 时 间 超 过 10 s, 种 子 就 会 死亡 。 3) 将 幼 嫩 的 小 穗 浸泡 在 70% 乙醇 中 10 min, 在 通风 橱 内 除去 叶片 。 第 一 部 分 基础 性 实验 。47。 1 一 1.5 cm 长 的 幼 嫩 小 穗 是 愈 伤 组 织 诱导 的 最 佳 时 期 。 4) 将 种 子 放 在 烧杯 内 用 流水 冲洗 2 一 10 min, 然 后 浸没 在 装 有 70% 乙 醇 的 无 菌 培养 下 内 5 min, 5) 除去 乙醇 ,向 培养 下 内 加 入 3%% 次 氯 酸 钠 溶液 。 不 时 地 振荡 , 播 动 处 理 45 min, 6) 将 种 子 完全 浸没 在 无 菌 水 中 漂洗 。 7) 将 种 子 和 幼 嫩 小 穗 接种 在 加 有 生长 素 的 MS 培养 基 中 以 诱导 愈 伤 组 织 。 MS 培养 基 的 组 成 以 及 附加 成 分 如 下 ,其 中 大 量 元 素 和 微量 元 素 同 小 麦 。 有 机 成 分 (g/) 水 解 酷 蛋 自 琼 脂 0.5 6.0 生长 调节 物质 (mg/L) 2,4-D IAA 激动 素 2 0.2 0. 2 培养 基调 到 pH 5. 8,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 8) 将 种 子 和 幼 嫩 小 穗 在 27"、 黑 暗中 培养 。 约 4 周 后 , 愈 伤 组 织 诱导 出 来 。 9) 将 愈 伤 组 织 转 人 再 分 化 培养 基 。 这 种 培养 基 是 在 MS 基本 培养 基 的 基础 上 附加 有 2 mg/L 激动 素 .0.2 mg/L IAA 和 800 mg/L 水 解 酷 蛋 白 。 愈 伤 组 织 27°C 8 光照 (16001x) 条 件 下 培养 。 10) 统计 每 一 品种 每 一 植株 愈 伤 组 织 的 诱导 频率 ,比较 基因 型 与 不 同 植株 的 诱导 率 的 差异 。 11) 统计 绿 苗 诱导 频率 。 比 较 不 同 基 因 型 以 及 不 同 外 值 体 (如 种 子 与 幼 嫩 小 穗 ) 诱 导 率 的 差异 。 12) 将 愈 伤 组 织 每 3 周 继 代 培 养 一 次 , 共 继 代 培 养 4 次 (3 周一 6 周一 9 周一 12 周 )。 在 每 一 继 代 周期 之 末 ,将 愈 伤 组 织 分 化 培养 。 比 较 经 继 代 培养 的 和 未 经 继 代 培养 的 愈 伤 组 织 绿 苗 诱 导 率 的 差别 。 一 般 来 讲 , 继 代 培 养 时 间 越 长 , 绿 苗 诱导 率 越 低 , 药 苗 生 长 较 弱 ,细胞 学 上 的 异常 也 会 增加 。 4. 种 子 繁殖 植物 (如 乔 豆 .豌豆 .大豆 等 ) 的 葵 尖 分 生 组 织 培养 1) 将 种 子 放 和 人 70% CE PIE 1 min, ABBAKA 1. 2%% 次 氯 酸 钠 溶 液 的 烧杯 中 15~20 min, 不 时 用 手 或 磁力 搅拌 器 搅拌 和 振荡 。 2) 用 无 菌 蒸馏 水 彻底 冲洗 灭 了 菌 的 种 子 。 3) 将 种 子 放 人 无 菌 的 垫 有 一 层 滤 纸 或 吸水 棉 的 培养 下 内 使 其 萌发 。 + 48 « 遗传 学 实验 教程 4) 种 子 一 旦 萌发 ( 约 4~5 d) ,立即 无 菌 切取 长 约 0. 3 一 0. 5 mm HARA 组 织 。 5) 分 生 组 织 的 无 菌 分 离 是 在 放 人 过 滤 空 气 通风 橱 内 的 立体 显微镜 下 进行 。 所 有 的 仪器 ,包括 手术 刀 、 解 剖 针 和 狠 子 必须 浸 人 70% 乙 醇 中 消毒 。 解 剖 显 微 镜 和 载 物 台 也 必须 用 70%% 乙 醇 消毒 。 6) 在 显微镜 (10X 或 20X) 下 用 镖 子 夹 住 茎 尖 , 用 解剖 针 或 解剖 刀 将 外 轮 叶片 一 片 一 片 地 去 掉 , 仅 剩 下 分 生 组 织 圆锥 体 与 一 对 叶 原 基 。 在 距 圆 锥 体 尖 端 0. 3 一 0. 5 mm 处 ,用 解剖 刀 切 成 "V7 字 形 ,将 带 有 原形 成 层 的 组 织 切 下 ,立即 接种 在 装 有 2.5iml 固 体 培养 基 的 小 试管 (10 mmxX1l. 2 mm) 中 ,用 棉花 塞 住 管 口 ;在 24~28°C F 培养 。 7) 很 多 种 类 的 分 生 组 织 均 可 培养 在 MS 或 BS 培养 基 上 。 了 B5 培养 基 的 组 成 如 下 。 KICK (mg/L) (NH4)2SO, CaClz * 2H20 FeSO; + 7H20 Naz * EDTA KNO3; MgSO, * 7H20 NaH2PO, » 2H20 134 150 27.8 37.3 2 500 370. 0 150 (ITA (mg/L) CuSO, *5H20 MnSO, + 4H20 ZnSO, + 7H20 H3BO3 CoClz *6H20 NazMoQ,*2H20 KI 0. 025 10 2 3 0. 025 0. 25 0.75 of +: F% (mg/L) 烟 酸 VBs 肌 醇 VBi 1.0 1.0 100 10.0 有 机 成 分 (g/L) 蔗糖 20.0 琼 脂 6.0 生长 调节 物质 (mg/EL) 2,4-D 0.1~1.0 激动 素 0.1 培养 基调 到 pH 5. 5,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 8) 各 种 植物 葵 尖 分 生 组 织 培养 的 形态 发 生 。 第 一 部 分 基础 性 实验 。49 。 种 类 培养 基 激素 成 分 (mol/L) 培养 条 件 形态 发 生 Bi (Pisum sativum) B5 BAO.5 26°C/16h 芽 we B5 BAO.5 白天 20C , 晚 F 15C,16h 光 照 FF KE (Glycine max) MS _ BAO. 1+NAAI1, 0 26°C/16h 植株 页 豆 (Vignra vulgaris) MS BA0.001+TNAA10 ”29C/16h 植株 菜豆 (Phaseolus vulgaris ) MS BAS. 0 十 NAA10 29°C/16h x EH (Arachis hypogaea) MS BAO.1+NAAI1~10 29°C/16h 植株 Hii (Lycopersicum esculentum) MS BA,NAAO, 1~1.0 26°C/16h 植株 9) 一 个 学 生 选 择 一 种 作物 进行 分 生 组 织 培养 。 统 计 形 态 发 生 的 类 型 以 及 频 率 ,观察 是 否 有 形态 学 和 细胞 学 的 变异 。 在 通常 情况 下 ,培养 已 经 分 化 了 的 器 官 。 分 生 组 织 是 不 会 发 生体 细胞 克隆 变异 或 细胞 学 变异 的 。 5. BAAD Ws SRE ASS!) HARTA 以 草莓 CFragaria ananassa) Ke BL, E EAP BD EY & HE 作物 。 1) 将 草 等 栽培 在 温室 中 的 腐 殖 土 .泥炭 玖 、 败 石 ( 或 沙子 )(3 : 2 : 1) 的 混合 物 上 。 的 掉 花 条 以 促进 铀 和 灸 葵 的 生长 。 2) MRAMAWARG cm 长 ) ,用 1. 2% 次 毛 酸 钠 的 20% AED) KA 饮水 冲洗 3 次 。 3) 将 蔡 尖 分 生 组 织 切 下 (0. 4 一 0. 5 mmy) ,培养 在 由 琼脂 固化 的 MS 培养 基 ， 附加 1 pmol/L BA、1 pmol/L F5|PET ARLA RR 0.1 pmol/L GA: 。 培 养 条 件 为 26"C ， 16 h 4 000 1x 光 照 以 及 70 罗 的 湿度 。 4) 约 3 一 4 周 后 , 芽 分 化 形成 ,将 这 些 芽 再 培养 在 MS 附加 10 pmol/L BA 的 培养 基 中 。 以 同样 条 件 培 养 , 可 促进 芽 的 增生 。 5) 将 扩 增 芽 再 培养 在 含有 同样 营养 成 分 的 培养 基 中 。 降 低 BA(1.0 pmol/L) 和 NAA(1.0 pmol/L) 的 水 平 或 不 加 生长 调节 物质 以 促进 根 的 形态 发 生 。 每 个 学 生 用 草莓 进行 分 生 组 织 培养 实验 。 统 计 诱 导出 植株 的 频率 以 及 可 能 发 生 的 形态 变异 。 6. Bt (Medicago sativa) MAK (BFF) AY ZA AA ER 1) 从 生长 在 温室 或 生长 箱 (16 h 光照 /d,4 000 Ix) A BR LKR 嫩 叶 柄 。 2) 叶柄 毁 段 ( 约 1 cm 长 ) 的 表面 灭 菌 步骤 如 下 : 在 70%% 乙 醇 中 浸泡 15 s, 在 50 久 (容积 /容积 ) 次 毛 酸 钠 溶 液 中 灭 菌 5 min, 在 无 菌 蒸 馏 水 中 洗涤 2 次 ,每 次 洗涤 15 s。(〈 叶 柄 用 干 酷 布 包 庄 ,可 用 狠 子 从 一 种 溶液 转 人 另 一 种 溶液 。) 3) 培养 基 采 用 SH-NAA 或 KS7951, 每 个 培养 下 接种 10 个 叶柄 切 段 。 @ Shenk-Hildebrandt(SH)- NAA 培养 基 。50 。 遗传 学 实验 教程 te Rm mol/L 贮 存 mR mol/L(g) 大 量 元 素 50 激动 素 5.0 微量 元 素 A 2.5 NAA 0. 37 微量 元 素 B Zo 肌 醇 lg Fe- EDTA 2.0 蔗糖 30g 维生素 1.0 琼脂 6g 注意 : 先 加 水 400 ml, 再 依次 加 入 各 种 成 分 ,前 一 种 成 分 充分 溶解 后 再 加 入 下 一 种 ,最 后 将 体积 定 容 到 1 L。 将 pH 调 到 5. 8 一 6. 0 后 再 添加 琼脂 。 @ 贮存 液 大 量 元 素 质量 /500 ml 维生素 质量 /10 ml 微量 元 素 也 质量 /100 ml KNO; 25g VB, 50 mg KI : 40 mg MgSO; * 7H20 4g 烟 酸 50 mg CuSOl。5H5O 8 mg NH, H2PO, 3¢g VBs 5 mg NazMoQ, * 2H2O 4 mg CaClz。2H2O 2g 微量 元 素 A 质量 /100 ml CocClz。6H2O 4 mg Fe- EDTA jas /L MnSO, * HzO 400 mg FeSO, * 7H20 0.75¢ H;3BO3 200 mg Naz - EDTA 10g ZnSO, °7H20 40mg 以 上 两 种 溶质 分 别 溶 在 30 ml 水中。 加 热 沸腾 时 将 两 种 溶液 混合 。 @ BRIAR ) 激动 素 ( 先 溶 在 1 ml 0.5 mol/L HCl 中 ) 21. 5 mg/L 2,4-D 100 mg/10 ml 95% A NAA( 先 溶 在 95%% 乙 醇 中 ) 186. 2 mg/L( mmol/L) 由 配制 500mlSH-NAA 培 养 基 , 装 在 1L 的 瓶 内 ,用 铝 稍 封口 ,在 121C、 0.105 MPa 高 压 灭 菌 20 min, © 待 培 养 基 冷却 到 40°C ,无 菌 分 装 到 100 mmX15 mm 培养 下 或 50 ml 三 角 瓶 中 ,封口 作 标记 , 放 和 人 冰箱 保存 。 所 有 的 培养 下 需 用 螨 带 封口 , 以 备 后 用 。 4) 将 每 个 培养 四 用 螨 带 封 好 , 标 上 姓名 、 品 种 、 植 株 号 码 以 及 日 期。 培养 四 放 在 27C、16h 光 周 期 的 培养 箱 内 培养 。 5) 愈 伤 组 织 大 约 在 4 周 后 出 现 。 将 这 些 愈 伤 组 织 转 人 诱导 培养 基 (CSH 培养 基 不 附加 NAA, 但 含有 50 pmol/L 2,4-D 和 5 pmol/L 激动 素 ) 培 养 5d: 6) 将 愈 伤 组 织 分 别 转 人 BLY 培养 基 或 SHAP 培养 基 (SH 培养 基 不 含 任 何 激素 ,但 加 有 超过 滤 灭 菌 的 50 mmol/L ff AAAI 30 mmol/L WAR). EAR 再 生 。 7) 大 约 一 个 月 后 体 细 胞 胚胎 发 生 。 当 幼苗 的 根 及 枝条 发 育 得 较 充 分 时 ,可 将 第 一 部 分 基础 性 实验 ss 它 转 人 装 有 赋 石 或 湿 砂 子 的 小 钵 中 。 开 始 几 天 须 盖 上 烧杯 以 保持 湿度 。 8) 当 植株 生根 较 困 难 时 ,用 附加 有 25 pmol/L GA; 和 0. 25 umol/L NAA 的 1/2SH 培养 基 和 水 浇灌 。 9) 好 的 植株 可 移 箱 栽 到 装 有 星 石 或 湿 沙 子 的 小 钵 内 ， 并 在 最 初 儿 天 盖 上 人 烧 PP ,湿度 应 逐渐 降低 到 与 外 界 环境 相同 。 这 个 过 程 至 少 需要 4 一 7 d。 在 移 栽 时 ,应 避免 将 植株 暴露 在 外 界 环境 时 间 过 长 ,否则 植株 将 会 萎 芒 并 且 不 可 挽回 。 7. 五 彩 苏 ( 锦 紫 苏 ) 叶 片 培养 这 个 实验 中 将 从 五 彩 苏 的 叶片 外 植 体 诱 导 芽 以 及 根 的 形成 ,观察 器 官 发 生 的 诱导 条 件 , 以 及 变异 的 叶片 通过 营养 繁殖 的 遗传 传递 。 1) WHR (Coleus scutellarioides ) 为 材料 ,选择 叶片 大 面积 缺乏 叶绿体 的 植株 栽培 。 2) 配制 BRVS, 培养 基 (pH 4. 5) 在 教师 指导 下 ,学 生 要 自 配 贮 存 液 ,高 压 灭 菌 ,将 培养 基 分 装 在 125 ml 的 三 角 瓶 中 (每 瓶装 培养 基 50 ml) 。 3) 摘 取 10 片 距 茎 尖 第 二 和 第 三 个 节 上 的 幼 嫩 叶片 ,用 浸 有 80%% 乙 醇 的 棉花 eth. RMT IA 10%% 的 次 氯 酸 钠 溶 液 灭 菌 10 min, 4) 用 无 菌 蒸 馏 水 将 叶片 冲洗 3 次 ,将 单 张 叶 片 放 在 垫 有 两 层 滤 纸 的 培养 四 上 ,用 打 孔 器 打 成 圆 片 。 滤 纸 在 这 里 起 缓冲 作用 ,并 有 助 于 打 孔 器 对 叶片 组 织 的 切割 。 Ye BE / (mg/L) Me FE / (mg/L) Ca(NO3)2 = 4H20 He MoO, * H20 0. 009 KCl 41.6 VB; 0. 337 KNO; 83. 2 VBs 0. 206 KH2PO, 83, 2 HAR 0. 123 MgSO, * 7H2O0 83. 2 ZR 0. 477 BARRE 3.25 对 氨基 苯 甲 酸 0. 137 H; BOs; 0. 286 NAA 0. 5 pg/50 ml MnCl, « 4H2O0 0. 181 AREY 5. 0 pg/50 ml ZnSO, + 7H2O 0. 022 肌 醇 216. 0 FER 2 000, 0 5) 将 圆 叶 片 直接 转 和 人 装 有 培养 基 的 125 ml 三 角 瓶 中 ,每 瓶 接 种 一 个 外 植 体 。 静 置 培养 而 不 需 振 功 。 6) 当 芽 形成 后 ,将 圆 叶 片 外 植 体 转 人 装 有 200 ml BRVS, 固体 培养 基 的 500 ml 三 角 瓶 中 (附加 琼脂 0. 45% ,重量 /体积 )。 这 种 培养 基 需 加 有 NAA(9 pg/ 200 ml 培养 基 ) 和 和 个 氨基 嗓 叭 (5 wg/200 ml 培养 基 ) 。 ww 遗传 学 实验 教程 7) 在 静 置 的 液体 培养 条 件 下 , 圆 叶 片 较 易 诱导 出 愈 伤 组 织 和 芽 。 当 芽 形 成 | 后 ,将 圆 叶 片 转 人 固体 培养 基 , 有 助 于 芽 的 继续 发 育 。 转 移 后 ,每 个 圆 叶 片 能 形成 20 个 或 更 多 的 芽 , 并 且 根 也 会 长 出 。 大 约 5 周 后 , 当 根 和 幼苗 长 到 适当 大 小 \ 蔡 长 到 10 一 15 cm 长 时 ,用 水 冲 去 根部 的 培养 基 ,将 苗 取出 移 栽 到 土壤 中 。 8) 最 初 的 外 植 体 来 自 带 有 不 同 颜色 斑纹 的 叶片 。 注 意 在 再 生 植 株 中 带 有 同 ， 样 颜 色 斑纹 的 叶片 类 型 。 | 9) 在 五 彩 苏 黄花 叶片 问题 上 ,就 遗传 因子 、 维 管束 的 抑制 以 及 氨基 酸 的 累加 作用 等 方面 , 试 解释 黄花 叶片 变异 的 类 型 。 8. in (Lycopersicum esculenum ) MH A AY ZAZA SEAR RA PRA FE 1) FRSA AY SO RR A TT EA 2) FA 70% CR KA 10 s, 转 人 1OKV KARAM 5 min, RRA 菌 蒸馏 水 冲洗 3 次 。 3) 将 灭 了 菌 的 长 方形 叶片 切 成 6 mm X 8 mm KY), 4) 采用 MS 液体 培养 基 , 附 加 VB, (0. 4 mg/L), WLBEC100 mg/L), FEHR (30 g/L) IAA(2 mg/L) ` 激 动 素 (2 mg/L), A 50 ml 三 角 瓶 中 倒 人 15 ml 液体 培养 基 , 用 来 培养 外 植 体 。 5) 在 25C ,12h 光 周期 下 培养 。 6) 8~10 d 后 , 愈 伤 组 织 即 可 诱导 出 来 。 7) 根 形成 后 ,将 材料 转 人 加 有 IAA(4 mg/L) 和 激动 素 (4 mg/L) 的 同样 的 培 养 基 中 。 大 约 4 周 后 , 葵 叶 即 可 长 出 。 8) 将 培养 物质 转 人 不 加 任何 外 源 植物 激素 的 MS 基本 培养 基 以 促进 植株 的 形成 。 每 隔 3 一 4 周 需 进 行 继 代 培 养 。 9) 每 个 学 生 用 两 个 品种 作 材料 进行 培养 。 简 述 不 同 基因 型 对 诱导 的 影响 , 以 及 可 能 出 现 的 体 细胞 克隆 变异 和 细胞 学 变异 。 9. FRRA TENA BFE 1) HBR 4+ 4E (Petunia inflata) fh) 1 cm 长 的 节 间 葵 段 作 外 植 体 。 2) 配制 培养 基 。 | MS KICK HEME 20 g/L. KASEI 0. 2 mg/L. BRAK 0. 7 g/L \Nitsch 和 Nitsch 微量 元 素 。 H3 BOs 0. 5 mg/L Naz MoO, * 2H2O 0. 025 mg/L MnSQ, * 2H20 3 mg/L ZnSO, * 7H2O 0. 5 mg/L CuSO, + 5H20 0. 025 mg/L 3) 将 培养 物 放 在 24°C A K/17°CR HK. 16 b 光 周 期 下 培养 。 4) 大 约 培养 2 周 后 会 出 现 芽 。 第 一 部 分 基础 性 实验 533" 5) 将 芽 切 下 转 人 MS 基本 培养 基 培 养 , 芽 即 可 发 育成 带 根 的 完整 植株 。 6) 记录 不 同 基因 型 的 差异 .诱导 频率 (小 苗 数 / 外 植 体 数 ), 以 及 可 能 出 现 的 体 细胞 克隆 变异 和 细胞 学 变异 。 10. 杨 树 的 葵 段 培养 1) RRP A (Populus spp. ) 第 一 年 生长 的 嫩 枝 。 2) 取 1 一 2 cm RBA HAR AKT AATF 3) 培养 四 中 垫 一 层 激 动 素 (2 mg/L) 水 溶液 浸 湿 了 的 滤纸 ,将 茎 段 外 植 体 放 在 ine ARE, WO rE. 4) 几 星 期 后 , 愈 伤 组 织 便 诱 导出 , 紧 接 着 芽 即 长 出 。 【实验 报告 】 植物 组 织 培养 的 意义 是 什么 ? (#4) AAAI) 第 三 章 ”微生物 遗传 学 实验 13 粗糙 链 抱 霉 的 杂交 【实验 目的 】 1. 通过 对 粗糙 链 孢 霉 杂 交 产 生 的 子宫 孢子 的 观察 、 ieee 了 解 顺序 四 分 子 的 遗传 学 分 析 方 法 。 2. 观察 由 于 基因 转换 引起 的 异常 分 离 现 象 , 进 一 _ 步 验证 分 离 和 交换 规律 3. 学 习 并 掌握 重组 值 的 计算 方法 及 着 丝 粒 作 图 的 方法 。 【实验 原理 】 #H he Ef & ( Neuros pore crassa » 2n = 14) ATARI). FRA 、 球 壳 目 、 脉 孢 菌 属 ,其 菌 丝 体 是 单 倍 的 Cn = 7), 基因 型 能 够 直接 在 表 型 上 反映 出 来 ,而 且 生 长 快 . 易 培养 ,有 性 生殖 过 程 以 及 染色 体 的 结构 和 功能 类 似 于 高 等 生物 ,一 次 杂交 就 可 达到 高 等 二 倍 体 生物 一 次 杂交 和 一 次 测 交 的 目的 ,因而 被 广泛 地 用 作 遗 传 学 研究 的 材料 。 粗糙 链 孢 霉 的 生殖 方式 有 无 性 繁殖 和 有 性 繁殖 两 种 。 无 性 繁殖 方式 是 菌 丝 体 顶端 断裂 形成 的 分 生 孢 子 ( 分 生 孢 子 有 只 含 一 个 核 的 小 型 分 生 孢 子 和 含有 多 个 核 的 大 型 分 生 孢 子 两 种 ) 或 菌 丝 体 的 片段 ,经 有 丝 分 裂 直接 发 育成 菌 丝 体 , 菌 丝 体 可 再 生成 分 生 孢 子 , 如 此 周而复始 。 有 性 生殖 可 通过 两 种 方式 进行 。 其 一 是 一 种 结合 型 菌株 的 分 生 孢 子 落 在 另 一 种 结合 型 菌株 的 原子 吉 果 的 受精 丝 上 ,分 生 驳 子 的 细胞 核 进入 受精 丝 , 形 成 异 核 体 ,经 过 大 约 7 一 10 次 的 双核 并 裂 ( 有 丝 分 裂 ) ,最 后 两 种 接合 型 的 核 融 合 为 合子 核 。 另 一 种 方式 是 两 种 不 同 结合 型 菌株 的 菌 丝 连接 ,进而 发 生 核 的 融合 。 无 论 哪 种 方式 形成 的 二 倍 体 核 (合子 核 ) ,都 随 之 进行 减 数 分 裂 ,形成 4 个 单 倍 体 的 核 , 成 为 四 分 体 。 四 分 体 再 各 自 进行 一 次 有 丝 分 裂 , 结 果 使 每 个 子 吉 中 含有 8 FFRA 子 ,30 一 40 FFHRARKE-PREANHFRRE. FRA OCHA 30~60 min , 便 会 发 芽 ,长 出 菌 丝 ,再 度 开 始 繁殖 (图 1-18)。 RE i Be Fd Bs) EH FR EIS Ken AO He Ht I 所 以 一 对 等 位 基因 决定 的 性 状 在 杂交 子 代 中 就 能 分 离 。 在 粗糙 链 孢 霉 中 ,一 次 减 数 分 裂 产物 包含 在 一 个 子 吉 中 ,所 以 很 容易 看 到 一 次 减 数 分 裂 所 产生 的 四 分 体 中 一 对 基因 的 分 离 , 从 而 直观 地 证 明基 因 的 分 离 。 同 时 ,由 于 一 个 子 吉 中 间 的 空间 很 第 一 部 分 基础 性 实验 * 55° 小 ,8 AFF KA RAEI CEP ET TE AK) #424 20 pm Xx £ RAT wrms a aS pee a 200 wm, 而 每 个 子囊 孢子 “treat a “HB , KA 17~26 pm), RA “FR lease DERI — 一 aa5a Pas Sy 现 基 因 转 变 (gene tea conversion) .44 PRK oa nario ag A 菌株 有 某 一 遗传 性 状 的 ar 工 子囊 原始 om “a 差异 ,那么 杂交 形成 的 每 a aes 7S 胞 〈 肉 性 生殖 结构 ) 三 个 子 赛 孢 子 属于 一 种 iia 类 型 ,4 FHF 另 一 种 类 型 ,它们 的 分 离 比例 是 1: 1 ,而 且 子 训 稳 子 按 一 定 顺序 排列 。 如 果 这 一 对 等 位 基因 与 子 圳 孢子 的 颜色 或 形状 有 关 , 那 么 在 显微镜 下 可 以 直接 观察 到 子 妻 孢子 的 不 同 排列 方式 。 本 实验 用 赖 氨 酸 营养 缺陷 型 (Lys- ) 与 野生 型 (Lys+ ) 杂 交 , 得 到 的 子囊 孢子 分 离 为 4 个 黑 的 ( 王 ) 和 4 ASE). RAO LFF A Te Rw 蔓 迟 ,所 以 呈 灰 色 :- 根据 黑色 孢子 和 灰色 孢子 在 子 妻 中 的 排列 顺序 ,可 把 子 事 分 为 6 种 子囊 类 型 ， 图 I-18 粗糙 链 孢 霉 的 生活 史 ( 引 自 梁 彦 生 等 “1989) FHM), 十 十 十 十 一 子囊 型 (2): 一 一 一 一 十 十 十 十 子 吉 型 (3) : 十 十 一 一 十 十 一 一 FHM), 一 一 十 十 二 一 十 十 ere Pee ++—-— 44 (Pee FHM (6); 一 一 十 十 十 十 一 一 子宫 型 (1) 和 (2) 的 产生 如 图 1- 19 所 示 。 第 一 次 减 数 分 裂 (M ) 时 , 带 有 Lys 的 两 条 染色 单 体 移 向 一 极 ,而 带 有 Lys 的 两 条 染色 单 体 移 向 另 一 极 ,Lys / Lys” 在 第 一 次 减 数 分 裂 时 分 离 , 称 第 一 次 分 裂 分离 (first division segregration) 。 第 三 次 减 数 分 裂 (M; ) 时 ,每 一 染色 单 体 相互 分 开 ,形成 四 分 体 ,顺序 是 十 十 一 一 或 一 一 十 十 ,再 经 过 一 次 有 丝 分 裂 ,成 为 子宫 型 (1) 和 (2)。 形 成 这 两 种 子宫 型 时 ,在 22 SEAR Lys+/Lys- 间 未 发 生 过 交换 ,是 第 一 次 分 裂 分 离子 宫 , 也 属于 非 交换 型 子囊 。 子 寺 型 (3) 和 (4) 的 形成 如 图 1 - 20 所 示 。 由 于 Lys 基因 与 着 丝 粒 间 发 生 了 一 | 第 一 ree ue 。 55。 遗传 学 实验 教程 | 出 图 1-19 第 一 次 分 裂 分 离 《 引 自 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 ”1987) ® 个 交换 ,Lys+ /Lys- 在 第 一 次 分 裂 时 没有 分 离 , 到 第 二 次 减 数 分 裂 (M: ) 时 , 带 有 四 Lys+ 的 染色 单 体 才 和 带 有 Lys- 的 染色 单 体 相互 分 开 , 所 以 称 为 第 二 次 分 裂 分 离 | (second division segregration) 。 然 后 再 经 一 次 有 丝 分 裂 ,形成 4 个 孢子 对 ， 顺序 是 ， 十 十 一 一 十 十 一 一 或 一 一 十 十 一 一 十 十 。 这 是 第 二 次 分 裂 分 离子 事 | 图 1- 20 ”第 二 次 分 裂 分 离 (一 ) 《 引 有 自 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 ”1987) 子 吉 型 (5) 和 (6) 的 形成 与 3) 和 (4) 类 似 , 也 是 两 个 染色 单 体 发 生 了 交换 ,不 过 交换 不 是 发 生 在 第 二 条 染色 单 体 与 第 三 条 染色 单 体 之 间 , 而 是 发 生 在 1、3 BY 204 两 条 染色 单 体 之 间 ( 图 1- 21)。 1 SE TE AY adr AT A. FU PS PS EY HH A RA Ae ZB 间 发 生 了 一 次 交换 的 结果 ,所 以 ,子囊 型 (3) (4) (5)、(6) 亦 被 称 为 交换 型 子囊。 第 二 次 分 裂 分 离 的 子囊 愈 多 , 则 有 关 基 因 和 着 丝 粒 之 间 的 距离 愈 远 。 因 此 ,由 第 三 第 一 部 分 基础 性 实验 + 3% ~~ + ee ae 一 人 一 二 一， s + 7 = TP iain Bg 了 eee ee Dae - 党 = 心 ----- 二 - ete a ce =@--===5" eg ee el = a eo = — Se > ae ow + ---- -cd 一 一 一 一 一 一 一 -了 = 只 -一 = 一 一 图 并 二 2 第 三 次 分 列 分 离 ( 一 ) ( 引 自 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 ”1987) 次 分 裂 分 离子 宫 的 频 度 可 以 计算 某 一 基因 和 着 丝 粒 之 间 的 距离 , 称 为 着 丝 粒 距离 。 因为 交换 在 两 条 染色 单 体 之 间 发 生 而 与 另外 两 条 染色 单 体 无 关 , 而 每 发 生 一 次 交 换 , 产 生 一 个 第 二 次 分 裂 分 离子 吉 , 所 以 求 出 第 二 次 分 裂 分 离子 圳 在 所 有 子 吉 中 所 点 的 比例 ,再 除 以 2, 即 可 决定 某 一 基因 与 着 丝 粒 之 间 的 重组 值 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 赖 氮 酸 营养 缺陷 型 (Lys- ) ,野生 型 (Lys+ ) 。 2. 用 具 及 药品 1) 实验 用 具 显微镜 、 解 剖 镜 、 大 试管 或 培养 四 、 接 种 针 、 解 剖 针 、 钟 表 杀 子 酒精 灯 、 三 角 瓶 、 载 玻 片 \ 恒 温 培养 箱 .高压 灭 菌 器 。 (2) 药品 So ARIA. (3) 培养 基 1) 野生 型 用 培养 基 一 一 土豆 培养 基 ”新鲜 土豆 洗 净 去 皮 , 切 成 黄豆 粒 大 小 块 状 ,将 100 ml 水 加 热 至 沸 , 加 入 2 g 琼脂 溶解 ,然后 分 装 试管 ,每 管 2 一 3 ml, 加 入 5 抉 土豆 。 2) 缺陷 型 用 培养 基 一 一 补充 培养 基 将 土豆 培养 基 分 装 前 加 入 2 ml MAR 水 溶液 ,再 分 装 ,加 土豆 。 3) 杂交 用 培养 基 一 一 玉米 培养 基 ”将 玉米 浸泡 24 h JB. BC ll 2% ARAB 分 装 试管 后 ,每 管 加 入 2 一 3 粒 玉米 ,再 放 1 小 片 折 春 的 滤纸 (长 3 一 4 cm). “58 。 遗传 学 实验 教程 三 种 培养 基 配 好 后 , 塞 上 棉 塞 ,0. 056 MPa 灭 菌 30 min, 取 出 摆 成 斜面 备用 。 | 【实验 步骤 】 1. 菌 种 活化 把 野生 型 和 营养 缺陷 型 菌 种 从 冰箱 中 取出 ,分 别 接种 到 土豆 培养 基 和 补充 培 ， 养 基 上 ,活化 \ 扩 大 培养 ,28"C 3 一 5-d。 2. 接种 杂交 在 无 菌 条 件 下 或 酒精 灯 旁 ,分 别 取 野生 型 和 赖 氨 酸 营养 缺陷 型 菌株 的 少许 菌 ， 丝 或 分 生 孢 子 ,接种 到 同一 试管 的 玉米 培养 基 上 , 贴 好 标签 ,于 .25 恒温 箱 中 进行 培养 。5 一 7 d 后 可 见 到 棕色 原子 圳 果 出 现 ,以 后 原子 圳 果 变 大 变 黑 成 为 子囊 果 , 下 周 左右 即 可 观察 。 也 可 先 在 杂交 培养 基 上 接种 一 个 亲本 菌株 ,25@ 培 养 5 一 7 d 有 原子 圳 果 出 现 ， 后 ,将 另 一 亲本 的 分 生 孢 子 悬 浮 于 无 菌 水 中 ,加 到 形成 原子 吉 果 的 培养 物 表面 ,使 ， 表面 基本 湿润 即 可 ,继续 在 25C 下 培养 ,1 d 后 原子 圳 果 即 开始 膨大 ,7 d 后 即 成 熟 可 以 观察 。 3. 子 圳 果 的 收集 向 长 有 黑色 子囊 果 的 试管 中 加 入 少量 无 菌 水 ,摇动 片刻 , 倒 和 三角 瓶 中 ,加 热 二 煮沸 5 min, 以 防止 分 生 孢 子 飞散 。 4, Fee 取 一 载 玻 片 ,加 1 一 2 5 6 REE, FAA SE Hk MF 上 ,然后 覆 一 盖 玻 片 ,用 拇指 适当 压 片 ,将 子 圳 果 压 破 ,或 用 杀 子 赤 破 子 圳 果 。 5. 观察 统计 置 载 片 于 显微镜 低 倍 镜 下 ,找到 子囊 果 破 裂 量 大 量子 囊 分 散 的 视野 ,观察 子囊 孢子 的 颜色 表 型 和 在 子囊 中 的 排列 顺序 ,统计 结果 填 在 下 表 中 。 子 BK 型 观 察 数 子 eK 型 WR eK 十 十 十 十 一 一 一 一 一 一 十 十 一 一 十 十 一 一 一 一 十 十 十 十 一 一 十 十 十 十 一 一 十 十 一 一 十 十 一 一 6. 计算 Lys 基因 的 着 丝 粒 距 离 着 丝 粒 与 Lys 基因 间 的 重组 值 一 3 有 让 人 下 和 二 x x 100% 第 一 部 分 基础 性 实验 "59 【注意 事项 】 1, WEF RAT. BS iia SH. RN. BAP THY AR BA TEV BF AE A ER AO SRT TA) ACG UU As ABE A 变 为 黑色 ,无 法 辨认 两 种 性 状 。 2. 正常 情况 下 ,无 论 有 无 交换 ,野生 型 ( 黑 ) 与 缺陷 型 ( 白 ) 的 孢子 的 分 离 比 均 为 1: 卫 但 有 时 出 现 异 常 的 分 离 比 , 如 子 吉 中 的 不 同 孢 子 比 为 6: 2(2: 6) 或 5:3 《3 : 5), 这 是 由 于 基因 转变 造成 的 。 3 实验 用 过 的 恬 具 要 严格 消毒 灭 菌 ,用 过 的 实验 材料 经 5 min 煮沸 灭 杀 后 方 可 倒 掉 ,以 防 污染 环境 。 【实验 报告 】 1. 记录 所 观察 到 的 各 种 子宫 类 型 ,并 计算 出 交换 值 。 2. 绘 一 显微镜 下 观察 到 的 杂交 子宫 图 。 3. 说 明 粗 糙 链 孢 霉 的 分 离 现象 与 高 等 动 植物 的 基因 分 离 有 什么 不 同 ? 4. 简要 解释 计算 重组 值 时 为 什么 要 除 以 2。 ALE) 实验 14 WE BE pal AY ARS 【实验 目的 】 1. 了解 异 宗 配合 型 啤酒 酵母 的 生活 史 。 2. SOFIE AHA EE. 3. 掌握 酵母 菌 杂 交 的 基本 方法 。 【实验 原理 】 酵母 菌 属于 单 细 胞 真菌 ,与 其 他 真菌 一 样 , 可 以 以 单 倍 体 或 二 倍 体 状 态 存 在 。 不 论 是 单 倍 体 或 是 二 倍 体 , 它 的 营养 繁殖 一 般 是 通过 不 对 称 出 芽 方 式 进行 。 众 分 类 学 角度 看 ,大 多 数 酵 母 属于 子宫 菌 类 ,一 部 分 种 类 属于 担子 菌 类 。 遗 传 学 申 经 常 采用 的 是 一 种 子囊 酵母 一 一 啤酒 酵母 (又 称 面包 酵母 , Saccharomzyces cerevisiae) 。 当 两 个 不 同 接合 型 的 啤酒 酵母 单 倍 体 细胞 ( 称 为 a 或 w 结合 型 ) 混 合 后 可 以 融 合 形成 二 倍 体 细胞 。 将 二 倍 体 (a/a) 营 养 细 胞 放 在 孢子 形成 条 件 下 ,可 以 发 生 减 数 分 裂 ,形成 具有 4 个 孢子 的 子宫 ,其 中 两 个 a 型 和 两 个 型。 每 个 孢子 各 具有 一 个 单 相 的 核 , 当 子宫 孢子 接 在 营养 培养 基 上 约 6~S h 后 , 便 开 始 发 芽 , 长 成 单 倍 体 菌 株 。 具 有 这 样 生 活 史 的 酵母 菌 称 为 异 宗 接合 型 (heterothallism) 酵 母 。 异 宗 接合 型 啤酒 酵母 的 生活 史 如 图 1- 22。 5 BO\* 遗传 学 实验 教程 现 已 知 啤酒 酵母 共有 17 个 连锁 群 Gn = 17), 啤酒 酵母 的 a 或 两 种 接合 型 是 受 第 三 oO anh 连锁 群 上 的 一 对 等 位 基因 控制 2 th 的 。 两 种 不 同 接合 型 的 营养 缺 下 陷 型 的 酵母 单 倍 体 菌株 ,在 基 @ u 本 培养 基 上 都 不 能 形成 菌落 ， Ce) gs) ay SF RA EMA ATE MRE ©)a 种 细胞 ,才能 在 基本 培养 基 上 we F RHF 生长 。 二 倍 体 杂 种 细胞 在 形成 图 1-22 异 宗 接合 型 啤酒 酵母 的 生活 史 FRA PUES ARAM 《3 引 自 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 ”1987) 体重 组 PAE At A PEK 【材料 与 用 品 】 1. 材料 啤酒 酵母 单 倍 体 腺 味 叭 缺 陷 型 (ade ) ,接合 型 为 a; mE a ARAL ALA 47 (Hisl” ) ,接合 型 为 a。 2. 用 具 及 药品 (1) 实验 用 有 具 试管 .培养 四、 离心 管 、 离 心机 ` 石 英 砂 吸管 三角 烧瓶 . 涂 布 棒 。 | (2) 药品 ie | 生理 盐水 (0. 85 g NaCl WF 100 ml 蒸馏 水 中 ,0. 105 MPa KR 15 min, 44 Ze ig BN ts HE (3) 培养 基 | 1) 完全 液体 培养 基 RAK 2 g .酵母 浸出 汁 1 g. AH 2 g.7k 100 ml,pH 6.0,0.056 MPa 灭 菌 30 min, 2) 完全 固体 培养 基 ， 在 完全 液体 培养 基 中 加 2%% 琼 脂 。 3) 基本 液体 培养 基 葡萄 糖 10 g.NH)SO, 1 g.K, HPO, 0. 125 g.KH;PO， 0. 875 g\KI 母 液 1 ml\MgSO,。7H2O 0.5 g.CaCl, * 2H,O 0. 1g.NaCl 0.1 g. ft — 量 元 素 母 液 1 ml .维生素 母液 1ml、 水 1000 ml, pH 5. 3,0. 056 MPa KE 30min, KI 母 液 : 10 mg KI 于 100 ml 水 中 。 微量 元 素 母 液 : H;PO, 1 mg, ZnSO, » 7H,O 7 mg, CuSO, » 5H,0 1 mg, CoCl, * 6H:O 5 mg 水 100 ml, 维生素 母液 : 烟 碱 酸 40 mg 维生素 B 40 mg、 肌 醇 200 mg, KBR 20 mg, 物 素 0. 2 mg.7k 100 ml, 4) 基本 固体 培养 基 在 基本 液体 培养 液 中 加 2%% 琼 脂 。 O> & NF 第 一 部 分 基础 性 实验 - Ge 引产 孢子 培养 基 =CH;COONa 8. 2g. KCl 1. 86 gM BEER 1 ml .泛酸 母 M1 ml, + MAAR 1 ml HAS 20 g. 28H 7K 1 000 ml。 吡 多 醇 母 液 : 20 ml 吡 多 醇 /100 ml 7k. 泛酸 母液 : 20mg 泛酸 /100 ml 水 。 生物 素 母 液 : 2 mg 生物 素 /100 ml 水。 6) 补充 培养 基 © 基本 固体 培养 基 100 ml 加 组 氮 酸 3.5 mg. Q 基本 固体 培养 基 100 ml DNAS 3 mg. 【实验 步骤 】 1. 取 感 有 完全 固体 培养 基 斜 面 的 试管 4 支 ,把 ade” 和 Hisl- 两 菌 种 各 接种 在 两 只 斜面 上 ,30C 温 箱 中 培养 24 h。 2 用 5ml 生 理 盐水 洗 下 一 支 ade 斜面 上 的 菌 , 再 倒 人 另 一 支 ade 试管 中 ， 洗 下 菌 后 倒 人 无 菌 离心 管 中 。 另 取 5-ml 生理 盐水 洗 下 Hisl- 2 支 试管 斜面 的 菌 ， 倒 入 无 菌 离心 管 中 。 这 样 制 成 的 菌 液 ,浓度 约 10°/ml, 3. 两 亲本 菌 液 各 吸 0. 5 ml, BLA 5 ml 完全 液体 培养 基 中 ,30 人 CC 静止 培养 2 h。 4, 3000 r/min Bt) 3 min, 30°C PIL BEF 0.5 h, 5. AIF LIM. ITA SAR. HLA 6 ml 新 鲜 完 全 液体 培养 基 ,30C 培养 过 夜 。 6. 离心 , 倒 去 上 清 液 。 再 加 6 ml 新 鲜 完 全 液体 培养 基 , 洗 一 次 ,离心 , 倒 去 上 清 液 。 通 过 换 用 新 鲜 且 营养 丰富 的 培养 基 , 以 培养 出 好 的 新 鲜 细胞 ,并 使 不 同 接合 型 的 细胞 充分 接触 ,形成 合子 ,为 产生 孢子 创造 条 件 。 7. 将 离心 管 中 的 沉淀 菌 接种 在 产 孢子 培养 基 斜 面 上 ,30C 培 养 2 一 3 d。 在 显 微 镜 下 观察 杂交 后 形成 的 子 面 ,可 见 其 中 有 4 个 子囊 孢子 。 8. 测定 子囊 孢子 的 表 型 推断 其 基因 型 1) 在 长 有 子宫 的 斜面 上 加 基本 培养 液 2 ml, 用 接种 环 子宫 刮 下 , 倒 人 无 菌 离 心 管 中 。 2) 在 55 一 60C 的 恒温 水 浴 中 加 热 15 min, 杀 死 酵母 菌 的 营养 体 即 单 倍 体 细 胞 。 离 心 , 倒 去 上 清 液 , 加 生理 盐水 到 原 体积 ,形成 子囊 悬 液 。 3) 把 孢子 悬 液 倒 人 消毒 过 的 感 有 石英 砂 的 三 角 烧 瓶 各 振荡 5 min, FR 破碎 ,子囊 孢子 散 出 ,成 为 子 圳 苞 子 悬 液 。 也 可 用 蜗牛 酶 充分 处 理子 囊 后 ,再 用 超 声波 处 理 使 子 圳 孢子 充分 分 散 。 蜗 牛 酶 处 理 温 度 为 30~37" ,15 一 30 min, 4) 取 打 散 的 子 吉 孢子 悬 液 0. 1 ml 涂 布 在 完全 培养 基 培 养 下 上 , 30°C 培 养 48 h。 5) 以 上 面 的 培养 四 为 原始 培养 四 ,依次 影印 基本 培养 基 、 腺 嗓 叭 补充 培养 基 、 组 氨 酸 补充 培养 基 、 完 全 培养 基 ,30 人 培养 48 h。 * 62° 遗传 学 实验 教程 6) KEE @ 从 原始 培养 呀 上 挑 取 各 个 已 经 初步 鉴定 的 菌落 ;接种 | 在 完全 培养 基 斜 面 上 。 同 时 接种 在 有 5 ml 液体 完全 培养 基 的 离心 管 中 ,50C 墙 ， 养 48h。G@O) 3 000 r/min 离心 3 min, 倒 去 上 清 液 , 打 勾 沉淀 ,然后 离 恋 洗涤 3 次 ， 最 后 加 生理 盐水 至 原 体积 。@ 吸取 菌 液 0. 1 ml, 移 至 灭 过 菌 的 空 培养 别 中 。 然 后 倒 人 融化 后 冷 至 40~-50C 的 固体 基本 培养 基 , 播 匀 , 待 凝 。 各 做 Tim 在 每 一 培养 严 的 严 底 划分 4 格 , 两 格 放 少量 组 氨 酸 结晶 粉 未 , 另 两 格 放 少量 腺 顺 喉 ， 结晶 粉 未 。 然 后 放 到 30C 温 箱 培养 48 bh, © 观察 生长 情况 ,营养 缺陷 型 菌株 会 在 所 需 物质 的 周围 长 出 来 。 如 需 两 种 物质 ,就 只 能 在 两 种 物质 都 扩散 到 的 地 方 | 生长 。 | 1 | 因为 有 关 的 ade 和 Hisl 基因 属于 不 同 的 连锁 群 ,是 两 对 基因 的 自由 组 合 ,所 以 在 实验 结果 中 , 单 倍 体 基 因 型 的 比例 为 十 十 :ade + Hisl~ :ade Hisl =~ 1351:1: 1。 单 倍 体 菌株 的 表 型 比 也 应 为 1 : 1 : 1 : 1。 表 型 分 离 比 直接 反映 了 ， 基因 型 的 分 离 比 ， 【实验 报告 】 * 1. RE ER SRILA BSE SEHEIE BR A CREAR FE“ ESR RABE KFS” £m). 基本 培养 基 RGR scare ”组 氢 酸 补充 培养 基 ”完全 培养 基 单 倍 体 基因 型 ， 生长 情况 菌落 数 2. 分 析 解 释 实验 结 果 。 ( 赵 建 萍 ) Si 15 E.coli AEE | : 【实验 目的 】 l. 了解 E.coli 下 因子 的 性 质 及 作用 。 2. 掌握 下 .co 杂交、 遗传 重组 的 原理 。 3. 学 习 五 .col 杂交 的 方法 。 【实验 原理 】 Hayes(1952) Ail FW E. coli 营养 缺陷 型 和 抗菌 素 抗 性 突变 型 进行 正 反 杂 欧 ” BMT E. coli 的 致 育 因子 (frtility factor, 称 下 因子)。 根 据 F 因 子 的 有 无 ， 已 . co 可 分 为 FF 和 下 两 类 。 带 有 下 因子 的 细菌 表面 具有 一 种 称 为 性 伞 毛 的 后 第 一 部 分 基础 性 实验 人 状 突起 ,长 1 一 20 wm。 性 伞 毛 上 有 雄性 专 一 噬菌体 (MS2、K17 fb、QB 等 ) 的 吸 附 位 点 ,又 和 细菌 的 结合 有 关 。 下 因子 在 细胞 中 能 以 两 种 状态 存在 , 即 游 离 状 态 或 整合 到 寄主 染色 体 的 一 定位 置 上 ,从 而 使 带 有 下 因子 的 细菌 分 为 FE 和 Hfr 两 类 菌株 。 E. coli 杂交 在 FE 和 Hfr 45 FO 菌株 之 间 进 行 , 通 过 细胞 的 暂时 沟通 ,形成 局 部 合子 。 在 部 分 合子 形成 中 , 提供 部 分 染色 体 或 少数 基因 的 菌株 称 为 供 体 菌 , 而 提供 整个 染色 体 的 菌株 称 为 受 体 菌 。 所 以 说 ,FE 和 Hfr 是 供 体 菌 ,F- 是 受 体 菌 。 F* 和 Hfr 菌株 都 能 与 杂交 ,但 两 种 杂交 组 合 的 结果 不 同 , 主 要 表现 在 : © Htfr 和 FI 杂交 后 E 细菌 性 质 不 变 , FoF 杂交 后 FE RBA FY 70%);@ F* Al E> 细菌 杂交 重组 频率 10 ,而 Hf 和 下- 杂交 重组 频率 为 前 者 的 几 百 倍 , 故 称 为 高 频 重 组 。 究 其 原因 主要 是 在 FOF 因子 独立 于 染色 体 之 外 , 呈 游离 状态 , 它 的 高 频 转 移 与 供 体 菌 当 色 体 基因 的 转移 没有 关系 ;但 在 Afr 中 ,F 因 手 是 整合 在 染色 体 的 一 定 部 位 上 ,转移 时 由 下 因子 内 的 原点 作 起 点 ,此 时 ,F 因子 被 割裂 ,F 因子 的 一 部 分 基因 首先 进入 受 体 菌 , 另 一 些 却 留 在 了 最 后 。 在 这 类 杂 交 申 , 供 体 染 色 体 上 的 一 些 基 因 随 原点 很 容易 转移 到 受 体 菌 中 ,但 只 有 杂交 过 程 足够 长 时 , 供 体 细胞 中 下 因子 的 后 一 部 分 方 能 进入 受 体 细 胞 , 受 体 细胞 才能 由 下 变 4 Hfr. 细菌 杂交 实验 的 方法 有 多 种 ,我 们 介绍 直接 混合 培养 法 和 液体 培养 法 。 前 者 操作 简单 , 适 于 确定 两 个 菌株 能 否 杂 交 或 测定 重组 频率 ;后 者 适 于 细菌 的 基因 定位 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 E. coli 的 于 个 菌株 , 即 K12Pro(CA)F+、W1485His Ile F* 、W1177Thr Leu Thi Xyl Gat Ara Mtl Mal Lac Str*(A)F~ 和 Hfr C Met Trp. 2. 用 具 及 药品 (1) 实验 用 具 灭 菌 的 培养 下 (9 cm) .三 角 瓶 (150 ml) .吸管 (1.5、10 ml) .离心 管 . 试 管 等 。 (2) 培养 基 1) 基本 培养 基 Vogel 50 X, MgSO, » 7H,O 10g、 柠 檬 酸 100g、 NaNH, HPO, +» 4H,O 175 g.K, HPO; 500 g(K, HPO, « 3H,O 644 g) , 配 好 后 放 和 人 冰箱 保存 备用 。 此 配 好 的 培养 基 浓 度 为 使 用 浓度 的 50 倍 。 将 称 好 的 药品 分 别 溶解 于 670 ml 蒸馏 水 中 , 待 一 种 药品 溶解 后 再 放 另 一 种 药 品 , 直 至 全 部 药品 都 溶解 ,然后 加 水 定 容 到 1 000 ml, 2) 平板 用 基本 培养 基 2 ml Vogel 50X、 葡萄 糖 2 g .琼脂 2 g. ARTA IK + 68 * 遗传 学 实验 教程 98 ml, pH 7. 0,0. 056 MPa 高 压 灭 菌 30 min, 3) 液体 完全 培养 基 ( 肉 汤 培 养 基 ) “FATE 0.5 g EAR 1 g.NaCl 0.5 2.7 饮水 100 mg,pH 7. 2,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 4) 半 固 体 培养 基 琼脂 0. 7~1 g\ 蒸 饮水 100 ml, pH 7. 0,0. 105 MPa HE 菌 15 min, 【实验 步骤 】 1. MRI 1) 实验 前 14~16 h, 从 冰箱 保存 的 菌 种 斜面 挑 取 少 量 菌 种 转 接 于 成 有 5m “完全 液体 培养 基 的 三 角 瓶 中 ,每 一 菌株 接 一 瓶 , 置 37 人 培养 过 夜 。 | 2) 取出 培养 过 夜 的 细菌 ,在 W1177 一 瓶 中 加 入 5 ml 新 鲜 的 完全 培养 基 液 , 摇 匀 后 等 量 分 为 2 瓶 。 其 余 3 瓶 分 别 用 ml 吸管 各 吸出 2. 5 ml, 然 后 各 加 入 2.5ml 新 鲜 完 全 培养 液 ,充分 摇 勺 。 各 菌 液 均 置 37C 恒 温 播 床 继续 培养 3 一 5 h。 3) 自 温 箱 取出 三 角 瓶 ,分 别 倒 人 离心 管 , W1177 菌株 倒 两 只 离心 管 , 其 余 菌 株 ， 各 倒 人 一 支 离 心 管 ,离心 沉淀 ,3 500 r/min, 离 心 10 min, BOR. HK EGR. MM 无 菌 水 悬浮 菌 体 ,同样 方式 离心 洗涤 3 次 ,最 后 加 无 菌 水 至 原 体积 。 2. BRACES) 1) 取 12 支 灭 菌 试管 ,每 支 吸入 3 ml 经 融化 的 半 固 体 培养 基 , 保 温 在 45°C ae 2) 12 支 试管 分 为 三 个 杂交 组 合 , 即 W1177 x K12Pro, W1177 X W1485, W1177XHfrC。 每 个 组 合 4 支 试管 ,其 中 2 支 作为 对 照 ,2 支 作 混合 菌 液 杂交 用 。 向 对 照 组 试管 中 吸 加 供 体 F* 或 Hfr 菌 液 1 ml, 其 余 按 杂 交 组 合 各 吸 加 供 体 菌 和 受 体 菌 0. 5 ml ,充分 混 匀 。 | 3) 将 各 试管 中 含 菌 的 半 固 体 倒 在 有 Vogel FEM ERE BUG. SE 37 人 条 件 下 培养 ,48 h 后 观察 。 【注意 事项 】 1. E. coli 中 除了 不 同型 细胞 结合 外 ,同型 细胞 F+ 与 EF+ 和 fe 与 Hfr 也 能 接 合 ,但 重组 频率 很 低 。 这 主要 是 由 于 下 因子 是 细胞 壁 抗 F 原 发 生变 化 ,不 同 于 了 | 性 菌 毛 的 表面 成 分 阻止 了 F+ 与 F+ 细胞 之 间 的 杂交 。 2. 带 有 下 因子 的 下 coli @ F* Al Hfr 两 类 ,实际 上 并 不 是 所 有 的 Hfr 都 很 稳 定 ,在 许多 Hi 群体 中 有 回复 子 。 在 这 些 回复 子 中 ,F 因子 不 再 整合 到 染色 体 上 5 而 是 重新 游离 出 来 。 重 新 游离 的 F 因子 往往 带 有 细菌 染色 体 上 的 基因 ,如 iac 和 gal 等 基因 , 称 之 为 下 因子 。 带 有 下 ' 因 子 的 菌株 也 能 和 下 -杂交 3. 实验 过 程 中 的 全 部 操作 均 应 为 无 菌 操作 ,尽量 避免 杂 菌 污染 ,用 过 和 无 用 的 菌 液 均 应 灭 菌 后 再 倒 掉 。 me 第 一 部 分 基础 性 实验 + 65 + 【实验 报告 】 1. 将 实验 结果 填 于 下 表 , 并 对 实验 结果 进行 分 析 。 组 重 组 子 数 m| 组 = 号 | 合 A | W1177XK12pro | W1177 X W1485 W1177 X HfrC A 对 照 K12pro 2. 如 何 用 五 .coli 杂交 进行 基因 定位 ? ( 赵 建 萍 ) 实验 16 细 需 的 局 限 性 转 导 【实验 目的 】 本 实验 利用 噬菌体 (A) 专 一 性 转 导 半 乳 糖 发 酵 基因 (gal) 现 象 ,说 明 局 限 性 转 导 的 基本 原理 ,进一步 证 明 DNA 是 遗传 物质 ,学 习 并 掌握 转 导 实验 的 基本 方法 。 【实验 原理 】 。 转 导 是 指 以 只 菌 体 作为 媒介 ,将 某 一 细胞 ( 供 体 ) 的 基因 导入 另 一 细胞 ( 受 体 ) 的 过 程 。 转 导 可 分 为 两 大 类 : 一 是 普遍 性 转 导 , 即 可 转 导 供 体 细胞 的 任意 一 个 基 困 ; 二 是 局 限 性 转 导 , 只 能 转 导 供 体 细胞 的 某 些 特定 基因 。 转 导 现 象 的 发 现 进一步 说 明 DNA 是 遗传 物质 。 目 前 转 导 已 作为 基因 精细 分 析 的 常用 方法 。 本 实验 进行 局 限 性 转 导 ,采用 的 供 体 菌 为 下 coli 溶 源 性 菌株 E. coliKy, Gy)gal+ ,由 于 噬菌体 (》) 与 半 乳 糖 发 酵 基 因 (gal) 紧 密 联 锁 , 所 以 能 在 细菌 中 专 一 性 转移 半 乳 糖 发 酵 基因 。 当 此 细菌 受 紫外 线 照射 后 ,噬菌体 被 诱发 释放 ,并 以 一 定 的 比例 形成 转 导 噬菌体 ( 带 有 供 体 细菌 的 半 乳 糖 发 酵 AA AAAS REA HIME RK), FES UK Ae E. coliK,(A) gal” (HEE) UV | (We Bal RAR AE 细菌 E. coli 混合 接触 , 带 有 供 体 菌 DNA 片段 (外 基 OUsgal+ ( 转 导 噬菌体 ) 因子 ) 的 转 导 鸣 菌 体 以 一 定 的 频率 整合 到 寄主 染色 体 | 上 ,使 原来 不 能 利用 半 乳 糖 的 受 体 细胞 变 为 能 利用 半 kaSgal-〈 受 体 ) 乳糖 的 细菌 。 整 个 过 程 如 图 1 - 23 所 示 。 【材料 与 用 品 】 ki2Sgal-/ (gal/( 杂 基因 子 ) 1. 材料 图 1-23 供 体 菌 株 E. coliK,: (A) gal* , 受 体 菌株 ( 周 国 利 做 ) E. coliK,,Sgal- 。 2. 用 具 及 药品 。66 。 遗传 学 实验 教程 (1) 试验 用 有 具 培养 四 (9 cm) = fA fi (150 ml)、 吸 管 (1.5、10 ml) 离心 管 、 试 管 (15 cm X 1.5 cm) 玻璃 涂 棒 ,离心 机 \ 水 浴 锅 、 紫 外 线 照射 箱 ` 温 箱 、 接 种 环 。 (2) 药品 氯仿 、 磷 酸 缓冲 液 (KH,PO, 2 g,K, HPO, 7 g,MgSO,。7H;O 0. 25 g, 1B kK 1 000 ml,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min) .生理 盐水 (NaCl 8. 5 g, 蒸 饮水 1 000 ml, 0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min), (3) 培养 基 1) 肉 汤 液 体 培 养 基 FAS g. As 10 g.NaCl 0. 5 g 蒸馏 水 1 000 ml, pH 7. 0~7. 2,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 2) 加 倍 肉 汤 液 体 培养 基 (2E) 牛肉 襄 0. 5 g. ARK 1 g.NaCl 0.5 g 蒸馏 水 50 ml, pH 7. 0 一 7. 2,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 3) 肉 汤 半 固 体 培 养 基 ” 肉 汤 液体 培养 基 中 加 1%% 的 琼 4) 肉 汤 固 体 培养 基 ” 肉 汤 液体 培养 基 中 加 aia 5) RFLP EMBER FLT Y 0.4 g\ 美 蓝 0. 06g EFLH 10 2, SR 10g K, HPO, 2 g、 琼 脂 20 g, 218 7k 1 000 ml, pH 7. 0 一 7. 2,0. 056 MPa 高 压 灭 菌 25 min, 6) Vogel 50X 基 本 培养 基 ( 浓 缩 50 倍 的 基本 培养 基 ) MgSO:,。7H2:O 10 g、 柠檬 酸 100 g, NaNH, HPO, .4H:O 175 g,.K,HPO, 500 g. 28 87k 72 41 000 ml, 配 好 后 放 冰 箱 备用 。 7) 半 乳 糖 基本 固体 培养 基 ”2 ml Vogel 50X . 半 乳 糖 2 g、 优 质 琼脂 粉 1. 8 g、 蒸馏 水 98 ml, pH 7. 0,0. 056 MPa 高 压 灭 菌 25 min, 【实验 步骤 】 1. 鸣 菌 体 的 诱导 和 裂解 液 的 制备 (1) 供 体 菌 的 活化 与 培养 取 一 环 供 体 菌 ,接种 于 盛 有 5 ml 肉 汤 液 体 培养 基 的 三 角 瓶 中 ,在 37 条 件 下 培养 16h 后 , 吸 0.5 ml 菌 液 接种 于 盛 有 4. 5 ml 肉 汤 液 体 培养 基 的 三 角 瓶 中 ,继续 培养 4~6 h, (2) 制备 悬浮 液 将 三 角 撼 中 菌 液 倒 人 离心 管 , 以 3 500 r/min, 离 心 10 min, 这 样 反复 洗 三 制备 成 悬浮 液 。 (3) 诱导 裂解 取 悬 浮 液 3 ml 于 培养 下 中 ,经 紫外 线 (UV) 处 理 (15 W. PES 40 cm), 导 10 一 20 s。 第 一 部 分 基础 性 实验 “。67 ， (4) 避 光 培养 UV 处 理 后 ,加 入 .3 ml 2E 肉 汤 液 体 培养 基 , 在 37 人 条 件 下 避 光 培养 2 一 3 h。 (5) 制备 裂解 液 吸取 培养 物 于 离心 管 中 , 以 3 500 r/min, 离心 10 min, 吸 取 上 清 液 ,再 加 入 0. 21 ml 氯仿 (4 一 5 滴 ) 剧 烈 振 荡 30 s, 静 置 5 min, 把 上 清 液 用 无 菌 吸管 转移 到 另 一 试管 ,就 制 成 吻 菌 体 (X)gal* 的 裂解 液 。 2， 鸣 菌 体 的 效 价 测定 (1) 受 体 菌 的 活化 与 培养 挑 取 一 环 受 体 菌 ,接种 于 万 有 5 ml 肉 汤 的 离心 管 中 , 在 37C 条 件 下 避 光 培养 16 h。 然 后 从 受 体 菌 培养 液 中 吸取 0. 5 ml, 放 和 人 盛 有 4. 5 ml 肉 汤 液体 培养 基 的 三 角 瓶 中 ,继续 培养 4 一 6 h, 作 指示 菌 用 ,剩余 的 菌 液 用 于 点 滴 法 转 导 实验 ,随即 放 人 冰箱 中 保存 , 供 涂 布 转 导 实验 用 。 (2) 双 层 培养 测 效 价 1) 取 已 经 熔化 并 于 45C 保 温 的 半 固 体 琼 脂 试管 4 支 , 每 支 加 上 述 的 指示 菌 液 0.5 ml, 2) HRW PA AR SU AER 0.5 ml, BLA BEA 4.5 ml 肉 汤 液 体 培养 基 的 试管 中 ,依次 稀释 到 10 °S 10-8, 3) 从 稀释 的 10“、10“ 倍 试管 中 分 别 吸取 0. 5 ml 裂解 液 , 加 到 有 指示 菌 的 半 固 体 琼脂 中 (每 个 稀释 做 成 2 支 ) , 摇 匀 ,分 别 倒 人 备 好 的 肉 汤 固 体 培养 下 中 ES). RPE 37C 培 养 过 夜 ,观察 出 现 噬 菌 斑 数 ,并 计算 喉 菌 体 裂解 液 效 价 。 效 价 (单位 /ml) 王 两 培养 下 中 平均 斑 数 义 稀释 倍数 X 取 样 量 折算 数 。 3， 转 导 (1) 点 滴 法 1) 取 倒 好 的 EMB 培养 基 培养 四 2 只 ,在 严 底 用 玻璃 铅笔 按 图 1 - 24 的 样子 画 好 2) 取 一 满 环 受 体 菌 , 涂 出 一 条 菌 带 , 共 涂 两 条 ,在 37C 条 件 下 培 RUSh. ei 3) 取出 培养 下, 在 两 个 圆圈 和 四 外 方 格 处 ,各 加 一 环 喉 菌 体 裂解 液 ,两 Wie al FAS eH 个 圆圈 作为 对 照 , 四 个 方 格 作 为 转 导 图 1- 24 点 滴 转 导 涂 正法 处 理 , 培 养 2 天 ,观察 结果 。 ( 引 自 河北 师范 大 学 等 “1982 或 傅 焕 延 1987) (2) 涂 布 法 或 傅 焕 延 等 ”1987 1) 取 倒 好 的 EMB 培养 基 培养 四 6 只 ,其 中 2 只 加 0. 1 ml 叭 菌 体 裂解 液 , 用 于 对 照 ;2 只 加 0. 1 ml 受 体 菌 ,也 用 于 对 照 , 另 2 只 加 入 鸣 菌 体 裂 解 液 和 受 体 菌 液 > 68 。 遗传 学 实验 教程 450. 05 ml, 2) FABER ES IL A ae SRO EH RD PRE AA 一 根 玻璃 涂 棒 , 在 37°CAR UE FIRE 2 d, 观 察 结果 。 【实验 报告 】 1. 按 下 表 要 求 观察 记录 数据 ,并 分 析 实 验 结果 。 噬菌体 效 价 测定 噬菌体 来 源 ZR WC PEE 取样 /ml ni ER Wie A RENE /ml DME 2 nea | ‘ 细菌 转 导 结果 记录 表 mR of OO Rm tw 、 | ete +e 受 体 菌 十 只 菌 受 体 曾 | meio sa taiaete zr | mi oealiER Kam 菌落 生长 情况 菌落 色泽 2. 在 做 局 限 性 转 导 实验 中 应 注意 哪些 问题 ?为 什么 ? ( 赵 建 萍 ) 第 四 章 ”数量 和 群体 遗传 学 实验 17 Hardy- Weinberg 遗传 平衡 定律 的 检验 【实验 目的 】 通过 对 人 和 群 若干 嗅 国 的 测量 与 分 析 , 学 会 人 类 群体 遗传 调查 的 基本 方法 ,了 解 中 华 民族 各 地 方 群体 嗅觉 相关 基因 的 频率 与 分 布 , 利 用 Hardy - Weinberg 遗传 平 衡 定 律 检 验 嗅觉 基因 是 否 处 于 遗传 平衡 状态 。 【实验 原理 】 嗅觉 是 由 嗅 上 皮 中 嗅 细胞 的 嗅 党 受 体 接 受气 味 分 子 的 化 学 信号 ,通过 神经 传 导 在 嗅觉 中 枢 产 生 的 反应 。 不 同 的 气味 分 子 与 不 同 的 嗅 党 受 体 组 合 相 互 作用 , 产 生出 多 种 多 样 的 嗅觉 。 各 种 嗅觉 受 体 蛋白 则 是 由 不 同 的 基因 编码 的 。 嗅 觉 受 体 基 因 的 差异 造成 了 不 同 个 体 ` 不 同人 群 和 不 同 种 族 之 间 嗅 觉 的 遗传 差异 。 疾 病 等 其 他 因素 也 可 以 引起 嗅觉 差异 。 自从 嗅觉 受 体 基因 首次 被 鉴定 以 来 ,这 些 基 因 及 其 编码 的 受 体 吸引 了 越 来 越 多 的 注意 。 学 者 们 估计 ,人 类 有 将 近 1 000 个 嗅觉 基 因 ,分 布 于 除 20 SAY 之 外 的 所 有 染色 体 上 ,组 成 了 基因 组 中 最 大 的 基因 家 族 。 其 中 约 72%% 由 于 移 框 突变 或 终止 突变 等 而 成 为 假 基因 。 嗅 觉 受 体 基 因 或 类 嗅觉 受 体 基因 在 嗅 上 皮 中 大 量 表 达 , 但 也 在 其 他 不 相关 的 组 织 如 学 丸和 心脏 中 表达 。 有 学 者 认为 ,这 反应 了 这 些 基 因 编 码 的 蛋白 质 可 能 具有 多 种 功能 。 嗅觉 受 体 基 因 的 重要 特征 之 一 是 在 一 个 任意 给 定 的 嗅觉 受 体 神 经 元 中 , 只 表 达 一 对 等 位 基因 中 的 一 个 成 员 。 排 斥 另 一 等 位 基因 和 其 他 基因 的 机 制 尚未 完全 明 节 。 另 一 方面 ,一 种 受 体 却 能 以 不 同 的 亲和力 与 许多 种 不 同 的 气味 分 子 结合 。 此 推测 ,气味 密码 可 能 是 一 种 组 合 密码 , 即 一 种 特定 的 气味 或 气味 混合 物 的 刺激 对 所 有 的 嗅觉 细胞 都 有 不 同 程度 的 激活 。 最 近 , 正在 用 若干 表达 系统 和 配 体 与 受 体 的 分 子 模型 相 结 合 的 方法 ,研究 气味 分 子 结合 的 机 制 。 已 经 有 证 据 显 示 ,气味 分 子 是 通过 与 嗅觉 受 体 的 结合 口袋 (binding pocket) 相 互 作 用 产生 最 初 信号 的 。 嗅 觉 受 体 的 结合 口袋 与 其 他 G -蛋白 偶 联 受 体 相 似 , 但 其 特定 残 基 能 更 广泛 地 与 气味 配 体 相 结合 。 多 种 嗅觉 差异 可 以 通过 简单 的 嗅觉 测量 实验 检 出 。 用 一 组 不 同 浓度 的 嗅觉 物 质 可 以 测量 出 不 同 个 体 对 该 物质 的 嗅觉 敏感 性 差异 ,进而 汇总 成 测试 群体 的 嗅 阔 | | “a es 遗传 学 实验 教程 分 布 图 , 供 进一步 分 析 利 用 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 桂花 、 薄 荷 等 食用 香精 。 2. 期 具 与 药品 乙醇 乙酸、 乙醚、 氨水 等 国产 AR 级 试剂 ,无 菌 水 。 以 0. 03% CW/V) EE 1 荷 香精 为 13 号 母液 ,依次 按 1/2 倍 作 倍 比 系列 稀释 成 第 12~1 号 薄荷 香精 深 | 液 。 桂 花香 精 、 乙 醚 、 氨 水 试 液 的 配制 方法 与 浓度 系列 同上 。 乙 醇 与 乙酸 的 试 液 | 则 分 别 以 25%(V/V) 乙 醇和 1%(CV/V) 乙 酸 为 母液 ,同样 按 1/2 倍 作 倍 比 系列 | 依次 稀释 成 第 12~1 号 溶液 。 因 嗅 味 溶液 容易 挥发 ,各 种 试 液 均 应 现 配 现 用 . 四 烧杯 、 锥 形 瓶 . 量 简 、 试 剂 瓶 等 (所 有 用 具 均 经 干 热 灭 菌 或 湿热 高 压 灭 菌 后 ;次 却 待 用 ) 。 i 【实验 步骤 】 ay 1. SFE ES 5D YI PA SP I ae SR DB | 先 由 教师 演示 嗅 味 方法 : BRR TE. KAP RO, 稍稍 吸 气 并 试 着 说 出 自己 的 感觉 。 然后 ,学 生 依次 从 低 浓 度 溢 液 向 高 浓度 溶液 逐一 闻 过 ,并 说 出 用 号 溶液 感觉 有 味道 ( 即 其 察觉 阔 ) 。 之 后 ,让 学 生 再 继续 闻 下 去 ,直到 说 出 所 测 物质 的 准确 名 称 状 ， 止 ( 即 其 识别 阔 ) 。 如 此 反复 测试 三 次 ,以 其 中 相同 的 2 次 或 3 次 数据 为 准 : 最 后 , 记 下 所 得 “pe F 2. SZ Seas 根据 学 生 数 的 多 寡 , 确 定 每 组 每 次 测定 1 一 2 A AR 其 他 物质 的 嗅 阔 测 定 , 可 以 组 织 研究 小 组 课外 进行 ,也 可 以 组 织 学 生 作 更 广泛 的 社会 调查 为 防止 学 生 之 间 相 互 影响 ,最 好 逐个 单独 测试 ,并 尽量 不 使 测试 过 的 学 生 与 待 测 学 生 接 触 。 3. 实验 记载 与 结果 分 析 对 每 二 种 嗅觉 物质 的 嗅 测 量 结果 (以 乙醇 嗅 半 测 量 结果 为 例 ), 均 记 人 表 中 ， 或 以 统计 图 的 形式 给 出 实验 结果 ,并 作 分 析 。 乙醇 嗅 阔 测量 数据 统计 溶液 编号 ] 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 察 党 人 数 识别 人 数 第 一 部 分 基础 性 实验 a) 人 数 os888SS5S 1 2 3 4 5 8 有 10 M1 12 ¥4 13 sata ZWEI BR \ 4} Ah I HSH FY EWE ER, ARE TZ. EM A BR OE TR PE AR | 种 类 型 : ARR AA 1 ~6 Ss HRA AR Ee | 围 为 第 7 一 13 号 液 。 依据 对 乙醇 嗅 味 的 识别 阔 , 则 可 将 被 测 群 体 分 为 三 种 类 型 : @ 高 度 敏 感 型 ， 国 值 范围 为 第 1 一 6 号 液 ;@) 中 度 敏 感 型 , 国 值 范围 为 第 7 一 11 号 液 ;G) 不 敏感 型 或 称 嗅 盲 型 , 阔 值 范围 为 第 12 一 13 号 液 。 【实验 报告 】 如 果 对 乙醇 嗅 味 的 识别 能 力 由 一 对 等 位 基因 S- s 控制 ,敏感 为 不 完全 显 性 瞪 ) 不 敏感 为 隐 性 (s), 设 一 群体 有 高 敏 型 (SS)76 人 、 中 敏 型 (Ss)60 人 ,不 敏感 型 或 嗅 (ss)10 人 大。 请 计算 出 嗅 盲 率 和 基因 频率 ,进一步 用 Hardy - Weinberg 定律 检验 该 群体 是 否 处 于 遗传 平衡 状态 。 ( 刘 林 德 ) 实验 18 ”环境 因素 对 果 蝇 发 生 量 的 影响 【实验 目的 】 学 习 测定 果 蝇 发 生 量 与 温度 和 基因 型 之 间 的 定量 关系 ,加 深 理 解 基因 型 与 环 境 相互 作用 的 机 理 。 【实验 原理 】 本 实验 中 ,教师 提供 给 学 生 3 或 5 个 恒温 培养 箱 、. 野 生 型 和 若干 突变 型 纯 种 果 蝇 , 学 生 经 过 实验 小 组 讨论 决定 使 用 何 种 温差 梯度 .哪些 果 蝇 类 型 和 具体 实验 方 案 , 整 个 实验 过 程 是 在 完全 开放 的 状态 下 进行 的 。 实 验 过 程 中 涉及 定时 记录 果 蝇 的 发 生 量 ,要求 学生 在 一 段 时 间 内 安排 好 实验 与 其 他 课程 之 间 的 关系 ,如 实 记 录 实 验 中 出 现 的 现象 和 问题 ,并 做 出 自己 的 分 析 和 判断 。 sr 遗传 学 实验 教程 【材料 与 用 品 】 1. 材料 普通 果 蝇 野生 型 及 不 同 突变 型 果 蝇 。 2. 用 具 及 药品 恒温 培养 箱 烘箱 、 双 简 解 剖 镜 、 双 目 显 微 镜 、 放 大 镜 RET SS 白 瓷 板 、 载 玻 片 、 盖 玻 片 毛笔、 白板 纸 ERS. 乙醚 、 玉 米粉 . 糖 .酵母 粉 丙 酸 、 琼 脂 等 。 【实验 步骤 】 1. 配制 培养 基 培养 果 蝇 用 的 容器 可 以 是 粗 指 管 或 广 口 瓶 ,这 些 容器 及 其 棉 塞 均 需 在 实验 前 ， 进行 高 温 灭 菌 才能 使 用 。 可 以 按 如 下 成 分 进行 培养 基 配 制 : 玉米 粉 28 gH 22 g. 琼脂 2.5 g .酵母 粉 2.5 g\ 水 250 ml, AR 2 ml. 将 玉米 粉 , 糖 、 琼 脂粉 和 水 混合 在 容器 内 ,在 电炉 上 加 热 , 不 断 用 玻璃 棒 搅 拌 以 免 痢 糊 。 者 沸 后 稍 放 置 冷却 ,将 酵母 粉 和 两 酸 加 入 ,用 玻璃 棒 搅 拌 均匀 后 分 装 到 经 高 温 灭 菌 的 培养 瓶 内 , 塞 上 棉 塞 , 置 温 箱 内 备用 。 ; 2. 恒温 培养 箱 的 温度 设 定 及 果 蝇 的 培养 二 准备 3 一 5 个 恒温 培养 箱 , 设 定 每 个 培养 箱 的 温度 使 它们 形成 温度 梯度 ,如 15 .C18C), 217, (24°C), 27C BR IST, (19°C) 23°C) C27°C)A 3UO BRAC 20C、25C 等 。 向 新 配制 培养 基 的 瓶 内 转 接 不 同 基 因 型 的 \. 相 同 对 数 的 成 蜗 (3~5 对 ) ,放置 在 不 同 温度 的 恒温 培养 箱 内 培养 ,定时 观察 记录 果 蝇 的 发 育 进程 ,统计 不 同 温度 下 果 蝇 的 发 生 量 , 记 和 人 表 (1- 15). 表 1-1S 果 蝇 发 生 量 记 录 表 果 蝇 基因 型 15° 18 21°C 24°C Ane 野生 型 突变 型 1 突变 型 2 结果 的 统计 与 分 析 分 别 设 定 纵 坐 标 和 横 坐 标的 变量 ,绘制 温度 - 果 蝇 发 生 量 关 系 曲线 、 基 因 型 采 和 蝇 发 生 量 关 系 曲线 ,得 出 实验 结论 。 【实验 报告 】 1. 不 同类 型 的 果 蝇 在 发 生 量 上 有 什么 差异 ? 2. 观察、 比较 所 经 CR 果 蝇 发 生 量 关 系 曲 线 、 基 因 型 果 蝇 发 生 量 关 系 曲 线 ,可 以 分 别 得 出 哪些 ( 刘 林 德 ) 第 五 章 分 了 于 遗传 学 实验 19， 高 等 植物 总 DNA 的 提取 和 纯化 【实验 目的 】 学 习 提取 和 纯化 高 等 植物 总 DNA 的 方法 ,理解 其 原理 。 【实验 原理 】 植物 细胞 中 的 DNA 主要 存在 于 细胞 核 内 , 称 为 核 DNA 或 染色 体 DNA , 单 倍 体 细胞 核 DNA 称 为 基因 组 DNA(Cgenomic DNA)。 细 胞 质 中 也 有 少量 的 DNA， 主要 分 布 在 线粒体 和 叶绿体 内 , 称 为 核 外 DNA。 细 胞 内 的 各 种 DNA 称 为 总 DNA(total DNA) 。 高 等 植物 的 核 DNA 相对 分 子 质量 较 大 ,与 蛋白 质 结 合成 脱氧 核糖 核 蛋白 (DNP) ,在 纯 水 或 1 mol/L 的 NaCl 溶液 中 溶解 度 较 大 ,而 不 溶 于 有 机 Ya 提取 和 纯化 DNA 的 关键 是 将 DNA 与 蛋白 质 分 开 , 且 尽量 减少 DNA 的 降 解 。 从 提取 原理 上 看 植物 总 DNA 的 提取 方法 主要 有 两 种 , 即 CTAB 法 及 SDS 法 ,常用 的 为 SDS 法 。SDS( 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ) 是 一 种 阴离子 去 垢 剂 , 高 浓度 的 SDS 在 较 高 温度 (55 一 65C ) 条 件 下 裂解 细胞 ,使 染色 体 离 析 ,蛋白 质变 性 ,使 DNA . 众 蛋 白质 上 游离 出 来 。 然 后 通过 提高 盐 浓度 及 降低 温度 使 蛋白 质 及 多 糖 杂 质 沉 演 (最 常用 的 是 加 大 5 mol/L 的 KAc 于 冰 上 保温 ,在 低温 条 件 下 KAc 与 蛋白 质 及 多 糖 结合 成 不 溶 物 ) ,离心 除去 沉淀 后 ,上 清 液 中 的 DNA 再 用 酚 - 氯 仿 - 异 戊 醇 混 合 液 反复 抽 提 , 以 去 除 DNA 中 的 蛋白 质 ,进行 纯化 。 最 后 用 等 体积 的 异 两 醇 或 二 倍 体积 的 无 水 乙醇 沉淀 水 相 中 的 DNA。 SDS 法 操作 简单 .温和 ,也 可 提取 到 相对 分 子 质 量 较 高 的 DNA, 但 所 得 产物 含 糖 类 杂 质 较 多 。 该 方法 所 得 的 DNA 样品 也 可 直接 用 于 Southern 杂交 ,但 在 限制 内 切 酶 消化 时 需 加 大 酶 用 量 , 并 适当 延长 反应 时 间 。 需 要 说 明 的 是 ,用 该 法 提取 的 DNA 如 果 因 后 继 实验 在 纯度 上 要 求 而 必须 用 氯 化 铭 密 度 梯 度 离心 纯化 的 话 , 那 么 提取 时 应 用 Sarkosyl( 十 二 烷 基 肌 氮 酸 钠 ) 代 替 SDS, AA Sarkosyl 能 溶解 在 低 浓 度 的 氧化 钢 溶 液 中 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 植物 的 根茎. 叶 、 愈 伤 组 织 等 新 鲜 材 料 或 冷冻 干燥 的 材料 。 ‘as 遗传 学 实验 教程 【用 具 和 药品 】 (1) AB 研 钵 和 桂子 .离心 管 . 量 简 RAL. HA TB KA A DL ee EK a, i 4s Eppendorf 管 、 吸 管 、. 枪 头等 。 (2) 试剂 提取 缓冲 液 (100 mmol/L Tris. Cl(pH 8. 0) .50 mmol/L EDTA(pH 8. 0), 500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 一 基 乙 醇 )、10% SDS、5 mol/L KAC、 酚 -氯仿 - 异 ， MBE A Tak Tris 饱和 栈 无 菌 水 . 异 两 醇 或 无 水 乙醇 。 【实验 步骤 】 1) 将 提取 缓冲 液 于 65C 预 热 。 2) 称 取 新 鲜 的 植物 材料 2~4 g, 研 钵 中 加 液 所 迅速 .充分 研磨 成 细 粉 。 3) 把 研磨 好 的 粉末 迅速 转 人 50 ml 离心 管 中 , 加 入 15 ml 提取 缓冲 液 ,1 ml 10% SDS ,充分 混 匀 ,65C 保 温 20 min, 其 间 揪 动 1 一 2 次 。 4) 在 离心 管 中 加 入 5 ml KAC, 混 匀 ,平衡 ， 冰 浴 放 置 30 min 以 上 ,然后 6 000~7 500 r/min ,离心 15 min, 5) 取 上 清 至 另 一 离心 管 ,加 入 5 ml 酚 - 氯 仿 - 异 成 醇 混合 液 或 加 5 ml Tris 和 酚 十 5 ml CHC]: 混 匀 , 混 匀 后 4C .6 000~7 500 r/min 离 心 10 min, 6) 将 上 清 液 转移 至 另 一 离心 管 中 , 加 入 5 ml 氯仿 , 混 匀 后 ,4C、 6 000~7 500 r/min 离 心 10 min, 7) 转移 上 清 液 至 另 一 离心 管 中 , 加 入 等 体积 一 20C 预 冷 的 异 丙 醇 或 二 倍 体积 的 无 水 乙醇 , 轻 轻 颠 倒 混 匀 ,一 20C ,30 min 静 置 至 出 现 絮 状 物 。 8) 用 剪 去 前 端 尖 部 的 大 枪 头 吸 出 絮 丝 状 DNA 至 Eppendorf 管 中 ， 13 000 r/min 离心 1 min, 弃 上 清 , 不 能 太 干 ,加 入 适量 的 70%% 乙 醇 ; 轻 轻 播 动 离 忌 SFL. BMA 70%% 乙 醇 ,重复 上 面 操作 1 一 3 次 。 9) 将 沉淀 吹 干 ,用 80~ 100 pl 无 菌 水 加 2 岂 RNase 溶 解 ,37C,2h。4C 保 存 备用 。 【实验 报告 】 1. 怎样 初步 检测 提取 的 植物 总 DNA 的 质量 ? 2. 在 提取 植物 总 DNA 的 操作 过 程 中 应 注意 哪些 问题 ? ( 王 淑芳 ) 实验 20 ”聚合 酶 链 反 应 PCR 【实验 目的 】 1. 学 习 和 掌握 PCR 基因 扩 增 的 原理 和 操作 方法 。 第 一 部 分 基础 性 实验 * 75° 2. 深刻 理解 PCR 基因 扩 增 技术 在 DNA 操作 中 的 重要 性 。 【实验 原理 】 聚合 酶 链 反应 (polymerase chain reaction,PCR) 的 原理 类 似 于 DNA 的 天 然 复制 过 程 。 在 待 扩 增 的 DNA RAMA SHAMAN TBARS. 变性 ,退火 和 延伸 若干 个 循环 后 ,DNA 扩 增 2" 倍 ( 图 1-25)。 7 4 ¥ 高 温 变性 eae i, 低温 退火 IE a =o 1. oon an a | 中 温 延 伸 = ae | SS Eee 二 Sw os a a Ee SS Se SE ee 一 rr ESEEE ive ee Po rae a Fi we ad -. =e -Imr ~ 图 ,= 大 1) 变性 : 加 热 使 模板 DNA 在 高 温 下 (94C ) 变 性 , 双 链 间 的 氧 键 断 裂 而 形成 两 条 单 链 , 即 变 性 阶段 。 2) 退火 : 使 溶液 温度 至 50~60°C ,模板 DNA 与 引物 按 碱 基 配 对 原则 互补 结 合 , 即 退火 阶段 。 3) 延伸 : 溶液 反应 温度 升 至 72C 。 耐 热 DNA 聚合 酶 以 单 链 DNA 为 模板 ， 在 引物 的 引导 下 ,利用 反应 混合 物 中 的 4 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 (dNTP) , 按 5 一 3 方 向 复制 出 互补 DNA, 即 引物 的 延伸 阶段 。 EX 3 步 为 一 个 循环 , 即 高 温 变性 、 低 温 退 火 . 中 温 延 伸 3 个 阶段 。 从 理论 上 讲 , 每 经 过 一 个 循环 ,样本 中 的 DNA 量 应 该 增加 一 倍 , 新 形成 的 链 又 可 成 为 新 一 轮 循环 的 模板 ,经 过 25~30 个 循环 后 DNA 可 扩 增 10°~10° 倍 。 典型 的 PCR 反应 体系 由 : DNA 模板 反应 缓冲 液 .4NTP、MgCl ,两 个 合 的 DNA 引 物 、 耐 热 Tag 聚合 酶 等 组 分 组 成 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 自选 的 DNA 模板 。 2. 用 具 及 药品 (1) 仪器 PCR 热 循 环 仪 、. 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 系统 。 (2) 材料 4 种 dNTP. 51% 1 和 引物 2、.Tag 聚合 酶 .琼脂 糖 `.DNA 相对 分 子 质量 标准 76 。 遗传 学 实验 教程 物 、 吸 头 、 小 指 管 。 (3) 试剂 . 1) 10 RyP¥RK 500 mmol/LKC1,100 mmol/LTris + HCI(pH 8. 3, 室温 )、 15 mmol/L MgCl, 0.1% 明胶 。 2) 4XdNTP 1mmol/LdATP、1Immol/L dCTP,1 mmol/L dGTP, 1 | Ld REP, 3) Tag fH 1U/pL. 4) DNA 模 板 1 ng/pL. 5) 3).1. 5’ GTG GGG GGC CCC AGG CAC CA 3’; 6) 3) 92 =526TC CTPAAT'GTC ACG,CAC. TTC 3°; ; 7) 引物 溶液 浓度 ”10 pmol/pl, | 和 | 【实验 步骤 】 1. 在 0.5mlEppendorf 管内 配制 25 pl RIA 反应 物 体积 /nl ddH2O 11~15 10 PCR 缓冲 液 2y5 2.5 mmol/L dNTP 2.0 . 25 mmol/L MgCl, 1.5( 有 时 MgCl 45 10 PCR 缓冲 液 混 在 一 起 ) 引物 1 1.0 引物 2 1.0 模板 DNA 1~5 Tag fit 1 2. 7 38 1) 94C 预 变性 5 min, 2) 94°C 25# 1 min, 3) 52°C3B-K 1 min, 4) 72°C HE{# 1 min, 5) We AER 2)~4)25~35 次 。 6) 72°C RE{# 10 min, 注意 ,步骤 2) 一 4) 中 温度 和 时 间 的 长 短 可 根据 扩 增 产物 的 不 同 变化 而 调整 。 3. SAS BEL DK aT PCR 结果 配制 1%% 琼 脂 糖 凝 胶 , 取 10 wl 扩 增 产物 电泳 。 保 持 恒 流 , 调 节 电 压 , 电 压 大 小 一 般 根 据 电 泳 槽 两 电极 之 间 的 距离 定 , 如 5 V/cm。 电 泳 结 束 后 ,用 EB 染色 15 min( 或 在 配制 琼脂 糖 凝 胶 时 加 入 EB) ,紫外 灯 下 观察 结果 。 第 一 部 分 基础 性 实验 « T's 4, 实验 结果 观察 本 实验 扩 增 片段 的 量 (图 1- 26)。 1. DNA 相对 分 子 质量 标准 ; 2. 10 pl 样品 ; 3. 5 pl Fans 4. 对 照 ( 没 有 模板 DNA). 【实验 报告 】 简 述 PCR 技术 在 分 子 遗传 学 领域 的 应 用 。 (AE BE NS) 图 1-26 本 实验 扩 增 片段 的 量 HW Be ART MR 一 一 -一 -一 一 -一 一 me 一 (aS -~ 工 图 》 Bat’ > soap aNTP 2. i hot Rtg, AE 1.4 | bom i LT 1) 94° AE 5 min. 2>:-44C 4 | min 3) $820 3B At min. 4) 72°C GE 1b min 5) Wee we 2) ee 7 ad) 4th} ‘ " be af Pm Fe OT a) 4th ae 实验 21 三 点 测验 的 基因 定位 方法 | 【实验 目的 】 | 1 了 解 利用 三 点 测验 法 绘制 遗传 学 图 的 原理 和 方法 。 5 2, 学 习 并 掌握 实验 结果 的 数据 统计 处 理 方法 。 【实验 原理 】 | 三， 位 于 同一 条 染色 体 上 的 基因 一 般 是 随 染色 体 一 起 传递 的 , 即 这 些 基因 是 连锁 | AA. 同 源 染色 体 上 的 基因 之 间 会 发 生 一 定 频 度 的 交换 ,因此 其 连锁 关系 发 生 改 变 ,使 子 代 中 出 现 一 定数 量 的 重组 型 。 重 组 型 出 现 的 多 少 反映 出 基因 间 发 生 交换 的 频率 的 | 高低。 基因 在 染色 体 上 是 呈 直 线 排 列 的 ,基因 间距 离 越 远 ,其 间 发 生 交换 的 可 能 性 就 越 大 , 即 交 换 频 率 越 高 ,反之 则 小 ,交换 频率 就 低 。 也 就 是 说 基因 间距 离 与 交换 频率 清二 定 对 应 关系 。 基 因 图 距 就 是 通过 重组 值 的 测定 而 得 到 的 。 如 果 基 因 座 位 相距 很 近 , 重 组 率 与 交换 率 的 值 相等 ,可 以 直接 把 重组 率 的 大 小 作为 有 关 基 因 间 的 相对 距 离 ,把 基因 顺序 地 排列 在 染色 体 上 ,绘制 出 遗传 连锁 图 。 如 果 基 因 间 相距 较 远 , 两 个 基因 间 往 往 发 生 两 次 以 上 的 交换 ,如 简单 地 把 重组 率 看 作 交 换 率 ,那么 交换 率 就 会 被 心 估 , 图 距 就 会 偏 小 。 这 时 需要 利用 实验 数据 进行 校正 ,以 便 正 确 估 计 图 距 。 基 因 在 染色 体 上 的 相对 位 置 的 确定 除 进行 两 个 基因 间 的 测 交 外 ,更 常用 的 是 三 点 测 交 法 , 即 同时 研究 三 个 基因 在 染色 体 上 的 位 置 。 如 msn? pw 三 个 基因 是 连锁 的 (它们 都 在 又 msn? w m sn w m sn w Ss eres, = = as = == as a agree’ A coat + + + + + + + + + ween: | 形成 配子 | 形成 配子 | | m sn w msn? w m sn w m sn’ + ok ae F, wmsn? x wmsn? + sn? w + + w + sn? + 十 十 十 开平 - 量 + + + + + + + + + A 发 生 在 m-sn3 B 发 生 在 snma-w OB 发 生 在 m-sn3 之 之 间 的 变换 之 间 的 变换 间 和 sn3-w 之 间 的 测 交 后 代 变换 图 2-1 三 点 测 交 中 获得 测 交 图 2-2 在 连锁 的 三 基因 杂种 里 总 共 可 后 代 的 交配 方式 产生 8 种 不 同 基因 型 的 配子 《3 引 自 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 等 1987) « 80 = 遗传 学 实验 教程 染色 体 上 ) ,要 测定 三 个 基因 的 相对 位 置 可 以 用 野生 型 果 蝇 ( 十 十 十 ,表示 三 个 相应 | 的 野生 型 基因 ) 与 三 隐 性 果 蝇 (msnsw, 三 个 突变 型 基因 ) 杂 交 , 制 成 三 因子 杂种 中 msn?w /十 十 十 ,再 用 三 隐 性 个 体 对 雌性 三 因子 杂种 进行 测 交 (图 2-1)， 以 测 出 三 因子 杂种 在 减 数 分 裂 中 产生 的 配子 类 型 和 相应 数目 。 由 于 基因 间 的 交换 ， 除 产 i 生 亲 本 类 型 的 2 种 配子 外 ,还 有 6 种 重组 型 配子 ,因而 在 测 交 后 代 中 有 8 种 不 同 胡 | | 型 的 果 蝇 出 现 (图 2- 2) ,这 样 ,经 过 数据 的 统计 和 处 理 , 一 次 试验 就 可 以 测 出 3 不 几 连锁 基因 的 距离 和 顺序 ,这 种 方法 就 叫做 三 点 测 交 或 三 点 试验 。 | 【材料 与 用 品 】 只 1. 材料 | 黑 腹 果 蝇 品 系 : 野生 型 果 蝇 (十 十 十 ) 长 翅 . 直 刚毛 、 红 了 眼 ; 三 隐 人 性 果 蝇 | (msn? w) 小 芭 、 焦 刚毛 、 白 眼 。 三 隐 性 果 蝇 (wmsns*) 个 体 的 眼睛 是 白色 的 4w)5 焉 时 膀 比 野生 型 的 翅膀 短 些 , 翅 仅 长 至 腹 端 , 称 小 翅 (m); 刚 毛 是 卷曲 的 ; 称 焦 刚 毛 或 卷 刚毛 (sn ) 。 这 三 个 基因 都 位 于 X 染色 体 上 ,所 以 也 可 以 在 本 实验 中 同时 进行 ft! 性 遗传 的 实验 观察 。 2. 用 具 及 药品 同 实验 2。 【实验 步骤 】 1. 选择 处 女 蝇 egg a BH 5 一 6 只 2， 杂 交 挑 出 野生 型 雄 蝇 放 到 处 女 蜗 瓶 中 杂交 ,每 并 5 一 6 只 。 贴 好 标签 , 注 明 杂交 组 合 . 日 期 及 实验 人 姓名 ;在 22 一 23\C 中 培养 。 司 3. 移 去 亲本 7 一 8 d 后 移 去 亲本 。 4, WH F, | 4 一 5 d Je HE AF — ARM FT LA UL) PE ee Tee AB 是 三 隐 性 。 | Pee ats i'd PEE FER A Fy A S~8 YE TEAL wR . EA PL. WP aE EBA 交 组 合 、 日 期 及 实验 人 姓名 。 在 20~25°CIHK. 6. BEF, 7~8 d 后 晴 出 现 , 移 去 Fi 。 7. 观察 F， 4~5 dJ&q Fy 成 蝇 出 现 ,开始 观 察 。 把 F, 果 蝇 个 出 麻醉 , 放 在 白 瓷 板 上 ,用 实 体 显微镜 观察 眼色 、 翅 形 . 刚 毛 。 各 类 果 蝇 分 别 计数 。 检 查 过 的 果 蝇 处 死 倒 掉 。 隔 YL 第 二 部 分 综合 性 实验 。81 。 | 天 S 知 记录 二 次 ,连续 观察 统计 4 一 5 次 (8 一 10 d) 。 要 求 至 少 统计 200 只 果 蝇 。 1 8, 实验 结果 与 数据 处 理 | 1) 统计 观察 数 | FB MPSA F。 8 种 表 型 , 填 上 观察 数 ,并 计算 总 数 ( 表 2- 1)。 表 2-1 也 观察 结果 记录 表 F2 类 型 人 |】 基因 是 否 重组 (2) 填写 “基因 是 否 重组 ”一 行 因为 测 交 亲本 是 三 隐 性 的 ,所 以 铬 基因 间 有 交换 , 便 可 在 表 型 上 显示 出 来 。 因 而 从 测 交 后 代 的 表 型 便 可 推 知 某 两 个 基因 之 间 是 否 发 生 了 重组 。 (3) 计算 基因 间 的 重组 值 。 【实验 报告 】 1. 统计 实验 结果 ,并 绘 出 遗传 学 图 和 计算 并 发 率 、 干 涉 。 2. 三 点 测 交 有 什么 优点 ? 3 如果 进 行 常 染 色 体 基因 三 点 测 交 , 在 实验 程序 设计 上 与 本 实验 有 什么 差 别 ? 需要 注意 什么 ? (ek SA ) 实验 22 植物 有 性 杂交 技术 【实验 目的 】 在 对 常见 植物 (农作物 ) 的 生育 过 程 进行 观察 的 基础 上 ,尝试 进行 人 工 授粉 完 成 植物 的 杂交 过 程 。 【实验 原理 】 基因 型 不 同 的 生物 个 体 之 间 相 互 交 配 的 过 程 叫 杂 交 。 植 物 的 交配 是 通过 传粉 受精 完成 的 ,供给 花粉 的 植株 叫 父 本 ,接受 花粉 的 植株 叫 母 本 。 无 论 是 自 花 授粉 的 植物 还 是 异 花 授 粉 的 植物 ,都 可 以 通过 控制 授粉 而 进行 人 工 有 性 杂交 。 人 工 有 性 杂交 技术 是 遗传 学 研究 的 一 种 重要 方法 。 人 工 有 性 杂交 技术 是 人 工 创造 植物 新 的 变异 类 型 的 最 常用 的 方法 ,是 现代 - 82° 遗传 学 实验 教程 上 二 作物 育种 的 有 效 方法 之 一 。 通 过 有 性 杂交 方式 可 以 重新 组 合 父母 本 的 基因 , 悄 | 以 产生 亲本 各 种 性 状 的 新 组 合 ,从 中 选择 出 人 们 所 需要 的 基因 型 ,从 而 培育 出 对 f 人 类 有 利 的 新 品种 或 新 物种 。 植 物 的 有 性 杂交 分 为 近 缘 杂交 和 远 缘 杂 交 , HE 杂交 是 指 同一 物种 内 不 同 基因 型 个 体 的 杂交 , 远 缘 杂 交 是 指 包 括 亚 种 .种 ` 属 . 科 | 之 间 的 杂交 。 品 种 间 的 杂交 为 同 种 内 的 近 缘 杂交 ,品种 间 具 有 相同 的 遗传 物质 | 基础 ,因此 容易 获得 成 功 。 远 缘 杂 交 可 以 扩大 栽培 植物 的 种 质 库 , 把 有 益 的 基因 重新 组 合 到 新 ( 品 ) 种 中 ,使 之 产生 新 的 有 益 性 状 , 并 丰富 植物 的 基因 型 。 但 远 缘 f 杂交 由 于 存在 着 染色 体 的 异 源 性 ,往往 不 易 获 得 成 功 ,出 现 杂 种 天 亡 、 结 实 率 低 甚至 不 育 的 情况 。 并 且 , 杂 种 分 离 强烈 ,中 间 类 型 不 稳定 ,因而 增加 了 杂交 的 复 | 杂 性 和 困难 。 | 本 实验 给 出 了 常见 的 具有 代表 性 的 植物 (农作物 ) 如 小 麦 \, 水 稻 和 栽培 棉 的 参 | 考 发 育 指标 ,为 实验 提供 一 定 的 基础 知识 ,进而 指导 人 工 授粉 ,完成 人 工 厅 交 过 程 .| 1. 小 麦 的 开花 生物 学 (1) 花 器 构造 (图 2-3) 小 麦 为 复 穗 状 花 序 , 由 穗 轴 和 若干 小 穗 组 成 ,小 穗 排 成 两 行 ,相互 交错 着 生 在 穗 轴 节 片 上 , 穗 轴 两 端 着 生 的 小 穗 Be, AAR. PRN BRK AG 5 EAT 2 MPR LAE HA) 花 , 第 一 .第 二 采 小 花 发 育 较 大 、 结 实 ， 部 上 部 小 花 较 小 , 常 因 缺 乏 营 养 而 不 结 图 2- 3 小 麦 花 器 的 构 器 实 。 小 伦 有 内 外 颖 包 被 , 花 内 有 雄 芒 3 1. 护 颖 ;2， 外 颖 ;3. 芒 ;4. 内 颖 ;5. 柱头 ; 枚 , 肉 蕊 1 枚 。 雄 蕊 分 花丝 、 花 药 两 部 6 子 房 ;7 花药 ;8 花丝 ;9 鳞片 分 ,花丝 很 细 , 花 药 两 裂 , 未 成 熟 时 为 黄 Ce 4. HERSEK JERE FREE EL RA BRD FOE. 外 颖 的 一 侧 下 部 有 两 片 很 小 的 鳞片 ,开花 时 吸水 膨大 ,使 内 外 颖 张 开 。 | (2) 开花 习性 小 麦 在 抽穗 3 一 5 d 即 开 始 开花 ,一 天 中 有 两 个 开花 高 峰 期 ,分 别 在 上 午 和 下 午 , 各 地 时 间 不 一 ,如 北京 地 区 为 上 午 9 一 11 时 ,下 午 3 一 4 时 。 其 开花 顺序 是 :就 全 株 来 说 , 主 葵 穗 的 花 先 开 , 然 后 按 分 药 的 先后 顺序 开花 ;就 一 穗 来 说 ,中 部 的 ， 3 一 5 个 小 穗 先 开 花 ,渐次 向 上 部 和 基部 的 小 穗 发 展 ;每 个 小 穗 的 第 一 小 花 先 开 , 然 ， 后 是 第 二 、 第 三 花 开放 。 一 茉 花 从 开 到 闭 的 时 间 约 为 10~30 min, 一 个 穗 子 的 花期 约 5 一 7 d, 通 常 在 第 三 、 第 四 天 花 最 多 ,为 成 花期 。 小 麦 开 花 受 温度 ,湿度 影响 较 大 。 开 花 的 最 低温 度 为 9~11'C ,最 适 温度 为 18 二 220。 温 度 超过 30°C .雨水 过 多 .日照 不 足 , 均 对 开花 不 利 ,尤其 是 高 温 干 燥 ,不 仅 会 第 二 部 分 综合 性 实验 + 83 缩短 开花 时 间 , 降 低 花粉 和 柱头 的 生活 力 ,而 且 会 破坏 受精 过 程 的 正常 进行 。 (3) 授粉 与 受精 过 程 小 麦 是 自 花 授粉 作物 ,授粉 后 外 颖 、 内 颖 就 闭合 起 来 ,如 果 没 有 授粉 ,内 、 外 上 颖 则 秒 关 闭 ,一 直 处 于 开张 状态 。 有 的 小 麦 品种 闭 颖 授粉 , 即 不 待 颖 张 开 即 行 授粉 。 桂 头 在 正常 情况 下 保持 受精 能 力 时 间 较 长 ,可 达 7 一 8 d, 不 过 一 般 在 3 一 4d 后 生 | 活力 即行 降低 。 花 粉 保 持 生活 力 的 时 间 较 短 , 在 散粉 半 小 时 后 即 由 鲜 黄 色 变 为 深 黄色 ,这 时 就 有 一 定数 量 的 花粉 死亡 ,因此 ,延迟 授粉 或 用 不 新 鲜 的 花粉 授粉 ,结实 率 就 会 降低 。 2. 水 稻 的 开花 生物 学 (1) 花 器 构造 稻 穗 属 圆锥 花序 , 穗 中 央 为 主轴 主轴 上 生 枝 梗 , 枝 梗 上 生 小 枝 梗 ,小 枝 梗 上 生 本 穗 ;小 穗 由 一 个 颖 花 组 成 , 颖 花 有 花 柄 (图 2- 4)。 小 穗 有 护 颖 、 副 护 颖 各 2 个 ， 搞 颖 止 有 毛 、 较 硬 。 花 的 内 、 外 颖 长 度 相等 ,外 颖 有 芒 或 无 芒 。 外 颖 基部 的 内 侧 有 三 对 卵 圆 形 肉质 物 , 称 为 浆 片 (或 称 鳞片 ) , 浆 片 吸水 膨胀 促使 内 、 外 颖 张 开 而 开花 。 肉 、 雄 营 位 于 内 、 外 颖 之 中 。 雌 芒 分 柱头 \ 花 柱 和 子 房 三 部 分 。 子 房 卵 形 ,花柱 顶端 发 育成 两 个 羽毛 状 的 柱头 (图 2-5)。 雄 蕊 6 个 ,每 3 个 排 成 一 列 , 分 两 组 着 生 于 子 房 基部 。 每 个 雄 芝 由 花丝 和 花药 组 成 ,花丝 细 长 ,花药 为 "本 ”字形 ,分 4 室 。 图 2-4 稳 穗 的 构造 图 2-5 稻 花 的 构造 1. 穗 节 ;2. 穗 轴 ;3. 第 一 枝 梗 ; 1. 护 颖 ;2. 内 颖 ;3. 外 矣 ;4. WER; 4. 第 二 枝 梗 ;5. BUTE 5. 花丝 ;6. 462937. Fs8. HE (5) A b4E I), XK “1992) (2) FEF Fei BDAY Ba HH a A “4 BK 1 ~2 d 就 可 以 开花 。 开 花 时 浆 片 膨大 ,内 外 颖 张 FF AEA Hh, ZZ 30 min, 花 丝 凋 萎 , 浆 片 因 水 分 蒸发 失 水 而 收缩 ,内 外 颖 重新 关闭 。 水 稻 开 花 受 环境 影响 很 大 ,气温 20~30°C ,相对 温度 70% 一 80%% 是 水 稻 开 花 遗传 学 实验 教程 最 适宜 的 外 界 条 件 。 开 花 的 顺序 是 : 整个 稻 穗 ,主轴 上 的 花 先 开 , 其 次 是 上 部 的 枝 梗 ,从 上 到 下 依次 开花 ;同一 枝 梗 上 , 顶部 的 颖 花 先 开 , 基 部 的 颖 花 第 二 开放 ,然后 由 | 下 而 上 渐次 开放 。 从 开 颖 到 闭 颖 ,一 落花 一 般 需 经 历 1. 5 一 2 h( 籼 稻 短 \ 粳 稻 长 )。 个 稻 穗 开花 所 需 天 数 因 品种 气候 及 穗 子 大 小 而 有 所 不 同 , 一 般 自 开始 开花 到 全 穗 开 | 完 , 早 稻 需 5 d, 中 稻 需 6 一 7 d, 晚 稻 需 8 d 左右。 早稻 和 中 稻 在 穗 露出 叶鞘 的 当天 就 有 部 分 小 穗 开花 ,而 以 第 二 和 第 三 天 开花 最 感 , 且 开花 较为 集中 ,以 后 逐渐 减少 。 晚 | 稻 在 穗 露出 叶 萌 的 第 二 天 才 开 花 , 以 4 一 5 d 为 最 盛 ,开花 比较 分 散 ; 每 天 开花 的 | 时 间 因 和 气候、 品种 而 异 , 早 .中 稻 开 花 比较 早 , 晚 稻 比 较 迟 。 正常 情况 下 ,一 般 上 年， 9 点 开始 开花 ,中 午 开 花 最 盛 , 下 午 4 时 以 后 开花 较 少 (个 别 品 种 例外 ) 。 (3) 授粉 与 受精 过 程 i 水 稻 为 自 花 授粉 作物 ,花药 散粉 后 , 落 在 柱头 上 的 花粉 在 1.5 min 后 便 可 萌 发 ,大 约 在 开花 后 1. 5 一 4 h 便 可 完成 受精 过 程 。 花 粉 在 自然 条 件 下 放置 3 min BE 有 502% 左 右 失 去 生活 力 ,5 min 后 几乎 全 部 失去 生活 力 ,10 一 15 min 后 再 授粉 ; 则 ) 已 完全 不 能 结实 。 柱 头 的 生活 力 可 维持 到 去 雄 后 的 第 六 天 ,但 一 般 在 去 雄 后 12 d 内 授粉 效果 最 好 。 i 3. 棉花 的 开花 生物 学 (1) 花 器 的 构造 | Hate (Gossypium jazrsutauza ) 的 花 为 单 生 完全 花 , 由 花 苯 、 花 冠 、 雄 蕊 和 雌蕊 组 成 , 花 的 外 层 有 苞 叶 。 苞 叶 三 角形 ,基部 联合 或 分 离 。 陆 地 棉 苞 叶 葵 部 外 面目 处 有 蜜 腺 三 个 。 花 冠 由 5 片花 瓣 组 成 ,开花 前 相互 重 释 为 螺旋 形 , 花 瓣 大 小 和 颜色 因 析 种 而 异 , 有 的 棉 种 或 品种 花瓣 基部 有 红 芯 。 雄 巷 由 花丝 和 花药 组 成 。 花 丝 基部 连 合成 管状 ,与 冠 基 部 连接 , 套 于 雌 世 外 而 成 为 雄 蓝 管 。 花 药 60~90 枚 或 更 多 ,为 单 室 ,每 个 花药 内 约 有 100~200 粒 花粉 。 花 粉 粒 呈 球形 ,表面 有 小 刺 。 肉 营 由 柱头 、 花柱 和 子 房 三 部 分 组 成 。 子 房 3 一 5 室 或 更 多 ,每 室 着 生 胚 珠 7 一 11 个 ,受精 后 每 一 胚珠 发 育成 一 枚 种 子 。 花 柱 细 长 , 顶端 为 柱头 。 柱 头 有 纵 棱 , 常 扭曲 ,多 露出 雄 蕉 管 外 ,表面 密生 乳头 状 突起 ,开花 时 分 沁 黏 液 ,便于 黏着 花粉 。 (2) 开花 习性 棉花 多 在 上 午 8:00~10:00 开花 ,气温 高 .气候 干燥 时 开花 提早 ,温度 低 、 阴 雨 天 时 开花 延迟 。 棉 花 开 花 有 一 定 顺 序 : 由 下 而 上 ,由 内 而 外 , 沿 果枝 呈 螺 旋 形 进 行 。 一 般 情 况 下 , 相 邻 果枝 同 节 花蕾 开花 时 间 相 隔 2 一 4 d, 同一 果枝 相 邻 果 节 的 花 蕾 开 花 时 间 约 相隔 5 一 8 d。 开 花 时 间 相 隔 的 天 数 因 温度 .养分 和 棉 株 长 势 而 有 增 减 。 一 采花 从 花冠 露出 苞 叶 至 开放 约 经 12~16 h。 开 花 3 d 以 后 , 花 苯 8 花 冠 连同 雄蕊 管 ,花柱 与 柱头 从 子 房 上 一 起 脱落 下 来 。 (3) 授粉 与 受精 棉花 是 常 异 花 授 粉 作物 。 棉 花 的 花冠 张 开 时 ,雌雄 两 性 配子 已 发 育成 熟 ， 花 第 二 部 分 综合 性 实验 药 在 开花 的 前 后 或 同时 开裂 散粉 。 在 上 自然 条 件 下 ,花粉 生活 力 最 强 的 时 间 是 10:00 一 世 :00, 以 后 生活 力 显著 减弱 ,到 第 二 天 上 午 即 丧失 生活 力 。 柱 头 生活 力 维 持 的 时 间 稍 入 ,但 也 不 超过 第 二 天 上 午 。 花 粉 落 到 柱头 上 后 ,经 1 h 左 右 即 开 始 萌 发 吧 所 后 花粉 管 即 到 达 子 房 ,20 一 30 h 完成 受精 作用 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 小 麦 \ 水 稻 、 陆 地 棉 各 两 个 品 2. 用 具 与 药品 普通 热水瓶 .温度计 、 放 大 镜 、 杀 子 .剪刀 ,大 头 针 、 回 形 针 、 半 透明 玻璃 纸袋 (4 emX 10 cm) BAR AE ES RA. EEE. 70% CE. : (2878) 1. NHATARRENA RTE (1) 选 穗 选择 生长 健壮 ,发 育 良 好 .具有 本 品种 典型 特征 的 主 葵 穗 作 母 本 。 为 保证 去 雄 后 第 二 天 或 第 三 天 能 及 时 授粉 ,并 获得 较 高 的 结实 率 , 所 选用 植株 的 主 葵 穗 抽出 剑 叶 叶 鞘 约 半 才 较为 适宜 ,气温 较 高 或 后 期 抽穗 的 可 适当 提早 。 (2) 检查 花药 用 狠 子 小 心 打开 中 部 两 侧 的 小 花 ,查看 其 花药 ,花药 呈 青 色 微 透 黄 者 为 好 。 花 药 过 嫩 , 去 雄 时 易 损 伤 花 器; 花药 过 老 ,去 雄 时 花粉 赛 易 裂 , 散 出 花粉 发 生 自 交 。 不 过 ,去 雄 的 穗 子 宁可 嫩 一 点 ,不 可 过 老 。 (3) 整 穗 荆 在 当选 植株 的 主 茎 穗 上 , 先 用 狠 子 或 剪刀 摘 去 上 部 和 基部 发 育 不 好 的 小 穗 , 仅 RE PRB 10 A) RS 5 个 , 共 5 对 ) ,而 留 下 的 小 穗 也 只 选取 第 一 和 第 二 花 ， 其 余 的 小 花 三 律 用 凶 子 夹 除 。 若 是 有 芒 品 种 , 则 应 从 基部 将 芒 剪 去 ,以 便 操作 。 (4) KR 为 避免 自 交 ,必须 及 时 除去 母 本 植株 花 中 的 花药 。 操 作 时 用 左手 大 拇指 和 中 指 捏 住 重子 ,食指 轻 压 花 颖 的 顶端 ,内 、 外 颖 即 被 分 开 ,形成 二 裂 日 ,然后 用 右手 合 紧 锰 子 插 大 有 裂口 ,再 略微 放松 ,小 心地 将 三 枚 花药 狠 出 。 注 意 不 要 刺 破 花药 、 损 伤 柱头 及 颖 片 , 若 不 慎 刺 破 花 药 则 须 将 此 花 摘 除 , 同 时 用 70% CTR. We 造成 人 为 的 自 花 授粉 。 去 雄 的 顺序 是 从 下 部 小 穗 开始 依次 向 上 ,做 完 一 侧 再 做 另 一 侧 ,避免 遗漏 。 如 发 现 小 花 中 花药 已 有 自然 成 熟 开 裂 的 , 则 应 另 换 一 穗 。 全 部 去 完毕 后 要 逐个 检查 一 遍 , 做 到 去 雄 彻 底 ,防止 遗漏 。 检 查 时 可 用 狠 子 分 开 两 洒 小 花 迎 着 阳光 透视 小 花 , 即 可 看 出 小 花 中 有 无 遗漏 花药 。 去 雄 干 净 后 ,在 此 穗 上 套 上 透明 纸袋 ,纸袋 开口 沿 穗 轴 折 合 , 用 大 头 针 别 住 ,注意 不 要 别 住 剑 叶 。 然 后 在 穗 基 节 基 部 挂 上 纸牌 ,用 铅笔 写 明 母 本 名 称 和 去 雄 日 期 。 。86 。 遗传 学 实验 教程 (5) RR EH 6 选取 发 育 良好 、 正 值 开 花期 的 父 本 植株 ,用 锰 子 轻 轻 分 开 穗 中 部 小 花 的 内 ` 外 颖 ,从 中 小 心地 取出 尚未 开 要 的 花药 (金黄 色 饱 满 的 花药 ) 两 个 ;或 采集 刚 开放 小 花 的 花粉 。 为 能 多 采集 花粉 ,也 可 以 对 已 有 数 邓 小 花 开放 的 穗 子 ;用 手轻 轻 摩擦 由， VOC Cumin ied Canad ae ee Wl tebe on 粉 。 采 集 时 应 注意 ,使 用 的 容器 要 光滑 ,不 要 使 花粉 遭受 高 温 及 日 光 长 秋 暴 晒 , 应 当 随 采集 随 授粉 ,以 免 花 粉 活力 降低 或 志 失 生活 力 ,影响 受精 结实 如 发 现 花粉 成 团 , 则 不 能 使 用 。 (6) 授粉 | 1) 裂 颖 授粉 法 | 去 雄花 东 的 柱头 呈 羽 毛 状 分 又 时 ,用 手轻 轻 抚摸 , 颖 片 自行 张 开 , 这 时 即 可 授 | 粉 。 授 粉 时 间 一 般 在 去 雄 后 的 第 二 天 上 午 8 时 (露水 已 干 ) 岂 后 ;或 下 午 3 时 以 后 进行 。 如 遇 阴 雨天 ,温度 低 , 可 在 去 雄 后 3~4 d 内 授粉 。 授 粉 时 先 取 下 母 本 穗 子 上 的 隔离 袋 ,由 下 向 上 依次 用 银子 在 每 洒 小 花 里 投入 略微 压 破 了 的 花药 一个 ;或 用 ， 银 子 芯 少 量 花粉 撒 在 柱头 上 ,但 须 注意 勿 伤 柱头 及 颖 片 , 授 完 二 边 之 后 再 给 另 二 边 的 花 授 粉 ,全 部 授粉 完毕 再 套 上 隔离 袋 ,用 大 头 针 封 好 ,并 在 所 挂 纸牌 上 填写 父 本 名 称 及 授粉 日 期 ,同时 剪 去 纸牌 下 方 一 角 ,作为 已 授粉 的 标志 ,以 便 检 查 。 更 换 授 粉 品种 时 ,不 能 忘记 换 用 授粉 纸 和 用 酒精 浸 洗 角 子 , 杀 死 沾 在 上 面 的 花粉 ; 2) 抢 穗 授粉 法 母 本 去 雄 后 ,把 每 只 小 花 的 颖 片 前 去 1/4-.113, 使 上 部 露 二 小 口 ;人 应 注意 不 要 损伤 柱头 。 而 后 用 长 约 15 cm 两 头 都 不 封口 的 隔离 纸袋 套 住 全 穗 E 下 端 都 福 好 ,分 别 用 大 头 针 别 住 ,授粉 时 把 选 好 的 父 本 穗 在 每 末 小 花 顶端 前 二 小 日 ;再 用 手 摩擦 几 次 , 待 有 花药 从 颖 片 伸 出 ,立即 打开 母 本 穗 上 的 隔离 袋 的 上 口 , 把 父 本 穗 个 插入 袋 ,在 母 本 穗 上 凌空 抢 几 次 ,让 花粉 落 在 柱头 上 , 移 去 父 未 穗 或 将 父 本 穗 留 在 袋 内 ,用 大 头 针 重新 封 上 纸袋 上 口 ,填写 纸牌 , 即 完成 授粉 。 此 法 省 工 省 时 操作 简 便 ; 只 是 结果 率 低 , 一般 在 杂交 工作 量 大 时 采用 。 (7) Shee HEBD 1~2 h, 小 麦 花 粉 粒 就 开始 在 柱头 上 萌发 , 约 经 40 多 小 时 就 可 以 受精 在 授粉 后 的 第 三 、 第 四 天 可 以 打开 套 袋 ,检查 子 房 膨大 情况 。 若 子 房 脱 大 ;内 \ 外 颖 台 拢 ,说 明 已 经 受精 ;如 果 内 .外 颖 仍然 开张 , 子 房 不 见 有 柳 大 ,说 明 未 能 受精 ,受精 后 一 般 不 需要 继续 隔离 ,可 以 除去 套 袋 。 但 为 了 防止 意外 和 收获 时 易于 辨认 ,可 以 不 去 套 袋 ;到 收获 时 连同 母 本 麦 穗 -- 起 取 回 ， (8) 收获 与 储藏 去 雄 及 人 工 授粉 后 , 母 本 麦 穗 上 结 出 的 种 子 就 是 杂交 种 子 。 成 熟 后 按 组 谷 收 获 ,同一 组 合 的 杂交 穗 剪 下 后 放 在 一 起 ,脱粒 后 装 在 同一 个 纸袋 里 , 写 明 组 谷 名 称 、 第 二 部 分 综合 性 实验 > 87 种 子粒 数 ; 置 阴凉 干燥 处 保存 。 2 水 稻 人 工 杂交 步骤 及 方法 (1) 选 株 和 整 穗 选取 生长 健壮 ,发 育 良 好 的 植株 做 母 本 , 剪 去 上 部 和 基部 枝 梗 上 的 小 穗 ,再 先 遇 其 中 已 抽出 1/3-~2/3 的 单 穗 , 把 开花 的 或 当天 不 能 开花 的 颖 花 剪 掉 , 留 下 花丝 伟 长 ,花药 将 顶 内 颖 的 中 部 颖 花 20~30 个 。 @) £ik 水 稻 的 去 雄 方法 有 三 种 。 1) 剪 颖 去 雄 法 整 好 的 母 未 穗 子 在 杂交 前 一 天 下 午 或 当天 开花 以 前 进行 去 雄 ， 先 把 上 部 的 叶 精 剪 去 一部分 ,露出 穗 子 ,然后 用 剪刀 再 剪 去 蜂 的 1/4~.173。 因 内 颖 靠近 皮 蕊 ;所 以 要 从 外 颖 面 剪 , 以 免 伤 及 柱 Je. 然后 把 刍 子 伸 大 颖 内 , 轻 轻 夹 出 6 不 花药 ;注意 不 要 夹 破 花药 ,不 要 损伤 桩 头 。 将 去 雄 后 的 穗 子 套 袋 挂牌 , 注 5 ; 明 母 本 名 称 及 去 雄 日 期 (图 2- 6)。 这 0 种 方法 易 伤 花 器 ;结实 率 低 ,_- 般 只 有 5% 左 右 。 图 2-6 水 稻 剪 颖 去 雄 操作 过 程 2) 遮光 去 雄 法 ( 引 自 艺 奉 同 , 刘 林 德 1992) 水 稻 开 花 前 光照 骤然 变 暗 ,可 促使 颖 花 提前 开 疾 ,花丝 伸 长 ,但 花药 未 成 熟 不 开裂 ,因此 便于 去 雄 。 在 开花 前 1 h 用 特别 的 黑 纸袋 将 选 好 的 作 母 本 的 穗 子 套 住 ,刺激 当天 要 开 的 花 提 前 开 颖 。 大 约 在 遮光 后 10 一 20 min 后 , 颖 片 陆 续 张 开 , 花 丝 伸 长 ,此 时 花药 尚未 开裂 , 移 去 黑 纸袋 ， 迅速 用 狠 子 自 上 而 下 把 花药 摘除 ,并 剪 去 穗 上 未 开 的 小 穗 。 知 发 现 花药 已 开裂 , 则 要 剪 掉 此 花 ， 重新 套 袋 挂牌 。 这 种 去 雄 法 最 为 方便 , 且 不 易 损 伤 花 器 。 但 套 袋 的 时 间 不 容易 掌握 , 套 袋 时 间 过 短 、 开 花 不 多 ,过 长 则 花药 已 在 袋 内 破裂 ,会 发 生 自 花 授粉 ， 并 且 由 于 一 次 所 开 的 花 较 多 ,往往 去 雄 工 作 跟 不 上 。 ”3) 温水 杀 雄 法 (图 2-7) 水 稻 的 花粉 和 柱头 对 高 温 的 敏感 程度 不 同 ， 肉 营 比 雄蕊 对 高 温 有 较 好 的 耐 受 力 ,控制 一 定 的 图 2-7 水 稻 温 水 杀 雄 ( 引 自 艺 奉 同 , 刘 林 德 1992) | 水 温和 持续 时 间 浸 泡 稻 穗 , 使 能 恰好 杀 死 花粉 而 对 柱头 无 影响 ， eres 雄 、 简 化 去 雄 手续 的 目的 。 在 自然 开花 前 1 h, 选 取 穗 部 抽出 叶鞘 243~3/4 LIE 的 母 本 穗 ,将 暖 水 瓶 中 的 水 温 调整 到 43 一 45'C ,然后 将 稻 穗 轻 轻 压 大 水 瓶 的 水 中 ,43\C 温 水 浸泡 8 一 10 min, ak 45°C 的 温水 浸泡 3 一 5 min, 然后 取出 ; 套 上 和 玻 | 璃 纸袋 ,由 于 温水 有 促进 开花 的 作用 ,十 几 分 钟 后 花 即 陆续 开放 。 用 剪刀 将 未 开 花 的 小 花 一 律 去 掉 , 套 袋 挂牌 , 注 明 母 本 及 去 雄 日 期 。 应 用 * 温 水 杀 雄 法 "应 注意 处 理 的 时 间 不 可 过 时 或 太 退 。 过 早 则 去 雄 后 采 不 到 花粉 , 颖 花 已 经 闭合 不 好 授粉 ,过 迟 则 会 发 生 自 花 授粉 : (3) 采 粉 及 授粉 摇动 颖 花 开 放 的 父 本 穗 子 , 使 花粉 散 出 ,在 父 本 穗 下 放 一 张 自 纸 收集 父 本 的 花 ， 粉 。 收 集 到 的 花粉 应 迅速 给 母 本 授粉 ,可 用 狠 子 夹 点 花粉 轻 轻 放 在 母 本 的 柱头 上 也 可 用 杀 子 夹 取 将 要 开裂 的 两 个 花药 放 在 母 本 的 柱头 上 。 应 注意 的 是 ;每 个 穗 子 的 授粉 时 间 不 能 超过 3 min。 另 一 种 方法 是 : 前 下 即将 开花 的 父 本 小 穗 * 此 时 对 痢 太阳 可 看 到 .6 个 花药 已 项 到 内 颖 的 顶端 ,说 明 花 粉 已 成 熟 花药 即将 开裂 .1 拨 开 内 外 颖 ,用 杀 子 取出 花药 ,在 太阳 光 下 照 一 会 使 其 干燥 ,让 花药 裂 开 ,然后 轻 轻 地 把 鲜 黄色 花粉 放 到 母 本 的 柱头 上 。 父 本 的 小 穗 可 随 用 随 取 。 在 更 换 杂 交 品 种 时 ， 永国 用 具 都 要 用 702 酒 精 浸 擦 ,以 防 花粉 混杂 将 授 过 粉 的 重子 用 玻璃 纸 航 套 好 ,下 面 用 大 头 针 别 住 ;在 纸牌 上 说 明 父 本 名 各 及 授粉 日 期 ,同时 剪 去 纸牌 下 方 一 角 , 作 为 已 授粉 的 标志 。 (4) 受精 情况 检查 及 收获 授粉 几 天 后 可 以 检查 杂交 情况 , 子 房 膨 大 的 表示 已 受精 , 子 房 不 膨大 则 说 明 未 能 受精 。 杂 交 20 天 后 即 可 收获 种 子 , 把 成 熟 的 稻 德 按 组 合 收回 保存 。， 3. 棉花 人 工 杂交 步骤 及 方法 (1) 去 雄 在 母 本 典型 株 上 ,选择 中 部 2~6 个 果枝 上 靠近 主干 第 一 、 第 二 节 位 的 花 共 去 雄 。 去 雄 时 间 以 开花 前 一 天 下 午 为 宜 , 亦 可 在 杂交 当日 清晨 花 采 未 开放 时 进行 ,这 时 去 雄花 朵 的 花冠 应 已 露出 苞 叶 , 花 杀 即 可 开放 。 常 用 的 去 雄 方法 有 三 种 。 1 手 剥 去 雄 法 (图 2- 8) 用 刀片 从 花 葛 士 缘 一 侧切 入 (深度 以 不 伤 及 子 房 为 度 ) ,然后 自 右 向 左旋 转 ,将 花冠 连同 雄蕊 一 起 剥离 子 房 。 注 意 不 要 折断 花柱 的 柱头 。 剥 下 花冠 后 , 若 有 残留 小 片 雄 茧 管 ,可 用 儿子 夹 住 雄 芒 管 据 下 ,去 雄 后 ,在 柱头 上 套 一 蜡 管 ( 约 3 cm 长 ;一 matey 管 的 顶端 与 柱头 之 间 保 持 间隔 1 cm Jets 5 WT SEAT Ca 。 去 雄 时 不 要 损伤 苞 叶 ,以 免 影响 发 育 和 杂交 质量 。 为 SEAR 用 剪刀 剪 去 花冠 上 部 ,露出 柱头 和 部 分 花药 ,再 用 长 4 om 一 端 折 封 ` 比 柱头 粗 。88 ， 遗传 学 实验 教程 第 二 部 分 综合 性 实验 人 “。 图 2-8 棉花 去 雄 授粉 ( 引 自 邱 奉 同 , 刘 林 德 ”1992) 的 麦 管 从 柱头 上 套 下 ,并 轻 轻 转动 向 下 压 , 使 花丝 折断 花药 脱落 。 去 雄 干 净 后 ,* 麦 管 仍然 套 在 柱头 上 进行 隔离 。 3) By MERE FABY IM 4 eh BY FARE RT ee PE ee. tL BA LE eho 花冠 使 雄蕊 露出 。 FA BBY IPRA EDS. OA RBA ED. AT A KE. AE 后 ,用 麦 管 套 住 柱 头 进 行 隔离 。 把 纸牌 套 在 去 雄花 条 的 节 上 ,并 写 明 母 本 名 称 及 去 雄 目 期 。 这 种 方法 比较 麻烦 费 工 , 但 花 器 受伤 小 , 结 铃 率 高 。 (2) 授粉 选取 父 本 典型 株 , 于 杂 交 的 前 一 天 下 午 或 当天 清晨 去 雄 的 同时 ,选取 与 去 雄 母 本 同时 开放 的 花 条 ,用 棉线 将 花冠 顶端 扎 住 , 以 防 昆 贝 和 风力 把 其 他 花粉 带 入 。 扎 结 的 高 低 、 松 紧 都 要 适宜 ,不 要 扎 破 花冠 和 扎 住 柱头 。 授粉 最 好 在 上 午 9:00 一 11:00 进行 , 因 这 时 的 花粉 和 柱头 活力 较 强 。 授 粉 前 先 用 放大 镜 检 查 母 本 柱头 上 是 否 有 去 雄 时 残留 下 来 的 花粉 粒 , 当 天 去 雄 的 可 用 毛 笔 轻 轻 将 花粉 粒 指 拭 掉 ,前 一 天 下 午 去 雄 的 ,该 花 则 不 宜 再 作 杂 交 用 。 授 粉 时 用 钵 隆 从 父 本 花 上 撕 取 约 2/3 的 雄 芒 管 ,在 母 本 的 柱头 上 涂抹 几 次 , 待 柱头 粘 满 花粉 粒 Zee LE. ALS MLAS RH A. 为 防止 棉铃 脱落 ,提高 成 铃 率 , BE ASH PR ER EA ASR, HAVA HN 花蕾 。 (3) 收获 吐 积 时, 先 收 和 杂交 铃 ,将 棉籽 及 纸牌 一 同 装 人 纸袋 内 , 按 组 合 分 别 存放 。 【注意 事项 】 不 同 作物 的 生育 期 不 同 , 为 了 使 杂交 用 的 父母 本 花期 相遇 ,可 在 播种 时 进行 调 他, 即 进行 分 期 播种 : 将 所 有 父母 本 种 子 分 2~3 次 , 隔 7 一 10 d 分 期 播种 。 若 播种 后 发 现 花期 不 遇 , 可 在 幼苗 期 进行 日 照 处 理 或 加 大 肥水 量 促使 作物 旺 长 推迟 开 人 花期。 人 遗传 学 实验 教程 【实验 报告 】 1. 选用 小 麦 (或 水 稻 、` 棉 花 ) 两 个 品种 ,做 正 、` 反 交 组 合 ,各 做 4 穗 ,其 中 一 穗 不 授粉 ,以 检查 去 雄 质 量 。 统 计 杂 交 结 实 率 , 并 分 析 成 功 或 失败 的 原因 。 2. 如 何 把 传统 的 杂交 育种 技术 与 现代 育种 技术 结合 ? (AF) 实验 23 互补 测验 【实验 目的 】 通过 E. coli 互补 实验 ,探索 顺 反 子 的 遗传 特点 并 进一步 加 这 对 基因 的 认识 。 【实验 原理 】 在 经 典 遗 传 学 中 ,基因 被 认为 是 在 染色 体 上 占据 特定 位 置 的 DNA 序列 ,次 定 特定 性 状 的 表达 。 基 因 既 是 功能 单位 ,又 是 突变 单位 和 重组 单位 ,基因 之 间 通 过 交换 而 发 生 重组 。 随 着 遗传 学 研究 的 发 展 , 人 们 从 分 子 水 平 上 对 基因 产生 予 进一步 地 认识 ,基因 的 概念 随 之 发 生 了 改变 。 基 因 作 为 一 段 DNA 序列 ,其 中 的 任何 碱 基 对 都 可 以 改变 从 而 使 基因 发 生 突变 。 因 此 ,基因 内 部 有 许多 能 引起 遗 ， 传 效应 的 突变 位 点 。 基 因 间 的 重组 是 通过 染色 体 之 间 对 应 位 置 的 交换 而 实现 ” 而 染色 体 对 应 位 置 的 交换 并 不 仅 限 于 在 具有 转录 功能 的 区 段 之 间 发 生 ,染色 体 DNA 的 任何 位 置 均 可 能 发 生 交换 , 即 在 基因 之 间 和 基因 内 部 的 DNA 序列 中 均 可 发 生 交 换 。 因 此 ,同一 基因 内 部 的 不 同 突变 位 点 可 以 通过 重组 而 形成 正常 基 因 , 所 以 ,不 能 仅 赁 重组 (交换 ) 来 判断 基因 的 界限 ,只 有 通过 功能 性 互补 测验 才 能 区 别 基 因 。 所 谓 功 能 性 互补 测验 (complementation test) ,就 是 从 基因 的 生理 功能 的 角度 来 研究 基因 的 互补 作用 。 这 里 的 互补 是 指 一 个 染色 体 上 的 基因 所 不 能 编码 的 蛋 自 质 , 可 以 由 另 一 染色 体 上 的 等 位 基因 的 产物 所 补充 。 因 此 ,这 是 基因 产物 的 互补 ，. 通过 基因 产物 的 互补 而 完成 正常 的 生理 功能 。 互 补 作 用 一 般 只 发 生 在 不 同 基因 ， 间 , 所 以 ,凡是 功能 上 可 以 互补 的 则 属于 不 同 基因 , 即 为 非 等 位 基因 ;凡是 功能 上 不 能 互补 的 , 则 属于 同一 基因 , 即 为 等 位 基因 。 基 因 的 概念 也 从 决定 性 状 转变 为 决定 一 种 转录 产物 。 ; 在 E. coli 2.7 AN EFL BE — FN RE lac”) ,如 各 种 Z 突变 型 和 了 突变 型 。 各 种 Z 突变 型 和 Y 突变 型 之 间 是 可 以 互补 的 ,表现 为 能 够 利用 乳糖 。 而 各 种 Z 突变 型 相互 之 间 、 各 种 Y 突变 型 相互 之 间 是 不 能 互补 的 ,不 能 利用 乳 糖 。 因 此 ,可 以 确定 QZ 和 Y 分 别 是 两 个 基因 ( 顺 反 子 )。 Z ALY SEE. coli 乳糖 操纵 子 Coperon) 中 的 两 个 不 同 的 结构 基因 (structure 第 二 部 分 综合 性 实验 s « gene), 各 种 不 同 的 Z 突变 型 的 那些 位 点 均 属 于 同一 结构 基因 ,不 同 的 Y 突变 型 的 情况 也 是 一 样 的 。 E. coli 乳糖 操纵 子 结构 基因 的 互补 , 受 下 列 一 些 因素 的 影响 ,增加 了 基因 间 互 补 测 验 的 复杂 性 。 1) 某 些 Z 突 变型 发 生 极 性 突变 ,使 一 和 YY- 突变 型 之 间 不 能 正常 互补 。 2) 调节 基因 (regulator gene) 发 生 突变 袜 ,突变 型 的 表 型 效应 与 Z OY 双 突 变 型 相同 。 因 此 它 与 Z 或 Y 突变 型 均 不 能 互补 。 3) 由 于 基因 内 互补 的 发 生 ,使 某 些 Z 突变 型 与 另 一 些 Z 突变 型 发 生 互 补 。 重组 也 可 使 两 个 突变 型 变 成 野生 型 ,所 以 互补 测验 中 要 排除 重组 的 发 生 。 为 此 ,选用 的 受 体 菌 为 重组 缺陷 型 rec A- 。 另 外 ,由 于 互补 作用 可 发 生 在 每 一 杂 基 因子 细胞 中 , 而 重组 只 发 生 在 少数 杂 基 因子 细胞 中 ,所 以 实验 中 的 菌 液 浓度 要 低 。 这 样 不 会 妨碍 互补 现象 的 出 现 , 却 能 尽量 避免 重组 的 发 生 。 本 实验 观察 基因 间 的 互补 和 基因 内 无 互补 的 现象 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 (1) 受 体 菌株 FD1007 | \FielacZ' trp | thi str A recA FD1008 Flac Y thi strA recA (2) 供 体 菌 株 ESEHO 一 下 34ac 了 一 一 proA+B+ / A(laei pro) thi CSH14 F'lacZ proA*B*/ A(lac pro) thi supE 2. 用 具 及 药品 (1) AA 超 净 工作 人 台 、 离 心机、 分 光 光 度 计 ,恒温 振荡 器 、 接 种 环 `pH 试纸 .无 菌 培养 下 (9 sm) = fA} (150 ml) 试管 (15 mm X 150 mm) 、 无 菌 移 液 管 (0.1.0.5、1.5、 10 ml)、 量 简 (5、10、.25、100.500 ml) 离心 管 (10 ml) .烧杯 (50、100、250、500 ml), 称 量 瓶 (5、10 ml) \ 滴 管 .玻璃 涂 棒 、 玻 璃 棒 、 酒 精 灯 等 。 (2) 试剂 和 培养 基 1) LB 液 (加 乳糖 10 g/L) HARK 10 g、 酵 母 浸出 汁 5 g、 氯 化 钠 10 g，pH 7.5。 每 组 16 管 ,每 管 5 ml. 2) 含 乳 糖 、 色 氨 酸 、 链 霉 素 的 基本 培养 基 10x A 缓冲 液 100 ml, VB, (1 mg/ml) 4 ml, MgSO, * H,O(0. 25 mol/L)4 ml。 加 莹 饮水 至 1000 ml, AE 酸 (10 mg/ml) 4 ml、 链 霉 素 (50 mg/ml) 4 ml, 448 12~24 Ml. 3) 乳糖 EMB 培养 基 = EZ 16 TL. 4) 10XA 绥 冲 液 = BEBE — BACK, HPO,) 105 g, BEM — AA CKH,PO, ) ° 92 « 遗传 学 实验 教程 45 g. Wi PR EK (NH, )2SO,10 g. FT RAR GA (Na; C; H;O; * 2H,0,5 g> TN Ze BKB | 1 000 ml, pH 7.0。 % 5) 0.85 %4: Fah 7K ”每 组 36 管 ,每 管 4 5 ml. 6) 4 mg/ml 邻 硝 基 8- D - 半 乳 糖苷 (CO - nitrophenyl — P- D - galactoside, B-ONPG) ， 每 组 5ml。 此 溶液 无 色 。 | 7) 0.5 mol/L 碳酸 钢 每 组 5 ml, | 8) 甲苯 | | (c+) | | 1. 活化 菌株 将 各 实验 菌株 ( 供 体 及 受 体 ) 分 别 接种 于 5 ml IB 液 中 ,在 30C 条 件 下 培养 过 夜 。 2. 扩 菌 培养 | 4 吸取 经 活化 的 供 体 及 受 体 菌 液 1 ml, 分 别 加 入 5 ml 鲜 的 LB 液 中 扩 菌 培 SEE 3. 杂交 培养 下 3h 后 , 按 右 表 组 合 各 取 1 ml 混合 ,37"C, 轻 播 30 min. 然后 将 各 组 合 的 混合 菌 液 用 无 菌 生 理 盐水 稀释 至 10、 10 ,各 吸取 0.1 ml 分 别 涂 在 2 一 4 个 含 乳糖 和 链 霉 素 的 基本 培养 基 平板 上 。 同时 将 供 体 和 受 体 的 4 个 菌株 也 稀释 至 10 ,各 吸取 0. 1 ml 涂 在 两 个 同样 的 平 板 上 作为 对 照 。 以 上 平板 置 37C 条 件 下 培养 48 h。 4. 划 线 分 离 观察 实验 组 和 对 照 组 平板 上 的 菌落 情况 ,然后 将 在 基本 培养 基 上 长 出 的 实验 组 和 对 照 组 的 菌落 各 取 2 个 在 EMB 平板 上 划 线 分 离 。37C 培 养 过 夜 。 观察 EMB 平板 上 菌落 的 情况 ,可 观察 到 基因 间 有 互补 ,基因 内 无 互补 的 结 ， 果 。 然 后 将 在 EMB 平板 上 长 出 的 互补 菌落 (紫红 色 )、 不 能 互补 的 菌落 (5 白色) 以 及 各 对 照 菌株 的 白色 菌落 ,分别 接种 于 含 乳 糖 的 LB 液 中 ,30C 培 养 过 夜 。 5. 定性 测定 半 乳 糖苷 酶 将 菌 液 离心 ,用 1XA 缓冲 液 洗 涤 两 次 ,最 后 用 5 ml 1XA 缓冲 液 悬浮 菌 体 。 取 1 ml 菌 液 ,加 1 WAAR, We BGR 10 s, 然 后 在 37C 恒 温 揪 床 上 轻 摇 40 min, A 的 是 让 甲苯 挥发 ( 甲 茶 的 作用 是 破坏 细胞 ,使 酶 得 以 释放 ) 。 取 0.2ml 的 8-ONPG(4 mg/ml) PAZ FA EAD FS A PAP. FE 37C 恒 温 TKS PEK ESR HE 5 min、 观 察 菌 液 颜色 的 变化 。 若 菌 液 中 有 COFFEE BS B- ONPG 可 被 分 解 ,释放 出 黄色 的 对 硝 基 葵 酚 (O- nitrophenol) 。 这 就 是 B-FFL 糖苷 酶 的 定性 分 析 。 FD1007 FD1008 第 二 部 分 综合 性 实验 * 93 « 最 后 ,根据 实验 结果 填 人 下 表 。 互 补 测验 的 工作 程序 见 图 2 - 9。 互补 与 8- ONPG 的 颜色 反应 qth 与 8- ONPG 的 颜色 反应 FD1007 FD1008 wa 株 CSH40 CSH14 FD1007 FD1008 5 B- ONPG 的 颜色 反应 (两 种 供 体 ， 两 种 受 少量 菌 SmlL.B 液 2 1X4 1 30C 过 液 1 混合 | ces oes oe i 体 菌 的 组 合 ) | 37C 轻 摇 30 ~ 60 min ff 05, 40.5 0.5 在 4.5 ml 生理 ®t j i \ 10" ‘a 10° | 107 aE) pe te >. mm i" a 07 -3 本 01ml ae - ! as 0140.14 本 培养 基 平板 上 7 Phi 7EEMB Alana 落 是 否 分 离 : | Belg 24 hja 同 右 - 挑 红色 菌落 至 对 照 OFD1008 30°CR Y tins 同 右 | 离心 、 洗 涤 f A mid FA37C HeH 40 min 加 ONPG， 观 察 m 颜色 反应 图 2-9 互补 测验 工作 程序 ( 引 自 梁 彦 生 等 1989) 【实验 报告 】 1. 能 互补 的 菌落 在 EMB 平板 上 划 线 ,为 何 出 现 分 离 ? 2 亲本 菌株 在 加 乳糖 的 基本 培养 基 上 表现 如 何 ” 试 解释 其 原因 。 3. 互补 测验 中 为 什么 要 排除 重组 ”在 本 实验 中 采取 了 哪些 措施 ? 4. 将 试验 结果 做 出 报告 ,并 对 实验 结果 加 以 分 析 。 5. 根据 实验 结果 给 顺 反 子 下 一 个 定义 。 ( BR A 5] ) = a» 遗传 学 实验 教程 实验 24 “人 体外 周 血 淋 巴 细胞 妨 妹 染色 单 体 区 分 染色 法 【实验 目的 】 | 1 了解 姊妹 染色 单 体 区 分 染色 法 的 原理 和 制作 SCE 标本 的 基本 方法 :一 2 了解 SCE 计数 在 诱 变 剂 检测 中 的 作用 。 7 | 【实验 原理 】 | 某 些 药物 及 射线 等 因素 对 染色 体 具 有 诱 变 效应 ,但 微量 时 的 效果 通过 一 般 的 ， 畸变 观察 分 辨 不 出 来 ,而 染色 单 体 之 间 遗 传 上 等 价 的 染色 质 部 分 则 受 其 影响 发 生 交换 , 即 发 生 姊 妹 染 色 单 体 交 换 (sister chomatid exchange,SCE)。 这 种 交换 的 发 ， 生 就 可 以 通过 姊妹 染色 单 体 的 区 分 染色 来 观察 ,在 互 换 处 可 见 有 一 界限 明显 .颜色 深浅 对 称 的 互 换 片 断 , 且 可 作 SCE 计数 ,即使 在 一 定 距 离 发 生 多 次 互 换 亦 可 被 检 测 出 来 。 研 究 发 现 ,引起 染色 体 伤 害 的 因素 (如 病毒 `.X 线 .紫外 线 和 化 学 诱 变 剂 》 都 能 增加 SCE 的 发 生 频率 。 目 前 认为 SCE 反映 了 DNA 的 损伤 ,可 以 使 用 SCE 作为 突变 形成 的 指标 。SCE 分 析 方 法 比 观 察 染色 体 畸 变更 简便 、 迅 速 、 敏 感 ,并 表 现 出 很 好 的 剂量 效应 关系 ,因此 ,目前 已 将 此 法 列 为 检测 诱 变 剂 或 致癌 物 的 常规 指 ， 标 之 一 。 此 外 ,这 一 技术 无 疑 为 研究 细胞 周期 染色体 半 保留 复制 ` 染 色 体 的 分 子 | 结构 和 畸变 `.DNA 损伤 修复 等 重要 理论 问题 提供 了 新 的 手段 。 【材料 与 用 品 了 】 1. 材料 人 或 哺乳 类 动物 外 周 血 。 2. 用 具 与 药品 分 析 天 平 、 离 心机 (水 平 式 .4 000 r/min) 恒温 培养 箱 ( 电 热 隔 水 式 ) .干燥 箱 (50~300°C) . 超 净 工作 台 、 普 通 冰 箱 、 恒 温水 浴 锅 .高压 灭 菌 锅 、 真 空 泵 、 铝 饭 BRIN KAR LARK .离心 管 . 吸 管 、 刻 度 移 液 管 (5 mD AER fal .培养 瓶 ( 青 霉 素 瓶 ) .试剂 瓶 . 抽 滤 瓶 .G- 5 漏斗 .2 ml 无 菌 注 射 器 、 针头 (5 7* )、 采 血 针 、 棉 签 、 剪 刀 、 杀 子 酒精 灯 、 烧 杯 、 载 玻 片 .切片 盒 ,精密 PHL TAR ae 纸 、 记 录 本 。 RPMI1640 干粉 培养 基 、 小 牛 血清 `.PHA、 肝 素 、5 YR ERE. (Giemsa) 青霉素 、 链 霉 素 、 柠 檬 酸 钠 .5%% 碳 酸 氢 钠 .2%% 碘 酒 .75%% 乙 醇 、 毛 化 钠 、 氯 化 钾 、 磷 酸 二 氧 钾 、 磷 酸 氧 二 钠 、 上 甘油. 甲醇 、 冰 酝 酸 、10 wg/ml 秋水 仙 素 。 【实验 步骤 】 1. : 需 亚 的 清洗 与 消毒 将 针头 、 针 管 . 培 养 瓶 (用 青霉素 瓶 ) 刻度 移 液 管 . 抽 滤 瓶 .G- 5 漏斗 .烧杯 、 量 第 二 部 分 综合 性 实验 * 和 人 简 等 玻璃 器 亚 先 经 洗 液 浸泡 ,用 自来水 彻底 冲 干净 ,最 后 用 蒸馏 水 ` 双 蒸 水 各 冲洗 3 遍 , 在 烘箱 中 烤 干 。 将 针头 针管 .培养 瓶装 人 铝 饭盒 覆盖 纱布 ,其 他 器 亚 也 要 用 比 布 或 牛皮 纸 包 好 ,连同 橡皮 用 有 具 等 ,一 起 在 高 压 锅 中 灭 菌 。 2. 溶液 配制 1) 生理 盐水 0. 85 g NaCl 溶 于 100 ml 重 蒸 水 中 。 2) 肝素 溶液 = 160 mg(125 单位 /mg) 肝 素 钠 溶 于 40 ml 的 生理 盐水 中 。 3) 5% NaHCO; 溶液 5g 碳酸 氢 钠 溶 于 100 ml 重 蒸 水 中 。 以 上 三 种 溶液 都 要 在 0. 056 MPa 高 压 灭 菌 15 min。 ， 4) 秋水 仙 素 溶液 “ 称 取 10 mg 秋水 仙 素 , 溶 于 10 ml BAEK HH, A 1 ml, HH 到 100 ml, 浓 度 为 10 pg/ml, 5) BrdU 溶液 “ 称 5- 省 脱氧 尿 喀 喧 核 苷 2 mg, 在 超 净 工作 台 上 装 人 无 菌 青霉素 瓶 , 加 无 菌 生理 盐水 4 ml, 用 黑 纸 包 好 避 光 , 置 冰箱 保存 。 最 好 现 配 现 用 。 ii) 双 抗 溶液 “青霉素 、 链 霉 素 , 按 原 针 剂 的 效 价 ,各 自用 无 菌 生 理 盐 水 , 按 a 2 万 单位 /ml 配制 ,两 者 混合 后 ,为 1 万 单位 /ml。 7) 0.4% KCl] 溶液 4g KCILYAF 1000 ml B+, 8) PHAR TH AY BEL 10 mg, 临 用 前 用 2 ml 无 菌 生理 盐水 溶解 。 好 要 自制 ,可 取 6 g 菜豆 豆 粉 , 放 于 小 烧杯 中 ,加 入 25 ml 生理 盐水 ,充分 搅 匀 , 置 于 &C 冰 箱 中 24 h, 然 后 以 3 000 r/min 离心 20 min, 取 上 清 液 , 按 1 : 10 用 生理 盐水 RH G-5 滤 斗 抽 滤 除 菌 ,在 超 净 工作 台 上 分 装 成 小 瓶 , 置 冰箱 保存 。 _，9) 磷酸 缓冲 液 Ad: 9. 465 g 磷酸 氢 二 钠 溶 解 于 蒸馏 水 中 , 定 容 到 1 000 ml。 BYR: 9.07 g 磷酸 二 氢 钾 溶解 于 蒸馏 水 中 , 定 容 到 1 000 mi, 10) 2XSSC HR ” ”0.3 mol/L 氯 化 钠 .0.03 mol/L 柠檬 酸 钠 : 称 17.54 g 氧化 钠 、8. 82 g 柠檬 酸 钠 ,用 蒸馏 水 溶解 后 定 容 到 1 000 mi. _ ID Giemsa 母液 称 取 0.5 g Giemsa 粉 置 于 研 钵 中 ,加 入 几 滴 甘油 ,充分 研磨 后 ,再 加 入 33 ml 甘油 ,在 60C 温 箱 中 放置 2 h, 然 后 用 33 ml 甲醇 分 几 次 将 其 冲洗 到 棕色 瓶 中 。 3. 培养 液 的 配制 称 RPMI1640 干粉 1. 05 g, 溶 于 100 ml 重 蒸 水 中 ,在 超 净 工作 台 上 用 G-5 波 斗 抽 滤 除 菌 。 将 无 菌 培养 液 倒 人 灭 菌 的 烧杯 中 ,加 入 25 ml 灭 活 的 小 牛 血 清 、 4.2ml 肝 素 .1. 25 ml 双 抗 ,使 双 抗 最 终 浓度 为 每 ml 培养 液 100 单位 ,用 5 PMA 钠 调 pH 至 7. 2, 再 用 刻度 移 液 管 分 装 在 青霉素 小 瓶 中 ,每 瓶 5 ml。 4. 加 血 与 培养 用 肝素 湿润 针管 ,用 碘 酒 酒精 棉 球 控 净 采血 处 ,用 7# 针头 采 静 脉 血 2 ml, 在 超 净 工作 台 上 按 每 瓶 0. 2 一 0. 3 ml 的 量 加 入 培养 液 中 ,再 加 入 0.2 ml PHA (AK 。96 。 遗传 学 实验 教程 价 、 出 厂 日 期 不 同 , 用 量 可 有 所 改变 )、.0.1 ml BrdU, 使 ,BrdU ne 10 pg/ml #24) , 3E_EHRSE. FBR tt a. CE 37C 温 箱 中 避 光 培养 72 bh. 区 5. til 由 (1) 培养 和 离心 培养 66 一 68 h 后 ,在 每 瓶 中 用 5# 针头 加 入 秋水 仙 素 1 滴 ， 全 最 终 让 度 为 0.01~0. 02 ng/ml, 继 续 培 养 4~-6 h。 培 养 结束 后 ,将 培养 液 及 材料 转 和 人 离心 管 ， 1 000 r/min 离 心 10 min, (2) 1B 时 倒 掉 上 层 培养 液 后 ,加 入 6 ml 预 热 的 0. 4% KC1(37°C) KHL 15 min, 1 000 r/min#§.y 10 min, ‘=: (3) 固定 则 倒 掉 低 渗 液 ， Prog tas 冰 醋 酸 1 份 ,临时 配制 ) ,固定 15 min Bl. SAE. Ab 3 4 (4) aH | 最 后 一 次 固定 离心 后 ,保留 下 层 固定 液 约 0. 5 ml, 冲 匀 , 用 滴 管 在 10 cm Fah 将 材料 滴 在 冰片 上 (干净 载 玻 片 装 入 烧杯 ,加 上 蒸馏水 ,在 冰箱 中 冷 灰 26 LIED, 每 片 滴 2 滴 , 立 即 在 酒精 灯 上 烤 干 。 va (5) 照射 处 理 a 在 恒温 水 浴 中 放 一 铝 饭盒 ,饭盒 内 放 一 铁丝 架 或 玻璃 架 , 加 入 2 x SSC 溶液 (50°C ) ,溶液 的 高 度 以 不 超过 铁丝 架 为 准 (最 好 接近 )。 在 室温 下 将 染色 体制 片 施 置 一 天 以 上 , 滴 两 滴 2X SSC 溶液 ,将 片子 放 在 铁丝 架 上 ,上 盖 一 小 张 控 镜 纸 ,使 纸 的 两 边 浸 在 饭盒 的 2XSSC 溶液 中 ,水 浴 锅 上 放 一 带 单 的 紫外 灯 , 灯 与 标本 垂直 十 照射 距离 为 6 cm, 照 射 15 一 50 min, (6) 染色 | HR Soe Jes FA 28 1B 7k oh Os HR BEAK, A 20 + 1 的 Giemsa 染色 液 (pH 6.8) 色 10 一 20 min, 全 | (7) RE : HF Bek ze hE» 自然 干燥 ,在 高 倍 镜 下 进行 检查 。 【注意 事项 】 在 看 到 的 中 期 分 裂 相 中 ,可 以 看 到 两 条 姊妹 染色 单 体 着 色 显著 不 同 , 一 条 染色 深 , 一 条 染色 浅 ,并 能 看 到 有 的 姊妹 染色 单 体 进行 了 交换 。 在 统计 时 , 若 交换 发 生 在 染色 体 端 部 , 则 算 为 一 个 交换 ,发 生 在 染色 体 中 间 的 则 算 为 两 个 交换 。 若 被 检查 者 有 某 种 疾病 ,或 经 常 接触 有 害 物质 ,或 采用 正常 人 的 血液 ,但 在 培 养 过 程 中 加 入 了 诱 变 剂 , 则 交换 频率 会 大 大 增加 。 第 二 部 分 ”综合 性 实验 - OF 【实验 报告 】 1. 绘制 在 含有 BrdU 培养 液 中 连续 生长 三 个 细胞 周期 的 细胞 及 其 染色 体 的 模式 图 。 2. 二 实验 为 什么 要 在 全 黑 的 条 件 下 培养 ? ( 5 & fF] ) 实验 25 水 鼠 骨 艇 细胞 染色 体 显 带 技 术 与 姊妹 染色 单 体 色差 法 【实验 目的 】 掌握 制作 动物 骨髓 细胞 染色 体 标本 的 方法 ,练习 染色 体 显 带 技术 与 姊妹 染色 单 体 色 差 技术 。 【实验 原理 】 。 常规 染色 体 组 型 分 析 是 根据 染色 体 的 外 部 形态 和 结构 来 进行 的 。 在 辨认 相似 莱 色 体 和 鉴别 结构 变异 上 具有 一 定 的 困难 。20 世纪 70 年 代 开始 ,研究 者 对 染色 体 采用 了 热 . 碱 . 盐 和 酶 等 处 理 方法 ,使 染色 体 分 化 ,再 经 不 同 的 方法 显 色 ,使 染色 辟 上 显示 出 了 特定 的 带 纹 ( 如 有 C 带 .Q 带 .R 带 和 G 带 等 )。 染 色 体 产生 的 色 (ant mie 人 体 性 。 这 样 ,无 论 对 鉴别 染色 体 和 染色 体 组 型 ,还 是 就 染色 体 的 结构 与 功能 的 研 究 ,都 开辟 了 一 条 新 的 途径 。 染色 体 的 C 带 是 特异 性 地 显示 结构 异 染 色 质 的 带 ,可 以 专 一 地 显示 着 丝 粒 区 域 的 结构 异 染色 质 。 在 制作 C 带 标本 时 ,染色 体 要 经 酸 、 碱 和 SSC 处 理 。 酸 处 理 使 DNA 脱 嗓 叭 , 碱 处 理 可 能 通过 产生 一 个 高 水 平 的 DNA 变性 ,促使 激发 的 DNA 溶解 ,SSC 处 理 使 DNA 骨架 断裂 ,并 使 断 片 溶解 ,因而 可 以 使 非 C 带 区 ( 常 染色 质 区 ) 的 DNA 优先 被 抽取 ,而 C 带 区 (蜡染 色 质 区 ) 则 对 DNA 的 抽取 有 较 大 的 抗 性 ， 以 至 经 Giemsa 染色 ,呈现 深 染 。 本 实验 仅 就 C 带 标本 的 制备 方法 进行 练习 。 【材料 与 用 品 】 1 材料 /\y FR Mus musculus ) 。 2. 用 具 与 药品 (1) AB 离心 机 、 显 微 镜 、 台 式 天 平 、 恒 温水 浴 锅 、 解 剖 器 .无 菌 注射 器 (2 ml, 4* ,6* Ft 头 信 离 心 管 .吸管 烧杯 ` 量 简 、 载 玻 片 .紫外 灯 (30 BL). 。98 。 遗传 学 实验 教程 (2) 药品 1) 10% 酵 母 制剂 ”和 干 酵母 2. 5 g、 葡 萄 糖 5. 5 g, 加 25iml40O 无 菌 水 ,充分 | 混 匀 后 , 置 40C 温 箱 保 温 1. 5 一 2 h, 待 液体 表面 有 少量 气泡 出 现时 即 可 。 此 制剂 的 作用 是 刺激 骨 侯 细胞 的 有 丝 分 裂 , 以 增加 有 丝 分 裂 的 细胞 数目 。 2) 5 PR Abe ALR RR EA EP ak 5 - 碘 脱 氧 尿 喀 喧 核 尿 苷 使 用 量 为 0. 5 mg/g 体重 。 3) 阳性 对 照 药 物 “” 环 磷 酰 胺 或 丝 裂 霉 素 C AM AR. AA 别 为 10 一 30 pg/g 体重 0. 5 g/g 体重 .5 一 10 wg/g 体重 。 | 4) 秋 水 仙 素 溶液 1 mg/ml, 0. 85% 4 FRE IK IY Ca 3%) Giemsa (#48 5) A WK .1/15 mol/L 磷酸 缓冲 液 (pH 6. 8) .2 又 SSC WR. AL FH CO. 075 mol/L) 、 固 定 ; YR (3 甲醇 : 1 冰 醋 酸 ) 0. 2 mol/L HCl. Ah (5%) BALA 20 ae 米 油 。 【实验 步骤 】 i 1. J) BR BEE FA py AE ill VE | (1) 秋水 仙 素 预 处 理 实验 前 3 一 3. 5 hh, 腹腔 注射 秋水 仙 碱 溶液 ,每 10 g 体重 注入 50 一 80 ne 秋 | 水 仙 碱 。 4 (2) PBF Bi ea he : 断 头 法 处 死 小 鼠 ,立即 取 股 骨 , 闲 去 肌肉 ,将 股 肯 前 为 几 段 , 浸 和 人 5 mil 0. 85% 生理 盐水 中 ,反复 搅动 以 使 骨髓 腔 中 的 骨 甬 细胞 冲刷 出 来 。 除 去 碎 股骨 后 ,将 细 悬 液 移 人 离心 管 中 以 1 000 r/min 的 速度 离心 10 min, 弃 去 上 清 液 。 再 用 0. 85% 生理 盐水 洗涤 ,加 入 1/3 离心 管 的 生理 盐水 ,用 吸管 反复 吸 打 。 再 次 离心 10 min, FE LIAM. (3) 低 渗 处 理 加 入 4 ml 预 温 (37C) 的 0.075 mol/L 氧化 钾 , 用 吸管 吸 打 混 习 , 著 37 CHa 中 处 理 25 min 左右 ,使 细胞 吸 胀 。 | 入 固定 4 ) 预 固定 “在 低 渗 处 理 的 同时 ,可 加 入 1 一 2 rl RL LE ET 定 ， eetotte 心 时 细胞 结 团 。 2) 第 一 次 固定 ”， 低 渗 处 理 和 预 固定 后 ,进行 离心 ,要 求 与 上 述 一 样 ,吸取 上 上 清 液 , 先 加 入 0. 5 ml 固定 液 , 小 心 用 吸管 吹 打 混 匀 ,再 加 入 4.5 ml Ae RIES 后 , 静 置 15 一 30 min, 3) 第 二 次 固定 RRMA. RLM. MAS ml BERK FIBA. 4B 15~30 min, 4) 第 三 次 固定 操作 同上 。 充 分 的 固定 ,有 助 于 获得 染色 体 清 晰 、 分 散 良 q 4 第 二 部 分 综合 性 实验 “的 9 « 好 的 染色 体 标 本 ,所 以 ,第 三 次 固定 的 时 间 可 延长 至 过 夜 。 5) 滴 片 第 三 次 固定 后 “离心 , 吸 去 大 部 分 上 清 液 ,根据 沉淀 物 的 多 少 留 下 至 定量 的 固定 液 ( 一 般 留 0. 5 一 1 ml) , 混 匀 后 进行 滴 片 。 先 滴 一 张 片 染 色 , 若 制 片 申 申 期 分 裂 相 较 多 且 染 色 体 分 散 较 好 , 则 可 继续 滴 片 ,以 作 分 带 之 用 。 2. Giemsa 显 带 ~ 1) Be) a RE 64 A Hl EL 3~7 d 后 , 放 和 人 0. 2 mol/L HCl 中 处 理 1 h。 2) 蒸馏 水 冲洗 后 ,将 制 片 转 入 50~65°C 5% A ALAA HOO ~15 min( 也 有 天 在 55 条件 下 处 理 20 一 25 s) 。 3) 自来水 冲洗 后 ,再 用 温 蒸馏 水 冲洗 ; BEARS AE. Rae il 置 于 -60 一 65 CAE F 1~1.5h, 4) 蒸馏 水 冲洗 ,自然 干燥 。 5) 1: 20 Giemsa 染 液 染 色 5 一 6 min, 6) 自来水 冲洗 ,自然 干燥 后 即 可 镜 检 。 3. 姐妹 染色 单 体 色差 (1) 实验 设计 为 方便 观测 SCE ,在 制作 SCD 之 前 加 入 能 激发 SCE 的 药物 。 也 可 自己 设计 ， 找 几 种 药物 测定 其 对 SCE 产生 的 影响 。 实 验 用 鼠 一 般 选 用 6 一 8 周 龄 ,体重 约 为 20 g 的 纯 系 雄性 (或 肉 、 雄 各 半 ) 小 鼠 。 将 小 鼠 分 为 5 组 ,每 组 5 只 ,分 别 用 于 阳性 对 照 组 测试 组 和 空白 对 照 组 。 1) 阳性 对 照 组 用 能 强烈 诱发 SCE 的 药物 环 磷 酰胺 或 丝 裂 霉 素 C 或 甲 基 磺 酸 甲 酯 ,采取 一 次 性 腹腔 注射 的 办 法 给 药 。 使 用 剂量 分 别 为 10 一 30 pg/g 体重 、0.5 pg/g 体 重 .5 一 10 pe/g 体重 。 2) 测试 组 分 为 3 组 , 低 剂 量 组 的 药物 用 量 为 临床 剂量 的 5 倍 ,中 剂量 组 的 药物 用 量 为 临 床 剂量 的 20 倍 ,高 剂量 组 的 药物 用 量 为 临床 剂量 的 100 倍 。 待 测 药物 结合 其 溶解 度 选择 相应 的 方法 进行 溶解 ,给 药方 法 以 参考 临床 服药 方法 为 好 ,或 腹腔 注射 或 灌 服 。 给 药 次 数 根据 实际 情况 而 定 。 3) 空白 对 照 组 注射 实验 中 的 有 关 溶剂 ,如 生理 盐水 .蒸馏水 等 。 注 射 剂量 为 0. 2 ml/ 只 。 (2) 实验 步骤 1) 腹腔 注射 待 测 药物 .阳性 对 照 药 物 和 空白 对 照 物 。 2) 1h 后 ,在 小 鼠 背 部 皮下 注射 102% 的 酵母 制剂 0. 3 ml 只 3) 24h 后 ,在 股骨 沟 注 射 0.5 ml 内 含 10 mg BrdU 或 IdU 的 玉米 油 。 用 玉米 油 作为 媒介 物 , 目 的 是 使 核 苷 类 似 物 能 较 长 时 间 地 保存 在 体内 。 。 100 遗传 学 实验 教程 4) 14h 后 ,腹腔 注射 1 mg/ml 的 秋水 仙 碱 0.1 ml 只。 5) 16h 后 , 断 颈 处 死 小 鼠 , 按 常规 方法 制备 染色 体 标 本 。: 6) 紫外 光 分 化 染色 (FPG 法 )。 制 片 老化 1~3 d 后 , 载 片 上 滴 满 2x SSC 溶液 后 , 放 在 45~48°C FY) TET ZK A 8 89 FE: (5 PAS 7K 1 Te 22 PB, DOE PRE | 板 的 温度 为 45 一 48"C ,在 灯 距 为 6 cm 的 紫外 光 灯 (30 W) 下 照射 40 min HM | egenipiropguelicteibnnnnatanstininieilinaaiedbbiiibbicein oo Ja FA 1%Giemse(1 : 20) 42 f4 5~10 min, 7kK¥E RFR ee. . 7) SCE 计数 。 选 择 30~50 个 染色 体 长 短 适 中 ,分 散 良 好 的 中 期 相 细 胞 ， fer 表 进 行 SCE 的 统计 。 供 试 小 鼠 数 【实验 报告 】 1. 能 否 将 C 带 技术 和 SCE 技术 合并 到 一 起 进行 染色 体 标本 制作 ? 2. 小 鼠 染色 体 数目 是 多 少 ? 根据 着 丝 粒 的 位 置 它们 属于 哪 一 种 类 型 的 染色 体 ? 出 现 姊妹 染色 单 体 姊妹 桨 色 单 体 互 换 CSCE) TH 4 3. NAN ME HREM ae 8 2 和 (HAR) 实验 26 植物 原生 质 体 的 分 离 再 生 【实验 目的 】 | 1. 学 习 植物 原生 质 体 的 分 离 和 培养 技术 。 | 2. WS NGA ECAR FE UA HUD . 【实验 原理 】 ad 原生 质 体 是 植物 细胞 的 一 部 分 ,位 于 细胞 壁 内 。 因 此 ,必须 除去 细胞 壁 ,才能 获得 原生 质 体 。 一 般 通 过 酶 的 消化 来 分 离 原 生 质 体 ,但 这 种 方法 仅 局 限于 具有 禄 生 细胞 壁 的 组 织 。 植 物 细胞 壁 是 由 纤维 素 . 半 纤 维 素 . 果 胶 质 和 少量 的 蛋白 质 和 脐 类 组 成 的 。 由 于 这 些 不 同 物质 的 化 学 键 ,必须 使 用 混合 酶 液 以 降解 细胞 壁 ; 通 党 混合 使 用 纤维 素 酶 和 果 胶 酶 分 离 原生 质 体 。 【材料 与 用 品 】 1 材料 大 白菜 幼苗 ， 2. 用 具 及 药品 第 二 部 分 综合 性 实验 - 101 + | 超 净 工作 台 、 台 式 离 心机 、 倒 置 显微镜 、 尼 龙 过 滤 网 (400 目 ) Millipore 过 滤器 支持 物 、 滤 膜 ( 孔 径 0.45 pm) 、 杀 子 .剪刀 离心 管 (10 ml) ` 巴 斯 德 吸管 .直径 70 mm 培养 和 和 50 mm 圆 形 培养 瓶 和 烧杯 (100 ml 及 400 ml). 70% CBE .8% WK ARRAN. D -山梨 糖 醇 .D -= 葡萄糖、 了 D - 木 糖 、 水 解 酪 蛋白、 罗 4- 卫 . 葵 乙 酸 、 茶 基 腺 味 叭 、. 果 胶 酶 .纤维 素 酶 .Driselase、Bs 培养 基 。 DBs 培养 基 的 成 分 (pH 5.5) 如 下 。 下 大量 元 素 (mg/L) QNHy)2SO, CaCl; > 2H20 FeSO; "7H2O_ Naz» EDTA KNO; MgSO; + 7H20 NaH2PO, * 2H20 134 150 27.8 37.3 2500 370. 0 150 微量 元 素 (mg/L) CuSO, “s 5H20 MnSQ, = 4H2O ZnSO, o 7H20 H3 BO; CoCle = 6H2O0 Naz MoO, - 2H20 KI 0. 025 10 2 3 0. 025 0. 25 0.75 HEA: & (mg/L) 烟 酸 VRH 肌 醇 VB q 1.0 1.0 100 10. 0 Ki ARAL ATCe/L) ik 糖 20. 0 琼 脂 6.0 生长 调节 物质 (mg/L) 类 2,4-D 0.1~1.0 激动 素 0.1 【实验 步骤 】 1 叶肉 组 织 的 原生 质 体 的 分 离 和 培养 1) 实验 前 将 在 温室 条 件 下 生长 20 一 30 d 的 大 白菜 幼苗 的 叶片 转移 到 黑暗 中 一 天 。 选 取 第 一 和 第 二 片 真 叶 。 2) FERS LEGA FEM ERA 70% CREA 1 min, 然 后 放 到 8% 次 氧 酸 钠 液 中 ,浸泡 4 一 5 min。 用 无 菌 水 冲洗 5 次 , 放 在 烧杯 内 备用 。 注 意 , 此 步 及 以 下 操作 必须 在 无 菌 条 件 下 完成 。 3) 用 无 瑚 滤纸 吸 干 叶片 水 分 , 据 去 叶片 下 表皮 ,把 大 约 300 mg 叶片 转移 到 含 10 ml 酶 溶液 ,直径 70 mm 的 培养 四 中 。 ¢ 102 » 遗传 学 实验 教程 酶 液 的 配制 : 1%% 纤 维 素 酶 .1%% 果 胶 酶 .0.6% 纤 维 素 讲解 酶 .3.5 mmol/L CaCl, + 2H,0,0.7 mmol/L KH,PO,,275 mmol/L lj 448. 275 mmol/L He #3 mmol/LMES, pH 6.0, ; a | 4) 螨 膜 带 封 住 培 养 耿 ,用 纸 包 好 , 放 在 28 士 1 的 培养 箱 中 培育 ， 5) 洗涤 游离 的 原生 质 体 ”Q@ 酶 解 后 的 叶片 原生 质 体 通过 = - 插 闪 离心 管 (10 ml) 内 的 400 目 镍 丝 网 ,去 掉 残 存 的 叶 组 织 ; 在 1 500 r/min MAKE FE. BD 5 min。C) 用 巴 斯 德 吸管 去 掉 上 清 液 ,将 沉淀 悬浮 在 10 ml 培养 基 中 半 培 养 基 包括 | B 大 量 元 素 、 微 量 元 素 、 维 生 素 和 下 表 中 的 物质 。 - 山梨 醇 275 mmol/L “6 EARS 0. 5 mg/L HEE 275 mmol/L CaClz + 2H20 0..87. g/L 葡萄 糖 2.5 2/1. 2,4-D 2 0. 5 mg/L 核糖 0.125 g/L NAA 0.5 mg/L 0. 25/1. @ 重复 洗涤 两 次 。 6) 原生 质 体 的 培养 7 @ 用 上 述 培养 基 2 ml, 使 原生 质 体 再 悬浮 。 @ 吸取 原生 质 体 悬 浮 液 ,转移 到 直径 5 cm 的 培养 瓶 中 ,密度 (1 一 2) x 10° 司 生 质 体 /ml。 @ 将 培养 瓶 放 人 28 温 箱 中 培养 两 周 。 在 开始 培养 后 第 七 天 ,更 换 一 次 新 鲜 培养 基 , 以 1 ml 原生 质 体 / 瓶 分 装 ,然后 隔 7 d 补 加 几 滴 新 鲜 培 养 基 。2 周 后 ,将 培 养 瓶 转 放 在 1 500 lx 光照 条 件 培养 室 中 培养 。 + 2. 观察 原生 质 体 壁 的 再 生 和 细胞 分 裂 y 为 了 观察 细胞 壁 再 生 ,可 以 在 载 玻 片上 加 一 滴 原 生 质 体 悬 液 ,再 在 悬 液 上 加 二 滴 用 0. 4 mol/L 山梨 醇 配制 的 0. 1% 的 荧光 增 白 剂 ,然后 用 336 nm 波长 的 紫外 线 照射 。 在 获 光 显微镜 下 ,可 看 到 纤维 素 层 发 出 的 绿色 光 。 在 倒置 显微镜 下 ,6 可 观察 细胞 的 分 裂 过 程 。 【实验 报告 】 1. 哪些 是 影响 原生 质 体 分 离 成 功 的 因素 ”为 什么 ? 2. 哪些 是 影响 原生 质 体 再 生 的 因素 ? 为 什么 ? 3. 研究 原生 质 体 的 意义 是 什么 ? ( 郭 善 利 ” 周 国 利 ) 第 二 部 分 综合 性 实验 。 103 。 i 实验 27 FE. coli 的 转化 【实验 目的 】 理解 转化 的 原理 和 学 习 用 质粒 PBR322 转化 E. coli 的 方法 。 【实验 原理 】 1928 年 ,Griffith 在 肺炎 双 球 菌 (Dizpliococcxws pneumoniae) PRIM S FE(EMAB 后 ,直到 1944 年 转化 因子 的 本 质 才 被 Avery 等 所 鉴定 。 这 是 说 明 遗 传 物质 基础 fe DNA 的 第 一 个 明确 的 实验 根据 。 转 化 是 外 源 DNA( 包 括 染色 体 DNA 和 质粒 DNA) 引 入 受 体 细 胞 ,从 而 传递 遗传 信息 的 过 程 。 目 前 ,转化 已 成 为 基因 工程 中 一 种 常用 的 基本 实验 手段 。 在 细菌 转化 过 程 中 , 受 体 细 菌 必须 处 于 一 种 特殊 的 生理 状态 , 即 感受 态 状 态 (competent cell) 下 。 用 一 定 浓 度 的 氯 化 钙 处 理 , 并 辅 之 短 时 间 的 高 热 《42 一 45C ), 受 体 菌 即 可 呈现 感受 态 。 此 时 ,外 源 DNA 将 容易 进入 受 体 菌 ,并 进 而 在 细胞 中 复制 和 表达 。 {: “pBR922, BB A A MAE EK A 四 环 素 抗 性 基因 (Ap Tc). SA pBR322 质粒 的 细菌 具有 对 氮 苯 青 霉 素 和 四 环 素 的 抗 性 ,在 含有 这 两 种 抗生素 的 培养 基 上 可 以 正常 生活 。 本 实验 所 用 的 E. coli HB10L1 受 体 菌 * 不 具有 pBR322 质粒 ,所 以 对 氨 革 青霉素 和 四 环 素 是 敏感 的 ,在 含有 这 两 种 抗生素 的 培养 基 上 不 能 生活 。 将 抽 提 的 pBR322 质粒 通过 转化 使 其 进入 受 体 菌 (FE. coli HB101) 后 ,结果 实 现 了 两 个 抗 性 基因 的 转移 ,从 而 使 受 体 菌 出 现 了 抗 所 个 青 霉 素 和 四 环 素 的 新 性 状 。， 转化 子 在 含有 抗生素 的 培养 基 上 ,就 可 被 筛选 出 来 。 转 化 的 成 功 说 明 我 们 提取 的 质粒 DNA 是 有 生物 活性 的 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 E. coli HB101, 2. 用 具 及 药品 CQ) 实验 用 有 具 三 角 瓶 (150 ml) 离心 管 (C5 ml、10 ml) \ 离 心机 、 微 量 注 射 器 或 微量 移 液 器 、 培 养 四 (9 cm) AKER FAS (2 六 培养 基 与 试剂 1) 完全 培养 液 L(LB 液 )(pH7. 2 一 7.4) REA GARE AH 10 g、 AEE 5 g、 氧 化 钠 5 g, 加 蒸馏 水 800 ml 溶解 上 述 试剂 ,用 1 mol/L NaOH if] pH 17. 2 一 7.4, 补 加 蒸 馅 水 至 1 000 ml。0. 056 MPa 灭 菌 30 min, + 104 - 遗传 学 实验 教程 2) 完全 固体 培养 基 LB 液 十 2%% 琼 脂 ,0. 056 MPa 灭 菌 30 min, | 3) AK BSR (Ap) YK (20 mg/ml) ， 称 取 Ap20 mg, 加 无 菌 蒸 饮水 1 ml, 临 用 时 配制 。 4) 75 mmol/L 氯 化 钙 ，0. 105 MPa KE 15 min,4C 冰 箱 保 存 。 5) 10 mmol/L Ath #A.0. 105 MPa 灭 菌 15 min,4 人 冰箱 保存 。 6) Fabia IBK. | 【实验 步骤 】 1) 接种 受 体 菌 E. coli HB101 于 5 ml 的 LB 液 中 ,37 了 振 划 培养 过 夜 。 | 2) 取 2.5 ml 的 细菌 培养 物 扩 菌 至 50 ml 的 LB 液 中 ,37" 继续 振 划 培 | 养 1. 5 hCODs00~0. 4) 。 有 3) 冰 浴 中 放置 5 min, 取 5 ml 细菌 培养 物 , 以 4 000 r/min By 10min( 有 条 件 时 可 在 4C 条 件 下 ,以 6 000 r/min 离心 5 min) ,收集 菌 体 。 站 4) 菌 体 悬浮 于 2. 5 ml 4H 10 mmol/L 毛 化 钠 ,4 000 rmiin, 离 心 10 “aa i 条 件 时 可 在 4C 条 件 下 ,以 6 000 r/min 离心 5 min) ,洗涤 菌 体 。 a 5) 为 使 细菌 呈现 感受 态 , 菌 体 应 再 悬浮 于 0. 25 ml WAY 75 mmol/L 氢化 局 中 , 冰 浴 20 min, 注 意 要 不 断 地 摇动 ,以 促使 细胞 膜 形成 小 孔 , 有 利于 外 源 DNA 进 ， 人 细胞 。 . | 6) 取 自 制 的 质粒 DNA 10 pl 和 0. 1 ml 感受 态 细 菌 混 合 , 冰 浴 30 min, 每 隔 ， 5 min 振 葛 一 次 ,以 防止 菌 体 下 沉 于 管 底 。 | 另 各 取 受 体 菌 0. 1 ml, 质 粒 DNA 10 pl (EXTER. > | 7) 将 装 有 转化 和 对 照样 品 的 试管 置 于 42°C Ab 2 min, 进行 热 冲击 ,这 一 二 了 又 将 有 利于 质粒 DNA 进入 受 体 菌 。 8) 按 下 表 补 加 1.9ml 的 LB 液 ,在 37C 培 养 2h。 > | LB 液 /ml 受 体 菌 /ml ji, DNA/pl 4 转化 组 1.9 0.1 10 受 体 菌 对 照 1:9 0.1 0 供 体 菌 质 粒 DNA 对 照 1.9 0 10 9) 按 下 表 处 理 涂 平板 LB 固体 平板 加 抗生素 平板 不 加 抗生素 平板 转化 组 原液 .10-1、10-2( 各 3 Mm) JAR 10 10-2 (% 3 Ml) 受 体 菌 对 照 原液 (3 Ml) 10-5 10-610-7( 各 -3 Ml) 供 体 菌 质粒 DNA 对 照 原液 (3 ML) 原液 (3 ML) 第 二 部 分 综合 性 实验 。105 。 将 以 上 平板 置 于 37C 培 养 24 h( 加 抗生素 的 平 血 可 延长 至 48 h) ,观察 并 统计 | 转化 子 的 数目 。 10) 计算 转化 频率 (图 2- 10) 上 受 体 菌 “” 25|ml 37 C 振 荡 过 夜 AN |B7c 振 功 15h 410mmo/L 475 mmol/L 10 几 质粒 DNA at NaCl 2.5 ml _4-CaCl 0.25 ml eee -_ WA 离心 omin mage 离心 TO wie 不 断 摇 动 ae 每 隔 5 min 摇 1 次 1 ween DNA ,.0.1 ml 受 体 菌 oe ty eke Y OY OY 1 ml 受 体 菌 42C 热 冲击 2 min |42C 热 冲击 2 min | 42°C PPT min [leh irl beens 19ml 一 ~ 人 19ml 一 = 人 1 LB 液 LB 液 GY LB 液 F137°C, 2h G 37°C, 2h Yon 37°C, 2h "orm (Coe ¢ 5 CEOS 原液 103) Mice 10, ee OD. io, Al 2-10 转化 实验 的 主要 步骤 ( 引 自 梁 彦 生 等 ”1989) D 求 每 微克 DNA 转化 子 数 ,公式 为 ， 转化 频率 一 直 司 攻 人 二 二 条 全 二 转化 子 /微克 DNA D 求 转化 子 的 百分数 ,公式 为 ， we Hepa FLEE 100% ACF RI — NB PEE ID UA 5 106 遗传 学 实验 教程 【实验 报告 】 1 什么 是 转化 ?什么 是 转 导 ? 两 者 有 什么 区 别 ? 2、 转 化 实验 中 ,实验 组 和 对 照 组 平 阵 应 有 什么 样 的 结果 ?如何 解释 这 个 结果 ? ( 郭 善 利 “” 周 国 利 ) 附 (本 实验 的 备 选 实验 ) E. coli 的 转化 实验 人 【实验 目的 】 学 习 毛 化 钙 法 制备 E. coli 感受 态 细胞 和 外 源 质 粒 DNA 转 人 受 体 菌 细胞 的 技 ， 术 以 及 筛选 转化 体 的 技术 。 了 解 细胞 转化 的 概念 及 其 在 分 子 生物 学 研究 中 的 H =p 1 克隆 的 筛选 : 主要 用 不 同 抗生素 基因 筛选 。 常 用 的 抗生素 有 : AKER, 卡 那 霉 素 、 氧 霉 素 、 四 环 素 、 链 霉 素 等 。 【材料 与 药品 】 1. 材料 菌株 E. coli DH5a,pUC19 质粒 。 2. 用 具 及 药品 无 菌 超 净 台 .电热 恒温 水 浴 锅 、 分 光 光 度 计 、 离 心机 、 移 液 器 、 微 型 离心 管 等 。 LB 液体 培养 基 和 含 抗生素 的 LB 平板 培养 基 (50 一 100 pg/ml 氨 苯 青霉素 六 预 冷 的 CaCl ¥ W (O.1 mol/L), A** FEA (Amp) HH Bk RM 100 mg/ml JAK. B— 20°C FG RF. (xR) 1. 受 体 菌 的 培养 从 LB 平 板 上 挑 取 新 活化 的 下 .coli DH5a 单 菌落 ,接种 于 3 一 5 ml LB 液体 培 养 基 中 , 37C 下 振荡 培养 12 h 左右 ,直至 对 数 生 长 后 期 。 将 该 菌 悬 液 以 (1 : 50)~(1 : 100) 的 比例 接种 于 50 一 100 ml LB RAIS FEE 37 CHR GBF 2 一 3 h 至 ODio 委 0. 5 左右。 注意, 细胞 数 务必 用 10 /ml, 此 为 实验 成 功 的 关键 。 2. E. coli 感受 态 细胞 的 制备 (CaCl 法 ) (1) 每 组 取 培 养 液 3 个 4ml 转 人 4ml 离心 管 中 , 在 冰 上 冷却 20 一 30 min, 于 4°C, 4 000 rmin 离 心 10 min。 从 这 一 步 开 始 ,所 有 操作 均 在 冰 上 进行 ,速度 尽量 快 而 稳 。 (2) 倒 净 上 清 培养 液 ,将 管 倒 置 1 min 以 便 培 养 液 流 尽 ,用 2 ml 冰冷 的 0. 1 mol/L CaCl, 溶液 轻 轻 悬浮 细胞 , 冰 浴 30 min, 第 二 部 分 综合 性 实验 。107 。 Emma (3) 0 一 4C,4000 r/min 离心 10 min, (4) FE EWR. OMA 1 ml 冰冷 的 0.1 mol/L CaCl, 溶液 ,小 心 悬 浮 细 胞 。 | 0~4°C ,4 000 r/min 离心 10 min, 5) 弃 去 上 清 液 ,加 入 200 pl 冰冷 的 0. 1 mol/L CaCls 溶液 ,小 心 悬 浮 细胞 , 冰 上 放置 片刻 后 ， , 即 制 成 了 感受 态 细胞 悬 液 。 《6) 制备 好 的 感受 态 细 胞 悬 液 可 直接 用 于 转化 实验 ,也 可 加 入 占 总 体积 15% 友 右 高 压 灭 区 过 的 甘油 , 混 匀 后 分 装 于 1. 5 ml 离心 管 中 , 置 于 一 70C 条 件 下 ,可 保 存 半年 至 一 年 。 3. 细胞 转化 (1) 取 200 岂 感受 态 细胞 悬 液 ( 如 是 冷冻 保存 液 , 则 需 化 冻 后 马上 进行 下 面 的 操 作 ) 加 入 质粒 DNA 2 21(50 ng) 混 匀 ，, 冰 上 放置 20~30 min。 同 时 做 两 个 对 照 组 : ， 对 照 组 1: 以 同体 积 的 无 菌 双 蒸 水 代替 DNA 溶液 ,其 他 操作 与 上 面相 同 。 对 照 组 2: 以 同体 积 的 无 菌 双 莹 水 代替 DNA 溶液 ,但 涂 板 时 只 取 5 pl 菌 液 涂 布 于 不 含 抗生素 的 LB 平 板 上 。 (2) 于 42C 水 浴 中 保温 1~2 min( 热 激 ) ,然后 迅速 冰 上 冷却 2 min, (3) 立即 向 上 述 管 中 分 别 加 入 0. 8 ml LB 液体 培养 基 ( 不 需 在 冰 上 操作 ) ,该 溶液 称 为 转化 反应 原液 , 摇 匀 后 于 37"C 振 功 培 养 约 45 一 60 min ,使 受 体 菌 恢复 正 常生 长 状态 ,并 使 转化 体 表达 抗生素 基因 产物 (Amp") 。 4. 平板 培养 (有 时 需要 稀释 ) 。_ (1) 取 各 样品 培养 液 0. 1 ml, 分 别 接种 于 含 抗生素 LB 平板 培养 基 上 , RA 《如 果 用 玻璃 棒 涂 抹 ,酒精 灯 烧 过 后 稍微 凉 一 下 再 用 ,不 要 过 泛 )。 (2) 菌 液 完全 被 培养 基 吸 收 后 ,倒置 培养 秋 , 于 37"C 恒 温 培 养 箱 内 培养 过 夜 《12 一 16 h) , 待 菌落 生长 良好 而 又 未 互相 重 亚 时 停止 培养 。 用 CaCl, 法 制备 的 感 受 态 细胞 ,可 使 每 微克 超 螺旋 质粒 DNA 产生 5X 10°~2 10" 个 转化 菌落 。 在 实 际 工 作 中 ,每 微克 有 10° 以 上 的 转化 菌落 足以 满足 一 般 的 克隆 实验 。 5. 检 出 转化 体 和 计算 转化 率 统计 每 个 培养 下 中 的 菌落 数 ,转化 后 在 含 抗生素 的 平板 上 长 出 的 菌落 即 为 转 化 子 , 根 据 此 严 中 的 菌落 数 可 计算 出 转化 子 总 数 和 转化 频率 ; 转化 子 总 数 王 菌 落 数 X 稀 释 倍 数 义 转化 反应 原液 总 体积 / 涂 板 菌 液体 积 转化 频率 (转化 子 数 /每 mg 质粒 DNA) 一 转化 子 总 数 / 质 粒 DNA 加 入 量 Cmg) 对 照 组 2 菌落 数 X 稀 释 倍 数 义 菌 液 总 体积 涂 板 菌 液体 积 感受 态 细 胞 总 数 三 。 108 。 遗传 学 实验 教程 感受 态 细胞 转化 效率 三 转化 子 总 数 /感受 态 细胞 总 数 【注意 事项 】 本 实验 方法 也 适用 于 其 他 . coli 受 体 菌 株 的 不 同 的 质粒 DNA 的 转化 。 但 它 们 的 转化 效率 并 不 一 定 一 样 。 有 的 转化 效率 高 , 须 将 转化 液 进行 多 梯度 稀释 涂 板 才能 得 到 单 菌落 平板 ,而 有 的 转化 效率 低 , 涂 板 时 必须 将 菌 液 浓 缩 ( 如 离心 才能 ， 较 准 确 的 计算 转化 率 。 【实验 报告 】 1. 观察 各 组 实验 的 结果 有 什么 不 同 并 加 以 分 析 。 2. 统计 菌落 数 ,计算 转化 率 。 3. 制备 感受 态 细胞 的 原理 是 什么 ? 这 种 现象 ? ( 刘 ” 文 ) 实验 28 数量 性 状 的 遗传 参数 一 eH 【实验 目的 】 1. 以 果 蝇 为 材料 ,在 较 简便 的 操作 条 件 下 ,用 较 短 的 时 间 获 得 亲 代 与 其 子 代 的 一 个 数量 性 状 一 一 体 长 (或 腹 板 刚毛 数 ) 的 资料 。 2. 运用 子 代 对 亲 代 的 回归 法 这 一 基本 的 方法 估计 遗传 力 , 从 而 了 解 遗 传 力 的 估算 方法 及 其 在 研究 生物 群体 数量 性 状 遗 传 中 的 重要 意义 。 【实验 原理 】 群体 某 一 数量 性 状 的 遗传 方差 与 总 的 表 型 方差 的 比率 ,通常 称 为 该 性 状 的 遗 传 力 (heritability) 记 为 吾 ” 。 其 定义 式 为 : _ % Op 遗传 力 是 进行 动 . 植 物 育种 时 必须 利用 的 一 种 参考 数值 或 统计 常数 之 一 , 故 称 为 遗传 参数 。 遗 传 力 可 分 为 广义 遗传 力 和 狭义 遗传 力 两 种 。 H? 表示 某 数量 性 状 的 表 型 值 中 有 Vc/Ve 是 由 多 基因 累加 效应 造成 的 , 则 这 个 比率 称 为 该 数量 性 状 的 狭义 遗传 力 , 记 为 产 。 其 定义 公式 为 : ais nS h? = P Op 4. 如 果实 验 中 对 照 组 本 不 该 长 出 菌落 的 平板 上 长 出 了 一 些 菌 落 ,将 如 何 解 释 第 二 部 分 综合 性 实验 * 009 它 所 表示 的 是 ,在 性 状 由 父母 到 子女 的 传递 过 程 中 可 遗传 并 能 予以 固定 的 部 分 。 因而 它 是 群体 最 重要 的 性 质 之 一 。 测定 遗传 力 的 方法 很 多 ,不 同 生物 ,不同 性状 所 适宜 的 方法 不 同 , 但 基本 的 方 法 只 有 亲子 相关 (或 回归 ) 和 同胞 相关 两 大 类 。 子 代 与 亲 代 的 相似 性 表现 为 遗传 ,相似 性 的 程度 在 统计 遗传 学 中 往往 用 相关 系数 或 回归 系数 来 表示 。 亲 代 与 子 代 的 相关 包括 子女 与 其 母亲 的 相关 和 子女 对 其 父母 平均 值 的 回归 ,在 同样 条 件 下 ,后 者 的 精确 度 比 前 者 高 。 果 蝇 等 实验 动物 在 一 雄 配 一 肉 的 情况 下 ,多 采用 子女 对 其 父母 平均 值 ( 简 称 中 亲 值 ) 的 回归 法 来 估计 遗传 力 。 但 这 必须 根据 性 状 的 特点 来 选用 不 同 的 方法 。 由 亲 代 与 子 代 的 相关 关系 来 估计 遗传 力 的 方法 是 最 基本 又 简便 的 方法 。 知 亲 代 与 子 代 的 表 型 方差 相同 ,而 且 雌 雄性 别 间 的 方差 也 相同 , 则 亲 代 与 子 代 在 同一 性 状 上 的 相关 系数 即 等 于 子 代 对 于 亲 代 的 回归 系数 。 此 时 估计 遗传 力 用 回归 系数 比 用 相关 系数 更 为 方便 。 在 随机 交配 和 环境 条 件 稳定 的 情况 下 ,女儿 群体 茶 性 状 的 标准 差 与 母亲 群体 同一 性 状 的 标准 差 基本 相同 。 因 此 ,为 了 计算 方便 起 见 , 可 用 女儿 对 于 母亲 的 回归 系数 代替 女儿 与 母亲 的 相关 系数 。 设 : 母亲 某 性 状 的 表 型 值 为 P, 女 儿 该 性 状 的 表 型 值 为 0。 两 者 的 标准 差 相 等 , 即 op = co WX FEM KAR: 式 中 ，bop 为 女儿 对 于 母亲 的 回归 系数 ,Covro 为 母 本 协 方差 。 由 于 ; CovGro = LV a Bh on) RF AMT) h? — 20m Vo = Vp 1 Vi ere, = toe _ Com 2 OP JVoVe V; 和 oe = 2rop 如 果 性 状 ( 如 生长 率 、 体 长 , 体 宽 .刚毛 数 等 ) ,在 两 性 间 都 能 表现 , 则 可 以 由 中 末 值 ( 即 父母 同一 性 状 的 平均 值 ) 来 估计 遗传 力 : 设 : 子 代 某 性 状 的 平均 值 为 0, 父 母 该 性 状 的 平均 值 为 P sa。 110 = 区 用 8 Covcp ae de hive SILAS RANE REO FS KOE Jy BB URE RA a A 资 时 料 按 雄 蝇 ( 父 本 ) 分 组 并 整理 成 母 女 配对 的 资料 见 表 2- 2。 母 本 2.77 3. 00 2. 90 2.41 2.77 子女 2.72 2.54 2. 63 2e0t 2. 69 $P,+9Py ) 父 本 2 母 本 2.45 3.09 3, 2, Z. o9 2. 41 子女 2. 82 2 3. 00 2. 63 2. 82 母 本 2.41 3.14 2. 82 2. 82 2.54 1 1 CR FX 2. 82 2. 82 3. 63 2.95 2. 50 表 2-2 果 蝇 体 长 母 女 配对 资料 父 本 3 父 本 4 母 本 ce 3. 09 2.72 2.41 2. 82 3.05 2 2. 45 2.72 2. 82 2. 82 以 第 一 个 父 本 内 母 女 对 的 数据 为 例 , 说 明 计 算 的 具体 步骤 。 设 : 母 本 体 长 的 表 型 值 为 X, 子 女体 长 的 表 型 平均 值 为 了 ,列表 计算 如 下 。 X 时 2.12 2. 54 2. 63 Zell Z, 99 la 20 Weis he = baa WON — 2X2 x2 7.6729 9. 000 0 8. 410 0 5. 808 1 7.672 9 38. 563 9 a £18: BOM “y' 5 C1325 9 Y2? 7. 398 4 6. 451 6 6. 916 9 7.6729 6. 708 1 35. 147 9 >) X = 13.85, DJY = 13. 25, >) X? = 38.5639, SY? = 35987915) XK = 86. 6314, = 38. 3645, = 55. 1125; (13. 85) (13. 25) 5 = 36.7020 « 单位 : mm , 父 本 5 母 本 Fx 2, 68 B77. 2, 86 2.95 PY 2.59 2. 63 2. 63 2.77 2. 90 XY 7.5344 7. 6200 6. 6270 6.6767 7.1743 36. 631 4 第 二 部 分 综合 性 实验 。111 。 ， 其 他 各 父 本 组 也 都 如 法 一 计算 出 上 述 数 据 , 列 出 以 下 总 数据 表 ( 表 2- 3)。 和 表 2-3 父 本 内 母 女 间 体 长 表 型 值 相 关 计算 表 RA AACE Dx > 入 入 2， DY So XY Cx Cy Cxy 组 别 本 数 T 1 5 13,85) "13.25 °36. 5009 35.1479 36. 631 4 38. 3645 下 36. 7025 区 5 13.81 14.04 38.7597 39. 494 6 38. 886 2 88. 143 2 39.4243 38. 778 4 1 3 5 aia. 13.72 38.0241 37.7742 37. 736 6 37. 7025 37. 647 6 sf Gto 于 4 5 2. Be oe lktn SO) uo. 380613 8 38. 100 0 38. 113 4 38. 198 4 38. 088 0 38. 143 2 5 5 13.20 wlevo4. “85. 8342 38. 410 4 36. 819 3 35. 166°5 38. 309 1 36. 703 6 & 25 68.47 68.65 189.2955 188.9271 188.1869 187.5741 188.5815 188.0028 计算 父 本 内 平方 和 乘积 和 : X 的 父 本 内 平方 和 SSwo = >) >) X? — D)Cx = 189. 295 5 — 187. 574 1 = 4.17214 Y WRAA FAA SSwm = >) VY’ — DIG = 188. 927 1 — 188. 581 5 == 0; 345 6 XY 的 父 本 内 乘积 和 SSwan = >) >) XY— >) Cw = 188. 186 9 — 188. 002 8 = 0, 1341 按 下 列 公 式 计 算 父 本 内 (组 内 ) 女 . 母 相关 系数 和 遗传 力 : SPwom Vv SSwam SSwoo 0. 184 1 /0. 345 6 X 1. 721 4 = 0. Z30at 父 本 内 女 母 相关 系数 为 全 了 这 个 结果 告诉 我 们 , 果 蝇 的 体 长 的 表 型 变异 中 有 47 色 左右 决定 于 遗传 因素 ， 53 斩 左右 决定 于 环境 因素 。 上 述 方法 是 为 了 消除 雄 亲 ( 父 本 ) 群 间 的 差异 ,而 采用 的 父 本 内 相关 性 。 ° 112 。 遗传 学 实验 教程 此 外 ,也 可 采用 在 各 雄性 亲本 内 ( 父 本 内 ) 求 子女 对 于 母 本 ( 肉 亲 ) 的 回归 系数 ，， 然后 进行 加 权 平 均 ( 以 母 , 女 配对 数 加 权 ) ,以 求 得 平均 的 回归 系数 。 Ra | 于 母亲 的 父 本 内 回归 ,此 法 在 畜牧 业 中 常用 。 现 仍 以 上 述 资料 为 例 , 简 要 说 明 其 计算 方法 。 按 表 2- 2 数据 形式 算出 每 个 雄 亲 内 的 子女 均值 对 于 母 本 的 回归 系数 ,如 果 各 | 母 本 的 子女 数 相等 , 则 可 直接 代入 回归 系数 的 公式 : ae oe S32 aX oko ee — 利用 EL - 5002 型 计算 器 (国产 或 日 本 SHARP 出 产 ) 可 以 直接 求 得 。 如 果 各 母 本 的 子女 数 不 相 等 ;, 则 须 用 下 列 公式 计算 ， n >,RXY — > kX > RY n > RX? — CD>TRX)? bx = 式 中 ,三 各 母 本 的 子女 数 。 现 将 所 计算 的 各 父 本 内 女儿 对 于 母亲 的 回归 系数 列表 如 下 。 QA A Gl 1 2 3 4 5 回归 系数 (Ax ) —0. 350 0.1747 0. 1900 0.0700 0. 680 0 求 加 权 的 平均 回归 系数 ,由 于 各 雄 亲 的 与 配 瞧 亲 的 数目 均 相等 (mm = = 7 | FE bik NYE bike Yep bang) “Pbk aa) “Bs Sin © SLi + be + bs + bs + 5 J 25 = 0. 152 94 he = 2X 015294 = OF 305 58 由 于 采用 的 方法 不 同 , 果 蝇 同一 性 状 的 遗传 力 的 数值 有 些 差异 ,这 是 各 种 具体 方法 的 精确 度 不 同 造成 的 。 如 果 我 们 的 资料 是 来 自 一 雄 配 一 了 则 可 求 子女 均值 对 双亲 均值 (中 亲 值 ) 的 回归 系数 ,此 时 , h? = 加 少 。 这 只 需要 将 资料 整理 为 中 亲 值 与 子女 均值 的 第 二 部 分 综合 性 实验 ”和 8。 配对 数据 计算 出 通常 的 回归 系数 , 则 为 所 求 的 遗传 力 。 一 般 来 说 ,该 方法 的 精确 度 比 前 法 要 高 ,因为 此 方法 的 标准 误差 比 前 述 方法 的 标准 误差 要 小 得 多 。 【材料 与 用 品 了 】 1. 材料 D. melanogaster 野生 型 果 蝇 ,为 了 测量 体 长 方便 起 见 亦 可 考虑 采用 突变 种 残 2H (ve) AERA (nub’ ) 果 蝇 。 2. 用 具 及 药品 显微镜 ( 带 推进 器 ) 测 微 尺 ( 台 尺 、 目 尺 配 套 ) EL - 5002 型 计算 器 .吸虫 右 、 解 前 镜 、 放 大 镜 、 毛 笔 、 麻 醉 瓶 .吸水 纸 、 白 瓷 板 和 指 管 ( 或 大 试管 ) 等 。 果 蝇 用 培养 基 、 乙醚 等 。 【实验 步骤 】 ”1) 取 野外 采集 来 的 雄 果 蝇 5 只 ,麻醉 ,在 低 倍 镜 下 用 测 微 尺 测 其 体 长 。 即 将 麻醉 好 的 果 蝇 头 部 朝向 同一 方向 整齐 地 纵向 排列 在 一 张 载 玻 片上 , 在 物镜 镜头 简 肉 放 和 人 测 微 尺 目 尺 。 在 低 倍 镜 下 观察 ,使 果 蝇 侧 卧 ,推动 推进 器 ,逐个 地 读 出 其 头 部 触角 前 缘 至 腹部 末端 的 小 格 数 。 然 后 按 台 尺 的 比例 换算 成 毫米 单位 ,将 个 体 记 录 记 入 预先 设计 的 表格 内 ( 按 表 2- 2 的 格式 ) ， 2) 随机 地 取 25 只 处 女 蝇 , 按 5 只 雌 蝇 义 1 只 雄 蝇 随机 地 分 为 5 个 杂交 组 合 使 之 在 中 等 饲养 瓶 中 进行 杂交 ,正常 情况 下 培养 。 也 可 用 1 只 雌 蝇 义 1 ew 设计 ,但 配偶 数目 不 得 少 于 30 对 。 3) 自 杂 交 起 24h 后 ,将 各 杂交 组 合 中 的 受 了 孕 的 雌 蝇 ,用 吸虫 器 小 心地 逐个 | 移入 小 饲养 瓶 中 , 置 温 箱 培养 ,使 其 产生 Fw AS ~7 d 后 将 它们 逐 组 、 逐 个 地 麻 酬 , 按 上 述 方法 测 其 体 长 (也 可 考虑 测 其 腹部 刚毛 数 ,以 便 与 下 一 实验 相互 对 应 ) 的 表 型 值 然后 弃 去 。 4) 在 每 一 雌 亲 的 后 代 中 ,用 吸虫 器 随机 地 取出 10 只 肉 晶 、10 只 雄 蝇 , 并 逐个 地 依 上 法 测量 其 体 长 , 求 其 平均 值 , 全 部 记录 填 人 下 表 中 。 实验 原始 记录 表格 形式 母 本 编号 及 表 型 值 Lae 5) 子女 对 于 母亲 的 加 权 平 均 回 归 系 数 及 遗传 力 。 - 2 遗传 学 实验 教程 6) 讨论 并 分 析 其 结果 。 7) 本 实验 历时 约 10 一 15 d, 可 与 其 他 实验 穿插 安排 。 【实验 报告 】 1. 估计 遗传 力 在 育种 实践 中 有 什么 指导 意义 ? 2 表现 型 方差 与 基因 方差 的 关系 怎样 ? 3. 思考 一 下 ,质量 性 状 与 数量 性 状 的 研究 方法 有 什么 区 别 ? (24) FAA) 实验 29 FMA IC ee PETRY Fe FE AY Bz Hie 【实验 目的 】 @ 1. 掌握 某 数量 性 状 对 于 选择 的 反应 的 实验 方法 。 # 2, 学 习 一 些 遗传 参数 的 计算 方法 : ull 【实验 原理 】 . iB PE BREF LC ERE LF 2 BLL SE SR 个 体 挑选 一 选择 。 其 次 是 对 亲本 的 交配 方式 的 控制 ,包括 近 交 与 杂交 。 在 考虑 | 选择 时 ,暂时 不 计 近 交 的 效应 ,因为 我 们 假定 群体 相当 大 而 足以 把 近 交 效应 忽略 选择 的 基本 效应 是 改变 群体 中 的 某 些 基因 频率 。 作 用 于 某 数 量 性 状 的 个 别 大 位 上 的 基因 的 选择 效应 是 无 法 加 以 定量 描述 的 。 因 此 ,只 能 利用 可 以 观察 到 的 平 均 数 和 方差 来 测定 选择 的 效应 。 J A CE RRR PASH BL ac EUR TTS BE HA] — LE PR 正 态 分 布 最 上 端 ( 上 向 选择 ) 或 最 下 端 (下 向 选择 ) 的 个 体 ,由 这 些 和 人 选 的 极端 类 型 的 个 体 繁殖 产生 下 一 代 ,下 一 代 的 群体 平均 值 一 般 向 选择 的 方向 移动 ,移动 的 程度 与 该 性 状 的 遗传 力 有 关 。 由 数量 遗传 学 可 知 ; AG. 王 -1 S- 一 或 -一 人- 一 7]2S (1) stth AG 为 遗传 获得 量 , R. yx 性 状 对 于 选择 的 反应 量 , 1? 6 2 HEREOHE BE 在 选择 差 中 可 遗传 给 下 一 代 的 百分数 ,S 为 亲 代 群 体 平均 值 与 中 选 亲 本 的 平均 值 之 差 , 即 选择 差 。 9 三 元 二 元。 式 中 ,元 = 亲 代 群体 工 性 状 的 平均 值 , 二 中 选 亲 本 该 性 状 的 平均 值 。 关系 式 (1) 的 主要 用 途 在 于 预测 选择 的 反应 。 只 要 在 选择 前 ,从 基本 群体 申 依 计 了 某 数量 性 状 的 遗传 力 (如 前 一 实验 估计 了 果 蝇 体 长 的 遗传 力 尼 = 0. 48, 腹部 第 二 部 分 综合 性 实验 = 115 « AUER? = 0. 52 等 ) ,而 选择 差 亦 是 可 求 的 ,然后 就 可 以 预测 中 选 亲本 将 要 繁殖 苗子 三 代 群 体 在 立 性 状 ( 体 长 或 腹部 刚毛 数 等 ) 上 的 遗传 获得 量 , 也 就 是 该 性 状 在 未 来 的 下 一 代 群 体 中 将 会 产生 多 大 的 反应 。 > 关系 式 (1) 的 另 一 形式 为 ; iA : Op hh") ieee Open (为 Re=AG== 五 一 元 是 中 选 个 体 所 繁殖 的 F, 代 群 体 在 工 性 状 上 的 平均 值 ( 云 ) 于 亲 代 原 群 体 的 该 性 状 平均 值 (z ) 之 差 ,这 就 是 遗传 获得 的 实际 值 。 利用 关系 式 (2) ,可 以 作为 一 种 从 已 经 实现 的 选择 效果 来 估计 遗传 力 的 近似 方 法 。Falconer 称 为 现实 遗传 力 。 利 用 观察 到 的 一 代 遗 传 进展 AG 可 以 求 姑 。 这 个 遗传 力 的 数值 表示 每 个 单位 的 选择 差 所 获得 的 一 代 遗 传 进展 。 本 实验 是 以 果 蝇 的 第 五 腹 板 上 的 刚毛 数 (或 体 长 ) 为 选择 的 性 状 。 预 测 选择 作 用 的 一 代 和 遗传 进展 ,观察 选择 的 作用 在 各 个 世代 中 引起 的 刚毛 数 的 变化 。 用 实验 证 明 该 性 状 是 一 种 数量 性 状 。 现 以 Clayton, Morris 和 Robertson(1957) 在 果 蝇 秆 对 其 腹部 刚毛 数 的 选择 实验 与 选择 反应 的 分 析 为 例 ,说 明 选 择 反应 在 期 望 值 与 实测 值 之 间 相 吻合 的 程度 。 选择 前 ,从 果 蝇 的 基本 群体 中 估计 了 刚毛 数 的 遗传 力 。 然 后 ,从 这 个 群体 中 ， 取 5 个 各 含 100 个 雄 体 和 100 个 肉体 的 随机 样本 ,测量 其 腹部 刚毛 数 , 求 其 平均 值 厦 为 5 。 在 每 个 样本 中 挑选 具有 最 多 刚毛 数 ( 上 向 选择 ) 和 最 少 刚毛 数 ( 下 向 选择 ) 欧 不 体 。 每 种 性 别 各 选 出 20 个 极端 类 型 的 个 体 ,分 别 求 其 刚毛 数 的 平均 值 zs。 中 亚 个 体 耻 离 它们 所 选择 的 样本 的 平均 值 的 离 差 值 即 选择 差 S。 期 望 的 选择 反应 则 是 按 (G1) 式 求 出 ,这 是 由 选择 差 和 遗传 力 ( 尼 = 0. 52 ) 的 乘积 得 来 。 观 测 的 反应 就 是 在 子 代 平均 数 与 亲本 所 选择 的 样本 平均 数 之 间 的 差 数 (所 有 负 号 都 省 掉 了 ) 。 表 2-4 黑 腹 果 蝇 腹部 刚毛 数 进行 一 代 选 择 的 结果 [从 表 2-4 可 见 ,除了 第 三 .第 四 世系 外 ,期 望 的 选择 反应 值 与 观测 的 选择 反应 | 值 相 比较 时 都 吻合 得 很 好 。 不 吻合 的 情况 说 明了 只 进行 一 个 世代 的 选择 实验 所 得 =。 下 HI6 。 遗传 学 实验 教程 到 的 数据 与 预测 数据 之 间 容 易 产 生 误 差 。 我 们 以 Lawrence MJ 和 Jinks JL 以 果 蝇 胸 侧 板 刚毛 数 选 择 的 实验 程序 说 明 具体 的 实验 方法 。 取 果 蝇 任 何 一 个 分 离 群体 (最 好 为 F; 的 家 系 ) 为 实验 的 原始 材料 。 供 给 实验 者 两 个 培养 瓶 ,培养 瓶 I 是 (OXC) x (OX C) ;培养 瓶 开 是 (CCXO) X(CXO). 人 在 每 只 瓶 中 随机 地 测量 10 只 雄 蝇 和 10 只 雌 蝇 的 胸 侧 板 刚毛 数 。 为 了 建立 高 刚 毛 数 的 选择 系 ( 上 回 选 择 ) 按 图 2- 11 方式 进行 杂交 。 培养 瓶 培养 瓶 工 F, (O X C)X(O X C) (C X O)X(C X O) 选择 10 只 中 的 高 了 it of i of i $ S, 培养 瓶 L FUE I 选择 10 只 中 的 高 ii nn 2 S2 培养 瓶 [， Sa FE IL, S4 培养 瓶 [4 培养 瓶 I 图 2- 11 维持 选择 系 的 双重 第 一 代表 兄妹 交配 系统 ( 引 自 北京 大 学 生物 系 遗 传 学 教研 室 1983) 这 种 交配 系统 比 同一 培养 瓶 中 高 刚毛 雄 蝇 和 高 刚毛 雌 蝇 的 姊妹 交配 的 近亲 演 殖 要 少 。 低 选择 系 ( 下 向 选择 ) 也 以 同样 方 式 建立 ,被 选择 的 个 体 则 是 刚毛 数 最 少 的 个 3 体 。 连 续 选 择 四 代 之 后 ,刚毛 数 在 高 系 与 低 30 系 中 的 变化 结果 如 图 2- 12 所 示 。 e 在 这 个 实验 模型 中 , 留 种 率 为 10% (从 = 10 个 个 体 中 选择 1 个 个 体 作 为 交配 用 亲本 ， ”22 低 系 HE EVES PAR). WRENS 配偶 死亡 , 则 在 每 一 个 选择 系 的 平行 成 对 的 ”图 2-12 高 低 刚毛 数 对 选择 的 反应 培养 瓶 中 取 第 二 个 极端 的 个 体 作 为 补充 。 ( 引 自 北京 大 学 生物 系 遗 传 学 教研 室 1983) 选择 的 实验 结果 表明 : 上 向 选择 (高 ”“。: 12 个 培养 瓶 的 了 均 数 ( 即 240 ABR) 系 ) 和 下 疝 选 择 ( 低 系 ) 对 于 选择 都 有 稳定 的 反应 。 这 种 反应 说 明 果 蝇 的 刚毛 数 是 一 种 数量 性 状 。 因 为 如 果 被 选择 的 亲本 的 刚毛 数 与 其 培养 瓶 中 的 个 体 的 平均 刚毛 数 之 间 的 差异 纯 属 环境 影响 ,那么 将 不 可 能 期 望 对 选择 会 有 反应 。 其 次 ,这 种 稳定 的 反应 还 表明 ,决定 果 蝇 刚毛 数目 的 基因 有 若干 对 ,无 疑 这 是 一 种 数量 性 状 。 第 二 部 分 综合 性 实验 - 017» 【材料 与 用 品 】 1. 材料 D. melanogaster 的 突变 种 即 残 刀 (vg) 及 匙 状 翅 Cnub2: ) ATE A238 F. 群体 。 2. 用 具 及 药品 电子 计算 器 ` 小 指 型 管 ` 果 蝇 实 验 常规 用 有 具 : 果 蝇 饲养 的 常规 成 分 .乙醚 或 三 乙 基 胺 (麻醉 时 间 比 乙 醚 长 ,便于 数 刚 毛 数目 的 操作 ) 、 低 浓度 的 酒精 。 【实验 步骤 】 1. 大 约 在 25 天 前 完成 下 列 杂 交 , 以 便 取得 F; 的 分 离 群 体 : (CvgvgXnub2nub: ) & (vgvg X nub’ nub? ) (nub’ nub’ & vgvg) X (nub? nub’ X vgvg) 上 述 群 体 作 为 选择 用 的 基础 群体 。 2. 从 两 个 基础 群体 中 随机 地 取出 各 售 10 个 雄 体 和 10 个 肉体 的 样本 。 逐 批 采 醉 ,在 解剖 镜 下 逐个 地 计数 第 五 腹 板 刚毛 数 。 因 为 果 蝇 的 性 别 不 同 , 第 五 腹 板 的 位 置 不 同 (图 2 - 13) , 须 加 注意 。 图 2-13 果 蝇 (雌雄 ) 成 虫 腹部 结构 示意 图 ( 引 自 北京 大 学 生物 系 遗 传 学 教研 室 “1983) A. 腹 片 ;B. 背 片 ;C. 生殖 弓 ;D. ALER;E. 平 横 棒 3. 将 已 计数 的 个 体 分 别 装 和 小 指 形 管 中 , 并 在 指 管 上 记录 其 刚毛 数 与 性 别 。 4. 在 每 个 样本 中 选 留 具 有 最 多 刚毛 数 和 最 少 刚毛 数 的 个 体 各 1 只 ,作为 中 选 亲本 (选择 率 或 留 种 率 为 10%) 。 另 一 部 分 实验 者 则 可 各 选 2 只 作为 亲本 ( 留 种 率 为 20 站)。 留 种 率 的 不 同 ,选择 的 反应 也 会 有 变化 。 由 于 我 们 的 基本 假定 之 一 是 ， 数量 性 状 是 正 态 分 布 的 ,因而 留 种 率 的 大 小 就 决定 选择 差 的 大 小 。 另 一 方面 选择 差 又 决定 于 性 状 标准 差 的 大 小 。 因 而 有 ; = > Op 。118 。 遗传 学 实验 教程 SAP i 为 选择 强度 , 即 是 以 性 状 的 标准 差 为 单位 的 选择 差 ,ap 为 性 状 的 标准 差 ， S 为 选择 差 。 根据 正 态 分 布 的 理论 , 留 种 率 、 选 择 强度 的 关系 见 表 2- 5。 表 2-S 留 种 率 ,. 选 择 差 和 选择 强度 的 关系 (S 列 中 cp 前 面 的 数字 是 2 留 种 率 选择 差 S = ;icp Ze 6650p ite 1590p 0. 5840p 0. 05 2. 0630p 0. 36 1. 0390p 0. 70 0. 4970p 0. 10 1. 7550p 0. 40 0. 9660p 0. 76 0. 4090p 0.15 1. 5540p 0. 50 0. 7980p 0. 80 0. 3500p 0. 20 1. 4000p 0. 56 0. 7046p 0. 90 0. 1950p 1. 27 lop 0. 6440p 0. 0000p 5. 按 图 2 - 14 程序 进行 观测 及 选择 杂交 。 ti 培养 瓶 I Hi I 处 女 蝇 10 只 雄 蝇 10 只 处 女 蝇 10 只 雄 蝇 10 只 高 值 肉 蝇 1 只 ”高 值 雄 蝇 1 只 高 值 肉 蝇 I 只 高 值 雄 蝇 1 只 S; 培养 瓶 IT 培养 瓶 TI | waa 随机 | 处 女 蝇 10 只 雄 蝇 10 只 处 女 蝇 10 只 雄 蝇 10 只 选择 选择 选择 选择 高 值 肉 蝇 1I 只 高 值 雄 蝇 1 只 高 值 肉 蝇 1 只 高 值 雄 蝇 1 只 93 SEF I, 培养 瓶 工 ， S， 培养 瓶 培养 瓶 IT 图 2- 14 选择 杂交 程序 图 解 ( 引 自 北京 大 学 生物 系 遗 传 学 教研 室 1983) 由 另 一 部 分 实验 者 以 同样 方式 建立 低 选 择 系 , 当然 被 选择 的 乃 是 刚毛 数 最 少 的 个 体 。 6. 数据 整理 及 结果 分 析 D 计算 基础 群 中 (0 代 )? 随 机 取得 的 40 只 果 蝇 的 刚毛 数 的 平均 值 与 标准 差 (z 及 wm)。 第 一 次 中 选 的 4 个 个 体 的 刚毛 数 的 平均 值 及 标准 差 (zs Mos). WKS, 代 群 体 中 的 40 只 果 蝇 刚毛 数 的 平均 值 及 标准 差 (zs 及 os )。 @) 假定 已 知 果 蝇 的 腹 板 刚毛 数 的 遗传 力 为 0. 52( 亦 可 根据 前 一 实验 中 所 估计 第 二 部 分 综合 性 实验 - 119 - 五 腹 节 刚毛 数 的 遗传 力 ) 按 下 列 分 别 求 出 : S = % —as> HEB A — (ie PEN I= R, = h’S, 观测 的 一 代 选 择 后 的 反应 = Fs, — Fo o 将 全 部 计算 结果 填 人 下 面 表格 中 ,进行 选择 反应 期 望 值 与 观测 值 的 吻合 性 的 比较 。 @ WE S..S.. Ss. S, 各 代 中 随机 样本 的 刚毛 数目 的 平均 值 。 按 高 系 与 低 系 整理 数据 , 亦 作 图 表示 刚毛 数 变异 的 情况 。 7. 实验 期 间 ( 自 0 一 S, 代 ) 历 时 约 58 d。 所 用 的 常规 培养 瓶 及 饲料 ` 温 度 等 环 境 条 件 力 求 保持 稳定 。 并 要 严防 霉菌 污染 和 成 虫 的 非 生理 性 死亡 。 8, 果 蝇 第 二 个 选择 的 配偶 死亡 , 则 在 每 一 个 选择 系 的 平行 成 对 的 培养 瓶 中 取 第 二 个 极端 的 个 体 作 为 补充 。 【实验 报告 】 1 写 出 实验 结果 。 2. 果 蝇 还 有 哪些 数量 性 状 ? 选择 其 中 的 某 一 数量 性 状 , 写 出 一 个 你 的 实验 设计 。 〈 郭 善 利 ” 周 国 利 ) 实验 30” 蜡 色 球 虫 群体 划 翅 斑纹 表 型 与 基因 型 频率 的 计算 【实验 目的 】 1. 了 解 异 色 球 虫 的 生活 习性 .生活 史 、 雌 雄 区 别 及 其 他 性 状 特征 。 2. 学 会 利用 异 色 球 虫 群体 的 某 些 性 状 计算 表 型 和 基因 型 频率 的 方法 ,加 深 对 群体 遗传 学 基本 原理 和 意义 的 理解 。 【实验 原理 】 4 8 hh ( Harmonia azyridis) 俗 称 花 大 姐 ， 是 人 类 生活 环境 中 最 常见 的 一 * 120 遗传 学 实验 教程 种 标 虫 ,广泛 分 布 于 亚洲 ,是 蚜虫 的 天 敌 。 异 色 球 虫 易 于 捕捉 ,大 工 饲养 简单 易 行 ， 而 且 其 本 身 也 不 会 造成 对 作物 的 危害 。 因 此 , 异 色 球 虫 可 以 作为 一 种 方便 的 生物 学 实验 材料 。 在 普通 遗传 学 实验 中 ,一般 多 采用 果 蝇 进行 性 状 的 遗传 与 变异 观察 。 然而 ,除了 需要 常年 维持 果 蝇 突变 品系 之 外 ,还 要 求 配 制 和 定期 更 换 无 菌 培养 基 。 如 用 飘 虫 做 实验 可 省 去 很 多 这 类 麻烦 。 异 色 球 虫 世 代 周 期 短 ,野外 采集 和 人 工人 饲 养 方便 。 我 们 可 以 用 雄 蜂 幼虫 粉末 、 猪 肝 提 取 液 以 及 蚜虫 等 作为 饲料 ,在 培养 下 中 简单 地 饲养 异 色 球 虫 。 只 要 室温 适当 (20~30" ) , 异 色 球 虫 一 年 四 季 都 可 产 卵 .每 殖 。 通 过 观察 球 虫 闲 翅 斑纹 的 坐 镶 显 性 现象 , 既 能 具体 而 形象 地 了 解 基 因 与 表 型 的 关系 、 等 位 基因 的 遗传 规律 ,也 可 以 在 成 虫 羽 化 的 过 程 中 观察 到 基因 表达 所 具有 时 间 和 空间 上 的 特异 性 。 另 外 ,在 野外 生态 环境 中 , 异 色 球 虫 有 群集 越冬 的 习性 。 这 样 ,通过 简单 的 采集 活动 有 可 能 获得 1 个 或 多 个 异 色 球 虫 群体 的 信息 。 利 用 这 些 数据 ,可 以 对 异 色 球 虫 群 体 的 遗传 构成 进行 分 析 。 1， 异 色 球 虫 的 生活 习性 异 色 球 虫 分 布 在 南 起 台湾 . 北 至 西伯 利 亚 的 广泛 地 域 。4 一 7 月 和 9 一 11 月 最 容易 在 野外 见 到 成 虫 。4 月 中 旬 , 异 色 球 虫 主要 生活 在 枫 树 、 瘟 蕉 、 果 松 等 蚜虫 发 生 较 早 的 庭院 植物 上 ,5 一 6 月 则 广泛 分 布 于 小 麦 .垂柳 等 植物 上 。 此 间 ,它们 在 这 些 植物 上 产 下 大 量 的 卵 。 随 着 蚜虫 的 增加 ,幼虫 迅速 发 育 ,成 虫 数 量 激增 。 这 一 季 节 里 ,成 虫 对 于 蚜虫 的 发 生 反 应 敏感 、 移 迁 性 大 ,可 以 在 短 时 间 内 迅速 向 蚜虫 的 多 发 地 聚集 。7 月 下 旬 一 9 月 初 , 异 色 飘 虫 在 白昼 高 温 时 主要 静止 在 草根 等 处 ,偶尔 ， 也 有 进入 屋内 的 情况 。 因 此 ,几乎 看 不 到 成 群 的 成 由 和 幼虫 ,采集 相当 困难 。 进 入 9 月 以 后 ,天 气 凉爽 起 来 , 异 色 球 虫 开始 进入 第 二 次 繁殖 高 峰 。 它 们 在 栗 树 等 木 本 植物 上 产 卵 ,成 虫 的 数目 随 之 显著 增多 。 从 10 月 上 旬 到 11 月 ,大量 异 色 球 虫 的 成 虫 聚集 在 向 阳 的 白色 或 浅 色 墙 壁 上 ,这 是 采集 最 方便 的 时 期 。 此 后 , 异 色 球 虫 开始 FEY BS I] Bik. a WSR 、. 地 缝 等 处 群集 越冬 。 成 虫 群集 时 间 及 地 点 和 以 气温 为 中 心 的 气象 要 素 有 紧密 的 联系 。 人 春 后 (3 月 份 左右 ) ,越冬 群体 开始 解散 。 2， 异 色 球 虫 的 生活 史 异 色 球 虫 的 卵 呈 淡 黄 色 ,成 虫 通常 一 次 产 卵 15 一 40 粒 。 卵 经 过 数 日 孵化 ,发 育 为 体 长 1. 2 一 1. 9 mm 的 黑色 1 龄 标 虫 。 刚 孵化 的 幼虫 即 开始 摄食 ,如 果 附 近 没 有 可 供 捕 食 的 蚜虫 , 则 答 食 未 孵化 的 球 虫 卯 , 甚至 同胞 幼虫 。3 龄 幼虫 体 长 达 4.2~6.9 mm。 在 4 龄 期 ( 终 龄 ) ,幼虫 摄食 量 剧 增 。 据 福 岛 (1970) 实 验 刀 只 二 龄 虫 共 可 捕食 约 160 只 蚜虫 。 接 近 晴 期 , 杜 虫 身体 变 圆 ,并 开始 分 泌 黏 性 强 的 液体 国 定 尾 端 ,进入 静止 状态 (前 晴 )。 一 两 天 后 , 背 板 裂 开 晓 皮 ,形成 白色 柔软 的 晴 ， 2 一 3 h 后 颜色 变 褐 ,4~6 d 后 晴 开 始 羽 化 。 成 虫 芋 翅 最 初 呈 乳白 色 , 约 30 min 后 开始 着 色 ,呈现 出 黑色 和 红色 的 斑纹 。 3. 异 色 球 虫 的 雌雄 区 别 第 二 部 分 综合 性 实验 村 和 大 多 数 昆虫 一 样 , 异 色 球 虫 的 肉 虫 比 雄 果 个 体 大 ,但 是 仅 从 这 一 点 上 区 分 是 很 不 可 靠 的 。 最 简单 的 区 分 方法 是 依据 中 胸 腹 板 及 后 胸 腹 板 . 中 足 腿 节 的 色差。 唆 球 虫 身体 的 这 些 部 分 都 是 黑 褐色 ,而 雄 球 虫 色 淡 。 另 外 ,相对 于 雌 球 虫 上 层 为 黑 色 ; 雄 球 虫 的 上 层 为 淡色 。 黄 底 型 叭 雄 区 别 困难 ,特别 有 必要 从 这 两 点 上 加 以 确认 。 4, 蒜 虫 萌 翅 斑纹 及 其 遗传 变异 异 色 球 下 畏 地 色 斑 丰富 多 彩 ,变化 多 端 , 绝 大 部 分 属于 以 下 几 种 类 型 ; D 黄 底 型 ; 精 运 的 底 色 为 红 或 橙黄 色 , 上 有 0 一 19 个 黑色 斑点 ,这 些 黑色 斑点 的 数目 、 大 小 及 位 置 有 显著 的 个 体 变异 ,它们 既 受 遗传 基因 的 支配 ,也 受 环境 条 件 特别 是 师 期 温度 的 影响 ; Q) 二 窗 型 : 精 翅 底 色 为 黑色 ,在 左右 起 的 中 上 部 各 有 1 个 较 大 的 红 或 橙黄 色 斑点 ,斑点 的 位 置 . 大 小 等 有 个 体 差异 ; @ 四 窗 型 : 精 翅 底 色 为 黑色 , 左 者 过 各 有 两 个 红 或 橙黄 色 斑点 ,上 边 的 一 对 较 大 ,下 边 的 一 对 较 小 ;@ 花 斑 型 : 精 翅 的 底 色 为 黑色 ,上 有 红 或 橙黄 色 的 斑点 ,一般 为 10 或 12 个 ,这 种 类 型 在 俄罗斯 的 阿尔 泰 地 区 很 多 ,在 日 本 也 常见 ,但 在 我 国 则 罕见 。 在 野外 , 约 99 儿 的 异 色 球 虫 属于 以 上 4 种 ,其 他 1% 包 括 一 些 稀 有 的 斑纹 类 型 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 异 色 球 虫 2 用 具 及 药品 恒温 培养 箱 烘箱 、 双 简 解剖 镜 、 放 大 镜 、 温 度 计 、 培 养 中 ,白板 纸 、 滤 纸 等 。 雄 峰 幼虫 粉 未 、 猪 肝 提 取 液 或 蚜虫 . 乙 本 或 氧 仿 等 。 【实验 步骤 了 1. 异 色 球 虫 的 人 工 饲 养 异 色 球 下 人 工 饲 养 的 关键 是 人 工 饲 料 的 种 类 和 配方 问题 。 雄 蜂 贤 是 饲养 异 色 球 虫 效果 最 好 的 人 工 饲 料 ,人 工 饲 养 的 赤 眼 蜂 师 和 以 猪 肝 一 蔗糖 为 基础 的 人 工人 饲 料 ( 表 2 - 6) 也 可 作为 异 色 球 虫 的 饲料 。 异 色 球 虫 规模 化 饲养 的 难题 是 人 工 饲 料 对 球 虫 生殖 力 的 负面 影响 ,主要 表现 为 产 卵 前 期 延长 . 产 卵 量 少 和 贱 化 率 低 等 。 2-6 ， 猪 肝 一 蔗糖 人 工 饲 料 配方 单位 : 质量 分 数 / 加 配方 鲜 猪 肝 蜂蜜 蔗糖 葡萄 糖 啤 酵 母 蜂王 浆 维生素 C CT (oo See wo) ro) oOo O17 Bo ott a ans o So onc 1 1 4 0 0 ”22 ， 遗传 学 实验 教程 2. 异 色 球 虫 靖 翅 斑 纹 的 观察 与 遗传 分 析 中 国境 内 的 异 色 球 虫 鞘 翅 斑 纹 主要 有 黄 底 型 .二 窗 型 和 四 窗 型 ,分 别 由 复 等 位 基因 s.S 和 Se 文 配 , 三 者 的 显 性 程度 为 : S>S>s, 因此 , 黄 底 型 的 基因 型 为 ss, 四 窗 型 为 SeSs 或 SNs, 二 窗 型 为 SS STS? aK Ss。 其 中 ,在 有 些 二 窗 型 鞘翅 的 红色 斑点 里 ,常常 能 够 看 到 1 个 甚至 2 个 来 自 于 黄 底 型 基因 s 的 黑色 斑点 ,这 是 典型 的 内 灸 显 性 现象 。 如 果 进 一 步 观 察 这 类 黑 底 色 鞘 翅 的 标 虫 (SEEs`Ss) 的 自 交 后 代 , 可 以 发 现 有 黄 底 型 (ss) 分 离 出 来 ,分 离 比 符合 备 德 尔 定律 。 上 述 观 察 和 实验 , 既 可 用 于 说 明基 因 型 与 表 型 的 关系 ,也 可 作为 分 离 定律 的 验证 实验 。 3. 异 色 球 虫 闽 翅 斑 纹 与 基因 表达 的 特异 性 异 色 肚 虫 鞘翅 的 黑色 部 分 与 红色 部 分 分 别 含 黑 色素 和 类 胡 葛 卜 素 衍 生物 ,这 些 色素 的 分 布 范 围 和 布局 主要 由 鞘翅 斑纹 基因 决定 。 成 虫 刚 刚 羽 化 时 ,各 类 蜡 色 对 虫 的 鞘翅 均 呈 乳白 色 ,其 后 ,逐渐 开始 着 色 。 仔细 观察 鞘翅 的 着 色 过 程 , 可 以 发 现 黑色 素 及 类 胡萝卜 素 衍 生物 都 只 有 在 特 定 的 鞘翅 部 分 出 现 。 这 表明 ,控制 相应 色素 合成 的 基因 仅 在 特定 的 时 间 ( 羽 化 开始 后 数 小 时 ) 特定 的 空间 (鞘翅 的 黑色 或 非 黑 色 部 分 ) 上 表达 。 这 种 现象 能 够 直观 地 说 明基 因 特 异 性 表达 的 生物 学 意义 。 4. 异 色 杜 虫 群体 鞘翅 斑纹 表 型 与 基因 型 频率 的 计算 异 色 球 虫 群体 包括 数 种 不 同 的 闽 翅 斑纹 类 型 ,它们 之 间 可 以 自由 交配 ,因而 构 成 了 一 个 典型 的 备 德 尔 群 体 。 采 集 和 利用 即将 群集 越冬 的 异 色 杜 虫 ,可 以 计算 ` 测 定 鞘 翅 斑纹 型 的 复 等 位 基因 在 群体 中 的 相对 频率 。 假 设 SS 和 ss 基因 频率 分 别 为 bp.q 和 ,鞘翅 斑纹 型 ( 表 型 ) .基因 型 及 基因 频率 关系 如 表 2- 7。 表 2-7 异 色 标 虫 主 要 斑纹 型 与 基因 型 频率 的 关系 色 斑 型 基 因 型 基因 型 频率 标 本 数 二 宿 型 SCSE_SCSP SCs p?+2p(q+nr) Np 四 窗 型 SS g +2qr Ng 黄 底 型 SS r? Ny a it 1 N 因为 99 办 以 上 的 个 体 均 属 上 述 3 种 色 斑 型 , 故 可 使 p 十 g 十 r 兰 1。 由 此 得 出 基 因 频 率 分 别 为 : V Ng + My gee +, = Vy a vm JN JN JN pi 1 第 二 部 分 综合 性 实验 + 123 « 【实验 报告 】 对 蜡 色 球 虫 有 哪些 新 认识 ? ( 刘 林 德 ) 实验 31 Southern 印迹 杂交 【实验 目的 】 学 习 Southern 印迹 杂交 的 实验 方法 ,理解 其 实验 原理 。 【实验 原理 】 不 同 来 源 的 核酸 分 子 , 但 具有 互补 序列 或 某 一 区 段 互补 ,经 过 变性 、 缓 慢 退火 可 重新 结合 成 双 链 ,成 为 杂交 分 子 。 这 一 过 程 称 为 核酸 分 子 杂 交 。 杂 交 分 子 的 双 方 中 , 一 般 有 一 方 的 核 苷 酸 序列 已 知 且 被 人 为 标记 。 该 标记 能 用 特定 方法 检 出 , 即 为 探 针 。 探 针 是 指 经 特殊 化 合 物 标 记 的 特定 的 核 苷 酸 序列 ,用 于 核酸 分 子 杂 交 的 探 针 有 DNA 探 针 及 RNA 探 针 。 探 针 与 互补 的 核 苷 酸 序列 形成 杂交 分 子 后 也 带 有 标记 ,可 被 检 出 ,这 样 就 会 检测 到 与 已 知 核酸 同 源 的 序列 。 核酸 分 子 杂 交 包 括 Southern 印迹 杂交 和 Northern 印迹 杂交 。Northern 杂交 是 以 DNA 或 RNA 为 探 针 ,检测 RNA 链 , 用 于 检测 特定 基因 的 转录 产物 mRNA。 Southern 杂交 是 以 DNA 或 RNA 为 探 针 ,检测 DNA 链 , 来 鉴定 或 分 析 特 定 基 因 的 位 置 和 大 小 。 Southern 印迹 杂交 由 Southern 于 1975 年 建立 ,用 于 检测 限制 性 内 切 酶 切割 的 植物 DNA 片段 中 是 否 存在 与 探 针 同 源 的 序列 ,并 可 分 析 外 源 基 因 在 植物 染色 ” 体 上 整合 情况 ,如 拷贝 数 、 插 人 方式 以 及 外 源 基因 在 转化 植株 Fi 代 中 的 稳定 性 等 问题 。 一 般 是 将 基因 组 DNA 提取 出 来 ,用 限制 性 内 切 酶 酶 解 后 ,经 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ;DNA 各 片段 按 分子 大 小 依次 分 开 排 布 在 凝 胶 上 ,然后 用 碱 处 理 凝 胶 , 使 各 酶 切 DNA 片段 在 凝 胶 上 原 位 变性 成 为 单 链 。 在 高 盐 条 件 下 ,利用 印迹 技术 ,通过 毛细 管 虹 吸 作用 ,将 单 链 DNA 从 凝 胶 中 吸 印 至 硝酸 纤维 素 膜 上 ,各 片段 在 固 相 膜 止 的 相互 位 置 与 在 凝 胶 上 相同 , 凝 胶 中 DNA 片段 的 相对 位 置 在 转移 至 滤 膜 的 过 程 中 保持 不 变 , 经 烘 干 或 紫外 线 照 射 处 理 ,使 印迹 的 各 片段 与 固 相 膜 牢固 结合 。 经 预 杂 交 处 理 ,掩盖 膜 上 的 非特 异性 杂交 位 点 后 ,将 膜 放 人 含有 单 链 或 经 变性 处 理 成 为 单 链 的 探 针 杂交 液 中 ,在 适宜 的 条 件 下 进行 杂交 。 膜 上 与 探 针 同 源 的 单 链 序列 与 探 针 杂交 成 双 链 ,从 而 使 探 针 固定 在 相应 位 置 上 。 外 源 基 因 与 探 针 同 源 , 凡 含有 外 源 基 因 序 列 的 片段 都 可 以 发 生 杂 交 , 形 成 带 标记 的 特异 性 杂交 体 。 最 后 根据 控 针 的 标记 性 质 进 行 检 出 (放射 性 同位 素 标记 的 通过 放射 自 显影 检 出 , 酶 标记 的 则 可 通过 酶 反应 检 出 ) ,特异 性 杂交 体 的 数量 及 位 置 将 清晰 而 准确 地 显示 出 来 (图 B15). * 124 。 遗传 学 实验 教程 SaaS S| 基因 组 DNA 有 DNA BR Ail He BE 含有 EtBr 染 料 的 琼脂 糖 凝 胶 NA AAA 重 物 ~_ ema 玻璃 板 吸引 滤纸 一 下 二 凝 胶 高 盐 缓冲 液 硝酸 纤维 素 波及 TS 人 CO 同 探 针 同 源 杂 交 的 X 光 底片 图 2=15 (GIB AEBS 2002) 【材料 与 用 品 】 1. 材料 高 等 植物 的 总 DNA 及 探 针 。 2. 用 具 及 药品 (1) AA ELTA TA BE Ty AH FOL at i) GED RT ER RT PH YEAR 吸水 纸 , 重 物 ( 约 500 g) ,恒温 烘箱 ,高 压 灭 菌 锅 `.PCR {Eppendorf 管 、 移 液 器 ` 紫 外 透射 反射 分 析 仪 ` 放 射 性 探测 仪 、. 杂 交 盒 .杂交 恒温 箱 . 增 感 屏 、 低 温 冰 箱 。 (2) 试剂 1) 预 杂 交 液 (Church Buffer) 终 浓 度 为 7%SDS、 1% BSA、1 mmol/L EDTA(pH 8.0) .0. 25 mol/L NasPOCpH 7. 2) 。 做 为 溶剂 ,配制 500 ml NasPO,， HX 70 ml 1 mol/L NaH,PO, .360 ml 0.5 mol/L Na HPO， 70 ml H,O, 2) 琼脂 糖 .变性 液 0. 4 mol/L HCL. BM 0. 4 mol/L NaOH, 10 X SSC FH BK 20 SSC WYK.10%SDS Ww ak 1% SDS 溶液 ,a-2P - dCTP. HARB KE 菌 水 ) 。 【实验 步骤 】 1. DNA 片段 的 Southern 印迹 转移 ( 碱 转移 法 ) (1) 限制 性 酶 切片 段 的 琼脂 糖 凝 胶 分 离 1) 取 灭 菌 的 0.5 ml Eppendorf 管 , 按 顺序 依次 加 入 无 菌 水 、 酶 缓冲 液 . 植 物 总 “es 人 全 第 二 部 分 综合 性 实验 。 125 » DNA1O pg,10 u 特定 限 制 内 切 酶 ,体积 为 20 由 , 混 匀 ,离心 至 管 底 ,37C 过 夜 充分 酶 切 。 2) 根据 要 分 离 的 DNA 片段 大 小 配置 合适 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 ( 含 0.1 pg/ml 省 化 乙 锭 ) ,将 酶 解 产 物 进行 电泳 分 离 , 恒 压 电 泳 10 一 16 h( 电 压 王 1 V/cm). (2) 印迹 1) 将 凝 胶 放 人 扩 瓷 盘 或 大 培养 下 中 , 切 去 多 余部 分 ,并 切 去 一 角 以 作 样品 顺 序 标记 。 加 入 0. 4 mol/L HCl 没 过 凝 胶 ,缓慢 摇动 10 一 15 min, 使 DNA 变性 ,省 酚 蓝 由 蓝 色 变 为 橘 黄色 。 2) 将 凝 胶 用 无 菌 水 冲洗 1 一 2 次 ,再 于 0.4 mol/L NaOH PBZ PAM 15 min 左 右 。 3) 剪 取 与 凝 胶 同 样 大 小 的 硝酸 纤维 素 膜 , 先 用 无 菌 水 浸透 5 min, 再 浸入 0. 4 mol/L NaOH #5 20 x SSC WYK 5 min, 4) R— Pee. WAT A O. 4 mol/L NaOH 溶液 或 20XSSC 溶液 77 HE 架 一 玻璃 板 ,玻璃 板 上 平 铺 上 一 张 洁净 的 滤纸 ,滤纸 两 端 要 浸 于 NaOH 溶液 中 , 玻 璃 板 与 滤纸 间 不 能 有 气泡 。 5) 将 凝 胶 放 到 滤纸 上 ,让 点 样 孔 向 下 ,用 玻璃 棒 驱 除 凝 胶 与 滤纸 之 间 的 气泡 。 6 六 把 处 理 好 的 硝酸 纤维 素 膜 准确 地 盖 在 凝 胶 上 面 , 用 玻璃 棒 小 心 驱 除 凝 胶 与 滤 膜 之 间 的 气泡 。 将 两 张 与 膜 同样 大 小 的 滤纸 在 0.4 mol/L NaOH 溶液 中 浸 湿 ， 将 其 一 一 放 在 膜 上 ,排除 膜 与 滤纸 之 间 滤纸 与 滤纸 之 间 的 气泡 。 7) 准备 与 膜 大 小 基本 相同 或 略 大 的 拆 琶 好 的 吸水 纸 , 放 在 滤纸 上 面 高 8 一 10 cm 在 吸水 纸 上 放 一 块 玻璃 板 ,在 玻璃 板 上 放 上 约 500 g 的 重 物 ,水平 放 置 ， 室温 下 转移 12 一 20 h。 注 意 , 中 间 要 更 换 , 添 加 吸水 纸 。 8) 取出 硝酸 纤维 素 膜 ,使 DNA 印迹 面 癌 下 ,于 254 nm 紫外 光 下 照射 5 min 后 ,在 滤纸 上 室温 晾 干 ,用 保鲜 膜 包 好 ,一 20C 冰 箱 保存 备用 。 2. 探 针 的 制备 一 一 随机 引物 标记 法 在 Eppendorf 管 中 加 入 模板 DNA 10 ng~1 pg( 约 1 一 2 wl) 、 随 机 引物 2 由 ,加 无 菌 水 至 14 风 ,在 PCR {KE 95°C HHA 3 一 5 min 后 迅速 置 于 冰 浴 中 放置 5 min, 然后 依次 加 入 10 X Buffer (2 PWR) 2.5 wl. dNTP 2.5 内 、1 pl Exo-free Klenow Fragment fi, UNSC RAK EA 22 vl. BR EZR PIMA ae-?2P - dCTP(50 pCi) 3 pl, Ze PCR 仪 上 按 以 下 程序 进行 : 37 ,20 min; 65°C,5 min; 95°C,3 min, Ra 迅速 置 冰 浴 中 5 min, 3. 杂交 (1) HBR DNA BE CDNA 附着 面向 上 ) 浸 入 65°C 预 热 的 预 杂交 液 中 ( 预 杂 交 液 的 加 入 量 以 刚好 没 过 膜 为 宜 ) ,50 一 65 人 恒温 培养 箱 中 预 杂 交 4h, * 126 遗传 学 实验 教程 (2) 杂交 将 标记 并 已 变性 的 探 针 加 入 预 杂 交 液 中 ,50 一 65C 杂 交 过 夜 。 (3) AR 1) 室温 条 件 下 ,2XSSC/0.5%SDS 溶液 中 5 min, 2) 室温 条 件 下 ,2XSSC7/0.1%SDS 溶液 中 15 min, 3) 37 条件 下 ,0.1XSSC/0.5%SDS 溶液 中 30 一 60 min, 4) 68°CARI# F 0. 1X SSC/0. 5% SDS WHF 30 min, 因 膜 及 杂交 情况 洗 膜 的 时 间 长 短 不 一 定 。 用 滤纸 吸 去 膜 表面 水 分 ,用 保鲜 膜 包 儒 ; 用 Moniter 检测 放射 性 强度 ;在 暗室 HEE EX GH. ,两 面 覆 以 增 感 屏 , -70 曝光 2 一 7 d, 常 规 方法 冲洗 尺 片 。 【实验 报告 】 1. 为 什么 在 印迹 转移 过 程 中 特别 强调 玻璃 板 与 滤纸 之 间 、 滤 纸 与 滤纸 之 间 等 不 能 有 气泡 ? 2. 标记 探 针 除了 用 随机 引物 法 以 外 还 有 那些 方法 ? (ERF) 实验 32 质粒 DNA 的 提取 及 酶 切 【实验 目的 】 学 习 和 掌握 碱 裂 解法 提取 质粒 的 原理 和 方法 。 【实验 原理 】 ”，” 碱 裂 解法 提取 质粒 是 根据 共 价 闭合 环 状 质粒 DNA 与 线性 染色 体 DNA 在 拓 扑 学 上 的 差异 来 分 离 它 们 。 在 pH 值 介 于 12. 0 一 12. 5 这 个 狭窄 的 范围 内 ,线性 的 DNA 双 螺 旋 结 构 解 开 而 被 变性 。 尽 管 在 这 样 的 条 件 下 , 共 价 闭环 质粒 DNA 的 氢 键 会 被 断裂 ,但 两 条 互补 链 彼此 相互 盘 绕 , 仍 会 紧密 地 结合 在 一 起 。 当 加 入 pH 4.8 的 乙酸 钾 缓冲 液 ,恢复 pH 至 中 性 时 , 共 价 闭合 环 状 的 质粒 DNA 的 两 条 互补 链 仍 保持 在 一 起 ,因此 复 性 迅速 而 准确 。 而 线性 的 染色 体 DNA 的 两 条 互补 链 彼 此 已 完全 分 开 , 复 性 就 不 会 那么 迅速 而 准确 ,它们 缠绕 形成 网 状 结构 ,通过 离心 , 染 色 体 DNA 与 不 稳定 的 大 分 子 RNA, 和 蛋白质- SDS 复合 物 等 一 起 沉淀 下 来 而 被 除去 。 【材料 与 用 品 了】 1. 材料 pUC19 质粒 的 E. coli, 2. 用 具 及 药品 第 二 部 分 综合 性 实验 * 227 » (1) 仪器 及 用 有 具 恒温 培养 箱 ,恒温 摇 床 、 台 式 离心 机 、 高 压 灭 菌 锅 、 吸 头 、 小 指 管 、 微 量 离心 管 。 (2) 药品 葡萄 糖 .三 羟 甲 基 毛 基 甲 烷 (Tris)、 乙 二 胺 四 乙酸 (EDTA) AA. tok 基 硫 酸 钠 (SDS) 乙酸 钾 、 冰 乙酸 、 氯 仿 、 乙 醇 、 胰 RNA Hf AK RSA RD 蓝 、 酚 、8 -羟基 哮 啉 .8 琉 基 乙醇 盐酸 (HCI) EcoRI fig. 3. 试剂 1) WRI (solution 工 ) 50 mmol/L #j4##.25 mmol/L =# Hae Ig (Tris) Tris * HCI(pH 8.0) .10 mmol/L 乙 二 胺 四 乙酸 (EDTA)(CpH 8.0). 2) WW (solution J) 0.2 mol/L NaOH,2% SDS, 使 用 前 等 体积 混合 ， 现 用 现 配 。 3) ¥ YW Tl (solution []) (pH 4. 8) 若 配 200 ml, = FH A a AY et Ot BION 5 mol/LZ FF 120 ml、 冰 乙酸 23 ml #1 DDW 57 ml, 4) TE 缓冲 液 10 mmol/L Tris * HCl,1 mmol/L EDTA(pH 8. 0), 5) 70%% 乙 醇 ( 放 一 20C 冰 箱 中 ,用 后 即 放 回 ) 。 6) 胰 RNA fig RNA 酶 溶 于 10 mmol/L Tris + HCl (pH 7.5), 15 mmol/L NaCl 中 , 配 成 10 mg/ml 的 浓度 ,于 100°C ANA 15 min, RBH SS fa RAFF —20°C 。 7) 终止 液 ” 40% 芒 糖 .0. 25 YR BE 1% SDS. 8) 酚 ( 见 附录 )。 【实验 步骤 】 1. 提取 质粒 1) 2~4 ml 含 相 应 抗生素 的 LB 液体 培养 基 加 入 试管 中 , 接 人 含 pPUC19 质 HL E. coli ,37 了 振荡 培养 过 夜 。 2) 将 试管 中 播 好 的 菌 体 一 般 分 2~ 3 次 倒 人 微量 离心 管 (Eppendorf 管 ) 中 ， 7 000 rmin 离 心 1 min, 弃 去 上 清 , 使 细胞 沉淀 尽 可 能 干燥 。 3) 将 细菌 沉淀 悬浮 于 200 el RK 工 中 ,充分 混 匀 ,室温 放置 5 min, 4) 加 300 pl 溶液 开 ( 新 鲜 配 制 ) , 盖 紧 管 下 , 混 匀 内 容 物 ,将 离心 管 室温 或 冰 上 放置 5 min, 5) 加 入 300 由 溶液 焉 , 盖 紧 管 口 ,颠倒 数 次 使 混 义 。 室 温 或 水 上 放置 5 min, 6) 12000 rmin, 离 心 15 min, 将 上 清 转 至 另 一 离心 管 中 。 向 上 清 中 加 入 等 体 积 4800 pD) 酚 : AA? 1) 或 氯仿 (去 蛋白 ) ,反复 混 勺 ,12 000 rmin, 离 心 5 min, 将 上 清 转移 到 另 一 离心 管 中 。 7) 向 上 清 加 入 预 冷 的 异 两 醇 或 2 倍 体积 无 水 乙醇 , 混 匀 后 ,室温 或 一 20C 订 箱 放 置 30 min。12 000 r/min 离心 10 一 15 min。 倒 去 上 清 液 ,把 离心 管 倒 扣 在 吸 。128 。 遗传 学 实验 教程 水 纸 上 , 吸 干 液体 。 8) 用 0.5 ml 70% 乙醇 洗涤 质粒 DNA TERK. RBH. BK LIAM. BHT RSA PIE. 9) 加 30~50 岂 无 菌 水 或 IE 缓冲 液 ,其 中 含有 20 pg/ml AYR RNA Bi, 37°C 2~5h 使 DNA 完 全 溶解 ,一 20 人 可 保存 数 月 。 2. 酶 切 Hi 5 wl DNA 4K. A 1 wl BD AP YR. EcoRI 酶 1 岂 , 无 菌 水 补 至 总 体积 10 yl 体系 ,37C 保 温 3 h , MAS EMR MER PSS ETT LK. ZT RL DNA. 的 限制 性 me) is 【实验 报告 】 1. 碱 裂 解法 提取 质粒 DNA 需要 注意 哪些 问题 ? 2. 除 碱 裂 解法 外 ,质粒 DNA 的 提取 ,还 有 其 他 哪些 方法 ? HUE) 实验 33 SRA PE EBC Ha Dk tel] DNA 【实验 目的 】 学 习 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 检测 DNA 的 方法 和 技术 。 【实验 原理 】 DNA 分 子 在 琼脂 糖 凝 胶 中 泳 动 时 有 电荷 效应 和 分 子 得 效应 。DNA 分 子 在 高 于 等 电 点 的 pH 溶液 中 带 负 电荷 ,在 电场 中 向 正极 移动 。 由 于 糖 -磷酸 骨架 在 结构 -上 的 重复 性 质 , 相 同 数量 的 双 链 DNA 几乎 具有 等 量 的 净 电 荷 , 因 此 它们 能 以 同样 的 速度 向 正极 方向 移动 。 在 一 定 的 电场 强度 下 ,DNA 分 子 的 迁移 速度 取决 于 分 子 得 效应 , 即 DNA 分 子 本 身 的 大 小 和 构 型 。 具 有 不 同 的 相对 分 子 质量 的 DNA 片段 泳 动 速度 不 一 样 ,可 进行 分 离 。DNA 分 子 的 迁移 速度 与 相对 分 子 质量 的 对 数值 成 反比 关系 。 雍 胶 电泳 不 仅 可 分 离 不 同 相 对 分 子 质量 的 DNA, 也 可 以 分 离 相对 分 子 质量 相同 ,但 构 型 不 同 的 DNA 分 子 。 如 实验 32 提取 的 pPUC19 质粒 ,有 3 种 构 型 ， © 超 螺旋 的 共 价 闭合 环 状 质粒 DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA) Q 开 环 质粒 DNA, 即 共 价 闭合 环 状 质粒 DNA 的 1 条 链 断 裂 , (open circular DNA,ocDNA);G) 线 状 质粒 DNA, 即 共 价 闭合 环 状 质粒 DNA 的 2 ARE RE Te (linear DNA，LDNA)。 这 3 种 构 型 的 质粒 DNA 分 子 在 凝 胶 电 泳 中 的 迁移 率 不 同 ,因此 电泳 后 呈 3 条 带 : 超 螺旋 质粒 DNA 泳 动 最 快 ,其 次 为 线 状 DNA, 最 慢 的 为 开 环 质粒 DNA。 第 二 部 分 综合 性 实验 “8 【材料 与 用 品 】 1. 材料 pUC19 质粒 。 2. 用 具 及 药品 (1) hE 恒温 培养 箱 Sar A BE BE MB HB Uk FA Soe CHK A AS hl BOAR) GDL. 高 压 灭 菌 锅 、 紫 外 线 透 射 仪 。 (2) 药品 三 羟 甲 基 毛 基 甲 烷 (CTris) . 冰 乙 酸 、 乙 二 胺 四 乙酸 (EDTA) RK 、 琼 Bee 、 澳 化 乙 锭 .DNA marker, (3) 试剂 1) 工 000ml50XTAE(50 倍 体积 的 TAE 贮存 液 ) Tris 242 g.57. 1 ml 冰 乙酸 .0.5mol/L EDTA(pH 8. 0)100 ml, 加 DDW 定 容 到 1 000 ml, 2) BERNER UR (6X) ”省 酚 蓝 0. 25%% ,蔗糖 40%. 3) 琼脂 糖 ,0. 5 g/ml 省 化 乙 锭 溶液 CEB) 。 【实验 步骤 】 1. 制备 琼脂 糖 凝 胶 按照 被 分 离 DNA 的 大 小 ,决定 凝 胶 中 琼脂 糖 的 百 分 含量 。 琼脂 糖 凝 胶 浓 度 / 2% 线性 DNA 的 有 效 分 离 范围 /kb 0. 3 5 一 60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0. 9 0: 5~7/ 1.2 0. 4 一 6 1,5 0.2~4 2.0 Opl=3 称 取 0. 3 g 琼脂 糖 , 放 入 锥 形 瓶 中 ,加 入 30 ml 1x TAE 缓冲 液 , 置 微波 炉 或 水 浴 或 电热 套 中 加 热 至 完全 溶化 ,取出 摇 匀 , 则 为 1% 琼 脂 糖 凝 胶 液 。 2.， 胶 板 的 制备 1) 取 有 机 玻璃 内 槽 , 洗 净 , 了 晾 干 ,用 橡皮 襄 将 有 机 玻璃 内 槽 的 两 端 边 缘 封 好 。 注意 一 定 要 封 严 ,不 能 留 缝隙。 2) 将 有 机 玻璃 内 槽 放置 于 一 水 平 位 置 , 并 放 好 样品 梳子 。 3) 将 冷 到 60C 左 右 的 琼脂 糖 凝 胶 液 , 加 入 万 分 之 一 或 两 万 分 之 一 的 EB 混 匀 , 缓 缓 倒 人 有 机 玻璃 内 槽 ,直至 有 机 玻璃 板 上 形成 一 层 均匀 的 胶 面 。 注 意 ,不 要 = 130 遗传 学 实验 教程 形成 气泡 ,同时 加 EB 一 定 要 带 一 次 性 手套 ,以 防 EB 对 实验 者 污染 造成 衔 害 ， 4) 待 胶 凝固 后 ,取出 梳子 , 取 下 橡皮 襄 , 放 在 电泳 槽 内 。 5) 加 电泳 缓冲 液 人 电泳 槽 中 。 3. 加 样 用 移 液 枪 将 已 加 入 上 样 缓冲 液 的 DNA 样品 加 入 加 样 孔 ,记录 点 样 顺序 及 点 样 量 。 4. 电泳 1) 接 通电 泳 槽 与 电泳 仪 的 电源 。 注 意 正 负极 ,DNA 片段 从 负极 向 正极 移动 。 DNA 的 迁移 速度 与 电压 成 正比 ,最 高 电压 不 超过 5 V/cm. 2) 当 溴 酚 蓝 染料 移动 到 距 凝 胶 前 沿 1 一 2 cm 处 ,停止 电泳 。 5. 结果 观察 在 紫外 灯 (360 nm 或 254 nm) 下 观察 染色 后 的 电泳 凝 胶 。DNA 存在 处 应 显 出 橘红 荧光 条 带 。 在 紫外 灯 下 观察 时 应 戴 上 防护 眼镜 ,紫外 线 对 眼睛 有 伤害 作用 。 注意 以 下 三 种 情况 的 条 带 : O DNA 相对 分 子 质量 标准 物 Cmarker);CG) pUC19 质 #i DNA & EcoRI 5¢ 428% ;@ pUC19 质粒 DNA & EcoRI 部 分 酶 解 ; 【实验 报告 】 分 析 解 释 实 验 结果 。 〈 贺 继 临 ) 第 三 部 分 实验 34 调查 人 群 中 茶 一 或 茶几 种 性 状 【实验 目的 】 OL. 了 解 人 类 几 种 性 状 的 遗传 规律 。 2. 掌握 色盲 的 遗传 机 制 。 3. 培养 实验 设计 ,科普 调查 的 能 力 。 【实验 原理 】 由 遗传 因素 引起 的 疾病 称 为 遗传 病 。 大 多 数 遗 传 病 是 先天 性 病 , 即 在 胎儿 出 生前 由 于 染色 体 结 构 或 数目 异常 或 基因 的 点 突变 在 婴儿 出 生 时 就 显示 症状 ,如 先 RBH MAR A 09 fH (color blindness)。 色 盲 指 患者 不 能 辨别 红色 和 绿 色 , 是 人 类 比较 常见 的 隐 性 伴 性 遗传 病 , 也 是 人 类 遗传 病 研 究 得 最 早 的 一 个 性 状 。 色盲 的 遗传 是 隐 性 的 色盲 基因 ,由 X 染色 体 携带 ,Y 染色 体 上 没有 它 的 等 位 基 因 。 作 为 半 合子 的 男性 个 体 的 X 染 色 体 上 如 果 带 有 色盲 基因 (X'Y) 表 型 一 定 为 色 盲 。 而 女性 色盲 患者 的 基因 型 则 为 XSX5 的 纯 合 体 。 由 伴 性 遗传 规律 可 知 , 如 果 一 个 色盲 的 女子 与 一 个 正常 色觉 的 男性 婚配 , 则 他 们 的 儿子 都 像 他 们 的 母亲 一 样 表现 色盲 ,而 所 有 的 女儿 都 会 像 父亲 一 样 表 现 正 常 。 红 色觉 基 因 座 与 绿色 觉 基 因 座 已 定位 在 双 染色体 的 Xa28。 【实验 内 容 】 “设计 一 个 实验 方案 ,调查 人 群 中 的 色盲 .白化 病 、 AC FER BAER . 1 原始 数据 , 绘 出 遗传 系谱 , 试 推 个 体 的 基因 型 。 【实验 报告 】 完成 一 篇 调查 论文 。 ( 张 爱 民 ) 实验 35 观察 不 同 诱 变 因 素 对 染色 体 结 构 的 影响 【实验 目的 】 1. 了解 不 同 诱 变 因 素 对 遗传 物质 的 效应 及 诱 变 机 制 。 2. 学 习 诱 发 植物 染色 体 结构 变 异 的 方法 。 “82 遗传 学 实验 教程 3. 认识 畸变 的 几 种 类 型 。 【实验 原理 】 任何 一 个 物种 的 染色 体形 态 、 结 构 和 数目 是 相当 稳定 的 ,但 绝 非 永恒 不 变 。 在 自然 条 件 下 , 某 些 环境 因素 的 异常 变化 往往 能 引起 植物 染色 体 的 形态 .结构 和 数目 变异 。 如 果 用 物理 、 化 学 因素 人 为 地 处 理 植物 , 则 可 以 大 大 提高 变异 频率 。 这 类 物 理 、 化 学 因素 被 称 为 诱 变 因 素 或 诱 变 剂 。 目前 应 用 最 广 而 行 之 有 效 的 物理 诱 变 因 素 是 辐射 。 辐 射 可 分 电离 辐射 与 非 电 离 辐射 。 电 离 辐射 具有 更 高 的 能 量 , 当 与 被 照射 物质 起 作用 时 , 除 能 引起 物质 的 激 发 外 ,还 能 引起 电离 。 在 高 等 植物 诱 变 工作 中 主要 是 利用 电离 辐射 。 电 离 辐射 是 通过 电离 作用 使 染色 体 受 到 损伤 , 轻 则 造成 基因 结构 的 改变 , 重 则 造成 染色 体 结构 的 断 折 。 断 折 了 的 染色 体 在 重新 接合 时 难免 发 生 差 错 , 于 是 就 出 现 结构 变异 。 不 同 结构 变异 的 出 现 需要 不 同 的 断 折 数 。 顶 端 缺 失 的 出 现 只 需要 染色 体 断 折 一 次 ; 重复 和 易 位 的 出 现 则 需要 两 个 染色 体 分 别 断 折 一 次 或 一 次 以 上 , 即 至 少 两 次 断 折 。 凡 只 要 求 断 折 一 次 就 能 出 现 的 结构 变异 ,它们 的 出 现 频率 同 辐射 的 剂量 成 正比 。 需要 两 次 断 折 的 结构 变异 ,出现 的 频率 都 与 辐射 剂量 的 平方 成 正比 。 从 20 世纪 40 年 代 成 功 地 使 用 化 学 诱 变 剂 以 来 ,研究 过 的 诱 变 剂 已 有 很 多 种 ， 然而 能 在 栽培 作物 诱 变 中 有 实际 应 用 价值 的 还 为 数 不 多 。 它 们 大 都 属于 烷 化 剂 ， dn FA Se fk RZ A CEMS) . ii RZ. BR (des). Z Hi ML He CED , 10 A BE Z SE PR bE CNEU) 以 及 亚 硝 基 乙 基 脲 CNEH)。 除 烷 化 剂 以 外 ,在 植物 中 羟 胺 CNH5OH) 也 能 引起 染色 体 畸 变 。 烷 化 剂 带 有 一 个 或 多 个 活性 烷 基 , 此 烷 基 能 够 转移 到 其 他 分 子 电子 密度 极 高 的 位 置 上 去 。 这 种 通过 烷 基 在 分 子 内 置换 氨 原 子 的 作用 ,就 叫 烷 化 作用 。 烷 化 了 的 分 子 是 高 度 不 稳定 的 物质 。Reiner 和 Zamenhof 证 明了 NA Wie 酸 基 是 烷 化 作用 的 最 初 反应 位 置 , 所 形成 的 磷酸 三 酯 是 不 稳定 的 ,很 快 能 水 解 成 酸 酯 和 去 氧 核糖 ,结果 使 DNA 链 断 裂 。Brooks 和 Lawley 证 明了 味 吟 和 喀 喧 碱 基 也 发 生 烷 化 作用 , 碱 基 的 烷 化 作用 偶尔 也 导致 结构 的 重 排 ,使 糖苷 键 断裂 ,去 味 吟 后 的 DNA 是 易 变 的 ,在 去 嗓 叭 的 位 置 上 能 打上 断 糖 一 雁 酸 键 。 经 诱 变 因 素 处 理 过 的 材料 ,其 细胞 在 有 丝 分 裂 过 程 中 常常 可 以 看 到 染色 体 黏 连 , 着 丝 点 区 域 断 裂 ,破坏 纺锤 丝 形成 ,染色 体 或 染色 单 体 的 断裂 ,出 现 环 状 染 色 体 以 及 "染色体 桥 ?和 落后 染色 体 等 异常 现象 。 在 实际 工作 中 ,选择 合适 的 剂量 浓度、 处 理 的 持续 时 间 及 温度 也 是 很 重要 的 。 一 般 要 求 尽量 减少 对 植物 的 生理 损伤 ,提高 遗传 方面 的 效应 ,以 有 效 地 选择 优 展 的 变异 类 型 和 个 体 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 小 麦 \ 大 麦 、 乔 豆 、 玉 米 等 植物 种 子 。 第 三 部 分 研究 性 实验 °) 133. - 2. 用 具 及 药品 (1) 实验 用 有 具 显微镜 恒温 箱 ,恒温 水 浴 锅 剪子、 杀 子 刀片 酒精 灯 、 烧 杯 、 小 指 瓶 、 载 玻 片 、 RA 滤纸、 纱布 .培养 四 。 (2) 药品 甲 基 磺 酸 乙 酯 .乙醇 .1 mol/L 盐酸 .0.05%% 秋 水 仙 素 ,上 趟 诺 固 定 液 .改良 苯酚 品 红 染 色 液 .45%% 醋 酸 。 【实验 步骤 】 1. 辐射 诱 变 的 染色 体 结 构 变异 1) 将 小 麦 \, 大麦 、 乔 豆 或 玉米 等 植物 种 子 各 分 成 4 份 ,三 份 交 辐 射 中 心 用 Y 射 线 照射 ,剂量 分 别 为 1 万 .2 万 和 3 万 伦琴 , 另 一 份 作为 对 照 。 2) 辐射 后 的 种 子 连 同 对 照 分 别 放 于 25C 温 箱 内 浸种 发 芽 。 3) 待 乔 豆 初生 根 长 至 1. 5 om, 小 麦 \, 大麦 或 玉米 初生 根 长 至 0.5 cm, 切 下 根 尖 于 卡 诺 固定 液 中 固定 1 一 2 h。 4) 洗 去 固定 液 ,在 1 mol/L 盐酸 60°C F 2k f— 10 min 左右 ,立即 放 人 冷 的 1 mol/L 盐 酸 中 。 5) 将 根 尖 置 于 干净 的 载 玻 片 中 央 , 切 下 根 尖 分 生 组 织 , 再 履 一 张 载 玻 片 对 压 后 , 滴 一 滴 改 良 葵 酚 品 红 染色 液 10 min, 加 上 凌 玻 片 压 片 。 6) 观察 后 ,未 期 细胞 染色 体 。 每 处 理 观察 10 条 根 尖 制 片 , 每 根 尖 观 察 10 个 以 上 后 ,未 期 细胞 ,统计 其 染色 体 畸 变 率 。 -种子 辐 射 处 理 后 统计 有 丝 分 裂 中 畸变 数 时 , 必须 观察 第 一 次 有 丝 分 裂 周期 中 的 畸变 。 因 为 畸变 细胞 的 数量 在 以 后 的 第 二 、 第 三 次 分 裂 周 期 中 会 逐渐 下 降 , 只 有 根据 种 子 发 芽 后 第 一 次 有 丝 分 裂 周 期 所 作 的 统计 数 ,才能 对 不 同 诱 变 处 理 的 结果 进行 可 靠 的 比较 。 2. 化 学 诱 变 剂 诱发 的 染色 体 结构 变异 1) E/N KRAEMEKE FHL 25°C PR. FP AIR KE 0.6~1 cm 时 ,用 0. 6% FA SER ZA UE TAP 2D lb FH O12 和 3 h。 2) 自来水 冲洗 0.5h 后 在 25 位 温 箱 中 恢复 培养 20 一 24h。 步骤 同上 。 【实验 报告 】 1. 按照 一 般 科 技 论文 的 形式 自行 设 表 , 统 计 不 同 处理 根 尖 细 胞 的 染色 体 畏 2. 分 析 讨论 : 自发 突变 与 诱发 突变 .不 同 材 料 . 不 同 诱 变 剂 `. 不 同 照射 剂量 、 EMS 的 处 理 时间 等 对 染色 体 结构 变异 的 影响 。 (人 =” 33 遗传 学 实验 教程 实验 36 ”染色 质 的 分 离 及 组 成 成 分 分 析 【实验 目的 】 1. 掌握 染色 质 分 离 的 方法 。 2. 了 解 染 色 质 组 成 成 分 分 析 的 方法 。 【实验 原理 】 染色 质 是 遗传 物质 的 载体 ,在 间 期 细胞 核 中 呈现 分 散 状 态 。 当 细胞 从 裂 时 进 一 步 螺旋 化 , 折 春 成 染色 体 。 它 是 真 核 生 物 核 基因 遗传 和 变异 的 物质 基础 。 本 实 验 以 大 鼠 肝 细胞 为 材料 说 明 染 色 质 制备 的 一 般 原 理 和 方法 。 先 把 细胞 匀 浆 于 一 定 的 介质 中 ,再 经 过 过 滤 除 去 细胞 碎片 ,用 低速 离心 把 核 沉 这 ,去 掉 含 有 其 他 颗粒 和 可 溶性 蛋白 及 核酸 的 上 液 , 用 含有 EDTA 盐 溶液 洗 核 。 用 中 性 非 离子 型 去 污 剂 TritonX - 100 抑制 核酸 酶 的 活性 ,溶解 膜 状 物质 ,去 除 染 色 质 上 膜 物 质 的 污染 。EDTA( 乙 二 胺 四 乙酸 钠 盐 ) 是 丈 合 剂 ,能 和 三 价 离子 鳌 合 ， 抑制 DNA 酶 的 活性 ,并 可 去 除 染 色 质 上 污染 的 蛋白 质 。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 大 鼠 肝 细胞 。 2. 用 具 及 药品 (1) AA URED PL. I SR at BR ak . BE AZ A. 电磁 搅拌 器 .解剖 用 具 ; 烧 杯 、 量 简 等 一 般 玻璃 器 中。 (2) 药品 1) A 液 ( 匀 浆 缓冲 液 ) 0.075 mol/L NaCl- 0. 024 mol/L EDTA, pH 8, 2) B 液 ( 悬 浮 与 洗涤 缓冲 液 ) 10 mmol/L Tris/HCl - 0.2 mmol/L EDTA -0. 1%TristonX - 100, pH 8。 3) CR 10 mmol/L Tris/HCl - 0. 2 mmol/L EDTA, pH 8, 4) DY 1. 7 mol/L FHF 0. 01 mol/L Tris / HCl - 0. 2 mmol/L EDTA, pH 8, 以 上 各 种 缓冲 液 均 含 有 0. 1 mmol/L PMSF( A AE Ga. MW174) . HIT 液 时 可 以 先 配 制 50 mmol/L PMSF 贮 液 , 即 称 取 0. 87 g PMSF HF 100 ml WH 两 醇 或 95 儿 乙醇 中 即 可 , 临 用 时 按 稀释 比例 加 入 缓冲 液 。 【实验 步骤 】 本 实验 采用 BONNER 法 。 l. 染色 质 的 分 离 全 部 操作 都 在 0 一 4C 下 进行 ,全 部 试剂 均 存 于 冰箱 中 。 第 三 部 分 研究 性 实验 + eae 1) 把 饥饿 24 h WHKA RBTBHDTC, FART. MIRAE KA YE 去 血 污 。 2) 称 15g 肝 ( 约 三 只 大 白鼠 肝脏 ) 在 冰 浴 上 剪 碎 , 加 入 200 ml A 液 和 1 ml 辛 醇 以 消除 泡沫 。 在 刀 匀 浆 器 中 匀 浆 ,快速 1 min, 慢 速 1 一 2 min, 每 15 间歇 数秒 。 3) 把 匀 浆 液 用 四 层 纱布 过 滤 。 滤 液 经 1 500 g* 离心 10 min。 弃 去 混浊 的 ER. 4) 沉淀 加 入 150 ml A. DR. HMB. BEM 1 500 g 离心 10 min, 沉 淀 再 以 80 ml A 液 洗 涤 两 次 ,可 得 到 较 纯净 的 细胞 核 。 5) 将 此 核 沉淀 加 入 80 ml BR, ERI SRA PAR 10 一 15 次 , 破 核 , 再 经 1 500g 离 心 10 min, 获得 粗 染 色 质 沉淀 。 然 后 再 用 80 ml B 液 匀 浆 , 依 次 经 4500 g.12 000 g 各 离心 10 min, 反 复 洗 涤 染 色 质 沉淀 。 6) 把 染色 质 沉淀 加 入 20 ml C 液 ,用 玻璃 匀 浆 器 匀 浆 ,电磁 搅拌 器 搅拌 1 h。 把 悬浮 液 分 成 44 份 ,每 份 5 ml 铺 在 25 mlD 液 之 上 ,经 70000g 离 心 3h, 即 可 获得 纯化 的 染色 质 沉 淀 。 7) AA LIAM ,将 沉淀 悬浮 在 C 液 中 ,在 30 000 g 离心 20 min, 洗 涤 两 次 ,以 除去 染色 质 上 残留 的 蔗糖 。 或 者 将 悬浮 液 对 C 液 在 冰箱 中 透析 过 夜 , 亦 可 除去 蔗糖 。 8) 本 法 纯化 的 染色 质 可 用 电镜 观察 ,组 成 成 分 的 定量 分 析 、 免 疫 反应 以 及 DNA 和 染色 质 蛋 白质 (组 蛋白 和 非 组 蛋白 ) 的 制备 等 实验 。 2. 染色 质 纯 度 的 鉴定 (1) 紫外 吸收 的 特征 曲线 将 染色 质 沉淀 加 入 双 营 水 (pH 8, 用 NH4:OH 调 ) 用 刀 匀 浆 器 冰 浴 匀 浆 2 min 《快速 ) ,然后 冰箱 中 电磁 搅拌 0.5 一 1 h, 4 10 000 g 离 心 30 min, 可 获得 含 纯 染色 质 的 上 清 液 ,最 终 使 染色 质 稀释 30 倍 。 或 者 取 染 色 质 沉淀 在 0. 1 mmol/L Tris/ HCICpPH 8) 缓 冲 液 中 悬浮 ,加 入 等 体积 的 0.1 mol/L NaOH 溶液 使 之 溶解 ,然后 用 双 蒸 水 (pH 8) 稀 释 30 倍 以 上 , 即 可 用 于 测定 。 用 紫外 分 光 光 度 计 测定 染色 质 溶液 在 190 一 340 nm( BK 230~340 nm) 范围 之 lala OD 值 变化 。 纯 染色 质 的 紫外 吸收 光谱 ,在 320 nm 测 不 到 吸收 值 , 而 在 220 nm 和 260 nm 出 现 高 吸收 峰 。 根据 经 验 数据 ， Sti Ye £4, JH AJ OD 320 OD 260 比值 应 小 于 0.05。 (2) 熔 解 温度 Tu 值 的 特征 各 种 来 源 的 染色 质 Tu 值 是 恒定 的 ,并 且 比 相应 的 DNA 的 T.. 值 高 。 如 大 鼠 if DNA 的 Tu 值 为 68 , 常 染 色 质 的 Tu 值 为 81YC , 异 染 色 质 Tu 值 近似 86°C. * 1RCF=1g=(1.18X10-5)2 r/min, Fla. + -T36 。 遗传 学 实验 教程 熔 解 温度 可 用 257 nm 相对 紫外 吸收 测定 。 (3) 形态 观察 纯 染 色 质 呈 黏 液 状 ,用 醋酸 洋红 常规 染色 法 ,在 光学 显微镜 下 可 以 观察 到 玻 散 的 网 状 纤维 结构 。 电 子 显微镜 下 可 以 观察 到 直径 为 100 一 300A 粗细 不 等 ,交叉 成 网 状 的 纤维 ,250~300A 纤维 上 有 螺旋 斜纹 和 100A 纤维 的 念珠 状 结 节 , 旦 现 出 染 色 质 的 多 级 螺旋 结构 。 (4) 染色 质 组 成 成 分 的 分 析 (Sinclair 法 ) 1) 取 染 色 质 1 g, 加 入 预 冷 的 0. 25 mol/L HCL- 0.9%NaCl 20 ml, EAA. 在 4C 条 件 下 电磁 搅拌 1.5 h。12 000 g 离心 10 min, 上 清 液 用 0.52 mol/L HC - 0.9% NaCl 补充 到 25 ml, FA Folin 酚 法 测 上 清 液 组 蛋白 的 含量 ,以 牛 血清 白 蛋白 为 一 标准 。 2) 把 1) 的 沉淀 (去 组 蛋白 染色 质 沉 淀 ) ,用 冷 10%TCA( 三 氯 醋酸 ) 洗 两 次 后 加 入 10 ml 0. 3 mol/L KOH 493g , 匀 浆 液 在 37C 水 浴 保 温 16h。 浴 却 使 沉淀 完全 ， 再 用 5% PCA(HCIO, , 高 毛 酸 ) 调 pH 1~2, 12 000 g 离心 55 min, ERMA 0. 3 mol/LKOH -HCIO, (pH 1.5) 补 充 到 25 ml。 用 地 衣 酚 法 测 上 清 液 RNA 含 量 , 以 酵母 RNA 为 标准 。 3) 沉淀 加 15 ml 10% PCA 匀 浆 , 匀 浆 液 在 70C 水 浴 保 温 30 min, 12 000 g 离心 10 min, 上 清 液 用 10% PCA 补充 到 25 ml。 用 二 葵 胺 法 测定 上 清 液 DNA 含 量 , 以 小 牛 胸腺 DNA 为 标准 。 4) 沉淀 用 适量 0.05 mol/L 或 0.1 mol/L NaOH WH (25°C), 12 000 g 离心 5 min, 上 清 液 用 0. 05 mol/L NaOH 补充 至 25 ml, 其 中 的 非 组 蛋 自 用 了 olin 酚 法 测定 ,以 牛 血清 蛋白 为 标准 。 5) 根据 DNA、 组 蛋白 .RNA 和 非 组 蛋白 的 含量 ,以 DNA 为 工 ,计算 出 大 鼠 肝 染色 质 各 组 分 的 比值 。 附 1 FOLIN HAM ESAS —, RE 蛋白 质 在 碱 性 条 件 下 与 铀 形成 复合 物 , 然 后 又 与 钨 酸 钠 - 钼 酸 钠 混合 物产 生 蓝 色 反 应 ,在 750 nm 有 最 大 吸收 。 若 蛋白 质 浓度 超过 25 pg/ml 时 ,应 在 500 nm 测 定 。 本 法 灵敏 ,可 测 出 0.2 pg/ml 的 和 蛋白质 。 =, wl 1. 试剂 甲 使 用 前 将 4%NazCO, 和 0. 2 mol/L NaOH 等 体积 混合 ,1%CuSO。5H2O 2. 试剂 乙 (Folin 酚 试 剂 ) 在 2 000 ml 的 磨 口 回流 装置 内 加 入 100 g 钨 酸 钠 (Na WO, * H,O),25 g ‘A PRK Na,MoQ, * 2H2O),700 ml 蒸馏 水 ,再 加 50 ml 85% BEB R 100 ml RRM, 充分 混合 后 ,以 小 火 回 流 10 h。 再 加 入 150 g 硫酸 锂 (LizSO, ) ,50 ml 蒸馏 水 及 省 液 数 滴 。 然 后 开口 继续 沸腾 15 min 以 驱除 过 量 的 省 。 冷 却 后 定 容 到 1 工 。 过 滤 后 , 呈 绿 色 , 置 于 棕色 试剂 瓶 中 冰箱 保存 。 使 用 时 用 标准 氢 氧 化 钠 溶 液 滴定 , 酚 本 为 指示 剂 。 最 后 约 稀释 1 倍 ,浓度 即 为 1 molL。 存 于 冰箱 中 可 长 期 保存 。 3. 蛋白 质 标准 液 ( 先 用 定 氮 法 确定 蛋白 质 纯度 ) 用 牛 血清 白 蛋白 配 成 250 pg/ml 的 水 溶液 。 1 和 第 三 部 分 研究 性 实验 - 137 - 和 2%BARAASARIEA. HARARE 50: 1 混合 。 当 天 使 用 。 =, SMR 1. 绘制 标准 曲线 按 0.0.1.0.2.0.4.0.6.0.8、1.0 ml 往 试 管 中 加 入 蛋白 质 标准 液 ,然后 各 管 加 WARK 1 ml。 再 加 试剂 甲 5 ml 混 匀 ,30C 保 温 10 min, 加 试剂 乙 0. 5 ml, 快 速 混 义 ,30C 保 温 30 min, 在 500 nm 测 光 密度 。 每 种 蛋白 质 标 准 浓度 测 两 管 , 取 平均 值 。 以 蛋 和 白质 浓度 为 横 坐 标 , 光 密度 为 纵 坐 标 ,绘制 标准 化 曲线 。 2. 样品 的 测定 按 下 表 顺 序 进 行 , 在 500 nm 下 测 光 密度 。 和 HP NHP st 最 No 1 2 3 4 5 = 样品 /ml 0. 05 0.1 0. 05 0.1 0 = D. W. /ml 0. 95 0.9 0. 95 0.9 1 试剂 甲 /ml 5 5 5 5 5 30C ， 保温 10 min 试剂 乙 /ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 快速 混 匀 30°C ”保温 30 min ODsoo 3. He 1) 查 标 准 曲线 得 蛋白 质 浓度 可 测定 范围 是 25 ~ 250 pg/ml HAM. 2) 标准 液 标准 值 对 比 te pe 待 测 液 OD 值 一 对 照 液 OD 值 蛋白 质 浓度 二 标准 液 OD 值 二 对 照 滚 OD 什 X 标 准 液 蛋 白质 浓度 义 稀 释 倍数 。138 « 遗传 学 实验 教程 | 附 2 | 二 苯胺 法 测 DNA 含量 —, RE DNA 55 5 BR TES > FF Ay HE BRE Ab ABE A Fe EPR A EEE 酸性 条 件 下 又 脱水 生成 w — PSE y - 酮 基 戊 醛 , 和 二 苯胺 作用 形成 蓝 色 物质 ,在 595 nm 有 最 大 吸收 ,用 小 牛 胸腺 DNA 为 标准 ,进行 DNA 含量 测定 。 =, wl 1. 二 苯胺 试剂 4g 二 苯胺 溶 于 400 ml 冰 乙 酸 中 ,再 加 40 ml HCIO, 。 使 用 前 取 100 ml, 加 入 1] ml 1. 6% 乙 醛 。 2. DNA 标准 曲线 (用 定 磷 法 确定 DNA 纯度 ) 取 小 牛 胸腺 DNA, 以 0.01 mol/L NaOH 溶液 配制 成 200 pg/ml, 三 、 实 验方 法 1. 绘制 标准 曲线 取 10 支 试 管 ,分 成 两 组 ,各 加 O. 4.0. 8,1. 2.1. 6,2. 0 ml DNA treme MNF 水 到 2 ml。 另 取 2 支 试 管 加 入 双 营 水 为 对 照 。 各 管 加 入 4 ml SERA, 60C 保 温 Lh. WEE 595 nm 处 测 光 密度 , 取 平 均值 。 以 DNA RENAE, 光 密度 值 为 纵 坐标 ,绘制 标准 曲线 。DNA 在 40~400 pg/ml 范围 与 光 密 度 值 成 正 量 HR 0 | 2. DNA 定量 测定 步骤 同上 ,只 是 待 测 样品 的 加 样 量 为 0.05 ml 和 0. 1 ml。 3, PEt 1) 查 标准 曲线 , 求 得 DNA YREE (ug/ml) . 2) 用 标准 液 标准 值 对 比 : _ 待 测 液 OD 值 一 对 照 液 OD 值 DNA (ug/ml) = 5p OD fH — at HAY OD {fi 义 标准 液 的 DNA 浓度 义 黎 释 倍数 a i 附 3 地 衣 酚 法 测定 RNA 含量 as 原理 RNA 和 浓 盐 酸 共 热 被 分 解 为 喀 啶 核 苷 酸 、 味 叭 碱 基 和 核糖 ,核糖 又 脱水 成 糖 第 三 部 分 研究 性 实验 ”天 9 - 醛 , 后 者 在 三 价 铁 离子 催化 下 ,与 地 衣 酚 形成 鲜 绿 色 , 在 670 nm 有 最 大 吸收 值 , 可 ” 测 其 浓度 ,RNA 浓度 在 20~250 ng/ml 与 其 光 密 度 值 成 正比 。 二 、 试 剂 1. HOA COricinol) 称 50 g 地 衣 酚 溶 于 50 ml 0. 1% FeCl, - 浓 HCl 中 。 2. RNA 标准 液 ( 用 定 磷 法 测 RNA 纯度 ) 取 酵 母 RNA 配 成 100 pg/ml 的 溶液 。 三 、 实 验方 法 1. 标准 曲线 的 制定 取 10 支 试 管 分 成 两 组 ,分 别 加 入 0.5.1.0.1.5,2.0,2.5 ml RNA 标准 液 , 再 加 双 蒸 水 至 2.5 ml。 另 取 2 支 试 管 加 入 2.5 ml 双 营 水 为 对 照 。 每 管 均 加 入 2.5 ml 地 衣 红 酚 试 剂 , 混 匀 。 沸 水 浴 20 min, 冷 却 后 于 670 nm 处 测 OD 值 , 取 两 组 平均 值 。 以 RNA 浓度 为 横 坐 标 , 光 密度 值 为 纵 坐 标 , 绘 制 标准 曲线 。 2. 样品 RNA 的 定量 测定 方法 同上 ,只 是 样品 加 入 量 为 1 ml 和 2. 5 ml, 两 组 同时 测定 。 加 双 莹 水 补足 2.5 ml 后 再 加 地 衣 酚 试剂 2. 5 ml。 沸 水 浴 20 min, 冷 却 后 测 ODar 。 3. 1+# 1) 查 标 准 曲线 求 得 RNA(Cug/ml) 。 可 测 范围 为 20~250 ug/ml. 2) 用 标准 液 标准 值 对 比 。 alle 一 对 照 液 OD RNA (B/D = Fo OD HE FE OD fh 义 标准 液 的 RNA 浓 度 X 黎 释 倍 数 【实验 报告 】 1. 绘 出 大 鼠 肝 细胞 染色 质 的 紫外 吸收 特征 曲线 (190 一 340 nm), +R ODs20 /ODe«0 比值 。 2. 根据 染色 质 各 组 成 成 分 的 含量 计算 出 大 鼠 肝 染色 质 各 组 分 的 比值 。 44] ABA 实验 37 RAE ES £8 RAB oT 【实验 目的 】 利用 染色 体 组 型 分 析 的 方法 ,研究 任何 一 个 未 知 动 植物 材料 的 染色 体 组 成 ,分 析 其 染色 体 组 型 ,了 解 染色 体 组 型 分 析 的 意义 。 。 140。 遗传 学 实验 教程 【实验 原理 】 见 实验 10。 【材料 与 用 品 】 1. 材料 任 选 一 种 动 植 物 材料 , 制 成 染色 体 玻 片 标本 ,染色体 要 分 散 均 匀 ， 互 不 重 春 。 2. 用 有 具 及 药品 剪子 . 杀 子 .塑料 直 矿 、 硬 板 纸 、 浆 糊 、 显 微 镜 、 测 微 斥 .圆规 .摄像 及 暗室 冲 扩 设备 。 【实验 步骤 】 按 实 验 10 的 方法 步骤 进行 。 【实验 报告 】 搞 清 你 所 选用 材料 的 染色 体 组 型 , 写 出 该 物种 的 染色 体 组 型 ( 核 型 ) 公 式 ,并 将 全 部 实验 过 程 写 成 研究 报告 。 (Aste KER) 实验 38 DNA 重组 分 子 的 构建 与 筛选 【实验 目的 】 学 习 基 因 克 隆 的 基本 技术 ,学 会 设计 简单 的 DNA 重组 分 子 的 构建 方案 。 【实验 原理 】 构建 重组 DNA 分 子 是 基因 工程 的 基本 技术 ,包括 目的 基因 和 载体 DNA 的 限 制 酶 酶 切 \DNA 片段 的 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 离 和 DNA. 的 回收 .DNA 重组 分 子 ( 重 组 体 ) 的 构建 .重组 分 子 转化 宿主 细胞 以 及 重组 体 的 筛选 等 部 分 。 可 以 根据 实际 情 况 ,选用 合适 的 目的 基因 和 载体 进行 实验 。 本 实验 中 选用 来 自 于 烟草 的 锰 超 氧化 物 歧化 酶 (MnSOD)cDNA 基因 ,其 上 Ut. 下 游 分 别 有 EcoRI, Sall 限制 酶 的 单一 位 点 。 开 .co 热 激 诱 导 表 达 载 体 pBV221 的 多 克隆 位 点 有 EcoRI, Sal] BR fil MELAS 【材料 与 用 品 】 1. 材料 烟草 的 锰 超 氧化 物 歧 化 酶 (MnSOD) cDNA 基因 、 质 粒 PBV221、 E. coli JM109, 2. 用 具 及 药品 (1) AA 电泳 槽 、 高 压 灭 菌 锅 `.PCR 1. Eppendorf 管 、 移 液 器 、 离 心 管 `. 电 热 恒温 水 浴 第 三 部 分 研究 性 实验 . © 141» FR OR DL PET PTA HOE BEI KF IS LEB (2) 试剂 EcoRI, Sall ft #i] HE. T,DNA 连接 酶 GeneClean 回收 试剂 盒 .、0.1 mol/L CaCl, .LB 培养 基 抗生素。 "(eo RI 1. 质粒 的 酶 切 在 20~-40 则 的 反应 体系 中 ,加 入 0. 2~1 pg 的 质粒 DNA、 酶 的 反应 缓冲 液 、 5~10 U 的 限制 酶 ,用 水 补足 体积 。37' (最 适 反 应 温度 非 37 的 酶 除外 ) 保 温 2 一 4h。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 酶 切 结果 。 2. Gene Clean 方法 从 琼脂 糖 凝 胶 上 回收 DNA 片段 1) 紫外 灯 下 ,切取 含 所 需 DNA 条 带 的 凝 胶 块 并 测 其 质量 。 2) 按照 1:2.5~3.0( 质 量 克 数 /体积 md Hl A Nal 溶液 ,55 一 65C 温 育 5 min, 使 凝 胶 充 分 溶解 于 Nal 溶液 。 3) 加 入 5 pl 充分 混 匀 的 Glassmilk (每 5 Al 可 吸附 5 pg DNA) ,室温 放 置 30 min, 并 不 断 摇动 。 4) 12 000 r/min 离心 2 min, 弃 上 清 , 用 100 wl NewWash WRITE; 12 000 rmin 离 心 1 一 2 min。 按 上 述 操作 重复 3 次 ,最 后 弃 上 清 , 烘 干 沉 演 。 5) 根据 回收 的 DNA 量 加 入 适当 的 水 溶解 ,4 一 65\C 温 育 3 一 5 min, 促使 Glassmilk 释放 所 吸附 的 DNA。 6) 13 000 r/min 离心 10 min, MR LAR. pagan 3. 连接 反应 在 10 wl 的 连接 体系 中 ,加 入 外 源 捅 人 片段 150 一 200 ng 载体 片 段 约 100 ng, 1 pl 连接 酶 缓冲 液 .1 pl TDNA 连接 酶 ,用 水 补足 体积 ,14 一 16C 连 接 10 一 16 h 或 过 夜 。 4. E. coli 感受 态 细胞 的 制备 1) PER E. coli JM109 的 单 菌落 ,接种 于 5 ml LB 液体 培养 基 中 ,37" 振 荡 培 Fe 12h, 2) 取 1 ml 菌 液 加 入 100 ml LB 液体 培养 基 中 ,扩大 培养 约 2 h。 3) 将 菌 液 在 冰 上 放置 15 min, 无 菌 条 件 下 倒 人 50 ml 离心 管 中 ,4C， 3 500 T/min 离 心 5 min, 4) FEV. HECK EMMA 8 ml FRE WICH CaCl, (0. 1 mol/L) 轻 摇 使 细菌 悬浮 。 5) 4°C,3 500 r/min 离心 5 min, 弃 上 清 。 6) 用 1 ml 预 冷 的 无 菌 CaCl (0. 1 mol/L) 重 新 悬浮 细胞 ,200 pl/ 份 分 装 到 预 冷 的 无 菌 Eppendorf 管 中 ,4C 保 存 备 用 ,在 1 周 内 转化 率 不 降低 。 “1 142、， 遗传 学 实验 教程 5. E.coli 的 转化 1) 取 适 量 连 接 产 物 加 到 分 装 的 感受 态 细胞 中 , 混 匀 , 冰 浴 30 min, 2) 42°C UK 90 s, 再 冰 浴 2~3 min; 3) 加 入 800 pl LB 培养 基 , 于 37" 人 振荡 培养 1h。 4) 取 适 量 菌 液 涂 布 LB 平板 (含有 抗生素 ) ,室温 晾 于 后 ,于 37 人 倒置 过 夜 培养 。 5) 观察 菌落 的 生长 情况 。 6. 重组 体 的 筛选 1) 挑 取 转 化 平板 上 的 单 克 隆 ,接种 于 5 ml LB 液 体 培养 基 中 ,37C 振 功 培 养 12 bg 2) 提取 质粒 DNA. 3) 进行 PCR 检测 或 酶 切 检 测 。 【实验 报告 】 按 上 述 实验 步骤 构建 合 有 MnSOD cDNA 基因 的 pBV221 重组 DNA 分 子 。 (ERF) 实验 39 EE. coli 营养 缺陷 型 将 株 的 诱发 和 筛选 【实验 目的 】 了 解 紫外 线 的 诱发 机 制 ,学 会 紫外 线 诱 变 的 一 般 方 法 ,掌握 微生物 突变 型 的 【实验 原理 】 突变 型 的 获得 是 许多 遗传 学 研究 工作 的 首要 条 件 。 突 变 可 自发 形成 ,也 可 诱 变 产 生 ,诱发 突变 一 般 分 为 化 学 诱 变 和 物理 诱 变 。 紫 外 线 是 微生物 诱 变 中 常用 的 物理 诱 变 剂 ,主要 能 使 DNA 链 中 两 个 相 邻 的 喀 啶 核 苷 酸 形成 二 聚 体 而 影响 DNA 的 正常 复制 ,从 而 造成 基因 突变 。Kelner(1949) 在 灰色 链 孢 霉 (Strez 加 tomayces g7ises) 中 首先 发 现 把 经 紫外 线 照 射 的 微生物 立即 暴露 于 可 见 光 下 时 ,就 可 出 现 明显 降低 其 死亡 率 的 现象 , 即 光复 活 作 用 。 后 来 在 许多 微生物 中 都 陆续 得 到 了 证 实 , 最 明显 的 是 在 E. coli 实验 中 。 这 主要 是 因为 细菌 体内 存 有 一 套 修复 系统 ,在 有 光 的 条 件 下 光 解 酶 (photolyase) 可 以 将 喀 啶 二 聚 体 在 原 位 裂 开 而 使 DNA 链 在 该 处 恢复 正常 。 所 以 在 用 紫外 线 处 理 时 及 处 理 后 的 培养 过 程 都 应 避免 可 见 光照 射 《可 在 红 光 下 进行 操作 )。 诱 变 处 理 必 须 选 择 合 适 的 剂量 。 剂 量 的 表示 有 两 种 , 即 绝对 剂量 和 相对 剂量 。 第 三 部 分 研究 性 实验 。143 。 绝对 剂量 的 单位 以 尔格 /cm'- 表示 ,一 般 用 相对 剂量 。 相 对 剂量 与 诱 变 源 和 处 理 微 生物 间 的 距离 , 诱 变 源 (紫外 灯 ) 的 功率 以 及 处 理 的 时 间 这 三 个 因素 有 关 。 前 两 个 因素 是 固定 的 ,所 以 要 通过 处 理 时 间 控 制 诱 变 剂 量 。 各 种 微生物 的 处 理 最 适 剂量 是 不 同 的 , 须 经 预备 实验 确定 。 细菌 经 诱 变 处 理 后 , 夫 发 生 基 因 突 变 , 丧 失 了 合成 某 一 物质 如 氨基 酸 、 维 生 素 、 核 苷 酸 等 ) 的 能 力 , 即 不 能 在 基本 培养 基 上 生长 ,必须 补充 茶 些 物 质 才 能 生长 。 从 野生 型 经 诱 变 筛选 得 到 的 菌株 , 称 为 营养 缺陷 型 。 营 养 缺 陷 型 菌株 的 筛选 一 般 ” 要 经 过 诱 变 ,淘汰 野生 型 、 检 出 和 鉴定 营养 缺陷 型 四 个 环节 。 之 所 以 要 经 淘汰 野生 型 ,是 因为 在 诱 变 后 的 存活 个 体 中 ,营养 缺陷 型 的 比例 一 般 较 低 ,通常 只 有 百 分 之 几 至 千 分 之 几 。 通 过 淘汰 为 数 众 多 的 野生 型 菌株 ,从 而 达 到 “浓缩 2 极 少数 营养 缺陷 型 的 目的 。 细 菌 中 常用 的 浓缩 法 是 青霉素 法 。 青 霉 素 是 杀菌 剂 ,只 杀 死 生长 的 细胞 ,对 不 生长 的 细胞 没有 致死 作用 。 所 以 在 含有 青霉素 的 基本 培养 基 中 野生 型 能 生长 而 被 杀 死 ,缺陷 型 不 能 生长 被 保存 得 以 浓缩 。 检 出 缺陷 型 的 方法 有 逐个 检 出 法 . 严 层 培养 法 .限量 补充 培养 法 .影印 平板 法 ， 其 中 逐个 检 出 法 较为 常用 。 这 种 方法 是 把 经 过 浓缩 的 缺陷 型 菌 液 接种 在 完全 培养 基 上 , 待 长 出 菌落 后 将 每 一 菌落 分 别 接种 在 基本 培养 基 和 完全 培养 基 上 ,使 两 个 平 板 上 的 菌落 位 置 严格 对 应 。 经 培养 后 ,如 果 在 完全 培养 基 某 一 位 置 上 长 出 菌落 ,而 在 基本 培养 基 相 应 位 置 上 却 不 长 ,说 明 此 乃 营养 缺陷 型 。 经 初步 确定 为 营养 缺陷 型 的 菌 ,还 须 借 生长 谱 法 (auxanography) 进 一 步 鉴定 是 哪 二 种 化 合 物 的 缺陷 型 。 具 体 做 法 是 在 同一 培养 下 的 几 个 标定 位 置 上 分 别 放置 微量 待 鉴定 缺陷 型 所 需 车 养 物 , 如 氨基 酸 、 微 生物 、 碱 基 等 ,在 适宜 条 件 下 培养 后 ， 若 发 现 某 一 营养 物 的 周围 有 生长 圈 , 就 说 明 此 菌 就 是 该 营养 物 的 缺陷 型 。 【材料 与 用 品 】 人 1. 材料 E. coliKy2 AY EFA: 2! PARK.E. coli Ki.SF* 。 2. 用 具 及 药品 (1) AA 培养 四 (9 cm) = fA EHR (150 ml) REF. 5 ml) 、 离 心 管 。 (2) 培养 基 1) 肉 汤 液 体 培 养 基 ”牛肉 癌 0. 5 g BAK 1 g.NaCl 0. 5 g 蒸馏 水 100 ml, pH 7. 2,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 2) 肉 汤 液 体 培养 基 (2EE) 牛肉 襄 0.5 ga AK 1 g. NaCl 0.5 g` 蒸 馅 水 50 ml,pH 7. 2,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 3) 基本 液体 培养 基 2 mlVogel50, 4] 4d BH 2 g. 蒸馏 水 98 ml、 pH 7.0, 0.056 MPa 高 压 灭 菌 30 min, - 144 。 遗传 学 实验 教程 4) 基本 固体 培养 基 琼脂 2 g、 基 本 液体 培养 基 100 ml, pH 7.0,0.056 MPa 高 压 灭 菌 30 min。 5) 无 N 基本 液体 培养 基 K, HPO, 0.7 g(ak K,HPO, * 3H,O 0.92 g)、 KH, PO, 0. 3 g. 柠檬 酸 钠 。3H2O 0.5 g.MgSO, * 7H,O 0. 1 g.(NH,)?SO, 0. 2g, 4 HF 2 @, ZEB 7k 100 ml, pH 7. 0,0. 056 MPa 高 压 灭 菌 30 min, 6) 2 N 基本 液体 培养 基 K, HPO, 0.7 g( 或 K HPO, » 3H,O 0.92 g)、 KH,PO, 0.3 g、 柠 檬 酸 钠 .3H:O 0.5 g, MgSO, .7HO 0.1 g, (NH, )， SO, 0. 2 g 葡萄糖 2 g. 蒸 饮水 100 ml, pH 7. 0,0. 056 MPa 高 压 灭 菌 30 min, 7) 混合 氨基 酸 和 混合 维生素 及 核 苷 酸 的 配制 氨基 酸 (包括 核 苷 酸 ) 分 7 组 ( 工 一 亚 ) ,其 中 工 一 克 组 每 组 有 6 种 氨基 酸 (包括 核 苷 酸 ) 每 种 氨基 酸 ( 包 括 核 苷 酸 ) 等 量 研 细 充分 混合 ;第 七 组 是 且 氨 酸 ,因为 这 种 氨基 酸 容易 潮解 ,所 以 单独 成 一 组 。 L: Bi. At AE Il: AAR. FH. RE. I: A. Rao. en. NV: 5e.-F AP ee I V: AA EKA HL. Vi: f&.RS ME 22 i VI: Afi. 把 维生素 B, 、.B, .Be » YAR. Ht ASE TE FA RC BAPA) , SH i PR Be AE RE et 细 , 充 分 混合 , 配 成 混合 维生素 。 (3) 生理 盐水 NaCl 0. 85 g, 蒸 馅 水 100 ml,0. 105 MPa 高 压 灭 菌 15 min, 【实验 步骤 】 1. 菌 液 制备 1) 实验 前 14 一 16 h, 挑 取 少 量 Ky. SF* A. RAT RA 5 ml 肉 汤 培 养 液 的 三 角 瓶 中 , 置 37 冯 培养 过 夜 。 2) 第 二 天 添加 5 ml 新 鲜 的 肉 汤 培养 液 ,充分 混 匀 后 ,分 装 2 只 三 角 瓶 ,继续 eae ohh. 3) 将 两 只 三 角 瓶 的 菌 液 分 别 倒 人 离心 管 中 , 离 心 (3 500 r/min) 10 min, 4) 倒 去 上 清 液 , 打 勾 沉淀。 其 中 一 管 吸 入 5 ml 生理 盐水 ,然后 倒 人 另 一 离心 管 ,两 管 并 成 一 管 。 2. 诱 变 处 理 1) 吸取 上 述 菌 液 3 ml 于 培养 下 中 ,将 培养 四 放 在 15 W 的 紫外 灯 下 ,距离 为 28. SMO Ts 第 三 部 分 研究 性 实验 - 145 « 2) 处 理 前 先 开 紫外 灯 稳 定 30 min, 将 待 处 理 的 培养 四 连 盖 放 在 灯 下 灭 菌 1 min, 然 后 开 盖 处 理 1 min。 照 射 完 毕 先 盖 上 严 盖 ,再 关 紫 外 灯 。 3) 吸 3 ml 加 倍 肉 汤 培 养 液 到 上 述 处 理 后 的 培养 耻 中 。 置 37 温 箱 内 , 避 光 培养 12 h 以 上 。 3. 青霉素 法 淘汰 野生 型 1) 吸 5 ml 处 理 过 的 菌 液 耶 以 灭 菌 的 离心 管 ,3 500 r/min 离心 10 min, 2) 倒 去 上 清 液 , 打 多 沉淀 ,加 入 生理 盐水 ,离心 洗涤 3 次 ,加 生理 盐水 到 原 体 积 。 3) 吸取 经 离心 洗涤 的 菌 液 0. 1 ml 于 5 ml 无 氮 基 本 培养 液 ,37 纪 培养 12 h。 4) 培养 12h 后 , 按 1:1 加 入 2N 基 本 培养 液 5 ml, 称 取 青 霉 素 钠 盐 ,使 青 霉 素 在 菌 液 中 的 最 终 浓 度 为 1 000 单位 /ml, 再 放 人 37C 温 箱 中 培养 。 5) 先 从 培养 12.16、.24h 的 菌 液 中 各 取 0. 1 ml 菌 液 倒 在 两 个 灭 菌 培养 下 中 ， 再 分 别 倒 人 经 融化 并 冷却 到 40~50C 的 基本 及 完全 培养 基 , 摇 匀 放 平 , 待 凝固 后 ， BWA 37 忆 温 箱 中 培养 。 培 养 下 上 注 明 取样 时 间 。 4. 缺陷 型 的 检 出 1) 以 上 平板 培养 36 一 48 h 后 ,进行 菌落 计数 。 选 用 完全 培养 基 上 长 出 的 菌 落 数 大 大 超过 基本 培养 基 的 那 一 组 ,用 接种 针 挑 取 完 全 培养 基 上 长 出 的 菌落 80 个 ,分 别 点 种 于 基本 培养 基 与 完全 培养 基 平板 上 , 先 基 本 培养 基 、 后 完全 培养 基 , 依 次 点 种 , 放 37C 温 箱 培养 。 2) 培养 12h 后 , 选 在 基本 培养 基 上 不 生长 ,而 在 完全 培养 基 上 生长 的 菌落 ,再 在 基本 培养 基 的 平板 上 划 线 ,37C 温 箱 培养 ,24 h 后 不 生长 的 可 能 是 营养 缺陷 型 。 5. 生长 谱 鉴 定 1) 将 可 能 是 缺陷 型 的 菌落 接种 于 盛 有 5 ml 肉 汤 培 养 液 的 离心 管 中 ,37 尼 培 养 14 一 16 h。 2) 培养 16h 后 ,3 500 r/min 离心 10 min, 倒 去 上 清 液 , 打 匀 沉淀 ,然后 离心 洗 涤 3 次 ,最 后 加 生理 盐水 到 原 体 积 。 3) 吸取 经 离心 洗涤 的 菌 液 1 ml 于 一 灭 菌 的 培养 下 中 ,然后 倒 人 融化 后 冷却 至 40~50C 的 基本 培养 基 , 摇 匀 放 平 , 待 凝 , 共 做 两 耿 。 4) 在 2 只 培养 四 的 严 背 划分 8 个 区 ,依次 放 和 人 混合 氨基 酸 ( 包 括 核 苷 酸 ), 混 合 维生素 和 且 氨 酸 ( 加 量 要 很 少 ,否则 会 抑制 菌 的 生长 ), 然 后 放 37C 温 箱 培养 24~48 h ,观察 生长 圈 , 并 确定 是 哪 种 营养 缺陷 型 。 【实验 报告 】 1. 完成 实验 报告 ,包括 本 次 实验 的 意义 、 材 料 与 方法 、 结 果 、 分 析 与 讨论 。 2， 紫 外线 处 理 后 的 菌 液 为 什么 要 避 光 培养 ? (KE HF) ahi Eve IP Aebrat ae 和 CHRD EE Ah CH MA e199 | 附录 1 实验 室 工作 规程 1, 实验 规则 1) 要 有 严肃 .认真 的 科学 态度 ,诚实 .仔细 地 对 待 科学 实验 。 2) 实验 前 认真 预习 实验 内 容 , 列 出 实验 步骤 的 程序 示意 图 (流程 图 ), 标 出 重 点 和 难点 。 3) 自觉 遵守 课堂 纪律 。 不 大 声 喧哗 ,不 随处 扔 纸 导 、 火 柴 头 及 其 他 脏 物 ,保持 4) 按照 实验 教师 的 讲解 进行 实验 操作 , 既 要 独立 进行 又 要 与 同 组 同学 默契 配合 。 5) 随时 把 实验 现象 记录 在 实验 记录 本 上 ,不 可 记 在 散 纸 片上 。 遇 到 疑难 问题 主动 请 教 ,按时 交 实 验 报告 。 6) 爱护 仪器 .设备 及 用 具 。 如 有 损坏 或 遗失 ,及 时 向 教师 报告 ,说 明 原 因 并 请 求 补 齐 。 7) 注意 节俭 。 按 需要 量 取 用 药品 .试剂 ` 蒸 馏 水 、 实 验 材 料 和 其 他 易 耗 品 。 用 过 的 废物 废 液 倒 人 指定 的 盛 留 器 中 。 8) 公用 试剂 和 用 具 用 后 要 及 时 放 回 公用 场所 ,以 免 影响 其 他 同学 使 用 。 9) 注意 安全 。 使 用 挥发 性 试剂 有 毒物 品 、 强 酸 强 碱 时 , 切 纪 将 试剂 溅 到 身体 上 ;使 用 易 燃 物品 时 不 得 靠近 火焰 ;漏电 的 电器 设备 不 能 使 用 。 遇 到 异常 情况 要 及 时 报告 。 10) 值 日 生 负责 实验 室 的 卫生 、 安 全 及 服务 性 工作 ,并 在 离开 实验 室 前 检查 好 水 电 门 窗 。 2. 显微镜 的 正确 使 用 与 保养 (1) 显微镜 的 使 用 1) 搬 动 显微镜 时 ,应 一 手 握 镜 臂 、 一 手 托 镜 座 , 轻 拿 轻 放 。 从 箱 中 取 显 微 镜 时 ，, 切 不 可 将 显微镜 拖 出 。 放 置 显 微 镜 时 ,应 先 放 稳 镜 座 的 一 侧 再 慢 慢 放下 其 余部 分 ,不 能 使 镜 座 底 部 一 起 与 桌面 或 箱底 面 接触 。 放 置 显微镜 的 位 置 不 能 太 靠 近 桌 边 。 总 之 ,一 切 会 引起 显微镜 强烈 震动 .碰撞 滑落 乃至 损伤 的 可 能 情况 均 要 时 刻 注意 避免 。 * 148 « 遗传 学 实验 教程 2) 把 显微镜 放 到 实验 台 后 , 先 用 纱布 将 显微镜 的 机 械 系统 尤其 是 载 物 台 擦拭 干净 。 如 果 是 曾经 长 期 闲置 的 显微镜 ,除了 用 纱布 或 软 毛 刷 控 拂 镜 身 的 灰尘 污 物 外 ,还 要 用 吸 耳 球 将 各 处 缝隙 及 镜头 上 的 灰尘 、 纤 维 等 吹 去 ,然后 再 用 擦 镜 纸 将 目 镜 、 物 镜 、 反 射 镜 或 光源 灯 上 的 滤 光 片 等 表面 氛 拭 洁净 。 扩 镜 时 只 能 顺 着 一 个 方向 多 次 抹 探 ,不 能 往复 或 旋转 抹 控 。 最 后 再 用 细 丝 绸 把 镜头 擦拭 一 次 , 便 可 接 通电 源 对 光 。 3) 对 光 时 , 先 转动 物镜 转换 台 将 低 倍 物镜 移 人 光路 (不 可 直接 用 手 来 回 扳 弄 物镜 简 ) ,再 开 大 集 光 器 上 的 光 阑 。 不 带 光 源 的 显微镜 可 以 通过 调节 反射 镜 和 集 光 器 进行 对 光 ; 自 带 光源 的 显微镜 ,打开 开关 后 ,通过 调节 集 光 器 对 光 。 4) 对 光 后 ,将 洁净 的 待 观察 玻 片 标本 固定 在 载 物 台 上 。 镜 检 时 ,应 先 用 低 售 镜 观 察 ,然后 转换 到 高 倍 镜 。 在 使 用 高 倍 镜 观 察 时 ,一 定 注 意 镜头 与 载 物 台 之 间 的 工作 距离 : 首先 降低 载 物 台 ( 或 升 高 镜 简 ) ,然后 旋 动 物镜 转换 台 ,使 物镜 镜头 靠近 标本 MRED AH mie. TER. RAVER BER MAMI. Bl 极 易 损坏 所 检 标 本 ,严重 的 还 会 损伤 物镜 镜头 。 如 换 成 高 倍 镜 后 视野 亮度 不 够 ,应 重新 调整 光 阑 开 孔 的 大 小 、 集 光 器 的 高 低 以 及 灯泡 的 亮度 。 5) 调换 观察 标本 ,应 先 把 高 倍 物镜 换 成 低 倍 物镜 ,降下 载 物 台 , 调 换 后 重新 调 焦 。 6) 油 镜 的 使 用 : 按照 由 低 倍 到 高 倍 的 顺序 ,用 高 倍 镜 观 察 清 楚 标本 后 ,将 需 要 进行 更 细致 观察 的 部 位 移 到 视野 中 心 , 移 开 高 倍 镜头 ,在 油 镜 未 到 定位 时 , 滴 一 滴 香 柏油 在 盖 玻 片 的 预定 位 置 上 。 之 后 ,使 油 镜 进 入 定位 ,与 油 接触 , 极 轻 组 地 旋转 细 调 至 物 像 清 晰 。 滴 油 时 避免 油 滴 形 成 气泡 ,如 有 气泡 应 将 其 排除 。 观 察 完 毕 后 ,立即 用 扩 镜 纸 将 油 镜头 及 标本 上 的 油 擦 去 ,然后 用 探 镜 纸 萨 少许 镜头 清洁 剂 ( 或 二 甲 茶 ) 控 拭 。 转 动物 镜 转 换 台 ,将 低 倍 物镜 移 人 光路 ,再 进行 其 他 镜 检 项 目 。 7) 用 完 显微镜 后 , 取 下 玻 片 标本 , 先 将 机 械 部 分 尤其 是 载 物 台 控 拭 干 净 。 然 后 , 调 低 灯 泡 亮 度 , 断 开 电源 ,降下 集 光 器 并 把 光 阑 调 小 ,将 载 物 台 (或 镜 简 ) 降 至 最 低 点 ,转动 物镜 转换 台 , 使 物镜 头 不 正 对 集 光 器 。 最 后 , 按 要 求 把 显微镜 搬 回 存 放 处 。 (2) 使 用 显微镜 时 应 注意 的 几 个 问题 1) 使 用 显微镜 观察 时 ,双眼 都 应 张 开 , 以 减轻 眼睛 的 疲劳 。 如 用 单 简 显微镜 ， 可 用 两 眼 轮 换 观 察 。 如 需 绘 图 , 则 用 左 眼镜 检 , 用 右 眼 看 绘图 纸 , 边 看 边 绘 2) 使 用 双 简 显微镜 时 , 双眼 视力 不 同 者 应 该 注意 : 先 用 右 眼看 到 清晰 的 图 像 , 再 旋转 左 侧 目镜 使 左 眼 也 能 看 到 同样 清晰 的 图 像 。 这 样 可 以 减轻 眼睛 的 疲 筋 。 3) 换 成 高 倍 镜 观察 后 ,有 时 将 细 调 旋转 到 行程 终点 也 不 能 使 图 像 清晰 。 此 时 应 先 拉 开镜 头 与 标本 之 间 的 距离 ,然后 倒转 细 调 ,重新 调整 一 下 粗 调 之 后 再 用 细 调 将 图 像 调 清晰 。 4) 使 用 显微镜 时 , 切 不 可 让 染料 或 其 他 试剂 并 脏 镜头 和 载 物 台 , 如 有 天 污 , 必 须 随时 用 擦 镜 纸 或 纱布 擦拭 干净 。 5) 实验 中 间 , 暂 时 停止 镜 检 进行 制 片 或 其 他 操作 步骤 时 ,应 随手 把 光源 灯 关 上 ,以 免 发 生意 外 。 《3) 显微镜 的 维护 和 保养 1) 显微镜 是 比较 精密 的 光学 仪器 , 使 用 时 必须 注意 防磁 ` 防 潮湿 、 防 药品 侵蚀 。 2) 使 用 中 如 操作 不 当 , 常 常会 出 现 一 些小 故障 ,如 灯泡 不 亮光 源 射出 的 光 不 全 部 进入 视野 或 视野 不 正 、 标 本 夹 松 动 、 物 镜 转换 台 松 动 ` 调 焦 失 灵 、 升 上 去 的 载 物 台 或 镜 简 自动 下 滑 、 显 微 镜 外 表 很 洁净 而 视野 里 很 及 等 。 一 旦 发 现 问题 ,应 报告 教师 以 便 及 时 维修 或 调换 显微镜 ,以 免 影响 实验 进程 或 进一步 损 3) 显微镜 要 与 化 学 药物 分 开放 置 ,严禁 混 藏 。 4) 镜 箱 内 于 燥 剂 应 定期 更 换 , 以 确保 干燥 剂 处 于 干燥 状态 。 5) 定期 检修 保养 显微镜 ,以 保证 其 一 直 处 于 良好 状态 。 3. 实验 报告 的 写作 要 求 1) 写作 要求 所 谓 试验 ,就 是 在 一 定 条 件 下 ,排除 各 种 次 要 因素 ,突出 主要 因素 ,让 现象 以 纯 粹 的 典型 方式 重 现 。 而 实验 报告 , 则 是 将 实验 的 全 部 过 程 和 结果 写成 文字 材料 。 尽管 各 类 实验 报告 从 内 容 上 看 千差万别 ,但 从 写作 的 角度 来 看 ,一 个 实验 报告 是 否 合格 ,应 看 它 是 否 符合 如 下 五 项 原则 : 1) 正确 性 原则 : 实验 报告 的 原理 、 方 法 、 数 据 及 结论 都 是 正确 无 误 的 ,同时 也 要 求实 验 报告 的 表达 方式 是 正确 无 误 的 。 2) 客观 性 原则 : 不 仅 抱 着 客观 的 态度 观察 和 记录 现象 ,同时 在 写作 时 也 应 当 尽 可 能 客观 地 ,忠实 地 反映 试验 的 结果 。 3) 公正 性 原则 : 实验 者 不 能 带 着 某 种 偏见 去 观察 和 理解 实验 现象 ,这 样 , 在 描述 试验 和 报道 试验 的 结论 时 才能 表现 出 公正 的 态度 。 4) 确证 性 原则 : 指 实验 的 结果 是 能 够 被 证 实 的 , 亦 即 任何 人 按 给 定 的 条 件 去 重复 实验 ,都 一 定 能 观察 到 同样 的 现象 并 能 得 到 同样 的 结果 。 5) 可 读 性 原则 : 指 实验 报告 符合 语法 和 句法 规范 , 而 且 具 有 简洁 明晰 的 风格 。 要 完全 符合 上 述 五 项 原则 并 不 是 轻易 就 能 做 到 的 。 况 且 , 单 纯 从 写作 上 要 求 对 实验 做 客观 报告 是 不 够 的 ,还 应 该 要 求实 验 者 具有 熟练 的 实验 操作 技术 、 细 心 观 察 实验 现象 .详细 写 好 观察 记录 用 正确 的 方法 去 分 析 和 整理 试验 结果 等 等 。 * 150 « 遗传 学 实验 教程 (2) 写作 格式 实验 报告 的 格式 多 种 多 样 ,一 般 分 为 题目 .目的 和 要 求 、 实 验 原理 、 材 料 与 方 法 、 实 验 结果 讨论 和 结论 等 部 分 ,有 时 也 可 以 把 几 个 部 分 组 合 在 一 起 来 写 ， 1) SA: 所 有 的 实验 都 有 个 题目 ,应 该 位 于 实验 报告 的 顶端 。 2) 目的 和 要 求 : 为 什么 要 做 本 实验 ? 应 达到 的 目标 有 哪些 ? 实验 的 意义 和 作用 何在 ?这 些 问 题 都 需要 实验 者 用 概括 性 语言 来 描述 ,通常 点 到 即 可 ;在 较 重要 的 地 方 也 可 稍 作 说 明 。 这 一 部 分 也 可 以 用 引言 来 包括 或 代替 。 3) 实验 原理 : 是 对 实验 依据 的 理论 所 作 的 简要 说 明 。 原 理 部 分 的 主要 内 容 包括 简略 介绍 实验 设计 的 重要 概念 .实验 依据 的 基本 理论 及 据 此 推演 出 的 重要 结 果 。 如 果 能 对 实验 中 试图 证 明 的 内 容 进 行 一 下 粗略 的 描述 则 更 好 :。 4) 材料 和 方法 : 介绍 所 用 材料 的 名 称 ( 学 名 ) .出 处 及 实验 中 应 用 的 特殊 方 法 。 这 一 部 分 的 描述 要 简洁 而 明晰 ,以 便 他 大 能 够 重复 ,但 是 决 不 能 照抄 指导 书 上 所 列 的 实验 准备 和 试验 步骤 。 5) 实验 结果 : 这 一 部 分 连同 后 面 的 讨论 是 试验 报告 的 主体 三 般 在 写作 前 应 将 数字 、 图 表 整 理 好 ;写作 时 分 好 类 、 按 一 定 顺序 安排 并 加 以 必要 的 说 明 。 要 KE: 必须 如 实地 描写 现象 ,不 许 有 任何 夸张 ;引用 的 数字 图 表 必 须 真 实 可 靠 ， 数字 的 记 法 和 处 理 方法 必须 符合 规定 ,图 和 表格 要 合乎 规范 要 求 。 例 如 ,遗传 学 实验 报告 中 染色 体 图 的 绘制 必须 反映 显微镜 下 的 真实 情况 ,描绘 时 要 用 点 、` 线 结 构 ,不 许 涂抹 ,不 必 加 上 彩色 。 总 之 ,这 些 基 本 事实 如 有 错误 ,会 使 整个 实验 报告 失去 价值 。 6) 讨论 : 讨论 不 是 实验 结果 的 重 述 ,而 是 以 结果 为 基础 的 逻辑 推论 二 讨论 可 包括 : 影响 实验 的 因素 有 哪些 ? 是 什么 ?实验 中 观察 到 哪些 现象 ,如 何 解释 ? 实 验 中 证 实 了 那些 规律 ?将 实验 结果 与 由 已 知 理论 推算 出 的 预期 结果 进行 对 比 , 找 出 理论 结果 与 实验 结果 的 异同 ,并 初步 解释 这 种 异同 。 有 时 ,可 以 在 “目的 和 要 求 ” 部 分 对 实验 提出 问题 ,然后 看 “讨论 ”中 能 对 问题 回答 到 什么 程度 。 如 果 认 为 没有 必要 进行 讨论 ,这 部 分 也 可 以 不 写 。 7) 结论 : 结论 应 当 简 洁 而 中 肯 。 可 以 逐条 列 出 实验 结果 ,可 以 引用 关键 性 数 据 , 但 一 般 不 应 再 列 图 和 表格 。 8) 其 他 : 实验 报告 中 一 般 没有 参考 文献 .致谢 及 摘要 ,而 在 学 术 论文 中 通常 是 有 的 。 参 考 文献 是 指引 用 的 别人 的 文章 ,应 按 作者 姓名 .题目 .出 处 ` 出 版 单位 、 出 版 日 期 ,页码 的 顺序 写 好 列 在 文章 末尾 .“ 摘 要 ”是 写 在 题目 下 面 的 一 段 文字 ,内 容 仅 包括 全 篇 报告 最 突出 的 几 条 结论 ,并 不 加 任何 说 明 。“ 致 谢 ” 常 常 放 在 结论 的 文 末 ,向 给 本 实验 或 本 论文 提供 过 帮助 的 人 或 单位 致 以 感谢 。 ( 刘 林 德 ) Mt 录 e TS] « 附录 2 实验 室 一 般 溶液 的 配制 1. 各 种 百分比 浓度 的 酒精 和 酸 的 配制 Pr aa He BE y= Vv, 十 Vs; VW (原液 需要 量 )= 稀释 后 浓度 X100 Vz (加 水 量 )=〈 原 液 浓 度 一 稀释 后 浓度 ) X100 例 : 用 95%% 乙 醇 配制 70% CB. 取 95%% 乙 醇 70 ml( 即 V;=70% X 100), HAE BKB 95 ml, 即 得 70%% 乙 醇 。 各 种 百分比 浓度 的 酸 的 配制 方法 同上 ,配制 时 应 注意 将 浓 酸 漫漫 加 入 水 中 。 2. 用 固体 配制 百分比 浓度 溶液 (1) 体积 百分比 浓度 100 ml 溶液 中 含有 固体 质量 的 克 数 为 固体 的 体积 百分比 浓度 。 例 : 配制 1%% 秋 水 仙 素 。 称 取 1 g 秋水 仙 素 ,加 蒸馏水 至 100 ml 即 可 。 (2) 质量 百分比 浓度 溶液 100g 溶 液 中 含有 溶质 的 克 数 叫做 质量 百分比 浓度 。 即 : 质量 百分比 浓度 = 溶质 质量 (g)/ 溶质 质量 (g) 十 溶剂 质量 (g)X100 和 2 溶质 质量 = 溶液 质量 百分比 浓度 X 溶液 质量 溶剂 质量 = 溶液 质量 一 溶质 质量 3. 摩尔 浓度 溶液 的 配制 1 工 溶液 中 含有 溶质 的 摩尔 数 ( 克 分 子 数 ) 称 为 摩尔 浓度 , 即 : 摩尔 浓度 mol/L= 溶质 的 量 ( 摩 尔 数 ) / 溶液 的 体积 (L) C1) 用 固体 配制 a Farris (4S A) oe et Cg) = mol/L Vn SUP mol/L 为 溶液 的 摩尔 浓度 ,V 为 溶液 的 体积 ,m 为 固体 的 摩尔 质量 (固体 的 分 子 质量 )。 例 : 配制 0.02 mol/L 8 - 闫 基 嗪 啉 溶液 100 ml, 取 8 SLEW 0. 02 X (100 +1 000) X 145.16 = 0. 290 3(g) 用 水 溶解 后 ,加 水 定 容 ,至 100 ml, - 152 ，* 遗传 学 实验 教程 (2) 用 液体 配制 所 需 液 体 的 质量 (g) = mol/L Vm /P 所 需 液 体 的 体积 = mol/L Vm/Pd 式 中 ,mol/L 为 所 要 配制 的 溶液 的 摩尔 浓度 ,V 为 所 要 配制 的 溶液 的 体积 CL) ,mn 为 液体 试剂 中 溶质 的 摩尔 浓度 (相对 分 子 质 量 ), 忆 为 液体 试剂 的 质量 百分比 浓度 ， d 为 液体 试剂 的 比重 (g/ml) 。 il: 用 95%% 浓 硫酸 (一 1.83 g/ml) Acti] 2 mol/L 硫酸 250 ml( 硫 酸 摩尔 质 为 98) 。 称 取 浓 硫酸 的 质量 二 2 (250+1 000) X 98/95%=51. 58(g) 量 取 浓 硫酸 的 量 = 2x (250+1 000) X 98/95 % X1. 83 =28. 2 (ml) 将 浓 硫 酸 在 不 断 搅 拌 下 缓慢 倒 人 适量 水 中 ,冷却 后 再 用 水 稀释 至 250 ml 即 得 2 mol/L 硫酸 溶液 。 4. 实验 常用 试剂 的 配制 (1) 1 mol/L HCl #e 3.5 mol/L HCl 取 比 重 为 1. 19 g/ml 的 浓 盐 酸 82.5 ml, MFR A,B 1000 ml。 取 比 重 为 1. 19 g/ml 的 浓 盐 酸 288. 8 ml, NAIK EA, ZB 1 000 mi, (2) 0.4% KCl #2 0.075 mol/L KCl 称 取 4 g KCl, 溶 于 蒸馏 水 中 , 定 容 , 至 1000 ml。 称 取 11. 18 g KCl, 定 容 于 1 000 ml 重 蒸 水 中 ,得 到 1.5 mol/L KCl RR. FA 前 稀释 20 倍 , 即 , 量 取 原 液 , 加 重 蒸 水 至 100 ml, 即 得 0. 075 mol/L KCl, (3) 5% NaHCO, 称 取 5 g NaHCO, ,加 重 蒸 水 至 100 ml, (4) 0. 85% 4 tk K 称 取 0. 85 g NaCl, 加 重 蒸 水 至 100 ml, (5) 45% me mR 量 取 45 ml CRAG NAR IB KE A. Z 100 ml, (6) 秋水 仙 素 溶液 称 取 1 g 秋水 仙 素 粉末 , 溶 于 少量 无 水 乙醇 中 ,加 蒸馏 水 定 容 至 100 ml, 配 成 1% 秋 水 仙 素 母液 。 各 种 浓度 的 秋水 仙 素 液 分 别 用 母液 加 蒸馏 水 稀释 即 可 。 (7) ZAR 量 取 200 ml 蒸馏 水 于 试剂 瓶 中 ,加 入 100 ml 1 mol/L HCl #l 1 g 偏重 亚 硫 酸 钠 ( 钾 )。 此 液 应 临时 配 用 ,溶液 失去 SO, 味 即 不 能 使 用 。 (8) 1/15 mol/L 磷酸 缓冲 液 A: 1/15 mol/L KH, PO, 称 取 KH PO, 9. 078 g, 加 重 蒸 水 , 定 容 , 至 1000 ml, 附 录 中 3 B: 1/15 mol/L Na: HPO, 称 取 NazHPO,。2H:O 11.876 g 或 NazHPO, ， 12H,0 2 3. 86 g, 加 重 蒸 水 定 容 , 至 1 000 ml, pH 7. 4 4 1/15 mol/L 磷酸 缓冲 液 : 取 A 液 18.2 ml;B 液 81.8 ml, 混 合 后 即 可 。 各 种 pH 的 1/15 mol/L 磷酸 缓冲 液 的 配制 如 下 表 。 1/15 mol/L Naz HPO; /ml 1/15 mol/L KH2PO,/ml 1/15 mol/L Naz HPO; /ml 1/15 mol/L KH2PO,/ml 本 Ue «es Sa [Oo ee SS ab See (9) 0.2 mol/L 磷酸 缓冲 液 A: 0.2 mol/L Na,HPO, #K BX Na; HPQ, » 2H2O 36. 61 g,B% Na,HPO, » 12H20O 71. 64 g, NBA KER Z 1 000 ml。 B: 0.2 mol/L NaH,PO, 称 取 NaH.PO, « H,O 27.6 g, 或 NaH,PO, - 2H2O 31. 21 g, JIMA KER 1000 ml。 0. 2 mol/L 磷酸 缓冲 液 ( 各 种 pH) 配 方 如 下 表 。 0. 2 mol/L 0. 2 mol/L 0. 2 mol/L 0. 2 mol/L PH {él Naz HPO; /ml NaH, PO, /ml pH ff Naz HPO, /ml NaH2PO,/ml 5.8 8.0 92. 0 7.0 61.0 39. 0 6.0 12.3 87.7 7.2 72.0 28, 2 6.2 18.5 81.5 TA 81.0 19. 0 6.4 26.5 73.5 7.6 87.0 13.0 6. 6 37.5 62.5 7.8 91.0 8.5 6. 8 49.0 57..0 8.0 94.5 yee (10) 2XSSC 溶液 0. 3 mol/L NaCl 和 0. 03 mol/L 柠檬 酸 钠 : PRA 17.54 g NaCl #il 8. 82 g 柠檬 酸 钠 , 用 重 蒸 水 溶解 后 定 容 ,至 1000 ml, (11) BrdU 溶液 称 取 BrdU 2 mg ,在 无 菌 条 件 下 , 装 人 无 菌 青霉素 药 瓶 中 ,加 入 无 菌 生 理 盐水 ， 用 黑 纸 包 好 避 光 于 4C 冰 箱 中 保存 。 现 用 现 配 。 500 pmol/L BrdU 溶液 : 取 BrdU15. 4 mg, 加 重 蒸 水 100 ml, 装 人 棕色 瓶 中 ， 包 黑 纸 避 光 ,4C 冰 箱 中 保存 。 = 154 “* 遗传 学 实验 教程 附录 3 组织 和 细胞 培养 常用 的 培养 基 1. 常用 激素 性 质 及 其 配制 方法 Fh My]: ZR IAA mI T BR IBA 蔡 乙 酸 NAA 2,4- 二 毛茶 氧 乙酸 2;4=D 6 "Kt 味 叭 BA 6 - 糠 基 氮 SLUGS KT 玉米 素 (Zeatin) ZT 脱落 酸 ABA 化 学 式 相对 分 子 质量 Cio Ha NO2 C2 Hi3 NOz C2 Hio NOz Cg Hg CLO Ci2 Hi Ns Cio Hy N50 Cio Hi3 NsO Cis H20 Og 175. 19 203. 24 186. 20 221. 04 225. 25 215.21 219. 0 264. 31 2. MS) 培养 母液 成 分 表 母 液 m 4 NH, NOs; KNO; MgSO, + 7H20 KH2PO, KI H3BO3 MnSO, + 1H20 ZnSO, + 7H20 CuSO, * 5H20 CoClz + 6H20 NazMoQ, * 2H20 FeSO, + 7H2O NazEDTA + 2H2O 溶解 特性 易 溶 于 热 水 、 乙 醇 . 乙 醚 ,丙酮 HF BE PA Biel. ik SAVE T BOK TAF AB BEE HT AG. A Biel. CB, MERA 7k HET PR Fi. AIT Ce Save FFs OR Fie Bet ja] KT 易 溶 于 碱 性 溶液 氯仿、 乙醇 称 量 /g 7 16. 500 19. 000 . 700 700 083 620 690 860 25 mg/ml 母液 5 ml 25 mg/ml 母液 5 ml 0125 390 865 二 二 配制 方法 FFD SE 95% AE 同 IAA 用 热 水 溶解 先 溶 于 少量 95% 乙 本 先 溶 于 少量 1 mol/L HCl 同 BA 同 BA 先 溶 于 少量 1 mol/L NaOH 缩 倍数 配制 体积 20X 500 ml 100 x 500 ml 100 X 500 ml 附 录 ¢ (155. (4 #) 母 液 m 4 称 量 /g 浓缩 倍数 配制 体积 /ml 肌 醇 Inositol 1. 00 烟 酸 Nicotinic acid 5 mg/ml 母液 1 ml WV 维生素 Beg Pyrodoxine HCl 5 mg/ml 母液 1 ml 20X 500 维生素 B Thiamine HCl 4 mg/ml 母液 1 ml 甘氨酸 (氨基 乙酸 )Glycine 20 mg/ml 母液 1 ml TY CaClz。2H2O 22. 000 100 500 或 CaCl， 16.6 100 500 3. MS, 培养 母液 成 分 表 500 ml 1 000 ml 1 500 ml 2 000 ml 母液 工 25 ml 50 ml 75 ml 100 ml #4 I 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 母液 亚 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml AE IV 25 ml 50 ml 75 ml 100 ml 母液 V 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 蔗糖 Sucrose 15.0g 30.0g 45. 0g 60.0g 琼脂 Agar 3.52 7.0g 10.5g 14.0g _ pH 5:7 4. BS 培养 基 的 成 分 (pH 5.5) (1) 大 量 元 素 (mg/L) (CNH4)2SO CaClz。 2H2O FeSO; » 7H20 Naz。EDTA KNO;3 MgSO; .7HzO NaH2PO; + 2H20 134 150 21.8 Blas 2 500 370. 0 150 (2) t&S 70% (mg/L) CuSO, *5H20 MnSO; + 4H20 ZnSO: * 7H2O0 H3BO; CoCle » 6H2O NazMoO, * 2H20 KI 0.025 10 2 3 0. 025 0. 25 0.75 (3) 44% (mg/L) 烟 R VBs 肌 BF VB, 1.0 1.0 100 10. 0 (4) 有 机 成 分 (g/L) kK 20. 0 Bn OAB 6. 0 « 156 。 遗传 学 实验 教程 5. Hi=3#: 2 (Bourgin 和 Nitsch 化 物 KNO; NH, NOs 720 烟 酸 9 MgSO + 7H2O 185 HAR 2 KH2PO, 68 盐酸 硫 胺 素 0.5 CaCl; + 2H2O 166 盐酸 吡 多 素 0.5 MnSO, + 4H2O 25 Ii 0.5 ZnSO, * 7H2O 10 生物 素 0..05 HBO; 10 蔗糖 20 000 NaMoQ, * 2H2O 0. 25 DRA 8 000 CuSO; * 5H20 铁 盐 7.45 g NasEDTA( 忆 二 胺 四 乙酸 二 钠 ) 和 5. 57 g FeSO。7H?O 洲 解 于 1 工 水 ,每 世 培 养 基 取 此 液 ml, 6. LB 培养 基 成 分 表 500 ml 1 000 ml 1 500 ml 2 000 ml NaCl 5g 10g 15g 20g 酵母 提取 物 Yeast Extract 2.5¢g 5g 7.52 10g 酷 蛋 白水 解 物 Tryptone 5 g 10 g 15g 20g 琼脂 粉 Agar (NW. 15g 22, 5.5 30g pH 5 mol/L NaOH 调 至 7. 0 一 7. 2 7. YEB 培养 基 成 分 表 500 ml 1 000 ml 1 500 ml 2 000 ml 酵母 提取 物 Yeast Extract 2. Diet 5g (Par 10g 栈 蛋 白水 解 物 Tryptone 0.5¢g lg Wee 2g 牛肉 浸 襄 258 5g toe 10g 蔗糖 Sucrose Z.5¢ 5g 7. 5ig 10g MgSO, * 7H2O 0.247 ¢ 0.493 g 0.740 g 0. 986 g 琼脂 粉 Agar ee 15g 2235 下 30 g pH 5 mol/L NaOH wal @ 7. 4 * YEB 培养 基 不 作为 常备 品 , 需 要 时 提前 1 d 配制 。 附录 = 附录 4 第 用 染色 液 的 配制 ， 1. BRAM 取 30 ml vKARAR. DLA 70 ml 蒸馏 水 ,加 热 至 沸 ; 加 大 0. 75 g 大 丽 紫 ,搅动 , 冷 却 过 滤 ,贮存 于 棕色 瓶 中 。 2 醋酸 洋红 取 45 ml 冰 醋 酸 , 加 入 55 ml 蒸馏 水 ,加 热 至 沸 , 移 走火 源 , 徐 徐 加 入 2g 洋红 粉末 :再 加 热 至 沸 1 一 2 min, 冷 却 后 加 入 2%% 硫 酸 亚 铁 ( 铁 明 砚 ) ,过 滤 后 贮存 于 棕 色 瓶 中 。 3. Bae 21 配 法 同 醋酸 洋红 , (AAS FR AW GL (FeSO, * 7H20). 4. ARAB KA 取 丙 酸 和 乳酸 各 50 ml, 混合 后 加 热 至 沸 , 加 入 2 g 地 衣 红 ,冷却 过 滤 即 为 原 液 , 用 时 稀释 为 45%% 的 染 液 。 5. BRE UL AAG (1) #7 I A YR: 称 取 苏 木 精 1g, 加 50%% 冰 醋酸 或 丙 酸 100 ml, By: 称 取 铁 矶 0.5 g, 加 50%% 醋 酸 或 丙 酸 100 ml. 以 上 两 液 可 长 期 保存 ,用 前 等 量 混合 ,每 100 ml 混合 液 中 加 入 4g 水 合 三 氯 乙 醛 , 充 分 溶解 , 摇 勾 ,存放 1 d 后 使 用 。 该 混合 液 只 能 存放 一 个 月 ,两 周 内 使 用 效果 最 好 , 故 不 宜 多 配 。 (2) 配方 工 A 液 : 称 取 铵 明 矶 [LAINH (SO,)2 。12HO]0.1 到 铬 明 砚 LCrK(CSO 7 。 12H:O]0.1g、 碘 0.1g, 加 3ml95% 乙 醇 。 By: 浓 盐 酸 (比重 1.19)3 ml, C 液 : 称 苏 木 精 2 g, 加 入 50 ml 452% 冰 醋酸 , 待 苏 木 精 完全 溶解 后 ,加 入 0.5g FRA HL (FeSO, + 7H2.O). fF 2K 1 d 后 方 可 使 用 ,染色 力 可 保持 本 周 ,一 次 不 要 多 配 ; 以 上 三 种 溶液 染色 时 混合 使 用 。 (3) &0F% I] PRIA OO. 5 g ,溶解 于 100 ml 45 加 冰 醋 酸 中 ,用 前 取 3 一 5 ml, 用 45% ok 酸 稀释 1 一 2 倍 , 加 入 铁 明 大 饱和 溶液 ( 铁 明 矶 溶 于 45%% 冰 栈 酸 中 )1 一 2 滴 , 溶 液 即 由 棕 黄 变 为 紫色 ,立即 使 用 ,不 能 保存 。 “TS8"。 遗传 学 实验 教程 6. 铁 明 硕 - 苏 木 精 A 液 : 称 苏 木 精 0. 5 g, 溶 解 于 100 ml 蒸馏 水 中 (也 可 配 成 2% 苏 木 精 母液 ,用 时 稀 释 )。 经 1 一 2 个 月 后 方 可 使 用 ,如 果 急 用 可 在 溶液 中 加 0. 1 g 础 酸 钠 , 溶 解 后 即 可 使 用 。 BYR: PK 4 g FAA. AF 100 ml 蒸馏 水 中 , 现 用 现 配 。 以 上 两 种 溶液 染色 前 配合 使 用 。 7. 席 夫 试剂 及 漂洗 液 (1) 席 夫 试剂 将 100 ml 蒸馏 水 加 热 至 沸 , 移 去 火 源 , 加 入 0.5 g 碱 性 品 红 , 再 继续 煮沸 5 min, 并 随时 搅拌 ,冷却 到 50C 时 过 滤 , 置 和 人 棕色 瓶 中 ,加 10 ml 1 mol/ 工 盐酸 , 待 冷 至 25 时 加 入 1 g 偏重 亚硫酸钠 ( 钾 ) ,同时 震荡 一 下 , 盖 紧 , 放 暗 处 过 夜 A 出 呈 淡 黄色 ,加 0. 5 g 中 性 活性 痰 ,剧烈 震 蔓 1 min, 过 滤 后 即 可 。 如 果 次 目 取出 为 “ 无 色 透 明 液体 ,可 直接 使 用 ,不 必 加 活性 炭 。 此 液 必 须 保存 在 冰箱 中 或 阴凉 处 ,并 且 外 包 黑 纸 , 以 防 长 期 露 在 空气 中 加 速 氧 化 而 变色 。 如 不 变色 可 继续 使 用 ,如 变 为 淡 红 色 可 再 加 少许 偏重 亚硫酸钠 , 转 为 无 色 可 使 用 ,出 现 白色 沉淀 不 可 再 使 用 。 (2) 漂洗 液 量 取 5 ml 1 mol/L 盐酸 、5 ml 10% 偏 重 亚硫酸钠 ( 钾 )、100 ml 蒸馏 水 。 现 用 现 配 。 8. 改良 茶 酚 ( 卡 宝 ) 品 红 染 液 (1) 母液 A: 100 ml 70%% 乙 醇 加 3 g 碱 性 品 红 ( 可 长 期 保存 )。 (2) 母液 B: 取 5%% 葵 酚 水 溶液 90 ml, 加 入 10 ml 母液 A( 此 液 限 于 两 周 内 使 用 )。 (3) 苯酚 ( 卡 宝 ) 品 红 染 液 : 取 45 ml 母液 B, 加 入 6 ml 37 儿 的 甲醛 。 (4) 改良 苯酚 ( 卡 宝 ) 品 红 : 取 2 一 10 ml 苯酚 ( 卡 宝 ) 染 液 ,加 90~98 ml 45% BARRA 1.8 g 山梨 醇 , 在 室温 下 保存 2 周 后 再 使 用 。 附录 5 实验 贡 用 数据 1. 主要 作物 种 子 的 发 芽 温 度 和 水 分 发 芽 温 度 / 种 子 发 芽 需 要 水 分 say 最 低 最 适 ae C4 FF AY %) 水 、, 稻 10~12 28~32 40~44 25~30 WV, 1~2 15~20 30~35 50~55 x = 3~4 20~25 28~30 48~68 玉 米 6 一 7 28~35 44~50 40 左右 Bw # 6~7 32~33 44~50 45~50 > > || | a oy HH > 名 称 km 1 谷 子 7~8 KE 6~7 & @ 3.8 RB 1~2 棉 花 10~11 RK 1~3 OR 10 麻 4~6 油 x 1~5 te 生 12 a] A 4~6 = 麻 15 at 菜 2~3 烟 草 10 H # 20 Bee 4~5 B O0~5 2. 多 种 植物 种 子 的 寿命 BF Vea JE /°C Rm if 2446 25~31 25 25~26 25~30 35~40 15~20 15~20 20~25 18~25 15~20 24~32 15~20 25~28 28~32 11~13 31~37 (1) 作物 种 子 的 寿命 与 利用 年 限 称 寿命/ 年 利用 年 限 / 年 稻 3 2 # 2 2 ca 2 2 米 3 3 <9 5 1 梁 2 2 >HaS + | m 名 称 寿命 /年 蜀 葵 3 一 4 金鱼 草 3 一 4 FEAL 2 4 2 一 3 = 菊 2 “人 业 59 - ( 续 #) 种 子 发 芽 需 要 水 分 最 高 (相当 于 种 子 重 的 史 ) 30 25~30 39~40 120~140 30~35 110~120 36~37 100~110 40 50 以 上 40~45 45 左右 37~44 40~50 35 一 -一 55~60 一 100~170 30~40 一 35 一 37 一 44 一 称 寿命 /年 利用 年 限 / 年 豆 3 2 豆 4 2 葵 3 1 瓜 5 4 IR 3 2 名 称 寿命 /年 4 Fete 3~4 风铃 草 3 EA 3~4 长 春花 2 “Kike BE 1 。160 。 遗传 学 实验 教程 站 2 o> Kl Al + ooh OS i Oo mh & Ht Re aw 4k 3. 几 种 动 植物 及 人 细胞 有 丝 分 裂 持 续 时 间 和 持续 时 间 /min | % #6 组 织 20 Ee ae 前 ; 期 天 lOO OOCOCORESOA 洋 RM MA 20 71 6.5 2.4 3.8 83. 7 He BA 19 26~45 “7~10 15 一 20 和 二 人 | 更 豆 ”内 胚乳 一 40 20 12 110 182 根 尖 = 78 14. 4 4.2 13.2 109. 8 RO PRES =| ERE 103 103 14 6 15 128 & 尾 胚乳 一 40~65 10~30 12~22 40~75 102108 根 尖 20 78 14.4 4,2 13. 2 110 & FB mR 19 90 31 34 34 199 Wee ”成 神经 细胞 一 102 13 9 57 181 We 晨 胚胎 肯 脏 细胞 20 59 55 6 75 195 肝脏 成 纤维 细胞 26 >18 17~38 14~26 28 一 鸟 成 纤维 细胞 培养 物 — 102 13 9 57 181 小 鼠 ARV a A 38 2] 13 5 20 59 Hh. 癌 细 胞 37 <30 36 4 19 一 Mt 录 5 二 人 4. 几 种 植物 减 数 分 裂 的 持续 时 间 单位 : 分 fi DB 细 线 - 粗 线 粗 线 - 二 分 体 二 分 体 - 终 变 期 全 人 k # 29. 8 7.4 2.2 39.4 In # 16. 0 5.6 2.4 24.0 m x 39. 4 8.1 ae, 51.2 小 黑 麦 12.8 5.8 2.3 20. 9 百合 120.0 24. 0 24.0 168. 0 延 龄 草 190. 0 64. 0 24. 0 274. 0 5. 多 种 生物 体 细胞 染色 体 数目 名 ORK 染色 体 数目 /个 名 称 染色 体 数目 /个 衣 藻 16(n) 芥菜 型 油菜 36 水 纺 24 甘蓝 型 油菜 38 链 孢 霉 7(n) A eS 20 A & 4(n) 韭 菜 32 曲 霉 8(n) i 16 玉 米 20 丝 瓜 26 K B 14 冬 瓜 24 小 Ba 42 B i= 18 m # 14 杨 树 38 He ca 42 榆 28 FF ca 16 银 Ay 24 水 fai 24 梅 16 高 粱 20 ay 16 栗 18 aA Rm HR 34 R 36 葡 萄 38、40、76 马 # 48 zl 子 32 甘 e 90 柚 了 18 甜 菜 18 柠 ed 18,36 烟 草 48 香 HE 22.33.44 大 豆 40 tt A fe 32 花 生 40 ox & 16 油 Hal 22 & f H 16 K PR 20 牡 F} 20 红 IR 36 lis 黄 28 a FR 28 板 of 24 亚 RK 30,32 柏 22 BE IR 20 杉 22 2. PR 52 垂 柳 76 [Bal FR FP BR 14 国 槐 28 He SR AP BE PR 14 刺 槐 20 白菜 型 油菜 20 紫 aay 40 遗传 学 实验 教程 ¢ 162 « (4 #) 染色 体 数 目 /个 称 染色 体 数 目 /个 18 12 i ik 90 眼 12 要 关 24 22 28 22 24 14 OSE! 值 分 布 表 概 率 值 CP) 自由 度 0. 99 0. 95 0. 05 0. 01 0. 001 1 0. 000 157 0. 003 93 3. 841 6. 635 10. 83 2 0. 020 1 0. 103 9.991 9. 210 13. 82 3 0. 115 0. 352 7.815 11. 34 16. 24 4 0. 297 0. 711 9. 488 13. 28 18. 47 5 0.554 1.145 11. 07 15. 09 20. 51 6 0. 872 1. 635 1259 16. 81 22. 46 7 1.239 2. 167 14. 07 18. 48 24. 32 8 1. 646 2033 TSS 20. 09 26. 13 9 ~ 2.088 3. 325 16. 92 21. 67 27. 88 10 2. 558 3. 940 18. 31 23. 21 29. 59 11 3«053 4,575 19. 68 24. 72 31. 26 12 3.571 5. 226 21503 26. 22 32. 91 13 4,107 5. 892 22. 36 27. 69 34. 53 14 4. 660 6.571 23. 68 29. 14 36. 12 15 5.229 7. 261 25. 00 30. 58 37. 70 16 5. 812 7. 962 26. 30 32. 00 39.25 17 6. 408 8. 672 21. 09 33. 41 40. 79 18 7.015 9. 390 28. 87 34. 81 42. 31 19 7. 633 10. 12 30. 14 36. 19 43. 82 20 8. 260 10. 85 31. 41 Gieat 45. 31 21 8. 897 11.759 32. 67 38. 93 46. 80 22 9. 542 12. 34 33.192 40. 29 48. 27 23 10. 20 13. 09 SLY 41. 64 49. 73 24 10. 86 13. 85 36. 42 42.98 51. 18 TE: 本 表 可 用 于 频数 分 析 和 差异 显著 性 检验 。 表 中 的 数值 , 除 自由 度 与 概率 值 外 均 为 难 值 。 7. 值 分 布 表 - 自由 度 0. 10 i 6. 314 2 2. 920 3 Ze ood 4 Z, 132 5 2.015 6 1. 943 if 1. 895 8 1. 860 9 1. 833 10 1. 812 11 1.796 12 1. 782 13 ser i fl 14 | 15 Dios 16 1. 746 ay 1. 740 18 1. 734 19 1. 729 20 ras: 21 sla A 22 aN LAY 23 1.714 24 HPs (7g 25 1. 708 1 NNN NNN NYNNYNNNNNNN YN NN NYDN DW WS 概 率 . 值 (P) 0. 02 0. O1 31. 82 63. 66 6. 965 9.1925 4.541 5. 841 3. 747 4. 604 3. 365 4. 032 3. 143 3. 707 2.998 3. 499 2. 896 3.355 2. 821 3. 250 2. 764 3. 169 2g718 3. 106 2. 681 3. 055 2. 650 3. 012 2. 624 2 911 2. 602 2. 947 2. 583 2. 921 2. 567 2. 898 28552 2. 878 20939 2. 861 2.528 2. 845 2.518 2831 2. 508 2. 819 2. 500 2. 807 2.492 797 2. 485 二 2. 479 Ze wow wow we ww ww we ww we we FF PR RP oo 4 ee Oe oS eee 。 164 。 遗传 学 实验 教程 ( 续 表 ) 概 {8(p) 自由 度 0. 99 0. 95 0. 05 0.01 0. 001 25 11.52 14.61 37. 65 44, 31 52. 62 26 12. 20 25. 38 38. 89 45. 64 54. 05 27 12. 88 16.15 40.11 46. 96 55. 48 28 13. 56 16. 93 41. 36 48, 28 56. 89 29 14. 26 17.71 42. 56 49. 59 58, 30 30 14. 65 18. 49 43. 77 50. 89 59. 70 Mt = oe ° 165 « (42 表 ) 概 率 (ACP) 自由 度 ; 0. 10 0.05 0. 02 0. O01 0. 002 0. 001 27 1. 703 2.052 2: 413 ram at 3.421 3. 690 28 1.701 2. 048 2. 467 2. 763 3. 408 3. 674 29 1. 699 2. 045 2. 462 2. 756 3. 396 3. 659 30 1. 697 2. 042 2.457 2. 750 3. 385 3. 646 * 本 表 用 于 差异 显著 性 及 可 信 限 测定 , 由 计算 所 得 上 值 根据 其 自由 度 可 查 得 概率 值 。 例 如 , 自由 度 为 10, 值 为 3. 169 时 ,其 概率 值 为 0.01, 即 1% 。 反 之 ,也 可 根据 自由 度 和 所 需 概 率 值 , 查 得 上 值 。 附录 6 消毒 及 灭 瑚 1. 玻璃 器 血 的 灭 菌 玻璃 器 严 清 洗 晾 于 后 ,用 报纸 或 牛皮 纸 包 好 ,以 免 灭 菌 后 被 重新 污染 。 (1) BARA 用 高 压 蒸气 锅 灭 菌 , 灭 菌 时 先 放 出 冷 空 气 , 至 放 气 阀 喷 出 蒸气 时 再 升 压 ,一 般 FAO. 105 MPa20 min 即 可 。 灭 菌 完 毕 后 排放 蒸气 ,取出 后 烘 王 备用 。 (2) FRRA 有 橡皮 头 的 玻璃 器 具 不 能 使 用 干 热 灭 菌 。 将 包 好 的 器 严 均 匀 地 放 人 干燥 箱 内 ,注意 用 纸 包扎 的 物品 不 要 靠近 干燥 箱 壁 ， 不 要 摆 得 太 挤 ,以 免 影响 气体 流通 。 于 燥 箱 温度 调 至 160Y ,在 160~170C 人 恒温 下 处 理 2h 即 可 。 灭 菌 后 到 干燥 箱 冷 却 至 40 一 50 人 时 方 可 开门 取 物 。 2. 金属 器 械 的 灭 菌 接种 针 、 接 种 环 可 直接 在 火焰 上 灼 烧 灭 菌 。 解剖 器 具 一 般 用 者 沸 法 消毒 ,者 沸 , 15 一 30 min 即 可 杀 死 细菌 营养 体 ,而 对 其 Fs 1 一 2 h。 在 水 中 加 入 2 妈 碳 酸 钠 可 促使 芽孢 死亡 , 亦 可 防止 金属 器 械 生 锈 。 aah A RT) Ab) th By A A a A KR a. tT 52 石炭 酸 或 1? 50 的 新 洁 尔 灭 浸泡 灭 菌 。 3. 无 菌 室 、 接 种 箱 的 灭 菌 (1) 加 热 蒸馏 $i BFE ZS a] 2~6 ml/ms 计算 , 量 取 36% 一 40%% 甲 醛 溶液 ,成 于 小 铁 桶 内 ,用 三 脚 架 支 好 ,在 酒精 灯 内 注 人 适量 酒精 (估计 能 蒸 干 甲醛 溶液 所 需 的 量 , 不 要 超过 太 多 )。 将 室内 各 物品 准备 妥当 后 点 燃 酒 精 灯 ,关闭 室内 , 任 甲醛 溶液 煮沸 挥发 。 熏蒸 12h 以 上 。 » 166) - 遗传 学 实验 教程 (2) 氧化 熏蒸 称 取 高 锰 酸 钾 为 1/2 甲醛 的 用 量 , 于 瓷 碗 或 玻璃 容器 内 ,再 取 定 量 的 甲醛 洲 液 , 室 内 准备 妥当 后 ,把 甲醛 倒 人 成 有 高 锰 酸 钾 的 器 严 内 ,立即 关门 , 儿 秒 钟 后 甲醛 溶液 即 沸腾 蒸发 。 关 门 更 蒸 12h 以 上 。 甲醛 对 人 的 眼 . 鼻 有 强烈 刺激 ,为 减弱 甲醛 对 人 的 刺激 ,更 蒸 12 h We 甲醛 等 量 的 所 水 迅速 放 和 人 室内 ,同时 敞开 门窗 放出 剩余 有 刺激 性 的 气体 。 (3) 喷 刷 消毒 用 3%% 一 5% 石 炭 酸 或 1%% 一 5%% 漂 白粉 在 室内 喷 刷 墙 面 ` 地 面 。 (A) 紫外 线 灭 菌 2 560 一 2 260A 波长 的 紫外 线 杀菌 力 最 强 。 其 机 制 是 诱导 形成 胸腺 喀 啶 二 聚 体 ,抑制 DNA 复制 和 使 空气 中 产生 臭氧 (O;: ) 杀 菌 。 紫 外 线 透 过 物质 的 能 力 很 差 ， 只 用 于 空气 及 物体 表面 的 灭 菌 。 常 在 下 阁 和 喷 刷 灭 菌 后 ,操作 前 半 小 时 进行 。 通 常 紫 外 线 的 照射 时 间 为 20 一 30 min, 紫外 线 由 紫外 线 灯 管 产生 ,对 人 体 也 有 伤害 作用 ,不 能 直 视 开 着 的 紫外 灯 , 更 不 能 在 开 着 紫外 灯 的 情况 下 工作 ,可 见 光 能 激活 生物 体 中 的 光复 活 酶 ,使 形成 的 胸 腺 喀 啶 二 聚 体 拆 开 复原 ,因此 ,不 能 在 开 紫 外 灯 的 同时 开 日 光 灯 或 钨 丝 灯 。 4. 培养 基 和 药剂 的 灭 菌 一 般 培 养 基 在 0. 105 MPa 下 灭 菌 20 min; 溶液 类 (如 盐 溶液 .EDTA 溶液 等 ) ,应 FAO. 056 MPa 灭 菌 30 min 或 0. 07 MPalo min; 葡 萄 糖 、 氨 基 酸 、 生 物 素 等 用 0.056 MPa 灭 菌 20 min; 组 织 培养 中 常用 的 生物 活性 物质 (如 酶 溶液 .培养 基 、 血 清 等 ) 不 能 用 高 温 .高 压 法 灭 菌 ,应 该 用 过 滤 除 菌 法 处 理 。 常 用 的 除 菌 滤器 有 以 下 轧 种 。 (1) 蔡氏 滤器 (Seitz 滤器 ,又 称 赛 氏 滤器 ) 是 用 金属 制 成 的 滤器 ,用 后 洗 净 , 干 后 高 压 灭 菌 。 滤 板 为 石棉 制 成 ,每 次 换 用 新 的 滤 板 ,安装 时 光 面 向 下 。 滤 板 型 号 有 多 种 ,国产 的 一 般 分 为 甲 1、 甲 2. 甲 3 型 ， 相当 于 进口 EK 型 除 菌 滤 板 的 EK 、EK.、EK: 型。 石棉 滤 板 往往 使 滤液 中 有 微量 毒素 ,对 细胞 生长 不 利 ;, 因 此 ,使 用 前 要 用 无 菌 生理 盐水 洗 3 一 5 次 。 胰 酶 通过 石棉 滤 板 会 失去 活性 ,pH 值 也 会 升 高 ,所 以 最 好 不 用 。 近 年 来 常用 各 种 型 号 的 醋酸 纤 维 薄 膜 放 人 节 馅 水 中 , 灭 菌 后 再 用 。 (2) 玻璃 滤器 玻璃 滤器 的 滤 板 是 用 玻璃 粉 热 压制 成 的 , 滤 板 与 玻璃 漏斗 猪 合 在 一 起 。 常 用 滤 菌 型 号 为 Gs .Ge 。 新 滤器 表面 有 碱 性 物质 ,应 先 在 流水 中 彻底 洗涤 ,然后 放 人 1 : 100 的 盐酸 中 浸泡 数 小 时 ,再 用 流水 洗涤 ;用 过 的 滤器 0. 070 MPa 高 压 灭 菌 1 h， 冷却 后 取出 , 烘 王 即 可 。 由 于 玻璃 滤器 高 压 灭 菌 后 会 在 板 上 析出 碱 性 物质 ,使 用 前 可 先 用 水 或 少量 滤液 洗涤 。 玻璃 滤器 不 能 用 含有 重 铬 酸 钊 的 洗 液 浸泡 ,因为 可 能 影响 玻璃 孔 的 电荷 ,用 于 — i eae BY 录 « 167 = 洗涤 玻璃 滤器 的 洗 液 为 浓 硫 酸 -硝酸 钠 洗涤 液 。 YK H2SO, 467444) 5. 72 ml ZR Bk 94 ml “NaNO; (化 学 纯 ) 2g 使 用 完 后 ,立即 用 浓 硫 酸 -硝酸 钠 洗 涤 液 抽 滤 一 次 ,滤液 未 干 时 将 滤器 进入 洗 液 中 ( 滤 片 两 面 均 应 接触 洗 液 ) 约 48 h, 取 出 后 用 热 蒸 饮水 冲洗 至 中 性 , 烘 干 后 备用 。 玻璃 滤器 常用 真空 减 压 法 抽 滤 , 当 液 体 临 近 抽 滤 完毕 时 ,应 减 小 压力 ,停止 抽 滤 ,否则 ,液体 抽 完 后 有 可 能 将 细菌 抽 滤 下 去 。 附录 7 DAA ae ML ADEA 1. 重 铬 酸 钾 洗 涤 液 的 配制 (1) Ratz KeCr2O; (lk. FA) 60g 自来水 300 ml H2SO4 (工业 用 ) 460 ml (2) 黎 配 方 K2Cr2O0; (工业 用 ) 60 g 自来水 1 000 ml 浓 H2SO, (工业 用 ) 60 ml (3) 配制 方法 将 重 铬 酸 钾 溶 解 于 水 中 ,然后 慢 慢 加 浓 硫 酸 , 边 加 边 搅动 , 配 好 的 溶液 呈 红 色 。 将 配 好 的 洗 液 盛 放 于 有 塞 玻璃 并 中 ,以 防 氧化 变质 。 洗 液 为 强 氧化 剂 ,去 污 力 强 ， 常用 来 洗 去 玻璃 瓶 或 次 质 器 四 上 的 有 机 物质 , 切 不 可 洗涤 金属 器 具 。 此 液 可 反复 使 用 至 变 蓝 失效 为 止 。 2 玻璃 器 血 的 处 理 C1) 新 购置 的 玻璃 器 阵 的 处 理 新 购置 的 玻璃 器 秋 含 有 游离 碱 , 先 用 2% CI 或 洗涤 液 浸 数 小 时 , 再 用 清水 洗 净 。 新 的 载 玻 片 和 盖 玻 片 , 先 浸 在 肥皂 水 中 ,再 用 自来水 冲洗 ,最 后 用 蒸馏 水 冲洗 ， RF. SW AEF RFE 2% HC! 的 90%% 乙 醇 中 保存 备用 ,用 时 在 酒精 灯 上 烧 去 酒精 即 可 。 (2) 旧 载 玻 片 和 盖 玻 片 的 处 理 将 旧 玻 片 放 在 肥皂 水 中 煮沸 10 min, 然后 用 毛 刷 去 掉 上 面 的 污 物 , 流 水 冲洗 之 后 , 放 和 人 洗 液 中 浸泡 数 小 时 ,将 玻 片 从 洗 液 中 取出 ,然后 流水 冲洗 2 h 以 上 ,再 用 “68 。 遗传 学 实验 教程 蒸馏 水 冲洗 2~3 1K BIL A 95% 乙醇 或 蒸馏水 中 保存 备用 ， (3) 带 油 污 玻璃 器 了 严 的 处 理 凡 带 有 凡士林 或 石 晴 油 的 玻璃 严 ,在 未 洗刷 前 ,尽量 除去 油腻 ,然后 放 和 人 5% 苏打 液 内 者 两 次 ,再 用 肥 电 水 和 热 水 冲 刷 , 最 后 用 清水 洗 净 。 (4) 带菌 玻璃 器 严 的 处 理 | 1) PAAR A FRE 5 A eR BK 1 : 50 的 新 洁 尔 灭 溶液 中 消毒 ， 然后 用 夹子 夹 出 , 依 上 法 冲洗 干净 。 2) 带菌 移 液 管 及 滴 管 的 处 理 先 在 5% Ame RK 0. 25 WBE AK RAR 中 浸泡 数 小 时 或 过 夜 , 取 出 后 高 温 灭 菌 ,然后 用 自来水 冲洗 ,及 蒸馏水 冲洗 。 3) 其 他 带菌 玻璃 器 严 的 处 理 将 器 严 连 同 内 容 培 养 物 一 起 放 人 高 压 灭 菌 ar 15 磅 灭 菌 20 一 30 min, 然 后 趁 热 倒 出 培养 物 , 再 用 肥 电 热 水 洗刷 ,用 自来水 冲 洗 干 净 。 经 以 上 处 理 的 硕 亚 可 用 于 一 般 实 验 。 进 行 分 析 类 实验 时 ,可 先 在 洗 液 中 浸 洗 数 十 分 钟 , 然 后 用 自来水 冲洗 ,再 用 蒸馏 水 冲洗 ,用 双 蒸 水 浸 洗 10 min, HEPA. 附录 8 实验 报告 范文 花头 RR) OE: 遗传 学 R Fl: 生物 科学 系 实验 号 数 : 1 班 Ry XXxXx& 实验 日 期 : 2004 - 06 - 20 wt 264s KX 题 目 : 植物 细胞 有 丝 分 裂 及 染色 体 行为 的 观察 ”教师 签字 : 植物 细胞 有 丝 分 裂 及 染色 体 行 为 的 观察 一 、 实 验 目的 1. 观察 植物 细胞 有 丝 分 裂 过 程 及 各 时 期 染色 体 的 特征 。 2. 学 习 并 掌握 植物 染色 体 玻 片 标本 的 制作 方法 。 二 、 实 验 原理 细胞 分 裂 是 细胞 繁殖 的 惟一 途径 ,细胞 分 裂 一 般 分 为 直接 分 裂 和 间接 分 裂 。 直接 分 裂 也 就 是 无 丝 分 裂 , 细 胞 核 直接 地 一 分 为 二 。 间 接 分 型 又 可 分 为 有 丝 分 裂 及 减 数 分 裂 两 种 。 植物 体 生 长 旺盛 的 分 生 组 织 ( 如 根 尖 , 葵 尖 、 幼 叶 等 ) ,都 在 进行 着 有 丝 分 裂 。 经 过 取材 .固定 、 解 离 . 染 色 和 压 片 等 处 理 过 程 ,将 细胞 分 散在 装 片 中 ,在 显微镜 下 就 可 看 到 大 量 处 于 有 丝 分 裂 各 时 期 的 细胞 和 染色 体 。 由 于 有 丝 分 裂 中 期 的 染色 体 具有 典型 的 形态 特征 ,并 易于 计数 ,所 以 为 了 获得 更 多 的 中 期 染色 体 图 像 ,可 以 采 Mt | « 169 。 ”用 药物 处 理 或 冰冻 处 理 的 方法 ,阻止 纺锤 体 的 形成 ,使 细胞 分 裂 停止 在 中 期 。 同 时 ,通过 处 理 可 使 染色 体 缩短 变 粗 , 易 于 分 散 ,便于 进行 观察 研究 。 另 外 ,通过 对 组 织 细胞 进行 酸性 水 解 或 酶 处 理 , 可 以 分 解 细胞 之 间 的 果 胶 层 ,并 使 细胞 壁 软 化 。 这 样 ;细胞 容易 彼此 散 开 ,有 利于 染色 和 压 片 。 三 、 实 验 材 料 和 用 品 1. 材料 YEA (Allium cepa). Kg (Allium sativum ) A RA, HK (Zea mays), BR (Secale cereale) ./\\#( Triticum aestivum) #3 (Vicia Fapoa ) 的 种 子 等 。 本 实验 以 大 蒜 为 实验 材料 。 2. 用 具 及 药品 显微镜 ,恒温 培养 箱 . 电 冰箱 水浴 锅 、 分 析 天 平 、.17/100 天 平 .电热 套 或 电炉 、 温度 计 、 剪 刀 、 杀 子 .刀片 .解剖 针 、 载 玻 片 . 盖 玻 片 、 滤 纸 、 擦 镜 纸 、 量 简 、 量 杯 漏斗、 Re SFL. = AI Ge A a ES 酒精 灯火 柴 . 切 片 盒 ,标签 .铅笔 、 胶水 纱布 等 。 蒸馏 水 .无 水 乙醇 .95%% 乙 醇 二 甲苯 、 冰 醋酸 、 醋 酸 钠 、 葵 酚 、 甲 醛 、 碱 性 品 红 、 山梨 醇 、 秋 水 仙 素 或 对 二 毛茶 或 0.002 mol/L 的 8 - 凑 基 唆 啉 .中 性 树胶 (或 油 派 胶 六 卡 诺 氏 固定 液 .1mol/L RAR 45% BARR 1 0 FEAR 4 0 FRR 2 0 BR PELL 6 SE a ZY AK 2. AER AA 2.5% RIAA. 四 、 实 验 步 又 1. 材料 准备 与 取材 可 直接 从 田间 挖 取 刚 长 出 的 幼 嫩 根 尖 , 也 可 以 在 室内 培养 根 尖 。 本 实验 用 大 蒜 根 尖 作 材料 ,因为 取材 方便 ,而 且 能 够 获得 较 多 的 根 尖 ,可 供 多 人 使 用 。 首先 将 大 蒜 为 扒 去 皮 ,然后 用 细 铁 丝 串 起 放 在 盛 清水 的 培养 下 内 ,使 根部 与 “ 清水 接触 ,在 20 一 25C 光 照 条 件 下 培养 2 一 3 d, 待 根 尖 长 到 1 一 2 cm 时 ,选择 健 壮 根 尖 自 尖 端 约 1 cm 处 剪 下 准备 预 处 理 用 。 剪 取 根 尖 的 时 间 以 上 午 10 时 左右 为 好 。 2. 预 处 理 为 了 阻止 纺 绯 体 的 活动 ,获得 较 多 的 中 期 分 裂 相 , 同时 使 染色 体 相 对 缩短 , 便 于 染色 体 分 散 和 计数 ,可 对 根 尖 进 行 预 处 理 。 预 处 理 的 方法 有 药物 和 冰冻 预 处理 两 种 。 (1) 药物 处 理 将 材料 放 在 培养 下 中 ,加 0. 05% ~0. 2% 秋 水 仙 素 水 溶液 室温 下 处 理 2~4 bh, 也 可 用 对 二 毛茶 饱和 水 溶液 或 0.002 mol/L 的 8 —-FESEMEMITK IA YR SI PB Ab HS ~ 4h. 这 些 药物 都 能 使 染色 体 缩短 ,但 对 染色 体 有 破坏 作用 。 使 用 时 应 注意 处 理 的 时 间 ,小 麦 \ 黑 麦 , 大麦、 圆 殴 和 大 蒜 等 处 理 2 一 4h 为 宜 , 棉 花 和 水 稻 等 处 理 2 h 左 + 180 +° 遗传 学 实验 教程 右 为 宜 。 而 且 处 理 时 间 长 短 与 温度 也 有 很 大 的 关系 。 (2) 冰冻 处 理 将 根 尖 浸泡 在 蒸馏水 中 , 置 于 1 一 4C 冰 箱 内 或 盛 有 冰 块 的 保温 瓶 中 冰冻 24 h。 这 种 方法 对 染色 体 无 破坏 作用 ,染色 体 缩 短 均 匀 ,效果 良好 ,简便 易 行 ,各 种 作物 都 适用 ,但 常用 于 处 理 禾 本 科 植 物 材 料 。 如 果 只 是 为 了 观察 有 丝 分 裂 各 个 时 期 的 染色 体 动 态 变 化 而 不 进行 染色 体 计 数 , 可 以 不 进行 预 处 理 。 3. 固定 或 前 低 渗 将 经 过 预 处 理 和 未 经 预 处 理 的 材料 (用 于 和 经 预 处 理 的 根 尖 进 行 对 比 ) 用 蒸馏 水 冲洗 两 次 ,然后 转移 到 卡 诺 氏 固定 液 (3 份 无 水 乙醇 ,加 入 工 份 冰 醋 酸 , 现 用 现 配 ) 中 ,室温 下 固定 3 一 24 h。 或 者 将 根 尖 放 和 人 0. 075 mol/L KCl 溶液 申 低 渗 处 理 20 min, 然 后 再 用 蒸馏 水 冲洗 2 一 3 次 。 注意 : 如 果 固 定 后 的 材料 不 立即 使 用 ,可 放 在 70%% 酒 精 中 , 置 冰箱 或 阴暗 处 保 存 。 用 时 再 用 固定 液 重新 固定 一 下 (30 min~3 hb) 效果 会 较 好 。 4. 解 离 常用 的 解 离 方 法 有 以 下 几 种 。@ 将 根 尖 用 蒸馏 水 冲洗 2 次 , 放 人 已 经 在 607C 水 浴 锅 中 预 热 的 1 mol/L 盐酸 中 ,在 60 人 恒温 条 件 下 处 理 5 一 10 min, 当 根 尖 的 伸 长 区 变 透 明 而 分 生 区 呈 米 黄 或 乳白 色 时 即 可 取出 ;GO 将 根 尖 放 和 人 2.5%% 纤 维 素 酶 和 2.5% 果 胶 酶 的 等 量 混 合 液 中 (pH 5. O~5. 5) ,室温 下 处 理 3 h AAS @ ABR BLA 95%% 酒 精 和 浓 盐 酸 (1 : 1) 混 合 液 中 处 理 2 一 10 min, 或 将 根 尖 放大 5 mol/L 盐酸 中 处 理 5 一 10 min。 5. Bea 将 解 离 好 的 材料 用 蒸馏水 冲洗 以 后 , 转 和 人 45 RR PIE 10 min AA. RL 1 一 2 根 软化 好 的 根 尖 放 在 载 玻 片 上 ,用 刀片 切 去 伸 长 区 ,只 留 下 1 一 2 mm 的 分 生 区 ,也 就 是 生长 点 , 滴 一 滴 龙 胆 紫 染 色 液 ,染色 3 一 5 min; 也 可 用 改良 苯酚 品 红 染 色 液 ,染色 10 一 15 min; 也 可 用 醋酸 洋红 染色 液 染 色 30 min FA. 染色 完毕 ,加 上 盖 片 ,在 酒精 灯火 焰 上 过 3 一 4 次 ,以 手背 试 之 ,感觉 微 烫 为 家 (如 果 室 内 气温 较 高 ,或 认为 染色 较 好 ,也 可 不 用 酒精 灯 烤 片 ) 。 在 盖 片 上 复 以 吸水 纸 , 用 左手 拇指 压 住 盖 片 的 一 角 , 用 右手 拿 铅 笔 垂 直 涡 盖 片 几 下 ,用 力 要 均 匀 , 尽 量 多 敲 几 下 ,把 材料 震 散 。 继 续 用 左手 拇指 压 住 盖 片 一 角 , 用 右手 拇指 用 力 下 压 盖 片 ,在 保证 两 玻 片 不 错 动 的 前 提 下 ,将 材料 压 成 薄 薄 一 层 , 即 可 放 在 显 微 镜 上 观察 。 6. 镜 检 压 好 的 片子 先 在 低 倍 镜 下 镜 检 , 找到 分 裂 细胞 后 ,再 转换 成 高 倍 镜 观察 染色 体 的 动态 变化 。 注 意 比较 经 过 预 处 理 和 未 经 预 处 理 的 材料 的 不 同 之 处 。 如 果 染 色 体 Mr 录 s aii - 分 散 良 好 ,图 像 清晰 ,就 可 以 脱水 封 片 , 制 成 永久 片 。 7. 永久 制 片 将 玻 片 标 本 用 干冰 或 制冷 器 冷冻 数 分 钟 , 也 可 放 在 冰箱 中 冷冻 几 小 时 ,取出 后 用 薄 刀 片 掀 开 ,将 附着 材料 的 载 片 或 盖 片 置 于 37C 恒 温 箱 中 烘 干 , 然 后 在 二 甲 茉 中 透明 15 min 左右 ,中 性 树胶 封 片 ,干燥 后 即 可 长 久保 存 。 五 、 实 验 结果 由 于 做 实验 时 ,严格 按照 教材 操作 规程 ,并 且 在 教师 的 指导 下 ,制作 的 植物 根 尖 的 压 片 也 比较 清晰 ,因此 本 实验 结果 基本 验证 了 植物 有 丝 分 裂 的 现象 ,而 且 在 实 验 过 程 中 也 找到 了 有 丝 分 裂 : 前 期 .中 期 .后 期 和 末期 的 分 裂 相 各 个 时 期 。 各 个 分 裂 时 期 的 图 形 如 附 图 1。 六 、 作 业 与 思考 根据 实验 结果 , 绘 出 在 显微镜 下 观察 到 的 有 丝 分 裂 各 时 期 的 图 像 的 示意 图 并 注 明 时 期 ( 附 图 2) 。 未 期 附 图 1 有 丝 分 裂 各 个 分 裂 期 的 图 形 附 图 2 有丝分裂 各 个 分 裂 期 的 示意 图 形 ( 周 国 利 ) 和 区 植物 愈 伤 组 织 的 超低温 保存 x fe A 指导 教师 : 郭 善 利 (聊城 师范 学 院 生物 系 ”山东 聊城 252059) 【摘要 】 对 毛 白 杨 、 地 椒 、 浦 公 英 的 愈 伤 组 织 超低温 保存 中 的 一 些 因素 进行 了 对 比 研 究 ,试验 的 重点 在 于 不 同 的 保护 剂 在 超低温 保存 中 对 植物 组 织 保护 的 作用 。 = 172 遗传 学 实验 教程 试验 结果 表明 : 在 液 所 (一 196" ) 温 度 下 ,地 椒 用 5 0 = FASE YB +- 10% HY +6 % 蔗糖 保护 剂 保存 较 好 ; BAH BASE 10% 二 甲 基 亚 硕 十 0.5 mol/L 甘露 醇 保 存 较 好 。 【关键 词 】 OAR ”超低温 保存 BAM HW WAR 植物 组 织 培养 可 以 迅速 建立 无 菌 植 物 无 性 繁殖 系 , 是 种 质保 存 的 有 效 途 径 之 一 。 随 着 组 织 培养 技术 的 完善 ,发现 用 组 织 培养 维持 种 系 的 缺点 在 于 继 代 培养 的 费用 ,和 因 误 差 或 微生物 污染 造成 的 危险 ,更 重要 的 是 在 继 代 培养 过 程 中 发 生 细胞 学 变化 导致 染色 体 变 异 和 基因 突变 ,以 及 形态 建成 能 力 的 丧失 51。 超低温 通常 是 指 低 于 一 80C 的 低温 , 主要 是 液 氮 以 及 液 所 蒸气 相 , 在 超低温 下 活 细 胞 的 物质 代 谢 和 生长 活动 几乎 完全 停止 ,植物 材料 处 于 相对 稳定 的 状态 。 因 而 对 植物 愈 伤 组 织 的 保存 超低温 冷冻 是 较为 理想 的 途径 。 它 不 仅 可 以 解决 组 织 细胞 继 代 培 养 中 的 变异 问题 ,还 可 以 用 于 长 期 保存 无 性 系 繁 殖 植物 的 优良 品种 ,以 及 育种 工作 中 要 求 的 纯 系 ,避免 自然 界 累积 性 突变 ,建立 去 病毒 茎 尖 分 生 组 织 以 及 稀有 和 濒危 动物 物 种 资源 的 储存 同时 也 便于 国际 交流 号 ?5 。 到 目前 为 止 通过 超低温 保存 获得 成 功 的 植物 材料 已 达 百 余 种 "7 。 我 国 在 这 方面 的 研究 起 步 较 晚 ,对 植物 愈 伤 组 织 超低温 保存 成 功 的 首 篇 报道 是 来 自 简 令 成 等 的 甘蔗 愈 伤 组 织 超低温 保存 中 一 些 因 素 的 研究 ,在 此 以 后 又 陆续 出 现 了 玉米 、 三 j= 28 RBA AE. Mth SSK. BA RS. TRS SED BAAR RIE. A RRA Bt BL, MA AUFERO A ELAR ETE FAD BFE RR RPA OR BE 程序 .解冻 再 培养 几 个 方面 。 而 冰冻 保护 剂 处 理 是 尤为 重要 的 一 个 环节 。 本 试验 仅 就 这 个 环节 进行 探讨 。 1. 材料 与 方法 1.1 材料 培养 在 材料 培养 过 程 中 用 到 的 培养 基 有 以 下 几 种 : a. MBD,: MS+B; 有 机 酸 十 2,4- D2 mg/L b. MSB,: MS-+6 - BA2 mg/L ce. MSh.;B,: MS+IAAO. 5 mg/L+6- BA] mg/L d. MSI.2B,: MS+IAAO. 2 mg/L+6 - BA] mg/L e. MSNo.2B,: MS+NAAO. 2 mg/L+7 - BA2 mg/L 以 上 培养 基 均 加 入 酷 蛋 白 250 mg/L 和 琢 脂 8 g/L 地 椒 愈 伤 组 织 由 无 菌 苗 的 葵 段 (除去 节 , 只 留 节 间 ) 或 叶 接 于 a 或 b 上 诱导 而 来 ,在 < 上 继 代 培养 ,生长 10~15 d 的 愈 伤 供 试 。 毛 和 白杨 愈 伤 由 毛 白杨 的 葵 尖 或 叶 接 于 a 上 诱导 而 来 ,并 在 a 上 继 代 培 养 , 生 长 10 一 15 d 的 材料 供 试 。 附 录 4 Bis « 蒲公英 愈 伤 叶片 接 于 b 或 e 上 诱导 , 愈 伤 组 织 在 b 或 d 上 继 代 培养 ,生长 10~15 d 的 材料 供 试 。 1.2 冰冻 保护 处 理 使 用 的 冰冻 保护 剂 为 5 种 , 均 为 复合 保护 剂 ,如 下 : (1) 10% 二 甲 基 亚 硕 十 3 的 蔗糖 (2) 10% = ASE WM + 12% REE (3) 10%—FWM+0.5 mol/L 甘露 醇 (4) 10% — Ase Wi +10% Hi (5) 5 吃 二 甲 基 亚 砚 十 10% 甘 油 十 6%% 芒 糖 将 培养 10~15 d 的 愈 伤 切 成 0.5 cmX0.5 cmX0.5 cm 大 小 的 组 织 块 , 放 人 冻 存 管内 ,加 入 冰冻 保护 剂 至 没 过 组 织 块 ,加 盖 , 并 用 封口 膜 封 住 管 口 ,4C 保持 30 min, 备 用 。 1.3 冰冻 降温 由 4C 直 接 投入 液 所 和 低温 冰箱 内 。 1.4 解冻 和 洗涤 40C 水 浴 解 冻 , 倾 去 全 部 保护 剂 ,用 对 应 的 液体 继 代 培 养 基 冲洗 3 次 。 1.5 存活 率 的 检测 将 解冻 洗涤 后 的 组 织 块 称 取 100 mg, BF 10 ml 试管 中 ,然后 加 入 0.5% ”TITC( 氯 化 三 茶 四 氮 唑 ) 溶 液 5 ml, 在 20~25C FRB PHA 18~20 h, 倾 去 TTC, 葵 饮水 洗涤 2~3 次 ,再 加 入 95%% 乙 醇 5 ml,60C 水 浴 20~30 min, 提取 TTC 被 还 原生 成 的 红色 甲 敌 用 723 分 光 光 度 计 于 485 nm 波长 处 测试 提取 液 的 光 吸 收 值 ， 2. 结果 与 讨论 2.1 愈 伤 组 织 培养 时 间 的 选择 细胞 的 抗 寒 能 力 与 其 分 裂 和 生长 活动 等 生理 状态 有 密切 关系 ,一 些 研究 成 果 表 明 : 处 于 快速 生长 的 组 织 抗 冻 能 力 较 强 。 毛 和 白杨、 地 椒 、 薄 公 英 的 愈 伤 组 织 在 接 到 新 鲜 的 继 代 培 养 基 以 后 7 一 20 d 内 生长 较 快 ,之 后 细胞 开始 衰落 。 故 本 试验 所 用 的 愈 伤 组 织 均 是 在 新 鲜 培 养 基 上 培养 10~15 d 的 处 于 生长 旺盛 时 期 的 组 织 。 2.2 冰冻 保护 剂 很 多 研究 表明 : 单一 的 保护 剂 对 细胞 的 伤害 较 大 ,而 复合 保护 剂 的 毒性 较 小 ， 这 可 能 是 因为 复合 保护 剂 中 各 组 分 产生 累加 效应 减 小 或 消除 了 单一 成 分 的 毒害 作 FAS 。 各 种 保护 剂 对 材料 的 保存 效果 如 下 。 了 遗传 学 实验 教程 表 工 液 气 保存 后 各 组 织 的 TIC 还 原 值 及 细胞 活力 wm A 英 aaa I) / % SmI I /%4 44.1 49, 2 66. 1 D0, 7. 40. 1 (1) (2) (3) (4) (5) TE: 细胞 活力 三 保存 后 的 愈 伤 组 织 TTC 还 原 值 /未 保存 的 您 伤 组 织 TIC 还 原 值 。 未 保存 的 愈 伤 组 织 TTC 还 原 值 : HHH: 0. 338A; BAG: 0. 395A; G3: 0. 540A。 结果 表明 : 复合 保护 剂 的 保存 效果 是 较为 理想 的 ,虽然 不 同 的 保护 剂 保存 效果 之 间 存 在 着 一 些 差 异 , 但 差异 并 不 显著 。 对 三 种 材料 而 言 ,5) 对 于 地 椒 、3) 对 于 毛 白杨 (3) 对 于 蒲公英 的 保存 效果 较 好 一 些 。 而 且 五 种 保护 剂 对 于 三 种 材料 的 保存 并 没有 规律 可 言 , 即 没有 一 种 保护 剂 可 以 使 三 种 材料 都 有 较 高 的 存活 率 。 值得 注意 的 一 点 是 : 使 用 同样 的 保护 剂 ,在 低温 冰箱 内 保存 的 材料 细胞 活力 则 较 低 , 均 低 于 10% ,这 说 明 低温 冰箱 虽然 在 动物 细胞 保存 方面 取得 了 较 好 的 效 果 , 但 在 植物 细胞 保存 方面 仍 有 不 足 之 处 。 原 因 可 能 是 : 一 87C 更 易于 形成 冰晶 ， 对 植物 细胞 的 伤害 较 大 “2 。 2.3 降温 冰冻 常见 的 降温 冰冻 方法 有 三 种 : @ 快速 冷冻 法 ;@) 逐步 冷冻 法 ;@ 慢 速 冷冻 法 。 三 种 方法 都 能 成 功 地 保存 材料 ”。 缓 慢 冷冻 时 ,由 于 细胞 外 的 水 分 首先 变 成 小 冰晶 ,细胞 外 部 溶液 浓度 提高 ,细胞 内 外 形成 渗透 压 梯度 ,使 细胞 脱水 ,同时 也 损 伤 了 细胞 壁 ;快速 冷冻 时 ,形成 冰晶 的 速度 较 快 ,细胞 不 易 脱 水 ,对 细胞 壁 的 损伤 也 较 小 。 该 方法 曾 成 功 地 保存 了 康乃馨 的 茎 尖 …。 因 条 件 限 制 本 试验 采用 了 快速 冷 冻 法 , 亦 取 得 了 较 好 的 效果 。 2.4 ， 融 冰 与 再 培养 保存 样品 的 融 冰 速度 是 超低温 保存 中 的 一 个 重要 问题 ,缓慢 融 冰 ,由 于 细胞 内 发 生 剧 烈 的 冰晶 再 结晶 过 程 , 易 导致 细胞 死亡 2 。 相 反 40C 水 浴 快 速 融 冰 则 避免 了 这 一 过 程 的 发 生 ,细胞 的 存活 率 较 高 。 将 融 冰 的 组 织 块 洗 去 保护 剂 , 接 于 新 鲜 培 养 基 上 进行 暗 培养 ;再 培养 的 时 间 较 长 ,一 般 10 d 之 后 才 恢复 生长 , 待 完全 恢复 还 需要 一 段 较 长 的 时 间 2“ 。 恢复 培 养 的 结果 有 待 进一步 观察 。 3. 结语 试验 结果 表明 ,复合 保护 剂 在 超低温 保存 愈 伤 组 织 过 程 中 ,具有 较 好 的 保护 作 用 ,推动 了 植物 愈 伤 组 织 超低温 保存 的 研究 。 植 物 愈 伤 组 织 超低温 保存 的 研究 目 MY 录 5 £75 。 前 虽 已 取得 了 了 一些 进 展 , 但 许多 问题 尚 有 待 进一步 探讨 。 比 如 : 对 超低温 保存 后 材料 的 遗传 稳定 性 的 研究 ;对 再 培养 的 植株 缺乏 结构 上 和 细胞 学 上 的 研究 ;保护 剂 的 作用 机 理 尚 不 完全 清楚 ; 冻 存 保护 技术 中 各 因素 的 相互 作用 知之 甚 少 ;各 种 植物 的 组 织 在 超低温 保存 过 程 中 是 否 有 共同 的 保存 途径 等 等 ,这 些 问题 需要 做 进一步 的 研究 。 致谢 : 在 试验 过 程 中 得 到 了 孙 震 晓 、 张 谦 明 老 师 的 指导 , 王 风 亭 、 董 平原 、 王 世 华 ` 迟 娜 、 苏 俊 伟 等 同学 的 积极 帮助 ,再 此 一 并 表示 感谢 。 参考 文献 1 BA. 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Taraxacum. mongoliaim. Hand-Mazz. Populus Tomentosa Carr Callus. The stress of this experiment is the effect of defferent Cryopreserved materials on callus. The result shows that celak callus was well cryopreservated in 5% DMSO+ 10% glycerine + 6% sucrose; Hand-mazz callus and Carr callus was well cryopreservated in 10% DMSO+0.5 mol/L mannitol with LN (liquid itrogen —196°C). Key word; Cryopreservation Callus Thymus Quinques. Celak.’ Taraxacum. mongoliaim. Hand-Mazz Populus Tomen-tosa Carr im, 参考 文 献 2 — 北京 大 学 生物 系 遗 传 学 教研 室 . 1983. 遗传 学 实验 方法 和 技术 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 陈 瑶 生 , 盛 志 廉 . 1999. 数量 遗传 学 . 北京 : 科学 出 版 社 RTE, EES, EMMI . 1987. 遗传 学 实验 . 北京 : 北京 师范 大 学 出 版 社 河北 师范 大 学 等 . 1982. 遗传 学 实验 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 华 卫 建 , 昌 君 . 2002. 新 编 人 类 群体 遗传 学 实验 一 组 . 遗传 ,24(3): 432 一 344 = PEE RAFAL. 1990. 遗传 学 实验 原理 和 方法 . 成 都 : 四 川 大 学 出 版 社 兰州 大 学 . 2000. 细胞 生物 学 实验 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 兰州 大 学 生物 系 细胞 遗传 教研 室 ,细胞 学 研究 室 . 1986. 细胞 生物 学 实验 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 李 艳 , 邵 阳光 , 孙 晖 . 2001. 异 色 球 虫 一 一 简单 而 方便 的 遗传 学 实验 材料 . 生物 学 通报 ,36(3): 39 一 40 ZEBRA . 1988. 细胞 生物 学 实验 . 北京 : 北京 大 学 出 版 社 EAS . 1989. 遗传 学 实验 . 北京 : 北京 师范 大 学 出 版 社 刘 祖 洞 , 江 绍 慧 . 1987. 遗传 学 实验 . 第 2 版 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 。 邱 奉 同 , 刘 林 德 . 1992. 遗传 学 实验 . 青岛 : 青岛 海洋 大 学 出 版 社 RASA RAS .1993. 作物 遗传 与 育种 学 实验 实习 指导 . 北京 : 农业 出 版 社 盛 祖 嘉 , 陈 中 孕 . 1982. 微生物 遗传 学 实验 . 北京 : 高 等 教育 出 版 社 ERM. 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